<table><caption>Tableau 5.1 : Avantages et désavantages des trois méthodes étudiées pour mesurer la viabilité des TMD</caption><thead><tr><th></th><th>Microscopie confocale</th><th>Cytométrie en flux</th><th>Marqueur de mortalité LDH</th></tr></thead><tbody><tr><th>Avantages</th><td><ul><li>Information sur :<ul><li>1) La distribution spatiale</li><li>2) La morphologie</li><li>1 mesure par TMD</li><li>Imagerie sur puce</li><li>Possibilité de ré-imager les mêmes échantillons</li><li>Automatisation possible</li></ul></li></ul></td><td><ul><li>Analyse quantitative cellule par cellule</li><li>Détection de deux stades d'apoptose</li><li>Possibilité d'évaluer le stade du cycle cellulaire et la prolifération</li><li>Possibilité d'identifier différentes populations cellulaires</li></ul></td><td><ul><li>Plusieurs lectures du même système</li><li>Analyse des cellules détachées</li><li>Analyse quantitative</li></ul></td></tr><tr><th>Désavantages</th><td><ul><li>Profondeur d'imagerie limitée à environ 40 µm</li><li>Cellule détachées non imagées</li><li>Autofluorescence</li></ul></td><td><ul><li>Digestion des tissus avant l'analyse</li><li>Mesure moyennée sur tout un système</li><li>Haute concentration cellulaire nécessaire</li></ul></td><td><ul><li>Mesure moyennée sur tout un système</li><li>Dégradation de LDH</li><li>Sensibilité du test à certaines substances du milieu</li></ul></td></tr></tbody></table>

La microscopie confocale permet d'obtenir de l'information visuelle sur les échantillons analysés, comme la distribution spatiale de la viabilité et la morphologie des échantillons. Les TMD sont individuellement imagées par cette méthode, ce qui permet d'obtenir plusieurs mesures à partir d'un seul microsystème : la viabilité variable entre les régions de tumeur représentées par les différentes TMD se trouve donc mieux caractérisée. L'imagerie peut être faite directement à travers la plateforme microfluidique sans extraire ou perturber les échantillons, ce qui aide à standardiser la procédure et pourrait éventuellement faciliter son automatisation. Cependant, l'autofluorescence pourrait entraver l'utilisation massive de la technique si elle s'avère trop importante dans certains échantillons humains. Aussi, puisque la profondeur d'imagerie est limitée à environ 40 µm par cette méthode et puisque les cellules détachées et relâchées dans le canal ne sont pas considérées, la technique capture seulement la viabilité d'une portion de l'échantillon. En microscopie confocale inversée, cette portion correspond à la surface inférieure des TMD qui est la moins affectée par les chimiothérapies et qui a le moins accès aux fluorophores. Il en résulte parfois des échantillons faiblement marqués où il est difficile de détecter la mortalité induite par un traitement. Les échantillons pourraient éventuellement être imagés avec un microscope confocal droit à travers le haut de la plateforme, mais cela nécessiterait quelques adaptations au design actuel. Toutes ces
limites ont mené à l'évaluation d'autres techniques d'analyse de viabilité. Toutefois, la microscopie confocale et d'autres types de microscopie présentent un potentiel important d'automatisation qui justifie la poursuite de leur étude. Par ailleurs, même si cela n'a pas encore été testé avec nos échantillons, la microscopie offre le potentiel d'imager les mêmes TMD à plusieurs reprises. En choisissant bien les marqueurs fluorescents, deux mesures indépendantes de viabilité à des temps différents pourraient ainsi être effectuées. Cela permettrait d'améliorer grandement la puissance statistique de nos tests de traitement avec chimiothérapies, car les résultats générés avant et après traitement pourraient être pairés, rendant la variabilité inter-échantillons moins critique.

La cytométrie en flux pour la détection des stades d'apoptose offre quant à elle une analyse quantitative des cellules formant le tissu. En analysant les fractions de milieu récoltées des microsystèmes, les cellules détachées du tissu et sorties du piège sont aussi considérées. Toutes les cellules du tissu se trouvent donc représentées dans les bonnes proportions. En détectant deux stades d'apoptose (précoce et tardive) plutôt qu'une seule, le laps de temps pendant lequel un événement de mort cellulaire peut être détecté est plus grand. Cependant, la préparation du tissu pour la cytométrie nécessite plusieurs étapes qui seraient plus difficiles à automatiser : marquage, extraction des microsystèmes, dissociation pour libérer les cellules, puis tamisage pour conserver seulement les cellules individuelles. Ces étapes de préparation entraînent des pertes et pour obtenir un nombre intéressant de cellules, les cinq échantillons d'un système doivent être combinés pour l'analyse qui donne donc une mesure moyenne pour chaque système. Chaque groupe de cinq échantillons ne peut être analysé qu'une seule fois, éliminant donc la possibilité de pairer les résultats d'avant et d'après traitement. Néanmoins, la cytométrie en flux est une technique très polyvalente qui permettra d'examiner divers autres processus cellulaires utiles à l'étude du cancer, comme le cycle cellulaire et la prolifération. Aussi, en utilisant des marqueurs spécifiques à certains types de cellules, il serait possible d'évaluer les différentes sous-populations cellulaires représentées au sein des TMD.

La détection de l'enzyme LDH sécrétée dans le milieu par les cellules mourantes est une façon intéressante de suivre quantitativement l'état des mêmes échantillons dans le temps. Cette technique permet aussi, comme la cytométrie en flux, d'analyser l'ensemble des échantillons de tissu, incluant les cellules ayant pu se détacher et sortir des systèmes. Il est possible, toutefois, que toute la LDH sécrétée ne se retrouve pas dans les fractions de milieu extraites en raison de la dégradation de l'enzyme pendant l'incubation ainsi que de notre incapacité à prélever et à
renouveler complètement le milieu se trouvant dans les puits microfluidiques. En outre, nous avons trouvé que la sensibilité du kit de détection est affectée par certaines composantes du milieu. Alors chaque nouvelle substance devrait d'abord être testée pour s'assurer qu'il n'y ait pas d'interaction indésirable avec la réaction du kit de détection. La procédure de détection se fait pour l'instant dans une plaque à 96 puits et prend un temps considérable puisqu'elle demande beaucoup d'interventions de l'usager. Toutefois, une méthode permettant de mesurer continuellement la LDH ou un autre marqueur de mortalité dans le milieu sortant d'un système perfusé à faible débit pourrait être mise au point pour complètement automatiser la lecture de la mortalité des échantillons d'un système en limitant les problèmes de dégradation de la LDH.

### 5.1.3.1 Étude de corrélation entre les résultats de viabilité mesurés par microscopie confocale et par cytométrie en flux

Après avoir acquis tous les résultats de microscopie confocale et de cytométrie en flux, la corrélation entre les deux techniques a été évaluée. Pour ce faire, toutes les mesures de viabilité d'une même expérience faites par les deux techniques au même jour d'analyse ont été compilées dans le graphique montré à la *Figure 5.1A*. Des 47 résultats qui ont ainsi pu être comparés, une très faible corrélation avec un coefficient de Pearson égal à 0,10 a été trouvé. En retirant trois données aberrantes ayant une différence de viabilité supérieure à 50% entre les deux techniques, le coefficient de Pearson a augmenté à 0,33 (*Figure 5.1B*). Celui-ci représente toujours une corrélation faible, mais significative avec une valeur-p de 0,03 pour 44 points de comparaison.
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

Figure 5.1: Graphique de corrélation entre les données de viabilité mesurées en microscopie confocale et en cytométrie en flux. A) Toutes les données de comparaison disponibles provenant de l'étude de survie sont représentées. B) Trois données aberrantes (encerclées en rouge) ont été retirées du graphique montré en A. r et n sont respectivement le coefficient de Pearson et le nombre de points considérés.

Cette faible corrélation et la tendance générale de la microscopie confocale à surestimer la viabilité pourraient être dues aux quelques différences importantes entre les techniques énumérées ci-dessous.

1. Portion des TMD analysée : pour la microscopie confocale, seule la couche inférieure est imagée jusqu'à une profondeur de 40 µm, représentant seulement 15% du tissu alors que pour la cytométrie, l'échantillon en entier est représenté. Des différences notables peuvent exister entre le haut et le bas des TMD en raison de l'asymétrie du système microfludique à piégeage par sédimentation. En effet, le haut des TMD a plus directement accès aux nutriments, aux traitements et aux fluorophores apportés par le canal.

2. Inclusion/exclusion des cellules détachées : les cellules détachées du tissu et perdues lors des lavages ne sont pas incluses dans l'analyse en microscopie confocale alors qu'elles le sont en cytométrie. Ces cellules peuvent représenter une portion importante du tissu, en particulier lorsqu'il est exposé à des traitements qui peuvent entraîner sa fragmentation.
3- Stades d'apoptose détectés : la microscopie confocale catégorise les cellules en deux groupes, les cellules viables et les cellules en apoptose tardive ou mortes, tandis que la cytométrie ajoute une troisième catégorie, soit les cellules en apoptose précoce. Il est impossible de prédire dans laquelle des deux catégories de microscopie confocale se trouvent les cellules en apoptose précoce. Il serait possible, par exemple, que certaines cellules en apoptose précoce soient marquées au CTG pour la microscopie ou encore qu'elles ne soient pas marquées du tout. Dans ces cas, l'analyse par microscopie confocale surestimerait une fois encore la viabilité des échantillons comparativement à la cytométrie.

4- Dénombrement des cellules : en cytométrie, les cellules sont comptées une à une lorsqu'elles passent devant le détecteur. Toutefois, avec la technique de microscopie confocale mise au point, nous supposons que le signal d'une cellule viable et celui d'une cellule morte occupent en moyenne des superficies égales dans les images et donc que le calcul de l'aire des signaux constitue une bonne approximation de la proportion des cellules dans chacun des groupes. Cette hypothèse n'est pas valide si le cytoplasme des cellules mortes n'est pas détecté ou si le faible signal d'autofluorescence du tissu est capté par l'algorithme.

En observant le graphique de corrélation à la *Figure 5.1B*, on constate qu'il n'y a pratiquement aucun point plus bas que 50% de viabilité en microscopie confocale et très peu de points en bas de 40% de viabilité en cytométrie en flux. La corrélation entre les deux techniques serait grandement améliorée si des points étaient ajoutés au graphique dans cette zone de faible viabilité. Des tests ont donc été menés par l'équipe du CRCHUM visant à produire des échantillons peu viables. Les échantillons ont été gelés ou traités avec des doses très élevées de chimiothérapies. Dans certains cas, des viabilités très faibles ont été mesurées en cytométrie, mais cela ne s'est traduit qu'une seule fois sur cinq en une viabilité inférieure à 50% mesurée en microscopie confocale. En considérant ces derniers résultats et toujours en retirant les trois données aberrantes, le coefficient de Pearson augmente très légèrement à 0,34 et reste significatif avec une valeur-p de 0,01 pour un total de 52 comparaisons (*Figure 5.2*).

