# Dynamique des communautés procaryotiques actives dans l'élevage larvaires de la crevette bleue du Pacifique, Penaeus stylirostris : influence des intrants et identification de biomarqueurs bactériens de la santé des larves

Carolane Giraud

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## To cite this version:

Carolane Giraud. Dynamique des communautés procaryotiques actives dans l'élevage larvaires de la crevette bleue du Pacifique, Penaeus stylirostris : influence des intrants et identification de biomarqueurs bactériens de la santé des larves. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de la Nouvelle-Calédonie, 2023. Français. NNT : 2023NCAL0003. tel-04610311

HAL Id: tel-04610311

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Submitted on 13 Jun 2024

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# THÈSE

présentée devant
L'UNIVERSITÉ DE LA NOUVELLE-CALÉDONIE
ÉCOLE DOCTORALE DU PACIFIQUE

par
Carolane GIRAUD

pour obtenir le grade de
DOCTEUR

Spécialité : Biologie des populations et écologie | Écologie microbienne

# Dynamique des communautés procaryotiques actives dans les élevages larvaires de la crevette bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris* : influence des intrants et identification de biomarqueurs bactériens de la santé des larves

*Travail réalisé au sein de l'Unité Lagons, Écosystèmes et Aquaculture durable en Nouvelle-Calédonie (LEAD-NC) de l'Ifremer et de l'Institut des Sciences Exactes et Appliquées (ISEA) de l'Université de la Nouvelle-Calédonie (UNC)*

Sous la direction de : **Viviane Boulo** (Ifremer) et **Nazha Selmaoui-Folcher** (UNC)

Sous l'encadrement de : **Nolwenn Callac** (Ifremer) et **Nelly Wabete** (Ifremer)

Soutenue publiquement le **26 Avril 2023** devant le jury formé par :

**Benjamin Misson**

**Ludwig Jardillier**

**Christine Paillard**

**Pierre Galand**

**Yves Letourneur**

**Viviane Boulo**

**Nazha Selmaoui-Folcher**

**Nolwenn Callac**

MCF HDR, Université de Toulon, MIO

Pr, Université de Paris-Saclay, ESE

DR, CNRS, LEMAR

DR, CNRS, LECOB

Pr, UNC, ENTROPIE

CR HDR, Ifremer, IHPE

Pr, UNC, ISEA

CR, Ifremer, LEAD-NC

Rapporteur

Rapporteur

Examinatrice

Examinateur

Examinateur

Directrice

Directrice

Encadrante

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Ifremer

UNIS

UNIVERSITÉ
NOUVELLE-CALÉDONIE

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

INSTITUT DE SCIENCE
EXACTES ET APPLIQUÉES

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

ÉCOLE DOCTORALE DU PACIFIQUE

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

GOUVERNEMENT DE LA
NOUVELLE-CALÉDONIE

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

PROVINCE NORD
DE LA
NOUVELLE-CALÉDONIE
## Remerciements

Les premiers mots de ce manuscrit sont les derniers écrits et marquent la fin de 3 années (et 2 mois) incroyables. Il est donc temps d'arriver au bout de cette dernière ligne droite et de remercier toutes les personnes qui m'ont accompagnée au cours de cette thèse, tant dans les bons que dans les mauvais moments.

Rappelons d'abord que cette thèse est issue d'une collaboration entre l'unité Lagons, Écosystèmes et Aquaculture Durable en Nouvelle-Calédonie (LEAD-NC) de l'Ifremer et l'Institut des Sciences Exactes et Appliquées (ISEA) de l'Université de la Nouvelle-Calédonie (UNC). Elle a été effectuée sous la co-direction de Viviane Boulo (IHPE, Ifremer) et de Nazha Selmaoui-Folcher (ISEA, UNC) ainsi que sous l'encadrement de Nolwenn Callac (LEAD-NC, Ifremer) et de Nelly Wabete (LEAD-NC, Ifremer). Ce travail a bénéficié du soutien financier de l'École Doctorale du Pacifique (EDP) ainsi que du programme de recherche Ressources et Écosystèmes Aquacoles en Nouvelle-Calédonie (RESSAC) lui-même financé par un accord-cadre établi entre l'Ifremer, le Gouvernement de la Nouvelle-Calédonie et les Provinces. Ce programme a d'ailleurs permis le financement de ma participation au congrès ISS10 (Lyon, France) ainsi que 2 missions de formation en France et à Tahiti.

Pour commencer, je tiens à remercier les membres du jury d'avoir accepté de lire et d'évaluer ce manuscrit ; les rapporteurs Benjamin Misson et Ludwig Jardillier ainsi que les examinateurs Christine Paillard, Pierre Galand et Yves Letourneur.

Je remercie également les membres de mon comité de thèse : Linda Guentas, Véronique Bertheaux-Lecellier et Guillaume Cleuziou.

Je tiens à exprimer ma reconnaissance à Emmanuel Tessier et Benoît Soulard ainsi qu'à Peggy Gunkel-Grillon pour leur accueil respectif au sein des équipes du LEAD-NC et de l'ISEA.

Je remercie mes co-directrices de thèse, Nazha Selmaoui-Folcher et Viviane Boulo, de m'avoir donnée l'opportunité de réaliser ce travail.

Nazha, puisque la biologie et l'informatique ne parlent pas la même langue, ça n'a pas toujours été évident de se comprendre mais merci de m'avoir donnée les clés nécessaires pour apprivoiser les analyses multivariées et les méta-analyses.

Viviane, merci pour cet encadrement à distance au cours duquel tu as toujours été disponible. Merci pour tous ces échanges (virtuels ou non et parfois tardifs) et pour ta rigueur qui m'ont permis de garder un esprit critique pour faire avancer mon travail. Merci aussi pour nos brefs moments en France, à Montpellier et à Paris.

Je remercie mes co-encadrantes Nelly Wabete et Nolwenn Callac de m'avoir guidée, soutenue et encouragée pendant ces 3 années.

Nelly (ou cheffe ou jefa, c'est toi qui choisis), tu es l'une de mes plus belles rencontres sur cette île. Merci d'avoir partagé avec moi toutes tes connaissances passionnantes sur le monde de la crevette et de m'avoir fait une place dans ton emploi du temps déjà surchargé. Sur un plan plus personnel, merci de m'avoir ouvert les portes de ta maison et de m'en avoir appris un peu plus sur la Nouvelle-Calédonie et ses plantes.

Nolwenn, sans toi cette thèse n'aurait tout simplement pas été possible. Je ne pense pas avoir les qualités rédactionnelles nécessaires pour t'exprimer correctement toute ma
reconnaissance et ma gratitude mais je vais essayer de faire au mieux. Je tiens à te remercier d'avoir été une encadrante brillante tant sur le plan professionnel que personnel. Te rencontrer à Banyuls en 2018 a été une chance incroyable et je n'en serai pas là aujourd'hui si tu n'avais pas été là. Merci de t'être battue pour cette thèse et d'avoir cru en moi (tu y sûrement plus que cru que moi d'ailleurs !). Évidemment, ce projet n'a pas toujours été facile, on a connu des galères de mission (entre les logements, les prières au dieu de la crevette et les grèves d'avion...) mais aussi beaucoup de galères informatiques (parce que c'est bien connu R et Inkscape ne nous comprennent pas). Malgré tout ça, tes conseils, ta bienveillance et ta gentillesse ont toujours su me faire rebondir. Merci pour toutes ces (longues) heures de travail et pour ton implication sans limite. Merci aussi pour tous nos moments de vie en dehors du labo ; les déménagements, les repas de Noël (ou pas d'ailleurs), les apéros... Tu es une personne formidable, je te souhaite le meilleur pour la suite, tu le mérites !

Je remercie également Dominique Pham pour son implication toujours bienveillante au cours de cette thèse. Merci d'avoir répondu à toutes mes questions sur la crevette et son élevage avec bonne humeur. Avec Nelly, vous avez été mon encyclopédie styli ! Bon courage pour ton prochain encadrement de thèse, dernière ligne droite avant une retraite bien méritée !

Je remercie toutes les équipes de la SASV pour leur aide au cours de cette thèse et sans qui j'aurais sûrement eu beaucoup moins de données à analyser. Merci à toutes les personnes qui ont été impliquées de près ou de loin dans ce projet ainsi qu'à toutes celles qui font vivre la station.

Merci aux équipes écloserie et zootechnie, Jean-Sébastien, Jean-René, Pierre, Matehau, Julien L., Maxime et Vincent, d'avoir géré les élevages de la SASV et de m'avoir aidée à préparer le matériel pour les campagnes de prélèvement chez les privés.

Merci à Dominique et Florence pour leur implication dans les manips de biologie moléculaire et de chimie. Les filles merci de m'avoir formée et de m'avoir aidée pour les préparations de matériel (un véritable déménagement à chaque campagne !). Un merci tout particulier à Domi pour sa participation aux campagnes de prélèvement et pour les nombreux aller-retours Nouméa-Port Ouenghi en covoiturage.

Merci à Julien d'apporter de la bonne humeur dans le bureau.

Merci à tous les VSC qui sont passés par la station et qui ont contribué à l'avancement de ce projet : Célia, Armelle, Valentine, Gwenola, Valérie, Mélanie, Étienne et Thomas.

Merci à tous les autres avec qui je n'ai pas travaillé directement mais qui font aussi vivre le site : Eugénie, José, Jean-Marc et toute l'équipe du LEAD à Nouméa.

