# Imagerie CARS multiplexée pour la discrimination sans marquage des protéines musculaires

Malik Nafa, Ludovic Trautmann, Ugo Arles Bottega, Tigran Mansuryan, Alessandro Tonello, Lionel Rechignat, Marc Fabert, Laetitia Magnol, Véronique Blanquet, Fabienne Baraige, et al.

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Malik Nafa, Ludovic Trautmann, Ugo Arles Bottega, Tigran Mansuryan, Alessandro Tonello, et al. Imagerie CARS multiplexée pour la discrimination sans marquage des protéines musculaires. IMO-TOP 2025 - Imagerie et résolution ultime, Réseau Optique et Photonique (ROP), Oct 2025, Vill neuve d'Ascq, France. hal-05324561

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Submitted on 21 Oct 2025

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# Imagerie CARS multiplexée pour la discrimination sans marquage des protéines musculaires

Malik Nafa¹, Ludovic Trautmann², Ugo Arles Bottega¹, Tigran Mansuryan¹, Alessandro Tonello¹, Lionel Rechignat¹, Marc Fabert¹, Laetitia Magnol³, Véronique Blanquet³, Fabienne Baraige³, Vincent Couderc¹, Claire Carrion⁴, Jean-René Duclère⁵, Claire Lefort¹

1. Université de Limoges, XLIM, UMR CNRS 7252, Limoges, France

2. Center for Visual Computing - OPIS Inria group, CentraleSupélec, University Paris-Saclay, Gif sur Yvette, France

3. Université de Limoges, Epidemiology of chronic diseases in tropical zone EpiMaCT, Inserm U1094, IRD U270, INRAE USC1501, Limoges, France

4. Université de Limoges, BISCEM, Microscopy core Facility, Limoges, France

5. Université de Limoges, IRCER, UMR CNRS 7315, Limoges, France

## Résumé

Depuis les années 80, de nombreuses stratégies d'optiques non linéaire ont été développées pour imager des cibles issues du vivant. On peut notamment citer la fluorescence biphotonique [Denk 1990, Denk 1995, Hamzeh 2015, Fischer 2016, Delmon 2023] basée sur un marquage externe des protéines d'intérêt, ou la génération de seconde harmonique (SHG) qui permet la détection sans marquage de protéines uniquement non centrosymétriques [Freund 1986, Aghigh 2023].

Durant cette période, l'apparition de sources laser pulsées femtosecondes a contribué à l'émergence de la microscopie CARS (Coherent Anti-stokes Raman Microscopy) [Zumbusch 1999, Pope 2012, Sheng 2023]. Une technique dérivée appelée multiplex-CARS (M-CARS) permet une acquisition simultanée d'un spectre Raman sur une large bande spectrale plutôt que point par point [Cheng 2002]. Cette technique a été développée dans notre équipe avec une source laser nanoseconde à 1064 nm, divisée en 2 faisceaux : un faisceau pompe, ainsi qu'un supercontinuum généré après passage dans une fibre PCF servant de faisceau Stokes.

Les techniques CARS permettent de détecter de nombreuses molécules organiques (lipides, protéines, sucres etc.) grâce à leur signature vibrationnelle, ce qui sert notamment pour la détection précoce de maladies cardiaques [Tolstik 2022]. Cependant la distinction entre 2 protéines reste un challenge à cause de la similarité des signatures vibrationnelles. Nous présentons ici une technique novatrice pour discriminer deux protéines du muscle, l'actine et la myosine, en utilisant le fond non résonnant (NRB) de leurs spectres Raman respectifs, un signal plus souvent considéré dans la littérature comme du bruit de fond à éliminer. Mais notre équipe a démontré son utilité dans la caractérisation spectrale de divers matériaux inorganiques [Capitaine 2016, Rajaofara 2019, Rajaofara 2021]. Dans ce nouveau travail, nous montrons que le NRB contient en réalité un signal de susceptibilité non résonnante d'ordre 3 de $\chi_{NR}^{(3)}$ qui fournit des informations discriminantes entre ces deux protéines. L'illustration est faite ici sur la discrimination entre les filaments d'actine et de myosine.

Nous travaillons sur du muscle de souris coupé en longitudinal afin de voir l'alternance entre filaments d'actine et de myosine (qui sont à la base des fibres musculaires). Notre approche est
multimodale : d'abord nous détectons la myosine grâce à son signal SHG endogène (Figure 1), puis nous acquérons le signal CARS sur une large bande spectrale de 3200 à 700 cm⁻¹ (Figure 2). L'analyse pixel par pixel du ratio entre contribution non résonante et résonante permet de mettre en évidence la localisation des filaments d'actine et ce sans marquage externe (Figure 3).

