# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure 3.12:** Variations de l'inverse de la densité du courant en fonction des concentrations cumulatives d'IgG à partir de MIPs réalisés avec : **a)** la stratégie 1 ; et **b)** la stratégie 2</figcaption></figure>

Différents modèles mathématiques ont été testés pour estimer l'affinité entre la protéine d'intérêt et les cavités formées au sein de la matrice polymérique, tout en tenant compte de la part d'adsorption non spécifique. C'est un modèle combiné loi de puissance / Hill qui a permis par la suite d'ajuster la courbe de calibration du capteur fonctionnalisé avec un MIP. Son expression est présentée dans l'équation (Equation 3.2).

$$ \frac{1}{J_{MIP}(C)} = (a + b \times C^{\alpha}) + \frac{m \times C^{\beta}}{K_{d}^{\beta} + C^{\beta}} \quad (\text{Equation 3.2}) $$

$J_{MIP}(C)$ est la densité de courant pour une concentration donnée C de la protéine, $K_d$ est la constante de dissociation, a, b et m sont des constantes empiriques et $\alpha$ est l'exposant de pondération et $\beta$ est le coefficient de Hill. L'ensemble de ces valeurs a été déterminé à partir du logiciel Origin.

Le modèle de Hill [24] a été en effet largement utilisé en biochimie, physiologie, et en pharmacologie pour analyser les équilibres de liaison dans les interactions ligand-récepteur. C'est donc à partir de ce modèle que nous avons pu estimer la valeur de la constante de dissociation $K_d$. La loi de puissance provient quant à elle de la modélisation de la réponse électrochimique du capteur fonctionnalisé avec le NIP, et ce afin de tenir compte de l'adsorption non spécifique (courbes non présentées dans ce manuscrit). Bien qu'il n'ait pas été possible d'obtenir un modèle unique pour toutes les mesures réalisées, en raison de la grande dispersion des résultats, nous avons néanmoins remarqué qu'une loi de puissance convenait dans la majorité des cas.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

Les valeurs de sensibilités, calculées à partir des pentes à l'origine dans la représentation en semi-log, et de constantes de dissociations sont présentées dans le Tableau 3.1.

<table><caption>**Tableau 3.1:** Valeurs de sensibilités et de constantes de dissociation estimées à partir des courbes de calibration présentées dans la Figure. 3.11.</caption><thead><tr><td></td><td>Kd (M)</td><td>S (mA<sup>-1</sup>.cm<sup>2</sup>/mg.ml<sup>-1</sup>)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Stratégie 1</td><td>(1,65±0,45) 10<sup>-10</sup></td><td>(7,23±0,53) 10<sup>-5</sup></td></tr><tr><td>Stratégie 2</td><td>(3,13±0,43) 10<sup>-11</sup></td><td>(8,85±0,27) 10<sup>-5</sup></td></tr></tbody></table>

Les données du Tableau 3.1 montrent que les sensibilités des deux capteurs sont comparables et qu'il existe une très grande affinité entre les empreintes formées et la protéine d'intérêt. La valeur de constante de dissociation du MIP₂ est cependant inférieure d'un ordre de grandeur à celle du MIP₁. La pré-orientation de la protéine, avant l'électropolymérisation de la dopamine, favoriserait donc la création d'empreintes localisées à la surface du polymère, ce qui améliorerait l'accessibilité et donc la reconnaissance des protéines par le MIP. Une représentation schématique de ces deux MIPs est présentée dans la Figure 3.13.

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure 3.13:** Représentation schématique des stratégies de construction des MIPs : a) stratégie 1 ; et b) stratégie 2</figcaption></figure>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

De l'ensemble des résultats, présentés dans la première partie de ce chapitre, nous pouvons donc conclure que le greffage covalent, via des SAMs mixtes, d'une protéine modèle sur une surface en or préalablement à l'électropolymérisation de la dopamine améliore les performances métrologiques du biocapteur, notamment en termes de constante de dissociation.

Fort de ce constat, nous avons décidé d'étudier d'autres MIPs réalisés à partir de trois protéines modèles : i) la sérum-albumine bovine (BSA) et la sérum-albumine humaine (HSA), deux protéines présentant des propriétés comparables, en termes de point isoélectrique (pI = 4,6) et de masse moléculaire (Mw = 64 KDa), et ii) l'antigène spécifique de la prostate (PSA) qui présente des propriétés différentes de celles de la BSA et la HSA (pI = 7,2 et Mw = 32 KDa).

## 3.3 Etude comparative de MIP-BSA, MIP-HSA et MIP-PSA

### 3.3.1 Construction des MIPs

A l'image de la première partie, nous avons commencé cette étude par fonctionnaliser des surfaces d'or avec une monocouche mixte (MUDA / MHOH) (1 / 9 ; v / v). Nous avons réalisé par la suite une activation de cette couche avec le couple EDC/NHS, puis nous avons greffé la protéine d'intérêt. Différentes études ont été réalisées par la suite pour optimiser l'épaisseur de chaque MIP, du fait que ce dernier est étroitement dépendant de la nature de la protéine.

Pour chacune des trois protéines, nous avons changé l'épaisseur du film en faisant varier le nombre de cycles (entre 13 et 20) lors de l'électropolymérisation de la dopamine par voltammétrie cyclique. L'ensemble des films a été caractérisé par SWV, ce qui nous a permis de déterminer l'épaisseur optimale de chaque MIP (résultats non présentés dans ce manuscrit). L'épaisseur optimale était de 17 cycles pour les MIP-BSA et MIP-HSA et de 15 cycles pour le MIP-PSA.

Dans la Figure 3.14 sont représentés les voltamogrammes, enregistrés par SWV, des trois MIPs et des NIPs correspondants. Il en ressort que les voltamogrammes caractéristiques des MIPs de la BSA et de la HSA sont quasi-comparables, aussi bien en forme qu'en intensité de courant, alors que celui du PSA est mieux résolu et présente une plus grande intensité, signe que le PSA favorise le transfert de charge vers la surface.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>**Figure 3.14:** Voltamgrammes caractéristiques des MIP de la BSA, de la HSA et du PSA et de leurs NIPs. Caractérisation dans le PBS (0,1M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻) avec une concentration égale à (5mM)</figcaption></figure>

Le manque de réversibilité du système de transfert de charge du couple redox et la mal résolution des pics des MIPs réalisés des différentes protéine, suite à la diminution de la cinétique de transfert de charge du couple ferrique sur la surface d'électrode, nous a incités à nous poser plusieurs questions concernant notre méthodologie de caractérisation électrochimique. Jusque-là, nous avons caractérisé tous les films dans un tampon PBS (0,1 M à pH = 7.4) en présence du couple redox [Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻ de concentration 5 mM. Mais au fait, ne risque-t-on pas, en utilisant le couple ferrique, de perturber la charge de la protéine et/ou celle du film ou encore la nature des interactions créées entre la protéine et la cavité ? Ne modifie-t-on pas les paramètres de liaison, telles que l'isotherme de liaison, la sensibilité ou encore la constante d'équilibre entre ces entités ?

