### 3.4. Recherche moléculaire des composants antibactériens

Les gènes codant pour la reutérine sont recherchés chez les souches de Lb. reuteri en utilisant des amorces spécifiques. Les amorces utilisées permettent d'amplifier le gène gldC qui code pour l'enzyme déshydratant le glycérol en aldéhyde et impliquée dans la conversion de glycérol en reutérine (Figure 24).

$$ \begin{array}{r@{\,=\,}l} \chemfig{*6(---(-OH)-(-[2]OH)-(-[1]OH)-)} & \chemfig{HO-C(=[2]C(=[1]C)-C(=[2]C)-O=)} + \textcolor{blue}{\text{H}_2\text{O}} \\[1.5ex] \textcolor{blue}{\text{glycerol}} & = \textcolor{blue}{3-hydroxypropanal} + \textcolor{blue}{\text{H}_2\text{O}} \end{array} $$
(Reutérine)

<caption>**Figure 24.** Réaction catalysée par Gld (Glycérol déshydratasse) - EC 4.2.1.30.</caption>

Les amorces utilisées ont été décrites par Cadieux et al. (2008) (GDCRev-5'-GC[A/G]GC[C/T]TT[G/C]ATATCT[G/T][G/C]AACCAT-3' et GDCFor-5'-GC[A/C]TA[C/T]GC[A/T]GAAACCAT TTCAGTTTA-3'). Il s'agit d'amorces dégénérées correspondant à une région très conservée, cela veut dire que ces amorces sont conçues comme un ensemble de toutes les combinaisons possibles de nucléotides pouvant coder pour une séquence d'acides aminés donnée (Kwok et al., 1994). 50 µL du mélange réactionnel contiennent 100 pmol de chaque primer, 1x de PCR buffer, 2mM de MgCl2, 200µM de dNTPs, 0,5µg de ADN et 2,5 U de Taq polymerase. Le programme PCR comprend une étape initiale de dénaturation (5 minutes à 94°C), 30 cycles (1 minute à 94°C, 30 secondes à 55°C et 1,5 minutes à 72°C) et une étape finale de 10 minutes à 72°C. La taille attendue du produit est de 728pb. Le produit est cloné en utilisant le kit pGEM®-T Easy (Promega), puis il est séquencé.

## 4. Etude du potentiel probiotique

### 4.1. Dosage de l'acide lactique

La quantité d'acide lactique produite par les souches isolées a été déterminée par dosage HPLC.
* **Principe de la chromatographie liquide haute performance (HPLC)**

La chromatographie HPLC est une technique qui permet la séparation de différents composants d'un échantillon grâce à l'interaction entre les phases. Le solvant (phase mobile) passe généralement à travers la colonne (phase stationnaire), l'échantillon est séparé en différents constituants à l'aide de différences d'affinités relatives (Thammana, 2016). En fonction du substrat utilisé, il y a des HPLC de phase normal ou reverse où la séparation est dû à la polarité; le HPLC de exclusion par taille et HPLC d'exchange d'ion (variant le pH ou la force ionique) (Bird, 1989; Snyder, 2000; Thammana, 2016). Pour la détection de molécules, il y a des détecteurs basés sur une propriété de la phase mobile (indice de réfraction, dispersion de la lumière...) ou sur une propriété du soluté (absorbance en UV, IR, fluorescence...).

* **Protocole experimental**

Une culture standard est réalisée pour toutes les souches (1 colonie dans 5 mL de bouillon MRS incubé pendant 24 heures à 37°C). Une lecture de la densité optique à 600nm, et la mesure du pH sont effectuées et suivies d'une centrifugation (10 000 g, 10 min, 4°C), les surnageants sont alors filtrés sur filtres Millipore (0,2 µm). L'acide lactique est quantifié par HPLC Spectra System P1000 XR (Thermo, USA). La colonne utilisée est une Fast Juice Column (50 mm x 7.8 mm, Phenomenex, Torrance, CA) avec une élution isocratique avec du H3PO4 (0.05% p/p), un débit de 0,8 mL/min et une température de 55 °C. Le volume d'échantillon injecté est de 25 µL. Une courbe d'étalonnage de l'acide lactique (Sigma-Aldrich) avec des concentrations de 1, 2, 5 et 10 g/L est réalisée pour établir la corrélation entre les données obtenues d'aire du pic chromatographique et la concentration d'acide lactique présente. Le pic correspondant à l'acide lactique est identifié en utilisant le Logiciel Azur qui est élué à la minute 5,27.

## 4.2. Formation de biofilms par les souches de bactéries lactiques

Des cultures de 18 heures de nos souches à une DO₆₀₀nm de 5, sont diluées au 1/50ème en utilisant un bouillon MRS frais dans des plaques en polystyrène de 96 puits. Une fois inoculés, les plaques sont incubées à 37°C en anaérobiose pendant 24h. Le protocole décrit par Jones et Versalovic (2009) est alors utilisé pour quantifier les biofilms formés. Ainsi, deux lavages avec de l'eau sont réalisés pour éliminer les bactéries qui n'ont pas adhéré au fond du puits. Le crystal violet 0,1% (p/v) (Sigma-Aldrich) est utilisé pour colorer les bactéries formant les biofilms. Après 15 minutes
d'incubation à 37°C et une centrifugation (200 rpm), des lavages à l'eau sont alors effectués. Enfin, le colorant est dissout par ajout de l'éthanol à 96% et l'absorbance à 600nm est mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaque Safas MP96 (Monaco).

## 4.3. Fermentation des carbohydrates par les bactéries lactiques isolées

La détermination du profil fermentaire des hydrates de carbone a été réalisée en utilisant les galeries API 50CH (Bio Mérieux). Les souches sont cultivées sur gélose MRS pendant 24 h à 37°C dans des conditions d'anaérobiose. Les colonies sont mises en suspension dans le milieu API 50CHL à une densité égale à 2 sur l'échelle de McFarland. Les galeries ont été ensuite ensemencées en suivant les instructions du fournisseur, puis incubées à 37C°. La lecture est alors effectuée après 24 et 48 h d'incubation. Les identifications sont ensuite obtenues à l'aide du logiciel apiweb version 3 (https://apiweb.biomerieux.com).

## 4.4. Etude de la résistance aux conditions gastro-intestinales du poulet

* **Effet du pH et de la bile.**

Les conditions gastro-intestinales ont été testées indépendamment. Le produit Actisaf® STD, produit à base de levures vivantes, commercialisé par Lesaffre pour des applications chez le poulet, a été alors utilisé comme un premier témoin positif pour la détermination des conditions d'essai.

Les différentes conditions du tractus gastro-intestinal du poulet, sont reproduites (simulation) in vitro, comme indiqué dans le **Tableau 10**, ci-dessous.

<table><caption>**Tableau 10.** Conditions de pHs et biles testées.</caption><tr><td rowspan="4">pH</td><td>2,6</td></tr><tr><td>3,5</td></tr><tr><td>4,5</td></tr><tr><td>6,4</td></tr><tr><td rowspan="2">Bile</td><td>0,35% (p/v)</td></tr><tr><td>0,70% (p/v)</td></tr></table>
Toutes les solutions ont été préparées dans le milieu Tryptone-Sel permettant de réduire le stress que pourrait rencontrer les bactéries. Pour la simulation de la bile, l'oxgall bile, porcine (Sigma) a été utilisé. Les échantillons sont incubés à 41,3°C pendant 45, 90 et 180 min.

Une fois les conditions du tractus gastro-intestinal à tester définies, les souches sélectionnées y sont exposées de façon consécutive, avec l'apport de quelques modifications. Ainsi pour le jabot un pH à 4,5 est appliqué pendant 45 minutes, ensuite pour le gésier le pH est ajusté à 3,5 pendant 90 min en présence de pepsine à 3 mg/mL (Sigma-Aldrich) et 2 g des billes en verre, de 2mm de diamètre, agitées à 350 rpm pour simuler le broyage. Pour l'intestin, un pH de 6,4 est testé avec l'addition de pancréatine (Sigma-Aldrich), à 1mg/mL et une concentration de 0,35% de bile oxgall (Sigma-Aldrich) pendant 3 heures (Martinez-Haro et al., 2009; Musikasang et al., 2009). Toutes ces étapes sont réalisées à la température physiologique du poulet (41,3°C). Le but final étant de simuler les différentes étapes de la digestion qui ont lieu dans le jabot, le gésier et l'intestin de poulets (Figure 25). Lb. rhamnosus ATCC 7469 est utilisée comme témoin. Les souches testées sont préparées selon le protocole suivant : Des cultures de 20 heures à 37 °C sont centrifugés à 5000g 15 minutes à 4°C. Les culots sont lavés avec du Chlorure de Sodium (NaCl) à 0,9% (p/v) puis résuspendus dans les différentes solutions correspondant aux conditions décrites précédemment.

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 25.** Reconstitution des conditions gastro-intestinales.</figcaption></figure>
Des échantillons sont prélevés à T = 0 et après incubation. Pour déterminer le nombre de bactéries et la viabilité des souches, deux approches ont été utilisées. D'abord les dénombrements sur milieu gélosé MRS en utilisant la technique de *drop-plate* (Tomas et al., 2015), puis la technique de cytométrie en flux.

* Mesure par cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technique qui permet de distinguer les cellules selon leur caractéristiques physiques, tels que la taille (FSC) et la granulométrie (SSC), mais aussi par la fluorescence qui peuvent être émises à des longueurs d'onde précises en utilisant certains colorants (Bunthof et al., 2001). Ces caractéristiques sont déterminées à l'aide d'un système de couplage électro-optique qui enregistre la façon dont la cellule ou la particule diffuse la lumière laser et émet de la fluorescence. Chaque particule qui passe à travers le cytomètre et est détectée et classifiée comme un évènement différent. Les signaux lumineux sont détectés et converties en signaux électroniques qui sont traités par l'ordinateur avec le logiciel Attune NxT. Pour la mesure, un flux laminaire est créé, permettant le passage de cellules isolées à travers le faisceau laser et le comptage des évènements. Cette technique est intéressante car permettant l'évaluation rapide de la viabilité cellulaire. Ses avantages sont l'obtention rapide de données et la différentiation parmi les états physiologiques des cellules (Figure 26).

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 26.** Etats physiologiques des bactéries.</figcaption></figure>
Pour les analyses réalisées, le cytomètre en flux Attune™ N iT (Thermo Fisher) est utilisé. Il est équipé d'un laser bleu (488nm, 50 mW) et le logiciel associé est Attune™ N iT software. La gamme de taille de particule est de 0,5 à 50 µm.

La méthode utilisée est celle décrite par la réglementation ISO19344:2015 pour la quantification de bactéries lactiques dans les produits laitiers par cytométrie en flux. Deux colorants sont utilisés : le syto-24 (Invitrogen), colorant qui pénètre dans les cellules et se lie aux acides nucléiques des bactéries en donnant une fluorescence vert brillant à une concentration finale de 10nM, permettant la détection de bactéries vivantes et mortes. Pour la différentiation entre les bactéries vivantes et mortes, l'iodure de propidium (Molecular Probes) est utilisé pour colorer les cellules mortes. De par sa structure, la membrane lui est imperméable, et donc la coloration aura lieu que quand il y a une rupture de la membrane bactérienne, il se lie alors à l'ADN et donne une coloration rouge aux cellules. Il est utilisé à une concentration finale de 200nM. Pour quantifier les bactéries vivantes dans l'échantillon, une soustraction du nombre de cellules mortes au nombre de cellules totales est réalisée. La différence correspondant aux viables cultivables et non cultivables c'est-à-dire les bactéries qui sont vivantes et actives métaboliquement mais sont incapables de se diviser en formant une colonie sur milieu gélosé.

**4.5. Propriétés d'agrégation**

La mesure des capacités auto-agrégatives des souches bactériennes est un indicatif du comportement de souches au niveau de l'adhésion aux cellules épithéliales (Zarate et al., 2002). L'auto-agrégation et la co-agrégation des souches isolées ont été évaluées selon le protocole de Campana et al. (2017) et Collado et al. (2008).

**4.5.1. Mesure de l'auto-agrégation**

10 mL de culture des souches sur milieu MRS de 18 h à 37°C sont centrifugées (10 000 g, 10 min, 4°C). Les culots sont lavés avec du tampon phosphate salin (PBS 1X, pH 7,4) et résuspendus dans la même solution à une DO600 égale à 0,25 ± 0,05. Cette suspension bactérienne est vortexée pendant 10 secondes et incubée à 37°C. Après 24h de contact, l'absorbance à 600 nm des échantillons est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre (UV mini 1240, Shimadzu) à intervalles réguliers (0, 6 et 24h), en prélevant 1mL du haut de la solution. Le pourcentage d'auto-agrégation est déterminé par la formule suivante :
$$ \% \text{agrégation} = 1 - \left(\frac{A_t}{A_0}\right) \times 100 $$

où A_t est l'absorbance à DO_600 à différents temps et A_0 est l'absorbance à DO_600 initiale.

### 4.5.2. Mesure de la co-agrégation

Les suspensions bactériennes sont préparées de la même façon que pour les essais d'auto-agrégation. Des volumes égaux de solutions bactériennes des différentes souches lactiques et pathogènes sont mélangés, au vortex pendant 10 secondes, puis incubés à 37 °C sans agitation. Les pathogènes testés sont C. perfringens DSM 756, E. coli ER184 (souche isolée à l'ANSES et portant une résistance à la colistine) et Salmonella enterica Enterica serovar Newport (ATCC 6962).

Les absorbances (600nm) des mélanges sont mesurées également à intervalles de temps réguliers (0, 6 et 24 h d'incubation). La co-agrégation est déterminée pour le mélange des bactéries et pour les témoins contenant chaque bactérie seule. Le prélèvement est réalisé comme décrit dans l'analyse d'auto-agrégation. Le pourcentage de co-agrégation est déterminée en utilisant la formule ci-dessous :

$$ \% \text{ co-aggregation} = \left[ 1 - \frac{A_{\text{mélange}}}{\left( \frac{A_{\text{pat}} + A_{\text{b.lactique}}}{2} \right)} \right] $$

où A_mélange est l'absorbance à DO_600 du mélange de pathogène et la souche probiotique ; A pat est l'absorbance à DO_600 du pathogène seul, et A b.lactique est l'absorbance à DO_600 du probiotique seul.

### 4.6. Adhésion aux cellules intestinales

Dans le but d'évaluer la capacité d'adhésion de C. perfringens et des souches de lactobacilles sélectionnées aux cellules de l'épithélium intestinal, la lignée cellulaire Caco-2 a été utilisée comme model.

#### • Lignée cellulaire Caco-2

La lignée cellulaire Caco-2 est issue d'un adénocarcinome du côlon. Cependant, l'une de ses propriétés les plus avantageuses est sa capacité à se différencier spontanément en une monocouche de cellules adhérentes. Les cellules différentiées présentent une morphologie polarisée cylindrique, avec des microvillosités du côté apical, des jonctions serrées entre les cellules adjacentes et
expriment de petites activités enzymatiques d'hydrolases intestinales sur la membrane apicale. Ces caractéristiques sont très similaires à celles des entérocytes intestinaux trouvés dans l'intestin grêle (Sambuy et al., 2005; Verhoeckx et al., 2015). Pour cette expérience, les cellules Caco-2 sont cultivées dans des plaques de 24 puits. Elles sont ensemencées à une charge de $4 \times 10^4$ cellules par puits et incubées pendant 7 jours à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CO$_2$ dans du milieu DMEM (Lonza) supplémenté avec 25 mM glucose, 5 mM L-glutamine, 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF) et 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine.

### 4.6.1. Test d'adhésion bactérienne

Ce test a été réalisé selon le protocole décrit par Bendali et al. (2014). Pour cela, des cultures de 24 heures de nos souches sont préparées en bouillon MRS pour les bactéries lactiques, et sur milieu BHI pour *C. perfringens*. Les cellules sont centrifugées (8000 g / 10 min / 4°C) lavées deux fois avec du tampon PBS 1X, et enfin re-suspendues dans du milieu DMEM non complémenté. 500 µL de ces suspensions sont ensuite ajoutés à chaque puits contenant les cellules Caco-2 avec un ratio de 1:10 (cellule Caco-2 : cellules bactériennes). Après incubation à 37°C pendant 2 h, les monocouches de cellules Caco-2 sont lavées deux fois avec du PBS à 37°C puis traitées avec 200 µL de Trypsine/EDTA (Gibco) et incubées pendant 10 min à 37°C pour détacher les cellules Caco-2. Pour déterminer le pourcentage d'adhésion, deux méthodes sont utilisées. La méthode classique où le contenu de chaque puits est dilué puis ensemencé sur gélose MRS pour déterminer le nombre de bactéries adhérentes, ou par la méthode décrite par Candela et al. (2008) en utilisant la PCR en temps réel. Le pourcentage d'adhésion a ensuite été calculé par rapport au nombre de bactéries inoculées.

### 4.6.2. Détermination de l'adhésion par PCR quantitative en temps réel

La PCR quantitative en temps réel permet de détecter et mesurer d'une manière fiable les produits générés au cours de chaque cycle PCR (Polymerase Chain Reaction), et sont directement proportionnels à la quantité de matrice présente avant l'amplification. Les produits de PCR (amplicons) sont quantifiés durant la phase exponentielle de la réaction car c'est seulement à cette étape qu'il est possible d'extrapoler la quantité de départ de la séquence matrice. Pour les mesurer, il est possible d'utiliser des fluorochromes qui s'intercalent de façon non-spécifique (par exemple
SYBR Green) ou des sondes moléculaires contenant un « quencheur ». L'intensité de fluorescence augmente chaque cycle ce qui se traduit à une augmentation de la quantité d'amplicons produits d'une façon proportionnelle. Le « threshold cycle » (Ct) est défini comme le nombre de cycles de PCR auquel la fluorescence du rapporteur est supérieure à la fluorescence de fond. Cette valeur Ct est toujours atteinte pendant la phase exponentielle de l'amplification de la cible. Le Ct est inversement proportionnel au niveau d'expression relatif d'origine du gène d'intérêt. C'est un élément essentiel pour l'obtention de données précises et reproductibles (Arya et al., 2005).

Le SYBR Green 1 est très utilisé. Il est fluorescent uniquement lorsqu'il est intercalé dans l'ADN double brin (db). L'intensité du signal de fluorescence dépend donc de la quantité d'ADN db présent dans la réaction. La quantification par PCR quantitative en temps réel est réalisée avec les amorces pour la détection de *Lactobacillus* (LactoG1F [5'- TGGAAACAGRTGCTAATACCG -3'] et LactoG1R [5'- GTCCATTGTGGAAGATTCCC -3']), et pour *Clostridium perfringens* (CPerf165F [5'- CGCATAACGTTGAAAGATGG -3'] et CPerf269R [5'- CCTTGGTAGGCCGTTACCC -3']) (Wu et al., 2011).

Selon Candela et al. (2008), les suspensions cellulaires obtenues à partir des tests d'adhésion sont décongelées à température ambiante puis homogénéisées. Un aliquote de 20 µL est transféré dans un tube de 0,2 mL et incubé pendant 10 min à température ambiante avec 3,8 µL de solution d'inhibiteur de trypsine (Sigma-Aldrich).

La PCR quantitative en temps réel (QuantStudio®3, Applied Biosystems) est réalisée avec le fluorophore SYBR Green I (Molecular Probes Inc.) pour quantifier le signal fluorescent. L'amplification est réalisée dans un volume final de 20 µL contenant 2 µL de la suspension cellulaire, 0,4 µM de chaque amorce et complété avec du SYBR® Select Master Mix (Applied biosystems). Le programme suivi est le suivant: pré-incubation à 94°C/10min, 40 cycles d'amplification (95°C/15 sec, 60°C/10 sec, 72°C/30sec) et finalement 72°C/10min. Pour avoir une quantification absolue, les dilutions de chaque bactérie testée dans du PBS avec de concentrations de 10⁶ à 10³ UFC/mL sont utilisées comme standards.

## 4.7. Innocuité des souches sélectionnées

Afin d'évaluer l'innocuité des souches, ces dernières ont été testées pour leur activité hémolytique, leur profil de résistance aux antibiotiques et leur effet cytotoxique.
**4.7.1. Activité hémolytique**

Pour le test d'hémolyse, une pré-culture des souches est réalisée dans du bouillon MRS à 37°C pendant 24h. Après un isolement sur MRS gélosé, trois colonies de la même souche sont repiquées sur milieu *Columbia agar + sang de cheval* (Oxoid). L'incubation est réalisée en anaérobiose à 37°C avec une lecture à 24 h, et une deuxième à 48 h. Les boîtes sont examinées pour la présence d'une zone transparente (β-hémolyse) pour une hémolyse complète, verdâtre (α-hémolyse) quand l'hémolyse est incomplète ou l'absence de toute zone (γ-hémolyse) autour de colonies de *Lactobacillus* (Pisano et al., 2014). *Staphylococcus aureus* ATCC 25923 (β-hémolytique) est utilisée comme souche témoin-positif.

**4.7.2. Résistance aux antibiotiques**

Les cultures bactériennes ont été étalées par écouvillonnage de façon uniforme sur la surface du milieu MRS gélosé. Après séchage, des disques d'antibiotiques sont déposées et les boîtes sont incubées à 37°C pendant 24 h. Après cette période d'incubation, les souches sont classées comme sensibles ou résistantes selon les diamètres de la zone d'inhibition et les recommandations du manuel d'EUCAST à Janvier 2017 (http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/disk_diffusion_methodology/).

**4.7.3. Cytotoxicité sur cellules eucaryotes de la lignée HT-29**

La lignée cellulaire HT29 provient d'un adénocarcinome colorectal humain. Ces cellules sont capables d'exprimer les caractéristiques des cellules intestinales matures, telles que les entérocytes ou les cellules productrices de mucus. Pour cela, elles constituent un modèle *in vitro* pour simuler l'épithélium intestinal. Cette lignée possède plusieurs avantages tels que la polarisation des cellules, lorsqu'elles sont matures, une organisation en monocouche, la présence de microvillosités et la production de mucine (Verhoeckx et al., 2015).

Les cellules de la lignée cellulaire HT29 sont cultivées à 37°C dans une atmosphère humide avec 5% de CO₂ dans du milieu DMEM (Lonza) supplémenté avec 25 mM glucose, 5 mM L-glutamine, 10% (v/v) de sérum de veau fœtal (SVF), 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine soit dans des flacons type Falcon de 75 cm³ soit en plaques de 96 puits. Des passages sont effectués chaque semaine dans un nouveau flacon avec du milieu frais. Pour les tests de cytotoxicité, un
inoculum de $8 \times 10^3$ cellules par puits est préparé une semaine avant de commencer l'expérience.
Durant ce laps de temps (7 jours), trois changements de milieu sont réalisés pour maintenir les
conditions optimales pour la croissance des cellules HT-29.

