# Activité anti-oomycète des lipopolysaccharides (LPS)-binding proteins/bactericidal/permeability-increasing proteins

Olga Baron, Jean-Marc Reichhart, Michel Ponchet, Christine Coustau

► To cite this version:

Olga Baron, Jean-Marc Reichhart, Michel Ponchet, Christine Coustau. Activité anti-oomycète des lipopolysaccharides (LPS)-binding proteins/bactericidal/permeability-increasing proteins. France, N° de brevet: WO2013120619; EP2841085; FR2986970. 2012, 37 p. hal-01607420

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Submitted on 6 Jun 2020

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(19) RÉPUBLIQUE FRANÇAISE
INSTITUT NATIONAL
DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE
PARIS

(11) N° de publication : 2 986 970
(à n'utiliser que pour les commandes de reproduction)

(21) N° d'enregistrement national : 12 00492

(51) Int Cl⁸ : A 61 K 38/17 (2013.01), A 01 K 67/027, A 01 H 5/00, A 01 N 37/18, A 01 P 3/00, A 61 P 31/10

(12) DEMANDE DE BREVET D'INVENTION

A1

(22) Date de dépôt : 17.02.12.

(30) Priorité :

(43) Date de mise à la disposition du public de la demande : 23.08.13 Bulletin 13/34.

(56) Liste des documents cités dans le rapport de recherche préliminaire : Se reporter à la fin du présent fascicule

(60) Références à d'autres documents nationaux apparentés :

(71) Demandeur(s) : INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE — FR, CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE Etablissement public — FR et UNIVERSITE DE STRASBOURG Etablissement public — FR.

(72) Inventeur(s) : BARON OLGA, REICHHART JEAN MARC, PONCHET MICHEL et COUSTAU CHRISTINE.

(73) Titulaire(s) : INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE, CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE Etablissement public, UNIVERSITE DE STRASBOURG Etablissement public.

(74) Mandataire(s) : SIMODORO IP.

(54) ACTIVITE ANTI-OOMYCETES DES LIPOPOLYSACCHARIDES (LPS)-BINDING PROTEINS/BACTERICIDAL/ PERMEABILITY-INCREASING PROTEINS.

(57) La présente invention se rapporte à l'utilisation de polypeptide de LBP/BPI pour prévenir et/ou traiter les maladies causées par les oomycètes. La présente invention se rapporte également à des compositions contenant des polypeptides de LBP/BPI pour prévenir et/ou traiter les maladies causées par les oomycètes. La présente invention se rapporte en outre à la préparation de plantes et animaux transgéniques exprimant le polypeptide de LBP/BPI de l'invention. La présente invention se rapporte enfin à une méthode de production du polypeptide de LBP/BPI de l'invention.

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# ACTIVITE ANTI-OOMYCETES DES LIPOPOLYSACCHARIDES (LPS)-BINDING PROTEINS/BACTERICIDAL/PERMEABILITY-INCREASING PROTEINS

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## DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention se rapporte à la production et à l'utilisation de LBP/BPI dans la lutte contre les oomycètes.

## ART ANTERIEUR

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Les oomycètes (Oomycota ou Oomycetes) représentent un phylum de protistes filamenteux classés parmi les Chromista et comprenant environ 600 espèces. Ce sont des organismes aquatiques ou terrestres non photosynthétiques, autrefois classés dans les champignons (d'où la terminologie -mycète), mais qui sont désormais considérés comme très différents des champignons dits « vrais » : Eumycètes (Basidiomycètes et Ascomycètes) tant sur le plan évolutif que physiologique.

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Ces organismes peuvent avoir un mode de vie saprophyte, jouant un rôle important dans le recyclage des matières en décomposition, ou bien être des parasites. Ces oomycètes sont ainsi responsables de dégâts majeurs sur de nombreuses cultures : mildiou de la vigne, mildiou de la pomme de terre, fonte de semis des graminées et cultures maraîchères, rouille blanche des crucifères, pourriture racinaire des légumineuses et des crucifères. Les pertes économiques agricoles sont ainsi estimées à plus de 3,5 milliards d'euros par an. A titre d'exemple, la seule culture de la pomme de terre en Europe (couvrant environ 2 millions d'hectares) nécessite un traitement annuel contre Phytophthora infestans d'un coût supérieur à 1,3 milliard d'euros avec, malgré ces traitements, des pertes estimées à près d'un milliard d'euros.

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Il est à noter que les dégâts causés par les oomycètes ne se limitent pas aux seules plantes puisque dans le domaine aquacole notamment, les oomycètes de l'ordre des Saprolegniales causent des dégâts majeurs dans les élevages de crustacés et de poissons. A titre d'exemple, on estime ainsi à près de 10% les pertes en écloseries de salmonidés provoquées par des oomycètes et pour la seule industrie écossaise, les oomycètes causent des pertes annuelles évaluées à plusieurs millions d'euros. Les mammifères eux-mêmes sont également menacés par ces organismes puisque les oomycètes du genre Pythium sont responsables de la pythiose, aussi appelée cancer des marais, affectant les chevaux, les chiens, les chats, le bétail ainsi que les populations humaines dans les zones tropicales et subtropicales.

A l'heure actuelle, il existe peu de traitements spécifiques contre les oomycètes qui soient efficaces. Par exemple, le métalaxyl, est souvent utilisé contre les mildious, mais des résistances apparaissent très rapidement (au cours de la première année d'utilisation) rendant cette matière active inutilisable par la suite. D'autres molécules comme des fongicides non-spécifiques à large spectre sont utilisés mais possèdent une toxicité environnementale et humaine importante. Les trois fongicides majeurs utilisés dans la lutte contre les oomycètes sont des dérivés du carbamate : Le manèbe (dont l'usage est restreint depuis la directive 2007/57/CE), le mancozèbe (hautement toxique pour la flore, la faune aquatique et les animaux) et le propamocarbe hydrochloride (forte toxicité vis-à-vis des organismes aquatiques). Du fait de leur toxicité élevée, ces dérivés du carbamate sont susceptibles d'être retirés du marché de l'Union Européenne.

Concernant plus spécifiquement le déroulement du cycle d'un oomycète phytopathogène, notamment Phytophtora, celui-ci implique au départ un stade unicellulaire dépourvu de paroi, nommé zoospore, qui est responsable de la propagation épidémique de la maladie au champ. Les zoospores, produites par les sporanges, sont équipées de flagelles, ce qui leur permet de se déplacer dans l'eau ou dans des films d'eau à la surface des plantes afin de contaminer les plantes alentour. Puis, il se produit un enkystement d'une zoospore à la surface d'une plante, en général à proximité des stomates de la plante mais également au niveau des feuilles, des racines, des tiges, des graines ou encore des tubercules. Ensuite, il y a germination des zoospores et pénétration
dans le tissu de l'hôte végétal. Ce cycle peut impliquer une dynamique des populations de zoospores qui, après enkystement, s'organisent en microcolonies puis forment des biofilms à la surface des plantes. Toutes les espèces d'oomycètes présentent ce stade mobile (zoospore), qui est la forme infectieuse par excellence des espèces pathogènes. Cette forme libre et mobile n'existe pas chez les champignons (Eumycètes) et elle représente donc une cible spécifique et d'importance majeure si l'on veut lutter contre les maladies à Oomycètes. A ces différences de biologie du développement s'ajoutent des différences biochimiques importantes. En particulier, la paroi des oomycètes est constituée essentiellement de cellulose et ne contient pas, ou très peu, de chitine et de β-1-3 glucanes. De plus, leurs membranes sont dépourvues de stérols que la plupart des Oomycètes sont incapables de synthétiser. A l'inverse, les champignons possèdent des parois très riches en chitine et glucane, et leurs membranes contiennent des stérols (majoritairement l'ergostérol). Ces constituants, typiques des champignons, sont la cible de nombreux fongicides, ce qui explique leur inefficacité phytosanitaire sur Oomycètes.

Il existe donc un besoin crucial de bénéficier d'un agent de lutte contre les oomycètes qui soit spécifique et non toxique.

## SOMMAIRE DE L'INVENTION

Les protéines LBP/BPI (LPS-binding protein/Bactericidal Permeability-Increasing Protein) sont connues pour interagir avec le lipide A du LPS des bactéries, et présenter une activité bactéricide. Les inventeurs ont d'ailleurs mis en évidence qu'une protéine LBP/BPI recombinante de mollusque présente aussi cette capacité de liaison au lipide A et une faible activité bactéricide.

