# Évaluation de l'effet antilithiasique, cystinique et oxalo-calcique d'extrait aqueux de Zilla spinosa L.

Mecheri Rim, Boutefnouchet Abdelatif, Smati Dalila, Daudon Michel

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

## To cite this version:

Mecheri Rim, Boutefnouchet Abdelatif, Smati Dalila, Daudon Michel. Évaluation de l'effet antilithiasique, cystinique et oxalo-calcique d'extrait aqueux de Zilla spinosa L.. 2023. hal-03952113

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Submitted on 23 Jan 2023

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Évaluation de l'effet antilithiasique, cystinique et oxalo-calcique d'extrait aqueux de
*Zilla spinosa* L.

Evaluation of antilithiasic, cystine and oxalo-calcium effect of *Zilla spinosa* L. aqueous extract

Mecheri Rim a*, Boutefnouchet Abdelatif b, Smati Dalila c, Daudon Michel d

a Département de pharmacie, Faculté de médecine, Université Badji Mokhtar, Annaba, Algérie

ᵇLaboratoire de biophysique, Faculté de médecine, Université Badji Mokhtar, Annaba, Algérie

c Département de pharmacie, Faculté de médecine, Université Benyoucef Benkhadda, Alger, Algérie

d Service d'explorations fonctionnelles, Hôpital Tenon, Paris, France

Adresse e-mail : pharma_rym@yahoo.fr (Rim Mecheri).

<footnote>* Auteur correspondant.</footnote>
Résumé

*Objectif.* — En Algérie, comme en plusieurs pays africains, un grand nombre de personnes utilisent la thérapie traditionnelle dans le traitement des maladies dont la lithiase urinaire. Le but de la présente étude est d'évaluer l'effet de l'extrait aqueux de *Zilla spinosa* L, réputée antilithiasique dans le Nord-Est algérien, sur deux types de lithiase cystinique et oxalocalcique.

*Méthodes.* — L'effet antilithiasique de l'extrait aqueux de *Z. spinosa* a été évalué in vitro par la dissolution des calculs rénaux de cystine et in vivo par l'effet après l'induction de la lithiase oxalocalcique. Les paramètres biochimiques urinaires ont été mesurés et les coupes histologiques des reins ont été analysées.

*Résultats.* — On a noté une différence significative (P ≤ 0.001) de perte de masse des calculs cystiniques, environ 65% en présence d'extrait de *Z. spinosa* par rapport à la solution témoin pour laquelle la perte de masse n'est que d'environ 23% au terme des 8 semaines d'expérimentation. L'extrait aqueux de la plante n'a pas inhibé le développement des calcifications parenchymateuses et papillaires par conséquent, aucun effet prévenant le développement des cristaux d'oxalate de calcium rénaux. Cependant l'eau de source a présenté un effet plus efficace par rapport à l'extrait aqueux de *Z. spinosa*, en effet, elle a contribué à la diminution remarquable des dépôts des cristaux surtout sur le plan cortico médullaire.

*Conclusion.* — L'extrait de *Z. spinosa* tel qu'il est préconisé en usage traditionnel montre une meilleure activité litholytique sur les calculs de type cystine plutôt que ceux d'oxalate de calcium.

**Mots clés :** *Zilla spinosa* L. ; Oxalate de calcium ; Cystine ; Rats ; In vitro ; In vivo.
**Summary**

*Objective.* — In Algeria, as in several African countries, a large number of people use traditional therapy in the treatment of diseases including urinary lithiasis. The aim of the present study is to evaluate the effect of the aqueous extract of *Zilla spinosa*, reputed to be antilithiasis in the Algerian Northeast, on two types of cystine and oxalocalcic lithiasis.

*Methods.* — The antilithiasis effect of the aqueous extract of Z. spinosa was evaluated in vitro by the dissolution of cystine renal calculi and in vivo by the effect after the induction of oxalocalcic lithiasis. Urinary biochemical parameters were measured and histological sections of kidneys were analyzed.

*Results.* — There was a significant difference (P ≤ 0.001) in the loss of mass of cystine stones, about 65% in the presence of *Z. spinosa* extract compared to the control solution for which the loss of mass was only about 23% at the end of the 8 weeks of experimentation. The aqueous extract of the plant did not inhibit the development of parenchymal and papillary calcifications and therefore had no effect in preventing the development of renal calcium oxalate crystals. However, the spring water showed a more effective effect than the aqueous extract of *Z. spinosa*, in fact, it contributed to the remarkable decrease of the crystals deposits especially on the cortico-medullary level.

*Conclusion.* — The extract of *Z. spinosa* as recommended in traditional use shows a better litholytic activity on cystine stones than on calcium oxalate stones.

**Key words:** *Zilla spinosa* L. ; Calcium oxalate; Cystine; Rats; In vitro; In vivo.
## Introduction

La lithiase urinaire, est une affection très répandue qui touche 4 à 18% de la population, préférentiellement une population active [1,2]. En progression dans tous les pays industrialisés, sa fréquence a presque doublé depuis un demi-siècle [3].

