# Potentiel probiotique et activités anti-Clostridium perfringens établies in vitro et in vivo pour des souches du genre Lactobacillus nouvellement isolées du caecum de poulets

Nuria Vieco Saiz

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Nuria Vieco Saiz. Potentiel probiotique et activités anti-Clostridium perfringens établies in vitro et in vivo pour des souches du genre Lactobacillus nouvellement isolées du caecum de poulets. Sciences de l'environnement. Université de Lille, 2019. Français. NNT: tel-04549500

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UNIVERSITE DE LILLE

Ecole Doctorale Sciences de la Matière, du Rayonnement et de l'Environnement (ED104)

THESE DE DOCTORAT

Spécialité : **Ingénierie des Fonctions Biologiques**

Présentée par

Nuria VIECO SAIZ

Pour l'obtention du grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE LILLE

Soutenance le 28 Février 2019 devant le jury composé de :

Potentiel probiotique et activités anti-*Clostridium perfringens* établies *in vitro* et *in vivo* pour des souches du genre *Lactobacillus* nouvellement isolées du caecum de poulets

<table><tr><td>Mr. Djamel DRIDER</td><td>Professeur, Université de Lille</td><td>Directeur de thèse</td></tr><tr><td>Mme. Frédérique GANCEL</td><td>Maitre de conférences, Université de Lille</td><td>Co-encadrante de thèse</td></tr><tr><td>Mme. Martine BOULIANNE</td><td>Professeur, Université de Montréal</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Mme. Anne Christine LALMANACH</td><td>Chargée de recherche-HDR INRA, Tours</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Mme. Julie BOUCKAERT</td><td>Chargée de recherche CNRS, Université de Lille</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Mr. Georges DAUBE</td><td>Professeur, Université de Liège</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Mr. Benoit FOLIGNE</td><td>Professeur, Université de Lille</td><td>Président du jury</td></tr><tr><td>Mr. Gilles SALVAT</td><td>Directeur Général Délégué à la recherche de l'Anses</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Mr. Eric AUCLAIR</td><td>Directeur R&D de Phileo (Lesaffre International)</td><td>Invité</td></tr><tr><td>Mr. Yanath BELGUESMIA</td><td>Ingénieur de recherche- Université de Lille</td><td>Invité</td></tr></table>
*A todos aquellos que han creído en mí
y me han apoyado*

*A tous ceux qui ont cru en moi
et m'ont soutenu*
Remerciements

En tout premier lieu, je tiens particulièrement à remercier Mme. Anne-Christine Lalmanach et Mme. Martine Boulianne pour avoir accepté d'être rapporteurs de ce travail. Je tiens également à remercier tous les membres du jury pour avoir accepté d'évaluer mon travail et pour le temps qu'ils ont consacré à la lecture du manuscrit.

Je remercie :

Le Pr. Pascal Dhulster de m'avoir accueillie au sein de l'Institut Charles Viollette où j'ai pu
réaliser la plus grande partie de mes travaux.

Agradezco al madrileño de corazón, el Pr. Djamel Drider la confianza que depositó en mí para
la realización de este proyecto y el haberme acogido en su equipo. Gracias por guiarne en las
reflexiones científicas tras la obtención de resultados y por ser de vez en cuando mi profesor de
idiomas. Admiro tu pasión por la ciencia, tus grandes ideas científicas y tu capacidad para conectar
con las personas.

Le Dr. Frédérique Gancel pour son support, encadrement et empathie. Pour m'avoir montré comment valoriser mes résultats, voir le côté positif des choses et m'encourager à m'améliorer chaque jour.

Le Dr. Yanath Belguesmia pour les grands moments vécus ensemble surtout les derniers temps, pour son énorme patience et son humour. C'est une énorme chance pour un jeune chercheur de travailler à ses côtés.

Hamza, qui m'a aidé toujours et que je considère comme un collègue-chercheur clairvoyant, un ami d'exception et presque un frère.

Corinne Boistel pour répondre toujours à mes petites questions, à Matthieu Duban pour m'avoir montré la magie de l'ADN et Dr. Gabrielle Chataigne pour son aide précieuse dans plusieurs méthodes analytiques.

A l'équipe de la plateforme Realcat, surtout à Egon pour avoir mis à disposition tous les moyens disponibles.

Dr. Benoit Cudennec pour ses conseils scientifiques dans le domaine de cultures cellulaires, et sans oublier à Rezak Mendil car son nom est synonyme de Caco-2 et HT-29. Merci pour me guider dans mes premiers pas dans la manipulation de cellules eucaryotes.

En sachant que la liste est immense, et comme je ne voudrais oublier personne, je remercie de
façon globale, les doctorants, postdocs et ingénieurs au sein de l'Institut Charles Viollette, pour les
moments de partage au niveau scientifique comme humain, pour rigoler, se relaxer ou manger la
glorieuse nourriture du RU ensemble. Particulièrement je voudrais remercier Ludivine pour nos
balades anti-stress faites de temps en temps, à mon grand ami Mahammed pour nos conversations et son support ; et à Cyril pour son immense aide et son grand cœur.

Du côté de l'entreprise je tiens à remercier Eric Auclair, pour sa vision appliquée de la recherche, pour m'encourager à prendre contact avec des collègues et chercheurs, pour me montrer l'importance du travail en équipe, et pour m'avoir donné cette expérience exceptionnelle de faire une thèse CIFRE.

Je remercie Ruth pour m'avoir suivi en toute cette période, pour son support et discussion scientifique.

Je ne veux pas oublier au reste de l'équipe R&D, les cocottes Clotilde, Julie, Eloise, Claire, Aurore, Johanna, Cécile et les sudistes Christine, Nadege, Virginie et Jean-Philippe. J'ai trouvé le département très dynamique et ouvert, il m'a été vraiment facile me sentir à l'aise avec vous. Un grand merci également au reste de Phileo. Et une grande pensée à Alain, Tadele et Jimmie qui, même de loin, m'ont aidé.

Je tiens également à remercier tous les membres de la plateforme bactérie pour m'avoir faire sentir comme un autre membre de l'équipe. Je voudrais remercier en particulier Dr. Christel Garrigues et Dr. Rober Kemperman pour mettre à ma disposition les équipements disponibles dans leurs laboratoires et aussi pour avoir partagé avec moi leurs expérience et conseils scientifiques et humains. Un grand merci à Florent Le Broc pour me dédier de son temps et à Marion Damman qui m'a encouragé à continuer dans les moments difficiles.

Aussi un grand merci au Renaud Toussaint et toute son équipe pour m'avoir initié à des techniques modernes. Merci Julie pour le temps que vous m'avez consacré.

A Adrián, por su apoyo en todos los aspectos de mi vida, por ver todo lo positivo que llevo dentro, y tener la paciencia para hacerme verlo, y porque tus risas suben el ánimo a cualquiera. La distancia es difícil pero no con una persona como tú, gracias por complementarme y hacerme mejor.

A mi familia, que desde lejos ha sabido como apoyarme y alegrarme las tardes sombrías, que de vez en cuando, solo de vez en cuando aparecen en Lille. A mi padre, por sus llamadas telefónicas, apoyándome desde lejos y teniendo fe ciega en mi criterio. A mi hermana pequeña, Lidia, aunque realmente es la mayor por su protección y apoyo, que se siente sin necesidad de comunicarse. Pero a quien realmente debo agradecer es a mi madre, única en el mundo, por estar ahí en cada momento de debilidad, tristeza o falta de fortaleza, una de las mujeres más valientes que conozco, por todos sus viajes relámpago y sus "Bonjoures" mañaneros.

En résumé, je tiens à remercier toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin á la réalisation de ce modeste travail de recherche.

Merci à tous! Gracias a todos !
Table de matières

<table><tr><td>RESUME</td><td>IX</td></tr><tr><td>ABSTRACT</td><td>XI</td></tr><tr><td>LISTE DES FIGURES</td><td>XII</td></tr><tr><td>LISTE DES TABLEAUX</td><td>XIV</td></tr><tr><td>ABREVIATIONS</td><td>XVI</td></tr><tr><td>INTRODUCTION GENERALE</td><td>1</td></tr><tr><td>REVUE BIBLIOGRAPHIQUE</td><td>8</td></tr><tr><td>I. LA FILIERE AVIAIRE</td><td>9</td></tr><tr><td>I.1. La production mondiale de volaille</td><td>9</td></tr><tr><td>I.2. Les maladies zoonotiques et aviaires</td><td>13</td></tr><tr><td>II. L'ENTERITE NECROTIQUE</td><td>21</td></tr><tr><td>II.1. Etiologie</td><td>21</td></tr><tr><td>II.2. Pathologie</td><td>21</td></tr><tr><td>II.3. Epidémiologie et symptomatologie</td><td>24</td></tr><tr><td>II.4. Facteurs de prédisposition</td><td>27</td></tr><tr><td>II.5. Modèles animaux servant à l'étude de l'entérite nécrotique</td><td>32</td></tr><tr><td>II.6. Lutte contre l'entérite nécrotique</td><td>33</td></tr><tr><td>III. UTILISATION DES ANTIBIOTIQUES EN SANTE ANIMALE</td><td>34</td></tr><tr><td>III.1. Antibiotiques utilisés dans les élevages industriels</td><td>35</td></tr><tr><td>III.2. Les antibiotiques utilisés chez la volaille</td><td>37</td></tr><tr><td>III.3. Mécanismes de résistance et transmission</td><td>39</td></tr><tr><td>III.4. Mesures d'action contre la résistance aux antibiotiques</td><td>41</td></tr><tr><td>III.5. Le concept de seule sante ou One-Health</td><td>45</td></tr><tr><td>III.6. Les stratégies alternatives aux antibiotiques</td><td>46</td></tr><tr><td>IV. LES PROBIOTIQUES</td><td>49</td></tr><tr><td>IV.1. Critères de sélection des probiotiques</td><td>50</td></tr><tr><td>IV.2. Historique</td><td>50</td></tr><tr><td>IV.3. Marché des probiotiques et domaines d'applications</td><td>51</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>IV.4. Sureté et innocuité</td>
      <td>52</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.5. La genèse des probiotiques</td>
      <td>53</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V. LES BACTERIES LACTIQUES ET LE POTENTIEL PROBIOTIQUE</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.1. Définition, systématique, taxonomie</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.2. Physiologie</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.3. Intérêts industriels des bactéries lactiques</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.4. Résistance aux conditions gastro-intestinales</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.5. Adhésion aux cellules intestinales</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.6. Mécanisme d'action contre les bactéries pathogènes</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.7. Effets bénéfiques associés aux probiotiques</td>
      <td>62</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.8. Innocuité des bactéries lactiques</td>
      <td>63</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.9. Culture de barrière</td>
      <td>63</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VI. AUTRES PROBIOTIQUES</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VI.1. Les bactéries probiotiques autres que les bactéries lactiques</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VI.2. Les levures probiotiques</td>
      <td>68</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>STRATEGIE EXPERIMENTALE ET OBJECTIFS DE LA THESE</td>
      <td>70</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>MATERIELS ET METHODES</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. ISOLEMENT DE BACTERIES LACTIQUES</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1. Préparation du caecum</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2. Milieux de dénombrement et d'isolement des bactéries lactiques</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3. Isolement après enrichissement</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. IDENTIFICATION DES SOUCHES</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1. Tests préliminaires d'identification des bactéries lactiques et conservation</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2. Identification moléculaire et proximité génétique des bactéries lactiques isolées</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3. Séquençage du génome</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. ACTIVITES ANTI-CLOSTRIDIUM PERRINGENS</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1. Test des slabs</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2. Test des puits</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3 Lectures des tests</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4. Recherche moléculaire des composants antibactériens</td>
      <td>82</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><thead><tr><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>4. ETUDE DU POTENTIEL PROBIOTIQUE</td><td>82</td></tr><tr><td>4.1. Dosage de l'acide lactique</td><td>82</td></tr><tr><td>4.2. Formation de biofilms par les souches de bactéries lactiques</td><td>83</td></tr><tr><td>4.3. Fermentation des carbohydrates par les bactéries lactiques isolées</td><td>84</td></tr><tr><td>4.4. Etude de la résistance aux conditions gastro-intestinales du poulet</td><td>84</td></tr><tr><td>4.5. Propriétés d'agrégation</td><td>87</td></tr><tr><td>4.6. Adhésion aux cellules intestinales</td><td>88</td></tr><tr><td>4.7. Innocuité des souches sélectionnées</td><td>90</td></tr><tr><td>5. SURVIE DES BACTERIES LACTIQUES ISOLEES DANS LES CONDITIONS DE STOCKAGE, ET LORS DE L'ADMINISTRATION AUX ANIMAUX</td><td>92</td></tr><tr><td>5.1. Survie des bactéries au procédé de lyophilisation et leur conservation sous forme déshydratée</td><td>92</td></tr><tr><td>5.2. Survie des souches de lactobacilles en suspension aqueuse</td><td>93</td></tr><tr><td>5.3. Inhibition croisée des souches de bactéries lactiques</td><td>93</td></tr><tr><td>6. ÉVALUATION IN VIVO DES TROIS SOUCHES SELECTIONNEES COMME CANDIDATS PROBIOTIQUES</td><td>94</td></tr><tr><td>6.1. Environnement des poulets et régime alimentaire</td><td>94</td></tr><tr><td>6.2. Vaccination</td><td>94</td></tr><tr><td>6.3. Traitements des différents lots</td><td>96</td></tr><tr><td>6.4. Administration de C. perfringens</td><td>97</td></tr><tr><td>6.5. Administration des bactéries lactiques</td><td>97</td></tr><tr><td>6.6. Mesures effectuées sur les oiseaux</td><td>98</td></tr><tr><td>7. ANALYSES STATISTIQUES</td><td>98</td></tr><tr><td>RESULTATS ET DISCUSSION</td><td>99</td></tr><tr><td>1. DENOMBREMENTS ET IDENTIFICATION DES BACTERIES ISOLEES</td><td>100</td></tr><tr><td>1.1. Identification moléculaire des bactéries lactiques et étude de leur proximité génétique</td><td>101</td></tr><tr><td>1.2. Détermination de la proximité génétique des lactobacilles par Random Amplified Polymorphic DNA</td><td>103</td></tr><tr><td>2. ACTIVITE ANTI-CLOSTRIDIUM PERFRINGENS</td><td>108</td></tr><tr><td>2.1. Activité antimicrobienne en slabs</td><td>108</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>2.2. Activité antimicrobienne des surnageants neutralisés et filtrés</td><td>111</td></tr><tr><td>2.3. Détection moléculaire des métabolites antibactériens</td><td>112</td></tr><tr><td>3. ETUDE DU POTENTIEL PROBIOTIQUE</td><td>115</td></tr><tr><td>3.1. Dosage de l'acide lactique produit</td><td>115</td></tr><tr><td>3.2. Formation de biofilms par les bactéries lactiques isolées</td><td>118</td></tr><tr><td>RECAPITULATIF DE LA PREMIERE SELECTION DE SOUCHES</td><td>121</td></tr><tr><td>3.3. Résistance des souches aux conditions gastro-intestinales du poulet</td><td>122</td></tr><tr><td>3.4. Test d'activité contre différentes souches de Clostridium</td><td>127</td></tr><tr><td>3.5. Etude des propriétés d'agrégation des souches</td><td>128</td></tr><tr><td>SYNTHESE DES RESULTATS PORTANT SUR LA SELECTION DE SOUCHES</td><td>134</td></tr><tr><td>3.6. Adhésion aux cellules intestinales</td><td>135</td></tr><tr><td>4. INNOCUITE DES SOUCHES SELECTIONNEES</td><td>138</td></tr><tr><td>4.1. Activité hémolytique</td><td>139</td></tr><tr><td>4.2. Résistance aux antibiotiques</td><td>139</td></tr><tr><td>4.3. Cytotoxicité envers les cellules eucaryotes de la lignée HT-29</td><td>141</td></tr><tr><td>5. DESCRIPTION DES PROPRIETES TECHNOLOGIQUES DES SOUCHES</td><td>142</td></tr><tr><td>5.1. Survie des bactéries à la lyophilisation et conservation sous forme déshydratée</td><td>143</td></tr><tr><td>5.2. Survie des souches de lactobacilles en suspension aqueuse</td><td>144</td></tr><tr><td>5.3. Inhibition croisée des souches de bactéries lactiques</td><td>145</td></tr><tr><td>6. SEQUENÇAGE ET ANALYSE DES GENOMES</td><td>145</td></tr><tr><td>6.1. Recherche de gènes codant des molécules antibactériennes putatives</td><td>146</td></tr><tr><td>6.2. Recherche moléculaire des propriétés d'innocuité</td><td>147</td></tr><tr><td>6.3. Caractérisation prédictive du métabolisme des souches</td><td>149</td></tr><tr><td>6.4. Prédiction des capacités probiotiques</td><td>150</td></tr><tr><td>6.5. Prédiction des capacités technologiques</td><td>151</td></tr><tr><td>7. TEST IN VIVO</td><td>151</td></tr><tr><td>7.1. Essai de croissance ou performance zootechnique pendant la phase de démarrage</td><td>152</td></tr><tr><td>7.2. Effet des souches sur l'entérite nécrotique</td><td>155</td></tr><tr><td>CONCLUSION GENERALE</td><td>160</td></tr><tr><td>RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES</td><td>165</td></tr></table>
# RESUME

## Potentiel probiotique et activités anti-*Clostridium perfringens* établies *in vitro* et *in vivo* pour des souches du genre *Lactobacillus* nouvellement isolées du caecum de poulets

Dans cette étude, nous avons isolé et évalué le potentiel probiotique et l'effet barrière de nouvelles souches de bactéries lactiques contre l'entérite nécrotique du poulet de chair, une infection qui cause des lésions intestinales, mais aussi qui diminue le poids des oiseaux et entraînant dans certains cas leur mort. Le recours aux antibiotiques pour prévenir cette infection, et comme facteurs de croissance est prohibé depuis 2006 en Europe, par la directive 1831/2003/CE. Ainsi, le développement de stratégies alternatives aux antibiotiques reste un objectif louable sur les plans scientifique, industriel et sociétal. Dans cette optique, nous avons procédé à l'isolement et évaluation de nouvelles souches de bactéries lactiques, plus particulièrement de lactobacilles, comme flores probiotiques et potentiellement protectrices contre l'entérite nécrotique. Les bactéries lactiques sont capables de produire plusieurs molécules antagonistes comme l'acide lactique, ou encore les acides gras et phénylactique, le peroxyde d'hydrogène, le diacétype et les bactériocines. Outre cet arsenal, les bactéries lactiques bénéficient du double statut GRAS/QPS (innocuité et sécurité des souches), et sont pour autant utilisables dans divers secteurs de la biotechnologie et de l'agroalimentaire. Les bactéries lactiques sont capables de former des biofilms et d'exercer de nombreuses fonctions biologiques de grande importance, les rendant ainsi des microorganismes de choix pour des applications probiotiques.

Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont porté sur la caractérisation des effets barrière et probiotique de nouvelles souches de bactéries lactiques appartenant au genre *Lactobacillus*, et plus particulièrement aux espèces *Lactobacillus reuteri* et *Lb. salivarius*. Ces souches ont été isolées de caeca de poulets sains élevés dans la région des Hauts-de-France. Les résultats que nous avons obtenus ont permis de mettre en évidence les activités antagonistes de ces nouvelles souches, notamment contre *Clostridium perfringens*; bactérie responsable de l'entérite nécrotique. Cet antagonisme est d'abord mis en évidence *in vitro* sur un milieu gélosé. Il est attribué à la production d'acide lactique, comme principale molécule antagoniste. Les propriétés d'agrégation, d'adhésion et de formation de biofilms de ces nouvelles souches et leur résistance aux conditions gastro-intestinales de poulets reconstituées ont également été étudiées et établies dans le cadre de cette
thèse. Les souches que nous avons nouvellement isolées et sélectionnées se sont avérées être non-hémolytiques. Par ailleurs, les propriétés de résistance au procédé de lyophilisation, à la conservation ainsi que la viabilité aux conditions d'administration aux animaux ont été également étudiées. Ces critères technologiques nous ont permis d'établir la faisabilité de leur production à à grande échelle avant une possible commercialisation. Les génomes des souches ayant donnée des activités les plus intéressantes sur le plan de l'antagonisme et qualification probiotique ont été séquencés. Il faut noter que la validation de ces activités et plus particulièrement de l'effet anti-C. perfringens a été réalisée avec succès *in vivo* sur des modèles de poulets de chair.
ABSTRACT

Probiotic features and in vitro and in vivo evidences on anti-*Clostridium perfringens* activities
of novel Lactobacilli from chicken ceca origin

Here, we propose the use as probiotic novel lactic acid bacteria (LAB), mainly lactobacilli for their anti-*Clostridium perfringens* properties. This Gram-positive, spore-forming and harmful bacterium is responsible of necrotic enteritis in broilers. This infection is characterized by severe intestinal lesions, weight loss and ultimately death. The use of antibiotics to prevent necrotic enteritis or just as growth promotors has been banned in Europe since 2006 based on the EU regulation 1831/2003/CE.

Antibiotics replacement in the animal production is therefore an area where research is extremely active. In this project, we have successfully isolated novel lactobacilli strains endowed with anti-C. *perfringens* activity and additional probiotic features. LAB are recognized as GRAS/QPS organisms and can offer advantages for industrial applications.

In this study, LAB strains were isolated from healthy chicken caeca. These LABs, mainly those belonging to *Lactobacillus reuteri* and *Lb. salivarius* species have revealed high capabilities to inhibit *in vitro* *C. perfringens* through lactic acid production. In addition to produce lactic acid, these strains newly isolated were able to form biofilms and display high aggregation and adhesion scores. The resulted to be non-hemolytic and resist to simulated gastro-intestinal conditions in strain dependent-manner.