De façon surprenante, les inventeurs ont maintenant mis en évidence que ces mêmes protéines LBP/BPI natives, mais aussi recombinantes, induisent la mort rapide des zoospores d'oomycètes (la forme principale de dissémination épidémique) et notamment de *Phytophthora parasitica* (pathogène de nombreuses plantes). Ce résultat est d'autant plus surprenant que les oomycètes ne possédant pas de lipide A, rien ne laissait présager
d'une quelconque interaction avec les protéines LBP/BPI et donc d'une activité biocide des LBP/BPI sur les oomycètes.

En conséquence, un premier objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique pour prévenir et/ou traiter des maladies causées par les oomycètes, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein », leurs dérivés et leurs fragments.

Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein », leurs dérivés et leurs fragments comme agent phytosanitaire anti-oomycète,

Un autre objet de l'invention concerne une plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Une méthode de préparation de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments et comprenant les étapes de :

a) Transformation d'au moins une de ladite plante avec un vecteur comprenant le polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci;

b) Sélection d'au moins une cellule de plante transformée qui exprime ledit polypeptide; et

c) Générer une plante transgénique à partir de ladite cellule de plante transformée sélectionnée à l'étape b).
Un autre objet de l'invention concerne un animal transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de l'animal transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

## DESCRIPTION DES FIGURES

**Figures 1** : Courbes représentant l'effet de la rBgLBP/BPI (**figure 1a**), de la hBPI (**figure 1b**) et de la BSA (**figure 1c**) sur la viabilité des zoospores de *Phytophthora parasitica*. Les concentrations de protéines sont indiquées sur la figure. La viabilité est exprimée en pourcentage de zoospores vivantes.

**Figures 2** : Histogrammes représentant l'effet de la rBgLBP/BPI (**figure 2a**), de la hBPI (**figure 2b**) et de la BSA (**figure 2c**) sur la viabilité des zoospores de *Saprolegnia parasitica*, et *S.diclina*. Les concentrations de protéines sont indiquées sur la figure. La viabilité est exprimée en pourcentage de zoospores vivantes.

## DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Un premier objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique pour prévenir et/ou traiter des maladies causées par les oomycètes, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments.

Le terme « LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein » ou « protéine LBP/BPI », fait référence, au sens de la présente invention, à une protéine impliquée dans la défense des organismes contre les infections par des bactéries à gram
négatif. Les protéines LBP/BPI sont une famille de protéines présentant deux domaines LBP/BPI/CETP. Les domaines LBP/BPI/CETP, N-terminal et C-terminal sont identifiés dans les bases de données du Sanger Institute et du « European Bioinformatic Institute » (EMBL-EBI) avec les références pfam PF01273 et InterPro IPR001124, respectivement. La classification des domaines, tels que cités précédemment, est très caractéristique et utilisée en routine pour l'annotation des protéines. Ces domaines déterminent des fonctions pour les protéines qui les portent.

Ce sont des protéines qui ont une forte affinité avec les lipopolysaccharides des bactéries gram négatif ce qui leur permet de s'y lier.

L'homme du métier sera à même d'identifier simplement les LBP/BPI, notamment des LBP/BPI d'animal.

La LBP/BPI peut ainsi être une protéine de vertébrés ou d'invertébrés. A titre d'exemple de telles LBP/BPI issues d'invertébrés, on peut citer celles décrites chez les mollusques *Crassostrea gigas* (Numéro d'accession ACQ72939 et ADN05759), *Euprymna scolopes* (Numéro d'accession AEL03862, AEL03861 et AEL03860), *Chlamys farreri* (Numéro d'accession ACS72242) ou encore chez *Biomphalaria glabrata*, de séquence SEQ ID N°1, dont la séquence nucléique est SEQ ID N°2.

A titre d'exemple de telles LBP/BPI issues de vertébrés, on peut citer celles décrites chez les mammifères tels que la souris (Numéro d'accession Q67E05.1), la vache (Numéro d'accession P17453.2), le lapin (Numéro d'accession Q28739.1), le rat (Numéro d'accession Q6AXU0.1) ; chez les gallinacés, on peut citer celle de la poule (Numéro d'accession BX930367.2) ; chez les oiseaux, on peut citer celle issue du diamant mandarin (*Taeniopygia guttata*: Numéro d'accession XP002192404.1), chez le poisson , on peut citer celles issues du poisson chat (*Ictalurus punctatus*: Numéro d'accession AAX20011.1), de la morue (*Gadus morhua*: Numéro d'accession AAM52335.1, AAM52336.1), de la carpe (*Cyprinus carpio*: Numéro d'accession BAC56095.1), de la truite (*Oncorhynchus mykiss*: Numéro d'accession NP001118057.1, NP001117670.1), et du tetraodon (*Tetraodon nigroviridis* Numéro d'accession CAF96904.1, CAG03233.1) ; chez les
amphibiens, on peut citer celle du xenope (Xenopus laevis: Numéro d'accession NP001089628.1, NP 001086208.1).

On entend par « dérivé », on entend un polypeptide dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, par exemple d'au moins 85%, de préférence d'au moins 90%, et de manière particulièrement préférée d'au moins 95% avec la séquence polypeptidique d'une protéine de LBP/BPI.

Un tel dérivé peut être d'origine naturelle, tel qu'un variant issu d'une variation allélique préexistant à l'état sauvage. Un tel dérivé peut être également une séquence polypeptidique non préexistante naturellement et obtenue, par exemple, par des techniques de mutagenèse ou de synthèse nucléotidique. De préférence, un tel dérivé est obtenu à l'issue d'une étape de mutagénèse ou de synthèse.

Par "pourcentage d'identité entre deux séquences polypeptidiques", on entend le pourcentage d'acides aminés identiques, entre deux séquences devant être comparées, obtenu avec le meilleur alignement possible desdites séquences. Ce pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences sont réparties aléatoirement sur toute la longueur des séquences d'acides aminés.

Par "meilleur alignement possible ou alignement optimal", on entend l'alignement permettant d'obtenir le pourcentage d'identité le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont habituellement réalisées en comparant lesdites séquences après que celles-ci aient été alignées selon le meilleur alignement possible ; la comparaison est alors réalisée sur des segments de comparaison de façon à identifier et comparer des régions de similarité.

Le meilleur alignement possible pour effectuer une comparaison peut être réalisé en utilisant l'algorithm e d'homologie globale développé par Smith et Waterman (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), en utilisant l'algorithme d'homologie locale développé par Neddleman et Wunsch (J. Mol. Biol., vol.48, p:443, 1970), en utilisant la méthode de similarité développé par Pearson et Lipman (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988), en utilisant des programmes d'ordinateur basés sur de tels algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,
Madison, WI USA), en utilisant les algorithmes d'alignement multiples MUSCLE (Edgar, Robert C., Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004). Pour obtenir le meilleur alignement possible, on utilisera de préférence le programme BLAST avec la matrice BLOSUM 62 ou la matrice PAM 30. Le pourcentage d'identité est déterminé en comparant les deux séquences alignées de façon optimale, lesdites séquences pourront comprendre des additions ou des délétions au regard de la séquence de référence de sorte d'obtenir le meilleur alignement possible entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques entre les deux séquences, en divisant le nombre obtenu par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par fragment de protéine LBP/BPI, on entend un polypeptide d'au moins 25 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 50 ou 100 ou 150 acides aminés, de préférence d'au moins 200 acides aminés, à titre d'exemple d'au moins 250 ou 350 acides aminés, et de manière particulièrement préférée un polypeptide d'au moins 400 acides aminés.

Les termes "acide aminé" et "acides aminés" au sens de la présente invention correspondent à tout acide aminé présent naturellement ou à leurs résidus. Les acides aminés peuvent être identifiés soit par leur abréviation à une seule lettre, soit par leur abréviation à trois lettres. (Asp D acide aspartique ; Ile I isoleucine ; Thr T threonine ; Leu L leucine ; Ser S serine ; Tyr Y tyrosine ; Glu E acide glutamique ; Phe F phenylalanine ; Pro P proline ; His H histidine ; Gly G glycine ; Lys K lysine ; Ala A alanine ; Arg R arginine ; Cys C cysteine ; Trp W tryptophane ; Val V valine ; Gln Q glutamine ; Met M methionine ; Asn N asparagine). Selon la présente invention, les acides aminés naturels peuvent être remplacés par des acides aminés chimiquement modifiés.

De préférence, ledit polypeptide est un polypeptide isolé.

Le terme "isolé" au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polypeptide présent à l'état naturel dans une
plante n'est pas isolé. Le même polypeptide séparé des autres polypeptides adjacents au sein de la cellule dans laquelle il est naturellement présent est isolé.