Notre travail est une preuve de concept qui démontre l'utilité de la contribution non résonante du spectre Raman pour discriminer différentes substances au sein d'une même famille. Pour continuer cette étude, des applications sur le modèle humain puis in vivo pourraient être envisagées afin de détecter des maladies musculaires avec une sonde spectrale. Cela ouvre la voie vers le remplacement des biopsies musculaires, habituellement réalisées pour ce genre de diagnostic, par des biopsies optiques.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1. Génération de signal SHG à 532 nm sur les filaments de myosine au sein du muscle de souris. A. Image de microscopie biphotonique. B. Image en lumière blanche issue du microscope M-CARS. Inset : image hyperspectrale (10 µm de côté, 10000 spectres) enregistrée à 532 nm.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 2. Exemple d'un spectre M-CARS du muscle de souris (parmi les 10000) sur la bande 700-3200 cm⁻¹. La zone utilisée pour discriminer l'actine et la myosine (correspondant au fond non résonant) se situe sur la bande 1700-2600 cm⁻¹.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 3. Exemples d'images hyperspectrales des filaments d'actine (rouge) et myosine (vert) discriminés par l'exploitation de la région non résonnante des données hyperspectrales M-CARS.</figcaption></figure>

## Remerciements

Ce travail a été partiellement financé par le LabEx Sigma-Lim ANR-10- LBX-0074, laboratoire d'excellence lancé par le ministère français de l'Enseignement supérieur et de la Recherche (https://www.unilim.fr/labex-sigma-lim). Nous remercions le MITI du CNRS qui a soutenu financièrement le projet Multikhi.

Ce travail a également été soutenu par l'Agence Nationale de la Recherche dans le cadre de deux programmes : (1) le programme France 2030, référence « ANR-24-RRII-0002 », géré par le programme Quadrant de l'Inria pour le projet $\chi$-MAIMa-PIQ n°id20250104 et (2) le programme T-ERC STG 2024 avec les références de projet « ANR-24-ERCS-0009-01 ». Les travaux expérimentaux ont été réalisés dans les installations PLATINOM, avec le soutien du Fonds européen de développement régional et de la région Nouvelle-Aquitaine (FEDER-PILIM 2015-2020 Nouvelle-Aquitaine).

## Références

[Denk 1990] W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, "Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy", Science, New Series, 248, 4951, pp. 73-76 (1990)

[Denk 1995] W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb, "Two-Photon Molecular Excitation in Laser-Scanning Microscopy", Handbook of Biological Confocal Microscopy, ed J Pawley (1995)

[Hamzeh 2015] H. Hamzeh, C. Lefort, F. Pain, D. Abi Haidar, "Optimization and characterization of nonlinear excitation and collection through a gradient-index lens for high-resolution nonlinear endomicroscopy", Optics Letters, vol. 40, no. 5, pp. 808 (2015)

[Fischer 2016] M. C Fischer, J. W Wilson, F. E Robles, W. S Warren, "Invited Review Article: Pump-probe microscopy", Review of Scientific Instruments, 87 (3), 031101 (2016)

[Delmon 2023] C. Delmon, E. Ferrandon, E. Chouzenoux, A. Prorot, S. Alain, C. Lefort, "A computational two-photon fluorescence approach for revealing label-free of viruses and bacteria", Journal of Biophotonics, vol. 16, no. 5 (2023)

[Freund 1986] I. Freund, M. Deutsch, "Second-harmonic microscopy of biological tissue", Optics Letters 11, 94-96 (1986)

[Aghigh 2023] A. Aghigh, S. Bancelin, M. Rivard, M. Pinsard, H. Ibrahim, F. Légaré, "Second harmonic generation microscopy: a powerful tool for bio-imaging", Biophysical Reviews, 15, 43-70 (2023)

[Zumbusch 1999] A. Zumbusch, G. R. Holtom, X. S. Xie, "Three-Dimensional Vibrational Imaging by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering", Physical Review Letters, 82 (20), 4142-4145 (1999)

[Pope 2012] I. Pope, W. Langbein, P. Borri, P. Watson, "Live cell imaging with chemical specificity using dual frequency CARS microscopy", Methods in Enzymology, 504, 273-291 (2012)

[Sheng 2023] M. Sheng, Y. Zhao, Z. Wu, J. Zhao, H. Lui, S. Kalia, H. Zeng, "Single source CARS-based multimodal microscopy system for biological tissue imaging", Biomedical Optics Express, 6, 15 (1), 131-141 (2023)
[Cheng 2002] J.-X. Cheng, A. Volkmer, L. D. Book, X. S. Xie, "Multiplex Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microspectroscopy and Study of Lipid Vesicles", J. Phys. Chem. B, 106, 8493-8498 (2002)

[Tolstik 2022] E. Tolstik, N. Ali, S. Guo, P. Ebersbach, D. Möllmann, P. Arias-Loza, J. Dierks, I. Schuler, E. Freier, J. Debus, H. A. Baba, P. Nordbeck, T. Bocklitz, K. Lorenz, "CARS Imaging Advances Early Diagnosis of Cardiac Manifestation of Fabry Disease", Int J Mol Sci, 11, 23 (10), 5345 (2022).

[Capitaine 2016] E. Capitaine, N. Ould Moussa, C. Louot, C. Lefort, D. Pagnoux, J. Duclère, J. Kaneyasu, H. Kano, L. Duponchel, V. Couderc, P. Leproux, "Coherent anti-Stokes Raman scattering under electric field stimulation", Physical Review B, vol. 94, no. 24 (2016).

[Rajaofara 2019] Z. Rajaofara, P. Leproux, E. Capitaine, H. Kano, T. Hayakawa, P. Thomas, J.-R. Duclère, V. Couderc, "Measurement of the third order nonlinear susceptibility of paratellurite single crystal using multiplex CARS", AIP Advances 9, 105301 (2019)

[Rajaofara 2021] Z. Rajaofara, P. Leproux, M. Dussauze, A. Tonello, V. Rodriguez, L. Karam, H. Kano, J. Duclére, V. Couderc, "Mapping the second and third order nonlinear susceptibilities in a thermally poled microimprinted niobium borophosphate glass", Optical Materials Express, vol. 11, no. 10, pp. 3411 (2021)