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Table des figures

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure 1 : Phases de vie en élevage cunicole adapté de Dutta, Sengupta (2018)</td>
      <td>3</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2 : Ingestion des lapereaux avant le sevrage (Gidenne, Lebas 2005)</td>
      <td>5</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3 : Anatomie générale et caractéristiques moyennes du tube digestif du lapin (Gidenne, Lebas 2006)</td>
      <td>6</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 4 : Anatomie du tube digestif adapté de Newberry, Gustafsson (2016)</td>
      <td>8</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 5 : Représentation de la structure du GALT avec les plaques de Peyer (Mowat 2003). TDA : zone reliée au thymus ; SED : dôme sub-épithélial</td>
      <td>9</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 6 : Localisation des sites immunitaires inducteurs digestifs matérialisés par les zones grisées (Fortun-Lamothe, Boullier 2007)</td>
      <td>9</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 7 : Origine des cellules immunitaires d'après Murphy, Weaver (2018)</td>
      <td>10</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 8 : Localisation des organes lymphoïdes primaires et secondaires du lapin (Fortun-Lamothe, Boullier 2007)</td>
      <td>11</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 9 : Structure des oligosaccharides du lait composés d'une chaîne principale (MOS Core) à laquelle peuvent s'ajouter des résidus fucosylés (formant les MO neutres) ou sialylés (formant les MO acides) (Ayechu-Muruzabal et al. 2018)</td>
      <td>14</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 10 : Schéma méthodologique</td>
      <td>20</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 11 : Protocole d'isolement des cellules mononuclées de la lamina propria</td>
      <td>22</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 12 : Graphique des densités des différents types cellulaires issu de l'étude de Yu et al. (2017) sur les cellules sanguines</td>
      <td>23</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 13 : Phases cellulaires observées après centrifugation dans le gradient de Percoll</td>
      <td>23</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 14 : Détail du déroulé d'un cycle de PCR</td>
      <td>27</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 15 : Effet de la composition de la solution de digestion enzymatique sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules par puits en fonction du temps, n = 1 lapereau, n = 4 puits/temps/modalités (réplicats techniques). Intra-temps, # : p &lt; 0, 1</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 16 : Effet du milieu de culture sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre moyen de cellules en fonction du temps (h) et du milieu de culture. Chaque courbe représente un lapin pour un milieu de culture, n = 2 lapereaux par milieu de culture et n = 3 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques)</td>
      <td>32</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 17 : Effet du 2-mercaptoéthanol sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont présentées en nombre de cellules, n = 2 lapereaux par milieu de culture et par temps, n = 2 puits/temps/modalités/lapereau 02 et n = 4 puits/temps/modalités/lapereau 03 (réplicats techniques). IMDM2me = milieu IMDM supplémenté avec 50 µM de 2-mercaptoéthanol</td>
      <td>32</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 18 : Effet du 2-mercaptoéthanol sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont présentées en nombre de cellules, n = 1 lapereau par milieu de culture et par temps et n = 4 puits/temps/modalités (réplicats techniques). Intra-temps, # : p &lt; 0, 1</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 19 : Effet du traitement à la PHA sur la viabilité et la prolifération des cellules immunitaires de la lamina propria en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules, n = 5 lapereaux par temps et par traitements (réplicats biologiques). Intra-temps # : p &lt; 0, 1. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre diffèrent (p &lt; 0, 05) avec les lettres grises associées au lot Control et les vertes au lot PHA</td>
      <td>38</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 20 : Effet du traitement à la PHA sur l'expression relative des cytokines des cellules en culture au cours du temps. Intra-temps * : p &lt; 0, 05 entre les échantillons Control et PHA. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre diffèrent (p-value &lt; 0, 05) avec les lettres</td>
      <td></td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
grises associées au lot Control et les lettres vertes au lot PHA. n = 4 individus, n = 3 individus pour le gène IL17, n = 2 individus pour le gène TNF et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). 39

Figure 21 : Effet du traitement à la PHA sur l'expression relative des marqueurs cellulaires des cellules en culture au cours du temps. Intra-temps # : p < 0, 1 entre les échantillons Control et PHA. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre diffèrent (p < 0, 05) avec les lettres grises associées au lot Control et les vertes au lot PHA, n = 3 individus, n = 2 individus pour le gène FOXP3 et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). 40

Figure 22 : Effet du traitement au LPS sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules, n = 4 individus par temps et par traitements (réplicats biologiques). 40

Figure 23 : Effet du traitement au LPS sur l'expression relative des gènes codant pour les cytokines des cellules immunitaires de la lamina propria en culture au cours du temps. Intra-temps * : p-value < 0, 05 entre les échantillons Control et LPS. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre diffèrent (p < 0, 05) avec les lettres grises associées au lot Control et les rouges au lot LPS. n = 4 individus, n = 3 individus pour IL6 et TGFβ et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). 41

Figure 24 : Effet du traitement au LPS sur l'expression relative du gène TLR4 des cellules immunitaires de la lamina propria en fonction du temps de culture, n = 3 individus et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). 42

Figure 25 : (A) Effet de l'âge sur le nombre de cellules obtenues à l'issu de l'isolement, n = 8 lapereaux lot 21-22 jours, n = 6 lapereaux lot 35-36 jours. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules. (B) Effet de l'âge sur le rendement cellulaire (nombre de cellules/g de tissu prélevé) à l'issu de l'isolement, n = 6 lapereaux lot 21-22 jours, n = 5 lapereaux lot 35-36 jours, les valeurs sont représentées en nombre de cellules par g de tissu. Un point correspond à un individu, les boxplots représentent la variabilité entre individus d'un même lot. 43

Figure 26 : (A) Effet de l'âge sur l'expression relative des gènes des cytokines des cellules traitées à la PHA au cours du temps, n = 2 individus de 21-22 jours, n = 2 individus de 35-36 jours, n = 1 individu par âge pour le gène TNF, n = 2 individus de 21-22 jours et 1 individus de 35-36 jours pour IL17 et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). (B) Effet de l'âge sur l'expression relative des marqueurs cellulaires des cellules en culture traitées à la PHA au cours du temps. n = 1 individu de 21-22 jours, n = 2 individus de 35-36 jours et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). 44

Figure 27 : (A) Effet de l'âge sur l'expression relative des cytokines des cellules en culture traitées au LPS au cours du temps. n = 2 individus de 21-22 jours, n = 2 individus de 35-36 jours, n = 1 individu de 35-36 jours pour les gènes IL6 et TGFβ et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). (B) Effet de l'âge sur l'expression relative du récepteur membranaire TLR4 des cellules en culture traitées au LPS au cours du temps. n = 2 individus de 21-22 jours, n = 1 individu de 35-36 jours et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). 45
Table des tableaux

<table><tr><td>Tableau 1 : Synthèse des avantages et inconvénients des deux méthodes de culture cellulaires en 2D</td><td>18</td></tr><tr><td>Tableau 2 : Composition des milieux de culture testés</td><td>24</td></tr><tr><td>Tableau 3 : Liste des articles conservés lors de la recherche bibliographique</td><td>25</td></tr><tr><td>Tableau 4 : Conditions testées pour les stimulations des cellules immunitaires en culture</td><td>25</td></tr><tr><td>Tableau 5 : Origine des principaux mitogènes utilisés dans la stimulation des cellules immunitaires</td><td>34</td></tr><tr><td>Tableau 6 : Conditions testées au sein des articles ayant recours à la stimulation par lectines mitogènes et mitogènes inflammatoires. PHA = phytohemagglutinin, ConA = concanavalin A, LPS = lipopolysaccharides, PWM = pokeweed mitogen</td><td>34</td></tr><tr><td>Tableau 7 : Liste des gènes testés en amont de la qPCR. L'ensemble des amorces non valides ont été écartées de l'étude. Une partie des amorces valides ont été utilisées sur nos échantillons, les autres permettront la réalisation de manipulations ultérieures</td><td>36</td></tr></table>
Table des matières

