# Isolation of trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of Carthamus tinctorius L.

Andrzej Patyra, Marcin Kolakowski, Marta Dudek, Anna Kiss

► To cite this version:

Andrzej Patyra, Marcin Kolakowski, Marta Dudek, Anna Kiss. Isolation of trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of Carthamus tinctorius L.. Biuletyn Wydzialu Farmaceutycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, 2022, 20 (2), pp.24-30. 10.56782/pps.39. hal-04623230

HAL Id: hal-04623230

https://hal.science/hal-04623230

Submitted on 25 Jun 2024

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
# Isolation of trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of Carthamus tinctorius L.

Andrzej Patyra, Marcin Kolakowski, Marta Dudek, Anna Kiss

► To cite this version:

Andrzej Patyra, Marcin Kolakowski, Marta Dudek, Anna Kiss. Isolation of trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of Carthamus tinctorius L.. Biuletyn Wydzialu Farmaceutycznego Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, 2022, 20 (2), pp.24-30. 10.56782/pps.39. hal-04623230

HAL Id: hal-04623230

https://hal.science/hal-04623230v1

Submitted on 25 Jun 2024

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
Original paper

# Isolation of trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of Carthamus tinctorius L.

Andrzej Patyra <fnref n="1" />,<fnref n="2" />,<fnref n="3" />*, Marcin Kołakowski <fnref n="1" />, Marta Katarzyna Dudek <fnref n="4" />, Anna Karolina Kiss <fnref n="1" />

**Abstract:** Trachelogenin 4-O-β-D-glucoside or tracheloside is a rare lignan glycoside present mostly in some plants from the *Cynarae* tribe of the *Asteraceae* family. As this lignan is also present in small amounts in the human diet, isolation and study of the pharmacological properties of this compound may bring some new insights into the role of lignans. This study aimed to isolate trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of safflower using chromatographic methods. Briefly, 339 mg of tracheloside was isolated from 500 g of plant material. The yield is sufficient for performing biological studies, thus confirming that safflower fruits are a significant source of this rare compound.

**Keywords:** Carthamus tinctorius, lignans, isolation, tracheloside, trachelogenin

Article is published under the CC BY license.

## 1. Wstęp

Krokosz barwierski (*Carthamus tinctorius* L.) jest rośliną jednoroczną należącą do rodziny astrowatych (*Asteraceae*), dorastającą do 130 centymetrów wysokości, posiadającą białożółte, błyszczące, krzaczaste, wyprostowane i cylindryczne łodygi, klasyfikowane jako podstawowe, drugo- i trzeciorzędowe, które są zakończone kulistymi główkami. Zielone, miękkie liście są ułożone naprzemiennie, mają jajowaty lub jajowato-lancetowaty kształt, mogą być gładkie lub pokryte licznymi kolcami. Obupłciowe kwiaty o budowie rurkowatej, promienistej, występują na szczytach łodyg, są barwy pomarańczowej lub czerwono-pomarańczowej, ściśle otoczone przylistkami i kolczastymi wypustkami. *C. tinctorius* owocuje tworząc białe, błyszczące i gładkie owoce, zwane niełupkami, mogą być pokryte włoskami. Korzeń krokosza barwierskiego jest cienki, wrzecionowaty z licznymi korzeniami bocznymi, może osiągać długość do 2-3 metrów w zależności od dostępności wody [1,2].

W czasach prehistorycznych był uprawiany na terenach dzisiejszych Chin, Indii, Iranu i Egiptu. W Tajlandii wodny ekstrakt z kwiatów był stosowany do koloryzacji głosów. W średniowieczu nastąpił początek upraw krokosza barwierskiego na terenie Włoch, Hiszpanii oraz Francji, skąd w XX wieku został wprowadzony do upraw na terenie Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej [1]. Kwiaty omawianego gatunku posłużyły, ze względu na obecność czerwonych i pomarańczowych pigmentów, do produkcji barwników. Do komercjalizacji upraw krokosza barwierskiego przyczynił się w latach pięćdziesiątych XX wieku, rozwój przemysłu farb i lakierów, gdzie znalazł zastosowanie przy ich produkcji [3]. Gdy zaczęto stosować barwniki anilinowe w skali przemysłowej, krokosz przestał być uprawiany w celu pozyskania barwników.

Zastosowania krokosza barwierskiego w tradycyjnej medycynie perskiej były zależne od wykorzystywanej części rośliny. Kwiat, nasiona i olej z nasion były stosowane jako środek przeczyszczający, w literaturze opisano również stosowanie tych części rośliny w reumatyzmie i paraliżu. Owoc i liście wykorzystywane były jako środek przeciwbólowy, rozkurczający oraz jako odtrutka na jad skorpiona [2]. W tradycyjnej medycynie indyjskiej krokosz barwierski był stosowany w świerzbie, zapaleniu stawów i mastalgii oraz w celu zwiększenia libido [3]. W Chinach różyczki krokosza barwierskiego były szeroko stosowane w chorobach

<footnote n="1">¹ Department of Pharmacognosy and Molecular Basis of Phytotherapy, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland</footnote>

<footnote n="2">² Doctoral School, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland</footnote>

<footnote n="3">³ Institut des Biomolécules Max Mousseron, Université de Montpellier, CNRS, ENSCM, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="4">⁴ Structural Studies Department, Centre of Molecular and Macromolecular Studies, Polish Academy of Sciences, Łódź, Poland</footnote>

<footnote>* Correspondence: andrzej.patyra@wum.edu.pl</footnote>
Original paper

# Isolation of trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of Carthamus tinctorius L.

Andrzej Patyra <fnref n="1" />,<fnref n="2" />,<fnref n="3" />*, Marcin Kołakowski <fnref n="1" />, Marta Katarzyna Dudek <fnref n="4" />, Anna Karolina Kiss <fnref n="1" />

**Abstract:** Trachelogenin 4-O-β-D-glucoside or tracheloside is a rare lignan glycoside present mostly in some plants from the *Cynarae* tribe of the *Asteraceae* family. As this lignan is also present in small amounts in the human diet, isolation and study of the pharmacological properties of this compound may bring some new insights into the role of lignans. This study aimed to isolate trachelogenin 4-O-β-D-glucoside from the fruits of safflower using chromatographic methods. Briefly, 339 mg of tracheloside was isolated from 500 g of plant material. The yield is sufficient for performing biological studies, thus confirming that safflower fruits are a significant source of this rare compound.

