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Ecole Doctorale BioSE (Biologie-Santé-Environnement)

Thèse

Présentée et soutenue publiquement pour l'obtention du titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE LORRAINE

Mention : « Sciences de la Vie et de la Santé »

Par Nader HADIFE

# Interleukine-24 : Rôle immunologique et mécanismes d'induction de mort cellulaire dans les lymphocytes B

Soutenue publiquement le 25 Avril 2013

## MEMBRES du jury :

**Rapporteurs :** Mme. le docteur Véronique MACHELON Université Paris-Sud, Clamart

M. le professeur Jean-Claude LECRON Université de Poitiers, Poitiers

**Examinateurs :** M. le professeur Bernard FOLIGUET Université de Lorraine (Président du Jury)

M. le professeur Ali DALLOUL Université de Lorraine (Directeur de thèse)
Ecole Doctorale BioSE (Biologie-Santé-Environnement)

Thèse

Présentée et soutenue publiquement pour l'obtention du titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE LORRAINE

Mention : « Sciences de la Vie et de la Santé »

Par Nader HADIFE

# Interleukine-24 : Rôle immunologique et mécanismes d'induction de mort cellulaire dans les lymphocytes B

Soutenue publiquement le 25 Avril 2013

## MEMBRES du jury :

**Rapporteurs :** Mme. le docteur Véronique MACHELON Université Paris-Sud, Clamart

M. le professeur Jean-Claude LECRON Université de Poitiers, Poitiers

**Examinateurs :** M. le professeur Bernard FOLIGUET Université de Lorraine (Président du Jury)

M. le professeur Ali DALLOUL Université de Lorraine (Directeur de thèse)
A ma mère et mon frère

A l'âme de mon père et ma soeur

A mes amis et amies
Remerciements

Je remercie la Communauté Urbaine du Grand Nancy (CUGN) ainsi que la Société
Française d’Hématologie (SFH) pour leur support financière. Je suis conscient que c’est une
chance sans laquelle je n’aurais sans doute pas réalisé ce rêve. Je Salue également l’Université
Henri Poincaré, l’UFR Sciences et Techniques et l’école doctorale BioSE.

Tout d'abord, je tiens à remercier les membres du jury

Je suis particulièrement sensible à l'honneur que me font le Professeur Jean-Claude LECRON et le docteur Véronique MACHELON en acceptant d'être rapporteurs et de juger ce travail. Je les remercie pour toutes leurs critiques enrichissantes.

Je remercie également le Professeur Bernard FOLIGUET d'avoir accepté d'être président du jury. Je le remercie également pour la vacation qu'il m'avait donnée à la maternité régionale de Nancy pendant un an et demi.

La réalisation de cette thèse n'aurait jamais été possible sans l'aide de nombreuses
personnes envers lesquelles je suis infiniment redevable. Aussi, je tiens tout particulièrement
à les remercier.

Merci aux Professeurs Gilbert FAURE et Marie-Christine BENE de m'avoir accueilli dans leur équipe d'accueil (EA4369).

Je remercie infiniment le Professeur Ali DALLOUL qui a été le directeur de thèse pendant ces quatre années. Je le remercie pour la confiance qu'il m'a témoignée en m'accueillant au sein de son équipe. Je rends hommage à son honnêteté scientifique et morale. Ses enseignements ont toujours été d'une grande qualité, m'ont énormément apporté et resteront un exemple pour moi.

Enfin, je remercie tous qui font ou qui ont fait partie de l'EA4369.

Merci à Christophe NEMOS pour m'avoir apporté son aide technique en Bio puces à ADN.

Je tiens à remercier également toute l'équipe du laboratoire d'immunologie du CHU de Nancy et plus particulièrement mon ami Fred pour m'avoir apporté son aide technique en cytométrie de flux.
Je remercie le Professeur Jean-pol FRIPPIAT, le chef du JE 2537, pour m'avoir donné
l'occasion de faire les manips de biologie moléculaire au sein de son laboratoire.

Je remercie également toute l'équipe du JE 2537, et plus particulièrement, Mathieu, Nathan,
Véronique, Fanny, Guillaume, Oussama, et Nassima pour leur amitié et leur sympathie. Je
n'oublierai jamais les bons moments qu'on avait passés ensemble.

Je voudrais enfin rendre hommage à mes proches

Merci à ma mère, mon frère, mon oncle Gassan qui m'ont toujours soutenu et encouragé
même dans les moments difficiles.

Je suis infiniment redevable à mon unique et exceptionnel frère, Fadi, d'avoir suivi et réglé
ma situation professionnelle au Liban pendant toutes mes années d'études en France. Je sais
que ce n'était pas assez facile pour lui. Je le remercie également d'avoir rempli ma place
envers ma mère pendant que je n'étais pas à côté d'elle. Je le remercie de fond du mon cœur.
LISTE DES ABREVIATIONS

**Ad.Mda-7**: Recombinant adenovirus vector encoding for human Mda-7

**ADN**: Acide désoxyribonucléique

**AIF**: Apoptosis inducing factor

**AP**: Apyrimidinic endonuclease

**Apaf-1**: Apoptotic protease activating factor-1

**ARNm**: Acide ribonucléique messager

**ATP**: Adénosine triphosphate

**Bad**: Bcl-xL/Bcl-2 associated death promoter

**BAFF**: B-cell-activating factor belonging to the TNF family

**Bag1**: Bcl-2-associated athanogene 1

**Bak**: Bcl-2 homologous antagonist killer

**Bax**: Bcl-2 associated x protein

**BCL**: B cell lymphomas

**BCMA**: B cell maturation antigen

**BET**: Bromure d'éthidium

**Bid**: BH3 interacting domain death agonist

**Bim**: Bcl-2 interacting mediator of cell death

**BM**: Bone marrow

**BP**: Binding protein

**BSA**: Bovin serum albumin

**C/EBP**: CCAAT/enhancer binding protein

**Caspase**: Cystein aspartate proteases

**CG**: Centre germinatif

**CLL**: Chronic lymphocytic leukemia

**CLP**: Common lymphoid progenitor

**CMP**: Common myeloid progenitor

**Cre**: Cyclic AMP response element

**CSR**: Class Switch Recombination

**DC**: Dendritic cell

**DEPC**: Diéthyl pyrocarbonate

**DIABLO**: Direct IAP binding with low pI

**DMSO**: Diméthyl sulfoxyde

**dNTP**: Désoxyribonucléosides triphosphate

**DTT**: Dithiotréitol

**ELP**: Early lymphoid progenitor

**Endo G**: Endonuclease G

**Erk**: Extracellular signal-regulated kinases

**ETP**: Early thymocyte progenitor

**FACS**: Fluorescence-activated cell sorting

**FADD**: Fas-associated death domain

**Fc**: Fragment cristallisable

**FcγR**: Fc-gamma receptor

**FITC**: Fluorescéine isothiocyanate

**FLIP**: FADD-like ICE inhibitory proteins

**GADD**: Growth arrest and DNA damage

**GM-CSF**: Granulocyte Maacrophage Colony –Stimulating Factor

**HtrA2**: High temperature requirement protein A2

**IAP**: Inhibitors apoptosis proteins
**ICE**: Interleukin -1β □ converting enzyme

**IGF1-R**: Insulin growth factor 1 receptor

**IL-R**: Interleukin receptor

**INF**: Interferon

**IRF4**: Interferon regulatory factor 4

**ITAM**: Immunoreceptor tyrosine-based activation motif

**JAK**: Janus Kinase

**KDa**: Kilodalton

**KID2DL**: Killer-cell immunoglobulin-like receptors 2 DL

**KO**: knock-out

**LMPP**: Lymphoide multipotent progenitor

**MAPK**: Mitogen Activated Protein Kinase

**MCL-1**: Myeloid leukemia cell differentiation protein 1

**MCP-1**: Monocyte chemotactic protein 1

**MIP1**: Macrophage inflammatory protein 1

**MPP**: Multipotent progenitor

**NCR1**: Natural cytotoxicity triggering receptor 1

**NF-kB**: Nuclear factor-kB

**NK**: Natural killer

**PALS**: Periarteriolar lymphoid sheath

**PAX5**: Paired Box Protein 5

**PBMC**: Peripheral blood mononuclear cells

**PBS**: Phosphate buffer saline

**PCR**: Polymerase chain reaction

**PD1**: Protein disulfures isomerase

**PI3K**: Phosphatidyl-inositol 3-kinase

**PMA**: Phorbol 12-Myristate 13-Acetate

**RANTES**: Regulated and normal T cell expressed and secreted

**SDF-1**: Stromal cell-derived factor 1

**SDS**: Sodium dodécysulfate

**Si-RNA**: Small interfering RNA

**SMAC**: Second mitochondria derived activator of caspases

**SOCS**: Suppressor of cytokine signaling

**STAT**: Signal Transducer and Activator of Transcription

**SVF**: Serum Veau Foetal

**TAE**: Tris acétate EDTA

**TBS**: Tris base SDS

**TD**: Thymo-Dependent

**T<sub>FH</sub>**: Follicular B helper T cell

**TI**: Thymo-Independent

**TNF**: Tumor necrosis factor

**TRAIL**: TNF related apoptosis inducing ligand

**Tregs**: lymphocytes T régulateurs

**Tris**: Tri-(hydroxyméthyl) amino méthane

**V<sub>H</sub>**: Région variable de la chaîne lourde des Ig

**XBP1**: X-box binding protein 1

**β-ME**: β-mercapto ethanol
## RESUME

Notre équipe a précédemment démontré que l'Interleukine (IL)-24, une cytokine de la famille de l'IL-10, a un effet cytostatique voire cytotoxique sur des cellules B normales ou leucémiques mises préalablement en cycle, mais non sur des cellules quiescentes. L'IL-24 inhibe également la différenciation plasmocytaire des cellules B humaines du centre germinatif dans un modèle de différentiation *in vitro*. Nous avons utilisé ce modèle pour analyser pour la première fois le transcriptome de cellules B stimulées ou non par IL-24 au bout de 6 et 36 h. Plusieurs transcrits impliqués dans le métabolisme et la réplication de l'ADN sont inhibés précocement à l'exception d'IGF-1 qui est stimulé. L'IGF1 ayant été décrit comme une molécule de survie des cellules B ou pré-B, nous avons analysé son effet biologique et démontré qu'il a au contraire un rôle proapoptotique à doses physiologiques. En revanche, l'IL-24 induit l'expression plus tardive des gènes de la voie mitochondriale de la mort cellulaire programmée (MCP). Cet effet est également retrouvé dans des LLC « IgVH mutées » ou non mais avec une cinétique distincte des cellules B normales. Au total, dans des cellules activées au préalable, l'IL-24 induit séquentiellement un blocage précoce du cycle cellulaire suivi d'une apoptose. D'autres gènes potentiellement importants dans la synapse immune ainsi que dans la régulation de l'immunité innée sont décrits et suggèrent que l'IL-24 a un rôle immunologique particulier au-delà de son effet cytostatique et potentiellement anti-tumoral.

**MOTS-CLES** : Cytokines de classe II, IL-24, Lymphocytes B, Centre Germinatif, LLC, Apoptose.

## ABSTRACT

We have previously shown that Interleukin(IL)-24, a class-II cytokine of the IL-10 family, has cytostatic and cytotoxic properties on normal and malignant human B-cells previously engaged into the cell cycle, but not on quiescent B-cells. IL-24 also inhibits the differentiation of germinal center B-cells in plasma cells in an *in vitro* model; the later was used to compare for the first time the transcriptome of B-cells cultured or not with IL-24 for 6 and 36h. Several “early” transcripts involved in DNA metabolism and replication were inhibited whereas that of *Igf1* a molecule described as a B-cell growth factor was induced. We show herein that IgF1 has instead a proapoptotic role on B-cells at physiological concentrations. In contrast, several genes of the intrinsic apoptotic pathway were stimulated after 36h. This expression pattern was also found in CLL cells whether they were “IgVH mutated” or “unmutated”, albeit with distinct kinetics from normal B-cells. In addition several genes belonging to the immune synapse and innate immunity were regulated by IL-24. These results disclose additional, possibly immunoregulatory properties, for IL-24 than its already described cytostatic and potentially anti-tumoral effects.

**KEYWORDS** : Class II Cytokines, IL-24, B-lymphocytes, Germinal Center, CLL, Apoptosis.
<figure><img src="image_1.png" /></figure>
AVANT PROPOS 1

INTRODUCTION 3

LES LYMPHOCYTES B 3

1 Retour historique : la découverte des anticorps et des lymphocytes B 3

2 La contribution des lymphocytes B à la réponse immunitaire 3

3 Ontogénie des lymphocytes B 6

3.1. Différents stades de différentiation des lymphocytes B 6

3.2. La diversité du répertoire d'anticorps et la théorie de sélection clonale 9

3.3. Le développement des lymphocytes B dans la moelle osseuse : les réarrangements génétiques et la tolérance au soi 10

3.4. Les lymphocytes B transitionnels et leur maturation au niveau de la rate 12

4 La réponse des lymphocytes B matures aux différents types d'Ag 13

4.1. La réponse des lymphocytes B aux Ag T-indépendants de type I 13

4.2. La réponse des lymphocytes B aux Ag T-indépendants de type II 14

4.3. La réponse des lymphocytes B aux antigènes T-dépendants 14

4.3.a. L'initiation de la réponse des lymphocytes B naïfs 16

4.3.a.i. Le recrutement des Ag et des cellules B dans les organes lymphoïdes secondaires 16

4.3.a.ii. La première interaction spécifique lymphocytes B naïfs – lymphocytes T 18

4.3.b. Les CG et leur fonction 20

4.3.b.i. L'expansion et la sélection des lymphocytes B 20

4.3.b.ii. Les changements moléculaires se déroulant dans les CG 24

4.3.b.iii. La mémoire immunologique en réponse aux Ag T-dépendants 26

4.3.c. La réponse extrafolliculaire des lymphocytes B naïfs 34

LA LEUCÉMIE LYMPHOÏDE CHRONIQUE (LLC)- B 35

1 Définition et historique 35

2 Etiologie et Pathogénèse 36

2.1. Facteurs environnementaux et héréditaires 36

2.2. Cytogenèse 36

2.3. Anomalies cytogénétiques 37

2.4. Modèle animal pour la LLC 38

2.5. Accumulation de cellules leucémiques 39

3 Rôle de Mda-7/IL-24 dans la leucémie lymphoïde chronique 41

LES CYTOKINES DE CLASSE II 43

1 Généralités 43

2 Fonctions biologiques des cytokines de classe II 46

2.1. IL-10 47

2.2. Mda-7/IL-24 49

2.2.a. Structure du gène Mda-7/IL-24 49

2.2.b. Expression de Mda-7/IL-24 50

2.2.c. Orthologues de Mda-7/IL-24 51

2.2.d. Récepteurs de Mda-7/IL-24 51

2.2.e. Rôle de Mda-7/IL-24 dans le système immunitaire 52

2.2.f. Rôle de Mda-7/IL-24 dans le cancer 53

APOPTOSE 55

1 Généralités sur le processus d'apoptose 55

1.1. Définition 55

1.2. Rôles physiologiques de l'apoptose 56

1.3. Les différentes voies de l'apoptose 56

OBJECTIFS 60

MATERIEL ET METHODES 62

1 Première partie : les modèles d'étude 62

1.1. Les cellules B d'amygdales 62

1.1.a. Préparation des suspensions amygdaliennes 62

1.1.b. Isolement des lymphocytes totaux 63

1.1.c. Comptage et étude de la viabilité cellulaire 63

1.1.d. Isolement des lymphocytes B 64
<table><tbody><tr><td>1.1.e. Traitement et culture des lymphocytes B</td><td>65</td></tr><tr><td>1.2. Les cellules B de LLC</td><td>66</td></tr><tr><td>1.2.a. Patients et prélèvements</td><td>66</td></tr><tr><td>1.2.b. Isolement des lymphocytes B de LLC</td><td>67</td></tr><tr><td>1.2.c. Traitement et culture des lymphocytes B de LLC</td><td>67</td></tr><tr><td><b>2</b> <b>Deuxième partie : Exploration phénotypique et fonctionnelle par cytométrie en flux</b></td><td><b>67</b></td></tr><tr><td>2.1. Cytométrie en flux</td><td>67</td></tr><tr><td>2.2. Etude immunophénotypique des lymphocytes B normaux et ceux de LLC</td><td>70</td></tr><tr><td>2.3. Etude de l'expression d'IGF1-R</td><td>70</td></tr><tr><td>2.4. Etude de la répartition des cellules dans le cycle cellulaire</td><td>70</td></tr><tr><td>2.5. Etude des caractéristiques de l'apoptose</td><td>71</td></tr><tr><td>2.5.a. Détection des Phosphatidyl Sérines par l'Annexine V</td><td>71</td></tr><tr><td>2.5.b. La dépolarisation des membranes mitochondriales</td><td>72</td></tr><tr><td>2.5.c. La diminution de nombre de mitochondries dans les cellules apoptotiques.</td><td>72</td></tr><tr><td><b>3</b> <b>Troisième partie : Etude de l'expression des ARN messagers</b></td><td><b>73</b></td></tr><tr><td>3.1. Extraction des ARN totaux</td><td>73</td></tr><tr><td>3.1.a. Extraction au Trizol</td><td>73</td></tr><tr><td>3.1.b. Extraction sur colonne (RNeasy Mini Kit - Qiagen)</td><td>73</td></tr><tr><td>3.2. Préparation des échantillons</td><td>74</td></tr><tr><td>3.3. Etude de l'expression des ARN messagers par la technique des Biopuces</td><td>74</td></tr><tr><td>3.4. RT-PCR semi quantitative et PCR en temps réel (qPCR)</td><td>75</td></tr><tr><td>3.4.a. Transcription inverse (RT)</td><td>75</td></tr><tr><td>3.4.b. PCR semi quantitative</td><td>75</td></tr><tr><td>3.4.c. PCR quantitative ou en temps réel</td><td>77</td></tr><tr><td><b>4</b> <b>Quatrième partie : Etude de l'expression des protéines (Western Blot)</b></td><td><b>82</b></td></tr><tr><td>4.1. Préparation des échantillons</td><td>82</td></tr><tr><td>4.1.a. Extraction des protéines</td><td>82</td></tr><tr><td>4.1.b. Dosage des protéines (Méthode de Bradford ou Bleu de Coomassie)</td><td>82</td></tr><tr><td>4.1.c. Séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide</td><td>83</td></tr><tr><td>4.1.d. Transfert des protéines sur membrane de PVDF (polyvinylidene difluoride) ou Dot Boltting</td><td>83</td></tr><tr><td>4.1.e. Blocage de la membrane</td><td>84</td></tr><tr><td>4.1.f. Incubation avec des anticorps monoclonaux primaires</td><td>84</td></tr><tr><td>4.1.g. Incubation avec des anticorps polyclonaux secondaires</td><td>84</td></tr><tr><td>4.1.h. Détection par chimiluminescence (ECL)</td><td>85</td></tr></tbody></table>

## RESULTATS 87

1 Effets transcriptomiques de l'IL-24 sur les lymphocytes B 87

2 Régulation de l'expression de l'IL-24 dans les lymphocytes B normaux. 91

3 Expression du récepteur de l'IL-24 dans les lymphocytes B 92

4 Expression du récepteur de l'IGF1 par les lymphocytes B d'amygdales ainsi que ceux de la LLC 96

5 L'inhibition de la voie de signalisation de l'IGF1 reverse les effets biologiques de l'IL-24 98

6 IL-24 induit la voie d'apoptose mitochondriale dans les lymphocytes B activés 99

7 L'apoptose des lymphocytes B activés induite par l'IL'24 est p53 dépendante 101

## DISCUSSION 105

1 IL24 et Apoptose 105

2 Expression et induction de Mda-7/IL-24 dans les cellules immunitaires 108

3 Effet de l'IL-24 sur les cellules immunitaires 110

4 IL24 et lymphocytes B 111

5 IL24 et plasmocytes à vie courte 112

6 IL24 et lymphocytes B mémoires 113

7 Aspect controversé de l'expression de l'IL-24R dans les LB 114

8 Rôle de l'IL-24 dans le système immunitaire 114

9 Effet antiviral potentiel de l'IL-24 115

10 IL-24 et autres cytokines de la famille de l'IL-10 116

## PERSPECTIVES 119

1 Mécanisme d'action de l'IL-24 119

2 IL-24 et immunité 119
<table><tr><td>2.1. IL-24 et la réponse B T-dépendante</td><td>119</td></tr><tr><td>2.2. IL-24 et la réponse B T-indépendante</td><td>120</td></tr><tr><td>2.3. IL-24 et la fonction des cellules présentatrices de l'antigène (APC)</td><td>120</td></tr><tr><td>3 IL-24 et Tumeurs</td><td>122</td></tr><tr><td>3.1. LLC</td><td>122</td></tr><tr><td>3.2. Autres cancers</td><td>122</td></tr><tr><td>4 L'IL-24 et les cellules endothéliales</td><td>122</td></tr><tr><td>5 L'IL-24 et vaccinations</td><td>123</td></tr><tr><td>TRAVAIL ANNEXE</td><td>125</td></tr><tr><td>REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES</td><td>128</td></tr></table>
AVANT PROPOS

Le gène Mda-7 (Melanoma Differentiation Associated gene 7) a été cloné en 1995 par
hybridation soustractive à partir de mélanocytes normaux différenciés *in vitro* en présence
d'IFN-β et Mezeréine (Jiang et al., 1995). L'expression de ce gène est inhibée en cas de
différentiation cellulaire, en particulier dans les mélanomes malins. Il a donc été conclu que le
produit du gène Mda-7 pouvait bloquer la prolifération tumorale. En effet, l'introduction du
cDNA de Mda-7 dans des lignées de cancer du sein, ovaire, bronches ou mélanome provoque
l'apoptose. Plus tard, il a été montré que Mda-7 code pour une protéine sécrétée, nommée
interleukine 24 (IL-24) et dont la structure et les récepteurs l'apparentent aux cytokines de
type II de la famille de l'IL-10. Bien que le Mda7 soit cytostatique, aucune maladie n'a
encore été découverte avec un déficit (quantitatif ou fonctionnel) de Mda-7, associé par
exemple à un cancer donné. Par conséquent, il n'existe aucune preuve directe que ce gène soit
un suppresseur de tumeur comme évoqué par l'équipe de P.B Fisher. De plus, nous n'avons
pas eu connaissance de résultats publiés sur le « KO » du gène Mda-7 (est-il létal ? ou bien
silencieux ?).

Nos travaux ont porté sur la lignée lymphocytaire « DAUDI », dans laquelle l'introduction du
gène CD5 induit l'expression de plusieurs gènes de la famille de l'IL-10 et de leurs récepteurs
y compris le gène Mda-7/IL-24. Nous avons observé que les cellules B CD5⁺ de la leucémie
lymphoïde chronique sont fortement IL-24⁺ par rapport aux cellules B normales (Sainz-Perez
et al., 2006). En revanche, l'IL-24 recombinante, provoque l'apoptose de cellules leucémiques
en culture après stimulation par l'IL-2 (Sainz-Perez et al., 2008). Il est à signaler que la
leucémie lymphoïde chronique est due à l'amplification d'un clone malin de cellules B de
type mémoire et que dans cette maladie les lymphocytes B ne se différencient pas en
plasmocytes in vivo, d'où une hypo-gammaglobulinémie. En accord avec cette observation,
notre équipe a montré que l'IL-24 inhibe la différentiation plasmocytaire des cellules B
normales du centre germinatif (Maarof et al., 2010). Dans le prolongement de ces travaux,
l'objectif de ma thèse a donc été : 1) d'analyser les mécanismes moléculaires de l'action de
cette cytokine sur les cellules B normales et de la leucémie lymphoïde chronique 2) de mettre
en évidence les mécanismes physiologiques de production de l'IL-24 dans les lymphocytes 3)
d'explorer les effets immunologiques de cette cytokine en dehors de l'effet cytostatique et
cytotoxique.
# INTRODUCTION
## LES LYMPHOCYTES B

### 1 Retour historique : la découverte des anticorps et des lymphocytes B

C'est à la fin du XIXe siècle, à la suite des travaux séquentiels de Emil Von Behring et de Paul Ehrlich, que l'existence de molécules solubles spécifiques, connues d'abord sous le nom d'antitoxine puis sous le nom d'anticorps (Ac) ou immunoglobuline (Ig), ont été mises en évidence dans le sang (Ehrlich, 1899). À cette époque, des essais étaient déjà mis en place afin d'exploiter les propriétés protectrices de ces molécules, aussi bien à titre de traitement que d'immunisation passive contre diverses maladies, dont la diphtérie. Il fallut cependant près de 70 ans de plus pour découvrir, par les travaux de Mitchell et Miller (Miller and Mitchell, 1968; Miller, 1999; Mitchell and Miller, 1968), que la production de ces Ac était spécifiquement l'apanage des lymphocytes B, ou cellules B, qui ont été nommés ainsi par Roitt et collaborateurs (Roitt et al., 1969) à cause de leur dérivation de la bourse de Fabricius chez les oiseaux (B pour *Bursa*), par opposition aux lymphocytes T dérivant du thymus. En plus de séparer pour la première fois la population de lymphocytes en deux sous-populations distinctes, leurs travaux ont également suggéré un rôle auxiliaire d'importance aux lymphocytes T en regard à la production d'Ac. Bien que ces découvertes ont été accueillies avec critique et perçues par certains comme « compliquant les choses » (Miller, 1999), plusieurs avancées dans le domaine de l'immunologie ont suivi, validant le phénomène de la collaboration lymphocytes T-B, éclaircissant les étapes de la maturation et de la réponse des lymphocytes B, autant au niveau cellulaire que moléculaire.

