UBO

université de bretagne
occidentale

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

THÈSE / UNIVERSITÉ DE BRETAGNE OCCIDENTALE

sous le sceau de l'Université européenne de Bretagne

pour obtenir le titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE BRETAGNE OCCIDENTALE

Mention : Microbiologie

École Doctorale des Sciences de la Mer

présentée par

Charlotte BALIERE

Laboratoire LSEM Ifremer centre de Brest

LES ESCHERICHIA COLI
POTENTIELLEMENT
PATHOGENES DANS
L'ENVIRONNEMENT
LITTORAL : CAS DES STEC
ET DES EPEC

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Ifremer

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Agence de l'eau
Loire-Bretagne

Thèse soutenue le 28 Janvier 2016

devant le jury composé de :

- Rapporteur : Mme. Maite Muniesa, Professeur,
Université de Barcelona, Espagne

- Rapporteur : Mr. Hubert Brugère, Professeur
Ecole Nationale Vétérinaire, Toulouse

- Examinatrice : Mme. Gwenaelle Le Blay,
Professeur, Université de Bretagne Occidentale, Brest

- Examinateur : Mr. Stéphane Bonacorsi, Professeur,
Praticien Hospitalier, Service de Microbiologie, CNR
associé Escherichia coli, Paris

- Examinatrice : Mme. Anne-Marie Pourcher,
Directeur de recherche, IRSTEA, Unité de Recherche
Gestion Environnement et traitement biologique des déchets,
Rennes

- Directeur de thèse : Mr. Alain Rincé, Professeur,
Université de Caen, Normandie

- Co-directrice de thèse : Mme. Michèle Gourmelon,
## REMERCIEMENTS

Aux membres du jury,

A Madame le Professeur Maite Muniesa et Monsieur le Professeur Hubert Brugère pour avoir accepté d'examiner cette thèse en qualité de rapporteur. Je tiens à vous exprimer toute ma reconnaissance pour le temps passé à l'étude de ces travaux et pour l'intérêt que vous y avez porté.

A Madame le Professeur Gwenaelle Le Blay qui nous a fait l'honneur d'accepter la présidence de ce jury de thèse.

A Madame le Directeur de recherche Anne-Marie Pourcher pour avoir accepté de faire partie de ce jury en qualité d'examinatrice.

A Monsieur le Professeur Stéphane Bonacorsi pour avoir accepté de faire partie de ce jury en qualité d'examineur, pour sa disponibilité et ses conseils avisés.

A Madame le Docteur Michèle Gourmelon et Monsieur le Professeur Alain Rincé pour leur encadrement pendant cette thèse, leur confiance et leur disponibilité.

Un grand merci tout particulièrement à Michèle Gourmelon pour ton aide et pour ton investissement sans limite dans la rédaction des publications et la correction du manuscrit. Merci pour ta confiance et pour m'avoir donner l'opportunité de collaborer avec plusieurs équipes. Ton soutien entant qu'encadrante nous a permis de pouvoir présenter des travaux de qualité.

Je tiens à remercier toutes les personnes avec qui j'ai eu la chance de collaborer dans ce projet, Delphine Thévenot-Sergentet, Josée Harel, Philippe Vogeleer, Jorge Blanco, Ghizlane Dahbi, Sabine Delannoy et Patrick Fach, pour leur disponibilité et leurs conseils pour mener à bien ce projet.
Mille mercis à Madame Patricia Mariani-Kurkdjian pour avoir partagé cette aventure avec moi et pour être toujours présente à mes côtés. Une pensée également pour Monsieur le Professeur Edouard Bingen.

Un grand merci à toute l'équipe du service de Microbiologie de l'Hôpital Robert Debré pour leur accueil si chaleureux et pour ces quelques années supplémentaires passées avec vous. Vous êtes tous chouettes ! Merci tout particulièrement à Céline, Elsa et Audrey.

Je tiens à remercier vivement l'ensemble de l'équipe du laboratoire LSEM pour leur accueil chaleureux et leur bonne humeur et pour tous nos échanges.

Un merci tout particulier à l'équipe LSEM de Plouzané, Joelle, Manue, Solen, Véro, Dominique, Michèle, Jean-Claude et Marie-Paule pour leur accueil et tous les moments partagés dans le labo, sur le terrain mais également en dehors du travail.

Merci à Noémie, Céline, Cyrielle et Natasha pour nos bons moments passés sur Brest et dans le labo.

Merci aux copines, Louise et Nolwenn qui ont partagé ce morceau de cherrin avec moi.

Un grand merci à ma famille, à mes parents, Brigitte et Dominique, pour leur soutien et leur présence. Vous êtes toujours là...

Un énorme merci à ma sœur, Clémence, pour ton soutien et pour le travail que tu as accompli dans ce projet. Je ne pouvais pas espérer mieux que de partager cette expérience d' aussi près avec toi.

A Mamie Huguette
# Sommaire

LISTE DES ABREVIATIONS..................................................................................................................10

LISTE DES FIGURES .................................................................................................................................13

LISTE DES TABLEAUX .................................................................................................................................15

CONTEXTE DE L'ETUDE .................................................................................................................................17

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE .................................................................................................................................21

I. ESCHERICHIA COLI COMMENSAL ET PATHOGENE.................................................................23

A. Généralités concernant l'espèce E. coli..................................................................................23

B. Notion d'habitat primaire et d'habitat secondaire..................................................................24

C. Organisation et dynamique du génome ..................................................................................26

D. E. coli pathogène : définition des pathovars ........................................................................28

E. E. coli commensal et pathogène : notion de classification .................................................................33

1. Classification selon le sérotype ........................................................................................................33

2. Classification selon les phylogroupes ..................................................................................34

3. Classification selon les séropathotypes..................................................................................39

II. E. COLI ENTEROPATHOGENE (EPEC) ET E. COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC) ..................................................................................................................40

A. Présentation des EPEC ..................................................................................................................40

B. Présentation des STEC ..................................................................................................................41

C. Pathologies humaines et animales........................................................................................................44

1. Symptômes liés aux infections par des EPEC ........................................................................44

2. Symptômes liés aux infections par des STEC ........................................................................44

D. Les facteurs de virulence ..................................................................................................................47

1. Les Shiga-toxines .................................................................................................................................47

2. Locus of enterocyte effacement (LEE) ..................................................................................54

3. Autres gènes de virulence ..................................................................................................................56

4. Notion de risque moléculaire........................................................................................................60

E. Réservoirs des EPEC.................................................................................................................................61

F. Réservoirs des STEC.................................................................................................................................61

G. Mode de transmission.................................................................................................................................66

III. ESCHERICHIA COLI DANS L'ENVIRONNEMENT LITTORAL..................................................70

A. Définition de l'environnement littoral........................................................................................................70
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>B. Réglementation sanitaire en zone littorale</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. Les indicateurs de contamination fécale : E. coli et les entérocoques</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. Classification des zones de baignade</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. Classification des zones conchylicoles</td>
      <td>73</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>C. Contamination et décontamination des coquillages</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>D. Sources et apports de E. coli dans l'environnement littoral</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. Sources d'origine urbaine</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. Sources d'origine agricole</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. Sources environnementales : les animaux sauvages</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>E. E. coli de la source à l'environnement littoral</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>MEMOIRE EXPERIMENTAL</td>
      <td>85</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>AXES DE RECHERCHE</td>
      <td>87</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chapitre 1 : CONTEXTE ET DESCRIPTION DES SITES D'ETUDES</td>
      <td>89</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>A. Site sélectionné en Région Bretagne</td>
      <td>89</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>B. Sites sélectionnés en Région Basse-Normandie</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>C. Les paramètres suivis au cours de l'étude globale</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>D. Organisation des prélèvements et des analyses</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chapitre 2 : DETECTION ET ISOLEMENT DES E. COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES APPARTENANT AUX CINQ SEROTYPES MAJEURS DANS L'ENVIRONNEMENT LITTORAL</td>
      <td>95</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>A. Contexte de la première partie de l'étude</td>
      <td>95</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>B. Publication N°1</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chapitre 3 : PREVALENCE ET CARACTERISATION DES E. COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES ET DES E. COLI ENTEROPATHOGENES DANS DES ZONES CONCHYLICOLES FRANCAISES ET LEUR BASSINS VERSANTS</td>
      <td>101</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>A. Contexte de la deuxième partie de l'étude</td>
      <td>101</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>B. Publication N°2</td>
      <td>105</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chapitre 4 : PROFIL DE VIRULENCE DES E. COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES ET DES E. COLI ENTEROPATHOGENES ISOLES EN ZONES CONCHYLICOLES FRANCAISES</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>A. Contexte de la troisième partie de l'étude</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>B. Publication N°3</td>
      <td>111</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
Chapitre 5 : EVALUATION DE LA CINETIQUE DE CONTAMINATION ET DE DECONTAMINATION DE COQUILLAGES AU CONTACT DE SOUCHES STEC ......113

A. Contexte de la quatrième partie de l'étude ....................................................113

B. Matériels et méthodes....................................................................................114

C. Résultats................................................................................................................117

D. Discussion................................................................................................................119

DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ....................................................................121

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES................................................................................131

ANNEXES.................................................................................................................................169

LISTE DES PUBLICATIONS ................................................................................................177

LISTE DES COMMUNICATIONS ORALES........................................................................178

LISTE DES COMMUNICATIONS AFFICHEES ....................................................................178
LISTE DES ABREVIATIONS

<table><tr><td>A/E</td><td>Attachement/Effacement</td></tr><tr><td>AA</td><td>Aggregative adherence</td></tr><tr><td>AAF</td><td>Aérobie-anaérobie facultatif</td></tr><tr><td>aap</td><td>accumulation-associated protein</td></tr><tr><td>ADN</td><td>Acide désoxyribonucléique</td></tr><tr><td>AEEC</td><td>Attaching and Effacing E. coli</td></tr><tr><td>AFSSA</td><td>Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments</td></tr><tr><td>aggA/R</td><td>AraC-like transcriptional activator A/R</td></tr><tr><td>AgH</td><td>Antigène flagellaire H</td></tr><tr><td>AgK</td><td>Antigène capsulaire K</td></tr><tr><td>AgO</td><td>Antigène somatique O</td></tr><tr><td>AIDA</td><td>Adhesin involved in diffuse adhesion</td></tr><tr><td>AIEC</td><td>E. coli à adhérence invasive</td></tr><tr><td>ARN</td><td>Acide ribonucléique</td></tr><tr><td>ARS</td><td>Agence Régionale de la Santé</td></tr><tr><td>a<sub>w</sub></td><td>la disponibilité en eau</td></tr><tr><td>bfp</td><td>bundle-forming pilus gene</td></tr><tr><td>CDC</td><td>Centre for Disease Control and prevention</td></tr><tr><td>Cdt</td><td>Cytolethal distenting toxin protein</td></tr><tr><td>Ces</td><td>Chaperone for E. coli secreted protein</td></tr><tr><td>CF</td><td>Facteur de colonisation</td></tr><tr><td>CG</td><td>Copies de Génome</td></tr><tr><td>CH</td><td>Colite Hémorragique</td></tr><tr><td>CLI</td><td>Chairs et liquides intervalvaires</td></tr><tr><td>CNRS</td><td>Centre National de la Recherche Scientifique</td></tr><tr><td>UFC</td><td>Unité Formant Colonie</td></tr><tr><td>DA</td><td>Diffuse-adherence</td></tr><tr><td>DAEC</td><td>E. coli à adhésion diffuse</td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Escherichia coli</td></tr><tr><td>eae</td><td>E. coli attaching and effacing</td></tr><tr><td>EAEC/EAgg</td><td>E. coli entéroagrégatif</td></tr><tr><td>EAHEC</td><td>E. coli entéro-agrégant hémorragique</td></tr><tr><td>ECDC</td><td>European Centre for Disease Prevention and Control</td></tr><tr><td>ecfl</td><td>E. coli attaching and effacing gene positive conserved fragment 1</td></tr><tr><td>efa</td><td>EHEC factor for adherence</td></tr><tr><td>EFSA</td><td>European Food Safety Authority</td></tr><tr><td>EHEC</td><td>E. coli entérohémorragique</td></tr><tr><td>EHECa</td><td>E. coli entérohémorragique atypique</td></tr><tr><td>EHECt</td><td>E. coli entérohémorragique typique</td></tr><tr><td>EHESP</td><td>Ecole des Hautes Etudes en Santé Publique</td></tr><tr><td>ehxA</td><td>enterohemolysin A</td></tr></table>

<table><tr><td>EIEC</td><td>E. coli entéroinvasif</td></tr><tr><td>EPEC</td><td>E. coli entéropathogène</td></tr><tr><td>EPECa</td><td>E. coli entéropathogène atypique</td></tr><tr><td>EPECt</td><td>E. coli entéropathogène typique</td></tr><tr><td>EPT</td><td>Eau peptonée tamponnée</td></tr><tr><td>Esc</td><td>E. coli secretion protein</td></tr><tr><td>Esp</td><td>E. coli secreted protein</td></tr><tr><td>ETEC</td><td>E. coli entérotoxinogène</td></tr><tr><td>ExPEC</td><td>E. coli extra-intestinaux</td></tr><tr><td>fyuA</td><td>ferric yersiniabactin uptake</td></tr><tr><td>hlyA</td><td>alpha-hemolysin</td></tr><tr><td>ial</td><td>invasion-associated locus</td></tr><tr><td>Iha</td><td>IrgA homologue adhesin</td></tr><tr><td>IMS</td><td>Immuno-Magnetic Separation</td></tr><tr><td>InPEC</td><td>E. coli intestinaux</td></tr><tr><td>ipaH</td><td>invasion plasmid antigen H</td></tr><tr><td>IrgA</td><td>Iron-regulated gene homologue A</td></tr><tr><td>irp2</td><td>Iron responsible protein 2</td></tr><tr><td>ISO</td><td>International Organization for Standardization</td></tr><tr><td>kDa</td><td>Kilo dalton</td></tr><tr><td>LABEO</td><td>Laboratoire d'analyse de la Manche</td></tr><tr><td>LAL</td><td>Localized adherence-like</td></tr><tr><td>LDC</td><td>Lysine décarboxylase</td></tr><tr><td>LEE</td><td>Locus of Enterocyte Effacement</td></tr><tr><td>lifA</td><td>Lymphocyte inhibitory factor</td></tr><tr><td>Lpf</td><td>Long polar fimbriae</td></tr><tr><td>LSEM</td><td>Laboratoire Santé Environnement et Microbiologie</td></tr><tr><td>LT</td><td>Heat-labile toxin</td></tr><tr><td>MAT</td><td>Microangiopathie thrombotique</td></tr><tr><td>MLST</td><td>Multi-Locus Sequence Typing</td></tr><tr><td>nd</td><td>Non déterminé</td></tr><tr><td>NESP</td><td>National Enteric Surveillance Program</td></tr><tr><td>NGS</td><td>Next Generation Sequencing</td></tr><tr><td>nle</td><td>Non LEE-encoded effector</td></tr><tr><td>ODC</td><td>Ornithine décarboxylase</td></tr><tr><td>OI</td><td>Genomic O island</td></tr><tr><td>OMS</td><td>Organisation Mondiale de la Santé</td></tr><tr><td>ORF</td><td>Open Reading Frame</td></tr><tr><td>paa</td><td>porcine attaching-and effacing associated factor gene</td></tr><tr><td>pagC</td><td>PhoP-activated gene C</td></tr><tr><td>Pb</td><td>Paire de base</td></tr><tr><td>pEAF</td><td>Plasmide codant pour le facteur</td></tr><tr><td>PFGE</td><td>Pulsed-Field Gel Electrophoresis</td></tr><tr><td>pic</td><td>Serine protease gene</td></tr><tr><td>PTT</td><td>Purpura Thrombotique</td></tr><tr><td></td><td>Thrombocytopénique</td></tr></table>
<table><tr><td>RBE</td><td>Ressources Biologiques et Environnement</td></tr><tr><td>REMI</td><td>REseau de surveillance Microbiologique de l'Ifremer</td></tr><tr><td>Saa</td><td>STEC autoagglutinating adhesine</td></tr><tr><td>sep</td><td>Secretion of E. coli protein</td></tr><tr><td>SG2M</td><td>Santé Génétique et Microbiologie des Mollusques</td></tr><tr><td>SHU</td><td>Syndrome Hémolytique et Urémique</td></tr><tr><td>SPATE</td><td>Serine protease autotransporter of Enterobacteriaceae</td></tr><tr><td>SSTT</td><td>Système de sécrétion de type III</td></tr><tr><td>ST</td><td>Heat-stable toxin</td></tr><tr><td>ST</td><td>Sequence type</td></tr><tr><td>STEC</td><td>E. coli producteur de Shiga toxines</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Station d'épuration</td></tr><tr><td>Stx</td><td>Shiga-toxine</td></tr><tr><td>subA</td><td>cytotoxine subtilase gene</td></tr><tr><td>TBX</td><td>Trypton-Bile-X-glucuronidase</td></tr><tr><td>TIAC</td><td>Toxi-Infection Alimentaire Collective</td></tr><tr><td>Tir</td><td>Tyrosine phosphorylated protein</td></tr><tr><td>TSA</td><td>Trypticase-caséine-soja</td></tr><tr><td>TSM</td><td>Traceurs de Sources Microbiennes</td></tr><tr><td>UFC</td><td>Unité formant colonie</td></tr><tr><td>USDA/FSIS</td><td>U.S. Department of Agriculture's Food Safety and Inspection Service</td></tr><tr><td>VNC</td><td>Viable non-cultivable</td></tr><tr><td>β-Glu</td><td>β-glucuronidase</td></tr></table>
**Figure 15** : Flux potentiels de *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) et de *E. coli* entéropathogènes (EPEC) et voies potentielles de contamination de l'environnement et de l'Homme. En gris : voie regroupant les effluents, en vert : voie végétale, en bleu clair: voie hydrique, en bleu foncé : voie contact directe ou indirecte, en orange : voie consommation (d'après AFSSA 2003) ......69

**Figure 16** : Représentation schématique de l'environnement littoral................................................70

**Figure 17** : Exigences réglementaires microbiologiques issues du classement des zones conchylicoles [Règlement (CE) n° 854/2004 et arrêté du 06/11/2013 fixant les conditions sanitaires de transfert et de traçabilité des coquillages vivants] ................................................................................................................74

**Figure 18** : Schéma de l'anatomie de l'huître creuse *Crassostrea gigas* (gauche) et de la moule *Mytilus edulis* (droite) ................................................................................................................75

**Figure 19** : Photo de bassin de dépuration d'huîtres ................................................................................77

**Figure 20** : Influence du niveau de pluviométrie sur la pénétration et le ruissellement de fumier épandu sur le sol (d'après Blaustein *et al.*, 2016) ................................................................................................................81

**Figure 21** : Chaîne de contamination des *E. coli* de la source au coquillage. Identification des facteurs abiotiques (jaune) et biotiques (vert) présents au niveau de chaque compartiment agissant sur la survie des *E. coli*. **STEP** : station d'épuration ................................................................................................................82

**Figure 22** : Carte présentant le bassin versant de la baie de la Fresnaye (site 1), situé en région Bretagne et la localisation des points de prélèvements sélectionnés pour l'étude. Le nombre de porcs, de bovins, de volailles et d'habitants présents estimés au niveau des quatre sous-bassins versants principaux et du point de prélèvement en mer sont indiqués (source J. Cheve, Ifremer, Dinard)........90

**Figure 23** : Carte présentant les deux sites sélectionnés en Région Basse-Normandie : le Havre de Regnéville (site 2) et le Havre de la Vanlée (site 3), avec l'identification des points de prélèvements sélectionnés pour l'étude. Nombre d'habitants (hab.) présents dans les villes alentours....................92

**Figure 24** : Organisation du suivi de la cinétique de contamination et de décontamination d'huîtres au contact d'une souche de *E. coli* (*E. coli* stx1 ou *E. coli* stx2 ou *E. coli* 1 ou *E. coli* 2) .................................116

**Figure 25** : Niveaux moyens des concentrations en *E. coli* stx1, *E. coli* 1, *E. coli* stx2 et *E. coli* 2 mesurés dans les huîtres au cours des phases de contamination (T0 à T5h) et de décontamination (T5h à T24h). Représentation du seuil de détection de la méthode de numération par impédancemétrie (ligne)................................................................................................................................................................................118

**Figure 26** : Niveaux moyens des concentrations en *E. coli* stx1, *E. coli* 1, *E. coli* stx2 et *E. coli* 2 mesurés dans l'eau de mer au cours des phases de contamination (T0 à T5h) et de décontamination (T5h à T24h)................................................................................................................................................................................119

**Figure 27** : Répartition des souches de *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) et *E. coli* entéropathogènes (EPEC) et *E. coli* entérohémorragique (EHEC) isolées à partir des échantillons environnementaux prélevés (coquillage en orange, sédiment en gris, eaux en bleu clair et foncé) entre Février 2013 et Janvier 2015 sur le site 1 : Baie de la Fresnaye (A), le site 2 : Havre de Regnéville et le site 3 : Havre de la Vanlée (B). huîtres :L et F ;, moules :G et M et coques :E. eaux de rivière :A, B, C, I, H. sédiments :K et D................................................................................................................................................124
LISTE DES TABLEAUX

**Tableau 1** : Principaux paramètres influençant la survie des bactéries dans l'environnement (d'après van Elsas et al., 2011 et Campos et al., 2013). 25

**Tableau 2** : Sélection de génomes séquencés de souches de E. coli commensaux et pathogènes. 28

**Tableau 3** : Description des pathovars de E. coli. 30

**Tableau 4** : Mise en évidence des phylogroupes de E. coli en fonction des combinaisons de gènes recherchés. 34

**Tableau 5** : Répartition des principaux groupes phylogénétiques de E. coli chez l'Homme, les animaux et dans l'environnement. 36

**Tableau 6** : Classification des sérotypes E. coli en séropathotypes (d'après Gyles 2007, EFSA 2013). 39

**Tableau 7** : Incidence des variants stx sur l'Homme et détection préférentielle des différents variants des gènes stx1 et stx2 codant pour les Shiga-toxines. 51

**Tableau 8** : Sélection d'études évaluant la répartition des variants et sous-variants du gène eae (codant l'intimine) sur des souches LEE-positives, au niveau de différentes sources. 56

**Tableau 9** : Sélection d'études révélant le taux de portage des EPEC dans différents réservoirs et proportion de souches EPECa et EPECt isolées. 63

**Tableau 10** : Sélections d'études révélant le taux de portage des E. coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) dans différents réservoirs et le nombre de souches E. coli entérohémorragiques typiques majeurs (EHEC) isolées. 64

**Tableau 11** : Liste d'épidémies et d'infections liées aux E. coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) et aux E. coli entéropathogènes (EPEC) et identification de la voie de transmission. 67

**Tableau 12** : Réglementation sanitaire microbiologique des eaux intérieures et des eaux côtières et de transition selon la directive 2006/7/CE. 72

**Tableau 13** : Facteur de bioaccumulation de l'indicateur de contamination fécale E. coli dans les huîtres et les moules. nd : non déterminé. 76

**Tableau 14** : Concentrations en E. coli présentes au niveau des fèces humaines et de différentes sources urbaines. 79

**Tableau 15** : Concentrations en E. coli dans les fèces d'animaux d'élevage (d'après Cox et al., 2005, Smati et al., 2015). 80

**Tableau 16** : Concentration en E. coli dans les effluents de porcs, de bovins et de volaille. 80
## CONTEXTE DE L'ETUDE

Le littoral est un lieu où s'exercent de fortes activités urbaines, agricoles, économiques et touristiques. De ces activités, découle une forte pression sur le milieu qui fragilise ces espaces où les activités humaines sont très variées (conchyliculture, pêche récréative et baignade).

La rédution de la contamination du milieu littoral par des microorganismes potentiellement pathogènes pour l'Homme est un enjeu sanitaire majeur pour la pérennité de certains usages littoraux tels que la conchyliculture, la pêche à pied ou la baignade.

Les rejets urbains et agricoles chargés en microorganismes d'origine fécale sont susceptibles de contenir des bactéries potentiellement pathogènes pour l'Homme tels que les *Salmonella spp.*, les *Campylobacter spp.*, les *Listeria spp.*, ainsi que des *Escherichia coli* pathogènes (tels que les *E. coli* producteurs de Shiga-toxines, STEC). Via les rivières, ces bactéries pathogènes peuvent se retrouver en zone littorale et contaminer l'eau de mer et les coquillages filtreurs et fouisseurs qui s'y trouvent (Wilson *et al.*, 1996; Pommepuy *et al.*, 2004; Westrell *et al.*, 2010).

Les coquillages contaminés sont parfois impliqués dans des Toxi-Infections Alimentaires Collectives (TIAC). En France, entre 1996 et 2010, parmis les 11 261 TIAC déclarées, 5 % ont été attribuées à la consommation de coquillages contaminés. Les salmonelles ont été mises en cause dans 8 % des TIAC liées aux coquillages, les autres cas étant liés à la présence de norovirus (54 %) (virus entériques), *Staphylococcus aureus* (4 %), *Vibrio parahaemolyticus* (3 %) (bactérie marine), *Clostridium perfringens* (1 %) ou à la présence de toxines et pour 17 % des cas l'agent en cause n'a pas été identifié (Vaillant *et al.*, 2012).

Actuellement en France, très peu d'études sur la présence de bactéries pathogènes dans l'environnement littoral ont été décrites en dehors de la déclaration obligatoire des TIAC liées à la consommation de coquillages.

