# Détection et caractérisation de biofilms par méthodes électrochimiques.

Eva l'Hostis

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Eva l'Hostis. Détection et caractérisation de biofilms par méthodes électrochimiques. Autre. Université Pierre & Marie Curie - Paris 6, 1996. Français. NNT: 1996PA066607 . tel-04166773

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THESE DE DOCTORAT
DE L'UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE
PARIS 6

Spécialité Electrochimie

présentée par

Eva L'HOSTIS

pour obtenir le grade de

Docteur de l'UNIVERSITE DE PARIS 6

Sujet

DETECTION ET CARACTERISATION DE BIOFILMS
PAR METHODES ELECTROCHIMIQUES

soutenue le 24 octobre 1996 devant le jury composé de

Mr C. FIAUD
Président

Mr H.-C. FLEMMING
Rapporteur

Mr M. L'HER
Rapporteur

Mr B. TRIBOLLET

Mr D. FESTY

Mr Y. LEVI

Mr G. HERROUIN
Ce travail a été réalisé dans cinq différents laboratoires :

* Laboratoire Matériaux Marins, IFREMER Centre de Brest, Plouzané

* Laboratoire Physique de Liquides et Electrochimie, UPR 15 du CNRS, Paris 6

* CIRSEE / Lyonnaise des Eaux, Le Pecq

* Lehrstuhl für Wassergüte der TU Munchen, Munich

* Laboratoire d'Océanographie Biologique d'Arcachon, Bordeaux I

Donc cinq fois plus de possibilités de rencontres, de conseils, d'échanges et de découvertes. Toute ma reconnaissance va bien évidemment aux personnes qui m'ont aidée au cours de ces trois années. Ce n'est pas seulement pour leur aide scientifique et technique que je tiens à les remercier mais aussi pour leurs qualités humaines. Les nommer toutes tient de la gageure mais mes remerciements leur sont dédiés à tous et toutes.

Je remercie M. Keddam pour son accueil au sein de l'UPR15. Toute ma reconnaissance va à Bernard Tribollet, un directeur de thèse toujours présent, à Claude Deslouis mais aussi à tous les membres de l'UPR15 : Takenouti, M. et Mme Cachet, Isabelle, Hubert, Gabrielli... Je garderai aussi dans mon coeur une place pour toutes ces personnes de passage au laboratoire pour de plus ou moins brefs séjours : Célia, Guilherme, Touriya, Marco...

Je tiens à remercier Lionel Lemoine pour son accueil au sein du laboratoire Matériaux Marins et Dominique Festy pour avoir été mon parrain de thèse mais aussi Chantal, Florence, Régis, Maxou, Dominique, Peter, Jean-Pierre, Luc, Annie et Michel. Je n'oublierai pas non plus tous les stagiaires qui sont passés au laboratoire pendant ma thèse : Nathalie, Fabrice, JB, Gildas, Patrick, Anne...

Toute ma gratitude va à Yves Lévi et à Laurent Kiéné du CIRSEE / Lyonnaise des Eaux ainsi qu'à Karine et Michel.

Je remercie Hans-Curt Flemming pour son accueil au Lehrstuhl für Wassergüte der TU Munchen. Mon séjour à Munich restera un très bon souvenir et certains visages resteront gravés dans ma mémoire : Stéfan, Uli, Martin...

Et je remercie Nathalie et Xavier au Laboratoire d'Océanographie Biologique d'Arcachon pour leur participation et leur gentillesse.
LISTE DES SYMBOLES ET ACRONYMES UTILISES 7

INTRODUCTION 10

Chapitre 1 BIOFILM : FORMATION, TECHNIQUES D'ETUDE ET PROPRIETES

I. FORMATION DU BIOFILM 14

A. Différentes étapes de la formation du biofilm 14

1. Adhésion primaire 14

2. Adhésion réversible 15

3. Adhésion irréversible 16

B. Paramètres influençant la formation d'un biofilm 18

1. Physico-chimie du milieu 19

2. Support 20

II. TECHNIQUES DE DETECTION ET DE CARACTERISATION DU BIOFILM 21

A. Techniques de détection permettant le suivi des premières étapes du développement du biofilm 21

B. Techniques de caractérisation du biofilm 23

1. Masse 23

2. Densité et porosité 24

3. Epaisseur 24

C. Techniques d'analyse des propriétés physico-chimiques du biofilm 27

1. Analyses physico-chimiques 27

2. Analyses biochimiques 28

3. Microscopies 29

4. Mesures du frottement et du transfert de chaleur 30

5. Mesures de transport de matière 30

a) Mesures de vitesses 32

b) Mesures de profil de concentration 32

c) Mesures de coefficients de diffusion 33
### III. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DU BIOFILM.................................................. 34

A. Structure du biofilm.................................................................................................................. 34

1. Distribution spatiale.................................................................................................................. 34

2. Epaisseur........................................................................................................................................ 35

3. Densité et porosité.................................................................................................................. 35

4. Rhéologie........................................................................................................................................ 37

B. Composition chimique du biofilm................................................................................................ 37

C. Propriétés de transport et interfaciales ................................................................................ 38

1. Transport de matière.................................................................................................................. 38

2. Conductivité thermique et coefficient de friction................................................................ 43

### IV. CONCLUSION.................................................................................................................. 45

## Chapitre 2 MODELE, TECHNIQUES ET PROCEDURES

### I. MODELE PHYSIQUE : ANALYSE DU TRANSPORT DE MATIERE.................................................................................. 47

A. Analyse du transport de matière au voisinage une électrode à disque tournant.................................................................................. 47

B. Analyse du transport de matière au voisinage une électrode à disque tournant recouverte d'une couche poreuse................................................ 50

### II. TECHNIQUES D'ETUDE.................................................................................................................. 53

A. Régime stationnaire.................................................................................................................. 53

B. Techniques transitoires.................................................................................................................. 54

1. Impédance électrohydrodynamique (EHD) ........................................................................ 56

2. Impédance électrochimique (AC) ................................................................................................ 64

### III. TECHNIQUES EXPERIMENTALES.................................................................................................................. 67

A. Dispositifs expérimentaux.................................................................................................................. 67

B. Procédures expérimentales.................................................................................................................. 73

1. Préparation des électrodes de travail .................................................................................. 73

2. Traceurs électrochimiques.................................................................................................................. 73

a) Traceur ferricyanure.................................................................................................................. 73
<table><tr><td>b) Oxygène</td><td>74</td></tr><tr><td>3. Mesures</td><td>75</td></tr><tr><td>a) Mesures en régime stationnaire</td><td>75</td></tr><tr><td>b) Mesures d'impédance EHD</td><td>76</td></tr><tr><td>c) Mesures d'impédance AC</td><td>76</td></tr><tr><td>C. Traitement des données</td><td>77</td></tr></table>

# Chapitre 3 ELABORATION ET CARACTERISATION D'UNE COUCHE MODELE POREUSE

## I. CONDITIONS EXPERIMENTALES

A. Elaboration de la couche de gélatine

1. Préparation de la gélatine

2. Dépôt de la gélatine sur l'électrode

B. Traceurs électrochimique

1. Traceur ferricyanure

2. Traceur oxygène

## II. DETERMINATION DU NOMBRE DE SCHMIDT

A. Traceur ferricyanure

B. Traceur oxygène

## III. DETERMINATION DE DF ET DF DANS UNE COUCHE DE

GELATINE

A. Traceur

1. Régime stationnaire

2. Impédance EHD

3. Traitement des données

B. Traceur oxygène

1. Régime stationnaire

2. Impédance EHD

3. Traitement des données

C. Comparaison des résultats obtenus avec les traceurs ferricyanure et oxygène
<table><tr><td>V. CONCLUSION</td><td>101</td></tr></table>

# Chapitre 4 CARACTERISATION D'UN BIOFILM FORME EN MILIEU NATUREL

<table><tr><td>I. CARACTERISATION DE BIOFILMS FORMES EN EAU DE MER</td><td>105</td></tr></table>

<table><tr><td>A. Caractérisation de biofilms formés en eau de mer additionnée d'un nutriment</td><td>105</td></tr></table>

<table><tr><td>1. Conditions expérimentales</td><td>105</td></tr></table>

<table><tr><td>2. Résultats et discussion</td><td>109</td></tr></table>

<table><tr><td>a) Traceur ferricyanure</td><td>109</td></tr></table>

<table><tr><td>b) Traceur oxygène</td><td>120</td></tr></table>

<table><tr><td>c) Comparaison des épaisseurs obtenues avec les deux traceurs</td><td>123</td></tr></table>

<table><tr><td>B. Etude en milieu stérile</td><td>128</td></tr></table>

<table><tr><td>1. Conditions expérimentales</td><td>128</td></tr></table>

<table><tr><td>a) Montage expérimental</td><td>128</td></tr></table>

<table><tr><td>b) Procédures de stérilisation</td><td>131</td></tr></table>

<table><tr><td>c) Contrôles de stérilité</td><td>133</td></tr></table>

<table><tr><td>2. Résultats et discussion</td><td>134</td></tr></table>

<table><tr><td>a) Maintien de la stérilité</td><td>134</td></tr></table>

<table><tr><td>b) Régime stationnaire</td><td>136</td></tr></table>

<table><tr><td>3. Conclusion</td><td>140</td></tr></table>

<table><tr><td>C. Caractérisation de biofilms formés en eau de mer naturelle</td><td>141</td></tr></table>

<table><tr><td>1. Conditions expérimentales</td><td>141</td></tr></table>

<table><tr><td>2. Résultats et discussion</td><td>142</td></tr></table>

<table><tr><td>a) Traceur ferricyanure</td><td>142</td></tr></table>

<table><tr><td>b) Traceur oxygène</td><td>151</td></tr></table>

<table><tr><td>c) Comparaison des épaisseurs obtenues avec les deux traceurs</td><td>157</td></tr></table>

<table><tr><td>3. Conclusion</td><td>161</td></tr></table>

<table><tr><td>D. Comparaison des épaisseurs des biofilms formés en eau de mer</td><td>162</td></tr></table>

<table><tr><td>E. Conclusion</td><td>163</td></tr></table>
## II. CARACTERISATION DE BIOFILMS FORMES EN EAU DOUCE 164

### A. Etude exploratoire en eau douce 165

#### 1. Conditions expérimentales 165

#### 2. Résultats et discussion 169

#### 3. Conclusion 175

### B. Seconde étude réalisée en eau douce 179

#### 1. Conditions expérimentales 180

#### 2. Résultat et discussion 180

a) Mesures en régime stationnaire 180

b) Impédance EHD 183

c) Impédance AC 189

d) Traitement des données 191

e) Observations en épifluorescence 192

#### 3. Conclusion 193

## CONCLUSION GENERALE 196

## ANNEXE 199

### Dosage de l'oxygène dissous : Méthode de Winkler 199

### Etude bactéricide de toxicité bactérienne du ferri/ferrocyanure de potassium 201

### Préparation des échantillons destinés à l'observation en Microscopie Electronique à Balayage 202

### Observations au Microscope en Epifluorescence 203

### Milieu culture R2A 205

### Milieu de culture et procédure utilisés dans le chapitre §4.I.B concernant l'étude en eau de mer stérile 206

### Dosage de l'ATP 207

### Dosage du chlore résiduel : méthode à l'orthotolodine 210

### Ajustement des paramètres par la technique de simplexe 211

## REFERENCE 213
# Liste des symboles et acronymes utilisés
LISTE DES SYMBOLES ET ACRONYMES UTILISES

<table><tr><td>A</td><td>Amplitude de l'impédance EHD</td></tr><tr><td>A<sub>o</sub></td><td>Amplitude à la fréquence zéro de l'impédance EHD</td></tr><tr><td>A/A<sub>o</sub></td><td>Amplitude réduite</td></tr><tr><td>AC</td><td>Impédance électrochimique ou AC</td></tr><tr><td>a<sub>D</sub></td><td>Coefficient (5/3 pour une orientation aléatoire des pores dans un gel) (§1.III)</td></tr><tr><td>ADN</td><td>Acide DésoxyriboNucléique</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Adénosine TriPhosphate</td></tr><tr><td>b</td><td>Coefficient de Tafel</td></tr><tr><td>BET</td><td>Technique de mesure de surface spécifique des poudres (Brunauer, Emett, Teller)</td></tr><tr><td>c</td><td>Concentration</td></tr><tr><td>C<sub>dc</sub></td><td>Capacité double charge</td></tr><tr><td>c<sub>∞</sub></td><td>Concentration dans la solution</td></tr><tr><td>D</td><td>Coefficient de diffusion dans la solution électrolytique</td></tr><tr><td>D<sub>gel</sub></td><td>Coefficient de diffusion dans un gel (§1.III)</td></tr><tr><td>D<sub>sol</sub></td><td>Coefficient de diffusion dans la solution (§1.III)</td></tr><tr><td>E</td><td>Potentiel</td></tr><tr><td>E<sub>i</sub></td><td>Potentiel interfacial</td></tr><tr><td>ECS</td><td>Electrode au Calomel Saturé</td></tr><tr><td>EDT</td><td>Electrode à Disque Tournant</td></tr><tr><td>EHD</td><td>Impédance ElectroHydroDynamique</td></tr><tr><td>EPS</td><td>Polymères Extracellulaires</td></tr><tr><td>F</td><td>Constante de Faraday (96500C)</td></tr><tr><td>f</td><td>Fréquence de modulation</td></tr><tr><td>i</td><td>Courant total</td></tr><tr><td>i&#773;</td><td>Courant moyen</td></tr><tr><td>i<sub>f</sub></td><td>Courant faradique</td></tr><tr><td>i<sub>K</sub></td><td>Courant d'origine cinétique</td></tr><tr><td>i<sub>L</sub></td><td>Courant de Levich</td></tr><tr><td>i<sub>o</sub></td><td>Courant non diffusionnel</td></tr><tr><td>i<sub>∞</sub></td><td>Courant fonction de la diffusion moléculaire dans la couche poreuse</td></tr><tr><td>IgG</td><td>Immunoglobulines humaines de classe G</td></tr><tr><td>IR</td><td>Infra-Rouge</td></tr><tr><td>IRMN</td><td>Imagerie à Résonance Magnétique Nucléaire</td></tr><tr><td>IR-TF</td><td>Infra-Rouge à Transformée de Fourier</td></tr></table>
<table>
  <tr>
    <td>j</td>
    <td>Nombre complexe</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>J</td>
    <td>Flux</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>K</td>
    <td>Coefficient de Levich</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>MAF</td>
    <td>Microscope à Force Atomique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>MEB</td>
    <td>Microscope Electronique à Balayage</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>MET</td>
    <td>Microscope Electronique à Transmission</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>MLBC</td>
    <td>Microscope Laser à Balayage Confocal</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>n</td>
    <td>Nombre d'électrons mis en jeu lors de la réaction électrochimique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>p</td>
    <td>Fréquence adimensionnelle (p = ω/Ω)</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>q</td>
    <td>Charge</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>R</td>
    <td>Constante des gaz parfait</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>R<sub>e</sub></td>
    <td>Résistance électrolytique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Re{x}</td>
    <td>Partie réelle de x</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>RMN</td>
    <td>Résonance Magnétique Nucléaire</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>RX</td>
    <td>Rayon X</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>S</td>
    <td>Surface active de l'électrode</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SAB</td>
    <td>Sérum Albumine Bovin</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Sc</td>
    <td>Nombre de Schmidt</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>s<sub>f</sub></td>
    <td>Fréquence adimensionnelle (s<sub>f</sub> = jω (δ<sub>f</sub><sup>2</sup> / D<sub>f</sub>)</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>T</td>
    <td>Température</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>t</td>
    <td>Temps</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>v</td>
    <td>Vitesse</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>v<sub>z</sub></td>
    <td>Composante normale de la vitesse</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>z'</td>
    <td>Coordonnée axiale (origine de l'axe pris à l'interface métal/couche) par rapport à l'électrode</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>z*</td>
    <td>Coordonnée axiale (origine de l'axe pris à l'interface solution/couche, z* = z - δ<sub>f</sub>)</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>z</td>
    <td>Valeur absolue de la charge d'un ion</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Z</td>
    <td>Impédance électrochimique sous contrôle diffusionnel</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Z<sub>C</sub></td>
    <td>Fonction de transfert dépendant du transport de charge</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Z<sub>d</sub>(p)</td>
    <td>Impédance de diffusion convective (Z<sub>d</sub>(p)/Z<sub>d</sub>(0) = -1/θ'(0))</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Z<sub>EHD,E</sub></td>
    <td>Impédance électrohydrodynamique sous contrôle potentiostatique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Z<sub>EHD,i</sub></td>
    <td>Impédance électrohydrodynamique sous contrôle potentiostatique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Z<sub>f</sub></td>
    <td>Impédance lié au processus faradique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>δ<sub>f</sub></td>
    <td>Epaisseur de la couche poreuse</td>
  </tr>
</table>
$\delta_n$ Epaisseur de la couche de diffusion

$\Delta\Omega$ Amplitude de modulation de la vitesse de rotation

$\Delta i$ Amplitude de modulation du courant

$\varepsilon$ Porosité

$\phi$ Potentiel électrostatique

$\phi_D$ Coefficient correspondant à la fraction de volume occupé par un gel

$\Gamma(4/3)$ Fonction Gamma de 4/3

$\eta$ Surtension

$\phi$ Déphasage

$\nu$ Viscosité cinématique

-1/θ'(0) Impédance de diffusion adimensionnelle sur une électrode nue, fonction de pSc¹/³

$\omega$ Pulsation

$\Omega$ Vitesse de rotation de l'électrode

$\overline{\Omega}$ Vitesse moyenne de rotation

$\nabla$ Gradient

$\overline{D_f}$ Vitesse de diffusion dans la couche poreuse

$\overline{\delta_f^2}$ Temps de diffusion dans la couche poreuse
# Introduction
Le développement de biofilms sur les surfaces immergées en milieu aquatique naturel a un impact très important sur la productivité et la compétitivité industrielle ainsi que sur la santé publique. Les enjeux économiques sont énormes.

Les biofilms peuvent s'avérer nocifs en :

* accélérant et/ou induisant la corrosion

* diminuant l'efficacité des circuits de refroidissement et des échangeurs thermiques

* ralentissant les navires

* bloquant certaines fonctions mécaniques

* induisant des problèmes de santé publique tels que le développement de la plaque dentaire

Mais l'existence de ces biomasses peuvent aussi être exploitée de façon bénéfique, par exemple pour :

* le traitement des eaux usées

* la fabrication du vinaigre ou de certains vins

Le biofilm est un thème de recherche interdisciplinaire reposant sur la compréhension des phénomènes biologiques, chimiques et électrochimiques en prenant en compte les processus de transfert interfaciaux et de transport. Son étude nécessite donc la collaboration de spécialistes dans de nombreux domaines tels que la microbiologie, la chimie et la physique. Pour être pleinement efficace, cette collaboration implique de trouver un vocabulaire compréhensible par chacun de ces membres.

L'objectif de ce travail est d'élaborer et de développer une technique de détection et de caractérisation des biofilms développés en milieux naturels d'un point de vue physico-chimique (porosité, épaisseur et coefficient de diffusion).

Dans un premier temps, ce manuscrit permettra d'appréhender les connaissances actuelles sur la formation du biofilm, les techniques de détection et de caractérisation de celui-ci et ses propriétés physico-chimiques.
A partir de ces recherches bibliographiques, les biomasses peuvent être considérées en première approximation comme une couche poreuse homogène, à l'échelle macroscopique, du point de vue du transport de matière. L'étude présentée confirmera la véracité cette hypothèse.

Une approche expérimentale possible permettant de caractériser les couches poreuses est donc l'étude du transport de matière. La méthode développée dans ce travail repose sur l'analyse du courant limite de réduction d'un traceur rédox contrôlé par le transport de matière. Le gradient de concentration de l'espèce diffusante est distribué entre la couche poreuse où seule intervient la diffusion moléculaire et la solution électrolytique, siège de la diffusion convective. Par la variation des conditions hydrodynamiques au voisinage du biofilm, à partir des mesures du courant limite de diffusion, il est possible de distinguer les contributions respectives de ces processus diffusionels et d'atteindre ainsi des paramètres propres à la couche poreuse.

Les deux principales techniques électrochimiques utilisées sont :

* la mesure du courant limite stationnaire en fonction de la vitesse de rotation.

* l'impédance électrohydrodynamique (EHD)

Deux traceurs électrochimiques sont employés dans cette étude : l'oxygène et le ferricyanure. Ces deux traceurs permettent de valider la méthode en montrant que les résultats obtenus sont indépendants du traceur utilisé. L'oxygène a l'avantage d'être naturellement présent dans le milieu. Le ferricyanure est, quant à lui, une espèce rédox habituellement choisie pour les études de transport de matière, sa vitesse de réaction électrochimique pouvant être considérée comme infiniment rapide.

La première étape du travail expérimental est l'élaboration d'une couche poreuse modèle reproduisant le comportement d'un biofilm ainsi que le développement d'un protocole expérimental ayant pour objet la caractérisation de sa géométrie par analyse du transport de matière. Le matériau choisi pour jouer le rôle du biofilm doit avoir un caractère poreux. Le choix s'est dirigé assez naturellement vers un gel. C'est la gélatine alimentaire qui a été retenue pour sa simplicité d'emploi, son faible coût et sa disponibilité.

La seconde étape est l'adaptation du protocole mis au point avec la couche modèle afin de suivre *in-situ* l'évolution d'un biofilm développé en milieu naturel tel que l'eau de mer ou l'eau douce.
L'adaptation de la technique est plus aisée en milieu marin car la composition de l'eau de mer avec sa forte salinité en fait un excellent électrolyte support pour des mesures électrochimiques. De plus, en raison de l'entartrage, les mesures électrochimiques s'avèrent plus délicates en eau douce.

Le développement de la technique en milieu marin est la première étude abordée, comme un but en soi, mais aussi afin d'aplanir les difficultés propres à l'eau douce. L'adaptation du protocole est réalisée sur des biofilms relativement épais développés avec un apport de nutriment. Une fois ce premier point accompli, une étude est réalisée en milieu stérile afin de déterminer, pour la technique présentée, la limite de détection du biofilm. Enfin, la technique est appliquée dans le cas d'un biofilm développé en eau de mer sans apport extérieur de nutriment.

La technique électrochimique est alors adaptée à des biofilms développés en eau douce. Le milieu de mesure doit limiter les risques de dépôt calcaire sans toute fois perturber de façon trop importante les microorganismes présents dans le biofilm. Le milieu de mesure est différent du milieu de développement. Le choix s'est porté sur l'eau de Volvic qui est peu minéralisée et contient peu de calcium et de carbonates. Des modifications du protocole expérimental sont nécessaires du fait de la faible minéralisation de l'eau de Volvic.

A chaque étape, des observations (Microscope Electronique à Balayage, cultures, épifluorescence, Microscope Laser à Balayage Confocal) sont réalisées pour permettre l'interprétation des résultats obtenus du point de vue de la biologie.

Le prolongement naturel de cette étude sera le développement d'un capteur pour détecter *in-situ* les biomasses et de les caractériser par leur géométrie (épaisseur et porosité).
# Chapitre 1

## Biofilm : formation, techniques d'étude et propriétés

I. Formation du biofilm

II. Techniques de détection et de caractérisation du biofilm

III. Propriétés physico-chimiques du biofilm

IV. Conclusion
Des cellules microbiennes viennent recouvrir et se lier à presque toute surface immergée dans un environnement aquatique. Les cellules immobilisées croissent, se reproduisent et excrètent des polymères organiques extracellulaires constitués principalement de polysacharrides et de protéines. Ces polymères forment une matrice qui englue les microorganismes pour former une entité appelée *biofilm* ou *biomasse* ou *voile bactérien*.

Dans la nature, les bactéries prédominent numériquement et métaboliquement sous forme de biofilm. Les microorganismes planctoniques(a) ne sont que des "émissaires" de colonies inclus dans des biofilms vers de nouveaux sites d'implantation. Les cellules sessiles(b) réagissent à leur environnement et sont fondamentalement différentes des cellules planctoniques de la même espèce (Costerton et al., 1995).

En fait, la différence essentielle entre un biofilm et d'autres systèmes microbiens est l'hétérogénéité de la biomasse où les processus de transport et les gradients sont importants. A titre d'exemple, un film bactérien épais peut contenir à la fois des environnements aérobies et anaérobies.

Dans le cas le plus simple, le biofilm est composé de cellules microbiennes et de leurs produits. Un tel biofilm est généralement une structure très adsorptive et poreuse (> 95% d'eau). Le plus souvent, les biofilms observés se composent d'une part importante de particules inorganiques et abiotiques adsorbées et enrobées dans les exopolymères.

