## Infrastructures et organisation

L'étude de la cinétique de contamination et de décontamination a été réalisée en collaboration avec l'autre partie de l'équipe du laboratoire LSEM (Brest) localisé sur le site Ifremer de Nantes. L'équipe de Nantes disposait des infrastructures adaptées à ce genre d'expérimentation. Les cultures bactériennes ont été préparées au laboratoire Ifremer de Plouzané et les suspensions à Nantes. Cette répartition des tâches a nécessité l'élaboration d'un planning prenant en considération la préparation des souches bactériennes, le temps d'acheminement des coquillages, leur acclimatation en eau de mer (minimum 24 heures) et la mise en place des expérimentations de contamination/décontamination pour les deux types de souches STEC et non STEC sélectionnées. Les souches ont été testées par couple soit les souches *E. coli* stx1 et *E. coli* 1 ou *E. coli* stx2 et *E. coli* 2, en parallèle.

De plus, des essais préalables de suivi de croissance en cultures successives des souches sélectionnées dans les conditions d'expérimentations (préparation, expédition, conservation) ont permis de montrer que l'organisation générale de l'expérience n'avait pas d'impact sur la cinétique de croissance des *E. coli* (données non présentées). Les tests préliminaires sur la réponse des souches sélectionnées à l'analyse par impédancemétrie ont également montré une bonne sensibilité de la méthode pour la détection des souches (données non présentées).

## Expérience de biaccumulation

L'étude de la cinétique de contamination et de décontamination des huîtres a été réalisée pendant 24 heures.

Lors de la phase de contamination, les essais ont été réalisés en triplicat dans des bacs de 30 litres d'eau de mer (Bac A, B et C) avec un nombre de 30 huîtres par bac. Des dispositifs d'oxygénation d'aquarium ont été placés dans chaque bac pour l'oxygénation de l'eau et le maintien d'un courant d'eau continu dans les bacs.

La mesure de la concentration en *E. coli* réelle à T0 a montré que les bacs d'eau de mer ont été contaminés à hauteur de :

* souche *E. coli* stx1 : 4,1 log₁₀ UFC/100 mL d'eau de mer (A), 4,2 log₁₀ UFC/100 mL (B) et 6,1 log₁₀ UFC/100 mL (C)

* souche *E. coli* stx2 : 4,1 log₁₀ UFC/100 mL pour les 3 bacs (A, B et C)

* souche *E. coli* 1 : 7 log₁₀ UFC/100 mL (A), 3,9 log₁₀ UFC/100 mL (B) et 5,7 log₁₀ UCF/100 mL (C)

* souche *E. coli* 2 : 4,2 log₁₀ UFC/mL (A), 4,2 log₁₀ UFC/mL (B) et 4 log₁₀ UFC/mL (C)

Un prélèvement de six huîtres a été effectué à T0 (avant contamination) à partir du lot entier dans le bac d'acclimatation, puis à T2h et à T5h dans chaque bac de contamination (triplicat A, B et C) pour étudier la phase de contamination.
Pour la phase de décontamination, après le T5h, les huîtres ont été rincées rapidement à l'eau douce (eau du robinet) avant d'être ré-immergées dans deux bacs de 300 litres d'une nouvelle eau de mer : un bac pour les huîtres contaminées avec une souche STEC et un bac pour les huîtres contaminées avec une souche non STEC. Pour des raisons pratiques, toutes les huîtres contaminées par une souche STEC issues des triplicats A, B et C de contamination ont été rassemblées dans un même bac mais en ne modifiant pas la répartition des huîtres dans les paniers A, B et C (triplicat de contamination) de même pour les huîtres contaminées avec une souche non STEC (Figure 24).

Un prélèvement de six huîtres a été effectué à T10h et à T24h pour étudier la phase de décontamination.

Les temps de prélèvement ont été choisis en fonction des trois répétitions de test réalisés préalablement (données non présentées). Les résultats préliminaires ont mis en évidence que les temps T0, T2h, T5h, T10h et T24h suffisaient pour avoir un bon aperçu de la cinétique de contamination et de décontamination des huîtres. De plus, il était difficile d'augmenter le nombre de prélèvement pour des raisons pratiques (nombre d'échantillons analysables en 24h limité ; capacité d'analyses par impédancemétrie).

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure 24** : Organisation du suivi de la cinétique de contamination et de décontamination d'huîtres au contact d'une souche de *E. coli* (*E. coli* stx1 ou *E. coli* stx2 ou *E. coli* 1 ou *E. coli* 2)</figcaption></figure>
C. Résultats

La salinité mesurée dans l'eau de mer était de 32,5 ‰, le taux d'oxygènation était 82,8 % et la température de l'eau de mer était de 17 ±0,8°C.

Les variations observées entre les triplicats pour les concentrations en *E. coli* dans l'eau de mer à T0 étaient probablement dues à une mauvaise homogénéisation dans le bac.

Pour toutes les expériences, la concentration en *E. coli* mesurée dans les huîtres avant contamination était en dessous du seuil de détection établi de la méthode par impédancemétrie qui est de 1,83 log₁₀ UFC/ 100 g de CLI (Figure 25).

Le suivi des concentrations en *E. coli* dans l'eau de mer est présenté dans la Figure 26 et celui des concentrations en *E. coli* dans les huîtres est présenté en Figure 25 pour les quatre souches testées.

Pendant la phase de contamination entre T0 et T5h, les concentrations en *E. coli* dans l'eau de mer ont évoluées :

* de 4,8 ±1,1 log₁₀ UFC/100 mL à 4,6 ±0,5 log₁₀ UFC/100 mL pour la souche *E. coli* stx1

* de 5,5 ±1,6 log₁₀ UFC/100 mL à 4,5 ±0,9 log₁₀ UFC/100 mL pour la souche *E. coli* 1

* de 4,1 ±0 log₁₀ UFC/100 mL à 4,6 ±0,6 log₁₀ UFC/100 mL pour la souche *E. coli* stx2

* de 4,1 ±0,1 log₁₀ UFC/100 mL et 4 ±0,1 log₁₀ UFC/100 mL pour la souche *E. coli* 2

Pendant la phase de contamination, entre T0 et T2h, la concentration en *E. coli* dans les huîtres est passée de < 1,8 log₁₀ *E. coli*/100 g CLI (seuil de détection) à :

* 3,9 ±0,3 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI pour la souche *E. coli* stx1

* 4,5 ±0,8 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI pour la souche *E. coli* 1

* 3,7 ±0,7 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI pour la souche *E. coli* stx2

* 4,5 ±0,3 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI pour la souche *E. coli* 2.

Les facteurs de bioaccumulation calculés sont donc de :

* 0,9 ±0,1 pour les huîtres contaminées avec la souche *E. coli* stx1

* 1 ±0,1 pour les huîtres contaminées avec la souche *E. coli* 1

* 0,9 ±0,1 pour les huîtres contaminées avec la souche *E. coli* stx2

* 1,1 ±0,1 pour les huîtres contaminées avec la souche *E. coli* 2

Les concentrations en *E. coli* ont très peu varié dans les huîtres pour les quatre souches testées entre T2h et T5h avec une moyenne de 4,3 ±0,3 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI.
Pendant la phase de décontamination, de T10h à T24h, les concentrations en E. coli pour les quatre souches testées ont varié en moyenne, dans l'eau de mer, de 1,5 ±0,5 log₁₀ UFC/100 mL à 1,6 ±0,5 log₁₀ UFC/100 mL.

Pendant la phase de décontamination, de T5h à T10h, les concentrations en E. coli pour les quatre souches testées ont chuté en moyenne, dans les huîtres, de 4,4 ±0,3 log₁₀ E. coli/100 g CLI à 3,3 ±0,7 log₁₀ E. coli/100 g CLI. De T10h à T24h, les concentrations en E. coli dans les huîtres ont encore chuté en moyenne d'1 log avec une concentration moyenne en fin d'expérience de 2,5 ±0,3 log₁₀ E. coli/100 g CLI.

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 25** : Niveaux moyens des concentrations en E. coli stx1, E. coli 1, E. coli stx2 et E. coli 2 mesurés dans les huîtres au cours des phases de contamination (T0 à T5h) et de décontamination (T5h à T24h). Représentation du seuil de détection de la méthode de numération par impédancemétrie (ligne).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 26** : Niveaux moyens des concentrations en *E. coli* stx1, *E. coli* 1, *E. coli* stx2 et *E. coli* 2 mesurés dans l'eau de mer au cours des phases de contamination (T0 à T5h) et de décontamination (T5h à T24h)</figcaption></figure>

## D. Discussion

Cette étude est, à notre connaissance, la première évaluation du comportement des *E. coli* producteurs de Shiga-toxines pendant des phases de contamination et de décontamination chez l'huître *Crassostrea gigas*.

