# Une approche clinico-biologique intégrée pour interpréter la pathogénicité des variants du gène de la titine

Aurélien Perrin¹, Raul Juntas-Morales¹,², Mireille Cossée¹

La titine est la plus grande protéine présente dans notre organisme. L'isoforme la plus longue a un poids moléculaire de 4 200 kilodaltons. Deux filaments de titine à polarité opposée recouvrent chaque moitié du sarcomère entre le disque Z et la ligne (ou bande) M. La titine joue un rôle crucial dans le maintien de l'intégrité de la structure du sarcomère par l'intermédiaire d'interactions avec de nombreuses protéines dont la myosine, l'actine, l'alpha-actinine, les calpaïnes 1 et 3, l'obscurine, la téléthonine et bien d'autres [1].

Les titinopathies sont des pathologies en relation avec des altérations de la titine codée par le gène *TTN*. Le développement des techniques de séquençage à haut débit a permis l'identification d'un nombre important de variants du gène de la titine. Précédemment au séquençage à haut débit, presque uniquement la partie C-terminale était séquencée, ce qui explique que la majorité des phénotypes initialement décrits concerne cette seule partie du gène *TTN*. En raison de l'hétérogénéité clinique, du mode d'hérédité (qui peut être autosomique dominant [AD] ou récessif AR)), de la fréquence des variants *TTN* (1,5-3 % au sein de la population générale) et de l'absence d'outils bioinformatiques fiables pour l'interprétation de leur impact fonctionnel, il est souvent difficile de statuer quant au caractère pathogène des variants identifiés chez les patients. Les mécanismes qui sous-tendent la variabilité phénotypique et du mode d'hérédité des titinopathies sont encore mal connus. Ils impliquent les fonctions structurelles de la titine sur la formation et la stabilité du sarcomère, ainsi que ses interactions avec d'autres protéines.

En raison de la taille gigantesque de la protéine, peu d'équipes au sein de la communauté internationale, et aucune équipe française en particulier, ne proposait jusqu'ici l'analyse en *western-blot* (WB) de la titine à des fins diagnostiques. Les laboratoires de génétique moléculaire identifient par séquençage à haut débit, chez des patients atteints de myopathie, avec ou sans cardiomyopathie, un nombre important de variants *TTN* potentiellement pathogènes. Une analyse clinico-biologique intégrée est

importante afin d'évaluer la pathogénicité des variants identifiés. L'approche diagnostique consiste à évaluer, chez des patients suspects de titinopathie, les conséquences des variants *TTN* sur les transcrits, la protéine et ses interactions protéiques, puis de les corréler aux données familiales et phénotypiques. Une part de ces variants pourrait en effet affecter des domaines d'interaction à des protéines partenaires de la titine. Nous aborderons dans cet article la méthodologie et les différents aspects de la démarche diagnostique de patients suspectés de titinopathie, basée sur une approche intégrée phénotype-hérédité-génotype-transcrits-protéine regroupant :

1) les données familiales ;

2) le recueil complet des données cliniques et paracliniques ;

3) l'analyse exhaustive des données génotypiques ;

4) l'analyse des transcrits (ARNm) ;

5) l'analyse de la protéine titine en *western-blot* et éventuellement ses partenaires protéiques. Cette approche intégrée (Figure 1) permet d'améliorer la démarche diagnostique en clinique et d'approfondir les connaissances des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la variabilité de l'hérédité et du phénomène.

Les Cahiers de Myologie ont déjà abordé le sujet en 2017 (hors-série n° 1) dans un article intitulé « Pathologies musculaires liées à la titine, un domaine en émergence » par Ana Ferreiro. et J. Andoni Urtizberea [8]. Cet article résumait de façon claire et détaillée l'historique des titinopathies, leurs modes de transmission, les connaissances en 2017 de l'épidémiologie et des caractéristiques phénotypiques de ces pathologies. Nous aborderons dans le présent article l'apport de chaque élément dans notre démarche intégrée visant à étudier la pathogénicité des variants *TTN* et à améliorer ainsi le diagnostic des titinopathies (Figure 1).