<table><tr><td>Remerciements</td><td>III</td></tr><tr><td>SOMMAIRE</td><td>IV</td></tr><tr><td>Sigles et abréviations</td><td>1</td></tr><tr><td>Introduction générale</td><td>1</td></tr><tr><td>PARTIE 1 : Contexte et enjeux de l'étude</td><td>2</td></tr><tr><td>1 Contexte général</td><td>3</td></tr><tr><td>1.1 Panorama de la filière cunicole : une filière implantée avec des enjeux sanitaires majeurs</td><td>3</td></tr><tr><td>1.2 Troubles digestifs et antibiotiques : une dépendance forte</td><td>4</td></tr><tr><td>1.3 Stratégies alimentaires réduisant les troubles digestifs en élevage cunicole</td><td>4</td></tr><tr><td>2 Le système digestif du lapin</td><td>5</td></tr><tr><td>2.1 Anatomie du tractus digestif du lapin</td><td>5</td></tr><tr><td>2.2 Le caecum : un fermenteur développé chez le lapin</td><td>6</td></tr><tr><td>3 La muqueuse digestive</td><td>7</td></tr><tr><td>3.1 Des barrières physiques et chimiques pour une défense optimale</td><td>7</td></tr><tr><td>3.2 Le GALT : un tissu immunitaire majeur</td><td>8</td></tr><tr><td>3.3 La lignée myéloïde : première ligne de défense du GALT</td><td>10</td></tr><tr><td>3.4 La lignée lymphoïde : des cellules activées au sein du GALT</td><td>11</td></tr><tr><td>4 Maturation de la muqueuse digestive et mécanismes</td><td>12</td></tr><tr><td>4.1 Maturation immunitaire de l'hôte</td><td>12</td></tr><tr><td>4.2 Maturation du microbiote intestinal</td><td>13</td></tr><tr><td>4.3 Lait maternel et composés favorisant la maturation digestive</td><td>14</td></tr><tr><td>5 La culture cellulaire : un outil pour l'étude des mécanismes d'action de composés alimentaires</td><td>15</td></tr><tr><td>5.1 Une méthode exigeante</td><td>15</td></tr><tr><td>5.2 Choix du milieu de culture, paramètre clé</td><td>16</td></tr><tr><td>5.3 La culture cellulaire : culture primaire ou lignées cellulaires</td><td>17</td></tr><tr><td>6 Problématique</td><td>18</td></tr><tr><td>PARTIE 2 : Démarche et méthodologie d'étude</td><td>19</td></tr><tr><td>1 Phase 1 : Optimisation de la méthode d'isolement</td><td>21</td></tr><tr><td>1.1 Animaux et matériel biologique nécessaire à l'isolement des cellules</td><td>21</td></tr><tr><td>1.2 Isolement des cellules mononucléées de la lamina propria</td><td>21</td></tr><tr><td>2 Phase 2 : Mise en place de la méthode de culture</td><td>23</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>3</td>
      <td>Phase 3 : La stimulation des cellules en culture</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1</td>
      <td>Recherches bibliographiques</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>Stimulation in vitro des LPMC de lapin</td>
      <td>25</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4</td>
      <td>Phase 4 : Mesures de la viabilité et prolifération cellulaires et la réponse immunitaire des LPMC</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.1</td>
      <td>Mesures et analyses de prolifération</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2</td>
      <td>Mesure de l'expression des gènes : RT-qPCR</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2.1</td>
      <td>Extraction d'ARN</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2.2</td>
      <td>Transcription inverse</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2.3</td>
      <td>La PCR quantitative</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2.4</td>
      <td>Design des amorces et mesure de l'efficacité d'amplification</td>
      <td>27</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5</td>
      <td>Phase 5 : Calcul et analyse de données</td>
      <td>28</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1</td>
      <td>Traitement des données</td>
      <td>28</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1.1</td>
      <td>Nombre de cellules au cours du temps : données de luminescence</td>
      <td>28</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1.2</td>
      <td>Expression relative des gènes : données de qPCR</td>
      <td>28</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2</td>
      <td>Analyse des données avec le logiciel R</td>
      <td>29</td>
    </tr>
    <tr>
      <td colspan="2">PARTIE 3 : Résultats obtenus</td>
      <td>30</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1</td>
      <td>Optimisation de la méthode d'isolement des cellules immunitaires de la lamina propria</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2</td>
      <td>Mise en place de la culture cellulaire</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1</td>
      <td>Choix du milieu de synthèse</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2</td>
      <td>Supplémentation en 2-mercaptoéthanol</td>
      <td>32</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3</td>
      <td>La stimulation des cellules immunitaires : choix des stimulants et des marqueurs de réponse</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1</td>
      <td>Bilan des recherches bibliographiques : molécules, doses et durées de stimulation</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>Bilan des recherches bibliographiques : choix des indicateurs de réponse à la stimulation</td>
      <td>35</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3</td>
      <td>L'étude des marqueurs de réponse à la stimulation : évaluation des couples d'amorces de qPCR</td>
      <td>36</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4</td>
      <td>Concentration en ARN au sein des prélèvements des cellules stimulées</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4</td>
      <td>La réponse des cellules immunitaires de la lamina propria en culture à la stimulation à la PHA</td>
      <td>38</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.1</td>
      <td>Impact sur la viabilité et la prolifération cellulaire</td>
      <td>38</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2</td>
      <td>Expression des gènes codant pour les cytokines en réponse à la stimulation</td>
      <td>38</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.3</td>
      <td>Expression des gènes codant pour les marqueurs cellulaires de l'immunité en réponse à la stimulation</td>
      <td>39</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5</td>
      <td>La réponse des cellules immunitaires de la lamina propria en culture à la stimulation au LPS</td>
      <td>40</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1</td>
      <td>Impact sur la viabilité et la prolifération cellulaire</td>