La lithiase étant une pathologie récidivante dans presque un cas sur deux [3] et le risque de récidive à 5 ans est estimé à plus de 50 %. Environ 5-10 % des sujets lithiasiques ont une forme sévère avec des récidives multiples et parfois une altération de la fonction rénale [4].

Une série de 360 [5] puis de 1354 calculs urinaires de l'adulte [6] provenant de quatre grandes villes de l'Ouest algérien a été étudiée. La fréquence de la lithiase vésicale est élevée puisqu'elle représente 45,5% des calculs d'origine masculine traités urologiquement. La composition cristalline montre que l'oxalate de calcium monohydraté (Whewellite) est majoritaire dans 48,1%. Ces chiffres n'ont pas été repris dans l'étude élargie comportant 1354 calculs publiée près de 10 ans plus tard. Cependant, en raison de sa signification pathologique forte, la présence de struvite a été réévaluée dans cette plus grande série [6]. Les données rapportées montrent que 28,8% de l'ensemble des calculs contenaient de la struvite, suggérant une forte implication des infections à germes uréasiques dans la formation ou le développement des calculs observés dans l'Ouest Algérien.

Il ressort de l'analyse des données que la lithiase urinaire dans l'Ouest algérien a tendance à évoluer dans le même sens que celle des pays industrialisés. Toutefois, les infections urinaires restent une cause fréquente de lithiase [5,6] par rapport à d'autres études effectuées en Europe [7,8].

De nombreux patients ont recours à la médecine conventionnelle pour éliminer les calculs urinaires, mais ne préviennent pas la formation de nouveaux calculs [9] avec en plus des effets secondaires non négligeables [10]. De ce fait, il est utile de chercher une alternative à la lithotritie extracorporelle ou aux méthodes endoscopiques, par exemple en utilisant des plantes médicinales qui pourraient aider à l'expulsion des fragments de calculs, voire à prévenir leur formation. Dans le cas de la lithiase rénale, on compte plus de 70 espèces ayant des propriétés anti lithiasiques [11]. Ces études sont presque exclusivement orientées vers les lithiases calciques [11, 12, 13], cependant on ne trouve pas assez de recherches consacrées à l'étude de la lithiase cystinique qui est la conséquence d'une anomalie héréditaire du transport rénal (tube contourné proximal) et intestinal (jéjunum) de la cystine et des acides aminés dibasiques [14, 15].

Notre travail tente à évaluer l'effet antilithiasique cystinique et oxalo-calcique de l'extrait aqueux de Zilla spinosa : In vitro par la dissolution des calculs rénaux de cystine et in vivo par l'effet après l'induction de la lithiase oxalocalcique.
# MATERIEL ET METHODES

## Matériel végétal

Les échantillons de Z. spinosa ont été prélevée au niveau de Sahara central à Tamanrasset (Sud algérien) dans la partie montagneuse 'Tifouugen' 1200m en décembre 2014 et séchés à l'étuve à 45 °C pendant toute une nuit.

La préparation d'extrait et le choix des concentrations ont été calqués sur le mode opératoire recommandé en médecine traditionnelle [16].

## Test de dissolution des calculs de cystine in vitro

Le test a été réalisé au niveau du laboratoire de Biochimie Appliquée du département de biochimie de la faculté des sciences (Université Badji Mokhtar, Annaba, Algérie).

Douze calculs rénaux de cystine pure de sous type Va [3], de dimensions comparables provenant du laboratoire de physique de la faculté de médecine d'Annaba ont été utilisés. Leur masse moyenne était de 160.01±24.14mg.

L'extrait a été préparé par infusion, pendant 30 minutes, de 10 g de poudre de la plante Z. spinosa dans 100 ml de solution de chlorure de sodium (NaCl) à 9 g/L préalablement portée à ébullition. L'extrait a été ensuite filtré avant l'utilisation. Une solution de NaCl à 9g/l a été préparée pour être utilisée comme solution témoin dans notre expérimentation.

Les solutions ainsi préparées (extrait et solution témoin de NaCl) ont été réparties par fractions de 30 ml dans des béchers contenant au préalable un égal volume de tampon phosphate (Na2 HPO4 à M/15 et KH2PO4 à M/15) de pH égal à 6. Les calculs ont été placés chacun dans un sachet poreux en fibres tressées pour éviter tout contact avec la paroi du contenant. Les extraits, ainsi préparés et la solution témoin de NaCl ont été changés tous les 3 jours après mesure de leur pH et l'expérimentation s'est déroulée au total pendant huit semaines cumulées à température ambiante sous agitation dans un shaker.

