# Développement de biocapteurs électrochimiques fonctionnalisés avec des empreintes moléculaires pour la détection de protéines

Amal Tlili

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Amal Tlili. Développement de biocapteurs électrochimiques fonctionnalisés avec des empreintes moléculaires pour la détection de protéines. Chimie. Faculté de Sciences de Monastir. Université de Monastir. Tunisie, 2021. Français. NNT: tel-04147685

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Submitted on 30 Jun 2023

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Public Domain
REPUBLIQUE TUNISIENNE
MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR,
DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITÉ DE MONASTIR

FACULTÉ DES SCIENCES DE MONASTIR

Thèse en vue de l'obtention de grade de

DOCTEUR EN CHIMIE

Spécialité « Synthèse Physico-chimique des Matériaux»

PAR

TLILI Amal

Développement de Biocapteurs Electrochimiques
Fonctionnalisés avec des Empreintes
Moléculaires pour la Détection de Protéines

Soutenue le 30 septembre 2021, devant le jury composé de:

<table><tr><td>M. Jalel MHALLA</td><td>Professeur Emérite à la Faculté des Sciences de Monastir</td><td>Président</td></tr><tr><td>M. Mohamed CHEHIMI</td><td>Directeur de recherche, CNRS, l'ITODYS Université Paris Diderot, Paris, France</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. Rafik KALFAT</td><td>Professeur à l'INRAP, Sidi Thabet</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. Hatem MAJDOUB</td><td>Professeur à la Faculté des Sciences de Monastir</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>M. Ali Othmane</td><td>Professeur à la Faculté de Médecine Monastir</td><td>Directeur</td></tr><tr><td>Mme. Najla Fourati</td><td>Maîtresse de conférences, HDR, Cnam, Paris, France</td><td>Co-directrice</td></tr></table>
<figure><img src="image_1.png" /></figure>
# Je dédie cette thèse à ... ❧

## A mon père « Nourddine » et ma mère « Aicha »

Affable, honorable, aimable, vous êtes pour moi le symbole de la bonté par excellence, la source de tendresse et l'exemple du dévouement. Vous n'avez jamais cessé de m'encourager et de prier pour moi.

Aucune dédicace ne saurait être assez éloquente pour exprimer ce que vous méritiez et tous les sacrifices faits depuis ma naissance, durant mon enfance et même à l'âge adulte.

## A mes chers frères et sœurs

« Ahlem », « Akrem », « Ayoub » et « Sameh »

## A ma chère cousine

« Hiba »

## A mes amours

« Hanin », « Ranim », « Ahmed » et « Kenza »

## A la mémoire de ma chère Tante

« Naima »

Tu étais toujours avec moi, je t'aime Fort
Remerciement ...

Avant de vous laisser découvrir le contenu scientifique de cette thèse, j’aimerais remercier toutes les personnes qui ont rendu ce travail possible ainsi que tous ceux qui ont contribué à le rendre meilleur ou plus agréable.

Je tiens à exprimer ma très profonde gratitude à mes directeurs de thèse, **Ali Othmane**, Professeur à la Faculté de Médecine Monastir (FMM) et **Najla Fourati**, Maitresse de conférences, HDR, au conservatoire Nationale des arts et des métiers, (CNAM), Paris, France, pour m'avoir encadrée durant mes travaux de thèse avec efficacité et disponibilité et pour leur aide précieuse et leur confiance dont ils m'ont honoré tout au long de ces années de travail en commun. Je leur adresse ici ma sincère et profonde reconnaissance pour leurs consignes scientifiques ainsi qu'humaines. Sans votre soutien, je ne serais jamais arrivée jusqu'à ce stade.

« **UN GRAND MERCI** ».

J'adresse ma reconnaissance à l'ensemble des membres du jury, qui m'ont fait l'honneur de bien vouloir étudier avec attention cette thèse. Je remercie, en premier lieu, Monsieur **Mohamed Mahdi Chehimi**, Directeur de Recherche au Centre National de Recherche Scientifique (CNRS), à l'ITODYS, Université Paris Diderot, Paris, France et Monsieur **Rafik Kalfat**, Professeur à l'Institut National de Recherches et d'Analyse physico-chimique (INRAP) à Sidi Thabet, pour le temps qu'ils ont consacré à évaluer ce travail et pour l'intérêt scientifique qu'ils ont manifesté en participant à ce jury en tant que rapporteurs. Je remercie également, Monsieur **Jalel Mhalla**, Professeur Emérite à la Faculté des Sciences de Monastir (FSM) pour m'avoir fait l'honneur d'accepter de présider ce jury. Enfin, je remercie, Monsieur **Hatem Majdhoub**, Professeur à la Faculté des Sciences de Monastir (FSM) pour sa participation à mon jury de thèse en tant qu'examineur.

Une pensée particulière est accordée à Monsieur **Chouki Zerrouki**, Maître de Conférences au Conservatoire Nationale d'Arts et Métiers, (CNAM), Paris, France, pour sa grande disponibilité, son ouverture d'esprit, sa bonne humeur, ses conseils sincères et fructueux durant nos nombreuses discussions.
Je tiens à remercier chaleureusement, **Sohayb** et **Ghada** (Boudeuse Numéro 1). Nous avons passé des jours et des nuits, en discutant les travaux de cette thèse. Je ne peux pas oublier ma Boudeuse Numéro 3, merci **Meriem**.

Ce travail ne serait jamais agréable sans la présence de mes chères **Dhekra**, **Ines** et **Nessrine**.

Enfin, je remercie très sincèrement et dédie ce travail à mes amies proches : **Amal** et **Marwa**.
Vous étiez toutes les deux, toujours un support moral pour moi.

Tlili Amal
## Table des matières

<table><tr><td>Introduction générale</td><td>1</td></tr></table>

## Chapitre 1: Synthèse bibliographique

<table><tr><td>1.1</td><td>Introduction</td><td>5</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Structure, rôles et propriétés des protéines</td><td>5</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Limitations des techniques conventionnelles dans la quantification des protéines</td><td>9</td></tr><tr><td>1.4</td><td>Les empreintes moléculaires</td><td>10</td></tr><tr><td>1.4.1</td><td>Historique</td><td>10</td></tr><tr><td>1.4.2</td><td>Principe</td><td>11</td></tr><tr><td>1.4.3</td><td>Polymérisation chimique</td><td>12</td></tr><tr><td>1.5</td><td>Polymérisation par voie électrochimique</td><td>5</td></tr><tr><td>1.5.1</td><td>Introduction</td><td>5</td></tr><tr><td>1.5.2</td><td>Les monomères fonctionnels</td><td>5</td></tr><tr><td>1.5.3</td><td>Différentes approches pour l'élaboration d'une empreinte par voie électrochimique</td><td>5</td></tr><tr><td>1.5.4</td><td>Techniques électrochimiques les plus utilisées en électropolymérisation</td><td>5</td></tr><tr><td>1.5.5</td><td>Extraction de l'analyte</td><td>5</td></tr><tr><td>1.6</td><td>Les principales applications des empreintes moléculaires</td><td>5</td></tr><tr><td>1.6.1</td><td>Historique des capteurs à bases d'empreintes moléculaires</td><td>5</td></tr><tr><td>1.6.2</td><td>Principe physique des capteurs</td><td>5</td></tr><tr><td>1.6.3</td><td>Les différents types de transducteurs</td><td>5</td></tr><tr><td>1.7</td><td>Références bibliographiques</td><td>39</td></tr></table>

## Chapitre 1: Synthèse bibliographique

<table><tr><td>2.1</td><td>Introduction</td><td>47</td></tr><tr><td>2.2</td><td>Techniques et méthodes</td><td>47</td></tr></table>
<table><tr><td>2.2.1</td><td>Les mesures électrochimiques</td><td>47</td></tr><tr><td>2.2.2</td><td>Dispositifs expérimentaux</td><td>55</td></tr><tr><td>2.3</td><td>Spectroscopie infrarouge à transformation de fourier FTIR</td><td>58</td></tr><tr><td>2.4</td><td>La zêtamétrie ou mesure du potentiel zêta</td><td>60</td></tr><tr><td>2.5</td><td>Produits chimiques et biologiques</td><td>63</td></tr><tr><td>2.5.1</td><td>Choix du monomère</td><td>63</td></tr><tr><td>2.5.2</td><td>Choix de protéines</td><td>63</td></tr><tr><td>2.5.3</td><td>Produits utilisés pour la réalisation des couches mixtes auto-assemblées</td><td>65</td></tr><tr><td>2.6</td><td>Références bibliographiques</td><td>66</td></tr></table>

Chapitre 3: Résultats et discussions

<table><tr><td>3.1</td><td>Introduction</td><td>70</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Choix de la technique de fonctionnalisation des surfaces pour la construction d'un MIP</td><td>71</td></tr><tr><td>3.2.1</td><td>Optimisations des paramètres fondamentaux pour la conception des deux MIPs</td><td>72</td></tr><tr><td>3.2.2</td><td>Evaluation des performances des deux empreintes</td><td>82</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Etude comparative de MIP-BSA, MIP-HSA et MIP-PSA</td><td>86</td></tr><tr><td>3.3.1</td><td>Construction des MIPs</td><td>86</td></tr><tr><td>3.3.2</td><td>Etude comparative des réponses électrochimiques des MIPs de BSA, de HSA et de PSA en absence et en présence du couple redox</td><td>88</td></tr><tr><td>3.3.3</td><td>Test de sélectivité</td><td>93</td></tr><tr><td>3.4</td><td>Etude de l'effet du pH et de la force ionique sur l'interaction MIP-protéines</td><td>94</td></tr><tr><td>3.4.1</td><td>Revue bibliographique de l'effet du pH et de la force ionique sur l'interaction MIP-protéines</td><td>94</td></tr><tr><td>3.4.2</td><td>Effets de la variation de la force ionique sur la réponse électrochimique des capteurs fonctionnalisés avec un MIP</td><td>95</td></tr><tr><td>3.4.3</td><td>Effet du pH sur la détection de la BSA</td><td>101</td></tr><tr><td>3.5</td><td>Références bibliographiques</td><td>106</td></tr><tr><td colspan="2">Conclusions et perspectives</td><td>109</td></tr><tr><td colspan="2">Annexe</td><td>111</td></tr></table>
Table des abréviations

<table><thead><tr><th colspan="2">A</th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>Surface active de l'électrode</td></tr><tr><td>ATR</td><td>Attenuated Total Reflectance<br>(Réflectance totale atténuée)</td></tr><tr><td colspan="2">B</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bovin Serum Antigen<br>(Albumine du sérum bovin)</td></tr><tr><td>BHb</td><td>Bovine Hemoglobin<br>(Hémoglobine bovine)</td></tr><tr><td colspan="2">C</td></tr><tr><td>CA-125</td><td>Antigène Cancéreux 125</td></tr><tr><td>CA 15-3</td><td>Antigène Cancéreux 15-3</td></tr><tr><td>CEA</td><td>Antigène CarcinoEmbryonnaire</td></tr><tr><td>cTnT</td><td>Troponine cardiaque T</td></tr><tr><td>CV</td><td>Cyclic Voltammetry<br>(Voltammétrie cyclique)</td></tr><tr><td>CLC</td><td>Chromatographie liquide capillaire</td></tr><tr><td>C</td><td>Célérité de l'onde dans le quartz</td></tr><tr><td>CDNF</td><td>Facteur neurotrophique dopaminergique<br>cérébral</td></tr><tr><td>CE</td><td>Contre électrode</td></tr><tr><td>C</td><td>Concentration superficielle</td></tr><tr><td>Cd1</td><td>Capacité de la double couche</td></tr><tr><td colspan="2">D</td></tr><tr><td>3D</td><td>Trois dimensions</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>DA</td><td>Dopamine</td></tr><tr><td>DPV</td><td>Voltammétrie différentielle à impulsions</td></tr><tr><td>D</td><td>Coefficient de diffusion</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Dimethyl sulfoxide</td></tr><tr><td colspan="2">E</td></tr><tr><td>ELISA</td><td>Dosage d'immuno-absorption par enzyme liée</td></tr><tr><td>ESI</td><td>Ionisation par électronébuliseur</td></tr><tr><td>EIS</td><td>Spectroscopie d'impédance électrochimique</td></tr><tr><td>EDC</td><td>1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide</td></tr><tr><td colspan="2">F</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Isomère I de fluorescéine isothiocyanat</td></tr><tr><td>f0</td><td>Fréquence de résonance du quartz</td></tr><tr><td>F</td><td>Fréquence</td></tr><tr><td>FTIR</td><td>Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier</td></tr><tr><td>F</td><td>Faraday</td></tr><tr><td>FFPM</td><td>Filaments flagellaires de Proteus mirabilis</td></tr><tr><td colspan="2">G</td></tr><tr><td>GS</td><td>Chromatographie en phase gazeuse</td></tr><tr><td colspan="2">H</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Chromatographie en phase liquide à haute performance</td></tr><tr><td>HRP</td><td>Peroxydase de raifort</td></tr><tr><td>HSA</td><td>Albumine du sérum humain</td></tr><tr><td colspan="2">I</td></tr><tr><td>IgG</td><td>Immunoglobine G</td></tr></table>
<table><tr><td>IgM</td><td>Immunoglobine M</td></tr><tr><td>IDTs</td><td>Peignes inderdigités métalliques</td></tr><tr><td>I<sub>0</sub></td><td>Courant généré</td></tr><tr><td>I<sub>c</sub></td><td>Courant capacitif</td></tr><tr><td>I<sub>f</sub></td><td>Courant faradique</td></tr><tr><td colspan="2">L</td></tr><tr><td>LC</td><td>Chromatographie en phase liquide</td></tr><tr><td>Lys</td><td>Lyzosyme</td></tr><tr><td colspan="2">M</td></tr><tr><td>MIPs</td><td>Polymères à empreintes moléculaires</td></tr><tr><td>MS</td><td>Spectroscopie de masse</td></tr><tr><td>MALDI</td><td>Désorption/Ionisation laser assistée par matrice</td></tr><tr><td>MANF</td><td>Facteur neurotrophique dérivé des astrocytes mésencéphaliques</td></tr><tr><td>MPA</td><td>Acide mercaptopropanoïque</td></tr><tr><td>MHDA</td><td>Acide mercaptohexadécanoïque</td></tr><tr><td>MUDA</td><td>Acide mercaptoudécanoïque</td></tr><tr><td>MHOH</td><td>Mercaptohexanol</td></tr><tr><td>Myo</td><td>Myoglobine</td></tr><tr><td colspan="2">N</td></tr><tr><td>NHS</td><td>N-hydroxysuccinimide</td></tr><tr><td>n</td><td>Nombre d'électrons</td></tr><tr><td>NIP</td><td>Polymères non imprimés</td></tr><tr><td colspan="2">O</td></tr><tr><td>Ova</td><td>Ovalbumin</td></tr><tr><td colspan="2">P</td></tr></table>
<table><tr><td>pI</td><td>Point isoélectrique</td></tr><tr><td>PCR</td><td>Réaction de polymérase en chaîne</td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Polyvenyldiène fluoré</td></tr><tr><td>pDA</td><td>Polydopamine</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Antigène spécifique de la prostate</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Tampon phosphate</td></tr><tr><td>Po</td><td>Pic d'oxydation</td></tr><tr><td>Pr</td><td>Pic de réduction</td></tr><tr><td colspan="2">Q</td></tr><tr><td>QCM</td><td>Microbalance à quartz</td></tr><tr><td colspan="2">R</td></tr><tr><td>RIA</td><td>Dosage radio-immunologique</td></tr><tr><td>Rs</td><td>Résistives de l'électrolyte</td></tr><tr><td>Ru</td><td>Résistance non compensée</td></tr><tr><td>RE</td><td>Electrode de référence</td></tr><tr><td colspan="2">S</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sodécylsulfate de sodium</td></tr><tr><td>SIDA</td><td>Syndrome d'immunodéficience acquise</td></tr><tr><td>SPE</td><td>Extraction en phase solide</td></tr><tr><td>SPEM</td><td>Micro-extraction en phase solide</td></tr><tr><td>SBSE</td><td>Extraction par sorption sur barre d'agitation</td></tr><tr><td>SPR</td><td>Résonance surfacique plasmonique</td></tr><tr><td>SAW</td><td>Ondes acoustiques de surface</td></tr><tr><td>SWV</td><td>Voltammétrie à onde carrée</td></tr><tr><td>SPE</td><td>Electrodes sérigraphiées</td></tr><tr><td>S</td><td>Surface</td></tr></table>
<table><thead><tr><th>SAMs</th><th>Monocouches autoassemblés</th></tr></thead><tbody><tr><td>U</td><td></td></tr><tr><td>UV</td><td>Ultra-Violet</td></tr><tr><td>U<sub>0</sub></td><td>Tension appliquée</td></tr><tr><td>V</td><td></td></tr><tr><td>v</td><td>Vitesse de balayage</td></tr><tr><td>W</td><td></td></tr><tr><td>We</td><td>Electrode de travail</td></tr><tr><td>Z</td><td></td></tr><tr><td>Z<sub>w</sub></td><td>Impédance de Warburg</td></tr></tbody></table>
# Listes des Figures

## Chapitre 1: Synthèse bibliographique

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure 1. 1: a) Structure d'un acide aminé ; b) Structure primaire ; et c) structure secondaire de protéine : hélice α et feuillets β</td>
      <td>6</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 2: Structure tertiaire d'une protéine</td>
      <td>7</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 3: Variation de la charge globale d'une protéine en fonction du pH du milieu</td>
      <td>7</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 4: Solubilité de la protéine en fonction du pH</td>
      <td>8</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 5: Etat structural de la protéine en fonction de la température (Tm = température de fusion)</td>
      <td>9</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 6: Principe de préparation d'une empreinte moléculaire</td>
      <td>11</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 7: Evolution du nombre de publications portant sur les empreintes moléculaires entre 2000 et 2020 ; Source « PubMed »</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 8: Structures chimiques de monomères généralement utilisés lors du processus électrochimique</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 9: Les différentes approches utilisées pour l'élaboration d'une empreinte moléculaire</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 10: Spectre d'électropolymérisation de : a) la dopamine [61]; b) le pyrrole [60]; et c) l'o-diaminophénol [62]</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 11: Exemple d'un chronoampéromètre correspondant à l'électropolymérisation du pyrrole [60]</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 12: Les différentes applications des empreintes moléculaires</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 13: Structure chimique de l'O-acryloyl L-hydroxyproline conjuguée à la dansyléthylènediamine (Hyp-En-Dans)</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 14: Variation de I/I0 en fonction de la nature des protéines testés lors des tests de sélectivité du MIP-HSA [77]</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 15: Principe de la détection par résonance surfacique plasmonique (SPR)</td>
      <td>12</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 1. 16: Variation de l'angle de résonance en fonction des différentes concentrations de la protéine CA-125. Dans l'insert est représentée la comparaison des réflectivité SPR obtenus pour la surface du NIP avec celles obtenues avec le MIP [81]</td>
      <td>12</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>Figure 2. 8 : Les différents modes de vibration des liaisons dans une molécule suite à une excitation par IR : a) elongation symétrique ; b) elongation asymétrique ; c) déformation par torsion ; d) déformation par rotation ; e) déformation par balancement ; et f) déformation par cisaillement</td><td>58</td></tr><tr><td>Figure 2. 9 : Schéma du principe de la réflexion totale atténuée</td><td>59</td></tr><tr><td>Figure 2. 10 : Principe de fonctionnement de la spectroscopie FTIR</td><td>59</td></tr><tr><td>Figure 2. 11 : a) Principe du potentiel zêta ; et b) variation du potentiel en fonction de la distance à partir de la surface de la particule</td><td>62</td></tr><tr><td>Figure 2. 12 : Principe de fonctionnement du potentiel zêta</td><td>63</td></tr></table>