### 2 La contribution des lymphocytes B à la réponse immunitaire

Lorsque l'intégrité d'un organisme est menacée par l'entrée d'un pathogène, une réponse immunitaire se met en jeu afin de contrôler l'infection en cours. Dans un premier temps, les mécanismes de défense de l'immunité innée ou naturelle entrent en jeu. Ces mécanismes sont normalement codés dans la version germinale des gènes de l'hôte, n'étant pas spécifiques à l'antigène (Ag) envahissant (Chaplin, 2006). Parmi les principaux acteurs de cette réponse, on retrouve les macrophages, les neutrophiles et les monocytes, dont la responsabilité repose sur la phagocytose du pathogène. Un rôle est également attribué aux lymphocytes B, résidant
dans le maintien des Ac en circulation dans l'organisme (Manz et al., 2005). Étant principalement de type IgM, mais pouvant aussi être de type IgA et IgG (Manz et al., 2005), les Ac dont il est question sont de faible affinité et polyréactifs, pouvant reconnaître plus d'un Ag (Baumgarth et al., 2005; Manson et al., 2005). Ils sont couramment qualifiés d'Ac « naturels » parce qu'ils sont générés par une sous-population particulière de lymphocytes B, dits B1, soit selon certains en absence de stimulation antigénique (Baumgarth et al., 2005; Manson et al., 2005) ou soit selon d'autres à la suite d'une activation constante par des bactéries, des mitogènes ou des auto-antigènes (Manz et al., 2005). Ils contribuent clairement à la première ligne de défense de l'organisme en remplissant des fonctions comparables aux Ac dits « immuns », dont la neutralisation des particules antigéniques, leur opsonisation et l'activation du complément en vue de les détruire (Baumgarth et al., 2005; Manson et al., 2005). Une représentation de ces fonctions lors d'une infection virale est présentée en figure 1 (Hangartner et al., 2006).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1 : les Ac naturels représentent un lien important entre l'immunité innée et adaptative. Ils permettent de prendre en charge l'infection temporairement, le temps qu'une réponse spécifique se mette en place. Les principales fonctions des Ac naturels ainsi que l'amorçage de l'immunité adaptative sont démontrées ici (D'après Hangartner et al., 2005).</figcaption></figure>
Une fois l'infection prise en charge temporairement par les mécanismes de l'immunité innée, les lymphocytes B s'apprêtent à remplir leur rôle primordial s'insérant dans l'immunité adaptative : engendrer une réponse spécifique au pathogène envahissant, par la production massive d'Ac spécifiques de haute affinité. Cette réponse immunitaire, aussi dite acquise, implique également les lymphocytes T, dont l'étroite collaboration avec les cellules B est nécessaire afin de générer les cellules spécialisées dans la sécrétion d'Ac nommées plasmocytes. Contrairement à l'immunité innée, l'élaboration de cette réponse repose sur la modification de certains gènes de l'hôte, particulièrement ceux codant pour les récepteurs des cellules T (TCR pour *T cell receptor*) et celui des cellules B (BCR pour *B cell receptor*), conférant à ces cellules la capacité de reconnaître et de répondre spécifiquement à l'Ag (Chaplin, 2006). Chez les lymphocytes B, cette reconnaissance est médiée par une forme membranaire de l'Ac qui sera éventuellement sécrété par la cellule, à titre de molécule effectrice visant la neutralisation de l'Ag. La seconde particularité de la réponse adaptative est de générer une mémoire immunologique permettant une réponse rapide de l'organisme si l'infection survient de nouveau (Gourley et al., 2004). Cette fonction mémoire se traduit chez les lymphocytes B d'une part par la génération d'une sous-population persistante de cellules spécifiques à l'Ag en constante recirculation, que l'on nomme lymphocytes B mémoires (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a). Ces cellules à longue vie seront sollicitées lors de la réapparition de l'Ag et seront à la base de la réponse secondaire de défense. D'autre part, les lymphocytes B contribuent à la mémoire immunologique *via* la sécrétion soutenue d'Ac spécifiques par les plasmocytes dits à longue vie générés lors de la réponse primaire à l'Ag. Le maintien de ces cellules effectrices au niveau de la moelle osseuse assure à long terme un moyen de neutraliser ou d'éliminer les pathogènes et leurs toxines de l'organisme (Manz et al., 2005).

Par la production d'Ac, les lymphocytes B sont responsables de l'immunité humorale, qui se définit comme une protection que l'on peut transférer à une autre personne par le sérum contenant des Ac. Le pendant de l'immunité humorale est l'immunité dite cellulaire, qui englobe toutes les réponses adaptatives dans lesquelles les lymphocytes T spécifiques sont impliqués. Elle est par définition l'immunité qui ne peut pas être transférée par les Ac du sérum (D'après Chatenoud et Bach, l'immunologie de la biologie à la clinique 2008).
# 3 Ontogénie des lymphocytes B

## 3.1. Différents stades de différentiation des lymphocytes B

La différentiation des cellules B, à partir des cellules souches hématopoïétiques (CSH), se déroule dans la moelle osseuse. Les LB obtenus sont alors des cellules dites « immatures naïves ». Ils subissent plusieurs étapes de sélection positive et négative avant d'aboutir à un lymphocyte naïf. Les cellules B qui présentent des récepteurs (preBCR ou BCR) autoréactifs sont éliminées par délétion clonale. Ce processus est appelé Tolérance centrale. Plusieurs « checkpoints » de ce type existent et leur déficience peut aboutir à des maladies auto-immunes (Meffre and Wardemann, 2008; Tsuiji et al., 2006; Vinuesa et al., 2010) et à des pathologies lymphoïdes notamment la LLC. Dans les organes lymphoïdes secondaires a lieu la maturation de ces LB en cellules mémoires/effectrices et en plasmocytes à partir des cellules B folliculaires mais aussi extrafolliculaires. Les cellules B subissent également des processus de sélection positive et de délétion clonale dans le centre germinatif.

De nombreux facteurs de transcription interviennent au cours du développement des LB (Ramírez et al., 2010). Comme présenté dans la figure 2, le facteur IKaros, indispensable à la différenciation précoce de la CSH vers la voie lymphoïde (Yoshida et al., 2006), intervient très tôt dans la régulation de l'expression de gènes spécifiques de la lignée B (Tonnelle et al., 2009). PU.1, un autre facteur interviendrait plutôt dans la bifurcation entre développement myéloïde et lymphoïde B. Le facteur E2A n'est pas nécessaire à l'expression d'IKaros, PU.1 et Gfil mais est requis pour l'expression d'EBF, Pax5 et pour le « programme » spécifique des LB. Il interviendrait aussi bien précocement dans la lymphogenèse B qu'au niveau de la maturation des LB au niveau des centres germinatifs (Kwon et al., 2008). Pax5, est quand à lui, un facteur majeur d'engagement et de maintien de la lignée B (Medvedovic et al., 2011) et des régulations épigénétiques du gène de Pax5 sont à l'origine de ces effets (Linderson et al., 2004). Enfin, EBF régule de nombreux gènes de la lignée B, et comme Pax5, est exprimé plus tardivement que les autres facteurs de transcription (Vilagos et al., 2012).
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2 :** *Facteurs de transcription impliqués dans la lymphogenèse B (Ramirez et al., 2010).*</figcaption></figure>

Les différents stades de différentiation des LB sont bien caractérisés chez la souris et sont décrits précisément dans la figure 3. Ils sont déclinés en stade pro/pré BI, en stade pré-BII qui peut se subdiviser lui-même en deux, en stade B immature, en stade B transitionnel et enfin en stade B mature comprenant plusieurs types de LB (Tussiwand et al., 2009).

**Le stade pro/pré BI** : la cellule B, à ce stade, possède encore le marqueur de CSH qui est le CD34 et déjà des marqueurs plus spécifiques de la lignée B comme CD19 (qui persistera jusqu'au stade de différentiation plasmocytaire) et le marqueur CD117 (c-kit). Ces cellules n'expriment pas CD20 et ne possèdent qu'un « pro-récepteur » à l'antigène. Leur engagement dans la lignée B est à ce stade réversible (Medvedovic J et al., 2011) et peut être annulé par l'ablation du gène Pax5.

**Le stade pré-BII** : la progression vers le stade pré-B se caractérise par la disparition du CD34 et du CD117 et la présence de la plupart des marqueurs caractérisant les LB (dont le CD20). Ce stade est également associé à l'activation des systèmes enzymatiques responsables des réarrangements des gènes des Ig [enzymes RAG (Recombination Activating Gene) 1 et 2] à l'origine de la synthèse d'une chaîne lourde et la cellule B possède alors un pré-BCR. Seules les cellules qui possèdent ce pré-récepteur vont proliférer et on parle alors de pré-BCR « checkpoint » (Tussiwand et al., 2009).

**Stade B immature** : les cellules, après une phase d'expansion, deviennent plus petites et sont capables de synthétiser les chaînes légères des Ig et celles-ci s'associent aux chaînes lourdes pour former les Ig de classe IgM qui constituent le BCR exprimé à la surface des cellules B. Seuls les LB ayant un BCR fonctionnel reçoivent des signaux de survie (sélection positive) et vont proliférer. Les cellules sélectionnées positivement vont alors migrer de la moelle osseuse
vers la rate chez la souris pour compléter leur maturation (Sims et al., 2005). A ce stade, avant le départ de la moelle osseuse, il existe une sélection contre l'auto-réactivité, appelée « sélection négative », visant à détruire, par apoptose, les LB reconnaissant des antigènes du soi, c'est la tolérance « centrale ». De plus, lorsque les LB quittent la moelle osseuse, ils deviennent « sensibles » aux signaux de survie induit par BAFF (pour B-cell Activating Factor). Cette molécule de la famille du TNF, encore appelée BLyS, interagit avec son récepteur, BAFF-R présent à la surface des LB (Schneider, 2005). Ce facteur joue un rôle primordial dans la survie et la maturation des LB murins.

**LB transitionnels** : à ce stade, ces cellules expriment le CD93 alors que les LB matures ne l'expriment plus et présentent des IgM mais également des IgD (Tussiwand et al., 2009). Ces LB vont pouvoir se différentier en LB matures naïfs de trois types : LB de la zone marginale (BMZ), LB B1 et LB B2 ou folliculaires.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3** : Différents stades de développement des lymphocytes B chez la souris (Tussiwand et al., 2009).</figcaption></figure>

Ces connaissances, obtenues chez la souris, ont permis d'étudier le développement des LB chez l'homme. La différentiation des LB dans la moelle osseuse chez l'homme est très proche de celle décrite ci-dessus chez la souris. Par contre, au niveau périphérique, des différences sont observées entre les deux espèces et les connaissances sont plus limitées chez l'homme.

Chez l'homme, les différents stades pro-B, pré-BI, pré-BII et LB immatures sont en effet retrouvés. Les différents marqueurs de ces sous-populations sont détaillés dans la figure 4 (page suivante) (Perez-Andres et al., 2010).
<figure><img src="image_5.png" /></figure>

**Figure 4 :** Différentiation des lymphocytes B chez l'homme. La classification est effectuée selon les caractéristiques phénotypiques des différentes sous-populations (Perez-Andres et al., 2010).

## 3.2. La diversité du répertoire d'anticorps et la théorie de sélection clonale

Afin de remplir leur rôle d'importance dans l'immunité adaptative, les lymphocytes B doivent assurer la reconnaissance spécifique d'innombrables pathogènes. Ils s'acquittent de cette tâche grâce à la grande diversité de la spécificité de leurs récepteurs, les Ac membranaires. On réfère couramment à cette diversité comme le répertoire des Ac qui représente la variété totale d'Ac dont dispose l'organisme. Chaque individu possède une multitude de lymphocytes B dont chacun présente une spécificité unique. Ce concept « une cellule, un Ac » a été démontré par les travaux de Nossal et collaborateurs (Nossal, 2002) et constitue la première évidence de la théorie de la sélection clonale avancée par Burnet en 1957 (BURNET, 1957). Cette théorie, à la base de l'immunité adaptative, postule entre autres que chaque lymphocyte possède un récepteur de spécificité unique, que seulement les cellules exprimant un récepteur approprié pourront lier un Ag particulier avec une grande affinité, ce qui conduira à l'activation des lymphocytes qui se différencieront alors en cellules effectrices portant un récepteur de spécificité similaire à celui exprimé par la cellule dont ils dérivent (BURNET, 1957). Afin de
générer une telle diversité, il est inconcevable que tout le répertoire des Ac soit codé par des gènes distincts, puisqu'il faudrait plus de gènes pour coder ces récepteurs qu'il en existe dans le génome en entier. Pour contourner cette difficulté, une astuce génétique a été adoptée par l'organisme : on permet des modifications moléculaires dans le nombre restreint de gènes qui codent pour les Ac.

### 3.3. Le développement des lymphocytes B dans la moelle osseuse : les réarrangements génétiques et la tolérance au soi

Les réarrangements moléculaires amenés précédemment surviennent dans les gènes des Ig lors du développement des lymphocytes B dans la moelle osseuse à partir des cellules souches hématopoïétiques. De multiples signaux solubles et membranaires, comme l'interleukine-7 (IL-7), le stem cell factor (SCF) et le fms-like tyrosine kinase-3 ligand (FLT-3L) produits ou présentés par les différents types de cellules stromales constituant cet environnement, sont nécessaires à leur génération (Nagasawa, 2006). La figure 5, reprenant les concepts présentés dans la revue de Ollila et collaborateurs (Ollila and Vihinen, 2005), illustre les différentes phases de ce processus de développement, au travers desquelles les gènes des Ig des cellules B subissent des modifications génétiques.

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

**Figure 5** : Les stades du développement des lymphocytes B dans la moelle osseuse et les réarrangements moléculaires associés. Ce schéma reprend les concepts présentés en (Ollila et al., 2005). Pour la chaîne légère, uniquement les gènes du locus κ sont reproduits. Les abréviations présentées dans cette figure correspondent aux termes suivant : Chaîne L : chaîne légère; Chaîne H : chaîne lourde; L : séquence leader; V : segment de variabilité ; J : segment de jonction; D : segment de diversité; C : segment de région constante.
Au départ, uniquement la chaîne lourde des Ig est réarrangée à l'aide des enzymes de recombinaison RAG-1 et RAG-2 et est exprimée fonctionnellement en surface des cellules pré-B à titre de pré-BCR, conjointement à une chaîne légère de substitution, VpreB ou λ5 (Geier and Schlissel, 2006). À cette étape, l'expression des protéines RAG est diminuée, les cellules prolifèrent et éliminent leur dépendance à l'IL-7 (Geier and Schlissel, 2006)). Par la suite, la chaîne légère des Ig est réarrangée toujours à l'aide des protéines RAG, ce qui conduit à l'expression d'un BCR de type IgM, unique et fonctionnel, en surface des cellules B dites « immatures » et à l'inactivation subséquente des recombinases (Geier and Schlissel, 2006).

Durant ces processus de réarrangement, on note une première perte majeure des cellules B, parce que seulement le tiers des cellules pourra procéder à un réarrangement productif de la chaîne lourde et qu'une fraction encore plus petite réussira un réarrangement productif de la chaîne légère (Su et al., 2004). Les cellules ne pouvant exprimé des Ig fonctionnelles mourront par apoptose et seront possiblement éliminées *in situ* par les macrophages (Su et al., 2004).

Malgré ces pertes cellulaires précoces, un nombre important de cellules B atteint tout de même chaque jour le stade dit immature, chiffré à $2 \times 10^7$ cellules chez la souris (Su et al., 2004) et estimé à $10^{10} – 10^{11}$ cellules chez l'humain (Banchereau and Rousset, 1992). Cependant, seulement 10 à 20% de ces cellules sortiront de la moelle osseuse, en vue de rejoindre la périphérie (Su et al., 2004). Cette seconde perte cellulaire est due à plusieurs « checkpoints » (tableau 1) que subit la cellule B pour éliminer les cellules autoréactives afin d'éviter qu'elles puissent engager une réponse immunitaire contre le soi une fois relarguées en périphérie (Yurasov et al., 2005). On décrit ce phénomène comme l'induction de la tolérance au soi.

<table><caption>Tableau 1 : différents « checkpoints » subis par les LB pour éliminer les cellules autoréactives.</caption><thead><tr><td>Délétion clonale</td><td>Anergie</td><td>Receptor Editing</td></tr></thead><tbody><tr><td>Sélection négative des LB auto-réactifs suite à une forte liaison de l'AC membranaire avec l'auto-Ag.</td><td>Faible liaison de l'AC membranaire avec l'auto-Ag. Les cellules passent dans la circulation pour être détruites au niveau de la Rate (Chung et al., 2003).</td><td>Recombinaison supplémentaire dans les gènes de chaîne légère pour éliminer la spécificité autoréactive du récepteur en le remplaçant par un nouveau BCR non autoréactif (Pelanda and Torres, 2006).</td></tr></tbody></table>
En résumé, l'environnement de la moelle osseuse est le siège de la génération de cellules B porteuses d'un répertoire d'Ac diversifiés, tolérants au soi. Les cellules B ainsi générées, ayant survécu à cette étape de sélection négative, sont maintenant prêtes à être relarguées en périphérie. Contrairement à ce qu'on croyait il y a une dizaine d'années, les cellules relâchées sont toujours de type immature.

### 3.4. Les lymphocytes B transitionnels et leur maturation au niveau de la rate

Chez la souris et l'humain, on retrouve en circulation des lymphocytes B immatures, transitant de la moelle osseuse vers la rate, où ils achèveront leur développement en cellules matures dites naïves (Carsetti et al., 2004). Tout d'abord décrites et étudiées chez la souris, ces cellules immatures ont été appelées « transitionnelles » (transitional B cells) pour la première fois en 1995 par Carsetti et collaborateurs (Carsetti et al., 1995). Elles représentent 10 à 15% des cellules de la rate murine et possèdent une courte durée de vie, de 3 à 4 jours, qui représentent la période de temps nécessaire à leur maturation en cellules naïves (Su et al., 2004). Chez l'humain, ces cellules ont été quantifiées dans le sang et représentent 2% des lymphocytes B circulants (Dudley et al., 2005 ; Sims et al., 2005 ; Carsetti et al., 2004). Chez les deux espèces, ces cellules transitionnelles acquièrent l'expression des IgD en surface (Carsetti et al., 2004) en plus de celle des IgM, par un processus d'épissage alternatif d'un pré-acide ribonucléique messager (pré-ARNm) (Dudley et al., 2005). À partir du modèle murin, on suggère que dans la phase précoce de maturation dans la rate, les cellules B seraient sélectionnées négativement à la suite de la reconnaissance d'un Ag du soi et seraient éliminées par apoptose (Su et al., 2004). Ensuite, un processus plus tardif de sélection positive s'opérerait (Su et al., 2004), suivi (Srivastava et al., 2005) ou non (Allman et al., 2001) d'une phase de prolifération, permettant théoriquement d'augmenter la fréquence des cellules dont la spécificité serait potentiellement utile dans le répertoire mature de cellules B (Srivastava et al., 2005). Les signaux délivrés à ces cellules en maturation semblent cibler le BCR et/ou les récepteurs apparentés à la famille Toll (Toll-like receptors, TLR), dont la fonction première est de reconnaître et de répondre à des structures bactériennes spécifiques (Su et al., 2004).

Globalement, seulement 3 à 5% des lymphocytes B immatures générés dans la moelle osseuse rejoindront le réservoir de cellules matures de la périphérie (Jankovic et al., 2004; Srivastava et al., 2005) y demeureront en circulation de 80 à 120 jours (Cancro, 2004). Les cellules B n'interagissant jamais avec leur Ag seront éliminées par apoptose et remplacées par de
nouvelles cellules B matures (Gaudin et al., 2004). Ce processus de remplacement cellulaire équilibré représente bien l'homéostasie du réservoir périphérique chez l'individu sain dont la taille globale ainsi que les proportions des sous-populations cellulaires sont maintenues constantes malgré les changements s'y opérant (Gaudin et al., 2004). Ce réservoir de cellules B renferme le répertoire primaire des Ac dont les spécificités ont été établies avant la réponse à un Ag étranger et qui servira à monter adéquatement les réponses immunitaires futures.

# 4 La réponse des lymphocytes B matures aux différents types d'Ag

On classe les agents étrangers pouvant induire une réponse immunitaire en différentes catégories, suivant la manière avec laquelle ils peuvent engendrer une activation des cellules B, traduite par une prolifération cellulaire et la production d'Ac. On peut catégoriser ces agents soit en Ag indépendants du thymus, dits T-indépendants de type I ou II, soit en Ag T-dépendants. Les premiers pourront enclencher seuls l'activation des lymphocytes B, alors que les seconds nécessiteront l'aide spécifique des lymphocytes T.

## 4.1. La réponse des lymphocytes B aux Ag T-indépendants de type I

Les Ag T-indépendants de type I sont couramment appelés mitogènes, puisqu'ils ont la capacité intrinsèque d'induire la mitose des cellules. À de fortes concentrations, ils peuvent stimuler de multiples cellules B à la fois, phénomène auquel on réfère en tant que stimulation polyclonale (Vos et al., 2000). Le pouvoir de ces Ag à agir sur plus d'une cellule B réside dans leurs sites de liaison qui sont indépendants du BCR. Entre autres, ces molécules font entrer en jeu les TLR, dont la stimulation enclenche une cascade d'activation qui mènera éventuellement à la production d'Ac (Peng, 2005). Les lipopolysaccharides (LPS) retrouvés dans les parois bactériennes sont un exemple de cette catégorie d'Ag (Vos et al., 2000), que les cellules B pourront rencontrer, comme les autres types d'Ag, au niveau des organes lymphoïdes secondaires. Autant les lymphocytes B matures qu'immatures peuvent répondre à ce type de stimulation, ce qui n'indique aucune préférence au niveau de la population cible. Les cellules ainsi activées semblent contribuer au maintien des niveaux d'Ac dans le sérum, bien que la voie de différenciation empruntée par ces dernières demeure encore obscur (Manz et al., 2005).
## 4.2. La réponse des lymphocytes B aux Ag T-indépendants de type II

Les Ag T-indépendants de type II, de leur côté, n'ont pas la capacité intrinsèque d'activer les lymphocytes B (Weintraub, 2003). Ils agissent sur les cellules B spécifiquement via le BCR en induisant sa multimérisation (Vos et al., 2000). Le regroupement d'un minimum de 10 à 20 molécules d'Ac de surface semble critique pour l'activation des cellules, suivi du recrutement d'un récepteur supplémentaire, comme celui du récepteur du complément 2, aussi connu sous le nom de Cluster of differentiation 21 (CD21) et qui est également le récepteur à l'EBV (Jeurissen et al., 2004). Bien que cette réponse ne nécessite pas l'aide spécifique des cellules T, il semble que des signaux secondaires provenant de ces cellules pourraient tout de même être requis (Jeurissen et al., 2004). Les cellules B répondant à ce type d'Ag reçoivent également l'aide des cellules dendritiques (DC) du sang ayant capturé l'Ag, principalement via la production de facteurs comme le B Lymphocyte Stimulator (BLyS)/BAFF et/ou A Proliferation-Inducing Ligand (APRIL) (Balázs et al., 2002). Cette interaction influence directement la survie des cellules B répondantes et leur différenciation en cellules sécrétrices d'Ac, appelées plasmocytes (Balazs et al., 2002), par une voie extrafolliculaire (Shapiro-Shelef and Calame, 2005) qui sera abordé plus loin. Les Ag responsables de cette réponse sont de haut poids moléculaire et possèdent des structures répétitives, généralement polysaccharidiques, comme on en retrouve fréquemment dans la capsule de bactéries telles que Streptococcus pneumoniae ou Haemophilus influenzae (Weintraub, 2003). Bien qu'il soit généralement admis que ces Ag ne génèrent pas de mémoire immunologique comme les Ag T-dépendants, il a récemment été démontré qu'ils pourraient induire la génération de lymphocytes B mémoires chez la souris (Obukhanych and Nussenzweig, 2006), ainsi qu'une protection à plus long terme de l'organisme par la production d'Ac sériques spécifiques, autant chez la souris que chez l'humain (Obukhanych and Nussenzweig, 2006; Welsh et al., 2004).

## 4.3. La réponse des lymphocytes B aux antigènes T-dépendants

Les Ag T-dépendants sont de nature protéique (protéines solubles ou peptides) et sont désignés ainsi car les lymphocytes B nécessitent la collaboration des lymphocytes T pour monter une réponse humorale efficace (Mond et al., 1995). La majorité des cellules B répondant à ce type d'Ag sont dites conventionnelles (ou folliculaires) et font partie de la catégorie B2. La contribution des cellules B des MZ ne peut cependant pas être exclue (Lopes-Carvalho et al., 2005). Ces dernières possédant une capacité supérieure à celle des
cellules B folliculaires à activer les lymphocytes T CD4⁺ chez la souris (Attanavanich and Kearney, 2004) et pouvant également former des CG, acquérir des mutations somatiques, exprimer des Ig de haute affinité et préserver une mémoire immunologique comparable à celle des cellules folliculaires dans ce type de réponse (Song and Cerny, 2003). En fait, la mémoire immunologique engendrée par les cellules B des MZ pourrait être jugée plus importante que celle des cellules B conventionnelles, car en plus de monter une réponse secondaire IgG, les cellules B des MZ seraient les seules à générer une réponse secondaire IgM (Song and Cerny, 2003).