Je tiens à exprimer ma reconnaissance au Groupement des Fermes Aquacoles et plus spécifiquement à Séverine Duval sans qui nos campagnes de prélèvement en écloseries privées n'auraient pas pu avoir lieu. Je remercie également toutes les écloseries du territoire et leurs équipes de nous avoir fait confiance et de nous avoir accueillies avec bienveillance.

Merci pour ces échanges passionnants et pour votre disponibilité. Un merci particulier à Philippe M. pour ses nombreuses blagues, à David et Philippe R. pour leur immense gentillesse ainsi que leur disponibilité et à Anthony pour sa cuisine et son partage d'expérience.

Je remercie également les équipes de l'IHPE à Montpellier et du SeBiMER (Ifremer, Brest) chez qui j'ai eu l'occasion de faire de brèves missions pour des échanges scientifiques très intéressants et qui ont fait évoluer mon raisonnement ainsi que mon projet. Un merci tout particulier à Cyril Noël qui m'a grandement aidée pour la méta-analyse. Merci d'avoir partagé
ton expertise avec moi et de t'être arraché les cheveux pour faire parler ces données sans leur faire dire n'importe quoi.

Je remercie Claire Goarant de m'avoir fait confiance et de m'avoir confiée ses étudiants de L1 pour ma première expérience, plus que positive, d'enseignements.

Je remercie ma stagiaire préférée Claudia Wabete pour sa bonne humeur quotidienne, ses bons gâteaux hebdomadaires (tu sais si bien me parler !) et son sérieux au travail. J'ai été ravie que tu sois ma toute première stagiaire !

Je remercie également les étudiants que j'ai pu encadrer en projet tutoré, Mathilde Nyikieine, Dimitri Tran et Cassandra Lamataki, qui ont été bienveillants devant mes codes R pas toujours protocolaires. Merci pour votre investissement, votre bonne volonté et votre bonne humeur.

Sur un plan plus personnel, je remercie toutes mes belles rencontres calédoniennes ; Anthony, Aurélien et Célia.

Antho merci d'avoir accepté de partager ton quotidien avec ma thèse (quelque peu omniprésente ces derniers temps !). Merci pour ta gentillesse, tes bons repas et tes gâteaux (et merci d'avoir le même humour que moi !). Surtout, merci à toi et ta famille pour votre accueil à bras ouverts.

À mes collègues devenus ami(e)s, Aurél et Cécé, merci pour vos potins et vos histoires toutes plus improbables les unes que les autres, vous avez égayé ma vie à la station ! Ma Cécé malgré les (trop nombreuses) galères, on a de sacrés souvenirs, tu es quand même la seule personne qui a réussi à me traîner en boîte, et ça je pense que ça dit tout sur ce je pense de toi !

Je remercie le meilleur groupe d'ami(e)s dont on puisse rêver : Isa, Max, Nico, Estelle et Bastien. On a hâte de vous retrouver les copains, on a 3 ans à rattraper !

Je remercie la meilleure binôme de tous les temps, ma Juju ! Sans toi mes années master n'auraient pas du tout étaient les mêmes et mes années thèse non plus. L'un des plus gros points négatifs de cette thèse est sûrement de ne pas t'avoir vue pendant plus de 3 ans mais l'expression (un peu cheesy) loin des yeux près du cœur prend tout son sens. Merci pour nos interminables appels visio où j'ai pu vider mon sac plus d'une fois.

Je remercie toute ma famille et ma belle-famille et plus particulièrement mes parents et mes beaux-parents.

Philippe et Isabelle merci pour votre soutien, vos encouragements et votre aide, quelle chance d'avoir des beaux-parents comme vous ! Promis je ramène votre fils rapidement en métropole.

Papa, Maman, je l'ai fait ! merci pour votre soutien sans faille et vos encouragements depuis toutes ces années. Merci de m'avoir donnée l'opportunité de faire ce que je voulais. Merci de m'avoir transmis vos valeurs. Merci pour votre amour inconditionnel, plus que réciproque.

Enfin, je remercie tout particulièrement l'homme qui a été assez fou pour tout quitter et me suivre à l'autre bout du monde en pleine pandémie mondiale. Si cette thèse s'est aussi bien passée c'est en grande partie grâce à toi Do, tu as été mon plus grand soutien et ma plus grande motivation. On a connu 5 ans de brigade, 1 an de galère et 3 ans de thèse (agrémentées de quelques confinements) alors je pense qu'on est parés pour la suite Vallot !
À mon grand-père avec qui je danserai toujours joue contre joue,
À Germaine Vallot à qui nous aurions aimé dire au revoir une dernière fois...
# Sommaire

<table><tr><td>Remerciements</td><td>2</td></tr><tr><td>Sommaire</td><td>6</td></tr><tr><td>Liste des figures</td><td>12</td></tr><tr><td>Liste des tableaux</td><td>16</td></tr><tr><td>Liste des abréviations</td><td>18</td></tr><tr><td>Introduction générale</td><td>22</td></tr><tr><td>I- Chapitre I – État de l'art</td><td>26</td></tr><tr><td>I.1- La crevetticulture, du monde à la Nouvelle-Calédonie</td><td>26</td></tr><tr><td>I.1.1- Place de la crevette dans l'aquaculture mondiale</td><td>26</td></tr><tr><td>I.1.1.a- Chiffres clés de l'aquaculture</td><td>26</td></tr><tr><td>I.1.1.b- Crevetticulture</td><td>26</td></tr><tr><td>I.1.2- Crevetticulture en Nouvelle-Calédonie</td><td>27</td></tr><tr><td>I.1.2.a- Historique</td><td>27</td></tr><tr><td>I.1.2.b- Enjeux socio-économiques</td><td>29</td></tr><tr><td>I.1.2.c- Difficultés de production</td><td>30</td></tr><tr><td>I.2- Penaeus stylirostris : présentation du modèle d'étude</td><td>32</td></tr><tr><td>I.2.1- Présentation et morphologie de l'espèce</td><td>32</td></tr><tr><td>I.2.1.a- Origine et classification</td><td>32</td></tr><tr><td>I.2.1.b- Morphologie</td><td>33</td></tr><tr><td>I.2.2- Reproduction et cycle de vie des crevettes pénéides en milieu naturel</td><td>34</td></tr><tr><td>I.2.3- Reproduction et cycle de vie de Penaeus stylirostris en conditions maîtrisées</td><td>35</td></tr><tr><td>I.2.3.a- Élevage des géniteurs en bassins</td><td>35</td></tr><tr><td>I.2.3.b- Acclimatation et maturation des géniteurs</td><td>36</td></tr><tr><td>I.2.3.c- Reproduction des géniteurs</td><td>36</td></tr><tr><td>I.2.3.d- Élevage larvaire en écloserie</td><td>36</td></tr><tr><td>I.2.3.e- Élevage post-larvaire en nurserie</td><td>37</td></tr><tr><td>I.2.4- Présentation des stades larvaires</td><td>38</td></tr><tr><td>I.2.4.a- Le stade larvaire nauplius</td><td>38</td></tr><tr><td>I.2.4.b- Le stade larvaire zoé</td><td>39</td></tr><tr><td>I.2.4.c- Le stade larvaire mysis</td><td>40</td></tr><tr><td>I.2.4.d- Post-larves</td><td>41</td></tr><tr><td>I.3- Le microbiote ou les microorganismes au service de leur hôte</td><td>41</td></tr><tr><td>I.3.1- Historique et définitions</td><td>41</td></tr><tr><td>I.3.1.a- Les 3 phases majeures de la microbiologie</td><td>41</td></tr><tr><td>I.3.1.b- Caractérisation de l'holobione</td><td>43</td></tr><tr><td>I.3.2- Le microbiote intestinal humain</td><td>45</td></tr><tr><td>I.3.2.a- Quelques données clés</td><td>45</td></tr><tr><td>I.3.2.b- Rôle du microbiote intestinal humain dans la digestion et l'immunité</td><td>45</td></tr><tr><td>I.3.3- Microbiote d'espèces aquacoles d'intérêt économique</td><td>47</td></tr><tr><td>I.3.3.a- Microbiote et poissons</td><td>47</td></tr><tr><td>I.3.3.b- Microbiote et bivalves (mollusques)</td><td>48</td></tr><tr><td>I.3.3.c- Microbiote et crustacés marins</td><td>49</td></tr><tr><td>I.3.4- Le microbiote des crevettes, de la larve à l'adulte</td><td>51</td></tr><tr><td>I.3.4.a- Le microbiote larvaire</td><td>51</td></tr><tr><td>I.3.4.b- Microbiote et crevettes adultes</td><td>54</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>I.4- Analyses multivariées et méta-analyses pour étudier le microbiote</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.4.1- Définitions</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.4.1.a- Analyses multivariées</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.4.1.b- Méta-analyses</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.4.2- Méta-analyses pour l'étude du microbiote des crevettes</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I.4.3- Limites des méta-analyses</td>
      <td>63</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II- Chapitre II – Matériels et méthodes</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1- Élevages larvaires réalisés dans le cadre de cette thèse et échantillonnages</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.1- Élevage larvaire à la Station Aquacole de Saint-Vincent (SASV)</td>
      <td>67</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.1.a- Traitement de l'eau de la baie de Saint Vincent aux bacs d'élevage larvaire</td>
      <td>67</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.1.b- Nourrissage des larves à la SASV</td>
      <td>69</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.2- Élevage larvaire à l'écloserie privée 1</td>
      <td>70</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.2.a- Traitement de l'eau de la baie aux bacs d'élevage larvaire</td>
      <td>70</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.2.b- Nourrissage des larves à l'écloserie privée 1</td>
      <td>70</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.3- Élevage larvaire à l'écloserie privée 2</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.3.a- Traitement de l'eau de la baie aux bacs d'élevage larvaire</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1.3.b- Nourrissage des larves à l'écloserie privée 2</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2- Échantillonnages</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2.1- Échantillonnages en élevage larvaire</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2.1.a- Échantillons d'eau</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2.1.b- Échantillons de larves</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2.1.c- Échantillons de nourriture</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2.2- Échantillonnages des géniteurs</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.3- Paramètres zootechniques</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.3.1- Taux de survie larvaire</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.3.2- Indice de croissance</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.4- Paramètres de qualité physico-chimique de l'eau</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.4.1- Température, pH et salinité</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.4.2- Paramètres de matière organique dissoute colorée (CDOM)</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.4.3- Dosage des sels nutritifs</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.4.3.a- Dosage des TAN (Total Ammonium Nitrogen, NH3-N et NH4+)</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.4.3.b- Dosage des SRP (Soluble Reactive Phosphorus, PO43-, HPO42- et H2PO4-)</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.5- Méthodes de biologie moléculaire et évaluation de la diversité microbienne active</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.5.1- Extractions ARNs, rétrotranscriptions ADNc et séquençage</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.5.2- Traitement des données de séquençage</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.5.3- Analyses de la diversité microbienne</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.6- Méta-analyse</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III- Chapitre III – De l'échantillon aux analyses de diversité : choix d'une méthode optimale</td>
      <td>86</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.1- ARN et ADNc pour étudier les communautés microbiennes actives</td>
      <td>86</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.2- Le séquençage</td>
      <td>86</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.2.1- Historique du séquençage</td>
      <td>86</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.2.2- Le séquençage Illumina</td>
      <td>87</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.2.3- Le métabarcoding</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.3- Différentes stratégies d'analyses des résultats de séquençage</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.3.1- La méthode FROGS : Find Rapidly OTUs using Galaxy Solution</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.3.1.a- Démultiplexage</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.3.1.b- Pré-traitement</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.3.1.c- Clustering</td>
      <td>93</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>III.3.1.d- Suppression des chimères</td><td>94</td></tr><tr><td>III.3.1.e- Filtres</td><td>95</td></tr><tr><td>III.3.1.f- Assignation taxonomique</td><td>95</td></tr><tr><td>III.3.2- La méthode DADA2 : Divise Amplicon Denoise Algorithm</td><td>95</td></tr><tr><td>III.3.2.a- Identification des séquences</td><td>96</td></tr><tr><td>III.3.2.b- Filtres</td><td>96</td></tr><tr><td>III.3.2.c- Taux d'erreur</td><td>96</td></tr><tr><td>III.3.2.d- Dé-réplication</td><td>98</td></tr><tr><td>III.3.2.e- Construction des ASVs</td><td>98</td></tr><tr><td>III.3.2.f- Assemblage</td><td>98</td></tr><tr><td>III.3.2.g- Suppression des chimères</td><td>98</td></tr><tr><td>III.3.2.h- Assignation taxonomique</td><td>98</td></tr><tr><td>III.3.3- Unité Taxonomique Opérationnelle (OTU) et Variants de Séquence d'Amplicon (ASV)</td><td>99</td></tr><tr><td>III.3.3.a- Différences entre un OTU et un ASV</td><td>99</td></tr><tr><td>III.3.3.b- Comment choisir ?</td><td>99</td></tr></table>

