<figure><img src="image_98.png" /></figure>

**Figure §4.34** : Epaisseur du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer naturelle. Calculs réalisés en tenant compte de la surface active de l'électrode. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène). Les symboles ♦, ■ et ● distinguent 3 électrodes différentes.

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

**Figure §4.35** : Comparaison des épaisseurs du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer naturelle obtenues avec les traceurs $Fe(CN)_6^{3-}$ (symboles blancs) et oxygène (symboles noirs). Les symboles correspondent aux points expérimentaux et la courbe en pointillée à l'allure générale de l'évolution de l'épaisseur du biofilm.
> Observation au Microscope Laser à Balayage Confocal (MLBC)

Des observations au Microscope Laser à Balayage Confocal sont effectuées sur la surface des électrodes au "Lehrstuhl für Wassergüte der TU Munchen" à Munich. Ce moyen d'étude permet l'examen de biofilms hydratés par une technique non intrusive en trois dimensions sur des biofilms vivants. Le MLBC a l'avantage de permettre l'observation des biomasses fixées sur des surfaces non transparentes telles que l'or. Il est notamment possible de déterminer l'épaisseur du voile biologique. La limite inférieure de la caractérisation est de 8 µm avec une précision de ± 3 µm.

Il est nécessaire de concevoir un montage afin de pouvoir observer les embouts d'électrodes au MLBC. Dans le cas des échantillons, des observations sont effectuées afin d'obtenir des vues de face et de profil. Le premier type d'examen permet d'observer la répartition des masses du biofilm sur la surface et le second d'évaluer l'épaisseur du voile biologique. Les résultats présentés sont représentatifs de l'ensemble des électrodes étudiées.

La vue de face de la photo §4.3a permet d'appréhender la répartition aléatoire et en petits amas du biofilm. Les parties sombres correspondent à la biomasse et les parties claires à la surface du métal.

La vue de profil §4.3b est réalisée en déposant une goutte de FMC-Dextrane d'un poids moléculaire de 580 000 sur la surface de l'électrode. Cette molécule est un composé fluorescent dont la taille ne lui permet pas de diffuser dans le biofilm. La goutte forme donc un film soulignant à la surface de la biomasse. A partir d'observations dans différents plans successifs, un ordinateur reconstitue une vue de profil permettant alors de déterminer l'épaisseur maximum du biofilm. L'épaisseur maximum des échantillons testés a été évaluée à environ 10 µm.

Cette détermination corrobore les évaluations faites avec la technique électrochimique. Le voile biologique présent sur les électrodes était donc très ténu.
<figure><img src="image_100.png" /><figcaption>(a) vue de face</figcaption></figure>

<figure><img src="image_101.png" /><figcaption>(b) vue de profil</figcaption></figure>

**Photos §4.3** : Observations réalisées au MLBC d'une surface exposée 15 jours en eau de mer naturelle (objectif 100 à immersion). (a) vue de face et (b) vue de profil. Sur la vue de profil, il est possible de distinguer trois lignes blanches, du haut vers le bas, la surface du liquide fluorescent, la surface du biofilm et la surface de l'électrode.
### 3. Conclusion

La technique électrochimique développée a permis de mesurer l'épaisseur d'un biofilm formé en eau de mer "naturelle" c'est-à-dire sans addition d'un nutriment. Les épaisseurs déterminées sont comparables avec les mesures réalisées avec le Microscope Laser à Balayage Confocal. La faisabilité et la validité de la méthode ont été montrées dans le cas d'études en eau de mer.

Les phénomènes mis en évidence lors du développement du biofilm en eau de mer additionnée d'extrait de levure sont observés en eau de mer naturelle quoiqu'en moindre amplitude. Un courant non diffusionnel et le blocage de surface active sont observés. Le courant non diffusionnel est attribuable à la production d'espèces électroactives excrétées par les microrganismes. Le blocage de la surface est dû à l'adsorption de produits métaboliques des bactéries.

L'impédance AC a permis de montrer le blocage de la surface active réelle de l'électrode et la diffusion à travers la couche poreuse vers l'interface.

Dans le cas d'une électrode recouverte d'une couche poreuse, le blocage partiel de la surface ne peut être montré en impédance EHD car aucun modèle théorique correspondant n'a été développé jusqu'à ce jour.

La diminution de surface active apparente peut être mis en évidence à l'aide de mesures en régime stationnaire (variation de $K^{-1}$) et en impédance EHD.
D. Comparaison des épaisseurs des biofilms formés en eau de mer

Sur la figure §4.36 sont représentées les allures générales de l'évolution de l'épaisseur des biofilms développés dans les différentes eaux de mer : additionnée d'extrait de levure, naturelle et stérilisée.

L'importance des différentes épaisseurs entre elles est cohérente vis à vis des conditions expérimentales de développement. Plus l'activité biologique est favorisée par l'apport de nutriment, plus l'épaisseur de la couche poreuse augmente.

Suivant les conditions d'exposition, les constantes de temps de développement de la biomasse sont différentes. La formation du film bactérien est plus rapide avec l'apport d'un complément nutritif.

Ce diagramme est comparable à la figure §1.1 présentant les différentes étapes de formation du biofilm (Characklis, 1990).

<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>Figure §4.36 : Allures générales du développement des biofilms dans différentes eaux de mer :
— additionnée d'extrait de levure, — — naturelle et — limite de détection.</figcaption></figure>
## E. Conclusion

La technique mise au point en eau de mer donne des résultats satisfaisants. Elle permet de suivre l'évolution de l'épaisseur de la biomasse ainsi que celle de la surface active de l'électrode lors de l'adhésion bactérienne.

Cette série d'expérience a permis de montrer que l'activité de la biomasse provoque le blocage de la surface active de l'électrode vraisemblablement par la production d'espèces chimiques s'adsorbant sur la surface. L'implication de l'extrait de levure dans le blocage de la surface est à exclure car celui-ci a lieu avec ou sans apport de ce nutriment.

Le blocage de la surface est plus marqué pour un biofilm nourri. Si on considère que la qualité de l'eau reste constante, l'adsorption d'une substance présente dans l'eau semble peu plausible car le courant observé et le blocage serait d'intensité comparable dans les deux milieux d'exposition.

Dès les premiers jours d'exposition apparaît un courant non diffusionnel qui croît avec le développement du biofilm. Ce courant n'existe pas en absence de biomasse lors de l'utilisation du traceur ferricyanure. Sa valeur est différente suivant le traceur utilisé car le potentiel de polarisation est différent. Les microorganismes génèrent des espèces électroactives.

Un biofilm nourri a une activité physiologique plus importante et génère plus de produits métaboliques. Le blocage de la surface et l'augmentation du courant non diffusionnel est en effet plus important en eau de mer additionnée d'extrait de levure. De plus, ce phénomène n'a pas été observé en milieu stérile où l'activité biologique est nulle.

Le biofilm développé est constitué de plusieurs types de microorganismes produisant eux-mêmes différentes espèces chimiques. Une étude polarographique devrait permettre d'établir quelles substances électroactives sont à l'origine du courant non diffusionnel.

La prochaine étape est d'adapter cette méthode à des biofilms développés en eau douce.
## II. CARACTERISATION D'UN BIOFILM FORME EN EAU DOUCE

La réglementation concernant l'utilisation du chlore dans les réseaux d'eau potable afin de contrôler la quantité de bactéries est plus en plus contraignante. Les bactéries planctoniques ne constituent qu'une très faible partie de la flore bactérienne vis à vis des bactéries sessiles présentes dans les biofilms. Les microorganismes planctoniques ne sont que des émissaires de colonies inclues dans des biofilms vers de nouveaux sites d'implantations. Contrôler le taux de bactéries dans l'eau doit passer obligatoirement par le contrôle du voile biologique et donc la connaissance de la quantité de biomasse dans les canalisations des réseaux d'eau potable.

Le but de ce travail est de transposer la méthode mise en place pour la caractérisation d'un biofilm développé en eau de mer en milieu eau douce. L'adaptation de la technique à ce nouveau milieu soulève des problèmes qui n'existent pas ou à bien moindre échelle en eau de mer.

La principale difficulté en eau douce est le risque de formation de dépôts calcaires ; l'eau douce contenant souvent une quantité importante de carbonates et calcium. Ces sels peuvent précipiter et former un dépôt calco-magnésien bloquant ainsi la surface active de l'électrode. Le dépôt ainsi formé bloque la surface active de l'électrode de façon très significative. Lors de la réaction de réduction de l'oxygène dans un milieu riche en carbonates et calcium, ce phénomène peut être particulièrement marqué et rapide. Il y a production de $OH^-$ et par conséquent une augmentation du pH interfacial. Cette augmentation de l'alcalinité de l'interface déplace les équilibres chimiques suivants :

$$HCO_3^- + OH^- \rightleftharpoons H_2O + CO_3^{2-} \quad (§4.1)$$

$$Ca^{2+} + CO_3^{2-} \rightleftharpoons CaCO_3 \quad (§4.2)$$

Ce qui entraîne le dépôt d'une couche de calcaire à l'interface.

