# Protocole d'évaluation des réactifs : essai sur deux modèles viraux et un modèle bactérien avec des techniques sérologiques

Christelle François, Vincent Herau, Delphine Robert, Jennifer Bureau, Coralie Mouniau, Isabelle Renaudin, Valérie Molinéro-Demilly, Helène Soublet

► To cite this version:

Christelle François, Vincent Herau, Delphine Robert, Jennifer Bureau, Coralie Mouniau, et al. Pro-
tocole d'évaluation des réactifs : essai sur deux modèles viraux et un modèle bactérien avec des tech-
niques sérologiques. 9ème conférence internationale des maladies des plantes, Dec 2009, Tours, France.
hal-04611086

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# Protocole d'évaluation des réactifs : essai sur deux modèles viraux et un modèle bactérien avec des techniques sérologiques

Christelle François, Vincent Herau, Delphine Robert, Jennifer Bureau, Coralie Mouniau, Isabelle Renaudin, Valérie Molinéro-Demilly, Helène Soublet

► To cite this version:

Christelle François, Vincent Herau, Delphine Robert, Jennifer Bureau, Coralie Mouniau, et al. *Protocole d'évaluation des réactifs : essai sur deux modèles viraux et un modèle bactérien avec des techniques sérologiques*. 9ème conférence internationale des maladies des plantes, Dec 2009, Tours, France. *hal-04611086*

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# Protocole d'évaluation des réactifs : essai sur deux modèles viraux et un modèle bactérien avec des techniques sérologiques

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Christelle François¹, Vincent Herau¹, Delphine Robert¹, Jennifer Bureau¹, Coralie Mouniau¹, Isabelle Renaudin¹, Valérie Molinero-Demilly¹, Hélène Soubelet¹

1 : Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station d'Angers, 7 Rue Jean Dixméras - FR-49044 Angers cédex 01

Le décret 2007-311 du 05 mars 2007 définit les modalités de contrôle de la conformité des réactifs utilisés dans le cadre des analyses de diagnostic en santé publique vétérinaire et en protection des végétaux. Outre l'accréditation/certification des fabricants, importateurs ou distributeurs de réactifs, ce décret prévoit que les réactifs les plus importants fassent l'objet d'une évaluation visant à en garantir la performance et la sécurité : attestation initiale de conformité voire contrôle systématique des lots par le laboratoire national de référence (LNR). En tant que LNR, le LNPV s'est engagé dans la démarche de définition et d'identification des réactifs susceptibles d'être évalués puis dans la rédaction d'un guide basé sur le travail déjà mené en matière d'évaluation de méthodes au sein des LNR (détermination des critères de performance).

Dans ce cadre, le LNPV a débuté ses travaux par les réactifs sérologiques et réalisé une comparaison relative des kits ELISA et antisera présents sur le marché pour différents modèles d'étude puis a évalué plus finement les réactifs retenus afin de permettre leur validation pour une utilisation dans le cadre d'analyses officielles. Le présent poster présente les résultats obtenus pour le BNYVV et Erwinia amylovora par la technique ELISA.

## Méthodes

Le choix des modèles d'étude s'est basé sur la disponibilité de plusieurs réactifs (kits / antisera) commerciaux, sur le statut des analyses de dépistage (majontairement déléguées) et enfin sur la disponibilité d'échantillons positifs naturellement contaminés pour chacun des modèles. Des travaux ont été conduits au sein du LNPV en virologie sur le Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) et le Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) par la technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) et en bactériologie Erwinia amylovora par les techniques d'IF (Immunofluorescence) et ELISA.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>BNYVV, symboîmes sur tomate, photo LNPV</figcaption></figure>

### Phase de sélection (1er semestre 2009)

Pour chaque modèle et technique retenus, tous les réactifs (kits et antisera) disponibles sur le marché sont testés sur les mêmes souches ou isolats (5 souches ou isolats différents, 2 réplicats et 5 niveaux de concentration différents) dans les mêmes conditions (solutions-mères / échantillons aliquotés). Les concentrations testées sont celles encadrant le seuil de détection :

- estimé de la technique en bactériologie (10⁵ ufc / ml) à savoir 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴ et 10³ ufc / ml ;

- déterminé pour chaque échantillon en virologie au cours de manipulations préliminaires (les échantillons ont été testés à des concentrations de l'échantillon pur au 1/50 000⁶) ;

Cette pré-évaluation est effectuée sur la base de la détectabilité (inclusivité) et du seuil de détection relatif, les manipulations étant effectuées 2 fois. Cette phase permet d'exclure les réactifs les moins performants.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Erwinia amylovora sur pomier, photo LNPV</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Test ELISA, photo LNPV</figcaption></figure>

### Phase d'évaluation et de validation (2ème semestre 2009)

Les critères de performance de sensibilité, spécificité, répétabilité et reproductibilité sont déterminés pour chacun des réactifs conservés lors de la première phase. Pour ce faire, 16 à 20 échantillons positifs et 10 échantillons ne contenant pas la cible (2 réplicats de chaque) ont été testés, les manipulations étant également effectuées 2 fois par deux opérateurs et à des moments différents.