Une revue de la bibliographie nous a permis d'avoir quelques éléments de réflexion à ce sujet. Scheller et al., [25] ont mis en évidence le fait que l'utilisation du couple ferrique génère un « signal global » qui peut inclure, en plus de l'interaction spécifique entre la protéine et la cavité réalisée dans le MIP, des interactions sondes redox-matrice polymérique, sondes redox-protéine et sondes redox-surface de l'électrode de travail. Chiku et al., [26] et Enache et al., [27] ont étudié, quant-à eux, la réponse électrochimique de la BSA et des peptides amyloïdes bêta (Aβ1-40 et Aβ1-42) dans une solution tampon phosphate (PBS à pH = 7,4 et à une
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

concentration égale à 0,1 M). Leurs résultats ont confirmé que les protéines peuvent générer leurs propres réponses électrochimiques sans utilisation de sondes redox.

Sur la base de ces résultats bibliographiques, nous avons décidé de mener une étude comparative entre les réponses électrochimiques des MIPs en présence et en absence du couple ferrique.

## 3.3.2 Etude comparative des réponses électrochimiques des MIPs de BSA, de HSA et de PSA en absence et en présence du couple redox

Les voltamgrammes des trois MIPs, réalisés par des mesures de SWV dans le PBS en présence du couple ferrique ont été présentés dans la Figure. 3.14. Ceux dont la caractérisation est faite uniquement dans le PBS (Figure 3.15) sont nettement mieux résolus, que ceux caractérisés avec le couple ferrique, et présentent un pic d'oxydation aux alentours de 0.32 V.

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 3. 15:** Voltamgrammes caractéristiques des MIPs : BSA, HSA et PSA. Caractérisation faite dans le PBS (pH = 7,4 et force ionique = 167 mM)</figcaption></figure>

Cependant, le MIP-PSA présente un pic d'oxydation plus important que ceux de la BSA et de la HSA (dont les intensités sont comparables). Pour comprendre l'origine de cette variation, nous avons calculé, à partir de l'équation 3.3, le pourcentage (P) d'acides aminés électro-actifs protéiques (L-histidine (L-His), L-méthionine (L-Met), L-tyrosine (L-Tyr), L-tryptophane (L-Trp) et L-cystéine (L-Cys)) [26],[28] pour chaque unité de protéine :
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

$$P = \frac{\text{Nombre d'acides aminés électroactifs par unité de protéine}}{\text{Nombre total d'acides aminés par unité de protéine}} \times 100 \quad (\text{Equation 3.3})$$

Les résultats, présentés dans le Tableau 3.2, indiquent que le PSA est plus riche en acides aminés électroactifs, ce qui peut contribuer à l'augmentation de la densité de courant dans les mesures électrochimiques.

<table><caption>**Tableau 3.2:** Pourcentage d'acides aminés électroactifs présents pour chaque unité protéinique pour la BSA, la HSA et le PSA</caption><thead><tr><th>Protéine</th><th>Nombre total des acides aminées</th><th>L-Trp</th><th>L-Cys</th><th>L-Tyr</th><th>L-His</th><th>L-Met</th><th>Moyenne</th></tr></thead><tbody><tr><td>BSA</td><td>601</td><td>3</td><td>35</td><td>21</td><td>17</td><td>5</td><td>13.48 %</td></tr><tr><td>HSA</td><td>604</td><td>2</td><td>35</td><td>19</td><td>16</td><td>7</td><td>13.07 %</td></tr><tr><td>PSA</td><td>255</td><td>9</td><td>10</td><td>4</td><td>11</td><td>5</td><td>15.29 %</td></tr></tbody></table>

Nous avons procédé par la suite à l'extraction de chacun des MIPs. Différentes études ont été menées, à l'image de celle réalisée pour l'IgG, afin d'optimiser le type et la nature de l'agent extracteur. Le protocole optimum pour les 3 MIPs est le suivant : une incubation pendant 2 heures à 37°C avec une enzyme, la protéinase K, suivie par un premier rinçage avec le PBS pendant 15 min puis un second rinçage avec l'eau ultrapure pendant 15 min. Les MIPs extraits ont été par la suite incubés dans des concentrations croissantes (allant de $10^{-15}$ mg.ml$^{-1}$ à 0,1 mg.ml$^{-1}$) de la protéine d'intérêt.

Sur la Figure 3.16 sont représentés les voltamogrammes, enregistrés par SWV dans une solution du PBS en présence (a, b et c) et en absence du couple ferrique (d, e et f), suite à la détection de concentrations croissantes de chacune des protéines d'intérêt. Il en ressort que contrairement à une caractérisation faite dans le couple ferrique, l'augmentation de la concentration d'une protéine donnée se traduit par une augmentation de la densité de courant, attribué à la reconnaissance de la protéine par les cavités formées au sein de la matrice en polydopamine.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>**Figure 3.16** : Voltamogrammes enregistrés par SQW suite à la détection de concentrations croissantes de : a) BSA avec couple ferrique ; b) HSA avec couple ferrique ; c) PSA avec couple ferrique ; d) BSA sans couple ferrique ; e) HSA sans couple ferrique ; et f) PSA sans couple ferrique.</figcaption></figure>

De ces premières mesures, nous pouvons donc établir qu'il est parfaitement possible de suivre
le signal électrochimique de détection d'une protéine électroactive sans avoir recours au couple
ferrique.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

La question qui se pose à ce niveau est la suivante : est-ce que le couple ferrique, souvent utilisé dans l'ensemble des mesures électrochimiques, a une influence, ou pas, sur l'interaction protéine / empreinte ? Pour répondre à cette question, nous avons tracé les courbes de calibration des capteurs électrochimiques fonctionnalisés avec les 3 MIPs, dont les caractérisations ont été faites avec et sans sondes rédox, pour en extraire les valeurs de constantes de dissociation. L'ensemble des courbes est présenté dans la Figure. 3.17.

Signalons que compte tenu du fait que la densité de courant *J* diminue avec la concentration pour les caractérisations faites avec les sondes rédox, nous avons tracé dans la Figure 3.15a la variation de 1/*J* et non pas de *J*.

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>**Figure 3.17:** Courbes de calibration des capteurs fonctionnalisés avec MIP-BSA, MIP-HSA et MIP-PSA dans le PBS: **a)** (avec sonde redox et **b)** sans sonde redox</figcaption></figure>

Pour déterminer les valeurs de constantes de dissociation, nous avons utilisé le modèle combiné Loi de puissance / Hill dont l'expression est présentée dans l'équation 3.4a pour une caractérisation avec le couple rédox et 3.4b pour une caractérisation dans le PBS :

$$ \frac{1}{J_{MIP}(C)} = (a + b \times C^{\alpha}) + \frac{m \times C^{\beta}}{K_{d}^{\beta} + C^{\beta}} \qquad (\text{Equation 3.4a}) $$

$$ J_{MIP}(C) = (a' + b' \times C^{\alpha'}) + \frac{m' \times C^{\beta'}}{K_{d}^{\beta'} + C^{\beta'}} \qquad (\text{Equation 3.4b}) $$

$J_{MIP}(C)$ est la variation de densité du courant pour une concentration donnée *C* de la protéine d'intérêt, $K_d$ est la constante de dissociation, *a*, *a'*, *b*, *b'*, *m* et *m'* sont des constantes empiriques, *α* et *α'* sont les exposants de pondération, *β* et *β'* sont les coefficients de Hill.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

Les valeurs de constante de dissociation en l'absence et en présence des sondes rédox sont portées sur Tableau 3.3.

