L'alignement des 2305 séquences de domaines CoBaHMA, couplé à l'examen du modèle de la structure 3D, nous a permis de mettre en évidence une signature fonctionnelle constituée de résidus basiques conservés sur la face exposée au solvant du feuillet β. Par analogie avec des domaines présents chez les eucaryotes, nous avons formulé l'hypothèse que le domaine CoBaHMA de la calcyanine puisse lier une membrane via une interaction avec des phospholipides chargés négativement. En nous basant sur la considération des lipidomes des cyanobactéries et des bactéries (non-cyanobactéries) (Kralj et al., 2022; Wada & Murata, 2004), nous proposons que le domaine CoBaHMA interagisse avec le phosphatidylydilglycérol (PG) et/ou l'acide phosphatidique (PA).
Une autre possibilité, plus spécifique aux cyanobactéries, concerne le lipide majoritaire des membranes des thylakoïdes, le sulfoquinovosyldiacylglycérol (SQDG), un lipide chargé négativement.

Cette hypothèse permet de réconcilier le comportement de la calcyanine de *S. calcipolaris* avec celui de *Gloeomargarita lithophora*. En effet, il a été constaté que la calcyanine de *G. lithophora*, qui a pour architecture protéique X - (GlyZip)₃, est membranaire dans *E. coli* (Görgen, 2017, Rapport de M2). De même, la construction X - GlyZip1 exprimée récemment au laboratoire se retrouve dans la fraction membranaire de *E. coli*, contrairement à la construction CoBaHMA - GlyZip1. Enfin le domaine X semble être un domaine membranaire, probablement même transmembranaire, du moins chez *E. coli*. En effet, nous avons purifié cette calcyanine en présence de détergent, puis éliminé ce détergent avec de la cyclodextrine, ce qui a induit la précipitation de la protéine. Ce comportement est typique de protéine transmembranaire. Nous pouvons donc émettre l'hypothèse que les domaines N<sub>ter</sub> de la calcyanine X et CoBaHMA, auraient en commun une capacité d'interaction avec des lipides.
Dans ce contexte, il faut aussi noter que, des essais d'expression de calcyanines à domaine CoBaHMA associées à l'eGFP dans une souche biominéralisante ont conduit à observer une localisation de la protéine aux membranes (Görgen, 2020, Thèse). Par ailleurs, des essais de purification de la calcyanine de *S. calcipolaris* entière menés par nos partenaires du BIAM (Institut de Biosciences et biotechnologies d'Aix-Marseille), en présence de β-D-maltopyranoside de décyle (un détergent), semblaient stabiliser la protéine sous forme de dimère/trimère. Ceci indiquerait qu'une partie de la protéine a besoin d'un environnement hydrophobe pour se structurer correctement.
A partir de ces résultats et observations, une hypothèse plausible est que la calcyanine de *S. calcipolaris* interagit avec des membranes.

La nature précise de cette interaction, transmembranaire ou simplement associée aux membranes, est encore sujette à discussion. En effet, les résultats expérimentaux présentent le domaine CoBaHMA, ainsi que le domaine (GlyZip)₃ comme des domaines cytosoliques, ce qui indiquerait que la calcyanine de *S. calcipolaris* n'est pas transmembranaire mais qu'elle s'associe aux membranes via son domaine CoBaHMA.

Toutefois, notre modélisation des GlyZips du domaine (GlyZip)₃, nous a amenés à formuler l'hypothèse que ces éléments pourraient être transmembranaires. En effet, nous les avons modélisés comme des épingles à cheveux formées de 2 hélices interrompues par un motif GP, avec le motif glycine zipper enfoui à l'interface entre ces 2 hélices. Ces modèles présentent des similarités structurales avec des structures 3D de protéines membranaires, en raison de leur caractère largement apolaire.

Une hypothèse qui permettrait de lever cet apparent paradoxe est que le domaine (GlyZip)₃ pourrait être, chez la cyanobactérie, cytosolique ou membranaire en fonction de sa conformation. La protéine
SmhABC (constitué de 3 composants : A, B et C) qui forme un pore dans une membrane adopte ce comportement. Avant de s'insérer dans la membrane, les composants A et B de cette protéine sont cytosoliques. Ils sont ensuite recrutés par le composant C qui est membranaire, puis opèrent un changement conformationnel pour insérer une de leur partie dans la membrane (Churchill-Angus et al., 2021). La partie du composant B qui s'insère dans la membrane est précisément celle qui a des similarités structurales avec le modèle de la structure 3D des GlyZips de la calcyanine. Nous pourrions donc envisager un comportement similaire pour le domaine $(GlyZip)_3$. Comme les GlyZips ont une face hydrophile et une face hydrophobe, le domaine $(GlyZip)_3$ pourrait permuter la face qui se trouve à la surface de la protéine pour passer de cytosolique (face polaire vers l'extérieur, en contact avec le solvant) à membranaire (face hydrophobe vers l'extérieur, en contact avec les lipides). Ce changement de conformation du domaine $(GlyZip)_3$, s'il existe, pourrait être déclenché par une interaction du domaine CoBaHMA avec la membrane ou par une interaction avec une autre protéine. Si cette hypothèse est vérifiée, la calcyanine de *S. calcipolaris* pourrait être transmembranaire. L'incapacité de la calcyanine de *S. calcipolaris* à s'insérer dans la membrane d' *E. coli* pourrait être imputable à un lipidome non adapté, notamment si la calcyanine interagit avec des lipides spécifiques des cyanobactéries comme le SQDG, ou à l'absence du partenaire protéique.

Enfin, les expériences menées sur le fragment CoBaHMA-GlyZip1 ainsi que sur la protéine fusion MBP-CoBaHMA-GlyZip1 ont montré que ce fragment oligomérisait. Nous n'avons pas pu réaliser de détermination précise de cet état oligomérique, et les expériences de caractérisation que nous avons mis en œuvre à ce sujet ne sont qu'indirectes (SAXS, profil d'élution, gel natif...). Cependant il semblerait que ce fragment puisse former au moins des dimères, voir des objets de plus haut poids moléculaire. Si le fragment peut s'oligomériser, il est très probable que la calcyanine complète de *S. calcipolaris* oligomérise aussi. Cela expliquerait le grand nombre d'objets constaté sur gel natif pour cette protéine quand nous avons essayé de la purifier. Les gels natifs et les profils d'élution de la calcyanine complète témoignent en effet de la présence de gros assemblages. La calcyanine semble tendre vers des objets de haut poids moléculaires (> 15 unités monomères).

Il est vraisemblable que l'interface d'oligomérisation, que ce soit pour le fragment CoBaHMA-GlyZip1 ou la protéine complète, soit localisée au niveau des motifs GlyZip, faisant intervenir la tranche du motif en épingle à cheveux, comme illustré dans un modèle préliminaire que j'ai réalisé d'un dimère de 2 motifs GlyZip1 (Figure 33). En amont de cette thèse, des essais d'expression du domaine $(GlyZip)_3$ de la calcyanine de *G. lithophora* avaient montré que ce domaine tend à former des objets de différentes tailles, jusqu'à ~25 unités monomériques (Targowla, 2019, Rapport de M2). Ce comportement rappel fortement celui observé pour la calcyanine de *S. calcipolaris*. Au regard de leur modèle, les GlyZips pourraient s'assembler entre eux et former des assemblages de haut poids moléculaire.
(A)

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

(B)

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 33 : Modèle d'assemblage de 2 motifs GlyZip.**</figcaption></figure>

Modèle d'assemblage de 2 motifs GlyZip vu (A) de côté et (B) de haut. Les glycines sont colorées en jaune. Les a.a acides et polaires conservés sont colorés en vert et en rouge.

Nous avions pour ambition au départ de cette thèse, d'avancer sur la compréhension de la fonction de la calcyanine. Si nous n'avons pas encore abouti, nos résultats nous permettent de mettre en avant 2 grandes hypothèses fonctionnelles:

1. La calcyanine forme une enveloppe protéique autour des iACC via son domaine (GlyZip)₃. Le domaine CoBaHMA lierait une membrane de la cellule, pour des raisons encore inconnues (Figure 34).

2. Le domaine (GlyZip)₃ s'insère dans une membrane lipidique (iACC ou autre), avec l'aide du domaine CoBaHMA, par exemple pour former un pore (Figure 36).

La co-occurence du seul gène marqueur de cette biominéralisation, ccyA, et des iACC incite fortement à supposer que la calcyanine est directement en interaction avec ces derniers.

Si la tendance à former de gros oligomères est bien une propriété de la calcyanine de *S. calcipolaris* nous pourrions envisager que l'assemblage des GlyZips des domaines (GlyZip)₃ forme l'enveloppe qui entoure les iACC dans les cyanobactéries. En effet il a été supposé que cette enveloppe pouvait être, entre autres, de nature protéique (Blondeau et al., 2018).

Dans cette hypothèse, le domaine CoBaHMA pourrait interagir avec des lipides de thylakoïdes ou de la membrane cellulaire. Bien que les iACC ne soient pas systématiquement co-localisés à proximité de membrane (Blondeau et al., 2018), il se pourrait toute de même qu'il y ait un lien entre ces 2 éléments cellulaires. Dans de nombreuses souches, dont *S. calcipolaris* les iACC sont localisées aux pôles de la cellule. Chez ces souches il semblerait que la formation des inclusions soit concomitante de la formation du septum, lors de la division cellulaire (Benzerara et al., 2014). De même, chez des souches où les iACC sont dispersés dans la cellule, certains de ces iACC sont localisés à proximité des
thylakoïdes (Blondeau et al., 2018). Il pourrait donc y avoir un lien entre les membranes lipidiques et les iACC, par exemple au moment de leur formation.

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>**Figure 34 : La calcyanine pourrait former une enveloppe protéique autour des iACC.**</figcaption></figure>

Figure produite avec www.BioRender.com.

Il est intéressant de noter à ce sujet que le domaine CoBaHMA de la calcyanine est similaire d'un point de vue structural au domaine BMC (Bacterial Microcompartment Domain; pfam PF00936) qui forme, par oligomérisation, certaines parties de l'enveloppe protéique du carboxysome, le compartiment où a lieu la fixation du carbone chez les cyanobactéries. En effet, ces 2 domaines partagent le même cœur structural caractérisé par l'enchaînement de structure secondaire βαββαβ (Figure 35; Kinney et al., 2011).

Comme l'enveloppe autour des iACC a aussi été observée chez des cyanobactéries qui expriment des variants de la calcyanine autres que le variant à domaine CoBaHMA (Benzerara et al., 2022; Blondeau et al., 2018), le domaine CoBaHMA ne peut pas être le seul responsable de la formation de cette enveloppe. Mais il se pourrait que le domaine CoBaHMA soit un module supplémentaire dans la formation de l'enveloppe protéique. Dans ce cas la proximité structurale entre le domaine BMC et le domaine CoBaHMA pourrait fournir des indications sur la façon dont ce dernier interviendrait.
(A)

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

(B)

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Figure 35 : Structure du domaine BMC.**</figcaption></figure>

ID PDB RCSB : 2A1B. (A) Structure expérimentale du domaine BMC. (B) Structure de l'hexamère de domaine BMC qui forme l'enveloppe du carboxysome.

L'autre hypothèse présentée ici, serait que le domaine $(GlyZip)_3$ s'insère dans une membrane lipidique, que ce soit celle qui forme la membrane cellulaire, les thylakoïdes, ou encore la mono-couche qui pourrait entourer les iACC (Blondeau et al., 2018). Le domaine CoBaHMA pourrait alors déclencher le changement de conformation du domaine $(GlyZip)_3$ en reconnaissant les membranes.

Dans ce cas, nous pourrions envisager que les GlyZips s'assemblent en pore dans la membrane, comme les protéines avec qui ils partagent des similarités structurales. Les faces hydrophiles des glycine zippers permettraient le passage de substrat à travers la membrane. Ces pores pourraient permettre le passage de molécules d'eau, impliquées dans la formation des iACCs, ainsi que dans leur structures et propriétés (Goodwin et al., 2010). Ce transport pourrait ainsi assurer les conditions nécessaires au maintien d'iACC sous forme amorphe (Du & Amstad, 2020), alors qu'il pourrait aussi permettre le passage concomitant d'ions, médiés par les a.a acides conservés qui pourraient interagir avec les ions $Ca^{2+}$, comme c'est le cas dans de nombreuses protéines impliquées dans la biominéralisation. Ce pore pourrait être localisé dans l'enveloppe qui entoure les iACC, ou dans les membranes cellulaires.
<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>Figure 36 : La calcyanine pourrait être un pore.</figcaption></figure>

Figure produite avec www.BioRender.com.
## Perspectives :

Durant cette thèse, nous avons avancé sur la compréhension des propriétés structurales de la calcyanine et avons avancé des hypothèses sur sa/ses fonction(s). Nous proposons ici des expériences qui permettraient de continuer à progresser et aboutir sur ces 2 points.

### Enrichissement de la modélisation de la structure 3D de la calcyanine.

Les modèles que nous proposons de la structure 3D de la calcyanine de *S. calcipolaris* sont encore incomplets. Il existe cependant des pistes pour espérer aboutir à des modèles plus aboutis, notamment sur l'assemblage des GlyZips du domaine (*GlyZip*)<sup>3</sup>. Si nous avons utilisé ESMFold et AlphaFold2 durant cette thèse, d'autres logiciels de modélisation ont été publiés à la suite d'AlphaFold2, tel qu'OmegaFold (R. Wu et al., 2022) ou RoseTTAFold (Baek et al., 2021). Plusieurs études ont montré la pertinence de comparaison des résultats de plusieurs logiciels de modélisation lors de prédictions de structure 3D (Aubel et al., 2023; Azzaz et al., 2022; Téletchéa et al., 2023). Il semblerait que selon les protéines, certains logiciels soient plus adaptés que d'autres. Dans le cas de la calcyanine de *S. calcipolaris*, RoseTTAFold pourrait être un excellent candidat. En effet, au vu des hypothèses avancées pour les 2 domaines de la calcyanine, cette protéine pourrait être membranaire par l'intermédiaire de son domaine (*GlyZip*)<sup>3</sup>. Or Azzaz et al. ont montré plusieurs exemples de protéines transmembranaires pour lesquelles Robetta modélise avec succès le domaine membranaire, là où AlphaFold2 échoue (Azzaz et al., 2022). De même, ESMFold semble être moins performant que RoseTTAFold pour modéliser les protéines membranaires (Téletchéa et al., 2023).

Par ailleurs, une autre piste pour améliorer le modèle serait de modéliser plus exhaustivement les oligomères de la calcyanine. Nous avons essayé de modéliser la calcyanine sous forme de trimère, sans succès. Cependant, les protéines présentant des similitudes de structure avec les motifs GlyZips sont des protéines qui forment des oligomères avec un haut nombre de sous unités (jusqu'à 10 (J. S. Wilson et al., 2019)). De même, comme nous l'avons supposé, la calcyanine pourrait former des oligomères de haut poids moléculaire. La calcyanine a peut être besoin d'un grand nombre d'unités pour se structurer en homo-oligomère. Cependant, réaliser de tels modèles à haut nombre d'oligomères serait extrêmement gourmand en ressources, surtout avec AlphaFold2.

Outre son intérêt intrinsèque, un modèle plus précis de la calcyanine pourrait être utilisé pour résoudre sa structure par remplacement moléculaire, si nous parvenons à obtenir une carte de diffraction des rayons X à partir de cristaux de la calcyanine ou un de ses fragments.

### Structure 3D expérimentale du fragment CoBaHMA-GlyZip1.

La suite immédiate de la partie expérimentale de ce projet serait de répéter la purification du fragment CoBaHMA-GlyZip1 pour obtenir de nouveaux des cristaux. En travaillant sur les conditions et/ou l'échelle pour la cristallisation, nous pourrions aboutir à des cristaux plus gros et plus réguliers qui seraient plus propices pour obtenir une carte de diffraction.
Une telle structure devrait permettre de comprendre les potentielles interactions entre le domaine CoBaHMA et le GlyZip1. Enfin cette structure du fragment pourrait former un oligomère, ce qui devrait permettre de caractériser les surfaces impliquées dans ces mécanismes d'oligomérisation et ainsi, de mieux comprendre le comportement de la protéine complète en solution.