## Chapitre 3: Résultats et discussions

<table><tr><td>Figure 3. 1: a) Voltamogramme caractéristique de l'électropolymérisation de la dopamine ; et b) mécanisme de l'électropolymérisation de la dopamine</td><td>71</td></tr><tr><td>Figure 3. 2: a) Voltamogrammes correspondant à des MIPs de différentes épaisseurs, b) Variations des valeurs de pics de courant en fonction du nombre de cycle. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM) et une vitesse de balayage égale à 50 mV.s⁻¹</td><td>73</td></tr><tr><td>Figure 3. 3: Voltamogrammes comparatifs du MIP et du NIP réalisés à deux vitesses de balayages 20 et 50 mV.s⁻¹. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM)</td><td>74</td></tr><tr><td>Figure 3. 4 : Voltamogrammes du NIP et des MIPs réalisés à différentes rapports protéine / monomère. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM)</td><td>75</td></tr><tr><td>Figure 3. 5: Voltamogrammes du NIP et des MIPs avant et après incubations dans les différents extracteurs. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM)</td><td>76</td></tr><tr><td>Figure 3. 6: a) Voltamogrammes obtenus à partir de mesures SWV après la fonctionnalisation d'une surface en or avec des monocouches de MPA, MUDA et MHDA ; b) Variations des pics du courant en fonction de la nature de la monocouche formée. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM)</td><td>77</td></tr></table>
Figure 3. 7 : a) Voltamogrammes obtenus à partir de mesures SWV après la fonctionnalisation d'une surface en or avec différentes monocouches mixtes ; b) Histogrammes des variations des pics du courant en fonction de la nature de la couche mixte. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM). 78

Figure 3. 8: Représentation schématique des hypothèses d'organisation, sur des surfaces d'or, des monocouches a) (MHDA / MPA) et b) (MUDA / MHOH) .................................................. 79

Figure 3. 9: a) Diagrammes de Nyquist des surfaces fonctionnalisées avec MHOH, MUDA et MUDA/MHOH avec trois rapports différents (1/9, 5/5, 9/1); et b) Variations des valeurs des résistance de transfert de charge en fonction de la nature de la couche de fonctionnalisation. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration de (5 mM) .................................................................................. 79

Figure 3. 10: a) Voltamogrammes représentatifs des différentes étapes de modification de surface, b) Voltamogrammes représentatives du MIP et NIP. Caractérisation dans le PBS (0,1M) avec le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) de concentration égale à (5mM) ........................ 81

Figure 3. 11: Voltamogrammes de détection de l'IgG par : a) MIP₁; b) MIP₂; c) NIP₁; et d) NIP₂. Caractérisation dans le PBS (0,1M) avec le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) (5 mM) ... 83

Figure 3. 12: Variations de l'inverse de la densité du courant en fonction des concentrations cumulatives d'IgG à partir de MIPs réalisés avec : a) la stratégie 1 ; et b) la stratégie 2 ....... 84

Figure 3. 13: Représentation schématique des stratégies de construction des MIPs : a) stratégie 1 ; et b) stratégie 2 .................................................................................................................. 85

Figure 3. 14: Voltamogrammes caractéristiques des MIP de la BSA, de la HSA et du PSA et de leurs NIPs. Caractérisation dans le PBS (0,1M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻) avec une concentration égale à (5mM) .................................................................................. 87

Figure 3. 15: Voltamogrammes caractéristiques des MIPs : BSA, HSA et PSA. Caractérisation faite dans le PBS (pH = 7,4 et force ionique = 167 mM).................................................. 88

Figure 3. 16 : Voltamogrammes enregistrés par SQW suite à la détection de concentrations croissantes de : a) BSA avec couple ferrique ; b) HSA avec couple ferrique ; c) PSA avec couple ferrique ; d) BSA sans couple ferrique ; e) HSA sans couple ferrique ; et f) PSA sans couple ferrique. .................................................................................................................................................. 90

Figure 3. 17: Courbes de calibration des capteurs fonctionnalisés avec MIP-BSA, MIP-HSA et MIP-PSA dans le PBS: a) avec sonde redox et b) sans sonde redox .................................................. 91

Figure 3. 18: Courbes de calibration obtenues à partir des tests de sélectivité réalisés sur : a) MIP-BSA b) MIP-HSA et c) MIP-PSA. Sont aussi présentés les résultats de détection avec le
NIP pour a) la BSA, b) la HSA et c) le PSA. Caractérisation faite dans le PBS (0,1 M, pH = 7.4). 93

Figure 3. 19 : a) Voltamogrammes de MIPs réalisés à différentes forces ioniques. Les caractérisations électrochimiques ont été faites à force ionique constante I = 167 mM et b) Variation des maximas de densité du courant enregistrés sur la Figure (a) en fonction des différentes forces ioniques. 96

Figure 3. 20: Variations des densités de courant en fonction des concentrations cumulées de BSA pour les cinq forces ioniques étudiées (les lignes sont des guides pour les yeux). Le pH est égal à 7,4 pour l'ensemble des mesures. 97

Figure 3. 21: Variation du potentiel zêta en fonction des valeurs de la force ionique. 98

Figure 3. 22: Estimation du point isoélectrique de la BSA. 99

Figure 3. 23 : a) Variation de la densité maximale du courant de MIPs préparés à différents pH : 3,5 (courbe noire), 7,4 (courbe rouge) et 9 (courbe bleue) en fonction du pH de l'électrolyte (pH<sub>PBS</sub>); b) Voltamogrammes SWV du MIP-BSA, préparé à un pH fixe (pH<sub>BSA</sub> = 9) et caractérisés à différentes milieux (pH<sub>PBS</sub> = 3,5, 7,4 et 9). Toutes les expériences ont été effectuées à une force ionique fixe (I = 167 mM). 100

Figure 3. 24 : Variation relative des densités de courant pour le MIP et le NIP en fonction des concentrations cumulées de BSA (en représentation semi-logarithmique) : a) pour pH<sub>BSA</sub> et/ou pH<sub>PBS</sub> inférieur au pI de la BSA et b) pour (pH<sub>BSA</sub> et/ou pH<sub>PBS</sub>) supérieur au pI de la BSA. Caractérisation dans le PBS (0,1 M, pH = 7,4). 101

Figure 3. 25 : Variations des densités relatives du courant ΔJ en fonction des concentrations cumulatives de BSA pour pH<sub>BSA</sub> et pH<sub>PBS</sub> supérieurs au pI du BSA. Les traits pleins correspondent aux meilleurs ajustements. Encart : vue à l'échelle semi-logarithmique montrant la forme quasi-linéaire des courbes de calibration pour des concentrations de BSA allant de 10<sup>-15</sup> mg. ml<sup>-1</sup> à 10<sup>-3</sup> mg. ml<sup>-1</sup>. 102

Figure 3. 26: Spectres FTIR de trois MIPs réalisés dans les conditions suivantes : (pH<sub>BSA</sub> / pH<sub>PBS</sub>) ajustés à (3,5 / 3,5), (7,4 / 7,4) et (9 / 9) : a) Totalité du spectre, b) un zoom entre 2700 et 3100 cm<sup>-1</sup>, et c) un zoom entre 1500 et 1800 cm<sup>-1</sup>. 104

Figure 3. 27 : Evolution de la conformation de la protéine BSA en fonction du pH du milieu de dissolution. 104
# Listes des Tableaux

## Chapitre 1: Synthèse bibliographique

Tableau 1. 1: Stratégies de polymérisation chimique avec leurs avantages et inconvénients.. 14

Tableau 1. 2: Avantages et inconvénients de chaque voie de conception d'une empreinte moléculaire.................................................................................. **ERREUR! Signet non défini.**

Tableau 1. 3 : Revue bibliographique dédiée aux empreintes moléculaires réalisées par adsorption de la protéine d'intérêt suivie de l'électropolymérisation du monomère.................. 35

Tableau 1. 4 : Revue bibliographique dédiée aux empreintes moléculaires réalisées par mélange du monomère et de la protéine avant électropolymérisation.................................................. 36

Tableau 1. 5: Revue bibliographique dédiée aux empreintes moléculaires réalisées par greffage covalent de la protéine à la surface de l'électrode .................................................................... 38

## Chapitre 2 : Matériel et méthodes

Tableau 2. 1: Quelques exemples de circuits électriques équivalents et des diagrammes Nyquist qui leurs sont associés. .................................................................................................................. 50

Tableau 2. 2:Echelle de stabilité de RIDDICK .................................................................................................................. 60

Tableau 2. 3: Les différentes caractéristiques intrinsèques des trois protéines.................................................. 64

## Chapitre 3: Résultats et discussions

Tableau 3. 1: Valeurs de sensibilités et de constantes de dissociation estimées à partir des courbes de calibration présentées dans la Figure. 3. 11. .................................................................................. 85

Tableau 3. 2: Pourcentage d'acides aminés électroactifs présents pour chaque unité protéique pour la BSA, la HSA et le PSA.................................................................................................................. 89
## Introduction générale
## Introduction générale

Les protéines sont des macromolécules présentes dans tous les systèmes biologiques et y jouent un rôle structural et/ou fonctionnel. Plusieurs d'entre elles sont considérées comme biomarqueurs de plusieurs pathologies humaines telles que le cancer, les maladies cardiaques ou les maladies métaboliques. En conséquence, différentes techniques ont été développées pour quantifier les protéines totales ou des protéines spécifiques. Néanmoins, ces techniques souffrent de plusieurs inconvénients notamment la complexité des méthodes de prétraitement de l'échantillon, la longue durée de l'analyse et le coût élevé des équipements.

Pour remédier à ces inconvénients, une nouvelle technologie à base de biocapteurs a émergé depuis quelques décennies. Les biocapteurs sont, en effet, un outil analytique constitué d'un transducteur et d'un récepteur. La première version des biocapteurs exige l'utilisation de biomolécules en tant que récepteur responsable de la reconnaissance et de la capture de la protéine à détecter. Ces biomolécules, appelées aussi biorécepteurs peuvent être des anticorps, des enzymes, des cellules ou des aptamères. Malgré les bonnes performances montrées par ces dispositifs analytiques, quelques limitations persistent et nécessitent plus de mise au point surtout au niveau de l'orientation, la stabilité et la conservation des biomolécules sur la surface du transducteur. Pour s'affranchir de tous ces obstacles rencontrés lors de l'utilisation des biorécepteurs, plusieurs chercheurs se sont orientés vers les polymères à empreintes moléculaires (MIPs pour *Molecularly Imprinted Polymers*). Il s'agit d'une structure synthétique à base du polymère ayant la capacité d'imiter les molécules biologiques avec de bonnes caractéristiques structurelles et mécaniques, une affinité élevée vis-à-vis de l'analyte à détecter et une résistance aux variations extrêmes de température, de pression et du pH.

La conception d'une empreinte moléculaire est basée sur la polymérisation chimique ou électrochimique d'un monomère préalablement sélectionné autour d'une protéine cible. La structure résultante est tridimensionnelle et elle est maintenue grâce à des interactions de type électrostatique, liaison $\pi-\pi$, liaison hydrogène et liaison Van Der Walls.

L'analyte est ensuite extrait pour laisser son empreinte au sein du polymère. Cette empreinte jouera ainsi le rôle de « capteur » pour détecter l'analyte correspondant éventuellement présent dans un milieu biologique. La détection est assurée par un processus de reconnaissance sélectif contrôlé par la position, l'arrangement et la nature des groupes fonctionnels mis en jeu entre l'analyte et les monomères de l'empreinte polymérique.
Le concept d'une telle empreinte moléculaire a surtout été bien adapté pour les petites molécules et il a conduit à plusieurs empreintes moléculaires désormais disponibles dans le commerce. Par contre, pour les « grosses » molécules, telles que les protéines, le processus d'impression demeure relativement moins développé malgré son grand intérêt dans le domaine biomédical. Cette limitation est expliquée, essentiellement, par les propriétés inhérentes aux protéines.

L'objectif de cette thèse s'inscrit donc dans le cadre de l'élaboration d'un capteur électrochimique à base d'empreintes moléculaires pour la détection de protéines. La réussite de cette élaboration nécessite, essentiellement, la compréhension du mécanisme d'interaction entre la protéine à détecter et l'empreinte moléculaire conçue. Ce mécanisme est déterminé par plusieurs facteurs tels que les paramètres physicochimiques du milieu (pH, force ionique) et les caractéristiques intrinsèques de la protéine (point isoélectrique, poids moléculaire, conformation, degré de liberté au sein du film polymérique...). L'effet de l'ensemble de ces paramètres sur la conception de l'empreinte et en conséquence sur ses interactions avec la protéine a été analysé, au cours des travaux de cette thèse.

Ce manuscrit s'articule en trois parties subdivisées comme suit :

Un premier chapitre qui comprend trois parties : la première est une étude bibliographique portant sur les protéines (leurs propriétés intrinsèques et extrinsèques et leurs rôles biologiques dans l'organisme) et sur les différentes techniques de dosage des protéines. La seconde est dédiée aux polymères à empreintes moléculaires qui constituent une vraie alternative pour la détection de protéines. Sont donc présentés le principe des MIPs et les techniques d'impression moléculaire. La troisième partie concerne la présentation des principales techniques de transduction utilisées pour la détection des protéines par le biais des polymères à empreintes moléculaires.

Le deuxième chapitre comprend une brève description des techniques et dispositifs expérimentaux électrochimiques utilisés dans le cadre de ce travail. Sont aussi présentées les structures chimiques des différentes molécules et les propriétés intrinsèques des protéines objet de ces travaux.

Le troisième chapitre, dédié à la présentation des résultats expérimentaux, est divisé en trois parties. La première concerne le choix de la technique de fonctionnalisation des électrodes en or parmi deux stratégies : immobiliser la protéine préalablement à l'électropolymérisation du
monomère, via un greffage covalent sur des couches autoassemblées, ou au contraire, la laisser libre. Pour cette étude, nous avons utilisé une protéine modèle, l'immunoglobuline G (IgG).

Une fois le choix de la fonctionnalisation fait, nous avons évalué, dans la deuxième partie, l'effet de la nature de la protéine sur la construction d'un MIP et le rôle des sondes rédox sur l'affinité protéine/monomère, et ce en réalisant des caractérisations électrochimiques en présence et en absence de ces sondes.

La troisième et dernière partie de ce chapitre, est dédiée à l'étude des effets de la force ionique et du pH sur l'interaction entre une protéine modèle et son empreinte. Nous avons donc réalisé des mesures électrochimiques et du potentiel zêta et des analyses physicochimiques par spectroscopie infra-rouge à transformée de Fourier. L'ensemble des résultats a permis de déterminer les valeurs optimales du pH et de force ionique garantissant la meilleure affinité entre une protéine modèle l'albumine du sérum bovin (BSA pour *Bovin Serum Albumin*) et son empreinte.

Une conclusion générale et des perspectives viennent clôturer ce travail.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

## 1.1 Introduction

Les protéines sont des macromolécules présentes dans tous les systèmes biologiques, allant des procaryotes aux eucaryotes. Elles occupent une place prépondérante dans toutes les cellules vivantes, à la fois quantitativement que qualitativement ; ce qui explique l'origine de leur nom dérivé du mot grec "protos", signifiant « premier rang d'importance » [1]. Quantitativement, les protéines sont la classe de biomolécules la plus abondante puisqu'elles représentent plus de 50 % du poids sec des cellules, bien plus que d'autres biopolymères importants tels que les acides nucléiques, les polysaccharides ou les assemblages lipidiques. Alors que, qualitativement, les protéines sont impliquées pratiquement dans tous les processus biologiques physiologiques et pathologiques [2],[3],[4]. C'est pour toutes ces raisons que plusieurs techniques sont disponibles pour doser les protéines. Néanmoins, ces méthodes sont souvent complexes. L'élaboration d'une nouvelle technologie telle que les biocapteurs à base de polymère à empreintes moléculaires serait d'un grand apport dans le domaine biomédical.

Quelques généralités sur les protéines seront donc présentées dans la première partie de ce chapitre avant d'expliquer le principe des empreintes moléculaires et les différentes stratégies adoptées pour les élaborer ainsi que leurs applications dans les capteurs électrochimiques.

### 1.1 Structure, rôles et propriétés des protéines

Les protéines sont considérées comme un polymère dont les monomères sont des acides aminés liés entre eux d'une manière covalente par l'intermédiaire de liaisons amides, appelées liaisons peptidiques [5]. Tous les acides aminés ont la même architecture et sont composés d'un carbone tétraédrique central (α). Sur cet atome de carbone qui est asymétrique sont fixés quatre groupements différents dont un groupement amine (-NH₂), un groupement carboxylique (-COOH), un hydrogène et un groupement appelé chaîne latérale R (Figure 1.1a).

Les protéines jouent un rôle structural ou fonctionnel dans l'organisme. En effet, elles sont d'une part nécessaires pour constituer le support mécanique et l'architecture filamenteuse à l'intérieur et entre les cellules pour leur assurer une contraction et un mouvement coordonné [1]. D'autre part, elles assurent une multitude de fonctions au sein de la cellule et dans les tissus. Certaines d'entre elles sont des enzymes permettant la catalyse des réactions chimiques en augmentant leurs vitesses de plusieurs ordres de grandeur alors que d'autres sont impliquées dans le transport et le stockage d'ions, de petites molécules ou d'électrons.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.1:** a) Structure d'un acide aminé ; b) Structure primaire ; et c) structure secondaire de protéine : hélice α et feuillet β</figcaption></figure>

Des activités de type hormonal, immunologique ou régulation de l'expression génétique sont également assurées par certaines protéines produites physiologiquement par l'organisme.

Par ailleurs, de nombreuses molécules protéiques sont utilisées à des fins thérapeutiques ou diagnostiques pour plusieurs pathologies telles que le diabète, le cancer et les maladies inflammatoires.

Les protéines sont donc des molécules incontournables que ce soit à travers leur rôle structural, fonctionnel, thérapeutique ou diagnostique.

Chacune des protéines est déterminée par sa structure primaire qui dépend du nombre, de la nature et de l'ordre séquentiel des acides aminés qui la constituent (Figure 1.1b). Des interactions hydrogène peuvent s'établir entre les différents groupements de ses acides aminés (-NH₂, -COOH) pour aboutir à deux nouvelles conformations spatiales de type hélice α ou feuillet β schématisées dans la Figure 1.1c. Ces conformations déterminent la structure secondaire de la protéine [6].

Le fait que ces chaines (α ou β) peuvent se trouver liées entre elles par de fortes liaisons telle que les ponts disulfures, de Vander Walls ou électrostatiques dote la protéine d'une structure tertiaire (Figure 1.2). Cette caractéristique structurale permet un repliement des chaines polypeptidiques pour enfuir les groupements hydrophobes à l'intérieur alors que les parties hydrophiles restent à l'extérieur [7],[8].
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 1.2:** Structure tertiaire d'une protéine</figcaption></figure>

Dans le cas où la protéine est constituée de plusieurs chaines polypeptidiques α et/ou β, on parle de structure quaternaire qui donne un aspect globulaire à la protéine.

Les quatre structures citées ci-dessus (primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire) déterminent plusieurs caractéristiques de la protéine dont la charge nette, la flexibilité ainsi que le degré de mobilité de cette protéine.

Selon le pH dans lequel est dissoute une protéine, les charges des groupements acide (-COOH) et amine (-NH₂) des acides aminés varient et conduisent à une charge globale de la protéine positive, négative ou nulle. Le pH correspondant à une charge nette nulle de la protéine est appelée point isoélectrique "pI" de cette protéine (Figure 1.3) [9],[10].

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 1.3:** Variation de la charge globale d'une protéine en fonction du pH du milieu</figcaption></figure>

De plus, lorsque le pH du milieu est égal au pI de la protéine, la solubilité de cette dernière est minimale. Ceci est dû au fait que les interactions entre les acides aminés chargés positivement
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

et négativement sont maximales, entraînant ainsi la précipitation de la protéine [11] (Figure 1.4).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 1.4:** Solubilité de la protéine en fonction du pH</figcaption></figure>

Pour des variations extrêmes du pH, la solubilité de la protéine est altérée conduisant à sa dénaturation donc à la perte de son activité. En effet, une augmentation ou une diminution importante du pH entraîne une rupture des liaisons ioniques créées entre les chaines latérales des acides aminées ($R-NH_3^+$ et $R-COO^-$) et des liaisons hydrogène établies entre un doublet libre d'un hétéroatome et un hydrogène.

Par ailleurs, la stabilité de la structure d'une protéine dépend aussi de la température et de la force ionique du milieu dans lequel cette protéine est dissoute [12],[13].