**Keywords:** Carthamus tinctorius, lignans, isolation, tracheloside, trachelogenin

Article is published under the CC BY license.

## 1. Wstęp

Krokosz barwierski (*Carthamus tinctorius* L.) jest rośliną jednoroczną należącą do rodziny astrowatych (*Asteraceae*), dorastającą do 130 centymetrów wysokości, posiadającą białożółte, błyszczące, krzaczaste, wyprostowane i cylindryczne łodygi, klasyfikowane jako podstawowe, drugo- i trzeciorzędowe, które są zakończone kulistymi główkami. Zielone, miękkie liście są ułożone naprzemiennie, mają jajowaty lub jajowato-lancetowaty kształt, mogą być gładkie lub pokryte licznymi kolcami. Obupłciowe kwiaty o budowie rurkowatej, promienistej, występują na szczytach łodyg, są barwy pomarańczowej lub czerwono-pomarańczowej, ściśle otoczone przylistkami i kolczastymi wypustkami. *C. tinctorius* owocuje tworząc białe, błyszczące i gładkie owoce, zwane niełupkami, mogą być pokryte włoskami. Korzeń krokosza barwierskiego jest cienki, wrzecionowaty z licznymi korzeniami bocznymi, może osiągać długość do 2-3 metrów w zależności od dostępności wody [1,2].

W czasach prehistorycznych był uprawiany na terenach dzisiejszych Chin, Indii, Iranu i Egiptu. W Tajlandii wodny ekstrakt z kwiatów był stosowany do koloryzacji głosów. W średniowieczu nastąpił początek upraw krokosza barwierskiego na terenie Włoch, Hiszpanii oraz Francji, skąd w XX wieku został wprowadzony do upraw na terenie Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej [1]. Kwiaty omawianego gatunku posłużyły, ze względu na obecność czerwonych i pomarańczowych pigmentów, do produkcji barwników. Do komercjalizacji upraw krokosza barwierskiego przyczynił się w latach pięćdziesiątych XX wieku, rozwój przemysłu farb i lakierów, gdzie znalazł zastosowanie przy ich produkcji [3]. Gdy zaczęto stosować barwniki anilinowe w skali przemysłowej, krokosz przestał być uprawiany w celu pozyskania barwników.

Zastosowania krokosza barwierskiego w tradycyjnej medycynie perskiej były zależne od wykorzystywanej części rośliny. Kwiat, nasiona i olej z nasion były stosowane jako środek przeczyszczający, w literaturze opisano również stosowanie tych części rośliny w reumatyzmie i paraliżu. Owoc i liście wykorzystywane były jako środek przeciwbólowy, rozkurczający oraz jako odtrutka na jad skorpiona [2]. W tradycyjnej medycynie indyjskiej krokosz barwierski był stosowany w świerzbie, zapaleniu stawów i mastalgii oraz w celu zwiększenia libido [3]. W Chinach różyczki krokosza barwierskiego były szeroko stosowane w chorobach

<footnote n="1">¹ Department of Pharmacognosy and Molecular Basis of Phytotherapy, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland</footnote>

<footnote n="2">² Doctoral School, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland</footnote>

<footnote n="3">³ Institut des Biomolécules Max Mousseron, Université de Montpellier, CNRS, ENSCM, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="4">⁴ Structural Studies Department, Centre of Molecular and Macromolecular Studies, Polish Academy of Sciences, Łódź, Poland</footnote>

<footnote>* Correspondence: andrzej.patyra@wum.edu.pl</footnote>
związanych z zastojem krwi, zaburzeniach miesiączkowania, a także w leczeniu ran wewnętrznych lub zewnętrznych [1]. W Korei ekstrakt z nasion *C. tinctorius* był stosowany do wzmacniania kości, zapobiegania osteoporozie i w chorobach ginekologicznych [4]. W Irańskiej medycynie ludowej był stosowany również jako lek na łuszczycę, bielactwo, owrzodzenia jamy ustnej, drętwienie kończyn, obniżonym nastroju, łysieniu, stłuczeniach z towarzyszącą opuchlizną i kolce [1-3].

W *C. tinctorius* stwierdzono obecność szeregu lignanów takich jak: arktygeniny, matairezynolu, sekoizolaricirezynolu, trachelogeniny i ich glikozydów [3]. Dla wymienionych lignanów wykazano potencjalne działanie przeciwnowtorowe, wspomagające leczenie otyłości czy neuroprotekcyjne [5]. W badaniu *in vitro* na komórkach Huh7 i HEK 293T stwierdzono, że trachelogenina zapobiega wnikaniu wirusa zapalenia wątroby typu C do komórek wątroby [6]. Wykazano hamujące działanie trachelogeniny na proliferację komórek nowotworowych w badaniu *in vitro* na komórkach HCT-116 [7]. Istnieją również doniesienia o działaniu antyestrogennym liganów. W tym kontekście potwierdzono *in vitro* aktywność trachelozydu na komórkach Ishikawa, wykazując znaczne obniżenie aktywności alkalicznej fosfatazy, porównywalne z tamoksyfenem [8]. Lignany obecne w owocach krokosza barwierskiego należą do związków obecnych w ludzkiej diecie, w szczególności w produktach mącznych i ziarnach zbóż, natomiast ze względu na ich nieznaczną zawartość (czasem wręcz śladową) istnieje potrzeba znalezienia źródła tych związków do izolacji.

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Rysunek 1.** Wzór strukturalny 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny (trachelozydu).</figcaption></figure>

Celem tej pracy było opracowanie wydajnego schematu izolacji jednego z bardziej istotnych i rzadkich w przyrodzie lignanów, 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny (trachelozydu) (Rysunek 1.), z owoców krokosza barwierskiego za pomocą metod chromatograficznych.

## 2. Materiały i Metody

Materiał badawczy stanowiło 500 g owoców krokosza barwierskiego zakupionych od Złota Rybka Ilona Bura Jarosław Bury (Ostrów Wielkopolski, Polska). Metanol (cz.d.a.), kwas mrówkowy (cz.d.a.), octan etylu (cz.d.a.), chloroform (cz.d.a.), kwas siarkowy 98% (cz.d.a.), dichlorometan (cz.d.a.), aceton (cz.d.a.) i n-heksan (cz.d.a.) zakupiono od POCh (Gliwice, Polska). Acetonitryl do chromatografii (gradient), żel krzemionkowy TLC 60G F<sub>254</sub> płytki szklane 10 x 20 cm oraz żel krzemionkowy (60-200 µm) zakupiono od Merck (Darmstadt, Niemcy). DMSO zakupiono od Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy). Diaion HP-20 zakupiono od Supelco Analytical (Bellefonte PA, USA). Wanilinę zakupiono od Veb Laborchemie (Apolda, Niemcy). Woda do HPLC była przygotowana przy użyciu systemu oczyszczającego Milli-Q Plus (Millipore, Billerica, MA, USA) (18.2 MΩ cm).

