# Les automates de phénotypage à haut débit du CIRM

David Navarro, Victoria Chuat

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David Navarro, Victoria Chuat. Les automates de phénotypage à haut débit du CIRM. NOV'AE, 2022, Numéro Spécial 02, RARe, pp.125-129. 10.17180/novae-2022-NS02-art15. hal-03735633

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Submitted on 15 Feb 2023

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David NAVARRO<fnref n="1" />,<fnref n="2" />

Victoria CHUAT<fnref n="3" />

CORRESPONDANCE

victoria.chuat@inrae.fr

Le Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM) est un Groupe-
ment d'Intérêt Scientifique (GIS), créé en 2004 par l'INRA, qui a pour vocation
la préservation, l'enrichissement et la valorisation de la diversité microbienne
présente dans ses collections. Il compte aujourd'hui plus de 22 000 souches
de champignons filamenteux, levures et bactéries.

Les collections du CIRM ont la particularité d'être spécialisées, les ressources biologiques hébergées étant liées à des thématiques précises : des Levures d'intérêt biotechnologique, des Bactéries d'intérêt alimentaire, pathogènes des animaux et de l'Homme, associées aux Plantes, et des Champignons Filamenteux d'intérêt agro-industriel. Ces collections sont capables d'offrir plus d'une centaine de souches d'une seule et même espèce. Elles représentent ainsi un vivier très intéressant pour la recherche de fonctionnalités d'intérêts dans les domaines de l'agroalimentaire, de la santé et des biotechnologies.

Pour investiguer les capacités de ses ressources microbiennes, le GIS CIRM s'est doté de deux outils de criblage, l'un au CIRM dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaire (CIRM-BIA) de Rennes, et l'autre au CIRM dédié aux Champignons Filamenteux (CIRM-CF) à Marseille, chaque plateforme étant optimisée pour la manipulation des ressources biologiques lui étant propres.

<footnote n="1">1 Biodiversité et Biotechnologie Fongiques, Aix-Marseille Université, INRAE, UMR1163, 13288 Marseille, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, Aix-Marseille Université, UMR1163, CIRM-CF, 13288 Marseille, France.</footnote>

<footnote n="3">3 STLO, INRAE, Agrocampus Ouest, 35000 Rennes, France.</footnote>
Une plateforme de criblage à haut débit pour
la caractérisation phénotypique des souches
bactériennes d'intérêt alimentaire au CIRM-
BIA de Rennes

Contexte

Le Centre International de Ressources Microbiennes dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaire (CIRM-BIA), situé à Rennes, possède une collection de plus de 4 000 souches bactériennes issues de collections rapatriées, de dépôts et de collectes ciblées. Si dans les premières années d'activité du CIRM-BIA, les souches de la collection provenaient principalement d'aliments fermentés laitiers, comme le yaourt et les fromages, la collection s'est fortement enrichie ces dernières années avec des souches provenant de matrice d'origine végétale, comme le moût de raisin, le levain de boulangerie ou encore les légumes fermentés.

Les micro-organismes jouent un rôle crucial dans la fermen-
tation des aliments. En fermentant les sucres naturellement
présents dans la matrice, différents composés aromatiques
sont produits, impactant le goût final de l'aliment. La texture
finale de l'aliment peut également être impactée par la pro-
duction d'exopolysaccharides, par exemple. Enfin, la diminu-
tion de pH ayant lieu pendant la fermentation d'une matrice
peut empêcher le développement de micro-organismes in-
désirables tout comme la production de bactériocines.

Ces fonctionnalités très recherchées sont cependant
souche-dépendantes et dépendent pour beaucoup de la
matrice à fermenter. En effet, une souche produisant des
arômes et une texture intéressante sur une matrice laitière
n'aura pas forcément les mêmes caractéristiques sur une
matrice végétale. À partir de notre expérience, nous avions
réalisé que seulement 10 % des souches criblées pouvaient
potentiellement montrer un intérêt dans la recherche d'une
fonctionnalité ciblée ; cela soulignait l'immense avantage à
mettre en place un outil permettant le criblage d'un grand
nombre de souches, pour sélectionner rapidement des
souches d'intérêt à étudier plus en détails.

Dans ce but, le CIRM-BIA s'est doté, en 2009, d'un automate
de criblage à haut débit HAMILTON. Les projets étant très
variables, nous avons souhaité une plateforme modulable
pour répondre aux questions de recherche très diverses.

Description de la plateforme

Cette plateforme est dotée de 8 canaux (1) et travaille en
plaques 96 puits. Un spectrophotomètre est relié au robot

permettant des suivis de croissance par mesure d'absor-
bance (2). La plateforme est dotée d'une pompe à vide (3)
permettant les extractions d'ADNs en haut débit. Elle pos-
sède également des blocs chauffants et agitants permettant
l'incubation de cultures bactériennes liquides en aérobiose
sur la plateforme (4, 4'). Différents supports sont présents
pour s'adapter aussi bien aux plaques (5), microplaques
PCR (6), tubes hémolyse (7), cryotubes (8), eppendorfs
(9) ou encore vials CPG (10). Tous les racks sont mobiles
et peuvent être déplacés, enlevés ou ajoutés selon le pro-
gramme. Cette plateforme ainsi équipée est située dans
une enceinte stérile.