Ce chapitre a pour objet de permettre d'appréhender les connaissances actuelles sur les biofilms :

* formation du biofilm

* techniques de détection et de caractérisation de la biomasse

* propriétés physico-chimiques du voile bactérien

<footnote>(a) *Planctonique* : qui flotte, est emporté par les courant.</footnote>

<footnote>(b) *Sessile* : fixé à un substratum.</footnote>
# I. FORMATION DU BIOFILM

## A. Différentes étapes de la formation du biofilm

La formation du biofilm peut être décomposée (fig. §1.1) :

* Événements initiaux (adhésion primaire)

* Accumulation exponentielle

* Etat stationnaire

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure §1.1 : Evolution du développement du biofilm dans le temps (Charaklis, 1990).</figcaption></figure>

### 1. Adhésion primaire

La première phase (fig. §1.2) consiste en une accumulation irréversible de macromolécules organiques présentes dans le milieu ou sécrétées par des microrganismes vivant dans le milieu. Ces particules conditionnent la surface support en un temps très court (quelques minutes à quelques heures après l'immersion). Les propriétés de la surface
telles que la mouillabilité, les propriétés hydrophobes, la charge de surface, le potentiel de contact, la tension de surface et la mobilité électrophorétique sont modifiées (Loeb et Neihof, 1975 ; Baier, 1980). Des auteurs ont décrit ce film comme fortement composé de lipopolysaccharides, glycoprotéines, exopolymères et acides humiques (Baier et Weiss, 1975 ; Baier, 1980 ; Berk et al, 1981). Cette couche constitue un "film primaire" qui conditionne l'attachement ultérieur des bactéries.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure §1.2** : Transport et adsorption de molécules organiques sur un support propre : formation du film primaire.</figcaption></figure>

## 2. Adhésion réversible

Des cellules viennent s'adsorber réversiblement sur le support où la concentration en nutriments est plus importante (fig. §1.3). Cette adsorption réversible met en jeu de faibles interactions entre le support et les cellules telles que les forces de Van Der Waals, les interactions électrostatiques de double couche, les interactions stériques et des liaisons par l'intermédiaire de polymères (Pethica, 1961 ; Dolowy, 1980 ; Fletcher, 1980 ; Vincent, 1980 ; Rutter et Vincent, 1980). Les forces mises en jeu dans le phénomène de fixation réversible des bactéries sont décrites par la théorie de la stabilité des colloïdes lyophobes(c)

<footnote>(c) *Lyophobe* : se dit des substances qui ne peuvent subir ni dessiccation, ni imbibation.</footnote>
(Derjaguin et Landau, 1941 ; Verway et Overbeek, 1948). Les bactéries sont considérées comme des particules colloïdales vivantes du fait de leur petite taille, leur densité qui n'est pas beaucoup plus importante que celle de l'eau, leur charge de surface négative et les différentes variations de l'hydrophobicité des parois bactériennes. Cependant, les microorganismes sont plus complexes que des particules colloïdes classiques car ces organismes sont capables de se mouvoir de façon indépendante, de se développer et de produire des polymères extracellulaires.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure §1.3 : Transport des cellules microbiennes au support conditionné, adsorption réversible, désorption et adsorption irréversible de cellules sur le support.</figcaption></figure>

### 3. Adhésion irréversible

Une partie des cellules s'adsorbent irréversiblement alors qu'une autre partie se désorbent (fig. §1.3). Ce type d'adhésion met en jeu des interactions de hautes énergies telles des interactions dipôle-dipôle, dipôle-dipôle induit, ion-dipôle, liaisons hydrogène,... Les cellules irréversiblement adsorbées se multiplient et excrètent des produits métaboliques. Durant le processus complexe de l'adhésion, les cellules bactériennes altèrent leur phénotype en réponse à la proximité de la surface du support (Fletcher, 1991). Cette modification de leur phénotype provoque un changement de leurs molécules structurales et les bactéries synthétisent les polymères extracellulaires (EPS). Ces polymères jouent alors un rôle de pont polymérique entre la cellule et la surface et garantissent alors l'intégrité du biofilm.

D'autres cellules continuent à s'attacher au biofilm pour augmenter le volume du voile biologique alors que des particules s'emprisonnent dans la structure. Finalement, des
parties de biofilm se détachent et sont entraînées dans la solution. Les étapes d'attachement et de détachement permettent l'évolution des différentes populations bactériennes dans un biofilm (fig. §1.4). L'évolution du voile biologique atteint un plateau.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure §1.4 : Attachement et détachement de cellules et autres particules à partir du biofilm.</figcaption></figure>

Les premiers microorganismes mis en jeu dans le phénomène d'adhésion sont généralement dits copiotrophes, c'est-à-dire nécessitant des teneurs en matières organiques importantes qu'ils trouvent alors dans le film primaire. Les bactéries dites oligotrophes (d) succèdent à la précédente population. Le voile bactérien sert alors de support à la fixation et au développement de cellules eucaryotiques (e).

<footnote>(d) *Oligotrophe* : qui a besoin de très peu de matière organique pour se développer (opposé à copiotrophe).</footnote>

<footnote>(e) *Eucaryotique* : se dit d'un être vivant dont les cellules possèdent un noyau structuré (opposé à procaryote). Cellule animale ou végétale eucaryote.</footnote>
## B. Paramètres influençant la formation d'un biofilm

Les conditions nécessaires à la formation d'un biofilm sont simples : surface, nutriments, microorganismes et humidité (tableau §1.1). L'adhésion sur des surfaces est une stratégie développée par les microorganismes pour survivre dans les milieux peu propices à leur développement. Ainsi, le développement des biomasses est possible avec des valeurs de concentration supérieures à 2 mg.L⁻¹ de chlore (biocides très utilisé). Des voiles biologiques ont été observés dans les canalisations de désinfectants. Des biofilms ont aussi été mis en évidence autour de lampes UV et sur des sources radioactives (Flemming, 1991).

<table><caption>Tableau §1.1 : Conditions permettant la vie d'un biofilm (Flemming, 1991).</caption><tr><td>Température</td><td>de -12°C<br/>à +115°C</td></tr><tr><td>pH</td><td>de 0<br/>à 13</td></tr><tr><td>Salinité</td><td>de 0<br/>à presque toutes les solutions salines saturées</td></tr><tr><td>Potentiel rédox</td><td>sur la gamme complète de la stabilité de l'eau</td></tr><tr><td>Pression hydrostatique</td><td>de moins de 0,01 bar<br/>à des pressions supérieures à 1400 bar</td></tr><tr><td>Concentrations en nutriments</td><td>à partir de 10 µg.L⁻¹</td></tr><tr><td>Nature de la surface</td><td>Tout type de surface</td></tr></table>

L'organisation en biofilm confère de nombreux avantages aux cellules (Marshall, 1985) :

* Possibilité de former des microconsortiums

* Facilité d'échange de matériel génétique

* Accumulation de nutriments à partir de la phase liquide
* Protection contre les agressions extérieures telles que les substances toxiques : les bactéries immobilisées dans un biofilm montrent une remarquable capacité de résistance aux biocides et antibiotiques.

La majorité des études sur la formation des biofilms et l'adhésion bactérienne se focalisent sur les effets directs de l'activité microbienne sur les surfaces. Cependant, il existe des indications montrant que les microorganismes immobilisés sur des surfaces possèdent des propriétés physiologiques différentes par rapport aux microorganismes en phase aqueuse. Les cellules bactériennes planctonique altèrent leur phénotype pour devenir des cellules sessiles lors de l'adhésion. Les cellules sessiles vivant dans un biofilm et les cellules planctoniques de la même espèce sont différentes sous bien des points de vue : biochimie, phénotype, physiologie,... Dans la nature, les cellules bactériennes se développent de façon prédominante sous le mode sessile et sont engluées dans une matrice afin de se protéger des agressions extérieures. Cette protection est sacrifiée par les cellules planctoniques qui périodiquement s'échappent vers de nouveaux habitats pouvant être colonisés par de nouveaux biofilms (Costerton et al., 1995).

# 1. Physico-chimie du milieu

Les conditions hydrodynamiques influencent le transport de matière : apport de nutriments, cellules et autres matériels de la solution vers le biofilm et détachement de matériel à partir du voile biologique. L'épaisseur d'un biofilm peut varier de quelques micromètres dans un milieu où les forces de cisaillement sont importantes à plusieurs centimètres dans un système d'eaux usées où ces forces sont faibles. Cependant, des forces de cisaillement importantes n'évitent pas la formation d'un biofilm mais rendent celui-ci plus fin et plus dense (Characklis, 1990 ; Leech et Hefford, 1980 ; Powell et Slater, 1982, 1983).

La température du milieu semble jouer un rôle important dans le développement du biofilm à plusieurs niveaux : adhésion primaire des microorganismes et croissance bactérienne. De plus, la vitesse de la plupart des processus chimiques et biochimiques et des processus de transport est influencée par les conditions thermiques.
Le pH du milieu a été décrit comme jouant un rôle important dans les premières phases de l'adhésion microbienne en modifiant les doubles couches électrostatiques du support et des cellules bactériennes (Applegate et Erkenbrecher, 1987).

Les *substances organiques dissoutes* ont une action sur l'adhésion initiale en formant un film primaire qui conditionne la surface du matériau-support et en modifiant la surface de la cellule microbienne. Ainsi Little *et al*. (1986) ont montré que la quantité de source carbonée influence l'hydrophobicité des microorganismes. De plus, le carbone organique, l'azote, le phosphore, les matières organiques biodégradables ... présents dans le milieu sont des sources nutritives pour les microorganismes de la biomasse. En outre, les *particules organiques et inorganiques* peuvent s'accumuler dans le voile biologique qui a une structure adsorptive.

## 2. Support

La vitesse de colonisation microbienne des surfaces dépend de la *composition chimique du support* (Schoenen, 1990). Les populations bactériennes peuvent être très différentes du point de vue morphologique et quantitatif suivant la nature chimique du support (Little *et al.*, 1986). Des facteurs tels que l'hydrophobicité et l'énergie de surface du matériau sont reconnus pour avoir un rôle important dans l'adhésion. La majorité des microorganismes montrent une préférence pour les surfaces hydrophobiques de basse énergie (Baier, 1980).

La *microtypologie de la surface* est un facteur important pour la formation d'un biofilm. Ce fait est particulièrement marqué dans le cas des surfaces d'échangeurs de chaleur (Characklis, 1990). Cependant, si la dimension des rugosités est inférieure à la taille des microorganismes, ce facteur devient négligeable.

La *polarisation de la surface* peut influencer la formation du voile bactérien. En effet, la polarisation d'une surface métallique induit une modification du pH interfacial qui joue lui-même un rôle sur la charge de la surface des cellules microbiennes. La mobilité électrophorétique de la bactérie est modifiée par la polarisation du support (Little *et al.*, 1986).
## II. TECHNIQUES DE DETECTION ET DE CARACTERISATION DU BIOFILM

Les différentes méthodes d'étude du biofilm (Tableau §1.2) peuvent se classer suivant différents critères : directes ou indirectes, ex-situ ou in-situ, destructive ou non-destructive. De plus, les techniques utilisées peuvent permettre d'appréhender différents paramètres concernant le biofilm tels les premières étapes de son développement, sa quantification et ses propriétés physico-chimiques. Cette revue de différentes techniques de détection et de caractérisation du biofilm n'est pas exhaustive mais seulement indicatrice de techniques pouvant être rencontrées dans la littérature. Ce chapitre n'aborde pas les techniques biologiques. En effet, le propos de ce travail est de détecter et de caractériser d'un point de vue physico-chimique le biofilm.

### A. Techniques de détection permettant le suivi des premières étapes du développement du biofilm

La première phase consiste en une accumulation de macromolécules organiques qui conditionnent la surface support. Les techniques permettant de suivre ces premières étapes du développement du biofilm sont essentiellement des techniques d'analyse de surface.

Les propriétés électrostatiques de la surface sont modifiées lors de la formation du film primaire et peuvent être suivies par des techniques d'étude de surface et d'analyses physico-chimiques.

* *Microélectrophorèse* permettant l'étude de la charge de surface mais limitée à quelques matériaux tels que le platine (Loeb et Neihof, 1975)

* *Mesures d'angles de contact* montrant le changement de la charge de surface (Loeb et Neihof, 1975 ; Baier et Weiss, 1975)

* *Ellipsomètrie* permettant de déterminer les indices de réfraction et l'épaisseur de ces films très minces et transparents (Kristoffersen *et al.*, 1982)

* *Spectroscopie Infrarouge* permettant l'étude de la composition de la couche formée mais applicable seulement sur certaines surfaces
<table><caption>Tableau §1.2 : Différentes méthodes pour évaluer l'accumulation du biofilm.</caption><tr><td rowspan="7">Techniques de détection permettant de suivre les premières étapes du développement du biofilm</td><td>Microélectrophorèse</td><td>Loeb et Neihof, 1975</td></tr><tr><td>Mesures d'angles de contact</td><td>Loeb et Neihof, 1975</td></tr><tr><td>Ellipsomètrie</td><td>Baier et Weiss, 1975</td></tr><tr><td>Spectroscopie IR</td><td>Kristoffersen et al., 1982</td></tr><tr><td>Spectroscopie RX</td><td>Nivens et al., 1991</td></tr><tr><td>Techniques de microscopie</td><td>Baier et Weiss, 1975</td></tr><tr><td>Spectrométrie de masse - pyrolyse</td><td></td></tr><tr><td rowspan="5">Techniques directes de caractérisation du biofilm</td><td>Techniques électrochimiques</td><td>Duic et al., 1973</td></tr><tr><td rowspan="3">Spectroscopie photoacoustique</td><td>Ramasamy et al., 1973</td></tr><tr><td>Stoner et Srinivasan, 1970</td></tr><tr><td>Dexter et Lucas, 1985</td></tr><tr><td rowspan="10">Techniques directes de caractérisation du biofilm</td><td>Masse</td><td>Nivens et al., 1991 et 1993</td></tr><tr><td rowspan="9">Epaisseur</td><td>Picologlou et al., 1980</td></tr><tr><td>Trulear et Characklis, 1982</td></tr><tr><td>Bakke et Olsson, 1986</td></tr><tr><td>Bryers et Characklis, 1981</td></tr><tr><td>Hoehn et Ray, 1973</td></tr><tr><td>Norrman et al., 1977</td></tr><tr><td>Sanders, 1966</td></tr><tr><td>Trulear et Characklis, 1982</td></tr><tr><td>Trulear, 1983</td></tr><tr><td>Zelver, 1979</td></tr><tr><td rowspan="7">Mesures indirectes de la quantité de biofilm : activité microbienne</td><td>Comptage de cellules vivantes</td><td>Coterston et Colwell, 1979</td></tr><tr><td rowspan="5">Microscopie épifluorescente</td><td>Corpe, 1973</td></tr><tr><td>Gerchakov et al., 1977</td></tr><tr><td>Geesey et al., 1977</td></tr><tr><td>Little et Lavoie, 1979</td></tr><tr><td>Bobbie et al., 1979</td></tr><tr><td rowspan="4">ATP</td><td>Costerton et Colwell, 1979</td></tr><tr><td>Trulear et Characklis, 1982</td></tr><tr><td>Bakke et al., 1984</td></tr><tr><td>Vitesse d'utilisation des substrats</td><td></td></tr><tr><td rowspan="7">Mesures indirectes de la quantité de biofilm : constituant spécifique du biofilm et effets du biofilm sur les propriétés de transport</td><td>Constituant spécifique du biofilm : polysaccharides, carbone organique total, protéines</td><td>Bobbie et al., 1979</td></tr><tr><td rowspan="5">Effets du biofilm sur les propriétés de transport : frottement et transfert de chaleur</td><td>Bobbie et White, 1980</td></tr><tr><td>Bryers et Characklis, 1981</td></tr><tr><td>Little et Lavoie, 1979</td></tr><tr><td>McCoy, 1979</td></tr><tr><td>Trulear et Characklis, 1982</td></tr><tr><td rowspan="4">Picologlou et al., 1980</td><td>Norrman et al., 1977</td></tr><tr><td>Characklis et al., 1981</td></tr></table>
* Spectroscopie Rayon X permettant l'étude de la nature de la couche formée (Baier et Weiss, 1975)

* Techniques de microscopie permettant de suivre les premiers stades du développement bactérien (voir le paragraphe §1.II.C.3)

* Spectrométrie de masse - pyrolyse donnant des informations sur les poids moléculaires des espèces chimiques composant le film

* Techniques électrochimiques utilisées pour étudier l'adsorption des protéines sur les surfaces métalliques : voltamétrie cyclique (Duic et al., 1973 ; Ramasamy et al., 1973) et mesure de capacité (Stoner et Srinivasan, 1970).

* Spectroscopie photo acoustique permettant de déterminer in-situ la présence d'un film organique adsorbé (Dexter et Lucas, 1985)

## B. Techniques de caractérisation du biofilm

### 1. Masse

Du biofilm humide est prélevé de son milieu de culture puis séché à une température élevée constante (100-105°C). La différence de masse entre le support recouvert du biofilm et du support nettoyé et séché donne la masse du biofilm sec (Characklis, 1990).

La microbalance à quartz (Gabrielli et al., 1991 et 1992) a été utilisée pour suivre l'évolution de la masse d'un biofilm de façon non destructive et en temps réel (Nivens et al., 1991 et 1993 ; Ebersole et al., 1991). Le principe de cette technique repose sur l'effet piézo-électrique. Une tension appliquée sur les deux côtés d'un cristal provoque une elongation ou une contraction de celui-ci parallèlement au champ électrique. L'analyse de la réponse en fréquence de résonance d'un quartz où se développe un biofilm permet de déterminer la masse de la biomasse. Cette technique est sensible à la pression, à la température, aux propriétés viscoélastiques du dépôt,... La limite de détection de cette méthode est de 1 pg environ.
## 2. Densité et porosité

Zhang et Bishop (1994a et b) ont élaboré un modèle pour calculer la porosité d'un voile biologique basé sur la différentiation de l'eau présente dans et hors des cellules. La connaissance de différents paramètres tels que la densité de la biomasse humide, des matières minérales et volatiles est indispensable.

## 3. Épaisseur

Trulear et Characklis (1982) ont utilisé un microscope optique pour déterminer l'épaisseur apparente d'un biofilm en adaptant une méthode mise au point par Sanders (1966). Le microscope est successivement mis au point sur la surface du biofilm et sur le support inerte où s'est développé ce biofilm (fig. §1.5). La précision de cette mesure est de ± 10-12 µm (incluant les irrégularités de la surface du biofilm) pour des épaisseurs de la limite de détection à 130 µm. Il est possible de corriger cette épaisseur en tenant compte de l'indice de réfraction du biofilm humide et d'utiliser cette technique in-situ (Bakke et Olsson, 1986).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure §1.5** : Détermination de l'épaisseur du biofilm à l'aide d'un microscope optique (Bakke et Olsson, 1986).</figcaption></figure>
Le volume du biofilm peut être mesuré par la différence de volume déplacé d'un liquide eau-surfactant par un support recouvert d'un biofilm par rapport au volume déplacé par le support nettoyé et séché (Zelver, 1979). Le niveau du liquide est mesuré à l'aide d'un bras manipulateur dont le contact avec le liquide est déterminé par observation visuelle ou mesure de conductivité (fig. §1.6). La connaissance de ce volume et de la surface de l'échantillon permet d'atteindre l'épaisseur du biofilm. La précision de cette mesure est de ± 10 µm pour des épaisseurs allant de 50 à 300 µm.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure §1.6 : Mesure de volume de biofilm humide par différence de volume déplacé entre un support recouvert par un biofilm et le même support nettoyé et séché (Zelver, 1979).</figcaption></figure>

Norrman *et al.* (1977) ont pu mesurer l'épaisseur d'un biofilm en localisant, par la mesure de la *conductivité électrique*, les interfaces liquide-biofilm et biofilm-support en adaptant une technique mise au point par Hoehn et Ray (1973). Une aiguille en acier est enfoncée dans le biofilm (fig. §1.7). Un pic de courant est observé à la traversée de chaque interface. La précision de cette méthode est d'environ ± 6%.
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**Figure §1.7** : Mesure d'épaisseur de biofilm par mesure de conductivité électrique à l'aide d'une aiguille d'acier (Hoehn et Ray, 1973).

L'utilisation d'un *Microscope Laser à Balayage Confocal (MLBC)* permet l'observation de biofilms hydratés par une technique non intrusive, en trois dimensions et en temps réel sur des biofilms vivants. Cette technique permet l'étude des relations chimiques et spatiales existant entre les bactéries, leurs produits extracellulaires et leur environnement (morphologie, métabolisme, chimie environnementale). Il est possible de suivre les premières étapes de la formation du biofilm et de caractériser les propriétés de transport de la biomasse par l'étude de la diffusion de molécules fluorescentes (Lawrence et al., 1991, 1992). Le MLBC a l'avantage de permettre l'observation des biomasses fixées sur des surfaces non transparentes telles que les métaux, les gels, les minéraux,... L'épaisseur minimale du biofilm observable est de 8 µm avec une précision de ± 3 µm.
# C. Techniques d'analyse des propriétés physico-chimiques du biofilm

## 1. Analyses physico-chimiques

L'analyse de la composition des exopolymères fait appel à différentes techniques : infrarouge (IR), Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), chromatographie en phase gazeuse, spectrométrie de masse, analyse élémentaire par combustion,...

La spectroscopie à infrarouge à Transformée de Fourier (IR-TF) à Réflexion Totale Atténuée est une technique non-destructive et puissante qui permet l'analyse en continu de la nature chimique de l'attachement bactérien et de la formation du biofilm (Nichols et al., 1985 ; Nivens et al., 1991 ; Bremer et Geesey, 1991). Une source IR émet un rayon qui entre en contact avec un matériau transparent au IR tel que le germanium. Le rayon se reflète sur la face interne de ce matériau transparent sur lequel se développe un biofilm (fig. §1.8). Le spectre d'absorption donne des informations sur la nature chimique des composés organiques localisés dans la région proche de la surface (≈ 1µm).

Suivant les ions métalliques présents dans le milieu, il est possible d'observer une modification des propriétés des exopolymères produits par le biofilm (formation de complexes). Ces interactions ions métalliques/polymères peuvent être mises en évidence par IR-TF (Geesey et al., 1988).

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une technique directe et non destructive. Cette technique donne des informations concernant des assemblages de noyaux atomiques spécifiques telles que leur concentration, l'environnement chimique,...

La RMN à impulsion a été utilisée pour estimer la fraction de polymère liée à une surface solide en milieux aqueux par mesure des énergies d'interaction polymère/substrat (Barnett et al., 1981).

La RMN ¹³C permet d'étudier les événements physiologiques ayant lieu dans le biofilm tels que l'utilisation des sources de carbones par les micro-organismes. Cette technique demande un biofilm mature et des concentrations en substrats élevés qui ne reflètent pas toujours les conditions en milieu naturel (Lapin-Scott et al., 1993).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure §1.8** : Spectroscopie à Infrarouge à Transformée de Fourier à réflexion Totale Atténuée (d'après Lapin-Scott *et al.*, 1993).</figcaption></figure>

## 2. Analyses biochimiques

Le dosage de certains constituants du biofilm tels que le carbone organique, protéines ou les polysaccharides permet de suivre l'accumulation du biofilm (Bobbie *et al.*, 1979 ; Bobbie et White, 1980). De plus, l'analyse biochimique de composés cellulaires peut permettre l'évaluation de l'activité biologique du voile biologique et de son accumulation. Les composés les plus couramment étudiés sont l'Adénosine TriPhosphate (ATP), les protéines, les phospholipides, l'acide muramique et l'ADN.

Le dosage de l'ATP extractible peut donner une idée de l'importance de la biomasse "vivante" totale (bactéries, algues,...). Une source potentielle d'erreur de cette technique est l'extraction incomplète du matériel à partir des échantillons (Geesey et Costerton, 1979).
Le dosage des phospholipides permet, quant à lui, de quantifier les cellules vivantes dans le milieu (Vestal et White, 1989). Ce composé chimique est présent dans les cellules vivantes suivant une quantité variable suivant les espèces bactériennes et se dégrade après la mort des microorganismes.

### 3. Microscopies

Le Microscope Optique et le Microscope Laser à Balayage Confocal, déjà présentés, permettent une évaluation directe de l'épaisseur des biofilms. D'autres techniques microscopiques sont utilisées pour suivre de façon indirecte l'évolution du biofilm en fonction de l'activité microbienne.

Les premiers stades de l'adhésion bactérienne peuvent être suivis par Microscopie de Lumière Transmise qui permet de visualiser l'attachement et la distribution des bactéries sur les surfaces. L'observation des premières étapes de la fixation bactérienne est aussi possible à l'aide de la Microscopie Electronique à Transmission (MET).