Les souches de lactobacilles sélectionnées sont cultivées pendant 36 heures à 37°C dans du
bouillon MRS. Les cultures sont centrifugées 10 min à 10 000g à 4°C puis re-suspendues dans le
DMEM sans antibiotique ni SVF. Le contact est ensuite réalisé pendant 24 heures à 37°C et 5%
$CO_2$. Deux concentrations de bactéries sont testées : Une concentration élevée ($10^7$ UFC/puits) et
une concentration plus faible ($10^5$ UFC/puits). Un contact avec les bactéries mortes est également
testé pour contrôler qu'il n'y ait pas de composants de la surface la bactérie qui pourraient être
cytotoxiques. Les tests sont réalisés en triplicata.

Pour mesurer l'effet cytotoxique, les cellules sont lavées 2 fois avec du PBS pour éliminer les
bactéries, puis le milieu DMEM complémenté en gentamicine (50 µg/mL) et 5% du réactif CCK-
8 « *Cell Counting Kit-8* » (Dojindo Molecular Technology) est ajouté. Le kit « *Cell Counting Kit-
8* » permet de quantifier la viabilité de cellules HT-29 après le contact avec les bactéries. Les
cellules HT29 vivantes sont capables de réduire le sel de tétrazolium par l'activité des
déshydrogénases qu'elles possèdent. Après 2 heures d'incubation à l'obscurité, le produit formé,
de couleur orangé, est quantifié par mesure de l'absorbance à 450nm avec un lecteur de
microplaques (Xenius, Safas). L'intensité de la coloration orangée obtenue et la quantité de cellules
vivantes sont directement proportionnelles. Les résultats obtenus sont exprimés en pourcentage de
survie des cellules HT-29 par rapport au témoin (cellules HT-29 sans contact avec les bactéries).

## 5. Survie des bactéries lactiques isolées dans les conditions de stockage, et lors de l'administration aux animaux.

Les souches sélectionnées doivent être résistantes aux conditions d'administration aux animaux.
Par conséquent, il est nécessaire de connaître leur viabilité dans les conditions de stockage utilisées
et aussi d'évaluer la survie des bactéries dans l'eau de boisson des animaux.

### 5.1. Survie des bactéries au procédé de lyophilisation et leur conservation sous forme déshydratée

1L de milieu MRS est ensemencé pendant 19 h avec une $DO_{600}$ initiale est de 0,1 en utilisant
une pré-culture de 18 heures à 37°C. L'agitation est fixée à 110 rpm et la température à 37 °C. Les
cellules bactériennes sont ensuite récoltées par centrifugation à 10 000g pendant 10 minutes à 10°C dans une centrifugeuse Avanti JXN-26 (Beckman® Coulter). Les surnageants sont retirés et les culots cellulaires sont pesés et mélangés avec des agents cryoprotecteurs comme le lait écrémé (20% [p/v]) ou le saccharose (20% [p/v]) avec un ratio (1 :2) (1g bactéries : 2g cryoprotecteur) (Ming et al., 2009).

Des échantillons sont rapidement congelés en isopropano-2-ol à -55°C. La lyophilisation est réalisée pendant 24 heures dans un lyophilisateur Heto PowerDry PL9000 (Thermo Fisher) pour obtenir une forme déshydratée des culots cellulaires. Ce processus nécessite un premier séchage à -20°C et 20 Pa, puis un deuxième séchage à 25°C et une pression minimale (Fonseca et al., 2015). Le nombre de cellules vivantes après la lyophilisation a été mesuré par dénombrement sur boîte de MRS gélosé au temps 24 h en suspendant le lyophilisat dans de l'eau stérile. Puis un essaie de durabilité a été fait en mesurant le nombre UFC /g dans un période de 176 jours.

## 5.2. Survie des souches de lactobacilles en suspension aqueuse.

Pour vérifier la résistance des souches sélectionnées à ces conditions, des cultures fraîches sont centrifugées (8000g /10 min/ 4°C), et lavées deux fois avec du PBS 1X puis remises en suspension dans l'eau du réseau pour simuler les conditions réelles utilisées dans les fermes. Un témoin en PBS est également réalisé (conditions isotoniques). Des échantillons sont pris à différents intervalles de temps (de 0 à 24 heures), dilués et ensemencés sur MRS gélosé pour dénombrer les bactéries viables.

## 5.3. Inhibition croisée des souches de bactéries lactiques

Le test de spots est effectué pour vérifier que ces souches ne sont pas antagonistes entre elles. Les souches à tester sont cultivées pendant 18h en bouillon MRS. 5 µL sont déposés à la surface d'une gélose MRS. Après séchage des spots, les boîtes sont incubées à 37°C pendant 18 h en anaérobiose. Les boîtes sont ensuite recouvertes par 10 mL d'une gélose MRS molle (8 g d'agar/L), contenant la souche cible à une charge de $10^6$ UFC/mL, puis sont incubées de nouveau dans les mêmes conditions. Après incubation, l'activité antibactérienne est révélée par la présence ou l'absence de zones claires autour des dépôts.
# 6. Évaluation in vivo des trois souches sélectionnées comme candidats probiotiques.

Un essai a été réalisé afin de déterminer *in vivo* l'efficacité des souches comme agent préventif de l'entérite nécrotique sur du poulet de chair provenant d'un croisement des lignées Cobb 500 (femelle) et Hubbard M99 (mâle). Cette étude a été réalisée sur *Lb. reuteri* ICV416, *Lb. salivarius* ICV421 et *Lb. salivarius* ICV430 qui présentaient les meilleures propriétés probiotiques *in vitro*. Les expériences *in vivo* se sont déroulées pendant 17 jours sur 240 poulets (30 par condition expérimentale). L'essai a débuté le jour de l'éclosion. Il s'agit d'un schéma factoriel quasi complet. Durant les essais, les lactobacilles ont été administrés seuls (*Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 ou *Lb. salivarius* ICVB430), en association par paire (*Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB421; *Lb. reuteri* ICVB 416 et *Lb. salivarius* ICVB 430), et tous les trois ensembles par gavage une fois par jour, aux jours 1 et 2, puis du jour 10 au jour 13. Il y a un seul groupe qui manque, c'est celui du mélange de *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430.

## 6.1. Environnement des poulets et régime alimentaire

Les poulets ont été élevés dans des cages donnant une surface moyenne de 432 cm² par poulet. Les cages ont été placées à plusieurs niveaux dans une salle climatisée maintenue à une température ambiante tout au long de l'étude, et habilitée pour des essais avec un risque biologique de niveau 2. Les conditions ont été choisies selon la guide pour le soin et l'utilisation des animaux agricoles dans la recherche et l'enseignement (https://www.aaalac.org/about/ag_guide_3rd_ed.pdf). Après l'avis favorable du « *Institutional Animal Care and Use Committee* » le test a été donc réalisé. L'éclairage a été fourni 24/24 heures pendant toute la durée de l'étude. Les oiseaux ont reçu de l'eau et de la nourriture *ad-libitum*. c'est-à-dire qu'ils ont été nourris à satiété.

L'alimentation des 9 premiers jours est à base de maïs et de soja. Après le jour 10, le régime de croissance inclut du blé (**Tableaux 11 et 12**). Les deux régimes sont administrés sous forme de purée.

## 6.2. Vaccination

A l'exception du groupe non-challengé, les poulets ont été vaccinés au jour 1 avec « Advent@9X ». Ce vaccin contient des oocystes vivants d'Eimeria acervulina, E. maxima et E.
tenell, la gentamicine et l'amphotéricine B comme conservateurs. L'objectif est d'aider à prévenir la coccidiose aviaire générée par ces pathogènes. Au 9ème jour, les poulets ont été vaccinés d'une manière intra-occulaire contre la bursite infectieuse aviaire par l'Intervet, Bursal Vac-G603 qui est vaccin contenant des virus vivants atténués.

<table><caption>**Tableau 11.** Composition des régimes par ingrédients (g/100g)</caption><thead><tr><th></th><th>Régime de démarrage<br>(0-9 jours)</th><th>Régime de croissance<br>(10-17 jours)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Maïs</td><td>60,83</td><td>34,87</td></tr><tr><td>Farine de soja (48%)</td><td>33,91</td><td>28,14</td></tr><tr><td>Blé</td><td>-</td><td>20,00</td></tr><tr><td>Grains séchés de distillation</td><td>-</td><td>10,00</td></tr><tr><td>Mélange de graisses végétales</td><td>1,17</td><td>3,06</td></tr><tr><td>Pierre calcaire</td><td>1,47</td><td>1,45</td></tr><tr><td>Phosphate monocalcique</td><td>1,54</td><td>1,44</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>0,44</td><td>0,28</td></tr><tr><td>L-Lysine HCl</td><td>0,15</td><td>0,26</td></tr><tr><td>DL-Metionine</td><td>0,21</td><td>0,21</td></tr><tr><td>L-Thréonine</td><td>0,06</td><td>0,08</td></tr><tr><td>Vitamine premix</td><td>0,18</td><td>0,18</td></tr><tr><td>Minéral premix</td><td>0,05</td><td>0,05</td></tr></tbody></table>
<table><caption>**Tableau 12.** Composition approximative des régimes (g/100g)</caption><thead><tr><th></th><th>Régime de démarrage<br>(0-9 jours)</th><th>Régime de croissance<br>(10-17 jours)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Matière sèche</td><td>87,98</td><td>88,93</td></tr><tr><td>Protéines</td><td>22,00</td><td>22,00</td></tr><tr><td>Matière grasse</td><td>3,63</td><td>5,87</td></tr><tr><td>Fibre</td><td>2,17</td><td>2,89</td></tr><tr><td>Cendre</td><td>5,45</td><td>5,54</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>1,3</td><td>1,3</td></tr><tr><td>Calcium</td><td>0,88</td><td>0,88</td></tr><tr><td>Phosphore</td><td>0,70</td><td>0,71</td></tr><tr><td>Apparent metabolizable energy value<br>(Kcal/kg)</td><td>3 000,00</td><td>3 000,00</td></tr></tbody></table>

## 6.3. Traitements des différents lots

Huit traitements différents ont été testés (Tableau 13). Chaque traitement a été répété six fois et chaque réplica contient 5 poulets.
<table><caption>**Tableau 13.** Expérimentation animale (essai *in vivo*)</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Traitement</td><td>Rôle</td></tr></thead><tbody><tr><td>NCp</td><td>Pas de vaccination. Pas de supplémentation en bactéries lactiques, pas d'infection par Clostridium perfringens</td><td>Témoin de croissance</td></tr><tr><td>Cp</td><td>Vaccination. Pas de supplémentation en bactéries lactiques, infection par Clostridium perfringens</td><td>Témoin d'infection</td></tr><tr><td>Lb. reuteri ICVB 416</td><td>Vaccination. Supplémentation par une souche de bactéries lactiques. Infection par Clostridium perfringens</td><td>Essai</td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB 421</td><td>Vaccination. Supplémentation par une souche de bactéries lactiques. Infection par Clostridium perfringens</td><td>Essai</td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB 430</td><td>Vaccination. Supplémentation par une souche de bactéries lactiques. Infection par Clostridium perfringens</td><td>Essai</td></tr><tr><td>ICVB 416+ ICVB 421</td><td>Vaccination. Supplémentation par deux souches de bactéries lactiques. Infection par Clostridium perfringens</td><td>Essai</td></tr><tr><td>ICVB 416+ ICVB 430</td><td>Vaccination. Supplémentation par deux souches de bactéries lactiques. Infection par Clostridium perfringens</td><td>Essai</td></tr><tr><td>ICVB 416+ ICVB 421+ ICVB 430</td><td>Vaccination. Supplémentation par trois souches de bactéries lactiques. Infection par Clostridium perfringens</td><td>Essai</td></tr></tbody></table>

**6.4. Administration de C. perfringens**

La souche de *C. perfringens* sauvage a été cultivée dans du bouillon thioglycollate pendant une nuit à 37°C. *C. perfringens* a ensuite été administré à une concentration de $10^7$ CFU/mL en dose de gavage oral de 3 mL administrée dans du thioglycollate stérile, à l'aide d'une seringue de 20 mL et d'une aiguille de dosage 20 jauge, aux $14^{\text{ème}}-16^{\text{ème}}$ jours d'âge. Après l'administration, les oiseaux ont été immobilisés à la main pendant 5 à 10s pour confirmer la délivrance de la dose appropriée et l'absence de stress.

**6.5. Administration des bactéries lactiques**

Les souches de bactéries lactiques ont été cultivées dans bouillon MRS à 37°C pendant une nuit. Aux 1er et 2ème jours d'âge, 250 à 500 µL de suspension de *Lactobacillus* à $10^7$ UFC/mL ont été administrés par voie orale aux oiseaux. Pour les $10^{\text{ème}}$ à $13^{\text{ème}}$ jours d'âge, la posologie est
augmentée à 1 mL, tout en maintenant la concentration à 10⁷ UFC/mL. Les groupes témoins (NCp et Cp) ont reçu le même volume de solution de PBS stérile. Les oiseaux témoins négatifs ont été traités en premier afin de réduire le risque de contamination croisée.

## 6.6. Mesures effectuées sur les oiseaux

L'étude s'est terminée le 17ème jour. Les performances des oiseaux ont été mesurées aux 0, 10ème, 14ème et 17ème jours de la période expérimentale en enregistrant le poids des oiseaux (en g) et la consommation d'aliments pour chaque cage. Ce qui nous a également permis de calculer le « Feed Conversion Ratio » définit comme les besoins en aliments en kg par kg de poids corporel de l'animal. C'est une mesure importante pour juger de la performance économique de l'élevage (Wenk et al., 1980). Au 10ème jour un poulet de chaque lot a été autopsié, et l'échantillonnage a été fait. À la fin de l'essai, tous les oiseaux ont été euthanasiés par asphyxie au CO₂, le contenu du caeca et l'intestin retirés et stockés pour des analyses métagénomiques prévues ultérieurement. Les lésions d'entérite nécrotique ont été recherchées dans les intestins et analysés à la suite des recommandations faits par Prescott et al. (1978).

## 7. Analyses statistiques

L'activité biologique anti-*C. perfringens*, la quantification de l'acide lactique produit, l'étude de la formation des biofilms, l'étude de la résistance aux conditions gastro-intestinales du poulet, les études des propriétés d'agrégation, l'étude de l'adhésion aux cellules intestinales, la cytotoxicité sur cellules HT-29, la survie à la lyophilisation et la survie des souches de lactobacilles en suspension aqueuse ont été réalisées en triplicat. L'essai *in vivo* présentait 5 répétitions pour chaque traitement. Les comparaisons statistiques entre les différents résultats obtenus sont effectuées par analyse de la variance ANOVA à l'aide du logiciel Statgraphics® Centurion XVI.
# Résultats et discussion
# 1. Dénombrements et identification des bactéries isolées

Les bactéries isolées de caeca des 3 poulets sains issus du même élevage ont été dénombrées après croissance en aérobiose, à 37°C, comme décrit dans les conditions énoncées dans le chapitre matériels et méthodes, sur les milieux Elliker et LAMVAB qui est un milieu MRS complémenté par de la vancomycine (20 mg/L). L'objectif est d'isoler des bactéries lactiques potentiellement probiotiques et plus spécifiquement des lactobacilles. Les résultats obtenus sont présentés dans le **Tableau 14** ci-dessous :

<table><caption>**Tableau 14.** Dénombrements des bactéries lactiques (UFC/g) dans le caecum des 3 poulets.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Milieu</th><th>Poulet 1</th><th colspan="2">Poulet 2</th><th colspan="2">Poulet 3</th><th rowspan="2">Moyenne</th></tr><tr><th>Caeca</th><th>Caecum droit</th><th>Caecum Gauche</th><th>Caecum Droit</th><th>Caecum Gauche</th></tr></thead><tbody><tr><td>Elliker</td><td>3.37 · 10<sup>8</sup></td><td>3.21 · 10<sup>8</sup></td><td>3.40 · 10<sup>8</sup></td><td>3.72 · 10<sup>8</sup></td><td>2.45 · 10<sup>8</sup></td><td><strong>3.23 ± 0.5 · 10<sup>8</sup></strong></td></tr><tr><td>LAMVAB</td><td>1.17 · 10<sup>8</sup></td><td>9.15 · 10<sup>7</sup></td><td>8.65 · 10<sup>7</sup></td><td>1.40 · 10<sup>8</sup></td><td>1.23 · 10<sup>8</sup></td><td><strong>1.12 ± 0.3 · 10<sup>8</sup></strong></td></tr></tbody></table>

Les milieux Elliker et LAMVAB ont été incubés à 37°C, en anaérobiose, pendant 48h. Les résultats de dénombrements sont donnés en UFC/g

Pour les 3 échantillons analysés, il n'y a pas de différence quantitative dans la colonisation des caeca droit et gauche de chaque animal. Ce résultat est en adéquation avec ceux obtenus par Stanley et al. (2015). La population moyenne de bactéries lactiques des caeca des trois poulets sains est estimée à 3,23 ± 0.5 · 10⁸ UFC/g sur milieu Elliker et à 1.12 ± 0.3 · 10⁸ UFC/g sur milieu LAMVAB, soit près d'un tiers plus faible. Elliker est un milieu peu spécifique, qui permet la croissance des lactobacilles et des streptocoques (Elliker et al., 1956), alors que le milieu MRS, qui est la base du LAMVAB, est plus favorable à la croissance de *Lactobacillus* (De Man et al., 1960). Les populations plus faibles dénombrées sur LAMVAB peuvent également s'expliquer par le fait que le milieu est complémenté en vancomycine qui est un antibiotique inhibiteur de la synthèse du peptidoglycane de la paroi des bactéries à Gram-positif non résistantes, comme les entérocoques, les streptocoques ou les bifidobactéries (Reynolds, 1989; Hartemink et al., 1997), alors que la plupart des espèces de *Lactobacillus* présentent une résistance intrinsèque aux antibiotiques glycopeptidiques (Hamilton-Miller et Shah, 1998; Handwerger et al., 1994; Klare et al., 2007).
Selon Bjerrum et al. (2006) et Pourabedin et al. (2015), la population microbienne anaérobie dans le contenu intestinal est de l'ordre de $10^{10}$ UFC/g. D'après plusieurs auteurs, les bactéries du genre *Lactobacillus* représentent 1,5 à 24% de la population microbienne totale dans le caecum du poulet. Zhu et al. (2002b) ont établi un pourcentage de 1,5% de la communauté microbienne totale. D'autres auteurs comme Gong et al. (2002), Bjerrum et al. (2006), Lu et al. (2003), et Lan et al. (2002) ont établi les pourcentages suivants 4%, 5 à 8%, 8%, et 24%, soit environ $10^8$ *Lactobacillus*. Toutefois, si on considère le milieu LAMVAB comme sélectif permettant l'isolement de Lactobacilles, alors les pourcentages obtenus sont conformes à la bibliographie. La culture en milieu spécifique est incomplète, il est estimé qu' autour d'un 60% de bactéries qui proviennent de différents environnement ne peuvent pas se développer dans les conditions de culture artificielles de laboratoire (Apajalahti et al., 2004; Rinttilä et Apajalahti, 2013).

70 colonies ont été choisies au hasard sur les milieux LAMVAB et Elliker ; les bactéries ont été ensuite caractérisées suivant deux paramètres comme étant à Gram-positif et dépourvues de catalase et oxydase. Ces bactéries présentent plusieurs phénotypes coloniaux (morphologie, taille de la colonie...) et présentent des capacités d'acidification différentes après 20 h d'incubation en bouillon (37°C).

**1.1. Identification moléculaire des bactéries lactiques et étude de leur proximité génétique**

Les 70 souches isolées ont été identifiées par spectrométrie de masse MALDI-TOF-MS. Cette méthode permet de comparer les masses moléculaires des protéines de chaque souche isolée avec celles de bactéries de la base de données (MALDI Biotyper Systems) en donnant un score d'identification selon la similitude des profils obtenus. Les espèces identifiées sont listées dans le **Figure 27**.
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 27.** Répartition des espèces de *Lactobacillus* isolées dans des échantillons de caeca.</figcaption></figure>

Sur la base de cette identification, les bactéries isolées des caeca appartiennent majoritairement aux espèces suivantes: *Lb. reuteri* et *Lb. salivarius* représentant 45 et 43%, respectivement de la population identifiée.

Les différences observées parmi les souches prédominantes sont dues en partie à la méthode d'obtention de données. Stanley et al. (2015), Bjerrum et al. (2006) et Wang et al. (2014) ont pour leur part analysé l'ADN extrait d'échantillons. Stanley et al. (2015) ont utilisé le « Barcoding moléculaire » qui montre que les OTUs plus abondants sont *Bacteroides fragilis*, *Lb. crispatus*, *Lb. johnsonii*, *Lb. salivarius* et *Lb. reuteri*. Bjerrum et al. (2006) après une analyse par séquençage de l'ADNr 16S, ont trouvé que *Lb. salivarius* était prédominant parmi les *Lactobacillus* dans le caecum, suivi de *Lb. johnsonii*. Wang et al. (2014), quant à eux, ont suggéré que les espèces décrites dans le **Tableau 15** sont les plus prédominantes mais les mêmes auteurs font aussi référence à d'autres populations secondaires comme *Lb. plantarum*, *Lb. paracasei*, *Lb. brevis* et *Lb. gasseri*.
## 1.2. Détermination de la proximité génétique des lactobacilles par *Random Amplified Polymorphic DNA*

Après identification par spectrométrie de masse, les isolats ont été analysés par la méthode RAPD-PCR afin d'éliminer les doublons potentiellement présents dans les collections de *Lb. reuteri* (32 isolats) et *Lb. salivarius* (30 isolats). L'amorce M13 [5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'] a été utilisée pour établir cette proximité génétique. Comme indiqué dans la **Figure 28**, différents profils et empreintes de bandes sont redondants dans le gel comme par exemple les isolats S5.3, et S5.7. Dans cette configuration, les souches sont groupées par similitude des bandes d'ADN, permettant de générer un arbre phylogénétique représenté dans la **Figure 29**. Les souches sont ainsi classées selon leur distance génétique, permettant de mettre en évidence 14 souches *Lb. reuteri* présentant des profils d'amplification différents.

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

**Figure 28.** Electrophorèse sur gel d'agarose montrant les profils d'amplification PCR-RAPD pour 10 souches de *Lactobacillus reuteri*. L'ADN des souches a été extrait par le kit Wizard® (Genomic DNA purification Kit, Promega, Madison, USA) et amplifié par l'amorce 5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3'. Les marqueurs utilisés sont le O'GeneRuler™ DNA Ladder Mix qui montre bandes entre 100 et 10000 pb (marqueur d'ADN 1) et le O'GeneRuler™ DNA Ladder Mix qui montre bandes entre 100 et 1000 pb (marqueur d'ADN 2).
<figure><img src="image_29.png" /></figure>

**Figure 29.** Arbre phylogénétique généré à partir de l'analyse des amplicons de la PCR-RAPD obtenus à partir des souches *Lactobacillus reuteri* en utilisant le logiciel PyElph 1.4. Les distances génétiques sont affichées sur les branches.

