# Pep-1 transporte des protéines dans les cellules de mammifères

May C Morris, Frédéric Heitz, Gilles Divita

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May C Morris, Frédéric Heitz, Gilles Divita. Pep-1 transporte des protéines dans les cellules de mammifères. Médecine/Sciences, 2002, 18 (6-7), pp.672-674. 10.1051/medsci/20021867672. hal-03129164

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# Pep-1 transporte des protéines dans les cellules de mammifères

**Article** in *Medecine sciences: M/S · June 2002*

DOI: 10.1051/medsci/20021867672

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May Morris
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Gilles Divita
DIVINCELL

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thérapeutiques. On peut en effet rappeler
que, chez la femme ménopausée, la chute
des hormones stéroïdes sexuelles s'ac-
compagne d'une diminution importante
des taux de relaxine. Compte tenu de cer-
tains symptômes associés à la ménopause
tels que la prédisposition au développe-
ment de fibroses, les défauts de cicatrisa-
tion ou les troubles vasculaires, une hor-
monothérapie substitutive à base
d'agonistes de la relaxine pourrait offrir
des perspectives intéressantes. ◊

The receptor for relaxin has finally been
identified

RÉFÉRENCES

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récepteur. *Med Sci* 2000;
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Cryptorchidism in mice
mutant for INSL3. *Nat Genet*
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Derivation of functional antagonists using N-
terminal extracellular domain of gonadotropin
and thyrotropin receptors.
*Mol Endocrinol* 1997; 11 :
1659-68.

NOUVELLE

Pep-1 transporte des protéines
dans les cellules
de mammifères

May Catherine Morris, Frédéric Heitz, Gilles Divita

Centre de Recherche en Biochimie
Macromoléculaire (CRBM),
Cnrs UPR 1086,
1919, route de Mende,
34293 Montpellier, France.
divita@crbm.cnrs-mop.fr

> Au cours des dix dernières années, la recherche dans le domaine de la thérapie génique a été principalement focalisée sur l'amélioration des vecteurs viraux et non viraux pour le transfert de gènes. Toutefois, les formulations proposées pour l'introduction de « transgènes » restent encore limitées en raison de difficultés liées à leur pouvoir immunogène, à leur toxicité et à leur faible efficacité in vivo. Face à ces limitations, l'alternative était d'imaginer de nouvelles stratégies qui permettraient le transfert direct de la protéine d'intérêt dans un grand nombre de cellules [1]. Le développement de peptides ou pro-

téines à visée thérapeutique reste limité
par la faible perméabilité membranaire et
par la présence, à la surface de la cellule,
de protéines ou de récepteurs qui contrô-
lent sélectivement le transport cellulaire
de molécules. Récemment, ces restrictions
ont été levées par la découverte de petits
domaines protéiques, appelés protein
transduction domains (PTD). Ces derniers,
de nature basique, sont capables de tra-
verser les membranes biologiques indé-
pendamment de la présence de transpor-
teurs ou de récepteurs spécifiques à la
surface des cellules, et permettent le
transfert de peptides ou de protéines dans

les cellules [1, 2]. Les trois domaines PTD
qui ont été le mieux caractérisés et utilisés
dérivent de la protéine Tat du virus de l'im-
munodéficience humaine (VIH-1) [3], de
la troisième hélice de l'homéo-domaine
d'Antennapedia (Antp) [4], et de la pro-
téine de structure Vp22 du virus de l'herpès
simplex [5]. À ce jour, le PTD de la protéine
Tat constitue le système le plus efficace
pour le transfert des protéines in vitro et in
vivo [6, 7]. Cependant, l'utilisation des
vecteurs PTD présente un certain nombre
de contraintes réduisant leur exploitation
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in vivo. D'une part, cette approche nécessite dans tous les cas la formation d'une protéine de fusion entre la séquence PTD et la protéine d'intérêt. Cette fusion peut être obtenue soit par voie chimique (Antp et Tat), soit par clonage (Vp22 et Tat). D'autre part, leur efficacité pour la transduction de protéines de grande taille reste faible et nécessite une étape de dénaturation de la protéine avant la transduction, introduisant ainsi un délai avant que ne soit restaurée la forme active de la protéine dans la cellule.