Une augmentation de la température entraîne, en effet, une rupture des liaisons hydrogène conduisant au passage de la protéine d'un état replié vers un état déplié ; ce qui engendre une réorganisation conformationnelle qui provoque la perte de la structure native de la protéine. La Figure 1.5 montre un profil de dénaturation thermique typique d'une protéine modèle.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 1.5:** Etat structural de la protéine en fonction de la température (Tm = température de fusion)</figcaption></figure>

De même, la force ionique joue un rôle curial dans la stabilité d'une protéine en solution. En effet, à une faible force ionique, les ions du sel interagissent avec les groupements chargés de la protéine créant ainsi des interactions répulsives entre les différentes chaines protéiques. Ce phénomène appelé "salting-in" conduit à une solubilité maximale de la protéine [14],[15]. Par contre, à une force ionique élevée, les ions du sel entrent en compétition avec les protéines pour se lier à l'eau, favorisant ainsi le processus de la solvatation. Ce dernier favorise à son tour l'interaction protéine-protéine qui conduit à la formation d'agrégats protéine-protéine appelé "salting-out" [14]. La capacité d'induire le phénomène "salting-out" d'une protéine dépend de la nature de l'ion.

## 1.2 Limitations des techniques conventionnelles dans la quantification des protéines

La quantification des protéines dans les matrices biologiques constitue un sujet essentiel porteur de nouveaux défis aussi bien dans le domaine du diagnostic que celui de la thérapeutique. Cependant, en raison de la différence entre les propriétés des molécules protéiques, leur quantification dans les milieux biologiques fait appel à des techniques différentes telles que les méthodes d'immunodosages. Ces dernières sont basées sur la reconnaissance de l'analyte par un anticorps en présence d'un marqueur qui peut être radioactif ou enzymatique. Ces techniques de dosage sont respectivement le dosage radio-immunologique (RIA pour Radio Immuno Assay) et le dosage d'immuno-absorption par enzyme liée (ELISA pour Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Les marqueurs fluorescents ou l'amplification par réaction de polymérase en chaîne (PCR pour Polymerase Chain Reaction) sont aussi utilisés.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

Malgré que ces méthodes d'immunoanalyse sont des techniques bien maîtrisées et présentent de nombreux avantages tels que d'excellentes sensibilités, un haut débit et un coût relativement faible, elles pâtissent parfois d'une variabilité inter-individus, des interactions anticorps-antigènes en présence de la matrice, et d'un manque de spécificité, en raison de réactions croisées des anticorps avec d'autres composants des fluides biologiques.

D'autres techniques analytiques plus spécifiques ont alors été développées et constituent une alternative aux immunodosages. Elles sont basées sur la chromatographie en phase gazeuse (GC pour *Gas Chromatography*) ou en phase liquide (LC pour *Liquid Chromatography*) couplée à la spectrométrie de masse (MS pour *mass spectrometry*). En effet, avec la découverte de nouvelles méthodes de désorption/ionisation douces (ESI pour *Electrospray/Ionisation*) et Désorption/Ionisation laser assistée par matrice (MALDI pour *Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation*), il est devenu possible de transformer les macromolécules telles que les protéines en ions à l'état gazeux et de les analyser ensuite en fonction de leur rapport masse/charge [16],[17]. La sensibilité et la résolution de cette technologie ne cessent de s'améliorer avec le perfectionnement de ses instruments tels que les analyseurs ou le système de mesure de la masse. En conséquence, plusieurs applications ont vu le jour dans l'analyse des milieux biologiques tels que la protéomique, la peptidomique, la glycomique, la lipidomique ou la métabolomique.

Toutefois, les analyses quantitatives de protéines dans des matrices biologiques par spectrométrie de masse demeurent chères et complexes dans leur utilisation. De plus, elles nécessitent beaucoup de précautions afin de rendre les dosages des protéines sensibles et robustes.

Depuis quelques décennies, la technologie des biocapteurs a été développée et peut constituer très prochainement l'alternative aux méthodes d'immunodosages et de la spectrométrie de masse pour quantifier rapidement les protéines avec une sensibilité élevée et une excellente spécificité. Une grande variété de ces dispositifs a été testée mais celle qui est à base de polymères à empreintes moléculaires est actuellement la catégorie la plus recherchée dans le domaine analytique des biocapteurs appliqués aux protéines.

## 1.3 Les empreintes moléculaires

### 1.3.1 Historique

L'idée d'empreinte moléculaire a été inspirée, la première fois, par les travaux de Linus Pauling qui lui ont valu le prix Nobel de chimie en 1954 [18]. Ces travaux portent sur le processus de reconnaissance ou "complémentarité moléculaire" d'un antigène par son anticorps grâce aux faibles interactions entre les groupements fonctionnels des deux entités. Ce processus de
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

reconnaissance a conduit à l'hypothèse selon laquelle une chaine polymérique en mouvement libre tel que l'anticorps pourrait former un moule complémentaire à une structure moléculaire. D'où la naissance du domaine d'empreinte moléculaire ou polymère à empreintes moléculaires.

## 1.3.2 Principe

Au départ, les polymères à empreintes moléculaires sont considérés comme des matériaux, imitant les anticorps naturels dont le principe de fonctionnement est basé sur le mécanisme «clé-serrure» [19],[20]. Puis, ce concept s'est généralisé à tout processus de polymérisation d'un monomère fonctionnel autour d'une molécule cible désignée par "analyte" [21]. L'extraction de ce dernier engendre des cavités qui, de nouveau, reconnaîtront sélectivement et spécifiquement l'analyte (Figure 1.6).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 1.6:** Principe de préparation d'une empreinte moléculaire</figcaption></figure>

Par rapport à leurs homologues biologiques, les empreintes moléculaires ont montré plusieurs avantages, notamment ; une très bonne stabilité thermique et chimique même dans des milieux agressifs, un faible coût, une facilité de préparation, une stabilité au stockage, une régénérabilité sans perte d'activité, une résistance mécanique élevée et une stabilité à la chaleur et à la pression [22],[23],[24]. Grâce à ces performances, les MIPs sont devenus de plus en plus appliqués à des domaines assez diversifiés. L'évolution importante du nombre de publications entre 2000 et 2020, présentée à la Figure ci-dessous, constitue une preuve incontestable (Figure 1.7).
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 1.7 :** Evolution du nombre de publications portant sur les empreintes moléculaires entre 2000 et 2020 ; Source « PubMed »</figcaption></figure>

Cette simplicité de conception de l'empreinte moléculaire des protéines a séduit plusieurs chercheurs et équipes de recherche dont le Prix Nobel de chimie Jean marie Lehn [25]. Cependant, la capacité de reconnaissance moléculaire reste une étape limitante, du fait qu'elle dépend de plusieurs facteurs dont les complémentarités fonctionnelle et de forme, la quantité, la qualité et les arrangements des groupes fonctionnels au sein de la structure de l'empreinte [26].

Les stratégies de la polymérisation pour la conception des empreintes moléculaires étaient surtout chimiques. Elles sont non seulement complexes à réaliser mais nécessitent également beaucoup de réactifs. Par contre, les méthodes électrochimiques qui commencent à être de plus en plus utilisées sont faciles et rapides à utiliser avec très peu de réactifs. Ce sont ces dernières qui ont été utilisées lors de notre travail. Néanmoins, un bref rappel sur les stratégies de polymérisation chimique va être dressé pour justifier notre choix de la polymérisation électrochimique.

### 1.3.3 Polymérisation chimique

La procédure d'une polymérisation chimique est complexe. Il se déroule en plusieurs étapes et nécessite une sélection judicieuse du monomère fonctionnel, de l'initiateur, du réticulant et du solvant. La durée de l'initiation et de la polymérisation doit être également optimisée.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

Le choix du monomère dépend du type et de la nature des groupements fonctionnels présents dans le modèle. Deux catégories de monomères sont rencontrées : ceux capables de générer des liaisons covalentes avec l'analyte et des ceux capables de générer des liaisons non covalentes avec l'analyte [20],[27]. Ces derniers peuvent être acides, basiques ou bien neutres. Ces monomères interagissent avec le modèle moléculaire soit par des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques ou d'empilement π-π. Généralement, les monomères sont utilisés en excès par rapport au nombre de moles de matrice ; commençant habituellement par un rapport analyte : monomère égal à 1 : 4 [28].

Les systèmes MIPs les plus performants et les plus largement étudiés sont des hydrogels polymériques fortement réticulés, à base d'acide acrylique ou d'acide méthacrylique [29]. Dans les applications biologiques, ces monomères sont aussi les plus favorisés car ils ont des groupes acides anionique qui peuvent se complexer de manière non covalente avec la molécule matrice ; ce qui permet également d'extraire facilement l'analyte.

Par ailleurs, la sélectivité de l'empreinte formée est fortement influencée par le type et la quantité d'agent de réticulation utilisé. En effet, le réticulant rigidifie la structure 3D du polymère [30],[31]. Des rapports de réticulation élevés de l'ordre de 80 % sont souvent préférés pour accéder à des matériaux macroporeux [27],[31].

Une réaction de polymérisation chimique nécessite, en plus, un initiateur. Les initiateurs sont notamment utilisés à des concentrations faibles par rapport au monomère, par exemple 1% (w/w) [27].

Les performances du polymère à empreintes moléculaires élaboré par polymérisation chimique sont également déterminées par la nature du solvant. Ce dernier est sélectionné selon le critère de solubilité de l'analyte, du réticulant et de l'initiateur. Il doit aussi permettre la formation de pores de grandes dimensions afin d'assurer l'écoulement du polymère résultant tout en évitant des interactions avec les interférents. En conséquence, grâce au choix du solvant, il est possible de contrôler la morphologie du polymère puis la sélectivité des MIPs formés [27].

Pour faciliter la lecture de ce manuscrit, nous avons opté pour la présentation des différents types de monomères, de réticulants et d'initiateurs dans les annexes 1, 2 et 3. Les principes des stratégies de polymérisation chimique avec leurs avantages et leurs limitations sont réunis dans un tableau synoptique (Tableau 1.1).
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><caption>## Tableau 1. 1: Stratégies de polymérisation chimique avec leurs avantages et inconvénients</caption><thead><tr><th colspan="2">Stratégie</th><th colspan="3">Conception</th><th>Limitations</th><th>Ref</th></tr><tr><th colspan="2">Principe</th><th colspan="2">Schéma de principe</th><th>Avantages</th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>Polymérisation en masse</td><td>- Mélange, dans un tube, de tous les réactifs dans un faible volume de solvant.<br>- Polymérisation<br>- Récupération du monolithe en brisant le tube de polymérisation.<br>- Broyage et tamisage pour l'obtention des MIPs<br>- Extraction et détection</td><td>Polymérisation<br>Récupération du monolithe<br>Broyage et tamisage</td><td></td><td>- Simplicité de mise en œuvre.<br>- Non-nécessité d'instrumentation sophistiquée.</td><td>- Procédure lente<br>- Particules irrégulières en taille.<br>- Possibilité de destruction des empreintes.<br>- Faible Rendement.<br>- Difficulté de diffusion de l'analyte.</td><td>[32],[33], [34]</td></tr><tr><td rowspan="3">Nanoimpression</td><td>Polymérisation par précipitation</td><td>- Mélange, dans un tube, de tous les réactifs dans un excès de solvant.<br>- Polymérisation<br>- Croissance des chaines jusqu'à précipitation<br>- Récupération par centrifugation des nanoparticules imprimées.<br>- Extraction et détection</td><td>Récupération du MIP<br>Extraction</td><td>- Procédure rapide.<br>- Croissance individuelle des chaines polymériques.<br>- Bon contrôle de la morphologie des particules.</td><td>- Nécessité d'un volume important de solvant.<br>- Faible contrôle de la vitesse de polymérisation.<br>- Une cinétique de reconnaissance lente.</td><td>[32],[33], [34],[35]</td></tr><tr><td>Polymérisation par émulsion</td><td>- Mélange de tous les réactifs, en utilisant un monomère hydrophobe dans un milieux aqueux, en présence d'un tensioactif.<br>- Polymérisation<br>- Récupération des micelles nanométriques par centrifugation<br>- Extraction et détection</td><td>Récupération du MIP<br>Extraction</td><td>- Monodispersité des nanoparticules<br>- Faible taille des particules<br>- Reproductibilité.<br>- Taille nanométrique</td><td>- Nécessité d'utilisation de surfactants, incompatibles avec les protéines.<br>- Difficulté d'enlever les surfactants.<br>- Non homogénéité de taille des particules réalisées.</td><td>[32],[33], [34],[35]</td></tr><tr><td>Polymérisation par suspension</td><td>- Mélange des réactifs dans deux phases, aqueuse et huileuse, en présence des agents dispersants.<br>- Polymérisation<br>- Récupération et centrifugation.<br>- Extraction d'analyte et détection</td><td></td><td>- Particules sphériques<br>- Reproductibilité</td><td>- Recours à plusieurs phases.<br>- Difficulté de diffusion de la protéine.<br>- Taille micrométrique</td><td>[32],[35]</td></tr></tbody></table>
Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2">Stratégie</th><th colspan="2">Conception</th><th rowspan="2">Avantages</th><th rowspan="2">Limitations</th><th rowspan="2">Ref</th></tr><tr><th>Principe</th><th>Schéma</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Impression de surface<br>Impression d'une surface plane</td><td></td><td>- Immobilisation de l'analyte sur la surface des nanoparticules<br>- Polymérisation<br>- Récupération des nanoparticules imprimées<br>- Extraction</td><td></td><td>- Minimisation du volume par rapport à la polymérisation en masse, précipitation et émulsion<br>- Stabilité des empreintes<br>- Homogénéité des cavités<br>- Bonne orientation des cavités formés</td><td>- Une longue durée de préparation<br>- Utilisation de plusieurs substrats<br>- Non contrôle de l'épaisseur<br>- Instabilité des films<br>- Adhérence du film sur la surface</td><td>[35], [36], [37]</td></tr><tr><td>Impression sur un support sacrificiel</td><td>- Immobilisation de l'analyte sur un support sacrificiel.<br>- Polymérisation<br>- Décollage ou retrait du support</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impression sur un micro-contact</td><td>- Immobilisation de l'analyte sur un support en verre ou en quartz.<br>- Mise en contact de la première surface avec une deuxième surface contenant le monomère<br>- Polymérisation<br>- Décollage ou retrait du support</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impression d'épitope</td><td>- Impression d'un épitope de protéine<br>- Extraction<br>- Détection de protéine</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

Eu égard à la complexité du processus de la polymérisation chimique et au nombre important des produits nécessaires, nous avons utilisé dans notre travail plutôt la polymérisation électrochimique.

## 1.4 Polymérisation par voie électrochimique

### 1.4.1 Introduction

En comparaison à la polymérisation chimique, qui s'effectue selon un processus radicalaire initié par voie thermique ou par une irradiation aux UV [20], l'électropolymérisation ne nécessite pas l'utilisation systématique d'initiateur externe et/ou de réticulant. Elle est généralement réalisée en appliquant un potentiel ou une plage de potentiel entre une électrode de travail et une de référence, à une solution contenant la protéine avec un monomère et un électrolyte. L'optimisation des conditions électrochimiques telles que la plage du potentiel appliqué, la vitesse de balayage et la qualité de l'électrolyte conduit à la formation d'un film sur la surface de l'électrode de travail [32],[38] avec une épaisseur, une morphologie et une densité contrôlées.

### 1.4.2 Les monomères fonctionnels

Sur la Figure 1.8 sont présentées quelques structures chimiques des monomères les plus utilisés et ce pour illustrer les groupements fonctionnels susceptibles de réagir lors du processus de la polymérisation.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 1.8** : Structures chimiques de monomères généralement utilisés lors du processus électrochimique</figcaption></figure>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

Leur électropolymérisation sur des substrats conducteurs conduit généralement à la formation d'un film polymérique qui peut être conducteur ou isolant en fonction du choix du monomère et des conditions d'électropolymérisation.

L'utilisation de polymères conducteurs permet d'avoir un film épais avec un avantage pour l'élaboration d'une empreinte moléculaire à trois dimensions (MIPs 3D) micro ou nano structurée [39]. En revanche, la croissance de films à base de polymères isolants est limitante en termes d'épaisseur à cause du blocage du transfert d'électrons par la première couche de polymère formée. En conséquence, le film formé est compact ; ce qui limite la migration de nouvelles monomériques vers l'électrode [39].

## 1.4.2.1 Les polymères isolants

Les polymères isolants offrent des avantages en termes de préparation de films ultra-minces de l'ordre du nanomètre. Par exemple, la scopolétine a été utilisée, par Bosserdt et al., pour élaborer une empreinte capable de détecter sélectivement le cytochrome C qui est un composant protéique essentiel de la chaîne de transport des électrons [40] dans l'organisme. Grâce aux propriétés du polymère à base de scopolétine telle que la robustesse et l'hydrophobie, Drzazgowska et al., ont récemment élaboré un MIP pour détecter un biomarqueur enzymatique d'un cancer de neurones appelé "énolase" [41]. Ce processus d'impression a été considérablement amélioré, par Pizarda et al., en introduisant des nanoparticules en or (AuNPs) dans la matrice du polymère [42]. Le MIP hybride ainsi formé a permis d'augmenter la sensibilité d'un facteur 2.5 et de diminuer la limite de détection jusqu'à 25 pg/mL.

D'auteurs monomères isolants ont été aussi utilisés pour les MIPs des protéines tels que le phénol ou l'acide 3 aminophénylboronique. Le phénol a montré une haute affinité lors de la détection de la ferritine [43] et une bonne capacité pour détecter les protéines filamenteuses des bactéries. L'acide 3 aminophénylboronique est par contre largement proposé pour l'impression des glycoprotéines et ce grâce au groupement hydroxyle de ce monomère capable de former des liaisons covalentes réversibles avec la partie glucidique des glycoprotéines [44].

## 1.4.2.2 Les polymères conducteurs

En raison de sa haute conductivité, sa biocompatibilité et sa stabilité chimique, le pyrrole est considéré comme le monomère le plus proposé pour l'impression électrochimique des protéines. Il a été, en effet, utilisé pour l'impression de l'hémoglobine [45], de l'ovalbumine [46], de l'antigène spécifique de prostate (PSA) [47],[48], de la troponine [49] ainsi que pour
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

l'impression de bactéries telle que le *bacillus cereus* [50] et de virus comme le *bovine leukaemia* [51]. Les MIPs à base de polypyrrole présentent plusieurs avantages dont la reproductibilité, la régénération, une faible limite de détection et une sélectivité élevée. Certains MIPs à base de pyrrole ont été utilisés pour la détection de protéines dans les milieux réels tels que le sérum humain. Une bonne corrélation a été trouvée avec les résultats obtenus par les techniques conventionnelles [47],[48],[49].

L'aniline est un autre exemple de monomère conducteur utilisé pour imprimer les protéines telle que l'albumine du sérum de veau [52] ou un biomarqueur de pathologie cardiaque de type troponine [53]. Le processus d'impression à base d'aniline a été plus optimisé par la combinaison avec d'autres monomères conducteurs ayant des groupes fonctionnels comme l'acide carboxylique [54]. Pour amplifier les interactions hydrogène et électrostatiques avec l'analyte, des dérivés ont été également privilégiés par rapport à l'aniline seul. Parmi ces dérivés, on peut citer l'o-phénylènediamine, le m-phénylènediamine, l'o-aminophénol et l'aminothiophénol.

La dopamine (DA) est un autre exemple de monomère conducteur de plus en plus utilisée pour l'élaboration des MIPs pour détecter les protéines. La DA était en effet méconnue malgré ses multiples avantages tels que sa biocompatibilité et son caractère très hydrophile. Sa richesse en groupes fonctionnels permet d'avoir des liaisons amine, hydroxyle et $\pi-\pi$ et en conséquence un film polymérique dense et ultramince [55],[56].

De ce qui précède, notre choix s'est porté sur l'élaboration d'une empreinte à base de dopamine par voie électrochimique.

### 1.4.3 Différentes approches pour l'élaboration d'une empreinte par voie électrochimique

La conception d'une empreinte par voie électrochimique peut généralement être générée selon trois approches.

La première et la plus simple consiste à former d'abord un complexe de pré-polymérisation en dissolvant l'analyte dans la solution monomérique puis à électropolymériser pour avoir un film mince au sein du que se trouve l'analyte cible (Figure 1.9 (A)) [57],[58]. Cette stratégie semble facile à réaliser mais une optimisation de plusieurs paramètres est nécessaire tels que le choix de la méthode d'électropolymérisation et ses conditions, la nature du solvant et du sel de fond, le rapport protéine/monomère et le protocole d'extraction de l'analyte.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

La deuxième approche se base sur le greffage de la protéine à la surface de l'électrode par adsorption spontanée suivie d'une électropolymérisation du polymère [57]. Néanmoins, une dénaturation ou un relargage de la protéine est tout à fait possible après un simple rinçage.
Comme indiquée sur la (Figure 1.9 (B)), cette technique peut aussi générer un greffage aléatoire et non contrôlé de la protéine sur la surface, provoquant ainsi la diminution de la sensibilité, la sélectivité et la complémentarité des cavités formées.

