# En quoi l'étude du microbiote peut apporter des protections à la plante?

Corinne VACHER

INRAE-Bordeaux, UMR BIOGECO/SAVE

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

RÉPUBLIQUE
FRANÇAISE

Liberté
Égalité
Fraternité

INRAE

<figure><img src="image_2.png" /></figure>
# La vigne héberge des micro-organismes

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Microscopie confocale
avec marquage
fluorescent des bactéries

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

Bactéries épiphytes à la
surface de la feuille
(phyllosphère)

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Bactéries endophytes à
l'intérieur des tissus
(endosphère)
# La vigne héberge des micro-organismes

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Bactéries à la surface (rhizosphère) et à l'intérieur des racines (endosphère)
# L'ensemble des micro-organismes forme le microbiote de la vigne

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

- Bactéries

- Levures

- Champignons filamenteux

- Oomycètes

- (Virus)
# La composition du microbiote dépend de la plante, de l'environnement et des pratiques

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

Climat et microclimat

Plante (organe, âge, greffon, porte-greffe)

Type de sol

Pratiques de gestion (parcelle, paysage)
# Seuls certains micro-organismes ont une fonction connue

* Espèces pathogènes

* Espèces antagonistes des pathogènes (rôle protecteur)

* Espèces promotrices de croissance

* Micro-organismes associés à la fabrication du vin

Fournier, Pellan *et al*. The functional microbiome of grapevine. *Advances in Ecological Research*, 2022

<figure><img src="image_10.png" /></figure>
# Comment renforcer le rôle protecteur du microbiote?

* Identifier les microorganismes qui inhibent directement les espèces pathogènes

* Identifier les microorganismes qui stimulent l'immunité de la plante

* Favoriser leur présence au vignoble par inoculation ou par conservation des réservoirs environnementaux

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Bactéries associées aux spores d'un oomycète pathogène (mildiou) à la surface d'une feuille</figcaption></figure>

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Cellule de racine colonisée par un champignon mycorhizien à arbuscule</figcaption></figure>
# Comment renforcer le rôle protecteur du microbiote?

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Augmenter la biodiversité du microbiome de manière à accroître sa résilience aux perturbations et favoriser les synergies entre microorganismes bénéfiques

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

<figure><img src="image_15.png" /></figure>
# Comment renforcer le rôle protecteur du microbiote?

* Augmenter la biodiversité du microbiome de manière à accroître sa résilience aux perturbations et favoriser les synergies entre microorganismes bénéfiques

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Insurance or redundancy</figcaption></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Complementarity</figcaption></figure>

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Synergy</figcaption></figure>

<figure><img src="image_19.png" /></figure>
# Comment renforcer le rôle protecteur du microbiote?

* Identifier et favoriser les microorganismes 'cœur' qui pilotent l'assemblage du microbiome et permettent le recrutement de micro-organismes bénéfiques

<figure><img src="image_20.png" /></figure>
# Notre approche pour identifier le microbiote protecteur

Consortias microbiens
résilients avec une
activité de biocontrôle

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# Notre approche pour identifier le microbiote protecteur

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# Notre approche pour identifier le microbiote protecteur

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<figure><img src="image_24.png" /></figure>

# Notre approche pour identifier le microbiote protecteur

## 1. Experimental design

Long-term
epidemiological records
on untreated plots

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Selection of 5 grapevine
plot pairs

Mildew susceptibility

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Spring 2022 : Sampling of
young leaves and top soil

<figure><img src="image_27.png" /></figure>
<figure><img src="image_28.png" /></figure>

Cultiver la vigne sans pesticides

# Quelques espèces fongiques sont associées aux parcelles peu sensibles

## 1. Experimental design

Long-term epidemiological records on untreated plots

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

Selection of 5 grapevine plot pairs

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Mildew susceptibility

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Spring 2022 : Sampling of young leaves and top soil

## 2.a. Metabarcoding analysis

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Analyse d'abondance différentielle MaAsLin2 pour la phyllosphère

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
# Quelques genres bactériens sont associés aux parcelles peu sensibles

## 1. Experimental design

Long-term epidemiological records on untreated plots

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Selection of 5 grapevine plot pairs

