l'équation de la courbe : f(x)= ax+b ainsi que le coefficient R² qui doit être ≥ 0,9. La concentration des échantillons en protéines est mesurée selon cette formule :

$$C = \left[ \frac{DO-b}{a} \times 10 \right] \mu g/\mu l$$

Les échantillons (30-40 µg de protéines) sont ensuite bouillis pendant 5 minutes dans une solution tampon (Laemmli 1X) contenant une substance tampon (Tris HCl), un colorant (bleu de Bromophénol), un composant sulfhydryl (β-mercaptoéthanol 1/20), un détergent anionique lipophile (SDS) et du glycérol pour augmenter la poussée d'Archimède. A la fin de l'ébullition, les échantillons sont incubés sur la glace en attendant la migration par électrophorèse (le plus souvent juste après).

### 4.1.c. Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide

Cette méthode permet une séparation des protéines selon leur taille. Les protéines ne traversent le gel que dans une dimension (du haut vers le bas). Après ébullition, les échantillons sont déposés dans des puits constitués dans le gel. Un puits est réservé à un marqueur de taille (BioRad), une mixture de protéines possédant différents poids moléculaires (de 10 KD à 250 KD). La migration est faite pendant 1h30 à 80 volts dans le « stocking gel » puis 100 volts dans le « Running gel ». Les protéines sont scindées par masse en bandes dans chaque couloir constitué sous les puits. Le pourcentage du gel en Acrylamide varie selon la taille des protéines d'intérêt (pour la plupart des nos protéines d'intérêt, un gel de 12% a été utilisé). La composition d'un tampon d'électrophorèse (Running buffer) pour western blot est d'1 volume de tampon TGS (Tris-glycine-SDS) (BioRad) concentré 10 fois dans 9 volumes d'eau distillée.

### 4.1.d. Transfert des protéines sur membrane de PVDF (polyvinylidene difluoride) ou Dot Boltting

Pour que les protéines soient accessibles à la détection par anticorps, elles sont transférées depuis le gel sur une membrane de PVDF. Avant d'être utilisée, la membrane est activée dans le méthanol 100% pendant 10 minutes. Puis elle est positionnée face-à-face avec le gel, et mise sur une cassette entre deux papiers filtre (papiers Wattman) et deux éponges. Le transfert est fait dans une cuve contenant un tampon de transfert à un ampérage constant de 300 mA pendant 1 heure. Les protéines chargées migrent depuis le gel vers la membrane en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans le gel.
La composition pour un litre d'un tampon de transfert est de :

* 700 ml d'eau distillée

* 100 ml de tampon TG (Tris-glycine) concentré 10 fois

* 200 ml de méthanol

#### 4.1.e. Blocage de la membrane

Le blocage des sites d'interactions non spécifiques entre la membrane et les anticorps est réalisé en plongeant la membrane dans une solution du lait sans matières grasses dilué à 5% dans de l'eau distillée, et en présence d'un détergent (Tween® 20) à 0,1 % pendant une heure à température ambiante.

#### 4.1.f. Incubation avec des anticorps monoclonaux primaires

Après le blocage, une solution diluée d'anticorps primaire (comprise entre 0.5 et 5 µg/ml) est incubée avec la membrane sous agitation modérée. Les anticorps utilisés dans nos expériences (Tableau 9) sont dilués ou bien dans du lait dilué à 5% dans du 1X TBS, 0,1% Tween 20 (anti-CDC45, anti-FEN1, anti-BID, anti-PHB1) ou bien dans une solution de BSA diluée à 5% dans du 1X TBS, 0,1% Tween 20 (anti-Casp8 et anti-Bax). L'incubation est faite à une température de 4°C sur toute la nuit.

<table><caption>Tableau 9 : les anticorps monoclonaux utilisés en WesternBlot.</caption><thead><tr><td>Anticorps</td><td>Espèce</td><td>Dilution</td><td>Compagnie</td></tr></thead><tbody><tr><td>Anti-cdc45</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>Cell Signaling</td></tr><tr><td>Anti-FEN1</td><td>Souris</td><td>1/500</td><td>Calbiochem</td></tr><tr><td>Anti-PHB1</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>Cell Signaling</td></tr><tr><td>Anti-casp8</td><td>Souris</td><td>1/1000</td><td>Cell Signaling</td></tr><tr><td>Anti-Bax</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>Cell Signaling</td></tr><tr><td>Anti-Bid</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>Cell Signaling</td></tr></tbody></table>

#### 4.1.g. Incubation avec des anticorps polyclonaux secondaires

Après incubation primaire, la membrane est rincée dans du TBS-0,1% Tween 20 trois fois pendant 10 minutes. Puis incubée avec une solution diluée (1/1000 et 1/3000) d'anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante. Les deux anticorps secondaires utilisés sont liés à la peroxydase de raifort (horseradish peroxidase) et utilisé en conjonction avec un agent luminescent. Deux anticorps secondaires-HRP ont été utilisés : chèvre anti-Mouse et chèvre anti-lapin.
### 4.1.h. Détection par chimiluminescence (ECL)

Après rinçage de la membrane, elle est incubée avec une solution de détection chimique (Millipore). Cette solution contient deux réactifs : réactif A et réactif B (1 volume de A pour 2 volumes de B). Ces deux réactifs servent comme un substrat de la peroxydase liée à l'anticorps secondaire qui, une fois mit en contact, ils donnent une lumière détectable par une caméra CCD (Charge-Coupled Device).
## RESULTATS
# 1 Effets transcriptomiques de l'IL-24 sur les lymphocytes B

Dans un travail précédent, notre équipe a démontré que l'IL-24 recombinante bloque la différenciation des cellules B du centre germinatif en plasmocytes, en tuant surtout les précurseurs des cellules plasmatiques. Elle diminue également le pourcentage des cellules B CD38⁺ (plasmocytes) ainsi que la production des IgG dans les surnageants (Maarof et al., 2010). Dans ce modèle, les cellules B du CG ont été stimulées avec un cocktail de cytokines (IL-2+IL-10) et CD40-ligand soluble pendant 3 jours, suivi d'une stimulation de 4 jours avec IL-2 et IL-10 pour induire la différenciation des cellules plasmocytaires. L'addition d'IL-24 à la culture au jour 4 conduit à l'inhibition des pics G0/G1 et G2/M et l'augmentation du nombre de cellules hypodiploïdes ou mortes. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la mort cellulaire induite par IL-24, nous avons analysé le profil transcriptomique des cellules B stimulées pendant 3 jours avec le cocktail et stimulées ou non avec rIL-24 sur deux temps différents : temps précoce (6h) et temps tardif (36h). L'ensemble des transcrits régulés dans les cellules B stimulées pendant 6h et 36h est représenté sur un diagramme de Venn (figure 28).

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

**Figure 28** : Diagramme de Venn illustrant les gènes dont l'expression a été régulée par l'IL-24 dans les cellules B normales activées. Les cellules B d'amygdales purifiées (n=3) ont été cultivées pendant 3 jours avec IL-10 + IL-2 + CD40-ligand (contrôle), puis avec ou sans rIL-24 pendant 6h (Panneau A) et 36h (Panneau B), avant l'extraction des ARNm et l'hybridation sur puces à ADN. Pour chaque temps, les entités (1 à 3 pour A et B) ont été générées et comparées. NS: non stimulé, S: stimulé avec IL-24. Le nombre de gènes régulés entre les deux entités est représenté au sein des cercles.
Sachant qu'il existe des gènes d'expression précoce (3h) et tardive (48h) dans de très nombreux modèles de stimulation. A titre d'exemple, un article montre que l'expression des chimiokines dans les cellules dendritiques du sang humain (cellules dendritiques plasmacytoïdes et myéloïdes) suit 3 vagues d'expression : une première vague se produit à un temps précoce (de 2 à 4h), une deuxième vague entre 8 et 12h et une troisième se produit entre 24 et 48h (Piqueras et al., 2006). Cependant, nous avons utilisé une cinétique arbitraire afin de mettre en évidence des modifications « précoces » et « tardives ». Et comme par chance, cette technique a permis de démontrer une différence de cinétique d'induction par l'IL-24.

L'analyse des données avec le programme de GO (Gene Oncology) montre une régulation précoce de l'expression de 11 transcrits appartenant à la famille des gènes du "métabolisme de l'ADN". Parmi ceux-ci, 10 transcrits ont été inhibés tandis qu'en revanche les transcrits de l'IGF1ont été stimulés. En effet, les fonctions de 9 sur 10 gènes inhibés précocement (6h) sont limitées à la réplication et à la réparation de l'ADN (Tableau 10).

<table><caption>Tableau 10 : Gènes de la voie du métabolisme d'ADN dont l'expression est stimulée ou inhibée par l'IL-24 (>2fold) dans les cellules B.</caption><thead><tr><td>Gene</td><td>Name</td><td>Genebank Accession</td><td>Gene Expression</td><td>Putative Function</td></tr></thead><tbody><tr><td>CDC6</td><td>Cell Division Cycle 6 homolog</td><td>NM_001254</td><td>downregulated</td><td>Initiation of DNA replication</td></tr><tr><td>CDC45L</td><td>Cell Division Cycle 45 homolog</td><td>NM_001178010</td><td>downregulated</td><td>Initiation of DNA replication</td></tr><tr><td>DMC1</td><td>Dosage suppressor of mck-1 homolog</td><td>NM_007068</td><td>downregulated</td><td>Homologous Recombination during Meiosis</td></tr><tr><td>MCM4</td><td>Minichromosome Maintenance Complex component 4</td><td>NM_005914</td><td>downregulated</td><td>Replication Initiation; DNA replication Fork; DNA helicase</td></tr><tr><td>MCM10</td><td>Minichromosome Maintenance Complex component 10</td><td>NM_018518</td><td>downregulated</td><td>Replication Initiation; DNA Forks</td></tr><tr><td>FEN1</td><td>Flap structure-specific Endonuclease 1</td><td>NM_004111</td><td>downregulated</td><td>DNA replication and repair</td></tr><tr><td>DTL</td><td>Denticeless homolog</td><td>NM_016448</td><td>downregulated</td><td>DNA replication and repair; Cell cycle regulation</td></tr><tr><td>POLE2</td><td>Polymerase Epsilon 2</td><td>NM_001197330</td><td>downregulated</td><td>DNA replication and repair; Telomere maintenance; Cell cycle progression</td></tr><tr><td>ORC1L</td><td>Origin recognition Complex subunit 1</td><td>NM_001190818</td><td>downregulated</td><td>DNA replication; Assembly of initiation factors</td></tr><tr><td>PHB</td><td>Prohibitin</td><td>NM_002634</td><td>downregulated</td><td>Mitochondrial morphology/ function, transcriptional modulation</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Insulin-like Growth Factor 1</td><td>NM_000618</td><td>upregulated</td><td>Promotes cell growth, anabolism, inhibits apoptosis, decreases GH and insulin release</td></tr></tbody></table>
En outre, nous avons observé une stimulation tardive (36h) de 5 « gènes mitochondriaux » liés à l'apoptose. Ces transcrits codent pour les effecteurs d'apoptose : caspase 8, Bax, Bid et sous-unités du cytochrome c oxydase COX6C et COX7B (tableau 11). Par contre, nous avons observé une inhibition des gènes intervenant dans la défense cellulaire (à l'exception de CXCL9) (tableau 12).

<table><caption>Tableau 11 : Gènes de la voie d'apoptose mitochondriale dont l'expression est stimulée ou inhibée par l'IL-24 (>2fold) dans les cellules B.</caption><thead><tr><td>Gene</td><td>Name</td><td>Genebank Accession</td><td>Gene Expression</td><td>Putative Function</td></tr></thead><tbody><tr><td>Casp8</td><td>Caspase 8</td><td>NM_001080124</td><td>upregulated</td><td>Fas-induced AICD</td></tr><tr><td>Bax</td><td>BCL2-associated X protein</td><td>NM_004324</td><td>upregulated</td><td>apoptotic activator p53-mediated cell death</td></tr><tr><td>Bid</td><td>BH3 interacting domain death agonist</td><td>NM_001196</td><td>upregulated</td><td>cleaved by casp8 to induce cytochrome c release</td></tr><tr><td>Cox6C</td><td>cytochrome c oxidase subunit VIc</td><td>NM_004374</td><td>upregulated</td><td>catalyzes the electron transfer from reduced cytochrome c to oxygen</td></tr><tr><td>Cox7b</td><td>cytochrome c oxidase subunit VII</td><td>NM_001866</td><td>upregulated</td><td>catalyzes the electron transfer from reduced cytochrome c to oxygen</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 12 : Gènes impliqués dans la défense cellulaire dont l'expression est stimulée ou inhibée par l'IL-24 (>2fold) dans les cellules B.</caption><thead><tr><td>Gene</td><td>Name</td><td>Genebank Accession</td><td>Gene Expression</td><td>Putative Function</td></tr></thead><tbody><tr><td>CXCL9</td><td>Chemokine(C-X-C motif) ligand 9</td><td>NM_002416</td><td>upregulated</td><td>T cell trafficking; cellular defense response</td></tr><tr><td>CCL5</td><td>Chemokine(C-C motif) ligand 5</td><td>NM_002985</td><td>downregulated</td><td>HIV- suppressive factor</td></tr><tr><td>CCR5</td><td>Chemokine(C-C motif) receptor 5</td><td>NM_000579</td><td>downregulated</td><td>cellular defense response; virus-host interaction</td></tr><tr><td>CSF2</td><td>Colony stimulating factor2(granulocyte-macrophage)</td><td>NM_000758</td><td>downregulated</td><td>Production, differentiation and function of granulocytes and macrophages</td></tr><tr><td>KIR2DL4</td><td>Killer cell immunoglobulin-like receptor, two domains, long cytoplasmic tail, 4</td><td>NM_001080770</td><td>downregulated</td><td>cellular defense response; regulation of immune response</td></tr><tr><td>NCR1</td><td>Natural cytotoxicity receptor 1</td><td>NM_001145457</td><td>downregulated</td><td>cellular defense response; NK cell activation</td></tr><tr><td>CD244</td><td>Natural killer cell receptor 2B4</td><td>NM_001166663</td><td>downregulated</td><td>Regulation of NK-cell cytolytic activity</td></tr></tbody></table>

Pour confirmer les résultats des biopuces, nous avons validé les données par RT-PCR (figure 29 à gauche) et par PCR en temps réel (Figure 30). Etant donné que l'IL-24 était cytostatique et tue la fraction en cycle des cellules de LLC stimulées par IL-2 (Sainz-Perez et al., 2008), nous avons étudié les transcrits ci-dessus dans les cellules B de LLC. Sur deux expériences représentatives d'une LLC IgVH muté (M CLL) et une non muté (UM CLL), l'IL-24 induit l'expression de l'IGF-1, tandis que les autres transcrits ont été variablement inhibés (figure 29
à droite). L'image est variable au sein d'échantillons leucémiques et même parmi les échantillons de LLC mutés et non mutés (données non présentées).

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

**Figure 29 :** Etude de l'expression des gènes précoces (6h) régulés par l'IL-24 par RT-PCR dans les cellules B. Les cellules B purifiées à partir des amygdales (n=3) ont été stimulées comme dans la figure 28. Les cellules B de LLC ont été stimulées avec l'IL-2 pendant la nuit suivie ou non par une stimulation de 100 ng/ml d'IL-24 pendant 6h avant la purification et la RT des ARNm.

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

**Figure 30 :** Etude de l'expression des gènes précoces (6h) régulés par l'IL-24 par PCR en temps réel dans les cellules B d'amygdales. La quantification des ARNm CDC45, CDC6, FEN1, IGF1, MCM10 et POLE2 des cellules co-stimulées par le cocktail CK (IL2 + IL10 + CD40L) et IL-24 (histogrammes rouges) a été normalisée par rapport à celle des cellules stimulées par le cocktail CK seul. n=3, moyenne ± SD, les valeurs p ont été calculées par le test-Student.
Contrairement aux transcrits qui ont été inhibés à 6h, les transcrits de l'IGF-1 étaient plus abondants dans les échantillons stimulés par l'IL-24 à 6h (tableau 9). C'était un peu inattendu vue que l'IGF-1 était rapporté comme étant un facteur de croissance universel pour les cellules de mammifères, y compris les lymphocytes et les organes lymphoïdes (Clark et al., 1993; Heemskerk et al., 1999; Zapf et al., 1989). Pour écarter la contradiction potentielle entre les effets respectifs de l'IGF-1 et l'IL-24, nous avons étudié l'expression et les effets de l'IGF-1 sur les cellules B.

## 2 Régulation de l'expression de l'IL-24 dans les lymphocytes B normaux.

Le travail précédent de Maarof et al. a démontré que les transcrits de l'IL-24 étaient inhibés après l'activation *in vitro* des cellules B normales (B du CG) par un anti-IgM à 48h. Cette inhibition était plus significative en activant les cellules avec un anti-IgM plus un CD40L trimérique. En revanche les résultats ne sont pas significatifs en activant les cellules par la voie des TLRs (LPS et CPG) (Maarof et al., 2010). De manière intéressante, l'expression des transcrits de l'IL-24 au bout de 5 jours d'activation des cellules B a été augmentée fortement (20 à 25 fois) avec l'anti-IgM plus CD40L trimérique.

Dans notre travail, nous avons voulu savoir dans quel contexte T-dépendant l'expression de l'IL-24 est régulée. Pour cela, nous avons purifié les cellules B d'amygdales et les avons co-stimulés par anti-IgM+CD40L trimérique et différentes cytokines. Les ARNm ont été extraits après 1, 3 et 5 jours. L'analyse par qPCR montre qu'après 24h de stimulation, l'expression de l'IL-24 a été augmentée significativement par l'IL4 (contexte Th2) et plus faiblement par l'IL-22 (contexte Th17). Par contre, à J5, l'expression de l'IL-24 a été augmentée significativement dans un contexte plutôt Th1 (INFγ) ou bien Th17 (IL-22). Cette expression est significativement inhibée sous l'action de l'IL-4 (contexte Th2) (figure 31, page suivante).

L'ensemble de nos données suggère donc que l'expression de l'IL-24 est fortement régulée dans les cellules B humaines au cours de la réponse aux antigènes T-dépendant
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 31 : Analyse de la régulation de l'expression de l'IL-24 par PCR en temps réel dans les cellules B d'amygdales. La quantification de l'ARNm IL-24 dans les LB en fonction de différents stimuli (INFg, IL12, IL22 et IL4) a été normalisée par rapport aux cellules co-stimulées par antiIgM et CD40L seuls. n=3, moyenne ± SD, les valeurs p ont été calculées par le test-Student.**</figcaption></figure>

### 3 Expression du récepteur de l'IL-24 dans les lymphocytes B

L'IL-24 possède deux types de récepteurs (R1 et R2). Ces récepteurs sont des hétérodimères constitués de la chaîne commune, IL-20Rβ, s'associant soit à la chaîne IL-20Rα pour former le récepteur de type 1, soit à la chaîne IL-22Rα1 pour former le récepteur de type 2.