Pour la troisième approche, la protéine est immobilisée de manière covalente sur la surface de l'électrode à travers une couche d'ancrage auto-assemblée. Elle présente des avantages par rapport à l'immobilisation aléatoire ou à l'électropolymérisation à partir d'une solution protéine-monomère (Figure 1.9 (C)) [57],[58]. Ce procédé peut aboutir, en effet, à une fixation homogène de la protéine sur la surface avec une orientation préférentielle, qui entrave par la suite les changements de conformation et génère des sites de liaison uniformément accessibles.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 1.9** : Les différentes approches utilisées pour l'élaboration d'une empreinte moléculaire</figcaption></figure>

Le Tableau 1.2 présente les avantages et inconvénients des différentes stratégies citées auparavant.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><caption>**Tableau 1. 2:** Avantages et inconvénients de chaque voie de conception d'une empreinte moléculaire</caption><thead><tr><th>Stratégie</th><th>Principe</th><th>Avantages</th><th>Limitations</th></tr></thead><tbody><tr><td>Stratégie A</td><td>- Pré-polymérisation du monomère autour de la protéine<br>- Electropolymérisation du monomère</td><td>- Simplicité<br>- Rapidité</td><td>- Plusieurs paramètres à optimiser<br>- Possibilité de la génération de sites non accessibles</td></tr><tr><td>Stratégie B</td><td>- Greffage non covalent de la protéine sur la surface de l'électrode<br>- Electropolymérisation du monomère</td><td>- Simplicité<br>- Rapidité</td><td>- Greffage aléatoire de la protéine sur la surface<br>- Possible dénaturation de la protéine au cours du processus d'électropolymérisation<br>- Possible décollement de la protéine suite au rinçage<br>- Possibilité de génération de cavités non homogènes et non spécifiques<br>- Surface non stable</td></tr><tr><td>Stratégie C</td><td>- Greffage covalent de la protéine sur la surface d'électrode<br>- Electropolymérisation du monomère</td><td>- Bonne orientation de la protéine<br>- Cavités homogènes et accessibles<br>- Stabilité des cavités et de la structure 3D</td><td>- Procédure lente<br>- Difficulté d'extraction de la protéine (nécessité de rompre des liaisons covalentes)</td></tr></tbody></table>

## 1.4.4 Techniques électrochimiques les plus utilisées en électropolymérisation

Les techniques électrochimiques les plus utilisées sont la voltammétrie cyclique et la chronoampérométrie. Nous nous limitons dans cette partie à l'explication de l'utilisation de ces deux techniques lors de l'élaboration des MIPs. Leurs principes seront détaillés dans le chapitre 2 dédié au matériel et méthodes de caractérisation des MIPs élaborés.

### 1.4.4.1 La voltammétrie cyclique

La voltammétrie cyclique (CV pour *Cyclic Voltammetry*) est la technique la plus utilisée pour la réalisation d'un MIP mince et homogène. Selon la nature de l'analyte, trois paramètres
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

doivent être optimisés à savoir la gamme de potentiel appliqué, le nombre de cycles et la vitesse de balayage [57].

La gamme du potentiel appliqué joue un rôle crucial dans le mécanisme de polymérisation du monomère fonctionnel, constituant ainsi une frontière entre la réaction de nucléation du premier monomère et le processus physique d'adsorption sur la surface de l'électrode de travail [59]. Plus précisément, le groupe fonctionnel, généralement, l'amine est tout d'abord oxydée pour former un cation radicalaire, qui sera impliqué par la suite dans des interactions radical-radical avec les autres monomères pour former une structure dimérique. Le mécanisme se poursuit de la même manière conduisant à la croissance du film polymère selon le nombre de cycles appliqués. Les groupes hydroxyles ou soufrés, présents au sein de la structure du monomère, favorisent ainsi la réticulation entre le film polymérique et la molécule par des liaisons hydrogène, électrostatique ou Van Der Walls [24],[59]. La vitesse de balayage contrôle, par contre, la compacité du film. Une vitesse de balayage très faible peut conduire à la formation d'un film compact à partir duquel l'analyte ne peut pas être éliminé efficacement et facilement, suggérant par la suite une faible capacité de reconnaissance avec le film MIP. Tandis qu'une vitesse de balayage trop élevée génère un réseau de polymère lâche avec une faible capacité de reconnaissance par la suite. On a fait le choix de présenter ci-dessous des spectres de voltammétrie cyclique d'électropolymérisation de quelques monomères à savoir la dopamine, le pyrrole et l'o-diaminophénol (Figure 1.10).

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 1.10:** Spectre d'électropolymérisation de : a) la dopamine [60]; b) le pyrrole [59]; et c) l'o-diaminophénol [61]</figcaption></figure>

### 1.4.4.2 La chronoampérométrie

La chronoampérométrie consiste à appliquer un potentiel entre l'électrode de travail et l'électrode de référence pendant un temps bien défini. Le temps d'électropolymérisation et la
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

valeur du potentiel sont les deux paramètres qui doivent être optimisés pour réussir l'élaboration d'un MIP par chronoampérométrie. Cette dernière s'effectue en trois étapes (Figure 1.11) : la première étape est la nucléation ou l'oxydation du premier germe monomèrique qui se fait suite à l'application d'un potentiel judicieusement choisi à partir de mesures préalables par voltammétrie cyclique [59]. Cette étape se caractérise par une diminution très rapide du courant. Sa durée est de quelques secondes. La deuxième étape de la chronoampérométrie est celle du couplage, qui correspond à la croissance continue et progressive du polymère conducteur. Cela se traduit par une augmentation progressive du courant. La troisième étape est celle de stabilisation de la densité de courant. Elle indique généralement la limitation de la croissance des réactions de transfert de masse [59].

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 1.11 :** Exemple d'un chronoampéromètre correspondant à l'électropolymérisation du pyrrole [[59]]</figcaption></figure>

### 1.4.5 Extraction de l'analyte

L'extraction représente l'étape la plus critique pour l'élaboration d'empreintes moléculaires uniformes ayant une bonne affinité et une complémentarité envers leurs analytes [22]. Au cas où le processus de l'extraction est incomplet, les protéines restent piégées dans les cavités des MIPs et le nombre de cavités disponibles sera réduit. En conséquence, la sensibilité de la capture diminue. Pour parvenir à une extraction totale de l'analyte, des conditions drastiques sont donc proposées, mais elles peuvent endommager les cavités imprimées et diminuer les performances du MIP [62]. Un protocole d'extraction adéquat est celui qui prend en considération les
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

interactions entre les groupements fonctionnels de la protéine et ceux du monomère polymérisé ainsi que de leurs interactions avec la surface de l'électrode.

## 1.4.5.1 Extraction d'analyte ayant des interactions non covalentes

Quatre protocoles d'extraction sont proposés : extraction physique, chimique, électrochimique ou bien enzymatique.

* Dans le cas de l'extraction physique : la rupture des liaisons non covalentes peut être assurée par une sonication. Cependant, l'utilisation de cette procédure peut endommager la stabilité du film [51].

* Dans le cas de l'extraction chimique : un large éventail de traitements chimiques a été reporté dans la littérature. Des sels [48], des alcools, des acides [45],[47],[49], des bases ou encore les tensioactifs comme le dodécylsulfate de sodium (SDS pour *Sodium Dodecyl Sulfate*) [63],[64] et le Tween ont été utilisés pour assurer soit la rupture des liaisons non covalentes, entre le monomère et la protéine, soit la dénaturation de la structure tertiaire de la protéine. Des protocoles combinés, en utilisant des acides et des tensioactifs [46] ou bien des sels et des tensioactifs ont été également appliqués.

* Dans le cas de l'extraction électrochimique : cette méthode est largement appliquée pour éliminer les matrices de faible poids moléculaire. Récemment, elle était appliquée pour l'extraction des protéines. Dechtrirat et al., ont oxydé une surface d'électrode en or modifié par un MIP à base de scopolétine en appliquant un potentiel élevé, pour éliminer une chaine peptidique attachée à la surface d'électrode par un groupement thiol [65]. Tandis que Kan et al., ont suroxydé le film du polypyrrole pour éliminer la protéine [45].

* **Extraction enzymatique** : la digestion enzymatique est également considérée comme une méthode efficace et douce pour l'élimination des protéines. Les protéases, comme subtilisine, protéinase K, pronase ou pepsine, sont les enzymes les plus utilisées pour le clivage des protéines [57]. Ces enzymes sont capables de décomposer la protéine en peptides très courts ou même en acides aminés uniques. Ces derniers seront facilement extraits sans altération ni de l'empreinte ni de la structure tridimensionnelle du film.

## 1.4.5.2 Extraction d'analyte ayant des interactions covalentes avec l'empreinte

Les protéines immobilisées d'une manière covalente sont éliminées selon la nature de la liaison de leur greffage sur la surface. Un réticulant contenant un disulfure peut être clivé avec du mercaptoéthanol [55],[66], tandis que la liaison imine est facilement hydrolysée à l'aide d'acide
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

acétique [67]. Des solutions d'acide fort (pH = 2.2) et des enzymes ont également été utilisées pour extraire les protéines liées par des liaisons peptidiques sur la surface.

## 1.5 Les principales applications des empreintes moléculaires

Grâce aux performances des empreintes moléculaires, plusieurs domaines ont fait appel à cette technologie (Figure 1.12) [22]. Le prétraitement des échantillons avec les différentes méthodes d'extraction constitue l'une des trois principales applications des empreintes moléculaires. En effet, en 1994, Sellergren a développé un MIP pour l'extraction de la pentamidine, un médicament utilisé pour le traitement de la pneumonie liée au Syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) [68].

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 1.12 :** Les différentes applications des empreintes moléculaires</figcaption></figure>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

D'autres molécules telles que des produits pharmaceutiques, des polluants environnementaux ont été extraits sélectivement grâce aux MIPs développés [22]. Ces derniers ont également été utilisés en tant que phase stationnaire dans les techniques de chromatographie pour la séparation et la purification de certaines molécules [22].

La dernière principale application qui fait l'objet de ce travail est l'intégration de structures MIPs en tant qu'élément récepteur du dispositif capteur. Ce dernier constitue un outil analytique très convoité dans plusieurs domaines tels que l'environnement, l'agroalimentaire et le biomédical. Plusieurs variétés de (bio)capteurs ont été développés mais nous allons nous limiter, dans la partie ci-dessous, à présenter seulement les capteurs à base d'empreintes moléculaires, leurs principes physiques, ainsi que les différents types de transducteurs utilisés dans la détection des protéines.

## 1.5.1 Historique des capteurs à bases d'empreintes moléculaires

L'utilisation des capteurs à base des MIPs ont été proposés pour la première fois par Chemistiy et al., qui ont montré que les polymères imprimés peuvent remplacer les anticorps dans des tests immunologiques [69]. Pour la quantification du cortisol qui est une hormone de stress, les auteurs ont utilisé l'acide méthacrylique, le diméthacrylate d'éthylène glycol, azobisisobutyronitrile respectivement en tant que monomère, réticulant et initiateur. La sélectivité de cette empreinte était comparable à celle des anticorps monoclonaux avec une reconnaissance quasi-nulle pour des substances à structure similaire et une très bonne corrélation avec les tests conventionnels (ELISA).

Grâce à ces travaux et en raison des performances montrées par les capteurs à savoir, une stabilité élevée, une simplicité de fabrication, une rentabilité ainsi qu'une polyvalence dans des différents domaines, les capteurs à base d'empreintes moléculaires ont fait un progrès considérable au cours de ces dernières années.

## 1.5.2 Principe physique des capteurs

L'interaction entre les MIPs, en tant qu'éléments de reconnaissance, avec l'analyte cible, sera traduite par un transducteur pour générer un signal de sortie. Selon le mécanisme de transduction, le signal de sortie peut être un signal optique, gravimétrique ou bien électrochimique.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

## 1.5.3 Les différents types de transducteurs

### 1.5.3.1 Les transducteurs optiques

La détection optique implique l'utilisation de la colorimétrie, la fluorescence, la résonance surfacique plasmonique (SPR), ou encore la chimiluminescence.

* **La colorimétrie**

La colorimétrie est la technique optique la moins coûteuse et la plus simple à mettre en œuvre, avec l'avantage de la possibilité de visualiser la reconnaissance MIPs-analyte à l'œil nu. Cependant, cette méthode n'était pas largement appliquée pour la détection des protéines. Récemment, un dispositif à base de papier microfluidique (µPAD pour *microfluidic paper-based analytic device*) avec des empreintes moléculaires a été développé pour la détermination colorimétrique de la chymotrypsine qui est une enzyme protéique responsable de la dégradation de peptides [70].

* **La fluorescence**

La fluorescence est une technique très sensible et capable de détecter des concentrations faibles, et de ce fait, et contrairement à la colorimétrie, elle est largement investiguée pour la reconnaissance des protéines. Le principe de cette technique implique la restitution d'une énergie lumineuse absorbée, sous forme de photons fluorescents.

La configuration la plus simple est la quantification directe des protéines fluorescentes. Dans ce cas, l'intensité de fluorescence est directement corrélée à la présence de la protéine dans son empreinte, comme dans le cas de l'enzyme peroxydase de raifort, extraite des racines du raifort (HRP pour *Horseradish Peroxidase*) [71].

Cependant, la majorité des protéines ne sont pas fluorescentes, des traceurs fluorescents comme l'isomère I de fluorescéine isothiocyanate (FITC pour *Fluorescein isothiocyanate*) [72], l'acide boronique fluorescent à base de quinoléine [73],[74] et les quantums dots [75] doivent être alors utilisés, pour permettre la quantification des protéines.

Une autre alternative, couramment utilisée pour la quantification des protéines, consiste à utiliser des monomères fonctionnels fluorescents. A titre d'exemple, Inoue et al, [76] ont utilisé l'O-acryloyl L-hydroxyproline conjuguée à la dansyléthylènediamine (Hyp-En-Dans), dont la
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

structure est présentée dans la Figure 1.13, comme monomère fonctionnel pour la quantification de l'albumine du sérum humain (HSA pour Human Serum Albumin).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 1.13 :** Structure chimique de l'O-acryloyl L-hydroxyproline conjuguée à la dansyléthylènediamine (Hyp-En-Dans)</figcaption></figure>

Un changement de fluorescence spécifique a été observé pour la liaison de la HSA sur le film mince de polymère imprimé, tandis qu'une réponse plus faible a été observée pour d'autres protéines, y compris l'albumine sérique bovine, la chymotrypsine, le lysozyme et l'avidine (Figure 1.14).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 1.14 :** Variation de ΔI/I0 en fonction de la nature des protéines testés lors des tests de sélectivité du MIP-HSA [77].</figcaption></figure>

## La résonance surfacique plasmonique (SPR)

La résonance surfacique plasmonique (SPR pour Surface Plasmon Resonance) permet la quantification des protéines par voie optique pour des composés qui ne présentent ni de propriétés colorimétriques ni de propriétés fluorescentes. Cette technique consiste à diriger un faisceau lumineux monochromatique vers une surface de verre recouverte par un film fin d'or, préalablement modifié par le film polymérique à empreintes moléculaires, en contact avec le milieu liquide à analyser. Lorsque l'angle d'incidence θ est supérieur à l'angle critique θc, la lumière est totalement réfléchie à l'interface et sera détectée à l'aide d'une photodiode. A θ = θc, une onde évanescente, dont l'amplitude décroît de façon exponentielle par rapport à
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

l'interface entre le prisme et la couche métallique, est engendrée par réflexion interne totale de lumière. Lorsque l'onde lumineuse se couple avec le plasmon de surface, elle lui transfère une partie de sa puissance, engendrant une diminution de la réflectivité pour un angle d'incidence donné qui renseigne sur la présence ou l'absence de la cible (Figure 1.15).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 1.15 :** Principe de la détection par résonance surfacique plasmonique (SPR)</figcaption></figure>

La transduction par résonance surfacique plasmonique a été initialement utilisée dans les années 90 pour la détection de la théophylline, de la caféine et de la xanthine [77] avant d'être appliquée à la détection de plusieurs types de protéines [78],[79],[80],[81],[82]. Nous avons fait le choix de présenter sur la Figure 1.16 la variation de l'angle SRP en fonction de la gamme de détection de l'antigène glucidique-125 (CA-125), biomarqueur de cancer d'ovaire, avec un MIP à base de polypyrrole.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 1.16 :** Variation de l'angle de résonance en fonction des différentes concentrations de la protéine CA-125. Dans l'insert est représentée la comparaison des réflectivité SPR obtenus pour la surface du NIP avec celles obtenues avec le MIP [80]</figcaption></figure>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

La gamme de linéarité du capteur s'étend de 0,1 à 300 U/mL (avec un coefficient de régression R2 = 0,992). La limite de détection était de l'ordre de 0,1 U/mL, suggérant ainsi que la combinaison de la détection SPR avec la technologie d'empreinte moléculaire pourrait être une méthode robuste pour la détection de protéines [80].

## 1.5.3.2 Les transducteurs piézoélectriques

Les matériaux piézoélectriques sont des substances capables de transformer l'énergie électrique en énergie mécanique et réciproquement. Les plus couramment utilisés comme substrats de transducteurs piézoélectriques sont : le quartz (SiO₂), le tantalate de lithium (LiTaO₃), le niobiate de lithium (LiNbO₃) et le polyvenyldiène fluoré (PVDF). L'application d'un champ électrique alternatif génère en effet une onde acoustique mécanique qui se propage le long ou dans le volume du matériau piézoélectrique. Toute modification (par un dépôt d'un film polymérique ou de molécules protéiques) conduit donc à une variation de la fréquence caractéristique de l'onde acoustique.

Les deux types de transducteurs piézoélectriques qu'on va présenter très brièvement ci-après sont les plus utilisés pour la détection de protéines. Il s'agit de la microbalance à quartz (QCM pour Quartz Cristal Microbalance) et du capteur à ondes acoustiques de surface (SAW pour Surface Acoustic Waves).

### La microbalance à quartz (QCM)

La microbalance à quartz (QCM pour *Quartz Crystal Microbalance*) est un capteur à onde acoustique de volume. Elle est constituée d'un disque mince circulaire de quartz et de deux électrodes métalliques déposées de part et d'autre des deux surfaces du cristal (Figure 1.17). L'onde appliquée se propage le long du volume du quartz

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 1.17** : Structure des électrodes des microbalances à quartz QCM</figcaption></figure>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

La variation de fréquence $\Delta f$ suite à l'adsorption (ou à la désorption) de masse $\Delta m$ est calculée à partir de l'équation de Sauerbrey [83] :

$$ \Delta f = - \frac{2 f_0^2}{A \rho c} \Delta m $$

Avec :

$f_0$ : fréquence de résonance du quartz,

A : aire de la surface sensible,

$\rho = 2650$ kg. m⁻³ : masse volumique du quartz

c : céleitété de l'onde dans le quartz

L'équipe de Dickert et al, a été la première à utiliser la QCM, dont la surface a été modifiée par des MIPs à base de polyuréthane, pour la détection des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans l'eau [84]. La faible limite de détection (3.5 µg/L) a contribué à élargir l'utilisation des QCMs à base des MIPs pour la détection de plusieurs autres substances biologiques telles que, les virus [85], les bactéries [86] et plus particulièrement les protéines, dont l'hémoglobine [87], le lysozyme [88] et les immunoglobulines M (IgM) [89].

## • Capteur à onde acoustique de surface (SAW)

Le capteur à onde acoustique de surface (SAW pour Surface Acoustic Wave) est constitué d'un matériau piézoélectrique sur lequel sont déposées des électrodes en peignes inderdigités métalliques (IDT pour Inter Digital Transducers) séparées par une zone sensible métallisée permettant l'adsorption de molécules chimiques ou biologiques (Figure 1.18). L'application d'un signal électrique au niveau des peignes d'entrée génère une onde acoustique qui se propage le long du substrat piézoélectrique. Cette onde de surface est ensuite convertie en un signal électrique, par effet piézoélectrique direct au niveau des IDTs de sortie.

