# Use of an LH-RH analogue to induce ovulation in Hypophtalmichthys molitrix (teleost fish) in various environmental conditions

Roland Billard, Jacqueline Marcel, D. Matei, C. Rusu

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Roland Billard, Jacqueline Marcel, D. Matei, C. Rusu. Use of an LH-RH analogue to induce ovulation in Hypophtalmichthys molitrix (teleost fish) in various environmental conditions. Buletinul de Cercetări Piscicole, 1982, 1-2, pp.29-36. hal-02728386

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INDUCTION DE L'OVULATION
PAR UN ANALOGUE DU LH-RH
CHEZ HYPOPHTHALMICHTHYS
MOLITRIX (POISSON TÉLÉOSTÉEN)
PLACÉ DANS DIVERSES CONDITIONS
D'ENVIRONNEMENT

R. BILLARD <fnref n="1" />, JACQUELINE MARCEL <fnref n="2" />, D. MATEI <fnref n="3" /> et C. RUSU <fnref n="4" />

## Introduction

L'existence d'un facteur hypothalamique provoquant la décharge de l'hor-
mone gonadotrope (GTH) de l'hypophyse est démontrée depuis 1971 (BRETON
et al., 1972) chez les poissons. De même, l'administration du facteur de décharge
mammalien « Luteinizing hormone-releasing hormone » (LH—RH) entraîne une
décharge plasmatique de GTH chez la truite Arc-en-ciel (Salmo gairdneri) et la
carpe (Cyprinus carpio) (WEIL, 1981), ainsi que chez la truite Fario (Salmo trutta
fario) (CRIM et CLUETT, 1974). Le LH—RH stimule aussi in vitro la sécrétion
de GTH par des hypophyses de truite Arc-en-ciel (CRIM et EVANS, 1979). L'usage
du LH—RH ou d'analogues structuraux a été envisagé pour induire l'ovulation
d'espèces qui ne se reproduisent pas spontanément en captivité ou dont on cherche
à avancer ou synchroniser l'ovulation. Ces neurohormones sont intésessantes car
elles sont disponibles sur le marché et les doses préconisées sont faibles (de l'ordre
de 1 à 10 µg/kg de poids vif). Ces produits sont susceptibles de constituer un sub-
stitut avantageux aux poudres hypophysaires brutes du préparations hypophysaire
partiellement purifiées actuellement employées. Malheureusement, peu de succès
ont été rapportés jusqu'à présent et les doses employées pour induire l'ovulation
sont très élevées: entre 2 et 10 mg/kg de poids vif chez le poisson rouge (Caras-
sius auratus) (LAM et al., 1975), 1 mg/kg chez la limande (Limanda flavimanus) (AIDA
et al., 1978) et 0,1 mg/kg chez la tanche (KOURIL et BARTH, 1981). Ces doses

<footnote n="1">¹ Laboratoire de Physiologie des Poissons, I.N.R.A. 78350 JOUY EN JOSAS, France.</footnote>

<footnote n="2">² Elève de l'EPHE, 25, rue du Plat, 69288 LYON CEDEX 5, France.</footnote>

<footnote n="3">³ Station de Recherches et Production Piscicoles de Podu Iloaiei, IASI, Roumanie.</footnote>

<footnote n="4">⁴ Station de Recherches Piscicoles de Nucet, DIMBOVITA, Roumanie.</footnote>
sont faibles avec un analogue du LH—RH (LH—RHa), le D Ala⁶ Des Gly¹⁰ EA LHRH avec lequel les auteurs chinois obtiennent l'ovulation de diverses espèces de poissons phytophages dans une gamme allant de 1 à 10 g/kg de poids vif (Cooperative Team for Hormonal application in Pisciculture, 1977). Par contre, nous venons de voir que le D Try⁶ Des Gly¹⁰ EA LHRH n'a pas d'effet chez le brochet à la dose de 10 et même 100 µg/kg. Comme les auteurs chinois replacent généralement les géniteurs après injection dans des bassins circulaires avec eau courante où la reproduction a lieu normalement, l'hypothèse d'un effet facilitant de cet environnement qui se rapproche des conditions naturelles où frayent ces espèces a été avancée (BILLARD et MARCEL, 1980), d'autant plus que le LH—RH influence le comportement reproducteur chez *Fundulus* (PICKFORD et al. 1980) et le rat (MOSS et Mc CANN, 1973).

