## 2- Travail de laboratoire

L'extraction des grains de pollen comprend plusieurs étapes : (1) le tamisage des échantillons à 0,5-1 mm, (2) la centrifugation à 3000 tours/min pendant 3 min, et (3) une acétolyse à chaud pendant 4 min avec une proportion de 2,2 ml d'acide sulfurique et de 22,5 ml d'anhydride acétique. À la suite de ce traitement, la réaction a été arrêtée par l'ajout d'acide acétique (Féat et al., 2024). Les grains de pollen obtenus ont été transférés dans des piluliers avec de l'alcool, éliminés ensuite par centrifugation. Pour éviter la détérioration des grains de pollen par l'air, de la glycérine a été ajoutée dans les piluliers. Ce traitement a pour but de rendre visible l'ectexine, ce qui est nécessaire pour l'analyse palynologique (Faegri et al., 1989). Le protocole utilisé pour traiter les échantillons de grains de pollen fossiles est décrit par Féat et al. (2024).

Plusieurs datations radiocarbone ont été réalisées (Muller et al., 2024). La tourbière à Saule des Lapons date d'environ 6000 cal. BP, tandis que la tourbière de Ronc de la Gleize, plus récente, s'est formée il y a environ 2200 ans (Muller et al., 2024).

## 3- Analyse morphométrique du pollen actuel et fossile

Les grains de pollen de chaque espèce et de chaque site ont été observés au microscope optique (x630) et des photographies ont été réalisées. Les mesures ont ensuite été prises à l'aide du logiciel d'analyse d'image Image J v1.54g (Schneider et al., 2012). Le logiciel a été étalonné au préalable en indiquant l'échelle à respecter. Six caractères ont été mesurés sur chaque grain : "Diamètre équatorial" (DE, µm), "Épaisseur de la paroi" (EP, µm), "Profondeur du pore" (PP, µm), "Largeur de l'annulus" (LA, µm), "Diamètre du pore" (DP, µm) et "Surface" du grain en

vue équatoriale (S, µm²) (Fig. 1).

Une étude préliminaire a été réalisée sur 10 grains de pollen de chaque espèce par quatre opératrices pour évaluer les erreurs de mesures inter-opératrices et tester leur reproductibilité. Une analyse de la variabilité intra-opératrice a également été réalisée sur 5 grains de pollen de *B. nana* et de *B. pendula* pour vérifier la répétabilité de l'approche d'une même opératrice.

Pour l'analyse morphométrique appliquée aux grains de pollen actuels, 250 photos ont été prises : 50 photos pour chaque espèce et pour chaque tourbière (Lajo et Bourge), excepté pour *B. nana* qui n'a été prélevé qu'à Lajo car il est absent dans la tourbière de Bourge.

L'approche morphométrique a ensuite été testée sur les grains de pollen fossiles des deux carottes de tourbe prélevées (Table 2). L'analyse morphométrique des grains de pollen fossiles a été effectuée de deux manières pour élaborer une technique nécessitant moins de manipulation. Une première a consisté à mesurer les grains de pollen via les photographies. La seconde a consisté à mesurer les grains de pollen au microscope (x630) avec le réticule oculaire. Cette seconde méthode a l'avantage d'être moins chronophage que la première. Ainsi, les mesures sont obtenues plus facilement.

## 4- Traitements statistiques

Les données utilisées pour tester la reproductibilité des mesures inter- et intra-opératrices ont été analysées à l'aide d'Analyses en Composantes Principales (ACP) via Rstudio version 2023.09.1+494 (RStudio team, 2020) et des packages *FactoMineR* (Husson et al., 2023) et *Factoshiny* (Vaissie, 2021).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 1. Mesures palynologiques réalisées. A : Profondeur du pore (PP), largeur de l'annulus (LA), diamètre du pore (DP) ; B : Diamètre équatorial (DE), surface du pollen (S) ; C : Epaisseur de la paroi (EP).</figcaption></figure>

