# Dynamique de récupération de biofilms microbiens suite à une diminution du niveau d'exposition au cuivre : Influence des migrations d'espèces

Anne Sophie Lambert

► To cite this version:

Anne Sophie Lambert. Dynamique de récupération de biofilms microbiens suite à une diminution du niveau d'exposition au cuivre : Influence des migrations d'espèces. Sciences de l'environnement. 2011. hal-04353361

HAL Id: hal-04353361

https://hal.inrae.fr/hal-04353361

Submitted on 19 Dec 2023

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>
Stage de 2ème année Master 2010-2011

Master de Sciences et Technologies, Mention Biologie Moléculaire et Cellulaire, Spécialité Microbiologie
Appliquée, Environnement, Santé (MAPES)

# Dynamique de récupération de biofilms microbiens suite à une diminution du niveau d'exposition au cuivre : Influence des migrations d'espèces

Anne-Sophie LAMBERT

Maître de stage : Stéphane PESCE, stephane.pesce@cemagref.fr

Co-encadrante : Soizic MORIN, soizic.morin@cemagref.fr
Remerciements
---

En préambule à ce mémoire, je souhaite adresser mes remerciements les plus sincères aux
personnes qui m'ont apporté leur aide et qui ont contribué à l'élaboration de ce mémoire.

Je tiens à remercier sincèrement Stéphane Pesce pour sa confiance et sa grande patience et
qui, en tant que maître de stage, s'est toujours montré à l'écoute et très disponible tout au long
de la réalisation de ce mémoire, ainsi que pour l'inspiration, l'aide et le temps qu'il a bien
voulu me consacrer et sans qui ce mémoire n'aurait jamais vu le jour.

Mes remerciements s'adressent également à Soizic Morin (co-encadrante) du Cemagref de
Bordeaux, pour sa générosité et son implication à distance.

J'exprime ma gratitude à tous les autres membres de l'équipe EMHA : Marc Neyra,
Bernadette Volat, Bernard Motte, Christophe Rosy, Arnaud Foulquier, Joan Artigas Alejo, et
Ahmed Tlili. Je remercie également les membres du laboratoire d'analyses physicochimiques
des milieux aquatiques (LAMA) du Cemagref de Lyon pour l'ensemble des analyses
chimiques réalisé au cours de ce travail et plus particulièrement Josiane Gahou, Eloïse Vray et
Hélène Sanejouand, pour leur accueil chaleureux, leur aide, et leur gentillesse.

Enfin, j'adresse mes plus sincères remerciements à mes proches, qui m'ont toujours soutenue
et encouragée au cours de la réalisation de ce mémoire.

Merci à toutes et à tous.
## Abréviations

* **ARISA** : Automated Approach for Ribosomal Intergenic Spacer Analysis

* **CE₅₀** : Concentration Efficace 50%, concentration d'un polluant qui entraîne une inhibition de 50% d'un paramètre biologique donné

* **EDTA** : acide éthylène diamine tétracétique

* **Lampe HPS** : Lampe "Hight Pressure Sodium"

* **MCA-Leu** : Methyl-Coumarinyl-Amide-Leucine

* **MSSC** : Matière Sèche Sans Cendre (= matière organique)

* **MUF-Glu** : 4-méthyleum-belliferyl-β-D-glucoside

* **PCR** : Polymerase Chain Reaction

* **PICT** : Pollution Induced Community Tolerance

* **SIR** : Substrate Induced Respiration
# I. Introduction :

La politique publique française de l'eau n'a cessé d'être modernisée et complétée afin de répondre aux enjeux fondamentaux, comme la préservation des milieux aquatiques et des ressources en eau. La gestion actuelle de ces ressources est basée à la fois sur la législation française et sur des directives européennes spécifiques comme la directive cadre sur l'eau du 23 octobre 2000 (directive 2000/60). Elle fixe notamment des objectifs pour la préservation et la restauration de l'état des eaux superficielles, l'objectif général étant d'atteindre d'ici à 2015 le bon état chimique et écologique des différents milieux sur tout le territoire européen. En France, malgré le développement de nouvelles pratiques agricoles plus respectueuses de l'environnement, les pesticides organiques (en particulier les herbicides et les fongicides) et inorganiques (métaux lourds) restent les principaux polluants chimiques des rivières. Ainsi, les petits cours d'eau situés en zone agricole se retrouvent particulièrement exposés à ces deux types de polluants, qui peuvent perturber les communautés aquatiques et engendrer un impact écologique important.

Dans les milieux lotiques, les communautés microbiennes phototrophes (microalgues et cyanobactéries) et hétérotrophes (bactéries et champignons), qui se structurent majoritairement sous forme d'agrégats, appelés « biofilm » ou encore « périphyton », jouent un rôle clé dans différents processus écologiques comme la production primaire ou la dégradation de la matière organique et le recyclage des nutriments. De plus, ces assemblages microbiens interagissent précocement avec les pesticides organiques et inorganiques et possèdent une capacité de réponse rapide aux changements environnementaux et un fort potentiel d'adaptation. Compte tenu de ces propriétés, ils peuvent être considérés comme des « bio-indicateurs » pertinents dans le cas de contaminations chimiques (Pesce et al, 2008). De ce fait, les biofilms microbiens représentent un outil biologique particulièrement intéressant pour évaluer le « gain écologique » résultant d'une diminution de pression chimique en étudiant leurs capacités de récupération suite à une amélioration de la qualité de l'eau.

Parmi les agrosystèmes, les zones viticoles représentent des secteurs particulièrement sensibles. En effet ces zones sont soumises à une exposition importante en pesticides organiques, et inorganiques, en particulier le cuivre (Pesce et al, 2008 ; Rabiet et al, 2010). Or, plusieurs études ont montré que le cuivre pouvait engendrer des effets sur les biofilms en terme de diminution de biomasse, de modifications structurales et d'impact fonctionnel (inhibition de la photosynthèse, diminution de certaines activités enzymatiques, etc.), (Barranguet et al, 2003 ; Serra et al, 2009). Une exposition prolongée au cuivre peut
également engendrer une augmentation de tolérance des communautés à ce polluant (Barranguet et al, 2003; Montuelle et al, 2010; Tlili et al 2010). Cette acquisition de tolérance par les communautés microbiennes suite à leur exposition à ce toxique répond au concept PICT (Pollution Induced Community Tolerance), qui postule qu'une communauté exposée chroniquement à un contaminant peut s'adapter et devenir tolérante à celui-ci (Blanck et al, 1988).

La Morcille, rivière située au nord du département du Rhône, est concernée par cette pollution en cuivre, de par une activité viticole importante sur le bassin versant. En effet il existe un gradient d'implantation de vignes le long de la Morcille, allant de 7% en amont, jusqu'à 69% en aval, qui se traduit, entre autre, par une contamination graduelle en cuivre (Pesce et al 2008). Cette contamination engendre des impacts structuraux et fonctionnels sur les communautés microbiennes de la Morcille, entraînant une acquisition de tolérance au cuivre dans les zones les plus contaminées (Dorigo et al, 2010a). Des études ont également été réalisées afin de tester le potentiel de récupération des communautés microalgales périphytiques exposées au cuivre dans ce cours d'eau. Le principe général de ce type d'approche était de simuler une réduction de pression polluante par transfert du périphyton d'aval en amont, afin d'appréhender les changements structuraux et/ou fonctionnels en découlant. Les analyses qualitatives et quantitatives, réalisées au cours de ces suivis ont ainsi montré une récupération structurale et fonctionnelle progressive des communautés microbiennes transférées vers le site moins contaminé. Après plusieurs semaines, les communautés microbiennes transférées étaient ainsi caractérisées par des structures et des niveaux de tolérance au cuivre proches de celles des communautés autochtones (Dorigo et al 2010a; Dorigo et al 2010b; Morin et al 2010). Des travaux similaires réalisés le long de la Meuse, dans un contexte de pollution au zinc et au cadmium ont également permis d'obtenir des résultats comparables (Ivorra et al 1999). Toutefois, ces approches de transferts de communautés périphytiques impactées vers des zones non contaminées ne permettent pas de savoir si la présence des communautés autochtones influencent ou non les processus de récupération des biofilms microbiens issus de zones contaminées. En effet une des hypothèses envisageables, serait que la proximité de ces communautés faciliterait la récupération des communautés exposées préalablement au toxique via notamment le transfert d'espèces qui pourraient rapidement s'implanter et se développer au sein des biofilms déplacés. D'autre part, il est impossible dans ces études en milieux naturels, de dissocier l'influence de la réduction du niveau de contamination au cuivre dans le processus de récupération, des autres
facteurs pouvant fluctuer d'un site à l'autre (ex. réduction de la pression chimique due à d'autres toxiques, niveaux trophiques variables...).