Le Laboratoire Santé Environnement et Microbiologie (LSEM), au sein duquel cette thèse a été réalisée, est rattaché au département Ressource Biologie et Environnement (RBE) et à l'unité Santé Génétique et Microbiologie des Mollusques (SG2M), situé sur le site Ifremer de Plouzané (Finistère). Il s'emploie à étudier la présence des pathogènes humains (virus et bactéries) dans les coquillages destinés à la consommation humaine. Le laboratoire étudie également les paramètres environnementaux favorisant les contaminations et travaille sur l'identification de l'origine des sources de contamination par l'utilisation de marqueur de contamination fécale (marqueurs Bacteroidales).
Ce travail de thèse a été initié dans le cadre du projet de recherche Riskmanche (Interreg IVA, Septembre 2012 à Mars 2015), dont l'objectif principal était d'acquérir plus de connaissances sur la présence et la diversité de microorganismes potentiellement pathogènes (virus entériques, bactéries entériques et bactéries marines) dans des coquillages et dans des eaux du littoral français et du littoral anglais et sur le risque sanitaire potentiel asssocié à la présence de ces microorganismes dans l'environnement côtier.

Dans le cadre de ce projet, mon travail de thèse a reposé essentiellement sur la recherche et la caractérisation de souches de *E. coli* pathogènes de type STEC et de *E. coli* entéropathogènes (EPEC) responsables de pathologies digestives (diarrhées aqueuses et colites hémorragiques) ou extra-digestives (Syndrome Hémolytique et Urémique et Purpura Thrombotique Thrombocytopénique).

Naturellement présent au niveau du tube digestif des bovins mais également d'autres animaux à sang chaud, les STEC se retrouvent facilement dans les déjections animales, dans les fumiers, les pâturages, les rivières et les eaux usées urbaines et agricoles. Les EPEC sont préférentiellement retrouvés au niveau du tube digestif de l'Homme mais ils sont aussi détectés au niveau des animaux et sont véhiculés par les eaux usées urbaines, agricoles et environnementales. Situé en aval des zones urbaines et agricoles, le littoral est le réceptable de nombreuses sources potentielles de contamination pouvant conduire les STEC et les EPEC jusqu'aux coquillages.

Une première étude effectuée de 2002 à 2004, au laboratoire LSEM, avait mis en évidence la présence de STEC dans des coquillages du littoral français (huîtres, moules et coques) (Gourmelon et al., 2006) mais l'effet des apports potentiels de contamination par les bassins versants n'avaient pas été pris en compte et aucune caractérisation approfondie des souches isolées n'avait été faite afin d'évaluer leur pouvoir pathogène.

En ce qui concerne les EPEC, aucune étude, à notre connaissance, ne s'est encore intéressée à leur présence au niveau de l'environnement littoral.

Ces aspects ont été pris en compte dans les actions de recherche menées lors de cette thèse :

L'objectif principal de ce travail était d'évaluer la présence et la diversité des STEC et des EPEC dans l'environnement littoral et les bassins versants en amont, sur une période d'étude donnée, en prenant en considération les données environnementales à différentes périodes de l'année et les données liées aux activités en amont. Pour cela, trois questions ont été posées :

* les STEC et les EPEC sont-ils présents au niveau des compartiments qui constituent l'environnement littoral : coquillages, sédiment, eau de mer et eaux douces présentes au niveau des bassins versants ?
* et si présents, quels types de STEC et de EPEC sont présents au niveau de l'environnement littoral et sont-ils proches de ceux retrouvés en santé humaine ?

Enfin,

* les STEC se comportent-ils de la même manière que les *E. coli* utilisés comme indicateur de contamination fécale dans l'environnement littoral?

Pour répondre à ces questions, trois zones de production conchylicole françaises ont été étudiées mensuellement pendant deux ans. Les souches STEC et EPEC isolées au cours de cette étude ont été caractérisées à l'aide de plusieurs approches culturales, immunologiques et moléculaires. Enfin, des expérimentations en microcosmes d'eau de mer ont été mises en place pour étudier le comportement de souches STEC au niveau de coquillages.

Afin de comprendre les approches expérimentales mises en place pour répondre aux questions posées dans ce travail, la première partie de ce rapport se propose de définir ce que sont les *E. coli* commensaux et pathogènes. La deuxième partie décrit, d'un point de vue épidémiologique, les *E. coli* pathogènes sélectionnés dans ce travail, à savoir les STEC et les EPEC. Enfin, la troisième partie s'emploie à définir la présence des *E. coli* dans l'environnement littoral.
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
# I. *ESCHERICHIA COLI* COMMENSAL ET PATHOGENE

## A. Généralités concernant l'espèce *E. coli*

En 1885, l'allemand Theodor Escherich décrit pour la première fois la bactérie *Escherichia coli*, bactérie isolée à partir de selles de nourrissons, qu'il nomma tout d'abord *Bacterium coli* commune. Ce n'est que 70 ans plus tard que le nom de *Escherichia coli* (*E. coli*) est réellement retenu en hommage aux travaux de T. Escherich (Cowan *et al.*, 1954).

Le genre *Escherichia* fait partie de la famille des *Enterobacteriaceae*, appartenant à la classe des γ-protéobactéries. En plus de l'espèce *E. coli*, il existe au sein du genre *Escherichia* cinq autres espèces : *E. albertii*, *E. blattae*, *E. fergusonii*, *E. hermannii* et *E. vulneris*. Chaque espèce présente des caractéristiques biochimiques spécifiques qui permettent de les différencier. Une bactérie du genre *Escherichia* est un bacille à coloration de Gram négative, aérobie-anaérobie facultatif (AAF), possédant une nitrate réductase et une catalase, dépourvue d'oxydase et non halophile. *E. coli* est une bactérie immobile ou mobile avec une structure flagellaire péritriche et non-sporulée. Sa température optimale de croissance est de 37°C. Bactérie non exigeante, elle est capable de croître sur des milieux ordinaires tels que le milieu TSA (trypticase-caséine-soja). *E. coli* est capable de fermenter le lactose et de produire de l'indole et possède différentes enzymes telles que la lysine décarboxylase (LDC), l'ornithine décarboxylase (ODC) et la β-glucuronidase (β-Glu). La majorité des souches fermente le sorbitol. La plupart des caractéristiques biochimiques sont partagées par l'ensemble des *E. coli* en dehors du sérotype O157:H7 qui ne fermente pas le sorbitol, à l'exception de certains mutants qui ont la capacité de fermenter ce sucre (King *et al.*, 2014) et qui sont dépourvus de l'activité β-Glu. Ces caractéristiques particulières sont utilisées pour sa recherche et son isolement dans l'environnement et l'alimentation (ISO 16654:2001).

*E. coli* constitue une espèce bactérienne sous-dominante du microbiote aérobie-anaérobie facultatif intestinale de l'Homme et des animaux. Cette bactérie représente 80 à 90 % des coliformes thermotolérants ou coliformes fécaux (capables de fermenter le lactose à 44,5°C) qui constituent un sous-groupe des coliformes totaux.

Enfin, l'espèce *E. coli* est une bactérie versatile qui comprend, à la fois, des bactéries commensales du tube digestif, des bactéries pathogènes et des bactéries adaptées à l'environnement (Tenaillon *et al.*, 2010).
# B. Notion d'habitat primaire et d'habitat secondaire

## Habitat primaire

E. coli appartient à la microflore commensale de l'Homme et de nombreux animaux. C'est une bactérie colonisatrice du tube digestif des animaux à sang chaud (carnivores, omnivores, herbivores et oiseaux) mais également des reptiles (Gordon et Cowling 2003). Le tractus digestif constitue son habitat primaire. Cette bactérie est présente principalement au niveau du colon et du cæcum à des concentrations environ $> 10^6$ UFC (Unité Formant Colonie)/ g de contenu intestinal (Ducluzeau et Raibaud 1985). E. coli se niche plus particulièrement dans le mucus recouvrant les cellules épithéliales de la paroi du tube digestif qui constitue une niche écologique propice à son développement de par ses conditions de température, d'humidité et de disponibilité en nutriment. La flore bactérienne intestinale aérobie-anaérobie facultative est représentée par E. coli à hauteur de $7,9 \pm 0,5 \log_{10}$ UFC/ g fèces chez l'Homme, de $6,9 \pm 0,5 \log_{10}$ UFC/ g de fèces chez les animaux d'élevages (volailles, porc, mouton, vache) et de $6,2 \pm 0,8 \log_{10}$ UFC/ g de fèces chez les animaux sauvages (sanglier, cerf, lapin) (Smati et al., 2015).

## Habitat secondaire

E. coli est rejeté dans l'environnement via les fèces à une concentration d'environ $10^8$ UFC/ g de fèces (Smati et al., 2015). Il se retrouve dans les eaux environnementales par le biais des effluents, tels que les eaux usées, les lisiers ou les fumiers des animaux d'élevage ou par les déjections des animaux d'élevage ou des animaux sauvages.

L'environnement qui dans cette étude correspond à tout ce qui est à l'extérieur de l'hôte, constitue l'habitat secondaire des E. coli. Il est contrairement à l'habitat primaire plutôt défavorable à leur survie. Dans l'environnement, la bactérie E. coli est soumise à plusieurs types de pression, biotiques (prédation et compétition de flore) et abiotiques (lumière, température, oligotrophie et salinité) (Tableau 1).

E. coli perd plus ou moins rapidement sa capacité à être cultivé sur milieu de culture et par conséquent, ne peut plus être détecté par les méthodes classiques de dénombrement des E. coli. Il évolue vers un état viable mais non-cultivable (VNC) (Darcan et al., 2009). Cependant, il peut conserver une certaine activité métabolique (Pommepuy et al., 1996). Dans des conditions favorables, il peut retrouver sa capacité à se multiplier (Li et al., 2014).
<table><caption>**Tableau 1 :** Principaux paramètres influençant la survie des bactéries dans l'environnement (d'après van Elsas *et al.*, 2011 et Campos *et al.*, 2013)</caption><thead><tr><th>Facteur</th><th>Description</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Biotique</strong></td><td></td></tr><tr><td><strong>Prédation</strong></td><td>Bactéries entériques exogènes utilisées comme source de nutriment par les populations indigènes</td></tr><tr><td><strong>Compétition</strong></td><td>Compétition pour l'accès aux nutriments avec des populations indigènes</td></tr><tr><td><strong>Oligotrophie</strong></td><td>Accessibilité aux sources en nutriment, sédimentation</td></tr><tr><td><strong>Abiotique</strong></td><td></td></tr><tr><td><strong>Radiations solaires</strong></td><td>Dépendantes des saisons et de la zone géographique. Niveau de pénétration des rayons dans l'eau conditionné par les paramètres de diffusion et d'absorption du fluide</td></tr><tr><td><strong>Température</strong></td><td>Variation positive ou négative sur la survie de certains microorganismes. Dépendante des saisons</td></tr><tr><td><strong>Pluviométrie</strong></td><td>Conditionne le taux d'humidité. Impacte les débits des rivières, conduit à la dilution des polluants drainés, participe à la remise en suspension de la matière organique</td></tr><tr><td><strong>Texture du sol</strong></td><td>Sableux, vaseux, sec, humide, dur ou mou</td></tr><tr><td><strong>pH</strong></td><td>Milieu acide dû au compostage, à la fermentation ou aux traitements chimiques</td></tr><tr><td><strong>Salinité</strong></td><td>Responsable du choc osmotique, surtout observé en eau de mer</td></tr></tbody></table>

La population de *E. coli* dans l'habitat secondaire se renouvelle par les apports de bactéries provenant de l'habitat primaire. Une minorité de *E. coli* est capable de coloniser et de persister dans l'environnement hors de son hôte (Walk *et al.*, 2007). Cette population de *E. coli* dite colonisatrice de l'environnement est qualifiée de population naturalisée (Ishii *et al.*, 2006) ou de coliformes du microbiote environnemental (Walk *et al.*, 2007) (Figure 1). Si cette population naturalisée s'établit dans le temps, elle devient une nouvelle communauté microbienne autochtone.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 1** : Cycle de vie de *E. coli* (d'après Ishii et Sadowski 2008)</figcaption></figure>

Ce processus d'adaptation ou de naturalisation dans l'environnement secondaire a été observé au niveau de coliformes fécaux environnementaux avec l'identification de *E. coli* ayant développé la capacité à produire une capsule pour se protéger des agressions extérieures (Power et al., 2005). La présence importante de gènes associés au mécanisme de formation de biofilms dans des souches de *E. coli* environnementales versus les souches fécales suggère également une adaptation des souches de *E. coli* pour une meilleure survie dans l'environnement (Tymensen et al., 2015). De même, pour résister à la pression exercée par le manque d'eau dans certains sols et au choc osmotique provoqué par la présence de sel en eau de mer, les souches de *E. coli* ont développé une capacité à produire des solutés organiques type tréhalose pour résister à la dessiccation et à la salinité (Zhang et Van 2012).

C. Organisation et dynamique du génome

*E. coli* est l'espèce bactérienne la plus étudiée à ce jour. C'est au sein de cette espèce qu'il existe le plus de génomes disponibles, entièrement séquencés et annotés : environ 3 690 génomes de *E. coli* étaient disponibles dans GenBank, en Novembre 2015. *E. coli* K12 MG1655, dont le génome a été totalement séquencé en 1997 (Blattner *et al.*, 1997) est la souche la plus étudiée.

L'ensemble des gènes de l'espèce *E. coli* constitue le pan-génome de cette espèce bactérienne où actuellement plus de 18 000 gènes ont été répertoriés (van Elsas et al., 2011). Le nombre de gènes présent chez *E. coli* varie d'une souche à l'autre en fonction de l'acquisition ou de la délétion de certains gènes. Le pan-génome de *E. coli* se compose de trois parties (Figure 2) :

* **le core-génome** ou le génome universel qui regroupe les gènes communs à toutes les souches, c'est la partie stable du génome. Le core-génome code les fonctions vitales de la cellule et il est considéré comme étant la colonne vertébrale de l'information génétique
nécessaire pour l'accomplissement des fonctions vitales de la cellule (Dobrindt 2005). Cette
partie regroupe environ 2 000 gènes et représente environ 11 % du pan-génome de *E. coli*.

* **le génome unique** regroupe les gènes spécifiques à une souche. C'est une partie variable, non commune à toutes les souches, qui code des protéines impliquées dans l'amélioration de la « fitness » de la bactérie (capacité d'ajuster son métabolisme en fonction des conditions environnementales, afin de survivre et de croître), dans des mécanismes de colonisation et d'adaptation de la bactérie aux différentes conditions environnementales rencontrées. Cette partie variable est considérée comme l'information génétique propre à chaque souche. Elle est composée pour une grande majorité de régions ORFs (Open Reading Frame) sans fonction évidente et est conditionnée par la présence d'éléments génétiques mobiles tels que les plasmides, les bactériophages ou les îlots de pathogénicité. Ces éléments sont intégrés dans le chromosome bactérien ou bien répliqués de manière indépendante grâce à la machinerie cellulaire (Dobrindt et al., 2010). Cette partie regroupe environ 63 % du pan-génome.

* **le génome périphérique** ou volatil regroupe l'ensemble des gènes présents uniquement dans un sous-ensemble de souches. Cette partie est utilisée pour distinguer les souches entre elles et elle est notamment porteuse de l'information concernant les sérotypes. La fonction de la plupart des gènes dans cette catégorie est mal connue. Cette partie représente environ 26 % du pan-génome.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 2** : Représentation de la composition du génome moyen de *E. coli* (d'après van Elsas *et al*., 2011).</figcaption></figure>

Le génome moyen de *E. coli* varie entre 4 500 et 5 900 kilopaires de base (Kpb) selon qu'il s'agisse d'une souche commensale ou d'une souche pathogène. Plus précisément, la comparaison de 61 gènes de *E. coli* a montré que le nombre de gènes d'une souche pouvait varier de 4 087 pour le plus petit génome, correspondant à une souche commensale, à 5 429, correspondant à une souche pathogène de sérotype O157:H7 (Lukjancenko *et al*., 2010) (Tableau 2).
<table><caption>**Tableau 2** : Sélection de génomes séquencés de souches de *E. coli* commensaux et pathogènes.</caption><thead><tr><th>Souche E. coli</th><th>Taille (Kpb)</th><th>Nombre de gène</th><th>Caractéristique</th><th>Numéro d'accession</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>BL21 (DE3)</td><td>4 557</td><td>4 087</td><td>E. coli commensal</td><td>AM946981</td><td>Lukjancenko et al., 2010</td></tr><tr><td>K12 MG1655</td><td>4 639</td><td>4 149</td><td>E. coli commensal</td><td>U00096</td><td>Blattner et al., 1997</td></tr><tr><td>ONT:H10 101-1</td><td>4 979</td><td>4 607</td><td>EAEC<sup>a</sup></td><td>AAMK00000000</td><td>Rasko et al., 2008</td></tr><tr><td>O6 :H31</td><td>5 215</td><td>4 704</td><td>ExPEC<sup>b</sup></td><td>AAJU00000000</td><td>Rasko et al., 2008</td></tr><tr><td>O104 :H4</td><td>5 270</td><td>5 092</td><td>Hybride EHEC<sup>c</sup>- EAEC : (épidémie Allemagne)</td><td>CP003289</td><td>Ahmed et al., 2012</td></tr><tr><td>O148 :H28 B7A</td><td>5 300</td><td>4 648</td><td>ETEC<sup>d</sup></td><td>AAJT00000000</td><td>Rasko et al., 2008</td></tr><tr><td>O103 :H2 E22</td><td>5 528</td><td>5 105</td><td>EPEC<sup>e</sup></td><td>AAJV00000000</td><td>Rasko et al., 2008</td></tr><tr><td>O157 :H7 Sakai</td><td>5 594</td><td>5 230</td><td>EHEC (épidémie Japon)</td><td>BA000007</td><td>Hayashi et al., 2001</td></tr><tr><td>O157 :H7 EDL933</td><td>5 620</td><td>5 312</td><td>EHEC (épidémie Etats-Unis)</td><td>AE005174</td><td>Perna et al., 2001</td></tr><tr><td>O157 :H7 EC4486</td><td>5 933</td><td>5 429</td><td>EHEC</td><td>ABHS00000000</td><td>Lukjancenko et al., 2010</td></tr></tbody></table>

Le séquençage de nouveaux génomes de *E. coli* permet de mettre en évidence de nouvelles séquences caractéristiques de *E. coli* pathogènes ou naturalisés très utiles pour une meilleure connaissance des différents profils que cette bactérie peut avoir.

## D. *E. coli* pathogène : définition des pathovars

Les souches de *E. coli* pathogènes sont capables de se multiplier et de persister dans le tractus digestif de l'hôte en contournant les défenses immunitaires et d'induire des dommages cellulaires. L'étude des différents modes d'interactions entre l'hôte et la bactérie lors des infections permet de classer les souches de *E. coli* pathogènes en deux principaux pathotypes regroupant les pathogènes extra-intestinaux (ExPEC), responsables d'infections urinaires, de méningites chez les nouveaux-nés ou de septicémies et les pathogènes intestinaux (InPEC) responsables de maladies entériques (Dobrindt et al., 2003, Dobrindt 2005, Kern Benaibout 2006).

Au sein de ces pathotypes, il existe une classification basée sur le phénotype de virulence de chaque souche prenant en considération les facteurs de virulence, l'environnement colonisé, les caractéristiques d'invasion et les pathologies induites (Müller et al., 2007, Croxen et al., 2013). Cette

<footnote><sup>a</sup>EAEC : *E. coli* entéroagrégatif ; <sup>b</sup>ExPEC : *E. coli* extra-intestinaux ; <sup>c</sup>EHEC : *E. coli* entérohémorragique ;</footnote>

<footnote><sup>d</sup>ETEC : *E. coli* entérotoxinogène ; <sup>e</sup>EPEC : *E. coli* entéropathogène.</footnote>
classification permet de classer les *E. coli* intestinaux en plusieurs variants pathogènes appelés « pathovars » : les *E. coli* entéropathogènes (EPEC), les *E. coli* entéroinvasifs (EIEC), les *E. coli* entéroagrégatifs (EAgg ou EAEC), les *E. coli* entérotoxinogènes (ETEC), les *E. coli* à adhésion diffuse (DAEC) et les *E. coli* entérohémorragiques (EHEC) (Tableau 3).

*E. coli* peut devenir pathogène par l'acquisition, la délétion ou l'inactivation de certains éléments génétiques mobiles (transposon, phage, plasmide,...). A titre d'exemple, les STEC sont des *E. coli* ayant acquis, par un bactériophage, des gènes codant pour une toxine (la Shiga-toxine) (Figure 3).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 3** : Vue d'ensemble des phénomènes d'acquisition et de délétion de gènes chez *E. coli* appartenant aux différents pathovars (d'après Croxen *et al*., 2013).</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 3 : Description des pathovars de E. coli</caption><thead><tr><th>Pathovars</th><th>Hôtes</th><th>Sites de colonisation</th><th>Maladie</th><th>Réservoirs et sources</th><th>Traitements</th><th>Adhésion</th><th>Marqueurs génétiques</th><th>Sérotypes ou sérogroupes majeurs</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>EPECt<br>E. coli<br>entéropathogène<br>typique</td><td></td><td></td><td></td><td>Humain</td><td>Réhydratation, antibiotique en cas de persistance des symptômes</td><td>Attachement et effacement</td><td>eae, bfp</td><td>O55 :[H6]<sup>b</sup>,<br>O86 :H34,<br>O111 :[H2],<br>O114 :H2,<br>O119 :[H6],<br>O127 :H6,<br>O142 :H6,<br>O142 :H34</td><td>Trabulsi et al., 2002,<br>Afset et al., 2003,<br>Chen et Frankel<br>2005, Varela et al.,<br>2015</td></tr><tr><td>EPECa<br>E. coli<br>entéropathogène<br>atypique</td><td>Enfant &lt; 5 ans, adulte</td><td>Intestin grêle</td><td>Diarrhée aqueuse abondante</td><td>Humain, animal</td><td></td><td></td><td>eae, absence de bfp</td><td>O26 :[H11],<br>O55 :[H7],<br>O55 :H34,<br>O86 :H8,<br>O111 :[H8],<br>O111 :[H9],<br>O111 :H25,<br>O119 :H2,<br>O125 :H6,<br>O128 :H2</td><td></td></tr><tr><td>EHEC (STEC)<br>E. coli<br>entérohémorragique</td><td>Adulte, enfant</td><td>Iléon distal, colon</td><td>Diarrhée aqueuse, colite hémorragique, SHU</td><td>Humain, animal, aliment, eau</td><td>Hydratation, traitement symptomatique</td><td>Attachement et effacement <sup>a</sup></td><td>stx, eae (présence ou absence selon les souches)</td><td>O26, O45,<br>O103, O111,<br>O121, O145,<br>O157, O91</td><td>Croxen et al., 2013,<br>Beutin et Fach 2014</td></tr><tr><td>EIEC/Shigella<br>E. coli</td><td>Enfant &lt; 5 ans, adulte,</td><td>Colon</td><td>Shigellose/dysenterie bacillaire</td><td>Humain, animal,</td><td>Réhydratation, antibiotique</td><td>Absence (invasif)</td><td>ipaH, ial, stx</td><td>O28, O29,<br>O112, O124,<br>O136, O143,</td><td>Van den Beld et<br>Reubsaet 2012,<br>Schroeder et Hilbi</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>entéroinvasif</td><td>voyageurs,<br/>Patients immuno-déprimé</td><td>potentiel SHU</td><td>aliment, eau</td><td></td><td></td><td>O144, O152, O159, O164, O167 (HNM)</td><td>2008</td></tr><tr><td>EAEC<br/>E. coli<br/>entéroagrégatif</td><td>Adulte<br/>Enfant</td><td>Intestin grêle et/ou colon</td><td>Diarrhée du voyageur, SHU (stx<sup>+</sup>)<br/>Diarrhée persistante</td><td>Aliment, Adulte occasionnelle ment<br/>Réhydratation, antibiotique<br/>Réhydratation, antibiotique, potentiel probiotique</td><td>Formation en briques empilées et/ou invasif<br/>aggA, aggR, aap pic, pAA</td><td>O3, O15, O44, O86, O77, O111, O127</td><td>Huang et al., 2006, Harrington et al., 2006, Johnson et Nolan 2009</td></tr><tr><td>ETEC<br/>E. coli<br/>entérotoxinogène</td><td>Patient immuno-déprimé, enfant &lt; 5 ans, voyageurs</td><td>Intestin grêle</td><td>Diarrhée aqueuse et persistante</td><td>Aliment, eau, humain, animal</td><td>Fluoroquinolones, Réhydratation, antibiotique</td><td>Facteur de colonisation (FC)</td><td>O6, O8, O11, O15, O20, O25, O27, O78, O128, O148, O149, O159, O173</td></tr><tr><td>DAEC<br/>E. coli à<br/>adhérence diffuse</td><td>Enfant (cas plus sévères entre 18 mois et 5 ans),<br/>Adulte</td><td>Intestin (localisation incertaine)</td><td>Diarrhée aqueuse abondante<br/>Peut contribuer au développement de la maladie de Crohn</td><td>inconnu</td><td>Réhydratation<br/>Adhésion diffuse et/ou invasive</td><td>Gène de l'opéron dra (Afa/Dr)</td><td>O1, O4, O6, O17, O75, O77</td></tr></table>
<table><tr><td>AIEC</td><td>Adulte et enfant</td><td>Intestin grêle</td><td>Maladie de Crohn</td><td>inconnu</td><td>Antibiotique, intervention chirurgicale</td><td>Absence (invasif)</td><td>Non identifié</td><td>O2, O6</td><td>Nash et al., 2010</td></tr></table>

a seulement pour les STEC LEE-positifs, pas pour les STEC LEE-négatifs

b : antigène H parfois absent ou non exprimé

SHU : Syndrome Hémolytique et Urémique

eae : E. coli attaching and effacing

bfp : bundle-forming pilus

stx : shiga-toxin

ipaH : invasion plasmid antigen H

ial : invasion-associated locus

aggA, aggR : AraC-like transcriptional activator A/R

aap : accumulation-associated protein

pic : serine protease

paa : virulence plasmid

CF : colonisation factor

LT : heat-labile toxin

ST : heat-stable toxin

Afa/Dr : famille « Dr blood group antigen adhesin»
E. coli est une espèce bactérienne avec un génome présentant une forte plasticité conduisant, par exemple, à l'apparition de nouveaux pathovars. Récemment, une souche hybride EAEC et STEC a été isolée chez des patients en 2011, en Allemagne (Frank et al., 2011) et en France (King et al., 2012). L'importante épidémie en Allemagne a touché 4 321 personnes dont 900 patients qui ont développé un Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU) et a causé plus de 50 décès (Frank et al., 2011). Cette souche a été identifiée comme étant un E. coli de sérotype O104:H4, possédant les gènes caractéristiques des EAEC (gènes *aggA*, *aggR*, *pic* et *aap*) et celui codant pour la Shiga-toxine de type 2 typique des STEC (gène *stx2*), faisant apparaître un nouveau pathovar dénommé E. coli entéroagrégant-hémorragique, EAHEC (Brzuszkiewicz et al., 2011). D'autres souches de E. coli hybrides EAHEC ont également été décrites dans d'autres études : E. coli de sérotype O111:H2 en France (Morabito et al., 1998) et E. coli de sérotype O111:H21 en Irlande (Dallman et al., 2012). Récemment, d'autres souches de E. coli hybrides ont été recensées ; trois souches de E. coli (hybride STEC/ETEC) de sérotypes O101:H33, O2:H25 et O2:H27, possédant les gènes codant la Shiga-toxine des STEC et une toxine ST (*heat-stable toxin*) caractéristique des ETEC (Nyholm et al., 2015), une souche de E. coli (hybride EPEC/ETEC) possédant le gène *eae* des EPEC et le gène codant la toxine LT (*heat-labile toxin*) caractéristique des ETEC (Dutta et al., 2015) et enfin une souche de E. coli de sérotype O80:H2 possédant à la fois des caractéristiques des E. coli ExPEC et des STEC (Mariani-Kurkdjian et al., 2014).