Comme indiqué dans les **Figures 30 et 31**, le schéma des bandes chez *Lb. salivarius* présente plus de variabilité que *Lb. reuteri* aboutissant ainsi à une collection de 28 souches différentes.
<figure><img src="image_30.png" /></figure>

**Figure 30.** Electrophorèse sur gel d'agarose montrant les profils d'amplification PCR-RAPD pour 10 souches de *Lactobacillus salivarius*. La méthodologie est la même que celle décrite pour *Lb. reuteri*. Les marqueurs utilisés sont le O'GeneRuler™ DNA Ladder Mix qui montre les bandes entre 100 et 10000 pb (marqueur 1)
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 31.** Arbre phylogénétique généré à partir de l'analyse des amplicons de RAPD-PCR obtenus à partir des souches *Lactobacillus salivarius* en utilisant le logiciel PyElph 1.4. Les valeurs sur les branches représentent les distances entre les groupes.</figcaption></figure>

Après analyse phylogénétique, il a été constaté que dans notre échantillon de souches, il y a finalement 14 souches différentes de *Lb. reuteri* et 28 souches de *Lb. salivarius*. Les résultats obtenus sont en concordance avec ceux obtenus par Messaoudi et al. (2011); Stanley et al., (2015) et Wang et al. (2014c) (Tableau 15).
<table><caption>**Tableau 15.** Etudes montrant les bactéries lactiques prédominant dans les caeca de poulets.</caption><thead><tr><th></th><th></th><th>Résultats obtenus</th><th>Messaoudi et al. (2011)</th><th>Wang et al. (2014)</th><th>Stanley et al. (2015)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="7">PREDOMINANCE</td><td rowspan="4">+</td><td>Lb. salivarius</td><td>Lb. sakei</td><td>Lb. reuteri</td><td>Lb. crispatus</td></tr><tr><td>Lb. reuteri</td><td>Lb. salivarius</td><td>Lb. salivarius</td><td>Lb. johsonii</td></tr><tr><td>Streptococcus lutetiensis</td><td>Lb. reuteri</td><td>Lb. johsonii</td><td>Lb. salivarius</td></tr><tr><td>Streptococcus alactolyticus</td><td>Lb. curvatus</td><td>Lb. aviarius</td><td>Lb. reuteri</td></tr><tr><td rowspan="3">-</td><td>Lb. gallinarum</td><td>Weissella spp.</td><td>Lb. crispatus</td><td></td></tr><tr><td>Lb. gasseri</td><td>Ent. faecalis</td><td>Lb. acidophilus</td><td></td></tr><tr><td>Lb. johsonii</td><td>Streptococcus spp.</td><td>Lb. kefiranofaciens</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Lb. antri</td><td></td><td>Lb. delbrueckii</td><td></td></tr></tbody></table>

Les souches récurrentes dans les différentes études citées ci-dessus sont *Lb. salivarius*, *Lb. reuteri*, *Lb. johsonii* et *Streptococcus* spp. Avec une prévalence différente d'une étude à une autre. Ces différences peuvent être expliquées par les méthodes de traitement des échantillons et les méthodes de leur identification. En effet, les techniques de microbiologie classique ne permettent pas d'identifier la majorité des microorganismes (Rappé et Giovannoni, 2003). Les données bibliographiques indiquent que les méthodes cultures-dépendantes permettent de mettre en évidence uniquement entre 10 et 60% des bactéries du caecum (Zhu et al., 2002a). Donc, l'utilisation de nouvelles techniques comme la NGS pour des analyses métagénomiques pourront donner plus d'informations sur les populations trouvées dans les caeca de poulets.
## 2. Activité anti-Clostridium perfringens

Durant nos travaux, nous nous sommes concentrés plus particulièrement sur la sélection des BL ayant une activité anti-C. perfringens, un pathogène récurrent chez les poulets. Pour cela, une pré-sélection des souches a été réalisée à la lumière des résultats obtenus durant les tests d'activités antibactériennes. Les souches cibles choisies pour ce test sont une souche de référence, C. perfringens DSM 756 et une souche isolée de poulet malade provenant de l'ANSES, C. perfringens Clin 1.

Deux techniques ont été mises en œuvre incluant la culture brute des souches en milieu solide (slab) ou liquide (test des puits en gélose molle) car les métabolites synthétisés dans ces 2 conditions peuvent être différents. Dans un deuxième temps, les surnageants de culture ont été neutralisés pour éliminer l'effet de l'acide (facteur pH) par addition de d'hydroxyde de sodium (NaOH, 3M). Cette étude a été complétée par une analyse moléculaire. En effet, l'absence d'activité visible ne signifie pas pour autant l'absence de gènes codant des substances antibactériennes.

### 2.1. Activité antimicrobienne en slabs

L'activité anti-C. perfringens a été recherchée en utilisant les tests en slabs après culture des souches antagonistes pendant 20 h sur milieu MRS gélosé à 37°C. Les résultats (largeur du halo d'inhibition) sont présentés dans le **Tableau 16** pour C. perfringens DSM756, et dans le **Tableau 17** pour C. perfringens ANSES Clin 1.

87% des isolats testés présentent une activité antimicrobienne moyenne (++ = halo d'inhibition entre 2.1-4 mm) contre la souche de référence C. perfringens DSM756.

Lb. salivarius ICVB423 est la souche présentant la valeur d'activité la plus haute obtenue durant ce test.

C. perfringens ANSES Clin 1 a été choisi comme cible notamment pour son origine clinique. Cette bactérie a été isolée d'un poulet atteint d'entérite nécrotique. Les zones d'inhibition observées avec C. perfringens ANSES Clin 1 sont généralement plus petites (+ = 1-2 mm) et le nombre de souches actives est plus faible si on compare aux résultats observés avec la souche de Clostridium de collection. Lb. reuteri ICVB412 est une des souches qui présente l'activité la plus forte avec une zone d'inhibition comprise entre 4.1 et 7 mm. Ces données montrent que globalement la souche
de *C. perfringens* Clin 1 est moins sensible à l'inhibition induite par les souches de BL que nous avons isolé.

<table><caption>**Tableau 16.** Activités anti-*Clostridium perfringens* DSM756 des bactéries lactiques.</caption><thead><tr><th>Niveau d'activité</th><th>Espèce</th><th>Nombre</th><th>Souches</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">-</td><td>Lb. reuteri</td><td>2</td><td>ICVB413, 3DMV2</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Autres</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">+</td><td>Lb. reuteri</td><td>1</td><td>ICVB493</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Autres</td><td>1</td><td>Lb. gasseri SE.3</td></tr><tr><td rowspan="3">++</td><td>Lb. reuteri</td><td>11</td><td>2GE8, ICVB412, ICVB414, S5.5, ICVB415, S5.12, ICVB416, ICVB417, ICVB418, ICVB419, 2GMV9</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>27</td><td>ICVB420, 3GRM9, ICVB421, ICVB422, 2GRM1, 2GE1, ICVB424, ICVB425, ICVB426, ICVB427, ICVB428, ICVB429, ICVB430, ICVB431, ICVB432, S4.15, ICVB433, ICVB434, ICVB435, ICVB436, 2GRM6, 2GMV1, ICVB437, S3.15, ICVB438, ICVB439, ICVB440</td></tr><tr><td>Autres</td><td>6</td><td>Lb. gallinarum SE.2, St. alactolyticus SE.1 St. alactolyticus 3DE6, St. lutetiensis S4.18, Lb. johnsonii SE.4 et Lb. antri ICVB441.</td></tr><tr><td rowspan="3">+++</td><td>Lb. reuteri</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>1</td><td>ICVB423</td></tr><tr><td>Autres</td><td>0</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Légende. - : absence de halo, + : halo de taille entre 1-2mm ; ++ entre 2.1-4 mm ; et +++ entre 4.1-7 mm)
<table><caption>**Tableau 17.** Activités anti-*Clostridium perfringens* ANSES Clin1.</caption><thead><tr><th>Niveau d'activité</th><th>Espèce</th><th>Nombre</th><th>Souches</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">-</td><td>Lb. reuteri</td><td>1</td><td>3DMV2</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Autres</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">+</td><td>Lb. reuteri</td><td>6</td><td>2GE8, ICVB413, ICVB414, ICVB418, ICVB419, 3GMV7</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>8</td><td>ICVB422, 2GRM1, ICVB425, ICVB426, ICVB427, ICVB429, ICVB436, 2GMV1</td></tr><tr><td>Autres</td><td>7</td><td>Lb. gasseri SE.3, Lb. gallinarum SE.2, St. alactolyticus SE.1 St. alactolyticus 3DE6, St. lutetiensis S4.18, Lb. johnsonii SE.4 et Lb. antri ICVB441</td></tr><tr><td rowspan="3">++</td><td>Lb. reuteri</td><td>6</td><td>S5.5, ICVB415, S5.12, ICVB416, ICVB417, ICVB493</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>20</td><td>ICVB420, 3GRM9, ICVB421, 2GE1, ICVB423, ICVB424, ICVB428, ICVB430, ICVB431, ICVB432, S4.15, ICVB433, ICVB434, ICVB435, 2GRM6, ICVB437, S3.15, ICVB438, ICVB439, ICVB440</td></tr><tr><td>Autres</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">+++</td><td>Lb. reuteri</td><td>1</td><td>ICVB412</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Autres</td><td>0</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Légende. - : absence de halo, + : halo de taille entre 1-2 mm ; ++ entre 2.1-4 mm ; et +++ entre 4.1-7 mm)

Si le milieu solide peut induire une synthèse de composés non exprimée en milieu liquide, le test en slabs ne permet de visualiser qu'une activité antimicrobienne globale couplant l'effet des acides organiques et celui des autres molécules potentiellement produites. La diminution du pH lié à la production d'acide lactique est largement décrite (Murry et al., 2004). Certaines espèces produisent des peptides antimicrobiens, plus particulièrement des bactériocines comme la nisine (Garde et al., 2014), des entérocines (Caly et al., 2017) ou des pédiocines. D'autres molécules
comme la reutérine (Garde et al., 2014), ou le peroxyde d'hydrogène (Kizerwetter-Świda et Binek, 2016) sont également produites et sont actives contre C. perfringens.

Afin d'étudier séparément les mécanismes d'inhibition dus à la synthèse d'acide(s) organique(s) et à la synthèse de composés comme les bactériocines, nous avons recherché l'activité anti *Clostridium* à partir de surnageants de culture par la technique en puits en gélose aussi appelé *Agar Diffusion Test*.

## 2.2. Activité antimicrobienne des surnageants neutralisés et filtrés

Parmi les 70 isolats cultivés, seul le surnageant neutralisé de la souche témoin *Ent. faecalis* DD14 a montré une activité sur les souches cibles de *C. perfringens* DSM 756 et ANSES Clin1.

La neutralisation peut avoir introduit un biais de manipulation car certaines bactériocines ne sont actives qu'en milieu acide, comme par exemple la nisine qui a son pH optimal à pH 2 (Tan et al., 2015) et perd son activité à un pH supérieur à 7 (Juncioni de Arauz et al., 2009). D'autre part, la filtration stérilisante qui suit la neutralisation peut avoir réduit la quantité de bactériocine en deçà de la concentration minimale inhibitrice. En effet, certaines bactériocines présentent des régions hydrophobes qui peuvent provoquer une adsorption de la molécule sur la membrane de filtration (Drider et al., 2006 ; Elayaraja et al., 2014 ; Joosten et Nuñez, 1995).

Afin d'exclure une absence d'activité en raison d'une concentration trop faible de molécules actives, nous avons réalisé une culture sur milieu Elliker puis concentré le surnageant 10 fois sous vide par l'utilisation d'une centrifugeuse (miVac Quattro, Genevac™ SP Scientific, Ipswich, UK), à une température de 40°C. Le surnageant concentré neutralisé ne présente pas non plus d'activité anti-*C. perfringens*. Le milieu de culture a une grande influence sur la production de bactériocines (Todorov et al., 2000), et le milieu Elliker est peut-être trop riche pour favoriser la synthèse des bactériocines. Cependant, le milieu MRS ne peut être concentré dix fois, du fait de la présence de tween 80, inhibiteur de la croissance de *C. perfringens* lorsqu'il est concentré en dehors de toute production d'antibactérien par la souche antagoniste. La synthèse étant liée aux conditions environnementales, nous avons donc recherché la présence de gènes de structure codant pour des bactériocines.
## 2.3. Détection moléculaire des métabolites antibactériens

Dans les expériences précédentes, la production de bactériocines a été recherchée après culture des souches en bouillon MRS ou Elliker pendant 24h à 37°C. Cependant, même si les activités biologiques n'ont pas été retrouvées, on ne peut pas exclure une synthèse de ces molécules *in vivo* si les gènes sont présents.

La recherche de gènes de bactériocines a été réalisée sur les souches de *Lb. salivarius* et de *Lb. reuteri*. Pour rechercher les gènes de synthèse de ces molécules, des amorces permettant l'amplification des déterminants génétiques ont été utilisées. Les séquences sont décrites dans le **Tableau 18**.

<table><caption>**Tableau 18.** Amorces utilisées la recherche des gènes codant les bactériocines.</caption><thead><tr><td></td><td>Forward primer (5'-3')</td><td>Reverse primer (5'-3')</td><td>Reference</td></tr></thead><tbody><tr><td>Salivaricine</td><td>AATGGTGGTAAAAATGGTTATGG</td><td>TTAACGGCAACTTGTAAAAAC CA</td><td>Macwana et Muriana (2012)</td></tr><tr><td>Reutérine</td><td>GC[A/G]GC[C/T]TT[G/C]ATATCT[G/T] [G/C]AACCAT</td><td>GC[A/C]TA[C/T]GC[A/T]GAA A CCATTTCAGTTTA</td><td>Cadieux et al. (2008)</td></tr></tbody></table>

Pour les ADN des souches de *Lb. salivarius*, la taille attendue des amplicons était de 150pb. Aucune souche ne présentait le gène de la salivaricine. Certaines souches de *Lb. salivarius* peuvent produire des salivaricines du type ABP-118 (Abp118α et Abp118β), CLR 1328 (Salα et Salβ), P (Sln1 et Sln2) et T (SalTα et SalTβ (Collins et al., 2017)). Toutes ces molécules sont de type II sous-classe b (bactériocines à deux composantes), cependant, aucune des salivaricines synthétisées par des souches de *Lactobacillus* n'a présenté d'activité anti-*Clostridium*. Par contre, les salivaricines produites par *Lb. salivarius* sont actives contre *Listeria*, *Campylobacter*, *Pseudomonas* ou *Staphylococcus* (Barrett et al., 2007; Stern et al., 2006; Therdtatha et al., 2016). Il existe toutefois des salivaricines, produites par *Streptococcus salivarius* (salivaricine D), qui présentent des activités contre différentes espèces de *Clostridium* (Birri et al., 2012).

Les bactériocines peuvent être synthétisées de façon constitutive ou être produites d'une façon conditionnelle contrôlée, par exemple, par le QS (Blanchard et al., 2016). Le QS est une méthode de communication utilisée par les bactéries pour coordonner une réponse au sein d'une population. Chez *Lb. pantarum* C11, *Lb.sakei* LTH673 ou *Lb. pentosus* 31-1, la production de bactériocines
est régulée par QS (Risøen et al., 2000; Zhang et al., 2012). Un autre facteur qui améliore la production de bactériocines est la compétition, leur production va d'un côté permettre l'invasion d'une souche dans une communauté microbienne établie, ou d'un autre côté, jouer un rôle défensif et interdire l'invasion d'autres souches ou espèces dans une niche occupée (Riley, 2009). Les bactériocines sont destinées à nuire aux cellules qui sont étroitement liées au producteur et à le concurrencer pour les mêmes ressources. Cependant, dans le biofilm, lorsque les producteurs interagissent, la bactériocine de l'un peut non seulement nuire à l'autre, mais aussi servir à déclencher sa production de bactériocine, armant ainsi le concurrent pour une contre-attaque (Majeed et al., 2013).

En ce qui concerne les souches de Lb. reuteri, les gènes codant la reutérine ont été mis en évidence par l'utilisation d'amorces dégénérées décrites par Cadieux et al. (2008) et données dans le tableau 18. Les résultats obtenus figurent dans la **Figure 32**. Les 14 souches de Lb. reuteri ont été testées par amplification PCR pour la recherche du gène permettant la production de reutérine. Seuls Lb. reuteri, ICVB412 et ICVB414 présentaient le fragment ayant la taille attendue de 728 pb. L'amplification et le séquençage de cette région, après une recherche par alignement sur BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov), a permis de confirmer que l'amplicon fait partie de la sous-unité majeure de l'enzyme Gld qui déshydrate le glycérol en aldéhyde durant le processus de production de la reutérine.
<figure><img src="image_32.png" /></figure>

**Figure 32.** Détection du fragment du gène *gldC* par PCR. Les produits PCR utilisant les souches indiquées dans chacune des pistes ont été analysés dans un gel d'agarose à 1 %. FlashGel® DNA marker 100 – 4 000pb est utilisé pour la détermination de la taille du fragment. Les témoins utilisés sont souches de *Lb. reuteri* productrices de reutérine (souche de collection privée de l'Université Laval- Canada, et *Lb. reuteri* BCC1707 de la collection de Lesaffre).

La reutérine est un puissant agent antimicrobien actif contre les bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif, ainsi que contre les levures, les moisissures et les protozoaires (Axelsson et al., 1989). Elle est notamment active contre les pathogènes *E. coli*, *C. perfringens*, *Salmonella*, *C. difficile*, *Listeria* entre autres (Cleusix et al., 2007; Garde et al., 2014; Mu et al., 2018). La reutérine est un sous-produit de la fermentation du glycérol et consiste en des formes hydratées, non hydratées et dimériques du 3-hydroxypropionaldéhyde (3-HPA) (Axelsson et al., 1989). Elle est soluble dans l'eau, active à divers pH et résistante aux protéases et aux lipases (Garde et al., 2014). Deux mécanismes d'action de la reutérine ont été décrits. Schaefer et al. (2010) suggèrent le rôle du stress oxydatif dans le mécanisme d'action de la reutérine. Ce stress oxydatif est induit chez les microorganismes par interaction de groupes thiols dans les protéines. La deuxième hypothèse est le blocage de l'enzyme ribonucléide réductase en agissant comme un inhibiteur compétitif, impliquant l'impossibilité de la synthèse de l'ADN (Cleusix et al., 2007; Rasch, 2002).

L'intérêt de souches productrices de reutérine réside dans l'absence de résistance développée contre la reutérine sauf chez les lactobacilles (Mu et al., 2018). Le fait de détecter le gène impliqué dans la voie de synthèse de la reutérine sans pour autant obtenir de résultats durant les tests
d'activité *in vitro* suggère que les conditions de croissance appliquées ne sont pas adéquates pour
la production de ce métabolite.

3. Etude du potentiel probiotique

**3.1. Dosage de l'acide lactique produit**

Après l'analyse de l'activité anti-*Clostridium* par les méthodes des slabs et celle des puits, nous avons supposé que l'activité était due à la capacité de la souche à produire des acides organiques, notamment l'acide lactique qui est le principal acide organique produit par les lactobacilles selon Tachedjian et al. (2017). Pour vérifier cette hypothèse, l'acide lactique produit par les souches a été quantifié par HPLC après 24 h de culture dans du milieu MRS à 37°C. Les résultats obtenus sont présentés dans le **Tableau 19**. Les dosages ont été réalisés 3 fois et suivis d'une analyse statistique, réalisée par ANOVA à un seul facteur.

La production d'acide lactique par les bactéries lactiques testées est comprise entre 4,65 et 15,4 g/L, et elle est plus importante chez les souches de *Lb. salivarius*. En ce qui concerne *Lb. salivarius*, on distingue 5 groupes significativement différents selon leur niveau de production, *Lb. salivarius* ICVB439, ICVB430, ICVB429, ICVB436 et ICVB423 sont les plus grands producteurs avec 13,00 ; 13,01 ; 13,40 ; 13,90 et 15,42 g/L d'acide lactique produit respectivement (**Tableau 19**). Les moins productrices sont ICVB433, ICVB428 et ICVB426 avec des productions moyennes de 7,41 ; 7,71 et 8,26g/L respectivement.

Pour ce qui est de *Lb. reuteri*, 4 groupes significativement différents selon le niveau de production d'acide lactique ont été déterminés. Parmi eux, les souches les plus productrices sont ICVB418 et ICVB419, avec des valeurs de 12,48 et 13,71g/L, respectivement. Cependant les moins productrices sont S5.12 et ICVB414 avec une production de 5,39 et 5,32 g/L.

La production d'acide lactique est souche-dépendante. Ainsi dans la littérature, il existe des exemples de souches produisant des niveaux variables d'acide lactique parmi les souches probiotiques, allant de 2,97 g/L (Hor et Liong, 2014) ou 6,16 (Vodnar et al., 2010) chez *Lb. casei* ou de 6,08 g/L (Vodnar et al., 2010) à 13,14 g/L (Ait Seddik et al., 2017) pour *Lb. plantarum*. Concernant ces niveaux de production, les souches isolées de *Lb. salivarius* présentent une haute capacité de production d'acide lactique en comparaison avec d'autres *Lactobacillus*.
Dans la bibliographie des souches de lactobacilles hyper-productrices d'acide lactique, qui présentent un intérêt pour l'industrie pharmaceutique et agroalimentaire, ont été décrites avec des niveaux de production allant de 27,90 à 84,9 g/L (Bai et al., 2003; Nancib et al., 2015; Orozco et Zuluaga, 2014).

Motevaseli et al. (2013) ont démontré que la synthèse d'acide lactique est importante pour l'effet inhibiteur des lactobacilles plus que le pH seul. L'effet de l'acidité dû à la concentration d'acide lactique génère des inhibitions plus fortes dans la croissance de pathogènes que la même diminution du pH du milieu du à l'HCl (Wang et al., 2014a). Ceci est dû au fait que l'acide lactique endommage la membrane cellulaire au niveau des protéines, générant un pH acide à l'intérieur de la cellule ce qui provoque une inhibition des activités enzymatiques et une altération de la structure de l'ADN, remettant ainsi en cause la viabilité cellulaire (Stanojević-Nikolić et al., 2016; Wang et al., 2015). En outre, il a été démontré que des pathogènes comme Salmonella Enteritidis, E. coli et L. monocytogenes pouvaient être complètement inactivées après une exposition de 2h à 0,5% d'acide lactique (Wang et al., 2015). Guo et al. (2017) ont également montré la capacité de certaines souches de Lb. fermentum ou Lb. acidophilus à inhiber l'α-toxine de C. perfringens par la diminution du pH, qui déstabilise la structure de la toxine. Les souches isolées durant nos travaux, pourraient donc être de bons candidats probiotiques capables de fragiliser l'intégrité membranaire des microorganismes pathogènes et pouvant agir de façon synergique avec d'autres substances antibactériennes (Alakomi et al., 2005).