      <td>40</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>5.2</td><td>Expression des gènes codant pour les cytokines en réponse à la stimulation</td><td>41</td></tr><tr><td>5.3</td><td>Expression du gène codant pour le récepteur membranaire TLR4 en réponse à la stimulation au LPS</td><td>42</td></tr><tr><td>6</td><td>Effets de l'âge des individus prélevés sur les résultats d'expérimentations</td><td>42</td></tr><tr><td>6.1</td><td>Effet de l'âge des individus sur le nombre de cellules isolées</td><td>42</td></tr><tr><td>6.2</td><td>Effet de l'âge des individus sur l'expression des gènes d'intérêt</td><td>43</td></tr><tr><td colspan="2">PARTIE 4 : Discussion et propositions</td><td>46</td></tr><tr><td>1</td><td>Optimisation de la méthode d'isolement des cellules</td><td>47</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Choix méthodologique</td><td>47</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Limites du protocole appliqué et perspectives d'optimisations ultérieures</td><td>48</td></tr><tr><td>2</td><td>Mise en place de la culture cellulaire : influence du milieu de culture</td><td>49</td></tr><tr><td>2.1</td><td>Le choix du milieu de synthèse</td><td>49</td></tr><tr><td>2.2</td><td>Supplémentation en 2-mercaptoéthanol</td><td>50</td></tr><tr><td>2.3</td><td>Des limites à l'optimisation de la culture cellulaire</td><td>50</td></tr><tr><td>3</td><td>La stimulation des cellules immunitaires</td><td>51</td></tr><tr><td>3.1</td><td>Exploration bibliographique : choix des stimulants et marqueurs de réponse</td><td>51</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Les effets de la stimulation à la PHA</td><td>52</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Les effets de la stimulation au LPS</td><td>53</td></tr><tr><td>3.4</td><td>Effets de l'âge des individus sur la réponse aux stimulations</td><td>54</td></tr><tr><td>3.5</td><td>Limites de la fiabilité des résultats obtenus par qPCR</td><td>54</td></tr><tr><td>4</td><td>Perspectives</td><td>55</td></tr><tr><td>4.1</td><td>Isolement des cellules</td><td>55</td></tr><tr><td>4.2</td><td>Méthodes d'évaluation de l'impact des stimulations</td><td>55</td></tr><tr><td>4.3</td><td>Applications aux évaluations d'impacts de composés nutritionnels ou microbiens</td><td>56</td></tr><tr><td colspan="2">Conclusion générale</td><td>57</td></tr><tr><td colspan="2">Références bibliographiques</td><td>58</td></tr><tr><td colspan="2">Table des figures</td><td>67</td></tr><tr><td colspan="2">Table des tableaux</td><td>69</td></tr><tr><td colspan="2">Table des matières</td><td>70</td></tr><tr><td colspan="2">Table des annexes</td><td>91</td></tr></table>
ANNEXES
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Annexe 1 : Préparation du tissu en amont de l'isolement des LPMC</figcaption></figure>
<table><caption>Annexe 2 : Poids des tissus des individus utilisés lors des expérimentations</caption><thead><tr><th>Individus</th><th>Age (j)</th><th>Génétique</th><th>Poids individu (g)</th><th>Poids caecum plein (g)</th><th>Poids tissu préparé (g)</th><th>Poids tissu préparé par tube (g tube 1/ g tube 2)</th><th>Date de la manipulation</th></tr></thead><tbody><tr><td>Echantillon de cellules congelées (6,5.10<sup>6</sup> cellules)</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>18/01/2022</td></tr><tr><td>3 échantillons de cellules congelées (16,10<sup>6</sup> cellules)</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>25/01/2022</td></tr><tr><td>0,1</td><td>25</td><td>1777</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>02/02/2022</td></tr><tr><td>0,2</td><td>28</td><td>1777</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>07/02/2022</td></tr><tr><td>0,3</td><td>36</td><td>1777</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>22/02/2022</td></tr><tr><td>Individu 1</td><td>21</td><td>1777</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>28/03/2022</td></tr><tr><td>Individu 2</td><td>21</td><td>1777</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>28/03/2022</td></tr><tr><td>Individu 3</td><td>21</td><td>(1777 x bélier) x (1777 x fauve)</td><td>242</td><td>3</td><td>1,5</td><td>0,7/0,8</td><td>11/04/2022</td></tr><tr><td>Individu 4</td><td>21</td><td>(1777 x bélier) x (1777 x fauve)</td><td>279</td><td>6</td><td>1,7</td><td>0,7/1</td><td>11/04/2022</td></tr><tr><td>Individu 5</td><td>35</td><td>1777</td><td>820</td><td>87,5</td><td>4,2</td><td>2,1/2,1</td><td>11/04/2022</td></tr><tr><td>Individu 6</td><td>35</td><td>1777</td><td>855</td><td>85</td><td>4,2</td><td>2,1/2,1</td><td>11/04/2022</td></tr><tr><td>Individu 7</td><td rowspan="2">22</td><td rowspan="2">(1777 x bélier) x (1777 x fauve)</td><td>247</td><td>3,5</td><td>1,5</td><td>0,7/0,8</td><td rowspan="2">12/04/2022</td></tr><tr><td>Individu 8</td><td>259</td><td>3</td><td>1,3</td><td>0,7/0,5</td></tr><tr><td>Individu 9</td><td rowspan="2">35</td><td rowspan="2">(1777 x bélier) x (1777 x fauve)</td><td>660</td><td>65</td><td>3</td><td>1,7/1,3</td><td rowspan="2">25/04/2022</td></tr><tr><td>Individu 10</td><td>792</td><td>49,5</td><td>2,9</td><td>1,6/1,3</td></tr><tr><td>Individu 11</td><td>17</td><td>1777</td><td>102</td><td>3,72</td><td>3,12</td><td>0,6/0,6</td><td>05/05/2022</td></tr><tr><td>Individu 12</td><td rowspan="2">21</td><td rowspan="2">(1777 x bélier) x (1777 x fauve)</td><td>390</td><td>4,5</td><td>1,5</td><td>0,9/0,6</td><td rowspan="2">16/05/2022</td></tr><tr><td>Individu 13</td><td>310</td><td>4,8</td><td>1,6</td><td>0,9/0,7</td></tr><tr><td>Individu 14</td><td>36</td><td>1777</td><td>/</td><td>80,5</td><td>3,8 / 3,8</td><td>1,8 / 2 - 1,8 / 2</td><td>31/05/2022</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Annexe 3 : Comparaison des milieux de culture IMDM et RPMI, le remplissage vert indique la similitude entre les deux milieux (Fisher scientific 2022a; 2022b)</caption><thead><tr><th>Milieu de culture</th><th>IMDM GlutaMAX Supplement</th><th>RPMI 1640 supplément GlutaMAX, HEPES</th></tr></thead><tbody><tr><td>Lien</td><td>https://www.fishersci.fr/shop/products/gibco-imdm-glutamax-supplement-hepes-2/12539089</td><td>https://www.fishersci.fr/shop/products/gibco-rpmi-1640-medium-glutamax-liquid-supplement-hepes-4/11569726</td></tr><tr><td>Utilisation</td><td>Macrophages</td><td>Lymphocytes</td></tr><tr><td>Marque</td><td>Gibco™ 31980030</td><td>Gibco™ 72400047</td></tr><tr><td>Modification</td><td>GlutaMAX™, du rouge de phénol ; sans a-thioglycérol, sans 2-mercaptoéthanol</td><td>GlutaMAX™, rouge de phénol, HEPES</td></tr><tr><td>Présence</td><td>Sélénium, acides aminés, vitamines supplémentaires</td><td>Biotine, vitamine B12 et PABA, vitamines inositol et choline à concentrations élevées, agent de réduction glutathion</td></tr><tr><td>Absence</td><td>Fer, nitrate de potassium remplaçant le nitrate ferrique et ne contient ni protéines, ni lipides, ni facteurs de croissance</td><td>Ne contient ni protéines, ni lipides, ni facteurs de croissance</td></tr><tr><td>Supplément</td><td>GlutaMAX, pour limiter l'accumulation d'ammoniac toxique et améliorer la croissance et la viabilité cellulaires dans un format facile à utiliser</td><td>GlutaMAX™ qui limite l'accumulation d'ammoniac toxique et améliore la croissance ainsi que la viabilité cellulaires dans un format facile à utiliser</td></tr><tr><td>A ajouter</td><td>10 % de SVF</td><td>10 % SVF</td></tr><tr><td>Système de tampon</td><td>Tampon au bicarbonate de sodium (3,024 g / l) et nécessite donc un environnement contenant 5 à 10 % de CO2 pour préserver le pH physiologique</td><td>Tampon au bicarbonate de sodium (2,0 g / l) et nécessite donc un environnement contenant 5 à 10 % de CO2 pour préserver le pH physiologique</td></tr><tr><td>Stérilité</td><td>Sterile-filtered</td><td>Sterile-filtered</td></tr><tr><td>Volume</td><td>500 ml</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Forme</td><td>Liquide</td><td>Liquide</td></tr><tr><td>Indicateur</td><td>Rouge de phénol</td><td>Rouge de phénol</td></tr><tr><td>Additif</td><td>Pyruvate de sodium</td><td>Sans pyruvate de sodium</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Haute teneur en glucose</td><td></td></tr><tr><td>Tampon</td><td>HEPES</td><td>HEPES</td></tr></tbody></table>
Annexe 4 : Exemple de plan de plaque de culture