Depuis plusieurs années, notre laboratoire travaille au développement d'outils peptidiques facilitant le transport cellulaire d'acides nucléiques, de peptides et de drogues [8, 9]. Récemment nous avons proposé une nouvelle stratégie pour le transfert de protéines dans les cellules, fondée sur un vecteur peptidique unique (Pep-1), permettant de s'affranchir des étapes de couplage et/ou de dénaturation des protéines d'intérêt [10]. Le choix de la

séquence de Pep-1 est fondé sur le criblage d'une série de peptides amphiphatiques ayant la capacité de traverser la membrane plasmique des cellules. Contrairement aux vecteurs PTD, Pep-1 est un peptide amphiphatique primaire de 21 résidus. Il comporte trois domaines : (1) un domaine hydrophobe riche en résidus tryptophane, qui est essentiel pour la formation de complexes stables avec la protéine d'intérêt, par l'intermédiaire de liaisons non covalentes, et pour l'association avec la membrane cellulaire ; (2) un domaine hydrophile riche en résidus lysine qui favorise le transfert cellulaire ; et enfin (3) un court bras peptidique reliant les deux domaines, qui est essentiel pour l'intégrité des propriétés de Pep-1 [10]. Pep-1 piège la protéine d'intérêt dans une cage peptidique, dont le transport cellulaire est uniquement contrôlé par Pep-1 et indépendant des caractéristiques de la protéine d'intérêt. La balance hydrophobe/hydrophile est nécessaire pour le

mécanisme de translocation membraneaire, et l'association du domaine hydrophile avec un ou plusieurs résidus tryptophane du domaine hydrophobe semble cruciale pour le transport de protéines. Pep-1 n'est pas toxique, est stable dans les milieux physiologiques et insensible à la présence de sérum.

Le peptide vecteur (Pep-1) traverse rapidement la membrane plasmique et la majeure partie se localise dans le noyau, suivant un mécanisme d'internationalisation indépendant des voies d'endo-cytose. Pep-1 est capable de former des complexes non covalents stables avec des protéines et des peptides de taille variable (3 kDa à 500 kDa). La caractérisation de ces complexes a permis de mettre en évidence l'existence d'un réseau de Pep-1 autour de la protéine ou du peptide d'intérêt. Cette cage peptidique stabilise le complexe dans un milieu biologique et limite la dégrada-tion de la molécule à vectoriser. L'application de cette technologie à des séries de peptides et de protéines a démontré que les complexes Pep-1/protéine étaient rapidement internalisés (1-2 h), avec une efficacité de l'ordre de 60 à 90 % selon les lignées cellulaires. De plus, la présence de Pep-1 ne perturbe ni la localisation cellulaire de la protéine ni son activité biologique. Le mécanisme de transduction de protéines par Pep-1 comporte plusieurs étapes : la formation d'une cage peptidique autour de la protéine d'intérêt, suivie de son transport rapide à travers la membrane cellulaire et enfin la dissociation du complexe Pep-1/protéine qui intervient immédiatement après son entrée dans la cellule (Figure 1). Nous avons démontré que le mécanisme d'internalisation des complexes Pep-1/protéine était indépendant de l'état du cycle cellulaire, de la présence de récepteurs cellulaires spécifiques et des voies classiques d'endo-cytose, se rapprochant ainsi des mécanismes proposés pour les PTD [7]. L'utilisation de Pep-1 pour le transfert de protéines permet d'envisager des applications multiples en biologie cellule

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**Figure 1.** Différentes étapes du mécanisme de transduction de protéines par Pep-1. Le mécanisme de Pep-1 comporte quatre étapes majeures : (1) la formation d'une « cage » peptidique stable autour de la protéine d'intérêt ; (2) l'interaction du complexe Pep-1/protéine avec la membrane cellulaire ; (3) suivie de son internalisation ; et enfin (4) de la libération dans le cytoplasme de la protéine d'intérêt.
laire et en thérapeutique. Nous avons déjà appliqué Pep-1 à la vectorisation d'anticorps ou d'inhibiteurs protéiques contrôlant la progression du cycle cellulaire. Actuellement, nous focalisons notre activité sur l'identification du potentiel d'un tel vecteur in vivo.

Les vecteurs peptidiques constituent des outils très prometteurs dans le domaine du transfert de molécules biologiquement actives. Ils sont facilement accessibles par voie de synthèse, ce qui rend possible la conception de multiples analogues. La stratégie mise au point avec le vecteur Pep-1 offre un puissant outil utilisable tant en recherche fondamentale que pour le criblage de protéines et de peptides potentiellement thérapeutiques. Le développement des méthodes facilitant le transfert de protéines présente plusieurs avantages. En particulier, elles permettent d'envisager l'utilisation directe de protéines ou domaines protéiques en thé-

rapeutique sans avoir besoin de recourir à la thérapie génique ou à l'élaboration de drogues, ce qui contournerait les contraintes qui leur sont associées. ◁

**Peptidic transport across cell membranes**

## RÉFÉRENCES

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