## E. E. coli commensal et pathogène : notion de classification

Malgré la diversité des génomes de E. coli et les nombreuses variations dues aux phénomènes d'acquisition et de délétion de gènes, plusieurs approches moléculaires ont permis d'élaborer une signature génétique permettant de classer l'espèce E. coli indépendamment des notions de E. coli commensal et pathogène.

### 1. Classification selon le sérotype

Comme toutes les autres entérobactéries, E. coli possède trois antigènes majeurs. L'antigène somatique O (Ag O) est un composant du lipopolysaccharide qui entre dans la composition de la membrane externe des bacilles Gram négatif. Les gènes codant les enzymes impliquées dans la synthèse de l'antigène O sont regroupés dans le cluster de gènes *rfb*. L'antigène flagellaire H (AgH) est de nature protéique et entre dans la construction du flagelle permettant la mobilité de la bactérie. Il est généralement codé par le gène *fliC*. Cependant, certaines souches perdent leur mobilité et sont classées comme non mobiles (NM ou H-). L'antigène capsulaire K (Ag K) est une protéine de surface. La méthode généralement utilisée pour la classification des E. coli par sérotypage est basée sur le schéma décrit par Kauffmann (1947), qui associe ces différents antigènes transmis verticalement par les E. coli à la génération suivante (Nataro et Kaper 1998).
La méthode immunologique de typage par agglutination sur lame à l'aide d'immunsérums spécifiques est un moyen rapide mais non exhaustif de typer les souches (Guinée *et al.*, 1981). La détection par biologie moléculaire des gènes impliqués dans la biosynthèse de l'AgO (wzx et wzy) et du gène *fliC* pour l'AgH est un autre moyen d'identifier le sérotype des souches. Selon ce schéma de classification, il existerait plus de 174 sérogroupes O, 80 sérogroupes K et 56 sérogroupes H différents avec plus de 9 000 combinaisons possibles (Karmali *et al.*, 2010).

## 2. Classification selon les phylogroupes

Un phylogroupe se définit par l'étude phylogénétique qui s'intéresse à la classification des individus en groupes selon l'identification de critères moléculaires communs. En 1984, les travaux d'Ochman et Selander ont permis de répartir les souches de *E. coli* en quatre grands groupes phylogénétiques (A, B1, B2 et D) par l'analyse du polymorphisme électrophorétique de 11 enzymes métaboliques de 2 600 souches isolées chez l'Homme et des animaux et provenant des différents continents (Ochman et Selander 1984). Ces travaux ont été confirmés par la suite avec des techniques de génotypage comme le ribotypage puis affinés par Multi-Locus Sequence Typing (MLST) et le séquençage génomique de nombreuses souches mettant en évidence la présence des quatre groupes phylogénétiques majeurs A, B1, B2 et D précédemment décrits ainsi que trois groupes mineurs nommés C, E et F. (Jaureguy *et al.*, 2008, Escobar-Paramo *et al.*, 2004). Cette classification ne cesse de s'affiner avec l'apparition de nouveaux sous-phylogroupes (A₀, A₁, B₂, B₂₃, D₁, D₂) (Smati *et al.*, 2013) et de clades ou branches (clades I à V) (Clermont *et al.*, 2011, Clermont *et al.*, 2013) (Tableau 4).

<table><caption>**Tableau 4** : Mise en évidence des phylogroupes de *E. coli* en fonction des combinaisons de gènes recherchés.</caption><thead><tr><th>Phylogroupes</th><th>Méthodes</th><th>Gènes cibles</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>A, B1, B2 et D</td><td>PCR</td><td>chuA<sup>a</sup>, yjaA<sup>b</sup> fragment d'ADN TSPE4.C2<sup>c</sup></td><td>Clermont et al., 2000</td></tr><tr><td>A, B1, B2, D, E et F<br>Clades I à V</td><td>PCR</td><td>chuA<sup>a</sup>, yjaA<sup>b</sup> fragment d'ADN TSPE4.C2<sup>c</sup>, arpA<sup>d</sup></td><td>Clermont et al., 2013</td></tr><tr><td>A₀, A₁, B₂, B₂₃, D₁, D₂</td><td>PCR</td><td>chuA<sup>a</sup>, yjaA<sup>b</sup> fragment d'ADN TSPE4.C2<sup>c</sup></td><td>Smati et al., 2013</td></tr><tr><td>A, B1, B2, C, E et D</td><td>Typage<br>moléculaire<br>/Séquençage</td><td>trpA<sup>e</sup>, trpB<sup>e</sup>, pabB<sup>f</sup>, putP<sup>g</sup>, icd<sup>h</sup>, polB<sup>i</sup></td><td>Escobar-Páramo et al., 2004</td></tr></tbody></table>

<footnote><sup>a</sup> codant une protéine impliquée dans le transport de l'hème, <sup>b</sup> codant une protéine de fonction inconnue, <sup>c</sup> codant une lipase estérase, <sup>d</sup> codant une protéine régulatrice, <sup>e</sup> gène de l'opéron tryptophane, <sup>f</sup> codant une p-aminobenzoate synthase, <sup>g</sup> codant une proline perméase, <sup>h</sup> codant une isocitrate déshydrogénase, <sup>i</sup> codant la polymérase Pol II.</footnote>
La prévalence et la répartition des *E. coli* appartenant aux phylogroupes principaux A, B1, B2 et D chez les mammifères est conditionnée par les caractéristiques de l'hôte (alimentation, morphologie du tube digestif et masse corporelle) et par les facteurs environnementaux (climat et géo-localisation) (Tenaillon *et al.*, 2010).

A partir des études recensées dans le Tableau 5, l'étude de Gordon et al., en 2015 qui porte sur un nombre plus élevé de souches de *E. coli* que les autres, a mis en évidence une majorité de souches de phylogroupe B2 chez l'Homme. En parallèle, la revue de plusieurs études réalisée par Tenaillon et al., en 2010 a également mis en évidence une prévalence plus marquée des phylogroupes B2 et A chez l'Homme.

Chez les animaux, les phylogroupes B1 et A sont les plus souvent retrouvés au sein du tube digestif des animaux qu'ils soient d'élevage (bovins, porcs, volaille, chèvres, moutons) ou sauvages (oiseaux, sangliers, mouflons) comme il avait déjà été démontré dans l'étude d'Escobar-Paramo et al., en 2006. Dans l'environnement (eau, effluents et sols), les phylogroupes B1 et A semblent être les plus fréquemment retrouvés.

L'analyse de l'arbre phylogénétique obtenu lors de l'étude d'Escobar-Paramo et al., en 2004 a permis de mettre en évidence la répartition de différents types de *E. coli* commensaux et pathogènes. Dans cette étude, 98 souches de *E.coli* (10 EAEC, 16 DAEC, 11 STEC dont 9 EHEC, 6 EPEC, 8 ETEC, 9 ExPEC, 5 *Shigella*/ETEC et des souches de *E. coli* commensales) ont été analysées par la méthode de typage moléculaire par séquençage des six gènes chromosomiques de ménage *trpA*, *trpB*, *pabB*, *putP*, *icd* et *polB* (Figure 4).

Selon cette étude, les *E. coli* commensaux semblent faire partie préférentiellement du phylogroupe A. Les souches virulentes de *E. coli* responsables d'infection extra-intestinales (ExPEC) semblent majoritairement associées au phylogroupe B2 et en minorité au phylogroupe D. Les souches responsables de diarrhées chroniques légères telles que les EPEC ne semblent pas être classées spécifiquement parmi un phylogroupe bien que certaines études les associent préférentiellement au phylogroupe B1 (Reid et al., 2000, Wang et al., 2013). Les *E. coli* pathogènes producteurs de toxines comme les EHEC se répartissent préférentiellement entre les phylogroupes A et B1, ce qui est également soutenu par deux études récentes (Badouei et al., 2015, Martins et al., 2015). Toutefois, certaines de ces souches telles que celles de sérotype O157:H7 appartiennent au phylogroupe E (Girardeau et al., 2005).
<table><caption>**Tableau 5** : Répartition des principaux groupes phylogénétiques de *E. coli* chez l'Homme, les animaux et dans l'environnement.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Catégories</th><th rowspan="2">Genres</th><th rowspan="2">Nombre de souches E. coli</th><th colspan="5">Répartition (%)</th><th rowspan="2">Phylogroupes dominants</th><th rowspan="2">Pays</th><th rowspan="2">Références</th></tr><tr><th>A</th><th>B1</th><th>B2</th><th>D</th><th>autres</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Homme</td><td>Homme</td><td>4 957</td><td>8,1</td><td>13,9</td><td>47</td><td>23,5</td><td>7,5</td><td>B2</td><td>Australie</td><td>Gordon et al., 2015</td></tr><tr><td>Homme</td><td>94</td><td>40,4</td><td>8,5</td><td>12,8</td><td>38,3</td><td>0</td><td>A/D</td><td>Brésil</td><td>Carlos et al., 2010</td></tr><tr><td>Homme</td><td>98</td><td>31</td><td>13</td><td>33</td><td>21</td><td>2</td><td>A/B2</td><td>France</td><td>Smati et al., 2013</td></tr><tr><td rowspan="10">Animaux d'élevage</td><td>Bovin</td><td>50</td><td>28</td><td>58</td><td>0</td><td>14</td><td>0</td><td>B1</td><td>Brésil</td><td>Carlos et al., 2010</td></tr><tr><td>Bovin</td><td>13</td><td>46,2</td><td>38,5</td><td>0</td><td>7,7</td><td>7,6</td><td>A</td><td>Iran</td><td>Badouei et al., 2015</td></tr><tr><td>Porc</td><td>39</td><td>53,8</td><td>23,1</td><td>5,1</td><td>17,9</td><td>0</td><td>A</td><td>Brésil</td><td>Carlos et al., 2010</td></tr><tr><td>Chèvre</td><td>16</td><td>18,8</td><td>81,3</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>B1</td><td>Brésil</td><td>Carlos et al., 2010</td></tr><tr><td>Chèvre</td><td>12</td><td>0</td><td>100</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>B1</td><td>Japon</td><td>Ishii et al., 2007</td></tr><tr><td>Mouton</td><td>130</td><td>5,7</td><td>90</td><td>0</td><td>4,3</td><td>0</td><td>B1</td><td>Brésil</td><td>Martins et al., 2015</td></tr><tr><td>Mouton</td><td>18</td><td>11,1</td><td>88,9</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>B1</td><td>Iran</td><td>Badouei et al., 2015</td></tr><tr><td>Mouton</td><td>29</td><td>13,8</td><td>68,7</td><td>0</td><td>17,5</td><td>0</td><td>B1</td><td>Brésil</td><td>Carlos et al., 2010</td></tr><tr><td>Volaille</td><td>13</td><td>76,9</td><td>15,4</td><td>7,7</td><td>0</td><td>0</td><td>A</td><td>Brésil</td><td>Carlos et al., 2010</td></tr><tr><td>Volaille</td><td>363</td><td>53,1</td><td>19,3</td><td>4,4</td><td>23,1</td><td>0</td><td>A</td><td>Italie</td><td>Pasquali et al., 2015</td></tr><tr><td rowspan="3">Animaux sauvages</td><td>Oiseau</td><td>134</td><td>8,2</td><td>49,2</td><td>22,3</td><td>20,3</td><td>0</td><td>B1</td><td>Australie</td><td>Gordon et Cowling 2003</td></tr><tr><td>Oiseau</td><td>237</td><td>17,5</td><td>40</td><td>17,9</td><td>6,9</td><td>17,7</td><td>B1</td><td>Australie</td><td>Blyton et al., 2015</td></tr><tr><td>Buse</td><td>36</td><td>47,2</td><td>8,3</td><td>13,9</td><td>30,5</td><td>0</td><td>A/D</td><td>Portugal</td><td>Radhouani et al., 2012</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>Renard</td><td>22</td><td>31</td><td>18,2</td><td>9,1</td><td>41</td><td>0</td><td>A/D</td><td>Portugal</td><td>Radhouani et al., 2013</td></tr><tr><td>Animaux aquatiques</td><td>Poisson</td><td>12</td><td>0</td><td>91,7</td><td>8,3</td><td>0</td><td>0</td><td>B1</td><td>Australie</td><td>Gordon et Cowling 2003</td></tr><tr><td>Batraciens</td><td>Grenouille</td><td>13</td><td>7,7</td><td>84,6</td><td>0</td><td>7,7</td><td>0</td><td>B1</td><td>Australie</td><td>Gordon et Cowling 2003</td></tr><tr><td>Reptiles</td><td>Serpent/Lézard</td><td>33</td><td>15,1</td><td>69,7</td><td>6,1</td><td>9,1</td><td>0</td><td>B1</td><td>Australie</td><td>Gordon et Cowling 2003</td></tr><tr><td>Environnement</td><td>Sols amendés</td><td>85</td><td>35,3</td><td>49,4</td><td>3,5</td><td>11,7</td><td>0</td><td>A/B1</td><td>Angleterre</td><td>Holden et al., 2014</td></tr><tr><td></td><td>Effluents</td><td>62</td><td>46,7</td><td>46,7</td><td>1,61</td><td>4,8</td><td>0</td><td>A/B1</td><td>Espagne</td><td>Garcia-Aljaro et al., 2009</td></tr><tr><td></td><td>Eaux d'estuaire</td><td>120</td><td>57</td><td>22,9</td><td>14,3</td><td>5,8</td><td>0</td><td>B1</td><td>Italie</td><td>Perini et al., 2015</td></tr><tr><td></td><td>Eaux de mer</td><td>875</td><td>3,2</td><td>70,5</td><td>25</td><td>1,3</td><td>0</td><td>B1</td><td>Etats-Unis</td><td>Hamilton et al., 2010</td></tr></table>
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Escherichia fergusonii

10

**Figure 4** : Arbre phylogénétique basé sur l’analyse simultanée de six gènes chromosomiques de ménage (*trpA*, *trpB*, *pabB*, *putP*, *icd* et *polB*) utilisant la méthode de parcimonie (méthode statistique non-paramétrique) sur une collection de 98 souches commensales et pathogènes de *E. coli/Shigella*, enraciné avec une souche *E. fergusonii* (Escobar-Paramo *et al.*, 2004).
### 3. Classification selon les séropathotypes

Pour les souches de *E. coli* pathogènes appartenant au pathovar des STEC, en considérant leur niveau de pathogénicité chez l'Homme, les sérotypes ont pu être classés en séropathotypes basés sur leur fréquence d'association avec des infections humaines et leurs implications dans des épidémies ou de graves complications. En 2003, Karmali *et al.*, ont proposé de classer les sérotypes majeurs en cinq séropathotypes, de A à E ; soit du séropathotype A correspondant aux sérotypes les plus virulents, tel que l'O157:H7, au séropathotype E représentant l'ensemble des sérotypes de *E. coli* non associés à des maladies humaines (Tableau 6).

<table><caption>**Tableau 6 :** Classification des sérotypes *E. coli* en séropathotypes (d'après Gyles 2007, EFSA 2013)</caption><thead><tr><th>Séropathotypes</th><th>Sérotypes</th><th>Fréquence (association avec une infection)</th><th>Implication (responsable d'épidémie)</th><th>Association avec SHU<sup>a</sup> et CH<sup>b</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>O157:H7, O157:HNM</td><td>Importante</td><td>Souvent</td><td>+</td></tr><tr><td>B</td><td>O26:H11, O103:H2, O111:HNM, O121:H19, O145:HNM</td><td>Modérée</td><td>Peu souvent</td><td>+</td></tr><tr><td>C</td><td>O5:HNM, O91:H21, O104:H21, O113:H21, O121:HNM, O165:H25</td><td>Faible</td><td>Rare</td><td>+</td></tr><tr><td>D</td><td>O7:H4, O69:H11, O103:H25, O113:H4, O117:H7, O119:H25, O132:HNM, O146:H21, O171:H2, O172:HNM, O174:H8...</td><td>Faible</td><td>Rare</td><td>-</td></tr><tr><td>E</td><td>O6:H34, O8:H19, O39:H49, O46:H38, O76:H7, O84:HNM, O88:H25, O98:H25, O113:HNM, O136:HNM, O143:H31, O156:HNM, O163:HNM...</td><td>Non impliqué</td><td>Non impliqué</td><td>-</td></tr></tbody></table>

Plusieurs observations récentes remettent en cause cette classification basée sur la fréquence des sérotypes responsables d'infection, leur association avec des épidémies et la sévérité des symptômes engendrés. Les critiques exposées dans un récent rapport publié par l'EFSA (2013) (*European Food Safety Authority*) montrent que ce système de classification ne semble pas refléter la réalité puisque des sérotypes du séropathotype D (O84, O113, O153, O156) ont été recensés par l'ECDC (*European Centre for Disease Prevention and Control*) comme responsables d'infection chez l'Homme.

Scheutz (2014) a suggéré récemment de réviser cette classification en se basant sur le phénotype ou le typage moléculaire pour définir les groupes.

<footnote><sup>a</sup>SHU : Syndrome Hémolytique et Urémique, <sup>b</sup>CH : Colites Hémorragiques</footnote>
## II. E. COLI ENTEROPATHOGENE (EPEC) ET E. COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC)

### A. Présentation des EPEC

Les *E. coli* entéropathogènes sont caractérisés par une adhésion spécifique entre la cellule bactérienne et la surface de l'entérocyte. Ils sont regroupés sous le terme d'AEEC pour *Attaching and Effacing E. coli*, quels que soient les signes cliniques associés. D'un point de vue histopathologique, les symptômes liés aux infections dues aux AEEC sont associés à des lésions caractéristiques des cellules de la muqueuse intestinale. Ces lésions sont engendrées par le mécanisme d'attachement et d'effacement (A/E) caractérisé par une adhésion intime des bactéries aux entérocytes et à l'effacement des microvillosités intestinales (Nataro et Kaper 1998).

Cette adhésion s'effectue en deux temps : initialement, une pré-adhésion dite localisée s'effectue par l'intermédiaire de *fimbriae* de type IV que sont les *pili* BFP (Bundle Forming Pili). Les gènes *bfpA* codant ces *pili* sont situés sur le plamide EAF (*EPC adhesion factor* ; pEAF). Puis cette adhésion est suivie d'une fixation étroite de la bactérie à la bordure en brosse des entérocytes, s'accompagnant d'une destruction de celle-ci sans invasion cellulaire. Cette étape est associée aux produits de différents gènes situés sur un locus chromosomique appelé le LEE (*locus of enterocyte effacement*) et plus particulièrement grâce au gène *eae* codant une protéine de la membrane externe de 94 kDalton, l'intimine. L'expression des différents gènes du LEE aboutit à la polymérisation de filaments d'actine entraînant la formation d'un piédestal sur lequel viennent adhérer les bactéries de façon étroite (McDaniel *et al.*, 1995, Garmendia *et al.*, 2005) (Figure 5). L'acquisition simultanée du pEAF et du LEE est indépendante.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 5** : Adhésion des EPEC typiques aux entérocytes caractérisée par le développement des lésions d'attachement et d'effacement. 1. Adhésion initiale due aux *pili* BFP, 2. Fixation étroite de la bactérie due à la sécrétion des protéines codées par le LEE, 3. Formation du piédestal par la polymérisation de filaments d'actine. BFP : *bundle-forming pilus*. (d'après Kaper *et al.*, 2004).</figcaption></figure>
Au sein des EPEC, il existe deux sous-groupes ; d'une part, les EPEC dits typiques (EPECt) possédant les *pili* BFP permettent l'adhésion initiale aux entérocytes, d'autre part, les EPEC dits atypiques (EPECa) qui ne possédent pas ce plasmide EAF. Les EPECa peuvent disposer d'autres facteurs responsables de cette pré-adhésion tels que les facteurs LAL (*localized adherence-like*) (Rodrigues *et al.*, 1996), DA (*diffuse-adherence*) ou AA (*aggregative adherence*) (Trabulsi *et al.*, 2002).

Douze sérogroupes O26, O55, O86, O111, O114, O119, O125, O126, O127, O128, O142 et O158 ont été reconnus comment étant le plus souvent associés aux EPEC responsables de diarrhées chez l'Homme par l'OMS (Organisation Mondiale de la Santé) (Schmidt 2010). Les EPEC sont le plus souvent associés à des épidémies de diarrhées dans les pays en voie de développement et à des cas sporadiques dans les pays développés (Trabulsi *et al.*, 2002). Plusieurs études épidemiologiques suggèrent que l'incidence des EPECa est plus marquée que celle des EPECt : 41 cas associés à des souches EPECa et aucune EPECt au Japon (Yatsuyanagi *et al.*, 2003), 58 associés à des souches EPECa et un cas à une souche EPECt en Norvège (Afset *et al.*, 2004), 12 cas associés à des souches EPECa et un cas à une souche EPECt au Brésil (Franzolin *et al.*, 2005), 42 cas associés à des souches EPECa et aucun à une souche EPECt au Brésil (Araujo *et al.*, 2007).

Une méta-analyse sur l'étiologie des diarrhées en pédiatries (266 études publiées entre 1996 et 2002), montre que les EPEC sont encore identifiés parmi les agents pathogènes importants (Ochoa et Contreras 2011).

## B. Présentation des STEC

Les *E. coli* producteurs de Shiga-toxines sont principalement définis par leur capacité à produire des toxines (Stx) appelées *Shiga-like toxin* ou Shiga-toxines. Deux familles de Stx ont pu être identifiées : les Stx de type 1 très proches de la Shiga-toxine produite par *Shigella dysenteriae* sérotype 1 et les Stx de type 2 qui présentent moins de 60 % d'homologie avec la séquence en acides aminés des Stx1 (Strockbine *et al.*, 1986, Karch *et al.*, 2005).

D'autre part, une partie des STEC sont capables de produire des lésions A/E lorsque l'ilot de pathogénicité LEE est présent et de former un piédestal de la même façon que les EPEC (Figure 6).
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Figure 6** : Adhérence des STEC aux entérocytes caractérisée par le développement des lésions d'attachement et d'effacement, puis d'un piédestal et la production de Shiga-toxines (Stx). (d'après Kaper *et al*., 2004).

Si tous les STEC ne sont pas pathogènes pour l'Homme, un sous-groupe de souches dénommées *E. coli* entérohémorragiques (EHEC) sont responsables des infections humaines les plus graves.

Les EHEC typiques (**EHECt**) représentent le groupe des STEC Stx-LEE-positifs, ayant la capacité à la fois de produire des lésions A/E et d'induire des lésions au niveau de l'endothélium vasculaire intestinal, rénal et cérébral de l'Homme, sous l'action des Shiga-toxines. Le LEE joue un rôle important dans la colonisation et la destruction de la muqueuse intestinale par l'intermédiaire du gène *eae*. Les souches EHEC dépourvues de LEE sont dites atypiques (**EHECa**). Les souches EHECa utilisent d'autres moyens d'adhérer à la membrane des entérocytes par l'intermédiaire par exemple des facteurs : Iha (IrgA homologue adhesin) (Tarr *et al*., 2000), Lpf (long polar fimbriae) (Doughty *et al*., 2002) ou Saa (STEC autoagglutinating adhesine) (Paton *et al*., 2001).

Plus de 400 sérotypes différents appartenant au pathovar des STEC ont été isolés chez l'Homme et les animaux mais seul un petit nombre de sérotypes est réellement lié à des pathologies humaines. Les plus connus font partie des séropathotypes A, B et C décrits plus haut, soit les O26, O157, O111, O103, O145 (Nguyen et Sperandio 2012, Croxen *et al*., 2013).

Le sérotype le plus incriminé dans les infections à STEC est le sérotype O157:H7. En Europe, en 2012, il a été responsable de 34 % des cas d'infections (ECDC 2014).