Les niveaux de contamination de l'eau de mer utilisée dans cette expérience, de 4,1 à 5,5 log₁₀ UFC/100 mL, sont des niveaux de concentration en *E. coli* élevés, observés également dans l'environnement (Publication N°1 : concentrations mesurées dans les eaux douces de 1,6 à 5,3 log₁₀ UFC/100 mL) et utilisées dans d'autres études sur la bioaccumulation des *E. coli* dans les coquillages (Marino *et al.*, 2005, Love *et al.*, 2010, Ottaviani *et al.*, 2015).

Cette étude montre une contamination très rapide et maximale des huîtres par les *E. coli*, avec des concentrations en *E. coli* évoluant de < 1,8 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI mesurées à T0 avant contamination, vers une moyenne maximale de 4,2 ±0,4 log₁₀ *E. coli* /100 g CLI mesurée après deux heures de balnéation. Ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus dans l'étude de Jozic *et al.*, en 2012, qui avaient contaminé des huîtres dans une eau de mer avec une concentration en *E. coli* d'environ 5 log₁₀/100 mL. La concentration maximale en *E. coli* a été observée dans les huîtres dès la première heure de balnéation avant d'atteindre un plateau (l'équilibre cinétique). La rapidité de la contamination des coquillages par *E. coli* a également été mise en évidence dans des moules en balnéation dans une eau de mer contaminée à hauteur de 7 log₁₀/100 mL. La concentration maximale en *E. coli* mesurée dans les coquillages a été observée dès 3 heures de balnéation (Marino *et al.*, 2005).
Le facteur de bioaccumulation moyen calculé dans cette étude est de 1 ±0,1. Ce facteur est en accord avec ceux retrouvés dans la littérature en conditions expérimentales, de >0,6, 1 et 1,1 pour des huîtres au contact de fèces de porc, d'effluents ou de fèces de bovin, respectivement, pour des concentrations initiales en *E. coli* mesurées dans l'eau de mer de 7,1, 5,8 et 4,3 log₁₀ UFC/100 mL (Mauffret *et al.*, 2013). Toutefois, ces facteurs peuvent être variables car très dépendants des conditions environnementales (température et salinité) qui vont influencer la physiologie du coquillage ou de l'espèce de coquillage étudiée (Jozic *et al.*, 2012, Derolez *et al.*, 2013). Le facteur de bioaccumulation de l'indicateur *E. coli* peut varier entre 0,3 et 7,7 chez les moules et entre 0,9 et 10,3 chez les huîtres en balnéation (Campos *et al.*, 2013). Les variations peuvent être encore plus importantes *in situ* avec des variations observées entre 0,1 et 406 chez les huîtres dans l'environnement (Derolez *et al.*, 2013).

Aucune différence de cinétique n'a été mise en évidence entre des souches de *E. coli* STEC (souches *E. coli* stx1 ou *E. coli* stx2) et les souches de *E. coli* non STEC (souches *E. coli* 1 ou *E. coli* 2) dans les conditions de l'expérience, suggérant ainsi que la présence des gènes *stx* n'a pas incidence sur le comportement des *E. coli* dans les huîtres. Il semble également que le sérotype ne soit pas un facteur intervenant dans la cinétique de contamination et de décontamination car les souches de sérotype O100:HNM (souche *E. coli* stx2) et O154:H31 (souche *E. coli* stx1) ont le même comportement face aux huîtres. Il serait intéressant de comparer d'autres souches de sérotypes différents pour confirmer cette observation.

Au final, cette expérience expose les premiers éléments de réponse concernant l'influence de la présence des gènes *stx* chez *E. coli* sur la cinétique de contamination et de décontamination d'huîtres au contact de STEC. *E. coli* étant utilisé comme indicateur de contamination fécale pour la classification sanitaire des zones conchylicoles, il était important de savoir si le fait d'acquérir des gènes de virulence, était un critère à prendre en compte dans l'élaboration des protocoles de décontamination des coquillages mis en place par la réglementation CE/854/2004. Les premiers tests suggèrent donc l'absence de l'influence des gènes *stx* sur la persistance des STEC dans les coquillages. Néanmoins, il serait important d'appliquer ce protocole d'évaluation à un panel plus grand de souches STEC isolées de l'environnement pour mieux démontrer que la présence des gènes *stx* n'a aucune influence sur la cinétique de contamination et de décontamination de coquillages. Il serait intéressant de tester deux souches d'un sérotype donné possédant un gène *stx* pour l'une et dépourvu de gène *stx* pour l'autre. Il serait également nécessaire de tester ces souches sur d'autres espèces de coquillages (coques, moules, palourdes) et dans des conditions environnementales différentes.
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES

L'objectif principal de ce travail de thèse était d'évaluer la présence des *E. coli* producteurs de Shiga-
toxines (STEC) et des *E. coli* entéropathogènes (EPEC) dans l'environnement littoral. Cette étude
constitue, à notre connaissance, la première recherchant et caractérisant simultanément des STEC et
EPEC dans cet environnement. Elle présente de plus l'avantage de rechercher, à la fois, ces bactéries
dans les zones conchylicoles au niveau des coquillages, les sédiments superficiels et les eaux côtières
mais également aux exutoires des bassins versants amont.

Si de nombreuses études ont eu comme objectifs d'évaluer la présence de ces souches au niveau des sources : fèces, effluents ou rivières, des données manquaient au niveau des exutoires de bassins versants et des zones littorales (Garcia-Aljaro et al., 2005, Mora et al., 2012, Bibbal et al., 2015).

Parmi les différents pathovars de *E. coli*, nous avons sélectionné les STEC et les EPEC du fait des pathologies qui leur sont associées, de leurs réservoirs potentiellement présents en amont du littoral et des gènes de virulence pouvant être présents à la fois dans ces deux pathovars. Ces agents pathogènes gastro-intestinaux continuent de poser une menace pour la santé humaine dans le monde entier. Alors que les EPEC restent une cause importante de diarrhées dans les pays à faibles revenus, les STEC et tout particulièrement les EHEC sont responsables de colites hémorragiques ou du Syndrome Hémolytique et Urémique chez l'enfant.

La réalisation des trois étapes majeures de ce travail de thèse a permis : 1) d'évaluer la présence de
STEC et de EPEC dans trois zones conchylicoles françaises et d'investiguer les paramètres pouvant
influer sur leur présence, 2) de caractériser les souches isolées et d'évaluer la présence de marqueurs
génétiques potentiellement associés à ces pathovars, 3) et enfin de comparer la cinétique de
contamination et de décontamination de coquillages par des souches de *E. coli* STEC et non STEC,
isolées dans cette étude.

La première étape pour rechercher les *E. coli* STEC ou EPEC a reposé sur la détection des gènes caractéristiques de ces pathovars, soient les gènes *stx1*, *stx2* et *eae*, dans les bouillons d'enrichissement des échantillons analysés. Ces gènes ont été fréquemment mis en évidence dans ces bouillons d'enrichissement avec la détection des gènes *stx1* ou *stx2* respectivement dans 30,3 % des lots de coquillages, 85,9 % des eaux de rivière, 41,7 % des eaux marines et 29,2 % des sédiments superficiels. La détection du gène *eae* a été faite dans 74,8 % des lots de coquillages, 100 % des eaux de rivière, 100 % des eaux marines et 43,6 % des sédiments superficiels. L'analyse des données acquises sur les deux années de suivi montre une fréquence similaire de détection des gènes *stx1* et *stx2* dans les échantillons pour les différentes matrices analysées. Au niveau des coquillages, les gènes *stx1* et *stx2* ont été plus fréquemment détectés dans les coques (31,5 % et 31,5 %, respectivement) que dans les
moules (18,7 % et 17,7%, respectivement) ou les huîtres (9,6 % et 9,6 %, respectivement). Ce résultat est en accord avec les résultats obtenus lors d'une précédente étude au cours de laquelle les gènes stx avaient été également plus fréquemment détectés dans des coques (100 %) que dans des moules (43,9%) ou des huîtres (33,3 %) collectées sur des sites des différentes façades maritimes françaises (n=72 lots de coquillages analysés) entre 2002 et 2004 (Gourmelon et al., 2006).

La présence fréquente de ces gènes dans des eaux environnementales (eaux de mer ou effluents) a été également observée dans des études précédentes (Bennani et al., 2011, Bibbal et al., 2014). Toutefois, au cours de notre étude, des souches STEC ou EPEC n'ont été isolées respectivement que dans 5,1 % et 13,7 % des échantillons analysés (n=505). La faible fréquence d'isolement de souches STEC et EPEC vs la fréquence élevée de détection des gènes dans les échantillons analysés a également été observée dans des études ciblées sur les fèces d'origine bovine, des aliments ou des échantillons de l'environnement (Miyagi et al., 2001, Bai et al., 2013, Bibbal et al., 2015).