## Données familiales

Les données familiales et le(s) mode(s) de transmission probable(s), autosomique dominant (AD) ou récessif (AR), sont recueillis par le médecin lors de la consultation.

**Aurélien Perrin,**
**Mireille Cossée**

Laboratoire de Génétique
Moléculaire, EA7402,
Centre Hospitalier
Universitaire de
Montpellier, Université de
Montpellier, France

**Raul Juntas Morales**

Laboratoire de Génétique
Moléculaire, EA7402,
Centre Hospitalier
Universitaire de
Montpellier, Université de
Montpellier, France
Service de Neurologie.
Centre de référence des
Maladies
Neuromusculaires AOC
(Atlantique-Occitanie-
Caraïbe) Centre
Hospitalier Universitaire
de Montpellier, France

**Contact**

aurelien.perrin@
ext.inserm.fr
<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Figure 1
Stratégie d'analyse intégrée des patients suspects de titinopathie.</figcaption></figure>

## Données phénotypiques

Les données phénotypiques (cliniques, histologiques et d'imagerie) des patients sont recueillies par le médecin lors de la consultation (Figure 2). Une analyse phénotypique détaillée est nécessaire étant donné la grande hétérogénéité des phénotypes décrits (voir article « Corrélations phénotype-génotype des titinopathies » par Raul Juntas-Morales et al., de ce même numéro des Cahiers de Myologie) en rapport avec des variants *TTN* pathogènes. La présence d'anomalies histologiques ou radiologiques évocatrices de titinopathie constitue un élément fondamental lors de l'interprétation des variants.

## Clinique

L'article de ce même numéro des *Cahiers de Myologie* écrit par le Dr Raul Juntas Morales montre l'étendue des phénotypes décrits et leurs modes de transmission. La description des atteintes peut orienter vers un type de titinopathie pouvant être déjà décrit. Cependant l'émergence de nouveaux patients porteurs de variants potentiellement pathogènes du gène *TTN* associés à des signes cliniques jusqu'alors non documentés montre que de nouveaux phénotypes sont possibles. Les connaissances actuelles à leur sujet sont encore parcellaires mais en pleine expansion.

## Histologie

L'apport de la biopsie musculaire est un élément important dans l'interprétation des variants génétiques du gène *TTN*. En rapport avec la grande hétérogénéité clinique des patients atteints de titinopathie, de nombreuses lésions histologiques sur les biopsies musculaires ont déjà été décrites. Prises individuellement, la plupart sont peu spécifiques mais le profil histologique d'une combinaison de ces lésions permet souvent d'étayer le diagnostic. Le profil évocateur de titinopathie comprend, en microscopie optique, les anomalies suivantes : une internalisation excessive des noyaux (plus de 10 % et souvent plus de 40-50 %), une prédominance des fibres de type 1, une irrégularité de la taille des fibres, et/ou une présence de minicores. En dehors de ces anomalies communes à la plupart des patients, d'autres plus spécifiques peuvent être présentes dans certaines formes de titinopathies. C'est le cas des corps cytoplasmiques retrouvés chez la plupart des patients atteints de la forme HMERF (« Hereditary Myopathy with Early Respiratory Failure »). Dans les formes congénitales décrites par l'équipe d'Ana Ferreiro, la myopathie précoce avec cardiomyopathie létale (EOMFC) [2] et la myopathie à minicores avec cardiomyopathie, des dépôts basophiles en forme d'étoiles peuvent être visualisés et
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2 Analyse des données familiales et phénotypiques.</figcaption></figure>

