# QUEL TEST DE TOXICITÉ CHRONIQUE SUR INVERTÉBRÉS FAUT-IL CHOISIR POUR L'ÉVALUATION DE LA DANGEROSTÉ DES DÉCHETS ?

Jean-François Férard* et Benoît Ferrari**

Centre des sciences de l'environnement, Metz

Dans cet article, les tests *Ceriodaphnia dubia* 7 jours et *Daphnia magna* 21 jours, utilisables pour l'évaluation de l'écotoxicité des déchets, sont présentés. Les principales différences sont discutées et commentées, et montrent que le test C. dubia 7 jours est préférable au test D. magna 21 jours. Des résultats obtenus sur des lixiviats de déchets viennent confirmer ce fait.

In this article, the 7-d *Ceriodaphnia dubia* and 21-d *Daphnia magna* tests, which can be used for the eco-toxicology assessment of wastes, are presented. The main differences between them are discussed and commented. They show that it would be preferable to use the 7-d C. dubia test than the 21-d D. magna test for the ecotoxicology assessment of wastes. Some results are presented and confirmed this statement.

## INTRODUCTION

Différentes méthodes d'écotoxicité chronique sur invertébrés sont susceptibles d'être mises en oeuvre pour évaluer, au laboratoire, la dangerosité potentielle des lixiviats (ou percolats) provenant de matrices solides complexes telles que les déchets. Parmi les invertébrés, deux espèces de microcrustacés, représentatifs du zooplancton filtreur, appartenant aux genres *Daphnia* et *Ceriodaphnia* sont les supports biologiques de deux tests, le test *Daphnia magna* 21 jours et le test *Ceriodaphnia dubia* 7 jours, déjà normalisés par diverses instances (Calow, 1993). Très schématiquement, ces deux tests obéissent au même principe, à savoir que de jeunes animaux (d'âge inférieur à 24 heures), provenant d'un élevage (réalisé dans des conditions définies), sont exposés en conditions semi-statiques (i.e. avec renouvellement périodique des milieux) à diverses concentrations de milieu testé : au fur et à mesure du déroulement de l'essai, les jeunes organismes placés en expérience au début de l'essai atteignent eux-mêmes la maturité sexuelle et se reproduisent dominant ainsi lieu à une série de pontes successives (cf. figure 1). Ces deux méthodes d'essai ne présentent donc pas de difficultés particulières, notamment pour ce qui est de l'évaluation des effets qui est simplement basée sur des dénom-

brements (individus morts ou vivants, nombres de jeunes). Compte tenu que la procédure réglementaire en cours de discussion au niveau du ministère de l'Environnement laisse le libre choix entre les deux méthodologies, il est important que l'ensemble des parties en présence (scientifiques, gestionnaires de l'environnement et décideurs) ait une parfaite connaissance des conditions de réalisation de ces deux tests d'écotoxicité, de leurs avantages et inconvénients, afin de mieux les guider dans le choix d'une procédure, ce qui constitue l'objectif de cet article.

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Figure 1 : Schéma synoptique d'un test sur microcrustacé d'eau douce</figcaption></figure>

### Le test *Daphnia magna* 21 jours

D'un point de vue historique, la daphnie a été utilisée depuis beaucoup plus longtemps que la cériodaphnie. Une des pre-
mières utilisations est, à notre connaissance, le fait d'un hol-
landais (Buijtendijk, 1918). Les raisons du choix du genre
*Daphnia* ont été résumées par Baudo (1987).

La première méthodologie relative à un test daphnie chro-
nique a été publiée en 1972 (Biesinger et Christensen, 1972).
Depuis lors, et malgré le fait qu'un certain nombre de pro-
cédures normalisées ait détaillé une procédure d'essai (e.g.
OCDE, 1984), il n'y eut guère de données précises sur les
conditions d'élevage qui précédaient le test (cf. figure 1) et
sur la quantité de nourriture à fournir durant l'essai.

Divers auteurs ont signalé les difficultés liées à l'entretien des
élevages ou à la réalisation des essais (Blok, 1981 ; Nebeker
et al., 1982). Pour pallier ces aléas, différents additifs, non chi-
miquement définis, ont été utilisés par le passé, avant
qu'Elendt et Bias (1990) ne proposent un milieu de culture
suffisamment complet pour assurer une survie et une repro-
duction suffisante dans la plupart des laboratoires. Par ailleurs,
l'utilisation d'une nourriture imparfaitement définie (quali-
tativement et quantitativement) au cours des élevages et
des tests représente un des principaux facteurs de variabi-
lité (Calow, 1993).