<table><caption>**Tableau 3.3 :** Estimation des constantes de dissociation pour les différents MIPs en absence et en présence du couple redox</caption><thead><tr><th rowspan="2">Protéines</th><th>Constantes de dissociation (mg.ml-1)</th><th>Constantes de dissociation (mg.ml-1)</th></tr><tr><th>pour les MIPs caractérisés en présence du couple redox</th><th>pour les MIPs caractérisés en l'absence du couple redox</th></tr></thead><tbody><tr><td>BSA</td><td>(9,09 ± 1,84) 10-9</td><td>(8,2 ± 0,79) 10-11</td></tr><tr><td>HSA</td><td>(2,85 ± 0,49) 10-9</td><td>(1,24 ± 0,91) 10-11</td></tr><tr><td>PSA</td><td>(3,55 ± 2,11) 10-10</td><td>1,85 ± 1,65 10-12</td></tr></tbody></table>

Plusieurs renseignements peuvent être tirés à partir des données du Tableau 3.3. Le premier est, non le moindre, est que la présence du couple rédox diminue de façon considérable l'interaction entre une protéine donnée et son empreinte (quasiment deux ordres de grandeurs séparent les valeurs des constantes de dissociation). Nous confirmons donc par ces calculs les conclusions présentées dans les études préalablement citées de Scheller *et al.*, [25] Chiku *et al.*, [26] et Enache *et al.*, [27]. Nous avons donc décidé que pour la suite de nos travaux, toutes les caractérisations électrochimiques seront faites uniquement dans le PBS.

La seconde information est relative au PSA dont l'affinité avec les empreintes est supérieure à celles de la BSA et de la HSA (les valeurs de la constante de dissociation du PSA, en présence et en absence du couple rédox, sont en effet toutes les deux inférieures d'un ordre de grandeur à celles de la BSA et de la HSA). Ceci pourrait être expliqué par : i) un « volume » de PSA plus faible que celui de la HSA et la BSA, ce qui rend plus aisée la création d'un accès plus facile d'empreintes dans la matrice polymérique, et ii) une plus forte interaction électrostatique avec la matrice de polydopmaine. En effet, l'ensemble des mesures électrochimiques a été réalisé à pH 7,4. Or à cette valeur de pH :

- La BSA et la HSA (dont les points isoélectriques sont inférieurs à 4.6) présentent des groupements neutres (NH₂) et des groupements négatifs (COO⁻) [29],[30] ;

- Le PSA (dont le point isoélectrique est égal à 7,2) présente des groupements chargés positivement (NH₃⁺) et d'autres chargés négativement (COO⁻),

- La polydopamine (dont le point isoélectrique est égal à 4) est chargée négativement [31].
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

Ce sont donc les charges globales négatives de la BSA et de la HSA qui rendent défavorable l'interaction avec la polydopamine (pDA), contrairement au cas du PSA, d'où une affinité BSA / pDA et HSA / pDA moins favorable que PSA / pDA [29],[30].

### 3.3.3 Test de sélectivité

L'étude de la sélectivité est une étape importante pour évaluer la réussite de l'impression moléculaire. Elle renseigne sur la capacité d'un capteur à discriminer l'analyte d'intérêt des autres espèces interférentes.

Pour chaque MIP, nous avons suivi le protocole suivant :

1) Une extraction avec le protocole optimisé,

2) Incubation du MIP extrait (par exemple MIP-PSA) dans des concentrations croissantes, allant de $10^{-15}$ à 0,1 mg.ml$^{-1}$, de la protéine d'intérêt (PSA pour cet exemple).

3) Nouvelle extraction et réincubation dans des concentrations croissantes, allant de $10^{-15}$ à 0,1 mg.ml$^{-1}$, de chacune des protéines interférentes (BSA et HSA pour l'exemple considéré).

4) Nouvelle extraction et réincubation dans la protéine d'intérêt (PSA pour l'exemple considéré).

Des tests de détection de chaque protéine par le NIP ont été entrepris en parallèle.

Les courbes de calibration correspondantes à l'ensemble des mesures effectuées pour cette étude de sélectivité sont présentées dans la Figure 3.18. Les valeurs de sensibilités, calculées à partir de ces courbes de calibration en échelle semi-log, sont reportées dans le Tableau 3.4.

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Figure 3.18:** Courbes de calibration obtenues à partir des tests de sélectivité réalisés sur : a) MIP-BSA b) MIP-HSA et c) MIP-PSA. Sont aussi présentés les résultats de détection avec le NIP pour a) la BSA, b) la HSA et c) le PSA. Caractérisation faite dans le PBS (0,1 M, pH = 7.4)</figcaption></figure>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<table><caption>**Tableau 3.4 : Valeurs de sensibilités des différents capteurs fonctionnalisés avec les MIPs PSA, HSA et BSA**</caption><thead><tr><th>Capteur fonctionnalisé avec:</th><th colspan="3">MIPBSA</th><th colspan="3">MIPHSA</th><th colspan="3">MIPPSA</th></tr><tr><th>Protéine à détecter</th><th>BSA</th><th>HSA</th><th>PSA</th><th>HSA</th><th>BSA</th><th>PSA</th><th>PSA</th><th>BSA</th><th>HSA</th></tr></thead><tbody><tr><th>Sensibilité (µA,cm²/mg,ml⁻¹)</th><td>3,90 ± 0,10</td><td>2,65 ± 0,14</td><td>1,37 ± 0,15</td><td>4,36 ± 0,41</td><td>1,36 ± 0,15</td><td>3,33 ± 0,01</td><td>5,42 ± 1,24</td><td>3,52 ± 0,18</td><td>2,80 ± 0,80</td></tr></tbody></table>

De l'ensemble de ces données, nous pouvons conclure qu'à partir des valeurs de la sensibilité et des écarts types, chaque protéine est parfaitement reconnue par son MIP.

La relative reconnaissance des protéines interférentes pourrait être expliquée par les multiples étapes d'extraction d'une part et des interactions électrostatiques avec la matrice polymérique d'autre part. En effet, les extractions multiples pourraient induire une déformation des cavités MIPs et conduire à une pseudo-reconnaissance qui est observée seulement à forte concentration de la protéine ajoutée.

Notons par ailleurs que la valeur de sensibilité du MIP-PSA est supérieure à celle du MIP-HSA, supérieure elle-même à celle du MIP-BSA. Ces résultats sont en parfait accord avec les données du Tableau 3.3 (valeurs de constante de dissociation), et confirment le fait que le PSA a une meilleure affinité (que la BSA et la HSA) avec son empreinte formée dans la matrice polymérique.

De l'ensemble des résultats présentés dans la partie 2 de ce chapitre, nous avons donc conclu qu'il est parfaitement possible de détecter une protéine électroactive dans un tampon PBS à pH 7,4 sans utilisation de sondes rédox. Mais alors qu'en est-il des effets du pH et de la force ionique ? Peuvent-ils eux aussi influencer la reconnaissance d'une protéine par son empreinte ?

La réponse à cette question sera présentée dans la partie qui suit.

## 3.4 Etude de l'effet du pH et de la force ionique sur l'interaction MIP-protéines

### 3.4.1 Revue bibliographique de l'effet du pH et de la force ionique sur l'interaction MIP-protéines

De nombreux travaux ont porté sur l'étude de l'effet du pH et de la force ionique sur l'interaction d'une protéine avec son empreinte. Bereli *et al.*, [32] ont développé des cryogels pour la purification du Lysozyme (Lyz) du blanc d'œuf. Ils ont montré que l'augmentation de la concentration de NaCl conduit à une diminution de la capacité d'adsorption du Lyz de 16,6 à
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

6,7 mg.g⁻¹. Ces résultats ont été attribués à la création de forces électrostatiques répulsives entre le cryogel et les protéines.