### *Structure 3D expérimentale de la calcyanine complète de S. calcipolaris.*

Si l'approche par fragment fonctionne, nous pourrions exprimer l'autre fragment de la calcyanine de S. calcipolaris, c'est à dire la partie GlyZip2 - GlyZip3 de cette protéine pour obtenir l'ensemble de la structure 3D par fragment, et ainsi recueillir des informations utiles quant aux interactions GlyZip/GlyZip et GlyZip/CoBaHMA.

S'il s'avère que le fragment GlyZip2 - GlyZip3 ne peut être exprimé ou purifié, nous pourrions rébasculer sur la calcyanine entière avec de nouvelles stratégies.

Comme évoqué précédemment, des expériences de purification de la calcyanine entière en présence de β-D-maltopyranoside de décyle (un détergent), menées par nos partenaires au BIAM (Institut de Biosciences et biotechnologies d'Aix-Marseille), semblent indiquer que ce détergent stabilise un dimère/trimère de la calcyanine, et limite la présence d'une multitude d'objet en solution. Toutefois, la présence du détergent n'est pas une condition favorable à la cristallogenèse. De plus, un dimère/trimère de la calcyanine (~78-117kDa) est probablement trop petit pour être confortablement caractérisé par Cryo-EM, cette technique n'est pas vraiment appropriée pour des assemblages de moins de 150kDa (Benjin & Ling, 2020). Une dernière solution serait donc la RMN (Resonance Magnétique Nucléaire) mais dans ce cas, elle risque de s'avérer complexe pour des assemblages de cette taille et nécessiterait probablement la mise en œuvre de marquages des protéines (N15 et C13).

Si ce détergent s'avère être trop gênant pour la détermination structurale, nous pourrions exprimer la calcyanine complète de S. calcipolaris associée à la MBP, comme nous l'avons fait pour le fragment. La MBP a stabilisé le fragment CoBaHMA-GlyZip1, et elle pourrait stabiliser la protéine complète.

Une autre solution, plus exotique et donc plus difficile à mettre en place, serait d'exprimer la calcyanine de S. calcipolaris dans une cyanobactérie, avec une étiquette 6His. L'expression dans une cyanobactérie permettrait de garantir la présence d'un lipidome adapté à une éventuelle interaction avec la calcyanine. De cette manière, nous devrions aussi avoir une meilleure idée de la localisation de la calcyanine dans les cyanobactéries. Par ailleurs, il pourrait y avoir des partenaires protéiques chez les cyanobactéries qui pourraient stabiliser la protéine.

Des souches de cyanobactéries ont déjà été utilisées pour exprimer et purifier des protéines étiquetées 6His, tel que la protéine PsbQ du photo-système II dans *Synechococcus* sp. PCC 6803 (Roose et al., 2007) ou CikA étiquetée 6His dans *Synechococcus elongatus* PCC 7492 (Mutsuda et al., 2003). Cependant, ces systèmes sont encore peu utilisés, et donc mal maîtrisés.
## Étude du GlyZip.

Nous pourrions compléter l'analyse bioinformatique des domaines de la calcyanine par l'étude ses motifs GlyZip. Ce type d'étude était très difficile à poursuivre en début de thèse, en raison du caractère original de ce type de motif, ne présentant pas d'homologues dont les structures 3D aient été étudiées expérimentalement. Cependant, le développement de l'outil Pcalf dans notre laboratoire (travaux de Maxime Millet), ainsi que l'émergence d'outils comme FoldSeek (Van Kempen et al., 2022) permettent de fouiller avec une plus grande sensibilité les bases de données.

Aussi, nous pourrions réaliser une étude similaire à celle conduites pour le domaine CoBaHMA, avec une description étendue de la diversité des protéines qui auraient ce motif. A terme, cela pourrait permettre de préciser le rôle fonctionnel de ce type de long motif glycine zipper.

## Localisation de la calcyanine dans S. calcipolaris.

Pour préciser la fonction de la calcyanine, il est crucial de déterminer sa localisation cellulaire dans la cyanobactérie. Comme nous l'avons discuté, ce sujet reste très ouvert. Plusieurs techniques sont envisageables dans ce but. L'expression d'une protéine fusionnée à un fluorophore dans les cyanobactéries a déjà été testée comme cela a été décrit précédemment, et s'est avérée particulièrement complexe à mettre en œuvre pour des résultats qui n'ont pas été entièrement concluants (Görgen, 2020, Thèse).

Une autre option serait d'utiliser un anticorps contre la calcyanine, puis de l'identifier soit dans une cellule fixée, soit dans un extrait cellulaire de S. calcipolaris.

Dans le cas d'un fractionnement cellulaire, il serait très intéressant d'isoler 3 fractions : les membranes, le cytosol, et les iACC, bien que l'isolement de cette dernière fraction ait été testé au labo par Gabriel Brandt et Neha Mehta, est en cours d'optimisation. Néanmoins cette extraction d'iACC inclut des solvants, comme le chloroformes, qui pourraient avoir un impact sur les protéines.

## Interactions de la calcyanine.

Il a été supposé dans cette thèse que la calcyanine interagirait avec des lipides et/ou le calcium. Il serait judicieux de tester ces hypothèses.

Dans le cas des lipides, des expériences de sédimentation pourraient être mises en place (Zhao & Lappalainen, 2012), en choisissant soigneusement les lipides étudiés afin de correspondre au mieux à la membrane des cyanobactéries. Le candidat principal pour ce type d'expériences est le phosphatidylglycérol. Mais il serait aussi intéressant d'étudier le sulfoquinovosyldiacylglycérol et qui est un lipide chargé négativement chez les cyanobactéries.

Pour l'interaction avec le calcium, des expériences de titrage calorimétrique isotherme (Beccia et al., 2015), de fluorescence ou de dynamique moléculaire permettraient de déterminer si interaction il y a.
Durant cette thèse, nous avons fait des premiers essais d'interaction entre la calcyanine et le calcium. Ces essais n'ont pas été entièrement concluants, notamment car ils nécessitent de partir d'une protéine dans une solution sans calcium. Or le calcium est omniprésent dans l'eau, et peut se trouver sous forme de trace sur les plastiques. Il est dès lors très difficile de s'assurer de cette absence de calcium. De plus, la calcyanine était étiquetée 6His, ce qui pouvait fausser les mesures faites. Néanmoins, ces premiers essais ont permis de préciser les paramètres expérimentaux pour une future expérience mieux maîtrisée.

De même, une éventuelle interaction avec des ions carbonates seraient intéressante à étudier.

Nous pourrions aussi chercher des partenaires protéiques à la calcyanine en immunoprécipitant la calcyanine recombinante étiquetée (6 His ou Strep II) avec un extrait cellulaire de cyanobactéries. Nous pourrions identifier les protéines interagissant avec la calcyanine par spectroscopie de masse.

*Travail similaire sur d'autres variants.*

Sur du plus long terme, nous pourrions répéter l'étude que nous avons mis œuvre dans cette thèse pour les autres variants de la calcyanine, ceux à domaine X, Y et Z.

Pour la calcyanine à domaine X, des essais d'expression et de purification ont déjà été effectués sur la souche de *G. lithophora*. Il semblerait que cette protéine soit propice à une détermination expérimentale. Par contre, il y a très peu de séquences de calcyanine à domaine X répertoriées, avec un domaine X ne présentant pas, de plus, d'apparentes similitudes de séquence avec d'autres séquences, ce qui limite fortement les possibilités d'analyse bioinformatique et de modélisation. Nos quelques essais de modélisation de la structure 3D du domaine X par des logiciels ne requérant, en théorie, pas de MSA comme ESMFold, n'ont pas abouti.

A l'inverse, les calcyanines à domaine Y et Z ont encore été très peu étudiées. Les quelques expériences préliminaires sur des calcyanines avec ces domaines ont montré que ce sont des protéines difficiles à exprimer dans *E. coli*, ce qui semble être un motif très récurrent avec cette famille de protéines. De même, les essais de modélisation de la structure 3D des domaines Y et Z n'ont pas abouti.

La comparaison de ces protéines devraient permettre de mieux comprendre le rôle de la calcyanine et de ses différents domaines. Il est à noter qu'une partie des calcyanine à domaines Y n'ont pas le GlyZip2 (Benzerara et al., 2022). Étudier une de ces séquences pourrait fournir des informations pertinentes sur le rôle structural et fonctionnel de ce GlyZip.

A terme, finaliser l'étude de la calcyanine permettrait de mettre en évidence des caractéristiques structurales et fonctionnelles très originales.
# Matériels et Méthodes :

Le Chapitre 3 étant un résumé de l'article présent en Annexe 2, le Matériels et Méthodes associé à ce chapitre est contenu dans l'article en question.

## 1.Bioinformatique.

### 1.1. Pymol, Chimera : visualisation, hydrophobicité, RMSD.

Les structures 3D de protéines, qu'elles soient expérimentales ou modélisées, ont été observées et analysées à l'aide des logiciel PyMOL (Schrödinger) et Chimera (Pettersen et al., 2004).

Nous avons coloré chaque a.a en fonction de son hydrophobicité à l'aide de la fonction python color_h (https://pymolwiki.org/index.php/Color_h), sur la base de l'échelle d'hydrophobicité définie par (Eisenberg et al., 1984). Cette échelle n'a pas d'unité, les valeurs numériques d'hydrophobicité de chaque a.a sont attribuées de telle manière que 0 corresponde à un a.a ni hydrophobe, ni hydrophile.

L'écart quadratique moyen entre atomes (RMSD pour Root Mean Square Deviation) a été calculé avec la fonction super de pymol (https://pymolwiki.org/index.php/Super), qui effectue une superposition structurale sans alignement de séquences.

### 1.2. Modélisation.

#### 1.2.1 Modélisation comparative.

La modélisation comparative du domaine CoBaHMA de la calcyanine de Synechococcus RS9917 a été faite avec Modeller 9.23 (Webb & Sali, 2016).

#### 1.2.2 AlphaFold2.

AlphaFold2 est un logiciel de modélisation de structure 3D de novo développé en 2021 par Jumper et al.. Il repose sur des techniques d'apprentissage profond (deep learning) pour prédire la structure 3D d'une protéine, à partir d'un MSA (pour Multiple Sequence Alignment ou Alignement Multiple de Séquences) de séquences homologues. AlphaFold2 a été entrainé sur des structures expérimentales issues de la PDB (Protein Data Bank), antérieures à avril 2018. Sans rentrer dans les détails techniques, AlphaFold2 repose sur un dialogue entre 2 blocs : un bloc interprète le MSA sous forme de co-variation et de co- évolution, et l'autre positionne les paires d'acide aminés dans l'espace 3D. Les échanges entre ces 2 blocs permettent d'obtenir une représentation précise de la structure 3D de la protéine. Il faut toutefois préciser que les auteurs eux-mêmes ne sont pas certains du fonctionnement exact
d'AlphaFold2 : par exemple la délétion complète du bloc MSA qui parait essentiel en théorie, n'affecte que très peu les performances final du logiciel (D. T. Jones & Thornton, 2022; Jumper et al., 2021). Paradoxalement, en l'absence de MSA, les performances d'AlphaFold2 chutent tout de même drastiquement (Lin et al., 2023).

Ses extraordinaires performances durant la compétition CASP14 (Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction) lui ont valu d'être considéré comme la solution au problème, vieux de 50 ans, de la prédiction de la structure 3D des protéines à partir de leur séquence seule. Cette affirmation doit être nuancée, car de nombreux cas posent encore problème à AlphaFold2, mais il n'en reste pas moins qu'AlphaFold2 a révolutionné le champ de la prédiction des structures de protéines (Bertoline et al., 2023). Depuis sa publication, AlphaFold2 a été utilisé pour créer la database AlphaFoldDB (Varadi et al., 2022) qui regroupe les prédictions de la structure de plus de 200 millions de protéines issues de UniProt_2021_04 (The UniProt Consortium et al., 2023).

Pour modéliser le monomère de calcyanine de *S. calcipolaris*, nous avons utilisé l'outil Colabfold (Mirdita et al., 2021), qui permet d'utiliser AlphaFold2 en passant par un serveur plutôt que via une installation locale. Nous sommes passés par le notebook AlphaFold2_advanced (https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/beta/AlphaFold2_advanced.ipynb) qui est devenu obsolète entre temps. A partir de la séquence de la protéine, Colabfold génère un alignement multiple avec l'outil mmseq2 (Steinegger & Söding, 2017) à partir de la base de données BFD/MGnify (Mirdita et al., 2021). Sur la base de ce MSA, AlphaFold2 modélise 5 structures 3D. Le meilleur de ces 5 modèles est évalué manuellement sur la base du pLDDT (cf partie 1.3.2 du Matériels et Méthodes) et du PAE (cf partie 1.3.4 du Matériels et Méthodes).
Colabfold ne permettant pas de modéliser les protéines ou assemblage protéiques de plus de ~ 1000 acides aminés, les modèles de trimère de calcyanine de *S. calcipolaris* ont été prédits par une installation locale d'AlphaFold2, par le Dr. Thibault Tubiana (Institute of Integrative Biology of the Cell, Université Paris Saclay).

### 1.2.3. ESMFold.

ESMFold est un logiciel modélisation de structure 3D qui repose sur l'utilisation de modèles de langage. Contrairement à AlphaFold2, il ne nécessite pas de MSA incluant la séquence à modéliser. ESMFold permet de modéliser une structure 3D à partir d'une séquence seule, jusqu'à 60x plus vite qu'AlphaFold2 au prix d'une précision moindre. Sur l'ensemble de structure de la compétition CASP14, AlphaFold2 a obtenu un score de modélisation (TM-score) de 0,85/1 en moyenne, contre 0,68/1 pour ESMFold (Lin et al., 2023).

ESMFold a été utilisé pour modéliser >617 millions de structure des séquences de la base de métagénomes MGnify90 (Lin et al., 2023; Mitchell et al., 2019). Tout comme AlphaFold2, ESMFold utilise le pLDDT comme score de confiance dans ses prédictions (Lin et al., 2023).

Pour modéliser le monomère de calcyanine *S calcipolaris* nous avons utilisé ESMFold (Lin et al., 2022), directement sur le site de ESM Metagenomic Atlas (https://esmatlas.com/resources? action=fold). A partir de la séquence de la protéine, ESMFold génère un modèle avec le pLDDT associé. Le site ne génère pas le PAE associé à la structure.

Le logiciel présent sur le site de l'Atlas ne permettant pas de modéliser les protéines ou assemblage protéiques de plus de 400 acides aminés, les modèles de trimère de calcyanine de *S. calcipolaris* ont été
fait sur une installation locale d'ESMFold, par le Dr. Thibault Tubiana (Institute of Integrative Biology of the Cell, Université Paris Saclay).

## 1.3. Outils d'évaluation des structures 3D.

### 1.3.1. ProSA.

ProSA est un programme qui permet d'évaluer la qualité du repliement d'une structure 3D de protéine d'un point de vue énergétique, pour repérer les mauvais repliements ou les erreurs locales. Pour une structure 3D évaluée, ProSA calcule la somme de toutes les énergies d'interaction entre chaque paire d'a.a (notée Ex). Une même somme est calculée pour des protéines de séquences similaires mais de conformations 3D aléatoires (notées Ea). Le Z-score est calculé comme la différence entre Ex et la moyenne des Ea, divisée par l'écart type de cette moyenne. Pour une protéine correctement repliée, l'énergie d'interaction totale doit être un minimum vis à vis des conformations aléatoires, donc le Z-score doit être négatif. Il est intéressant de noter que les énergies d'interactions entre a.a sont issues d'un ensemble de protéines globulaires (Sippl, 1993). Pour des protéines membranaires, à cause de l'environnement hydrophobe, ces énergies ne sont plus les mêmes (Mbaye et al., 2019), et il est possible que ProSA ne soit plus adapté.

