# Sélection phénotypique d'une variété résistante aux pucerons Aphis fabae et Acyrthosiphon pisum chez la légumineuse Vicia faba dans un but agroécologique

Manon Le Bihan

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Manon Le Bihan. Sélection phénotypique d'une variété résistante aux pucerons Aphis fabae et Acyrthosiphon pisum chez la légumineuse Vicia faba dans un but agroécologique. Inrae. 2024. hal-05308392

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MASTER 1 EFCE : ÉCOLOGIE FONCTIONNELLE COMPORTEMENTALE
ET ÉVOLUTIVE - UNIVERSITÉ DE RENNES

ANNÉE 2023-24

RAPPORT DE STAGE DE :
LE BIHAN Manon

Sélection phénotypique de variétés résistantes aux pucerons
*Aphis fabae* et *Acyrthosiphon pisum* chez la légumineuse *Vicia faba* dans un but agroécologique

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STRUCTURE D'ACCUEIL : UMR 1349 IGEPP, INRAE

Référent universitaire : Krespi Liliane, maître de conférences

Tuteur de stage : Galland Marc, chargé de recherche

Période de stage : 08/04/24 au 11/06/24

Soutenu à Rennes le : 27/06/24
REMERCIEMENTS

Je tiens tout d'abord à remercier Marc Galland, mon maître de stage, pour son encadrement, ses conseils, ses explications concernant le projet et son accompagnement.

Merci d'avoir si bien anticipé mon arrivée concernant les expériences et de m'avoir si bien accueilli, notamment en me présentant aux autres membres de l'équipe. Merci aussi pour ta gentillesse et ta précieuse aide pour ce rapport.

Merci également à Maïwen Le Floch, qui m'a apporté un réel soutien durant ce stage, notamment en me donnant des conseils sur mon rapport de stage et comment réaliser les analyses statistiques, et en m'accompagnant dans le suivi et la réalisation de chacune des expériences. Grâce à elle, j'ai également eu accès à d'autres données sur le crible qu'elle a réalisé avec 251 génotypes de féveroles.

J'adresse mes remerciements à Salomé Bodin, ma collègue de bureau. Merci pour ses précieux conseils, notamment sur la façon de procéder pour les statistiques, pour nos discussions et sa compagnie.

Merci aussi aux autres stagiaires de M1, notamment Corentin Courteille et Enora Martin pour nos discussions pendant la pause café, et le midi.

Je tiens également à remercier Isabelle Glory, qui m'a montré la serre, comment réaliser des croisement et l'autofécondation des plans de féveroles.

Enfin, merci à toute l'équipe EGI qui m'a réservé un super accueil, pour la seconde fois.

Merci pour votre bonne humeur et votre cohésion d'équipe.

Je soussigné Manon Le Bihan certifie que le texte de ce rapport, *abstract* compris, a été rédigé entièrement par moi même et n'a pas été reformulé ensuite par une IA.

Signature

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TABLE DES MATIÈRES

<table><tr><td>INTRODUCTION</td><td>1</td></tr><tr><td>MATÉRIEL ET MÉTHODES</td><td>4</td></tr><tr><td>Origine du matériel végétal</td><td>4</td></tr><tr><td>Elevage des pucerons</td><td>4</td></tr><tr><td>Test de fécondité des pucerons A. pisum et A. fabae</td><td>4</td></tr><tr><td>Survie et développement de larves L1 d'A. fabae</td><td>5</td></tr><tr><td>Analyses statistiques</td><td>5</td></tr><tr><td>RÉSULTATS</td><td>6</td></tr><tr><td>Test de fécondité des pucerons sur le premier crible (251 génotypes)</td><td>6</td></tr><tr><td>Test de fécondité des pucerons sur le deuxième crible (10 génotypes)</td><td>7</td></tr><tr><td>Fécondité des pucerons généralistes/spécialistes sur le premier crible (251 génotypes)</td><td>9</td></tr><tr><td>Fécondité des pucerons généralistes/spécialistes sur le deuxième crible</td><td>10</td></tr><tr><td>Survie et développement de larves L1 d'A. fabae</td><td>11</td></tr><tr><td>DISCUSSION / CONCLUSION</td><td>11</td></tr><tr><td>Caractérisation de la résistance de panels de diversité</td><td>11</td></tr><tr><td>Caractérisation de la résistance des généralistes et des spécialistes</td><td>13</td></tr><tr><td>Mécanismes de résistance semi-complète</td><td>14</td></tr><tr><td>BIBLIOGRAPHIE</td><td>16</td></tr></table>
## INTRODUCTION

Au fil des années, les terres agricoles se sont étendues et l'utilisation d'intrants artificiels a augmenté, ce qui a conduit à la simplification des habitats naturels et à la perte de nombreuses fonctions biologiques, impactant ainsi négativement la productivité agricole et la biodiversité (Knapp et Sciarretta 2023). L'agroécologie a pour but de rendre l'agriculture plus durable en minimisant ces intrants chimiques (Hatt et al. 2016). La diversification des cultures permet notamment d'améliorer les services écosystémiques, comme la pollinisation, sans affecter les rendements, tout comme l'utilisation de produits sémiochimiques et d'ennemis naturels pour lutter contre les ravageurs. Ces méthodes permettent de ne pas recourir aux pesticides chimiques (Knapp et Sciarretta 2023).