La production d'acide lactique est en parfaite adéquation avec les résultats de l'activité anti-C. perfringens ; les souches produisant plus d'acide lactique telles Lb. salivarius ICVB423, ICVB429 ou Lb. reuteri ICVB412 sont, par ailleurs, les souches présentant la plus forte activité antagoniste. Cependant, les souches produisant moins d'acide lactique telles Lb. reuteri ICVB413, Lb. reuteri ICVB414 ou Lb. gasseri SE.3 se distinguent par une moindre activité antagoniste. Cette corrélation a été déjà rapportée dans la littérature pour d'autres bactéries lactiques actives contre C. perfringens (Golic et al., 2017) ou C. difficile (Lee et al., 2013; Ratsep et al., 2014).
<table><caption>**Tableau 19.** Production d'acide lactique (g/L) par les souches isolées des caeca après incubation pendant 20 h dans le milieu MRS à 37°C. Quantification par HPLC en utilisant la méthode isocratique (Eluant: 0.05% H₃PO₄).</caption><thead><tr><th colspan="2">Lb. reuteri</th><th colspan="3">Lb. salivarius</th><th colspan="2">Autres</th></tr></thead><tbody><tr><td>ICVB419</td><td>13,71 ± 0,98</td><td>ICVB423</td><td>15,42 ± 1,43</td><td>2GRM6</td><td>11,17 ± 1,65</td><td>Lb. antri ICVB441</td><td>6,99 ± 0,70</td></tr><tr><td>ICVB418</td><td>12,48 ± 2,10</td><td>ICVB436</td><td>13,90 ± 0,86</td><td>S4.15</td><td>10,18 ± 0,85</td><td>Lb. johnsonii SE 4</td><td>9,67 ± 1,38</td></tr><tr><td>ICVB415</td><td>10,00 ± 0,38</td><td>ICVB429</td><td>13,39 ± 0,42</td><td>ICVB437</td><td>10,11 ± 1,44</td><td>Lb. gallinarum SE.2</td><td>7,58 ± 0,86</td></tr><tr><td>2GMV9</td><td>9,79 ± 0,51</td><td>ICVB430</td><td>13,02 ± 2,76</td><td>ICVB425</td><td>10,10 ± 0,91</td><td>Lb. gasseri SE.3</td><td>6,91 ± 1,24</td></tr><tr><td>ICVB493</td><td>9,47 ± 0,31</td><td>ICVB439</td><td>13,00 ± 0,85</td><td>ICVB435</td><td>9,85 ± 2,24</td><td>Strep. alactolyticus<br>3DE6</td><td>8,16 ± 2,01</td></tr><tr><td>ICVB417</td><td>8,16 ± 0,41</td><td>ICVB431</td><td>12,88 ± 1,31</td><td>ICVB422</td><td>9,82 ± 0,75</td><td>Strep. alactolyticus<br>SE 1</td><td>8,35 ± 1,07</td></tr><tr><td>ICVB412</td><td>7,63 ± 1,03</td><td>ICVB440</td><td>12,87 ± 0,36</td><td>ICVB432</td><td>9,62 ± 0,10</td><td>Strep. lutetiensis S4<br>18</td><td>4,65 ± 0,70</td></tr><tr><td>3DMV2</td><td>7,62 ± 0,49</td><td>2GE1</td><td>12,86 ± 2,11</td><td>ICVB420</td><td>9,20 ± 2,10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2GE8</td><td>7,26 ± 0,72</td><td>2GMV1</td><td>12,23 ± 1,07</td><td>ICVB438</td><td>8,91 ± 1,70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICVB416</td><td>6,91 ± 0,61</td><td>ICVB434</td><td>11,85 ± 2,97</td><td>S3.15</td><td>8,74 ± 0,86</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S5.5</td><td>6,68 ± 0,62</td><td>ICVB424</td><td>11,55 ± 0,33</td><td>ICVB427</td><td>8,64 ± 2,16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICVB413</td><td>5,49 ± 0,31</td><td>ICVB421</td><td>11,30 ± 2,02</td><td>ICVB426</td><td>8,26 ± 0,87</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S5.12</td><td>5,39 ± 0,30</td><td>2GRM1</td><td>11,25 ± 3,32</td><td>ICVB428</td><td>7,71 ± 0,57</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICVB414</td><td>5,32 ± 0,26</td><td>3GRM9</td><td>11,20 ± 2,13</td><td>ICVB433</td><td>7,41 ± 0,38</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
## 3.2. Formation de biofilms par les bactéries lactiques isolées

Le terme biofilm est utilisé pour décrire une communauté structurée de cellules bactériennes enfermées dans une matrice polymérique autoproduite adhérente à une surface inerte ou vivante (Costerton, 1999). La formation de biofilm a été étudiée car les souches probiotiques qui sont capables de former un biofilm offrent un moyen prometteur de contrecarrer l'établissement de biofilms pathogènes (Salas-Jara et al., 2016).

Les souches incubées en plaques pendant 24 h à 37°C en anaérobiose ont été traitées pour déterminer indirectement la formation de biofilm par la mesure de la DO à 600 nm. Après une analyse statistique ANOVA, les résultats obtenus montrent qu'au sein de *Lb. reuteri*, les souches sont regroupées en 8 groupes significativement différents, et en 9 groupes chez *Lb. salivarius* (Tableau 20).

Les souches ne présentent pas toutes le même degré d'adhésion au polystyrène. Les souches les plus performantes dans la formation de biofilms sont *Lb. salivarius* ICVB430, ICVB423 et ICVB421, avec des absorbances mesurées à 600nm de 4,00 ; 3,38 et 2,17, respectivement. Pour ce qui est de *Lb. reuteri*, les souches ICVB412, ICVB417 et ICVB416 sont les plus performantes dans la formation de biofilms avec des absorbances respectives de 2,19 ; 1,673 et 1,64. En comparant les moyennes entre espèces, *Lb. reuteri* présente des valeurs plus basses que *Lb. salivarius*, ce qui correspond aux données publiées par Raftis et al. (2011) et Tannock et al. (2005) qui ont noté que *Lb. salivarius* UCC118 a formé des biofilms plus importants que ceux formés par *Lb. reuteri* 100-23.

Les valeurs obtenues chez *Lb. reuteri* sont comparables à celles retrouvés par Jones et Versalovic (2009), avec des DO<sub>560nm</sub> mesurées allant de 1 à 4. Dans une autre étude, *Lb. reuteri* CRL 1324, connu pour sa capacité de former de biofilm présente une DO<sub>570nm</sub> de 1,5 quand elle est cultivée sur MRS tween (Leccese Terraf et al., 2012).

Concernant la capacité des souches de bactéries lactiques à former des biofilms, il y a une grande variabilité entre les souches. Comme Jones et Versalovic (2009) le suggèrent, la formation de biofilms est souche-dépendante. En outre Gómez et al. (2016); Pérez Ibarreche et al. (2014) ont démontré que les souches de lactobacilles ayant la capacité de former des biofilms sont capables de diminuer la colonisation de pathogènes comme *Listeria* ou *Salmonella* en conditions *in vitro*. Par ailleurs, les bactéries lactiques probiotiques dans les communautés de type biofilm peuvent être essentielles (i) pour favoriser la persistance de ces souches bénéfiques, permettant ainsi l'expression
de leurs propriétés probiotiques, (ii) pour un remodelage de la composition et de la fonction du microbiome intestinal par la compétition pour les nutriments pour les récepteurs et les sites de fixation ; la production de substrats de croissance ou d'inhibiteurs comme les bactériocines; et la modulation de l'immunité intestinale. Son effet probiotique est renforcé dans les situations de dysbiose, renversant cette situation et rétablissant une flore normale (Jones et Versalovic, 2009; O'Toole et Cooney, 2008).
<table><caption>**Tableau 20.** Formation de biofilms par les bactéries lactiques. Mesure par spectrométrie à une absorbance de 600nm (DO<sub>600nm</sub>).</caption><thead><tr><th colspan="2">Lb. reuteri</th><th colspan="2">Lb. salivarius</th><th colspan="2">Autres</th></tr></thead><tbody><tr><td>ICVB412</td><td>2,19 ± 0,11 <sup>a</sup></td><td>ICVB430</td><td>4,00 ± 0,01 <sup>A</sup></td><td>2GMV1</td><td>0,66 ± 0,09</td></tr><tr><td>ICVB417</td><td>1,67 ± 0,08 <sup>b</sup></td><td>ICVB423</td><td>3,38 ± 0,39 <sup>B</sup></td><td>S4.15</td><td>0,66 ± 0,07</td></tr><tr><td>ICVB416</td><td>1,64 ± 0,18 <sup>b</sup></td><td>ICVB421</td><td>2,17 ± 0,20 <sup>C</sup></td><td>ICVB434</td><td>0,65 ± 0,15</td></tr><tr><td>S5.12</td><td>1,14 ± 0,09 <sup>c</sup></td><td>ICVB433</td><td>1,12 ± 0,07 <sup>D</sup></td><td>ICVB420</td><td>0,64 ± 0,04</td></tr><tr><td>ICVB413</td><td>0,99 ± 0,07 <sup>d</sup></td><td>ICVB429</td><td>0,96 ± 0,20</td><td>S3.15</td><td>0,62 ± 0,16</td></tr><tr><td>ICVB414</td><td>0,95 ± 0,06 <sup>d</sup></td><td>ICVB437</td><td>0,90 ± 0,14</td><td>ICVB427</td><td>0,61 ± 0,12</td></tr><tr><td>ICVB493</td><td>0,83 ± 0,06 <sup>e</sup></td><td>ICVB422</td><td>0,83 ± 0,06</td><td>ICVB432</td><td>0,56 ± 0,03</td></tr><tr><td>3DMV2</td><td>0,80 ± 0,07 <sup>e</sup></td><td>ICVB424</td><td>0,77 ± 0,07</td><td>ICVB440</td><td>0,44 ± 0,04</td></tr><tr><td>2GE8</td><td>0,68 ± 0,07 <sup>f</sup></td><td>2GRM1</td><td>0,77 ± 0,21</td><td>ICVB438</td><td>0,44 ± 0,04</td></tr><tr><td>2GMV9</td><td>0,37 ± 0,03 <sup>g</sup></td><td>ICVB435</td><td>0,77 ± 0,35</td><td>ICVB439</td><td>0,41 ± 0,02</td></tr><tr><td>ICVB418</td><td>0,37 ± 0,10 <sup>g</sup></td><td>3GRM9</td><td>0,73 ± 0,07</td><td>ICVB426</td><td>0,36 ± 0,07</td></tr><tr><td>S5.5</td><td>0,31 ± 0,04 <sup>h</sup></td><td>ICVB431</td><td>0,71 ± 0,07</td><td>ICVB436</td><td>0,35 ± 0,05</td></tr><tr><td>ICVB415</td><td>0,31 ± 0,03 <sup>h</sup></td><td>ICVB428</td><td>0,66 ± 0,04</td><td>2GE1</td><td>0,27 ± 0,03</td></tr><tr><td>ICVB419</td><td>0,27 ± 0,03 <sup>h</sup></td><td>2GRM6</td><td>0,66 ± 0,10</td><td>ICVB425</td><td>0,20 ± 0,01</td></tr></tbody></table><table><tbody><tr><td>Lb. antri ICVB441</td><td>1,11 ± 0,38</td></tr><tr><td>Lb. johnsonii SE 4</td><td>0,31 ± 0,02</td></tr><tr><td>Lb. gallinarum SE.2</td><td>0,61 ± 0,14</td></tr><tr><td>Lb. gasseri SE.3</td><td>0,37 ± 0,09</td></tr><tr><td>Strep. alactolyticus 3DE6</td><td>0,93 ± 0,20</td></tr><tr><td>Strep. alactolyticus SE 1</td><td>0,38 ± 0,03</td></tr><tr><td>Strep. lutetiensis S4 18</td><td>0,42 ± 0,01</td></tr></tbody></table>
Récapitulatif de la première sélection de souches

Pour faire une première sélection des souches, la production d'acide lactique (liée à la taille des halos dans le test de *slabs*) et la capacité de formation des biofilms ont été prises en compte. Les 13 souches sélectionnées sont données dans la **Figure 33**.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 33.** Arbre décisionnel résumant la première sélection des souches isolées.</figcaption></figure>
### 3.3. Résistance des souches aux conditions gastro-intestinales du poulet

#### a. Evaluation des conditions expérimentales sur une levure probiotique

Le principal site d'action des probiotiques est l'intestin. Cependant, dans un premier temps, les bactéries probiotiques doivent d'abord survivre au passage par le jabot et le gésier dans des conditions défavorables. Ensuite, les bactéries sont soumises, dans le tractus gastro-intestinal, à l'action des acides et de la bile produits pour digérer les aliments et protéger le corps contre l'invasion d'agents pathogènes potentiels (Hofmann et Eckmann, 2006). Un probiotique doit donc être capable de survivre à ces conditions et atteindre en nombre suffisant l'intestin pour qu'il puisse exercer ses effets bénéfiques (Mainville et al., 2005).

* **Effet du pH et de la bile sur le taux de survie.**

Le tube digestif aviaire est complexe, dynamique et très différent de celui des mammifères (Martinez-Haro et al., 2009). Peu d'articles décrivent les conditions standards pour la simulation du tractus gastro-intestinal du poulet, nous avons utilisé le produit probiotique Actisaf® STD, à base de levures vivantes, commercialisé et actif dans le tractus gastro-intestinal des poulets, comme base de sélection des conditions à tester ultérieurement sur les isolats bactériens. Chaque condition a été testée indépendamment avec un nombre de levures de l'ordre de $2,44 \pm 0.72 \cdot 10^8$ UFC/mL, et chaque expérience a été répétée 3 fois.

Les conditions de pH et le temps d'incubation ont été choisis de façon à simuler les conditions réelles rencontrées au cours du passage à travers tout le tractus gastro-intestinal du poulet. Le pH du jabot, compris entre 4,5 et 6,5, est déterminé principalement par le type d'aliment que l'animal ingère et par le temps de rétention de la nourriture dans cette cavité, car un temps de rétention long impliquerait une fermentation. Lors de nos expériences, le pH a été fixé à 4,5 pendant un temps de 45 min.

Au niveau du gésier, le pH est très variable et peut osciller entre 2 et 4,5 selon la quantité d'aliments, la composition chimique et le temps de rétention de ceux-ci (Svihus, 2014). Le temps de rétention dépend de la quantité d'aliment et il est compris entre 1 et 3 h (Musikasang et al., 2009). Plusieurs études ont décrit les conditions testées simulant le tractus gastro-intestinal de poulet (Chang et Chen, 2000; Martinez-Haro et al., 2009; Musikasang et al., 2009). Nous avons choisi de tester l'influence de ce compartiment pendant 90 min et dans deux conditions de pH, pH 2,6 et pH 3,5, afin de simuler des conditions plus ou moins défavorables.
Le pH dans l'intestin est plus élevé que celui des compartiments précédents avec des valeurs de l'ordre de 6 en raison de la présence de la bile (Svihus, 2014) et de secrétions de solutions alcalines riches en ions hydrogénocarbonates libérés par le pancréas. Dans nos expériences, ce compartiment a été simulé avec un pH 6,4 pendant 3 h. Au regard des résultats obtenus, les conditions testées pour simuler le gésier montrent qu'un pH de 3,5 pendant 90 min est moins délétère avec un taux de survie (98,1%) que celui obtenu avec un pH 2,6 (96,9%) (Tableau 21). Les pourcentages de survie augmentant à mesure que le pH testé augmente.

<table><caption>**Tableau 21.** Survie des levures (Actisaf) aux différents pHs. Le pourcentage de survie est calculé en base logarithmique.</caption><thead><tr><th>Compartiment simulé</th><th>pH</th><th>Temps (min)</th><th>UFC/mL</th><th>% survie</th></tr></thead><tbody><tr><td>Solution initial</td><td>-</td><td>0</td><td>2,44 ± 0,72 · 10<sup>8</sup></td><td></td></tr><tr><td>Gésier 1</td><td>2,6</td><td>90</td><td>1,34 ± 0,41 · 10<sup>8</sup></td><td>96,9</td></tr><tr><td>Gésier 2</td><td>3,5</td><td>90</td><td>1,70 ± 0,15 · 10<sup>8</sup></td><td>98,1</td></tr><tr><td>Jabot</td><td>4,5</td><td>45</td><td>1,93 ± 0,36 · 10<sup>8</sup></td><td>98,8</td></tr><tr><td>Intestin</td><td>6,4</td><td>180</td><td>2,23 ± 0,12 · 10<sup>8</sup></td><td>99,5</td></tr></tbody></table>

Pour simuler le passage dans le gésier, nous avons choisi d'utiliser le pH 3,5 car en présence d'aliments, ce compartiment présente un pH autour de 3. De plus, Bunthof et al. (2001) ont montré que l'exposition à un pH 2,0 affecte la membrane des bactéries lactiques, alors qu'à pH 3,0, la membrane reste intacte.

La bile a été utilisée pour tester les conditions intestinales, car cette sécrétion digestive est déversée dans l'intestin à la fin de l'ilium. La bile joue un rôle majeur dans l'émulsification et la solubilisation des lipides du duodénum. Elle affecte les phospholipides et les protéines des membranes cellulaires en induisant une déstructuration de la membrane et en perturbant l'homéostasie cellulaire bactérienne (Begley et al., 2005; Hofmann et Eckmann, 2006; Svihus, 2014). Comme montre le **Tableau 22**, la survie des levures est affectée dès 0,35% de bile et une perte significative est observée pour 0,70%.
<table><caption>**Tableau 22.** Survie des levures (Actisaf) à différents pourcentages (%) de bile</caption><thead><tr><td>Bile</td><td>Temps (min)</td><td>UFC/mL</td><td>% survie</td></tr></thead><tbody><tr><td>Contrôle</td><td>0</td><td>3,95 ± 0,76 · 10<sup>8</sup></td><td></td></tr><tr><td>0,35%</td><td>180</td><td>1,78 ± 0,38 · 10<sup>8</sup></td><td>96,0</td></tr><tr><td>0,70%</td><td>180</td><td>9,00 ± 0,35 · 10<sup>7</sup></td><td>92,5</td></tr></tbody></table>

Les résultats permettent de montrer un effet modéré de la bile sur la survie des levures Actisaf à la concentration supérieure testée.

## b. Taux de survie des bactéries dans les conditions gastro-intestinales du poulet

Le taux de survie des bactéries aux conditions gastro-intestinales nous donne des indications précieuses pour la sélection des probiotiques car ces derniers doivent résister :

* aux pH acides, car ils modifient l'équilibre de la cellule en raison d'une augmentation de la concentration des protons intracellulaires (Hofmann et Eckmann, 2006) ;

* aux sels biliaires, car il s'agit d'un préalable à la colonisation et au maintien de l'activité métabolique des bactéries probiotiques dans l'intestin grêle de l'hôte (Strompfová et Lauková, 2007)

Suite aux résultats obtenus sur la levure Actisaf, les conditions de pH et de pourcentage de bile ont été déterminés comme suit : jabot : pH 4,5 (45 min) ; gésier : pH 3,5 (90 min) ; et l'intestin à pH 6,4 (3h). Afin de se rapprocher des conditions réelles du tractus gastro-intestinal des enzymes ont été également introduites dans le test. L'effet combiné d'une solution de pepsine-pH et de billes en verre (3g) vise à simuler le gésier. La combinaison du pH, de bile et de pancréatine vise quant à elle à simuler les conditions intestinales (Tableau 23).

Toutes les souches ont été cultivées pendant 20 h à 37 °C sur MRS. *Ent. faecalis* DD 14, isolée du méconium et productrice d'une bactériocine de classe IIb (Caly et al., 2017), et *Lb. rhamnosus* ATCC 7469, ont été utilisées comme témoin de survie. Deux techniques d'estimation de la biomasse ont été utilisées, le dénombrement sur milieu MRS et la cytométrie en flux. Pour ce dernier dénombrement les bactéries marquées par les colorants syto-24 et l'iodure de propidium ont été dénombrées (Tableau 24). Les taux de survie ont été calculés selon la formule : (Log
population finale/Log population initiale) * 100. Les expériences ont été répétées 3 fois de façon indépendante.

<table><caption>**Tableau 23.** Conditions expérimentales finales simulant le tractus gastro-intestinal du poulet.</caption><thead><tr><th>Compartiment simulé</th><th>pH</th><th>Temps (min)</th><th>Enzymes</th><th>Bile</th><th>Autres</th></tr></thead><tbody><tr><td>Jabot</td><td>4,5</td><td>45</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gésier</td><td>3,5</td><td>90</td><td>Pepsine (3mg/mL)</td><td>-</td><td>Billes 3 mm diam. agitation de 150 rpm</td></tr><tr><td>Intestin</td><td>6,4</td><td>180</td><td>Pancréatine (1mg/mL)</td><td>0,35%</td><td>-</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Tableau 24.** Survie des bactéries lactiques aux conditions gastro-intestinales du poulet.</caption><thead><tr><th></th><th></th><th>MRS</th><th>Cytométrie en flux</th></tr></thead><tbody><tr><td>Lb. rhamnosus</td><td>ATCC 7469</td><td>32,29 ± 3,03</td><td>80,68 ± 3,23</td></tr><tr><td>Ent. Faecalis</td><td>DD14</td><td>34,35 ± 2,64</td><td>77,62 ± 6,77</td></tr><tr><td rowspan="4">Lb. salivarius</td><td>ICVB421</td><td>32,56 ± 3,32</td><td><b>91,67 ± 1,45</b></td></tr><tr><td>ICVB423</td><td>24,01 ± 3,03</td><td>86,12 ± 0,41</td></tr><tr><td>ICVB429</td><td><b>57,32 ± 0,71</b></td><td>79,58 ± 1,32</td></tr><tr><td>ICVB430</td><td>30,43 ± 4,03</td><td><b>95,05 ± 3,73</b></td></tr><tr><td rowspan="10">Lb. reuteri</td><td>ICVB412</td><td>51,98 ± 4,13</td><td>90,27 ± 0,38</td></tr><tr><td>ICVB413</td><td>59,53 ± 0,26</td><td>83,88 ± 1,00</td></tr><tr><td>ICVB414</td><td><b>71,60 ± 1,65</b></td><td>78,06 ± 3,00</td></tr><tr><td>ICVB415</td><td>46,43 ± 3,40</td><td>90,23 ± 0,39</td></tr><tr><td>ICVB416</td><td><b>73,47 ± 0,92</b></td><td><b>93,34 ± 1,41</b></td></tr><tr><td>ICVB417</td><td>25,83 ± 1,69</td><td>84,95 ± 2,16</td></tr><tr><td>ICVB418</td><td>46,07 ± 2,21</td><td>84,06 ± 1,37</td></tr><tr><td>ICVB419</td><td><b>65,68 ± 1,37</b></td><td>81,92 ± 1,80</td></tr><tr><td>ICVB493</td><td>27,05 ± 1,63</td><td>85,25 ± 1,49</td></tr></tbody></table>

Valeurs obtenues après dénombrement sur milieu MRS gélosé. La cytométrie a été faite après marquage des cellules par syto-24 et l'iodure de propidium.
Les résultats obtenus par dénombrement sur milieu MRS ont permis de montrer que les conditions drastiques combinant acidité-bile à 0,35 % et les différentes enzymes, induisaient une certaine mortalité des souches testées, même si celles-ci ont été isolées du tractus gastro-intestinal.