La pesée des calculs a été effectuée à l'aide d'une balance de précision toutes les deux semaines après rinçage à l'eau distillée et un séchage pendant 18h à 40°C. Pour chaque type d'extrait, les expériences ont été répétées avec six calculs afin de déterminer la moyenne des masses mesurées ainsi que la moyenne des pH. Le taux de dissolution des calculs a été déterminé selon l'équation suivante :

$$a\% = (m_i - m_f) \cdot 100 / m_i$$

a% : Taux de dissolution du calcul.

mi et mf : Moyenne des masses des calculs avant et après le maintien dans les solutions

Le protocole d'expérimentation et de mesure, réalisé pour les extraits de plante, a été également réalisé pour la solution témoin de chlorure de sodium (NaCl) à 9 g/L.
## Observations micrographiques

L'observation micrographique de nos échantillons a été effectuée par un microscop électronique à Balayage (MEB) à effet de champ JEOL JSM-7100F sous une tension de 2kV.

## Etude statistique

L'analyse statistique des données a été réalisée en utilisant le logiciel Minitab 16. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart type. La comparaison entre les différents groupes a été effectuée après une analyse de la variance (ANOVA), les moyennes sont comparées 2 à 2 par test de Tukey. Les différences sont considérées comme :

- significatives lorsque ($P \le 0,05$).

- hautement significative comparant au témoin ($P \le 0,01$).

- très hautement significative comparant au témoin ($P \le 0,001$). Avec P : Seuil de signification.

## Modèle de cristallisation oxalo-calcique *in vivo*

L'objectif de notre étude est double, nous avons testé une infusion de Z. spinosa telle qu'elle est préconisée en usage traditionnel, et par la même occasion, nous avons testé une eau de source réputée anti-lithiasique et à la fin de l'expérience, nous avons comparé les résultats obtenus.

Le test a été réalisé au niveau du laboratoire de Biophysique de la faculté de médecine Annaba.

## Expérimentation sur les animaux

Nous avons utilisé 48 rats de la souche Wistar albinos, provenant de l'institut pasteur d'Alger âgés de 7-8 semaines, pesant 180 g. Les rats ont été soumis à une période d'adaptation de deux semaines environ, aux conditions de l'animalerie ; à une température de 22°C ± 2°C, de degré hydrométrique de l'ordre de 40 % et une photopériode naturelle (12h/12h). Les rats sont élevés dans des cages en polyéthylène qui dispose de mangeoires et des biberons d'eau. Les cages tapissées d'une litière constituée de copeaux de bois, sont nettoyées ; Notons que les rats avaient un libre accès, durant la période d'adaptation, à l'eau et à la nourriture qui a été fournie sous forme de granule fournis par l'Office National des Animaux et du Betail (ONAB).

## Préparation de l'extrait aqueux brut

La préparation de l'extrait aqueux brut, administré quotidiennement aux rats de notre expérience, a été faite en utilisant 10g de poudre des parties aériennes de Z. spinosa infusés dans 100ml d'eau distillée bouillie pendant 15 minutes. L'extrait ainsi obtenu a été filtré et prêt pour l'utilisation.

## Induction de la lithiase rénale oxalo-calcique

Afin d'induire la lithiase oxalocalcique chez nos rats, nous avons opté pour la méthode d'induction par l'oxalate de sodium en se basant sur la composition du régime alimentaire et des apports bien proportionnés entre l'Oxalate et le Calcium. Ainsi, la formation des cristaux d'oxalate de calcium monohydraté (Whewellite) sera obtenue par hyperoxalurie induite par une
rétention rénale accrue et l'excrétion de l'oxalate dont le chargement dans l'urine est relativement plus important que celui du calcium. Nous avons jugé que ce mode opératoire présente un moindre risque d'intoxication contrairement aux méthodes classiques qui utilisent l'injection d'inducteurs de lithiase rénale oxalocalcique in vivo, comme l'éthylène glycol, qui présente une toxicité élevée.

## Préparation de la nourriture

La nourriture est composée de substances nutritives riches en minéraux et oligoéléments :

- *Substances nutritives* : Au nombre de cinq, elles présentent la plus grande proportion de cette nourriture dont le rôle essentiel est de rassasier les rats et subvenir à leur faim.

- *Minéraux* : Sont introduits sous forme de produits chimiques et concernent le sodium, le potassium, le magnésium et le calcium. Ce dernier, qui rentrera directement dans la composition des cristaux de Whewellite, a été utilisé globalement avec une proportion de 0,11% pour le régime pauvre en calcium et à 0,75% pour le régime normo-calcique. Ces composés chimiques ont été ensuite mélangés et suffisamment broyés puis introduits dans le produit de nutrition final.

- *Oligoéléments* : Les minéraux utilisés en guise d'oligoéléments (Fe, Zn, ...) ont été introduits à partir de composés chimiques avec les mêmes proportions pour les régimes normo-calcique et pauvres en calcium. Après pesée, mélange et broyage, ils ont été rajoutés dans le produit nutritif final.

L'introduction de l'oxalate de sodium NaOx a été ciblée pour l'induction des cristaux de Whewelitte et ne concerne, de ce fait, qu'un ensemble de rats selon le protocole envisagé. La quantité administrée est de 20g/kg de nourriture fournie.