L'effet de la force ionique a été également étudié par Gai *et al.*, [33] qui ont élaboré un polymère à empreintes moléculaires à base d'acrylamide pour la détection d'hémoglobine bovine (BHb). Contrairement aux résultats cités précédemment, Gai *et al*, ont montré que l'adsorption de l'hémoglobine ne dépend pas de la concentration de NaCl. Les auteurs ont supposé que les forces électrostatiques ne jouent, dans ce cas, aucun rôle sur l'interaction entre la protéine étudiée et les monomères d'acrylamide.

L'effet du pH a été étudié par Wang *et al.*, qui ont synthétisé des MIPs pour la détection de la BSA [34] et de la BHb [35]. Les auteurs ont montré que l'adsorption des protéines était maximale à pH 5 pour la BSA et pH 7 pour la BHb, des valeurs proches du point isoélectrique (pI) de chaque protéine. Saylan *et al.*, [36] ont étudié l'effet du pH sur l'adsorption de l'IgG sur les surfaces de microsphères de silice fonctionnalisées avec un MIP à base de N-methacryloyl-L-aspartic acid. Ils ont montré que l'adsorption maximale de la protéine a lieu à pH 6, une valeur proche du pI de l'IgG (de l'ordre de 6,2). D'autres études ont rapporté qu'au contraire les protéines sont moins solubles et moins stables autour de leur pI [37],[38].

L'incohérence de ces résultats a soulevé la nécessité de comprendre les effets du pH et de la force ionique sur les mécanismes d'interaction entre les protéines et leurs empreintes créées au sein d'une matrice polymérique. Nous avons mené cette étude et nous avons pris comme protéine modèle, la BSA.

## 3.4.2 Effets de la variation de la force ionique sur la réponse électrochimique de capteurs fonctionnalisés avec un MIP

La littérature rapporte que les protéines sont généralement stables dans les conditions « standards », à savoir une force ionique égale à 167 mM et un pH de 7,4. Nous avons fait le choix d'étudier, par SWV, l'effet de la force ionique en faisant varier sa valeur entre 16,7 et 334 mM (16,7, 42, 167, 250 et 334 mM). Cette étude a concerné aussi bien la force ionique du milieu de l'élaboration du MIP que celui de la détection de la protéine. Dans tous les cas le pH a été fixé à 7,4.

### 3.4.2.1 Effets de la force ionique sur l'élaboration du MIP

Pour cette étude, nous avons fait varier les valeurs de forces ioniques lors de l'élaboration du MIP et nous avons gardé celle du milieu de caractérisation constante (I = 167 mM). Les résultats
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

présentés dans les Figures 3.19 a et b montrent une augmentation de la densité du courant en fonction de la force ionique.

Pour comprendre l'origine de cette variation, nous avons déterminé, à partir de mesures de potentiel zêta, les valeurs de conductivité de la BSA aux forces ioniques étudiées. Les valeurs calculées sont regroupées dans le tableau 3.5.

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure 3. 19 :** a) Voltamogrammes de MIPs réalisés à différentes forces ioniques. Les caractérisations électrochimiques ont été faites à force ionique constante $I = 167$ mM et b) Variation des maxima de densité du courant enregistrés sur la Figure (a) en fonction des différentes forces ionique</figcaption></figure>

<table><caption>**Tableau 3. 5 :** Variation de la conductivité de la BSA en fonction des différentes forces ioniques</caption><tr><td>Force ionique (mM)</td><td>16,7</td><td>42</td><td>167</td><td>250</td><td>334</td></tr><tr><td>Conductivité (mS.cm<sup>-2</sup>)</td><td>3,10 ± 0,32</td><td>6,27 ± 1,24</td><td>15,18 ± 0,33</td><td>25,69 ± 1,89</td><td>29.50 ± 1,56</td></tr></table>

Les résultats présentés dans le Tableau 3.5 montrent que l'augmentation de la force ionique conduit à une augmentation de la conductivité de la BSA ce qui se traduit par une augmentation de la densité du courant dans la Figure 3.19b.

### 3.4.2.2 Effets de la force ionique sur la détection de la BSA

Nous avons préparé cinq MIPs, à un pH fixe de 7,4, et aux forces ioniques suivantes : 16,7, 42, 167, 225, 334 mM. Nous les avons extraits et incubés dans des solutions de concentrations croissantes de BSA allant de $10^{-15}$ à 0,1 mg.ml$^{-1}$. Pour contrôler l'interaction entre la protéine et les cavités formées, les caractérisations électrochimiques par SWV ont été réalisées dans des solutions de PBS ajustées aux forces ioniques d'intérêt. Nous avons relevé par la suite les
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

variations de l'intensité maximale de la densité du courant en fonction des concentrations de BSA (Figure 3.20).

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 3.20:** Variations des densités de courant en fonction des concentrations cumulées de BSA pour les cinq forces ioniques étudiées (les lignes sont des guides pour les yeux).
Le pH est égal à 7,4 pour l'ensemble des mesures.</figcaption></figure>

Les résultats indiquent que les valeurs de la densité de courant augmentent avec la force ionique de 16,7 mM à 167 mM, et qu'au-delà de cette valeur, l'augmentation de la force ionique entraîne le phénomène inverse.

Deux hypothèses ont été émises pour expliquer ce comportement :

1) Une augmentation du volume de la matrice polymérique à cause des molécules du sel, à l'image de l'étude de Chen *et al.*, [39] sur l'adsorption de lysozyme dans le film d'un cryogel ;

2) Une augmentation de l'hydratation des protéines, ce qui minimise leurs affinités envers leurs cavités polymériques [34],[35].

Pour confirmer ou infirmer ces hypothèses, nous avons mesuré les valeurs du potentiel zêta de la protéine BSA à différentes forces ioniques (Figure 3.21).
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Figure 3.21:** Variation du potentiel zêta en fonction des valeurs de la force ionique.</figcaption></figure>

Les résultats du potentiel zêta indiquent qu'une augmentation de la force ionique jusqu'à 167 mM conduit à une diminution du potentiel zêta. Cette variation peut être expliquée par les interactions répulsives créées entre les protéines [40] confirmant ainsi la solubilité et la stabilité de la BSA à ces valeurs de forces ioniques [41],[42]. Au-delà de 167 mM, le phénomène inverse se produit (les valeurs de potentiel zêta augmentent légèrement avec la force ionique). Cette variation est probablement due à des interactions protéine-protéine plus importantes, minimisant ainsi la solubilité de la BSA [43],[44]. Aux « fortes » forces ioniques, il est fort probable que les régions hydrophobes de la protéine réagissent ensemble et provoquent une agrégation protéique [45].

### 3.4.2.3 Effets du pH sur la réponse électrochimique de capteurs fonctionnalisés avec un MIP

Le second élément qui joue un rôle clé dans la conception réussie d'une empreinte au sein d'un MIP est le pH. EL-Sharif et al., [46] ont comparé le processus de reconnaissance entre différentes protéines et leurs empreintes dans divers tampons. Ils ont mis en valeur le fait que la détermination du point isoélectrique de la protéine d'intérêt est un préalable à chaque étude de pH et que les variations du pH peuvent influencer la liaison spécifique protéine / empreintes. Nous avons donc commencé cette étude de l'effet de pH par la détermination du point isoélectrique de la BSA à partir de mesures de potentiels zêta.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**Figure 3.22:** Estimation du point isoélectrique de la BSA</figcaption></figure>

La Figure 3.22 montre que la valeur du point isoélectrique est égale à 4,6 en parfait accord avec les valeurs rapportées dans la littérature [47],[48],[49].