Surowiec (500 g) odtłuszczono przy pomocy 1 L n-heksanu i 3-krotnie ekstrahowano na łaźni ultradźwiękowej SONIC-5 (POLSONIC, Poznań, Polska) z wykorzystaniem 100% metanolu w 60°C przez 2 h i odparowano do sucha na wyparce rotacyjnej Rotavator R-3 (Buchi, Flawil, Szwajcaria) uzyskując 12,8 g suchego wyciągu, który scharakteryzowano fitochemicznie.
związanych z zastojem krwi, zaburzeniach miesiączkowania, a także w leczeniu ran wewnętrznych lub zewnętrznych [1]. W Korei ekstrakt z nasion *C. tinctorius* był stosowany do wzmacniania kości, zapobiegania osteoporozie i w chorobach ginekologicznych [4]. W Irańskiej medycynie ludowej był stosowany również jako lek na łuszczycę, bielactwo, owrzodzenia jamy ustnej, drętwienie kończyn, obniżonym nastroju, łysieniu, stłuczeniach z towarzyszącą opuchlizną i kolce [1-3].

W *C. tinctorius* stwierdzono obecność szeregu lignanów takich jak: arktygeniny, matairezynolu, sekoizolaricirezynolu, trachelogeniny i ich glikozydów [3]. Dla wymienionych lignanów wykazano potencjalne działanie przeciwnowtorowe, wspomagające leczenie otyłości czy neuroprotekcyjne [5]. W badaniu *in vitro* na komórkach Huh7 i HEK 293T stwierdzono, że trachelogenina zapobiega wnikaniu wirusa zapalenia wątroby typu C do komórek wątroby [6]. Wykazano hamujące działanie trachelogeniny na proliferację komórek nowotworowych w badaniu *in vitro* na komórkach HCT-116 [7]. Istnieją również doniesienia o działaniu antyestrogennym liganów. W tym kontekście potwierdzono *in vitro* aktywność trachelozydu na komórkach Ishikawa, wykazując znaczne obniżenie aktywności alkalicznej fosfatazy, porównywalne z tamoksyfenem [8]. Lignany obecne w owocach krokosza barwierskiego należą do związków obecnych w ludzkiej diecie, w szczególności w produktach mącznych i ziarnach zbóż, natomiast ze względu na ich nieznaczną zawartość (czasem wręcz śladową) istnieje potrzeba znalezienia źródła tych związków do izolacji.

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Rysunek 1.** Wzór strukturalny 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny (trachelozydu).</figcaption></figure>

Celem tej pracy było opracowanie wydajnego schematu izolacji jednego z bardziej istotnych i rzadkich w przyrodzie lignanów, 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny (trachelozydu) (Rysunek 1.), z owoców krokosza barwierskiego za pomocą metod chromatograficznych.

## 2. Materiały i Metody

Materiał badawczy stanowiło 500 g owoców krokosza barwierskiego zakupionych od Złota Rybka Ilona Bura Jarosław Bury (Ostrów Wielkopolski, Polska). Metanol (cz.d.a.), kwas mrówkowy (cz.d.a.), octan etylu (cz.d.a.), chloroform (cz.d.a.), kwas siarkowy 98% (cz.d.a.), dichlorometan (cz.d.a.), aceton (cz.d.a.) i n-heksan (cz.d.a.) zakupiono od POCh (Gliwice, Polska). Acetonitryl do chromatografii (gradient), żel krzemionkowy TLC 60G F<sub>254</sub> płytki szklane 10 x 20 cm oraz żel krzemionkowy (60-200 µm) zakupiono od Merck (Darmstadt, Niemcy). DMSO zakupiono od Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Niemcy). Diaion HP-20 zakupiono od Supelco Analytical (Bellefonte PA, USA). Wanilinę zakupiono od Veb Laborchemie (Apolda, Niemcy). Woda do HPLC była przygotowana przy użyciu systemu oczyszczającego Milli-Q Plus (Millipore, Billerica, MA, USA) (18.2 MΩ cm).

Surowiec (500 g) odtłuszczono przy pomocy 1 L n-heksanu i 3-krotnie ekstrahowano na łaźni ultradźwiękowej SONIC-5 (POLSONIC, Poznań, Polska) z wykorzystaniem 100% metanolu w 60°C przez 2 h i odparowano do sucha na wyparce rotacyjnej Rotavator R-3 (Buchi, Flawil, Szwajcaria) uzyskując 12,8 g suchego wyciągu, który scharakteryzowano fitochemicznie.
Analiza UHPLC-DAD-ESI-MS/MS została przeprowadzona na systemie ultrasprawnej chromatografii cieczowej UHPLC-3000 RS (Dionex, Dreieich, Niemcy) z detektorem diodowym (DAD) i spektrometrem mas typu pułapka jonową i interfejsem ESI AmaZon SL (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Niemcy). Rozdziału dokonano na kolumnie Zorbax SB-C18 (150 mm × 2,1 mm, 1,9 µm) (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (B) wykorzystując gradient: 0–60 min, 15–100% B. Wielkość nastrzyku wynosiła 5 µL. Eluenty z chromatografu cieczowego były wprowadzane do interfejsu ESI bez splitting i analizowane w trypie jonów ujemnych, z następującymi parametrami: ciśnienie nebulizatora – 40 psi; natężenie przepływu neutralnego gazu – 9L/min; temperatura azotu – 300°C; napięcie kapilary – 4,5 kV. Masy jonów rejestrowano w zakresie 100 do 2200 m/z. Widma UV były rejestrowane przy długości fal 200-400 nm.

Widma NMR ¹H, ¹³C i dwuwymiarowe (ROESY, COSY, HSQC, HMBC) otrzymano przy użyciu spektrometru Bruker Avance III 500 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Niemcy) odpowiednio przy częstotliwościach 500 i 126 MHz i wyposażonego w 5 mm głowicę sondy BBFO. Przesunięcia chemiczne odniesiono do sygnałów rozpuszczalnika: odpowiednio 3,31 i 49,50 ppm dla ¹H i ¹³C w metanolu-d₄.