Dans le cas d'un biofilm développé en eau douce, il n'était donc pas possible de réaliser les mesures électrochimiques dans l'eau du réseau d'eau potable. Le milieu de mesure devait limiter les risques de dépôt calco-magnésien sans toutefois perturber de
façon trop importante les micro-organismes présents dans le biofilm (par exemple : éclatement des parois bactériennes dû à la pression osmotique). Le choix s'est donc porté sur une eau du commerce peu minéralisée et contenant peu de calcium et de carbonates : l'eau de Volvic (Tableau §4.4). Cependant, ce choix apporte certains inconvénients. La résistance électrolytique $R_e$ de l'eau de Volvic est importante et conduit à la prise en compte de la chute de tension dite **chute ohmique** entre l'électrode de référence et l'électrode de travail.

<table><caption>Tableau §4.4 : Principaux constituants minéraux de l'eau de Volvic.</caption><thead><tr><th>Cations</th><th>Concentration (mg.L<sup>-1</sup>)</th><th>Anions</th><th>Concentration (mg.L<sup>-1</sup>)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Ca<sup>2+</sup></td><td>9,9</td><td>Cl<sup>-</sup></td><td>8,4</td></tr><tr><td>Mg<sup>2+</sup></td><td>6,1</td><td>NO<sub>3</sub><sup>-</sup></td><td>6,3</td></tr><tr><td>Na<sup>+</sup></td><td>9,4</td><td>SO<sub>4</sub><sup>2-</sup></td><td>6,9</td></tr><tr><td>K<sup>+</sup></td><td>5,7</td><td>CO<sub>3</sub><sup>2-</sup></td><td>65,3</td></tr></tbody></table>

# A. Etude exploratoire en eau douce

## 1. Conditions expérimentales

Plusieurs électrodes sont immergées dans des bacs contenant différents milieux d'exposition d'eau douce sur le site du CIRSEE/Lyonnaise de Eaux (Le Pecq). Trois différents milieux sont testés :

* Eau du réseau Le Pecq

* Mélange 50/50 eau du réseau Le Pecq / eau de Seine filtrée sur sable

* Eau de Seine filtrée sur sable
L'eau dû réseau d'eau potable du Pecq est une eau peu chargée du point de vue biologique, des matières organiques et des nutriments. Ce milieu est donc peu favorable de produire des biofilms.

L'eau de Seine filtrée sur sable est, quant à elle, une eau très chargée et peut produire des biofilms fortement développés.

Le mélange 50/50 de ces deux eaux devrait donc pouvoir donner des biomasses intermédiaires par rapport aux deux extrêmes décrites précédemment.

Des électrodes statiques ont été disposées dans des bacs contenant les différents milieux qui étaient continuellement renouvelés à raison de 10% par heure. La surface des électrodes était dirigée vers le bas et maintenue à l'abri de la lumière durant la phase de colonisation.

Différents paramètres physico-chimiques et biologiques durant la période d'exposition sont présentés dans le tableau §4.5.

<table><caption>Tableau §4.5 : Paramètres physico-chimiques et biologiques contrôlés durant la période d'exposition. COD carbone organique dissous, CODB carbone organique dissous biodégradable, R2A dénombrement bactérien à 22°C sur milieu R2A (cf. Annexe) et UFC unités formation colonie.</caption><thead><tr><th>Paramètres</th><th>Eau Le Pecq</th><th>50/50<br>Eau Le Pecq / Seine</th><th>Eau de Seine</th></tr></thead><tbody><tr><td>Température (°C)</td><td>20 - 22</td><td>20 - 22</td><td>22 - 24</td></tr><tr><td>Turbidité (NTU)</td><td>0,3</td><td>7 - 23</td><td>15 - 44</td></tr><tr><td>UV (254 nm)</td><td>0,075 - 0,106</td><td>1,003 - 2,159</td><td>2,058 - 4,156</td></tr><tr><td>COD (mg.L<sup>-1</sup>)</td><td>0,8 - 1,3</td><td>1,8 - 2,4</td><td>2,6 - 3,8</td></tr><tr><td>CODB (mg.L<sup>-1</sup>)</td><td>0,1 - 0,2</td><td>0,3 - 0,5</td><td>0,6 - 0,9</td></tr><tr><td>R2A (ufc.mL<sup>-1</sup>)</td><td>1 - 30 000</td><td>100 - 200 000</td><td>3 000 - 400 000</td></tr></tbody></table>
De plus, des billes de verre d'un diamètre de 2,8 mm² sont placées dans chaque bac avec les électrodes. Vingt billes sont prélevées dans chaque milieu à différents instants durant la période d'exposition des électrodes pour permettre une mesure d'ATP (protocole, cf Annexe).

Les mesures sont réalisées dans une eau de Volvic à une température de 25°C. Seules des mesures en régime stationnaire sont effectuées.

Dans le cas des milieux d'exposition eau réseau du Pecq et mélange eau du Pecq eau de Seine, le traceur électrochimique est l'oxygène. Par contre, dans le cas du milieu eau de Seine, deux traceurs sont utilisés : l'oxygène et le $Fe(CN)_6^{3-}$. La composition des milieux de mesure est la suivante :

* Traceur oxygène

Eau de Volvic
Oxygène dissous $9,3 \text{ mg.L}^{-1}$

* Traceur ferricyanure

Eau de Volvic
$K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 \ 10^{-2}\text{M}$

L'eau de Volvic possède une résistance électrolytique importante, $R_e = 810 \ \Omega \cdot \text{cm}^2$ (mesurée par impédance AC), du fait de sa faible minéralisation. Dans cette première expérience exploratoire en eau douce, le choix est fait de ne pas corriger, même partiellement, cette chute ohmique.

La chute ohmique importante décale les potentiels interfaciaux par rapport aux potentiels imposés. De plus, la cinétique de réduction de l'oxygène dans l'eau de Volvic est à l'origine d'un plateau de diffusion de réduction de l'oxygène très mal défini. Toute la difficulté réside dans la détermination du potentiel de mesure. Afin d'estimer ce potentiel, des mesures en régime stationnaire sont réalisées sur une électrode nue à différents potentiels. L'ajustement des données expérimentales permet alors d'évaluer les paramètres $i_0, i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$. Le potentiel retenu est déterminé pour un courant non diffusionnel et un paramètre $i_\infty^{-1}$ les plus petits possibles ainsi que pour un inverse du coefficient de Levich le plus proche de sa valeur théorique.
Lors de l'utilisation du premier milieu de mesure, l'électrode est polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction de l'oxygène à -1300 mV/ECS (fig. §4.37).

<figure><img src="image_103.png" /><figcaption>Figure §4.37 : Courbes de polarisation dans : ① Eau de volvic et ② Eau de volvic + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 10^{-2}M$.</figcaption></figure>

Dans le second milieu de mesure, l'électrode est polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction du $Fe(CN)_6^{3-}$ à -300 mV/ECS (fig. §4.37).

La résistance d'électrolyte de cette solution est de $R_e = 21 \ \Omega \cdot cm^2$ (mesurée par impédance AC). Quoique la résistance d'électrolyte soit ici moins élevée que dans une solution d'eau de Volvic pure, ici aussi, la chute ohmique est à l'origine du déplacement du plateau de diffusion de réduction du $Fe(CN)_6^{3-}$ vers les valeurs plus négatives. Le potentiel de mesure est déterminé par la méthode décrite ci-dessus.
## 2. Résultats et discussion

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

### Régime stationnaire

Les paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ déterminés par ajustement des données expérimentales sont présentées figures §4.38, §4.39, §4.40 et §4.41.

Dans le cas du traceur oxygène, le courant non diffusionnel est nul et n'évolue pas dans le temps et cela quel que soit le milieu. Par contre, dans le cas du traceur ferricyanure, le courant non diffusionnel est élevé et augmente légèrement au cours du temps avec un phénomène semblable à celui décrit pour le biofilm développé en eau de mer. Le paramètre $i_\infty^{-1}$, reste constant dans le temps quel que soit le traceur utilisé et les électrodes testées. Dans le cas du traceur oxygène, la valeur de $i_\infty^{-1}$ n'est pas nulle. Le paramètre $K^{-1}$ reste constant dans le temps et d'une valeur proche de sa valeur théorique.

L'existence du courant $i_0$ avec le traceur ferricyanure dès le jour 0 d'exposition peut s'expliquer par l'existence de traces d'espèces électroactives dans l'eau de Volvic. Ce courant augmente dans le temps dans un phénomène analogue à celui décrit pour l'eau de mer. Le courant $i_0$ n'est pas observable avec le traceur oxygène. Cependant, le potentiel de polarisation est très différent et peut expliquer cette différence entre les résultats obtenus avec les deux traceurs. La hausse du courant $i_0$ avec le ferricyanure peut être attribuée à la sécrétion d'espèces électroactives par les microorganismes.

La composante cinétique de la réaction de réduction de l'oxygène se répercute sur $i_\infty^{-1}$ (éq. §2.10). En partant du principe que le jour 0 correspond à une électrode nue donc à une épaisseur nulle, la présence d'un biofilm n'a pas été mise en évidence.

Le coefficient de Levich reste constant durant toute l'expérience et est égal à sa valeur théorique. Ce fait indique que les mesures électrochimiques se sont bien déroulées.