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Mildew susceptibility

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

Spring 2022 : Sampling of young leaves and top soil

## 2.a. Metabarcoding analysis

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Analyse d'abondance différentielle MaAsLin2 pour la phyllosphère

Coefficient

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
# Quelques genres bactériens sont associés aux parcelles peu sensibles

## 1. Experimental design

Long-term epidemiological records on untreated plots

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Selection of 5 grapevine plot pairs

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

Mildew susceptibility

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Spring 2022 : Sampling of young leaves and top soil

## 2.a. Metabarcoding analysis

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

A poursuivre
(endosphère, sol)

A valider
expérimentalement

Coefficient

Analyse
d'indice
antielle
sLin2
pour la
sphère

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
# Caractérisation du microbiote des tissus foliaires sains

* 3 régions

* 3 parcelles par région

* 30 feuilles par parcelle

* 1 feuille par cep

* 2 types de tissus par feuille (A, S)

<figure><img src="image_44.png" /></figure>

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

## ANALYSE DU MICROBIOME

* **Métabarcoding** ciblant l'ITS1 fongique et le 16S bactérien

* **ddPCR** pour quantifier l'abondance fongique et bactérienne totale

* **qPCR** pour quantifier le mildiou
# Caractérisation du microbiote des tissus foliaires sains

## Communauté fongique

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

AQ

CH

GHI

OC

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

A

S

<figure><img src="image_48.png" /></figure>
# Caractérisation du microbiome des tissus foliaires sains

## Communauté bactérienne

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

AQ

OC

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

A

S

<figure><img src="image_51.png" /></figure>
# Le composition du microbiote varie d'une région à l'autre

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
# Le composition du microbiote varie d'une région à l'autre

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
# Quelques espèces fongiques sont plus abondantes dans les tissus sains

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

Analyse
d'abondance
differentielle
MaAsLin2

Coefficient

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
# Quelques genres bactérien sont plus abondants dans les tissus sains

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

Analyse
d'abondance
differentielle
MaAsLin2

Thèse en cours de Paola Fournier (VITAE)
Les réseaux microbiens génèrent des hypothèses sur les types d'interaction

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

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<figure><img src="image_58.png" /></figure>

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

<table><thead><tr><th>Name</th><th>Vineyard</th><th>Interaction</th></tr></thead><tbody><tr><td>Cladosporium delicatulum</td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td>Mycosphaerella tassiana</td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td>Alternaria sp.</td><td>A</td><td>amensalism</td></tr><tr><td>Alternaria alternate</td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td>Alternaria brassicae</td><td>B</td><td>competition</td></tr><tr><td>Aureobasidium pullulans</td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td>Filobasidium chernovii</td><td>Ix2</td><td>competition</td></tr><tr><td>Filobasidium magnum</td><td>D</td><td>competition</td></tr><tr><td>Fusarium sp.</td><td>A, B, E</td><td>competition</td></tr><tr><td>Phlebia rufa</td><td>E</td><td>amensalism</td></tr><tr><td>Sporobolomyces roseus</td><td>Ix3</td><td>competition</td></tr><tr><td>Sporobolomyces pararoseus</td><td>A, G</td><td>competition</td></tr><tr><td>Vishniacozyma victoriae</td><td>B, C</td><td>amensalism, competition</td></tr><tr><td>Vishniacozyma carnescens</td><td>D</td><td>amensalism</td></tr></tbody></table>

Interaction type: amensalism commensalism competition mutualism predation
# Les réseaux microbiens génèrent des hypothèses sur les types d'interaction

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

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<figure><img src="image_67.png" /></figure>

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

<table><thead><tr><th>Name</th><th>Vineyard</th><th>Interaction</th></tr></thead><tbody><tr><td><em>Cladosporium delicatulum</em></td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td><em>Mycosphaerella tassiana</em></td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td><em>Alternaria sp.</em></td><td>A</td><td>amensalism</td></tr><tr><td><em>Alternaria alternate</em></td><td>I</td><td>competition</td></tr><tr><td><em>Alternaria brassicae</em></td><td>B</td><td>competition</td></tr></tbody></table>

carnescens

D

amensalism

Avalider experimentalement !
# Cas de l'oïdium: une analyse du pathobiome suivie d'une validation expérimentale