La fréquence élevée de détection des gènes stx dans ces bouillons d'enrichissement pourrait être due à la présence de bactéries viables non cultivables, de cellules mortes ou de bactériophages porteurs des gènes stx, à l'état libre, éventuellement présents dans ces bouillons (Gourmelon et al., 2006, Rozen et Belkin, 2001, Martinez-Castillo et al., 2013). Pour évaluer cette dernière possibilité, nous avons recherché si des bactériophages porteurs de gènes stx pouvaient être présents dans une partie des échantillons analysés (24 eaux de rivière et six eaux de mer prélevées d'Août 2014 à Janvier 2015 et 34 bouillons d'enrichissements d'eaux ou de coquillages trouvés positifs pour les gènes stx1 ou stx2 au cours de la même période sur le site en Bretagne) (collaboration avec le Laboratoire du Département de Microbiologie, Faculté de Biologie de l'Université de Barcelone, Espagne). La présence des bactériophages stx1 et stx2 a été mise en évidence dans respectivement 25 % des eaux à des concentrations variant entre 3,2 log₁₀ Copies de Génome (CG)/100 mL d'eau et 5,6 log₁₀ CG/100 mL et dans 83,3 % des eaux entre 3,0 log₁₀ CG/100 mL et 4,8 log₁₀ CG/100 mL. Ces concentrations sont en accord avec les concentrations généralement retrouvées dans des effluents ou eaux de rivières dans d'autres études (Immamovic et al., 2010a, Yang et al., 2011) et la plus forte fréquence de détection de bactériophages stx2 dans des eaux environnementales (Martinez-Castillo et Muniesa 2014). Dans les bouillons d'enrichissement analysés, les bactériophages stx2 ont été détectés dans 27,3 % des eaux de rivière (n=6/22) et dans une eau de mer (n=1/3) mais ils n'ont pas été mis en évidence dans les bouillons d'enrichissement de coquillages. Les bactériophages stx1 ont été détectés dans 9,1 % des eaux douces (n=2/22), dans deux eaux de mer et dans un bouillon d'enrichissement correspondant au lot de coques prélevé en Août 2014. Ce résultat constitue, à notre connaissance, la première mise en évidence de bactériophages stx1 dans des coquillages. La présence de bactériophages dans les enrichissements obtenus à partir des eaux filtrées suggère que des bactériophages ont été retenus en même temps que les bactéries sur les filtres. Ces résultats confortent notre hypothèse que les
bactériophages Stx pourraient être responsables d'une partie de la détection des gènes stx dans les échantillons analysés dans ce travail.

Au cours de cette étude, un total de 27 souches STEC, 1 EHEC, 70 EPEC atypiques et 5 EHEC typiques différentes a été isolé, montrant une faible présence de ces bactéries potentiellement pathogènes au regard des 12 016 isolats de E. coli analysés.

Cette étude montre la présence de STEC ou EPEC sur les trois zones conchylicoles étudiées en Bretagne et Normandie et dans tous les matrices étudiées : coquillages : 12 souches STEC et 23 souches EPEC isolées sur la période étudiée ; eaux de rivières, 14 souches STEC et 62 souches EPEC isolées ; eaux côtières une souche STEC et quatre souches EPEC isolées ; sédiments : une souche STEC isolée et aucune souche EPEC isolée (Février 2013 à Janvier 2015 ; Figure 27).

<figure><img src="image_39.png" /></figure>
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

**Figure 27** : Répartition des souches de *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) et *E. coli* entéropathogènes (EPEC) et *E. coli* entérohémorragique (EHEC) isolées à partir des échantillons environnementaux prélevés (coquillage en orange, sédiment en gris, eaux en bleu clair et foncé) entre Février 2013 et Janvier 2015 sur le site 1 : Baie de la Fresnaye (A), le site 2 : Havre de Regnéville et le site 3 : Havre de la Vanlée (B). huîtres :L et F ;, moules :G et M et coques :E. eaux de rivière :A, B, C, I, H. sédiments :K et D.

Ces résultats montrent donc qu’un faible nombre de souches STEC et EPEC a été isolé dans ces échantillons environnementaux, et que pour les trois sites, la majorité des souches STEC et EPEC ont été isolées dans les eaux de rivières et dans les coquillages et qu’enfin une plus forte proportion de souches EPEC que de souches STEC a été observée, en accord avec les résultats d’études précédentes (Hamilton *et al.*, 2010, Chandran et Mazumder 2015).

Le faible isolement de souches *E. coli* pathogènes (1 STEC et 0 EPEC) dans les sédiments superficiels peut être expliqué par la nature des sédiments des zones conchylicoles étudiées. Ils étaient constitués principalement de particules grossières (sable) avec une absence ou une faible présence de vase et donc peu propices au maintien d'une population de *E. coli* dans ce compartiment. Des études précédentes avaient montré que les sédiments superficiels pouvaient jouer le rôle de réservoir de souches de *E. coli* mais dans ce cas les sédiments avaient une teneur élevée en matière organique et étaient riches en vase (Luna *et al.*, 2010, Whitman *et al.*, 2014). La recherche des *E. coli* dans les sédiments indépendamment de la recherche de STEC ou de EPEC a permis d'obtenir 21 isolats pour 39 échantillons de sédiments, soit un nombre beaucoup plus faible que dans les eaux ou les coquillages, confirmant la faible présence de ce genre de bactéries dans ces sédiments.

Une partie des souches isolées appartenait à un des sérotypes majeurs soit une souche STEC (E. coli O26:H11) isolée d'un lot de moules correspondant à une souche EHEC et un total de 14 souches EPEC appartenant aux sérotypes O26:H11, O145:H28 et O103:H2. Au cours de cette étude, trois protocoles complémentaires avaient été utilisés pour rechercher les souches STEC et EPEC : i)
application du protocole ISO/TS-13136 ciblant les sérotypes majeurs, ii) isolement de souches de E. coli dans les bouillons d'enrichissement et iii) isolement de souches de E. coli directement dans les échantillons, ces deux derniers protocoles étant indépendants des sérotypes. Le protocole ISO/TS-13136 a été le seul protocole permettant d'isoler une souche STEC de sérotype majeur ou EHEC typique, au cours de l'étude et a conduit à une plus forte détection de souches EPEC de sérotypes majeurs que les autres protocoles (n=9/14). Cette étude présentait la première application de ce protocole ISO/TS-13136 à des coquillages et à des eaux littorales (Publiation N°1). Ces résultats suggèrent que ce protocole est à privilégier dans le cas d'une recherche des sérotypes majeurs dans des échantillons environnementaux. Les deux autres protocoles ont, quant à eux, permis d'isoler un total de 56 souches STEC et 103 souches EPEC n'appartenant pas aux sérotypes majeurs. Lors de cette étude, aucune souche de sérotype O157:H7 n'a été isolée bien que le protocole ISO/TS-13136 ciblant les sérotypes majeurs incluant le O157 (protocole appliqué sur 282 échantillons de Février 2013 à Février 2014) ait été appliqué. Ce résultat est en accord avec la faible prévalence de ce sérotype dans l'environnement au niveau des effluents d'origine agricole (Bibbal et al., 2014), des eaux de rivières (Jokinen et al., 2011), des eaux marines (Miyagi et al., 2001) et des coquillages (Manna et al., 2008).

Cette étude a également permis d'apporter des données sur la présence de souches STEC et EPEC dans les échantillons environnementaux en fonction de différents paramètres : sites, périodes d'isolement (saisons), matrices, pluviométrie et concentrations en indicateur de contamination fécale (E. coli). Pour les sites étudiés, l'analyse de l'ensemble des données acquises sur les deux ans d'étude montre un effet saisonnier de la détection des E. coli pathogènes avec la détection de souches STEC plus fréquemment en été et des souches EPEC plus fréquente en été et en automne (test khi-deux ; p< 0,05).