Une fois le contact lymphocyte B - Ag établi, un premier phénomène de coopération lymphocyte B – lymphocyte T s’installe. Elle découle d’une interaction spécifique à l’Ag de la part des deux types cellulaires, bien qu’ils ne reconnaissent pas exactement la même structure antigénique, appelée épitope (Mitchison, 2004). La clonalité des récepteurs des cellules B et T et le fait que l’Ag représente le lien qui les unisse impliquent que de très rares cellules spécifiques (environ 1 sur un million) devront entrer en contact (Mitchison, 2004). Encore aujourd’hui, il est peu clair comment ces cellules rejoignent leur Ag et se rencontrent pour monter une réponse (Okada and Cyster, 2006). On suppose que leur recrutement et leur maintien dans un environnement particulier reposent sur le pouvoir d’attraction des chimiokines qui sont présentes différentiellement dans les tissus et sont reconnues par des récepteurs spécifiques exprimés sur les cellules cibles (Stein and Nombela-Arrieta, 2005).

En plus de générer, comme lors des réponses T-indépendantes, une première vague de plasmocytes dont la majorité est à courte vie (via la réponse extrafolliculaire), les réponses T-dépendantes ont la capacité d’induire une mémoire immunologique classique (Weintraub, 2003), grâce à la génération de lymphocytes B mémoires et de plasmocytes dits à longue vie. Ces deux types de cellules « mémoires » sont issus de la réaction des CG, au sein desquels un second phénomène de coopération lymphocyte B – lymphocyte T prend place. La réponse à ce type d’Ag est soi-disant la seule à conduire à la production d’Ac de haute affinité pour l’Ag par le processus génétique d’hypermutation somatique des gènes des Ig. Avec les avancées récentes touchant les réponses T-dépendantes, on envisage toutefois une modification éventuelle de cette assertion. Néanmoins, les Ac ainsi modifiés contribuent à augmenter la diversité du répertoire d’Ac établi précédemment durant la génération du réservoir de lymphocytes B matures.
### 4.3.a. L'initiation de la réponse des lymphocytes B naïfs

À l'initiation de la réponse primaire T-dépendante, les lymphocytes B naïfs recevront principalement deux signaux : le premier dérivera de leur rencontre avec l'Ag correspondant à leur spécificité uniquement et le second proviendra de leur premier contact avec un lymphocyte T spécifique.

#### 4.3.a.i. Le recrutement des Ag et des cellules B dans les organes lymphoïdes secondaires

Anatomiquement, la rencontre des lymphocytes B et des Ag s'amorce au sein d'un organe lymphoïde secondaire comme les ganglions, la rate et les tissus lymphoïdes associés aux muqueuses (MALT pour *Mucosal-associated lymphoid tissue*), qui incluent entre autres les amygdales et les plaques de Peyer (Drayton et al., 2006). Ces structures sont spécialisées dans la capture et la concentration des particules étrangères, à travers lesquelles les cellules B recirculent continuellement (Drayton et al., 2006). Les Ag peuvent pénétrer ces structures sous forme soluble, sous forme de complexe immun ou bien déjà en association avec des DC qui les auront captés au niveau des différentes surfaces épithéliales avant de migrer, par exemple, aux ganglions (Okada and Cyster, 2006).

Les vaisseaux lymphatiques afférents sont majoritairement responsables de l'entrée des Ag et des DC au niveau du ganglion, alors que les veinules post-capillaires à endothélium épais, connues sous le nom de *High endothelial venules* (HEV), sont spécialisées dans l'extravasation exclusive des lymphocytes (B et T) du sang vers les ganglions (Miyasaka and Tanaka, 2004). Les DC activées par l'Ag qui entrent dans le ganglion vont majoritairement se loger dans la zone riche en lymphocytes T à proximité des HEV, où elles pourront exercer leur fonction première, c.-à-d. présenté des Ag aux cellules T (Miyasaka et Tanaka., 2004). La migration dirigée des DC, des lymphocytes T et B dans cette structure est dépendante de la capacité de chacune des populations à répondre à l'attraction des chimiokines *CC-chemokine ligand 19* (CCL19), CCL21 et *CXC-chemokine ligand 13* (CXCL13) (Miyasaka et Tanaka., 2004), dont la présence est illustrée dans la figure 6, représentant l'organisation structurale d'un ganglion lymphatique.

Dans cet environnement, les lymphocytes B spécifiques sont traditionnellement activés par la liaison de leur BCR soit avec la forme soluble de l'Ag, soit avec sa forme complexée (Ag-Ac) présentée en surface des cellules dendritiques folliculaires (FDC) (Okada et Cyster., 2006). Récemment, la contribution supplémentaire des DC à l'activation spécifique des lymphocytes B a été mise en évidence, où la forme native de l'Ag pourrait être présentée en complexe à la
surface des DC (Qi et al., 2006) via un mécanisme d'endocytose impliquant le récepteur FcγRIIB (Okada et Cyster., 2006). Ce processus de présentation des Ag diffère de ce qui est observé dans le cas de l'activation des cellules T où les Ag sont obligatoirement dégradés avant de retourner en surface. Une fois le BCR multimérisé à la suite du contact avec l'Ag, une signalisation intracellulaire s'enclenche chez la cellule B favorisant l'internalisation du complexe Ag – Ac (Clark et al., 2004). L'Ag est ensuite dégradé en fragments peptidiques avant de retourner en surface de la cellule B au sein d'un autre complexe, le complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH II) (Clark et al., 2004). Ce processus de reconnaissance antigénique modifie la réponse de la cellule B aux chimiokines en variant l'expression de récepteurs spécifiques, ce qui dirige la poursuite de leur migration dans le ganglion vers la zone folliculaire (Garside et al., 1998)(Miyasaka et Tanaka., 2004).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 6 : La structure d'un ganglion lymphatique (Drayton et al., 2006).</figcaption></figure>
4.3.a.ii. La première interaction spécifique lymphocytes B naïfs – lymphocytes T

Les lymphocytes B sont maintenant prêts à coopérer une première fois avec des lymphocytes T spécifiques via une interaction entre le TCR de la cellule T et les complexes peptide – CMH II présentés en surface de la cellule B. Cette rencontre se produira à la frontière de la zone folliculaire et de la zone de cellules T (Okada et Cyster., 2006), 2 à 3 jours (interaction précoce T-B) après l'entrée de l'Ag dans l'organisme (Garside et al., 1998). Les cellules T destinées à assister les lymphocytes B dans leur réponse, sont connus sous le nom de cellules T auxiliaires (T<sub>H</sub> pour *T helper*) et se caractérisent par l'expression du récepteur CD4 en surface (Chaplin, 2006), qui joue un rôle de corécepteur stabilisateur pouvant lier les molécules de CMH II en surface de la cellule B (Chaplin, 2006). En vue de cette interaction, les cellules T auront été au préalable activées par une cellule présentatrice d'Ag (APC) à la suite, entre autres, de la liaison du TCR avec les complexes peptides - CMH II qu'elles portent (Gogolák et al., 2003) et de l'interaction du CD154 (sur la cellule T) avec le CD40 (sur la CPA) (Crawford et al., 2006). Tel que mentionné précédemment, les APC possédant cette fonction sont traditionnellement les DC, bien qu'une contribution additionnelle des lymphocytes B dans ce processus précoce a récemment été montrée comme essentielle chez la souris (Crawford et al., 2006). La reconnaissance de l'Ag par la cellule T résultera en son activation, sa multiplication et sa maturation en différentes sous-populations de cellules effectrices, dont des lymphocytes T auxiliaires du type T<sub>H1</sub> ou T<sub>H2</sub> (Kim, 2005). Habituellement, les cellules du type T<sub>H1</sub> sont médiatrices de l'immunité cellulaire contre les bactéries et les virus intracellulaires et les cellules T<sub>H2</sub> participent à l'immunité humorale ainsi qu'à la réponse contre les parasites extracellulaires (Lee et al., 2006). La première interaction spécifique cellule B – cellule T impliquerait autant des cellules T<sub>H1</sub> que T<sub>H2</sub>, qui se distinguent par le patron de cytokines qu'elles sécrètent : la production d'interféron γ (IFN-γ) étant réservée aux T<sub>H1</sub>, alors que la production d'IL-4, d'IL-5 et d'IL-13 étant associée aux T<sub>H2</sub> (Stetson et al., 2004; Vinuesa et al., 2005). Comme le fait l'Ag par sa nature, les différentes cytokines produites influenceront la commutation isotypique des cellules B en favorisant l'expression d'une classe ou d'une sous-classe d'Ig particulière (Vinuesa et al., 2005). Durant la différenciation des cellules T en T<sub>H2</sub>, la première cytokine produite est l'IL-4, dont la présence est nécessaire à leur polarisation et par la suite, cette polarisation (Ansel et al., 2006) ainsi que la survie des cellules (Pulendran and Ahmed, 2006) sont renforcées par la production d'IL-2, normalement réservée aux cellules du type T<sub>H1</sub> (Stetson et al., 2004). De l'IL-4 serait également produite par les lymphocytes T à la suite de l'interaction avec les
cellules B spécifiques, sans stimulation via le CD154 (Cunningham et al., 2004) qui survient
plus tard.

Une fois le contact cellule B – cellule T activée établi via les interactions peptide-CMH II - TCR et CMH II - CD4, des signaux supplémentaires sont nécessaires à la poursuite de la réponse. Entre autres, on note la contribution de quatre couples récepteurs – ligands, CD72-CD100, CD154-CD40, CD86-CD28 et B7 related-protein 1- inducible costimulator (B7 RP 1-ICOS), dont les récepteurs se retrouvent sur les cellules B et les ligands sur les cellules T (Bernard et al., 2005).

Globalement, à l'issue de la première interaction T-B, les cellules B pourront soit migrer dans la zone folliculaire et élaborer un CG, soit migrer dans la zone extrafolliculaire (sinus médullaire du ganglion ou pulpe rouge de la rate) et monter rapidement la première réponse. Ac dite extrafolliculaire par la génération de plasmocytes à courte vie (MacLennan et al., 2003). La résultante de cette première interaction est schématisée dans la figure 7, tirée de (Vinuesa et al., 2005).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 7 : Schématisation de l'aboutissement de la première rencontre B–T au niveau de la rate chez la souris. On y représente la décision de rejoindre la voie extrafolliculaire et de former des plasmocytes à courte vie ainsi que celle de former un CG au niveau de la zone folliculaire (Vinuesa et al., 2005).</figcaption></figure>

L'engagement dans la voie extrafolliculaire ou celle des CG semble dépendre de l'intensité de stimulation du CD40 (Erickson et al., 2002) et de la force du signal reçu par le BCR, qui elle même dépend de l'affinité du récepteur pour l'Ag (Paus et al., 2006). Les cellules de plus haute affinité seraient recrutées préférentiellement dans la voie extrafolliculaire assurant ainsi
une réponse Ac rapide et spécifique (Paus et al., 2006). Au niveau transcriptionnel, des facteurs clés sont connus comme dirigeant exclusivement les cellules dans l'un ou l'autre des voies : par exemple, l'induction de l'expression du *B lymphocyte-induced maturation protein-1* (BLIMP-1) engage les cellules dans la voie extrafolliculaire des plasmocytes, alors que l'augmentation de l'expression de Bcl-6 les dirige dans la voie des CG (MacLennan and Vinuesa, 2002). *In vivo*, bien que la réaction des CG s'établisse et se complète après la réponse Ac extrafolliculaire, on l'abordera tout de même ici en premier, à cause de sa complexité.

### 4.3.b. Les CG et leur fonction

La réaction des CG se définit comme étant le cycle d'activité cellulaire et de changements moléculaires qui régulent l'évolution clonale des cellules spécifiques durant le développement des cellules B mémoires (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a). En d'autres mots, la réaction du CG permet d'amplifier la population cellulaire spécifique à l'Ag, d'augmenter son affinité pour ce dernier et de ne sélectionner que les cellules les plus affines pour monter le réservoir de cellules mémoires et de plasmocytes effecteurs.

#### 4.3.b.i. L'expansion et la sélection des lymphocytes B

Chez la souris, l'initiation de chaque CG implique le recrutement de 1 à 3 cellules B spécifiques dans la zone folliculaire (McHeyzer-Williams et al., 2001). Ces cellules connaissent alors une expansion, à un point tel que le CG pourra contenir environ $10^4$ cellules B à sa taille maximale, atteinte après 10-12 jours suivant le début de la réponse primaire (McHeyzer-Williams et al., 2001). C'est ce foyer de cellules en prolifération que l'on nomme CG et qui constitue le follicule dit secondaire au sein du follicule primaire (zone folliculaire), comme on peut l'observer dans la figure 8. Les zones claire et foncée constituent le CG, alors que la zone du manteau représente soit les cellules résidentes du follicule primaire qui ont été repoussées durant l'initiation du CG soit les cellules B non réactives (Wolniak et al., 2004).

Dès l'initiation du CG, les lymphocytes B, exprimant des Ig en configuration germinale, entrent en prolifération rapide. Ces cellules portent alors le nom de centroblastes et se situent dans la zone foncée du CG (McHeyzer-Williams et al., 2006). Le processus d'hypermutation somatique se met alors en jeu, induisant dans les gènes des Ig une mutation par division cellulaire (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a), ce qui implique une fréquence de $1 \times 10^{-3}$ base mutée par génération (Notarangelo et al., 2006). Par la suite, les cellules exprimeront des Ig à l'affinité modifiée, cesseront de se diviser et migreront dans la zone claire des CG au sein de laquelle elles seront appelées centrocytes (McHeyzer-Williams
et al., 2006). C'est sur la base de la nouvelle affinité que présente l'Ac de surface pour l'Ag que les cellules seront une nouvelle fois sélectionnées (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a). Les FDC, retrouvées en grande concentration dans cette zone des CG, maintiennent en surface les Ag natifs sous forme de complexes immuns et les exposent ainsi aux lymphocytes B (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a; Park and Choi, 2005). Les cellules possédant les affinités les plus faibles pour l'Ag meurent par apoptose *in situ*, alors que celles possédant les plus hautes affinités sont sélectionnées positivement (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a). Bien que ce mécanisme de compétition ne soit pas clairement défini (McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a), on croit que les cellules seraient initialement programmées à mourir, à moins qu'elles ne reçoivent des signaux positifs de survie.

L'implication directe des FDC au niveau de la liaison BCR-Ag demeure à être démontrée (Manser, 2004; Park and Choi, 2005). Plusieurs cycles de sélection – maturation d'affinité peuvent ensuite se succéder, jusqu'à ce que la différenciation des cellules en plasmocytes ou en cellules mémoires soit induite (Manser, 2004). En absence de stimulation antigénique supplémentaire, le CG disparaîtra après 21 jours suivant le début de l'infection (McHeyzer-Williams et al., 2001). Même si les événements décrits précédemment prennent majoritairement leur source de l'étude du modèle murin, ces derniers semblent bien s'appliquer au modèle humain, où les travaux sont souvent confinés à l'étude de tissus inflammés (Wolniak et al., 2004). Chez les deux espèces, on retrouve une morphologie classique comparable des CG (Wolniak et al., 2004) définie par des sous-populations distinctes regroupées en zones (Manser, 2004) similairement à celle illustrée à la figure 8.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 8 :** *Structure micro-anatomique de la zone folliculaire d'une rate de souris, montrant la structure d'un follicule secondaire, que l'on nomme CG (Sagaert and De Wolf-Peeters, 2003).*</figcaption></figure>
Tel qu'abordé précédemment, la seconde interaction T-B via la liaison du CD40 avec le CD154 se déroule au niveau de la réaction du CG. À cette étape, l'aide des cellules T est requise pour la progression de cette réaction (Manser, 2004), dont la sélection des cellules B (McHeyzer-Williams et al., 2006) et la différenciation en plasmocytes (Moser et al., 2006). La sous-population de cellules T destinée à cette coopération diffère toutefois de celle(s) impliquée(s) lors de la première interaction T-B (voir section 4.3.aii). En effet, cette sous-population particulière de cellules T, appelée « cellules T folliculaires aidant les B » (pour follicular B helper T cells ou T<sub>FH</sub> (Breitfeld et al., 2000) se retrouve uniquement dans l'environnement des CG, autant chez la souris que chez l'humain, et aurait comme rôle d'aider les lymphocytes B à se différencier en cellules mémoires et en plasmocytes (Vinuesa et al., 2005). Ces cellules, auxquelles on peut aussi référer en tant que cellules T des CG (germinal center helper T cells), se situent principalement dans la zone du manteau ainsi qu'à proximité et dans la zone claire des CG (Vinuesa et al., 2005). Elles ont été récemment définies par l'expression de CXCR5<sup>high</sup>, ICOS<sup>high</sup> (pour inducible costimulator, une molécule de co-stimulation T de la famille du CD28 qui favorise particulièrement la production de l'IL-10 par les lymphocytes T), PD1<sup>high</sup>, BTLA<sup>high</sup>, CD200<sup>high</sup>, SLAM<sup>low</sup>, CXCL13 et CD40L (Johnston et al., 2009). Le développement des TFH est médié par l'IL-6 et l'IL-21, mais est indépendant des voies Th1, Th2 et Th17 (Nurieva et al., 2009, 2008; Vogelzang et al., 2008). Cette avancée met en évidence que les cellules B nécessitent l'aide de différentes sous-populations de lymphocytes T pour monter une réponse, expliquant ainsi le dogme réservant principalement aux cellules T<sub>H2</sub> cette fonction (Vinuesa et al., 2005). La figure 9, tirée de (Vinuesa et al., 2005), suggère deux voies pouvant mener à la génération des T<sub>FH</sub>, qui sont mis en relation avec la réponse extrafolliculaire et celle des CG des cellules B.

Chez l'humain, les T<sub>FH</sub> interagissent avec les lymphocytes B via l'interaction CD40-CD154 (Vinuesa et al., 2005). Cette interaction contribuerait à fournir une aide optimale aux lymphocytes B au niveau de la production d'Ac de tous les isotypes, de l'induction de l'expression de l'enzyme nécessaire à la commutation isotypique (AID pour activation-induced cytidine deaminase ou activation-induced deaminase) et de la commutation proprement dite (Kim et al., 2005). Également, cette interaction est nécessaire au maintien des CG, puisque son blocage conduit à la dissolution de cette structure (Vinuesa et al., 2005). On assume généralement que le contact CD40-CD154 est requis pour le processus d'hypermutation somatique qui se déroule normalement dans les CG, tel que le suggère l'expression de AID (Kim et al., 2005) et les études antérieures portant sur la caractérisation
des cellules de patients atteints du Syndrome Hyper-IgM relié au chromosome X (Durandy et al., 2005). Habituellement, ces études font état d'une absence de mutations dans les gènes des Ig, que l'on associe à un défaut de l'interaction CD40-CD154. L'une d'entre elles tend aussi à associer l'expression partielle du CD154 à la présence surprenante de mutations chez un patient (Razanajaona et al., 1996). Cependant, des études plus récentes montrent un niveau de mutations significatif dans les gènes des Ig de tels patients, bien que la liaison CD40-CD154 soit clairement compromise (Brezinschek et al., 2000; Weller et al., 2001). On suggère alors que l'origine de ces mutations pourrait être T-indépendante plutôt que T-dépendante ou bien le fruit d'une seconde voie de diversification (Durandy, 2002).

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Figure 9** : voies possibles conduisant à la génération des T<sub>FH</sub>. Deux avenues (a et b) sont présentées, en parallèle avec les étapes décrivant la réponse des lymphocytes B aux Ag T-dépendants. Il n'est pas clair si les T<sub>FH</sub> proviennent directement de l'activation et de la polarisation des cellules T stimulées par l'Ag (b) ou bien si elles dérivent de cellules T<sub>H2</sub> en différenciation ayant migré dans la zone folliculaire (a) (Vinuesa et al., 2005).
Chez la souris, les cellules $T_{FH}$ ont la capacité de produire de grandes quantités d'IL-10 (McHeyzer-Williams et al., 2006) comme on le soupçonne aussi chez l'humain (Kim et al., 2005; Vinuesa et al., 2005). Les $T_{FH}$ produisent également de l'IL-21 (Chtanova et al., 2004), pour laquelle la majorité des cellules B des amygdales expriment le récepteur, en plus grande abondance sur les cellules naïves que mémoires (Chtanova et al., 2004). L'IL-21 jouerait un rôle important au niveau de la commutation isotypique des cellules B et de leur différenciation en plasmocytes (Ettinger et al., 2005). On rapporte également la production d'IL-2, d'IL-4 et d'IL-10 dans cet environnement, dont les cellules T activées seraient la source (Park and Choi, 2005). L'IL-4 dirigerait la différenciation des cellules B des CG vers le stade de cellules mémoires, l'IL-10 vers le stade de plasmocytes, alors que l'IL-2 synergiserait avec l'IL-4 et l'IL-10 pour favoriser la prolifération cellulaire (Park et Choi., 2005). La contribution des FDC à ces événements de la réponse n'est toutefois pas exclue, particulièrement en ce qui concerne la survie des cellules et leur prolifération (Park et Choi., 2005).

### 4.3.b.ii. Les changements moléculaires se déroulant dans les CG

Chez l'homme, durant la réaction des CG, deux modifications majeures surviennent au niveau des gènes des Ig visant à modifier la fonction ou l'affinité des Ac produits par les cellules B. On réfère à ces deux changements en tant que commutation isotypique (isotype switching) et hypermutation somatique, respectivement. L'enzyme responsable des changements moléculaires a été récemment identifiée et porte le nom d'AID (Muramatsu et al., 2000). La commutation isotypique requiert la présence du contact direct avec la cellule T CD4+ spécifique du même antigène (interaction CD40-CD40L). Les souris CD40L⁻/⁻ ne présentent aucune activité de l'AID (Cunningham et al., 2004). Le signal CD40L peut être renforcé par d'autres signaux comme l'action du BAFF (Litinskiy et al., 2002). L'implication de la voie CD40L dans la CSR est confirmée par l'existence de déficits immunitaires sévères, liés à l'absence d'expression du CD40L, avec une hyperprodution d'IgM et un déficit de tous les autres isotypes (syndrome XHIM). Les individus atteints de ce syndrome ne forment pas de centres germinatifs et n'ont pas de cellules B mémoires (Allen et al., 1993; DiSanto et al., 1993; Korthäuer et al., 1993). Un déficit similaire est observé chez les souris CD40L⁻/⁻ ou CD40⁻/⁻ (Kawabe et al., 1994; Renshaw et al., 1994). Chez ces souris, on peut cependant remarquer une réponse Ac normale aux antigènes TI, avec production normale d'IgG1, d'IgG3 et d'IgA. Ces résultats montrent le rôle essentiel du signal CD40 pour la CSR induite par la coopération T-B au cours d'une réponse TD. La molécule CD40L soluble induit, en synergie avec l'IL-4, la prolifération des cellules B et la CSR vers IgG1 et IgE (Stavnezer,
2000). La voie CD40 peut être inhibée par l'interaction de CD30 (exprimée par le lymphocyte B activé) avec son ligand CD30L (exprimé par le lymphocyte T activé) (Cerutti et al., 1998).

De même, la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T CD4⁺ permet d'orienter la commutation isotypique vers l'un ou l'autre des isotypes d'Ig. L'IL-4 induit la production d'IgG1 et IgE et inhibe celles d'IgG3 et IgG2b (Coffman and Carty, 1986; Layton et al., 1984). Chez les souris IL4⁻/⁻, IgE est totalement absente même après infection par des helminthes. Il n'en est pas de même pour IgG1 dont la quantité produite est fortement inhibée dans un contexte TD indiquant l'existence d'autres signaux capables d'activer la CSR vers IgG1 (Kühn et al., 1991). L'IL-4 et IFN-γ sont des antagonistes (Coffman and Carty, 1986). L'addition d'IFN-γ inhibe la CSR vers IgG1 et IgE dans les cellules B de souris stimulées par le LPS et IL-4 (Berton et al., 1989). En revanche, l'addition IFN-γ induit la commutation vers IgG2a dans les cellules B stimulées pas le LPS (Collins and Dunnick, 1993). L'IFN-γ inhibe également la production d'IgG3 dans les cellules B stimulées par le LPS (Coffman et al., 1986). Chez des souris déficientes pour le récepteur de l'IFN-γ on observe une réduction des réponses IgG2a et IgG3 (Huang et al., 1993). Le TGF-β (Transforming growth factor-β) favorise la CSR vers IgA, surtout quand il agit en synergie avec IL-2 et IL-5 (Coffman et al., 2009). Une isoforme du TGF-β, le TGF-β1, est également impliqué dans la CSR vers IgG2b (McIntyre et al., 1993).

Chez la souris, l'IL-5, impliquée dans la différentiation B, conduit, indépendamment de l'IL-4, à une augmentation du nombre des plasmablastes à IgG1 (Mizoguchi et al., 1999). L'IL-23 stimule la production de l'IgG1, de l'IgG2b et surtout de l'IgG3 (Ooi et al., 2009). Chez l'homme, l'IL-10 stimule la CSR vers IgG1 et IgG3 des cellules B stimulées par le LPS (Brière et al., 1994; Shparago et al., 1996). En revanche, l'IL-10 inhibe fortement CSR vers IgA dans des cellules activées par une combinaison de LPS, IL-4, IL-5 et TGF-β. *In vivo*, il est clair que le jeu de toutes les cytokines est rendu plus complexe par l'association de leurs effets directes et indirectes, notamment par le rétrocontrôle des cytokines de type Th1 (IL-2, IFN-γ..), par les cytokines de type Th2 (IL-4, IL-10, IL-13...) et inversement. En plus des cytokines, les signaux issus des contacts directes de type « cognate » entre cellules T et B sont impliqués dans la CSR.