Le test *Ceriodaphnia dubia* 7 jours

Le test C. dubia a vu le jour aux États-Unis où l'agence pour
la protection de l'environnement (EPA) a développé des
tests de toxicité à court terme (≤ 8 jours) pour évaluer la
toxicité chronique des matrices complexes. Ces tests de
toxicité à court terme ont été proposés afin de remplacer
les tests de toxicité chronique traditionnels. En effet, ces der-
niers, bien qu'utilisés en routine pour l'évaluation des sub-
stances chimiques (dans le cadre des dossiers d'homologa-
tion), avaient été jugés inadaptés pour l'évaluation de la toxi-
cité chronique des matrices complexes essentiellement pour
des raisons de durée et de coût du test. La première publi-
cation décrivant l'utilisation de C. dubia dans un test de toxi-
cité chronique date de 1984 (Mount et Norberg, 1984).
En 1990, les agences de l'eau françaises ont voulu dévelop-
per des tests pour évaluer la toxicité chronique des effluents.
Parmi l'ensemble des tests retenus, Garric et al. (1992) ont
proposé en particulier le test C. dubia 7 jours. Par la suite,
ce test a fait l'objet d'une enquête inter-comparaison réali-
sée en 1992-1993 à la demande du comité inter-agences de
l'Eau et pilotée par le cabinet Beture-Setame. Depuis,
quelques laboratoires en France (Cemagref, CSE, Institut
Pasteur Lille, IRH, LSE...) continuent à travailler sur ce test,
avec ou sans modification de la méthodologie dite du rap-
port inter-agences.

En 1990, les agences de l'eau françaises ont voulu dévelop-
per des tests pour évaluer la toxicité chronique des effluents.
Parmi l'ensemble des tests retenus, Garric et al. (1992) ont
proposé en particulier le test C. dubia 7 jours. Par la suite,
ce test a fait l'objet d'une enquête inter-comparaison réali-
sée en 1992-1993 à la demande du comité inter-agences de
l'Eau et pilotée par le cabinet Beture-Setame. Depuis,
quelques laboratoires en France (Cemagref, CSE, Institut
Pasteur Lille, IRH, LSE...) continuent à travailler sur ce test,
avec ou sans modification de la méthodologie dite du rap-
port inter-agences.

UTILISATION COMPARÉE DE LA
DAPHNIE ET DE LA CÉRIODAPHNIE
POUR L'ÉVALUATION DE LA
DANGEROSETÉ DES DÉCHETS

Le tableau I résume les principales conditions expérimentales
de ces deux tests dans l'état actuel de la normalisation. Les
parties de ce tableau qui apparaissent en italique montrent

les différences entre ces deux tests. Seules certaines de ces
différences qui nous apparaissent spécialement importantes
au regard du problème posé seront discutées ci-dessous.

- La périodicité journalière des renouvellements des milieux du test cériodaphnie constitue un indiscutable avantage car elle diminue les risques de transformation des diverses substances présentes dans les milieux complexes entre 2 changements. En effet, l'ajout de nourriture algale consomme le CO2 dissous (du fait de la photosynthèse), ce qui provoque une augmentation du pH dans les milieux (dont l'importance varie en fonction de la capacité tampon différente d'un milieu à l'autre, cf. § Milieu). Ceci étant, plus l'intervalle entre deux changements va se prolonger, plus la probabilité de voir apparaître ou disparaître des espèces chimiques sera importante du fait de cette augmentation de pH, nonobstant les effets propres de l'augmentation du pH sur la survie et la reproduction des microcrustacés. Or le protocole EPA (1994) prévoit un changement tous les jours pour le test cériodaphnie, ce qui diminue d'autant les deux phénomènes mentionnés ci-dessus.

Il est donc important de choisir la méthode d'essai qui dimi-
nue le plus possible les effets des variations de pH, qu'il
s'agisse d'effets sur la composition chimique du milieu ou qu'il
s'agisse d'effets sur les daphnies.

- La durée plus courte du test cériodaphnie est aussi un avan-
tage car les lixiviats (ou percolats) de déchets sont suscep-
tibles d'évoluer dans le temps au cours de leur conservation.
Nous avons pu montrer au cours d'un travail réalisé récem-
ment pour le compte de l'Ademe dans le cadre d'une étude
sur l'écocompatibilité des déchets que deux percolats, pro-
venant l'un de scories de seconde fusion au plomb et l'autre
de mâchefers d'incinération d'ordures ménagères (MIOM)
se caractérisaient par des cinétiques d'écotoxicité diffé-
rentes. Les figures 2 et 3 rassemblent les résultats obtenus
avec le test Microtox (Afnor, 1991) pour des percolats de
MIOM et de scories conservés à 4°C, à l'obscurité dans des
flacons en polyéthylène. Par exemple, l'écotoxicité des per-
colats de MIOM diminue d'un facteur égal à 13,7 entre le pre-
mier jour et le douzième jour de conservation. Au contrai-
re, l'écotoxicité des percolats de scories augmente d'un fac-
teur égal à 3,8 entre le premier et le quatrième jour de
conservation.

