## 1.3 Les particularités de mise en œuvre

Compte tenu de l'imprévisibilité et de l'évolution du phénomène, deux impératifs s'imposent :

- Une surveillance locale quotidienne d'un échantillon représentatif de l'ensemble des arbres à noter, pour démarrer les notations dans la fenêtre idéale.

- La mise en alerte du personnel nécessaire pour effectuer les mesures en un minimum de temps.

Ces notations décrivent le débourrement de la plupart des espèces forestières usuelles ; mais, nous n'avons pas de méthode pour les espèces à croissance continue telles les *Cupressacées*.

## 2. Résultats

Pour l'ensemble des espèces forestières courantes, les chercheurs ont constaté une grande stabilité du caractère débourrement, dans l'espace et dans le temps. Ainsi en 1992, pour les 3 sites du même test de Sapin de Douglas installés en Normandie, dans les Vosges et dans la Montagne Noire, nous obtenons d'excellentes corrélations linéaires entre sites pour les 200 descendances en test, bien que les notes moyennes de débourrement ne soient pas tout à fait homogènes (**graphique 1**).

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

Les chercheurs ont aussi montré une structuration du débourrement pour le Sapin de Douglas et ils ont défini trois grandes zones :

- le nord de l'aire (Colombie Britannique) aux climats rudes dont les origines trouvent en France des conditions de croissance très tôt en saison (nombre de degrés/jours trop rapidement atteint), débourrent trop tôt et se trouvent donc sensibles aux gelées

- la zone centrale (Etat du Washington et Nord de l'Orégon), partie de l'aire aux conditions climatiques les plus proches des nôtres, et qui fournit les génotypes les plus adaptés aux besoins français
- le sud de l'aire (sud Orégon et Californie) aux climats doux et chauds qui produisent des matériels qui ne supportent aucune gelée.

On a également montré que les origines à débourrement précoce font davantage de polycyclisme (plusieurs pousses dans l'année, séparées par des arrêts de croissance), qui, quoique potentiellement intéressant sur le plan de la vigueur au stade juvénile, est plutôt néfaste sur le plan de la qualité du bois car induisant chaque année un pseudo verticille (couronne de branches) supplémentaire donc des nœuds en plus.

## Conclusion

Après l'intérêt initial de sélectionner des matériels "résistants" aux gelées tardives puis de les croiser entre eux pour créer des variétés améliorées, il apparaît maintenant que l'évaluation de la phénologie permettra en plus de prédire les aires de répartitions des espèces forestières, confrontées aux conséquences des changements climatiques globaux.

Dans cette perspective, un Groupement de Recherche intitulé « Système d'Information Phénologique pour l'Etude et la Gestion des Changements Climatiques »<fnref n="35" /> a été crée et qui a comme objectif de constituer une base de données compilant des observations phénologiques réalisées en France par divers organismes de 1880 à nos jours. C'est le parfait exemple d'une relecture par une nouvelle discipline d'observations réalisées lors de la conduite de programmes d'amélioration génétique.

## Bibliographie

- Lacaze JF, Tomassone R (1967) Contribution à l'étude de la variabilité infraspécifique du douglas. Annales des Sciences Forestières, n°1 volume 24, 85-106

- Birot Y (1972) Propositions sur les moyens pour obtenir du matériel amélioré de reproduction de douglas. Document CNRF, 22p

- Bastien JC, Roman Amat R, Michaud D (1986) Le douglas, in n° spécial « Amélioration génétique des arbres forestiers », Revue Forestière Française, 113-117

- Bastien JC, Roman Amat B (1992) Le douglas, in "Amélioration des espèces végétales cultivées", 710-719

<footnote n="35">³⁵ Pour plus d'informations sur le GDR : consulter le site http://medias.dsi.cnrs.fr/pheno/</footnote>
# Tests en laboratoire d'évaluation de la résistance partielle des clones de Peuplier vis-à-vis des rouilles à Melampsora larici-populina