Cependant, aucune relation n'a été observée entre la prévalence des STEC et des EPEC et la pluviométrie ou la température. Concernant les concentrations en E. coli des échantillons analysés, l'isolement des souches STEC a été plus fréquent dans les eaux faiblement contaminées (présence dans 8 % des eaux avec des concentrations < 500 E. coli / 100 ml) que dans les eaux fortement contaminées (présence dans 5 % des eaux avec des concentrations > 1000 E. coli / 100 ml). Tandis que dans les coquillages l'isolement des souches a été plus important dans les coquillages fortement contaminés (présence dans 2 % des coquillages avec des concentrations > 4 600 E. coli / 100 g de CLI) que dans les coquillages faiblement contaminés (concentrations < 230 E. coli / 100 g de CLI). Pour les EPEC, l'isolement de souches a été plus fréquent dans les échantillons d'eaux et de coquillages fortement contaminés en E. coli avec la présence de souches EPEC dans 25 % des eaux avec des concentrations > 1 000 E. coli / 100 ml et dans 23 % des coquillages avec des concentrations > 4 600 E. coli / 100 g de CLI.
Ce travail de thèse s'insérant dans un projet plus large, il a été également possible de comparer les données de présence de STEC et de EPEC dans les échantillons environnementaux à celles acquises en utilisant les marqueurs *Bacteroidales* associés à l'Homme (HF183, Seunrick *et al.*, 2005), aux ruminants (bovin et ovin ; Rum2Bac ; Mieszkin *et al.*, 2010) et aux porcs (Pig2Bac ; Mieszkin *et al.*, 2009) dans les échantillons d'eaux. Si les marqueurs *Bacteroidales* ont été également recherchés dans les coquillages collectés sur les trois sites conchylicoles, il n'a pas été possible d'obtenir des résultats par ces marqueurs sur l'origine de la contamination fécale ; des développements méthodologiques sont encore nécessaires pour obtenir une sensibilité suffisante.

Les résultats montrent généralement que dans 58 % des échantillons d'eaux où une souche STEC a été isolée (7 sur 12 échantillons), une origine de contamination a pu être mise en évidence : soit une contamination mixte (humaine et animale ; détection du marqueur HF183 et Rum2Bac) dans 5 échantillons sur 12, une contamination seulement par les ruminants (bovins ou ovins) dans deux échantillons. De même pour les souches EPEC, une origine de contamination a pu être mise en évidence dans 69 % des échantillons (31 sur 45 échantillons) : soit une contamination mixte (humaine et animale ; détection du marqueur HF183 et Rum2Bac) dans 16 échantillons sur 45 et une contamination seulement par les ruminants (bovins ou ovins) dans 15 échantillons. Ces résultats suggèrent que la présence de ces souches est souvent associée à une présence de contamination par les ruminants. Toutefois, ces résultats sont à prendre avec précaution car il est également à noter que ces marqueurs associés à l'Homme et aux ruminants étaient également détectés dans les échantillons dans lesquels aucune souche STEC ou EPEC n'a été isolée (présence d'une origine de contamination fécale identifiée dans 70 % des échantillons).

Ce travail de thèse a permis également d'acquérir des données sur la diversité des souches STEC et EPEC dans des échantillons environnementaux. La caractérisation des souches montre une diversité très importante des souches environnementales isolées lors de cette étude : 75 sérotypes différents, 46 ST différents, 79 profils PFGE différents et 75 profils de gènes de virulence ont été ainsi obtenus. Ces résultats sont en accord avec la grande diversité de sérotypes précédemment observée dans des échantillons d'effluents ou d'eaux environnementales en Espagne ou en Californie (Garcia-Aljaro *et al.*, 2005, Cooley *et al.*, 2014). Il est également à noter que des phylogroupes différents ont été observés au sein de ces souches STEC et EPEC avec une majorité de souches STEC de phylogroupe A et B1 et une répartition des souches EPEC au sein des quatre phylogroupes A, B1, B2 et D étudiés.

Cette très grande diversité de souches suggère un apport de multiples souches STEC ou EPEC, présentes chacune probablement en faible quantité dans les échantillons analysés. De plus, il est probable que d'autres souches STEC ou EPEC étaient également présentes dans les enrichissements mais n'ont pas pu être mises en évidence car nous n'avons analysé qu'un faible pourcentage d'isolats de *E. coli* au vu de l'ensemble des *E. coli* présents. Il est possible aussi que certaines souches STEC ou
EPEC ne se soient pas développées dans les enrichissements ou sur les milieux solides du fait de leur plus faible présence dans la population de départ ou de leur mauvais état physiologique du au transit de la source aux coquillages. Des souches STEC ou EPEC peuvent en effet perdre leur capacité à cultiver mais rester viables (bactéries viables non cultivables) du fait des conditions stressantes rencontrées par ces bactéries lors de leur transfert jusqu'aux coquillages.

Un des objectifs de cette étude était également d'évaluer le caractère plus ou moins pathogène des souches isolées de l'environnement en déterminant des profils de gènes de virulence reposant sur un nombre élevé de gènes (technique de PCR haut débit permettant la recherche de 75 gènes de virulence).

Parmi les souches potentiellement les plus virulentes du fait de la mise en évidence d'un nombre important de gènes présents, nous pouvons citer une souche de sérotype O26:H11 $stx_1^+$, $eae\beta1^+$, caractéristique des EHEC du fait de la présence du gène *eae* et de son appartenance aux sérotypes majeurs, isolée à partir d'un lot de moules sur le site 1. La caractérisation de cette souche O26:H11 a permis de l'associer au ST21 qui avait déjà été décrit pour des souches O26:H11 responsables de SHU et de colites hémorragiques chez l'Homme (Bielaszewska *et al.*, 2013, Zweifel *et al.*, 2013). Cette étude a mis en évidence la présence de 45 gènes de virulence dans cette souche. Une autre souche STEC susceptible d'être associée à des infections humaines est la souche appartenant au sérotype O91:H21 $stx_1^+$, $stx_2^+$, $stx_2^+$, $stx_2^+$, ST442, soit un ST qui a également été associé à une souche de O91:H11 responsable de SHU (Mellmann *et al.*, 2009).

Au regard de la caractérisation des souches EPEC isolées de l'environnement, 11 souches appartenant aux sérotypes O23:H8 (n=2), O153:H2 (n=2), O26:H11 (n=3), O103:H25 (n=1), O103:H2 (n=1) et O145:H28 (n=2) pourraient être potentiellement pathogènes pour l'Homme. Ces souches possèdent entre 13 et 19 gènes de virulence sur un total de 20 gènes associés à des marqueurs de virulence retrouvés sur les îlots de pathogénicité OI-122, OI-43-48, O-57 et OI-71 typiquement utilisés pour identifier les souches EHEC hautement pathogènes pour l'Homme parmi les souches STEC et EPEC avec un potentiel de virulence moindre (Coombes *et al.*, 2008, Bugarel *et al.*, 2010, Chui *et al.*, 2013).

Si d'autres souches isolées au cours de cette étude présentaient également un profil moléculaire de virulence, la majorité des souches isolées semble toutefois présenter un risque faible pour la santé humaine avec par exemple la présence majoritaire du variant *stx1d* au sein des souches STEC isolées, peu associé à des cas sévères d'infection chez l'Homme et la détection que de un à 13 gènes de virulence supplémentaires aux gènes *stx*.

Parmi les souches potentiellement peu virulentes, le sérotype O100:HNM a présenté un intérêt particulier pour plusieurs raisons. Ce sérotype O100:HNM $stx_2^+$ a été en effet le sérotype le plus isolé à partir des échantillons prélevés sur les sites normands : sites 2 et 3 (9 isolats différents après retrait
des éventuels réplicats). Ces clones ont plus particulièrement été isolés dans les coquillages (n=7/9).
Ils proviennent des différents types de coquillages (huîtres, moules et coques), d'un sédiment et d'une
eau de rivière, prélevés aux mois de Mai et Juin 2013 et Mars et Juin 2014. La caractérisation de ces
isolats par PFGE et MLST (ST993) a confirmé la présence d'un même et unique clone au sein de
l'ensemble de ces échantillons. L'étude de son profil de virulence nous a amené à penser que cette
souche était peu virulente puisqu'elle ne possédait que les gènes paa, codant une adhésine et terE,
codant une enzyme impliquée dans la dégradation des tellurites, sur les 75 gènes de virulence ciblés,
en plus du gène stx2. D'ailleurs, ce variant du gène stx2 reste encore inconnu et devrait être identifié
rapidement grâce au séquençage total du génome en cours.

Pour terminer la caractérisation des souches, nous avons recherché si des souches isolées dans cette
 étude possédaient des capacités à former des biofilms, favorables à une meilleure survie dans
 l'environnement. Nous avons donc recherché la présence de gènes en association avec la production
de biofilm et évalué la capacité de certaines souches environnementales à former des biofilms. Pour
cela, 10 gènes de virulence associés à la formation de biofilms (crl, ang43K12 (flu), csgA, csgD, pgaA,
fim1/H, fim9, ehaA, ehaB et ehaD) ainsi que six gènes impliqués dans les mécanismes d'adhésion aux
cellules: lpfAO157, lpfAO26, lpfAO113, sab, iha et efa1 ont été recherchés par PCR haut débit
(données non présentées). Brièvement, les résultats ont montré qu'au moins cinq gènes sur 10 (crl,
csgD, fim1H, fim9 et ehaB) étaient présents chez toutes les souches qu'elles soient capables de former
ou non des biofilms. L'expression de ces gènes est une notion à prendre en considération dans cette
analyse et qui serait intéressante à étudier en ciblant les ARN issus de ces gènes par RT-PCR (Biscola
et al., 2011). En effet, dans une récente étude, Kim et al. (2013) ont observé que la détection des gènes
fim1/A/I/C/D/F/G/H chez des souches O91:H21 n'était pas systématiquement associée à leur
expression.