La gamme des courants mesurés évolue peu sur 20 jours. Aussi, les paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ varient peu durant la période d'exposition. Les résultats obtenus avec les deux traceurs sont cohérents entre eux. Seule l'évolution du courant non diffusionnel avec le traceur ferricyanure permet de mettre en évidence une activité bactérienne pour les électrodes immergées en eau de Seine.
<figure><img src="image_105.png" /></figure>

Figure §4.38 : $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau du réseau Le Pecq. Mesures réalisées dans une solution de Volvic (traceur oxygène). Les symboles ■, ● et ♦ distinguent 3 électrodes différentes.
<figure><img src="image_106.png" /></figure>

**Figure §4.39** : $i_o$, $i_{\infty}^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau de Seine filtrée. Mesures réalisées dans une solution de Volvic (traceur oxygène). Les symboles ■, ● et ♦ distinguent 3 électrodes différentes.
<figure><img src="image_107.png" /></figure>

**Figure §4.40** : $i_o$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau de Seine filtrée. Mesures réalisées dans une solution de Volvic + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 \ 10^{-2}M$ (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$). Les symboles ■ et ● distinguent 2 électrodes différentes.
Caractérisation de biofilms formés en eau douce

<figure><img src="image_108.png" /></figure>

**Figure §4.41** : $i_o$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau de Seine filtrée/réseau Le Pecq.
Mesures réalisées dans une solution de Volvic (traceur oxygène). Les symboles ■, ● et ♦ distinguent 3 électrodes différentes.
## ➤ Mesures d'ATP

Les mesures d'ATP (fig. §4.42) montrent une hausse de l'activité biologique de la biomasse se développant sur les billes de verre exposées dans l'eau de la Seine et dans le mélange Seine/Le Pecq. Cette augmentation n'est pas observée sur les billes prélevées dans l'eau du Pecq. L'activité biologique observée est conforme aux attentes qui avaient été envisagées dans chaque milieu. Elle est proportionnelle aux nutriments présents dans l'eau

<figure><img src="image_109.png" /><figcaption>Figure §4.42 : Mesures d'ATP en fonction du temps d'immersion dans différents milieux (— ■ — Le Pecq, — ♦ — Seine/Le Pecq, — — — ● — — Seine).</figcaption></figure>

## ➤ Observations au MEB et en épifluorescence

Des observations par épifluorescence (protocole, cf. Annexe) et au MEB (protocole, cf. Annexe) sont réalisées sur la surface des électrodes à la fin du temps d'exposition afin d'évaluer l'importance de la biomasse :
### • Eau du Pecq (Photos §4.4)

Densité bactérienne > 7 10⁵ bactéries.cm⁻² au MEB

1 10⁶ bactéries.cm⁻² en épifluorescence

La surface des échantillons est peu colonisée avec des dépôts particulaires épars et quelques formes bactériennes pédonculées et coccoïdes.

### • Mélange eau du Pecq / eau de Seine

Densité bactérienne non mesurée au MEB

> 9 10⁶ bactéries.cm⁻² en épifluorescence

L'évaluation des densités bactériennes en épifluorescence est rendue difficile (limite de détection de la méthode).

### • Eau de Seine (Photos §4.5)

Densité bactérienne > 5 10⁶ bactéries.cm⁻² au MEB

non mesurable en épifluorescence

L'évaluation des densités bactériennes au MEB est rendue difficile par la présence d'une forte concentration en matériel dendritique. L'aspect général de la surface est caractérisé par des dépôts particulaires importants, des débris organiques et des bactéries de type morphologique différent : filamenteux, bâtonnets longs ou trapus, coccoïdes.

## 3. Conclusion

Les observations au MEB et en épifluorescence ainsi que les mesures d'ATP montrent qu'il est indéniable qu'un grand nombre de bactéries s'est développé sur les électrodes. Les densités bactériennes évaluées au MEB et en épifluorescence sont du même ordre de grandeur. Les différences peuvent être attribuées aux erreurs d'estimation et aux préparations différentes des échantillons suivant la technique d'observation utilisée. Les estimations sont conformes aux densités bactériennes attendues entre elles dans les différents milieux.

La méthode électrochimique n'a pas permis, quant à elle, de mettre en évidence la présence de couches poreuses sur les électrodes avec le traceur oxygène. En se basant sur les résultats obtenus en eau de mer, le courant non diffusionnel observé avec le traceur
ferricyanure montre l'existence de microorganismes sur les électrodes immergées en eau de Seine. L'épaisseur de ce biofilm est inférieure au seuil de détection.

Cependant, l'expérimentation de la méthode en eau de mer a montré sa faisabilité et la validité des résultats obtenus.

La structure du biofilm étudié dans cette étude peut être incriminée. Les électrodes ont été immergées dans des bacs où l'eau était renouvelée mais relativement stagnante. La structure des biofilms développés doit être très hétérogène et ne se présente pas comme une barrière de diffusion. Ce biofilm est donc très différent des biofilms développés en eau de mer. Il ne correspond pas au modèle physique de couche poreuse proposé.

Compte tenu du désaccord entre les mesures électrochimiques et biologiques, une étude au Microscope Laser Confocal à Balayage semble être l'étude permettant de trancher sur cette divergence.
Caractérisation de biofilms formés en eau douce

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

a

<figure><img src="image_111.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_112.png" /></figure>

c

Photos §4.4 : Observations de la surface d'une électrode immergée 3 semaines dans l'eau du réseau Le Pecq : (a) aspect général en épifluorescence, (b) aspect général et (c) détail au MEB. L'échelle représentée sur la partie gauche des photos par un trait blanc correspond à une dimension de 10 µm pour la photo (a) prise en épifluorescence (objectif 100 à immersion), de 100 µm pour la photo (b) prise au MEB et de 1 µm pour la photo (c) prise au MEB.
Caractérisation de biofilms formés en eau douce

<figure><img src="image_113.png" /></figure>

<figure><img src="image_114.png" /><figcaption>Photos §4.5 : Observations de la surface d'une électrode immergée 3 semaines dans l'eau de la Seine :
(a) aspect général en épifluorescence, (b) aspect général et (c) détail au MEB. L'échelle représentée sur la partie gauche des photos par un trait blanc correspond à une dimension de 10 µm pour la photo (a) prise en épifluorescence (objectif 100 à immersion), de 100 µm pour la photo (b) prise au MEB et de 10 µm pour la photo (c) prise au MEB.</figcaption></figure>
## B. Seconde étude réalisée en eau douce

L'étude préalable a montré que le biofilm développé en eau douce stagnante à une structure différente des biomasses formées en eau de mer. Le biofilm de l'étude précédente n'a pas une structure de couche poreuse et ne joue donc pas un rôle de barrière de diffusion.

Afin d'effectuer les mesures sur un biofilm plus épais, les conditions de culture de la biomasse sont changées. Le dispositif déjà décrit dans le paragraphe §4.A.I concernant le biofilm développé en eau de mer est utilisé. Ce système renouvelle le milieu en continu avec un débit relativement important permettant un meilleur apport nutritif. De plus, de l'extrait de levure est ajouté pour améliorer encore cet effet.

L'utilisation du traceur oxygène dans une solution de Volvic pure s'est avérée trop délicate lors de la première série de mesures et est abandonnée. Ici, seul le traceur ferricyanure est utilisé. La salinité de cette solution est plus importante, néanmoins, pour palier aux problèmes liés à la résistance électrolytique, la chute ohmique est corrigée partiellement pour améliorer les conditions de mesure.

### 1. Conditions expérimentales

Plusieurs électrodes sont immergées durant une période d'environ un mois dans l'eau potable du réseau de Brest. Les conditions d'exposition sont les suivantes :

* Eau potable (Brest)

* Extrait de levure 3,0 mg.L⁻¹

* Température 23-25°C

* Chlore libre 0,05 ppm

* Débit 1 L.min⁻¹ (≈ 0.1 m.s⁻¹)
Le taux de chlore libre est mesuré par une méthode colorimétrique dont le protocole est présenté en Annexe. Sa faible concentration n'interfère pas avec le développement de la biomasse.

La *solution de mesure* est composée d'eau de Volvic additionnée de $K_3Fe(CN)_6/ K_4Fe(CN)_6 10^{-2}M$. La température est régulée à 20°C.

Trois types de mesures sont réalisées successivement : mesures en régime stationnaire, impédances EHD et AC. Durant toutes les mesures, la chute ohmique est corrigée. Les électrodes sont alors polarisées sur le plateau limite de diffusion de réduction de $Fe(CN)_6^{3-}$ durant les mesures en régime stationnaire et d'impédance EHD. Elles sont ensuite polarisées au potentiel correspondant à la moitié du courant évalué sur le plateau limite de diffusion de réduction de $Fe(CN)_6^{3-}$. Les mesures d'impédance AC sont réalisées à 1200 tr.min$^{-1}$.

## 2. Résultat et discussion

### a) Mesures en régime stationnaire

Sur une période d'un mois environ, des mesures en régime stationnaire sont réalisées régulièrement sur plusieurs électrodes. Les résultats de deux électrodes, appelées respectivement électrodes 1 et 2, sont développés ici et seront distinguées les uns aux autres dans cette présentation. La gamme des courants mesurés est présentée dans la figure §4.43. Les paramètres $i_0, i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps sont présentés dans la figure §4.44.

