# Dosage du phosphore (méthode au vert de malachite)

Eric Lecloux

► To cite this version:

Eric Lecloux. Dosage du phosphore (méthode au vert de malachite) : Mode opératoire de minéralisation pour des échantillons végétaux de 100 mg. INRAE. 2022, pp.31. hal-04243886

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Submitted on 16 Oct 2023

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# Dosage du phosphore (méthode au vert de malachite)

## Mode opératoire de minéralisation pour des échantillons végétaux de 100 mg

Eric Lecloux, UMR AGIR, 2022
# Organisation d'une journée type-Dosage du phosphore 38 échantillons

<table><thead><tr><th></th><th>Journée type - Dosage du phosphore</th></tr></thead><tbody><tr><td>heures</td><td>tâches à accomplir</td></tr><tr><td>8h</td><td>dépôt de la plaque de creusets sur la plaque chauffante</td></tr><tr><td>8h-9h30</td><td>attaque acide + installation des fioles jaugées, entonnoirs, filtres</td></tr><tr><td>9h30-10h</td><td>transfert du contenu des creusets dans le filtre, début filtration</td></tr><tr><td>10h-11h</td><td>filtration + préparation du tableau de résultats + mettre 2,25 mL d'eau distillée dans les cuves + vaisselle des creusets</td></tr><tr><td>11h-12h</td><td>fin filtration, mise à niveau des fioles jaugées puis conditionnement</td></tr><tr><td>12h-13h</td><td>déjeuner</td></tr><tr><td>13h-14h</td><td>coloration</td></tr><tr><td>14h-16h00</td><td>pesée de la série suivante</td></tr><tr><td>16h-16h30</td><td>lecture au spectrophotomètre</td></tr><tr><td>16h30-17h</td><td>vaisselle des fioles jaugée et des entonnoirs</td></tr><tr><td>17h</td><td>Interprétation des résultats</td></tr></tbody></table>
## Etape 1 : Micro pesées
## I) Matériel et/ou réactifs nécessaires pour la pesée :

<table><thead><tr><td>Matériels</td><td>Contrôles</td></tr></thead><tbody><tr><td>Balance de précision 0,0001g</td><td>Externe annuel<br>Interne avant utilisation</td></tr><tr><td>Spatule plus papier essuie tout</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de boîte de pétri</td><td></td></tr><tr><td>Creusets</td><td></td></tr><tr><td>plaque</td><td></td></tr><tr><td>Plan de plaque</td><td></td></tr></tbody></table>

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1) 1) Contrôle de la balance : enregistrer sur la fiche de suivi de la balance le poids des masses de contrôle avec la date et le nom de l'utilisateur

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1) 2) Tarer avec le creuset

1) 3) Peser l'aliquote, introduire dans le creuset à l'aide d'une spatule

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<table><thead><tr><th>Date</th><th>N°</th><th>Serie:</th><th>N°</th><th>Plaque</th><th>N°</th><th>N°</th><th>N°</th><th>NOEMIE</th><th>Attaque Acide</th><th>Temps</th><th>Temperature</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td rowspan="10"></td><td> volume acide</td><td>0,8 ml</td></tr><tr><td> volume eau</td><td>0,1ml</td></tr><tr><td> Concierge Plaque</td><td>175°C</td></tr><tr><td> Heure debut</td><td></td></tr><tr><td> Heure 100°C</td><td></td></tr><tr><td> l'vapeur</td><td></td></tr><tr><td> stabilisation</td><td></td></tr><tr><td> Heure 1°bis 1ml</td><td></td></tr><tr><td> Temp stabilisé °C</td><td></td></tr><tr><td> Heure 2° fois 1ml</td><td></td></tr><tr><td> stabilisation</td><td></td></tr><tr><td> Heure 3° fois 1ml</td><td></td></tr><tr><td> Heure 4° fois 2ml</td><td></td></tr><tr><td> Heure fin</td><td></td></tr><tr><td colspan="13">Mise en route</td></tr><tr><td colspan="13">Heure fin</td></tr></tbody></table>

### l) 4) Inscrire la masse de l'échantillon pesée sur la feuille du plan de plaque (retourner le premier creuset, sens de la plaque)

### l) 5) Une plaque complète comprend 38 échantillons, 3 blancs, 3 standards de contrôle standard: Maïs V463 USRAVE

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## Etape 2 : Calcination
II) 1) Mettre la plaque dans le four, puis démarrer le chauffage à 100°C