<table><tr><td>III.4- Normalisation</td><td>100</td></tr><tr><td>III.4.1- Pourquoi normaliser ?</td><td>101</td></tr><tr><td>III.4.2- Principales méthodes de normalisation</td><td>102</td></tr><tr><td>III.4.2.a- La raréfaction</td><td>102</td></tr><tr><td>III.4.2.b- Méthodes basées sur les proportions</td><td>103</td></tr><tr><td>III.4.2.c- Méthodes plus complexes</td><td>104</td></tr><tr><td>III.4.3- Quelle normalisation choisir ?</td><td>107</td></tr></table>

## IV- Chapitre IV – Des transmissions horizontales et verticales modulent le microbiote actif des œufs et des nauplii de Penaeus stylirostris 110

<table><tr><td>IV.1- Étude A – Premières preuves de transmission horizontale</td><td>110</td></tr><tr><td>IV.1.1- Introduction</td><td>110</td></tr><tr><td>IV.1.2- Article 1 – Potential lineage transmission within the active microbiota of the eggs and the nauplii of the shrimp Litopenaeus stylirostris: possible influence of the rearing water and more</td><td>111</td></tr><tr><td>IV.1.3- Synthèse des résultats et perspectives</td><td>135</td></tr></table>

<table><tr><td>IV.2- Étude B – Contributions des géniteurs et de l'eau d'élevage au cours de la mise en place du microbiote larvaire</td><td>136</td></tr><tr><td>IV.2.1- Introduction</td><td>136</td></tr><tr><td>IV.2.2- Article 2 – The active microbiota of the eggs and the nauplii of the Pacific blue shrimp Litopenaeus stylirostris partially shaped by a potential vertical transmission</td><td>138</td></tr><tr><td>IV.2.3- Synthèse des résultats et perspectives</td><td>151</td></tr></table>

## V- Chapitre V – Évolution des communautés procaryotiques associées à un élevage larvaire en bonne santé 154

<table><tr><td>V.1- Introduction</td><td>154</td></tr><tr><td>V.2- Article 3 – Environmental factors and potential probiotic lineages shape the active microbiota associated with healthy Penaeus stylirostris larvae and their rearing water</td><td>155</td></tr><tr><td>V.3- Synthèse des résultats et perspectives</td><td>190</td></tr></table>

## VI- Chapitre VI – Caractérisation des communautés procaryotiques de l'eau d'élevage au cours de mortalités larvaires : identification de biomarqueurs 194

<table><tr><td>VI.1- Introduction</td><td>194</td></tr><tr><td>VI.2- Article 4 – Microbiota of the rearing water of Penaeus stylirostris larvae influenced by lagoon seawater and specific key lineages of larval stage and survival</td><td>196</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>VI.3- Article 5 - Microbial biomarker detection in shrimp larvae rearing water as putative biosurveillance proxies in shrimp aquaculture</td>
      <td>215</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VI.4- Synthèse des résultats et perspectives</td>
      <td>252</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII- Chapitre VII - Méta-analyse : cores microbiens et biomarqueurs bactériens</td>
      <td>258</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.1- Normalisation par les méthodes DESeq2 et CPM et ordonnancements de l'ensemble des échantillons d'élevage</td>
      <td>258</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.1.1- Rappel des méthodes d'analyse de la diversité bêta</td>
      <td>258</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.1.2- Interprétation des résultats</td>
      <td>259</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.2- Recherche de cores microbiens</td>
      <td>262</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.2.1- Identification des ASVs</td>
      <td>262</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.2.2- Influence des intrants</td>
      <td>264</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.3- ASVs différentiellement abondants en fonction de l'état de santé des élevages</td>
      <td>265</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.3.1- ASVs différentiellement abondants dans les eaux d'élevage</td>
      <td>265</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.3.2- ASVs différentiellement abondants dans les larves</td>
      <td>268</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.3.3- Comparaison des ASVs différentiellement abondants</td>
      <td>269</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.4- Influence des intrants et identification de potentiels biomarqueurs</td>
      <td>270</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.4.1- Biomarqueurs des élevages en bonne santé</td>
      <td>270</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII.4.2- Biomarqueurs des élevages en mauvaise santé</td>
      <td>277</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII- Chapitre VIII - Conclusions générales</td>
      <td>284</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1- Synthèse, discussion et perspectives</td>
      <td>284</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.1- Transmissions horizontales et verticales au cours de la mise en place du microbiote larvaire</td>
      <td>284</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.2- Eutrophisation du milieu d'élevage</td>
      <td>285</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.3- Évolution du microbiote des élevages au cours du développement larvaire</td>
      <td>286</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.4- Influence des intrants</td>
      <td>290</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.5- Biomarqueurs bactériens de la santé des élevages larvaires</td>
      <td>290</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.5.a- Biomarqueurs bactériens de bonne santé : vers la maîtrise des communautés procaryotiques associées aux élevages et identification de potentiels nouveaux probiotiques</td>
      <td>290</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1.5.b- Biomarqueurs bactériens de mauvaise santé : outils de détection des mortalités à venir</td>
      <td>293</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.2- Points de discussion et limites de l'étude</td>
      <td>294</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.2.1- Communautés procaryotiques actives</td>
      <td>294</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.2.2- Biais expérimentaux</td>
      <td>295</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.2.3- Un jeu de données à compléter</td>
      <td>296</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.3- Conclusion</td>
      <td>296</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Bibliographie</td>
      <td>298</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Annexes</td>
      <td>308</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.1- Annexe 1 - Le séquençage de Sanger</td>
      <td>308</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.2- Annexe 2 - Le pyroséquençage</td>
      <td>310</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VIII.3- Annexe 3 - Le séquençage IonTorrent</td>
      <td>313</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Appendices</td>
      <td>314</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Appendice 1 : Obtention du Prix Jeunes Talents France Fondation L'Oréal-UNESCO Pour les Femmes et la Science (2022)</td>
      <td>314</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Appendice 2 : Diffusions scientifiques</td>
      <td>316</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Présentations orales</td>
      <td>316</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tbody><tr><td>Posters</td><td>316</td></tr><tr><td><strong>Appendice 3 - Formations</strong></td><td><strong>319</strong></td></tr><tr><td>Formations dispensées par l'École Doctorale du Pacifique</td><td>319</td></tr><tr><td>Autres formations</td><td>319</td></tr><tr><td><strong>Appendice 4 - Encadrements et enseignements</strong></td><td><strong>320</strong></td></tr><tr><td>Encadrements</td><td>320</td></tr><tr><td>Enseignements</td><td>320</td></tr><tr><td><strong>Appendice 5 - Communication auprès du grand public</strong></td><td><strong>321</strong></td></tr><tr><td>Presse</td><td>321</td></tr><tr><td>Activités et évènements</td><td>321</td></tr><tr><td>VIII.3.1.a- Nuit de la Science 2022</td><td>321</td></tr><tr><td>VIII.3.1.b- Journée Mondiale des Océans 2021</td><td>322</td></tr><tr><td><strong>Appendice 6 - Articles scientifiques publiés au cours de la thèse mais ne portant pas sur le sujet de thèse</strong></td><td><strong>323</strong></td></tr><tr><td>Article 1 - Microbial diversity and activity during the biodegradation in seawater of various substitutes of conventional plastic cotton swab sticks (Jacquin et al. 2021)</td><td>323</td></tr><tr><td>Article 2 - Evidence of coupled autotrophy and heterotrophy on plastic biofilms and its influence on surrounding seawater (Conan et al. 2022)</td><td>324</td></tr><tr><td><strong>Résumé</strong></td><td><strong>327</strong></td></tr><tr><td><strong>Abstract</strong></td><td><strong>327</strong></td></tr></tbody></table>
## Liste des figures