Technological properties as resistance to freeze-drying process, conservation and viability were determined and allowed to shape and predict scale production of these novel LAB strains. Genomes of Lactobacilli with relevant fulfilling antagonistic activities and probiotic grade were sequenced and analyzed. To conclude this study, *in vivo* assays were successfully tested in challenged birds. Interestingly and remarkably, these strains allowed birds to gain weight and avoid lesions caused by *C. perfringens*.
## Liste des Figures

<table><tr><td>Figure 1. Observation au microscope optique de Clostridium perfringens après coloration différentielle de Gram</td><td>3</td></tr><tr><td>Figure 2. Segments d'intestins de poulets</td><td>4</td></tr><tr><td>Figure 3. Evolution de la production mondiale des différents types de viandes de 2015 à 2017</td><td>9</td></tr><tr><td>Figure 4. Production de viandes par région et par type de viande</td><td>10</td></tr><tr><td>Figure 5. Consommation de viande de poulet entre 1990 et 2026 pour différents pays</td><td>11</td></tr><tr><td>Figure 6. Panel A) Distribution de la production de la viande de volaille dans le monde. Panel B) Distribution de la production totale de viande de poulet en 2016 dans le monde (données exprimées en pourcentages)</td><td>12</td></tr><tr><td>Figure 7. Représentation de la structure cristalline de la toxine NetB</td><td>23</td></tr><tr><td>Figure 8. Organisation génétique des loci spécifiques associés aux entérites nécrotiques</td><td>24</td></tr><tr><td>Figure 9. Nécrose à C. perfringens dans le jéjunum de poulets</td><td>25</td></tr><tr><td>Figure 10. Coupes histologiques du jéjunum de poulets sain (Panel A) et infecté avec Clostridium perfringens (Panel B)</td><td>26</td></tr><tr><td>Figure 11. Réseau de facteurs de prédisposition à l'entérite nécrotique</td><td>28</td></tr><tr><td>Figure 12. Répartition des ventes en 2015 (en mg/UCP) des méthodes d'administration des agents antimicrobiens vétérinaires pour les élevages industriels, dans 30 pays européens</td><td>36</td></tr><tr><td>Figure 13. Catégories et commercialisation, en 2015, des agents antimicrobiens vétérinaires en pourcentages des ventes totales d'espèces productrices d'aliments, en mg / UCP dans 30 pays européens</td><td>36</td></tr><tr><td>Figure 14. Mécanismes de résistance aux antibiotiques</td><td>40</td></tr><tr><td>Figure 15. Répartition des ventes totales, en 2015, d'agents antimicrobiens vétérinaires (en tonnes de matière active) par pays</td><td>43</td></tr><tr><td>Figure 16. Concept de seule-sante dite One-Health sur la transmission de bactéries résistantes aux antibiotiques</td><td>46</td></tr><tr><td>Figure 17. Effets et apports des probiotiques sur la santé et la production des animaux</td><td>52</td></tr><tr><td>Figure 18. Taxonomie des bactéries lactiques</td><td>55</td></tr><tr><td>Figure 19. Voies d'utilisation du glucose chez les bactéries lactiques</td><td>56</td></tr><tr><td>Figure 20. Substances antibactériennes produites par les bactéries lactiques</td><td>60</td></tr><tr><td>Figure 21. Mécanismes d'action des probiotiques dans le renforcement de la barrière épithéliale</td><td>64</td></tr><tr><td>Figure 22. Structure de jonctions serrés des cellules épithéliales</td><td>65</td></tr><tr><td>Figure 23. Illustration du tractus gastro-intestinal du poulet</td><td>75</td></tr><tr><td>Figure 24. Réaction catalysée par Gld (Glycérol déshydratasse)</td><td>82</td></tr><tr><td>Figure 25. Reconstitution des conditions gastro-intestinales</td><td>85</td></tr><tr><td>Figure 26. Etats physiologiques des bactéries</td><td>86</td></tr><tr><td>Figure 27. Répartition des espèces de Lactobacillus isolées dans des échantillons de caeca</td><td>102</td></tr><tr><td>Figure 28. Electrophorèse sur gel d'agarose montrant les profils d'amplification PCR-RAPD pour 10 souches de Lactobacillus reuteri</td><td>103</td></tr></table>
<table><tr><td>Figure 29. Arbre phylogénétique généré à partir de l'analyse des amplicons de la PCR-RAPD obtenus à partir des souches Lactobacillus reuteri en utilisant le logiciel PyElph 1.4</td><td>104</td></tr><tr><td>Figure 30. Electrophorèse sur gel d'agarose montrant les profils d'amplification PCR-RAPD pour 10 souches de Lactobacillus salivarius</td><td>105</td></tr><tr><td>Figure 31. Arbre phylogénétique généré à partir de l'analyse des amplicons de RAPD-PCR obtenus à partir des souches Lactobacillus salivarius en utilisant le logiciel PyElph 1.4.</td><td>106</td></tr><tr><td>Figure 32. Détection du fragment du gène gldC par PCR</td><td>114</td></tr><tr><td>Figure 33. Arbre décisionnel résumant la première sélection des souches isolées.</td><td>121</td></tr><tr><td>Figure 34. Autoagrégation (%) des souches de bactéries lactiques isolées</td><td>129</td></tr><tr><td>Figure 35. Pourcentage d'adhésion des souches bactériennes aux cellules Caco-2 par la méthode de dénombrement sur boîte et par PCR quantitative (qPCR)</td><td>135</td></tr><tr><td>Figure 36. Corrélation entre l'autoagrégation et le taux d'adhésion aux cellules intestinales de la lignée cellulaire Caco-2</td><td>138</td></tr><tr><td>Figure 37. Viabilité cellulaire (%) de la lignée cellulaire eucaryote HT-29, après 24 h de contact avec les bactéries lactiques</td><td>142</td></tr><tr><td>Figure 38. Survie des souches lyophilisées</td><td>144</td></tr><tr><td>Figure 39. Test d'activité croisée en spots</td><td>145</td></tr><tr><td>Figure 40. Prédiction de la présence de gènes de bactériocines dans les génomes des souches de Lactobacillus salivarius</td><td>146</td></tr><tr><td>Figure 41. Gène putatif de l'entérolysine A dans les génomes des souches de Lactobacillus salivarius</td><td>147</td></tr><tr><td>Figure 42. Gènes potentiels codant la synthèse de la bactériocine LS2 dans les génomes de Lactobacillus salivarius</td><td>147</td></tr><tr><td>Figure 43. Lésions de l'entérite nécrotique</td><td>156</td></tr></table>
# Liste des Tableaux

<table><tr><td>Tableau 1. Pourcentage de réduction de l'administration d'antibiotiques aux volailles en France pour les années 2014-2015 versus 2011, selon l'ANSES, 2016.</td><td>6</td></tr><tr><td>Tableau 2. Pathologies aviaires et agents pathogènes.</td><td>13</td></tr><tr><td>Tableau 3. Typage de Clostridium perfringens en fonction des toxines produites</td><td>22</td></tr><tr><td>Tableau 4. Revue de certaines conditions prédisposantes testées dans les modèles expérimentaux d'entérite nécrotique</td><td>32</td></tr><tr><td>Tableau 5. Antibiotiques utilisés dans les élevages industriels pour traiter l'entérite nécrotique</td><td>33</td></tr><tr><td>Tableau 6. Antibiotiques utilisés dans l'élevage de volaille dans les états membres de l'OIE</td><td>38</td></tr><tr><td>Tableau 7. Exposition des volailles aux antibiotiques (Années 2014-2015 versus 2011)</td><td>44</td></tr><tr><td>Tableau 8. Probiotiques utilisés en productions animales</td><td>54</td></tr><tr><td>Tableau 9. Souches de Clostridium utilisées comme bactéries cibles</td><td>81</td></tr><tr><td>Tableau 10. Conditions de pHs et biles testées.</td><td>84</td></tr><tr><td>Tableau 11. Composition des régimes par ingrédients (g/100g)</td><td>95</td></tr><tr><td>Tableau 12. Composition approximative des régimes (g/100g)</td><td>96</td></tr><tr><td>Tableau 13. Expérimentation animale (essai in vivo)</td><td>97</td></tr><tr><td>Tableau 14. Dénombrements des bactéries lactiques (UFC/g) dans le caecum des 3 poulets.</td><td>100</td></tr><tr><td>Tableau 15. Etudes montrant les bactéries lactiques prédominant dans les caeca de poulets</td><td>107</td></tr><tr><td>Tableau 16. Activités anti-Clostridium perfringens DSM756 des bactéries lactiques.</td><td>109</td></tr><tr><td>Tableau 17. Activités anti-Clostridium perfringens ANSES Clin1.</td><td>110</td></tr><tr><td>Tableau 18. Amorces utilisées la recherche des gènes codant les bactériocines.</td><td>112</td></tr><tr><td>Tableau 19. Production d'acide lactique (g/L) par les souches isolées des caeca après incubation pendant 20 h dans le milieu MRS à 37°C.</td><td>117</td></tr><tr><td>Tableau 20. Formation de biofilms par les bactéries lactiques.</td><td>120</td></tr><tr><td>Tableau 21. Survie des levures (Actisaf) aux différents pHs.</td><td>123</td></tr><tr><td>Tableau 22. Survie des levures (Actisaf) à différents pourcentages (%) de bile</td><td>124</td></tr><tr><td>Tableau 23. Conditions expérimentales finales simulant le tractus gastro-intestinal du poulet.</td><td>125</td></tr><tr><td>Tableau 24. Survie des bactéries lactiques aux conditions gastro-intestinales du poulet.</td><td>125</td></tr><tr><td>Tableau 25. Halos d'activité produits par Lactobacilles contre Clostridium.</td><td>128</td></tr><tr><td>Tableau 26. Coagrégation des souches de Lactobacillus avec des agents pathogènes</td><td>131</td></tr><tr><td>Tableau 27. Survie des bactéries pathogènes et coagrégation avec les souches de lactobacilles</td><td>134</td></tr><tr><td>Tableau 28. Sensibilités des souches lactobacilles aux antibiotiques</td><td>140</td></tr><tr><td>Tableau 29. Effet du processus de lyophilisation selon des cryoprotecteurs.</td><td>143</td></tr><tr><td>Tableau 30. Survie bactérienne (%) après mises en suspensions aqueuses.</td><td>144</td></tr><tr><td>Tableau 31. Données génétiques des souches de lactobacilles sélectionnées.</td><td>146</td></tr><tr><td>Tableau 32. Conditions testées in vivo (expérimentation animale).</td><td>152</td></tr><tr><td>Tableau 33. Effets sur le poids vif des poulets, la consommation alimentaire et la FCR (Feed Conversion Ratio) après supplémentation des Lactobacillus.</td><td>153</td></tr></table>
<table><tr><td>Tableau 34. Lésions intestinales. Pourcentages de mortalité, poids des animaux, FCR trouvés au 17ème jour de l'essai.</td><td>157</td></tr></table>
## Abréviations

<table><tr><td>Abs</td><td>Absorbance</td></tr><tr><td>ADN</td><td>Acide DésoxyriboNucléique</td></tr><tr><td>ADNr</td><td>ADN ribosomique</td></tr><tr><td>AGP</td><td>Antibiotics Growth Promoters</td></tr><tr><td>ALEA</td><td>Animal Level of Exposure to Antimicrobials</td></tr><tr><td>ANOVA</td><td>Analysis of Variance</td></tr><tr><td>APF</td><td>Promoteurs de l'agrégation</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>American Type Culture Collection</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Adenosine TriPhosphate</td></tr><tr><td>B.</td><td>Bacillus</td></tr><tr><td>Bifido.</td><td>Bifidobacterium</td></tr><tr><td>BHI</td><td>Brain Heart Infusion</td></tr><tr><td>BSH</td><td>Bile Salt Hydrolase</td></tr><tr><td>BTS</td><td>Bacterial Test Standard</td></tr><tr><td>C.</td><td>Clostridium</td></tr><tr><td>CGE</td><td>Center for Genomic Epidemiology</td></tr><tr><td>CPE</td><td>Clostridium perfringens Enterotoxin</td></tr><tr><td>CPF</td><td>Promoteurs de coagrégation</td></tr><tr><td>CRISPR</td><td>Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats</td></tr><tr><td>Ct</td><td>threshold cycle</td></tr><tr><td>db</td><td>double brin</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Désoxyribonucléotides</td></tr><tr><td>DO</td><td>Densité Optique</td></tr><tr><td>DON</td><td>Déoxynivalénol</td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Escherichia coli</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ethylen Diamine TetrAcetate</td></tr><tr><td>EEE</td><td>Espace Economique Européen</td></tr><tr><td>EFSA</td><td>European Food Safety Authority</td></tr><tr><td>Ent.</td><td>Enterococcus</td></tr></table>
<table>
   <tr>
    <td>ERV</td>
    <td>Entérocoques résistants à la vancomycine</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>EUCAST</td>
    <td>European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>FAO</td>
    <td>Food and Agriculture Organization</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>FB</td>
    <td>Fumonisines</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>FCR</td>
    <td>Feed Conversion Ratio</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>FOS</td>
    <td>Fructo-OligoSaccharides</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Gld</td>
    <td>Glycérol déshydratasse</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>GLEAM</td>
    <td>Global Livestock Environmental Assessment Model</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>GOS</td>
    <td>Galacto-OligoSaccharides</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>GRAS</td>
    <td>Generally Recognized As Safe</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>HCCA</td>
    <td>A-Cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>HPLC</td>
    <td>Chromatographie Liquide Haute Performance</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>HSP</td>
    <td>Heat Shock Protein</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>IFN</td>
    <td>InterFéroN</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>IL</td>
    <td>InterLeukin</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>IR</td>
    <td>InfraRouge</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>LAMVAB</td>
    <td>Lactobacillus Anaerobic MRS with Vancomycin and Bromocresol green</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Lb.</td>
    <td>Lactobacillus</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Lc.</td>
    <td>Lactococcus</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>M.</td>
    <td>Mycobacterium</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MALDI-TOF</td>
    <td>Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, Time of Flight</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MATE</td>
    <td>Multidrug And Toxic Compound Extrusion</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MOI</td>
    <td>Multiplicity of Infection</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MRS</td>
    <td>de Man Rogosa et Sharpe</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Mt</td>
    <td>Million de tonnes</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>m/z</td>
    <td>masse moléculaire / charge de l'ion</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NetB</td>
    <td>Necrotic Enteritis B-like Toxin</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NGS</td>
    <td>Next-Generation Sequencing</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NSP</td>
    <td>Non-Starch Polysaccharides</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>OCDE</td>
    <td>Organisation de Coopération et de Développement Economiques</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>OIE</td>
    <td>Organisation mondiale de la santé animale</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>OMI</td>
    <td>Isomaltooligosaccharides</td>
   </tr>
  </table>
<table><tr><td>OMS</td><td>Organisation Mondiale de la Santé</td></tr><tr><td>OTUs</td><td>Operational Taxonomic Units</td></tr><tr><td>PAM</td><td>Peptides AntiMicrobiens</td></tr><tr><td>pb</td><td>paire de base</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Phosphate Buffer Saline</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Polymerase Chain Reaction</td></tr><tr><td>Ped.</td><td>Pediococcus</td></tr><tr><td>ppm</td><td>partie par million</td></tr><tr><td>p/p</td><td>poids/poids</td></tr><tr><td>p/v</td><td>poids/volume</td></tr><tr><td>qPCR</td><td>PCR quantitative</td></tr><tr><td>QPS</td><td>Qualified Presumption of Safety</td></tr><tr><td>QS</td><td>Quorum Sensing</td></tr><tr><td>RAPD</td><td>Random Amplified Polymorphic DNA</td></tr><tr><td>RAST</td><td>Rapid Annotation using Subsystem Technology</td></tr><tr><td>S.</td><td>Salmonella</td></tr><tr><td>SARM</td><td>Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline</td></tr><tr><td>spp.</td><td>Espèce</td></tr><tr><td>Strep.</td><td>Streptococcus</td></tr><tr><td>SVF</td><td>Sérum de Veau Fœtal</td></tr><tr><td>Sch.</td><td>Saccharomyces</td></tr><tr><td>TLR2</td><td>Toll-like receptor 2</td></tr><tr><td>TNF</td><td>Tumor Necrosis Factor</td></tr><tr><td>UCP</td><td>Unité de Correction de la Population</td></tr><tr><td>UE</td><td>Union Européenne</td></tr><tr><td>UFC</td><td>Unité Formant Colonie</td></tr><tr><td>UV</td><td>Ultraviolet</td></tr><tr><td>VBNC</td><td>Cellules Viables mais Non Cultivables</td></tr><tr><td>v/v</td><td>volume/ volume</td></tr><tr><td>XOS</td><td>XyloOligoSaccharides</td></tr><tr><td>ZO</td><td>protéines de jonction serrée Zonula Occludens</td></tr><tr><td>6-PG/PK</td><td>6-PhosphoGluconate/PhosphoKétolase</td></tr></table>
# Introduction Générale
L'utilisation des antibiotiques comme facteurs de croissance dans les élevages industriels est un sujet controversé et ce depuis plusieurs années. En effet, de plus en plus de pays dans le monde légifèrent dans le sens de leur interdiction comme facteurs de croissance. Depuis 2006, les pays de l'Union Européenne (règlement 1831/2003/CE) puis le Mexique, la Nouvelle-Zélande et la Corée du Sud ont adopté des lois interdisant l'utilisation des antibiotiques de manière préventive dans les élevages (Laxminarayan et al., 2015). Les raisons de cette interdiction sont liées au développement de l'antibiorésistance, un phénomène de plus en plus inquiétant qui est essentiellement attribué à l'utilisation abusive des antibiotiques dans le secteur de l'élevage. Selon une étude britannique, si rien n'est fait pour endiguer ce phénomène, en 2050 les infections dues à des pathogènes résistant aux antibiotiques seront la première cause de mortalité au Royaume-Uni, devançant ainsi les décès causés par d'autres maladies comme le cancer (O'Neill, 2014). La prise de conscience vis-à-vis de cette problématique sociétale, a poussé les organisations internationales de santé, telles que l'OMS, la FAO et l'OIE, à appeler à la recherche d'alternatives viables pour diminuer l'utilisation abusive des antibiotiques. Pour aider à faire face à la problématique de l'antibiorésistance, un concept majeur appelé *One Health* a été proposé. Ce concept vise une meilleure gestion des antibiotiques, et une meilleure appréhension de l'antibiorésistance dans les domaines de la santé humaine et animale mais aussi dans l'environnement et l'industrie agro-alimentaire. L'usage abusif des antibiotiques a participé à la dissémination des antibiotiques dans l'environnement, rendant possible les interactions avec des bactéries pathogènes. Dans la nature, ces interactions entre bactéries environnementales et résidus d'antibiotiques, peuvent se traduire par l'acquisition et le développement de nouveaux mécanismes de résistance transmissibles horizontalement et donc difficilement contrôlables (Patz et Hahn, 2013). Le concept *One Health* ne vise pas seulement des solutions à l'antibiorésistance liées à la santé humaine, mais aussi le contrôle d'une façon transversale (Patz et Hahn, 2013).

La production mondiale de viande d'élevage devrait augmenter de près de 40 Mt entre 2016 et 2026. Cette croissance principalement liée à la production de viande de volailles, devrait passer de 117 Mt à 132 Mt, soit une augmentation de 13%. Concernant la viande de porc, celle-ci passera de 116 Mt à 128 Mt, soit une augmentation de 10%. La production de viande de bœuf, de veau et de mouton devrait augmenter selon le rapport conjoint de l'OCDE/FAO (2017). L'augmentation de la production de viande dans la prochaine décennie serait cependant plus lente dans les pays développés, avec une augmentation de 6%, mais serait plus marquée dans les pays en voie de
développement, avec une augmentation de 21%, selon un rapport conjoint de l'OCDE et FAO (2018).

La production de viande de volaille représente la principale filière dans l'industrie des produits carnés. Ceci s'explique par son coût de production plus faible comparativement à celui des viandes rouges, notamment en raison du temps de production et des frais liés à l'alimentation du bétail (OECD/FAO, 2017). Selon un rapport récent OCDE/FAO (2018), le niveau de consommation de viande de volaille a augmenté au niveau mondial durant les 5 dernières années et est estimé juste pour l'année 2018 à 119.208,2 kilotonnes (OCDE/FAO, 2018). La viande de volaille est une source de protéines de haute qualité, de faible teneur en matières grasses et contenant majoritairement des acides gras insaturés (http://www.fao.org/poultry-production-products/products/products-processing/en/).

Parmi les germes problématiques dans la filière aviaire, on retrouve *Clostridium perfringens*, une bactérie à Gram-positif (Figure 1), appartenant à la famille des *Clostridiaceae* de l'ordre des *Clostridia*. Cette bactérie sporulée, anaérobie stricte mais aérotolérante, produit différentes toxines dont NetB (Drider et Salvat, 2015).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.** Observation au microscope optique de *Clostridium perfringens* après coloration différentielle de Gram (ANSES, 2010)</figcaption></figure>

*Clostridium perfringens* est un agent pathogène ubiquitaire pouvant infecter aussi bien l'Homme que les animaux. Il impacte fortement les élevages de volaille où il est responsable de l'entérite nécrotique, une infection caractérisée par des nécroses et une inflammation du tractus gastro-intestinal (Figure 2). L'infection est accompagnée plus généralement d'une diminution
significative de la croissance des individus dans les élevages touchés et d'une mortalité élevée
(M'Sadeq et al., 2015)

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2.** Segments d'intestins de poulets Panel A) échantillons non infectés, Panel B) échantillons infectés par *C. perfringens*, et illustrations des lésions et dommages (Shojadoost et al., 2012).</figcaption></figure>

Les lésions produites dans le cas d'une entérite nécrotique sont dues à la capacité de certaines
souches de *C. perfringens* à sécréter la toxine NetB et la toxine de type alpha (**Keyburn et al., 2008; Rood et al., 2018**). La toxine NetB est le principal facteur de virulence lié à l'entérite nécrotique aviaire. Cette toxine est responsable de la destruction de la *lamina propria*, de la matrice extracellulaire et des jonctions intercellulaires (**Navarro et al., 2018; Rood et al., 2016**). La toxine alpha est une métalloenzyme à Zinc ayant une activité hémolytique et dermonécrotique (**Sakurai et al., 2004**). Elle est responsable de la dégradation extensive de la membrane plasmatique accompagnée par une libération de la lactate déshydrogénase qui caractérise la nécrose (**Navarro et al., 2018**). Les souches de *Clostridium* sont généralement classées en plusieurs biotypes (A, B...), selon les toxines qu'elles produisent. Les souches produisant les toxines NetB et la toxine de type alpha sont actuellement incluses dans le tout nouveau type G (**Navarro et al., 2018**). En plus de la virulence des souches de *C. perfringens*, des facteurs de prédisposition sont nécessaires pour induire la maladie, parmi lesquels la coccidiose, la présence de mycotoxines, les agents d'immunosuppression, les facteurs nutritionnels ou les facteurs anthropiques de management des élevages (**Shojadoost et al., 2012**).

L'entérite nécrotique à *C. perfringens* se développe sous plusieurs formes, clinique ou subclinique. Les symptômes cliniques sont caractérisés par une relative immobilité des oiseaux, une dépression, une anorexie, l'apparition de diarrhée et une diminution de l'appétit. Un autre signe caractéristique est la litière humide (**Paiva et McElroy, 2014; Williams, 2005**). En ce qui concerne la forme subclinique, il n'y a pas de pic de mortalité, ni de signes cliniques apparents (**Timbermont**
et al., 2011). Cette forme génère plus de pertes économiques à cause de son caractère silencieux et, par conséquent, l'impossibilité de détecter des manifestations typiques de l'infection (M'Sadeq et al., 2015). Les antibiotiques utilisés pour traiter l'entérite nécrotique sont la pénicilline, le lincosamide, l'amoxicilline, l'ampicilline, la narasine et les ionophores (Landoni et Albarellos, 2015; Marshall et Levy, 2011). Avant leur interdiction dans les élevages, certains antibiotiques comme la virginiamycine, l'avilamycine, l'avoparcine, la bacitracine, la bambermycine, l'érythromycine, le lasalocide, la néomycine, l'oléandomycine, l'ormetoprime, la procaïne pénicilline, la roxarsone et les tétracyclines ont été utilisés comme facteurs de croissance pour promouvoir la croissance des poulets (Marshall et Levy, 2011).

Ainsi en 2016 en France, le volume total moyen des ventes d'antibiotiques à destination du secteur de la volaille était de l'ordre de 139 tonnes. L'indicateur ALEA permettant d'évaluer l'exposition des animaux aux antibiotiques, appliqué depuis 1999, semble décliner annuellement en raison de la mise en place du plan ECOANTIBIO (plan national de réduction des risques d'antibiorésistance en médecine vétérinaire). En France, les valeurs obtenues en 2016, ont montré une baisse de 20,5 % par rapport à la moyenne des deux années précédentes (2014 et 2015).

D'après les données ALEA, sur ces deux dernières années, les volailles ont été traitées majoritairement avec des polypeptides, des tétracyclines, des pénicillines, et de façon moindre avec des sulfamides et du triméthoprime (ANSES, 2016) (Tableau 1). Malgré l'arsenal thérapeutique disponible, les pertes économiques dues à l'entérite nécrotique, dans le monde, sont estimées à 6 milliards de dollars (Wade et Keyburn, 2015) et l'interdiction de l'utilisation des antibiotiques en prophylaxie dans la filière a augmenté la fréquence des épisodes épidémiques dus à C. perfringens (Caly et al., 2015).

Pour faire face à cette situation, la recherche d'alternatives aux antibiotiques est devenue, depuis quelques années, une nécessité absolue et représente un défi majeur pour le secteur de l'élevage. Actuellement, plusieurs alternatives sont considérées pour leur efficacité et leur faisabilité, et ce afin de réduire l'utilisation des antibiotiques dans ce secteur. Ces alternatives incluent l'utilisation des probiotiques d'origines fongique ou bactérienne. Les probiotiques sont, selon l'OMS/FAO, des microorganismes vivants apportant des bénéfices à la santé de l'hôte lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates/suffisantes (FAO/OMS, 2002).
<table><caption>**Tableau 1.** Pourcentage de réduction de l'administration d'antibiotiques aux volailles en France pour les années 2014-2015 versus 2011, selon l'ANSES, 2016.</caption><thead><tr><td></td><td>% réduction</td></tr></thead><tbody><tr><td>Aminoglycosides</td><td>54,44</td></tr><tr><td>Fluoroquinolones</td><td>29,73</td></tr><tr><td>Lincosamides</td><td>94,15</td></tr><tr><td>Macrolides</td><td>18,65</td></tr><tr><td>Pénicillines</td><td>9,4</td></tr><tr><td>Pleuromutilines</td><td>74,28</td></tr><tr><td>Polypeptides</td><td>17,3</td></tr><tr><td>Quinolones</td><td>32,03</td></tr><tr><td>Sulfamides</td><td>16,88</td></tr><tr><td>Tétracyclines</td><td>31,96</td></tr><tr><td>Triméthoprime</td><td>17,96</td></tr><tr><td><strong>Total</strong></td><td><strong>22,05</strong></td></tr></tbody></table>

Les bactéries lactiques font partie du microbiote normal du poulet et produisent des substances antimicrobiennes comme les acides organiques, les bactériocines, le peroxyde d'hydrogène, l'éthanol ou le CO₂... (Pessione, 2012). Elles peuvent également entrer en compétition avec les autres microorganismes, induisant le contrôle des agents pathogènes par un mécanisme dit d'exclusion compétitive (Callaway et al., 2008). Certaines de ces bactéries lactiques agissent sur le système immunitaire (immuno-stimulation) de l'hôte et induisent la production de cytokines de type IL-6 (Kiczorowska et al., 2017). Elles augmentent la biodisponibilité de certains nutriments utilisés par les cellules épithéliales intestinales (Liao et Nyachoti, 2017; Russo et al., 2014; Sharifuzzaman et Austin, 2017), ou peuvent stimuler la production de mucus par les cellules intestinales (Ljung et Wadström, 2006; Park et al., 2016).