<sup>36</sup> Jean Gauvin, Daniel Lacan, Patrick Poursat, Michel Verger

**Résumé** : Les rouilles à Melampsora larici-populina sont des ennemis majeurs du Peuplier. Mieux comprendre les mécanismes génétiques de la relation hôte – pathogène et mettre sur le marché des nouveaux clones minimisant l’impact du champignon est un enjeu essentiel pour la populiculture. La sélection de variétés à résistance complète s’est avérée vaine du fait du fort potentiel d’adaptation de l’agent pathogène. Dans l’objectif d’explorer des formes de résistance potentiellement plus durables, des tests en laboratoire d’évaluation de la résistance partielle ont été mis au point par les améliorateurs forestiers de l’Inra d’Orléans. Des protocoles d’inoculation sur disques foliaires excisés permettent d’accéder à trois composantes épidémiologiques clés : la latence infectieuse, le nombre d’urédosores et leur taille.

Ce travail, couplé à des expérimentations en pépinière, des travaux de cartographie génétique et de détection de QTL, permettra d’identifier l’emplacement puis la nature des gènes qui contribuent aux résistances partielles présentes chez le Peuplier.

**Mots clés** : Peuplier, clones, rouille, résistance partielle, Melampsora larici-populina

## Introduction

Les Peupliers, de la famille des Salicacées, appartiennent au genre Populus qui se divise en six sections botaniques. Bien que ne représentant en France que 230 000 ha (1,3% de la surface boisée), sa forte productivité en fait une espèce d’intérêt majeur pour la filière bois. La bonne aptitude au bouturage généralement observée chez les Peupliers a amené l’homme très tôt à utiliser des « cultivars » (clones). Hélas, cette culture est attaquée par de nombreux ennemis et la faible variabilité génétique du matériel planté (plantations monoclonales, peu de cultivars commercialisés parfois même apparentés) accentue l’importance du phénomène.

Parmi ces ennemis, les rouilles foliaires, maladies qui induisent des défeuillaisons précoces, provoquent de grosses pertes de rendement (jusqu’à 30% sur la croissance) et souvent des mortalités. La rouille à Melampsora larici-polulina (Mlp) est la plus fréquente et la plus dommageable en France. Elle doit son nom à un cycle hétéroïque combinant une phase de recombinaison (reproduction sexuée) en avril-mai sur Mélèze et une longue période de multiplication végétative sur Peuplier, entre mai et octobre, par production d’urédosores donnant des urédospores à la face inférieure des feuilles.

Durant plusieurs décennies, les améliorateurs ont sélectionné des clones de Peuplier dont la résistance totale fut à chaque fois rapidement contournée par le champignon. Ils s’orientent maintenant vers la sélection de clones sensibles à Mlp mais ne subissant pas de pertes de croissance économiquement dommageables et n’exerçant pas non plus une forte pression de sélection sur l’agent pathogène : autrement dit des clones tolérants porteurs de résistances partielles. Cet article décrit le protocole mis au point pour les étudier.

<footnote n="36"><sup>36</sup> INRA UAGPF, amélioration, génétique et physiologie forestières, Avenue de la Pomme de Pin, Ardon BP 20619 - 45166 Olivet cedex ☎02 38 41 48 41 jean.gauvin@orleans.inra.fr</footnote>
# 1. Description du matériel et de la méthode

## 1.1 Gestion des isolats de Mlp

Ces isolats sont constitués d'urédospores et se présentent sous la forme d'une poudre orange. Ils sont conditionnés dans des tubes Eppendorf rangés dans des boîtes à couvercle dont le fond, rempli de chlorure de magnésium, permet de conserver un taux d'humidité de 30%. Afin d'éviter les pollutions, tous les tubes, à l'intérieur d'une boîte, contiennent le même isolat. Les boîtes sont conservées au réfrigérateur à +5° C.