Après vérification de la reproductibilité des mesures inter- et intra-opératrices, une Analyse Factorielle Discriminante (AFD) a été réalisée sur une matrice de données comportant 250 individus statistiques (250 grains), les 6 variables quantitatives explicatives (les 6 caractères morphologiques) et une variable qualitative dépendante présentant 5 modalités (5 groupes équilibrés en effectif : *Betula nana* _Lajo_ ; *Betula pendula* _Lajo_ ; *Betula pendula* _Bourge_ ; *Betula pubescens* _Lajo_ ; *Betula pubescens* _Bourge_). La variable “Surface” a fait l’objet d’une transformation racine carrée afin de rendre comparable en taille / unité cette variable aux autres. L’AFD a été utilisée

pour répondre à deux objectifs correspondant aux deux principales propriétés de cette méthode d’analyse statistique multidimensionnelle : (1) établir un modèle de discrimination permettant de différencier et de quantifier le taux de discrimination entre les trois espèces étudiées en mettant en lumière les caractères morphologiques qui contribuent le plus à la distinction et (2) attribuer les grains de pollen fossiles à une des trois espèces étudiées selon une approche probabiliste. Ici, les grains de pollen fossiles ont été attribués à une espèce si sa probabilité d’appartenir à celle-ci était supérieure à 75%. L’AFD a été réalisée via Rstudio version 2023.09.1+494 (RStudio team, 2020) avec le package MASS (Ripley, 2023).
Dans un deuxième temps, les traits considérés comme les plus discriminants par l'AFD ont été mesurés à l'aide du réticule de l'oculaire du microscope, comme pourrait le faire un palynologue en cours de comptage pollinique. Les résultats des mesures des pollen actuels de référence ont été présentées sous forme d'histogrammes, espèce par espèce. Cette représentation graphique des données de référence permettra aux palynologues d'affilier les grains fossiles lors de la mesure des traits sélectionnés, directement au réticule.

Enfin, le classement des grains de pollen à une espèce de *Betula* réalisé à l'aide de l'AFD a été comparé avec celui réalisé par la méthode univariée, c'est-à-dire la mesure de traits effectuée directement au réticule. L'efficacité des deux méthodes a pu être évaluée.

Enfin, une Analyse de la Variance à 2 facteurs a été réalisée pour laquelle, la tourbière et l'espèce constituent deux variables quantitatives à deux modalités. L'objectif étant de tester s'il existe de la variation entre les grains de pollen actuels de même espèce entre les différentes tourbières, un modèle de régression linéaire a été construit à partir des données prises en photo. Les espèces utilisées sont *B. pendula* et *B. pubescens* et les tourbières sont Bourge et Lajo. *B. nana* n'est pas inclus, car il est uniquement présent sur la tourbière de Lajo. Une transformation en log10 a permis de normaliser les résidus de certaines variables. Cependant, l'homoscédasticité n'est pas totalement respectée.

# RESULTATS

## 1- Erreurs de mesures et reproductibilité des mesures

Les mesures réalisées par chaque opératrice ont permis d'apprécier la variabilité intra-opératrice et inter-opératrice. L'influence des 4 opératrices (MD, SF, CM, SI), évaluée à l'aide d'une Analyse en Composantes Principales (ACP) dont les deux premiers axes principaux expliquent à eux seuls 55,22

% de l'inertie, ne semble pas générer des différences significatives dans l'appréciation des mensurations des grains de pollen (Annexe 2). Ainsi, les erreurs de mesure peuvent être considérées comme minimes et l'approche morphométrique reproductible.

## 2- De l'établissement d'un modèle morphométrique discriminant à l'identification des grains de pollen fossiles

*Approche multivariée.* L'Analyse Factorielle Discriminante (AFD) utilisée pour tester la discrimination des 3 espèces de *Betula* affiche un pouvoir discriminant global de 88,8% (Fig. 2). L'axe 1 (73,1% de variance expliquée) traduisant les variations des variables "Surface du pollen" (S), "Diamètre équatorial" (DE) et dans une moindre mesure "Largeur de l'annulus" (LA) contribue fortement à la distinction des 3 espèces dont les grains de pollen se répartissent le long de l'axe 1 de l'AFD selon un gradient de taille (Fig. 2). Ainsi, selon les coordonnées des individus dans l'AFD (grains de pollen), *Betula nana* produit les grains les plus petits (coordonnées les plus faibles sur l'axe 1) alors que les grains de pollen de *B. pendula* et de *B. pubescens* apparaissent comme possédant une surface et un diamètre équatorial de taille supérieure. Par ailleurs, ces deux dernières espèces semblent se distinguer partiellement sur la base des variables qui contribuent à définir l'axe 2 de l'AFD (20,7% de variance expliquée), c'est-à-dire essentiellement le caractère "Profondeur du pore" (PP) et secondairement "largeur de l'annulus" (LA). Globalement, les grains de pollen de *Betula pubescens* semblent posséder des pores moins profonds que ceux de *B. pendula* (Fig. 2).