Afin de connaitre quelles sont les cellules répondeuses à la stimulation par l'IL-24, nous avons analysé l'expression de récepteurs de l'IL-24 par FACS dans différentes populations cellulaires d'amygdales et de PBMC. Trois anticorps monoclonaux dirigés contre les trois chaines du récepteur de l'IL-24 ont été utilisés : anti-IL-20Rα-PE, anti-IL-20Rβ-Biotine suivi de Streptavidine-PC5 et anti-IL-22Rα1-APC.

Nous avons constaté qu'à l'état basal les cellules B d'amygdales n'expriment pas les chaînes IL-20Rα et IL-20Rβ, et faiblement la chaîne IL-22Rα1 (figure 32, page suivante). Une stimulation de cellules par LPS induit l'expression de la chaîne commune IL-20Rβ (figure 32).
<figure><img src="image_35.png" /></figure>

**Figure 32** : Analyse de l'expression de récepteurs de l'IL-24 par FACS par les cellules B d'amygdales stimulées ou non par LPS. A l'état basal, ces cellules n'expriment pas les chaines IL-20Rβ, IL-22Ra1 ni IL-22Ra1. Le LPS induit l'expression des chaînes IL-20Rβ et IL-22Ra1 à la surface de ces cellules, mais pas de la chaîne IL-20Rα. Ainsi, seul le récepteur de type 2 de l'IL-24 est exprimé par les cellules B d'amygdales. (Lignée BW : contrôle positif de l'expression des chaînes IL-20Rα et IL-20Rβ). Ces résultats sont représentatifs de 5 expérimentations différentes.

Un profil d'expression similaire a été observé dans les cellules T CD3 d'amygdales (figure 33, page suivante). Ces cellules exprimant à l'état basal le récepteur de type 1 de l'IL-24 et le récepteur de type 2 une fois stimulées par LPS. Par contre le profil des monocytes (CD14)
diffère de celui des cellules B et T. Ces cellules exprimant à l'état basal les trois chaînes IL-20Rα, IL-20Rβ et IL-22Rα1(figure 34, page suivante).

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

**Figure 33 :** Analyse de l'expression de récepteurs de l'IL-24 par les lymphocytes T d'amygdales stimulés ou non par LPS. A l'état basal, ces cellules expriment faiblement les chaînes IL-20Rα et IL-22R mais pas la chaîne IL-20Rβ. Le LPS induit l'expression des chaînes IL-20Rβ et d'IL-22Rα1, mais pas IL-20Rα. (Lignée BW : contrôle positif de l'expression des chaînes IL-20Rα et IL-20Rβ). Ces résultats sont représentatifs de 5 expérimentations différentes.
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 34 : Analyse de l'expression de récepteurs de l'IL-24 par les Monocytes d'amygdales à l'état basal. A l'état basal, ces cellules expriment les trois chaînes IL-20Rα, IL-20Rβ et IL-22R. (Lignée BW : contrôle positif de l'expression des chaînes IL-20Rα et IL-20Rβ). Ces résultats sont représentatifs de 5 expérimentations différentes.</figcaption></figure>

Nous avons constaté que les cellules B et T n'ont pas le même profil d'expression de récepteurs de l'IL-24 en fonction de leur localisation sanguine ou dans les amygdales : dans le sang, ces cellules expriment le récepteur de type 2 de l'IL-24 à l'état basal (chaînes IL-20Rβ et IL-22Rα1). Par contre les monocytes circulants ont le même profil d'expression que les monocytes d'amygdales (ils expriment les trois chaînes IL-20Rα, IL-20Rβ et IL-22Rα1) (figure 35, page suivante).

Dans ces expériences, nous avons utilisé comme contrôle une lignée BW5147 (lymphome-T souris) transfectée par un vecteur vide (BW-) ou par IL-20Rα plus IL-20Rβ humaines (BW+). L'hétérodimère IL-24R1 a été donné par M. le docteur J-C Renauld.
<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Figure 35 : Analyse de l'expression des récepteurs de l'IL-24 par les cellules B, T et Monocytaires périphériques (PBMC). (Lignée BW : contrôle positif de l'expression des chaînes IL-20Rα et IL-20Rβ). Ces résultats sont représentatifs de 3 expérimentations différentes.

## 4 Expression du récepteur de l'IGF1 par les lymphocytes B d'amygdales ainsi que ceux de la LLC

Dans le but de comprendre le rôle de l'IGF1 dans notre modèle, nous avons d'abord analysé l'expression du récepteur à l'IGF-1 par les cellules B. Pour cela, 7 patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (2 non mutée pour le gène IgHV, 3 muté et 2 avec un statut inconnu), ainsi que 7 amygdales différentes ont été utilisés comme sources de cellules B. Ni les cellules B de LLC ni les cellules B d'amygdales humaines n'expriment l'IGF1-R à l'état basal (figure 36, page suivante). Cependant ce récepteur a été induit par la stimulation. Nous avons observé
une induction de l'expression membranaire de l'IGF1R lorsque nous stimulions les cellules B normales ou malignes par CD40-ligand, anti-IgM, CpGODN et SDF1/CXCL12. Par contre l'expression de l'IGF1-R n'a pas été modifiée par l'addition d'IL-24 à la culture. Notons que l'expression de l'IGF1R est moins inductible dans les cellules B de LLC que dans les cellules B d'amygdales (figure 36). Finalement, plusieurs stimuli spécifiques ou non de l'antigène induisent l'expression de l'IGF1R et sensibilisent les cellules B normales et malignes à l'action de l'IGF-1.

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 36 : Expression de l'IGF1-R par les cellules B normales et leucémiques. Cette expression a été mesurée par cytométrie en flux sur des cellules B purifiées (normales et leucémiques) après 48h de culture avec les stimuli indiquées. Le pourcentage de cellules IGF1-R positives est indiqué dans le quadrant 2. n=7.</figcaption></figure>

Nous avons ensuite incubé les cellules B des amygdales IL-2 et IL-10 comme décrit plus haut pendant 3 jours puis avec 0, 10 ou 100 ng/ml d'IGF-1 pendant 2 jours supplémentaires. Les cellules B de LLC ont été incubées avec 100 ng/ml d'IL-2 pendant la nuit suivie ou non par une incubation avec IGF1 comme mentionné plus haut. Comme montré par la technique de coloration avec l'annexine V et l'iodure de propidium (PI) (Figure 37a, page suivante), l'IGF1 à 10 ng/ml a été préjudiciable à la survie cellulaire. En plus, l'IGF1 diminue le pourcentage de cellules en phase G0/G1 et parallèlement augmente celui de cellules hypodiploïdes (phase sub G0), dans le même échantillon de LLC (Figure 37b, page suivante). Au total, ces résultats
sont en accord avec un effet cytostatique de l'IGF1 sur les cellules B activées, et suggèrent
que l'induction de l'IGF-1 par l'IL-24 est physiologiquement pertinente.

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Figure 37 : Etude des effets de l'IGF-1 sur les cellules B normales et celles de LLC. (a) l'apoptose induite par l'IGF-1 a été déterminée par la technique de coloration d'AnnexinV-PI sur des cellules B stimulées par le cocktail (CK) d'IL2 + IL10 + CD40L, puis par IGF1 (10 et 100 ng/ml) (amygdales) ou par IL2 suivie d'IGF1 (LLC). (b) le cycle cellulaire a été réalisée sur la même LLC analysée ci-dessus. n=3.

5 L'inhibition de la voie de signalisation de l'IGF1 reverse les effets biologiques de l'IL-24

Afin de déterminer si l'IGF1 agit en aval de l'IL-24 dans le but de promouvoir la mort cellulaire dans les cellules B, nous avons activé les cellules B d'amygdales avec le cocktail de cytokines comme ci-dessus, puis les avons incubés avec divers inhibiteurs d'IGF1 à des concentrations et des temps divers, avant d'ajouter l'IL-24 recombinante à la culture. Comme
le montre la figure 31a, seulement un inhibiteur pharmacologique sur les trois testés, la tyrphostine AG, a réussi à inverser l'effet apoptotique de l'IL-24 (44% mort cellulaire sous l'IL-24 versus 17% chez des cellules incubées avec tyrphostine et stimulées par la suite avec rIL-24). En revanche, les inhibiteurs ALX et SC étaient inactifs dans ce domaine, et ont même montré un effet additif à celui de l'IL-24 (figure 38a). En outre, à une concentration optimale (5µM) et un temps d'incubation court (6h), la tyrphostine inhibe l'expression des transcrits de Cox7b, CASP8, Bax induite par l'IL-24 comme indiqué par qPCR (figure 38b). L'observation selon laquelle un inhibiteur spécifique d'IGF1 antagonise l'effet de l'IL-24 suggère fortement que l'IGF1 agit en aval de l'IL-24 dans l'induction de l'apoptose des cellules B.

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

**Figure 38 :** L'inhibition de la voie d'IGF1 inverse les effets biologiques de l'IL-24. (a) les cellules B d'amygdales ont été stimulées avec le cocktail, puis incubées avec différents inhibiteurs de l'IGF1 (5 µM pendant 6 heures), avant stimulation par rIL-24. L'apoptose a été analysée par la technique d'annexinV-PI 3 jours après. Les inhibiteurs sont : SC (sc-205907), tyrphostine (ALX-270-217), l'ALX (ALX-270-362). (b) Les cellules ont été incubées avec tyrphostine avant la q-PCR des gènes de la voie d'apoptose mitochondriale (à J3). n=3.

## 6 IL-24 induit la voie d'apoptose mitochondriale dans les lymphocytes B activés

Les résultats des expériences des biopuces ont montré que l'IL-24 module l'expression de plusieurs gènes liés à la prolifération cellulaire ou à la mort en deux vagues. La première
vague (6h) est liée au métabolisme de l'ADN, tandis que la seconde (36h) est reliée à la voie de l'apoptose (intrinsèque) mitochondriale. Les transcrits tardifs (36h) ont été validés par RT-PCR sur des cellules B d'amygdales et des cellules B leucémiques (un échantillon de cellules B d'amygdale, et 3 échantillons de LLC avec un statut d'IgV muté, non muté ou indéterminée) (figure 39a) et par qPCR sur les cellules B d'amygdales (figure 39b). La protéine Caspase 8 a été étudiée par western blot et s'est révélée être soit augmentée ou induite par l'IL-24 dans les cellules B normales ou dans la LLC respectivement (figure 39c, page suivante). Nous avons enfin étudié l'effet de l'IL-24 sur le potentiel de la membrane mitochondriale comme indicateur spécifique de l'apoptose intrinsèque. Comme le montre la figure 38d, page suivante, le potentiel mitochondrial constaté par le colorant fluorescent NIR, diminue de façon significative sous l'effet d'IL-24.

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

<figure><img src="image_43.png" /></figure>
<figure><img src="image_44.png" /></figure>

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

Figure 39 : (a) Etude de l'expression des gènes régulés par l'IL24 à 36h par RT-PCR. Les cellules B d'amygdales ont été cultivées avec le cocktail (CK), tandis que les échantillons de LLC (LLC IgVH 1 muté, LLC non mutée et une LLC non déterminée) ont été stimulés pendant une nuit avec l'IL-2 puis par l'IL-24. (b) L'expression des gènes a été validée par qPCR sur 3 amygdales différentes (moyenne ± SD expression relative des cellules stimulées ou non avec l'IL-24). (c) la protéine Casp 8 a été analysée par western blot dans les mêmes conditions de culture. (d) le potentiel de la membrane mitochondriale a été mesuré dans les échantillons ci-dessus au moyen de la sonde NIR en cytométrie en flux A gauche : cellules B d'amygdales, à droite : cellules B de LLC. l'histogramme rouge : CK ou IL2 seul, et l'histogramme bleu : stimulées par IL-24, respectivement.

## 7 L'apoptose des lymphocytes B activés induite par l'IL-24 est p53 dépendante

Nous avons déjà constaté que l'apoptose induite par l'IL-24 dans les cellules B de LLC pourrait être évitée par pré-incubation des cellules avec pifithrin alpha, un inhibiteur pharmacologique de la transactivation de p53 (Sainz-Perez et al., 2008). De plus, nous avons suggéré que l'IL-24 dé-réprime l'expression de p53 en partie par déphosphorylation de STAT3 sur tyrosine (Sainz-Perez et al., 2008 ; Maarof et al., 2010). Afin de valider cette hypothèse sur les cellules B normales, nous avons stimulé les cellules B d'amygdales avec le
cocktail précédemment mentionné pendant 3 jours, puis par de la pifithrin alpha ou l'inhibiteur de caspase zVAD-fmk pendant 1 heure, pour finalement les stimuler avec l'IL-24 pendant 24 heures. Comme le montre la technique d'annexine V-PI (figure 40), pifithrin-alpha et zVAD étaient capables d'antagoniser l'effet apoptotique de l'IL-24 (pifithrin-alpha et zVAD n'avaient aucun effet toxique propre).

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 40 : La mort cellulaire induite par IL-24 est p53-dépendante et est inversée par les inhibiteurs de p53 et de caspase. Les cellules B d'amygdales ont été stimulées avec le cocktail (contrôle) et incubées ou non avec 10µM de pifithrine-alpha (α PFT) ou ZVAD-fmk, pendant 1h, puis avec 100 ng/ml d'IL-24 pendant 24 h. L'apoptose a été mesurée par cytométrie en flux (dot plots). N=3.</figcaption></figure>

La Pifithrin alpha a également bloqué l'effet cytostatique de l'IL-24 sur les cellules B, comme indiqué par l'analyse du cycle cellulaire (figure 41a page suivante), ainsi que la transcription des gènes de la voie de l'apoptose mitochondriale (BAX, BID, COX6c, COX7b et CASP8) induite par l'IL-24 (figure 41b page suivante). Cette inhibition a été confirmée au niveau protéique par Western Blot pour CASP8 (figure 41c page suivante).
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>(b)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>c)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

**Figure 41** : La mort cellulaire induite par IL-24 est p53-dépendante et est inversée par les inhibiteurs de p53 et de caspase. Les cellules B d'amygdales ont été stimulées avec le cocktail (contrôle) et incubées ou non avec 10µM de pifithrine-alpha (α PFT) ou ZVAD-fmk, pendant 1h, puis avec 100 ng/ml d'IL-24 pendant 24 h. (a) analyse du cycle cellulaire (% de cellules hypodiploïdes sous IL-24 est montré en icône noire). (b) q-PCR des transcrits BAX, BID, COX6c, COX7b et CASP8. (c) Analyse par Western Blot de CASP8. N=3.
ORIGINAL ARTICLE: RESEARCH

# Interleukin-24 mediates apoptosis in human B-cells through early activation of cell cycle arrest followed by late induction of the mitochondrial apoptosis pathway

Nader Hadife¹, Christophe Nemos², Jean-Pol Frippiat³, Tala Hamadé¹, Aurore Perrot⁴ & Ali Dalloul¹

¹EA 4369, ²EA 4368 and ³JE 2537, Université de Lorraine, Nancy, France and ⁴Service de Médecine Interne-Hématologie, CHU Nancy, France

## Abstract

Interleukin (IL)-24 has death-promoting effects on various proliferating cells including B-cells from chronic lymphocytic leukemia (CLL) and germinal center B-cells, but its molecular mechanisms are poorly understood. Using a B-cell differentiation model and mRNA profiling, we found that recombinant (r)IL-24 stimulated genes of the mitochondrial apoptotic pathway (Bax, Bid, Casp8, COX6C, COX7B) after 36 h, whereas the transcription of genes involved in DNA replication and metabolism was inhibited within 6 h. Unexpectedly, insulin-like growth factor 1 (IGF1), a hormone known to promote cell growth, was stimulated by IL-24. Activated B-cells express receptor for IGF1, to which they become sensitized and undergo apoptosis, a mechanism similar in this respect to IL-24-induced cell death. Furthermore, inhibition of the IGF1 pathway reversed the effects of IL-24. IL-24-mediated apoptosis was also antagonized by pifithrin-alpha, an inhibitor of p53 transactivation. Altogether, these results disclose sequential molecular signals generated by IL-24 in activated B-cells.

**Keywords:** IL-24, apoptosis, B-cells, gene arrays

## Introduction

Interleukin-24/melanoma differentiation-associated gene-7 (IL-24/MDA-7) was studied initially in the context of its activity as a tumor suppressor [1–3]. By contrast, the immune function of IL-24 has been investigated only recently. Lymphocytes can be stimulated to produce IL-24, which in turn stimulates the production of T-helper cell type 1 (TH1) cytokines by peripheral blood mononuclear cells [4,5]. IL-24 is also produced by, and acts on, keratinocytes, and displays overlapping functions with other members of the IL-20 family of cytokines [6–8]. We previously found that recombinant IL-24 selectively induced the apoptosis of cells engaged in proliferation of

B-lymphocytes from chronic lymphocytic leukemia, while sparing quiescent cells [9]. IL-24 also inhibited plasma cell differentiation of normal B-cells apparently by blocking cell cycle progression and killing large proliferative plasma cell precursors [10]. Thus, at least in human lymphocytes expressing receptors for IL-24, the action of IL-24 was not mediated by the induction of other cytokines but was direct. Indeed, IL-24 directly killed proliferating cells in part by stabilizing p53 or relieving the suppressive effect of pSTAT3 (phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3) on the transcription of p53 [9].

MDA-7 was discovered in terminally differentiated melanocytes, whereas it is repressed in malignant melanocytes [11]. Likewise, in the immune system, IL-24 is prominently expressed in naive B-cells and in memory B-cells, but repressed in centroblasts [10]. In CLL B-cells, which are mostly in the G0/early G1 phase of the cell cycle, IL-24 is strongly expressed as well, and promotes cell survival [12]. Thus, in various malignant and non-malignant cells, IL-24 expression is repressed by mitotic signals. Conversely, IL-24 expression is restored or even amplified once the cells have started their differentiation process. This strongly suggests that the function of IL-24 in various tissues is not detrimental in quiescent cells, and may even help them survive, partly by blocking progression into the cell cycle.

