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open science

# Dosage en microplaque de l'activité Carboxyl Esterase
(CE)

Patrice Noury

► To cite this version:

Patrice Noury. Dosage en microplaque de l'activité Carboxyl Esterase (CE). 2022. hal-03773898v2

HAL Id: hal-03773898

https://hal.science/hal-03773898v2

Submitted on 3 Nov 2025

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# MODE OPERATOIRE/PROTOCOLE

## Dosage en microplaque de l'activité Carboxylesterase (CE)

### AVERTISSEMENT ET PRECAUTIONS DE SECURITE

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Le présent mode opératoire nécessite l'utilisation de de DMSO. Il convient donc de respecter les règles de sécurité indispensables à l'utilisation d'un tel produit.

Le schéma ci-contre rappelle les Equipements de Protection Individuels (EPI) indispensables

Les produits et manipulations à risques ainsi que les moyens de protections spécifiques sont détaillés dans le contenu de ce document.

<table><thead><tr><td>N° de version</td><td>Rédacteur</td><td>Vérificateur</td><td>Approbateur</td></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Nom : NOURY<br/>Fonction : IE</td><td>Nom : TUTUNDJIAN<br/>Fonction : IR</td><td>Nom : CHAUMOT<br/>Fonction : Responsable du laboratoire d'Ecotoxicologie</td></tr></tbody></table>

### Mises à jour

<table><thead><tr><td>N° de version</td><td>Date</td><td>Auteur</td><td>Modifications apportées par rapport à la précédente version</td></tr></thead><tbody><tr><td>1.1</td><td>08/04/2022</td><td>PN</td><td>Corrections mineures, ajout de statistiques sur la pente d'étalonnage</td></tr><tr><td>1.2</td><td>25/01/2024</td><td>PN</td><td>Inversion des paragraphes « matériel » et « produits utilisés », orthographe de carboxylestérase</td></tr><tr><td>1.3</td><td>06/10/2025</td><td>PN</td><td>Proposition de prises d'essai pour échantillons de poissons (sérum, mucus)</td></tr></tbody></table>
## SOMMAIRE

<table><tr><td>1</td><td>INTRODUCTION</td><td>2</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Objet et domaine d'application</td><td>2</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Références</td><td>2</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Conditions d'application</td><td>2</td></tr><tr><td>1.4</td><td>Définitions et abréviations</td><td>2</td></tr><tr><td>2</td><td>VOLET SECURITE</td><td>3</td></tr><tr><td>3</td><td>PROTOCOLE</td><td>3</td></tr><tr><td>3.1</td><td>Principe</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Matériel et réactifs</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2.1</td><td>Matériel</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2.2</td><td>Produits utilisés</td><td>4</td></tr><tr><td>3.2.3</td><td>Solutions préparées</td><td>4</td></tr><tr><td></td><td>Extemporanément</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Mode opératoire</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3.1</td><td>Préparation de la fraction S9</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3.2</td><td>Préparation du spectrophotomètre</td><td>6</td></tr><tr><td>3.3.3</td><td>Réalisation de la plaque</td><td>6</td></tr><tr><td>3.3.4</td><td>Calculs</td><td>7</td></tr><tr><td>4</td><td>SYNTHESE DU DOCUMENT</td><td>7</td></tr></table>
# 1 INTRODUCTION

## 1.1 Objet et domaine d'application

Cette procédure décrit la mesure de l'activité enzymatique Carboxylestérase en microplaque. La mesure est réalisée sur une fraction post-mitochondriale (cytosol) d'homogénat de tissus (organe ou organisme entier).

La famille de la carboxylestérases regroupe un certain nombre de protéines enzymatiques de type hydrolase. Ces enzymes dégradent le groupement ester en alcool et en acide. Les trois grand groupes d'insecticides (carbamates, organophosphorés et pyréthrinoïdes de synthèse) étant des esters, les carboxylestérases jouent un grand rôle dans leur métabolisation assurant un rôle protecteur de l'acétylcholinestérase, d'où l'intérêt de ces enzymes comme marqueur en bio surveillance de l'environnement.