Le courant non diffusionnel $i_0$ augmente de manière significative dans la première semaine pour atteindre des valeurs pouvant aller jusqu'à plus de 60 µA puis redescend pour se stabiliser à environ 15-20 µA suivant l'électrode considérée. Le paramètre $i_\infty^{-1}$ déterminé dans le cas de l'électrode 1 croît régulièrement pour atteindre un maximum au jour 8 d'environ $8 \times 10^{-4} \mu A^{-1}$ pour ensuite se stabiliser à une valeur de 5 ou $6 \times 10^{-4} \mu A^{-1}$. Dans le cas de la seconde électrode, le paramètre $i_\infty^{-1}$ subit une brusque augmentation aux jours 3 et 4 pour ensuite redescendre à des valeurs oscillant entre 2 et $3 \times 10^{-4} \mu A^{-1}$. L'inverse du coefficient de Levich $K^{-1}$ reste constant à une valeur de $0,04 \mu A^{-1}$ (tr / min)$^{-0,5}$. Seuls les
jours 3 et 4 pour l'électrode 2 présentent des valeurs très élevées pouvant atteindre
$0,12 \ \mu\text{A}^{-1} \cdot (\text{tr / min})^{-0,5}$.

<figure><img src="image_115.png" /></figure>

**Figure §4.43** : Gamme des courants mesurés avec des vitesses allant de 120 à 1200 tr.min⁻¹ en fonction du temps d'immersion dans l'eau du réseau de Brest additionné d'extrait de levure pour deux électrodes 1 — et 2 —. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).

Comme dans le cas des mesures en eau de mer, l'apparition du courant non
diffusionnel au cours de la période d'immersion peut être attribuée à la production
d'espèces électroactives par le biofilm. Les microorganismes se succédant lors de
l'établissement de la biomasse semblent sécréter différents composés en quantité variable
pouvant être réduits ou oxydés lors de la polarisation de l'électrode. Cette altération du
milieu interfacial se traduit par l'existence même puis la modification de ce courant.

$i_{\infty}^{-1}$ étant proportionnel à $\delta_f / SD_f$, cette soudaine élévation puis diminution de ce paramètre peut être attribuée à un brutal changement de $\delta_f$, S et/ou $D_f$ c'est-à-dire de l'épaisseur, la surface active apparente et/ou de la porosité de la couche poreuse.
<figure><img src="image_116.png" /></figure>

Figure §4.44 : $i_o$, $i_\infty^1$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau du réseau de Brest additionné d'extrait de levure pour les électrodes 1 ♦ et 2 □. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 10^{-2}M$ (traceur Fe(CN)$_6^{3-}$).
$K^{-1}$ est inversement proportionnel à la surface active apparente de l'électrode. Cette brusque augmentation puis diminution pourrait être due à un blocage puis un déblocage de la surface.

Le phénomène ayant lieu les jours 3 et 4 pour l'électrode 2 se manifeste par une diminution de la vitesse de diffusion $\frac{D_f}{\delta_f}$ dans la couche poreuse ainsi que celle de la surface active de l'électrode. Au même moment, une forte baisse des courants mesurés peut être observée (fig. §4.43). La concentration du traceur dans la solution restant constante dans la solution de mesure, le blocage de la surface est alors confirmé. La structure de la couche recouvrant l'électrode est donc plus dense durant cette période. Un phénomène analogue, mais moins marqué, a pu être observé en eau de mer.

### b) Impédance EHD

Les mesures en impédance EHD ont été réalisées à intervalle régulier durant la période d'exposition des électrodes. Dans un premier temps, au jour 0, les diagrammes de Bode obtenus ont permis de vérifier la réductibilité par la fréquence adimensionnelle $p$ des courbes réalisées avec une électrode nue.

Par contre, les diagrammes obtenus après plusieurs jours d'immersion montrent que les données ne sont pas réductibles par la fréquence $p$. A titre d'exemple, les figures §4.45 et §4.46 donnent les courbes obtenues pour les deux électrodes au jour 14 à différentes vitesses de rotation (300, 600 et $1200 \text{ tr.min}^{-1}$). Les courbes sont déplacées vers les plus basses fréquences quand la vitesse de rotation de l'électrode augmente.

Sur les figures §4.47 et §4.48, les courbes obtenues à $1200 \text{ tr.min}^{-1}$ à différents moments durant la période d'exposition ont été superposées. Comme dans le cas des mesures en régime stationnaire, les deux électrodes 1 et 2 ont montré un comportement différent.

Dans le cas de l'électrode 1 (fig. §4.47), les données sont décalées vers de plus faibles valeurs de $p$ par rapport à celles obtenues pour une électrode nue. La courbe du jour
4 est légèrement déplacée vers les basses fréquences puis les jours 7, 14 et 18 sont regroupées plus bas en fréquence. A partir du jour 7, les données sont translatées vers des plus faibles valeurs de p.

Dans le cas de l'électrode 2 (fig. §4.48), aux jours 4 et 7, la translation des données vers de plus faibles valeurs de p est beaucoup plus importante ce qui indique une couche poreuse beaucoup plus dense et recoupe les informations tirées des mesures en régime stationnaire. Les courbes aux jours 14 et 18 sont regroupées et légèrement déplacées vers les plus basses fréquences par rapport au jour 0. Par contre, les données sont fortement déplacées vers de plus faibles valeurs de p pour les jours 4 et 7.

La translation des courbes sur les figures §4.45 et §4.46 est cohérente avec une diffusion à travers une couche poreuse. Le temps de diffusion du traceur dans le biofilm est identique aux différents âges du biofilm. Quoiqu'il en soit, le déplacement des différentes courbes est relativement faible quel que soit l'âge du biofilm. La porosité de la biomasse est donc très proche de 1 et les coefficients de diffusion dans le biofilm et la solution électrolytique peuvent être considérés comme égaux.

Dans le cas de l'électrode 2 (fig. §4.48), aux jours 4 et 7, le temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ dans la couche poreuse est beaucoup plus important. Tout comme les mesures en régime stationnaire, l'impédance EHD montre que la structure de la couche poreuse est alors plus dense. Le biofilm montre ensuite un comportement identique au biofilm développé sur l'électrode 1. Les courbes aux jours 14 et 18 montrent une porosité de la biomasse proche de 1.
<figure><img src="image_117.png" /></figure>

Figure §4.45 : Impédance EHD à différentes vitesses de rotation △ 300, ■ 600, ○ 1200 tr.min⁻¹ pour un biofilm âgé de 14 jours développé en eau douce sur l'électrode 1 comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue —. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).
<figure><img src="image_118.png" /></figure>

Figure §4.46 : Impédance EHD à différentes vitesses de rotation △ 300, ■ 600, ○ 1200 tr.min⁻¹ pour un biofilm âgé de 14 jours développé en eau douce sur l'électrode 2 comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue —. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).
<figure><img src="image_119.png" /></figure>

Figure §4.47 : Impédance EHD pour un biofilm développé en eau douce sur l'électrode 1 au jour ○ 0, △ 4, ◇ 7, □ 14 et × 18 à 1200 tr.min⁻¹. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).
<figure><img src="image_120.png" /></figure>

Figure §4.48 : Impédance EHD pour un biofilm développé en eau douce sur l'électrode 2 au jour ○ 0, △ 4, ◇ 7, □ 14 et × 18 à 1200 tr.min⁻¹. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).
c) Impédance AC

Les résultats obtenus en impédance AC à différents temps d'exposition sont présentés
dans les figures §4.48 et §4.49.

Pour l'électrode 1, au jour 4, la boucle correspondant au transport de matière voit son diamètre augmenter pendant que la résistance de transfert de charge, R<sub>tc</sub>, croît aussi en passant de 300 à 650 Ω. La R<sub>tc</sub> atteint son maximum avec une valeur de 850 Ω au jour 7 puis reste stable. La résistance de transport de matière atteint sa valeur maximale le 14<sup>e</sup> jour pour ensuite légèrement rediminuer et rester stable.

<figure><img src="image_121.png" /></figure>

Figure §4.48 : Impédance AC pour un biofilm développé sur l'électrode 1 au jour ○ 0, △ 4, ◇ 7, □ 14 et × 18 à 1200 tr.min⁻¹. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (Traceur Fe(CN)₆³⁻).
<figure><img src="image_122.png" /></figure>

Figure §4.49 : Impédance AC pour un biofilm développé sur l'électrode 2 au jour ○ 0, △ 4, ◇ 7 et □ 14 à 1200 tr/min. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (Traceur Fe(CN)₆³⁻).
Dans le cas de l'électrode 2, la résistance de transfert de charge et la boucle contrôlée par le transport de matière varient fortement durant le temps d'exposition. La résistance de transfert de charge commence par augmenter du jour 0 au jour 4 en passant de 250 Ω à plus de 6000 Ω, diminue ensuite pour atteindre une valeur d'environ 1300 Ω au jour 14. Dans le même temps, la boucle contrôlée par la diffusion commence par s'agrandir jusqu'au jour 4 puis décroît.

Pour ces mêmes électrodes, K⁻¹ reste invariant en montrant bien que l'inverse du coefficient de Levich est proportionnel à une surface active apparente et non pas à une surface active réelle.