L'objectif principal de notre étude est donc d'étudier plus finement le processus de récupération des communautés périphytiques après une exposition chronique au cuivre en appréhendant notamment l'influence des migrations d'espèces dans la dynamique de récupération des communautés. Pour répondre à cet objectif, nous avons réalisé un suivi dans des canaux artificiels de laboratoire permettant de reproduire différents contextes de contamination et de récupération (avec ou sans apport de communautés peu exposées).

Les communautés microbiennes ont été caractérisées à l'aide de plusieurs descripteurs complémentaires :

- Des descripteurs quantitatifs (mesures de biomasse et dosages de la chlorophylle a) ;

- Des descripteurs qualitatifs (analyse taxonomique des diatomées, analyses de la diversité bactérienne par biologie moléculaire : technique de fingerprint, PCR-ARISA) ;

- Des descripteurs fonctionnels (mesures d'activités photosynthétique, respiratoire et exo-enzymatiques).

Ces derniers descripteurs ont été utilisés également dans une approche de type PICT, afin de déterminer les capacités de tolérance acquises ou non par les diverses communautés aux cours des phases d'exposition au polluant, et de suivre l'évolution de ces capacités, lors de la phase de récupération.

# II. Matériel et méthodes

## 1. Protocole expérimental

### 1.1. Dispositif expérimental

L'ensemble de l'expérience a été réalisé dans cinq canaux de laboratoire en verre, composés de trois compartiments indépendants servant de triplicats (Lx1xh : 63x11x4 cm; Fig. 1). Chacun des compartiments a été alimenté en continu dans un circuit fermé, à l'aide de pompes submersibles (Rena Flow 600) immergées dans des réservoirs de 50 litres. L'éclairage, d'intensité constante (~ 170 µmol.m⁻².s⁻¹) a été assuré par des lampes HPS (Hight Pressure Sodium, 400W) selon une photopériode jour-nuit 13h-11h.
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

**Figure 1** : Photographie des cinq canaux de laboratoire lors de la période d'exposition au cuivre (les flèches illustrent la circulation de l'eau dans trois réplicats)

## 1.2. Calendrier expérimental

L'expérience a été réalisée durant 11 semaines (25 janvier - 13 avril) selon trois périodes successives distinctes (Fig. 2) : i) une étape de pré-colonisation faisant suite à l'inoculation du biofilm (1 semaine), ii) une période d'exposition au cuivre (4 semaines) et iii) une phase visant à appréhender les processus de récupération des communautés microbiennes suite à l'arrêt de l'exposition au cuivre (6 semaines).

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

**Figure 2** : Schématisation du calendrier expérimental ainsi que des différents temps de prélèvements pour les analyses du biofilm (t0 à t6).

### 1.2.1. Inoculation et pré-colonisation

Les biofilms utilisés lors de l'expérience ont été prélevés par grattage sur une vingtaine de cailloux de taille moyenne, récoltés sur un site de référence, peu contaminé au cuivre (concentrations généralement inférieures à 1 µg/L ; Montuelle *et al.*, 2010), localisé en amont
de la rivière Morcille (Beaujolais). La suspension de biofilm ainsi obtenue à été inoculée dans les canaux alimentés en eau de rivière (prélevée au site décrit précédemment) et contenant dans chacun de leurs compartiments 33 lames de verre (20 cm²) servant de substrats artificiels pour la colonisation des communautés microbiennes. Cette étape de pré-colonisation d'une durée d'une semaine a permis l'adhésion et le début de développement du biofilm sur ces lames.

### 1.2.2. Exposition au cuivre

Suite à la période de pré-colonisation, le biofilm a été exposé au cuivre pendant 4 semaines. Afin d'évaluer les effets de cette exposition, les canaux ont été séparés en deux catégories (Fig. 3):

- deux canaux « Témoin », alimentés par une eau de forage osmosée, caractérisée par une faible concentration en cuivre (<0,3 µg/L) et supplémentée en nutriments (Na₂S₄O₃, 9H₂O, 4 mg Si/L final ; NaNO₃, 5 mg NO₃/L final; K₂HPO₄, 0,05 mg PO₄/L final) afin de reproduire des conditions trophiques proches de celles mesurées au niveau du site d'échantillonnage initial ;

- trois canaux « Cuivre », alimentés par la même eau (eau de forage osmosée supplémentée en nutriments) et contaminés au cuivre (à partir d'une solution mère de CuSO₄·5H₂O) à la concentration nominale de 60 µg Cu²+/L.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3** : Représentation schématique de la répartition des canaux artificiels lors de la période d'exposition au cuivre.</figcaption></figure>

Durant cette période d'exposition, l'eau a été renouvelée chaque semaine afin d'éviter une carence nutritive des communautés et de maintenir un niveau de contamination au cuivre relativement constant.
### 1.2. 3. Récupération

La période de récupération des communautés microbiennes s'est étendue sur 6 semaines. L'objectif de notre étude étant d'évaluer la dynamique de récupération des biofilms suite à une diminution de l'exposition au cuivre, en appréhendant particulièrement l'influence des migrations d'espèces dans la trajectoire des communautés, les canaux ont été répartis suivant quatre contextes (Fig. 4) :

- un canal « Témoin », identique à ceux décrits précédemment,

- deux canaux « Ex-Cu 1 », contenant pour moitié des lames issues du deuxième canal « Témoin » (communautés non contaminées au cuivre, placées en amont du canal et qui n'ont pas été considérée pour les analyses microbiennes) et des lames issues du canal « Cu » (communautés impactées) afin de favoriser la migration d'espèces entre les deux types de communautés,

- un canal « Ex-Cu 2 », contenant exclusivement des lames issues du canal « Cu » (communautés impactées),

- un canal « Cu », identique à ceux décrits précédemment.

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

**Figure 4** : Représentation schématique des différents canaux durant la période de récupération des communautés microbiennes.

L'ensemble des canaux a été alimenté par l'eau osmosée supplémentée en nutriments, et seul le canal « Cuivre » a été contaminé au cuivre, selon le protocole décrit précédemment. Durant la période de récupération, l'eau a été renouvelée toutes les deux semaines avec un ajout de nutriments hebdomadaire.
## 2. Caractérisation du contexte physico-chimique

### 2.1. Paramètres majeurs

L'ensemble des analyses physico-chimiques de l'eau a été réalisé avant et 2 h après chaque changement d'eau durant les phases d'exposition et de récupération. La température, la teneur en oxygène dissous, la conductivité et le pH ont été respectivement mesurés à l'aide d'un oxymètre (Oxi 323-B/Set, WTW), d'un conductimètre (Cond 3210/Set2, WTW) et d'un pHmètre (3210 electrode sentix 41-3, WTW).

Les concentrations en ammonium ($NH_4^+$), nitrite ($NO_2^-$), nitrate ($NO_3^-$), orthophosphates ($PO_4^{3-}$), silice ($SiO_2$) et en carbone organique total (COT) et dissous (COD) ont été mesurées selon la norme AFNOR (1999) à partir d'échantillons d'eau (850 mL) prélevés dans les réservoirs servant à alimenter les canaux. Ces analyses ont été réalisées par le Laboratoire d'Analyse physicochimiques des Milieux Aquatiques (LAMA) du Cemagref de Lyon, qui est accrédité par le Comité Français d'Accréditation (COFRAC).

### 2.2. Cuivre

L'analyse du cuivre (Cu) a été effectuée dans l'eau des différents réservoirs durant les périodes d'exposition et de récupération et dans le biofilm durant la phase de récupération uniquement.

Pour le dosage des concentrations totales en Cu dissous, réalisé avant et 2 h après chaque changement d'eau, 30 mL d'eau ont été filtrés à l'aide de seringues et de filtres (45 µm Whatman) préalablement nettoyés à l'acide nitrique ($HNO_3$) 0,5% (v/v) suprapur ainsi qu'à l'eau ultra-pure. Ces échantillons ont ensuite été acidifiés avec de l'acide nitrique 5% et conservés à 4°C jusqu'à analyse.

Afin d'analyser le contenu en cuivre dans le biofilm, 6 lames par canal (2 lames par triplicat) ont été grattées pour chacun des temps de prélèvements, avant le changement d'eau. Ces suspensions de biofilm ont été reprises dans 50 mL d'eau ultra-pure (Milli-Q) et 20 mL ont été répartis dans des tubes de 50 mL l'un contenant 320 µL d'EDTA (0.25M) pour mesurer la teneur en cuivre internalisé dans le biofilm, et l'autre ne contenant pas d'EDTA pour mesurer la teneur en cuivre total. Après 10 minutes d'incubation (afin de laisser agir l'EDTA), les échantillons ont été filtrés à l'aide d'un système en polycarbonate contenant un support avec filtre en polypropylène (0.45 µm) et relié à une pompe à vide. Les filtres ont été récupérés et séchés au four à 50°C pendant 48 h, pesés après dessiccation, puis conservés à l'obscurité à température ambiante jusqu'à analyse.
Pour l'ensemble des échantillons (fraction dissoute et biofilms), les dosages du cuivre ont été réalisés par le laboratoire LAMA par spectrométrie de masse associée à un plasma à couplage inductif (ICP-MS Série II, THERMO ELECTRON).