Związki były identyfikowane lub częściowo identyfikowane na podstawie ich czasu retencji, widma UV, jonu pseudomolekularnego i jego fragmentacji, widm NMR ¹H, ¹³C i dwuwymiarowych oraz porównując powyższe dane, z danymi związków uprzednio wyizolowanymi w naszym laboratorium i/lub z danymi literaturowymi.

Analizę TLC przeprowadzono na płytach szklanych pokrytych żelem krzemionkowym 60G F₂₅₄. Płynki rozwijano w komorze pionowej wcześniej nasyconej fazą ruchomą przez co najmniej 15 minut. Odczynnikiem wywołującym był 1% roztwór waniliny w stężonym kwasie siarkowym (VI). Chromatogram wybarwiano poprzez ogranie w temperaturze 105°C. Fazą ruchomą stanowiła mieszanina dichlorometanu i metanolu (93:7).

Do izolacji wykorzystano chromatografię preparatywną (HPLC-PREP) z wykorzystaniem systemu LC20-AP (Shimadzu, Japonia). Rozdziału dokonano na kolumnie Zorbax SB-C18 (150 mm × 21,2 mm, 5 µm) (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (B) używając następującego gradientu: 0–60 min, 5–40% B. Parametry analizy: objętość nastrzyku – 400 µL; prędkość przepływu – 20 ml/min; λ₁=254 nm, λ₂=350 nm.

### 3. Wyniki

Z 500 gramów owoców krokosza otrzymano 12,8 g suchego wyciągu metanolowego, który scharakteryzowano fitochemicznie z wykorzystaniem metody UHPLC-DAD-ESI-MS/MS. W wyciągu stwierdzono obecność dwóch glukozydów lignanowych: 4-O-β-D-glukozyd trachelogeniny (RT = 15,2 min; MS = 595 m/z; UVmax λ = 227 nm, 278 nm) oraz 4-O-β-D-glukozyd matairezynolu (RT = 15,2 min; MS = 519 m/z; UVmax λ = 227 nm, 278 nm) (Rysunek 2.).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Rysunek 2. Chromatogram związków występujących w ekstrakcie metanolowym z owoców krokosza przy długości fali 280 nm.</figcaption></figure>
Analiza UHPLC-DAD-ESI-MS/MS została przeprowadzona na systemie ultrasprawnej chromatografii cieczowej UHPLC-3000 RS (Dionex, Dreieich, Niemcy) z detektorem diodowym (DAD) i spektrometrem mas typu pułapka jonową i interfejsem ESI AmaZon SL (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Niemcy). Rozdziału dokonano na kolumnie Zorbax SB-C18 (150 mm × 2,1 mm, 1,9 µm) (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (B) wykorzystując gradient: 0–60 min, 15–100% B. Wielkość nastrzyku wynosiła 5 µL. Eluenty z chromatografu cieczowego były wprowadzane do interfejsu ESI bez splitting i analizowane w trypie jonów ujemnych, z następującymi parametrami: ciśnienie nebulizatora – 40 psi; natężenie przepływu neutralnego gazu – 9L/min; temperatura azotu – 300°C; napięcie kapilary – 4,5 kV. Masy jonów rejestrowano w zakresie 100 do 2200 m/z. Widma UV były rejestrowane przy długości fal 200-400 nm.

Widma NMR ¹H, ¹³C i dwuwymiarowe (ROESY, COSY, HSQC, HMBC) otrzymano przy użyciu spektrometru Bruker Avance III 500 (Bruker BioSpin, Rheinstetten, Niemcy) odpowiednio przy częstotliwościach 500 i 126 MHz i wyposażonego w 5 mm głowicę sondy BBFO. Przesunięcia chemiczne odniesiono do sygnałów rozpuszczalnika: odpowiednio 3,31 i 49,50 ppm dla ¹H i ¹³C w metanolu-d₄.

Związki były identyfikowane lub częściowo identyfikowane na podstawie ich czasu retencji, widma UV, jonu pseudomolekularnego i jego fragmentacji, widm NMR ¹H, ¹³C i dwuwymiarowych oraz porównując powyższe dane, z danymi związków uprzednio wyizolowanymi w naszym laboratorium i/lub z danymi literaturowymi.

Analizę TLC przeprowadzono na płytach szklanych pokrytych żelem krzemionkowym 60G F₂₅₄. Płynki rozwijano w komorze pionowej wcześniej nasyconej fazą ruchomą przez co najmniej 15 minut. Odczynnikiem wywołującym był 1% roztwór waniliny w stężonym kwasie siarkowym (VI). Chromatogram wybarwiano poprzez ogranie w temperaturze 105°C. Fazą ruchomą stanowiła mieszanina dichlorometanu i metanolu (93:7).

Do izolacji wykorzystano chromatografię preparatywną (HPLC-PREP) z wykorzystaniem systemu LC20-AP (Shimadzu, Japonia). Rozdziału dokonano na kolumnie Zorbax SB-C18 (150 mm × 21,2 mm, 5 µm) (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Faza ruchoma składała się z 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie (A) i 0,1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu (B) używając następującego gradientu: 0–60 min, 5–40% B. Parametry analizy: objętość nastrzyku – 400 µL; prędkość przepływu – 20 ml/min; λ₁=254 nm, λ₂=350 nm.

### 3. Wyniki

Z 500 gramów owoców krokosza otrzymano 12,8 g suchego wyciągu metanolowego, który scharakteryzowano fitochemicznie z wykorzystaniem metody UHPLC-DAD-ESI-MS/MS. W wyciągu stwierdzono obecność dwóch glukozydów lignanowych: 4-O-β-D-glukozyd trachelogeniny (RT = 15,2 min; MS = 595 m/z; UVmax λ = 227 nm, 278 nm) oraz 4-O-β-D-glukozyd matairezynolu (RT = 15,2 min; MS = 519 m/z; UVmax λ = 227 nm, 278 nm) (Rysunek 2.).