Le produit nutritif final a été pétri (pendant 15 mn) en utilisant une quantité adéquate d'huile de table. Ajouter la quantité adéquate de l'huile dans chaque partie et la mélanger pendant 15 minutes. Stocker le régime dans des sacs noirs en plastique marqués et les conserver dans un endroit frais.

## Traitement des animaux

Les 48 rats mâles ont été répartis en deux groupes dont chacun contient quatre lots de six rats (Fig. 1).
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.** Description schématique des deux protocoles expérimentaux utilisés.</figcaption></figure>
A titre indicatif, il y a lieu de signaler qu'une analyse préalable de l'eau de robinet et de l'eau de source utilisée (Eau Ben Daoued Oueled Driss de la commune de Bouhadjar, Wilaya d'El-Taref) a été effectuée pour s'assurer que l'apport calcique globale ne sera pas outre dépassée par l'injection de ces eaux. Cette analyse a été réalisée au niveau du laboratoire hydro-bromatologie de la faculté de médecine d'Annaba, ce qui a permis de constater que l'apport calcique de ces eaux reste insignifiant.

## Protocole de suivi

La mesure du poids des rats est effectuée à raison de 3 fois par semaine et la quantité de l'alimentation est aussi dosée au quotidien. La cristallurie (La formation éventuelle des cristaux) a été analysée par microscopie photonique. Pour ce faire, les urines observées sont celles rassemblées jusqu'en début de matinée après avoir dépourvu les rats de tout apport alimentaire pendant les périodes nocturnes (12h/nuit). Nous avons utilisé à cette fin des cages métaboliques conçues et adaptées à ce genre de collecte.

## Le sacrifice

Après 40 jours de traitement tous les groupes sont sacrifiés (par décapitation), le sang est immédiatement recueilli dans des tubes secs étiquetés, puis centrifugés à 3000 tours/min pendant 15 minutes. Le sérum est séparé en trois fractions dans des tubes Eppendorf et stockés au congélateur à une température de (-20° C) jusqu'au moment du dosage.

## Prélèvement des organes

Après la dissection, le rein droit et gauche, sont pesés et sectionnés transversalement, puis immergés dans une solution de formol 4 % qui ne dissout pas les cristaux d'oxalate de calcium. Nous avons réalisé des coupes en morceau de 5 mm maximum d'épaisseur, puis colorées avec l'hématoxyline et l'éosine. L'observation morphologique des coupes histologiques du rein est réalisée à l'aide de microscope optique en lumière blanche et polarisée.

## Analyse statistique des résultats

Nous avons employé un test statistique paramétrique par le biais du test t de student en vue de comparer les moyennes tout en vérifiant les critères de normalité. Les résultats ont été exprimés en moyennes plus ou moins l'erreur standard moyenne. Dans tous les cas, les différences dont les valeurs de p inférieures à la valeur 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives. L'ensemble des analyses a été réalisé à l'aide du logiciel (version 20.0).
# RESULTATS

## Test de dissolution des calculs de cystine in vitro

L'exposition des calculs cystiniques aux extraits aqueux de Z. spinosa, a entraîné une perte moyenne de masse de 98.05±15.94 mg versus 40.6±15.08 mg pour les calculs traités par le NaCl seul (p <0,01 vs témoin de NaCl).

La Figure 2 (a), montre l'évolution de la masse des calculs au cours des 8 semaines d'expérience mettant en évidence une perte de masse progressive et soutenue des calculs de cystine dans l'extrait de la plante. Le taux de dissolution de ces calculs (Fig. 2 b) augmentait progressivement et les écarts par rapport à la solution témoin étaient importants et s'accentuaient avec le temps de contact. Au total, le taux de perte massique des calculs de cystine avec l'extrait de Z. spinosa et la solution témoin étaient respectivement de 63.4% et 23%.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 2.** Evolution de la masse (a) et du taux de perte de masse (b) en fonction du temps (0, 2, 4, 6 et 8 semaines) de maintien dans l'extrait de Z. spinosa (5g/100ml) et la solution témoin de NaCl (9g/l)</figcaption></figure>

## Evolution du pH pendant l'expérience

Les résultats relatifs à l'évolution du pH le long de huit semaines d'expérimentation pour l'extrait ainsi que pour la solution témoin sont rassemblés dans le tableau I. Les mesures effectuées ont été ponctuées par périodes égales de trois jours. Il ressort, aussi bien pour les deux extraits que pour la solution témoin, que les valeurs enregistrées ne présentent pas des fluctuations significatives confortant ainsi la stabilité de valeur de leurs pH autour de celle du tampon utilisé (pH=6).