# 3. Caractérisation des biofilms microbiens

## 3.1. <u>Echantillonnage</u>

Les analyses microbiennes ont été effectuées sur des suspensions de biofilm obtenues en prélevant à chaque temps d'échantillonnage 5 lames dans chacun des réplicats. Après avoir été décollé à l'aide d'une lame de rasoir, le biofilm a été repris dans 33 mL d'eau minérale (Volvic), homogénéisé puis réparti (et dilué si besoin) pour les différentes analyses.

## 3.2. <u>Evolution de la structure du biofilm</u>

### 3.2.1. <u>Biomasse</u>

La biomasse totale et la biomasse organique ont été respectivement estimées par mesure du poids sec et de la matière sèche sans cendre (MSSC), rapportés à la surface des lames grattées. Le poids sec a été déterminé après séchage des échantillons à 70-90° C (étuve) pendant 24 h. Ensuite, la totalité de la matière organique a été brûlée à 500°C (four) durant 1 h afin d'obtenir la MSSC en soustrayant le poids des cendres au poids sec obtenu précédemment.

### 3.2.2. <u>Chlorophylle a et structure de la communauté algale</u>

La quantité de chlorophylle a (chl a), évaluée à partir d'une mesure de fluorescence chlorophyllienne, et la répartition des principales classes algales (diatomées, algues vertes et cyanobactéries) ont été estimées à l'aide un fluorimètre à modulation d'amplitude et de fréquence (Phyto-PAM, Heinz Walz) présentant 4 longueurs d'ondes d'excitation (470 nm, 520 nm, 645 nm, 665 nm).

## 3.3. <u>Evolution de la diversité microbienne</u>

### 3.3.1. <u>Communauté diatomique</u>

L'évolution de la communauté diatomique, fortement représentée dans les biofilms de rivière, a été caractérisée à partir d'une analyse taxonomique par microscopie réalisée par Soizic Morin (Cemagref Bordeaux, UR REBX). Pour chaque réplicat, 4,5 mL de suspension ont été fixés au formol (4% final) puis conservés à 4°C jusqu'à analyse. L'identification au niveau
spécifique des diatomées est basée sur les caractéristiques morphologiques et les
ornementations de leur coquille siliceuse (appelée frustule). La préparation des échantillons
consiste en i) un prétraitement des suspensions de biofilm à l'eau oxygénée à chaud, afin d'en
détruire le contenu organique, ii) plusieurs cycles de rinçage de l'échantillon, par
centrifugation, récupération du culot et resuspension dans de l'eau distillée, et iii) le montage
de l'échantillon nettoyé entre lame et lamelle, dans une résine réfringente (Naphrax®, Brunel
Microscopes Ltd UK). L'identification a été réalisée à partir des flores diatomiques d'Europe
Centrale (notamment Krammer et Lange-Bertalot, 1986-1991, et Hofmann et al., 2011).

L'évolution des communautés dans les différents canaux a été caractérisée à l'aide d'une
analyse en composante principale (ACP), réalisée avec le logiciel R (version 2.11.0) en
considérant uniquement les espèces présentant une abondance relative supérieure à 1%, afin
de s'affranchir des biais liés à la présence aléatoire d'espèces rares lors des comptages
(environ 400 cellules dénombrées pour chaque échantillon, conformément à la norme NF
T90-354).

3.3.2. <u>Communauté bactérienne</u>

L'évolution de la communauté bactérienne a été étudiée à l'aide d'une méthode moléculaire de fingerprint: la PCR-ARISA (Polymerase Chain Reaction - Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis).

3.3.2.1. *Extraction de l'ADN et amplification de la région intergénique 16S-23S*

Deux millilitres de suspension de biofilm ont été centrifugés (30 min, 14000g) et le culot a été conservé à -20°C, jusqu'à extraction. L'extraction d'ADN a été réalisée en utilisant le kit Fast DNA Spin (MPBiomedicals) par lyse mécanique et passages successifs de différents tampons dans une colonne d'élution, suivant les instructions du fabricant. La région intergénique localisée entre la petite (16S) et la grande (23S) sous unité du gène rDNA a été amplifiée avec les amorces S-D-Bact-1522-b-S-20 (16S) et L-D-Bact-132-a-A-18 (23S) d'après le protocole de Ranjard *et al* (2001), légèrement modifié.

Le mélange réactionnel utilisé (25 µl final) contenait 2,5 µl de tampon 10X (GE Healthcare), 0,75 mM de MgCl2, 7,5 µg de Bovine Serum Albumine, 200 µM de chaque dNTP, 0,2 µM de chaque amorce, 12,5 unités de Taq polymérase (illustraTM rTaq DNA Polymerase, GE Healthcare) et 2 µl d'ADN.
Les amplifications ont été réalisées dans un thermocycler T-Personal48 (Biometra) suivant le programme suivant : une étape de dénaturation initiale (94°C/5 min) suivie de 30 cycles comprenant une étape de dénaturation (94°C/1min), une étape d'hybridation (55°C/1 min) et une étape d'élongation (72°C/1 min 30 s), et enfin une étape d'élongation finale (72°C/10 min).

Afin de vérifier l'amplification, les produits PCR obtenus ont été déposés sur gel d'agarose 2%, coloré au BET et dosés à l'aide du kit Quant-iT dsDNA BR utilisé avec le fluorimètre Qubit™ (Invitrogen) selon les instructions du fabricant.

### 3.3.2.2. Analyse ARISA des communautés bactériennes

Les analyses ARISA ont été effectuées avec le système Bioanalyzer 2100 (Agilent) à partir du kit DNA 1000. Cette analyse repose sur une électrophorèse capillaire automatisée, utilisant comme support une puce caractérisée par un réseau microfluidique dans lequel circule un gel matriciel et un marqueur fluorescent.

L'appareil mesure en temps réel l'intensité de fluorescence émise en fonction du temps de rétention des ADN au sein du microréseau. Les résultats peuvent être visualisés sous la forme d'électrophorégrammes ou de gels reconstitués numériquement par le programme Agilent 2100 Expert (Fig. 5). L'analyse a été effectuée à partir des gels reconstitués et les profils de bandes ainsi obtenus ont été analysés avec le logiciel GelCompar II (Applied Maths) afin d'obtenir une matrice basée sur l'intensité relative des différentes bandes présentes. Cette matrice a été utilisée afin de comparer les différents échantillons à l'aide d'une analyse en composante principale (ACP) réalisée avec le logiciel R (version 2.11.0).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5a</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 5b</figcaption></figure>

**Figure 5** : Exemple d'un profil électrophorétique (a) et d'un gel reconstitué numériquement (b) après analyse ARISA, avec le système Bioanalyzer 2100 (Agilent).
### 3.4. Evolution des activités microbiennes :

#### 3.4.1. Activité photosynthétique :

L'efficacité photosynthétique, basée sur la mesure du rendement photosynthétique, reflète l'état physiologique des communautés phototrophes. Cette mesure a été effectuée sur les différentes suspensions de biofilm soumises à un pulse de lumière émise à 665 nm en utilisant le fluorimètre PhytoPam.

#### 3.4.2. Activité respiratoire :

Le MicroResp™ est une technique respirométrique basée sur l'analyse de la respiration induite par un substrat (SIR : Substrate Induced Respiration) (Tlili *et al.*, 2011). C'est une méthode colorimétrique traduisant une respiration des communautés hétérotrophes, entraînant un dégagement de CO2 qui acidifie le milieu, provoquant alors un virage de l'indicateur de pH coloré, virage détecté par spectrophotométrie. La quantité de CO2 produite par les communautés hétérotrophes est calculée d'après une courbe d'étalonnage exprimant l'absorbance en fonction de la quantité de CO2 mesurée par chromatographie à gaz.

Le système consiste en deux microplaques (96 puits) placées face à face. L'une des microplaques contient 510 µL de suspension, 60 µL d'eau et 30 µL d'une solution de glucose à 120mg/ml. Après incubation de cette microplaque 4 h sous agitation à 20°C, celle-ci a été scellée à l'autre microplaque contenant un gel de détection avec l'indicateur de pH. Après incubation de l'assemblage à l'obscurité et à température ambiante durant 15 h, la quantité de CO2 piégée a été estimée après mesure à 590 nm dans un lecteur de microplaques (Biotek Synergy HT).

#### 3.4.3. Activités exo-enzymatiques :

Le principe de cette mesure est basé sur l'utilisation d'un ensemble non fluorescent composé d'un fluorogène associé à une molécule analogue au substrat de l'enzyme étudiée (substrat analogue). L'hydrolyse enzymatique casse la liaison de cet ensemble, libérant ainsi le fluorogène qui devient fluorescent. Les activités enzymatiques peuvent être ainsi quantifiées par augmentation de la fluorescence (une mole de fluorogène pour une mole de substrat libéré). Les ensembles substrats-fluorogènes pour les deux activités enzymatiques étudiées sont :

- Le 4-méthylumbelliféryl-β-D-glucopyranoside (MUF-Glu) pour la β-glucosidase

- Le L-Leucine-7-amino-4-méthylcoumarin hydrochloride (MCA-Leu) pour la leucine-aminopeptidase
Les fluorogènes libérés lors de l'hydrolyse enzymatique sont :

- Le 4-méthylumbelliferone (MUF) pour la β-glucosidase

- Le 7-amino-4-méthylcoumarin (MCA) pour la leucine-aminopeptidase.