La réponse de l'électrode 1 en impédance AC est cohérente avec les informations obtenues par les méthodes précédentes. L'analyse est identique à celle décrite pour l'eau de mer. Dans un premier temps, la surface est bloquée partiellement par le biofilm. Au bout du 7ᵉ jour, la surface de l'électrode ne varie plus. Le processus de diffusion dans le voile biologique est visible dès le 4ᵉ jour. La biomasse se développe en épaisseur puis atteint un plateau.

L'électrode 2 se distingue encore dans son comportement vis à vis de l'électrode 1. Dès le 4ᵉ jour, la surface se bloque partiellement et la boucle de diffusion augmente fortement montrant ainsi qu'une couche de forte épaisseur et dense s'est formée. Ces observations confirment les résultats obtenus en impédance EHD et en régime stationnaire. Du jour 4 au jour 7, la surface se débloque et l'épaisseur du biofilm diminue. Par la suite, la surface décroît encore alors que son épaisseur fluctue légèrement.

### d) Traitement des données

La valeur moyenne du paramètre K⁻¹ au jour 0 déterminée en régime stationnaire est d'environ 0,037 (√tr.min⁻¹.µA)⁻¹. A partir de cette dernière, il est possible de déterminer un coefficient de diffusion de Fe(CN)₆³⁻ de 6,0 10⁻⁶ cm².s⁻¹ pour une température de mesure de 20°C comme lors de la procédure suivie pour les biofilms formés en eau de mer. Cette valeur est légèrement supérieure à celle déterminée pour de
l'eau de mer car la solution eau de Volvic + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ a une salinité inférieure.

$$D = D_f = 6,0 \ 10^{-6} \ cm^2 \cdot s^{-1}$$

En prenant D = D<sub>f</sub> = 6,0 10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>·s<sup>-1</sup>, l'épaisseur de la biomasse se formant sur les électrodes est déterminée à partir du coefficient i<sub>∞</sub><sup>-1</sup> puis son évolution est tracée en fonction du temps (fig. §4.50).

Les courbes obtenues montrent une forte augmentation de l'épaisseur dans les premiers jours d'exposition. Pour chaque électrode, un plateau est ensuite atteint. La valeur limite obtenue au bout de 3 semaines est assez proche de la valeur obtenue dans le cas des biofilms formés en eau de mer additionnée de nutriment. La forte augmentation de l'épaisseur correspond à la forte chute des courants observés sur la figure §4.43. Des phénomènes analogues mais beaucoup moins marqués ont été observés en eau de mer.

A partir de K<sup>-1</sup>, il est possible de supposer que la surface reste constante sauf pour les jours 3 et 4 de l'électrode 2. Les points correspondant aux jours 3 et 4 pour l'électrode 2 correspondent à des valeurs de K<sup>-1</sup> très importantes et qui peuvent être interprétées comme un fort blocage de la surface. Le biofilm doit être très dense et le coefficient de diffusion dans le biofilm doit être différent de celui-ci dans la solution. Un calcul prenant les coefficients de diffusion dans et hors de la couche comme égaux et tenant compte de la surface active apparente conduit à des valeurs abhérentes. Durant cette courte période, le biofilm doit être plus dense.

### e) Observations en épifluorescence

Des observations au Microscope à épifluorescence (protocole, cf. Annexe) sur la surface des électrodes font apparaître une population bactérienne importante (photos §4.6).
La densité élevée des microorganismes et des exopolymères ne permet pas d'évaluer
le nombre de bactéries sur la surface. Il est cependant possible de mettre en évidence un
biofilm important.

<figure><img src="image_123.png" /></figure>

Figure §4.50 : Epaisseur en fonction du temps d'exposition dans l'eau du réseau de Brest additionnée d'extrait de levure pour deux électrodes 1 ♦ et 2 □. Mesures réalisées dans une solution d'eau de Volvic additionnée de K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).

3. Conclusion

La technique électrochimique mise en oeuvre pour évaluer la quantité de biomasse
donne des résultats satisfaisants.

Cependant le protocole expérimental est plus complexe en eau douce qu'en eau de
mer du fait de l'entartrage.
Il est nécessaire d'utiliser un milieu de mesure différent du milieu d'exposition. Le transfert des biofilms d'un milieu à un autre dont les caractéristiques sont différentes peuvent modifier le voile biologique.

Le protocole de mesure est plus complexe et le traitement des données est moins aisé qu'en eau de mer du fait de la chute ohmique.

L'évolution de l'épaisseur des biofilms formés en eau d'eau douce dans le cadre de cette étude n'est pas monotone. L'épaisseur atteint une valeur limite au bout de 2 semaines.

Comme dans le cas des biofilms développés en eau de mer, un courant non diffusionnel est aussi observé en eau douce. Ce courant peut être attribué à la production d'espèces électroactives par les microorganismes présents dans les biofilms.
Caractérisation de biofilms formés en eau douce

<figure><img src="image_124.png" /></figure>

Photos §4.6 : Observations en épifluorescence de la surface d'électrodes dans de l'eau douce du réseau d'eau potable additionnée d'extrait de levure. L'échelle représentée sur la partie gauche des photós par un trait blanc correspond à une dimension de 10 µm (objectif 100 à immersion).
# Conclusion générale
Ce travail a permis d'élaborer une technique de caractérisation *in-situ* de biomasses formées en milieu naturel.

Cette technique part du postulat que le biofilm est une couche poreuse homogène, du point de vue du transport de matière, qui agit comme une barrière de diffusion. La variation de concentration d'une espèce électroactive, impliquée dans une réaction rédox rapide à l'interface électrode/couche poreuse, est distribuée entre :

* la couche poreuse où le transport est contrôlé par un processus de diffusion moléculaire

* la solution électrolytique où le transport est contrôlé par la diffusion convective

L'étude du transport de matière au voisinage d'une électrode recouverte par une couche poreuse non réactive repose sur l'analyse du courant limite de réduction ou d'oxydation d'un traceur électrochimique.

Une couche poreuse modèle d'un voile biologique composée de gélatine alimentaire a été élaborée. Il a alors été possible de développer un protocole expérimental ayant pour objet de caractériser ce film en terme d'épaisseur et de porosité. Celui-ci repose sur la mesure conjointe du courant limite stationnaire en fonction de la vitesse de rotation et de l'impédance électrohydrodynamique. Deux traceurs ont été employés : l'oxygène et le ferricyanure. L'obtention des mêmes caractéristiques géométriques (épaisseur et porosité) avec ces deux espèces rédox a permis de valider la méthode.

Le protocole a été ensuite adapté afin de suivre *in-situ* l'évolution du développement d'un biofilm formé en milieu naturel tel que l'eau de mer ou l'eau douce.

La technique a été appliquée pour l'étude de biofilms développés dans différents types d'eau de mer : additionnée de nutriment, stérile et naturelle.

L'addition d'extrait de levure à l'eau a permis d'obtenir des biomasses relativement épaisses facilitant ainsi l'adaptation du protocole expérimental.
L'expérimentation en milieu stérile a eu pour objet de déterminer le seuil de détection de la méthode.

Enfin, l'étude d'un biofilm développé en eau de mer naturelle, sans addition de nutriment, a été réalisée.

Le protocole a également été adapté pour des mesures en eau douce additionnée de nutriment. Afin d'éviter au maximum les problèmes d'entartrage, une solution d'eau de Volvic additionnée de ferri/ferrocyanure de potassium a été utilisée pour réaliser les mesures électrochimiques. Le milieu de mesure est alors différent du milieu de développement du biofilm.

Les voiles biologiques formés dans ces différents milieux ont été trouvés extrêmement poreux. Ces résultats sont en accord avec la littérature dans le chapitre bibliographique (De Beer et al., 1994 ; Lawrence et al., 1994). La porosité du biofilm pouvant être considérée comme égale à l'unité, seule l'épaisseur du biofilm reste a déterminer. Cette donnée a pu être obtenue simplement à partir d'une analyse du courant limite stationnaire de diffusion. Les épaisseurs de biofilm mesurées au Microscope Laser a Balayage Confocal sont en accord avec celles déterminées avec la technique décrite dans ce mémoire.

Par ailleurs, un courant non diffusionnel a été mis en évidence durant la formation du biofilm. Ce courant a été attribué à la production d'espèces électroactives par les microorganismes présents dans la biomasse. Son étude constitue une perspective d'étude pour ce travail.

Le blocage progressif de la surface active de l'électrode en or par le film bactérien a pu être mis en évidence par impédance AC. Cette technique contient l'ensemble des informations relatives au transport dans le biofilm et à la réactivité de la surface. Des études complémentaires sont nécessaires pour son utilisation comme méthode de mesure.

Le développement de capteurs permettant de suivre l'évolution des biomasses constitue la première application majeure de la technique décrite dans ce manuscrit. La
mise en oeuvre d'un tel capteur demande des études complémentaires afin d'automatiser les mesures et d'améliorer la sensibilité de la technique.