Pour mettre en place ces mesures de gestion, une connaissance poussée du fonctionnement des écosystèmes et des réseaux trophiques au sein de cet écosystème est nécessaire (Knapp et Sciarretta 2023). Les plantes et les insectes sont en interaction depuis environ 390 millions d'années (Schatz et al. 2017) et l'une des formes que peut prendre cette interaction est l'antagonisme, où l'un des partenaires tire profit de l'interaction au détriment de l'autre. C'est notamment le cas pour la phytophagie avec les insectes nuisibles (Calatayud et al. 2018). A l'heure actuelle, on considère que toutes les espèces de plantes sont la proie d'au moins une espèce d'insectes (Gatehouse 2002). Cette interaction aurait permis la diversification des deux phylums grâce à des phénomènes de co évolution (Gatehouse 2002). En effet, face à ces attaques, l'évolution a sélectionné des mécanismes de défense diversifiés chez la plante, qui ont conduit, à leur tour, à des contre-adaptations chez les insectes herbivores (Rashid War et al. 2018).

Dans le cas de l'interaction plante-puceron, et notamment l'interaction légumineuse-puceron, les pucerons (Hémiptera, Aphididae) vont causer des dommages importants aux plantes, via l'introduction de leur stylets, afin de se nourrir de la sève du phloème, mais surtout en transmettant des virus phytopathogènes (Shih et al. 2023). La résistance des plantes hôtes face à ces attaques se compose de trois mécanismes déterminés génétiquement : l'antibiose, l'antixénose et la tolérance. L'antibiose, qui va particulièrement nous intéresser ici, va diminuer la fitness des insectes, alors que l'antixénose va affecter leur comportement via une acceptation tardive de la plante hôte (Bansal et al. 2021). La capacité de la plante à induire des mécanismes de défense repose sur la reconnaissance de motifs
génériques du puceron, que l'on appelle HAMPs (“Herbivore-Associated Molecular Patterns”), via des PRRs (“Pattern Recognition Receptors”) (Snoeck et al. 2022). *Arabidopsis thaliana* peut par exemple reconnaître des extraits de pucerons entiers de *Myzus persicae* et induire une défense locale (Prince et al. 2014). La réponse immunitaire déclenchée est de type PTI (“Pattern Triggered Immunity”) et entraîne la mise en place de défenses diversifiées comme par exemple le dépôt de callose (Ngou et al. 2022). La PTI peut être bloquée par des effecteurs du puceron, qui vont entraîner une sensibilité de la plante nommée ETS (“Effector Triggered Susceptibility”) (Snoeck et al. 2022). L’expression de Mp55 par *M. persicae*, limiterait par exemple la production de ROS exprimée par *A. thaliana*, ce qui améliorerait sa reproduction (Ellis et al. 2002). Une plante résistante va par exemple mettre en place une ETI (“Effector Triggered Immunity”) via la reconnaissance spécifique des effecteurs du puceron. Cette ETI peut se traduire par une réponse hypersensible de mort programmée de la cellule (HR). Ces différentes réponses constituent le modèle en “zig-zag” (Jones et al. 2006).

Dans le cadre de ces interactions, la féverole (Vicia faba) est une légumineuse à graines dont l'importance est non négligeable pour plusieurs services écosystémiques, notamment pour l'agriculture durable et la protection des sols (Carrillo-Perdomo et al. 2020). Elle possède une haute valeur nutritionnelle et constitue une source de protéines à la fois pour la consommation humaine et animale (Veloso et al. 2016). Elle est cultivée dans divers climats, ce qui a permis la différenciation de groupes de germoplasmes, que l'on différencie par la taille des graines (paucijuga, minor, equina, major) ainsi que par leur région d'adaptation (types méditérranéen, hivernal, printanier) (Veloso et al. 2016). Sa grande capacité à fixer l'azote via des activités symbiotiques, permet le soutien et la productivité du sol en rendant l'azote davantage disponible pour les organismes qui s'y trouvent (Köpke et Nemecek 2010). Elle permet ainsi la diversification des agro-écosystèmes (Veloso et al. 2016). La féverole joue également un rôle clé dans l'alimentation des pollinisateurs et des insectes, en fournissant du nectar et du pollen (Veloso et al. 2016).

La féverole est attaquée par différents ravageurs dont les pucerons du pois (Acyrthosiphon pisum) et de la féverole (Aphis fabae). A. fabae est l'un des principaux ravageurs de la féverole tout en étant une espèce généraliste dont le spectre d'hôte rassemble une grande diversité d'espèces (environ 80) (Skovgård et Stoddard 2023). A. pisum est un puceron spécialiste. Il présente environ 15 biotypes qui vont posséder des adaptations
particulières pour se nourrir sur des espèces de légumineuses, et auront, en contrepartie, du mal à se nourrir sur d'autres espèces (Peccoud et al. 2009). A l'heure actuelle, en Europe, quatres espèces hôte du puceron du pois sont connues : le pois, la féverole, la luzerne et le trèfle rouge (Frantz et al. 2010). Ils sont tous deux faciles à utiliser en laboratoire du fait de leur reproduction parthénogénétique et de leur cycle de vie court, permettant d'atteindre un nombre important d'individus en peu de temps (Nalam et al. 2019).

Des études récentes ont permis de mettre en évidence une résistance partielle chez certains génotypes de pois, exposé à un biotype d'*Acyrthosiphon pisum* adapté au pois. Des génotypes résistants ou présentant une sensibilité partielle à un biotype de la luzerne non adapté au pois ont été trouvés, ainsi qu'un locus de trait quantitatif nommé *ApRVII* à effet majeur, impliqué dans la résistance au biotype du pois et de la luzerne, localisé au niveau du chromosome 7 (Ollivier et al. 2022). Il n'existe pour le moment que très peu d'études sur la féverole, et plus précisément sur sa résistance à ces deux espèces de pucerons. Il est pourtant important de s'intéresser à ces interactions car on les retrouve très fréquemment en milieu naturel (Skovgård & Stoddard 2023, Frantz et al. 2010). Il est de plus important de développer des variétés de féverole résistantes aux pucerons afin d'augmenter leur part culturale sans avoir recours à la lutte chimique.