Pour conclure, une fois que la DC est activée par l'Ag, elle contribue, à l'aide des cytokines à l'activation de la voie Th1, Th2 ou Th17. Ces cellules T vont activer à leur tour les cellules B qui vont se différencier en plasmocytes sécrétant des sous classes des Ig selon la voie
d'activation par les Th. Si c'est la voie Th1, les plasmocytes sécrètent des IgG2a et IgG3. Dans le cas de la voie Th2, sécrétion des IgG1, IgG2a et IgE. Par contre dans le cas de la voie Th17, les plasmocytes sécrètent des IgG1, IgG2b et surtout IgG3 (Tableau2).

<table><thead><tr><th></th><th>IgG1</th><th>IgG2a</th><th>IgG2b</th><th>IgG3</th><th>IgE</th><th>Th</th></tr></thead><tbody><tr><td>IL-4</td><td>X</td><td></td><td></td><td></td><td>X</td><td>Th2</td></tr><tr><td>IL-5</td><td>X</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>Th2</td></tr><tr><td>IL-23</td><td>X</td><td></td><td>X</td><td>X</td><td></td><td>Th17</td></tr><tr><td>IFN-γ</td><td></td><td>X</td><td></td><td>X</td><td></td><td>Th1</td></tr><tr><td>TGF-β</td><td></td><td></td><td>X</td><td></td><td></td><td>Treg</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 2 : cytokines favorisant l'expression des sous classes d'Ig chez la souris (à gauche) et chez l'humain (à droite)</caption><thead><tr><th></th><th>IgG1</th><th>IgG3</th><th>IgA</th><th>Th</th></tr></thead><tbody><tr><td>IL-4</td><td>X</td><td>X</td><td></td><td>Th2</td></tr><tr><td>IL-10</td><td>X</td><td>X</td><td></td><td>Th2</td></tr><tr><td>TGF-β</td><td></td><td></td><td>X</td><td>Treg</td></tr></tbody></table>

### 4.3.b.iii. La mémoire immunologique en réponse aux Ag T-dépendants

Les processus de maturation d'affinité et de sélection des cellules B qui s'opèrent dans les CG visent à générer une mémoire immunologique spécifique à l'Ag envahissant. Le processus de sélection des cellules B dans cet environnement n'est toutefois que partiellement décrit aujourd'hui (Moser et al., 2006), similairement aux signaux qui régulent la différenciation des cellules répondantes vers le stade de cellules mémoires et de plasmocytes. À la sortie des CG, la décision d'aller dans l'une ou l'autre des voies semble dépendre de la stimulation antigénique initiale ainsi que des signaux échangés dans le CG lors de l'interaction T – B (McHeyzer-Williams, 2003).

La mémoire immunologique aux Ag T-dépendants se divise en deux volets : celui des lymphocytes B mémoires et celui des plasmocytes à longue vie, tous deux destinés à produire des Ac spécifiques de haute affinité. Les cellules mémoires constituent un réservoir de cellules spécifiques qui seront à l'origine d'une réponse Ac secondaire. Ainsi, si l'Ag se présente à nouveau, ces cellules seront réactivées spécifiquement et monteront une réponse rapide et amplifiée comparativement à la réponse primaire. Les plasmocytes à longue vie, quant à eux, résident majoritairement dans la moelle osseuse et peuvent produire de grandes quantités d'Ig en absence d'Ag et de lymphocytes B mémoires. À cause de leur persistance et de leur productivité, ces cellules contribuent à la mémoire immunologique par le maintien des titres d'Ac spécifiques dans le sérum (Bernasconi et al., 2002) (Manz et al., 2005 ; Shapiro-Shelef et Calame., 2005). Récemment, il a également été mis en évidence qu'en absence de l'Ag, les cellules mémoires peuvent aussi être activées de façon polyclonale et servir de réservoir de cellules aptes à se différencier constamment en plasmocytes, pour faciliter le
maintien des titres sériques (Bernasconi et al., 2002). Cette contribution des cellules mémoires pourrait clarifier la dynamique du maintien de la mémoire immunologique sérique, puisque la moelle osseuse ne peut héberger qu'un nombre restreint de plasmocytes et que, même s'ils sont dits à longue vie, ces plasmocytes ont tout de même une durée de vie limitée (Lanzavecchia et al., 2006). Une telle production constante d'Ig est clairement importante pour le maintien de l'immunité, particulièrement à cause de la courte demi-vie des Ig dans le sérum. Reflétant la maturation d'affinité et la sélection qui sont survenues durant la génération de cette mémoire immunologique, le répertoire d'Ac « mémoires » en circulation chez l'humain est plus restreint (10²-10³ spécificités) que le répertoire primaire (plus de 10⁶ spécificités) (Höfer et al., 2006).

## La génération des lymphocytes B mémoires :

Les cellules B mémoires se définissent comme étant des cellules spécifiques à l'Ag et à longue durée de vie, dont la survie dépend (Kraus et al., 2004) ou pas (McHeyzer-Williams, 2005) d'une signalisation via le BCR. Elles persistent ainsi dans l'organisme en absence de l'Ag et constituent la population cellulaire qui répondra rapidement par une différenciation massive en plasmocytes si l'Ag ayant déclenché leur génération revient (Traggiai et al., 2003). Bien que les signaux nécessaires pour quitter la réaction du CG et entrer dans le compartiment de cellules mémoires soient peu décrits, cette décision repose vraisemblablement sur l'expression différentielle de différents facteurs de transcription (Calame, 2006; McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005b). La génération des cellules mémoires dépend toutefois de l'interaction préalable CD40-CD154 (Bernard et al., 2005; Bishop and Hostager, 2003).

Suite à des expérimentations réalisées chez la souris par Blink et collaborateurs (Blink et al., 2005), un modèle a été proposé par Dörner et Radbruch, concernant la génération des lymphocytes B mémoires et des plasmocytes durant la réponse T-dépendante (Dörner and Radbruch, 2005). Ce dernier a été repris dans la Figure 10. L'étude à la base de ce modèle a démontré que des cellules mémoires spécifiques à l'Ag apparaissent dans la circulation une semaine après l'initiation de la réponse primaire (Blink et al., 2005), ce qui est aussi rapide que ce qu'on observe lors de la réponse secondaire chez l'humain. Au fil du temps, ce réservoir de cellules renfermerait des membres exprimant des Ig de plus en plus haute affinité (Blink et al., 2005). Ces cellules ne semblent cependant pas posséder une longue durée de vie et pourraient migrer dans la zone folliculaire du ganglion en suivant l'attraction de certaines chimiokines (Blink et al., 2005). Ces observations suggèrent que ces cellules précoces
représenteraient des cellules mémoires à courte vie qui pourraient, après un passage subséquent dans le CG, devenir des cellules mémoires à longue vie ou des plasmocytes (Dörner et Radbruch., 2005). Les auteurs de ces travaux proposent que ces cellules mémoires à courte vie pourraient être générées durant la réaction des CG, bien qu'aucune évidence directe ne soit présentée. Le fait d'immuniser une souris avec un Ag T-dépendant et de suivre l'apparition des cellules spécifiques dans le sang n'implique pas en soi que toutes les cellules émergeront nécessairement des CG classiques de la zone folliculaire.

En fait, une autre étude réalisée chez la souris met en évidence que les foyers de prolifération qui apparaissent à la frontière des zones T-B rapidement après l'initiation de la réponse, pourraient être associés à des CG puisque leur structure et des cellules qui les composent sont comparables aux CG conventionnels de la zone folliculaire (Inamine et al., 2005). Ces foyers peuvent également générer une première vague de cellules mémoires spécifiques de faible affinité (Inamine et al., 2005), qu'on pourrait associer aux cellules mémoires à courte vie présentées dans le modèle précédent. Les auteurs suggèrent que ces cellules pourraient transiter ou élaborer plus tard un CG classique, afin de constituer une seconde vague de cellules mémoires de haute affinité (Inamine et al., 2005).

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**Figure 10 : Nouveau modèle suggéré de la mémoire immunologique.** On y propose la génération de cellules mémoires à courte et longue vie ainsi que leur potentiel à repasser par les CG lors d'une réponse primaire à un Ag T-dépendant. CPA : cellules présentatrices d'Ag (Modifiée d'après Dörner et Radbruch., 2005).
Globalement, les travaux de ces deux groupes se complètent, en mettant en lumière qu'une
génération rapide de cellules mémoires a lieu *in vivo* durant les réponses T-dépendantes, mais
que ces cellules pourraient émerger autant des CG classiques de la zone folliculaire que de
structures apparentées à l'extérieur de cette zone. Il n'a toutefois pas été établi par aucune des
études précédentes si les cellules à l'origine de cette réponse mémoire précoce sont
uniquement des cellules B folliculaires conventionnelles ou bien si elles peuvent faire partie
de la catégorie des MZ. Connaissant la capacité des cellules B des MZ à répondre rapidement
aux Ag T-dépendants (Lanzavecchia and Sallusto, 2002) (Song et Cerny., 2003) et T-
indépendants (Obukhanych et Nussenzweig., 2006), autant par une différenciation en
plasmocytes qu'en cellules mémoires, on ne peut exclure leur participation à une telle
réponse.

Un autre modèle, proposé par Lanzavecchia et collaborateurs (Lanzavecchia and Sallusto, 2002), amène quant à lui le concept de cellules B mémoires centrales possédant des propriétés de type cellules souches. Selon ce modèle, toutes les cellules mémoires générées lors d'une réponse représenteraient des intermédiaires de différenciation, conservant le pouvoir de proliférer et de se différencier continuellement en plasmocytes, à la suite d'une stimulation polyclonale en absence d'Ag (Tangye and Hodgkin, 2004) (Bernasconi et al., 2002 ; Lanzavecchia et Sallusto., 2002). Ce modèle est d'ailleurs appuyé par la nécessité des cellules à proliférer pour s'engager et avancer dans leur voie de différenciation (Tangye and Hodgkin, 2004). En fait, la régulation de la différenciation des cellules B serait associée aux nombres de divisions cellulaires et viserait à réguler les proportions de cellules mémoires se différenciant en plasmocytes versus celles demeurant mémoires, afin d'éviter un épuisement du réservoir et de balancer les réponses immunitaires (Tangye et Hodgkin., 2004).

Une fois générées, les cellules mémoires persistent dans l'organisme en absence de l'Ag ayant
conduit à leur génération. Jusqu'à tout récemment, peu de données étaient disponibles
concernant la durée de vie et le maintien des cellules mémoires humaines in vivo. La majorité
des études à ce sujet provenait du modèle murin, dont l'extrapolation à l'humain n'est pas
toujours appropriée, entre autres, à cause des différences au niveau de la durée de vie des
deux modèles, de la fraction de cellules hypermutées présentes en circulation, 5% chez la
souris et 40% chez l'humain, ainsi que des différentes sources de cellules analysées (Macallan
et al., 2005). Les études du modèle murin sont souvent restreintes à la rate alors que chez
l'humain, elles se confinent aux ganglions, à la rate et au sang, chacun renfermant des cellules
qui diffèrent au niveau de leur état d'activation. Chez la souris, les cellules mémoires
survivent quelques dizaines de mois en se divisant peu ou pas, alors que chez l'humain, il a récemment été démontré qu'en périphérie, les cellules mémoires se divisent, à un taux de prolifération qui est 5 fois plus rapide que celui des cellules naïves (Macallan et al., 2005). Ces observations indiquent que les cellules mémoires seraient maintenues par la prolifération constante de clones (Macallan et al., 2005), ce qui corrobore le modèle de Lanzavecchia et collaborateurs, énonçant l'activation polyclonale continue des cellules mémoires pour maintenir le compartiment (Bernasconi et al., 2002).

Afin de distinguer les cellules B mémoires des cellules naïves, plusieurs critères ont été utilisés au cours des années. Le critère le plus important pour assurer cette distinction repose sur l'analyse moléculaire des gènes des Ig : les cellules porteuses de gènes en configuration germinale sont associées au compartiment naïf, alors que la présence de mutations somatiques dans ces gènes identifie les cellules mémoires (Klein et al., 1998). Des caractéristiques plus facilement identifiables, impliquant l'expression de marqueurs de surface, ont par la suite été déterminées. Entre autres, l'expression différentielle de l'IgD a longtemps été utilisée : les cellules IgD⁺ étant associées aux cellules naïves et les cellules IgD⁻ aux cellules mémoires (Black et al., 1978; Hayakawa et al., 1987). Cependant, l'interprétation de ce marqueur a été mise en cause avec la découverte d'une sous-population de cellules B mémoires exprimant des IgD en surface (Klein et al., 1998). Actuellement, le marqueur CD27 est largement utilisé pour l'identification des cellules B mémoires humaines, puisque son expression en surface corrèle avec la présence de mutations somatiques dans les gènes des Ig (Agematsu et al., 2000; Klein et al., 1998; Tangye et al., 1998).

## La génération des plasmocytes à longue durée de vie :

Au même titre que les cellules mémoires proprement dites, les plasmocytes à longue durée de vie font partie du compartiment mémoire à cause de leur contribution à la mémoire humorale sérique. Un facteur de différenciation clé, nommé BLIMP-1 chez la souris et *positive regulatory domain 1-binding factor 1* (PRDI-BF1) chez l'humain (Medina et al., 2002) est nécessaire au développement des plasmocytes, à leur sécrétion d'Ac (Kallies et al., 2004)(Shapiro-Schelef et Calame., 2005) ainsi qu'à leur survie dans la moelle osseuse (Calame, 2006). L'expression de ce facteur est augmentée plus la cellule avance en différenciation (Kallies et al., 2004) et elle semble nécessaire à la sortie de la cellule du CG (Calame, 2006). Ce facteur est en fait un répresseur transcriptionnel qui empêche l'expression des facteurs de transcription BCL-6 et PAX-5 requis dans les CG, s'assurant ainsi que les cellules engagées dans la voie des plasmocytes ne puissent retourner en arrière (Shapiro-Schelef et Calame., 2005). Il est
l'initiateur d'une longue séquence d'événements moléculaires menant ultimement à la
différenciation en plasmocytes, revue en détails dans (Shapiro-Schelef et Calame., 2005).

La figure 11 (page suivante) montre les différents facteurs de transcription impliqués dans la réaction du centre germinatif et la différentiation terminale des lymphocytes B.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 11 : les facteurs de transcription impliqués dans la réaction du centre germinatif et la différentiation terminale des lymphocytes B (d'après Klein and Dalla-Favera, 2008).</figcaption></figure>

De même, il a été montré dans les cellules B que STAT5 bloque la différentiation plasmocytaire et favorise la prolifération cellulaire (Scheeren et al., 2005). Chez l'homme, STAT5 augmente l'expression de BCL6 qui, à son tour, inhibe la différentiation des cellules B en plasmocytes (Scheeren et al., 2005) (figure 12). Un déficit dans l'expression de STAT3 a également été associé à un défaut de production des plasmocytes à IgG (Fornek et al., 2006). Par ailleurs, il a été démontré que STAT3 augmente l'expression de BLIMP1 et favorise la différentiation des plasmocytes dans les lignées B murines (Reljic et al., 2000) (figure 12). L'équipe de Diehl et al., a montré que l'activation de STAT3 dans les cellules B humaines augmente l'expression de BLIMP1 et conduit à la différentiation des plasmocytes et que cette activation est suffisante pour induire BLIMP1 même en présence de BCL6 (Diehl et al., 2008). Toutes les cytokines capables d'activer la phosphorylation de STAT3 dans divers types de cellules (IL-6, IL-10 et IL-21) sont impliquées dans la différentiation plasmocytaire
(Ettinger et al., 2005; Jego et al., 2001; Riley et al., 1999). En effet, l'IL-6 semble jouer un rôle dans la survie des plasmocytes (Kawano et al., 1995). Elle est particulièrement importante pour la survie des plasmocytes à longue durée de vie dans la moelle osseuse (Kawano et al., 1995). De même, il a été démontré que la production d'IL-6 est dépendante de XBP1 (Iwakoshi et al., 2003; Wen et al., 1999). L'implication de STAT3 et STAT5 dans la voie de différentiation plasmocytaire est résumée dans la figure 12.

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 12: l'activation de STAT 3 augmente BLIMP1 qui à son tour favorise la différentiation des plasmocytes. En revanche, l'activation de STAT5 augmente BCL6 qui, à son tour, inhibe la voie de différentiation plasmocytaire (d'après Diehl et al., 2008 ; Scheeren et al., 2005).</figcaption></figure>

Les plasmocytes à longue vie expriment habituellement des Ig d'autres isotypes que l'IgM qui sont de haute affinité, ayant pris part au processus d'hypermutation somatique (Calame, 2006). Ils ont une capacité unique à produire de façon persistante des titres élevés de ces Ac mémoires (Moser et al., 2006) atteignant quelques milliers de molécules d'Ac par seconde (Hibi and Dosch, 1986; Manz et al., 2005). On estime le taux de sécrétion pour toute la population de la moelle osseuse à 250µg/ml d'Ig par jour (Traggiai et al., 2003). Dans cet environnement, ces cellules ne possèdent pas la capacité de se renouveler seules (McHeyzer-Williams, 2005), ont cessé toute synthèse d'ADN et sont réfractaires à des signaux supplémentaires de l'Ag (Hofer et al., 2006). Le stade de plasmocyte se traduit également par un changement au niveau de la morphologie cellulaire : les plasmocytes sont 2 à 3 fois plus volumineux que les cellules naïves ou mémoires, renferment un abondant cytoplasme et un noyau à position excentrique, contrastant avec les noyaux centrés des autres populations
(Ellyard et al., 2004; Medina et al., 2002). Également, on note chez ces cellules la présence d'Ig intracellulaires couplée à leur disparition de la surface (O'Connor et al., 2003) ou bien à une diminution de leur expression (Ellyard et al., 2004; Horst et al., 2002). Elles expriment aussi à un haut niveau les molécules CD38 (Jego et al., 1999; Medina et al., 2002), CD27 (Avery et al., 2005; Horst et al., 2002; Jung et al., 2000; Medina et al., 2002) et CD138, cette dernière étant aussi appelée syndecan-1 (Medina et al., 2002 ; Horst et al., 2002 ; Jego et al., 1999).

Bien que toutes les cellules B expriment CXCR4 (Manz et al., 2005), le CXCL12/SDF1 qui est produit par les cellules stromales de la MO n'attire que les plasmablastes issues du CG mais pas les plasmocytes matures (Moser et al., 2006). Ces derniers ont besoin d'autres facteurs actuellement inconnus (Hofer et al., 2006)

Bien que la différenciation des cellules B en plasmocytes à longue vie soit peu décrite, il est établi que la stimulation préalable du CD40 est nécessaire mais non suffisante à leur génération (Moser et al., 2006). Des signaux supplémentaires provenant de la niche de la moelle osseuse permettraient vraisemblablement d'achever la différenciation des plasmablastes en plasmocytes et de maintenir leur survie (Moser et al., 2006). En effet, la capacité à survivre des plasmocytes à longue vie ne semble pas être une propriété intrinsèque des cellules, mais semble plutôt dépendre de l'aptitude de ces dernières à répondre aux signaux des cellules stromales de la moelle osseuse (Manz et al., 2005). On soupçonne la contribution de CD21 et de BCMA, récepteur de BAFF (B-cell-activating factor belonging to the TNF family) et APRIL, à la génération des plasmocytes et/ou à leur survie (Moser et al., 2006).

La moelle osseuse contient un nombre limité de niches favorisant la différenciation et la survie des plasmocytes, puisqu'au cours de la vie d'un individu, la fréquence de plasmocytes dans cet environnement est constante (Manz et al., 2005). Elle excède rarement 1% des cellules, aussi bien chez la souris que chez l'humain (Hofer et al., 2006). Cette stabilité implique que les nouveaux plasmocytes formés à chaque réponse immunitaire entreront en compétition avec de plus anciennes cellules pour gagner leur survie dans ce contexte (Manz et al., 2005). Ce concept de compétition prend son importance à chaque nouvelle infection, lorsque les cellules mémoires sont réactivées lors d'une réponse secondaire. Chez la souris, il a été démontré que les plasmocytes dans la moelle osseuse pourraient vivre aussi longtemps que l'animal (Slifka et al., 1998), en absence de cellules mémoires. Chez l'humain, cette
question fait toujours l'objet de débats (Manz et al., 2005). On postule que leur demi-vie
serait beaucoup plus courte, soit d'environ trois mois (Manz and Radbruch, 2002; Traggiai et
al., 2003). Cependant, sachant que ces cellules sont dépendantes des signaux de la moelle
osseuse pour survivre, il n'est pas exclu que leur demi-vie puisse être aussi longue que celle
des cellules de souris, lorsque leur localisation n'est pas modifiée.

4.3.c. La réponse extrafolliculaire des lymphocytes B naïfs

Rapidement après l'initiation de la réponse T-dépendante, on assiste à l'élaboration de la
réponse extrafolliculaire, dont la finalité est de produire des plasmocytes à courte durée de vie
permettant de maîtriser temporairement l'infection en cours. Les signaux nécessaires à
l'amorçage de cette réponse extrafolliculaire demeurent peu décrits (MacLennan et al., 2003;
McHeyzer-Williams and McHeyzer-Williams, 2005a). Ils initient la prolifération des
lymphocytes B dans la zone riche en cellules T des organes lymphoïdes secondaires
(MacLennan et al., 2003). Des molécules comme l'IFNα augmentent la prolifération des
plasmocytes à vie courte chez les souris normales (BALB/c) et lupiques (Koutouzov et al.,
2006; Mathian et al., 2011). Cependant, dans cette zone T, les cellules B peuvent procéder
rapidement à la commutation isotypique et engager leur différenciation en plasmablastes
(MacLennan et al., 2003) environ une journée après l'initiation du contact avec la cellule T
(Sze et al., 2000). Une étude réalisée chez la souris a démontré que leur prolifération et leur
commutation isotypique seraient dépendantes de l'interaction précoce T-B via la stimulation
du CD40 par le CD154 (Cunningham et al., 2004). Par la suite, les plasmablastes générés
migrent dans la zone extrafolliculaire où ils continuent à proliférer sans l'aide des cellules T et
où ils achèvent leur différenciation en plasmocytes (MacLennan et al., 2003). Les cellules
accessoires impliquées dans la différenciation terminale des plasmablastes et dans la survie
des plasmocytes générés sont les DC CD11c<sup>high</sup> et se localisent aussi dans la zone
extrafolliculaire (MacLennan et al., 2003).
# 1 Définition et historique

La leucémie lymphoïde chronique est une affection hématologique caractérisée par l'accumulation de lymphocytes B phénotypiquement matures mais néanmoins immunologiquement incompétents dans le sang, la moelle osseuse et les tissus lymphoïdes (Caligaris-Cappio, 1996; Messmer et al., 2005). C'est la forme de leucémie la plus fréquente dans les pays occidentaux. Elle représente 0,8% de tous les cancers et quasiment 30% de toutes les formes de leucémies de l'adulte. Le risque de développer une leucémie lymphoïde chronique augmente avec l'âge (en moyenne vers 60 ans) et touche 2,8 fois plus les hommes que les femmes (Diehl et al., 1999; Redaelli et al., 2004).

En 1967 c'est Dameshek qui émit l'hypothèse que la LLC était caractérisée par l'accumulation de lymphocytes incompétents (Dameshek, 1967). Au début des années 70, on trouva que la majorité des cellules de LLC expriment des immunoglobulines de surface, indiquant leur appartenance à la lignée B (Fialkow et al., 1978; Fu et al., 1974; Preud'homme and Seligmann, 1972; Salsano et al., 1974; Schroer et al., 1974). Le caractère clonal fut ensuite confirmé par des expériences de génétique moléculaire.

A la fin des années 70, deux classifications cliniques furent proposées par Rai et Binet en fonction des complications cliniques engendrées par la pathologie (Binet et al., 1981; Rai et al., 1975).

En 1999, il a été démontré que les patients dont les cellules leucémiques ne présentant pas de mutation dans la région variable de leurs immunoglobulines (environ 40% des cas) développaient une maladie avec un plus mauvais pronostic que ceux avec des immunoglobulines mutées (Damle et al., 1999; Hamblin et al., 1999). Néanmoins, par des analyses de transcriptome, un profil d'expression génique caractéristique de la leucémie lymphoïde chronique indépendamment du statut mutationnel de l'immunoglobuline a pu être déterminé (Klein et al., 2001; Rosenwald et al., 2001). Ce profil suggère que la leucémie lymphoïde chronique est constituée de cellules de type mémoire plutôt que de cellules B CD5⁺. Ces cellules CD5⁺ (B1a-like) composent plus de 80% des cellules B du cordon ombilical et leur pourcentage diminue progressivement après la naissance jusqu'à la puberté où leur taux atteint 10% à l'âge de 14 ans.
## 2 Etiologie et Pathogénèse

### 2.1. Facteurs environnementaux et héréditaires

Aucun facteur environnemental n'a été retrouvé comme facteur prédictif de la leucémie lymphoïde chronique. Certaines études ont accusés le virus de l'hépatite C (HCV) (Bianco et al., 2004) mais ce virus n'est pas nécessaire au développement de la pathologie (Luppi et al., 1996). En revanche, de manière intéressante, les cellules de LLC sont résistantes à l'infection par le virus d'Epstein-Barr (EBV) in vitro (Avila-Cariño et al., 1997). Les raisons de cette caractéristique ne sont pas encore connues. Mais l'on ne peut exclure une infection de ces cellules avec l'EBV ou avec un virus apparenté, antérieure au développement de la pathologie. Néanmoins, on n'a jamais retrouvé de séquences correspondant à ces virus dans les cellules de LLC.