pourraient servir de marqueur histologique de ces formes particulièrement sévères de titinopathie. Des lésions dystrophiques modérées avec nécrose, régénération et fibrose endomysiale accompagnées de vacuoles bordées sont souvent présentes dans les formes dites TMD (« Tibial Muscular Dystrophy ») et LGMD2J (« Limb Girdle Muscular Dystrophy 2J / récemment renommée LGMDR10). Des structures de type « casquette » (cap en anglais) ont aussi été décrites dans quelques cas donnant lieu à un tableau de myopathie congénitale. Une désorganisation myofibrillaire et des agrégats de desmine et myotine peuvent également être présents et visibles en immunohistochimie (Dr. Marcorelles, résultats d'une étude multicentrique dans le cadre de la commission « Outils Diagnostiques » de la filière nationale maladies rares neuromusculaires, Filnemus). En microscopie électronique, il existe surtout des lésions avec désorganisations focales d'une largeur variable et qui

concernent habituellement toute la longueur d'un sarcomère.

### Imagerie par résonance magnétique (IRM)

Compte tenu de l'hétérogénéité phénotypique des titinopathies, il n'existe pas un pattern d'imagerie unique chez les patients concernés. Néanmoins, certains muscles sont plus régulièrement atteints dans certaines formes de titinopathie que dans d'autres. L'exemple le plus frappant est l'involution adipeuse, très évocatrice, du muscle semitendineux au niveau de la loge postérieure de la cuisse, y compris chez des patients ayant des formes distales comme les TMD et HMERF. À un niveau plus distal, les anomalies touchent principalement les muscles releveurs des pieds.

### Génotype

La présence de variant(s) déjà rapporté(s) comme pathogène(s) dans la littérature ou de deux variants
tronquants en *trans* chez un patient avec un phé-
notype clinique compatible permet de poser le dia-
gnostic de titinopathie. En revanche, il est plus dif-
ficile de confirmer le rôle pathogène d'un seul
variant tronquant devant la présence d'un phéno-
type évocateur d'une forme rapportée comme AR.
Comme le souligne Savarese *et al*. [3] un deuxième
variant peut être localisé dans une région mal cou-
verte par le NGS (mutation située dans une région
intronique profonde ou dans une des trois régions
répétées du gène *TTN*). Il est recommandé, dans
cette situation, de réaliser une étude de la protéine
par WB. Toutefois la mise en place de cette analyse
se heurte à des difficultés concernant principalement
la taille énorme de la protéine (3,8MDa) (cf. ci-des-
sous).

Les variants non tronquants (principalement faux-
sens) sont encore plus difficiles à interpréter. Étant
donné l'existence d'une grande hétérogénéité cli-
nique avec une expressivité variable aussi bien sur
le plan cardiaque que sur le plan musculaire sque-
lettique, les études de ségrégation familiale du
variant avec la pathologie peuvent ne pas être infor-
matives. Par ailleurs, les outils de prédictions bioin-
formatiques sont actuellement peu développés pour
l'analyse des variants faux-sens du gène *TTN*. Pour
y remédier, une application en ligne spécifique a été
développée récemment, appelé TITINdb [4]
(http://fraternalilab.kcl.ac.uk/TITINdb/). Elle
intègre les informations de séquence et de structure
de la protéine, ainsi que les variants déjà répertoriés
comme pathogènes. L'outil permet de visualiser la
prédiction des conséquences d'un variant sur la
structure de la titine et sur ses interactions avec
d'autres protéines, tout en tenant compte des diffé-
rentes isoformes. Il est également possible d'obtenir
des scores de prédictions génétiques comme le score
MPA (« MoBiDiC prioritization algorithm ») déve-
loppé dans notre laboratoire et accessible en ligne
(https://mobidetails.iurc.montp.inserm.fr/MD/). Il
est recommandé de vérifier les prédictions de
l'impact des variants *TTN* sur l'épissage et de les
confirmer, si possible, par des études complémen-
taires au niveau de l'ARN (cf. ci-dessous), ceci apport-
tant un argument supplémentaire de pathogénicité.
Un autre aspect à prendre en compte dans l'analyse
du génotype est le profil d'épissage des exons du
gène *TTN*. Au cours du développement, les trans-
crits du gène *TTN* subissent physiologiquement un
épissage alternatif. La forme fœtale des transcrits
titine reste encore très peu décrite notamment en
raison de la difficulté d'accès au matériel biologique

foetal. Dans le but de connaître le degré d'épissage
des différents exons au niveau du muscle squelet-
tique, Savarese et al. ont analysé en 2018 les iso-
formes de la titine par séquençage à haut débit
d'ARN (RNAseq) sur des biopsies issues de 42 sujets
[5]. Les auteurs ont constaté que certains exons
étaient épissés de manière systématique dans les
muscles squelettiques après la naissance, tandis que
d'autres l'étaient à des degrés variables [5].

