## Zusammenfassung

Zum Nachweis der PBTS im Harn bei Föllingscher Krankheit wird ein papierchromatographisches Verfahren geschildert. Nachweisbare Mindestmenge 1—2 γ. Die zugehörigen $R_F$-Werte werden angegeben und Fehlermöglichkeiten besprochen. Die Anwendung des Verfahrens zur quantitativen Schätzung wird beschrieben.

# Über Clupein

## XI. Mitteilung

Von

K. Felix, H. M. Rauen und G. H. Zimmer

Aus dem Institut für vegetative Physiologie der Universität Frankfurt a. Main
Ausgeführt mit Mitteln der Deutschen Forschungsgemeinschaft

(Der Schriftleitung zugegangen am 18. Oktober 1952)

Zur weiteren Aufklärung der Reihenfolge der Aminosäuren in den Peptidketten des Clupeins haben wir unsere früheren Versuche<fnref n="1" /> der partiellen Hydrolyse wieder aufgenommen und zunächst geprüft, ob sich die damaligen Resultate reproduzieren lassen. Wir verwandten dazu ein Präparat von Clupeinmethylester-hydrochlorid, das nach einem noch zu beschreibenden, schonenden Verfahren<fnref n="2" /> dargestellt worden war; es enthielt 23,92% Stickstoff, wovon 90% auf Arginin kamen. 50 g derselben (= 11,96 g N) wurden mit n-Salzsäure soweit (8 Stdn.) hydrolysiert, daß die Biuretreaktion noch positiv war. 92,7% des Gesamtstickstoffs des Hydrolysats fielen mit Phosphorwolframsäure aus. Das Filtrat des Phosphorwolframats (6,4% des Gesamtstickstoffs) enthielt nur Monoaminosäuren und auch Peptide derselben, da der freie Aminostickstoff durch Hydrolyse anstieg. Papierchromatographisch ließen sich Isoleucin, Prolin und Alanin nachweisen, ferner noch zwei bis drei andere Flecke, die keinen freien Aminosäuren zugeordnet werden konnten und wahrscheinlich Monoaminosäurepeptiden angehörten.

Nach Entfernung der Phosphorwolframsäure gab die „Basenfraktion“ die Biuretreaktion. Sie enthielt das gesamte Arginin, meist in Peptiden gebunden. Durch heißen 90-proz. Alkohol ließ sich ein Teil extrahieren und der unlösliche Rückstand (35% des Gesamt-N) in ein kristallisiertes Pikrolonat überführen. Der freie Aminostickstoff dieses Peptid-pikrolonates betrug 6,4% des Gesamtstickstoffs und stieg nach der Hydrolyse auf 26%. Praktisch der ganze Stickstoff dieses Peptid-hydrolysates (98,8%) konnte als Arginin identifiziert werden, d. h. das Peptid bestand nur aus Arginin. Nach dem freien Aminostickstoff vor

<footnote n="1">¹ K. Felix. R. Hirohata u. K. Dirr, diese Z. 218, 269 [1933].</footnote>

<footnote n="2">² H. M. Rauen, W. Stamm u. K. Felix, diese Z., im Druck.</footnote>
und nach der Hydrolyse sowie dem Pikrolonsäuregehalt des Pikrolonates muß es ein Triarginyl-arginin gewesen sein, womit der frühere Befund bestätigt ist, daß die Kombination von vier Argininresten nebeneinander mehrmals in den Peptidketten des Clupeins vorkommt.

Die alkoholische Lösung wurde zur Trockene eingeengt und der Rückstand, der ebenfalls noch die Biuretreaktion gab, mit heißem absol. Alkohol extrahiert, wobei ein Teil nicht in Lösung ging. Der Extrakt wurde wieder eingeengt und von neuem extrahiert. Der zweite unlösliche Rückstand wurde mit dem ersten vereinigt.