Pour multiplier un isolat, on en prélève 1 à 2 mg que l'on met en suspension dans 10 à 15 ml d'eau osmosée gélosée (0,5 g/L d'agar). Afin d'assurer une bonne homogénéité, on agite le mélange durant 2 minutes. Au préalable, des feuilles du clone 'Robusta', qui a la particularité d'être sensible à toutes les souches de Mlp connues, ont été récoltées. Ces feuilles, placées sur pellicule d'eau (face inférieure en haut) dans une boîte de Pétri, sont alors inoculées par pulvérisation de la suspension d'urédospores. La faculté germinative de l'isolat est contrôlée en le pulvérisant sur 2 boîtes de Pétri contenant une pellicule de gélose solide (à 20 g/L d'agar). On compte 24 et 48 h après pulvérisation, au microscope, le pourcentage d'urédospores qui ont germé.

Les feuilles de 'Robusta' sont mises en chambre de culture (température de 17 °C et photopériode de 16 heures de jour). Après 10 à 12 jours, les urédospores sont récoltées en tapotant les feuilles sur du papier aluminium. L'isolat est pesé, stocké et on en teste la faculté germinative (même méthode que précédemment).

La gestion du stock se fait sur ordinateur grâce à une base de données sous Access.

## 1.2 Elevage du matériel végétal

Des boutures de 20 à 25 cm, issues de parcs à pieds mères, sont récoltées en hiver, stockées en chambre froide à 4°C puis mises en pot et élevées en serre climatisée. Il est important de surveiller ces plants de manière à éviter tout stress (thermique, hydrique, phytosanitaire) qui induise des variations de comportement vis-à-vis de l'attaque de rouille.

Durant cette étape, il est primordial d'éviter toute pénétration de rouille dans la serre : sas, entrée contrôlée, combinaison pour les agents intervenant dans la serre, traitements fongicides de contact en cas d'attaque...

## 1.3 Récolte du matériel végétal et mise en place du dispositif

Le matin de l'installation d'un test, on prélève une à deux feuilles, entre la 5ème et la 10ème feuille en partant du sommet du plant de Peuplier ; et on y découpe à l'emporte pièce des disques de 3 cm de diamètre. Parallèlement, on dispose des boîtes à puits (6 puits par boîte) sur une table. Le dispositif comporte 5 blocs complets. Pour des raisons de place en chambre de culture, les blocs ne peuvent dépasser 90 boîtes. On remplit à moitié les puits d'eau distillée. Puis, clone par clone, les disques sont distribués dans les puits aux emplacements affectés aléatoirement par une procédure informatique. Ils sont disposés face inférieure vers le haut. Dans chaque bloc, outre les clones en testage, on trouve les parents de la population en test (2 à 3 disques), 8 clones porteurs de résistances complètes qui permettent de discriminer (= clones discriminants) les différents pathotypes de rouille (3 disques chacun).
**1.4 Inoculation**

Le lendemain de l'installation, on remplace les disques qui ont coulé ou qui se sont recroquevillés. La pulvérisation de l'inoculum s'effectue à l'aide d'un pulvérisateur à main à réserve d'air comprimé en 2 fois 5 passages. Pour une surface d'1 m² à inoculer, on pulvérise sur les boîtes à puits 25 ml de solution (isolat + eau gélosée). La quantité d'isolat nécessaire (de 1 à 3.5 mg/m²) est décidée en fonction de la faculté germinative de l'isolat et de son pourcentage d'humidité. La solution est maintenue au froid pendant l'homogénéisation par agitateur magnétique pour ralentir l'évolution des urédospores dont la durée de vie dans l'eau est limité (+/- 30 minutes) à température ambiante.

Entre les boîtes à puits sont intercalées des boîtes de Pétri contenant de la gélose solide (de 4 à 8 suivant la taille du bloc) qui permettent de vérifier, par comptage au microscope, sur une surface équivalente à un disque de 3 cm, l'homogénéité et l'intensité de l'inoculation.