Le principe de fonctionnement de ce capteur est donc basé sur la mesure de la variation des paramètres de l'onde acoustique (fréquence ou phase et amplitude) suite à toute modification se produisant à la surface de la zone sensible (Figure 1.18).
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 1.18 :** Schéma de principe des capteurs à ondes acoustique de surface</figcaption></figure>

Ce type de transduction a été utilisé par l'équipe de Tretjakov et al., pour la détection d'une immunoglobuline G (IgG). Ces auteurs ont en effet greffé d'une manière covalente la protéine cible sur la zone sensible du capteur SAW avant d'électropolymériser la dopamine ou le m-phényldiamine [55],[90]. Récemment, en 2020, Kidakova et al., ont adopté la même stratégie pour la détection de la protéine du facteur neurotrophique dopaminergique cérébral (CDNF pour Brain-Derived Neurotrophic Factor) [66]. Nous avons fait le choix de présenter, dans la Figure 1.19, le test de sélectivité réalisé sur le MIP-(CDNF) en prenant comme molécule interférente le facteur neurotrophique dérivé des astrocytes mésencéphaliques (MANF pour Mesencephalic Astrocyte Derived Neurotrophic Factor).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 1.19 :** Variation de phase du capteur SAW modifié avec un MIP à base de m-phényldiamine en fonction de différentes concentrations de CDNF et son analogue MANF</figcaption></figure>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

Les résultats montrent une plus grande affinité vis-à-vis la molécule cible (CNDF), confirmant par conséquent le fait que les capteurs à ondes acoustiques de surface (SAW) fonctionnalisés avec des MIPs sont de très bons candidats pour une future utilisation dans divers domaines, dont celui du biomédical.

### 1.5.3.3 Les transducteurs électrochimiques

En raison de la simplicité de leur mise en œuvre, de leur rapidité, de leurs bonnes sensibilités ainsi que de leur faible coût, les méthodes électrochimiques sont devenues, depuis une vingtaine d'année, les techniques de transduction les plus utilisées pour la détection de protéines, comme en témoigne le nombre grandissant de publications dans la Figure 1.20a [21],[38],[91]. Cette même tendance à la hausse concerne aussi les capteurs électrochimiques fonctionnalisés avec des polymères à empreintes moléculaire (Figure 1.20b). C'est pour ces raisons, que nous nous sommes décidés à élaborer un capteur électrochimique fonctionnalisé avec un polymère à empreintes moléculaires pour la détection de protéines.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 1. 20 :** a) Evolution du nombre des publications portant sur les biocapteurs électrochimiques pour la détection de protéines entre 2003-2019 ; b) Evolution du nombre des publications portés sur les MIPs électrochimiques pour la détection de protéines entre 2003-2020. Source « PubMed »</figcaption></figure>

Le dispositif expérimental général est basé sur un système à trois électrodes (électrode de référence, contre électrode et électrode de travail) qui a pour rôle de convertir, en un signal physique mesurable, les interactions chimiques ou biochimiques pouvant avoir lieu entre le récepteur préalablement immobilisé à la surface de l'électrode de travail et son analyte. Ces
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

interactions génèrent des signaux électrochimiques qui se traduisent par une variation de courant, de tension, de conductivité ou de résistance.

Pour quantifier ces grandeurs, plusieurs méthodes électrochimiques peuvent être utilisées telles que la voltammétrie cyclique, la voltammétrie différentielle à impulsions (DPV pour *Differential Pulse Voltammetry*), la voltammétrie à onde carrée (SWV pour *Square Wave Voltammetry*) ou la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS pour *Electrochemical Impedance Spectroscopy*).

De nombreuses protéines ont été détectées par l'une ou l'autre de ces techniques. Par exemple, la ferritine, qui est une protéine qui assure le stockage du fer dans le plasma, et l'albumine du sérum humain (HSA) anormalement présente dans l'urine ont été dosées par voltammétrie cyclique avec un capteur imprimé par le polyscolétine [92]. Les Figure 1.21a et b montrent la variation de courant en fonction des différentes concentrations de HSA et ferritine respectivement.

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 1.21** : Variation du courant en fonction des différentes concentrations de HSA dans une plage de concentration allant de 5 jusqu'à 300 mg/dm³; et b) Variation du courant en fonction des différentes concentrations de ferritine dans une plage de concentration allant de 40 jusqu'à 600 mg/dm³.
Inset: Courbes CV correspondantes. Les caractérisations ont été faites dans du PBS contenant 10 mM K₄Fe(CN)₆</figcaption></figure>

Malgré la linéarité des réponses observées pour la ferritine, dans la plage de 120-360 mg/dm³, et pour la HSA dans la plage de concentration de 20-100 mg/dm³, la limite de détection enregistrée n'était n'est pas suffisamment faible pour pouvoir être reliée à certaines pathologies humaines. Une modification a été alors introduite, par d'autres auteurs, au niveau de la conception de l'empreinte en utilisant le bis(2,2'-bithien-5-yl) méthane en tant que monomère fonctionnel et une transduction à base de mesures d'impédance électrochimique [93]. Cette stratégie a été appliquée pour détecter la HSA et a montré une réponse linéaire dans la plage de
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4 à 80 µg/mL avec une limite de détection égale à 800 ng/mL. En changeant de technique électrochimique, et en réalisant des mesures par voltammétrie différentielle à impulsions, la gamme de linéarité a été réduite (de 0,8-20 µg/Ml), mais la limite de détection a été grandement améliorée : 0,16 ng/ml au lieu de 800 ng/ml, soit une valeur 48 fois plus faible que celle déterminée par les mesures d'impédance électrochimique.

Cette variation dans la limite de détection, en fonction de la méthode de transduction, a aussi été soulevée par Moreira et al., lors de la détection d'une protéine musculaire, la myoglobine. L'équipe a utilisé un capteur imprimé par le poly(o-aminophenol) et a réalisé des mesures par voltammétrie à onde carrée (SWV) et par spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS). La limite de détection obtenue par SWV était deux fois plus faible que celle obtenue à partir de mesures EIS [94].

Avec une intégration plus large de la littérature, il s'avère que les résultats de la quantification des protéines avec des capteurs à empreintes moléculaires et des mesures électrochimiques dépendent étroitement de la stratégie de l'élaboration de l'empreinte d'une part et des conditions des mesures électrochimiques d'autre part.

Nous avons donc tenté d'apporter des éléments de réponses à ces questions en expliquant, dans le chapitre 2 dédié aux matériel et méthodes, les approches adoptées pour la fabrication de l'empreinte et les principes des méthodes électrochimiques utilisées ainsi que l'optimisation des conditions des mesures.

Une sélection bibliographique, présentée aux tableaux 1.3, 1.4 et 1.5, complète les différentes stratégies d'élaboration d'une empreinte moléculaire de protéine par voie électrochimique ainsi que leurs paramètres optimisés.
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><caption>Tableau 1.3 : Revue bibliographique dédiée aux empreintes moléculaires réalisées par adsorption de la protéine d'intérêt suivie de l'électropolymérisation du monomère</caption><thead><tr><th>Monomère</th><th>Protéine</th><th>Transducteur</th><th>Technique d'électropolymérisation</th><th>Rapport massique (Protéine / Monomère)</th><th>Electrolyte</th><th>Extraction</th><th>Performance d'empren te</th><th>Référen ces</th></tr></thead><tbody><tr><td>Aminophénol</td><td>cTnT</td><td>Electrochimique (VC + EIS)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.2 - 0.8] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 15</td><td>1 / 200<br>Protéine incubée sur la surface pendant 15 min sur la surface Nue</td><td>Acétate buffer (0.1 M)<br>pH = 5</td><td>-Extraction enzymatique (500 µg/ml, pH = 7.4)<br>- Rinçage plusieurs fois avec le PBS.</td><td>LOD = 0.8 µg/ml par SWV</td><td>[94] 2014</td></tr><tr><td rowspan="2">Phénol</td><td>CA 125</td><td>Electrochimique (VC + DPV + EIS)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [0.0 - 0.9] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 10</td><td>400 U/ml / 2 mM, incubée sur la surface avant l'électropolymérisation</td><td>PBS (0.1 M)<br>pH = 7.4</td><td>- Extraction par une solution d'acide acétique (3 %) et SDS (1 %).</td><td>LOD = 0.5 U/ml</td><td>[95] 2012</td></tr><tr><td>FFPM</td><td>Electrochimique (VC + SQW + EIS)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.2 - 0.8] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 15</td><td>100 µg/mL / 3.55 mM<br>Protéine incubée sur la surface pendant 15 min sur la surface Nue</td><td>Acétate buffer 0.01 M<br>pH = 5</td><td>-Extraction enzymatique (500 µg/ml, pour 2.5 h)<br>- Extraction électrochimique pour 25 cycles dans le MES.</td><td>LOD = 0.9 ng/mL par SWV</td><td>[96] 2017</td></tr><tr><td>Aniline</td><td>cTnT</td><td>Electrochimique (VC + SQW)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.2 - 1.0] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 20</td><td>50 µg mL<sup>-1</sup> / 10 mM, incubée toute une soirée à 4°C sur une surface d'électrode modifiée par une couche de polyaniline</td><td>PBS (0.01 M)<br>+ LiClO<sub>4</sub> (0.005 M)</td><td>- Extraction par une solution d'acide acétique (0.5 M).<br>-Rinçage avec une solution dE PBS</td><td>LOD = 0.04 pg/ml</td><td>[53] 2020</td></tr><tr><td rowspan="3">o-phényldiamine</td><td>CA 15-3</td><td>Electrochimique</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.45 - 0.8] V<br>Vitesse de balayage = 100 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 10</td><td>100 U/mL incubés sur une surface nue pendant 90 min à une température ambiante</td><td>PBS (0.1 M)</td><td>- Incubation dans une solution de trypsin pendant 90 min à 37°C.<br>-Extraction électrochimique dans le PBS.</td><td>LOD = 0.05 U/mL</td><td>[61] 2018</td></tr><tr><td>cTnT</td><td>Electrochimique (CV + EIS)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [0 - 1.1] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 20</td><td>1 µg/mL (27 nM) / 7.5 mM, incubée sur la surface avant électropolymérisation</td><td>Acétate buffer (0.5 M)<br>pH = 5.2</td><td>-Rinçage avec une solution d'éthanol/eau (2:1 ; v/v) contenant 0.25 M NaOH pendant 15 min à 50°C.<br>-Rinçage plusieurs fois avec l'eau.</td><td>LOD = 9 pg/mL</td><td>[97] 2013</td></tr><tr><td>cTnT</td><td>Electrochimique (CV + SQW)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [0 - 1.1]<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 20</td><td>1 µg/mL (27 nM) / 7.5 mM, incubée sur la surface avant électropolymérisation</td><td>Acétate buffer (0.5 M)<br>pH = 5.2</td><td>-Rinçage avec une solution d'éthanol/eau (2:1 ; v/v) contenant 0.25 M NaOH pendant 15 min à 50°C.<br>-Rinçage plusieurs fois avec l'eau.</td><td>K<sub>D</sub> = 2.3 × 10<sup>-13</sup> M</td><td>[98] 2014</td></tr></tbody></table>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><caption>**Tableau 1. 4 :** Revue bibliographique dédiée aux empreintes moléculaires réalisées par mélange du monomère et de la protéine avant électropolymérisation</caption><thead><tr><th></th><th>Protéine</th><th>Transducteur</th><th>Technique d'électropolymérisation</th><th>Rapport</th><th>Electrolyte</th><th>Extraction</th><th>Performance d'empreinte</th><th>Ref</th></tr></thead><tbody><tr><td>Amino-phénol</td><td>Protéine A</td><td>Elcctrochimique (CV + EIS)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.2 - 0.8] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 10</td><td>2.38 µM / 10 mM</td><td>Acétate buffer (0.01 M)</td><td>-Extraction enzymatique (500 µg/ml, pour 2.5 h)<br>- Extraction électrochimique pour 25 cycles dans le MES.</td><td>LOD = 16.83 nM</td><td>[99]<br>2016</td></tr><tr><td>Phénol</td><td>Myo</td><td>Elcctrochimique (CV + EIS)</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel appliqué = [-0.3 - 0.8]<br>Vitesse de balayage = 100 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 1</td><td>5 mg. ml / 10 mM</td><td>PBS (0.1 M)</td><td>- 20 mM SDS dissout dans le PBS /Méthanol (10:1, v/v) pour une nuit.<br>-Rinçage plusieurs fois avec l'eau.</td><td>KF = 0.119 ±0.002 ng mL<sup>-1</sup></td><td>[100]<br>2017</td></tr><tr><td>Aniline</td><td>BSA</td><td>Elcctrochimique</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [0.4 - 1.2] V<br>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles = 6</td><td>0.2 M / 5.0 mg mL<sup>-1</sup></td><td>PBS (0.1 M)</td><td>- 3 fois avec une solution de 5% acetic acid /10 % SDS</td><td>LOD = 6.210<sup>-11</sup> g.mL<sup>-1</sup></td><td>[52]<br>2012</td></tr><tr><td rowspan="2">Scoloptéine</td><td>HSA</td><td>Elcctrochimique</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [0.0 - 1.0] V<br>Vitesse de balayage = 150 mV.s<sup>-1</sup></td><td>7.5 µM / 1 mM</td><td>PBS (0.1 M)</td><td>- 5 mM NaOH (10 min)<br>- 5 % SDS (5 min)<br>- 5 mM NaOH (10 min)</td><td>LOD = 56 nM<br>K<sub>d</sub> = 2.8 ± 0.4 µM</td><td>[92]<br>2017</td></tr><tr><td>Lys</td><td>Elcctrochimique</td><td>Ampérométrie<br>Nombre d'étapes = 50<br>Potentiel 1 = 0 V<br>Temps 1 = 5 s<br>Potentiel 1 = 0.9 V<br>Temps 1 = 1 s</td><td>10 µM / 0.5 mM</td><td>NaCl (0.1 M)</td><td>-50 mM NaOH (15 min).<br>-SDS/acetic acid, 2.5% (w/v) and 5% (v/v) (10 min).<br>-Rinçage avec l'eau ultra-pure (5 min) sous une agitation planaire 200 rpm.</td><td>IF = 2.5<br>LOD = 141 nM</td><td>[101]<br>2020</td></tr></tbody></table>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><tr><td></td><td>BHb</td><td>Elcctrochimique (EIS + DPV)</td><td>Voltammétrie cyclique<br/>Gamme de potentiel = [-0.2 - 1.2] V<br/>Vitesse de balayage = 100 mV.s<sup>-1</sup><br/>Nombre de cycles = 6</td><td>1 mg.ml /<br/>5 10<sup>-3</sup> M</td><td>KCl (0.1 M)</td><td>- Incubation des électrodes dans H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> (1 mol/L) pour 2 h.<br/>- Suivi par suroxydation de pyrrole par CV à une vitesse de balayage égale à 20 mV.s-1</td><td>-</td><td>[45]<br/>2012</td></tr><tr><td rowspan="4">Pyrrole</td><td>cTnT</td><td>Elcctrochimique (CV + SQW)</td><td>Voltammétrie cyclique<br/>Gamme de potentiel appliqué = [-0.8 - 0.8]<br/>Vitesse de balayage = 20 mV.s<sup>-1</sup><br/>Nombre de cycles= 20</td><td>0.01 M /<br/>0.01 mgml<sup>-1</sup></td><td>LiClO<sub>4</sub> (0.005 M) + PB (0.01 M)</td><td>- Immersion des électrodes dans une solution d'acide oxalique d'une concentration de 5.0 mmol L<sup>-1</sup> pendant 10 h à 4°C.</td><td>LOD =<br/>0.006 ng/ml</td><td>[49]<br/>2016</td></tr><tr><td>Ova</td><td>Elcctrochimique (EIS + VC + SQW)</td><td>Voltammétrie cyclique<br/>Gamme de potentiel = [-0.2 - 1.2] V<br/>Vitesse de balayage = 100 mV.s<sup>-1</sup><br/>Nombre de cycles = 4</td><td>1 mg.ml /<br/>0.1 M</td><td>KCl (0.1 M)</td><td>-Immersion des électrodes modifiées dans un mélange d'acide acétique à 5% et une solution SDS à 10% sous agitation magnétique pendant 1,5 h.</td><td>LOD =<br/>2.95 10<sup>-9</sup> mg/mL</td><td>[46]<br/>2017</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Elcctrochimique (CV + SWV)</td><td>Par Voltammétrie cyclique<br/>Vitesse de balayage=50 mV.s<sup>-1</sup><br/>Nombre de cycles= 5<br/>Avec un temps d'incubation = 24 h</td><td>0.0128 mg.ml<sup>-1</sup><br/>0.01 M</td><td>KCl (0.1 M)</td><td>- Immersion des électrodes dans une solution d'acide oxalique d'une concentration de 5.0 mmol L<sup>-1</sup> pendant une nuit</td><td>LOD =<br/>2.0 pg/mL</td><td>[47]<br/>2019</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Elcctrochimique (SWV)</td><td>Par Chronoampérométrie<br/>BL : Potentiel appliqué = 1.05 V<br/>Durée = 2s<br/>MIP : Potentiel appliqué = 1.05 V<br/>Durée = 7s</td><td>3.10<sup>-8</sup> M<br/>10<sup>-2</sup> M</td><td>LiClO<sub>4</sub> (0.1 M)</td><td>-Immersion dans une solution de sel NaCl sursaturé pendant 5 min<br/>-Rinçage avec l'eau ultrapure pendant 30 min</td><td>LOD =<br/>10<sup>-19</sup> M</td><td>[48]<br/>2020</td></tr><tr><td>Dopamine</td><td>CEA</td><td>Optique<br/>Electrochemilumin escence (ECL)</td><td>Voltammétrie cyclique<br/>Gamme de potentiel = [-0.5 - 0.5] V<br/>Vitesse de balayage = 20 mV.s<sup>-1</sup><br/>Nombre de cycles = 30</td><td>15 ng mL<sup>-1</sup> /<br/>5 mM</td><td>PBS (0.1 M)</td><td>-Rinçage alterné entre SDS (1%, wt %) et eau ultrapure.</td><td>-</td><td>[64]<br/>2014</td></tr><tr><td>o-phénylèdiamine</td><td>Myo</td><td>Gravimétrique (QCM)<br/>+<br/>EC (SQW+VC+DPV)</td><td>Voltammétrie cyclique<br/>Gamme de potentiel = [-0.5 - 0.5] V<br/>Vitesse de balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br/>Nombre de cycles = 20</td><td>1/10</td><td>PBS (0.1 M) +<br/>NaCl (0.05 M) +<br/>0.5 Acétate buffer</td><td>-Rinçage avec une solution d'éthanol/eau (2:1 ; v/v) contenant 0.25 M NaOH pendant 15 min à 50°C.<br/>-Rinçage plusieurs fois avec l'eau.</td><td>Kd =<br/>2.3 10<sup>-13</sup> M</td><td>[102]<br/>2016</td></tr></table>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

<table><caption>**Tableau 1. 5:** Revue bibliographique dédiée aux empreintes moléculaires réalisées par greffage covalent de la protéine à la surface de l'électrode</caption><thead><tr><th>Monomère</th><th>Protéine</th><th>Transducteur</th><th>Modification de surface</th><th>Technique d'électropolymérisation</th><th>Electrolyte</th><th>Extraction</th><th>Performance d'empreinte</th><th>Ref</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Scopolétine</td><td>HTHP</td><td>Elcctrochimique (VC)</td><td>- SAM 'MUDA'</td><td>Ampérométrie<br>Pot 1 = 0.7 V, T 1 = 5 s<br>Pot 1 = 0V, T 1 = 5 s</td><td>NaCl (0.5 mM)</td><td>-50 mM glycine-HCl (pH 2.2) sous une agitation planaire 300 rpm pendant 1 h (25 °C).</td><td>-</td><td>[92]<br>2016</td></tr><tr><td>Lys</td><td>Elcctrochimique (VC + EIS)</td><td>- SAM '4-ATP'<br>-Réticulation avec Glu<br>-Ajout de lysine</td><td>Ampérométrie<br>Nombre d'étapes = 50<br>P 1 = 0 V, T 1 = 5 s<br>P 1 = 0.9 V, T 1 = 1 s</td><td>NaCl (0.1 mM)</td><td>-50 mM NaOH (15 min).<br>-SDS/acetic acid, 2.5% (w/v) and 5% (v/v) (10 min).<br>-Rinçage avec l'eau ultra-pure (5 min).</td><td>IF = 7.1<br>LOD = 62 nM</td><td>[101]<br>2020</td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>CA125</td><td>Elcctrochimique (EIS + VC)</td><td>- SAM 'Cystéamine'<br>-Ajout de lysine</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel appliqué = [-0.2 - 1.0]<br>Vitesse de Balayage = 100 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles= 10</td><td>PB</td><td>-Immersion des électrodes dans une solution du SDS 2.5 mM (SDS est dissout dans une solution du PB / Méthanol (10 :1, v : v)) pour une soirée.</td><td>LOD = 0.01 U/mL</td><td>[80]<br>2019</td></tr><tr><td>m-phénylènediamine</td><td>IgG</td><td>Gravimétrie (SAW)</td><td>SAM 4-ATP<br>-Activation avec DTSSP<br>- Ajout d'IgG</td><td>Chronoampérométrie<br>Potentiel = 0.9 V<br>Temps = Non mentionné</td><td>PBS (0.1 M)</td><td>-Immersion des électrodes dans une solution 0,1 M de 2-mercaptoéthanol avec chauffage à 100 ° C sous agitation pendant 15 min.<br>-Rinçage avec l'éthanol et l'eau.<br>-Rinçage avec du NaCl 3 M (15 min)</td><td>IF = 2.8-4</td><td>[90]<br>2016</td></tr><tr><td rowspan="2">Dopamine</td><td>PSA</td><td>Elcctrochimique (CV + EIS)</td><td>-Modification de surface par des aptamères soufrés.<br>- Ajout du PSA</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.5 - 0.5] V<br>Vitesse de Balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles= 13</td><td>PBS (0.01 M)</td><td>- Immersion des électrodes avec une solution d'acide acétique 5% v/v et SDS 5% dans l'eau pour une soirée.<br>- Rinçage avec l'eau.</td><td>LOD = 1 pg/ml</td><td>[63]<br>2017</td></tr><tr><td>PSA</td><td>Elcctrochimique (CV + SQW)</td><td>-Modification de surface par Chitosane-AuNP<br>-Activation avec Glu<br>- Ajout du PSA</td><td>Voltammétrie cyclique<br>Gamme de potentiel = [-0.5 - 0.5] V<br>Vitesse de Balayage = 50 mV.s<sup>-1</sup><br>Nombre de cycles= 15</td><td>PBS (0.01 M)</td><td>- Immersion des électrodes dans une solution d'acide acétique (0.5 M) pour 15 min.<br>-Rinçage des électrodes avec l'eau ultrapure.</td><td>LOD = 0.15 pg/ml</td><td>[67]<br>2017</td></tr></tbody></table>
# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

## 1.6 Référence bibliographique

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# Chapitre 1 : Synthèse bibliographique

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# Chapitre 2 : Matériel et méthodes
## 2.1 Introduction

Ce deuxième chapitre est dédié à la présentation des techniques et produits utilisés dans le cadre de ce travail. Seront donc présentés brièvement les principes des techniques électrochimiques (la spectroscopie d'impédance électrochimique, le voltammétrie cyclique et la voltammétrie à ondes carrées), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et la zêtamétrie.