Afin de mesurer la fluorescence dans les échantillons, 0,7 mL de suspension et 0,3 mL d'eau ont été incubés pendant 4h à température ambiante, sous agitation, à l'obscurité. Après ajout de 2 mL de substrat-fluorogène (concentration saturante de substrat analogue déterminée au préalable pour chacune des activités), les échantillons ont été incubés à température ambiante durant 1h15 à l'obscurité. Afin d'arrêter la réaction et d'optimiser la fluorescence, 300 µL de tampon glycine ont ensuite été ajoutés (Glycine 0,05M+ NH<sub>4</sub><sup>+</sup>OH 0,2M; pH 10,4). Les échantillons ont alors été centrifugés 8 min à 20°C à 5292g puis déposés sur microplaque à 96 puits (300 µL par puit). La fluorescence émise par chacun des deux fluorogènes a été mesurée par un lecteur de microplaque (Biotek Synergy HT) (longueur d'onde : excitation : 360 nm ± 40 nm ; émission : 460 nm ± 40 nm). Les quantités de fluorogènes (MUF et MCA) ont été calculées grâce à des gammes étalon de fluorogènes réalisées au préalable, (MCA et MUF ; solution mère de 10 mM) allant de 0,0625 µM à 200 µM, permettant d'obtenir une relation entre unité de fluorescence et quantité de fluorogène libérée.

### 3.5. Evolution de la tolérance au cuivre :

Dans le cadre d'une approche PICT, l'analyse d'une courbe dose-réponse, après une exposition court-terme, permet de représenter le niveau d'une activité biologique donnée, en fonction du niveau d'exposition au cuivre et de déterminer la valeur de la CE<sub>50</sub> (concentration efficace d'un polluant qui cause une inhibition de 50% de l'activité testée). Les fonctions microbiennes utilisées pour l'approche PICT sont celles décrites ci-dessus. (cf. 3.4). Pour obtenir cette courbe dose-réponse, une gamme semi-logarithmique de concentrations croissantes de cuivre a été réalisée à partir d'une solution mère de CuSO<sub>4</sub>5H<sub>2</sub>O (249,6 g/L), afin d'obtenir des concentrations finales comprises entre 0 et 30,48 mg Cu/L pour l'activité photosynthétique (rendement photosynthétique et fluorescence chlorophyllienne), 0 et 127 mg Cu/L pour l'activité respiratoire (SIR) et, 0 et 40,6 mg Cu/L pour les activités exoenzymatiques.

Les protocoles utilisés pour les tests de toxicité réalisés avec la SIR et les activités exoenzymatiques sont identiques à ceux décrits précédemment, l'eau étant remplacée par les différentes concentrations de cuivre.
Concernant les activités photosynthétiques (rendement photosynthétique et fluorescence chlorophyllienne), un mélange de 0,75 mL de suspension et 0,3 mL des différentes concentrations de cuivre ont été incubés dans une étuve sous lampe à rayons ultraviolets à 23°C pendant 2h30, puis 30 min à l'obscurité à température ambiante avant d'effectuer les mesures à l'aide du Phyto-PAM.

Pour chacun des triplicats et pour chaque test de toxicité, il a été réalisé quatre réplicats analytiques pour la concentration C0 (eau ultra-pure uniquement, afin de déterminer le niveau d'activité optimale des communautés) et deux réplicats analytiques pour les différentes concentrations en cuivre testées. Les différentes valeurs de CE50 ont été déterminées à l'aide du logiciel RegTox (E. Vindimian, http://eric.vindimian.9online.fr), au moyen de courbes « doses-réponse » obtenues après modélisation des paramètres observés (modèle de Hill). Pour les activités phototrophes (rendement photosynthétique et fluorescence chlorophyllienne) et les activités hétérotrophes (SIR et activités exo-enzymatiques), les CE50 obtenues ont été respectivement divisées par les quantités de chlorophylle a (Soldo et Behra., 2000) et de MSSC (Fechner et al., 2010) mesurées pour chaque échantillon, afin de normaliser les résultats en fonction de la biomasse.

# 4. Traitements statistiques

Les résultats obtenus dans les différents canaux ont été comparés au moyen d'une analyse de la variance à mesures répétées (ANOVA) suivi du test post-hoc HSD (Honest Significant Differences) de Tukey, à l'aide du logiciel xlstat (version 2009.4.02, http://www.xlstat.com). Au préalable les données ont subi une transformation logarithmique afin de répondre à l'hypothèse de normalité et d'homogénéité des variances. Le seuil de significativité pour les différents tests statistiques a été fixé à 5%.

# III. Résultats :

## 1. Analyses physico-chimiques

### 1.1. Paramètres majeurs

L'évolution moyenne des conditions physico-chimiques entre les différents changements d'eau réalisés durant la période de récupération est présentée dans le tableau 1. Les concentrations nutritives mesurées après chaque changement d'eau sont proches des valeurs théoriques souhaitées suite à l'ajout des nutriments (voir 1.2.2).
La plupart des paramètres mesurés sont relativement stables aux cours du suivi, sauf les concentrations en carbone organique (COD et COT) qui augmentent fortement dans tous les canaux entre chaque changement d'eau. Les seules différences statistiques (p<0,05) entre les canaux avant les changements d'eau, sont observées au niveau des concentrations en silice, qui sont très nettement inférieures dans les témoins.

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="1">Conditions initiales<br>(après changement d'eau)</th><th colspan="4">Conditions après 2 semaines<br>(avant changement d'eau)</th></tr><tr><th>Ensemble des canaux</th><th>Témoin</th><th>Ex-Cuivre 1</th><th>Ex-Cuivre 2</th><th>Cuivre</th></tr></thead><tbody><tr><td>pH</td><td>7,93 ± 0,07</td><td>8,04 ± 0,20</td><td>8,06 ± 0,19</td><td>8,01 ± 0,21</td><td>7,99 ± 0,20</td></tr><tr><td>Conductivité (µS/cm)</td><td>129,40 ± 16,34</td><td>121,57 ± 22,82</td><td>114,70 ± 19,30</td><td>116,43 ± 18,65</td><td>117,47 ± 20,93</td></tr><tr><td>Oxygène (mg/L)</td><td>8,63 ± 0,49</td><td>7,15 ± 2,05</td><td>7,28 ± 2,06</td><td>7,73 ± 2,47</td><td>7,00 ± 2,71</td></tr><tr><td>Température (°C)</td><td>20,84 ± 0,46</td><td>21,30 ± 1,06</td><td>22,03 ± 1,02</td><td>21,60 ± 1,06</td><td>21,43 ± 1,02</td></tr><tr><td>COT (mg/L)</td><td>1,94 ± 0,45</td><td>7,83 ± 2,92</td><td>9,57 ± 3,68</td><td>8,17 ± 2,65</td><td>8,15 ± 2,55</td></tr><tr><td>COD (mg/L)</td><td>1,06 ± 0,36</td><td>6,42 ± 1,05</td><td>7,52 ± 4,29</td><td>5,48 ± 3,88</td><td>3,87 ± 1,98</td></tr><tr><td>NH<sub>4</sub><sup>+</sup> (mg/L)</td><td>&lt;0,02</td><td>0,01 ± 0,01</td><td>0,01 ± 0,01</td><td>0,02 ± 0,02</td><td>0,02 ± 0,01</td></tr><tr><td>NO<sub>2</sub><sup>-</sup> (mg/L)</td><td>0,04 ± 0,01</td><td>0,02 ± 0,01</td><td>0,02 ± 0,02</td><td>0,04 ± 0,02</td><td>0,05 ± 0,03</td></tr><tr><td>NO<sub>3</sub><sup>-</sup> (mg/L)</td><td>4,06 ± 0,48</td><td>&lt;1</td><td>&lt;1</td><td>&lt;1</td><td>&lt;1</td></tr><tr><td>PO<sub>4</sub><sup>3-</sup> (mg/L)</td><td>0,04 ± 0,02</td><td>0,08 ± 0,05</td><td>0,10 ± 0,02</td><td>0,10 ± 0,03</td><td>0,07 ± 0,01</td></tr><tr><td>SiO<sub>2</sub> (mg/L)</td><td>4,22 ± 1,19</td><td>1,27 ± 1,25</td><td>5,03 ± 0,85</td><td>9,50 ± 0,56</td><td>10,30 ± 1,21</td></tr></tbody></table>

Tableau 1 : Valeurs moyennes (± écarts-types) des différents paramètres physico-chimiques mesurés dans les canaux de laboratoire avant et après chaque changement d'eau durant la période de récupération.