<footnote>* : Différence significative comparant au témoin (P ≤0,05).</footnote>

<footnote>** : Différence hautement significative comparant au témoin (P ≤0,01).</footnote>

<footnote>*** : Différence très hautement significative comparant au témoin (P ≤0,001).</footnote>

<footnote>P : Seuil de signification.</footnote>
<table><caption>**Tableau I** : Valeurs du pH mesurées après chaque trois jour de maintien le long de huit semaines d'expérimentation</caption><thead><tr><th rowspan="2">pH des solutions</th><th colspan="4">Deux semaines (S2)</th><th colspan="4">Quatre semaines (S4)</th><th colspan="4">Six semaines (S6)</th><th colspan="4">Huit semaines (S8)</th></tr><tr><th>J3</th><th>J6</th><th>J9</th><th>J15</th><th>J18</th><th>J21</th><th>J24</th><th>J27</th><th>J30</th><th>J33</th><th>J36</th><th>J39</th><th>J42</th><th>J45</th><th>J48</th><th>J51</th><th>J54</th><th>J57</th><th>J60</th></tr></thead><tbody><tr><td>Témoin</td><td>5,84</td><td>5,85</td><td>5,90</td><td>5,88</td><td>5,93</td><td>5,9</td><td>5,95</td><td>5,92</td><td>5,93</td><td>5,9</td><td>5,85</td><td>5,84</td><td>5,83</td><td>5,8</td><td>5,8</td><td>5,82</td><td>5,81</td><td>5,81</td><td>5,8</td></tr><tr><td></td><td colspan="4">5,87</td><td colspan="4">5,93</td><td colspan="4">5,84</td><td colspan="4">5,81</td></tr><tr><td>Zilla spinosa L</td><td>6,05</td><td>5,94</td><td>6,03</td><td>6,04</td><td>6,10</td><td>6,11</td><td>5,96</td><td>5,98</td><td>6,07</td><td>6,10</td><td>6,11</td><td>6,03</td><td>6,00</td><td>6,05</td><td>6,07</td><td>6,08</td><td>5,97</td><td>5,99</td><td>6,05</td></tr><tr><td></td><td colspan="4">6,02</td><td colspan="4">6,04</td><td colspan="4">6,05</td><td colspan="4">6,03</td></tr></tbody></table>

### Observations micrographiques

La figure 3 représente les états de surface des calculs de cystine à l'échelle mésoscopique observés par microscopie électronique à balayage (M E B) avant et après un séjour de huit semaines dans les différents extraits.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 3.** Micrographies visualisées par MEB de l'état de surface des calculs cystiniques : (a, b) avant traitement, (c, d) après séjours de huit semaines dans une solution aqueuse de NaCl, (e, f) après séjours de huit semaines dans l'extrait de Z. spinosa.</figcaption></figure>

Initialement, les calculs de cystine présentent une surface constituée de cristallites bien agencées donnant à la surface un aspect compact où certains de ces cristallites présentent des faciès de forme hexagonale, caractéristique généralement observée dans les calculs de cystine à cette échelle (Fig.3 a et b).
Dans la figure 3(b) sont mis en évidence, sur les faciès des cristallites de cystine, des macles de croissance présentant également une forme hexagonale avec des arrêtes bien droites. Pour ce qui est de la solution témoin de NaCl et après un séjour de huit semaines, la surface des calculs se présente avec moins de relief et une perte partielle mais conséquente de la forme hexagonale initiale des cristallites de cystine témoin de leur dissolution (Fig.3 c et d). L'effet des extraits des plantes utilisées sur l'état de surface des calculs de cystine semble cependant plus évident et plus marqué. En effet, pour L'extrait de Z. spinosa, la surface présente un aspect global en feuillets, témoin d'une forte érosion en surface, avec une perte totale de la forme hexagonale initiale des faciès de cystine (Fig.3 e et f).

## Modèle de cristallisation oxalo-calcique in vivo

### Suivi Pondéral

Dans le premier Groupe, nous observons une légère diminution de la masse corporelle chez tous les rats de lots (G1L2, G1L3 et G1L4) qui sont sous un régime alimentaire pauvre en calcium, mais sans différence significative (Fig. 4).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4.** Variation pondérale des rats du groupe pauvre en calcium.</figcaption></figure>

Dans le protocole sous un régime alimentaire normo-calcique, nous avons observé qu'il y a une légère augmentation de la masse corporelle chez les groupes lithiasiques traités par Z. spinosa et de l'eau de source en comparaison avec le groupe lithiasique non traité, mais sans différence significative (Fig. 5).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5. Variation pondérale des rats du groupe normo-calcique.</figcaption></figure>

## Suivi de la Cristallurie

Nous avons fait un suivi par étude de Cristallurie des urines des rats le long de l'expérience basée sur la formation et l'inhibition des cristaux d'oxalate de calcium monohydratés (COM).

Pour les lots témoins sains, les rats n'ont pas formé des cristaux C1 tout au long du protocole (du j7au j40).

### Les lots témoins non traité (G1L2 et G2L2) :

Nous avons observé que l'induction de NaOx a favorisé la formation des COM. La formation de ces cristaux est plus précoce lorsque les rats sont préalablement sous un régime pauvre en calcium (Tableau II).