On entend par « agent anti-oomycète », un composé capable de prévenir et/ou traiter les maladies causées par des oomycètes.

Par « maladies causées par des oomycètes », on entend, au sens de la présente invention, les troubles, désordres, causées par un individu, quelque soit son stade de développement, appartenant au phylum des oomycètes et parasitant un hôte quelque soit son stade de développement. Les hôtes peuvent être végétaux ou animaux, aquatiques ou terrestres. Les maladies causées par des oomycètes peuvent conduire, ou non, à la mort de l'organisme hôte touché. Chez les plantes, les maladies sont de deux types :

- maladies affectant seulement ou principalement les parties aériennes de la plante telles que les feuilles, les tiges et les fruits ;

- les maladies affectant les parties de la plante en contact avec le sol telles que les racines, les tubercules, la partie base de la tige, les graines et les fruits touchant le sol.

A titre d'exemple, les maladies causées par les oomycètes sur les parties aériennes des plantes peuvent être le mildiou de la tomate, de la pomme de terre ou de la vigne, la rouille blanche des crucifères, etc. Les maladies causées par les oomycètes sur les parties en contact avec le sol sont par exemple : la pourriture racinaire du pois, du haricot ou du radis, la stèle rouge du fraisier, la pourriture du collet et des fruits chez les cucurbitacées et les solanacées.

Dans le cas d'hôtes aquatiques, les oomycètes sont responsables d'épizooties. Par exemple, les poissons peuvent être victimes de saprolégniose, aussi appelée « la maladie de la mousse » des poissons à cause de l'aspect mousseux que prennent les poissons quand ils sont recouverts de mycelium.

Chez les mammifères, tels que les équidés, les bovidés, les canidés ou encore les hommes, la principale maladie causée par les oomycètes est la pythiose, aussi appelée « cancer du marais ».
Au sens de la présente invention, les termes « prévenir » et « prévention » signifient éviter l'apparition d'une maladie, d'un trouble ou d'un ou plusieurs signes et/ou symptômes d'une maladie et/ou d'un trouble.

Au sens de la présente invention, les termes « traiter » et « traitement » signifient éliminer, améliorer, les symptômes d'un trouble et/ou d'une maladie et permettre la régression de ce trouble et/ou de cette maladie.

La composition de l'invention contient en outre un ou plusieurs excipients acceptables selon la destination de la composition, à savoir composition phytosanitaire, dans le cas où la maladie causée par les oomycètes touche les plantes ; composition à usage aquacole, dans le cas où la maladie causée par les oomycètes touche des poissons et les crustacés ; et composition à usage en médecine humaine et vétérinaire.

Un excipient a pour but de modifier au moins une propriété physicochimique de la composition choisie dans la groupe comprenant la stabilité, le pH, le pKa, la densité, la solubilité, la viscosité, la coloration, le coefficient de partage eau/octanol, ou encore des propriétés olfactives ou gustatives. Un homme du métier et capable, au regard de ses connaissances de déterminer un ou plusieurs excipients acceptables.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que les protéines LBP/BPI sont des protéines d'animaux choisis parmi les vertébrés et les invertébrés.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine LBP/BPI est une protéine de mollusques, de préférence la protéine LBP/BPI de *Biomphalaria glabrata*.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine LBP/BPI est une protéine de mammifères, de préférence la protéine LBP/BPI d'*Homo sapiens*.

Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique de l'invention est caractérisée en ce qu'elle est utilisée en médecine humaine.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition pharmaceutique de l'invention est caractérisée en ce qu'elle est utilisée en médecine vétérinaire.

De manière préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention vise les espèces d'oomycètes touchant les poissons et crustacés appartenant au genre *Saprolegnia*.

De manière encore préférée, les espèces d'oomycètes touchant les poissons et les crustacés sont *Saprolegnia parasitica*, *Saprolegnia ferax* et *Saprolegnia diclina*.

Les oomycètes peuvent parasiter de nombreuses espèces de poissons et crustacés, notamment les poissons comme les saumons, et les crustacés comme les crevettes, les crabes, les bernard l'ermite, le homard ou encore les écrevisses.

De manière préférée, les maladies induites par les espèces d'oomycètes touchant les mammifères appartiennent au genre *Pythium*.

De manière encore préférée, l'espèce oomycète touchant les mammifères est l'espèce *Pythium insidiosum*.

Un autre objet de l'invention concerne une utilisation d'un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments comme agent phytosanitaire anti-oomycète.

De manière préférée, les espèces oomycètes touchant les plantes sont les espèces phytophages, appartenant aux genres *Phytophthora*, *Pythium*, *Plasmospora*, *Aphanomyces* ou encore *Hyaloperonospora*.

De manière encore préférée, l'espèce oomycète touchant les plantes appartient au genre *Phytophthora* et plus particulièrement il s'agit de *Phytophthora parasitica*.

Les espèces de plantes susceptibles d'être touchées par les espèces oomycètes citées ci-dessus appartiennent par exemple à la famille des *Solanaceae*, parmi laquelle les genres *Solanum* - e.g. *Solanum tuberosum*, *Solanum lycopersicum*, *Solanum melongena*,
etc-, Capsicum- e.g. Capsicum annuum, etc-, Nicotiana- e.g. Nicotiana tabacum, etc., Physalis- e.g. Physalis alkekengi, etc.; Lycopersicum- e.g. Lycopersicum: esculentum etc.; des Brassicaceae, parmi laquelle les genres Arabidopsis- e.g. Arabidopsis thaliana-, Brassica- e.g. Brassica oleracea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica negra, etc., Eruca-e.g. Eruca sativa, etc., Raphanus- e.g. Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Raphanus caudatus, etc.; Vitaceae parmi laquelle les genres Ampelopsis- e.g. Ampelopsis aconitifolia, Ampelopsis brevipedunculata, Ampelopsis vitifolia, etc., Cissus- e.g. Cissus antartica, Cissus rhombifolia, Cissus verticillata, etc., Parthenocissus- e.g. Parthenocissus quinquefolia, parthenocissus tricuspidata, etc., Vitis- e.g. Vitis acerifolia, Vitis coignetiae, Vitis labrusca, Vitis vinifera, etc.; des Poaceae parmi laquelle les espèces Saccharum, Sorghum, Hordeum e.g. Hordeum murinum, Hordeum vulgare etc., Avena e.g. Avena sativa etc., Secale- e.g. Secale cereale, etc., Triticum- e.g. Triticum turgidum, Triticum aestivum, Triticum monoccocum, Triticum durum, Triticum dicoccon, etc., Oryza- e.g. Oryza sativa, Oryza glaberrima, etc., Zea mays, etc.; des Cucurbitaceae parmi laquelle les genres Cucumis- e.g. Cucumis melo, Cucumis sativus, etc., Citrullus- e.g. Citrullus lanatus, etc., Cucurbita- e.g. Cucurbita pepo, Cucurbita maxima, etc.; des Fabaceae parmi lesquelles Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Trifolium sp. etc.; des Chenopodiaceae parmi lesquelles Beta vulgaris ou Spinacia oleracea etc.; ou encore des Rutaceae parmi lesquelles le genre Citrus e.g. Citrus sinensis etc., des Rosaceae parmi lesquelles le genre Malus e.g. Malus domestic etc.; des Fagaceae parmi lesquelles le genre Quercus e.g. Quercus robur etc., le genre Castanea e.g. Castanea sativa etc.; des Betulaceae parmi lesquelles le genre Alnus e.g. Alnus glutinosa etc.; des Malavaceae parmi lesquelles le genre Theobroma e.g. Theobroma cacao etc.; des Euphorbiaceae parmi lesquelles le genre Hevea e.g. Hevea brasilensi etc.; des Arecaceae parmi lesquelles le genre Elaeis e.g. Elaeis oleifera etc.

Selon un mode de réalisation préféré, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que les protéines LBP/BPI sont telles que définies dans la présente invention.
Pour les besoins de la présente invention, un polynucléotide isolé comprend une séquence codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention, ou des variants ou fragments de celui-ci.

Par "polynucléotide", on entend, au sens de la présente invention, une chaine nucléotidique simple brin ou son complémentaire ou une chaine nucléotidique double brin pouvant être de type ADN ou ARN. De préférence, les polynucléotides de l'invention sont de type ADN, notamment d'ADN double brin.