Dans cette étude nous cherchons à savoir s'il existe des génotypes sensibles et résistants de *Vicia faba* à *Acyrthosiphon pisum* et *Aphis fabae*, au sein d'un panel de diversité de la féverole comprenant 251 génotypes et créé lors du projet PeaMUST (Burstin et al. 2021). Cette étude cherchera également à déterminer s'il existe des résistances distinctes face à des espèces de pucerons généralistes ou spécialistes. Nous cherchons également à confirmer si certains génotypes présentent une résistance complète à *A. fabae*. Pour ce faire, la fécondité des pucerons du pois et de la féverole est mesurée sur ce panel de diversité comme une mesure indirecte de la résistance. Le nombre de larves devrait être différent en fonction des génotypes avec certains sensibles, avec plus de larves, ou résistants, avec moins de larves. Cette résistance devrait être différente en fonction des espèces de pucerons généralistes ou spécialistes, c'est-à-dire qu'un génotype résistant à l'un ne le serait pas à l'autre par exemple. Enfin, certains génotypes devraient présenter une forte résistance, avec peu ou pas de larves.
# MATÉRIEL ET MÉTHODES

Les expérimentations ont été réalisées en deux temps. Le premier crible sur 251 génotypes a été réalisé en amont de mon stage par Maïwenn Le Floch (ingénieure d'étude, équipe Ecologie et Génétique des insectes) entre Octobre 2022 et Mars 2024 et j'ai pu analyser les données de ce premier criblage. Le deuxième crible sur 10 génotypes a été réalisé durant mon stage entre Avril et Mai 2024 : j'ai donc mené ces expériences, récolté et analysé les données produites.

## Origine du matériel végétal

Les féveroles qui ont été utilisées dans cette expérience proviennent d'une collection de 251 génotypes issus de variétés cultivées (Burstin et al 2021). Ils diffèrent par la taille des graines, l'origine géographique ainsi que l'année de prélèvement. Les graines ont été fournies par le Centre de Ressource Biologique de Dijon (UMR Agroécologie, France) et, pour certains génotypes, multipliés localement à l'IGEPP (Le Rheu, France). Les 251 génotypes ont été utilisés lors d'un premier crible basé sur l'analyse de la fécondité d'une larve L1 de puceron, afin de déterminer leur degré de résistance/sensibilité aux deux espèces de pucerons.

## Elevage des pucerons

Les pucerons utilisés, *Aphis fabae* et *Acyrthosiphon pisum*, ont été élevés dans une chambre climatique à cycle jours longs (18°C, cycle de 16h jour/ 8h nuit), permettant de maintenir les populations par reproduction parthénogénétique (les adultes femelles vont produire leurs clones génétiques). Pour chaque espèce, un clone unique dénué de symbiotes secondaires (P123 pour *A. pisum*, AF001 pour *A. fabae*) a été utilisé dans toutes les expériences (Ollivier et al. 2022). Chacun des clones a ensuite été multiplié sur *Vicia faba* cv Castell.

## Test de fécondité des pucerons *A. pisum* et *A. fabae*

Les féveroles utilisées ont été cultivées individuellement dans des pots (7x7x8 cm) placés dans une chambre climatique à 20°C, à cycle de 16h jour/8h nuit pendant 15 jours. Des pucerons adultes, 5 pour *Acyrthosiphon pisum* et 7 pour *Aphis fabae* par plant, de chaque espèce ont ensuite été déposés sur des plants de *Vicia faba* cv Castell (génération 1, G1). Un adulte pond en moyenne 5 larves aptères (stade N1) par jour à 20°C. Au bout de 24h, les larves N1 de ces adultes (génération 2, G2) sont récupérées et déposées sur chaque plant des
251 génotypes pour le premier crible ou des 10 génotypes pour le second crible. Après un délai de 15 jours, la descendance d'une seule larve N1-G2 est dénombrée en comptant les descendants de cette génération (génération 3, G3) comptés sur chacun des plants. Nous avons compté également le nombre d'adultes, le nombre d'ailés, ainsi que le nombre de feuilles afin d'avoir une idée du stade de développement de la plante au moment du comptage. Des pré-tests ont été réalisés lors du premier crible afin de savoir si les deux pucerons se développent de la même manière, quand installer la larve N1-G2, et au bout de combien de temps réaliser les comptages.

## Survie et développement de larves L1 d'A. fabae

Les féveroles, ainsi que des pucerons *Aphis fabae*, utilisés pour tester la survie des pucerons ont été cultivées et élevées de la même manière et dans les mêmes conditions que précédemment. Cette fois-ci, 10 larves N1-G2 ont été déposées sur chacun des 10 plants de 5 génotypes différents. Au bout de 9 jours, le nombre d'adultes vivants a été compté, ainsi que le nombre éventuel de larves produites.

## Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel R (Version 2023.09.1+494). Les données de comptage des larves de pucerons sur les 251 génotypes, sur les 10 génotypes puis sur les génotypes qui sont résistants et/ou sensibles aux deux pucerons de Vicia faba ont été analysées pour la variable "Génotypes" en variable explicative et la variable "Réplicats" en effet aléatoire, à l'aide d'un glmmTMB à binomial négative [package R "glmmTMB"] (Brooks et al. 2017). Les génotypes ont ensuite été comparés deux à deux à l'aide de la fonction glht et de la méthode de Tukey [package R "multcomp"] (Hothorn et al. 2008), afin d'observer d'éventuelles différences significatives entre les génotypes considérés résistants et sensibles. Les degré de liberté et les valeurs de chi² ont été obtenus à l'aide des valeurs z contenues dans les résultats des glht. Concernant l'expérience de survie, un test de chi² de conformité à été utilisé dans le but de comparer les proportions de zéro obtenues lors du crible des 251 génotypes, qui constitue les proportions attendues, avec celles du crible des 10 génotypes, qui constituent les proportions observées.
# RÉSULTATS

## Test de fécondité des pucerons sur le premier crible (251 génotypes)

Le nombre de descendants issus d'une larve L1 varie de 15 ± 2 à 38 ± 2 pour *Acyrthosiphon pisum* et de 23 ± 5 à 50 ± 4 pour *Aphis fabae*. Cette descendance issue des 251 génotypes est distribués suivant un gradient continu allant d'une résistance partielle, avec un faible nombre de descendants, à une sensibilité importante, avec un fort nombre de descendants, que ce soit pour *A. pisum* (Fig 1.1) ou pour *A. fabae* (Fig 1.2). Cette résistance et cette sensibilité des génotypes, dont on cherche à isoler les plus extrêmes, sont marqués par une différence significative du nombre de larves (*P* < 0,05 ; Tab 1.1, Tab 1.2).

<table><caption>**Tableau 1.1.** Fécondité moyenne d'Acyrthosiphon pisum obtenu pour 20 génotypes de *Vicia faba* avec 12 réplicats, parmi lesquels ont été retirés ceux sans adultes retrouvés vivants. Chaque génotype a été comparé à l'intercept, les p-values ont été obtenues à l'aide d'un summary du modèle.</caption><thead><tr><th>Génotypes Résistants</th><th>Réplicats retenus (N)</th><th>Moyenne ± Erreur Standard</th><th>P-values</th><th>Génotypes Sensibles</th><th>Réplicats retenus (N)</th><th>Moyenne ± Erreur Standard</th><th>P-values</th></tr></thead><tbody><tr><td>7 (Intercept)</td><td>12</td><td>20 ± 1</td><td>&lt; 2e-16 ***</td><td>113</td><td>11</td><td>37 ± 4</td><td>0.0001 ***</td></tr><tr><td>38</td><td>10</td><td>23 ± 4</td><td>0.6534</td><td>77</td><td>8</td><td>37 ± 2</td><td>0.0004 ***</td></tr><tr><td>61</td><td>10</td><td>22 ± 3</td><td>0.7992</td><td>138</td><td>12</td><td>35 ± 2</td><td>0.0005 ***</td></tr><tr><td>172</td><td>12</td><td>21 ± 4</td><td>0.8160</td><td>148</td><td>12</td><td>35 ± 2</td><td>0.0005 ***</td></tr><tr><td>14</td><td>12</td><td>21 ± 3</td><td>0.9609</td><td>153</td><td>11</td><td>37 ± 5</td><td>0.0014 **</td></tr><tr><td>55</td><td>12</td><td>21 ± 4</td><td>0.8391</td><td>221</td><td>11</td><td>31 ± 4</td><td>0.0393 *</td></tr><tr><td>57</td><td>10</td><td>23 ± 5</td><td>0.8007</td><td>232</td><td>9</td><td>38 ± 2</td><td>0.0001 ***</td></tr><tr><td>134</td><td>12</td><td>21 ± 3</td><td>0.9174</td><td>241</td><td>8</td><td>35 ± 3</td><td>0.0017 **</td></tr><tr><td>170</td><td>10</td><td>15 ± 2</td><td>0.1931</td><td>84</td><td>10</td><td>35 ± 2</td><td>0.0006 ***</td></tr><tr><td>106</td><td>6</td><td>18 ± 2</td><td>0.7267</td><td>224</td><td>11</td><td>33 ± 2</td><td>0.0021 **</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Tableau 1.2.** Fécondité moyenne d'Aphis fabae obtenu pour 20 génotypes de *Vicia faba* avec 12 réplicats, parmi lesquels ont été retirés ceux sans adultes retrouvés vivants. Chaque génotype a été comparé à l'intercept, les p-values ont été obtenues à l'aide d'un summary du modèle.</caption><thead><tr><th>Génotypes Résistants</th><th>Réplicats retenus (N)</th><th>Moyenne ± Erreur Standard</th><th>P-values</th><th>Génotypes Sensibles</th><th>Réplicats retenus (N)</th><th>Moyenne ± Erreur Standard</th><th>P-values</th></tr></thead><tbody><tr><td>88 (Intercept)</td><td>11</td><td>26 ± 4</td><td>&lt; 2e-16 ***</td><td>34</td><td>8</td><td>44 ± 4</td><td>0.0060 **</td></tr><tr><td>111</td><td>9</td><td>26 ± 4</td><td>0.9695</td><td>45</td><td>10</td><td>50 ± 4</td><td>0.0006 ***</td></tr><tr><td>124</td><td>11</td><td>33 ± 3</td><td>0.1432</td><td>49</td><td>11</td><td>47 ± 3</td><td>0.0025 **</td></tr><tr><td>143</td><td>11</td><td>27 ± 4</td><td>0.9382</td><td>81</td><td>10</td><td>45 ± 3</td><td>0.0023 **</td></tr><tr><td>198</td><td>7</td><td>27 ± 5</td><td>0.7585</td><td>94</td><td>9</td><td>44 ± 4</td><td>0.0050 **</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>208</td><td>7</td><td>24 ± 3</td><td>0.8700</td><td>162</td><td>9</td><td>41 ± 5</td><td>0.0142 *</td></tr><tr><td>222</td><td>9</td><td>26 ± 4</td><td>0.7712</td><td>52</td><td>9</td><td>39 ± 7</td><td>0.1645</td></tr><tr><td>189</td><td>6</td><td>28 ± 5</td><td>0.6940</td><td>155</td><td>7</td><td>49 ± 7</td><td>0.0012 **</td></tr><tr><td>230</td><td>8</td><td>23 ± 5</td><td>0.6065</td><td>58</td><td>11</td><td>43 ± 5</td><td>0.0047 **</td></tr><tr><td>224</td><td>9</td><td>24 ± 4</td><td>0.5452</td><td>106</td><td>9</td><td>41 ± 5</td><td>0.0325 *</td></tr></table>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 1.1.** Distribution des génotypes en fonction du nombre moyen de larve d'Acyrthosiphon pisum rangé par ordre croissant (ligne bleue = médiane)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 1.2.** Distribution des génotypes en fonction du nombre moyen de larve d'Aphis fabae rangé par ordre croissant (ligne bleue = médiane)</figcaption></figure>