L'usage des probiotiques ne vise pas uniquement une application comme facteurs de croissance, il vise aussi à répondre aux attentes du consommateur, qui est de plus en plus sensibilisé aux questions liées aux conditions d'élevage des animaux et à l'usage des antibiotiques dans cette industrie.

L'objectif de ce travail est de sélectionner des souches de bactéries lactiques dotées d'activités anti-C. perfringens et présentant des qualités probiotiques en vue de leur éventuelle application dans les élevages de volaille. Cette étude vise, donc, à isoler et caractériser de nouvelles souches
de bactéries lactiques qui pourront être utilisées pour contrôler l'entérite nécrotique causée par *C. perfringens* et être également utilisées comme facteurs de croissance dans les élevages de volailles.

Dans ces perspectives, nous avons isolé de nouvelles souches de bactéries lactiques, à partir de caeca de poulets élevés dans la région des Hauts-de-France. Les souches ont été isolées sur des milieux favorables aux bactéries lactiques comme les milieux MRS, (de Man et al., 1960), LAMVAB (Hartemink et al., 1997), ou encore Elliker (Elliker et al., 1956). Les souches isolées ont été identifiées par la technique de spectrométrie de masse et les doublons ont été écartés parmi les souches par une approche de biologie moléculaire dite RAPD-PCR. Elles ont ensuite été testées pour leur activité antagoniste, particulièrement contre *C. perfringens*.

Une fois l'activité antagoniste démontrée, la recherche des molécules impliquées dans cet antagonisme, puis une première caractérisation du potentiel probiotique de ces souches antagonistes ont été réalisées. Le potentiel probiotique inclut des critères spécifiques comme la capacité à former des biofilms, à l'instar de ceux formés par des agents pathogènes. Ce premier test a permis une première sélection et un classement des souches isolées. Des tests additionnels, toujours en lien avec la caractérisation des probiotiques, ont été réalisés sur ces souches; il s'agissait notamment d'étudier la résistance aux conditions mimant l'environnement gastro-intestinal du poulet, l'évaluation de leur innocuité dénotée par l'absence de certains effets adverses comme leur activité hémolytique, la cytotoxicité, et la résistance aux antibiotiques. Les souches ont également été étudiées pour leurs capacités d'agrégation et d'adhésion aux cellules eucaryotes, Caco-2 et HT-29, d'origine intestinale.

Lors de notre approche expérimentale, nous avons utilisé plusieurs techniques de microbiologie classique et de biologie moléculaire (PCR, qPCR et cytométrie en flux) afin de mieux aboutir dans nos résultats et compléter la caractérisation de nos souches. Cela nous a permis de sélectionner trois souches d'intérêt : deux souches de *Lactobacillus salivarius* (Lb. salivarius ICVB421 et Lb. salivarius ICVB430) et une souche de *Lactobacillus reuteri* (Lb. reuteri ICVB416).

Les capacités antagonistes de ces souches et leur potentiel probiotique pour une application contre l'entérite nécrotique ou pour le bien-être des animaux ont été évaluées *in vivo*.
# Revue Bibliographique
# I. La filière aviaire

La volaille domestiquée peut être élevée pour la production d'œufs, viande à destination de la consommation humaine ou pour la production de plumes. Le terme "volaille" couvre un large éventail d'oiseaux, allant des races de poules indigènes et commerciales aux canards de Barbarie, canards colverts, dindes, pintades, oies, cailles, pigeons, autruches ou faisans.

## I.1. La production mondiale de volaille

En 2017, la production mondiale de viande a augmenté de 1,25% pour atteindre 323 Mt et elle devrait progresser encore de près de 15% à l'horizon 2027, afin d'atteindre près de 371 Mt (OECD/FAO, 2018a). La croissance de la demande en produits carnés est principalement due à la croissance démographique, à l'urbanisation et à la hausse des revenus dans les pays en développement (Figure 3).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3.** Evolution de la production mondiale des différents types de viandes de 2015 à 2017 (FAO, 2018).</figcaption></figure>
Dans certains pays en développement, la croissance de la production est soutenue par l'augmentation de la productivité. Ainsi le poids des carcasses est plus élevé par unité de bétail et l'efficacité du rendement de l'utilisation des aliments pour animaux ne cesse de s'améliorer. (OECD/FAO, 2018a). A l'horizon 2027, les pays en développement représenteront 76% de l'augmentation de la production de viande, alors que les pays développés n'en représenteront que 24% (Figure 4). Parmi tous les types de viandes, la production de la volaille enregistre la plus forte expansion dans les pays en développement. La production mondiale de viande continue d'être dominée par le Brésil, la Chine, l'Union européenne, la Fédération de Russie et les États-Unis (OECD/FAO, 2018a).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4.** Production de viandes par région et par type de viande. Augmentation estimée en 2027 par rapport à 2015-2017. Le taux est mesuré par millions de tonnes de viande équivalent prêt à cuire (OECD/FAO, 2018a).</figcaption></figure>

Pour la période 2015-2030 (http://www.fao.org/docrep/005/y4252e/y4252e05b.htm); la production la plus importante sera celle de la viande de poulet (2,4%), suivie par les viandes ovine et bovine (1,8 et 1,2 % respectivement); alors que la viande de porc enregistre uniquement 0,8% d'augmentation. La consommation de viande de poulet a augmenté légèrement ces dernières années et les projections laissent à croire à la continuité de cette tendance. Selon un rapport de l'OCDE, la consommation de viande de volaille est estimée pour l'année 2018 à 119,2 Mt, et les Etats-Unis restent le plus grand pays consommateur avec 48,83 Kg de viande per capita (Figure 5).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 5.** Consommation de viande de poulet entre 1990 et 2026 pour différents pays (Kg/capita). Source : OECD-FAO Agricultural Outlook (**Edition 2017**).</figcaption></figure>

Le poulet reste dominant parmi les autres types de produits carnés consommés car il est économiquement abordable et disponible. Il n'est associé à aucun tabou religieux ou culturel, le contenu en graisses est faible et offre un meilleur apport protéique par rapport aux autres types de viandes (De Castro Cardoso et al., 2013; Farrell, 2012; Mottet et Tempio, 2017). Le poulet et les œufs contiennent des protéines de haute qualité, de plus, on y trouve des vitamines et des minéraux importants pour la croissance et l'organisme humain (Farrell, 2012). Les œufs, en particulier, contiennent 13 vitamines et minéraux essentiels, et des protéines pour environ 70 calories par œuf (Mottet et Tempio, 2017). Les volailles sont bien adaptées à l'intensification de production en raison de leur taux de conversion élevés et de leur taux de reproduction rapide à faibles coûts (OECD/FAO, 2017). Au niveau environnemental, la volaille consomme le moins d'eau par kg de croissance que les autres espèces (Mekonnen et Hoekstra, 2012). Tous ces paramètres font de la volaille la principale source mondiale de protéines animales, suivie par le porc, ces dernières années. La viande de poulet est la viande de volaille la plus consommée, suivie de celles des dindes et des canards (Figure 6). Les poules fournissent près de 92% de la production mondiale d'œufs. Selon les régions du globe, la proportion d'œufs produits par les espèces de volaille autres que le poulet représente 13% des œufs en Asie, 1% sur le continent américain (avec 3% en Amérique latine), 0,6% en Océanie et 0,9% en Europe, alors qu'en Afrique elle est
pratiquement inexistante (http://www.fao.org/poultry-production-products/production/poultry-species/en). Les estimations du GLEAM viennent de révéler que la production mondiale d'œufs est d'environ 73 Mt (GLEAM2.0., 2018).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 6.** Panel A) Distribution de la production de la viande de volaille dans le monde. Panel B) Distribution de la production totale de viande de poulet en 2016 dans le monde (données exprimées en pourcentages). Source : FAOSTAT (http://www.fao.org/faostat/en/#data/QL (Aout 2018).</figcaption></figure>

Depuis le début des années 60, la consommation mondiale de viande de volaille a été multipliée par cinq. La plus forte croissance a eu lieu en Asie et en Amérique latine. La volaille est particulièrement importante pour les petits exploitants et les communautés rurales et urbaines pauvres. Elle est principalement produite dans le cadre d'opérations intensives à grande échelle, ce qui en fait l'un des sous-secteurs agricoles à la croissance la plus rapide (Mottet et Tempio, 2017).

Entre 2000 et 2030, la demande de viande de volaille par habitant devrait augmenter de 271% en Asie du Sud, de 116% en Europe orientale et en Asie centrale, de 97% au Moyen-Orient et en Afrique du Nord et de 91% en Asie orientale et dans le Pacifique (http://www.fao.org/poultry-production-products/products-processing/en/).
## I.2. Les maladies zoonotiques et aviaires

L'industrie mondiale de la volaille est devenue un secteur générant des profits importants dont le succès est intimement lié à la santé des animaux et plus précisément aux tractus gastro-intestinaux sains, qui assurent la conversion efficace des aliments. Le tractus gastro-intestinal de volaille est exposé à plusieurs types d'infections, celles-ci peuvent être catégorisées en fonction de l'agent pathogène incriminé. Ces infections peuvent être d'origines bactérienne, fongique, virale ou parasitaire (Tableau 2).

<table><caption>**Tableau 2.** Pathologies aviaires et agents pathogènes
(http://www.fao.org/ag/againinfo/programmes/en/empres/gemp/avis/cards.html)</caption><thead><tr><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Bactériennes</strong></td><td></td></tr><tr><td>- <em>Escherichia coli</em></td><td>- Bordetella,</td></tr><tr><td>- <em>Salmonella</em></td><td>- Avibacterium</td></tr><tr><td>- <em>Chlamydophila</em></td><td>- Yersenia pseudotuberculosis,</td></tr><tr><td>- <em>Clostridium</em></td><td>- Riemerella anatipestifer,</td></tr><tr><td>- <em>Campylobacter</em></td><td>- Staphylococcus,</td></tr><tr><td>- <em>Mycobacterium</em></td><td>- Streptococcus,</td></tr><tr><td>- <em>Mycoplasma</em></td><td>- Coxiella,</td></tr><tr><td>- <em>Pasteurella multocida</em></td><td>- Pseudomonas</td></tr><tr><td>- <em>Ornithobacterium rhinotracheale</em></td><td>- Autres</td></tr><tr><td>- <em>Erysipelas</em></td><td></td></tr><tr><td><strong>Fongiques</strong></td><td></td></tr><tr><td>- <em>Aspergillus</em></td><td>- Cryptococcus</td></tr><tr><td>- <em>Candida</em></td><td>- Macrorhabdus ornithogaster</td></tr><tr><td>- <em>Microsporum gallinae</em></td><td>- Autres</td></tr><tr><td>- <em>Ochroconis</em> (ou <em>Dactylariosis</em>)</td><td></td></tr><tr><td><strong>Virales</strong></td><td></td></tr><tr><td>- Herpes Virus</td><td>- Retrovirus de la leucose aviaire du sarcome</td></tr><tr><td>- Laryngotrachéite infectieuse aviaire</td><td>- Birnavirus (Bursite infectieux (IBD))</td></tr><tr><td>- Maladie de Marek</td><td>- Metapneumovirus aviaire</td></tr><tr><td>- Entérite Virale du canard (DVE)</td><td>- Poxvirus aviaire</td></tr><tr><td>- Coronavirus (Bronchite infectieuse Aviaire)</td><td>- Circovirus (Anémia infectieuse du poulet (CIAV))</td></tr><tr><td>- Paramyxovirus aviaires (Maladie de Newcastle)</td><td>- Parvovirus</td></tr><tr><td>- Virus de l'influenza (ex. H5N1 (grippe aviaire))</td><td>- Reovirus aviaires</td></tr><tr><td>- Enterovirus</td><td>- Adénovirus aviaires</td></tr><tr><td></td><td>- Papovavirus</td></tr></tbody></table>
- Encephalomyelite aviaire

- Hépatite virale du canard (DVH)

- Astrovirus

- Autres

## Parasitaires

- par Protozoïde

- *Eimeria* (Coccidioses)

- *Atoxoplasma*

- *Histomonas*

- *Cryptosporidium*

- *Sarcocystis*

- *Toxoplasma*

- *Microsporidia*

- *Trichomonas*

- *Leucocytozoon*

- *Plasmodium* (Malaria aviaire)

- par nématodes

- *Ascaris*

- *Capillariasis*

- *Setaria*

- *Syngamus*

- *Hétérakis*

- Nématodes du proventricule et gésier

- Cestodes

- Trématodes

- Arthropodes (acariens, poux, puces, tiques)

Les infections bactériennes les plus courantes chez les oiseaux sont les infections à *Escherichia coli*, salmonelloses, l'entérite nécrotique (*C. perfringens*), les infections à *Mycoplasma*, le choléra aviaire, la dermatite gangréneuse et la tuberculose aviaire.

### I.2.1. Les zoonoses

#### a) Les zoonoses virales

Les maladies zoonotiques représentent une problématique majeure de santé publique. Une zoonose est une maladie infectieuse ou parasitaire transmise d'un animal vertébré (chien, vache, poule, cochon...) à l'Homme. En général, les humains peuvent contracter ces maladies de deux manières, soit à partir des oiseaux vivants ou par exposition ou consommation de viande ou de produits à base d'œufs provenant d'oiseaux infectés. Les salmonelloses, les campylobactérioses, la grippe aviaire (H5N1) sont les infections le plus fréquemment transmises par la volaille (Dale et Brown, 2013). La grippe aviaire est considérée comme la pathologie la plus importante. En effet, les virus de type A de la famille des *Orthomyxoviridae* représentent la majorité des agents responsables des grippes humaines, mais aussi celles touchant les animaux domestiques, y compris les oiseaux (Lee et Saif, 2009). Le virus grippal de type A présente deux types de protéines de
surface, l'hémagglutinine (H) et la neuraminidase (N), qui régissent le cycle de vie viral depuis l'entrée jusqu'à la libération des virions (Alexander et Capua, 2008; Chen et al., 2013). La virulence du virus en termes de capacité de propagation et la sévérité des symptômes dépend du type de protéines H et N présentes. Les virus hautement pathogènes appartiennent aux sous-types H5 ou H7. La volaille infectée meurt rapidement, souvent dans les 48 à 72 h suivant l'infection. La pathogenèse implique une infection des capillaires sanguins avec un œdème et une hémorragie résultante touchant de multiples zones, rapidement suivies d'une défaillance de plusieurs organes. Le système respiratoire, digestif et/ou nerveux de nombreuses espèces d'oiseaux est également affecté. Les oiseaux infectés excrètent le virus dans les matières fécales et les décharges oculonasales. Les virus qui sont capables de se transmettre aux humains sont le H5N1, le H7N2, le H7N3, le H7N7, le H9N2, le H7N9 et le H10N7 (Chen et al., 2013).

Outre les virus grippaux, la maladie la plus dévastatrice de la volaille rurale est la maladie de Newcastle (Alexander, 2000; Awan et al., 1994). Cette maladie est épidémique, causée par des formes virulentes du paramyxovirus, chez la volaille et peut causer des pertes économiques importantes (Alexander, 2001). Cette maladie a un potentiel zoonotique mais demeure beaucoup moins grave chez l'Homme que l'influenza aviaire. Le virus ne représente pas une menace importante ou grave pour la santé humaine. Les infections cliniques chez l'homme résultent généralement d'une exposition à des concentrations de virus particulièrement élevées (Iowa State University, 2016).

## b) Les zoonoses bactériennes

La tuberculose aviaire est causée par *Mycobacterium avium* et moins fréquemment par *M. genavense*. Ces bactéries se propagent par voies fécale et orale (fécale-orale), lorsque des oiseaux infectés contaminent l'environnement. C'est une maladie importante affectant les oiseaux et les mammifères. Le tableau clinique se caractérise par une faiblesse chronique et progressive. La diarrhée est fréquente et certains oiseaux peuvent présenter des signes de faiblesses respiratoires et la mort subite reste occasionnelle (OIE, 2014). Chez l'Homme, l'infection par *M. avium* se développe principalement chez les patients immunodéprimés et reste extrêmement rare chez les individus immunocompétents (Dale et Brown, 2013).

Par ailleurs, les infections causées par *Campylobacter* et *Salmonella* sont des causes majeures de maladies d'origine alimentaire et sont principalement associées à la consommation de volaille
insuffisamment cuite et/ou à la consommation de produits contaminés par la viande de volaille crue (Grant et al., 2016).

Les *Campylobacter* spp. sont des organismes commensaux colonisant l'intestin des bovins, moutons, porcs et oiseaux, cependant, les volailles sont les hôtes les plus communs (Grant et al., 2016; Silva et al., 2011). Les oiseaux sont naturellement infectés par transmission horizontale (voie fécale-orale). Les *Campylobacter* s'établissent dans le tractus intestinal avec une charge bactérienne élevée dans le caeca (Awad et al., 2018). Dans les élevages, les bactéries se propagent rapidement, infectant plus de 90% des oiseaux en 2 semaines. L'omniprésence des bactéries dans l'environnement rend l'éradication et la prévention de l'infection à la ferme pratiquement impossibles (Dale et Brown, 2013).

*Campylobacter jejuni* et *Campylobacter coli* sont deux espèces thermotolérantes et responsables de campylobactérioses chez l'Homme, provoquant des diarrhées et parfois des atteintes plus importantes. Le plus souvent chez l'Homme; il s'agit de *Campylobacter jejuni* (Dale et Brown, 2013; Kaakoush et al., 2015). Les principales voies d'exposition sont les aliments (en particulier la viande de poulet, la contamination croisée accidentelle de la volaille crue par des aliments prêts à consommer) et le contact direct avec les animaux (Dale et Brown, 2013; Grant et al., 2016). La contamination de la viande résulte d'une mauvaise manipulation dans les abattoirs, où la transmission se fait par les fuites du tractus intestinal souillant la peau et la carcasse (Silva et al., 2011). La campylobactériose est la maladie gastro-intestinale la plus fréquemment enregistrée en Europe depuis 2005 et reste selon ECDC (2016) en augmentation constante. Selon une étude relativement ancienne, la majorité des cas de campylobactériose (70%) sont liés à la consommation de viande de poulet (Allos, 2001). Ainsi, il a été montré que plusieurs organites et mécanismes incluant les flagelles, l'adhésion à la muqueuse intestinale, la production de toxines, la capacité invasive induisant l'augmentation de la perméabilité intestinale qui contribue à la translocation paracellulaire ou transcellulaire de la bactérie elle-même, sont associés donc à la pathogénicité de *Campylobacter* (Awad et al., 2018; Silva et al., 2011).

La symptomatologie apparaît 2 à 5 jours avec l'apparition de nausées, de douleurs abdominales, d'une diarrhée aqueuse ou sanglante et une fièvre occasionnelle pouvant durer de un jour à une semaine. Rarement, la maladie peut se propager dans le sang et entraîner des complications pouvant provoquer la mort (généralement chez les individus immunodéprimés) (Dale et Brown, 2013; Grant et al., 2016). Il est de plus en plus admis que l'infection à *Campylobacter jejuni* est un
important facteur de causalité pour le syndrome de Guillain–Barré, qui est la cause la plus fréquente de paralysie neuromusculaire aiguë (Rees et al., 1995). La production d'une réponse immunitaire contre l'infection à *Campylobacter jejuni* par la production des gangliosides génère une réaction croisée qui favorise le développement de la maladie (Giesecke et McCarthy, 2001).

La salmonellose est la deuxième infection gastro-intestinale en Europe, après les campylobactérioses (EFSA et ECDC, 2017). Il s'agit d'une cause importante d'épidémies d'origine alimentaire dans l'UE/EEE (ECDPC, 2016), voire dans le monde (Lamas et al., 2018). Elle est causée par plusieurs sérovars différents de *Salmonella enterica*, dont la plupart provoquent des maladies chez l'Homme (Dale et Brown, 2013). Les souches de *S. enterica* sont capables de produire chez l'homme un des quatre syndromes suivants: fièvre entérique (typhoïde), une entérocolite/diarrhée, une bactériémie et un portage asymptomatique chronique (Coburn et al., 2007). Les isolats cliniques humains les plus courants sont les sérotypes *Salmonella enterica* subsp. *enterica* Typhimurium et Enteritidis. Les sérovars de *Salmonella* non typhoïdiques sont une cause majeure de maladies d'origine alimentaire aiguë dans le monde entier (Santos et al., 2009). La plupart des sérovars infectent les poulets sans provoquer la maladie apparente. Certains sérovars, tels que Pullorum et Gallinarum, sont des pathogènes spécifiques des poulets mais ne sont pas infectieux chez l'homme (Dale et Brown, 2013).

Les infections causées par les salmonelles sont majoritairement d'origine alimentaire incriminant la consommation des produits aviaires (Roy et al., 2001). Cependant, les infections par contact avec des animaux incluant des volailles vivantes sont possibles (Gaffga et al., 2012). Les volailles peuvent être infectées par *Salmonella* après contact avec des oiseaux infectés ou par des aliments contaminés voire par transmission verticale de poules infectées, c'est-à-dire, la transmission poule-œuf (Roy et al., 2001). Le système reproducteur de la poule peut être infecté par *Salmonella* Enteritidis alors que la pondeuse ne présente aucun signe clinique. Les œufs et leurs contenus pourront être contaminés lors de leur formation dans l'ovaire ou après leur ponte (Howard et al., 2012). De la même façon, les carcasses peuvent être contaminées, si après l'abattage les matières provenant du tube digestif entrent en contact avec elles (Dale et Brown, 2013).

Dans le tractus gastro-intestinal humain, *Salmonella* pénètre dans les cellules épithéliales détruisant l'épithélium et engendre des ulcères et une diarrhée. Les symptômes apparaissent généralement 12 à 72 h après la consommation d'aliments contaminés et durent de 4 à 7 jours. Chez les humains immunocompétents, ils sont marqués par un début aigu, des crampes, des douleurs
abdominales et une diarrhée avec ou sans sang. Les nausées et les vomissements sont également fréquents (Coburn et al., 2007; Dale et Brown, 2013). Chez les individus immunodéprimées, la maladie peut évoluer en une infection sanguine invasive vers d'autres organes (septicémie) et peut avoir une issue fatale (Grant et al., 2016; Kariuki et al., 2015).

Coburn et al. (2007) estiment que l'incidence des salmonelles non typhoïdes dans le monde varie de 200 millions à 1,3 milliards. Ces estimations varient considérablement en raison du manque diagnostic et de rapports concordants. Dans l'UE/EEE le nombre de cas de salmonelloses déclarés continue de diminuer. Cette diminution est principalement attribuable à la mise en œuvre de programmes efficaces de lutte contre Salmonella, en particulier dans la production de volaille (ECDPC, 2016).

## I.2.2. Maladies aviaires

Il existe d'autres maladies étudiées en raison de leur intérêt économique pour la filière volaille. Celles-ci touchent directement les animaux et peuvent générer des pertes financières importantes, en raison du taux de mortalité élevé et de la faible efficacité alimentaire. *E. coli* et les clostridies sont considérés parmi les agents les plus importants des maladies entériques chez les volailles (Cooper et al., 2013).

### a) La colibacilloses

La colibacilloses est une maladie qui peut impacter tous les producteurs de volaille dans le monde. Elle se caractérise par une grande diversité de lésions chez la volaille (Dziva et Stevens, 2008). Il s'agit d'une maladie infectieuse systémique affectant une grande variété d'oiseaux (Porter, 1998). Elle est causée par certaines souches d'E. coli produisant des facteurs de virulence comme les adhésines (fimbriaires ou afimbriaires), la résistance au sérum et des toxines (comme VT2y ou « Escherichia coli vacuolating factor ») (Stordeur et Mainil, 2002). Les souches d'E. coli responsables de la colibacilloses sont des pathogènes extra-intestinaux, c'est-à-dire qu'elles ont la capacité de se déplacer à travers les muqueuses intestinales ou respiratoires (Dziva et Stevens, 2008; Porter, 1998). La principale voie d'entrée est le tractus respiratoire via l'inhalation de particules de poussière contaminées par des E. coli excrétées du tractus digestif d'animaux sains (Stordeur et Mainil, 2002). La contamination par ces bactéries constitue souvent des infections secondaires suite à une irritation des muqueuses respiratoires causée par des infections virales telle
la bronchite infectieuse à *Coronavirus*. Les bactéries diffusent dans le corps de l'animal par le sang entrainant une inflammation localisée dans plusieurs organes et en provoquant une septicémie pouvant entraîner la mort subite de l'animal (Dziva et Stevens, 2008).

b) Les entérites à clostridies

*Clostridia* vient du nom grecque « Klostro » qui signifie fuseau ou petite bobine car les bactéries prennent la forme d'allumette, de bâton de tambour ou de fuseau : ce sont des bacilles larges à extrémités carrés. Les bactéries de ce groupe sont classées dans le phylum des *Firmicutes*. Elles sont anaérobies, à Gram-positif et productrices de spores. Ubiquistes elles se retrouvent dans l'environnement et dans le tractus gastro-intestinal des animaux (Prescott et al., 2016). La plupart des espèces du genre *Clostridium* sont non pathogènes.