Sur la base de cette étude, nous avons fait le choix d'ajuster la valeur du pH du tampon (7,4) vers 3,5 et 9 et d'étudier l'interaction entre la protéine BSA et le film de polydopamine dans trois valeurs du pH. Nous avons fait une première étude où nous avons fait varier le pH de l'électrolyte (milieux de mesure : $pH_{PBS}$) et fixé le pH de la BSA (milieu de préparation du MIP : $pH_{BSA}$), puis nous avons effectué l'opération inverse, c'est-à-dire que nous avons fixé $pH_{PBS}$ et avons suivi les variations de $pH_{BSA}$.

Nous avons aussi utilisé la voltammétrie à ondes carrées pour suivre les réponses électrochimiques de MIPs-BSA réalisés dans différents $pH_{BSA}$ (3.5, 7,4 et 9) en fonction des valeurs du $pH_{PBS}$ (3,5, 7,4 et 9). Pour toutes ces expériences, la force ionique a été fixée à 167 mM et la concentration de BSA à 0.1 mg.ml⁻¹.

Les résultats, présentés sur la Figure 3.23a, montrent qu'à l'exception du couple ($pH_{BSA} = 9$, $pH_{PBS} = 9$), la densité du courant MIP augmente en fonction du pH de l'électrolyte support et de celui de la BSA.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>**Figure 3. 23 :** a) Variations de la densité maximale du courant de MIPs préparés à différents pH : 3,5 (courbe noire), 7,4 (courbe rouge) et 9 (courbe bleue) en fonction du pH de l'électrolyte (pH<sub>PBS</sub>); b) Voltamogrammes SWV du MIP-BSA, préparé à un pH fixe (pH<sub>BSA</sub> = 9) et caractérisés à différentes milieux (pH<sub>PBS</sub> = 3,5, 7,4 et 9). Toutes les expériences ont été effectuées à une force ionique fixe (I = 167 mM)</figcaption></figure>

Cette augmentation pourrait tout d'abord être expliquée par la richesse de la polydopamine, à pH basique, en groupements chargés négativement (tels que les quinone-imines et les catéchols) [50]. Ces groupements chimiques pourraient en effet améliorer la conductivité de la polydopamine et donc son électroactivité [51]. La seconde explication pourrait être l'augmentation de la charge négative, et donc de l'électronégativité, de la protéine pour des valeurs du pH supérieures à son pI.

Pour confirmer cette hypothèse, nous avons effectué des mesures de potentiel zêta. Les valeurs présentées dans le Tableau 3.6 confirment que la valeur de potentiel augmente en faisant passer le pHBSA de 3,5 à 7,4.

<table><caption>**Tableau 3. 6:** Détermination des valeurs du potentiel zêta des solutions du BSA pour les pH à 3,5, 7,4 et 9. La protéine BSA a été dissoute à une concentration fixe de 10<sup>-1</sup> mg.ml<sup>-1</sup></caption><thead><tr><td>pH<sub>BSA</sub></td><td>Potential zeta (mV)</td></tr></thead><tbody><tr><td>3,5</td><td>5,77 ± 1,00</td></tr><tr><td>7,4</td><td>-11,11 ± 0,20</td></tr><tr><td>9</td><td>-10,66 ± 0,05</td></tr></tbody></table>

Pour expliquer la diminution de la densité du courant pour le couple (pH<sub>BSA</sub> = 9, pH<sub>PBS</sub> = 9), nous avons tracé les trois voltamogrammes du MIP réalisé à (pH<sub>BSA</sub> = 9) et caractérisé dans un (pH<sub>PBS</sub> = 3,5 ; 7,4 et 9).
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

La Figure 3.23b montre l'apparition de trois pics d'oxydation distincts et bien résolus pour le MIP du couple ($pH_{BSA} = 9$, $pH_{PBS} = 9$). Ces pics peuvent être attribués à l'oxydation de trois résidus d'acides aminés de la BSA : la cystéine, le tryptophane et la tyrosine [26],[28].

### 3.4.3 Effet du pH sur la détection de la BSA

Pour mieux comprendre l'interaction entre la BSA et les empreintes créées dans le film de polydopamine, nous avons comparé la « reconnaissance » de la BSA par un MIP et un NIP. Pour cela, nous avons calculé et représenté les variations « relatives » $\Delta J_{MIP} = J_{MIP} - J_{MIP\_ext}$ et $\Delta J_{NIP} = J_{NIP} - J_{NIP\_ext}$ en fonction des concentrations cumulées de BSA. $J_{MIP\_ext}$ et $J_{NIP\_ext}$ étant les valeurs de densités de courants du MIP extrait et du NIP incubé dans la solution d'extraction. Les expériences ont été faites trois fois pour chaque couple ($pH_{BSA}$, $pH_{PBS}$). Les courbes moyennes sont présentées dans la Figure 3.24.

Les résultats de la Figure 3.24a montrent un comportement quasi-identique entre les MIPs et les NIP lorsque les valeurs de pH sont inférieures au pI. Cela signifie que l'adsorption sur la matrice polymérique est dans ce cas plus importante que la reconnaissance spécifique des analytes par les empreintes.

Lorsque les valeurs du pH de la BSA et du PBS sont supérieures au point isoélectrique de la protéine, les réponses du NIP et du MIP peuvent parfaitement être discriminées (Figure 3.24b), même en tenant compte de la dispersion des résultats et de leurs incertitudes. Ce qui confirme la reconnaissance entre la protéine et les empreintes formées.

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>**Figure 3.24** : Variations relatives des densités de courant pour le MIP et le NIP en fonction des concentrations cumulées de BSA (en représentation semi-logarithmique) : a) pour $pH_{BSA}$ et/ou $pH_{PBS}$ inférieur au pI de la BSA et b) pour ($pH_{BSA}$ et/ou $pH_{PBS}$) supérieur au pI de la BSA. Caractérisation dans le PBS (0,1 M, pH = 7,4)</figcaption></figure>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

Pour mieux analyser les résultats obtenus en milieu basique, nous présentons, dans la Figure 3.25, les courbes de calibration et leurs ajustements en échelles linéaires et semi-logarithmiques. Nous avons estimé par la suite les valeurs de constantes de dissociation ($K_d$) à partir d'un ajustement des courbes de calibration par un modèle combiné loi de puissance/ modèle à un site, dont l'expression est présentée dans l'équation 3.5 :

$$ \Delta J(C) = (a + b \times C^{\alpha}) + \frac{m \times C}{K_d + C} \quad (\text{Equation 3.5}) $$

$\Delta J(C) = J_{MIP} - J_{MIP-extrait}$ pour une concentration donnée C de BSA, $K_d$ est la constante de dissociation, a, b et m sont des constantes empiriques et $\alpha$ est l'exposant de pondération.

Nous avons calculé aussi les valeurs de sensibilité à partir des variations de $\Delta j$ en échelle semi-log.