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Rysunek 2. Chromatogram związków występujących w ekstrakcie metanolowym z owoców krokosza przy długości fali 280 nm.</figcaption></figure>
Suchy wyciąg poddano rozdziałowi z zastosowaniem chromatografii kolumnowej z wykorzystaniem Diaion HP-20 jako fazy stacjonarnej i gradientu wody i metanolu (80:0 - 100:100) jako eluentu. Otrzymano 4 frakcje, które scharakteryzowano przy użyciu metody UHPLC-DAD-ESI-MS/MS. Stwierdzono obecność obu związków lignanowych we frakcji wymytej 70% metanolem (CT-70 - 2,432 g). Ponadto we frakcji wymytej 100% metanolem zidentyfikowano aglikon arktygeninę (RT = 25,8 min; MS = 371 m/z; UVmax λ = 222 nm, 281 nm). Pełen schemat rozdziału i izolacji przedstawiono na Rysunku 3.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Rysunek 3.** Schemat izolacji 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny z owoców krokosza barwierskiego. Stworzono za pomocą BioRender (Biorender.com).</figcaption></figure>

Frakcja CT-70 została poddana dalszemu rozdziałowi na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, wymywając gradientem mieszaniny chloroformu i metanolu (100:0 - 80:20), otrzymując 38 frakcji po 60 ml, które połączono w 6 głównych frakcji na podstawie ich profilu TLC (CT-70-1 – CT-70-6). Następnie skład poszczególnych frakcji przeanalizowano metodą UHPLC-DAD-ESI-MS/MS i potwierdzono rozdział obu związków lignanowych. Obecność 4-O-β-D-glukozyd matairezynolu potwierdzono we frakcji CT-70-3 (0,774 g), natomiast 4-O-β-D-glukozyd trachelogeniny we frakcjach CT-70-4 (1,852 g) i CT-70-5 (0,625 g). Ponadto we frakcjach CT-70-1 (0,060 g) i CT-70-2 (0,196 g) stwierdzono obecność sekoizolaricirezynolu (RT = 15,0; MS = 361 m/z; UVmax λ = 218 nm, 280 nm) oraz w samej CT-70-1 śladowe ilości aglikonów trachelogeniny (RT = 22,1; MS = m/z 387 Da; UVmax λ = 220 nm, 280 nm) i matairezynolu (RT = 22,3; MS = m/z 357 Da; UVmax λ = 219 nm, 280 nm) (Rysunek 4.).

Z frakcji CT-70-4 i CT-70-5 wyizolowano przy użyciu chromatografii preparatywnej, jednorodny związek (odpowiednio 210 i 129 mg; RT = 11,75-14,00 min). Wyizolowany związek miał postać krystalicznego proszku i był barwy bladoróżowej. Jego tożsamość potwierdzono najpierw na podstawie jonu pseudomolekularnego m/z 595 [M-H+HCOOH]⁻ i jego fragmentacji - m/z 549 Da [M-H]⁻ odpowiadający odłączeniu się adduktu HCOOH, m/z 387 Da [M-H-162]⁻ odpowiadający utracie heksozy, m/z 357 Da
Suchy wyciąg poddano rozdziałowi z zastosowaniem chromatografii kolumnowej z wykorzystaniem Diaion HP-20 jako fazy stacjonarnej i gradientu wody i metanolu (80:0 - 100:100) jako eluentu. Otrzymano 4 frakcje, które scharakteryzowano przy użyciu metody UHPLC-DAD-ESI-MS/MS. Stwierdzono obecność obu związków lignanowych we frakcji wymytej 70% metanolem (CT-70 - 2,432 g). Ponadto we frakcji wymytej 100% metanolem zidentyfikowano aglikon arktygeninę (RT = 25,8 min; MS = 371 m/z; UVmax λ = 222 nm, 281 nm). Pełen schemat rozdziału i izolacji przedstawiono na Rysunku 3.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Rysunek 3.** Schemat izolacji 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny z owoców krokosza barwierskiego. Stworzono za pomocą BioRender (Biorender.com).</figcaption></figure>

Frakcja CT-70 została poddana dalszemu rozdziałowi na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, wymywając gradientem mieszaniny chloroformu i metanolu (100:0 - 80:20), otrzymując 38 frakcji po 60 ml, które połączono w 6 głównych frakcji na podstawie ich profilu TLC (CT-70-1 – CT-70-6). Następnie skład poszczególnych frakcji przeanalizowano metodą UHPLC-DAD-ESI-MS/MS i potwierdzono rozdział obu związków lignanowych. Obecność 4-O-β-D-glukozyd matairezynolu potwierdzono we frakcji CT-70-3 (0,774 g), natomiast 4-O-β-D-glukozyd trachelogeniny we frakcjach CT-70-4 (1,852 g) i CT-70-5 (0,625 g). Ponadto we frakcjach CT-70-1 (0,060 g) i CT-70-2 (0,196 g) stwierdzono obecność sekoizolaricirezynolu (RT = 15,0; MS = 361 m/z; UVmax λ = 218 nm, 280 nm) oraz w samej CT-70-1 śladowe ilości aglikonów trachelogeniny (RT = 22,1; MS = m/z 387 Da; UVmax λ = 220 nm, 280 nm) i matairezynolu (RT = 22,3; MS = m/z 357 Da; UVmax λ = 219 nm, 280 nm) (Rysunek 4.).

Z frakcji CT-70-4 i CT-70-5 wyizolowano przy użyciu chromatografii preparatywnej, jednorodny związek (odpowiednio 210 i 129 mg; RT = 11,75-14,00 min). Wyizolowany związek miał postać krystalicznego proszku i był barwy bladoróżowej. Jego tożsamość potwierdzono najpierw na podstawie jonu pseudomolekularnego m/z 595 [M-H+HCOOH]⁻ i jego fragmentacji - m/z 549 Da [M-H]⁻ odpowiadający odłączeniu się adduktu HCOOH, m/z 387 Da [M-H-162]⁻ odpowiadający utracie heksozy, m/z 357 Da
[M-H-162-30]⁻ odpowiadający utracie grupy metoksylowej i m/z 339 Da [M-H-162-48]⁻ odpowiadający jednoczesnej utracie wody i grupy metoksylowej. Zaobserwowano też charakterystyczne dla lignanów widmo UV (UVmax λ = 197 nm, 225 nm i 279 nm). Identyfikację potwierdzono analizą NMR, porównując widma ¹H, ¹³C i dwuwymiarowe z danymi literaturowymi [9].

