# Les marqueurs moléculaire et leur utilisation en amélioration des plantes et pour la conservation des ressources génétiques

Marie Pégard et Philippe Barre

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RÉPUBLIQUE
FRANÇAISE

Liberté
Égalité
Fraternité

INRAE

marie.pegard@inrae.fr
> Plan du cours

1. Rappel sur les marqueurs moléculaires

2. Utilisation des marqueurs dans le cadre de l'amélioration des plantes

3. Utilisation des marqueurs pour la gestion des ressources génétique.

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> Rappel sur les marqueurs moléculaires

Voir le CM de Maryse Laloi M1
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# L'ADN

## Acide DésoxyriboNucléique

C'est le support de l'information génétique

**Chromosome** (métaphase) : Forme condensée de l'ADN (= forme visible)

Éléments constitutifs : 4 nucléotides

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Organisation en double brin :

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# Définition des marqueurs moléculaires

## Lié à un Locus

Un endroit sur le génome (fragment d'ADN) : **locus**

De 1 à plusieurs bases

Présentant du polymorphisme entre et au sein des individus : **allèles**

Les différents allèles sont identifiables en totalité (**co-dominant**) ou en partie (**dominant**) pour chaque individu

2 chromosomes
homologues

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Gène

Locus | marqueur

A T G C

Allèles

p. 5

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## Les marqueurs moléculaires pour quelle mutation?

En fonction de la structure du génome

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Historique

Une évolution fulgurante!!!

* Découverte de la double hélice de l'ADN 1953
  (James Watson and Francis Cricks)

• Techniques d'hybridation (années 1970)

- Séquençage de l'ADN 1955 (Fred Sanger)

* Invention de la PCR 1993 (Kary Bank Mullis)

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# Historique

## Le séquençage, des coûts de moins en moins élevés

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### Illumina Sequencing Technology

Robust Reversible Terminator Chemistry Foundation

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/probe/doc/Technologies.shtml

http://www2.warwick.ac.uk/fac/sci/lifesci/research/vegin/geneticimprovement/geneticmarker/

http://get.genotoul.fr/

http://gentyane.clermont.inra.fr/
## De quoi dépend le coût du génotypage?

Coût du génotypage dépend de plusieurs paramètres

* De la technologie : réactifs, temps de travail ...

* Du nombre de marqueurs

* Du nombre d'individus

Exemples:

- 0,3 €/point pour un marqueur sur un génotype

- 0,05€/point pour 384 marqueurs sur 1536 individus

- 0,003€/point pour 20000 marqueurs sur 500 individus

Moins le coût du point est cher plus il faut
 génotyper de marqueurs et d'individus

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> De multiples méthodes de génotypage

Méthode a
choisir selon
les besoins

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Séquençage
complet de
petits
génomes
(<1 Gb)

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# Génotypage

## Quelles régions du génome?

Répartis sur l'ensemble du génome

Ciblés sur des régions particulières:

* Gènes candidats

* Ensemble des gènes

Connaissance préalable du génome

* Séquençage complet / partiel du génome

* Séquençage du transcriptome

Selon les marqueurs à
développer, il faut ou non avoir
des informations de séquences
!!!

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# Rappel des différents types de marqueurs

Pour plus de détail voir le cours M Laloi

## A Taqman genotyping

① Reaction preparation

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② PCR amplification

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③ Allelic determination

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## B Pyrosequencing

① Reaction preparation

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② Sequence synthesis

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③ Sequence reading

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## C Microarray genotyping

① Bead hybridization

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② Allelic determination

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## D Next generation sequencing

① Library preparation

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② DNA library bridge amplification

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③ DNA library sequencing

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④ Alignment and data analysis

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## Résumé des différentes techniques de génotypage

<table><thead><tr><td>Name</td><td>Cost</td><td># markers</td><td>Pro</td><td>Con</td><td>Ref.</td></tr></thead><tbody><tr><td>PCR-RFLP</td><td>+</td><td>1</td><td>Easy to run in any lab, fast, flexible</td><td>Time consuming, manual inspection</td><td>(Saiki et al., 1985)</td></tr><tr><td>Allele-specific PCR</td><td>+</td><td>1</td><td>Easy to run in any lab, fast, flexible</td><td>Time consuming, manual inspection</td><td>(Gaudet et al., 2009)</td></tr><tr><td>TaqMan PCR</td><td>+</td><td>1</td><td>Standardized, more accurate</td><td>Manual inspection, requires specific equipment</td><td>(Hui et al., 2008)</td></tr><tr><td>Microsatellite</td><td>+</td><td>1</td><td>Robust, do not require specific equipment, flexible</td><td>Low resolution, manual inspection, time consuming</td><td>(Weber & May, 1989)</td></tr><tr><td>Pyrosequencing</td><td>++</td><td>1</td><td>Captures all potential alleles</td><td>Time consuming, manual inspection, requires specific equipment</td><td>(Kreutz et al., 2013)</td></tr><tr><td>iPLEX</td><td>++</td><td>40</td><td>Multiplex assay</td><td>Manual inspection, requires specific equipment</td><td>(Gabriel et al., 2009; Tang et al., 1999)</td></tr><tr><td>Multiplex TaqMan</td><td>++</td><td>up to 100</td><td>Multiplex assay</td><td>Requires specific equipment</td><td>(Martínez-Cruz et al., 2011)</td></tr><tr><td>Genotyping arrays</td><td>+++</td><td>50k-2 mil</td><td>Multiplex assay</td><td>Requires specific equipment and expertise</td><td>(Verlouw et al., 2021)</td></tr><tr><td>NGS-Exome</td><td>++++</td><td>25000</td><td>captures all coding variants</td><td>Requires specific equipment and expertise, demanding processing</td><td>(Seaby et al., 2016)</td></tr><tr><td>NGS-Whole Genome</td><td>+++++</td><td>up to 40 mil</td><td>captures all variants</td><td>Requires specific equipment and expertise, demanding processing</td><td>(Slatko et al., 2018)</td></tr></tbody></table>
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FOCUS SUR LE GÉNOTYPAGE PAR SÉQUENÇAGE