## Test de fécondité des pucerons sur le deuxième crible (10 génotypes)

Afin de confirmer les résultats de fécondité obtenus sur le premier crible, certains génotypes parmi les plus résistants et sensibles ont été phénotypés à nouveau lors d'une expérience réalisée sur un temps relativement court. Le but étant de diminuer la variabilité des résultats, particulièrement élevée lors du premier crible causé par la longueur de l'expérience.
Le nombre de descendants d'Acyrthosiphon pisum des génotypes considérés comme résistants, représenté en vert, varie de 3 ± 1 à 7 ± 1, et celui des génotypes considérés comme sensibles, représenté en bleu, varie de 2 ± 1 à 4 ± 1. Les "résistants" ne sont pas significativement différents des "sensibles". Par exemple, le génotype 170 (résistants) présente environ le même nombre de larves que le génotype 241 (sensibles) (χ² = 2,77 ; 45 ddl ; P = 0,79) (Fig 2.1).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 2.1.** Nombre de larve d'Acyrthosiphon pisum obtenues au bout de 15 jours en fonction des génotypes considérés résistants et sensibles, avec 10 réplicats chacun (une même lettre signifie : pas de différence significative)</figcaption></figure>

Le nombre de descendants d'Aphis fabae des génotypes considérés résistants en vert varie de 21 ± 3 à 30 ± 2, et celui des génotypes considérés sensibles en bleu varie de 19 ± 2 à 34 ± 2. Il n'y a pas de différence significative entre le nombre de larves des génotypes "résistants" et des "sensibles" pour A. fabae. Seuls certains génotypes au sein des "sensibles", sont significativement différents, comme le 155 et le 49 (χ² = 11,15 ; 45 ddl ; P = 0,02) (Fig 2.2).
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 2.2.** Nombre de larve d'Aphis fabae obtenues au bout de 15 jours en fonction des génotypes considérés résistants et sensibles, avec 15 réplicats chacun (une même lettre signifie : pas de différence significative)</figcaption></figure>

## Fécondité des pucerons généralistes et spécialistes sur le premier crible (251 génotypes)

Les génotypes présentent des résistances/sensibilités différentes en fonction des espèces de pucerons. On distingue 4 catégories, des génotypes qui vont être sensibles ou résistants aux deux espèces, des génotypes qui vont être résistants à *Aphis fabae* et sensible à *Acyrthosiphon pisum* et inversement (Fig 3).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 3.** Distribution de la résistance/sensibilité des génotypes par rapport aux nombres de larves d'Acyrthosiphon pisum et d'Aphis fabae (ligne bleue = médiane, S = sensible, PR = partiellement résistant)(une même lettre signifie : pas de différence significative)</figcaption></figure>
## Fécondité des pucerons généralistes et spécialistes sur le deuxième crible

Le nombre de larves d'Acyrthosiphon pisum produites sur le génotype 106 lors du crible de confirmation, est significativement plus faible que celui produit par *Aphis fabae* ($\chi^2 = 32,43$ ; 1 ddl ; *P* = 1,23e-08) (Fig 4.1).

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 4.1.** Représentation du nombre de larves d'Acyrthosiphon pisum et d'Aphis fabae obtenus lors du deuxième crible en fonction du génotype 106, présentant une résistance ou une sensibilité commune lors du premier crible (une même lettre signifie : pas de différence significative)</figcaption></figure>

Le nombre de larves d'Acyrthosiphon pisum produites sur le génotype 224, sur le panel réduit, est ici aussi significativement plus faible que celui produit par *Aphis fabae* ($\chi^2$ =16,91 ; 1 ddl ; *P* = 3,91e-05) (Fig 4.2).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 4.2.** Représentation du nombre de larves d'Acyrthosiphon pisum et d'Aphis fabae obtenus lors du deuxième crible en fonction du génotype 224, présentant une résistance ou une sensibilité commune lors du premier crible (une même lettre signifie : pas de différence significative)</figcaption></figure>
## Survie et développement de larves L1 d'A. fabae

Lors des tests de fécondité d'Aphis fabae réalisés sur le premier crible (251 génotypes), certains génotypes (5) présentaient un nombre élevé de zéro (plus de 50 %). Cela signifie qu'une larve a été installée mais qu'aucun adulte ne s'est développé à partir de cette unique individu et un phénotype binaire est observable. Les proportions de valeurs nulles allant de 50 à 75% (Fig. 5A).

