# DE LA TOMOGRAPHIE OPTIQUE PAR COHÉRENCE PLEIN CHAMP (FFOCT)
# À LA TOMOGRAPHIE OPTIQUE PAR TRANSMISSION PLEIN CHAMP (FFOTT)

Viacheslav MAZLIN<fnref n="1" />, Samer ALHADDAD<fnref n="1" />, Martine BOCCARA<fnref n="2" />, Thomas MALDINEY<fnref n="3" />,
Olivier TOUVENIN<fnref n="1" /> et Claude BOCCARA<fnref n="1" />*

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

La tomographie par cohérence optique ou OCT a révolutionné le diagnostic oculaire. Nous avons proposé une variante de l'OCT, dite « plein champ » (FFOCT) dont les principales applications se sont situées en cancérologie ex et in vivo. Nous souhaitons ici introduire une nouvelle méthode de tomographie plein champ par transmission (FFOTT) et comparer les avantages et inconvénients des deux méthodes.

https://doi.org/10.1051/photon/202312331

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## PRINCIPE ET MONTAGE DE FFOCT ET FFOTT

La tomographie optique cohérente est une technique interférométrique mise au point en 1991 et qui a eu un impact majeur dans l'imagerie de l'œil en permettant l'observation des couches cellulaires de la rétine en coupe virtuelle (voir l'article publié dans Photoniques N95, [1]). Après plus de vingt ans d'utilisation de cette méthode de tomographie optique pour laquelle le « sectionnement optique » est obtenu par l'utilisation d'interférences avec des sources à spectres larges, nous avons récemment proposé une nouvelle méthode de tomographie optique par

transmission basée sur l'utilisation de la phase de Gouy.

Un montage permettant l'observation du même plan de sectionnement optique par les deux méthodes est présenté sur la figure 1. En suivant les chemins de la lumière nous nous posons de décrire les deux méthodes que nous illustrerons par la suite.

Le but des deux méthodes de tomographie que nous décrivons ici est d'observer des échantillons dont les microstructures diffusent la lumière, comme les organelles des cellules, ou les fibres de collagène des tissus biologiques.

FFOCT est une technique interférométrique dans laquelle la lumière

rétrodiffusée par l'échantillon diffusant interfere avec le faisceau de référence réfléchi par un miroir (encadrement bleu de la figure 1). D'un autre côté, FFOTT est aussi une approche interférométrique opérant par transmission et utilisant un chemin optique commun : le faisceau lumineux incident se propage, en effet, le long du même chemin que le faisceau diffusé par l'échantillon (encadrement rouge de la figure 1). Bien que se propageant le long du même chemin, le faisceau d'éclairage et le faisceau échantillon interfèrent avec un déphasage qui varie entre -π/2 et π/2 autour du foyer de l'objectif de microscope sur une distance sensiblement égale à la profondeur

<footnote n="1">¹Institut Langevin ESPCI Université PSL, 1 rue Jussieu 75005 Paris</footnote>

<footnote n="2">²ISYEB, Muséum National d'Histoire Naturelle, Sorbonne Université, 57 rue Cuvier, 75005 Paris</footnote>

<footnote n="3">³Service de Réanimation - Surveillance Continue, Centre Hospitalier William Morey, 4 rue Capitaine Drillien, 71100 Chalon-sur-Saône</footnote>

<footnote>*claude.boccara@espci.fr</footnote>
de champ de l'objectif du microscope et qui se nomme déphasage de Gouy.

Nous sommes tous familiers de l'utilisation l'interféromètre de Michelson et de sa variante Linnik (avec un objectif dans chacun des bras) que l'on voit sur la figure 1, dans ce cas le « sectionnement » optique dans le milieu diffusant et la sélection des photons balistiques rétrodiffusés (ceux qui ont échappé à la diffusion) sont en général imposés par la longueur de cohérence temporelle de la source (liée à sa largeur spectrale). Mais nous utilisons aussi des sources incohérentes spatialement comme les LEDs qui sont peu bruyantes et permettent une détection, avec des caméras, limitée par le bruit shot avec un rapport signal sur bruit de la centaine de dB pour une mesure moyennée sur une seconde (2).

Sans doute sommes-nous moins familiers de « la phase de Gouy » dé couverte par ce très talentueux physi cien lyonnais il y a plus d'un siècle. Le déphasage de Gouy est un déphasage de $\pi$ qui se produit lorsqu'une onde convergente passe par son centre, il s'agit d'une propriété générale de toutes les ondes (électromagné tiques, acoustiques, etc.). Le dépha sage de $\pi$ est associé à une structure d'onde à 3 dimensions (comme celle d'une onde optique issue d'un objec tif de microscope) et il est différent ($\pi/2$) pour une onde à 2 dimensions (comme une onde acoustique issue d'une barrette ultrasonore).