Die in absol. Alkohol lösliche Fraktion enthielt 2,5% des gesamten Clupeinstickstoffs und konnte wieder in ein Pikrolonat übergeführt werden. Sein freier Aminotickstoff betrug vor der Hydrolyse 11,6 und danach 33,5% vom Hydrolysatstickstoff. Aus diesem Hydrolysat wurden 89% des Stickstoffs in Form von Argininflavianat isoliert. Das Filtrat des Flavianates enthielt papierchromatographisch nur Alanin. Eine zweite Probe des Peptidpikrolonates wurde von der Pikrolonsäure befreit, in das Dinitrophenylderivat nach Sanger übergeführt und aus seinem Hydrolysat N-2.4-Dinitrophenyl-alanin isoliert. So ergibt sich, daß das in absol. Alkohol lösliche Peptid Alanyl-arginylarginin ist.

Die in absol. Alkohol unlöslichen, in 90-proz. Alkohol aber löslichen Rückstände wurden vereinigt und wieder mit 90-proz. Alkohol extrahiert, wobei nur ein kleiner Rückstand blieb. In Lösung gingen 24,9% des Clupeinstickstoffs. Aus der wäßrigen Lösung dieses Anteils wurde über die Flavianate Arginyl-arginindipikrolonat und Arginin isoliert.

Der Rückstand, der bei der zweiten Extraktion verblieben war, gab eine deutliche Biuretreaktion und enthielt 6,7% des Clupeinstickstoffs. Auch hier konnte wieder ein arginin-haltiges Peptid als kristallisiertes Pikrolonat isoliert werden. Sein freier Aminostickstoff betrug vor der Hydrolyse 11,08% vom Gesamtstickstoff und danach 33,9%. 90,5% des Peptidstickstoffs waren als Arginin vorhanden, der Rest als Serin. Aus dem Dinitrophenylderivat des Peptids wurde nach der Hydrolyse N-2.4-Dinitrophenyl-serin isoliert. Somit lag hier ein Seryl-arginyl-arginin vor.

Diese neuen Resultate lassen sich noch mit Hilfe der Formel erklären, die seiner Zeit aufgestellt wurde. Nach ihr sollen die Peptidketten des Clupeins mit einem Prolinrest beginnen, dann jeweils vier Arginin mit zwei Monoaminosäuren abwechseln und am Carboxylende soll Arginyl-arginin stehen:

Prol-[Arg-Arg-Arg-Arg MM]n-Arg-Arg.

Wir haben sie aus Untersuchungen an einer Fraktion des Clupeinmethylesterhydrochlorids entwickelt, die wir damals für einheitlich hielten, nach den neuesten Versuchen über das Verhalten des Clupeins bei der Gegenstromverteilung aber ein Gemisch aus mehreren Komponenten ist². Diese Komponenten müssen sehr ähnlich zusammengesetzt sein und alle am Aminoende Prolin tragen. Bei der ersten Bestimmung der End-
aminosäuren fanden wir neben Prolin noch eine kleine Menge Serin<fnref n="3" />. Inzwischen haben wir die Bestimmung mehrmals an auf zwei verschiedene Arten dargestelltem Clupein wiederholt und nur Prolin gefunden. Wahrscheinlich ist jenes Präparat bei der Darstellung etwas gespalten worden. In allen muß das Tetrapeptid aus Arginin häufig vorkommen; denn es fiel, wie die folgende Übersicht demonstriert, in relativ hoher Ausbeute an. Ob alle mit Arginin bzw. Arginyl-arginin enden, läßt sich noch nicht sagen.

<table><thead><tr><th></th><th>% des Clupein-N</th></tr></thead><tbody><tr><td>Arg-arg-arg</td><td>35</td></tr><tr><td>Ala-arg-arg</td><td>2,5</td></tr><tr><td>Ser-arg-arg</td><td>6,7</td></tr><tr><td>Arg-arg + Arg</td><td>24,9</td></tr><tr><td>Monoaminosäurenfraktion</td><td>6,4</td></tr></tbody><tfoot><tr><td></td><td>75,5</td></tr></tfoot></table>

Auch von der Fraktion, in der Arginyl-arginin und freies Arginin enthalten waren, war die Ausbeute noch recht gut, was bei dem hohen Gehalt an Arginin nicht unerwartet war. Daß aber von Peptiden aus Arginin und Monoaminosäuren so wenige isoliert werden, liegt daran, daß sie wegen des einheitlich stark basischen Charakters schwer voneinander zu trennen sind.