## Résultats pour la technique ELISA

<table><thead><tr><th></th><th>Critères de performances</th><th>Kit A 1h</th><th>Kit B 1h</th><th>Kit B 2h</th><th>Kit C 1h</th><th>Kit C 2h</th><th>Kit D 30mn</th><th>Kit D 45mn</th><th>Kit D 1h</th></tr></thead><tbody><tr><th>Phase 1</th><td>Inclusivité sur 10 souches</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>6/10</td><td>8/10</td><td>6/10</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>S. de détection (5 gammes) (ufc/mL)</td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>7</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>6</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>6</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>7</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>7</sup></td><td>9x10<sup>8</sup> <br> à <br> 3x10<sup>7</sup></td><td>9x10<sup>8</sup> <br> à <br> 3x10<sup>7</sup></td><td>9x10<sup>8</sup> <br> à <br> 3x10<sup>7</sup></td></tr><tr><th>Phase 1</th><td>Inclusivité (sur 42 échantillons)</td><td>91%</td><td>91%</td><td>91%</td><td>81%</td><td>81%</td><td>26%</td><td>41%</td><td>60%</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Spécificité*</td><td>36%</td><td>36%</td><td>36%</td><td>36%</td><td>36%</td><td>64%</td><td>55%</td><td>55%</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Répétabilité intra-plaques</td><td>88%</td><td>93%</td><td>95%</td><td>77%</td><td>81%</td><td>66%</td><td>86%</td><td>85%</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Répétabilité inter-plaques</td><td>72%</td><td>98%</td><td>98%</td><td>74%</td><td>91%</td><td>67%</td><td>54%</td><td>63%</td></tr></tbody></table>

Résultats obtenus pour la détection d'Erwinia amylovora par la technique ELISA

<table><thead><tr><th></th><th>Critères de performances</th><th>Kit A 2h</th><th>Kit B 2h</th><th>Kit C 2h</th><th>Kit D 2h</th><th>Kit E 2h</th><th>Kit F 2h</th><th>Kit G 2h</th><th>Kit H 2h</th></tr></thead><tbody><tr><th>Phase 1</th><td>Inclusivité sur 10 souches</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>7/10 <br> + 1 dx</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>S. de détection relatif (5 gammes)</td><td>1/1: 3 <br> 1/500<sup>6</sup>: 1 <br> 1/500<sup>7</sup>: 1</td><td>1/1: 3 <br> 1/1000<sup>8</sup>: 3 <br> 1/50<sup>9</sup>: 1 <br> 1/500<sup>10</sup>: 3</td><td>ND: <br> 1/1: 4 <br> 1/50<sup>11</sup>: 1 <br> 1/50<sup>12</sup>: 2</td><td>ND: <br> 1/1: 4 <br> 1/50<sup>13</sup>: 1 <br> 1/50<sup>14</sup>: 2</td><td>1/1: 5</td><td>1/1: 4 <br> 1/50<sup>15</sup>: 0 <br> 1/500<sup>16</sup>: 1</td><td>1/1: 4 <br> 1/50<sup>17</sup>: 0 <br> 1/500<sup>18</sup>: 1</td><td>1/1: 4 <br> 1/50<sup>19</sup>: 0 <br> 1/500<sup>20</sup>: 1</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Inclusivité (sur 46 échantillons)</td><td>96%</td><td>98%</td><td colspan="4">Kits non retenus</td><td>98%</td><td>96%</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Spécificité</td><td>100%</td><td>100%</td><td colspan="4">100%</td><td>100%</td><td>100%</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Répétabilité intra-plaques</td><td>96.2%</td><td>97.5%</td><td colspan="4">98.2%</td><td>96.7%</td><td>96.7%</td></tr><tr><th>Phase 2</th><td>Répétabilité inter-plaques</td><td>85.1%</td><td>91.4%</td><td colspan="4">74.1%</td><td>86.4%</td><td>86.4%</td></tr></tbody></table>

Résultats obtenus pour la détection du BNYVV par la technique ELISA

## Conclusions et perspectives

Les travaux conduits au LNPV ont permis de rédiger un protocole d'évaluation des kits ELISA et des antisera utilisés en IF utilisable soit en évaluation initiale en vue de la délivrance d'une attestation par le LNR, soit en routine pour vérifier la qualité des nouveaux lots. La première partie d'étude a déjà permis de montrer des différences entre kits (sensibilité relative et seuil de détection). La seconde partie permet de les évaluer globalement et ainsi de statuer sur leur conformité à un usage dans le cadre d'analyses officielles et même d'effectuer un classement des différents kits au regard de leurs critères de performance respectifs.