* 1 parcelle expérimentale

* 2 modes de gestion du sol (avec ou sans couverture)

* 3 dates

* 3 types de tissus foliaires

* 16 échantillons par tissu

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

## ANALYSE DU MYCOBIOME

* **Metarbarcoding** ciblant l'ITS fongique

* **ddPCR** pour quantifier l'abondance fongique
<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>L'inférence de réseau suggère des interactions entre l'oïdium et des levures basidiomycètes</figcaption></figure>

Réseau microbien associé aux tissus asymptomatiques, inféré avec PLN models en intégrant des covariables environnementales
# Quelques interactions entre l'oïdium et les levures basidiomycètes ont été validées in vitro

Tests de confrontation pour évaluer l'effet des levures sur la croissance de l'oïdium

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

<table><thead><tr><th rowspan="3">Yeast strain</th><th colspan="4">PREVENTIVE TREATMENT</th><th colspan="4">CURATIVE TREATMENT</th></tr><tr><th colspan="2">PELLET</th><th colspan="2">SUPERNATANT</th><th colspan="2">PELLET</th><th colspan="2">SUPERNATANT</th></tr><tr><th>En growth (in %)</th><th>p-value</th><th>En growth (in %)</th><th>p-value</th><th>En growth (in %)</th><th>p-value</th><th>En growth (in %)</th><th>p-value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Buckleyzyma aurantiaca</td><td>-1.87</td><td>0.33</td><td>2.25</td><td>0.99</td><td>-19.63</td><td>0.18</td><td>-31.25</td><td>&lt;0.001</td></tr><tr><td>Filobasium wieringae</td><td>0.5</td><td>0.98</td><td>6.38</td><td>0.8</td><td>-10.63</td><td>0.75</td><td>-1.87</td><td>1</td></tr><tr><td>Udeniomyces pyricola</td><td>-1</td><td>0.85</td><td>6</td><td>0.83</td><td>-32.5</td><td>&lt;0.001</td><td>-3.75</td><td>0.97</td></tr><tr><td>Vishniacozyma victoriae</td><td>-0.37</td><td>0.99</td><td>7.63</td><td>0.67</td><td>-10</td><td>0.79</td><td>3.88</td><td>0.97</td></tr><tr><td>Growth inhibitor (control+, BTH)</td><td>-98.62</td><td>&lt;0.001</td><td>-90.62</td><td>&lt;0.001</td><td>-85.62</td><td>&lt;0.001</td><td>-86.25</td><td>&lt;0.001</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_78.png" /></figure>

Les levures d'intérêt sont rares dans les réservoirs environnementaux ...

Espèces plus abondantes dans les tissus sains (analyse DESeq2)

<figure><img src="image_79.png" /></figure>
<figure><img src="image_80.png" /></figure>

... et ne sont pas favorisées par la couverture végétale

Espèces plus abondantes dans les tissus sains (analyse DESeq2)

<figure><img src="image_81.png" /></figure>
# La gestion du sol influence peu la composition du mycobiome foliaire

<table><thead><tr><th>Most explanatory variables</th><th>Adj. R2 (%)</th><th>Adj. p-value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Sampling date</td><td>13.9</td><td>&lt;0.001</td></tr><tr><td>+ Distance to cordons</td><td>16.0</td><td>&lt;0.001</td></tr><tr><td>+ Distance to inoculated leaves</td><td>16.7</td><td>0.42</td></tr><tr><td>+ Mean VPD since flush</td><td>17.4</td><td>0.48</td></tr><tr><td>+ Spatial position (PCNM4)</td><td>18.0</td><td>0.49</td></tr><tr><td>+ All variables</td><td>21.3</td><td></td></tr></tbody></table>

June 1

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June 23

<figure><img src="image_83.png" /></figure>

July 5

<figure><img src="image_84.png" /></figure>

CAP analysis with forward selection of variables
# Conclusions et perspectives

* Nos approches bioinformatiques et statistiques ont généré de **nouvelles hypothèses d'interactions écologiques** entre les **pathogènes** foliaires de la vigne et le **microbiote** foliaire.