Von dem mit dem Clupein eingesetzten 11,96 g Stickstoff wurden in den Fraktionen nur <fnref n="3" />/₄ wieder gefunden, der Rest ging bei den Regungsversuchen verloren.

## Beschreibung der Versuche

Partialhydrolyse des Clupeins: 50 g Clupeinmethylester-hydrochlorid mit 11,96 g Gesamtstickstoff und 90,01% Argininstickstoff vom Gesamtstickstoff wurden mit 500 cm<fnref n="3" /> n-Salzsäure unter Rückfluß 8 Stdn. gekocht, wonach die Biuretreaktion deutlich positiv war, und nach Abkühlen mit n-Salzsäure auf 2035 cm<fnref n="3" /> aufgefüllt. Nach Zusatz von 30-proz. Phosphorwolframsäure im Überschuß (insgesamt 340 g) wurde der Niederschlag nach 24-stdg. Aufbewahren im Eisraum abgesaugt, in der Reibschale dreimal mit 2,5-proz. Phosphorwolframsäure zerrieben und schließlich scharf abgesaugt.

Mutterlauge und Waschwasser wurden vereinigt, die überschüssige Phosphorwolframsäure mit Bariumhydroxyd und die überschüssigen Bariumionen durch Einleiten von Kohlendioxyd entfernt und im Vakuum eingeengt. Papierchromatographisch wurden als freie Aminosäuren Isoleucin, Prolin und Alanin gefunden. Außerdem waren noch 2-3 andere, mit Ninhydrin anfärbbare Positionen sichtbar, die keinen freien Aminosäuren zugehören, sondern wahrscheinlich Monoaminosäurepeptiden. In der gesamten, mit Phosphorwolframsäure nicht fällbaren Fraktion befanden sich 0,764 g Gesamt-N, von denen 0,355 g, d. h. 46,4%, formoltitrierbar waren.

Die Phosphorwolframsäurefällung wurde in verd. Salzsäure suspendiert, mit insgesamt 6 l Amylalkohol-Äther 1:1 extrahiert, die salzsaure wäßrige Lösung im Vakuum eingeengt, mit NaOH neutralisiert und im Vakuum zur Trockene

<footnote n="3">³ K. Felix, H. Fischer, A. Krekels u. H. M. Rauen, diese Z. 286, 67 [1950].</footnote>
gebracht. Diese Fraktion der Basenanteile des Clupeins enthielt 11,08 g Gesamt-N, d. h. 92,7% des vorgelegten Clupeinstickstoffs.

Fraktionierung der Basenanteile: Das Trockenprodukt wurde mit 500 cm³ heimlich 90-proz. Äthanol extrahiert und vom Ungelösten abgesaugt. Der Rückstand enthielt 4,2 g Gesamtstickstoff, d. h. 37,9% des Gesamtstickstoffs der Basenanteile. Von diesem waren 20,8% formoltitrierbar. Die wäßrige Lösung reagierte schwach sauer und gab eine deutliche Biuretreaktion.

Zur wäßrigen Lösung dieser Fraktion wurde Pikrolonsäure im Überschuß zugesetzt und nach 24-stdg. Aufbewahren im Eisraum, Absaugen und Trocknen im Exsiccator, 6,7 g Pikrolonat gewonnen. Es konnte viermal aus heimlich, reinem Äthanol umkristallisiert werden, jedoch zersetzte sich ein Teil des Kristallisates beim fünften Umkristallisierungsversuch und es verblieben 1,3 g eines schwarzen Rückstandes auf dem Filter. 1,8 g eines in büschelförmig angeordneten Nadeln kristallisierenden Pikrolonates konnten noch gewonnen werden. Es ist in heimlich Wasser sehr schwer löslich, ziemlich leicht dagegen in heimlich verd. Äthanol. Es zersetzt sich unter Schwarzfärbung bei 230° C. (unkorr.).