Parmi les souches bactériens, la survie dans les conditions gastro-intestinales est une propriété souche dépendante. Cependant, la survie des souches de *Lb. salivarius* dans les conditions testées est de 24,01 à 57,32% sur MRS alors que celle des *Lb. reuteri* varie de 25,83 à 73,47%, ce qui donne des différences significatives (p=0,0087) après ANOVA. Ainsi *Lb. reuteri* apparaît comme l'espèce la plus résistante aux conditions testées. Au niveau statistique, *Lb. rhamnosus* ATCC 7469 a été incluse dans le groupe des *Lb. salivarius* au regard des valeurs similaires de survie.

Les études réalisées testant des conditions d'acide et bile sur *Lb. rhamnosus* Lr32 ou GG ont montré une diminution de la viabilité de 50 à 60% (Ding et Shah, 2007; Koskenniemi et al., 2011). Ces résultats correspondent à ce qui a été obtenu lors du dénombrement sur milieu MRS. Selon Musikasang et al. (2009), les bactéries lactiques testées pour leur tolérance aux conditions gastro-intestinales du poulet présentent des survies entre 27 et 43%, quand elles sont soumises à du jus gastrique simulé, à pH3 contenant de la pepsine (3mg/mL), et à un environnement intestinal simulé, avec 7% de bile fraiche de poulet à pH 8 et contenant 1mg/mL de pancréatine. Les valeurs obtenues après notre simulation sont supérieures et atteignent des valeurs maximales de 73,41%.

La méthode d'estimation de la survie par dénombrement en milieu gélosé est fastidieuse et ne permet pas de mettre en évidence les cellules viables mais non cultivables (VBNC) qui sont métaboliquement actives mais ont perdu la capacité de se diviser (Khan et al., 2010). Pour prendre en compte ces bactéries, la survie a été également déterminée par la méthode de cytométrie en flux qui prend en compte les bactéries viables et les VBNC. Comme attendu, les pourcentages de survie obtenus par cette technique sont nettement supérieurs à ceux trouvés par dénombrement sur MRS pour toutes les souches à l'exception de l'isolat ICVB414. La souche *Lb. reuteri* ICVB414 présente des taux de survie comparables dans les deux méthodes (71,60±1,65 et 78,06 ± 3,00 respectivement sur MRS et en cytométrie). La souche de *Lb. reuteri* ICVB416 et les 2 souches de *Lb. salivarius* ICVB421 et ICVB430 présentent les meilleurs pourcentages de survie (respectivement 93,34±1,41 ; 91,67±1,45 et 95,05±3,73), et ce taux est significativement différent de celui des autres isolats avec une valeur de p de 0,0001.
Ceci peut être dû à la capacité des souches de *Lb. reuteri* à précipiter les sels biliaires par l'action de la BSH (*Bile Salt Hydrolase*) (**De Boever et al., 2000**). Elle est produite par différentes bactéries d u microbiote intestinal. C'est une enzyme qui catalyse la réaction essentielle du métabolisme des acides biliaires dans l'intestin grêle et qui joue un rôle important dans le métabolisme de l'hôte et la récupération d'énergie (**Begley et al., 2005; Joyce et al., 2014; Martoni et al., 2015**). En effet, la production de la BSH dans l'intestin influence le métabolisme lipidique la malabsorption des lipides, la baisse du taux de cholestérol, etc. chez l'hôte (**Begley et al., 2006**). Ces effets permettent dans les élevages d'obtenir des animaux avec un contenu bas en LDL-cholestérol (**Jin et al., 1998; Martoni et al., 2015**). Chez les souches de *Lactobacillus*, d'autres mécanismes de résistance à la bile ont été décrits comme un système de pompe, à deux composantes, de transporteurs multi-drugs, ou des changements dans l'architecture ou la composition de la membrane qui se traduisent par un changement de la perméabilité, de la fluidité ou de la charge de la membrane (**Begley et al., 2005; Koskenniemi et al., 2011; Ruiz et al., 2013**).

**3.4. Test d'activité contre différentes souches de Clostridium**

Le test d'activité par slabs a été refait sur 13 différentes souches de *Clostridium*. Le but était de vérifier l'activité anti-*Clostridium* sur un grand nombre de souche cliniques. Le **Tableau 25** montre les moyennes d'activité des lactobacilles contre ces souches de *Clostridium*.
<table><caption>**Tableau 25.** Halos d'activité produits par Lactobacilles contre *Clostridium*.</caption><thead><tr><th>Niveau d'activité</th><th>Espèce</th><th>Nombre</th><th>Souches</th></tr></thead><tbody><tr><td>-</td><td>-</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="2">+</td><td>Lb. reuteri</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td rowspan="3">++</td><td>Lb. reuteri</td><td>9</td><td>ICVB413, ICVB493, ICVB412, <b>ICVB416</b>, ICVB415, ICVB417, ICVB414, ICVB418, ICVB419</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>1</td><td>ICVB429</td></tr><tr><td>Autres</td><td>2</td><td>Ent. faecalis DD14, Lb. rhamnosus ATCC7469</td></tr><tr><td rowspan="2">+++</td><td>Lb. reuteri</td><td>0</td><td>-</td></tr><tr><td>Lb. salivarius</td><td>3</td><td><b>ICVB421</b>, <b>ICVB430</b>, ICVB423</td></tr></tbody></table>

Légende. - : absence de halo, + : halo de taille entre 1-2mm ; ++ entre 2.1-4 mm ; et +++ entre 4.1-7 mm)

Les souches plus productrices de halos sont les *Lb. salivarius*, en étant les souches plus antagonistes *Lb. salivarius* ICVB421, ICVB430 et ICVB423.

## 3.5. Etude des propriétés d'agrégation des souches

La capacité des bactéries à former des agrégats cellulaires est considérée comme une caractéristique positive pour les candidats probiotiques car cette propriété d'agrégation est importante dans la formation de biofilms et la protection de l'hôte contre la colonisation par des agents pathogènes (Gómez et al., 2016; Vlková et al., 2008). Les 13 souches sélectionnées ont été testées pour leurs propriétés d'agrégation en termes :

- d'autoagrégation : agrégation entre elles (cellules bactériennes de la même souche)

- de coagrégation : agrégation des candidats probiotiques avec des agents pathogènes intestinaux

### a) Mesure de l'autoagrégation des souches

Les pourcentages d'auto agrégation ont été déterminés après 3 h, 6 h et 24 heures d'incubation à 37°C selon le protocole décrit dans le matériel et méthodes (4.5.2). Les souches *Lb. rhamnosus*
ATCC 7469 et *Ent. faecalis* DD14 ont été choisi comme témoin probiotiques. *Clostridium perfringens* DSM 756, *E. coli* ER184 et *Salmonella enterica* subsp. *enterica* Newport (ATCC 6962) ont été choisis pour leur statut de pathogènes les plus couramment retrouvés chez le poulet.
Les résultats expérimentaux sont donnés ci-dessous dans la **Figure 34**.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 34.** Autoagrégation (%) des souches de bactéries lactiques isolées</figcaption></figure>

Les pourcentages d'autoagrégation des pathogènes se trouvent dans la moyenne des valeurs d'agrégation obtenues, il n'y a pas de différence significative entre l'autoagrégation des souches pathogènes et celle des souches de *Lactobacillus* à 24h, ce qui est comparable aux résultats obtenus par Collado et al. (2007b), et en contradiction avec Tareb et al. (2013) qui trouvent des valeurs d'agrégation des pathogènes à 24 h plus basses que celles des souches de *Lactobacillus*.

Toutes les souches de lactobacilles testées s'autoagrègent dès 3h et présentent des valeurs proches de celles des souches de référence utilisées comme témoin. Les pourcentages d'auto agrégation varient entre 6 et 15%.
Le test ANOVA montre que l'autoagrégation augmente significativement au cours de la période d'incubation (p<0.05) pour atteindre à 24h des valeurs de 50 à 73%. Ces résultats sont comparables avec ceux trouvés par Botha et al. (2012), De Gregorio et al. (2014), Tareb et al. (2013) ou Ait Seddik et al. (2017) et sont plus élevées que celles retrouvées par Abushelaibi et al. (2017) avec *Lb. plantarum* et *Lc. lactis*.

Après une analyse statistique effectuée par ANOVA à un facteur, nous avons constaté qu'il existe des différences significatives parmi les souches. A 24h, l'autoagrégation des souches de *Lb. reuteri* ICVB413 et ICVB418 et les souches de *Lb. salivarius* ICVB423, ICVB430 et ICVB421 atteint des valeurs importantes comprises entre 55,71 et 73,55% statistiquement supérieure à celle des autres souches. Ces valeurs d'autoagrégation suggèrent que ces *Lactobacillus* forment de puissants agrégats, qui peuvent augmenter l'adhésion aux cellules épithéliales. Il a été suggéré que les souches avec une capacité agrégative importante ont plus d'aptitude à adhérer aux cellules intestinales et aux surfaces muqueuses (**Collado et al., 2008** ; **Taheri et al., 2009**) et de former un biofilm (**Botha et al., 2012**). Ceci permet la colonisation d'environnements où les temps de séjour sont courts comme c'est le cas dans le tractus gastro-intestinal (**Gomaa, 2013**).

## b) Mesure de la coagrégation des souches

Ce test permet de mettre en évidence les souches ayant une capacité d'agrégation avec des pathogènes typiques du tractus gastro-intestinal de la volaille, tels que *Salmonella enterica* serovar. Enterica, *E. coli* ou *C. perfringens*. Des volumes égaux de suspensions de candidat probiotique et de pathogènes, dans du tampon PBS 1x, ont été mélangés ensemble. Les propriétés de coagrégation ont été calculées en fonction de la formule décrite dans la section 4.5.2 de matériel et méthodes. Les résultats obtenus après 3h, 6h et 24h sont reportés dans le **Tableau 26**.
<table><caption>**Tableau 26.** Coagrégation des souches de *Lactobacillus* avec des agents pathogènes</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">Clostridium perfringens</th><th colspan="3">Salmonella</th><th colspan="3">Escherichia coli</th></tr><tr><th>3h</th><th>6h</th><th>24h</th><th>3h</th><th>6h</th><th>24h</th><th>3h</th><th>6h</th><th>24h</th></tr></thead><tbody><tr><td>DD14</td><td>10,8 ± 0,6</td><td>18,5 ± 3,8</td><td>51,7 ± 15,2</td><td>13,9 ± 1,9</td><td>24,3 ± 5,0</td><td>47,6 ± 6,2</td><td>5,9 ± 3,2</td><td>13,4 ± 4,7</td><td>62,4 ± 2,0</td></tr><tr><td>ATCC 7469</td><td>11,5 ± 0,6</td><td>18,8 ± 2,9</td><td>56,9 ± 5,1</td><td>14,7 ± 2,3</td><td>22,7 ± 3,0</td><td><b>60,5 ± 4,0</b></td><td>5,9 ± 2,0</td><td>12,8 ± 3,5</td><td>59,4 ± 2,3</td></tr><tr><td>ICVB412</td><td>15,3 ± 2,3</td><td>26,7 ± 2,2</td><td><b>68,7 ± 11,5</b></td><td>15,7 ± 4,1</td><td>23,7 ± 6,9</td><td>58,0 ± 8,0</td><td>3,2 ± 1,3</td><td>8,8 ± 1,9</td><td>64,2 ± 7,8</td></tr><tr><td>ICVB413</td><td>16,4 ± 1,2</td><td>27,4 ± 2,0</td><td><b>68,2 ± 0,5</b></td><td>14,5 ± 0,4</td><td>19,7 ± 4,2</td><td>55,4 ± 6,4</td><td>4,9 ± 0,5</td><td>14,0 ± 1,3</td><td>65,7 ± 3,6</td></tr><tr><td>ICVB414</td><td>12,5 ± 1,2</td><td>23,7 ± 4,8</td><td>63,0 ± 4,0</td><td>13,8 ± 3,4</td><td>20,5 ± 4,2</td><td>49,7 ± 3,5</td><td>5,4 ± 2,0</td><td>10,2 ± 4,0</td><td>64,7 ± 4,1</td></tr><tr><td>ICVB415</td><td>14,6 ± 1,4</td><td>23,7 ± 4,0</td><td>55,8 ± 3,9</td><td>14,1 ± 3,6</td><td>20,9 ± 5,2</td><td>53,7 ± 0,9</td><td>4,7 ± 3,6</td><td>11,7 ± 2,4</td><td><b>69,8 ± 0,9</b></td></tr><tr><td>ICVB416</td><td>14,7 ± 1,3</td><td>23,8 ± 4,6</td><td>62,5 ± 5,0</td><td>14,1 ± 0,8</td><td>21,3 ± 6,4</td><td>47,3 ± 7,7</td><td>5,5 ± 3,3</td><td>16,3 ± 4,8</td><td>61,3 ± 3,9</td></tr><tr><td>ICVB417</td><td>9,7 ± 1,9</td><td>19,6 ± 7,2</td><td>61,9 ± 10,6</td><td>13,7 ± 2,0</td><td>21,0 ± 4,0</td><td>51,0 ± 4,1</td><td>8,2 ± 2,6</td><td>10,6 ± 2,9</td><td><b>66,6 ± 0,8</b></td></tr><tr><td>ICVB493</td><td>14,9 ± 0,8</td><td>23,7 ± 6,0</td><td><b>65,7 ± 2,2</b></td><td>14,9 ± 2,4</td><td>23,0 ± 6,3</td><td>59,1 ± 8,7</td><td>4,0 ± 2,8</td><td>9,0 ± 3,2</td><td><b>65,6 ± 9,1</b></td></tr><tr><td>ICVB418</td><td>11,7 ± 1,1</td><td>18,9 ± 3,7</td><td>60,3 ± 4,5</td><td>13,4 ± 2,6</td><td>20,4 ± 5,4</td><td>49,6 ± 4,8</td><td>5,5 ± 1,3</td><td>12,2 ± 2,7</td><td>58,4 ± 4,8</td></tr><tr><td>ICVB419</td><td>15 ± 1,9</td><td>23,8 ± 6,9</td><td>56,0 ± 7,0</td><td>12,8 ± 2,3</td><td>18,9 ± 3,2</td><td>43,4 ± 1,8</td><td>3,3 ± 0,8</td><td>8,0 ± 1,9</td><td>54,1 ± 7,5</td></tr><tr><td>ICVB421</td><td>14,9 ± 1,6</td><td>27,9 ± 5,9</td><td><b>66,4 ± 1,5</b></td><td>16,1 ± 2,5</td><td>24,9 ± 3,9</td><td><b>67,3 ± 9,3</b></td><td>6,7 ± 0,8</td><td>17,6 ± 3,3</td><td><b>67,3 ± 4,0</b></td></tr><tr><td>ICVB423</td><td>15,3 ± 1,7</td><td>30,9 ± 6,0</td><td>65,1 ± 6,4</td><td>15,4 ± 3,5</td><td>23,6 ± 5,7</td><td>56,3 ± 3,2</td><td>5,3 ± 0,9</td><td>11,5 ± 1,2</td><td>57,8 ± 5,7</td></tr><tr><td>ICVB429</td><td>10,6 ± 1,3</td><td>21,9 ± 2,9</td><td>59,9 ± 1,3</td><td>13,2 ± 3,1</td><td>20,6 ± 4,8</td><td>51,1 ± 2,8</td><td>5,0 ± 3,8</td><td>8,1 ± 1,6</td><td>55,6 ± 1,3</td></tr><tr><td>ICVB430</td><td>15,1 ± 1,6</td><td>24,0 ± 4,4</td><td>61,9 ± 2,0</td><td>15,6 ± 3,9</td><td>24,2 ± 4,4</td><td><b>60,4 ± 3,7</b></td><td>3,4 ± 2,8</td><td>18,5 ± 4,7</td><td><b>70,4 ± 3,0</b></td></tr></tbody></table>
Tous les candidats probiotiques testés ont montré des capacités d'agrégation avec les pathogènes choisis. Le pourcentage de coagrégation a été démontré comme étant spécifique et dépendant du temps. Selon le test ANOVA, la coagrégation des souches de *Lactobacillus* avec la souche de *Salmonella enterica* ne présente pas de différences significatives ni après 3h (p=0,9593) ni après 6 heures (p=0,9511). Les résultats obtenus à 24h montrent que les souches qui présentent le pourcentage de coagrégation le plus important avec *Salmonella* sont les souches de *Lb. salivarius* ICVB421, ICVB430 et ICVB423, une souche de *Lb. reuteri* (ICVB493) et la souche témoin *Lb. rhamnosus*.

Il n'y a pas de différences significatives entre les souches de lactobacilles lorsque celles-ci sont co agrégés avec *E. coli* pendant 3h. Les différences commencent à devenir évidentes à partir de 6h pour les souches *Lb. reuteri* ICVB415, *Lb. salivarius* ICVB421 et ICVB430.

La coagrégation *avec* C. *perfringens* montre des différences entre les souches de lactobacilles dès 3h de contact. Les lactobacilles se répartissent dans 3 groupes significativement différents selon leur comportement. *Lb. reuteri* ICVB412, ICVB413, ICVB415, ICVB416 ICVB419 et ICVB493 et *Lb. salivarius* ICVB421, ICVB421 et ICVB430 appartiennent au groupe qui présente les valeurs les plus élevées avec des pourcentages variant de 14-16%. A 24h, les valeurs minimales de coagrégation avec C. *perfringens* sont celles des souches de référence *Ent. faecalis* DD14 et *Lb. rhamnosus* ATCC7469 et *Lb. reuteri* ICVB419. Les souches de *Lb. reuteri* ICVB413, ICVB412 et ICVB493 et *Lb salivarius* ICVB421 présentent les pourcentages les plus importants avec 68,7 ; 68,2 ; 65,7 ; et 66,4% respectivement. Au regard des pathogènes testés, les pourcentages de coagrégation sont les plus importants quand la coagrégation se fait avec C. *perfringens* comme l'on également montré Kizerwetter-Świda et Binek (2016).

Si les capacités agrégatives et coagrégatives sont analysées ensemble, seule la souche *Lb. salivarius* ICVB421 présente de hautes valeurs avec les trois souches pathogènes. Néanmoins, Taheri et al. (2009) ont suggéré qu’il n’y avait pas de corrélation entre les résultats d’auto et de coagrégation : une souche qui présente une haute autoagrégation n’a pas obligatoirement la capacité à coagréger de façon importante. Cet effet peut être dû à un effet spécifique à chaque souche.

Les valeurs hautes d'agrégation se traduisent par une plus grande capacité à créer une barrière protectrice contre les agents pathogènes en se liant au mucus, aux cellules épithéliales, en coagrégeant avec la flore commensale de l'intestin ou avec les pathogènes empêchant ceux-ci de
coloniser la surface intestinale (Collado et al., 2007a; Goh et Klaenhammer, 2010; Shen et al., 2005).

Par conséquent, la coagrégation peut s'apparenter à un mécanisme de défense contre les infections dans le tractus gastro-intestinal (Gomaa, 2013). Quand ces interactions sont présentes, il n'est pas possible de déplacer de façon compétitive les organismes déjà présents dans l'agrégat en ajoutant d'autres organismes, ce qui suggère des interactions étroites et/ou des interactions multiples (O'Toole et al., 2000).

Le phénomène d'agrégation chez les lactobacilles est le résultat d'interactions complexes entre les composants à la surface des cellules, tels que les protéines, les glycoprotéines, les acides téichoïques ou lipoïques, les carbohydrates de la paroi cellulaire bactérienne, et également les facteurs sécrétés (Goh et Klaenhammer, 2010; Tareb et al., 2013). Deux types de protéines peuvent être impliquées dans ce phénomène, les protéines solubles et les protéines de la surface cellulaire (Miljkovic et al., 2015). Certains lactobacilles comme *Lb. brevis*, *Lb. acidophilus* ou *Lb. crispatus* présentent une couche S, dont les protéines sont impliquées dans le processus d'agrégation (Hynönen et Palva, 2013). Ces protéines sont également impliquées dans les premières étapes de l'adhésion comme Kos et al. (2003) l'ont démontré sur *Lb. acidophilus* M92.

Parmi les facteurs sécrétés qui favorisent le processus d'agrégation, on peut citer les facteurs promoteurs de l'agrégation (APF), et de la coagrégation (CPF) qui sont des protéines secrétées pour les bactéries et sont trouvés par exemple chez *Lb. acidophilus* (Goh et Klaenhammer, 2010). Les protéines qui promeuvent l'autoagrégation comme AggE chez *Ent. faecium* ou AggLb chez *Lb. paracasei* ont été décrites; cette dernière a été identifiée comme étant la plus grande protéine ancrée dans la paroi cellulaire des lactobacilles (Miljkovic et al., 2015; Veljović et al., 2017). Ces facteurs sont également impliqués dans le processus d'adhésion et aussi dans la maintenance de la forme cellulaire de la bactérie. Cependant ces facteurs n'ont pas été décrit chez *Lb. salivarius* (Kang et al., 2017). Chez *Lb. reuteri*, le processus d'agrégation et d'adhésion dépend des protéines membranaires et des glucides pour la production d'exopolysaccharides et d'oligosaccharides (Walter et al., 2008).
Synthèse des résultats portant sur la sélection de souches

Dans un premier temps, nous avons sélectionné 13 souches d'intérêt parmi 70. Une deuxième sélection a été ensuite réalisée en prenant en compte les propriétés de coagrégation des *Lactobacillus* avec *C. perfringens* et surtout le pourcentage de survie mis en évidence par la cytométrie en flux. Cette deuxième sélection a pour but de sélectionner des souches qui auraient la plus grande probabilité d'atteindre l'intestin en gardant leur viabilité et seraient donc capables d'exercer leur potentiel probiotique. Nous avons retenu au final 3 isolats, *Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430, dont les propriétés sont énumérées ci-dessous (Tableau 27); notamment la survie aux conditions gastro-intestinales par l'approche en cytomètre en flux et leurs capacités de coagrégation avec *C. perfringens* à 6 et 24 h d'incubation.