Les résultats de cette section semblent indiquer que la plage dynamique de la microscopie confocale est très limitée, allant d'environ 60% pour les échantillons de faible viabilité à 74% pour
les échantillons à haute viabilité en se fiant à la courbe de régression linéaire de la *Figure 5.2*. Des modifications à l'algorithm de segmentation des images pourraient aider à améliorer la situation, mais les limites expérimentales énumérées ci-dessus sont tout aussi importantes à considérer. En outre, le type de tissu étudié semble avoir une incidence importante sur la plage dynamique de la microscopie confocale. Par exemple, pour le tissu tumoral de patiente analysé à la *Figure 3.7*, des viabilités moyennes allant de 45% jusqu'à près de 90% ont été mesurées. Pour le tissu de foie de la *Figure A.6* (Annexe A), les viabilités se sont étalées de 35% à 80%, en moyenne. Malheureusement, aucune donnée de cytométrie en flux n'était alors disponible pour ces expériences qui ne sont donc pas représentées dans les graphiques de corrélation.

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

**Figure 5.2:** Graphique de corrélation entre les données de viabilité mesurées en microscopie confocale et en cytométrie en flux après l'ajout des points de faible viabilité. r et n sont respectivement le coefficient de Pearson et le nombre de points considérés. La ligne grise pointillée montre la courbe idéale de corrélation qui maximiserait la plage dynamique de détection en microscopie confocale.

En somme, des trois techniques étudiées, la cytométrie en flux offre les résultats les plus robustes, mais c'est aussi la technique qui nécessite le plus de tissu et le plus de manipulations de l'usager. Des modifications à la technique de microscopie confocale, comme l'utilisation de nouveaux marqueurs et la poursuite de l'amélioration de l'algorithm de segmentation, pourraient aider à améliorer la corrélation avec la cytométrie et à accroître la plage dynamique de la technique. La détection du biomarqueur de mortalité LDH pourrait aussi offrir des lectures intéressantes du
tissu cancéreux mourant à condition de limiter la dégradation de l'enzyme sécrétée et de valider
l'absence d'interaction du test de détection avec les nouveaux composants appliqués.

5.1.4 Tests de chimiothérapie sur puce

Le test préliminaire de chimiothérapie appliquée sur un échantillon de tumeur humaine décrit à la section 3.4 semble prometteur, mais la procédure reste à valider avec un nombre plus important d'échantillons. Idéalement, vu les difficultés notées pour la technique de microscopie confocale, il faudrait aussi inclure des mesures de cytométrie en flux. Cette technique d'analyse n'est toutefois pas parfaite non plus, car certains tissus sont plus difficiles à fragmenter et à marquer que d'autres. Pour une preuve de concept plus complète, l'étude devrait être faite avec des groupes de tissus sensibles et résistants à la chimiothérapie d'intérêt. Les résultats permettraient de valider qu'une mortalité plus élevée serait induite dans le groupe sensible comparativement au groupe résistant. Des études en ce sens ont déjà été initiées au CRCHUM en utilisant des xénogreffes de souris formées de cellules ayant différentes sensibilités au traitement de carboplatine. Aussi, ces tests pourraient servir à déterminer le nombre minimal de TMD nécessaires pour produire des résultats statistiquement significatifs. Effectivement, il se peut que les cinq TMD d'un canal ne suffisent pas en microscopie confocale. En cytométrie, il faudrait au moins deux systèmes par condition pour produire des statistiques sur les échantillons étudiés.

Pour que la procédure puisse éventuellement être employée comme test prédictif de réponse
aux médicaments, il faudra en plus exposer le tissu à plusieurs chimiothérapies en parallèle. Cela
nécessitera un nombre plus important de TMD produites à partir du tissu du patient. La technique
de coupe devra donc être davantage optimisée pour minimiser les pertes de tissu et réduire les
temps de manipulation.

5.2 Défis à surmonter

De manière générale, la complexité d'utilisation d'un modèle cellulaire s'accroît avec la
tridimensionnalité du tissu et avec l'emploi d'échantillons primaires. Dans ce projet de maîtrise,
ces deux caractéristiques ont été exploitées en même temps afin d'augmenter la pertinence
biologique des échantillons étudiés et afin d'offrir un modèle empirique sur lequel l'efficacité de
traitements pourrait être testée pour les patients atteints de cancers solides. Plusieurs aspects de la
méthode ont été résolus, comme la coupe du tissu en de nombreux échantillons, le maintien d'une
viabilité convenable du tissu cultivé *in vitro* et l'incubation dans un système simple au travers duquel l'oxygène et le dioxyde de carbone peuvent diffuser. Plusieurs défis restent toutefois à surmonter avant que ces tissus primaires tridimensionnels puissent être utilisés pour caractériser la sensibilité du cancer à différents traitements.

Premièrement, les tissus primaires sont hétérogènes; différentes portions du tissu peuvent donc comporter des proportions variables de cellules viables provenant de différentes sous-populations cancéreuses, stromales et immunitaires. Cette variabilité intrinsèque du tissu fait en sorte que les TMD ne sont pas toutes identiques. La variance entre les groupes de TMD exposées à différents traitements devient moins significative comparée à la variance intra-groupe. L'évaluation de cinq TMD par système compense partiellement cette variabilité, mais il est fort probable qu'un nombre plus important d'échantillons soit nécessaire pour compenser complètement l'hétérogénéité des tumeurs humaines. Puisqu'il n'est pas forcément possible de multiplier le nombre d'échantillons par condition en raison de la quantité limitée de tissu, une solution alternative consisterait à interroger plusieurs fois les mêmes échantillons avant et après l'application d'un traitement particulier. Cela peut déjà être accompli par la détection du marqueur de mortalité LDH dans le milieu extrait des mêmes systèmes à différent temps d'analyse. Une autre possibilité serait de marquer les mêmes échantillons à plusieurs reprises en utilisant différents marqueurs fluorescents n'affectant pas les cellules, puis de les imager par microscopie confocale ou toute autre technique alternative de microscopie en fluorescence. Par exemple, avant l'application d'un traitement, la viabilité initiale des TMD pourrait être évaluée par microscopie confocale en utilisant le CTG pour marquer les cellules viables et le marqueur *LIVE/DEAD® Fixable Far Red Dead Cell Stain* pour marquer les cellules mortes. Après le traitement, une seconde lecture de viabilité pourrait être faite en utilisant une autre couleur de la gamme *CellTracker®* (orange, par exemple) pour marquer les cellules viables ainsi que le même marqueur dans le rouge lointain pour les cellules mortes. Les deux mesures d'avant et d'après traitement pourraient être pairées dans les tests statistiques, ce qui diminuerait l'influence de la variabilité inter-échantillon sur les résultats. De plus, le marqueur de mortalité dans le rouge lointain colore le même compartiment cellulaire que les marqueurs *CellTracker®*, ce qui améliorerait la performance de l'algorithme de segmentation.

Deuxièmement, la profondeur d'imagerie est limitée en microscopie confocale. La microscopie demeure attrayante, en particulier à cause de sa capacité à analyser individuellement
l'évolution de cinq TMD indépendantes d'un système et en raison de la possibilité d'automatiser
la prise de mesure. Pour améliorer la profondeur d'imagerie du tissu, une solution serait de le fixer
et de le rendre transparent [75]. Cela pourrait augmenter la profondeur de pénétration jusqu'à
500 µm, mais la procédure serait longue, pourrait être difficile à effectuer dans les microsystèmes
et ne permettrait qu'une mesure de viabilité par TMD. La microscopie à deux photons a aussi été
explorée en utilisant du tissu de foie (voir la section A.2.1.3 de l'Annexe A) et la technique a permis
d'imager jusqu'à 100 µm de profond. Il s'agit d'une amélioration majeure, mais toujours
insuffisante pour imager la totalité d'une TMD, en particulier son centre plus susceptible à un
phénomène d'hypoxie et sa partie supérieure plus exposée aux traitements. Pour réussir à imager
au moins la moitié de l'échantillon, une profondeur de 150 µm devrait être atteinte. Cela pourrait
être accompli grâce à la microscopie à feuillet de lumière (en anglais : *light sheet fluorescence microscopy*) qui permet d'exciter un échantillon avec un mince feuillet de lumière (de quelques
micromètres d'épaisseur) perpendiculaire à la direction d'observation du spécimen. En plus de
permettre d'imager des spécimens aux dimensions près du millimètre, l'acquisition se fait très
rapidement (environ une seconde par tranche optique de 10 megapixels) [17].

Troisièmement, les quantités de tissu cancéreux obtenues par biopsie sont très limitées. Par
exemple, une biopsie de prostate fournirait seulement autour de 7 mm³ de tissu [25], correspondant
à environ 200 fois le volume d'une TMD. Cependant, la procédure de coupe actuelle conduit à des
pertes importantes de tissu. Cela ne pose pas autant problème pour le tissu provenant de xénogreffes
ou de chirurgies de patients, car le volume de tissu est généralement beaucoup plus important. Des
modifications à la procédure de coupe devraient tout de même être envisagées pour réduire les
pertes et pour mieux adapter la procédure à la coupe de biopsies. Il pourrait être intéressant
d'investiguer d'autres instruments pour trancher le tissu, en particulier l'instrument microtome
VT1200 (ou VT1200 S) de Leica qui a été utilisé avec succès pour produire des tranches de tissu
cancéreux à partir d'échantillons frais provenant de 271 patients différents (cancers du colon, du
poumon et de la prostate) [22]. De plus, un autre groupe de recherche a simplement utilisé un
scalpel pour couper les échantillons à environ 500 µm de diamètre [76]. Ces échantillons de tissu
ont ensuite été cultivés en suspension sous agitation giratoire pendant un à deux jours, ce qui a
produit des échantillons hautement viables qui ont ensuite été analysés par spectrométrie
d'impédance. Une technique similaire de coupe et de pré-incubation pourrait être envisagée, peut-
être en utilisant un scalpel à lames multiples espacées de 0,5 mm, pour maximiser le nombre de TMD obtenues par tranche de tissu.

Finalement, la viabilité n'est probablement pas suffisante à elle seule pour mesurer l'action de chimiothérapies. L'analyse de la prolifération et du cycle cellulaire par cytométrie en flux pourrait être fort utile. En microscopie, la taille et la morphologie des TMD pourraient être d'autres facteurs à considérer. Une version modifiée du test des comètes servant à mesurer la dégradation de l'ADN d'un tissu a aussi été développée et pourrait être intéressante à implémenter sur les TMD [77]. Enfin, la spectroscopie d'impédance a déjà été employée pour mesurer la densité cellulaire et la viabilité d'échantillons de tumeur de tailles similaires aux TMD [76]. Ce type de mesure pourrait être fait directement sur puce si des détecteurs étaient intégrés aux côtés des puits, ce qui augmenterait bien sûr la complexité et le coût de fabrication des plateformes.