Le terme "séquence d'acide nucléique" se réfère à une séquence d'ADN (par exemple un ADNc (ADN complémentaire) ou de l'ADN génomique ou synthétique) ou à une séquence d'ARN (par exemple un ARN messager ou encore de l'ARN synthétique), aussi bien qu'à des analogues d'ADN ou ARN contenant des analogues de nucléotides non naturels, des liens internucléotidiques non naturels ou encore les deux. De manière préférée, ladite séquence nucléotidique est une séquence ADN. Les séquences nucléotidiques peuvent présenter toute conformation topologique, telle que linéaire ou circulaire.

Aux fins de la présente description, l'expression "séquence d'acide nucléique" peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression "séquence d'acide nucléique" englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.

Le terme "nucléotide" désigne à la fois les nucléotides naturels (Adénine : A, Thymine : T, Guanine : G, Cytosine : C) ainsi que des nucléotides modifiés qui comprennent au moins une modification telle que (i) un analogue d'une purine, (ii) un analogue d'une pyrimidine, ou (iii) un sucre analogue, de tels nucléotides modifiés étant décrits par exemple dans la demande PCT N° WO 95/04064.

Selon l'invention, un vecteur comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention.
Ledit vecteur peut être un vecteur de clonage ou un vecteur d'expression, préférentiellement un vecteur d'expression et peut être sous la forme d'un plasmide, d'un cosmide, d'un phagemide, d'une particule virale ou encore d'un phage.

De tels vecteurs peuvent être des plasmides bactériens, des phages à ADN, des plasmides de levures, des vecteurs dérivés de plasmides et de phages à ADN, de l'ADN viral. Un homme du métier, au regard de ses connaissances est capable de déterminer un vecteur approprié à la situation de la présente invention.

La séquence nucléotidique, préférentiellement la séquence d'ADN, dans le vecteur d'expression est liée de manière opérationnelle à un promoteur pour diriger la synthèse d'ARN. A titre d'exemple, les promoteurs peuvent être des promoteurs eucaryotes ou procaryotes tels que CMV immediate early, HSV thymidine kinase, early and late SV40, LTRs de retrovirus et métallothionéine-I de souris. Le vecteur d'expression comporte également un site de fixation de ribosome pour l'initiation de la traduction et un vecteur de transcription. Le vecteur devrait également comporter des séquences d'amplification de l'expression.

De plus, le vecteur d'expression comporte un ou plusieurs gènes marqueurs pour conférer un trait phénotypique pour la sélection des cellules hôtes transformées.

Le vecteur de l'invention contenant la séquence nucléotidique d'intérêt telle que décrite dans la présente invention, ainsi qu'un promoteur approprié devrait être employé pour transformer un hôte pour permettre à cet hôte d'exprimer un polypeptide de LBP/BPI tel que décrit dans la présente invention.

De manière préférée, le vecteur d'expression utilisé est pPIC9 de *Pichia pastoris*.

Selon l'invention, une cellule hôte transformée comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention ou le vecteur contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention.

Les termes « cellule hôte transformée », « transformé » et « transformation » au sens de la présente invention font référence à l'introduction d'ADN dans une cellule. La cellule est appelée « cellule hôte » et peut être une cellule procaryote ou une cellule
eucaryote. Les cellules procaryotes typiques incluent différentes souches d'E.coli. Les cellules eucaryotes typiques sont les cellules de plantes, de levures, d'insectes ou d'animaux. Un homme du métier, au regard de ses connaissances est capable de déterminer une cellule hôte adaptée à la présente invention.

La cellule hôte transformée selon l'invention est eucaryote ou procaryote. L'introduction d'un polynucléotide ou d'un vecteur tel que décrit dans la présente invention dans la cellule hôte peut être effectuée par des méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par DEAE-Dextran ou encore l'électroporation.

De manière préférée, la cellule hôte transformée selon l'invention est une cellule procaryote choisie dans le groupe consistant en les eubactéries, les archaebactéries et les cyanobactéries.

Préférentiellement, la cellule hôte transformée selon la présente invention est une cellule procaryote d'E.coli.

Les cellules hôtes peuvent aussi être utilisées comme cellules hôtes pour les étapes initiales de clonage de la présente invention. Ils sont particulièrement utiles pour permettre une production rapide de grandes quantités d'ADN, pour la production de matrices d'ADN simple brin utilisés pour la mutagénèse dirigée, pour le screening de plusieurs mutants simultanément et pour le séquençage des mutants générés. Les cellules hôtes procaryotes adaptées incluent E. coli K12 souche 94 (ATCC No. 31,446), E. coli souche W3110 (ATCC No. 27,325) E. coli X1776 (ATCC No. 31,537), and E. coli B; Néanmoins, de nombreuses autres souches of E.coli peuvent être utilisées telles que HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 et de nombreuses autres espèces et genres de procaryotes peuvent être utilisés tels que les bacilles comme *Bacillus subtilis*, d'autres *Enterobacteriaceae* telle que *Salmonella typhimurium* ou *Serratia marcesans* et différentes espèces de *Pseudomonas* peuvent aussi être utilisées.

De manière encore préférée, la cellule hôte transformée selon l'invention est une cellule eucaryote choisie dans le groupe consistant en les cellules animales, fongiques, de levure et de plantes.
Préférentiellement, la cellule eucaryote est un microorganisme fongique, plus particulièrement une levure.

Une liste non exhaustive de microorganismes adaptés inclut : une espèce appartenant au genre *Saccharomyces* -e.g. *S. cerevisiae*, *S. bayanus*, *S. pastorianus*, *S. paradoxus*, *S. exiguous*, *S. servazzi*, *S. uvarum*, *S. kluyveri*, et *S. castellii* ; une espèce appartenant au genre *Kluyveromyces* -e.g. *K. lactis*, *K. marxianus* var. *marxianus*, *K. thermotolorens*, *K. waltii*, *K. delphensis*, *K. nonfermentas*, et *K. wickerhamii* ; une espèce appartenant au genre *Candida* -e.g. *C. utilis*, *C. tropicalis*, *C. castellii*, et *C. humilis* ; une espèce appartenant au genre *Zygosaccharomyces* -e.g. *Z. rouxii*, *Z. bailii*, *Z. fermentati*, *Z. bisporus*, et *Z. florentinus* ; une espèce appartenant au genre *Pichia* -e.g. *P. stipidis*, *P. pastoris*, *P. sorbithophila*, et *P. anomala* ; ou d'autres espèces telles que *Hansenula polymorpha*, *Yarrowia lipolytica*, *Debaromyces hansenii*, *Schizosaccharomyces pombe*, *Torulaspora delbueckii*, *Ashbya gossipie*, *Aspergillus niger*, *Aspergillus awamori*, *Aspergillus oryzae*, *Aspergillus nidulans*, *Penecillium chrysogenum*, *Rhizopus oryzae*, et *Mucor circenelloides*.

De manière encore préférée, la cellule eucaryote est une levure et le microorganisme est *Pichia pastoris*.

Autrement, la cellule eucaryote est une cellule de plante, de manière préférée sélectionnée dans le groupe comprenant par exemple les familles des *Solanaceae*, parmi laquelle les genres *Solanum* -e.g. *Solanum tuberosum*, *Solanum lycopersicum*, *Solanum melongena*, etc., *Capsicum* -e.g. *Capsicum annuum*, etc., *Nicotiana* -e.g. *Nicotiana tabacum*, etc., *Physalis* -e.g. *Physalis alkekengi*, etc. ; *Lycopersicum* -e.g. *Lycopersicum*: *esculentum* etc. ; des *Brassicaceae*, parmi laquelle les genres *Arabidopsis* -e.g. *Arabidopsis thaliana*-, *Brassica* -e.g. *Brassica oleracea*, *Brassica napus*, *Brassica rapa*, *Brassica negra*, etc., *Eruca* -e.g. *Eruca sativa*, etc., *Raphanus* -e.g. *Raphanus raphanistrum*, *Raphanus sativus*, *Raphanus caudatus*, etc. ; *Vitaceae* parmi laquelle les genres *Ampelopsis* -e.g. *Ampelopsis aconitifolia*, *Ampelopsis brevipedunculata*, *Ampelopsis vitifolia*, etc., *Cissus* -e.g. *Cissus antartica*, *Cissus rhombifolia*, *Cissus verticillata*, etc., *Parthenocissus* -e.g. *Parthenocissus quinquefolia*, *parthenocissus tricuspidata*, etc., *Vitis* -e.g. *Vitis acerifolia*, *Vitis coignetiae*, *Vitis labrusca*, *Vitis vinifera*, etc. ; des *Poaceae* parmi laquelle les espèces
Saccharum, Sorghum, Hordeum e.g. Hordeum murinum, Hordeum vulgare etc-, Avena e.g. Avena sativa etc- Secale- e.g. Secale cereale, etc- Triticum- e.g. Triticum turgidum, Triticum aestivum, Triticum monoccocum, Triticum durum, Triticum dicoccon, etc-, Oryza- e.g. Oryza sativa, Oryza glaberrima, etc-, Zea mays, etc- ; des Cucurbitaceae parmi laquelle les genres Cucumis- e.g. Cucumis melo, Cucumis sativus, etc-, Citrullus- e.g. Citrullus lanatus, etc-, Cucurbita- e.g. Cucurbita pepo, Cucurbita maxima, etc- ; des Fabaceae parmi lesquelles Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Trifolium sp. etc- ; des Chenopodiaceae parmi lesquelles Beta vulgaris ou Spinacia oleracea etc- ; ou encore des Rutaceae parmi lesquelles le genre Citrus e.g. Citrus sinensis etc-, des Rosaceae parmi lesquelles le genre Malus e.g. Quercus domestic etc- ; des Fagaceae parmi lesquelles le genre Quercus e.g. Quercus robur etc-, le genre Castanea e.g. Castanea sativa etc ; des Betulaceae parmi lesquelles le genre Alnus e.g. Alnus glutinosa etc- ; des Malavaceae parmi lesquelles le genre Theobroma e.g. Theobroma cacao etc- ; des Euphorbiaceae parmi lesquelles le genre Hevea e.g. Hevea brasilensi etc- ; des Arecaceae parmi lesquelles le genre Elaeis e.g. Elaeis oleifera etc-.