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>**Figure 3.25** : Variations des densités relatives du courant $\Delta J$ en fonction des concentrations cumulatives de BSA pour $pH_{BSA}$ et $pH_{PBS}$ supérieurs au pI du BSA. Les traits pleins correspondent aux meilleurs ajustements. Encart : vue à l'échelle semi-logarithmique montrant la forme quasi-linéaire des courbes de calibration pour des concentrations de BSA allant de $10^{-15}$ mg. ml$^{-1}$ à $10^{-3}$ mg. ml$^{-1}$.</figcaption></figure>

Les valeurs de constantes de dissociation et de sensibilité sont présentées dans le Tableau 3.6.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<table><caption>**Tableau 3.7:** Valeurs des constantes de dissociation et de sensibilité pour les différentes valeurs de pHBSA et pHPBS</caption><thead><tr><td>pHBSA</td><td>pHPBS</td><td>Sensibilité (µA.cm<sup>-2</sup>/mg.ml<sup>-1</sup>)</td><td>Constante de dissociation (mg/ml)</td></tr></thead><tbody><tr><td>7,4</td><td>7,4</td><td>3,36 ± 0,13</td><td>(8.56 ± 6,09) ×10<sup>-11</sup></td></tr><tr><td>7,4</td><td>9</td><td>2,48 ± 0,08</td><td>(1,18 ± 1,38) ×10<sup>-6</sup></td></tr><tr><td>9</td><td>7,4</td><td>3,01 ± 0,19</td><td>(0,75 ± 1,68) ×10<sup>-6</sup></td></tr><tr><td>9</td><td>9</td><td>2,15 ± 0,08</td><td>(18,43 ± 32,45) ×10<sup>-3</sup></td></tr></tbody></table>

Les données du Tableau 3.6 indiquent que la meilleure condition de détection, en termes de constante de dissociation et de valeur de sensibilité, est celle correspondante au couple (pHBSA = 7,4 ; pHPBS = 7,4). Aux autres couples du pH correspondent des constantes de dissociation très faibles.

Pour mieux comprendre le mécanisme d'interaction entre la protéine BSA et son empreinte dans des milieux acides, neutres et basiques, nous avons réalisé des études physicochimiques par spectroscopie FTIR. Nous avons donc préparé trois MIPs à (pHBSA / pHPBS) égal à (3,5 / 3,5), (7,4 / 7,4) et (9 / 9). Les spectres correspondants sont présentés sur la Figure 3.26.

La diminution des intensités de transmission avec le pH, observée sur la première zone allant de 3600 à 3200 cm⁻¹ pourrait être attribuée à la déprotonation des groupements amines (R-NH₂) de la protéine et du polydopamine et la formation de l'ion ammonium (R-NH₃⁺) à pH acide.

Les résultats présentés dans la Figure 3.26 montrent aussi : i) une augmentation de l'intensité de transmission des pics caractéristiques de la vibration de la liaison C-H, enregistrés dans la deuxième zone (Figure 3.26b) ; ii) l'apparition de deux pics à 1707 cm⁻¹ et 1545 cm⁻¹, caractéristiques de vibration des groupements COO⁻ et C=O des acides glutamique (Glu) et aspartique (Asp) [52], pour le MIP réalisé à (3,5 / 3,5) (Figure 21c) et iii) l'apparition de plusieurs pics caractéristiques de la vibration des amides secondaires II et II' allant de (1400-1575 cm⁻¹) [52],[53] et des amides tertiaires III (1229-1301 cm⁻¹) [53] dans la région allant de (800 à 1500 cm⁻¹) pour le MIP réalisé à (3,5 / 3,5).
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>**Figure 3.26:** Spectres FTIR de trois MIPs réalisés dans les conditions suivantes : (pHBSA / pHPBS) ajustés à (3,5 / 3,5), (7,4 / 7,4) et (9/9) : a) Totalité du spectre, b) un zoom entre 2700 et 3100 cm⁻¹, et c) un zoom entre 1500 et 1800 cm⁻¹</figcaption></figure>

Ces différentes observations pourraient être expliquées par les changements d'isomérie conformationnelle de la protéine BSA. En effet, en milieu acide, la protéine BSA évolue rapidement d'une conformation de type (N) à une conformation de type (F) et se déplie donc totalement (Figure 3.27). Il s'en suit une réduction du nombre d'hélices et l'apparition de feuillets béta. Cette structure est par essence instable [52],[54].

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>**Figure 3.27:** Evolution de la conformation de la protéine BSA en fonction du pH du milieu de dissolution</figcaption></figure>

En augmentant les valeurs de pH et en allant vers les milieux alcalins, la protéine se dénature jusqu'à avoir une conformation de type B aux pH avoisinant la valeur de 9.

Sur la base de ces hypothèses, nous pensons donc que les cavités n'ont pas été créées aux faibles et fortes valeurs de pH, et que dans ces cas, l'interaction entre les cavités et la protéine n'est contrôlée que par des interactions électrostatiques.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

Nous confirmons donc par cette étude le rôle crucial du pH dans la réalisation d'un MIP et lors de la détection d'une protéine donnée et surtout qu'il faut absolument tenir compte des points isoélectriques de la protéine d'intérêt et de la matrice polymérique avant de construire un MIP.

## 3.5 Conclusion

Différentes études ont été menées pour comprendre les mécanismes d'interaction entre une protéine donnée et son empreinte créée au sein d'une matrice polymérique. De l'ensemble des résultats obtenus nous sommes arrivés aux conclusions suivantes que nous allons énumérer pour plus de clarté :

- Un préarrangement des protéines, par le biais de couches autoassemblées, préalablement à l'électropolymérisation du monomère fonctionnel garantit une « meilleure » reconnaissance de ces entités qu'une électropolymérisation directe ;

- L'utilisation de sondes redox diminue l'affinité entre la protéine et son empreinte. Nulle nécessité d'utiliser ces entités pour suivre la reconnaissance d'une protéine électrocative par un MIP donné ;

- Le pH et la force ionique jouent un rôle crucial aussi bien pour la construction d'un MIP que pour la détection de la protéine d'intérêt ;

- La prise en compte des valeurs des points isoélectriques, de la protéine d'intérêt comme de la matrice polymérique avant de construire un MIP, est crucial.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

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# Chapitre 3 : Résultats et discussions

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[44] D. F. Parsons, M. Boström, P. Lo Nostro & B. W. Ninham, "Hofmeister effects: Interplay of hydration, nonelectrostatic potentials, and ion size," *Phys. Chem. Chem. Phys.*, vol. 13, no. 27, pp. 12352-12367, 2011, doi: 10.1039/c1cp20538b.

[45] R. Patel, M. Kumari & A. B. Khan, "Recent advances in the applications of ionic liquids in protein stability and activity: A review," *Appl. Biochem. Biotechnol.*, vol. 172, no. 8, pp. 3701-3720, 2014, doi: 10.1007/s12010-014-0813-6.

[46] H. F. El-Sharif, H. Aizawa & S. M. Reddy, "Spectroscopic and quartz crystal microbalance (QCM) characterisation of protein-based MIPs," *Sensors Actuators*, B Chem., vol. 206, pp. 239-245, 2015, doi: 10.1016/j.snb.2014.09.053.

[47] S. Salgin, U. Salgin & S. Bahadir, "Zeta potentials and isoelectric points of biomolecules: The effects of ion types and ionic strengths," *Int. J. Electrochem. Sci.*, vol. 7, no. 12, pp. 12404-12414, 2012.

[48] L. R. S. Barbosa, M. G. Ortore, F. Spinozzi, P. Mariani, S. Bernstorff & R. Itri, "The importance of protein-protein interactions on the pH-induced conformational changes of bovine serum albumin: A small-angle x-ray scattering study," *Biophys. J.*, vol. 98, no. 1, pp. 147-157, 2010, doi: 10.1016/j.bpj.2009.09.056.