Le traceur oxygène offre l'avantage d'être naturellement présent dans le milieu. Son utilisation est tout indiquée pour le développement d'un capteur en milieu marin. Par contre, en raison de l'entartrage, l'oxygène n'est pas adapté pour les mesures électrochimiques en eau douce. Le développement d'un capteur en eau douce devra donc utiliser un traceur électrochimique tel que le ferricyanure injecté dans le milieu au voisinage du capteur.
# Annexes

## Dosage de l'oxygène dissous : Méthode de Winkler

### Etude bactéricide de toxicité bactérienne du ferri/ferrocyanure de potassium

### Préparation des échantillons destinés à l'observation en microscopie électronique à balayage

### Observation au microscope en épifluorescence

### Milieu culture Agar R2A

### Milieu de culture et procédure utilisés dans le chapitre §4.I.B concernant l'étude en eau de mer stérile

### Dosage de l'ATP

### Dosage du chlore résiduel

### Ajustement des paramètres par la technique de simplexe
# DOSAGE DE L'OXYGENE DISSOUS : METHODE DE WINKLER

La dissolution de l'oxygène dans l'eau dépend de la pression atmosphérique, de la pression de vapeur saturante, de la température de l'eau et de la salinité. La solubilité de l'oxygène est de 9 mg.L⁻¹ en eau pure à 20°C. L'accroissement de la salinité réduit la solubilité à 7,4 mg.L⁻¹ à 20°C et pour une salinité de 35‰. Les processus biologiques ont une influence prépondérante sur la concentration en oxygène. Ainsi, les zones riches en composés organiques en décomposition telles que les estuaires peuvent être totalement anoxiques et les zones où un fort développement de phytoplancton est observé peuvent engendrer une sursaturation pouvant aller jusqu'à 150-200%.

La méthode chimique dite de Winkler est la méthode de référence pour le dosage de l'oxygène dissous. Cette méthode a été optimisée par Carpenter (1965) et Caritt et Carpenter (1966).

L'eau à analyser est ajoutée à une solution de manganèse(II) précipitée par une base forte :

$$Mn^{2+} + 2OH^{-} \rightarrow Mn(OH)_{2} \downarrow$$

En milieu alcalin, l'oxygène réagit rapidement sur $Mn(OH)_2$ pour donner des oxydes de manganèse(III) et de manganèse(IV). Cette opération doit naturellement avoir lieu à l'abri de l'air.

$$2Mn(OH)_2 \downarrow + \frac{1}{2}O_2 + H_2O \rightarrow 2Mn(OH)_3 \downarrow$$

$$Mn(OH)_2 \downarrow + \frac{1}{2}O_2 \rightarrow MnO(OH)_2 \downarrow$$

Une fois l'oxygène totalement fixé, le milieu est acidifié. Le précipité se redissout. Le manganèse est ramené au degré d'oxydation II en oxydant des ions iodures en iode.
$$2 \text{Mn(OH)}_3 \downarrow + 2 \text{I}^- + 6 \text{H}^+ \rightarrow 2 \text{Mn}^+ + 6 \text{H}_2\text{O} + \text{I}_2$$ $$\text{MnO(OH)}_2 \downarrow + 2 \text{I}^- + 4 \text{H}^+ \rightarrow \text{Mn}^{2+} + 3 \text{H}_2\text{O} + \text{I}_2$$

Avec un excès d'ions iodure, l'équilibre suivant s'établit :

$$I_2 + I^- \rightleftharpoons I_3^-$$

L'iodé libéré est dosé à l'aide de thiosulfate :

$$2 \text{S}_2\text{O}_3^{2-} + \text{I}_3^- \rightleftharpoons \text{S}_4\text{O}_6^{2-} + 3 \text{I}^-$$

Le point équivalent du dosage de l'iodé par le thiosulfate est déterminé par
potentiométrie.

Le domaine des concentrations mesurables par ce dosage est compris entre 0,05 à 63 mg.L⁻¹. La précision de la mesure est d'environ ± 0,02 mg.L⁻¹.
# ETUDE BACTERICIDE DE TOXICITE BACTERIENNE DU FERRI/FERROCYANURE DE POTASSIUM

Cette étude a pour objet d'évaluer l'impact du ferri/ferrocyanure de potassium sur la flore bactérienne. Cette étude a été réalisée au CIRSEE / Lyonnaise des Eaux.

Une population bactérienne est mise en contact avec du ferri/ferrocyanure de potassium $10^{-2}M$ pendant 1 heure. L'eau de Seine (après dégrillage et filtration) a été choisie en raison de sa charge bactérienne naturellement élevée. Cette eau contient $6,44 10^4$ ufc.mL$^{-1}$ mesurées par dénombrement des bactéries revivifiables sur gélose R2A (cf. Annexe milieu de culture) après incubation à 20°C pendant 7 jours.

Des solutions de $K_3Fe(CN)_3$ et $K_4Fe(CN)_6$ sont préparées à une concentration de $10^{-1}M$. Un volume de 10 mL de chaque solution est ajouté à 80 mL d'eau de Seine pour atteindre une concentration finale de $10^{-2}M$ de chaque produit.

La concentration bactérienne résiduelle mesurée par étalement sur gélose R2A est de $14,3 10^4$ bactéries.mL$^{-1}$.

La densité bactérienne finale après contact avec le ferri/ferrocyanure de potassium est identique à la valeur initiale aux incertitudes près. Le ferri/ferrocyanure de potassium ne présente pas de toxicité vis à vis de la flore bactérienne de l'eau de Seine. Ces résultats montrent donc que le ferri/ferrocyanure de potassium n'a pas d'effet bactéricide.
# PREPARATION DES ECHANTILLONS DESTINES A L'OBSERVATION EN MICROSCOPIE ELECTRONIQUE A BALAYAGE

Les échantillons sont fixés dans une solution de glutéraldéhyde 2,5% préparée en eau de mer filtrée sur 0,2 µm.

Ils sont ensuite rincés dans des bains de salinité décroissante (eau de mer artificielle stérile/eau distillée v/v : 100, 75/25, 50/50, 25/75, 0/100). L'eau de mer artificielle est préparée à une concentration 30 g/l de seasalt Sigma (mélange de sels proche de la composition des sels dissouts dans l'eau de mer).

Ils sont ensuite partiellement déshydratés dans des bains d'éthanol de degré croissant (25°, 50°, 70°, 95° et 100°). Cette déshydratation est complétée par un passage au point critique selon la méthode décrite par Anderson (1951).

La surface à observer est ensuite métallisée par une fine couche d'or (200-300 Å). L'observation est effectuée sur un Microscope Electronique à Balayage.
# OBSERVATION AU MICROSCOPE EN EPIFLUORESCENCE

Le nombre de bactéries est déterminé en comptant les cellules fluorescentes après coloration au DAPI (4,6-diaminophénylindole) ou à l'acridine orange à une concentration finale de 0,1 % suivant une technique décrite par Troussellier *et al.* (1985).

## Préparation des colorants

L'eau distillée est stérilisée par filtration sur un filtre Whatman humide de 25 mm de diamètre et de porosité 0,2 µm dans un erlenmeyer stérile avec une pression toujours inférieure à 10 cm de mercure. Cette eau distillée stérile peut être conservee au réfrigérateur (+ 4°C).

Une solution mère de DAPI à 1 mg.L⁻¹ est préparée et conservée au réfrigérateur. Cette solution est diluée au 1/100e à l'aide d'eau distillée stérile pour obtenir une solution de DAPI à 10 µg.ml⁻¹ stable 1 mois à l'abri de la chaleur et de la lumière. Avant utilisation, le DAPI est stérilisé par filtration (0,2 µm).

Une solution mère d'acridine orange est préparée à une concentration de 10 g.L⁻¹. La solution finale est obtenue par dilution de la solution mère pour atteindre une concentration de 0,25%.

## Préparation des échantillons

*Dénombrement des cellules obtenues par filtration d'un volume donné d'un milieu*

Sur un matériel préalablement stérilisé par autoclavage, 3 échantillons et un témoin de 10 mL sont filtrés sur filtre noir Isopore 0,2 µm. Les échantillons correspondent chacun
à une solution composée de 9 mL de milieu prélevé à la sortie de la cellule additionné de 1 mL de DAPI et le témoin à 9 mL d'eau distillée stérile additionné de 1 mL de DAPI à 10 µg.mL⁻¹. Après cette filtration, le filtre noir isopore est séché puis monté entre lame et lamelle avec de l'huile à immersion non fluorescente.

## Dénombrement des cellules présentes sur la surface de l'électrode

L'échantillon est fixé par immersion dans une solution de formol 2,5% pendant au moins 3 heures. L'embout est séché près de la flamme d'un bec Bunsen, plongé dans le bain de coloration à l'acridine orange ou au DAPI pendant quelques minutes et séché près de la flamme. Une goutte d'huile à immersion non fluorescente est placée sur la préparation qui est ensuite recouverte d'une lamelle. L'embout est observé au grossissement 40 ou 100 en immersion dans l'huile.