La majorité des patients ont plus de 60 ans (90% ont plus de 50 ans) et l'âge moyen de diagnostique se situe entre 64 et 70 ans. Bien que l'incidence de la leucémie lymphoïde chronique soit plus élevée chez l'homme que chez la femme, aucun lien n'a encore été trouvé concernant le rôle joué par les hormones (Adami et al., 1997; Cartwright et al., 2002). En revanche, il existe bien une contribution génétique puisque la LLC est une pathologie très rare chez les populations asiatiques et ce même lorsque celles-ci ont migré dans un pays occidental (Ahn et al., 1991; Tamura et al., 2001). De même, les parents de personnes ayant eu une LLC ont trois fois plus de chance d'être atteints à leur tour de LLC ou d'une affection lymphoïde que la population générale (Cuttner, 1992; Goldin et al., 2004). Ceux-ci développent d'ailleurs l'affection en étant plus jeunes (Rawstron et al., 2004; Yuille et al., 2000). Ces facteurs génétiques ne sont pas encore connus. Mais il ne semble pas y avoir d'association avec le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) (Jones and Whittaker, 1991; Shah et al., 1992). Plus récemment, l'inhibition épigénétique de la DAPK1 (Death Associated Protein Kinase 1) à été évoqué comme un facteur de prédisposition héréditaire (Raval et al., 2007).

### 2.2. Cytogenèse

Les cellules de LLC expriment à leur surface des antigènes de cellules B, tels que CD19 et CD20 (Marti et al., 1992). Mais également un marqueur de cellule B mémoire, CD27, un membre de la famille des récepteurs au TNF (Ranheim et al., 1995). C'est également la seule
pathologie B, avec le lymphome du manteau, à être CD5⁺ (Bell et al., 1999; Cabezudo et al., 1999) et qui, tout comme les lymphocytes B-1a, présentent un phénotype anergique. Mais surtout, ces cellules semblent présenter un profil d'expression caractéristique, différent de celui d'autres pathologies B, de cellules B normales ou même de lymphocytes B issus de sang de nouveau-nés qui sont majoritairement CD5 positifs. Leur profil d'expression semble d'ailleurs plutôt correspondre à celui de cellules non-naïves, qui ont déjà subi une activation antigénique et que l'on trouve généralement dans la zone marginale de la rate (voir le tableau ci dessous)

<table><caption>Tableau 3 : les différents marqueurs de surface des cellules B de LLC vs B-MZ (Marginal zone), B-CD5 naturelles et cellules B mémoires (D'après Marti et al., 1992; Ranheim et al., 1995; Bell et al., 1999; Cabezudo et al., 1999; Banchereau and Rousset, 1992; Deans and Polyak, 2008; Dighiero and Hamblin, 2008).</caption><thead><tr><th></th><th>B -MZ</th><th>B-CD5<br>naturelles</th><th>B mémoires</th><th>B-LLC</th></tr></thead><tbody><tr><td>CD5</td><td>+/- à ++</td><td>+</td><td>+/-</td><td>+</td></tr><tr><td>CD19</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>CD20</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+/-</td></tr><tr><td>CD22</td><td>+</td><td>+</td><td>+/-</td><td>-</td></tr><tr><td>CD23</td><td>-</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>CD27</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>CD43</td><td>-</td><td>++/-</td><td>-</td><td>+</td></tr><tr><td>IgM</td><td>+++</td><td>+++</td><td>+/-</td><td>Low</td></tr><tr><td>FMC7</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+/-</td></tr></tbody></table>

## 2.3. Anomalies cytogénétiques

Les cellules leucémiques d'approximativement la moitié des patients possèdent des anomalies chromosomiques. La plus commune est la délétion 13q14-23, suivie dans l'ordre par la trisomie 12 (Chena et al., 2003), les délétions 11q22.3-q23.1, 6q21-q23 (Döhner et al., 1999), 17p13.1 (impliquant la délétion ou la mutation du gène suppresseur de tumeurs TP53) (Barnabas et al., 2001) et les anomalies 14q. Il s'agit essentiellement de délétions ou mutations mais rarement de translocations chromosomiques (Sen et al., 2002). L'identification de gènes présents dans ces différentes régions chromosomiques est un outil précieux pour mieux comprendre le mécanisme de la tumorogénèse.
## 2.4. Modèle animal pour la LLC

Il n'existe pas à ce jour de modèle animal de LLC. Cependant, Bichi et al ont démontré, pour la première fois, que des souris transgéniques pour la TCL1 (human T cell Leukemia-1 gene) sous contrôle d'un promoteur μ développent une expansion clonale B similaire à celle observée chez des sujets atteints de lymphocytose monoclonale essentielle B (Bichi et al., 2002). Cette expansion de cellules clonales B CD5⁺ est détectable dans le péritoine à l'âge de 2 mois, puis dans la rate entre 3 et 5 mois et enfin dans la moelle osseuse entre 5 et 8 mois. Des souris plus âgées développent une maladie similaire à la LLC avec des caractéristiques phénotypiques, fonctionnelles et cliniques semblables à celles observées chez l'homme (Bichi et al., 2002 ; Yuille et al., 2001). A noter que le gène TCL1 n'est pas impliqué dans la LLC.

D'autres souches de souris ont été rapportées pour développer une LLC. Chez les souris NZB (New Zealand Black), qui développent des lymphoproliférations CD5 positifs à un âge avancé, trois loci au total ont été associés à ce phénotype y compris une mutation ponctuelle à proximité de la tige-boucle de miR-16-1(Raveche et al., 2007). Alors que dans ces études, le rôle de miR-15a/16-1 dans la pathogenèse de la leucémie lymphoïde chronique de type lymphoprolifératif observée n'a pas pu être démontrée de façon concluante en raison de la complexité du génotype, l'observation que la délétion du gène de ce groupe de microARN favorise le développement d'une LLC, soutient cette hypothèse.

Plus récemment, Klein et Dalla-Favera ont confirmé *in vivo* que la délétion de la région MRD (Minimal Deleted Region) du chromosome 13q14 est impliquée dans la pathogénie de la LLC (Klein and Dalla-Favera, 2010). Les souris transgéniques utilisées ont été conçues pour imiter la délétion humaine 13q14-MRD et développer une LLC ainsi que d'autres lymphoproliférations associées à cette délétion 13q14. Deux lignées transgéniques ont été générées. Un modèle représente le MDR, un second contient une délétion spécifique de miR-15a/16-1 dans l'intron 4 du gène DLeu2 (figure 18, page suivante). Les deux lignées de souris ont développé tardivement des lymphoproliférations clonales qui ont été pour la plupart indolentes et produites dans un modèle autonome de cellule B.
<figure><img src="image_14.png" /></figure>

**Figure 18 :** modèles murins de la délétion 13q14. Chez la souris, le locus 13q14 humain se trouve sur la région chromosomique 14qC3. Modèle 1 imite une LLC humaine avec délétion du MDR de la région 13q14; modèle 2 délaite le cluster miR-15a/16-1 sans interférer avec l'expression du dLeu2 (Klein and Dalla-Favera, 2010).

## 2.5. Accumulation de cellules leucémiques

### Cinétique de croissance

Dans la rate, les cellules leucémiques prolifèrent préférentiellement dans la pulpe blanche (Lampert et al., 1999). En revanche, les cellules circulant dans le sang sont majoritairement en phase G0 du cycle cellulaire (Andreeff et al., 1980). Il est clairement admis que les cellules de LLC s'accumulent surtout par défaut d'apoptose. En réalité, des expériences réalisées chez des patients ayant ingéré de l'eau lourde (avec du deutérium, D₂O) ont démontré que le taux de « naissance » in vivo des cellules leucémiques va de 0,1% à 1% du clone par jour (Messmer et al., 2005). Ce taux élevé à été constaté même chez des patients où la quantité de lymphocytes dans le sang reste stable. Les formes les plus agressives présentent un taux de prolifération plus élevée. Ces résultats sont en contradiction avec l'idée selon laquelle la LLC est une maladie statique. En réalité ceci suggère que le taux de lymphocytes leucémiques dans le sang dépend d'un processus dynamique où le taux d'apparition de nouvelles cellules est compensé par celui de mort cellulaire. Mais globalement, le taux d'apoptose est inférieur à celui de prolifération ce qui aboutit à une accumulation de ces cellules.
## Résistance à l'apoptose

Les cellules de leucémie lymphoïde chronique expriment de forts taux de la protéine anti-apoptotique, BCL-2 (Schimmer et al., 2003). Mais d'autres protéines anti-apoptotiquess sont également fortement exprimées, telles que Bcl-xL, Mcl-1 et Bag-1 (Kitada et al., 1998). De taux faibles d'expressions de protéines pro-apoptotiques telles que Bax ou Bcl-xS sont observés (Gottardi et al., 1996).

Le microenvironnement tumoral semble également jouer un rôle important dans la sensibilité des cellules leucémiques à l'apoptose. En effet, ces cellules peuvent survivre de longues périodes *in vitro* si elles sont cultivées en présence de cellules stromales non hématopoïétiques de la moelle osseuse (Lagneaux et al., 1998; Panayiotidis et al., 1996) ou de cellules nourricières (Burger et al., 2000) qui sont des cellules auxiliaires non leucémiques se différenciant à partir de cellules mononuclées CD14+ du sang lorsqu'elles sont cultivées en présence de cellules de leucémie lymphoïde chronique (Tsukada et al., 2002). Des cellules présentant les mêmes caractéristiques phénotypiques et morphologiques que ces cellules nourricières sont retrouvées dans les tissus lymphoïdes secondaires de patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (Tsukada et al., 2002) où elles participent probablement à l'inhibition de l'apoptose des cellules leucémiques *in vivo*. Les FDC peuvent également protéger les cellules de la leucémie lymphoïde chronique de la mort cellulaire (Pedersen et al., 2002). Ces différents mécanismes de protection semblent requérir un contact cellulaire et doivent probablement impliquer plusieurs interactions récepteur-ligand ainsi que des molécules d'adhésion.

## Déficits immunitaires

Les patients avec une leucémie lymphoïde chronique développent des déficits immunitaires à prédominance humorale avec la présence des auto-anticorps causant une Anémie Hémolytique auto immune (AHA) et une Thrombopénie (Winkelstein and Jordan, 1992). Avec le temps, les taux d'immunoglobulines sériques diminuent progressivement, conduisant à une hypogammaglobulinémie IgM puis IgG qui est en rapport avec l'inhibition de la différentiation plasmocytaire. De plus, ces patients peuvent présenter de faibles taux de complément (Schlesinger et al., 1996), des défauts fonctionnels des lymphocytes T (inhibition de la réponse T contre les virus de type Herpes) (Rossi et al., 1996), des niveaux d'expression antigène-CMH altérés dans les cellules leucémiques (Nückel et al., 2005; Veenstra et al., 1996) et une activité granulocytaire défectueuse (Itälä et al., 1996). Les cellules leucémiques elles-mêmes peuvent contribuer à cet état d'immunodéficience en produisant des cytokines
immunosuppressives telles que le TGF-β (Lagneaux et al., 1997) et l'IL-10 (Sjöberg et al., 1996). Dans 90% des cas, les cellules leucémiques expriment l'immunoglobuline de surface à un faible niveau. Les immunoglobulines exprimées par les cellules de la leucémie lymphoïde chronique présentent souvent une réactivité vis-à-vis d'auto-antigènes. Une caractéristique importante de ces auto-anticorps est leur « poly-réactivité », c'est-à-dire leur capacité à reconnaitre plusieurs auto-antigènes

### 3 Rôle de Mda-7/IL-24 dans la leucémie lymphoïde chronique

Dans les travaux précédents, notre équipe a démontré qu'il existait dans les cellules de la leucémie lymphoïde chronique un profil d'expression génique en partie assimilable à une signature CD5 (Gary-Gouy et al., 2007). Parmi les différentes familles de gènes induits par le CD5, plusieurs gènes de la famille de l'IL-10 et de leurs récepteurs sont retrouvés, dont le gène Mda-7/IL-24. Notre équipe a également montré que Mda-7/IL-24 joue un rôle complexe dans les cellules B de la leucémie lymphoïde chronique pouvant contribuer à la physiopathologie de cette maladie. Dans ces cellules, le gène Mda-7/IL-24 est fortement exprimé. Ceci est corrélaté avec le caractère différentié et hors cycle des cellules de LLC (Sainz-Perez et al., 2006). En effet, Mda-7/IL-24 est exprimé surtout dans des cellules différenciées (mélanocytes) est son expression est perdue dans les cellules en prolifération ou bien les cellules indifférenciées.

En ce qui concerne la protéine, son expression est fortement détectée dans les lysats cellulaires de cellules leucémiques. Ces résultats confirment ceux obtenus sur les transcrits. Mda-7/IL-24 sous sa forme native fait environ 23 KDa, mais elle possède plusieurs sites de glycosylation pouvant lui conférer un poids de 34 KDa. Notre équipe a détecté principalement la forme à 23 KD dans les lysats cellulaires. Ceci indique que les cellules de la leucémie lymphoïde chronique produisent essentiellement la forme non glycosylée (Sainz-Perez et al., 2006).

Mda-7/IL-24 est également décrit comme un gène dont le produit d'expression peut être sécrété sous forme d'une cytokine (Caudell et al., 2002). De manière surprenante, Mda-7/IL-24 est absente dans les sérum des patients leucémiques (Sainz-Perez et al., 2006). Ceci peut donc provenir d'un défaut de sécrétion intrinsèque des cellules de la leucémie lymphoïde chronique. Néanmoins, on retrouve dans le sérum de patients leucémiques des quantités significatives de plusieurs cytokines telles que, IL-6, IL-10 ou TGF-β, mais ces cytokines
peuvent être sécrétées par d'autres cellules. Une autre hypothèse est que la protéine sécrétée est immédiatement internalisée par la cellule leucémique via ses récepteurs, constituant ainsi une boucle de régulation autocrine (Sainz-Perez et al., 2006).

Différentes études ont montré que Mda-7/IL-24 est capable d'activer la voie de signalisation p38 MAPK dans différentes lignées cellulaires (Sarkar et al., 2002b). Il s'agit d'une voie de stress au carrefour de plusieurs signaux régulant le cycle cellulaire, l'apoptose et la survie cellulaire. Alors que l'activation de la voie p38 MAPK par Ad.Mda-7 sur différentes lignées conduit à un signal pro-apoptotique, elle joue un rôle de survie dans les cellules hépatiques humaines où elle est constitutivement active (Mendelson et al., 1996).

Notre équipe a montré que Mda-7/IL-24 est capable d'induire la voie de la p38 MAPK dans les cellules de la leucémie lymphoïde chronique. Fait intéressant, cette voie de signalisation est constitutivement active dans les cellules de la leucémie lymphoïde chronique. Les résultats obtenus après inhibition des transcrits Mda-7/IL-24 par siRNA ont permis d'affirmer que la protéine endogène est capable d'activer cette voie. On a également montré que l'action de la protéine endogène peut être mimée par la protéine soluble IL-24. Les cellules de la leucémie lymphoïde chronique sont donc sensibles à Mda-7/IL-24 sous sa forme cytokine (Sainz-Perez et al., 2006). De même, Sainz-Perez *et al.* ont montré que la voie p38 MAPK joue un rôle de survie dans les cellules de la leucémie lymphoïde chronique puisque l'apoptose des ces cellules a été induite après incubation avec l'inhibiteur spécifique de P38 MAPK, le SB 203580. Ils ont également montré, à l'aide de siRNA dirigés contre les transcrits Mda-7/IL-24, que la protéine Mda-7/IL-24 endogène contribue à la survie des cellules de la leucémie lymphoïde chronique. Cet effet a pu être mimé par l'ajout de l'IL-24 qui est capable de « reverser » l'effet pro-apoptotique du SB 203580. Sur des cultures à long terme de cellules leucémiques, ils ont également confirmé le rôle de l'IL-24 en tant que facteur de survie des cellules leucémiques. En revanche, l'IL-24 recombinante induit l'apoptose des cellules de LLC *in vitro* à condition qu'elles aient été mises en cycle au préalable (par l'IL-2) (Sainz-Perez et al., 2008). Ce travail implique que l'IL-24 recombinante tue des cellules activées et/ou en cycle, ce qui corrobore les résultats d'autres équipes sur des lignées cellulaires.
# 1 Généralités

Les membres de la famille de l'interleukine-10 (IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24/Mda-7 et IL-26) font partie, avec les interférons de type I et II ainsi que les interférons like (limitin, IL-28A, IL-28B et IL-29), de la grande famille des cytokines de classe II à hélices α (Kotenko, 2002; Renauld, 2003). Bien que ces molécules possèdent une structure similaire et une origine commune, leurs fonctions biologiques ne sont pas identiques et sont parfois même antagonistes. Schématiquement, il semble que ces cytokines jouent un rôle dans l'immunité innée ainsi que dans le contrôle naturel de l'auto-immunité (Renauld, 2003). Cinq nouveaux membres de la famille de l'IL-10 ont été décrits chez les mammifères dernièrement en utilisant des techniques de clonage de cDNA par hybridation soustractive dans différents modèles cellulaires : la différentiation mélanocytaire (IL-24) (Jiang et al., 1995), la transformation des cellules T induite par des virus (IL-26) (Knappe et al., 2000) ou l'induction génique médiée par l'IL-9 (IL-22) (Dumoutier et al., 2000a). Enfin, par l'analyse bioinformatique du génome : IL-19 (Gallagher et al., 2000) et IL-20 (Blumberg et al., 2001).

Bien que parmi ces membres il existe une faible homologie en structure primaire (homologies de séquences en acides aminés : 18-25%) (Figure 13, page suivante), ils conservent des caractéristiques structurelles et une organisation génomique similaires. En effet, l'IL-10, IL-19, IL-20 et l'IL-24 se situent sur le même cluster 1q32 du chromosome 1 humain et l'IL-22 avec l'Il-26 se situent sur la même région 12q15 que l'IFN-γ sur le chromosome 12 (Figure 14, page suivante). De même, ils possèdent tous une structure tertiaire similaire, composée de 6 hélices α (Chang et al., 2003). Ceci indique qu'ils sont très probablement dérivés à partir d'un ancêtre commun. Par ailleurs, on trouve les équivalents de ces gènes chez la souris, sauf pour IL-26.

En parallèle, une famille de récepteurs aux cytokines de classe II a été décrite, basée sur la structure de leur domaine extracellulaire (Figure 15, page suivante). En revanche cette homologie ne concerne pas les domaines intracytoplasmiques. Ces récepteurs s'associent pour former des hétérodimères de haute affinité. Ces hétérodimères sont classiquement constitués d'une chaîne appelée « longue » et d'une chaîne appelée « courte » en fonction de la longueur de la région intra-cytoplasmique. Une chaîne déterminée peut s'associer avec différentes chaînes de manière à constituer une variété d'hétérodimères différents pouvant lier une ou
plusieurs cytokines de la famille de l'IL-10. De même, une cytokine déterminée peut s'associer à différents hétérodimères (Figure 15, page suivante). Ainsi par exemple, la chaîne IL-10Rβ peut lier l'IL-10 lorsqu'elle est associée avec la chaîne IL-10Rα (Kotenko et al., 1997), ou l'IL-22 lorsqu'elle est associée à l'IL-22Rα1 (Dumoutier et al., 2000b; Kotenko et al., 2001; Xie et al., 2000). Il existe également des récepteurs solubles comme l'IL-22BP, probablement impliqué dans la modulation de l'activité de ces différents facteurs (Kotenko et al., 2001), ou encore l'homodimère IL20R2 soluble qui semble être un potentiel bloqueur de l'IL-24 dans un modèle de souris transgénique IL-24 (He and Liang, 2010).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 13 : Arbre phylogénétique des différentes cytokines de la famille de l'IL-10(Modifiée d'après Renauld et al., 2003).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 14 :** Localisation chromosomique des gènes codant pour les cytokines de la famille de l'IL-10 ainsi que leurs récepteurs dans le génome humain (D'après Kotenko, 2002)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 15 :** Représentation schématique des différentes combinaisons de chaines de récepteurs de la famille de l'IL-10 fonctionnels et de leurs ligands (modifiée d'après Renauld, 2003).</figcaption></figure>
La transduction du signal médié par ces récepteurs passe principalement par la voie JAK-STAT. Toutes les chaines de ces récepteurs peuvent potentiellement s'associer avec un membre de la famille JAK qui s'active lorsqu'un ligand se lie au récepteur. Dans ce cas, le récepteur est phosphorylé et crée des sites d'ancrage pour les protéines STAT qui sont à leur tour phosphorylées sur résidus tyrosines par les protéines JAK. Ce processus entraine la dimérisation puis la translocation nucléaire de ces protéines STAT. D'autres voies peuvent également être activées, telles que la voie de MAPK qui implique les kinases ERK, JNK et p38 (figure 16).

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 16 :** Représentation schématique des voies de signalisation activées par les récepteurs aux cytokines de classe II (modifiée d'après Renauld, 2003)</figcaption></figure>

## 2 Fonctions biologiques des cytokines de classe II

Bien que ces cytokines possèdent des similarités structurales et partagent des récepteurs communs, elles semblent avoir des rôles physiologiques divergents. Cette divergence est due au fait que l'activité biologique dépend essentiellement des domaines cytoplasmiques de ces récepteurs et des voies de signalisation activées (Wolk et al., 2002).

Le profil d'expression des différentes chaînes de récepteur est également un facteur déterminant (Kunz et al., 2006). Ainsi par exemple, on trouve une forte expression des différentes chaînes des récepteurs aux cytokines de la famille de l'IL-10 dans la peau. Par exemple, les souris exprimant de manière constitutive l'IL-20 meurent quelques jours après la naissance. Des analyses histologiques montrent un fort épaississement de l'épiderme
caractérisé par une augmentation du nombre de kératinocytes et l'expression de marqueurs de
différentiation et de prolifération dans les couches supra-basale alors que ceux-ci sont
normalement confinés à la couche basale (Blumberg et al., 2001). Ces observations rappellent
celles trouvées dans les lésions de peau de patients atteints de psoriasis. Une forte expression
des chaînes de récepteur IL-20Rα et IL-20Rβ est retrouvée chez ces patients, et il semblerait
que l'IL-20 joue un rôle dans la physiopathologie de cette maladie. Au contraire, des souris
transgéniques pour l'IL-19 ne présentent pas le même phénotype que les souris transgéniques
pour l'IL-20 (Parrish-Novak et al., 2002). Or, l'IL-19 peut se lier à l'hétérodimère IL-
20Rα/IL-20Rβ (IL-20R de type I) mais pas IL-20Rβ/IL-22Rα1 (IL-20R de type II). Il
semblerait donc que le récepteur IL-20R de type II soit responsable du phénotype au niveau
de la peau. D'ailleurs, des souris transgéniques pour la chaîne IL-22R semblent présenter des
anomalies au niveau de la peau concernant la régulation de la différentiation et de la
prolifération des kératinocytes (Renauld, 2003).

2.1. IL-10

L'IL-10 a été initialement caractérisé comme une cytokine produite par les cellules sanguines (surtout les monocytes). Chez la souris, l'IL-10 est produite par les cellules Th2 activées par la concanavaline A. Elle est capable d'inhiber la production de cytokines telles que l'IL-2, TNF-α, l'IFN-γ et le GM-CSF par les cellules Th1 (Fiorentino et al., 1989). Il a ensuite été décrit que les cellules B normales et les cellules des lymphomes B pouvaient également produire de l'IL-10 (O'Garra et al., 1990). Un homologue viral (IL-10v) a été identifié dans le génome du virus d'Epstein-Barr (EBV) visant à limiter l'inflammation et l'apoptose cellulaire, à améliorer sa survie et en conséquence à faciliter sa dissémination dans l'organisme (Moore et al., 1990). Il a été alors très vite envisagé que l'IL-10 avait un rôle suppresseur des réponses immunitaires.

L'IL-10 active une large gamme de fonctions une fois fixée sur son récepteur. On a
initialement supposé que le mécanisme d'action de l'IL-10, en tant qu'inhibiteur de
production de cytokines, était du à une inhibition de la présentation antigénique par les
macrophages (Ding and Shevach, 1992) et par les DC (Enk et al., 1993; Fiorentino et al.,
1991; Macatonia et al., 1993; Péguet-Navarro et al., 1994). Des recherches ultérieurs ont
montré que l'IL-10 pouvait également bloquer la production de cytokines (Fiorentino et al.,
1991), la production de molécules co-stimulatrices (telles que CD80, CD86, le CMH II) (Ding
et al., 1993; Willems et al., 1994) et de la sécrétion de chimiokines (Jinquan et al., 1993;
Kasama et al., 1994). Elle modifie également l'expression des récepteurs aux chimiokines (Sozzani et al., 1998; Takayama et al., 2001), augmente l'expression du ligand de la β2-intégrine (ICAM-1) (Willems et al., 1994) et la génération des radicaux libres (Dokka et al., 2001). Ces actions de l'IL-10 limitent l'amplitude d'activation et dès lors, la sécrétion de cytokines (l'IFN-γ, l'IL-2, le TNF-α et l'IL-4) par les cellules T lors de la réponse immune spécifique. En plus d'affecter la réponse T, il a été démontré que l'IL-10 favorise le développement des cellules B1 (Ishida et al., 1992), ainsi que la survie des cellules B (Levy and Brouet, 1994) et des cellules T (Cohen et al., 1997). Enfin, on a récemment découvert que l'IL-10 pouvait promouvoir l'activité des cellules NK (Cai et al., 1999).