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Rysunek 4.** Chromatogramy frakcji CT-70 rozdzielonych na żelu krzemionkowych przy długości fali 280 nm. (A) frakcja CT-70-1 z zaznaczonymi pikami odpowiadającymi sekoizolaricirezynolu, trachelogeniny i matairezynolu; (B) frakcja CT-70-2 z zaznaczonym pikiem sekoizolaricirezynolu; (C) frakcja CT-70-3 z zaznaczonym pikiem glukozydu matairezynolu; (D) frakcja CT-70-4 z zaznaczonym pikiem glukozydu trachelogeniny; (E) frakcja CT-70-5 z zaznaczonym pikiem glukozydu trachelogeniny.

### 4. Dyskusja

W owocach krokosza stwierdzano dotychczas obecność takich lignanów jak arktygenina, matairezynol, trachelogenina, sekoizolaricirezynol oraz ich glukozydów [3]. W toku analizy surowca potwierdziliśmy obecność wszystkich wyżej wymienionych aglikonów oraz glukozydów matairezynolu i trachelogeniny. Spośród wymienionych lignanów trachelogenina i jej glukozyd występują w materiale roślinnym stosunkowo rzadko. Ich obecność, oprócz w owocach krokosza, stwierdzono w łodygach *Trachelospermum* Lem. [10], w owocach *Cirsium* Mill. [11] czy *Cynara* L. [12].

Z 500 gramów surowca pozyskaliśmy łącznie 339 mg 4-O-β-D-glukozyd trachelogeniny. Zawartość tego związku w owocach krokosza nie była dotąd określona ilościowo, a izolacja najczęściej dotyczyła samego aglikonu. *Kuehnli* i *wsp.* wyizolowali 21,8 mg aglikonu trachelogeniny z 1 kg owoców [13]. W rodzaju ostrożeń (*Cirsium* Mill.) glukozyd tracheloginy występuje w owocach
[M-H-162-30]⁻ odpowiadający utracie grupy metoksylowej i m/z 339 Da [M-H-162-48]⁻ odpowiadający jednoczesnej utracie wody i grupy metoksylowej. Zaobserwowano też charakterystyczne dla lignanów widmo UV (UVmax λ = 197 nm, 225 nm i 279 nm). Identyfikację potwierdzono analizą NMR, porównując widma ¹H, ¹³C i dwuwymiarowe z danymi literaturowymi [9].

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Rysunek 4.** Chromatogramy frakcji CT-70 rozdzielonych na żelu krzemionkowych przy długości fali 280 nm. (A) frakcja CT-70-1 z zaznaczonymi pikami odpowiadającymi sekoizolaricirezynolu, trachelogeniny i matairezynolu; (B) frakcja CT-70-2 z zaznaczonym pikiem sekoizolaricirezynolu; (C) frakcja CT-70-3 z zaznaczonym pikiem glukozydu matairezynolu; (D) frakcja CT-70-4 z zaznaczonym pikiem glukozydu trachelogeniny; (E) frakcja CT-70-5 z zaznaczonym pikiem glukozydu trachelogeniny.

## 4. Dyskusja

W owocach krokosza stwierdzano dotychczas obecność takich lignanów jak arktygenina, matairezynol, trachelogenina, sekoizolaricirezynol oraz ich glukozydów [3]. W toku analizy surowca potwierdziliśmy obecność wszystkich wyżej wymienionych aglikonów oraz glukozydów matairezynolu i trachelogeniny. Spośród wymienionych lignanów trachelogenina i jej glukozyd występują w materiale roślinnym stosunkowo rzadko. Ich obecność, oprócz w owocach krokosza, stwierdzono w łodygach *Trachelospermum* Lem. [10], w owocach *Cirsium* Mill. [11] czy *Cynara* L. [12].

Z 500 gramów surowca pozyskaliśmy łącznie 339 mg 4-O-β-D-glukozyd trachelogeniny. Zawartość tego związku w owocach krokosza nie była dotąd określona ilościowo, a izolacja najczęściej dotyczyła samego aglikonu. *Kuehnli* i *wsp.* wyizolowali 21,8 mg aglikonu trachelogeniny z 1 kg owoców [13]. W rodzaju ostrożeń (*Cirsium* Mill.) glukozyd tracheloginy występuje w owocach
ilościach sięgających 26,1 mmol/kg, co w przeliczeniu daje około 10 g związku na kilogram surowca [14]. Warto przy tym jednak zwrócić uwagę, że są to wartości wyliczone na podstawie widma HPLC-UV, a nie ilości wyizolowane z surowca roślinnego. W tym kontekście owoc krokosza może być uznany za dość dobre źródło glukozydu trachelogeniny (1,2 mmol/kg; 678 mg na kg surowca), a ponadto, przez swoje przemysłowe zastosowanie, znacznie łatwiej dostępne.

Głównym wyzwaniem w izolacji było odseparowanie glukozydów trachelogeniny i matarezynolu – oba związki miały ten sam czas retencji na kolumnie RP-C18 rozwijanej gradientem wody i acetonitrylu. Pod tym względem kluczowym momentem izolacji była separacja z wykorzystaniem kolumny wypełnionej zelem krzemionkowym, co pozwoliło na skuteczny rozdział tych lignanów i izolację poszczególnych związków.

## 5. Wnioski

Owoce krokosza barwierskiego mogą stanowić wartościowe źródło 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny, a opracowana metoda izolacji tego związku pozwala na łatwe pozyskanie istotnych ilości związku do badań biologicznych.

**Wkład autorski:** Koncepcja, A.K. i A.P.; metodologia, A.P.; ekstrakcja i izolacja, M.K i A.P.; analiza fitochemiczna, A.P.; analiza NMR, M.D.; źródła, M.K. i A.P.; tekst – zasadniczy tekst manuskryptu, A.P. i M.K.; edycja tekstu manuskryptu, A.P. i A.K.; wizualizacja, A.P.; nadzór, A.P. Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.

**Podziękowania:** Marvin był używany do rysowania, wyświetlania i charakteryzowania struktur chemicznych Marvin 17.21.0, Chemaxon (https://www.chemaxon.com).

W artykule wykorzystano fragmenty pracy magisterskiej pt. „Identyfikacja i izolacja lignanów o potencjalnej aktywności biologicznej” autorstwa magistra farmacji Marcina Kołakowskiego.

Modernizacja spektrometru Bruker 500 MHz, który został wykorzystany do pomiarów NMR przeprowadzonych w tej pracy, została sfinansowana przez fundusze Unii Europejskiej w ramach Regionalnego Programu Operacyjnego Województwa Łódzkiego, RPLD.01.01.00-10-0008/18.