<table><caption>Tableau II : Les lots témoins non traités de deux groupes.</caption><thead><tr><th colspan="6">G1L2</th><th colspan="6">G2L2</th></tr><tr><th>Durée (jours)</th><th>C1</th><th>nbr Rats</th><th>Nbr/m m³</th><th>Dim (µm)</th><th>Agrégats</th><th>Durée (Jours)</th><th>C1</th><th>nbr Rats</th><th>Nbr/ mm³</th><th>Dim (µm)</th><th>Agrégats</th></tr></thead><tbody><tr><td>J 8</td><td>+</td><td>2/6</td><td></td><td>3</td><td>-</td><td>J 12</td><td>+</td><td>1/6</td><td>10</td><td>8</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>100</td><td>1</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>J16</td><td>+</td><td>2/6</td><td></td><td>2</td><td>-</td><td>J16</td><td>//</td><td>//</td><td>//</td><td>//</td><td>//</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>160</td><td>6</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>J 21</td><td>+</td><td>2/6</td><td></td><td>76</td><td>6</td><td>J 21</td><td>//</td><td>//</td><td>//</td><td>//</td><td>//</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>7</td><td>4</td><td>+</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>J 25</td><td>+</td><td>3/6</td><td></td><td>45</td><td>10</td><td>J25</td><td>+</td><td>2/6</td><td>120</td><td>4</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td>7</td><td></td><td></td><td></td><td>80</td><td>6</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td>6</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>J 30</td><td>+</td><td>3/6</td><td></td><td>210+2</td><td>8</td><td>J 30</td><td>+</td><td>4/6</td><td>100</td><td>8</td><td>+</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>G</td><td>8</td><td>+</td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td>7</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>160</td><td>6</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>20</td><td>7</td><td>-</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th></th><th></th><th></th><th>30+3G<br>*</th><th></th><th></th><th></th><th></th><th>15</th><th>7</th><th>-</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">J 40</td><td rowspan="3">+</td><td rowspan="3">3/6</td><td>350</td><td>12</td><td>+</td><td rowspan="3">J 40</td><td rowspan="3">+</td><td rowspan="3">4/6</td><td>350</td><td>6</td><td>+</td></tr><tr><td rowspan="2">40</td><td>10</td><td>+</td><td>240</td><td>5</td><td>+</td></tr><tr><td>8</td><td>+</td><td>35</td><td>8</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>24</td><td>5</td><td>-</td></tr></tbody></table>

G*: Gros cristaux Dim > 25µm.

## Les lots traités par l'infusé de Z. spinosa (G1L3 et G2L3) :

Nous avons observé juste un retard dans la formation des COM pour les lots traités par l'extrait aqueux du Z. spinosa. Les rats ayant subi un régime pauvre en calcium sont plus impliqués dans la formation des cristaux COMs (Tableau III).

<table><caption>Tableau III : Les lots traités par l'infusé du Z. spinosa : (G1L3, G2L3)</caption><thead><tr><th colspan="6">G1L3</th><th colspan="6">G2L3</th></tr><tr><th>Durée (Jours)</th><th>C1</th><th>nbr Rats</th><th>Nbr/m m³</th><th>Dim (µm)</th><th>Agréga ts</th><th>Durée (Jours)</th><th>C1</th><th>nbr Rats</th><th>Nbr/ mm³</th><th>Dim (µm)</th><th>Agrégats</th></tr></thead><tbody><tr><td>J 8</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J 8</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>J16</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J16</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>J 21</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J 21</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>J 25</td><td>+</td><td>3/6</td><td>280<br>180<br>50</td><td>5<br>4<br>2</td><td>-</td><td>J25</td><td>+</td><td>1/6</td><td>-5</td><td>4</td><td>-</td></tr><tr><td>J 30</td><td>+</td><td>3/6</td><td>60<br>11</td><td>3<br>4</td><td>-</td><td>J 30</td><td>+</td><td>4/6</td><td>80<br>80<br>40<br>40</td><td>7<br>7<br>7<br>5</td><td>-</td></tr><tr><td>J 40</td><td>+</td><td>4/6</td><td>88<br>50<br>20<br>5<br>5</td><td>3<br>9<br>8<br>10<br>8</td><td>-</td><td>J 40</td><td>+</td><td>4/6</td><td>180<br>150<br>100<br>20</td><td>12<br>8<br>10<br>6</td><td>+</td></tr></tbody></table>

## Les lots traités par l'eau de source : (G1L4 et G2L4)

Nous avons observé un retard plus important dans la formation des COM dans les lots traités par l'eau de source par rapport aux lots traités par l'extrait aqueux du Z. spinosa (Tableau IV).
<table><caption>**Tableau VI :** Les lots traités par l'eau de source (G1L4 et G2L4).</caption><thead><tr><th colspan="6">G1L4</th><th colspan="6">G2L4</th></tr><tr><th>Durée (Jours)</th><th>C1</th><th>nbr Rats</th><th>Nbr/mm³</th><th>Dim (µm)</th><th>Agrégats</th><th>Durée (Jours)</th><th>C1</th><th>nbr Rats</th><th>Nbr/m³</th><th>Dim (µm)</th><th>Agrégats</th></tr></thead><tbody><tr><td>J 8</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J 8</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>J16</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J16</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>J 26</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J 26</td><td>+</td><td>1/6</td><td>2</td><td>5</td><td>-</td></tr><tr><td>J 30</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>-</td><td>J 30</td><td>+</td><td>1/6</td><td>25</td><td>10</td><td>-</td></tr><tr><td>J 37</td><td>+</td><td>1/6</td><td>19</td><td>2</td><td>-</td><td>J 35</td><td>+</td><td>1/6</td><td>153</td><td>9</td><td>-</td></tr><tr><td>J 40</td><td>+</td><td>2/6</td><td>25</td><td>5</td><td>-</td><td>J 40</td><td>+</td><td>2/6</td><td>30</td><td>6</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td>5</td><td>-</td><td></td><td></td><td></td><td>20</td><td>7</td><td>-</td></tr></tbody></table>