Les boîtes contenant les disques foliaires sont ensuite refermées et mises dans la chambre de culture (cf. conditions décrites § 1.1).

**1.5 Les observations**

Du 6ème au 13<sup>ème</sup> jour, la latence (temps entre l'inoculation et l'apparition du 1<sup>er</sup> sore sporulant) est observée deux fois par jour. Un disque où le 1<sup>er</sup> sore sporulant apparaît le matin du 8ème jour sera noté 8 et 8,5 s'il apparaît le soir. La température de la chambre de culture (17°C) permet d'accentuer les différences entre clone pour la latence par rapport à ce qui se passe en milieu naturel.

Au matin du 13<sup>ème</sup> jour, on compte sur chaque disque le nombre de sores. Ce comptage est assorti de commentaires informatifs sur l'état sanitaire du disque. Les disques qui à première vue ne présentent pas d'attaque de rouille sont examinés plus attentivement pour ne pas conclure abusivement à la présence d'une résistance totale.

Au 14<sup>ème</sup> jour intervient la notation de taille des sores. On constitue pour chaque bloc une échelle de 1 (petit) à 5 (taille maximum) avec un disque représentatif pour chaque taille. Le notateur attribue à chaque disque foliaire porteur d'urédosores une note correspondant à cette échelle. Quand tous les disques sont notés, on photographie à l'aide d'un appareil numérique posé sur banc, les disques qui ont servi à construire les échelles, plus deux autres disques par bloc et par classe de taille. On procède de même pour les disques des parents et des clones discriminants. Ces photos sont analysées avec un logiciel d'analyse d'image ImageJ®. Puis on calcule une surface moyenne de sore (en mm²) pour toutes les échelles de notation. On peut ainsi passer d'une variable qualitative (note) à une variable quantitative exprimée sur une échelle linéaire.

**2. Résultats**

Un résultat important obtenu dans notre laboratoire est une connaissance fine des relations entre les différents paramètres mesurés. Ainsi on constate (figure 1(1) et 1(2)) que, pour des génotypes présentant des valeurs de latence faible (zone A), à une valeur donnée de latence correspondent des valeurs de nombre et de taille d'urédosores très diverses. En d'autres termes, une grande variabilité génétique peut s'exprimer pour ces caractères.

En revanche, on voit que des valeurs de latence élevées (zone B) empêchent l'expression des différences entre génotypes pour les deux autres caractères : nombre et taille des urédosores sont faibles pour tous les génotypes. Pour la taille des urédosores, lorsqu'ils apparaissent tard, on peut penser qu'ils n'ont pas le temps d'exprimer tout leur potentiel de développement. Pour le nombre d'urédosores, on peut faire l'hypothèse qu'il existe des gènes qui conduisent à
la fois à une latence élevée et à un faible nombre d'urédosores. Les génotypes porteurs de ces gènes ont un niveau de résistance partielle proche de la résistance totale.

Par ailleurs, aux pressions d'inoculum utilisées, l'indépendance entre le nombre et la taille des urédosores est complète (figure 1(3)).

Tous ces résultats justifient que l'on continue à mesurer ces trois caractères et laisse espérer que l'on puise un jour les combiner favorablement dans un même génotype.

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>**Figure 1** : Exemple caractéristique des relations fréquemment observées entre les différentes composantes de la résistance partielle mesurées en laboratoire.</figcaption></figure>

Chaque point représente un génotype de Peuplier.

Zone A = génotypes à latence courte (<10j), zone B = génotypes à latence longue (10j<X<14j).
Conclusion et perspectives

Nous envisageons d'améliorer notre protocole d'étude de la résistance partielle à Mlp. On se focalisera plus particulièrement sur les points suivants :

- L'élevage en serre : il sera nécessaire d'améliorer le contrôle climatique et d'augmenter l'étanchéité des serres pour éviter les contaminations par la rouille naturelle.

