# Etude métabolomique par RMN de l'exposition chronique à faible dose de composés génotoxiques

Cécile Canlet, Marie Tremblay-Franco, Roselyne Gautier, Yannick Brunato, Patricia Kembia-Kalombo, Nathalie Poupin, Gladys Mirey

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Cécile Canlet, Marie Tremblay-Franco, Roselyne Gautier, Yannick Brunato, Patricia Kembia-Kalombo, et al. Etude métabolomique par RMN de l'exposition chronique à faible dose de composés génotoxiques. 15èmes journées scientifiques du RFMF, May 2023, Perpignan, France. hal-04332320

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Submitted on 8 Dec 2023

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# Etude métabolomique par RMN de l'exposition chronique à faible dose de composés génotoxiques

**Cécile Canlet**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, **Marie Tremblay-Franco**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, **Roselyne Gautier**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, **Yannick Brunato**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, **Patricia Kembia-Kalombo**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, **Nathalie Poupin**<fnref n="1" />, **Gladys Mirey**<fnref n="1" />

## Contexte

* Agents génotoxiques doivent être identifiés car présentent un risque pour la santé humaine/animale et les biosystèmes

* Test du micronoyau est reconnu mais ne permet pas de différencier les mécanismes d'action clastogènes

* Techniques omiques pourraient apporter des informations complémentaires afin de mieux caractériser les mécanismes de toxicité de ces substances

* **Objectif** : Caractériser les métabolites associés à l'exposition chronique des cellules hépatiques humaines à des composés génotoxiques et classifier ces composés toxiques en fonction des voies métaboliques perturbées

## Méthodes

Exposition journalière
à 12 composés
génotoxiques pendant
5 jours

Cellules hépatiques humaines
HepaRP
1 million cellules par puits
N=16

Analyse RMN du
proton des extraits
cellulaires

Spectromètre RMN
600 MHz Bruker
Avance III HD
Cryosonde

Pré-traitement des
spectres RMN

Découpage des
spectres en buckets de
largeur 0,01 ppm et
intégration des buckets

Analyses
statistiques
multivariées

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Analyse OPLS-DA
Test univarié des
variables avec VIP>1

<table><thead><tr><td>Composés</td><td>Dose journalière (µM/jour)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Méthanesulfonate de méthyle (MMS)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Cyclophosphamide (CPA)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Benzo-a-Pyrene (BaP)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>2,4-diaminotoluène (DAT)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>2-Acetaminofluorene (AAF)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Aflatoxin B1 (AFT)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Dimethylnitrosamine (DMN)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Cisplatine (Cys)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Mitomycin C (MMC)</td><td>0,001</td></tr><tr><td>Etoposide (Etp)</td><td>0,1</td></tr><tr><td>Taxol</td><td>0,001</td></tr><tr><td>Diethanolamine (DAE)</td><td>0,1</td></tr></tbody></table>

## Résultats

Spectre RMN 600 MHz du proton d'un extrait cellulaire

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Analyse Heat Map des données de métabolomique

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Analyse Heat Map des données de métabolomique.** Les lignes correspondent aux métabolites et les colonnes aux génotoxiques. Les métabolites dont la concentration diminue sont coloriés en bleu alors que les métabolites dont la concentration augmente sont coloriés en rouge.

Analyses Statistiques multivariées
Orthogonal-Partial Least Square-Discriminant Analysis

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

**Score plots PLS-DA** des spectres RMN des extraits de cellules HepaRP exposées aux 12 composés toxiques. Chaque cercle représente une observation projetée sur la première composante latente prédictive (axe horizontal) et la première composante orthogonale (axe vertical). Les cercles rouges correspondent aux échantillons témoins et les cercles bleus aux échantillons exposés.

* Les analyses OPLS-DA sur les données RMN ont permis de discriminer les cellules exposées des cellules témoins pour chaque toxique (modèles valides et robustes, Q<fnref n="2" /> variant de 0,505 (MMS) et 0,971 (DAE))

* Le nombre de métabolites discriminant les cellules exposées des cellules témoins dépend du toxique, variant de 3 métabolites pour le BaP à 26 pour Cisplatin

* L'analyse Heat-Map réalisée sur les fold-change de tous les métabolites identifiés permet de mettre en évidence des similarités dans les variations de concentrations de métabolites, par exemple pour AAF, DAT, Cys et Taxol une augmentation d'alanine, glutamate, betaine, tyrosine, threonine, GPC, glycine, phenylalanine et phosphocholine est observée

## Conclusions

* Les profils de modulation métabolique identifiés par RMN permettent de classer les composés toxiques en fonction de leurs effets métaboliques, par exemple AAF, DAT, Cys et Taxol ont des variations de concentrations de métabolites similaires

* Ces premiers résultats montrent que les voies métaboliques perturbées sont spécifiques du composé toxique, suggérant des mécanismes d'action différents pour certains composés toxiques

<footnote n="1">¹Toxalim (Research Centre in Food Toxicology), Toulouse University, INRAE UMR 1331, ENVT, INP-Purpan, UPS, Toulouse, France</footnote>

<footnote n="2">²Metatoul-AXIOM Platform, National Infrastructure for Metabolomics and Fluxomics: MetaboHUB, Toxalim, INRAE, F-31027, Toulouse, France</footnote>