<table><thead><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B</td><td></td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>Bianc</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>IMDM sans 2-mercaptoethanol</td></tr><tr><td>C</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E</td><td></td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>Bianc</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>IMDM avec 2-mercaptoethanol</td></tr><tr><td>F</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
<table><caption>Annexe 5 : Séquences des amorces réalisées au cours du stage</caption><thead><tr><th>Nom amorces</th><th>Nom du gène</th><th>Espèces séquences ARNm</th><th>N° accession</th><th>Espèces utilisées pour dessins amorce</th><th>N° exons concernés</th><th>Longueur de l'intron entre les 2 exons concernés</th><th>Longueur amplicon</th><th>Amorce foward</th><th>Temp am. Gauche</th><th>Amorce reverse</th><th>Temp. Am. Droite</th><th>Design</th><th>dimères amorces</th><th>Efficacité qPCR</th><th>R²</th><th>Organe test</th></tr></thead><tbody><tr><td>CD11b</td><td>ITGAM</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_002721749.3</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>17 et 18</td><td>2427</td><td>130</td><td>AGTGTGTTTGAGTGTCGGGAG</td><td>60,03</td><td>CGTAAGTGATGGTGCTCTGG</td><td>61,3</td><td>Mathilde</td><td>Leger</td><td>92%</td><td>0,91</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>ITGAM</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_002721749.3</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>6 et 7</td><td>1581</td><td>125</td><td>CTTCCTCCAAAGACTCCCTGAC</td><td>60,2</td><td>TCCCAGGTAAGCATCGGACTC</td><td>58,35</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>96%</td><td>0,95</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>ITGAX</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_017337775.1</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>20 et 21</td><td>3650</td><td>121</td><td>GATGGCGAAGACTCCTACGG</td><td>59,97</td><td>TGCACATGTCAGACGCAGG</td><td>60,32</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>106%</td><td>0,95</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>ITGAX</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_017337775.1</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>20 et 21</td><td>3650</td><td>119</td><td>GGCGAAGACTCCTACGGAAC</td><td>60,18</td><td>CTGTCACATGTCAGACGCAG</td><td>58,93</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>75%</td><td>0,99</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>ITGAX</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_017337775.1</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>17 et 18</td><td>2467</td><td>108</td><td>GCAAGAACTTGGCTTGGACC</td><td>59,68</td><td>ACCAGGGAGAAGTTGAGACG</td><td>59,03</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>88%</td><td>0,97</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>CD69</td><td>CD69</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_017343428.1</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>2 et 3</td><td>951</td><td>135</td><td>AGCAAGTCACGAAGGGTCTC</td><td>59,68</td><td>GAGAACTCACACTGGCTCGG</td><td>60,39</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>91%</td><td>0,97</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>CD69</td><td>CD69</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_017343428.1</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>1 et 2</td><td>3930</td><td>143</td><td>TTCACTTGGCCCGCGATTAC</td><td>61,02</td><td>TCGTGACTTGCTGCAAAACG</td><td>59,97</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>88%</td><td>0,96</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>FOXP3</td><td>FOXP3</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_002719910.3</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>9 et 10</td><td>1248</td><td>132</td><td>TTCAAGTTCCACAACATGCGG</td><td>59,66</td><td>GAAGAAGGCGAACATGCGAG</td><td>59,63</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>83%</td><td>0,98</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>FOXP3</td><td>FOXP3</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_002719910.3</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>5 et 6</td><td>852</td><td>103</td><td>AGGTCTTTGAGGAGCCAGAG</td><td>58,73</td><td>TGTACCACCTCTCTCTGGAGG</td><td>59,99</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>87%</td><td>0,94</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>JCHAIN</td><td>JCHAIN</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_008267769.2</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>2 et 3</td><td>5131</td><td>138</td><td>AGTGTGTCCGCATCACTTCC</td><td>60,32</td><td>CGGTTCTCAATGGTGAGGTG</td><td>58,56</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>90%</td><td>0,98</td><td>Caecum</td></tr><tr><td>JCHAIN</td><td>JCHAIN</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>XM_008267769.2</td><td>Oryctolagus cuniculus</td><td>2 et 3</td><td>5131</td><td>137</td><td>AATGCCAGTGTGTCCGCATC</td><td>61,31</td><td>CAATGGTGAGGTGGGATCAGAG</td><td>60,42</td><td>Mathilde</td><td>Non</td><td>93%</td><td>0,93</td><td>Caecum</td></tr></tbody></table>
Annexe 6 : Mesure de luminescence à T0 d'une expérimentation du protocole 2. Le premier tableau correspond au plan de plaque, le second tableau donne les résultats du signal lumineux. A partir de ces derniers nous obtiendrons le nombre de cellules vivantes en culture.