- L'inoculation : on cherchera à mieux calibrer la concentration des suspensions d'inoculation. On pourrait réaliser des mesures de densité optique, ce qui serait compatibles avec la durée de survie des spores dans l'eau à condition de disposer d'une courbe étalon. La dispersion spatiale de l'inoculum devra aussi être améliorée. Les premiers essais de tour à inoculation n'ont malheureusement pas donné satisfaction.

- Les observations : il serait nécessaire d'automatiser la mesure de la taille des urédosores grâce à un système automatique d'analyse d'image.

L'amélioration technique de ces étapes nous permettra de constituer une plateforme expérimentale performante pour le phénotypage à haut débit du Peuplier vis-à-vis de la rouille foliaire et d'aboutir plus rapidement à la sélection de nouveaux cultivars performants.

Bibliographie

Dowkiw A (2003) Analyse génétique de la résistance et de la tolérance de peupliers hybrides *Populus deltoides* X *Populus trichocarpa* à la rouille foliaire à *Melempsora larici-populina*. Thèse de doctorat de l'université d'Orléans, 179p

Lefévre F, Faivre-Rampant P, Goué M.C, Laurens F, Pilate G, Pinon J, Valadon A, Villar M (1995) Composantes de la résistance aux rouilles chez les peupliers : utilisation en sélection. Comptes-Rendus de l'Académie d'Agriculture de France 81:111-121

Paillassa E (2006) Quelles pertes de croissance pour 7 cultivars de peuplier face aux attaques de la rouille E4 du mélèze. Forêt-Entreprise 168:60-63

Pinon J, Frey P, Villar M (2001) La populiculture à la recherche de la résistance durable aux maladies, La Forêt Privée 258:25-32
# Comment doser plusieurs activités enzymatiques sur un même type d'ectomycorhizes avec un minimum de matériel prélevé ?

Jean-Louis Churin <fnref n="37" />

**Résumé** : Afin de mesurer efficacement la capacité des mycorhizes à mobiliser les éléments du sol au bénéfice des arbres, nous avons développé une micro-technique à haut débit qui permet de mesurer les activités de huit enzymes différentes secrétées par les mêmes ectomycorhizes avec seulement sept échantillons d'un même type. Ainsi d'une part nous comparons les profils d'activités enzymatiques de différents types d'ectomycorhizes dans un même peuplement, et d'autre part nous apprécions les variations de ces activités dues aux interventions sylvicoles : chaulage, fertilisation, éclaircies...

**Mots clés** : Ectomycorhize, fluorimétrie, colorimétrie, fluorochrome, tubes PCR, activités enzymatiques.

## Introduction

Les racines fines des arbres des forêts tempérées sont associées avec des champignons formant des organes symbiotiques mixtes appelés ectomycorhizes (ECM). Les champignons ectomycorhiziens jouent un rôle crucial dans la survie et le développement des arbres. Ils sont capables de mobiliser et de prélever les nutriments à partir de la litière par sécrétion d'un grand nombre d'enzymes.

La plupart de nos connaissances sur la diversité fonctionnelle des ECM résultent des expérimentations sur les jeunes semis cultivés en conditions contrôlées en laboratoire. Ces conditions sont très différentes de celles qui prévalent sur les arbres adultes en sols forestiers. Afin de décrire la diversité fonctionnelle des ECM *in situ* pour comprendre le rôle joué par les partenaires fongiques parmi les communautés ectomycorhiziennes des écosystèmes forestiers, nous mesurons différentes activités contribuant à la nutrition de l'arbre.

Nous avons d'abord utilisé une méthode de micro-radiorespirométrie (Jany et al. 2003) qui demandait un investissement important en temps du fait de l'impossibilité de traiter plusieurs types de mycorhizes simultanément. Nous traitions seulement vingt quatre échantillons à la semaine. Puis nous avons utilisé un système mesurant le potentiel d'activité enzymatique des phosphatases et des déshydrogénases à l'aide de microplaques (Buée et al. 2004). Plus récemment nous avons développé, en collaboration avec un laboratoire de Munich dans ces mêmes conditions de microplaques, des méthodes de colorimétrie et de fluorimétrie pour la détection simultanée de plusieurs activités enzymatiques sur un même type de mycorhize (Pritsch et al. 2004 et Courty et al 2005). Nous avons ainsi abouti à une méthode à haut débit avec 50 types de mycorhizes traités par jour et huit activités enzymatiques. Nous décrivons ici cette méthode.