* Certaines interactions écologiques, impliquant des levures basidiomycetes, ont été **validées in vitro** et pourraient jouer un rôle dans de futures solutions de **biocontrôle**.

Nous allons poursuivre et renforcer cette validation expérimentale grâce à notre **collection microbienne** de manière à élucider la structure des **réseaux microbiens** foliaires et identifier de nouveaux **antagonistes** des pathogènes et les **espèces 'cœur'** (au sens de Toju et al. 2018)
# Conclusions et perspectives

* Les levures foliaires d'intérêt ont été détectées dans d'autres **habitats microbiens**, comme l'écorce et le sol, mais elles sont relativement rares et ne semblent pas favorisées par l'enherbement.

* L'enherbement semble avoir peu d'influence sur le composition du microbiote foliaire. Selon nos résultats, ce n'est pas un **levier pour piloter le microbiote foliaire**.

* Nous allons développer des **outils moléculaires de diagnostic** pour détecter et quantifier les espèces microbiennes protectrices dans les **réservoirs de biodiversité microbienne** des paysages viticoles afin de comprendre l'origine environnementale des microorganismes protecteurs et de développer le biocontrôle microbien par **conservation**.
Culturomique
et séquençage
de génomes

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

Echantillons
foliaires

- Epidémiologie

- Ecologie évolutive

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

Inférence des
réseaux
microbiens

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

Native range of :

V. acerifolia

V. arizonica

V. aestivalis

V. berlandieri

V. cinerea

V. labrusca

V. palmata

V. riparia

V. rotundifolia

V. rupestris

V. vulpina

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

Locations where the microbiome of American and Asian *Vitis* species has been described (references below)

① Brum et al. (2012)

③ Kernaghan et al. (2017)

⑤ Fan et al. (2020)

⑦ Aleynova et al. (2022)

② Felber et al. (2016)

④ Cureau et al. (2021)

⑥ Sun et al. (2021)

<figure><img src="image_93.png" /></figure>

Native range of American and Asian *Vitis* species with known genetic resistance to North American pathogens

Fournier, Pellan *et al.*
The functional
microbiome of
grapevine. *Advances
in Ecological
Research, 2022

<figure><img src="image_94.png" /></figure>
Remerciements

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

<figure><img src="image_96.png" /></figure>

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

<figure><img src="image_99.png" /><figcaption>Charlie Pauvert, Didac Barroso-Bergadà, Paola Fournier, Aarti Jaswa, Lucile Pellan</figcaption></figure>

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>François Delmotte, Simon Labarthe, Jessica Vallance, Patrice This, David Bohan</figcaption></figure>
# Remerciements

**UMR SAVE**: François Delmotte, Jessica

Vallance, Paola Fournier, Lucile Pellan, Aarti

Jaswa, Marie-Cécile Dufour, Isabelle Demeaux, Manon Chargy, Valérie Martin, Laurent Delière, Agnès Calonnec

**UMR BIOGECO/PGTB**: Charlie Pauvert, Simon

Labarthe, Tania Fort, Erwan Guichoux, Emilie Chancerel, Marie Massot, Julie Faivre d'Arcier

**UMR Agroécologie**: David Bohan, Didac

Barroso-Bergadà

**MIA**: Julien Chiquet, Stéphane Robin, Julie

Aubert

**UMR AGAP**: Patrice This

**Cornell University**: Lance Cadle-Davidson, Erin

Galarneau

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

RÉPUBLIQUE
FRANÇAISE

Liberté
Égalité
Fraternité

anr

<figure><img src="image_106.png" /></figure>

agence nationale
de la recherche

AU SERVICE DE LA SCIENCE

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

CONSORTIUM

biocontrôle

<figure><img src="image_108.png" /></figure>

BORDEAUX
SCIENCES
AGRO

INRAO

université
de BORDEAUX

MoëtHennessy
Merci pour l'invitation et pour votre attention

<figure><img src="image_109.png" /></figure>

Corinne VACHER (corinne.vacher@inrae.fr)

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