Nous avons terminé ce travail par l'étude du comportement des souches STEC par rapport à
l'indicateur E. coli vis à vis de la cinétique de contamination et de décontamination d'huîtres. Aucune
différence de cinétique n'a été mise en évidence entre les souches STEC et non STEC sélectionnées
dans les conditions expérimentales mises en œuvre. Cette expérience a exposé des premiers éléments
de réponse concernant l'influence de la présence des gènes stx chez E. coli sur la cinétique de
contamination et de décontamination d'huîtres au contact de STEC. Beaucoup d'études se sont
intéressées au comportement des E. coli dans les coquillages mais à notre connaissance aucune n'avait
encore abordé l'influence de la présence de gènes de virulence tels que les gènes stx (Marino et al.,
2005, Love et al., 2010, Chinnadurai et al., 2014, Ottaviani et al., 2015).

E. coli étant utilisé comme indicateur de contamination fécale pour la classification sanitaire des zones
conchylicoles, il est important de connaître si le fait d'acquérir des gènes de virulence, est un critère à
prendre en compte dans l'élaboration des protocoles de décontamination des coquillages mis en place
par la réglementation CE/854/2004.

En conclusion, cette étude sur la prévalence, la distribution et la virulence des souches STEC et EPEC
présentes dans l'environnement littoral, au niveau des coquillages, des sédiments, de l'eau de mer et
des exutoires de rivières a permis de constituer une collection de souches intéressantes pour évaluer le
risque sanitaire lié à la présence de ces pathogènes dans l'environnement littoral.

Cette étude a permis d'avoir un premier aperçu de la présence de souches de *E. coli* potentiellement pathogènes pour l'Homme. Néanmoins, il serait intéressant par rapport aux résultats obtenus, de poursuivre l'évaluation du pouvoir pathogène de certaines souches. Pour cela, l'étude concernant l'expression des gènes de virulence s'identifie comme une étape essentielle à l'évaluation du pouvoir pathogène des souches, car la présence des gènes dans les souches bactériennes ne signifie pas systématiquement que les gènes sont exprimés et une souche est vraiment pathogène sous réserve qu'elle exprime les gènes en protéines effectrices. En ce qui concerne l'expression des gènes *stx* plusieurs approches existent, orientées sur l'effet cytotoxique des toxines produites sur des cellules Véro en culture (cellule de rein de singe) (Staples *et al.*, 2012) ou bien sur la quantification des toxines produites par méthode ELISA (Yamasaki *et al.*, 2015). Plus généralement, d'autres moyens permettent de mettre en évidence la toxicité de certaines souches par l'évaluation de l'effet pathogène en produisant une infection à STEC sur des modèles vivants. Un des modèles vivants déjà utilisé pour l'étude de la toxicité des souches STEC est le modèle lapin (Shringi *et al.*, 2012). Cependant, la mise en œuvre de ce type de test étant assez lourde et contraignante (notion d'éthique), le modèle chenille (Galleria mellonella) apparaît récemment comme un modèle vivant d'invertébré simple et facile à mettre en œuvre, de plus en plus utilisé pour étudier la virulence de souches bactériennes (Kalkanci *et al.*, 2015).

L'émergence des méthodes de séquençage de nouvelles générations (NGS) apparaît comme un élément indispensable à mettre en œuvre au niveau de ces souches environnementales pour mieux connaître et prédire l'émergence de nouvelles souches pathogènes. Dans cet objectif, le projet H2020 Compare débuté au laboratoire en 2015, a pour objectif d'évaluer le pouvoir pathogène de certaines souches de la collection par le séquençage total du génome.

L'étude plus approfondie de certaines souches comme celles de sérotype O100 :HNM stx2 dont le variant du gène reste encore non identifié à l'issu de ce travail, est une perspective très intéressante par rapport à l'étude de la diversité des souches isolées. L'identification d'un nouveau variant pourrait être une avancée concernant le gène stx à l'origine de la production de la Shiga-toxine de type 2.
Comprendre pourquoi certaines souches ont été isolées plus que d'autres est également un point très intéressant à développer suite à ce travail. La souche de sérotype O100 :HNM reste encore le parfait exemple, avec sa prévalence très marquée au niveau des sites d'étude de Normandie et son isolement dans les trois types de coquillages (huîtres, moules et coques) à différentes périodes (Mai et Juin 2013 et Mars et Juin 2014). Il serait intéressant de voir si certaines souches ont la capacité de persister plus longtemps dans l'eau de mer que d'autres en évaluant sa persistance dans des microcosmes d'eau de mer sur une longue période.

Avec une autre approche, il serait intéressant d'identifier les sources potentielles de contamination liées à la présence de certaines souches dans les coquillages, le sédiment et les eaux de rivière en allant échantillonner plus en amont des exutoires des rivières ainsi qu'au niveau des cheptels présents au niveau des bassins versants.

E. coli est encore de nos jours l'indicateur de contamination fécale utilisé pour évaluer la qualité sanitaire de produits destinés à la consommation humaine. Ce travail a permis d'avoir un premier aperçu de la présence de E. coli potentiellement pathogènes pour l'Homme avec le cas des STEC et des EPEC dans les compartiments soumis à des contaminations d'origine fécale. Suite à ce travail on pourrait également se demander ce qu'il en est des autres pathovars de E. coli dans l'environnement littoral. Connaître et évaluer la circulation et le pouvoir pathogène des E. coli présents au niveau des zones côtières ainsi que leur comportement dans le coquillage sont des enjeux majeurs pour la pérennité de certains usages littoraux tels que la conchyliculture, la pêche à pied et la baignade.
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# ANNEXES
Annexe I : Sélection de gènes de virulence identifiés chez E. coli