De plus, la Microscopie Electronique à Balayage (MEB) permet l'observation de la répartition des amas bactériens. Cette méthode comporte cependant l'inconvénient de modifier la morphologie du biofilm lors de la phase de préparation des échantillons. En effet, le MEB, ainsi que le MET, nécessite la fixation puis la déshydratation des échantillons alors que la matrice du biofilm est composée de près de 95 % d'eau. Il est toutefois possible d'atténuer la modification de la morphologie du biofilm en utilisant la cryofixation de l'échantillon avant l'observation (Alleman et al., 1985). La résolution du MEB est moins bonne que celle du MET. Récemment, l'utilisation du Microscope Electronique à Balayage Environnemental a permis l'observation d'échantillons partiellement déshydratés.

Le Microscope à Force Atomique (MFA) est basé sur les phénomènes de répulsion et d'attraction générés entre une micro-sonde et une surface. Cette technique permet de visualiser la topographie d'une surface. Le grand avantage de cette technique sur le MEB et le MET est qu'il n'est pas nécessaire de déshydrater l'échantillon pour l'observation (Bremer et al., 1992). De plus, le MFA permet l'étude des premiers stades de l'adhésion.
## 4. Mesures du frottement et du transfert de chaleur

L'accumulation d'un biofilm augmente les frottements (Zelver, 1979 ; Picologlou et al., 1980 ; Trulear et Characklis, 1982) et la résistance de transfert de chaleur (Characklis et al., 1981) permettant ainsi de suivre son développement dans le temps. Des réacteurs sont utilisés pour étudier le développement du biofilm en fonction de la résistance de friction et de la conductivité thermique :

* Un réacteur annulaire (fig. §1.9) est un outil sensible de laboratoire pour suivre le développement du biofilm. Ce réacteur consiste en deux cylindres concentriques : un cylindre externe fixe et un cylindre interne rotatif. Des lamelles forment une partie intégrante de la paroi interne du cylindre externe et permettent de suivre l'épaisseur (au microscope), la masse et/ou la composition chimique et microbienne du biofilm. Le frottement peut être calculée à partir de la force qu'il est nécessaire d'appliquer pour imposer une vitesse de rotation donnée au cylindre interne. Ce réacteur permet de suivre indirectement et en continu l'accumulation du biofilm.

* Un réacteur tubulaire (fig. §1.10) permet de calculer le frottement à partir du débit et de la chute de pression dans une section test tubulaire. Une autre section du réacteur permet de suivre le transfert de chaleur en fonction du développement du biofilm. Le prélèvement de sections de tube permet de suivre périodiquement l'épaisseur, la masse, la composition chimique du biofilm... Une section transparente du tube permet l'observation visuelle ou microscopique du biofilm.

## 5. Mesures de transport de matière

L'étude du transport de matière dans la biomasse et à la surface de celle-ci est importante pour la compréhension et la prédiction des cinétiques de croissance du biofilm. Les facteurs hydrodynamiques influencent le voile biologique durant chaque étape de son développement.
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure §1.9 : Diagramme schématique d'un réacteur annulaire (d'après Characklis, 1990).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure §1.10 : Diagramme schématique d'un réacteur tubulaire (d'après Characklis, 1990).</figcaption></figure>
a) Mesure de vitesses

La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) est une technique directe et non destructive permettant l'étude des flux convectifs à l'extérieur et dans le biofilm.

Ainsi, la RMN à impulsion a été utilisée pour estimer les flux dans le voile bactérien (Lewandowski *et al.*, 1992).

L'imagerie à RMN (IRMN) permet l'étude de l'hydrodynamique dans et à la surface du biofilm ainsi que l'environnement chimique, la géométrie et la structure de la biomasse (Lewandowski *et al.*, 1992 et 1993 ; Costerton *et al.*, 1995). L'IRMN a la capacité de montrer les ions H⁺ mobiles. La variation de la mobilité des molécules d'eau dans le biofilm et dans la solution permet la localisation de la biomasse et la visualisation des mouvements d'eau dans celle-ci.

La célerimétrie de particules par imagerie est une technique non intrusive.
L'utilisation simultanée d'un Microscope Optique et un Microscope Laser à Balayage
Confocal (Costerton et al., 1995) permet de déterminer la trajectoire et la vitesse de
particules fluorescentes.

b) Mesures de profils de concentration

Les gradients de concentration d'espèces chimiques telles que l'oxygène dissous, le glucose, les sulfures, les protons... peuvent être mesurés à l'aide de microélectrodes dans un biofilm (Bungay et al., 1969 ; Nelson et al., 1986, Jørgensen et al., 1986 ; Cohen et al., 1986 ; Revsbech, 1989a). Lewandowski (1994) a développé un microcapteur alliant un capteur électrochimique à une fibre optique pour une mesure simultanée de la concentration de substrat chimique et de la densité optique. La variation de la densité optique permet de déterminer la position de la microsonde par rapport à la surface du film. Le développement de systèmes de détection basés sur les fibres optiques devrait permettre dans le futur l'analyse de molécules organiques dissoutes et d'abaisser les limites de détection (Revsbech, 1989b).

L'épaisseur des biofilms pouvant être relativement faible, l'espace permettant des
mesures instrumentées intra-film est limité. La taille de l'électrode doit être assez petite
pour pénétrer dans la couche sans modifier sa structure physique. L'avancée des travaux pour l'étude du voile biologique par des microcapteurs dépend donc des progrès de la miniaturisation de l'instrumentation. A l'heure actuelle, la taille des microélectrodes utilisées est inférieure à 10 µm. La mesure locale de concentrations peut donner lieu à des erreurs expérimentales qui, considérant la complexité de l'équipement, peuvent être dues à différentes causes telles que les bruits électromagnétiques et la distorsion du signal. Cette mesure peut être automatisée et effectuée in-situ.

### c) Mesures de coefficients de diffusion

La mesure des coefficients de diffusion peut aider à étudier l'efficacité des agents anti-microbiens, le transport de nutriments,... Les techniques de détermination de coefficients de diffusion peuvent demander l'inactivation de la biomasse avec des sels de métaux lourds ou par irradiation. Ces inactivations peuvent changer les caractéristiques diffusionnelles du voile bactérien.

Une approche possible est le calcul des coefficients de diffusion dans le biofilm ainsi que dans le milieu à partir des *profils de concentration* mesurés à l'aide de microélectrodes. Les procédures de calcul des paramètres cinétiques basées sur les gradients de concentration d'un substrat requièrent le plus souvent une solution stagnante (Lewandowski *et al.*, 1991).

Les mesures de diffusion peuvent être obtenues par l'utilisation de *biomasse filtrée* sur une membrane (Matson et Characklis, 1976).

L'utilisation du *Microscope Laser à Balayage Confocal* permet de déterminer les coefficients de diffusion de molécules fluorescentes (Lawrence *et al.*, 1994). Pour cela, le biofilm est imbibé d'une solution contenant une espèce chimique fluorescente. Le principe de cette technique est basé sur une forte photoexcitation d'un point précis de la biomasse pendant une très courte période. Cette excitation provoque l'extinction de la fluorescence. L'observation du retour de la fluorescence, correspondant à la diffusion des fluorophores, permet d'atteindre les coefficients de diffusion des molécules-traceurs. Cette technique permet d'étudier un ensemble de molécules fluorescentes de différents poids moléculaires et, ainsi, de décrire la structure du biofilm.
# III. PROPRIETES PHYSICO-CHIMIQUES DU BIOFILM

## A. Structure du biofilm

### 1. Distribution spatiale

Le volume d'un biofilm est occupé par une matrice de polymères associée à des
espaces remplis de liquide (80 à 95%) et par des cellules bactériennes (5 à 20%). Les
cellules sont réparties de façon aléatoire dans la matrice et concentrées dans la partie
supérieure du biofilm (Lawrence, 1991 ; Caldwell et al., 1992a ; Zhang et Bishop, 1994a).
Elles tendent à former des microcolonies. La matrice polymérique occupe l'espace séparant
les agrégats de cellules appelés souvent "clusters" (Caldwell et al., 1992b ; De Beer et al.,
1994). La distribution spatiale des composants d'un film bactérien dépend des paramètres
hydrodynamiques.

Dans le cas des matrices les moins denses, différentes méthodes telles que le
Microscope Laser à Balayage Confocal et IR-TF ont mis en évidence des "canaux d'eau",
des cavités et des pores dans la matrice de biopolymères (Jass et al., 1991 ; Dudman,
1977 ; Lawrence et al., 1994). L'importance volumétrique de ces canaux est difficile à
déterminer avec précision. Cependant, ils sont plus ou moins réguliers suivant les espèces
bactériennes présentes et le régime hydrodynamique. La RMN a permis l'étude de
l'hydrodynamique au niveau des "canaux" et de montrer que les flux ne sont pas nuls au
niveau de la surface du biofilm par rapport à la solution, ni dans les "canaux d'eau"
présents dans la matrice (Lewandowski et al., 1992 et 1993). Les microcolonies
bactériennes se situent le plus souvent au niveau des "canaux" où l'apport nutritif est
facilité.

L'utilisation de nouvelles techniques d'observation telles que le MLBC a permis de
modifier la conception de la structure du biofilm au début des années 90. Auparavant, la
biomasse était décrite comme une distribution homogène de cellules dans une matrice
d'exopolymère uniforme (Wanner et Gujer, 1986). Par la suite, le modèle proposé a été
basé sur une structure hétérogène (De Beer et al., 1994 ; Lawrence et al., 1994).
La structure du biofilm est actuellement décrite comme tortueuse, fortement hydratée, poreuse, stratifiée, contenant de nombreux canaux et avec des distributions aléatoires de cellules et d'agrégats (fig. §1.11) (Costerton *et al.*, 1995).

## 2. Epaisseur

L'épaisseur d'un biofilm peut varier de façon importante suivant les conditions environnementales. Ainsi, l'épaisseur d'un biofilm pourra aller de quelques micromètres à plusieurs centimètres suivant les conditions hydrodynamiques du milieu, la composition et la texture du support, la diversité des espèces bactériennes,... (Characklis, 1980 ; Characklis, 1990).

## 3. Densité et porosité

La densité d'un biofilm varie suivant différents facteurs :

* Epaisseur : augmentation de la densité avec l'épaisseur (Rittmann et McCarty, 1981 ; Williamson et McCarty, 1976)

* Profondeur : densité plus importante dans les parties les plus profondes (Christensen et Characklis, 1990 ; Zhang et Bishop, 1994b)

* Structure : corrélation entre une faible densité du biofilm et une structure filamenteuse (Picologlou *et al.*, 1980 ; Trulear et Characklis, 1982 ; McCoy et Costerson, 1982)

* Age : augmentation de la densité en fonction du temps due à une accumulation des EPS (Hoehn et Ray, 1973 ; Trulear, 1983 ; Nivens *et al.*, 1991).

* Réponse à l'agressivité du milieu : forces de cisaillement ou concentration limitée en substrat (Characklis, 1980).

* Milieu : augmentation de la densité dans un milieu où la turbidité est importante.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure §1.11 : Structure du biofilm décrite comme tortueuse, fortement hydratée, poreuse, stratifiée et contenant de nombreux canaux (Costerton, 1995).</figcaption></figure>
La porosité d'un biofilm a été définie par Wanner (1989) comme la proportion du film occupé par de l'eau, eau des cellules excepté. Comme la densité, la porosité varie en fonction de la profondeur dans le voile biologique passant de 84-93% dans les couches supérieures à 58-67% dans les couches inférieures (Zhang et Bishop, 1994a).

La biomasse est décrite comme un milieu poreux contenant des porosités différentes. La diffusion à travers les "clusters" peut être associée à une faible porosité dite primaire et le transport à travers les canaux ou interstices avec une forte porosité dite secondaire (De Beer et al., 1994).

### 4. Rhéologie

La présence de groupements chargés dans un polymère bactérien influence de façon importante ses propriétés physiques (stabilité, viscosité) et fournit des sites d'échange ionique (Geesey, 1982). La nature et la concentration des ions présents en solution influencent les propriétés du polymère. La formation de certains gels de biopolymères se fait par l'intermédiaire d'ions (ex : $Ca^{2+}$, $Mg^{2+}$) qui servent de ponts entre différentes chaînes de polymères par l'intermédiaire de forces électrostatiques (Smidsrød, 1974). Ces gels de polymères possèdent des propriétés viscoélastiques. La nature viscoélastique du biofilm a été démontrée par des mesures réalisées *in-situ* à l'aide d'un viscosimètre de Weissenburg. L'augmentation des frottements confirme cette propriété (Characklis, 1980 ; Christensen et Characklis, 1990).

## B. Composition chimique du biofilm

La composition chimique organique est fortement conditionnée par les sources d'énergie et de carbone assimilables par le métabolisme des microorganismes.

La composition chimique inorganique varie suivant la composition du support et de la phase aqueuse. De nombreuses particules organiques et inorganiques sont emprisonnées dans la matrice polymérique (ex : substances humiques, débris, silice, produits de corrosion...).
La plupart des polymères extracellulaires sont composés de polysaccharides et/ou de protéines (Fletcher, 1980 ; Sutherland, 1984 ; Costerton et al., 1987 ; Christensen et Characklis, 1990). Les polysaccharides sont constitués principalement de sucres courants : glucose, galactose, mannose, fructose, N-acétylglucosamine, acide glucuronique... Les polymères extracellulaires confèrent au biofilm un caractère extrêmement hydrophile et la biomasse est fortement hydratée (Characklis et al., 1981 ; Lawrence, 1991).

Des gradients de concentration d'espèces chimiques telles que l'oxygène, les oxydes nitreux, les ions hydrogène,... ont été mis en évidence par l'utilisation de microcapteurs dans le biofilm (Revsbech, 1989).

L'activité métabolique des microorganismes altère la composition du milieu. Les molécules et ions produits par les cellules diffusent à partir des cellules. Certains ions et molécules sont retenus et forment un "halo" autour de la cellule en fonction de leur taille et de leur densité de charge. Durant les processus métaboliques, le pH est modifié. Les ions $H^+$ produits par les microorganismes sont retenus autour des bactéries et provoquent une diminution du pH autour des cellules (Caldwell et al., 1992a et b).

L'hétérogénéité chimique du biofilm donne lieu à des disparités électrochimiques. Lewandowski a cartographié les zones anodiques et cathodiques sur des surfaces métalliques recouvertes de biomasse (Costerton et al., 1995). Les études initiales ont indiqué que les parties recouvertes par le voile biologique sont généralement anodiques alors que les parties dépourvues de biofilm sont cathodiques.

Les concentrations en oxygène dissous sont extrêmement variables suivant la situation géographique de la mesure. Ainsi les valeurs relevées au centre des microcolonies bactériennes montrent que celles-ci peuvent être totalement anoxique alors que les valeurs relevées au niveau des canaux s'étendent sur toute une gamme de concentration.

## C. Propriétés de transport et interfaciales

### 1. Transport de matière

Le transport de matière est extrêmement important car il apporte nutriments, cellules et autres matériels dans le biofilm. La matrice d'exopolymères peut jouer à différents
degrés un rôle de barrière de diffusion. Cette propriété est souvent invoquée pour expliquer la résistance aux agents anti-microbiens, le développement de microzones anaérobies, l'hétérogénéité de la structure du biofilm... De plus, la mesure de la mobilité de différentes espèces chimiques est importante pour la compréhension de phénomènes dynamiques dans les biomasses.

La mécanique des fluides décrit traditionnellement les conditions près de surfaces rigides. Un biofilm est constitué de biopolymères viscoélastiques et sa surface n'est pas rigide et est quelquefois filamenteuse. Il n'y a pas de modèle mathématique pouvant être directement appliqué à la description des flux près de telles surfaces.

Différents auteurs (Harremöes, 1978 ; Williamson et McCarty, 1976 ; Revsbech, 1989b) ont élaborés des modèles décrivant le transport de matière au niveau d'une biomasse et de son interface tout en tenant compte de l'utilisation des nutriments par les organismes vivants (fig. §1.12).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure §1.12** : Profil de concentration de l'oxygène à travers un biofilm (Redessiné à partir de Revsbech, 1989b).</figcaption></figure>
La forme des profils de concentration d'une espèce chimique dans le biofilm peut être attribuée à :

* Vitesse de consommation de cette espèce dépendant de la quantité de microorganismes présents et de leur affinité pour cette substance.

* Vitesse de transport de cette espèce dans le film dépendant de la diffusion moléculaire

* Vitesse de transport de cette espèce vers le biofilm dépendant de la vitesse de consommation de l'espèce et de la diffusion convective.

Pour simplifier les modèles, il est possible d'inactiver la biomasse avec des sels de métaux lourds ou par irradiation. Ces inactivations peuvent changer les caractéristiques diffusionnelles du voile bactérien.

Les coefficients de diffusion obtenus pour différentes espèces chimiques à travers un biofilm varient énormément d'un auteur à l'autre (tableau §1.3). Cependant, le plus souvent, les valeurs des coefficients de diffusion ne sont pas corrélées avec l'âge ou la densité du biofilm étudié et sont mesurées par des méthodes expérimentales différentes.

Siegrist et Gujer (1985) indiquent que les coefficients de diffusion décroissent avec l'augmentation de l'épaisseur du biofilm et de sa densité. Les coefficients de diffusion varient suivant les régions de la biomasse. Les valeurs déterminées dans les régions les moins denses telles que la partie supérieure du biofilm ou dans les volumes adjacents aux canaux sont plus importantes que les valeurs déterminées dans les parties les plus denses.

Récemment, De Beer et al. (1994) ont montré que les coefficients de diffusion dans un biofilm ne diffèrent pas considérablement de ceux mesurés dans l'eau (tableau §1.4). Seules les macromolécules diffusent significativement plus lentement dans le biofilm (Lawrence et al., 1994).
<table><caption>Tableau §1.3 : Coefficients de diffusion de différentes espèces dans des biofilms.</caption><thead><tr><th>Espèce diffusante</th><th>Coefficient de diffusion D<sub>f</sub> (10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>)</th><th>D<sub>f</sub>/D<sub>H<sub>2</sub>O</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>Oxygène</td><td>15</td><td>0,70</td><td>Tomlinson et Snaddon, 1966.</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td></td><td>0,95</td><td>Bungay et al., 1969.</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>22</td><td>0,9</td><td rowspan="3">Williamson et McCarty, 1976.</td></tr><tr><td>Ammoniaque</td><td>13</td><td>0,8</td></tr><tr><td>Nitrate</td><td>14</td><td>0,9</td></tr><tr><td>Glucose</td><td></td><td>≈ 0,5</td><td rowspan="3">Siegrist et Gujer, 1985.</td></tr><tr><td>Sodium (Na<sup>+</sup>)</td><td></td><td>≈ 0,6</td></tr><tr><td>Bromure (Br<sup>-</sup>)</td><td></td><td>≈ 0,6</td></tr><tr><td>Lactose</td><td></td><td>0,66</td><td>Yu et Pinder, 1993.</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>17,6</td><td>0,88</td><td>Lewandowski et al., 1991</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>13</td><td>0,75</td><td>Lewandowski, 1994.</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau §1.4 : Coefficients de diffusion dans des biofilms de différentes espèces (SAB = Sérum Albumine Bovin, IgG = Immunoglobulines humaines de classe G, ADN = Acide DésoxyriboNucléique) (De Beer et al., 1994).</caption><thead><tr><th>Molécule</th><th>Masse moléculaire</th><th>Coefficient de diffusion D<sub>H<sub>2</sub>O</sub> (10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>)</th><th>Coefficient de diffusion D<sub>f</sub> (10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>)</th><th>D<sub>f</sub>/D<sub>H<sub>2</sub>O</th></tr></thead><tbody><tr><td>Fluorescéine</td><td>332</td><td>5,55</td><td>5,40</td><td>0,91</td></tr><tr><td>Dextrane</td><td>10 000</td><td>0,22</td><td>0,196</td><td>0,89</td></tr><tr><td>Dextrane</td><td>70 000</td><td>0,17</td><td>0,144</td><td>0,85</td></tr><tr><td>SAB</td><td>68 000</td><td>0,69</td><td>0,59</td><td>0,86</td></tr><tr><td>IgG</td><td>146 000</td><td>0,38</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Hexokinase</td><td>102 000</td><td>0,59</td><td>0,41</td><td>0,69</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>225 000</td><td>0,41</td><td>0,278</td><td>0,67</td></tr><tr><td>ADN</td><td>3,2 10<sup>6</sup></td><td>0,0008</td><td>0,0005</td><td>0,63</td></tr></tbody></table>
Une couche modèle de gel de polyacrylamide a montré un comportement identique à celui du biofilm (White et Dorion, 1961). L'expression suivante met en relation la diffusion à travers des gels (agar) par rapport à la diffusion dans la solution (Dudman, 1977) :

$$D_{\text{gel}} = \frac{D_{\text{sol}}}{1 + (a_{\text{D}} - 1)\phi_{\text{D}}} \qquad (\text{§1.1})$$

où $D_{\text{gel}}$ et $D_{\text{sol}}$ sont respectivement les coefficients de diffusion dans le gel et dans la solution, $\phi_{\text{D}}$ un coefficient correspondant à la fraction de volume occupé par le gel (Lauffer, 1961) et $a_{\text{D}}$ un coefficient (5/3 pour une orientation aléatoire des pores). D'après cette relation, un gel d'agar 1,5% ($\phi_{\text{D}} \approx 0,05$ ; Schantz et Lauffer, 1962) modifie peu la vitesse de diffusion d'une espèce donnée ($D_{\text{gel}} \approx 97\% D_{\text{sol}}$). De plus, la taille des pores du gel impose une limite de la dimension des molécules diffusant à travers ce gel. Les facteurs influençant la diffusion à travers les gels (et probablement les biofilms) sont les forces électrostatiques, le pH, la composition et la force ionique.

D'autres hypothèses sur la structure des biomasses proposent la possibilité de mouvements d'eau dans le biofilm infirmant ainsi la supposition présentant le transport de matière dans le biofilm comme gouverné totalement par la diffusion moléculaire. Des mesures en IRMN et en célérimétrie de particules par imagerie ont corroboré ces suppositions en montrant des flux convectifs au niveau des pores et canaux dans la biomasse (Costerton et al., 1995).

De Beer et al. (1994) ont décrit le biofilm comme un milieu poreux contenant des pores primaires associés à la diffusion à travers les agrégats cellulaires et des pores secondaires associés au transport à travers les interstices. L'utilisation d'un paramètre de transport tel que le coefficient de diffusion est alors insuffisant. Par exemple, dans le cas des biocides, la présence de biocide à la base d'un biofilm ne signifie pas obligatoirement que le produit a pénétré entièrement dans les "clusters" composés de cellules bactériennes. L'expérience montre qu'il y a un retour de l'activité et de la croissance microbienne à partir des cellules des "clusters".
## 2. Conductivité thermique et coefficient de friction

Un biofilm recouvrant les parois d'un conduit réduit considérablement le transfert de chaleur (fig. §1.13). Ce phénomène est notamment rencontré dans les échangeurs de chaleur (Charaklis et al., 1981 ; Zelver et al., 1982). La conductivité thermique d'un biofilm est significativement moindre par rapport à celle d'une surface métallique. Par contre, la conductivité thermique de la biomasse est assez proche de celle de l'eau ce qui n'est pas une surprise puisque le biofilm contient 73 à 99% d'eau (Tableau §1.5).

De plus, l'accumulation d'un voile biologique provoque une perte d'énergie cinétique par augmentation du frottement (fig. §1.13) (Picoglou et al., 1980 ; Trulear et Characklis, 1982). Cette perte d'énergie peut être due à la modification de la rugosité de la surface recouverte par le biofilm, à la nature viscoélastique et à la nature filamenteuse des organismes composant le biofilm (McCoy et Costerson, 1982)... Le frottement dépend de l'épaisseur du biofilm au-delà d'une épaisseur critique approximativement égale à celle de la couche hydrodynamique.

<table><caption>Tableau §1.5 : Conductivité thermique du biofilm et d'autres matériaux impliqués dans les échangeurs de chaleurs (d'après Characklis, 1981).</caption><thead><tr><th>Matériaux</th><th>Conductivité thermique (W/mK)</th><th>Température (°C)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Biofilm</td><td>0,68 ± 0,27</td><td>8,3 ± 0,3</td></tr><tr><td>0,71 ± 0,39</td><td>26,7 ± 0,3</td></tr><tr><td>0,57 ± 0,10</td><td>28,3 ± 0,3</td></tr><tr><td rowspan="2">Eau</td><td>0,61</td><td>26,7</td></tr><tr><td>0,62</td><td>28,3</td></tr><tr><td>Acier au carbone</td><td>51,92</td><td>0 - 100</td></tr><tr><td>Acier inoxydable</td><td>16,30</td><td>0 - 100</td></tr><tr><td>Titane</td><td>16,44</td><td>0 - 100</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure §1.13** : Cinétique de croissance du biofilm décrite en terme d'accumulation du dépôt, de frottement hydrodynamique et de résistance de transfert de chaleur (Characklis, 1990)</figcaption></figure>
IV. CONCLUSION

La structure du biofilm est décrite suivant les auteurs en utilisant différentes caractéristiques :

* Porosité (Wanner, 1989; Characklis et al., 1981 et Characklis, 1990 ; Costerton, 1994)

• Hydratation (Characklis et al., 1981 ; Lawrence, 1991)

* Viscoélasticité (Characklis, 1980 ; Christensen et Characklis, 1990).