<table><thead><tr><th colspan="12">Protocol Description</th></tr><tr><td colspan="12">Protocol name: ck2201luciferase2-2-22</td></tr><tr><td colspan="12">Result File name: \Thumb Drive\Promega\Data\CSV\isolementT0_ck2201luciferase2-2-22_2-2-2022_5-50-59 PM.csv</td></tr><tr><td colspan="12">Total steps: 1</td></tr><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000|Blanc</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>IMDM</td></tr><tr><td>B</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000|Blanc</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>RPMI</td></tr><tr><td>C</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>F</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>G</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table><thead><tr><th colspan="12">Step 1 Luminescence. 1 repeat. 96 well plate</th></tr><tr><th colspan="12">PlateResults</th></tr><tr><td colspan="12">Read 1</td></tr><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th><th>11</th><th>12</th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>1974290</td><td>2042630</td><td>1844600</td><td>663,021 X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>B</td><td>2011180</td><td>2012020</td><td>2058210</td><td>730,025 X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>C</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>D</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>E</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>F</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>G</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>H</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr></tbody></table>
Annexe 7 : Quantités d'ARN après extraction, les individus manquants sont ceux dont les cellules n'ont pas été prélevées, les individus 2 et 11 n'ont pas été utilisés pour raisons techniques

<table><thead><tr><th></th><th>Milieu de culture</th><th>Quantité de puits pour le prélèvement des cellules (Trizol)</th><th>Quantité d'ARN après extraction (ng/ul) pool 1</th><th>Quantité d'ARN après extraction (ng/ul) pool2</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Individu 1</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>28,890<br>7,139<br>6,506<br>10,05</td><td>42,490<br>6,663<br>1,953<br>5,482</td></tr><tr><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>28,890<br>3,541<br>3,492<br>5,619</td><td>42,490<br>2,229<br>4,474<br>7,336</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Individu 2</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>2,235<br>1,59<br>4,678<br>5,978</td><td>12,070<br>5,809<br>8,470<br>8,702</td></tr><tr><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>2,235<br>2,179<br>6,339<br>22,37</td><td>12,070<br>1,063<br>3,742<br>11,570</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Individu 4</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>1 réplicat technique : 3 puits</td><td>3,675<br>2,201<br>1,224</td><td>/<br>/<br>/</td></tr><tr><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>1 réplicat technique : 3 puits</td><td>2,766<br>0,827<br>2,089<br>2,741</td><td>/<br>/<br>/<br>/</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Individu 5</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>1,86<br>2,825<br>2,972<br>17,30</td><td>3,492<br>4,108<br>6,014<br>11,79</td></tr><tr><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>1,86<br>3,211<br>7,541<br>4,873</td><td>3,492<br>3,579<br>2,644<br>11,540</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Individu 6</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>1,696<br>2,147<br>1,840<br>2,380</td><td>2,966<br>2,857<br>1,529<br>3,029</td></tr><tr><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>1,696<br>2,691<br>1,991<br>1,979</td><td>2,966<br>1,635<br>1,765<br>1,922</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Pool individu 7 et 8</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>1 réplicat technique : 4 puits</td><td>2,973<br>3,471<br>9,183<br>6,455</td><td>/<br>/<br>/<br>/</td></tr><tr><td>IMDM 10% SVF + Gentamycin (6 µg/ml) + 2-mercaptoethanol (50 µM) = 1 µg/ml LPS</td><td>1 réplicat technique : 4 puits</td><td>2,973<br>6,601<br>5,804<br>10,901</td><td>/<br>/<br>/<br>/</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Pool individu 9 et 10</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits et 3 puits</td><td>4,624<br>8,639<br>6,036<br>5,042</td><td>2,079<br>3,116<br>4,216</td></tr><tr><td>IMDM 10% SVF + Gentamycin (6 µg/ml) + 2-mercaptoethanol (50 µM) = 1 µg/ml LPS</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits et 3 puits</td><td>3,825<br>3,642<br>16,901</td><td>4,225<br>4,723<br>5,149</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Individu 11</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>T0</td><td>1,978<br>2,861<br>4,373<br>4,471<br>3,824</td><td>/<br>/<br>2,585<br>26,800<br>4,349</td></tr><tr><td>IMDM 10% SVF + Gentamycin (6 µg/ml) + 2-mercaptoethanol (50 µM) = 1 µg/ml LPS</td><td>2 réplicats techniques : 3 puits chacun</td><td>2,861<br>2,842<br>12,910<br>3,346</td><td>7<br>5,901<br>3,760<br>28,640</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td rowspan="3">Pool individu 12 et 13</td><td>IMDM Glutamax supplémenté 10 % SVF + 6 µg/ml gentamycin + 2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>4,409<br>4,091<br>2,597<br>2,943</td><td>19,400<br>4,346<br>2,957<br>2,685</td></tr><tr><td>IMDM 10% SVF + Gentamycin (6 µg/ml) + 2-mercaptoethanol (50 µM) = 1 µg/ml LPS</td><td>2 réplicats techniques : 4 puits chacun</td><td>4,409<br>4,018<br>5,528<br>3,266</td><td>19,400<br>5,077<br>3,237<br>4,819</td></tr><tr><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Annexe 8 : Nombre de cellules isolées pour les individus utilisés lors des expérimentations</caption><thead><tr><td>Individus</td><td>Age</td><td>Date de la manipulation</td><td>Nombre de cellules après isolement</td></tr></thead><tbody><tr><td>0.1</td><td>25</td><td>02/02/2022</td><td>13 500 000</td></tr><tr><td>0.2</td><td>28</td><td>07/02/2022</td><td>10 000 000</td></tr><tr><td>0.3</td><td>36</td><td>22/02/2022</td><td>20 800 000</td></tr><tr><td>1</td><td>21</td><td>28/03/2022</td><td>8 520 000</td></tr><tr><td>2</td><td>21</td><td>28/03/2022</td><td>1 098 000</td></tr><tr><td>3</td><td>21</td><td>11/04/2022</td><td>7 960 000</td></tr><tr><td>4</td><td>21</td><td>11/04/2022</td><td>4 000 000</td></tr><tr><td>5</td><td>35</td><td>11/04/2022</td><td>10 620 000</td></tr><tr><td>6</td><td>35</td><td>11/04/2022</td><td>10 940 000</td></tr><tr><td>Pool 7 et 8</td><td>22</td><td>12/04/2022</td><td>4 600 000</td></tr><tr><td>Pool 9 et 10</td><td>35</td><td>25/04/2022</td><td>6 440 000</td></tr><tr><td>11</td><td>17</td><td>05/05/2022</td><td>1 460 000</td></tr><tr><td>Pool 12 et 13</td><td>21</td><td>16/05/2022</td><td>6 040 000</td></tr><tr><td>14</td><td>36</td><td>31/05/2022</td><td>14 000 000</td></tr></tbody></table>
Annexe 9 : Protocole d'isolement des cellules mononucléées de la lamina propria du caecum des lapereaux

<table><tr><td>Protocole CK2201</td><td>7 février 2022</td></tr><tr><td colspan="2">Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de lapereaux</td></tr><tr><td colspan="2">(adapté de Weigmann et al. 2007)</td></tr></table>

## ➤ MATERIEL

- Ciseaux

- Pinces

- Boîtes de Pétri (1/échantillon)

- Incubateur thermique (étuve)

- Unité de rotation

- Tamis cellulaires de 40 (2/échantillons) et 100 µm (4/échantillons) (Falcon ; BD)

- Tubes de 15 (2/échantillons) et 50 ml (11/échantillons + 6 pour les solutions)

- Tubes de 1,5 ml

- Centrifugeuse pour culture cellulaire

- Pipettes sérologiques

- Cellules de malassez pour comptage

- Microscope

- Vortex

- Pipetboy

- Bain marie

- P10, P100 et P1000 + pointes à filtres

- PSM

- Cryotubes 1,8 ml (si cryoconservation des cellules)

- Tubes FACS

## ➤ REACTIFS

- PBS 1X froid (à mettre à 4°C la veille)

- PBS 1X à 37°C (à mettre à l'étuve la veille)

- Solution de prédigestion PD : HBSS (sans Ca et Mg) + 5mM EDTA + 1 mM DTT

- Solution de digestion D : PBS + Collagenase + DNase I + dispase II (x2)
  7,5 mg de collagenase D Sigma 11088858001
  7,5 mg de DNase I Sigma 10104159001
  45 mg de dispase II Sigma D4693-1G
  15 ml de PBS à 37°C

- Percoll 100% : 2,5ml de NaCl 1,5M + 22,5ml de percoll

- Percoll 80% : 12ml percoll 100% + 3 ml PBS 1X

- Percoll 40% : 10ml percoll 100% + 15 ml PBS 1X

- Tampon FACS: 3% (vol/vol) SVF dans PBS

- Tampon FACS2 : Tampon FACS + 2 mM d'EDTA
Protocole CK2201

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de lapereaux
(adapté de Weigmann et al. 2007)

7 février 2022

- Solution de bleu trypan 0,4%
  1 PBS, solution de bleu Trypan (0,4% (pt/vol) dans HBSS).
  ! ATTENTION Utiliser des gants lors de la préparation et de l'utilisation car le bleu Trypan est cancérigène.

- Solution de Cryoconservation : 80% SVF + 20% DMSO

- Milieu IMDM supplémenté avec 2-mercaptoethanol

- Milieu IMDM supplémenté sans 2-mercaptoethanol

- Kit CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega, ref : G7570)

► **PRELEVEMENTS ET PREPARATION DES TISSUS**

A Pectoul

1| Prélever le caecum (avec appendice vermiforme) et le placer dans du PBS froid.

Au labo

2| Enlever l'appendice vermiforme ainsi qu'un centimètre de caecum à partir de la jonction iléo-cæcale. Retirer le mésentère et la graisse précautionneusement à la pince si présente. Faire des sections de 4-5 cm de caecum (1 section par tube ; prévoir 2 morceaux/individu et les tubes associés). Ouvrir les morceaux de caecum longitudinalement (sur l'axe du mésentère), et enlever le contenu en rinçant dans du PBS froid. Si le contenu est « collant » ou abondant enlever la majorité à la spatule avant en veillant à ne pas abimer le tissu.

3| Couper en morceaux de 1 cm et les laver dans du PBS froid.

