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# Action de petits peptides, fragments d'ACTH, sur l'incorporation de P32 dans les protéines cérébrales in vitro.

G Cehovic, Patricia Cassonnet

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G Cehovic, Patricia Cassonnet. Action de petits peptides, fragments d'ACTH, sur l'incorporation de P32 dans les protéines cérébrales in vitro. Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série III, Sciences de la vie, 1984, 298 (7), pp.191-4. hal-02939553

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Comptes rendus de
l'Académie des sciences. Série
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Académie des sciences (France). Auteur du texte. Comptes rendus de l'Académie des sciences. Série 3, Sciences de la vie. 1984-01.

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ENDOCRINOLOGIE. — Action de petits peptides, fragments d'ACTH, sur l'incorporation de P³² dans les protéines cérébrales *in vitro*. Note de Georges Cehovic et Patricia Cassonnet, présentée par Robert Courrier.

Remise le 21 novembre 1983, acceptée après révision le 9 janvier 1984.

Certains petits peptides, fragments d'ACTH, peuvent modifier l'incorporation de P³² dans les protéines cérébrales *in vitro*. La possibilité du rôle de ces peptides dans le mécanisme de régulation de certaines fonctions cérébrales par l'activation des protéine-kinases différenciées est envisagée.

ENDOCRINOLOGY. — Action of Small Peptides (ACTH sequences) on ³²P Incorporation in Brain Proteins *in vitro*.

Some small peptides, ACTH sequences, are able to modify the ³²P incorporation in brain proteins in vitro. The possibility that these peptides play a role in the regulation mechanism of some brain functions through differentiated protein-kinases could be considered.

Il y a une dizaine d'années, en travaillant sur le problème de l'action de MSH et de ses analogues sur la fonction thyroïdienne, nous avions conclu : « ... il serait raisonnable d'envisager l'existence d'un certain nombre de peptides à structure proche de MSH et ACTH dont le spectre d'activité biologique serait en relation qualitative avec leurs structures » [1].

Depuis, on connaît l'extraordinaire développement des recherches sur les peptides hypothalamiques qui ont conduit à l'isolement et la synthèse de plusieurs hormones hypothalamiques ([2], [3], [4]).

On a aussi isolé et synthétisé des peptides du groupe MSH, comme la gamma-MSH et la delta-MSH, avec des variations dans la structure dues à l'espèce [4], ainsi que la betalipotropine et des endorphines beta et gamma qu'on a détectées dans différents organes [6].

En dépit d'un grand nombre de travaux consacrés à ces hormones mélanophoriques, leur rôle dans les régulations endocriniennes, en dehors de leur action pigmentaire, n'est pas encore élucidé.

En étudiant l'action de nouveaux facteurs isolés du placenta humain, nous avons constaté l'existence, d'une part de facteurs stimulant la phosphorylation de certaines protéines cérébrales *in vitro*, et d'autre part de facteurs l'inhibant. En purifiant ces facteurs par chromatographie et HPLC ([7], [8]), nous avons trouvé qu'il s'agit de petits peptides (300 à 600 dalton). Ceci nous a conduit à étudier l'action des acides aminés libres et d'un certain nombre de petits peptides. Une faible stimulation de l'incorporation de P³² a été constatée avec des doses très élevées (15 mM) de certains acides aminés et de quelques petits peptides ([9], [10]).

Dans cette Note, nous rapportons les résultats obtenus avec MSH, ACTH et certains de leurs fragments sur la phosphorylation des protéines cérébrales du Rat *in vitro*.

MÉTHODES ET MATÉRIEL. — La méthode de phosphorylation décrite auparavant [7] consiste essentiellement en une incubation *in vitro* des protéines totales du cerveau du Rat obtenues à partir des broyats selon la technique de Rudolf [11] avec les substances utilisées en présence de gamma P³²-ATP. Après incubation (2 mn à 30°C), la phosphorylation totale des protéines a été estimée par la mesure de la radioactivité (P³²) dans le précipité (TCA – 10%), et par le degré d'incorporation de P³² dans différentes protéines après SDS gel électrophorèse sur plaques et autoradiographie. Cette même méthode a
été utilisée par nous dans plusieurs études et permet une comparaison avec nos résultats obtenus avec d'autres substances, et en particulier ceux obtenus avec des acides aminés [9] ou des petits peptides [10].