L'IL-10 joue également un rôle essentiel dans la régulation négative des réponses inflammatoires. Il a été en effet démontré que différents types de cellules Th (Th1, Th2, Th17, Tregs....) peuvent produire de l'IL-10 dans certaines conditions. Un concept proposé met en jeu l'IL-10 comme moyen de rétrocontrôle négatif des réponses inflammatoires en général (Anderson et al., 2007; Jankovic et al., 2007; Murugaiyan et al., 2009; Trinchieri, 2007).

Les souris dépourvues d'IL-10 présentent, de manière spontanée, une entérocolite et divers symptômes observés chez des patients atteints de colite inflammatoire (Kühn et al., 1993), lorsqu'elles sont élevées dans un environnement normal (au contraire de « germ free »). Ceci indique que l'IL-10 régule l'inflammation induite par les bactéries commensales du tube digestif. Concernant la réponse immunitaire, les souris IL-10⁻ présentent une augmentation des réponses Th1 (Murray and Young, 1999; Sewnath et al., 2001; Yang et al., 1999), anti-fongique (Vazquez-Torres et al., 1999) ou anti-toxoplasmique (Gazzinelli et al., 1996). Paradoxalement, ces souris présentent également des réponses de type allergique (cutanées ou respiratoires) (Berg et al., 1995; Grünig et al., 1997; Tournoy et al., 2000). Ces résultats montrent le rôle immunomodulateur important de l'IL-10 dans la régulation des réponses inflammatoires en général. Une autre étude a montré que l'IL-10 induit la différentiation des DCs CD11c-low CD45RB-high qui dirigent la différentiation des cellules T régulatrices de type 1 (Tr1), aussi bien *in vitro* qu'*in vivo* (Wakkach et al., 2003). Les cellules Tr1 elles mêmes sont une source très importante d'IL-10.

Chez l'homme, l'IL-10 est une molécule de survie des LB péritonéaux ainsi que des cellules B1-like CD5⁺ (Gary-Gouy et al., 2002).
## 2.2. Mda-7/IL-24

### 2.2.a. Structure du gène Mda-7/IL-24

Le cDNA de Mda-7 possède une longueur de 1718 pb et code pour un polypeptide de 206 acides aminés. Mda-7 est une protéine d'environ 23.8 kDa. La région 3' UTR possède trois éléments consensus (AUUUA), probablement impliqués dans la stabilité de l'ARN, ainsi que trois séquences de polyadénylation (AAUAAA) (Jiang et al., 1996).

Le gène Mda-7 est localisé en 1q32 à l'intérieur d'un cluster comprenant quatre gènes de la famille de l'IL-10 (IL-10, IL-19, IL-20 et Mda-7/IL-24) sur 195 kb (Figure 14, page 45) (Huang et al., 2001). Il est composé de sept exons et de six introns (Huang et al., 2001). Comme pour IL-19, les deux premiers exons possèdent chacun un codon ATG initiateur de traduction (Met<sub>UP</sub> et Met) correspondant à l'acide aminé méthionine (Figure 17a, page suivante) (Kotenko, 2002). L'épissage alternatif du deuxième exon (exon 1a) permet la génération de deux messagers différents (Figure 17b, page suivante). Lorsque le premier codon start est impliqué (Met<sub>UP</sub>), la protéine est traduite avec un peptide signal riche en aa hydrophiles plus long sur sa région N-terminale, ce qui a pour effet de diminuer significativement la sécrétion de cette protéine, conduisant de ce fait à la production d'une protéine intracellulaire. En revanche, lorsque la traduction débute à partir du deuxième codon start (Met), la protéine générée possède un peptide signal plutôt hydrophobe, constitué par 49 acides aminés, permettant à la molécule d'être clivée et sécrétée (Figure 17b) (Hang et al., 2001).

Mda-7 possède trois sites de glycosylation au niveau des acides aminés 95, 109 et 126 permettant la production d'une protéine sécrétée avec différent poids moléculaires possibles (Caudell et al., 2002) (Figure 17c, page suivante). Des analyses structurales indiquent que le Mda-7 est un membre des cytokines à quatre hélices α de la famille de l'IL-10 (Wang et al., 2002). Bien que Mda-7 et IL-10 ne partagent que 23% d'identité de séquence (Figure 13, page 44), Mda-7 possède une séquence signature de l'IL-10 qui permet de la classer parmi les cytokines de cette sous-famille.
<figure><img src="image_19.png" /></figure>

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

**Figure 17 :** *Structure du gène de Mda-7/IL-24 ; a) nomenclature exonique ; b) épissage alternatif du transcript Mda-7/IL-24 ; c) les sites de glycosylation sont désignés par Gly et l'acide aminé correspondant encadré (D'après Huang et al., 2001 ; Kotenko et al., 2002)*

2.2.b. Expression de Mda-7/IL-24

L'analyse du profil d'expression de Mda-7 dans différents tissus a démontré que son expression était particulièrement restreinte aux tissus associés au système immunitaire tels que la rate, le thymus et les leucocytes du sang périphérique (Huang et al., 2001), mais également dans la peau, essentiellement dans les mélanocytes normaux (Ekmekcioglu et al., 2001; Jiang et al., 1995). Sur la base de ces observations, Mda-7 a été renommée IL-24 par le système de nomenclature de HUman Gene Organisation (HUGO). La régulation de l'expression de Mda-7/IL-24 durant la phase de différentiation terminale s'opère essentiellement au niveau post-transcriptionnel (Madireddi et al., 2000a, 2000b). Le co-traitement par IFN-β et Mezeréine induit une stabilité des transcrits Mda-7/IL-24. Au niveau transcriptionnel, l'expression de Mda-7/IL-24 est principalement régulée par deux facteurs de transcription, AP-1 et C/EBP (Madireddi et al., 2000a).

D'après l'hypothèse soutenue par Fisher et al, Mda-7/IL-24 posséderait deux activités biologiques distinctes. A des faibles concentrations (entre 2 et 20 ng/ml), Mda-7/IL-24 agit en tant que cytokine, en induisant la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires (IL-6, TNF-α et INF-γ) par les PBMC (Caudell et al., 2002). En revanche, à des fortes concentrations
(lorsque Mda-7/IL-24 est exprimé fortement à l'aide d'un système de vectorisation adénoviral), Mda-7/IL-24 agit comme un facteur d'induction de l'apoptose de manière sélective dans les cellules cancéreuses mais pas dans les cellules normales (Jiang et al., 1996; Madireddi et al., 2000c; Mhashilkar et al., 2001; Sarkar et al., 2002a). Sur la base de ces propriétés intéressantes, Mda-7/IL-24 est devenu la cible d'intenses recherches, notamment dans le domaine de traitements anti-cancers.

### 2.2.c. Orthologues de Mda-7/IL-24

La découverte d'orthologues de Mda-7/IL-24 indique que cette protéine joue un rôle complexe. Deux équipes ont cloné de manière indépendante Mda-7/IL-24 chez le rat sous le nom de C49a et Mob-5 (Soo et al., 1999; Zhang et al., 2000). Le gène Mda-7/IL-24 du rat code pour une protéine de 183 acides aminés avec 58,7 % d'identité avec la protéine humaine. L'expression de C49a est augmentée durant le processus de réparation de blessure dans les cellules du derme chez des rats blessés. Mob-5 est induit dans des cellules possédant une molécule de Ras oncogénique.

L'orthologue de Mda-7/IL-24 chez la souris, appelé Fisp (IL-4 induced secreted protein), code pour une protéine de 220 acides aminés avec 93% d'identité avec Mob-5/C49a et 69% avec Mda-7/IL-24 humain (Schaefer et al., 2001). L'expression de Fisp est induite durant la différentiation des lymphocytes Th2, ainsi que par le signal transduit *via* le récepteur T à l'antigène, impliquant l'activation de la protéine kinase C et le signal du récepteur à l'IL-4 STAT6 dépendant. Mda-7/IL-24 et Fisp partagent certaines propriétés telles qu'une expression essentiellement localisée dans le système immunitaire. De plus, l'expression de ces deux orthologues est induite durant le processus de différentiation et lors d'un traitement par une cytokine (INF-β ou IL-4) et d'un activateur de la protéine kinase C (PMA). Bien que le rôle de Fisp ne soit pas encore connu, il semble avoir un rôle plus proche de celui de son orthologue humain Mda-7/IL-24 que ne l'est C49a/Mob-5.

### 2.2.d. Récepteurs de Mda-7/IL-24

En transfectant les cellules avec différentes combinaisons de chaînes de récepteurs de la famille de l'IL-10 et en réalisant des test de fixation avec la protéine IL-24, il a été possible de déterminer les récepteurs pouvant lier l'IL24 (Dumoutier et al., 2001; Parrish-Novak et al., 2002; Wang et al., 2002). Il s'agit des hétérodimères IL-20R1/IL-20R2 et/ou IL-22R1/IL-20R2 (Figure 15). Ces hétérodimères sont donc tous constitués de la chaîne commune IL-20R2, possédant une région cytoplasmique courte, qui peut s'associer avec une autre chaîne
possédant un domaine cytoplasmique long : soit avec la chaîne IL-20R1 pour former le récepteur IL-20 de type 1, soit avec chaîne IL-22R1, pour former le récepteur IL-20 de type 2 (Figure 15) (Wang and Liang, 2005). Des tests de retard sur gel réalisés sur une lignée de kératinocytes humains ont révélé que, comme les autres cytokines membres de la famille de l'IL-10, l'IL-24 induit l'activation de STAT, notamment STAT1 et STAT3 (Wang et al., 2002). La phosphorylation de STAT3 a également été démontrée par des techniques de Western Blot après traitement avec l'IL-24 (Dumoutier et al., 2001).

## 2.2.e. Rôle de Mda-7/IL-24 dans le système immunitaire

Le rôle potentiel de Mda-7/IL-24 en tant que cytokine et ses implications dans le système immunitaire commencent à être mieux élucidé. L'expression de Mda-7/IL-24 a pu être induite dans des PBMC humains après activation avec PHA (phytohémagglutinine) ou LPS (Caudell et al., 2002) ainsi que dans des macrophages alvéolaires de rat stimulés par du LPS ou de l'IL-4 (Garn et al., 2002). De plus, l'expression de Mda-7/IL-24 a pu être détectée par PCR en temps réel dans des mélanocytes humains et son expression augmentée après traitement avec LPS ou dans des cellules T, plus particulièrement dans des cellules T naïves et mémoires (T CD44+) après activation via anti-CD3 (Wolk et al., 2002).

Chez la souris, Fisp semble avoir une expression exclusive dans les lymphocytes T CD4+ de type Th2 (Schaefer et al., 2001). Néanmoins, chez l'homme, le profil d'expression de Mda-7/IL-24 dans les cellules T est différent de celui observé chez la souris. A des temps précoces (6h), l'expression de Mda-7/IL-24 est inhibée en cas de différentiation vers un profil Th1 (médiateurs de l'immunité cellulaire), son expression étant légèrement augmentée dans des cellules différenciées Th2 (régulateurs de la réponse humorale). A 66h, l'expression augmente dans les cellules différenciées en Th1 (Wolk et al., 2002).

Si on ajoute à des PBMC humains en culture de l'IL-24, on induit la production de l'IL-6, l'IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-12 et de GM-CSF par ces cellules (Caudell et al., 2002). Cette induction peut être bloquée par l'ajout d'IL-10 de manière concomitante et implique que l'IL-10 est un antagoniste de l'IL-24. Ceci pourrait être dû au fait que l'IL-10 puisse partager des sous-unités de récepteur avec Mda-7/IL-24 ainsi qu'au fait que l'IL-10 possède une affinité pour ses récepteurs 10 fois supérieure à celle de l'IL-24 pour les siens.

L'hypothèse selon laquelle les cytokines secondaires induites par l'IL-24 pouvaient augmenter la présentation d'antigènes tumoraux par les cellules cancéreuses et de ce fait la réponse immune anti-tumorale a été émise par Caudell *et al.* (Caudell et al., 2002).
L'expression de Mda-7/IL-24 peut être détectée dans les mélanocytes, mais elle diminue graduellement en fonction de la progression du mélanome vers des stades plus agressifs, tels que pendant les phases de prolifération radiales et verticales. Mda-7/IL-24 est d'ailleurs complètement absent dans les mélanomes métastasiques (Ekmekcioglu et al., 2001; Ellerhorst et al., 2002; Jiang et al., 1995). La perte d'expression de Mda-7/IL-24 pourrait contribuer à la perte d'efficacité de la réponse immune vis-à-vis du mélanome. Une autre observation intéressante montre que l'expression de Mda-7/IL-24 peut être induite dans les monocytes humains après infection par le virus de la grippe A (A/PR/8). Ceci suggère un rôle potentiel de Mda-7/IL-24 dans la réponse immune antivirale (Garn et al., 2002).

## 2.2.f. Rôle de Mda-7/IL-24 dans le cancer

Une des fonctions potentiellement les plus intéressantes de Mda-7/IL-24 est son rôle anti-tumoral. Lorsque le Mda-7/IL-24 est délivré dans les cellules cancéreuses via un vecteur adénoviral à réplication incompétente (Ad.Mda-7), il induit l'apoptose sur une très grande variété de lignées cancéreuses telles que celles retrouvées dans les mélanomes, les glioblastomes multiformes, les ostéosarcomes et les carcinomes de sein, prostate, colon, foie, poumons, nasopharynx, cervical et ovaire. Ceci indépendamment du statut des gènes suppresseurs de tumeurs tels que p53, p16INK4A ou Rb (Sarkar et al., 2002b; Sauane et al., 2003b). Dans les gliomes malins, le Mda-7/IL-24 induit l'apoptose aussi bien chez des cellules avec un gène p53 sauvage ou muté. De ce point de vue, le Mda-7 peut s'avérer être un candidat intéressant pour une thérapie génique de ce type de cancer en particulier (Su et al., 2003). Notons que l'IL-24 n'est pas secrétée dans ces modèles. L'infection par un Ad.Mda-7 ainsi qu'un traitement avec une protéine GST-Mda-7 purifiée peut sensibiliser les cellules de gliome aux effets antiprolifératifs des rayons ionisants. Une exception intéressante à l'effet anti-tumoral d'Ad.Mda-7 est observée dans des cellules pancréatiques cancéreuses qui présentent souvent de nombreuses mutations génétiques conduisant à l'activation de l'oncogène K-ras. Néanmoins, la combinaison de Ad.Mda-7 avec un oligonucléotide anti-sens K-ras conduit à l'apoptose des cellules de cancer pancréatique présentant un K-ras muté mais pas sur celles présentant un K-ras sauvage (Su et al., 2001). A l'inverse, l'infection par Ad.Mda-7 n'a pas d'influence sur la prolifération d'une grande variété de cellules normales telles que les fibroblastes humains, les cellules épithéliales mammaires, bronchiques, rénales et de la prostate, les mélanocytes, les astrocytes et les cellules endothéliales vasculaires (Su et al., 2001).
L'infection par le Ad.Mda-7 conduit à une inhibition des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et /ou Bcl-xL et l'augmentation des protéines pro-apoptotiques Bax et/ou Bak, principalement dans différentes cellules cancéreuses mais pas dans les cellules normales (Lebedeva et al., 2002). De manière intéressante, la forte expression de Bcl-2 et/ou Bcl-xL dans les cellules du cancer de la prostate protège ces cellules de l'apoptose médiée par Ad.Mda-7. Ceci pourrait indiquer que l'équilibre entre les protéines pro- et anti-apoptotiques est un facteur déterminant dans le mécanisme d'apoptose induite par Ad.Mda-7 (Lebedeva et al., 2003).

Dans les cellules de mélanome et de gliome, mais pas dans leur contrepartie normale, l'induction de l'apoptose par Ad.Mda-7 est médiée par l'activation de la voie p38 MAPK qui aboutit à l'induction des protéines GADD (Growth Arrest and DNA Damage) telles que GADD153, GADD45 et GADD34 (Sarkar et al., 2002b; Su et al., 2003). Dans un modèle de cancer du poumon, il a été montré que l'apoptose induite par Ad.Mda-7 est médiée par l'augmentation et l'activation de la protéine kinase dépendante de l'ARN double brin, la PKR (Pataer et al., 2002). L'activation de la PKR active également la p38 MAPK, ce qui semble indiquer que la voie p38 MAPK est essentielle pour l'induction de l'apoptose médiée par Ad.Mda-7. De plus, l'infection par Ad.Mda-7 supprime l'expression de l'oxyde nitrique synthétase inductible (iNOS) qui est essentielle à la survie des cellules de mélanome mais pas aux mélanocytes (Ekmekcioglu et al., 2003). Ces observations indiquent que l'Ad.Mda-7 peut induire l'apoptose chez différentes cellules cancéreuses par divers mécanismes. Enfin, en plus de son rôle directe dans l'apoptose des cellules cancéreuses, Ad.Mda-7 inhibe également la croissance et la progression de la tumeur en inhibant l'angiogénèse (Saeki et al., 2002). Une observation intéressante est que l'apoptose induites par Ad.Mda-7 ne semble pas requérir l'activation de la voie JAK-STAT car dans ces modèles l'IL-24 n'est pas secrétée. Il n'existe aucune corrélation entre l'induction de l'apoptose et l'expression des chaînes des récepteurs IL-20/IL-22 (Sauane et al., 2003a). Les différentes équipes travaillant sur Ad.Mda-7 ont donc conclu qu'il existait une dichotomie entre la fonction de Mda-7/IL-24 en tant qu'inducteur d'apoptose et les fonctions de la forme secretée.

Cependant, notre équipe a démontré lors de travaux utilisant une forme recombinante de l'IL-24 que Mda-7/IL-24 peut également jouer un rôle dans la balance survie/apoptose lorsqu'elle est secrétée, et ceci sur des lymphocytes B humains normaux et leucémiques (Sainz-Perez et al., 2008).
# 1 Généralités sur le processus d'apoptose

## 1.1. Définition

Il existe deux types principaux de mort cellulaire : l'apoptose et la nécrose.

La **nécrose** est le résultat d'une agression environnementale des cellules (exposition à un produit toxique, une infection virale ou bactérienne). Elle est considérée comme une mort cellulaire désordonnée. La rupture de la membrane cytoplasmique libère le contenu cellulaire dans l'espace extracellulaire et déclenche une réaction inflammatoire.

L'**apoptose** ou « mort cellulaire programmée », est un mode d'élimination physiologique des cellules en excès ou anormales dans l'organisme. Elle résulte de l'exécution d'un programme hautement régulé qui va induire la destruction d'une cellule, tout en préservant l'intégrité tissulaire environnante. Ce phénomène a été décrit pour la première fois par Kerr et al (Kerr et al., 1972). L'apoptose est caractérisée par un certain nombre de modifications :

- morphologiques : diminution du volume cellulaire, maintien de l'intégrité de la membrane plasmique au début du processus, relocalisation des organites cytoplasmiques, condensation de la chromatine puis fragmentation du noyau (figure 19).

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 19 : modifications morphologiques au cours de l'apoptose (d'après le web)</figcaption></figure>

- biochimiques : chute du potentiel mitochondrial transmembranaire, externalisation de lipides membranaires (phosphatidylsérines), activation des caspases et fragmentation de l'ADN. L'exposition des phosphatidylsérines est reconnue par les macrophages pour la phagocytose (Messmer and Pfeilschifter, 2000).
Les acteurs moléculaires de l'apoptose sont :

* Les récepteurs membranaires de mort « Death receptors » (Fas, TNFR et TRAIL)

* Les protéines cytoplasmiques :

* Caspases

* Apaf-1

* IAP, protéine régulatrice des caspases

* cFLIP, protéine régulatrice de la voie extrinsèque

* Les protéines mitochondriales

* Cytochrome C

* Protéines régulatrices des IAPs : Smac/DIABLO, Omi/HtrA2

* AIF, endoG

* Les protéines de la famille Bcl-2 (pro-apoptotiques, ex : Bid, Bax, Bak, Bim.....)

* La protéine p53

## 1.2. Rôles physiologiques de l'apoptose

L'apoptose est un mécanisme régulateur essentiel à l'intégrité tissulaire qui intervient dans l'homéostasie cellulaire, et constitue le type de mort cellulaire tout désigné pour l'élimination des cellules excédentaires ou « nuisibles ». Cette mort physiologique douce a un rôle fondamental notamment au cours du développement embryonnaire et fœtal, dans l'organisation du système nerveux central, ainsi que dans l'élaboration du système immunitaire (Opferman and Korsmeyer, 2003). Sa dérégulation peut mener à de nombreuses pathologies. Pour exemple, les cancers et certaines maladies auto-immunes présentent des défauts d'apoptose. Au contraire une sur-activation de l'apoptose est observée dans d'autres maladies comme certaines maladies neuro-dégénératives ou des désordres immunitaires comme le SIDA (Danial and Korsmeyer, 2004; Elmore, 2007; Gougeon, 2003). Ainsi, un intérêt croissant est constaté dans la compréhension des mécanismes régulant les voies apoptotiques à visée thérapeutique, notamment dans les futurs traitements des cancers comme ceux d'origine hématopoïétique. Ces enjeux expliquent que l'apoptose soit aussi la forme la plus étudiée et décrite parmi les programmes de mort cellulaire.

## 1.3. Les différentes voies de l'apoptose

Il existe deux voies principales de signalisation aboutissant à l'apoptose. La première est la voie des récepteurs de mort (voie extrinsèque) (figure 20, page suivante). La deuxième voie
est la voie mitochondriale (voie intrinsèque) mettant en jeu la mitochondrie (figure 21, page suivante). Ces deux voies aboutissent à l'activation des molécules effectrices de l'apoptose, les caspases. Une connexion entre ces deux voies existe à travers le clivage et l'activation de BID. Toutefois, il existe une troisième voie activée en réponse à un stress et faisant intervenir le réticulum endoplasmique (RE) (figure 21, page suivante).

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 20 : La voie extrinsèque de l'apoptose.</figcaption></figure>

La voie extrinsèque de l'apoptose est initiée par la reconnaissance des récepteurs de mort (TNF-R1, Fas/CD95/Apo-1/DR2, TRAIL-R1/DR4, TRAIL-R2/DR5) par leurs ligands respectivement (TNF-alpha, FasL/CD95L/Apo-1L, TRAIL/Apo-2L, TRAIL/Apo-2L) (Wallach et al., 2008). Cette reconnaissance permet le recrutement de la protéine adaptatrice, FADD puis de la caspase 8, entraînant sa dimérisation et son activation (Wang et al., 2008). Ainsi, le clivage et l'activation des caspases 3 et 7 peuvent en découler directement et conduire à l'apoptose (Yuan and Kroemer, 2010).
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 21 : Les voies intrinsèques et de stress du RE (Reticulum Endoplasmique) de l'apoptose.</figcaption></figure>

La voie intrinsèque de l'apoptose, activée par différents stimuli apoptotiques intracellulaires, conduit à une régulation négative des protéines anti-apoptotique comme XIAP (inhibiteurs de caspase) et les protéines de la famille Bcl-2 (Bcl-2, BCL-xL), et une activation des protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 (Bax, Bad, Bid), SMAC et Diablo, induisant la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP). Celle-ci entraîne le relargage de diverses protéines de l'espace intermembranaire mitochondrial (IMS (exemple : cytochrome C). Le cytochrome c ainsi libéré se lie avec l'APAF-1 et la pro-caspase-9 pour former l'apoptosome (Siu et al., 2008). La caspase-9 est alors activée, permettant le clivage en aval des caspase-3 et -7 (Ohtsuka et al., 2003).

La voie de stress du RE induit l'activation de la caspase-2 ou -4, conduisant à l'activation des caspases-12, qui activent alors la voie intrinsèque de l'apoptose (Lai et al., 2007).
# OBJECTIFS DE LA THESE
# OBJECTIFS

Notre équipe a précédemment montré que Mda7/IL-24 est surexprimé dans les lymphocytes B de la leucémie lymphoïde chronique, mais en y jouant un rôle protecteur (Sainz-Perez et al., 2006). Ceci est en accord avec le fait que la majorité des cellules de LLC dans le sang sont en phase G0/G1 précoce du cycle cellulaire. Par contre, l'IL-24 recombinante provoque l'apoptose de cellules leucémiques en culture après stimulation par l'IL-2 (Sainz-Perez et al., 2008). Ceci indique que l'IL-24 recombinante tue les cellules mises en cycle. De plus, nous avons également montré que l'IL-24 recombinante inhibe la différentiation plasmocytaire des cellules B normales du centre germinatif en tuant surtout les précurseurs plasmatiques (Maarof et al., 2010). Finalement, ces observations suggèrent que l'expression de l'IL-24 est inversement corrélée à la prolifération cellulaire. Cependant, les mécanismes moléculaires de l'action antiproliférative de l'IL-24 sur les cellules B humaines restaient à mettre en évidence.
Les objectifs de ma thèse ont donc été :

1) d'analyser les mécanismes moléculaires de l'action de cette cytokine sur les cellules B normales ainsi que sur celles de la leucémie lymphoïde chronique,

2) de mettre en évidence les mécanismes physiologiques de production de l'IL-24 dans les lymphocytes,

3) d'explorer les effets immunologiques potentiels de cette cytokine en dehors de l'effet cytostatique et cytotoxique.
MATERIEL ET METHODES
# MATERIEL ET METHODES

Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé plusieurs méthodes :

1. Sélection des lymphocytes B humains (à partir des amygdales et du sang de LLC)

2. Culture des Lymphocytes B avec ou sans IL-24

3. Extraction des ARN

4. Hybridation de Biopuces à ADN

5. Analyse du Transcriptome

6. Confirmation de l'expression des gènes par PCR et q-PCR

7. Etudes fonctionnelles des lymphocytes B (Prolifération en CFSE, cycle cellulaire, apoptosis, expression des protéines en Western Blot).