* Tortuosité

* Stratification

Ce film poreux est une barrière de diffusion et modifie donc le transport de matière.
Le rôle du transport de matière dans un biofilm est extrêmement important : apport de
nutriments, de cellules bactériennes et d'autres matériels, résistance aux agents anti-
microbiens... Mais, dans le cadre de ce travail, l'intérêt d'étudier le transport de matière
dans un biofilm sera de permettre sa caractérisation physique en terme de porosité ε et
d'épaisseur δf.
# Chapitre 2

## Modèle physique,
Techniques d'étude
et expérimentales

I. Modèle physique : Analyse du transport de matière

II. Techniques d'étude

III. Techniques expérimentales
Dans cette étude, le biofilm sera considéré à l'échelle macroscopique comme une couche poreuse homogène.

La caractérisation de la porosité d'une couche fine recouvrant un support solide n'est pas aisée par les techniques conventionnelles. Ainsi, la technique BET qui est utilisée dans le cas d'un milieu poreux (généralement une poudre) en contact avec un gaz est peu sensible ; l'aire spécifique n'étant pas assez importante.

Les techniques électrochimiques basées sur le contrôle du transport de matière permettent de caractériser la porosité.

L'électrode à Disque Tournant (EDT) est un outil dont l'hydrodynamique est parfaitement connue aussi bien en régime stationnaire (Levich, 1962) qu'en régime transitoire (Tribollet et Newman, 1983 ; Deslouis et Tribollet, 1991). Son emploi est particulièrement bien adapté aux études mettant en jeu un courant limite de diffusion. Ce travail s'appuiera plus particulièrement sur l'étude d'une EDT recouverte d'une couche poreuse (Deslouis et al., 1987).

L'étude du transport de matière au voisinage d'une électrode recouverte par une couche poreuse non réactive d'épaisseur $δ_f$ à travers laquelle les espèces sont transportées par diffusion moléculaire repose sur l'analyse du courant limite de réduction ou d'oxydation d'un traceur électrochimique.

Différentes techniques électrochimiques peuvent être utilisées :

* **Régime stationnaire** : mesure du courant limite en fonction de la vitesse de rotation

* **Régime transitoire** : impédance électrochimique et impédance électrohydrodynamique
# I. MODELE PHYSIQUE : ANALYSE DU TRANSPORT DE MATIERE

L'équation de Nersnst-Planck pour le flux J d'une espèce chargée est de la forme :

$$J = -D\nabla c - \frac{zF}{RT} D c \nabla\phi + cv \quad (§2.1)$$

où les différents termes représentent respectivement :

* **Diffusion** ($-D\nabla c$) : flux d'espèces, chargées ou non, créé par un gradient de potentiel chimique. Le milieu tend à retrouver son homogénéité lors de l'apport ou de la consommation d'une espèce chimique.

* **Migration** ($-\frac{zF}{RT}Dc\nabla\phi$) : flux de particules chargées créé par un gradient de potentiel électrique. Lorsque le milieu contient un excès d'électrolyte support, ce terme peut être négligé.

* **Convection** (c v) : flux d'espèces créé par le mouvement du milieu dû à l'agitation mécanique et/ou thermique.

## A. Analyse du transport de matière au voisinage d'une électrode à disque tournant

Le transport de matière au voisinage d'une électrode en mouvement dans un fluide immobile est décrit par le modèle de diffusion convective. Ce modèle suppose l'existence, au contact de l'électrode, d'une couche d'électrolyte d'épaisseur $\delta_n$ appelée couche de diffusion dans laquelle est localisée la variation de concentration. Au voisinage immédiat de l'interface, les concentrations des espèces électroactives varient linéairement en fonction de la distance à l'électrode (fig. §2.1).
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure §2.1 : Profil de concentration d'espèces électroactives consommées à l'électrode nue en fonction de la coordonnée axiale z de l'électrode à disque tournant.</figcaption></figure>

Dans le cas d'une électrode à disque tournant, les profils de vitesse et les lignes de courant peuvent être obtenus à partir de la résolution de l'équation de Navier-Stokes et de l'équation de continuité. La rotation du disque entraîne dans son mouvement le fluide qui est rejeté vers l'extérieur selon des directions radiales. Le renouvellement de la solution au voisinage du disque s'effectue grâce un mouvement le long de la direction normale à sa surface (fig. §2.2). La résolution stationnaire de ces équations montre que la composante normale de la vitesse $v_z$ est indépendante des coordonnées radiale et tangentielle et ne fait intervenir que les coordonnées normales. L'origine de l'axe z est prise à l'interface métal/solution.
<figure><img src="image_16.png" /></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure §2.2 : (a) Représentation vectorielle des vitesses près du disque et (b) lignes de courant résultantes d'une EDT en rotation uniforme autour de son axe.</figcaption></figure>

La distribution de concentration dans la solution est gouvernée par la diffusion convective. En supposant une concentration uniforme en tout point de l'électrode (réactivité uniforme) et compte tenu des propriétés hydrodynamiques de la EDT, l'équation du transport de matière se réduit à une équation monodimensionnelle :

$$ \frac{\partial c}{\partial t} + v_z \frac{\partial c}{\partial z} = D \frac{\partial^2 c}{\partial z^2} \qquad (§2.2) $$

Cette équation peut être décomposée en deux équations stationnaire et non-stationnaire.

Le champ de concentration stationnaire est obtenu par l'intégration de l'équation précédente avec :

$$ \frac{\partial c}{\partial t} = 0 \qquad (§2.3) $$
L'expression du gradient de concentration à l'interface conduit à celle du courant sachant que :

$$i_L = n F D S \left. \frac{\partial c}{\partial z} \right|_0 \qquad (§2.4)$$

Levich (1962) a ainsi obtenu l'équation §2.5 reliant le courant limité par le transport de matière à la vitesse angulaire du disque.

$$i_L = 0,62 \text{ nFS} \sqrt{\frac{2\pi}{60}} D^{2/3} v^{-1/6} c_{\infty} \Omega^{1/2} \qquad (§2.5)$$

avec n nombre d'électrons mis en jeu
F constante de Faraday (96500 C)

S surface de l'électrode (en cm²)

D coefficient de diffusion du traceur dans la solution électrolytique (cm².s⁻¹)

v viscosité cinématique (cm².s⁻¹)

c_∞ concentration du traceur (mol.cm⁻³)

Ω vitesse de rotation (tr.min⁻¹)

Lorsque la réaction électrochimique n'est pas infiniment rapide, un terme cinétique i_K doit être pris en compte dans l'expression du courant total.

$$i^{-1} = i_{L}^{-1} + i_{K}^{-1} \qquad (§2.6)$$

## B. Analyse du transport de matière au voisinage une électrode à disque tournant recouverte d'une couche poreuse

Une couche poreuse d'épaisseur δ_f recouvrant l'interface métallique d'une EDT agit comme une barrière de diffusion. La variation de concentration d'une espèce électroactive (Deslouis et al., 1987), impliquée dans une réaction Rédox rapide, est distribué entre (fig. §2.2) :
* la couche poreuse où le transport de matière est contrôlé par un processus de diffusion moléculaire

* la solution électrolytique où le transport de matière est contrôlé par la diffusion convective

L'interface métal/couche est supposée uniformément réactive. Le problème reste monodimensionnel (le long de l'axe z de l'EDT).

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

**Figure §2.3** : Profil de concentration d'espèces électroactives consommées à l'électrode recouverte d'une couche poreuse en fonction de la coordonnée axiale z de l'électrode à disque tournant.

Dans une couche poreuse, la distribution de concentration $c_1$ est seulement déterminée par la diffusion moléculaire :
$$ \frac{\partial c_1}{\partial t} = D_f \frac{\partial^2 c_1}{\partial z^2} \qquad (§2.7) $$

Dans la solution électrolytique, la distribution de concentration $c_2$ est gouvernée par la diffusion convective :

$$ \frac{\partial c_2}{\partial t} + v_z \frac{\partial c_2}{\partial z^*} = D \frac{\partial^2 c_2}{\partial z^{*2}} \qquad (§2.8) $$

Pour plus de facilité, deux coordonnées z et $z^*$ ont été définies. L'origine de l'axe z est prise à l'interface métal/couche et celle de l'axe $z^*$ à l'interface couche/solution ($z^* = z - \delta_f$). Les conditions de continuité des concentrations et des flux à l'interface solution/couche constituent les conditions limites des équations différentielles précédentes.

$$ \Leftrightarrow \text{Pour } z = \delta_f \quad \text{soit } z^* = 0 \qquad c_1(\delta_f) = c_2(0) $$

$$ D_f \frac{\partial c_1}{\partial z} = D \frac{\partial c_2}{\partial z} \qquad (§2.9) $$

En régime stationnaire, ce système d'équations a été résolu par Deslouis *et al.* (1987). Le courant total s'écrit sous la forme :

$$ i = \frac{1}{i_{\infty}^{-1} + i_{K}^{-1} + i_{L}^{-1}} \qquad (§2.10) $$

$$ \text{où} \quad \left\{ \begin{array}{l} i_{\infty}^{-1} = \frac{\delta_f}{n F S D_f c_{\infty}} \qquad (§2.11) \\[1.5em] i_K^{-1} = \frac{1}{n F S c_{\infty} k \exp(b\eta)} \qquad (§2.12) \\[1.5em] i_L^{-1} = \left( 0,62 \ nF_S \sqrt{\frac{2\pi}{60}} D^{2/3} v^{-1/6} c_{\infty} \Omega^{1/2} \right)^{-1} \qquad (§2.13) \end{array} \right. \quad \begin{array}{l} \text{Inverse du courant} \\ \text{fonction de la diffusion} \\ \text{moléculaire dans la} \\ \text{couche poreuse} \\[1.5em] \text{Inverse du courant} \\ \text{d'origine cinétique avec} \\ \text{b coefficient de Tafel et} \\ \text{η surtension.} \\[1.5em] \text{Inverse du courant de} \\ \text{Levich} \end{array} $$
## II. TECHNIQUES D'ETUDE

Différentes techniques électrochimiques ont été utilisées conjointement ou séparément :

* **technique stationnaire** : mesure du courant limite en fonction de la vitesse de rotation

* **techniques transitoires** : impédances électrohydrodynamique (EHD) et électrochimique (AC)

### A. Régime stationnaire

Dans le cas d'une EDT nue, l'équation §2.5 décrite par Levich peut aussi être exprimée sous la forme :

$$i_L = K \Omega^{1/2} \qquad (\text{§2.14})$$

avec K coefficient de Levich.

L'équation reliant le courant i à Ω est une droite dans les coordonnées (√Ω, i). Cette droite passe par l'origine et sa pente correspond au coefficient de Levich K. Cette technique permet de mesurer K et ainsi d'atteindre le coefficient de diffusion D du traceur utilisé dans la solution électrolytique (éq. §2.5). L'équation précédente peut être représentée sous la forme $i_L^{-1} = f(\Omega^{-1/2})$ dite de Koutechy-Levich. La droite ainsi définie a pour pente l'inverse du coefficient de Levich.

Dans les cas pratiques, au courant limite de diffusion s'ajoute un courant non diffusionnel $i_o$ correspondant à une réaction électrochimique parallèle. En considérant la réaction Rédox du traceur infiniment rapide, l'expression du courant devient alors :

$$i = i_o + i_L \qquad (\text{§2.15})$$
Dans le cas d'une EDT recouverte d'une couche poreuse, le courant est de la forme :

$$i = i_o + \frac{1}{i_{\infty}^{-1} + K^{-1}\Omega^{-0.5}} \qquad (§2.16)$$

A partir de l'étude du courant en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode, trois paramètres interviennent :

$$i_o \qquad (§2.17)$$

$$i_{\infty}^{-1} = \frac{\delta_f}{nFD_f c_{\infty} S} \qquad (§2.18)$$

$$K^{-1} = \left( 0.62nFS \sqrt{\frac{2\pi}{60}} D^{2/3} v^{-1/6} c_{\infty} \right)^{-1} \qquad (§2.19)$$

Par l'ajustement de l'équation §2.16 aux données expérimentales, les trois paramètres $i_o$, $i_{\infty}^{-1}$ et $K^{-1}$ peuvent être déterminés. Le paramètre $i_{\infty}^{-1}$ permet alors d'atteindre la vitesse de diffusion $\frac{D_f}{\delta_f}$ à travers la couche.

## B. Techniques transitoires

Parmi les méthodes en régime transitoire se trouvent l'impédance électrochimique (AC) et l'impédance électrohydrodynamique (EHD). Le principe de base de ces techniques repose pour l'utilisation de perturbations de faible amplitude du potentiel, du courant ou de la vitesse de rotation de l'électrode sur un système à l'état stationnaire. L'amplitude du signal de perturbation doit être suffisamment faible pour que la réponse demeure dans le domaine de linéarité. L'analyse en fréquence de grandeurs observables telles que le
potentiel ou le courant permet de caractériser le système : coefficients de diffusion, constantes de vitesse de réaction....

Dans le cas d'une électrode à disque tournant, le régime hydrodynamique est contrôlé. Si le système électrochimique étudié est au moins partiellement sous contrôle diffusionnel, il peut être décrit par une relation de la forme :

$$F(i,E,\Omega) = 0 \qquad (\text{§2.20})$$

où i est le courant total traversant la cellule d'électrolyse

E est le potentiel de l'électrode de travail par rapport à l'électrode de référence

$\Omega$ est la vitesse de rotation de l'EDT

Les dérivées partielles de ces trois grandeurs sont liées entre elles par la relation :

$$\left(\frac{\partial i}{\partial \Omega}\right)_E = -\left(\frac{\partial i}{\partial E}\right)_{\Omega} \left(\frac{\partial E}{\partial \Omega}\right)_i \qquad (\text{§2.21})$$

avec $\left(\frac{\partial i}{\partial \Omega}\right)_E$ impédance électrohydrodynamique $Z_{EHD,E}$ sous contrôle potentiostatique

$\left(\frac{\partial E}{\partial \Omega}\right)_i$ impédance électrohydrodynamique $Z_{EHD,i}$ sous contrôle galvanostatique

$\left(\frac{\partial E}{\partial i}\right)_{\Omega}$ impédance électrochimique $Z_{\Omega}$ sous contrôle diffusionnel

L'expression §2.21 s'écrit alors :

$$Z_{EHD,E} = -\frac{1}{Z} Z_{EHD,i} \qquad (\text{§2.22})$$

A partir de la relation §2.20, l'équation suivante peut être exprimée :

$$\Delta i = \frac{1}{Z} \Delta E + Z_{EHD,E} \Delta \Omega \qquad (\text{§2.23})$$
Les deux équations §2.22 et §2.23 montrent l'interdépendance entre les impédances EHD et l'impédance électrochimique.

# 1. Impédance électrohydrodynamique (EHD)

L'impédance électrohydrodynamique repose sur l'analyse de la réponse en fréquence d'un système électrochimique à la modulation sinusoïdale de la vitesse de rotation (fig. §2.4) d'une électrode à disque tournante (Tribollet et Newman, 1983 ; Deslouis et Tribollet, 1991). La description suivante portera sur l'impédance EHD sous contrôle potentiostatique c'est-à-dire avec une concentration constante à l'interface.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure §2.4 : Principe de l'impédance EHD sous contrôle potentiostatique.</figcaption></figure>

Le potentiel d'électrode est maintenu constant et le courant électrique est limité par le transport de matière. Une petite perturbation sinusoïdale est imposée à la vitesse de rotation de l'électrode tournante et le courant électrochimique sinusoïdal résultant est mesuré. La vitesse de rotation peut être exprimée mathématiquement en fonction du temps :

$$ \Omega(t) = \bar{\Omega} + \text{Re}\{\Delta\Omega \exp(j\omega t)\} \quad (\text{§2.24}) $$
où $\omega$ la pulsation est liée à la fréquence de modulation f par $\omega = 2\pi f$, $\Delta\Omega$ et $\bar{\Omega}$ sont respectivement l'amplitude de modulation et la valeur moyenne de la vitesse de rotation et $\text{Re}\{x\}$ est la partie réelle de x.

La perturbation de la vitesse de rotation induit une modulation sinusoïdale de l'épaisseur de la couche de diffusion. Cette méthode est donc particulièrement bien adaptée dans l'étude du transport de matière. L'amplitude de la modulation $\Delta\Omega$ doit être suffisamment petite ($\Delta\Omega \ll \bar{\Omega}$) pour que la réponse en courant soit linéaire :

$$i(t) = \bar{i} + \text{Re}\{\Delta i \exp(j\omega t)\} \qquad (\text{§2.25})$$

où $\Delta i$ est une fonction complexe et $\bar{i}$ est le courant moyen.

L'impédance EHD est définie comme :

$$Z_{\text{EHD}}(\omega) = \frac{\Delta i}{\Delta \Omega} = A(\omega) \exp[j\phi(\omega)] \qquad (\text{§2.26})$$

où $A(\omega)$ et $\phi(\omega)$ sont respectivement le rapport des amplitudes et le déphasage entre les deux signaux.

Tribollet et Newman (1983) ont développé l'analyse de l'équation de diffusion convective transitoire nécessaire à l'interprétation rigoureuse de $Z_{\text{EHD}}$. Dans une première partie, la résolution numérique de l'équation de Navier - Stokes a permis de déterminer le flux résultant de la modulation de la vitesse de rotation. Ces profils de vitesse sont alors utilisés dans l'équation de diffusion convective pour obtenir le profil de concentration modulé des espèces électroactives.

A l'interface, la conservation du flux est :

$$\frac{\Delta i_f}{nF} = D \left. \frac{\partial \Delta c}{\partial z} \right|_0 \qquad (\text{§2.27})$$
Une fois le profil de concentration connu, le flux transitoire linéarisé est donné par :

$$ \left. \frac{\partial \Delta c}{\partial z} \right|_0 = \frac{\Delta c_o}{\delta_n} \Gamma(4/3) \theta'(0) + \left. \frac{\Delta \Omega}{\bar{\Omega}} \frac{\partial c}{\partial z} \right|_0 W \quad (§2.28) $$

où z est la distance axiale par rapport à l'électrode et $\Gamma(4/3) = 0,89298$. L'impédance de diffusion adimensionnelle sur une électrode nue, $-1/\theta'(0)$ est fonction uniquement de $pSc^{1/3}$ ($p = \frac{\omega}{\bar{\Omega}}, Sc = \frac{\nu}{D}$) pour une surface uniformément accessible. La fonction complexe W dépend de p et de Sc.

$\delta_n$ est l'épaisseur de la couche de diffusion en régime stationnaire et s'exprime par :

$$ \delta_n = \left(\frac{a}{3} Sc\right)^{-1/3} \Gamma(4/3) \sqrt{\frac{\nu}{\bar{\Omega}}} \quad (§2.29) $$

$$ \text{avec } a = 0,51023 $$

La dernière étape de cette démarche est de relier la concentration interfaciale et le gradient de concentration à l'interface, aux grandeurs électriques observables courant et potentiel.

Dans une cellule électrochimique, à l'interface électrode/électrolyte, le courant total i est la somme du courant faradique et du courant capacitif. Le courant faradique $i_f$ résulte d'une réaction électrochimique avec transfert d'électrons à travers l'interface. Le courant capacitif $i_c$ est dû à la variation de charge interfaciale.

Le courant capacitif s'exprime par :

$$ i_c = \frac{dq}{dt} = C_{dc} \frac{dE_i}{dt} \quad (§2.30) $$
avec $C_{dc}$ capacité double couche et $E_i$ potentiel interfacial. L'équation du courant total s'exprime par :

$$ \Delta i = \Delta i_f + j\omega C_{dc} \Delta E \qquad (\text{§2.31}) $$

Compte tenu de la chute ohmique où $R_e$ est la résistance de l'électrolyte, la différence de potentiel entre les électrodes de travail et de référence $\Delta E$ est définie par l'expression suivante :

$$ \Delta E = \Delta E_i + R_e \Delta i \qquad (\text{§2.32}) $$

A partir des équations §2.27, §2.28, §2.31 et §2.32, on a :

$$ Z_{\text{EHD}} = \left( \frac{\Delta i}{\Delta \Omega} \right)_E = \frac{\bar{i}}{\bar{\Omega}} \frac{Z_d(p)}{R_e + (R_{tc} + Z_d(p))(1 + j\omega R_e C_{dc})} W(p) \qquad (\text{§2.33}) $$

où $R_{tc}$ est la résistance de transfert de charge et $Z_d(p)$ est l'impédance de diffusion convective ($\frac{Z_d(p)}{Z_d(0)} = -\frac{1}{\theta'(0)}$). Quand $R_e$ est très faible ou quand la chute ohmique est compensée, il n'y a pas de modulation du potentiel interfacial et $\Delta i = \Delta i_f$. L'équation précédente donne :

$$ Z_{\text{EHD}} = \frac{\bar{i}}{\bar{\Omega}} \frac{Z_d}{R_{tc} + Z_d} W \qquad (\text{§2.34}) $$

Pour une réaction électrochimique très rapide sur le plateau de diffusion, $R_{tc} \ll |Z_d|$, on a alors :

$$ Z_{\text{EHD}} = Z_C = \frac{\bar{i}}{\bar{\Omega}} W \qquad (\text{§2.35}) $$

où $Z_C$ est une fonction de transfert dépendant uniquement du transport de matière.
Ces différentes étapes peuvent être représentées par le schéma suivant :

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Les impédances EHD sont généralement représentées dans le plan de Bode
log A/A₀ = f(log p) et phase = f(log p), p = ω/Ω étant la fréquence réduite adimensionnelle,
A/A₀ l'amplitude réduite et A₀ l'amplitude à fréquence nulle.

Pour une électrode nue uniformément accessible, les courbes obtenues à différentes vitesses de rotation sont réductibles en p (fig. §2.5). L'amplitude varie en p⁻² et la phase atteint une limite à 180° dans la gamme des plus hautes fréquences.

L'impédance EHD peut avoir différentes applications. La première application est la détermination de coefficients de diffusion par l'intermédiaire du nombre de Schmidt $Sc = \frac{v}{D}$. Cette technique peut aussi permettre de caractériser la surface d'électrodes partiellement bloquées ou recouvertes d'une couche poreuse (Deslouis et Tribollet, 1991).
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure §2.5 : Variation de l'impédance EHD en fonction de la fréquence adimensionnelle p pour un nombre de Schmidt 1000 à différentes vitesses de rotation △ 300, ■ 600 et ● 1200 tr.min⁻¹.</figcaption></figure>
Dans le cas d'une couche poreuse non réactive recouvrant l'électrode, l'intégration des équations non-stationnaires §2.5 et §2.7 donne (Deslouis et al., 1987) :

$$Z_{\text{EHD}} = \frac{\Delta(\left.\frac{\partial c_1}{\partial z}\right|_0)}{\Delta\Omega} = \frac{1}{D_f \text{ch} s_f^{1/2}} \frac{D Z_C}{1 - \frac{\delta_f D}{D_f \delta_n} \Gamma(\frac{4}{3}) \theta'(0) \frac{\text{th} s_f^{1/2}}{s_f^{1/2}}} \quad (\text{§2.36})$$

$$\text{avec } s_f = j\omega \frac{\delta_f^2}{D_f} \qquad (\text{§2.37})$$

où $-1/\theta'(0)$ est l'impédance de diffusion adimensionnelle sur une électrode nue et est fonction uniquement de $pSc^{1/3}$ ($p = \frac{\omega}{\Omega}$).

Il est facile de vérifier que quand l'effet de la couche est graduellement diminué, $\delta_f \to 0$ et $D_f \to D$, on retrouve alors $Z_{\text{EHD}} = \frac{\Delta i}{\Delta\Omega} = Z_C$

Trois paramètres peuvent être déterminés à partir des expressions §2.36 et §2.37 : le nombre de Schmidt Sc, la vitesse de diffusion $D_f / \delta_f$ et le temps de diffusion $\delta_f^2 / D_f$ à travers la couche poreuse.

Contrairement au comportement d'une électrode nue, les données ne sont plus réductibles par la fréquence adimensionnelle p. Une augmentation de la vitesse de rotation de l'électrode produit un déplacement des diagrammes de Bode vers de plus petites valeurs de p. De plus, les phases ne tendent pas vers une valeur limite lorsque la fréquence tend vers l'infini : elles restent des fonctions croissantes de la fréquence (fig. §2.6)
<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Figure §2.6 : Simulation de l'impédance EHD dans le cas d'une diffusion à travers une couche poreuse en prenant le nombre de Schmidt à 1000, la vitesse de diffusion à 5 10⁻³ cm.s⁻¹ et le temps de diffusion 1 s. Courbes obtenues à différentes vitesses de rotation △ 300, ■ 600 et ● 1200 tr.min⁻¹ pour une EDT recouverte d'une couche poreuse comparées au diagramme obtenu pour une électrode nue —.
## 2. Impédance électrochimique (AC)

L'impédance électrochimique repose sur l'analyse de la réponse en fréquence d'un système électrochimique à une modulation sinusoïdale appliquée à un potentiel continu ou un courant continu. La description suivante portera sur l'impédance électrochimique en mode potentiostatique avec une EDT à vitesse de rotation constante.