[49] R. Li, Z. Wu, Y. Wangb, L. Ding & Y. Wang, "Role of pH-induced structural change in protein aggregation in foam fractionation of bovine serum albumin," *Biotechnol. Reports.*, vol. 9, pp. 46-52, 2016, doi: 10.1016/j.btre.2016.01.002.

[50] D. R. Dreyer, D. J. Miller, B. D. Freeman, D. R. Paul & C. W. Bielawski, "Elucidating the structure of poly(dopamine)," *Langmuir.*, vol. 28, no. 15, pp. 6428-6435, 2012, doi: 10.1021/la204831b.

[51] H. Coskun, A. Aljaboura, L. Uiberlackerb, M. Strobelb, S. Hildb, C. Cobetc, D. Farkaa, P. Stadlera & N. S. Sariciftcia, "Chemical vapor deposition - based synthesis of conductive polydopamine thin-films," *Thin Solid Films*, vol. 645, no. November 2017, pp. 320-325, 2018, doi: 10.1016/j.tsf.2017.10.063.

[52] G. Navarra, C. Peres, M. Contardi, P. Picone, P. L. S. Biagio, M. D. Carlo, D. Giacomazza, V. Militello, "Heat- and pH-induced BSA conformational changes, hydrogel formation and application as 3D cell scaffold," *Arch. Biochem. Biophys.*, vol. 606, pp. 134-142, 2016, doi: 10.1016/j.abb.2016.07.020.

[53] X. L. Cao, H. W. Li, Y. Yue & Y. Wu, "PH-Induced conformational changes of BSA in fluorescent AuNCs@BSA and its effects on NCs emission," *Vib. Spectrosc.*, vol. 65, pp. 186-192, 2013, doi: 10.1016/j.vibspec.2013.01.004.

[54] N. Varga, V. Hornok, D. Sebok & I. Dékány, "Comprehensive study on the structure of the BSA from extended-to aged form in wide (2-12) pH range," *Int. J. Biol. Macromol.*, vol. 88, pp. 51-58, 2016, doi: 10.1016/j.ijbiomac.2016.03.030.
## Conclusions et perspectives
## Conclusions et perspectives

L'objectif de ces travaux de recherche était d'étudier et de comprendre le mécanisme d'interaction entre quelques protéines modèles et leurs empreintes formées au sein d'une matrice polymérique en polydopamine.

La première partie de ce travail a été dédiée au choix de la technique de fonctionnalisation des surfaces de biocapteurs électrochimiques en vue de la détection d'une protéine modèle, l'immunoglobuline ‘‘IgG’’. Deux stratégies ont été testées : une pré-polymérisation de la dopamine autour de la protéine suivie par son électropolymérisation (stratégie 1) et un greffage de la protéine, d'une manière covalente, sur des couches autoassemblées (simples ou mixtes) préalablement à l'électropolymérisation de la dopamine (stratégie 2). Plusieurs paramètres ont été ensuite testés : l'épaisseur du film, le rapport protéine / monomère, la vitesse de balayage pour la construction du MIP, ainsi que la nature de l'agent extracteur. De l'ensemble des résultats obtenus, nous avons conclu que la stratégie 2 permettait d'avoir de meilleures performances métrologiques du biocapteur, notamment en termes de taux d'impression de la protéine et de constante de dissociation, une constante qui renseigne sur l'affinité protéine/empreinte.

Une fois ce choix fait, nous avons étudié, dans la deuxième partie de ce travail, trois autres protéines modèles : l'albumine du sérum bovin (BSA pour *Bovin Serum Albumin*) et l'albumine du sérum humain (HSA pour *Human Serum Albumin*) qui présentent des propriétés similaires en termes de point isoélectrique (pI = 4,6) et de masse moléculaire (Mw = 64 KDa), et l'antigène spécifique de la prostate (PSA pour *Specific prostate antigen*) dont les propriétés intrinsèques sont différentes de celles de la BSA et de la HSA (pI = 7,2 et Mw = 32 KDa). Le manque de réversibilité de l'ensemble des MIPs réalisés nous a incité à nous poser plusieurs questions concernant notre méthodologie de caractérisation électrochimique, où nous avions systématiquement eu recours au couple redox [Fe(CN)₆]³⁻/`. Nous nous sommes donc intéressés à l'étude de l'effet de ces entités sur les réponses électrochimiques des biocapteurs. Des caractérisations électrochimiques ont été donc faites en présence et en absence du couple redox. De la comparaison des valeurs de constantes de dissociation, estimées à partir des courbes de calibration des trois biocapteurs, nous avons conclu que le couple rédox diminue de façon
considérable l'interaction entre une protéine donnée et son empreinte. La suite des travaux a été
donc menée dans un tampon phosphate sans ajout de couple rédox.

Dans la dernière partie, et afin de mieux comprendre le mécanisme d'interaction entre une protéine et son empreinte, nous avons étudié les effets de deux éléments clés, la force ionique et le pH, aussi bien pour la réalisation du MIP que pour la détection d'une protéine modèle, la BSA. Les résultats électrochimiques, les mesures de potentiel zêta et les analyses par spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier ont montré qu'une force ionique de 167 mM et un pH de 7,4, permettent d'avoir une meilleure stabilité structurelle de la protéine et une électroactivité élevée de la matrice polymérique en polydopamine, améliorant de la sorte la reconnaissance de la protéine par ses empreintes moléculaires

Deux perspectives peuvent être proposées à l'issu de ce travail :

Nous pensons tout d'abord que la deuxième stratégie peut être généralisée pour la détection directe et in-situ de divers types de protéines, et notamment celles associées au SARS-Cov-2 (les protéines virales nucléocapside « N » et spike « S » et les protéines de l'immunité les immunoglobulines « IgG » et « IgM »).

La deuxième perspective concerne la construction un système sur puce (Lab-on-Chip) regroupant un transducteur électrochimique fonctionnalisé avec un MIP et un système microfluidique pour pouvoir effectuer un diagnostic rapide et in-situ en vue d'une intervention préventive et/ou thérapeutique efficaces. Ce type de système peut aussi répondre à une demande croissante émanent d'autres secteurs, autres que celui du secteur médical, dont l'agroalimentaire et l'environnement.
Annexe
Annexe 1 : Les différents monomères impliqués dans la polymérisation chimique

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1 : A) ; les monomères utilisés pour générer des liaisons covalentes : a) 1-vinyl-4-(vinyldithio)benzene, b) 2-hydroxy-5-vinylbenzaldehyde, c) 2-(4-vinylphenyl)propane-1,3diol, d) (4-vinylphenyl)methanediol, B) ; les monomères acides utilisés pour générer des liaisons non covalentes : e) acide methacrylique (MAA), f) acide p-vinylbenzoïque, g) acide acrylique (AA), h) acide itaconique, i) acide 2-(trifluoromethyl)-acrylic, j) acide acrylamido-(2-methyl)-propane sulfonique, C) ; les monomères basiques utilisés pour générer des liaisons non covalentes : k) 4-vinylpyridine, l) 2-vinylpyridine, m) 4-(5)-vinylimidazole, n) allylamine, o) N-vinylpyrrolidone, p) N-(2-aminethyl)-methacrylamide, D) ; les monomères neutres utilisés pour générer des liaisons non covalentes : q) acrylamide, r) methacrylamide, s) methyl methacrylate, t) 2-hydroxyethyl methacrylate, u) styrene, v) acrylonitrile
Annexe 2 : Les différents réticulants impliqués dans la polymérisation chimique