Nous avons utilisé ProSA via l'interface web ProSA-web, en y téléchargeant les modèles de la structure 3D de la calcyanine (https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php). ProSA web indique un le Z-score global et local de la protéine ainsi qu'une comparaison de ce score vis à vis de Z-score de structures expérimentales déterminées par diffraction des rayons X et RMN (Wiederstein & Sippl, 2007).

### 1.3.2. pLDDT.

Pour évaluer la qualité de leurs modèles AlphaFold2 et ESMFold utilisent le pLDDT.

Le pLDDT (predicted Local Difference Test) est la prédiction du score IDDT (local superposition Difference Distance Test) sur les Cα. Le IDDT mesure la similarité entre 2 structures sous la forme d'un score allant de 0 à 100, 0 correspondant à aucune similarité, et 100 à une identité parfaite. A la différence de métriques couramment utilisées, comme le RMSD, le IDDT ne nécessite pas de superposition de structures. A l'inverse pour chaque atome d'une structure, il considère les distances de cet atome à tous les atomes inclus dans une sphère d'inclusion de rayon R₀. Cet ensemble de distances est comparé entre les 2 structures considérées. Le pourcentage de distances conservées entre les deux structures donne le IDDT d'un atome. C'est la métrique principalement employée au CASP depuis le CASP9 (Mariani et al., 2011, 2013). Jumper *et al.* ont montré que le pLDDT était un bon prédicteur du IDDT sur les Cα, avec toutefois de grandes différences dans certains cas (Jumper *et al.*, 2021). Le pLDDT peut être vu comme un score de confiance du logiciel prédicteur dans sa prédiction. Ce score est découpé en 4 sections :

* ≥90 : très haute confiance, avec orientation des chaines latérales correctement prédite;

* [70; 90] : haute confiance;

* [50; 70] : basse confiance;
_<50 : non interprétable (Tunyasuvunakool et al., 2021).

Il a été montré qu'un pLDDT<50 était cependant équivoque chez AlphaFold2. En effet cela peut correspondre à 2 situations :

_ une région repliée dont la structure 3D ne peut être prédite avec confiance, par exemple en raison d'un manque de séquence homologues ou d'un repliement inédit (Bruley et al., 2022, 2023);

_une région désordonnée (Tunyasuvunakool et al., 2021; C. J. Wilson et al., 2022).

Pour l'heure il n'y a pas d'observation similaire démontrée pour ESMFold.

### 1.3.3. PROCHECK.

PROCHECK est un ensemble de programmes dédiés à l'évaluation de la qualité d'une structure 3D. Il évalue notamment la stéréochimie des a.a de la structure, et les place dans un diagramme de Ramachandran. Il les classe aussi selon les différentes régions autorisées ou interdites pour la stéréochimie des a.a, identifiées par Morris et al., 1992.

Nous avons utilisé PROCHECK via le site PDBSum (http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/). Nous avons directement téléchargé les modèles de la calcyanine sur PDBSum.

### 1.3.4. PAE.

Le PAE (Predicted Alignment Error) se présente comme une matrice qui indique l'erreur de positionnement relative de toutes les paires d'a.a de la séquence, en Ångström (Jumper et al., 2021; Mirdita et al., 2021). Elle est directement calculée par AlphaFold2 lors de la génération d'un modèle.

### 1.4. FoldSeek.

FoldSeek est un outil de recherche de similitudes entre les structures 3D de protéines. Il ne repose pas sur une recherche de similitudes de séquences. Par rapport aux outils préexistants, comme DALI (Holm, 2020), FoldSeek est spectaculairement plus rapide (180 000x plus rapide que DALI), mais généralement moins précis (Van Kempen et al., 2022).

Nous avons utilisé FoldSeek directement sur le site associé (https://search.foldseek.com/search). Le modèle de la calcyanine de *S.calcipolaris* construit par ESMFold a été téléchargé sur le site. Nous avons demandé à FoldSeek de fouiller 6 bases de données : AlphaFold/Uniprot50 v4; AlphaFold/Swiss-Prot v4; AlphaFold/Proteome v4; MGnifiy-ESM30 v1; PDB100 2201222; GMGCL 2204 avec le mode TM-align, sans filtre taxonomique. L'alignement affiché sur la figure **[2B changed]** est celui fourni par FoldSeek.

### 1.5. Téléchargement de structure 3D.
Les structures 3D expérimentales ont été téléchargées depuis le site RCSB PDB (https://www.rcsb.org/) (Berman, 2000).

## 1.6. Alignements de séquences.

Les séquences et les MSA ont été étudiés avec le logiciel JalView (Waterhouse et al., 2009).

Nous avons aligné les séquences à l'aide d'une installation locale du logiciel mafft version 7 avec les options par défaut du logiciel (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) (Katoh & Standley, 2013).

Nous avons calculé l'identité et la similarité entre deux séquences alignées à l'aide de la version web de Sequence Manipulation Suite (https://www.bioinformatics.org/sms2/ident_sim.html) (Stothard, 2000). L'identité est définie par la proportion d'a.a strictement conservés entre les 2 séquences. La similarité est définie par la proportion de positions de la séquence qui conservent la même propriété d'une séquence à l'autre. Les groupes de similarités sont définis comme suit par le logiciel: {GAVLI}; {FYW}; {CM}; {ST}; {KRH}; {DENQ}; {P}.

## 1.7. Prédiction de l'agrégation.

La prédiction de la propension à l'agrégation a été calculée avec l'outil Protein-Sol sur la base des séquences seules. Cet outil calcule un score de solubilité qui est le rapport de la quantité de protéines qui resterait en solution après centrifugation et de la quantité totale de protéines; les protéines éliminées par agrégation étant agrégées. Cet outil se base sur les travaux de Niwa et al. (Niwa et al., 2009), qui ont mesuré cette propension à l'agrégation pour un grand nombre de protéines d'E.coli exprimées dans un système Cell-free, sans chaperonne (Hebditch et al., 2017).

Nous avons utilisé Protein-Sol via son site https://protein-sol.manchester.ac.uk/.
## 2. Experimental.

### 2.1. Différentes constructions de calcyanine étudiées.

<table><caption>**Table 1 :** Constructions de la calcyanine étudiées pendant cette thèse.</caption><thead><tr><th>Souches</th><th>Constructions<br>(Largeur des blocs non proportionnelles à la longueur des séquences)</th><th>Poids<br>moléculaire<br>(kDa)</th><th>ε<sub>1%</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>Synechococcus<br>calcipolaris (séquence<br>entière)</td><td>CoBa<br>HMA (GlyZip)<sub>3</sub> 6His</td><td>39,1</td><td>7,1</td></tr><tr><td>Synechococcus<br>calcipolaris (séquence<br>entière)</td><td>CoBa<br>HMA (GlyZip)<sub>3</sub> L 1 TE V sp Strep II</td><td>40,8</td><td>8,6</td></tr><tr><td>Synechococcus<br>calcipolaris (fragment)</td><td>CoBa<br>HMA GlyZip 1 L 1 TE V sp Strep II</td><td>22,8</td><td>8,1</td></tr><tr><td>Synechococcus<br>calcipolaris (fragment)</td><td>CoBa<br>HMA GlyZip 1 L 1 TE V sp 10His</td><td>22,8</td><td>5,7</td></tr><tr><td>Synechococcus<br>calcipolaris (fragment)</td><td>MBP L 2 CoBa<br>HMA GlyZip 1 L 1 10His</td><td>63</td><td>12,4</td></tr><tr><td>Synechococcus<br>calcipolaris (fragment)</td><td>MBP L 3 TE Vsp CoBa<br>HMA GlyZip 1 L 1 10His</td><td>65,1</td><td>12,2</td></tr><tr><td>PCC 6716<br>(séquence entière)</td><td>CoBa<br>HMA (GlyZip)<sub>3</sub> L 4 6His</td><td>35</td><td>7,6</td></tr><tr><td>PCC 6717<br>(séquence entière)</td><td>CoBa<br>HMA (GlyZip)<sub>3</sub> L 4 6His</td><td>35</td><td>7,6</td></tr><tr><td>Thermosynechococcus<br>elongatus BP-1(séquence<br>entière)</td><td>CoBa<br>HMA (GlyZip)<sub>3</sub> L 4 6His</td><td>35</td><td>6</td></tr></tbody></table>

6His (6 histidines) = HHHHHH

10His (10 histidines) = HHHHHHHHHH

Strep II = ASWSHPQFEKGA

TEV sp (Site de protéolyse de la TEV) = ENLYFQ|S

MBP = Maltose Binding Proteins

L1 (Linker 1) = GSS

L2 (Linker 2) = AARAFAAA

L3 (Linker 3) = NSSSTSGSGGGGGRLVPRGSMS

L4 (Linker 4) = AAALE
La MBP peut être utilisée comme les étiquettes poly-his et Strep II pour purifier des protéines par fusion. En effet, les protéines fusionnées à la MBP peuvent être isolées, par accrochage sur une résine d'amylose (Malhotra, 2009). Néanmoins, le principal attrait de la MBP est d'augmenter la solubilité des protéines auxquelles elle est associée. En effet, il existe des protéines qui sont en théorie solubles mais qui ne forment que des corps d'inclusions insolubles quand elles sont exprimées seules dans *E.coli*. Pour certaines d'entre elles, une fois exprimées fusionnées à la MBP, elles deviennent parfaitement solubles et ne s'agrègent plus, même après clivage et élimination de la MBP (Kapust & Waugh, 1999). Bien que cette caractéristique de la MPB ait été bien décrite dans la littérature, les mécanismes sous-jacents qui permettent cela sont encore mal compris. Parmi les hypothèses fréquemment citées on peut trouver la création d'un environnement entropiquement favorable, la formation de micelles hydrophiles par la MBP, ou encore une action chaperonne moléculaire de la MBP (Jin et al., 2017; Raran-Kurussi & Waugh, 2012). La MBP a aussi été rapportée comme facilitant la cristallisation de certaines protéines, comme le domaine extracellulaire de la GCPR (Pioszak & Xu, 2008). Cependant, il est à noter que la large taille de la MBP peut diminuer le rendement effectif de l'expression : pour une protéine de 40kDa, il faut que les cellules produisent 2mg de protéines fusionnées à la MBP pour former 1mg de protéines non fusionnées.

Parmi les différents linkers employés, L1 et L4 ont été conçus pour avoir le moins d'impact structurel et fonctionnel possible. Ils sont utilisés uniquement pour éloigner la calcyanine des différentes étiquettes utilisées et ainsi minimiser les risques d'interaction entre elles.

L2 a été conçu comme un linker rigide qui se structure en hélice α. Cela permet de bloquer la position des deux domaines qu'il relie. Cela a été utilisé pour favoriser la cristallisation de protéines fusionnées à la MBP (Jin et al., 2017).

L3 est un long linker flexible, qui permet de maintenir éloigné le bloc MBP du bloc CoBaHMA-GlycineZipper1 afin de ne pas mettre de contrainte structurale entre eux.

## 2.2. Gène et expression de la calcyanine.

Au cours de la thèse, nous avons testé plusieurs souches d' *E. coli* pour l'expression : *E. coli* C41 (DE3), C43 (DE3), C44 (DE3) et C45 (DE3), des dérivées de la souche d' *E. coli* BL21 (DE3). La souche BL21 (DE3) possède le gène nécessaire à l'expression de la T7 ARN polymérase. Cette polymérase reconnait spécifiquement le promoteur T7. Sa vitesse de transcription est 5 fois plus élevée que celle de l'ARN polymérase native d' *E. coli* (Golomb & Chamberlin, 1974). L'expression de la T7 ARN polymérase est contrôlée par le promoteur lacUV5, lui-même réprimé par le gène *LacI*. Cette répression peut être levée par l'ajout d'un inhibiteur de lacI, tel que l'IPTG. BL21 (DE3) permet donc une expression inductible du gène qui lui est fourni sur un vecteur pET (plasmid for Expression by T7 RNA polymease) (Studier & Moffatt, 1986; William Studier et al., 1990). BL21 a aussi l'avantage de ne pas posséder l'endoprotéase OmpT ce qui diminue sa capacité à dégrader les protéines produites (Grodberg & Dunn, 1988). La production de protéines hétérologues dans *E.coli* à l'aide d'un système T7 ARN polymerase inductible est un des systèmes les plus populaires dans le champ de la purification de protéines (Angius et al., 2018). Néanmoins un certains nombre de protéines sont toxiques pour BL21 (DE3), et donc ne peuvent y être exprimées. Les souches *E.coli* C41 (DE3), C43 (DE3), C44 (DE3) et C45 (DE3) ont été sélectionnées pour leur capacité à exprimer des protéines réputées difficiles d'expression (Miroux & Walker, 1996) (Angius et al., 2018). *E.coli* C41 (DE3), C43 (DE3) sont des souches dérivées de BL21 (DE3), où le promoteur *lacUV5* est muté. Ceci limite l'expression de la T7
ARN polymérase, ce qui ralentit l'expression des protéines recombinantes par rapport à BL21 (DE3) (Wagner et al., 2008). La présence d'un trop grand nombre de protéine recombinantes inutiles à *E.coli* déclenche une destruction des ribosomes et une mort cellulaire (Dong et al., 1995). De plus, dans le cas des protéines membranaires, une sur-expression de protéines recombinantes sature le système d'insertion des protéines dans la membrane. Cela empêche la cellule de maintenir son protéome membranaire, ce qui a pour effet, entre autres, d'empêcher la génération d'ATP (Wagner et al., 2008). La souche C43 (DE3) a une mutation supplémentaire sur son gène *LacI*, ce qui ralentit encore l'expression de la T7 ARN Polymerase, qui permet une plus grande tolérance aux protéines membranaires (Kwon et al., 2015). C44 (DE3) et C45 (DE3) sont des souches spécifiquement conçues pour exprimer des protéines membranaires à très faible vitesse mais sur de très longues périodes, pour atteindre de haut taux d'expression, supérieurs à ceux obtenus avec C41 (DE3) et C43 (DE3). Ces souches expriment une majorité de T7 ARN Polymérase tronquée et inactive, et seulement une minorité de T7 ARN Polymérase active (Angius et al., 2018).

Chaque construction mentionnée dans ce manuscrit correspond à un gène synthétique dont la séquence a été optimisée pour l'usage des codons de *E.coli* puis qui a été cloné dans le plasmide pet24d ou pet24b (soustraité à la société GeneCust). Ces plasmides confèrent une résistance à la Kanamycine (Umezawa et al., 1957) pour permettre la sélection des mutants correctement transformés. La séquence codante pour la protéine d'intérêt est située en aval d'un promoteur T7. L'expression de la protéine d'intérêt est induite par ajout d'IPTG dans le milieu de culture.

Pour exprimer les constructions, les cellules d'E.coli sont transformées avec le plasmide choisi, soit par
choc thermique, selon le protocole fourni par Lucigen
(https://biosearchtech.a.bigcontent.io/v1/static/manual_COMCEL-004_OverExpress-
Chemicallycompetent-Cells), soit par électroporation. Les cellules sont ensuite étalées dans une boîte
de pétri contenant de l'Agar-LB-Lennox (Lysogeny Broth) (Bertani, 1951) (Lennox, 1955) et de la
Kanamyicine à 40µg/mL, pour sélectionner les cellules correctement transformées. La boîte est incubée
une nuit à 37°C. Ensuite la boîte de pétri est conservée en chambre froide jusqu'à utilisation.
Les colonies ayant poussé après la nuit à 37°C sont prélevées à l'aide d'une hanse sous hotte à flux
laminaire, et mises en pré-culture dans du milieu LB-Lennox contenant 40µg/mL de Kanamycine. La
pré-culture est incubée sur nuit à 37°C à 200 rpm. Pour la culture, la pré-culture est ajoutée à 1L de
milieu riche 2xYT (20g/L poudre de LB-Lennox + 6g/L d'Hydrolisat de Caséine + 5g/L d'Extrait de
Levure) contenant 40µg/mL de Kanamycine, de manière à atteindre une DO600 (Densité Optique à
600nm) de 0,1. La culture est placée à 37°C, 200rpm et la DO600 est suivie au cours du temps.
Lorsqu'elle atteint [0,6-0,8], l'IPTG est ajouté de manière atteindre 0,1 à 0,5 mM final selon
l'expérience, pour induire l'expression du gène. Ensuite, la culture est placée à 19°C, 30°C ou 37°C
selon l'essai, sous 200 rpm d'agitation. A 30°C et 37°C la culture est laissée 4h sous agitation. A 19°C,
la culture est laissée une nuit sous agitation. Les cellules sont ensuite concentrées par centrifugation à
~4000g, lavées avec du tampon (50mM Tris pH7.5, 100mM NaCl) puis les culots cellulaires sont
congelés à -20°C pour être utilisés ultérieurement.