## 2.2 Techniques et méthodes

### 2.2.1 Les mesures électrochimiques

L'électrochimie est une discipline associée aux phénomènes de transport de charge et de matière ainsi qu'aux réactions chimiques se produisant à une interface entre un conducteur électronique (métal, polymère conducteur...) et un conducteur ionique (solution électrolytique, sels fondus, des électrolytes solides...) [1].

Les processus électrochimiques impliquent plusieurs étapes élémentaires dont :

- Des phénomènes de transport de masse : l'application d'un potentiel électrique engendre en effet un déplacement des entités oxydantes ou réductrices (selon la modification du potentiel de l'électrode) de la solution vers la surface de l'électrode ;

- Des réactions purement chimiques couplées à des transferts de charge, et régies par l'équation 2.1, se produisent ensuite à la surface de l'électrode ;

$$ Ox + ne^- \rightleftharpoons Red, \qquad (\text{Equation 2. 1}) $$

- Un transfert des produits de réaction de l'électrode vers la solution va ensuite se produire : les espèces oxydées (ou réduites) seront mises en solution par le biais d'un processus de diffusion, de migration, ou encore de convection.

Ces différentes étapes sont représentées schématiquement sur la Figure 2.1.
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 2. 1:** Schéma général des différentes étapes d'une réaction électrochimique se produisant à la surface d'une électrode</figcaption></figure>

La connaissance des caractéristiques d'une réaction électrochimique se fait par le biais de la mesure des variations du courant en fonction du potentiel appliqué aux bornes de la cellule électrochimique. Cela se traduit, de point de vue expérimental, par l'obtention de figures appelées voltamogrammes.

Différentes méthodes sont utilisées dans les analyses électrochimiques. Nous ne présenterons dans ce chapitre que celles que nous avons utilisé lors de nos travaux :

## 2.2.1.1 La spectroscopie d'impédance électrochimique

Cette technique, généralement appelés EIS, permet d'évaluer les propriétés intrinsèques des matériaux, en étudiant les processus particuliers impliqués dont la conductivité, la résistivité ou la capacité du système électrochimique au niveau de l'interface électrode / électrolyte [2]. Son principe repose sur le fait que l'application d'une tension sinusoïdale de très faible amplitude, entre l'électrode de référence et l'électrode de travail, génère un courant mesurable entre la contre-électrode et l'électrode de travail. Dans un système linéaire ou pseudo-linéaire, le courant résultant est un courant sinusoïdal superposé au courant stationnaire et déphasé d'un angle $\phi$ par rapport à la tension appliquée (Figure 2.2).
Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 2. 2 :** Représentation graphique de la variation temporelle du potentiel appliqué et du courant généré au cours de la mesure d'impédance</figcaption></figure>

Le résultat obtenu à partir de la perturbation périodique peut être représenté en utilisant une
notation complexe : l'impédance Z(ω) (Equation 2.2), rapport entre la tension appliquée et
l'intensité de courant mesuré [3] :

$$
Z(\omega) = \frac{U_0 e^{i\omega t}}{I_0 e^{i(\omega t + \varphi)}} \qquad (\text{Equation 2.2})
$$

U₀ et I₀ sont respectivement les amplitudes de la tension appliquée et du courant généré, ω = 2 πf représente la pulsation, f est la fréquence et φ est le déphasage. Le résultat peut être représenté graphiquement à l'aide de deux types de tracés :

- Le diagramme de Bode [4], où est reportée la variation du module de Z en fonction de la fréquence ;

- Le diagramme de Nyquist [5], qui est un tracé des composantes imaginaires Z'' par rapport aux composantes réelles Z' à différentes fréquences.

L'étude d'un phénomène physico-chimique conduit souvent à l'élaboration d'un modèle, ou d'un circuit équivalent pour représenter d'une façon rationnelle les processus électrochimiques se produisant aux différentes interfaces (électrode/solution, électrode/film ou film/solution, etc...). Il faut donc faire un choix judicieux de composants électriques et les associer ensuite, en série ou en parallèle, de façon à reproduire « le plus fidèlement possible » la réalité de la mesure.

Quelques exemples de circuits électriques équivalents et des diagrammes Nyquist qui leurs sont
associés sont présentés dans le Tableau 2.1. Les principaux composants associés à ces circuits
sont :
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

- $R_s$ : une résistance qui représente les contributions résistives de l'électrolyte et qui dépend de sa nature et de la valeur de la force ionique,

- $C_{dl}$ : Pour définir cette capacité, nous ferons appel à la théorie de Stern [6] sur la double couche électronique dans laquelle il avait formulé l'hypothèse qu'une partie des charges serait localisée dans une couche compacte proche de la surface alors que l'autre partie se situerait dans une couche diffuse. Son interprétation physique de ces deux couches consistait à leur associer deux condensateurs en série. Le premier condensateur, correspondant à la couche compacte, est celui du modèle d'Helmholtz [7] et le second condensateur, décrivant la couche diffuse, est celui du modèle développé par Gouy-Chapman [8].

- $R_{tc}$ : La résistance de transfert de charge représente, selon la norme ISO 16773-1:2016 (Fr), les caractéristiques de l'interface métal-électrolyte dans un circuit équivalent. Elle est généralement liée à la cinétique de transfert de charges qui se produit au niveau de l'interface électrode/électrolyte. Ce transfert est en effet provoqué par une réaction d'oxydation, ou de réduction, des espèces électroactives présentes à proximité de la surface de l'électrode de travail.

- $Z_w$ : l'impédance de Warburg renseigne sur la diffusion linéaire semi-infinie des espèces électroactives dans une solution donnée. Ce phénomène étant généralement plus lent que celui du transfert de charge, il est donc mesurable aux basses fréquences.

<table><caption>**Tableau 2. 1:** Quelques exemples de circuits électriques équivalents et des diagrammes Nyquist qui leurs sont associés.</caption><thead><tr><th>Circuits équivalents</th><th>Représentations de Nyquist</th></tr></thead><tbody><tr><td><img src="" alt="Circuit équivalent à un branchement de R<sub>s</sub> à R<sub>tc</sub> avec C<sub>dl</sub> en parallèle à R<sub>s</sub>"></td><td><img src="" alt="Représentation de Nyquist pour un circuit équivalent à celui de la figure 2.1 avec un支路 de R<sub>tc</sub> en parallèle à R<sub>s</sub> et une source de courant C<sub>dl</sub> enleichemment en parallèle à R<sub>tc</sub>."><br/>-Z''<br/>R<sub>tc</sub>/2<br/>ω<sub>max</sub> = 1/R<sub>tc</sub> C<sub>dl</sub></td></tr></tbody></table>
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

## 2.2.1.2 La voltammétrie cyclique

La voltammétrie cyclique est une technique couramment utilisée pour étudier les propriétés d'entités qui peuvent être oxydées ou réduites en échangeant des électrons avec l'électrode de travail. Elle consiste à appliquer un balayage triangulaire de potentiel à une vitesse constante, et à mesurer le courant résultant (Figure 2.3a). Les espèces formées par oxydation lors du premier balayage (de $E_1$ vers $E_2$) sont ensuite réduites lors du second balayage (de $E_2$ vers $E_1$). L'inversion de la direction de variation du potentiel permet d'observer le comportement électrochimique des réactifs et des produits, et donc de quantifier la réversibilité des réactions. Un exemple de voltamogramme enregistré suite à une réaction d'oxydoréduction pour un système réversible est présenté à la Figure 2.3b [9]. Le courant enregistré est la somme de deux courants, un capacitif et un faradique. Le premier est généré lors de la (dé)charge de la surface de l'électrode à la suite d'une variation du potentiel qui provoque uniquement l'accumulation (ou la désertion de charges électriques. Le second, c'est-à-dire le courant faradique, est le résultat de réactions électrochimiques qui se sont produites à la surface de l'électrode (oxydation ou réduction).
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 2. 3: a) Principe de la voltammétrie cyclique (variation du potentiel en fonction du courant) ; et b) voltamgramme enregistré suite à une réaction d'oxydoréduction</figcaption></figure>

Les courbes i-E sont obtenues en balayant le potentiel de l'électrode de travail en fonction du temps. Habituellement, l'utilisateur contrôle la fenêtre de potentiel ($E_i$ et $E_f$) à côté de la vitesse de balayage, v. Dans le cas d'un système réversible, composé d'une espèce électroactive en solution, le comportement électrochimique du couple redox se traduit par un voltammogramme réversible (figure 2.3b). L'expression théorique du courant de pointe $I_p$ est donnée par la résolution de la deuxième loi de diffusion de Fick [10] comme condition limite à l'interface de l'équation de Nernst (Equation 2.3) :

$$I_p = (2,69 \times 10^5) n^{3/2} A D^{1/2} v^{1/2} C \quad (\text{Equation 2.3})$$

n est le nombre d'électrons impliqués dans le processus redox, A est la surface active de l'électrode (cm²), D est le coefficient de diffusion de l'espèce électroactive (cm² s⁻¹), $C_0$ est la concentration de l'espèce électroactive en solution (mol.L⁻¹), v est la vitesse de balayage (V.s⁻¹).

Dans le cas d'un système irréversible, où l'espèce oxydée (ou l'espèce réduite) est instable vis-à-vis d'une autre espèce présente dans la solution, l'expression théorique du courant est donnée par la résolution de la deuxième loi de diffusion de Fick avec la loi de Butler-Volmer comme condition aux limites à l'interface (Equation 2.4) [11]:
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

$$ I_p = \frac{n^2 F^2 A v \Gamma}{4 R T} = (9,39 \times 10^5) n^2 A v \Gamma \quad (\text{Equation 2.4}) $$

Γ est la concentration « superficielle » d'une espèce électroactive adsorbée à la surface d'une électrode (mol. cm⁻²), n est le nombre d'électrons impliqués dans le processus redox, A est la surface active de l'électrode (cm²), v est la vitesse de balayage (V.s⁻¹), F est la constante de Faraday, R est la constante universelle des gaz parfaits (8,3144621 J/K/mol) et T est la température (en Kelvin).

Dans l'équation 2.4, la puissance du taux de balayage est égale à 1, ce qui signifie que l'espèce électroactive est adsorbée à la surface de l'électrode. Ainsi, nous pouvons distinguer la nature des systèmes redox selon l'exposant de la vitesse de balayage : $I_p = f(v^{1/2})$ si l'espèce électroactive est dissoute dans la solution et $I_p = f(v)$ si l'espèce électroactive est adsorbée à la surface de l'électrode.

La CV est généralement utilisée pour vérifier l'état des surfaces des capteurs avant et après les étapes de fonctionnalisation ou pour électropolymériser des monomères. Pour des mesures plus quantitatives, on utilise généralement des méthodes à impulsions de potentiel, dont la voltammétrie à ondes carrées.

## 1.1.1.1 La voltammétrie à ondes carrées

Grâce à sa sensibilité et à la rapidité de la mesure, la voltammétrie à ondes carrées (ou SWV pour Square Wave Voltammetry) est devenue l'une des techniques électrochimiques les plus couramment utilisées dans des domaines aussi variés que le diagnostic [12], l'analyse environnementale [13],[14], ou encore le suivi des cinétique enzymatiques [15] et les capteurs chimiques et biologiques [16],[17],[18]. La SWV réunit les avantages des techniques pulsées (sensibilité accrue), la voltammétrie cyclique (compréhension des mécanismes se produisant à la surface de l'électrode) et des techniques d'impédance (informations cinétiques) [19]. Son principe repose sur la combinaison d'une modulation d'une onde carrée d'amplitude ΔE et de période $1/f$ (typiquement entre 1 et 500 Hz) avec une rampe de potentiel (Figure 2.4).
Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 2. 4:** Profil de variation du potentiel appliqué en voltammétrie carrée, avec : a) le potentiel de marche ; b) la variation en « escalier » ; et c) la combinaison de (a) et (b) dans la forme carrée</figcaption></figure>

L'avantage de la SWV par rapport à la voltammétrie cyclique, est lié au fait qu'elle puisse discriminer les courants faradiques des courants capacitifs. En effet, suite à l'application d'un potentiel E, le courant capacitif Ic décroît beaucoup plus rapidement que le courant faradique en raison de son évolution en exponentielle décroissante (Equation 2.5) [20] :

$$I_c = \frac{E}{R_u} e^{-\left(\frac{t}{R_u C_{dl}}\right)} \qquad (\text{Equation 2.5})$$

Ru est la résistance non compensée par le potentiostat du fait que la différence de potentiel entre l'électrode auxiliaire et l'électrode de référence n'est généralement pas connue. Cdl est la capacité de la double couche.

Le courant faradique IF est quand-à-lui inversement proportionnel à la racine carrée du temps (Equation 2.6) [20].

$$I_F = \frac{n F A C D^2}{\frac{1}{\pi^2} t^2} = K t^{-\frac{1}{2}} \qquad (\text{Equation 2.6})$$

Avec : n le nombre d'électrons, F la constante de Faraday, A la surface de l'électrode, C la concentration apparente et D le coefficient de diffusion.

Les échantillons de courant sont prélevés deux fois par cycle, à la fin de chaque impulsion. L'échantillon de courant avant, I₁, provient de la première impulsion (par cycle) qui est dans la direction du balayage en escalier. L'échantillon de courant I₂ est pris à la fin de la deuxième
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

impulsion, qui est dans la direction opposée. Ces deux valeurs de courant sont conservées séparément et le courant différentiel $\Delta I$ est donc égal à la différence entre les deux, soit $I_1-I_2$. Par conséquent, le résultat d'un seul cycle SWV est trois voltammogrammes montrant les courants directs, inverses et différentiels en fonction du potentiel sur la marche de l'escalier correspondant (Figure 2.5) [21].

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 2.5** : Exemple d'un voltamgramme à ondes carrés.</figcaption></figure>

## 2.2.2 Dispositifs expérimentaux

Toutes les mesures électrochimiques ont été réalisées à l'aide d'un potentiostat, un dispositif électronique destiné à maintenir une électrode de travail (WE) au potentiel souhaité par rapport à une électrode de référence (RE).

Quatre potentiostats ont été utilisés au cours de ce travail :

- Un Voltalab PGZ 40 piloté par un logiciel Voltamaster 4.0. La plage de de potentiel varie entre -10 et +10 V, et la plage de courant entre -10 et +10 mA. Il est capable de mesurer des courants aussi faibles que 0.3 picoampères et d'effectuer des balayages à des vitesses de 20 V/s.

- Un CHI 650 qui offre une très large gamme dynamique, et un taux de balayage en voltammétrie cyclique pouvant aller jusqu'à 1000 V/s, avec un incrément de potentiel de 0,1 mV, ou 5000 V/s avec un incrément de potentiel de 1 mV. Le potentiel peut varier entre -10 V et +10 V, et la plage de courant entre -250 et +250 mA. Cet instrument est capable de mesurer des intensités de courant de quelques picoampères.
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

- Un potentiostat DY2100 dont la plage de potentiel varie entre -2.2 et +2.2 V, et la plage de courant entre -2 et +2 mA. Il est capable de mesurer des intensités de de 30 picoampères et sa vitesse de balayage peut atteindre 20 V/s.

## 2.2.2.1 Cellule électrochimique

Une cellule électrochimique conventionnelle à trois électrodes a été utilisée pour étudier les phénomènes électriques des réactions (Figure 2.6). Les trois électrodes sont :

- L'électrode de travail (WE pour *Work Electrode*) : c'est l'élément clé puisqu'elle est le siège des réactions d'oxydo-réductions. Elle est généralement réalisée à partir de matériaux ayant de bonnes propriétés de transfert d'électrons comme le platine, l'ITO (Indium Tin Oxide), le carbone, ou encore l'or. Trois types d'électrode ont ainsi été utilisées : i) or déposé sur un substrat polymérique en Kapton (un film de polyimide); ii) or déposé sur verre ; et iii) et des électrodes sérigraphiées (SPE) qui seront présentées dans le paragraphe qui suit.

- L'électrode de référence (RE pour *Reference Electrode*), dont le potentiel doit être stable et bien connu pour contrôler celui de l'électrode de travail. Nous avons utilisé une électrode Ag/AgCl/KCl(saturé).

- La contre-électrode (CE) : elle assure le passage du courant dans la cellule et est généralement constituée de matériaux inertes (métaux nobles ou carbone/graphite). Elle doit avoir une surface active plus importante que celle de l'électrode de travail.

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 2.6 :** Cellule électrochimique et électrodes utilisées dans le cadre de ces travaux de thèse</figcaption></figure>
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

Les électrodes sérigraphiées (SPE pour Screen Printed Electrode) sont des électrodes miniaturisées qui combinent les trois électrodes sur un substrat en papier rigide. Nous avons utilisé dans le cadre de ce travail des SPE DS 250 AT avec une électrode de travail en or de 4mm de diamètre, une électrode auxiliaire en platine et une électrode de référence en argent (Figure 2.7).

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 2.7 :** Electrode sérigraphiée ( Dropsens )</figcaption></figure>

Les surfaces de l'ensemble de ces électrodes de travail doivent subir un nettoyage approfondi et reproductible pour éliminer les résidus organiques préalablement à toute mesure électrochimique. Ainsi :

- Pour les électrodes en or évaporé déposé sur le verre : le nettoyage se fait tout d'abord par un rinçage sous sonication avec l'acétone et l'éthanol pendant 5 min; Les électrodes sont par la suite incubées dans une solution de piranha (H₂SO₄ / H₂O₂, V/V, 3/1) pendant 10 min et rincées avec l'eau ultrapure et séchage à température ambiante.