<table><thead><tr><th>Gènes (position chromosomique EDL933)</th><th>Support génétique</th><th>Description/Rôle</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>LEE</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eae (Z5110)</td><td>LEE</td><td>Intimine : protéine d'adhésion</td><td>Garrido et al., 2006</td></tr><tr><td>espB (Z5105)</td><td>LEE</td><td>protéine EspB intervenant dans la formation de la seringue moléculaire</td><td>Garrido et al., 2006</td></tr><tr><td>espD (Z5106)</td><td>LEE</td><td>protéine EspD intervenant dans la formation de la seringue moléculaire</td><td>Garrido et al., 2006</td></tr><tr><td>espA (Z5107)</td><td>LEE</td><td>protéine EspA intervenant dans la formation de la seringue moléculaire</td><td>Garrido et al., 2006</td></tr><tr><td>tir (Z5112)</td><td>LEE</td><td>tyrosine phosphorylated protein : récepteur de l'intimine</td><td>Garrido et al., 2006</td></tr><tr><td>espZ (Z5122)</td><td>LEE</td><td>régule la translocation de protéines effectrices codées par le LEE</td><td>Berger et al., 2012</td></tr><tr><td>escC (Z5126)</td><td>LEE</td><td>protéine de structure et de la machinerie du SSTT</td><td>Garmendia et al., 2005</td></tr><tr><td>escD (Z5109)</td><td>LEE</td><td>protéine de structure et de la machinerie du SSTT</td><td>Garmendia et al., 2005</td></tr><tr><td>escN (Z5119)</td><td>LEE</td><td>protéine de structure et de la machinerie du SSTT</td><td>Garmendia et al., 2005</td></tr><tr><td>escV (Z5120)</td><td>LEE</td><td>protéine de structure et de la machinerie du SSTT</td><td>Garmendia et al., 2005</td></tr><tr><td>escJ (Z5124)</td><td>LEE</td><td>protéine de structure et de la machinerie du SSTT</td><td>Garmendia et al., 2005</td></tr><tr><td>espG</td><td>LEE</td><td>EspG déstabilise la formation de microtubules en agissant sur l'appareil de Golgi</td><td>Clements et al., 2011</td></tr><tr><td>espJ</td><td>OI-79</td><td>Inhibe l'action des macrophages</td><td>Marches et al., 2008</td></tr><tr><td>espM2 (Z3918)</td><td>OI-108</td><td>EspM régule la formation du piédestal et agit sur les jonctions serrées des cellules épithéliales intestinales</td><td>Simovitch et al., 2010</td></tr><tr><td>espV (Z1387)</td><td>OI-44</td><td>EspV altère la morphologie des cellules eucaryotes</td><td>Arbeloa et al., 2011</td></tr><tr><td>espM1 (Z2565)</td><td>OI-71</td><td>EspM régule la formation du piédestal et agit sur les jonctions serrées des cellules épithéliales intestinales</td><td>Simovitch et al., 2010</td></tr><tr><td><strong>Adhésines fimbriae</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfpA</td><td>plamide</td><td>bundle-forming pilus : Sous-unité structurale majeure pour la formation du</td><td>Sohel et al., 1993</td></tr></tbody></table>
<table>
  <tr>
    <td>F6/987P (fasA)pig</td>
    <td>plasmide</td>
    <td>faisceau de pili, entéroadhésion (spécifique aux EPECt)</td>
    <td>Kwon et al., 2002</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>F18, F107 (fedA)pig</td>
    <td>plasmide</td>
    <td>adhésine fimbriale 987P: Adhérence aux cellules de l'intestin grêle du porc nouveau-né (spécifique au ETEC responsable de l'œdème chez le porc)</td>
    <td>Kwon et al., 2002</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>F41 (fimF41a)pig</td>
    <td>chromosome</td>
    <td>adhésine fimbriale F18: Adhérence aux cellules du l'intestin grêle du porc nouveau-né (spécifique au ETEC responsale de l'œdème chez le porc)</td>
    <td>Kwon et al., 2002</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>lpfAO157</td>
    <td>OI-141-154 (chromosome)</td>
    <td>long polar fimbrial protein: adhésion des EHEC in vitro aux patchs Peyer; formation de micro-colonies</td>
    <td>Doughty et al., 2002</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>lpfAO26</td>
    <td>chromosome</td>
    <td>long polar fimbrial protein: adhésion des EHEC in vitro aux patchs Peyer; formation de micro-colonies</td>
    <td>Doughty et al., 2002</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>lpfAO113</td>
    <td>OI-154 (chromosome)</td>
    <td>long polar fimbrial protein: observé chez les STEC LEE-négatifs (non-O157), produite par les STEC O113:H21</td>
    <td>Doughty et al., 2002</td>
  </tr>
  <tr>
    <td colspan="4"><b>Adhésines non-fimbriae</b></td>
  </tr>
  <tr>
    <td>toxB</td>
    <td>plasmide O157</td>
    <td>Proche de la toxine B de Clostridium difficile: potentielle protéine d'adhésion et régulateur post-transcriptionnel du SSTT, potentiel effet toxique</td>
    <td>Tatsuno et al., 2001</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>efa1/LifA</td>
    <td>OI-122 (chromosome)</td>
    <td>EHEC factor for adherence (efa) (EHEC) et lymphocyte inhibitory factor (lifA) (EPEC): rôle dans la colonisation du tube digestif des bovins (homologue de ToxB) et inhibe l'action des lymphocytes</td>
    <td>Badea et al., 2003</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>iha</td>
    <td>OI-43-48 (chromosome)</td>
    <td>IrgA homologue adhesin: Protéine homologue d'IrgA (Iron-regulated gene homologue) de Vibrio cholerae impliquée dans l'adhésion</td>
    <td>Tarr et al., 2000</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>eibG</td>
    <td>plasmide O113</td>
    <td>E. coli immunoglobulin-binding: protéine de liaison aux immunoglobulines</td>
    <td>Lu et al., 2006</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>saa</td>
    <td>plasmide O113</td>
    <td>STEC autoagglutinating adhesin: Adhésion par autoagglutination observée chez les STEC LEE-négatifs</td>
    <td>Paton et al., 2001</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>orfA/orfB</td>
    <td>Plasmide</td>
    <td>open reading frames A and B (adhesin involved in diffuse adhesion AIDA): adhésion diffuse observée dans les cas d'œdème chez le porc</td>
    <td>Zhao et al., 2009</td>
  </tr>
</table>
<table>
  <tr>
    <td>paa</td>
    <td>plasmide ou<br>chromosome</td>
    <td>porcine attaching- and effacing-associated factor : impliqué dans<br>l'attachement intime des bactéries aux entérocytes et induits des lésions A/E<br>typiques au niveau l'iléon chez le porc</td>
    <td>Vidotto et al., 2013</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>stcE</td>
    <td>plasmide O157</td>
    <td>métalloprotéase et mucinase: protéase contribuant à l'adhésion intime des<br>EHEC O157: H7 à des cellules hôtes par clivage de glycoprotéine de surface</td>
    <td>Grys et al., 2005</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>sab</td>
    <td>plasmide O113</td>
    <td>STEC contributing to biofilm formation : autotransposteur contribuant à la<br>formation de biofilm, adhésion observée chez les EHEC LEE-négatifs</td>
    <td>Buvens et Pierard 2012</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>espP</td>
    <td>plasmide O157</td>
    <td>E. coli secreted protein : Sérine protéase autotransporteur, responsable de<br>l'adhésion aux cellules rectales primaires bovines et de la colonisation des<br>intestins de bovins et effet cytoléthale</td>
    <td>Dziva et al., 2007</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>epeA</td>
    <td>plasmide O113</td>
    <td>serine protease autotransporter of Enterobacteriaceae (SPATE) :<br>autotransporteur observé chez les EHEC LEE-négatifs</td>
    <td>Leyton et al., 2003</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ehaA</td>
    <td>OI-15</td>
    <td>Enterohemorrhagic E coli Autotransporter: favorise l'attachement aux<br>surfaces biotiques type cellule épithéliale primaire et abiotique, associé à un<br>système de sécrétion de type V</td>
    <td>Wells et al., 2008</td>
  </tr>
  <tr>
    <td colspan="4"><strong>Toxines</strong></td>
  </tr>
  <tr>
    <td>subA</td>
    <td>plasmide O113</td>
    <td>Cytotoxine subtilase capable d'induire l'arrêt de la synthèse protéique</td>
    <td>Paton et al., 2004</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ehxA</td>
    <td>plasmide O157</td>
    <td>Enterohemolysin A: cytotoxine capable de lyser les érythrocytes, induit la<br>libération de cytokines inflammatoires</td>
    <td>Lorenz et al., 2013</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>cdt-I</td>
    <td>chromosome ou<br>plasmide</td>
    <td>cytolethal distending toxin ou cyclomoduline: bloque le cycle cellulaire des<br>cellules eucaryotes en phase G2/M</td>
    <td>Nougayrede et al., 2005</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>cdt-III</td>
    <td>chromosome ou<br>plasmide</td>
    <td>cytolethal distending toxin ou cyclomoduline: bloque le cycle cellulaire des<br>cellules eucaryotes en phase G2/M</td>
    <td>Nougayrede et al., 2005</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>cdt-V</td>
    <td>chromosome ou<br>plasmide</td>
    <td>cytolethal distending toxin ou cyclomoduline: bloque le cycle cellulaire des<br>cellules eucaryotes en phase G2/M</td>
    <td>Nougayrede et al., 2005</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>STa (estla)</td>
    <td>plasmide</td>
    <td>Heat-stable toxin a: entérotoxine responsable de l'hyper excrétion de H2O,</td>
    <td>Nagy 2005</td>
  </tr>
</table>
<table><tbody><tr><td>LT (elt)</td><td>plasmide</td><td>Na+ et Cl- favorisant la déshydratation et l'acidose<br>Heat-labile toxin: entérotoxine responsable de l'hyper excrétion de H2O, Na+ et Cl- favorisant la déshydratation et l'acidose</td><td>Nagy 2005</td></tr><tr><td>astA</td><td>plasmide ou chromosome</td><td>EAEC heat-stable enterotoxin (EAST1): entérotoxine associée aux EAEC, responsable de diarrhées aqueuses</td><td>Silva et al., 2014</td></tr><tr><td>hlyA</td><td>plasmide</td><td>alpha-hemolysin: capable de lyser les lymphocytes et les érythrocytes</td><td>Lorenz et al., 2013</td></tr><tr><td>cnf1</td><td>plasmide</td><td>cytotoxic necrotizing factor: lié aux cdt</td><td>Oloomi et Bouzari 2008</td></tr><tr><td>cnf2</td><td>plasmide</td><td>cytotoxic necrotizing factor: lié aux cdt</td><td>Oloomi et Bouzari 2008</td></tr><tr><td colspan="4"><strong>Effecteur non-LEE</strong></td></tr><tr><td>nleB (Z4328)</td><td>OI-122</td><td>interfère avec la réponse immunitaire inflammatoire de l'hôte</td><td>Gao et al., 2013</td></tr><tr><td>nleE (Z4329)</td><td>OI-122</td><td>inhibe la voie NF-Kappa-B</td><td>Vossenkaemper et al., 2010</td></tr><tr><td>nleF (Z6020)</td><td>OI-71</td><td>colonisation du tube digestion des porcelets</td><td>Echtenkamp et al., 2008</td></tr><tr><td>nleG (Z6010)</td><td>OI-71</td><td>activité ubiquitine ligase similaire à des enzymes eucaryotes</td><td>Wu et al., 2010</td></tr><tr><td>nleH1-2(Z6021)</td><td>OI-71</td><td>protéine NleH kinase sérine-thréonine agit contre la réponse immunitaire innée de l'hôte</td><td>Holmes et al., 2012</td></tr><tr><td>nleA(Z6024)</td><td>OI-71</td><td>perturbe la fonction de la barrière intestinale</td><td>Thanabalasuriar et al., 2010</td></tr><tr><td>nleC (Z0986)</td><td>OI-36</td><td>supprime la réponse immunitaire inflammatoire de l'hôte</td><td>Sham et al., 2011</td></tr><tr><td>nleD(Z0990)</td><td>OI-36</td><td>perturbe la fonction de la barrière intestinale</td><td>Long et al., 2014</td></tr><tr><td>nleG2 (Z2149/Z2339)</td><td>OI-57</td><td>activité ubiquitine ligase similaire à des enzymes eucaryotes</td><td>Wu et al., 2010</td></tr><tr><td>nleG5-1</td><td>OI-57</td><td>activité ubiquitine ligase similaire à des enzymes eucaryotes</td><td>Wu et al., 2010</td></tr><tr><td>nleG5-2 (Z2151)</td><td>OI-57</td><td>activité ubiquitine ligase similaire à des enzymes eucaryotes</td><td>Wu et al., 2010</td></tr><tr><td>nleG6-2 (Z2150)</td><td>OI-57</td><td>activité ubiquitine ligase similaire à des enzymes eucaryotes</td><td>Wu et al., 2010</td></tr><tr><td>nleH1-1(Z0989)</td><td>OI-36</td><td>kinase sérine-thréonine agit contre la réponse immunitaire innée de l'hôte</td><td>Holmes et al., 2012</td></tr><tr><td colspan="4"><strong>Résistance/ Persistance</strong></td></tr><tr><td>frrerfkatP</td><td>chromosome</td><td>catalase/péroxidase: protège contre les dommages oxydatifs</td><td>Heimer et al., 2002</td></tr></tbody></table>
<table>
  <tr>
    <td>pagC (Z4321)</td>
    <td>OI-122 (chromosome)</td>
    <td>pagC-like membrane protein lphoP-activated gene C (PagC) : permet la survie dans les macrophages de Salmonella enterica responsable d'infection systémique chez le porc et l'Homme. pagC (Z4321) est la protéine homologue retrouvée chez les STEC</td>
    <td>Nishio et al., 2005</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ecf1</td>
    <td>plasmide O157</td>
    <td>hydrolase présente sur un opéron qui améliore la structure de la membrane bactérienne par la biosynthèse de polysaccharide et impliquée dans l'invasion, spécifique aux STEC LEE-positifs</td>
    <td>Yoon et al., 2005</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>terE (Z1176)</td>
    <td>OI-43-48 (chromosome)</td>
    <td>enzyme impliquée dans la dégradation des tellurites</td>
    <td>Orth et al., 2007</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ureD (Z1142)</td>
    <td>OI-43-48 (chromosome)</td>
    <td>uréase impliquée dans la dégradation de l'urée</td>
    <td>Steyert et Kaper 2012</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>espK (Z1829)</td>
    <td>prophage</td>
    <td>E. coli secreted protein : intervenant dans la formation du piédestal chez O157</td>
    <td>Vlisidou et al., 2006</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>espN</td>
    <td>prophage</td>
    <td>E. coli secreted protein : impliquée dans la persistance des O157 au niveau de l'intestin chez les veaux</td>
    <td>Vlisidou et al., 2006</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>aggR</td>
    <td>plasmide</td>
    <td>régulateur de la transcription de nombreux gènes de virulence chez les EAEC</td>
    <td>Morin et al., 2013</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>pic</td>
    <td>chromosome</td>
    <td>sérine protéase impliquée dans la colonisation chez les EAEC</td>
    <td>Harrington et al., 2009</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>irp2</td>
    <td>HPI (hight pathogenicity island)</td>
    <td>iron responsible protein 2: code une protéine ayant un rôle dans l'absorption du fer chez Yersinia</td>
    <td>Gophna et al., 2001</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>fyuA</td>
    <td>HPI (hight pathogenicity island)</td>
    <td>ferric yersiniabactin uptake A: pour une protéine ayant un rôle dans l'absorption du fer chez Yersinia</td>
    <td>Gophna et al., 2001</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>etpD</td>
    <td>plasmide O157</td>
    <td>effecteur du système de sécrétion de type II en lien avec la sécrétion de StcE</td>
    <td>Tseng et al., 2014</td>
  </tr>
</table>
LISTE DES PUBLICATIONS