2.3. *Lyse cellulaire.*

Quelle que soit la construction protéique considérée, la lyse cellulaire a été effectuée avec la même
méthode et le même protocole.
Pour lyser les cellules d'E.coli transformées, le culot cellulaire est décongelé sur glace. Il est ensuite re-suspendu dans un tampon Tris-NaCl (concentrations dépendants de la protéine purifiée, cf les paragraphes sur la purification) contenant 1 pastille d'antiprotéase et 1mM PMSF (Fluorure de phénylméthylsulfonyle) pour bloquer l'action des protéases, 50u/mL de Benzonase Nucléase pour dégrader l'ADN, et 600u/mL de rLyzozyme pour dégrader la paroi d'E.coli. La suspension est homogénéisée mécaniquement à l'aide d'un potter. La lyse cellulaire se fait ensuite par 2 passages successifs de la suspension homogène dans un CF Broyeur (CellD), à une pression de 2kBar, à 4°C. La sortie du broyeur est centrifugée à ~9500 g 30 min pour séparer les cellules non cassées du lysat. Le surnageant, qui contient le produit de lyse, est isolé.

## 2.4. Purification des constructions de calcyanine.

Pour l'ensemble des constructions, la première étape de purification est une centrifugation à 100 000g à 4°C pendant 1h, qui permet de séparer les membranes contenant les protéines membranaires, qui se retrouvent dans le culot, des protéines cytosoliques qui restent dans le surnageant. Comme toutes les protéines que nous avons étudiées dans cette thèse se comportaient comme des protéines cytosoliques, nous avons travaillé uniquement sur le surnageant de cette centrifugation.

### 2.4.1. Calcyanine de Synechococcus calcipolaris étiquetée 6-Histidines.

Cette construction est purifiée en 2 étapes (Figure 37.A) :

- Chromatographie d'affinité sur résine nickel (Ni Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare)

- Chromatographie d'exclusion de taille sur colonne Superdex (Superdex 200 16/600 PG ou Superdex 200 10/300 increase, Cytiva)

La purification est réalisée dans un tampon Tris 50mM, NaCl 100mM à pH 8,0.

La résine nickel est lavée à l'eau distillée puis équilibrée avec le tampon Tris-NaCl contenant 10mM d'imidazole, pour limiter les interactions non spécifiques. De la même manière, le surnageant de la centrifugation à 100 000g est ajusté à 10mM d'imidazole final. Le surnageant est mis au contact de la résine pendant 20min, sur roue, en chambre froide. Une résine contenant du nickel permet de séparer les protéines étiquetées 6His des protéines non étiquetées (Schmitt et al., 1993). La résine est ensuite déposée sur colonne, puis lavée avec de l'imidazole 20mM pour éliminer les protéines contaminantes qui se seraient fixées non spécifiquement. Les protéines sont ensuite éluées à 400mM d'imidazole. L'imidazole ayant aussi une forte affinité pour le nickel, il va entrer en compétition avec les protéines fixées et les décrocher de la résine.
<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 37 : Schéma des différentes étapes des 2 grands types de purification qui ont été mis en œuvre pendant la thèse.</figcaption></figure>

Les fractions contenant la calcyanine sont identifiées par gel SDS-page, rassemblées puis injectées sur une colonne Superdex 200 16/600 PG ou Supedex 200 10/300 increase, pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire apparent. La présence de protéine en sortie de colonne est suivie par absorbance à 280nm. En effet, principalement grâce à la tyrosine et au tryptophane, les protéines absorbent à
280nm (Noble & Bailey, 2009). Les fractions contenant la calcyanine sont de nouveau identifiées par gel SDS-page, avec confirmation éventuelle par Western Blot à l'aide d'un anticorps commercial polyclonal anti-étiquette 6 histidines. Ce gel et ce Western Blot permettent aussi d'évaluer la pureté de l'échantillon. L'état oligomérique de la calcyanine dans les différentes fractions est estimé par gel natif. Les fractions contenant la calcyanine pure, dans l'état oligomérique souhaité, sont rassemblées. La concentration de l'échantillon est mesurée au Nanodrop (Labtech). Selon les applications désirées, il peut être nécessaire de concentrer la calcyanine. Dans ce cas, la protéine est concentrée par centrifugation sur Protein Concentrator (cut-off ≥30kDa: VIVASPIN, Sartorius). Si la calcyanine ne peut pas être utilisée immédiatement pour des analyses ou des expériences, elle est congelée en azote liquide avec 10% de glycérol final, puis stockée à -80°C.

### 2.4.2. Calcyanine de Synechococcus calcipolaris étiquetée Strep II clivable à la protéase TEV (Tobacco etch virus).

Cette construction est purifiée en 2 étapes (Figure 37.A) :

_Chromatographie d'affinité sur résine Strep-Tactin (Strep-Tactin Superflow, Iba)

_Chromatographie d'exclusion de taille sur colonne Superdex (Superdex 200 increase 10/300 GL, Cytiva)

La purification est réalisée dans un tampon Tris 50mM, NaCl 150mM à pH 8,0.

La résine Strep-Tactin est lavée à l'eau distillée puis équilibrée avec le tampon Tris NaCl, contenant 5mM β-mercaptoéthanol et 5% glycérol. Le surnageant de la centrifugation est mis au contact de la résine pendant 20min, sur roue, en chambre froide. La résine est déposée sur colonne puis lavée avec par le tampon qui a servi à équilibrer. Les protéines qui se sont fixées sur la résine sont éluées avec un tampon Tris NaCl, contenant 5mM β-mercaptoéthanol, 5% glycérol et 10mM de d-desthiobiotine. La d-desthiobiotine ayant aussi une forte affinité pour la Strep-Tactin, elle va entrer en compétition avec les protéines fixées et les décrocher de la résine. Les fractions contenant la protéine sont identifiées par gel SDS-page, rassemblées et concentrées à 500µL par centrifugation sur Protein Concentrator (cut-off ≥30kDa) puis injectées sur colonne Superdex 200 increase 10/300 GL, pour séparer les protéines selon leur poids moléculaire apparent.

La détermination de la pureté et de l'état oligomérique de la calcyanine, ainsi que son éventuelle concentration et congélation sont réalisées selon le protocole décrit en 3.1.

### 2.4.3. Construction CoBaHMA-GlycineZipper1 étiquetée Strep clivable à la protéase TEV.

Cette construction est purifiée comme décrit en 3.2. avec les variations suivantes :

_ L'élution de la résine Strep-Tactin est réalisée sur nuit, à 25mM d-desthiobiotine, et en présence de 250µg/mL de protéase TEV, pour décrocher la construction et cliver son étiquette dans le processus.

_ La chromatographie d'exclusion de taille est réalisée sur colonne Superdex 200 16/600 PG

### 2.4.4. Constructions fusion MBP(Maltose Binding Protein)-CoBaHMA-GlycineZipper1-10His (linker rigide) et MBP-Site de Clivage TEV-CoBaHMA-GlycineZipper1-10His (linker souple).
Ces 2 constructions sont purifiées en 2 étapes (Figure 37.A) :

_Chromatographie d'affinité sur résine nickel (Ni Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare)

_Chromatographie d'exclusion de taille sur colonne Superdex (Superdex 200 16/600 PG, Cytiva)

Pour ces deux étapes, le protocole de purification est quasiment identique à celui décrit à 3.1, aux
exceptions suivantes :

_Le tampon de purification est Tris 50mM, NaCl 150mM à pH 7.6.

_Lors de la chromatographie d'affinité, l'équilibrage se fait à 20mM imidazole, le lavage à 40mM imidazole et l'élution à 400mM imidazole.

2.4.5. Fragment CoBaHMA-GlycineZipper1-10His à partir de la protéolyse de la construction fusion MBP-Site de Clivage TEV-CoBaHMA-GlycineZipper1-10His (linker souple).

Cette construction est purifiée en 3 étapes (Figure 37.B):

_Chromatographie d'affinité sur résine nickel (Ni Sepharose 6 Fast Flow, GE Healthcare)

_Clivage par la protéase TEV étiquetée 6His

_Chromatographie échangeuse d'ions (HiTrap ANX FF (highsub), GE Healthcare)

La purification est réalisée dans un tampon Tris 50mM, NaCl 150mM à pH 7,6.

Pour isoler le fragment CoBaHMA-GlycineZipper1 issu de la calcyanine de S.calcipolaris, la protéine fusion MBP-Site de Clivage TEV-CoBaHMA-GlycineZipper1-10His est purifiée jusqu'à la fin de l'étape de chromatographie d'affinité, comme indiqué dans la partie 3.4.

Les fractions contenant la protéine fusion issue de la chromatographie d'affinité sont rassemblées. La protéase TEV (Parks et al., 1994) étiquetée 6His produite au laboratoire est ajoutée à la protéine fusion à un rapport de 1/100e en masse. La protéolyse est réalisée sur nuit, en chambre froide. La TEV clive la construction fusion sur son site de clivage dans la séquence, ce qui sépare la MBP de la partie CoBaHMA-GlycineZipper1-10His. A l'issue de ce clivage, un précipité blanc est présent dans le tube. Le tube est alors centrifugé à ~9500g à 4°C pendant 10 min pour séparer le précipité des protéines encore en solution. Le surnageant est dilué au 2/3 par un tampon Tris 50mM pH 7.6 pour abaisser la concentration en NaCl à 100mM.

Afin de séparer le fragment CoBaHMA-GlycineZipper1-10His de la MBP et de la TEV, le surnageant est injecté sur colonne échangeuse d'ions HiTrap ANX FF (highsub). Une fois les protéines accrochées, l'élution est établie par un gradient de sel, de 50mM à 500mM NaCl pour séparer les différentes protéines selon leur charge apparente. Les fractions contenant le fragment sont identifiées par gel SDS-page, avec confirmation éventuelle par Western Blot à l'aide d'un anticorps anti-6-His. Ce gel et ce Western Blot permettent aussi d'évaluer l'état de pureté de l'échantillon. L'état oligomérique du fragment dans les différentes fractions est estimé par gel natif. Les fractions contenant le fragment pur, dans l'état oligomérique souhaité sont rassemblées. La concentration du fragment est mesurée au Nanodrop. Selon les applications désirées, il peut être nécessaire de concentrer le fragment. Dans ce cas le fragment est concentré sur par centrifugation sur Protein Concentrator (cut-off ≥5kDa, VIVASPIN, Sartorius).
## 2.5. Expression et purification de la protéase TEV étiquetée 6His.

La protéase TEV étiquetée 6His est exprimée et purifiée selon un protocole similaire à ceux utilisés pour les constructions de calcyanine, avec les changements suivants :

_ La protéase TEV est exprimée comme une protéine recombinante dans un plasmide PRK793 (résistance à l'ampicilline (Acred et al., 1962)), dans la souche d'E.coli BL21(DE3)-RIL (résistance au chloramphénicol (Ehrlich et al., 1947)). La sélection des cellules correctement transformées est réalisée à 34µg/mL chloramphénicol et 50µg/mL d'ampicilline.

_ L'expression dure 24h à 4°C après l'induction à l'IPTG.

_ La purification est réalisée en une étape d'affinité sur résine nickel, dans un tampon de purification Tris 20mM, NaCl 500mM pH = 8.

_ La protéine purifiée est dialysée en 2 bains successifs, avec une membrane ≥8000kDa, dans un tampon Tris 20mM, NaCl 200mM, Glycerol 10%, EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid ou acide éthylène diamine tétra-acétique) 2mM, pH = 8.

_ Les éventuels précipités formés avant ou pendant la dialyse sont éliminés par centrifugation à ~4000g pendant 10min.

## 2.6. Protéolyse limitée.

La calcyanine de Scalcipolaris étiquettée 6-Histidines purifiée est exposée à 2 protéases :

_ La trypsine (de pancréas de bovin, Sigma-Aldrich) (Kühne, 1877) (Gutfreund et al., 1976).

_ L'α-chymotrypsine (de pancréas de bovin, Sigma-Aldrich) (Bender et al., 1967).

La trypsine clive principalement en C<sub>ter</sub> des lysines et des arginines. L'α-chymotrypsine clive principalement en C<sub>ter</sub> des acides aminés aromatiques (tryptophane, phenylalanine et tyrosine) et de certains a.a hydrophobes comme la leucine et l'isoleucine (Fontana et al., 2012).

Avant utilisation, les protéases sont conservées en alicquot à -80°C. La trypsine est congelée dans un tampon Tris 50mM pH=7,5, NaCl 150mM, CaCl<sub>2</sub> 5mM. L'α-chymotrypsine est congelée en HCl 1mM, CaCl<sub>2</sub> 2mM.

Pour la protéolyse limitée, les protéases sont décongelées sur glace. La calcyanine est mises en contact avec chaque protéase à un ratio masse/masse connue, dans un tampon Tris 50mM pH=7,5, NaCl 150mM, CaCl<sub>2</sub> 5mM. Typiquement ce ratio va de 10:1 à 100 000:1 masse de calcyanine par masse de protéase. Pour la trypsine et l'α-chymotrypsine, la digestion dure 1h sur glace.

La réaction de protéolyse est arrêtée par l'ajout de 5mM final de PMSF, qui inhibe les protéases à sérine dont font parties la trypsine et l'α-chymotrypsine (Garcia-Carreno, 1992). Le résultat est analysé par gel SDS-page et les bandes les plus intéressantes sont découpées puis analysées en spectroscopie de masse. La séquence exacte des fragments de protéolyse est déterminée par spectroscopie de masse en phase liquide.

Dans le but d'isoler le fragment et en analyser la séquence, la digestion est suivie par une chromatographie d'exclusion de taille (Superdex 200 5/150G1 ou 16/600PG selon la quantité de protéine disponible).
La prédiction des potentiels sites de clivage de la trypsine et de l'α-chymotrypsine sur la calcyanine est réalisée grâce au site internet PeptideCutter d'Expasy (https://web.expasy.org/peptide_cutter/) (Gasteiger et al., 2005).

## 2.7. Spectroscopie de masse.

Les expériences de spectroscopie de masse (MS) ont été réalisées par le Dr. Christophe Marchand (Institut de Biologie Paris-Seine, UMR 7238 CNRS, Biologie Computationnelle et Quantitative (LCQB), Sorbonne Université).

### 2.7.1. Préparation des bandes des gels SDS-PAGE.

Les bandes d'intérêt ont été excisées du gel de manière précise à l'aide d'un scalpel sur une surface en verre préalablement nettoyée à l'éthanol. Les bandes sont alors redécoupées en petits cubes d'environ 1-2 mm³ afin d'optimiser la pénétration des différents réactifs dans les mailles du gel de polyacrylamide. Afin d'éliminer le bleu de Coomassie fixé aux protéines ainsi que les différents contaminants possibles (SDS, sels, ...), les cubes sont ensuite placés à 37°C en présence de 150 µL d'une solution de bicarbonate d'ammonium (AMBIC) 50 mM. Après 15 min d'incubation au thermomixer (Eppendorf) à 37°C sous agitation (1000 rpm), le surnageant est éliminé et 150 µL d'acétonitrile (CH₃CN ; ACN) sont ajoutés. Après 5 min d'incubation à 37°C au thermomixer, le surnageant est prélevé et éliminé. Ces lavages successifs sont répétés autant de fois que nécessaire pour obtenir la décoloration complète des morceaux de gels et ces derniers sont alors déshydratés sous vide à l'aide d'un speedvac (Concentrator plus, Eppendorf) pendant 20 min.