**FIGURE 1** – Contributions de la pêche et de l'aquaculture à la production mondiale d'animaux aquatiques.

**FIGURE 2** – Animaux aquatiques majoritairement produits pas l'aquaculture en 2020.

**FIGURE 3** – Crevette bleue du Pacifique (*Penaeus stylirostris*) adulte.

**FIGURE 4** – Part de la production de la crevette bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris*, dans la production mondiale aquacole de Crustacés.

**FIGURE 5** – Carte des infrastructures crevetticoles sur la Grande Terre de Nouvelle-Calédonie.

**FIGURE 6** – Production aquacole de crevettes bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris*, en Nouvelle-Calédonie.

**FIGURE 7** – Production aquacole de post-larves de *Penaeus stylirostris* en Nouvelle-Calédonie.

**FIGURE 8** – Déroulement d'un élevage de crevettes, *Penaeus stylirostris*, en Nouvelle-Calédonie.

**FIGURE 9** – Morphologie des crevettes pénéides.

**FIGURE 10** – Dimorphisme sexuelle de la crevette bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris*.

**FIGURE 11** – Cycle de développement des crevettes pénéides en milieu naturel.

**FIGURE 12** – Zones d'élevage de crevettes en conditions contrôlées à la Station Aquacole de Saint Vincent.

**FIGURE 14** – Larves nauplii 1 à 6.

**FIGURE 13** – Succession des stades larvaires de *Penaeus stylirostris*.

**FIGURE 15** – Larves zoé 1 à 3.

**FIGURE 16** – Larves mysis 1 à 3.

**FIGURE 17** – Post-larve.

**FIGURE 18** – Bref historique de la microbiologie.

**FIGURE 19** – État des lieux des méthodes « omics ».

**FIGURE 20** – Visualisation du phénomène de dysbiose.
**FIGURE 21** – Implication du microbiote intestinal humain dans la digestion.

**FIGURE 22** – Implication du microbiote intestinal humain dans l'immunité.

**FIGURE 23** – Espèces de mollusques les plus cultivées en aquaculture en 2022.

**FIGURE 24** – Communautés microbiennes majoritaires mises en évidence dans la littérature traitant des microorganismes associés aux larves de crevettes, Penaeus vannamei, et à leur environnement.

**FIGURE 25** – Familles bactériennes mises en évidence par Zheng et al. (2017) dans l'eau d'élevage des larves aux stades zoé 1 (Z1), zoé 3 (Z3), mysis 1 (M1), mysis 3 (M3), post-larve 1 (P1), post-larve 3 (P3) et post-larve 6 (P6).

**FIGURE 26** – Facteurs susceptibles d'influencer le microbiote intestinal des crevettes adultes.

**FIGURE 27** – Pyramide de la hiérarchie des preuves en recherche médicale.

**FIGURE 28** – Répartition des échantillons considérés par le méta-analyse de Cornejo-Granados et al. (2018).

**FIGURE 29** – Répartition des échantillons considérés par la méta-analyse de Yu et al. (2018).

**FIGURE 30** – Répartition des échantillons considérés par la méta-analyse de Sha et al. (2022).

**FIGURE 31** – Chronologie des campagnes de prélèvement des échantillons analysés au cours du projet de thèse.

**FIGURE 32** – Traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire utilisé à la Station Aquacole de Saint Vincent.

**FIGURE 33** – Protocoles d'élevage larvaire réalisés à la Station Aquacole de Saint Vincent.

**FIGURE 34** – Traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire utilisé à l'écloserie privée 1.

**FIGURE 35** – Protocole d'élevage larvaire appliqué à l'écloserie privée 1.

**FIGURE 36** – Traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire utilisé à l'écloserie privée 2.

**FIGURE 37** – Protocole d'élevage larvaire appliqué à l'écloserie privée 2.

**FIGURE 38** – Casque de prélèvement de l'eau.

**FIGURE 39** – Poste de filtration des échantillons d'eau.
**FIGURE 40** – Protocole d'échantillonnages employé lors de la campagne géniteurs en mai 2021 à la Station Aquacole de Saint Vincent.

**FIGURE 41** – Méthodes de calcul des distances de Bray-Curtis, Jaccard, weighted UniFrac et UniFrac.

**FIGURE 42** – Historique du séquençage.

**FIGURE 43** – Séquençage Illumina.

**FIGURE 44** – Structure du gène codant pour l'ARNr 16S.

**FIGURE 45** – Exemple d'un fichier fastq contenant deux séquences.

**FIGURE 46** – Schéma du workflow FROGS implanté dans la plateforme GALAXY (Escudié et al. 2018).

**FIGURE 47** – Formation d'une séquence chimérique au cours du processus PCR.

**FIGURE 48** – Processus d'identification des chimères.

**FIGURE 49** – Schéma du pipeline DADA2 implanté dans le package DADA2 sous R (Callahan et al. 2016).

**FIGURE 50** – Normalisation par la méthode de raréfaction.

**FIGURE 51** – Exemples de méthodes de normalisation basées sur les proportions.

**FIGURE 52** – Normalisation par la méthode DESeq2 (Differential Expression Analysis for Sequence count data.

**FIGURE 53** – Normalisation par la méthode edgeR.

**FIGURE 54** – Normalisation par la méthode CSS (Cumulative Sum Scaling).

**FIGURE 55** – NMDS (Non Metric Dimensionnal Scaling) basées sur des matrices de distances de Jaccard, Bray-Curtis, UniFrac ou weighted UniFrac obtenues à partir des données d'élevage normalisées par A) la méthode DESeq2 ou B) la méthode CPM.

**FIGURE 56** – A) Diagramme de Venn des ASVs mis en évidence dans les cores microbiens des eaux d'élevage, des larves et de l'ensemble des échantillons. Taxonomie des ASVs identifiés dans les cores microbiens A) des eaux d'élevage, B) des larves et C) de l'ensemble des échantillons d'élevage (communs eaux et larves).

**FIGURE 57** – Comparaison des ASVs différentiellement abondants dans les eaux d'élevage en fonction du stade larvaire et de l'état de santé des animaux.
**FIGURE 58** – Abondances relatives moyennes des ASVs différentiellement abondants mis en évidence par ANCOM-BC (184 ASVs).

**FIGURE 59** – ASVs différentiellement abondants dans les larves en fonction du stade larvaire et de l'état de santé des animaux.

**FIGURE 60** – Abondances relatives moyennes des ASVs différentiellement abondants mis en évidence par ANCOM-BC (193 ASVs).

**FIGURE 61** – Nombre d'ASVs présents dans les eaux d'élevage ou dans les larves en fonction de l'état de santé des animaux.

**FIGURE 62** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 189 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en bonne santé.

**FIGURE 63** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 90 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en bonne santé, absents des intrants des élevages en mauvaise santé (campagnes M1, M3 et M4 réalisées à la SASV) et présents dans au moins un type d'intrant de l'ensemble des élevages en bonne santé (campagnes E1 et E2 réalisées dans les écloseries privées 1 et 2).

**FIGURE 64** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 121 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en mauvaise santé.

**FIGURE 65** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 13 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en mauvaise santé, absents des intrants des élevages en bonne santé (campagnes E1 et E2 réalisées dans les écloseries privées 1 et 2) et présents dans au moins un type d'intrant de l'ensemble des élevages en mauvaise santé (campagnes M1, M3 et M4 réalisées à la SASV).

**FIGURE 66** – Processus écologiques déterministes et stochastiques d'assemblages de communautés microbiennes.

**FIGURE 67** – Méthodes de détermination du core microbien.

**FIGURE 68** – Réponse immunitaire chez les crevettes pénéides.

**FIGURE 69** – Schéma bilan résumant les Interactions hôte – microbiote – environnement au sein des élevages de Penaeus stylirostris.

**FIGURE SUPPLÉMENTAIRE 1** – Di-désoxyribonucléotide.

**FIGURE SUPPLÉMENTAIRE 2** – Séquençage de Sanger.

**FIGURE SUPPLÉMENTAIRE 3** – Principe de synthèse des acides nucléiques.
**FIGURE SUPPLÉMENTAIRE 4** – Processus de transformation du pyrophosphate en lumière.