We attempted herein to gain insight into the molecular mechanisms behind IL-24 activity. Having previously established that IL-24 inhibited the differentiation of plasma cells from germinal center B-cells, we used this *in vitro* model to analyze the effect of recombinant (r)IL-24 on the mRNA profile of activated B-cells. We arbitrarily extracted mRNAs at an early, 6 h time point, and at 36 h. These results seemed meaningful in retrospect, since several proapoptotic genes were activated after 36 h. In addition, IL-24 inhibited the expression of 10 genes involved in DNA replication within 6 h. Thus, IL-24 acted
sequentially on B-cells by inducing a first wave of tran-
scripts in order to promote cell cycle arrest and a second
wave of transcripts aimed at promoting cell death.

**Materials and methods**

Cell isolation and culture

Human tonsils were obtained from seven children (aged
2-6 years) undergoing tonsillectomy. Briefly, tonsils were
minced, the cell suspension was filtered through a 70 µm
cell strainer (Becton Dickinson), and mononuclear cells
were separated using Ficoll-Hypaque (GE Healthcare) den-
sity gradient. The resultant mononuclear cells were submit-
ted to a B Cell Negative Isolation Kit (Dynal Biotech) and
stained for further fluorescence-activated cell sorting (FACS)
analysis and/or cell culture. B-cells comprised between
50 and 80% mononuclear cells and were 97-99% pure after
purification as assessed by CD19 staining.

The cells of seven patients with chronic lymphocytic
leukemiua (CLL; two immunoglobulin heavy chain
variable gene [IgVH] mutated, three unmutated, two
undetermined) were collected after informed consent and
signature according to the Declaration of Helsinki and ethi-
cal bylaws of the University of Nancy Medical School. Cells
from this group were processed on the bench, and B-cells
separated using RosetteSep Enrichment Cocktail (Stem Cell
Technologies, Vancouver, Canada). Purified B-cells were
cultured in RPMI medium supplemented with 10% fetal calf
serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 mg/mL),
2 mM L-glutamate and 1 mM sodium pyruvate (Invitrogen)
at 37 °C in 5% CO2. The following reagents were used
for stimulation experiments: rIL-2 (100 ng/mL), rIL-10
(50 ng/mL), rIL-24 (100 ng/mL) and CD40-ligand trimer
(200 ng/mL) (all from R&D Systems). F(ab)'2 rabbit anti-
human IgM (Jackson Immunosearch, Baltimore) was used
at 20 µg/mL. Insulin-like growth factor 1 (IGF1) inhibitors
used were: sc-205907 (SC; Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA), tyrphostin IGF1-specific inhibitor (ALX-
270-217) and a non-selective receptor tyrosine kinase (RTK)
inhibitor (ALX; ALX-270-362; both from Enzo Life Sciences,
Famingdale, NY). The p53 inhibitor pifithrin-alpha and
caspase inhibitor ZVAD-fmk were both from Calbiochem.

Monoclonal antibodies and flow cytometry

The following monoclonal antibodies (mAbs) were used:
fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-CD20,
phycoerythrin (PE)-anti-CD38, PE-anti-IGF1R (all from
BD Biosciences), peridinin-chlorophyll-protein complex
(PerCP)/Cy5.5-anti-CD5 and PE-Cy7-anti-CD19 (Beckman
Coulter). Fluorescence was analyzed using a FC500
(Beckman Coulter) system and data analyzed using CXP
software.

Apoptosis

For apoptosis studies, cultured normal and CLL B-cells
(1 × 10⁶) were washed with cold 1 × phosphate buffered
saline (PBS) and resuspended in 1 mL of 1 × binding
buffer of an annexin V-FITC kit (BD Biosciences). Cells

(1 × 10⁵) in 100 µL 1 × binding buffer were stained with
5 µL of annexin V-FITC and 5 µL of propidium iodide (PI)
in the dark for 15 min at room temperature. Next, 400 µL
of 1 × binding buffer was added before FACS analysis.

Mitochondrial membrane potential

An NIR Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit
was purchased from Abcam (Cambridge, UK). Cells were
incubated with the near-infrared (NIR) probe according
to the manufacturer's instructions, and analyzed by flow
cytometry using the FL4 channel.

RNA isolation and semi-quantitative reverse
transcription polymerase chain reaction

Cells (10⁶/mL) cultured under various conditions were
washed in PBS and homogenized with 1 mL of TRIzol
reagent (Invitrogen Life Technologies), and total RNA
was isolated according to the manufacturer's protocol.
cDNA was synthesized by extension of a mix of oligo(dT)
and random hexamers with SuperScript II reverse
transcriptase (all from Invitrogen Life Technologies) in
a mixture containing 300 ng of total RNA first digested by
RNase-free DNA I (1 U/µg RNA) (Sigma) for 15 min at 37 °C.
The primers and protocols used for polymerase chain reac-
tion (PCR) are listed in Table I.

Real-time PCR

Cells (10⁶/mL) cultured under various conditions were
washed in 1×PBS, resuspended in RTL lysis buffer and
stored at -80° C, and RNA was purified using an RNeasy
Mini Kit (Qiagen). Reverse transcription was performed
with random hexamers using the SuperScript II first-
strand synthesis system for reverse transcription (RT)-PCR
(Invitrogen Life Technologies). Transcript expression was
analyzed by quantitative real-time PCR using LightCycler
SsoFast EvaGreen technology (Bio-Rad). Thermocycling
was performed on a Mastercycler RealPlex² instrument
(Eppendorf). The SsoFast EvaGreen super mix (Bio-Rad)
was used to perform real-time PCR. After incubation at
95 °C for 2 min, 40 cycles of amplification were per-
formed. Each cycle consisted of 15 s at 95 °C and 45 s at the
corresponding melting temperature (T<sub>m</sub>) for each couple
of primers. For each sample, serial dilutions were done to
determine the PCR efficiency. The oligonucleotides used
for the LightCycler are listed in Table II.

Results were analyzed using using RealPlex software
version 2.2 (Eppendorf). Each reaction was performed
in triplicate, and results were normalized using the cycle
threshold (Ct) of GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase) or actin expression. Relative expression
was calculated by measuring the difference of normalized
Ct between condition A versus condition B and applying
the following formula: difference of expression between
A and B = 2^CtA-CtB.

Gene arrays

Total RNA was extracted and purified from B-cells
according to the RNeasy Mini Kit protocol (Qiagen,
<table><caption>Table I. Primers used for PCR amplification.</caption><thead><tr><th>Primer</th><th><i>T</i><sub>m</sub> (°C)</th><th>Sequence</th><th>Product length</th><th>PCR program</th></tr></thead><tbody><tr><td>CDC6</td><td>60</td><td>F: GCA-CTG-GAT-GTT-GTC-AGG-AGA-GCT<br>R: CCG-CCA-CCT-GCT-GTT-GTC-GA</td><td>331</td><td>5 min 95 °C, 30 cycles (30 s 95 °C, 30 s 60 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>CDC45L</td><td>60</td><td>F: CAC-GTT-ATA-TGC-GAC-CAA-GG<br>R: CGG-AGG-TCA-TAC-TCA-AAG-GA</td><td>766 or 628</td><td>5 min 95 °C, 28 cycles (30 s 95 °C, 30 s 60 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>MCM10</td><td>59</td><td>F: AAT-GGC-GAG-CCC-GAC-GCA-TT<br>R: CCG-GGG-AGA-CTT-CTC-AGG-GGA-TT</td><td>363</td><td>5 min 95 °C, 27 cycles (30 s 95 °C, 30 s 59 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>FEN1</td><td>69</td><td>F: GCG-GCT-GAA-CGT-CAG-GCC-AC<br>R: CTT-GAG-CTG-TGG-CGG-CTT-GC</td><td>420</td><td>5 min 95 °C, 27 cycles (30 s 95 °C, 30 s 69 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>POLE2</td><td>57</td><td>F: GGG-CGC-TCT-CCG-CCT-TCA-AG<br>R: GCC-TGT-GGG-TCC-TCT-GGT-GC</td><td>405</td><td>5 min 95 °C, 30 cycles (30 s 95 °C, 30 s 57 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>59</td><td>F: GAC-CCT-TTG-CGG-GGC-TGA-GCT-GGT<br>R: CTT-CTG-AGT-CTT-GGG-CAT-GTC-AGT</td><td>419</td><td>5 min 95 °C, 30 cycles (30 s 95 °C, 30 s 50 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>Casp8</td><td>58</td><td>F: GGTGGAGCGGATTATATTCTCC<br>R: CCAGCAGGTTCATGTCATCATC</td><td>457</td><td>5 min 95 °C, 28 cycles (30 s 95 °C, 30 s 50 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>Bax</td><td>60</td><td>F: CTGACATGTTTTCTGACGGC<br>R: TCAGCCCATCTTCTTCCAGA</td><td>290</td><td>5 min 95 °C, 37 cycles (30 s 95 °C, 30 s 54 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>Bid</td><td>54°C</td><td>F: AGGCCATGGACTGTGAGGTCAACA<br>R: CCATCCCATTTCTGGCTAAGCTCC</td><td>588</td><td>5 min 95 °C, 35 cycles (30 s 95 °C, 30 s 54 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>COX6C</td><td>62</td><td>F: GTCAGGAAGGACGTTGGTGT<br>R: ACCAGCCTTCCTCATCTCCT</td><td>262</td><td>5 min 95 °C, 37 cycles (30 s 95 °C, 30 s 54 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>COX7B</td><td>50°C</td><td>F: AATCGTCTCCAAGTTCGAAGCAT<br>R: GCCATATCTTAATGGGTACACAG</td><td>305</td><td>5 min 95 °C, 35 cycles (30 s 95 °C, 30 s 50 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr><tr><td>Actin</td><td>58</td><td>F: CTA-CAA-TGA-GCT-GCG-TGT-GGC<br>R: CAG-GTC-CAG-ACG-CAG-GAT-GGC</td><td>270</td><td>5 min 95 °C, 30 cycles (30 s 95 °C, 30 s 50 °C, 1 min 72 °C)<br>10 min 72 °C</td></tr></tbody></table>

PCR, polymerase chain reaction; *T*<sub>m</sub>, melting temperature.

Valencia, CA) and hybridized with a Whole Human Genome Oligo (60-mer) expression array, using samples (n = 4) for each condition. For each sample, 350 ng of total RNA was reverse transcribed, linear amplified and labeled with Cy3 (one-color protocol) using Agilent's Low RNA Input Linear Amplification Kit PLUS, according to the manufacturer's instructions. After labeling, samples were measured on a Nanodrop microarray module for labeling efficiency and quantification. Samples were then hybridized on Agilent 4×44K Whole Human Genome Gene Expression arrays (Agilent Design #014850) at 65 °C

<table><caption>Table II. Oligonucleotides used for LightCycler.</caption><thead><tr><th>Primer</th><th>Sequence</th></tr></thead><tbody><tr><td>CDC6</td><td>F: CCAGGCACAGGCTACAATCAG<br>R: AACAGGTTACGGTTTGGACATT</td></tr><tr><td>CDC45L</td><td>F: CTTGAAGTTCCCGCCTATGAAG<br>R: GCATGGTTTGCTCCACTATCTC</td></tr><tr><td>MCM10</td><td>F: CAACCCCTACAGACGATTTCTC<br>R: GGGTCCCCACAATTTGACCTC</td></tr><tr><td>FEN1</td><td>F: GTATTGGGCAACCTCATTCCC<br>R: CCTTGCGTTCCTTCATGTAGT</td></tr><tr><td>POLE2</td><td>F: TACTCCTCCGGTGATAGGTTCT<br>R: CTGGAATTTGCTTCCGCTTTC</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>F: GGAGCTGTGATCTAAGGAGGC<br>R: GGACAGCGAGCTGACTT</td></tr><tr><td>Casp8</td><td>F: TTTCTGCCTACAGGTTCCACT<br>R: CCTCAATTCTGATCTGCTCACTT</td></tr><tr><td>Bax</td><td>F: CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG<br>R: CCAGCCCATGATGGTTCTGAT</td></tr><tr><td>Bid</td><td>F: CCTTGCTCCGTGATGTCTTTC<br>R: GTAGGTGCGTAGGTTCTGGT</td></tr><tr><td>COX6C</td><td>F: CCAAAACCTCGGATGCGTG<br>R: AAAATCTGCGTATGCCTTCTTTCT</td></tr><tr><td>COX7B</td><td>F: CTTGGTCAAAAGCGCACTAAATC<br>R: AAAATCAGGTGTACGTTTCTGGT</td></tr><tr><td>Actin</td><td>F: CATGTACGTTGCTATCCAGGC<br>R: CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>F: CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT<br>R: CCATGGTGTCTGAGCGATGT</td></tr></tbody></table>

for 17 h. After washing in Gene Expression Wash Buffer, the slide was scanned with an Agilent Microarray Scanner G2565CA. Feature extraction software (version 9.5.3.1; Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) was used to convert images into gene expression data. GeneSpring GX10 software (Agilent Technologies Inc.) was used to compile and analyze the data. First, normalized data (background subtracted) were filtered on expression (lower and upper cut-off 20 and 100, respectively, for 100% of signal), then on error (coefficient of variation [CV] < 50% for 100% of signal). Only genes that were two-fold differentially expressed on four arrays were scored as significant and used for analysis. The biological process and cellular component of genes were classified according to Gene Ontology categories (*p* < 0.1).

## Western blot

Freshly isolated B-cells (5 × 10⁶) were stimulated with rIL-2, rIL-10 and CD40L for 3 days, washed, and incubated or not with rIL-24 for the indicated time. Cells were lysed at 4 °C for 30 min in lysis buffer [20 mM tris(hydroxymethyl) amoniomethane HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid, 50 U/mL aprotinin, 1 mM phenyl-methylsulfonyl fluoride, 1 mM sodium orthovanadate] containing 1% Nonidet P-40 detergent. Proteins were separated on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis gels, electrotransferred onto polyvinylidene fluoride membranes (Amersham), and blotted sequentially with anti-Casp8 mAb, anti-actin mAb and anti-α-tubulin mAb (all from Cell Signaling Technology, Danvers, MA) after dehybridization. Blots were revealed using horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit and goat anti-mouse antibodies (Bio-Rad Laboratories) and enhanced chemiluminescence detection (Millipore, Billerica, MA).
## Results

### Transcriptomic effects of IL-24 on stimulated B-cells: early cell cycle arrest is followed by late induction of mitochondrial apoptosis pathway

In a previous study we observed that rIL-24 blocked the differentiation of germinal center (GC) B-cells into plasma cells mostly by killing plasma cell precursors [10]. In this model, GC B-cells were stimulated with a cocktail of IL-2, IL-10 and CD40-ligand for 3 days followed by 4-day stimulation with IL-2 + IL-10 to induce plasma cell differentiation. The addition of IL-24 to the culture at day 4 resulted in the inhibition of both G0/G1 and G2/M peaks and the increase of sub-G1 cell numbers. To gain insight into the molecular mechanisms of IL-24-mediated cell death, we analyzed the transcriptomic profile of B-cells stimulated for 3 days with cocktail and stimulated or not with rIL-24 for 6 h and 36 h. The transcripts present only in 6 h or in 36 h stimulated cells are depicted on a Venn diagram (Figure 1). We observed an early (6 h) modification in the expression of 11 genes belonging to “DNA metabolism” according to the Gene Ontology (GO) program (Table III); among these, 10 were inhibited, whereas in contrast, IGF1 transcripts were stimulated. These data were confirmed by RT-PCR, as the expressions of CDC6, MCM10, CDC45, FEN1, POLE2 and PHB were down-regulated within 3-6 h in IL-24-stimulated samples (Figure 2, left panel). Furthermore, we observed that five “mitochondrial genes” related to apoptosis were stimulated

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>Figure 1. Venn diagram depicts genes whose expression was regulated by IL-24 in activated normal B-cells. Purified tonsil B-cells (three samples) were cultured for 3 days in IL-10 + IL-2 + CD40-ligand (control) followed by 6 h (left panel) or 36 h (right panel) culture with or without rIL-24, before mRNA extraction and hybridization with DNA chips. For each experiment, three entities [(a-c) and (d-f)] were generated and compared. NS, non-stimulated; S, IL-24-cultured. Numbers of regulated genes between two entities are shown within circles.</figcaption></figure>

after 36 h; these transcripts encoded the apoptosis effectors: Casp8, Bax, Bid, and cytochrome c oxidase subunits COX6C and COX7B (Table I). Altogether these data were meaningful, and gave credence to our published results on the cytostatic and proapoptotic functions of IL-24. Indeed, the functions of nine out of 10 early inhibited genes were strikingly restricted to DNA replication and repair

<table><caption>Table III. Genes whose expression was stimulated or inhibited > 2-fold in B-cells by IL-24.</caption><thead><tr><th>Gene</th><th>Name</th><th>GenBank accession</th><th>Gene expression</th><th>Putative function</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="5"><strong>6H regulated genes</strong></td></tr><tr><td>CDC6</td><td>Cell division cycle 6 homolog</td><td>NM_001254</td><td>Down-regulated</td><td>Initiation of DNA replication</td></tr><tr><td>CDC45L</td><td>Cell division cycle 45 homolog</td><td>NM_001178010</td><td>Down-regulated</td><td>Initiation of DNA replication</td></tr><tr><td>DMC1</td><td>Dosage suppressor of mck-1 homolog</td><td>NM_007068</td><td>Down-regulated</td><td>Homologous recombination during meiosis</td></tr><tr><td>MCM4</td><td>Minichromosome maintenance complex component 4</td><td>NM_005914</td><td>Down-regulated</td><td>Replication initiation, DNA replication fork, DNA helicase</td></tr><tr><td>MCM10</td><td>Minichromosome maintenance complex component 10</td><td>NM_018518</td><td>Down-regulated</td><td>Replication initiation, DNA forks</td></tr><tr><td>FEN1</td><td>Flap structure-specific endonuclease 1</td><td>NM_004111</td><td>Down-regulated</td><td>DNA replication and repair</td></tr><tr><td>DTL</td><td>Denticeless homolog</td><td>NM_016448</td><td>Down-regulated</td><td>DNA replication and repair, cell cycle regulation</td></tr><tr><td>POLE2</td><td>Polymerase epsilon 2</td><td>NM_001197330</td><td>Down-regulated</td><td>DNA replication and repair, telomere maintenance, cell cycle progression</td></tr><tr><td>ORC1L</td><td>Origin recognition complex subunit 1</td><td>NM_001190818</td><td>Down-regulated</td><td>DNA replication, assembly of initiation factors</td></tr><tr><td>PHB</td><td>Prohibitin</td><td>NM_002634</td><td>Down-regulated</td><td>Mitochondrial morphology/function, transcriptional modulation</td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Insulin-like growth factor 1</td><td>NM_000618</td><td>Up-regulated</td><td>Promotes cell growth, anabolism, inhibits apoptosis, decreases GH and insulin release</td></tr><tr><td colspan="5"><strong>36H regulated genes</strong></td></tr><tr><td>Casp8</td><td>Caspase 8</td><td>NM_001080124</td><td>Up-regulated</td><td>Fas-induced AICD</td></tr><tr><td>Bax</td><td>BCL2-associated X protein</td><td>NM_004324</td><td>Up-regulated</td><td>Apoptotic activator of p53-mediated cell death</td></tr><tr><td>Bid</td><td>BH3 interacting domain death agonist</td><td>NM_001196</td><td>Up-regulated</td><td>Cleaved by casp8 to induce cytochrome c release</td></tr><tr><td>COX6C</td><td>Cytochrome c oxidase subunit VIc</td><td>NM_004374</td><td>Up-regulated</td><td>Catalyzes electron transfer from reduced cytochrome c to oxygen</td></tr><tr><td>COX7b</td><td>Cytochrome c oxidase subunit VII</td><td>NM_001866</td><td>Up-regulated</td><td>Catalyzes electron transfer from reduced cytochrome c to oxygen</td></tr><tr><td>IFI6</td><td>Interferon alpha-inducible protein 6</td><td>NM_002038</td><td>Down-regulated</td><td>Regulation of apoptosis</td></tr></tbody></table>