En l'absence d'autres données écotoxicologiques (car il n'y
a pas à notre connaissance d'autres résultats d'écotoxicité

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 2 : Évolution de la toxicité des MIOM en fonction du temps. % de variation par rapport à JO - Test Microtox</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 1 : Résumé des conditions expérimentales normalisées du test *Daphnia magna* 21 jours et du test *Ceriodaphnia dubia* 7 jours</caption><thead><tr><th>Paramètre</th><th>Méthodologie OCDE (1996)</th><th>Méthodologie EPA (1994)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Espèce</td><td>Daphnia magna</td><td>Ceriodaphnia dubia</td></tr><tr><td>Critère de toxicité</td><td>NOEC/LOEC ou CEx</td><td>NOEC/LOEC ou CEx</td></tr><tr><td>Type de test</td><td>Semi-statique</td><td>Semi-statique</td></tr><tr><td>Renouvellement des milieux</td><td>Au moins 3 fois par semaine</td><td>Tous les jours (voir texte)</td></tr><tr><td>Durée du test</td><td>21 jours</td><td>7 jours (voir texte)</td></tr><tr><td>Élevage préalable</td><td>Conditions non précisées</td><td>Conditions précisées (voir texte)</td></tr><tr><td>Type de nourriture</td><td>Algue</td><td>Algue(s) + Levure + Cérophyl + Nourriture pour poisson (voir texte)</td></tr><tr><td>Apport nutritif</td><td>0,1 à 0,2 mg de carbone (COT)/Daphnie/Jour</td><td>0,1 ml de mélange (Levure + Cérophyl + Nourriture pour poisson) + 0,1 ml de concentré d'algue représentant 3 à 3,5.10<sup>6</sup> cellules/jour et par ceriodaphnie (voir texte)</td></tr><tr><td>Age des organismes au début du test</td><td>&lt; à 24 heures</td><td>8 heures - 24 heures</td></tr><tr><td>Lumière</td><td>≤ 1200 Lux</td><td>300 à 500 Lux</td></tr><tr><td>Milieu d'essai</td><td>Milieu M4 ou M7, Milieu ISO ou Milieu ASTM</td><td>Eau reconstituée de dureté moyenne ou Eau minérale diluée à 20 % ou Eau naturelle</td></tr><tr><td>Volume</td><td>50-100ml</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Température</td><td>20°C ± 2°C</td><td>25°C ± 1°C</td></tr><tr><td>Photopériode</td><td>16 heures de lumière/8 heures d'obscurité</td><td>16 heures de lumière/8 heures d'obscurité</td></tr><tr><td>Organismes/Concentration</td><td>10</td><td>10</td></tr><tr><td>Nombre de réplicats</td><td>10</td><td>10</td></tr><tr><td>Contrôle de la mortalité dans les témoins</td><td>≤ 20 % chez les adultes</td><td>≤ 20 % chez les adultes</td></tr><tr><td>Contrôle de la reproduction dans les témoins</td><td>≥ 60 petits par mère</td><td>3 pontes dans au moins 60 % des mères survivantes, 15 petits pondus par mère survivante</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 3 : Évolution de la toxicité des scories en fonction du temps. % de variation par rapport à JO - Test Microtox</figcaption></figure>

dans la littérature relatifs à la conservation des lixi viats ou percolats de déchets), il est nécessaire de postuler une possible variation d'écotoxicité en fonction du temps de conservation, ce qui avantagerait de facto l'essai le plus court.

- Pour *D. magna*, il est maintenant prouvé que la nutrition des daphnies-mères dans les élevages affecte non seulement la taille, mais surtout la sensibilité, des jeunes daphnies auxquelles elles donnent naissance et qui servent pour le test (Enserink et al., 1990; Cox et al., 1991). Or les conditions des élevages qui précèdent le test sont peu définies pour le test daphnie, alors que pour le test cériodaphnie il est nécessaire de réaliser un « élevage intermédiaire » dans des conditions très proches du test proprement dit (en terme de milieu et de nourriture). Cet élevage intermédiaire permet d'ailleurs de sélectionner pour le test des jeunes cériodaphnies à partir de cériodaphnies-mères qui ont elles-mêmes pondues un nombre suffisant de jeunes cériodaphnies (au moins 8 selon la norme EPA). Cette pratique est à

l'évidence un indicateur de la qualité des élevages intermédiaires et de la capacité à satisfaire ultérieurement les conditions de validité de l'essai (cf. tableau 1).