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II) 2) Attendre 30 min de chauffage

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II) 3) Au bout des 30 min, monter la température à 200°C
II) 2) Attendre 30 min de chauffage

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II) 3) Au bout des 30 min, monter la température à 300°C

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II) 4) Attendre 30 min de chauffage
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II) 3) Au bout des 30 min, monter la température à 550°C

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II) 4) Attendre 5 heures de chauffage
## Etape 3 : Minéralisation
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### III) Matériel et/ou réactifs nécessaires pour minéraliser :

<table><thead><tr><td>matériels</td><td>consommables</td><td>produits</td><td>EPI</td><td>Contrôles</td></tr></thead><tbody><tr><td>Pipette automatique (5000 microL)</td><td>Cône P5000</td><td>Eau distillé</td><td>Gants nitrile</td><td>Externe annuel<br>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Pipette automatique (100 microL)</td><td>Cône P100</td><td></td><td>Blouse</td><td>Externe annuel<br>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Pipette automatique (1000 microL)</td><td>Cône P1000</td><td></td><td>visière</td><td>Externe annuel<br>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td></td><td></td><td></td><td>Interne systématique</td></tr><tr><td>Pipette distributrice 50mL</td><td></td><td></td><td></td><td>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Petit bécher (50ml)</td><td></td><td>Acide nitrique (65%)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grand bécher avec couvercle en verre</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chronomètre</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feuille d'enregistrement de température</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaque avec creuset calcinés</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
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### III) 1) Poser la plaque en fonte et vérifier qu'elle soit bien a plat sur la plaque chauffante : tous les creusets doivent être chauffés de manière homogène puis poser le bécher d'eau distillée sur la plaque (maintenir la température des creusets lors des ajouts d'eau)

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### III) 2) Introduire 100 microlitres d'eau distillée dans chaque creuset avec la pipette automatique

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### III) 3) Mettre en route la hotte de sécurité à petite vitesse
### III) 4) S'équiper de gants, blouse et lunettes de sécurité ou visière (E.P.I.)

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### III) 5) Introduire 0,8 mL d'acide nitrique (95%) dans chaque creusets avec la pipette automatique

### III) 6) Mettre en route la plaque chauffante affichage : 178°C enregistrer le départ de l'attaque acide (heure et températures) et poursuivre ces enregistrements à chaque ajout d'eau **voir la courbe de température à la suite**

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## II) Suivi et enregistrement de la température dans les creusets pendant l'attaque acide en fonction du temps :

Contrôle permanent de la température et contrôle d'un niveau d'eau suffisant dans les creusets (ne doivent jamais être secs).

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### III) 7) Laisser chauffer pendant 28 min, évaporation principale, production de premières vapeurs : visibles au bout d'environ 10 min (à 110 - 120°C)

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### III) 8) Introduire 1 mL d'eau chaude dans chaque creusets et un peu plus pour les échantillons les plus évaporés.

### III) 9) Laisser chauffer une nouvelle fois pendant 14 min la plaque (température de consigne 178°C).

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II) 10) Introduire 1 mL d'eau chaque creusets et un peu plus pour les échantillons les plus évaporés.

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II) 11) Laisser évaperer une troisième fois pendant 15 min.

II) 12) Introduire 2 mL d'eau chaque creusets et un peu plus pour les échantillons les plus évaporés.

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II) 13) Éteindre la plaque chauffante, s'équiper de gants anti chaleur puis poser la plaque contenant les creusets sur la paillasse pour l'étape de filtration
## Etape 4 : Filtration
IV) Matériel et/ou réactifs nécessaires pour Filtrer :

<table><thead><tr><td>matériels</td><td>consommables</td><td>produits</td><td>EPI</td><td>Contrôles</td></tr></thead><tbody><tr><td>Fioles jaugée de 50mL</td><td>Filtres Whatman Ashless 40 (110 mm de diamètre)</td><td>Eau distillée</td><td>Gants anti chaleur</td><td></td></tr><tr><td>Entonnoirs</td><td>Cône P5000</td><td>Échantillons</td><td>Blouse</td><td></td></tr><tr><td>Pissette d'eau distillée</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piluliers étiquetés</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette P5000</td><td></td><td></td><td></td><td>Externe annuel</td></tr><tr><td>Plaque avec creusets minéralisés</td><td></td><td></td><td></td><td>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Grand bécher rempli d'eau distillée chaude</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
#### IV) 1) Disposer les fioles jaugées avec les piluliers dans l'ordre de la plaque avec entonnoirs + filtres (les imbiber d'eau distillée pour garder la forme de l'entonnoir)