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1. Plateforme de criblage du Centre International de Ressources Microbiennes dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaires (CIRM-BIA).</figcaption></figure>

Méthodes développées

Si l'outil permet en routine des expérimentations classiques
de repiquages de souches, d'extractions d'ADN en plaques
96 puits ou encore de congélation de souches, il est aussi
modulable pour permettre le criblage de fonctionnalités
recherchées.

Ainsi, de nombreux suivis de croissance ont pu être réali-
sés, en conditions de cultures optimales ou au contraire en
conditions fixées, bas pH, présence de sels, permettant ain-
si de cribler les souches sur des critères bien définis.

Ces dernières années, l'outil est très utilisé pour cribler les
souches de la collection sur leur capacité à dégrader des
sucres d'intérêt dans des milieux synthétiques, des matrices
laitières ou encore des matrices végétales. Aujourd'hui ce
sont environ 1 000 souches de la collection du CIRM-BIA
qui ont déjà pu être testées.
Une plateforme de phénotypage à haut-débit, dédiée à l'exploration fonctionnelle de la biodiversité fongique, au CIRM-CF de Marseille

Contexte

Les champignons filamenteux, principaux micro-organismes impliqués dans la dégradation de la matière organique végétale, sont une source majeure d'enzymes et de molécules d'intérêt biologique dans les domaines de l'agro-alimentaire (arômes, antioxydants, agent de fерментation), de la santé (antiviraux, antimicrobiens, anti-inflamatoires) ou encore des biotechnologies blanches (biomédiation, biocarburant...). Malgré ce fort potentiel de valorisation, peu d'outils permettent d'explorer la diversité enzymatique et métabolique offerte par les champignons filamenteux, dont la biodiversité est estimée, aujourd'hui, à plus de 5 millions d'espèces. En effet, contrairement à d'autres micro-organismes (bactéries, levures), le développement de méthodes automatisées, adaptées aux champignons filamenteux, et notamment des basidiomycètes, est rendu difficile par des contraintes spécifiques

(cultures hétérogènes, sporulation, pigmentation et viscosité des sécrétomes). C'est dans ce contexte que le CIRM-CF et l'UMR 1163 BBF ont développé, depuis plus de 15 ans, une plateforme de phénotypage à haut-débit, dédiée à l'exploration fonctionnelle de la biodiversité fongique.

Équipements mis en place

Pour répondre aux défis posés par la miniaturisation de culture de champignons filamenteux et par la grande diversité des différents types de champignons filamenteux, nous avons fait le choix d'une plateforme robotisée évolutive, permettant de s'adapter à chaque problématique rencontrée. Aujourd'hui, la plateforme réunit plusieurs équipes autour d'un automate de pipetage TECAN Freedom Evo 200 (Figure 2).

Selon les applications, la plateforme peut utiliser des cônes stériles ou des aiguilles téflonisées pour les pipetages (Figure 2, n°3). Deux manipulateurs de microplaques permettent de déplacer les microplaques aux emplacements requis. Enfin, un ordinateur contrôle l'ensemble de ces équipements.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2. Plateforme de crriblage du Centre International de Ressources Microbiennes dédié aux Champignons Filamenteux (CIRM-CF).</figcaption></figure>

1) Automate de pipetage TECAN Freedom Evo 200 :

2) Manipulateurs de microplaques :

3) Cônes stériles ou aiguilles téflonisées pour pipetage ;

4) Scelleuse de microplaque (VELOCITY11) ;

5) Incubateur avec agitation pour microplaque (de 25 à 55 °C) ;

6) Unité de filtration de microplaque (TECAN T-Vacs) ;

7) Bloc chauffant statique pour microplaque (jusqu'à 100 °C) (EPPENDORF, Thermomixer) ;

8) Spectrofluorimètre, avec agitation et incubation (TECAN Infinite 200).
Autour de la plateforme robotisée, d'autres équipements viennent compléter les possibilités :

→ Des incubateurs Minitron et Microtron (INFORS) destinés aux cultures moyen-débit (plaques 16 puits) et haut-débit (plaques 24 et 96 puits).

→ Une chaine de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) couplée à un spectromètre de masse (quadrupole simple).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 3. Photos des incubateurs Minitron et Microtron ainsi que de la chaine de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) couplée à un spectromètre de masse.</figcaption></figure>

## Méthodes développées

La plateforme est ouverte à nos partenaires académiques et industriels, ainsi qu'à l'enseignement. Elle a permis le développement de méthodes variées :

→ Isolement de lignées monocaryotiques à partir de souches basidiomycètes.

→ Criblage et sélection de clones recombinants pour la production d'enzymes en système hétérologue.

→ Criblage et sélection de souches pour la production de métabolites ou d'enzymes d'intérêt.

→ Phénotypage haut-débit de sécrétomes fongiques pour la saccharification de biomasses lignocellulosiques.

→ Sélection de souches performantes pour la fermentation en milieu solide.

→ Purification haut-débit de protéines recombinantes (His-tag).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 4. Chronologie des méthodes de cribages développées et des partenariats associés.</figcaption></figure>
Références

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