**Finansowanie:** Niniejsze badanie nie posiadało zewnętrznego finansowania.

**Konflikt Interesów:** Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

## Odnośniki literaturowe

1. Asgarpanah, J.; Kazemivash, N. Phytochemistry, pharmacology and medicinal properties of Carthamus tinctorius L. Chin J Integr Med 2013, 19, 153-159, doi:10.1007/s11655-013-1354-5.

2. Delshad, E.; Yousefi, M.; Sasannezhad, P.; Rakhshandeh, H.; Ayati, Z. Medical uses of Carthamus tinctorius L. (Safflower): a comprehensive review from Traditional Medicine to Modern Medicine. Electron Physician 2018, 10, 6672-6681, doi:10.19082/6672.

3. Zhang, L.L.; Tian, K.; Tang, Z.H.; Chen, X.J.; Bian, Z.X.; Wang, Y.T.; Lu, J.J. Phytochemistry and Pharmacology of Carthamus tinctorius L. Am J Chin Med 2016, 44, 197-226, doi:10.1142/s0192415x16500130.

4. Zafari, M.; Ebadi, A.; Jahanbakhsh, S.; Sedghi, M. Safflower (Carthamus tinctorius) Biochemical Properties, Yield, and Oil Content Affected by 24-Epibrassinosteroid and Genotype under Drought Stress. J Agric Food Chem 2020, 68, 6040-6047, doi:10.1021/acs.jafc.9b06860.

5. Zalesak, F.; Bon, D.J.D.; Pospisil, J. Lignans and Neolignans: Plant secondary metabolites as a reservoir of biologically active substances. Pharmacol Res 2019, 146, 104284, doi:10.1016/j.phrs.2019.104284.

6. Qian, X.J.; Jin, Y.S.; Chen, H.S.; Xu, Q.Q.; Ren, H.; Zhu, S.Y.; Tang, H.L.; Wang, Y.; Zhao, P.; Qi, Z.T.; et al. Trachelogenin, a novel inhibitor of hepatitis C virus entry through CD81. J Gen Virol 2016, 97, 1134-1144, doi:10.1099/jgv.0.000432.

7. Moura, A.F.; Lima, K.S.B.; Sousa, T.S.; Marinho-Filho, J.D.B.; Pessoa, C.; Silveira, E.R.; Pessoa, O.D.L.; Costa-Lotufo, L.V.; Moraes, M.O.; Araújo, A.J. In vitro antitumor effect of a lignan isolated from Combretum fruticosum, trachelogenin, in HCT-116 human colon cancer cells. Toxicol In Vitro 2018, 47, 129-136, doi:10.1016/j.tiv.2017.11.014.

8. Yoo, H.H.; Park, J.H.; Kwon, S.W. An anti-estrogenic lignan glycoside, tracheloside, from seeds of Carthamus tinctorius. Biosci Biotechnol Biochem 2006, 70, 2783-2785, doi:10.1271/bbb.60290.

9. Jo, A.R.; Han, H.-s.; Seo, S.; Shin, J.-S.; Lee, J.Y.; Kim, H.J.; Lee, K.-T. Inhibitory effect of moschamine isolated from Carthamus tinctorius on LPS-induced inflammatory mediators via AP-1 and STAT1/3 inactivation in RAW 264.7 macrophages. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2017, 27, 5245-5251, doi:https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2017.10.035.

10. Tan, X.Q.; Chen, H.S.; Liu, R.H.; Tan, C.H.; Xu, C.L.; Xuan, W.D.; Zhang, W.D. Lignans from Trachelospermum jasminoides. Planta Med 2005, 71, 93-95, doi:10.1055/s-2005-837761.

11. Boldizsár, I.; Kraszni, M.; Tóth, F.; Noszál, B.; Molnár-Perl, I. Complementary fragmentation pattern analysis by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography tandem mass spectrometry confirmed the precious lignan content of Cirsium weeds. J Chromatogr A 2010, 1217, 6281-6289, doi:10.1016/j.chroma.2010.08.018.

12. Graikou, K.; Kourtiri, P.M.; Zengin, G.; Gortzi, O.; Danalatos, N.; Chinou, I. Chemical Characterisation-Biological Evaluation of Greek Cultivar Cardoon Seeds (Cynara cardunculus). A By-product with Potential High Added Value. Planta Med 2021, 87, 1025-1031, doi:10.1055/a-1472-6336.
ilościach sięgających 26,1 mmol/kg, co w przeliczeniu daje około 10 g związku na kilogram surowca [14]. Warto przy tym jednak zwrócić uwagę, że są to wartości wyliczone na podstawie widma HPLC-UV, a nie ilości wyizolowane z surowca roślinnego. W tym kontekście owoc krokosza może być uznany za dość dobre źródło glukozydu trachelogeniny (1,2 mmol/kg; 678 mg na kg surowca), a ponadto, przez swoje przemysłowe zastosowanie, znacznie łatwiej dostępne.

Głównym wyzwaniem w izolacji było odseparowanie glukozydów trachelogeniny i matairezynolu – oba związki miały ten sam czas retencji na kolumnie RP-C18 rozwijanej gradientem wody i acetonitrylu. Pod tym względem kluczowym momentem izolacji była separacja z wykorzystaniem kolumny wypełnionej zelem krzemionkowym, co pozwoliło na skuteczny rozdział tych lignanów i izolację poszczególnych związków.

## 5. Wnioski

Owoce krokosza barwierskiego mogą stanowić wartościowe źródło 4-O-β-D-glukozydu trachelogeniny, a opracowana metoda izolacji tego związku pozwala na łatwe pozyskanie istotnych ilości związku do badań biologicznych.

**Wkład autorski:** Koncepcja, A.K. i A.P.; metodologia, A.P.; ekstrakcja i izolacja, M.K i A.P.; analiza fitochemiczna, A.P.; analiza NMR, M.D.; źródła, M.K. i A.P.; tekst – zasadniczy tekst manuskryptu, A.P. i M.K.; edycja tekstu manuskryptu, A.P. i A.K.; wizualizacja, A.P.; nadzór, A.P. Wszyscy autorzy przeczytali i zaakceptowali opublikowaną wersję manuskryptu.

**Podziękowania:** Marvin był używany do rysowania, wyświetlania i charakteryzowania struktur chemicznych Marvin 17.21.0, Chemaxon (https://www.chemaxon.com).

W artykule wykorzystano fragmenty pracy magisterskiej pt. „Identyfikacja i izolacja lignanów o potencjalnej aktywności biologicznej” autorstwa magistra farmacji Marcina Kołakowskiego.