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# Génotypage par séquençage

## Séquencer tout le génome (WGS : Whole genome Sequencing):

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Oui mais peut être coûteux selon la taille du génome

<table><thead><tr><td>Espèce</td><td>Taille génome</td><td>$ Coût estimé pour 30X</td></tr></thead><tbody><tr><td>Arabidopsis</td><td>120 Mb</td><td>20.98</td></tr><tr><td>Humain</td><td>3000 Mb</td><td>525</td></tr><tr><td>Blé</td><td>16 Gb</td><td>2797</td></tr></tbody></table>

## Séquencer une partie du génome :

* Les gènes : transcriptome

* Des régions réparties sur le génome mais non « choisies » : GBS avec enzyme de restriction

* Des régions choisies : capture

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# Génotypage par séquençage

Trois étapes:

1. Fabrication de la « banque » : mélange de fragments d'ADN : peut être réalisée dans un labo de biologie moléculaire classique + compétence BM

2. Séquençage : nécessité des machines très chères et qui évoluent très vite

3. Analyse bio-informatique : nécessite des ordinateurs très puissants + compétences en bio-informatique

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# Les banques

Banques d'ADNc : attention aux tissus choisis selon la question et si besoin de standardisation

Banque d'ADN génomique :

* ADN total fragmenté de manière aléatoire

* ADN issu de l'amplification d'une partie du génome par PCR: séquences cibles (ex. barcoding) ou enzymes de restriction

* ADN issu de l'hybridation sur des séquences connues : capture

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Exemple : GBS Elshire et al.2011 PLOS One

Digestion de l'ADN génomique par une enzyme de restriction (ici ApeKI)

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Exemple : GBS Elshire et al. 2011 PLOS One

GBS library construction

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Il existe beaucoup de variantes RADseq....

(Elshire et al., 2011 PLOS One)

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# Séquençage: plusieurs plateformes selon les besoins

## Séquenceurs 2ème génération

<table><thead><tr><th>Société</th><th colspan="2">Roche</th><th colspan="2">Illumina</th><th colspan="2">Life Technologies</th></tr></thead><tbody><tr><th>Plateforme</th><td>GS Junior</td><td>454</td><td>MiSeq</td><td>HiSeq 1000</td><td>HiSeq 2000</td><td>Genome Analyzer IIx</td></tr><tr><th>Technologie</th><td>Titanium</td><td>FLX<br/>Titanium</td><td>FLX +</td><td></td><td></td><td>Ion Torrent<br/>PGM</td></tr><tr><th></th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>Chip<br/>314</td></tr><tr><th></th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>Chip<br/>316</td></tr><tr><th></th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>Chip<br/>318</td></tr><tr><th></th><td colspan="6">Acides nucléiques (matrice)</td></tr><tr><th></th><td colspan="6">Ligation adaptateurs</td></tr><tr><th>Méthode d'amplification</th><td colspan="2">PCR en émulsion</td><td colspan="2">« Bridge PCR »</td><td colspan="2">PCR en émulsion</td></tr><tr><th>Méthode de séquençage</th><th colspan="2">Synthèse (Pyroséquençage)</th><th colspan="2">Synthèse</th><th colspan="2">Ligation</th></tr><tr><th>Durée de séquençage/run</th><td>10h</td><td>10h 20h</td><td>26h</td><td>8jrs</td><td>8jrs</td><td>14jrs</td></tr><tr><th>Capacité (Mb) séquençage/run</th><td>50</td><td>500 900</td><td>1500</td><td>100000</td><td>200000</td><td>95000</td></tr><tr><th>Taille moyenne des reads</th><td>400</td><td>400 700</td><td>150+150</td><td>100+100</td><td>100+100</td><td>150+150</td></tr><tr><th>Coût ($) /run</th><td>1100</td><td>6200</td><td>750</td><td>10000</td><td>20000</td><td>11500</td></tr><tr><th>Coût machine + annexes ((K$))</th><td>110+25</td><td>500+30</td><td>125</td><td>560</td><td>690</td><td>250</td></tr><tr><th>Exactitude de séquençage (%)</th><td>99</td><td>99</td><td>99,9</td><td>99,9</td><td>99,9</td><td>99,9</td></tr></tbody></table>

Nouveaux séquenceurs encore plus performants
Bio-informatique >

Enormément de données à traiter : penser à la mémoire !!! : machines dédiées

Logiciels :

Quelques uns sous Windows dont CLC genomics: convivial, payant, peu modulable

Beaucoup d'application sous Linux : gratuit, très modulable, moyennement convivial

