<figure><img src="image_1.png" /></figure>

HAL
open science

# Étude structurale de la calcyanine, nouvelle protéine impliquée dans la bioméralisation intracellulaire chez les cyanobactéries

Geoffroy Gaschignard

► To cite this version:

Geoffroy Gaschignard. Étude structurale de la calcyanine, nouvelle protéine impliquée dans la bioméralisation intracellulaire chez les cyanobactéries. Biochimie, Biologie Moléculaire. Sorbonne Université, 2023. Français. NNT: 2023SORUS272. tel-04264752

HAL Id: tel-04264752

https://theses.hal.science/tel-04264752

Submitted on 30 Oct 2023

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.
Sorbonne Université

École doctorale Complexité du Vivant – ED 515

Thèse préparée à l'Institut de Minéralogie, de Physique des Matériaux et de Cosmochimie.

(Équipes BIBIP et BIOMIN)

# Etude structurale de la calcyanine, une nouvelle protéine impliquée dans la biominéralisation intracellulaire chez les cyanobactéries.

Par Geoffroy Gaschignard

Thèse de doctorat de Biologie Structurale / Bioinformatique

Dirigée par Isabelle Callebaut, Fériel Skouri-Panet et Manuela Dezi

Présentée et soutenue publiquement le 25/09/23

Frédéric MARIN – Directeur de recherche / Université de Bourgogne – Rapporteur

Guillaume LENOIR – Maître de conférences / Université Paris-Saclay – Rapporteur

Anne LOPES – Maîtresse de conférences / Université Paris-Saclay – Examinatrice

Ingrid LAFONTAINE – Professeure / Sorbonne Université – Examinatrice, Présidente

Isabelle CALLEBAUT – Directrice de recherche / Sorbonne Université – Directrice de thèse

Manuela DEZI – Maîtresse de conférences / Sorbonne Université – Co-encadrante de thèse

Membre invité :

Fériel SKOURI-PANET – Ingénieure de recherche / Sorbonne Université – Co-encadrante de thèse
## Remerciements :

Je tiens tout d'abord à remercier les rapporteurs, Frédéric Marin et Guillaume Lenoir, pour avoir relu et évalué ce manuscrit, et pour leurs retours constructifs sur ce dernier. Je les remercie aussi, ainsi qu'Ingrid Lafontaine et Anne Lopes, d'avoir accepté d'être les jurys pour la défense de cette thèse. J'ai grandement apprécié la qualité de la discussion qui a suivi la présentation.

Je veux aussi exprimer ma gratitude envers Isabelle Callebaut, Fériel Skouri-Panet et Manuela Dezi pour le grand investissement et la bienveillance dont elles ont fait preuve dans leur encadrement tout au long de cette thèse, ainsi que pour leur volonté de faire de cette thèse un espace d'apprentissage et de développement de mon projet professionnel. Grâce à elles j'ai énormément appris pendant ce projet, tant sur le plan humain que scientifique.

Ce doctorat n'aurait pu avoir lieu sans l'apport financier, humain et scientifique de l'ANR Harley. Je remercie ses membres, et plus spécifiquement son porteur, Karim Benzerara, pour m'avoir fait confiance, et m'avoir accompagné scientifiquement tout au long de cette thèse.

Je tiens à adresser des remerciements spéciaux à Catherine Berthomieu, Nicolas Bremond, Morgane Recuerda et Edern Pamart pour m'avoir très bien accueilli au BIAM à Cadarache, et pour leurs apports scientifiques. Cela a été l'occasion de découvrir un autre environnement de travail et de me former sur de nouvelles expériences, ce qui a été précieux dans ma formation.

Merci aux équipes BIOMIN et BIBIP de l'IMPMC, qui m'ont eu en garde partagée. Durant ces 3 ans et demi en leur compagnie, j'ai toujours reçu l'aide et le soutien dont j'avais besoin.

Un immense merci à Maxime Millet de m'avoir expliqué comment fonctionnait un ordinateur, et pour son flux continu de critiques non-constructives sur mes expériences. J'ai adoré avoir un co-bureau avec qui je puisse travailler et exposer mes idées, des plus stupides aux plus intelligentes, sans me faire (trop) juger, tout en pouvant rire.

Merci à Elodie Duprat pour sa gentillesse et surtout son expertise scientifique qui nous a permis d'aboutir à mon premier article en tant que premier auteur !

Merci à Cynthia Travert pour sa gentillesse et son aide pour toutes les expériences que j'ai faites. Sans elle, ce projet serait resté bloqué à l'étape « Trouver son chemin dans le laboratoire ».

Merci à Slavica Jonic de m'avoir formé à l'analyse d'image de Cryo-EM, je n'ai pas eu l'occasion de me servir de cette compétence dans ce projet, mais je ne désempère pas de le faire un jour !

Merci à Stéphanie Finet d'être restée (plusieurs fois) jusqu'à 3h du matin un samedi soir au Synchrotron SOLEIL pour me permettre d'étudier mes échantillons au SAXS.

Merci à Neha Mehta pour ses conseils avisés sur le monde de la recherche et pour son investissement pour faire vivre la vie scientifique du laboratoire. Par ailleurs j'ai énormément apprécié sa présence pour me guider et me donner confiance lors de ma première conférence scientifique internationale.

Merci à Kamel Bouazza, Helin Elhan et Si Min Montagnie d'être venus en renfort pour cette thèse lors de leur stage respectif, et de m'avoir permis de satisfaire mes pulsions dictatoriales.

Merci à Catherine Vénien-Bryan, Gabriel Brandt et à tout les autres membres du couloir 22-23 avec qui j'ai pu discuter entre deux expériences.

Merci enfin à tout le personnel administratif pour leur implication et pour leur bienveillance même quand je fournissais mes ordres de mission la veille de mon départ.
Je remercie aussi tous les partenaires qui ont pu prendre part à ce projet. Notamment je remercie chaleureusement Julien Henri pour son expertise scientifique sur la partie cristallisation de ce projet, mais aussi pour avoir été un excellent tuteur de thèse, toujours prêt à m'écouter avec bienveillance sur mes questionnements scientifiques ou professionnelles.

Merci aussi à Aurélie Di Cicco pour m'avoir formé à la microscopie électronique, à Christophe Marchand pour toutes ses analyses de spectrométrie de masse qui nous ont permis d'éviter de ré-étudier une protéine déjà connue et Benjamin Bailleul pour ses remarques constructives au cours des différents comités de suivi de thèse.

Je tiens de même à remercier la légion des doctorants/post-docs de l'IMPMC qui ont assuré un super soutien moral à travers le Covid, les expériences qui plantent et les périodes de stress.

Je voudrais vraiment exprimer ma plus grande gratitude à Juliette Gaëtan qui a toujours été présente pour discuter et me soutenir. Sans elle et sa capacité d'écoute, ma thèse n'aurait pas été la même, et j'aurais eu beaucoup moins de plaisir à venir au laboratoire chaque jour.

Je voudrais dire aussi merci à : Dania Marisol Zuniga pour avoir animé tout le couloir 22-23, pour sa bonne humeur dès le matin et pour m'avoir apporté beaucoup d'excellents conseils scientifiques;

Juliette Debrie pour ses très nombreuses critiques pas constructives sur ma thèse, mes choix vestimentaires et ma vie en générale;

Jeanne Caumartin pour sa gentillesse au quotidien;

Apolline Bruley, pour m'avoir appris à naviguer les eaux incertaines de la bio-informatique et de l'administration de l'école doctorale;

Amandine Hecquet pour son sourire, pour ses supers gâteaux et pour m'avoir fait découvrir l'IEES;

Divine Vangu pour son investissement pour les autres, et pour ses incroyables pâtisseries;

Julie Aufort pour ses discours de motivation qui m'ont beaucoup aidé à écrire ce manuscrit;

Rémi Vuillemot pour son sourire, et pour m'avoir débloqué mon ordinateur quand je pensais l'avoir définitivement verrouillé et perdu 2 ans de thèse;

Romain Bolzonni pour m'avoir accueilli à Cadarache, et pour son stock inépuisable de nourriture;

Anne-Elisabeth Marceline, Quentin Bollaert, Martin Demoucron, Ramón Messias, Öykü Ataytür, Octave Duros pour avoir toujours été présents et plein de bonnes humeurs pour les déjeuners, les gouters ou allers prendre des bières au Baker.

Merci enfin à Cécile Bidaud, Laura Galezowski, Andreas Zoumpoulakis, Carlos Fernandes, Rafael Veloso, Baptiste Truffet, Romain Taureau, Léon Ambriambariijaona, Mohamad Harastani, Aashini Rajpal et à tous les autres membres du laboratoire présents ou passés que je pourrais avoir oublié.

Je voudrais ensuite prendre le temps de remercier tout les gens qui n'ont pas directement pris part à cette thèse, mais qui m'ont permis de maintenir un bon équilibre vie personnelle - vie professionnelle.

A ce titre je voudrais dire merci à tous mes amis de l'ESPCI, de la prépa Clémenceau, des mes années de collège-lycée et d'ailleurs, qui, parfois en dépit de la distance ou des années, sont toujours là quand j'ai besoin d'eux. Je voudrais adresser des remerciements spéciaux à Emile qui me supporte aux quotidiens et qui m'écoute râler (et aussi qui fait le ménage de l'appartement quand j'oublie). De même je voudrais dire merci à Hugo qui a eu le courage héroïque de me soutenir durant toutes ma rédaction et la préparation de ma soutenance, à travers mes coups de stress et mes pertes de motivation.

Enfin, et parce que c'est grâce à leur soutien depuis ma naissance que j'ai pu faire des études puis une thèse, je remercie du fond de mon cœur mes parents qui ont toujours été là pour moi. Je remercie aussi mon frère Amaury et mes sœurs, Margaux, qui m'aura volé le titre de premier docteur de la fratrie et Camille. J'espère qu'avec ma défense ils auront enfin compris quel était mon sujet de thèse.
<table><tr><td>La protéolyse limitée a permis d'identifier un fragment stable et homogène, exploitable pour la cristallogénèse</td><td>65</td></tr></table>

<table><tr><td>Chapitre 3 : Les protéines à domaine CoBaHMA</td><td>79</td></tr></table>

<table><tr><td>Le domaine CoBaHMA est présent sur d'autres architectures protéiques, principalement associé à des domaines membranaires</td><td>79</td></tr></table>

<table><tr><td>Conclusion et Discussion</td><td>87</td></tr></table>

<table><tr><td>Perspectives</td><td>95</td></tr></table>

<table><tr><td>Matériels et Méthodes</td><td>101</td></tr></table>

<table><tr><td>1.Bioinformatique</td><td>101</td></tr></table>

<table><tr><td>1.1. Pymol, Chimera : visualisation, hydrophobicité, RMSD</td><td>101</td></tr></table>

<table><tr><td>1.2. Modélisation</td><td>101</td></tr></table>

<table><tr><td>1.3. Outils d'évaluation des structures 3D</td><td>103</td></tr></table>

<table><tr><td>1.4. FoldSeek</td><td>104</td></tr></table>

<table><tr><td>1.5. Téléchargement de structure 3D</td><td>104</td></tr></table>

<table><tr><td>1.6. Alignements de séquences</td><td>105</td></tr></table>

<table><tr><td>1.7. Prédiction de l'agrégation</td><td>105</td></tr></table>

<table><tr><td>2. Experimental</td><td>106</td></tr></table>

<table><tr><td>2.1. Différentes constructions de calcyanine étudiées</td><td>106</td></tr></table>

<table><tr><td>2.2. Gène et expression de la calcyanine</td><td>108</td></tr></table>

<table><tr><td>2.3. Lyse cellulaire</td><td>109</td></tr></table>

<table><tr><td>2.4. Purification des constructions de calcyanine</td><td>110</td></tr></table>

<table><tr><td>2.5. Expression et purification de la protéase TEV étiquetée 6His</td><td>114</td></tr></table>

<table><tr><td>2.6. Protéolyse limitée</td><td>114</td></tr></table>

<table><tr><td>2.7. Spectroscopie de masse</td><td>115</td></tr></table>

<table><tr><td>2.8. Small Angle X-rays Scattering : expériences et analyses</td><td>116</td></tr></table>

<table><tr><td>2.9. Essais de cristallogénèse</td><td>117</td></tr></table>

<table><tr><td>Références</td><td>119</td></tr></table>

<table><tr><td>Annexes</td><td>152</td></tr></table>
## Liste des abréviations :

a.a : acides aminés

ACC : Amorphous Calcium Carbonate

cryo-EM : cryo-Electron Microscopy

C<sub>ter</sub> : C-terminal

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

EPS : ExoPolySaccharide

HCA : Hydrophobic Cluster Analysis

HMA : Heavy Metal Associated

HMM : Hidden Markov Model

iACC : intracellular Amorphous Calcium Carbonate

iHMA : integrated Heavy Metal Associated

IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LCD : Low Complexity Domain

MALS : Multiple Angle Light Scattering

MEB : Microscope Electronique à Balayage

MET : Microscope Electronique à Transmission

MFS : Major Facilitator Transporter

MS : Spectroscopie de Masse

MSA : Multiple Sequence Alignement

N<sub>ter</sub> : N-terminal

PA : Phosphatidic Acid

PAE : Predicted Aligned Error

PCC : Pasteur Culture collection of Cyanobacteria

PDB : Protein Database

PEEM : PhotoEmission Electron Microscope

pET : plasmid for expression by T7 RNA polymerase

PG : Phosphatidylglycerol

pLDDT : predicted Local Distance Difference Test

RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire

RMSD : Root-Mean-Square-Deviation

SAXS : Small Angle X-Ray Scattering

SEC : Size Exclusion Chromatography

SQDG : Sulfoquinovosyldiacylglycerol

TEV : Tobacco Etched Virus
## Introduction :

### La biominéralisation est un phénomène répandu dans le vivant.

Les minéraux et les êtres vivants ont coévolué (Hazen et al., 2008) depuis au moins 3,4 milliards d'années (Javaux, 2019). Cette connexion très ancienne a mené à un haut degré d'interaction entre eux. L'un des exemples les plus frappants de ce type d'interaction est la biominéralisation, qui est souvent définie comme l'ensemble de processus qui mènent à la formation de minéraux, appelés biominéraux, par des êtres vivants (Görgen et al., 2021; Skinner, 2005). L'International Mineralogical Association définit le minéral de la façon suivante : « *a mineral is an element or chemical compound that is normally crystalline and which has been formed as a result of geological processes.* ». Cette définition s'accompagne d'une exclusion stricte des produits formés par des êtres vivants sans intervention d'un processus géologique (Nickel, 1995). De plus, les solides amorphes comme les ACC (Amorphous Calcium Carbonate) (Martignier et al., 2017), ou les cristaux organiques, comme l'hemozoïne (cristal d'heme) (Matz et al., 2020), sont exclus de cette définition, alors qu'ils sont étudiés dans le cadre de la biominéralisation. Pour ces raisons, la définition d'un biominéral est généralement plus large que celle d'un minéral et inclut tous les composés cristallins, organiques ou inorganiques, ainsi que les précipités amorphes inorganiques. De plus, les biominéraux peuvent être un mélange d'éléments organiques (protéines, polysacharrides...) et inorganiques, comme la coquille en calcite des mollusques qui contient une matrice organique (Marin, 2020).

La biominéralisation est très répandue dans le vivant. On trouve des biominéraux chez les eucaryotes, comme par exemple l'hydroxyapatite (Ca₅(PO₄)₃(OH)) des os et des dents des vertébrés (Sharma et al., 2021), l'aragonite (CaCO₃) du squelette des coraux (Figure 1.D; C. A. Schmidt et al., 2022) ou encore la silice (SiO₂) que l'on peut trouver dans les parois cellulaires chez certaines plantes (Figure 1.C; Bauer et al., 2011; Zexer & Elbaum, 2022). De même, la biominéralisation est aussi répandue chez les procaryotes (Cosmidis & Benzerara, 2022; Görgen et al., 2021), comme chez les bactéries magnétotactiques (Figure 1.A; Blakemore, 1975) qui forment des magnétosomes, des organelles constituées de la magnétite (Fe₃O₄) ou de la greigite (Fe₃S₄) (Faivre & Schüler, 2008), ou certaines espèces de bactéries qui stockent du souffre élémentaire (Nims et al., 2019).

La biominéralisation peut répondre à de nombreux impératifs biologiques. Certains d'entre eux sont biens connus, comme la structuration et la résistance aux chocs apportés par le squelette des vertébrés ou la protection fournie par la coquille des mollusques et des coquillages, mais il en existe des plus exotiques. Les bactéries magnétotactiques s'alignent dans le champ magnétique terrestre grâce à leurs magnétosomes, ce qui leur permet de s'orienter dans l'espace (Blakemore, 1975). La calcite de l'exosquelette des fourmis coupe-feuille aurait des propriétés antifongiques (H. Li et al., 2020). Enfin le parasite *Plasmodium falciparum* transforme l'heme libre issu de la digestion de l'hémoglobine humain, qui lui est extrêmement toxique, en hemozoïne (cristal d'heme) qui ne lui est pas toxique (Matz et al., 2020).
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1 : Exemples de biominéralisation.**</figcaption></figure>

Photos en microscopie électronique (A) d'une bactérie magnétotactique, du genre *Vibrio*, et de sa chaîne de magnétosomes (en noir) (Faivre & Schüler, 2008); (B) de l'algue coccolithophore *Emiliana huxleyi* (Skeffington & Scheffel, 2018); (C) d'agrégats de silice (indiqués avec des flèches blanches) dans les racines du Sorgo *Sorghum bicolor* L. (Zexer & Elbaum, 2022). (D) Image de squelettes de coraux (C. A. Schmidt et al., 2022) avec, en vignette, une carte de composition des minéraux établie grâce à un PEEM (PhotoEmission Electron Microscope).
Toutefois, si la biominéralisation peut être bénéfique pour les organismes impliqués, elle peut aussi avoir des effets délétères. Chez l'être humain, les calculs rénaux (Sivaguru et al., 2021) ou la calcification des tendons (Sansone et al., 2018) sont 2 pathologies dues à la formation de biominéraux. De la même manière, les micro-organismes qui biominéralisent extracellulairement peuvent se retrouver piégés dans leurs propres biominéraux (Cosmidis & Benzerara, 2022).

Comme le montrent ces exemples, la grande diversité d'organismes qui biominéralisent s'accompagne d'une grande diversité d'espèces de biominéraux formés : des carbonates, des phosphates, des sulfures... Cette diversité de minéraux est illustrée dans la table 1 de l'article de Skinner, reprise ici en Figure 2, qui répertorie un grand nombre de biominéraux inorganiques connus (Skinner, 2005). Ce tableau n'inclut pas les biominéraux constitués de cristaux organiques comme l'hemozoïne déjà mentionnée (Matz et al., 2020), qui étendent encore cette diversité.

La biominéralisation est généralement scindée en 2 sous catégories, selon que le processus est contrôlé par l'être vivant ou non (Dupraz et al., 2009; Görgen et al., 2021; Weiner, 2003).

Dans le premier cas, la biominéralisation est appelée contrôlée (Figure 3.C). Elle fait intervenir des processus biologiques spécifiques impliquant des protéines, des tissus, des organelles... C'est un processus qui a donc un coût énergétique, ne serait-ce que pour transporter les ions, souvent contre leur gradient, jusqu'au site de minéralisation pour pouvoir former le biominéral même dans un environnement sous-saturé (Gilbert et al., 2022).

Les exemples non-pathologiques de biominéralisation chez les eucaryotes que nous avons cités, ainsi que les bactéries magnétotactiques sont des exemples de biominéralisation contrôlée.

Dans le 2<sup>nd</sup> cas, la biominéralisation n'est pas contrôlée par l'organisme, mais est la conséquence de son activité dans un environnement qui est sursaturé en phase minérale. Ce cas là est parfois lui-même subdivisé en 2 cas. Dans le cas où l'organisme, ou sa matrice extracellulaire, n'est qu'un site de nucléation pour le minéral, la biominéralisation est dite influencée (Figure 3.A). Ce type de minéralisation peut alors avoir lieu sur un organisme biologiquement inactif, voir mort.

La précipitation du CaCO₃ sur la matrice extracellulaire des biofilms de cyanobactéries en est un exemple (Arp et al., 1999).

Dans le cas où la précipitation est un produit secondaire du métabolisme de l'organisme, la biominéralisation est dite induite (Figure 3.B). C'est le cas des bactéries sulfato-réductrices, qui, comme leur nom l'indique, réduisent le sulfate (SO₄²⁻) de leur environnement en sulfure (H₂S), qui peut alors réagir avec des métaux comme le Fer pour former un précipité de sulfure de métal (Barton & Tomei, 1995).

L'étude de la biominéralisation a donc des impacts dans de nombreux domaines, tels que l'environnement ou la médecine.
<table><caption>TABLE 1. Biominerals*.</caption><thead><tr><th>Class</th><th>Chemical designation</th><th>Example</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Native elements/alloys</td><td>S</td></tr><tr><td>2,3</td><td>Sulphides/arsenides</td><td>FeS<sub>2</sub> pyrite, marcasite<br>FeFe<sub>2</sub>S<sub>4</sub>, greigite<br>(Fe,Ni)S<sub>0.9</sub>, mackinawite<br>Fe<sub>(1-x)</sub>S, pyrrhotite where x = 0-0.2<br>FeS·nH<sub>2</sub>O, hydrotroilite<br>ZnS, sphalerite, wurtzite<br>PbS, galena<br>Ag<sub>2</sub>S, acanthite<br>As<sub>2</sub>S<sub>3</sub>, orpiment</td></tr><tr><td>4-8</td><td>Oxides/hydroxides</td><td>FeFe<sub>2</sub>O<sub>4</sub>, magnetite<br>Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub>, amorphous<br>Fe<sup>2+</sup>TiO<sub>2</sub>, ilmenite<br>α-FeOOH, goethite<br>γ-FeOOH, lepidocrocite<br>5Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub>·9H<sub>2</sub>O, ferrihydrite<br>Mn<sub>3</sub>O<sub>4</sub>, amorphous<br>(Mn<sup>2+</sup>Ca,Mg) Mn<sup>4+</sup>·2H<sub>2</sub>O, todorokite<br>Na<sub>2</sub>Mn<sub>2</sub>O<sub>2</sub>·9H<sub>2</sub>O, birnesite</td></tr><tr><td>9-12</td><td>Halogenides</td><td>CaF<sub>2</sub>, fluorite<br>K<sub>2</sub>SiF<sub>6</sub>, hieratite<br>Cu<sub>2</sub>Cl(OH)<sub>3</sub>, atacamite</td></tr><tr><td>13-17</td><td>Carbonates</td><td>CaCO<sub>3</sub>, calcite, aragonite, vaterite, amorphous<br>CaCO<sub>3</sub>·H<sub>2</sub>O, monohydrocalcite<br>(Ca<sub>(1-x)</sub>)Mg<sub>x</sub>)CO<sub>3</sub>, magnesian calcite<br>(Ca,Mg)CO<sub>3</sub>, ‘protodolomite’<br>Pb<sub>3</sub>(CO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>(OH)<sub>2</sub>, hydrocerrusite</td></tr><tr><td>28-32</td><td>Sulphates</td><td>CaSO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O, gypsum<br>KFe<sup>3+</sup>(SO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>(OH)<sub>6</sub>, jarosite<br>SrSO<sub>4</sub>, celestite<br>CaSO<sub>4</sub>, baryte</td></tr><tr><td>37-43</td><td>Phosphate/arsenates</td><td>Ca<sub>5</sub>(PO<sub>4</sub>)<sub>3</sub>(OH,F,Cl), calcium apatite group:<br>(Ca,X)<sub>10</sub>(PO<sub>4</sub>,CO<sub>3</sub>)<sub>6</sub>(OH,CO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>, ‘bioapatite’ X = cations<br>CaHPO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O, brushite<br>Ca<sub>8</sub>H<sub>2</sub>(PO<sub>4</sub>)<sub>6</sub>·6H<sub>2</sub>O, octacalcium phosphate<br>Ca<sub>18</sub>H<sub>2</sub>(Mg<sup>2+</sup>, Fe<sup>2+</sup>)(PO<sub>4</sub>)<sub>14</sub>, whitlockite<br>Fe<sup>2+</sup>(PO<sub>4</sub>)<sub>2</sub>·8H<sub>2</sub>O, vivianite<br>Mg(NH<sub>4</sub>)(PO<sub>4</sub>)·6H<sub>2</sub>O, struvite</td></tr><tr><td>Silicates</td><td></td><td>SiO<sub>2</sub>·nH<sub>2</sub>O opal, non-crystalline or disordered<br>crystobalite, tridymite</td></tr></tbody></table>

Figure 2 : Liste de biominéraux connus

Extrait de Skinner, 2005.

La 1ère colonne indique la/les classe(s) des minéraux de la ligne telle(s) que définie(s) dans *Dana's new mineralogy* (Dana *et al.*, 1997).

<footnote>* See Lowenstam and Weiner (1989) Table 2.1 pp. 8-15 for a listing of the phyla where these mineral species have been found.</footnote>
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 3 : Classification de la biominéralisation.**</figcaption></figure>

Extrait de Görgen *et al.*, 2021.

Schéma récapitulatif des catégories de biominéralisation, illustrées dans le cas du carbonate de calcium. (A) Biominéralisation influencée. (B) Biominéralisation induite. (C) Biominéralisation contrôlée.
La biominéralisation du carbonate de calcium.