<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>**Figure 2** : Les réticulants les plus utilisés dans la littérature : a) N,N'-methylenediacrylamide, b) éthylène glycol diméthacrylate, c) tetraméthylène dimethacrylate, d) divinylbenzène, e) 1,3-diisopropenyl benzène, f) 1,4-diacryloyl pipérazine, g) N,O-bisacryloyl-phénylalanine, k) triméthylpropane triméthacrylate, l) pentaerythritol tetraacrylate</figcaption></figure>
Annexe 3 : Les différents initiateurs impliqués dans la polymérisation chimique

<figure><img src="image_89.png" /><figcaption>**Figure 3** : Les initiateurs les plus utilisés dans la littérature : a) azobisisobutyronitrile, b) 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone, c) benzoylperoxide, d) azobisdimethylvaleronitrile, et e) 4,4'-azo( acide 4-cyanovalerique)</figcaption></figure>
Résumé

Titre : Développement de biocapeurs électrochimiques fonctionnalisés avec des empreintes moléculaires pour la détection de protéines

Les travaux de cette thèse visent la conception de biocapeurs électrochimiques sélectifs à base de polymère à empreintes moléculaires (MIP) pour la détection des protéines. Dans la première partie, une empreinte moléculaire à base de dopamine a été élaborée pour la détection d'une immunoglobuline G (IgG), considérée comme protéine modèle. Deux différentes stratégies ont été testées : la première est basée sur l'électropolymérisation de la dopamine en présence de la protéine libre et la seconde consiste à greffer la protéine d'une manière covalente sur la surface de l'électrode préalablement fonctionnalisée par des monocouches autoassemblées (SAMs).

Les résultats des mesures électrochimiques ainsi que les modélisations mathématiques ont montré un taux d'impression élevé et une faible constante de dissociation pour la seconde stratégie (IF2 = 80%, Kd2 = 3.14 ± 0.43 10⁻¹¹ M) par rapport aux valeurs de la première stratégie (IF1 = 50%, Kd1 = 1.65 ± 0.45 x 10⁻¹⁰ M). Les résultats obtenus confirment que le greffage covalent de la protéine engendre la création de cavités surfaciques homogènes, plus accessibles pour la protéine, améliorant ainsi les performances métrologiques de ce capteur. La second approche a ensuite été adoptée pour étudier les interactions de trois types de protéines avec l'empreinte de polydopamine en présence et en absence du couple redox [Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻. Il s'agit de l'albumine du sérum bovin (BSA), de l'albumine du sérum humain (HSA) et de l'antigène spécifique de la prostate (PSA) ayant des poids moléculaires et des points isoélectriques différents. La modélisation des résultats des mesures électrochimiques a montré que la présence du couple redox diminue de façon considérable l'interaction entre la protéine et son empreinte. Cette interaction dépend également des propriétés intrinsèques de la protéine. En effet, en raison de son faible poids moléculaire et de sa richesse en groupements chargés positivement, le PSA est plus réticulé que la BSA et la HSA au sein de l'empreinte de polydopamine.

Pour mieux comprendre le mécanisme d'interaction entre une protéine et son empreinte, l'effet du pH et de la force ionique a été étudié sur la réalisation de l'empreinte et la détection d'une protéine modèle, la BSA. Les résultats électrochimiques, les mesures de potentiel zêta et les analyses par spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier ont montré qu'une force ionique de 167 mM et un pH de 7,4, permettent d'avoir une meilleure stabilité structurelle de la protéine et une électroactivité élevée de la matrice polymérique en polydopamine, améliorant ainsi la reconnaissance de la protéine par ses empreintes moléculaires.

En conclusion, ce travail nous a permis d'optimiser les conditions d'élaboration d'une empreinte moléculaire à base de dopamine pour détecter les protéines par des mesures électrochimiques. Ce biocapteur à base de MIP présente une bonne sélectivité, une grande spécificité et une faible limite de détection. L'approche adoptée peut être appliquée à la détection d'autres protéines telles que les protéines virales, les protéines bactériennes, les immunoglobulines ainsi que les biomarqueurs protéiques de nombreuses pathologies. L'intégration d'un système microfluidique à ce biocapteur à base d'empreintes moléculaires pourrait constituer un outil analytique capable d'effectuer un diagnostic rapide et in-situ dans plusieurs domaines dont le biomédical, l'agroalimentaire et l'environnemental.

Mots clés : Protéine, Biocapteur électrochimique, électropolymérisation, Empreinte moléculaire (MIP),

Abstract

Title: Design of electrochemical biosensors functionalized with molecularly imprinted polymer for protein detection

The aim of this work is the design of selective electrochemical biosensors based on molecularly imprinted polymers (MIP) for proteins detection.
The first part is carried to polydopamine-MIP elaboration, for a model protein "immunoglobulin G (IgG)" detection. Two different strategies are investigated: the first is based on the dopamine electropolymerization with the free protein and the second consists to protein covalently grafting on the transducer surface previously functionalized by self-assembled monolayers (SAMs).

The electrochemical results as well as the mathematical modelling have shown a higher impression rate with a low dissociation constant for the second strategy (IF2 = 80%, Kd2 = 3.14 ± 0.43 10⁻¹¹ M) compared to the first one (IF1 = 50%, Kd1 = 1.65 ± 0.45 x 10⁻¹⁰ M). The obtained results confirm that covalent protein grafting to the electrode surface could generate more homogeneous and accessible surface cavities for protein recognition, improving then the sensor metrological performance.

The second approach was then adopted to study the interactions between others three proteins (having different molecular weights and isoelectric points) with polydopamine MIP in the presence and absence of the redox probe [Fe(CN)6]³⁻/⁴⁻. These are bovine serum albumin (BSA), human serum albumin (HSA) and prostate specific antigen (PSA). The modeling of electrochemical measurements showed that the presence of the redox probe considerably reduces the interaction between the protein and its imprint. In addition, the MIP – protein interaction depends on the intrinsic properties of the protein. Indeed, due to its low molecular weight and its richness in positively charged groups, PSA is more cross-linked than BSA and HAS within the polydopamine-based MIP.

To better understand the interaction mechanism between the protein and its MIP, the effect of pH and ionic strength was studied on the MIP 's design and the further recognition process of the analyte by its imprints. The selected protein for this study is the BSA. The combination of electrochemical results, zeta potential measurements and infrared spectroscopy with Fourier transform analyzes have shown that an ionic strength of 167 mM and a pH of 7.4, allow to have a better protein structural stability and a high electroactivity of the polymeric matrix in polydopamine, ameliorating thus the recognition of the protein by its MIP.

In conclusion, this work allowed us to optimize the conditions for the design of a dopamine-based molecularly imprinted polymer (MIP) for the detection of proteins by electrochemical measurements. This MIP-based biosensor has good selectivity, high specificity and low detection limit. The adopted approach can be applied to the quantification of other proteins such as viral proteins, bacterial proteins, immunoglobulins as well as protein biomarkers of many pathologies. The integration of microfluidic system with this MIP-based biosensor could constitute an analytical tool performing a rapid and in-situ diagnosis in several fields including biomedical, food and environmental.

Keywords: Protein, Electrochemical biosensor, electropolymerization, molecularly imprinted Polymer (MIP),