Un système intermédiaire : Galaxy https://usegalaxy.org/

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> Bio-informatique : plusieurs étapes

Démultiplexage : séparation des séquences par génotypes

Nettoyage : enlever les adaptateurs, bonne qualité, longueur minimale

Alignement des séquences:

Sur une séquence de référence

Sur un assemblage de novo

Nettoyage post-alignement

Duplicats

Non aligné

Détection des SNP

Profondeur de séquence

Fréquence minimale d'un allèle

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# Optimisation du coût de génotypage

## L'imputation génotypique

Décrite pour la première fois par Burdick et al., 2006 sous le terme « in silico genotyping »

Renvoi au processus de prédire la valeur du génotypage non disponible au locus pour un individu

Deux méthodologies reposant sur :

<figure><img src="image_60.png" /></figure>
# L'imputation génotypique

## Le principe

Données génotypiques manquantes sur certains SNP (points d'interrogation gris)

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Chaque échantillon phasé et les haplotypes sont modélisés comme une mosaïque

Comparaison avec des haplotypes de référence (provenant d'un génotypage plus dense)

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Imputation (prédiction) des allèles dans les échantillons pour créer des génotypes imputés (orange)
# L'imputation génotypique

## Quels facteurs influence la qualité de l'imputation

L' apparentement entre les populations de référence et les populations imputées

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le niveau de déséquilibre de liaison (DL)

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

la densité des marqueurs qui influe sur la perception de la liaison.

<figure><img src="image_65.png" /></figure>
# Optimisation du coût de génotypage

## Exemple avec l'imputation

Basse densité : Puce 12K SNP Infinium (Faivre-Rampant et al., 2016)

* Répartition non homogène

* Plus de marqueurs dans les zones avec des QTL connus

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### Imputation avec Fimpute²

* **Pédigrée information**

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* **Population information**

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Haute densité :
WGS => 1.4 Millions SNP

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# Optimisation du coût de génotypage

Exemple avec l'imputation

Percentage of correctly imputed SNP
by individuals

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Impact de l'apparentement et
du nombre d'apparentés sur
la qualité de la prédiction

% of correctly imputed SNP
> Optimisation du coût de génotypage

Exemple avec l'imputation

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Impact de la densité de marqueurs
# Optimisation du coût de génotypage

## Exemple avec l'imputation

* L'imputation a permis de passer de 7540 SNPs a 1.4 millions

* Meilleur couverture du génome

* Plus homogène que précédemment

* Coût réduit

### Puce 7540 SNPs

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### Après imputation

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## Conclusions

Une multitude de méthodes avec des avantages et inconvénients

Adapter la méthode à la question posée et aux connaissances de l'espèce d'intérêt

Génotypage de plus en plus spécialisé à sous traiter tout ou partie (Macrogen, Keygene, LGC genomics...)

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## › Conclusions

Dans l'avenir séquençage complet systématique??

Outils de bio-informatique cruciaux, problème de stockage

Changement des outils d'analyse des données de génotypage et de phénotypage maintenant en très grand nombre

Des outils impressionnants pour mieux comprendre la diversité du monde vivants !!!!!

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INRAO

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# Utilisation des marqueurs en amélioration des plantes

## Partie 2
Distinction entre variété/ individus

Dans quels cas

* Pour gérer le matériel du sélectionneur :

* Problème d'échantillonnage

* Perte d'identifiant ou dérive entre en phénotype observé et attendu

* Vérification pré-inscription

* Pour vérifier que la nouvelle variétés est suffisamment différente des parents

* si on utilise une variété du sélectionneur concurrent comme parent par exemple

* Vérification post-inscription

* Vérification des lots de multiplication d'une variété

* Contrôle de la dérive génétique pour les variétés population

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Distinction entre variété/ individus

exemple

Génotypage de plusieurs individus appartenant à
des variétés.

On cherche à savoir a quel variété appartient
l'échantillon

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

Projet Invite
Dactyle
Génotypage via capture
# Test de paternité

## Dans quels cas

Pour faciliter le travail du sélectionneur :

* Croisement contrôlés en cage avec un mélange de pollen (On retrouve le père avec les marqueurs)

* Correction du pedigree et vérification de la présence de pollution génétique.

Exemple Pin maritime :

* Différent méthodes de sélection

* Prédiction des valeurs des descendants selon le pedigree ou les marqueurs

* Correction du pedigree à l'aide des marqueurs

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# Test de paternité

Autre exemple

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<figure><img src="image_88.png" /></figure>

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Population de 1 440 Individus

**Objectif :**

Identifier des régions du génome impliqués dans des caractères quantitatifs (QTL) :

**Génotypage + Phénotypage**

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Extraction ADN

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

Préparation ADN

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Séquençage par illumina

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Analyse Bio-informatique

INRAE

Nouvelles Plantes, été

1er Septembre 2024 / Marie PEGARD

<figure><img src="image_94.png" /></figure>
## Test de paternité

Autre exemple

Individuals - PCA

ACP des descendants
classés par famille de
demi-frère

<figure><img src="image_95.png" /></figure>
<figure><img src="image_96.png" /></figure>

# Suivi introgression / backcross

Comment utiliser les marqueurs : trier les descendants

<figure><img src="image_97.png" /></figure>
> Suivi introgression / backcross

Les marqueurs permettent de suivre l'introgression a chaque étape et de sélectionner les descendants ayant le gène de résistance et un plus grande portion du génome élite