Pour se donner une idée de la PSF axiale que l'on obtient en FFOTT, nous utilisons l'approximation gaus sienne du faisceau issu de la diffusion de la lumière par une particule afin de disposer d'une expression ana lytique simple (3) : un objet de très petite taille éclairé par une onde in cidente diffuse une onde quasi-sphé rique dont l'ouverture angulaire est limitée par celle de l'objectif de mi croscope. Les ondes incidentes et dif fusées interférent, et sur la caméra on observe alors une image limitée par la diffraction avec une intensité plus faible ou plus forte que le fond

traversée de l'échantillon (aberra tions, diffusion). Pour un échantil lon dont l'épaisseur est supérieure à la longueur de transport, longueur au bout de laquelle les photons inci dents ont perdu la direction de leur vecteur d'onde initiale (typiquement 1 mm dans les tissus biologiques), la perte de cohérence spatiale annihi lera le signal d'interférence. FFOTT sera donc principalement limité aux échantillons optiquement peu épais ou transparents.

Les points qui sont, par contre, à l'avantage de l'OTT se trouvent dans le niveau des signaux détectés. En effet les objets qui diffusent la lumière, dès qu'ils possèdent une taille supérieure au quart de la longueur d'onde $\lambda$ de d'éclairage, le font préférentiellement vers l'avant : par exemple pour un ob jet de taille $\lambda/2$ un calcul de diffusion de Mie montre que la section efficace de diffusion est mille fois plus grande vers l'avant (ici transmission) que vers l'arrière (rétrodiffusion).

Le choix de l'ouverture numérique d'éclairage (ONe) en transmission est aussi critique : si l'échantillon est constitué de structures de tailles $<< \lambda$, les angles de diffusion couvriront l'ONo de l'objectif quel que soit ONe et on atteindra la résolution, donc la profondeur de champ de l'objectif. Si la diffusion est très anisotrope, il faudra augmenter ONe sans toute fois atteindre ONo ce qui risquerait de trop réduire la cohérence spatiale (Théorème de Van Cittert Zernike).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.** Montage permettant l'observation d'une même "tranche" d'un échantillon diffusant par FFOCT (encadrement bleu) et FFOTT (encadrement rouge). Figure adaptée de la référence (3).</figcaption></figure>

selon que l'objet se trouve avant ou après le foyer (interférence construc tive ou destructive).

## MÉRITES ET LIMITES DE FFOCT ET FFOTT

On peut voir sur la figure 1 à quel point le montage de FFOTT est simple, ce pendant la première limite qu'il est aisé de se représenter est que, à la différence de FFOCT qui utilise un faisceau de référence qui n'a pas été dégradé au cours de sa propaga tion, FFOTT utilise un faisceau de référence qui sera perturbé par la

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2.** La partie supérieure de la figure schématise le principe de l'OTT. En dessous les images représentent, autour du foyer, l'amplitude du champ diffusé (A), sa phase (B), la forme du signal d'interférence pour une modulation périodique (C) ou aléatoire (D) de la distance particule/objectif.</figcaption></figure>
TOMOGRAPHIE OPTIQUE DOSSIER

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3.** Tomographie statique et dynamique du flux sanguin en FFOCT et OTT chez l'embryon de poisson zèbre. Barres d'échelle : 20 µm. Figure adaptée de la référence (4).</figcaption></figure>

## DOMAINES APPLICATIFS

### Domaine biomédical

A l'aide du montage de la figure 1 nous pouvons comparer les images des mêmes

champs obtenus par FFOCT et FFOTT. Les résultats obtenus sur l'embryon de poisson zèbre sont représentés sur la figure 3. Ces dernières années, ●●●

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4.** FFOTT encytologie dynamique en mycologie médicale. A: Vue macroscopique d'une culture solide de *Candida albicans*. B: FFOTT statique de *Candida albicans* (100×). C: Examen direct obtenu en FFOTT dynamique (100×). D: Composante spectrale moyenne du signal obtenu en FFOTT dynamique et largeur spectrale associés et F: Composante liée à la variation d'amplitude du signal obtenu en OTT dynamique (100×). Barre d'échelle = 3 µm. Les flèches noires pointent le noyau des levures, la flèche blanche pointe les vacuoles des levures.</figcaption></figure>

## GUIDES DE LUMIÈRE EN FIBRE DE VERRE

### Reprise de l'activité

Corning SAS

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

## FIBRES SOUPLES

Embouts spécifiques compatibles aux systèmes d'éclairage

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

## BARREAUX RIGIDES

Transmission lumineuse exceptionnelle
ON > 0,37

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

## CONÇUS À FAÇON

## ULTRA RÉSISTANTS

* Autoclave, substances chimiques

* Analyse médicale

* Pièces à mains dentaires

* Aéronautique

* Contrôle de processus

* Mesures industrielles

* Détection

* Industrie nucléaire

<figure><img src="image_9.png" /></figure>
les embryons de poisson zèbre ont été utilisés comme modèles pour le développement précoce de nouveaux médicaments dans les domaines de la toxicologie, du cancer, de la génomique humaine, de la biologie du développement et pour d'autres recherches du domaine biomédical.