Dans un second temps, les mesures des grains de pollen fossiles obtenues ont été confrontées au modèle de discrimination de référence établi sur des grains de pollen actuels et décrit précédemment. L'allocation probabiliste des grains fossiles étudiés issus des sites tourbeux *Ronc de la Gleize* et *Saule des Lapons* aux 3 espèces étudiées est détaillée en Annexe 3. Il a été considéré que l'attribution d'un grain de pollen à une espèce
<figure><img src="image_23.png" /></figure>

Figure 2. Analyse Factorielle Discriminante de la distribution des grains de pollen fossiles des trois espèces de Betula en fonction de la profondeur.

Bien que le nombre de grains de pollen fossile étudié soit faible et déséquilibré entre les différentes couches tourbeuses, il apparaît que *B. nana* est présente tout au long des séquences des deux sites, *Ronc de la Gleize* et *Saule des Lapons* (Annexe 3). Les occurrences de *B. pendula* et *B. pubescens* sont sporadiques. *B. pendula* n'est enregistré qu'à *Ronc de la Gleize* dans tous les échantillons tourbeux, sauf dans celui daté à 330 cal. BP. *B. pubescens* n'est quant à lui enregistré qu'à *Saule des Lapons* à 5740 et 3350 cal. BP (Annexe 3).

*Approche univariée.* Pour tenter de distinguer les grains de pollen fossiles au réticule du microscope, les 2 caractères “Diamètre équatorial” (DE) et “Largeur de l’annulus” (LA) dont le pouvoir discriminant a été mis en évidence par l’AFD ont été mesurés. Un chevauchement entre les histogrammes de *B. nana* de Lajo avec *B. pendula* de Bourge et *B. pubescens* de Bourge et de Lajo sont à

noter pour le caractère LA (Fig. 3). Pour DE, *B. nana* de Lajo se recoupe uniquement avec *B. pendula* de Bourge. *B. pendula* de Bourge et *B. pubescens* de Lajo se recoupent plus pour DE que pour LA. Une distinction semble tout de même réalisable à partir des valeurs de DE et de LA entre *B. nana* et les deux autres espèces. Selon cette approche, DE permet la mise en évidence de *B. nana* tout au long de la séquence des deux sites, *Ronc de la Gleize* et *Saule des Lapons*. Betula pendula est enregistré dans les deux sites, en particulier à *Ronc de la Gleize* où il semble quasi-omniprésent, sauf dans les échantillons datés à 1950 et à 700 et à cal. BP (un seul grain dans chaque échantillon alloué à *B. nana*). *B. pubescens* n'est révélé dans aucun site. Selon les valeurs du caractère LA, *B. nana* semble omniprésent dans la séquence des deux sites. Par contre, *B. pendula* n'est jamais mis en évidence et une seule occurrence de *B. pubescens* est à noter à *Ronc de la Gleize* à 2190 cal. BP.
Cependant, des divergences d'identification entre les méthodes sont à noter. Elles seront discutées ultérieurement.

## 3- Variation inter-site de la taille du pollen actuel

Le modèle d'Analyse de la Variance à 2 facteurs montre qu'il existe pour les 6 variables, un effet significatif entre le facteur espèce (deux espèces prises seulement) et le facteur site (P < 0.05) (Annexe 4). Les résultats semblent montrer une variation entre les individus d'une même population dans chaque site. En effet, les données de chaque variable de *B. pendula* (Annexe 4) pour les deux sites ne se chevauchent pas. C'est également le cas pour *B. pubescens*.

# DISCUSSION

## 1- Distinction des espèces de *Betula*

L'Analyse Factorielle Discriminante appliquée sur les 250 grains de pollen de référence indique qu'il est possible de distinguer les différentes espèces de *Betula* (taux de discrimination égal à 88,8%). *B. nana* est l'espèce qui se distingue le plus facilement des deux autres espèces (96 % de classement correct) car il semble qu'elle produise des grains globalement plus petits (Fig. 2). En effet, comme le note Birks (1968), les grains de pollen de *B. nana* ont des tailles généralement inférieures (0,8x plus petit) à celles de *B. pendula* et *B. pubescens*, et ce pour l'ensemble des six caractères mesurés. Les grains de pollen les plus petits correspondent donc à *B. nana*. Cette tendance vers des grains de pollen plus petits pour *B. nana* semble cohérente avec son type biologique, un chaméphyte (Karlsdottir et al, 2007), tandis que les deux autres espèces sont,

quant à elles, des phanérophytes. Il semblerait donc qu'il existe une relation entre la taille des grains de pollen et le type biologique, donc la taille maximale potentielle, de l'espèce ligneuse qui les produit.