<figure><img src="image_98.png" /></figure>
## Détection QTL

### Deux possibilités

* Via une analyse de liaison

* Population de cartographie

* Croisement contrôlé

* Parent et apparentement connu

* Intervalle de confiance large autour de l'allèle = Résolution faible

* Via la génétique d'association (GWAS)

* Population naturelle

* Croisement non contrôlé

* Parent et apparentement inconnu

* Intervalle de confiance faible autour de l'allèle = Résolution forte

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<figure><img src="image_100.png" /></figure>
## Détection QTL

### Exemple de GWAS

400 populations de Luzerne (EUCLEG)

* Génotypage GBS (118 K SNP)

* Phénotypage de la dormance automnale

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

L'ensemble des QTL se trouve dans ou a moins de 5000 bp d'un gène
# Détection QTL

## Débouchés

### Différents débouchés

* Introgression (BackCross)

* Pyramidage : BackCross de plusieurs gènes)

* Transformation ciblée (CRISPR/Cas9)

* Sélection Assisté par marqueur (MAS)

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

Wang, Y.; Zafar, N.; Ali, Q.; Manghwar, H.; Wang, G.; Yu, L.; Ding, X.; Ding, F.; Hong, N.; Wang, G.; et al. CRISPR/Cas Genome Editing Technologies for Plant Improvement against Biotic and Abiotic Stresses: Advances, Limitations, and Future Perspectives. Cells **2022**, *11*, 3928. https://doi.org/10.3390/cells11233928
# Rappels sur la sélection génomique...

## Qu'est-ce que la sélection génomique?

Meuwissen, Hayes et Goddard, 2001 :

"Estimer les effets de ~50 000 marqueurs haplotypes simultanément à partir d'un nombre limité de données phénotypiques".

"La sélection sur les valeurs génétiques prédites par les marqueurs pourrait augmenter substantiellement le taux de gain génétique chez les animaux et les plantes".

Genetics 157: 1819-1829 (April 2001)

# Prediction of Total Genetic Value Using Genome-Wide Dense Marker Maps

T. H. E. Meuwissen,* B. J. Hayes† and M. E. Goddard†,‡

*Research Institute of Animal Science and Health, 8200 AB Lelystad, The Netherlands, †Victorian Institute of Animal Science, Attwood 3049, Victoria, Australia and ‡Institute of Land and Food Resources, University of Melbourne, Parkville 3052, Victoria, Australia

Manuscript received August 17, 2000
Accepted for publication January 17, 2001
## Rappels sur la sélection génomique...

### Qu'est-ce que la sélection génomique?

<figure><img src="image_106.png" /></figure>
> Rappels sur la sélection génomique...

Les attentes vis à vis de la SG

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

<figure><img src="image_108.png" /></figure>
> Quels facteurs impactent la qualité de la prédiction génomique?

<figure><img src="image_109.png" /></figure>
# Quels facteurs impactent la qualité de la prédiction génomique?

## Mesure de la qualité de prédiction

<figure><img src="image_110.png" /><figcaption>**Qualité de prédiction : Corrélation de Pearson**</figcaption></figure>
# Quels facteurs impactent la qualité de la prédiction génomique?

## Mesure de la qualité de prédiction

**Qualité de prédiction :** Corrélation de Pearson

**Précision :**
*Corrélation*
*Héritabilité*

**Héritabilité** : Variance génétique expliquée par le modèle

**Héritabilité au sens strict** : Variance des effets additifs expliquée par le modèle

<figure><img src="image_111.png" /></figure>
# Quels facteurs impactent la qualité de la prédiction génomique?

## Mesure de la qualité de prédiction

**Qualité de prédiction : Corrélation de Pearson**

**Précision :**
*Corrélation*
*Héritabilité*

**Classement : Corrélation de Spearman**

<figure><img src="image_112.png" /></figure>
> Quels facteurs impactent la qualité de la prédiction génomique?

Mesure de la qualité de prédiction

<figure><img src="image_113.png" /></figure>

<figure><img src="image_114.png" /></figure>
# Quels facteurs impactent la qualité de la prédiction génomique?

## Taille et composition de la population d'entrainement

<table><thead><tr><th></th><th>Groupe 1</th><th>Groupe 2</th><th>Groupe 3</th><th>Groupe 4</th></tr></thead><tbody><tr><td>T50.Individus</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25.Individus</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T50.Groupe</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T25.Groupe</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_115.png" /></figure>

<figure><img src="image_116.png" /></figure>

**CDmean** (Rincent et al, 2012 Genetics)
# Optimisation schéma de sélection

## Exemple Projet Eucleg

400 populations de Luzerne (EUCLEG)

- Génotypage GBS (118 K SNP)

- Phénotypage de la dormance automnale

Effet de la taille de la population d'entrainement

<figure><img src="image_117.png" /></figure>

Effet du modèle utilisé

<figure><img src="image_118.png" /></figure>
> Optimisation schéma de sélection

Programme d'amélioration français (GIS peuplier)

<figure><img src="image_119.png" /><figcaption>Fécondation fleur P. deltoides ♂</figcaption></figure>

<figure><img src="image_120.png" /><figcaption>Fleur ♂ P. nigra & récolte pollen</figcaption></figure>