**Photographie des cristaux à l'aide d'un microscope optique à polarisation :**

Des cristaux de COM sont observés chez les deux groupes de rats témoins non traités dés j16, la taille des cristaux augmente avec le temps voire des agrégats. Après traitement par Z. spinosa et l'eau de source, nous avons remarqué la dégradation des agrégats de cristaux grossiers de COM visibles en lumière polarisée. Cependant, la dégradation des cristaux est plus remarquable dans les lots traités par l'eau de source par rapport à ceux traités par Z. spinosa (Fig.6).
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

**Figure 6.** Observation de la formation des cristaux de Whewelitte sous microscope optique à polarisation ; (a,b,c) lots témoins non traités après 16 jours:(a) G :×100, (b) G : ×400 forme ovale, (c, d) G : ×400 forme en sablier ; (e) lot traité par Z. spinosa G : ×100 ; (f) lot traité par l'eau de source G : ×100 ; (g) lot traité par l'eau de source G : ×400.

Examen histologique

L'examen des coupes histologiques des reins droits des rats lithiasiques induits par NaOx (oxalate de sodium) montre la présence des cristaux d'oxalate de calcium aussi bien dans la zone cortico-médullaire que dans la zone papillaire. Le traitement par l'extrait aqueux de Z. spinosa n'a pas d'effet marqué sur la déposition des cristaux dans la zone cortico-médullaire et la papille qui est encore maintenue. Contrairement au traitement par l'eau de source qui révèle la disparition des cristaux dans la zone médullaire.
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**Figure 7.** Coupes histologiques à différents niveaux d'un rein de rat lithiasique non traité (a), traité par l'extrait de *Z. spinoza* (b), et traité par l'eau de source (c) vu au microscope photonique émanant du protocole du régime normo calcique; a: Parenchyme médullaire ; b : Papille ; c: Cortex. Barre : 200µm.

# DISCUSSION

## Test in vitro

L'utilisation des plantes médicinales pour le traitement de la lithiase de l'arbre urinaire est une pratique ancrée dans la population Algérienne [17,18,19]. L'objectif premier de ce test est de vérifier l'efficacité litholytique sur la lithiase cystinique du *Z. spinosa*. En outre le mode de préparation ainsi que la dose préconisée a été celle pratiquée par la population locale.

Les résultats ont montré une différence significative ($P \le 0.001$) de perte de masse des calculs cystiniques: environ 65% en présence d'extrait de la plante par rapport à la solution témoin pour laquelle la perte de masse n'est que d'environ 23% au terme des 8 semaines d'expérimentation.

Cette dissolution a été effectuée en présence d'un tampon phosphate assurant à l'extrait un pH légèrement acide compris entre 5,8 et 6,1. Ce résultat est intéressant si l'on considère que la cystine est peu soluble pour ces valeurs de pH, sa limite de solubilité ne dépassant pas 1,2 mmole/l pour des pH<6.5. La dissolution des calculs cystiniques, telle que rapportée par des études similaires [20], a été effectuée sans la présence de tampon laissant libre cours à l'évolution du pH vers des valeurs parfois élevées [21]. La perte de masse des calculs a été, de ce fait, favorisée, pour certaines expériences, par l'alcalinisation du milieu.

Les observations micrographiques à l'échelle mésoscopique viennent confirmer une érosion de la surface des calculs de cystine pour l'extrait de *Z. spinosa* témoignant ainsi une dissolution de la cystine due à l'interaction de cette dernière avec l'extrait. L'état de surface des calculs de cystine ayant séjourné dans les extraits des plantes d'Arenaria ammophila et de Parietaria officinalis observé à l'échelle mésoscopique par *Hannache et al* montre une érosion en surface qui se caractérise également par la perte partielle ou totale de la forme hexagonale des cristallites de cystine et la présence de feuillets séparées par des espaces plus ou moins larges [21]. Une alcalinisation classique comme celle du trométamol permet également de réduire la taille des cristallites de cystine mais ne modifie pas la forme des cristaux. De plus, elle peut générer la formation de carbapatite [21].