## 1.2. Cuivre

L'évolution moyenne des concentrations en cuivre dissous dans les différents canaux est présentée dans le tableau 2. Dans les canaux contaminés au cuivre, les biofilms ont été exposés chroniquement à des concentrations effectives comprises entre 14 et 25 µg/L, alors que celles-ci sont restées inférieures à 3 µg/L dans les canaux « témoins ». La comparaison des concentrations mesurées après et avant chaque changement d'eau permet de mettre en évidence une diminution des concentrations dans l'eau dans les canaux contaminés alors que ces concentrations augmentent légèrement dans les témoins. Cette augmentation est encore plus marquée durant la période de récupération au sein des canaux « Ex-Cu 1 » et « Ex-Cu 2 », puisque les concentrations sont multipliées par 5 environ au cours des deux semaines séparant chaque changement d'eau.
<table><thead><tr><th></th><th>Témoin</th><th>Ex-Cuivre 1</th><th>Ex-Cuivre 2</th><th>Cuivre</th></tr></thead><tbody><tr><td>Conditions initiales<br>(après changement d'eau)</td><td>0,60 ± 0,36</td><td>1,11 ± 0,18</td><td>1,63 ± 0,11</td><td>20,48 ± 4,00</td></tr><tr><td>Conditions après 2 semaines<br>(avant changement d'eau)</td><td>2,53 ± 0,27</td><td>5,67 ± 1,25</td><td>8,26 ± 0,59</td><td>15,50 ± 1,61</td></tr></tbody></table>

**Tableau 2:** Valeurs moyennes (± écarts-types) de la quantité de cuivre dissous mesurée dans les canaux de laboratoire avant et après chaque changement d'eau (période d'exposition et de récupération confondues).

Concernant les concentrations en cuivre dans le biofilm, seuls les échantillons prélevés à la fin de la période d'exposition (t0) ont pu être analysés pour l'instant (Fig. 6). Après 4 semaines d'exposition, les biofilms prélevés dans les canaux « Cu » présentent des teneurs en cuivre (~1,3 mg/g poids sec) 30 fois supérieures à celles mesurées sur les biofilms « témoins » (~45 µg/g poids sec). La répartition entre les fractions internalisées et externalisées est également différente suivant les canaux puisque le cuivre se retrouve majoritairement dans la fraction internalisée (~80%) dans les « Témoins » et dans la fraction externalisée (~75%) dans les canaux contaminés.

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**Figure 6 :** Concentrations moyennes (µg/g poids sec) en cuivre internalisé et externalisé dans les biofilms « Témoins » (T) et « Cuivre » (Cu) à la fin de la période d'exposition (t0).

## 2. Caractérisation des biofilms microbiens

### 2.1. Evolution de la structure du biofilm

#### 2.1.1. Biomasse

Sur l'ensemble du suivi, la biomasse organique (MSSC) représente en moyenne 84% (± 10%) du poids sec total. La MSSC (Fig. 7) et le poids sec (non présenté) suivent la même tendance, avec, dans les canaux « Témoin » des valeurs significativement supérieures à celles mesurées dans les canaux « Cu » durant toute l'expérience. En fin de suivi, aucune différence significative n'est observée pour ces deux paramètres entre les biofilms « Ex-Cu 1 », « Ex-Cu 2 » et « Cu ».
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Figure 7:** Evolution moyenne (± écarts-types) des concentrations (mg/cm²) de la matière sèche sans cendre (MSSC) dans les différents canaux.

### 2.1.2. Chlorophylle *a* et structure de la communauté algale

Dans les canaux « Témoins » et « Cu », la biomasse algale estimée à partir de la concentration en chl *a* suit une tendance similaire à la biomasse organique totale, avec sur l'ensemble du suivi, des valeurs deux à trois fois inférieures dans les canaux contaminés (Fig. 8). Après quatre semaines de récupération (t4), une augmentation de la biomasse algale est observée au sein des communautés « Ex-Cu 1 ». Ainsi, en fin de suivi, les concentrations en chl *a* mesurées dans les canaux « Ex-Cu1 » sont similaires à celles des canaux « Témoins » alors que celles mesurées dans les canaux « Ex-Cu2 » sont similaires à celles des canaux « Cu ».

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Figure 8:** Evolution moyenne (± écarts-types) de la biomasse algale estimée par la concentration en chlorophylle *a* (µg/cm²) dans les différents canaux.
La structure des communautés algales montre aussi des différences très nettes entre les canaux « Témoin » et « Cu » (Fig. 9). En effet, sur l'ensemble du suivi, la proportion des diatomées au sein des biofilms « Témoin » représente 88 % (± 2 %) de la communauté algale, composée uniquement de diatomées et de cyanobactéries, alors que les biofilms exposés au cuivre sont caractérisés par un fort pourcentage d'algues vertes, qui représentent 53 % (±4 %) de la communauté. Au cours du suivi, on observe une évolution progressive de la structure de la communauté « Ex-Cu 1 » qui se retrouve très comparable à celle de la communauté « Témoin » à partir de 4 semaines (t4). A l'opposé, la communauté « Ex-Cu 2 » reste relativement stable et présente encore une forte proportion d'algues vertes (~40%) en fin d'expérience, malgré une légère augmentation de la proportion de diatomées (~45%) par rapport à celle observée dans les canaux « Cu » (~35%).

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 9** : Evolution de la proportion des différents types d'algues (cyanobactéries, algues vertes et diatomées) dans les différents canaux.</figcaption></figure>

## 2.2. Evolution de la diversité microbienne

### 2.2.1. La communauté diatomique

Compte tenu des contraintes temporelles, l'analyse taxonomique des communautés diatomiques prélevées lors du dernier temps d'échantillonnage (t6) n'a pas pu être réalisée à ce jour. L'évolution des communautés diatomiques au cours des quatre premières semaines a
été étudiée à l'aide d'une ACP. Les deux axes choisis expliquent 44,1% de la variabilité entre les différents échantillons (Fig. 10). L'ACP montre une séparation très nette entre les communautés « Témoin » et « Cu » durant tout le suivi. On observe, suivant l'axe 2, une forte évolution de la communauté « Cu » au cours des deux premières semaines, alors que les communautés « Témoin » restent relativement stables durant les quatre semaines. Dès la deuxième semaine de récupération (t2), les communautés diatomiques « Ex-Cu1 » se rapprochent des communautés « Témoin » alors que les communautés « Ex-Cu2 » restent proches des communautés « Cu » durant tout le suivi.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 10** : Analyse en composantes principales (ACP) de l'évolution de la diversité des communautés diatomiques selon deux axes principaux.</figcaption></figure>

### 2.2.2. La communauté bactérienne

L'évolution de la diversité des communautés bactériennes dans les différents canaux a été étudiée à l'aide d'une ACP des profils génétiques obtenus par ARISA. Les deux axes représentés sur la figure 11, expliquent 31% de la variabilité entre les différents échantillons. L'ACP montre une première séparation des communautés « Témoin » et des communautés « Cu », selon l'axe 2. On observe également suivant l'axe 1 une forte évolution temporelle des communautés « Témoin » au cours du suivi alors que les communautés exposées au cuivre restent relativement stables tout au long de l'expérience. Les communautés « Ex-Cu1 » et « Ex-Cu2 » suivent une évolution temporelle comparable à celle observée dans les témoins (suivant l'axe 1), mais restent cependant proches des communautés « Cu » suivant l'axe 2.
<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**Figure 11** : Analyse en composantes principales (ACP) de l'évolution de la diversité des communautés bactériennes selon deux axes principaux.