Pour terminer, il existe donc des limites – décrites dans ce chapitre – aux techniques développées. Néanmoins, les résultats présentés dans ce mémoire ont permis d'établir les bases d'une toute nouvelle technique d'incubation de micro-fragments de tissu cancéreux primaire à l'intérieur d'une plateforme microfluidique simple conçue sur mesure. Plusieurs améliorations ont été proposées qui pourront faire l'objet d'expériences futures.
# CHAPITRE 6 CONCLUSION

Dans le cadre de ce projet de maîtrise, une technique de découpe du tissu cancéreux en de nombreux échantillons sous-millimétriques individuels a été développée. Leur petite taille facilite leur manipulation à l'intérieur de canaux microfluidiques et aide à préserver leur viabilité en permettant le transport diffusif de nutriments jusqu'en leur centre. Ensuite, un nouveau design de plateforme microfluidique a été conçu pour piéger ces échantillons de manière stable et en minimisant les contraintes de cisaillement sur le tissu. La procédure de découpe et d'incubation du tissu tumoral primaire a été d'abord optimisée en utilisant quatre différents types de xénogreffes humaines en souris dérivées de cellules de cancers de la prostate et de l'ovaire. La viabilité des échantillons ainsi produits a pu être évaluée par trois méthodes : l'imagerie des TMD par microscopie confocale, l'analyse du stade d'apoptose des cellules composant les TMD par cytométrie en flux et la détection du marqueur de mortalité lactate déshydrogénase sécrété par le tissu. Ensuite, la procédure a été testée de manière préliminaire avec un échantillon de tumeur extrait d'une patiente atteinte du cancer de l'ovaire.

Malgré plusieurs défis qui restent à surmonter, ce projet a le potentiel de générer des impacts sociaux-économiques à plusieurs niveaux, en partant du développement de nouveaux médicaments jusqu'à leur administration chez les patients. D'abord, l'outil pourra être utilisé en recherche et développement tant au niveau industriel qu'universitaire pour tester l'efficacité de nouveaux traitements, pour étudier les mécanismes de livraison de thérapies et pour élucider les mécanismes d'évolution du cancer. Vu la petite taille des canaux, l'utilisation de réactifs coûteux sera réduite. Une plus faible utilisation de modèles animaux devrait s'ensuivre, diminuant aussi les coûts. En milieu hospitalier, l'outil rendra l'approche davantage personnalisée en permettant de tester l'efficacité des traitements avant leur administration chez les patients. Cela diminuera les coûts en évitant les traitements de première ligne inefficaces chez certains patients et en choisissant, dès le départ, la solution la plus susceptible de produire des résultats positifs. Les patients, quant à eux, éviteront les effets secondaires liés à des traitements inefficaces et verront leurs chances de guérison augmentées par une application plus rapide des traitements adaptés à leur situation. La flexibilité du système, induite par l'interchangeabilité des échantillons testés (sphéroïdes et biopsies de tumeurs), par son adaptabilité à plusieurs types de cancers, ainsi que par son utilité potentielle dans plusieurs sphères de l'industrie biomédicale, pourrait favoriser l'adoption de cette technologie pour le développement et la prescription de médicaments anti-cancer.
LISTE DE RÉFÉRENCES

[1] Canadian Cancer Society's Advisory et Committee on Cancer Statistics, "Canadian Cancer Statistics 2014," Toronto, ON, 2014.

[2] T. Högberg, B. Glimelius et P. Nygren, "A systematic overview of chemotherapy effects in ovarian cancer.," *Acta Oncol.*, vol. 40, no. 2–3, pp. 340–60, 2001.

[3] M. Hofman, J. L. Ryan, C. D. Figueroa-Moseley, P. Jean-Pierre et G. R. Morrow, "Cancer-related fatigue: the scale of the problem.," *Oncologist*, vol. 12-S1 1, pp. 4–10, 2007.

[4] L. Chin, J. N. Andersen et P. A. Futreal, "Cancer genomics: from discovery science to personalized medicine.," *Nat. Med.*, vol. 17, no. 3, pp. 297–303, 2011.

[5] P. A. Futreal, L. Coin, M. Marshall, T. Down, T. Hubbard, R. Wooster, N. Rahman et M. R. Stratton, "A census of human cancer genes.," *Nat. Rev. Cancer*, vol. 4, no. 3, pp. 177–183, 2004.

[6] K. Yoshida et Y. Miki, "Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage," *Cancer Sci.*, vol. 95, no. 11, pp. 866–871, 2004.

[7] P. C. Fong, D. S. Boss, T. A. Yap, A. Tutt, P. Wu, M. Mergui-Roelvink, P. Mortimer, H. Swaisland, A. Lau, M. J. O'Connor, A. Ashworth, J. Carmichael, S. B. Kaye, J. H. M. Schellens et J. S. de Bono, "Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers," *N. Engl. J. Med.*, vol. 361, no. 2, pp. 123–134, 2009.

[8] A. A. Ayantunde et S. L. Parsons, "Pattern and prognostic factors in patients with malignant ascites: A retrospective study," *Ann. Oncol.*, vol. 18, no. 2, pp. 945–949, 2007.

[9] W. J. Allard, J. Matera, M. C. Miller, M. Repollet, M. C. Connelly, C. Rao, A. G. J. Tibbe, J. W. Uhr et L. W. M. M. Terstappen, "Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases," *Clin. Cancer Res.*, vol. 10, no. 20, pp. 6897–6904, 2004.

[10] R. Siegel, J. Ma, Z. Zou et A. Jemal, "Cancer Statistics, 2014," vol. 64, no. 1, pp. 9–29, 2014.

[11] M. Hay, D. W. Thomas, J. L. Craighead, C. Economides et J. Rosenthal, "Clinical development success rates for investigational drugs," *Nat. Biotechnol.*, vol. 32, no. 1, pp. 40–51, 2014.

[12] N. E. Sharpless et R. A. Depinho, "The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.," *Nat. Rev. Drug Discov.*, vol. 5, no. 9, pp. 741–754, 2006.

[13] C. G. Begley et L. M. Ellis, "Drug development: Raise standards for preclinical cancer research," *Nature*, vol. 483, no. 7391, pp. 531–533, 2012.
[14] E. H. Rubin et D. G. Gilliland, "Drug development and clinical trials—the path to an approved cancer drug," *Nat. Rev. Clin. Oncol.*, vol. 9, no. 4, pp. 215–222, 2012.

[15] T. Vargo-Gogola et J. M. Rosen, "Modelling breast cancer: one size does not fit all," *Nat. Rev. Cancer*, vol. 7, no. 9, pp. 659–672, 2007.

[16] J. Bin Kim, "Three-dimensional tissue culture models in cancer biology," *Semin. Cancer Biol.*, vol. 15, no. 5, pp. 365–377, 2005.

[17] F. Pampaloni, E. G. Reynaud et E. H. K. Stelzer, "The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue," *Nat. Rev. Mol. Cell Biol.*, vol. 8, no. 10, pp. 839–45, 2007.

[18] L. G. Griffith et M. A. Swartz, "Capturing complex 3D tissue physiology in vitro," *Nat. Rev. Mol. Cell Biol.*, vol. 7, no. 3, pp. 211–224, 2006.

[19] S. Ghosh, G. C. Spagnoli, I. Martin, S. Ploegert, P. Demougin, M. Heberer et A. Reschner, "Three-dimensional culture of melanoma cells profoundly affects gene expression profile: A high density oligonucleotide array study," *J. Cell. Physiol.*, vol. 204, no. 2, pp. 522–531, 2005.

[20] M. Zietarska, C. M. Maugard, A. Filali-Mouhim, M. Alam-Fahmy, P. N. Tonin, D. M. Provencher et A.-M. Mes-Masson, "Molecular description of a 3D in vitro model for the study of epithelial ovarian cancer (EOC)," *Mol. Carcinog.*, vol. 46, no. 10, pp. 872–885, 2007.

[21] F. T. Unger, I. Witte et K. A. David, "Prediction of individual response to anticancer therapy: historical and future perspectives," *Cell. Mol. Life Sci.*, vol. 72, no. 4, pp. 729–757, 2014.

[22] V. Vaira, G. Fedele, S. Pyne, E. Fasoli, G. Zadra, D. Bailey, E. Snyder, A. Faversani, G. Coggi, R. Flavin, S. Bosari et M. Loda, "Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors," *Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.*, vol. 107, no. 18, pp. 8352–6, 2010.

[23] I. A. de Graaf, G. M. Groothuis et P. Olinga, "Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs," *Expert Opin. Drug Metab. Toxicol.*, vol. 3, no. 6, pp. 879–98, 2007.

[24] G. M. Whitesides, "The origins and the future of microfluidics," *Nature*, vol. 442, no. 7101, pp. 368–373, 2006.

[25] C. Öbek, T. Doanca, S. Erdal, S. Erdoğan et H. Durak, "Core length in prostate biopsy: Size matters," *J. Urol.*, vol. 187, no. 6, pp. 2051–2055, 2012.

[26] A. Mandal, "Avastin (Bevacizumab) Price," *News Medical*, 2014. [En ligne]. Disponible : http://www.news-medical.net/health/Avastin-(Bevacizumab)-Price.aspx. [Consulté le 03 mai 2015].
[27] P. J. A. Kenis, R. F. Ismagilove et G. M. Whitesides, "Microfabrication Inside Capillaries Using Multiphase Laminar Flow Patterning," *Science*, vol. 285, no. 5424. pp. 83–85, 1999.

[28] Y. Xia et G. M. Whitesides, "Soft Lithography," *Angew. Chemie Int. Ed.*, vol. 37, no. 5, pp. 550–575, 1998.

[29] A. K. Au, W. Lee et A. Folch, "Mail-order microfluidics: evaluation of stereolithography for the production of microfluidic devices," *Lab Chip*, vol. 14, no. 7, pp. 1294–301, 2014.

[30] T. Das, L. Meunier, L. Barbe, D. Provencher, O. Guenat, T. Gervais et A.-M. Mes-Masson, "Empirical chemosensitivity testing in a spheroid model of ovarian cancer using a microfluidics-based multiplex platform," *Biomicrofluidics*, vol. 7, no. 1, pp. 1–15, 2013.

[31] D. Huh, G. A. Hamilton et D. E. Ingber, "From 3D cell culture to organs-on-chips," *Trends Cell Biol.*, vol. 21, no. 12, pp. 745–54, 2011.

[32] L. Liu, K. Loutherback, D. Liao, D. Yeater, G. Lambert, A. Estévez-Torres, J. C. Sturm, R. H. Getzenberg et R. H. Austin, "A microfluidic device for continuous cancer cell culture and passage with hydrodynamic forces," *Lab Chip*, vol. 10, no. 14, pp. 1807–13, 2010.