<figure><img src="image_121.png" /></figure>
>Optimisation schéma de sélection

Taux de sélection

Programme d'amélioration actuel

Populus deltoides &
Hybrides

Espèces parentales
& Hybrides

<figure><img src="image_122.png" /></figure>
>Optimisation schéma de sélection

Taux de sélection

Programme d'amélioration actuel

Populus deltoides &
Hybrides

Espèces parentales
& Hybrides

Multiplication
végétative

<figure><img src="image_123.png" /></figure>
# Optimisation schéma de sélection

## Programme d'amélioration actuel

Populus deltoides & Hybrides

Espèces parentales & Hybrides

<figure><img src="image_124.png" /></figure>

**Pépinière :**
- Croissance
- Phénologie
- angle de branche
- résistance à la rouille

<figure><img src="image_125.png" /></figure>

Multiplication végétative
# Optimisation schéma de sélection

## Programme d'amélioration actuel

Populus deltoides & Hybrides

Espèces parentales & Hybrides

Partie II

<figure><img src="image_126.png" /></figure>

Pépinière :
Croissance
Phénologie
angle de branche
résistance à la rouille

<figure><img src="image_127.png" /></figure>

Multiplication
végétative

Populetum mono arbre :
Résistance pathogènes /
ravageurs
Architecture

<figure><img src="image_128.png" /></figure>
# Optimisation schéma de sélection

## Programme d'amélioration actuel

### Populetum pluri-arbre :

- Croissance
- Architecture
- qualité et propriété du bois
- Sexe
- interaction GxE

<figure><img src="image_129.png" /></figure>

### Populetum mono arbre :

- Résistance pathogènes / ravageurs
- Architecture

<figure><img src="image_130.png" /></figure>

### Pépinière :
- Croissance
- Phénologie
- angle de branche
- résistance à la rouille

<figure><img src="image_131.png" /></figure>

- Multiplication végétative

<figure><img src="image_132.png" /></figure>

Populus deltoides & Hybrides

Espèces parentales & Hybrides

10 %

<figure><img src="image_133.png" /></figure>

Partie II
>Optimisation schéma de sélection

Qu'apporte la sélection génomique?

$$G = \frac{ir\sigma_A}{L}$$

Cycle Long

<figure><img src="image_134.png" /></figure>

Forte intensité de sélection

<figure><img src="image_135.png" /></figure>

Précision de sélection la plus faible

<figure><img src="image_136.png" /></figure>

Variabilité génétique la plus forte

<figure><img src="image_137.png" /></figure>

Populus deltoides &
Hybrides

Espèces parentales
& Hybrides

10 %

50 %

50 %

6 %

50 %

50 %

800

Croisements Contrôlés

Nombres d'individus

Partie II

p. 60
> Optimisation schéma de sélection

Comment intégrer la sélection génomique?

<figure><img src="image_138.png" /></figure>
> Optimisation schéma de sélection

Comment intégrer la sélection génomique?

A court terme :

Au stade plantule ➔ grande variabilité

Combiner une approche multi-caractères

Améliorer la précision

P. nigra

<figure><img src="image_139.png" /></figure>
> Optimisation schéma de sélection

Comment intégrer la sélection génomique?

A court terme :

Au stade plantule ➔ grande variabilité

Combiner une approche multi-caractères

Améliorer la précision

P. nigra

A plus Long terme :

P. deltoides

Hydrides

Intégrer des caractères évalués plus

tardivement ou plus coûteux

<figure><img src="image_140.png" /></figure>
# Gestion / Conservation ressource génétique

## Partie 3
<figure><img src="image_141.png" /></figure>

# Qu'est-ce qu'une ressource génétique

Selon le Ministère de l'enseignement supérieur, de la recherche et de l'innovation

Selon la Convention sur la Diversité Biologique (CDB) adoptée en 1992 lors du Sommet de Rio, les **ressources génétiques** sont un "**matériel d'origine végétale, animale, microbienne ou autre, contenant des unités fonctionnelles de l'hérédité**".

Ces matériels génétiques ont une valeur effective ou potentielle.

Les "connaissances traditionnelles associées aux ressources génétiques" sont détenues par une communauté d'habitants autochtone ou locale. Leur **utilisation** présente un **intérêt scientifique** ou **technique** précisée dans les **conditions convenues d'un commun accord** entre fournisseur et utilisateur.

Dans les années 90, les ressources génétiques sont devenues des **composants stratégiques** pour les industriels lorsqu'ils se sont lancés dans le développement des biotechnologies. Les industries qui utilisent le plus de ressources génétiques sont : les industries pharmaceutique, biotechnologique, cosmétique et agro-alimentaire.

Gérer les ressources génétiques consiste à inventorier, caractériser et évaluer, conserver, régénérer et diffuser.
<figure><img src="image_142.png" /></figure>

# Comment et par qui sont-elles gérées?

## Le CRB Prairies (Espèces Fourragères et à Gazon)

* conserve sous forme de graine, en chambre froide et au congélateur, **1589 accessions** de pop. naturelles de graminées (Lolium, Festuca, Dactylis) et légumineuses (Medicago, Trifolium, Vicia) et quelques variétés.

* maintient d'une **collection nationale** de **731 accessions** dans le cadre d'un réseau national

* représente le réseau national dans les activités du **réseau européen des ressources génétiques ECP GR** (groupe de travail espèces fourragères) et contribuent à l'établissement de **la collection européenne AEGIS** pour les espèces fourragères.