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#### IV) 2) Transférer les échantillons minéralisés dans les fioles correspondantes et rincer 2 fois les creusets à l'eau distillée tiède pour récupérer la totalité de l'échantillon

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#### IV) 3) Remettre de l'eau dans les filtres au bout de 20 min
Le temps de filtration dure en tout 1h pour récupérer tout le filtrat de chaque échantillon
#### IV) 4) Au bout de 1h de filtration, retirer les filtres + entonnoirs

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#### IV) 5) Ajuster chaque fiole à l'eau distillée (dilution au 1/50ème) au trait de jauge

#### IV) 6) Homogénéiser longuement chaque fiole et verser les solutions dans les piluliers correspondants (s'assurer du transfert de la totalité de la solution)

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Fin de manip : Interprétation des résultats, vaisselle et nettoyage paillasse

La vaisselle est
effectuée avec une
éponge dédiée et
sans savon ni autre
détergent pour éviter
de polluer le matériel
au contact des
solutions à doser

Creusets

→ Entonnoirs

→ Fioles jaugées

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## Etape 5 : Coloration

A l'issu de la minéralisation du matin, les flacons de solutions sont conservés à température ambiante en attente de l'étape de coloration de l'après midi

* Les quantités nécessaires de réactifs sont sorties du réfrigérateur le matin pour une utilisation à température ambiante

* Après coloration, les flacons se conservent deux ans à 4°C
V) a) Matériel et/ou réactifs nécessaires pour colorer et lire :

<table><thead><tr><td>matériels</td><td>consommables</td><td>produits</td><td>EPI</td><td>Contrôles</td></tr></thead><tbody><tr><td>Cuves spectrophotométriques : contenance 4,5 mL en PMMA 4 faces optiques</td><td>bouchons</td><td>Eau distillée</td><td>blouse</td><td></td></tr><tr><td>Boîte cuves + couvercles</td><td></td><td>réactifs (R1, R2)</td><td>Gants nitrile</td><td></td></tr><tr><td>Pipette P5000</td><td>Cône P5000</td><td>Gamme</td><td></td><td>Externe annuel<br>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Pipette P1000</td><td>Cône P1000</td><td>Échantillons</td><td></td><td>Externe annuel<br>Interne ponctuel</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Beckmann (longueur d'onde : 610nm)</td><td></td><td></td><td></td><td>Interne par comparaison avec un autre spectrophotomètre</td></tr></tbody></table>
## V) b) Conseils d'organisation et méthodes de travail :

* Préparer le bon nombre de cuves + les 7 cuves de gamme

* Disposer les échantillons dans l'ordre de la fiche plan de plaque

* Bien homogénéiser le flacon avant de prélever

* Décaler la cuve d'un cran vers la gauche une fois le réactif ou l'échantillon versé

* Changer le cône de la pipette après avoir introduit chaque échantillon

* Vérifier régulièrement que le volume affiché par la pipette reste inchangé

* S'assurer que le pipetage/refoulement s'effectue correctement (afin d'éviter les erreurs de volume)

* Utiliser un seul bouchon par cuve, et ne pas les mélanger
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V) 1) Préparer les cuves pour la gamme et les échantillons de manière a se repérer facilement (cuves non identifiables)

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V) 2) > **Gamme** : prélever 2,5 mL de chaque solution étalon et verser dans les cuves correspondantes

> **Echantillons/Essais** : d'abord introduire 2,25 mL d'eau distillée dans chaque cuve puis prélever 0,25 mL de chaque échantillon (dilution au 1/10ème).

V) 3) Introduire dans chaque cuve (gamme + échantillons) 0,5 mL de réactif R1 et homogénéiser chaque cuve après avoir mis les bouchons de cuves. Enfin, laisser réagir pendant 10 min

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V) 4) Au bout des 10 min, retirer les bouchons de cuves pour ajouter 0,5 mL du réactif R2 (vert de malachite) dans chaque cuve (gamme + échantillons)

V) 5) Homogénéiser chaque cuve après avoir mis les bouchons de cuves. Puis, laisser réagir une nouvelle fois pendant à 2h maximum.