Le processus mis en œuvre dans la dissolution des calculs cystiniques, en présence de *Z. spinosa* est très vraisemblablement lié à l'effet de certains de ses principes actifs puisque la variation de
pH très minime observée au cours des expériences ne peut expliquer un tel effet. Ces principes actifs peuvent former des complexes cystine-principe actif plus solubles que la cystine d'où la dissolution de cette dernière, même en milieu légèrement acide. En termes de principes actifs, l'étude de F.El Sharabasy et al [23] a permis de constater que les parties aériennes de Z. spinosa sont constituées de : coumarines isolées, stérols, triterpènes, polyphénols, saponines triterpéniques ainsi que de sept types de flavonoïdes. Ainsi, les complexes « cystine-principe actif » formés lors des expérimentations entreprises peuvent être de type : cystine-flavonoïdes, cystine-tanins ou encore cystine-saponosides dont le processus de formation serait assuré par des liaisons hydrogènes et des liaisons hydrophiles entre les groupements fonctionnels des principes actifs et les fonctions carboxyliques ou amines de la molécule de cystine, comme suggéré par Meiouet et al (2011). La nature et l'abondance de ces composés varient d'une plante à l'autre, ce qui peut expliquer les différences d'efficacité observées.

## Test in vivo

Dans le protocole pauvre en calcium, les rats sont rendus lithiasiques par administration de NaOx introduit dans la nourriture en parallèle avec le traitement par l'extrait aqueux de la plante et l'eau de source, afin de vérifier son pouvoir inhibiteur vis-à-vis de la cristallisation de l'oxalate de calcium dans les reins. Dans ce protocole, notamment dès le début de l'expérience, nous avons pu noter une diminution de la masse corporelle chez tous les lots du groupe, ceci est en accord avec les constatations de Da silva SL et al (1994), qui ont remarqué que la carence du calcium dans l'alimentation des rats est accompagnée d'une réduction du poids corporel en comparaison avec le groupe de régime normal [24]. L'insuffisance du calcium est associée à des troubles de l'ingestion de nourriture et particulièrement l'anorexie chez l'animal et l'homme ont également justifié l'anorexie par le rôle central du calcium dans l'activation de nombreux systèmes enzymatiques qui synthétisent et dégradent certains peptides biologiquement actifs, également appelés les neuropeptides, impliqués dans le règlement de l'ingestion de nourriture tels que (Choecystokinin (CCK), Ghrelin, sérotonine). Ces peptides sont synthétisés par l'hypothalamus. Il a été signalé que l'hypophyse est responsable de la modulation de l'ingestion de nourriture ; elle reçoit des signaux de l'hypothalamus puis elle les transmet à d'autres tissus ou organes périphériques cibles [24,25]. D'autre part, l'insuffisance en calcium mène invariablement aux désordres digestifs graves comme la perte d'appétit et la chute de poids, principalement dues à la détérioration du gout et de l'odorat [26].

La Cristallurie montre d'avantage des cristaux COM de taille et nombre plus élevés chez le groupe pauvre en calcium par rapport au groupe normo calcique pour les deux lots non traités. Donc pour un régime pauvre en calcium, les cristaux d'oxalate de calcium se forment en effet préférentiellement d'une façon plus précoce. Concernant les lots traités par l'extrait brut de Z. spinosa, nous avons constaté une diminution du nombre et de taille des cristaux de COM ainsi qu'un retard de leur formation avec parfois un effet de détérioration léger des cristaux par rapport à celui observé lors de l'utilisation d'Herniaria hirsuta L [27] (une plante très réputée en Algérie pour son activité anti-lithiasique).

À la suite de l'induction par NaOx, l'observation microscopique en lumière polarisée des coupes histologiques rénales des rats néphrolithiasiques montrent des dépôts cristallins intra-tubulaires et interstitiels. Ces dépôts sont répartis sur tout le rein, dont le traitement du rat par Z. spinosa n'en aboutit qu'à une légère diminution non significative. Ces résultats prouvent que
la plante est incapable d'empêcher le développement des calcifications parenchymateuses et papillaires ; Par conséquent, aucun effet prévenant le développement des calculs rénaux n'est mentionné. L'eau de source a un effet plus efficace par rapport à l'extrait aqueux de Z. spinosa, en effet, elle contribue à la diminution remarquable des dépôts des cristaux surtout sur le plan cortico médullaire.

Il faut rappeler que le processus de la lithiase urinaire est un processus métabolique qui se développe au cours d'un temps plus ou moins long. Ainsi, les protocoles expérimentaux in vivo de lithiase utilisée [25], même ceux validés par plusieurs chercheurs, restent limités du fait qu'ils ne peuvent pas être appliqués sur l'être humain.

## CONCLUSION

L'extrait de Z. spinosa tel qu'il est préconisé en usage traditionnel n'a pas d'effet sur la cristallisation oxalo-calcique cependant il montre une meilleure activité litholytique sur les calculs de type cystine. Les plantes médicinales anti-lithiasique peuvent offrir des avantages pour une meilleure prise en charge de lithiase rénale et ouvrent des perspectives thérapeutiques.

## DECLARATION DE LIENS D'INTERETS

Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.
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