Le carbonate de calcium est un minéral qui est retrouvé en abondance dans l'environnement, principalement sous forme de calcaire ou de craie. Il peut se trouver naturellement sous 6 formes : 3 formes cristallines (aragonite, vaterite, calcite), 2 formes hydratées métastables (monohydrocalcite et ikaite), et sous forme amorphe (ACC) (Sekkal & Zaoui, 2013). Les ACC sont eux-mêmes subdivisés en 2 catégories selon qu'ils soient hydratés ou non (Innocenti Malini et al., 2017). Les ACC sont métastables thermodynamiquement. Ils cristallisent à forte température (Koga et al., 1998) ou à forte pression (Yoshino et al., 2012). Dans le cas de la biominéralisation, les ACC sont souvent des précurseurs de phase de CaCO₃ cristallisée (Gilbert et al., 2022).

Le calcium est un alcalino-terreux (2nde colonne du tableau périodique) qui forme donc des cations divalents, Ca²⁺, en solution. Le CaCO₃ peut accepter des substitutions du calcium par d'autres alcalino-terreux comme le magnésium, le strontium, le baryum ou le radium. Ces substitutions sont polymorphes-dépendantes : la calcite s'accommode bien des ions Mg²⁺ mais très mal du Sr²⁺ et du Ba²⁺, au contraire de l'aragonite, alors que les ACC peuvent intégrer tous les alcalino-terreux grâce à leur absence de structure cristalline. Il dépend aussi du processus de formation du CaCO₃ : la calcite cristallisée à partir d'un ACC dopé au strontium ou au barium est capable d'accommoder bien plus de strontium et de barium qu'une calcite qui a cristallisé sans intermédiaire (A. Saito et al., 2020).

Le CaCO₃ précipite dans des conditions de sur-saturation, locale ou globale, selon l'équation :

$$Ca^{2+}_{(aq)} + CO_{3}^{2-}_{(aq)} = CaCO_{3}(s) \quad (1)$$

Le carbonate CO₃²⁻ est la base conjuguée du bicarbonate HCO₃⁻ (pKa = 10,32) qui est lui-même la base conjuguée du CO₂ (pKa = 6,37). L'océan, où se fait l'essentiel de la production de CaCO₃ (Morse et al., 2007), a un pH compris entre 8 et 8,25 (L.-Q. Jiang et al., 2019). Dans la majeure partie des cas, il faut donc aussi prendre en compte la réaction de dissociation du bicarbonate :

$$2HCO_{3}^{-}(aq) = CO_{3}^{2-}(aq) + CO_{2}(aq) + H_{2}O \quad (2)$$

Ce qui donne la réaction la plus courante pour la précipitation du CaCO₃ :

$$Ca^{2+}_{(aq)} + 2HCO_{3}^{-}(aq) = CaCO_{3}(s) + CO_{2}(aq) + H_{2}O \quad (3)$$

Un grand nombre d'eucaryotes dont les coraux (Figure 1.D), les oursins, les poules, les étoiles de mers ou encore les coccolithophores (Figure 1.B) biominéralisent le CaCO₃ (Gilbert et al., 2022). De même, c'est une occurrence commune chez les procaryotes (Görgen et al., 2021), qui sont notamment responsables de la formation de larges macro-dépôts de CaCO₃ comme certains stromatolithes (Saghaï et al., 2016).

La biominéralisation du carbonate de calcium fait l'objet d'une attention toute particulière de la part de la communauté scientifique pour plusieurs aspects.

Des études s'intéressent à l'impact de l'acidification des océans conséquente à l'augmentation du CO₂ dans l'atmosphère due à l'activité humaine (L.-Q. Jiang et al., 2019), sur les capacités de
biominéralisation des organismes marins, comme le corail (C. A. Schmidt et al., 2022) ou les coccolithophores (Meyer & Riebesell, 2015). Cela pourrait modifier durablement les cycles du carbone et du calcium sur lesquels ces organismes agissent (Riebesell et al., 2009; Zavarzin, 2002). Si ces organismes ont de fortes chances d'être durablement affectés par le changement climatique, ils pourraient aussi amener des solutions pour lutter contre celui-ci. Des organismes comme l'iroko (un arbre originaire d'Afrique de l'Ouest) ou les cyanobactéries sont étudiés pour piéger de vaste quantité de CO₂ sous forme de CaCO₃ (Gwenzi, 2019). De même des stratégies de stockage du carbone s'inspirent de la biominéralisation, notamment en utilisant l'anhydrase carbonique, une protéine qui catalyse la réaction :

$$CO_2(d) + H_2O = HCO_3^-(aq) + H^+(aq) \quad (4)$$

et qui est considérée comme centrale dans les processus de biominéralisation (Gilbert et al., 2022), comme catalyseur pour accélérer la précipitation du CO₂ sous forme de carbonates (Gwenzi, 2019).

Les organismes biominéralisants pourraient aussi être intéressants pour lutter contre d'autres formes de pollution, en piégeant dans leur biominéraux des radio-éléments ou des métaux toxiques (Gadd & Pan, 2016; Mehta et al., 2019).

Par ailleurs, alors que les parties organiques d'un organisme se dégradent rapidement, les biominéraux sont très présents dans le registre fossile et constituent de précieux indices pour l'étude des formes ancestrales de vie. Par exemple, les microbialithes, des roches formées par l'action de micro-organismes, sont considérés comme étant les plus anciennes traces de vie sur Terre (Wacey, 2012). De plus, les espèces qui biominéralisent sont plus représentées dans les dépôts géologiques que les espèces qui ne forment pas de biominéraux (J. Li et al., 2013).
Les protéines impliquées dans la biominéralisation contrôlée du CaCO$_3$.

La biominéralisation contrôlée du CaCO$_3$ chez les procaryotes est pour l'heure assez mal comprise, principalement faute d'exemples. Il n'y en a à ce jour que 3 de répertoriés : chez les gamma-protéobactéries *Achromatium* (Figure 4.A; Benzerara et al., 2021), chez certaines cyanobactéries (Couradeau et al., 2012) dont il sera sujet plus tard dans cette introduction, et chez certaines alphaproteo-bactéries magnétotactiques (Figure 4.B; Monteil et al., 2021). Signe, de la méconnaissance de ce type de biominéralisation, la nature exacte du biominéral formé par *Achromatium*, calcite ou ACC, ainsi que sa localisation, cytoplasmique ou periplasmique, faisaient encore objet de débats en 2021 (Benzerara et al., 2021), près d'un siècle et demi après la première description de ce phénotype en 1893 (Schewiakoff, 1893).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 4 :** Biominéralisation contrôlée du CaCO$_3$ chez les procaryotes.</figcaption></figure>

(A) Cellule d'Achromatium du lac Pavin, observée au MEB (Microscope Electronique à Balayage) (Benzerara et al., 2021). (B) Image MET (Microscope Electronique à Transmission) d'une bactérie magnétotactique du lac Pavin. Les larges inclusions blanches sont des ACC. Les petites inclusions en chaîne sont des magnétosomes (Monteil et al., 2021).

A l'inverse, la biominéralisation contrôlée du CaCO₃ chez les eucaryotes est bien mieux comprise et à même fait l'objet d'un modèle intégré par Gilbert *et al.* en 2022 pour les organismes marins. Pour résumer très succinctement ce modèle, chez ces organismes biominéralisants, le CaCO₃ se trouve dans un compartiment très contrôlé biologiquement, nommé « espace privilégié ». Ce compartiment est isolé de l'environnement extérieur par des cellules épithéliales ou des phospholipides selon la taille de l'espace et/ou les organismes. Le CaCO₃ est tout d'abord précipité sous forme d'ACC dans des vésicules dont la concentration en Ca²⁺, en CO₃²⁻ et le pH sont augmentés jusqu'à saturation. Les ACC sont relargués dans l'espace privilégié puis s'agglomèrent ensuite sur le biominéral déjà formé puis cristallisent, si le biominéral est un cristal. Les espaces libres entre les ACC sont, en parallèle, comblés par croissance du cristal par attachement ionique (Gilbert et al., 2022).
Ces études menées chez les eucaryotes ont pu montrer l'importance des protéines dans ces mécanismes de biominéralisation. Il serait trop long d'en faire une liste exhaustive, mais il est pertinent de décrire en partie la diversité des fonctions qui peuvent être impliquées dans la formation d'un biominéral, afin de nourrir des hypothèses pour la calcyanine, la protéine dont il sera sujet dans cette thèse. Les protéines qui seront abordées ici, sont schématisées sur la Figure 5.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 5 : Les protéines de la biominéralisation du CaCO₃.**</figcaption></figure>

Schéma de quelques classes de protéines qui ont été identifiées comme intervenant dans des biominéralisations contrôlées, et qui sont décrites dans cette thèse. La forme ainsi que la taille des protéines représentées ne sont pas représentatives de la réalité. L'espace contenant le biominéral est un compartiment. Figure produite avec www.BioRender.com
Tout d'abord, pour pouvoir déclencher la précipitation du CaCO₃ il faut atteindre la super-saturation au niveau du site de biominéralisation, en important ou exportant les ions nécessaires au biominéral. Ces ions sont généralement transportés à travers les membranes par des protéines de transports. Il en existe 4 grandes classes :

_ Les protéines ABC (ATP Binding Cassette) qui hydrolysent l'ATP pour transporter leur substrat à travers la membrane;

_ Les ATPases qui sont subdivisées en 3 types : F-, V- et P-. Les F-types utilisent le gradient des ions pour générer de l'ATP, quand les V- et P-types ATPases hydrolisent l'ATP pour transporter leur substrat à travers la membrane en effectuant d'important changements conformationnels;

_ Les SLC (SoLute Carrier) qui transportent un grand nombre de solutés (ions, vitamines, acides aminés...) à travers la membrane soit selon leur gradient, soit contre leur gradient mais en s'appuyant dans ce cas sur le transport d'un autre ion selon son gradient (symport ou antiport). Ces protéines n'utilisent pas l'hydrolyse de l'ATP comme source d'énergie pour le transport;

_ Les canaux ioniques qui sont des transporteurs passifs fournissant un passage sélectif aux ions (Pizzagalli et al., 2021).

*Transport des ions Ca²⁺.*

Comme les ions Ca²⁺ sont essentiels à un grand nombre de processus biologiques (Remick & Helmann, 2023), il est parfois difficile de distinguer les transporteurs du Ca²⁺ impliqués dans la formation du biominéral de ceux qui sont utiles pour d'autre processus. Par exemple, chez le coccolithophore *Emiliania huxleyi* (visible en Figure 1.B), la Ca²⁺-ATPase ECA2 est sur-exprimée dans les cellules diploïdes biominéralisantes par rapport aux diploïdes non-biominéralisantes. Cependant, cette même protéine est 2 fois plus exprimée dans les coccolithophores haploïdes, qui sont tous non-biominéralisants, par rapport aux cellules diploïdes, biominéralisantes ou non. Il parait donc y avoir une implication de cette protéine à la fois dans la formation des biominéraux, mais aussi dans d'autres processus (Mackinder et al., 2011). De même, Yarra *et al*. n'ont pas été capables de détecter de sur-expression de protéines de transport du Ca²⁺ dans des bivalves biominéralisants, en dépit de la formation de carbonate de calcium (Yarra et al., 2021).

Il existe toutefois des exemples concrets de protéines de transport d'ions Ca²⁺ qui ont été identifiées comme associées à la biominéralisation du CaCO₃.

Sur les 4 grandes classes de transporteurs, on trouve des transporteurs du calcium impliqués dans la biominéralisation dans au moins 3 d'entre elles : ATPases, SLCs et canaux ioniques, ce qui montre la variété des mécanismes moléculaires employés.

Chez *E. huxleyi*, le phénotype de biominéralisation s'accompagne de la sur-expression de l'échangeur cation/proton CAX3, un antiporteur H⁺/Ca²⁺ (Mackinder et al., 2011).

La formation des œufs chez les oiseaux exige un transfert important de calcium vers les cellules de l'utérus depuis le plasma sanguin, puis de ces cellules vers le fluide utérin où a lieu la formation de l'œuf. Ceci a permis de mettre en avant la potentielle implication d'un grand nombre de protéines de transport du calcium :
_ Pour l'entrée du Ca²⁺ dans les cellules, les protéines TRPV2, 3 et 6 (Transient Receptor Potential Vanilloid), des canaux ioniques et/ou ATP2C2, une P-type ATPase de transport du calcium de type 2C seraient utilisés ;

_ Le transport du calcium dans la cellule se ferait grâce à la calbindin, une protéine capable de chelater les ions. D'autres protéines comme l'ATP2A2/3, des P-type ATPases endoplasmiques du transport du calcium, ou l'ITPR1/2/3, des canaux ioniques à Ca²⁺ activés par l'inositol trisphophaste pourraient aussi être impliquées ;

_ Enfin l'export de la cellule vers le fluide utérin aurait lieu grâce à l'antiporteur Ca²⁺/Na⁺ SLC8A1-3 et la P-type ATPase ATP2B1-B2 (Gautron et al., 2021; Nys & Le Roy, 2018; Sah et al., 2018).

### Transport des ions HCO₃⁻.

La production des ions bicarbonates n'est pas forcément co-localisée avec le site de précipitation du bioméral, comme c'est le cas dans la formation des œufs de poule (Gautron et al., 2021). Dès lors, il est aussi nécessaire de transporter ces ions. Ce sont, à notre connaissance, quasi exclusivement des protéines du groupe SLC qui assurent ce processus. Plus spécifiquement, la famille SLC4, qui rassemblent des transporteurs de bicarbonate ou de carbonate, semble être la plus représentée des SLC. Dans les SLC4, le transfert de carbonate/bicarbonate s'accompagne généralement d'un transport d'ions Na⁺ ou Cl⁻, sous forme de symport ou d'antiport, afin de profiter d'un gradient chimique favorable pour aller à l'encontre de celui, défavorable, du bicarbonate (Romero et al., 2013).

Plus précisément, il est possible de citer SLC4A4, A5 et A10, des symporteurs Na⁺/HCO₃⁻, ainsi que SLC26A9, un antiporteur HCO₃⁻/Cl⁻ chez la poule (Nys & Le Roy, 2018); AEL1 (Anion Exchangeur like 1), un membre de la famille SLC4 dont le mécanisme n'est pas encore bien connu, et qui est surexprimé dans les coccolithophores E. huxley biominéralisants (Mackinder et al., 2011); SpiSLC4γ, une SLC4 localisée uniquement sur le derme calcifiant chez le corail (Zoccola et al., 2015); enfin les bivalves qui biominéralisent sur-expriment une SLC4, ainsi qu'une SLC26A qui pourrait transporter des HCO₃⁻ (Yarra et al., 2021).

### Transport des ions H⁺ et contrôle du pH.

La précipitation du CaCO₃ (réaction (3) qui peut être considérée comme Ca²⁺ + HCO₃⁻ = CaCO₃ + H⁺) s'accompagne d'une libération de protons et d'une acidification de l'organisme. Il est donc nécessaire d'évacuer ces protons pour maintenir un pH basique favorable à la précipitation du bioméral, ainsi que l'homéostasie de l'organisme biominéralisant. Ainsi, Taylor et al. ont calculé qu'en l'absence d'export de protons, le pH cytosolique d'un coccolithophore biominéralisant diminuerait de 0,3 pH/min (Taylor et al., 2011). De fait, des transporteurs de protons ont été identifiés comme impliqués dans la biominéralisation.

Les protéines qui semblent les plus importantes dans ce contexte sont les V-types H⁺ ATPases, des ATPases qui transportent des protons. En effet, ces protéines sont sur-exprimées chez les bivalves et les coccolithophores biominéralisants (Mackinder et al., 2011; Yarra et al., 2021). De même, chez les foraminifères, la diminution du pH autour de ces organismes qui accompagne l'évacuation des protons
issus de la biominéralisation peut être annulée par l'ajout d'un inhibiteur de V-types H⁺ ATPases (Toyofuku et al., 2017). Enfin, chez les larves d'oursin, l'inhibition des V-types H⁺ ATPases diminue les capacités de régulation du pH intracellulaire des cellules biominéralisantes lors de la formation du squelette (Hu et al., 2020).

Ce ne sont toutefois pas les seuls transporteurs de H⁺ qui ont été répertoriés. Les bivalves sur-expriment aussi un canal à proton dépendant du voltage pendant la biominéralisation (Yarra et al., 2021), canal que l'on retrouve chez les coccolithophores (Taylor et al., 2011), mais dont l'utilité chez ces organismes ne semble pas être liée à la biominéralisation (Mackinder et al., 2011). Par ailleurs, chez les larves d'oursins, le SLC Na⁺/H⁺, un antiporteur, est aussi associé à la régulation du pH en période de calcification du squelette (Hu et al., 2020).

## Autre transports d'ions (Na⁺, K⁺, Cl⁻).

Très succinctement, le transport des ions essentiels à la biominéralisation est parfois réalisé avec des antiporteurs ou des symporteurs, comme décrit précédemment. Pour maintenir l'homéostasie des cellules, la biominéralisation nécessite parfois l'implication de transporteur d'ions Na⁺, K⁺ ou Cl⁻ comme cela a pu être illustré chez les bivalves ou dans la formation de l'œuf (Nys & Le Roy, 2018; Yarra et al., 2021).

## Initiation de la formation du biominéral.

La formation d'un précipité se fait en au moins 2 étapes : la formation d'un noyau, puis la croissance de ce noyau. Ces 2 étapes peuvent s'accompagner d'autres évènements, comme l'agrégation de plusieurs précipités entre eux, un changement de structure, par exemple pour passer d'un précipité amorphe à cristallin (Carino et al., 2017). La formation du noyau est souvent considérée comme l'étape la plus complexe. Bien qu'en théorie la précipitation peut se faire dès lors que la saturation est atteinte, dans la pratique il faut être en état de sursaturation pour voir l'apparition d'une phase solide (Carino et al., 2017; McPherson, 2017). Dans le cas des ACC, Carino et al. ont modélisé que la précipitation avait lieu à une sursaturation égale à ~3,5 fois le seuil de saturation (Carino et al., 2017).

Les être vivants biominéralisants ont développé des stratégies impliquant des protéines pour atteindre plus facilement la sursaturation et déclencher la précipitation de leur biominéral.

*In vitro*, l'anhydrase carbonique accélère la formation d'ACC, comparé à une solution contrôle sans protéine, en augmentant la concentration d'ions bicarbonate en solution en catalysant la réaction (4), et donc la sursaturation (Rodriguez-Navarro et al., 2019). Cette réaction fait de l'anhydrase carbonique l'une des protéines les plus importantes dans la biominéralisation du carbonate (Gilbert et al., 2022; Le Roy et al., 2014).

Une autre stratégie pour les protéines consiste à interagir avec les ions Ca²⁺ ou HCO₃⁻ afin de les concentrer localement. Ainsi, une étude de dynamique moléculaire a montré que le lysozyme, une protéine présente dans le blanc d'œuf connue pour ses propriétés antibactériennes et qui est étudiée
dans la synthèse de biominéraux à base d'or (Bakshi et al., 2010) ou de titane (Y. Wu et al., 2023), favoriserait la précipitation des ACC grâce à un triplet d'arginine. Ce triplet permettrait de concentrer localement les ions carbonates (Rani & Saharay, 2019).

Cependant, ce sont plus souvent les a.a (acides aminés) acides, donc chargés négativement, qui sont considérés comme sites de nucléation, via une interaction avec les ions Ca²⁺. Par exemple, dans le cas de l'huitre perlière *Pinctada fucata*, la partie riche en acide aspartique de l'aspein serait responsable de la nucléation de la calcite (Takeuchi et al., 2008).

Enfin, il s'est aussi développé récemment l'idée que la nucléation du CaCO₃ pouvait être considérée comme une séparation de phase liquide - liquide, un processus dans lequel une solution homogène se sépare en 2 phases liquides contenant des concentrations distinctes de solutés. Des protéines ont été identifiées comme capable de diriger une séparation de phase liquide-liquide. De fait, ces protéines, comme Pif80 trouvée chez *Pinctada funcata*, pourraient s'avérer être des candidates très intéressantes pour expliquer la nucléation du CaCO₃. Cette idée est encore peu développée, et donc manque encore d'exemples et de théorie, mais selon Tarczewska *et al*, elle pourrait être une piste de recherche très intéressante dans le futur (Tarczewska et al., 2022).

## Sélection du polymorphe et de la cristallinité.

Les organismes qui biominéralisent le CaCO₃ cherchent généralement à contrôler le polymorphe du CaCO₃ qui est formé. Un exemple intéressant est l'huitre perlière *P. fucata* déjà évoquée. Sa coquille est formée de deux couches de biominéraux : une couche d'aragonite, et une autre de calcite. Ces 2 couches seraient formées depuis une même solution riche en Mg²⁺, une condition qui favorise fortement la formation d'aragonite. La précipitation de calcite serait due à l'aspein exprimée par *P. fucata*, une protéine qui permet la précipitation de ce minéral même dans un milieu qui favorise la précipitation abiotique de l'aragonite (Takeuchi et al., 2008).

De même chez le corail, la protéine CARP3 permet de favoriser, dans un milieu ne contenant pas de Mg, la précipitation de la vatérite vis à vis de la calcite, alors que la vatérite est un polymorphe instable du carbonate de calcium (Laipnik et al., 2020).

Enfin, ces protéines peuvent aussi prévenir la formation de cristaux en stabilisant des ACC, une phase thermodynamiquement métastable du carbonate de calcium. Le domaine riche en glycine de la protéine SM50, une SMP (Spicule Matrix Protein) que l'on trouve dans la matrice des spicules de la larve d'oursin a cette capacité, par exemple (Rao et al., 2013).

## Inhibition de la précipitation.

Le contrôle de la biominéralisation implique d'être capable de déclencher la formation du biominéral, mais aussi de l'arrêter pour contrôler sa taille, et éviter la formation spontanée de biominéraux.

Ce rôle a été reporté pour au moins 2 protéines différentes chez l'abalone : la perlinhibine, une protéine riche en cystéine, en histidine et en arginine, et la perlwapine, une protéine qui possède 3 domaines
WAP (Whey Acidic Domain), qui s'attachent à la surface de la calcite pour inhiber sa croissance (Mann et al., 2007; Treccani et al., 2006).

Contrôle de la forme du biominéral.

Les biominéraux peuvent adopter des formes très complexes. Les coccolithes en sont un exemple frappant (une image de coccolithes est visible en Figure 1.B). La finesse et la diversité de leurs motifs en font des sujets d'applications en nano-fluidique, en exploitant les canaux présent sur les coccolithes de certaines espèces, ou en optique pour moduler les propriétés de biréfringences de la calcite (Skeffington & Scheffel, 2018). Dans un registre moins impressionnant, mais tout aussi pertinent, la calcite de la coquille d'œuf de la poule croit selon une direction privilégiée, là où un cristal abiotique, en l'absence de contrainte croîtra dans toutes les directions de l'espace (Gautron et al., 2021).

Les protéines responsables de la forme du biominéral, sont généralement des protéines de la matrice du biominéral, quand une telle matrice existe.

Dans le cas de l'œuf de poule, la protéine Ovocleidin 116, aussi connue sous le nom de MEPE (Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein), une protéine de la matrice de la coquille, joue un rôle crucial dans cette morphogenèse. Elle est associée à la formation de micro-cavités dans la coquille, ainsi qu'à l'organisation de la calcite. De même, elle est impliquée dans l'élasticité, l'épaisseur et la forme de la coquille d'œuf. Enfin, elle est aussi impliquée dans l'arrêt de la biominéralisation (Sah et al., 2018).

De même, la protéine Starmaker qui est impliquée dans la formation des otolithes des poisson-zèbres, permettrait d'intercaler la matrice organique avec les cristaux de carbonate de calcium en interagissant à la fois avec le calcium et avec d'autres protéines. Ce serait des a.a acides régulièrement répartis sur sa chaîne carbonée qui permettraient à la protéine d'interagir avec le calcium. Par ailleurs, l'interaction des ions calcium avec les a.a acides de Starmaker permettrait de diminuer la répulsion électrostatique entre ces derniers. Cela expliquerait l'augmentation de la compacité de la protéine en présence de ces ions qui a été observée. Il a été postulé que cette diminution de l'entropie de la protéine faciliterait son interaction avec d'autres protéines (Kaplon et al., 2009).

La structuration du biominéral peut aussi faire appel au cytosquelette de l'organisme. Chez les coccolithophores, l'inhibition de la polymérisation des microtubules entraîne une malformation des coccolithes, ce qui suggère une implication du réseau de microtubules dans le contrôle de la forme du biominéral (Durak et al., 2017). De même, chez les foraminifères, la F-actine est très impliquée dans la structuration de la zone de biominéralisation (Tyszka et al., 2019). Enfin, il a été identifié chez le bivalve *Atrina rigida*, une chitine synthase qui possède un domaine myosin motor head. Cela suggère un lien entre la synthèse de la chitine, qui a été supposée avoir un rôle crucial dans la formation des biominéraux chez les bivalves (Weiss & Schönitzer, 2006), et le cytosquelette d'actine (Weiss et al., 2006).

Par ailleurs, il a été montré chez les coccolithophores, que la disruption du cytosquelette d'actine entraîne un arrêt de la biominéralisation et de l'extrusion des écailles (Durak et al., 2017). Si ce n'est pas à proprement parler un contrôle de la forme du biominéral, cela démontre chez cet organisme un rôle crucial du cytosquelette dans la biominéralisation.
### Importance des protéines acides et des LCD (Low Complexity Domain).

En dépit de cette très grande diversité de protéines, certaines propriétés communes ont émergé dans l'étude des protéines de la biominéralisation.