Dans la présente expérience, nous avons voulu reproduire les expériences des auteurs chinois (Cooperative Team for Hormonal Application in Pisciculture, 1977) dont les succès sur l'induction de l'ovulation par le LR—RH n'ont jamais été confirmés et tenter de tester l'hypothèse d'une influence facilitante de l'environnement physique et social.

## Materiel et Methodes

L'expérience s'est déroulée en Roumanie à la station de Nucet entre le 22 et le 25 juillet 1981 et a porté sur l'espèce de poisson phytophage dite argentée (Hypophtalmichthys molitrix) élevée à la station. Les géniteurs mâles et femelle sont âgés de 6 ans et pèsent entre 6 et 8 kg. Ils sont stockés ensemble dans des étangs de prématuration (4500 m²) depuis le mois de mars. Ces femelles sont mises en reproduction pour la première fois. Elles sont considérées comme effectuant leur premier cycle reproducteur, mais il n'est pas exclu que certaines femelles alent été pubères l'année précédente.

Cinq groupes constitués de 5 à 6 femelles sont placés avec ou sans mâles en petits étangs de maturation ou en bassins de ponte circulaires (voir tableau 1). Un groupe témoin n'a reçu que l'injection de solution saline et du fait du nombre réduit de femelles disponibles, il a été réutilisé et a constitué le groupe 4. Les étangs sont enherbés et de forme rectangulaire (25×3 m pour une profondeur de 60 à 80 cm). Ils sont mis en eau 12 heures avant l'expérience et l'eau n'est pas renouvelée, seul un léger apport est admis pour compenser des pertes (infiltrations, évaporation). Les caractéristiques du bassin circulaire ont été décrites (ENE, 1980; le diamètre est de 10 m, la profondeur de 1,70 m et le volume de 135 m³). Il este alimenté en eau de même origine que celle des étangs. Quelques caractéristiques de l'eau sont mesurées dans un étang le matin à 7h45; en mg/l: Ca: 56, Mg: 12,1, Chlorure: 210, O₂: 7,6, matières en suspension: 32. Le pH est de 7,9 et la température de 23°C. Dans la journée cette dernière n'excède pas 26°C et le taux de saturation en O₂ est de 70% dans les étangs, contre 100% dans les bassins circulaires. Le temps est ensoleillé pendant la durée de l'expérience, mais une partie des étangs se trouve ombragée en fin d'après-midi.

Le LH—RHa (Sigma D 2383) est dissous dans une solution saline à 6% et est administré à la dose de 10 µg/kg de poids vif en deux injections: la première de 1 µg/kg et la seconde de 9 µg/kg, chacune dans un volume de 0,5 ml/kg. La première injection est pratiquée à 13h00 et la seconde le lendemain à 8h00. Les femelles destinées aux bassins circulaires (groupes 4 et 5) restent en fait dans des étangs entre la lère et la 2ème injection du fait d'une plus grande facilité de capture et ne séjournent dans les bassins circulaires qu'entre la 2ème injection et la ponte
Un groupe témoin ne reçoit que le solvant (0,5 ml/kg). Les mâles reçoivent une seule injection de 2 mg/kg de poudre hypophysaire brute de carpe administrée en même temps que la seconde injection des femelles. Dans tous les cas, l'injection se pratique dans le sinus, à l'arrière de la nageoire dorsale sur animaux non anesthésiés immédiatement après leur capture au filet. Les femelles stockées en étrangs sont recapturées environ 10 h après la seconde injection ou plus tôt si des signes de comportement reproducteur sont observés avant ce délai. Les œufs des femelles ovulées sont prélevés individuellement, leur volume est mesuré, puis ils sont inséminés et mis en incubation. Les femelles des bassins circulaires sont laissées à pondre normalement et les œufs semi demersaux sont recueillis dans le dispositif de collecte en sortie du bassin circulaire. Les femelles sont retirées 24 h après la seconde injection, et on vérifie si l'ovulation a eu lieu (présence d'ovules résiduels) et si elle est complète (aspect de l'abdomen). Les œufs sont mis en incubation dans des dispositifs d'Incubation faits de grillage fin alimentés en eau par le haut. La température de l'eau est de 22-23°C, et le taux de saturation en O₂ mesuré à 16 heures est de 110%. Le pourcentage d'œufs embryonnés est établi juste avant l'éclosion et porte sur environ 200 œufs.