Par "cellule de plante", on entend, au sens de la présente invention, les protoplastes, les gamètes produisant des cellules et les cellules régénérant des plantes complètes. Le terme "cellule de plante" fait également référence, sans limitations, aux cellules obtenues ou isolées de : graines, cultures en suspension, embryons, méristèmes, feuilles, racines, pousses, gamétophytes, sporophytes, pollen et microspores. Une "cellule de plante" peut faire référence à une seule cellule ou une population de cellules. Une population de cellules de plantes peut être pure, c'est-à-dire composée d'un seul type de cellule, ou bien composée de différents types de cellules. Une cellule de plante au sens de la présente invention peut être isolée ou comprise dans un tissu de plante, un organe de plante ou une plante quelque soit son stade de développement

Pour les besoins de la présente invention, une bactérie transgénique comprend un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention ou le vecteur contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention.

La transformation de cellules de plantes cultivées est normalement effectuée par l'intermédiaire de *Agrobacterium tumefaciens* Ainsi, la plante transgénique peut être
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obtenue, par exemple, en transférant le vecteur de la présente invention et un gène marqueur (par exemple le gène de résistance à la kanamycine) dans *Agrobacterium tumefaciens* contenant un plasmide helper -Ti comme décrit dans HOECKEMA et al. (*Nature*, 303:179-181, 1983) et en cultivant les cellules de *Agrobacterium tumefaciens* avec des morceaux de feuilles ou d'un autre tissu de la plante à transformer, tel que décrit par AN et al. (*Plant Physiology*, 81:301-305, 1986). Néanmoins, d'autres méthodes pour introduire l'ADN dans les cellules peuvent être utilisées telles que le Polybrène (Kawai and Nishizawa, Mol. Cell. Biol., 4:1172 [1984]), la fusion de protoplastes (Schaffner, Proc. Natal. Acad. Sci. USA, 77:2163 [1980]), l'électroporation (Neumannet al., EMBOJ., 1:841 [1982]), et la microinjection directe dans les noyaux des cellules (Capecchi, Cell, 22:479 [1980]).

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Les cals de plantes transformées peuvent être sélectionnées grâce à un marqueur de sélection en cultivant les cellules dans un milieu contenant par exemple de la kanamycine et une quantité suffisante de phytohormone telles que l'acide naphtalène acétique et la benzyladénine. Les cellules de plantes peuvent ensuite être régénérées et les plantes en résultant transférées dans la terre en utilisant des techniques bien connues de l'homme du métier.

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Un autre objet de l'invention concerne une plante transgénique contenant un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention.

De manière préférée, la plante transgénique de l'invention a intégré dans son génome le polynucléotide ou le vecteur tels que décrits dans l'invention.

De manière encore préférée, la plante transgénique de l'invention est résistante aux oomycètes.

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Par exemple, ladite plante transgénique peut être choisie dans le groupe comprenant par exemple la famille des *Solanaceae*, parmi laquelle les genres *Solanum* e.g. *Solanum tuberosum*, *Solanum lycopersicum*, *Solanum melongena*, etc-, *Capsicum* e.g. *Capsicum annuum*, etc-, *Nicotiana* e.g. *Nicotiana tabacum*, etc-, *Physalis* e.g. *Physalis*
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alkekengi, etc-; Lycopersicum- e.g. Lycopersicum: esculentum etc-; des Brassicaceae, parmi laquelle les genres Arabidopsis- e.g. Arabidopsis thaliana-, Brassica- e.g. Brassica oleracea, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica negra, etc-, Eruca- e.g. Eruca sativa, etc-, Raphanus- e.g. Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Raphanus caudatus, etc-; Vitaceae parmi laquelle les genres Ampelopsis- e.g. Ampelopsis aconitifolia, Ampelopsis brevipedunculata, Ampelopsis vitifolia, etc-, Cissus- e.g. Cissus antartica, Cissus rhombifolia, Cissus verticillata, etc-, Parthenocissus- e.g. Parthenocissus quinquefolia, parthenocissus tricuspidata, etc-, Vitis- e.g. Vitis acerifolia, Vitis coignetiae, Vitis labrusca, Vitis vinifera, etc-; des Poaceae parmi laquelle les espèces Saccharum, Sorghum, Hordeum e.g. Hordeum murinum, Hordeum vulgare etc-, Avena e.g. Avena sativa etc-; Secale- e.g. Secale cereale, etc-; Triticum- e.g. Triticum turgidum, Triticum aestivum, Triticum monoccocum, Triticum durum, Triticum dicoccon, etc-, Oryza- e.g. Oryza sativa, Oryza glaberrima, etc-, Zea mays, etc-; des Cucurbitaceae parmi laquelle les genres Cucumis- e.g. Cucumis melo, Cucumis sativus, etc-, Citrullus- e.g. Citrullus lanatus, etc-, Cucurbita- e.g. Cucurbita pepo, Cucurbita maxima, etc-; des Fabaceae parmi lesquelles Pisum sativum, Phaseolus vulgaris, Trifolium sp. etc-; des Chenopodiaceae parmi lesquelles Beta vulgaris ou Spinacia oleracea etc-; ou encore des Rutaceae parmi lesquelles le genre Citrus e.g. Citrus sinensis etc-, des Rosaceae parmi lesquelles le genre Malus e.g. Malus domestic etc-; des Fagaceae parmi lesquelles le genre Quercus e.g. Quercus robur etc-, le genre Castanea e.g. Castanea sativa etc; des Betulaceae parmi lesquelles le genre Alnus e.g. Alnus glutinosa etc-; des Malavaceae parmi lesquelles le genre Theobroma e.g. Theobroma cacao etc-; des Euphorbiaceae parmi lesquelles le genre Hevea e.g. Hevea brasilensi etc-; des Arecaceae parmi lesquelles le genre Elaeis e.g. Elaeis oleifera etc-

Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci.

La descendance peut être sous la forme d'une graine ou d'une plante.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de préparation de la plante transgénique exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci et comprenant les étapes de :

a) Transformation d'au moins une de ladite plante avec un vecteur comprenant le polynucléotide codant pour un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, les dérivés et les fragments de celles-ci ;

b) Sélection d'au moins une cellule de plante transformée qui exprime ledit polypeptide; et

c) Générer une plante transgénique à partir de ladite cellule de plante transformée sélectionnée à l'étape b).

L'étape a) de transformation peut être réalisée par des méthodes bien connues telles que décrites précédemment comme l'électroporation, la transfection, la génération de protoplastes, le transfert direct d'ADN dans le pollen, l'embryon ou les cellules pluripotentes, la transformation par Agro-bactérie, le bombardement de particules ou le bombardement de microprojectiles.

L'étape b) de sélection peut être faite par des méthodes bien connues.

L'étape c) de générer une plante transgénique à partir de ladite cellule de plante transformée peut être réalisée par des méthodes bien connues comme la génération de cellules pluripotentes à partir de ladite cellule de plante transformée.

De manière préférée, ladite méthode est pour préparer une graine de plante, ladite méthode comprend en outre une étape d) d'obtention d'une graine à partir de la plante transgénique de l'invention.