Tout d'abord, les protéines acides, mais aussi les polysaccharides acides, sont régulièrement mis en avant par les articles traitant de la biominéralisation, notamment pour leur importance dans la matrice organique des biominéraux (Aizenberg et al., 1996; Gilbert et al., 2022; Marin & Luquet, 2007; Tyszka et al., 2019). Leur importance est souvent liée à l'hypothèse qu'elles interagissent avec les ions Ca²⁺ pour organiser et structurer le biominéral. Les a.a basiques sont beaucoup moins mis en avant. Par exemple, selon Innocentini et al., l'arginine, un a.a basique, est peu présente dans les protéines biominéralisantes, même si il faut préciser que les auteurs ne proposent pas de données chiffrées pour appuyer leur propos. D'après eux, l'arginine pourrait avoir une trop grande affinité pour les ACC, plus grande que les acide glutamique et aspartique, ce qui verrouillerait les protéines riches en arginines sur les ACC, et empêcherait l'intervention d'autre protéines dans la maturation du biominéral; ce qui n'est pas souhaitable par les organismes biominéralisants (Innocenti Malini et al., 2017).

De même, une autre grande caractéristique qui a émergé de l'étude des protéines de la biominéralisation, est la prévalence de LCD (Low Complexity Domains, ou domaines de faible complexité). Ces domaines ont une composition fortement biaisée vers un ou quelques a.a. Dans le cas de la biominéralisation, ces a.a sont souvent l'acide aspartique, la serine, la thréonine, la glycine ou l'alanine, bien que des LCD biaisés vers l'arginine ou la lysine puissent aussi être rencontrés (Gilbert et al., 2022; Marin, 2020). Ces domaines sont souvent désordonnés (Marin, 2020). Le désordre étant par ailleurs probablement très important pour ces protéines pour augmenter leur surface de contact avec le biominéral ou d'autres protéines, et changer rapidement de conformation pour s'adapter aux changements du biominéral (Kalmar et al., 2012).

### L'inconnue des protéines de la biominéralisation.

Nous avons ici cherché à illustrer quelques fonctions qui nous paraissaient importantes dans la biominéralisation et qui pourraient nourrir des hypothèses pertinentes sur la fonction de la calcyanine qui est l'objet de cette thèse. Cependant il faut garder à l'esprit qu'il existe encore une quantité impressionnante de fonctions très diverses de protéine associées à la formation de biominéraux. A ce propos, dans une revue sur le shellome des mollusques, l'ensemble des protéines associées aux coquille, F. Marin rapporte qu'il peut être trouvé associé à la coquille des mollusques des domaines protéiques typiques d'enzymes (tyrosinase, protéase, peroxidase..), de fonctions immunitaires et d'inhibiteurs de protéases (serpin, TIMP, lipocain-like...), de fixation aux saccharides... Soit une grande variété de fonctions protéiques. De plus, comme l'illustrent ces exemples, une part importante de ces domaines n'ont pas d'utilité évidente pour la biominéralisation, indiquant ainsi qu'il y a encore beaucoup à apprendre sur les mécanismes biochimiques de formation de biominéraux (Marin, 2020).

Enfin, il est tout à fait possible qu'il existe encore des fonctions protéiques crucales pour la biominéralisation qui sont encore inconnues.
Par ailleurs, Polowczyk et al. ont montré que l'action combinée du lysozyme et de l'ovalbumine sur le CaCO₃ était très différente de l'action du lysozyme ou de l'ovalbumine seuls (Polowczyk et al., 2016). Ce n'est donc pas seulement la connaissance des protéines individuelles qui est pertinente dans le cadre de la biominéralisation, mais aussi celle de leurs interactions, ce qui complexifie d'autant leur étude.

Enfin, certaines protéines impliquées dans la biominéralisation ont été reconnues comme ayant plusieurs fonctions potentielles. C'est le cas de l'anhydrase carbonique qui catalyse la formation des ions bicarbonates, accélère la transition des ACC vers la calcite et peut s'auto-assembler pour s'intégrer à la matrice du biominéral (Rodriguez-Navarro et al., 2019). Il faut donc aussi prendre en compte que ces protéines peuvent être multifonctionnelles pour comprendre pleinement leur importance.

## La biominéralisation intracellulaire d'ACC par les cyanobactéries.

Parmi les organismes les plus impliqués dans la biominéralisation du CaCO₃ se trouvent les cyanobactéries. Les cyanobactéries sont des bactéries qui sont présentes dans une très grande diversité d'environnements : eau douce, eau salée, sources géothermales, déserts, régions polaires, microbialithes (Whitton, 2012), ou encore l'intestin humain (Soo et al., 2017). Elles sont souvent considérées comme étant toutes capables de photosynthèse, bien que la découverte récente de bactéries qui sont reliées génétiquement aux cyanobactéries, mais qui sont dépourvues de systèmes photosynthétiques, laisse penser que ce trait n'est peut-être pas tout à fait commun à toutes les cyanobactéries (Soo et al., 2014, 2017). Quoiqu'il en soit, celles qui en sont capables ont eu un impact majeur sur la Terre. Tout d'abord, les cyanobactéries pourraient être les responsables du « Great Oxygenation Event », qui a vu la proportion d'O₂ dans l'atmosphère passer de 10⁻⁵ % à 1-10% de la pression atmosphérique actuelle, il y a ~2,4 milliards d'années (Olejarz et al., 2021).
Ensuite, l'endosymbiose d'une cyanobactérie par une cellule eucaryote est la théorie la plus populaire pour expliquer l'existence des chloroplastes qui permettent aux plantes de faire de la photosynthèse (Raven & Allen, 2003; Sato, 2021).

Ce sont aussi ces capacités photosynthétiques qui expliquent une partie de la biominéralisation du CaCO₃ faite par les cyanobactéries. En effet, pour pouvoir fixer le CO₂ avec l'enzyme RuBisCO, le HCO₃⁻ est transformé en CO₂ par l'anhydrase carbonique ce qui augmente le pH de l'environnement extra-cellulaire et favorise la précipitation du CaCO₃. Cette biominéralisation induite s'accompagne aussi d'une biominéralisation influencée. Il a été constaté que le CaCO₃ peut aussi nucléer et précipiter sur l'EPS (ExoPolysSaccharide) ou la membrane des cyanobactéries, bien que les mécanismes sous-jacents ne soient pas toujours bien compris (Görgen et al., 2021).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 6 :** La biominéralisation intracellulaire chez les cyanobactéries.</figcaption></figure>

(A) Image MEB d'une cyanobactérie biominéralisée (Couradeau *et al.*, 2012). Les inclusions blanches sont des ACC. (B) Image MET de *Synechococcus calcipolaris* avec les iACC localisés aux pôles de la cellule (Benzerara *et al.*, 2014). (C) Image de cryo-EM (cryo-Electron Microscopy) de l'enveloppe entourant les iACC de *Gloeomargarita lithophora* (indiquée par une flèche blanche) (Blondeau *et al.*, 2018). (D) Image MET des iACC de *G. lithophora*. (E) Cartographie chimique EDXS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy) des iACC montrés en D. La structure en anneaux témoigne de la sélectivité vis-à-vis de l'incorporation d'alcalino-terreux de la souche lors de la formation de ces inclusions (Cam *et al.*, 2016).

<caption>**Figure 8 :** Alignements de séquence du domaine $(GlyZip)_3$ et du domaine CoBaHMA des calcyanines.</caption>

Extraits de Benzerara *et al.*, 2022.

Alignement de séquence du domaine (A) $(GlyZip)_3$ et du domaine (B) CoBaHMA des calcyanines. Les positions sont surlignées en noir. Les autres positions conservées sont colorées selon le type d'a.a.

Pendant longtemps, il a été considéré qu'il n'existait pas de biominéralisation contrôlée du $CaCO_3$ par les cyanobactéries. Toutefois, en 2012, il a été observé au laboratoire pour la première fois la présence d'ACC intracellulaires chez la cyanobactérie *Gloeomargarita lithophora* (Figure 6.A; Couradeau et al., 2012), une cyanobactérie isolée depuis le lac alcalin d'Alchichica au Mexique (Moreira et al., 2017).

Cette souche a aussi été identifiée par Ponce-Toledo et al. (2017), grâce à des analyses phylogénétiques, comme le plus proche voisin de l'ancêtre bactériens des plastides, dont font partie les chloroplastes. Ces ACC ont été nommés iACC (pour ACC intracellulaire).

Le nombre d'espèces de cyanobactéries où des iACC ont été observés a fortement augmenté par la suite. Benzerara *et al.* en dénombrait 19 en 2022, Mehta *et al.* ont répertorié 4 *Microcystis* supplémentaires formant des iACC, enfin Gaëtan *et al.* ont rapporté la présence d'iACC dans des prélèvements environnementaux de *Microcystis* (Benzerara et al., 2014, 2022; De Wever et al., 2019; Gaëtan et al., 2023; Mehta et al., 2022).
Ces iACC mesurent entre 60 nm et 870 nm. Ils sont entourés par une enveloppe, dont la nature est pour l'heure inconnue, mais qui a une épaisseur cohérente avec une mono-couche lipidique ou une couche protéique (Figure 6.C; Blondeau et al., 2018). Deux distributions spatiales ont été observées pour la localisation de ces iACC : soit dispersés dans la cellule (Figure 6.A), soit localisés à ses pôles (Figure 6.B), ce second cas évoquant une implication de la machinerie de division cellulaire et/ou du cytosquelette (Benzerara et al., 2014; J. Li et al., 2016). De même, 2 comportements distincts ont été observés quant à l'incorporation des alcalino-terreux dans les iACC. Dans la majorité des espèces de cyanobactéries qui forment des iACC, la proportion d'alcalino-terreux autres que le calcium dans le biominéral est proche de celui de l'environnement. A l'inverse, *Gloeomargarita lithophora* privilégie les alcalino-terreux les plus lourds pour la formation de ses iACC : en présence de baryum, de strontium et de calcium, la cellule prélève d'abord le baryum, puis le strontium, et une fois ces 2 éléments épuisés, le calcium (Figure 6.D&E; Cam et al., 2016). Pour l'heure, seulement une autre souche de cyanobactérie, *Gloeomargarita ahousahtiae*, a été reportée comme ayant possiblement une sélectivité similaire (Bacchetta et al., 2022). Les expériences de précipitation abiotique d'ACC ne permettent pas d'expliquer ce comportement, ce qui indique une implication de *G. lithophora* dans la sélection de ces alcalino-terreux (Cam et al., 2015).

Les souches qui forment des iACC sont des hyper-accumulatrices d'alcalino-terreux. La masse de calcium contenue dans la cellule comparée à la masse sèche de la cellule est 10 à 100 fois plus élevées chez ces cyanobactéries, par rapport aux procaryotes non biominéralisants. Parmi les cyanobactéries biominéralisantes, *G. lithophora* fait partie de celles qui hyper-accumulent le plus. Par ailleurs, certaines de ces souches ont besoin de plus de Ca²⁺ dans leur environnement que les souches non-biominéralisantes pour ne pas être limitées dans leur croissance (De Wever et al., 2019).
Cette hyper-accumulation de la part de *G. lithophora* couplée à la sélectivité de cette espèce pour les alcalino-terreux lourds et à sa tolérance à la radioactivité, en font un organisme très prometteur pour isoler les isotopes radioactifs ²²⁶Ra et ⁹⁰Sr des milieux aqueux (Mehta et al., 2019).

Les cyanobactéries formant des iACC sont capables de biominéraliser dans une solution sous-saturée en CaCO₃ (Cam et al., 2018). De plus, les mesures rapportées dans la littérature des conditions chimiques intracellulaires pour les cyanobactéries indiquent des pH cytosoliques compris entre 6,4 et 8,4 (Sekine et al., 2023), et des concentrations en Ca²⁺ qui vont de 100-200nM à 3 µM (Barrán-Berdón et al., 2011; Torrecilla et al., 2000), des valeurs qui sont incompatibles avec une saturation en CaCO₃ (Cam et al., 2018). Ces mesures n'ont pas été effectuées sur des souches qui forment des iACC, mais, à moins que les conditions intracellulaires des souches biominéralisantes ne soient spectaculairement différentes de celles dans lesquelles ont été faites les mesures, la précipitation de CaCO₃ ne peut pas avoir lieu spontanément dans une cyanobactérie. Il y a donc un contrôle actif de la part des cyanobactéries formant des iACC pour accumuler et concentrer localement dans un compartiment le Ca²⁺ et le CO₃²⁻ nécessaires à la précipitation du CaCO₃.

Les raisons de ce phénotype de biominéralisation sont pour l'heure inconnues. Plusieurs hypothèses ont été soulevées par les auteurs ayant travaillé sur ce sujet. Pour reprendre le résumé établi par De Wever et al. (De Wever et al., 2019), il a été proposé que :

- Les iACC lestent la cellule;

- Les iACC servent à tamponner le pH de la cellule, et à compenser la formation d'ions OH⁻ lors de la transformation de HCO₃⁻ en CO₂ pendant la photosynthèse;

- Les iACC sont un réservoir de carbone inorganique.
## Découverte de la calcyanine.

Afin de comprendre les mécanismes à l'œuvre derrière la formation des iACC, une analyse de génomique comparative a été effectuée entre 6 souches de cyanobactéries formant des iACC, et 50 n'en formant pas. Un seul et unique gène a été identifié comme partagé par toutes les souches biominéralisantes, et absents des autres. A l'inverse, il n'a été observé aucun gène spécifique des souches non-biominéralisantes mais absent des souches biominéralisantes (Diop, 2016, Rapport de M2).

Ce gène spécifique des souches formant des iACC était totalement inconnu à l'époque, et a été nommé *ccyA*. L'étude de la phylogénie du gène *ccyA* semble indiquer que ce gène est ancestral chez les cyanobactéries. *CcyA* code pour une protéine qui a été nommée calcyanine. Cette protéine n'a jamais été décrite, et son rôle est donc inconnu.

Des premières analyses bioinformatiques ont été conduites, résumées dans l'article de Benzerara *et al.* (2022), qui se trouve en Annexe 1.

Les séquences de calcyanine qui ont été répertoriées ont tout d'abord été soumises à une analyse HCA (Hydrophobic Cluster Analysis). Cette approche, utilise une représentation 2D des séquences en a.a, reprenant la trame d'une hélice α dupliquée. Les amas d'a.a hydrophobes forts (V I L F M Y W) sont entourés pour être mis en évidence. Cette méthode permet de mettre en lumière des informations structurales, par l'intermédiaire des amas hydrophobes dont il a été montré qu'ils correspondent majoritairement aux structures secondaires régulières présents dans les domaines repliés. En sus de mettre en évidence des structures secondaires, l'analyse HCA permet de révéler la présence d'éléments répétés ou de régions désordonnées (caractérisées par l'absence d'amas) (Bitard-Feildel et al., 2018; Callebaut et al., 1997).

Hormis les calcyanine à domaine Z (en bleu sur la Figure 7), les séquences de calcyanine contiennent sur la quasi totalité de leur séquence des amas hydrophobes. Les tailles et les contenu en a.a de ces amas sont caractéristiques de domaines globulaires de protéines (Lamiable et al., 2019). Des similitudes très nettes sont visibles entre les régions $C_{ter}$ (C-terminal) des différentes calcyanines (encadrés orange sur la Figure 7). A l'inverse, les amas des régions $N_{ter}$ (N-terminal) divergent entre les différentes séquence. Le fait que la région $C_{ter}$ soit conservée, alors que la région $N_{ter}$ soit variable a permis de découper la calcyanine en 2 domaines.

Le domaine $C_{ter}$ de la calcyanine est hautement conservé (Figure 8.A). Il est formé d'une triple répétition d'un motif glycine zipper long de ~50 a.a, défini par la répétition de la séquence GxxxG (en jaune sur la Figure 7), et s'accompagne d'une répétition tous les 3/4 résidus également d'a.a hydrophobes. Il est interrompu en son milieu par un motif GP conservé. Bien que le motif glycine zipper ait été largement décrit dans la littérature, celui des calcyanines est bien plus long (~12 répétions du GxxxG) que la majorité de ceux déjà reportés (Kim et al., 2005; Martin et al., 2012; Teese & Langosch, 2015). Enfin, les glycine zippers des calcyanines ont des positions polaires conservées à leurs extrémités, souvent occupées par des a.a acides (en rose sur la Figure 7).

La forme horizontale des amas hydrophobes intégrés aux glycine zippers (en vert sur la Figure 7) est indicatrice de structures hélicoïdales de type amphiphatique, la structure 3D de chacun de ces 3 motifs glycine zippers a donc été prédite comme un motif en épingle à cheveux formé de 2 hélices
antiparallèles, le motif GP formant l'épingle. Les 3 motifs ont été nommés GlyZip1, GlyZip2 et GlyZip3. Le domaine complet a été nommé (GlyZip)₃.

Des recherches de similarité de séquences ont pu montrer une proximité entre le GlyZip2 et le glycine
zipper localisé en C<sub>ter</sub> du domaine OmpA-like de la famille de protéines PdsO (Proteobacterial sortase
system peptidoglycan-associated protein). Selon l'entrée de la banque de domaines InterPro (Paysan-
Lafosse et al., 2023) associée à PdsO (IPR022511), cette famille de protéines est spécifique des
Protéobactéries, mais sa fonction, et donc celle de son glycine zipper, est pour l'heure inconnue.
En revanche aucune similarité de séquence n'a été détectée pour le domaine (GlyZip)₃ complet.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 7 : Tracés HCA des 4 variants de la calcyanine actuellement décrits.**</figcaption></figure>

Extrait de Benzerara *et al.*, 2022.

Les séquences en a.a sont inscrites sur une trame α-hélicoïdale dupliquée. Les a.a hydrophobes forts (V
I L F M Y W) sont entourés, formant des amas correspondant majoritairement aux structures
secondaires régulières. Les symboles utilisés pour représenter certains a.a sont repris dans l'encart du
haut. Le découpage en domaine est illustré avec des flèches. Les 3 glycines zippers sont encadrés en
orange. Les a.a conservés sont surlignés en couleur. La duplication du domaine Y est mise en valeur
par des cadres rouges.
A l'inverse, le domaine $N_{ter}$ a plusieurs variants répertoriés. 4 d'entre eux, nommés X, Y, Z et CoBaHMA, ont été décrits dans Benzerara et al., 2022, mais il se pourrait qu'il en existe d'autres encore. Les 4 variants décrits pour le moment sont radicalement différents les uns des autres en termes de séquence, au point qu'il n'est pour l'heure pas possible de détecter de similarité de séquence entre eux. Ces 4 domaines n'avaient jamais été décrits avant l'étude des calcyanines. De plus, 3 d'entre eux, X, Y et Z, ne présentent pas de similarité de séquence avec des domaines déjà connus.

A l'inverse, le domaine CoBaHMA partage des similarités de séquence avec des domaines du repliement « ferredoxin-like » qui feront l'objet d'une plus ample description dans la suite de cette thèse. Le domaine CoBaHMA est aussi caractérisé par une très forte conservation de 4 a.a basiques, qui forment un motif HxxxxRxRxR (Figure 8.B).

Il est aussi intéressant de remarquer que le domaine Y est constitué d'une duplication de séquence, une caractéristique qui pourrait être partagée avec le domaine X.

Par ailleurs, la majorité des calcyanines à domaine Y n'ont pas le GlyZip2 dans leur domaine ($GlyZip_3$), ce qui laisserait entendre que ce GlyZip n'est pas essentiel à la fonction de la calcyanine.

Il semblerait que la sélectivité dans le choix des alcalino-terreux que présente *G. lithophora* (Cam et al., 2016) et que semble partager *G. ahousahtiae* (Bacchetta et al., 2022) dans la formation des iACC soit liée au domaine X que ces 2 souches ont sur leur calcyanine. Il est cependant difficile de conclure sur le lien entre un domaine et un phénotype avec seulement 2 exemples.

Enfin, la partie $C_{ter}$ désordonnée, dont les séquences sont visibles sur la Figure 8.A, semble peu conservée entre les différents variants de la calcyanine. Par exemple, elle est très riche en prolines chez *G. lithophora* (~1/3 des a.a) alors que celle *Fischerella sp. NIES-4106*, n'a qu'une seule proline (Figure 1). De plus, au sein même des variants de la calcyanine, il ne semble pas y avoir de conservations évidentes pour cette partie de la protéine.

Comme le $N_{ter}$ de la calcyanine est variable, la recherche de nouvelles calcyanines a été réalisée sur la base du domaine ($GlyZip_3$) $C_{ter}$. Un profil de ce domaine a été utilisé pour rechercher le gène *ccya* dans 594 génomes de cyanobactéries. 27 d'entre elles possèdaient ce gène. Sur ces 27, 17 ont pu être observées au microscope. 13 de ces souches observées, formaient des iACC. Ce gène est donc un marqueur génétique de cette biominéralisation. Par la suite, il a été utilisé pour repérer de nouvelles souches de cyanobactéries biominéralisantes. Ce gène est répandu chez les cyanobactéries, il se trouve dans plusieurs de ses genres comme *Microcystis*, *Synechococcus* ou encore *Fischerella* (Benzerara et al., 2022).
(A)

Gloeomargarita lithophora Alchichica-D10
Cyanothecae sp. PCC 7425
Synechococcus calcipolaris G9
Synechococcus sp. PCC 6312
Thermosynechococcus elongatus BP-1
Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203
Neosynechococcus sphagnicola sy1
Scytonema millei
Synechococcus lividus PCC 6715
Synechococcus PCC 6716
Synechococcus PCC 6717
Thermosynechococcus vulcanus NIES-2134
Thermosynechococcus sp. NK55a
Microcystis sp. T1-4
Microcystis aeruginosa PCC 9806
Microcystis aeruginosa PCC 9432
Microcystis aeruginosa CACIAM 03
Microcystis aeruginosa PCC 9443
Microcystis aeruginosa PCC 9808
Microcystis aeruginosa PCC 7941
Microcystis aeruginosa NaRes975
Microcystis aeruginosa SPC777
Microcystis aeruginosa PCC 7806SL
Microcystis aeruginosa PCC 9717
Microcystis aeruginosa PCC 9807
Synechococcus sp. CB0101
Synechococcus sp. Lanier
Synechococcus sp. RS9917
Fischerella sp. NIES-4106
Mastigocladus laminosus UU774
Fischerella muscicola PCC 7414
Fischerella sp. NIES-3754
Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212
Fischerella major NIES-592
Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912

GlyZip1

<table><tbody><tr><td>126</td><td>IPEPQNLQTGGGMVLMGC</td><td>HVVGSAIGGVAGAVTLE</td><td>GPVGAVIGAVQGCFGTGRVMG</td><td>AQLETLAGG</td><td>191</td></tr><tr><td>141</td><td>REIESKLEIGGAVLGGAA</td><td>DLVGGAIAGGAAGAAV</td><td>GPPGAILLSGMQGFVCGVIG</td><td>CAKGAETITQLDQLSDPASSP.E</td><td>191</td></tr><tr><td>110</td><td>QEVGGKLKQGGFVGGQIC</td><td>DDVGGVVGTTAGGVFV</td><td>GPAGMLMGAVQGTFVCGVIG</td><td>GRLGIEAMEQISQLTFQDMQADPGPKTALTPEEI</td><td>199</td></tr><tr><td>116</td><td>EQVSDKAQDIGSFIVGGQV</td><td>DLVGGIGAGVGAAGAT</td><td>GPAGVLGTLGQVCGVIG</td><td>ARVCVESMQTLKEHAFDLQTLCLD</td><td>195</td></tr><tr><td>105</td><td>EEVGNKLTAMGGFLMGGYLC</td><td>DILGGMVGGTAGGLL</td><td>GPCGAVMGVQGTFVCGVIG</td><td>CARLGMEATEQMIQLQFTALETEETP</td><td>184</td></tr><tr><td>116</td><td>DDAQSQRRTFGATLVGGAA</td><td>DMGGFAIGAGATAGAIF</td><td>GPAGAILLGGQVCGVIG</td><td>CAQIGAETVHHVDQFVSLANIQGTG</td><td>195</td></tr><tr><td>116</td><td>QAFQGHLESIAGGIVGLATC</td><td>EIVGGAIIGGVAGGMVI</td><td>GPAGVLLGNRVGCFAGSVC</td><td>CATIMGDVAPNLLRGGNVATVPG</td><td>193</td></tr><tr><td>116</td><td>DAPIQLRTFGAALVGAVGAT</td><td>DMGGFAVGATAGAIFM</td><td>GPAGAILLGGQVCGVIG</td><td>CAQIGAETVQQVDQFVWLADTQGTK</td><td>195</td></tr><tr><td>105</td><td>EEVGHKATAMGGFVGGYLC</td><td>DMVGGMVGATAGGVFV</td><td>GPACAVMGVQGTFVCGVIG</td><td>CARLGMS TTQEISQLQFTSFEQTPO</td><td>184</td></tr><tr><td>105</td><td>EEVGHKATAMGGFVGGYGI</td><td>DMVGGMVGATAGGVFV</td><td>GPACAVMGVQGTFVCGVIG</td><td>CARLGMS TTQEISQLQFTSFEQTPO</td><td>184</td></tr><tr><td>105</td><td>EEVGHKATAMGGFVGGYGI</td><td>DMVGGMVGATAGGVFV</td><td>GPACAVMGVQGTFVCGVIG</td><td>CARLGMS TTQEISQLQFTSFEQTPO</td><td>184</td></tr><tr><td>105</td><td>EEVGNKLTAMGGFLMGGYLC</td><td>DILGGMVGGTAGGLL</td><td>GPCCAVMGVQGTFVCGVIG</td><td>CARLGMEATEQMIQLQFTALETEETP</td><td>184</td></tr><tr><td>105</td><td>EEVGNKLTSMGGFLIGGYVC</td><td>DILGGMAGGTAGGLFV</td><td>GPACVVMGVQGTFVCGVIG</td><td>CARLGMEASEQMTQLQFTALETEETP</td><td>184</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGVI GGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPGKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>116</td><td>ISQAVDPAAVGGAFLGMSAQ</td><td>QVAGGMIGGAIG. SAIGPC</td><td>CAVLGAVQGAFACSTT</td><td>CAKGYDVTHEIVHPEPDKAQAG</td><td>192</td></tr><tr><td>90</td><td>SPWVRMRQGGMNIGMAA</td><td>QVLLGGGGAALGAWLI</td><td>GARCAVMGGACALLGS</td><td>CVGSVAGGELADGDSPLRKGD</td><td>163</td></tr><tr><td>67</td><td>NPWEQIGLEIIGSLI...</td><td>CAVGSGALGFGFFIAC</td><td>GPACAT...</td><td>GSAATESLDFNQFKRSDLNTEL</td><td>135</td></tr><tr><td>102</td><td>GGWDQVRSDVGGSMIGA</td><td>QVLLAGTAGTVGAVLFG</td><td>GPCKAILLGATGSLFG</td><td>CAVIGSALE SALADGKNPVHSQV</td><td>173</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKAKIQEFGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVGIAM</td><td>GPACAIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDARQVQNITQKNSETV</td><td>247</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKATIQEFGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVGIAM</td><td>GPACMIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDARQVQNQSTQKNSKIV</td><td>247</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKTTIQEFGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVGVV</td><td>GPACAIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDTVRQVQNITQKNSETV</td><td>247</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKTAMQELGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVAGIVM</td><td>GPACAIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDTVRQVQNITQKNFATV</td><td>247</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKTIQEFGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVAGMAI</td><td>GPACAIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDVRQVQNIAQKNSETV</td><td>247</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKTAMQELGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVAGIVM</td><td>GPACAIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDTVRQVQNITQKNFATV</td><td>247</td></tr><tr><td>170</td><td>PASKTATIQEFGGLSGLIATV</td><td>GETVGGTGVGAVVAGMAI</td><td>GPACAIVGTOVGSV</td><td>FTC AQLGEDVRQVQNIAQKNSETV</td><td>247</td></tr></tbody></table>

