# Utilisation d'un gène marqueur pour la recherche de plantes haploïdes de pommier : comparaison entre pollinisation manuelle et pollinisation par les abeilles

Yves Lespinasse, Elisabeth Chevreau

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Yves Lespinasse, Elisabeth Chevreau. Utilisation d'un gène marqueur pour la recherche de plantes haploïdes de pommier : comparaison entre pollinisation manuelle et pollinisation par les abeilles. Vème Symposium International sur la Pollinisation, Sep 1983, Versailles, France. hal-01600727

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Submitted on 4 Jun 2020

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# Utilisation d'un gène marqueur pour la recherche de plantes haploïdes de pommier : comparaison entre pollinisation manuelle et pollinisation par les abeilles

Y. LESPINASSE et Elisabeth CHEVREAU

INRA, Station d'Arboriculture fruitière
Beaucouzé, 49000 Angers, France

## RESUME

La sélection de plantes haploïdes de Pommier issues de gynogénèse in vivo est effectuée après pollinisation de variétés cultivées par un hybride porteur d'un gène marqueur. Les descendants qui échappent au marquage génétique sont à priori d'origine maternelle, parthénogenétiques : certains se sont révélés haploïdes, d'autres diploïdes. La pollinisation a été effectuée soit manuellement, soit grâce à des abeilles placées dans des cages d'isolement. La pollinisation par les abeilles conduit à un excès de plantes de phénotype maternel. Parmi les hypothèses explicatives avancées, nous démontrons l'apport de pollen étranger par les abeilles : une partie au moins des plantes étudiées est donc hybride et non d'origine maternelle. Il est ainsi nécessaire de contrôler les abeilles avant leur introduction en cage d'isolement. Un protocole d'expérience pour déterminer la durée du contrôle est proposé.

## SUMMARY

### SELECTION OF HAPLOID PLANTS IN APPLE BY USE OF A MARKER GENE : POLLINATION BY-HAND AND BY HONEY BEES ARE COMPARED.

Haploïd apple produced by in vivo gynogenesis were selected after pollination of cultivated varieties by a hybrid carrying a marker gene. The unmarked seedlings, were mainly of maternal origin, parthenogenetic : some were haploid, others diploid. Pollination was either by hand, or by honeybees inside an isolation cage. Most plants resulting after honeybees pollination had the maternal phenotype. Among hypotheses explaining this result, we demonstrated that honeybees carried viable pollen collected the previous day in the open : some of the plants were therefore hybrids and not of maternal origin. It is also necessary to control the bees before their introduction into the isolation cage. An experiment is proposed to determine how long pollen remains viable on the bodies of honeybees.

## INTRODUCTION

Les premières plantes haploïdes de Pommier ont été obtenues par gynogénèse in vivo. La méthode utilisée a déjà été décrite ainsi que les résultats obtenus (LESPINASSE et GODICHEAU, 1980 ; LESPINASSE et al., 1982). Nous disposons d'un clone dont la couleur pourpre (feuilles, tiges et fruits) est sous le contrôle d'un gène dominant R à l'état homozygote ; nous avons pollinisé des variétés à phénotype vert (de génotype rr) avec le clone RR. Tous les descendants hybrides sont théoriquement pourpres ; toutefois certains sont de phénotype vert, à priori donc, d'origine maternelle. Parmi ces plants à phénotype vert, nous avons décelé quelques haploïdes issus de parthénogénèse.
Les premiers croisements ont été réalisés par l'intermédiaire d'abeilles placées sous la cage d'isolement en présence du pollinisateur (arbre en pot). Par la suite, une comparaison entre pollinisation manuelle et pollinisation par les abeilles a été réalisée. Cette comparaison montre que les 2 traitements ne conduisent pas à des résultats équivalents exprimés en pourcentages de plantes à phénotype vert. L'objet de cette note est de discuter les différences ainsi observées.

# 1. PRINCIPAUX RESULTATS ILLUSTRANT LES DIFFERENCES OBSERVEES

La pollinisation par les abeilles s'effectue en disposant sous la cage d'isolement une ruchette prélevée le matin même chez l'apiculteur ; ce traitement est dénommé par la suite, "ruche non contrôlée". En effet les abeilles ont pu butiner la veille des fleurs de pommier ; bien que l'apiculteur habite une zone dépourvue de vergers de pommiers, la présence de quelques arbres isolés chez des particuliers est inévitable. Quoiqu'il en soit, les travaux de KRAAI (1962) effectués sur un grand nombre d'espèces florales et légumières, indiquent clairement que les abeilles ayant séjourné 12 heures dans la ruche ne sont plus porteuses de pollen capable de germer. En conséquence et en appliquant ces résultats au pommier, les abeilles du traitement "ruche non contrôlée" sont théoriquement vierges de tout pollen apte à féconder la variété à phénotype vert.