## 1.2 Références

La méthode employée utilise comme substrat le 4-Nitrophenyl acetate (p-Nitrophenyl acetate) et a été mise au point en cuve par Ljunquist ¹puis adaptée pour la microplaque par Baker<fnref n="2" />

## 1.3 Conditions d'application

La mesure de la carboxylestérase est réalisée sur extrait de d'organe ou d'organisme entier frais ou congelé. L'extraction, la centrifugation et la conservation des surnageant jusqu'à l'analyse sont réalisées à 4°C (bain de glace). La réaction enzymatique en microplaque doit être réalisée à 19-21 °C (climatisation en été).

## 1.4 Définitions et abréviations

Pour les besoins du présent mode opératoire, les définitions et abréviations suivantes sont nécessaires :

* **Fraction S9** : surnageant obtenu après centrifugation de 15 minutes à 9000g des homogénats de tissus

* **CE** : Carboxylestérase

* **4NA** : 4 Nitrophényl-acétate

* **FCR** : Force Centrifuge Relative

* **PE** : prise d'essai

<footnote n="1">¹ Ljungquist, A. and K. B. Augustinsson (1971). "Purification and properties of two carboxylesterases from rat-liver microsomes." *European journal of biochemistry* **23**(2): 303-313.</footnote>

<footnote n="2">² Baker, J. E., J. A. Fabrick and K. Y. Zhu (1998). "Characterization of esterases in malathion-resistant and susceptible strains of the pteromalid parasitoid Anisopteromalus calandrae." *Insect Biochemistry and Molecular Biology* **28**(12): 1039-1050.</footnote>
## 2 VOLET SECURITE

DMSO

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

## 3 PROTOCOLE

### 3.1 Principe

En réaction avec le 4 Nitrophényl-acétate (4NA) la carboxylestérase conduit à la formation de nitro phénol de couleur jaune dont l'absorbance est lue à 405 nm et à 20°C toutes les 30 secondes, durant plusieurs minutes. L'activité est calculée sur la partie linéaire de la cinétique et exprimée en nmol de produit formé par minute et par mg d'équivalent matière fraîche (ou mg de protéines).

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

### 3.2 Matériel et réactifs

#### 3.2.1 Matériel

* Microtubes Eppendorf de 1,5 mL et microtubes 2 ml à bouchon vissant

* Bonbonne d'azote liquide

* Congélateur -80°C

* Broyeur à bille + billes de verre 2mm et acier 4mm

* Spectrofluorimètre à microplaques: (Tecan Safire) appareil permettant de lire des microplaques de 96 puits, il est piloté par ordinateur avec le logiciel XFLUOR (macro Excel)

* Centrifugeuse réfrigérée.

* Verrerie et pipettes automatiques

* Microplaque 96 puits (Greiner)

* Pipette automatique multi coup + réservoirs 1 ml (10µl/coup)

* Microplaques 96 puits sans couvercle (Greiner)
### 3.2.2 Produits utilisés

<table><caption>**Tableau I** : produits utilisés pour le dosage de la Carboxylestérase</caption><thead><tr><td>PRODUIT</td><td>N° CAS</td><td>Ref. Sigma</td><td>RANGEMENT</td></tr></thead><tbody><tr><td>4 Nitrophényl-acétate</td><td>830-03-5</td><td>N8130</td><td>Congélateur</td></tr><tr><td>DMSO Qualité analytique</td><td>67-64-1</td><td>D8418</td><td>Armoire solvant</td></tr><tr><td>Disodium Hydogenophosphate (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>, 12 H<sub>2</sub>O)</td><td>10039-32-4</td><td>71650</td><td>Armoire 1 (E9)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenophosphate, (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)</td><td>7778-77-0</td><td>P5655</td><td>Armoire 1 (C7)</td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>9002-93-1</td><td>234729</td><td>Armoire 1</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>9048-46-8</td><td>A7906</td><td>Congél. -20°C</td></tr><tr><td>Esterase from porcine liver</td><td>9016-18-6</td><td>E3019</td><td>Congél. -20°C</td></tr></tbody></table>

### 3.2.3 Solutions préparées

#### A l'avance

##### Tampon phosphates (100 mM, pH 7.8)

* solution A : 35,8 g de Na₂HPO₄, 12H₂O (358 g.mol⁻¹) dans 1l d'eau ultra pure.