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

<footnote n="37">³⁷INRA-Univ.Nancy 1- UMR Interactions Arbres/Microorganismes - 54280 Champenoux</footnote>

<footnote n="03">03 83 39 40 82 churin@nancy.inra.fr</footnote>
# 1. Principe de la méthode

Les huit enzymes étudiées contribuent à la dégradation de la paroi des végétaux morts : dégradation cellulolytique (cellobiohydrolase et glucosidase), hémicellulolytique (glucuronidase et xylosidase) et dégradation de la lignine et des composés phénoliques (laccase). Elles contribuent également à la dégradation de la chitine qui provient des parois des cellules fongiques et des insectes (chitinase), des phosphates organiques (phosphatase acide) et des protéines (leucine amino peptidase).

Selon les enzymes, deux méthodes sont employées : la fluorimétrie ou la colorimétrie.

Dans le cas des mesures par fluorescence, les substrats des enzymes étudiées sont couplés avec des fluorochromes : MU (MéthylUmbelliférone) ou AMC (AminoMéthylCoumarine). En solution, par exposition à une longueur d'onde précise, ces fluorochromes ont la propriété de réémettre à une autre longueur d'onde. C'est la mesure de la quantité de photons réémise qui indique la quantité de fluorochrome libre dans le milieu et ainsi de connaître la quantité de substrat hydrolysé par les enzymes. En effet, lorsque la liaison entre le fluorochrome et le substrat reste intacte, on ne mesure que l'autofluorescence naturelle du couple substrat-fluorochrome ; mais, si la liaison entre le substrat et le fluorochrome est rompue, on mesure la quantité de fluorochrome en solution, qui est proportionnelle à la quantité d'enzyme secrétée. En colorimétrie (détermination de l'activité laccase), l'ABTS (diammonium 2,2'-azinobis-3-éthylbenzothiazoline-6-sulfonate), un substrat synthétique de l'enzyme étudiée, change de couleur lorsqu'il est oxydé ; on mesure l'intensité de la couleur verte proportionnelle à la quantité d'enzyme secrétée dans le milieu.

On souhaite mesurer les différentes activités enzymatiques secrétées sur les mêmes apex ectomycorhiziens. Il faut donc pouvoir transférer ces apex d'un réactif à un autre. Pour cela on utilise des barrettes de tubes PCR modifiées. Ces barrettes sont utilisées dans les laboratoires de biologie moléculaire et entrent parfaitement dans une rangée de 8 puits des microplaques à 96 puits utilisées ici pour l'incubation et le rinçage. La modification de ces barrettes de tubes PCR<fnref n="38" /> s'effectue ainsi : on coupe la base conique des 8 tubes d'une barrette, on coupe également le dôme de chacun des bouchons pour garder sur l'anneau résiduel le début de la courbure (figure 1). Des rondelles de 5 mm de diamètre sont alors découpées à l'emporte-pièce dans de la toile nylon<fnref n="39" /> de maillage 250 µm et déposées à la pince au fond des bouchons préparés. Il ne reste plus qu'à insérer les tubes dans les bouchons et à élaguer au scalpel les liants plastiques restant autour des capuchons (figure 1 et photo 1). Avec les barrettes ainsi transformées, nous transférons ces apex d'un substrat à un autre sans avoir à les reprendre avec des pinces et risquer ainsi de les détériorer.