En France depuis 2002, l'O157:H7 a été responsable de la moité des épidémies recensées :

* sérotype O148:H8, 11 cas, viande de mouton en 2002 (Espié *et al*., 2006a)

* sérotype O157:H7, 3 cas, fromage au lait cru de chèvre, en 2004 (Espié *et al*., 2006b)

* sérotype O157:H7, 69 cas, viande hachée de bœuf congelée, en 2005 (King *et al*., 2009)

* sérotype O26:H11/O80:H2, 16 cas, camembert en 2005 (Espié *et al*., 2008)

* sérotype O123:HNM, 2 cas, hamburger en 2009 (King *et al*., 2010)

* sérotype O104:H4, 15 cas, germes de fenugrec en 2011 (King *et al*., 2012)
* sérotype O157:H-/O177:H25, 18 cas, viande hachée de bœuf congelée en 2011 (King et al., 2012)

* sérotype O157:H7, 6 cas, viande hachée de bœuf fraîche en 2012 (Barret et al., 2012)

La grande majorité des cas cliniques graves chez l'Homme sont dus à un petit nombre de sérotypes (Farrokh et al., 2013, Beutin et Fach 2014). Aux Etats-Unis, les souches **EHEC**t dites **majeurs** appartiennent aux sérogroupes O26, O45, O103, O111, O121, O145 et O157 (USDA 2014). En Europe, les EHECt majeurs appartiennent aux sérotypes O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H8 et O145:H28 (EFSA 2013).

Pour mieux comprendre la relation existante entre les STEC et les EPEC le schéma présenté en Figure 7, propose un système de classification où :

* toutes les souches possédant le LEE, incluant le gène *eae*, quels que soient les signes cliniques associés, appartiennent au groupe des AEEC

* toutes les souches possédant les gènes codant pour les toxines Stx, quels que soient les signes cliniques associés, sont des STEC

* toutes les EHEC sont des STEC mais toutes les souches STEC ne sont pas responsables de pathologies humaines

* les EHEC possèdent le LEE sont dénommées EHEC typiques et les EHEC-LEE négatifs sont dénommées des EHEC atypiques

* les souches EHEC typiques majeures, les plus souvent associées à des signes cliniques graves et aux épidémies appartiennent aux sérogroupes O157, O26, O103, O111, et O145

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Figure 7** : Système de classification des AEEC/EPECt/EPECa/STEC/EHEC à partir des signes cliniques et des facteurs de virulence associés aux souches de *E. coli*. EPEC: enteropathogenic *E. coli*. EHEC: enterohaemorrhagic *E. coli*. STEC: Shiga toxin-producing *E. coli*. AEEC: Attaching and effacing *E. coli*. LEE: Locus of enterocyte effacement. pEAF : plasmid EPEC adhesion factor. stx : Shiga-toxin gene. SHU: Syndrome Hémolytique et Urémique (d'après Naylor *et al*., 2005).
# C. Pathologies humaines et animales

## 1. Symptômes liés aux infections par des EPEC

### Chez l'Homme

Les EPEC sont responsables de la majeure partie des diarrhées infantiles mais sont rarement incriminés dans les diarrhées chez l'adulte. Les EPEC sont principalement responsables de diarrhées accompagnées de fièvre, de vomissements et de déshydratation chez les enfants de moins de 2 ans (Varela et al., 2015).

Pour la plupart des cas d'infection à EPEC chez l'Homme, une réhydratation suffit à éliminer le pathogène et dans les cas graves chez l'enfant, l'utilisation d'une antibiothérapie peut être nécessaire (Croxen et al., 2013).

### Chez les animaux

De nombreuses études mettent en évidence le caractère pathogène des EPEC vis à vis des animaux également. Les EPEC sont responsables de diarrhées chez les bovins (Kobayashi et al., 2001), les ovins (de la Fuente et al., 2002), les porcs (Malik et al., 2006) et ils sont également responsables d'épidémies chez la volaille (Farooq et al., 2009, Dutta et al., 2011). Les symptômes peuvent varier d'une simple diarrhée, à une diarrhée aqueuse abondante mucoïde ou sanglante, accompagnée d'anorexie, de déshydratation et de léthargie comme observée dans une épidémie chez le lapin aux Etats-Unis (2 224 cas) (Swennes et al., 2012).

## 2. Symptômes liés aux infections par des STEC

### Chez l'Homme

Les EHEC ou STEC sont associés à des colites hémorragiques et/ou à un syndrome hémolytique et urémique. Les cas sévères sont observés chez les enfants et les personnes immuno-déprimées. Les sérotypes O157 et non-O157 provoquent les mêmes symptômes mais avec des niveaux de gravité variables, rappelant la classification en séropathotype proposée par Karmali et al., 2003. Le premier symptôme de la maladie est une diarrhée non sanglante qui peut être accompagnée de fièvre, de crampes abdominales ou de vomissements. Dans la majorité des cas, les diarrhées deviennent sanglantes entre un et cinq jours suivant la première diarrhée. Les complications observées peuvent se manifester sous la forme d'un SHU dans environ 15 % des cas surtout chez l'enfant (Figure 8). Le SHU est défini par l'association d'une anémie hémolytique microangiopathique avec présence d'hématies fragmentées (schizocytes), d'une thrombopénie et d'une insuffisance rénale aiguë. Il correspond à des lésions de type microangiopathie thrombotique (MAT), touchant les reins et
éventuellement d'autres viscères, caractérisées par un épaississement des parois des capillaires glomérulaires et/ou des artérioles et par la présence de micro-agrégats plaquettaire dans les capillaires et les artérioles. Le SHU est la principale cause d'insuffisance rénale du nourrisson. Il peut entraîner la mort dans moins de 5 % des cas. Chez l'adulte, il se traduit par un Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT) caractérisé par des lésions thrombotiques microvasculaires généralisées.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 8** : Evolution d'une infection à O157:H7 chez un enfant (d'après Tarr *et al*., 2005). HUS : Hemolytic Uremic Syndrom.</figcaption></figure>

L'essentiel des signes cliniques est lié à la production des Shiga-toxines. Après ingestion, les STEC doivent résister à l'acidité de l'estomac (Yang *et al*., 2015). Une étape de colonisation du tube digestif est nécessaire : la plupart des souches STEC (en particulier celles de sérotype O157:H7) sont capables de produire les lésions A/E. En dehors de la voie du LEE, les mécanismes de colonisation sont mal connus. Les toxines produites par les bactéries doivent ensuite traverser l'épithélium intestinal, avant de rejoindre le système circulatoire et atteindre les récepteurs spécifiques glycolipidiques localisés à la surface des cellules endothéliales, présentes principalement au niveau intestinal, rénal et cérébral (Figure 9). Les Shiga-toxines entraînent ensuite la mort des cellules cibles par arrêt de la synthèse protéique.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 9** : Processus infectieux des STEC (AFSSA 2003).</figcaption></figure>

Le traitement du SHU est purement symptômatique : hyperhydratation, transfusion et dialyse pour corriger l'insuffisance rénale. L'antibiothérapie est peu recommandée dans les infections à STEC. Plusieurs études suggèrent que les antibiotiques augmenteraient le risque de SHU, par le relargage des toxines lors de la lyse bactérienne (Scheiring et al., 2008). Le principe selon lequel il n'est pas nécessaire, voire risqué, de prescrire une antibiothérapie à un patient atteint d'une diarrhée à EHEC est remis en cause par les données de l'épidémie allemande (réduction de la durée de portage) et la possibilité de recourir à un traitement bactériostatique (azithromycine) (Nitschke et al., 2012). L'azithromycine appartient à la famille des macrolides et inhibe la synthèse des protéines dont les Stx. Elle présente cependant de nombreux effets secondaires (effets cutanéo-muqueux et allergiques, digestifs, hépatiques et cardiaques) (Mortensen et al., 2014, Barni et al., 2015). Des études complémentaires sont nécessaires pour évaluer la recommandation de cet antibiotique.

De nombreux cas d'infection et d'épidémies liées aux STEC sont régulièrement reportés chaque année dans le monde et recensés par des programmes nationaux de surveillance ;

- au Canada, *National Enteric Surveillance Program* (NESP) : 3 495 cas d'infection liée à O157:H7 recensés entre 2007 et 2012 (NESP 2013).
- en Europe, European Food Safety Authority (EFSA): 13 545 cas d'infection liée à STEC recensés entre 2007 et 2010 (EFSA 2013).

- aux Etat-Unis, U.S. Department of Agriculture's Food Safety and Inspection Service (USDA/FSIS) et Centre for disease control and prevention (CDC) : 23 épidémies à STEC entre 2006 et 2015 avec 898 cas.

A notre connaissance, aucune épidémie à STEC liée à la consommation de produits de la mer (poissons ou coquillages) n'a été rapportée à ce jour dans le monde.

## Chez les animaux

Les STEC sont également responsables d'infection chez les animaux. Ils peuvent causer la maladie de l'œdème chez les porcs en post-sevrage et les jeunes porcs par la capacité de certains STEC à se fixer sur des récepteurs glycolipidiques présents chez le porc (Ching et al., 2002).

Ils sont responsables de diarrhées chez les veaux (Coura et al., 2014). L'absence de récepteur pour les Shiga-toxines chez les bovins adultes pourrait expliquer que les ruminants ne développent pas de toxémie ou de dommage vasculaire systémique (Pruimboom-Brees et al., 2000). Chez les ovins, les STEC touchent préférentiellement les animaux jeunes en causant de fortes diarrhées chez les chevreaux et les agneaux (Wani et al., 2005; Turkyilmaz et al., 2013). La volaille est également touchée par des diarrhées à STEC (Dutta et al., 2011). Enfin, les animaux domestiques tels que les chiens peuvent également être sujets aux diarrhées (Sancak et al., 2004).

# D. Les facteurs de virulence

## 1. Les Shiga-toxines

### Définition des Shiga-toxines

Le terme Shiga-toxine a tout d'abord été utilisé pour identifier les toxines produites par Shigella dysenteriae de type 1 donnant naissance au terme Shiga-like toxin, ou Shiga-toxine, quand celles-ci ont été identifiées chez E. coli. Ce terme a remplacé celui de « Vérotoxine » utilisé pour caractériser les toxines lysant les cellules Vero (cellules épithéliales de rein extraites de singe) chez E. coli (Bergan et al., 2012).

Ces toxines sont principalement produites par S. dysenteriae sérotype 1 (Stx1) mais également par certains E. coli et sporadiquement par Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae et Shigella flexneri (Herold et al., 2004).
Il existe deux types de Shiga-toxines ; la Shiga-toxine de type 1 codée par les gènes stx1 et la Shiga-toxine de type 2 codée par les gènes stx2. Alors que la Shiga-toxine Stx1 est neutralisée par des anticorps anti-Shiga-toxine de S. dysenteriae sérotype 1, la Shiga-toxine Stx2 ne l'est pas (Strockbine et al., 1986, Paton et Paton 1998). Les gènes stx1 et stx2 possèdent respectivement 99 % et 56 % d'homologie avec la Stx1 de S. dysenteriae (O'Brien et al., 1984, Strockbine et al., 1986). Ceci s'explique par le fait que les deux toxines ne partagent respectivement que 55 % et 57 % d'identité pour les sous-unités protéiques A et B qui les composent. En revanche, leur mécanisme d'action et leurs propriétés biochimiques sont similaires.

## Structure de la Shiga-toxine

Chez *E. coli*, la Shiga-toxine est codée par deux gènes *stx* (*stxA* et *stxB*), présents sur un prophage lambdoide (*stx-converting bacteriophage* ou *stx-phage*) qui est un élément génétique mobile (Herold *et al.*, 2004).

L'opéron codant la Shiga-toxine a une structure commune constituée d'une seule unité transcriptionnelle qui code les sous-unités A et B (Figure 10). Les toxines produites sont des hétéropolymères de 70 kDa composés d'une sous-unité A (Activité toxique) de 33 kDa et de 5 sous-unités B (Binding) de 7,7 kDa. La sous-unité A présente une activité de type N-glycosidase sur une adénosine de l'ARN ribosomique 28S et la sous-unité B a un rôle important au niveau du degré de toxicité de la toxine, car elle conditionne le niveau de compatibilité de la toxine avec le récepteur cible (Bergan *et al.*, 2012).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 10** : Structure de l'opéron codant les Shiga-toxines (AFSSA 2003)</figcaption></figure>

## Le mécanisme d'action des Shiga-toxines

Le mécanisme d'action des Shiga-toxines au niveau des cellules cibles commence tout d'abord par la fixation des Shiga-toxines à la membrane cytoplasmique de la cellule : les sous-unités B se lient au récepteur glycolipidique : globotriaosylcéramide (Gb3) chez l'Homme, présent au niveau du tube digestif, des reins et du système nerveux central ou globotetraosylcéramide (Gb4) chez le porc
(Muething *et al.*, 2012). Une fois la Shiga-toxine internalisée par le mécanisme classique d'endocytose, elle subit un transport rétrograde à travers l'appareil de Golgi, puis le réticulum endoplasmique. La sous-unité A de la Shiga-toxine est alors libérée des sous-unités B et clivée en deux parties A1 et A2 par réduction des ponts disulfures. La partie A1 ainsi clivée est transloquée dans le cytoplasme jusqu'à sa cible, la sous-unité 60S du ribosome où elle exerce son activité en bloquant la synthèse protéique. Ceci conduit à l'arrêt de la synthèse protéique et à la mort de la cellule (Figure 11) (Bergan *et al.*, 2012).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 11** : Mécanisme d'action des Shiga-toxines. 1) Fixation, 2) Internalisation, 3) Transport rétrograde, 4) Clivage et Action (d'après Pacheco et Sperandio 2012)</figcaption></figure>

La toxine Stx2 est la plus répandue parmi les STEC et est considérée comme la plus toxique. On peut détecter la présence concomitante de plusieurs toxines chez une même bactérie avec la présence des gènes codant les Shiga-toxines 1 et 2 (stx1, stx2) ou la présence de plusieurs variants du gène stx (Friedrich *et al.*, 2003, Prager *et al.*, 2011, Feng et Reddy 2013). La présence de plusieurs toxines influence le pouvoir pathogène des souches ; une étude montre qu'une souche exprimant une seule toxine est plus pathogène qu'une souche exprimant plusieurs toxines (Krueger *et al.*, 2011)

## Les variants des gènes stx

De nombreux variants ont été identifiés au niveau des gènes codant pour les Shiga-toxines : trois variants pour le gène stx1 (stx1a, stx1c et stx1d) et sept variants pour le gène stx2 (stx2a, stx2b, stx2c, stx2d, stx2e, stx2f et stx2g) (Scheutz *et al.*, 2012).

Le type de variant peut refléter à la fois l'origine d'une souche, sa phylogénie mais aussi son pouvoir pathogène (Bertin *et al.*, 2001, Friedrich *et al.*, 2002, Fuller *et al.*, 2011).
Ainsi, chez l'Homme, les variants associés aux pathologies sévères sont les variants stx2a, stx2c et stx2d tandis que les variants stx1a, stx1c, stx1d, stx2b, stx2e, stx2f et stx2g sont associés à de faibles diarrhées. Les variants stx1c, stx2b, stx2e et stx2f sont plus particulièrement associés à des souches isolées chez les moutons, les bovins, les porcs et les pigeons, respectivement. Les variants ont tous été détectés dans des souches isolées de produits frais type légumes et d'aliments d'origine animale (Tableau 7).
<table><caption>**Tableau 7** : Incidence des variants *stx* sur l'Homme et détection préférentielle des différents variants des gènes *stx1* et *stx2* codant pour les Shiga-toxines.</caption><thead><tr><td>Variant du gène stx</td><td>Pathologie</td><td>Sources animales (fèces) ou humaine</td><td>Détection dans les aliments</td><td>Références</td></tr></thead><tbody><tr><td>stx1a</td><td>Diarrhées sans SHU<sup>a</sup> chez l'Homme</td><td>Bovins, ovins, chamois, chevreuils, sangliers, renards, Homme, effluents d'origine humaine, bovine</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine bovine, ovine, viandes de lapin</td><td>Friedrich et al., 2002, Martin et Beutin 2011, Mora et al., 2012, Kumar et al., 2012, Martinez-Castillo et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Bibbal et al., 2014, Shen et al., 2015</td></tr><tr><td>stx1c</td><td>Faibles diarrhées chez l'Homme</td><td>Ovins, chèvres, chevreuils, sangliers, chamois, bovins, Homme</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine bovine, ovine et de chèvre, de cerf, coquillages</td><td>Zhang et al., 2002a, Brett et al., 2003, Friedrich et al., 2003, Gourmelon et al., 2006, Wani et al., 2007, Mora et al., 2012, Kumar et al., 2012, Martin et Beutin 2011, Feng et Reddy 2013, Shen et al., 2015</td></tr><tr><td>stx1d</td><td>Pas ou peu virulente chez l'Homme</td><td>Bovins, ovins, chèvres, Homme</td><td>Produits frais type légumes, aliments (non précisé), coquillages</td><td>Gourmelon et al., 2006, Kumar et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Shen et al., 2015</td></tr><tr><td>stx2a</td><td>Cas sévères de SHU chez l'Homme</td><td>Bovins, ovins, cerfs, chevreuils, Eaux usées urbaines, effluents d'origine bovine et humaine</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine bovine, ovine, viande de lapin</td><td>Kumar et al., 2012, Martinez-Castillo et al., 2012, Diaz-Sanchez et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Bibbal et al., 2014</td></tr><tr><td>stx2b</td><td>Diarrhées chez l'Homme</td><td>Ovins, chamois, chevreuils, sangliers, cerfs, Homme rarement</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine ovine et chèvre bovine</td><td>Martin et Beutin 2011, Mora et al., 2012, Diaz-Sanchez et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Shen et al., 2015</td></tr><tr><td>stx2c</td><td>Cas sévères de SHU et CH<sup>b</sup> chez l'Homme</td><td>Bovins, chevreuils, sangliers, Hommes, effluents d'origine humaine, bovine</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine bovine, porcine, ovine, chèvre</td><td>Friedrich et al., 2002, Wani et al., 2007, Martin et Beutin 2011, Martinez-Castillo et al., 2012, Mora et al., 2012, Kumar et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Bibbal et al., 2014</td></tr><tr><td>stx2d</td><td>Cas sévères de SHU et CH chez l'Homme</td><td>Bovins, ovins, Homme, effluents d'origine humaine</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine bovine, ovine</td><td>Friedrich et al., 2002, Wani et al., 2007, Monaghan et al., 2012, Martinez-Castillo et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Kumar et al., 2012, Delannoy et al., 2015</td></tr><tr><td>stx2e</td><td>Rares cas d'infection chez l'Homme</td><td>Porcs, sangliers, renards, effluents d'origine urbaine, bovine, porcine, eaux usées urbaines</td><td>Produits frais type légumes, viandes de porcs et de sangliers</td><td>Friedrich et al., 2002, Fratamico et al., 2004, Martin et Beutin 2011, Martinez-Castillo et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Tseng et al., 2014a, Shen et al., 2015</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>Œdème chez le porc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>stx2f</td><td>Rares cas d'infection chez l'Homme</td><td>Pigeons, Homme, effluents d'origine humaine</td><td>Produits frais type légumes</td><td>Schmidt et al., 2000, Sonntag et al., 2005, Martinez-Castillo et al., 2012, Feng et Reddy 2013</td></tr><tr><td>stx2g</td><td>Pas de cas d'infection chez l'Homme</td><td>Sangliers, renards, chevreuils, effluents d'origine bovine</td><td>Produits frais type légumes, aliments d'origine bovine</td><td>Martin et Beutin 2011, Diaz-Sanchez et al., 2012, Martinez-Castillo et al., 2012, Mora et al., 2012, Feng et Reddy 2013, Shen et al., 2015</td></tr></table>

<footnote>a Syndrome Hémolytique et Urémique, b Colites Hémorragiques</footnote>
## Le bactériophage stx

Les gènes codant les Shiga-toxines ont la particularité d'être portés par un bactériophage tempéré (Figure 12) capable d'alterner entre une phase lysogénique et une phase lytique. Le bactériophage stx en phase lysogénique infecte une bactérie et intégre son génome au sein du chromosome bactérien. Ce matériel génétique ainsi intégré prend le nom de prophage et est le plus souvent « dormant » en raison d'une répression de la transcription des gènes nécessaires au cycle lytique. Sous différentes conditions, le bactériophage stx peut entrer en phase lytique avec une activation de la transcription des gènes correspondants, sous l'influence d'un élément déclencheur (exposition aux UV, antibiothérapie, traitement alimentaire...) conduisant à la production de dizaines voire de centaines de phages au sein de la bactérie qui finira par littéralement exploser, libérant ainsi les nouveaux phages qui pourront infecter d'autres bactéries.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 12** : Représentation schématique d'un bactériophage stx dans sa configuration tête-queue (d'après Schmidt *et al.*, 2001)</figcaption></figure>

Les bactériophages stx sont impliqués dans le transfert horizontal des gènes stx (transfert du matériel génétique du phage dans le génome bactérien) chez E. coli (Cornick *et al.*, 2006, Picozzi *et al.*, 2012) et ceci de manière aléatoire, participant ainsi à l'émergence de nouvelles souches STEC (Martinez-Castillo et Muniesa 2014). Le bactériophage est un élément instable à l'intérieur de la bactérie. Il peut être perdu au cours d'une infection ou de cultures successives comme cela a été observé chez le sérotype O157:H7 (Friedrich *et al.*, 2007) et le sérogroupe O26 (Bielaszewska *et al.*, 2007).

Les bactériophages stx sont retrouvés libres chez l'Homme (Martinez-Castillo *et al.*, 2013) et dans l'environnement ; dans les fèces animaux (Yan *et al.*, 2011), dans les effluents d'origine humaine et animale (bovin, porc, volaille) (Imamovic *et al.*, 2010a, Rooks *et al.*, 2010, Yan *et al.*, 2011), dans les rivières (Dumke *et al.*, 2006) et dans les aliments (viandes et salade) (Imamovic et Muniesa 2011).

Les concentrations en bactériophages stx peuvent varier par exemple entre 1 à 9 log₁₀ copies de gène/ml dans les effluents d'origine humaine et animale (Imamovic *et al.*, 2010a, Rooks *et al.*, 2010) et sont souvent plus importantes que les concentrations en E. coli qui elles peuvent varier entre 4 et 5 log₁₀ UFC/ml dans les effluents (Muniesa *et al.*, 2011).
Les bactériophages persistent plus longtemps que les bactéries ; ils sont stables à 4, 22 et 37°C et à pH 7 et 9 pendant un mois, tandis que les populations de STEC déclinent rapidement dans ces mêmes conditions (Allué-Guardia *et al.*, 2014).

Les bactériophages portant les gènes *stx2* sont plus souvent détectés que les bactériophages portant les gènes *stx1* dans l'environnement : par exemple dans une méta-analyse de 25 études, les bactériophages *stx2* ont été détectés dans les 25 études et le bactériophage *stx1* dans cinq cas seulement (Martinez-Castillo et Muniesa 2014). Cette même observation a également été confirmée par une récente étude effectuée sur 357 échantillons de fèces humaines et d'animaux, d'eaux usées, de matières fécales, d'eaux de rivière, de sols, de boue et d'aliments où *stx1* a été détecté dans 7,6 % des échantillons et *stx2* dans 68,4 % (Grau-Leal *et al.*, 2015).

## 2. Locus of enterocyte effacement (LEE)

Le locus of enterocyte effacement ou LEE contient les gènes codant i) l'intimine (gène *eae* : *E. coli attaching and effacing*), ii) un système de sécrétion de type III (SSTT), iii) des protéines sécrétées de type Esp (*E. coli* secreted protein), iv) des protéines Esc (*E. coli* secretion) qui participent à la structure et au fonctionnement de la seringue moléculaire du SSTT et v) un récepteur de translocation de l'intimine nommé Tir (*Tyrosine phosphorylated protein*) (Figure 13) (Garrido *et al.*, 2006). Il regroupe les gènes responsables des lésions d'attachement et d'effacement (A/E) générées par les bactéries pour s'implanter au niveau des cellules du tube digestif. Cinq régions distinctes sont classiquement décrites : la région 5' qui regroupe les opérons LEE 1, 2 et 3 qui codent plusieurs protéines de régulation (Ler, GrlR et GrlA) et de structure du SSTT, la région centrale qui comprend le LEE5 qui code l'intimine et son récepteur Tir et la région 3' qui se compose du LEE4 et code d'autres effecteurs bactériens et d'autres protéines de structures impliquées dans la translocation (EspA, B et D) (Garmendia *et al.*, 2005).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 13** : Organisation schématique du LEE des EHEC/EPEC. *esc* : *E. coli* secretion ; *sep* : secretion of *E. coli* protein ; *esp* : *E. coli* secreted protein ; *ces* : chaperone for *E. coli* secreted protein ; *orf* ou *rorf* : Open Reading Frame (d'après Garmendia *et al.*, 2005)</figcaption></figure>
L'intimine est une protéine de la membrane externe de la bactérie nécessaire à l'adhésion intime entre la bactérie et l'entérocyte. C'est un facteur de virulence essentiel pour les souches EPEC. Dix-sept variants et huit sous-variants du gène *eae* ont été identifiés : alpha (α1, α2), béta (β1, β2, β3), gamma (γ1, γ2), delta (δ), épsilon (ε1, ε2, ε3, ε4), zéta (ζ), éta (η1, η2), théta (θ), iota (ι1, ι2), kappa (κ), lambda (λ), mu (μ), nu (ν), xi (ξ), omicron (ο), pi (π) et rho (ρ) (Oswald *et al.*, 2000).

Pour les autres gènes du LEE les plus impliqués dans l'adhésion, il existe également, quatre variants pour le gène *tir* (α1, β1, β2 et γ1), quatre pour le gène *espA* (α1, β1, β2 et γ1), trois pour le gène *espB* (α1, β1 et γ1) et trois pour le gène *espD* (α1, β1 et γ1). Plusieurs combinaisons différentes entre ces gènes ont été mises en évidence et sont utilisées pour classer les souches (Garrido *et al.*, 2006).

Des études menées *in vivo* et *in vitro*, mettent en évidence une colonisation du tube digestif géographiquement différente (côlon ou intestin grêle) selon le type de variant, on parle de tropisme cellulaire ou de spécificité d'hôte (Phillips et Frankel 2000, Reece *et al.*, 2001, Fitzhenry *et al.*, 2002, Girard *et al.*, 2005). Par exemple, une souche O157:H7 exprimant l'intimine γ s'associe préférentiellement aux cellules épithéliales du côlon (Fitzhenry *et al.*, 2002).