Beaucoup de ces espèces sont largement utilisées dans les fermentations industrielles par exemple, dans la synthèse de composés chimiques tels que l'acétate, le butyrate, le lactate, l'éthanol, le dioxyde de carbone ou les solvants (Cooper et al., 2013). Par fermentation de substrats, elles peuvent produire des biocarburants comme l'hydrogène. On peut noter également l'utilisation de C. beijerinckii pour fermenter les déchets alimentaires (Han et Shin, 2004; Kim and Austin, 2008). Les clostridies peuvent fermenter une large gamme de substrats – les glucides simples ou le glycérol et les polysaccharides complexes tels que les matériaux lignocellulosiques (Udaondo et al., 2017). Néanmoins, ils sont plus connus pour leur rôle pathogènes telles que C. botulinum, C. tetani, C. difficile, C. perfringens, C. novyi, C. septicum (Cooper et al., 2013).

D'un point de vue taxonomique, le genre *Clostridium* est très complexe et hétérogène (Udaondo et al., 2017). Initialement dans le genre *Clostridium* contenait toutes les bactéries en bâtonnets anaérobies à Gram-positif, capables de former des endospores. Après l'avènement des techniques moléculaires et l'étude des ADNr 16S, il a été proposé de créer différents clusters dans ce genre. Les vrais représentants du genre *Clostridium* proches de l'espèce type, *C. butyricum*, ont été regroupés dans le cluster I ou *Clostridium stricto sensu* (Collins et al., 1994; Gupta et Gao, 2009). Le genre *Clostridium* comprend actuellement 181 espèces décrites (Keto-Timonen et al., 2006) moins de la moitié fait partie du cluster I (Wiegel, J., Tanner, R., Rainey, 2006).

Outre l'entérite nécrotique causée par *C. perfringens*, qui se manifeste généralement chez les poulets de chair, que nous aborderons dans la section suivante, les clostridies provoquent plusieurs atteintes parmi lesquelles l'entérite ulcéreuse, causée par *C. colinum*. Elle constitue l'autre maladie
entérique clostridienne majeure de la volaille. Les autres infections entériques à *Clostridium* comprennent les infections causées par *C. difficile*, *C. septicum*, *C. fallax* et *C. baratii* (Cooper et al., 2013).

L'entérite ulcéreuse causée par *C. colinum*, est une maladie entérique hautement mortelle affectant principalement les cailles en captivité (Kondo et al., 1988). Cette infection été signalée chez d'autres oiseaux, notamment les poulets, les dindes et les faisans (Porter, 1998). Il faut noter que l'entérite ulcéreuse est très fréquemment observée chez les jeunes oiseaux (Cooper et al., 2013). La mortalité chez les poulets varie de 2% à 10%. Après l'infection orale, la bactérie adhère aux villosités intestinales, causant une inflammation et des ulcères dans l'intestin grêle et les caeca. *C. colinum* peut alors migrer vers le foie, produisant de petits foyers nécrotiques ou zones de nécrose hépatique et aussi splénique (Cooper et al., 2013; Porter, 1998). Les symptômes peuvent survenir sans signes ou avec une perte de poids. Une diarrhée aqueuse et blanchâtre initialement, puis sanglante quand la maladie est plus développée, survient au cours de l'infection. Les animaux présentent aussi une dépression, de l'apathie et des plumes à l'aspect ébouriffé. Des épidémies ponctuelles ont été décrites avec d'autres espèces comme *C. baratii* et *C. fallax* (Cooper et al., 2013).

*C. difficile* est une bactérie plutôt associée aux infections nosocomiales (infections liées aux soins hospitaliers) (Keessen et al., 2011). Elle est aussi un colonisateur de l'intestin et une cause possible de diarrhées chez les animaux destinés à l'alimentation (Gould et Limbago, 2010). Néanmoins, il n'est pas établi que les oiseaux infectés transmettent le pathogène aux humains même s'il est retrouvé dans un large pourcentage de viandes de consommation (2-15%) (Curry et al., 2012; Harvey et al., 2011; Weese et al., 2010).

*C. septicum* est une bactérie responsable de la gangrène gazeuse traumatique et de la myonécrose clostridienne chez l'animal et chez l'Homme, en particulier chez les dindes et poulets. *C. septicum* produit 4 toxines majeures (α, β, γ et δ) responsables de lésions tissulaires et de toxémie (Koransky et al., 1979). Il n'existe pas de données sur la répartition et les sources de *C. septicum* dans les installations de production de volaille (Thachil et al., 2012).

Le botulisme animal, également appelé "limberneck" est principalement causé par *C. botulinum*, une bactérie toxinogène. En effet, cette bactérie produit des neurotoxines botuliques de types C et D responsables du botulisme. Cette infection a augmenté dans plusieurs pays Européens depuis 2000 (Skarin et al., 2013). Les oiseaux atteints meurent d'un arrêt cardiaque, d'une insuffisance
respiratoire ou des deux, conséquence d'une paralysie ascendante (Sato et al., 2016). Les principales sources de contamination sont les invertébrés, l'eau potable, le système de ventilation et le sol (Souillard et al., 2014).

## II. L'entérite nécrotique

L'entérite nécrotique est une maladie affectant les élevages dans toutes les régions avicoles du monde (Timbermont et al., 2011). Elle est responsable chaque année de pertes économiques colossales dans le monde, celles-ci sont évaluées à plus de 6 milliards de dollars. Ces pertes sont dues aux coûts des mesures de contrôle de la maladie et à la diminution de la production en termes de poids et de mortalité des animaux dans les élevages (Wade et Keyburn, 2015). L'entérite nécrotique est plus fréquente chez les poulets de chair, cependant les poules pondeuses et les dindes peuvent également être touchées.

### II.1. Etiologie

C. perfringens est le microorganisme pathogène responsable de l'entérite nécrotique. Son nom dérive du latin du perfringere « casser », car la culture dans la masse « casse » la gélose par une production abondante de gaz (Veillon et Zuber, 1898).

### II.2. Pathologie

C. perfringens est responsable d'un grand nombre de maladies chez l'Homme et les animaux (Paiva et McElroy, 2014), allant des infections histotoxiques aux infections entériques (Uzal et al., 2014). Celles-ci comprennent la gangrène gazeuse, l'intoxication alimentaire par C. perfringens de type A, les maladies gastro-intestinales non alimentaires associées à l'entérotoxine (CPE) et l'entérite nécrotique chez l'animal (entérotoxémie) ou l'Homme. Le potentiel pathogène de C. perfringens est lié aux toxines extracellulaires et aux enzymes hydrolytiques, dont le portage génétique est souvent plasmidique. C. perfringens se distingue des autres clostridies par son caractère immobile et sa capacité à réduire les nitrates. La capacité de C. perfringens à provoquer des maladies dépend de la production de certaines toxines. Selon la toxine produite, C. perfringens est alors classé en différents types. Rood et al. (2018) ont proposé une grille de typage basée sur
ces toxines. Selon cette grille, *C. perfringens* responsable de l'entérite nécrotique chez la volaille est placé dans le groupe G (Tableau 3).

<table><caption>**Tableau 3.** Typage de *Clostridium perfringens* en fonction des toxines produites (Rood et al., 2018).</caption><thead><tr><th>Toxinotype</th><th>α-toxine</th><th>β-toxine</th><th>ε-toxine</th><th>i-toxine</th><th>CPE</th><th>NetB</th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>B</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>C</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>±</td><td>-</td></tr><tr><td>D</td><td>+</td><td>-</td><td>+</td><td>-</td><td>±</td><td>-</td></tr><tr><td>E</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>±</td><td>-</td></tr><tr><td>F</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td><td>-</td></tr><tr><td>G</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>+</td></tr></tbody></table>

Lors du développement de l'entérite nécrotique, *C. perfringens* attaque la paroi intestinale en produisant diverses enzymes et toxines extracellulaires qui vont dégrader les cellules de l'intestin pour obtenir des nutriments. Ces toxines et enzymes ont des activités et des rôles spécifiques dans le processus de la maladie. Une action synergique a d'ailleurs été suggérée entre ces toxines. Les enzymes extracellulaires et les facteurs de virulence semblent être synthétisés d'une manière coordonnée (Ohtani et Shimizu, 2015). Les souches pathogènes présentent des gènes codant pour des systèmes de transport d'acides aminés et de sucres permettant l'absorption des nutriments libérés. La dégradation de cellules intestinales compense l'absence des gènes impliqués dans la biosynthèse de nombreux acides aminés (Shimizu et al., 2002).

Dans un premier temps, les études sur l'entérite nécrotique ont identifié l'alpha-toxine comme le principal facteur de virulence. Cependant, Keyburn et al., (2006) ont démontré que cette hypothèse était erronée grâce au développement de mutants alpha-toxine négatifs. Keyburn et al. (2008) ont démontré qu'une nouvelle toxine, appelée NetB serait essentielle pour le développement de l'entérite nécrotique aviaire (Keyburn et al., 2008, 2010). La toxine NetB de *C. perfringens* est une toxine de 33-kDa formant des β-pores, elle présente une similarité avec la β-toxine de *C. perfringens* (38% d'identité de la séquence en aminoacides), gamma-toxine de *C. perfringens* (40% d'identité), l'alpha-hémolysine de *Staphylococcus aureus* (30% d'identité) et la gamma-toxine de
S. aureus (23% d'identité) (Paiva et McElroy, 2014; Yan et al., 2013). Le gène codant NetB est porté par des plasmides et est placé dans le locus de pathogénicité NELoc-1 (Lepp et al., 2010).

La toxine NetB forme des pores d'une taille de 1,6 nm de diamètre qui cassent la bicouche lipidique de la membrane cellulaire provoquant des changements dans les voies de transduction du signal de l'hôte (Rood et al., 2016) et permettant la sortie des ions Ca²⁺, Na⁺ ou Cl⁻ ce qui entraîne la lyse osmotique de la cellule (Keyburn et al., 2008; Savva et al., 2013). La toxine interagit avec le cholestérol membranaire présent et forme des structures de 7 monomères en forme d'anneau comme illustré dans la **Figure 7** (Rood et al., 2016; Savva et al., 2013).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 7.** Représentation de la structure cristalline de la toxine NetB. (Panel A) Structure monomérique (Panel B) Structure du complexe heptamérique représentant les conditions de la membrane cytoplasique (Panel C) Vision apicale du pore de la toxine (Savva et al., 2013).</figcaption></figure>

La virulence de *C. perfringens* est déterminée par un système de régulation à deux composantes, appelé VirR/VirS. Ce système contrôle plus de 150 gènes incluant des gènes codant des toxines comme NetB, des hyaluronidases, des sialidases, des enzymes catalytiques ou encore ceux codant des transporteurs (Ohtani et Shimizu, 2015; Prescott et al., 2016). La production de la toxine NetB est corrélée à l'activation du système VirR/VirS, en réponse à une forte densité cellulaire de *C. perfringens* (Timbermont et al., 2011).

Par comparaison de plusieurs génomes de *C. perfringens*, Lepp et al. (2010), ont établi que la virulence est loci dépendante, c'est-à-dire de la localisation des gènes sur le support génétique, comme indiquée sur la **Figure 8**. Ces locus de pathogénicité, plasmidiques (NELoc-1 et NELoc-3) ou chromosomique (NELoc-2), regroupent des gènes de virulence potentiels pouvant contribuer à la diversité de *C. perfringens* en tant qu'agent pathogène (Lepp et al., 2010; Parreira et al., 2012).
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Figure 8.** Organisation génétique des loci spécifiques associés aux entérites nécrotiques (Lepp et al. 2010). NELoc-1 (42 kb) et NELoc-3 (5,6kb) sont présents sur des plasmides. NELoc-2 est localisé dans une région du chromosome de 11,2 kb. Les gènes sont représentés par flèches. Dans la partie du dessus les fonctions prédites sont spécifiées et au-dessous les étiquettes de locus.

La transmission de plasmides par conjugaison permet de transférer des gènes conférant de nouvelles fonctions biologiques aux bactéries. Ainsi, Lacey et al. (2017) ont montré que la transmission du plasmide codant pour la toxine NetB est possible entre des souches de C. *perfringens* pathogènes et non-pathogènes, même si leurs contenus chromosomiques sont très différents. Ce transfert horizontal peut avoir lieu dans le tractus gastro-intestinal du poulet, transformant les souches commensales ou non pathogènes de C. *perfringens* en souches pathogènes (Barbara et al., 2008; Lacey et al., 2017).

## II.3. Epidémiologie et symptomatologie

L'entérite nécrotique apparaît chez les poulets de chair âgés de 2 à 6 semaines (Cooper et Songer, 2009), ce qui correspond à une période où le système immunitaire du poussin est immature ceci jusqu'à environ 3 ou 4 semaines (Caly et al., 2015; Cooper et al., 2013; La Ragione et
Woodward, 2003). Les poulets contractent la maladie par exposition aux cellules végétatives ou aux spores des souches pathogènes de *C. perfringens*, présentes dans les fermes d'élevage (les murs, la saleté à l'extérieur de l'entrée, les ventilateurs, le sol, les abreuvoirs, les conduites d'eau, la litière contaminée, les boîtes de livraison des poussins, les bottes du personnel), la nourriture ou par la contamination croisée avec des animaux infectés (Caly et al., 2015; M'Sadeq et al., 2015).

Il existe deux types d'entérite nécrotique, lorsque la classification est établie par des critères symptomatologiques. L'entérite aigüe et l'entérite subclinique. Les signes les plus fréquents pour établir l'entérite aigüe sont des poulets somnolents, manquant de tonus et d'appétit, présentant diarrhées, déshydrations ou inappétence(Cooper et Songer, 2009). L'intestin grêle est généralement distendu avec du gaz et la paroi intestinale est mince et friable. La muqueuse est tapissée d'une pseudomembrane jaune-brune ou verte biliaire (Cooper et Songer, 2009; Opengart, 2008; Timbermont et al., 2011) (Figure 9). Les poulets meurent souvent en 1 à 2 h. Les taux de mortalité associés à l'entérite nécrotique sont généralement compris entre 2 et 10% mais parfois des taux de 50% sont rapportés (Cooper et al., 2013; M'Sadeq et al., 2015; Paiva et McElroy, 2014). L'affection est caractérisée par l'augmentation soudaine de la mortalité des cheptels, les oiseaux meurent généralement sans signes avant-coureurs (M'Sadeq et al., 2015).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 9.** Nécrose à *C. perfringens* dans le jéjunum de poulets. Présence des zones de nécrose muqueuse recouvertes de pseudomembrane (Cooper et al., 2013)</figcaption></figure>
La forme subclinique affecte négativement les taux de conversion des aliments, c'est-à-dire que les animaux doivent consommer plus d'aliment pour avoir le même gain du poids ; en outre il n'y a pas une mortalité significative. Ce type d'entérite nécrotique est problématique car il a un impact négatif sur la productivité et la rentabilité ayant pour résultat des poulets de taille et de poids réduits (Savva et al., 2013), en raison de dommages chroniques de la muqueuse intestinale (Timbermont et al., 2011). Lors d'une infection subclinique, les bactéries peuvent atteindre la circulation sanguine et la voie biliaire (M'Sadeq et al., 2015). Les animaux malades présentent des lésions macro et microscopiques généralement dans le jéjunum et l'ilium mais celles-ci peuvent apparaître également dans le duodénum et les caeca (Opengart, 2008), ou dans d'autres organes, tels que le foie et les reins (Timbermont et al., 2011). Au niveau microscopique, des effets sont observées selon le stade de l'infection. Les premiers stades de l'entérite nécrotique induisent de fortes réactions inflammatoires à C. perfringens. La lamina propria est hyperémique et infiltrée par de nombreuses cellules inflammatoires, principalement des granulocytes hétérophiles. La progression des lésions se produit généralement des apex des villosités aux cryptes (Figure 10). Dans les stades ultérieurs de l'entérite nécrotique, les lésions apparaissent comme des nécroses coagulatrices diffuses et sévères de la muqueuse (Opengart, 2008; Smyth, 2016; Timbermont et al., 2011).

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**Figure 10.** Coupes histologiques du jéjunum de poulets sain (Panel A) et infecté avec *Clostridium perfringens* (Panel B). A) Les villosités sont très longues et représentent l'essentiel de l'épaisseur de la paroi intestinale. B) Avec le développement de l'entérite nécrotique la partie superficielle de la muqueuse est nettement éosinophile (nécrose coagulative) et est séparée de la muqueuse viable par une zone intense d'inflammation hétérophile (flèches). Les souches de *C. perfringens* en bleu recouvrent le coagulum nécrotique (Smyth, 2016).
## II.4. Facteurs de prédisposition

C. perfringens est présent naturellement dans l'intestin. En tant que bactérie opportuniste, elle a besoin que l'équilibre intestinal soit compromis pour coloniser, proliférer et exprimer les toxines, et ainsi provoquer la maladie (Broom, 2017; Caly et al., 2015; Immerseel et al., 2010). L'isolement de souches de C. perfringens porteurs de gènes netB chez des poulets sains indique que la simple infection par C. perfringens n'est pas seule suffisante pour induire la pathologie (Rood et al., 2016). Le déclenchement de l'entérite nécrotique nécessite la présence de conditions appelée facteurs de prédisposition comme schématisé dans la **Figure 11**.

### a) La coccidiose

La coccidiose est le facteur de prédisposition le plus important pour le développement de l'entérite nécrotique; c'est une maladie causée par le parasite *Eimeria spp*. Certaines espèces (*E. necatrix*, *E. brunetti*, *E. maxima*, *E. tenella*) induisent des lésions plus sévères que d'autres (*E. acervulina*, *E. mitis*, *E. praecox*). L'affection est dose dépendante; ainsi des doses infectieuses de 2 · 10⁴ ou 5 · 10⁵, pour des souches plus ou moins pathogènes respectivement, ont des effets délétères sur les poulets (Shojadoost et al., 2012). Cependant ces 2 maladies sont mutuellement prédisposantes l'une pour l'autre chez la volaille. *Eimeria* est un parasite qui colonise l'intestin grêle et tue les cellules épithéliales durant les étapes intracellulaires de son cycle de vie (Williams, 2005). Cette infection produit la fuite de plasma vers la lumière intestinale et le plasma constitue un substrat riche pour la croissance et la prolifération de *Clostridium* (Broom, 2017; Immerseel et al., 2010). D'un autre côté, la coccidiose induit une réponse inflammatoire par médiation des lymphocytes T qui augmentent de manière excessive la production de mucus intestinal. L'augmentation de mucine dans le lumen favorise également la croissance à C. perfringens en raison de la capacité de celui-ci à utiliser le mucus comme substrat (Collier et al., 2008; Timbermont et al., 2011).
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 11.** Réseau de facteurs de prédisposition à l'entérite nécrotique. Les facteurs représentés par des flèches et des ellipses en trait plein ont un effet bénéfique sur le contrôle de la maladie, ceux qui ont des flèches pointillées et les ellipses favorisent la maladie. Les principales relations à haut risque sont indiquées par des flèches à double ligne. AGP, antibiotique promoteurs de la croissance ; CIA, anémie infectieuse des poussins ; CEP, produit d'exclusion compétitif ; Cp, *Clostridium perfringens* ; MICI, bursite infectieuse ; MD, maladie de Marek ; NE, entérite nécrotique. (Williams, 2005)</figcaption></figure>
b) Régime alimentaire

La composition de l'alimentation affecte les populations bactériennes de l'intestin, ce qui peut
favoriser le développement de la maladie. Des régimes enrichis en céréales (blé, seigle, orge ou
avoine), ou des régimes passant brusquement d'une teneur faible à une teneur élevée en protéines
ont été utilisés pour produire expérimentalement l'entérite nécrotique. Le type de céréale utilisé
peut favoriser le développement de l'entérite nécrotique. Les grains de céréales fournissent la
majorité de l'amidon et des polysaccharides dans l'alimentation des poulets, et différentes céréales
affectent le développement de l'entérite nécrotique (Apajalahti et Vienola, 2016; Palliyeguru et
Rose, 2014). Les régimes enrichis en céréales comme l'orge et le blé entraînent une incidence
accrue de la maladie (26 à 35%), par rapport à un régime à base de maïs (0 à 12%). Cela peut être
dû à une augmentation du nombre de C. perfringens lors du régime alimentaire à base de blé ou
d'orge (Riddell et Kong, 1992; Shojadoost et al., 2012). En effet, ces céréales (le blé, le seigle et
l'orge) contiennent des taux élevés de polysaccharides non amylacés solubles dans l'eau (NSP) tels
que les arabinoxylanes et les β-glucanes qui augmentent la viscosité du digesta et prédisposent les
poulets à l'entérite nécrotique (Annett et al., 2002; Shojadoost et al., 2012). La viscosité plus
élevée des digesta dans les régimes contenant du blé ou de l'orge entraîne un temps de transit
prolongé dans l'intestin, qui peut être responsable de la corrélation directe entre la viscosité
intestinale et la quantité des clostridies. Un régime avec de grandes quantités de NSP épaissit la
couche d'eau non agitée de la muqueuse en interagissant avec les mucopolysaccharides ce qui peut
réduire l'absorption et augmenter l'apport en nutriments aux microorganismes dans l'intestin
favorisant ainsi la croissance de bactéries pathogènes dans le tractus gastro-intestinal (Palliyeguru
et Rose, 2014). De même, l'épaississement de la couche muqueuse intestinale peut diminuer sa
tension en oxygène, favorisant ainsi l'adhésion de C. perfringens sur la surface muqueuse
(Palliyeguru et Rose, 2014).

L'autre facteur prédisposant à l'entérite nécrotique est un régime riche en protéines comme par
exemple un régime à base de farine de poisson (Drew et al., 2004; Wu et al., 2014). Une
augmentation des taux de protéines alimentaires de 24 à 38% a été associé à l'augmentation de
risque d'entérite nécrotique (Lee et al., 2018). Le niveau de protéines brutes, la source de protéines
et la teneur en acides aminés d'un régime alimentaire ont tous un effet significatif sur la population
intestinale de C. perfringens. Ces protéines complètent les acides aminés que C. perfringens ne
peut pas synthétiser (Shimizu et al., 2002). Les acides aminés peuvent jouer un rôle important dans
la prolifération de *C. perfringens*. Les taux élevés de glycine, et de lysine dans une moindre mesure, augmentent le risque d'épidémie clinique d'entérite nécrotique (Dahiya et al., 2005; Wilkie et al., 2005). Des acides aminés comme l'arginine ou l'acide glutamique réduisent au contraire l'entérite nécrotique en aidant à maintenir le microbiote normal. Un haut ratio de thréonine/lysine dans l'aliment ne prévient pas l'entérite nécrotique mais peut améliorer les performances des poulets (Star et al., 2012).

Les inhibiteurs de la trypsine présents dans les régimes à base de soja ou de pomme de terre augmentent la gravité des lésions de l'entérite nécrotique. En effet la trypsine détruit les toxines de *C. perfringens*. L'inhibition de cette enzyme est un facteur important prédisposant aux maladies entériques causées par les clostridies (Palliyeguru et Rose, 2014; Shojadoost et al., 2012; Songer, 1996). En ce qui concerne la complémentation de la nourriture avec des minéraux, l'addition de grosses quantités de calcium à la nourriture semble également favoriser le développement de la maladie (Paiva et al., 2013).

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par de nombreuses espèces de moisissures dont *Aspergillus*, *Fusarium* et *Penicillium*, qui se développent sur les matières premières des aliments pour animaux. Les mycotoxines contaminent une certaine partie de la nourriture utilisée dans les élevages industriels (Schatzmayr et Streit, 2013 ; Filazi et al., 2017). Les mycotoxines peuvent provoquer des dommages intestinaux favorisant la prolifération de *C. perfringens*. Par exemple, la présence de fumonisines (FB) crée un impact négatif sur le microbiote intestinal et l'animal hôte ce qui le prédispose à développer l'entérite nécrotique (Antonissen et al., 2015). La présence de déoxynivalénol (DON) dans la nourriture augmenterait de 27% le pourcentage de lésions dues à *C. perfringens*, en comparaison à une infection produite par la bactérie seule (Antonissen et al., 2014).

### c) Les facteurs de management des élevages

Les facteurs liés à la gestion de l'approvisionnement en eau, au contrôle de la température et des systèmes de ventilation dans les élevages peuvent favoriser la maladie. L'effet de la litière humide permet la croissance de champignons et le développement ultérieur de *Clostridium*. C'est un phénomène courant dans les élevages anglais comme l'ont montré Hermans et Morgan (2007) dans environ 56% des fermes. La litière humide apparaît quand il y a des fuites dans les abreuvoirs, lorsque les toits des installations sont vétustes ou à cause d'une mauvaise ventilation. La litière
atteint alors le seuil de saturation, perd sa friabilité et forme une couche humide en surface (Palliyeguru et Rose, 2014).