* solution B : 3,4 g de KH₂PO₄ (136 g.mol⁻¹) dans 250ml d'eau ultra pure

La solution A est ajustée à pH 7,8 avec la solution B. Se conserve au frais (3-7°C) jusqu'à 6 mois. Verrerie spécifique.

##### Tampon de broyage

Le tampon de broyage est du tampon phosphate (100mM, pH7,8) qui peut être additionné de 0,1 % de Triton X100 (exemple pour 50 µl + 50 ml). Bien agité à l'aide d'un barreau aimanté.

##### Etalon d'estérase

Peser la quantité nécessaire pour réaliser une série d'aliquote de 50 µl à 0,5 U/µl

Exemple pour 20 aliquotes avec une estérase à 18 Unités/mg : 25,78 mg dans 1000 µl de tampon phosphate

Les étalons sont ensuite conservés à -80°C jusqu'à utilisation.
## Extemporanément

### Solution de 4-Nitrophenyl acétate (181,15 g/mol)

Préparer une solution à 140 mMol soit 25,36 mg/ml dans du DMSO pur dans un récipient en verre bien fermé.

### Gamme étalon d'estérase

L'utilisation d'une gamme étalon d'enzyme apporte la possibilité de convertir les activités de nmol par minute en unité enzymatique (U). L'unité enzymatique représente la quantité d'enzyme nécessaire pour traiter une micromole de substrat en une minute dans des conditions opératoires. Pour information, au cours de 20 sessions de dosage, et pour un même lot commercial d'enzyme le facteur de conversion (pente de la gamme d'étalonnage) varie dans les conditions décrites dans le **Tableau II**.

<table><caption>**Tableau II** : Pente de la gamme d'étalonnage de plusieurs sessions analytiques</caption><thead><tr><th>Moyenne</th><th>Ecart type</th><th>%var</th><th>N</th><th>Médiane</th><th>3ème quartile</th><th>1er quartile</th><th>CENTILE 95%</th><th>CENTILE 5%</th></tr></thead><tbody><tr><td>44,80</td><td>4,36</td><td>9,92</td><td>20</td><td>44,41</td><td>47,64</td><td>41,40</td><td>50,37</td><td>38,78</td></tr></tbody></table>

* Décongeler dans l'eau froide un aliquote d'estérase 0,5 U/µl

* Diluer au 1/200 eme dans du tampon-BSA 1mg/ml (10 µl d'étalon +1990 µl) pour obtenir une solution de travail (ST) à 2,5 U/ml

* Diluer cette solution selon une gamme de raison 2/3 (Tableau III).

A noter que généralement seuls les 6 premiers points de la gamme (zéro compris) sont pris en compte pour l'étalonnage.

<table><caption>**Tableau III** : Exemple de gamme étalon</caption><thead><tr><th>0</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>ST</th><th>N° de la dilution</th></tr></thead><tbody><tr><td>0</td><td>0,15</td><td>0,22</td><td>0,33</td><td>0,49</td><td>0,74</td><td>1,11</td><td>1,67</td><td>2,5</td><td>U/ml</td></tr><tr><td>0</td><td>800 de 2</td><td>800 de 3</td><td>800 de 4</td><td>800 de 5</td><td>800 de 6</td><td>800 de 7</td><td>800 de prédil.</td><td>2000</td><td>Enzyme (µl)</td></tr><tr><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>0</td><td>Tampon (µl)</td></tr><tr><td>0</td><td>0,0022</td><td>0,0033</td><td>0,0049</td><td>0,0074</td><td>0,0111</td><td>0,0167</td><td>0,0025</td><td>0,0375</td><td>U/puit (15 µl PE)</td></tr></tbody></table>

## 3.3 Mode opératoire

### 3.3.1 Préparation de la fraction S9

* Allumer et régler la centrifugeuse (4°C, FCR= 9000, 15 min)