[33] P. J. Hung, P. J. Lee, P. Sabounchi, R. Lin et L. P. Lee, "Continuous perfusion microfluidic cell culture array for high-throughput cell-based assays," *Biotechnol. Bioeng.*, vol. 89, no. 1, pp. 1–8, 2005.

[34] B. Patra, Y. H. Chen, C. C. Peng, S. C. Lin, C. H. Lee et Y. C. Tung, "A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis," *Biomicrofluidics*, vol. 7, no. 5, pp. 1–11, 2013.

[35] A. Y. Hsiao, Y. Torisawa, Y.-C. Tung, S. Sud, R. S. Taichman, K. J. Pienta et S. Takayama, "Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids," *Biomaterials*, vol. 30, no. 16, pp. 3020–7, 2009.

[36] K. Ziółkowska, A. Stelmachowska, R. Kwapiszewski, M. Chudy, A. Dybko et Z. Brzózka, "Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip," *Biosens. Bioelectron.*, vol. 40, no. 1, pp. 68–74, 2013.

[37] J. Ruppen, L. Cortes-Dericks, E. Marconi, G. Karoubi, R. A. Schmid, R. Peng, T. M. Marti, and O. T. Guenat, "A microfluidic platform for chemoresistive testing of multicellular pleural cancer spheroids," *Lab Chip*, vol. 14, no. 6, pp. 1198–205, 2014.

[38] H. Cao, H. Deng et Y. Wang, "Segmentation of M-FISH Images for Improved Classification of Chromosomes with an Adaptive Fuzzy C-means Clustering Algorithm," *IEEE Transactions on Fuzzy Systems*, vol. 20, no. 1, pp. 1–7, 2012.
[39] S. L. Stott, C.-H. Hsu, D. I. Tsukrov, M. Yu, D. T. Miyamoto, B. A. Waltman, S. M. Rothenberg, A. M. Shah, M. E. Smas, G. K. Korir, F. P. Floyd, A. J. Gilman, J. B. Lord, D. Winokur, S. Springer, D. Irimia, S. Nagrath, L. V. Sequist, R. J. Lee, K. J. Isselbacher, S. Maheswaran, D. A. Haber et M. Toner, “Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip,” *Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.*, vol. 107, no. 43, pp. 18392–7, 2010.

[40] T. M. Geislinger et T. Franke, “Sorting of circulating tumor cells (MV3-melanoma) and red blood cells using non-inertial lift,” *Biomicrofluidics*, vol. 7, no. 4, pp. 1–9, 2013.

[41] B. J. Kirby, M. Jodari, M. S. Loftus, G. Gakhar, E. D. Pratt, C. Chanel-Vos, J. P. Gleghorn, S. M. Santana, H. Liu, J. P. Smith, V. N. Navarro, S. T. Tagawa, N. H. Bander, D. M. Nanus et P. Giannakakou, “Functional characterization of circulating tumor cells with a prostate-cancer-specific microfluidic device,” *PLoS One*, vol. 7, no. 4, p. e35976, 2012.

[42] V. M. Peterson, C. M. Castro, J. Chung, N. C. Miller, A. V. Ullal, M. D. Castano, R. T. Penson, H. Lee, M. J. Birrer et R. Weissleder, “Ascites analysis by a microfluidic chip allows tumor-cell profiling.,” *Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.*, vol. 110, no. 51, pp. E4978–86, 2013.

[43] Y. Huang, J. C. Williams et S. M. Johnson, “Brain slice on a chip: opportunities and challenges of applying microfluidic technology to intact tissues,” *Lab Chip*, vol. 12, no. 12, pp. 2103–17, 2012.

[44] P. M. van Midwoud, E. Verpoorte et G. M. M. Groothuis, “Microfluidic devices for in vitro studies on liver drug metabolism and toxicity,” *Integr. Biol. (Camb)*., vol. 3, no. 5, pp. 509–21, 2011.

[45] S. M. Hattersley, D. C. Sylvester, C. E. Dyer, N. D. Stafford, S. J. Haswell et J. Greenman, “A microfluidic system for testing the responses of head and neck squamous cell carcinoma tissue biopsies to treatment with chemotherapy drugs,” *Ann. Biomed. Eng.*, vol. 40, no. 6, pp. 1277–88, 2012.

[46] D. Sylvester, S. M. Hattersley, N. D. Stafford, S. J. Haswell et J. Greenman, “Development of Microfluidic-based Analytical Methodology for Studying the Effects of Chemotherapy Agents on Cancer Tissue,” *Curr. Anal. Chem.*, vol. 9, no. 1, pp. 2–8, 2013.

[47] T. C. Chang, A. M. Mikheev, W. Huynh, R. J. Monnat, R. C. Rostomily et A. Folch, “Parallel microfluidic chemosensitivity testing on individual slice cultures,” *Lab Chip*, vol. 14, no. 23, pp. 4540–51, 2014.

[48] D. M. Provencher, H. Lounis, L. Champoux, M. Tétrault, E. N. Manderson, J. C. Wang, P. Eydoux, R. Savoie, P. N. Tonin et A. M. Mes-Masson, “Characterization of four novel epithelial ovarian cancer cell lines,” *In vitro cellular & developmental biology–Animal*, vol. 36, no. 6. pp. 357–361, 2000.

[49] M. Amiji et K. Park, “Prevention of protein adsorption and platelet adhesion on surfaces by PEO/PPO/PEO triblock copolymers,” *Biomaterials*, vol. 13, no. 10, pp. 682–692, 1992.
[50] “Diagram of confocal principle,” *Wikimedia Commons*, 2006. [En ligne]. Disponible : http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Confocalprinciple_in_English.svg. [Consulté le 22 avril 2015].

[51] Thermo Fisher Scientific Inc., “CellTracker™ Fluorescent Probes,” 2014.

[52] Molecular Probes, “Propidium Iodide Nucleic Acid Stain,” 2006.

[53] Thermo Fisher Scientific Inc., “Fluorescence SpectraViewer,” *Life Technologies*, 2015. [En ligne]. Disponible : https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/cell-analysis /labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html. [Consulté le 22 mars 2015].

[54] “Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) showing positive cell selection,” *Wikimedia Commons*, 2011. [En ligne]. Disponible : http://commons.wikimedia.org/wiki/File: Fluorescence-Assisted: //labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html. [Consulté le 22 avril 2015].

[55] P. M. van Midwoud, M. T. Merema, N. Verweij, G. M. M. Groothuis et E. Verpoorte, “Hydrogel embedding of precision-cut liver slices in a microfluidic device improves drug metabolic activity.,” *Biotechnol. Bioeng.*, vol. 108, no. 6, pp. 1404–12, 2011.

[56] Roche Applied Science, “Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH),” 2011.

[57] Promega, “CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay,” 2009.

[58] T. A. Krouskop, T. M. Wheeler, F. Kallel, B. S. Garra et T. Hall, “Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression,” *Ultrason. Imaging*, vol. 20, no. 4, pp. 260–274, 1998.

[59] H. Bruus, *Theoretical Microfluidics*. New York: Oxford University Press Inc., 2009.

[60] G. K. Batchelor, *An Introduction to Fluid Dynamics*, Illustrate. Cambridge University Press, 2000.

[61] J. F. Petersen, L. V. McIntire et E. T. Papoutsakis, “Shear sensitivity of cultured hybridoma cells (CRL-8018) depends on mode of growth, culture age and metabolite concentration,” *J. Biotechnol.*, vol. 7, no. 3, pp. 229–246, 1988.

[62] H. Lu, L. Y. Koo, W. M. Wang, D. A. Lauffenburger, L. G. Griffith et K. F. Jensen, “Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion,” *Anal. Chem.*, vol. 76, no. 18, pp. 5257–5264, 2004.

[63] R. Thomlinson et L. Gray, “The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy,” *Br. J. Cancer*, vol. 9, no. 4, pp. 539–549, 1955.

[64] R. Sander, “Compilation of Henry’s law constants, version 3.99,” *Atmos. Chem. Phys. Discuss.*, vol. 14, no. 21, pp. 29615–30521, 2014.
[65] P. Vaupel, H. P. Fortmeyer, S. Runkel et F. Kallinowski, "Blood flow, oxygen consumption, and tissue oxygenation of human breast cancer xenografts in nude rats," *Cancer Res.*, vol. 47, no. 13, pp. 3496-3503, 1987.

[66] J. Grote, R. Süsskind et P. Vaupel, "Oxygen diffusivity in tumor tissue (DS-Carcinosarcoma) under temperature conditions within the range of 20-40°C," *Pflügers Arch. Eur. J. Physiol.*, vol. 372, no. 1, pp. 37-42, 1977.

[67] P. Han et D. M. Bartels, "Temperature Dependence of Oxygen Diffusion in H₂O and D₂O," *J. Phys. Chem.*, vol. 100, no. 13, pp. 5597-5602, 1996.

[68] H. L. T. Lee, P. Boccazzi, R. J. Ram et A. J. Sinskey, "Microbioreactor arrays with integrated mixers and fluid injectors for high-throughput experimentation with pH and dissolved oxygen control," *Lab Chip*, vol. 6, no. 9, pp. 1229-1235, 2006.

[69] R. Ivanova et G. Simeonov, "A formula for the oxygen uptake of thin tissue slice in terms of its surface oxygen tension," *Comput. Math. with Appl.*, vol. 64, no. 3, pp. 322-336, 2012.

[70] J. W. Boyd, "The rates of disappearance of L-lactate dehydrogenase isoenzymes from plasma," *Biochim. Biophys. Acta (BBA)-Enzymology*, vol. 132, no. 2, pp. 221-231, 1967.

[71] Olympus America Inc., K. Spring, T. J. R. Fellers et M. W. Davidson, "Signal-to-Noise Considerations," *Olympus Microscopy Resource Center*, 2012. [En ligne]. Disponible : http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/signaltonoise.html. [Consulté le 15 mars 2015].

[72] R. C. Gonzalez et R. E. Woods, *Digital image processing*, 3rd edition. Upper Saddle River, N.J.: Pearson Prentice Hall, 2008.

[73] T. Suzuki, K. Fujikura, T. Higashiyama et K. Takata, "DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy," *J. Histochem. Cytochem.*, vol. 45, no. 1, pp. 49-53, 1997.

[74] K. Chung, Y. Kim, J. S. Kanodia, E. Gong, S. Y. Shvartsman et H. Lu, "A microfluidic array for large-scale ordering and orientation of embryos," vol. 8, no. 2, 2011.

[75] R. M. Zucker, "Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: morphology and apoptosis.," *Cytometry Part A*, vol. 69, no. 11, pp. 1143-52, 2006.

[76] H.-G. Jahnke, S. Poenick, J. Maschke, M. Kendler, J. C. Simon et A. A. Robitzki, "Direct Chemosensitivity Monitoring Ex Vivo on Undissociated Melanoma Tumor Tissue by Impedance Spectroscopy," *Cancer Res.*, vol. 74, no. 9, pp. 6408-6418, 2014.