## 2.3. Evolution des activités microbiennes :

### 2.3.1. Activité photosynthétique :

L'activité photosynthétique, évaluée à partir du rendement photosynthétique, est relativement stable sur l'ensemble du suivi dans les canaux « Témoin », sans différence significative avec les canaux « Cu » durant les deux premières semaines (Fig. 12). Une diminution de cette activité est observée au sein de la communauté exposée au cuivre à partir de 4 semaines, engendrant une différence significative par rapport à la communauté Témoin en fin de suivi. Durant toute l'expérience, les communautés « Ex-Cu 1 » présentent un niveau d'activité similaire à celui mesuré dans les canaux « Témoin » alors qu'une diminution comparable à celle enregistrée dans les canaux « Cu » est observée au sein des communautés « Ex-Cu 2 ».
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 12:** Evolution moyenne (± écarts-types) du rendement photosynthétique (unité relative) dans les différents canaux.</figcaption></figure>

### 2.3.2. Activité respiratoire :

Les niveaux d'activité respiratoire, mesurés à l'aide de la technique MicroResp, présentent une forte variation temporelle sur l'ensemble du suivi et ne permettent pas de mettre en évidence une tendance marquée lors de la comparaison entre les différents canaux (Fig. 13).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 13:** Evolution moyenne (± écarts-types) de la respiration hétérotrophe estimée par la mesure de la quantité de dioxyde de carbone (µg CO₂/h/mg MSSC) dans les différents canaux.</figcaption></figure>
### 2.3.3. Activités exo-enzymatiques :

L'activité enzymatique de la β-glucosidase se caractérise par des différences significatives entre les communautés « Témoin » et « Cu », les niveaux d'activités mesurés étant 4 à 9 fois plus faibles en présence de cuivre durant tout le suivi (Fig. 14a). Une augmentation de cette activité est observée au sein des communautés « Ex-Cu » tout au long de l'expérience, les communautés « Ex-Cu 1 » et « Ex-Cu 2 » ne présentant plus de différence significative avec les communautés « Témoin » après respectivement 4 et 6 semaines de récupération. En ce qui concerne l'activité de la leucine-aminopeptidase (LAP), aucune différence significative entre les communautés « Témoin » et « Cu » n'est observée en début d'expérience (Fig. 14b). Une légère augmentation est enregistrée en présence de cuivre après 2 semaines, l'analyse statistique ne faisant apparaître des différences significatives qu'à t2 et t4. Les communautés « Ex-Cu » présentent des niveaux d'activité LAP comparables à ceux mesurés dans les témoins durant tout le suivi, sauf après 6 semaines, où le niveau d'activité mesuré dans les canaux « Ex-Cu2 » est significativement supérieur à celui des témoins (sans différence significative avec les autres canaux).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 14** : Evolution moyenne (± écarts-types) de la l'activité β-glucosidase (a) et leucine-aminopeptidase (b) dans les différents canaux.</figcaption></figure>

### 2.4. Evolution de la tolérance au cuivre :

Afin de suivre l'évolution de la tolérance au cuivre des communautés phototrophes et hétérotrophes durant cette expérience, différentes fonctions microbiennes ont été testées, à savoir la fluorescence chlorophyllienne, le rendement photosynthétique, la respiration et les activités enzymatiques de la β-glucosidase et de la leucine-aminopeptidase.

Etant donné l'absence d'effets à court-terme du cuivre (selon le protocole utilisé) sur l'activité β-glucosidase, il n'a pas été possible d'établir de courbes dose-réponse à partir de ce paramètre. Les tests de toxicité basés sur les autres fonctions microbiennes ont permis de
déterminer des CE<sub>50</sub> pour chacun des échantillons testés, mais compte tenu des grandes variabilités observées entre les différents triplicats pour le rendement photosynthétique et la respiration, seuls les résultats obtenus avec la fluorescence chlorophyllienne et l'activité enzymatique LAP sont présentés ci-dessous.

Au niveau de la fluorescence chlorophyllienne (Fig. 15), les communautés « Témoin » et « Cu » se distinguent durant tout le suivi par leur niveau de tolérance au cuivre, celui-ci étant environ 3 fois plus important pour les communautés exposées à ce toxique (CE<sub>50</sub>= 0,34 ± 0,05 mg/L vs 0,12 ± 0,07 mg/L pour les témoins). Durant toute l'expérience, les communautés « Ex-Cu 2 » présentent un niveau de tolérance identique à celui des communautés « Cu », alors qu'une diminution significative des CE<sub>50</sub> est observée au cours du temps pour les communautés « Ex-Cu1 ». A la fin de l'expérience, deux groupes se distinguent ainsi fortement à savoir d'un coté, les communautés « Témoin » et « Ex-Cu1 » (CE<sub>50</sub> proches de 0,09 mg/L) et de l'autre, les communautés « Ex-Cu2 » et « Cu », qui présentent des niveaux de tolérance 4 fois plus élevés (CE<sub>50</sub> proches de 0,35 mg/L).

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

**Figure 15** : Evolution de la tolérance au cuivre des communautés phototrophes dans les différents canaux, exprimée à partir des CE<sub>50</sub> (mg/L après normalisation par la quantité de chlorophylle) obtenues à partir des mesures de la fluorescence chlorophyllienne.

Concernant l'activité enzymatique LAP (Fig. 16), la CE<sub>50</sub> mesurée à la fin de la période d'exposition au cuivre (t0), est significativement supérieure pour les communautés « Cu » (2,11 ± 0,55 mg/L) par rapport aux communautés « Témoin » (0,88 ± 0,18 mg/L). Toutefois, les niveaux de tolérance mesurés durant le reste du suivi sont fortement variables, et ne font pas apparaître de différence significative entre les canaux, du fait notamment de l'importance des écarts-types observés entre les différents triplicats.
<figure><img src="image_18.png" /></figure>

**Figure 16** : Evolution de la tolérance au cuivre des communautés hétérotrophes dans les différents canaux, exprimée à partir des $CE_{50}$ (mg/L après normalisation par la MSSC) obtenues à partir des mesures de l'activité enzymatique de la leucine-aminopeptidase.

# IV. **Discussion** :

## 1. **Effets du cuivre** :

Afin d'étudier l'effet du cuivre sur les communautés microbiennes, celles-ci ont été exposées au contaminant durant une période totale de 10 semaines (4 semaines durant la phase « d'exposition » + 6 semaines durant la phase de « récupération »), à des concentrations effectives comprises entre 14 et 25 µg/L de cuivre dissous. La diminution des concentrations en cuivre dissous dans les canaux contaminés entre chaque changement d'eau semble traduire un fort piégeage du toxique sur les biofilms durant toute l'expérience comme cela a été observé à la fin de la phase d'exposition à partir du dosage des fractions internalisées et externalisées. Cette hypothèse pourra être testée suite à l'analyse des concentrations en cuivre dans les biofilms prélevés durant toute la période de récupération (analyses en cours). Plusieurs travaux ont mis en évidence un fort piégeage du cuivre dans des biofilms exposés chroniquement (Dorigo et al., 2010 ; Tlili et al. 2010), soulignant l'importance des quantités internalisées pour expliquer l'impact du toxique sur les communautés.

L'exposition chronique a engendré un impact négatif important sur la biomasse totale des biofilms (poids sec et MSSC), traduisant une forte inhibition du développement des communautés microbiennes. Cet impact quantitatif est notamment observé au niveau des communautés phototrophes comme le montre l'évolution de la biomasse algale tout au long de l'expérience. Les effets du cuivre sur la biomasse organique ainsi que sur la biomasse algale ont aussi été montrés par Barranguet et al. (2002).
D'un point de vue fonctionnel, l'activité photosynthétique subit également les effets du toxique car malgré une activité maintenue en début de suivi, celle-ci diminue après 8 semaines d'exposition, traduisant ainsi un effet à plus long terme. L'absence d'effet du cuivre sur l'activité photosynthétique de biofilms après 6 semaines d'exposition a déjà été soulignée par Serra *et al.* (2009). D'après ces auteurs, ce maintien témoigne d'une acclimatation des communautés phototrophes, qui engendre un coût important entraînant une perte de biomasse. Au sein de la communauté algale, les diatomées semblent être les plus touchées, l'ajout de cuivre entraînant une forte diminution de leur proportion relative. La silice étant le constituant majeur des frustules des diatomées, l'impact observé sur la communauté diatomique peut être relié à l'évolution de la quantité de ce composé dans les canaux. En effet, alors qu'une forte consommation de silice est notée dans les canaux non contaminés durant tout le suivi, on observe, entre chaque changement d'eau dans les canaux contaminés, une augmentation des teneurs en silice pouvant traduire un relargage de ce composé après la mort de diatomées. L'analyse taxonomique diatomique révèle que le cuivre présente aussi un impact qualitatif marqué sur cette communauté, en terme de structure et de diversité. En parallèle, l'augmentation de la proportion des algues vertes en présence de cuivre suggère une tolérance importante de cette communauté à ce toxique, alors que les cyanobactéries ne semblent pas être particulièrement affectées par le contaminant. L'impact du cuivre sur la répartition des groupes algaux a déjà été mis en évidence. Ainsi, Tlili *et al.* (2010) ont également observé une prolifération d'algues vertes en présence du toxique alors que d'autres études ont montré des changements de structure favorisant les cyanobactéries aux dépends des diatomées, après une exposition plus longue (Serra *et al.*, 2009 ; Barranguet *et al.*, 2003). Il est possible que les différences observées entre les études soient attribuables à des différences au niveau des compositions spécifiques initiales au sein des différentes communautés phototrophes, ce facteur conditionnant fortement la réponse de communautés complexes à un stress toxique (Pesce *et al.*, 2009).