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure §2.7 : Principe de l'impédance AC en mode potentiostatique.</figcaption></figure>

Une perturbation sinusoïdale de faible amplitude est imposée à une tension continue et le courant sinusoïdal résultant est mesuré (fig. §2.7). Le potentiel peut alors être exprimé mathématiquement en fonction du temps :

$$E(t) = \bar{E} + \text{Re}\{\Delta E \exp(j\omega t)\} \quad (\text{§2.38})$$

où la pulsation $\omega$ est liée à la fréquence de modulation par $\omega = 2\pi f$ et $\text{Re}\{x\}$ est la partie réelle de $x$. Cette perturbation du potentiel engendre une perturbation de la concentration interfaciale ou du gradient de concentration à l'interface et implique une réponse en courant. L'amplitude de la modulation $\Delta E$ doit être suffisamment petite pour que la réponse en courant soit linéaire :

$$i(t) = \bar{i} + \text{Re}\{\Delta i \exp(j\omega t)\} \quad (\text{§2.39})$$

où $\Delta i$ est une fonction complexe.
L'impédance est définie comme étant le rapport des deux grandeurs observables $\Delta E$ et $\Delta i$ :

$$Z(\omega) = \frac{\Delta E}{\Delta i} = A(\omega) \exp[j\varphi(\omega)] \qquad (\text{§2.40})$$

où $A(\omega)$ et $\varphi(\omega)$ sont respectivement le rapport des amplitudes et le déphasage entre les deux signaux.

La combinaison des deux équations §2.31 et §2.32 amène à l'expression suivante :

$$\Delta i = (\Delta E_i - R_e \Delta i)(\frac{\Delta i_f}{\Delta E} + j\omega C_{dc}) \qquad (\text{§2.41})$$

$$Z = R_e + \frac{1}{Z_f + j\omega C_{dc}} \qquad (\text{§2.42})$$

L'impédance $Z_f = \frac{\Delta E}{\Delta i_f}$ n'est liée qu'au processus faradique et est indépendante de $R_e$ et de $C_{dc}$. $Z_f$ peut être définie comme la somme d'une résistance de transfert de charge $R_{tc}$ et d'une impédance de diffusion convective $Z_d(p)$. L'impédance AC s'écrit alors par :

$$Z = R_e + \frac{R_{tc} + Z_d(p)}{1 + j\omega C_{dc}(R_{tc} + Z_d(p))} \qquad (\text{§2.43})$$

A partir de cette expression, il est possible de décrire un circuit électrique équivalent ainsi qu'un diagramme d'impédance théorique en représentation de Nyquist (fig. §2.8). Ce diagramme permet de déterminer expérimentalement les différents paramètres : $R_e$ la résistance de l'électrolyte, $C_{dc}$ la capacité double couche, $R_{tc}$ la résistance de transfert de charge et $R_p$ la résistance de polarisation. La représentation de $Z_d$ dans le plan complexe fait apparaître une droite inclinée à 45° appelée droite de Warburg.
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 2.8 : Circuit électrique équivalent et diagramme d'impédance théorique.</figcaption></figure>

Dans le cas d'une couche poreuse non réactive recouvrant l'électrode, l'intégration des équations non-stationnaires §2.7 et §2.9 fait intervenir deux fréquences adimensionnelles. La première fréquence pSc¹/³ correspond au transport dans la solution électrolytique et la seconde, ω (δf²/Df), à la diffusion dans la couche poreuse. L'impédance de diffusion devient alors :

$$Z_d = \frac{\Delta c_1(0)}{\left. \Delta \left( \frac{\partial c_1}{\partial z} \right) \right|_0} = -\delta_f \frac{1 - \Gamma(4/3) \frac{D}{\delta_n} \frac{\delta_f}{D_f} \theta'(0) \frac{\text{th} s_f^{1/2}}{s_f^{1/2}}}{s_f^{1/2} \text{th} s_f^{1/2} - \Gamma(4/3) \frac{D}{\delta_n} \frac{\delta_f}{D_f} \theta'(0)} \quad (\text{§2.44})$$

L'influence de la couche poreuse pourra donc être observée dans le diagramme d'impédance dans la seconde boucle correspondant au contrôle par le transport de matière. L'impédance électrochimique permet la détermination simultanée d'au moins huit paramètres pour un simple système rédox : résistance de transfert de charge, résistance de diffusion, capacité double couche, résistance d'électrolyte, capacité du film, nombre de Schmidt et finalement la vitesse de diffusion et la constante de temps de diffusion à travers la couche poreuse.
### III. TECHNIQUES EXPERIMENTALES

#### A. Dispositifs expérimentaux

La cellule électrochimique utilisée est un système à trois électrodes comprenant :

* Electrode de travail : électrode à disque tournant en or 24 carats.

* Contre électrode : grille de platine de grande surface

* Electrode de référence : électrode au calomel saturé (ECS)

L'électrode de travail est constituée de deux parties (fig. §2.9). Elle est formée d'une tige sur laquelle se visse un embout d'environ 1,5 cm de haut où se trouve collé un disque d'or d'un diamètre de 0,5 cm (surface 0,196 cm²). Chaque partie est enrobée d'un isolant (résine) avec un joint étanche entre la tige et l'embout pour éviter toute entrée d'eau. Ce système a été mis au point pour faciliter l'observation au microscope.

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure §2.9 : Electrode de travail.</figcaption></figure>

Le choix du matériau formant le disque de l'électrode de travail a été assujetti à différentes contraintes. Ainsi, pour dissocier les problèmes de corrosion et de développement du biofilm, il était nécessaire d'opter pour un métal inerte. Tout naturellement, le choix s'est porté sur des métaux tels que l'or ou le platine. Des études
préliminaires réalisées à l'UPR15 du CNRS (Deslouis et al., 1992) ont montré que l'utilisation du platine avait quelques désavantages : résultats non reproductibles dans le temps et tendance à devenir inactif par l'adsorption significative d'oxygène et d'hydrogène. L'or ne présente pas ou à moindre degré ces désavantages. De plus, l'or possède aussi une surtension plus importante vis à vis de l'évolution de l'hydrogène par rapport au platine.

Les mesures en régime stationnaire, d'impédance EHD et d'impédance AC ont été réalisées respectivement grâce aux montages présentés figures §2.10, §2.11 et §2.12 ainsi que sur la photo §2.1. Les différents montages comprennent :

* Moteur à faible inertie avec son asservissement (Société AE)

* Interface électrochimique Schlumberger 1286

* Analyseur de fonction de transfert Schlumberger 1255 (FRA1255) qui permet à la fois la génération du signal perturbateur et de la mesure des fonctions de transfert
  $$ \frac{\Delta E}{\Delta i} \text{ et } \frac{\Delta i}{\Delta \Omega} $$

* Filtre Kemo VBF-8 pour éliminer les bruits en hautes fréquences

* Générateur de rampe

* Oscilloscope afin de contrôler les signaux de mesure

* Ordinateur avec un logiciel d'acquisition de données en régime stationnaire (Xtalk) ainsi qu'un logiciel (Fracom) permettant de réaliser les mesures d'impédance en pilotant le FRA 1255 et le filtre Kemo

* Cellule électrochimique

Le potentiel est imposé à l'aide de l'interface électrochimique Schlumberger 1286. Les mesures de courant sont réalisées par cette même interface par l'intermédiaire d'un contacteur au mercure auquel est fixée l'électrode à disque tournant.

Le moteur à faible inertie permet d'atteindre des fréquences de modulation mécanique de près de 100 Hz sans amortissement notable de l'amplitude. La vitesse du moteur est contrôlée au moyen d'une dynamo tachymétrique.
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure §2.10 : Montage expérimental utilisé pour les mesures en régime stationnaire.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure §2.11 : Montage expérimental utilisé pour les mesures d'impédance EHD.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure §2.12 : Montage expérimental utilisé pour les mesures d'impédance AC.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>(a) Appareils de mesure</figcaption></figure>

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>(b) Moteur de l'électrode
à disque tournante</figcaption></figure>

Photo §2.1 : Appareillage utilisé pour les mesures en régime stationnaire, impédance EHD et impédance AC.
# B. Procédures expérimentales

## 1. Préparation des électrodes de travail

Avant chaque début d'expérience, les électrodes de travail sont passées au papier émeri 1200 pour éliminer les rayures éventuelles, puis polies successivement avec de l'alumine 3 µm puis 1 µm. Après chacune de ces étapes, les électrodes sont rincées à l'eau distillée dans un bain à ultrason pour éliminer les particules d'alumine puis dégraissées successivement avec de l'alcool et de l'acétone.

## 2. Traceurs électrochimiques

Deux traceurs électrochimiques ont été utilisés : l'ion ferricyanure $Fe(CN)_6^{3-}$ et l'oxygène (Deslouis et al., 1992).

$$ \text{a) } \underline{\text{Traceur Fe(CN)}_6^{3-}} $$

Le couple rédox $Fe(CN)_6^{4-} / Fe(CN)_6^{3-}$ a l'avantage d'être un système électrochimique connu. La réaction rédox mise en jeu est très rapide comparée au transport de matière (fig. §2.13). Dans le cas de cette étude, c'est la réduction du ferricyanure qui sera la réaction employée.

$$ Fe(CN)_6^{3-} + 1 e^{-} \rightleftharpoons Fe(CN)_6^{4-} \qquad (§2.45) $$
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure §2.13 : Courbe de polarisation dans une solution aqueuse neutre ou alcaline contenant le couple $Fe(CN)_6^{2-}$ / $Fe(CN)_6^{3-}$ en concentration équimolaire.</figcaption></figure>

b) Oxygène

Au potentiel correspondant au palier de diffusion, la réaction de réduction de l'oxygène se produit en deux étapes en milieu neutre ou alcalin.

$$ \left\{ \begin{array}{l} O_2 + 2 H_2O + 2 e^- \rightarrow H_2O_2 + 2 OH^- \\ H_2O_2 + 2 e^- \rightarrow 2 OH^- \end{array} \right. \qquad (§2.46) $$

Les deux étapes sont des processus rapides et la réaction totale apparaît comme un transfert relativement rapide à quatre électrons (fig. §2.14).

$$ O_2 + 2 H_2O + 4 e^- \rightarrow 4 OH^- \qquad (§2.47) $$
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure §2.14 : Courbe de polarisation dans une solution aqueuse neutre ou alcaline.</figcaption></figure>

### 3. Mesures

#### a) Mesures en régime stationnaire

Les mesures en régime stationnaire sont réalisées suivant la procédure suivante :

* Polarisation sur le plateau limite de diffusion de la réaction de réduction du traceur

* Stabilisation du courant (10 min)

* Augmentation régulière de la vitesse de rotation de l'EDT de 120 à 1200 tr.min⁻¹ en 10 min

* Diminution régulière de la vitesse de rotation de 1200 à 120 tr.min⁻¹ en 10 min avec enregistrement du courant en fonction de $\sqrt{\Omega}$

Les valeurs $i = f(\sqrt{\Omega})$ ne sont donc enregistrées que 20 min après le début de la polarisation c'est-à-dire lorsque le système est dans un état quasi-stationnaire.
b) Mesures d'impédance EHD

Toujours sur le plateau limite de diffusion après établissement d'un état quasi-stationnaire, une amplitude de modulation de 10% est réalisée autour de la vitesse de rotation $\Omega$. Cette valeur de modulation assure la linéarité nécessaire aux mesures d'impédance.

Un filtre est utilisé pour éliminer les bruits en hautes fréquences. Un oscilloscope est employé pour contrôler les signaux de mesure tant en vitesse de rotation qu'en courant. Il permet d'éviter des artefacts dûs à des instabilités de la régulation, à des distorsions provenant d'un signal de mesure trop important ou à la présence d'un bruit parasite excessif. Sa présence facilite l'élimination de la composante continue des signaux de mesure avant leur introduction dans l'analyseur de fonction de transfert.

Le filtre et l'analyseur de fonction de transfert sont pilotés à l'aide d'un ordinateur.

Le domaine de fréquence exploré peut aller de quelques dizaines de milliHertz à une centaine de Hertz.

c) Mesures d'impédance AC

Un potentiel correspondant à la moitié du courant mesuré sur le plateau limite de diffusion de la réaction de réduction du traceur est imposé au système électrochimique. Après stabilisation du courant, la mesure d'impédance AC est réalisée. Tout comme l'impédance EHD, l'analyse de l'impédance AC doit être faite dans le domaine de linéarité. Une amplitude de modulation est de 10 mV. Pour les mêmes raisons que celles citées pour l'impédance EHD, un oscilloscope est employé.

L'analyseur de fonction de transfert est piloté à l'aide d'un ordinateur.

Le domaine de fréquence exploré peut aller de quelques dizaines de milliHertz à une centaine de kiloHertz.
C. Traitement des données

Le traitement des données est basé sur une méthode d'ajustement élaborée et développée à l'UPR15 du CNRS. Elle repose sur l'emploi d'un simplexe pour minimiser une fonction. Les informations connues *a priori* sur les paramètres sont introduit dans le simplexe.

Le problème est de rechercher la meilleure détermination des paramètres, de façon univoque de telle façon que les valeurs définies aient un sens physique. Pour chaque ajustement, il faut estimer d'une part les erreurs sur les mesures et d'autre part les bornes inférieure et supérieure de chaque paramètre entre lesquelles s'effectue la recherche du paramètre (cf Annexe).

La figure §2.15 présente les différents paramètres pouvant être déterminés par l'ajustement des données expérimentales obtenues avec les différentes techniques.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Régime stationnaire</figcaption></figure>

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Vitesse de diffusion</figcaption></figure>

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

$\delta_f$ épaisseur

$D_f$ coefficient de diffusion du traceur

$\epsilon$ porosité

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Electrode à disque tournante
recouverte d'une couche poreuse</figcaption></figure>

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Impédance EHD</figcaption></figure>

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Fréquence réduite p = ω/Ω</figcaption></figure>

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Vitesse et temps de diffusion</figcaption></figure>

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Impédance AC</figcaption></figure>

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Réel</figcaption></figure>

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

Imaginaire

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Vitesse et temps de diffusion</figcaption></figure>

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure §2.4 : Synopsis des techniques employées et des renseignements qui en sont retirés.</figcaption></figure>
# Chapitre 3

## Elaboration et caractérisation
d'une couche modèle poreuse

I. Conditions expérimentales

II. Détermination du nombre de
Schmidt

III. Détermination de $\delta_f$ et $D_f$ dans une
couche de gélatine

IV. Conclusion
L'objectif du travail exposé dans ce chapitre est d'élaborer une couche modèle de biofilm et de définir le protocole expérimental pour la caractérisation de sa géométrie (porosité ε, épaisseur δ<sub>f</sub>) par analyse du transport de matière. Cette étude part du principe que la biomasse peut être considérée en première approximation comme une couche poreuse homogène à l'échelle macroscopique. La bibliographie abonde dans ce sens (Christensen et Characklis, 1990 ; Wanner, 1989 ; De Beer et al., 1994).

Le matériau qui joue le rôle du biofilm doit répondre à différents critères, le principal étant bien évidemment le caractère poreux. Par le passé, différents gels ont été utilisés comme couche modèle de la biomasse et ont montré un comportement identique au biofilm. Ainsi White et Dorion (1961) ont employé un gel de polyacrylamide et Dudman (1977) un gel d'agar.

Le choix s'est donc dirigé assez naturellement vers un gel. C'est la gélatine alimentaire qui a été retenue pour sa simplicité d'emploi, son faible coût et sa disponibilité.

A partir du modèle physique proposé, un protocole d'étude basé sur les techniques électrochimiques présentées dans le chapitre 2 est élaboré puis testé. Deux techniques sont utilisées dans cette étude : l'impédance ElectroHydroDynamique (EHD) et la mesure du courant limite de diffusion en fonction de la vitesse de rotation. La mesure du temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ par l'impédance EHD et la mesure de vitesse de diffusion $\frac{D_f}{\delta_f}$ à partir des données stationnaires, fournissent une détermination de l'épaisseur $\delta_f$ et du coefficient de diffusion $D_f$ dans la couche de gélatine. La comparaison des coefficients de diffusion dans la couche poreuse et dans la solution électrolytique permet de déduire la porosité de la gélatine.

Les résultats obtenus sur une même couche à l'aide de deux traceurs différents (oxygène et ferricyanure) sont comparés.
# I. CONDITIONS EXPERIMENTALES

## A. Elaboration de la couche de gélatine

La gélatine alimentaire est une substance albuminoïde extraite par hydrolyse de tissus animaux riches en collagène. La gélatine commercialisée est produite à partir de la peau, du tissu conjonctif et des os de bovins. C'est un aliment composé de 65 à 90% de protéines, de sels minéraux et d'eau.

### 1. Préparation de la gélatine

La gélatine utilisée se présente sous forme de feuillets. La proportion de gélatine est de l'ordre de 1 à 1,5%. Avant manipulation, les feuillets sont ramollis dans de l'eau froide quelques minutes. Les feuilles de gélatine sont ensuite égouttées puis ajoutées à de l'eau chaude. La préparation est alors agitée jusqu'à complète dissolution de la gélatine puis ramenée à température ambiante.

### 2. Dépôt de la gélatine sur l'électrode

Après retour à la température ambiante, la préparation change de structure pour devenir un gel. Lorsque la solution commence à se polymériser, la gélatine est déposée sur une électrode en or. Pour obtenir une couche plane et uniforme, le dépôt est effectué sur une électrode en rotation à une vitesse de 2500 tr.min⁻¹ (Fig. §3.1). Plusieurs couches successives sur l'électrode sont nécessaires afin d'obtenir un film relativement épais. L'électrode est alors maintenue en rotation durant quelques minutes afin de permettre la polymérisation du gel.

## B. Traceurs électrochimique

La couche de gélatine est testée dans un premier temps avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$ puis dans un second temps avec le traceur oxygène. Les procédures expérimentales employées sont décrites dans le chapitre 2. Les mesures sont réalisées à température ambiante (18°C).
<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure §3.1 : Technique de dépôt de la gélatine sur l'électrode.</figcaption></figure>

## 1. Traceur ferricyanure

Dans un premier temps, l'électrode est placée dans une solution composée de KCl 1M, de $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 \ 10^{-2}M$ et d'eau distillée. Avant la mesure, l'électrode est laissée dans la solution une demi-heure pour permettre la diffusion des différents ions de la solution dans la couche poreuse. Elle est alors polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction de $Fe(CN)_6^{3-}$ à 0 mV/ECS (Electrode au Calomel Saturé). Ce potentiel a été déterminé en traçant la courbe de polarisation dans la solution de mesure à l'aide d'une électrode de travail nue (fig. §3.2).

## 2. Traceur oxygène

Dans un second temps, les mesures sont réalisées dans une solution aqueuse de KCl 1M dont la concentration en oxygène dissous déterminée par la méthode Winkler (Protocole, cf. Annexe) est de 6,0 ppm soit $2 \ 10^{-4}M$. Après quelques minutes, l'électrode est polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction l'oxygène à -900 mV/ECS (fig. §3.3).
<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>Figure §3.2 : Courbe de polarisation avec une électrode de travail nue dans une solution KCl 1M - K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure §3.3 : Courbe de polarisation avec une électrode de travail nue dans une solution KCl 1M.</figcaption></figure>
## II. DETERMINATION DU NOMBRE DE SCHMIDT

Le nombre de Schmidt $Sc$ est défini par :

$$ Sc = \frac{v}{D} \qquad (§3.1) $$

$Sc$ est une grandeur adimensionnelle caractéristique des espèces diffusantes en solution. De sa mesure, après détermination de la viscosité cinématique $v$, il est possible de déduire le coefficient de diffusion $D$.

Le nombre de Schmidt est utilisé lors de la procédure d'ajustement des données expérimentales EHD. La méthode d'ajustement repose sur l'emploi d'un simplexe où les informations connues a priori sur les paramètres sont introduites. Il est donc avantageux de déterminer ce paramètre dans une première étape pour réduire le nombre d'inconnus lors de la régression des données en présence de la couche poreuse.

La mesure d'un coefficient de diffusion moléculaire $D$ par des techniques électrochimiques, et par conséquent du nombre de Schmidt, est généralement réalisée à l'aide d'une électrode à disque tournant.

Levich (1962) a décrit l'équation reliant le courant limité par le transport de matière à la vitesse angulaire du disque (éq §2.5). L'utilisation de cette technique pour mesurer le coefficient de diffusion nécessite la connaissance des paramètres suivants : la surface de l'électrode, le nombre d'électrons mis en jeu dans la réaction rédox, la concentration du traceur dans la solution et la viscosité cinématique. Les erreurs de mesure de ces différentes quantités peuvent causer une erreur conséquente sur la détermination de $D$.

Cet inconvénient est partiellement écarté avec les méthodes transitoires, impédances AC et EHD, qui ne nécessitent pas la connaissance des paramètres énumérés ci-dessus.
Afin d'obtenir un courant modulé détectable, les mesures d'impédance AC doivent être réalisées sous le plateau limite de diffusion. Il a été montré que ces mesures ne sont exploitables pour la détermination du nombre de Schmidt que dans certains cas particuliers (Newman, 1973 ; Deslouis et Tribollet, 1984). Cette technique ne sera donc pas utilisée à cette fin dans ce travail.

L'impédance EHD est mieux adaptée à ce genre d'étude. Le nombre de Schmidt est déduit par comparaison des données expérimentales avec une fonction théorique (Robertson *et al.*, 1988).

La détermination de Sc est réalisée avec une électrode nue pour les différents traceurs.

## A. Traceur ferricyanure

Les mesures d'impédance EHD ont été réalisées sur une électrode nue à différentes vitesses de rotation : 120, 300, 600 et $1200 \text{ tr.min}^{-1}$ dans la solution KCl 1M - $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 10^{-2}M$. L'électrode est polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction du ferricyanure à 0 mV/ECS. Les données expérimentales sont présentées dans le plan de Bode sur la figure §3.4.

La réductibilité des résultats en EHD par la fréquence adimensionnelle p sur une électrode nue est vérifiée. Les données sont seulement fonction de la fréquence adimensionnelle p.

Pour chaque vitesse de rotation, le nombre de Schmidt est déterminé par ajustement des données expérimentales. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau §3.1.
<figure><img src="image_52.png" /></figure>

Figure §3.4 : Impédances EHD représentées dans le plan de Bode pour une EDT nue en or dans une solution KCl 1M - K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M à différentes vitesses de rotation : ○ 120, △ 300, ■ 600 et ● 1200 tr.min⁻¹ (Traceur Fe(CN)₆³⁻).
<table><tr><td>Ω (tr.min<sup>-1</sup>)</td><td>120</td><td>300</td><td>600</td><td>1200</td></tr><tr><td>Sc<sub>Fe(CN)<sub>6</sub></sub><sup>3-</sup></td><td>1423</td><td>1474</td><td>1501</td><td>1418</td></tr></table>

**Tableau §3.1 : Valeurs de Sc<sub>Fe(CN)<sub>6</sub></sub><sup>3-</sup> déterminées par ajustement des données EHD à différentes valeurs de rotation d'une électrode nue.**

La dispersion des valeurs suivant la vitesse de rotation peut être attribuée à l'incertitude de mesure. La valeur moyenne de Sc<sub>Fe(CN)<sub>6</sub></sub><sup>3-</sup> est 1454 ± 47. Cette valeur peut être comparée à celles disponibles dans la littérature (tableau §3.2).

<table><thead><tr><td>Auteurs</td><td>Sc<sub>Fe(CN)<sub>6</sub></sub><sup>3-</sup></td></tr></thead><tbody><tr><td>Robertson et al., 1988</td><td>1155,1 ± 43,2</td></tr><tr><td>Orazem et al., 1996</td><td>1110 ± 61</td></tr></tbody></table>

**Tableau §3.2 : Valeurs de Sc<sub>Fe(CN)<sub>6</sub></sub><sup>3-</sup> issues de la littérature.**

La valeur du nombre de Schmidt déterminé par régression est supérieure à celles décrites dans la littérature car ces dernières ont été mesurées à 25°C alors que la température expérimentale est ici de 18°C. Cet écart de température explique cette différence. Dans la suite de ce chapitre, la valeur utilisée pour le nombre de Schmidt du traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup> sera de 1500.

$$Sc_{Fe(CN)_6}^{3-} = 1500$$
## B. Tracer oxygène

Des mesures d'impédance EHD ont été réalisées sur une électrode nue dans la solution KCl 1M. L'électrode est alors polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction de l'oxygène à -900 mV/ECS. Les données obtenues sont présentées dans le plan de Bode sur la figure §3.5. La réductibilité des résultats en EHD par la fréquence adimensionnelle p sur une électrode nue est vérifiée.