GlyZip2

<table><tbody><tr><td>192</td><td>HPLETVDARMQLRASDYMG</td><td>SSM GAVVGTVC</td><td>GPVGAWGNFV</td><td>DAVGGQLGTNAYQIQ KQGQAQO.</td><td>259</td></tr><tr><td>192</td><td>VLTGKYVTASLTKRAGETT</td><td>GETGELVGCMVGRV</td><td>GPGEIVTGIV</td><td>GAIAGQLGEDALQQQPAETTETTA</td><td>289</td></tr><tr><td>200</td><td>RREAEIAKALEIRSGAKM</td><td>GEVVGELAGGIA</td><td>GTVLPGP</td><td>GEAVGRVLG</td><td>EMLGGQIGIEDVSRQVAEKSEAA.</td><td>268</td></tr><tr><td>196</td><td>KTKEKVTQSLEIRTSSKAG</td><td>EVGEITGLVGCA</td><td>CGALLGP</td><td>GEII GCMGM</td><td>NMGGGQIAEADAARQVISPDKPD.</td><td>265</td></tr><tr><td>185</td><td>....RIAKALEIHSGDKI</td><td>CGAAGELAGGLA</td><td>GVVLPGP</td><td>GETLGRVV</td><td>NMVGSQLGEDLGRQLAEP SPE.</td><td>248</td></tr><tr><td>196</td><td>LTAEKIAQTLQRASEKMI</td><td>GETTGQIFGAVAG</td><td>VVLGP</td><td>GAVFGSTIL</td><td>GAIGAQLGEDTA.</td><td>254</td></tr><tr><td>194</td><td>VNPVRETALQKRAGDKVG</td><td>ATIGEVTGKTIC</td><td>TGALGP</td><td>GAVIGTVI</td><td>GAVGGRIGEDAVHVFQKHPSPSPS.</td><td>263</td></tr><tr><td>196</td><td>LTAEQIAQTLQRRTSEK</td><td>GETTGQIFGAVAG</td><td>VVLGP</td><td>GAIFGSIL</td><td>GAIGAQLGEDTA.</td><td>254</td></tr><tr><td>185</td><td>....QVAKALEVRTGDKI</td><td>GETAGEIAGLA</td><td>GVVMMGP</td><td>GETVGRVLG</td><td>SMIGSQVGEDLGRQIAEPTPV.</td><td>248</td></tr><tr><td>185</td><td>....QVAKALEVRTGDKI</td><td>GETAGEIAGLA</td><td>GVVMMGP</td><td>GETVGRVLG</td><td>SMIGSQVGEDLGRQIAEPTPV.</td><td>248</td></tr><tr><td>185</td><td>....QVAKALEVRTGDKI</td><td>GETAGEIAGLA</td><td>GVVMMGP</td><td>GETVGRVLG</td><td>SMIGSQVGEDLGRQIAEPTPV.</td><td>248</td></tr><tr><td>185</td><td>....RIAKALEIHSGDKI</td><td>CGAAGELAGGLA</td><td>GVVLPGP</td><td>GETLGRVV</td><td>NMVGSQLGEDLGRQLAEP SPE.</td><td>248</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIEIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVFGGQLGENTAVAFNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIEIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGEDTAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIKIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGEDTAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIKIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGTDAAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIKIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGEDTAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIKIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGEDTAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIKIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGEDTAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>193</td><td>ANPIKIAEHLSKKSGEKI</td><td>GETLTAGCAIL</td><td>CVIA GP</td><td>CGMMVCA</td><td>EVLFGGQLGTDAAVALNQQVERQGK</td><td>263</td></tr><tr><td>164</td><td>.....LGSVSMRKLGGKI</td><td>GEEAGWSTGAA</td><td>CAALA GP</td><td>GAVAGMTL</td><td>GSMVAGQAVEDLIASHGRDR.</td><td>224</td></tr><tr><td>136</td><td>.....NSAKTRVSSRLASRI</td><td>GEEAGAMA</td><td>GLRIGLIA</td><td>GASTGAL</td><td>GTRLLLLGGQID EA DAHLARHSEQ.</td><td>197</td></tr><tr><td>174</td><td>.....IPLTWNRLSTQL</td><td>GEEMGTRST</td><td>CTALGLAIA</td><td>GPVGCLAG</td><td>GMLGGQLGSDLTTGWK.</td><td>230</td></tr><tr><td>248</td><td>.SLDQVTEKLOKRGEIL</td><td>GETIGCGVAG</td><td>GVAGCRVVL</td><td>GPICIVVG</td><td>SVGAQOAI GGGQLGEDTAHQLNPTNQPHRK</td><td>317</td></tr></tbody></table>
GlyZip3

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Gloeomargarita lithophora Alchichica-D10</td>
      <td>260</td>
      <td>ADRLWAI....</td>
      <td>DHSGETTSELIGGTGRLVAGA..QGOMYGARLGTY....</td>
      <td>FGRKISWQNAAGVPDPPLATAAPISPPTDPLPDPE(+11*)</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Cyanothece sp. PCC 7425</td>
      <td>260</td>
      <td>EATAPTEMASKTNSWLEKTAKGFVGETASATIGGALGSLALGP..QGKEVGMKLCNRV.</td>
      <td>ISRFIDWEGKEKPSPDKPAPELPPPCS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus calcipolaris G9</td>
      <td>269</td>
      <td>..IPTDLSVNIVLEWMKTSRAFVGETALATLGGLLSRVILGP..QAESVGLRAGTR....</td>
      <td>VGRLVDWNGDQGKTKEMAETPPTETEITTSPES(+07*)</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. PCC 6312</td>
      <td>266</td>
      <td>TTAPTSSSSVNIVLEWMKTSRAFVGETALATGGLLMLRLLGP..QAEAVGLKAGSR....</td>
      <td>AGRIIDWNTESASCKQPQSNQAKTEEL*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Thermosynechococcus elongatus BP-1</td>
      <td>249</td>
      <td>..GPPPPSLHFFLEWVKTQSTFAKETLLATGGIVARGILGP..QAEAAGIRAGSR....</td>
      <td>MSRHLDRQOSNTAAKEKKV*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203</td>
      <td>255</td>
      <td>TATNPQRLPATTQOWFVQTTQGFVGETATVTVGGAVGKIVLGS..PQOMCLKLCRK....</td>
      <td>ISKIVEWDTTTHRVVDTITPPTQLLGETQTGDRQSY*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Neosynechococcus sphagnicola syl1</td>
      <td>264</td>
      <td>..HPSSGNVLQDLQSVIDRTSRDFAGETSTAVLGSTLGGFLFGT..SGRDTGRIGSY....</td>
      <td>VGRRLNWDRDSSPPPILEATTSPASPAPESTAIAS(+14*)</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Scytomena millei</td>
      <td>255</td>
      <td>SSATLQKSPATTQOWLVNTQFVGETATVGVAGKIIILGS..PQOMCLKLCRK....</td>
      <td>ISKIVDWNATTHQVVNITPTQLPSVENLQPSDR*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus lividus PCC 6715</td>
      <td>249</td>
      <td>..DPTPPSVDVVLEWLKASRSFVGETLWATLGGLLARLTLGP..HAEAVGIRAGTR....</td>
      <td>ISRQLDMSEPALTTPAQKKEV*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. PCC 6716</td>
      <td>249</td>
      <td>..DPTPPSVSNVVLEWLKASRSFVGETLWATGGVLARLTLGP..HAEAVGIRAGTR....</td>
      <td>ISRQLDMSEPALTTPAQKKEV*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. PCC 6717</td>
      <td>249</td>
      <td>..DPTPPSVDVVLEWLKASRSFVGETLWATGGVLARLTLGP..QAEAVGIRAGTR....</td>
      <td>ISRQLDMSEPALTTPAQKKEV*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Thermosynechococcus vulcanus NIES-2134</td>
      <td>249</td>
      <td>..GPPPPSLHFFLEWVKTQSTFAKETLLATGGIVARGILGP..QAEAAGIRAGSR....</td>
      <td>MSRHLDRQOSNTAAKEKKV*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Thermosynechococcus sp. NK55a</td>
      <td>249</td>
      <td>..EPSPPSLHFFLEWVKTQSTFMMELLGTLGGIVARGILGP..QAEAPGIRAGSR....</td>
      <td>MSRHLDRQOSNTAPGEKKYNPKVIAYGDVQRDRS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis sp. Tl-4</td>
      <td>264</td>
      <td>PSEEASPEQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGRAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGERIDWTSQOPQGSLPRPSQEGQEEPQIS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 9806</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSQSQPPQPPQGDENPHVS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 9432</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQGSPGLQVPQDG*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa CACIAM 03</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQLGSLQPVQPDG*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 9443</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGSL....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQSSPPQLPQDQEELPHVS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 9808</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQGSPGLQVPQDQ*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 7941</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGQSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQGSPGLQVPQDQ*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa NaRes975</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQGSPGLQVPQDQ*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa SPC777</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQGSPGLQVPQDQ*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 7806SL</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPAQTDVRDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAI....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQSSPPQLPQDQEEDSPHS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 9717</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPEQTVDKDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGALATRSQRETAGKKIDWTSQOPQSSPPQLPQDAQEELPHVS*</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQSSPPQLPQDAQEELPHVS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Microcystis aeruginosa PCC 9807</td>
      <td>264</td>
      <td>PSQEASPEQTVDKDWIKTGSSFVGETGSALVGGAIGKLVAGA..AGAEIGRSLGAL....</td>
      <td>AGKKIDWTSPPQSSPPQLPQDQEELPHVS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. CB0101</td>
      <td>225</td>
      <td>QVGRVSWLVRLEDQAGERAISEALLGGLGRGLSGGQEWGAQLCRTLGS..LGRKIDWASSWSHRQLVSRIKRPRVAPPAS*</td>
      <td>LGRKIDWASSWSHRQLVSRIKRPRVAPPAS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. Lanier</td>
      <td>198</td>
      <td>WRNPLOWLTQGRSAAGEAASQNLFGLLGCAILQN..PGRKACEKGLY....</td>
      <td>LGRRIINWQNKLPLTN*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. RS9917</td>
      <td>231</td>
      <td>....GVGKRFWFNSMVDDSAAGEALSESLAARIGSLLGGNNPAARQGASVGMR....</td>
      <td>VGRKINWRASVEQRHLVNRLQPVQT*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Fischerella sp. NIES-4106</td>
      <td>318</td>
      <td>DNKVPPLSSEQAKRWSLNNTFCNLFGEGTAVIGGVIGTVLGP..KGKEVGRKIGLF..</td>
      <td>VGRRTDWNPNKTIAANVEAGSEGEKQQYP*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Mastigocladus laminosus UU774</td>
      <td>248</td>
      <td>SNVKPSSQQKGSLGNTTCNFLEGEGTAVIGGVIGTVLGP..KGKEVGRKIGLF..</td>
      <td>VGRRTEWNSPNTKIAADHEVGEDEGEKQQP*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Fischerella muscicola PCC 74</td>
      <td>248</td>
      <td>CDVKPVSSQEQKGSLGNTACNFLEGEGTAVIGGVIGTVLGP..KGKEVGRKIGIV....</td>
      <td>VGRRTGWNFNTKTVDLSEKVT*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Fischerella sp. NIES-3754</td>
      <td>248</td>
      <td>SNVKPSSQQKGSLGNTACDFLGEGTAVIGGVIGSTVLGP..KGKEVGRKIGMV....</td>
      <td>VGRRTDWNPNKTITTNPH*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chlorogloeopsis fritschii PCC 9212</td>
      <td>248</td>
      <td>YNVKPSSHHQKGSLGNTACNFLEGEGTAVIGGAIGVTVLGP..KGKEVGRKIGMF....</td>
      <td>VGRRTDWNPNIKTATRVEVGGGEKQQS*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Fischerella major NIES-592</td>
      <td>248</td>
      <td>SNVKPSSQQKGSLGNTACDFLGEGTAVIGGVIGSTVLGP..KGKEVGRKIGMV....</td>
      <td>VGRRTDWNPNKTITTNPH*</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chlorogloeopsis fritschii PCC 6912</td>
      <td>248</td>
      <td>YNVKPSSSHQKGSLGNTACNFLEGEGTAVIGGAIGVTVLGP..KGKEVGRKIGMF....</td>
      <td>VGRRTDWNPNIKTATRVEVGGGEKQQS*</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

(B)

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Cyanothece sp. PCC 7425</td>
      <td>1</td>
      <td>MTSTSVNCSPGYESADAARSLIPALFTBTAIGTRERLIERLRODKAYGVC</td>
      <td>QQQITQSLAGVVSIRVNPE.AGSIVVDVQVVMGQE.AQTQAEALLKVLQEVCNLHVFQPKGS</td>
      <td>109</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus calcipolaris G9</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MPKPSDDEESLPPVAELVLTRDRERLRELPPLKKDPDGYRG</td>
      <td>QODYLKPIPGITEVRLNLQ.AASLSITHYALD......LITPLQLILALLIERWGDVIQIIGGKH</td>
      <td>96</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. PCC 6312</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MSSTSPSSSSPPGGDPVPIQAELVLTPDRERLKIPLRQDPGYGT</td>
      <td>QQHLQAOQTGITEVRLNST.AQSLTLHWNPO......VISLPOQLTQLAIGDLEVIGQGNH</td>
      <td>102</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Thermosynechococcus elongatus BP-1</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MATAETAPIAEVLVTGDRERLRIQELKTDVGFDRSD</td>
      <td>TAYLKTLRGIQSVHVNPL.AASITIEYHRE......QITPLQLLAAIQWFGEVQIIGGNR</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Thermosynechococcus sp. NK55a</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MATAETPIAVVMLTGDRERLRIQELKTDVGFDRSD</td>
      <td>TAYLKTLRGIKSVHVNPL.AASITIEYHLE......QITPLQLLAAIQWFGDVQIIGGNR</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus lividus PCC 6715</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MAAADTAPIAEVMLTGDRERLRIQELKREPAFRDS</td>
      <td>VAYLHTLEGIRAVHCNPL.AASLTLEYQLE......QITPLQLLAAIQLWGDVQIVGQNG</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Thermosynechococcus vulcanus NIES-2134</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MATAETAPIAEVLVTGDRERLRIQELKTDVGFDRSD</td>
      <td>TAYLKTLRGIQSVHVNPL.AASITIEYHRE......QITPLQLLAAIQWFGEVQIIGGNR</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus PCC 6716</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MAAADTAPIAEVMLTGDRERLRIQELKRDPAFRDS</td>
      <td>VAYLHTLEGIRAVHCNPL.AASLTLEYQLE......QITPLQLLAAIQLWGDVQIVGQNG</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus PCC 6717</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MAAADTAPIAEVMLTGDRERLRIQELKREPAFRDS</td>
      <td>VAYLHTLEGIRAVHCNPL.AASLTLEYQLE......QITPLQLLAAIQLWGDVQIVGQNG</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MSLAVELDAAEESTVVKVRSIAI</td>
      <td>AVAGRERLLOPIEDAYA.QEQIIRSLAFVESIRVNPT.VGCLTITVEVTOFASTPIPIELLAAIAQVSNLQIDLGTN.</td>
      <td>104</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Scytomena millei VB511283</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MSLAAELDATEEITVIKVRGAI</td>
      <td>AVAGRERLLOPIEDAYA.QEQIIMSLTCVESVRVNTT.VGCLTITVEVSOFPGAAIPIPVELLAAIAQVSSLQIDLDTN.</td>
      <td>104</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Neosynechococcus sphagnicola syl1</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MPDVLPQVGYEIVSTLGRERCRIRYLTLDESYAQQ</td>
      <td>EQQLRSQVVWSQRINAA.AASLIVEYSGSOLSP.AEAEARLVAVMAQFSIVTKISPPGA</td>
      <td>95</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. RS9917</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MNPRSNTLQVVELPLGRERLWRPADLTAEQR.G</td>
      <td>QOSLLMELPWAALRCSAA.SRSLVITLAAG......CTAVRWQIAALAMGWQLSDGHHAS</td>
      <td>87</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. CB0101</td>
      <td>1</td>
      <td>...........MSSAQLQLMRTATNQRERLRYSELMPDALE.A</td>
      <td>IAALWGQPWVHALQORRA.SRSLVLELEPG......CTPVRWHLALADLGCGLVDRRR.</td>
      <td>83</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Synechococcus sp. Lanier</td>
      <td>1</td>
      <td>...................MLPKRIRLLEIH..................</td>
      <td>GSYKNVIEVASSLGGHWHGA.SRSLIVLPP...........TLSQVSANLYNQGWWLQAPHPLL</td>
      <td>65</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

Identical aa

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

Conserved aa:

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

V,I,L,F,M,Y,W (A,C,T,S) - hydrophobic

W,Y,F - aromatic

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

G,A (C,S,T) - small

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

R,K,H - basic

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

D,E,Q,N,S,T - polar, non basic

<figure><img src="image_13.png" /></figure>
La calcyanine semble donc jouer un rôle central dans la biominéralisation des iACC chez les cyanobactéries. Pour comprendre précisément ce rôle, ainsi que le mécanisme dans lequel la protéine est impliquée, plusieurs projets ont été initiés sur la calcyanine, pour la plupart rassemblés au sein de l'ANR HARLEY, qui a financé cette thèse.

Tout d'abord les souches biominéralisantes ont été étudiées d'un point de vue génétique. Pour cela l'équipe de F. Chauvat (I2BC) a dû tout d'abord développer des outils pour pouvoir transformer plusieurs espèces de cyanobactéries biominéralisantes pour lesquelles aucun outil n'était disponible. Cette étape indispensable a été laborieuse et a mis en évidence les limites de ce type de manipulation pour des souches polyploïdes, à croissance lente, naturellement résistantes aux antibiotiques. De fait les résultats présentés ci-dessous doivent être considérés d'un œil critique.

Les essais d'inactivation (KO) du gène *ccyA* par insertion d'une cassette dans des souches de cyanobactéries biominéralisantes (*Cyanothece* sp. PCC 7425 et *Synechococcus* sp. PCC 6312, calcyanine à domaine CoBaHMA) n'ont pas pu aboutir. Une des hypothèses serait que le gène *ccyA* est essentiel à ces bactéries, et que sa délétion entraîne la mort des mutants.

L'essai inverse, qui a consisté à exprimer le gène *ccyA* (calcyanine à domaine X ou domaine CoBaHMA) dans des souches ne formant pas d'iACC (*Synechocystis* sp. PCC 6803 et *Synechococcus elongatus* PCC 7942) n'a pas permis de voir l'apparition d'un phénotype de biominéralisation intracellulaire. Par contre, le métabolisme du calcium de ces cellules semblait impacté par cette transformation. En effet, les mutants de *S. elongatus* PCC 7942 incorporaient plus de calcium que la souche contrôle, avec une accumulation de calcium dans les polyphosphates. Si cela peut être le signe de cellules stressées ou mourantes, cela pourrait être aussi expliqué par le fait que la calcyanine a un impact sur l'import de calcium dans les cyanobactéries.

Enfin, ces expériences de génétique ont été l'occasion de tenter de localiser la calcyanine dans les cyanobactéries. Pour cela, la calcyanine a été exprimée fusionnée à l'eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein), une protéine fluorescente. Avec ce type de fusion, il est possible de localiser la protéine dans une cellule vivante, par étude de la fluorescence au microscope optique. Dans la souche biominéralisante *Synechocystis* sp. PCC 6312, la calcyanine (à domaine CoBaHMA) fusionnée à l'eGFP semblait être localisée aux membranes. Par contre, dans la souche non-biominéralisante *Synechococcus elongatus* PCC 7942, l'expression des calcyanines de *Cyanothece* PCC 7425 (CoBaHMA-(GlyZip)₃) et *G. lithophora* (X-(GlyZip)₃) fusionnées à l'eGFP faisait apparaître une fluorescence diffuse dans le cytoplasme. Ni les interférences entre la fluorescence de la GFP et l'autofluorescence des cyanobactéries ni l'impact de l'eGFP sur la calcyanine n'ont été quantifiés dans ces expériences, ce qui limite leur interprétation. Toutefois, ces résultats pourraient indiquer que la calcyanine à domaine CoBaHMA est localisée à la membrane, mais qu'elle a besoin de partenaire pour être adressée correctement (P. S. Görgen, 2020, Thèse).

Au risque de se répéter, ces résultats doivent être considérés avec un regard critique car les expériences ont été complexes, et tout les contrôles n'ont pas pu être effectués. Néanmoins cette approche génétique dessine pour la calcyanine à domaine CoBaHMA, l'image d'une protéine vitale pour les cyanobactéries biominéralisantes, localisée aux membranes, en interaction avec des partenaires, et impliquée directement ou indirectement dans l'accumulation du calcium.
Toujours en relation avec ces aspects génétiques, la co-occurence de *ccyA* avec certains autres gènes a été étudiée. Comme nous l'avons décrit plus en amont dans la thèse, les processus de biominéralisation nécessitent un grand nombre de protéines, notamment impliquées dans le transport d'ions. De Wever *et al.* ont montré que dans les génomes de 7 souches biominéralisantes, se trouvaient systématiquement les gènes de plusieurs antiporteurs : un échangeur $Ca^{2+}/H^{+}$, UPF0016 un gène codant possiblement pour un antiporteur $Ca^{2+}/Cation$ et un échangeur $Na^{+}/H^{+}$ qui pouvait se comporter comme un antiporteur $Ca^{2+}/H^{+}$ à pH élevé. De même, le gène d'un canal mécano-sensible a été répertorié (De Wever et al., 2019). Une recherche dans 602 génomes cyanobactériens a montré la co-occurence de la calcyanine avec un antiporteur $Ca^{2+}/H^{+}$ ainsi que le SLC26 BicA un transporteur d'ions $HCO_3^-$ dépendant du $Na^+$ (Benzerara et al., 2022). A notre connaissance, BicA n'a encore jamais été reliée à un processus de biominéralisation contrôlé. Par contre, c'est un transporteur qui a été identifié comme étant impliqué dans les processus de concentration du carbone pour la photosynthèse (Price & Howitt, 2011). De même sur le méga plasmide de *Fischerella* sp NIES-4106, la calcyanine est localisée dans une région où l'on trouve un antiporteur du calcium, des ATPases transporteur de calcium ainsi qu'une anhydrase carbonique, des protéines qui, comme décrit précédemment, peuvent être liées à la biominéralisation (Benzerara et al., 2022).

## Projet de thèse.

Pour résumer ce qui a été présenté ci dessus, les études menées jusqu'à présent dans l'équipe ont pu montrer, pour la première fois, l'existence d'un processus de biominéralisation intracellulaire chez certaines souches de cyanobactéries. L'observation de la précipitation de carbonate de calcium dans un environnement, le cytosol, en pratique sous-saturé, a guidé les chercheurs vers la recherche de gènes responsables de ce phénotype. L'analyse de génomique comparative a, en effet, permit d'associer la calcyanine, codé par le gène nommé *ccyA*, à la présence d'iACC. La découverte de *ccyA* chez les souches biominéralisantes et l'observation de iACC dans des souches porteuse du gène *ccyA* dans leur génome, a permis, sans équivoque, d'identifier la calcyanine comme le marqueur de la biominéralisation intracellulaire des cyanobactéries (Benzerara et al., 2022).

Comme décrit dans cette introduction, la biominéralisation du $CaCO_3$ implique un grand nombre de protéines avec des fonctions distinctes. De fait, comme résumé en Figure 9, il existe beaucoup d'hypothèses fonctionnelles pour la calcyanine.

Les études de génétique réalisées dans le but de comprendre le rôle physiologique de la production d'iACC dans ces souches, semblaient indiquer que la calcyanine a un rôle dans l'accumulation intracellulaire du calcium. Cela expliquerait le lien qui semble être présent entre le domaine X et la sélectivité dans l'incorporation des alcalino-terreux.