<table><caption>Tableau 27. Survie des bactéries pathogènes et coagrégation avec les souches de lactobacilles</caption><thead><tr><th></th><th></th><th>Lb. reuteri<br>ICVB416</th><th>Lb. salivarius<br>ICVB421</th><th>Lb. salivarius<br>ICVB430</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Survie aux conditions<br>GIT (%)</td><td>CF</td><td>93,34 ± 1,41</td><td>91,67 ± 1,45</td><td>95,05 ± 3,73</td></tr><tr><td>MRS</td><td>73,47 ± 0,92</td><td>32,56 ± 3,32</td><td>30,43 ± 4,03</td></tr><tr><td rowspan="2">Coagrégation avec<br><i>C. perfringens</i> (%)</td><td>6h</td><td>23,8 ± 4,6</td><td>27,9 ± 5,9</td><td>24,0 ± 4,4</td></tr><tr><td>24h</td><td>62,5 ± 5,0</td><td>66,4 ± 1,5</td><td>61,9 ± 2,0</td></tr><tr><td rowspan="2">Coagrégation avec<br><i>Salmonella enterica</i><br>(%)</td><td>6h</td><td>21,3 ± 6,4</td><td>24,9 ± 3,9</td><td>24,2 ± 4,4</td></tr><tr><td>24h</td><td>47,3 ± 7,7</td><td>67,3 ± 9,3</td><td>60,4 ± 3,7</td></tr><tr><td rowspan="2">Coagrégation avec<br><i>E. coli</i> (%)</td><td>6h</td><td>16,3 ± 4,8</td><td>17,6 ± 3,3</td><td>18,5 ± 4,7</td></tr><tr><td>24h</td><td>61,3 ± 3,9</td><td>67,3 ± 4,0</td><td>70,4 ± 3,0</td></tr><tr><td rowspan="2">Agrégation (%)</td><td>6h</td><td>4,8 ± 0,74</td><td>7,1 ± 1,0</td><td>7,1 ± 2,1</td></tr><tr><td>24h</td><td>39,3 ± 3,2</td><td>37,2 ± 4,13</td><td>36,9 ± 2,54</td></tr><tr><td colspan="2">Biofilms (DO<sub>600nm</sub>)</td><td>1,64 ± 0,18</td><td>2,17 ± 0,20</td><td>4,00 ± 0,01</td></tr><tr><td colspan="2">Acide lactique (g/L)</td><td>6,91 ± 0,61</td><td>11,30 ± 2,02</td><td>13,02 ± 2,76</td></tr></tbody></table>

CF : cytométrie en flux, MRS : dénombrement sur boîte en gélose MRS.
## 3.6. Adhésion aux cellules intestinales

La lignée cellulaire Caco-2 a été utilisée comme lignée modèle dans le but d'évaluer les capacités d'adhésion de *C. perfringens* DSM 756 et des souches de lactobacilles sélectionnées aux cellules de l'épithélium intestinal. La souche *Lb. rhamnosus* ATCC 7469 a été utilisée comme souche témoin incapable d'adhérer aux cellules eucaryotes. Les cellules bactériennes cultivées 24h et reprises en DMEM ont été ajoutées aux cellules Caco-2 avec une MOI de 10:1 (bactéries : Caco-2). Pour déterminer le pourcentage d'adhésion, deux méthodes ont été utilisées. La méthode classique de dénombrement sur gélose MRS et l'approche moléculaire par PCR en temps réel. Le pourcentage d'adhésion a ensuite été calculé par rapport au nombre de bactéries inoculées. Les taux d'adhésion après 2h d'incubation sont représentés sur la **Figure 35**.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 35.** Pourcentage d'adhésion des souches bactériennes aux cellules Caco-2 par la méthode de dénombrement sur boîte et par PCR quantitative (qPCR).</figcaption></figure>

Le témoin négatif, *Lb. rhamnosus* ATCC 7469 présente les valeurs les plus basses avec une moyenne de 0,19% ; ces valeurs sont en accord avec celles données par Chauviere et al. (1992) qui ont montré que cette souche adhère faiblement aux cellules Caco-2 après 1 h d'incubation. Sa faible capacité d'adhésion a été démontrée également sur un modèle cellulaire de la muqueuse intestinale notamment par l'utilisation des glycoprotéines d'iléostomie humaine (Tuomola et al., 1999). En ce qui concerne les souches sélectionnées durant cette étude, les *Lb. salivarius* adhèrent plus fortement que la souche de *Lb. reuteri*. La méthode classique par dénombrement sur boîte, montre
que les souches *Lb. salivarius* présentent un taux d'adhésion variant de 3 à 5,18%, alors que par qPCR, ces pourcentages varient de 1,05 à 8,01%. Messaoudi et al. (2012) ont montré qu'une souche de *Lb. salivarius* SMXD51, isolée de fèces de poulet, adhérait à un épithélium formé d'une monocouche de cellules Caco-2 assez faiblement avec des valeurs d'adhésion de 1%, bien inférieures à celles retrouvées durant notre étude. Toutefois nos souches sont moins adhérentes en comparaison des celles décrites dans l'étude d'Ait Seddik et al. (2017) qui présentent des taux d'adhésion sur le même modèle expérimentale variant de 5 à 8%.

En ce qui concerne la relation entre la méthode de dénombrement sur boîte et la PCR quantitative, celle-ci varie selon l'espèce. Chez *Lb. reuteri* on retrouve des valeurs plus faibles dans les résultats de la qPCR, contrairement à *Lb. salivarius*. L'avantage de l'approche moléculaire, utilisant la PCR quantitative, est principalement l'absence de risques d'une sous-estimation du nombre de bactéries du fait de la culture sur milieu gélosé en boite de Pétri, qui ne permet d'évaluer que le nombre de microorganismes viables et cultivables. D'autre part la qPCR est une technique rapide, qui permet de différentier les bactéries dans un même échantillon en utilisant les amorces spécifiques de chaque espèce. Avec cet avantage, de tests sur l'effet de culture de barrière pourraient être faites, en observant si les souches sélectionnées ont un effet de compétition sur les sites d'union aux cellules intestinales par une administration précédant, ou de traitement si l'inoculation se fait après l'infection avec *C. perfringens*. Les inconvénients de cette technique sont principalement dus au temps d'optimisation de la méthode en utilisant les amorces spécifiques aux souches d'intérêt et le prix de revient liés à la complexité du matériel et aux traitements des échantillons (Friedrich et Lenke, 2006; Pathak et al., 2012). L'étude de l'adhésion *in vitro* s'agit d'une question controversée, par des sceptiques qui soutiennent l'incapacité des probiotiques à coloniser la muqueuse. D'un côté, la problématique vient de l'approche *in vitro*, où nombreux facteurs ne sont pas pris en compte : les cellules utilisées sont souvent utilisées en monoculture, elles proviennent de lignes cellulaires cancéreuses, les conditions d'incubation, les effets de la digestion sur les souches et la matrice alimentaire, ne sont pas envisagés. Également, il n'y a pas de microorganisme pour mimer les conditions de compétition du microbiote (Papadimitriou et al., 2015). D'un autre côté, la prémisse de qu'un probiotique doit coloniser. Ouwehand et Salminen (2003) défendent qu'il soit plus cohérent de parler de colonisation transitoire, temporelle ou de persistance des probiotiques plutôt que de colonisation.
Il est donc difficile d'extrapoler de manière fiable les résultats d'adhésion *in vitro* à la situation *in vivo* chez l'homme cependant les inconvénients décrits si des souches ont présenté valeurs d'adhésion *in vitro* elles les auront *in vivo*. Malgré tous les inconvénients décrits, il a été rapporté que les résultats des tests d'adhésion *in vitro* utilisant ce modèle ont une bonne corrélation avec ceux obtenu *in vivo* (Crociani et al., 1995; Ouwehand et Salminen, 2003). Les souches probiotiques doivent présenter une capacité d'adhésion aux cellules épithéliales intestinales, car c'est un prérequis pour la colonisation. Cette aptitude permet de prolonger le temps de séjour des souches dans l'intestin en prévenant leur élimination rapide dans les fèces. Qui plus est l'adhésion a un effet bénéfique sur la santé en permettant la mise en œuvre de l'exclusion compétitive des pathogènes et par les interactions avec les cellules épithéliales qui sont susceptibles de stimuler le système immunitaire et améliorer l'intégrité de barrière épithéliale (Surendran Nair et al., 2017; Yang et al., 2015).

La capacité d'adhésion d'une souche bactérienne dépend de plusieurs paramètres parmi lesquels nous citerons les propriétés intrinsèques de la souche, notamment les propriétés physico-chimiques de la surface de la cellule bactérienne. La composition de cette surface en acides gras et le ratio saturés/insaturés qui joue un rôle prépondérant sur la capacité d'adhésion. Toutefois il apparaît que les polysaccharides empêcheraient l'adhésion et l'agrégation en masquant les récepteurs des protéines. (Polak-Berecka et al., 2014). L'adhésion peut également être influencée par les conditions de l'environnement (le pH, la concentration de nutriments et la température ; Buntin et al. (2017)), et de l'exposition aux conditions gastro-intestinales qui peuvent stimuler l'adhésion à l'épithélium (Donlan, 2002; Donlan et Costerton, 2002)

Nos observations nous ont amené à considérer la corrélation entre l'autoagrégation à 6h et le taux d'adhésion aux Caco-2. On observe que les souches *Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB430 et *C. perfringens* DSM756 présentent une corrélation entre leurs capacités d'adhésion et les mesures effectuées concernant le phénomène d'autoagrégation. Cette corrélation est définie pour un diagonal comme on peut remarquer sur le graphique. Cependant, chez *Lb. rhamnosus* ATCC 7469 et *Lb. salivarius* ICVB421 il n'existe pas de relation comme montre la **Figure 36**.
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

**Figure 36.** Corrélation entre l'autoagrégation et le taux d'adhésion aux cellules intestinales de la lignée cellulaire Caco-2. Les valeurs représentées sur axe des abscisses le taux d'adhésion, et sur l'axe des ordonnées les données obtenus dans le test d'autoagrégation.

Selon Kos et al. (2003) dans la plupart des cas, la capacité d'agrégation est liée aux propriétés d'adhésion cellulaire. Cependant Vizoso Pinto et al. (2007) ont nuancé quant à eux cette affirmation car si l'autoagrégation est liée à l'adhésion, cette relation n'est peut-être pas exclusive. Li et al. (2015) ne trouvent pour leur part aucune relation entre ces deux propriétés chez les souches bactériennes qu'ils ont étudié.

L'étude de l'adhésion des souches bactériennes aux cellules épithéliales intestinales est de première importance. Celle-ci ne peut se substituer par des approches telles que les tests d'autoagrégation, bien que ceux-ci présentent des avantages de simplicité et de gain de temps. Toutefois ce type d'approche permet une évaluation en première intention pour une présélection des souches candidates probiotiques mais qui nécessitera finalement une confirmation par des tests *in-vitro* et *in-vivo*.

## 4. Innocuité des souches sélectionnées

Bien que les souches de lactobacilles soient communément reconnues comme inoffensives (statut GRAS), elles sont parfois impliquées dans des infections ce qui, dans ce cas de figure, devient problématique. Il est donc impératif de démontrer l'innocuité de chaque nouvelle souche destinée à un usage probiotique. Dans notre travail, l'innocuité des souches sélectionnées a été
évaluée par le test d'hémolyse, l'étude de la résistance aux antibiotiques et l'étude de la cytotoxicité sur modèle *in-vitro* de cellules eucaryotes.

**4.1. Activité hémolytique**

L'activité hémolytique des souches sélectionnées a été évaluée sur gélose au sang de cheval. Dans ce test, une souche est considérée hémolytique, si un halo se forme autour de la colonie suite à la sécrétion d'enzymes qui provoquent la libération de l'hémoglobine à la suite de la destruction des globules rouges II y a trois types d'hémolyse : α, où l'hémoglobine est partiellement dégradée ce qui se traduit sur la gélose au sang par une décoloration verdâtre qui entoure les colonies bactériennes ; β, où l'hémoglobine est totalement dégradée autour des colonies formant des halo translucides ou γ qui corresponds à l'absence d'hémolyse autour des colonies qui ne présentent pas d'halos dans la gélose au sang (Gerhardt et al., 1994). Aucune des souches de *Lactobacillus* testées n'a montré d'activité hémolytique après une lecture à 24, 48 et 72 heures, ce qui corrobore les observations faites lors de nombreuses études qui montrent que les lactobacilles ne sont généralement pas hémolytiques (Abushelaibi et al., 2017; Sha et al., 2016b; Shekh et al., 2016).

**4.2. Résistance aux antibiotiques**

Les souches sélectionnées ont été testées pour leur sensibilité à huit antibiotiques. Les souches ont été classées comme résistantes, intermédiaires ou sensibles selon les référentiels de l'EUCAST (Tableau 28).

*Lb. reuteri* présente de résistances aux antibiotiques comme la pénicilline G, la vancomycine et la ciprofloxacine selon les points critiques établis par l'EUCAST. Wang et al. (2014c) ont démontré que des souches de *Lb. reuteri* isolées de poulet ne présentaient pas de résistance, ou étaient sensibles à l'action des antibiotiques comme la kanamycine, la tétracycline ou l'érythromycine. Les souches de *Lb. reuteri* testées par Klare et al. (2007) présentaient une résistance à la vancomycine, et une sensibilité intermédiaire aux pénicillines et à l'oxytetracycline. La résistance à la clindamycine et ciprofloxacine a été déjà décrit sur *Lactobacillus*. La présence de cette résistance permet son énumération dans de protocoles décrits par les règlements ISO, comme par exemple, « ISO 20128:2006 : Produits laitiers ; Dénombrement de *Lactobacillus acidophilus* présomptifs sur un milieu sélectif ».
<table><caption>**Tableau 28.** Sensibilités des souches Lactobacilles aux antibiotiques</caption><thead><tr><th>Antibiotiques</th><th>Pénicilline G</th><th>Cefotaxine</th><th>Gentamicine</th><th>Vancomycine</th><th>Clindamycine</th><th>Ciprofloxacine</th><th>Tétracycline</th><th>Triméthoprime<br>Sulfamethoxazole</th></tr></thead><tbody><tr><td>Lb. rhamnosus ATCC7469</td><td>I</td><td>R</td><td>S</td><td>R</td><td>S</td><td>R</td><td>S</td><td>R</td></tr><tr><td>Lb. reuteri ICVB416</td><td>R</td><td>S</td><td>S</td><td>R</td><td>-</td><td>R</td><td>S</td><td>-</td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB421</td><td>S</td><td>S</td><td>S</td><td>R</td><td>S</td><td>S</td><td>S</td><td>R</td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB430</td><td>R</td><td>S</td><td>S</td><td>R</td><td>S</td><td>S</td><td>S</td><td>S</td></tr></tbody></table>

Légende. Les lettres affiches signifient **S**: Régime posologique standard et sensible (Un microorganisme est classé dans la catégorie du régime posologique standard sensible, lorsqu'il y a une forte probabilité de succès thérapeutique en utilisant un régime posologique standard de l'agent) ; **I**: Sensible, exposition accrue (Un microorganisme est classé dans la catégorie d'exposition accrue et sensible lorsqu'il y a une forte probabilité de succès thérapeutique parce que l'exposition à l'agent est augmentée en ajustant le schéma posologique ou par sa concentration au site de l'infection) et **R**: Résistant (Un microorganisme est classé comme résistant lorsqu'il y a une forte probabilité d'échec thérapeutique même en cas d'exposition accrue)( http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/). - : non testé.

Les souches de *Lb. salivarius* ICVB421 et ICVB430 sont sensibles à la céfotaxine (famille des β-lactamines), gentamicine (aminoglycosides), clindamycine (lincosamides), ciprofloxacine (fluoroquinolones) et tétracycline. Par ailleurs ces deux souches sont résistantes à la vancomycine, mais elles sont discordantes pour la résistance au triméthoprime-sulfamethoxazole (du groupe des sulfonamides) en étant résistante la souche ICVB421. Par contre la résistance à la pénicilline G est montrée par ICVB430.

Dans cette étude, les souches testées ont montré une résistance à la vancomycine (famille des glycopeptides), qui est décrite comme résistance naturelle chez les lactobacilles (Ammor et al., 2007). La résistance à la vancomycine est liée à la modification du pentapeptide du peptidoglycane qui présente une terminaison D-Alanine/D-Lactate ou D-Alanine/D-serine au lieu de D-Alanine/D-Alanine et, qui par conséquent, ne permet pas la liaison de l'antibiotique à la paroi (Gueimonde et al., 2013).
La résistance aux antibiotiques est un des paramètres importants pour la sélection de candidats probiotiques. Il est cependant utile de rappeler que la résistance en elle-même n'est pas problématique si elle est intrinsèque à la souche, c'est à dire si il s'agit d'une résistance naturelle qui n'a pas été acquise et qui n'est donc pas transférable par des éléments mobiles comme les plasmides, à des autres bactéries, pathogènes ou commensales de l'intestin (Devirgiliis et al., 2013; Hibberd et Davidson, 2008). Ce type de résistance peut même être intéressant lors du traitement d'une infection par la co-administration du probiotique avec l'antibiotique pour rétablir la flore intestinale et éviter des effets secondaires comme les diarrhées dues aux médicaments (Blaabjerg et al., 2017).

D'un autre côté, la présence de gènes de résistance aux antibiotiques codés par des plasmides potentiellement transmissibles présente des risques en raison de la possibilité de transfert horizontal dans les bactéries réceptrices de l'intestin (Mater et al., 2007).

### 4.3. Cytotoxicité envers les cellules eucaryotes de la lignée HT-29

La cytotoxicité a été évaluée pour les trois souches sélectionnées et le témoin *Lb. rhamnosus* ATCC7469 probiotique utilisé chez le porc avec des effets immunomodulateurs et potentialisation de l'intégrité de la barrière (Zhang et al., 2015; Zhu et al., 2014). Deux concentrations bactériennes ont été testées. Une concentration très élevée de 10⁷ UFC/puits, correspondant à un ratio de 1 : 100 (cellule HT-29 : bactéries) et une concentration de 10⁵ UFC/puits, correspondant à la fourchette du MOI (multiple of Infection bactéries/cellules) retrouvée dans différentes études REF. Le ratio est alors de 1 : 1. Un mélange des 3 souches à 10⁷ et 10⁵ UFC total/puit a aussi été testé (il est appelé Mix dans la Figure 37).

Les données obtenues (Figure 37) suggèrent que les souches ICVB430 et ICVB421, qui appartiennent à l'espèce de *Lb. salivarius*, ont un effet cytotoxique quand elles sont ajoutées à une concentration de 10⁷ UFC/puits, et lorsqu'on teste la combinaison des 3 souches. Pour une concentration de 10⁵ UFC/puits, les valeurs montrent que les souches ne présentent pas d'effet cytotoxique sur les cellules HT-29 et par conséquent, la fonction de barrière intestinale des cellules est maintenue en présence de ces probiotiques potentiels. L'effet cytotoxique des bactéries est dû à la forte concentration cellulaire et l'activité métabolique des bactéries, car la viabilité des cellules HT-29 n'est pas perturbée quand elles sont en contact avec 10⁷ bactéries inactivées par chaleur. Ces résultats sont en accord avec ceux décrits par Er et al. (2015) pour lesquels la cytotoxicité de
souches sur les cellules eucaryotes est dépendante de la quantité de bactéries testées influait sur la viabilité cellulaire.

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

**Figure 37.** Viabilité cellulaire (%) de la lignée cellulaire eucaryote HT-29, après 24 h de contact avec les bactéries lactiques. **ICVB416**: *Lb. reuteri* ICVB416; **ICVB421**: *Lb. salivarius* ICVB421; **ICVB430**: *Lb. salivarius* ICVB430. **MIX**: Mélange en volumes égales des trois souches précédentes. **ATCC7469**: *Lb. rhamnosus* souche de référence. **Témoin +**: cellules HT-29 sans ajouts. **Témoin -**: Triton 0,1%.

**5. Description des propriétés technologiques des souches**

Après avoir sélectionné les souches potentiellement probiotiques sur la base de critères fonctionnels et démontré l'innocuité de ces dernières, nous avons évalué quelques aptitudes technologiques dans l'optique d'une production à grand échelle pour une utilisation chez le poulet d'élevage. La survie lors du processus de conservation par lyophilisation a donc été étudiée ainsi que la stabilité du produit dans les conditions de stockage prédéfinies. Enfin, pour les souches devant être administrées aux poulets dans l'eau de boisson, la viabilité des souches a été évaluée en milieu aqueux.
## 5.1. Survie des bactéries à la lyophilisation et conservation sous forme déshydratée

Afin d'avoir un effet probiotique chez le poulet, une grande quantité de bactéries vivantes de l'ordre de $10^8$ UFC/g d'aliment de poulet ou mL d'eau est nécessaire. Pour obtenir des concentrations élevées, nous avons cultivé les souches pendant 24 h à 37°C en milieu MRS enrichi avec du glucose (20g/L), de la peptone (5g/L) et de l'extrait de levure (4g/L) en tamponnant le pH à 6,5. Dans ces conditions, les densités cellulaires varient de $7,25 \cdot 10^9$ UFC/mL à $1,93 \cdot 10^{10}$ UFC/mL (Tableau 29).

Les culots des cultures ont été ensuite lyophilisés avec deux cryoprotecteurs différents : le lait écrémé (20%) et le saccharose (20%). En termes de survie des souches lors de la lyophilisation, une diminution de la population d'environ 1 log a été observée quel que soit le cryoprotecteur ajouté.