Pour chaque vitesse de rotation, le nombre de Schmidt a été déterminé par ajustement des données expérimentales (tableau §3.3).

<table><caption>Tableau §3.3 : Valeurs de ScO₂ déterminées par ajustement des données EHD à différentes valeurs de rotation d'une électrode nue.</caption><tr><td>Ω (tr.min<sup>-1</sup>)</td><td>120</td><td>300</td><td>600</td><td>1200</td></tr><tr><td>Sc<sub>O2</sub></td><td>641</td><td>830</td><td>809</td><td>960</td></tr></table>

La dispersion de ces valeurs est plus importante que celle obtenue pour le traceur Fe(CN)₆³⁻. La plus faible de la concentration en oxygène entraîne une plus grande incertitude relative sur les mesures du courant de réduction que dans le cas du ferricyanure, expliquant ainsi la plus grande dispersion des valeurs de Sc. La valeur moyenne de ScO₂ est 810 ± 169.

Deslouis *et al.* (1992) ont déjà évalué ScO₂ à environ 500 à 25°C. La valeur du nombre de Schmidt ici déterminée est supérieure à celle de la littérature. L'écart de température explique cette différence. Dans la suite de ce chapitre, la valeur utilisée pour le nombre de Schmidt du traceur oxygène sera de 800.

$$Sc_{O_2} = 800$$
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure §3.5 : Impédances EHD représentées dans le plan de Bode pour une EDT nue en or dans une solution KCl 1M à différentes vitesses de rotation : ○ 120, △ 300, ■ 600 et ● 1200 tr.min⁻¹ (Traceur oxygène).</figcaption></figure>
### III. DETERMINATION DE δ<sub>f</sub> ET D<sub>f</sub> DANS UNE COUCHE DE GELATINE

Toutes les mesures présentées ont été réalisées sur une même couche de gélatine et réalisée successivement avec le traceur ferricyanure et le traceur oxygène.

#### A. Traceur ferricyanure

##### 1. Régime stationnaire

Après polarisation de l'électrode à 0 mV/ECS, le courant de réduction de Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup> en régime stationnaire est enregistré en fonction de la racine carrée de la vitesse angulaire avec et sans couche poreuse. A partir de l'équation §2.16, une procédure d'ajustement des données expérimentales permet de déterminer les trois paramètres i<sub>0</sub>, i<sub>∞</sub><sup>-1</sup> et K<sup>-1</sup>. Les résultats sont présentés dans le tableau §3.4.

<table><caption>Tableau §3.4 : Paramètres i<sub>0</sub>, i<sub>∞</sub><sup>-1</sup> et K<sup>-1</sup> ajustés à partir des données expérimentales pour une électrode avec et sans une couche de gélatine (traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup>).</caption><thead><tr><th></th><th>i<sub>0</sub> (µA)</th><th>i<sub>∞</sub><sup>-1</sup> (µA<sup>-1</sup>)</th><th>K<sup>-1</sup> (µA<sup>-1</sup>.(tr.min<sup>-1</sup>)-0,5)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Sans gélatine</td><td>0,0</td><td>0,0</td><td>0,032</td></tr><tr><td>Avec gélatine</td><td>0,0</td><td>1,3 10<sup>-3</sup></td><td>0,036</td></tr></tbody></table>

Sur la figure §3.6, les données sont présentées sous la forme $\frac{1}{i} = f(\frac{1}{\sqrt{\Omega}})$. La corrélation entre les données expérimentales et le modèle analytique proposé dans le cas
des mesures en régime stationnaire est excellente. L'ordonnée à l'origine correspond au paramètre $i_\infty^{-1}$ et la pente au paramètre K$^{-1}$. D'après l'équation §2.18, $i_\infty^{-1}$ est proportionnel au rapport de l'épaisseur de la couche sur le coefficient de diffusion du traceur dans cette même couche.

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

**Figure §3.6** : Mesure en régime stationnaire présentée sous la forme $\frac{1}{i} = f(\frac{1}{\sqrt{\Omega}})$ sur une électrode en or dans une solution KCl 1M - K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M avec et sans couche de gélatine. Les symboles correspondent aux points expérimentaux □ sans gélatine et ■ avec gélatine et les droites aux valeurs ajustées par régression (traceur Fe(CN)₆³⁻).

Dans le cas de l'électrode nue, à ce potentiel de polarisation, le courant non diffusionnel $i_0$ est nul. La droite passe par l'origine c'est-à-dire l'épaisseur de la couche est nulle. De plus, la valeur de la pente expérimentale est égale à 0,032 µA⁻¹·(tr.min⁻¹)⁻⁰,⁵. A l'incertitude de mesure prés, cette valeur est identique à la valeur théorique pouvant être calculée à partir de l'équation §2.19 qui est de 0,034 µA⁻¹·(tr.min⁻¹)⁻⁰,⁵ en prenant :

* Nombre d'électrons mis en jeu dans la réaction rédox $n = 1$
* Surface de l'électrode S = 0,196 cm²

* Coefficient de diffusin dans la solution électrolytique D = 6,7 10⁻⁶ cm².s⁻¹ calculé à partir du nombre de Schmidt

* Viscosité cinématique v = 10⁻² cm².s⁻¹

* Concentration du traceur dans la solution c_∞ = 10⁻² M

La translation de la droite obtenue avec une électrode recouverte d'une couche de gélatine par rapport à une électrode nue correspond à une valeur non nulle de $\frac{\delta_f}{D_f}$. La pente reste constante à l'incertitude de mesure prés.

## 2. Impédance EHD

Des mesures d'impédance EHD sont réalisées sur l'électrode recouverte d'une couche de gélatine à différentes vitesses de rotation : 120, 300, 600 et 1200 tr.min⁻¹. Les diagrammes (fig. §3.7) montrent que les données ne sont plus réduites par la fréquence adimensionnelle p. Les diagrammes de Bode sont déplacés vers des valeurs de p plus basses quand la vitesse de rotation de l'électrode augmente. La phase n'est plus limitée à 180° mais tend vers des valeurs supérieures. Ce comportement correspond qualitativement à la diffusion du traceur à travers une couche poreuse.

## 3. Traitement des données

La valeur de $i_\infty^{-1}$ déterminée lors de l'ajustement des données obtenues en régime stationnaire est inversement proportionnelle à la vitesse de diffusion $\frac{D_f}{\delta_f}$ dans la couche poreuse (éq. §2.18). On obtient alors :

$$ \frac{D_f}{\delta_f} = 4,06 \ 10^{-3} \text{cm.s}^{-1} $$
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

**Figure §3.7** : Impédance EHD représentée dans le plan de Bode dans une solution KCl 1M - $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ 10⁻²M à différentes vitesses de rotation : ○ 120, △ 300, ■ 600 et ● 1200 tr.min⁻¹ pour une EDT en or recouverte d'une couche de gélatine comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue — aux mêmes vitesses de rotation (Traceur $Fe(CN)_6^{3-}$).
Les données EHD sont ajustées au modèle analytique (éq. §2.36). Le nombre de Schmidt et la vitesse de diffusion qui ont été déterminés précédemment sont fixés respectivement à 1500 et à 4,06 $10^{-3}$ cm.s$^{-1}$. La régression des données permet alors de déterminer le temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ du traceur dans la couche poreuse. Pour chaque vitesse de rotation, les valeurs obtenues sont reportées dans le tableau §3.5.

<table><caption>Tableau §3.5 : Paramètres $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ ajustés à partir des données expérimentales pour une électrode recouverte d'une couche de gélatine (traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup>).</caption><thead><tr><th>Ω (tr.min<sup>-1</sup>)</th><th>δ<sub>f</sub><sup>2</sup> / D<sub>f</sub> (s)</th></tr></thead><tbody><tr><td>120</td><td>2,26 10<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>300</td><td>2,30 10<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>600</td><td>2,26 10<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>1200</td><td>2,33 10<sup>-1</sup></td></tr></tbody></table>

La valeur moyenne du temps de diffusion est $2,29 \pm 0,04 \ 10^{-1}$ s. L'association des deux paramètres que sont la vitesse et le temps de diffusion permet alors d'atteindre l'épaisseur de la couche poreuse ainsi que le coefficient de diffusion du traceur ferricyanure dans cette même couche.

$$ \delta_f = 9,3 \pm 0,2 \ \mu\text{m} \\ D_f = 3,77 \pm 0,07 \ 10^{-6} \ \text{cm}^2 \cdot \text{s}^{-1} $$
La porosité d'une couche a été définie par Newman (1991) et West (1993) en se basant sur la comparaison des coefficients de diffusion dans la couche poreuse (3,77 $10^{-6}$ cm$^2$.s$^{-1}$) et dans la solution électrolytique (6,4 $10^{-6}$ cm$^2$.s$^{-1}$):

$$D_f = D \varepsilon^{1.5} \qquad (\text{§3.2})$$

En utilisant cette relation, la porosité du film de gélatine étudié est de 0,8. Ce résultat confirme la nature très poreuse de la couche.

## B. Traceur oxygène

### 1. Régime stationnaire

L'électrode recouverte de la couche de gélatine est transférée dans la seconde solution constituée de KCl 1M et polarisée sur le plateau limite de diffusion de réduction l'oxygène à -900 mV/ECS. Le courant de réduction de l'oxygène en régime stationnaire est enregistré en fonction de la vitesse angulaire avec et sans le film de gélatine. A partir l'équation §2.16, une procédure d'ajustement des données permet de déterminer les paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et K$^{-1}$ (tableau §3.6). Sur la figure §3.8, les données sont présentées sous la forme $\frac{1}{i-i_0} = f(\frac{1}{\sqrt{\Omega}})$.

<table><caption>Tableau §3.6 : Paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et K$^{-1}$ ajustés à partir des données expérimentales pour une électrode avec et sans une couche de gélatine (traceur oxygène).</caption><thead><tr><th></th><th>$i_0$ (µA)</th><th>$i_\infty^{-1}$ (µA$^{-1}$)</th><th>K$^{-1}$ (µA$^{-1}$. (tr.min$^{-1}$)$^{-0.5}$)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Sans gélatine</td><td>10,0</td><td>0,0</td><td>0,29</td></tr><tr><td>Avec gélatine</td><td>7,6</td><td>6,6 10$^{-3}$</td><td>0,31</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_56.png" /></figure>

**Figure §3.8** : Mesure en régime stationnaire présentée sous la forme $\frac{1}{i - i_o} = f(\frac{1}{\sqrt{\Omega}})$ sur une électrode en or dans une solution KCl 1M avec et sans couche de gélatine. Les symboles correspondent aux points expérimentaux □ sans gélatine et ■ avec gélatine et les droites aux valeurs ajustées par régression (traceur oxygène).

Dans le cas de l'électrode nue, le courant non diffusionnel $i_o$ n'est pas nul. Ce courant correspond à la réduction de l'eau en hydrogène. La courbe $\frac{1}{i - i_o} = f(\frac{1}{\sqrt{\Omega}})$ est une droite passant par l'origine ce qui correspond bien à une épaisseur de couche nulle. La pente expérimentale est égale à $0,29 \ \mu A^{-1} \cdot (tr.min^{-1})^{-0,5}$. La pente théorique est de $0,28 \ \mu A^{-1} \cdot (tr.min^{-1})^{-0,5}$ à partir de l'équation §2.19 en prenant :

* Nombre d'électrons mis en jeu dans la réaction rédox $n = 4$

* Surface de l'électrode $S = 0,196 \ cm^2$

* Coefficient de diffusion dans la solution électrolytique $D = 1,3 \ 10^{-5} \ cm^2.s^{-1}$ calculé à partir du nombre de Schmidt

* Viscosité cinématique $\nu = 10^{-2} \ cm^2.s^{-1}$

* Concentration du traceur dans la solution $c_\infty = 2 \ 10^{-4}M$
Dans le cas de l'électrode recouverte par la couche de gélatine, le courant non diffusionnel diminue.

Une raison possible pour la variation du paramètre $i_o$ pourrait être que la présence du film modifie le pH à l'interface métal/film. En supposant que le courant non diffusionnel est dû à la réduction de l'eau en hydrogène, la diminution de $i_o$ en présence de la gélatine pourrait indiquer une augmentation du pH.

La courbe $\frac{1}{i-i_o} = f(\frac{1}{\sqrt{\Omega}})$ est une droite ne passant pas par l'origine. Cette ordonnée à l'origine correspond au paramètre $i_\infty^{-1}$. Celui-ci est correctement déterminé par ajustement des données expérimentales.

## 2. Impédance EHD

Des mesures d'impédance EHD ont été réalisées sur l'électrode recouverte d'une couche de gélatine à différentes vitesses de rotation : 120, 300, 600 et 1200 tr/min. Les diagrammes de Bode (fig. §3.9) sont déplacés vers des valeurs plus basses quand la vitesse de rotation de l'électrode augmente et la phase n'est plus limitée à 180° mais tend vers des valeurs supérieures. Ce comportement confirme le caractère poreux de la couche de gélatine.

## 3. Traitement des données

A partir de la valeur de $i_\infty^{-1}$, la vitesse de diffusion dans la couche poreuse $\frac{D_f}{\delta_f}$ est calculée :

$$ \frac{D_f}{\delta_f} = 9,9 \ 10^{-3} \text{ cm.s}^{-1} $$
<figure><img src="image_57.png" /></figure>

**Figure §3.9** : Impédance EHD représentée dans le plan de Bode dans une solution KCl 1M à différentes vitesses de rotation ◦ 120, △ 300, ■ 600 et ● 1200 tr.min⁻¹ pour une EDT en or recouverte d'une couche de gélatine comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue — (traceur oxygène).
Les données EHD sont ajustées au modèle analytique (éq. §2.36) en fixant le nombre de Schmidt $Sc = 800$ et la vitesse de diffusion $\frac{D_f}{\delta_f} = 9,9 \ 10^{-3} \text{cm.s}^{-1}$ qui ont été déterminés précédemment. La régression des données permet alors de déterminer le temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ du traceur oxygène dans la couche poreuse. Pour chaque vitesse de rotation, les valeurs obtenues sont reportées dans le tableau §3.7.

<table><caption>Tableau §3.7 : Paramètres $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ ajustés à partir des données expérimentales pour une électrode recouverte d'une couche de gélatine (traceur oxygène).</caption><thead><tr><th>Ω (tr.min<sup>-1</sup>)</th><th>δ<sub>f</sub><sup>2</sup> / D<sub>f</sub> (s)</th></tr></thead><tbody><tr><td>120</td><td>8,41 10<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>300</td><td>1,07 10<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>600</td><td>9,59 10<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>1200</td><td>8,95 10<sup>-2</sup></td></tr></tbody></table>

La valeur moyenne du temps de diffusion est $9,4 \pm 0,9 \ 10^{-2} \text{ s}$. La vitesse et le temps de diffusion permettent d'atteindre l'épaisseur de la couche poreuse ainsi que le coefficient de diffusion du traceur oxygène dans cette même couche.

$$ \delta_f = 9 \pm 1 \ \mu\text{m} $$

$$ D_f = 9 \pm 1 \ 10^{-6} \ \text{cm}^2 \cdot \text{s}^{-1} $$
A partir de l'expression §3.2, la porosité du film de gélatine est de 0,8. Ce résultat confirme les résultats obtenus avec le traceur ferricyanure et la nature hautement hydratée de la couche.

### C. Comparaison des résultats obtenus avec les traceurs ferricyanure et oxygène

Les résultats obtenus avec les deux traceurs sont rassemblés dans le tableau §3.8 suivant :

<table><caption>Tableau §3.8 : Résultats obtenus sur une même couche de gel avec deux traceurs différents (oxygène et $Fe(CN)_6^{3-}$.)</caption><thead><tr><th>Traceurs</th><th>δ<sub>f</sub> (μm)</th><th>D<sub>f</sub> (cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>)</th><th>Sc</th><th>D (cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>)</th><th>ε</th></tr></thead><tbody><tr><td>Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup></td><td>9,3 ± 0,2</td><td>3,77 ± 0,07 10<sup>-6</sup></td><td>1500</td><td>6,4 10<sup>-6</sup></td><td>0,8</td></tr><tr><td>Oxygène</td><td>9 ± 1</td><td>9 ± 1 10<sup>-6</sup></td><td>800</td><td>1,3 10<sup>-6</sup></td><td>0,8</td></tr></tbody></table>

L'épaisseur ainsi que la porosité déterminées avec les deux traceurs sont identiques. La valeur de porosité confirme que le film de gélatine est très poreux et hautement hydraté.

Le coefficient de diffusion de chaque traceur dans la couche poreuse est légèrement inférieur au coefficient de diffusion D dans la solution électrolytique. La diffusivité n'étant pas affectée localement, le coefficient de diffusion mesuré est un coefficient de diffusion apparent qui contient un facteur de tortuosité.

Les caractéristiques de la couche poreuse obtenues avec le ferricyanure sont en accord avec celles déterminées avec l'oxygène bien que les résultats obtenus avec l'oxygène soient plus dispersés.
Une des principales raisons pouvant être invoquées est la différence de concentration entre les traceurs. La concentration du ferricyanure est de $10^{-2}$M alors que celle de l'oxygène est de $2 \times 10^{-4}$M soit un facteur 50 entre les deux traceurs. La possibilité d'utiliser une concentration relativement importante en $Fe(CN)_6^{3-}$ est avantageuse car elle permet de contrôler la qualité de la mesure en jouant sur le rapport signal sur bruit. La concentration en oxygène dissous dans les solutions aqueuses dépend de la salinité, de la pression atmosphérique et de la température. Ainsi, l'eau de mer possède une concentration en oxygène dissous peu importante. La qualité de la mesure (rapport signal sur bruit) est liée à cette concentration.

De plus, la réaction de réduction de l'oxygène est plus lente que la réaction de réduction du ferricyanure. Un facteur cinétique peut entrer en jeu dans les résultats. Les modèles analytiques ont été définis en partant du postulat d'une réaction rédox rapide.

Les résultats obtenus n'en demeurent pas moins identiques. Il est donc possible d'utiliser les deux traceurs lors de la caractérisation de couches poreuses. L'emploi du traceur oxygène, naturellement présent en milieu naturel, est possible. Il présente un avantage indéniable dans le cas de mesure en milieu naturel tel qu'en eau de mer ou eau potable.
V. CONCLUSION

Cette étude a permis l'élaboration d'une couche poreuse modèle composée de gélatine alimentaire ainsi que le développement d'un protocole expérimental ayant pour objet la caractérisation de ce film par analyse des propriétés de transport.

Dans ce travail, les propriétés de transport dans le milieu poreux ont été analysées à l'aide de deux techniques électrochimiques : l'impédance électrohydrodynamique et la mesure du courant limite de diffusion en fonction de la vitesse de rotation. Le protocole utilisé peut être résumé par le schéma §3.10.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure §3.10 : Résumé du protocole utilisé pour la caractérisation d'une couche poreuse.</figcaption></figure>
Les deux traceurs (oxygène et ferricyanure) ont donné des résultats identiques. La caractérisation de la couche poreuse est donc bien indépendante du traceur rédox. L'emploi du traceur oxygène, naturellement présent dans les eaux étudiées, est possible.

La prochaine étape doit être l'adaptation du protocole dans le but de suivre *in-situ* l'évolution d'un biofilm développé en milieu naturel tel que l'eau de mer ou l'eau douce.
# Chapitre 4

## Caractérisation physique
de biofilms formés
en milieu naturel

I. Caractérisation de biofilms formés en eau de mer

II. Caractérisation de biofilms formés en eau douce
Le chapitre précédent présentait l'élaboration et la caractérisation d'une couche
modèle d'un voile biologique. C'est une étape préalable qui a permis de développer une
technique de caractérisation *in-situ* d'une biomasse formée en milieu naturel en terme
d'épaisseur et de porosité.

Adapter le protocole expérimental à un biofilm comporte des difficultés inhérentes à
la complexité des milieux aqueux naturels et à la structure même du voile biologique.

L'objectif affiché de cette étude est de ne pas s'arrêter à un seul type d'eau. La
technique doit pouvoir être utilisée pour des biomasses développées aussi bien en milieu
marin qu'en eau douce(a) Il s'est vite avéré que son adaptation est plus aisée en milieu
marin. La composition de l'eau de mer avec sa forte salinité est un excellent support
électrolytique pour des mesures électrochimiques. De plus, un des problèmes apparus lors
d'études électrochimiques en eau douce naturelle est l'entartrage. Lors de la réaction de
réduction de l'oxygène dans les milieux riches en carbonates et calcium tels que certaines
eaux douces, ce phénomène peut être particulièrement marqué et rapide. Par contre, la
vitesse d'entartrage est nettement moins rapide en eau de mer.

Le développement de cette technique en milieu marin sera le premier objectif. Cette étape
doit être abordée comme un but en soi mais aussi comme une étape qui aidera à aplanir les
difficultés propres à l'eau douce.

L'étude réalisée en milieu marin se déroule en trois étapes.

Dans un premier temps, l'adaptation du protocole développé pour une couche de gélatine est réalisée sur des biofilms relativement épais. Dans ce but, les conditions d'exposition des électrodes sont modifiées : augmentation de la température et de la concentration des nutriments.

Une fois ce premier point accompli, une étude est réalisée en milieu stérile afin de disposer
d'une référence.

<footnote>(a) *Eau douce* : Le terme 'eau douce' est utilisé en opposition au terme 'eau de mer'.</footnote>
Enfin, la technique est appliquée dans le cas d'un biofilm développé en eau de mer sans apport extérieur de nutriment et à température ambiante.

A chaque étape, des observations (MEB, cultures, épifluorescence, MLBC) sont réalisées pour valider les résultats obtenus.
# I. CARACTERISATION DE BIOFILMS FORMES EN EAU DE MER

Dans cette étude, l'eau de mer est à la fois le milieu d'exposition où se développent les biofilms et le milieu de mesure.

L'eau de mer est un milieu riche et complexe contenant en poids 3,5% de composés dissous (fig. §4.1). Onze espèces principales constituent 99,99% des composés dissous dont la proportion par rapport à la salinité est peu variable, excepté aux embouchures des fleuves (Aminot et Chaussepied, 1983). C'est un cadre propice pour le développement de la flore bactérienne.

## A. Caractérisation d'un biofilm formé en eau de mer additionnée d'un nutriment

### 1. Conditions expérimentales

Le biofilm est développé sur quatre électrodes exposées dans une eau de mer prélevée en Rade de Brest (Océan Atlantique). Cette eau possède les caractéristiques suivantes :

* Salinité 35 ‰

* pH 8,2

* Oxygène naturellement dissous $8,5 \text{ mg.L}^{-1}$ (méthode de dosage Winkler, cf. Annexe)

Le milieu d'exposition des électrodes (fig. §4.2, photos §4.1) est continuellement renouvelé avec un débit $3 \text{ L.min}^{-1}$ (≈ 0,3 $\text{m.s}^{-1}$) et est protégé de la lumière du jour.

Afin d'améliorer le développement bactérien, de l'extrait de levure (élément nutritif) est additionné à l'eau de mer à un taux de $3,5 \text{ mg.L}^{-1}$. De plus, dans la même optique, la température de l'eau a été amenée à 18°C.
<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Figure §4.1: Grandes classes de composés dissous dans l'eau de mer naturelle (Aminot et Chaussepied, 1983).</figcaption></figure>
Les mesures sont également réalisées à 18°C avec deux traceurs. Deux des électrodes sont testées avec le ferricyanure alors que les deux autres électrodes ont été testées avec l'oxygène. Les conditions expérimentales sont présentées dans le tableau §4.1.

<table><caption>Tableau §4.1 : Conditions expérimentales lors des mesures électrochimiques.</caption><thead><tr><th>Traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup></th><th>Traceur oxygène</th></tr></thead><tbody><tr><td>Eau de mer +<br>K<sub>3</sub>Fe(CN)<sub>6</sub>/K<sub>4</sub>Fe(CN)<sub>6</sub> 10<sup>-2</sup>M<br>Potentiel de polarisation 0 mV/ECS</td><td>Eau de mer<br>Oxygène dissous 8,5 mg.L<sup>-1</sup><br>Potentiel de polarisation -900 mV/ECS</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Figure §4.2 : Dispositif d'exposition des électrodes.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Photos §4.1 : Dispositif d'exposition des électrodes.</figcaption></figure>
Le fait d'ajouter un produit chimique au milieu aurait pu aussi être un inconvénient notamment par son impact sur les espèces vivantes présentes dans le milieu d'étude. Cependant, une étude préliminaire réalisée au CIRSEE (b) / Lyonnaise des Eaux a montré l'innocuité $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ vis à vis du monde bactérien (cf. Annexe).

L'oxygène, quant à lui, a l'avantage d'être naturellement présent dans la plus part des milieux d'étude : eau de mer, eaux douces naturelles, milieu biologique... et ne possède pas de toxicité particulière pour le biofilm.