► **RETRIRER LES LIE (LYMPHOCYTES INTRA EPITHELIAUX) ET LES CELLULES EPITHELIALES**

4| Incuber les morceaux de caecum dans 5 ml de solution de prédigestion (PD) dans des tubes de 50 ml (numéroté PD1) pendant 20 min à 37° sous rotation lente (40g) dans un incubateur thermique.

5| Secouer vigoureusement les tubes pendant 1 min. Passer les morceaux restants dans un tamis cellulaire de 100 µm; L'écoulement contient du contenu colique avec des cellules épithéliales et peut être décanté ou conservé pour l'isolement des IEL. Dans le cadre de ce protocole il est jeté.

6| Remettre les morceaux dans un nouveau tube de 50 ml de solution de prédigestion (numéroté PD2) et incuber à nouveau les morceaux pendant 20 minutes à 37°C sous rotation lente.

7| Secouer vigoureusement les tubes pendant 1 min. Passer les morceaux à travers un tamis cellulaire de 100 µm. Recueillir le tissu dans des tubes de 50 ml contenant 10 ml de PBS à 37°C et incuber 2*5 min à 37° sous rotation lente (40g) dans un incubateur thermique pour retirer l'EDTA puis passer les morceaux à travers un tamis cellulaire de 100 µm. A l'aide de ciseaux, coupez le tissu restant en morceaux de 1 mm.
Protocole CK2201

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de lapereaux

(adapté de Weigmann et al. 2007)

7 février 2022

➤ **ISOLER LES LPMC (CELLULES MONONUCLEES DE LA LAMINA PROPRIA)**

7' | **Préparer la solution de digestion et l'incuber à 37°C quelques minutes**

Recueillir le tissu dans des tubes de 50 ml (numéroté D1) contenant 5 ml de solution de digestion (D). Digérer en incubant les morceaux à 37°C pendant 20 min sous rotation lente.

8| Après incubation, vortexer intensément la solution cellulaire pendant 20 s et la faire passer dans un tamis cellulaire de 40 µm placé au-dessus d'un tube de 50 ml (numéroté C1). Laver en ajoutant 20 ml de tampon FACS froid et centrifuger 10 min à 500g à 4°C.

9| Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de tampon FACS froid. Stocker dans la glace.

10| Préparer la solution de digestion et l'incuber à 37°C quelques minutes

Recueillir tous les morceaux présents dans le tamis cellulaire et les placer dans des tubes de 50 ml avec une solution de digestion fraîche (numéroté D2). Digérer en incubant les morceaux à 37°C pendant 20 min sous rotation lente puis répéter les étapes 8 et 9 en collectant la suspension dans un tube de 50 ml numéroté C2. Idéalement, tous les morceaux de caecum devraient être digérés en petits morceaux invisibles.

11| Combinez les suspensions cellulaires de toutes les étapes de digestion (tubes C1 et C2) dans le tube C1 et centrifuger les cellules à 500g pendant 5 minutes à 20°C.

12| Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 10 ml de solution à 40% de Percoll.

13| A l'aide d'une pipette Pasteur, superposer soigneusement la suspension cellulaire sur 5 ml de solution à 80% de Percoll dans un tube de 15 ml (numéroté P).

14| Centrifuger le gradient Percoll 40/80 pendant 15 minutes à 1 000g (2,400 r.p.m.) à 20°C sans freins. Les cellules mononucléées de la LP (LPMC) devraient être visibles dans un anneau blanc a l'interface entre les 2 solutions de Percoll. Les érythrocytes contaminants devraient être visibles dans un anneau rouge sous-jacent. En haut se trouve une couche de cellules épithéliales et au fond des débits cellulaires et cellules mortes.

15| Recueillir soigneusement les LPMC dans un nouveau tube de 50 ml à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter 20 ml de tampon FACS (numéroté Final). Centrifuger à 500g pendant 5 min.

16| Retirer le surnageant par aspiration sur la paroi du tube pour récupérer un culot sec.

17| Resuspendre immédiatement les cellules dans 1 ml de tampon FACS2 et pooler les duplicats. Transférer la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 15 ml (le culot accroche mieux dans les tubes de 15ml que 50 pour ne pas perdre de cellules par la suite).

18| Pour tester la viabilité et le nombre de cellules extraites, effectuer un rapide test d'exclusion au bleu Trypan.

➤ **COMPTAGE**
Protocole CK2201

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de lapereaux

(adapté de Weigmann et al. 2007)

7 février 2022

Bien homogénéiser la suspension cellulaire en amont du comptage, les cellules sédimentant très rapidement

1. Placer 10 µl de suspension cellulaire sur l'hémocytomètre (entre la lame de comptage et la lamelle) et compter les cellules (attention à bien vérifier les paramètres du compteur, notamment concernant la correction bleu trypan)

2. Refaire l'opération avec la coloration bleu trypan (mélange 1 :1)
Annexe 10 : Protocole de mise en culture et stimulation des cellules à la PHA (n = 4 individus pour cette expérimentation)

Protocole CK2201 - PHA

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de 2
lapereaux

(adapté de Weigmann et al. 2007)

11 avril 2022

> **PRELEVEMENT DES CELLULES POUR L'ANALYSE D'EXPRESSION A T0**

20 | Prélever l'équivalent de 8.10<sup>s</sup> cellules et transférer les dans un 1 tube falcon de 15 ml noté T0 PHA 3/4.

21 | Centrifuger 5 min à 400g à température ambiante.

Manipulation à effectuer impérativement sous une
hotte chimique (le trizol est un CMR très volatile)

21 | Ajouter 300 µl de TRI Reagent © aux tubes et faire des allers retours vigoureux à la pipette pour homogénéiser et favoriser la lyse cellulaire.

22 | Prélever les suspensions cellulaires ainsi obtenues dans les tubes de 1.5 ml étiquetés pour le dosage de l'ARN. Cette étape permet de récupérer et lyser les cellules éventuellement contenues dans la suspension cellulaire.

23 | Effectuer des allers retour à la pipette afin de favoriser la lyse cellulaire et congeler à -80°C.

Mettre tous les consommables ayant été en contact avec le TRI Reagent © dans un sachet plastique zip fermé puis jeter dans le bidon chimique associé (manipulation à effectuer sous hotte chimique).

> **PRELEVEMENT DES CELLULES POUR L'ANALYSE D'EXPRESSION A T0**

20 | Prélever l'équivalent de 8.10<sup>s</sup> cellules et transférer les dans un 1 tube falcon de 15 ml noté T0 PHA 5/6.

21 | Centrifuger 5 min à 400g à température ambiante.

Manipulation à effectuer impérativement sous une
hotte chimique (le trizol est un CMR très volatile)

21 | Ajouter 300 µl de TRI Reagent © et faire des allers retours vigoureux à la pipette pour homogénéiser et favoriser la lyse cellulaire.

22 | Prélever les suspensions cellulaires ainsi obtenues dans les tubes de 1.5 ml étiquetés pour le dosage de l'ARN. Cette étape permet de récupérer et lyser les cellules éventuellement contenues dans la suspension cellulaire.

23 | Effectuer des allers retour à la pipette afin de favoriser la lyse cellulaire et congeler à -80°C.

Mettre tous les consommables ayant été en contact avec le TRI Reagent © dans un sachet plastique zip fermé puis jeter dans le bidon chimique associé (manipulation à effectuer sous hotte chimique).
Protocole CK2201 - PHA

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de 2
lapereaux

(adapté de Weigmann et al. 2007)

11 avril 2022

► MISE EN CULTURE DES CELLULES FINAL

A compter de cette étape toutes les manipulations des
cellules doivent être effectuées **sous le PSM**

24|Prélever l'équivalent de 4.2x10⁶ cellules et transférez les dans 1 Falcon de 15 ml notés **PHA**. Prélever l'équivalent de 4.5x10⁶ cellules et transférez les dans 1 Falcon de 15 ml notés **Control** respectivement.