[77] J. Plazar, I. Hreljac, P. Pirih, M. Filipic et G. M. M. Groothuis, "Detection of xenobiotic-induced DNA damage by the comet assay applied to human and rat precision-cut liver slices," *Toxicol. In Vitro*, vol. 21, no. 6, pp. 1134-42, 2007.
[78] I. A. M. de Graaf, P. Olinga, M. H. de Jager, M. T. Merema, R. de Kanter, E. G. van de Kerkhof et G. M. M. Groothuis, "Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies," *Nat. Protoc.*, vol. 5, no. 9, pp. 1540–1551, 2010.

[79] V. E. Centonze et J. G. White, "Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging," *Biophys. J.*, vol. 75, no. 4, pp. 2015–24, 1998.

[80] W. R. Zipfel, R. M. Williams et W. W. Webb, "Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences," *Nat. Biotechnol.*, vol. 21, no. 11, pp. 1369–77, 2003.

[81] F. Helmchen et W. Denk, "Deep tissue two-photon microscopy," *Nat. Methods*, vol. 2, no. 12, pp. 932–40, 2005.

[82] F. Bestvater, E. Spiess, G. Stobrawa, M. Hacker, T. Feurer, T. Porwol, U. Berchner-Pfannschmidt, C. Wotzlaw et H. Acker, "Two-photon fluorescence absorption and emission spectra of dyes relevant for cell imaging," *J. Microsc.*, vol. 208, no. 2, pp. 108–115, 2002.

[83] S. J. Cutler et J. H. Block, "Metabolic Changes of Drugs and Related Organic Compounds," in *Wilson and Gisvold's Textbook of Organic, Medicinal and Pharmaceutical Chemistry*, 12th ed., J. M. Beale and J. H. Block, Eds. Lippincott Williams & Wilkins, 2011, pp. 43–118.

[84] P. M. van Midwoud, G. M. M. Groothuis, M. T. Merema et E. Verpoorte, "Microfluidic biochip for the perfusion of precision-cut rat liver slices for metabolism and toxicology studies," *Biotechnol. Bioeng.*, vol. 105, no. 1, pp. 184–94, 2010.

[85] S. L. Nyberg, R. P. Remmel, H. J. Mann, M. V. Peshwa, W. S. Hu et F. B. Cerra, "Primary hepatocytes outperform Hep G2 cells as the source of biotransformation functions in a bioartificial liver," *Ann. Surg.*, vol. 220, no. 1, pp. 59–67, 1994.

[86] R. De Kanter, M. H. De Jager, A. L. Draaisma, J. U. Jurva, P. Olinga, D. K. F. Meijer et G. M. M. Groothuis, "Drug metabolizing activity of human and rat liver, lung, kidney and intestine slices," *Xenobiotica*, vol. 32, no. 5, pp. 349–362, 2002.

[87] P. M. van Midwoud, M. T. Merema, E. Verpoorte et G. M. M. Groothuis, "Microfluidics enables small-scale tissue-based drug metabolism studies with scarce human tissue," *J. Lab. Autom.*, vol. 16, no. 6, pp. 468–76, 2011.
# ANNEXE A CULTURE SUR PUCE DE MICRO-FRAGMENTS DE FOIE

Pendant le stage de trois mois dans le laboratoire de Dre Sabeth Verpoorte à l'Université de Groningue, la technique de coupe et d'incubation de tissus a pu être testée en utilisant du tissu de foie plutôt que de tumeur. En plus de valider que d'autres types de tissus peuvent être coupés et piégés dans notre plateforme microfluidique, cette collaboration a permis d'étudier la viabilité d'un tissu plus homogène pour lequel plusieurs techniques d'analyse (de viabilité et de fonction métabolique) avaient déjà été mises au point par le passé. De plus, des techniques de mesure encore jamais testées dans nos laboratoires de Montréal et nécessitant des expertises et installations spécialisées, soit la chromatographie en phase liquide à haute performance et la microscopie à deux photons, ont pu être appliquées de manière préliminaire aux échantillons de tissu micro-disséqué de foie (TMDF) pour la toute première fois. Pour chaque technique, des tranches de tissu de foie d'environ 4 mm de diamètre et de 250 µm d'épaisseur (PCLS, de l'anglais *precision-cut liver slices*) ont aussi été étudiées en parallèle afin d'établir une base de comparaison pour évaluer la performance des TMDF.

## A.1 Méthodologie

### A.1.1 Procédure de découpe du tissu de foie

À l'Université de Groningue, dans le laboratoire de Dre Geny Groothuis qui collabore de près avec la directrice du stage à l'étranger, du tissu de foie de rat est utilisé de manière routinière pour des études de toxicologie et de métabolisme de médicaments. Le tissu primaire est généralement étudié sous forme de tranches minces d'environ 4 mm de diamètre par 250 µm d'épais. Des tranches excédentaires de foie ont été coupées par l'équipe de Dre Groothuis pour répondre aux besoins de nos expériences de microfluidique.

La procédure de découpe des PCLS a déjà été décrite en détails dans la littérature [78]. Brièvement, tel que montré à la *Figure A.1*, des carottes de tissu ont été produites à l'aide d'un outil coupant et creux de 5 mm de diamètre (5 mm tissue coring tool, Alabama Research and Development, Munford, AL, É.-U.) opéré par une perceuse. Ces carottes de tissu ont ensuite été tranchées à l'aide de l'instrument *Krumdieck tissue slicer* (modèle MD6000, Alabama Research and Development, Munford, AL, É.-U.) à une épaisseur de 250 µm. Tout au long de la procédure,
le tissu a été conservé à 4°C dans du milieu de préservation UW (Du Pont Critical Care, Waukegab, IL, É.-U.) ou dans une solution tampon de Krebs-Henseleit à l'intérieur de l'instrument Krumdieck.

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure A.1: Production de tranches de tissu de foie (PCLS). Figure reproduite de la référence [78] avec l'autorisation de l'éditeur. a) Production de carottes de foie de rat à l'aide d'un outil coupant et creux opéré par une perceuse montée sur un support vertical. b-d) Insertion de la carotte de tissu dans le porte-échantillon cylindrique de l'instrument Krumdieck. e) Accumulation des tranches de tissu coupées automatiquement par l'instrument Krumdieck dans le réservoir de sortie. f) Allure des tranches de foie produites et conservées dans du milieu UW à 4°C.</figcaption></figure>

La suite de la procédure de coupe est similaire à celle du tissu cancéreux. Un poinçon à biopsie de 500 µm de diamètre (Zivic Instruments, Pittsburgh, PA, É.-U.) a été utilisé pour couper les tranches de foie en plusieurs TMDF (Figure A.1). Étant donné la fragilité du tissu de foie aux conditions ambiantes d'oxygène et de température, une attention particulière a été portée à le maintenir froid à 4°C dans la solution de préservation UW pendant la production des TMDF ainsi que pendant l'étape de chargement dans les microsystèmes
<figure><img src="image_39.png" /></figure>

Figure A.1: Procédure de coupe des tranches de tissu de foie pour l'insertion dans les systèmes microfluidiques. A) Tranches de foie intactes imagées sous un stéréomicroscope. B) Tranches de foie comportant des trous là où des TMDF ont été extraites à l'aide d'un poinçon à biopsie de 500 µm de diamètre. Barres d'échelle ≈ 1 mm.

## A.1.2 Procédure de chargement dans les systèmes microfluidiques

Les plateformes microfluidiques ont été fabriquées en suivant le même protocole que décrit à la section 2.2.2, mais les entrées et sorties ont été percées manuellement à l'aide de poinçons et les deux couches ont été assemblées en utilisant un plasma d'oxygène.

Dans le cas des systèmes recevant le tissu de foie, les surfaces des canaux n'ont pas été traitées avec le copolymère tribloc Pluronic® F-108. Après la stérilisation à l'éthanol, du milieu de préservation UW a directement été ajouté aux canaux et les plateformes ont été placées sur la glace en prévision du chargement.

La même procédure de chargement, décrite à la section 2.2.3, a été utilisée pour les micro-fragments de foie et de tumeur. Les TMDF ont été chargées dans le milieu de préservation UW plutôt que dans le HBSS et les plateformes ont été gardées froides tout au long de la procédure de chargement. Après le chargement des cinq TMDF dans un système, le milieu UW a été remplacé avec du milieu de culture de type *William's Medium E* (WME, #32551, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, É.-U.), supplémenté avec 14 mM de glucose et 50 µg/mL de gentamicine, préchauffé à 37°C et équilibré au carbogène (95% O₂, 5% CO₂). Avec environ 20 µL de milieu dans les entrées, les plateformes chargées ont été replacées dans une chambre humide, à l'intérieur d'un incubateur maison (37°C, 95% O₂, 5% CO₂) tel que montré à la Figure A.2.
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

Figure A.2: Incubateur maison utilisé pour cultiver les TMDF. Pour garder la température constante à 37°C, un élément chauffant est contrôlé par le relai déclenché lorsque le senseur de température détecte une température trop basse. Le ventilateur sert à répartir la chaleur autour de la boîte d'incubation. Le gaz carbogène est injecté dans l'humidificateur et le gaz humidifié est poussé dans la boîte d'incubation via un tube de caoutchouc. La pompe seringue peut être branchée aux microsystèmes à l'intérieur de la boîte au besoin. Le tout est contenu dans une armoire vitrée et scellée, pour limiter les échanges de température avec l'extérieur.

En suivant la procédure décrite à la section 2.2.3, le milieu de culture a été changé à plusieurs reprises au cours d'une expérience, après 1, 24 et 45 heure(s) d'incubation des TMDF. Dans certaines expériences, le milieu contenait en plus des agents chimiques dont la biotransformation par l'activité métabolique du foie devait être étudiée. Les fractions de milieu ainsi collectées ont donc été conservées pour l'analyse de molécules sécrétées ou métabolisées par les TMDF pendant la période d'incubation.