## 1.1 Mode opératoire

### 1.1.a Échantillonnage

Les échantillons de sol contenant les racines sont collectés dans des boîtes isothermes puis conservés avant traitement à 4 C°. Les racines sont traitées dans les quatre jours suivants. Elles sont lavées précautionneusement pour ne pas détériorer les mycorhizes. Les morphotypes d'ECM (types morphologiques communs) sont décrits à la loupe binoculaire selon Agerer (1987-98). Sept apex ectomycorhiziens de chaque morphotype étudié, sensiblement de même taille, sont prélevés et déposés individuellement dans chacun des tubes des barrettes PCR modifiées (photos 1 et 2) installées dans la plaque de rinçage (photo 3).

<footnote n="38">³⁸ Astucieux bricolage imaginé par un technicien du laboratoire de Munich avec lequel nous collaborons.</footnote>

<footnote n="39">³⁹ Sté Busine - 60600 Clermont de l'Oise</footnote>
Le huitième puits ne contient pas de mycorhize (témoin négatif). Un échantillon de chaque morphotype est congelé (-80°C) pour de futures identifications moléculaires.

<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>**Figure 1** : schéma représentant les étapes de transformations des barrettes PCR</figcaption></figure>

<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>**Photo 1** : Barrettes et capuchons tronqués</figcaption></figure>

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>**Photo 2** : Tamis en place</figcaption></figure>

<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>**Photo 3** : Barrette dans une microplaque</figcaption></figure>

<table><caption>**Tableau 1** : Récapitulatif des caractéristiques de chaque test enzymatique</caption><thead><tr><td>Ordre des tests</td><td>Substrats</td><td>Concentration de la solution de travail (µM)</td><td>pH</td><td>Temps d'incubation (min)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Glucuronidase</td><td>MU-β-D-glucuronide hydrate</td><td>500</td><td>4,5</td><td>60</td></tr><tr><td>Xylosidase</td><td>MU-β-D-xylopyranoside</td><td>500</td><td>4,5</td><td>60</td></tr><tr><td>Cellobiohydrolase</td><td>MU-β-D-cellobioside</td><td>400</td><td>4,5</td><td>40</td></tr><tr><td>β-Glucosidase</td><td>MU-β-D-glucopyranoside</td><td>500</td><td>4,5</td><td>60</td></tr><tr><td>Chitinase</td><td>MU-N-acetyl-β-D-glucosaminide</td><td>500</td><td>4,5</td><td>20</td></tr><tr><td>Phosphatase acide</td><td>MU-phosphate</td><td>800</td><td>4,5</td><td>10</td></tr><tr><td>Leucine aminopeptidase</td><td>L-leucine-AMC</td><td>400</td><td>6,5</td><td>60</td></tr><tr><td>laccase</td><td>ABTS</td><td>2000</td><td>4,5</td><td>60</td></tr></tbody></table>

### 1.1.b Préparation des solutions

Le tableau 1 donne les substrats et les paramètres expérimentaux pour chacune des huit activités enzymatiques mesurées. Tous les produits sont référencés chez Sigma Aldrich. Les solutions mères de chaque substrat (5 mM) et les solutions de calibration d'AMC et MU (25 mM) sont préparées dans du méthoxyéthanol. Les substrats sont dilués avec de l'eau ultra pure stérile pour atteindre les concentrations désirées (tableau 1). Les solutions mères, les substrats dilués et les solutions de travail doivent être stockés à -20 °C à l'abri de la lumière.
Le tampon d'incubation est préparé à une concentration de 150 mM et stérilisé. C'est un mélange d'acide maléique et de Tris (pH 2-7). Le tampon stop utilisé pour alcaliniser la solution et arrêter les réactions est le Tris 1 M à pH 10 – 11.

1.1.c Incubation et mesure (figure 2)

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>**Figure 2 :** schéma des manipulations en fluorimétrie.