**FIGURE SUPPLÉMENTAIRE 5** – Pyroséquençage 454.

**FIGURE SUPPLÉMENTAIRE 6** – Séquençage IonTorrent

## Liste des tableaux

**TABLEAU 1** – Principales publications traitant du microbiote larvaire de crevettes d'intérêt aquacole et utilisant une technique de séquençage.

**TABLEAU 2** – Liste non exhaustive des analyses multivariées les plus utilisées pour l'analyse du microbiote.

**TABLEAU 3** – Techniques utilisées par les études considérées dans la méta-analyse de Cornejo-Granados et al. (2018).

**TABLEAU 4** – Techniques utilisées par les études considérées dans la méta-analyse de Yu et al. (2018).

**TABLEAU 5** – Techniques utilisées par les études considérées dans la méta-analyse de Sha et al. (2022).

**TABLEAU 6** – Détails des élevages larvaires réalisés à la Station Aquacole de Saint Vincent et analysés au cours du projet de thèse.

**TABLEAU 7** – Composition des réactifs des dosages TAN (Total Ammonium Nitrogen) et SRP (Soluble Reactive Phosphorus).

**TABLEAU 8** – Présentation des indices de diversité utilisés au cours de cette thèse.

**TABLEAU 9** – Comparaison des technologies de séquençage de 2ème génération.

**TABLEAU 10** – Exemple d'une table d'ASVs.

**TABLEAU 11** – Illustration de trois librairies au sein d'une table d'ASVs.

**TABLEAU 12** – Taux de survie des bacs d'élevage suivis au cours des campagnes M1 (encadrées en noir), M3 (encadrées en rouge), M4 (encadrées en orange), E1 (encadrées en vert) et E2 (encadrées en bleu).

**TABLEAU 13** – Comptages non normalisés des ASVs identifiés dans les cores microbiens des eaux d'élevage, des larves et de l'ensemble des échantillons.

**TABLEAU 14** – Taxonomie des 29 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs de la bonne santé des élevages dans les échantillons d'eau.
**TABLEAU 15** – Taxonomie des 27 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs de la bonne santé des élevages dans les échantillons de larves.

**TABLEAU 16** – Taxonomie des 28 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs de la bonne santé des élevages dans les échantillons d'eau et de larves.

**TABLEAU 17** – Taxonomie des 9 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs d'une dégradation de l'état de santé larvaire.
## Liste des abréviations

- **A0**: Antibiotique ajouté le jour de l'ensemencement des larves dans les bacs d'élevage (J0)

- **A3**: Antibiotique ajouté dans les bacs d'élevage à partir du 3ème jour d'élevage (J3)

- **ACC**: Analyse Canonique des Correspondances

- **ACE**: Abundance-based Coverage Estimator

- **ACM**: Analyse en Correspondances Multiples

- **ACP**: Analyse en Composantes Principales (PCA en anglais, Principal Component Analysis)

- **ADN**: Acide désoxyribonucléique

- **ADNc**: ADN complémentaire

- **AFM**: Analyse Factorielle Multiple

- **ANCOM-BC**: Analysis of Compositions of Microbiomes with Bias Correction

- **ANOVA**: Analysis Of Variance

- **AQUACAL**: Aquaculture en Nouvelle-Calédonie

- **ARN**: Acide ribonucléique (RNA en anglais)

- **ARNi**: ARN interferant

- **ARNm**: ARN messager

- **ARNr**: ARN ribosomal

- **ARNt**: ARN de transfert

- **ASV**: Amplicon Sequence Variant (Variant de séquence d'amplicon)

- **CAH**: Classification Ascendante Hiérarchique

- **CAZymes**: Carbohydrate Active Enzymes

- **CDOM**: Colored Dissolved Organic Matter (Matière organique dissoute colorée)

- **CFP**: Change Franc Pacifique

- **CNEXO**: Centre National pour l'Exploitation des Océans

- **CPM**: Count Per Million

- **CPS**: Commission du Pacifique Sud

- **CSS**: Cumulative Sum Scaling

- **DADA2**: Divise Amplicon Denoising Algorithm

- **dbOTU**: Distribution-Based Operationnal Taxonomic Unit-calling

- **DESeq**: Differential Expression Analysis for Sequence data count
- DNase : Désoxyribonucléase

- dNTP : Désoxyribonucléotide triposphate en mélange [dATP (désoxyadénine triphosphate), dTTP : (désoxythymine triphosphate), dGTP (désoxyguanine triphosphate), dCTP (désoxycytosine triphosphate)]

- E1, E2 : Campagnes de prélèvements réalisées dans 2 écloseries privées de Nouvelle-
Calédonie (1 et 2) en août et novembre 2020

- EDTA : Acide éthylènediaminetétraacétique

- FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations (Organisation Mondiale des Nations Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture)

- FLASH : Fast Length Adjustment of Short reads

- FROGS : Find Rapidly OTUs using Galaxy Solution

- GRD : Growth Retardation Disease

- HCl : Acide chlorhydrique

- IEMH : Action Interactions Environnement - Microbiote - Hôte

- Ifremer : Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer

- IHHNV : Infectious Hematopoietic and Hypodermal Necrosis Virus (virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse)

- ISEA : Institut des Sciences Exactes et Appliquées

- LEAD-NC : Unité Lagons, Écosystèmes et Aquaculture Durable en Nouvelle-Calédonie de l'Ifremer

- LefSe : Linear discriminant analysis with effect size (Analyse discriminante linéaire avec effet de taille)

- M1, M3, M4 : Campagnes de prélèvements réalisées à la Station Aquacole de Saint Vincent en septembre 2018, novembre 2018 et février 2019

- Med : Médiane

- NGS : Next Generation Sequencing (Séquençage haut débit)

- NMDS : Non-Metric Dimensionnal Scaling

- NT : Non traité (désigne l'eau non traitée des bacs d'élevages larvaires de la Station Aquacole de Saint Vincent)

- OTC : Oxytétracycline

- OTU : Operationnal Taxonomic Unit (unité taxonomique opérationnelle)

- **pb** : Paires de bases
- PCoA : Principal Component Analysis (Analyse en Coordonnées Principales)

- PCR : Polymerase Chain Reaction

- PERMANOVA : Permutational Analysis Of Variance

- pH : Potentiel hydrogène

- POMS : Pacific Oyster Mortality Syndrome

- ProPO : Prophénol Oxidase

- PRR : Pathogen Recognition Receptor

- qPCR : PCR quantitative

- RDA : Redundancy Analysis (Analyse de redondance)

- RDP : Recombination Detection Program

- RESSAC : Ressources et Écosystèmes Aquacoles en Nouvelle-Calédonie

- RNase : Ribonucléase

- SA : Sans Antibiotique

- SASV : Station Aquacole de Saint-Vincent

- SODACAL : Société d'aquaculture calédonienne

- SpDUOX : Dual Oxidase

- SR : Slope Ratio (Ratio des pentes spectrales de 275 à 295nm et de 350 à 400nm)

- sRNA : Small RNA

- SRP : Soluble Reactive Phosphorus (Phosphates réactifs solubles)

- T : Traité (désigne l'eau non traitée des bacs d'élevages larvaires de la Station Aquacole de Saint Vincent)

- TAN : Total Ammonia Nitrogen (Azote ammoniacal total)

- TSS : Total Sum Scaling

- UNC : Université de la Nouvelle-Calédonie

- UniFrac : Unique Fraction metric

- UQ : Upper Quartile

- USD : United States Dollar

- UV : Ultra-violet

- WFS : White Feces Syndrom

- WSSV : White Spot Syndrome Virus
## Introduction générale

La production mondiale d'animaux aquatiques a augmenté de plus de 60% au cours des 30 dernières années. Le développement massif de l'aquaculture sur cette période explique en grande partie cette augmentation. En 2020, l'espèce animale la plus produite, toutes espèces aquacoles confondues, était la crevette à pattes blanches, Penaeus vannamei, témoignant de l'importance de la crevetticulture au sein des marchés aquacoles mondiaux. En Nouvelle-Calédonie, la crevette bleue du Pacifique, Penaeus stylirostris, est produite depuis les années 1970. À l'heure actuelle, son statut de premier exportateur agro-alimentaire et les emplois générés au sein de la filière confèrent à la crevetticulture calédonienne un rôle socio-économique essentiel à l'échelle du territoire. Cependant, après avoir été fortement impactée par des vibrioses causées par Vibrio penaeicida (Mermoud et al. 1998) et V. nigripulchritudo (Goarant et al. 1999; 2006), la production de crevettes en Nouvelle-Calédonie est à nouveau freinée, depuis 2005, par des mortalités larvaires massives non expliquées touchant l'ensemble des écloseries du territoire. Ces dernières étaient d'ailleurs au nombre de 4 au début du projet et ne sont plus que 3 à l'heure actuelle (2023). Diverses expérimentations menées au cours de ces dernières années ne permettent pas, pour l'instant, de mettre en évidence l'implication de pathogènes viraux ou bactériens dans cette diminution de production de post-larves. De plus, l'occurrence des mortalités étant variable au sein d'élevages larvaires provenant d'un même lot de fécondations et élevés dans un même environnement, les pistes liées à une potentielle baisse de la fécondité des géniteurs et de la qualité de leurs larves semblent pouvoir être écartées. Par ailleurs, suite au développement de nouvelles techniques pour étudier les microorganismes, de nombreuses publications scientifiques ont montré l'importance du microbiote sur la physiologie de l'hôte. Des méthodes analytiques ont également été développées pour comprendre la dynamique de ces communautés microbiennes et des nombreux facteurs biotiques et abiotiques les modulant. Des approches biostatistiques, combinant analyses multivariées et méta-analyses, ont récemment permis d'identifier des bioindicateurs microbiens de l'état de santé de crevettes d'élevage ; démontrant ainsi le rôle essentiel des communautés microbiennes au sein des systèmes aquacoles.