### A.1.3 Techniques d'analyse de viabilité

#### A.1.3.1 Sécrétion du marqueur de mortalité lactate déshydrogénase (LDH)

Il existe quelques différences entre les tests LDH effectués dans le laboratoire de Groningue par rapport à ceux effectués au CRCHUM en raison principalement des réactifs et instruments disponibles. À Groningue, le test a été adapté d'une procédure bien établie pour mesurer la LDH
des PCLS en utilisant un kit de détection en fluorescence (CytoTOX-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay, Promega Corporation, Madison, WI, É.-U.). Des fractions de milieu (100 µL) ont été extraites des microsystèmes aux différents temps d'analyse (Figure 2.5), puis conservées à 4°C jusqu'au moment du test de détection, au maximum quatre jours après le jour de coupe du tissu. Pour fins de comparaison, des PCLS complètes ont aussi été cultivées en parallèle dans une plaque à 12 puits (1 mL de milieu par puits, avec agitation) puis 1 mL de milieu a été extrait à chaque temps d'analyse. Après 45 heures d'incubation, le tissu a été extrait des systèmes (dans 100 µL de milieu) et des plaques (dans 1 mL de milieu). Dans ce cas-ci, la lyse a été accomplie par l'ajout d'un tampon de lyse (inclus dans le kit) à un ratio volumique 1:50 ainsi que par l'action mécanique d'un homogénéisateur à billes activé pendant 45 secondes. Après avoir centrifugé les échantillons lysés à 13 200 g pendant deux minutes, le surnageant était prêt à être analysé. L'analyse a été accomplie avec 50 µL d'échantillon (fraction de milieu ou surnageant de tissu lysé), 50 µL de réactif et 25 µL de solution d'arrêt. Pendant l'incubation avec le réactif à température de la pièce pendant 20 minutes (à l'abri de la lumière), la molécule résazurine est convertie en la molécule fluorescente résorufine (Figure 2.10) détectée à l'aide d'un lecteur à fluorescence (excitation à 560 nm et émission à 590 nm). Pour faciliter la comparaison avec les résultats précédents obtenus par cette méthode, aucun facteur de correction n'a été appliqué pour tenir compte de la dégradation de l'enzyme LDH. Chaque mesure a été normalisée par rapport à la somme des mesures de fluorescence de tous les échantillons d'un même système. Puisque la quantité de LDH relâchée est proportionnelle à la mortalité cellulaire, les données sont présentées comme un taux de mortalité (pourcentage de mort par heure).

### A.1.3.2 Microscopie confocale

#### A.1.3.2.1 Marquage des échantillons avec des fluorophores de viabilité

Les échantillons ont été marqués en suivant essentiellement la même procédure que celle décrite pour les micro-fragments de tumeur à la section 2.3.1.1. La calcéine AM, dont le mécanisme d'action est très similaire à celui du CTG CMFDA, a été utilisée en remplacement de celui-ci pour marquer les cellules viables alors que le PI a été utilisé pour marquer les cellules mortes. Les échantillons ont été marqués séquentiellement avec une solution de milieu WME contenant de la calcéine AM (4 µM) pendant une heure, puis avec une solution de PBS contenant du PI (3 µM) pendant 20 minutes. Les systèmes ont été rincés deux fois avec du PBS avant l'imagerie.
#### A.1.3.2.2 Acquisition d'images au centre de microscopie de l'UMCG

Les images de TMDF ont été acquises au centre de microscopie de l'UMCG en utilisant un microscope confocal inversé de type Leica TCS SP7 (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) muni d'un objectif 20X (sans liquide d'immersion), soit un microscope très similaire à celui utilisé au CRCHUM. Essentiellement, le même protocole d'imagerie a été suivi (section 2.3.1.2), sauf que la calcéine AM et le PI ont été excités séquentiellement en utilisant des lasers de 488 nm et de 552 nm, et leur signal fluorescent a été collecté aux plages de longueurs d'onde 500-545 nm et 601-700 nm, respectivement. Les spectres d'excitation et d'émission de la calcéine AM sont presque parfaitement superposés à ceux du CTG, alors la Figure 2.8 peut être utilisée comme référence.

#### A.1.3.3 Microscopie à deux photons

La microscopie à deux photons a le potentiel de doubler la profondeur d'imagerie des échantillons par rapport à la microscopie confocale [79]. Elle a été employée lors de tests préliminaires au Centre de microscopie de l'UMCG à Groningue dans le but d'imager le centre des échantillons de foie.

La microscopie à deux photons est une technique d'imagerie en fluorescence non linéaire : deux photons doivent interagir presque simultanément avec la molécule fluorescente pour l'exciter, résultant en une dépendance quadratique envers l'intensité incidente [80]. Alors en doublant l'intensité, la fluorescence quadruple. Les fluorophores sont excités par deux photons dont l'énergie vaut environ la moitié de l'énergie d'excitation. Une fois excité, le fluorophore suit un processus de désexcitation et d'émission fluorescente normal, signifiant que le spectre d'émission demeure pratiquement inchangé par rapport au spectre à un photon.

La non linéarité de cette technique d'imagerie permet de produire un sectionnement optique différent de celui produit par le microscope confocal. La probabilité que deux photons atteignent un même fluorophore dans un laps de temps suffisamment court (inférieur à $0,5 \times 10^{-15}$ secondes [81]) pour parvenir à additionner leurs énergies afin de l'exciter est extrêmement faible à l'extérieur du volume focal et donc aucune fluorescence ne provient de cette zone. À l'inverse, dans la zone focale, cette probabilité devient suffisante à condition qu'un laser pulsé soit utilisé. Pour produire un signal intéressant, il faut en effet concentrer l'intensité lumineuse dans l'espace (en focalisant
la lumière à l'aide d'un objectif à ouverture numérique (NA) élevée) et dans le temps (en produisant des pulses d'une durée de moins d'une picoseconde ayant une intensité élevée) [80], [81].

Cette technique a le potentiel d'augmenter la profondeur d'imagerie des tissus de deux façons. D'abord, le tissu se trouve excité à une longueur d'onde plus élevée (dans le proche infrarouge), généralement associée à des coefficients d'absorption et de diffusion plus faibles dans le tissu biologique [81]. Cela permet à une plus grande proportion des photons d'excitation de pénétrer profondément dans le tissu. Deuxièmement, grâce au sectionnement optique probabiliste, aucun sténopé n'est placé devant le détecteur. En effet, cette méthode de sectionnement assure que tous les photons qui reviennent au détecteur proviennent du volume focal et constituent le signal à détecter [81], ce qui permet de capter les photons ayant diffusé à travers le tissu qui réussissent à parvenir au détecteur.

Un microscope optique droit (non inversé) multiphotonique à balayage laser (Zeiss LSM 7MP, Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne) était disponible au centre de microscopie de l'UMCG. La technique a été utilisée pour vérifier si le centre des échantillons de foie pouvait être imagé. Étant donné l'ouverture numérique élevée des objectifs de ce type de microscopie, leur distance de travail est très courte, entre 1,27 et 2,5 mm dans le cas des objectifs disponibles. Une version différente du microsystème a donc été créée pour ces tests en modifiant la couche du dessus du système. Une lamelle de verre a été employée dont les trous d'entrée et de sortie ont été perforés à l'aide d'un instrument de sablage par micro-jet d'abrasif. Deux petits morceaux percés de PDMS couvrant tout juste l'entrée et la sortie du système ont été ajoutés pour créer des réservoirs facilitant les changements de milieu. Toutes les parties des systèmes ont été assemblées suite à un traitement des surfaces au plasma d'oxygène. Au total, l'épaisseur entre le haut de la lamelle de verre et le centre de l'échantillon, correspondant à la distance de travail maximale pour imager jusqu'au centre d'un spécimen déposé au fond du puits, était d'environ 1,15 mm, soit tout juste en-dessous de la limite posée par les objectifs disponibles.
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure A.3: Spectres d'excitation à deux photons et d'émission de fluorescence associés pour le PI et la fluorescéine (FITC). Figures reproduites de [82] avec l'autorisation de l'éditeur et légèrement modifiées.</figcaption></figure>

Des spectres d'excitation à deux photons et d'émission associés ont été trouvés dans la littérature pour la fluorescéine (dont la calcéine AM est un dérivé) et le PI (Figure A.3, [82]) et ont été utilisés pour tenter de trouver les conditions idéales d'imagerie. Cependant, aucune procédure standardisée n'a pu être déterminée pour ce type de microscopie pendant les quelques heures consacrées à cette investigation. Les TMDF ont été marqués suivant le protocole décrit à la section A.1.3.2.1. Seuls des tests préliminaires effectués en variant l'intensité du laser, le gain des détecteurs et la longueur d'onde d'excitation ont pu être menés. Des filtres fixes étaient disponibles pour placer devant les détecteurs. Deux sets de deux filtres correspondaient bien aux longueurs d'onde d'émission théoriques de nos fluorophores. Le premier set était composé d'un premier filtre passe-bande de 525 à 560 nm et d'un second filtre passe-bande de 650 à 705 nm. L'autre set était composé d'un filtre passe-bande de 500 à 550 nm et d'un filtre passe-bande de 575 à 610 nm.
### A.1.4 Analyse de l'état métabolique des micro-fragments de tissu

L'objectif premier d'une culture organotypique est de préserver, autant que possible, les caractéristiques fonctionnelles du tissu. La viabilité, bien sûr, est une condition essentielle mais non suffisante au maintien des fonctions d'un tissu. Pour le tissu de foie, l'une des fonctions à préserver est sa capacité à transformer, grâce à l'action d'enzymes spécialisées, les médicaments et d'autres composantes chimiques étrangères (xénobiotiques) qui sont généralement hydrophobes en des formes hydrophiles qui peuvent être plus facilement évacuées par le corps [83]. Certaines composantes médicamenteuses sont inactives et acquièrent une activité pharmacologique seulement au moment où elles sont métabolisées par le foie.

Les réactions de métabolisme sont séparées en deux phases. Pendant la phase I, ou la phasede fonctionnalisation, la molécule subit des transformations visant à faciliter l'ajout de petits groupements polaires et ionisables par la suite lors de la phase II dite de conjugaison [83]. La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP, en anglais : *high-performance liquid chromatography (HPLC)*) est l'une des méthodes pouvant mesurer ces réactions de métabolisme en détectant de telles petites modifications à la structure chimique d'une molécule.

#### A.1.4.1 Chromatographie en phase liquide à haute performance

La CLHP est une technique de séparation des molécules d'une solution dans une colonne remplie d'une phase stationnaire (constituée de grains fins solides) par laquelle circule une phase mobile (liquide). Les différentes molécules de la solution à analyser circulent à des vitesses différentes à travers la colonne en fonction de leur degré d'interaction avec la phase solide ainsi que de leur affinité avec la phase mobile.

Une technique de détection de métabolites de phase I et II de la composante 7-ethoxycoumarine a été mise au point au laboratoire de Dre Groothuis à l'Université de Groningue, tel que précédemment décrit en détails [84]. Cette xénobiotique comporte un métabolite de phase I, la 7-hydroxycoumarine (7-HC), et deux métabolites de phase II, soit la forme glucuronisée (7-HC-G) et la forme sulfatée (7-HC-S) du métabolite de phase I.