Les périodes de lumière sont aussi importantes comme facteur de prédisposition. Rodrigues et al. (2018) ont récemment rapporté que des alternances de lumière/obscurité de 18h/6h utilisées dans l'industrie prédisposent plus à développer la maladie que des périodes intermittentes de 6 heures. La génétique des oiseaux semble avoir une certaine influence sur la sensibilité à l'entérite nécrotique en raison de la réponse immunitaire à *C. perfringens* (Hong et al., 2014; Jang et al., 2013).

### d) L'immunosuppression et le stress

Un état d'immunosuppression prédispose les animaux à l'entérite nécrotique car les facteurs qui entraînent habituellement une immunosuppression peuvent modifier l'environnement intestinal et le microbiote intestinal (Paiva et McElroy, 2014). L'infection par des virus tels que les virus de la maladie de Marek, de la bursite infectieuse et de l'anémie infectieuse de poulet peut avoir des effets immunosuppresseurs et créer ainsi des infections secondaires à *C. perfringens* (Hoerr, 2010).

Le stress a probablement les mêmes effets immunosuppresseurs que les agents pathogènes. Il affecte le microbiote protecteur et la morphologie intestinale. Il a été démontré que les facteurs de stress environnementaux dus à la chaleur ou au froid (Calefi et al., 2018; Tsiouris et al., 2015), de gestion globale (changements du régime alimentaire, état de la litière, humidité, surpopulation, ammoniac environnemental, programmes de vaccination) et physiologiques (maturité sexuelle) provoquent une immunosuppression, prédisposant les oiseaux à la maladie et pouvant affecter les animaux à court ou long terme (Moore, 2016; Paiva et McElroy, 2014).

Pour résumer, il est clair que presque tout ce qui cause du stress et entraîne un déséquilibre du microbiote du tractus gastro-intestinal représente un facteur de risque potentiel pour le développement de l'entérite nécrotique.

En dépit des efforts consentis, les mécanismes impliqués dans de nombreux facteurs de prédisposition sont encore mal compris, car il n'est pas toujours possible voire très difficile de reproduire expérimentalement les signes cliniques et les lésions de l'entérite nécrotique même quand les facteurs de prédisposition sont présents (Van Immerseel et al., 2004).
## II.5. Modèles animaux servant à l'étude de l'entérite nécrotique

Plusieurs facteurs sont importants pour l'induction de l'entérite nécrotique *in vivo* au niveau expérimental et différents modèles de contamination peuvent être utilisés pour produire la maladie. Un des facteurs importants est le choix de la ou des souches virulentes de *C. perfringens* préalablement isolées d'animaux malades. Selon les modèles, les souches de *C. perfringens* peuvent être administrées par gavage, mélangés dans la nourriture ou de l'eau de boisson, ou d'une façon passive dans la litière. La dose et la fréquence d'administration varient selon les expériences comme le **Tableau 4** le montre. Les animaux sont prédisposés à l'infection par l'administration de virus (virus de la bursite infectieuse, virus de l'anémie du poussin et virus de la maladie de Marek) créant une immunosuppression et par une co-infection avec *Eimeria*. Les régimes à haute concentration de protéines favorisent la maladie (Lee et al., 2018; Uzal et al., 2015).

<table><caption>**Tableau 4.** Revue de certaines conditions prédisposantes testées dans les modèles expérimentaux d'entérite nécrotique</caption><thead><tr><th colspan="3">Challenge avec C. perfringens</th><th rowspan="2">Alternative évaluée</th><th rowspan="2">Référence</th></tr><tr><th>Jours de tests</th><th>Concentration de l'inoculum</th><th>Moyen d'administration</th></tr></thead><tbody><tr><td>J21</td><td>10<sup>5</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Lactobacillus johnsonii F19785</td><td>La Ragione et al. (2004)</td></tr><tr><td>J14-J21</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Lb. acidophilus</td><td>Li et al. (2018)</td></tr><tr><td>J14-J20</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Bacillus subtilis et paroi de levure</td><td>Li et al. (2017)</td></tr><tr><td>J19-J20</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Nourriture</td><td>Bacillus licheniformis</td><td>Knap et al. (2010)</td></tr><tr><td>J19-J21</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Nourriture</td><td>Bacillus subtilis PB6</td><td>Jayaraman et al. (2018)</td></tr><tr><td>J14</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Nourriture</td><td>Extrait de levure et grains</td><td>Alizadeh et al. (2016)</td></tr><tr><td>J26-J27</td><td>J26 : 10<sup>9</sup> - 10<sup>10</sup> UFC<br/>J27 : Mélangé avec la nourriture</td><td>Gavage<br/>Nourriture</td><td>Vaccination avec la toxine NetB recombinante</td><td>Keyburn et al. (2013)</td></tr><tr><td>J14-J20</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Huiles essentielles et enzymes</td><td>Sun et al. (2015)</td></tr><tr><td>J14-J15</td><td>10<sup>8</sup> - 10<sup>9</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Farine de poisson</td><td>Stanley et al. (2014)</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>J26</td><td>10<sup>9</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Réponse immunitaire</td><td>Park et al. (2008)</td></tr><tr><td>J17-J19</td><td>10<sup>7</sup> UFC<br>(2 fois/jour)</td><td>Gavage</td><td>Réponse immunitaire</td><td>McReynolds et al. (2004)</td></tr><tr><td>J14-J16</td><td>10<sup>8</sup> UFC</td><td>Gavage</td><td>Réponse immunitaire</td><td>Fasina et Lillehoj (2018)</td></tr><tr><td>J15-J17 ou<br>J19-J20</td><td>10<sup>7</sup> UFC<br>(2 fois/jour)</td><td>Gavage</td><td>Paroi de levure</td><td>Fowler et al. (2015)</td></tr></table>

## II.6. Lutte contre l'entérite nécrotique

La meilleure manière de lutter contre l'entérite nécrotique est la prévention car après l'infection, le développement de la maladie est très rapide et la mortalité haute. Avant les interdictions, il était courant d'ajouter des antibiotiques dans l'eau ou des promoteurs de croissances, connus sous la dénomination AGP dans l'aliment (bacitracine, lincomycine, virginiamycine, pénicilline, avoparcine, avilamycine et nitrovine) (Paiva et McElroy, 2014; Williams, 2005). Les antibiotiques utilisés pour traiter la maladie sont indiqués dans le **Tableau 5**.

<table><caption>**Tableau 5.** Antibiotiques utilisés dans les élevages industriels pour traiter l'entérite nécrotique (Landoni et Albarellos, 2015)</caption><thead><tr><th colspan="2">Antibiotiques utilisés contre l'Entérite Nécrotique</th></tr><tr><th>Bactéricides</th><th>Bactériostatiques</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ampicilline</td><td>Lincomycine</td></tr><tr><td>Bacitracine</td><td>Tylosine</td></tr><tr><td>Néomycine</td><td>Avoparcine</td></tr><tr><td>Pénicilline G</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td></td></tr><tr><td>Virginiamycine</td><td></td></tr></tbody></table>

L'avoparcine, la bacitracine et la virginiamycine sont très efficaces dans la prévention et le contrôle de l'entérite nécrotique (Shojadoost et al., 2013). Mais l'utilisation excessive d'avoparcine peut créer un réservoir d'Enterococcus résistant à la vancomycine (ERV) (Cooper et Songer, 2009). Pour réduire ce risque, et du fait qu'elles appartiennent aux antibiotiques utilisés
en médecine humaine, ces molécules sont interdites comme AGP dans l'UE depuis 1997 et 1998 (EMA, 2015; Food and Veterinary Office, 2015). Après les restrictions sur l'usage des AGP, il y a des alternatives pour prévenir ou traiter l'entérite nécrotique, comme la vaccination avec *Eimeria* par exemple afin de réduire la prévalence de coccidiose, un facteur de prédisposition important d'entérite nécrotique. L'utilisation de toxoïdes de NetB peut offrir une bonne protection contre les entérites nécrotiques à *C. perfringens* (Paiva et McElroy, 2014). Cependant, les probiotiques comme *Bacillus licheniformis*, *B. subtilis*, *Lactobacillus*, *Debaromyces hansenii*, *Saccharomyces boulardi* présentent également une stratégie de prévention intéressante (Caly et al., 2015). Moins décrite, l'utilisation de bactériophages, ou de leurs enzymes, est également envisageable. Zimmer et al. (2002) ont suggéré l'utilisation de la muréine hydrolase du bactériophage φ3626 par exemple. L'adjonction de tanins, qui viennent de châtaignes, ou de mannan-oligosaccharides dans les régimes alimentaires des poulets réduits les lésions macroscopiques de l'EN (Caly et al., 2015; Diaz-Carrasco et al., 2016). La sélection génétique des lignées de poulets, peut également être envisagée pour réduire le risque de développement de l'entérite nécrotique dans les élevages de volailles. Ainsi certaines lignées de poulets peuvent produire naturellement de manière accrue des peptides antimicrobiens comme les gallinacines (renommées β-défensines aviaires ou AvBDs), à partir de leucocytes ou de cellules épithéliales intestinales, ayant des activités contre *Salmonella*, *Listeria* ou *E. coli* (Derache et al., 2009b, 2009a; Sadeyen et al., 2006) Ainsi certaines lignées peuvent produire des peptides antimicrobiens comme les gallinacines, à partir de leucocytes, ayant des activités contre *Listeria* ou *E. coli* (Cuperus et al., 2013).

### III. Utilisation des antibiotiques en santé animale

Le code sanitaire de l'OIE pour les animaux terrestres définit les agents antimicrobiens comme « des médicaments essentiels qui tuent les micro-organismes ou arrêtent leur croissance » (OIE, 2018). Ces molécules comprennent des agents actifs contre les bactéries, les protozoaires, les virus et les champignons. La catégorie d'agent antimicrobien la plus utilisée, et qui présente actuellement le plus grand intérêt pour la santé publique, est la classe des antibactériens connu comme antibiotiques.
Au siècle dernier, les antibiotiques ont été, à juste titre, salués comme des « médicaments
miracles » et ont été considérés comme l'une des avancées majeures de la médecine moderne
(Rossolini et al., 2014). Leur développement et leur utilisation ont rapidement entraîné une
diminution spectaculaire des taux de mortalité et de morbidité associés aux infections bactériennes
courantes (Levy, 1992). A partir des années 1950, ils ont été utilisés comme promoteurs de
croissance ou AGP, et ont permis d'améliorer la croissance chez les jeunes animaux (jusqu'à 8%
de gain en poids) et aussi accroitre l'efficacité de la conversion alimentaire (Acar et al., 2000;
Bywater, 2005; Dumonceaux et al., 2006). L'utilisation d'agents antimicrobiens dans les élevages
permet la croissance d'animaux sains, en réduisant l'incidence des maladies, une morbidité et une
mortalité diminuées et une productivité accrue (Page et Gautier, 2012).

Les antibiotiques les plus efficaces ciblent les ribosomes (affectant la synthèse des protéines), l'ADN gyrase ou l'ADN topoisomérase (affectant la synthèse de l'ADN) ou la synthèse de la paroi cellulaire. D'autres antibiotiques ciblent la synthèse des ARN, les voies du métabolisme de l'acide folique (vitamine B9) et la membrane cellulaire bactérienne (Lewis, 2013; Morar et Wright, 2010).

### III.1. Antibiotiques utilisés dans les élevages industriels

De nombreux types d'antibiotiques sont utilisés dans les élevages industriels (OIE, 2013). L'administration d'agents antimicrobiens dans les aliments pour animaux est l'une des pratiques les plus largement adoptées dans le monde (43,4%). L'aliment contenant les antibiotiques peut être présenté sous forme de mélange libre en vrac, de purée, de miettes ou de granulés. Une autre voie d'administration possible des antibiotiques est par l'addition à l'eau de boisson (28,6%), en particulier dans les élevages de porcs et de volailles (Page et Gautier, 2012)(Figure 12).
<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**Figure 12.** Répartition des ventes en 2015 (en mg/UCP<fnref n="1" />) des méthodes d'administration des agents antimicrobiens vétérinaires pour les élevages industriels, dans 30 pays européens. (Source: European Medicines Agency and European Surveillance of Veterinary Antimicrobial Consumption, 2017).

Les antibiotiques les plus fréquemment utilisés dans les élevages en Europe et aux Etats-Unis appartiennent aux classes des tetracyclines, des pénicillines et des sulfonamides (ESVAC, 2017; FDA, 2016). La **Figure 13** montre le cas spécifique de l'UE.

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

**Figure 13.** Catégories et commercialisation, en 2015, des agents antimicrobiens vétérinaires en pourcentages des ventes totales d'espèces productrices d'aliments, en mg / UCP dans 30 pays européens. (Source: European Medicines Agency and European Surveillance of Veterinary Antimicrobial Consumption, 2017).

<footnote n="1">¹ Une unité de correction de la population (UCP) est utilisée comme indicateur de la taille de la population d'animaux producteurs de denrées alimentaires.</footnote>
Un antibiotique est considéré comme un promoteur de croissance lorsqu'il est administré aux animaux en concentrations non thérapeutiques pour favoriser la croissance et améliorer l'efficacité de conversion alimentaire (Page et Gautier, 2012). Les AGPs sont généralement administrés à des concentrations relativement faibles, allant de 2,5 mg/kg à 125 mg/kg (ppm), en fonction du type d'antibiotique et de l'espèce animale (OMS, 2004). Deux hypothèses sont proposées pour expliquer la fonction AGP des antibiotiques. Pour certains auteurs, ils modifient la composition du microbiote intestinal, mais ils sont capables de réduire la compétition pour les nutriments ou prévenir la colonisation des agents pathogènes. D'autres auteurs proposent que les AGP modifient la physiologie des intestins de l'hôte par le contrôle de l'inflammation (Brown et al., 2017; Bywater, 2005; Dumonceaux et al., 2006).

### III.2. Les antibiotiques utilisés chez la volaille

Les antibiotiques les plus utilisés chez les volailles sont listés dans le **Tableau 6** (Landoni et Albarellos, 2015). Certains de ces antibiotiques sont des AGPs non autorisés en alimentation animale en Europe. C'est les cas de l'avilamycine, l'avoparcine, la bacitracine, la flavomycine, la spiramycine, la tylosine et la virginiamycine.

Cette décision ayant pour but de réduire la pression sélective à laquelle les bactéries sont soumises. En effet, depuis plusieurs décennies, les bactéries ont développé de multiples mécanismes de résistance rendant les traitements prophylactiques actuels peu efficaces. L'utilisation abusive de ces molécules en médecine humaine et vétérinaire a provoqué une pression sélective qui a accéléré l'évolution et la propagation des bactéries résistantes aux antibiotiques (Blair et al., 2015 ; D'Costa et al., 2011). Le développement des médicaments, ou les classes de médicaments susceptibles d'être disponibles dans un avenir proche, est plus lent que le développement des résistances par les bactéries (O'Neill, 2014) ce qui se traduit en une pandémie croissante (Cars, 2008). Pour de nombreuses populations dans le monde, en particulier celles des pays en voie de développement, les possibilités thérapeutiques sont revenues à l'ère du pré-antibiotique en raison de la résistance croissante de bactéries. comme par exemple, E. coli (Rossolini, 2015). En Europe et aux Etats-Unis, chaque année 50 000 morts sont associés à des infections par des bactéries pathogènes (multi)résistantes. Au niveau mondial, le nombre de décès
annuels associés à la résistance aux antibiotiques sont actuellement estimés à 700 000 décès par an (O'Neill, 2014).

<table><caption>**Tableau 6.** Antibiotiques utilisés dans l'élevage de volaille dans les états membres de l'OIE (OIE, 2013)</caption><tr><td>Spectinomycine</td><td>Lincomycine</td><td>Florphenicole</td><td>Sulfadimethoxine</td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Erythromycine</td><td>Thiamphenicole</td><td>Sulfadimidine</td></tr><tr><td>Dihydrostreptomycine</td><td>Carbomycine</td><td>Fosfomycine</td><td>Sulfaguanidine</td></tr><tr><td>Kanamycine</td><td>Josamycien</td><td>Tiamuline</td><td>Sulfadimethoxazole</td></tr><tr><td>Néomycine</td><td>Kitasamycine</td><td>Valnemuline</td><td>Sulfamethoxine</td></tr><tr><td>Paromomycine</td><td>Spiramycine</td><td>Enramycine</td><td>Sulfamonomethoxine</td></tr><tr><td>Apramycine</td><td>Tilmicosine</td><td>Bacitracine</td><td>Sulfanilamide</td></tr><tr><td>Fortimycine</td><td>Tylosine</td><td>Colistine</td><td>Sulfaquinoxaline</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Mirosamycine</td><td>Flumequine</td><td>Sulfamethoxypyridazine</td></tr><tr><td>Roxarsone</td><td>Terdecamycine</td><td>Acide oxolinique</td><td>Trimethoprim+Sulfonamide</td></tr><tr><td>Nitarsone</td><td>Tylvalosine</td><td>Ciprofloxacine</td><td>Trimethoprime</td></tr><tr><td>Bicozamycin</td><td>Avilamycin</td><td>Danofloxacine</td><td>Ormetoprime</td></tr><tr><td>Ceftiofur</td><td>Benzylpenicilline</td><td>Difloxacine</td><td>Virginiamycine</td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>Penethamatee</td><td>Enrofloxacine</td><td>Tétracycline</td></tr><tr><td>Lasalocid</td><td>Amoxicilline</td><td>Marbofloxacine</td><td>Nosiheptide</td></tr><tr><td>Maduramycin</td><td>Ampicilline</td><td>Norfloxacine</td><td>Sulfachlorpyridazine</td></tr><tr><td>Monensin</td><td>Amoxicilline + Acide Clavulanique</td><td>Ofloxacine</td><td>Semduramicine</td></tr><tr><td>Narasin</td><td>Ampicilline + Sulbactame</td><td>Chlortetracycline</td><td>Dicloxacilline</td></tr><tr><td>Salinomycin</td><td>Phenoxymethylpenicilline</td><td>Doxycycline</td><td>Oxytetracycline</td></tr></table>

Aujourd'hui la majorité des antibiotiques utilisés dans le monde est également utilisée chez les animaux destinés à l'alimentation humaine : Aux Etats-Unis par exemple, on estime que l'utilisation d'antibiotiques chez les animaux destinés à l'alimentation représente environ 80% de la consommation annuelle d'antibiotiques du pays (Van Boeckel et al., 2015). L'utilisation principale chez les animaux destinés à l'alimentation (lorsqu'ils peuvent être mesurés) reste un usage en tant qu'AGP mais aussi en prophylaxie de masse (Sanders et al., 2017).
### III.3. Mécanismes de résistance et transmission

Les mécanismes de résistance aux antibiotiques incluent la résistance (i) intrinsèque, (ii) acquise par des éléments génétiques mobiles et (iii) adaptative (Figure 14). La résistance intrinsèque aux antibiotiques est un phénomène naturel antérieur à l’ère de l’utilisation des antibiotiques par l’Homme. Il s’agit d’un caractère naturellement présent dans le génome d’une espèce bactérienne, indépendamment de l’action de l’antibiotique et qui n’est pas sujet au transfert horizontal de gènes. Les mécanismes de la résistance intrinsèque les plus caractéristiques sont la perméabilité de la membrane externe bactérienne et les pompes d’efflux (Cox et Wright, 2013). La résistance acquise, quant à elle, peut être transmise horizontalement ou verticalement. Pour une transmission horizontale, les bactéries acquièrent du matériel génétique externe grâce à différentes stratégies comme la transformation (incorporation d’ADN disponible dans l’environnement), la transduction (médiation par phage) ou la conjugaison (transfert de matériel génétique entre deux bactéries en contact direct) (Munita et Arias, 2016). Pour une transmission verticale, des mutations spontanées apparaissant au sein de gènes localisés sur le chromosome et sont ensuite transmis aux descendants lorsque la bactérie se multiplie (Cox et Wright, 2013).
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 14.** Mécanismes de résistance aux antibiotiques (Adaptée de Lewis (2013) et Wright (2010))</figcaption></figure>

Pour Rossolini et al. (2014), les principales espèces résistantes sont :

* Le phénotype SARM est dû à l'expression de protéines de liaison à la pénicilline, codées par les gènes *mec* acquis horizontalement, qui ne sont pas inhibées par les β-lactames classiques.

* *Pseudomonas aeruginosa* résistant à toutes les classes d'agents anti-*Pseudomonas*, à l'exception des polymyxines. Ces souches ont acquis plusieurs déterminants de résistance par mutation, tels que les pompes à efflux Mex ou l'AmpC β-lactamase, ou affectant les régions de topoisomérides déterminant la résistance aux quinolones et / ou par l'acquisition horizontale de gènes de résistance tels que ceux codant les enzymes modifiant les aminoglycosides, bêta-lactamases à large spectre ou les carbapénèmes. Même, l'augmentation de l'utilisation des polymyxines pour traiter ces infections ont fait que *Pseudomonas* développe la résistance aussi aux polymyxines (Fernández et al., 2013).
* *Acinetobacter* spp. (principalement *Acinetobacter baumannii*) est devenu l'un des acteurs majeurs de la crise actuelle de résistance aux antibiotiques. Le défi dans ce cas est dû aux souches d'*Acinetobacter* résistantes aux carbapénèmes, qui résistent généralement à tous les agents anti-*Acinetobacter* disponibles, à l'exception des polymyxines.

* Les entérobactéries résistantes aux carbapénèmes (principalement *Klebsiella pneumoniae* ou *E. coli*) représentent l'évolution la plus récente et la plus inquiétante de la crise de la résistance aux antibiotiques. Les *Enterobacteriaceae* ont développé au moins deux mécanismes de résistance aux carbapénèmes: la réduction de la perméabilité de la membrane externe par altération de la porine associée à la production d'une β-lactamase à large spectre ou à la production d'une β-lactamase du type AmpC et la production de β-lactamases à activité carbapénémase. L'évolution la plus récente étant l'émergence de la résistance à la polymyxine, en particulier les résistances à la colistine et l'apparition du gène *mcr-1* transférable (Liu et al., 2016). Depuis la découverte de ce gène, la réglementation sur les polymyxines et particulièrement la colistine a légèrement changé, dès lors que cet antibiotique est inscrit sur la liste des antibiotiques critiques. De la même manière la saine de l'Anses sur cet antibiotique déconseille toute association synergique avec d'autres antibiotiques (Avis de l'Anses, 2016)(https://www.anses.fr/fr/content/avis-de-lanses-relatif-%C3%A0-la-saisine-n-2016-sa-0160-concernant-1%E2%80%99utilisation-de-la-colistine).

* Les entérocoques résistant à la vancomycine (ERV), principalement *Ent. faecium* et moins fréquemment *Ent. faecalis*, se limitent principalement aux établissements de santé et leur prévalence reste relativement faible dans le monde entier (Brown et al., 2017).

### III.4. Mesures d'action contre la résistance aux antibiotiques

Pour faire face à la problématique de multirésistance aux antibiotiques, la communauté scientifique et les autorités publiques encouragent une meilleure gestion des antibiotiques disponibles et le développement de concepts nouveaux visant une réduction significative de leur utilisation tant en santé humaine qu'en santé animale (FAO, 2016b). La FAO en collaboration avec
l'OMS et l'OIE ont élaboré un plan d'action 2016-2020 visant le management de la résistance aux antibiotiques. Pour atteindre un objectif : la diminution de l'incidence des résistances aux antibiotiques. Pour se faire ils proposent de :

(1) mieux sensibiliser les différents acteurs au problème de la résistance aux antibiotiques et aux menaces connexes ;

(2) renforcer les capacités de surveillance et de suivi de la résistance aux antimicrobiens et de l'utilisation des antimicrobiens dans le secteur de l'alimentation et de l'agriculture ;

(3) renforcer la gouvernance relative à l'utilisation d'agents antimicrobiens et à la résistance aux antimicrobiens dans le secteur de l'alimentation et de l'agriculture ;

4) promouvoir les bonnes pratiques au sein des secteurs de l'alimentaire et agricole ainsi qu'une utilisation prudente des agents antimicrobiens (FAO, 2016b).