IL-24, interleukin-24; GH, growth hormone; AICD, activation-induced cell death.
<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 2. (a) Validation of IL-24 6 h-regulated genes by means of RT-PCR. Purified B-cells from tonsils were stimulated as in Figure 1, and CLL B-cells were incubated with IL-2 overnight followed or not by rIL-24 for 6 h before RNA purification and reverse transcription. Shown are two representative experiments from IgHV gene mutated (M) or unmutated (UM) CLL. (b) Real-time PCR was performed on three separate tonsil B-cell samples, and ratios of mRNA expression in IL-24-stimulated cells (light histograms) versus cocktail, CK (IL2 + IL10 + CD40L)-stimulated cells (arbitrary value = 1, dark histograms) were calculated for the indicated genes. Mean ± SD, *p*-values were calculated using Student's *t*-test.</figcaption></figure>

(Table III). We validated the gene array data in tonsil B-cells by RT-PCR [Figure 2(a), left] and by real-time PCR [Figure 2(b)]. Because IL-24 was cytostatic and killed the cycling fraction of IL-2-stimulated CLL cells [9], we investigated the above transcripts in CLL B-cells. As shown in two representative experiments from one IgVH-mutated (M) and one IgVH-unmutated (U) CLL, IL-24 induced the expression of IGF1, whereas the other transcripts were variably inhibited [Figure 2(a), right]. The picture was variable within CLL samples and even among U-CLL and M-CLL samples (data not shown). However, the transcripts of POLE2, MCM10, FEN1 and CDC6 were constantly inhibited, whereas those of IGF1 were constantly enhanced or induced.

By contrast with the other 6 h-modulated genes that were inhibited, IGF1 transcripts were more abundant in the 6 h IL-24-stimulated samples (Table III). This was somewhat unexpected, as IGF1 was reported to be a universal growth factor for mammalian cells including lymphocytes and lymphoid organs [13–15]. To rule out the potential contradiction between the respective effects of

IGF1 and IL-24, the expression and effects of IGF1 on B-cells were therefore investigated.

## Activated B-cells from tonsils and from CLL express IGF1R and become sensitive to IGF1-mediated apoptosis

We analyzed the expression of IGF1 receptor(R) on the cells of seven patients with CLL (two unmutated for the IgHV gene, three mutated and two with unknown status), and in seven tonsils. Neither B-cells from human tonsils nor CLL B-cells expressed detectable IGF1R [Figure 3(a)]. However, this receptor was induced by stimulation. We tested the activity of CD40-ligand, anti-IgM, CpGODN and SDF1/CXCL12 on B-cells, and observed that all of them induced the expression of IGF1R at the surface of normal or malignant B-cells. IGFR expression was not modified by the addition of IL-24 to the culture (data not shown). Of note, the expression of IGF1R was less inducible in CLL B-cells than in tonsil B-cells [Figure 3(a)]. Altogether, several antigen-specific or non-specific stimuli induced the expression of IGF1R and sensitized malignant and normal B-cells to the action
<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Figure 3. Effects of IGF1 on normal and CLL B-cells. (a) IGF-receptor expression was measured by flow cytometry on fresh purified B-cells after 48 h culture with the indicated stimuli (upper left on dot plots). Percentage of IGFR-positive cells is shown at upper right. (b) IGF1-mediated apoptosis was determined by annexin V-PI staining of B-cells stimulated in order with IL2 + IL10 + CD40L cocktail (CK), then by IL-24 (tonsils) or with IL-2 followed by IL-24 (CLL). Cell cycle analysis was performed on same CLL as above.</figcaption></figure>

of IGF1. We next incubated tonsil B-cells with cocktail for 3 days followed by 0, 10 or 100 ng/mL IGF1 for 2 more days. CLL B-cells were incubated with IL-2 overnight followed or not by IGF1 for 2 more days. As shown by

means of annexin V and propidium iodide staining [Figure 3(b)], IGF1 at 10 ng/mL was detrimental to cell survival. IGF1 diminished the percentage of cells in G0/G1 and in parallel augmented that of hypodiploid
cells, in the same CLL sample [Figure 3(b)]. These results are in keeping with a cytostatic effect of IGF1 on activated B-cells, and suggest that the induction of IGF1 by IL-24 is physiologically relevant.

## Inhibition of the IGF1 pathway reverses several biological effects of IL-24

To investigate whether IGF1 acted downstream from IL-24 in order to promote cell death in B-cells, we activated tonsil B-cells with cytokine cocktail as above, and incubated them with various IGF1 inhibitors, at various concentrations and times, before adding rIL-24 to the culture. As shown in Figure 4(a), only one out of three tested pharmacological inhibitors, tyrphostin, was able to reverse the apoptotic effect of IL-24 (44% death under IL-24 vs. 17% death in cells incubated with tyrphostin and stimulated thereafter with IL-24). In contrast, ALX and SC inhibitors were inactive in this respect, and even were detrimental for cell survival, as shown by an enhancement of IL-24-induced cell death. Furthermore, at optimal concentration (5 µM) and incubation time (6 h), tyrphostin down-regulated the expression of COX7B, Casp8, Bax and Bid transcripts induced by IL-24, as shown by quantitative PCR (qPCR) [Figure 4(b)]. The observation that a specific IGF1 inhibitor antagonized the effect of IL-24 strongly suggested that IGF1 acted downstream of IL-24 to promote B-cell death.

## IL-24 triggers the mitochondrial apoptosis pathway in activated B-cells

The results of gene array experiments showed that IL-24 modulated the expression of several genes related to cell proliferation or death in two waves. The first (6 h) wave was

related to DNA metabolism, whereas the later (36 h) was related to the mitochondrial (intrinsic) apoptosis pathway as assessed by GO terms. The later transcripts were validated by RT-PCR on tonsil and CLL B-cells as shown from four representative samples on one tonsil B-cell sample, and three CLL samples with an Ig gene-mutated, unmutated or undetermined status [Figure 5(a)] and by qPCR on tonsil B-cells [Figure 5(b)]. Caspase 8 protein was investigated by Western blot and shown to be either enhanced or induced by IL-24 in normal or in CLL B-cells, respectively [Figure 5(c)]. We finally investigated the effect of IL-24 on the potential of the mitochondrial membrane as a specific indicator of intrinsic apoptosis. As shown in Figure 5(d), the mitochondrial potential evidenced by means of NIR dye fluorescence decreased significantly under IL-24.

## IL-24-mediated apoptosis on B-cells is dependent on p53

We previously found that IL-24-mediated apoptosis in CLL B-cells could be prevented by incubating the cells with pifithrin-alpha, a pharmacological inhibitor of p53 transactivation [9]. In addition, IL-24 was suggested to de-repress the expression of p53 in part by inhibiting STAT3 phosphorylation on tyrosine [9,10]. We activated tonsil B-cells with cocktail, and cells were incubated or not with pifithrin-alpha, or the caspase inhibitor ZVAD-fmk, prior to culture with IL-24. As shown by annexin V-PI staining [Figure 6(a)], both pifithrin-alpha and ZVAD at 10⁻⁵ M were not toxic by themselves; however, they were able to antagonize the apoptotic effect of IL-24. Pifithrin-alpha also reversed the cytostatic effect of IL-24 on B-cells as shown by cell cycle analysis [Figure 6(b)]; it also antagonized IL-24 at the transcriptional level, as shown by

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 4. Inhibition of IGF1 pathway reverses biological effects of IL-24. (a) B-cells were activated with cocktail, and incubated thereafter with various IGF1 inhibitors (5 µM for 6 h) before activation with rIL-24, and annexin V-PI assay was performed 3 days later. Inhibitors: SC (sc-205907), tyrphostin (ALX-270-217), ALX (ALX-270-362). (b) Cells were incubated with tyrphostin as above before qRT-PCR at day 3 for mitochondrial pathway apoptosis genes. Histograms display relative amounts of transcripts (cocktail [CK]: white histograms, CK + IL-24: gray histograms, CK + tyrphostin + IL-24: black histograms).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 5. (a) Validation of 36 h-modulated genes by means of RT-PCR. Tonsil B-cells were cultured with cocktail (CK) whereas CLL samples (one IgVH mutated, one unmutated and one of undetermined status) were stimulated overnight with IL-2 before being stimulated with IL-24. (b) Gene expression was validated by qPCR on three tonsil B-cell samples (mean ± SD relative expression of cells stimulated or not with IL-24). (c) Casp8 protein was analyzed by Western blot under same culture conditions. (d) Mitochondrial membrane was measured in above samples by means of NIR probe and flow cytometry. Left: tonsil B-cells, right: CLL B-cells. White and black histograms: CK or IL-2 alone, and IL-24-stimulated cells, respectively.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>Figure 6. IL-24-mediated cell death is p53-dependent and is reversed by p53 and caspase inhibitor. (a) Tonsil B-cells were stimulated with cocktail (control) and incubated or not with pifithrin-alpha (PFTα) for 1 h, or ZVAD-fmk, both at 10 µM, for 1 h, then with 100 ng/mL IL-24 for 24 h, and apoptosis measured by flow cytometry (dot plots). (b) The same cells were submitted to cell cycle analysis (% of hypodiploid cells under IL-24 is shown by black icon). (c) qPCR was performed on cDNAs from same cells cultured as above. (d) Casp8 expression is shown by Western blot.</figcaption></figure>

inhibition of the genes belonging to the mitochondrial apoptosis pathway [Figure 6(c)]. Casp8 protein was analyzed by Western blot and its induction by IL-24 was antagonized by pifithrin [Figure 6(d)].

Discussion

We have described herein the molecular basis for the death-promoting effect of IL-24 on B-lymphocytes. The mechanism involves a rapid, 6 h, induction of DNA replication arrest followed by late, 36 h, induction of mitochondrial endogenous apoptosis pathway genes. Among the genes modulated during the first wave we focused on IGF1, as its transcription was enhanced, at variance with the 11 other transcripts, the expressions of which were inhibited. This was rather surprising, as IGF1/ somatomedin-C is a growth hormone with positive effects on organ size, including lymphoid tissues [13-15]. Interestingly, however, a suppressive action of IGF1 on immune responses has been reported [16]. Physiological (100-1000 ng/mL) concentrations of IGF1 were indeed able to inhibit IL-2-mediated proliferation of murine splenocytes and to inhibit their production of antibodies. In retrospect, this gives credence to our previous [9,10] and present results. Note, however, that the suppressive mechanism evoked by IGF1 was not described in this work [16], whereas we clearly show here that it involved the apoptosis of B-cells. In murine models, the suppressive action of IGF1 is limited to activated mature lymphocytes,

in contrast to its well-documented role in the expansion of B-cell precursors [17,18]. No such activity was reported in human B-cells, as we could not detect a sizable IGF1R-positive B-cell population, including within the CD10 + B-cells in the blood or in tonsils. We were able to expand a B-cell population *in vitro* with IGF1 (data not shown). Thus, based on our data, human B-cells become responsive to IGF1 only after activation and therefore expression of the IGF1R. IGF1 may play a role in the B-cell contraction that follows antigen-driven B-cell expansion. Whether this hormone has endocrine or autocrine effects on activated B-cells remains to be elucidated, although most cells throughout the body produce IGF1. The parameters governing the concentration and activity of IGF1 in lymphoid organs may include serum concentration, but also local production of IGF1 and IGF1-binding proteins that extend the half-life of this hormone [14].

The finding that IGF1 induced the apoptosis of IL-2- and CD40-stimulated CLL cells paralleled similar results previously described with IL-24 [9]. This effect, however, is at variance with that reported in multiple myeloma where IGF1 activates the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) and mitogen activated protein kinase (MAPK) pathways in addition to the induction of telomerase and several antiapoptotic proteins, thereby providing protection to malignant cells [19-21]. Of note, in the study which demonstrated a suppressive effect of IGF1 on IL-2-stimulated splenocytes and on cell lines, the SP2 myeloma cell line was insensitive to IGF1 [16]. Whether IGF1, like IL-24 [10],
is detrimental for the survival of activated normal plasma
cells remains to be determined. Altogether, IGF1 is not a
growth factor for human B-cells. Of note, a recent study
demonstrated that IGF1 can activate cell cycle arrest in
G2M in irradiated cells [22]. Of interest, among the three
pharmacological inhibitors tested, only the one that spe-
cifically inhibited the IGF1 pathway, AG1024-tyrphostin,
was able to antagonize the apoptotic effect of IL-24. IGF1
is therefore a component of the IL-24-induced signaling
acting downstream of this molecule to promote cell death
in activated B-cells.

Our data also gave credence to our previous study
which demonstrated the role of p53 as a downstream activ-
vator of IL-24-mediated cell cycle arrest and cell death
[9]. Indeed, several transcripts are modulated similarly by
both IL-24 and p53. GADD45A, for instance, is induced by
both molecules [3,23], and blocks G2/M transition while
inducing cell senescence [24]. Bax and Bak are canoni-
cal transcripts induced by p53, either directly [25,26] or
indirectly induced by Puma [27], which activates caspase
8 [28]. Both Bax and Casp8 are key effectors of apopto-
sis, inasmuch as Casp8 cleaves and activates Bid [27,29].
Finally, p53 was shown to activate the expression of cyto-
chrome c oxidase subunits in various cells [30,31]. This is
of interest, as cancer cells preferentially utilize glycolysis
over aerobic respiration, the so-called Warburg effect,
which is inhibited by p53 through up-regulation of COX
[32,33]. Thus, engagement of the IL-24-p53 axis compro-
mises anaerobic respiration in malignant cells. This may
explain why the effect of IL-24 on CLL B-cells was reversed
by pifithrin-alpha and by ZVAD-fmk in our previous [9]
and present experiments.

By contrast to the role of p53 on the mitochondrial
pathway, the data on p53 and DNA replication and meta-
bolism are scarce, yet they often show that p53 regulates
this family either at the transcriptional level [34] or by sta-
bilizing the protein [35]. Physical interactions between
p53 and DMC1 [36] and DTL [37] proteins have also been
described. Alternatively, some of the “DNA metabolism”
genes such as prohibitin have been shown to stimulate
p53 transcriptional activity [38]. It is therefore likely that
p53 is central in IL-24-mediated cytostatic activity and
regulates a complex network of genes involved in cell cycle
arrest and apoptosis. It is also inferred from these results
that IL-24 may prove to be inefficient at inducing cell death
in p53 deleted or mutated cells.

Acknowledgements

We thank Mélanie Durand for technical help, and the Com-
munauté Urbaine du Grand Nancy (CUGN) and Société
Française d'Hématologie for financial support. This work is
part of the fulfillment of a PhD thesis of N.H.

**Potential conflict of interest:** Disclosure forms provided by the authors are available with the full text of this article at www.informahealthcare.com/lal.

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DISCUSSION
# 1 IL24 et Apoptose

Ce travail s'est proposé d'analyser le rôle immunologique de l'IL-24 ainsi que ses mécanismes d'induction de mort cellulaire dans les lymphocytes B. Pour cela, j'ai utilisé deux types de LB différentes :

1. les LB normaux, provenant d'amygdales humaines qui constituent une source accessible et intéressante de lymphocytes B car ils représentent au moins 60% de l'ensemble des cellules et sont présents à tous les stades de différentiation.

2. les cellules B de la leucémie lymphoïde chronique (LLC), qui est la forme de leucémie adulte la plus fréquente dans les pays occidentaux. Cette leucémie est caractérisée par l'accumulation dans le sang de lymphocytes B matures CD5+. Des travaux précédents ont montré que les cellules B de LLC expriment fortement l'IL-24 (Sainz-Perez et al., 2006). On sait par ailleurs que ces cellules présentent un phénotype mémoire. Elles expriment toutes le marqueur de LB mémoire CD27. Par ailleurs, ces cellules n'ont pas la capacité de se différentier en plasmocytes, ce qui entraine souvent chez les malades atteints de LLC une hypogammaglobulinémie.

Dans le cas des lymphocytes B normaux, nous avons utilisé le modèle de différentiation mis au point par YJ Liu et J Banchereau (Arpin et al., 1995). La seule différence apportée ici a été l'utilisation d'un CD40L soluble trimérique. Dans le cas des lymphocytes B de LLC, nous avons stimulé les cellules avec l'IL-2 pendant 24h avant de les traiter par l'IL-24.