Grâce à l'aide précieuse du personnel de recherche à Groningue, en particulier Marina de Jager et Jan Visser, pour mettre en place l'instrumentation nécessaire et préparer les réactifs, cette même technique de détection a pu être testée dans le cadre du stage à l'étranger.
Les TMDF ont été exposés, à l'intérieur des microsystèmes, à 100 µM de 7-EC et de 7-HC. Pour fins de comparaison, des PCLS complètes ont aussi été exposées en parallèle, dans une plaque à 12 puits (1 mL de milieu par puits, avec agitation), aux mêmes conditions. Les échantillons ont été incubés pendant deux heures pour leur laisser le temps de métaboliser les molécules. Cette incubation a été répétée à plusieurs temps d'analyse pour suivre l'évolution de l'état métabolique du tissu de foie. Après chaque période d'incubation, la procédure de changement de milieu a été suivie pour extraire 60 µL de la sortie des systèmes traités. De l'azoture de sodium a été ajouté aux échantillons de milieu à une concentration de 1 mg/mL pour éviter leur contamination, puis les échantillons ont été conservés à -20°C jusqu'au moment de l'analyse.

Une fois tous les échantillons récoltés, ils ont été transférés dans un échantillonneur automatique. Chacun des échantillons a été injecté tour à tour dans la colonne de séparation de type BDS Hypersil C8. La phase mobile était initialement composée de 7,5% d'acétonitrile, 1% d'acide acétique et 91,5% d'eau contenant 5 mM d'hydrogénosulfate de tétrabutylammonium, avec un gradient linéaire sur 18 minutes jusqu'à une composition finale de 45% d'acétonitrile, 1% d'acide acétique et 54% d'eau contenant 5 mM d'hydrogénosulfate de tétrabutylammonium. Les substances sortant de la colonne ont été détectées en continu à l'aide d'un lecteur d'absorbance à 320 nm. L'intensité détectée pour les pics correspondant aux métabolites d'intérêt a été comparée aux mesures des courbes d'étalonnage, produites au début et à la fin de chaque séance de prise de données, pour trouver la concentration de chaque métabolite dans la solution de milieu analysée.

## A.2 Résultats

### A.2.1 Analyse de viabilité

L'analyse de viabilité du tissu de foie a été accomplie à l'aide de trois techniques, dont deux en commun avec l'analyse de viabilité du tissu de tumeur. Il s'agit de la sécrétion du biomarqueur de mortalité, la lactate déshydrogénase, dans le milieu entourant les TMDF et de la microscopie confocale. Pour pousser encore plus loin la technique d'imagerie, un microscope multiphotonique a aussi été employé dans des tests préliminaires visant à imager le centre du tissu.
A.2.1.1 Sécrétion de lactate déshydrogénase

C'est à Groningue que les premiers résultats concluants de mesure de LDH sur les micro-
fragments de tissu ont été obtenus. Par la suite, les apprentissages sur la technique ont été transposés
à Montréal pour adapter la procédure aux échantillons de tumeurs (tel que décrit à la section 3.3.3).

La LDH a été mesurée dans les fractions de milieu collectées à la sortie des systèmes microfluidiques où étaient cultivés des TMDF ou dans le milieu prélevé des plaques à 12 puits où étaient incubées les PCLS. Les valeurs ont été normalisées à la quantité totale mesurée pour une même condition au cours de toute la période d'analyse de 45 heures afin de suivre l'évolution du taux de mortalité des mêmes échantillons dans le temps. Le nombre d'expériences indépendantes (E) s'est élevé à trois ou quatre. Chaque expérience a été effectuée avec du tissu de foie d'un rat différent en quadruplicat, signifiant que chaque condition a été répétée quatre fois dans chacune des expériences.

Tel que montré à la *Figure A.4*, une tendance similaire à celle décrite pour les TMD de xénogreffe de souris a été observée pour les TMDF, soit un taux de mortalité élevé au premier point d'analyse, suivi de taux beaucoup plus faibles par la suite. Toutefois, pour les échantillons de foie, une période de pré-incubation d'une heure est généralement admise et a été reproduite dans ces expériences pour la récupération du tissu, comparativement à une période de 24 heures laissée pour la récupération des échantillons de tumeur. Aussi, les échantillons de foie semblent mourir beaucoup plus rapidement que les échantillons de tumeur, tel que montré par un taux de mortalité exprimé en pourcentage par heure plutôt que par jour. Cela nous porte à croire que les échantillons de foie sont plus fragiles aux conditions d'incubation que les échantillons de tumeur. En effet, la mort cumulative mesurée pour les échantillons de tissu a atteint environ 75% après 45 heures pour le foie comparativement à seulement 48% après huit jours pour le tissu de xénogreffe le moins viable (xénogreffes de PC3). Une différence importante entre les deux types de culture est le rythme de prolifération qui est généralement beaucoup plus élevé pour les cellules tumorales [48] que pour les cellules hépatiques primaires [85].
<figure><img src="image_42.png" /></figure>

Figure A.4: Taux de mortalité pour les TMDF (ligne verte) de foie de rat et pour les PCLS (ligne pointillée grise) mesurés comme des taux de sécrétion du biomarqueur de mortalité LDH sur une période de 45 heures après le début de l'incubation. Les résultats sont normalisés à la quantité totale de LDH mesurée pour un même système ou un même puits tout au long de l'expérience. Les barres d'erreur représentent ± l'erreur type sur la moyenne de trois ou quatre expériences indépendantes.

Néanmoins, aucune différence significative n'a été notée pour les TMDF incubés dans la plateforme microfluidique comparativement aux PCLS incubées dans les plaques à 12 puits, ce qui indique que la mortalité relativement élevée des TMDF n'est pas due à la méthode d'incubation dans les microsystèmes mais est plutôt attribuable à la mort naturelle du tissu dans les conditions *in vitro* auxquelles il est exposé. Un taux de mortalité plus élevé a tout de même été mesuré dans les TMDF comparativement aux PCLS, même si cette différence n'est pas significative (le résultat au test-t non pairé vaut 0,066). La mortalité mesurée après une heure peut être attribuée, au moins en partie, au stress causé sur la surface du tissu par la procédure de coupe. À cause d'un ratio de surface sur volume plus important pour les TMDF (environ 1,5 fois supérieur pour une tranche de 250 µm d'épais), il n'est pas surprenant de constater une mortalité plus élevée au premier point d'analyse.

Ces résultats peuvent aussi être comparés aux résultats précédents obtenus par van Midwoud et al. (Figure A.5, [84]) dans le même laboratoire en 2010. On remarque d'abord que les taux de sécrétion après la période de pré-incubation étaient plus bas pour les expériences de 2010. Aussi, des taux plus faibles avaient été mesurés après quatre heures d'incubation comparativement
aux résultats de nos expériences. Malgré les efforts à reproduire les mêmes conditions expérimentales, il semble qu'il y ait eu des différences d'exécution ou des différences intrinsèques au tissu étudié entre les deux groupes d'expérience ayant conduit à des résultats sensiblement différents. Cela montre bien l'importance d'avoir répété les mesures de sécrétion pour les PCLS dans la plaque à 12 puits pour établir une base de comparaison juste entre les deux techniques d'incubation étudiées (TMDF dans les microsystèmes et PCLS dans une plaque à 12 puits).

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

Figure A.5: Taux de sécrétion de LDH en fonction du temps pour des PCLS d'expériences antérieures. Figure reproduite de la référence [84] avec l'autorisation de l'éditeur. Les PCLS ont été incubées soit dans une plaque à 12 puits (barres blanches), soit dans un système avec perfusion intégrée (barres grises). Les barres d'erreur indiquent ± l'erreur type sur la moyenne de trois expériences indépendantes.

Enfin, la mesure de la LDH dans le milieu entourant les échantillons de tissu nous a permis de constater qu'il n'y a pas de différence significative de survie entre les PCLS dans une plaque à 12 puits agitée et les TMDF dans les microsystèmes non perfusés. Toutefois, une tendance non significative de mortalité plus élevée a été notée après une heure d'incubation des TMDF qui peut s'expliquer par le fait qu'une plus grande proportion de l'échantillon a été exposé à la procédure de coupe à cause d'un ratio surface/volume plus important pour les TMDF.

### A.2.1.2 Microscopie confocale

Les TMDF ont aussi pu être imagées par microscopie confocale à deux reprises. Ces résultats sont compilés à la Figure A.6 (A).
<figure><img src="image_44.png" /></figure>

Figure A.6: Viabilité des TMDF après 24 et 45 heures d'incubation, mesurée par microscopie confocale sur les échantillons marqués à la calcéine AM et au PI. A) Résultat de l'analyse d'images faite par l'algorithme de segmentation pour deux expériences indépendantes, chacune comportant 10 TMDF. Les barres d'erreur indiquent ± l'écart-type de la moyenne des 10 TMDF. B-C) Projections maximales de séquences d'images représentatives de l'expérience 1 après 45 h d'incubation (B) et de l'expérience 2 après 24 h d'incubation (C) et scores de viabilité associés. Les images utilisées pour produire cette figure ont été acquises au Centre de microscopie de l'UMCG subventionné par NWO-grant 175-010-2009-023.

Selon les résultats de LDH, des mortalités cumulatives moyennes d'environ 55% et 70% étaient attendus après 24 heures et 45 heures, respectivement. Or, les résultats de microscopie confocale ne sont pas très consistants avec ces attentes. Une viabilité anormalement élevée de 81 ± 8% (moyenne ± écart-type) a été obtenue lors de la première expérience, analysée après 48 heures d'incubation. À l'opposé, une viabilité plutôt faible de 36 ± 16% a été obtenue lors de la seconde expérience (indépendante de la première), analysée après 24 heures d'incubation. Notons que la mortalité cumulative moyenne trouvée par le test LDH représente des résultats individuels assez étalés, dont certains recoupent avec les deux expériences de microscopie montrées à la Figure A.6 (A). Ces expériences ont été effectuées avec le tissu de deux rats différents, et malheureusement, la sécrétion de LDH n'a été mesurée pour aucune d'entre elles. Aussi, le microscope confocal n'image que la couche inférieure des TMDF jusqu'à une profondeur d'environ 40 µm, alors une importante portion des échantillons ne sont pas représentés dans ces résultats. Enfin, lors de la seconde expérience, la procédure de coupe était enseignée à un nouvel utilisateur, ce qui a pu introduire des erreurs de manipulation conduisant à une viabilité plus faible.
Il serait important d'identifier les sources de la variabilité qui peuvent résider dans la qualité initiale du tissu de foie, les conditions auxquelles il est exposé (température, concentration d'oxygène, type de milieu) pendant la procédure coupe, le temps entre la récolte du tissu et l'initiation de l'incubation, etc. En effet, les résultats de la première expérience après 45 heures d'incubation seraient très prometteurs s'ils pouvaient être reproduits.

Les résultats de viabilité calculés par l'algorithme de segmentation des images fluorescentes correspondent très bien à ce qui est observé visuellement en examinant les images acquises au microscope. Des exemples de projections maximales du signal et des résultats correspondants de viabilité sont montrés aux sous-figures *B* et *C* de la Figure A.6.