Nous décrivons ci-après les différentes techniques utilisées :

# 1 Première partie : les modèles d'étude

## 1.1. Les cellules B d'amygdales

### 1.1.a. Préparation des suspensions amygdaliennes

Les amygdales constituent une source importante de lymphocytes B matures (cf introduction) où ils représentent 60 à 80 % de cellules totales. Nous avons choisi de nous intéresser aux organes lymphoïdes secondaires que constituent les amygdales palatines (composées en majorité de cellules de centres germinatifs) qui, par leur emplacement, sont mises en cause lors d'infections à répétition ou peuvent présenter chez le jeune enfant une hypertrophie gênante conduisant à prescrire leur ablation.

Les amygdales palatines obtenues lors d'une amygdalectomie thérapeutique chez 40 enfants âgés de 1 à 10 ans (moyenne d'âge de 4,6±0,3 ans) ont été incluses dans cette étude. Ces amygdales, enveloppées dans une compresse imbibée de sérum physiologique, ont été acheminées du Bloc Opératoire de l'Hôpital d'Enfant de Nancy au laboratoire immédiatement après l'intervention chirurgicale faite par le professeur COFFINET. Un fragment d'environ 0,5 cm³ a été prélevé sur chaque échantillon de tissu frais et émincé à l'aide de ciseaux dans du RPMI 1640 (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA). Les cellules ont été dissociées en utilisant un Potter en verre et les lymphocytes amygdaliens ont été isolés par centrifugation sur gradient de densité comme décrit dans le paragraphe ci-dessous.
### 1.1.b. Isolement des lymphocytes totaux

La séparation des lymphocytes à partir de sang périphérique ou de suspensions cellulaires amygdaliennes a été réalisée par centrifugation sur gradient de Ficoll-Hypaque.

Cette technique repose sur les différences de densité que présentent les globules rouge, les polynucléaires, les lymphocytes et les monocytes. Les éléments figurés du sang, placés sur un milieu Ficoll-Hypaque (Pancoll human, PAN-Biotech GmbH, Aidenbach Bavaria, Allemagne) de densité 1,077, correspondant à la densité des lymphocytes, subissent durant la centrifugation une migration différentielle qui conduit à leur séparation en plusieurs fractions. A l'interface entre le sang et le Ficoll-Hypaque, les érythrocytes sont agrégés en raison du grand nombre de polymères que contient le Ficoll-Hypaque. La densité des agrégats étant supérieure à celle du Ficoll-Hypaque, les érythrocytes sédimentent au fond du tube. La densité des granulocytes (plus sensibles que les lymphocytes aux variations de pression osmotique) s'élève dans une solution hyper osmotique et par conséquence ces polynucléaires sédimentent également au fond du tube. Les lymphocytes restent à l'interface échantillon/milieu de sédimentation et se rassemblent en un anneau opaque surnageant au dessus du Ficoll-Hypaque. Les monocytes se retrouvent dans la phase supérieure qui contient également le plasma riche en plaquettes (Bøyum, 1976).

Environ 10 ml de suspension cellulaire amygdalienne ou de sang total périphérique dilués au demi dans du RPMI 1640 sont déposés sur 10 ml de Ficoll-Hypaque sans mélanger les deux phases. L'ensemble est centrifugé à 600g pendant 15 minutes à température ambiante. Les lymphocytes sont ensuite recueillis en prélevant l'anneau cellulaire formé à l'interface, puis lavés deux fois dans du PBS (PAA GmbH, Pasching, Austria).

### 1.1.c. Comptage et étude de la viabilité cellulaire

Le comptage ainsi que l'estimation de la viabilité cellulaire a été réalisé par exclusion du bleu trypan. Ce dernier est un composé toxique qui pénètre dans les cellules. Les cellules vivantes sont capables d'expulser le bleu trypan dans le milieu extracellulaire grâce aux transporteurs ABC (pour ATP binding cassette). Ces protéines membranaires utilisent l'hydrolyse de l'ATP comme source d'énergie pour expulser les molécules cytotoxiques hors de la cellule. Les cellules mortes, ne produisant plus d'ATP, sont incapables d'expulser le bleu trypan et apparaissent donc de couleur bleue.
Vingt microlitre de la suspension cellulaire amygdalienne ont été placés en présence du même volume du bleu trypan (dilué au 20ème) pendant 3 min. Les cellules vivantes excluant le bleu trypan sont comptées sur une cellule de Malassez.

**1.1.d. Isolement des lymphocytes B**

La séparation des lymphocytes B à partir des lymphocytes totaux du sang périphérique ou bien de suspensions amygdaliennes a été réalisée par sélection négative en utilisant un Kit de Billes Magnétiques (Dynal® B Cell Negative Isolation Kit), comme dans les articles précédant de notre équipe.

Cette technique repose sur l'isolation indirecte des cellules B naïves humaines à partir d'une suspension amygdalienne ou bien de PBMC, par déplétion des toutes les cellules non B en utilisant, dans une première étape, un mélange d'anticorps de type IgG murins contre CD2 (lymphocytes T), CD14 (les monocytes), CD36 (plaquettes et monocytes), CD43 (leucocytes sauf cellules B naïves) et CD235a (Glycophorine A, érythrocytes), et dans une seconde étape, les cellules non B sont éliminées au moyen de billes magnétiques couplées avec des anticorps anti-IgG murins.

100µl d'une suspension amygdalienne contenant $10^7$ cellules ont été incubées avec 10µl des anticorps mixtes pendant 30min à une température entre 4-8°C. Après lavage avec 2ml du PBS et centrifugation à 1600t/min pendant 5min, le culot obtenu a été suspendu avec 100µl de billes magnétiques lavées. Le volume est complété à 1ml avec du RPMI et incubé pendant 15 min à température ambiante, sur un rotateur. Après incubation, le tube a été placé sous un aimant pendant deux minutes et le surnageant est récupéré dans un nouveau tube. Finalement les cellules B obtenues ont été comptées sur cellule de **Malassez** puis analysées au cytomètre pour étudier leur pureté. La pureté moyenne était de 98% basée sur un marquage CD19 et CD5 en cytométrie en flux. En particulier, le double marquage CD19/CD5 permet d'analyser les cellules B CD19⁺CD5⁻ ou bien B CD19⁺CD5⁺. Ces dernières représentent, en moyenne, 10% des lymphocytes B (Gary-Gouy et al., 2002). La population CD19⁺/CD5⁺ représente les lymphocytes T résiduels contaminants (<2% dans nos analyses).

Nous avons également séparé les cellules B en fonction de plusieurs marqueurs de surface (figure 22, page suivante) : cellules B du CG (CD20<sup>hi</sup>CD38<sup>hi</sup>) (A) ; cellules B activées mémoires (CD27<sup>+</sup>CD38<sup>-</sup>) (C) ; plasmocytes (CD38<sup>hi</sup>CD27<sup>hi</sup>) (D) ; cellules B du CG (CD38<sup>+</sup>CD27<sup>+</sup>) (E) ; cellules B naïves (CD 38<sup>-</sup>CD27<sup>-</sup>) (F) ; centroblastes (CD44<sup>-</sup>IgD<sup>+</sup>) (G) ; cellules B naïves (CD44<sup>+</sup>IgD<sup>+</sup>) (H) ; centrocytes (CD44<sup>+</sup>IgD<sup>-</sup>) (I).
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 22 : Dot plots représentatives d'une amygdale après sélection des cellules B</figcaption></figure>

1.1.e. Traitement et culture des lymphocytes B

Le travail de Maarof et al, avait montré un effet de l'IL-24r sur un modèle de différentiation *in vitro* des lymphocytes B en cellules B mémoires et en plasmocytes. Nous avons utilisé ce modèle décrit précédemment par l'équipe de YJ Liu et J Banchereau. L'objectif était l'analyse des mécanismes moléculaires de l'effet de l'IL-24. Nous avons utilisé cette culture pour l'analyse du « Transcriptome ». Dans ce modèle les cellules B du centre germinatif ont été cultivées pendant 3 jours en présence d'IL-2, IL-10 et CD40L, suivi d'une culture secondaire de 4 jours soit en présence des mêmes cytokines pour obtenir des cellules B mémoires ou bien en absence du signal CD40L pour obtenir des plasmocytes (Arpin et al., 1995) (figure 23, page suivante). La seule modification apportée dans notre travail a été l'utilisation d'un CD40L soluble trimérique. En effet, cette molécule permet de réticuler le CD40 à la surface des cellules B et est indispensable à leur différentiation (cf. introduction). Le CD40L trimérique a été utilisé car nous ne disposions pas des lignées de fibroblastes CD40L+ et des fibroblastes contrôles.
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 23 :** *le modèle de différenciation B in vitro mise au point par l'équipe de J. Banchereau (d'après Arpin et al., 1995)*</figcaption></figure>

Dans le but d'étudier le mécanisme moléculaire de l'IL-24 ainsi que de l'IGF1, des cellules B d'amygdales, obtenues par sélection négative (98% de pureté), ont été mises en culture primaire en présence d'un cocktail de cytokines : rIL-2(100ng/ml), rIL-10(50ng/ml) et CD40-ligand soluble (400ng/ml) pendant trois jours. A J4 ces cellules ont été mises en culture secondaire en présence de mêmes concentrations de rIL-2, rIL-10 avec ou sans rIL-24(100ng/ml) et avec ou sans rIGF1 (10 et 100 ng/ml) (dans les deux cas sans CD40-L).

Pour chaque manipulation, les suspensions cellulaires ont été placées dans un milieu de culture complet RPMI, contenant les nutriments et les facteurs de croissance nécessaire à leur survie et dans des conditions optimales (atmosphère humide, enrichie en CO₂, à 37°C) en présence d'agent de stimulation. Ces cellules ont été manipulées dans des conditions limitant les risques de contamination sous hotte à flux laminaire.

## 1.2. Les cellules B de LLC

### 1.2.a. Patients et prélèvements

Des patients âgés de 41 à 84 ans (moyenne d'âge de 64,7 ± 0,3 ans) ont été inclus dans ce projet. Ils étaient tous suivis en consultation par le professeur Pierre Feugier dans le service d'Hématologie Adulte (Centre Hospitalier de Nancy). Tous les patients ont été informés oralement de l'étude et leur consentement éclairé écrit et signé a été recueilli. Leur participation à ce travail avait été approuvée par le Comité Local d'Ethique de Nancy. Les prélèvements, constitués de 2 tubes de 6 ml de sang total prélevé sur EDTA, ont été réalisés
dans le cadre habituel des bilans sanguins nécessaires pour l'exploration et le suivi des LLC-B.

### 1.2.b. Isolement des lymphocytes B de LLC

L'isolement des cellules B à partir de sang total du patient de LLC, a été réalisé par isolation négative en utilisant la technique des **Rosettes ou TAC** (Tetrameric Antibody Complex) (RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail, StemCell Technologies). Cette technique consiste à éliminer toutes les cellules non B à l'aide d'un cocktail d'anticorps dirigés contre les cellules hématopoïétique humaines non B : anticorps anti-CD2, CD3, CD16, CD36, CD56, CD66b ainsi que la glycophorin A des globules rouges.

Cinquante µL de RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail ont été ajouté à 1 ml du sang total, puis incubés, sous rotation, pendant 20 minutes à température ambiante. Après dilution du volume totale avec un volume égale du PBS, les cellules B non fixées par les rosettes ont été centrifugées sur gradient de **Ficoll-Hypaque**. Finalement une étude de pureté a été réalisée par cytométrie de flux.

### 1.2.c. Traitement et culture des lymphocytes B de LLC

Afin d'étudier l'effet de l'IL-24 sur les lymphocytes B de LLC, ces cellules purifiées (96-98%) ont été stimulées par IL-2 recombinant (100 ng/ml) pendant 24 heures puis cultivées avec ou sans r-IL-24 (100 ng/ml). Au troisième jour (72 heures), les cellules B stimulées ont été analysées par cytométrie de flux, PCR, qPCR et WesternBlot.

Comme dans le modèle des lymphocytes B normaux, ces cellules ont été cultivées dans un milieu de culture complet RPMI, contenant les nutriments et les facteurs de croissance nécessaire à leur survie et dans des conditions optimales (atmosphère humide, enrichie en CO₂ 5%, et à 37°C) en présence d'agent de stimulation. Ces cellules ont été manipulées dans des conditions limitant les risques de contamination sous hotte à flux laminaire.

## 2 Deuxième partie : Exploration phénotypique et fonctionnelle par cytométrie en flux

### 2.1. Cytométrie en flux

Cette technique permet une analyse quantitative et qualitative précise de cellules marquées de manière directe ou indirecte par des anticorps conjugués à un ou plusieurs fluorochromes.
L'analyse est réalisée dans un système fluidique très fin sous pression. Les cellules en suspension sont guidées dans un fin capillaire de liquide de gaine, où elles vont, l'une après l'autre, traverser le faisceau d'un laser émettant une lumière cohérente à une longueur d'onde spécifique permettant d'exciter le ou les fluorochromes présents sur/dans chaque cellule. Les fluorochromes ainsi excités émettent un signal lumineux dans une longueur d'onde spécifique de chacun d'eux.

Les signaux optiques émis par chaque cellule sont focalisés et séparés par des circuits de miroirs dichroïques puis acheminés vers les systèmes de détection qui sont des photomultiplicateurs permettant de convertir les signaux optiques en signaux électriques. Des filtres optiques sont placés avant ces détecteurs et permettent de séparer dans le rayonnement émis les différentes longueurs d'onde de façon à ce que seule la longueur d'onde correspondant à l'émission d'un fluorochrome spécifique soit recueillie par chaque détecteur : par exemple, comme l'isothiocyanate de fluorescéine émet dans le vert, un filtre absorbant à 525 nm est utilisé (figure 24).

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 24 :** Représentation schématique du système de la fluorescence du cytométrie en flux (adapté de http://www.cardiff.ac.uk/medic/aboutus/departements/hematology/resources/biomed04.ppt #306, 11, Diapositive 11)</figcaption></figure>

Chacun des fluorochromes va donc émettre une fluorescence qui sera séparée et transformée en signal électrique. Son intensité, exprimée par un numéro de canal, sera convertie en valeurs numériques qui seront analysées sur un ordinateur : on visualisera les résultats sur un écran par des histogrammes.

Hormis la fluorescence, d'autres propriétés de la cellule sont analysées. La lumière diffractée selon le même axe que la lumière du laser est détectée dans le canal "Forward Scatter"(FS). Cette valeur est proportionnelle à la taille de la cellule analysée et peut donc permettre de
distinguer les cellules vivantes des cellules mortes. Les signaux indésirables tels que les débris cellulaires peuvent ainsi être exclus de l'analyse. La lumière diffractée selon un axe perpendiculaire au trajet de la lumière du laser est quant à elle détectée dans le canal "Side Scatter"(SS) et témoigne du contenu de la cellule ou la granulosité (figure 25).

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 25 : Principe De détection du « Forward Scatter » (FS) et du « Side Scatter » (SS) (adapté de http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/educate/theory/fluiopti/sld035.htm)</figcaption></figure>

Ce signal dépend ainsi du rapport nucléocytoplasmique, des granulations cytoplasmiques et de la réfringence de la cellule. Ce paramètre analyse la diffraction du laser liée aux organites intracellulaires. Il reflète l'aspect plus ou moins granuleux du cytoplasme des cellules.

L'affichage simultané des paramètres FS, SS traités par le logiciel, visualise chaque cellule sur l'écran sous forme de point. C'est le cytogramme, nuage de signaux punctiformes, qui apparaît. La formation d'un nuage de points plus dense permet de placer une fenêtre d'intérêt englobant la population cellulaire à étudier.

Pour une même cellule, plusieurs paramètres de morphologie et de fluorescence sont enregistrés simultanément. L'analyse peut donc se faire selon un paramètre donné (analyse monoparamétrique) ou en associant deux ou plusieurs paramètres (analyse multiparamétrique) accompagnés pour chacun d'une liste des statistiques afférentes. Cette dernière peut contenir pour chaque sous population cellulaire sélectionnée le nombre de cellules, le pourcentage par rapport au total ou à un fenêtrage spécifique, la valeur moyenne des paramètres analysés, le pic de fluorescence ou encore les coefficients de variation.
## 2.2. Etude immunophénotypique des lymphocytes B normaux et ceux de LLC

La pureté des cellules B après isolation négative a été évaluée par une analyse immunophénotypique en cytométrie en flux en utilisant deux anticorps monoclonaux : anti-CD19 couplé à la phycoérythrine-cyanine 7(PC7) et anti-CD5 couplé à la phycoérythrine (PE).

Cinquante µl de cellules ($10^6$ cellules) en suspension, avant et après isolation des cellules B, ont été incubées 20 minutes à 4°C et à l'obscurité avec 5µl d'anticorps anti-CD19 PC7 et 5µl d'anti-CD5 PE. Un lavage a été réalisé en PBS et 500 µl de paraformaldéhyde ont été ajoutées dans chaque échantillon qui a été conservé à 4°C à l'obscurité jusqu'à analyse en cytométrie de flux (le jour même).

Des contrôles isotypiques ont été réalisés, de façon à déterminer le seuil de positivité du marquage, l'intensité de fluorescence de base pour chaque fluorochrome et à calculer les intensités moyennes de fluorescences (MFI) relatives et les Médianes.

## 2.3. Etude de l'expression d'IGF1-R

Dans le but d'étudier l'expression du récepteur à l'IGF1 par les lymphocytes B normaux et leucémiques, ces cellules ont été stimulées sous différentes conditions (CD40L; anti-IgM; CpG ODN et SDF1) pendant 48 heures. A j3, les cellules sont centrifugées 5 minutes à 400g à 4°C. Le culot est lavé dans 5 ml de PBS 1X froid et centrifugé à nouveau. Le culot est repris dans 50 µl du PBS 1X+ 0,1% BSA auxquels sont ajoutés 5 µl d'anticorps anti-IGF1-R FITC. Apres incubation 20 min à 4°C et à l'obscurité, les cellules sont lavées avec 5 ml du PBS 1X et centrifugées à nouveau. Le surnageant est éliminé et les cellules sont fixées par 500 µl de paraformaldéhyde (PFA) 1%. Les échantillons sont analysés par cytométrie en flux (FC500, Beckman-Coulter). L'analyse des données est réalisée à l'aide du logiciel XP (Beckman-Coulter).

## 2.4. Etude de la répartition des cellules dans le cycle cellulaire

Les cellules B stimulées avec le cocktail de cytokines puis stimulées ou non avec l'IL-24 et l'IGF1 sont centrifugées et lavées comme décrit plus haut. Le culot est ainsi repris dans 50 µl de la solution de DNA PREP LPR (solution de perméabilisation et de fixation des noyaux des
cellules), vortexé rapidement et incubé avec 500 µl de la solution de DNA PREP Stain (contenant de IP 50 µg/ml, RNAsé de type III-A 4 KU/ml) pendant une heure à température ambiante. Puis les échantillons sont analysés par cytométrie en flux selon un histogramme monoparamétrique en FL3-Lin.

Lorsque le cycle cellulaire est analysé, il est nécessaire de ne pas prendre en compte les doublets de cellules. En effet, si deux cellules passent simultanément dans la chambre de mesure du cytomètre, celui-ci détecte un seul événement, dont la fluorescence correspond à la somme des fluorescences de chacune des cellules. Pa exemple, si deux cellules en phases G₁ passent simultanément dans la chambre de mesure, le cytomètre détecte un événement possédant une fluorescence équivalente à la celle d'une cellule en phase G₂. De plus, les événements contenus dans le pic sub-G₁ sont des débris cellulaires, comme des cellules en fin d'apoptose ou des cellules en nécrose. Elles ne sont pas prises en compte dans l'analyse du cycle cellulaire pour ne pas fausser la proportion de cellules en cycle. C'est pourquoi il est question de « nombre d'événement » et non pas de «nombre de cellules ». Lorsqu'une cellule est marquée par l'IP, la fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN et permet de déterminer la phase du cycle dans laquelle elle se trouve.

## 2.5. Etude des caractéristiques de l'apoptose

### 2.5.a. Détection des Phosphatidyl Sérines par l'Annexine V

Dans une cellule non-apoptotique les phosphatidylsérines membranaires ne sont situées que sur la face interne de la membrane. Dés qu'une cellule entre en apoptose, sa membrane cytoplasmique est altéré et les phosphatidylsérines sont délocalisées et exprimées des deux cotés de la membrane. L'annexine V ayant une forte affinité pour ces molécules va donc marquer les cellules apoptotiques. Il faut noter que les cellules mortes seront aussi marquées par l'annexine. Toutefois, il est possible de discriminer par double marquage les cellules apoptotiques des cellules mortes (nécrotiques) en rajoutant de l'IP lors du marquage qui ne pénètrera que dans les cellules mortes et les cellules en apoptose tardive. Les cellules apoptotiques mais pas mortes seront Ann+IP- et les cellules mortes seront Ann+IP+.

Les cellules en culture ($10^6$ cellules/ml) sont centrifugées 5 minutes à 400 g à 20°C puis lavée avec 5 ml du PBS 1X et centrifugées à nouveau. Le culot est traité avec un kit de détection d'apoptose (kit Annexine V-FITC, BD). $10^5$ cellules contenues dans 100 µl de solution Binding Buffer 1X froid sont incubées avec 5 µl d'annexine V-FITC et 5 µl d'iodure de
propidium (IP) à l'obscurité pendant 15 minutes et à température ambiante. Après, 400 µl de solution Binding Buffer 1X est ajouté avant analyse au FACS.

### 2.5.b. La dépolarisation des membranes mitochondriales

Les changements de polarisation de la membrane mitochondriale sont évalués en utilisant le NIR Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (abcam). Le NIR Dye est un colorant cationique lipophile qui s'accumule dans les mitochondries polarisées. Dans les cellules normales, l'intensité de la fluorescence rouge est augmentée quand le NIR Dye s'accumule dans la mitochondrie. Par contre, dans les cellules apoptotiques, l'intensité est diminuée après l'effondrement du potentiel membranaire mitochondrial. Les cellules incubées avec le NIR ont été visualisé avec un cytométre en flux à une excitation et une émission rouge (canal FL4).

Les cellules (10⁶/ml) traitées ou non avec l'IL-24 sont collectées comme précédemment et lavées dans 5 ml de PBS. Le culot est repris dan 1 ml de PBS auquel est ajouté 5 µl de NIR Dye. Les cellules sont ensuite incubées entre 15 à 30 minutes à 37°C dans le noir. Les échantillons sont centrifugés et les culots sont lavés dans 5 ml de PBS avant d'être à nouveau centrifugés et analysés en cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules hautement marquées par le NIR est déterminé.

### 2.5.c. La diminution de nombre de mitochondries dans les cellules apoptotiques.

La diminution de nombre de mitochondries est évaluée en utilisant des sondes sélectives de mitochondries, MitoTracker®Orange CMTMRos (Invitrogen). Ces sondes ont une fluorescence orange et marquent les mitochondries dans les cellules vivantes. Leur accumulation dépend du potentiel membranaire mitochondrial. Après leur pénétration passive dans la cellule vivante, ces sondes sont séquestrées dans les mitochondries où elles réagissent avec des thiols de protéines et de peptides pour former un conjugué aldéhydique qui conserve la fluorescence des ces sondes. L'analyse est réalisée sur un cytométre en flux (Beckman Coulter, FC500) à une excitation de 554 nm de longueur d'ondes et une émission de 576 nm (canal FL2).

Le MitoTracker®Orange CMTMRos est solubilisé dans du DMSO de haute qualité pour réaliser une solution stock de 50 µM qui est diluée extemporanément dans du milieu complet. Les cellules (10⁶/ml) traitées ou non avec l'IL-24 sont collectées comme précédemment et lavées dans 5 ml de PBS. Le culot est repris dan 1 ml de PBS auquel est ajouté le
MitoTracker®Orange CMTMRos (25-500 nM). Les cellules sont ensuite incubées entre 15 à 30 minutes à 37°C dans le noir. Les échantillons sont centrifugés et les culots sont lavés dans 5 ml de PBS avant d'être à nouveau centrifugés et analysés en cytométrie en flux. Le pourcentage de cellules hautement marquées par le MitoTracker®Orange CMTMRos est déterminé.

# 3 Troisième partie : Etude de l'expression des ARN messagers

## 3.1. Extraction des ARN totaux

Suivant la disponibilité des trousses, deux techniques distinctes ont été utilisées :

### 3.1.a. Extraction au Trizol

Aux temps indiqués, les cellules en culture sont centrifugées à 400 g pendant 5 minutes et la lavées avec du PBS. Le culot est conservé à -80°C avant extraction d'ARN. Le jour de l'extraction, les cellules sont lysées en ajoutant 500 µl de Trizol (Invitrogene) pendant 5 minutes à température ambiante. Les ARN sont extraits en ajoutant 100 µl de chloroforme (CARLOERBA, France). La solution est agitée vigoureusement par inversion pendant 15 secondes puis incubé 2 minutes à température ambiante. Ensuite les échantillons sont centrifugés 15 minutes à 12000 g à 4°C. La phase aqueuse, d'environ 400 à 600 µl (pour 1 ml de Trizol initial) est prélevée et les ARN sont précipités avec 500 µl d'isopropanol froid, vortexés puis incubés à -20°C toute la nuit. Le lendemain, les échantillons sont centrifugés 10 minutes à 12000 g puis lavés avec 75% d'éthanol en H₂O DEPC (1 ml Ethanol pour 1 ml de Trizol) et centrifugés 5 minutes à 7500 g. Le surnageant est enlevé par inversion et le culot est séché à température ambiante. Les culots d'ARN sont enfin repris dans 30 à 60 µl d'H₂O DEPC ou H₂O ultra pure avant d'être dosés par la mesure de l'absorbance à 260 nm (sur un Nanodrop). Après dosage, les échantillons sont conservés à -80°C.