En l'absence de cystéines dans la calcyanine, les étapes de réduction des ponts disulfure, et d'alkylation des cystéines n'ont pas été mise en œuvre. La faible acidité (pH~5) constatée est suffisante pour inhiber l'activité de la trypsine sans l'inactiver et ainsi éviter son autolyse lors de la réhydratation.

Les morceaux de gels sont réhydratés sur glace en présence de 10 à 15 µL d'une solution de trypsine (Trypsine Gold, Proméga) à 12,5 ng/µL en HCl 1 mM.

Après une incubation d'au moins 30 min, 60 µL d'une solution d'AMBIC 50 mM sont alors ajoutés sur les morceaux de gels réhydratés pour corriger le pH (pH~8,5) et initier la digestion par la trypsine. Les tubes sont alors placés à 37°C sous agitation (800 rpm) sur nuit.

A l'issue de la digestion, les surnageants sont prélevés et conservés et les morceaux de gels sont lavés pendant 15 min à 30°C par 100 µL d'une solution d'acide trifluoroacétique 1% (TFA ; volume/volume). Les surnageants sont prélevés et ajoutés aux précédents. Les morceaux de gels sont lavés une seconde fois pendant 15 min à 30°C par 100 µL d'une solution aqueuse d'ACN/TFA 60/1 (volume/volume). Les surnageants sont prélevés et ajoutés aux précédents.

Les surnageants sont alors concentrés sous vide à l'aide d'un speedvac (Concentrator plus, Eppendorf) jusqu'à évaporation presque complète (5-10 µL) et conservés à -20°C jusqu'à l'analyse par spectrométrie de masse.

Pour l'analyse MS proprement dite, 1 µL de surnageant concentré par évaporation est mélangé rapidement avec 1,5 µL d'une solution aqueuse d'acide [cyano-4-hydroxycinnamique (matrice)
préparée à demi-saturation (poids/volume) dans de l'ACN/TFA 50/0,3 (volume/volume). 2 µL de ce mélange sont alors déposés sur la plaque porte échantillon et laissés sous un léger courant d'air pour faciliter l'évaporation des solvants et la co-cristallisation des peptides avec la matrice.

### 2.7.2. Préparation du fragment de la calcyanine pour une masse entière.

Le fragment est purifié après protéolyse limitée, comme décrit dans la partie 2.6. Le pic contenant la protéine est concentré puis diluée avec un tampon Tris 50mM pH 7,5, puis concentrée à nouveau pour se placer dans des conditions salines compatibles avec la spectroscopie de masse, à la concentration la plus élevée possible. Une fois concentré jusqu'à 4µL, 2µL d'une solution aqueuse d'ACN/TFA 30/0,3 (volume/volume) sont alors ajoutés pour acidifier l'échantillon et 1,1 µL de cet échantillon final est mélangé à 1,8 µL d'une solution aqueuse d'acide sinapinique (Sigma) préparée à saturation (poids/volume) dans de l'ACN/TFA 30/0,3 (volume/volume). 2 µL de ce mélange sont alors déposés sur la plaque porte échantillon et laissés sous un léger courant d'air pour faciliter l'évaporation des solvants et la co-cristallisation des peptides avec la matrice.

### 2.7.3. MALDI-TOF (pour Spectrométrie de masse Désorption-Ionisation Laser Assistée par Matrice-Temps de Vol).

Les analyses ont été réalisées sur un spectromètre de masse MALDI-TOF (Axima Performance, Shimadzu, Manchester, Angleterre) en mode positif linéaire (masse intacte) ou bien en mode positif réflectron (empreintes peptidiques massiques) après calibration du spectromètre de masse sur les pics de masse de protéines et de peptides références respectivement. Pour l'analyse de masse intacte du fragment, le pulse extraction a été fixé à 25000 tandis que pour l'analyse des mélanges peptidiques il a été fixé à 2800.

## 2.8. Small Angle X-rays Scattering : expériences et analyses.

Le SAXS (pour Small Angle X-Ray Scattering) consiste à exposer des particules en solution, telles que des protéines, à un faisceau de rayons X monochromatique et collimaté. Au contact de ces particules, les rayons X vont être diffusés, ce qui va aboutir à une figure de diffusion qui peut être enregistrée à l'aide d'un détecteur. Comme les particules en solution sont orientées aléatoirement, la figure de diffusion obtenue après le passage d'un grand nombre de particules est isotrope. La figure de diffusion peut alors être considérée comme la moyenne sphérique de la transformée de Fourier de la différence de densité électronique entre celles des particules et celle du solvant. L'intensité de diffusion 2D, I(q) avec $q = 4\pi \sin(\theta)/\lambda$ où $2\theta$ est l'angle de diffusion et $\lambda$ la longueur d'onde des rayons X, est isotrope, elle peut donc être ramenée à une courbe 1D par intégration azimutale.

De cette courbe, il est possible d'extrapoler le rayon de giration, $R_g$, et l'intensité à l'origine à partir de l'approximation de Guinier, qui stipule que pour $q<1/R_g$, $I(q) \propto I(0).\exp(-(q.Rg)^2/3)$. $R_g$ peut être vu comme une détermination de la taille globale de la particule (Guinier, 1939).
En condition diluée, tel qu'en sortie de SEC, les différentes populations de la particule sont séparées, et l'on se rapproche des conditions mono-disperse. Dans les conditions de mono-dispersité, le poids moléculaire peut être extrapolé à partir de I(0). Le tracé de Kratky, $q^2I(q) = f(q)$ permet de déterminer la globularité de la protéine. Enfin, l'enveloppe, $log(I(q)) = f(q)$, peut servir à construire une structure basse résolution (de l'ordre du nm) pour la particule considérée (Kikhney & Svergun, 2015) (Mertens & Svergun, 2010).

Toutes les expériences et analyses de SAXS ont été réalisées avec la Dr. Stéphanie Finet (Institut de minéralogie, de physique des matériaux et de cosmochimie, UMR 7590, Sorbonne Université, Muséum National d'Histoire Naturelle). Les expériences de SEC-SAXS ont été réalisées sur la ligne SWING du Synchrotron SOLEIL (St-Aubin, France) (Thureau et al., 2021). Sur cette ligne, le faisceau de rayon-X a une longueur d'onde de $\lambda = 1.03Å$, la distance échantillon-détecteur est de 2m et la gamme de fréquences spatiales accessibles, q, est de 0.045-0.546 Å⁻¹. La protéine analysée est injectée sur colonne HPLC (High Performance Liquid Chromatography) Bio Sec-3 300Å (Agilent), ou sur colonne Superdex 5/150 GL (Cytiva) équilibrée avec le tampon de purification de la protéine considérée. La colonne est branchée sur le système Agilent HPLC de la ligne, lui-même relié à la cellule SAXS. La quantité de protéine en sortie de colonne est évaluée par absorbance à 280nm. L'absorbance à 260nm est utilisée pour évaluer la contamination par des acides nucléiques. La durée des frames lors de l'acquisition SAXS est de 1s.

Les données issues du SAXS sont analysées par le logiciel Foxtrot (https://www.synchrotron-soleil.fr/fr/lignes-de-lumiere/swing) proposé par la ligne SWING. Les spectres de diffusions 2D sont ramenés à une courbe de diffusion 1D par intégration, à q constant, des intensités transmises. L'intensité diffusée à l'angle nul I(0) et le rayon de giration (R₀) de la molécule sont déterminés en se basant sur l'approximation de Guinier (Guinier, 1939).

## 2.9. Essais de cristallogénèse.

Les essais de cristallisation ont été réalisés avec le Dr. Julien Henri (Institut de Biologie Paris-Seine, UMR 7238 CNRS, Biologie Computationnelle et Quantitative (LCQB), Sorbonne Université) à l'aide d'un robot Mosquito TTP Labtech, qui permet de pipeter des nanovolumes de solutions liquides. La technique utilisée est la diffusion de vapeur en goutte assise.

Pour identifier des conditions de cristallogénèse, la protéine concentrée à environ 10 mg/mL est mélangée en volume équivalent dans une goutte de ~100 nL avec 384 conditions standardisées (crible JCSG (Lesley & Wilson, 2005) ou complémentaires (NeXtal Biotechnologies 6201 Trust Drive Holland, OH, Etats-Unis)). Ces kits permettent de couvrir une large gamme de pH, de force ionique et d'agents précipitants. Une fois la protéine mélangée aux conditions, la plaque d'essais de cristallisation est scellée et maintenue à 20°C. Les plaques sont régulièrement observées jusqu'à 12 mois après le début de l'essai. En cas d'apparition de cristaux, les conditions de précipitation sont répliquées et optimisées dans une goutte de 2 µL. Pour cela, la condition initiale est modifiée en faisant varier la concentration des différents composants du milieu de précipitation. Les cristaux sont cryo-protégés en éthylène glycol ou glycérol, congelés en azote liquide puis exposés au rayon X sur les lignes PROXIMA-1 ou PROXIMA-2 du synchrotron SOLEIL (Saint-Aubin, France) afin de collecter les informations de diffraction.
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Annexes :

Annexe 1 : Benzerara, K., Duprat, E., Bitard-Feildel, T., Caumes, G., Cassier-Chauvat, C., Chauvat, F., Dezi, M., Diop, S. I., Gaschignard, G., Görgen, S., Gugger, M., López-García, P., Millet, M., Skouri-Panet, F., Moreira, D., & Callebaut, I. (2022). A New Gene Family Diagnostic for Intracellular Biomineralization of Amorphous Ca Carbonates by Cyanobacteria. *Genome Biology and Evolution*, *14*(3), evac026. https://doi.org/10.1093/gbe/evac026

Annexe 2 : Gaschignard, G., Millet, M., Bruley, A., Benzerara, K., Dezi, M., Skouri-Panet, F., Duprat, E., & Callebaut, I. AlphaFold2-aided description of CoBaHMA, a novel family of bacterial domains within the Heavy-Metal Associated superfamily. *En cours de soumission*

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# A New Gene Family Diagnostic for Intracellular
Biomineralization of Amorphous Ca Carbonates by
Cyanobacteria

Karim Benzerara ID<fnref n="1" />,*,†,‡, Elodie Duprat<fnref n="1" />,†, Tristan Bitard-Feildel<fnref n="1" />, Géraldine Caumes<fnref n="1" />, Corinne Cassier-Chauvat<fnref n="2" />, Franck Chauvat<fnref n="2" />, Manuela Dezi<fnref n="1" />, Seydina Issa Diop<fnref n="1" />,§, Geoffroy Gaschignard<fnref n="1" />, Sigrid Görgen<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Muriel Gugger<fnref n="3" />, Purificación López-García<fnref n="4" />, Maxime Millet<fnref n="1" />, Fériel Skouri-Panet<fnref n="1" />, David Moreira<fnref n="4" />,†,‡ and Isabelle Callebaut<fnref n="1" />,*,†

## Abstract

Cyanobacteria have massively contributed to carbonate deposition over the geological history. They are traditionally thought to biomineralize CaCO₃ extracellularly as an indirect byproduct of photosynthesis. However, the recent discovery of freshwater cyanobacteria-forming intracellular amorphous calcium carbonates (iACC) challenges this view. Despite the geochemical interest of such a biomineralization process, its molecular mechanisms and evolutionary history remain elusive. Here, using comparative genomics, we identify a new gene (ccyA) and protein family (calcyanin) possibly associated with cyanobacterial iACC biomineralization. Proteins of the calcyanin family are composed of a conserved C-terminal domain, which likely adopts an original fold, and a variable N-terminal domain whose structure allows differentiating four major types among the 35 known calcyanin homologs. Calcyanin lacks detectable full-length homologs with known function. The overexpression of ccyA in iACC-lacking cyanobacteria resulted in an increased intracellular Ca content. Moreover, ccyA presence was correlated and/or colocalized with genes involved in Ca or HCO₃⁻ transport and homeostasis, supporting the hypothesis of a functional role of calcyanin in iACC biomineralization. Whatever its function, ccyA appears as diagnostic of intracellular calcification in cyanobacteria. By searching for ccyA in publicly available genomes, we identified 13 additional cyanobacterial strains forming iACC, as confirmed by microscopy. This extends our knowledge about the phylogenetic and environmental distribution of cyanobacterial iACC biomineralization, especially with the detection of multicellular genera as well as a marine species. Moreover, ccyA was probably present in ancient cyanobacteria, with independent losses in various lineages that resulted in a broad but patchy distribution across modern cyanobacteria.

**Key words:** biomineralization, amorphous calcium carbonates, cyanobacteria, protein structure prediction, phylogeny, glycine zipper motifs, comparative genomics.

<footnote n="1">¹Sorbonne Université, Muséum National d'Histoire Naturelle, UMR CNRS 7590. Institut de Minéralogie, de Physique des Matériaux et de Cosmochimie (IMPMC), Paris, France</footnote>

<footnote n="2">²Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), Gif-sur-Yvette, France</footnote>

<footnote n="3">³Institut Pasteur, Université de Paris, Collection of Cyanobacteria, Paris, France</footnote>

<footnote n="4">⁴Unité d'Ecologie Systématique et Evolution, CNRS, Université Paris-Saclay, AgroParisTech, Orsay, France</footnote>

<footnote>†These authors contributed equally to this work.</footnote>

<footnote>‡Lead contact.</footnote>

<footnote n="5">⁵Present address: Department of Systematic and Evolutionary Botany & Zurich-asel Plant Science Center, University of Zurich, Zollikerstrasse 107, Zurich, Switzerland.</footnote>

<footnote>*Corresponding authors: E-mails: karim.benzerara@sorbonne-universite.fr; isabelle.callebaut@sorbonne-universite.fr.</footnote>

<footnote>Accepted: January 29, 2022</footnote>

<footnote>© The Author(s) 2022. Published by Oxford University Press on behalf of the Society for Molecular Biology and Evolution.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits non-commercial re-use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. For commercial re-use, please contact journals permissions@oup.com</footnote>
## Significance

Few freshwater species of Cyanobacteria have been known to mineralize amorphous CaCO₃ (ACC) intracellularly. Despite the geochemical interest of this biomineralization, its evolutionary history and molecular mechanism remain poorly known. Here, we report the discovery of a new gene family that has no homolog with known function, which proves to be a good diagnostic marker of this process. Using this marker gene, we find new cyanobacteria forming ACC in several genera and environments such as seawater, where ACC biomineralization had not been reported before. Moreover, this gene is ancient and was independently lost in various lineages, resulting in a broad and patchy phylogenetic distribution in modern cyanobacteria.

## Introduction

The formation of mineral phases by living organisms is widespread in both eukaryotes and prokaryotes (Weiner and Dove 2003). Although many cases of biomineralization in eukaryotes involve specific genes (Marron et al. 2016; Wang et al. 2021; Yarra et al. 2021), there is presently only one documented case of genetically controlled biomineralization in bacteria: the intracellular magnetite formation by magnetotactic bacteria (Lefèvre and Bazylinski 2013). The formation of Ca carbonates by cyanobacteria has been studied for several decades and cyanobacteria are thought to have been among the main calcifiers at the Earth surface since their appearance several billion years ago (Altermann et al. 2006). However, it is only recently that a genetic control of intracellular amorphous calcium carbonates (iACC) biomineralization by some species of cyanobacteria has been hypothesized (Benzerara et al. 2014), but not yet proven. Interestingly, the involvement of ACC has been widely documented and studied in the formation of eukaryotic skeletons (Blue et al. 2017). By contrast and although a growing number of bacterial occurrences are described (Monteil et al. 2021), the determinants of iACC formation in prokaryotes remain poorly understood.