Le typage des variants et sous-variants *eae* permet de différencier les souches entre elles (Tableau 8).

Les variants β et γ sont les plus rencontrés dans des souches isolées de cas cliniques avec une association préférentielle, pour les EHEC typiques majeurs (Zhang *et al.*, 2002b, Blanco *et al.*, 2004, Monaghan *et al.*, 2011, Bibbal *et al.*, 2014) :

* du sous-variant γ1 avec les sérotypes O157:H7 et O145:H28

* du sous-variant β1 avec le sérotypes O26:H11

* du sous-variant θ avec le sérotype O111:H8

* du sous-variant ε avec le sérotype O103:H2

Parmi les études recensées dans le Tableau 8, les variants et sous-variants β1, γ1, γ2 et θ du gène *eae* sont le plus souvent associés à des souches isolées d'animaux d'élevage (bovins, ovins et porcs) et d'effluents d'origine humaine et animale, tandis que les variants α, ι, κ, ζ, η, ο et ρ le semblent beaucoup moins.
<table><caption>**Tableau 8 :** Sélection d'études évaluant la répartition des variants et sous-variants du gène *eae* (codant l'intimine) sur des souches LEE-positives, au niveau de différentes sources.</caption><thead><tr><th>Sources</th><th>Variants ou sous-variants (nombre)</th><th>Nombre total de souches</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Homme</td><td>β (38), γ (35), ε (14), ζ (5), ι(6), η(3), α (3), κ (2)</td><td>106</td><td>Zhang et al., 2002b</td></tr><tr><td>α1/α2 (18), β1/β2 (47), γ1/γ2 (66), ε (23)</td><td>154</td><td>Oswald et al., 2000</td></tr><tr><td>β1 (20), γ1 (27), ζ (6), γ2 (5), ε (3)</td><td>61</td><td>Blanco et al., 2004</td></tr><tr><td rowspan="2">Bovin</td><td>γ1/γ2 (17), β1/β2 (5), ε (2)</td><td>24</td><td>Oswald et al., 2000</td></tr><tr><td>β1 (49), θ (49), γ1 (16), ε (10),</td><td>124</td><td>Bibbal et al., 2014</td></tr><tr><td>Chien</td><td>α1/α2 (1), β1/β2 (1)</td><td>2</td><td>Oswald et al., 2000</td></tr><tr><td rowspan="2">Porc</td><td>γ2/θ (15), β1 (8), γ1 (7), ε (6), κ (6), ι (5), ζ (1), η (1), α2 (1)</td><td>51</td><td>Fröhlicher et al., 2008</td></tr><tr><td>β1/β2 (1)</td><td>1</td><td>Oswald et al., 2000</td></tr><tr><td rowspan="2">Ovin</td><td>γ2/θ (23), β1 (13), β2/δ (5), ε (4), γ1 (2), α1 (2), ι (1), κ (1), ζ (1)</td><td>52</td><td>Fröhlicher et al., 2008</td></tr><tr><td>β1/β2 (4)</td><td>4</td><td>Oswald et al., 2000</td></tr><tr><td>Lapin</td><td>β1/β2 (4)</td><td>4</td><td>Oswald et al., 2000</td></tr><tr><td>Effluent d'origine humaine</td><td>β2 (196), θ (76), α2 (40), ι1 (35), ο (31), γ (43), γ3, ζ, α1, ε, ι2, κ, ρ : (&lt;23)</td><td>467</td><td>Yang et al., 2014</td></tr><tr><td>Effluent d'origine animale</td><td>β1 (16), γ2/θ (18), γ1 (12), β2/δ (2), κ (2), η(1), ζ (1)</td><td>52</td><td>Loukiadis et al., 2006</td></tr></tbody></table>

### 3. Autres gènes de virulence

#### Des gènes impliqués dans l'adhésion

L'émergence d'infections humaines liées aux STEC LEE-négatifs montre que la présence de cet îlot de pathogénicité n'est pas le seul responsable de l'adhérence des bactéries et indique la présence d'autres facteurs de virulence portés par d'autres îlots de pathogénicité ou d'autres plasmides en rapport avec cette étape qui est indispensable au développement de la virulence des souches (Galli et al., 2010).

Plusieurs études montrent que les souches de sérogroupes O157 et non-O157 expriment une grande variété d'éléments de type *fimbriae* et non-*fimbriae* qui jouent un rôle important dans l'adhésion des bactéries au niveau du tube digestif et dans la persistance des souches au niveau des réservoirs que constituent les ruminants (Farfan et Torres 2012).

Parmi cette famille de gène, on trouve les gènes *efa1*, *lifA* et *toxB* codant des protéines homologues impliquées dans la formation de lésions A/E qui permettent l'adhésion des EPEC et des STEC aux cellules épithéliales (Tatsuno et al., 2001, Badea et al., 2003). L'hôte est capable de produire des
anticorps pour neutraliser ces adhésines qui sont exprimées pendant la phase infectieuse (Badea *et al.*, 2003).

Les gènes des *long polar adhesin* (Lpf) sont présents chez les STEC O157:H7 et sont situés sur deux régions chromosomiques OI-141 et OI-154 (OI: genomic O island) (Doughty *et al.*, 2002). Les Lpf sont présents chez de nombreuses souches de *E. coli*. Si leur rôle dans l'adhésion des souches STEC est avéré, il n'est cependant pas clairement défini chez les EPEC (Tatsuno *et al.*, 2006).

Le gène *saa* (*STEC autoagglutinating adhesin*) code une adhésine non fimbriale auto-agglutinante. Elle a été mise en évidence chez des souches LEE-négatives responsables d'infections humaines et animales et isolées de l'environnement (Friedrich *et al.*, 2003, Jenkins *et al.*, 2003, Blanco *et al.*, 2004, Amézquita-Lopez *et al.*, 2014). Cette adhésine est responsable de l'adhésion semi-localisée des bactéries (Paton *et al.*, 2001).

Le gène *iha* (*IrgA homologue adhesin*) code une protéine très proche de la protéine IrgA (*Iron-regulated gene homologue A*) produite chez *Vibrio cholerae*. Elle joue un rôle dans l'acquisition du fer par la bactérie en lien étroit avec l'adhésion des souches LEE-négatives mais aussi LEE-positives. Cette protéine contribue à la virulence des souches en favorisant leur fixation (Tarr *et al.*, 2000). Le gène *iha* semble être le gène de virulence en lien avec l'adhésion, le plus communément détecté dans un panel de 75 souches STEC isolées à partir d'aliments et d'eaux de boisson (Slanec *et al.*, 2009).

Le gène *stcE* code une protéase qui joue un rôle de métalloprotéase et de mucinase. Cette enzyme est impliquée dans l'adhésion intime de certains O157:H7 aux cellules de l'hôte par un clivage de glycoprotéines cellulaires (Grys *et al.*, 2005).

D'autres gènes codant des adhésines sont responsables de l'adhésion diffuse ou intime de certains STEC pathogènes chez le porc, comme les gènes F6, F18, F41 (Kwon *et al.*, 2002) ou les gènes *orfA/orfB* (*open reading frames*) (Zhao *et al.*, 2009). Le gène *paa* (*porcine attaching-and effacing-associated factor*) est également impliqué dans l'adhésion de souches STEC isolées chez le porc (Vidotto *et al.*, 2013).

Comme beaucoup d'autres gènes de virulence impliqués dans l'adhésion des bactéries aux cellules de l'hôte (Annexe I), ces facteurs sont plus ou moins détectés chez des souches EPEC, STEC et EHEC isolées de cas cliniques humains ou d'infections animales (Galli *et al.*, 2010, Monaghan *et al.*, 2011, Kobayashi *et al.*, 2013, Bibbal *et al.*, 2014, Tseng *et al.*, 2014a). Tous ces gènes ont également été détectés dans des souches isolées à partir d'aliments ou de l'environnement, témoignant du pouvoir effectif d'adhésion de certaines souches LEE-négatives isolées de l'habitat secondaire (Cergole-Novella *et al.*, 2007, Cadona *et al.*, 2013).
Des gènes codant pour des toxines

Outre la production des Shiga-toxines, les STEC peuvent produire des hémolysines ou d'autres toxines (Galli et al., 2010, Monaghan et al., 2011, Bai et al., 2013). Egalement rencontrés chez certaines souches EPEC (Aidar-Ugrinovich et al., 2007, Bibbal et al., 2014, Dutta et al., 2015), ces facteurs de virulence ont des effets cytotoxiques sur les cellules épithéliales. Ces toxines et ces hémolysines sont capables de lyser les cellules du système immunitaire et peuvent être responsables d'acidose et d'hypersécrétion de composants cellulaires par les entérocytes (Annexe I).

Les gènes cdt (cytolethal distenting toxin) codent des toxines qui interviennent au niveau du cycle cellulaire eucaryote en bloquant les cellules en phase G2/M (Nougayrede et al., 2005). Ces toxines sont portées par une faible portion des STEC LEE-négatifs mais ont été détectées dans des souches impliquées dans des infections humaines (Bielaszewska et al., 2004).

Le gène astA codant l'entérotoxine thermostable caractéristique des E. coli entéroagrégatifs (EAST1) est présent chez certains EPEC (Silva et al., 2014) et chez certains EHEC (Nishikawa et al., 2002). Même si son rôle n'est pas encore clairement défini, cette toxine contribue à l'apparition de diarrhées aqueuses.

Les gènes ehxA et hlyA codent les hémolysines, Enterohémolysine A et α-hémolysine, qui sont impliquées dans la lyse cellulaire des lignées lymphocytaires et érythrocytaires en formant des pores dans la membrane cellulaire (Lorenz et al., 2013). Ces toxines sont détectées chez les souches EPEC et les STEC isolées de cas cliniques graves, d'animaux malades et de l'environnement (eaux usées d'origine humaine et animale) (Blanco et al., 2004, Aidar-Ugrinovich et al., 2007, Feng et al., 2011, Martinez-Castillo et al., 2012, Kobayashi et al., 2013).

Le gène subA code la cytotoxine subtilase qui est une toxine homologue à celle produite chez Bacillus anthracis (Paton et al., 2004). Produite chez les STEC en général cette toxine est responsable de thrombose et de nécrose en agissant via l'arrêt de la synthèse protéique des cellules (Barth et al., 2007, Cergole-Novella et al., 2007, Galli et al., 2010).

Les gènes estla et elt codant respectivement les toxines Sta thermo-stable et LT thermo-sensible, ont été détectés dans des souches STEC responsables de colibacilloses chez le porc (Mohlatlole et al., 2013) et de diarrhées chez l'Homme (Prager et al., 2011). Les toxines produites agissent sur le dérèglement de l'absorption cellulaire et l'hyper-excrétion des ions dans la lumière du tube digestif, engendrant ainsi un dérèglement osmotique et des diarrhées aqueuses (Nataro et Kaper 1998).
Des gènes nle « effecteurs non codés par le locus LEE»

Un grand nombre de gènes effecteurs ne faisant pas partie du LEE sont appelés gènes *nle* pour *non LEE-encoded effector*. Ces gènes sont fortement liés à la virulence de souches responsables de lésions A/E (Gruenheid *et al.*, 2004, Echtenkamp *et al.*, 2008, Hodgson *et al.*, 2015). Ces gènes sont impliqués dans diverses fonctions, telles que l'inhibition de la phagocytose, des activités anti-apoptotiques, la perturbation des réponses immunitaires innées, l'augmentation de la perméabilité cellulaire, le blocage de la division cellulaire et la perturbation des microtubules du cytosquelette, entre autres (Galli *et al.*, 2010, Martinez-Castillo *et al.*, 2012) (Annexe I). Ces gènes sont pour la plupart codés par des prophages au sein d'îlots de pathogénicité tels que OI-122, OI-71, OI-57 ou OI-36 chez *E. coli*.

Des gènes impliqués dans la persistance

Au sein des autres gènes participant à la virulence des souches, on retrouve des gènes impliqués dans
la persistance (Annexe I) :

Le gène *katP* codant une catalase/péroxidase permet aux souches de *E. coli* de résister au stress oxydatif. Le gène *ureD* est associé à l'expression de l'uréase qui est une enzyme qui catalyse la réaction de transformation de l'urée en dioxyde de carbone et ammoniac (source d'énergie) (Steyert et Kaper 2012). En remarque, le rôle de l'uréase dans la virulence des souches du genre *Proteus* et *Klebsiella* a récemment été identifié ; elle agirait comme un élément protégeant la bactérie du système immunitaire de l'hôte en bloquant la phagocytose et créant des lésions cellulaires (action de l'ion ammonium) (Rutherford 2014).

Le gène *pagC* code pour une protéine (*pagC*-like menbrane protein/phP-activated gene C) homologue de celle produite par *Salmonella enterica* impliquée dans la résistance des souches à l'action des macrophages (Nishio *et al.*, 2005).

Dans ce groupe de gènes impliqués dans la persistance, on trouve également *terE* qui code pour une
enzyme capable de dégrader les tellurites en tellures permettant ainsi à certains *E. coli* comme
l'O157:H7 de se développer sur des milieux enrichis en tellurites (exemple : le milieu MacConkey
sélectif) (Orth *et al.*, 2007).

Le gène *ecfl* (*E. coli* attaching and effacing gene-positive conserved fragment 1) fait partie d'un opéron codant une hydrolase qui améliore la structure de la membrane bactérienne par la biosynthèse de polysaccharide et qui est impliquée dans l'invasion spécifique des STEC LEE-positifs (Yoon *et al.*, 2005).
D'autres gènes impliqués dans la résistance ou la persistance de souches appartenant aux autres pathovars ont été identifiés chez les STEC ; le gène *aggR* qui code le régulateur de la transcription de nombreux gènes de virulence chez les EAEC (Morin *et al.*, 2013), le gène *pic* qui code une sérine protéase impliquée dans la colonisation chez les EAEC (Harrington *et al.*, 2009) et les gènes *irp2* (*iron responsible protein 2*) et *fyuA* (*ferric yersiniabactin uptake*) qui codent des protéines ayant un rôle dans l'absorption du fer chez *Yersinia* (Gophna *et al.*, 2001).

**4. Notion de risque moléculaire**

La seule détection des gènes caractérisant les STEC et EHEC (*stx1*, *stx2* et *eae*) et les EPEC (*eae* et *bfpA*) ne suffit pas à définir le potentiel de virulence réel des souches du fait de l'intervention d'autres facteurs de virulence (EFSA 2013). Le séquençage total du génome du *E. coli* STEC O157:H7 EDL933 a montré la présence d'îlots de pathogénicité composés de différents gènes de virulence dont une partie des ilôts est décrit dans l'Annexe I (Figure 14). Les gènes présents sur ces îlots se composent essentiellement de gènes *nle*, de gènes codant des adhésines, des toxines ou des mécanismes impliqués dans la résistance des souches aux agressions extérieures.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 14** : Gènes de virulence de *E. coli* associés aux O-Islands 122, 36, 71 et 57.</figcaption></figure>

De récentes études se sont intéressées à l'association entre la présence de certains OI et le pouvoir pathogène des souches (Karmali *et al.*, 2003, Wickham *et al.*, 2006, Coombes *et al.*, 2008, Imamovic *et al.*, 2010b). Notamment en 2006, Wickham *et al.*, ont associé la présence de l'OI-122 à des souches responsables de SHU et d'épidémies. Coombes *et al.*, en 2008 ont mis en évidence que les gènes présents sur les OI-122, OI-57 et OI-71 étaient fortement détectés chez des souches STEC responsables de SHU et d'épidémies.

Les gènes localisés préférentiellement sur les OI-122, OI-43-47, OI-57, OI-71 sont le plus souvent associés à des cas cliniques graves (Coombes *et al.*, 2008, Bugarel *et al.*, 2010, Ju *et al.*, 2013, Chui *et al.*, 2015)
Le développement de méthodes miniaturisées dédiées à l'évaluation rapide du pouvoir pathogène des souches (puce à ADN) est en pleine expansion. La détection combinée des gènes *stx*, *eae* et d'une série de gènes *nle* permet donc de produire une sorte de signature de virulence utilisée pour identifier les souches potentiellement hautement pathogènes pour l'Homme, pour différencier par exemple les souches EHEC des STEC et des EPEC (Bugarel *et al.*, 2010, Delannoy *et al.*, 2013).

## E. Réservoirs des EPEC

Le réservoir principal des EPEC est le tube digestif de l'Homme, plus précisément des enfants malades ou asymptomatiques, des adultes asymptomatiques incluant les mères et les personnes au contact d'enfant (Nataro et Kaper 1998). Le portage varie entre 11 et 24 % dans les études recensées dans le Tableau 9.

Plusieurs études rapportent également la présence des EPEC dans les fèces d'animaux variant entre 8 % et 32 % selon l'espèce animale considérée. Les bovins, les ovins, les caprins, les animaux domestiques et les animaux sauvages sont des réservoirs potentiels d'EPECa.

Plus précisément, le réservoir principal des EPECt est l'Homme et le réservoir des EPECa est divisé entre l'Homme et les animaux (Trabulsi *et al.*, 2002). De plus, les EPECa sont plus communément détectés dans les échantillons humains et animaux que les EPECt, avec 211 souches isolées versus 12 souches parmi les études recensées ci-dessous (Tableau 9).

## F. Réservoirs des STEC

Les animaux d'élevage (bovins, ovins, porcs, chèvres, volaille) et tout particulièrement les bovins, sont les principaux réservoirs des STEC au niveau de leur tube digestif. Ce sont des porteurs sains et la colonisation de leur tube digestif est asymptomatique et transitoire (Ferens et Hovde 2011). Le portage varie d'un environnement à l'autre et peut varier entre 15 et 70 % selon les cheptels étudiés. De nombreuses études ont également mis en évidence le portage de STEC chez les ovins, les caprins, les porcs, les animaux sauvages et les animaux domestiques tels que les chiens et les chats mais également chez des animaux atypiques tels que les grenouilles ou les poissons par contamination indirecte (Tableau 10).

L'Homme symptomatique ou asymptomatique peut être le réservoir de STEC au niveau de son tube digestif (Blanco *et al.*, 2004). Le taux de portage varie entre 1,4 et 3 %.

Les études mettent en évidence l'isolement de souches appartenant aux EHEC typiques majeurs identifiés en Europe chez l'Homme et les animaux ; soit les sérogroupes O157, O26, O103 et O145. Le portage des EHEC typiques par les animaux domestiques et les animaux sauvages semble faible comparé au portage par l'Homme.
Au final, l'Homme et les animaux contribuent à la persistance et à la dissémination des STEC et des EPEC dans l'environnement par le portage symptomatique ou asymptomatique (Ferens et Hovde 2011).
<table><caption>**Tableau 9** : Sélection d'études révélant le taux de portage des EPEC dans différents réservoirs et proportion de souches EPECa et EPECt isolées</caption><thead><tr><th>Réservoirs (fèces)</th><th>Pays</th><th>Prévalence % (nombre d'échantillon positifs/nombre total)</th><th>EPECa ou EPECt (nombre de souches isolées)</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="6">Homme (symptomatique et asymptomatique)</td><td>Brésil</td><td>Enfant 11 % (13/119)</td><td>EPECa<sup>a</sup> (12) EPECt<sup>b</sup> (1)</td><td>Franzolin et al., 2005</td></tr><tr><td>Inde</td><td>Adulte/Enfant 17 % (20/115)</td><td>EPECa (nd)</td><td>Shetty et al., 2012</td></tr><tr><td>Chine</td><td>Enfant 24 % (130/540)</td><td>EPEC</td><td>Wang et al., 2014</td></tr><tr><td>Iran</td><td>Enfant 14 % (191/1355)</td><td>EPECa/EPECt (nd<sup>c</sup>)</td><td>Alikhani et al., 2006</td></tr><tr><td>Japon</td><td>Etudiant 41 cas</td><td>EPECa (41)</td><td>Yatsuyanagi et al., 2003</td></tr><tr><td>Norvège</td><td>Enfant 13 % (59/461)</td><td>EPECa (58) EPECt (1)</td><td>Afset et al., 2004</td></tr><tr><td rowspan="2">Bovins</td><td>Inde</td><td>Veau 10 % (39/391)</td><td>nd</td><td>Wani et al., 2003</td></tr><tr><td>Espagne</td><td>Bétail 8,2 % (34/412)</td><td>nd</td><td>de la Fuente et al., 2002</td></tr><tr><td rowspan="2">Ovins</td><td>Inde</td><td>Agneaux 27 % (27/101)</td><td>nd</td><td>Wani et al., 2003</td></tr><tr><td>Espagne</td><td>Mouton 15 % (88/590)</td><td>nd</td><td>de la Fuente et al., 2002</td></tr><tr><td rowspan="2">Caprins</td><td>Espagne</td><td>Chèvre 8 % (18/222)</td><td>EPECa</td><td>Cortes et al., 2005</td></tr><tr><td></td><td>Chèvre 15 % (62/423)</td><td>nd</td><td>de la Fuente et al., 2002</td></tr><tr><td>Porcs</td><td>Hongrie</td><td>Porcelet 13 % (29/221)</td><td>EPECa (37)</td><td>Malik et al., 2006</td></tr><tr><td rowspan="2">Volaille</td><td>Inde</td><td>Canard (nd)</td><td>EPECa (2)</td><td>Farooq et al., 2009</td></tr><tr><td></td><td>Poule (nd)</td><td>EPECa (25)</td><td></td></tr><tr><td>Oiseaux</td><td>Inde</td><td>Pigeon (nd)</td><td>EPECa (6)</td><td>Farooq et al., 2009</td></tr><tr><td rowspan="2">Animaux domestiques</td><td>Brésil</td><td>Chien (nd)</td><td>EPECa (5)</td><td>Moura et al., 2009</td></tr><tr><td></td><td>Chat (nd)</td><td>EPECa (2)</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">Primates</td><td>Brésil</td><td>Singe 32 % (18/56)</td><td>EPECa (14) EPECt (7)</td><td>Carvalho et al., 2003</td></tr><tr><td></td><td>Singe (nd)</td><td>EPECa (3) EPECt (3)</td><td>Moura et al., 2009</td></tr><tr><td>Autres animaux</td><td>Brésil</td><td>Lapin (nd)</td><td>EPECa (6)</td><td>Moura et al., 2009</td></tr></tbody></table>

<footnote><sup>a</sup>*E. coli* entéropathogène atypique, <sup>b</sup>*E. coli* entéropathogène typique, <sup>c</sup>non déterminé.</footnote>
<table><caption>**Tableau 10** : Sélections d'études révélant le taux de portage des *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) dans différents réservoirs et le nombre de souches *E. coli* entérohémorragiques typiques majeurs (EHEC) isolées.</caption><thead><tr><th>Réservoir (fèces)</th><th>Pays</th><th>Prévalence % (nombre d'échantillon positifs/nombre total)</th><th>Pathovar</th><th>EHEC typiques majeurs isolés (nombre de souches)</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="7">Homme</td><td>France</td><td>Enfant 3 % (19/658)</td><td>STEC</td><td>O157:H7 (1)</td><td>Pradel et al., 2000</td></tr><tr><td>Espagne</td><td>Adultes 2,5 % (126/5054)</td><td>STEC</td><td>O157:H7 (24), O26:H11 (11)</td><td>Blanco et al., 2004</td></tr><tr><td>Pays-Bas</td><td>Adultes 1,7 % (68/4069)</td><td>STEC</td><td>O157:H7 (5)</td><td>van Duynhoven et al., 2008</td></tr><tr><td>Canada</td><td>Adultes 1,4 % (38/2725)</td><td>STEC</td><td>O157 (2), O26 (1)</td><td>Couturier et al., 2011</td></tr><tr><td>Inde</td><td>Adultes 1,8 % (11/600)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Kumar et al., 2014</td></tr><tr><td>Argentine</td><td>Adultes 1,4 % (1/70)</td><td>STEC</td><td>nd</td><td>Favier et al., 2014</td></tr><tr><td>France</td><td>Bétail 70 % (330/471)</td><td>STEC</td><td>O157:H7 (1)</td><td>Pradel et al., 2000</td></tr><tr><td rowspan="10">Bovins</td><td>Allemagne</td><td>Vache laitière 18 % (131/726)</td><td>STEC</td><td>O26 (1)</td><td>Zschock et al., 2000</td></tr><tr><td>Japon</td><td>Veaux 46 % (40/87)<br>Génisses 66 % (58/88)<br>Vache 69 % (126/183)</td><td>STEC</td><td>O157:H7 (1)</td><td>Kobayashi et al., 2001</td></tr><tr><td>Inde</td><td>Vache 18 % (12/66)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Khan et al., 2002</td></tr><tr><td>Brésil</td><td>Bétail 49 % (119/243)</td><td>STEC</td><td>O157 (5)</td><td>Moreira et al., 2003</td></tr><tr><td>Vietnam</td><td>Buffle 27 % (64/237)<br>Bovin 23 % (29/126)</td><td>STEC</td><td>O157 (3), O145 (1), O26 (1)</td><td>Vu-Khac et Cornick 2008<br>Cobeljic et al., 2005</td></tr><tr><td>Serbie</td><td>Bovin 15% (126/823)</td><td>STEC</td><td>O26 (1)</td><td>Monaghan et al., 2011</td></tr><tr><td>Irlande</td><td>Bovin 40 % (480/1200)</td><td>STEC</td><td>O26 (14), O145 (1)</td><td></td></tr><tr><td>Allemagne</td><td>Chèvre 75 % (70/93)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Zschock et al., 2000</td></tr><tr><td>Serbie</td><td>Chèvre 74 % (31/42)</td><td>STEC</td><td>O157 (5)</td><td>Cobeljic M et al., 2005</td></tr><tr><td rowspan="2">Ovins</td><td>Allemagne</td><td>Mouton 32,1 % (9/28)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Zschock et al., 2000</td></tr><tr><td>Suisse</td><td>Mouton 30 % (196/653)</td><td>STEC</td><td>Non-O157 (nd)</td><td>Zweifel et al., 2004</td></tr><tr><td>Porcs</td><td>Etats-Unis</td><td>70 % (484/687)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Fratamico et al., 2004</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td></td><td>Suisse</td><td>22 % (139/630)</td><td>STEC</td><td>O26:H- (1), O103:H2 (1)</td><td>Kaufmann et al., 2006</td></tr><tr><td></td><td>Serbie</td><td>11 % (135/900)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Cobeljic et al., 2005</td></tr><tr><td></td><td>Espagne</td><td>Sanglier 8 % (17/212)</td><td>STEC</td><td>O157:H7 (7)</td><td>Sanchez et al., 2010</td></tr><tr><td></td><td>Inde</td><td>Porc 14,5 % (113/782)</td><td>STEC</td><td>O157 (4), O103 (2)</td><td>Rajkhowa et Sarma 2014</td></tr><tr><td></td><td>Chine</td><td>Porc 25,4 % (255/1003)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Meng et al., 2014</td></tr><tr><td rowspan="2">Volaille</td><td>Serbie</td><td>1 % (4/40)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Cobeljic et al., 2005</td></tr><tr><td>Canada</td><td>53 % (52/97)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Parreira et Gyles 2002</td></tr><tr><td rowspan="2">Oiseaux</td><td>Italie</td><td>Pigeon 11 % (71/649)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Morabito et al., 2001</td></tr><tr><td>Canada</td><td>15 espèces d'oiseaux 98 STEC isolés</td><td>STEC</td><td>Aucune O157</td><td>Chandran and Mazuder 2014</td></tr><tr><td rowspan="2">Animaux sauvages</td><td>Espagne</td><td>Daim, Cerf, Mouflon, Chevreuil 24 % (58/243)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Sanchez et al., 2009</td></tr><tr><td>Etats-Unis</td><td>Lévrier 45 % (52/116)</td><td>STEC</td><td>Aucune O157</td><td>Staats et al., 2003</td></tr><tr><td rowspan="2">Animaux domestiques</td><td>Argentine</td><td>Chien 8 % (36/450)</td><td>STEC</td><td>Aucune</td><td>Bentancor et al., 2007</td></tr><tr><td></td><td>Chat 6 % (9/149)</td><td>STEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">Autres animaux</td><td>Italie</td><td>Grenouille 3 % (2/60)</td><td>STEC</td><td>O157 (nd)</td><td>Dipineto et al., 2010</td></tr><tr><td>Afrique</td><td>Poisson 5 % (3/64)</td><td>STEC</td><td>O157 :HNM (2)</td><td>Tuyet et al., 2006</td></tr></tbody></table>
## G. Mode de transmission

Les STEC et les EPEC se transmettent principalement par voie indirecte alimentaire, par consommation d'aliments d'origine animale ou végétale et d'eaux de boisson contaminés par un environnement souillé par les matières fécales animales ou humaines (Kern Benaibout 2006). La seconde voie de transmission est directe par contact interhumain ou par contact avec des ruminants infectés porteurs et excréteurs. Les eaux récréatives comme les lacs, les rivières et également les eaux de mer peuvent être des vecteurs de contamination (LeJeune 2008) (Tableau 11).