En Nouvelle-Calédonie, l'ensemble des écloseries du territoire pompent l'eau de mer du milieu naturel pour remplir leurs bacs d'élevage. Ces derniers sont donc en système ouvert avec l'eau du lagon qui possède des caractéristiques physico-chimiques (qualité de l'eau) et des assemblages microbiens (microbiote) susceptibles de varier selon différents facteurs. Des études ont, par exemple, montré que les saisons et les phénomènes climatiques comme les fortes pluies entraînent des variations du pH, de la salinité, de la quantité d'oxygène et de la concentration en nutriments de l'eau de mer (Van Den Broeck et al. 2004; Satpathy et al. 2010). Ces facteurs sont également susceptibles d'influencer la dynamique des communautés microbiennes en présence (Hutchins & Fu 2017). De plus, l'anthropisation croissante des milieux marins et terrestres conduit à une augmentation des polluants organiques et chimiques (eutrophisation, pesticides, herbicides, antibiotiques, etc.) qui modulent la biologie et la chimie des écosystèmes côtiers (Cloern 2001; Hutchins & Fu 2017). Or, la qualité de l'eau d'élevage et les variations des communautés microbiennes associées à cette eau sont susceptibles d'influencer le microbiote larvaire impactant ainsi la physiologie et la qualité des larves et donc, à fortiori, leur survie. Dans ce contexte, les variations des communautés
**procaryotiques associées aux élevages pourraient-elles expliquer les mortalités larvaires observées ?** Afin de répondre à cette question ce projet de thèse a eu comme objectif :

- d'étudier les facteurs influençant la mise en place des communautés procaryotiques associées aux œufs ainsi qu'aux stades larvaires précoces (Giraud et al. 2021, 2022);

- de caractériser les communautés procaryotiques associées à des élevages soumis ou non à de fortes mortalités (Callac et al. 2022; Callac et al. In review; Giraud et al. In prep.);

- de réaliser une méta-analyse regroupant l'ensemble des données issues d'élevages larvaires soumis ou non à de fortes mortalités et conduits au sein de différentes écloseries entre 2018 et 2020.

Afin de répondre à ces objectifs, plusieurs élevages larvaires, effectués dans plusieurs écloseries du territoire et soumis ou non à des épisodes de fortes mortalités, ont été considérés. Pour chacun de ces élevages, des paramètres zootechniques relatifs à la survie et au développement des larves ont été quotidiennement calculés. En parallèle, la température, le pH et la salinité des eaux de remplissage (provenant du lagon) et d'élevages ont été mesurés afin d'analyser leur qualité, et des dosages de nutriments (azote et phosphate) et de matière organique ont également été réalisés. Par ailleurs, des échantillons d'eau, de larves et de nourriture ont été quotidiennement prélevés au cours des élevages afin d'étudier les communautés procaryotiques actives associées à ces échantillons. Des analyses multivariées ont été conduites sur l'ensemble des paramètres considérés afin de caractériser les variations ayant lieu au cours du développement larvaire. Enfin, une méta-analyse considérant les paramètres de tous les élevages larvaires étudiés a été conduite. Sur cette base expérimentale, il a d'abord été conclu que la mise en place du microbiote larvaire de *P. styrlirostris* était soumise à l'influence de communautés procaryotiques issues de l'environnement d'élevage et des organes reproducteurs des géniteurs. Il a ensuite été montré que ce microbiote larvaire ainsi que les communautés procaryotiques et les paramètres physico-chimiques associés à l'eau d'élevage évoluaient sous l'influence du stade de développement des larves et de leur état de santé. Enfin, de potentiels biomarqueurs bactériens ont été mis en évidence en comparant les élevages larvaires soumis ou non à de fortes mortalités. L'ensemble des analyses menées au cours de ce projet de thèse sont une première étape vers le développement d'outils de détection précoce des mortalités larvaires dans les écloseries de Nouvelle-Calédonie.
# CHAPITRE I

## État de l'art
# I- Chapitre I – État de l'art

## I.1- La crevetticulture, du monde à la Nouvelle-Calédonie

### I.1.1- Place de la crevette dans l'aquaculture mondiale

#### I.1.1.a- Chiffres clés de l'aquaculture

Depuis les années 1990, la production mondiale d'animaux aquatiques (poissons, crustacés, mollusques, etc.) a augmenté de plus de 60%, passant de 110 à 178 millions de tonnes. Alors que la contribution de la pêche est restée stable sur cette période (environ 91 millions de tonnes par an), cette augmentation est principalement due à une croissance de l'aquaculture qu'elle soit continentale, marine ou côtière. En effet, en 2020, les différentes activités aquacoles ont permis la production de 87,5 millions de tonnes d'animaux aquatiques contre 21,8 millions de tonnes, en moyenne, dans les années 1990 (Fig. 1). Ce chiffre record représente la moitié des animaux aquatiques produits à l'échelle mondiale ainsi qu'une valeur économique de plus de 264 milliards d'USD (FAO 2022). À l'heure actuelle, nous consommons chaque année environ 20,5kg de produits alimentaires d'origine aquatique par personne, soit 2 fois plus qu'il y a 50 ans. En Asie et en Afrique, cette consommation d'animaux aquatiques représente jusqu'à 50% des protéines animales consommées. Au-delà de cet aspect alimentaire, l'aquaculture génère également 20,5 millions d'emplois dont 28% des postes sont occupés par des femmes. Au regard de l'ensemble de ces chiffres, il semble donc évident que le développement et le maintien d'une aquaculture durable représentent des enjeux socio-économiques mondiaux majeurs (FAO 2022).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**FIGURE 1** – Contributions de la pêche et de l'aquaculture à la production mondiale d'animaux aquatiques (Source : FAO 2022).</figcaption></figure>

Contributions (en millions de tonnes) exprimées en moyenne des années pour 1990, 2000 et 2010 et par année pour 2019 et 2020.

#### I.1.1.b- Crevetticulture

En 2020, bien que la production aquacole mondiale ait été dominée par la production de poissons et de mollusques, l'espèce la plus produite, toutes espèces confondues, était la crevette à pattes blanches Penaeus vannamei avec 5,8 millions de tonnes générées (Fig. 2). Au total, 16% des produits aquacoles exportés à travers le monde sont des crevettes et ce marché représente une valeur économique de plus de 24 milliards d'USD. La production aquacole de crevettes, aussi appelée crevetticulture, domine ainsi la production de crustacés dans le monde. Cette activité est soutenue par des pays d'Amérique latine mais plus largement par des pays asiatiques tels que la Chine, la Thaïlande, l'Inde et l'Indonésie qui représentent d'ailleurs 91,7% de la production aquacole mondiale (FAO 2022).
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>B</figcaption></figure>

<table><thead><tr><td>NOM COMMUN</td><td>NOM LATIN</td><td>MILLIONS DE TONNES PRODUITES (2020)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Crevette à pattes blanches</td><td>Penaeus vannamei</td><td>5,81</td></tr><tr><td>Carpe de roseau</td><td>Ctenopharyngodon idellus</td><td>5,79</td></tr><tr><td>Huître creuse</td><td>Crassostrea spp.</td><td>5,45</td></tr><tr><td>Carpe argentée</td><td>Hypophthalmichthys molitrix</td><td>4,9</td></tr><tr><td>Tilapia du Nil</td><td>Oreochromis niloticus</td><td>4,41</td></tr><tr><td>Palourde Japonaise</td><td>Ruditapes philippinarum</td><td>4,27</td></tr><tr><td>Saumon Atlantique</td><td>Salmo salar</td><td>2,72</td></tr><tr><td>Écrevisse de Louisiane</td><td>Procambarus clarkii</td><td>2,47</td></tr><tr><td>Coquille Saint-Jacques</td><td>Pectinidae</td><td>1,75</td></tr><tr><td>Chano (poisson-lait)</td><td>Chanos chanos</td><td>1,17</td></tr><tr><td>Crabe Chinois</td><td>Eriocheir sinensis</td><td>0,78</td></tr><tr><td>Tortue à carapace molle</td><td>Trionyx sinensis</td><td>0,33</td></tr><tr><td>Mullet</td><td>Mugilidae</td><td>0,29</td></tr><tr><td>Concombre de mer</td><td>Apostichopus japonicus</td><td>0,2</td></tr><tr><td>Crapaud</td><td>Rana spp.</td><td>0,15</td></tr></tbody></table>

FIGURE 2 – Animaux aquatiques majoritairement produits par l'aquaculture en 2020. A) Animaux aquatiques produits par l'aquaculture en 2020. B) Top 3 des espèces animales les plus produites par l'aquaculture en 2020 par catégorie (Source : FAO 2022).

Les espèces de poissons issues de l'aquaculture terrestre et marine sont respectivement représentées en bleu et en vert, les mollusques en orange, les crustacés en rouge et les autres animaux aquatiques en gris.