Considérées indépendamment, l'utilisation des variables "Diamètre équatorial" (DE) et "Largeur de l'annulus" (LA) comme proxy de discrimination des espèces de *Betula* semble valide pour une méthode d'identification directe au microscope (Fig. 3). En effet, d'après les travaux de Klerk et al. (2007), la variable "Diamètre équatorial" qui correspond au diamètre du grain de pollen est considéré comme le meilleur paramètre pour distinguer les grains de pollen de *Betula* et notamment pour discriminer *B. nana* et *B. pubescens*. Toutefois, des doutes quant à la fiabilité des identifications peuvent être émis lorsque l'on examine le niveau de concordance (en nombre ou en % de grains de pollen identifiés à l'identique entre les différentes approches considérées deux à deux) (Table 3).

Si la méthode multivariée (AFD) peut être considérée comme la méthode la plus sure et la plus performante (taux de discrimination entre les 3 espèces de 88,8% et taux de distinction *Betula nana* – autres *Betula* égal à 96%), un taux de concordance de près de 2/3 entre l'AFD et la méthode univariée, quelle que soit la variable utilisée, ne plaide pas en faveur de la mesure directe au réticule. Qui plus est, l'utilisation des variables DE et LA ne donne pas le même résultat pour près de 23 grains sur 49, soient 46,9% (Table 3) et de nombreux grains de pollen restent non identifiables (Annexe 3). Par conséquent, nous pouvons considérer que seule la méthode multivariée est digne d'intérêt et de confiance dans la distinction des 3 espèces de *Betula* et dans l'identification des grains de pollen fossiles.
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 3. Variation du diamètre équatorial et de la largeur de l'annulus en fonction de l'espèce et du site</figcaption></figure>

<table><caption>Table 3. Concordance de l'identification des 49 grains de pollen étudiés entre les méthodes comparées 2 à 2. A, en nombre de grains de pollen dont l'identification est identique ; B, en %.</caption><thead><tr><th>A</th><th>Méthode multidimensionnelle</th><th>Méthode unidimensionnelle - DE</th><th>Méthode unidimensionnelle - LA</th></tr></thead><tbody><tr><td>Méthode multidimensionnelle</td><td>-</td><td>32</td><td>33</td></tr><tr><td>Méthode unidimensionnelle - DE</td><td>32</td><td>-</td><td>26</td></tr><tr><td>Méthode unidimensionnelle - LA</td><td>33</td><td>26</td><td>-</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th>B</th><th>Méthode multidimensionnelle</th><th>Méthode unidimensionnelle - DE</th><th>Méthode unidimensionnelle - LA</th></tr></thead><tbody><tr><td>Méthode multidimensionnelle</td><td>-</td><td>65,3</td><td>67,4</td></tr><tr><td>Méthode unidimensionnelle - DE</td><td>65,3</td><td>-</td><td>53,1</td></tr><tr><td>Méthode unidimensionnelle - LA</td><td>67,4</td><td>53,1</td><td>-</td></tr></tbody></table>
## 2- Variation morphologique entre les grains de pollen

L'Analyse de la Variance à deux facteurs semble révéler une différence morphologique entre *B. pubescens* et *B. pendula* dans les deux tourbières. Elle montre aussi que les tourbières à elles seules ne représentent pas un facteur influant la morphologie du pollen. Cependant, l'espèce et les conditions environnementales du site ont potentiellement eu un effet sur la morphologie du grain de pollen (Annexe 4). C'est ce que semble montrent l'étude de Fatmi et al (2020) qui observent chez *Atriplex halimus* un phénotype changeant, dans ce cas des couleurs de grains de pollen différentes, en fonction de la composition chimique du sol et d'autres paramètres abiotiques et biotiques (Muller, 1979 ; Fatmi et al., 2020). De plus, il est suggéré que des variants phénotypiques inhabituels pourraient être liés à la compétition ou représenter l'expression de mutations (Fatmi et al., 2020). Ces hypothèses pourraient également s'appliquer à cette étude où des grains de pollen tétraporés de *Betula* qui ont été observés dans certaines lames de pollen actuel.