L'analyse génomique de l'environnement génomique des gènes *ccyA* a montré la co-occurence de la calcyanine avec des protéines de transport du calcium et du carbonate. La présence dans le génome des souches biominéralisantes de protéines d'import du calcium indique que cette fonction est déjà assurée pour ces souches, et que donc ce n'est probablement pas là le rôle de la calcyanine. Cette dernière pourrait alors être plus impliquée dans le transport intracellulaire, par exemple pour emmener les alcalino-terreux de la membrane jusqu'au site de nucléation ou encore pour importer les alcalino-terreux dans les organelles où a lieu la précipitation. Enfin, comme le gène *ccya* est spécifique
de la formation d'iACC qui sont entourés d'une enveloppe, possiblement protéique, la calcyanine pourrait former cette enveloppe.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 9 : Hypothèses sur la fonction de la calcyanine.**</figcaption></figure>

En jaune sont illustrées quelques hypothèses pour la/les possible(s) fonction(s) de la calcyanine dans la biominéralisation. Figure produite avec www.BioRender.com.

Dans cette thèse, nous avons cherché à poursuivre et étendre l'étude de la calcyanine pour apporter des éléments pour comprendre sa fonction, en nous intéressant à ses caractéristiques structurales.

Nous nous sommes concentrés sur un seul des 4 variants de la calcyanine, celui portant un domaine CoBaHMA. En effet, c'est le plus répandu et *a priori* le plus ancestral des 4 variants de la calcyanine (Benzerara et al., 2022). Son étude devrait apporter des réponses sur le mécanisme moléculaire à l'œuvre dans ce phénotype de biominéralisation ainsi que son évolution. Parmi les souches de cyanobactéries présentant ce variant, nous avons étudié *Synechococcus calcipolaris*, une souche isolée depuis des microbialites du lac Alchichica, un lac alcalin situé au Mexique. C'est une des premières souches biominéralisantes à avoir été décrite, elle était donc déjà bien connue dans notre laboratoire. Ses iACC sont localisés au pôle de la cellule (Benzerara et al., 2014), et elle ne présente pas de sélectivité particulière vis-à-vis des alcalino-terreux.

Pour étudier cette calcyanine nous avons fait dialoguer 2 approches complémentaires relevant de la bioinformatique et de la biochimie.

D'un point de vue bioinformatique, nous nous sommes tout d'abord attachés à prédire la structure 3D de la calcyanine de *S. calcipolaris* et de ses différents domaines. Des approches de modélisation comparative ont été mises en œuvre afin de réaliser un modèle de la structure 3D du domaine CoBaHMA, seul domaine de la calcyanine à présenter des similarités de séquences avec des structures 3D connues. Nous avons profité du développement de méthodes de prédiction de structure 3D basées sur l'intelligence artificielle, qui ont vu le jour durant le déroulement de cette thèse, pour compléter
cette première approche par plusieurs modélisations de la structure 3D de la calcyanine complète. L'analyse de ces modèles à la lumière de la conservation des séquences de cette famille de protéines nous a donné de premières informations et hypothèses quant aux positions critiques pour la structure et la/les fonction(s).

Cependant ces modèles sont incomplets, le modèle du domaine $(GlyZip)_3$ ne pouvant être prédit de manière complètement satisfaisante. De plus, ils ne fournissaient pas d'information sur l'état oligomérique ou les interactions entre les domaines CoBaHMA et $(GlyZip)_3$.

Nous avons alors cherché à suppléer à ces limitations par une approche expérimentale. Nous avons exprimé la calcyanine dans le système hétérologue *E. coli*, puis cherché à la purifier pour pouvoir résoudre sa structure expérimentale. La calcyanine entière s'est avérée trop hétérogène pour espérer former des cristaux, étape indispensable à la diffraction des rayons X. Par contre, par protéolyse limitée, et à l'aide du modèle de la structure 3D, nous avons identifié et isolé un fragment de la calcyanine qui s'est avéré beaucoup plus propice à la détermination structurale. L'expression et la purification de ce fragment ont permis d'aboutir à des cristaux très prometteurs.

Par ailleurs nous avons recherché la présence éventuelle du domaine CoBaHMA dans d'autres protéines, pour préciser le contexte biologique dans lequel la ou les fonction(s) du domaine CoBaHMA s'expriment. Ces recherches ont également bénéficié de l'apport des nouvelles méthodes de prédiction de structures 3D, reposant sur l'intelligence artificielle, qui fournissent des modèles de structures 3D à un niveau de précision inégalé à l'échelle de protéomes entiers. Ces modèles ont ainsi été largement utilisés pour accroître la spécificité des recherches de similarités, ainsi que pour décrypter plus en avant l'organisation modulaire des protéines de la famille CoBaHMA, et proposer de nouvelles hypothèses quant à la fonction de ce domaine.
# Chapitre 1 : Analyse de la modélisation de la structure 3D de la calcyanine de S. calcipolaris.

Les modèles de la calcyanine complète de S. calcipolaris produits par AlphaFold2 et ESMFold, appuient nos premières modélisations par homologie et donnent un premier aperçu de l'ensemble de la structure 3D de la protéine, mais demandent à être complétés.

La modélisation de la structure 3D de la calcyanine de S. calcipolaris s'est faite en 2 temps. Dans un premier temps, courant 2020, nous avons établi un premier modèle par homologie (modélisation comparative) de son domaine CoBaHMA. L'absence de protéines dont les séquences sont similaires à celles du domaine (GlyZip)₃ et dont la structure 3D ait été résolue expérimentalement, nous a empêché de faire de même pour ce domaine. De fait, nous ne pouvions produire de modèle pour la séquence complète de la calcyanine.

Cependant, le champ de la modélisation des structures 3D de protéines a été révolutionné en 2021 par l'émergence de méthodes reposant sur l'intelligence artificielle, avec le logiciel AlphaFold2 (Jumper et al., 2021) qui permet de prédire les contacts entre résidus, à partir de coévolutions observées au sein d'alignement de séquences apparentées. D'autres logiciels comme RoseTTAFold (Baek et al., 2021) ou ESMFold (Lin et al., 2023) ont été développés par la suite, reposant sur des technologies différentes. Par exemple ESMFold ne nécessite pas d'alignement de séquences pour prédire une structure 3D, ce qui lui permet de modéliser des séquences qui ont peu ou pas de séquences apparentées, contrairement à AlphaFold2.

Nous avons alors modélisé la calcyanine complète à l'aide de 2 de ces logiciels : AlphaFold2 et ESMFold.

Par souci de synthèse et de clarté, j'ai choisi de présenter ces résultats de modélisation dans un ordre non chronologique. Je commencerai par présenter les modèles de la structure complète, pour ensuite me focaliser sur les domaines, avec, pour le domaine CoBaHMA, une mise en regard de la modélisation comparative avec celles réalisées par intelligence artificielle.

Nous avons donc modélisé la structure 3D de la calcyanine de S. calcipolaris avec 2 logiciels : AlphaFold2 (Figure 10.A) et ESMFold (Figure 10.C). Comme anticipé par analyse des séquences, la structure 3D de la calcyanine est modélisée sous la forme de 2 domaines structurés (CoBaHMA et (GlyZip)₃) et d'une queue désordonnée en $C_{ter}$ (Benzerara et al., 2022). Avant d'analyser les caractéristiques de ces modèles, nous avons tout d'abord évalué leur qualité selon 4 critères :

- Le Z-score fourni par ProSA (Wiederstein & Sippl, 2007), qui évalue le profil énergétique de la structure.

- Le pLDDT (predicted Local Distance Difference Test) (Jumper et al., 2021), qui évalue la confiance locale de chaque logiciel en sa prédiction.

- La stéréochimie des acides aminés fourni par PROCHECK (Laskowski et al., 1993).

- Le PAE (Mirdita et al., 2021) qui quantifie l'erreur de positionnement relatives des paires d'a.a de la séquence.

Les évaluations ProSA des 2 modèles de la calcyanine conduisent à des Z-scores (Sippl, 1993) de respectivement -6,02 (Figure 11.A) et -7,31 (Figure 11.B). Ces valeurs se situent dans la gamme de Z-score obtenus par des structures expérimentales de longueurs de séquence similaires, indiquant que ces modèles sont fiables d'un point de vue énergétique.
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 10 : Modèles de la structure 3D de la calcyanine de S. calcipolaris conçus par AlphaFold2 et ESMFold.</figcaption></figure>

Modèles conçus par (A) AlphaFold2 et (C) ESMFold, colorés selon le pLDDT. Le découpage en domaines est mis en évidence par des rectangles colorés. (B) PAE du modèle AlphaFold2 qui illustre l'erreur de positionnement relatif des a.a de la séquence 2 à 2, et permet de juger de la pertinence de la prédiction des contacts intra- et inter-domaines.
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 11 :** Evaluations ProSA des modèles de la structure 3D de la calcyanine de *S. calcipolaris* conçus par AlphaFold2 et ESMFold.</figcaption></figure>

Comparaison des Z-scores de structures expérimentales, avec les Z-scores des modèles conçus par (A) AlphaFold2 et (B) par ESMFold.

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 12 :** Comparaison des distribution du pLDDT des modèles de la structure 3D de la calcyanine de *S. calcipolaris* conçus par AlphaFold2 et ESMFold.</figcaption></figure>

Comme illustré en Figure 12, pour le modèle AlphaFold2, 77% des a.a se trouvent sous le seuil d'interprétabilité (pLDDT < 50). Ces a.a sont principalement sur le domaine $(GlyZip)_3$ pour lequel une structure ordonnée est proposée, mais dont la vraisemblance ne peut être étayée; et dans la région $C_{ter}$ qui été prédite comme désordonnée. Pour le modèle ESMFold, seuls 9% des a.a se trouvent sous le seuil d'interprétabilité. Ces a.a se trouvent soit à proximité, soit dans des boucles désordonnées. Le domaine $(GlyZip)_3$ a un pLDDT très majoritairement > 50, voir même > 70. Étrangement, en dépit du fait que le désordre ait été relié à un pLDDT < 50 dans les modèles de structure 3D d'AlphaFold2 (Tunyasuvunakool et al., 2021; C. J. Wilson et al., 2022), dans ce modèle ESMFold, la partie $C_{ter}$ est bien prédite désordonnée, mais avec un pLDDT > 70.
Selon le pLDDT, ESMFold semble donc plus confiant sur sa prédiction que ne l'est AlphaFold2. Il est
possible d'avancer au moins 3 hypothèses pour expliquer cela.

La première, de loin la plus problématique, est que les valeurs de pLDDT ne sont pas comparables
entre les 2 logiciels. Comme les deux logiciels reposent sur des méthodologies différentes, il est
envisageable que ce calcul de pLDDT soit réalisé différemment dans les 2 cas. La gestion du $C_{ter}$
désordonné est, à ce titre, particulièrement intéressante. Le désordre a été relié à un pLDDT < 50 chez
AlphaFold2 (Tunyasuvunakool et al., 2021; C. J. Wilson et al., 2022), cependant le modèle ESMFold
attribue un pLDDT > 70 à cette zone désordonnée. Cela semble indiquer une gestion différente de cette
métrique dans les 2 logiciels. Donc il ne serait pas possible de l'utiliser pour comparer ces 2 modèles.
La question de la pertinence de l'utilisation du pLDDT comme outil de comparaison de modèles issus
de logiciels différents a été déjà été soulevée par Aubel *et al*. (Aubel et al., 2023) avec pour exemple la
prédiction de la structure de la protéine Goddard avec 4 logiciels de prédiction (AlphaFold2, ESMFold,
OmegaFold (R. Wu et al., 2023) et RGN2 (Chowdhury et al., 2023)). Dans cet exemple, en dépit de
prédictions similaires, les pLDDT différaient significativement, interrogeant son utilité comme élément
comparatif de prédictions opérées par différents logiciels (Aubel et al., 2023).

Une autre hypothèse repose sur l'ensemble d'entrainement d'ESMFold. ESMFold a été entrainé sur les
données d'entrainement d'AlphaFold2 (des structures 3D expérimentales issues de la banque de
structures 3D expérimentales PDB (Protein DataBase), antérieures à Avril 2018), auxquelles ont été
ajoutés 12 millions de modèles AlphaFold2 de séquences issues de UniRef 50 (Hsu et al., 2023; Lin et
al., 2023, 2023 supplementary data). Dans le cas d'AlphaFold2, il a été montré que le pLDDT était, en
moyenne, supérieur lorsque la protéine à modéliser avait un homologue de structure 3D connue dans la
PDB. Dit autrement, le pLDDT d'un modèle augmente quand AlphaFold2 a déjà été entrainé sur la
structure 3D de la protéine à modéliser (D. T. Jones & Thornton, 2023). Pour l'heure, il n'y a pas eu de
démonstration similaire pour ESMFold, mais il est probable qu'un effet semblable soit observable.
Comme évoqué plus haut, nos recherches pour identifier des homologues au domaine (GlyZip)₃ dans la
PDB n'ont pas abouti. AlphaFold2 n'a donc pas pu être entrainé sur une structure 3D expérimentale de
référence pour ce domaine. Cependant, il pourrait y avoir des modèles de longs glycine zippers dans
l'ensemble d'entrainement d'ESMFold incluant des modèles d'AlphaFold2. Cela permettrait à
ESMFold de partir d'une base connue pour construire son modèle, et augmenterait sa précision. Par
exemple, les protéines possédant un domaine PdsO, qui présente des similarités de séquences avec le
GlyZip2 des calcyanine (Benzerara et al., 2023), sont présentes dans UniRef50 et pourraient avoir été
intégrées en tant que modèles AlphaFold2 à cet ensemble d'entrainement.

Enfin, la dernière hypothèse repose sur le fait qu'AlphaFold2 requiert un MSA (Multiple Sequence
Alignment) pour pouvoir modéliser une structure 3D quand ESMFold se contente de la séquence seule.
En l'absence de MSA, les performances d'AlphaFold2 chutent drastiquement (Jumper et al., 2021; Lin
et al., 2023). Le manque de séquences similaires au domaine (GlyZip)₃ des calcyanines ne permet pas
d'avoir un alignement suffisamment profond pour ce domaine, ce qui limite certainement les capacités
d'AlphaFold2. ESMFold n'est pas affecté par cette limite, ce qui pourrait justifier sa plus grande
confiance en sa prédiction.

L'évaluation par PROCHECK de la stéréochimie de ces modèles, reposant sur la considération des
angles φ-ψ associés à chaque a.a, a révélé des imperfections apparentes dans la prédiction (Figure
13.A). Selon PROCHECK, un bon modèle doit avoir 90% de ses a.a dans la région les plus favorisées
du diagramme de Ramachandran. Or, pour le modèle construit par AlphaFold2 seul 72,8% des a.a sont
dans ces régions. De plus 4,9% des a.a sont dans la région « Interdite ». De même pour le modèle ESMFold, 85,4% des a.a sont dans des régions plus favorisées et 0,3% dans la région « Interdite ».

Toutefois une étude plus approfondie des diagrammes de Ramachandran de ces deux modèles de structure 3D de la calcyanine (Figure 13.B&C) révèle que les zones structurées (CoBaHMA et les GlyZips) ont une très bonne stéréochimie, mais que les zones désordonnées ont de nombreux a.a dans les zones interdites du diagramme. Il est à noter que les logiciels AlphaFold2 et ESMFold reposent sur un apprentissage vis à vis des structures déjà connues, sans l'implication de modèle physique. Dès lors quand ces logiciels sont confrontés à des séquences pour lesquelles leur apprentissage n'est pas adapté, notamment pour les segments désordonnées, il est probable qu'ils agissent de manière incohérente, sans respect de physique et la stéréochimie. Pour AlphaFold2, cela se traduit par une distribution des a.a dans le diagramme de Ramachandran de plus en plus éloignée de celle attendue à mesure que le pLDDT diminue (D. T. Jones & Thornton, 2022).

Il est, là encore, pertinent de noter qu'en dépit d'un pLDDT > 70, la partie désordonnée du modèle ESMFold a une mauvaise stéréochimie, ce qui renforce l'idée qu'AlphaFold2 et EMSFold ne traitent pas le pLDDT de la même manière. De même il est intéressant de remarquer que les GlyZips prédits par AlphaFold2 ont beau avoir un pLDDT < 50, leur stéréochimie est correcte. Il y a donc probablement une base solide à cette prédiction.

Enfin, le dernier critère d'évaluation utilisé pour ces modèles est le PAE (Predicted Aligned Error), une prédiction de l'erreur de positionnement relative de tous les couples d'a.a de la séquence (Mirdita et al., 2021). Celui-ci, uniquement disponible pour le modèle d'AlphaFold2, indique des erreurs de positionnement relatives faibles au sein des GlyZip et du domaine CoBaHMA, mais une grande erreur entre ces différents éléments (Figure 10.B). Ainsi, le positionnement relatif des éléments de structures secondaires parait fiable au sein du domaine CoBaHMA et des GlyZips, au contraire des positionnements des GlyZips entre eux, et du CoBaHMA vis à vis du domaine (GlyZip)³. Il n'est donc pas possible de prédire les interactions inter-domaines, ni inter-GlyZips dans ce modèle.

De cette première analyse, nous pouvons constater qu'ESMFold et AlphaFold2 fournissent tous 2 des modèles cohérents de la structure des différents domaines de la calcyanine, avec des valeurs de pLDDT élevées pour le domaine CoBaHMA, et plus faibles pour le domaine (GlyZip)³. Néanmoins, afin de pleinement évaluer la pertinence de ces modèles nous nous attacherons ci-après à une analyse détaillée des 2 domaines de la calcyanine.

Comme ESMFold est globalement plus confiant qu'AlphaFold2 dans sa prédiction, nous nous servirons principalement de son modèle pour illustrer la suite de cette thèse.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 13 : Evaluations PROCHECK de la stéréochimie des modèles de la structure 3D de la calcyanine de S. calcipolaris.</figcaption></figure>

(A) Comparaison de la répartition des a.a dans les différentes régions du diagramme de Ramachandran, pour les 2 modèles. (B-C) Diagrammes de Ramachandran de chacune des régions des modèles conçus par (B) AlphaFold2 et (C) ESMFold. En rouge sont colorés les a.a du domaine (de gauche à droite) CoBaHMA ([15-104]) / des motifs GlyZip ([116-185], [198-263], [274-326])/ des régions désordonnées (pour AlphaFold 2 : [1-14], [105-116], [187-195], [265-274], [324-362]; pour ESMFold : [342-362]). Les a.a des autres parties sont colorés en bleu.
Le domaine CoBaHMA est une nouvelle famille dans la superfamille HMA, au sein du repliement ferredoxin-like et présente une signature structurale et fonctionnelle unique.

AlphaFold2 et ESMFold proposent des modèles semblables du domaine CoBaHMA de la calcyanine de S. calcipolaris. En amont de l'utilisation de ces outils d'intelligence artificielle, nous avions par ailleurs construit un modèle de la structure 3D du domaine la calcyanine de CoBaHMA de Synechococcus RS9917 par modélisation comparative. En effet, les recherches réalisées avec l'outil HH-PRED (alignement profils/profils) (Zimmermann et al., 2018), ont permis d'identifier des similitudes de séquence significatives entre le domaine CoBaHMA des calcyanines et 3 familles de domaines de la superfamille HMA (Heavy Metal Associated) : la famille HMA, la famille iHMA et la famille YAM. Les taux d'identité de séquence observés sont compris entre 8 % et 18 % (Probabilités comprises entre 96.5 et 91.3) (Figure 14).

Les domaines HMA (Bull & Cox, 1994) (parfois nommés MBD pour Metal Binding Domains) sont des domaines cytosoliques que l'on peut trouver seuls (Hearnshaw et al., 2009), ou associés à d'autres domaines tels que les P1B-type ATPases (Gourdon et al., 2011). Ces domaines sont impliqués dans la régulation de la concentration de cations métalliques. Ils sont caractérisés par un motif conservé CxxC, parfois étendu à MxCxxC (Bull & Cox, 1994). Il a été montré que ce site pouvait interagir directement avec les ions Cu⁺ (Hearnshaw et al., 2009) et les ions Zn²⁺ (Banci et al., 2003) (Figure 15.B).
Les domaines iHMA (pour integrated HMA, parfois nommés RATX1) sont des domaines cytosoliques que l'on trouve dans des protéines de résistance aux pathogènes chez les plantes. Les domaines iHMA permettent la reconnaissance de pathogènes (Cesari et al., 2013; De la Concepcion et al., 2018) (Figure 15.D).

Enfin, le domaine YAM est un domaine cytosolique du YajR, une protéine membranaire que l'on trouve dans des souches de bactéries Gram-négative (E. coli, Acinetobacter calcoaceticus, Cronobacter turicensis...), membre de la superfamille MFS (Major Facilitator Transporter). Son (ses) rôle(s) est/sont pour l'heure mal compris, mais il pourrait être impliqué dans la régulation de la fonction de YajR par oligomérisation et/ou en réponse à des variations de pH ou d'ions (D. Jiang et al., 2013, 2014) (Figure 15.C).
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 14 : Alignement de séquences du domaine CoBaHMA, et de membres de la superfamille HMA.</figcaption></figure>

Extrait de Benzerara *et al.*, 2022.

Les positions strictement conservées sont surlignées en noir. Les positions conservées sont colorées selon le type d'a.a. Les structures secondaires observés dans le repliement «ferredoxin-like», sont inscrites au dessus de l'alignement.
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 15 : Modèle 3D de la structure du domaine CoBaHMA, et structure expérimentale du domaine HMA, YAM, iHMA et au domaine N<sub>ter</sub> de KipI.</figcaption></figure>

(A) Modèle du domaine CoBaHMA construit avec ESMFold. La chaîne latérale des a.a basiques conservés est représentée. La topologie du domaine est affichée sous la structure 3D. (B) Structure et topologie du domaine HMA de la protéine CopZ (Hearnshaw et al., 2009; ID PDB RCSB : 2QIF). Ce domaine a la structure canonique du repliement « ferredoxin-like ». La chaîne latérale des cystéines du motif CxxC de liaison des ions Cu<sup>2+</sup> typique des HMA est affichée. (C) Structure et topologie du domaine YAM de la protéine YajR (Jiang et al., 2014; ID PDB RCSB : 2RU9). La chaîne latérale des a.a conservés est affichée sur la structure. (D) Structure et topologie du domaine iHMA de la protéine Pikm-1 (De la Concepcion et al., 2018; ID PDB RCSB : 6FU9). (E) Structure et topologie du domaine N<sub>ter</sub> de KipI (Jacques et al. 2010; ID PDB RCSB : 2KWA).
Ces 3 domaines adoptent un repliement « ferredoxin-like » caractérisé par un enchaînement de structures secondaires βαββαβ (β1-α1-β2-β3-α2-β4) avec une topologie de feuillet β 2↑3↓1↑4↓ (topologie basée sur (Richardson, 1981), les flèches indiquant l'orientation des brins). Il y a toutefois des variations entre ces familles, notamment au niveau du brin β4 : le domaine YAM ne possède pas ce brin (D. Jiang et al., 2014), quand les iHMA (De la Concepcion et al., 2018) ont un β4 très long et conservé. Sur la base de cette similitude de séquences, nous avons pu modéliser le domaine CoBaHMA avec la structure expérimentale de ces domaines comme référence grâce à Modeller (Webb & Sali, 2016). Cependant l'analyse du MSA du domaine CoBaHMA (Figure 14) indique la présence d'un élément de structure secondaire additionnel en amont du brin β1, incluant une histidine très conservée. Cette séquence $N_{\text{ter}}$ du domaine CoBaHMA a été modélisée comme un brin β additionnel nommé β0, en prenant comme référence le domaine $N_{\text{ter}}$ de KipI (ID PDB RCSB : 2KWA). En effet, des similitudes de séquence, plus faibles (12 %), ont également été détectées avec ce domaine grâce à l'outil HH-PRED. Le domaine $N_{\text{ter}}$ de KipI est formé d'un enchaînement de structures secondaires ββαββα (Jacques et al., 2011) (Figure 15.E), avec pour le feuillet β une topologie : 2↑3↓1↑0↓. Une superposition des structures 3D de KipI et du domaine YAM de YajR indique leur compatibilité (RMSD 2.1 Å sur 55 Cα). La topologie du repliement est donc conservée, mais avec une transformation topologique simple (β4 remplacée par le β0) conduisant à des positions différentes des extrémités N- et C-terminales du domaine. Ce type de transformation est un processus fréquemment observé au cours de l'évolution des domaines de protéines (Grishin, 2001).

Le modèle par homologie ainsi obtenu a un enchaînement de structure secondaire ββαββα(β), avec un brin β4 présent ou non selon les structures de référence utilisées. Le feuillet β adopte une topologie 2↑3↓1↑0↓(4↓).

Le même repliement, dérivé du repliement ferredoxin-like, est observé dans les 2 modèles AlphaFold2 et ESMFold, qui se superposent parfaitement (RMSD 0.33 Å sur les 80 atomes Cα sur les a.a [12-93] qui couvrent tout le domaine CoBaHMA). Le pLDDT est > 50 pour tout le domaine dans ces deux modèles, avec une large portion d'a.a avec un pLDDT > 70, voir > 90 surtout dans le modèle ESMFold, ce qui indique une bonne, voire une très bonne confiance des logiciels dans leur modèle.

Toutefois les 3 modèles (par homologie, AlphaFold2, ESMfold) divergent sur les a.a présents sur le brin β0. Il y a un décalage d'un 1 a.a entre le modèle établi par modélisation comparative et les 2 autres, ce qui induit une différence sur le positionnement de l'histidine conservée du β0 (Figure 14). La modélisation comparative l'oriente vers le cœur hydrophobe, quand les modèles conçus par l'intelligence artificielle l'orientent vers l'extérieur du domaine (Figure 15.A), ce qui parait plus cohérent au regard des propriétés hydrophiles de cet a.a. L'utilisation d'AlphaFold2 et ESMFold a non seulement permis de confirmer le modèle obtenu par comparaison du domaine CoBaHMA, mais a aussi permis de l'affiner sur le brin β0.