### I.1.2- Crevetticulture en Nouvelle-Calédonie

#### I.1.2.a- Historique

En Nouvelle-Calédonie, la crevetticulture a été initiée en 1970 sous l'instigation des membres de la Commission du Pacifique Sud (CPS) et de l'Organisation Mondiale pour l'Alimentation et l'Agriculture (FAO). Les premières expérimentations ont été réalisées en 1972 en baie de Saint-Vincent (Boulouparis). Les installations ont ensuite été confiées, en 1973, à l'Association pour le développement de l'Aquaculture en Nouvelle-Calédonie (AQUACAL) puis au Centre National pour l'Exploitation des Océans (CNEXO) en 1978. Ce dernier devient l'Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer (Ifremer) en 1984 (Goarant et al. 2003; Della Patrona & Brun 2009). Les premières expérimentations menées ont concerné des espèces de crevettes pénérides locales dont *Penaeus monodon*, *Fenneropenaeus merguiensis* et *Metapenaeus ensis*. Puis, au fil des années, une douzaine d'espèces de crevettes ont été testées. Les élevages de *P. monodon*, *P. stylirostris*, *P. vannamei*, et *F. indicus* ont été les plus satisfaisants. Néanmoins, la crevette bleue du Pacifique (Fig. 3), *P. stylirostris*, a finalement été sélectionnée en raison de ses qualités zootechniques et économiques. En effet, cette espèce était la seule à maintenir une croissance acceptable au cours de la saison fraîche. De plus, sa couleur bleutée, sa rareté (Fig. 4) ainsi que ses qualités gustatives permettaient d'envisager une exportation lucrative. Au
début des années 80, après une décennie d'expérimentations, les premiers résultats de la recherche sont transférés au secteur privé. La première ferme de crevettes, la Société d'aquaculture calédonienne (SODACAL) est alors créée. La première écloserie naît ensuite en 1988 et est intégrée à la ferme SODACAL (Goarant et al. 2003; Della Patrona & Brun 2009). En 1990, 3 fermes sont comptabilisées sur le territoire et ce chiffre passe ensuite à 10 en 1998 puis 19 en 2010 (Pham 2011). À l'heure actuelle, l'activité crevetticole calédonienne est portée par 17 fermes (18 au moment du début de cette thèse) et 3 écloseries (4 au moment du début de cette thèse) représentant une surface totale d'environ 650 hectares (Agence Rurale de la Nouvelle-Calédonie, https://www.agence-rurale.nc). Toutes les infrastructures crevetticoles sont implantées sur la côte Ouest de la Grande Terre (Fig. 5) sur des tannes de mangrove (zones sursalées en arrière de mangrove).

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>FIGURE 3 – Crevette bleue du Pacifique (*Penaeus stylirostris*) adulte (Source : Ifremer).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>FIGURE 4 - Part de la production de la crevette bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris*, dans la production mondiale aquacole de crustacés.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**FIGURE 5** – Carte des infrastructures crevetticoles sur la Grande Terre de Nouvelle-Calédonie.</figcaption></figure>

Les écloseries du Nord (EDN), d'EORI, de MARA et de Montagnes sont représentées en rouge sur la carte.

## I.1.2.b- Enjeux socio-économiques

Depuis son lancement en Nouvelle-Calédonie, la crevetticulture permet de valoriser des terres non exploitables par l'agriculture et les habitations humaines mais aussi de créer des emplois en Province Nord et en Province Sud. En 2018, la filière crevette calédonienne employait 244 personnes dans les fermes et les écloseries ainsi que 306 salariés dans les ateliers de conditionnement soit un total de plus de 500 emplois (Agence Rurale de la Nouvelle-Calédonie). Au-delà de cet aspect social, la crevetticulture revêt également un aspect économique important. En effet, en 2020, 1470 tonnes de crevettes ont été produites en Nouvelle-Calédonie, représentant un chiffre d'affaires de 1875 millions de CFP (plus de 15 millions d'euros). Plus de la moitié de cette production est destinée à l'exportation et fait ainsi de la crevetticulture le premier exportateur agroalimentaire du territoire et le deuxième exportateur tous produits confondus après le nickel (Agence Rurale de la Nouvelle-Calédonie). L'aquaculture de crevettes en Nouvelle-Calédonie s'inscrit donc dans une filière mondiale et représente des enjeux socio-économiques majeurs à l'échelle locale. Pourtant, malgré ces chiffres et ce potentiel, la crevetticulture calédonienne est en net recul depuis plusieurs années. En effet, après une progression rapide au cours des 20 premières années, la production de crevettes a atteint 2000 tonnes au début des années 2000. Elle a ensuite diminué de 40% entre 2005 et 2019 avec une production moyenne de 1500 tonnes alors que les projections à 10 ans étaient de 5000 tonnes annuelles (Fig. 6). Trois phénomènes majeurs ont durablement impacté la crevetticulture calédonienne :

- l'apparition d'une première vibriose, due à *Vibrio penaeicida*, en 1993 entrainant des mortalités en saison fraîche (Mermoud et al. 1998);

- l'apparition d'une seconde vibriose en 1997, due à *V. nigripulchritudo*, affectant les élevages réalisés en saison chaude mais dans une zone géographique limitée (Goarant et al. 2006; 1999);

- une pénurie de post-larves due à des mortalités larvaires importantes et non expliquées dans les écloseries (Pham et al. 2014) (Fig. 7).
<figure><img src="image_14.png" /></figure>

**FIGURE 6** – Production aquacole de crevettes bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris*, en Nouvelle-Calédonie (Source : ISEE, https://www.isee.nc/).

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

**FIGURE 7** – Production aquacole de post-larves de *Penaeus stylirostris* en Nouvelle-Calédonie (Source : ISEE, https://www.isee.nc/).

### I.1.2.c- Difficultés de production

**SYNDROME 93** – Au cours de la saison fraîche (mai-août, 15-23°C) de 1993, la Nouvelle-Calédonie est, pour la première fois, confrontée à des mortalités importantes et anormales affectant les juvéniles et les adultes (Mermoud et al. 1998). Ce phénomène est appelé « Syndrome 93 » ou « Syndrome d'hiver ». Les crevettes impactées par ce syndrome présentent des symptômes similaires à ceux provoqués par des virus de crevettes connus tels que le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (Infectious Hematopoietic and Hypodermal Necrosis Virus, IHHNV) (Lightner et al. 1983) et le syndrome Taura (Bonami et al. 1997). Ces signes cliniques sont caractérisés par une faiblesse des animaux et un comportement anormal de ces derniers, une sensibilité accrue au stress, une carapace molle et sombre, des tissus musculaires opaques ainsi qu'une coagulation lente de l'hémolymphe colonisée par un grand nombre de bactéries mobiles (Mermoud et al. 1998). Des analyses en biologie moléculaire ont permis d'identifier la bactérie *Vibrio penaeicida* comme étant responsable de ce phénomène (Goarant et al. 1999; Saulnier et al. 2000). Le Syndrome 93 est ainsi reconnu comme étant une vibriose septicémique s'exprimant de façon saisonnière. Bien que *V. penaeicida* puisse être détecté à toutes les étapes de l'élevage, les crevettes deviennent sensibles à cet agent pathogène à partir du stade juvénile au moment de
l'acquisition de la formule rostrale définitive (nombre définitif d'épines rostrales dorsales et ventrales) (Goarant et al. 1998). Cette sensibilité semble être accrue lorsque la température de l'eau d'élevage chute sous les 25°C en saison fraîche (Mermoud et al. 1998). Ces différentes constatations ont conduit à réorganiser la production et à arrêter les élevages de crevettes en saison fraîche à partir de 1997.

**SYNDROME D'ÉTÉ** – En 1995, 2 fermes du territoire sont affectées par une nouvelle épidémie. Malgré les recommandations sanitaires, en décembre 1997, ce phénomène, identifié comme « Syndrome d'été », s'étend à d'autres infrastructures localisées à 50km au Sud du foyer d'origine (Goarant et al. 1999; 2006). Bien que ce syndrome ait été géographiquement restreint à quelques fermes du territoire, il affecte actuellement plus largement les bassins de production de la Nouvelle-Calédonie. Cette épidémie est associée à une vibriose septicémique causée par une autre bactérie du genre *Vibrio*, *V. nigripulchritudo*, et causant des symptômes cliniques similaires à ceux énoncés précédemment. La maladie se caractérise par des flambées épizootiques brèves et chroniques se reproduisant d'une année sur l'autre en période chaude lorsque la température est supérieure à 25°C. Comme pour *V. penaeicida*, la maladie se développe exclusivement chez les stades juvéniles et adultes sans affecter les stades larvaires et post-larvaires. De plus, la pathogénicité bactérienne de ce *Vibrio* est liée à la présence de 2 plasmides et semble également être associée à la qualité des fonds de bassin et à une eutrophisation précoce du milieu d'élevage pouvant impacter la qualité de la colonne d'eau (Goarant et al. 2006; Lemonnier et al. 2006; Beliaeff et al. 2009; Le Roux et al. 2011).