Le traitement manuel (pollinisation au doigt après castration des fleurs) s'effectue aussi sous cage d'isolement dans des conditions donc extrêmement voisines.

Les différences entre les 2 traitements sont bien sûr l'absence de castration pour le traitement abeilles (ce qui implique des risques d'autofécondations conduisant à des plantes à phénotype vert) et la durée de la pollinisation : les abeilles restent en moyenne 1 semaine sous cage.

Le tableau 1 illustre les résultats obtenus après pollinisation en 1981 et étude des descendances en serre en 1982.

La différence entre les 2 traitements exprimée en p.1 000 d'individus à phénotype vert est tout-à-fait concluante : le traitement "ruche non contrôlée" conduit à un excès de ces plantes par rapport à la pollinisation manuelle. On sait toutefois, bien que le pommier soit une espèce auto-incompatible, que certaines variétés peuvent produire quelques pépins après autofécondation d'un grand nombre de fleurs. Il était donc important de répéter l'expérience avec une variété réputée pour son auto-incompatibilité stricte ; c'est le cas de 'Early Red One' et de
'Topred', mutants appartenant au groupe 'Delicious'. D'autre part, nous avons pris soin d'introduire un troisième traitement "ruche contrôlée" ; cette ruchette provenant du même apiculteur a séjourné une semaine en chambre froide à 5°C et à !'obscurité avant d'être introduite dans la cage d'isolement.

Le tableau 2 montre les résultats obtenus avec la variété 'Early Red One' en 1982 et 1983 et la variété 'Topred' en 1977 pour le traitement "ruche non contrôlée" uniquement. On peut faire les observations suivantes :

- le traitement "pollinisation manuelle" conduit à des résultats identiques en 1982 et 1983.

- le traitement "ruche non contrôlée" fait apparaître des variations assez importantes d'une année à l'autre : 49, 14 et 98 % dans le cas de 'Topred'. Il existe donc bien un effet dû à la ruche.

- le traitement "ruche contrôlée" étudié une seule année (1983) ramène le nombre de plantes à phénotype vert proche de celui obtenu par pollinisation manuelle : l'effet ruche pourrait être un apport de pollen étranger.

La variation suivant les années, observée lors du traitement "ruche non contrôlée" peut s'expliquer par la quantité plus ou moins importante de pollen de Pommier capable de germer et récolté la veille de l'introduction en cage d'isolement. Ces résultats remettent en cause bien sûr ceux de KRAAI (1962).

## 2. DISCUSSION CONCERNANT L'ORIGINE DES PLANTES A PHENOTYPE VERT.

Plusieurs hypothèses peuvent être avancées quant à l'origine des plantes à phénotype vert.

### 2.1. Hypothèses communes à la pollinisation manuelle et pollinisation par les abeilles.

- la parthénogénèse haploïde : les plantes haploïdes ont été trouvées aussi bien par pollinisation manuelle que par pollinisation par les abeilles.

- la parthénogénèse diploïde : c'est une hypothèse à considérer dans le cas des plantes diploïdes ; on peut invoquer la formation de noyaux de restitution soit après la 1ère division ou la 2ème division de la méiïose.

- un mauvais fonctionnement du gène marqueur R. Les plantes ne seraient plus d'origine maternelle mais hybrides.
## 2.2. Hypothèses propres à la pollinisation par les abeilles.

- l'autofécondation : cela peut être possible du moins chez les variétés dont l'auto-incompatibilité n'est pas stricte (les variétés 'Early Red One' et 'Topred' sont strictement auto-incompatibles). Toutefois, le mélange de pollen compatible et incompatible, ou plus précisement l'effet pionnier du pollen compatible (VISSER et al., 1982 et 1983) peut favoriser la croissance de l'auto-pollen et parfois la fécondation.

- l'apport de pollen étranger : c'est une hypothèse confortée par les expériences relatées.