Néanmoins, les échantillons récoltés ne sont pas suffisants pour permettre d'expliquer ces variations. En effet, les résultats obtenus peuvent être dus à de la variation individuelle. De plus, les ellipses de confiance obtenues pour *B. pendula* de Bourge semble se chevaucher avec l'ellipse de *B. pendula* de Lajo (Fig. 2). C'est également le cas pour *B. pubescens* (Fig. 2). Des études ultérieures pourraient être réalisées sur plusieurs populations de *B. pendula* et *B. pubescens* de différentes régions.

## 3- Interprétation paléoécologique

Les résultats obtenus fondés sur l'approche multivariée d'identification montrent une présence continue de *B. nana* depuis 6000 cal. BP pour *Saules des Lapons* et depuis 2190 cal. BP pour *Ronc de la Gleize*. Ces résultats valident le statut de relicte glaciaire de *B. nana* (Vasari & Vasari, 1985).

Les diagrammes polliniques réalisés par Féat

et al. (2024) sur les tourbières de Lajo montrent que le bouleau est retrouvé en petite quantité dans les carottes de tourbe et à tous les âges. Nos résultats (Annexe 3) sont confirmés par les études antérieures de Vasari & Vasari (1985) et Wallinga et al. (2019), qui montrent le maintien de *B. nana* depuis le Tardiglaciaire en Margeride.

Des grains de pollen fossiles témoignent de la présence de *B. nana* en France au cours de la période tardiglaciaire (Tralau, 1963), située entre 18000 et 12000 cal. BP environ (Reille, 1990). Cette espèce a perduré uniquement à l'étage montagnard dans des zones à climat rude et froid (de Beaulieu et al., 1985 ; Vasari & Vasari, 1985 ; Lacoste et al., 2021). Comme observé ici dans la Margeride où *B. nana* s'est maintenu sur la tourbière à Saule des Lapons depuis plus de 6000 ans et à Ronc de la Gleize depuis plus de 2000 ans (Annexe 3).

Malheureusement, compte tenu du faible nombre de grains de pollen étudiés, une étude diachronique précise n'a pu être effectuée pour chacun des sites, pas plus qu'une étude synchronique comparative s'agissant de la portion de séquence chronologique de *Saule des Lapons* contemporaine à la séquence de *Ronc de la Gleize*.

## CONCLUSION

L'approche de cette étude se démarque des études antérieures par la conception d'un modèle de distinction des grains de pollen de *Betula* à l'aide d'une approche multivariée, l'Analyse Factorielle Discriminante. L'utilisation des caractères morphométriques comme critères d'identification des trois espèces de *Betula* étudiées ici semblent être valide et vient compléter les travaux de Birks (1968) et Faegri et al. (1989). Le modèle utilisant l'analyse multivariée est largement plus précis que l'utilisation des modèles univariés utilisant des mesures réalisées directement au réticule du microscope.

Cette étude a finalement révélé la présence des différentes espèces de bouleaux, en particulier de *Betula nana* depuis plus de 6000 ans autour des tourbières de Lajo, ce qui
constitue un résultat d'intérêt paléoécologique
de premier ordre. Cette nouvelle approche
permettrait de lancer des recherches sur le
Tardiglaciaire et l'Holocène, périodes encore
mal connues en Margeride (de Beaulieu et al.,
1985 ; Reille, 1987).

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<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>ANNEXE 1. Représentation des individus statistiques (5 grains mesurés par 4 opératrices) dans le plan principal 1-2 (55,27% de variance expliquée) de l'Analyse en Composantes Principales réalisée pour tester la variabilité inter-opératrices</figcaption></figure>
ANNEXE 2. Cercle des corrélations de l'Analyse Factorielle Discriminante des variables quantitatives (Annexe 3) : profondeur du pore (PP) ; largeur de l'annulus (LA) ; diamètre du pore (DP) - DE : diamètre équatorial (DE) ; la racine carrée de la surface du pollen (rS), épaisseur de la paroi (EP)

<figure><img src="image_26.png" /></figure>
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>ANNEXE 3. Analyse Factorielle Discriminante des espèces de *Betula* actuelles et fossiles selon leurs sites. Bn-Lajo : *B. nana* de Lajo ; Bpe-Bourge : *B. pendula* de Bourge ; Bpe-Lajo : *B. pendula* de Lajo ; Bpu-Bourge : *B. pubescens* de Bourge ; Bpu-Lajo : *B. pubescens* de Lajo</figcaption></figure>