## Resultats

Les résultats sont rassemblés dans le tableau 1. Aucune ovulation n'est observée chez les femelles n'ayant reçu que l'injection de solution saline. Toutes les femelles recevant le LH-RHa placées en étang en présence ou non de mâles ovulent complètement. Par contre, une partie seulement de femelles mises en bassin circulaire ovule et pour certaines l'oviposition n'est que partielle car elles possèdent encore une partie de leurs ovules après retrait du bassin. Il est à noter que dans le groupe n° 2, deux femelles avaient déjà ovulé (dont une avait pondu) avant que ne soit administrée la seconde injection, ce qui indique que l'ovulation peut être induite par des doses de 1 µg/kg de LH-RHa. Dans les étangs le comportement reproducteur s'observe dès le début de l'après-midi. Dans le groupe n° 2, les femelles séparées des mâles effectuent aussi des mouvements circulaires en surface par groupe de 2 ou 3, et dans la partie ombragée des étangs. Les pourcentages de fécondations sont extrêmement variables, et pour plusieurs femelles, aucune fécondation n'est observée, mais l'ovulation a pu intervenir plusieurs heures avant la capture et plusieurs pontes présentaient des œufs de couleur grisâtre, signe de surmaturité.

## Discussion

Ces résultats confirment les données des auteurs chinois (Cooperative Team for Hormol Application in Pisciculture, 1977) et montrent que l'ovulation de l'argentée peut être obtenue avec le LH-RHa à des doses variant entre 1 et 10 µg/kg de poids vif. Malgré le nombre limité d'animaux mis en œuvre dans cette expérience, il est possible de constater que l'environnement, qu'il soit physique (bassin circulaire avec fort courant d'eau reproduisant les conditions naturelles où fraye cette espèce), ou social (présence de males) n'a pas amélioré les performances de reproduction par rapport à une simple stabulation dans un étang avec de l'eau stagnante. Le fait que cette espèce réponde plus favorablement au LH-RHa que d'autres tient vraisemblablement au fait que les niveaux de GTH induisant l'ovulation soient moins élevés. On sait que chez la carpe, l'injection de LH-RH ou de LH-RHa entraîne une élévation de la GTH circulante, jusqu'à 20-30 ng/ml de
<caption>Tableau 1</caption>

Nombre de femelles ovulées, volume de la ponte et pourcentage de fécondation obtenu après administration de LH RHa

<table><thead><tr><th rowspan="2">Groupes n° et structure</th><th rowspan="2">Poids des femelles (kg) x̄ ± DS</th><th rowspan="2">Trajetement</th><th colspan="2">Nombre de femelles</th><th rowspan="2">Volume d'ovules (ml) x̄ ± DS</th><th rowspan="2">% d'œufs embryonnés (extrèmes)</th></tr><tr><th>ovulées</th><th>non ovulées</th></tr></thead><tbody><tr><td>1 6 ♀ seules étang</td><td>7,3±0,8</td><td>NaCl</td><td>0</td><td>6</td><td>—</td><td></td></tr><tr><td>2 5 ♀ seules étang</td><td>7,2±1,1</td><td>LR RHa</td><td>5 (a)</td><td>0</td><td>832±245</td><td>30,2 (0—57)</td></tr><tr><td>3 5 ♀ + 5 ♂ étang</td><td>7,4±1,1</td><td>LR RHa</td><td>5</td><td>0</td><td>970±363</td><td>50,5 (0—78)</td></tr><tr><td>4 6 ♀ seules bassin</td><td>7,3±0,8</td><td>LR RHa</td><td>4</td><td>2</td><td>— (c)</td><td></td></tr><tr><td>5 5 ♀ + 5 ♂ bassin</td><td>7,7±1,0</td><td>LR RHa</td><td>4 (b)</td><td>1</td><td>507 (d)</td><td>10</td></tr></tbody></table>

(a) dont 2 femelles ont ovulé après la première injection de 1 µg/kg.