Les substances utilisées ont été fournies par les sociétés SERVA ou SIGMA, en l'occurrence α-MSH humaine (1-13) α-Melanocyte Stimulating Hormone); α-MSH (6-9) : His-Phe-Arg-Trp); ACTH humaine (1-39) (Adrenocorticotropin Hormone); ACTH (1-4 : Ser-Thr-Ser-Met); ACTH (4-10 : Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly); ACTH (5-10 : Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly).

Ces substances (hormones ou fragments) ont été dissoutes dans la solution Hepes – pH ajusté à 7,3 – et ajoutées à l'incubat des broyats de cerveaux à des concentrations finales de 1 µM à 1 mM.

RÉSULTATS. — L'α-MSH entière et l'ACTH entière n'ont pas significativement modifié l'incorporation de P³² (de 1 à 500 µM) (non présenté), ainsi que le fragment d'ACTH (1-4). Par contre, l'ACTH (4-10) (d'ailleurs sans activité corticotropique) s'est montrée très active sur la stimulation de la phosphorylation des protéines cérébrales du cerveau, alors que la fraction 5-10 de l'ACTH a été inactive (tableau).

Fait spectaculaire : l'α-MSH (6-9) (qui correspond à la même séquence 6-7-8-9 de l'ACTH) a une très nette action inhibitrice sur la phosphorylation (voir les courbes de la figure 1). L'enregistrement des autoradiogrammes des plaques de gels SDS-PAGE montre que l'ACTH (4-10) augmente la phosphorylation de presque toutes les protéines cérébrales, surtout celles à poids moléculaires plus élevés (fig. 2) : aucune modification avec ACTH (5-10) et nette diminution de la phosphorylation de tous les pics protidiques avec α-MSH (6-9).

DISCUSSION. — Basés sur nos précédentes publications ([7] à [10]) sur l'action des petits peptides sur la phosphorylation *in vitro* des protéines cérébrales, nous avons émis

TABLEAU

Action de fragments d'ACTH et d'α-MSH sur la phosphorylation des protéines cérébrales *in vitro*.

Action of ACTH and α-MSH fragments on phosphorylation of cerebral proteins *in vitro*.

<table><thead><tr><th>Substances</th><th>Conc. (a)</th><th>cpm (M+SD) (b)</th><th>% contr. (c)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Contrôle n° 340. . . . .</td><td>—</td><td>7 337 ± 16</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>10 µM</td><td>7 086 ± 32</td><td>96</td></tr><tr><td>α-MSH (6-9). . . . . . .</td><td>100 µM</td><td>7 294 ± 38</td><td>99</td></tr><tr><td></td><td>500 µM</td><td>6 290 ± 39</td><td>86</td></tr><tr><td></td><td>1 mM</td><td>4 586 ± 25</td><td>63</td></tr><tr><td>ACTH (5-10). . . . . . .</td><td>10 µM</td><td>7 451 ± 397</td><td>101</td></tr><tr><td></td><td>100 µM</td><td>7 204 ± 61</td><td>98</td></tr><tr><td>Contrôle n° 339. . . . .</td><td>—</td><td>8 918 ± 123</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>500 µM</td><td>9 042 ± 109</td><td>101</td></tr><tr><td>ACTH (5-10). . . . . . .</td><td>750 µM</td><td>8 785 ± 62</td><td>98</td></tr><tr><td></td><td>1 mM</td><td>8 522 ± 80</td><td>95</td></tr></tbody></table><table><thead><tr><th>Substances</th><th>Conc. (a)</th><th>cpm (M+SD) (b)</th><th>%/contr. (c)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Contrôle n° 341. . . . .</td><td>—</td><td>5 412 ± 50</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>50 µM</td><td>5 342 ± 28</td><td>99</td></tr><tr><td>ACTH (1-4). . . . . . .</td><td>100 µM</td><td>5 460 ± 40</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>200 µM</td><td>5 421 ± 30</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>500 µM</td><td>5 512 ± 106</td><td>102</td></tr><tr><td></td><td>1 mM</td><td>5 496 ± 76</td><td>101</td></tr><tr><td>Contrôle n° 320. . . . .</td><td>—</td><td>5 323 ± 89</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td>100 µM</td><td>5 286 ± 28</td><td>99</td></tr><tr><td>ACTH (4-10). . . . . . .</td><td>500 µM</td><td>6 462 ± 136</td><td>122</td></tr><tr><td></td><td>750 µM</td><td>7 467 ± 600</td><td>140</td></tr><tr><td></td><td>1 mM</td><td>8 325 ± 190</td><td>156</td></tr></tbody></table>

<footnote>(a) Concentrations (conc.) exprimées soit en micromoles (µM), soit en millimoles (mM).</footnote>

<footnote>(b) Radioactivité du précipité exprimée en coups par minute (cpm). Moyenne de trois échantillons ± déviation standard (ME ± SD).</footnote>

<footnote>(c) Pourcentage (%) par rapport au contrôle.</footnote>
Phosphorylation des protéines cérébrales en % par rapport au contrôle

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Fig. 1.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Fig. 2.</figcaption></figure>

Fig. 1. — Action des fragments d'ACTH sur la phosphorylation des protéines cérébrales *in vitro*.