De manière préférée, ladite plante transgénique est obtenue par des méthodes bien connues telles que celles décrites par Klee H., Horsch R., Rogers S. (1987) Agrobacterium-Mediated Plant Transformation and its Further Applications to Plant Biology. Annual Review of Plant Physiology 38, 467-486 et par Potrykus I. (1991) Gene
Transfer to Plants: Assessment of Published Approaches and Results. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 42, 205-225.

Par « production en bioréacteur », on entend, au sens de la présente invention, une méthode de production de biomasse et/ou de métabolite, ici un polypeptide de LBP/BPI, grâce à la multiplication de micro-organismes, transformés ou non, produisant ce métabolite en grande quantité, dans un bioréacteur, aussi appelé fermenteur, permettant de contrôler les conditions de culture du micro-organisme afin d'optimiser sa croissance et sa production de métabolite d'intérêt.

Un autre objet de l'invention concerne un animal transgénique contenant un polypeptide de LBP/BPI selon l'invention.

Ledit animal transgénique est obtenu par transformation à l'aide d'au moins un vecteur comprenant un transgène codant pour un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

De manière préférée, l'animal transgénique selon l'invention est un poisson ou un crustacé.

De manière préférée, l'animal transgénique de l'invention a intégré dans son génome le polynucléotide ou le vecteur tels que décrits dans l'invention.

De manière encore préférée, l'animal transgénique de l'invention est résistant aux oomycètes. De même, l'animal transgénique de l'invention exprime des protéines LBP/BPI dans ses pontes.

Par exemple, ledit animal transgénique peut être choisi dans le groupe comprenant les poissons d'élevage, notamment de la famille des salmonidés et plus particulièrement les espèces de saumon (e.g. *Oncorhynchus tshawytscha*, *Oncorhynchus nerka*, *Oncorhynchus kisutch*, *Oncorhynchus gorbuscha*, *Oncorhynchus keta* et *Salmo salar*) et les espèces de truites (e.g. *Salmo trutta*, *Salmo obtusirostris*, *Salvelinus fontinalis*, *Oncorhynchus mykiss*, *Oncorhynchus clarkii*). Ledit animal transgénique peut également être choisi dans le groupe comprenant les crustacés d'élevage tels que les crabes, les crevettes, les langoustes, les langoustines, les homards, le krill ou encore les écrevisses.
La méthode de préparation de tels animaux transgéniques est décrite dans Soroldoni D. et al. *Simple and efficient transgenesis with meganuclease constructs in Zebrafish*. Methods Mol Biol. (2009); ou encore dans Pavlopoulos A. et al. *Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis*. Proc Natl Acad Sci USA. (2005).

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Un autre objet de l'invention concerne la descendance, quelque soit la génération, de l'animal transgénique de l'invention, exprimant un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI, leurs dérivés et leurs fragments.

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Les exemples qui suivent sont fournis à titre d'illustration et ne sauraient limiter la portée de la présente invention.

## EXEMPLES

### Matériels et Méthodes

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Les espèces d'oomycètes utilisées sont *Phytophtora parasitica*, *Saprolegnia parasitica* et *Saprolegnia diclina*. *Phytophtora parasitica* fut cultivé dans des boites de Pétri de 90-mm de diamètre sur du milieu agar à 1 % V8 (350ml V8, 5g CaCO3, 3.5g agar) à 25°C durant 6-8 jours sous une lumière constante. La production de zoospores fut induite en plaçant les cultures de *Phytophtora* à 4°C pendant 30min. Le mycelium fut recouvert de 10ml d'eau stérile et laissé à 28°C pendant 30min. Les zoospores furent récoltées et comptées en chambre de Malassez. *Saprolegnia parasitica* et *S. diclina* furent cultivés sur milieu PDA (potato dextrose agar) durant 5 jours à 18± 1C. Pour obtenir des zoospores, de fines lamelles de milieu couvertes de mycelium furent transférées dans des boites de Pétri contenant un milieu "petit pois" (125 g/L_petits pois congelés, autoclavés, volume ajusté à 1L et autoclavé à nouveau) puis laissés 2 jours à 18°C. La formation de

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sporanges fut induite en lavant les cultures 3 fois dans de l'eau distillée, puis ajout d'eau minérale stérile. Après 14h d'incubation à 18°C, les zoospores furent récoltées.

L'activité des protéines recombinantes de *B. glabrata* BgLBP/BPI et humaine hBPI fut testée sur les 3 espèces citées ci-dessus. Les suspensions de zoospores furent ajustées à 500000cellules/ml et 10000cellules/ml pour *Phytophtora* et *Saprolegnia*, respectivement. Les rBgLBP/BPI furent utilisées à des concentrations de 0 (contrôle), 5, 10, 30, et 100ug/ml. Le nombre de zoospores vivantes ou mortes fut compté au microscope optique (Axioplan 2, Carl Zeiss) après 10, 30, 60, 120 et 240min de traitement pour *P. parasitica*. Pour les espèces de *Saprolegnia*, les observations furent réalisées à 30 min car la dynamique du développement de ces espèces ne permet pas de réaliser une cinétique de l'effet des protéines. La protéine BSA (albumine de sérum bovin) fut utilisée également aux mêmes concentrations pour servir de contrôle négatif. Toutes les expériences ont été répétées 3 fois de façon indépendante.

## Résultats

La BgLBP/BPI recombinante a montré une forte activité dose-dépendante contre les zoospores de *Phytophtora* (fig. 1a). Cet effet est observable dès 10 min de traitement et conduit à une survie de 63%, pour une concentration de 100ug/ml. Après deux heures de traitement, 100% des zoospores sont mortes. La protéine humaine hBPI a montré une activité similaire contre les zoospores de *Phytophtora* (fig. 1b). La survie des zoospores est réduite à 40 % après 10 min de traitement pour une concentration de hBPI de 100ug/ml et à 2% après 1h d'incubation. Aucun effet ne fut observé en présence de BSA, quelle que soit la concentration utilisée (fig. 1c).

Les zoospores de *Saprolegnia parasitica* et *S. diclina* furent traitées avec rBgLBP/BPI et hBPI dans les mêmes conditions que celles utilisées pour *P. parasitica* et observées après 30 min de traitement. Les résultats de la figure 2 montrent que les protéines rBgLBP/BPI et hBPI sont également actives contre les zoospores des deux espèces de *Saprolegnia*, avec un effet dose-dépendant.
REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique pour prévenir et/ou traiter des maladies causées par les oomycètes, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide choisi dans le groupe comprenant les protéines LBP/BPI (« LPS-Binding Protein/Bactericidal/Permeability-Increasing Protein »), leurs dérivés et leurs fragments.

2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que les protéines LBP/BPI sont des protéines d'animaux choisis parmi les vertébrés et les invertébrés.

3. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que la protéine LBP/BPI est une protéine de mollusques, de préférence la protéine LBP/BPI de *Biomphalaria glabrata*.

4. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la protéine LBP/BPI est une protéine de mammifères, de préférence la protéine LBP/BPI d'Homo sapiens.

5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en médecine humaine.

6. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est utilisée en médecine vétérinaire.

7. Utilisation d'un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4 comme agent phytosanitaire anti-oomycètes.

8. Une plante transgénique exprimant un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4 et résistante aux oomycètes.

9. La descendance, quelque soit la génération, de la plante transgénique telle que définie à la revendication 8, exprimant un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4.

10. Une méthode de préparation de la plante transgénique telle que définie à la revendication 8 et comprenant les étapes de :

a) Transformation d'au moins une cellule de ladite plante avec un vecteur comprenant le polynucléotide codant pour un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4 ;
b) Sélection d'au moins une cellule de plante transformée qui exprime ledit polypeptide ; et

c) Générer une plante transgénique à partir de ladite au moins cellule de plante transformée sélectionnée à l'étape b).

11. Un animal transgénique exprimant un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4 et résistant aux oomycètes.