Analyse des Pikrolonates: 1,0 g wurden mit Salzsäure und Äther zerlegt. Die wäßrige Lösung gab eine starke Biuretreaktion. 6,4% vom Gesamtstickstoff dieser Lösung waren formoltitrierbar. Nach 24-stdg. Hydrolyse eines Anteils mit 20-proz. Salzsäure unter Rückfluß waren 26% des Gesamtstickstoffs formoltitrierbar und 98,8% vom Gesamtstickstoff lagen als Argininstickstoff vor. Letzterer wurde als Argininflavianat bestimmt, das Filtrat von diesem wurde von der überschüssigen Flaviansäure befreit. Es war stickstofffrei.

Bestimmung der Pikrolonsäure<fnref n="4" />: 127,44 mg Pikrolonat wurden unter Zusatz von 1 cm³ verd. Salzsäure in 20 cm³ heimlich Wasser gelöst und 15 cm³ einer 0,3-proz. salzsauren Lösung von Acridin zugesetzt. Das voluminös ausfallende Acridinpikrolonat wurde nach 24-stdg. Aufbewahren im Eisraum abgesaugt, mit 40 cm³ eiskaltem Wasser gewaschen, bei 130° C getrocknet und gewogen. 130,98 mg Acridinpikrolonat entspr. 62,7% Pikrolonsäure. Für Triarginyl-arginin-tetrapikrolonat ber. 63,62% Pikrolonsäure.

Weiterverarbeitung des alkoholischen Extraktes der Basenanteile: Nach völligem Verdampfen des Alkohols im Vakuum wurde der Rückstand mit 500 cm³ absol. Äthanol ausgekocht. Die noch heiß filtrierte Lösung wurde wieder im Vakuum zur Trockene eingeengt und der Rückstand noch einmal mit 200 cm³ absol. Äthanol extrahiert. Die hierbei verbliebenen Rückstände wurden vereinigt und, wie später beschrieben, weiter verarbeitet.

Der Extrakt mit absol. Äthanol ergab nach Vertreiben des Lösungsmittels im Vakuum 2,1 g Rückstand. Eine kleine Menge wurde mit 6-n. Salzsäure 24 Stdn. hydrolysiert. Im Trockenrückstand befanden sich nach papierchromatographischer Prüfung nur Arginin und Alanin.

Der Gesamtstickstoff dieser Fraktion betrug 2,85% des Gesamtstickstoffs der Basenanteile. Von ihm waren 19,94% formoltitrierbar. Die wäßrige Lösung dieser Fraktion wurde neutralisiert, mit wäßriger Pikrolonsäure im Überschuß versetzt und über Nacht im Eisraum aufbewahrt. Nach viermaligem Umkristallisieren aus 50-proz. reinem Äthanol wurden 0,93 g eines in mikroskopisch kleinen Nadelbündeln kristallisierenden Pikrolonates von Schmp. 168 – 170° C. (unkorr.) erhalten.

Analyse des Pikrolonates: 800 mg Pikrolonat wurden in Wasser suspendiert und mit Salzsäure-Äther zerlegt. 11,6% vom Gesamtstickstoff dieser Lösung waren formoltitrierbar. Ein Teil dieser Lösung wurde 6-n. salzsauer gemacht und 24 Stdn. unter Rückfluß hydrolysiert. Nunmehr waren 33,5% vom Gesamtstickstoff formoltitrierbar. 89% vom Gesamtstickstoff wurden als Argininstickstoff durch Fällen des Arginins mit Flaviansäure bestimmt.

<footnote n="4">⁴ H. Schiedewitz, diese Z. 214, 177 [1933].</footnote>
Aus dem Filtrat des Argininflavianates wurde die überschüssige Flaviansäure entfernt und nach Verdampfen des Wassers im Vakuum im Rückstand papierchromatographisch nur Alanin festgestellt.

**Bestimmung der Pikrolonatäure:** 51,13 mg Pikrolonat ergaben 48,36 mg Acridinpikrolonat, d. h. 56,3% Pikrolonsäure. Für Alanyl-arginyl-arginin-dipikrolonat ber. 56,8%.