## Dénombrement des cellules

Les observations de tels échantillons s'effectuent à l'aide d'un microscope à épifluorescence (objectif 100). Pour que l'estimation soit représentative de la réalité, il est nécessaire de réaliser un dénombrement bactérien sur un nombre assez grand de champs d'observation. Dans le cas présent, un nombre moyen de bactéries par champ a été déterminé à partir de 15 champs choisis de façon aléatoire sur la surface du filtre. La connaissance de la surface d'un champ ainsi que la surface du filtre permet d'atteindre le nombre de bactéries par mL de solution filtrée :

$$ \text{Nbre de bactéries. mL}^{-1} = \frac{\text{Nbre de bactéries moyen par champ} \times \text{surface du filtre}}{\text{volume filtré} \times \text{surface du champ}} $$
# MILIEU CULTURE AGAR R2A

## Composition du milieu de culture Agar R2A par litre (Laboratoire Difco)

<table><tr><td>Extrait de levure bactérienne</td><td>0,5 g</td></tr><tr><td>Peptone protéose bactérien n°3</td><td>0,5 g</td></tr><tr><td>Acide casamine bactérien</td><td>0,5 g</td></tr><tr><td>Dextrose bactérien</td><td>0,5 g</td></tr><tr><td>Amidon soluble</td><td>0,5 g</td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>0,3 g</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium</td><td>0,3 g</td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>0,05 g</td></tr><tr><td>Agar bactérien</td><td>15 g</td></tr></table>
# MILIEU DE CULTURE ET PROCEDURE UTILISES
DANS LE CHAPITRE §4.I.B
CONCERNANT L'ETUDE EN EAU DE MER STERILE

Le milieu de culture composé de 55,1 g de marine agar 2216 (Difco) dissous dans 1 L d'eau distillée est porté à ébullition pour être homogénéisé. Cette préparation est ensuite autoclavée pendant 20 minutes à 121°C et 1 bar.

A la flamme, sous la hotte à flux laminaire auparavant stérilisée, le milieu de culture encore liquide est étalé dans des boîtes de Pétri stériles. Après refroidissement à température ambiante (12 h environ), les boîtes sont retournées et conservées au réfrigérateur (+ 4°C).

Les étalements sont réalisés sous la hotte stérile, à la flamme en étalant 0,1 mL d'échantillon (eau de mer prélevée à la sortie de la cellule) et 0,1 mL de témoin (eau distillée stérile) sur le milieu de culture. Puis, les boîtes de Pétri sont incubées dans une étuve à 35°C.
# DOSAGE DE L'ATP (ADENOSINE TRIPHOSPHATE)

Le dosage de l'ATP est effectué à l'aide d'un Kit Microbial Biomass Test par mesure de luminescence.

## Présentation du Kit

Un Kit permet d'effectuer cent analyses. Il comporte 4 flacons Lumit QM, 4 flacons de Lumit QM diluent et 1 flacon de NRM.

### Lumit QM

Le lumit QM est un complexe luciférase/D. luciférine, lyophilisé, purifié et standardisé.

La luciférase est une enzyme purifiée à partir de bactéries obtenues par génie génétique. La D. luciférine reproduit le phénomène de bioluminescence des lucioles. Elle catalyse une réaction lumineuse en présence d'ATP, de D. luciférine et d'ions Magnésium.

L'ensemble luciférase/D. luciférine est très rigoureusement contrôlé afin d'obtenir une bioluminescence standardisée avec une variation maximale de 10%. Le complexe est stabilisé avec un mélande de sérum albumine de bovin et de dithiothiéitol qui est un protecteur de groupement Sulphydryl des luciférases.

### "Lumit QM diluent"

Le Lumit QM diluent contient un tampon HEPES pH 7,75, un stabilisateur de la réaction enzymatique, des ions Mg²⁺ (MgSO₄), une faible quantité d'azide de sodium ainsi qu'un agent chélatant (EDTA). Ce dernier composant permet d'éviter les interférences dues aux ions Ca²⁺ et aux ions métalliques inhibiteurs. Ce produit se conserve au réfrigérateur.
## NRM (Nucleotide Releasing reagent for Microbial cells)

Le NRM est un agent tensioactif extractant de l'ATP total de l'échantillon. Il permet, par augmentation de la porosité bactérienne, une entrée massive d'eau dans la cellule et la sortie de l'ATP par diffusion. Il est fourni sous forme stérile et prêt à l'emploi. Il se conserve au réfrigérateur après ouverture.

## Reconstitution du Réactif Lumit QM

La reconstitution du Lumit QM est effectuée en transvasant le flacon contenant le "Lumit QM diluent" dans le flacon contenant la poudre lyophilisée du Lumit QM puis de retourner très doucement une à deux fois le flacon rebouché pour s'assurer une complète dilution de l'enzyme. Une agitation trop rapide du mélange peut provoquer une perte d'activité de la luciférase.

Ce mélange peut se conserver 24 h au réfrigérateur ou 4 jours au congélateur à l'abri de la lumière. Une température trop élevée peut provoquer une perte d'activité de la luciférase.

## Protocole

La première étape consiste à tracer une courbe d'étalonnage à l'aide d'une gamme étalon d'ATP standard.

### Solution tampon de glycine à 10mM

Cette solution tampon est utilisée pour stabiliser la gamme étalon d'ATP pendant 1 h.

Dissoudre 750 mg de glycine dans 1 L d'eau distillée désionisée. Neutraliser avec de la soude à 0,1N et l'amener à un pH de 11. Fractionner la solution obtenue dans des tubes à essais pouvant être fermés puis autoclaver à 114°C pendant 30 min pour stériliser.
Cette solution mère est diluée pour obtenir un tampon glycine à 2 mM comme agent de dilution. Cette dilution est réalisée à l'aide d'un matériel stérile.

## ATP Standard

L'ATP a un poids moléculaire de 507,2. Il est présenté en flacon contenant 10 µg d'ATP sous forme de sel disodique lyophilisé. L'ATP est reconstitué en ajoutant 5 ml d'eau distillée stérile. La solution mère obtenue a donc un titre de $2 \times 10^{-3} g.L^{-1}$. L'ATP lyophilisé est stable 1 an à -22°C ou 6 mois à 4°C. La solution mère d'ATP se conserve 4 semaines à -22°C.

Pour la préparation de la gamme étalon d'ATP standard à de plus faibles concentrations, la solution mère est diluée dans une solution tampon de glycine 2 mM qui permet la stabilisation de la solution diluée d'ATP pendant 1 h.

Une gamme étalon d'ATP standard de 2000 à 1 pg/100µL est alors réalisée afin de tracer une droite d'étalonnage.

## Echantillons (billes de verre)

Vingt billes de verre sont placées dans 10 mL d'eau stérile et passées au bain à ultra-sons pendant 2 min. Cette opération est réitérée 2 fois avec les mêmes billes. La quantité d'ATP dans la solution de 30 mL obtenue est alors mesurée.
# DOSAGE DU CHLORE RESIDUEL
METHODE A L'ORTHOTOLIDINE

L'addition d'orthotolidine à l'eau contenant du chlore résiduel provoque l'apparition d'une coloration jaune susceptible d'une comparaison spectrométrique.

Les lectures au spectromètre sont réalisées à la longueur d'onde de 440 nm. L'une courbe d'étalonnage est réalisée à partir de solutions de chromate bichromate à différentes concentrations. Chaque concentration de chromate bichromate donne une coloration correspondant une concentration donnée de chlore.

## Mode opératoire

Introduire 0,5 mL de solution d'orthotolidine à 0,1% dans un tube à essais. Ajouter 10 mL d'eau à analyser. Agiter. Attendre 3 min. Effectuer une lecture au spectromètre à 440 nm. Se reporter à la courbe d'étalonnage.

## Réactifs

* **Solution d'acide d'orthotolidine à 0,1%**
  135 mg de chlorohydrate d'orthotolidine dans 50 mL d'eau distillée puis ajouté dans 50 mL d'acide chlorhydrique à 30%

* **Solution tampon mère de phosphates disodique et monopotassique**
  28,66 g de Na₂HPO₄, 2 H₂O et 46,14 g de KH₂PO₄ dans 1 L d'eau distillée

* **Solution tampon fille de phosphate à 0,1M**
  200 mL de la solution mère additionnée de 1 L d'eau distillée

* **Solution de chromate-bichromate dont la coloration correspond à une teneur en chlore de 1 mg.L⁻¹**
  0,155 g de dichromate de potassium anhydre et 0,465 g de potassium anhydre dans 1 L de solution tampon fille
# AJUSTEMENT DES PARAMETRES PAR LA TECHNIQUE DE SIMPLEXE

La méthode de simplexe est employée pour l'ensemble des ajustements de paramètres. A titre d'exemple, cette annexe illustre son fonctionnement pour la loi §2.17 comportant 3 paramètres $i_0, i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$. Le but de la méthode SIMPLEXE est de trouver le meilleur jeu de paramètres ($i_0, i_\infty^{-1}, K^{-1}$) c'est-à-dire celui qui reproduit le mieux les résultats expérimentaux. Cette présentation expose le concept et l'illustration du programme SIMPLEXE. Ce programme a été développé à l'UPR15 du CNRS.

## Principe du programme SIMPLEXE

Le programme, écrit en langage FORTRAN, possède de multiples options afin de s'adapter aux différentes utilisations. Les données peuvent être réelles ou complexes comme dans le cas de l'impédance.