12. La descendance, quelque soit la génération, de l'animal transgénique tel que défini à la revendication 11, exprimant un polypeptide tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 4.
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1a</figcaption></figure>

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 1b</figcaption></figure>
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 1c</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 2a</figcaption></figure>
<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 2b</figcaption></figure>

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 2c</figcaption></figure>
listage de séquences_ST25

SEQUENCE LISTING

<110> Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
Université de Strasbourg
COUSTAU, Chrisine
BARON, Olga
REICHHART, Jean-Marc
PONCHET, Michel

<120> Activité anti-oomycètes des lipopolysaccharides (LPS)-Binding
proteins/bactericidal/permeability-increasing proteins

<130> INR-B-0012 FR1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 476

<212> PRT

<213> Biomphalaria glabrata

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (476)..(476)

<223> X= G, A, V, L, I, M, F, W, P, S, T, C, Y, N, Q, D, E, K, R, H or
no amino acid

<400> 1

Met Asn Thr Val Phe Leu Phe Phe Ala Leu Val Ala Gly Ile Phe Ala
1          5                   10                  15

Gln Asp Lys Pro Gly Ala Val Leu Arg Leu Asn Gln Glu Ala Leu Asp
20                   25                  30

Tyr Gly Ser Arg Ile Ala Pro Asp Val Leu Arg Lys Val Leu Asn Lys
35                   40                  45

Ala Ser Phe Glu Asn Leu Glu Asp Lys Glu Gly Pro Val Ser Tyr Lys
50                   55                  60

Phe Ser Lys Ile Ser Leu Glu Gln Ser Glu Ile Glu Ser Ala Asn Phe
65                   70                  75                  80

Ser Phe Asp Pro Ser Ile Asn Gly Ile Arg Ala Ser Ile Gln Arg Leu
85                   90                  95

Ser Ala Phe Val Arg Leu Asp Tyr Glu Ser Ser Ile Asp Met Ser Ile
100                 105                 110

Thr Lys Met Glu His Ser Gly Ser Val Asp Ile Ser Leu Gln Asp Val
115                 120                 125

Asp Val Asp Leu Lys Val Ala Val Glu Ala Asp Ser Asp Arg Arg Ala
130                 135                 140
listage de séquences_ST25

Ala Phe Lys Phe Thr His Met Val Val Arg Glu Ile Ala Val Lys Gln

Ile Glu Lys Val Leu Arg Lys Gly Leu Pro Leu Met Ser Leu Glu Asp

Leu Ser Leu Leu Asp Pro Thr Val Arg Phe Thr Asn Gly Ser Met His

Leu Ala Thr Asp Val Gln Tyr Lys Glu Tyr Ser Xaa

<210> 2

<211> 1628

<212> DNA

<213> Biomphalaria glabrata

<400> 2

ccagtcagtt cagtacttgg gacgagcaca ctgccccgag ccatgaacac cgtcttcctg 60
tttttcgcac tagtcgctgg catctttgcc caagataagc ctggagctgt actcagactc 120
aaccaagagg ctcttgatta tggctcaagg atcgctccag acgttcttcg taaggtactc 180
aacaaagcct ctttcgagaa tctagaggac aaagagggcc cagtcagcta caagtttagc 240
aagatctcat tggaacagtc tgagattgag agcgccaaact tcagcttсага tccaagcatc 300
aatggtattc gtgccagcat tcagagactc agtcattcg ttaggctgga ctatgaatca 360
tccatcgata tgtccatcac caagatggaa cacagcggaa gtggtgacat ttcccttcag 420
gatgtagatg tggacctgaa agttgccgtt gaggctgact cagatcgtcg tgccaagccc 480
aaaactttgg aatgcaaagc cagcatcaag gacagtgaat tcaacttctc ctccattgtt 540
gtccactgga tgtactcaac catgtccaaa gttctgccaа acaaatgccg tgaatggacc 600
gaggaaaggc tttgccgtgt gatcacagac tacattgaca acaaaatgcc tgaaaccatt 660
aaagaagtca aactgtctgc tgaaatggac gagttcaagg ttgactacag ccctgtttct 720
aaagtcagcg tttctcagca atcccttgaa gccagacaca ggggtgaagt ttcatggaaa 780
tccgacagta ccccaagcag ccagaagcca gatgatctcc ccagagaaga ccaggatgac 840
gaggacaaaa tgttcaacct ctggctggat gagtttgtcg ccaagacctt cgctgagtct 900
gctcacagcc acgactatct taaagccaga attgccgaag acacaatctc agaggaagac 960
cagaaagaga aactacgttt atcctacgtt agcagcctca tccccgagct cagctccaac 1020
agcgctggct ccgtccaagt tgaggtcagc tctagcaaag tgccagatgt tgagatctcc 1080
gaagaggtg tcagagttca actccatgga gatgtccttg tttctactcg cagcggctct 1140
aaacttgagc aacagttcaa actgaagaca actgtgaaac tcctggccaa ggccccacatt 1200
gagaagaatc gtcttattcc agacctcctc agctacgatg tcgaaactag tgaattgaca 1260
gcaatcaaaa ttaatccccaa ggaggctgat gctttcaaat tcactcacat ggtcgtcaga 1320
gaaatcgccg tgaaacagat tgaaaaggtt ctaaggaagg gattgcctct gatgtcccctt 1380
listage de séquences_ST25

<table><tr><td>gaggatcttt</td><td>cactgctcga</td><td>tccaaccgtc</td><td>agattcacca</td><td>atggatccat</td><td>gcacttggcc</td><td>1440</td></tr><tr><td>actgacgtcc</td><td>agtacaagga</td><td>gtactcttaa</td><td>cttaacacac</td><td>agcaagactc</td><td>tcagaggaac</td><td>1500</td></tr><tr><td>attacttcaa</td><td>gacctaatgt</td><td>agagcggcaa</td><td>agtgtccaca</td><td>caatgactag</td><td>tccaccaagt</td><td>1560</td></tr><tr><td>aacaaaacga</td><td>tggcattgaa</td><td>gtaataaata</td><td>aacaggaaac</td><td>tgaacactta</td><td>aaaaaaaa</td><td>1620</td></tr><tr><td>aaaaaaaa</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>1628</td></tr></table>
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RAPPORT DE RECHERCHE
PRÉLIMINAIRE

établi sur la base des dernières revendications
déposées avant le commencement de la recherche

N° d'enregistrement
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FA 766424