**Darstellung des N-2,4-Dinitrophenylderivates von Alanyl-arginyl-arginin:** Ein Anteil der Lösung des Peptides nach der Zersetzung seines Pikrolonates wurde im Vakuum zur Trockene gebracht, wieder mit Wasser aufgenommen und Fluor-2,4-dinitrobenzol in wenig Äthanol gelöst, zusammen mit der berechneten Menge Natriumbicarbonat zugegeben, kräftig geschüttelt und 2 Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach mehrstündigem Aufbewahren im Eisraum wurde von dem ausgeschiedenen unverbrauchten Fluordinitrobenzol abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene gebracht. Nach 24-stdg. Hydrolyse mit 6-*n*.Salzsäure und Entfernen des Säureüberschusses im Vakuum konnte papierchromatographisch Arginin und N-2,4-Dinitrophenyl-alanin nachgewiesen werden.

**Weiterverarbeitung des in absol. Äthanol unlöslichen Anteils:** Der von der Extraktion mit absol. Äthanol verbliebene Rückstand wurde nun mehrmals mit 90-proz. Äthanol extrahiert und von einer geringen Menge Ungelöstem filtriert. Dieser ungelöste Anteil wurde, wie weiter unten beschrieben, weiter verarbeitet. Die in 90-proz. Äthanol lösliche Fraktion gab eine deutliche Biuretreaktion. Sie wurde im Vakuum zur Trockene gebracht. Diese Fraktion enthielt 2,975 g Gesamtstickstoff. d. h. 26,9% des Gesamtstickstoffs der Basenanteile. 24,2% davon waren formoltitrierbar.

Die wäßrige Lösung dieser Fraktion wurde bei deutlich lackmussaurer, aber nicht kongosaurer Reaktion mit Flaviansäure im Überschuß versetzt. Vom sofort ausgefallenen schmierigen Flavianat wurde sogleich dekantiert. Aus dem Dekantat kristallisierten daraufhin 2 g eines zweiten Flavianates aus. Nach Absaugen kamen aus der Mutterlauge bei längerem Stehenlassen weitere 0,24 g eines dritten Flavianates.

Das schmierige Flavianat wurde in viel heißem Wasser gelöst, mit Bariumhydroxyd versetzt und das Bariumflavianat sowie der Überschuß an Bariumionen mit Schwefelsäure entfernt. Die verbliebenen 0,63 g Gesamtstickstoff betragen 21,2% des Gesamtstickstoffs des in 90-proz. Äthanol löslichen Anteils. Die wäßrige Lösung wurde mit Pikrolonsäure im Überschuß versetzt, über Nacht im Eisraum aufbewahrt, das isolierte Pikrolonat mehrmals aus 30-proz. Äthanol umkristallisiert und 0,675 g Pikrolonat erhalten. Die sehr kleinen Kristalldrusen zersetzten sich bei 282–283° C (unkorr.). Für Arginyl-arginin-dipikrolonat wurde ein Schmp. von 285° C angegeben<fnref n="5" />.

**Analyse des Pikrolonates:** Das Pikrolonat wurde wie üblich mit Salzsäure zerlegt und die freie Pikrolonsäure ausgeäthert. Vom Gesamtstickstoff der wäßrigen Lösung waren 13,03% formoltitrierbar. Ein Anteil wurde im Vakuum zur Trockene gebracht, mit 6-*n*.Salzsäure 24 Stdn. hydrolysiert, die überschüssige Salzsäure im Vakuum entfernt und der Rückstand in Wasser aufgenommen. Vom Gesamtstickstoff dieses Hydrolysates waren nunmehr 25,8% formoltitrierbar. 99,51% lagen als Argininstickstoff vor. Das Filtrat vom Argininflavianat war nach Entfernen der überschüssigen Flaviansäure stickstofffrei.

Das zweite kristallisierte Flavianat wurde mehrmals aus heißem Wasser umkristallisiert, worauf es bei 224° C (unkorr.) schmolz. Für Arginyl-arginin-diflavianat wurde ein Schmp. von 225° C angegeben<fnref n="5" />. Ausb. 0,78 g.