- Pour les électrodes en or déposé sur le Kapton i) les électrodes sont incubées dans un bain d'acétone puis dans l'éthanol pendant 3min sous agitation planaire. Cette étape est suivie par un rinçage avec l'eau ultra-pure. Une solution de piranha (H₂SO₄ / H₂O₂, V/V, 1/1) est ensuite déposée sur la surface d'or pendant 5 min. Les électrodes sont finalement rincées avec l'eau ultrapure et séchée à température ambiante.

- Electrodes SPE : un nettoyage électrochimique par voltammétrie cyclique a été opté en balayant le potentiel de -0.2 V jusqu'à 1.2 V pendant 15 cycles dans une solution de H₂SO₄ d'une concentration égale à 0,5 M.
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

## 2.3 Spectroscopie infrarouge à transformation de fourier FTIR

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR pour *Fourier Transform Infrared Spectroscopy*) est une technique permettant d'identifier et d'analyser la structure des composés chimiques. **Son principe repose sur l'absorption de la lumière dans l'infrarouge et de convertir ensuite cette absorption en vibrations moléculaires** associés aux différentes liaisons chimiques et groupements fonctionnels présents dans le composé étudié [22]. On distingue ainsi :

- Les vibrations d'élongation : elles correspondent à une variation de la distance interatomique dans l'axe de liaison entre les atomes. Elles peuvent être symétrique (Figure 2.8a) ou asymétrique (Figure 2.8b).

- Les vibrations de déformations : elles peuvent engendrer une modification de l'angle entre les liaisons. On distingue 4 types de vibrations de déformations : la torsion (Figure 2.8c), l'élongation par rotation (Figure 2.8d), le balancement (Figure 2.8e) et le cisaillement (Figure 2.8f).

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 2.8** : Les différents modes de vibration des liaisons dans une molécule suite à une excitation par IR : a) elongation symétrique ; b) elongation asymétrique ; c) déformation par torsion ; d) déformation par rotation ; e) déformation par balancement ; et f) déformation par cisaillement</figcaption></figure>

Cette absorption permet donc de renseigner sur les liaisons présentes au sein d'une molécule. Le résultat est un spectre qui donne une "empreinte chimique" des échantillons organiques et inorganiques.

L'acquisition des spectres se fait généralement par transmission, mais si les échantillons sont très absorbants ou très épais, il est vivement conseillé d'utiliser le mode de réflexion totale atténuée (ATR, *Attenuated Total Reflectance*), une technique qui se révèle particulièrement intéressante lorsqu'on veut caractériser la surface d'un échantillon donné. Son principe repose sur la mesure de la perte d'intensité d'un faisceau infrarouge qui subit plusieurs réflexions
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

totales à l'interface entre l'échantillon à analyser et un cristal d'indice de réfraction élevé (Figure2.9). A chaque réflexion le faisceau est réfléchi sans perte d'intensité, sauf pour des longueurs d'onde spécifiques, où ces réflexions sont fortement atténuées. Ces longueurs d'onde sont caractéristiques des groupements chimiques présents dans la molécule à analyser.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 2. 9: Schéma de principe de la réflexion totale atténuée**</figcaption></figure>

Le principe de fonctionnement d'un spectromètre FTIR, schématisé sur la Figure 2.10, consiste à envoyer un faisceau IR par l'intermédiaire d'une source lumineuse polychromatique vers l'interféromètre de Michelson. Sur une lame séparatrice comportant une face semi-réfléchissante, la moitié du faisceau est réfléchit sur un miroir fixe, alors que le reste est transmis vers un miroir mobile. Les deux faisceaux se réfléchissent puis retombent de nouveau sur la séparatrice où les deux faisceaux se recombinent, mais les différences de chemin optique créent des interférences constructives et destructives formant l'interférogramme. Le faisceau passe, après, vers le détecteur, où l'interférogramme sera analysé et converti finalement en un spectre infrarouge par une Transformée de Fourier (TF) [23].

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure 2. 10: Principe de fonctionnement de la spectroscopie FTIR**</figcaption></figure>
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

Nous avons utilisé, dans le cadre de ce travail, un spectromètre FTIR Perkin Elmer « Spectrum two » équipé d'un détecteur haute performance en LiTaO3, d'un système optique standard avec des fenêtres KBr, et d'un module ATR (pour Attenuated Total Reflection).

Les spectres ont été collectés à température ambiante de 500 à 4000 cm⁻<fnref n="1" /> avec une résolution de 2 cm⁻<fnref n="1" />. Un spectre de fond a été enregistré préalablement à chaque mesure et a été retranché du spectre final.

## 2.4 La zêtamétrie ou mesure du potentiel zêta

Cette technique permet de mesurer le potentiel zêta de particules en suspension dans un milieu liquide. Le potentiel zêta (ou potentiel électrocinétique) d'une particule en suspension dans un milieu liquide, correspond au potentiel électrostatique mesuré au niveau du diamètre hydrodynamique [24]. Ce dernier définit le plan de cisaillement qui se situe dans la couche diffuse de Gouy relativement proche de la limite avec la couche compacte de Stern [24]. Il renseigne sur la charge électrique au voisinage immédiat de la particule avec sa couche électrique liée de Stern [24]. Le potentiel zêta permet d'avoir une idée sur la nature du milieu étudié (dispersion, agrégation ou floculation), sur sa stabilité et sur les valeurs de conductivité et de point isoélectrique. Le tableau ci – dessous représente l'échelle de stabilité établie par RIDDICK<fnref n="1" />.

<table><caption>**Tableau 2. 2: Echelle de stabilité de RIDDICK**</caption><thead><tr><td>Dénomination</td><td>Potentiel zêta en mV</td></tr></thead><tbody><tr><td>Maximum d'agglomération et de précipitation</td><td>de 0 à +3</td></tr><tr><td>Forte agglomération et précipitation</td><td>de +4 à -5</td></tr><tr><td>Seuil d'agglomération</td><td>de -10 à -15</td></tr><tr><td>Seuil de dispersion</td><td>de -16 à -30</td></tr><tr><td>Stabilité médiocre</td><td>de -31 à -40</td></tr><tr><td>Bonne stabilité</td><td>de -41 à -60</td></tr></tbody></table>

<footnote n="1">¹T. M. RIDDICK, Control of colloid stability through zeta potential, Vol I.</footnote>
Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<table>
   <tr>
    <td>
     Très bonne stabilité
    </td>
    <td>
     de -61 à -80
    </td>
   </tr>
   <tr>
    <td>
     Stabilité excellente
    </td>
    <td>
     de -81 à -100
    </td>
   </tr>
  </table>

Le potentiel zêta, schématisé dans la Figure 2.11, ne peut pas être mesuré directement. Il est, en
effet, déduit à partir de la mobilité électrophorétique des particules chargées, sous l'action d'un
champ électrique appliqué [25]. La mobilité électrophorétique (μe) des particules est d'abord
calculée selon l'équation 2.7 :

$$
\mu_e = \frac{V}{E} \qquad (\text{Equation 2.7})
$$

où V est la vitesse électrophorétique des particules (m/s) mesurée à partir du système
d'électrophorèse et E est l'intensité du champ électrique appliqué (V/m).

Le potentiel zêta est ensuite calculé à partir de la valeur de la mobilité électrophorétique μe, en
utilisant un modèle approprié (Henry, Hückel, Smoluchowski,...).

L'équation de Henry (Equation 2.8) illustre la relation entre la mobilité et le potentiel zêta [25]:

$$
\mu_e = \frac{2 \varepsilon z f (\text{Ka})}{3 \eta} \qquad (\text{Equation 2.8})
$$

Où, μe est la mobilité électrophorétique, ε est le constant diélectrique, z est le potentiel zêta,
η est la viscosité du milieu et f(Ka) est la fonction de Henry. Cette dernière prend des valeurs
comprises entre 1 et 1,5 selon la valeur du produit Ka (K est l'inverse de la longueur de Debye-
Hückel et a est le rayon de la particule, incluant la couche liée de Stern).
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 2.11 :** a) Principe du potentiel zêta ; et b) variation du potentiel en fonction de la distance à partir de la surface de la particule</figcaption></figure>

Les domaines d'application concernés sont nombreux : peintures et pigments, traitement des eaux, matériaux et céramiques, filtration, santé, pharmacie, cosmétologie, agroalimentaire...Les mesures de potentiel zêta en fonction de différents paramètres (pH, force ionique...) fournissent des informations très pertinentes sur les interactions entre les particules. Ces mesures peuvent notamment permettre de prévoir le comportement des émulsions et des dispersions colloïdales (stabilité, floculation, coalescence...), et donc de résoudre certains problèmes de formulation.

Les mesures du potentiel zêta sont basées sur le principe de la diffusion de la lumière (Figure 2.12). L'échantillon est placé, tout d'abord, dans une chambre contenant deux électrodes. Suite à une application d'un champ électrique, les particules chargées migrent vers l'électrode avec la charge opposée, correspondante à une vitesse proportionnelle à son potentiel zêta. Par la suite, un faisceau laser est appliqué et divisé par le diviseur en deux. Le premier est dirigé vers l'échantillon, alors que l'autre est utilisé comme faisceau de référence. La lumière diffusée par l'échantillon est combinée ou mélangée optiquement avec le faisceau de référence pour déterminer le décalage optique [25]. En utilisant le principe de la diffusion de la lumière par analyse de phase (PALS pour *Phase Analysis Light Scattering*), la vitesse des particules est mesurée à partir du déphasage de la lumière diffusée.
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 2.12:** Principe de fonctionnement du potentiel zêta</figcaption></figure>

L'appareil de mesure que nous avons utilisé, au cours de ces travaux de thèse, est un Zétamétrie Nano ZS de Malvern instruments. Il a été utilisé pour déterminer le potentiel zêta de la protéine, à une concentration égale à 0.1 mg.ml⁻¹ à différentes valeurs de pH et de force ionique.

## 2.5 Produits chimiques et biologiques

### 2.5.1 Choix du monomère

Notre choix s'est porté sur la dopamine, en raison de sa haute hydrophilie, sa biocompatibilité avec différents matériaux, ainsi que sa richesse par une variété de groupements fonctionnels (liaisons amine, hydroxyle et π-π [26]. La première application de la polydopamine (PDA), en tant qu'élément de reconnaissance, remonte à 2006 et concerne la détection sélective de la nicotine dans le sérum humain [27]. Récemment, Palladino et al., ont mis en évidence, dans un revue, le potentiel et les applications du PDA en (bio) analyses, et ce allant des petites molécules (sucres, arômes et acides phénoliques) jusqu'aux biomolécules (oligonucléotides, enzymes) [28].

### 2.5.2 Choix de protéines

Quatre protéines ont été étudiées dans le cadre de ce travail :

- L'immunoglobuline G (IgG) : les IgG sont les immunoglobulines les plus abondantes dans l'organisme. Elles représentent 75 à 80 % des anticorps circulants.
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

- L'albumine du sérum humain (HSA) : c'est la protéine la plus abondante dans le sérum humain (60 % des protéines).

- L'albumine du sérum bovin (BSA) : Comme la HSA, la BSA est une protéine présente chez le mammifère. Son choix est dû au fait qu'elle a des caractéristiques comparables à celles de la HSA en termes de conformation, point isoélectrique et masse moléculaire.

- L'antigène spécifique de la prostate (PSA pour Specific Prostate Antigen) : est une protéine sécrétée par la prostate chez les hommes. Elle a été utilisée dans les tests de sélectivité du fait qu'elle a un poids moléculaire et un point isoélectrique différents de la protéine d'intérêt.

Le Tableau 2.3 montre les différentes caractéristiques intrinsèques à savoir le poids moléculaire et le point isoélectrique des quatre protéines.

<table><caption>**Tableau 2.3: Les différentes caractéristiques intrinsèques des trois protéines**</caption><thead><tr><td>Protéines</td><td>Poids moléculaire (KDa)</td><td>Point isoélectrique</td></tr></thead><tbody><tr><td>IgG</td><td>168</td><td>6,2 [29]</td></tr><tr><td>BSA</td><td>64</td><td>4,6 [30]</td></tr><tr><td>HSA</td><td>64</td><td>4,7 [31]</td></tr><tr><td>PSA</td><td>32</td><td>7,2 [32]</td></tr></tbody></table>

C'est le PBS (pour Phosphate Buffer solution) qui a été utilisé comme électrolyte support dans toutes nos expérimentations. Ce tampon a une concentration ionique, une osmolarité et un pH comparables aux fluides corporels humains. Il est donc susceptible de préserver la conformation native de protéines.

Le PBS est obtenu à partir d'un mélange de quatre sels : le chlorure de sodium (NaCl avec une concentration de 137 mM), le chlorure de potassium (KCl avec une concentration de 2.7 mM), l'hydrogénophosphate de sodium (Na₂HPO₄ avec une concentration de 10 mM) et le dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄ avec une concentration de 1.76 mM).

Le potentiel stabilisant des ions dans une solution aqueuse de PBS, et notamment ceux de la série de Hofmeister a été étudié dans la littérature [33],[34],[35]. Rappelons à ce niveau qu'une protéine possède à sa surface de nombreuses fractions hydrophiles et polaires dont les groupements amide et amino chaotropes et les groupements carboxyliques kosmotropes qui s'appariant fortement avec les anions chaotropes (Cl⁻ provenant majoritairement du NaCl et du
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

KCl) et les cations kosmotropes (Na⁺ provenant de NaCl et Na₂HPO₄). Une telle complémentarité entre les groupements chargés des protéines et les ions du PBS explique donc le pouvoir stabilisant de ce dernier.

## 2.5.3 Produits utilisés pour la réalisation des couches mixtes auto-assemblées :

- L'acide mercaptohexadécanoïque (MHDA pour *Mercaptohexadecanoic Acid*) : C₁₆H₃₂O₂S

- L'acide mercaptoundécanoïque (MUDA pour *Mercaptoundecanoic Acid*) : C₁₁H₂₂O₂S

- L'acide mercaptopropanoïque (MPA pour *Mercaptopropanoic Acid*) : C₃H₆O₂S

- Le 6-Mercapto-1-hexanol (MHOH pour *Mercaptohexanol*) : C₆H₁₄OS

- 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) : C₈H₁₇N₃

- N-hydroxysuccinimide (NHS) : C₄H₅NO₃
# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

## 2.6 Références bibliographiques

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# Chapitre 2 : Matériel et méthodes

[34] S. Z. Moghaddam & E. Thormann, “The Hofmeister series: Specific ion effects in aqueous polymer solutions,” *J. Colloid Interface Sci.*, vol. 555, pp. 615-635, 2019, doi: 10.1016/j.jcis.2019.07.067.

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# Chapitre 3 : Résultats et discussions
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

## 3.1 Introduction

Le dépistage et le suivi de l'évolution de traitements de certaines pathologies, comme les maladies neurodégénératives et les cancers, peuvent se faire à travers la mesure précise de la concentration de protéines spécifiques, les biomarqueurs. Ces protéines peuvent aussi donner des indications sur le risque de développer ultérieurement un type particulier de pathologie, ou encore informer sur la nature et la gravité d'une tumeur donnée. Les biocapteurs d'une manière générale, et ceux fonctionnalisés avec les polymères à empreintes moléculaires en particulier, sont capables de répondre à ces besoins de dosage ultra-sensible et sélectif de protéines d'intérêt. Une revue exhaustive de la bibliographie montre, cependant, que seule 9% des articles publiés dans le domaine des MIPs sont dédiés aux protéines<fnref n="2" />.

Plusieurs raisons pourraient être à l'origine de ce constat : i) la large taille des protéines, qui fait qu'elles peuvent rester piégées dans le réseau polymérique [1],[2] ; ii) la complexité de sa structure tridimensionnel qui peut être sujette à une modification conformationnelle lors de la construction du MIP [3] ; iii) la charge interfaciale qui pourrait conduire à une adsorption non spécifique de la protéine sur la matrice du polymérique ; et finalement iv) le nombre important d'étapes d'optimisation nécessaires pour conserver intactes les propriétés structurales d'une protéine donnée [4].

Une compréhension fine de l'interaction protéine-empreinte permettrait donc de contourner ces problèmes et de réussir l'élaboration d'empreintes sélectives. C'est dans ce cadre que s'inscrit ce travail qui vise à : i) comprendre le(s) mécanisme(s) d'interaction entre une protéine donnée et son empreinte en fonction de la stratégie de conception de l'empreinte ; ii) mettre en évidence l'importance de la nature de la protéine lors de fabrication d'une empreinte, et donc d'un polymère à empreintes moléculaires ; et iii) étudier l'effet des paramètres physico-chimique sur l'interaction entre une protéine donnée et son empreinte.

Ce chapitre est divisé en trois parties. La première est dédiée au choix de la technique de fonctionnalisation des électrodes en or, parmi deux stratégies : immobiliser la protéine préalablement à l'électropolymérisation de la dopamine, via un greffage covalent sur des couches autoassemblées, ou, au contraire, la laisser libre. Une fois ce choix fait, nous avons évalué, dans la deuxième partie, l'effet de la nature de la protéine lors de la construction d'un MIPs ainsi que le rôle des sondes redox. La troisième et dernière partie, est dédiée à l'étude des effets de la force ionique et du pH sur l'interaction entre une protéine modèle et son empreinte.

<footnote n="2">² Recherche faite sur Scifinder le 29/07/2021 avec les mots clés Molecularly Imprinted Polymers (12875 articles), puis « Refine » avec le mot Protein (1152 articles)</footnote>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

## 3.2 Choix de la technique de fonctionnalisation des surfaces pour la construction d'un MIP

Différentes stratégies ont été développées pour la fonctionnalisation d'une surface donnée préalablement à la détection de la protéine d'intérêt par des capteurs fonctionnalisés avec des polymères à empreintes moléculaires. Les plus courantes consistent à une pré-polymérisation du monomère autour de la protéine suivie par son électropolymérisation, ou à greffer la protéine d'une manière covalente sur la surface avant d'électropolymériser le monomère choisi. Ce sont ces deux méthodes qui ont été évaluées dans le cadre de ce travail. Nous appellerons la première stratégie 1 et la seconde stratégie 2. Le monomère d'intérêt étant la dopamine et nous avons choisi l'immunoglobuline G (IgG) comme protéine modèle.

Dans les deux cas, l'électropolymérisation de la dopamine a été réalisée par voltammétrie cyclique, en faisant varier le potentiel entre -0.5 et 0.5 V avec une vitesse de balayage de 50 mV/s. Ces valeurs ont été en effet choisies sur la base de nombreuses études bibliographiques, dont celles de Ma et al., [5] et Tretjakov et al., [6].

Le voltamogramme correspondant et le mécanisme d'électropolymérisation de dopamine sont présentés sur la Figure 3.1

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 3.1:** a) Voltamogramme caractéristique de l'électropolymérisation de la dopamine ; et b) mécanisme de l'électropolymérisation de la dopamine</figcaption></figure>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

La Figure 3.1 montre un pic d'oxydation ($Po_1$) à 0,23 V dans le premier cycle, qui correspond à l'oxydation de la dopamine en dopaminequinone. Les deux pics qui apparaissent vers 0.30 V ($Pr_1$) et 0,07 V ($Pr_2$) peuvent être associés à la réduction de la dopaminequinone et de la dopaminechrome, respectivement. Le nouveau pic d'oxydation à -0,22V ($Po_2$) observable à partir du deuxième cycle peut être associé à l'oxydation du leucodopaminechrome [7],[8]. La diminution du courant en fonction du nombre des cycles indique la formation d'un film compact et dense qui recouvre progressivement la totalité de l'électrode.

## 3.2.1 Optimisations des paramètres fondamentaux pour la conception des deux MIPs

### 3.2.1.1 Optimisation des paramètres de la construction du MIP par la stratégie 1

Comme mentionné dans le premier chapitre, plusieurs paramètres importants régissent la construction d'un MIP, et donc d'une empreinte sélective : son épaisseur, sa compacité, dictée par la vitesse de balayage en voltammétrie cyclique et le rapport entre le monomère et la protéine.

Ces différents paramètres ont été optimisés à partir de mesures par voltammétrie à ondes carrées. Pour la totalité des mesures, nous avons utilisé un système à trois électrodes (or, de surface $S = 0.5 \text{ cm}^2$, platine et Ag/AgCl/KCl saturé comme électrode de travail, contre électrode et électrode de référence respectivement) et nous avons implémenté les paramètres optimisés suivants : incrément = 4 mV, amplitude = 25 mV, fréquence = 25 Hz et sensibilité = $1 \times 10^{-3} \text{ A/V}$.
Toutes les mesures électrochimiques ont été effectuées à température ambiante dans un tampon phosphate salin (PBS pour Phosphate Buffer Solution) (0,1 M à pH = 7.4), en présence du couple redox [$Fe(CN)_6]^{3/-4}$ de concentration 5 mM. Chaque mesure a été refaite trois fois pour s'assurer de l'absence de biais dans la démarche.