L'ensemble des changements quantitatifs et structurels observés au niveau des communautés phototrophes exposées chroniquement au cuivre engendre une acquisition de tolérance à ce toxique. En effet, l'augmentation des $CE_{50}$ (obtenues sur la base de la fluorescence chlorophyllienne) traduit une augmentation de la tolérance au sein du compartiment phototrophe, qui peut sans doute être reliée à la sélection d'espèces plus résistantes au cuivre, notamment parmi les algues vertes. Une telle acquisition de tolérance par des communautés phototrophes exposées chroniquement au cuivre a déjà été observée par Tlili *et al.* (2010).
La structure des communautés hétérotrophes est également affectée par la présence de cuivre, qui engendre des changements de diversité importants au sein de la communauté bactérienne, comme le montre l'analyse des profils obtenus par PCR-ARISA. De tels changements au niveau de ce compartiment microbien ont déjà été observés précédemment (Barranguet et al., 2002 ; Tlili et al., 2010). On note également que la présence du polluant semble être un paramètre très structurant pour cette communauté, puisque les profils de diversité bactérienne évoluent très peu au cours du suivi dans les biofilms exposés au cuivre, contrairement à ceux non exposés au toxique.

Parallèlement à l'impact structurel, la présence du cuivre engendre un impact fonctionnel sur les communautés hétérotrophes. Ainsi, l'activité β-glucosidase diminue fortement en présence de cuivre, suggérant donc un effet toxique chronique direct de ce dernier sur cette fonction hétérotrophe. Au contraire, l'exposition chronique au cuivre ne semble pas avoir d'effet négatif sur l'activité LAP et sur la respiration durant le suivi. On observe même ponctuellement et de manière transitoire une stimulation de ces activités hétérotrophes en présence du polluant, ce qui pourrait suggérer un effet indirect du cuivre.

En ce qui concerne l'acquisition de la tolérance au cuivre mesurée sur ces paramètres fonctionnels, on remarque que pour l'activité LAP, seules les communautés exposées au cuivre pendant 4 semaines ont acquis une tolérance au cuivre, mais celle-ci disparaît ensuite au cours du suivi, laissant apparaître une variabilité importante de cette mesure. Fechner et al. (2010) ont également obtenu avec le cuivre, des $CE_{50}$ très variables lors de tests de toxicité réalisés avec l'activité β-glu. L'impact chronique du cuivre sur l'activité métabolique des communautés hétérotrophes a aussi été montré par Barranguet et al. (2003) à l'aide d'une approche de type Biolog, qui a permis de mettre en évidence une légère acquisition de tolérance au sein des communautés exposées. D'après Tlili et al. (2010), l'acquisition de tolérance aux métaux par les communautés hétérotrophes peut être variable suivant les études, car ce processus est notamment fortement conditionné par les concentrations en phosphates dans le milieu.

## 2. Récupération :

Après une exposition chronique de 4 semaines, les biofilms ont subi une période de récupération de 6 semaines, selon différentes conditions, afin d'appréhender la dynamique des communautés suite à une réduction de la pression toxique, en évaluant notamment l'influence d'apport d'espèces non exposées au cuivre. Au cours de la phase de récupération, malgré l'arrêt de la contamination au cuivre dans les canaux concernés et des changements d'eau
toutes les deux semaines, les communautés ont été exposées à des concentrations en cuivre dissous comprises entre 1 et 9 µg/L. Compte tenu de ces concentrations mesurées, les communautés ont bien été confrontées à une diminution significative de leur niveau d'exposition au cuivre. L'augmentation des concentrations en cuivre dissous entre chaque changement d'eau suggère un fort relargage de cuivre par les biofilms préalablement exposés chroniquement à ce toxique. Cette hypothèse semble particulièrement plausible au regard des fortes concentrations en cuivre mesurées à la fin de la période d'exposition dans les biofilm, avec une forte proportion de cuivre externalisé, donc facilement mobilisable dans le milieu (cependant Ivorra et al. (1999) ont précédemment montré que le relargage du cuivre ne peut être total). L'analyse des échantillons, actuellement en cours, permettra d'affiner ces conclusions. Les différentes quantités de cuivre retrouvées ainsi dans chacun des canaux et dans le biofilm conditionnent donc la phase de récupération.

Contrairement à ce qui a été observé précédemment *in situ* (Ivorra *et al.*, 1999), les biofilms subissant une diminution de l'exposition au cuivre ne récupèrent pas en terme de biomasse totale (PS et MSSC), même en présence de biofilms non contaminés. Les communautés phototrophes présentent toutefois une biomasse proche des biofilms non impactés, après 6 semaines de récupération, mais uniquement en présence de biofilms non contaminés. Ce gain de biomasse algale a précédemment été observé par mesure de la concentration en chlorophylle *a* dans des études de transfert de biofilm sur des sites non impactés (Ivorra *et al.*, 1999). Ceci suggère donc que la proximité de biofilms non contaminées améliore la récupération des communautés exposées.

Cette récupération semble être majoritairement due à la migration de diatomées. En effet, les diatomées, groupe le plus impacté par le cuivre, voient leur proportion augmenter suite à l'arrêt de la contamination, contrairement aux algues vertes qui tendent à disparaître dans les communautés concernées par un apport d'espèces non exposées. Dans ce contexte, 4 semaines de récupération ont été suffisantes aux communautés algales pour retrouver une structure proche des communautés non impactées. D'autres études de transfert *in situ* de communautés impactées par le cuivre vers des sites non contaminés révèlent aussi un changement de structure des communautés diatomiques se rapprochant de celle des communautés locales (Ivorra *et al.*, 1999). Dans notre étude, l'importance des migrations de diatomées dans ce processus de récupération est confirmée par l'analyse taxonomique diatomique puisque les canaux alimentés par un apport d'espèces non impactées (« Ex-Cu1 ») présentent des communautés similaires aux non exposées, contrairement aux canaux non concernés par cet apport (« Ex-Cu2 »).
Les effets du cuivre à long terme sur l'activité photosynthétique ne sont pas perceptibles en présence de migration de diatomées alors qu'ils sont observés au sein des biofilms subissant uniquement une diminution du niveau d'exposition en cuivre dissous. Cette différence de réponse est peut-être associée à la quantité de cuivre restant internalisée dans les biofilms au cours de la phase de récupération (Dorigo et al., 2010) dans les deux contextes testés. Cette hypothèse sera confrontée aux données chimiques issues des analyses en cours.

La dynamique de récupération des communautés phototrophes d'un point de vue structural peut être reliée à l'évolution de leur niveau de tolérance au cuivre, puisque l'on observe en fin de suivi, des $CE_{50}$ proches entre communautés non exposées et celles ayant reçu un apport d'espèces non contaminées. La diminution de tolérance observée peut vraisemblablement s'expliquer par l'apport d'espèces plus sensibles au toxique, provenant des biofilms non exposés. De plus si l'on s'intéresse aux communautés exposées à long terme et à celles qui ont subi une période de récupération sans apport allochtone, on remarque que leur période d'exposition au cuivre (10 et 4 semaines respectivement) entraîne un même niveau de tolérance en fin de suivi. On peut donc émettre l'hypothèse qu'une exposition à moyen terme suffit à acquérir un niveau de tolérance optimal. Il est possible également que le cuivre internalisé dans le biofilm ait prolongé l'exposition des communautés phototrophes, limitant ainsi les processus de récupération et la diminution de leur niveau de tolérance à ce toxique.

Contrairement aux communautés phototrophes, les communautés bactériennes ne semblent pas récupérer, en terme de structure et de diversité même en présence de biofilms non contaminés. Cela semble suggérer une faible influence des processus de migration sur la structure globale de cette communauté. Toutefois, la diminution de la pression toxique semble favoriser l'évolution de la communauté bactérienne au cours du temps, puisqu'on observe des changements temporels de la diversité alors que celle-ci reste très stable dans les communautés exposées aux fortes concentrations en cuivre.

Cette évolution structurale est associée à une récupération fonctionnelle. En effet, une récupération totale est observée en terme d'activité $\beta$-glu à la fin du suivi, quel que soit le contexte de récupération. Cependant, la présence de biofilms non contaminés semble accélérer le processus, la récupération survenant après 4 semaines seulement (contre 6 en absence de ces biofilms). Il n'a pas été possible d'appréhender la récupération des communautés en terme d'activité LAP et de respiration puisque aucun effet majeur du cuivre n'a été observé au préalable. Dorigo et al. (2010) ont toutefois observé une diminution du niveau de tolérance au cuivre de communautés hétérotrophes, à partir de mesures de
respiration, suggérant une récupération partielle après transfert de communautés impactées vers un site non pollué.

### 3. Conclusions et perspectives :

Les résultats de cette étude ont permis de confirmer l'impact chronique du cuivre sur les communautés microbiennes phototrophes et hétérotrophes en terme de structure, diversité et fonction. Les modifications engendrées par le cuivre ont entraîné une augmentation de la tolérance à ce toxique, que nous avons principalement mis en évidence au sein des communautés phototrophes. Il serait intéressant ultérieurement d'analyser plus finement la diversité diatomique dans nos différents échantillons afin de voir si certaines espèces sont connues pour être particulièrement sensibles ou tolérantes aux polluants métalliques.

La méthodologie utilisée pour les approches PICT sur les communautés hétérotrophes semble présenter encore certaines limites, qui peuvent être reliées à une biomasse microbienne trop faible lors des tests toxiques à court terme, ou une durée d'exposition trop courte au cuivre (qui pourrait notamment expliquer l'absence de courbe dose réponse avec l'activité β-glu).