Pour éviter la perspective alarmiste d'une inefficacité totale des antibiotiques, les gouvernements ont légiféré, mais aussi communiqué abondamment au travers de campagnes de sensibilisation, dans le but de réduire l'utilisation des antibiotiques, et ainsi préserver l'efficacité de ceux-ci. En 2003, l'UE a interdit l'ajout d'antibiotiques utilisés en médecine humaine aux aliments pour animaux (aliments médicamenteux). Le règlement 1831/2003/CE sur les additifs alimentaires a complété la mesure avec l'interdiction totale des antibiotiques en tant que facteurs de croissance à partir du 1er janvier 2006. Les stratégies adoptées comprennent des objectifs nationaux de réduction de l'utilisation des antibiotiques, l'analyse comparative de leur utilisation, des contrôles sur la prescription et des restrictions sur l'utilisation des molécules présentant une importance critique, ainsi que des améliorations des mesures de prévention et de contrôle des maladies dans les élevages (Murphy et al., 2017) Cela a eu pour effet des réductions dans les ventes d'agents antimicrobiens comme le montre la **Figure 15**.
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 15.** Répartition des ventes totales, en 2015, d'agents antimicrobiens vétérinaires (en tonnes de matière active) par pays. Données obtenues d'European Medicines Agency and European Surveillance of Veterinary Antimicrobial Consumption, (2017).</figcaption></figure>

En France, en 2016 le volume moyen des ventes d'antibiotiques à destination des volailles était de l'ordre de 139 tonnes. L'indicateur français ALEA qui permet d'estimer l'exposition des animaux aux antibiotiques - qui est mesuré depuis 1999 - est en nette diminution en raison du plan ECOANTIBIO mis en place (plan national de réduction des risques d'antibiorésistance en médecine vétérinaire). Ainsi les valeurs obtenues en 2016 ont montré une baisse de 20,5 % par rapport à la moyenne des années 2014 et 2015. D'après les données d'ALEA (Tableau 7) sur ces deux dernières années, les volailles sont traitées majoritairement avec des polypeptides, des tétracyclines, et des pénicillines, puis avec des sulfamides et triméthoprime (ANSES, 2017).
<table><caption>**Tableau 7.** Exposition des volailles aux antibiotiques (Années 2014-2015 versus 2011) (ANSES, 2017).</caption><thead><tr><th></th><th>% réduction</th></tr></thead><tbody><tr><td>Amynoglicosides</td><td>54,44</td></tr><tr><td>Fluoroquinolones</td><td>29,73</td></tr><tr><td>Lincosamides</td><td>94,15</td></tr><tr><td>Macrolides</td><td>18,65</td></tr><tr><td>Penicillines</td><td>9,40</td></tr><tr><td>Pleuromutilines</td><td>74,28</td></tr><tr><td>Polypeptides</td><td>17,30</td></tr><tr><td>Quinolones</td><td>32,03</td></tr><tr><td>Sulfamides</td><td>16,88</td></tr><tr><td>Tetracyclines</td><td>31,96</td></tr><tr><td>Trimethoprime</td><td>17,96</td></tr><tr><td><strong>Total</strong></td><td><strong>22,05</strong></td></tr></tbody></table>

D'autres pays hors UE ont également interdit les antibiotiques comme AGPs. C'est le cas du Mexique, de la Nouvelle-Zélande et la Corée du Sud (Maron et al., 2013). Dans certains pays (États-Unis, Canada, Japon), l'interdiction n'est pas appliquée mais serait remplacée par des lignes directrices et des recommandations visant à réduire l'utilisation des AGPs dans la production animale (Brown et al., 2017; Laxminarayan et al., 2015).

Malgré les efforts faits dans ces pays, l'utilisation d'antibiotiques chez les animaux destinés à l'alimentation devrait augmenter rapidement d'au moins 67% entre 2010 et 2030 en raison l'augmentation constante de la demande de produits carnés dans les pays en développement notamment les pays BRICS (Brésil, Russie, Inde, Chine et Afrique du Sud). Dans ces pays, la quantité d'antibiotiques produite à cette fin devrait atteindre 105 000 tonnes en 2030, contre 63 000 tonnes en 2010 (Van Boeckel et al., 2015).
### III.5. Le concept de seule santé ou l'One-Health

Bien que le terme *One-Health* soit relativement nouveau, le concept est connu de longue date. Depuis les années 1800, les scientifiques ont noté la similitude des processus pathologiques chez les animaux et chez l'Homme. Cependant, les pratiques de la médecine humaine et animale ont été séparées jusqu'au 20ème siècle, où le concept *One-Health* a été davantage reconnu dans les secteurs de la santé publique et de la santé animale (CDC, 2016).

Les bactéries résistantes se propagent de personne à personne, d'animal à animal et de personnes à des animaux et à l'environnement, ou inversement. Ces bactéries se retrouvent également fréquemment dans les aliments produits à partir d'animaux ayant reçu des antibiotiques. Les processus d'abattage et les réseaux de distribution entraînent une contamination croisée de nombreux produits alimentaires avec des bactéries résistantes (Landers et al., 2012). L'utilisation intensive des antimicrobiens dans tous les secteurs (agricoles et santé humain) implique leur dissémination dans l'environnement, en particulier dans l'eau (par le biais des excrétions et des déchets) et les sols. Dans ces biotopes, les bactéries résidentes sont donc exposées aux antibiotiques, souvent à de faibles concentrations (FAO, 2016b). L'approche « One-Health » du problème de la résistance aux antimicrobiens permettra de percevoir globalement la résistance aux antibiotiques (Figure 16).
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 16.** Concept de seule-sante dite *One-Health* sur la transmission de bactéries résistantes aux antibiotiques.</figcaption></figure>

### III.6. Les stratégies alternatives aux antibiotiques

Pour surmonter l'augmentation du taux de mortalité et de morbidité liée à l'interdiction des antibiotiques dans l'alimentation animale, de nombreuses recherches sont en cours pour trouver des solutions de remplacement viables permettant d'obtenir des performances similaires à celles obtenues avec les antibiotiques (Millet et Maertens, 2011). Les autorités publiques appellent à une meilleure gestion de l'efficacité des antibiotiques disponibles, et à développer des concepts visant une réduction significative des antibiotiques tant en santé humaine qu'en santé animale. Cette réduction peut s'exercer à travers la combinaison de différentes molécules antibiotiques pour créer des effets synergiques, ou à de nouvelles alternatives comme les vaccins, les bactériophages et leurs lysines ; les peptides antimicrobiens ; les probiotiques, les prébiotiques et symbiotiques, les extraits de plantes ; les inhibiteurs ciblant la pathogénicité, etc. (Cheng et al., 2014).
La vaccination est considérée comme une des alternatives les plus intéressantes en raison de sa faisabilité et de son efficacité. La vaccination est une méthode préventive, les vaccins sont généralement classés en vaccins vivants atténués ou inactivés/tués (Dahiya et al., 2006). Les vaccins inactivés ou tués peuvent être efficaces pour fournir une protection contre les infections systémiques et les maladies, mais la protection fournie par ces vaccins à une capacité limitée à empêcher la colonisation des surfaces muqueuses. Diverses études ont démontré que l'utilisation de divers vaccins bactériens et viraux dans les populations animales peut entraîner une réduction significative de la consommation d'antibiotiques (Hoelzer et al., 2018b, 2018a).

Les bactériophages sont des virus qui infectent et se multiplient chez les bactéries. Les phages peuvent être classés selon qu'ils aient des cycles de vie virulents (lytiques) ou tempérés. Ceux à usage thérapeutique sont lytiques, présentant un cycle infectieux virulent auto-répliquant qui entraîne une dégradation rapide de l'ADN de la bactérie hôte, la réplication des phages et la lyse de la bactérie avec libération de phages de la descendance (Caly et al., 2015; Johnson et al., 2008). Les bactériophages pourraient être administrés à faibles doses car ils se répliquent lorsque leur bactérie hôte est présente. Leur usage est attrayant en raison de la spécificité phage - souche cible (Joerger, 2003).

Les enzymes lytiques (endolysines) ont été identifiées comme traitement potentiel contre les bactéries. Des enzymes comme la glucosidase, l'amidase, l'endopeptidase, la transglycosylase, appartiennent au groupe des endolysines ; elles sont générées au cours du cycle lytique tardif du phage en provoquant une dégradation du peptidoglycane de la bactérie hôte, permettant la libération de nouveaux phages à partir des bactéries infectées (Cheng et al., 2014). Ici le but de cette stratégie, pour un usage en industrie agroalimentaire, est de réussir à concevoir et à exprimer des enzymes pour qu'elles soient utilisées dans presque tous les environnements dans lesquels vivent les cellules bactériennes (Kon et Rai, 2016).

Les composés phytochimiques sont des métabolites secondaires des plantes jouant un rôle dans les mécanismes de défense contre les micro-organismes. Les substances antimicrobiennes à base de plantes peuvent être divisées en composés phénoliques, terpénoïdes (huiles essentielles), alcaloïdes, lectines et polyacétylènes (Cowan, 1999). Les molécules phytochimiques sont certifiées GRAS car ces substances actives sont utilisées depuis des temps immémoriaux comme agents aromatisants et comme ingrédients actifs dans une multitude de produits commerciaux, comme l'origan (carvacrol), le thym (thymol), ou le clou de girofle (eugénol) (Hofacre et al.,
2018). Les principaux modes d'action des huiles essentielles sur les cellules bactériennes sont la rupture de la paroi cellulaire et de la membrane cytoplasmique qui provoquent la fuite du contenu et des ions de la cellule, et dans le cas des composés phénoliques, l'abolition de la force proton motrice, du flux d'électrons et du transport actif (Kon et Rai, 2016).

Les inhibiteurs ciblant la pathogénicité comprennent les inhibiteurs du quorum sensing, de la formation de biofilms et de la virulence. La pathogénicité bactérienne est en partie régie par le système de régulation QS. En effet, le système QS est un processus de communication bactérienne qui dépend de la densité de la population bactérienne. Il se compose de molécules de signalisation appelés auto-inducteurs, de récepteurs et de protéines régulatrices en aval (Bhardwaj et al., 2013). Les inhibiteurs ciblant le QS peuvent bloquer les fonctions du système QS et empêcher ainsi la virulence bactérienne. Il a été rapporté que les bactéries sont plus sensibles aux antibiotiques lorsque ceux-ci sont utilisés en combinaison avec des inhibiteurs de QS (Cheng et al., 2014). Les biofilms sont des consortiums de bactéries structurés incorporés dans une matrice polymère autoproduite constituée de polysaccharides, de protéines et d'ADN. Les bactéries formant des biofilms peuvent provoquer des infections chroniques car ces structures confèrent une tolérance accrue aux antibiotiques et aux produits chimiques désinfectants, ainsi qu'une résistance à la phagocytose et à d'autres composants du système de défense de l'organisme (Czaplewski et al., 2016; Høiby et al., 2010). La vie du biofilm implique l'adhésion des cellules bactériennes, la régulation du QS, la maturation du biofilm et la propagation des bactéries. En conséquence, un seul médicament peut difficilement éliminer complètement les agents pathogènes dans ces structures (Cheng et al., 2014). A ce jour, plusieurs composés anti-biofilm ont été identifiés à partir de diverses sources naturelles, par exemple les furanones bromées, l'ail ou l'acide corosolique (Rabin et al., 2015).

Les prébiotiques, qui sont pour la plupart des oligosaccharides non digestibles, sont des additifs stimulant la flore commensale et améliorant la santé à l'hôte. Il existe un ensemble de prébiotiques d'origines et aux propriétés chimiques diverses. Les exemples de prébiotiques les plus connus sont l'inuline, les FOS, les GOS, le MOS, la lactulose et le polydextrose. Il y a également de nouveaux prébiotiques prometteurs comme les isomaltooligosaccharides, les XOS et les arabinoxylooligosaccharides dérivés de la fibre de blé (Patel et Goyal, 2012). Certains d'entre eux peuvent favoriser l'absorption des minéraux et réguler le métabolisme (Cheng et al., 2014).
Les probiotiques sont des microorganismes qui, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte. Les probiotiques peuvent interagir avec l'hôte pour améliorer l'immunité et la morphologie intestinale ou stimuler le métabolisme. Ils réduisent le risque d'infection par des agents pathogènes opportunistes en produisant des molécules ayant des activités antimicrobiennes, ou en entrant en compétition avec les souches pathogènes de l'hôte pour l'accès aux nutriments ou aux sites d'adhésion (Caly et al., 2015). Nous nous intéresserons à ces microorganismes plus en détails dans la section suivante.

Les symbiotiques sont les combinaisons des probiotiques et des prébiotiques et ont donc le double rôle. Les prébiotiques renforcent également les effets bénéfiques des probiotiques quand ils sont administrés sous formes combinées en tant que symbiotiques (Cheng et al., 2014).

Les peptides antimicrobiens (PAM) sont classés en deux catégories, selon leur mécanisme de synthèse ribosomique ou non ribosomique. Les PAM non ribosomiques, sont principalement produits par des bactéries. Ils sont synthétisés par des peptides synthétases avec ou sans modifications structurelles. Les PAM synthétisées par voie ribosomique peuvent être classées en fonction de leur origine, telles que les mammifères, les oiseaux, les amphibiens, les insectes, les plantes, les bactéries, les virus, etc. (Hancock et Scott, 2000). Les PAM produits par les animaux présentent un large spectre d'activité. Ils sont localisés plutôt dans les zones qui sont les plus susceptibles chez les animaux d'entrer en contact avec les pathogènes provenant de l'environnement. La famille de PAM plus présente dans le règne animal est celle des defensines (Han et al., 2011; Hancock et Scott, 2000).

Les bactériocines sont des PAM synthétisés par voie ribosomique. Elles sont décrites comme des molécules capables d'inhiber la croissance d'espèces étroitement apparentées à la souche productrice (bactériocinogènes) grâce à de nombreux mécanismes (Chikindas et al., 2018). Les bactériocines synthétisées par les bactéries lactiques ont la capacité de tuer ou d'inhiber les bactéries actives à des concentrations nanomolaires, contrairement aux peptides antimicrobiens produits par les cellules eucaryotes, qui ont d'ailleurs potentiellement des activités inférieures (Drider et al., 2016).

## IV. Les probiotiques

Ce terme, qui vient de la combinaison du latin « pro » qui veut dire pour, et « bios » du grec « biotique » qui veut dire vie, a été introduit en 1953 par le scientifique allemand Werner Kollath
pour désigner « des substances actives indispensables à un développement sain de la vie » (Gasbarrini et Bonvicini, 2016). Actuellement, la définition la plus répandue et reconnue est celle donnée par la FAO et l'OMS. Ces deux institutions ont défini les probiotiques comme «des microorganismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités suffisantes, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte » (FAO/OMS, 2002).

## IV.1. Critères de sélection des probiotiques

Fuller, en 1989, a énuméré toutes les caractéristiques typiques d'un probiotique :

1. Il s'agit d'une souche capable d'exercer un effet bénéfique sur l'animal hôte.

2. Il doit être non pathogène et non toxique.

3. Il doit être présent sous forme de cellules viables, de préférence en grand nombre.

4. Il doit être capable de survivre et être actif. Dans l'environnement intestinal, par exemple, il doit résister aux faibles valeurs de pHs et aux acides organiques.

5. Il doit être stable et rester viable pendant les périodes de stockage et les conditions du terrain.

## IV.2. Historique

L'histoire des probiotiques est intimement liée à l'utilisation d'aliments fermentés. L'utilisation de probiotiques dans les aliments remonte à l'Antiquité. Les premiers fabricants de produits alimentaires ont transformé le lait en produits laitiers fermentés à l'aide de bactéries et de levures, sans avoir conscience de leur existence. Les archéologues ont trouvé des preuves de l'utilisation de microorganismes dans les boissons fermentées dès 7 000 avant JC dans le village néolithique de Jiahu en Chine (Gasbarrini et Bonvicini, 2016; Ozen et Dinleyici, 2015).

Les yaourts et autres laits fermentés par des probiotiques doivent être considérés comme les premiers aliments fonctionnels (Azizpour et al., 2009). Elie Metchnikoff suggéra une relation causale entre la longévité des populations rurales bulgares et la consommation régulière de produits laitiers fermentés tel le yaourt (Fuller, 1992). Les propriétés sanitaires de ces produits laitiers faisaient partie du folklore jusqu'à l'apparition du concept de probiotiques, et leur étude formelle. Plusieurs peuplades ont utilisé des produits fermentés pour se guérir de certaines pathologies, car ces aliments sont très nutritifs, ils contiennent des micro-organismes vivants capables de
combattre certaines infections, et ils sont, en outre, un moyen d'augmenter le goût et la digestibilité des aliments (Gasbarrini et Bonvicini, 2016; Ozen et Dinleyici, 2015). Si Louis Pasteur a identifié les microorganismes responsables du processus de fermentation, Metschnikoff (1907), un scientifique russe travaillant à l'Institut Pasteur de Paris, tente dès 1907 de découvrir l'effet possible de ces « microbes » sur la santé humaine. Il a suggéré que lactobacilles pouvaient contrer les effets de putréfaction du métabolisme gastro-intestinal en réduisant le pH du côlon (par utilisation du lactose), en inhibant la croissance des bactéries protéolytiques (Azizpour et al., 2009; Ozen et Dinleyici, 2015).

Actuellement, à l'ère où les probiotiques commencent à trouver toute leur place en alimentation et en santé humaine et animale, différentes sociétés qui analysent les tendances du marché comme Transparency Market Research, Variant Market Research, INK WoodResearch ou CISION PR Newswire indiquent que le chiffre d'affaires du marché mondial des probiotiques devrait augmenter de 7,4% à 8,3% pour la période 2018 à 2026. Cette augmentation étant due à la sensibilisation des consommateurs à l'utilisation de probiotiques (Elshaghabee et al., 2017).

### IV.3. Marché des probiotiques et domaines d'applications

En raison de leurs capacités les bactéries lactiques sont largement utilisées dans l'industrie agroalimentaire comme conservateur biologique des aliments ou dans les élevages industriels pour la prévention des maladies infectieuses et zoonotiques (Quinto et al., 2014) (Figure 17). Ces bactéries sont aussi utilisées pour améliorer la performance des élevages animaux grâce à la production d'enzymes digestives, d'acides gras volatiles et/ou de vitamines, qui participent à l'augmentation de la digestibilité des nutriments et l'amélioration du taux de conversion des aliments (Liao et Nyachoti, 2017; Russo et al., 2014; Sharifuzzaman et Austin, 2017). L'EFSA présente la liste des probiotiques parmi eux les bactéries lactiques qui peuvent être ajoutés intentionnellement aux denrées alimentaires ou aux aliments pour animaux pour son statut QPS (https://efsa.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.2903/j.efsa.2017.4664).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 17.** Effets et apports des probiotiques sur la santé et la production des animaux.</figcaption></figure>

Les probiotiques peuvent avoir des effets bénéfiques multiples sur les organismes hôtes selon différents mécanismes qu'ils peuvent mettre en œuvre. Ils jouent un rôle clé dans (i) le système immunitaire en déclenchant des cascades de signalisation activant le système immunitaire (Corthésy et al., 2007; Hardy et al., 2013; Perdigon et al., 1995), (ii) l'absorption de nutriments par ses capacités métaboliques en donnant chez l'Homme des améliorations dans la diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires (Yoo et Kim, 2016), (iii) l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale (Ohland et Macnaughton, 2010), (iv) le contrôle de la pathogenèse (Collado et al., 2007a), ainsi que dans (v) la santé et les fonctions physiologiques de l'hôte (Wang et al., 2014b).

## IV.4. Sureté et innocuité

Selon un rapport de 2002, publié conjointement par l'OMS et FAO (2002), «Les probiotiques peuvent théoriquement être responsables de quatre types d'effets secondaires :

1. Infections systémiques.
2. Activités métaboliques délétères.

3. Une stimulation immunitaire excessive chez les individus sensibles.

4. Transfert de gènes »

Il est donc recommandé de s'assurer de l'innocuité des nouvelles souches probiotiques en déterminant leur profil de résistance aux antibiotiques ; en évaluant leurs activités métaboliques comme la production de D-lactate ou la dé-conjugaison des sels biliaires ; en évaluant leurs effets secondaires en effectuant des études *in vivo* sur animaux, en surveillant les effets indésirables pour les produits déjà commercialisés, et en recherchant la production de toxines et la présence d'activités hémolytiques potentielles (FAO/OMS, 2002).

## IV.5. La genèse des probiotiques

La plupart des probiotiques bactériens appartiennent aux bactéries lactiques et à *Bifidobacterium* sp. Au sein des bactéries lactiques, le genre le plus représenté est celui de *Lactobacillus* (Martínez Cruz et al., 2012 ; FAO, 2016). D'autres genres et espèces bactériens, tels que *Bacillus* sp. et *C. butyricum* ont également été utilisés pour leurs propriétés probiotiques (Ljungh et Wadström, 2006). Les levures ont été également testées lors de la recherche de nouveaux probiotiques. De bons candidats ont été retrouvés parmi les genres *Saccharomyces*, *Candida*, *Kluyveromyces* ou *Pichia* notamment. Le **Tableau 8** montre la liste exhaustive des micro-organismes à potentiel probiotique utilisés dans les élevages industriels.

La dose, le moment et la durée de l'administration des probiotiques peuvent être des facteurs affectant leur efficacité (Gaggia et al., 2010). D'autres facteurs concernant l'hôte, comme l'état de santé de l'animal ou son âge ont également leur importance.
<table><caption>**Tableau 8.** Probiotiques utilisés en productions animales</caption><thead><tr><th colspan="7">TYPES DE PROBIOTIQUES (Genre)</th></tr><tr><th rowspan="2">Animal</th><th rowspan="2">Levure</th><th colspan="2">Bactérie</th><th rowspan="2">Fungi</th><th rowspan="2">Microalgue</th></tr><tr><th>BL</th><th>Non-BL</th></tr></thead><tbody><tr><td>Volaille</td><td>Candida, Saccharomyces Kluyveromyces</td><td>Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus, Enterococcus, Weissella</td><td>Bacillus, Bifidobacterium, Clostridium Butyricicoccus</td><td>Aspergillus</td><td>-</td></tr><tr><td>Porc</td><td>Saccharomyces Kluyveromyces</td><td>Lactobacillus, Pediococcus, Enterococcus, Weissella</td><td>Clostridium, Bacillus Bifidobacterium,</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Ruminant</td><td>Saccharomyces Trichosporon, Kluyveromyces</td><td>Lactobacillus, Enterococcus</td><td>Megasphaera, Bacillus Prevotella, Propionibacterium Bifidobacterium,</td><td>Aspergillus</td><td>-</td></tr><tr><td>Aquaculture</td><td>Saccharomyces Debaryomyces</td><td>Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Enterococcus, Pediococcus, Carnobacterium, Weissella</td><td>Bacillus, Enterobacter, Pseudomonas, Streptomyces, Alteromonas, Clostridium, Roseobacter, Eubacterium, Brevibacterium, Microbacterium, Staphylococcus, Streptomyces, Micrococcus, Psychrobacter</td><td>Aspergillus</td><td>Tetraselmis, Phaeodactylum</td></tr></tbody></table>

BL : Bactéries lactiques. (Données obtenues de Banerjee et Ray, 2017a; Carnevali et al., 2017; FAO, 2016; Hai, 2015; Kabir, 2009; Liao et Nyachoti, 2017; Seo et al., 2010)

# V. Les bactéries lactiques et le potentiel probiotique

## V.1. Définition, systématique, taxonomie

Le taxon appelé bactéries lactiques regroupe des coques des bacilles ou coccobacilles à Gram-positif, non sporulées, tolérants à l'acide, anaérobies ou aérobies facultatifs ayant un pourcentage de G+C inférieur à 53%. Ces bactéries sont acidophiles avec un pH optimal de croissance compris
entre 3,5 et 6,5 (Pessione, 2012). La plupart des souches présentent des exigences nutritionnelles et nécessitent des milieux riches pour se développer. Ce groupe inclus 10 genres dont les plus connu sont Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc et Carnobacterium. Les bactéries lactiques font partie du phylum des Firmicutes, de la classe des Bacilli et de l'ordre des Lactobacillales (Figure 18).

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 18.** Taxonomie des bactéries lactiques. (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Tree&id=91061&lvl=3&lalin=f&keep=1&srchmode=1&unlock).</figcaption></figure>

Les bactéries lactiques occupent une variété d'habitats naturels, comme dans l'environnement. Elles sont importantes dans le processus d'ensilage, à l'obtention d'aliments fermentés et aux systèmes gastro-intestinaux des vertébrés. Certaines bactéries lactiques font aussi partie de la flore buccale et vaginale des animaux (Holzapfel et Wood, 1995; Werner et al., 2008).