Pour confirmer ce résultat avec un effectif plus important, 10 larves ont été installées sur chaque plante (N = 10 plantes par génotype). En comparant les proportions de zéro observées sur les 5 génotypes du premier crible (Fig. 5A) avec les proportions observées sur le deuxième crible (Fig. 5B), il est possible de confirmer ou d'infirmer cet effet. Les proportions de zéro attendues sont significativement plus élevées que les proportions de zéro observées (χ² = 82,943 ; 4 ddl ; P < 2,2e-16).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 5.** Proportion de zéro du nombre d'adultes d'Aphis fabae en fonction des génotypes présentant un fort nombre de zéro sur le premier crible (251 génotypes ; A) et sur le deuxième crible (10 génotypes ; B)</figcaption></figure>

# DISCUSSION / CONCLUSION

## Caractérisation de la résistance de panels de diversité

Nous avons cherché à montrer que les génotypes de féverole (Vicia faba) présentent des mécanismes de résistance différents. En effet, sur le premier crible (251 génotypes) nous avons observé une variation continue du nombre de larves du puceron du pois ou celui de la féverole, sans pour autant avoir de génotypes qui soient totalement résistants. Cependant, nous avons sélectionné les génotypes avec le nombre de larves le plus élevé, considéré alors
comme sensibles, et le plus faible, considéré comme partiellement résistant, en appuyant ce
choix par un test statistique. Nous n'avons cependant pas fait les mêmes observations lors du
second crible (10 génotypes), dont le but était de confirmer ces éventuelles résistances ou
sensibilités des génotypes. Les distinctions faites entre sensibles et résistants ne sont pas aussi
nettes. La résistance graduelle, faite sur le premier crible, a aussi été observée dans une étude
sur le pois, qui a permis de mettre en évidence des génotypes résistants à *Acyrthosiphon pisum* (Ollivier et al. 2022). L'étude est réalisée, elle aussi, sur un grand nombre de
génotypes (240) et la fécondité de biotypes d'A. pisum adapté ou non adapté au pois a été
mesuré. Dans ce cadre, il y avait un continuum du nombre de larves par plant en fonction des
génotypes, sans avoir de génotypes complètement résistants. Une différence avait cependant
été trouvée entre les génotypes les plus contrastés au niveau de leur résistance. Il avait ainsi
été mis en évidence plusieurs génotypes (5) qui présentaient une forte résistance au biotope
adapté au pois parmi les 240 étudiés (Ollivier et al. 2022).

Une des explications possibles à nos observations lors du second crible, pourrait être
l'influence de la température de la chambre climatique utilisée pour *Acyrthosiphon pisum*, sur
le cycle de développement des pucerons. En effet, cette température étant de 18°C, a pu avoir
un impact non négligeable sur leur vitesse de développement. Il a justement été montré chez
*A. pisum*, sur *Vicia Faba*, qu'à 15°C les pucerons vont par exemple passer davantage de temps
à l'état de nymphe qu'à 20°C. On peut donc supposer qu'à 18°C, les pucerons sont devenus
adultes plus tardivement et n'ont pas eu le temps de pondre suffisamment (Ahn et al. 2020).
Une autre explication possible est que dans le second crible, les tests de fécondité se
concentrent sur un nombre restreint de génotypes. La sélection de génotypes supposés
sensibles ou résistants a été faite, sans de réelle distinction du nombre de larves, d'autres
génotypes auraient pu être choisis. Certains génotypes ont également présenté des taux de
germination assez faibles, ce qui à conduit à un nombre de réplicats différents en fonction des
génotypes. Il serait ainsi pertinent de réaliser une seconde étude qui prendrait en compte les
autres génotypes définis comme sensibles ou résistants, et pas seulement les extrêmes, ainsi
que leur taux de germination afin d'avoir le même nombre de réplicats.

Une des perspectives les plus intéressantes serait de cartographier les déterminants
génétiques de la résistance aux pucerons à l'échelle du génome, dans le but de déterminer s'ils
sont actuellement connus chez d'autres légumineuses, ou s'ils sont originaux. Pour ce faire,
une GWAS pourrait être réalisée. Cette méthode d'analyse a été utilisé sur une population
d'accessions d'Arabidopsis thaliana, en cherchant à identifier à l'échelle du génome le/les
déterminants génétiques qui permettrait d'expliquer la variabilité observée dans la durée
d'alimentation et le taux d'ingestion de la sève du phloème par le puceron Myzus persicae.
Cette GWAS a permis d'associer le comportement alimentaire des pucerons aux différents
polymorphismes du gène SLI1 (Kloth et al. 2017). Ce gène participe à la résistance contre
plusieurs espèces notamment le puceron du tabac (Myzus persicae nicotianae), le puceron du
chou (Brevicoryne brassicae) et l'aleurode du chou (Aleyrodes proletella) (Kloth et al. 2021).
Dans notre cas, nous pourrions tester la spécificité des gènes identifiés entre les pucerons
adaptés et non adaptés, comme les spécialistes et les généralistes. Cette technique pourrait
notamment être utilisée pour trouver des gènes de résistance qui nous permettraient de
différencier les génotypes sensibles et résistants comme cela a été fait chez Medicago
truncatula, une espèce modèle chez les légumineuses (Jacques et al. 2020). Une lignée
résistante au puceron tacheté a été croisée avec un génotype de M. truncatula, afin d'obtenir
un cultivar résistant à ce puceron ainsi qu'au puceron bleu-vert et au puceron du pois
(Jacques et al. 2020). Il a été trouvé que cette résistance est causée par un gène de résistance
particulièrement fort, nommé AKR ("Acyrthosiphon kondoi resistance"), qui est dominant sur
le chromosome 3. Il va permettre de réduire le taux de survie du puceron. Les pucerons qui se
trouvent sur des génotypes sensibles, qui ne présentent pas la version résistante du gène AKR,
vont causer la chlorose veineuse, alors que les pucerons qui se nourrissent sur des lignées
résistantes vont mourir au bout de 24h (Jacques et al. 2020). La réponse de défense contre ce
puceron serait également contrôlée par trois facteurs de transcription agissant comme acteurs
moléculaires. En effet, des codons stop prématurés au niveau de ces gènes dans les génotypes
résistants, qui bloquent leur expression, induisent une mortalité plus tardive du puceron et une
sensibilité plus forte (Jacques et al. 2020). Il serait intéressant de déterminer si les
mécanismes qui vont définir la résistance des plantes présents chez cette espèce peuvent
s'appliquer aux génotypes résistants et sensibles chez la féverole, grâce à des méthodes de
génomique comparative (Imbert et al. 2023).