* Sortir les échantillons du congélateur par petit nombre (4 à 6) en les maintenant en bain de glace et au fur et à mesure transférer dans chaque tube une bille d'acier + 3
ou 4 billes de verre ainsi qu'un volume de tampon (0,1% triton) à la proportion de 1/10 (m/V)

* Placer ensuite les tubes dans le broyeur à bille et lancer le premier broyage (vitesse 6 – 20 secondes)

* Sortir les tubes du broyeur et les placer 5 minutes dans la glace avant de lancer le deuxième broyage (même réglage)

* Placer ensuite les tubes en centrifugeuse réfrigérée à 4°C

* Centrifuger 15 minutes à 9000 g

* Transférer environs 400 µl de surnageant (S9) en microtube et conserver en bain de glace jusqu'au dosage à effectuer dans l'heure.

**Pré-dilution** : chaque échantillon doit être préalablement prédilué dans du tampon phosphate pH 7,8 pour qu'avec une **prise d'essai de 15 µL**, l'activité soit linéaire durant 3 minutes de cinétique.

* **gammares** extraits à 1/10 (m/V) : **pur**

* **Sérum de truite** : **1/40** (5 µl + 195 µl)

* **Mucus de truite** : **pur**

### 3.3.2 Préparation du spectrophotomètre

* Allumer le spectrofluorimètre (bouton derrière en bas à gauche) et l'ordinateur.

* Ouvrir le programme Xfluor4 : Démarrer/Programme/Tecan/Xfluor4 (menu Windows)

* Activer la connection avec le Safire : Xfluor/Connect/Safire (menu Excel)

* Ouvrir le menu d'onglets dans Xfluor/Edit measurement (menu Excel)

* Régler les paramètres de la mesure comme dans l'exemple ci-dessous.

<table><tr><td>Measurement mode:</td><td>Absorbance</td></tr><tr><td>Measurement wavelength:</td><td>405 nm</td></tr><tr><td>Number of flashes:</td><td>1</td></tr><tr><td>Plate definition file:</td><td>GRE96ft.pdf (plaque greiner)</td></tr><tr><td>Number of kinetic cycles:</td><td>15</td></tr><tr><td>Kinetic interval:</td><td>30 secondes</td></tr></table>

### 3.3.3 Réalisation de la plaque

Après ajustement de la température du tampon phosphate à 20°C (bain marie), déposer en triplicat le tampon, le S9 puis le 4 NA.

Exemple pour un extrait de gammare extrait au 1/10 (m/V)

* 330 µl de tampon phosphate 0,1M pH 7,8 (2x165 µl ; pipette multicaunaux)

* 15 µl d'homogénat ou de solution étalon de CbE

* 5 µl de 4NA (Multipette) soit 2mMol de concentration réactionnelle

* Passer brièvement la plaque à l'agitateur

* Lancer la lecture au spectrophotomètre
### 3.3.4 Calculs

Corriger préalablement chaque $\Delta DO$ (accroissement de DO/min):

$$ \Delta DO = \Delta DO \text{ essai} - \Delta DO \text{ Blanc réactif} $$

Puis d'après Beer Lambert

$$ \text{CE (nmol/min)} = (\Delta DO \times V) / (\varepsilon \times L) $$

$$ \text{CE (nmol/min)} = (\Delta DO \times 0,35) / (0,0170 \times 1) $$

* $\Delta DO$ = pente de la cinétique entre 0 et 3 min (abs/min)

* V = volume réactionnel (ml)

* $\varepsilon$ = coefficient d'absorption molaire du TNB = 0,017 $\mu M^{-1} cm^{-1}$.

* L = trajet optique (cm)

$$ \text{CE (nmol/min/mg frais)} = (\Delta DO \times V) / (\varepsilon \times L) / \text{PEmg} $$

$$ \text{CE (nmol/min/mgfrais)} = ((\Delta DO*0,35) / (0,0170*1)) / 15 $$

* PEmg = équivalent poids frais = 1,5 pour une prise d'essai de 15 $\mu l$ de gammare extrait au 1/10 m/V

## 4 SYNTHESE DU DOCUMENT

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