Das Flavianat wurde mit Bariumhydroxyd zersetzt, Bariumflavianat und der Überschuß an Bariumionen mit Schwefelsäure entfernt. 12,48% des Gesamt-

<footnote n="5">⁵ K. Felix u. H. Schuberth, diese Z. 273, 97 [1942].</footnote>

<footnote n="6">⁶ A. Kossel u. R. F. Groß, diese Z. 135, 167 [1924].</footnote>
stickstoffs dieser Lösung waren formoltitrierbar. Nach Hydrolyse eines Teiles waren 25,5% des Gesamtstickstoffs formoltitrierbar und 99,8% konnten als Arginin-stickstoff identifiziert werden.

Nach diesen Analysen waren die Basenanteile sowohl des ersten schmierigen als auch des zweiten kristallisierten Flavianates Arginyl-arginin.

Das dritte, kristallisiert erhaltene Flavianat schmolz nach Umkristallisieren bei 256° C (unkorr.). Für Argininflavianat wurde ein Schmp. von 258° C angegeben⁶. Ausb. 0,24 g. Sie wurde in heißem Wasser aufgenommen, mit Barium-hydroxyd zerlegt. Bariumflavianat und die überschüssigen Bariumionen mit Schwefelsäure entfernt. 25,6% des Gesamtstickstoffs waren formoltitrierbar und 99,7% wurden als Argininstickstoff wiedergefunden.

Weiterverarbeitung des in 90-proz. Äthanol unlöslichen Anteiles: Der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen, und diese Lösung gab eine deutliche Biuretreaktion. Sie enthielt 0,866 g Gesamtstickstoff, d. h. 7,24% des Gesamt-stickstoffs der Basenanteile, 21,1% des Gesamtstickstoffs waren formoltitrierbar.

Nach Zusatz von wäßriger Pikrolonsäurelösung im Überschuß und Aufbewahren im Eisraum über Nacht wurde ein Pikrolonat gewonnen und aus 30-proz. Äthanol fünfmal umkristallisiert. Schmp. 220° C (unkorr.). Ausb. 1,0 g.

Nach Zerlegen des Pikrolonates mit Salzsäure und Äther waren in der wäßrigen Lösung 738 mg Gesamtstickstoff, davon 11,08% formoltitrierbar. Ein Teil dieser Lösung wurde im Vakuum zur Trockene gebracht, mit 6-n.Salzsäure 24 Stdn. unter Rückfluß hydrolysiert, die überschüssige Säure im Vakuum verdampft Nummehr waren 33,9% des Gesamtstickstoffs formoltitrierbar und 90,5% lagen als Argininstickstoff vor. Während im Hydrolysat papierchromatographisch Arginin und Serin gefunden wurden, enthielt das Filtrat des Argininflavianates nach Entfernen der überschüssigen Flaviansäure nur noch Serin.

Bestimmung der Pikrolonsäure im Pikrolonat: 59,1 mg Pikrolonat ergaben 54,7 mg Acridinpikrolonat. Diese entsprechen 55,2% Pikrolonsäure. Für Seryl-arginyl-dipikrolonat berechneten wir 55,86%.

Darstellung des N-2,4-Dinitrophenylderivates: Ein Teil der Lösung des Peptides wurde mit Natronlauge neutralisiert und im Vakuum zur Trockene gebracht. Nach Aufnahme des Rückstandes in Wasser wurde die berechnete Menge 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol und Natriumbicarbonat zugesetzt und 2 Tage bei Zimmer-temperatur stehen gelassen. Nach Abfiltrieren wurde im Vakuum zur Trockene eingeengt und 24 Stdn. mit 6-n.Salzsäure unter Rückfluß hydrolysiert. Nach Verdampfen der Säure ließen sich papierchromatographisch 2,4-Dinitrophenyl-serin und freies Arginin nachweisen.

Die in 90-proz. Äthanol unlösliche Fraktion enthielt also das Tripeptid Seryl-arginyl-arginin.

Isolierung von Arginyl-arginin-diflavianat: 25 g Clupeinmethyl-ester-hydrochlorid wurden in 500 cm³ 2-n.Salzsäure gelöst und 4 Wochen bei 37° C aufbewahrt. Nach Abstumpfen mit Natronlauge bis zur lackmussauren, aber nicht mehr kongosauren Reaktion fiel auf Zusatz wäßriger Flaviansäure im Überschuß sofort ein oliges Flavianat aus, das sich rasch absetzte. Nach etwa 2 Stdn. wurde die entstandene Flüssigkeit dekantiert, aus der später nicht verbrauchte Flaviansäure auskristallisierte.