Cette première étude portant sur les réactifs sérologiques doit aboutir à l'établissement d'un guide complet proposant la méthodologie d'évaluation des autres types de réactifs critiques nécessaires aux analyses officielles.

<footnote>* Réactions croisées observées avec E. herbicola, E. pyriformiae, P. stewartii, Ps. syringae, B. rubrificaciens, Ps. morsprunorum, P. agglomerans.</footnote>
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

# Protocole d'évaluation des réactifs : essai sur deux modèles viraux et un modèle bactérien avec des techniques sérologiques

Christelle François¹, Vincent Herau¹, Delphine Robert¹, Jennifer Bureau¹, Coralie Mouniau¹, Isabelle Renaudin¹, Valérie Molinero-Demilly¹, Hélène Soubelet¹

1 : Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station d'Angers, 7 Rue Jean Dixméras - FR-49044 Angers cédex 01

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Le décret 2007-311 du 05 mars 2007 définit les modalités de contrôle de la conformité des réactifs utilisés dans le cadre des analyses de diagnostic en santé publique vétérinaire et en protection des végétaux. Outre l'accréditation/certification des fabricants, importateurs ou distributeurs de réactifs, ce décret prévoit que les réactifs les plus importants fassent l'objet d'une évaluation visant à en garantir la performance et la sécurité : attestation initiale de conformité voire contrôle systématique des lots par le laboratoire national de référence (LNR). En tant que LNR, le LNPV s'est engagé dans la démarche de définition et d'identification des réactifs susceptibles d'être évalués puis dans la rédaction d'un guide basé sur le travail déjà mené en matière d'évaluation de méthodes au sein des LNR (détermination des critères de performance).

Dans ce cadre, le LNPV a débuté ses travaux par les réactifs sérologiques et réalisé une comparaison relative des kits ELISA et antisera présents sur le marché pour différents modèles d'étude puis a évalué plus finement les réactifs retenus afin de permettre leur validation pour une utilisation dans le cadre d'analyses officielles. Le présent poster présente les résultats obtenus pour le BNYVV et Erwinia amylovora par la technique ELISA.

## Méthodes

Le choix des modèles d'étude s'est basé sur la disponibilité de plusieurs réactifs (kits / antisera) commerciaux, sur le statut des analyses de dépistage (majontairement déléguées) et enfin sur la disponibilité d'échantillons positifs naturellement contaminés pour chacun des modèles. Des travaux ont été conduits au sein du LNPV en virologie sur le Beet Necrotic Yellow Vein Virus (BNYVV) et le Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) par la technique ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) et en bactériologie Erwinia amylovora par les techniques d'IF (Immunofluorescence) et ELISA.

### Phase de sélection (1er semestre 2009)

Pour chaque modèle et technique retenus, tous les réactifs (kits et antisera) disponibles sur le marché sont testés sur les mêmes souches ou isolats (5 souches ou isolats différents, 2 réplicats et 5 niveaux de concentration différents) dans les mêmes conditions (solutions-mères / échantillons aliquotés). Les concentrations testées sont celles encadrant le seuil de détection :

- estimé de la technique en bactériologie (10⁵ ufc / ml) à savoir 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴ et 10³ ufc / ml ;

- déterminé pour chaque échantillon en virologie au cours de manipulations préliminaires (les échantillons ont été testés à des concentrations de l'échantillon pur au 1/50 000⁶) ;

Cette pré-évaluation est effectuée sur la base de la détectabilité (inclusivité) et du seuil de détection relatif, les manipulations étant effectuées 2 fois. Cette phase permet d'exclure les réactifs les moins performants.

### Phase d'évaluation et de validation (2ème semestre 2009)

Les critères de performance de sensibilité, spécificité, répétabilité et reproductibilité sont déterminés pour chacun des réactifs conservés lors de la première phase. Pour ce faire, 16 à 20 échantillons positifs et 10 échantillons ne contenant pas la cible (2 réplicats de chaque) ont été testés, les manipulations étant également effectuées 2 fois par deux opérateurs et à des moments différents.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>BNYVV, symboîmes sur tomate, photo LNPV</figcaption></figure>

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Test ELISA, photo LNPV</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Erwinia amylovora sur pomier, photo LNPV</figcaption></figure>