The iACC-biomineralizing cyanobacteria are geographically widespread in freshwater, hotspring, or karstic terrestrial systems (Ragon et al. 2014) and sometimes locally abundant (Bradley et al. 2017). They received particular attention because they challenge the usual paradigm that cyanobacteria biomineralize CaCO₃ extracellularly as an indirect byproduct of photosynthesis only (Altermann et al. 2006). Moreover, the geological history of iACC biomineralization remains mysterious because the fossilization potential of these bacteria appears uncertain (Couradeau et al. 2012; Riding 2012). They can form iACC even under thermodynamically unfavorable conditions, indicating that they consume energy to perform this process, possibly in relation with active sequestration of alkaline earth elements (Cam et al. 2018). An envelope of undetermined composition, either a lipid monolayer and/or proteins, surrounds the iACC granules (Blondeau, Sachse, et al. 2018) and it has been suggested that compartmentation is instrumental for the achievement of local Ca concentrations that are high enough for the formation of iACC (Cam et al. 2018). Furthermore, some iACC-forming species require

higher Ca amounts for optimal growth than iACC-lacking ones, indicating that they possess an unusual Ca homeostasis (De Wever et al. 2019). Interestingly, by forming iACC granules, these cyanobacteria accumulate very high Ca amounts, as well as other alkaline earth elements such as strontium (Sr) and barium (Ba) (Cam et al. 2016; Blondeau, Benzerara, et al. 2018) and may impact the geochemical cycles of these trace elements (Blondeau, Benzerara, et al. 2018). Indeed, by normalizing the uptake to their cell mass, they are among the highest Sr and Ba-scavenging organisms known (Cam et al. 2016). Moreover, they can efficiently sequester radioisotopes such as ⁹⁰Sr or radium (Ra) isotopes, a capability that may be used for bioremediation (Cam et al. 2016; Blondeau, Benzerara, et al. 2018; Mehta et al. 2019).

All the members of some clades of cyanobacteria, such as the *Canothece-Synechococcus-Thermosynechococcus* clade, share this capability to form iACC, suggesting the genetic heritability of this trait in this specific group (Benzerara et al. 2014). Yet, despite the geochemical relevance of this process, the genetic control of iACC formation has not been identified. Moreover, whether the presently known iACC-forming cyanobacteria share ancestral genetic traits related to this biomineralization process or they convergently developed this capability to form iACC during cyanobacterial evolution remains unknown. In the absence of a fossil record, investigating the genetic basis of this biomineralization process appears as the only way to track its geological history.

## Results and Discussion

### Detection of a Gene Family Diagnostic of iACC Biomineralization

We applied comparative genomics to search for putative genes exclusively shared by iACC-forming cyanobacteria, and therefore absent in iACC-lacking species. We analyzed the genomes of 56 cyanobacterial strains (supplementary table 1, Supplementary Material online), in which the presence or absence of iACC was previously determined by electron microscopy (EM) (Benzerara et al. 2014). Fifty strains were lacking iACC and six were shown to form iACC: *Synechococcus* sp. PCC 6312, *Synechococcus calcipolaris* PCC 11701, *Thermosynechococcus elongatus* BP-1,
Cyanothecesp. PCC 7425, *Chroococcidiopsis thermalis* PCC 7203, and *Gloeomargarita lithophora* D10. Among the 523,680 translated coding sequences (CDSs) contained in the 56 genomes, only one group of orthologous sequences (among the 27,230 groups comprising at least two sequences) was shared by all six iACC-forming strains and absent in all 50 iACC-lacking strains. The corresponding gene was named ccyA. Its predicted protein product was named calcyanin (CcyA as a protein symbol). Conversely, we found no group of orthologous sequences shared by all 50 iACC-lacking strains and absent in all 6 iACC-forming strains. No functional annotation of calcyanin could be achieved using profiles of known protein domain families.

We first investigated the architecture of calcyanin by hy-
drophobic cluster analysis (HCA), an approach that has al-
ready been largely applied to the detection of novel domain
families (Callebaut et al. 1997; Bitard-Feildel et al. 2018). The
two-dimensional HCA representation of the protein sequence
provides structural information based on the distribution of
strong hydrophobic amino acids in clusters (representative of
regular secondary structures) and their relative arrangement.
This last feature allows to appreciate the segmentation of the
protein into domains and their intrinsic nature (e.g., folded,
disordered), as well as to detect repeated motifs and their
overall conservation between sequences. The HCA approach
revealed that calcyanin is composed of two domains (fig. 1).
The C-terminal domain is composed of three long repeats of a
periodic pattern (called GlyZip), including glycine (or small
amino acids—indicated in yellow in fig. 1) and hydrophobic
amino acids (green) every four residues (long, horizontal clus-
ters). The pattern was clearly distinct for the N-terminal
domains, possessing smaller hydrophobic clusters, usually en-
countered in current globular domains. Although the C-ter-
minal domain was highly conserved in the six different
calcyanin sequences, the N-terminal domain appeared to be
conserved in five sequences only, and exhibited significant
differences in G. lithophora. Therefore, we used the con-
served C-terminal domain to search for additional homologs
in a comprehensive set of 594 cyanobacterial genomes avail-
able in public databases. We found additional ccyA homologs
in 27 strains (supplementary table 2 and fig. 1, Supplementary
Material online). Among them, we inspected 17 strains avail-
able to us by EM coupled with energy-dispersive X-ray spec-
trometry (EDXS), which allowed submicrometer-scale
chemical mapping of several elements, including Ca and P.
As shown by Benzerara et al. (2014) and Li et al. (2016), iACC
can be recognized by the fact that they contain Ca but little to
no P, in contrast with polyphosphate inclusions, which show a
major P EDXS peak with Mg and K and, sometimes, Ca. We
detected iACC in 13 of the 17 inspected strains (fig. 2 and
supplementary fig. 2, Supplementary Material online),
thereby increasing the number of known iACC-forming cya-
nobacterial species from 6 to 19. Moreover, we detected ccyA
in the two recently sequenced genomes of Synechococcus sp.

PCC 6716 and PCC 6717 that were previously shown to form
iACC (Benzerara et al. 2014) (supplementary table 2,
Supplementary Material online).

In some strains (e.g., *Fischerella* sp. NIES-4106, *Neosynechococcus sphagnicola* sy1), most of the cells exhibited abundant iACC granules. By contrast, for strains such as *Microcystis aeruginosa* PCC 7806, cells contained none or only few iACC granules. In other strains (e.g., *Chlorogloeopsis fritschii* PCC 9212), the cells contained few iACC granules and many Ca-rich polyphosphate inclusions that could be morphologically confused with iACC by EM alone but not chemically, hence requiring the use of EDXS (fig. 2 and supplementary fig. 2, Supplementary Material online). The four strains possessing ccyA but lacking iACC (C. *fritschii* PCC 6912; *Fischerella* sp. NIES-3754; M. aeruginosa PCC 9432 and PCC 9717; fig. 3) were phylogenetically very close to iACC-forming relatives. For example, C. *fritschii* PCC 9212 (iACC-forming) and PCC 6912 (no observed iACC) had only few differences in their gene repertoires (supplementary fig. 3 and table 3, Supplementary Material online) and the nucleotide sequences of the genomic regions containing ccyA in these two strains (corresponding to contigs of 97,542 and 97,528 bp in length, respectively) shared 100% identity over 97,528 bp. However, 57 genes of C. *fritschii* PCC 9212 had no homolog in C. *fritschii* PCC 6912. Their functional categories were annotated using the NCBI-curated clusters of orthologous groups (COG) protein classification resource. They mostly corresponded to unknown functions (46 without COG hit, 2 genes with COG category X indicating an unknown function) or inorganic ion transport (4 genes, COG category P; supplementary table 3, Supplementary Material online). Moreover, although we did not observe iACC in C. *fritschii* PCC 6912 and *Fischerella* sp. NIES-3754 cells, they both showed Ca- and P-rich inclusions morphologically similar to iACC, suggesting that they may have some but not all the capabilities required to produce iACC (fig. 3). Benzerara et al. (2014) and Cam et al. (2018) previously concluded that iACC-forming strains tend to show iACC inclusions when cultured in different growth media and/or sampled at different stages of their growth. Moreover, we conducted observations on multiple cultures sampled at different times for the four strains, supporting the idea that iACC do not appear transiently in these cultures. However, whether these strains are genetically unable to form iACC or this capability may depend on specific conditions will need to be assessed by future studies. At any rate, the search for ccyA in available cyanobacterial genome sequences allowed the detection of 13 additional iACC-forming strains among the 17 strains whose genomes contained ccyA, largely extending and optimizing the initial detection of 8 iACC-forming strains (i.e., 6 strains whose genomes were used for comparative genomics plus *Synechococcus* sp. PCC 6716 and PCC 6717 whose genomes were recently sequenced) among 58 randomly selected, phylogenetically diverse cyanobacteria
<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Fig. 1.**—Domain architecture of calcyanins, as viewed by HCA. HCA plots of the calcyanin sequences of *Synechococcus calcipolaris* PCC 11701 and *Gloeomargarita lithophora* D10. The protein amino acid sequences (one-letter code) are displayed on a duplicated alpha-helical net, on which the strong hydrophobic amino acids (V, I, L, F, M, Y, and W) are contoured. The latter form clusters, which mainly correspond to the internal faces of regular secondary structures (α-helices and β-strands). The way to read the primary (1D) and secondary (2D) structures is shown with arrows (one amino acid or one hydrophobic cluster after another, respectively), whereas special symbols used for four amino acids with specific structural properties (P, G, S, and T) are described in the inset, together with the color code used to highlight conserved amino acids within the periodic patterns of the two calcyanin sequences. The two distinct CcyA folded domains (~1/3 strong hydrophobic amino acids) are boxed.</figcaption></figure>

(Benzerara et al. 2014). Therefore, the search for *ccyA* occurrence significantly increased the probability of success in finding iACC-forming strains (binomial exact test, *P* = 9.0e-09), indicating that *ccyA* can be used as diagnostic marker of intracellular biomineralization.

Thanks to this approach, we expanded considerably the phylogenetic diversity of known iACC-forming cyanobacteria (fig. 4A). So far, iACC biomineralization had been reported in unicellular cyanobacteria only (Benzerara et al. 2014). Here, we find iACC in several multicellular genera belonging to the most complex morphotypes of the cyanobacterial phylum with cellular differentiation and ramifications (Chlorogloeopsis and Fischeraella). Moreover, we also discovered iACC in *M. aeruginosa*, one of the most common, worldwide-distributed bloom-forming cyanobacteria (Humbert et al. 2013). *Microcystis* shows a life cycle with a benthic phase in winter and a planktonic phase in warmer seasons when cells produce gas vesicles to float in the water column (Reynolds and Rogers 1976; Latour et al. 2007). Considering the high density of ACC relative to cells, a controlled production of dense iACC granules might favor a shift to benthic life. Interestingly, *ccyA* is present in the genome of some closely related *M. aeruginosa* strains but absent from others. This finding may be consistent with the high genome plasticity detected in this species, reflecting frequent horizontal gene transfers (HGTs) (Frangeul et al. 2008; Humbert et al. 2013).

The *ccyA* gene and iACC biomineralization were also found in four *Synechococcus*-like strains previously not known to produce iACC (*Neosynechococcus sphagnicola* sy1, *Synechococcus* sp. RS9917, *Synechococcus lividus* PCC 6715, and *Thermosynechococcus* sp. NK55a). *Synechococcus* is a polyphyletic genus, grouping strains isolated from very different environments (Komarek et al. 2020). We previously reported thermophilic and mesophilic freshwater iACC-biomineralizing *Synechococcus* representatives (Benzerara et al. 2014). Here, we significantly expanded this environmental distribution especially with the inclusion of the first marine (*Synechococcus* sp. RS9917) iACC-forming strain.

## Sequence-Based Analysis of the Calcyanin Structure

With the exception of the *Thermosynechococcus* sp. NK55a calcyanin, fused with a polypeptide containing a PIN-TRAM domain, the other 34 calcyanin family homologs contained 264–375 amino acids (average 336 ± 25; *supplementary table 2*, *Supplementary Material online*). All showed the already mentioned two-domain modularity: a variable N-terminal domain and a conserved C-terminal domain.

The N-terminal domain was composed of hydrophobic clusters with lengths and shapes typical of regular secondary structures found in globular domains (Lamiable et al. 2019). According to their N-terminal domains, we classified the 35 calcyanin homologs into four groups: W, X, Y, and Z (fig. 4B). There was only one calcyanin in the X group. Amino acid
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**FIG. 2.**—EM detection of iACC in 13 calcyanin-bearing cyanobacterial strains not previously known to biomineralize carbonates. STEM-HAADF images of the 13 newly identified iACC-forming strains and overlays of C (blue), Ca (green), and P (red) chemical maps as obtained by EDXS. The name of the strains is provided on the STEM-HAADF image. Numbers in parenthesis correspond to replicate numbers of SEM-EDXS, STEM-EDXS, or both analyses. (A and B) *Chlorogloeopsis fritschii* PCC 9212 (13); (C and D) *Fischerella musicola* PCC 7414 (4); (E and F) *Fischerella* sp. NIES-4106 (5); (G and H) *Microcystis aeruginosa* PCC 7806 (9); (I and J) *M. aeruginosa* PCC 7941 (7); (K and L) *M. aeruginosa* PCC 9443 (3); (M and N) *M. aeruginosa* PCC 9806 (4); (O and P) *M. aeruginosa* PCC 9807 (3); (Q and R) *M. aeruginosa* PCC 9808 (4); (S and T) *Neosynechococcus sphagnicola* sy1 (4); (U and V) *Synechococcus lividus* PCC 6715 (3); (W and X) *Synechococcus* sp. RS9917 (4); (Y and Z) *Thermosynechococcus* sp. NK55 (6).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>**FIG. 3.**—TEM analyses of the four ccyA-harboring strains not forming iACC. Each row corresponds to one strain. The first column shows STEM-HAADF images. The second column shows overlays of C, Ca, and P EDXS maps. The third column shows EDXS spectra of inclusions detected in the cells. (A, B, and C) *Fischerella* sp. NIES-3754. EDXS spectrum is extracted from the area indicated in (A) by a dashed line; (D, E, and F) *Chlorogloeopsis fritschii* PCC 6912. (G, H, and I) *Microcystis aeruginosa* PCC 9432; (J, K, and L) *M. aeruginosa* PCC 9717.</figcaption></figure>

identities between the N-terminal domains of calcyanin homologs were higher than 18%, 84%, and 82% within the W, Y, and Z groups, respectively. The Y-type N-terminal domain consisted of a duplicated small domain (measuring 66 amino acids in length, with a mean identity between the repeated domains in a same protein of 35.6%; **supplementary fig. 4, Supplementary Material online**), which was predicted

to contain five regular secondary structures (labeled a-e in fig. 4). As for X- and Z-type N-terminal domains, they were distinct from known protein domains, as inferred from the absence of significant similarities when searching sequence and domain databases. By contrast, significant sequence similarities were detected between the W-type N-terminal domain and three known domain families (fig. 5): 1) YAM
<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>**Fig. 4.**—Phylogenetic analysis and domain architecture of the calcyanin protein family. (A) Maximum-likelihood phylogenetic tree of Cyanobacteria based on 58 conserved proteins; the strains containing the *ccyA* gene are highlighted in bold and color. (B) HCA plots of representative calcyanin sequences (see fig. 1 for details of the HCA representation). The positions of the domains are indicated, with red boxes corresponding to the duplicated subdomain composing domain Y (labels a–e refer to equivalent hydrophobic clusters). The periodic patterns, made of glycine (or small amino acids—yellow) and hydrophobic amino acids (green) are highlighted for each GlyZip, with conserved signatures specific of each GlyZip shown with other colors. GlyZip2, which is present in only one species in the Y family, is indicated with a dotted box. (C) Unrooted maximum-likelihood phylogenetic tree of the GlyZip domain of calcyanin (left) compared with the species tree based on 58 conserved proteins (right). Numbers on branches indicate bootstrap support (BS, only values >50% are shown), BS of 100% are indicated by black circles. The species names and HCA profiles are color-coded according to the type of N-terminal domain of calcyanins (the code is shown at the bottom of the figure).</figcaption></figure>

domains, found in the cytosolic C-terminus of *Escherichia coli*
Major Facilitator Superfamily transporter YajR (Jiang et al.
2013, 2014); 2) heavy-metal associated (HMA) domains
(also called metal binding domains) present in various proteins
(e.g., P-type ATPases and metallochaperones), generally

involved in metal transport and detoxification pathways (Bull
and Cox 1994); and 3) integrated HMA (iHMA) domains
detected in plant immune receptors, where they are involved
in fungal effector recognition (De la Concepcion et al. 2018).
Similar to these three domains, the W-type N-terminal
A