Ces modèles, ainsi que les similitudes de séquence détectées lors de la recherche de moules expérimentaux pour la modélisation comparative nous permettent ainsi d'affirmer que le domaine CoBaHMA adopte un repliement « ferredoxin-like ». De plus, la proximité de séquence avec les familles HMA, iHMA et YAM le place dans la superfamille HMA (superfamille SCOP d58.17, https://scop.berkeley.edu/sunid=55008).
Cependant, le domaine CoBaHMA a une signature en a.a distincte des 3 autres familles, qui le place
dans une famille indépendante. En effet, le domaine CoBaHMA n'a pas les signatures des autres
familles de la superfamille HMA, comme le motif CxxC des HMA (Benzerara et al., 2022; Bull & Cox,
1994) ou le motif YxK conservé sur le brin β3 des YAM (D. Jiang et al., 2014). Par contre, il présente
un patch d'a.a basiques à la surface de son feuillet β, constitué d'une histidine sur le brin β0 et de 3
arginines (plus rarement de lysines) sur le brin β1 qui lui sont spécifiques (Figure 14). Il est donc
probable que le domaine CoBaHMA a une
fonction distincte de celles reportées pour les
autres membres de la superfamille.

C'est cette analyse qui a conduit à l'appellation « CoBaHMA », pour « domain with COnserved BAsic residues in the HMA superfamily ».

En considérant le phénotype de
biominéralisation dans lequel est impliquée la
calcyanine ainsi que les a.a conservés, nous
pouvons poser quelques hypothèses concernant
la fonction du domaine CoBaHMA.

Des simulations de dynamique moléculaire ont montré qu'en présence d'ions Ca2+ et CO3<sup>2-</sup>, les arginines avaient une forte proportion à interagir avec les ions carbonates (Innocenti Malini et al., 2017; Kumar et al., 2020; Rani & Saharay, 2019) (Figure 16). Dans le cas du lysozyme, une

protéine impliquée dans la biominéralisation des coquilles d'œuf, c'est cette interaction des ions carbonates avec un trio d'arginines spatialement proches qui serait à l'origine de la précipitation d'ACC (Amorphous Calcium Carbonate), possible précurseur de la calcite de la coquille (Rani & Saharay, 2019). La dynamique moléculaire a aussi montré une forte affinité des arginines pour les ACC (Innocenti Malini et al., 2017).

Nous pouvons donc supposer que le domaine CoBaHMA de la calcyanine interagit avec des ions carbonates via ses arginines conservées lors de la formation des iACC chez les cyanobactéries, par exemple pour favoriser leur précipitation.

L'histidine conservée pourrait elle aussi interagir avec les ions carbonates via sa charge positive. Néanmoins, il y a peu de données sur une possible interaction carbonate-histidine. Tout au plus, nous pouvons évoquer l'interaction de l'histidine avec la calcite (cristal de carbonate de calcium) reportée par Kumar *et al.*, mais dans un environnement acide (Kumar et al., 2020).

Cependant, ce n'est pas la seule hypothèse que nous pouvons formuler concernant cet ensemble d'a.a basiques conservés. En effet de nombreuse protéines interagissent avec les têtes chargées négativement de phospholipides via des a.a basiques (Lemmon, 2008; Stace & Ktistakis, 2006). Nous pouvons citer les domaines FYVE qui se fixent sur les phosphatidylinositol-3-phosphates via un motif RR/KHHCR (Kutateladze, 2006), ou encore le domaine PX de p47phox qui interagit avec les acides phosphatidiques via une histidine, une arginine et une lysine (Karathanassis et al., 2002). La présence d'a.a basiques

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 16 : L'arginine comme site de nucléation du carbonate de calcium.</figcaption></figure>

Extrait de Rani and Saharay, 2019.
En rouge les molécules de carbonate.
conservés sur un feuillet β rappelle plus spécifiquement l'un des 2 sites d'interaction avec les
phosphatydilserines et les phosphoinositides des domaines eucaryotiques C2, illustré sur la Figure 17
(Guerrero-Valero et al., 2009; Guillén et al., 2013). Nous pouvons ainsi poser l'hypothèse que le
domaine CoBaHMA interagit avec un lipide chargé négativement. Comme le lipidome des
cyanobactéries, contrairement à ceux des bactéries et des eucaryotes, est constitué quasiment
exclusivement de glycérolipides (Boudière et al., 2014; Wada & Murata, 2004), ces lipides pourraient
être le phosphatidylglycerol (PG) ou le sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG). Éventuellement, cela
pourrait aussi être les acides phosphatidiques (PA), dont la présence n'est pas systématiquement
mesurée, mais qui sont chargés négativement et qui sont les précurseurs probables des autres
glycerolipides des cyanobactéries (Lem & Stumpf, 1984; Murata & Nishida, 1987; Petroutsos et al.,
2014).

Grâce à cette modélisation, nous avons donc pu
obtenir un modèle robuste de la structure 3D du
domaine CoBaHMA. Ce modèle, ainsi que les
recherches de similitudes de séquence, nous ont
permis de placer le domaine CoBaHMA dans la
superfamille HMA du repliement « ferredoxin-
like », incluant les familles HMA, YAM et
iHMA. La signature fonctionnelle du domaine
CoBaHMA est unique dans cette superfamille,
et suggère une interaction avec les ions
carbonates ou les phospholipides.

Ces résultats ont été, pour partie, publiés en
2022 dans l'article « A New Gene Family
Diagnostic for Intracellular Biomineralization of
Amorphous Ca Carbonates by Cyanobacteria »
par Benzerara,...Gaschignard et al. que nous
avons placé en Annexe 1 de cette thèse. Cela
concerne la modélisation comparative et la
modélisation par AlphaFold2 du domaine
CoBaHMA, ainsi que la classification du
domaine CoBaHMA dans la superfamille
HMA du repliement « ferredoxin-like ». La
modélisation par ESMFold a été réalisée
ultérieurement.

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 17 :** Interaction entre le domaine C2 de la Rabphilin 3A, et les phosphates de PI(4,5)P2.</figcaption></figure>

Inspéré de Guillén *et al.*, 2013. ID PDB RCSB : 4NS0.

Les a.a impliqués dans l'interaction avec PI(4,5)P2 sont colorés selon leur atome (C:vert; N:bleu; O:rouge; P:orange), et nommés.
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 18 :** *Structure 3D du domaine $(GlyZip)_3$ modélisé par ESMFold.*</figcaption></figure>

(A) Domaine $(GlyZip)_3$ complet. Les glycines des GlyZip sont représentées par des sphères jaunes. Les chaînes latérales des a.a polaires conservés sont affichées, et colorées selon leur type (acide : rouge; basique : bleu; polaire non chargé : vert; aromatique : beige). Superposition des prédictions réalisées par ESMFold (bleu pâle) et AlphaFold2 (rouge pâle) avec les glycines colorés en jaune, pour (A) le GlyZip1 (RMSD sur les $C\alpha$= 0.297Å); (B) le GlyZip2 (RMSD sur les $C\alpha$ = 0.299); (C) le GlyZip3 (RMSD sur les $C\alpha$ = 0.429).
Contrairement au domaine CoBaHMA, la structure 3D du domaine $(GlyZip)_3$ s'est avérée complexe à modéliser. Comme indiqué initialement, il n'a pas été possible de réaliser un travail de modélisation comparative pour le domaine $(GlyZip)_3$ faute de références structurales expérimentales. Le domaine $(GlyZip)_3$ a une signature de séquence unique : une triple répétition d'un long glycine zipper, où chaque répétition a ses conservations propres en dehors du motif commun répété périodiquement, constitué de résidus hydrophobes et de résidus de faible encombrement stérique (glycine, alanine). Il y a notamment plusieurs a.a acides hautement conservés aux extrémités de ces glycines zippers.

ESMFold et AlphaFold2 prédisent tout les 2 les 3 GlyZips comme des double hélices en épingle à cheveux (Figure 18.A). Ceci est, là encore, conforme aux prédictions que nous avions faites sur ce domaine, sur la base de l'analyse de tracés HCA (Benzerara et al., 2022). Si l'arrangement relatif des 3 GlyZips diffère entre ces deux modèles, les prédictions individuelles de chacun des GlyZips par les 2 logiciels sont parfaitement superposables (Figure 18.B&C&D), avec des RMSD (Root-Mean-Square-Deviation) sur $Cα < 0.43Å$. La concordance de ces prédictions indique une robustesse de cette prédiction, en dépit de scores de confiance faibles ($pLDDT < 70$). Il est intéressant de noter que dans le cas du modèle produit par AlphaFold2, le $pLDDT$ est < 50 sur une zone structurée, alors qu'il a été montré qu'un tel score de confiance était un bon indicateur de désordre (Tunyasuvunakool et al., 2021; C. J. Wilson et al., 2022). Les GlyZips sont donc un bonne illustration que le $pLDDT$ n'est pas un indicateur suffisant pour prédire les zones désordonnées, ainsi que commenté par à l'échelle de protéomes entiers dans l'article de Bruley et al., 2022. Les faibles scores observés relèvent ici vraisemblablement d'un manque de données expérimentales relatives à cette structure lors des phases d'apprentissage, suggérant que l'on est en présence d'une structure 3D originale, non encore décrite. Les structures 3D prédites des 3 GlyZips individuels sont très proches, comme illustré pour le modèle ESMFold sur la Figure 19.A, avec un RMSD maximum de 0.75Å sur la chaîne carbonée, lors des comparaisons 2 à 2. L'écart le plus grand étant entre le GlyZip1 et le GlyZip3, qui correspondent aux GlyZips les plus éloignés en termes de séquence.

Comme dans de nombreux exemples motifs de glycine zippers plus courts (Kim et al., 2005; Martin et al., 2012), les glycines sont positionnées à l'interface entre les deux hélices (Figure 18.A). Le très faible encombrement stérique induit par l'absence de chaîne latérale carbonée chez la glycine, permet d'avoir un contact très proche entre les hélices. Ceci maximise les interactions de Van der Walls et facilite la formation de liaisons hydrogène, ce qui stabilise l'interaction entre les hélices (Teese & Langosch, 2015). Au niveau du coude entre les 2 hélices du motif GlyZip se trouve une proline fortement conservée, précédée d'une glycine.

L'analyse de la structure des GlyZips individuels, modélisés de façon cohérente par les approches AlphaFold2 et ESMFold, montre qu'en dépit de l'absence de références structurales expérimentales, les déterminants structuraux qui mènent au modèle de 2 hélices en épingle à cheveux, en orientation antiparallèle, sont forts.

Une recherche d'homologues structuraux du GlyZip1, qui est le plus régulier des 3 glycines zippers, a conduit à observer que celui-ci est structuralement similaire à 5 parties de protéines appartenant à 4 structures de la PDB100 (7ojf, structure de Slyb13-Bama d'E.coli; 7xdi, structure de la queue du bactériophage SSV19; 7a0g, structure du pore SmhB de Serratia marcescens; 6h2f, structure du pré-pore AhlB de Aeromonas hydrophilia), avec toutefois des e-value ≥ 8,76e-1 et des identités de séquence ≤ 31,8%.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 19 : Superposition de la structure 3D des 3 GlyZips individuels modélisées par ESMFold, et hydrophobicité des GlyZips.**</figcaption></figure>

(A) Les 2 faces de la superposition des structures des 3 GlyZips individuels modélisées par ESMFold. Les glycines des GlyZips sont colorées en jaune. Les chaînes latérales des a.a polaires conservés des GlyZips sont affichées, et colorées selon le type d'a.a (acide : rouge; basique : bleu; polaire non chargé : vert; aromatique : beige). (B) Surface des modèles représentés en A., colorée selon l'hydrophobicité des a.a.
Ces 5 chaines polypeptidiques possèdent toutes un « small zipper » étendu de taille similaire à GlyZip1, avec des répétitions périodiques d'a.a peu encombrants mais sans les signatures polaires conservées des glycines zippers des calcyanines, ni le motif GP présent sur son épingle à cheveux. Le small zipper est une version plus générale du glycine zipper : tout comme le glycine zipper, il est basé sur un motif de type *xxx* avec * = G/S/T/A/V, des petits acides aminés. Ses propriétés sont souvent considérées comme similaires à celle du glycine zipper (Kim et al., 2005; Teese & Langosch, 2015). L'une des ces structures est illustrée en Figure 20.A.

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 20 : Structure de la partie B de SmhABC de Serratia marcescens.**</figcaption></figure>

(A) La structure est un decamère. En bleu, la partie de la partie de la structure identifiée comme similaire au GlyZip1 de la calcyanine par FoldSeek. Sur un des monomères est représenté, par des sphères jaunes, le small zipper qui fait l'interface entre les 2 hélices en épingle à cheveux. ID PDB RCSB : 7a0g. (B) Alignement de la séquence de 7a0g et de GlyZip1. Les positions identiques sont écrites en blanc sur fond noir. (C) Tracé HCA de la portion de 7a0g qui s'aligne sur le domaine GlyZip1.

La modélisation des GlyZips sous forme de double hélices en épingle à cheveux parait donc cohérente avec ces structures expérimentales. Cette cohérence est remarquable dans le cas d'AlphaFold2, car ce dernier n'a pas pu être entraîné sur les structures mentionnées qui ont été publiées après Avril 2018, date limite pour faire partie du set d'entraînement (Jumper et al., 2021). Là encore, c'est un signe que les déterminants structuraux qui mènent à la modélisation en double hélices en épingle à cheveux sont forts.
La double hélice des GlyZips présente une face hydrophobe et une face hydrophile (Figure 19.B). Les a.a chargés/polaires conservés qui forment la signature de chacun des glycines zippers, sont tous sur la face hydrophile de la double hélice. Il est probable que cette face ait une importance fonctionnelle alors que la face hydrophobe remplit plus vraisemblablement un rôle dans l'architecture de cette région. Les modèles complets du domaine $(GlyZip)_3$ tels que proposés par ESMFold et AlphaFold2, exposent de larges portions de ces faces hydrophobes au solvant. Dans le cas d'ESMFold, les GlyZip sont assemblés en faisceau avec les faces hydrophobes orientées vers l'intérieur, tandis qu'AlphaFold2 n'aboutit pas de manière fiable à un assemblage. Les positionnements relatifs des différents GlyZip est donc probablement erronés. C'est d'ailleurs supporté dans le cas du modèle AlphaFold2 par le PAE associé. Il indique clairement de grandes incertitudes sur le positionnement relatif des différents GlyZips. Il nous manque donc des informations vis à vis de cet assemblage, nous empêchant par conséquent d'aboutir à un modèle complet du domaine $(GlyZip)_3$.

Pour modéliser correctement ce domaine, il manque probablement des partenaires. Sur les 5 homologues structuraux détectés, 3 sont des small zippers localisés dans une membrane (structure : 7aog (2 small zippers); 6h2f (1 small zipper)). Dans ces 3 résultats, plusieurs unités de small zippers de double hélices en épingle à cheveux, sont assemblés et forment la partie membranaire d'un pore (Churchill-Angus et al., 2021; J. S. Wilson et al., 2019). Ces exemples illustrent 2 potentiels partenaires d'interaction qui pourraient manquer pour aboutir à un modèle pertinent du domaine $(GlyZip)_3$ : les lipides et d'autres unités de GlyZip.

Premièrement, le domaine $(GlyZip)_3$ de la calcyanine pourrait nécessiter un environnement membranaire pour se structurer en un assemblage cohérent, par exemple pour orienter les faces hydrophobes des GlyZips vers l'extérieur de la protéine, contrairement ce que fait actuellement ESMFold et AlphaFold2. Le motif GxxxG est un motif surreprésenté dans les hélices transmembranaires (Senes et al., 2000), et il a été abondamment

décrit pour son importance dans leurs interactions (Teese & Langosch, 2015). Par ailleurs il a été montré sur plusieurs exemples qu'en dépit de leur prétention, AlphaFold2 et ESMFold pouvaient avoir de réels problèmes à modéliser les protéines membranaires, précisément car ils ne peuvent produire les contraintes issues des interactions lipides-protéines (Azzaz et al., 2022; Téletchéa et al., 2023). Ceci expliquerait leurs difficultés communes à modéliser le domaine $(GlyZip)_3$. Cette hypothèse que le

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 21 : Exemples d'assemblage de glycine zippers**</figcaption></figure>

Extrait de Martins *et al.*, 2012.

En gris la chaine carbonée. En rouge, les glycines. Les ID PDB RCSB sont écrits entre parenthèses. (A) Survival Motor Neurons YG-box (4GLI). (B) Hélices formant le pore du canal à potassium KcsA (1BL8). (C) Canal mecano-sensible MscL (1MSL). (D) Canal mecano-sensible MscS (1MXM).
domaine (GlyZip)₃ serait membranaire va de pair avec l'hypothèse que le domaine CoBaHMA interagirait avec des lipides via ses a.a basiques conservés.

Secondement, les GlyZips du domaine (GlyZip)₃ pourraient s'assembler avec d'autres GlyZips par la formation d'homoligomères de calcyanine. En effet, comme évoqué précédemment, les glycines zippers ont été abondamment décrits comme motifs d'interaction pour des hélices α transmembranaires ou cytosoliques. Un certains nombres d'hélices α porteuses de glycine zipper interagissent entre elles, soit en mettant face à face 2 glycine zippers (Figure 21.A) pour former des dimères; soit en positionnant la face porteuse du glycine zipper d'une hélice sur la face opposée au glycine zipper de l'autre, pour former des pores (Figure 21.B-D) (Kim et al., 2005; Martin et al., 2012; Teese & Langosch, 2015). Des essais de modélisation en trimère de la calcyanine ont été menés avec ESMFold et AlphaFold2 pour tester cette hypothèse. Malheureusement, ils n'ont pas abouti, les modèles ne proposant aucune interaction entre les différents monomères de calcyanine.

En l'absence de modèle pertinent pour l'assemblage du domaine (GlyZip)₃, il n'est pour l'heure pas possible de formuler efficacement des hypothèses quant à la fonction de ce domaine. Il est toutefois pertinent de mentionner que la séquence du domaine (GlyZip)₃ est riche en glycines, mais aussi en acides aspartiques et glutamiques. Or, c'est une caractéristique récurrente des protéines impliquées dans la biominéralisation du carbonate de calcium que d'être enrichies en a.a acides et en a.a petits (Aizenberg et al., 1996; Kalmar et al., 2012; Laipnik et al., 2020). Ces protéines peuvent jouer plusieurs rôles comme l'inhibition de la cristallisation du carbonate de calcium pour favoriser les ACC (Aizenberg et al., 1996) ou la sélection d'un polymorphe (Laipnik et al., 2020). Il parait donc possible que ce domaine soit directement impliqué dans la biominéralisation des ACC.

**L'expérience est indispensable pour accéder à la structure de l'ensemble de la calcyanine de S. calcipolaris.**

Le champ de le modélisation des structures 3D a spectaculairement progressé grâce, entre autres, à ESMFold et AlphaFold2. La calcyanine est cependant un excellent exemple de l'intérêt mais aussi des limites de ces logiciels. AlphaFold2 et ESMFold ne sont pas encore en état de modéliser toutes les protéines existantes, surtout quand celles-ci ont peu de points communs avec ce qui a déjà été décrit.

Par ailleurs, la calcyanine montre aussi la nécessité d'aborder le pLDDT avec un regard critique. En effet, comme décrit précédemment dans les comparaisons de modélisation, il parait très probable qu'ESMFold et AlphaFold2 n'abordent pas cette métrique de la même manière. Les scores issus de ces 2 logiciels ne sont donc a priori pas comparables. De même, la calcyanine est aussi un bon exemple que le lien entre le désordre et un pLDDT< 50 n'est pas absolu, que ce soit dans AlphaFold2 ou ESMFold.

Il apparaît clairement que la modélisation de la calcyanine de S. calcipolaris n'est pas triviale et que cette protéine a des propriétés structurales originales. De plus, même pour le domaine CoBaHMA dont la structure a été modélisée avec robustesse, la question de la fonction reste ouverte. Dès lors, une approche expérimentale apparaît nécessaire pour caractériser plus en avant ses propriétés structurales et éventuellement progresser dans la connaissance de sa/ses fonction(s).
# Chapitre 2 : Étude expérimentale de la calcyanine de *S. calcipolaris*.

## Le taux d'expression et le rendement de purification de la calcyanine de *S. calcipolaris* chez *E. coli* sont très faibles.

Nous avons exprimé la calcyanine chez *E. coli* comme une protéine recombinante fusionnée à une étiquette 6His (6 Histidines) (Wood, 2014) ou Strep II (T. G. M. Schmidt et al., 1996) pour permettre son identification et sa purification. Les gènes synthétiques utilisés ont été optimisés pour l'expression chez *E. coli*.

Nous avons réussi à exprimer la calcyanine dans des souches d'E. coli réputées pour leur capacité à exprimer des protéines considérées comme difficiles d'expression ou toxiques :

- BL21 (DE3) pLysS (Figure 22.D) et C41 (DE3) (Figure 22.A) (Miroux & Walker, 1996) pour la protéine étiquetée 6His en $C_{ter}$ (Görgen, 2017, Rapport de M2);

- C41 (DE3) et C43 (DE3) (Figure 22.B&C) (Miroux & Walker, 1996) pour la protéine étiquetée Strep II en $C_{ter}$.

A l'inverse, les essais d'expression de la protéine étiquetée 6His dans BL21(DE3) codons plus, une souche qui n'est pas spécifiquement adaptée à l'expression de protéine difficile d'expression, ont échoué (Görgen, 2017, Rapport de M2).

La calcyanine semble donc être une protéine difficile à produire pour *E. coli*, et qui nécessite une souche adaptée.

Nous avons choisi la souche *E. coli* C43 (DE3) pendant cette thèse qui donnait les meilleures résultats quelle que soit la construction.

Toutefois, même avec cette souche, l'expression restait faible. Les valeurs de rendement seront discutées plus en détails quand nous aborderons la purification, mais avec cette souche et la calcyanine de *S. calcipolaris*, nous étions en mesure d'isoler 500µg de protéine par litre de culture bactérienne.

Comme les rendements étaient faibles avec la calcyanine de *S. caclipolaris*, nous avons essayé d'exprimer d'autres calcyanines à domaine CoBaHMA. Nous nous sommes focalisés sur des protéines venant de souches thermophiles (*S. calcipolaris* est une souche mésophile (croissance optimale à 45°C>T>20°C)). En effet les protéines d'organismes thermophiles présentent une stabilité thermique accrue, grâce à diverses stratégies comme un plus grand nombre d'interactions ioniques, plus de liaisons hydrogène, un cœur hydrophobe plus gros... tout en conservant la structure de leurs homologues mésophiles (Zhou et al., 2008). De plus elles sont globalement meilleures que leurs homologues mésophiles à résister à l'agrégation (dans le sens, un assemblage de protéines mal repliées), en enfouissant les régions propices à former des agrégats dans leur cœur hydrophobe ou en les entourant d'a.a chargés ou de prolines (Thangakani et al., 2012). Ces calcyanines étaient donc potentiellement plus aisées à manipuler car plus stables.

Parmi toutes les souches de cyanobactéries répertoriées qui ont une calcyanine à domaine CoBaHMA, il y avait plusieurs souches thermophiles (Benzerara et al., 2022) (croissance optimale à 80°C>T>45°C), telle que *Thermosynechococcus elongatus* BP-1 (Nakamura, 2002).
<figure><img src="image_28.png" /></figure>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 22 : Expression de la calcyanine de S. calcipolaris et fractionnement cellulaire.**</figcaption></figure>

NI = Non Induit; I = Induit. La flèche noire indique la bande d'expression de la calcyanine dans les gels concernés.

Gel SDS-PAGE de l'expression de la calcyanine de S. calcipolaris (A) étiquetée 6His dans E. coli C41 (DE3) à 37°C avec une induction à 0,5mM IPTG. (B) étiquetée Strep II dans E. coli C41 (DE3) à 37°C avec une induction à 0,5mM IPTG; (C) étiquetée Strep II dans E. coli C43 (DE3) à 37°C avec une induction à 0,5mM IPTG. (D) Western-Blot du fractionnement cellulaire de l'expression de la calcyanine de S. calcipolaris dans E. coli BL21 (DE3) pLysS. La protéine a été identifiée avec un anticorps anti-étiquette 6His (Görgen *et al.*, 2017, Rapport de M2).
Nous avons choisi les séquences des calcyanines de *T. elongatus* BP-1, *Synechococcus lividus* sp. PCC (Pasteur Culture collection of Cyanobacteria) 6716 et *Synechococcus lividus* sp. PCC 6717. Toutes ces calcyanines ont une architecture de type CoBaHMA - (GlyZip)₃. Leurs séquences sont identiques à plus de 50%, et similaires à plus de 65% à celle de *S. calcipolaris*. Ces protéines sont donc proches en termes de séquence de celle de *S. calcipolaris*.

Toutefois, en dépit d'un grand nombre de conditions testées (5 souches différentes d'E. coli (BL21 pLysS, C41 (DE3), C43 (DE3), C44 (DE3), C45 (DE3) (Angius et al., 2018)) à 2 températures différentes (37°C et 20°C)) nous n'avons pas réussi à exprimer ces protéines. Nous avons donc continué à travailler avec la calcyanine de *S. calcipolaris*.