Fig. 2. — Densitométrie des autoradiogrammes des gels SDS après incubation avec un fragment d'ACTH et témoin correspondant. D, début gel; F, front; PM × 10³, poids moléculaire.

l'hypothèse de l'existence de petits peptides dans le placenta activant ou inhibant cette phosphorylation des protéines par l'intermédiaire des protéine-kinases membranaires.

Le fait que nous ayions trouvé une activité stimulante du fragment d'ACTH (4-10) et une action inhibitrice d'une partie de ce segment (6-9), serait en faveur de cette hypothèse.

Les peptides déjà étudiés ainsi que ces segments d'ACTH pourraient agir comme activateurs ou inhibiteurs des sites récepteurs des protéine-kinases différenciées. L'absence d'activation de cette phosphorylation par l'AMP cyclique que nous avons constatée [10] montre que ces protéine-kinases ne dépendent pas de l'AMP cyclique.

La synthèse par le placenta humain des substances corticotropes a été rapportée [12]. Ajoutons ici que les facteurs que nous avons isolés du placenta ont stimulé la phosphorylation des protéines cérébrales, à des concentrations de l'ordre de nanogrammes.

D'autre part, nous avons observé auparavant que certaines substances utilisées en thérapie humaine dans les troubles de la mémoire et ceux liés au vieillissement cérébral, augmentent aussi la phosphorylation de ces mêmes protéines dans nos expériences *in vitro* [13]. Fait important : d'après de Wied [14], dans ses travaux sur le comportement, le fragment d'ACTH (4-10) aurait une action dans le mécanisme de régulation de la mémoire et de la vigilance.

Des recherches basées sur l'hypothèse que l'existence des relations entre certaines fonctions cérébrales, et en particulier la mémoire, et la phosphorylation des protéines cérébrales, pourraient contribuer à une meilleure compréhension de ces mécanismes ainsi qu'à l'isolement des substances actives sur la mémoire, et éventuellement sur d'autres troubles du fonctionnement du système nerveux central.
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

[1] G. CEHOVIC, *Comptes rendus*, 265, série D, 1967, p. 1317.

[2] A. V. SCHALLY, *Science*, 202, 1978, p. 18.

[3] R. GUILLEMIN, *Science*, 218, 1982, p. 585.

[4] S. MAC CANN, in *Frontiers in Neuroendocrinology*, 1971, L. MARTINI éd., Oxford Press, p. 209.

[5] S. NAKANISHI, *Nature*, 278, 1979, p. 423.

[6] E. S. ORWOLL et J. W. KENDALL, *Endocrinology*, 107, 1980, p. 438.

[7] G. CEHOVIC, *Comptes rendus*, 293, série III, 1981, p. 147.

[8] G. CEHOVIC et N. B. GIAO, *Comptes rendus*, 294, série III, 1982, p. 813.

[9] G. CEHOVIC, *Comptes rendus*, 296, série III, 1983, p. 207.

[10] G. CEHOVIC, *Comptes rendus*, 296, série III, 1983, p. 351.

[11] S. A. RUDOLF et B. K. KRUEGER, *Adv. in Cycl. Nucl. Res.*, 1979, P. GREENGARD et G. A. ROBISON éd., 10, Raven Press, New York, p. 107.

[12] A. LIOTTA et coll., *Endocrinology*, 101, 1977, p. 1552.

[13] G. CEHOVIC, N. B. GIAO et P. CASSONNET, 65th Annual Meeting Endocrine Society, U.S.A., San Antonio, Texas, Abstr. n° 1284, 1983, p. 401.

[14] DE WIED et coll., *Pharm. Biochem. Behav.*, 4, 1976, p. 273.

Avec l'excellente assistance technique de Mme M. C. Dagens.

Laboratoire des Nucléotides cycliques,
Faculté de Pharmacie, Université Paris-Sud.
1, rue Jean-Baptiste-Clément, 92290 Chatenay-Malabry.