Il existe un lien étroit entre toutes les voies de transmissions possibles des STEC et des EPEC. Les flux potentiels de souches pathogènes sont caractérisés dans un premier temps par la présence des STEC et des EPEC au niveau des animaux domestiques et sauvages (Sanchez et al., 2010, Monaghan et al., 2011, Chandran and Mazumder 2014). La contamination passe par le contact d'animal à animal, d'animal à l'Homme (Lahti et al., 2002) mais aussi par la contamination des sols (prairies et champs) et des eaux superficielles à partir des déjections animales ou d'effluents contaminés (fumiers et lisiers) épandus pour fertiliser les terres agricoles (Grif et al., 2005, Quilliam et al., 2012, Brown et al., 2012). Les eaux usées issues des abattoirs ou des stations d'épuration véhiculent et favorisent la dissémination des bactéries d'origine fécale dans l'environnement (Franzolin et al., 2005, Martinez-Castillo et al., 2012). Les aliments (herbes et fourrages) et l'eau d'abreuvement des animaux peuvent ainsi être également contaminés (Polifroni et al., 2014). Les végétaux consommés par l'Homme ou les animaux peuvent être contaminés, soit par les fumures, soit par l'eau contaminée utilisée pour l'irrigation (Ma et al., 2014, Naganandhini et al., 2015). L'ensemble des flux potentiels de contamination de l'environnement et de l'Homme par ces bactéries entériques pathogènes sont présentés dans la Figure 15.
<table><caption>**Tableau 11** : Liste d'épidémies et d'infections liées aux *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) et aux *E. coli* entéropathogènes (EPEC) et identification de la voie de transmission</caption><thead><tr><th>Voie de transmissions</th><th>Sources</th><th>Sérotype ou sérogroupe (nombre de cas)</th><th>Pathovar</th><th>Pays</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="6"><strong>Contact indirect</strong></td></tr><tr><td rowspan="4">Viandes mal cuites</td><td>Burger</td><td>O123:HNM (2)</td><td>STEC</td><td>France</td><td>King et al., 2010</td></tr><tr><td>Porc</td><td>O157:H7 (29)</td><td>STEC</td><td>Canada</td><td>Trotz-Williams et al., 2012</td></tr><tr><td>Saucisse</td><td>O157:H7 (205)</td><td>STEC</td><td>Espagne</td><td>Bosch 2000</td></tr><tr><td>Mouton</td><td>O148:H8 (11)</td><td>STEC</td><td>France</td><td>Espié et al., 2006a</td></tr><tr><td rowspan="3">Produits frais</td><td>Lait</td><td>O157:HNM (14)</td><td>STEC</td><td>Etats-Unis</td><td>Guh et al., 2010</td></tr><tr><td>Fromage au lait cru</td><td>O157:H7 (29)</td><td>STEC</td><td>Canada</td><td>Gill et Oudit 2015</td></tr><tr><td>Fromage de chèvre</td><td>O157:H7 (2)</td><td>STEC</td><td>France</td><td>Espié et al., 2006b</td></tr><tr><td rowspan="5">Fruits-Légumes-autres</td><td>Graines germées</td><td>O104:H4 (3816)</td><td>STEC</td><td>Allemagne</td><td>Frank et al., 2011</td></tr><tr><td>Salade verte</td><td>O157:H7 (58)</td><td>STEC</td><td>Etats-Unis</td><td>Slayton et al., 2013</td></tr><tr><td>Cresson</td><td>O157 (5)</td><td>STEC</td><td>Angleterre</td><td>Jenkins et al., 2015</td></tr><tr><td>Germe de fenugrec</td><td>O104:H4 (15)</td><td>STEC</td><td>France</td><td>King et al., 2012</td></tr><tr><td>Riz</td><td>O157:H45 (80)</td><td>EPEC</td><td>Japon</td><td>Makino et al., 1999</td></tr><tr><td rowspan="4">Eaux de boisson</td><td></td><td>nd (41)</td><td>EPEC</td><td>Japon</td><td>Yatsuyanagi et al., 2003</td></tr><tr><td></td><td>O100:HNM (5 000)</td><td>STEC</td><td>Finlande</td><td>Lienemann et al., 2011</td></tr><tr><td></td><td>O157:H7 (174)</td><td>STEC</td><td>Japon</td><td>Akashi et al., 1994</td></tr><tr><td></td><td>O157:H7 (2 300)</td><td>STEC</td><td>Canada</td><td>Hrudey et al., 2003</td></tr><tr><td rowspan="6">Vecteurs alimentaires non identifiés</td><td></td><td>nd (16)</td><td>EPEC</td><td>Mexique</td><td>Estrada-Garcia et al., 2009</td></tr><tr><td></td><td>nd</td><td>EPEC</td><td>Angleterre</td><td>Wedley et al., 2012</td></tr><tr><td></td><td>O111 (37)</td><td>EPEC</td><td>France</td><td>Wight et al., 1997</td></tr><tr><td></td><td>nd (6)</td><td>EPEC</td><td>Colombie</td><td>Rúgeles et al., 2010</td></tr><tr><td></td><td>nd (38)</td><td>EPEC</td><td>Norvège</td><td>Afset et al., 2004</td></tr><tr><td></td><td>O26, O111, ... (40)</td><td>EPEC</td><td>Brésil</td><td>Scaletsky et al., 1999</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Contact direct</strong></td></tr><tr><td rowspan="4">Homme</td><td>Enfant (garderie)</td><td>O26:H11 (nd)</td><td>STEC</td><td>Etats-Unis</td><td>Brown et al., 2012</td></tr><tr><td>Adulte/enfant (camp)</td><td>O115:H19 (103)</td><td>EPEC</td><td>Japon</td><td>Saito et al., 2005</td></tr><tr><td>Enfant (Hôpital)</td><td>O111:HNM (25)</td><td>EPEC</td><td>Kenya</td><td>Senerwa et al., 1991</td></tr><tr><td>Enimaux</td><td>O157:H7 (1)</td><td>STEC</td><td>Pays-Bas</td><td>Heuvelink et al., 2002</td></tr><tr><td rowspan="2">Animaux</td><td>Vache (rodéo)</td><td>O157:H7 (14)</td><td>STEC</td><td>Etats-Unis</td><td>Lanier et al., 2011</td></tr><tr><td>Environnement</td><td>O157:H7 (5)</td><td>STEC</td><td>Finlande</td><td>Lahti et al., 2002</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td rowspan="10">Eaux de baignade</td><td>Herbe (Festival)</td><td>O157 :H7 (7)</td><td>STEC</td><td>Angleterre</td><td>Crankin et al., 1999</td></tr><tr><td>Prairie</td><td>O157 :H7 (3)</td><td>STEC</td><td>Autriche</td><td>Grif et al., 2005</td></tr><tr><td>Station d'épuration</td><td>O142, O25,...(13)</td><td>EPEC</td><td>Brésil</td><td>Franzolin et al., 2005</td></tr><tr><td>Inondation</td><td>O126 :H12, ... (32)</td><td>EPEC</td><td>Australie</td><td>Barlow et al., 1999</td></tr><tr><td>Lac</td><td>O157 :H7 (37)</td><td>STEC</td><td>Etats-Unis</td><td>Bruce et al., 2003</td></tr><tr><td>Lac</td><td>O157 :HNM (3)</td><td>STEC</td><td>Etats-Unis</td><td>Feldman et al., 2002</td></tr><tr><td>Rivière</td><td>O157 :H7 (7)</td><td>STEC</td><td>Angleterre</td><td>Ihekweazu et al., 2006</td></tr></table>
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 15** : Flux potentiels de *E. coli* producteurs de Shiga-toxines (STEC) et de *E. coli* entéropathogènes (EPEC) et voies potentielles de contamination de l'environnement et de l'Homme. En gris : voie regroupant les effluents, en vert : voie végétale, en bleu clair: voie hydrique, en bleu foncé : voie contact directe ou indirecte, en orange : voie consommation (d'après AFSSA 2003)</figcaption></figure>
### III. ESCHERICHIA COLI DANS L'ENVIRONNEMENT LITTORAL

#### A. Définition de l'environnement littoral

Le littoral peut être défini par la dénomination « zone entre la mer et le continent ». Il se divise en plusieurs parties ; (i) l'arrière pays côtier caractérisé par la présence des activités humaines, urbaines, agricoles et industrielles, (ii) l'interface entre le continent et l'océan avec la présence des activités humaines maritimes (ports, zones conchylicoles, zones de baignade, zones de pêche récréative...) et (iii) la pleine mer juridiquement répartie entre les eaux territoriales et la zone économique maritime plus au large (Figure 16). La zone côtière et spécifiquement les estuaires et les baies sont à l'interface entre trois types d'environnement : les terres, les rivières et la mer.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 16** : Représentation schématique de l'environnement littoral</figcaption></figure>

De ces activités, découle une forte pression sur le milieu qui fragilise ces espaces où les activités humaines sont très variées (baignade, conchyliculture, pêche récréative...). C'est en amont des zones côtières, au niveau des bassins versants, que la qualité de l'environnement est principalement impactée puisque 80 % des pollutions du littoral sont d'origine terrestre (Anonyme 2011).

Le littoral est un lieu où s'exercent de fortes activités urbaines, économiques et touristiques susceptibles d'apporter des contaminations d'origine fécale. En France, 20,8 % de la population vit à moins de 25 km du littoral. Occupant 4 % du territoire total, les communes littorales représentent 12,5 % des surfaces de logements. La pression de construction (surface construite par km² de territoire) est 2,5 fois plus forte dans les communes littorales que la moyenne métropolitaine.
En été, la population présente peut être beaucoup plus importante, augmentant ainsi les pressions exercées sur le littoral (Anonyme 2011).

Enfin au niveau de la zone littorale et des bassins versants en amont, s'exercent de nombreuses activités agricoles. L'agriculture (élevages intensifs, patûrage, culture...) est ainsi la principale activité qui occupe 40,2 % des terres des communes littorales (Anonyme 2011).

## B. Réglementation sanitaire en zone littorale

Depuis les années 1970, une réglementation européenne pour les eaux et les coquillages a été mise en place afin d'améliorer la qualité microbiologique des eaux de baignade et des eaux conchylicoles. Ces réglementations reposent sur la détection des indicateurs de contamination fécale que sont les *E. coli* et les entérocoques.

### 1. Les indicateurs de contamination fécale : *E. coli* et les entérocoques

Un bon indicateur de contamination fécale doit : (i) être présent au niveau du tractus digestif des animaux à sang chaud, (ii) être présent quand les pathogènes sont présents et absent quand l'échantillon n'est pas contaminé, (iii) être présent en plus grand nombre que les pathogènes, (iv) être capable de survivre de la même manière que les pathogènes dans l'environnement, (v) ne pas être capable de se multiplier dans l'environnement, (vi) être détectable et quantifiable facilement, rapidement et par des méthodes peu couteuses et enfin (vii) être non pathogène (Ishii et Sadowsky 2008). Les *E. coli* et les entérocoques sont généralement considérés comme étant de bons indicateurs de contamination fécale.

Leur présence dans les eaux ou les aliments témoigne d'une contamination fécale et donc d'un risque de propagation de germes transmissibles par voie oro-fécale tels que les salmonelles, les *Campylobacter spp.* ou les norovirus, par exemple. La consommation d'eau ou d'aliments contenant des *E. coli* en quantité importante peut présenter un danger pour l'Homme.

Ils sont les plus corrélés à l'apparition d'infections ou d'intoxications au niveau des eaux de baignade en eau douce ou marine (Crowther *et al.*, 2002).

Si les *E. coli* sont utilisés comme indicateur de contamination fécale pour classer les zones de baignade et les zones conchylicoles en Europe, ils présentent toutefois quelques limites : ils persistent moins longtemps en eau de mer et dans les coquillages que d'autres bactéries pathogènes ou des virus entériques (Marino *et al.*, 2005, Love *et al.*, 2010). Les entérocoques semblent mieux persister en eau de mer et seraient donc de meilleurs indicateurs que les *E. coli* en zone littorale (Love *et al.*, 2010).
## 2. Classification des zones de baignade

Le contrôle sanitaire des eaux de baignade est actuellement défini par la directive européenne 2006/7/CE (Anonyme 2006) basée sur la détection des indicateurs de contamination fécale : entérocoques et E. coli. Cette réglementation définit trois seuils de qualité en fonction de la corrélation entre les concentrations en E. coli et en entérocoques mesurées dans l'eau ; d'excellente à suffisante. Au delà de ces seuils les eaux sont considérées de qualité insuffisante (Tableau 12).

<table><caption>Tableau 12 : Réglementation sanitaire microbiologique des eaux intérieures et des eaux côtières et de transition selon la directive 2006/7/CE</caption><thead><tr><th>Paramètres<sup>a</sup><br>(NPP/100 ml)</th><th>Excellente qualité</th><th>Bonne qualité</th><th>Qualité suffisante</th><th>Méthode de<br>référence pour<br>l'analyse</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>E. coli</i></td><td>500<sup>b,d</sup>/250<sup>b,e</sup></td><td>1 000<sup>b,d</sup>/500<sup>b,e</sup></td><td>900<sup>c,d</sup>/500<sup>c,e</sup></td><td>ISO 9308-3 ou ISO<br>9308-2</td></tr><tr><td>Entérocoque</td><td>200<sup>b,d</sup>/100<sup>b,e</sup></td><td>400<sup>b,d</sup>/200<sup>b,e</sup></td><td>330<sup>c,d</sup>/185<sup>c,e</sup></td><td>ISO 7899-1 ou ISO<br>7899-2</td></tr></tbody></table>

Les États membres de l'Union Européenne établissent alors un classement des eaux en fonction de cette norme. En France, la période de suivi couvre l'ensemble de la saison balnéaire du 15 juin au 15 septembre lorsque les sites de baignade sont régulièrement fréquentés, avec une fréquence de prélèvements le plus souvent bimensuelle. La surveillance des zones de baignade est assurée pendant la saison estivale par les Agences Régionales de la Santé (ARS). Les résultats sont disponibles sur le site internet du ministère chargé de la santé (http://baignade.santé.gouv.fr).

En 2014, plus de 90 % des sites de baignade en France ont été classés d'excellente ou de bonne qualité pour les 3 345 sites de baignade suivis (EEA 2015). Seuls 3,1 % des sites ont été classés de qualité insuffisante.

L'information concernant la classification des plages doit être accessible et visible au public par le biais de tableaux d'affichage à l'entrée de chaque plage et sur le site internet du ministère de la santé (http://baignades.sante.gouv.fr/). En cas de classement en qualité suffisante voir insuffisante, les États adoptent les mesures nécessaires pour la gestion et l'élimination des contaminations, afin d'accroître le nombre d'eaux de baignade de bonne ou excellente qualité. En cas de classement épisodique en qualité

<footnote><sup>a</sup>Pour qu'une eau de baignade soit classée dans une catégorie de qualité donnée, il faut que les percentiles des résultats de dénombrement pour les deux indicateurs microbiologiques soient inférieurs aux valeurs seuils de la classe de qualité considérée.</footnote>

<footnote><sup>b</sup>Valeurs seuils à comparer aux percentiles 95 des mesures microbiologiques.</footnote>

<footnote><sup>c</sup>Valeurs seuils à comparer aux percentiles 90 des mesures microbiologiques</footnote>

<footnote><sup>d</sup>Eaux intérieures</footnote>

<footnote><sup>e</sup>Eaux côtières et de transition</footnote>
insuffisante, les Etats s'engagent à prendre les mesures nécessaires de gestion pour la protection et
l'information des baigneurs par la mise en place d'arrêtés municipaux d'interdiction de baignade.

La directive 2006/07/CE impose également l'établissement d'un profil de vulnérabilité des eaux de baignade pour chaque site. Ce profil nécessite une identification et une étude des sources de contamination fécale et la mise en place d'actions sur ces sources pour améliorer la qualité des eaux.

3. Classification des zones conchylicoles

Les zones conchylicoles sont classées selon le Paquet hygiène et en particularité le règlement CE/854/2004 (Anonyme 2004) et l'arrêté du 21 mai 1999 relatif au classement de salubrité et à la surveillance des zones de production et des zones de reparcage des coquillages vivants. L'ensemble des zones de production de coquillages (zones d'élevage et de pêche professionnelle) fait ainsi l'objet d'un classement sanitaire, défini par arrêté préfectoral. Celui-ci est établi sur la base d'analyses des coquillages présents dans ces zones : analyses microbiologiques en utilisant E. coli comme indicateur de contamination et le dosage de la contamination en métaux lourds (plomb, cadium et mercure). Le classement et le suivi des zones de production de coquillages distinguent trois groupes de coquillages au regard de leur physiologie :

* groupe 1 : les gastéropodes (bulots etc.), les échinodermes (oursins) et les tuniciers (violets) ; plus généralement des coquillages sauvages de gisements naturels,

* groupe 2 : les bivalves fouisseurs, c'est-à-dire les mollusques bivalves filtreurs dont l'habitat est constitué par les sédiments (palourdes, coques...) ; plus généralement des coquillages sauvages de gisements naturels,

* groupe 3 : les bivalves non fouisseurs, c'est-à-dire les autres mollusques bivalves filtreurs (huîtres, moules...) ; plus généralement des coquillages d'élevage.

En France, l'estimation de la qualité microbiologique des coquillages des zones de production utilise les données acquises en surveillance régulière par le REseau de contrôle MMicrobiologique (REMI) de l'Ifremer, sur des périodes de trois années consécutives (années calendaires). L'interprétation des données se fait par rapport aux seuils microbiologiques en vigueur établis par le règlement CE/854/2004 associé à des règles de gestion strictes avant la mise sur le marché (Figure 17)
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 17** : Exigences réglementaires microbiologiques issues du classement des zones conchylicoles [Règlement (CE) n° 854/2004 et arrêté du 06/11/2013 fixant les conditions sanitaires de transfert et de traçabilité des coquillages vivants]</figcaption></figure>

En France, en 2015, 51 sites relatifs à la production de coquillages appartenant au groupe 1, 182 pour les coquillages du groupe 2 et 328 pour les coquillages du groupe 3, ont été suivis le plus souvent mensuellement ; soit un total de 561 sites. Vingt-trois pourcents des zones ont été classés en catégorie A, 68 % en catégorie B, 6 % en catégorie C et 3 % en catégorie D (http://www.zones-conchylicoles.eaufrance.fr).

En France, la mise en évidence d'épisodes de forte contamination par le suivi du REMI, faisant suite à de fortes pluies ou à la présence de rejets non contrôlés, fait l'objet de bulletins d'alertes transmis aux autorités compétentes locales et nationales. La persistance de la contamination peut faire l'objet d'une mesure de gestion par le préfet (fermeture temporaire de la zone ou modification du classement).

Dès lors que les coquillages sont considérés comme des produits alimentaires, ils font l'objet d'une réglementation liée à la manipulation, au conditionnement et au traitement en vue de leur commercialisation. La réglementation qui classe les zones conchylicoles selon leur qualité sanitaire prévoit les mesures de traitements adéquats pour chaque catégorie de coquillages avant la mise sur le marché (Figure 17).

Le traitement des coquillages est basé principalement sur leur propriété physiologique liée à leur capacité à filtrer de grandes quantités d'eaux et ainsi à éliminer les contaminants microbiologiques éventuellement présents dans les coquillages. L'élimination des microorganismes se fait par le reparcage des coquillages issus du milieu naturel dans des bassins d'eau de mer propre et traitée pour une durée plus ou moins longue selon la catégorie de la zone pour obtenir une concentration en E. coli < 230 E. coli/100 g CLI (limite de commercialisation).
### C. Contamination et décontamination des coquillages

Les bivalves sont des organismes filtreurs qui par ce mécanisme physiologique complexe, captent et concentrent les particules de tailles variables entre 5 et 200 µm, de type phytoplancton, algues microscopiques, divers détritus présents dans leur environnement pour se nourrir. Un mouvement ciliaire assure le tri des particules puis leur transport jusqu'à la bouche de l'animal (Burkhardt et Calci 2000). Les microparticules sont ensuite ingérées, digérées *via* le tractus digestif et éliminées par les phénomènes de digestion et/ou de défécation (Figure 18). Une huître peut filtrer entre deux et six litres d'eau par heure par gramme de poids sec, tandis que les moules peuvent filtrer entre 0,3 à 2 litres d'eau par heure par gramme de poids sec (Gosling 2015).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 18** : Schéma de l'anatomie de l'huître creuse *Crassostrea gigas* (gauche) et de la moule *Mytilus edulis* (droite)</figcaption></figure>

Parmi les particules filtrées par les coquillages, les bactéries ou les virus potentiellement pathogènes pour l'Homme peuvent être présents car fixés aux éléments nutritifs. Leur présence dans les coquillages peut conduire à l'apparition de TIAC (maladie à déclaration obligatoire) lors de leur consommation (Iwamoto et al., 2010, Iritani et al., 2014, Loury et al., 2015). En France, en 2013, 102 foyers de TIAC sur 1 086 recensés étaient liés à la consommation de coquillages, dont 48 liés à la présence de virus entériques (InVS 2013).

Ces microorganismes de la même façon que les éléments nutritifs, peuvent être éliminés par le phénomène de digestion et de défécation de l'organisme filtreur. Le comportement des bactéries entériques pathogènes dans le coquillage est encore mal connu. Cependant, des études en microcosmes ont montré que les bactéries, telles que les salmonelles se concentraient préférentiellement au niveau des tissus digestifs du coquillage puis se retrouvaient dans les cellules des tissus conjonctifs profonds (Morrison et al., 2011).
Pour les virus entériques, certaines souches de norovirus (souches du génogroupe I) se lient aux tissus d'huîtres creuses (*Crassostrea gigas*) via des ligands carbohydrates, proches des ligands caractérisés chez l'Homme (Drouaz *et al.*, 2015).

Dans le coquillage, les bactéries entériques ne sont que de « passage » contrairement aux norovirus (Guyader *et al.*, 2013). Ce phénomène est utilisé pour dépurer les coquillages contaminés par des bactéries.

Les coquillages sont capables de concentrer les microorganismes, ce phénomène est appelé la bioaccumulation. Le facteur de bioaccumulation, traduit le niveau de concentration des microorganismes dans le coquillage par rapport à la concentration dans le milieu. Ce facteur est extrêmement variable d'un bivalve à l'autre et dépend des facteurs biologiques propres à chaque organisme (état physiologique, taille, espèce) et des facteurs environnementaux (température, salinité) (Jozic *et al.*, 2012, Derolez *et al.*, 2013). Le facteur de bioaccumulation de l'indicateur *E. coli* peut varier entre 0,9 et 9,8 chez les moules et entre 0,9 et 10,3 chez les huîtres en microcosme et entre 0,1 et 406 chez les huîtres dans l'environnement (Tableau 13).