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>**Fig. 5.**—The CoBaHMA domain. (A) Multiple sequence alignment of calcyanins and members of the HMA superfamily with known 3D structures. Identical amino acids are shown in white on a black background, similarities are colored according to amino acid properties (inset). Sequences of proteins of the HMA superfamily, whose 3D structures are known and with which the CoBaHMA sequences can be aligned, are shown on top. PDB identifiers are provided. Observed 2D structures are boxed. The two cysteines of the CXXC motif specific of the HMA family are boxed in red. Green dots highlight the positions in which the hydrophobic character is strongly conserved, corresponding to amino acids participating in the hydrophobic core of the ferredoxin fold. An additional β-strand, named *β0*, is predicted in the CoBaHMA sequences, including a strictly conserved histidine. (B) Model of the CoBaHMA 3D structure, illustrated here with the *Synechococcus* sp. RS9917 sequence. The HMA common core is colored in beige, whereas specific secondary structures of the CoBaHMA family are in blue. The four highly conserved basic amino acids are shown with atomic details.</figcaption></figure>

domain showed a repeated $\beta-\alpha-\beta$ motif corresponding to a ferredoxin-like fold, characteristic of the HMA superfamily (fig. 5). However, although most HMA domains possess two conserved cysteine residues directly involved in binding heavy metals, YAM, iHMA, and W-type calcyanin N-terminal domains do not conserve these amino acids (fig. 5). Moreover, the W-type domain showed a specific signature consisting of several basic amino acids distributed in strands $\beta1$ and $\beta2$ and a histidine located upstream of strand $\beta1$, in a region appearing as a calcyanin-specific extension of the HMA core (strand $\beta0$ in fig. 5). Therefore, we named this novel domain family CoBaHMA, after domain with Conserved Basic residues in the HMA superfamily. A model of the CoBaHMA 3D structure was built using the experimental 3D structures of the HMA, iHMA, and YAM as templates in Modeller (Webb and Sali 2016). The position of strand $\beta0$ was moreover putatively assigned with reference to the 3D structure of Kipl (pdb 2KWA), based on the results of HH-PRED searches and subsequent superimposition of the 3D corresponding 3D structures (pdb 2RU9 and 2KWA, root mean square value of 2.1 Å on 55 C$\alpha$ superimposed positions). The AlphaFold2 model (pLDDT scores above 85 from aa 7 to 81, with most of the values above 90) agreed with the first proposed model, in particular on the position of strand $\beta0$

relative to the $\beta1-\beta3$ core, but also led to propose a model for strand $\beta4$ as well as to refine the position of amino acids within strand $\beta0$ (fig. 5B). Although the calcyanin sequence of *Synechococcus* sp. Lanier also contained the specific signature of W-type domains with several basic amino acids, it clearly differed from the rest of the W-type N-terminal domains (fig. 5A), suggesting that calcyanin has deeply diverged in this species. Future studies should assess whether these different N-terminal domains can be found in other cyanobacterial proteins.

The C-terminal domain of the different calcyanin types consisted in three repetitions of a ~50 amino acid motif, which was largely apolar and displayed a constant periodicity in hydrophobic and small (glycine/alanine) amino acids (supplementary fig. 5, Supplementary Material online). We called this motif "GlyZip" in reference to the name proposed by Kim et al. (2005) to describe recurrent, short Gly-X(3)-Gly-X(3)-Gly motifs allowing tight packing of transmembrane helices (Senes et al. 2004). However, the calcyanin GlyZip motifs were much longer (12 basic Gly-X(3)-Gly units, interrupted in their middle by a central, highly conserved Gly-Pro dipeptide) than those already known at the 3D level, which generally contained no more than three such units (Leonov and Arkin 2005). Moreover, they did not share any obvious
sequence similarity with known domains, suggesting that these repeated motifs form a novel architecture. The repeated presence of glycine and hydrophobic amino acids every four amino acid residues over a large sequence length, with an unusual persistence of this periodic motif across the different cyanobacterial lineages (especially for the first repeat) suggests that it may form compact and highly constrained assemblages of helices compatible with a membrane-embedded structure. These assemblages might resemble homo-oligomeric structures formed by short subunits, such as the c-rings of sodium-translocating ATP synthases (Kuehlbrandt 2019), which share similar, albeit smaller, glycine zippers. Analysis of multiple sequence alignments (supplementary fig. 5, Supplementary Material online) allowed discriminating each of the three GlyZip calcyanin motifs based on specific signatures, including the presence of aromatic and polar amino acids, outside the repeated patterns. In particular, a tryptophan and a glutamic acid were strictly conserved in the third GlyZip motif in all calcyanin sequences. The second GlyZip motif of several calcyanin sequences matched part of a family model called PdsO (sortase-associated OmpA-like protein), found in, for example, *Shewanella oneidensis* (see NCBI Conserved Domain Database [CDD] annotations in supplementary table 2b, Supplementary Material online). The matching region, located before the OpmA-like C terminal domain, shows the typical features of a GlyZip unit (supplementary fig. 6, Supplementary Material online) and is present as a single copy in PdsO, suggesting that this basic unit evolved within calcyanin by triplication and enrichment in polar amino acids (see below). Last, among Y-type calcyanins, only that of *Fischerella* sp. NIES-4106 possessed all three GlyZip motifs. By contrast, all other Y-type calcyanins, including those found in iACC-forming strains, contained only the first and third GlyZip motifs. This suggests that calcyanins with only two GlyZip motifs remain functional (supplementary fig. 5, Supplementary Material online). Interestingly, although it did not match the characteristic GlyZip profile, the duplicated domain found in the N-terminal region of Y-type calcyanins was also largely apolar and rich in small amino acids so as in GlyZip motifs.

## Calcyanin May Be Involved in Ca Homeostasis

In *C. fritschii* PCC 9212 and PCC 6912, the genes located directly upstream and downstream of *ccyA* were annotated as encoding a Ca(2+)/H(+) antiporter and a Na(+)-dependent bicarbonate transporter *BicA*, respectively (supplementary table 4, Supplementary Material online). This is particularly interesting because bicarbonate and calcium are obvious crucial ingredients for the synthesis of CaCO₃. Moreover, these two transporter genes are located on the same DNA strand as *ccyA* and may therefore be transcribed simultaneously with *ccyA* in a single mRNA, although this will have to be tested by future studies. By searching homologs of

these two transporters in our complete data set of 602 cyanobacterial genomes (i.e., the genomes of the 8 iACC-forming strains described by Benzerara et al. 2014 plus the 594 genomes in which we searched for new *ccyA* homologs), we observed that their combined presence was significantly associated with that of *ccyA* ($\chi^2$ test, P value = 1.4e-08; supplementary table 5, Supplementary Material online). Indeed, all 35 genomes harboring *ccyA* had at least one copy of both genes, except *Synechococcus* sp. Lanier, which lacked *BicA*. The latter strain was also deviant from other *ccyA*-harboring strains based on very atypical N-terminal and C-terminal cyanin sequences. Because this strain was not available for EM analysis, we could not test if it contained iACC or not. By contrast, among the 567 genomes lacking *ccyA*, only 293 contained both transporter genes. Interestingly, in *Fischerella* sp. NIES-4106 megaplasmid, *ccyA* was located downstream a calcium/proton exchanger (sharing 92.9% identity with the above-mentioned antiporter of *C. fritschii* PCC 9212 and PCC 6912), in a region containing several additional genes potentially involved in biomineralization, such as two cation-transporting ATPases and a carbonic anhydrase (supplementary fig. 7, Supplementary Material online). Overall, the correlation and/or colocalization of *ccyA* and genes involved in Ca or HCO₃⁻ transport and homeostasis supports the hypothesis of a functional role of calcyanin in Ca-carbonate biomineralization.

Attempts to obtain *ccyA* deletion mutants in the iACC-forming strains *Synechococcus* sp. PCC 6312 were unsuccessful but there is no certainty at this point that the employed technique can generate deletion mutants in this strain. Some possibilities to be further explored in the future are that *ccyA* deletion is lethal and/or increase the sensitivity to toxicity by calcium, suggesting that this gene may carry out an essential function in these cyanobacteria. In the absence of a direct loss-of-function genetic analysis, we overexpressed the *ccyA* genes of the two evolutionary distant cyanobacteria *Synechococcus* sp. PCC 6312 and *G. lithophora* in the non-iACC-forming, but genetically manipulable host, *Synechococcus elongatus* PCC 7942, which does not originally contain *ccyA*. Investigation by EM-associated elemental chemical analyses of *S. elongatus* PCC 7942 cells overexpressing these *ccyA* genes did not show the presence of typical iACC (i.e., inclusions with Ca only and little to no P), whereas polyphosphate inclusions were found in cells of all mutants (fig. 6 and supplementary fig. 8, Supplementary Material online). However, the comparison of Ca chemical maps of *S. elongatus* PCC 7942 mutants harboring the empty plasmid (pC) and mutants harboring its derivative expressing the *ccyA* genes (pC-*ccyA*<sub>Gloeo</sub> and pC-*ccyA*<sub>AS6312</sub>) showed differences. No Ca hotspot was observed in cells with the empty plasmid (pC) sampled at two different growth stages, over a total of 135 counted polyphosphate inclusions. By contrast, 23 (pC-*ccyA*<sub>Gloeo</sub>) and 10 (pC-*ccyA*<sub>AS6312</sub>) Ca hotspots were
<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>**Fig. 6.**—SEM analyses of mutants overexpressing *ccyA*. SEM-EDXS images (in BSE mode), P (green), and Ca (red) maps of *Synechochoccus elongatus* PCC 7942 mutants. The scale bar provided on the BSE images is the same for the corresponding P and Ca maps on each row. The 0.2 µm pores of the filters appear as dark disks in the BSE images. At the accelerating voltage used for these analyses, *S. elongatus* cells appear as relatively transparent, packed rods. Polyphosphate inclusions appear as brighter dots. The first three rows show cells of a *S. elongatus* PCC 7942 mutant harboring the empty pC plasmid. No Ca-rich inclusions are observed in these cells as shown by the homogeneous background in the Ca maps. In contrast, Ca-rich inclusions (polyphosphates) are observed in cells of *S. elongatus* PCC 7942 mutants harboring the plasmids *pC-ccyAGloeo* (fourth row) or *pC-ccyAS6312* (fifth and sixth rows), appearing as hotspots in Ca maps. See **supplementary data 3**, **Supplementary Material online** for details concerning the plasmid and strains.</figcaption></figure>

detected over a total of 117 and 90 polyphosphate inclusions observed in the *pC-ccyAGloeo* and *pC-ccyAS6312* mutants, respectively (fig. 6). The Ca detection limit of scanning electron microscopy (SEM)-EDXS is not precisely known and we likely overlook some Ca. Future studies using more sensitive spatially resolved techniques will be required to have more quantitative assessment of the Ca enrichment in these cells. However, these results suggest that higher amounts of Ca were sequestered within

polyphosphate inclusions when *ccyA* was present and that this gene may be functionally involved in Ca homeostasis, via a molecular process that remains to be fully elucidated.

## Phylogenetic Distribution and Evolution of Calcyanin

Whatever the function of this diagnostic gene family, constructing its phylogeny allows to infer the possible
evolutionary history of iACC biomineralization. We placed the species containing the *ccyA* gene on a general phylogeny of cyanobacteria constructed using 58 conserved proteins (supplementary table 6, Supplementary Material online). The four calcyanin types were found in various lineages widely dispersed across this cyanobacterial tree (fig. 4A). Whereas the X, Y, and Z types showed a distribution restricted to some particular clades (*Gloeomargarita*, *Fischerella* and closely related genera, and *Microcystis*, respectively), the CoBaHMA domain (i.e., W-type) was found in several distantly related branches (fig. 4A). Similarly, *ccyA* was detected in all the species of some clades (e.g., the *Cyoanothece-Synechococcus-Thermosynechococcus* clade), suggesting that it already existed in the genome of their last common ancestor, whereas it is missing in some species of other clades such as the *Chlorogloeopsis-Fischerella* one, suggesting several independent losses and/or HGT events. To better characterize these evolutionary processes, we reconstructed the phylogeny of calcyanin using the conserved GlyZip domain sequences and compared it with the corresponding cyanobacterial species tree (fig. 4C). Despite a weaker resolution of the deep branches, reflecting the higher sequence variability of calcyanin, we retrieved the monophyly of most of the groups as found in the species tree (fig. 4C), supporting the idea that *ccyA* was ancestral in these groups, and that the *ccyA*-lacking species most likely lost it secondarily. To further compare the two trees, we carried out an approximately unbiased (AU) test (Shimodaira 2002). Whereas the species tree topology was not rejected by the GlyZip data set (*P* value = 0.64), the GlyZip topology was strongly rejected by the data set of conserved proteins used to build the species tree (*P* value = 0.00198). This strongly suggests that the differences between both trees were due to the smaller amount of phylogenetic signal contained in the GlyZip sequences compared with the set of conserved proteins and that the GlyZip sequences have evolved following the species evolution.

The overall congruence between the two trees, both retrieving the monophyly of several large cyanobacterial clades (fig. 4C), supports a very ancient origin of *ccyA* in cyanobacteria, with independent losses in various lineages. The alternative scenario of a more recent origin of *ccyA* in one group followed by its transfer to the rest by HGT was unlikely given the congruence of both trees and the extreme divergence of the N-terminal domains among the different types of calcyanin (fig. 4B). Because of its larger phylogenetic distribution, the CoBaHMA-type seemed to be the most ancient calcyanin version, whereas the Y- and Z-types have likely evolved in cyanobacterial groups that diverged more recently. The situation is less clear for the X-type due to its exclusive presence in *G. lithophora*, the so far single representative species of the poorly known Gloeomargaritales. As mentioned above, the N-terminal domains of these four types of calcyanin did not share any apparent sequence similarity (fig. 4B). This could reflect either an extreme divergence from a common

ancestral domain, potentially following the adaptation of the species to their habitat needs, or the independent recruitment of nonhomologous domains generating the different calcyanins by their fusion to the conserved GlyZip C-terminal domain.

To investigate if calcyanin might have originated before the diversification of cyanobacteria, we used our HMM profile to search for the GlyZip domain in other sequences present in the NCBI nonredundant database. We found homologs with a complete C-terminal domain in only five noncyanobacterial species: an uncultured candidate phyla radiation *Gracilibacteria* genome and four gammaproteobacteria of the Methylococcales order. We included these new sequences in a phylogenetic analysis of the GlyZip domain and found that they did not form a monophyletic group but branched intermixed with the cyanobacterial sequences (supplementary fig. 9, Supplementary Material online). On the one hand, the *Gracilibacteria* sequence was very close to the *Fischerella-Chlorogloeopsis* group and, in agreement with this similarity of the GlyZip domain, it also contained the typical Y-type N-terminal domain found in these cyanobacteria. On the other hand, the Methylococcales sequences branched close to the *Microcystis* group and, consistently, their N-terminal domains showed some similarity with the Z-type domains of the *Microcystis* sequences. This phylogeny and the extremely sparse distribution of *ccyA* outside the Cyanobacteria phylum suggest that these few noncyanobacterial species acquired their *ccyA* genes by HGT from *Fischerella-* and *Microcystis*-like donors, respectively. It will be interesting in future work to investigate the possible presence of iACC inclusions in these bacteria.