Caractérisation de la résistance des généralistes et des spécialistes

Le second objectif de cette étude était de montrer que les espèces de pucerons
généralistes, comme *Aphis fabae*, vont induire des mécanismes de défense de la plante
différents des espèces de pucerons spécialistes, comme *Acyrthosiphon pisum*. Les résultats
que nous avons obtenus vont dans ce sens (Fig. 3). En effet, certains génotypes sont par
exemple sensibles à *A. pisum* et résistants à *A. fabae* ou inversement, et certains présentent une sensibilité ou une résistance à seulement une des deux espèces. Dans ce crible, il est donc rare qu'une plante soit résistante ou sensible aux deux espèces. Il a notamment été montré que certains mécanismes vont différer entre *Myzus persicae*, un puceron généraliste et *A. pisum* chez *Vicia faba* (**Medina-Ortega et al. 2015**). Un des mécanismes de défenses des légumineuses repose sur des forisomes (protéines du phloème) qui vont permettre d'obturer le phloème lorsque celui-ci est endommagé par le stylet du puceron. Le puceron spécialiste ne déclenche pas cette occlusion alors que le puceron généraliste la déclenche (**Medina-Ortega et al. 2015**). Une autre étude a été réalisée chez *Arabidopsis thaliana*, dans le but de déterminer si la sécheresse va avoir une influence sur la présence de métabolites secondaires, et ainsi impacter la défense de la plante. Cela est testé avec *M. persicae* et le spécialiste *Brevicoryne brassicae*. Ici encore, il a été mis en évidence des mécanismes différents, le puceron spécialiste induit l'accumulation de plusieurs métabolites comme le glucosinolates d'indolyle et la camalexine, alors que le puceron généraliste n'induit pas d'accumulation de camalexine aussi importante (**Mewis et al. 2012**). Nous pouvons ainsi supposer que la plante reconnaît l'espèce de puceron qui l'attaque, et adapte ainsi sa défense. Nous pouvons appuyer cette théorie par le fait que lorsque la défense n'est pas induite par la reconnaissance de l'insecte mais par la thiamine, une vitamine qui permet d'induire la défense de la plante, il ne va pas y avoir de différence de défenses entre les pucerons généralistes *M. persicae* et spécialistes *Acyrthosiphon pisum* et *Rhopalosiphum padi* (**Hamada et al. 2018**). Plusieurs études, notamment chez le puceron *Sitobion miscanthi*, un spécialiste de céréales, sur *Nicotiana benthamiana*, ont montré que les spécialistes vont réussir à neutraliser l'immunité des plantes. L'effecteur salivaire Sm9723 a été mis en évidence lors de l'alimentation du puceron, dû à une forte expression. Lorsqu'il est volontairement surexprimé au sein de la plante, les différentes défenses issues de la PTI de la plante sont inhibées, comme le dépôt de callose. Lorsque celui-ci est supprimé, la fécondité et la survie du puceron diminuent fortement (**Zhang et al. 2022**).