## V.2. Physiologie

Une des caractéristiques principales de ce groupe de bactéries est la production d'acide lactique par fermentation homo ou hétéro-fermentaire du glucose (Quinto et al., 2014) (Figure 19). Les voies métaboliques par lesquelles les sucres sont convertis en acide lactique ont été bien établies et comprennent la fermentation homolactique par voie classique d'Embden-Meyerhof Pam (EMP)
pour la glycolyse. Les bactéries lactiques produisent soit exclusivement de l'acide lactique sous forme D (+) ou L (+), soit un mélange racémique des deux isomères (Holzapfel et Wood, 1995). La voie homo-fermentaire est caractérisée par le rôle prépondérant de l'aldolase. Par cette voie anaérobie, deux moles d'ATP sont formées par mole d'hexose. *Lb acidophilus*, *Lb. johnsonii*, *Lb. gallinarum*, *Lb. salivarius*, *Streptococcus thermophilus*, *E. faecium* ou *Pediococcus* spp. sont caractérisés par ce métabolisme.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 19.** Voies d'utilisation du glucose chez les bactéries lactiques. Le glucose est indiqué comme point de départ, bien que tout hexose métabolisable puisse alimenter ces voies avec les modifications appropriées. (Source : Gänzle et Gobbetti, 2013)</figcaption></figure>
Les organismes hétéro-fermentaires obligatoires fermentent les hexoses et les pentoses par la
voie de la 6-phosphogluconate/phosphokétolase (6-PG/PK). Ils synthétisent des quantités
équimoléculaires de lactate et d'éthanol ou d'acétate. Le CO2 étant également produit à partir des
hexoses (Gänzle et Gobbetti, 2013). La production d'ATP par voie hétéro-fermentaire des hexoses
est seulement d'une mole ATP par mole d'hexose. Lb. fermentum, Lb. brevis, Lb. reuteri et
Leuconostoc spp. utilisent cette voie.

Le troisième groupe est constitué d'organismes hétéro-fermentaires facultatifs qui fermentent les hexoses par la voie EMP et les pentoses et le gluconate par la voie 6-PG/PK. Par exemple Lb. casei, Lb. pentosus sont des organismes hétéro-fermentaires facultatifs (Holzapfel et Wood, 1995).

Le genre Lactobacillus comprend plus de 106 espèces décrites (Felis et Dellaglio, 2007). Les bactéries de ce genre sont des bacilles ou des coccobacilles. Elles sont catalase négative et ont un pourcentage de G+C < 54%. Selon Salvetti et al. (2012), le genre Lactobacillus, comprend 15 groupes phylogénétiques: Lb. delbrueckii, Lb. salivarius, Lb. reuteri, Lb. buchneri, Lb. alimentarius, Lb. brevis, Lb. collinoides, Lb. fructivorans, Lb. plantarum, Lb. sakei, Lb. casei, Lb. coryniformis, Lb. manihotivorans, Lb. perolens et le groupe Lb. vaccinostercus.

V.3. Intérêts industriels des bactéries lactiques

L'utilisation de bactéries lactiques pour la production d'acide lactique au niveau industriel est préférée à la production chimique en raison de la pureté de l'acide lactique obtenu par cette voie. Cet acide lactique est utilisé pour produire un nouveau type d'emballage biodégradable constitué d'acide poly-lactique ou PLA (en l'anglais) qui remplace les produits à base de pétrole (Ghaffar et al., 2014). Les bactéries lactiques sont utilisées dans la fermentation de diverses matières premières alimentaires telles que les fruits, les légumes, les céréales, la viande et le lait. Elles contribuent ainsi à la saveur, à la texture et à la durée de conservation des produits fermentés à destination de la consommation humaine et animale (Bron et Kleerebezem, 2011). Les bactéries lactiques sont notamment impliquées dans la production de produits fermentés tels les produits laitiers (yaourt, de fromage ou de laits fermentés). Ces bactéries apparaissent aussi sur le marché des aliments fonctionnels, et sont commercialisées sous formes de probiotiques. Elles sont alors utilisées pour exercer des effets bénéfiques sur la santé des consommateurs (Linares et al., 2017).
V.4. Résistance aux conditions gastro-intestinales

Une des caractéristiques requises chez les probiotiques est leur capacité à survivre aux conditions extrêmes retrouvées dans le tractus gastro-intestinal. Ceci afin de pouvoir assurer un apport suffisant de probiotiques viables et métaboliquement actives dans le compartiment intestinal. Plusieurs paramètres comme l'action des enzymes digestives, le pH acide, les défensines et les fortes concentrations en sels biliaires dans le tractus gastro-intestinal, affectent la viabilité et le métabolisme des souches bactériennes à visées probiotiques lors de leur transit dans le tractus digestif (Gonzalez-Rodriguez et al., 2013). Pour survivre dans les conditions hostiles, les bactéries utilisent plusieurs mécanismes. Pour survivre aux pH acides extrêmes, l'efflux actif de protons vers l'extérieur de la cellule par l'augmentation du nombre de F₀F₁-ATPase est observée; cette pompe est induite à faible pH et la régulation semble se produire au niveau transcriptionnel (Corcoran et al., 2005). Les cellules peuvent également séquestrer les protons intracellulaires par des réactions biochimiques qui consomment ces ions par décarboxylation d'acides aminés ou par génération d'ammoniac. Les bactéries peuvent aussi réparer ou prévenir les dommages dans les macromolécules ou modifier la perméabilité de la membrane cellulaire aux protons (Lund et al., 2014). Pour lutter contre l'acidité il a été montré que Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus ou Lb. plantarum augmentent la production d'ATPases (Lebeer et al., 2008).

En présence de bile, les acides biliaires s'accumulent dans le cytoplasme affectant l'homéostasie de la cellule, entraînant une fuite d'ions. Pour résister à la bile, certaines bactéries changent la composition lipidique et protéinique de leurs membranes par modification de la concentration des enzymes impliquées dans la synthèse des acides gras (Gonzalez-Rodriguez et al., 2013) ou la surexpression de protéines chaperones et de protéases pour contrer le repliement et l'agrégation des protéines. Les bactéries peuvent également mettre en œuvre la synthèse de composés protecteurs tels que des exopolysaccharides (Ventura et al., 2007) Le transport par pompes à efflux de la bile pour désintoxiquer ou effectuer la déconjugaison des sels biliaires par l'hydrolase des sels biliaires est également un mécanisme pouvant intervenir dans ce cas de figure (Gonzalez-Rodriguez et al., 2013). Enfin, on observe la mise en place de systèmes efficaces de réparation de l'ADN et des protéines (Lebeer et al., 2008; Lund et al., 2014). Parmi les bactéries lactiques, Lb. acidophilus, Lb. plantarum et Lb. reuteri peuvent évacuer la bile vers le milieu extracellulaire par l'entremise de systèmes intervenant également dans la résistance à des molécules thérapeutiques (comme les
systèmes d’efflux multi-médicaments AcrAB et EmrAB) (Begley et al., 2005; Lebeer et al., 2008). D’autres espèces comme *Lb. acidophilus*, *Lb. gasseri* ou *Lb. johnsonii* produisent de la BSH.

## V.5. Adhésion aux cellules intestinales

Une bonne aptitude d'adhésion aux cellules intestinales est généralement considérée comme une caractéristique souhaitable pour les probiotiques. Ainsi le temps de rétention des probiotiques dans l'intestin est accru, augmentant les chances d'exercer leurs actions bénéfiques comme l'exclusion compétitive des agents pathogène ou l'interaction avec les cellules hôtes, la protection des cellules épithéliales ou la modulation de la réponse immunitaire (Collado et al., 2008; Lebeer et al., 2008). Certains des facteurs agissant sur l'adhésion sont souche dépendants, comme par exemple la composition en protéines, en polysaccharides, les charges ioniques, les acides lipotéichoiques ou les interactions électrostatiques (Servin et Coconnier, 2003 ; Larsen et al., 2007, Granato et al., 1999). L'hydrophobicité joue un rôle clé dans le premier contact entre une cellule bactérienne et les cellules muqueuses ou épithéliales (Polak-Berecka et al., 2014). La présence de l'adhésine spécifique du mannose est requise pour l'adhésion chez *Lb. plantarum* WCFS1. Certaines souches de lactobacilles synthétisent des pili liant le mucus, ce qui augmenterait leur capacité de colonisation comme pour *Lb. reuteri* (Lebeer et al., 2008; Madsen, 2012). Dans le cas de *Lb. acidophilus* la capacité d'adhésion est multifactorielle, elle dépend de la présence de gènes codants la protéine liant la fibronectine (FbpA), la mucine (Mug) et une protéine de couche de surface (SlpA) (Lebeer et al., 2008).

## V.6. Mécanisme d'action contre les bactéries pathogènes

Certaines bactéries probiotiques vont interférer, voire annihiler la pathogénicité des agents microbiens causant des pathologies. Ceci par différents mécanismes, directs ou indirects, notamment en éliminant ou en inhibant la croissance des bactéries pathogènes dans la lumière intestinale. Les bactéries probiotiques sont parfois capables de produire des substances antibactériennes, d'entrer en compétition avec les pathogènes pour les nutriments, les facteurs de croissance et les sites de fixation à l'épithélium intestinal. Elles peuvent également exercer des fonctions immunobiotiques en modulant la réponse immunitaire de l'hôte lui permettant ainsi de mieux faire face aux infections.
a) Mécanisme direct par production de substances antibactériennes

Les bactéries lactiques probiotiques peuvent produire une large gamme de molécules capables
de réduire le nombre de pathogènes en modifiant leurs capacités métaboliques ou leur aptitude à
produire des toxines (Liao et Nyachoti, 2017) (Figure 20).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 20.** Substances antibactériennes produites par les bactéries lactiques</figcaption></figure>

Comme indiqué, les bactériocines sont des peptides antimicrobiens, produits à la fois par les bactéries à Gram-négatif et à Gram-positif, synthétisés par voie ribosomique (Drider et Rebuffat, 2011). Elles sont le plus souvent dépourvues de caractéristiques cytotoxiques (Belguesmia et al., 2010). Elles ont généralement un spectre d'activité étroit agissant ainsi sur la souche cible sans affecter le microbiote, contrairement aux antibiotiques. Différentes études ont mise en évidence le pouvoir inhibiteur in vitro des bactériocines produites par les bactéries lactiques contre divers agents zoonotiques. Ces molécules sont non toxiques et non immunogènes (Cotter et al., 2012). Nous pouvons citer par exemple, les plantaricines produites par Lb. plantarum actives contre Clostridium, Salmonella, Staphylococcus ou Pseudomonas (Seddik et al., 2017) ; La pédiocine PA-1 produite par Ped. acidilactici est active contre un grand nombre de bactéries à Gram-positif ; les
entérocines agissent contre *Staphylococcus aureus*, *C. perfringens*, *E. coli* et *Salmonella* (Al Atya et al., 2016; Caly et al., 2017; Grande Burgos et al., 2014). Les salivaricines comme celle produite par *Lb. salivarius* B-30514 qui inhibe *Campylobacter jejuni* chez les volailles (Stern et al., 2008).

Parmi les acides organiques produites par les bactéries lactiques, le plus connu est l'acide lactique, mais certains BL hétéro-fermentaires peuvent produire de l'acide acétique dans des conditions anoxiques (Elferink et al., 2001; Schnürer et Magnusson, 2005). Ces acides ont un spectre d'action large (Zhitnitsky et al., 2017) car ils agissent en réduisant le pH intracellulaire et en inhibant le transport actif, ainsi que différentes fonctions métaboliques. Prises dans leur ensemble, ces perturbations affectent la croissance des agents pathogènes (Surendran Nair et al., 2017).

L'acide phenyllactique et son dérivé l'acide 4-hydroxy phenyllactique sont produits par des bactéries lactiques comme *Lb. plantarum*, *Lb. alimentarius*, *Lb. brevis*, *Leu. mesenteroides*, etc. (Valerio et al., 2004). Ils présentent activité contre les champignons tels que affectant à la différenciation hyphal d'Aspergillus, Penicillium entre autres (Svanström et al., 2013). L'acide phenyllactique est également active contre bactéries comme Listeria, Staphylococcus ou Enterococcus (Valerio et al., 2004).

L'éthanol, produit par les bactéries lactiques hétéro-fermentaires en tant que produit de la voie de la glycolyse, affecte la fluidité de la membrane (Elshaghabee et al., 2016). Le diacétype généré par l'excès de pyruvate lors du métabolisme du citrate interfère avec l'utilisation de l'arginine en réagissant avec la protéine de liaison à l'arginine des bactéries à Gram négatif (Lindgren et Dobrogosz, 1990).

Le dioxyde de carbone, crée un environnement anaérobie où les bactéries aérobies ne peuvent pas se développer (Singh, 2018).

Le peroxyde d'hydrogène agit via la réaction en chaîne anionique superoxyde qui augmente l'oxydation toxique (Surendran Nair et al., 2017).

D'autres types de métabolites peuvent avoir des actions antimicrobiennes. La reutérine produite par *Lb. reuteri* est un métabolite secondaire dérivé de la fermentation du glycérol. Elle possède un large spectre d'activité, résiste aux enzymes protéolytiques et lipolytiques et agit en inhibant la synthèse de l'ADN (Singh, 2018). La reutericycline, premier antibiotique de faible poids
moléculaire produit par les bactéries lactiques, quant à elle est active contre bactéries à Gram-
positif et Gram-négatif ainsi que plusieurs champignons et levures (Reis et al., 2012).

b) Mécanisme indirect par exclusion compétitive

Les bactéries lactiques probiotiques peuvent exclure ou réduire la croissance d'autres micro-
organismes dans le tractus gastro-intestinal, par compétition directe ou indirecte pour les
nutriments ou la surface d'adhésion (Oelschlaeger, 2010). Le tractus gastro-intestinal est réputé
pour son abondance en nutriments, ce qui en fait un environnement propice à la colonisation
microbienne. Le fait que les agents pathogènes ne puissent pas adhérer à la muqueuse intestinale
entrave le développement de l'infection et affecte la population des agents pathogènes par le flux
constant de digesta (Callaway et al., 2008; Liao and Nyachoti, 2017; Yirga, 2015). Chez les
bactéries lactiques, les probiotiques comme Lb. plantarum ou Lb. rhamnosus GG stimulent la
production de mucine dans les cellules intestinales ce qui empêche l'adhésion des souches
pathogènes de Salmonella, Clostridium et E. coli (Oelschlaeger, 2010). Lactobacillus spp. et Lb.
pentosus HC-2 peuvent par exclusion compétitive empêcher le développement respectivement de
C. difficile ou Vibrio parahemolyticus (Arruda et al., 2016; Sha et al., 2016a). Des souches de
Lb. salivarius, seules ou en combinaison avec Ent. faecium PXN-33, ont également été capables
de réduire la colonisation de Salmonella Enteritidis (Carter et al., 2017; Casarin Penha Filho et
al., 2015).

V.7. Effets bénéfiques associés aux probiotiques

Il a été établi que les bactéries lactiques étaient capables d'agir positivement sur le système immunitaire, affectant à la fois la réponse immunitaire innée et la réponse adaptative, réduisant ainsi la colonisation par des agents pathogènes (Ashraf et Shah, 2014; Tellez et al., 2012; Tsai et al., 2012). Les bactéries lactiques possèdent différentes propriétés immunomodulatrices en raison de leur capacité à induire la production de cytokines intervenant dans les mécanismes de réponses immunitaires innées ou adaptatives (Kiczorowska et al., 2017). Les effets immunorégulateurs des probiotiques ont été suggérés comme étant souche, et probablement aussi espèce et hôte, spécifique (Vlasova et al., 2016). Les probiotiques peuvent moduler l'activité du système immunitaire par différentes voies comme la stimulation des macrophages, augmentant ainsi la phagocytose (Brisbin et al., 2015), et l'expression d' IFN-γ et l'IL-1β, IL-6, IL-8 et IL-12 (Quinteiro-Filho et
al., 2015). Les probiotiques peuvent générer un effet anti-inflammatoire quand ils inhibent la sécrétion de l'IL-6 et de l'IL-8 ou quand ils induisent les cellules T et les cellules dendritiques. Ils peuvent également activer l'immunité cellulaire en stimulant la production d'IL-12 par ces dernières (Shida et Nanno, 2008).

## V.8. Innocuité des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont reconnues comme GRAS (Etats-Unis), ou QPS (Europe), car elles colonisent de manière naturelle le tractus intestinal animal et humain et qu'elles sont également utilisées en industrie agro-alimentaire. Par ailleurs, les hommes ont été de longue date exposés à ces bactéries sans manifestations d'effets secondaires sauf chez personnes immunodéprimées ou souffrant d'autres maladies graves sous-jacentes (EFSA, 2007). Toutefois certaines souches de *Lactobacillus* ont été isolées d'échantillons cliniques d'endocardites et bactériémie. Ces souches cliniques présentent de phénotypes différents de celles qui ont le statut de probiotique (Gouriet et al., 2012; Salminen et al., 2004).

## V.9. Culture de barrière

La capacité de l'épithélium intestinal à agir comme une barrière entre l'environnement externe et le milieu interne est absolument essentielle pour la santé humaine et animal (Arrieta et al., 2006). Les cellules épithéliales intestinales sont supposées être les premières et les plus importantes cellules cibles de l'action des probiotiques (Lebeer et al., 2008). Il a été démontré que les souches probiotiques ont des effets bénéfiques liés à la fonction nutritive de l'épithélium intestinale (Lebeer et al., 2008). Elles améliorent également la fonction de barrière intestinale en stimulant : la production de mucus et de peptides antimicrobiens, l'augmentation des réponses immunitaires, l'amélioration de l'expression et / ou de la localisation des protéines de jonction serrée, empêchant l'apoptose des cellules épithéliales dû à des facteurs externes et l'induction de molécules cytoprotectrices (Madsen, 2012) (Figure 21).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 21.** Mécanismes d'action des probiotiques dans le renforcement de la barrière épithéliale (Source: Madsen, 2012).</figcaption></figure>

## V.9.1. Interactions métaboliques entre les probiotiques et l'hôte

L'exposition à un probiotique peut modifier le microbiote intestinal et altérer le métabolisme lipidique hépatique, associé à une diminution des lipoprotéines plasmatiques, à une augmentation des taux de triglycérides et à une glycolyse stimulée apparente (Lebeer et al., 2008). Certains auteurs ont observé des changements dans d'autres voies, notamment le métabolisme des acides aminés, des méthylamines et des acides gras à chaîne courte tels que le butyrate (Martin et al., 2008). Le butyrate est une source d'énergie particulièrement importante pour les cellules muqueuses du côlon, et il a été suggéré qu'il est nécessaire pour le maintien de l'épithélium intestinal (Donohoe et al., 2012).

## V.9.2. Préservation de la barrière épithéliale.

a) *Effets sur les jonctions épithéliales serrées*
Les jonctions épithéliales serrées se trouvent entre les cellules épithéliales et sont une série de jonctions intercellulaires le long des marges latérales. Ces structures sont complexes, constituées de composants lipidiques et protéiques. Les interactions spécifiques entre les protéines transmembranaires, les protéines adaptatrices intracellulaires et le cytosquelette d'actine sont impliquées dans l'assemblage des jonctions serrées. L'occludine, les claudines, la molécule d'adhésion jonctionnelle et la tricelluline sont les principales protéines transmembranaires impliquées (Rao et Samak, 2013). Du côté intracellulaire de la membrane, une des extrémités de ces protéines interagit avec les protéines de jonction serrée *zonula occludens* (ZO) : ZO-1, ZO-2 et ZO-3 (Figure 22) (Arrieta et al., 2006).

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 22.** Structure de jonctions serrés des cellules épithéliales. (Source : Arrieta et al. (2006)).</figcaption></figure>

Plusieurs études montrent que les probiotiques augmentent la résistance épithéliale par différentes voies :

1. Phosphorylation accrue de ZO-1 et d'occludine comme pour *Lb. rhamnosus* et *Bifido. lactis* (Mathias et al., 2010).

2. L'augmentation de l'expression protéique de ZO-1 et d'occludine, mécanisme décrit lors de l'utilisation du mélange probiotique VSL#3 (*Lactobacillus*, *Lactococcus* et *Bifidobacterium*) (Ewaschuk et al., 2008).

3. L'augmentation des niveaux d'expression de nombreux gènes liés aux jonctions serrées, y compris ceux codant pour les protéines d'ancrage de l'occludine et du cytosquelette par *Lb. plantarum* (Anderson et al., 2010).
Les probiotiques sont aussi capables de préserver les jonctions serrées des perturbations induites par les facteurs IFNγ and et TNFα comme par exemple *Lb. rhamnosus* GG ou le mélange VSL #3 (Madsen, 2006).

b) *Molécules cytoprotectrices*

Les probiotiques peuvent également améliorer la fonction de la barrière épithéliale de l'intestin en augmentant la production de molécules cyto-protectrices telles que les protéines de choc thermique (HSP). Les protéines de choc thermique sont omniprésentes dans tous les organismes où elles jouent un rôle physiologique important dans des conditions normales et des situations impliquant à la fois un stress systémique et cellulaire (Hao et al., 2012; Park et Seo, 2015). Dans les cellules stressées, ces protéines sont produites afin de maintenir l'homéostasie. La plupart des HSP ont des effets cytoprotecteurs importants, elles sont impliquées dans de nombreuses voies de régulation et se comportent comme des chaperonnes moléculaires pour d'autres protéines cellulaires (Kregel, 2002). *Lb. rhamnosus* GG, ou *B. subtilis* induisent également l'expression épithéliale de ces protéines de choc thermique cytoprotectrices (Madsen, 2012).

c) *Effets sur l'apoptose*

Les probiotiques sont également capables de prévenir les lésions épithéliales induites par les cytokines et les molécules oxydantes en favorisant la survie des cellules (Madsen, 2012). Cette réduction de l'apoptose permettrait de maintenir l'intégrité de la barrière épithéliale et d'accroître la résistance aux agents pathogènes en réduisant les ruptures de la barrière muqueuse. Les protéines solubles dérivées de *Lb. rhamnosus* GG, p40 et p75, empêchent ainsi les lésions épithéliales induites par les cytokines et l'apoptose (Yan et Polk, 2012).

# VI. Autres probiotiques

VI.1. Les bactéries probiotiques autres que les bactéries lactiques

Différents genres présentent des propriétés probiotiques et sont commercialisés pour une
utilisation à destination des élevages, parmi ceux-ci on retrouve *Bifidobacterium*, *Bacillus* ou *C*.
butyricum (FAO, 2016a). Les bifidobactéries sont des bactéries productrices d'acide lactique, non sporulées, à Gram-positif. Elles se différencient des bactéries lactiques notamment par un pourcentage de G+C de 55-67 % et une synthèse importante d'acides gras à chaîne courte. Ces bactéries ont été amplement étudiées comme probiotiques pour les Humains (Vlasova et al., 2016). Des études ont été faites sur différentes espèces comme *Bifido. animalis*, *Bifido. bifidum*, *Bifido. bifidus*, *Bifido. thermophilus*, *Bifido. longum*, *Bifido. pseudolongum* et *Bifido. lactis* notamment pour leurs applications chez les animaux (FAO, 2016a). Certaines souches sont capables d'induire une augmentation du poids chez les porcelets (Ezema, 2013). *Bifido. lactis* BB-12 est la souche type utilisée pour la prévention de l'entérocolite nécrosante (Quinto et al., 2014). Par ailleurs *Bifido. breve* et *Bifido. pseudocatenulatum* peuvent inhiber l'expression de la shiga-toxine chez *E. coli* (STEC) O157:H7 (Oelschlaeger, 2010). Les bactéries formant des spores, en particulier celles du genre *Bacillus*, sont de plus en plus utilisées comme probiotiques, car elles ont la capacité de résister aux conditions et aux facteurs physiques et environnementaux extrêmes, tels la chaleur, la dessiccation et les rayonnements UV. Les spores de *Bacillus* peuvent survivre aux pHs extrêmes de l'estomac, tolérer les sels biliaires et les autres conditions hostiles du tractus gastro-intestinal (Elshaghabee et al., 2017). Ces propriétés de résistance permettent aux souches de conserver leur viabilité dans les conditions de fabrication des pellets, de manipulation et de stockage (FAO, 2016a). Les espèces les plus exploitées sont *B. coagulans*, *B. subtilis* et *B. licheniformis* (FAO, 2016a). Certaines souches de *Bacillus* présentent des activités anti-oxydantes, immunomodulatrices ou antimicrobiennes chez l'hôte. Plusieurs substances antimicrobiennes sont actives contre les bactéries et les champignons (Baruzzi et al., 2011). Par exemple, des bactériocines de la famille des lantibiotiques (la subtiline, la subtilosin ou la mersacidine) sont produites par *B. subtilis* (Stein, 2005). La coaguline de la famille des « pediocin-like » est produites par *B. coagulans* (Marrec et al., 2000). Enfin, des lipopeptides de la famille des surfactines (surfactine, lichenysines et pumilacidines), sont produits par plusieurs souches de *B. subtilis*, *B. licheniformis*, ou *B. pumilus* (Baruzzi et al., 2011). L'influence positive des souches probiotiques de *Bacillus* sur la croissance et la composition d'espèces communes et bénéfiques sur l'intestin pourrait être médiée par la production d'enzymes, de vitamines et de peptides extracellulaires (Elshaghabee et al., 2017).