Sur ces images plusieurs points sont à noter ; si on peut distinguer des structures identiques sans ambi guité d'autres semblent se présenter de façon très différentes. Faute d'une biopsie de la zone observée nous nous limiterons à souligner que les images FFOTT ne présentent pas le niveau de speckle élevé des images FFOCT. Cela est dû au fait que la phase de Gouy varie de π dans la zone sectionnée alors qu'en FFOCT cette zone comprend plusieurs longueurs d'onde donc plusieurs fois 2π.

Plus près de l'hôpital et des maladies fongiques, la figure 4 présente un exemple d'application de FFOTT pour la réalisation d'un examen de cytologie dynamique en mycologie médicale avec l'observation d'une suspension de levures obtenue à partir d'une culture solide de Candida albicans (A). La Figure B présente l'image obtenue par FFOTT standard au grandissement maximal (100X), confirmant la visualisation aisée des différentes structures d'intérêt et caractéristiques de la morphologie de ce type de levures (noyaux pointés par les flèches noires, vacuole pointée par la flèche blanche, membrane délimitant les contours de chaque cellule fongique). L'image obtenue en FFOTT dynamique est présentée en C, avec ses différentes composantes (fréquence centrale, largeur spectrale, amplitude de variation :D-E). Elle confirme l'intérêt du signal dynamique pour une analyse comparée des différents compartiments de Candida albicans, avec des signaux très différents entre la membrane (signal jaune / vert), les vacuoles et le noyau (signal rose / violet) de chaque cellule fongique, témoignant de possibles activités métaboliques très différentes.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 5.** FFOTT de l'algue Fragilariopsis en différentes conditions d'éclairement tomographie statique (1) et dynamique (2) à la lumière et après deux mois d'obscurité (3 et 4). (collaboration Nathalie Joli).</figcaption></figure>

Ces résultats permettent d'envi- sager des applications potentielles en mycologie médicale, aussi plus largement en microbiologie médi- cale, pour la réalisation d'examens de cytologies dynamiques ultra-ra- pide, avec l'idée d'obtenir de nou- velles informations métaboliques susceptibles de servir la réalisation d'examens routiniers au laboratoire de biologie médicale.

## De la santé humaine à celle de l'environnement : les algues

Les arbres ne sont pas les seuls à ab- sorber du gaz carbonique à travers la photosynthèse atmosphérique grâce

à la photosynthèse. Les algues jouent également un rôle prépondérant dans la fixation du carbone. De ce fait sur- veiller la santé des océans (acidité de l'eau, équilibre phytoplancton-mi- crobes...) est d'importance. Les dia- tomées se retrouvent dans tous les océans et même dans les eaux douces, suivre leur métabolisme et leur évolu- tion constitue un biomarqueur. Parmi elles Fragilariopsis cylindrus vit dans les zones polaires et subit la nuit polaire pendant plusieurs mois avec un fort éclairement lors du retour à la lu- mière. Nous avons analysé par FFOTT Fragilariopsis en condition d'éclaire- ment et après une obscurité de deux mois (figure 5 et référence 5), on peut noter la très forte réduction de l'acti- vité métabolique dans ce dernier cas.

## CONCLUSION

Nous avons introduit un montage in- terférométrique tomographique des objets biologiques, montage simple, performant et peu coûteux capable de révéler un contraste morpholo- gique aussi bien que métabolique à l'échelle subcellulaire. Ce montage de FFOTT, du fait des trajets com- muns des ondes référence et objet, est très stable et ne nécessite pas les précautions que l'on prend avec FFOCT. Cependant cette approche par transmission nous limite à l'étude des échantillons peu épais optique- ment. FFOTT nous semble cependant pouvoir jouer un rôle en tant que nouveau biomarqueur sans agent de contraste (label free).

## RÉFÉRENCES

[1] A. Dubois et C. Boccara, Photoniques 95, 39 (2019)

[2] F. Harms et C. Boccara. Chapter 25 of W. Drexler and J. G. Fujimoto, eds., Optical Coherence Tomography (Springer International Publishing, 2015).

[3] V. Mazlin, O. Thouvenin, S. Alhaddad, M. Boccara, and C. Boccara, Biomed. Opt. Express 13, 4190 (2022).

[4] S. Alhaddad, O. Thouvenin, M. Boccara, C. Boccara and V. Mazlin, Biomed. Opt. Express 14, 4845 (2023)

[5] Nathalie Joli et al. accepted to New phytologist 2023
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<figure><img src="image_11.png" /></figure>

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>1. Prototype XPulse, 2. Rack développé en collaboration avec Certis, 3. Microscope ALPhANOV,</figcaption></figure>

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