* Optimisation de l'épaisseur du film

Rappelons que pour cette étude, nous avons fait le choix d'une matrice polymérique en polydopamine. Le choix de l'épaisseur d'un polymère à empreintes moléculaires pour recouvrir la protéine est en effet un compromis entre deux exigences : il faut qu'il soit « suffisamment épais » pour couvrir la majeure partie des protéines, mais pas « trop épais » pour pouvoir les extraire.

Nous nous sommes basés sur les données de la littérature pour optimiser l'épaisseur du film de polydopamine [5],[9]. Nous avons donc utilisé la voltammétrie cyclique pour
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

électropolymériser les films en faisant varier le nombre de cycle entre 10 et 20. Les voltamogrammes, obtenus à partir de mesures par SWV, sont présentés dans la Figure 3.2a.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 3.2:** a) Voltamogrammes correspondant à des MIPs-IgG de différentes épaisseurs, b) Variations des valeurs de pics de courant en fonction du nombre de cycle. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique $[Fe(CN)_6]^{3-/4-}$ avec une concentration de (5 mM) et une vitesse de balayage égale à 50 mV.s⁻¹.</figcaption></figure>

Pour une meilleure interprétation des résultats, nous avons tracé, dans la Figure 3.2b, des histogrammes représentant les variations de pics de courant en fonction du nombre de cycles. Il en ressort que pour un nombre de cycles inférieur à 15, une augmentation de l'épaisseur du film de polydopamine contenant l'IgG conduit à une diminution des valeurs de courant. Au-delà de 15 cycles, le phénomène inverse se produit. Cette variation peut être interprétée comme suit :

- 10 et 12 cycles ne sont pas suffisants pour que le film formé couvre la totalité des protéines ;

- Un film relativement épais a été réalisé à la suite d'une électropolymérisation avec 17 et 20 cycles, permettant ainsi une continuité pour le passage du courant via le polymère,

- L'épaisseur optimale du film de polydopamine est donc celle obtenue à partir de 15 cycles.

## Optimisation de la vitesse de balayage

Une revue bibliographique nous a orienté vers le choix de deux valeurs : 20 [7],[9] et 50 mV.s⁻¹ [5],[6]. Sur la Figure 3.3, sont présentés les spectres relatifs aux polymères imprimés (MIP) et non imprimés (NIP pour *Non Imprinted Polymer*) réalisés à des vitesses de balayage égales à
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

20 et 50 mV.s⁻¹. Pour rappel, le NIP est préparé dans les mêmes conditions que le MIP mais sans ajout de protéine.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 3.3:** Voltamogrammes comparatifs du MIP et du NIP réalisés à deux vitesses de balayages 20 et 50 mV.s⁻¹. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻) avec une concentration de (5 mM)</figcaption></figure>

De ces voltamogrammes, il ressort que les intensités des NIP sont supérieures à celles des MIPs, et ce pour les deux vitesses de balayage. Ceci est principalement dû à la présence de la protéine avec ses charges négatives au sein de la matrice polymérique en polydopamine.

Pour mieux comparer l'effet de la vitesse de balayage, nous avons calculé le taux d'impression τ à partir de l'équation 3.1 :

$$ \tau = \left(1 - \frac{J_{\text{MIP}}}{J_{\text{NIP}}}\right) \times 100, \qquad \text{(Equation 3.1)} $$

Ce taux permet en effet de tenir compte aussi bien de la part d'adsorption non spécifique que de la vraie reconnaissance de la protéine par l'empreinte.

Le taux d'impression d'IgG, dans la polydopamine, a été trouvé de l'ordre de 51 % pour une vitesse de balayage de 50 mV.s⁻¹ et de 46 % pour une vitesse de balayage égale à 20 mV.s⁻¹.

Une faible vitesse de balayage conduit donc à la formation d'un film compact qui minimise l'incorporation de la protéine au sein du film [10]. Notre choix s'est donc porté sur une vitesse de balayage de 50 mV/s pour la suite des mesures.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

## Optimisation du rapport protéine / monomère

Comme mentionné dans le premier chapitre, l'optimisation du rapport protéine / monomère garantit la formation d'une empreinte spécifique et sélective. Nous avons donc réalisé plusieurs MIPs avec différents rapports protéine / monomère : 1 / 1000 ; 1 / 500 ; 1 / 100 et 1 / 50. Concrètement, nous avons maintenue constante la concentration du monomère et nous avons fait varier celle de la protéine. Les voltamogrammes correspondants sont présentés sur la Figure 3.4. À titre de comparaison, nous avons également tracé celui du NIP.

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 3.4** : Voltamogrammes du NIP et des MIPs réalisés à différentes rapports protéine / monomère. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻) avec une concentration de (5 mM)</figcaption></figure>

Nous avons calculé, à partir de ce graphe et de l'équation 3.1, les taux d'impression (Equation 3.1) pour chaque MIP. Les taux d'impression ont été estimés à 40 %, 45 %, 51 % et 53 % pour les rapports 1 / 1000 ; 1 / 500 ; 1 / 100 ; 1 / 50. Nous avons donc choisi le rapport 1 / 100 pour le reste de cette étude.

## Optimisation de la nature de l'agent extracteur

Les conditions d'extractions doivent être soigneusement sélectionnées et optimisées afin de garantir l'extraction totale de l'analyte et la stabilité du film. Nous avons testé différents procédés d'extraction : enzymatique, incubation dans une solution d'acide sulfurique ($H_2SO_4$), dans un solvant organique (dimethyl sulfoxide, DMSO), ou encore dans un mélange d'acide acétique / dodécylsulfate de sodium ($CH_3COOH$ / SDS). Nous avons par ailleurs fait varier les
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

durées d'incubation et de rinçage. Seuls les résultats optimisés, pour chaque procédure d'extraction, sont présentés sur la Figure 3.5.

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>**Figure 3.5:** Voltamogrammes du NIP et des MIPs avant et après incubations dans les différents extracteurs. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻) avec une concentration de (5 mM)</figcaption></figure>

La plus grande variation, en termes de valeur de pic de courant, a été enregistrée suite à l'extraction avec l'acide sulfurique, pendant une heure, et un rinçage avec l'eau ultrapure pendant 30 min. Nous avons donc opté pour cette procédure d'extraction pour la suite de cette étude.

## 3.2.1.2 Optimisation des paramètres de construction du MIP par la stratégie 2

* Optimisation de nature de la couche de fonctionnalisation

Les monocouches autoassemblés (appelés SAMs pour *Self Assembled Monolayers* dans la suite de ce travail) sont parmi les technologies les plus attrayantes pour immobiliser une protéine donnée. Néanmoins, l'organisation des monocouches sur une surface donnée et l'accessibilité de leurs groupements fonctionnels dépendent très fortement de la nature et de la longueur des chaines d'alcanethiol mises en jeu.

Nous avons donc testé trois types de molécules souvent utilisées pour réaliser des SAMs sur des surfaces en or : l'acide mercaptopropanoïque (MPA, 3 carbones), l'acide mercaptoudécanoïque (MUDA, 11 carbones) et l'acide mercaptohexadécanoïque (MHDA, 16
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

carbones). Les mesures électrochimiques ont été réalisées avec des électrodes sérigraphiées (SPE pour Screen Printed Electrodes) avec une électrode de travail, de 4 mm de diamètre, en or, une contre d'électrode en platine et une électrode de référence en argent. Les voltamogrammes des surfaces fonctionnalisées sont présentés sur la Figure 3.6a, et les variations des pics de courant en fonction de la nature de la monocouche formée sont reportées sur la Figure 3.6b.

Les résultats indiquent qu'une augmentation de la longueur de la chaine mise en jeu conduit à une diminution du courant et à un shift du potentiel. Cette variation peut être expliquée par le fait que les chaines ordonnées agissent comme une barrière électronique qui inhibe le transfert de charge vers la surface d'or, d'autant plus que leur épaisseur est grande [11],[12].

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 3.6: a)** Voltamogrammes obtenus à partir de mesures SWV après la fonctionnalisation d'une surface en or avec des monocouches de MPA, MUDA et MHDA ; **b)** Variations des pics de courant en fonction de la nature de la monocouche formée. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ($[Fe(CN)_6]^{3-/4-}$) avec une concentration de (5 mM)</figcaption></figure>

Cette structure compacte peut, par ailleurs, rendre les groupements fonctionnels moins accessibles, ce qui limiterait *in-fine* l'accrochage des protéines. Une des solutions rapportées dans la littérature consiste à utiliser des monocouches mixtes [13],[14],[15]. Nous avons donc testé les configurations suivantes : (MHDA / MHOH), (MHDA / MPA), (MUDA / MHOH) et (MUDA / MPA) avec un rapport (1/9, v/v) pour cette étude<fnref n="3" />. Les voltamogrammes

<footnote n="3">³ Ce rapport sera optimisé dans la partie qui suit.</footnote>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

correspondants sont présentés sur la Figure. 3.7a et les histogrammes des variations des pics de courant en fonction de la nature de la couche mixte sont reportés sur la Figure. 3.7b.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 3.7 :** a) Voltamogrammes obtenus à partir de mesures SWV après la fonctionnalisation d'une surface en or avec différentes monocouches mixtes ; b) Histogrammes des variations des pics de courant en fonction de la nature de la couche mixte. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ($[Fe(CN)_6]^{3-/4-}$) avec une concentration de (5 mM).</figcaption></figure>

Les résultats indiquent que le meilleur transfert de charge, vers la surface de l'électrode, est obtenu avec le couple MUDA / MHOH (11 carbones / 6 carbones) et que le couple le plus bloquant est celui de MHDA / MPA (16 carbones / 3 carbones). Le blocage observé pourrait être expliqué par le fait qu'une grande différence entre les longueurs des chaines pourrait favoriser leur repliement sur la surface, voire créer, des liaisons hydrogènes entre leurs groupements terminaux, ce qui conduit *in-fine* à une réduction de passage de sonde redox vers la surface d'électrode [14]. Ce phénomène a beaucoup moins de chance de se produire avec le couple MUDA / MHOH.

Une représentation schématique des hypothèses d'organisation, sur des surfaces d'or, des monocouches (MHDA / MPA) et (MUDA / MHOH) est illustrée dans la Figure 3.8 [14].
Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure 3. 8:** Représentation schématique des hypothèses d'organisation, sur des surfaces d'or, des monocouches a) (MHDA / MPA) et b) (MUDA / MHOH)</figcaption></figure>

L'étape qui suit est dédiée à l'optimisation du rapport MHOH/MUDA. Trois configurations ont été donc testées : (1 / 9 ; 5 / 5 ; 9 / 1). Nous avons fait le choix de mener cette étude par spectroscopie d'impédance (EIS), une technique extrêmement sensible aux modifications pouvant avoir lieu aux interfaces [16],[17]. Nous avons utilisé un potentiostat Voltalab et un système à trois électrodes : une électrode de travail en or évaporé sur un substrat en verre, une électrode de référence en Ag/AgCl/KCl et une électrode auxiliaire en platine. Les mesures EIS ont été réalisées à température ambiante dans un tampon phosphate salin (0,1 M, pH = 7.4), en présence du couple redox ([Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻) de concentration 5 mM, en appliquant un potentiel égal à 0.2 V, dans une gamme de fréquences allant de 10 mHz jusqu'à 100 kHz. Les diagrammes de Nyquist correspondants et les variations des valeurs de résistances de transfert de charge R<sub>tc</sub> des surfaces d'or fonctionnalisées avec du MUDA, MHOH et avec MUDA/MHOH avec trois rapports différents (1/9, 5/5, 9/1) sont représentés dans la Figure 3.9.

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 3. 9:** a) Diagrammes de Nyquist des surfaces fonctionnalisées avec MHOH, MUDA et MUDA/MHOH avec trois rapports différents (1/9, 5/5, 9/1); et b) Variations des valeurs des résistance de transfert de charge en fonction de la nature de la couche de fonctionnalisation. Caractérisation faite dans un tampon PBS (0,1 M) contenant le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻/⁴⁻) avec une concentration de (5 mM)</figcaption></figure>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

La Figure 3.9 montre que l'augmentation de la concentration en MUDA provoque un blocage de la surface et donc une augmentation de la résistance de transfert de charge Rtc. Ceci est probablement dû à la déprotonation des groupements COOH (en groupements COO⁻) à pH neutre. La charge négative globale joue dans ce cas le rôle d'une barrière électronique qui inhibe le transfert du couple ferrique vers la surface de l'électrode [15].

Le fait que la meilleure configuration soit celle obtenue avec le couple (MHOH / MUDA) (9 / 1 : v / v) peut être attribué au bon espacement entre les chaines de MUDA et de MHOH, générant ainsi des groupements COOH plus accessibles pour accrocher la protéine d'intérêt.

Ce choix fait, et avant de procéder à l'électropolymérisation de la dopamine, nous avons activé les SAMs par EDC/NHS, une opération lors de laquelle le groupement carboxylique terminal du MUDA se transforme en un groupement NHS-ester, permettant ainsi le greffage de la protéine d'intérêt.

Nous allons présenter dans la partie suivante les différents paramètres à optimiser pour la conception de l'empreinte.

## Optimisation de l'épaisseur de la matrice polymérique

Nous avons réalisé plusieurs tests pour optimiser l'épaisseur du film de polydopamine dont l'électropolymérisation est réalisée par voltammétrie cyclique. Nous avons testé 4 configurations : 13, 15, 17 et 20 cycles. L'épaisseur optimale était celle correspondant à 17 cycles (résultats non présentés dans ce manuscrit).

La Figure 3.10a présente les différents voltamogrammes enregistrés après les modifications d'une surface en or (nu) par les SAMs mixtes MUDA / MHOH (1 / 9, v / v), greffage de la protéine IgG et électropolymérisation de la dopamine. Chacune de ces étapes provoque une diminution des valeurs de pics de courant. Les interprétations relatives aux SAMs mixtes ont été présentées dans la partie précédente. Le greffage de l'IgG induit un blocage de la surface du fait de son poids moléculaire important (167 kDa) et la diminution du courant, après l'électropolymérisation de la dopamine, confirme la réussite de la formation de la matrice polymérique.
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 3.10: a) Voltamogrammes représentatifs des différentes étapes de modification de surface, b) Voltamogrammes représentatives du MIP et NIP. Caractérisation dans le PBS (0,1M) avec le couple ferrique ([Fe(CN)₆]³⁻/<fnref n="4" />⁻) de concentration égale à (5mM)**</figcaption></figure>

Nous avons élaboré un film non imprimé, réalisé dans les mêmes conditions que le MIP mais sans ajout de protéines. La grande différence des intensités de courant entre les voltamogrammes du MIP et celui du NIP (Figure 3.10b) est une preuve de la réussite de fabrication de l'empreinte moléculaire.

Le taux d'impression calculé à partir de l'équation 3.1 est égal à 80 %, une valeur largement supérieure à celle obtenue à partir de la première stratégie (53 %). La stratégie 2 permet donc une meilleure répartition des protéines du fait qu'elles sont pratiquement à la même distance par rapport à la surface. Pour la stratégie 1, les protéines étant libres elles se situent à distances différentes par rapport à la surface, conduisant à la fin à un MIP 3D, où seule l'infime partie superficielle contribuerait à la détection par la suite [3],[18],[19].

Pour mieux évaluer les performances des deux empreintes, nous avons réalisé des MIPs et des NIPs que nous avons extraits<fnref n="4" /> puis incubés dans des concentrations croissantes d'IgG allant de 10⁻¹⁵ jusqu'à 10⁻² mg.ml⁻¹.

<footnote n="4">⁴ Les paramètres optimaux de l'extraction de l'IgG à partir des MIPs sont les suivants :</footnote>

<footnote>- Stratégie 1 : H₂SO₄ pendant une heure puis rinçage avec l'eau ultrapure pendant 30 min.</footnote>

<footnote>- Stratégie 2 : H₂SO₄ pendant une heure, puis rinçage avec le PBS pendant 30 min suivi par un rinçage avec l'eau ultrapure pendant 30 min.</footnote>
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

## 3.2.2 Evaluation des performances des deux empreintes

La SWV a été utilisée pour le suivi de la détection de l'IgG avec les MIPs et NIPs réalisés selon les deux stratégies. Les Figures 3.11 a et b montrent une augmentation du courant suite aux étapes d'extraction, ce qui prouve l'efficacité de l'acide à éliminer la protéine des deux MIPs. La SWV a été utilisée pour le suivi de la détection de l'IgG avec les MIPs et NIPs réalisés selon les deux stratégies. Les Figures 3.11 a et b montrent une augmentation du courant suite aux étapes d'extraction, ce qui prouve l'efficacité de l'acide à éliminer la protéine des deux MIPs. Pour mieux évaluer ce processus d'extraction, nous avons calculé le taux d'extraction, à partir de l'équation 3.2, pour les deux stratégies.

$$ \tau = \left( 1 - \frac{J_{Extraction}}{J_{MIP}} \right) \times 100, \qquad (\text{Equation 3.2}) $$

Ce taux permet en effet de tenir compte aussi bien de la part d'adsorption non spécifique que de la vraie reconnaissance de la protéine par l'empreinte.

Le taux d'impression d'extraction d'IgG du MIP, a été trouvé de l'ordre de 60 % pour la première stratégie 1, une valeur largement supérieure à celles rapportés dans la littérature pour l'extraction d'ovalbumine (26%) d'un film de pyrrole [20], ou encore de l'extraction, d'un film d'aniline, de la BSA (18%) [21] ou de la cTnT (43%) [22]. Ce taux est par ailleurs comparable à celui trouvé par Azirur et al., pour l'extraction du filament de la bactérie Proteus mirabilis d'un film du phénol [23]. Ce taux reflète toute la difficulté d'extraire les molécules cibles, surtout s'agissant de protéines, des empreintes qui ne sont pas situées à proximité immédiate de la surface des films polymères.

Ce taux d'extraction a été nettement amélioré dans la stratégie 2 où il est passé de 60% à 83 %. Cette amélioration est attribuée à la localisation des protéines IgG sur la surface du film polydopamine, ce qui facilite le processus d'extraction.

Les cavités formées sont par la suite incubées par différente concentration d'IgG allant de $10^{-15}$ mg.ml⁻¹ jusqu'à $10^{-2}$ mg.ml⁻¹. La diminution progressive du pic d'oxydation du couple redox suite à l'augmentation de la concentration de l'IgG confirme la reconnaissance de la protéine par les cavités formées dans les deux MIPs. La limite de détection des capteurs électrochimiques, définie dans ce travail comme étant la plus faible valeur détectée par les dispositifs fonctionnalisés avec les MIPs, est égale à $10^{-15}$ mg.ml⁻¹. La diminution progressive du pic d'oxydation du couple redox suite à l'augmentation de la concentration de l'IgG confirme
# Chapitre 3 : Résultats et discussions

la reconnaissance de la protéine par les cavités formées dans les deux MIPs. La limite de détection des capteurs électrochimiques, définie dans ce travail comme étant la plus faible valeur détectée par les dispositifs fonctionnalisés avec les MIPs, est égale à $10^{-15} \text{ mg.ml}^{-1}$.

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 3.11** : Voltamogrammes de détection de l'IgG par : a) MIP₁; b) MIP₂; c) NIP₁; et d) NIP₂. Caractérisation dans le PBS (0,1M) avec le couple ferrique ([$[Fe(CN)_6]^{3-/4-}$) (5 mM)</figcaption></figure>

Les votamogrammes des deux NIPs, présentés dans les Figures 3.11 c et d, montrent des variations du courant beaucoup moins importantes que celles enregistrées avec les MIPs, confirmant ainsi le rôle clé de l'empreinte moléculaire.

Pour mieux rendre compte de l'affinité entre la protéine et son empreinte, nous avons calculé les constantes de dissociation à partir des courbes de calibration<fnref n="5" /> présentées dans la Figure 3.12.

<footnote n="5">⁵ Pour ces courbes de calibration, nous avons tracé les variations de l'inverse de la densité de courant en fonction des concentrations cumulées de l'IgG.</footnote>