<table><caption>**Tableau 13** : Facteur de bioaccumulation de l'indicateur de contamination fécale *E. coli* dans les huîtres et les moules. nd : non déterminé.</caption><thead><tr><th></th><th>Espèce</th><th>Facteur de bioaccumulation</th><th>Température</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Microcosme</td><td>Moule (<i>M. galloprovincialis</i>)</td><td>1,1-1,3</td><td>14-21°C</td><td>Marino <i>et al.</i>, 2005</td></tr><tr><td>Huître (<i>C. virginica</i>)</td><td>3,8</td><td>14-30°C</td><td>Burkhardt et Calci 2000</td></tr><tr><td>Moule (<i>M. edule</i>)</td><td>0,9-7,7</td><td>nd</td><td>Campos <i>et al.</i>, 2013</td></tr><tr><td>Huître (<i>C. gigas</i>)</td><td>0,9-10,3</td><td>nd</td><td>Campos <i>et al.</i>, 2013</td></tr><tr><td rowspan="2">In situ</td><td>Huître (nd)</td><td>2-146</td><td>12,6-30,4°C</td><td>Shieh <i>et al.</i>, 2003</td></tr><tr><td>Huître (<i>C. gigas</i>)</td><td>0,1-406</td><td>5,7-15°C</td><td>Derolez <i>et al.</i>, 2013</td></tr></tbody></table>

Plusieurs études se sont focalisées sur le comportement des *E. coli* face au phénomène de bioaccumulation dans les coquillages (Marino *et al.*, 2005, Younger et Reese 2013). La cinétique de contamination par *E. coli* des bivalves filtreurs se traduit par une relation hyperbolique ; le temps de bioaccumulation nécessaire pour obtenir une contamination maximale dans les coquillages est très rapide de l'ordre d'une heure. Ensuite, on observe un équilibre cinétique entre la concentration des bactéries dans le coquillage et dans l'eau de mer.

La vitesse de contamination est très dépendante des conditions environnementales comme la température de l'eau ou la concentration initiale en bactéries Cette vitesse diminue lorsque la température de l'eau diminue (Jozic *et al.*, 2012).
Comme pour la phase de contamination, la phase de dépuration des coquillages par *E. coli* est très rapide de l'ordre parfois de deux à six heures pour passer au-dessous du seuil d'acceptabilité de la réglementation qui est de < 230 UFC/100 g (ou 2,4 log₁₀ UFC/100 g) de CLI (Marino *et al.*, 2005). Les paramètres physico-chimiques comme la température de l'eau et la salinité jouent un rôle important dans l'efficacité de la dépuration des coquillages. De meilleurs rendements de purification sont observés à la température de 25°C comparé à 18 ou 12°C (Love *et al.*, 2010). L'espèce du bivalve est également un paramètre à prendre en compte dans l'efficacité de la dépuration puisque les paramètres physiologiques ou le potentiel de filtration diffèrent d'une espèce à l'autre ; par exemple, à une concentration en *E. coli* de 3 log₁₀ UFC/ 100 g de CLI, à 25°C, salinité 28 ‰, pH 8, 1,1 jour est nécessaire pour que la concentration en *E. coli* passe en dessous du seuil critique de commercialisation (< 230 UFC/100 g CLI) chez l'huître, alors que 2,8 jours sont nécessaires pour des palourdes. Ces valeurs augmentent quand la concentration en *E. coli* augmente pour les deux espèces (Love *et al.*, 2010).

Sur la base de ces observations, la dépuration des coquillages selon la réglementation CE/854/2004 est un phénomène contrôlé et normé avec l'utilisation de bassins de dépuration (Figure 19). La dépuration s'effectue suite au passage des coquillages contaminés dans une eau propre et traitée afin d'éliminer les résidus de pathogènes rejetés dans l'eau par les coquillages. Cette eau peut être traitée de différentes manières par irradiation aux UV, ozonisation, ou récemment par électrolyse de l'eau de mer, basée sur le cycle perpétuel de transformation du sel en chlore et inversement, qui agit comme un puissant oxydant-désinfectant naturel (Kasai et al 2011, Oliveira *et al*., 2011).

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 19** : Photo de bassin de dépuration d'huîtres</figcaption></figure>

D. Sources et apports de *E. coli* dans l'environnement littoral

La contamination de l'environnement littoral par *E. coli* résulte de la présence de trois principales sources de contamination fécale, provenant essentiellement des bassins versants en amont : i) les sources d'origine urbaine caractérisées principalement par les eaux usées et les rejets domestiques, ii)
les sources d'origine agricole caractérisées par les déjections des animaux tels que les bovins et les ovins en pâturage et les effluents d'animaux d'élevage (lisiers et fumiers) et iii) les sources environnementales caractérisées par la présence d'oiseaux et d'animaux sauvages (Campos et al., 2013).

# 1. Sources d'origine urbaine

Les sources d'origine urbaine sont essentiellement représentées par les effluents des stations d'épuration (STEP), traitées ou non et les eaux usées issues des habitats dispersés.

L'Homme excrète par jour, via ses fèces, d'importantes concentrations en E. coli comprises entre 5 et 8,6 log₁₀ UFC/g de fèces (Tableau 14). E. coli se retrouve ensuite dans les fosses septiques et dans les réseaux d'assainissement puis au niveau des stations d'épuration.

Les stations d'épuration qui collectent et traitent les eaux usées permettent principalement l'élimination des composés carbonés, l'azote et le phosphore et plus ou moins efficacement, l'élimination des microorganismes entériques. Toutefois, les rejets de ces stations constituent encore une source importante de contamination des eaux environnementales. La France comptait en 2010, 18 637 stations de traitement des eaux usées sur l'ensemble du territoire (métropole et DOM) traitant une charge de pollution de 75 million Equivalent Habitant (estimation de la quantité de pollution émise par personne et par jour).

Ces stations de traitement permettent de diminuer les concentrations en microorganismes (de 1,6 à 3 log₁₀ de E. coli) par différentes filiaires de traitement : boues activées, boues activées associées à des membranes filtrantes, lagunage naturel, traitements tertiaires utilisant les rayonnements UV, la température, la chloration ou l'ozone ... (Pfannes et al., 2015, Lueddeke et al., 2015, Tondera et al., 2015).

La performance des usines de traitement et leur capacité de stockage ainsi que l'entretien des infrastructures de transport des eaux usées du domicile à la station d'épuration tels que le fonctionnement des postes de relèvement ou l'état des conduites sont des points critiques qui influencent les rejets de E. coli dans l'environnement (Campos et al., 2013).

Les boues de STEP épandues dans les champs peuvent aussi constituer un risque de contamination de l'environnement par les bactéries entériques.
<table><caption>Tableau 14 : Concentrations en *E. coli* présentes au niveau des fèces humaines et de différentes sources urbaines</caption><thead><tr><td>Sources urbaines</td><td>Concentrations en <i>E. coli</i></td><td>Références</td></tr></thead><tbody><tr><td>Fèces humaines</td><td>7,4 - 8,4 log<sub>10</sub> UFC/ g</td><td>Smati <i>et al.</i>, 2015</td></tr><tr><td>Eaux usées brutes</td><td>7 - 7,4 log<sub>10</sub> cellules/100 mL</td><td>Wéry <i>et al.</i>, 2008</td></tr><tr><td rowspan="2">Eaux usées traitées</td><td>2,9-3,7 log<sub>10</sub> UFC/100 mL</td><td>Gourmelon <i>et al.</i>, 2010</td></tr><tr><td>4,8-5,8 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i>/100 mL</td><td>Lueddeke <i>et al.</i>, 2015</td></tr><tr><td>Eaux de fosses septiques</td><td>4,3-5,3 log<sub>10</sub> NPP/100 mL</td><td>Appling <i>et al.</i>, 2013</td></tr></tbody></table>

Les habitations trop dispersées pour être raccordées au réseau d'assainissement collectif (traitement des eaux usées au niveau des STEP) doivent disposer d'un système d'assainissement autonome qui permet l'infiltration des eaux usées dans le sol après une épuration partielle grâce à l'action de microorganismes au niveau des fosses septiques. Si la conformité de l'installation n'est pas respectée ou s'il n'y a pas un bon fonctionnement, ce type d'installation peut être une source de pollution. De plus, la multiplication de *E. coli* dans les fosses septiques a été démontrée dans une étude où la concentration initiale mesurée était de 4,3 log₁₀ NPP/100 mL et passait à >5,38 log₁₀ NPP/100 mL (seuil supérieur de détection de la méthode) en deux semaines (Appling *et al.*, 2013).

Dans les zones fortement industrialisées, les rejets industriels portuaires peuvent également alimenter la source de contamination urbaine en *E. coli* entre 0,7 et 4 log₁₀ UFC/ 100 mL d'eau (Servais *et al.*, 2007).

Les risques de contamination de l'environnement sont souvent augmentés par temps de pluie. Les eaux usées urbaines non traitées dans les STEP, du au débordement des égouts et à l'engorgement des STEP, sont une source potentielle de contamination. Le ruissellement de ces eaux dans l'environnement peut être un apport supplémentaire en *E. coli* à hauteur de 4,5 à 5,5 log₁₀ UFC/100 mL (Parker *et al.*, 2010).

## 2. Sources d'origine agricole

Les sources d'origine agricole sont caractérisées par la présence d'élevages plus ou moins intensifs d'animaux tels que les bovins, les porcs, les ovins et la volaille et l'exploitation des terres pour les cultures. Les animaux d'élevage génèrent une quantité importante de fèces avec des concentrations en *E. coli* variant entre 3,1 et 9,5 log₁₀ UFC/ g fèces selon l'espèce animale considérée (Tableau 15). Ces fèces peuvent être retrouvées dans les patûrages avec les élevages en plein air.
<table><caption>**Tableau 15** : Concentrations en *E. coli* dans les fèces d'animaux d'élevage (d'après Cox *et al.*, 2005, Smati *et al.*, 2015)</caption><thead><tr><th>Sources animales</th><th>Concentrations en <i>E. coli</i> (log<sub>10</sub> UFC/g fèces)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Bovins</td><td>3,1 – 8,9</td></tr><tr><td>Ovins</td><td>5 – 8,3</td></tr><tr><td>Porcs</td><td>5,8 – 8,6</td></tr><tr><td>Volaille</td><td>6,2 – 8,7</td></tr><tr><td>Chèvres</td><td>4,7 – 9,5</td></tr></tbody></table>

Dans les fermes, les fèces des animaux tels que les porcs et les bovins sont souvent mélangées aux eaux de lavage pour former les lisiers ou à la litière des animaux pour former le fumier. Ces effluents sont ensuite éliminés : i) par traitement au niveau des exploitations avec des étapes de traitements par boues activées, par centrifugation, par compostage ou par lagunage selon les exploitations, ii) par exportation dans d'autres régions ou iii) par épandage sur les terres agricoles.

Au niveau des zones agricoles, les habitats dispersés et les exploitations agricoles sont aussi des sources de contamination potentielles de l'environnement.

Les effluents porcins, bovins et de volaille non traités peuvent contenir de fortes concentrations en *E. coli* comprises entre 2,3 et 8,3 log₁₀ *E. coli/g* de lisier de porcs, entre 4,2 et 9,4 log₁₀ *E. coli/g* de fumier de bovins et entre 0,1 et 4,3 log₁₀ *E. coli/g* de litière de volaille (Tableau 16). Ces effluents traités ou non sont utilisés pour fertiliser les sols cultivables et des concentrations en *E. coli* entre 3 et 4,5 log₁₀ UFC/g lisier épandu peuvent alors être mesurées sur le sol cultivé (Jensen *et al.*, 2013).

<table><caption>**Tableau 16** : Concentration en *E. coli* dans les effluents de porcs, de bovins et de volaille</caption><thead><tr><th>Sources</th><th>Concentration en <i>E. coli</i></th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Lisiers porcins non traités</td><td>2,3-6,6 log<sub>10</sub> cellules/ g</td><td>Marti <i>et al.</i>, 2010</td></tr><tr><td>4,5 ±3,8 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i> / g</td><td>Jaffrezic <i>et al.</i>, 2011</td></tr><tr><td rowspan="2">Lisiers porcins traités</td><td>1,6-3 log<sub>10</sub> cellules/ g</td><td>Marti <i>et al.</i>, 2010</td></tr><tr><td>4,3 ±0,4 log<sub>10</sub> MPN/ g</td><td>Mieszkin <i>et al.</i>, 2009</td></tr><tr><td rowspan="2">Fumiers bovins non traités</td><td>4,2-4,5 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i> / g</td><td>Johannessen <i>et al.</i>, 2004</td></tr><tr><td>4,7 ±4,7 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i> / g</td><td>Jaffrezic <i>et al.</i>, 2011</td></tr><tr><td rowspan="2">Fumiers bovins traités</td><td>2,1 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i> / g</td><td>Klein <i>et al.</i>, 2011</td></tr><tr><td>0,8-2,8 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i> / g</td><td>Johannessen <i>et al.</i>, 2004</td></tr><tr><td>Litières de volaille non traitées</td><td>2,2 ±2,1 log<sub>10</sub> <i>E. coli</i> / g</td><td>Cook <i>et al.</i>, 2014</td></tr><tr><td>Litières de volaille traitées</td><td>1,4-2 log<sub>10</sub> UFC/ g</td><td>Shepherd <i>et al.</i>, 2010</td></tr></tbody></table>
Les risques de contamination de l'environnement par les sources agricoles sont augmentés par temps de pluie en raison des ruissellements au niveau des sièges des exploitations et dans les champs sur lesquels les effluents sont épandus (Blaustein et al., 2016) (Figure 20).

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 20** : Influence du niveau de pluviométrie sur la pénétration et le ruissellement de fumier épandu sur le sol (d'après Blaustein et al., 2016)</figcaption></figure>

### 3. Sources environnementales : les animaux sauvages

Les animaux sauvages présents dans les forêts et les terres non cultivées (sangliers, cerfs, lapins, oiseaux,...) participent à la contamination en *E. coli* de l'environnement (Goto et Yan 2011). Les animaux en contact avec les points d'eaux et les rivières, participent à la contamination de l'environnement à hauteur de 7,1 log₁₀ UFC/g de fèces pour les sangliers ou de 6,1 log₁₀ UFC/g de fèces pour les cerfs (Smati et al., 2015).

Les oiseaux sauvages comme les goélands, les mouettes ou les canards présents sur le littoral sont également des sources de contamination potentielle en *E. coli* entre 5 et 9 log₁₀ UFC/g de fèces (Araújo et al., 2014, Withman et al., 2014)

#### E. *E. coli* de la source à l'environnement littoral

Les *E. coli* dans l'environnement suivent une « chaîne de contamination » de leur émission jusqu'à leur arrivée dans l'eau (Figure 21). A chaque étape, les *E. coli* sont soumis à des facteurs biotiques et abiotiques influençant leur devenir dans les différents compartiments. Les facteurs intrinsèques propres à chaque bactérie sont également des facteurs importants dans la survie et la persistance des souches dans l'environnement (Campos et al., 2013).
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 21** : Chaîne de contamination des *E. coli* de la source au coquillage. Identification des facteurs abiotiques (jaune) et biotiques (vert) présents au niveau de chaque compartiment agissant sur la survie des *E. coli*. STEP : station d'épuration</figcaption></figure>

## Les déjections humaines et animales

A la source, dans les fèces humaines et animales, les *E. coli* sont présents à des concentrations variables entre 3,1 et 9,5 log₁₀ *E. coli*/100 g. Dans ce compartiment, la fraction de *E. coli* pathogènes type STEC peut être entre 1,4 et 3 % dans les fèces humaines et entre 15 et 75 % dans les fèces des animaux. Certains STEC sont capables de persister de deux mois à 38 mois dans les fèces de bovins (Frémaux et al., 2010, Joris et al., 2013, Widgren et al., 2015) et jusqu'à 11 mois dans les fèces de moutons (Amezquita-Lopez et al., 2012). Les EPEC sont capables de survivre jusqu'à 24 mois dans les fèces humaines (Shetty et al., 2012). Le facteur le plus influent pour la survie des *E. coli* dans ce compartiment est la disponibilité en eau (a<sub>w</sub>) généralement liée aux variations de température. Plus la température est basse, plus l'a<sub>w</sub> est élevée : au dessus de 22°C, l'a<sub>w</sub> des fèces de bovins en fin de stockage est inférieure à 0,5, alors qu'elle reste voisine de 0,99 pour un stockage à +5°C (Wang et al., 1996). Les paramètres biotiques, telles que la prédation et la compétition avec la flore totale fécale sont des éléments qui interviennent également sur la survie des *E. coli* dans les fèces concernant la disponibilité en nutriments.

## Les effluents urbains et agricoles

Parmi les *E. coli* retrouvés dans les eaux usées urbaines, les STEC peuvent être présents dans 10 à 53 % des échantillons de STEP (Vernozy-Rozand et al., 2002). Au niveau des stations d'épuration, les traitements appliqués pour éliminer les microorganismes impactent la survie des *E. coli*. Par exemple, le traitement par filtration ou le traitement thermique permet de réduire la population entre 1,4 et 2,3 log₁₀ au niveau des eaux usées (Marin et al., 2015). Les EPEC peuvent être détectés jusqu'à 13 mois au niveau des eaux usées de STEP et dans les sols présents à proximité des stations (Yang et al., 2014).

Les lisiers et les fumiers peuvent contenir des *E. coli* à des concentrations de 4,2 à 4,5 log₁₀ UFC/100 g fèces. La prévalence de STEC dans les effluents agricoles peut être detectée dans 9 % des lisiers de
porcs analysés et dans 11 % des fumiers de bovins a été reportées dans l'étude de Vernozy-Rozand et al., (2002). Selon le type de sols amendés par des fumiers et des lisiers en parcelles expérimentales, les *E. coli* peuvent être retrouvés entre 110 jours et plus d'un an, selon la disponibilité en eau et en nutriments sur les sols (Brennan et al., 2010, Moynihan et al., 2015). Les STEC sont capables de résister dans ce compartiment à la dessiccation et à l'exposition solaire et de persister dans les sols amendés par des lisiers jusqu'à quatre mois (Frémaux et al., 2007).

Lors de fortes pluie les *E. coli* peuvent se retrouver dans les eaux de ruissellement et les rivières.

## Les rivières et les eaux de ruissellement

Concernant les eaux de rivières, il a été reporté que dans des rivières impactées par des apports urbains, les concentrations en *E. coli* peuvent varier entre 1,7 et 2,6 log₁₀ UFC/ 100 mL et pour celles impactées par des apports agricoles les concentrations peuvent varier entre 1,8 et 2,2 log₁₀ UFC / 100 mL (Walters et al., 2011). Des *E. coli* ont été détectés au niveau de la colonne d'eau douce entre 2 et 16 mois (Ouattara et al., 2011, Widmer et al., 2013). L'étude de Watterworth et al., (2006) a mis en évidence que les STEC présents dans l'eau douce sont capables de survivre entre 38 et 56 jours à 10°C.

## L'eau de mer et le sédiment

L'étude de Walters et al., (2011) a mis en évidence que les concentrations en *E. coli* peuvent varier entre 1,7 et 2,3 log₁₀ UFC /100 mL dans l'eau de mer. Les *E. coli* dans ce compartiment sont soumis à un facteur abiotique supplémentaire limitant la survie des bactéries : la salinité. En microcosmes d'eau de mer et d'eau douce, les *E. coli* sont détectables pendant au moins 60 jours dans l'eau douce alors que dans l'eau de mer les *E.coli* ne sont plus détectables à partir du 20ème jour d'expérimentation (Solecki et al., 2011). Un taux de décroissance des *E. coli* dans l'eau de mer de -4,2 log₁₀ UFC /100 mL et dans l'eau douce de -0,4 log₁₀ UFC /100 mL a été reporté par Anderson et al., (2005). L'ensoleillement est également un facteur très présent au niveau l'eau de mer, où les T90 (temps nécessaire pour que 90 % des bactéries ne soient plus cultivables) peuvent descendre jusqu'à 2,2 heures (Salomon et Pommepuy 1990). Whitman et Nevers (2003) ont montré que dans le sédiment, les *E. coli* peuvent être présents entre 2 et 4 log₁₀ UFC /100 g. La dessiccation et l'oligotrophie semblent être les deux facteurs les plus influents au niveau du sédiment. Whitman et al., (2014) ont mis en évidence que les *E. coli* étaient capables de persister jusqu'à 35 jours en microcosme à 19°C et jusqu'à 45 jours in situ.

Peu d'études existent sur la persistance des *E. coli* pathogènes type STEC dans le milieu marin à proprement parlé. Néanmoins in vitro, une étude a montré qu'un *E. coli* de sérotype O157:H7 était capable de survivre dans le sédiment marin et d'être relargé dans la colonne jusqu'à cinq jours
(Williams *et al.*, 2007). Cet agent pathogène est également capable de survivre pendant au moins 15 jours dans l'eau de mer (Miyagi *et al.*, 2001). Cependant, son activité métabolique diminue avec l'augmentation de la concentration en sel dans le milieu (Williams *et al.*, 2007). En microcosme d'eau de mer, l'apport d'élements nutritifs favorables, peut ré-activer le pouvoir pathogène du sérotype O157:H7 (Williams *et al.*, 2012).

Certaines souches de *E. coli* pathogènes ont été détectées ou isolées dans l'environnement marin comme un *E. coli* O157 dans des eaux de ballasts de bateaux en Inde (concentration > 2,5 *E. coli* log₁₀/mL) (Ramaiah *et al.*, 2005).

## Les coquillages

Dans des coquillages du littoral français, des concentrations en *E. coli* ont été reportées entre 2 et 3,4 log₁₀ NPP/100 g de CLI (Gourmelon *et al.*, 2006, Mieszkin *et al.*, 2013). A notre connaisance, aucune étude n'existe sur la persistance des souches de *E. coli* pathogènes de type STEC et EPEC dans les coquillages *in situ*. En microcosme, l'étude de la cinétique de décontamination de coquillage met en évidence qu'en moyenne les souches de *E. coli* ne persistent pas plus de quelques jours. Néanmoins, deux souches de sérotype O157:H7 (STEC=1, EPEC=1) et cinq souches non-O157 (STEC) ont été isolées dans des coquillages sur le littoral français (Guyon *et al.*, 2000, Gourmelon *et al.*, 2006). De plus, les gènes *stx* ont été détectés dans plusieurs lots de coquillages issus du littoral marocain mais aucune souche n'a pu être isolée (Bennani *et al.*, 2011).

En dehors de l'environnement littoral, les STEC ont également été détectés dans des coquillages ou des produits de la mer ; deux lots de coques destinés à la commercialisation, positifs à O157 (Samadpour *et al.*, 1994). Des souches O157 stx+ ont été isolées à partir de lots d'huîtres et de crevettes commercialisés (Rampersad *et al.*, 1999, Sanath-Kumar *et al.*, 2001, Surendraraj *et al.*, 2010). Des souches non-O157 stx+ ont été détectées et isolées (n=5) à partir de produits de la mer (palourdes, crevettes, poissons) commercialisés (Kumar *et al.*, 2004, Manna *et al.*, 2008).
MEMOIRE EXPERIMENTAL
# AXES DE RECHERCHE

Les principaux axes de recherche du travail de thèse étaient : i) de rechercher la présence de *E. coli* pathogènes tels que les STEC et EPEC au niveau de zones conchylicoles, ii) de caractériser les souches STEC et EPEC éventuellement présentes et d'estimer si possible leur virulence et iii) d'évaluer le comportement de souches STEC dans les coquillages par rapport à l'indicateur *E. coli*, vis-à-vis de la cinétique de contamination et de décontamination des coquillages.

Ces principaux axes de recherche ont conduit à la réalisation de trois étapes majeures :

- Le prélèvement et l'analyse d'échantillons de coquillages, de sédiments et d'eaux sur trois sites d'études sélectionnés auxquels j'ai participé pour un des trois sites.

- La caractérisation de la totalité des souches isolées sur les trois sites d'étude : sérotypage, groupage phylogénétique (classification en phylogroupe, MLST, PFGE), capacité à former des biofilms, profil d'antibio-résistance, recherche de gènes de virulence, effectuée grâce à plusieurs collaborations nationales et internationales.

- L'évaluation de la cinétique de contamination et de décontamination de coquillages par des souches STEC isolées au cours de cette étude en microcosmes.

Les travaux réalisés et les résultats acquis au cours de cette thèse sont présentés principalement, sous la forme de publications (trois dont une en préparation) et sous forme manuscrite pour le chapitre concernant l'étude de la cinétique de contamination/décontamination de coquillages.

Le chapitre 1 présente les sites d'étude et le contexte de l'étude.

Le chapitre 2 comprend le premier article qui décrit l'application de la norme ISO-TS-13136/2012, utilisée pour la détection et l'isolement des STEC hautement pathogènes, sur trois matrices de l'environnement littoral : coquillage, sédiment et eaux de rivières.

Le chapitre 3 est constitué par le second article ciblé sur la description des souches isolées à l'aide de trois méthodes de détection et d'isolement complémentaires. Il discute également de l'impact de la pluviométrie, de la distribution géographique, temporelle et matricielle des souches STEC et EPEC dans les sites d'étude. Cet article aborde également la caractérisation des souches (classification phylogénétique, profil de virulence, profil d'antibio-résistance) et la capacité à former des biofilms pour certaines souches.

Le chapitre 4 est représenté par le manuscrit en cours de finalisation qui aborde le potentiel de virulence des souches STEC et EPEC isolées dans l'environnement littoral au regard de leur profil moléculaire de virulence.
Enfin, le chapitre 5 présente les résultats obtenus concernant l'étude de la cinétique de contamination et de décontamination d'huîtres au contact de souches STEC en microcosmes d'eau de mer.

Pour finir, la dernière partie de ce manuscrit présente une discussion des résultats obtenus au cours de cette thèse ainsi que les perspectives de recherche dégagées à l'issu de ce travail.
# Chapitre 1 : CONTEXTE ET DESCRIPTION DES SITES D'ÉTUDES

Dans la cadre du projet Riskmanche dans lequel s'insère ce travail de thèse, les partenaires français (Ifremer de Brest, Université de Caen et CNRS Géosciences de Rennes) ont sélectionné trois sites conchylicoles sur la côte Nord-Ouest de la France : un en Région Bretagne et deux en Région Basse-Normandie.