FR 1200492

<table><thead><tr><th colspan="3">DOCUMENTS CONSIDÉRÉS COMME PERTINENTS</th></tr><tr><th>Catégorie</th><th>Citation du document avec indication, en cas de besoin, des parties pertinentes</th><th>Revendication(s) concernée(s)</th><th>Classement attribué à l'invention par l'INPI</th></tr></thead><tbody><tr><td>X</td><td>H G KLÄRNER ET AL: "Endotoxin neutralization by LBP199-IgG1 Fc chimeric molecules", CLINICAL MICROBIOLOGY AND INFECTION, vol. 5, no. s3, 1 janvier 1999 (1999-01-01), page 67, XP055048761,</td><td>1-12</td><td>A61K38/17<br>A01K67/027<br>A01H5/00<br>A01N37/18<br>A01P3/00<br>A61P31/10</td></tr><tr><td>Y</td><td>* abrégé *</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>X</td><td>WO 02/055022 A2 (MERCK &amp; CO INC [US]; DROPINSKI JAMES F [US]; HICKS PATRICIA SCOTT [US]) 18 juillet 2002 (2002-07-18)<br>* revendications 16,19 *<br>* page 4, ligne 12,19 *<br>* page 7, ligne 20 *<br>* page 8, ligne 8 *</td><td>1-12</td><td></td></tr><tr><td>X</td><td>WO 97/04008 A1 (XOMA CORP [US])<br>6 février 1997 (1997-02-06)<br>* page 1, ligne 5-8 *<br>* page 14, ligne 2 - page 15, ligne 3 *</td><td>1-12</td><td></td></tr><tr><td>X</td><td>US 2003/027762 A1 (LEVY OFER [US])<br>6 février 2003 (2003-02-06)<br>* revendications 1-9 *<br>* page 2, alinéa 10 *</td><td>1-12</td><td>A61K<br>C07K<br>A61P<br>C12N<br>A01K</td></tr><tr><td>X</td><td>WO 02/30975 A2 (XOMA TECHNOLOGY LTD [US]; LIN JONG JYE [US] XOMA TECHNOLOGY LTD [US];) 18 avril 2002 (2002-04-18)</td><td>1-12</td><td></td></tr><tr><td>Y</td><td>* page 6, ligne 26 - page 7, ligne 29 *<br>* page 8, ligne 18 - page 9, ligne 14 *<br>* revendications 1-16 *</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>-/--</td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table><tbody><tr><td>Date d'achèvement de la recherche</td><td>10 janvier 2013</td><td>Examinateur</td><td>Camilleri, Alain</td></tr><tr><td colspan="4">CATÉGORIE DES DOCUMENTS CITÉS</td></tr><tr><td colspan="4">X : particulièrement pertinent à lui seul</td></tr><tr><td colspan="4">Y : particulièrement pertinent en combinaison avec un autre document de la même catégorie</td></tr><tr><td colspan="4">A : arrière-plan technologique</td></tr><tr><td colspan="4">O : divulgation non-écrite</td></tr><tr><td colspan="4">P : document intercalaire</td></tr><tr><td colspan="4">T : théorie ou principe à la base de l'invention</td></tr><tr><td colspan="4">E : document de brevet bénéficiant d'une date antérieure à la date de dépôt et qui n'a été publié qu'à cette date de dépôt ou qu'à une date postérieure.</td></tr><tr><td colspan="4">D : cité dans la demande</td></tr><tr><td colspan="4">L : cité pour d'autres raisons</td></tr><tr><td colspan="4">& : membre de la même famille, document correspondant</td></tr></tbody></table>
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<table><thead><tr><th colspan="2">DOCUMENTS CONSIDÉRÉS COMME PERTINENTS</th><th rowspan="2">Revendication(s) concernée(s)</th><th rowspan="2">Classement attribué à l'invention par l'INPI</th></tr><tr><th>Catégorie</th><th>Citation du document avec indication, en cas de besoin, des parties pertinentes</th></tr></thead><tbody><tr><td>X</td><td>DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 2001, WONG P ET AL: "Secondary structure and side chain analyses of antifungal XMP peptides", XP002689840, Database accession no. PREV200200565881 * abrégé * &amp; ABSTRACTS OF THE INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, vol. 41, 2001, page 254, 41ST ANNUAL MEETING OF THE INTERSCIENCE CONFERENCE ON ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY; CHICAGO, ILLINOIS, USA; SEPTEMBER 22-25, 2001</td><td>1-12</td><td></td></tr><tr><td>X</td><td>ELSBACH P ET AL: "Role of the bactericidal/permeability-increasing protein in host defence", CURRENT OPINION IN IMMUNOLOGY, ELSEVIER, OXFORD, GB, vol. 10, no. 1, 1 février 1998 (1998-02-01), pages 45-49, XP004313619, ISSN: 0952-7915, DOI: 10.1016/S0952-7915(98)80030-7 * le document en entier *</td><td>1-12</td><td>DOMAINES TECHNIQUES RECHERCHÉS (IPC)</td></tr><tr><td></td><td>-/--</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2">Date d'achèvement de la recherche</td><td></td><td>Examinateur</td></tr><tr><td colspan="2">10 janvier 2013</td><td></td><td>Camilleri, Alain</td></tr><tr><td colspan="2">CATÉGORIE DES DOCUMENTS CITÉS</td><td colspan="2">T : théorie ou principe à la base de l'invention<br/>E : document de brevet bénéficiant d'une date antérieure à la date de dépôt et qui n'a été publié qu'à cette date de dépôt ou qu'à une date postérieure.<br/>D : cité dans la demande<br/>L : cité pour d'autres raisons<br/>&amp; : membre de la même famille, document correspondant</td></tr><tr><td colspan="2">X : particulièrement pertinent à lui seul<br/>Y : particulièrement pertinent en combinaison avec un autre document de la même catégorie<br/>A : arrière-plan technologique<br/>O : divulgation non-écrite<br/>P : document intercalaire</td><td colspan="2"></td></tr></tbody></table>
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<table><thead><tr><th colspan="2">DOCUMENTS CONSIDÉRÉS COMME PERTINENTS</th><th rowspan="2">Revendication(s) concernée(s)</th><th rowspan="2">Classement attribué à l'invention par l'INPI</th></tr><tr><th>Catégorie</th><th>Citation du document avec indication, en cas de besoin, des parties pertinentes</th></tr></thead><tbody><tr><td>Y</td><td>HATHAWAY J J M ET AL: "Identification of protein components of egg masses indicates parental investment in immunoprotection of offspring by Biomphalaria glabrata (Gastropoda, Mollusca)", DEVELOPMENTAL AND COMPARATIVE IMMUNOLOGY, PERGAMON PRESS, US, vol. 34, no. 4, 1 avril 2010 (2010-04-01), pages 425-435, XP026867021, ISSN: 0145-305X [extrait le 2009-12-16]<br/>* abrégé; tableau 1 *</td><td>3</td><td></td></tr><tr><td>A</td><td>ATTARD ET AL: "Strategies of attack and defense in plant-oomycete interactions, accentuated for Phytophthora parasitica Dastur (syn. P. Nicotianae Breda de Haan)", JOURNAL OF PLANT PHYSIOLOGY, FISCHER, STUTTGART, DE, vol. 165, no. 1, 19 décembre 2007 (2007-12-19), pages 83-94, XP022393012, ISSN: 0176-1617, DOI: 10.1016/J.JPLPH.2007.06.011<br/>* le document en entier *</td><td>1-10</td><td>DOMAINES TECHNIQUES RECHERCHÉS (IPC)</td></tr><tr><td>Y</td><td>ROXANA PORTIELES ET AL: "High level resistance to phytopathogenic fungi and oomycetes conferred by the use of a novel anti-microbial peptide", BIOTECNOLOGÍA APLICADA, vol. 28, no. 4, 1 septembre 2011 (2011-09-01), pages 262-264, XP055049066, ISSN: 1027-2852<br/>* le document en entier *</td><td>7</td><td></td></tr><tr><td colspan="2">Date d'achèvement de la recherche</td><td colspan="2">Examinateur</td></tr><tr><td colspan="2">10 janvier 2013</td><td colspan="2">Camilleri, Alain</td></tr><tr><td colspan="2">CATÉGORIE DES DOCUMENTS CITÉS</td><td colspan="2">T : théorie ou principe à la base de l'invention<br/>E : document de brevet bénéficiant d'une date antérieure à la date de dépôt et qui n'a été publié qu'à cette date de dépôt ou qu'à une date postérieure.<br/>D : cité dans la demande<br/>L : cité pour d'autres raisons<br/>& : membre de la même famille, document correspondant</td></tr><tr><td colspan="2">X : particulièrement pertinent à lui seul<br/>Y : particulièrement pertinent en combinaison avec un autre document de la même catégorie<br/>A : arrière-plan technologique<br/>O : divulgation non-écrite<br/>P : document intercalaire</td><td colspan="2"></td></tr></tbody></table>

1

EPO FORM 1503 12.99 (P04C14)
ANNEXE AU RAPPORT DE RECHERCHE PRÉLIMINAIRE

RELATIF A LA DEMANDE DE BREVET FRANÇAIS NO.

FR 1200492

FA 766424

La présente annexe indique les membres de la famille de brevets relatifs aux documents brevets cités dans le rapport de recherche préliminaire visé ci-dessus.

Les dits membres sont contenus au fichier informatique de l'Office européen des brevets à la date du 10-01-2013

Les renseignements fournis sont donnés à titre indicatif et n'engagent pas la responsabilité de l'Office européen des brevets, ni de l'Administration française

<table><thead><tr><th>Document brevet cité<br>au rapport de recherche</th><th>Date de<br>publication</th><th>Membre(s) de la<br>famille de brevet(s)</th><th>Date de<br>publication</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">WO 02055022 A2</td><td rowspan="4">18-07-2002</td><td>CA 2433652 A1</td><td>18-07-2002</td></tr><tr><td>EP 1351701 A2</td><td>15-10-2003</td></tr><tr><td>JP 2004521102 A</td><td>15-07-2004</td></tr><tr><td>WO 02055022 A2</td><td>18-07-2002</td></tr><tr><td rowspan="10">WO 9704008 A1</td><td rowspan="10">06-02-1997</td><td>AU 727085 B2</td><td>30-11-2000</td></tr><tr><td>AU 5367596 A</td><td>18-02-1997</td></tr><tr><td>CA 2227292 A1</td><td>06-02-1997</td></tr><tr><td>EP 0839156 A1</td><td>06-05-1998</td></tr><tr><td>JP 2001520631 A</td><td>30-10-2001</td></tr><tr><td>US 5858974 A</td><td>12-01-1999</td></tr><tr><td>US 6156730 A</td><td>05-12-2000</td></tr><tr><td>US 6664231 B1</td><td>16-12-2003</td></tr><tr><td>US 2002077298 A1</td><td>20-06-2002</td></tr><tr><td>WO 9704008 A1</td><td>06-02-1997</td></tr><tr><td rowspan="2">US 2003027762 A1</td><td rowspan="2">06-02-2003</td><td>US 2003027762 A1</td><td>06-02-2003</td></tr><tr><td>US 2006252688 A1</td><td>09-11-2006</td></tr><tr><td rowspan="3">WO 0230975 A2</td><td rowspan="3">18-04-2002</td><td>AU 1188502 A</td><td>22-04-2002</td></tr><tr><td>US 2003166528 A1</td><td>04-09-2003</td></tr><tr><td>WO 0230975 A2</td><td>18-04-2002</td></tr></tbody></table>