Une autre bactérie probiotique, en dehors du groupe des bactéries lactiques est *C. butyricum*.
Même si elle appartient au groupe de clostridies connues généralement pour leur pathogénicités ;
c'est une bactérie favorise la croissance des lactobacilles et des bifidobactéries et inhibe la diarrhée associé aux antibiotiques, notamment sous l'effet du butyrate sur la prolifération des cellules muqueuses de l'intestin (Yang et al., 2012). Qui plus est *C. butyricum* peut produire des endospores, ce qui lui confère un avantage pour être utilisé comme probiotique. Cette bactérie produit de grandes quantités d'acides gras à chaines courtes, tels que le butyrate et l'acétate. Les AGC constituent une source d'énergie importante pour les cellules intestinales, permettant la prolifération des entérocytes. Elles ont également des effets immunomodulateurs sur l'inflammation du côlon. Ils constituent dès lors une option thérapeutique pour les maladies inflammatoires de l'intestin en agissant sur la sécrétion de cytokines inflammatoires (Cassir et al., 2016; Kanai et al., 2015). Elles présentent également des effets préventifs et thérapeutiques sur les infections à *E. coli* entérohemorragique O157: H7 et contre certains *Clostridium* par production de butyricine, une bactériocine à spectre d'activité étroit (Takahashi et al., 2004; Kanai et al., 2015). Yang et al. (2012) montrent également que certaines souches peuvent être utilisées comme « facteurs » de croissance chez les poulets.

## VI.2. Les levures probiotiques

Parmi les microorganismes eucaryotes utilisés comme probiotiques chez l'homme ou l'animal, les levures constituent le groupe le plus représentatif. Elles agissent sur les réponses immunitaire, anti-inflammatoire, ont des effets cliniques contre les symptômes diarrhéiques ou les agents pathogènes entériques et maintiennent l'intégrité de la barrière épithéliale entre autres (Moslehi-jenabian et al., 2010). *Sch. cerevisiae* et *Sch. cerevisiae var boulardii* sont les seules souches de levures commercialisées pour leurs vertus probiotiques (Nayak, 2011). Les levures autres que *Sch. cerevisiae* ayant des propriétés probiotiques appartiennent aux genres *Pichia*, *Metschnikowia*, *Yarrowia*, *Candida*, *Debaryomyces*, *Isaatchenkia*, *Kluyveromyces* (Vohra et al., 2016). Ces microorganismes présentent un intérêt au niveau probiotique pour leurs activités antibactérienne et antifongique contre des pathogènes comme *S. aureus*, *E. coli*, *Salmonella* et *P. aeruginosa*, et pour leurs effets anti-inflammatoires sur les mécanismes immunitaires de l'hôte (Ait Seddik et al., 2016; Ceugniez et al., 2017; Nayak, 2011).

La supplémentation des aliments avec des levures probiotiques améliore non seulement la qualité nutritive des aliments pour animaux mais aussi leur croissance et leurs performances. Ces
levures contiennent des protéines de grande valeur, de la vitamine B et des oligo-éléments. Elles produisent également des enzymes extracellulaires telles que les amylases, la β-galactosidase et les phytases qui augmentent la digestibilité de certains aliments (Vohra et al., 2016).

En comparaison avec les probiotiques procaryotes, les levures ne sont pas affectées par les traitements antibiotiques, et il n'y a pas non plus de phénomène de transfert de gènes de résistance aux antibiotiques. Cependant, elles présentent une faible capacité à produire des composés antagonistes et à coloniser l'intestin (Nayak, 2011).

Dans cette synthèse bibliographique, nous montrons que suite aux longues années d'utilisation sans discernement des antibiotiques chez les animaux d'élevage et plus concrètement chez la volaille, les agents pathogènes ont développé des mécanismes de résistance multiples. Pour lutter contre ces résistances, et spécialement celle que pourrait acquérir l'agent de l'entérite nécrotique (C. perfringens), nous proposons l'utilisation de bactéries lactiques en tant que probiotiques comme une des alternatives possibles. Différentes études ont montré que certaines bactéries lactiques ont la capacité de limiter le développement de maladies, d'augmenter les performances de croissance des animaux sains et malades, et d'améliore la qualité des sous-produits de cette industrie.
# Stratégie expérimentale et
objectifs de la thèse
Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de cette thèse CIFRE, en collaboration entre l'Institut Charles Viollette (Université de Lille) et le groupe Lesaffre (par l'intermédiaire de sa filiale Phileo Lesaffre Animal Care) ont pour objectifs de développer des concepts biologiques basés sur l'utilisation des bactéries lactiques en vue de réduire voire de contrôler le développement de *Clostridium perfringens* une bactérie toxinogène responsable de l'entérite nécrotique du poulet de chair. En effet, cette infection bactérienne est à l'origine de pertes économiques colossales estimées à plusieurs milliards de dollars (Wade et Keyburn, 2015).

La démarche scientifique préconisée dans le cadre de cette thèse repose sur l'isolement de nouvelles souches de bactéries lactiques à activité anti *C. perfringens* à partir de caeca de poulets car cet organe est connu pour contenir un nombre élevé de *Clostridium*, bactérie anaérobie se développant dans cet environnement dépourvu en oxygène, et de bactéries lactiques. Du fait des interactions bactériennes susceptibles de se produire dans cet écosystème microbien, le caecum offre une possibilité d'isoler des bactéries lactiques antagonistes.

Ainsi, trois caeca de poulets sains ont été prélevés après dissection de l'appareil digestif. Chaque caecum a servi à l'isolement de bactéries lactiques par une approche culture-dépendante dite approche culturomique. Cette approche consiste en un broyage des échantillons, de leur dilution en série dans du tampon PBS et de leur étalement sur des milieux spécifiques des bactéries lactiques, à l'instar des milieux MRS, LAMVAB et Elliker. A l'issue d'une période d'incubation de 24h à 37°C en condition anaérobie, le développement de colonies bactériennes a été recherché dans les boîtes de Pétri. Les colonies ont été observées pour déterminer les différences macroscopiques de forme, de taille et de couleur. Un nombre significatif de colonies répondant aux critères des bactéries lactiques a été étudié pour des critères phénotypiques de base tels que la coloration différentielle de Gram et la présence de la catalase. Les bactéries Gram-positif et dépourvues de catalase ont été considérées comme étant potentiellement des bactéries lactiques, permettant ainsi de constituer une collection de 70 souches.

L'identification de ces bactéries a été confirmée par profilage protéique en utilisant la technique de spectrométrie de masse MALDI-TOF. A la suite de cette identification, des groupes de bactéries lactiques ont été constitués par une approche moléculaire PCR-RAPD pour établir une possible relation phylogénétique entre les bactéries de la même espèce réduisant ainsi les possibilités de doublons.
A partir de chaque groupe phylogénétique ainsi constitué, un nombre significatif de souches a été étudié pour ses capacités antagonistes, à travers la production de substances inhibitrices extracellulaires, ou encore à travers d'autres mécanismes d'inhibition comme les contacts cellulaires entre la bactérie lactique en question et la bactérie cible, à savoir *C. perfringens* DSM 756. Ce criblage a permis d'isoler 50 bactéries lactiques à activité anti-*C. perfringens* par la méthode de contact cellulaire.

Cette collection de bactéries lactiques dotées d'activité anti-*C. perfringens* a fait l'objet de tests visant à établir leurs capacités à former des biofilms, ou encore à produire de l'acide lactique. Ces deux tests ont été conçus pour affiner les capacités antagonistes de ces nouvelles souches de bactéries lactiques isolées de caeca de poulets. La capacité de former un biofilm est un critère technologique important donnant des possibilités de mieux s'opposer à la prolifération des bactéries pathogènes. Concernant la production d'acide lactique, celui-ci est connu pour ses propriétés inhibitrices d'une large gamme de microorganismes. La combinaison de ces deux critères a permis de sélectionner les bactéries lactiques les plus performantes parmi lesquelles *Lb. reuteri* ICVB412, ICVB413, ICVB414, ICVB415, ICVB416, ICVB417, ICVB418, ICVB419, et ICVB493, et *Lb. salivarius*, ICVB421, ICVB423, ICVB429, et ICVB430. La survie de ces 13 bactéries lactiques a été réalisée dans les conditions mimant le système gastro-intestinal du poulet (pH, enzymes, bile). De la même manière, les capacités d'agrégation (autoagrégation et coagrégation) ont été déterminées. A l'issue de cette double analyse, seules les souches *Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430 ont été retenues pour la suite du projet, qui consiste en la caractérisation *in vitro* de leurs propriétés probiotiques (cytotoxicité contre la lignée cellulaire humaines HT-29 et leur adhésion sur la lignée cellulaire humaine Caco-2, résistances aux antibiotiques, activité hémolytique). Avant les tests *in vivo* pour valider cette activité anti-*C. perfringens*, des essais de viabilité cellulaire dans l'eau et après lyophilisation ont été réalisés dans le but de déterminer leur mode d'administration.

Après cette description de notre stratégie expérimentale, il convient de revenir sur les objectifs scientifiques, sociétaux et industriels de cette thèse.
## 1. Objectifs scientifiques

i. Développer des formulations bactériennes plus particulièrement des bactéries lactiques susceptibles d'être utilisées en prévention de l'entérite nécrotique dans les élevages de poulets.

ii. Décrypter la diversité en bactéries lactiques du caecum de poulet.

iii. Mettre en relief les bactéries lactiques antagonistes et leur potentiel probiotique.

## 2. Objectifs sociétaux

i. Contribuer à la réduction de l'utilisation des antibiotiques en santé animale.

ii. Créer un lien « produit-consommateur » basé sur une qualité biologique

## 3. Objectifs industriels

i. Développer un produit à base de bactéries lactiques économiquement rentable.

ii. Elargir la gamme des produits de l'entreprise partenaire du projet CIFRE

iii. Renforcement de l'activité et du savoir-faire de l'entreprise dans le domaine de la santé animale.
# Matériels et Méthodes
# 1. Isolement de bactéries lactiques

Afin d'isoler des bactéries lactiques du microbiote intestinal du poulet, trois intestins de poulets de chair sains ont été obtenus auprès de la Ferme Dupire située à Wambrechies dans la région des Hauts-de-France. L'isolement a été réalisé à partir du caeca, une paire de saillies qui se projettent du côlon proximal à sa jonction avec l'intestin grêle (Clench et Mathias, 1995).

## 1.1. Préparation du caecum

Les deux caeca de chaque poulet découpés et pesés (environ 20g pour chaque diverticule) (Figure 23). Une dilution au 1:5 de ces caeca est réalisée dans du tampon PBS (*Phosphate Buffered Saline* 1x, pH 7,4). Chaque caecum est ensuite repris dans 100 mL de ce même tampon 1x. Une homogénéisation de l'échantillon est réalisée au « stomacker » pendant 3 minutes, à température ambiante. Afin de déterminer les charges bactériennes des différents échantillons, des dilutions en séries sont réalisées dans du PBS. 100 µl des dilutions allant de $10^{-5}$ à $10^{-7}$ sont ensemencés sur les milieux gélosés LAMVAB, MRS et Elliker. Les boîtes de Pétri sont ensuite incubées pendant 20h à 37°C en anaérobiose, en utilisant une jarre et des sachets d'anaérobiose (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, France).

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 23.** Illustration du tractus gastro-intestinal du poulet. (Photo Institut Charles Viollette)</figcaption></figure>
## 1.2. Milieux de dénombrement et d'isolement des bactéries lactiques

Plusieurs milieux d'isolement ont été choisis pour isoler les souches de bactéries lactiques.

* Le milieu Elliker (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, France) pour la culture des streptocoques et des lactobacilles.

* Le milieu MRS (Sigma-Aldrich, St. Quentin Fallavier, France) c'est un milieu normé pour la culture des bactéries lactiques.

* Le milieu LAMVAB pour la croissance des lactobacilles résistant à la vancomycine. Il s'agit d'un milieu MRS complémenté avec L-cystéine-HCl (0,25 g/L) (Sigma-Aldrich) et vancomycine (20 mg/L) (Sigma-Aldrich) (Hartemink et al., 1997). La vancomycine est un antibiotique inhibant la synthèse de la paroi cellulaire des bactéries à Gram-positif. Cette résistance est intrinsèque chez lactobacilles (Tynkkynena, et al., 1998).

## 1.3. Isolement après enrichissement

Dans ce travail, l'isolement de bactéries lactiques a été également réalisé après enrichissement afin de favoriser leur croissance. Pour cela, 1 g de caecum est mis dans 9 mL de plusieurs bouillons MRS ajustés à différents pHs: MRS pH 6,5 ; MRS pH4 ; MRS additionné de vancomycine (20 mg/L) et MRS pH4 additionné de vancomycine (20 mg/L). Tous les échantillons sont incubés pendant 20h à 37°C. Après cette période d'incubation, les échantillons sont repiqués sur gélose MRS et incubés en anaérobiose, pour obtenir colonies isolées.

# 2. Identification des souches

## 2.1. Tests préliminaires d'identification des bactéries lactiques et conservation

Les colonies obtenues sur gélose MRS sont choisies, selon leur morphologie, leur couleur et leur taille. Les colonies circulaires ou crénelées, blanc crème de diamètre 0,5 – 2,5 mm sont ensuite repiquées aléatoirement sur gélose MRS afin de vérifier leur pureté. Des tests de pré-identification, en utilisant la coloration différentielle de Gram et la recherche d'enzymes respiratoires (catalase et oxydase) sont ensuite réalisés. Les souches à Gram-positif, dépourvues de catalase et d'oxydase ont été retenues pour la suite du travail. Les souches isolées ont été purifiées par mise en culture dans 5 mL de bouillon MRS. Après 24h d'incubation à 37°C, les cultures sont centrifugées 10 min
à 10 000 g à 4°C. Le surnageant est ensuite remplacé par le bouillon MRS contenant du glycérol à 20%, puis les suspensions ainsi obtenues sont conservées à -20°C et -80°C

## 2.2. Identification moléculaire et proximité génétique des bactéries lactiques isolées.

Toutes les souches isolées ont été identifiées par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Autoflex speed, Bruker®). Un typage moléculaire par la technique RAPD-PCR (*fingerprinting*) a été réalisé afin d'avoir une reconnaissance spécifique de souches de la même espèce et supprimer les doublons.

### 2.2.1 Identification par spectrométrie de masse : Maldi-TOF

* **Principe de l'identification par MALDI-TOF**

Le MALDI-TOF est une technique basée sur l'ionisation de l'échantillon co-cristallisé par des impulsions courtes de laser. Les ions sont accélérés et leur temps de vol est mesuré dans un tube de vol à vide. L'énergie du laser vaporise, dans notre cas, le microorganisme avec la matrice conduisant à l'ionisation des protéines. Le temps de vol des protéines ionisées donne un spectre caractéristique de la carte peptido-protéique d'un type cellulaire, chaque temps de vol étant mesuré selon le rapport m/z où m est la masse moléculaire et z la charge de l'ion. Le logiciel compare ensuite automatiquement les spectres collectés avec une banque de données de référence contenant une grande variété de spectres (Wieser et al., 2012).

* **Mode opératoire**

Pour l'identification des isolats au niveau de l'espèce, la spectrométrie de masse MALDI-TOF a été effectuée avec une gamme m/z de 2 000 à 20 000 Da / 200 shots – en mode réflectron.

Pour cette identification, les bactéries sont cultivées sur gélose MRS sans tween. Une colonie est déposée puis est étalée sur la plaque cible du MALDI-TOF de façon à réaliser un frottis fin et homogène (trois dépôts sont effectués pour chaque isolat). Des dépôts de BTS (*Bacterial Test Standard*, Bruker Daltonics, Allemagne) sont réalisés comme témoins, afin de calibrer le spectromètre pour une identification fiable.

Les dépôts sont ensuite rincés à l'Eau milliQ et TFA 2,5% puis une étape d'extraction à l'acide formique (70% [v/v], Sigma-Aldrich) est réalisée. Après le séchage de l'acide formique, les dépôts sont recouverts par la matrice HCCA (*A-Cyano-4-hydroxycinnamic acid*, Sigma-Aldrich) préparée
dans une solution standard (50 % acétonitrile, 2,5 % acide trifluoroacétique (Sigma-Aldrich) et 47,5 % d'eau Mili-Q) ; à une concentration finale de 10mg HCCA/ml. Après séchage, la plaque cible est prête pour l'analyse dans l'Autoflex Speed (Bruker Daltonics, Allemagne). Les spectres obtenus sont analysés et comparés avec la base de données *Maldi Biotyper* 3.0. Les identifications sont données avec des scores qui correspondent à la fiabilité de l'identification.

### 2.2.2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)-PCR

La RAPD-PCR est une technique qui amplifie des segments de l'ADN génomique au hasard utilisant une seule amorce avec une séquence nucléotidique arbitraire (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrapd/) qui permet une reconnaissance spécifique de souches de la même espèce.

* Extraction de l'ADN génomique

L'ADN total est extrait à l'aide du kit de purification Wizard® (Genomic DNA purification Kit, Promega, Madison, USA), à partir de cultures fraîches (24h, 37°C) dans du bouillon MRS. 1 mL de la culture bactérienne est transféré dans un tube eppendorf de 1,5 mL, puis centrifugé à 13 000 g, pendant 2 minutes. Les cellules sont récupérées et remises en suspension dans 480 µL d'EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetate) à 50 mM. 120 µL de lysozyme, à une concentration de 10 mg/L, sont ajoutés et bien mélangés par pipetage. L'échantillon est ensuite incubé à 37°C pendant 60 minutes, puis centrifugé pendant 2 minutes à 13 000 g. Après élimination du surnageant, 600 µL de la solution de lyse (Nuclei Lysis Solution) sont ajoutés au culot et pipetés doucement jusqu'à ce que les cellules soient remises en suspension. La suspension est incubée à 80°C pendant 5 minutes pour lyser les cellules, puis refroidie à température ambiante. Ensuite 3 µL de la solution de ribonucléase (ARNase) sont ajoutés au lysat cellulaire, et le tube est incubé à 37°C pendant 60 minutes. Un volume de 200 µL de la solution de précipitation des protéines est ajouté au lysat cellulaire et le tube est ensuite incubé dans un bain de glace pendant 5 minutes puis centrifugé à 13 000 g, pendant 3 min. Le surnageant contenant l'ADN est transféré à nouveau dans un tube eppendorf de 1,5 mL contenant 600 µL d'isopropanol, puis mélangé doucement par inversion du tube. Le tube est centrifugé à 13000 g, pendant 2 minutes, puis le surnageant est éliminé. Un volume de 600 µL d'éthanol à 70 % est ajouté pour laver le culot d'ADN en inversant le tube plusieurs fois. Après centrifugation à 13000 g, pendant 2 minutes, l'alcool est aspiré. Le tube est ensuite séché à
l'air pendant 10-15 minutes et 100 µl de la solution de réhydratation de l'ADN sont ajoutés dans le tube afin de réhydrater l'ADN en réalisant une incubation à 65°C pendant 1 h. La concentration et la pureté du ADN est déterminé par Nanodrop™ (Termo Fisher) en mesurant l'absorbance à 260 et 280nm. L'ADN ainsi récupéré est conservé à -20°C.

* Amplification

L'amorce utilisée ici est la M13 [5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'] (Stenlid et al., 1994). Le mélange réactionnel de la PCR a un volume final de 25 µL et contient : 10 µL *DreamTaq™ PCR Master Mix* (Fermentas, Allemagne), 4 µL de Q-solution, 0,6 µL de l'amorce M13 à une concentration de 20 µM, 3,4 µl d'eau dépourvue de nucléases (*nucleases free*) et 2 µl d'ADN.

Le programme de PCR commence avec une première étape de 5 minutes à 94°C, après 40 cycles de trois étapes successives ; une étape de dénaturation de 1 min à 94°C, une étape d'hybridation de 40 secondes à 55°C et une étape d'extension pendant 2 min à 72°C. Enfin, une autre étape d'extension finale de 10 minutes à 72°C est effectuée. Les produits de PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d'agarose 1% (p/v) à 100V pendant 2 heures coloré au GelRed™ (Biotium) qui est ajouté au gel à raison de 5 µl/100 mL. Le marqueur de taille moléculaire utilisé est *O'Gene Ruler DNA Ladder* (Thermo-Fisher). Le gel est observé sous UV à l'aide de l'appareil Gel Doc™ (Bio-Rad, USA). Le profiles obtenus sont comparés avec le logiciel PyElph 1.4 pour construire les dendrogrammes (Pavel et Vasile, 2012).

## 2.3. Séquençage du génome

L'ADN total des souches bactériennes est extrait en utilisant le kit de purification d'ADN génomique Wizard (Promega Corp., Madison, WI, USA) selon les instructions du fabricant. L'ADN est dosé par spectrométrie UV à 260 nm au moyen du nanodrop (ThemoFischer). Pour une application de séquençage de génome, l'ADN est dosé par fluorescence au moyen du kit Qubit™ dsDNA HS Assay Kit (ThermoFischer) selon les instructions du fabricant. Les génomes bactériens sont séquencés par MicrobesNG (http://www.microbesng.uk) en utilisant les plates-formes technologiques Illumina MiSeq et HiSeq 2500, avec des séquences appariées de 250bp. L'analyse des séquences est réalisée par MicrobesNG en utilisant une procédure standardisée impliquant les logiciels Kraken (Wood et Salzberg, 2014) pour déterminer le génome de référence existant le plus proche, l'algorithme Burrows-Wheeler Aligner (BWA) MEM (http://bio-bwa.sourceforge.net)
pour cartographier les séquences et évaluer la qualité des données. Le génome est reconstitué par assemblage de novo en utilisant le logiciel SPAdes (http://cab.spbu.ru/software/spades/).

L'annotation prédictive du génome a été réalisée par le serveur RAST (http://rast.nmpdr.org). L'analyse de la présence de clusters de gènes impliqués dans la synthèse de métabolites secondaires a été avec antiSMASH (Weber et al., 2015) et BAGEL3 (van Heel et al., 2013).

## 3. Activités anti-Clostridium perfringens

Dans le but de mettre en évidence une activité antagoniste à l'égard de *Clostridium perfringens*, et réaliser une première sélection des souches d'intérêt, deux méthodes sont utilisées, un test en « slabs » ou morceaux (Dec et al., 2014) utilisant les colonies entières, et un test des puits en utilisant le surnageant neutralisé (Bendali et al., 2014). Cette dernière méthode permet de mettre en évidence et de caractériser les molécules impliquées ou bioactives (acides organiques, peroxyde d'hydrogène, bactériocines...).

* **Préparation des souches cibles**

Les souches de bactéries lactiques isolées sont testées contre la souche de référence *Clostridium perfringens* DSM 756 et contre 13 souches de *C. perfringens* isolées de poulets malades (Tableau 9). Des cultures de 20 heures de *C. perfringens* en anaérobiose sont étalées sur milieu BHI gélosé (1% [p/v] agar). L'étalement de *Clostridium* est effectué par écouvillonnage.

* **Préparation des souches lactiques pour les tests d'activités antagonistes**

Les souches isolées ont été mises en culture dans 5 mL de bouillon MRS à 37°C pendant 20h. La culture résultante est alors centrifugée (10.000g, 10 min, 4°C), le surnageant et les culots résultants sont alors séparés.

### 3.1. Test des slabs

Le culot cellulaire est utilisé comme pour le test en slab (Dec et al., 2014). La culture est ajustée à DO₆₀₀ = 0,4 avec du PBS 1x et 200 µl sont étalés sur boîtes de Pétri de 4cm de diamètre contenant 15 mL de MRS gélosé. Après une incubation de 20 h à 37°C, une colonne de gélose (slab) de 6 mm de diamètre est découpée et posée sur le BHI gélosé déjà inoculé avec *C. perfringens*.
<table><caption>**Tableau 9.** Souches de *Clostridium* utilisées comme bactéries cibles</caption><thead><tr><td>Souche</td><td>Origine</td><td>Institution</td></tr></thead><tbody><tr><td>C. perfringens DSM756</td><td>Bœuf</td><td>Leibniz-Institut DSMZ</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB079</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB080</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB081</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB082</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB083</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB085</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. sporogenes ICVB086</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB087</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB088</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB089</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens ICVB090</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr><tr><td>C. perfringens Clinique1</td><td>Poulet</td><td>ANSES</td></tr></tbody></table>

ANSES : Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (https://www.anses.fr/fr)

## 3.2. Test des puits

Le surnageant obtenu est neutralisé à pH 6,30-6,60 par addition de soude (NaOH) 3M, et filtré sur membrane de polyéthersulfone de porosité 0,45µm. Ensuite, 40 µl de surnageant neutralisé sont déposés dans le puits, comme décrit par Bendali et al. (2014).

## 3.3 Lectures des tests

Les boîtes des deux tests sont laissées à 4°C pendant 2 h pour permettre la diffusion des molécules puis les boîtes sont incubées en anaérobiose pendant 20 h à 37°C.

La lecture se fait par mesure de la longueur de l'anneau des halos d'inhibition. Lorsqu'il y a apparition d'un halo de petite taille (bord de puits), les souches sont de nouveau cultivées dans 30mL de bouillon et le surnageant concentré 10 fois, neutralisé et filtré est testé par la méthode des puits. La souche d'Ent. faecalis DD14 active contre C. perfringens a été utilisée comme contrôle positif.