Nos résultats montrent pour la première fois que l'effet apoptotique de l'IL-24 implique un arrêt précoce (6h) de la réplication d'ADN, suivi d'une induction plus tardive (36h) des gènes de la voie mitochondriale d'apoptose. Parmi les gènes régulés au cours de la première vague, nous nous sommes concentrés sur l'IGF1 car son expression était augmentée quand celle des 10 autres transcrits était inhibée. Ceci était assez surprenant si l'on tient compte du fait que l'IGF1/Somatomedin-C est connue pour être une hormone de croissance ayant des effets positifs sur la croissance des organes, y compris les tissus lymphoïdes (Clark et al., 1993; Heemskerk et al., 1999; Zapf et al., 1989). Cependant, et d'une façon intéressante, une action suppressive d'IGF1 sur les réponses immunitaires a été reportée (Hunt and Eardley, 1986). Des concentrations d'IGF1 allant de 100 à 1000 ng/ml sont en effet capables d'inhiber la
prolifération des splénocytes murins induite par l'IL-2 et d'inhiber leur production d'anticorps. Rétrospectivement, cela tend à corroborer nos résultats précédents (Sainz-Perez et al., 2008; Maarof et al., 2010) ainsi que les observations faites au cours de ce travail. Notons cependant que le mécanisme de suppression évoquée par l'IGF1 n'est pas décrit dans le travail de Hunt et Jardieu, alors que nous montrons clairement ici qu'il s'agissait de l'apoptose des cellules B. Dans des modèles murins, l'action suppressive de l'IGF1 est limitée aux lymphocytes matures activés contrairement à son rôle sur l'expansion des précurseurs des cellules B (Gibson et al., 1993; Jardieu et al., 1994). En revanche, aucune activité n'a été rapporté dans les lymphocytes B humains, vu que nous n'avons pas pu détecter de sous population de cellules B exprimant le récepteur à l'IGF1, y compris au sein des cellules B CD10⁺ dans le sang ou dans les amygdales. Par contre, nous avons pu développer *in vitro* une sous population de lymphocytes B sensible à l'IGF-1. Ainsi, les lymphocytes B humains deviennent sensibles à l'IGF1 seulement après activation et donc expression de l'IGF1-R. L'IGF1 peut donc jouer un rôle dans la contraction des cellules B qui suit l'expansion de ces cellules après rencontre avec l'antigène. Reste à élucider si cette hormone possède des effets endocrine ou autocrine sur les cellules B activées, même si la plupart des cellules de l'organisme produisent de l'IGF1. Les paramètres régissant la concentration et l'activité de l'IGF1 dans les organes lymphoïdes peuvent inclure la concentration sérique, mais aussi la production locale d'IGF1 et des protéines de liaison à l'IGF1 (IGF1-binding Proteins) qui prolongent la demi-vie de cette hormone (Heemskerk et al., 1999).

La constatation que l'IGF1 induit l'apoptose des cellules B leucémiques stimulées par IL-2 et CD40-L est en accord avec des résultats similaires décrits précédemment avec l'IL-24 (Saint-Perez et al., 2008). Cet effet est cependant en contradiction avec celui rapporté dans de myélome multiple où IGF1 active les voies de signalisation PI3K et MAPK, en plus de l'induction de la télomérase et de plusieurs protéines anti-apoptotiques, offrant ainsi une protection aux cellules malignes (Akiyama et al., 2002; Mitsiades et al., 2002; Qiang et al., 2002). A noter que dans les travaux qui ont démontré l'effet suppressif de l'IGF1 sur des splénocytes stimulées par IL-2 et sur des lignées cellulaires, la lignée de cellules de myélome SP2 était insensible à l'IGF-1 (Hunt and Eardley, 1986). Il reste à déterminer si l'IGF1, comme l'IL-24 (Maarof et al., 2010), est préjudiciable à la survie des cellules plasmatiques normales activées.

Finalement, nos résultats montrent que l'IGF-1 n'est pas un facteur de croissance pour les lymphocytes B humains. Ceci est à rapprocher à une étude récente qui a démontré que l'IGF-1
peut entrainer un arrêt du cycle cellulaire en phase G2/M dans les cellules irradiées (Mitchell et al., 2010). Fait intéressant : parmi les trois inhibiteurs pharmacologiques que nous avons testé, seul celui qui inhibe spécifiquement la voie de signalisation de l'IGF1, AG1024-tyrphostine, était capable d'antagoniser l'effet apoptotique de l'IL-24. Ceci montre que l'IGF1 est bien un composant de la signalisation induite par IL-24, agissant en aval de cette molécule pour promouvoir la mort cellulaire des cellules B activées.

Nos résultats ont également corroboré une précédente étude de notre équipe qui avait démontré que p53 agit en aval de l'arrêt du cycle et la mort cellulaire induite par l'IL-24 (Saint-Perez et al., 2008). En effet, plusieurs transcrits sont modulés de façon similaire par l'IL-24 et p53. GADD45A par exemple, est induite par les deux molécules (Kettenhofen et al., 2001; Smith et al., 1994) et bloque la transition G2/M tout en induisant la sénescence cellulaire (Zhan et al., 1994). Bax et Bak sont des transcrits canoniques de l'apoptose. Ils sont induits soit directement par p53 (Liu et al., 2003; Nakano and Vousden, 2001), soit indirectement par Puma (Liu et al., 2011) qui active caspase 8 (Gross et al., 1999). Notons que Bax et casp 8 sont des effecteurs clés de l'apoptose, dans la mesure où CASP8 clive et active Bid (Kato, 1999; Liu et al., 2011).

Enfin, il a été démontré que p53 active l'expression des sous-unités du cytochrome oxydase-c (COX) dans diverses cellules (Assaily and Benchimol, 2006; Okamura et al., 1999). Ceci est intéressant car les cellules cancéreuses utilisent préférentiellement la glycolyse aérobie pour la respiration, ce qu'on appelle « effet Warburg ». Ceci implique que la cellule cancéreuse se comporte comme si elle était en anaérobie. Cet effet est inhibé par p53 grâce à la régulation positive du COX (Duursma and Agami, 2005; Matoba et al., 2006). Ainsi, l'engagement de l'axe IL24-p53 compromet la respiration anaérobie dans les cellules malignes. Cela peut expliquer pourquoi l'effet de l'IL-24 sur les cellules B de LLC a été inversé par pifithrin alpha et par zVAD-fmk dans nos précédentes (Sainz-Perez et al., 2008) et actuelles expériences (figure 42, page suivante). Signalons que notre équipe, en collaboration avec un groupe Canadien, a montré un tel effet dans les cellules de LLC (Spaner et al., 2012).

S'il est bien établi aujourd'hui que p53 joue un rôle sur la voie mitochondriale, peu de données expliquent comment p53 régule la réplication d'ADN ainsi que le métabolisme de cette voie. Certains travaux montrent que p53 régule cette famille soit au niveau transcriptionnel (Christmann et al., 2005) soit en stabilisant la protéine (Habu et al., 2004). Des interactions physiques entre p53, les protéines DMC1 et DTL (Higa et al., 2006) ont
également été décrites. Par ailleurs, certains gènes du « métabolisme d'ADN» tels que prohibitine (PHB) ont été décrits pour stimuler l'activité transcriptionnelle de p53 (Fusaro et al., 2003). Il est donc probable que la protéine p53 soit un élément central dans l'activité cytostatique induite par l'IL-24 et régule un réseau complexe de gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose. Ces résultats suggèrent également que l'IL-24 serait inefficace pour induire la mort cellulaire dans les cellules délétées ou mutées pour p53.

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

**Figure 42 :** représentation schématique de l'effet de l'IL-24 sur l'apoptose, passant indirectement par p53 dans une cellule leucémique. IL-24 déréprime p53 soit en déphosphorylant STAT3 sur tyrosine (LLC) soit par une autre voie (résultats en cours). Ceci active la transcription du gène COX qui à son tour inhibe l'effet WARBURG provoquant ainsi l'apoptose de la cellule.

## 2 Expression et induction de Mda-7/IL-24 dans les cellules immunitaires

L'expression de l'IL-24 est détectée par Western Blot dans les PBMC activés par du LPS (lipopolysaccharide) ou de la PHA (activateur polyclonal de la phytohémagglutinine)
(Caudell et al., 2002). Dans cette étude, l'IL-24 est détectée par marquage immunohistochimique dans les cellules CD19⁺ et les cellules CD56⁺, mais est absente dans les cellules T ou les monocytes. En revanche, des études par PCR en temps réel ou marquage intracellulaire ont montré que le profil d'expression de Mda-7/IL-24 est très semblable à celui de l'IL-10 (Nagalakshmi et al., 2004; Poindexter et al., 2005; Wolk et al., 2002). Les auteurs montrent que Mda-7/IL-24 est exprimée par les monocytes humains activés avec du LPS seul ou avec de l'IFNγ, ainsi que par les lymphocytes T ou les PBMC activés par un anti-CD3 et un anti-CD28, mais présente dans seulement environ 15% des lymphocytes B et des cellules NK. Dans les monocytes activés par du LPS, l'expression de Mda-7/IL-24 est inhibée par l'IL-10. Il est intéressant de constater que l'expression de Mda-7/IL-24 dans les PBMC de sujets sains est fortement induite après activation par l'IL-2, IL-7 ou IL-15 (Poindexter et al., 2005), trois cytokines qui signalisent à travers la même chaîne commune γc de leur récepteur (Noguchi et al., 2008). Or, les cellules de LLC expriment la chaîne commune γc à leur surface. On peut émettre l'hypothèse que l'activation chronique *in vivo* de ces cellules par une de ces trois cytokines peut être responsable de la forte expression de Mda-7/IL-24 et contribuer à la survie des cellules de LLC.

L'IL-1β, le TNF-α ou le GM-CSF induit également l'expression de Mda-7/IL-24 dans les PBMC humains (Poindexter et al., 2005). Il est intéressant de noter que ces cytokines sont abondamment produites par les cellules de la peau. Dans tous les cas, la protéine intracellulaire est détectée dans les cellules T ou les macrophages. En revanche aucune induction d'expression de Mda-7/IL-24 n'est observée en présence de l'IL-4, l'IFN-α, IFN-β ou IFN-γ.

Si on incube les PBMC avec des anticorps dirigés contre les chaînes du récepteur à l'IL-2 avant l'activation par la PHA, on observe une inhibition de l'induction de Mda-7/IL-24 (Poindexter et al., 2005). Ces résultats suggèrent que l'induction d'expression de Mda-7/IL-24 dans les PBMC après activation est indirecte et due en grande partie à une stimulation de ces cellules par les cytokines produites lors de l'activation.

D'après ces données, nous constatons que les cellules du système immunitaire sont d'importants producteurs d'IL-24. Cependant, il y a peu d'études des voies de signalisation et des facteurs de transcription qui induisent l'expression d'IL-24 dans les cellules immunitaires. Schaefer et al., ont identifiée pour la première fois l'IL-24 dans les lymphocytes T CD4⁺ de souris et l'ont désignée comme FISP (IL-4 induced secreted protein), qui est sélectivement
exprimée et sécrétée par les cellules Th2. Des niveaux détectables d'IL-24 (FISP) sont
observés seulement 3 jours après le début de la différenciation Th2 et son expression nécessite
au moins deux signaux : voie de signalisation TCR impliquant la protéine kinase C (PKC) et
voie de signalisation de l'IL-4R qui est STAT6 dépendante (Schaefer et al., 2001). Cependant,
chez l'homme, l'expression d'IL-24 dans les cellules T semble être régulée différemment que
chez la souris. En effet, à courte durée (6h), son expression est inhibée dans un contexte Th1
et faiblement augmentée dans un contexte Th2. Un effet inverse est observé à longue durée
(66h) (Wolk et al., 2002). Plus récemment, les travaux de Poindexter et al., suggèrent que
l'IL-24 semble être exprimée par les cellules Th1 et induite par IL-2, IL-7, IL-15, TNF-α, IL-
1β et GM-CSF (Poindexter et al., 2005). Par contre, une étude menée par Chan et al montre
que l'IL-23 induit l'expression de l'IL-19 et l'IL-24 dans la peau chez la souris et ceci dans un
modèle de psoriasis (Chan et al., 2006). L'expression de ces deux gènes (IL-19 et IL-24) est
élevée en cas de psoriasis chez l'homme. Etant donné que l'IL-23 est la cytokine
indispensable à la polarisation des cellules Th0 en Th17, ceci suggère que l'induction de l'IL-
24 pourrait être de type Th17. Ces résultats vont dans le même sens que nos résultats non
publiés qui suggèrent que l'induction de l'IL-24 par les cellules B activées avec anti-IgM plus
CD40L est biphasique : à j1 cette expression est augmentée dans un contexte Th2 et Th17, par
contre à j5 elle est plutôt augmentée dans un contexte Th1 et Th17, et significativement
inhibée dans un contexte Th2 (Résultats, figure 30).

Globalement, nous pouvons constater que les résultats concernant l'expression et l'induction
de Mda-7/IL-24 dans les cellules du système immunitaire présentent des incohérences selon
les études. Ainsi, les travaux de Wang et al., montrent que les cellules de PBMC ne
produisent pas de Mda-7/IL-24 après activation par du LPS mais après activation par la
Concanavaline A (Wang et al., 2002). Ces différentes études emploient des techniques et des
protocoles très différents et ne nous permettent pas de définir aujourd'hui quelles sont les
cellules qui produisent Mda-7/IL-24 de manière constitutive ou dans quelles conditions. Une
étude plus extensive en utilisant diverses approches expérimentales doit être réalisée.

3 Effet de l'IL-24 sur les cellules immunitaires

L'IL-24 est capable d'induire la production d'IL-6, TNF-α et IFN-γ par les cellules de PBMC, ainsi que IL-1β, IL-12 et GM-CSF à un plus faible niveau. L'induction de la production de ces cytokines pro-inflammatoires par l'IL-24 est partiellement ou complètement inhibée par l'IL-10 (Caudell et al., 2002 ; Wang et al., 2002). Ces observations
soulèvent la question du profil d'expression des récepteurs à l'IL-24. Quelles sont les cellules et les tissus de l'organisme sensibles à l'action de l'IL-24 ?

## 4 IL24 et lymphocytes B

Dans la littérature, très peu d'études montrent que les lymphocytes B expriment l'IL-24 (Wolk et al., 2002), et parmi celles-ci, aucune n'identifie les sous-populations l'exprimant. Récemment notre équipe a pu démontrer par tri cellulaire des sous populations B suivi d'une PCR en temps réel que les cellules B CD5⁺ exprimaient fortement Mda-7/IL-24 en comparaison avec les cellules B CD5⁻ (Maarof et al., 2010). Ils ont également montré, avec le marquage IgD, CD44, CD27 et CD38 que l'expression de Mda-7/IL-24 était présente dans les cellules B naïves (IgD⁺ CD44⁺) et qu'il est accru dans les centrocytes (IgD⁻ CD44⁺) et quasiment absent dans les centroblastes (IgD⁻ CD44⁻) ainsi que dans les plasmocytes (CD27⁺ CD38<sup>high</sup>). En revanche, cette expression est prédominante dans les lymphocytes B mémoires (CD27⁺ CD38⁻). Maarof et al ont pu également visualiser l'expression de l'IL-24 *in vivo* dans les cellules B des tissus lymphoïdes secondaires à l'aide d'une coloration par immunofluorescence effectuée sur des sections congelées d'amygdales humaines avec l'anti-CD20 et anti-IL-24. Les résultats ont montré la présence de cellules B doublement marquées (CD20⁺, IL-24⁺) dans les follicules généralement situées à la périphérie des follicules secondaires, immédiatement adjacentes à la zone périfolliculaire des cellules T où l'on note également la présence de nombreux lymphocytes T exprimant l'IL-24. Fait à noter, très peu de cellules B exprimant l'IL-24 ont été trouvées dans la zone sombre du centre germinatif, dans le centre de la zone claire, dans le paracortex riche en lymphocytes T et dans les cordons médullaires.

Nos résultats obtenus avec les biopuces à ADN montrent pour la première fois que l'IL-24 inhibe l'expression des gènes de la synapse immunologique (CD3ε, CD8α, CD8β, ZAP-70 et LAT) (résultats non publiés). Ainsi, selon nos résultats, et en tenant compte de la localisation de la sous population B (B CD5⁺) exprimant l'IL-24 (Zone de contact B-T), un rôle potentiel à l'IL-24 dans la régulation de la réponse immune pourrait être attribué. Mais il reste également à déterminer quels sont les facteurs qui induisent l'expression de l'IL-24 dans la sous population B CD5⁺ du manteau. Maroof et al ont suggéré qu'une combinaison de stimulation CD40 et du BCR pourrait optimiser l'induction de l'IL-24 par les cellules B du centre germinatif (Maarof et al., 2010). Notons que les cellules B CD5⁺ sont localisées aussi bien dans le manteau que dans la zone sous épithéliale des amygdales, et que lors des travaux
de Maarof et al, ce sont les cellules B CD5⁺ du manteau et les autres cellules B CD5⁺ qui ont été analysées. Ceci nécessiterait d'autres travaux afin de préciser quelles cellules B CD5⁺ expriment l'IL-24.

## 5 IL24 et plasmocytes à vie courte

Chez l'homme ainsi que chez la souris, l'activation des cellules B naïves et leur différentiation en plasmocytes se font de deux manières :

1) différentiation plasmocytaire T-dépendante donnant naissance à des plasmocytes de longue durée de vie. Ceci nécessite l'engagement du BCR et l'intervention de cellules T via CD40L et IL-10, aboutissant à la formation des centres germinatifs et des cellules B mémoires. Les cellules B mise en cause sont plutôt des cellules B2 ou cellules B folliculaires (FO).

2) différentiation plasmocytaire T-indépendante donnant naissance à des plasmocytes de courte durée de vie. Ce phénomène se fait indépendamment des cellules T et du BCR. Il fait intervenir d'autres cellules, comme les cellules dendritiques myéloïdes (DC) (Balázs et al., 2002; Litinskiy et al., 2002; MacLennan and Vinuesa, 2002) et les cellules dendritique plasmacytoïdes (pDC) (Jego et al., 2003).

Chez la souris, il a été démontré que l'activation de la plupart des TLR aboutit à la différentiation des cellules B1a et B MZ en plasmocytes de courte durée de vie (Genestier et al., 2007). Chez l'homme, et dans le cadre d'une réponse antivirale, les cellules pDC induisent la différentiation plasmocytaire des cellules B de PBMC en plasmocytes de courte durée de vie et ceci par l'intervention séquentielle de l'IFNα et de l'IL-6 (Jego et al., 2003). Notre équipe a démontré que l'IL-24 inhibe la différentiation plasmocytaire dans une réponse T-dépendante (Maarof et al., 2010). Quel est, entre autres, le rôle de l'IL-24 dans la différentiation des plasmocytes à courte durée de vie produits au cours d'une réaction extra-folliculaire (surtout dans des modèles murins) T-indépendante dans le cadre d'une réponse antibactérienne ou antivirale ? Dans ce contexte, l'interaction possible de l'IL-24 avec les voies de signalisation de l'IFNα et/ou IL-6, ainsi que son rôle par rapport aux autres membres de la famille de l'IL-10 (effet synergique versus antagoniste ?) reste à définir tout comme l'impact de l'IL-24 sur les fonctions (système immunitaire innée et adaptatif) des autres types de cellules du système immunitaire.
Signalons que ce sont surtout les cellules B humaines du manteau (B CD5⁺) qui expriment l'IL-24 *in vivo* (résultats sur coupes de tissu) (Maaroof et al., 2010). Par ailleurs, les cellules de PBMC humaines stimulées par l'IL-24 purifié à partir du surnageant d'une lignée de cellules 293 produisent de l'IL-6 (Caudell et al., 2002). Ceci suggère un rôle potentiel de l'IL-24 dans la différentiation de plasmocytes à vie courte et surtout au stade plasmablastes-plasmocytes.