<figure><img src="image_143.png" /><figcaption>### Env. 600 échantillons ont été distribués de 2009 à 2019</figcaption></figure>

<figure><img src="image_144.png" /></figure>
# Comment et par qui sont-elles gérées?

## RÉGLEMENTATION APA

La réglementation APA encadre l'accès et l'utilisation des **Ressources Génétiques (RG)** et des **Connaissances Traditionnelles** qui leurs sont **Associées (CTA)**.

<figure><img src="image_145.png" /></figure>

Origine : elle découle de la **Convention sur la Diversité Biologique (Rio, 1992)** adoptée sous l'égide des Nations unies et son **Protocole additionnel (Nagoya, 2010)**.

Ces textes poursuivent **trois grands objectifs** :

<figure><img src="image_146.png" /></figure>

* Éviter l'épuisement des ressources biologiques

<figure><img src="image_147.png" /></figure>

* Assurer leur utilisation durable

<figure><img src="image_148.png" /></figure>

* Garantir entre un partage juste et équitables des avantages (APA) découlant de l'utilisation des ressources génétiques.

<figure><img src="image_149.png" /></figure>
<figure><img src="image_150.png" /></figure>

# Vérification d'identité ou duplicatas

<figure><img src="image_151.png" /></figure>
<figure><img src="image_152.png" /></figure>

# Caractérisation des ressources génétiques

## Phénotypique, moléculaire ....

Documentation de
l'origine des populations

Données climatiques

Recherche Genome
Environnement Association (GEA)
et signature de la sélection

<figure><img src="image_153.png" /></figure>

Phénotypage peu coûteux sur une
grande collection

Phénotypage très coûteux sur
seulement une partie de la collection

Phénotypage haut débit

- NIRS

- Drone

Recherche QTL-GWAS (Genome Wide
Association Study)

Génotypage :

- GBS

- Capture

<figure><img src="image_154.png" /></figure>
# Caractérisation des ressources génétiques

## Phénotypique, moléculaire ....

<figure><img src="image_155.png" /></figure>
# Caractérisation des ressources génétiques

Phénotypique, moléculaire ....

Documentation de
l'origine des populations

Données climatiques

Recherche Genome
Environnement Association (GEA)
et signature de la sélection

<figure><img src="image_156.png" /></figure>

Génotypage :

* GBS

* Capture

Phénotypage peu coûteux sur une
grande collection

Phénotypage très coûteux sur
seulement une partie de la collection

Phénotypage haut débit

* NIRS

* Drone

Recherche QTL-GWAS (Genome Wide
Association Study)

<figure><img src="image_157.png" /></figure>
# Caractérisation des ressources génétiques

Pourquoi rechercher la diversité moléculaire adaptative dans les populations naturelles ?

La diversité adaptative est le résultat de pressions de sélection naturelle qui tendent à adapter les phénotypes naturels aux conditions environnementales locales

Il est de plus en plus évident que la majeure partie de la diversité phénotypique naturelle est adaptative (Rieseberg et al., 2002 ; Rieseberg et al., 2004).

La diversité phénotypique naturelle constitue le matériel de base pour la sélection végétale (ressources génétiques).

<figure><img src="image_158.png" /></figure>

* Rechercher la diversité moléculaire adaptative, c'est rechercher la diversité moléculaire potentiellement utilisable pour la sélection végétale.

* La détection de la diversité adaptative directement au niveau moléculaire peut révéler la fonction adaptative de caractères qui ne sont généralement pas évalués par les sélectionneurs (et qui présentent un intérêt potentiel pour la sélection).
# Caractérisation de nouvelles ressources génétiques

Détection de la diversité adaptative dans les polymorphismes du génome : contexte

La **démographie** et l'**histoire des populations** impriment des modèles structurels similaires à **tous les loci** dans les génomes par le biais de la **dérive** et de la **migration**.

La **sélection** n'affecte qu'un **nombre limité** de loci

Les loci neutres situés à proximité des loci sélectionnés tendent à présenter des schémas spécifiques de variation allélique (zones de **balayage sélectif**).

Loci soumis à des pressions de sélection adaptative peuvent être détectés par la moyenne des marqueurs neutres présentant :

* un spectre de fréquence allélique typique des zones de balayage sélectif :
  méthodes de **génétique des populations**

* une distribution allélique corrélée aux variations environnementales :
  statistiques d'association (QTL, GWAS ...)
<figure><img src="image_159.png" /></figure>

# Rappel sur le balayage sélectif

## Genetic hitch-hiking along a recombining chromosome in a natural population
(from Storz, 2005)

## Diversité moléculaire au voisinage d'un locus sélectionné

Une mutation favorable (présentant un avantage sur le plan de la fitness) apparaît et est rapidement amenée à se fixer (sélection positive).

<figure><img src="image_160.png" /></figure>

<figure><img src="image_161.png" /></figure>

<figure><img src="image_162.png" /></figure>

Les mutations neutres initialement en déséquilibre de liaison avec la mutation favorable subissent une augmentation spectaculaire de leur fréquence.