## 3. CONCLUSION

Il est vraisemblable qu'une seule hypothèse ne peut expliquer la totalité des plantes à phénotype vert. Toutefois le traitement "abeilles non contrôlées" comparé au traitement "abeilles contrôlées" nous permet d'affirmer que l'apport de pollen étranger peut au moins en partie expliquer la différence entre pollinisation manuelle et pollinisation par les abeilles.

La technique d'analyse isoenzymatique par électrophorèse doit permettre d'établir l'origine de ces individus. Ce travail est en cours.

Enfin, il sera possible de vérifier l'hypothèse d'apport de pollen étranger par l'expérience décrite dans la figure 1. Après avoir butiné 2 jours sous cage d'isolement l'hybride porteur du gène marqueur R, la ruche A sera transférée sous un arbre à phénotype vert, 12 heures après (1 nuit) ; la ruche B séjournera en chambre froide durant 60 heures avant d'être placée sous la même variété à phénotype vert. La présence et la différence en pourcentage des hybrides à phénotype pourpre permettra de conclure.

## REMERCIEMENTS

Les auteurs remercient vivement Monsieur DENECHAUD, apiculteur à Andard (Maine et Loire), pour la fourniture des ruchettes.

## REFERENCES

KRAAI A., 1962. How long do honey-bees carry germinable pollen on them ? Euphytica 11 : 53-56.

LESPINASSE Y., GODICHEAU M., 1980. Création et description d'une plante haplotype de Pommier (Malus pumila Mill.). Ann. Amélior. Plantes, 30 (1) : 39-44.
LESPINASSE Y., GODICHEAU M., DURON M., 1983. Potential value and method of producing haploids in the apple tree, *Malus pumila* (Mill.). Acta Horticulturae, 131 : 223-230.

VISSER T., OOST E.H., 1982. Pollen and pollination experiments. V. An empirical basis for a mentor pollen effect observed on the growth of incompatible pollen tubes in pear. Euphytica, 31 : 305-312.

VISSER T. et al., 1983. Pollen and pollination experiments. VIII. The effect of successive pollinations with compatible and self-incompatible pollen in apple and pear. Euphytica, 32 : 57-64.

Figure 1

Protocole d'expérience permettant de conclure quant à l'apport de
pollen étranger par les abeilles non contrôlées.

<figure><img src="image_2.png" /></figure>
<table><caption>**Tableau 1** - Comparaison des descendances obtenues après pollinisation manuelle et le traitement "ruche non contrôlée".</caption><thead><tr><th>Traitement</th><th>Pollinisation manuelle</th><th>Ruche non contrôlée</th></tr></thead><tbody><tr><td>Croisement</td><td>Pi x RR*<br>(6 descendances 1982)</td><td>P'i x RR<br>(4 descendances 1982)</td></tr><tr><td>Nombre de plantes observées (a)</td><td>9961</td><td>3327</td></tr><tr><td>Nombre de plantes à phénotype vert (b)</td><td>30 **</td><td>220</td></tr><tr><td>Fréquence en p.1000 (c)</td><td>3 %o</td><td>66 %o</td></tr></tbody></table>

* Pi et P'i : différentes variétés à phénotype vert.

RR : hybride TNR 31-35 à génotype homozygote
RR codant pour la couleur pourpre.

** dont plantes haploïdes.

<table><caption>**Tableau 2** - Comparaison des traitements "pollinisation manuelle", "ruche non contrôlée" et "ruche contrôlée".</caption><thead><tr><th>Croisement</th><th></th><th>Early 1982</th><th>Red One x RR 1983</th><th>Topred x RR 1977</th></tr></thead><tbody><tr><td>Traitement :</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pollinisation manuelle</td><td>(a)</td><td>1 120</td><td>1 914</td><td></td></tr><tr><td></td><td>(b)</td><td>2**</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>(c)</td><td>2%o</td><td>2%o</td><td></td></tr><tr><td>Ruche non contrôlée</td><td>(a)</td><td>385</td><td>1 468</td><td>1 243</td></tr><tr><td></td><td>(b)</td><td>19</td><td>21</td><td>122**</td></tr><tr><td></td><td>(c)</td><td>49%o</td><td>14%o</td><td>98%o</td></tr><tr><td>Ruche contrôlée</td><td>(a)</td><td>-</td><td>1 627</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td>(b)</td><td></td><td>11</td><td></td></tr><tr><td></td><td>(c)</td><td></td><td>7%o</td><td></td></tr></tbody></table>

(a), (b), (c) : cf légendes tableau 1.

** : dont plantes haploïdes.