*Ce cycle est répété autant de fois qu'il y a d'activités à mesurer*</figcaption></figure>

En fonction du substrat, le temps d'incubation dans les plaques de titration noires à 96 puits est variable. Il a été choisi pour mesurer l'activité enzymatique la plus élevée. Chaque puits contient 50µl de tampon d'incubation, 50µl d'eau ultra pure et 50µl de solution de travail. Les mesures sont obtenues avec le lecteur de microplaques Victor (Wallac Perkin-Elmer Life Sciences) à une longueur d'onde d'excitation de 355 nm et de 460 nm en émission. Pour les laccases, l'intensité de la couleur verte est dosée à 415-425 nm avec le lecteur de plaques Hercules 550 (Biorad, Hercules, CA, USA)
Dès que les analyses fluorimétriques et colorimétriques sont terminées, les apex sont transférées à la pince directement des barrettes au fond des puits d'une microplaque transparente afin d'être passés à l'analyseur d'images Winrhizo 2003b (Regent Instrument, Inc., Québec, Canada) qui détermine la surface projetée de chaque échantillon. Les résultats de ces analyses sont exprimés par unité de temps et par unité de surface projetée de chaque type d'ectomycorhize (pmol/mm²/min). Les surfaces projetées présentent une corrélation linéaire avec les surfaces développées des ectomycorhizes supposées cylindriques.

## 2. Résultats et exemple d'application

La figure 3, tirée du travail de Courty et al (2005) montre qu'un même type d'ectomycorhize (formée par le champignon *Lactarius quietus*) présente des profils d'activité différents selon la saison. En été, les activités dominantes sont : glucosidase, chitinase et cellobiase, alors qu'en hiver, après la chute des feuilles, l'activité xylosidase domine.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Figure 3 : Exemple de profils d'activités d'ectomycorhize de *Lactarius quietus* selon la saison</figcaption></figure>

## Conclusion

Un grand progrès vient d'être réalisé, nous faisant passer de 24 échantillons et une seule activité par semaine à une cadence possible de 50 échantillons et 8 activités par jour. Ce progrès a été obtenu en combinant trois techniques :

- méthode d'analyse en colorimétrie et fluorimétrie utilisant les substrats fluorescents,

- analyse d'image évitant les pesées fastidieuses pour la calibration des mesures,

- adoption d'un bricolage gardant intacts les échantillons tout au long du processus.

Cela nous permet d'une part de comparer les profils d'activités enzymatiques de différents types d'ectomycorhizes dans un même peuplement, et d'autre part d'apprécier les variations de ces activités dues aux interventions sylvicoles (chaulage, fertilisation, éclaircies...).

Cette méthode pourra être utilisée pour de nouveaux tests concernant non seulement les activités enzymatiques extracellulaires mais aussi d'autres mécanismes relatifs à la mobilisation des nutriments, comme la chélation du fer ou l'altération des minéraux.
**Bibliographie**

Agerer R (1987-1998) Colour atlas of ectomycorrhizea. Munich, Germany: Einhorn-Verlag Eduard Dietenberger

Buée M, Vairelles D, Garbaye J (2004) Year-round monitoring of diversity and potential metabolic activity of the ectomycorrhizal community in a beech (*Fagus sylvatica*) forest subjected to two thinning regimes. *Mycorrhiza* 15, 235-245

Courty PE, Pritsch K, Schloter M, Hartmann A, Garbaye J (2005) Activity profiling of ectomycorrhiza communities in two forest soils using multiple enzymatic tests, *New phytologist*, 167, 309-319.

Jany JL, Martin F, Garbaye J (2003) Respiration activity of ectomycorrhizeas from *Cenococcum geophilum* and *Lactarius sp*. In relation to water potential in five beech forest. Plant Soil 255 : 487-494.

Pritsch K, Raidl S, Marksteiner E, Blaschke H, Agerer R, Schloter M, Hartmann A (2004) A rapid and highly sensitive method for measuring enzyme activities in single mycorrhizal tips using 4-methylumbelliferone-labelled fluorogenic substrates in a microplate system. *Journal of Microbiological Methods*, 58, 233-241.