Dans le cadre de cette thèse :

* **Balière** C., A. Rincé, S. Delannoy, P. Fach, and M. Gourmelon, Molecular profiling of STEC and EPEC strains isolated from French coastal environments, (soumis à AEM).

* **Balière** C., A. Rincé, J. Blanco, G. Dahbi, J. Harel, P. Vogeleer, J-C. Giard, P. Mariani-Kurdjian and M. Gourmelon, 2015, Prevalence and characterization of Shiga Toxin-producing and enteropathogenic *Escherichia coli* in shellfish-harvesting areas and their watersheds, *Front. Microbiol* 6, 1356.

* **Balière** C., A. Rincé, D. Thevenot, and M. Gourmelon, 2015, Successful detection of pathogenic Shiga-toxin-producing *Escherichia coli* in shellfish, environmental waters and sediment using the ISO/TS-13136 method, *Lett Appl Microbiol* 60, 315-320.

Antérieur à ces travaux :

* King, L. A., E. Loukiadis, P. Mariani-Kurkdjian, S. Haeghebaert, F-X. Weill, **C. Balière**, S. Ganet, M. Gouali, V. Vaillant, N. Pihier, H. Callon, R. Novo, O. Gaillot, D. Thevenot-Sergentet, E. Bingen, P. Chaud, and H. de Valk, 2014, Foodborne transmission of sorbitol-fermenting *Escherichia coli* O157:[H7] via ground beef: an outbreak in northern France, 2011, *Clin Microbiol Infect* 20, O1136-1144.

* Monecke, S., P. Mariani-Kurkdjian, E. Bingen, F-X. Weill, **C. Balière**, P. Slickers, and R. Ehricht, 2011, Presence of enterohemorrhagic *Escherichia coli* ST678/O104:H4 in France prior to 2011, *Appl Environ Microbiol* 77, 8784-8786.

* Monot, M., N. Honoré, **C. Balière**, B. Ji, S. Sow, P. J. Brennan, and S. T. Cole, 2008, Are variable-number tandem repeats appropriate for genotyping *Mycobacterium leprae* ?, J Clin Microbiol 46, 2291-2297.
LISTE DES COMMUNICATIONS ORALES

* **Balière, C.**, Mariani-Kurkdjian, P., Thevenot, D., Rincé, A., Gourmelon. M. Evaluation of the presence of Shiga-toxin-producing *Escherichia coli* in shellfish and in coastal areas. SfAM-MVNA, Summer Conference, Zoonoses. 30 juin au 3 juillet 2014, Brighton, Angleterre.

* **Balière, C.**, Balière, Cl., Courroux, C., Mariani-Kurkdjian, P., Thevenot, D., Fach, P., Delannoy, S., Blanco, J., Dahbi, G., Rincé, A., Gourmelon, M. Prevalence and characterization of STEC in shellfish-harvesting areas and their upstream catchments during a two-year study in France. VTEC 2015 Satellite Symposia – Food Safety from Farm and Field to Plate. 13 sept. 2015, Boston, Etat-Unis.

* M. Gourmelon, **C.Balière, M.P.Caprais, J.Cozien, P.Garry, D.Hervio Heath, C.Hubert, J.C.Le Saux, S.Le Guyader, S.Lozach, S.Parnaudeau, E.Quenot, S.Strubia, A.Veron, Cl.Baliere, Q.Bruey, J.C.Giard, I.Rince, E.Jarde, L.Harrault, L.Jeanneau, P.Petitjean, J.Cheve, A.Rincé** (2015). Recherche de bactéries potentiellement pathogènes et de norovirus dans de zones conchylicoles de Bretagne et Normandie et leurs bassins versants. Identification des sources de contamination fécale. Colloque Qualité et Sécurité des Produits Aquatiques QSPA, Boulogne-sur-Mer.