<figure><img src="image_163.png" /></figure>

- Lignes horizontales : un échantillon de population de chromosomes homologues

- Cercle ouvert : mutation favorable

- Cercles remplis : mutations neutres

<figure><img src="image_164.png" /></figure>
<figure><img src="image_165.png" /></figure>

# Etude de la structuration génétique

## Mesure de la différenciation entre (sous) populations: le F<sub>ST</sub>

Une population divisée en plusieurs sous-populations:

→ les sous-populations sont génétiquement différenciées si elles présentent des fréquences alléliques différentes (dérive, sélection, isolement génétique entre sous-populations)

→ le taux d'hétérozygotes dans la population globale est inférieur à celui qu'on aurait en situation de panmixie

$$FST = (Hs - HI) / HS$$

Hs = hétérozygotie attendue dans la population globale à l'équilibre Hardy-Weinberg

HI = hétérozygotie attendue dans les sous-populations à l'équilibre Hardy-Weinberg

FST entre 0 et 0,05 → différenciation faible

FST entre 0,05 et 0,15 → différenciation moyenne

FST entre 0,15 et 0,25 → différenciation importante

FST supérieur à 0,25 → différenciation très forte

<figure><img src="image_166.png" /></figure>
# Etude de la structuration génétique

## Exemple chez la luzerne

* Deux groups se distinguent clairement des autres

* Les 5 autres groups forment un continuum génétique

* Les accessions européennes et américaines se séparent entre plusieurs groups

<figure><img src="image_167.png" /></figure>
# Etude de la structuration génétique

## Exemple chez la luzerne

<figure><img src="image_168.png" /></figure>
# Etude de la structuration génétique

## Exemple chez le ray-grass anglais

### Résultats

* Les programmes de sélection n'ont utilisé qu'une partie limitée de la diversité naturelle de L. perenne (groupe de l'Europe de l'Ouest).

* Les cultivars sélectionnés ont tendance à remplacer la diversité naturelle dans toute l'Europe.

* Risque de perte de la diversité naturelle (adaptative)

<figure><img src="image_169.png" /></figure>

Additional genotyping of L. perenne cultivars:

* 32 cultivars representing the diversity of cvs bred in Europe and New-Zealand

* Cultivars projected as additional individuals on the DAPC of natural populations

<figure><img src="image_170.png" /></figure>
<figure><img src="image_171.png" /></figure>

# Reconstruction phylogéographique

## Exemple chez le ray-grass anglais

<figure><img src="image_172.png" /></figure>

δαδι Gutenkunst, et al. (2009)

<figure><img src="image_173.png" /></figure>

<figure><img src="image_174.png" /></figure>

Lolium perenne phylogeography and expansion inferred
from 507 583 nuclear SNPS

<figure><img src="image_175.png" /></figure>

Heterozygosity within populations

<figure><img src="image_176.png" /></figure>

Würm glaciation 12 – 110 kya,
from Rabineau et al. (2006)

* L'expansion de l'espèce antérieure à l'apparition de l'agriculture en Europe

* La structure spatiale actuelle a été façonnée par les variations climatiques tout au long de l'ère quaternaire.
<figure><img src="image_177.png" /></figure>

# Détection allèles adaptatifs

## Exemple chez le ray-grass anglais projet Grasslandscape

Objectif principal : Rapprocher la génomique du paysage et la génétique quantitative pour une adaptation régionale des prairies européennes au changement climatique.

<figure><img src="image_178.png" /><figcaption>In situ sampling</figcaption></figure>

<figure><img src="image_179.png" /><figcaption>Seed regeneration</figcaption></figure>

<figure><img src="image_180.png" /><figcaption>Conservation seeds in cold</figcaption></figure>

Opportunity: Large collections of natural populations of perennial ryegrass collected over the past decades and stored in genetic resource centers in European countries

<figure><img src="image_181.png" /></figure>

About 3500 natural populations of perennial ryegrass conserved by European genetic resource centers

<figure><img src="image_182.png" /></figure>
GrassLandscape

Datasets

<figure><img src="image_183.png" /></figure>

<figure><img src="image_184.png" /><figcaption>Phenotyping</figcaption></figure>

469 accessions

<figure><img src="image_185.png" /></figure>

<figure><img src="image_186.png" /><figcaption>GBS genotyping</figcaption></figure>

<figure><img src="image_187.png" /><figcaption>Climatic variables</figcaption></figure>

<figure><img src="image_188.png" /></figure>

Three common garden with different climatic conditions :
IPK, ILVO, INRAE

<figure><img src="image_189.png" /></figure>

Sowing on 04/2015 – Phenotyping up to 11/2018

→ 420 natural populations of perennial ryegrass and its relatives

-> 32 selected perennial ryegrass varieties

-> 3 complete blocks per location

-> Growth dynamics

→ Phenology, morphology, disease resistance

→ Biochemical composition, 13C discrimination

<figure><img src="image_190.png" /></figure>
<figure><img src="image_191.png" /></figure>
<figure><img src="image_192.png" /></figure>

# Détection allèles adaptatifs

## Autres méthodes

Méthode de détection de loci adaptatifs :

* Analyse CANCOR (Blanco-Pastor et al., 2019)

* Détection allèles adaptatifs

* Relations linéaires

* Gradient Forest et GDM (Fitzpatrick et al., 2015)

* Prise en compte de la distance géographique

* Relation linéaires et/ou non linéaires

* Décrit et prédit l'évolution de la fréquence de l'allèle adaptatif

<figure><img src="image_193.png" /></figure>

<figure><img src="image_194.png" /></figure>

<figure><img src="image_195.png" /></figure>
<figure><img src="image_196.png" /></figure>