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V) 6) Configurer le spectrophotomètre à 610 nm de longueur d'onde et mesurer tout d'abord les absorbances de la gamme (construction droite de régression), puis mesurer les absorbances des échantillons à doser.
V) 7) Construire la droite d'étalonnage donnée par la gamme de concentration linéaire du phosphore à l'aide d'un tableur puis relever l'équation de la droite de la forme ax + b (d'où A.sol. étalon) = f([phosphore]).

<table><thead><tr><td>gamme</td><td>Absorbances</td><td>Concentrations en P connues dans chaque étalon en mg P/L</td></tr></thead><tbody><tr><td>T0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>T1</td><td>0,102</td><td>0,05</td></tr><tr><td>T2</td><td>0,2068</td><td>0,1</td></tr><tr><td>T3</td><td>0,4248</td><td>0,2</td></tr><tr><td>T4</td><td>1,1935</td><td>0,5</td></tr><tr><td>T4,5</td><td>1,7713</td><td>0,75</td></tr><tr><td>T5</td><td>2,3154</td><td>1</td></tr></tbody></table>

Calcul de la concentration de l'échantillon: C'échantillon) = A'échantillon) + 0,0155)/ 2,3548

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## V) 8) calcul de la teneur en phosphore d'un échantillon

<table><thead><tr><th></th><th></th><th>Absorbance</th><th>Masses<br>echantillon en g</th><th>Calcul regression (concentration<br>en mg P/L)</th><th>Calcul teneur g P/Kg</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>Maïs</td><td>1,113</td><td>0,1005</td><td>0,47923391</td><td>2,38</td></tr><tr><td>1</td><td>Masse échantillon</td><td></td><td>0,1005</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>Regression donne mg P/L</td><td></td><td>0,47923391</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3</td><td>Fiolejaugée</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Volume de dilution ml</td><td></td><td>50</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4</td><td>Quantité de mg de P<br>dans 2,5ml</td><td>0,001198084</td><td></td><td>=(2,5*0,47923391)/1000</td><td></td></tr><tr><td>5</td><td>Volume d'échantillon<br>dans les 2,5 ml</td><td>0,25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6</td><td>Quantité mg P pour volume<br>echantillon</td><td>0,2396168</td><td></td><td>=(50*0,001198084)/0,25</td><td></td></tr><tr><td>7</td><td>Quantité de P pour 1Kg<br>g par Kg</td><td>2,38</td><td></td><td>=(1000*0,2396168)/0,1005</td><td></td></tr><tr><td></td><td>simplification</td><td>x*((2,5/1000)*50)/0,25</td><td></td><td>=x*0,5 ou divise/2</td><td>Ensuite divisé par masse échantillon</td></tr><tr><td></td><td></td><td>0,47923391</td><td></td><td>0,5</td><td>2,384</td></tr></tbody></table>
## Données du standard étudié :

<table><thead><tr><td>référence</td><td>Absorbance</td><td>Masse en g</td></tr></thead><tbody><tr><td>Maïs</td><td>1,113</td><td>0,1005</td></tr></tbody></table>

## Calcul de la concentration en P par litre de l'échantillon 194895 :

* D'après la droite : $y = 2,3548 \times -0,0155 \Leftrightarrow A_{(maîs)} = 2,3548 \times C_{(maîs)} - 0,0155$.

* D'où : $C_{(maîs)} = \frac{A_{(maîs)} + 0,0155}{2,3548} = 0,47923391 \text{ mg P/L}$

<table><thead><tr><td>référence</td><td>absorbance</td><td>Masse en g</td><td>Calcul régression C en mg P/L</td></tr></thead><tbody><tr><td>Maïs</td><td>1,113</td><td>0,1005</td><td>0,47923391</td></tr></tbody></table>

## Calcul de la teneur Tm (massique) en phosphore (g P/kg) de l'échantillon 194895 :

$$ \bullet Tm = \left( \frac{C_{(maîs)}}{2*} \right) / m_{(maîs)} = 2,38 \text{ g P/kg} $$

2*: on divise la concentration obtenue par 2

<table><thead><tr><td>référence</td><td>absorbance</td><td>Masse en g</td><td>Calcul régression C en mg P/L</td><td>Calcul teneur en g P/Kg</td></tr></thead><tbody><tr><td>Maïs</td><td>1,113</td><td>0,1005</td><td>0,47923391</td><td>2,38</td></tr></tbody></table>