## 6 IL24 et lymphocytes B mémoires

Maaroof et al ont démontré que l'IL-24 inhibe la différentiation plasmocytaire. Par contre, elle sensibilise les cellules à la prolifération induite par CD40L (Maaroof et al., 2010). Etant donné que les cellules B mémoires, mais pas les plasmocytes, répondent à une stimulation par CD40L, cela suggère que l'IL-24 redirige la différentiation des cellules B du centre germinatif vers la voie mémoire. Cette voie pourrait être « passive » si l'IL-24 « ferme les portes » de différentiation plasmocytaire laissant seule la voie B mémoire disponible. Mais elle pourrait également être un choix « actif » en améliorant la réactivité des cellules B à la maturation induite par CD40L. En effet, cette hypothèse a été prise en compte pendant nos travaux. Mais des résultats non publiés montrent que l'IL-24 n'a pas un effet sur l'induction de l'AID, enzyme clé dans la différentiation B mémoire (figure 43). Ceci suggère que les cellules B du centre germinatif seraient plutôt obligées, par un choix passif, d'emprunter la voie mémoire, vu que la voie plasmocytaire est bloquée par l'IL-24.

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

**Figure 43 :** Analyse de l'expression de l'AID par q-PCR. L'IL-24 a été utilisé comme contrôle positif d'expression d'AID et trois concentrations d'IL-24 ont été testées (50, 100 et 200 ng/ml).
# 7 Aspect controversé de l'expression de l'IL-24R dans les LB

Notre travail sur les résultats de l'IL-24 implique que l'un des récepteurs de l'IL-24 soit exprimé par les lymphocytes B. ceci a été démontré par notre équipe (Maarof et al., 2010) et confirmé au cours de ce travail (voir chapitre résultats, figures 32-35) dans les lymphocytes B d'amygdales ainsi que ceux de PBMC, mais également dans les cellules B DAUDI (résultats non publiés). Nos résultats ont été comparés avec un contrôle positif : la lignée de thymome murin BW5147 sauvage ou bien transfectée par deux chaines, IL-20Rα et IL-20Rβ (hétérodimère IL-24R1), gracieusement fournie par J-C Renauld (Dumoutier et al., 2001). Par ailleurs, l'expression de l'IL-22Rα1 est positive dans les cellules B de PBMC non stimulées et faiblement induite suite à l'activation des cellules totales d'amygdales par LPS. Ceci semble être en contradiction avec les résultats obtenus par LECRON et al., et WOLK et al., (Boniface et al., 2005; Lécart et al., 2002; Wolk et al., 2004), qui ont montré que l'expression de l'IL-22Rα1 est limitée aux cellules non hématopoïétiques. Cette contradiction est peut être due à la différence de techniques utilisées. En effet, LECRON et al., et WOLK et al. ont limité leur analyse à l'expression des transcrits de l'IL-22Rα1 par RT-PCR sans étudier leur expression membranaire comme nous l'avons fait au cours de ce travail par cytométrie en flux.

Enfin, la question posée est de confirmer si les récepteurs « conventionnels » de l'IL-24 sont bien exprimés sur les cellules B, ou si l'IL-24 agit également par l'intermédiaire d'un autre récepteur inconnu, ou encore interagit avec un autre récepteur de cette famille de cytokines. Une telle interaction serait de faible affinité à concentrations élevées, de l'ordre de 100 ng/ml d'IL-24 telles que nous les avons utilisées. Cependant, des résultats non publiés sur les cellules B montrent que l'IL-10 mais pas l'IL-22 a des effets antagonistes sur l'apoptose induite par l'IL-24. Ceci suggère donc fortement que l'effet de l'IL-24 est bien spécifique sur les lymphocytes B.

# 8 Rôle de l'IL-24 dans le système immunitaire

Le rôle physiologique joué par Mda-7/IL-24 dans la réponse immune est longtemps resté inconnu. C'est en 2010 que He et al., ont mis au point une lignée de souris transgéniques dans laquelle l'IL-24 est placée sous le contrôle du promoteur de la kératine 5. Ceci permet une expression épidermique de l'IL-24. Cette souris présente de nombreux phénotypes similaires à ceux observés chez des souris transgéniques IL-20 et IL-22, y compris une mortalité
néonatale, une hyperplasie de l'épiderme et une anomalie de la différentiation des kératinocytes. Ces résultats confirment le rôle largement redondant des fonctions épidermiques de l'IL-20, IL-22 et IL-24, qui semble être l'IL-22R1 dépendante. De plus, ils ont montré que les souris transgéniques IL-24 présentent une infiltration des macrophages dans le derme de façon concomittante à une augmentation de la production de MCP-1/CCL2 à la fois par les kératinocytes de l'épiderme et les kératinocytes des infiltrats leucocytaires dans la couche adjacente cutanée ci-dessous (He and Liang, 2010).

## 9 Effet antiviral potentiel de l'IL-24

Nos résultats montrent pour la première fois que l'IL-24 inhibe l'expression des gènes du « métabolisme de l'ADN », tel que défini par le programme « G0 », les cellules B activées. Il est possible que l'IL-24 soit efficace pour ralentir le développement des virus à ADN (exemple : famille Herpes). Cependant, l'IL24 peut-elle bloquer la réplication des virus à ARN ?

A l'appui de cette hypothèse, l'expression de Mda-7/IL-24 est induite dans les monocytes humains pré-cultivés après infection par le virus de la grippe A (A/PR/8) (Garn et al., 2002). Cette expression est à mettre en parallèle avec celle d'autres cytokines comme IL-1, IL-6, TNF-α et des chimiokines d'attraction des monocytes (MIP-1, MCP-1 et RANTES) qui ont également été décrites pour être induites par une infection du virus de la grippe dans des conditions comparables (Peschke et al., 1993; Sprenger et al., 1996). Ceci suggèrerait un rôle de Mda-7/IL-24 dans la réponse immune antivirale (Garn et al., 2002). En revanche, nos résultats montrent une inhibition des transcrits de CD8α et β ainsi que de CD3ε et LAT, gènes impliqués dans la synapse immunologique et la réponse T (résultats non publiés). Ceci suggère une inhibition des cellules T cytotoxiques, ce qui est contradictoire avec le rôle antiviral potentiel de l'IL-24 suggéré par Garn et al. Cette contradiction est peut être compensé par une activation des cellules NK, étant donné que nos résultats montrent que l'IL-24 inhibe fortement les gènes KIR2DL4, CD244 et NCR1. Ces derniers codent pour des protéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules NK et reliées par leurs domaines cytoplasmiques à un motif ITIM (Immune Tyrosine-based Inhibitory Motif) qui transduisent un signal inhibiteur de l'activité cytolytique des cellules NK. Donc l'IL-24 activerait les cellules NK.
Nos résultats ont également montré une inhibition des transcrit de CCR5 (récepteur de CCL3, CCL4, CCL5 et un corécepteur majeur du virus HIV) ainsi que de CCL5/RANTES (chimioattractant des cellules immunitaires : monocytes, Th et éosinophiles). Ces gènes codent pour des chimiokines favorisant l'entrée du virus HIV dans la cellule hôte. Ceci suggère que l'IL-24 pourrait inhiber l'entrée de certains pathogènes dans la cellule hôte et inhiber la réplication virale. Par ailleurs, la forte activation par l'IL-24 de CXCL9/MIG, une monokine induite par l'IFNγ et qui attire *in situ* les cellules productrices d'IFNα, suggère aussi le rôle antiviral potentiel de cette cytokine. En revanche, l'inhibition du gène CSF2/GM-CSF pourrait signifier que l'IL-24 inhibe spécifiquement certaines fonctions des monocytes (réponse au LPS) ou bien les fonctions des polynucléaires neutrophiles.

Enfin, certains de nos résultats étudiant l'effet de l'IL-24 sur l'expression des gènes qui codent pour des chimiokines (surtout CCL5) sont en contradiction avec ceux obtenus par He et Liang (He and Liang, 2010) montrant que l'IL-24 induit la production de chimiokines (surtout MCP-1/CCL2). Ce dernier est un chimioattractant des monocytes. Par contre, nous avons montré que l'IL-24 inhibe l'expression de transcrit de CCL5. Cette différence entre nos résultats et ceux de He et al, pourrait être due à la différence de modèle utilisé. He et al, ont utilisé un modèle murin, par contre, nous avons utilisé un modèle humain. Une deuxième raison pourrait dépendre des cellules utilisées comme sources de l'IL-24 (kératinocytes pour He et al contre lymphocytes B dans notre modèle).

## 10 IL-24 et autres cytokines de la famille de l'IL-10

L'IL-24 est un membre de la famille de l'IL-10 et en tant que tel, l'étude de son rôle dans l'organisme est indissociable de son interaction avec les autres membres de la famille de l'IL-10. Etant donné que l'IL-24 partage souvent les mêmes chaînes de récepteurs avec les membres de la famille de l'IL-10 (Parrish-Novak et al., 2002) et met en route le même processus de signalisation (Dumoutier et al., 2001), elle peut donc entrer en compétition avec d'autres membres tels que IL-19, IL-20 et IL-22 et antagoniser leur effet.

Le cas du psoriasis représente un bon modèle. Dans les lésions psoriasiques l'IL-19 et l'IL-20 sont exprimées au niveau de l'épiderme. Alors que par histochimie on a montré que l'IL-24 est exprimée dans les cellules mononucléées de l'infiltrat au niveau du derme (Rømer et al., 2003). Il est très probable que l'équilibre de production entre ces différentes cytokines ait un impact sur le développement de cette pathologie. Un traitement par rayons UV est souvent
prescrit et à pour objectif d'apaiser les symptômes de la maladie. Nous savons qu'une
exposition aux rayons UV provoque des altérations du génome conduisant à l'activation de la
voie de stress cellulaire p38 MAPK. Mda-7/IL-24 pourrait très bien jouer un rôle de
régulateur négatif de la réponse immune dans cette pathologie via l'activation de cette voie. Il
serait intéressant d'analyser l'expression de Mda-7/IL-24 dans les kératinocytes et les
monocytes de patients atteints de psoriasis avant et après traitement.

L'équipe de Lecron et al, a montré que l'IL-22 est un facteur clé de l'activation et de la migration des kératinocytes. Elle induit la production de plusieurs facteurs pro-inflammatoires, et diminue l'expression des gènes associés à la différentiation des kératinocytes. Cette étude met également en évidence une augmentation de l'expression de l'IL-22 dans la peau de sujets psoriasiques, suivie d'une hyperplasie de l'épiderme (Boniface et al., 2005). Ces résultats semblent concordants avec les résultats obtenus par He et al dans un modèle d'une souris transgénique IL-24 au niveau de la peau. Ainsi, l'IL-24 jouerait un rôle synergique avec l'IL-22 dans un modèle de psoriasis. L'IL-24 pourrait également inhiber la prolifération des kératinocytes induite par IL-22 (effet feedback) (figure 44).

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 44 :** Représentation schématique de l'effet synergique possible de l'IL-24 sur la prolifération des kératinocytes.</figcaption></figure>
PERSPECTIVES
# 1 Mécanisme d'action de l'IL-24

Dans ce travail, nous avons mis en évidence pour la première fois un nouveau mode d'action de l'Il-24 au niveau moléculaire. Ce mécanisme complète nos résultats précédents. Il démontre que l'IL-24 a un rôle pro-apoptotique dans les cellules lymphoïdes activées au préalable.

Nos perspectives sont de démontrer si ce mécanisme est général (dans des cellules non lymphoïdes également). Dans ce but, nous développons actuellement un modèle de lignées épithéliales (Mda7, SCOV et OVCAR) dérivées, respectivement, de cancer du sein, de la prostate et de l'ovaire ainsi dans des lignées lymphoïde (lignée Daudi) et myéloïde (lignée K562) experimant l'IL-24 sous contrôle d'un promoteur conditionnel. Ces expériences nous diront si l'activation préalable par un facteur de croissance, combiné à l'effet secondaire de l'IL-24, est une option pour entrainer l'apoptose de ces cellules.

Le fait que la réactivation de p53 dans des tumeurs *in vivo* entraine leur régression va dans le sens de cette hypothèse (Ventura et al., 2007). En effet nous avons auparavant montré que l'IL-24 déréprime p53 et stabilise cette protéine dans des cellules de LLC.

# 2 IL-24 et immunité

## 2.1. IL-24 et la réponse B T-dépendante

Notre équipe à démontré que l'IL-24 est exprimée dans les cellules B de type mémoire, normales et pathologiques (LLC). Le mécanisme de cette expression fait suite à une co-stimulation par anti-IgM et CD40L de cinq jours, ce qui évoque une stimulation T-dépendante et une coopération T-B efficace de type « cognate ». Il reste à définir quel(s) type(s) d'interactions T/B (systèmes récepteurs-ligands de surface, molécules solubles...), en dehors du signal CD40, a un impact clair sur la régulation de cette production. Dans ce contexte également, le type exact du partenaire T reste à démontrer (lymphocytes T de type Th1, Th2, Th17 ou Treg). Il est également fortement probable que la nature elle-même de l'antigène stimulant la réponse T-dépendante pourrait déterminer l'induction ou non de la production de l'IL-24.
## 2.2. IL-24 et la réponse B T-indépendante

Il reste également à définir si les éventuels signaux T-indépendants, autres que ceux testés dans nos expériences (BAFF, SDF1, CPG ODN, IFN/Imiquimod...), peuvent réguler l'expression de l'IL-24 dans des cellules B. Quel est, entre autres, le rôle de l'IL-24 dans la différentiation des plasmocytes à courte durée de vie qui sont produits au cours d'une réaction extra-folliculaire (surtout dans des modèles murins) T-indépendante dans le cadre d'une réponse antibactérienne ou antivirale ? Dans ce contexte, l'interaction possible de l'IL-24 avec les voies de signalisation de l'IFNα et/ou IL-6 mérite d'être analysée. En effet, comme cela a été proposé par l'équipe de J.Banchereau dans une étude de la différentiation des plasmocytes à courte durée de vie au cours d'une réponse antivirale, le couple l'IFNα/IL-6 jouerait un rôle essentiel dans cette différentiation (Jego et al., 2003). Dans ce contexte, le rôle de l'IL-24 par rapport aux autres membres de la famille de l'IL-10 (effet synergique versus antagoniste ?) reste également à définir tout comme l'impact de l'IL-24 sur les fonctions (système immunitaire inné ou adaptatif) des autres types de cellules du système immunitaire.

## 2.3. IL-24 et la fonction des cellules présentatrices de l'antigène (APC)

Une question particulièrement importante concerne l'effet de l'IL-24 sur les fonctions des DC ou autres types des cellules présentatrices d'antigène. En effet, les expériences préliminaires de notre équipe suggèrent un effet stimulant sur ces fonctions.

Un outil important afin de mener à bien ces recherches serait la disponibilité de modèles des souris IL-24 KO conditionnels ou de souris transgéniques surexprimant le gènes de IL-24 dans différentes sous-populations lymphocytaires B (modèles des souris IL-24 flox/flox croisées avec des souris CD19-Cre, BLIMP1-Cre ou Pax5-Cre) (figure 45 page suivante) ou d'autre part des souris transgéniques CD19-IL-24, BLIMP1-IL-24 ou Pax5-IL-24 (figure 46 page suivante). Ces modèles permettraient de démontrer de façon formelle le rôle de l'IL-24 (l'absence de l'expression ou l'expression constitutive) sur la différentiation lymphocytaire B et la maturation de la réponse B in vivo.
Croisements de souris transgéniques :

1) IL-24 flox/flox

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

CD19-Cre

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

2) IL-24 flox/flox

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

Blimp-1-Cre

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

3) IL-24 flox/flox

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

Pax5-Cre

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

Souris obtenues:

CD19-Cre; IL-24 flox/flox

Blimp-1-Cre; IL-24 flox/flox

Pax5-Cre; IL-24 flox/flox

Question posée:

Rôle de l'expression de l'IL24
par les cellules B dans
leur différentiation
fonctionnelle

Rôle de l'expression de l'IL24
par les cellules B déjà engagées
dans la voie de différentiation
plasmocytaire

Rôle de l'expression de l'IL24
par les cellules B déjà engagées
dans la voie de différentiation
mémoire

**Figure 45 : modèles de souris Knock-out conditionnels pour l'analyse du rôle de l'IL24 dans la différentiation fonctionnelle de la réponse B.** Grâce au système Cre/loxP, il est possible d'induire, en exprimant la recombinase Cre, l'excision d'une séquence d'ADN encadrée par deux sites loxP de même orientation. Cette technique a été largement utilisée afin d'étudier, de façon tissu/cellule spécifique, la fonction des gènes chez la souris, notamment dans le cadre ou leur inactivation biallélique germinale n'est pas viable.

Les souris transgéniques :

1)

CD19-IL24

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

2)

Blimp-1-IL24

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

3)

Pax5-IL24

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

Question posée:

Rôle de l'expression de l'IL24
par les cellules B dans
leur différentiation
fonctionnelle

Rôle de l'expression de l'IL24
par les cellules B déjà engagées
dans la voie de différentiation
plasmocytaire

Rôle de l'expression de l'IL24
par les cellules B déjà engagées
dans la voie de différentiation
mémoire

**Figure 46 : modèles des souris transgéniques pour l'analyse du rôle de l'IL24 dans la différentiation fonctionnelle de la réponse B (expression constitutive du gène de l'IL24 dans la population cellulaire ciblées).**
# 3 IL-24 et Tumeurs

## 3.1. LLC

IL-24 augmente la survie des cellules quiescentes dans le modèle de la LLC (Sainz-Perez et al., 2006). Il serait donc intéressant d'étudier le mécanisme moléculaire impliqué dans cet effet. D'autre part, l'IL-24 déclenche la mort par apoptose des cellules en cycle. Dans notre travail, nous avons défini un mécanisme moléculaire responsable de cet effet, et commencé à valider l'hypothèse que la présence de l'IL-24 déréprime p53, qui est considéré comme facteur de stress cellulaire et serait donc associée à l'induction de l'apoptose.

Il serait également intéressant d'étudier une corrélation possible entre l'expression de l'IL-24 dans les cellules de la LLC et leur statut mutationnel, le stade de la maladie ou le pronostique du patient.