Il est assez difficile d'expliquer cette difficulté d'expression des calcyanines à domaine CoBaHMA. Une possibilité serait que la calcyanine serait produite en trop grande quantité par *E. coli*. Comme cela a été montré, une accumulation de protéines recombinantes chez *E. coli* peut avoir des effets délétères voire létaux pour la cellule, par exemple en induisant une perte de capacité à synthétiser des protéines (Dong et al., 1995), ou en saturant le système de translocation à la membrane de la bactérie (Wagner et al., 2008). En théorie, les souches d'E. coli C41, C43, C44, C45 évitent ce problème en diminuant l'expression de leurs protéines recombinantes, ce qui induit une diminution du rendement d'expression par cellule, mais augmente la survie des bactéries et donc le rendement global (Angius et al., 2018; Kwon et al., 2015; Wagner et al., 2008). Cependant, dans le cas de la calcyanine, cela pourrait n'être pas suffisant.

La calcyanine pourrait aussi être toxique en elle-même pour *E. coli*. Les long motifs glycine zipper constitutifs de son domaine (GlyZip)₃ présentés précédemment évoquent ceux des toxines CdzC/CdzD (García-Bayona et al., 2017) ou ceux du Type VI secretion system (Ali et al., 2022). Dans ces 2 exemples, le glycine zipper est vu comme un élément central de la toxicité des protéines, car il s'insérerait dans les membranes de la cellules cible et les perméabiliserait (Ali et al., 2022; García-Bayona et al., 2017). La calcyanine pourrait avoir un effet similaire dans *E. coli*.

Toutefois cette 2ème hypothèse parait peu probable, car lors des expériences de fractionnement cellulaire, nous avons retrouvé la calcyanine de *S. calcipolaris* majoritairement dans la fraction cytosolique des protéines d'E. coli (Figure 22.D) et non dans les fractions membranaires.

## La calcyanine purifiée forme des homo-oligomères de haut poids moléculaires très hétérogènes.

Comme décrit dans la partie précédente, nous avons exprimé la calcyanine associée à 2 étiquettes distinctes 6His et Strep II, et ce afin de s'assurer que l'étiquette n'impactait pas ou peu la calcyanine.

Nous avons purifié ces 2 constructions par une chromatographie d'affinité suivie d'une SEC (Size Exclusion Chromatography) sur colonne Superdex 200. Les résultats étaient très similaires pour les 2 constructions. En dépit d'une gamme de séparation de 10-600 kDa, le profil de chromatographie était très complexe, avec la présence d'un large pic multiple. L'analyse du contenu de fractions correspondant à ce pic multiple par gel SDS-PAGE montrait la présence de la calcyanine, quasiment pure, dans tout le pic à partir du volume mort de la colonne (Figure 23.A&B&C).

La complexité du pic indiquait que la calcyanine ne formait pas un, mais plusieurs objets de tailles différentes en solution, dont les plus gros allait jusqu'au volume mort de la colonne Superdex 200.

D'après les informations fournies par le constructeur
(https://cdn.cytivalifesciences.com/api/public/content/digi-13947-pdf), ce volume mort se situe pour des protéines de taille 600kDa (~15 fois la masse de la calcyanine).

Cette observation a été confirmée par dépôt des différentes fractions d'élution sur gel natif. Ces fractions formaient plusieurs bandes sur gel natif, bandes allant du monomère de la BSA (~66 kDa), jusqu'en haut du gel, avec la présence d'un quasi continuum de bande en haut du gel (Figure 23.D). Une population majoritaire semblait toutefois se distinguer aux alentour du tétramère de la BSA (~264kDa). Mais cette population n'était jamais seule sur gel natif. De plus, en l'absence de pic clairement défini sur le chromatogramme, il nous paraissait difficile de l'isoler.

Nous avons tout de même essayé de prélever cette population en rassemblant les fractions de la 2ème moitié du pic, où elle est enrichie (Figure 23.A, cadre en pointillé).

Les analyses menées en SEC-SAXS (Small Angle X-ray Scattering) sur ces fractions nous ont montré un R<sub>g</sub> (Rayon de giration) décroissant sur la largeur du pic quelque soit l'étiquette (Figure 24.B), ce qui témoigne d'une hétérogénéité de la taille des objets en solution. Il était possible d'identifier tout de même une petite zone de R<sub>g</sub> stable en fin de pic. Le R<sub>g</sub> de cette zone est 59+/-4 Å. En se basant sur la formule log (R<sub>g</sub>) = -0.27 + 0.39 log(M<sub>w</sub>) (coefficient pour une expérience SAXS), développée par Smilgies et Folta-Stogniew pour des protéines globulaires, cela correspondrait, dans l'hypothèse d'une protéine globulaire, à un objet de ~ 470 kDa (~12 unités de calcyanine) (Smilgies & Folta-Stogniew, 2015). Comme les 2 déterminations de la masse, le gel natif et le Rg, sont imprécises, il est possible que cette population corresponde à celle qui ait été observée sur gel natif.
La décroissance du R<sub>g</sub> en amont de la zone stable indique que la calcyanine forme un grand nombre d'objets de poids moléculaires supérieurs au ~ 470 kDa estimé.

Il n'était matériellement pas possible d'isoler cette zone stable de R<sub>g</sub>. La calcyanine s'exprimait déjà très mal : en prenant l'intégralité du pic complexe visible sur le chromatogramme, nous ne pouvions isoler que 500µg de protéine par L de culture bactérienne. La fraction du pic avec un R<sub>g</sub> stable ne représentait qu'une infime portion de ce pic complexe.
Les essais de cristallogénèse demandent 1 mg de protéine monodisperse, une quantité et des conditions qui n'étaient pas envisageables pour la calcyanine de *S. calcipolaris*.

Il faut aussi noter que nous avons observé en fin de purification, de façon faible mais systématique, un contaminant à ~75kDA (Figure 23.B&C). Ceci était surprenant, notamment dans le cas de la construction étiquetée Strep II, cette étiquette étant connue pour sa forte spécificité à la Strep-Tactine ce qui permet une grande pureté dès la sortie de la chromatographie d'affinité (Lichty et al., 2005). Pour que ce contaminant passe les 2 étapes de purification avec les 2 étiquettes, il fallait envisager une interaction directe entre ce dernier et la calcyanine. Une analyse de MS (Mass Spectroscopy) de cette bande a révélé que ce contaminant était probablement la DnaK (H. Saito & Uchida, 1977), une chaperonne d'E. coli. Parmi ses différentes fonctions identifiées, on trouve l'aide au repliement des protéines, ainsi que la désintégration des agrégats puis le repliement des protéines dénaturées (Rosenzweig et al., 2019). La présence de la DnaK est peut-être une indication que la calcaynine était, en partie au moins, dans un état dénaturé ou mal replié.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 23 : Purification de la calcyanine de S. calcipolaris étiquetée 6His et Strep II.**</figcaption></figure>

La flèche noire indique la bande de la calcyanine sur le gel SDS-PAGE, la flèche blanche celle de la DnaK. La double flèche noire indique la population majoritaire sur gel natif.

(A) Profil d'élution de la calcyanine étiquetée 6His et StrepII, en sortie de SEC sur Superdex 200 10/300 HR. (B)&(C) Gel SDS-PAGE des fractions d'élution pour la calcyanine (B) étiquetée 6His (C) étiquetée Strep II. (D) Gel natif des fractions présentes sur le gel SDS-PAGE (B).

Les numéros au dessus des puits correspondent aux fractions d'élution de la SEC.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>(B)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 24 : Analyse SAXS de la calcyanine de S. calcipolaris étiquetée StrepII.**</figcaption></figure>

(A) Courbe I(q) = f(q) (cf partie 2.8 du Matériels & Méthodes) des frames correspondant à la population avec un Rg stable. (B) Courbe du Rg et I(0). La partie des courbes correspondant à la population avec un Rg stable est encadrée en noir. Le calcul du Rg s'est fait en sélectionnant la partie q ε [0.015; 0.023]Å⁻¹ des frames du cadre noir.
Devant ces résultats, nous avons établi qu'étudier la calcyanine de *S. calcipolaris* entière n'était pas une stratégie viable pour déterminer la structure de la calcyanine. Nous avons alors cherché à identifier un fragment de la calcyanine qui soit plus stable et plus propice à l'étude structurale par protéolyse limitée.

**La protéolyse limitée a permis d'identifier un fragment stable et homogène, exploitable pour la cristallogenèse.**

La protéolyse limitée consiste à exposer une protéine à une protéase dans des conditions très contrôlées afin de ne cliver que certains morceaux de la protéine. Classiquement, cela implique de travailler avec la protéine en excès vis à vis de la protéase (par ex ratio de 1:100 (w/w)), à basse température (par ex. sur glace) et sur un temps court (par ex. 1h), puis d'arrêter brutalement la réaction par ajout d'un inhibiteur de la protéase. Les fragments de protéine qui résistent à la protéolyse sont identifiés par gel SDS-PAGE et MS (Fontana et al., 2012).

Les protéases reconnaissent des sites de clivage spécifiques dans les séquences, mais leur capacité à cliver ces sites dépend directement de leur capacité à y accéder. 3 paramètres contrôlent cela, par ordre d'importance : l'exposition au solvant du site, la flexibilité de la chaine peptidique, et les interactions locales (par ex. liaisons hydrogènes). Concrètement, les clivages sont observés majoritairement dans les boucles flexibles et les parties désordonnées de la protéine (Kazanov et al., 2011). Pour cette raison, la protéolyse limitée peut être utilisée pour détecter les zones désordonnées (Fontana et al., 2012) et par voie de conséquence les cœurs structurés pour des protéines globulaires. La protéolyse limitée a donc été utilisée pour résoudre la structure 3D d'un grand nombre de protéines, en retirant les parties flexibles qui gênent la cristallisation (Derewenda, 2004).

Nous avons exposé la calcyanine à 2 protéases : la trypsine et l'α-chymotrypsine dans les conditions et les ratios décrits dans le Matériels & Méthodes. La trypsine clive principalement en $C_{ter}$ des lysines et des arginines. L'α-chymotrypsine clive principalement en $C_{ter}$ des a.a aromatiques (tryptophane, phénylalanine et tyrosine) et de certains hydrophobes comme la leucine, l'isoleucine ou la methionine.

Ces 3 protéases avaient un grand nombre de sites de clivage prédits sur la séquence de la calcyanine (Figure 27.A). Pour la protéolyse par la trypsine, une unique bande était visible pour un ratio protéine/protéase de 100/1, à un poids moléculaire compris entre 15 et 20 kDa. Cette bande était aussi visible à un ratio protéine/protéase de 10/1, indiquant un objet protéique très résistant à la protéolyse. Pour l'α-chymotrypsine, une unique bande était visible à un ratio de protéine/protéase de 10/1 à un poids compris entre 20 et 25 kDa (Figure 25).
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 25 : Gels SDS-PAGE de la protéolyse de la calcyanine de S. calcipolaris.**</figcaption></figure>

Protéolyse par le trypsine et l'α-chymotrypsine. Les contrôles sont réalisés avec la concentration maximale de la protéine/protéase utilisée dans les différents tests.

Avec l'aide de Christophe Marchand (Institut de Biologie Paris-Seine, UMR 7238 CNRS, Biologie Computationnelle et Quantitative (LCQB), Sorbonne Université), nous avons analysé les bandes du gel SDS-PAGE issus de la protéolyse par la trypsine et de l'α-chymotrypsine par MS (Spectroscopie de Masse). L'objet résistant à la trypsine est bien un fragment de la calcyanine, et correspond à la séquence P2 – K190, pour un poids moléculaire de 20,3kDa, supérieur à celui visible sur gel (Figure 26.A&B). Ce fragment recouvre donc le CoBaHMA + GlyZip1. L'objet résistant à l'α-chymotrypsine est aussi un fragment de calcyanine. Les fragments détectés en MS ne terminant pas sur un site de clivage de la protéase, il a fallu extrapoler le fragment complet. Le site de clivage le plus proche, et qui donne un fragment de la bonne taille vis à vis du gel SDS-PAGE, est la méthionine en 216. Cela correspond à la séquence P2 – M216 pour un poids moléculaire de 23,2kDa (Figure 26.D&E). Ce fragment recouvrirait aussi le CoBaHMA + GlyZip1, jusqu'au tout début du GlyZip2.

Les analyses MS faites sur gels SDS-PAGE ne permettent de détecter que certains fragments des protéines analysées. Afin d'être sûr d'avoir les bonnes bornes, et ne pas manquer un fragment en C<sub>ter</sub>, nous avons complété cette analyse par une détermination de la masse complète. Comme les bornes pour le fragment issu de la protéolyse par l'α-chymotrypsine étaient moins sures que celles obtenues lors de la protéolyse par la trypsine, nous nous sommes concentrés uniquement sur cette dernière.
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>(A)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>(B)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>(C)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

<figure><img src="image_40.png" /></figure>
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 26 : Analyses MS de la protéolyse limitée de la calcyanine de S. calcipolaris.**</figcaption></figure>

Protéolyse limitée faite par la trypsine (A)&(B)&(C) et l'α-chymotrypsine (D)&(E). Spectre MALDI-TOFF de la bande SDS-PAGE du fragment de digestion de la calcyanine par (A) la trypsine et (E) l'α-chymotrypsine. Les poids moléculaires et les bornes qui correspondent sur la séquence sont écrits au dessus de chaque pic. Ces fragments sont illustrés en gras sur la séquence de la calcyanine en (B) & (E). La séquence totale du fragment protéolytique après digestion par la trypsine est soulignée en trait plein en (B). La séquence putative totale du fragment protéolytique après digestion par l'α-chymotrypsine est soulignée en pointillé en (E). (C) Spectre de la masse totale du fragment protéolytique digéré par la trypsine. Sa masse expérimentale est : $MW_{experimentale}=20313,6$ Da (MH+ average). La masse théorique de [2-191] est : $MW_{théorique}=20319,5$ Da (MH+ average).
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 27 : Illustrations des résultats des protéolyses limitées par l'α-chymotrypsine et la trypsine.**</figcaption></figure>

Le domaine CoBaHMA est visible en rose pâle. Le domaine $(GlyZip)_3$ en bleu pâle. En rouge sont illustrés les sites prédit de clivage par l'α-chymotrypsine, et en bleu ceux de la trypsine.

Les sites clivés identifiés ou supposés par MS, sont illustrés avec des sphères. (A) Modèle de la calcyanine complète conçu par ESMFold, avec les sites de clivage illustrés. L'hélice α qui relie le CoBaHMA et le $(GlyZip)_3$ est entouré d'un cercle noir. (B)&(C) Modèle restreint au fragment résistant à (B) l'α-chymotrypsine (tel que supposé) (C) la trypsine (tel qu'identifié par MS).
Nous avons donc protéolysé la calcyanine par la trypsine dans un ratio en masse de 50/1 protéine/protéase, puis nous avons isolé le fragment par SEC sur Superdex 200 5/150 GL. L'analyse MS sur ce fragment purifié a confirmé le poids exact du fragment (Figure 26. C), et donc les bornes identifiées à partir du gel SDS-PAGE.

Sur le modèle de la structure 3D de la calcyanine, le site de clivage qui a été protéolysé par la trypsine est localisé sur la boucle désordonnée qui relie le GlyZip1 au GlyZip2 (Figure 27. A&C). Les protéases attaquent principalement les sites qui sont accessibles au solvant, donc majoritairement des boucles et des zones désordonnées (Kazanov et al., 2011). La protéolyse de la trypsine sur cette boucle et la résistance du CoBaHMA + GlyZip1, vient donc supporter la répartition des zones structurées/désordonnées proposées par le modèle, pour cette région de la calcyanine.

Par contre la protéolyse par l'α-chymotrypsine est plus complexe à interpréter. En effet, selon le modèle ESMFold, la coupure a eu lieu sur une hélice α à la limite N<sub>ter</sub> du GlyZip2 (Figure 27. A&B). Bien que plus rares que les clivages sur parties désordonnées, les protéases peuvent attaquer les hélices α (Kazanov et al., 2011). Cependant, comme illustré sur la Figure 27. A, l'α-chymotrypsine avait d'autres sites de clivage *a priori* bien plus accessibles sur la séquence. Nous pouvons formuler plusieurs explications au fait que ce site là ait été privilégié.

Premièrement il est possible que nous n'ayons pas les bonnes bornes pour ce fragment. En effet, nous avons fait une analyse MS de ce fragment seulement sur gel SDS-PAGE, sans détermination en masse entière. Dans ces conditions, il est possible que nous ayons oublié un fragment de la calcyanine en C<sub>ter</sub>. Peut être que l'α-chymotrypsine protéolyse la boucle désordonnée qui se situe après le GlyZip2, mais que les fragments C-terminaux ne sont pas visibles en MS. Le fragment ainsi formé aurait une taille de 28 kDa, bien supérieure au ~23 kDa constaté sur gel SDS-PAGE. Toutefois, en l'absence de détermination en masse entière pour vérifier le poids exact du fragment, nous ne pouvons pas exclure cette possibilité.

Deuxièmement, il est possible que nous ayons les bonnes bornes pour ce fragment, mais que le GlyZip2 (et éventuellement le GlyZip3) soit mal structuré. De fait, l'absence d'ordre permettrait le clivage par la protéase.

Enfin, il est aussi possible que le modèle ESMFold soit erroné sur cette section-là de la calcyanine, et que la zone en N<sub>ter</sub> du GlyZip2 ne soit pas structurée.

La résistance de ce fragment aux protéases indiquait qu'il avait donc de bonnes chances d'être une zone structurée, avec peu de zones flexibles ou désordonnées, et donc d'être adapté pour une détermination structurale.

L'isolement du fragment par protéolyse limitée n'était pas souhaitable, car cela posait le risque d'obtenir un mélange complexe composé de la calcyanine dans différents états d'avancement de protéolyse. Nous avons préféré exprimer le fragment CoBaHMA-GlyZip1 sous forme de protéine recombinante dans *E. coli* (DE3) C43.

En plus de l'étiquette 6His, nous avons fusionné le fragment à la MBP (Maltose-Binding Protein), qui a souvent été rapportée comme favorisant un bon repliement des protéines auxquelles elle est associée (Kapust & Waugh, 1999).
<figure><img src="image_43.png" /></figure>

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 28: Purification de la construction MBP-CoBaHMA-GlyZip1.**</figcaption></figure>

(A) Profil d'élution en sortie de SEC sur Superdex 200 16/600 PG. (B) Gel SDS-PAGE des fractions d'élution. (C) Gel natif des fractions présentes sur le gel SDS-PAGE (B).

Les numéros au dessus des puits correspondent aux fractions d'élution de la SEC.
La construction MBP-CoBaHMA-GlyZip1 se comporte comme une protéine cytosolique dans E.coli.
Nous l'avons purifiée comme décrit dans le Matériels & Méthodes. Sur le chromatogramme de sortie
de SEC, nous avons pu voir 2 pics bien séparés. Le 1er de ces pics avait un léger épaulement au niveau
des hauts poids moléculaires (figure 28.A). Un gel SDS-PAGE des fractions correspondant à ces 2 pics
nous a confirmé que ces 2 pics correspondaient bien à la construction MBP-CoBaHMA-GlyZip1.
Sur gel natif, le 1er pic semblait être constitué d'au moins 2 populations de taille > 132 kDa, ce qui
pourrait expliquer l'épaulement visible sur le chromatogramme pour ce pic. Le 2nd pic était
monodisperse sur gel natif, avec une taille comprise entre 66 et 132 kDa, et qui pourrait correspondre à
un dimère de la protéine fusion (~130 kDa) (Figure 28).

Les rendements étaient spectaculairement plus élevés que ceux obtenus pour la protéine entière, de l'ordre de 20mg de protéines/L de culture bactérienne contre 500µg/L de culture bactérienne pour la protéine entière. De plus il était très aisé de concentrer cette protéine fusion : nous l'avons ainsi concentré à plus de 50 mg/mL sans voir de précipité apparaître.

Ces résultats étaient de très loin les meilleurs que nous ayons jamais eus dans la partie expérimentale de ce projet. Pour la première fois nous avons réussi à obtenir des protéines pures, probablement homogènes, dans des quantités suffisantes pour faire des analyses biophysiques. Exprimer le fragment issu de la protéolyse, fusionné à la MBP semblait donc être une bonne stratégie pour obtenir au moins une partie de la structure de la calcyanine.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure 29 :** Protéolyse de la construction MBP-CoBaHMA-GlyZip1 par la protéase TEV.</figcaption></figure>

(A) Photo du précipité blanc apparu après la protéolyse. (B) Gel SDS-PAGE de la protéolyse.
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Figure 30 : Purification de la construction CoBaHMA-GlyZip1.</figcaption></figure>

(A) Profil d'élution en sortie de chromatographie échangeuse d'ions. Le gradient de conductimétrie utilisé pour l'élution est indiqué. (B) Gel SDS-PAGE des pics. (C) Gel natif des pics.
Cette précipitation a entraîné une perte importante de protéine, mais une fraction restait en solution. Ce fragment encore en solution précipitait à nouveau si nous le concentrions à plus de ~5mg/mL.

Pour séparer le fragment purifié de la MBP, de la TEV et de la protéine fusion non clivée nous avons injecté le surnageant sur une colonne échangeuse d'anions qui sépare les protéines selon leur charge de surface. Les protéines se décrochent quand leurs charges sont écrantées, au moins partiellement. Ceci présente un intérêt pour la cristallogénèse : une fois les charges écrantées, ces protéines se retrouvent dans un régime attractif, ce qui favorise la nucléation de cristaux (McPherson, 2017).

Lors de l'élution, 2 populations se sont distinguées (Figure 30.A). La première formait un pic relativement fin et était constituée du fragment pur et mono-disperse. La taille de cette population sur gel natif était inférieure à celle du monomère de la BSA (~66 kDa), ce qui pourrait correspondre à un trimère (66 kDa), un dimère (44 kDa) ou un monomère (22 kDa). La seconde formait un large pic, et était constituée du fragment légèrement contaminé et ne formait pas de bande visible sur gel natif (Figure 30.B&C). Cette absence pourrait être due au fait que les objets formés seraient trop gros pour rentrer dans le gel. Potentiellement ce 2<sup>nd</sup> pic pourrait être un début de précipité.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 31 : Analyse SAXS du fragment CobGly1.</figcaption></figure>

Courbes du Rg et I(0). La partie des courbes correspondant à la population avec un Rg stable est encadrée en noir. Le calcul du R<sub>g</sub> s'est fait en sélectionnant la partie q ∈ [0.03; 0.05]Å<sup>-1</sup> des frames du cadre noir.

La première population sur ce chromatogramme nous paraissait donc beaucoup plus intéressante à étudier, puisque pure et homogène en taille sur le gel natif. Nous l'avons isolée pour faire des analyses SAXS et des essais de cristallisation.

Les analyses SAXS sur cette population ont confirmé son homogénéité en taille (Figure 31). En effet, elle a un R<sub>g</sub> stable à 23+/-2Å. Pour une protéine globulaire, cela correspondrait à un objet de ~40kDa
(Smilgies & Folta-Stogniew, 2015), soit proche d'un dimère de fragment CoBaHMA-GlyZip1. Bien que le fragment CoBaHMA-GlyZip1 ne soit pas nécessairement globulaire, ces résultats de SAXS, combinés aux résultats des gels natifs sur le fragment et la protéine fusion, indiquent clairement que le fragment CoBaHMA-GlyZip1 peut oligomériser sous forme de dimère. La présence d'autres populations à plus haut poids moléculaires sur le chromatogramme et le gel natif de la protéine fusion semble indiquer que de plus haut degrés d'oligomérisation sont accessibles pour ce fragment.

L'absence du Glyzip2 et GlyZip3 est une différence majeure avec la calcyanine complète, mais devant ces résultats sur le fragment CoBaHMA-GlyZip1 ainsi que ce que nous avons observé sur la protéine complète, nous pouvons considérer que la calcyanine complète est une protéine qui peut oligomériser.

La précipitation du fragment CoBaHMA-GlyZip1 lors de la protéolyse à la TEV, quant à elle, est un phénomène qui est pour l'heure difficile d'expliquer.

Tout d'abord, l'enrichissement du fragment dans le précipité issu de la protéolyse, ainsi que la précipitation du fragment pur au delà de ~5mg/mL indique que ce phénomène n'est très certainement pas dû à une interaction avec d'autres protéines.

Nous avons essayé de comprendre si ce comportement de précipitation pouvait être relié à la séquence du fragment. Pour cela nous avons utilisé Protein-Sol, un outil qui évaluent la propension d'une protéine à rester en solution à partir de sa seule séquence. Cet outil se base sur le travail de Niwa et al. qui ont quantifié la proportion d'un grand nombre de protéines d'E. coli à rester en solution après expression dans un système cell-free dépourvu de chaperonnes, suivie d'une centrifugation à 21600g (Niwa et al., 2009). Cet outil calcule un Predicted Scale Solubility, qui représente la proportion de protéine qui resterait en solution lors d'un protocole similaire à celui décrit par Niwa et al.. Pour les protéines d'E. coli la moyenne est de 0,45 (Hebditch et al., 2017).

Toutefois, dans notre cas, les scores obtenus avec ce logiciel sont surprenants. Dans le cas de la protéine fusion ce score est de 0,343; pour la MBP et le linker qui la relie au fragment, ce score est de 0,501; et pour le fragment CoBaHMA-GlyZip1 ce score est de 0,568. Pour comparaison, la calcyanine complète étiquetée 6His à un score de 0,558. Il parait très surprenant que la protéine fusion ait un score plus bas que le fragment individuel quand il a été démontré que la MBP augmente fortement la capacité des protéines auxquelles elle est fusionnée à rester en solution (Kapust & Waugh, 1999). Devant ces résultats il y a 2 possibilités : soit ce logiciel n'est pas capable d'étudier correctement le fragment de la calcyanine, soit la précipitation du fragment individuel n'est pas liée à sa séquence.