## Mécanismes de résistance semi-complète

Le dernier objectif de cette étude était de déterminer si certains génotypes présentent une résistance complète à *Aphis fabae*. En effet, lors du premier crible (251 génotypes), plusieurs génotypes ont présenté une très faible proportion de valeurs non nulles (**Fig. 5A**). Cependant, une seconde expérience (**Fig. 5B**) a montré que cette observation ne s'est pas
renouvelée lors de l'expérience de survie. Nous supposons alors que la proportion importante
de zéros observée au premier crible est liée à un problème d'installation des pucerons. En
effet, les larves d'Aphis fabae sont de très petites taille, et rien ne garantit que lorsqu'elles
sont posées sur le plant, elles ne soient pas blessées. Nous pouvions pourtant nous attendre à
une forte résistance car elle a été observée chez certaines plantes. C'est notamment le cas chez
le melon (Cucumis melo) avec le puceron Aphis gossypii. La résistance va dans ce cas être
contrôlée par un gène appelé Vat dont l'allèle dominant Vat+ confère une résistance au
puceron via la reconnaissance d'un effecteur inconnu (Dogimont et al. 2014). L'activation
des défenses va conduire à une baisse de fitness des pucerons en réduisant leur alimentation,
leur fécondité ainsi que leur survie. En effet, les pucerons qui vont essayer de se nourrir vont
rapidement retirer leur stylet et mourir ou alors se diriger vers des plantes sensibles. Cette
résistance peut provoquer des réponses microscopiques comme le dépôt de callose ou de
lignine (Dogimont et al. 2014). Il serait intéressant de recommencer l'expérience et de
chercher à observer d'éventuelles traces qui confirment ou non l'hypothèse de problèmes
d'installation. C'est également le cas chez la tomate (Solanum lycopersicum) avec le gène de
résistance Mi 1.2 qui permet de lutter contre les herbivores en les empêchant de se nourrir
(Pallipparambil et al. 2015). Ce gène possède un large spectre d'action contre plusieurs
espèces herbivores comme le puceron de la pomme de terre (Macrosiphum euphorbiae), la
mouche de la patate douce (Bemisia tabaci), le psyllide de la tomate (Bactericera cockerelli)
ou encore les nématode à noeud de racine (Meloidogyne sp.). Il permet également de lutter
contre un prédateur généraliste phytophage, la punaise pirate (Orius insidiosus)
(Pallipparambil et al. 2015). Enfin, le gène de résistance NLR1 à été identifié chez le pêcher
(Prunus persicae) contre Myzus persicae. Il a été mis en évidence grâce à une cartographie du
locus Rm3 et conférerait la même résistance aux pucerons, comme la baisse de fitness, que les
gènes cités précédemment chez le melon et la tomate (Pan et al. 2022).

Pour conclure, nous n'avons pas mis en évidence de génotypes résistants de *Vicia faba*
à *A. pisum* et *A. fabae*, ni de génotypes complètement résistant à *A. fabae*. Nous avons
cependant trouvé une différence de résistance entre les deux pucerons. Une nouvelle étude
serait nécessaire pour réussir à déterminer des génotypes de résistances. Une fois ceux-ci
trouvés, de nombreuses perspectives, citées précédemment, sont possibles.
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SÉLECTION PHÉNOTYPIQUE DE VARIÉTÉS RÉSISTANTES AUX PUCERONS *APHIS FABAE* ET *ACYRTHOSIPHON PISUM* CHEZ LA LÉGUMINEUSE *VICIA FABA* DANS UN BUT AGROÉCOLOGIQUE

Les plantes et les insectes sont en interaction depuis près de 390 millions d'années. Ces interactions peuvent prendre la forme d'antagonisme, comme chez les légumineuses et les pucerons. *Vicia faba* est une légumineuse à graine dont l'importance est non négligeable pour la transition agroécologique. Elle est attaquée par divers ravageurs tels que les pucerons du pois (*Acyrthosiphon pisum*) et de la féverole (*Aphis fabae*). Durant notre étude, nous avons cherché à identifier des génotypes sensibles et résistants de *Vicia faba* à ces deux pucerons ; s'il existe des résistances distinctes entre ces pucerons, qui sont spécialistes et généralistes ; et enfin s'il existe une résistance complète à *A. fabae* chez certains génotypes. Pour ce faire, la fécondité des pucerons a été mesurée, comme une mesure indirecte de la résistance, sur 251 génotypes de féveroles (premier crible). Lors d'un second crible sur 10 génotypes sélectionnés parmi les 251, nous n'avons pas retrouvé de différences significatives entre les génotypes sensibles et ceux partiellement résistants. Cependant, nous avons mis en évidence une différence de résistance des génotypes entre pucerons généralistes ou spécialistes. Pour un génotype sélectionné, *A. pisum* a produit significativement moins de larves qu*A. fabae* (3 et 30 respectivement). Enfin, nous n'avons pas trouvé de résistance complète à *A. fabae*, avec des proportions de zéro relativement faible lors du second crible. Une étude complémentaire serait utile afin d'établir de manière certaine la résistance de génotypes de féverole aux pucerons, ce qui permettrait à terme l'identification des gènes qui confèrent cette résistance.

MOTS-CLÉS - *Vicia faba*, *Acyrthosiphon pisum*, *Aphis fabae*, résistance, génotypes, fécondité

PHENOTYPIC SELECTION OF VARIETIES RESISTANT TO THE APHIDS *APHIS FABAE* AND *ACYRTHOSIPHON
PISUM* IN THE LEGUME *VICIA FABA* FOR AGROECOLOGICAL PURPOSES

Plants and insects have been interacting since 390 million years. These interactions can take
the form of antagonism, as in the case of legumes and aphids. *Vicia faba* is a seed legume of
considerable importance to the agro-ecological transition. It is attacked by various pests such
as pea aphids (*Acyrthosiphon pisum*) and faba bean aphids (*Aphis fabae*). During our study,
we tried to identify susceptible and resistant genotypes of *Vicia faba* to these two aphids; also
if there are distinct resistances between these aphids, which are specialists and generalists;
and finally if there is complete resistance to *A. fabae* in certain genotypes. To make this, aphid
fecundity was measured, as an indirect measure of resistance, on 251 faba bean genotypes
(first screen). In a second screening of 10 genotypes, selected from the 251, we found no
significant differences between susceptible and partially resistant genotypes. However, we
found a difference in genotype resistance between generalist and specialist aphids. For a
selected genotype, *A. pisum* produced significantly fewer larvae than *A. fabae* (3 and 30
respectively). Finally, we did not find complete resistance to *A. fabae*, with relatively low
proportions of zeros in the second screen. A further study would be useful to establish with
certainty the resistance of faba bean genotypes to aphids, which would eventually enable the
identification of the genes conferring this resistance.

KEY WORDS - *Vicia faba*, *Acyrthosiphon pisum*, *Aphis fabae*, *resistance*, *genotypes*, *fertility*