## 3.2. Autres cancers

Comme dans le cas de la LLC, l'IL-24 pourrait représenter un inducteur de l'apoptose dans d'autres types de cellules cancéreuses. L'expression du récepteur de l'IL-24 déjà confirmée dans certaines cellules cancéreuses, suggérant que l'utilisation potentielle de cette cytokine pourrait constituer une stratégie thérapeutique anti-tumorale chez l'homme.

# 4 L'IL-24 et les cellules endothéliales

Une question ouverte et intéressante réside dans la démonstration de l'expression et du rôle de l'IL-24 dans les cellules endothéliales. L'endothélium humain peut exprimer différentes cytokines (Mantovani et al., 1998, 1992) y compris les cytokines de la famille de l'IL-10. En effet, l'IL-10 induit l'expression de SOCS-3, un régulateur négatif de la production de différentes autres cytokines par les cellules endothéliales. Elle est également capable d'induire l'expression de molécules inhibitrices de la réponse T comme ILT3/4 (Immunoglobulin-Like Transcript 3 and 4), via l'induction de l'expression du facteur GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) (Gleissner et al., 2007). Il serait donc intéressant d'étudier l'effet de l'IL-24 sur les fonctions de cellules APC de l'endothélium humain activé et dans l'endothélium des tissus périphériques (l'expression de l'IL-24 restant à démontrer) ainsi qu'au niveau du tissu lymphoïde secondaire (résultats non publiés de Maarof et al).
# 5 L'IL-24 et vaccinations

Des résultats non publiés de notre équipe montrent que l'IL-24 recombinante augmente la capacité des DC dérivées de monocytes à présenter des antigènes aux lymphocytes T. Les mécanismes moléculaires de cette action restent cependant inconnus. Ces résultats renforcent l'hypothèse que l'IL-24 agirait comme cytokine « co-stimulatrice » des réponses immunitaires, une action qui présenterait un intérêt potentiel dans les vaccinations. Dans ce cadre, l'IL-24 favoriserait la différentiation des cellules B mémoires qui font la réponse accélérée et qui représente l'un des objectifs majeurs de la vaccination. Il serait donc intéressant d'analyser l'association de cette cytokine aux protocoles de vaccination afin d'améliorer la réponse immune ainsi générée (figure 47).

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

**Figure 47 :** Représentation schématique du rôle possible de l'IL-24 dans la vaccination. (1) l'IL-24 augmente la capacité des DC à présenter des Ag aux LT qui à leur tour active la différenciation des LB, d'une façon passive, vers la voie mémoire. (2) l'IL-24 augmente la survie des cellules hors cycle (G0/G1) ou cellules quiescentes, y compris les B mémoires. (3) l'IL-24 inhibe la différentiation plasmocytaire des LB et favorise d'une façon passive la voie B mémoire.
# TRAVAIL ANNEXE
## High Membrane Cholesterol in CLL B-Cells and Differential Expression of Cholesterol Synthesis Genes in IG GENE-Unmutated vs Mutated Cells

Cécile Tomowiak, Anne Kennel, Hélène Gary-Gouy, Nader Hadife, Pierre Feugier, Torsten Haferlach, MC Béné et Ali Dalloul.

## Discussion de l'article :

Les travaux précédant de notre équipe conduisant à la mise au point de lignées Daudi, transfectées avec le gène du CD5 (Gary-Gouy et al., 2002) avaient été suivis d'une analyse transcriptomique de ces lignées comparées aux cellules Daudi « vecteur vide ».

Parmi les gènes induits par CD5, se trouvaient plusieurs gènes de synthèse du cholestérol à partir de HMG coA. Fait intéressant, l'expression de ces mêmes gènes est fortement induite dans les cellules de LLC (B CD5+) en comparaison aux cellules B normales. Une étude a donc été lancée afin d'analyser la quantité de cholestérol membranaire dans les cellules de malades et de la comparer aux cellules B normales du sang et à la sous population B CD5+ normale.

L'autre raison de cette étude est que les cellules leucémiques sont connues pour être faiblement répondeuses à une stimulation par anti-IgM. Or le cholestérol est nécessaire à l'internalisation du BCR après stimulation et maintient le caractère anergique dans un modèle de cellules B murines transgéniques HEL/anti-HEL (Bléry et al., 2006). Nous avons donc analysé l'expression du cholestérol à la surface cellulaire en utilisant sa propriété de liaison à un antibiotique fluorescent, la Filipin.

Les cellules de 26 malades ont été cultivées ou non en présence de Lovastatine, un inhibiteur de synthèse du cholestérol. Les cellules sub-G1 ont été analysées en cytométrie en flux, et les autres de Gumprecht comptées sur lames après coloration de Giemsa.

L'expression des gènes de synthèse a été analysée sur des données transcriptomiques du projet MILE incluant 150 LLC et 110 contrôles. Parmi les LLC, 134 ont été testées pour le caractère IgVH «muté» ou « non muté».

Nos résultats expérimentaux ont confirmé l'augmentation de cholestérol sur les cellules B leucémiques comparées aux cellules B normales, y compris les cellules B CD5+.

L'analyse des données du projet MILE a également confirmé que, parmi les gènes incriminés, 4 gènes (LSS, Cyp51A1, NSDHL et SC5DL) ont une expression augmentée dans les formes
indolentes « mutées » par rapport aux formes agressives « non mutées ».

Au total, une forte expression/synthèse de cholestérol serait un signe de bon pronostic et irait avec un caractère « anergique » des cellules B, plus prononcé dans les formes indolentes.

Enfin, la Lovastatine induit la mort des cellules leucémiques *in vitro* de manière dose-dépendante. L'expression d'Im n'a pas été affectée. En revanche, celle de CD19 et CD5 a été inhibée à des doses très fortes de Lovastatine ($10^{-4}$ M).

En conclusion, une forte expression de cholestérol à la membrane plasmique des cellules de LLC jouerait un rôle physiologique et expliquerait la sensibilité des cellules aux Statines, au moins en ce qui concerne les formes « mutées » IgVH.

Malheureusement cette étude n'a pas permis de conclure que les formes graves de LLC seraient également sensibles aux Statines.

Il reste possible que ces molécules puissent être utilisées comme traitement additionnel à l'Immuno-chimiothérapie classique, ce qui nécessiterait une étude plus spécifique.
<figure><img src="image_72.png" /></figure>

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

# High Membrane Cholesterol in CLL B-Cells and Differential Expression of Cholesterol Synthesis Genes in IG GENE-Unmutated vs Mutated Cells

Cécile Tomowiak<fnref n="1" />,<fnref n="4" />, Anne Kennel<fnref n="1" />, Hélène Gary-Gouy<fnref n="2" />, Nader Hadife<fnref n="1" />, Pierre Feugier<fnref n="1" />, Torsten Haferlach<fnref n="3" />, Marie C Béné<fnref n="1" /> and Ali Dalloul<fnref n="1" />,<fnref n="2" />*

## Research Article

Received 15th October 2011
Accepted 7th January 2012
Online Ready 28th March 2012

## ABSTRACT

**Objectives:** Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is associated with abnormalities of the B-Cell Receptor (BCR) signalling, including low responsiveness to antigenic stimulation and constitutive phosphorylation of several components of the signalling pathway. In B-cells, BCR-mediated signalling is regulated in part by the amount of membrane cholesterol. It was observed that Statins, pharmacological inhibitors of cholesterol synthesis, induce apoptosis of CLL cells *in vitro* and *in vivo*. Having previously reported that ectopic expression of CD5 in a B-cell line stimulated the transcription of genes involved in the synthesis of cholesterol, we investigated the expression and synthesis of cholesterol in CLL B-cells.

**Study Design & Methodology:** Plasma membrane cholesterol in CLL cells was evaluated by staining with Filipin and Flow cytometry in 26 patients. CLL cells were cultured with Lovastatin and subG1 cells and Gumprecht's shadows counted thereafter; surface expression of IgM, CD19 and CD5 was analysed. The expression of cholesterol synthesis genes was investigated in transcriptomic data from the MILE project (150 CLL and 110 controls).

<footnote n="1">¹EA RHEM 4369, Faculté de Médecine, Nancy Université, 54511, Vandoeuvre les Nancy, France.</footnote>

<footnote n="2">²IFR IPSIT, 32 rue des carnets, 92140, Clamart, France.</footnote>

<footnote n="3">³MLL München Leukemia Labor, Munich, Germany.</footnote>

<footnote n="4">⁴Present address: Service d'Hématologie, CHU de Poitiers, France.</footnote>
**Results:** We confirmed that leukemic B-cells contained more cholesterol in their plasma membranes than their normal counterparts. An enhanced expression of genes involved in the synthesis of cholesterol in CLL as compared to healthy controls was observed. Interestingly, among the 150 CLL patients analyzed, four cholesterol synthesis genes were activated in 65 "Ig-mutated" (M) in comparison to 69 "Ig-unmutated" (UM) CLLs. Leukemic cells cultured with Lovastatin exhibited a dose-response apoptosis, however surface IgM expression was unaffected and CD19 and CD5 were downregulated at highest concentrations only.

**Conclusions:** High membrane cholesterol in CLL cells may explain their sensitivity to Statins, with a potential difference between UM- and M-CLL.

Keywords: Chronic lymphocytic leukaemia; cholesterol; apoptosis; statins.

# 1. INTRODUCTION

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) expands from B-cells endowed with resistance to apoptosis and frequently stereotyped antigen receptors, as inferred from restricted IGVH and IGVL gene usage and a frequently autoreactive BCR repertoire (Chiorazzi et al., 2005; Schroeder et al., 1994; Stevenson et al., 2004). Patients segregate in two major groups, one in which the immunoglobulin heavy (IgH) chain variable fragment (VH) is in germline configuration (unmutated, UM), and the other in whom the VH gene presents somatic mutations (mutated, M) (3). UM and M patients undergo severe and mild clinical evolution respectively (Hamblin et al., 1999). The BCRs of UM and M clones use distinct variable VH genes which suggest that they can recognize different antigens and that M CLL cells have encountered this antigen which could be an infectious agent or a self-antigen (Hamblin, 1999; Klein et al., 2001; Rosenwald et al., 2001; Hervé et al., 2005; Lanemo Myhrinder et al., 2008). Yet both M and UM CLL clones originate from autoreactive cells (Hervé et al., 2005) and the malignant B-cell clone of CLL patients often produce auto-antibodies (Ruzickova et al., 2008). Most likely, CLL B-cells display properties that allow them to escape from several physiological checkpoints in charge of deleting autoreactive B-cells in the bone marrow (Wardeman et al., 2003; Lagneaux et al., 1998) and in the periphery (Meffre et al., 2008).

CLL B-cells display surface phenotype and mRNA signatures characteristic of antigen-experienced memory B-cells (Stevenson et al., 2004; Hamblin et al., 1999; Klein et al., 2001), suggesting repeated stimulation of the BCR, a condition that may lead to BCR desensitization also called anergy (Villen et al., 1999). Accordingly, in contrast with normal B-cells, the response of leukemic cells to BCR stimulation is poor as evidenced by low protein phosphorylation and intracellular Ca2+ mobilization (Michel et al., 1993; Lankester et al., 1995). However and possibly reflecting their higher proliferation capacity, UM CLL-cells are less anergic than M CLL-cells as they respond better to BCR stimulation (Stevenson et al., 2004; Lanham et al., 2003).

Following antigen encounter, the BCR moves to cholesterol/sphingolipid- enriched lipid rafts. This first step occurs before phosphorylation of the BCR complex on CD79 and activation of BCR-associated molecules (Pierce et al., 2002; Gupta et al., 2007). Cholesterol is therefore essential in regulating BCR-mediated signals especially in anergic cells (Blery et al., 2006). CD5 expression is a feature of CLL B-cells and a prominent diagnostic marker of this disease (Matutes et al., 1994). We previously generated a permanent B-cell line with ectopic
expression of CD5 at the cell surface (Gary Gouy et al., 2002). Comparing vector- and CD5-
transduced cells by DNA chip technology, we were surprised to find that most cholesterol
synthesis genes were activated by CD5 (Gary Gouy et al., 2007). We therefore examined
whether CLL B-cells might be enriched in membrane cholesterol (possibly as a consequence
of their CD5 expression) in comparison to normal B-cells. We also analyzed transcriptomic
data (Haferlach et al., 2010) in search for alterations in cholesterol synthesis genes in CLL.
Finally, as Statins, drugs known for their impact on cholesterol metabolism, were reported to
induce the apoptosis of CLL cells (Vitols et al., 1997; Chapman Shimshoni et al., 2003), we
analyzed the impact of these drugs on the expression of IgM and other cell surface markers
of CLL B-cells.

2. PATIENTS, MATERIALS AND METHODS

**2.1 Patients**

Peripheral blood samples from a total of 26 patients, 13 males and 13 females, with a mean age of 64 year old (median: 69 y.o, range: 43-80 y.o) was used for this study. The majority of them (N= 21), presented at diagnosis with a Binet-A stage, 2 with a Binet-B stage, and 3 with Binet-C stage. Three patients had been treated with Statins at the time of diagnosis. A first series of 16 donors without CLL and any treatment with Statins (8 males and 8 females, median age 61 y.o, range 22-82 y.o) from the local blood bank and 16 CLL patients was enrolled for the appreciation of membrane cholesterol. These patients were 8 men and 8 women with a mean age of 63 years old. All presented with untreated CLL, and Binet's stages were A for 7, B for 2 and C for 1.

A second series of patients was used to test the effect of in vitro treatment with Statins.
These were 14 CLL patients (7 men, 7 women), with a mean age of 59 years old. Binet's
stages were A for all at the time of sampling, two initial stages C having been induced to
remission after treatment.

Informed consent was obtained from all patients according to the Declaration of Helsinki and
the ethical committee of the "Université de Lorraine".

**2.2 CLL Cells**

Lymphocytes were obtained by Ficoll gradient centrifugation from peripheral blood collected
on EDTA.

**2.3 Flow Cytometry**

Separated lymphocytes were resuspended at 10⁶/mL and 50 µL aliquots were incubated
with PC5-conjugated CD5, PC7-conjugated CD19 monoclonal antibodies (Beckman Coulter,
Miami, FL). For each sample, a second tube was prepared with the addition of Filipin
(Robinson et al, 1980). Briefly, this antibiotic that selectively binds to cholesterol is also
fluorescent and emits above 520 nm, i.e. in the FL1 channel of most flow cytometers. The
best excitation is provided by UV light, but excitation is also possible with a 488nm argon
laser (Muller et al, 1984). We therefore tested labeled cells for these three markers using an
FC500 two lasers flow cytometer (Beckman Coulter). Filipin (Sigma), stored in DMSO at 25
mg/mL in the dark was used as working solution at 0.05 mg/mL in PBS. Normal B-cells
(CD19+/CD5-), normal T-cells (CD19-/CD5+) and normal B-1 cells or CLL cells
(CD19+/CD5+) were first gated using a CD5/CD19 biparametric scattergram. The autofluorescence signal in FL1 was recorded for each subset, then the Filipin fluorescence signal of each subset was recorded in the second tube.

## 2.4 Transcripts Levels of Genes Involved in Cholesterol Synthesis in CLL and Controls

As published elsewhere, the MILE project analyzed on whole genome H60 chips (Affymetrix) samples from over 3000 hematological malignancies and healthy controls (Haferlach et al., 2010). Within this data base, information was extracted for 110 healthy controls and 150 CLL patients. Mutational status was known for 135, with respectively 69 UM CLL and 66 M CLL. The list of genes of interest, selected from results of the previous transcriptome study on CD5 transfected Daudi cells, that was used for this query is shown on table 1.

<table><caption>Table 1. Genes involved in cholesterol synthesis that were investigated in the MILE database</caption><thead><tr><td>Acronym</td><td>Id#</td><td>Molecule</td></tr></thead><tbody><tr><td>HMGCS1</td><td>205822</td><td>3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1 (soluble)</td></tr><tr><td>HMGCS1</td><td>221750</td><td>3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1 (soluble)</td></tr><tr><td>HMGCR</td><td>202539</td><td>3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase</td></tr><tr><td>HMGCR</td><td>202540</td><td>3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A reductase</td></tr><tr><td>MVK</td><td>36907</td><td>mevalonate kinase</td></tr><tr><td>FDFT1</td><td>208647</td><td>farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1</td></tr><tr><td>FDFT1</td><td>210950</td><td>farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1</td></tr><tr><td>FDFT1</td><td>241954</td><td>Farnesyl-diphosphate farnesyltransferase 1</td></tr><tr><td>LSS</td><td>202245</td><td>lanosterol synthase (2;3-oxidosqualene-lanosterol cyclase)</td></tr><tr><td>CYP51A1</td><td>202314</td><td>cytochrome P450; family 51; subfamily A; polypeptide 1</td></tr><tr><td>CYP51A1</td><td>216607</td><td>cytochrome P450; family 51; subfamily A; polypeptide 1</td></tr><tr><td>SC4MOL</td><td>209146</td><td>sterol-C4-methyl oxidase-like</td></tr><tr><td>SC5DL</td><td>211423</td><td>sterol-C5-desaturase (ERG3 delta-5-desaturase homolog; S. cerevisiae)-like</td></tr><tr><td>DHCR7</td><td>201790</td><td>7-dehydrocholesterol reductase</td></tr><tr><td>DHCR7</td><td>201791</td><td>7-dehydrocholesterol reductase</td></tr></tbody></table>

Nine genes encoding for enzymes involved in the synthesis of cholesterol from fatty acids were investigated. Their order from the top (Acetyl coA) to the bottom (cholesterol) of the cascade is: HMGCS1, HMGCR, MVK, FDFT1, LSS, Cyp51A1, SC4MOL, SC5DL, DHCR7.

## 2.5 Inhibition of Cholesterol by Statins

Isolated lymphocytes from 14 patients were cultured at 10⁶ cells/ml for 24 hours to 6 days without (control) or with three different doses of Lovastatin (10⁻⁴, 10⁻⁵, 10⁻⁶), at 37°C in RPMI-1640 (Gibco) with 10% Fetal Calf serum (Hyclone), in a water-saturated incubator. Apoptosis was measured in flow cytometry by DNA staining with propidium iodide using the DNA Prep kit (Beckman Coulter) by recording the percentage of sub-G1 apoptotic cells. The expression level of surface IgM, CD5 and CD19 was also measured in flow cytometry after staining as above and with an FITC-conjugated rabbit anti-human IgM antiserum. In parallel, cells were
spun down and stained with May Grünwald Giemsa in order to count Gumprecht's shadows and evaluate the live/dead cells ratio.