Suite à une diminution de pression chimique, la plupart des paramètres étudiés ont permis de mettre en évidence le potentiel de récupération des communautés. Cependant, au sein des communautés phototrophes, la récupération est très faible voire inexistante après 6 semaines en absence de migration d'espèces provenant de biofilms non contaminés, alors que cette récupération est quasi totale en présence de ces biofilms.

La proximité des communautés non impactées semble moins importante pour l'évolution de la diversité bactérienne même si elle a permis une récupération plus rapide des communautés hétérotrophes en terme d'activité β-glu.

Nos résultats ont également permis de mettre en évidence que la forte quantité du cuivre internalisée dans les biofilms exposés chroniquement peut prolonger l'exposition des communautés et conditionner fortement leur dynamique de récupération. Ceci sera vérifié prochainement suite à l'analyse des échantillons restants.

Notre étude semble donc confirmer que la récupération est facilitée dans les approches de translocation *in situ* visant à transférer des communautés périphytiques impactées vers des zones non contaminées, du fait de la présence des communautés autochtones sur les sites de transfert. D'un point de vue plus écologique, et dans une perspective de restauration des cours d'eau, il semble donc primordial de conserver des zones non contaminées pouvant permettre le maintien de communautés microbiennes non impactées, susceptibles de recoloniser le milieu en cas d'amélioration de la qualité chimique.
## Bibliographie

Barranguet, C., van den Ende, F. P., Rutgers, M., Breure, A.M., Greijdanus, M., Sinke, J.J., Admiraal, W., 2003. Copper-induced modifications of the trophic relations in riverine algal-bacterial biofilms. *Environmental Toxicology and Chemistry* 22, 1340-1349.

Blanck, H., Wänkberg, S.A., Molander, S., 1988. Pollution-induced community tolerance, a new ecotoxicological toll. In: *Cairs Jr., J., Pratt, J.R. (Eds.), Functional Testing of Aquatic Biota for Estimating Hazards of Chemicals*, vol. 988. ASTM STP, Philadelphia, pp. 219-230.

Dorigo, U., Leboulanger, C., Berard, A., Bouchez, A., Humbert, J.F., Montuelle, B., 2007. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. *Aquatic Microbial Ecology* 50, 91-102.

Dorigo, U., Berard, A., Bouchez, A., Rimet, F., Montuelle, B., 2010a. Transplantation of Microbenthic Algal Assemblages to Assess Structural and Functional Recovery After Diuron Exposure. *Archives of Environmental Contamination and Toxicology* 59, 555-563.

Dorigo, U., Berard, A., Rimet, F., Bouchez, A., Montuelle, B., 2010b. In situ assessment of periphyton recovery in a river contaminated by pesticides. *Aquatic Toxicology* 98, 396-406.

Fechner, L. C., Gourlay-France, C., Uher, E., Tusseau-Vuillemin, M.H., 2010. Adapting an enzymatic toxicity test to allow comparative evaluation of natural freshwater biofilms' tolerance to metals. *Ecotoxicology* 19, 1302-1311.

Hofmann, G., Werum, M., Lange-Bertalot, H., 2011. Diatomeen in Süßwasser-Benthos von Mitteleuropa. A. R. G. Gantner Verlag Kommanditgesellschaft, 908p.

Ivorra, N., Hettelaar, J., Tubbing, G.M.J., Kraak, M.H.S., Sabater, S., Admiraal, W., 1999. Translocation of microbenthic algal assemblages used for in situ analysis of metal pollution in rivers. *Archives of Environmental Contamination and Toxicology* 37, 19-28.

Krammer, K., Lange-Bertalot, H., 1986-1991. Bacillariophyceae. 1. Teil: Naviculaceae. 876 p.; 2. Teil: Bacillariaceae, Epithemiaceae, Surirellaceae, 596 p.; 3. Teil: Centrales, Fragilariaceae, Eunotiaceae, 576 p.; 4. Teil: Achnanthaceae. Kritische Ergänzungen zu *Navicula* (Lineolatae) und *Gomphonema*. 437 p. Süßwasserflora von Mitteleuropa, G. Fischer Verlag, Stuttgart.

Montuelle, B., Dorigo, U., Berard, A., Volat, B., Bouchez, A., Tlili, A., Gouy V., Pesce, S., 2010. The periphyton as a multimetric bioindicator for assessing the impact of land use on rivers: an overview of the ArdiSres-Morcille experimental watershed (France). *Hydrobiologia* 657, 123-141.
Morin, S., Pesce, S., Tlili, A., Coste, M., Montuelle, B., 2010. Recovery potential of periphytic communities in a river impacted by a vineyard watershed. *Ecological Indicators* 10, 419-426.

Pesce, S., Batisson, I., Bardot, C., Fajon, C., Portelli, C., Montuelle, B., Bohatier, J., 2009. Response of spring and summer riverine microbial communities following glyphosate exposure. *Ecotoxicology and Environmental Safety* 72, 1905-1912.

Pesce, S., Tlili, A., Montuelle, B., 2008. Les biofilms aquatiques : dans quelle mesure permettent-ils de comprendre l'effet des pesticides sur le fonctionnement des cours d'eau ? Exemple en zone vignoble. *Ingénieries* 55-56, 79-91.

Ranjard, L., Poly, F., Lata, J.C., Mougel, C., Thioulouse, J., Nazaret, S., 2001. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. *Applied and Environmental Microbiolog*, 67, 4479-4487.

Serra, A., Guasch, H., 2009. Effects of chronic copper exposure on fluvial systems: Linking structural and physiological changes of fluvial biofilms with the in-stream copper retention. *Science of the Total Environment* 407, 5274-5282.

Soldo, D., Behra, R., 2000. Long-term effects of copper on the structure of freshwater periphyton communities and their tolerance to copper, zinc, nickel and silver. *Aquatic Toxicology* 47, 181-189.

Tlili, A., Berard, A., Roulier, J.L., Volat, B., Montuelle, B., 2010. PO₄³⁻ dependence of the tolerance of autotrophic and heterotrophic biofilm communities to copper and diuron. *Aquatic Toxicology* 98, 165-177.

Tlili, A., Marechal, M., Montuelle, B., Volat, B., Dorigo, U., Berard, A., 2011. Use of the MicroResp (TM) method to assess pollution-induced community tolerance to metals for lotic biofilms. *Environmental Pollution* 159, 18-24.
Résumé

L'objectif principal de notre étude est d'appréhender les processus de récupération des
communautés périphytiques après une exposition chronique au cuivre, en évaluant notamment
l'influence des migrations d'espèces dans la dynamique de récupération des communautés.
Pour répondre à cet objectif, des canaux de laboratoires ont été utilisés afin de recréer
différents contextes de contamination et de récupération. Ainsi, des descripteurs quantitatifs
(mesures de biomasse et dosages de la chlorophylle a), qualitatifs (analyse taxonomique des
diatomées, analyses de la diversité bactérienne par biologie moléculaire : technique de
fingerprint, PCR-ARISA) et fonctionnels (mesures d'activités photosynthétique, respiratoire
et exo-enzymatiques) ont permis de caractériser les communautés microbiennes présentes.
Ces mêmes descripteurs fonctionnels ont également été utilisés dans une approche de type
PICT (Pollution Induced Community Tolerance), afin de déterminer les capacités de tolérance
acquises ou non par les diverses communautés aux cours des phases d'exposition au polluant,
et de suivre l'évolution de ces capacités, lors de la phase de récupération.

Le cuivre ayant eu des effets chroniques significatifs sur les communautés phototrophes et
hétérotrophes durant la phase d'exposition, nous avons pu étudier leur dynamique de
récupération suite à une diminution du niveau d'exposition. La plupart des paramètres suivis
ont permis de mettre en évidence le potentiel de récupération des communautés. Il en résulte
une faible récupération des communautés phototrophes en absence de migration d'espèces
provenant de biofilms non contaminés, alors que cette récupération est quasi totale en
présence de ces biofilms. La proximité des communautés non impactées semble moins
importante pour l'évolution de la diversité bactérienne même si elle a permis une récupération
plus rapide des communautés hétérotrophes pour l'une des activités exo-enzymatiques testées
(β-glucosidase). Nos résultats semblent donc confirmer l'hypothèse d'une récupération
facilitée dans les études de translocation *in situ* visant à transférer des communautés
 périphytiques impactées vers des zones non contaminées, du fait de la présence des
 communautés autochtones sur les sites de transfert. D'un point de vue plus écologique, et
dans une perspective de restauration des cours d'eau, il semble donc primordial de conserver
des zones non contaminées pouvant permettre le maintien de communautés microbiennes non
 impactées, susceptibles de recoloniser le milieu en cas d'amélioration de la qualité chimique.

**Mots Clés :** biofilm ; communautés microbiennes ; cuivre ; récupération ; tolérance