Cette cartographie des exons exprimés dans la
forme squelettique adulte contribue à la prédiction
de l'impact d'un variant *TTN*.

Analyse des transcrits

L'analyse des transcrits est essentielle pour évaluer
si les ARNm porteurs d'un variant tronquant sont
dégradés par le mécanisme de NMD (Nonsens
Mediated Decay), système de dégradation des
ARNm porteurs d'un codon Stop prématuré), et
pour évaluer l'impact des variants d'épissage et des
variants faux-sens sur l'épissage (Figure 4). Ces don-
nées permettent ainsi de prédire les conséquences
au niveau de la protéine, constituant de la sorte des
éléments importants pour le diagnostic.

Une des principales difficultés de cette analyse réside
dans l'existence d'un épissage alternatif très
complexe. Raison pour laquelle il est important de
bien connaître les différentes isoformes de la pro-
téine et leur expression dans les différents tissus afin
de pouvoir réaliser une interprétation correcte de la
pathogénicité d'un variant [5, 6].

Certains variants rapportés dans la littérature sont
localisés dans les exons présents uniquement dans
le métatranscrit et absents dans l'isoforme muscu-
laire, N2A. Fernandes-Marmiesse et al. ont rap-
porté le cas d'un nouveau-né atteint d'un tableau
d'arthrogrypose multiple avec hypotonie sévère
secondaire à un variant décalant le cadre de lecture
(frameshift) homozygote dans l'exon 197
(p.(Lys12887Asnfs*6)). Cet exon n'est pas exprimé
dans les différentes isoformes connues en post-
natal. Pour les auteurs, les défauts de la protéine en
période fœtale sont responsables du tableau clinique
sévère à la naissance mais la stabilité de la maladie
après la naissance serait due à la présence d'une
protéine normale exprimée par l'isoforme N2A [7].
Dans le même ordre d'idées, sur les trente patients
atteints de titinopathie congénitale de la série récem-
ment publiée par Oates et al. dix avaient des
variants pathogènes localisés dans un exon présent
uniquement dans le métatranscrit et absents dans
l'isoforme N2A [9].
3

Génotype

- Nombre d'allèles mutés

- Type de mutation (tronquante ou non)

- Localisation dans le gène, domaine fonctionnel

Prédictions bioinformatique

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

MoBIDIC

MoBIDIC Prioritization Algorithm, a Free, Accessible, and Efficient Pipeline for Single-Nucleotide Variant Annotation and Prioritization for Next-Generation Sequencing Routine Molecular Diagnosis

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

CHU

Kevin Yauy¹, David Baux¹, Henri PEGEOT¹, Charles Van Goethem¹, Charly

Matthieu², Thomas Guignand¹, Raoul Jutten Monales¹, Delphine

Lacourt¹, Martin Krahn¹, Vilma-Lotta Lehtokantinen¹, Giusepina Bonne¹, Sylvie

Taffery-Giraud 5, Michel Koenig 5, Mireille Cossu 5

The Journal of Molecular Diagnostics Volume 3L, Issue 4, July 2018, Pages
465-473 DOI: 10.1016/j.mjod.2018.01.009

TITINdb—a computational tool to assess titin's role
as a disease gene

Anna Laddach, (Mathias Gauet), Franca Fraternali
(Bioinformatics, Volume 3L, Issue 23, 03 November 2017),
Pages 3483-3485, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btx24