Cette précipitation pourrait avoir une origine plus structurale. La protéine fusion MBP-CoBaHMA-GlyZip1 se partage en 2 grandes populations : un probable dimère, et une population de plus haut poids moléculaire. Lors du clivage par la protéase TEV ces 2 populations sont clivées. Après ce clivage, nous retrouvons le dimère probable de fragment, par contre la population de plus haut poids moléculaire n'est plus visible sur gel natif.

Il est possible que le précipité formé lors de la protéolyse par la protéase TEV soit cette population de
haut poids moléculaire, qui précipiterait une fois séparée de la MBP.

La précipitation du fragment au delà de ~5 mg/mL, quant à elle, pourrait alors s'expliquer de 2
manières. Soit comme un changement d'état d'oligomérique du fragment avec la concentration, comme
le font certaines protéines comme LptA (Merten et al., 2012), avec un passage du dimère soluble à
l'oligomère qui précipite, soit un seuil de saturation en solution qu'atteindrait le fragment à cette concentration (Trevino et al., 2008).

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>(B)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>(C)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure 32 : Essais de cristallogénèse sur le fragment CoBaHMA-GlyZip1.**</figcaption></figure>

(A) Conditions : 0,2 M Potassium Sodium tartrate; 20% (w/v) PEG 3350. (B) 0,1 M HEPES pH 6,5; 5% (w/v) PEG 6000. (C) Réplicat de la condition en (A).

Bien que nous eûmes perdu une quantité non négligeable de protéine à l'issue de la précipitation après la protéolyse à la protéase TEV, nous en avions tout de même suffisamment en solution pour mener des essais de cristallisation.

Nous avions donc une protéine pure, mono disperse, concentrée à un niveau proche de sa précipitation, dans une solution ou le contenu en sel écrantait au moins partiellement ses charges, et la plaçait dans un régime attractif. C'était donc un excellent candidat pour des essais de cristallogénèse.

Une première série d'essais de cristallisation, menée avec Julien Henri (Institut de Biologie Paris-Seine, UMR 7238 CNRS, Biologie Computationnelle et Quantitative (LCQB), Sorbonne Université),
sur une large gamme de conditions ont montré la présence d'objets qui pourraient être des cristaux dans 2 conditions :

_ 0,2M Potassium Sodium Tartrate et 20% (w/v) PEG (PolyEthylène Glycol) 3350 (JCSG I 22) (Figure 32.A);

_ 0,1M HEPES pH 6,5 et 5% (w/v) PEG 6000 (JCSG III 44) (Figure 32.B)

Dans le premier cas, les objets formés étaient des aiguilles (Figure 32.A). Dans le second les objets formés semblaient majoritairement amorphes, avec des facettes possiblement cristallines (Figure 32.B).

Seul les objets de la première condition de cristallisation ont pu être répliqués dans un plus grand volume (Figure 32.C). Ils ont été analysés par diffraction des rayons X au synchrotron SOLEIL.

Ces objets étaient bien des cristaux de protéine, et non des cristaux de sel. Les premières mesures permettaient d'estimer une maille en groupe d'espace P1. Cependant il n'a pas été possible d'obtenir des tâches de diffraction à moins de 30 Å sur ces cristaux, ce qui ne permettait pas d'obtenir une structure 3D pour le fragment.

Ces résultats, s'ils ne sont pas concluants, sont néanmoins très encourageants puisqu'ils ouvrent la voie à une détermination de la structure de ce fragment. Répéter cette cristallisation pour augmenter la taille des cristaux ou affiner les conditions de précipitations pourrait permettre, à terme, d'avoir des cristaux plus parfaits et plus gros, et donc plus exploitables (McPherson, 2017).
# Chapitre 3 : Les protéines à domaine CoBaHMA.

**Le domaine CoBaHMA est présent sur d'autres architectures protéiques, principalement associé à des domaines membranaires.**

Comme décrit précédemment, le domaine CoBaHMA a pour particularité d'être le seul domaine des calcyanines qui présente des similarités de séquence et de structure avec des domaines déjà décrits (HMA, YAM...) de la superfamille HMA (Cf Chapitre 1 & Benzerara et al., 2022). Les domaines HMA sont présents sur différentes architectures, 799 selon l'entrée Interpro (Paysan-Lafosse et al., 2023) IPR006121 (HMA). Pour ne citer que quelques exemples, le domaine HMA peut se trouver seul (Hearnshaw et al., 2009), répété plusieurs fois (UniProt ID : Q59HD1), associé à une P1B-type ATPase (Bitter et al., 2022), associé au domaine de transport du mercure MerT (UniProt ID : A0A076HZU1)... Cette apparente diversité peut en fait se restreindre à un contexte fonctionnel d'interaction avec des cations métalliques divalents (Bull & Cox, 1994). Les domaines HMA peuvent ainsi jouer le rôle de chaperonnes (Hearnshaw et al., 2009) ou de domaines auxiliaires de régulation de transporteurs de métaux comme les P1B-type ATPases (Smith et al., 2014) ou d'enzymes de détoxification (comme par exemple l'oxido-reductases MerA (Ledwidge et al., 2005)).

L'analyse des architectures protéiques associées à un domaine, permet, de manière plus générale, de préciser le contexte fonctionnel de ce domaine, comme cela a, par exemple, pu être fait pour le domaine LOTUS, une famille de domaines associée au métabolisme des ARN (Callebaut & Mornon, 2010).

Dans le but de mieux comprendre le domaine CoBaHMA, nous avons cherché à savoir si ce domaine est également présent dans d'autres architectures protéiques que les calcyanines, afin d'en déduire des caractéristiques ainsi que des hypothèses fonctionnelles.

Ci-après, je décris un résumé succin de l'article, dont le manuscrit est présenté en Annexe 2, et qui sera prochainement soumis pour publication. Toutes les figures qui sont citées dans ce chapitre sont issues de cet article. Pour plus de détail, les lecteurs sont invités à s'y référer.

Notre processus pour rechercher des domaines CoBaHMA est schématisé sur la Figure 2 de l'article. Nous avons utilisé les 15 séquences de domaines CoBaHMA de calcyanine, présentées dans Benzerara et al. 2022, comme sondes que nous avons fournies au programme HHblits (Remmert et al., 2012). HHblits est un outil qui permet de rechercher des similarités de séquences entre une sonde et une banque de séquences par comparaison de HMMs (Hidden Markov Model). Les HMMSs sont des versions condensées d'alignements de séquences, qui spécifient pour chaque position la probabilité d'observer chacun des 20 a.a dans des séquences apparentées. Les méthodes qui se basent sur des alignements HMM-HMM (ou profil-profil) sont les plus performantes pour la recherche de parentés éloignées. Avec HHblits, nous avons fouillé de manière itérative (8 itérations) la base de données UniClust30 (Mirdita et al., 2017), une version clusterisée à 30% d'identité de séquence de la base de séquences de protéines UniProt (The UniProt Consortium et al., 2023). Le recours à une base de données clusterisée permet de faciliter l'analyse et sonder de manière exhaustive la diversité des architectures existantes dans la banque d'origine, tout en réduisant les biais dus à la redondance présente dans cette dernière.
De cette manière, nous avons identifié 38444 protéines ayant au moins un segment similaire à un des 15 domaines CoBaHMA des calcyanines. Malheureusement, après inspection de la structure de quelques unes de ces séquences, nous avons constaté qu'une grande majorité d'entre elles étaient des domaines HMA. Sur la base des séquences, il était donc très difficile de distinguer ces 2 familles de domaines. Cependant, comme nous l'avons montré dans le Chapitre 1 de cette thèse, ces 2 domaines ont des structures 3D proches, mais différentes : le domaine CoBaHMA a un brin β supplémentaire par rapport au domaine HMA. Nous avons alors tiré parti du récent développement d'AlphaFold2, qui a donné naissance à la base de données AlphaFoldDB (Varadi et al., 2022). Cette base de données rassemble les modèles de structure 3D d'un très grand nombre de protéines de la base de données UniProt. Nous nous sommes servis de ces modèles pour discriminer finement et de manière automatique les domaines HMA des domaines CoBaHMA sur la base de critères structuraux. Pour chaque segment de séquence identifié par HHblits comme étant similaire en termes de séquence aux domaines CoBaHMA, nous avons extrait la structure 3D d'AlphaFoldDB. Nous avons ensuite traduit cette structure sous forme d'un enchaînement de structures secondaires via l'outil DSSP (Kabsch & Sander, 1983; Touw et al., 2015). Nous avons filtré toutes les structures, principalement sur la présence de l'enchaînement ββαβαβ(β) typique des domaines CoBaHMA. Les séquences qui passaient ce filtre structural était considéré comme étant des domaines CoBaHMA.

Les nouveaux domaines CoBaHMA identifiés de cette manière ont alors été utilisés à leur tour comme sondes pour répéter cette rechercher de manière transitive. Ce processus a été répété 6 fois, jusqu'à ce que nous ne trouvions plus de nouveaux domaines CoBaHMA et que nous atteignions ainsi la convergence de ce processus. De cette manière, nous avons identifié 2305 domaines CoBaHMA répartis dans 2227 séquences.

Nous avons ensuite cherché à identifier les zones conservées et variables du domaine CoBaHMA. Afin d'éviter la sur-représentation d'une sous famille du domaine CoBaHMA, nous avons clusterisé les 2305 séquences que nous avions identifiées pour ce domaine, avec l'outil mmseqs2 (Steinegger & Söding, 2017) (seuil de couverture 80%; seuil d'identité 60%). Nous avons ensuite aligné les représentants des 1432 clusters ainsi produits. Nous avons constaté dans le processus d'alignement, que les hélices α du domaine CoBaHMA sont trop variables pour être alignées. A l'inverse, (Figure 3 de l'article) les brins β, à l'exception du β4, ont tous des sites conservés.

Contrairement à ce que nous avions observé chez les domaines CoBaHMA des calcyanines, le motif HxxxxRxRxR complet n'est pas totalement conservé, seul 27 % des séquences l'ont. Sur ce motif les 2 arginines centrales sont très conservées (88 % des séquences), et 94 % des séquences ont au moins l'une de ces 2 arginines, quand l'histidine et l'arginine aux extrémités peuvent être remplacées par d'autres a.a polaires. Par ailleurs, une sous-population minoritaire des domaines CoBaHMA n'a aucun des a.a de ce motif basique.

Les séquences incluant un domaine CoBaHMA sont quasi exclusivement des séquences bactériennes, à l'exception d'une séquence eucaryote, et de 4 séquences d'archée, mais dont l'origine semble douteuse au vu du très faible nombre de séquences concernées.

Nous avons regroupé ces séquences avec l'outil mmseqs2 (Steinegger & Söding, 2017), et l'algorithme de Louvain (Blondel et al., 2008) en communautés de séquences similaires de longueurs proches. Nous nous sommes focalisés sur les 48 communautés qui comptaient au moins 5 membres, afin d'avoir
suffisamment de séquences pour produire des MSA et ainsi être en mesure de déterminer les conservations et analyser finement les architectures. Ces communautés rassemblent au total 1410 séquences.

Nous avons analysé ces communautés pour identifier dans leurs séquences les domaines déjà répertoriés dans les banques de domaines à l'aide des outils InterProScan (P. Jones et al., 2014) et DomainMapper (Manriquez-Sandoval & Fried, 2022)).

Comme le domaine (GlyZip)₃ des calcyanines (Benzerara et al., 2022) est absent des bases de domaines, nous avons aussi scanné ces communautés avec l'outil pCALF, développé au laboratoire par Maxime Millet. Cet outil permet de reconnaître les 3 GlyZips du domaine (GlyZip)₃. Cela nous a permis d'identifier les calcyanines de notre ensemble de séquences.

De plus, nous avons recherché les segments transmembranaires dans ces communautés avec l'outil DeepTMHMM (Hallgren et al., 2022). Au delà de l'intérêt général d'identifier les protéines transmembranaires, nous avions pour hypothèse (cf Chapitre 1) que le domaine CoBaHMA puisse interagir avec des membranes. Cette recherche nous permettait d'avancer sur cette hypothèse.

Enfin, nous avons complété ces analyses de séquences par une étude des modèles complets de la structure 3D du représentant de chaque communauté.

Nous avons ainsi identifié que le domaine CoBaHMA est présent dans d'autres architectures protéiques que la calcyanine (Figure 5 de l'article). En effet le domaine CoBaHMA est observé principalement :

- Seul;

- Répété à 2 ou 3 exemplaires dans la même protéine;

- Associé à des domaines de type P-type ATPase;

- Associé à des domaines ABC transporteur de type IV;

- Associé à des domaines phosphatidylglycerol phosphatase de type 2 (PAP2);

A cela s'ajoutent des architectures représentées par un petit nombre de séquences, comme par exemple des domaines CoBaHMA associés à des domaines diacylglycerol kinase.

Enfin une part non négligeable des domaines CoBaHMA sont associés à des régions encore non décrites dans les bases de domaines.

Le domaine CoBaHMA se trouve donc associé à au moins 3 domaines membranaires (P-type ATPase, ABC transporteur de type IV, PAP2). Deux de ces domaines sont des transporteurs, qui ont fait l'objet d'une brève description dans l'introduction.

L'association la plus représentée dans notre ensemble de données, est CoBaHMA - P-type ATPase, avec une forte prévalence de CoBaHMA - P1B-type ATPase (Figure 7 de l'article). Les P1B-type ATPases ont été abondamment décrites comme des transporteurs de cations métalliques (Smith et al., 2014).

Elles présentent les 4 domaines canoniques des P-type ATPases :

- Le domaine T, qui est constitué de 6 hélices transmembranaires qui permet la translocation du substrat. Chez les P1B-type ATPase, un site CPC situé sur ce domaine permet l'interaction avec les cations métalliques divalents ;

- Le domaine N, pour Nucleotide-binding;

- Le domaine P, pour Phosphorylation, et qui permet, avec le domaine N, l'interaction avec l'ATP;
_ Le domaine A, pour Actuator qui transmettrait l'information d'interaction avec l'ATP au domaine T;
(Palmgren & Nissen, 2011)

Dans le cas des P1B-type ATPases, s'ajoute au moins un domaine supplémentaire :

_ Le domaine S, qui est constitué de 2 hélices associées au domaine T. L'une de ces 2 hélices est amphiphatique et est supposée jouer un rôle dans l'entrée des ions transportés par cette protéine (Bitter et al., 2022);

_ A cela peut enfin s'ajouter en N<sub>ter</sub>, un ou plusieurs domaines HMA dont les rôles sont pour l'heure mal compris, mais qui pourraient avoir un rôle régulateur en interagissant avec le domaine A et/ou en amenant les cations métalliques jusqu'au domaine S (Bitter et al., 2022).

De façon inédite, les P1B-type ATPases associées à un ou plusieurs domaines CoBaHMA n'ont pas nécessairement le motif conservé CPC dans leur domaine T. Ce motif peut être remplacé par d'autres motifs conservés. Cela suggère que l'architecture CoBaHMA - P1B-type ATPase n'est pas spécifique du transport de cations métalliques divalents.

Notre analyse a aussi montré qu'au contraire des domaines HMA qui apparaissent limités au P1B-type ATPases, les domaines CoBaHMA sont également observés occasionnellement associés à des ATPases à Ca²⁺ (famille P2A, SERCA).

Comme évoqué ci-dessus, un des rôles possibles pour le HMA serait d'interagir avec le domaine A dans un mécanisme de régulation du P1B-type ATPase. De même, il est possible que les domaines CoBaHMA soient des domaines régulateurs dans cette architecture CoBaHMA - P-type ATPase, par une interaction avec un ou plusieurs des domaines de la P-type ATPase.

La 2ème architecture la plus présente, est CoBaHMA - ABC type IV (Figure 8 de l'article). Les ABC type IV, anciennement type I, sont des domaines membranaires qui exportent des substrats. Ils sont constitués d'un domaine transmembranaire et d'un domaine NBD (Nucleotide Binding Domain), et forment des homo ou des hétéro-dimères (Thomas et al., 2020). Les ABC de type IV exportent une large gamme de substrats, mais ceux observés associés au domaine CoBaHMA sont proches en termes de séquences d'exporteurs de lipides comme MsbA (Mi et al., 2017). De fait, il est possible que l'association CoBaHMA - ABC type IV soit aussi spécifique du transport de lipides. Le domaine CoBaHMA pourrait avoir un rôle régulateur en interagissant directement avec les domaines du transporteur ABC, et/ou interagir avec les têtes chargées négativement des lipides de la membrane, comme supposé dans le Chapitre 1.

Enfin, les domaines PAP2 sont des domaines membranaires qui catalysent la déphosphoylation de lipides ou de carbohydrates (Figure 8 de l'article). Ceux associés aux domaines CoBaHMA appartiennent à la famille LPT (lipid phosphatase/phosphotransferase), et interagissent avec de nombreux lipides dans des bactéries Gram-negative.

La co-occurence du domaine CoBaHMA avec des domaines membranaires, et plus spécifiquement de domaines qui interagissent directement avec des lipides (ABC type IV et PAP2) suggère une interaction entre le domaine CoBaHMA et ces derniers. Comme nous l'avons déjà développé dans le Chapitre 1, le domaine CoBaHMA pourrait interagir avec les têtes chargées négativement des lipides par ses a.a basiques conservés, d'une manière similaire au domaine eucaryote C2.

Notre analyse a permis de montrer que le domaine CoBaHMA n'était pas limité aux cyanobactéries, mais se trouvait aussi dans de nombreux phylums de bactéries (Figure 6 de l'article). Or bactéries et
cyanobactéries ont des lipidomes très différents (Wada & Murata, 2004). Il n'y a que 2 types de lipides avec une tête chargée négativement qui sont communs aux lipidomes des cyanobactéries et des bactéries (autres que cyanobactéries) : le phosphatidylglycerol (PG) et l'acide phosphatidique (PA). Si le domaine CoBaHMA interagit bien avec des lipides, l'hypothèse la plus vraisemblable est que cette interaction implique l'un ou l'autre de ces candidats.

Cependant, les séquences avec une région annotée par un autre domaine que le domaine CoBaHMA ne représentent qu'une partie de notre ensemble de séquences. Nous avons réalisé une analyse exhaustive des modèles de structure 3D des séquences où seul un domaine CoBaHMA était annoté. Dans ces modèles, nous avons souvent observé en $C_{ter}$ du domaine CoBaHMA un court domaine constitué d'une épingle à cheveux de 2 hélices (Figure 9 de l'article), qui est proche en terme de structure du motif GlyZip de la calcyanine. Ce court domaine est parfois identifié comme membranaire par DeepTMHMM, probablement en raison du fort taux d'a.a hydrophobes. Toutefois il porte souvent également des a.a chargés en particulier basiques. Ce court domaine pourrait servir de « plateforme » sur laquelle des a.a pourraient être greffés pour interagir spécifiquement avec des ligands ou des ions. Cette épingle à cheveux pourrait par ailleurs constituer un motif structural de base pour la constitution d'architectures protéiques plus complexes telle qu'observée pour le domaine $(GlyZip)_{3}$ des calcyanines ou d'autres domaines.

En conclusion, nous avons identifié, décrit et analysé la famille de domaines CoBaHMA. Les architectures sur lesquelles ces domaines sont observés permettent de proposer des hypothèses sur le rôle du CoBaHMA, et par conséquent, de progresser dans la compréhension de la fonction de la calcyanine.

Cette analyse, délicate en raison de la proximité en termes de séquences des différentes familles au sein de la superfamille HMA, a pu être menée à bien grâce à la mise en place d'un filtre structural pour discriminer finement les domaines CoBaHMA. En intégrant l'information structurale dans notre approche, nous avons pu étudier les architectures connues (P1B-type ATPase, ABC..) mais aussi nous intéresser aux régions encore non-décrites en apportant des observations inédites pour ces dernières, qui représentent encore des régions vierges d'annotations structurales et fonctionnelles. Si nous nous étions contentés de l'approche par séquence nous n'aurions, par exemple, pas observé l'épingle à cheveux de 2 hélices qui se trouve régulièrement associée aux domaines CoBaHMA.

Toutefois ce filtre structural apporte aussi la principale limitation à notre étude. 25% des séquences identifiées par HHblits comme ayant potentiellement un domaine CoBaHMA n'ont pas de modèle dans la base AlphaFoldDB les excluant donc de notre analyse. Par ailleurs, pour limiter la présence de faux positifs, nous avons été très sélectifs sur notre filtre structural, ce qui a induit des faux négatifs. Pour ces raisons, notre analyse n'est pas exhaustive. Nous pourrions avoir manqué des architectures incluant le domaine CoBaHMA. Notre analyse pourrait être complétée dans le futur, par exemple en utilisant ESM Metagenomic Atlas (Lin et al., 2023) plutôt qu'AlphaFoldDB comme base de données de modèles, car elle rassemble 772 millions de modèle, contre 200 millions pour AlphaFoldDB.

Par ailleurs, dans cet article nous n'avons pas encore pleinement exploité le potentiel des modèles 3D. Nous avons développé, en plus du travail de l'article, un outil pour détecter automatiquement les contacts inter-domaines uniquement dans les régions des modèles d'AlphaFold2 jugées comme fiables. Pour cela nous prenons en compte les distances inter-résidus uniquement pour les a.a où les métriques (pLDDT, PAE; cf Chapitre 1 pour ces métriques) sont au dessus d'un seuil de confiance. Nous n'avons
malheureusement pas eu le temps d'intégrer cet outil à notre étude sur le domaine CoBaHMA. Un
exemple de l'utilisation de cette métrique est cependant donné en Figure Supplémentaire 8 de l'article,
illustrant un réseau d'interaction entre le domaine CoBaHMA et le domaine A et le domaine T d'un
membre de la communauté C140 (P1B-type ATPase). Mais il serait intéressant dans le futur d'établir,
de manière automatique, les contacts potentiels établis entre les domaines CoBaHMA et d'autres
domaines. Cela permettrait d'aller plus en avant dans la formulation d'hypothèses fonctionnelles de ce
domaine, notamment en mettant en lumière des a.a impliqués dans des interactions inter-domaines.
Conclusion et Discussion :

Dans l'introduction de cette thèse, nous avions soulevé un certain nombre de questions auxquelles nous espérions apporter des éléments de réponse. En rassemblant les résultats que nous avons obtenus ainsi que les nombreuses hypothèses que nous avons soulevées au cours de ce travail, nous pouvons discuter de certains points.

Tout d'abord, nous avons progressé dans la compréhension du domaine CoBaHMA. La concordance de
nos approches de modélisation (modélisation comparative, AlphaFold2 et ESMFold) nous permet de
proposer un modèle robuste de la structure 3D de ce domaine CoBaHMA, représentant une nouvelle
famille dans la superfamille HMA. Grâce à ce modèle, nous avons développé une nouvelle approche
pour l'identification de familles de domaines protéiques, qui repose sur l'intégration des informations
séquentielles et structurales pour distinguer une famille de domaines de ses familles proches. Par cette
méthode nous avons réussi à discriminer finement le domaine CoBaHMA des autres domaines de la
superfamille HMA. A partir de cela, nous avons décrit la variété des organisations modulaires dans
lesquelles se trouve le domaine CoBaHMA. Cette analyse a mis à jour plusieurs architectures, voir
même domaines, encore non décrits dans la littérature.

Notre analyse du domaine CoBaHMA est la plus complète (et la seule) faite à ce jour, mais il est
probable qu'elle ne soit pas exhaustive. En effet, notre méthodologie (choix des bases de données, filtre
sur la structure 3D...) a privilégié la spécificité à la couverture pour éviter la contamination de
l'ensemble de données par des faux positifs. Nous avons donc peut-être manqué des architectures
possédant le domaine CoBaHMA, dont la description permettrait d'encore affiner notre analyse.
Cependant, même avec cette possible extension, on peut d'ores et déjà constater que les domaines
CoBaHMA ne sont présents que dans un ensemble relativement restreint de protéines au sein de
différentes familles, ce qui suggère une fonction spécifique au sein de ces familles, limitée à certaines
espèces ou phylums.

Grâce à l'analyse des modèles 3D, nous avons constaté que le domaine CoBaHMA est couramment
associé à un motif en épingle à cheveux constituée de 2 hélices. Cette association est celle que nous
avons modélisé pour la structure du fragment CoBaHMA – GlyZip1, que nous avons isolé depuis la
calcyanine complète par protéolyse limitée. La récurrence de cet assemblage structurale est peut-être
l'indication que nous devrions considérer la calcyanine comme l'association de 2 blocs : CoBaHMA-
GlyZip1 d'un côté et GlyZip2- GlyZip3 de l'autre. Cela pourrait expliquer pourquoi nos essais pour
exprimer les domaines CoBaHMA et (GlyZip)₃ de la calcyanine n'ont pas pu pleinement aboutir
(Targowla, 2019, Rapport de M2).

Nous avons aussi observé que le domaine CoBaHMA est souvent présent dans un contexte
membranaire, en particulier associé à des protéines permettant le transport de substrats au travers des
membranes ou des protéines modifiant les lipides. Un certain nombre de domaines CoBaHMA sont en
effet associés à des domaines transmembranaires, en particulier à des familles transporteurs (P-type
ATPases, ABC transporteurs). Il est difficile de prédire quels substrats pourraient être transportés par
ces architectures. Par analogie avec les P1B-type ATPases à domaine HMA, ces substrats pourraient
être des ions. Mais, en se basant sur la proximité des séquences des transporteurs ABC à domaines
CoBaHMA avec des transporteurs de lipides comme MsBA (Padayatti et al., 2019), il est aussi possible
d'envisager des transports de lipides. Dans le cas des P-type ATPases, ce transport de lipides
rappellerait alors celui des P4-type ATPases (dit « flippases ») (Lyons et al., 2020).