(b) dont 2 femelles ont ovulé partiellement (abdomen encore distendu et présence d'ovules)

(c) le volume d'œufs non fécondé n'a pu être établi du fait d'une décomposition précoce

(d) valeur établie à partir du nombre d'œufs fécondés et basée sur le chiffre de 1 million d'ovules/litre
plasma (WEIL et al., 1980; BRETON, communication personnelle), mais cette élé-
vation est insuffisante pour induire l'ovulation.

La supériorité du bassin circulaire et de la ponte *in situ* souvent exprimé
(ENE, 1980; TAPIADOR et al., 1977; ROTTMANN et SHIREMAN, 1979) n'apparaît
pas clairement dans cette expérience. Au contraire, les performances tendent à
être inférieures avec des ovulations incomplètes et quelques femelles non ovulées.
Cependant, dans le groupe n° 4, les non-ovulations pourraient être liées au fait
que les femelles qui avaient tout d'abord constitué le groupe témoin ont subi
des manipulations plus fréquentes. Les résultats du groupe n° 2 où toutes les
femelles ont ovulé montrent clairement que l'ovulation peut se produire en l'absence
de mâles. De même, l'oviposition est susceptible de se produire en l'absence de mâles
ou de tout contact (au moins visuel) avec ces derniers. On pourrait donc alors être
conduit à s'interroger sur l'opportunité d'avoir recours à ces bassins circulaires
qui représentent un investissement important et demandent des quantités d'eau
importantes et en considérant d'autre part que ce dispositif ne réduit pas le nombre
de manipulation subies pour les géniteurs.

Cependant les résultats relativement médiocres obtenus dans cette expé-
rience (nombre de femelles ovulées, taux de fécondation) peuvent être reliés à
un état de surmaturité des femelles, du fait de l'époque tardive à laquelle l'expé-
imentation a été pratiquée. On ne peut donc pas, au vu de ces résultats, remettre
en question l'usage des ces bassins circulaires, qui, bien que nécessitant un nombre
élevé de mâles, permet d'éviter les phénomènes de surmaturation des ovules qui
interviennent très rapidement après l'ovulation.

Remerciements

Ce travail, réalisé dans le cadre de la coopération scientifique franco-roumaine
et d'une ATP CNRS—CNEXO, a bénéficié de l'aide de Stan et Nadia GHITA, Nicolae
DINU, Paul PETRE et Rusanda RUSU.

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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# USE OF AN LH-RH ANALOGUE TO INDUCE OVULATION IN HYPOPHTALMICHTHYS MOLITRIX (TELEOST FISH) IN VARIOUS ENVIRONMENTAL CONDITIONS

## SUMMARY

Ovulation was induced in Hypophtalmichthys molitrix by an LH-RH analogue administered at doses ranging between 1 and 10 g/kg of body weight. The results obtained were significantly better when the fish were kept in stagnant water in a grass-grown pond than in a circular tank with a strong flow mimicking natural spawning conditions in the species. These results show that complex, expensive tanks are not necessary for inducing reproduction in H. molitrix.
# INDUCȚIA OVULAȚIEI PRINTR-UN ANALOG AL LH—RH LA HY-POPTHALMICHTHYS MOLITRIX (PISCES, TELEOSTEI) PLASAT ÎN DIFERITE CONDIȚII DE MEDIU

## REZUMAT

Administrarea pești a hormonului luteinizant specific mamiferelor (LH—RH) antrenează o descărcare plasmatică de hormon gonadotrop (GTH) la păstrăvul curcubeu și la crap (Weil, 1981) precum și la păstrăvul de riu (Crim și Cluett, 1974). Hormonul luteinizant stimulează de asemenea în vitro, secreția de hormon gonadotrop de către hipofiza păstrăvului curcubeu (Crim și Evans, 1979). Prin folosierea de LH—RH sau a analogilor structurali se urmărește inducerea ovulației specilor de pești care nu se reproduc spontan în captivitate și cercetarea grăbirii sau sincronizării ovulației. Acești neurohormoni sînt interesanți datorită disponibilului existent pe plată precum și dozelor slabe ce se preconizează a fi folosite (de ordinarul 1 la 10 micrograme la un kilogram greutate vie). Aceste produse pot deveni substituенți avantajoși pentru pulberea de hipofiză brută sau purificată care se folosește la ora actuală.