## 2.6 Statistics

Filipin expression in flow cytometry was expressed as mean fluorescence intensity (MFI) ratios comparing the MFI of the filipin signal and that of the autofluorescence in FL1. Transcriptome data were the expression levels of probesets as described elsewhere. All series were tested for normality with the Kolmogorov Smirnov test and consequently expressed as means or medians. Between groups comparisons were performed with Student's T test, paired Student's T test or Mann Whitney. Statistical significance was retained for P values lower than 0.05.

# 3. RESULTS AND DISCUSSION

## 3.1 Filipin Binding, as an Indicator of Cell Surface Cholesterol, is Higher on CLL B-Cells than in Control B-Cells

Having previously shown that CD5-transfected Daudi B-cells exhibited a higher content in membrane cholesterol than vector-transfected cells (Gary Gouy et al., 2007) we undertook to compare the amount of membrane cholesterol in (almost totally CD5+)-B cells from CLL with that of B-cells from age and sex-matched controls. As shown in Figure 1A, the fluorescence of Filipin-stained cells gated on CD19+ cells, was significantly enhanced in all but 3 CLL patients as compared to total normal B-cells (figure 1B). The mean MFI ratio was 5.7±3.4 in CLL and 4.1±1.6 in the group of healthy controls (P = 0.048). Of interest, retrospective analysis showed that the 3 samples that were slightly less fluorescent than controls turned out to belong to patients treated with Statins (patients 13, 14 and 16). Accordingly, when the analysis was limited to «Statin-free» samples, the MFI of CLL cells (5.9±3.5) was increased as compared to controls : 3.9±1.4 (P = 0.045) (Figure 1B). The difference in membrane cholesterol was also significant if CLL B-cells were compared to CD5+ B-cells from healthy controls, which account for some 10% of total B-cells (Gary Gouy et al., 2002), with respective MFI ratios of 5.7±3.4 vs 4.2±1.4 (P = 0.05). As the normal-CD5 negative- B-cell population is almost undetectable in CLL samples we could not compare it to the leukemic clone.

Altogether, we observed that CLL B-cells were enriched in membrane cholesterol in comparison to normal CD5+ or CD5- B-cells. We next analyzed the mRNA profiles of the transcripts coding for the enzymes involved in cholesterol synthesis.
A

Control cells

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

FL1 Log

CLL cells

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

FL1 Log

B

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

Figure 1. (A) Comparative FL1 fluorescence intensity of unstained (light gray) and Filipin stained (black) on CD19+/CD5- B-cells from a healthy control (left) and CD19+/CD5+ B-cells from a CLL patient (right). (B) Mean±SD of fluorescence ratios of all patients and controls (white histogram, n=16) or of Statin-untreated patients (black histogram, n=13). \* p = 0.048, \*\* p = 0.044.
## 3.2 The Transcription of Genes Involved in Cholesterol Synthesis Vary in CLL Cells

Data from the MILE study were first plotted to compare the expression levels of 15 genes, shown to be modified by CD5 transfection of Daudi cells (Gary Gouy et al., 2007), between CLL patients and controls (table 2). Affymetrix chip analysis showed that the expression of 7 transcripts from the cholesterol synthesis pathway was significantly modified in CLL patients. This significant shift is an upregulation in 4 instances and a downregulation in 3. Interestingly the four upregulated genes, LSS, Cyp51A1, NSDHL, and SC5DL, act sequentially in the final step of the pathway to synthesize lanosterol, lathosterol and finally 7 dehydrocholesterol. However transcripts from the last gene, DHCR7, leading to the transformation of 7 dehydrocholesterol into cholesterol appear to be lower in CLL vs normal B-cells.

The second analysis performed by comparing UM and M CLL cells provided further information. It showed that all of the four significant differences implied genes of the cholesterol synthesis pathway in M-CLLs, all of which were upregulated (table 3). Among the 5 genes involved in the final pathway, LSS, SC5DL and DHCR7 were upregulated. In addition, FDFT1 acting upstream of LSS was also stimulated. In conclusion, the cholesterol synthesis pathway appears to be enhanced in M- as compared to UM-CLL.

<table><caption>Table 2. Transcription levels of Cholesterol Biosynthesis genes in CLL vs Controls*</caption><thead><tr><th rowspan="2">Gene #</th><th colspan="3">CLL N=150</th><th rowspan="2">P value Mann Whitney</th><th colspan="3">Controls N=110</th></tr><tr><th>Median</th><th>Minimum</th><th>Maximum</th><th>Median</th><th>Minimum</th><th>Maximum</th></tr></thead><tbody><tr><td>205822</td><td>36,75</td><td>8,2</td><td>103,2</td><td>NS</td><td>34,8</td><td>11,3</td><td>126,9</td></tr><tr><td>221750</td><td>157,1</td><td>40</td><td>396,4</td><td>&lt;0.0001</td><td>109,15</td><td>47,3</td><td>227,7</td></tr><tr><td>202539</td><td>173,4</td><td>46,9</td><td>400,6</td><td>NS</td><td>184,45</td><td>78,4</td><td>400,6</td></tr><tr><td>202540</td><td>58,1</td><td>13,3</td><td>134</td><td>NS</td><td>53,9</td><td>4,4</td><td>132,7</td></tr><tr><td>36907</td><td>170,8</td><td>83,3</td><td>277,1</td><td>&lt;0.0001</td><td>207,4</td><td>113,4</td><td>537,9</td></tr><tr><td>208647</td><td>771,15</td><td>326,2</td><td>2338,6</td><td>&lt;0.0001</td><td>1265,55</td><td>585,7</td><td>3983</td></tr><tr><td>210950</td><td>630,85</td><td>148,9</td><td>2099,2</td><td>NS</td><td>447,2</td><td>156,2</td><td>3587</td></tr><tr><td>241954</td><td>83,8</td><td>20,2</td><td>309,4</td><td>NS</td><td>86,6</td><td>28,5</td><td>323,8</td></tr><tr><td>202245</td><td>260,05</td><td>105,8</td><td>684</td><td>&lt;0.0001</td><td>184,2</td><td>67,6</td><td>542</td></tr><tr><td>202314</td><td>367</td><td>62,2</td><td>1122,6</td><td>&lt;0.0001</td><td>260,5</td><td>65,7</td><td>668,2</td></tr><tr><td>216607</td><td>127,8</td><td>49,1</td><td>384,2</td><td>NS</td><td>150,55</td><td>40</td><td>302,7</td></tr><tr><td>209146</td><td>234,1</td><td>76,7</td><td>820,2</td><td>&lt;0.0001</td><td>147,9</td><td>65,2</td><td>729,1</td></tr><tr><td>211423</td><td>280,35</td><td>75,1</td><td>1132,1</td><td>&lt;0.0001</td><td>216</td><td>105</td><td>1148,5</td></tr><tr><td>201790</td><td>40</td><td>2,6</td><td>635,6</td><td>&lt;0.0001</td><td>149,05</td><td>33,9</td><td>803,8</td></tr><tr><td>201791</td><td>37,75</td><td>0,7</td><td>644,4</td><td>&lt;0.0001</td><td>125,4</td><td>5,6</td><td>683,2</td></tr></tbody></table>

<footnote>* Light gray lines indicate significant downregulation in CLL cells compared to controls. Dark grey lines indicate significant upregulation in CLL cells compared to controls.</footnote>
As CD5 stimulated the cholesterol pathway genes in transfected Daudi B-cells, we wondered if the same applied to CLLs and compared the CD5 transcripts in UM-CLL vs M-CLL samples. However, CD5 transcripts levels were the same between UM (median 84.2, range 3.5-325) and M (median 84.9, range 3.7-302) CLL cells.

<table><caption>Table 3. Transcription levels of cholesterol synthesis genes in Unmutated vs Mutated-CLL</caption><thead><tr><th rowspan="2">Gene #</th><th colspan="3">Unmutated N=69</th><th rowspan="2">P value<br>Mann Whitney</th><th colspan="3">Mutated n=66</th></tr><tr><th>Median</th><th>Minimum</th><th>Maximum</th><th>Median</th><th>Minimum</th><th>Maximum</th></tr></thead><tbody><tr><td>205822</td><td>42</td><td>8,2</td><td>103,2</td><td>NS</td><td>33,55</td><td>10,9</td><td>81,2</td></tr><tr><td>221750</td><td>171,2</td><td>43,1</td><td>299</td><td>NS</td><td>153,25</td><td>40</td><td>396,4</td></tr><tr><td>202539</td><td>180,6</td><td>54</td><td>310,7</td><td>NS</td><td>168,6</td><td>46,9</td><td>400,6</td></tr><tr><td>202540</td><td>55,2</td><td>13,3</td><td>128</td><td>NS</td><td>66,85</td><td>16</td><td>134</td></tr><tr><td>36907</td><td>164,9</td><td>88,2</td><td>277,1</td><td>NS</td><td>179,4</td><td>83,3</td><td>275,7</td></tr><tr><td>208647</td><td>727,5</td><td>326,2</td><td>1239,9</td><td>0.02</td><td>807,4</td><td>454,6</td><td>2338,6</td></tr><tr><td>210950</td><td>553,5</td><td>148,9</td><td>1523,7</td><td>NS</td><td>639,4</td><td>174,4</td><td>2099,2</td></tr><tr><td>241954</td><td>74,6</td><td>20,2</td><td>306,6</td><td>NS</td><td>85,65</td><td>35,3</td><td>309,4</td></tr><tr><td>202245</td><td>238,2</td><td>105,8</td><td>684</td><td>0.02</td><td>284,6</td><td>145,9</td><td>603,1</td></tr><tr><td>202314</td><td>357,3</td><td>62,2</td><td>1088,4</td><td>NS</td><td>415</td><td>91,9</td><td>1122,6</td></tr><tr><td>216607</td><td>128,1</td><td>49,2</td><td>301,3</td><td>NS</td><td>141</td><td>49,1</td><td>384,2</td></tr><tr><td>209146</td><td>235,7</td><td>88,2</td><td>529,7</td><td>NS</td><td>240,75</td><td>76,7</td><td>820,2</td></tr><tr><td>211423</td><td>248,6</td><td>75,1</td><td>808,3</td><td>0.003</td><td>357,85</td><td>112,2</td><td>1132,1</td></tr><tr><td>201790</td><td>33,2</td><td>3,2</td><td>635,6</td><td>0.03</td><td>44,55</td><td>2,6</td><td>109,3</td></tr><tr><td>201791</td><td>34,6</td><td>0,7</td><td>644,4</td><td>NS</td><td>42,4</td><td>5</td><td>113</td></tr></tbody></table>

### 3.3 Lovastatin-Induced Cell Death and Modifications in Surface Markers of CLL Cells

For 14 patients with CLL, isolated lymphocytes were cultured for 6 days without or with three graded doses of Lovastatin from $10^{-6}$ to $10^{-4}$ M. Cells were then permeabilized and stained with propidium iodide and the percentage of hypodiploid (sub G1) cells evaluated as described previously (Gary Gouy 2007).

As shown in Figure 2, a significant increase in cell death was seen with increasing doses of lovastatin, whether the percentage of hypodiploid cells or Gumprecht's shadows were considered. In both cases Lovastatin was inefficient at $10^{-6}$ M but showed a significant effect at $10^{-5}$ M if Gumprecht's shadows were compared (p=0.002) and to a lesser extent if subG1 cells were considered (p=0.005).

<footnote>* Light gray lines indicate significant downregulation in UM CLL cells compared to M CLL cells. The four genes are DHCR7, FDFT1, LSS and SC4MOL (see table 1).</footnote>
A

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Figure 2. Apoptosis of CLL B-cells cultured for 6 days in medium without or with 3 graded doses of Lovastatin. (A): Gumprecht's shadows, (B): Hypodiploid (sub G1) cells. (n=14). ** p =0.002.</figcaption></figure>

Concomitantly, the expression of IgM, CD19 and CD5 was assessed on the tumoral cells, and of CD5 on remaining T-cells. These data are shown in Table 4. Although no significant change was observed for the low expression of IgM, a significant decrease was noted on CLL cells for CD19 and CD5 expression at the highest Lovastatin concentration (p=0.01 and 0.03 respectively), and, interestingly, also for CD5 on resident T-cells upon incubation with Lovastatin (data not shown). A borderline dose-effect was also noticed, a concentration of $10^{-6}$ being less efficient than the two others.
<table><caption>Table 4. Variations in the expression of surface antigens upon 6day culture of CLL cells with Lovastatin (MFI ratios compared to day 0)</caption><thead><tr><th>Antigen</th><th>Day 0</th><th>10<sup>-6</sup><br>Lovastatin</th><th>P*</th><th>10<sup>-5</sup><br>Lovastatin</th><th>P*</th><th>10<sup>-4</sup><br>Lovastatin</th><th>P*</th></tr></thead><tbody><tr><td>Surface IgM</td><td>1.1±0.6</td><td>1.2±0.8</td><td>NS</td><td>1.1±0.6</td><td>NS</td><td>1.0±0.4</td><td>NS</td></tr><tr><td>CD19</td><td>7.4±4.7</td><td>7.3±4.9</td><td>NS</td><td>5.4±2.7</td><td>0.01</td><td>5.3±2.6</td><td>0.01</td></tr><tr><td>CD5</td><td>23.1±15.1</td><td>22.9±14.1</td><td>NS</td><td>18.7±10.6</td><td>0.04</td><td>18.9±10.7</td><td>0.03</td></tr><tr><td>CD5 on T-cells</td><td>35.6±11.2</td><td>34.6±9.9</td><td>0.07</td><td>31±7.4</td><td>0.01</td><td>31±7.1</td><td>0.02</td></tr></tbody></table>

## 3.4 DISCUSSION

Previous results from our group led us to hypothesize that CLL B-cells may be enriched in membrane cholesterol, possibly in relation with the expression of CD5; Data from the literature suggested that a high content in cholesterol at the plasma membrane may affect BCR trafficking and signalling (Bléry et al., 2006). Of interest, retention of the BCR in the cytoplasm of CLL cells has long been observed (Yasuda et al., 1982; Newell et al., 1983) suggesting trafficking abnormalities in this pathology. Membrane rigidity in CLL is a prominent cytological feature easily evidenced by the disruption of the cells and numerous Gumprecht's shadows on cytocentrifuged cells stained with May Grünwald Giemsa, and it is noteworthy that an increase in membrane cholesterol increases rigidity (Müller et al., 1970; An et al., 2010).

Our results demonstrate that there is more cholesterol in the plasma membranes of CLL B-cells than in the membranes of normal B-cells including the normal B-1 like CD5+ B-cell subpopulation. This finding was indirectly validated by the retrospective observation of lesser membrane cholesterol in the cells of patients receiving oral Statins than in the cells of the other patients, which is in keeping with the well known inhibitory activity of Statins on HMG-CoA reductase. Although it is tempting to attribute this difference to the effect of CD5, this is unlikely because CD5 expression was not diminished in the cells of the patients receiving Statins (data not shown) although it was inhibited *in vitro* by Lovastatin at the highest concentration (Table 4). Moreover, in our CD5-transfected cell line, 9 genes were stimulated, (as an example, a 4.5 fold stimulation was observed for MVK), and none were inhibited (Gary Gouy et al., 2007). This is at variance with the data gathered from the database of the MILE project (Haferlach et al., 2010). Although the expression of 4 gene transcripts involved in the synthesis of cholesterol is stimulated in CLL, the expression of 3 other genes is inhibited. How this could have modified cholesterol content at the membrane is difficult to interpret inasmuch as other parameters such as cholesterol trafficking and degradation should affect the whole picture and could not be analysed here. Interestingly however, we observed a difference between UM and M-CLL, which deserves a specific analysis in order to measure membrane cholesterol in both groups. Unfortunately only 2 out of 26 patients from our study were documented for IgVH mutational status (data not shown). Thus a dedicated study is needed to compare the amount of membrane cholesterol in both M and UM- CLL B-cells. How does membrane cholesterol affect BCR signaling? It has been shown that cholesterol is needed for BCR internalization in anergic but not in normal B-cells (Bléry et al., 2006). In this study on an HEL/anti-HEL double transgenic mouse model, the B-cells are anergic in vivo due to a permanent stimulation of surface immunoglobulins (slg). Upon stimulation with antigen, slg is internalized which desensitizes the cell to the antigen. This

<footnote>* Paired Student's T test's P value compared to D1</footnote>
process depends on cholesterol, indeed, when surface cholesterol was disrupted, slg was
restored and anergy was broken. This is reminiscent of what happened to the same mice
bred in a CD5-null background (Hippen et al., 2000) which resulted in the loss of anergy
characterized by autoimmune haemolytic anemia. Together with our data, the
abovementioned results suggest a direct link between CD5 expression, membrane
cholesterol and anergy in CLL B-cells. Here, the lower amounts of transcripts for relevant
membrane cholesterol synthesis pathway molecules observed in UM-CLL compared to M-
CLL is meaningful and may correlate with the "lesser anergic state" of the aggressive-
subset in comparison to the indolent one.

As patients treated with Statins displayed lesser membrane cholesterol on their B-cells than
untreated patients, we investigated *in vitro* the effect of Statins on the expression of IgM with
the possibility in mind that it would be augmented. Although Lovastatin failed to change the
expression of slgM, it induced a significant decrease of that of CD19 and CD5. Moreover, we
were able to confirm the results of others on the apoptotic effect of Statins (Vitols et al.,
1997; Chapman Shimshoni et al., 2003). The action of these molecules is far from being
limited to cholesterol. Statins may inhibit the farnesylation of key molecules such as ras (Cox
et al., 1992) and lamins (Cox; Karp et al., 2001) involved respectively in cell proliferation and
gene expression (Dechat et al., 2007). Finally, whether UM-CLL are more sensitive to
Statins than M-CLL because of lower cholesterol content, should be explored as Statins
could be useful adjuvants for chemotherapy (Fuchs et al., 2008; De Jong Peeters et al.,
2009).

4. CONCLUSION

CLL B-cells are sensitive to inhibitors of cholesterol synthesis, and display an enhanced
expression of cholesterol synthesis genes. Although it is tempting to attribute the increased
sensitivity of CLL B-cells to Statins to their high cholesterol expression and possibly
requirements in cholesterol, our study does not support this hypothesis. The relative
amounts of membrane cholesterol and sensitivity to Statins between U- and UM-CLL should
be evaluated in a specific study.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work is supported by a grant from the "Ligue contre le Cancer, Région Grand Est".

COMPETING INTERESTS

Authors have declared that no competing interests exist.

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© 2012 Tomowiak et al.; This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/3.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
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