Pour conclure, les quelques résultats de microscopie confocale acquis pour le tissu de foie ont témoigné de la variabilité des échantillons de différentes expériences en termes de viabilité. La technique a tout de même permis de mesurer toute une gamme de viabilités allant de 17% à 90% à travers les deux expériences et de valider l'applicabilité de l'algorithme de calcul de viabilité pour ces images. Le signal élevé, uniforme et non dispersé des cellules ainsi que la très faible autofluorescence aux intensités employées a permis à l'algorithme de performer sans faille.

### A.2.1.3 Microscopie à deux photons

La microscopie à deux photons a été étudiée comme technique alternative à la microscopie confocale pour imager plus profondément dans le tissu de foie. Toutefois, les conditions optimales d'excitation et de détection des marqueurs fluorescents (calcéine AM et PI) n'ont pas pu être trouvées avec certitude.

Néanmoins, ces expériences ont permis d'imager avec succès à travers un système microfluidique modifié dont la couche supérieure était composée d'une lamelle de verre. Pour la première fois, les échantillons ont été imagés par le haut à travers une lamelle de verre en utilisant un microscope droit multiphotonique.

Dans un premier temps, la profondeur d'imagerie a été évaluée en excitant l'échantillon à 830 nm. À cette longueur d'onde, des signaux intenses dans le vert et le rouge étaient détectés, laissant croire qu'il pourrait s'agir des fluorophores d'intérêt (calcéine AM et PI). Or, tel que confirmé plus tard en imageant le tissu non marqué, le signal vert détecté à cette longueur d'onde ne provenait pas de la calcéine AM. Tel que montré à la Figure A.7, cette première acquisition a
tout de même permis de constater que la profondeur d'imagerie était doublée à environ 100 µm par rapport à celle de la microscopie confocale.

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

Figure A.7: Comparaison de la profondeur d'imagerie de la microscopie à deux photons par rapport à celle de la microscopie confocale. Image d'une section optique et des deux coupes orthogonales de l'endroit indiqué par la croix jaune pour la microscopie multiphotonique (excitation à 830 nm, imagerie par un système droit) (A) et pour la microscopie confocale (imagerie par un système inversé) (B). Barres d'échelle = 100 µm. Les images utilisées pour produire cette figure ont été acquises au Centre de microscopie de l'UMCG subventionné par NWO-grant 175-010-2009-023.

La prochaine étape consistait à imager une TMDF non marquée en l'excitant à diverses longueurs d'onde pour valider l'absence de signaux pouvant contaminer le signal fluorescent d'intérêt. La Figure A.8 montre les signaux récoltés lorsque le tissu était excité à différentes longueurs d'onde allant de 780 à 1000 nm. Étonnamment, un signal a été détecté sur une large plage de longueurs d'onde allant de 780 à 940 nm. Ce signal pourrait être dû à l'autofluorescence du tissu ou à un autre processus optique non linéaire se produisant dans l'échantillon, tel que la génération de seconde harmonique. Toutefois, puisque la génération de seconde harmonique se fait exactement à la moitié de la longueur d'onde d'excitation et que ce type de signal se propage généralement vers l'avant, il est impossible que le signal capté en epi-collection dans le filtre de 500 à 550 nm soit de cette origine [80]. Il est beaucoup plus probable que le signal détecté soit
l'autofluorescence du tissu qui devient détectable grâce aux détecteurs ultra-sensibles utilisés en microscopie à deux photons.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure A.8: Images d'un échantillon de tissu de foie non marqué, excité à différentes longueurs d'onde allant de 780 à 1000 nm. Signaux captés de 500 à 550 nm (vert) et de 575 à 610 nm (rouge). Les longueurs d'onde d'excitation sont indiquées sur chaque image (en nm). Les images utilisées pour produire cette figure ont été acquises au Centre de microscopie de l'UMCG subventionné par NWO-grant 175-010-2009-023.</figcaption></figure>

Donc seule la plage de 960 à 1000 nm restait disponible pour exciter les échantillons en minimisant le signal d'autofluorescence du tissu. Un signal vert, correspondant possiblement au signal de la calcéine AM, a finalement été mesuré dans l'échantillon marqué en l'excitant à 960 nm (Figure A.9 (A)). Par contre, aucun signal rouge n'a été détecté à cette longueur d'onde. En se référant à la Figure A.8, on constate qu'il y a très peu de signal de contamination rouge aux longueurs d'onde testées. L'échantillon marqué de la Figure A.7 imagé à 830 nm montrait pourtant du signal rouge s'apparentant au signal de PI détecté au microscope confocal. Il se pourrait donc que le PI puisse être excité à 830 nm. Cependant, ni l'excitation à 960 nm pour la calcéine AM, ni l'excitation à 830 nm pour le PI ne sont en accord avec les spectres d'excitation à deux photons trouvés dans la littérature (Figure A.3, [82]), ce qui donne peu de confiance en ces paramètres d'imagerie.

Cette expérience a aussi permis de constater que les TMDF piégés dans le système microfluidique étaient bien plus simples à imager qu'une PCLS complète posée dans un pétri. D'abord, chaque TMDF imagé était complètement contenu dans le champ de vue des objectifs 20X et 32X utilisés, permettant d'en faire l'acquisition complète sans bouger l'échantillon. Aussi,
puisque le TMDF se trouvait dans un système fermé indépendant du liquide d'immersion, la
position du tissu n'était pas affectée par les mouvements du microscope pendant la recherche d'une
zone d'intérêt et pendant l'acquisition (Figure A.9).

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Figure A.9: Effet du mouvement sur la qualité de l'image. A) Image d'une PCLS acquise sans mouvement du tissu (excitation à 830 nm). B) Image d'une PCLS avec des artéfacts de mouvement causés par le déplacement de la tranche dû au mouvement de l'objectif. Les images utilisées pour produire cette figure ont été acquises au Centre de microscopie de l'UMCG subventionné par NWO-grant 175-010-2009-023.

Enfin, en poursuivant l'optimisation des paramètres d'imagerie et peut-être en choisissant
des fluorophores différents, cette technique pourrait doubler la profondeur d'imagerie du tissu
jusqu'à au moins 100 µm. Ceci permettrait de se rapprocher du centre de l'échantillon et d'avoir
une meilleure représentation de la distribution spatiale de la viabilité en fonction de la profondeur.

A.2.2 État métabolique

En plus de l'évaluation de la viabilité, le métabolisme des TMDF a été analysé lors des
expériences menées à Groningue. Dans une expérience préliminaire, les métabolites formés par la
biotransformation de la 7-EC et de la 7-HC ont été mesurés par chromatographie en phase liquide
à haute précision (CLHP) dans le milieu extrait des microsystèmes après deux heures d'incubation
avec ces xénobiotiques.
### A.2.2.1 Chromatographie en phase liquide à haute précision pour la détection de métabolites de la 7-EC et de la 7-HC

#### A.2.2.1.1 Métabolisme de phase I

Notre tentative à mesurer le métabolisme de phase I dans le milieu extrait des microsystèmes après incubation avec la 7-EC n'a pas été fructueuse, car les métabolites n'étaient présents qu'à faibles concentrations. Plusieurs facteurs peuvent expliquer ce résultat. Premièrement, la conversion du 7-EC en 7-HC se fait à un rythme relativement lent [86], puis ce métabolite peut ensuite être converti en les métabolites de phase II. Seulement de faibles concentrations de tous les métabolites (7-HC, 7-HC-G et 7-HC-S) se trouvent donc dans le milieu, ce qui les rend difficiles à détecter. En plus, l'activité de l'enzyme responsable de ce métabolisme de phase I est graduellement perdue au cours des 24 premières heures d'incubation *in vitro* [87]. Il a tout de même été possible de mesurer le métabolisme de phase I dans le milieu entourant les PCLS incubées dans une plaque à 12 puits, tel que précédemment montré [55], [86], [87]. Cette différence de détection pourrait simplement être due à la limite de détection de l'instrument qui aurait été atteinte pour les échantillons de milieu provenant des systèmes. En effet, ceux-ci étaient environ 1,5 fois plus dilués que ceux provenant des plaques à 12 puits (25 fois moins de tissu, mais seulement 17 fois moins de milieu récolté). Par la suite, le seuil d'analyse des pics d'absorbance a été réduit pour que l'instrument détecte les plus petits pics associés à des concentrations plus faibles de métabolites, mais le temps n'a pas permis de vérifier si cela aurait aidé à détecter le métabolisme de phase I avec les conditions expérimentales décrites ici.

Pour augmenter les chances d'obtenir des concentrations détectables de métabolites, la concentration de la substance 7-EC aurait pu être augmentée à 500 µM ou le métabolisme d'une autre substance, telle la testostérone, aurait pu être étudié.

#### A.2.2.1.2 Métabolisme de phase II

Le métabolisme de phase II a été évalué pour les PCLS et pour les TMDF incubés dans la plateforme microfluidique en détectant les métabolites 7-HC-G et 7-HC-S après une incubation avec 200 µM de 7-HC. Tel que montré à la *Figure A.10*, les résultats pour les TMDF dans les systèmes sont très similaires à ceux des PCLS dans la plaque à 12 puits, sauf pour la 7-HC-S qui a été métabolisée à un rythme plus faible dans les microsystèmes lors du première période
d'incubation de deux à quatre heures. Il se peut que cela soit dû à des erreurs expérimentales, puisque les valeurs mesurées à la seconde période d'incubation de 21 à 23 heures sont redevenues similaires à celles des PCLS cultivées dans la plaque à 12 puits.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure A.10: Rythme de formation des métabolites de la 7-HC à différentes périodes d'incubation pour des TMDF dans les microsystèmes ou pour des PCLS dans une plaque à 12 puits. Les barres d'erreur montrent ± l'écart-type de quatre mesures d'une même expérience.</figcaption></figure>

Enfin, ces résultats préliminaires nous portent à croire que la plus petite taille des TMDF n'affecte pas leur capacité métabolique de phase II. Quant au métabolisme de phase I, les conditions expérimentales devraient être modifiées pour améliorer la détection des métabolites par CLHP.
Il peut donc être conclu de ces résultats de stage que les échantillons de foie peuvent être coupés et cultivés dans la plateforme microfluidique développée. Les résultats ont permis de valider que la viabilité des TMDF peut être déterminée par la détection du biomarqueur de mortalité LDH ou par microscopie confocale des tissus marqués avec des fluorophores de viabilité. Différentes techniques d'analyse qui pourraient être utiles à l'étude des micro-fragments de tissu cancéreux ont aussi été explorées. En particulier, le test LDH a été adapté aux échantillons de tumeur cultivés au CRCHUM après le stage. De plus, la technique de CLHP, possiblement couplée à un spectromètre de masse pour plus d'information sur la composition chimique des substances sortant de la colonne, pourrait être employée pour détecter des protéines particulières sécrétées par le tissu tumoral. Une fois optimisée, la microscopie à deux photons aiderait, quant à elle, à imager plus profondément dans le tissu et à éventuellement déterminer la distribution spatiale des cellules viables et mortes à travers le tissu.