L'expression arithmétique représentative des données expérimentales que l'on désigne par la fonction de lissage §2.17 peut être exprimée de façon générale par :

$$i(\Omega) = f_{th}(\Omega, p_1, p_2, p_3, \dots, p_j, \dots, p_s)$$

où $p_j$ représente le paramètre de composant $j$ ($i_0, i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ dans cet exemple). Le programme fonctionne par itérations successives afin de minimiser l'écart global entre $i_{th}(\Omega)$ et $i_{exp}(\Omega)$ sur l'ensemble des points expérimentaux (soit $n_f$ points).

L'écart total $z$ entre la fonction expérimentale et celle de lissage peut alors être défini par :

$$z = \sum_{j=1,n_f} (Z_{th,j} - Z_{exp,j})^2$$

et la valeur quadratique moyenne des écarts est définie dans le cas général par :
$$ \sqrt{\sum_{j=1,n_f} \frac{(Z_{th,j} - Z_{exp,j})^2}{2n_d t_j^2}} $$

avec $n_d = n_{th} - n_{exp}$ = nombre de degré de liberté, les $t_j$ sont les erreurs expérimentales a priori et où les indices "exp" et "th" indiquent respectivement les valeurs expérimentales et celles calculées selon la fonction de lissage.

La recherche de z s'effectue par itérations successives selon une stratégie qui repose sur deux points. D'une part, le jeu de paramètres p est considéré comme un vecteur de dimension s(p) et le programme cherche l'azimuth où se localise un minimum. Ce minimum n'est malheureusement pas toujours le minimum recherché, c'est-à-dire le minimum global absolu mais seulmement le minimum local. Le programme modifie simultanément tous les paramètres selon l'azimuth déterminé. D'autre part, le programme ajuste le pas de la variation du vecteur p, soit deux fois plus grand soit deux plus petit, suivant le cas.

Ceci permet d'atteindre rapidement le voisinage du minimum puis d'affiner le jeu de paramètres.

Les deux étapes qui viennent d'être décrites constituent un pas d'itération de SIMPLEXE. Le nombre d'itération est ici fixé à 200. Toutefois, si la variation de z d'une itération à l'autre devient inférieure à $10^{-14}$, c'est-à-dire proche de la résolution numérique désirée, le calcul se termine alors spontanément une fois le jeu de paramètres ajustés. Le programme modifie la valeur initiale de chaque paramètre dans un large domaine puis effectue de nouveau le calcul itératif afin d'extraire le minimum local éventuel. Cette étape d'expansion est répétée trois à cinq fois selon le cas. En définitive, le programme SIMPLEXE appelle entre 2000 et 3000 fois le calcul de la fonction de lissage.
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Les travaux de recherche décrits dans cette thèse ont donné lieu aux publications et communications suivantes :

PUBLICATIONS

International

E. L'Hostis, C. Deslouis, B. Tribollet et D. Festy, "EHD and State Measurements for Characterisation of Transport Properties in a Gel Layer", *Electrochimica Acta*, **41**(7/8), 1996, p. 1393-1399.

E. L'Hostis, C. Compère, D. Festy, B. Tribollet, C. Deslouis, "Characterisation of Biofilms formed on Gold in Natural Seawater by the Oxygen Diffusion Analysis", *Corrosion NACE* (in press).

Proceedings

E. L'Hostis, B. Tribollet et D. Festy, "Caractérisation d'un biofilm formé eau de mer par analyse du transport de matière", *Eurocorr'96*, 24-26 septembre 1996, Nice.

E. L'Hostis, B. Tribollet et D. Festy, "Caractérisation d'un Biofilm formé en Eau de Mer par Analyse du Transport de Matière", 9ème *Forum sur les Impédances Electrochimiques*, novembre 30 1995, Paris, France, p. 76-86.

E. L'Hostis, C. Compère, D. Festy, B. Tribollet, C. Deslouis, "Characterisation of Biofilms formed on Gold in Natural Seawater by the Oxygen Diffusion Analysis", 1995 *Internationnal Conference on Microbially Influenced Corrosion*, May 8-10 1995, New Orleans, Louisiana, USA, p 60/1-60/11.

E. L'Hostis, B. Tribollet, C. Deslouis et D. Festy, "Caractérisation des Propriétés de Transport dans une Couche de Gel par Mesures en Régime Stationnaire et Impédance EHD", 8ème *Forum sur les Impédances Electrochimiques*, novembre 21 1994, Paris, France, p. 93-103.

A. Ambari, B. Tribollet, C. Compère, D. Festy et E. L'Hostis, "Detection and Characterisation of Biofilm in Natural Sea Water by Analysing Oxygen Diffusion under Controlled Hydrodynamic Conditions", *Third European Federation of Corrosion Workshop on Microbial Corrosion*, March 13-16 1994, Estoril, Portugal, p. 211-222.

COMMUNICATIONS

E. L'Hostis, B. Tribollet, L. Kiene and D. Festy, "Characterization of Biofilm by Mass Transport Analysis", 4th COST 511 workshop, Project n°60, May 30-31 1996, Budapest, Hungary.
E. L'Hostis, C. Deslouis, B. Tribollet et D. Festy, "EHD and State Measurements for Characterization of Transport Properties in a Gel Layer", 3rd COST 511 workshop, Project n°60, June 15-16 1995, Helsinki, Finlande.

R. Rousseau, E. L'Hostis, L. Roue, M. L'Her, "Etude du Transfert d'Electron et de Matière à l'aide d'une Microélectrode Liquide-Liquide", *Journées d'Electrochimie*, May 29 - June 1st 1995, Strasbourg, France.

E. L'Hostis, C. Deslouis, B. Tribollet et D. Festy, "EHD and State Measurements for Characterization of Transport Properties in a Gel Layer", 3rd *International Symposium on Electrochemical Impedance Spectroscopy*, May 7-12 1995, Nieuwpoort, Belgique.

B. Tribollet, C. Compère, D. Festy et E. L'Hostis, "Modeling of Oxygen diffusion through Biofilm", 2nd COST 511 workshop, Projet F3, June 30 - July 1st 1994, Brest, France.
Le développement de biofilms sur les surfaces immergées en milieu aquatique naturel a un impact très important sur la productivité et la compétitivité industrielle ainsi que sur la santé publique. L'objectif de ce travail est d'élaborer et de développer une technique de détection et de caractérisation des biofilms formés en milieux naturels d'un point de vue physico-chimique (porosité, épaisseur et coefficient de diffusion). Les biofilms peuvent être considérées comme une couche poreuse homogène, à l'échelle macroscopique, du point de vue du transport de matière. La méthode développée dans ce travail repose sur l'analyse du courant limite de réduction d'un traceur rédox contrôlé par le transport de matière. La variation de concentration de l'espèce diffusante est distribuée entre la couche poreuse où seule intervient la diffusion moléculaire et la solution électrolytique, siège de la diffusion convective. A partir des mesures du courant limite de diffusion en fonction des conditions hydrodynamiques, il est possible de distinguer les contributions respectives de ces processus diffusionnels et d'atteindre ainsi des paramètres propres à la couche. La première étape du travail expérimental est l'élaboration d'une couche poreuse modèle reproduisant le comportement d'un biofilm ainsi que le développement d'un protocole expérimental ayant pour objet la caractérisation de sa géométrie par analyse du transport de matière. La seconde étape est l'adaptation du protocole mis au point avec la couche modèle afin de suivre in-situ l'évolution d'un biofilm développé en milieu naturel tel que l'eau de mer ou l'eau douce. A chaque étape, des observations (Microscope Electronique à Balayage, cultures, épifluorescence, Microscope Laser à Balayage Confocal) sont réalisées pour permettre l'interprétation des résultats obtenus du point de vue de la biologie. Le prolongement naturel de cette étude sera le développement d'un capteur pour détecter in-situ les biomasses et de les caractériser par leur géométrie (épaisseur et porosité).

**MOTS CLEFS** : Electrochimie, Biofilm, Transport de matière, Couche poreuse, Impédances, Réduction de l'oxygène.

The biofilm development on immersed surfaces in a natural aquatic medium has a very important impact on industrial productivity and competitiveness as well as on public health. The objective of this work is to develop a detection and characterisation technique of biofilms formed in natural media using a physico-chemical approach (porosity, thickness and diffusion coefficient). Biofilms can be considered as homogeneous porous layers on a macroscopic scale for the mass transport. The method developed in this work is based on the analysis of the redox tracer reduction limit current which is controlled by the mass transport. The diffused species concentration variation is distributed between the porous layer where only the molecular diffusion takes place and the electrolytic solution where the convective diffusion occur. From the measurements of diffusion limit current as a function of hydrodynamic conditions, it is possible to distinguish the contributions of each diffusional process and to obtain the parameters of the layer. The first step of the experimental work is the production of a model porous layer reproducing the biofilm behavior, as well as the development of an experimental protocol for the characterisation of its geometry by mass transport analysis. The second step is the adaptation of the protocol in order to monitor in-situ the evolution of a biofilm developed in natural medium such as sea water or fresh water. For each step, some observations are made (Scanning Electronic Microscopy, cultures, epifluorescence, Confocal Laser Scanning Microscopy) for permitting the interpretation of the results obtained from a biological viewpoint. The natural prolongation of this study will be the development of a sensor for monitoring in-situ the biomass and to characterise it by its geometry (thickness and porosity).

**KEY WORDS** : Electrochemistry, Biofilm, Mass Transport, Porous Layer, Impedances, Oxygen reduction.