<table><caption>Tableau 29. Effet du processus de lyophilisation selon des cryoprotecteurs.</caption><thead><tr><th></th><th>Lb. reuteri<br>ICVB416</th><th>Lb. salivarius<br>ICVB421</th><th>Lb. salivarius<br>ICVB430</th></tr></thead><tbody><tr><td>Biomasse à T<sub>0</sub> (UFC/g)</td><td>1,93 · 10<sup>10</sup></td><td>7,25 · 10<sup>9</sup></td><td>9,58 · 10<sup>9</sup></td></tr><tr><td>Lait d'écrémé (UFC/g)</td><td>1,1 · 10<sup>9</sup></td><td>6,67 · 10<sup>8</sup></td><td>1,14 · 10<sup>9</sup></td></tr><tr><td>Saccharose (UFC/g)</td><td>1,6 · 10<sup>9</sup></td><td>1,3 · 10<sup>9</sup></td><td>1,02 · 10<sup>9</sup></td></tr></tbody></table>

Après leur lyophilisation, les souches ont été stockées à température ambiante pendant 6 mois et la viabilité a été mesurée par dénombrement sur boîte. La **Figure 38** permet d'établir la réduction de la population au cours du temps. La conservation en présence de saccharose présente des diminutions de 1 log alors que souches conservées en présence de lait écrémé perdent 3 log après 80 jours de stockage. En revanche pour les périodes plus longues après 176 jours, le taux de mortalité des souches est indépendant de la méthode de conservation sauf *Lb. reuteri* ICVB416 qui reste stable entre 80 et 176 jours quand elle est conservée dans du lait écrémé.
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 38.** Survie des souches lyophilisées. Les courbes en trait plein représentent les souches lyophilisées dans 20% de saccharose (S). Les courbes en trait discontinu représentent la lyophilisation avec 20% de lait écrémé (L).</figcaption></figure>

## 5.2. Survie des souches de lactobacilles en suspension aqueuse.

Dans les élevages industriels, les probiotiques peuvent être administrés comme supplément dans la nourriture des animaux ou dans l'eau de boisson. L'administration la moins coûteuse est la supplémentation aqueuse si les souches survivent bien dans ce milieu. Le pourcentage de survie des *Lactobacillus* a été établi dans l'eau du réseau et dans du tampon PBS utilisé comme témoin pour évaluer l'effet de la pression osmotique et du chlore. Le **Tableau 30** montre les résultats obtenus après 24 h de contact.

<table><caption>**Tableau 30.** Survie bactérienne (%) après mises en suspensions aqueuses.</caption><thead><tr><th></th><th>Lb. reuteri<br>ICVB416</th><th>Lb. salivarius<br>ICVB421</th><th>Lb. salivarius<br>ICVB430</th></tr></thead><tbody><tr><th>PBS 1X</th><td>93,7 ± 2,3</td><td>97,8 ± 1,8</td><td>97,3 ± 1,8</td></tr><tr><th>H<sub>2</sub>O</th><td>93,7 ± 4,2</td><td>97,6 ± 3,1</td><td>97,7 ± 0,5</td></tr></tbody></table>
Toutes les souches présentent des taux de survie supérieurs à 93,7 %. Après une analyse ANOVA, il n'y a pas de différence significative entre les pourcentages des souches testées en PBS et en eau du réseau. Cela indique que ces souches pourraient être administrées aux poulets par le biais de l'eau de boisson des animaux.

### 5.3. Inhibition croisée des souches de bactéries lactiques

Dans le but de commercialiser un mélange probiotique, le test d'inhibition croisée a été réalisé selon la méthodes des spots de Schillinger et Lücke (1989). 5 µL d'une culture de 18h sont déposés en spot à la surface d'une gélose MRS inondée avec une cible (Figure 39 ci-dessous). Il n'y a pas d'inhibition croisée des souches entre-elles.

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 39.** Test d'activité croisée en spots</figcaption></figure>

Suite aux résultats de cette première analyse, les souches sélectionnées pourraient donc être utilisées en combinaison dans un produit multi-probiotique car il n'y a pas d'antagonismes entre elles.

## 6. Séquençage et analyse des génomes

Les ADNs des 3 souches sélectionnées ont été extraits et ensuite séquencés par les plateformes technologiques Illumina MiSeq et HiSeq 2500 (MicrobesNG, Birmingham, Royaume-Uni). Le logiciel RAST (http://rast.nmpdr.org/) a permis de déterminer la taille du génome et le pourcentage
de G+C. Selon les données obtenues le génome de *Lb. reuteri* présente une taille et un pourcentage de G+C supérieurs à ceux retrouvés pour les souches de *Lb. salivarius* (Tableau 31).

<table><caption>**Tableau 31.** Données génétiques des souches de lactobacilles sélectionnées.</caption><thead><tr><td>Génome</td><td>Taille (pb)</td><td>%G+C</td><td>RNA total</td><td>Nombre de séquences de codage</td></tr></thead><tbody><tr><td><i>Lb. reuteri</i> ICVB416</td><td>2 120 802</td><td>38,5</td><td>80</td><td>2249</td></tr><tr><td><i>Lb. salivarius</i> ICVB421</td><td>1 944 585</td><td>33,3</td><td>71</td><td>1999</td></tr><tr><td><i>Lb. salivarius</i> ICVB430</td><td>1 902 367</td><td>33,0</td><td>68</td><td>1891</td></tr></tbody></table>

L'étude des génomes nous a permis de réaliser une analyse *in silico* des propriétés fonctionnelles démontrées durant les expériences décrites précédemment.

## 6.1. Recherche de gènes codant des molécules antibactériennes putatives

Les génomes des souches sélectionnées ont été analysées *in silico* grâce au logiciel en ligne antiSMASH (https://antismashLA secondary metabolites.org). Ce logiciel permet la détection de gènes en relation avec les métabolites secondaires produits par les bactéries et permet d'identifier les substances bioactives potentiellement produites par les souches considérées (Weber et al., 2015). Les souches de *Lb. salivarius* ICVB421 et ICVB430 possèdent dans leur génome un gène « ressemblant » à celui codant la bactériocine Abp118 de *Lb. salivarius* UCC118 (Corr et al., 2007) avec 18% de similarité seulement (Figure 40).

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 40.** Prédiction de la présence de gènes de bactériocines dans les génomes des souches de *Lactobacillus salivarius*.</figcaption></figure>

En revanche, l'analyse des 2 génomes de *Lb. salivarius*, à l'aide du logiciel en ligne BAGEL3 (http://bagel.molgenrug.nl/index.php/main) qui permet l'identification de gènes codant pour des bactériocines ou des peptides bactéricides modifiés ou non au niveau post-traductionnel (van Heel et al., 2013) a permis de prédire la présence de deux possibles gènes de bactériocines dans les
génomes. Ces gènes sont ceux d'une bactériocine de type III (entérolysine A) (Figure 41) et d'une bactériocine de type IIb (bactériocine LS2) (Figure 42).

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 41.** Gène putatif de l'entérolysine A dans les génomes des souches de *Lactobacillus salivarius*.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 42.** Gènes potentiels codant la synthèse de la bactériocine LS2 dans les génomes de *Lactobacillus salivarius*.</figcaption></figure>

Lb. reuteri ICVB416 quant à elle ne possède pas le gène de la reutérine, ce qui a été par la suite confirmé par l'analyse du génome à l'aide des logiciels Anti-SMASH et BAGEL3.

## 6.2. Recherche moléculaire des propriétés d'innocuité

### 6.2.a. Facteurs de virulence

Pour la prédiction des facteurs de virulence dans le génome, une analyse *in silico*, a été faite par RAST. Pour aboutir à prédire ces facteurs, plusieurs stratégies de détection des marqueurs ont été suivies :

(i) recherche d'homologie avec les gènes déjà décrits,
(ii) identification de facteurs de virulence parmi les gènes acquis de façon horizontale,

(iii) comparaison avec des génomes de souches pathogènes ou non.

La même méthodologie est utilisée pour à prédire la résistance aux antibiotiques (Bakour et al., 2016).

Parmi les souches analysées, RAST n'a trouvé aucun gène de virulence dans les génomes. Ceci correspond aux résultats donnés par le CGE (https://cge.cbs.dtu.dk//) qui donne en plus la probabilité que la bactérie analysée soit pathogène pour les êtres humains. Dans cette analyse, *Lb. reuteri* ICVB416 présente un score de probabilité de 0,091, *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430 un score de 0,065. L'absence de gènes de virulence est conforme à l'étude réalisée par Bennedsen et al. (2011), dans laquelle les auteurs ont analysé les génomes de 16 lactobacilles à la recherche de facteurs de virulence sans en trouver aucun.

## 6.2.b. Gènes de résistance aux antibiotiques

Comme expérimentalement établi, les 3 souches présentent des résistances à quelques antibiotiques. Les 2 souches de *Lb. salivarius*, présentent de gènes de résistance par exemple aux fluoroquinolones. Les souches portent également des gènes impliqués dans les mécanismes de résistance non-spécifique comme les pompes à efflux impliquées dans la multi-résistance aux médicaments aussi appelés transporteurs multi-drugs comme le MATE. Il s'agit de transporteurs secondaires qui utilisent l'énergie des gradients d'ions ou de substrat-produit pour l'expulsion des composés cytotoxiques comme les médicaments (Gueimonde et al., 2009; Poolman et Konings, 1993). RAST et Blastx montrent que *Lb. salivarius* ICVB421 possède un transporteur de flux de la famille MATE et un autre transporteur impliqué dans la multirésistance ; une protéine de transport de type ABC à ATP. En ce qui concerne *Lb. salivarius* ICVB430, seule la protéine de la famille d'efflux MATE est présente.

*Lb. reuteri* ICVB416 présente une résistance spécifique à la tétracycline et aux fluoroquinolones. Il n'est pas étonnant de retrouver les gènes de résistance à la tétracycline dans cette souche, car ces gènes sont les plus répandus dans les lactobacilles (Ammor et al., 2007). La souche possède également des gènes codant pour des pompes à efflux impliquées dans la multi-résistance aux médicaments aussi appelés transporteurs multi-drugs.

La présence de gènes de résistance aux antibiotiques n'est pas obligatoirement synonyme de risque car celui-ci n'apparaît que quand la résistance est transférable (Gueimonde et al., 2013). Il
a été démontré que lorsque les lactobacilles portent des éléments transférables, l'administration orale présente un risque potentiel, car le tractus gastro-intestinal est une niche écologique connue pour être un terrain favorable aux transferts horizontaux. En effet, dans le tractus gastro-intestinal :

(i) la quantité de microorganismes est extrêmement élevée favorisant ainsi les interactions microbiennes et générant un immense réservoir de gènes de résistances aux antibiotiques

(ii) les conditions hostiles comme le pH, les sels biliaires, la concurrence, les facteurs de défense de l'hôte (peptides antimicrobiens), ou l'immunité et stimulent l'adaptation (Mater et al., 2007; Zeng et Lin, 2017)

Cependant, nous n'avons pas retrouvé des éléments transposables ou de plasmides transférables dans les souches séquencées.

### 6.2.c. Gènes de résistance aux autres composants toxiques

Les 3 souches présentent des gènes permettant la mise en place de mécanismes de résistances au mercure, au cuivre, au cadmium, au cobalt et au zinc. Elles portent aussi le gène de la BSH qui permet l'hydrolyse de la bile. La présence de ce gène peut être une caractéristique souhaitable chez un probiotique car elle permet de multiplier les effets bénéfiques notamment sur la survie dans les conditions drastiques du tractus digestif, et par conséquence induire des effets positifs sur la santé chez l'hôte. D'autres mécanismes, incluant des systèmes à deux composants et les transporteurs multidrugs interviennent dans le processus de survie à la bile par l'élimination active des composés biliaires des cellules (Koskenniemi et al., 2011).

### 6.2.d. Présence de gènes du système CRISPR

Seules les souches de *Lb. salivarius* présentent des gènes associés au système CRISPR qui permet la défense contre de l'ADN étranger.

### 6.3. Caractérisation prédictive du métabolisme des souches
L'étude des souches sélectionnées ainsi que celle de leurs génomes montre qu'elles possèdent
la machinerie permettant d'utiliser différents hydrates de carbone. Chez *Lb. reuteri* ICVB416, on
retrouve les gènes impliqués dans la fermentation de monosaccharides (D-ribose, xylose, L-
arabinose, D-gluconate et cetogluconates, D-galactarate, D-glucarate et D-glycerate) et de
disaccarides (saccarose, lactose et galactose). Cette souche possède également les gènes
intervenant dans l'utilisation du lactate et le métabolisme du glycérol. Elle peut produire de l'acide
lactique, comme nous l'avons démontré expérimentalement, mais présente aussi les gènes
impliqués dans le mécanisme de fermentation de l'acetyl-CoA en butyrate, ainsi que les gènes du
métabolisme de l'acétoine et butane diol.

Concernant les souches de *Lb. salivarius* ICVB421 et ICVB430: elles sont pourvues de l'ensemble des déterminants permettant l'utilisation des sucres aminés, comme la chitine et la N-acétylglucosamine. Ces souches sont également capables de croître en utilisant le fructose, le D-ribose et le mannose, le saccharose, le lactose et le galactose. En outre, elles peuvent également métaboliser le lactate.

**6.4. Prédiction des capacités probiotiques**

Comme il a été décrit précédemment, les capacités probiotiques d'agrégation, d'adhésion et de
formation de biofilm sont liées. Nos recherches *in-silico* nous ont permis de rechercher les
mécanismes pour lesquelles les bactéries sélectionnées pourraient présenter un intérêt.

L'analyse à l'aide du logiciel RAST suggère la présence de facteurs d'agrégation. Les fragments
génomiques ont été analysés par BLASTp qui a identifié des protéines possédant des domaines
LysM de liaison au peptidoglycane. Ces protéines présentent des homologies avec des APFs et
peuvent être ancrées dans l'enveloppe cellulaire par ces domaines LysM (Goh et Klaenhammer,
2010 ; Kang et al., 2017). Dans le génome des souches ICVB421 et ICVB430, il y a des séquences
qui présentent 98% de similarité avec la protéine peptidase M23B capable de se lier avec le
peptidoglycane (Kang et al., 2017). En revanche, aucun gène codant pour des protéines de la
couche S (slpA) ou pour des facteurs comme AggLb ou AggE n'a été trouvé. Toutefois, *Lb. reuteri*
ICVB416, même si elle ne présente pas le gène *slpA*, elle présente le gène codant pour AggH
impliqué dans l'agrégation bactérienne cellule-cellule (Roos et al., 1999).

En ce qui concerne l'adhésion, les trois souches portent le gène de sortase (*srtA*) qui code pour
une protéine importante dans les interactions avec le mucus (Lebeer et al., 2008).
Les souches de *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430 ont au niveau de leurs génomes des gènes codant pour une protéine de liaison à la fibronectine : *LSL_0873*, et le gène responsable de la liaison au mucus *mbp2*. Le gène *mbp3* n'a pas été trouvé. *Lb. reuteri* ICVB416 présente le gène *Lreu_0932* responsable de la liaison à la fibronectine.

Aucune des trois souches ne présentent ni le gène *mub* qui a été décrit pour ses propriétés de liaison au mucus et d'agrégation (Mackenzie et al., 2010), ni le gène *msa* qui est responsable de la synthèse d'une adhésine à mannose présente dans les récepteurs des cellules épithéliales et qui favorise l'adhésion à l'intestin (Gross et al., 2010).

**6.5. Prédiction des capacités technologiques**

Selon l'analyse des génomes par le logiciel RAST, les souches présentent des gènes de réponse au stress oxydatif mais aussi au stress osmotique. Cela peut être corrélé avec la survie de ces souches quand elles ont été testées pour leur viabilité dans l'eau.

**7. Test in vivo**

Afin d'étudier l'effet bénéfique des souches sélectionnées et caractérisées *in vitro*, un test *in vivo* a été réalisé. Les expériences *in vivo* se sont déroulées pendant 17 jours sur 240 poulets (30 par condition expérimentale). Durant les essais, les souches de *Lactobacillus* ont été administrées seules (*Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 ou *Lb. salivarius* ICVB430), par binôme (*Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB421; *Lb. reuteri* ICVB 416 et *Lb. salivarius* ICVB 430) et tous les trois ensembles par gavage une fois par jour, puis aux jours 1 et 2, et jours 10 au 13. Il y a un seul groupe qui manque, c'est celui de *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430, en cherchant développer un probiotique « multistrain » et en augmentant le nombre d'échantillons par traitement. Une souche de *C. perfringens* décrite comme agent causal de l'EN a été administrée à raison de $10^7$ UFC durant les jours 14, 15 et 16 dans les lots de poulets ayant été gavés avec les bactéries lactiques et dans un lot témoin sans ajoutes de probiotiques (Cp). Un lot non gavé et non vacciné faisant office de lot témoin (NCp). Ces conditions sont récapitulées dans le **Tableau 32** (ci-dessous).
<table><caption>**Tableau 32.** Conditions testées *in vivo* (expérimentation animale).</caption><thead><tr><th>Jour d'essai</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th><th>11</th><th>12</th><th>13</th><th>14</th><th>15</th><th>16</th><th>17</th></tr><tr><th>Régime</th><td colspan="8">Régime démarreur</td><td colspan="8">Régime de croissance</td></tr></thead><tbody><tr><th>Vaccination</th><td>A</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>B</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th>Lactobacillus</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th>C. perfringens</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th>Mesures</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

(A) vaccin *Advent@9X*, (B) VACCIN Intervet, Bursal Vac-G603 contre la bursite infectieuse aviaire

## 7.1. Essai de croissance ou performance zootechnique pendant la phase de démarrage.

Cette partie de l'essai avait comme but de déterminer si l'administration des souches, ou des mélanges de souches, peut favoriser les performances zootechniques des poulets sains. Les lactobacilles ont été administrés dans deux périodes décrites comme étant crucales pour l'éventuelle installation des probiotiques dans le microbiote du poulet; ce sont : (i) les premiers jours de vie, pour cette raison l'apport des *Lactobacillus* a été fait les jours 1 et 2. L'échantillon a été pris le 10ème jour, pour savoir si les souches sont implantées et par conséquence, si elles ont des effets sur le poids des poulets. (ii) l'apport de souches après le changement de régime, c'est-à-dire, les 10, 11, 12, 13èmes jours. La mesure du poids et la consommation alimentaire au 14ème jour a permis de rechercher un bénéfice suite à l'administration des différents traitements probiotiques. Les résultats obtenus jusqu'au 14ème jour sont donnés dans le **Tableau 33**. L'indice de consommation ou FCR est défini comme étant la quantité d'aliments ingérée en kg par kg de gain de poids chez les poulets en termes de gain moyen quotidien de poids vif et d'ingéré alimentaire quotidien. Cette mesure présente un intérêt économique majeur car 70% du coût total de la production est dû uniquement au coût des aliments pour animaux. Il a été recherché une amélioration du FCR, car il augmentera sensiblement la marge bénéficiaire dans les élevages (Sarangi et al., 2016).
<table><caption>**Tableau 33.** Effets sur le poids vif des poulets, la consommation alimentaire et la FCR (Feed Conversion Ratio) après supplémentation des *Lactobacillus*.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">Poids moyen par oiseau (g)</th><th colspan="2">Consommation alimentaire moyenne par oiseau (g)</th><th colspan="2">FCR</th></tr><tr><th>J10</th><th>J14</th><th>J0-J10</th><th>J10-J14</th><th>J0-J10</th><th>J10-J14</th></tr></thead><tbody><tr><td>Témoin (sans ajouts)</td><td>320,4 ± 12,8 <sup>B</sup></td><td>547,4 ± 22,2 <sup>AB</sup></td><td>311,50 ± 9,9 <sup>AB</sup></td><td>280,21 ± 10,3</td><td>1,117 ± 0,02 <sup>AB</sup></td><td>1,236 ± 0,04 <sup>AB</sup></td></tr><tr><td>Lb. reuteri ICVB 416</td><td>317,9 ± 10,7<sup>B</sup></td><td>544,8 ± 24,8 <sup>AB</sup></td><td>305,50 ± 12,3 <sup>AB</sup></td><td>275,63 ± 12,3</td><td>1,123 ± 0,02 <sup>AB</sup></td><td>1,217 ± 0,05 <sup>B</sup></td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB 421</td><td>329,8 ± 8,4 <sup>AB</sup></td><td>564,6 ± 17,9<sup>A</sup></td><td>314,17 ± 10,1 <sup>AB</sup></td><td>285,42 ± 9,0</td><td>1,127 ± 0,01 <sup>AB</sup></td><td>1,217 ± 0,04 <sup>B</sup></td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB 430</td><td>326,9 ± 17,4 <sup>AB</sup></td><td>555,4 ± 22,9 <sup>AB</sup></td><td>316,33 ± 14,7 <sup>A</sup></td><td>282,08 ± 12,6</td><td>1,130 ± 0,02 <sup>A</sup></td><td>1,234 ± 0,04 <sup>AB</sup></td></tr><tr><td>ICVB 416 + ICVB 421</td><td>320,2 ± 9,2 <sup>AB</sup></td><td>543,4 ± 20,1 <sup>AB</sup></td><td>303,17 ± 9,4 <sup>B</sup></td><td>273,75 ± 7,8</td><td>1,109 ± 0,03 <sup>AB</sup></td><td>1,229 ± 0,02 <sup>AB</sup></td></tr><tr><td>ICVB 416 + ICVB 430</td><td><strong>334,1 ± 15,06 <sup>A</sup></strong></td><td>566,5 ± 20,0 <sup>A</sup></td><td>314,67 ± 9,1 <sup>AB</sup></td><td>284,38 ± 9,8</td><td>1,098 ± 0,03 <sup>B</sup></td><td>1,223 ± 0,04 <sup>AB</sup></td></tr><tr><td>ICVB 416 + ICVB 421 + ICVB 430</td><td>320,9 ± 12,3 <sup>AB</sup></td><td>536,7 ± 16,0<sup>B</sup></td><td>304,79 ± 8,4 <sup>AB</sup></td><td>274,58 ± 8,7</td><td>1,125 ± 0,04 <sup>AB</sup></td><td>1,274 ± 0,05 <sup>A</sup></td></tr></tbody></table>

J0-J10 : du 1er au 10ème jour ; J10-J14 : du 10ème au 14ème jour. Les lettres en index montrent de différences significatives. Les groupes qui possèdent la même lettre ne sont pas différent significativement. **Témoin sans ajouts** : Groupe témoin non supplémenté en lactobacilles. *Lb. reuteri ICVB 416* : supplémenté en lactobacille ; *Lb. salivarius ICVB 421* : supplémenté en lactobacille ; *Lb. salivarius ICVB 430* : supplémenté en lactobacille ; *ICVB 416 + ICVB 421* : supplémenté en mélange de *Lb. reuteri ICVB416* et *Lb. salivarius ICVB 421* ; *ICVB 416 + ICVB 430* : supplémenté en mélange de *Lb. reuteri ICVB416* et *Lb. salivarius ICVB 430* ; *ICVB 416 + ICVB 421 + ICVB 430* : supplémenté en mélange de *Lb. reuteri ICVB416*, *Lb. salivarius ICVB 421* et *Lb. salivarius ICVB 430*.
L'administration des *Lactobacillus* seuls ou en mélange dans les deux premiers jours de vie n'influence ni le poids ni la consommation d'aliments des poulets (il n'y a pas de différences significatives entre les groupes). En ce qui concerne les mesures faites au jour 10 dans tous les traitements sauf quand les animaux ont été traité avec *Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB430, qui ont présenté un poids significativement supérieur que celui du témoin. Ceci diffère des études de Blajman et al. (2017) qui montrent des différences significatives entre le groupe témoin et le groupe nourrit avec une souche probiotique, *Lb. salivarius* DSPV 001P. Cependant dans l'étude de Blajman et al. (2017), le probiotique est administré quotidiennement dans l'aliment alors que lors de notre expérience, l'apport des probiotiques potentiels est réalisé d'une manière discontinue. Ehrmann et al. (2002) ont quant à eux établi que *Lb. salivarius* TMW1.992, une souche à potentiel probiotique, est capable de survivre et de persister dans le tractus gastro-intestinal des volailles (Ehrmann et al., 2002).