## A. Site sélectionné en Région Bretagne

Le site d'étude sélectionné en région Bretagne se situe au niveau du département des Côtes d'Armor (Nord-Est de la Région Bretagne) : la baie de la Fresnaye (site 1). La baie est enfermée entre St Cast le Guildo à l'Est et le Fort la Latte à l'Ouest.

Le bassin versant de la baie de la Fresnaye couvre 121 km² et regroupe une population d'environ 12 756 habitants permanents et 34 686 habitants en période estivale.

On y trouve sept stations d'épuration, de nombreux assainissement autonomes et plus de 180 exploitations agricoles (élevages intensifs de bovins, de porcs et de volaille). Le bassin versant est représenté par 8 850 ha de surface agricole exploitée, avec 80 % de cette superficie soumis à l'épandage d'effluents agricoles.

La baie est caractérisée par la présence de quatre principaux sous-bassins versants comportant les quatre principales rivières : le Frémur (25 km de long, 65,5 km²), le Rat (16 km de long, 15,8 km²), le Clos (8,7 km de long, 13,8 km²) et le Kermiton (2,7 km de long, 5,3 km²). Les productions porcines, bovines et de volaille ainsi que la population humaine estimées sur les quatre sous-bassins versants sont présentées sur la Figure 22.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 22** : Carte présentant le bassin versant de la baie de la Fresnaye (site 1), situé en région Bretagne et la localisation des points de prélèvements sélectionnés pour l'étude. Le nombre de porcs, de bovins, de volailles et d'habitants présents estimés au niveau des quatre sous-bassins versants principaux et du point de prélèvement en mer sont indiqués (source J. Cheve, Ifremer, Dinard).</figcaption></figure>

La baie de la Fresnaye est un lieu de production d'huîtres sur table et de moules sur bouchot. Ce site regroupe à lui seul 21 professionnels exploitants. Cette zone conchylicole est classée depuis 2004 en zone B pour la production des huîtres et des moules (mollusques filtreurs du groupe 3), ce qui implique une purification des coquillages avant leur commercialisation (Anonyme 2004).

On trouve dans la baie des gisements sauvages de coques classés en catégorie C (pêche récréative interdite).

## Prélèvements sur le site 1

Dans le cadre du projet RiskManche, quatre points de prélèvement d'eau de rivière à l'exutoire des quatre sous-bassins (Le Frémur, Le Rat, Le Clos et Kermiton), un point sédiment superficiel, un point eau de mer et cinq points de prélèvement coquillages [2 huîtres (huître 1 et huître 2), 2 moules (moule 1 et moule 2) et 1 coque (coque)] ont été sélectionnés (Figure 22).

Les prélèvements ont été réalisés mensuellement de Février 2013 à Janvier 2015, un jour où le coefficient de marée était supérieur à 80.
## B. Sites sélectionnés en Région Basse-Normandie

Les deux sites d'étude sélectionnés en région Basse-Normandie sont situés dans le département de la Manche à l'intérieur de la baie de la Sienne : Le Havre de Regnéville (site 2) et le Havre de la Vanlée (site 3).

C'est une zone qui connaît, également, en été un afflux important de touristes attirés par les plaisirs de la baignade et de la pêche à pied.

Le bassin versant du Havre de Regnéville est un estuaire formé par l'embouchure de la Soulles et de la Sienne. Du confluent, au pont de la Roque, à la pointe d'Agon, qui le sépare de la mer, le Havre s'étend sur 1 800 ha, avec une profondeur de plus de cinq kilomètres, ce qui en fait le plus grand bassin versant du Cotentin. Ce bassin regroupe une population de 40 000 habitants.

On y trouve 20 stations d'épuration dans la zone d'influence microbiologique rapprochée [zone de vigilance, incluant la zone immédiate dans laquelle les germes bactériologiques (issus de rejets de pollution directs, dispersés ou diffus) transportés par les cours d'eau restent sensiblement actifs pour impacter les masses d'eaux côtières]. De nombreux assainissement autonomes et plus de 1 330 exploitations agricoles [élevages intensifs de bovins (64 000 individus) et moutons de prés salés (2 700 individus)] représentant 29 800 ha de surface agricole exploitée, sont présents dans ce Havre. La baie est caractérisée par la présence des deux principales rivières : la Soules [30,6 km de long, 125 Km² (point B)] et la Sienne [92,6 Km de long, 794 Km2) (point A)] (Figure 23).

Le Havre de la Vanlée est situé entre Granville et la pointe d'Agon. Le Havre s'étend sur 4 km de longueur et 2 km de largeur, il reçoit les eaux de ruissellement d'un bassin versant de 5 398 ha, regroupant une population d'environ 7 000 habitants.

Il est essentiellement composé de prés salés où l'élevage de mouton y est la principale activité. On y trouve 4 stations d'épuration et 213 exploitations agricoles dispersées sur une surface agricole de 3 066 ha [élevages intensifs d'ovins (1 400 individus), de bovins (4 200 individus) et de porcs (660 individus)]. Deux rivières principales se jettent dans ce havre : Les Hardes [6 km de long (I)] et la Vanlée [8,3 km de long (H)].
<figure><img src="image_26.png" /></figure>

**Figure 23** : Carte présentant les deux sites sélectionnés en Région Basse-Normandie : le Havre de Regnéville (site 2) et le Havre de la Vanlée (site 3), avec l'identification des points de prélèvements sélectionnés pour l'étude. Nombre d'habitants (hab.) présents dans les villes alentours.

D'un point de vue exploitation du littoral, la production annuelle conchylicole observée au niveau du Havre de Regnéville et de la Vanlée en 2014 était de 12 000 tonnes d'huître sur table et de 16 000 tonnes de moules sur bouchot. Cette zone de production conchylicole est classée en zone B pour la production des huîtres et des moules et on y trouve des gissements sauvages de coques classés en zone C.

## Prélèvements sur les sites 2 et 3

Dans le cadre du projet Riskmanche, sur le site du Havre de Regnéville (site 2), trois points de prélèvement d'eau douce (A, B et C), un point sédiment (D) et trois points de prélèvement de coquillages [1 huîtres (F), 1 moules (G) et 1 coques (E)] ont été sélectionnés. Sur le site du Havre de la Vanlée (site 3), deux points eaux douces (I et H), un point sédiment (K) et deux points coquillages [1 huîtres (L) et 1 moules (M)] ont été sélectionnés (Figure 23).

Les prélèvements ont également été réalisés mensuellement de Février 2013 à Janvier 2015 avec un coefficient de marée supérieur à 80.
### C. Les paramètres suivis au cours de l'étude globale

En plus des STEC et EPEC qui constituent le sujet de cette thèse, d'autres microorganismes potentiellement pathogènes pour l'Homme : des bactéries entériques (*Campylobacter*, *Salmonella*, *E. coli* et entérocoques), des bactéries marines *Vibrio spp.* et des virus entériques (norovirus) ont été également recherchés dans les prélèvements de coquillages, de sédiments et/ou d'eaux. Couplés à ces recherches de pathogènes, plusieurs paramètres ont été évalués : i) les niveaux de contamination (mesure des concentrations en *E. coli* et entérocoques) dans les coquillages et les rivières, ii) l'identification des sources de contamination fécale [utilisation des traceurs de sources microbiennes (TSM : marqueurs *Bacteroidales* et stanols fécaux] dans les coquillages et les rivières et iii) la mesure des paramètres physico-chimiques de l'envionnement (température, salinité, concentration en oxygène, pluviométrie).

### D. Organisation des prélèvements et des analyses

Sur le site 1 breton, les eaux des rivières ont été prélevées le matin à marée haute à un point de prélèvement où la marée n'avait pas d'impact sur la rivière par l'équipe du CNRS Géosciences de Rennes. L'équipe d'Ifremer de Brest a ensuite prélevé les coquillages et le sédiment sur la baie de la Fresnaye et assuré le transport des eaux et des coquillages jusqu'au i) CNRS Géosciences en charge des analyses des stanols fécaux pour identifier les sources de contamination fécale, ii) à l'Ifremer de Nantes pour la recherche des norovirus et le dénombrement des *E. coli* par impédancemétrie dans les coquillages.

L'équipe de l'Ifremer de Brest a réalisé les analyses concernant la recherche des salmonelles, des *Campylobacter* et des vibrions ainsi que la recherche des marqueurs *Bacteroidales* associés à l'Homme (HF183 ; Seurinck et al., 2005), aux porcs (Pig2Bac ; Mieszkin et al., 2009) et aux bovins (Rum2Bac ; Mieszkin et al., 2010). L'isolement de souches de *E. coli* et d'entérocoques a également été effectué au laboratoire puis celles-ci ont été expédiées à l'Université de Caen pour évaluer la présence de gènes de virulence et déterminer les phylogroupes et la résistance aux antibiotiques.

Sur les sites normands 2 et 3, les eaux des rivières ont été prélevées le matin à marée haute à un point de prélèvement où la marée n'avait pas d'impact sur la rivière par l'équipe de l'Université de Caen. L'équipe a effectué, à marée basse, le prélevement des coquillages sur les deux Havres et assurait le transport des coquillages jusqu'à i) l'Ifremer de Nantes pour la recherche des norovirus, ii) au Laboratoire d'analyse de la Manche (LABEO) pour le dénombrement des *E. coli* par impédancemétrie. L'équipe de l'Université de Caen a effectué les analyses concernant la recherche des salmonelles, des *Campylobacter*, des *E. coli*, des *E. coli* pathogènes, des entérocoques (isolement et/ou dénombrement) et des vibrions ainsi que la recherche des marqueurs *Bacteroidales* associés à l'Homme et aux ruminants.
Mon travail a consisté à participer aux prélèvements sur le site breton, aux préparations communes des échantillons pour la recherche des bactéries à l'Ifremer de Brest, à réaliser les analyses concernant les STEC et les EPEC sur les sites 1, 2 et 3 sur la période de Février 2013 à Janvier 2014. J'ai ensuite caractérisé les souches isolées sur les trois sites.
# Chapitre 2 : DETECTION ET ISOLEMENT DES E. COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES APPARTENANT AUX CINQ SEROTYPES MAJEURS DANS L'ENVIRONNEMENT LITTORAL

La première question qui s'est posée en début de thèse a été de sélectionner la ou les méthodes les plus pertinentes pour rechercher les STEC et les EPEC dans les échantillons environnementaux. Des protocoles très variés ont été publiés et ils permettent la détection des STEC et EPEC de façon dépendante ou indépendante des sérotypes majeurs (Farrokh et al., 2013, Beutin et Fach 2014).

## A. Contexte de la première partie de l'étude

Récemment, une méthode de détection horizontale par PCR a été développée pour la recherche et l'isolement des *Escherichia coli* producteurs de Shiga-toxines appartenant aux cinq sérotypes majeurs (O157:H7, O145:H28, O26:H11, O103:H2 et O111:H8) dans les aliments et l'alimentation animale (ISO-TS-13136). Cette méthode a été validée par l'Organisation Internationale de Normalisation (ISO) en 2012.

Cette méthode horizontale repose sur l'utilisation de la PCR en temps réel pour la détection des gènes de virulence caractéristiques des STEC (ou EHEC typiques), à savoir les gènes *stx1*, *stx2* et *eae*, et des gènes associés aux cinq sérogroupes majeurs (gène *wzx*).

Dans le cas de la présence des gènes de virulence (*stx1* et/ou *stx2* et *eae*) et d'au moins un des cinq sérotypes ciblés dans les bouillons d'enrichissement recommandés par la méthode, une procédure d'isolement de souches de *E. coli* et de confirmation de la présence des gènes caractéristiques est mise en place.

La méthode s'appliquant aux produits destinés à la consommation humaine et animale mais également aux échantillons environnementaux dans les zones de production et de manipulation d'aliment, nous avons fait le choix de sélectionner cette méthode pour les recherches sur la présence des STEC dans les coquillages destinés à la consommation humaine et dans l'environnement littoral. De plus, cette méthode n'avait pas été encore testée sur des coquillages et présentait l'avantage d'évaluer la présence des souches STEC potentiellement les plus pathogènes pour l'Homme.

L'application de cette procédure a été possible grâce à une collaboration avec le Laboratoire Nationnal de Référence pour les STEC (Laboratoire LMAP-LNR STEC VetAgroSup, Lyon).

Cette méthode a été appliquée sur une collection d'échantillons prélevés mensuellement sur une période de 13 mois (de Février 2013 à Janvier 2014) au niveau ; du site de la baie de la Fresnaye [par mois 2 lots d'huîtres, 2 lots de moules, 1 lot de coques, 1 sédiment et 4 eaux douces (total n = 130)], du site du Havre de Regnéville [par mois, 1 lot d'huîtres, 1 lot de moules, 1 lot de coques, 1 sédiment,
3 eaux douces (total n=91)] et du site du Havre de la Vanlée [par mois, 1 lot d'huître, 1 lot de moule, 1 sédiment, 2 eaux douces (n=65 (-4 lots coquillages non récoltés) total n= 61].

Une fois rapportés dans les laboratoires respectifs (transport à +4°C), les échantillons ont été traités
dans les 24 heures de la même manière soit : à partir de 25 g de CLI broyés obtenus à partir de 200 g
de CLI, des filtres des eaux douces (volume 1 litre) et de 10 g des sédiments ont été incubés dans le
milieu de culture Eau Peptonée Tamponnée, à 37°C, pendant 24 h. Ces enrichissements ont ensuite été
expédiés jusqu'au LNR STEC pour être analysés.

En parallèle à cette analyse, les concentrations totales en E. coli et en entérocoques (indicateurs de contamination fécale) ont été mesurées dans les coquillages (seulement E. coli) et dans les eaux douces, dans les conditions décrites précédemment (chapitre I, 4).

L'ensemble de ces travaux ont permi d'établir que :

* Les concentrations en *E. coli* mesurées dans les coquillages issus des zones conchylicoles sélectionnées et dans les eaux douces en amont étaient très variables : soit en moyenne de 3 493 ±7 812 *E. coli* pour 100 g de CLI pour les coquillages et en moyenne de 4 339 ±17 953 *E. coli* pour 100 mL pour les eaux pour la période d'étude. Au sein des coquillages, les lots de coques présentaient les plus fortes concentrations (moyennes géométriques : 2 440 *E. coli* / 100 g de CLI dans les coques versus 1 070 pour les moules et 364 pour les huîtres).

* Les gènes *stx* et *eae* codant respectivement pour les Shiga-toxines et l'intimine étaient fréquemment présents dans les échantillons environnementaux analysés :

* les gènes stx ont été détectés dans 35 % des lots de coquillages (n=44/126), 91 % des échantillons d'eaux douces (n=107/117) et 28 % des échantillons de sédiment (n=11/39).

* le gène *eae* a été détecté dans 73 % des lots de coquillages (n=92/126), 99 % des échantillons d'eaux douces (n=116/117) et 49 % (n=19/39) des échantillons de sédiment.

* 50 % des enrichissements répondaient aux critères de recherche établis par la norme à savoir la détection des gènes stx, eae et au moins un wzx.

* Les souches STEC et EPEC étaient peu présentes dans les échantillons environnementaux analysés.

Au final, une souche EHEC O26:H11 stx1+ et eae+ a été isolée à partir d'un lot de moules et neuf souches EPEC appartenant aux sérotypes O26:H11, O145:H28 et O103:H2 eae+ mais stx- ont été isolées à partir d'échantillons de coquillages et d'eaux douces.
En conclusion, cette étude a montré la pertinence de la norme ISO-TS-13136 pour évaluer la présence des *E. coli* producteurs de Shiga-toxines appartenant au cinq sérotypes EHEC majeurs dans des zones de production conchylicoles françaises et leurs bassins versants en amont. Même si une forte détection des marqueurs génétiques *stx* et *eae* a été observée au sein des bouillons d'enrichissement des échantillons, l'isolement d'une seule souche STEC O26:H11 et de neuf souches EPEC O26:H11, O103:H2 et O145:H28, suggèrent une faible présence des *E. coli* appartenant aux cinq sérotypes majeurs (O157:H7, O145:H28, O26:H11, O103:H2 et O111:H8) dans les zones conchylicoles étudiées.
## B. Publication N°1

# Successful detection of pathogenic Shiga-toxin-producing *Escherichia coli* in shellfish, environmental waters and sediment using the ISO/TS-13136 method

Balière Charlotte<sup>a</sup>, Rincé Alain<sup>b</sup>, Thevenot Delphine<sup>c</sup>, Gourmelon Michèle<sup>a*</sup>

**Running title:** STEC detection in the environment

<footnote><sup>a</sup>Laboratoire Santé Environnement et Microbiologie, Unité SG2M, Département RBE, IFREMER, F-29280 Plouzané, France</footnote>

<footnote><sup>b</sup>Normandie-Université; UCBN, U2RM Stress/Virulence EA4655, F-14032 Caen, France</footnote>

<footnote><sup>c</sup>VetAgroSup campus vétérinaire de Lyon, UMR5557/Equipe 6, Laboratoire LMAP-LNR, Avenue Claude Bourgelay, 69280 Marcy-L'Etoile, France</footnote>
ORIGINAL ARTICLE

# Successful detection of pathogenic Shiga-toxin-producing *Escherichia coli* in shellfish, environmental waters and sediment using the ISO/TS-13136 method

C. Balière<fnref n="1" />, A. Rincé<fnref n="2" />, D. Thevenot<fnref n="3" /> and M. Gourmelon<fnref n="1" />

**Significance and Impact of the Study:** (STEC) infections have been reported following ingestion of contaminated food or water or after bathing in contaminated waters. However, to date, few studies concerning their detection in coastal environment and shellfish have been reported. The aim of this work was to assess the presence of STEC in three shellfish-harvesting areas by the ISO/TS-13136 method, which has recently been used for STEC detection in food.

**Keywords**

eae, sediment, shellfish, Shiga-toxin-producing *Escherichia coli*, stx, water.

**Correspondence**

Michèle Gourmelon, Laboratoire de microbiologie LSEM, IFREMER, CS10070 Plouzané, France.

E-mail: Michele.Gourmelon@ifremer.fr

2014/2261: received 4 November 2014, revised 18 December 2014 and accepted 4 January 2015

doi:10.1111/lam.12386

**Abstract**

The presence of highly pathogenic Shiga-toxin-producing *Escherichia coli* (STEC) in shellfish, upstream waters and sediment from coastal shellfish sites was evaluated using the ISO/TS-13136 method. Shellfish (oysters, mussels and cockles), water and sediment samples were collected monthly over a period of 1 year. The method used real-time PCR detection of *stx1*, *stx2* and *eae* genes and genetic markers corresponding to the five major serogroups (O157, O26, O103, O111 and O145) on enrichment broths and the identification of STEC when these genes and markers were detected. *stx* genes were detected in the broth of 33% of shellfish batches (*n* = 126), 91% of water samples (*n* = 117) and 28% of sediment (*n* = 39). One *stx1*+, *eae*+ O26:H11 strain was isolated from a shellfish batch, and O26:H11, O145:H28 and O103:H2 strains without the *stx* gene (*n* = 9) were isolated from shellfish and waters. In conclusion, this study shows the suitability of the ISO/TS-13136 method to assess the presence of highly pathogenic *E. coli* strains in shellfish farming areas. It also highlights a low prevalence of STEC and consequently suggests a reduced corresponding human health risk.

**Introduction**

Pathogenic Shiga-toxin-producing *Escherichia coli* (STEC) may cause human illnesses such as haemorrhagic colitis and life-threatening haemolytic-uraemic syndrome. Although a wide range of serotypes have been implicated in human STEC infections, five major serotypes (O157: H7, O26:H11, O103:H2, O111:H8 and O145:H28) are responsible for the vast majority of sporadic cases and outbreaks in Europe (Beutin and Fach 2014). Pathogenic STEC are characterized by the production of Shiga-toxin, a bacteriophage-encoded cytotoxin (O'Brien *et al.* 1984) and, in addition, are often shown to produce attaching

and effacing lesions on intestinal mucosa. This latter property is encoded by genes, including *eae*, grouped together in a pathogenicity island referred to as the 'locus of enterocyte effacement' (Paton and Paton 1998). Human infection occurs through ingestion of contaminated food or water or by contact with animals. The main reservoir for STEC is domestic ruminants, especially cattle (Pradel *et al.* 2000). Other animals such as sheep, goats, pigs, birds, other wild animals as well as humans can also harbour STEC (Gyles 2007). STEC contamination of the environment may occur through the spreading of livestock manure, animal waste on pastures, via wastewaters from slaughterhouses, from treatment plant effluents and

<footnote n="1">1 Unité SG2M, Département RBE, Laboratoire Santé Environnement et Microbiologie, IFREMER, Plouzané, France</footnote>

<footnote n="2">2 UCBN, U2RM Stress/Virulence EA4655, Normandie-Université, Caen, France</footnote>

<footnote n="3">3 Laboratoire LMAP-LNR, UMR5557/Equipe 6, Marcy-L'Etoile, France</footnote>
by wildlife (Ogden *et al.* 2001; Vernozy-Rozand *et al.* 2002; Loukiadis *et al.* 2006). Coastal environments, including shellfish, may therefore become contaminated with STEC. Because of their filter-feeding behaviour and because they are traditionally consumed raw or undercooked, shellfish may present a potential risk to public health (Potasman *et al.* 2002). However, to our knowledge, while they have previously been detected in shellfish, STECs have not yet been reported as being involved in shellfish-borne outbreaks (Guyon *et al.* 2000; Gourmelon *et al.* 2006).

To date, few studies concerning the detection and isolation of pathogenic STEC strains in coastal environments and shellfish have been reported and, of those that have, none has focused on the prevalence of the five major STEC serotypes. Recently, a horizontal PCR-based method has been developed for the detection of STEC (including the five major serotypes associated with human infection) in foods and animal feed. This method, recommended by EFSA (2009), is described in the ISO-13136 Technical Specification (ISO/TS-13136:2012). It has already been applied in France for monitoring control in minced meat frozen beef (DGAL 2013) and to evaluate the prevalence of STEC from their corresponding serotypes in cattle faeces (Bibbal *et al.* 2014).

This study describes the first application of the ISO/TS-13136 protocol to shellfish, environmental waters and sediment in order to evaluate the presence of highly pathogenic STEC in shellfish-harvesting areas.

## Results and discussion

### Level of contamination in water and shellfish

*Escherichia coli* counts were determined for all shellfish and water samples. Widely varying *E. coli* concentrations were found in shellfish, with concentrations ranging from <67 to 71 000 per 100 g. Thirty-seven samples presented a concentration of ≤230 *E. coli* per 100 g, 64 contained between 230 and 4600 *E. coli* per 100 g and 25 presented a concentration >4600. Among shellfish, cockles were the most contaminated (geometric mean of 2440 *E. coli* per 100 g vs 1070 for mussels, and 364 for oysters). In waters, *E. coli* concentrations ranged from <38 to 190 530 per 100 ml, with a geometric mean of 1224.

### Detection of *stx1*, *stx2* and *eae* and prevalence of the five major serogroups

Real-time PCRs enabled detection of *stx* genes from enrichment broths of 44 shellfish batches (34·9%), 107 water samples (91·4%) and 11 sediment samples (28·2%) (Table 1). In correlation with the level of contamination

of shellfish, *stx* genes were more frequently detected from cockles and mussels (50·0 and 36·5% *stx*⁺ respectively) than from oysters (22%). The presence of *stx* gene was previously investigated in shellfish batches collected between 2002 and 2004 from across France (Gourmelon *et al.* 2006). In this earlier study, in which 72 samples of mussels (41) oysters (27) and cockles (4) were analysed, the *stx* gene was also more frequently detected from cockles (100%) than from mussels (43·9%) or oysters (33·3%). The *stx2* gene was slightly more frequently found than *stx1* in enrichment broths from water and sediments, while *stx1* was more frequently detected from shellfish. As with *stx*, *eae* gene was more frequently detected in water than in shellfish or sediments. Indeed, 116 water samples (99·1%), 92 shellfish batches (73·0%) and 19 sediments (48·7%) were *eae*⁺ (Table 1). *eae* was more frequently detected in cockles and mussels (87·5 and 82·7%, *eae*⁺ respectively) than in oysters (56·0% *eae*⁺). A total of 152 samples (37 shellfish, 107 waters and eight sediments) were positive for at least one *stx* gene and the *eae* gene. Real-time PCRs were performed to detect genetic markers associated with the five major serogroups from the 152 corresponding enrichment broths (Table 2). One or several serogroups were detected from 28 samples of shellfish, 106 waters and seven sediments. Consequently, 22·2% of shellfish samples, 90·6% of water samples and 17·9% of sediment samples were positive for *stx*, *eae* and one of the O-group markers, with a higher percentage of positive samples among environmental water samples than among cattle faeces collected at slaughterhouse (58% in cattle faeces (Bibbal *et al.* 2014)). Regardless of the sample type, serogroups O103 and O145, followed by O26 and O157 were the most frequently detected.

### Isolation and characterization of strains belonging to serogroups O157, O26, O103, O111 or O145

Ten strains (five from water and five from shellfish) were isolated using two complementary methods: direct streaking and IMS (Immuno-Magnetic Separation). Their characterization revealed that six belonged to the O26:H11 serotype, while two were identified as O103:H2 and two as O145:H28 (Table 3); all 10 isolates contained the *eae* gene. These strains were isolated from highly contaminated samples (*E. coli* geometric mean of 14 550 per 100 g for shellfish and 4490 per 100 ml for waters). Only one strain possessed a *stx* gene (*stx1*), whereas the remaining corresponded to potentially enteropathogenic *E. coli* (EPEC). The STEC strain belonged to the O26:H11 serotype and was isolated from mussels. Only nine of the 141 enrichment broths that were positive for *stx*, *eae* and one of the major serotypes (6%) resulted in STEC or