Din păcate pînă în prezent se cunosc puține succese iar dozele folosite sînt încă destul de rădicate, astfel: între 2 și 10 mg/kg greutate vie la carasul auriu (Sam și al., 1975), 1 mg/kg la cambulă (Aida și al., 1978) și 0,1 mg/kg la lin (Kouril și Barth, 1981). Doze slabe de D-Ala⁶—Des-Gly¹⁰—EA-LHRH analog al LH—RH au fost utilizate cu succes de cercetători chinezi obținînd ovulația la speciile de pești fitoplanctonofagi într-o gamă de la 1 la 10 micrograme pe kg greutate vie (Coope-rative Team for Hormonal application în Pisciculture 1977). Din contră, noi nu am obținut efecte la știucă cu doze de 10 la 100 micrograme pe kg greutate vie, din acest analog folosit de cercetătorii chinezi.

Cum cercetătorii chinezi introduc genitorii după injectare în bazine circulare care au un curent de apă aproplat condițiilor naturale, reproducerea are loc normal datorită efectului favorabil determinat de mediu ipoteză avansată de Billard și Marcel, 1980 pentru speciile fitoplanctonofage.

În prezenta lucrare s-a urmărit reproducerea experiențelor autorilor chinezi ale căror succese încă nu au fost confirmate și verificarea influenței favorabile a factorilor mediali fizici și sociali.

## Material și metodă

Experimentările s-au desfășurat în România la Stațiunea de cercetări pentru piscicultură Nucet — Dimbovița între 22 și 25 iulie 1981 și s-au efectuat utilizând genitori masculi și femele de 6 ani cu o greutate între 6 și 8 kg din specia *H. molitrix*.

Cinci grupe constituite din 5—6 femele au fost parcate cu sau fără masculi în bazine de maturare sau în bazinul circular (tabelul nr. 1). O grupă martor a fost injectată cu soluție salină 0,5 ml/kg ulterior fiind reutilizată pentru a înlocui grupa H.

Hormonul LH—RH (Sigma D 2383) a fost dizolvat într-o soluție salină — 6% și s-a administrat în doze de 10 micrograme la kg greutate vie în două injecții: prima cu doza de 1 micrograme/kg și a doua cu 19 micrograme/kg, fiecare într-un volum de 0,5 ml/kg.
Femelele destinate bazinului circular (grupa 4 și 5) au fost ținute în bazinul de maturare între prima și a doua injecție după care s-au introdus în bazinul circular.

Masculii au primit o singură injecție cu 2 mg/kg pudră hypofizară brută de crap administrată odată cu a doua injecție a femelelor.

În toate cazurile s-a practicat injectarea în sinus, înaintea aripioarei dorsale, pe material neanesteziat. Temperaturile au evoluat între 22 și 23°C.

## Rezultate

Toate femelele injectate cu LH—RH parcate în bazine de maturare împreună sau fără masculi au cedat complet icrele.

La bazinul circular o parte din femele au cedat parțial icrele (tabelul nr. 1). Este de notat că la grupul 2, două femele deja ceda icre încă înainte de cea de a doua injecție fapt ce dovedește că LH—RHa poate induce ovulația la o doză de 1 microgram/kg.

## Discuții

Aceste rezultate confirmă rezultatele autorilor chinezi arătând că cedarea icrelor (ovulația) poate avea loc cu doze variind de la 1 la 10 micrograme/kg greutate vie hormon luteinizant LH—RHa. Se poate constata că în condițiile de mediu create de factorul fizic — bazinul circular și factorul social — prezența reproducătorilor masculi nu a influențat hotăritor reproducerea,

Superioritatea performanțelor bazinului circular și a pontei în situ adesea afirmată (Ene, 1980; Tapiador și al., 1977; Rottman și Shireman, 1979) nu a apărut cu claritate în prezentele experimentări care au folosit specia H. molitrix.

Rezultatele obținute la grupa 2 indică clar că reproducerea se desfășoară cu rezultate foarte bune și în absența masculilor din bazinul de maturare.