## Résultats pour la technique ELISA

<table><thead><tr><th></th><th>Critères de performances</th><th>Kit A 1h</th><th>Kit B 1h</th><th>Kit B 2h</th><th>Kit C 1h</th><th>Kit C 2h</th><th>Kit D 30mn</th><th>Kit D 45mn</th><th>Kit D 1h</th></tr></thead><tbody><tr><td>Phase 1</td><td>Inclusivité sur 10 souches</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>6/10</td><td>8/10</td><td>6/10</td></tr><tr><td></td><td>S. de détection (5 gammes) (ufc/mL)</td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>7</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>6</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>6</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>7</sup></td><td>4.5x10<sup>8</sup> <br> à <br> 1.6x10<sup>7</sup></td><td>9x10<sup>8</sup> <br> à <br> 3x10<sup>7</sup></td><td>9x10<sup>8</sup> <br> à <br> 3x10<sup>7</sup></td><td>9x10<sup>8</sup> <br> à <br> 3x10<sup>7</sup></td></tr><tr><td>Phase 2</td><td>Inclusivité (sur 42 échantillons)</td><td>91%</td><td>91%</td><td>91%</td><td>81%</td><td>81%</td><td>26%</td><td>41%</td><td>60%</td></tr><tr><td></td><td>Spécificité*</td><td>36%</td><td>36%</td><td>36%</td><td>36%</td><td>36%</td><td>64%</td><td>55%</td><td>55%</td></tr><tr><td></td><td>Répétabilité intra-plaques</td><td>88%</td><td>93%</td><td>95%</td><td>77%</td><td>81%</td><td>66%</td><td>86%</td><td>85%</td></tr><tr><td></td><td>Répétabilité inter-plaques</td><td>72%</td><td>98%</td><td>98%</td><td>74%</td><td>91%</td><td>67%</td><td>54%</td><td>63%</td></tr></tbody></table>

Résultats obtenus pour la détection d'Erwinia amylovora par la technique ELISA

<table><thead><tr><th></th><th>Critères de performances</th><th>Kit A 2h</th><th>Kit B 2h</th><th>Kit C 2h</th><th>Kit D 2h</th><th>Kit E 2h</th><th>Kit F 2h</th><th>Kit G 2h</th><th>Kit H 2h</th></tr></thead><tbody><tr><td>Phase 1</td><td>Inclusivité sur 10 souches</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>7/10 <br> + 1 dx</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td><td>10/10</td></tr><tr><td></td><td>S. de détection relatif (5 gammes)</td><td>1/1: 3 <br> 1/500<sup>6</sup>: 1 <br> 1/500<sup>6</sup>: 1</td><td>1/1: 3 <br> 1/1000<sup>6</sup>: 3 <br> 1/50<sup>6</sup>: 1 <br> 1/500<sup>6</sup>: 3</td><td>ND: <br> 1/1: 4 <br> 1/50<sup>6</sup>: 1 <br> 1/50<sup>6</sup>: 2</td><td>ND: <br> 1/1: 4 <br> 1/50<sup>6</sup>: 1 <br> 1/50<sup>6</sup>: 2</td><td>1/1: 2</td><td>1/1: 5</td><td>1/1: 4 <br> 1/50<sup>6</sup>: 0 <br> 1/50<sup>6</sup>: 1</td><td>1/500<sup>6</sup>: 4 <br> 1/500<sup>6</sup>: 1</td></tr><tr><td>Phase 2</td><td>Inclusivité (sur 46 échantillons)</td><td>96%</td><td>98%</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>98%</td><td>96%</td></tr><tr><td></td><td>Spécificité</td><td>100%</td><td>100%</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>100%</td><td>100%</td></tr><tr><td></td><td>Répétabilité intra-plaques</td><td>96.2%</td><td>97.5%</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>98.2%</td><td>96.7%</td></tr><tr><td></td><td>Répétabilité inter-plaques</td><td>85.1%</td><td>91.4%</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>74.1%</td><td>86.4%</td></tr></tbody></table>

Résultats obtenus pour la détection du BNYVV par la technique ELISA

## Conclusions et perspectives

Les travaux conduits au LNPV ont permis de rédiger un protocole d'évaluation des kits ELISA et des antisera utilisés en IF utilisable soit en évaluation initiale en vue de la délivrance d'une attestation par le LNR, soit en routine pour vérifier la qualité des nouveaux lots. La première partie d'étude a déjà permis de montrer des différences entre kits (sensibilité relative et seuil de détection). La seconde partie permet de les évaluer globalement et ainsi de statuer sur leur conformité à un usage dans le cadre d'analyses officielles et même d'effectuer un classement des différents kits au regard de leurs critères de performance respectifs.

Cette première étude portant sur les réactifs sérologiques doit aboutir à l'établissement d'un guide complet proposant la méthodologie d'évaluation des autres types de réactifs critiques nécessaires aux analyses officielles.

<footnote>* Réactions croisées observées avec E. herbicola, E. pyriformiae, P. stewartii, Ps. syringae, B. rubrificaciens, Ps. morsprunorum, P. agglomerans.</footnote>