- Le type et la quantité de nourriture ont évidemment un effet sur le nombre de petits retrouvés dans les cultures témoins de daphnies ou de cériodaphnies (Cotelle et Ferard, 1996; Ferrari et Ferard, 1996). En outre, il est préférable que la préparation de cette nourriture soit le moins possible sujette à interprétation de la part des expérimentateurs. En ce sens, le test *C. dubia* est caractérisé par une ration alimentaire bien définie au niveau des essais (ou des élevages).

- Les milieux d'essais susceptibles d'être utilisés sont relativement variés. Mis à part, leur rôle tampon vis-à-vis de l'augmentation du pH dans les récipients, les milieux utilisés n'ont pas tous les mêmes capacités à complexer des substances minérales.

En particulier, certains milieux recommandés pour le test *D. magna* contiennent de l'EDTA (M4 ou M7), ce qui a pour effet de sous-estimer la toxicité des matrices minérales, ce qui est souvent le cas des lixi viats (ou percolats) de déchets.

<table><caption>Tableau 2 : Résultats de l'évaluation de la toxicité de 2 lixi viats issus d'un même MIOM à partir du test *Ceriodaphnia dubia* 7 jours et du test *Daphnia magna* 21 jours</caption><thead><tr><th>Test</th><th>CI50</th><th>Moyenne des CI50</th><th>CV %</th></tr></thead><tbody><tr><td>Cériodaphnie 1</td><td>12,2 %</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cériodaphnie 2</td><td>7,3 %</td><td>9,75 %</td><td>35,5 %</td></tr><tr><td>Daphnie</td><td colspan="3">Pas de toxicité observée</td></tr></tbody></table>
L'État de l'art de l'évaluation de l'écotoxicité des déchets que nous avons réalisé, en 1995, dans le cadre du programme de recherche sur l'écocompatibilité des déchets a montré que la daphnie avait surtout été utilisée pour une évaluation de la toxicité aiguë. Le test chronique (sur 28 jours) avec D. magna a été mis en œuvre par Millemann et Parkhust (1980) puis par Lambolez et al. (1994), mais aucune publication ne mentionne à ce jour la mise en œuvre du test C. dubia 7 jours, et encore moins la comparaison des deux méthodes d'essai sur un même échantillon.

Le tableau 2 résume les résultats que nous avons obtenu sur un lixiviat de MIOM (aimablement fourni par Polden) et réalisé selon la norme Afnor X-31210 (1992) avec 1 seule lixiviation de 24 heures. Les essais sur cériodaphnies et sur daphnies ont été réalisés dans les conditions définies par Ferrari et Férard (1996). Aucune écotoxicité n'a été observée avec le test D. magna 21 jours, tandis qu'une nette écotoxicité a été observée avec le test C. dubia : la concentration moyenne qui inhibe 50 % de le reproduction (n = 2), calculée à l'aide du logiciel ICP (aimablement fourni par l'agence de protection de l'environnement, USA), était de 9,7 % avec un coefficient de variation de 35 %.

## CONCLUSION

Ces résultats démontrent, il est vrai sur un seul échantillon, que le test C. dubia 7 jours est plus sensible que le test D. magna 21 jours. Il serait souhaitable de pouvoir réaliser la comparaison des deux méthodes d'essai sur davantage de déchets. En outre, beaucoup de questions restent encore sans réponse : comparaison du pouvoir tampon de différents milieux ; effets des variations de pH sur la spéciation des substances et la physiologie des cladocères testés ; effets des conditions de stockage.

Malgré son intérêt, l'essai Ceriodaphnia dubia 7 jours est encore peu pratiqué en France, ce qui peut s'expliquer par les contraintes techniques qu'il impose par rapport au test daphnie : petitesse des organismes, nécessité de réaliser un élevage intermédiaire, changement tous les jours, plus grand de sensibilité des élevages. A contrario, ce dernier inconvénient peut, en fait, être un avantage car il évitera de tester des animaux en mauvaises conditions physiologiques, comme cela est souvent le cas avec la daphnie.

En résumé, si le test daphnie 21 jours s'applique bien à l'évaluation des substances pures (notification des nouvelles substances), il faut lui préférer le test cériodaphnie 7 jours dès lors qu'il s'agit de tester des matrices complexes susceptibles d'évoluer en fonction du temps : c'est pour cette raison qu'il est normalisé dans plusieurs pays (États-Unis, Canada) pour évaluer les effluents industriels.

### * Jean-François Férard

Professeur d'écotoxicologie à l'Université de Metz, Centre des sciences de l'environnement - 1, rue des Récollets - BP 4025 - 57045 Metz Cedex 1

### ** Benoît Ferrari

Étudiant en Thèse sous la responsabilité du Professeur Jean-François Ferard

## Bibliographie

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