25 | Centrifuger 5 min à 400 g à température ambiante

26|Jeter le surnageant et re suspendre les culots dans 4.2 ml de milieu IMDM avec 2ME et PHA dans le tube **PHA** et 4.5 ml de milieu IMDM avec 2-mercaptoethanol dans le tube **Control**

27|Transférer les suspensions cellulaires **Control** et **PHA** dans des plaques de culture de 96 puits numérotées **24h**, **48h**, **72h** et **96h** pour les différents temps de mesures ainsi que la plaque de luminescence avec 100 µl/puit selon le plan de plaque ci-dessous :

► MISE EN CULTURE DES CELLULES FINAL

A compter de cette étape toutes les manipulations des
cellules doivent être effectuées **sous le PSM**

24|Prélever l'équivalent de 4.2x10⁶ cellules et transférez les dans 1 Falcon de 15 ml notés **PHA**. Prélever l'équivalent de 4.5x10⁶ cellules et transférez les dans 1 Falcon de 15 ml notés **Control** respectivement.

25 | Centrifuger 5 min à 400 g à température ambiante

26|Jeter le surnageant et re suspendre les culots dans 4.2 ml de milieu IMDM avec 2ME et PHA dans le tube **PHA** et 4.5 ml de milieu IMDM avec 2-mercaptoethanol dans le tube **Control**

27|Transférer les suspensions cellulaires **Control** et **PHA** dans des plaques de culture de 96 puits numérotées **24h**, **48h**, **72h** et **96h** pour les différents temps de mesures ainsi que la plaque de luminescence avec 100 µl/puit selon le plan de plaque ci-dessous :

<table>
  <thead>
    <tr>
      <th rowspan="2"></th>
      <th colspan="3">Luminescence</th>
      <th colspan="3">Cytokines pool1</th>
      <th colspan="3">Cytokines pool2</th>
      <th rowspan="2"></th>
    </tr>
    <tr>
      <th>1</th>
      <th>2</th>
      <th>3</th>
      <th>4</th>
      <th>5</th>
      <th>6</th>
      <th>7</th>
      <th>8</th>
      <th>9</th>
      <th>10</th>
      <th>11</th>
      <th>12</th>
    </tr>
  </thead>
  <tbody>
    <tr>
      <td>A</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>Control</td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>B</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>PHA</td>
      <td>21 jours L3</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>C</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>Control</td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>D</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>PHA</td>
      <td>21 jours L4</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>E</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>Control</td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>F</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>PHA</td>
      <td>35 jours L5</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>G</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>Control</td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>H</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000</td>
      <td>PHA</td>
      <td>35 jours L6</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

Bien homogénéiser la suspension cellulaire en amont de chaque pipetage, les cellules sédimentant très rapidement

► MESURE VIABILITE LE JOUR DU PROTOCOLE

Afin d'évaluer la survie des cellules en culture des tests de viabilité seront effectués à 24h, 48h et 72h post mise en culture avec le kit CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega)

<table>
  <thead>
    <tr>
      <th></th>
      <th colspan="10">T0</th>
      <th></th>
    </tr>
    <tr>
      <th></th>
      <th>1</th>
      <th>2</th>
      <th>3</th>
      <th>4</th>
      <th>5</th>
      <th>6</th>
      <th>7</th>
      <th>8</th>
      <th>9</th>
      <th>10</th>
      <th>11</th>
      <th>12</th>
      <th></th>
    </tr>
  </thead>
  <tbody>
    <tr>
      <th>A</th>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>Control</td>
      <td>23 jours L3</td>
    </tr>
    <tr>
      <th>B</th>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>Control</td>
      <td>23 jours L4</td>
    </tr>
    <tr>
      <th>C</th>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>Control</td>
      <td>35 jours L5</td>
    </tr>
    <tr>
      <th>D</th>
      <td>100 000</td>
      <td>100 000 Blanc</td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td>Control</td>
      <td>35 jours L6</td>
    </tr>
    <tr>
      <th>E</th>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <th>F</th>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <th>G</th>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
    </tr>
    <tr>
      <th>H</th>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
      <td></td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

1. Laisser la plaque T0 30 min à température ambiante

2. Ajouter 100µl/puit de CellTiter-Glo Reagent

3. Agiter 2 min sur un agitateur de plaque orbital pour induire la lyse cellulaire
Protocole CK2201 - PHA

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de 2
lapereaux

(adapté de Weigmann et al. 2007)

11 avril 2022

4. Laisser incuber 10 min à température ambiante pour que la luminescence se stabilise

5. Mesurer la luminescence avec une durée de mesure d'1 seconde par puit

➤ MESURE VIABILITE APRES 24, 48 ET 72H DE CULTURE

Pour les mesures à 24, 48 et 72h certaines cellules auront adhéré au fond des plaques de culture rendant leur transfert en plaques de luminescence difficile sans étape préalable de décollement. L'ajout du CellTiter-Glo Reagent se fera donc dans les plaques de culture cellulaire, la suspension sera ensuite transférée dans des plaques blanches pour la mesure de la luminescence.

<table><thead><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th><th>11</th><th>12</th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>Control</td><td></td></tr><tr><td>B</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>PHA</td><td>21 jours L3</td></tr><tr><td>C</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>Control</td><td></td></tr><tr><td>D</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>PHA</td><td>21 jours L4</td></tr><tr><td>E</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>Control</td><td></td></tr><tr><td>F</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>PHA</td><td>35 jours L5</td></tr><tr><td>G</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>Control</td><td></td></tr><tr><td>H</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>100 000</td><td>100 000 Blanc</td><td>PHA</td><td>35 jours L6</td></tr></tbody></table>

6. Sortir la plaque de culture cellulaire du jour de mesure et laisser la 30 min à température ambiante

7. Ajouter 100µl/puit de CellTiter-Glo Reagent. Faire des allers retours à la pipette pour favoriser le décrochage des cellules.

8. Agiter 2 min sur un agitateur de plaque orbital pour induire la lyse cellulaire

9. Laisser incuber 10 min à température ambiante pour que la luminescence se stabilise

10. Transférer le contenu des puits dans une plaque blanche de luminescence

11. Mesurer la luminescence avec une durée de mesure d'1 seconde par puit

➤ PRELEVEMENT DU MILIEU DE CULTURE POUR LA MESURE DE PRODUCTION DE CYTOKINES

Après prélèvements pour les mesures de luminescence, récupérer le milieu de culture par puit dans les colonnes dédiées aux mesures de cytokines (4 à 12) (bien pencher la plaque pour ne prélever que le surnageant) dans des tubes de 1.5 ml étiquetés pour les dosages d'ARN (cf étape suivante) en poolant 4 duplicats techniques par modalité (cf plan de plaque) puis centrifuger 5 minutes à 10 000g à 4°C. Récupérer ensuite le surnageant dans des nouveaux tubes de 1.5 ml étiquetés et congeler à -80°C. Cette étape permet de récupérer un surnageant claire, sans cellules. Le culot de cellules restant dans le tube initial est conservé pour l'étape suivante.

➤ PRELEVEMENT DES CELLULES POUR MESURES DE TRANSCRIPTOMIQUE (RT-qPCR)

Manipulation à effectuer impérativement sous une hotte chimique (le trizol est un CMR très volatile)

1. Ajouter 75 µl de TRI Reagent © aux puits après prélèvement du surnageant (cf étape précédente) et faire des allers retours vigoureux à la pipette pour homogénéiser et favoriser la lyse cellulaire.