# Évaluation de la vulnérabilité au changement climatique

## Genomic Offset : Methods

### Step 1: Data acquisition

<figure><img src="image_197.png" /></figure>

Genomic data

Phenotypic data

Climatic data

### Step 2: Identifying the genomic bases of local adaptation

<figure><img src="image_198.png" /></figure>

Genome scans

<figure><img src="image_199.png" /></figure>

Complementary approaches to detecting local adaptation

### Step 3: Generalization of the genetic-environment relationship

<figure><img src="image_200.png" /></figure>

### Step 4: Measuring the shift in genomic optimum

<figure><img src="image_201.png" /></figure>

Capblancq et al., 2020

### Step 5: Validation of the predictions

<figure><img src="image_202.png" /></figure>

Testing the decrease in fitness associated with an increasing genetic offset in controlled environments

<figure><img src="image_203.png" /></figure>

Linking population trend surveys and predicted genetic offset

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Genotyping biological specimens to look for genetic changes between historical and contemporary climates
➤ Genetic offset estimation on perennial ryegrass

Bio4 = Temperature seasonality (standard
deviation of daily mean temperature)

<figure><img src="image_205.png" /></figure>
# Genetic offset estimation on perennial ryegrass

Capblancq et al., 2020

**Step 4: Measuring the shift in genomic optimum**

<figure><img src="image_206.png" /></figure>

<figure><img src="image_207.png" /></figure>

Genetic composition related to adaptation in the current climate

<figure><img src="image_208.png" /></figure>

Genetic composition related to adaptation in the future climate RCP 8.5ccl

<figure><img src="image_209.png" /></figure>

<figure><img src="image_210.png" /></figure>

strong

weak
> Que faire de ces projections ?

Quelles sont les régions les plus menacées par le climat futur ?

<figure><img src="image_211.png" /></figure>

<figure><img src="image_212.png" /></figure>
<figure><img src="image_213.png" /></figure>

# Que faire de ces projections ?

Dans quelles régions une population sera-t-elle adaptée au climat futur ?

<figure><img src="image_214.png" /></figure>

<figure><img src="image_215.png" /></figure>

Bretagne (FR 56)

<figure><img src="image_216.png" /></figure>

<figure><img src="image_217.png" /></figure>

Sud de la France
(FR 11)
<figure><img src="image_218.png" /></figure>

# Que faire de ces projections ?

Dans quelles régions une population sera-t-elle adaptée au climat futur ?

<figure><img src="image_219.png" /></figure>

<figure><img src="image_220.png" /></figure>

Bretagne (FR 56)

<figure><img src="image_221.png" /></figure>

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Sud de la France
(FR 11)
<figure><img src="image_223.png" /></figure>

# Que faire de ces projections ?

Dans ma région, quelle population existante dois-je utiliser pour garantir que les populations de ray-grass de mes prairies sont adaptées à l'avenir ?

<figure><img src="image_224.png" /></figure>
> Que faire de ces projections ?

Conclusions

En étudiant la vulnérabilité génomique, nous pouvons :

* Identifier les populations en danger Améliorer la gestion des ressources génétiques

* Tenter de déterminer si les populations existantes présentent une préadaptation aux climats futurs prévus.

Ces analyses contribueront à :

* Informer sur la migration assistée afin de réduire la vulnérabilité au changement climatique

* Aider les sélectionneurs à identifier les régions où leurs cultivars sont susceptibles de donner les meilleurs résultats.

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# Création/maintien d'une core-collection

## Création

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# Création/maintien d'une core-collection

## Maintien / Modification

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INRAE

M2 Parcours Plantes et Société

11 Septembre 2024 / Tours / Marie PEGARD
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Conclusions générales
> Ce qu'il faut retenir

Que ce soit pour l'amélioration des plantes ou la gestion des ressources génétiques

Les marqueurs moléculaires sont un **outils essentiel**

Ils interviennent à **plusieurs moment** et pour **plusieurs utilités**

Ils permettent des **analyses génétiques** plus poussées et plus **détailées**

Ils permettent l'accélération des **programmes d'amélioration** et de la **caractérisation des ressources génétiques**

De part leur coût, il faut bien réfléchir a :

* Combien

* Quelle méthodologie

* Comment les utiliser

* Pour quelle utilisation

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## Proposition de stage M2

Début mars à fin août 2025

### Objectifs du Stage :

1. Vérifier l'impact du pollinarium sur l'émission de pollen.

2. Étudier la relation entre la date d'épiaison et l'émission de pollen.

**Hypothèse** : Les plantes dans le pollinarium, protégées et exposées plein Sud, émettent leur pollen plus tôt que celles situées en dehors de Poitiers.

### Dispositif Expérimental :

• Deux sites : Pollinarium de Grand Poitiers et pépinière à Lusignan.

• 15 populations de ray-grass anglais, du très précoce au très tardif.

• Mesures manuelles de mars à août sur la phénologie, morphologie et croissance des plantes.

• Prises de spectre proche infrarouge (NIRS) pour suivre la composition chimique des plantes.

### Bénéfices :

• Aider le pollinarium à anticiper l'émission de pollen et prévenir les allergiques.

• Permettre à l'INRAE de mieux comprendre la phénologie du ray-grass anglais.