## Conclusions

Here we show that the newly identified *ccyA* gene family, belonging to the genomic “dark matter” (i.e., unclassified or poorly understood genetic material) of cyanobacteria, can be used as a diagnostic iACC biomineralization marker. The *ccyA*-encoded calcyanin protein has a unique architecture composed of highly divergent N-terminal domains fused with a novel, much more conserved GlyZip-containing C-terminal domain, which may adopt an original, not yet described fold. Among the diverse N-terminal domains of calcyanin that we have identified here, the domain family that we named CoBaHMA is found in the most widespread, and likely most ancient, calcyanin version. This domain family likely supports an as-yet undisclosed function within the HMA superfamily, associated with a patch of conserved basic amino acids. By tracking this gene in available genome databases, we uncovered a diversity of *ccyA*-bearing cyanobacteria capable of iACC biomineralization that is phylogenetically and environmentally much broader than previously thought, supporting a potential environmental significance. Moreover, the distribution and phylogeny of *ccyA* suggest that iACC
biomineralization is ancient, with independent losses in various lineages. Additional genes are likely involved in iACC formation but, unlike *ccyA*, they may not be specific to this function and/or they are not shared by all iACC-forming cyanobacteria. The specific distribution of *ccyA* in iACC-forming cyanobacteria, its correlated presence with bicarbonate and calcium transporters, and genetic analyses, all support a pivotal role of *ccyA* in iACC biomineralization. Further investigations are required to determine whether this function may involve the conserved glutamic acid residues of the C-terminal domain, reminding Glu-rich proteins involved in ACC biomineralization (Aizenberg et al. 2002), or the basic amino acids in the N-terminal domain, which may stabilize dense liquid phases of $CaCO_3$ and delay the formation of ACC (Finney et al. 2020). Alternatively, calcyanin may have a more indirect role in iACC biomineralization serving as a cation transporter or a signaling molecule. In any case, iACC biomineralization clearly appears as an original case of controlled biomineralization in bacteria.

# Materials and Methods

## Identification of Candidate iACC-Specific Orthologous Groups

In a first step, the 56 genomic assemblies used to identify groups of orthologous genes specific to iACC-forming cyanobacteria (supplementary table 1, Supplementary Material online) were retrieved from the NCBI database. The 523,680 translated CDSs derived from these genomes were processed using OrthoMCL with default settings (Li et al. 2003). This analysis included an all-versus-all BLASTp routine ($E$-value < 1e-05) and a clustering procedure into orthologous groups using the MCL algorithm.

## Iterative Search for Homologs of Calcyanin in Cyanobacterial Genomes

Homologs of calcyanin were searched based on similarities of the conserved C-terminal domain in 594 available genomes of cyanobacteria using an iterative process. This search data set corresponded to the NCBI genome assemblies assigned to Cyanobacteria, published online before December 1, 2017 (except the six identified in the first step, see above). For each genome assembly, we iteratively searched for homologs of calcyanin in the first set of amino acid sequences available in the following ordered list (supplementary data 2, Supplementary Material online): 1) translated CDS or 2) proteins in RefSeq annotation records, 3) translated CDS or 4) proteins in GenBank annotation records.

A multiple sequence alignment of the conserved C-terminal domain was built for the six calcyanin sequences identified in the first step (see above), using MAFFT (Katoh and Standley 2013). A HMM profile was generated based on this alignment with the program hmmbuild from the HMMER package

(version 3.3) (Eddy 2011). The options wbllossum with wide 0.62 were used to downweight closely related sequences and upweight distantly related ones. To avoid biases toward glycine-rich unrelated proteins, we artificially reduced glycine weight by 20% in the profiles. The profile versus sequence similarity search was done with the program hmmsearch ($E$-value < 1.0e-70). The hits matching 100% of the profile length and corresponding to newly identified sequences were added to the new calcyanin data set. The multiple sequence alignment and the HMM profile of this data set were then updated. These steps (alignment, building of HMM-profile, similarity search) were repeated until no new sequence was detected. In order to detect remote homologs of calcyanin, seven iterations of the entire process were done as described in supplementary table 7, Supplementary Material online, with a progressive decrease of the stringency of the similarity search. In the beginning, we set a very low $E$-value and high cover to the profile. As the iterations proceeded, we increased the $E$-value and decreased the cover to the profile down to 70%. This cover threshold higher than 66% was designed to avoid (Gly)2 (instead of (Gly)3) to be matched. At the end of the whole process, we used the final HMM profile (as provided in supplementary data 3, Supplementary Material online) to search for similarities in the GenBank records of the processed genomic assemblies.

Last, *ccyA* was searched in the newly sequenced genomes of *Synechococcus* sp. PCC 6716 and PCC 6717 using tBLASTn with all previously identified *ccyA* sequences as queries. The CDS boundaries of the best BLAST hits were further assessed using Prodigal (Hyatt et al. 2010).

## Comparative Genomics of *C. fritschii* PCC 6912 (No iACC Observed) and *C. fritschii* PCC 9212 (with iACC)

The search of homologous genes shared by *C. fritschii* PCC 6912 and PCC 9212 genomes was achieved based on unidirectional BLASTp best hits as implemented in the PATRIC proteome comparison tool (Gillespie et al. 2011) ($E$-value < 1.0e-05, sequence coverage > 30%). For each genome assembly, we used the set of translated CDS as provided in the RefSeq annotation record. Gene functional categories were searched in COG database (v1) using CD-search (Marchler-Bauer and Bryant 2004) ($E$-value < 1.0e-05). The nucleotide sequences of the *ccyA*-containing contigs of *C. fritschii* PCC 6912 and PCC 9212 (NCBI accessions NZ_AJLN01000033.1 and NZ_AJLM01000017.1, 97,542 and 97,528 bp, respectively) were compared using BLASTn.

## Search for Homologs of the Ca(2+)/H(+) Antiporter and BicA Na(+)-Dependent Bicarbonate Transporter in Cyanobacterial Genomes

Homologs of the Ca(2+)/H(+) antiporter and the Na(+)-dependent bicarbonate transporter BicA, encoded in *C. fritschii* PCC 6912 and PCC 9212 by the genes located upstream and
downstream of *ccyA*, respectively, were searched using BLASTp (*E*-value < 1.0e-10) in our complete data set of 602 cyanobacterial genomes (composed of the 8 iACC-forming strains described by Benzerara et al. [2014] in which we initially detected *ccyA* and by the 594 genomes in which we iteratively searched for new *ccyA* homologs in a second step). Owing to the incompleteness of the *ccyA*-upstream gene in the genomic sequence of these two strains, we used the most similar full-length sequence as Ca(2+)/H(+) antiporter query (96% identity; accession WP_016868870.1, *Fischerella muscicola* PCC 7414). BicA homologs were identified using the protein sequence from C. *fritschii* PCC 6912 and PCC 9212 as query (accession WP_016872894.1).

## Calcyanin Functional Annotation and Structure Prediction

The structural features of calcyanin were explored based on the information provided by amino acid sequences using HCA (Callebaut et al. 1997; Bitard-Feildel et al. 2018). HCA provides a global view of the protein texture, with insights into the structural features of foldable regions (Bitard-Feildel et al. 2018). Similarities between domains composing calcyanin and known domains/3D structures were searched against different databases (NCBI nr sequence database, NCBI Conserved Domain Database [CDD] [Yang et al. 2020], and the Protein Data Bank [PDB]) using tools for profile-sequence and profile-profile comparison such as PSI-BLAST (Altschul et al. 1997) and HH-PRED (Zimmermann et al. 2018), respectively.

Three-dimensional structure modeling was performed using Modeller 9.23 (Webb and Sali 2016). This modeling was refined afterwards using AlphaFold (Jumper et al. 2021), through the notebook Alphafold2 advanced from Colabfold (Mirdita et al. 2021) (https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb). The full sequence of *Synechococcus* sp. RS9917 *CcyA* and the multiple sequence alignment of the 15 reported CoBaHMA-bearing *CcyA* were used as input. Three-dimensional structures were visualized using UCSF Chimera (Pettersen et al. 2004). Multiple sequence alignment handling and rendering were made using SeaView (Gouy et al. 2010) and EsPript (Robert and Gouet 2014), respectively.

## Molecular Phylogenetic Analyses

Phylogeny of cyanobacteria using different sets of species was reconstructed using 58 conserved proteins (Moreira et al. 2017; supplementary table 6, Supplementary Material online). Each individual protein was aligned using MAFFT with the accurate L-INS-I option (Katoh and Standley 2013) and poorly aligned regions were removed with *trimAl*-automated1 (Capella-Gutiérrez et al. 2009). Trimmed alignments were concatenated to produce a supermatrix and maximum-likelihood phylogenetic trees were reconstructed with the program IQ-Tree using the mixture model LG+C60+F+G

(Nguyen et al. 2015). Statistical support was estimated using 1,000 bootstrap replicates. The phylogeny of calcyanin was studied using the manually curated alignment of the conserved GlyZip C-terminal domain. A maximum-likelihood tree was constructed with the program IQ-Tree using the mixture model LG+C20+F+G (Nguyen et al. 2015). Statistical support was estimated using 1,000 bootstrap replicates.

Tree topologies based in the set of 58 conserved proteins (species tree) and in the GlyZip C-terminal domain of calcyanin were compared using the AU test (Shimodaira 2002) implemented in IQ-TREE with the options -n 0 -zb 10,000 -au -zw (Nguyen et al. 2015). The sequence evolution models used were, as before, LG+C60+F+G for the conserved protein data set and LG+C20+F+G for the GlyZip data set.

## Electron Microscopy Analyses of iACC

Strains recovered from culture collections were analyzed by scanning transmission electron microscopy (STEM) for iACC search. As previously shown by Benzerara et al (2014), Li et al. (2016), and De Wever et al. (2019), iACC can be recognized based on the fact that they mostly contain Ca with little to no P, whereas polyphosphate inclusions show a major P peak with Mg, K, and/or Ca. For that purpose, we used a field emission gun JEOL-2100F microscope operating at 200 kV, equipped with a JEOL detector with an ultrathin window allowing detection of light elements. STEM allowed Z-contrast imaging in the high angle annular dark field (HAADF) mode. EDXS analyses rely on the detection of X-rays emitted by samples excited by the electron beam. Their energy is characteristic of the atoms and their intensity depends on the atomic content. Compositional maps of Ca, P, and C were acquired by performing EDXS analysis in the STEM HAADF mode. These EDXS analyses provide hyperspectral data, that is, an image with EDXS spectra for each pixel of the image. For these analyses, a total of 0.5 mL of cultures aged between 5 and 30 days was centrifuged at 8,000 × g for 10 min. Pellets were rinsed three times in Milli-Q (mQ) water (Millipore). After the final centrifugation, pellets were suspended in 200 µL of mQ water. A drop of 5 µL was deposited on a glow discharged carbon-coated 200-mesh copper grid and let dry at ambient temperature.

For iACC-forming strains, we systematically measured several replicates by STEM and/or EDXS associated with SEM. Even more effort was invested in the analysis of strains harboring *ccyA* but not showing iACC. Indeed, although showing the presence of iACC in a strain only requires one single positive observation, concluding about the absence of iACC is difficult, if not impossible. For *Fischerella* sp. NIES-3754, we performed seven different SEM or STEM sessions over four different cultures, including two on the same culture with a 15 days interval and three on a second culture with 3 and 9 days interval. For C. *fritschii* PCC 6912, we performed eight different SEM or STEM sessions over five different cultures,
including three on the same culture with a 4 and 6 days interval and two on another culture with a 15 days interval. For *M. aeruginosa* PCC 9432, we performed seven different SEM or STEM sessions over four different cultures, including two on the same culture with a 3 days interval and three on another culture with 3 and 8 days interval. For *M. aeruginosa* PCC 9717, we performed six different SEM or STEM sessions over four different cultures, including two on the same culture with a 3 days interval and two on another culture with 25 days interval.

Mutant strains of *S. elongatus* PCC 7942 harboring the pC, pC-ccy*A<sub>Gloeo</sub>o, or ccy*A<sub>S6312</sub> were analyzed by SEM in the backscattered electron (BSE) mode, coupled with EDXS analyses to search for Ca enrichment. Analyses were replicated twice on at least three and up to six areas. Ca hotspots were identified each time and the signal in the Ca energy range was higher than the background by 1σ. One example of EDXS spectrum is provided per type of mutant in **supplementary figure 8**, **Supplementary Material online**.

## Genetics

The pC-ccy*A<sub>Gloeo</sub>o and pC-ccy*A<sub>S6312</sub> plasmids were derivatives of the RSF1010-derived pC vector (Veaudor et al. 2018) replicating in *E. coli* (supplementary table 8 and fig. 10, Supplementary Material online). Chenebault et al. (2020) showed that this expression plasmid allowed strong gene expression in cyanobacteria. The pC-ccy*A<sub>Gloeo</sub>o and pC-ccy*A<sub>S6312</sub> plasmids were transferred to *S. elongatus* PCC 7942 by transconjugation (Mermet-Bouvier and Chauvat 1994), using the improved triparental-mating protocol that follows. Overnight-grown cultures of the *E. coli* strains CM404, which propagates the self-transferable mobilization vector pRK2013, and TOP10, which propagates either pC, pC-ccy*A<sub>Gloeo</sub>o, or pC-ccy*A<sub>S6312</sub>, were washed twice and resuspended in LB medium (1 × 10⁹ cells·mL⁻¹). Meanwhile, *S. elongatus* PCC 7942 mid-log phase cultures grown in mineral growth medium (MM, a version of BG-11 supplemented with 3.78 mM Na₂CO₃) were centrifuged and concentrated five times (about 1 × 10⁸ cells/mL) in fresh MM. Then, 100 µL of *S. elongatus* PCC 7942 cells were mixed with 30 µL of CM404 cells and 30 µL of TOP10 cells harboring either pC, pC-ccy*A<sub>Gloeo</sub>o, or pC-ccy*A<sub>S6312</sub>. A total of 30 µL aliquots of this mixture were spotted onto MM solidified with 1% agar (Difco), and incubated for 48h under standard temperature (30 °C) and light (2,500 lux, i.e., 31 µE·m⁻²·s⁻¹) conditions. Then, cells were collected from each plate and resuspended into 50 µl of liquid MM, prior to plating onto MM containing 5 µg·mL⁻¹ of each the streptomycin (Sm) and spectinomycin (Sp) selective antibiotics. After about 10 days of incubation under standard light and temperature conditions, Sm⁴SpR⁻-resistant conjugant clones were collected and restreaked onto selective plates, prior to analyzing their plasmid content by PCR and DNA sequencing (Eurofins Genomics) using specific primers

(supplementary data 1c and 1d and fig. 10, Supplementary Material online).

## Supplementary Material

Supplementary data are available at *Genome Biology and Evolution* online.

## Acknowledgments

We thank two anonymous reviewers for their constructive comments which improved the overall quality of the manuscript. We thank Alexis De Wever and Marine Blondeau for helping acquiring some TEM data. We thank Mélanie Poinsot for helping in the preparation of some samples for transmission electron microscopy analyses. We thank Eva Jahodarova for shipping a culture of *Neosynehcococcus sphagnicola*. This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR Harley, ANR-19-CE44-0017-01; ANR PHOSTORE, ANR-19-CE01-0005) and the European Research Council under the European Union's Seven Framework Program: ERC grants Calcyan (PI: K. Benzerara, grant agreement no. 307110) and PlastEvol (PI: D. Moreira, grant agreement no. 787904). Sigrid Görgen PhD grant was funded by the Sorbonne Université doctoral program Interfaces pour le Vivant.

## Author Contributions

K.B.E., E.D.U., C.C.C., F.C.H., D.M.O., P.L.G., and I.C.A. conceived and designed the work. K.B.E., E.D.U., T.B.F., G.C.A., C.C.C., M.D.E., I.D.I., G.G.A., M.G.U., S.G.O., F.S.P., D.M.O., and I.C.A. acquired, analyzed, and/or interpreted data. K.B.E., E.D.U., C.C.C., F.C.H., M.G.U., P.L.G., D.M.O., and I.C.A. drafted the work or substantively revised it.

## Data Availability

Further information and requests for resources, codes and reagents should be directed to and will be fulfilled by the lead contact, Karim Benzerara (karim.benzerara@upmc.fr).

* Plasmids and mutant strains generated in this study are available upon request to the lead contact.

* The genomic assemblies are available at GenBank as follows:

*Synechococcus calcipolaris* PCC 11701—BioProject PRJNA800269

*Synechococcus* sp. PCC 6716—BioProject PRJNA801107

*Synechococcus* sp. PCC 6717—BioProject PRJNA801158

Accession numbers are listed in the key resources table.

* TEM-EDXS and SEM-EDXS data and the structure of the CoBaHMA domain have been uploaded to Zenodo: 10.5281/zenodo.5964253. DOIs will be listed in the key resources table.