## 2. Résultats et discussion

### a) Traceur ferricyanure

#### Régime stationnaire

Le courant limite de réduction de $Fe(CN)_6^{3-}$ en régime stationnaire est enregistré en fonction de $\sqrt{\Omega}$ à différents temps d'immersion.

Durant la période d'exposition, la gamme des courants mesurés diminue fortement. Les courants maxima obtenus pour une vitesse de rotation de 1200 tr.min⁻¹ passent de 880 à 190 µA pendant que les courants minima mesurés pour des vitesses de rotation de 120 tr.min⁻¹ passent de 260 à 90 µA (fig. §4.3). Les courants mesurés baissent fortement les 4 premiers jours. Une légère remontée peut être observée suivie d'une forte redescente des courants mesurés.

Les paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ sont déterminés par ajustement des données expérimentales au modèle et tracés en fonction du temps dans la figure §4.4.

<footnote>(b) CIRSEE : Centre International de Recherche Sur l'Eau et l'Environnement</footnote>
<figure><img src="image_62.png" /></figure>

**Figure §4.3** : Gamme des courants mesurés pour des vitesses de rotation s'échelonnant entre 120 et 1200 tr.min⁻¹ en fonction du temps d'immersion dans de l'eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).

Sur la figure §4.4, un courant non diffusionnel $i_o$ apparaît puis augmente de manière significative lors des cinq premiers jours pour atteindre un plateau d'environ 40 µA. Le paramètre $i_\infty^{-1}$, proportionnel à $\delta_f / S D_f$, monte régulièrement vers une valeur limite de $5 \times 10^{-3} \mu A^{-1}$. L'inverse du coefficient de Levich $K^{-1}$ reste constant pendant 5 jours à une valeur de $0,04 \mu A^{-1} (tr / min)^{-0,5}$ puis augmente pour atteindre une valeur moyenne $0,15 \mu A^{-1} (tr / min)^{-0,5}$.

L'apparition d'un courant non diffusionnel peut avoir plusieurs explications. Une raison plausible est la production d'espèces chimiques électroactives par les microorganismes s'adsorbant sur la surface de l'électrode.
<figure><img src="image_63.png" /></figure>

Figure §4.4 : $i_o$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ $10^{-2}M$ (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$). Les symboles ♦ et ■ distinguent 2 électrodes différentes.
Le paramètre K⁻¹ étant inversement proportionnel à la surface active apparente, son augmentation est vraisemblablement due à un blocage progressif de la surface de l'électrode. Dans le cas d'une électrode nue, l'inverse du coefficient de Levich peut rester inchangé alors que la surface est bloquée à plus de 50%. Par contre dans le cas d'une électrode recouverte d'une couche poreuse, ce coefficient est beaucoup plus sensible au blocage car il n'y a pas de convection dans la couche.

Ce blocage de la surface active peut être dû à l'adsorption sur la surface d'espèces chimiques produites par les microorganismes, de l'extrait de levure ou d'une substance présente naturellement dans l'eau.

La chute des courants mesurés devient telle au-delà du 15ᵉ jour d'exposition que l'ajustement des données en régime stationnaire par rapport au modèle n'est plus possible. Ce phénomène marque une limitation actuelle de la technique.

## Impédance EHD

Les diagrammes de Bode obtenus en impédance EHD avec une électrode nue permettent de vérifier la réductibilité par la fréquence adimensionnelle p (fig. §4.5).

Les diagrammes obtenus pour un biofilm âgé de 12 jours (fig. §4.6) montrent que les données ne sont plus réductibles par la fréquence p. Les courbes sont déplacées vers de plus basses valeurs quand la vitesse de rotation de l'électrode augmente. De plus, les phases ne tendent pas vers une valeur limite lorsque la fréquence tend vers l'infini : elles restent des fonctions croissantes de la fréquence.

Ce comportement est cohérent avec une diffusion à travers une couche poreuse.
<figure><img src="image_64.png" /></figure>

**Figure §4.5** : Impédance EHD d'une électrode nue dans une eau de mer additionnée $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ à différentes vitesses de rotation □ 600 et ■ 1200 tr.min$^{-1}$. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ 10$^{-2}$M (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$).
## Traitement des données

Dans le protocole élaboré pour l'étude de la couche de gélatine, le nombre de Schmidt Sc du traceur est déterminé préalablement afin de pouvoir le fixer lors de l'ajustement des données expérimentales EHD en présence de la couche poreuse.

A partir de l'inverse du coefficient de Levich, il est possible d'atteindre le coefficient de diffusion du ferricyanure ($5,6 \times 10^{-6} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$) dans l'eau de mer et ainsi d'obtenir le nombre de Schmidt correspondant. Le nombre de Schmidt de 1800 ainsi déterminé est ensuite vérifié par ajustement des données obtenues en impédance EHD pour une électrode nue.

$$ \text{Sc}_{\text{Fe(CN)}_6^{3-}} = 1800 $$

$$ D = 5,6 \times 10^{-6} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1} $$

En prenant $i_{\infty}^{-1} = 5 \times 10^{-3} \text{ µA}^{-1}$ déterminé pour une électrode donnée au jour 12, l'équation §2.18 donne la vitesse de diffusion $\frac{D_f}{\delta_f} = 1,0 \times 10^{-3} \text{ cm} \cdot \text{s}^{-1}$. En fixant $\text{Sc}_{\text{Fe(CN)}_6^{3-}}$ et $\frac{D_f}{\delta_f}$ suivant les valeurs prédéterminées, l'analyse des données EHD suivant l'expression §2.36 permet de calculer le temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ pour chaque vitesse de rotation (tableau §4.1).

<table><thead><tr><th>Ω (tr.min<sup>-1</sup>)</th><th>δ<sup>2</sup><sub>f</sub> / D<sub>f</sub> (s)</th></tr></thead><tbody><tr><td>600</td><td>4,24</td></tr><tr><td>1200</td><td>5,96</td></tr></tbody></table>

**Tableau §4.1** : Temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ ajustés à partir des données expérimentales pour une électrode recouverte d'un biofilm de 12 jours (traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup>).
<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Figure §4.6 : Impédance EHD d'une électrode d'or exposée 12 jours dans une eau de mer additionnée d'extrait de levure à différentes vitesses de rotation □ 600, ■ 1200 tr.min⁻¹ comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue — aux mêmes vitesses de rotation. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).
Néanmoins, connaissant le temps et la vitesse de diffusion dans la couche poreuse ainsi que le nombre de Schmidt, l'épaisseur, le coefficient de diffusion du traceur dans le film peuvent être alors calculés (tableau §4.2).

<table><caption>Tableau §4.2 : Epaisseur et coefficient de diffusion calculés à partir des données expérimentales pour une électrode recouverte d'un biofilm de 12 jours (traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup>).</caption><thead><tr><td>Ω (tr.min<sup>-1</sup>)</td><td>δ<sub>f</sub> (μm)</td><td>D<sub>f</sub> (cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>)</td></tr></thead><tbody><tr><td>600</td><td>60</td><td>6,0 10<sup>-6</sup></td></tr><tr><td>1200</td><td>43</td><td>4,3 10<sup>-6</sup></td></tr></tbody></table>

Les valeurs calculées du coefficient de diffusion dans la couche sont distribuées et la valeur de 6,0 10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup> est surestimée car elle ne peut être supérieure à celle du coefficient de diffusion dans la solution. La valeur moyenne du coefficient de diffusion du traceur dans la couche poreuse 5,1 ± 0,9 10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup> est voisine de celle mesurée dans la solution électrolytique qui est de 5,6 10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>. Ceci est cohérent avec une très grande porosité ε qui est ici d'environ 0,95 (éq. §3.2). Ce résultat est en accord avec le fait que la biomasse contient plus de 95% d'eau (Christensen et Characklis, 1990).

Dans ce travail, compte tenu de la précision accessible, les coefficients de diffusion dans le biofilm et l'eau de mer seront considérés comme équivalent et égaux à 5,6 10<sup>-6</sup> cm<sup>2</sup>.s<sup>-1</sup>.

$$D_f = D = 5,6 \ 10^{-6} \text{cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$$

Il est alors possible de suivre l'évolution de l'épaisseur du voile biologique dans le temps à partir de la détermination de la vitesse de diffusion obtenue avec de simples mesures stationnaires. A partir de l'équation §2.16 et en prenant :

$$\bullet n = 1$$
$$
\bullet S = 0,196 \text{ cm}^2
$$

$$
\bullet D_f = 5,6 10^{-6} \text{ cm}^2 \text{ s}^{-1}
$$

$$
\bullet c_{\infty} = 10^{-5} \text{M}
$$

les épaisseurs sont déterminées et représentées en fonction du temps d'exposition dans la
figure §4.7.

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

Figure §4.7 : Epaisseur du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻). Les symboles ♦ et ■ distinguent 2 électrodes différentes.

Ce calcul est réalisé en prenant comme hypothèse que la surface active S de l'électrode est constante dans le temps.

Il est possible de prendre comme hypothèse que dans le cas d'une électrode
recouverte d'une couche poreuse, K-1 est proportionnelle à la surface apparente active. En
effet, une électrode dont la surface est partiellement bloquée et non recouverte d'une
couche poreuse présente un coefficient K-1 identique à celui déterminé avec une électrode
active. Par contre, dans le cas d'une électrode recouverte d'une couche poreuse, la variation de K⁻¹ peut être attribuée à la diminution de la surface active.

En prenant l'inverse du coefficient de Levich (fig. §4.3) inversement proportionnel à la surface active apparente, S diminue durant la période d'exposition. En considérant qu'au jour 0, la surface est complètement active c'est-à-dire égale à 0,196 cm², il est possible de calculer l'évolution de la surface en fonction du temps d'immersion (fig. §4.8). La surface ne représente plus que 20 à 30% de sa valeur initiale après 2 semaines d'exposition.

La surface S intervient dans l'expression §2.16 exprimant $i_\infty^{-1}$. La prise en compte de cette variation de la surface active apparente amène à recalculer l'épaisseur du biofilm durant la période d'exposition (fig. §4.9). Les épaisseurs ainsi déterminées sont plus faibles par rapport aux premières estimations avec des valeurs maximales d'environ 15 µm.

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

**Figure §4.8** : Surface active apparente de l'électrode en fonction du temps d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻). Les symboles ♦ et ■ distinguent 2 électrodes différentes.
<figure><img src="image_68.png" /></figure>

Figure §4.9 : Epaisseur du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure. Calculs réalisés en tenant compte de la surface active apparente de l'électrode à partir de mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻). Les symboles ♦ et ■ distinguent 2 électrodes différentes.
b) Traceur oxygène

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

Régime stationnaire

Une procédure identique à celle décrite pour le traceur Fe(CN)₆³⁻ est réalisée avec le
traceur oxygène.

Durant la période d'exposition, la gamme des courants mesurés (fig. §4.10) diminue fortement dans un phénomène semblable à celui décrit pour le traceur Fe(CN)₆³⁻. Les courants maxima obtenus pour une vitesse de rotation de 1200 tr.min⁻¹ passent de 160 à 40 µA pendant que les courants minima mesurés pour une vitesse de rotation de 120 tr.min⁻¹ passent de 50 à 20 µA. Les courants mesurés baissent les 4 premiers jours puis réaugmentent pour ensuite rediminuer de nouveau. La remontée des courants observée entre le jour 3 et le jour 5 est très marquée.

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

Figure §4.10: Gamme des courants mesurés pour des vitesses de rotation s'échelonnant entre 120 et 1200 tr.min⁻¹ en fonction du temps d'immersion pour des électrodes immergées dans de l'eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène).
Les 3 paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ ont été déterminés par ajustement des données expérimentales en régime stationnaire et tracés en fonction du temps (fig. §4.11).

Le courant non diffusionnel $i_0$ subit une augmentation dans les cinq premiers jours d'immersion pour atteindre un plateau d'environ 6 µA. La valeur de $i_0$ obtenue pour une électrode nue au jour 0 est proche de zéro montrant ainsi une contribution très faible du courant de réduction des protons. Sur la même période, le paramètre $i_\infty^{-1}$ monte régulièrement pour atteindre une valeur limite de $3 \times 10^{-2} \mu A^{-1}$. L'inverse du coefficient de Levich $K^{-1}$ augmente régulièrement d'une valeur de $0,19 \mu A^{-1} \cdot (\text{tr / min})^{-0,5}$ pour atteindre une valeur moyenne de $0,77 \mu A^{-1} \cdot (\text{tr / min})^{-0,5}$.

Ces observations confirment le blocage de la surface active apparente déjà observée dans le cas des électrodes testées avec le $Fe(CN)_6^{3-}$. De plus, comme dans le cas du ferricyanure, le courant non diffusionnel augmente durant le temps de l'expérience. Les arguments avancés dans le cas du traceur précédent expliquent ce phénomène.

## Traitement des données

En se basant sur les résultats obtenus avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$, les coefficients de diffusion de l'oxygène dans le biofilm et dans la solution électrolytique sont supposés identiques. Cette hypothèse postule une très grande porosité du biofilm.

Le coefficient de diffusion de l'oxygène est évalué à $1,4 \times 10^{-5} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$ (c'est-à-dire $Sc_{O_2} = 700$) à partir du paramètre $K^{-1}$.

$$ Sc_{O_2} = 700 $$

$$ D_f = D = 1,4 \times 10^{-5} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1} $$

Tout comme les calculs réalisés pour le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$, il est alors possible de suivre l'évolution de l'épaisseur du voile biologique dans le temps à partir de la détermination de la vitesse de diffusion obtenue avec de simples mesures stationnaires.
<figure><img src="image_71.png" /></figure>

Figure §4.11 : $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion dans l'eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène). Les symboles ♦ et ■ distinguent 2 électrodes différentes.
L'inverse du coefficient de Levich étant inversement proportionnel à la surface active apparente, S diminue durant la période d'exposition. En considérant qu'au jour 0, la surface est complètement active, il est possible de calculer l'évolution de la surface en fonction du temps d'immersion. (fig. §4.12).

A partir de l'expression §2.17 exprimant $i_{\infty}^{-1}$ et en tenant compte de la variation de la surface active, l'épaisseur du biofilm est calculée durant la période d'exposition (fig. §4.13).

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>**Figure §4.12** : Surface active apparente de l'électrode en fonction du temps d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène).</figcaption></figure>

c) Comparaison des épaisseurs obtenues avec les deux traceurs

Les résultats obtenus avec les deux traceurs, l'oxygène et le ferricyanure, sont comparés sur la figure §4.14.
<figure><img src="image_73.png" /></figure>

Figure §4.13 : Epaisseur du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure. Calculs réalisés à partir mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène) en tenant compte de la surface active apparente de l'électrode.

A la précision des mesures près, les épaisseurs relevées sont en bon accord. La dispersion des mesures peut être attribuée en premier lieu à un développement différent de la biomasse sur les électrodes testées. Les conditions expérimentales ne sont pas rigoureusement analogues d'un emplacement à l'autre dans le système d'exposition. Les films bactériens ne sont pas identiques d'une surface à l'autre.

A partir des épaisseurs calculées avec les deux traceurs, l'allure générale de l'évolution de la biomasse en fonction du temps d'exposition en eau de mer est donnée sur la figure §4.14. Ce diagramme est comparable à la figure §1.1 présentant les différentes étapes de formation du biofilm (Characklis, 1990).
<figure><img src="image_74.png" /></figure>

**Figure §4.14** : Comparaison des épaisseurs du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure testées avec les traceurs $Fe(CN)_6^{3-}$ (symboles blancs) et oxygène (symboles noirs). Les symboles correspondent aux points expérimentaux et la courbe en pointillée à l'allure générale de l'évolution de l'épaisseur du biofilm.

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

Observations au MEB

Des observations au Microscope Electronique à Balayage (photos §4.2) sur la surface des électrodes ont fait apparaître une population bactérienne importante et de types morphologiques variés :

• formes coccoïdes

• formes en bâtonnet de tailles variables

• formes filamenteuses

• formes phytoplanctoniques et zooplanctoniques.

L'aspect général de la surface montre des dépôts importants de matière particulière. Le biofilm est épais et compacté sous forme d'une croûte visible dans l'arrière plan des photos. Cet écrasement de la biomasse peut être attribué à la technique de préparation des
échantillons (protocole, cf Annexe). Des formes filamenteuses et des formes "en baguette" au contour bien défini recouvrent le biofilm compacté. Ces corps en baguette peuvent correspondre à des formes cristallines ou plus probablement à des algues unicellulaires de type diatomée pennée.

Des cultures ont été réalisées à partir de prélèvements effectués sur les électrodes. Les densités bactériennes sur la surface des électrodes sont de :

<table><tr><td>• microflore aérobie</td><td>4,8 10<sup>8</sup>/cm<sup>2</sup></td></tr><tr><td>• microflore anaérobie facultative</td><td>7,9 10<sup>6</sup>/cm<sup>2</sup></td></tr><tr><td>• microflore anaérobie stricte</td><td>7,0 10<sup>4</sup>/cm<sup>2</sup></td></tr><tr><td>• traces de champignons</td><td>5,5 10<sup>2</sup>/cm<sup>2</sup></td></tr></table>

Ces observations au MEB confirment la présence d'un biofilm relativement épais détecté à l'aide de la méthode électrochimique. Le voile biologique montre une homogénéité globale. Les petits amas constituant la biomasse peuvent expliquer le blocage de la surface.

Les observations au MEB des biofilms n'apportent pas des renseignements comparables avec ceux déterminés par la technique électrochimique développée dans cette étude. Le MEB permet l'observation de la répartition des amas bactériens mais a l'inconvénient de modifier la morphologie du biofilm lors de la phase de préparation des échantillons.
<figure><img src="image_76.png" /></figure>

**Photo §4.2** : Observations au MEB de la surface d'une électrode après 19 jours d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure : (a) Aspect générale de la surface, (b), (c) et (d) détails. L'échelle représentée sur la partie gauche des photos par un trait blanc correspond à une dimension de 1000 µm prise pour la photo (a) , de 100 µm pour les photos (b) et (c) et de 10 µm pour la photo (d).
## B. Etude en milieu stérile

La technique mise au point avec la couche modèle et expérimentée avec un biofilm nécessite comme toute méthode de mesure à être étalonnée. Pour cela, il est indispensable de déterminer le zéro et la sensibilité de la technique. La vérification du zéro est bien sûr faite à l'aide d'une électrode nue, immédiatement après immersion. Par contre, les éventuelles fluctuations de l'état de surface de l'électrode et de sa réactivité en fonction du temps d'exposition ne peuvent être quantifiées que si celle-ci reste exempte de couche poreuse. Cette condition ne peut être réalisée que dans un milieu stérile. Ces modifications se traduisent par une incertitude sur la valeur des paramètres calculés et fournissent le seuil de détection de la méthode.

La mise en oeuvre des mesures en milieu stérile n'est pas aisée. Plusieurs impératifs doivent être pris en compte :

* Etablissement, maintien et contrôle du milieu stérile

* Réalisation des mesures électrochimiques

L'établissement et le contrôle des conditions de stérilité nécessitent à la fois des connaissances, un savoir-faire et des équipements propres à un laboratoire de microbiologie. Aussi ce travail a été effectué au Laboratoire d'Océanographie Biologique d'Arcachon de l'Université de Bordeaux I.

### 1. Conditions expérimentales

#### a) Montage expérimental

La principale difficulté vis à vis de la stérilité du milieu était l'étanchéité de la cellule tout en laissant possible la rotation de l'électrode tournante. Il a été nécessaire d'imaginer et de réaliser une cellule électrochimique adaptée à ces contraintes. Cette cellule a été conçue par le service Bureau d'Etude et Conceptions Prototypes de l'IFREMER (Brest) et réalisée à la Verrerie Prémont (Bordeaux).
Le principe de la cellule réside dans la mise en place d'un joint tournant liquide (fig. §4.15). Une gorge a été réalisée dans le couvercle de la cellule autour de l'orifice servant à l'insertion de l'électrode de travail. Les bords d'un cylindre fixé de manière étanche sur cette électrode viennent s'insérer dans la gorge remplie d'alcool.

La cellule comporte différents circuits permettant le renouvellement de l'eau de mer stérile, l'aération de la cellule et la régulation de la température du milieu. De plus, deux accès ont été aménagés dans le corps de la cellule pour permettre l'introduction de l'électrode de référence et de la contre-électrode. L'étanchéité entre le corps de la cellule et son couvercle ainsi que des différents accès est assurée par des joints Sovirel et par application de graisse silicone.

La cellule électrochimique est incluse dans un dispositif permettant le renouvellement du milieu à raison de 10% par heure par l'intermédiaire de pompes péristaltiques (fig. §4.16).

Un flacon stérile de 10 L d'eau de mer stérile alimente le circuit. Cette eau de mer est aérée à l'aide d'une pompe et d'un bulleur. L'air est filtré à l'aide d'un filtre de 0,3 µm. Tous les 10 jours, le circuit est arrêté pendant 24 h lors du remplacement du flacon d'alimentation. Deux raccords munis de clapets d'arrêt sont ajoutés au flacon d'alimentation pour permettre les prélèvements et les additions.

Les rejets sont récupérés dans un second flacon stérile d'une contenance de 10 L comportant une entrée pour la récupération des effluents et une sortie d'air avec un filtre de 0,3 µm.
<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>Figure §4.15: Cellule électrochimique pour réaliser des mesures à l'aide d'une électrode à disque tournant en milieu stérile.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_78.png" /></figure>

**Figure §4.16:** Circuit de renouvellement du milieu comportant un flacon d'alimentation et un flacon de rejets, une cellule électrochimique et des pompes à air et péristaltiques.

b) Procédures de stérilisation

Le protocole de stérilisation du montage est identique pour les flacons, la cellule électrochimique, les tuyaux de raccordement et les électrodes de travail et auxiliaire.
Les ouvertures sont fermées à l'aide de coton cardé et de papier aluminium et les raccords ont été protégés à l'aide de papier aluminium. Tous ces éléments sont alors autoclavés pendant une période de 20 min à une température de 121°C et sous une pression de 1 bar (Brock et Madigan, 1991). Après autoclavage, le dispositif est installé sous hotte à flux laminaire à proximité d'une flamme, la hotte étant stérilisée par rayons UV.

La méthode de stérilisation de l'eau de mer utilisée dans le Laboratoire d'Océanographie Biologique d'Arcachon est basée sur une technique proposée par Little *et al.* (1987).

L'eau de mer est prélevée dans le Bassin d'Arcachon (Océan Atlantique) à marée montante. La turbidité de cette eau provenant du large est moins élevée que celle prélevée dans le fond du Bassin d'Arcachon. De plus, une décantation de 2 à 3 jours permet d'éliminer une part importante des particules en suspension dans le prélèvement. Le pH de la solution est alors mesuré.

La stérilisation de l'eau de mer se déroule en deux temps :

* filtration

* autoclavage

L'eau est passée successivement sur des filtres 0,45 µm et 0,2 µm. Cette première étape permet l'élimination des précipités éventuellement présents dans l'eau et de la majorité des bactéries, la taille des microorganismes étant généralement supérieure à 0,2 µm.

Toutefois, la seconde étape de la stérilisation, l'autoclavage, est nécessaire pour détruire les bactéries ayant pu échapper à la filtration. L'autoclavage s'effectue à 121°C pendant une période de 2 h sous une pression de 1 bar. Cette seconde opération est souvent à l'origine de la précipitation de composés contenus dans l'eau de mer (carbonates, phosphates...) due à une augmentation du pH. Ce phénomène peut cependant être évité par l'addition de 2 mL d'HCl 1M par litre de milieu avant l'autoclavage.
Le retour de l'eau de mer à la température ambiante s'effectue en environ 12 h sous bullage d'air. Cet apport d'oxygène permet de retrouver une concentration en oxygène dissous proche la valeur d'équilibre (7 mg.L⁻¹) à température ambiante.

L'autoclavage provoque l'élimination des carbonates qui sont en équilibre avec le dioxyde de carbone atmosphérique et nécessite par la suite l'addition de carbonates (environ 4mM) dans le milieu. Le pH est alors réajusté à la valeur mesurée avant filtration par addition soit d'acide chlorhydrique soit de soude stériles.

L'eau de mer stérilisée possède les caractéristiques suivantes :

* salinité 35 ‰

* pH 8,2-8,3

* température 25°C.

* oxygène dissous 7 mg.L⁻¹

### c) Contrôles de stérilité

Pendant toute la période de l'expérience, tous les 2 jours, des prélèvements sont effectués afin de contrôler la stérilité du milieu. Différents types de contrôles sont employés :

* **Observations d'une goutte du milieu montée entre lame et lamelle au microscope à contraste de phase** (objectif 100 à immersion)

* **Cultures** en boîtes de Pétri sur marine agar (préparation, cf. Annexe)

* **Dénombrement, par épifluorescence, des cellules obtenues par filtration d'un volume donné du milieu** (protocole, cf. Annexe).