* M. Gourmelon, **C.Balière, E.Quenot, J.Cozien, S.Lozach, M.P.Caprais, D.Hervio-Heath, J.C.Le Saux, S.Parnaudeau, S.Strubbia, S.Le Guyader, Cl.Balière, Q.Bruey, J.C.Giard, I. Rincé, E.Jardé, A. Rincé** (2015). Occurrence of bacterial and viral enteric pathogens and marine bacteria and discrimination of faecal sources in shellfish-harvesting areas and their catchments in France. Congrès ICMSS2015, Chili.

* M. Gourmelon, **C.Balière, E.Quenot, J.Cozien, S.Lozach, M.P.Caprais, D.Hervio-Heath, J.C.Le Saux, Cl.Balière, Q.Bruey, J.C.Giard, I.Rincé, E.Jardé, S.LeHello, and A.Rincé** (2014). Occurrence of bacterial enteric pathogens and discrimination of faecal sources in shellfish-harvesting areas and their catchments in France. Colloque Temph, Lisbonne.

LISTE DES COMMUNICATIONS AFFICHEES

* **Balière, C.**, Mariani-Kurkdjian, P., Thevenot, D., Rincé, A., Gourmelon. M. Evaluation de la présence des *Escherichia coli* producteurs de Shiga-toxines dans des zones conchylicoles françaises et les bassins versants en amont. 6ème Colloque international francophone de microbiologie animale. 15&16 mai 2014, Toulouse, France.

* **Balière, C.**, Balière, Cl., Courroux, C., Mariani-Kurkdjian, P., Thevenot, D., Fach, P., Delannoy, S., Blanco, J., Dahbi, G., Rincé, A., Gourmelon, M. Prevalence and characterization of STEC in shellfish-harvesting areas and their upstream catchments during a two-year study in France. VTEC 2015 Satellite Symposia – Food Safety from Farm and Field to Plate. 13 sept. 2015, Boston, Etat-Unis.
Abstract

The contamination of coastal areas by potentially pathogenic enteric bacteria is of concern for the sustainability of some uses, such as shellfish farming, recreational shellfish harvesting and bathing. The contamination of these environments may occur through the land-spreading of livestock wastes, animal feces deposited on pastures, wastewaters from slaughterhouses or from municipal wastewater treatment plants. The presence of these bacteria in coastal environment may present a potential risk to human health. In fact, shellfish-borne outbreaks or human infections may occur by the consumption of shellfish from contaminated areas or the ingestion of water during bathing in contaminated waters, respectively. To date, few studies focusing on the presence and the diversity of enteric bacteria, such as pathogenic *Escherichia coli* (*E. coli*) in coastal environments and shellfish have been reported.

The PhD project aimed to (i) evaluate the presence of pathogenic *E. coli*, more precisely, Shiga toxin-producing *E. coli* (STEC) and enteropathogenic *E. coli* (EPEC) in shellfish-harvesting areas and their upstream catchments, (ii) characterize the diversity of isolated STEC and EPEC, (iii) estimate the molecular risk assessment by screening 75 *E. coli* virulence-associated gene targets and then (iv) evaluate the contamination and depuration of oysters in contact with STEC.

For this purpose, during a 2-year study (February 2013 to January 2015), shellfish batches (n=238), freshwater (n=216), seawater (n=12), and surface sediment (n=39) samples from three selected shellfish-harvesting areas and their upstream catchments, were monthly analyzed to evaluate the presence of STEC and EPEC strains. Five percent of samples were positive for the isolation of at least one STEC and 14% for the isolation of at least one EPEC. Twenty-eight STEC and 89 EPEC strains were isolated representing 1% of the total *E. coli* (n=12 016). The isolated STEC and EPEC strains belonged to a high diversity with 75 different serotypes, 79 distinguishable PFGE patterns and 46 distinguishable sequence types. STEC and EPEC strains were distributed into to 15 and 55 virulence profiles, respectively. One STEC strain isolated from a mussel batch, belonging to the serotype O26:H11 *stx1*<sup>+</sup>*eae*<sup>+</sup> displayed 45 additional virulence genes among the 75 investigated genes. Seventy-five percent of EPEC strains displayed between one and 19 virulence genes associated with pathogenicity islands specific to pathogenic *E. coli* involved in human infections.

No difference in the kinetics of the contamination and depuration of oysters by STEC and non-STEC
*E. coli* was found.

To our knowledge, this study is the first to focus on the diversity of STEC and EPEC strains isolated
from coastal environments. This study highlights the weak presence of STECs and EPECs in the
French shellfish-harvesting areas studied and a potential pathogenicity of some strains. The low
prevalence of STEC and EPEC strains in shellfish from B- and C-categories (depuration of shellfish
before commercialization), as well as the decontamination of shellfish by STEC, fast and similar to
that of non-pathogenic *E. coli*, is rather in favor of a limited risk of contamination of shellfish by
STEC in the studied areas. The results obtained during this study are important to better understand
the health risk associated with STEC and EPEC in coastal areas.
Résumé

La contamination des zones littorales par des bactéries entériques potentiellement pathogènes pour l'Homme constitue un problème majeur pour la pérennité de certains usages tels que la conchyliculture, la pêche à pied ou la baignade. Ces bactéries provenant de rejets urbains ou agricoles peuvent atteindre les zones conchylicoles ou de baignade et être impliquées dans des toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) lors de la consommation de coquillages contaminés ou dans des infections par contact avec l'eau de baignade contaminée. Actuellement, très peu de données sont disponibles sur la présence et la diversité des bactéries entériques telles que les *Escherichia coli* (*E. coli*) pathogènes dans les coquillages en France.

Ce sujet de thèse a donc eu pour objectifs : i) d'évaluer la présence de *E. coli* pathogènes de type *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) et de *E. coli* entéropathogènes (EPEC) en zone littorale et plus précisément dans des zones conchylicoles et leurs bassins versants en amont, ii) de caractériser la diversité des souches STEC et de EPEC isolées, iii) d'estimer le risque pathogène de ces souches par la recherche de gènes de virulence et enfin iv) d'évaluer le comportement des souches STEC dans les coquillages par rapport à l'indicateur *E. coli*, vis-à-vis de la cinétique de contamination de décontamination des coquillages.

La présence des *E. coli* pathogènes a été recherchée sur une période de deux ans (Février 2013 à Janvier 2015) dans les coquillages (n=238) de trois zones conchylicoles situées en Bretagne et en Normandie ainsi que dans les eaux aux exutoires des bassins versants (n=216), dans le sédiment (n=39) et l'eau de mer (n=12). Cinq pourcents des échantillons ont permis l'isolement d'au moins une souche STEC et 14 % l'isolement d'au moins une souche EPEC. Un total de 28 souches STEC et 89 souches EPEC différentes ont été isolées dans ces échantillons, représentant 1 % de la totalité des souches *E. coli* isolées (n = 12 016).

Les souches STEC et EPEC isolées présentaient une grande diversité avec 75 sérotypes identifiés, 79 profils phylogénétiques différents et 46 profils ST (Sequence Type). Les souches STEC et EPEC isolées étaient réparties respectivement au sein de 15 et 55 profils de virulence différents. Une souche STEC de sérotype O26 :H11 stx1⁺eae⁺ présentant 45 gènes de virulence sur les 75 gènes recherchés, a été isolée dans un lot de moule. Soixante-quinze pourcents des souches EPEC présentaient entre 1 et 19 gènes de virulence associés à des îlots de pathogénicités caractéristiques de souches *E. coli* pathogènes responsables d'infection grave chez l'Homme, révélant le potentiel pouvoir pathogène de certaines souches.

Enfin, l'étude de la cinétique de contamination de décontamination d'huîtres au contact de souches STEC isolées au cours de cette étude, n'a pas montré de différence de comportement comparé à un *E. coli* non STEC.

Les travaux réalisés au cours de cette thèse sont à notre connaissance les premiers de ce genre. Ils ont permis de mettre en évidence la faible présence de STEC et de EPEC au niveau de zones conchylicoles françaises ainsi que le potentiel pouvoir pathogène de certaines souches. La faible prévalence de souches STEC et EPEC dans les coquillages issus des sites conchylicoles suivis de catégorie B ou C (purification des coquillages avant commercialisation) ainsi que la décontamination des coquillages par les STEC, rapide et similaire à celle des *E. coli* non pathogènes, est plutôt en faveur d'un risque faible de contamination par les STEC des coquillages dans les zones étudiées. Les résultats acquis au cours de cette thèse sont des éléments importants pour mieux appréhender le risque sanitaire lié aux STEC et aux EPEC en zone littorale.