Das olige Flavianat wurde in 500 cm³ heißem Wasser aufgenommen, wobei sich nur ein Teil löste und beim Erkalten wieder ausfiel. Nach dem Abgießen des Waschwassers erstarrte das Öl nach der Behandlung mit Methanol in der Wärme. Nach Absaugen und Trocknen im Vakuum über Phosphorpentoxyd zeigte das Flavianat einen Schmp. von 224–225° C (unkorr.). Felix und Schuberth⁵ fanden für Arginyl-arginin-diflavianat 225° C. Nach Zersetzen des Flavia-nates mit Bariumhydroxyd wurde ein Teil des freigewordenen Peptides mit Salz-säure wie üblich hydrolysiert und die Säure im Vakuum verdampft. Im Rückstand konnte papierchromatographisch nur Arginin nachgewiesen werden.
## Zusammenfassung

Aus Partialhydrolysaten des Clupeins wurde das Tetrapeptid Triarginyl-arginin, die Tripeptide Alanyl-arginyl-arginin, Seryl-arginyl-arginin sowie das Dipeptid Arginyl-arginin gewonnen. In der Monoaminosäurenfraktion befand sich noch peptidgebundener Stickstoff. Diese Ergebnisse stimmen mit der früher aufgestellten Formel der Clupeinmolekel überein.

# Zur quantitativen Bestimmung des Oxyprolins in Eiweißhydrolysaten

Von

Dieter Müting

Aus dem Forschungsinstitut für Diabetes, Karlsburg, Kr. Greifswald (Präsident: Prof. Dr. G. Katsch), und der Chemischen Abteilung des Forschungsinstitutes für Tierseuchen, Insel Riems (Präsident Prof. Dr. H. Röhrer)

(Der Schriftleitung zugegangen am 20. Oktober 1952)

Bei der Ausarbeitung möglichst einfacher aber spezifischer und empfindlicher Aminosäurenbestimmungen für klinische Zwecke bediente ich mich auch der Oxyprolinbestimmung nach Lang in der Modifikation von Waldschmidt-Leitz und Akabori<fnref n="1" />. Diese Methode beruht auf einer Überführung des Oxyprolins in Pyrrol, das in einer komplizierten Apparatur aufgefangen und mit *p*-Dimethylaminobenzaldehyd stufenphotometrisch erfaßt wird. Für die Durchführung von Reihenuntersuchungen ist dieses Verfahren, das nach Lang eine Empfindlichkeit bis 10 γ hat, aber zu zeitraubend. Außerdem ist die auftretende Farbe bei diesem Vorgehen nur kurze Zeit haltbar.

Ich versuchte daher, durch verschiedene Oxydationsmittel auch ohne anschließende Destillation zum Ziel zu kommen. Hierbei erwies sich schließlich Hypobromit als geeignet. Der Überschuß an Hypobromit wurde ohne Störung der Farbreaktion am besten durch Natriumthiosulfat, Natriumsulfit oder Glucose zerstört. Die Empfindlichkeit dieser Methode liegt bei 1—2 γ; die Farbreaktion gehorcht dem Beerschen Gesetz bei Konzentrationen bis 0,1 mg/ccm. Bei größeren Konzentrationen von Oxyprolin, wie z. B. bei Gelatinehydrolysaten, muß unbedingt dementsprechend verdünnt werden, um zu niedrig vorgetäuschte Werte zu vermeiden. Kontrollversuche mit Alanin, Serin, Asparagsäure, Glutaminsäure, Tyrosin, Threonin, Prolin, Lysin, Cystin, Methionin, Arginin, Glykokoll, Valin, Aminobuttersäure, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Norvalin, Cystein und Phenylalanin fielen negativ aus. Lediglich Tryptophan gab bei 10 Min. langem Kochen in siedendem

<footnote n="1">¹ K.Lang, diese Z.219, 148 [1933]; E.Waldschmidt-Leitz u. S.Akabori, diese Z. 224, 187 [1934].</footnote>