De plus, un **dénombrement, par épifluorescence, des cellules présentes sur la surface** de l'électrode de travail est accompli à la fin de la période d'immersion (protocole, cf. Annexe).
## 2. Résultats et discussion

### a) Maintien de la stérilité

Pendant toute la durée de l'immersion de l'électrode dans le milieu stérile, des prélèvements sont réalisés tous les 2 jours afin de contrôler la stérilité du milieu.

Les observations au microscope à contraste de phase révèlent la présence de quelques objets immobiles de forme arrondie. Leur nombre est toujours inférieur à 10 par lame tout au long des prélèvements. L'immobilité de ces objets tend à les identifier comme des contaminants plutôt que comme des bactéries présentes dans le milieu.

Les cultures sur marine agar montrent quelques fois un développement bactérien. Une colonie est isolée à partir des prélèvements effectués les 12e et 17e jours ainsi que dans les cultures témoins des 3e et 19e jours. Chaque culture correspond à l'étalement de 0,1 mL du milieu ou du témoin stérile. Une colonie dénombrée dans une boîte de Pétri revient donc à considérer 10 bactéries.mL⁻¹.

Cependant, l'observation de colonies dans les milieux de culture est ponctuelle et non confirmée par le prélèvement pratiqué 2 jours plus tard. De plus, les colonies observées sont peu importantes. Tout ceci concourt à suggérer une contamination accidentelle lors de l'étalement pour expliquer ces développements bactériens. La présence de colonies dans les boîtes de cultures témoins vient également renforcer cette hypothèse. Considérer ces microorganismes comme venant de l'eau de mer circulant dans la cellule signifierait qu'ils ne sont pas viables dans un tel milieu et par conséquent, incapables d'être à l'origine d'une contamination.

Quelques bactéries sont, elles aussi, détectées par épifluorescence sur les filtres après filtration d'un volume donné du milieu circulant dans la cellule (fig. §4.17). Néanmoins, leur nombre reste faible.

Les courbes des échantillons prélevés dans le milieu et des témoins sont très semblables. Les densités bactériennes obtenues sont négligeables et relativement faibles
avec des valeurs d'environ 10 à $10^2$ cellules.mL$^{-1}$. Cependant, des valeurs plus élevées sont relevées les 17ᵉ et 19ᵉ jours pour atteindre une fourchette comprise entre $10^2$ et $10^3$ cellules.mL$^{-1}$.

Les densités bactériennes mesurées sont inférieures à la limite de détection de la technique d'observation. Les valeurs déterminées pourront donc être considérées comme suffisamment faible pour simuler un milieu stérile.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Figure §4.17 : Dénombrement bactérien, par épifluorescence, obtenu par filtration d'un volume de 10 mL du milieu circulant dans la cellule électrochimique (♦ échantillons, ■ témoins).</figcaption></figure>

Les observations effectuées par épifluorescence sur la surface de l'électrode à la fin de la période d'immersion révèlent des formes arrondies fluorescentes de taille relativement importante, quelques dizaines de µm, et en nombre peu important, avec une densité bactérienne de $10^2$ entités.cm$^{-2}$. Cette faible concentration est inférieure au seuil de détection et le milieu peut donc être considéré comme stérile.
b) Régime stationnaire

Cette étude en milieu stérile a pour objectif de suivre les éventuelles fluctuations de l'état de surface l'électrode et de sa réactivité en fonction du temps d'exposition à partir de la technique électrochimique développée. Un seuil de détection pourra ainsi être déduit de ces mesures.

Dans une première étape, le plateau limite de diffusion de réduction de l'oxygene dans la solution d'eau de mer stérilisée est déterminé (fig. §4.18). Le potentiel retenu pour réaliser les mesures en milieu stérile est de -900 mV/ECS.

La courbe de polarisation obtenue dans la solution d'eau de mer stérilisée est différente de la courbe obtenue en eau de mer naturelle non stérilisée. La modification de la courbe de polarisation peut être attribuée à la technique de stérilisation de l'eau de mer qui altère les propriétés physico-chimiques de celle-ci.

<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>Figure §4.18 : Courbes de polarisation sur une électrode nue en eau de mer naturelle non stérilisée ① et stérilisée ② à 120 tr.min⁻¹ en régime stationnaire.</figcaption></figure>
Des mesures en régime stationnaire ont été effectuées quotidiennement afin de suivre l'évolution de la formation éventuelle d'un biofilm durant une période de trois semaines. L'évolution des trois paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$, déterminés par ajustement des données expérimentales, est présentée en fonction du temps dans la figure 4.19.

Le courant non diffusionnel $i_0$ reste stable sur la période couvrant les deux premières semaines d'exposition de l'électrode dans le milieu stérile. La hausse de la valeur du paramètre $i_0$, qui peut être observée à partir du 14e jour, coïncide avec le rajustement du pH dans le flacon d'alimentation. Le paramètre $i_\infty^{-1}$ varie peu dans une fourchette allant de 0 à $1,8 \times 10^{-3} \mu A^{-1}$ pendant la période d'exposition. L'inverse du coefficient de Levich $K^{-1}$ reste stable pendant l'expérience en se distribuant autour de $0,20-0,25 \mu A^{-1} \cdot (\text{tr.min}^{-1})^{-0,5}$. De plus la gamme des courants mesurés reste stable dans le temps.

L'addition d'acide chlorhydrique pour réajuster le pH a provoqué une augmentation du courant non diffusionnel correspondant ici au courant de réduction des protons. Les valeurs atteintes par $i_0$ sont relativement importantes pour un potentiel de polarisation de -900 mV/ECS (autour 50-60 µA). La stérilisation modifie les propriétés de l'eau de mer non seulement biologiques mais physico-chimiques (Little *et al.*, 1989).

La filtration peut avoir plusieurs actions telles que retenir un certain nombre de composés organiques et minéraux mais aussi lyser(c) certains organismes libérant ainsi leur contenu intracellulaire. L'autoclavage peut, quant à lui, provoquer la dénaturation des substances protéiques de l'eau de mer. Toutes ces modifications du milieu lors de la stérilisation peuvent être invoquées pour expliquer cette valeur importante du courant non diffusionnel.

Supposons qu'un éventuel biofilm se soit formé à la surface de l'électrode. L'étude concernant le biofilm formé en eau de mer additionnée d'extrait de levure a montré que la porosité d'un biofilm est très proche de 1 c'est-à-dire que les coefficients de diffusion dans le biofilm et dans la solution électrolytique sont identiques.

<footnote>(c) *Lyser* : Destruire des éléments organiques (tissus : histolyse; cellules : cytolyse; micro-organismes : bactériolyse, etc.) sous l'action d'agents physiques, chimiques ou biologiques.</footnote>
<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>Figure §4.19 : $i_o$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'immersion en eau de mer stérile (traceur oxygène).</figcaption></figure>
A partir de $K^{-1}$, le coefficient de diffusion de l'oxygène peut être estimé à $1,5 \times 10^{-5} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$ dans la solution d'eau stérilisée à 25°C. Il est alors possible de calculer l'évolution de l'épaisseur dans le temps (fig §4.20).

L'épaisseur moyenne calculée est à $1,5 \pm 1,5 \mu\text{m}$. Cette épaisseur correspond à la limite de détection inférieure pouvant être atteinte à l'aide de cette technique avec le traceur oxygène. Les bactéries ont une taille moyenne de 1 $\mu\text{m}$. Abaisser le seuil de détection n'est donc pas nécessaire. En milieu vivant, une détermination inférieure ou égale à 3 $\mu\text{m}$ correspondra donc à l'absence de voile biologique.

<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>Figure §4.20 : Epaisseur d'un éventuel biofilm formé sur l'électrode à disque tournant dans un milieu marin stérile en fonction du temps d'exposition : ◆ points expérimentaux, --- moyenne (traceur oxygène).</figcaption></figure>

Contrairement à l'étude réalisée en eau de mer additionnée d'extrait de levure, l'augmentation progressive du courant non diffusionnel $i_o$ n'est pas observée. L'activité biologique de la biomasse semble donc pouvoir être invoqué dans l'apparition de ce
courant. De plus, la surface active apparente de l'électrode est demeurée stable durant les trois semaines d'exposition dans le milieu stérile.

### 3. Conclusion

Tous les contrôles effectués tendent à montrer que le milieu est demeuré stérile pendant toute la durée de l'exposition.

Le seuil de détection de la méthode pour l'épaisseur du biofilm est d'environ 3 µm. En milieu vivant, une détermination inférieure ou égale à cette valeur correspond donc à une épaisseur pouvant être considérée comme nulle. Cette épaisseur correspond à la limite inférieure pouvant être atteinte à l'aide de cette technique avec le traceur oxygène. Compte tenu des comparaisons déjà effectuées entre les mesures obtenues avec l'oxygène et le ferricyanure, le seuil de détection de 3 µm déterminé avec l'oxygène pourra être considéré comme un majorant pour le seuil de détection avec le ferricyanure.

L'apparition du courant non diffusionnel $i_o$ dans l'étude en eau de mer additionnée d'extrait de levure n'est pas observée en milieu stérile. Ce courant était attribué, en eau de mer nourrie, à la production d'espèces électroactives par le biofilm.

De plus, le blocage progressif de la surface active en eau de mer nourrie n'est pas non plus décrit en eau de mer stérile. Cette réduction de la surface était attribuée à l'adsorption sur l'électrode d'espèces chimiques produites par les microorganismes, de l'extrait de levure ou d'une substance présente naturellement dans l'eau.

A partir de cette étude en milieu stérile, l'activité biologique du biofilm semble pouvoir être invoquée dans l'apparition du courant non diffusionnel ainsi que dans le blocage de la surface active de l'électrode.
## C. Caractérisation d'un biofilm en eau de mer naturelle

Suite aux études précédentes, le protocole élaboré est appliqué à une biomasse développée dans une eau de mer naturelle, c'est-à-dire non additionnée d'un nutriment.

### 1. Conditions expérimentales

Les six électrodes sont exposées dans de l'eau de mer prélevée en Rade de Brest. Les caractéristiques de cette eau sont décrites au paragraphe §4.I.A.1. Les conditions d'exposition sont les suivantes :

* Débit $2 \text{ L.min}^{-1}$ ($0,2 \text{ m.s}^{-1}$)

* Température $21^{\circ}\text{C}$

* Oxygène naturellement dissous $8,5 \text{ mg.L}^{-1}$ (méthode de dosage Winkler, cf. Annexe)

* Saison automne

Les mesures sont réalisées à $20^{\circ}\text{C}$ avec deux traceurs : le ferricyanure et l'oxygène. Trois électrodes sont testées avec chaque traceur. Les conditions expérimentales sont présentées dans le tableau §4.3.

<table><caption>Tableau §4.3 : Conditions expérimentales lors des mesures électrochimiques.</caption><thead><tr><th>Traceur Fe(CN)<sub>6</sub><sup>3-</sup></th><th>Traceur oxygène</th></tr></thead><tbody><tr><td>Eau de mer +<br>K<sub>3</sub>Fe(CN)<sub>6</sub>/K<sub>4</sub>Fe(CN)<sub>6</sub> 10<sup>-2</sup>M</td><td>Eau de mer<br>Oxygène dissous 8,6 mg.L<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Potentiel de polarisation<br>{Stat.+EHD 0 mV/ECS<br>AC (1200 tr.min<sup>-1</sup>) 150 mV/ECS</td><td>Potentiel de polarisation<br>{Stat.+EHD -900 mV/ECS<br>AC (1200 tr.min<sup>-1</sup>) -350 mV/ECS</td></tr></tbody></table>
## 2. Résultats et discussion

### a) Traceur ferricyanure

➤ Régime stationnaire

Trois électrodes sont testées avec le traceur ferricyanure. Le courant limite de réduction de $Fe(CN)_6^{3-}$ en régime stationnaire est enregistré en fonction de $\sqrt{\Omega}$ à différents temps d'immersion.

La chute des courants mesurés entre 120 et 1200 tr.min⁻¹ est moins importante par rapport aux courants mesurés en eau de mer additionnée de nutriment, mais celle-ci est néanmoins réelle (fig. §4.21). Le phénomène décrit vers le 4ᵉ jour d'exposition en eau de mer additionnée d'extrait de levure est ici aussi observé. Le courant chute dès le second jour d'immersion pour retrouver une valeur avoisinant sa valeur initiale quelques jours plus tard.

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

**Figure §4.21** : Gamme des courants mesurés pour des vitesses de rotation d'échelonnant entre 120 et 1200 tr.min⁻¹ en fonction du temps d'immersion dans une eau de mer naturelle. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6 10^{-2}M$ (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$).
Les paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ sont déterminés par ajustement des données expérimentales à la loi §2.16 et tracés en fonction du temps dans la figure §4.22.

Comme dans le cas du biofilm formé en eau de mer additionnée d'extrait de levure, un courant non diffusionnel $i_0$ apparaît dès les premiers jours d'immersion. A temps égal d'exposition, le courant non diffusionnel est bien moins important dans une eau de mer naturelle par rapport à une eau additionnée de nutriment.

Le paramètre $i_\infty^{-1}$ augmente régulièrement pour atteindre une fourchette comprise entre 0,5 et $1 \times 10^{-3} \mu A^{-1}$. Ces valeurs inférieures sont à celles déterminées pour le biofilm nourri qui étaient d'environ $5 \times 10^{-3} \mu A^{-1}$ au bout de 2 semaines. L'inverse du coefficient de Levich $K^{-1}$ augmente peu lors des dix premiers jours pour augmenter plus fortement par la suite. La surface active apparente diminue au cours du développement du biofilm.

## Impédance EHD

Les diagrammes obtenus en impédance EHD avec une électrode nue permettent de vérifier la réductibilité des données par la fréquence adimensionnelle $p = \frac{\omega}{\Omega}$ (fig. §4.23).

Les courbes obtenues pour 300, 600 et $1200 \text{ tr.min}^{-1}$ pour un biofilm de 13 jours ne sont pas tout à fait réductibles par la fréquence p (fig. §4.24). La petite translation observée au jour 13 entre les courbes à différentes vitesses de rotation montre que le coefficient de diffusion du traceur ferricyanure dans la couche poreuse est très proche du coefficient dans l'eau de mer.

Sur la figure §4.25, les courbes d'impédance EHD obtenues à $1200 \text{ tr.min}^{-1}$ à différents temps d'exposition ont été rassemblées. La translation des courbes dans le temps est due à l'augmentation du temps de diffusion. Ces mesures sont cohérentes avec les résultats décrits en régime stationnaire.
<figure><img src="image_84.png" /></figure>

Figure §4.22 : $i_o$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'exposition en eau de mer naturelle. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ $10^{-2}M$ (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$). Les symboles ♦, ■ et ● distinguent 3 électrodes différentes.
<figure><img src="image_85.png" /></figure>

Figure §4.23 : Impédance EHD d'une électrode nue dans une eau de mer additionnée $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ à différentes vitesses de rotation $\Delta 300, \blacksquare 600$ et $\bigcirc 1200$ tr.min$^{-1}$. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + $K_3Fe(CN)_6/K_4Fe(CN)_6$ $10^{-2}M$ (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$).
<figure><img src="image_86.png" /></figure>

**Figure §4.24** : Impédance EHD d'une électrode d'or exposée 13 jours en eau de mer à différentes vitesses de rotation $\Delta 300, \blacksquare 600$ et $\bigcirc 1200$ tr.min$^{-1}$ comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue — aux mêmes vitesses de rotation. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + $\frac{K_3Fe(CN)_6}{K_4Fe(CN)_6}$ $10^{-2}$M (traceur $Fe(CN)_6^{3-}$).
<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>Figure §4.25 : Impédance EHD pour un biofilm développé en eau de mer au jour d'exposition △ 0, ■ 5 et ○ 13 à 1200 tr.min⁻¹. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_88.png" /></figure>

## Impédance AC

Les mesures d'impédance AC ont été réalisées à une vitesse de rotation de 1200 tr.min⁻¹ à différents temps d'exposition (fig. §4.26).

Dans les cinq premiers jours, la résistance de transfert de charge, R<sub>tc</sub>, augmente fortement alors (de 100 à 220 Ω) que la boucle correspondant à la diffusion est peu modifiée. Puis dans un second temps, entre les 5<sup>e</sup> et 20<sup>e</sup> jours, l'arc correspondant au transport de matière augmente considérablement pendant que R<sub>tc</sub> reste constant.

Entre le jour 0 et le jour 5, l'augmentation de la résistance de transfert de charge indique que la surface active de l'électrode diminue. L'effet de ce blocage partiel de la surface n'est cependant pas observé avec les mesures d'impédance EHD car il est masqué par le biofilm. Le gradient de diffusion se situe essentiellement au niveau de la solution électrolytique. Le biofilm est uniforme vis à vis du transport du traceur.

Au jour 20, la résistance de transfert de charge demeure identique. La surface active réelle reste donc constante par rapport au jour 5.

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

## Traitement des données

A partir des données en régime stationnaire, en impédances EHD et AC, il est possible de suivre l'évolution du biofilm dans le temps.

Dans l'étude concernant la gélatine et le biofilm nourri, le temps de diffusion $\frac{\delta_f^2}{D_f}$ du traceur dans le voile biologique a été évalué à partir de l'ajustement des données EHD. L'incertitude des déterminations était importante mais il a été possible de montrer que les coefficients de diffusion du ferricyanure dans la biomasse et dans la solution électrolytique sont identiques. Le biofilm obtenu en eau de mer naturelle étant plus mince, l'incertitude sur les ajustements a été augmentée. Seul un examen qualitatif des données EHD a été possible.
<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>Figure §4.26 : Impédance AC pour un biofilm développé en eau de mer au jour ○ 0, △ 5 et □ 20 à 1200 tr/min. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻).</figcaption></figure>

Celui-ci permet cependant de confirmer l'égalité du coefficient de diffusion dans et hors de la couche. Le coefficient de diffusion du ferricyanure dans le biofilm et dans la solution a été évalué à 5,5 10⁻⁶ cm².s⁻¹ (c'est-à-dire $Sc_{Fe(CN)₆}^{3⁻} = 1800$) à partir du paramètre K⁻¹.

$$D = D_f = 5,5 \ 10^{-6} \text{cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$$

En suivant la même procédure que celle décrite pour le biofilm nourri, l'évolution de l'épaisseur du biofilm dans le temps est déterminée à partir du paramètre $i_∞^{-1}$ en tenant compte de la surface active de l'électrode. Le paramètre K⁻¹ étant inversement proportionnel à S, la surface active apparente de l'électrode peut donc être évaluée au bout de 13 jours à 70-85% de sa valeur initiale (fig. §4.27).

Les résultats obtenus sont présentés dans la figure §4.28. Au bout de 13 jours, les épaisseurs atteignent des valeurs de 4 à 8 µm.
<figure><img src="image_91.png" /></figure>

**Figure §4.27** : Surface active apparente de l'électrode en fonction du temps d'exposition en eau de mer naturelle. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻). Les symboles ♦, ■ et ● distinguent 3 électrodes différentes.

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

**Figure §4.28** : Epaisseur du biofilm en fonction du temps d'exposition en eau de mer naturelle. Calculs réalisés en tenant compte de la surface active apparente de l'électrode. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer + K₃Fe(CN)₆/K₄Fe(CN)₆ 10⁻²M (traceur Fe(CN)₆³⁻). Les symboles ♦, ■ et ● distinguent 3 électrodes différentes.
b) Traceur oxygène

➤ Régime stationnaire

Trois électrodes sont testées avec le traceur oxygène. Le courant limite de réduction de l'oxygène en régime stationnaire est enregistré en fonction de la vitesse de rotation à différents temps d'immersion pour chaque électrode. Les paramètres $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ sont alors déterminés par ajustement des données expérimentales à la loi §2.16 (fig. §4.29).

Le courant non diffusionnel $i_0$ augmente légèrement dans le temps en passant d'environ 2 à 5 µA. Sur la même période, le paramètre $i_\infty^{-1}$ monte régulièrement pour atteindre des valeurs d'environ 2 × 10⁻³ µA⁻¹ et l'inverse du coefficient de Levich $K^{-1}$ reste constant montrant ainsi que la surface active apparente reste inchangée.

La sensibilité de la méthode ne permet la caractérisation que pendant 8 jours. La sensibilité de la technique est meilleure avec le traceur ferricyanure. Les électrodes testées avec le traceur ferricyanure ont pu être testées pendant 13 jours. Le biofilm formé est différent suivant l'emplacement des électrodes dans le système d'exposition. Les biomasses testées avec l'oxygène étaient placées dans la première partie de la canalisation et celles testées avec l'autre traceur étaient regroupées dans la seconde partie.

➤ Impédance EHD

Dans un premier temps, la réductibilité des données EHD suivant la fréquence adimensionnelle $p = \omega/\Omega$ a été vérifiée dans le cas d'une électrode nue (fig. §4.30).

Sur la figure §4.31, les diagrammes EHD obtenus pour une électrode immergée 13 jours montrent une réductibilité des données en fonction de $p$ qui n'est plus parfaite. Il y a un déplacement léger mais significatif vers les basses fréquences avec l'augmentation de la vitesse de rotation.
<figure><img src="image_93.png" /></figure>

Figure §4.29 : $i_0$, $i_\infty^{-1}$ et $K^{-1}$ en fonction du temps d'exposition en eau de mer naturelle. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène). Les symboles ♦, ■ et ● distinguent 3 électrodes différentes.
Ce glissement des courbes EHD est confirmé par la figure §4.32 où sont représentés les diagrammes EHD enregistrés à une vitesse de rotation de 1200 tr.min⁻¹ pour une électrode à 0, 5 et 13 jours d'exposition.

Le biofilm âgé de 13 jours montre donc un comportement de couche poreuse (fig. §4.32). Les courbes à 0 et 5 jours montrent que le temps de diffusion de l'oxygène dans la couche est pratiquement nul. La couche est donc très ténue au jour 5. Par contre, au 13ème jour, la translation de la courbe est visible. Un temps de diffusion dans la couche est observable.

## Impédance AC

Les mesures AC avec le traceur oxygène sont plus difficilement exploitables compte tenu du couplage entre la cinétique et le transport (fig. §4.33). Il est toutefois possible de noter la forte augmentation de la résistance de transport de matière et du transfert de charge au jour 13. La forte augmentation de la résistance de transport et la déformation faible des courbes est en accord avec les courbes EHD entre les jours 0 et 5.

## Traitement des données

De la même façon que pour le traceur ferricyanure, seul un examen qualitatif des données EHD est envisageable. L'équivalence des coefficients de diffusion dans et hors de la couche est néanmoins confirmée. Le coefficient de diffusion de l'oxygène dans le biofilm et dans la solution a été évalué à 1,3 10⁻⁵ cm².s⁻¹ (c'est-à-dire $ScO_2 = 750$) à partir du paramètre K⁻¹.

$$D_f = D = 1,4 \ 10^{-5} \text{cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$$

Tout comme les calculs réalisés pour le biofilm nourri, l'évolution de l'épaisseur du biofilm dans le temps est déterminée à partir du paramètre $i_\infty^{-1}$ en tenant compte de la surface active de l'électrode. Les résultats obtenus sont présentés dans la figure §4.34. Au bout de 8 jours, les épaisseurs atteignent des valeurs de 4 à 5 µm.
<figure><img src="image_94.png" /></figure>

Figure §4.30 : Impédance EHD d'une électrode nue dans une eau de mer naturelle à différentes vitesses de rotation $\Delta 300, \blacksquare 600$ et $\bigcirc 1200$ tr.min$^{-1}$. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène).
<figure><img src="image_95.png" /></figure>

Figure §4.31 : Impédance EHD d'une électrode d'or exposée 13 jours en eau de mer naturelle à différentes vitesses de rotation △300, ■ 600 et ○ 1200 tr.min⁻¹ comparée au diagramme obtenu pour une électrode nue — aux mêmes vitesses de rotation. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (traceur oxygène).
<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>Figure §4.32 : Impédance EHD pour un biofilm développé en eau de mer naturelle au jour △ 0, ○ 5 et ■ 13 jours à 1200 tr.min⁻¹. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (Traceur oxygène).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_97.png" /></figure>

Figure §4.33 : Impédance AC pour un biofilm développé en eau de mer naturelle au jour △ 0, ○ 5 ct □ 13 jours à 1200 tr.min⁻¹. Mesures réalisées dans une solution d'eau de mer (Traceur oxygène).

c) Comparaison des épaisseurs obtenues avec les deux traceurs

Les résultats obtenus avec les deux traceurs, l'oxygène et le ferricyanure, sont comparés sur la figure §4.35. A la précision des mesures près, les épaisseurs relevées sont du même ordre de grandeur. A partir des épaisseurs calculées pour les deux traceurs, il est possible de tracer l'allure générale de l'évolution de la biomasse en fonction du temps d'exposition en eau de mer.