The complexity of titin splicing pattern in human adult skeletal muscles

Marco Savanes¹,²,³, Per Håkan Jonsson¹,², Sanna Huvonen¹, Lars Paulus¹,

Perri Juvinen¹, Bjørn Udd¹,² and Peter Hackman¹

Skeletal Muscle (2018) 8:13 https://doi.org/10.1186/s13095-018-0156-r

Score MPA https://mobidetails.iurc.montp.inserm.fr/MD/
(SIFT, PROVEAN, Polyphen-HVAR, Polyphen-HDIV, Mutation
Taster, MetaSVM, MetaLR, LRT, FATHMM-MKL, FATHMM)

Titin database http://fraternallab.kcl.ac.uk/TITINdb/
Outils de prediction basé sur la séquence en acides
aminés (DUET-mCSM, Condell)
Préiction conséquences sur le site d'interaction
protéine-protéine (SPPIDER)

Données d'expression (RNAseq), l'exon contenant un
variant est-il exprimé dans les isoformes musculaires
squelettique ou cardiaque adultes?

Allèle 1

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Allèle 2

Nombre d'allèles mutés, impact du variant sur la structure, domaine fonctionnel?
Type variant (faux-sens, tronquant) impact sur l'épissage?

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 4
Exemple hypothétique d'une étude de transcrit(s) du gène TTN.</figcaption></figure>

Analyse de la protéine

Un variant décalant le cadre de lecture (variant non-
sens, ou frameshift en anglais) aura pour consé-
quence la synthèse d'une protéine tronquée dont il

faudra évaluer si elle est présente ou non dans le
muscle du patient. Une variation affectant l'épissage
peut aboutir au décalage du cadre de lecture ou à la
perte d'un domaine protéique si le cadre de lecture
est conservé. Les conséquences protéiques des variations de type faux-sens sont actuellement les plus difficiles à évaluer. En effet, le changement d'un acide aminé peut affecter la fonction du domaine dans lequel il est inclus. La titine est composée de nombreux domaines fonctionnels impliqués dans la signalisation musculaire, l'élasticité du muscle, les interactions avec les autres protéines du cytosquelette, l'ancrage à la bande M ou la bande Z. Il a été mis en évidence à plusieurs reprises une réduction secondaire de la calpaïne-3 dans des muscles de patients porteurs de variants pathogènes dans l'extrémité 3' du gène TTN, ce qui pourrait contribuer à la physiopathologie de la maladie.

L'analyse de la titine est difficile du fait qu'il s'agit d'une protéine géante. Les isoformes de la titine ont un poids moléculaire compris entre 1 000 et 3 800 kDa alors que pour la majorité des protéines d'une cellule, le poids moléculaire est habituellement de 5 à 300 KDa. Les méthodes conventionnelles de western-blot ne sont pas adaptées à l'étude de ce type de protéine géante. Pour analyser la protéine, nous avons mis au point une technique de WB faisant appel à une migration des protéines sur gel d'agarose. Cette technique assez particulière et originale permet ainsi de visualiser et discriminer les différentes isoformes de titine squelettique N2A (3,8 MDa), Novex 3 (1 MDa) ou cardiaque N2B

(3 MDa), N2BA (3,3 MDa) (Figure 5). L'objectif de cette technique est d'évaluer les conséquences des variants TTN sur la taille et la quantité de protéine, et de les comparer aux prédictions génomiques et aux résultats de l'analyse des transcrits. Les limites du WB concernent surtout les variants faux-sens dont les conséquences seront principalement structurales sans modification de taille ou de quantité de titine. Des stratégies d'études fonctionnelles sont à l'étude dans plusieurs laboratoires de recherche. Elles concernent des approches in vitro, par des tests d'interaction de la titine avec ses partenaires ou encore des approches plus globales à partir de modèles de laboratoires (souris, rat, poisson...). Le développement de tests fonctionnels est un enjeu essentiel pour l'évaluation des conséquences des variants TTN et le diagnostic des titinopathies en clinique.