Les mêmes résultats (pas de gain de poids, ni d'augmentation de la consommation alimentaire) sont également retrouvés dans la 2ème période de tests sur les oiseaux (jours 10 à 14). Selon Oakley et al. (2014) les effets des probiotiques sont plus visibles quand ceux-ci sont administrés dans les premiers jours de vie (où le microbiote initial est en cours de développement). Les auteurs estiment que l'efficacité des probiotiques peut apparaître aussi après un changement de régime ou une perturbation dus au stress ou à la consommation d'antibiotique par exemple. Cependant, Peng et al. (2016) montrent qu'une souche de *Lb. plantarum*, désignée B1, présente les meilleurs effets quand elle est administrée pendant toute la période de l'essai ou en fin d'essai (du jour 22 au 42). D'autres études quant à elles semblent indiquer l'absence d'effets significatifs sur les performances des animaux lorsqu'ils sont traités avec des probiotiques, comme le montre Nakphaichit et al. (2011) pour la souche *Lb. reuteri* KUB-AC5 ou Ashayerizadeh et al. (2011) avec le probiotique Primalac (*Lb. casei*, *Lb. acidophilus*, *Bifidobacterium thermophilum* et *Ent. faecium*) Ces écarts sont en partie dus à la souche de *Lactobacillus* choisie, la posologie, la méthode de préparation et l'état des animaux (Brisbin et al., 2011).

Par ailleurs il a été démontré que l'effet d'un probiotique est lié aux nombres de germes qui arrivent vivants dans l'intestin (Minelli et Benini, 2008; Ouwehand, 2017). L'effet de la concentration de probiotique a été décrit par Mountzouris et al. (2010) qui soulignent l'importance de la quantité de probiotiques administrée pour maximiser leur efficacité. Les souches probiotiques
ont d'autre part besoin d'une administration constante pour montrer des effets surtout quand l'environnement, ou l'écosystème, où ils sont implantés est développé et complexe (Grazul et al., 2016).

Les différences observées pour l'impact des probiotiques sur la prise de poids peuvent être également liées à la composition des microbiotes chez les volailles lors des essais indépendants, même lorsque les conditions sont soigneusement contrôlées et strictement identiques d'un essai à l'autre (Kers et al., 2018). Les microbiotes sont façonnés par des facteurs biologiques intrinsèques chez les hôtes (facteurs maternelles, races), mais également par des facteurs environnementaux comme la localisation, la litière, la température, l'hygiène (Brooks et al., 2015; Kers et al., 2018; Laukens et al., 2015).

Des effets favorisant la colonisation précoce des bactéries bénéfiques ont été trouvés après une administration *in ovo*, la base de cette technique est d'inoculer les probiotiques dans le liquide amniotique de l'œuf pour qu'ils soient le premier aliment de l'animal (Ferket, 2006). L'administration *in ovo* peut se traduire en la potentialisation du développement et le maintien d'une bonne santé intestinale (Roto et al., 2016). L'administration de ces bactéries au moment précis peut favoriser l'implantation du probiotique dans le microbiote du poussin.

## 7.2. Effet des souches sur l'entérite nécrotique.

Le but de cette partie de l'essai était d'étudier l'effet préventif de l'administration des probiotiques sur le développement de l'entérite nécrotique.

Les *Lactobacillus* ont été administrés aux 10, 11, 12 et 13<sup>emes</sup> jours. Au 14<sup>eme</sup> jour, tous les lots sauf le témoin négatif ont été infectés par *C. perfringens*. Les mesures effectuées au 17<sup>eme</sup> jour ont permis de chercher l'effet des lactobacilles comme agent préventif contre l'entérite nécrotique, pour cela des mesures de poids et la recherche des lésions nécrotiques au niveau de l'intestin des poulets (Tableau 34). Les lésions macroscopiques ont été mesurées dans les 8 traitements, et définies comme indiqué sur la **Figure 43**.
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>A) Lésion score 1</figcaption></figure>

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>B) Lésion score 2</figcaption></figure>

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Panel C.1</figcaption></figure>

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Panel C.2</figcaption></figure>

<caption>C) Lésion score 3</caption>

**Figure 43.** Lésions de l'entérite nécrotique (Score 1 : l'intestin est fin et friable ; Score 2. La photo montre l'intestin mince et friable avec une petite tache de nécrose (cercle jaune). Il y a aussi des rougeurs dans le tractus intestinal, et un peu de mucus gris qui en est caractéristique; de score 3 : l'intestin montre une lésion plus grande visible à travers la paroi extérieure du tractus intestinal. Il y a des taches de nécrose plus grandes (cercle et flèches orange), qui sont les zones vertes tachées par la bile. Le panel C.1 montre le tube fermé et le panel C.2 indique le tube ouvert et exposé face interne au-dessus)
<table><caption>**Tableau 34.** Lésions intestinales. Pourcentages de mortalité, poids des animaux, FCR trouvés au 17ème jour de l'essai.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="4">Score de lésions</th><th rowspan="2">Moyenne de score de lésion</th><th rowspan="2">Poids à 17 j</th><th rowspan="2">FCR</th><th rowspan="2">% mortalité</th></tr><tr><th>0</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th></tr></thead><tbody><tr><td>NCp</td><td>9</td><td>9</td><td>6</td><td>0</td><td>0,88 ± 0,8<sup>C</sup></td><td>765,00 ± 33,7<sup>a</sup></td><td>1,225 ± 0,02<sup>B</sup></td><td>0 ± 0</td></tr><tr><td>Cp</td><td>5</td><td>4</td><td>9</td><td>6</td><td>1,67 ± 1,09<sup>AB</sup></td><td>699,58 ± 35,2<sup>c</sup></td><td>1,245 ± 0,04<sup>AB</sup></td><td>8.33 ± 12,9</td></tr><tr><td>Lb. reuteri ICVB 416</td><td>4</td><td>12</td><td>5</td><td>3</td><td>1,29 ± 0,91<sup>BC</sup></td><td>709,79 ± 62,3<sup>bc</sup></td><td>1,255 ± 0,05<sup>AB</sup></td><td>8.33 ± 20,41</td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB 421</td><td>0</td><td>8</td><td>12</td><td>4</td><td>1,83 ± 0,70<sup>A</sup></td><td>744,58 ± 45,7<sup>abc</sup></td><td>1,244 ± 0,04<sup>AB</sup></td><td>4.17 ± 10,21</td></tr><tr><td>Lb. salivarius ICVB 430</td><td>2</td><td>11</td><td>8</td><td>3</td><td>1,50 ± 0,83<sup>AB</sup></td><td>707,50 ± 61,4<sup>bc</sup></td><td>1,277 ± 0,05<sup>A</sup></td><td>12.5 ± 20,91</td></tr><tr><td>ICVB 416 + ICVB 421</td><td>0</td><td>12</td><td>8</td><td>4</td><td>1,67 ± 0,76<sup>AB</sup></td><td>713,75 ± 34,9<sup>abc</sup></td><td>1,241 ± 0,02<sup>AB</sup></td><td>4.17 ± 10,21</td></tr><tr><td>ICVB 416 + ICVB 430</td><td>4</td><td>16</td><td>4</td><td>0</td><td><strong>1,00 ± 0,59<sup>C</sup></strong></td><td><strong>753,13 ± 36,9<sup>ab</sup></strong></td><td>1,232 ± 0,03<sup>AB</sup></td><td>8.33 ± 12,90</td></tr><tr><td>ICVB 416 + ICVB 421 + ICVB 430</td><td>1</td><td>10</td><td>10</td><td>2</td><td>1,56 ± 0,73<sup>AB</sup></td><td>710,35 ± 39,6<sup>bc</sup></td><td>1,250 ± 0,03<sup>AB</sup></td><td>12.5 ± 13,69</td></tr></tbody></table>

Les lettres en index montrent de différences significatives. Les groupes qui possèdent la même lettre ne sont pas diffèrent significativement. **NCp** : Groupe témoin non supplémenté en lactobacilles et non challengé avec *C. perfringens*. **Cp** : Groupe témoin positif, non supplémenté en lactobacilles et challengé à partir du jour 14 avec *C. perfringens* ; **Lb. reuteri ICVB416** : supplémenté en lactobacille et challengé ; **Lb. salivarius ICVB 421** : supplémenté en lactobacille et challengé ; **Lb. salivarius ICVB 430** : supplémenté en lactobacille et challengé ; **ICVB 416 + ICVB 421** : supplémenté en mélange de *Lb. reuteri ICVB416* et *Lb. salivarius ICVB 421* et challengé ; **ICVB 416 + ICVB 430** : supplémenté en mélange de *Lb. reuteri ICVB416* et *Lb. salivarius ICVB 430* et challengé. **ICVB 416 + ICVB 421 + ICVB 430** : supplémenté en mélange de *Lb. reuteri ICVB416*, *Lb. salivarius ICVB 421*, et *Lb. salivarius ICVB 430* et challengé.
Des différences significatives dans les mesures du poids des poulets après traitements sont apparues après l'infection par *C. perfringens*. En effet, le groupe traité avec le mélange de *Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB430 présente des poids similaires (753,13g) à ceux du groupe de poulet non challengés (765g) et ils sont significativement différents du groupe infecté (699,58g). Un effet significativement différent se trouve dans le score de lésion car ce groupe présente un nombre réduit de lésions dans l'intestin (**Tableau 33**): les souches *Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB430 sont synergiques et diminuent les lésions de l'intestin, c'est-à-dire, que l'effet qu'a *Lb. reuteri* ICVB416 sur les lésions quand il est inoculé sur les poulets d'une façon individuelle est augmenté par l'ajout de *Lb. salivarius* ICVB430 générant des différences significatives dans la mesure de ce paramètre.

Concernant le reste des traitements testés, il n'y a pas de différences significatives avec le témoin challengé avec *C. perfringens*, sauf la supplémentation avec *Lb. salivarius* ICVB421 dans les poulets challengés qui aggrave les lésions de l'EN. Il a été décrit que tous les BL n'ont pas d'effets probiotiques chez l'animal. Certains n'entraînent aucun changement comme mentionné ci-dessus, mais d'autres peuvent même avoir des effets néfastes sur l'animal. Même si ce phénomène n'a pas été décrit très souvent. Par exemple Oliveira et Widmer (**2018**) démontrent que l'administration d'un probiotique multi-souche à base de *Lactobacillus*, *Bifidobacter*, et *Strep. thermophilus* favorise l'implantation de *Cryptosporidium*.

La supplémentation avec *Lb. salivarius* ICVB430 génère de plus hautes valeurs de FCR ce qui se traduit par une diminution de la performance de l'animal car il faudra que l'animal consomme plus d'aliments pour qu'il gagne du poids corporel. Pour ce qui est du paramètre de la mortalité, celle-ci a été retrouvée dans tous les groupes challengés présentent des mortalités aux niveaux de 4,17 à 12,5% cependant ces pourcentages n'ont pas de différences significatives par rapport au groupe témoin (NCp).

En résumé les données obtenues durant cet essai *in vivo* montrent que le traitement le plus performant est celui qui utilise le mélange de *Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB430. Cet effet synergique, entre deux ou plusieurs souches probiotiques, a été déjà décrit dans la littérature. Par exemple, la combinaison de *Lb. reuteri* LM1 et *Lb. salivarius* LM2 est efficace contre la spirochétose intestinale aviaire (**Mappley et al., 2011**). Carter et al. (**2017**) ont démontré l'effet protecteur exercé par la combinaison de *Lb. salivarius* 59 (à 5 · 10⁷ UFC/mL) et d*'Ent. faecium* PXN33 en réduisant la colonisation de *Salmonella enterica* subsp. *enterica* Enteritidis S1400 chez
les poussins. Casarin Penha Filho et al. (2015) ont montré l'effet d'une solution probiotique à base de *Lactobacillus* (1·10⁵ UFC) sur la réduction de la colonisation par *Salmonella* lorsque cette souche était fournie aux poussins âgés de 1 à 7 jours.

Gérard et al. (2008) ont indiqué que certains lactobacilles sont particulièrement efficaces contre *C. perfringens*. Ainsi ils ont relevé une diminution de la population de *C. perfringens* dans les caeca après le traitement par *Lactobacillus* spp. Des résultats similaires ont été obtenues par Kizerwetter-Świda et Binek (2009) en utilisant *Lb. salivarius* 3d ; Geier et al. (2010) avec *Lb. johnsonii* qui réduisait le score des lésions intestinales et le FCR, mais qui n'a pas diminué la mortalité des poulets infectés ; ou Li et al. (2018) qu'après la supplémentation de *Lb. acidophilus* LAP5 dans le régime alimentaire ils ont constaté des améliorations sur la prise de poids et les taux de mortalité. Des probiotiques à base de *Lactobacillus* ont déjà été proposés comme traitement préventif de l'EN. C'est le cas de *Lb. johnsonii* FI9785 qui en étant administré à des concentrations de 1 · 10⁹ UFC réduit l'étendue de la colonisation et la persistance de *C. perfringens* chez les poussins de 20 jours (La Ragione et al., 2004) ou *Lb. johnsonii* BS15 qui présente des bénéfices chez les poulets atteints d'EN subclinique. *Lb. johnsonii* BS15 améliore le développement intestinal et la digestion, ajuste la microflore intestinale en diminuant le ratio *Firmicutes/Bacteroidetes* pour empêcher les réductions de poids typique de l'EN subclinique car les *Bacteroidetes* sont considérées comme le principal groupe de bactéries favorisant l'utilisation des glucides (Qing et al., 2017).

D'autres *Lactobacillus* comme *Lb. fermentum* 1.2029, présentent des effets comme la réduction de la gravité des lésions de l'EN chez les poulets en régulant la réponse immunitaire de la muqueuse intestinale et en atténuant l'inflammation en modifiant les niveaux d'expression d'interleukine-10, interféron-γ et TLR2 (Cao et al., 2012).
# Conclusion générale
L'objectif de cette étude était d'isoler et de caractériser des bactéries potentiellement probiotiques pour prévenir, voire soigner, l'entérite nécrotique du poulet. Les souches candidates ont été isolées à partir de caeca de poulets sains élevés dans la région des Hauts-de-France. De nombreuses expériences *in vitro* ont été réalisées pour sélectionner les souches montrant l'effet antagoniste avec un potentiel probiotique afin de les tester *in vivo*.

L'étude a commencé avec 70 isolats de bactéries lactiques provenant de 3 poulets de chair sains, obtenus d'une ferme de la région des Hauts-de-France. L'identification par spectrométrie de masse MALDI-TOF a montré que les bactéries prédominantes dans l'échantillon appartenaient aux espèces *Lb. reuteri* (32 souches) et *Lb. salivarius* (30 souches) et dans une moindre mesure à d'autres espèces comme *Lb. gallinarum*, *Lb. gasseri*, *Lb. johnsonii* et *Lb. antri*. Les streptocoques isolés appartiennent aux espèces *Strep. lutetiensis* et *Strep. alactolyticus*. La technique de PCR-RAPD a permis d'établir les proximités génétiques entre les espèces de lactobacilles isolées durant cette étude. Ainsi, grâce à cette technique de PCR-RAPD, les profils en doublons ont pu être éliminés. Par application de cette méthode et d'autres critères, la suite de l'étude a porté sur 14 souches de *Lb. reuteri* et 28 souches *Lb. salivarius*.

Plusieurs critères ont été retenus afin de caractériser les souches ainsi identifiées. D'abord, un premier critère basé sur le potentiel antagoniste notamment par la présence d'une activité anti-*C. perfringens* a été jugé prépondérant. L'antagonisme révélé est essentiellement attribué à la production d'acide lactique ainsi les souches produisant des quantités comprises entre 4,65 et 15,4 g/L ont été retenues. Le troisième critère utilisé pour affiner cette sélection est la capacité de ces souches à former des biofilms, à l'instar de ceux formés par les bactéries pathogènes. L'interprétation statistique de la capacité des souches à former des biofilms a mis en relief les souches appartenant à l'espèce *Lb. salivarius* par rapport à celles de *Lb. reuteri*. A l'issu de ce criblage, seules 13 souches ont été favorablement jugées pour la suite des analyses ; il s'agissait de *Lb. reuteri* ICVB412, ICVB413, ICVB414, ICVB415, ICVB416, ICVB417, ICVB418 et ICVB493 et *Lb. salivarius* ICVB419, ICVB421, ICVB423 et ICVB430.

Les souches ainsi choisies ont été ensuite testées aux conditions mimant l'environnement gastro-intestinal du poulet. De la même manière, elles ont été analysées pour leur capacité de résistance aux conditions de pH acide, à la présence de bile et de plusieurs enzymes digestives. La survie bactérienne a été réalisée par dénombrement classique sur boites de Pétri et par la technique de
cytométrie en flux. Les capacités d'agrégation (auto et coagrégation) et l'innocuité des souches (analyse de l'activité hémolytique) ont été ensuite établies lors d'un deuxième criblage. A ce stade 3 souches ont été sélectionnées dont *Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430 qui ont été retenues pour une analyse *in vivo*.

L'innocuité de *Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430 a été confirmée par l'évaluation de leur cytotoxicité sur cellules épithéliales intestinales de la lignée HT-29 et par la recherche de la résistance aux antibiotiques. Les résultats ont montré l'absence de cytotoxicité de ces trois souches à des concentrations de 10⁵ UFC/mL. Toutefois, elles présentent des résistances chromosomiques intrinsèques à certains antibiotiques comme la vancomycine.

Les capacités d'adhésion de souches ont été également évaluées. L'adhésion est une propriété fréquemment et systématiquement recherchée dans la qualification d'un probiotique car elle permet de prolonger le temps de séjour dans l'intestin pour exprimer leurs effets bénéfiques sur l'hôte. Les souches choisies présentent une adhésion similaire aux souches déjà décrites dans d'autres études entre 1 et 8%; parmi les souches sélectionnées, les souches de *Lb. salivarius* sont les plus adhérentes.

L'analyse *in silico* des génomes des souches *Lb. reuteri* ICVB416, *Lb. salivarius* ICVB421 et *Lb. salivarius* ICVB430 a porté notamment sur la recherche des gènes impliqués dans la synthèse de métabolites secondaires, des facteurs de virulence, de résistance aux antibiotiques, la présence de gènes du système CRISPR et des gènes relatifs aux stress.

*Lb. reuteri* ICVB416 ne présente pas de gènes pouvant coder la synthèse de molécules antibactériennes, contrairement aux souches de *Lb. salivarius* dont les génomes semblent contenir des gènes semblables à ceux de la salivaricine selon l'analyse avec le logiciel antiSMASH et l'enterolysine A et la bactériocine LS2 selon le logiciel BAGEL 3. Aucune des trois souches ne présente de gène de virulence selon RAST, mais elles portent des gènes de résistance aux antibiotiques comme les transporteurs d'efflux multi-drugs. D'une façon plus spécifique, *Lb. reuteri* ICVB416 possède des gènes de résistance à la tétracycline et aux fluoroquinolones. Chez les deux souches de *Lb. salivarius* sont présents seulement les gènes de résistance aux fluoroquinolones. Les trois isolats ont montré des gènes de résistance au stress oxydatif et osmotique. Néanmoins, des éléments transposables ou des plasmides conjugatifs n'ont pas été
trouvé dans les séquences génomiques après l'analyse avec le logiciel RAST. Chez *Lb. salivarius*
des gènes associés au système CRISPR sont présents.

Dans l'optique d'une commercialisation, une caractérisation des propriétés technologiques des
souches de lactobacilles sélectionnées a été faite. Des tests de lyophilisation, de conservation sous
forme déshydratée sur une période de 6 mois et la viabilité des souches en milieu aqueux, dans
l'optique d'une administration aux animaux par l'eau de boisson, ont permis de caractériser plus
concrètement ces souches. Les souches ont montré une bonne tolérance au processus de
lyophilisation avec les cryoprotecteurs testés (lait écrémé et saccharose). La conservation des
lyophilisats à température ambiante pendant une longue période de temps (6 mois) diminue
drastiquement la viabilité des souches. Concernant la survie des souches en suspension aqueuse,
les souches présentent une bonne survie qu'elles soient testées dans le PBS ou dans l'eau pendant
24h. Un dernier test sur l'inhibition croisée des trois souches choisies a été fait pour écarter
l'hypothèse d'une inhibition ou d'une compétition. Selon ce test, les souches ne présentent pas
d'activités inhibitrices entre elles.

Enfin, une expérience *in vivo* a été menée et pendant laquelle il a été possible de voir que l'apport
d'un consortium associant les deux souches *Lb. reuteri* ICVB416 et *Lb. salivarius* ICVB430
améliorait les performances des poulets traités, qui présentaient un score de lésion similaire au
groupe qui n'a pas été infecté par *C. perfringens* et des poids significativement plus élevés que
ceux des poulets témoins sans ajout de souches de lactobacilles mais infecté avec *C. perfringens*.

A l'issu de ce travail et au regard des résultats obtenus, les perspectives suivantes nous semblent
intéressantes à envisager :

* Réaliser une analyse métagénomique sur les caeca de poulets de l'expérience *in vivo* pour voir les effets sur le microbiote dans les animaux challengés.

* Répéter l'essai *in vivo* pour vérifier les données obtenues et pouvoir analyser d'autres aspects comme l'effet sur l'inflammation et le système immunitaire. Dans ce contexte aussi, il faudrait designer une approche moléculaire en utilisant des amorces de qPCR spécifiques pour évaluer l'efficacité et la persistance des souches choisies pendant le temps d'administration.
* Trouver une méthode de conservation de souches permettant de prolonger la survie lors du stockage.

* A long terme, cela serait également intéressant d'imaginer et mettre au point des probiotiques de la prochaine génération en utilisant les technologies basées sur le système CRISPR-Cas9 chez les souches qui possèdent déjà ce système. Avec ce mécanisme, on pourrait améliorer leur potentiel thérapeutique pour

* (i) administrer des vaccins par le mécanisme d'expression d'un antigène de *C. perfringens* ou de ses toxines modifiées, et de cette façon stimuler la réponse immunitaire des poulets face à l'entérite nécrotique.

* (ii) modifier leur capacité de résistance aux conditions gastro-intestinales par une production maximale de BSH, ou par modification de la couche superficielle des souches bactériennes, pour améliorer la quantité de bactéries qui survivent au passage du tractus gastrointestinal.

* (iii) éliminer les résistances aux antibiotiques présentes dans leur génome.
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