### 3.1.b. Extraction sur colonne (RNeasy Mini Kit – Qiagen)

Les cellules en culture sont centrifugées comme indiqué en haut. Le culot sec est conservé à -80°C jusqu'au jour d'extraction d'ARN ou bien homogénéisé dans 350 µl de la solution RTL+ β-ME (Tampon de Lyse) et vortexé vigoureusement pendant 1 minute. Les ARN sont purifiés en rajoutant un volume égal de 70% d'éthanol en H₂O DEPC. 700 µl du mélange est transféré sur une colonne RNeasy. Centrifugé 15 secondes à 11000 g à température ambiante. Une digestion de l'ADN contaminant est réalisée sur colonne en ajoutant 80 µl de la solution
de DNase (10 µl de DNase+ 70 µl de RDD) et incubant 15 minutes à température
ambiante. 700 µl de de la solution RW1 (pour arrêter l'action de DNase) est ajouté sur la
colonne puis centrifugés 15 secondes à 11000 g à température ambiante. Les ARN fixés sur la
colonne sont lavés deux fois avec 500 µl de la solution RPE puis centrifugés 15 secondes à
11000g pendant le premier lavage et 2 minutes à 11000 g pendant le deuxième lavage. Enfin,
la colonne est placée sur un tube de 1,5 ml (RNase free) et 40 µl de H₂O RNase-free est ajouté
au centre de la colonne puis centrifugée 2 minutes à vitesse maximale (16000g) à 4°C. Les
ARN totaux sont ensuite dosés par la mesure de l'absorbance à 260 nm (sur un Nanodrop).
Après dosage, les échantillons sont conservés à -80°C.

**3.2. Préparation des échantillons**

La concentration en ARN totaux est déterminée par la mesure de l'absorbance à 260, sachant qu'une unité d'absorbance correspond à une concentration de 40 µg d'ARN par ml. Les échantillons sont aliquotés de deux manières : 5 µg d'ARN sont précipités en présence de 1/10ème de volume d'acétate de sodium 3M pH 5,5 et de 2 volume d'éthanol absolu, 300 ou 500 ng sont utilisés pour la transcription réverse.

La qualité des ARN est contrôlée en réalisant une électrophorèse en gel d'agarose à 1,5% (TAE 1X) des échantillons de 500 ng d'ARN totaux.

**3.3. Etude de l'expression des ARN messagers par la technique des Biopuces**

Les puces "Agilent 60-mer Whole Human Genome", imprimées avec la technologie "Agilent SurePrint® ", sont utilisées dans notre travail. Ces puces ont 41000 gènes et transcrits humains avec une sonde d'oligonucléotide de 60-mer représentant chaque séquence. De plus, 75 sondes sélectées sont répliquées 10 fois pour permettre les mesures de reproductibilité intra-puces. Des sondes désignant 10 transcrits mRNA différents d'un contrôle interne, "Spike-in", sont répliquées 30 fois dans ces puces. Chaque puce est formée de quatre chambres de 44k chaqu'une (41000 sondes pour les transcrits et 3000 pour le "Spike-in").

La technique fait appel à une hybridation ADN-ARN. Mais ici, et contrairement à d'autres
biopuces (type AFFymétrix), on hybride directement avec les cRNA extraits des cellules. Ces
cRNA sont produits par transcription inverse des mRNA en cDNA simple brin. Dans un
second temps, les cDNA sont amplifiés en cRNA. Durant cette étape, ces derniers sont marqués avec le fluorochrome cy3 puis hybridés sur la puce. Après lavage et acquisition de l'image d'hybridation, le signal fixé sur chaque cible est détecté, quantifié et enregistré de façon automatique grâce à des logiciels d'analyse. Ce signal reflète la concentration de la séquence correspondante dans la sonde, donc le niveau d'expression du gène concerné. Les intensités obtenues sont ensuite normalisées par rapport à un contrôle interne d'ARN, "Spike-In", qui possède des sondes fixées sur la puce. Ceci permet de dresser, pour chaque échantillon, un véritable portrait moléculaire qui pourrait alors être comparé à celui d'autres échantillons.

## 3.4. RT-PCR semi quantitative et PCR en temps réel (qPCR)

### 3.4.a. Transcription inverse (RT)

Cette technique permet d'obtenir, à partir d'un ARN, le brin d'ADN complémentaire (ADNc). Dans toutes nos PCR et PCR en temps réel, nous avons utilisés entre 300 et 500 ng d'ARN totaux. Après une digestion à la DNase, les ART totaux (8 µl), 1 µl d'amorce oligo (dT₂₀) à 10 µM (1,5 µM final), 1 µl de dNTPs Mix à 10 mM, à une concentration de 0,5 mM chacun, 4 µl de tampon de l'enzyme 5X (fisrt strand buffer), 2 µl de DTT à 0,1 M (10 mM final) ainsi que 1 µl (soit 200 U) de transcriptase réverse SuperScript II RT (Invitrogen) sont incubés 50 minutes à 42°C puis 15 minutes à 70°C afin d'inactiver la transcriptase réverse. Dans la mesure du possible, les échantillons sont utilisés en PCR tout de suite après.

### 3.4.b. PCR semi quantitative

La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier *in vitro* une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l'étudier. Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d'une matrice d'ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l'amplification est donc exponentielle. Pour avoir réplication d'un ADN double brin, il faut agir en trois étapes.
(1) Il faut dénaturer l'ADN pour obtenir des matrices simple brin ; (2) borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l'aide d'oligonucléotides amorces spécifiques ; (3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin.

La PCR semi quantitative est réalisée avec un kit de Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen). Les amorces utilisées sont dessinées à l'aide du logiciel
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi). Ces amorces sont utilisées pour
amplifier des fragments de 260 à 800 pb (tableaux 4 et 5). La normalisation est effectuée avec
le niveau de transcrit β-Actine.

<table><caption>**Tableau 4 : Amorces des gènes de la voie de réplication d'ADN et de l'IL-24 utilisées pour la PCR semi quantitative.**</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Séquence</td><td>Tm</td><td>Longueur</td></tr></thead><tbody><tr><td>POLE2 F</td><td>GGGCGCTCTCCGCCTTCAAG</td><td>57°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>POLE2 R</td><td>GCCTGTGGGTCCTCTGGTGC</td><td>57°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>FEN1 F</td><td>GCGGCTGAACGTCAGGCCAC</td><td>69°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>FEN1 R</td><td>CTTGAGCTGTGGCGGCT0TGC</td><td>69°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>PHB F</td><td>TGTGGTTGGGGAATTCATGTGGAGG</td><td>58°C</td><td>25 nucléotides</td></tr><tr><td>PHB R</td><td>ATGAGCCCAAAGGTGGCGGC</td><td>58°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC45L F</td><td>GTGTGACACCCATAGGCCAGTCAAT</td><td>60°C</td><td>25 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC45L R</td><td>CCGGGAGACTTCTCAGGGGATT</td><td>60°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC6 F</td><td>GCACTGGATGTTTGCAGGAGAGCT</td><td>60°C</td><td>24 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC6 R</td><td>CCGCCACCTGCTGTTTGCGA</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>MCM10 F</td><td>AATGGCGAGCCCGACGCATT</td><td>58°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>MCM10 R</td><td>CCGGGGAGACTTCTCAGGGGATT</td><td>58°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>IGF1 F</td><td>GACCCTTTGCGGGGCTGAGCTGGT</td><td>59°C</td><td>24 nucléotides</td></tr><tr><td>IGF1 R</td><td>CTTCTGAGTCTTGGGCATGTCAGT</td><td>59°C</td><td>24 nucléotides</td></tr><tr><td>IL-24 F</td><td>ACGGCTGGGACGGGAACCTT</td><td>57°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL-24 R</td><td>GCCCTGGGCCCCTGATACCT</td><td>57°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>β-Actin F</td><td>CTACAATGAGCTGCGTGTGGC</td><td>58°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>β-Actin R</td><td>CAGGTCCAGACGCAGGATGGC</td><td>58°C</td><td>21 nucléotides</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Tableau 5 : Amorces des gènes de la voie d'apoptose utilisées pour la PCR semi quantitative.**</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Séquence</td><td>Tm</td><td>Longueur</td></tr></thead><tbody><tr><td>CASP8 F</td><td>GGTGGAGCGGATTATATTCTCC</td><td>58°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>CASP8 R</td><td>CCAGCAGGTTCATGTCATCATC</td><td>58°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>BID F</td><td>AGGCCATGGACTGTGAGGTCAACA</td><td>54°C</td><td>24 nucléotides</td></tr><tr><td>BID R</td><td>CCATCCCATTTCTGGCTAAGCTCC</td><td>54°C</td><td>24 nucléotides</td></tr><tr><td>BAXF</td><td>CAGGGTTTCATCCAGGATCGAGC</td><td>60°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>BAX R</td><td>CACCACTGTGACCTGCTCCAGAA</td><td>60°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>COX6C F</td><td>TAAGAAGATAAAGAGGTCGATAA</td><td>62°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>COX6C R</td><td>CCTGAAGAAATTCTTTATATTCC</td><td>62°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>COX7B F</td><td>AATCGTCTCCAAGTTCGAAGCAT</td><td>50°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>COX7B R</td><td>GCCATATCTTAATGGGTACACAG</td><td>50°C</td><td>23 nucléotides</td></tr></tbody></table>

Pour un volume final de 25 µl, le mélange réactionnel est composé de : 2,5 µl de 10X PCR Buffer (1X final), 0,5 µl de 10 mM d NTP Mix (0,2 mM final chacun'un), entre 0,75 et 1,25 µl
de 50 mM MgCl₂ (selon les amorces), 0,5 µl de chaque amorce spécifique (10 µM) (0,2 µM final), 1 µl d'ADNc totaux, 0,1 µl de l'enzyme Platinum® Taq DNA Polymerase (1 U final). Le mélange est complété avec H₂O-DEPC jusqu'à 25 µl.

Le programme d'amplification est le suivant :

<table><tr><td>• Dénaturation initiale (et activation de l'enzyme)</td><td>95°C</td><td>5 minutes</td></tr><tr><td>• Amplification en trois étapes (dénaturation+hybridation+elongation)</td><td>95°C<br>Tm<br>72°C</td><td>30 secondes<br>45 secondes<br>1 minute</td><td>27-35<br>cycles</td></tr><tr><td>• Elongation finale</td><td>72°C</td><td>7 minutes</td></tr></table>

La réaction d'amplification est réalisée dans un thermocycler programmé (MasterCycler gradient, Eppendorf). Le niveau d'expression des gènes cibles est analysé en réalisant une électrophorèse en gel d'agarose à 1,5% (TAE 1X), mélangé avec du bromure d'éthidium (BET) à une concentration finale de 0,5 µM. Le BET est un agent d'intercalation couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique. Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orangée, 20 fois plus intense lorsqu'il est lié à l'ADN. La visualisation des bandes d'ADN marqués avec le BET est faite dans un Gel Doc (BioRad) sous rayonnement UV et les images sont analysées avec le logiciel Quantity One.

### 3.4.c. PCR quantitative ou en temps réel

La PCR quantitative en temps réel est réalisée pas la méthode de SsoFast™ EvaGreen (BioRad). Le mélange SsoFast™ EvaGreen Supermix contient une ADN polymérase couplée avec une protéine, Sso7d, qui se fixe sur l'ADN double brin, permettant de stabiliser l'activité de l'enzyme. Les amorces ont été dessinées sur le site de CenScript (https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer). Ces amorces sont utilisées pour amplifier des fragments de 50 à 250 pb (Tableaux 6, 7 et 8, pages suivantes). La normalisation est effectuée avec le niveau de transcript β-actine et GAPDH.

Le mélange réactionnel (15 µl en volume final) est composé de 7,5µl de SsoFast™ EvaGreen Supermix, 0,4 µl de chaque amorce spécifique à 10 µM (final de 0,25 µM), 1 µl d'ADNc (à partir de 300 ng d'ARN) et 5,7 µl d'eau ultra-pure
<table><caption>Tableau 6 : Amorces des gènes de la voie de réplication d'ADN utilisées pour la q-PCR.</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Séquence</td><td>Tm</td><td>Longueur</td></tr></thead><tbody><tr><td>POLE2 F</td><td>TACTCCTCCGGTGATAGGTTCT</td><td>49°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>POLE2 R</td><td>CTGGAATTTGCTTCCGCTTTCC</td><td>49°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>FEN1 F</td><td>GTATTGGGCAACCTCATTC</td><td>52°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>FEN1 R</td><td>CCTTGCGTTCCTTCATGTAGT</td><td>52°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC45 F</td><td>CTTGAAGTTCCCGCCTATGAAG</td><td>52°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC45 R</td><td>GCATGGTTTGCTCCACTATCTC</td><td>52°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC6 F</td><td>CCAGGCACAGGCTACAATCAG</td><td>49°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>CDC6 R</td><td>AACAGGTTACGGTTTGGACATT</td><td>49°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>MCM10 F</td><td>CAACCCCTACAGACGATTTCTC</td><td>50°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>MCM10 R</td><td>GGGTCCCCACAATTTGACCTC</td><td>50°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>IGF1 F</td><td>GGAGCTGTGATCTAAGGAGGC</td><td>53°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IGF1 R</td><td>GGACAGAGCGAGCTGACTT</td><td>53°C</td><td>19 nucléotides</td></tr><tr><td>b-Actine F</td><td>CATGTACGTTGCTATCCAGGC</td><td>55°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>b-Actine R</td><td>CTCCTTAATGTCACGCACGAT</td><td>55°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>GAPDH F</td><td>CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>GAPDH R</td><td>CCATGGTGTCTGAGCGATGT</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 7 : Amorces du gène de l'IL-24 utilisées pour la q-PCR. Parmi les 7 couples d'amorces testés, une seule couple a fonctionné (couple 7), les autres couples ont donné des résultats non spécifiques.</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Séquence</td><td>Tm</td><td>Longueur</td></tr></thead><tbody><tr><td>IL24 F1</td><td>GTC ACA ACT GCA ACC CAG TC</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R1</td><td>CGT CCA ACT GTT TGA ATG CT</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 F2</td><td>CAA CTG CAA CCC AGT CAA GAA A</td><td>62°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R2</td><td>TGC TCT CCG GAA TAG CAG AAA</td><td>62°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 F3</td><td>ATG CAA CAC CAC ATC AGG AT</td><td>59°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R3</td><td>CAA CCG CTT GTC TTC ACA GA</td><td>59°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 F4</td><td>ACG GCT GGG ACG GGA ACC TT</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R4</td><td>GCC CTG GGC CCC TGA TAC CT</td><td>60°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 F5</td><td>TTT CAA CAG AGG CTG CAA AGC</td><td>56°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R5</td><td>GCA CAA CCA TCT GCA TTT GAG A</td><td>56°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 F6</td><td>TAG CGG CCG CAT GAA TTT TCA ACA GAG G</td><td>58°C</td><td>28 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R6</td><td>TAG CGG CCG CTC ACA GCT TGT AGA ATT T</td><td>58°C</td><td>28 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 F7</td><td>CAG ACC CTT CTG CCC TCC TTT G</td><td>61°C</td><td>22 nucléotides</td></tr><tr><td>IL24 R7</td><td>CAA GGG CTT TGG TCA GAG CTG C</td><td>61°C</td><td>22 nucléotides</td></tr></tbody></table>

Le programme d'amplification est le suivant :

<table><tbody><tr><td>• Dénaturation initiale (et activation de l'enzyme)</td><td>95°C</td><td>2 minutes</td></tr><tr><td>• Amplification en deux étapes (dénaturation, hybridation+elongation)</td><td>95°C<br>Tm</td><td>15 secondes<br>45 secondes</td><td>35-40<br>cycles</td></tr><tr><td>• Courbe de fusion (Melting Curve) (20 minutes)</td><td>95°C<br>Tm<br>95°C</td><td>15 secondes<br>15 secondes<br>15 secondes</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Tableau 8 : Amorces des gènes de la voie d'apoptose utilisées pour la q-PCR.</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Séquence</td><td>Tm</td><td>Longueur</td></tr></thead><tbody><tr><td>CASP8 F</td><td>TTTCTGCCTACAGGTTCCACT</td><td>48°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>CASP8 R</td><td>CCTCAATTCTGATCTGCTCACTT</td><td>48°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>BID F</td><td>CCTTGCTCCGTGATGTCTTTC</td><td>53°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>BID R</td><td>GTAGGTGCGTAGGTTCTGGT</td><td>53°C</td><td>20 nucléotides</td></tr><tr><td>BAXF</td><td>CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG</td><td>52°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>BAX R</td><td>CCAGCCCATGATGGTTCTGAT</td><td>53°C</td><td>21 nucléotides</td></tr><tr><td>COX6C F</td><td>CCAAAACCTCGGATGCGTG</td><td>56°C</td><td>19 nucléotides</td></tr><tr><td>COX6C R</td><td>AAATCTGCGTATGCCTTCTTTCT</td><td>560°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>COX7B F</td><td>CTTGGTCAAAAGCGCACTAAATC</td><td>57°C</td><td>23 nucléotides</td></tr><tr><td>COX7B R</td><td>AAAATCAGGTGTACGTTTCTGGT</td><td>57°C</td><td>23 nucléotides</td></tr></tbody></table>

**Analyse** : l'appareil de PCR en temps réel « Realplex² » (Eppendorf) est un thermocycler rapide (à air pulsé), couplé à un microspectrofluorimètre. Il est piloté par un ordinateur qui permet l'acquisition et le suivi en temps réel des données. L'EvaGreen est un fluorophore capable de se lier à l'ADN double brin et devient alors fluorescent. Contrairement au Syber Green I, l'EvaGreen présente une très faible inhibition de la PCR, ce qui en fait un choix idéal pour les protocoles de qPCR rapides.

Pendant la réaction de polymérisation et à chaque cycle d'amplification, l'EvaGreen se lie à l'ADN nouvellement synthétisé. La fluorescence est mesurée à la fin de l'étape d'élongation et augmente donc à chaque cycle d'amplification. Le tracé de l'intensité de fluorescence en fonction du nombre de cycles représente une courbe sigmoïde (figure 26, page suivante). Au cours de la phase exponentielle, la fluorescence est proportionnelle à la quantité d'ADN synthétisée et permet de quantifier la quantité d'ADNc initiale et donc celle du messager d'intérêt. Le cycle de PCR significatif est celui où le signal sort du bruit de fond, appelé Ct (pour cycle threshold), déterminé par l'appareil.

Pour nos expériences, nous avons choisi une quantification relative selon la méthode de Pfaffl (Pfaffl, 2001). Des PCR effectuées en utilisant différentes dilutions d'ADNc (1/1, 1/10, 1/100) permettant d'obtenir la pente (slope) de la courbe Ct=f(log(concentration)) donnée par l'appareil (figure). La formule $E=10^{(-1/pente)}$ permet de calculer l'efficacité E de la PCR pour chaque gène étudié. Le ratio du taux de messagers du gène d'intérêt « traité » par rapport au « contrôle » et normalisé par rapport au gène de référence se calcule selon la formule suivante (page suivante):
<table><thead><tr><th></th><th>Gène de normalisation</th><th></th><th>gène d'intérêt</th></tr></thead><tbody><tr><td>Standard</td><td>Ct<sub>1</sub></td><td>Ct<sub>2</sub></td><td></td></tr><tr><td>Recherché</td><td>Ct<sub>a</sub></td><td>Ct<sub>b</sub></td><td></td></tr></tbody></table>

$$ \Delta Ct_{\text{gène de normalisation, standard}} = Ct_{1} - Ct_{1} = 0 $$

$$ \Delta Ct_{\text{gène d'intérêt, standard}} = Ct_{2} - Ct_{2} = 0 $$

$$ \Delta Ct_{\text{gène de normalisation, rechercé}} = Ct_{1} - Ct_{a} $$

$$ \Delta Ct_{\text{gène d'intérêt, rechercé}} = Ct_{2} - Ct_{b} $$

$$ \text{Ratio}_{\text{standard}} = \frac{(E_{\text{gène d'intérêt}})^{(Ct_2 - Ct_1)}}{(E_{\text{gène de normalisation}})^{(Ct_1 - Ct_2)}} = 1 $$ $$ \text{Ratio}_{\text{recherché}} = \frac{(E_{\text{gène d'intérêt}})^{(Ct_2 - Ct_1)}}{(E_{\text{gène de normalisation}})^{(Ct_1 - Ct_2)}} = 1 $$

<table><thead><tr><th>Pos</th><th>Name</th><th>Ct</th><th>Copies</th></tr></thead><tbody><tr><td>C1</td><td>0 il24 1/1</td><td>16,49</td><td>1</td></tr><tr><td>C3</td><td>0 il24 1/10</td><td>19,85</td><td>0,1</td></tr><tr><td>C5</td><td>0 il24 1/100</td><td>23,22</td><td>1,00E-02</td></tr><tr><td>C7</td><td>0 il24 1/1000</td><td>26,99</td><td>1,00E-03</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Slope: -3.267

Y-Intercept: 16.92

Efficiency: 1.02

R²: 0.986

<caption>**Figure 26 :** Détermination du Ct et de l'efficacité. La fluorescence est mesurée à chaque cycle d'amplification. La courbe, représentant la fluorescence (F1) en fonction du nombre de cycles, dessine une sigmoïde (en haut). Le logiciel du Realplex² calcule le cycle à partir duquel la fluorescence sort du bruit de fond (Ct). A partir d'une gamme de dilution, le logiciel détermine la pente (Slope) de la droite représentant le nombre de cycles en fonction du logarithme de la concentration (en bas). Cette étape permet de calculer l'efficacité de la PCR pour chacun des couples d'amorces.</caption>
Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de fusion (Tf) spécifique, définie comme étant la température à laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin. Après le dernier cycle de PCR, la température est rapidement élevée à 95°C pour dénaturer l'ADN double brin, puis elle est abaissée jusqu'à la température d'hybridation des amorces, ce qui provoque l'hybridation de la totalité des brins d'ADN. La température est ensuite élevée lentement à 95°C. La fluorescence est mesurée en continu pendant cette remontée de la température. Lorsque la température atteint la température de fusion, les brins se dissocient, ce qui se traduit par une courbe sigmoïde (figure 27). La dérivée première négative de la fluorescence en fonction de la température est calculée par le logiciel et permet de déterminer la température de fusion du brin d'ADN polymérisé, qui correspond à la température atteinte au maximum du pic (figure 27).

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

**Figure 27 :** Détermination de la température de fusion. Après la déshybridation (95°C) puis l'hybridation (60°C) de la totalité des brins d'ADN, la température augmente lentement de 60°C à 95°C. Pendant cette élévation de température, la fluorescence, mesurée en continu, diminue progressivement et lentement (en bas). Lorsque la température atteint la température de fusion des fragments amplifiés, ils se déshybrident massivement, sur la totalité de leur longueur. Le logiciel du Realplex² calcule le pourcentage de la dérivée – d(I)/dT, avec I= intensité de fluorescence (en haut). La courbe obtenue montre un pic dont le maximum correspond à la température de fusion du brin amplifié (Tf). Le fait de n'avoir qu'un seul pic permet de s'assurer de la présence d'un seul produit d'amplification. Le tracé de couleur rose rectiligne représente le pourcentage d'un seuil (Threshold) donné automatiquement par la machine (33%). Il est obtenu dans le contrôle négatif contenant le mélange des réactifs de la PCR sans ADNc (blanc).
# 4 Quatrième partie : Etude de l'expression des protéines
(Western Blot)

## 4.1. Préparation des échantillons

### 4.1.a. Extraction des protéines

Les cellules (5.10⁶/ml) en culture sont centrifugées à 400 g pendant 5 minutes puis lavées avec 5 ml du PBS (1X). Les culots secs sont ensuite stockés à -80°C, jusqu'au jour de l'extraction des protéines, ou bien repris directement avec 200 µl d'une solution contenant un tampon de lyse (préparé au labo) et un inhibiteur de protéase (Roche). Les échantillons sont incubés sur la glace en vortexant régulièrement pendant 30 minutes. Puis ils sont centrifugés pendant 30 minutes à 16000g et à 4°C. Les surnageants (contenant les protéines) sont finalement récupérés dans des nouveaux tubes de 0,5 ml et mis à -20°C en attendant le dosage des protéines.

### 4.1.b. Dosage des protéines (Méthode de Bradford ou Bleu de Coomassie)

Cette méthode est un dosage colorimétrique, basé sur le changement d'absorbance (la mesure se fait à 595 nm), se manifestant par le changement de la couleur du bleu de Coomassie après liaison (complexation) avec les acides aminées aromatiques (tryptophane, tyrosine et phénylalanine) et les résidus hydrophobes des acides aminés présents dans la ou les protéines. Ce changement est proportionnel à la quantité de colorant lié, indiquant donc la concentration en protéines dans l'échantillon.

Pour doser les protéines, une gamme d'étalon de BSA est préparée à partir d'une solution mère à 2 µg/µl. 30 µl de chaque concentration sont déposés dans une plaque de 96 puits à fond plat, puis mélangés avec 200 µl de réactif de Bradford (chaque dépôt se fait en duplicate). De la même façon, 3 µl d'extrait protéique sont dilués dans 27 µl d'H₂O ultra pure, mélangés avec 200 µl de réactif de Bradford puis déposés dans la plaque. Les densités optiques (DO) des puits sont ensuite mesurées dans un lecteur (Wallac, VICTOR²). Les DO de la gamme d'étalon sont utilisées pour établir la droite de régression et déterminer