## En conclusion

L'interprétation des variants du gène TTN nécessite une approche globale et intégrée, allant de l'analyse phénomène jusqu'à l'étude de la protéine. Cette approche, associée à la documentation active des cas de titinopathies, contribue à l'amélioration du diagnostic des patients suspectés de titinopathies. Elle comporte toutefois des limites. L'accès au matériel musculaire n'est pas toujours possible, notamment

### 5 Etude qualitative de la protéine

- Western blot

- Quantité

- Taille

#### Western blot SDS-Agarose

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 5
Analyse de la protéine par western blot adapté à l'étude des protéines géantes.</figcaption></figure>
ment chez les enfants en raison du caractère invasif du prélèvement. Les connaissances scientifiques sur l'expression du gène et les fonctions des différents domaines protéiques ne sont pas encore suffisamment étoffées pour interpréter les conséquences fonctionnelles de la plupart des variants *TTN* déjà rapportés. L'analyse de l'ensemble des transcrits titine par séquençage à haut débit constitue certainement une technique de choix pour évaluer les conséquences des variants sur les transcrits, du fait de la complexité du pattern d'expression du gène. Cette technique est toutefois coûteuse et fait appel à un traitement bioinformatique des données nécessitant une grande expertise. L'analyse fonctionnelle de la titine est probablement à ce jour le facteur le plus limitant à l'interprétation de la pathogénicité des variants de ce gène. Disposer d'outils d'analyses fonctionnelles comme des modèles animaux serait d'une grande aide, aussi bien pour parfaire l'interprétation des variants que dans un but thérapeutique plus lointain.

An integrated clinical-biological approach for interpreting the pathogenicity of titin gene variants

## LIENS D'INTÉRÊT

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article.

## RÉFÉRENCES

1. Kontrogianni-Konstantopoulos A, Ackermann MA, Bowman AL, Yap S V., Bloch RJ. Muscle giants: molecular scaffolds in sarcomerogenesis. *Physiol Rev* 2009; 89: 1217-67.

2. Carmignac V, Salih MAM, Quijano-Roy S, et al. C-terminal titin deletions cause a novel early-onset myopathy with fatal cardiomyopathy. *Ann Neurol* 2007; 61: 340-51.

3. Savarese M, Maggi L, Vihola A, et al. Interpreting genetic variants in titin in patients with muscle disorders. *JAMA Neurol* 2018; 75: 557-65.

4. Laddach A, Gautel M, Fraternali F. TITINdb-a computational tool to assess titin's role as a disease gene. *Bioinformatics* 2017; 33: 3482-5.

5. Savarese M, Jonson PH, Huovinen S, Paulin L, Auvinen P, Udd B, Hackman P. The complexity of titin splicing pattern in human adult skeletal muscles. *Skelet Muscle* 2018; 8: 11.

6. Savarese M, Sarparanta J, Vihola A, Udd B, Hackman P. Increasing role of titin mutations in neuromuscular disorders. *J Neuromuscul Dis* 2016; 3: 293-308.

7. Fernández-Marmiesse A, Carrascosa-Romero MC, Alfaro Ponce B, et al. Homozygous truncating mutation in prenatally expressed skeletal isoform of TTN gene results in arthrogyrosis multiplex congenita and myopathy without cardiac involvement. *Neuromuscul Disord* 2017; 27: 188-92.

8. Ferreiro A, Urtizberea JA. Pathologies musculaires liées à la titine : un domaine en émergence. *Med Sci (Paris)* 2017; 33 (hors série 1 - Les Cahiers de Myologie) : 16-26.

9. Oates EC, Jones KJ, Donkervoort S, et al. Congenital titinopathy: comprehensive characterization and pathogenic insights. *Ann Neurol* 2018; 83: 1105-24.

Retrouvez toutes les Actualités de la Myologie sur les sites de :

la Société Française de Myologie

www.sfmyologie.org

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

la filière de santé neuromusculaire FILNEMUS

www.filnemus.fr

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Filnemus

LA FILIERE DE SANTÉ NEUROMUSCULAIRE