Modernizacja spektrometru Bruker 500 MHz, który został wykorzystany do pomiarów NMR przeprowadzonych w tej pracy, została sfinansowana przez fundusze Unii Europejskiej w ramach Regionalnego Programu Operacyjnego Województwa Łódzkiego, RPLD.01.01.00-10-0008/18.

**Finansowanie:** Niniejsze badanie nie posiadało zewnętrznego finansowania.

**Konflikt Interesów:** Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

## Odnośniki literaturowe

1. Asgarpanah, J.; Kazemivash, N. Phytochemistry, pharmacology and medicinal properties of Carthamus tinctorius L. Chin J Integr Med 2013, 19, 153-159, doi:10.1007/s11655-013-1354-5.

2. Delshad, E.; Yousefi, M.; Sasannezhad, P.; Rakhshandeh, H.; Ayati, Z. Medical uses of Carthamus tinctorius L. (Safflower): a comprehensive review from Traditional Medicine to Modern Medicine. Electron Physician 2018, 10, 6672-6681, doi:10.19082/6672.

3. Zhang, L.L.; Tian, K.; Tang, Z.H.; Chen, X.J.; Bian, Z.X.; Wang, Y.T.; Lu, J.J. Phytochemistry and Pharmacology of Carthamus tinctorius L. Am J Chin Med 2016, 44, 197-226, doi:10.1142/s0192415x16500130.

4. Zafari, M.; Ebadi, A.; Jahanbakhsh, S.; Sedghi, M. Safflower (Carthamus tinctorius) Biochemical Properties, Yield, and Oil Content Affected by 24-Epibrassinosteroid and Genotype under Drought Stress. J Agric Food Chem 2020, 68, 6040-6047, doi:10.1021/acs.jafc.9b06860.

5. Zalesak, F.; Bon, D.J.D.; Pospisil, J. Lignans and Neolignans: Plant secondary metabolites as a reservoir of biologically active substances. Pharmacol Res 2019, 146, 104284, doi:10.1016/j.phrs.2019.104284.

6. Qian, X.J.; Jin, Y.S.; Chen, H.S.; Xu, Q.Q.; Ren, H.; Zhu, S.Y.; Tang, H.L.; Wang, Y.; Zhao, P.; Qi, Z.T.; et al. Trachelogenin, a novel inhibitor of hepatitis C virus entry through CD81. J Gen Virol 2016, 97, 1134-1144, doi:10.1099/jgv.0.000432.

7. Moura, A.F.; Lima, K.S.B.; Sousa, T.S.; Marinho-Filho, J.D.B.; Pessoa, C.; Silveira, E.R.; Pessoa, O.D.L.; Costa-Lotufo, L.V.; Moraes, M.O.; Araújo, A.J. In vitro antitumor effect of a lignan isolated from Combretum fruticosum, trachelogenin, in HCT-116 human colon cancer cells. Toxicol In Vitro 2018, 47, 129-136, doi:10.1016/j.tiv.2017.11.014.

8. Yoo, H.H.; Park, J.H.; Kwon, S.W. An anti-estrogenic lignan glycoside, tracheloside, from seeds of Carthamus tinctorius. Biosci Biotechnol Biochem 2006, 70, 2783-2785, doi:10.1271/bbb.60290.

9. Jo, A.R.; Han, H.-s.; Seo, S.; Shin, J.-S.; Lee, J.Y.; Kim, H.J.; Lee, K.-T. Inhibitory effect of moschamine isolated from Carthamus tinctorius on LPS-induced inflammatory mediators via AP-1 and STAT1/3 inactivation in RAW 264.7 macrophages. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2017, 27, 5245-5251, doi:https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2017.10.035.

10. Tan, X.Q.; Chen, H.S.; Liu, R.H.; Tan, C.H.; Xu, C.L.; Xuan, W.D.; Zhang, W.D. Lignans from Trachelospermum jasminoides. Planta Med 2005, 71, 93-95, doi:10.1055/s-2005-837761.

11. Boldizsár, I.; Kraszni, M.; Tóth, F.; Noszál, B.; Molnár-Perl, I. Complementary fragmentation pattern analysis by gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography tandem mass spectrometry confirmed the precious lignan content of Cirsium weeds. J Chromatogr A 2010, 1217, 6281-6289, doi:10.1016/j.chroma.2010.08.018.

12. Graikou, K.; Kourtiri, P.M.; Zengin, G.; Gortzi, O.; Danalatos, N.; Chinou, I. Chemical Characterisation-Biological Evaluation of Greek Cultivar Cardoon Seeds (Cynara cardunculus). A By-product with Potential High Added Value. Planta Med 2021, 87, 1025-1031, doi:10.1055/a-1472-6336.
13. Kuehnl, S.; Schroecksnadel, S.; Temml, V.; Gostner, J.M.; Schennach, H.; Schuster, D.; Schwaiger, S.; Rollinger, J.M.; Fuchs, D.; Stuppner, H. Lignans from Carthamus tinctorius suppress tryptophan breakdown via indoleamine 2,3-dioxygenase. Phytomedicine 2013, 20, 1190-1195, doi:10.1016/j.phymed.2013.06.006.

14. Szokol-Borsodi, L.; Sólyomváry, A.; Molnár-Perl, I.; Boldizsár, I. Optimum yields of dibenzylbutyrolactone-type lignans from Cynareae fruits, during their ripening, germination and enzymatic hydrolysis processes, determined by on-line chromatographic methods. Phytochem Anal 2012, 23, 598-603, doi:10.1002/pca.2360.
13. Kuehnl, S.; Schroecksnadel, S.; Temml, V.; Gostner, J.M.; Schennach, H.; Schuster, D.; Schwaiger, S.; Rollinger, J.M.; Fuchs, D.; Stuppner, H. Lignans from Carthamus tinctorius suppress tryptophan breakdown via indoleamine 2,3-dioxygenase. Phytomedicine 2013, 20, 1190-1195, doi:10.1016/j.phymed.2013.06.006.

14. Szokol-Borsodi, L.; Sólyomváry, A.; Molnár-Perl, I.; Boldizsár, I. Optimum yields of dibenzylbutyrolactone-type lignans from Cynareae fruits, during their ripening, germination and enzymatic hydrolysis processes, determined by on-line chromatographic methods. Phytochem Anal 2012, 23, 598-603, doi:10.1002/pca.2360.