2. Prélever les suspensions cellulaires ainsi obtenues dans les tubes de 1.5 ml étiquetés pour le dosage de l'ARN (cf étape précédente) en poolant les duplicats. Cette étape permet de récupérer et lyser les cellules éventuellement contenues dans la suspension cellulaire.

3. Effectuer des allers retour à la pipette afin de favoriser la lyse cellulaire et congeler à -80°C.

Mettre tous les consommables ayant été en contact avec le TRI Reagent © dans un sachet plastique zip fermé puis jeter dans le bidon chimique associé (manipulation à effectuer sous hotte chimique).
Annexe 11 : Protocole de mise en culture et stimulation avec LPS

Protocole CK2201 - LPS

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de lapereaux
(adapté de Weigmann et al. 2007)

16 Mai 2022

► **PRELEVEMENT DES CELLULES POUR L'ANALYSE D'EXPRESSION A T0**

20| Prélever l'équivalent de 8.10⁵ cellules et transférer les dans un tube Falcon de 15 ml noté T0 (L12 ou L13).

21| Centrifuger 5 min à 400g à température ambiante.

**Manipulation à effectuer impérativement sous une hotte chimique (le trizol est un CMR très volatile)**

22| Ajouter 300 µl de TRI Reagent © et faire des allers retours vigoureux à la pipette pour homogénéiser et favoriser la lyse cellulaire.

23| Prélever les suspensions cellulaires ainsi obtenues dans les tubes de 1.5 ml étiquetés pour le dosage de l'ARN. Cette étape permet de récupérer et lyser les cellules éventuellement contenues dans la suspension cellulaire.

24| Effectuer des allers retour à la pipette afin de favoriser la lyse cellulaire et congeler à -80°C.

Mettre tous les consommables ayant été en contact avec le TRI Reagent © dans un sachet plastique zip fermé puis jeter dans le bidon chimique associé (manipulation à effectuer sous hotte chimique).

► **MISE EN CULTURE DES CELLULES FINAL**

**A compter de cette étape toutes les manipulations des cellules doivent être effectuées sous le PSM**

25| Prélever l'équivalent de 3.5x10⁶ cellules et transférez les dans 1 Falcon de 15 ml noté LPS (L12 ou L13) et 3.5x10⁶ cellules et transférez les dans 1 Falcon de 15 ml noté Control (L12 ou L13)

26| Centrifuger 5 min à 400 g à température ambiante

27| Jeter le surnageant et re suspendre les culots dans 3.5 ml de milieu IMDM avec 2ME et LPS dans le tube LPS (L12 ou L13) (concentration de 10⁶ cellules/ml) et dans 3.5 ml de milieu IMDM avec 2-mercaptoethanol dans le tube Control (L12 ou L13)

28| Transférer les suspensions cellulaires Control (L12 ou L13) et LPS (L12 ou L13) dans des plaques de culture de 96 puits numérotées 2h, 4h et 6h pour les différents temps de mesures ainsi que la plaque de luminescence avec 100 µl/puit selon le plan de plaque ci-dessous :

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

► **MESURE VIABILITE LE JOUR DU PROTOCOLE**

Afin d'évaluer la survie des cellules en culture des tests de viabilité seront effectués à T0 puis à 2h, 4h et 6h (plaques LPS) post mise en culture avec le kit CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability (Promega)

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

1. Laisser la plaque T0 30 min à température ambiante
Protocole CK2201 - LPS

Isolement de cellules de la Lamina Propria issues de 2
lapereaux

(adapté de Weigmann et al. 2007)

16 Mai 2022

2. Ajouter 100µl/puit de CellTiter-Glo Reagent

3. Agiter 2 min sur un agitateur de plaque orbital pour induire la lyse cellulaire

4. Laisser incuber 10 min à température ambiante pour que la luminescence se stabilise

5. Mesurer la luminescence avec une durée de mesure d'1 seconde par puit

► **PRELEVEMENT DU MILIEU DE CULTURE POUR LA MESURE DE PRODUCTION DE CYTOKINES**

Après prélèvements pour les mesures de luminescence, récupérer le milieu de culture par puit dans les colonnes dédiées aux mesures de cytokines (4 à 12) (bien pencher la plaque pour ne prélever que le surnageant) dans des tubes de 1.5 ml numérotés en poolant 4 duplicats techniques par modalité (cf plan de plaque) puis centrifuger 5 minutes à 10 000g à 4°C. Récupérer ensuite le surnageant dans des nouveaux tubes de 1.5 ml étiquetés et congeler à -80°C. Cette étape permet de récupérer un surnageant claire, sans cellules. Le culot de cellules restant dans le tube initial est conservé pour l'étape suivante.

► **PRELEVEMENT DES CELLULES POUR MESURES DE TRANSCRIPTOMIQUE (RT-qPCR)**

Manipulation à effectuer impérativement sous une hotte chimique (le trizol est un CMR très volatile)

1. Ajouter 75 µl de TRI Reagent © aux puits après prélèvement du surnageant (cf étape précédente) et faire des allers retours vigoureux à la pipette pour homogénéiser et favoriser la lyse cellulaire.

2. Prélever les suspensions cellulaires ainsi obtenues en poolant les réplicas et les transférer dans les tubes de 1,5 ml contenant les culots cellulaires des prélèvements de surnageants (cf étape précédente). Faire des allers retours vigoureux à la pipette pour homogénéiser et favoriser la lyse cellulaire. Cette étape permet de récupérer et lyser les cellules éventuellement contenues dans la suspension cellulaire (en particulier pour les prélèvements à 2h, 4h et 6h), les cellules étant potentiellement moins adhérentes à ces stades.

3. Transférer la suspension ainsi obtenue dans les tubes de 1,5 ml étiquetés pour le dosage de l'ARN et congeler à -80°C.

Mettre tous les consommables ayant été en contact avec le TRI Reagent © dans un sachet plastique zip fermé puis jeter dans le bidon chimique associé (manipulation à effectuer sous hotte chimique).
Table des annexes

<table><tr><td>Annexe 1 : Préparation du tissu en amont de l'isolement des LPMC</td><td>74</td></tr><tr><td>Annexe 2 : Poids des tissus des individus utilisés lors des expérimentations</td><td>75</td></tr><tr><td>Annexe 3 : Comparaison des milieux de culture IMDM et RPMI, le remplissage vert indique la similitude entre les deux milieux (Fisher scientific 2022a; 2022b)</td><td>76</td></tr><tr><td>Annexe 4 : Exemple de plan de plaque de culture</td><td>77</td></tr><tr><td>Annexe 5 : Séquences des amorces réalisées au cours du stage</td><td>78</td></tr><tr><td>Annexe 6 : Mesure de luminescence à T0 d'une expérimentation du protocole 2. Le premier tableau correspond au plan de plaque, le second tableau donne les résultats du signal lumineux. A partir de ces derniers nous obtiendrons le nombre de cellules vivantes en culture</td><td>79</td></tr><tr><td>Annexe 7 : Quantités d'ARN après extraction, les individus manquants sont ceux dont les cellules n'ont pas été prélevées, les individus 2 et 11 n'ont pas été utilisés pour raisons techniques</td><td>80</td></tr><tr><td>Annexe 8 : Nombre de cellules isolées pour les individus utilisés lors des expérimentations</td><td>81</td></tr><tr><td>Annexe 9 : Protocole d'isolement des cellules mononuclées de la lamina propria du caecum des lapereaux</td><td>82</td></tr><tr><td>Annexe 10 : Protocole de mise en culture et stimulation des cellules à la PHA (n = 4 individus pour cette expérimentation)</td><td>86</td></tr><tr><td>Annexe 11 : Protocole de mise en culture et stimulation avec LPS</td><td>89</td></tr></table>