**PÉNURIES DE POST-LARVES** – Depuis 2005, le nombre de post-larves produites par les écloseries a diminué d'environ 25%. Cette pénurie s'explique principalement par des mortalités larvaires importantes survenant au cours des 10 premiers jours d'élevage (Fig. 8) et dont les causes n'ont pas clairement été identifiées à l'heure actuelle (Pham et al. 2014). L'implication des agents pathogènes, *V. penaeicida* et *V. nigripulchritudo*, évoqués précédemment, a été écartée. En effet, bien que la bactérie *V. nigripulchritudo* ait été détectée dans les élevages larvaires, elle n'est pas pathogène pour les stades larvaires et sa présence n'est pas corrélée avec les mortalités observées (Goarant et al. 1998; Pham 2011). La bactérie *V. penaeicida* n'a quant à elle pas été identifiée dans les élevages larvaires et des infections expérimentales de larves avec ce *Vibrio* n'ont pas entraîné de mortalités (Goarant et al. 1998). Il existe également d'autres vibrioses connues dans la crevetticulture mondiale comme, par exemple, l'infection à *V. harveyi* touchant les larves de *P. vannamei* (Karunasagar et al. 1994). Néanmoins, à ce jour, aucune souche de bactérie *Vibrio* (ou d'autres genres) n'a pu être mise en évidence comme responsable des mortalités larvaires en écloserie en Nouvelle-Calédonie. D'autres hypothèses, telle qu'une baisse de fécondité des géniteurs, due à une température de l'eau trop élevée en bassin ou à des facteurs de stress, ont également été écartées (Pham 2011). De même, l'occurrence variable des mortalités au sein d'élevages conduits dans une même eau avec des larves provenant de géniteurs communs ont contribué à rejeter les hypothèses relatives à une baisse de la qualité physico-chimique de l'eau d'élevage. Enfin, suite à l'introduction de souches hawaïennes de *P. stylirostris* dans le cadre d'un programme de génétique sur le territoire, le virus IHHNV a été mis en évidence dans certains élevages calédoniens de crevettes adultes et a été suggéré d'impacter les performances zootechniques en écloserie (Pham 2011). Néanmoins, cette contamination a pu être écartée et les mortalités larvaires ont persisté. De manière général, à l'heure actuelle, il n'existe aucune preuve d'infection virale dans les écloseries qui puissent expliquer les mortalités larvaires constatées en Nouvelle-Calédonie.
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**FIGURE 8** – Déroulement d'un élevage de crevettes, *Penaeus stylirostris*, en Nouvelle-Calédonie.</figcaption></figure>

Le travail de thèse présenté dans ce manuscrit s'inscrit dans ce contexte de mortalités larvaires non expliquées en écloserie. Ce projet s'intègre dans le programme de recherche RESSAC (Ressources et Écosystèmes Aquacoles en Nouvelle-Calédonie), et plus précisément dans l'action IEMH (Interactions Environnement – Microbiote – Hôte), menés au sein de l'Unité de recherche LEAD-NC (Lagons, Écosystèmes et Aquaculture Durable en Nouvelle-Calédonie) à l'Ifremer.

## 1.2- Penaeus stylirostris : présentation du modèle d'étude

### 1.2.1- Présentation et morphologie de l'espèce

#### 1.2.1.a- Origine et classification

La crevette bleue du Pacifique élevée en Nouvelle-Calédonie est une espèce de crevette pénéide originaire d'Amérique centrale et du Sud, vivant à faible profondeur (0 à 25m). Son aire de répartition se situe dans l'Océan Pacifique Est et s'étend des zones côtières du Mexique au Nord du Pérou. Sa classification phylogénétique est la suivante :

- Phylum : *Arthropoda*,

- Sous- phylum : *Crustacea*

- Classe : *Malacostraca*

- Sous-classe : *Eumalacostraca*

- Super-ordre : *Eucarida*

- Order : *Decapoda*

- Sous-ordre : *Dendrobranchiata*

- Super-famille : *Penaeoidea*

- Famille : *Penaeidae*

- Genre : *Penaeus* (Ma et al. 2011; Yang et al. 2023)

- Espèce : *Penaeus stylirostris* (Stimpson, 1871).

<figure><img src="image_17.png" /></figure>
La première taxonomie des crevettes pénéides comportait 6 genres distincts (Litopenaeus, Farfantepenaeus, Fenneropenaeus, Marsupenaeus, Melicertus et Penaeus). La crevette bleue du Pacifique a ainsi d'abord été nommée Litopenaeus stylirostris, nom scientifique employé dans les articles 1 à 3 présentés dans les chapitres IV et V. Cependant, ces nomenclatures ont été longuement débattues et ne sont plus à jour au moment de l'écriture de ce manuscrit (2023). En effet, les crevettes pénéides sont désormais regroupées au sein du genre unique Penaeus (Ma et al. 2011; Yang et al. 2023).

## I.2.1.b- Morphologie

Comme tous les Arthropodes, le corps de *P. stylirostris* est métamérisé et ses métamères sont regroupés en 3 parties : la tête, le thorax et l'abdomen. Chez les crustacés décapodes, comme la crevette bleue du Pacifique, le thorax est incorporé dans la tête et forme ainsi le céphalothorax. Chez les crevettes pénéides, ce dernier comprend 5 paires de pattes marcheuses appelées péréiopodes. Le rostre, présentant des épines dorsales et ventrales, se situe également sur ce segment du corps tout comme les antennes et les yeux. L'abdomen, terminé par un segment nommé telson, se compose de 5 métamères présentant chacun une paire de pattes natatoires appelées pléopodes (Dakin 1938; Dall 1990; Felder et al. 2009) (Fig. 9).

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**FIGURE 9** – Morphologie des crevettes pénéides.</figcaption></figure>

Il existe un dimorphisme sexuel chez les crevettes pénéides. Les femelles possèdent des ovaires en position dorsale dans leur céphalothorax. Ils sont constitués de 8 lobes symétriquement disposés de part et d'autre de l'axe médian. Deux oviductes relient les lobes latéraux aux pores génitaux situé au niveau de l'abdomen où l'on trouve également un organe sexuel externe, appelé thélycum (Fig. 10A). Les mâles présentent quant à eux une paire de testicules au niveau de leur céphalothorax ainsi qu'un organe sexuel externe en position abdominal nommé pétasma (Fig. 10B). Des spermiductes permettent d'acheminer les spermatozoïdes vers les spermatophores (Fig. 10B), positionnés latéralement au niveau des pores génitaux (Fig. 10B) situés à la jonction entre le céphalothorax et l'abdomen.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>FIGURE 10 – Dimorphisme sexuel de la crevette bleue du Pacifique, *Penaeus stylirostris*. Morphologie de crevettes A) femelle et B) mâle (Source : N. Callac).</figcaption></figure>

I.2.2- Reproduction et cycle de vie des crevettes pénéides en milieu naturel

En milieu naturel, au moment de la reproduction qui a lieu en haute mer en saison chaude, le mâle dépose ses spermatophores, *via* son pétasma, au niveau du thélycum de la femelle. Quelques heures après la copulation, la femelle libère des ovules qui sont fécondés au contact de ces spermatophores. On parle de fécondation externe. La femelle nage lentement en effectuant des mouvements rapides avec ses pléopodes afin de disperser les œufs fécondés dans l'eau. Les œufs sédimentent sur les fonds marins. À l'intérieur des œufs ainsi libérés, le développement embryonnaire dure de 10 à 12h. L'éclosion des œufs libère les premiers stades larvaires appelés nauplii (larve nauplius). Le stade nauplius est ensuite suivi des stades zoé et mysis. Tous les stades larvaires présentent un mode de vie pélagique en mer (Fig. 11). À la suite du développement larvaire (environ 10 jours), des post-larves présentant la majorité des caractéristiques physiques des adultes sont obtenues. Au bout de 10 à 20 jours de croissance, ces post-larves se concentrent au niveau des estuaires et deviennent benthiques. Après 2 mois, les crevettes juvéniles acquièrent leur morphologie définitive et continuent leur croissance au niveau des estuaires et des lagunes où la nourriture est abondante. Au stade adulte, les crevettes rejoignent les eaux côtières où elles alternent des phases nocturnes d'activité (chasse, reproduction, mues) et des phases diurnes de repos jusqu'à la prochaine saison chaude (Dakin 1938; Dall 1990; Felder et al. 2009) (Fig. 11).
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>FIGURE 11 – Cycle de développement des crevettes pénéides en milieu naturel.</figcaption></figure>

### I.2.3- Reproduction et cycle de vie de Penaeus stylirostris en conditions maîtrisées

#### I.2.3.a- Élevage des géniteurs en bassins

La crevetticulture calédonienne repose sur la maîtrise du cycle de développement de *P. stylirostris* présenté précédemment. Afin d'obtenir des géniteurs en condition d'élevage, des post-larves âgées de 30 à 40 jours sont ensemencées dans des bassins de terre à raison d'un individu par m² (phase prégéniteur). Ces bassins de terre, d'une superficie moyenne de 2000 à 3000m², doivent avoir été mis en assec et labourés au minimum 3 semaines avant le début de l'élevage afin de permettre l'oxydation et la minéralisation des sédiments (Fig. 12A) (Della Patrona & Brun 2009). Dans ces bassins ensuite mis en eau (Fig. 12B) (salinité à 34‰ ± 1‰, pH = 8,3-8,4), les post-larves ensemencées sont nourries *ad libitum* avec de l'aliment commercial sous forme de granulés. Environ 5 à 20% de l'eau de mer du bassin d'élevage sont renouvelés quotidiennement. Au bout de 3 à 4 mois de développement, les crevettes pèsent entre 25 et 30g. À ce stade, elles sont triées selon leur sexe puis réensemencées en bassin à raison de 0,5 individu par m² et de 2 mâles pour 1 femelle (phase géniteur). Chaque semaine pendant 3 à 4 mois, un jour de jeûne est suivi d'un jour de ration de nourriture fraîche puis de 5 jours de ration sous forme de granulés. Les bassins sont vidangés lorsque les animaux adultes atteignent environ 50g pour les mâles et 60g pour les femelles (Wabete 2005). Lorsque la phase géniteur se déroule en saison chaude (de janvier à mars), les températures supérieures à 30°C peuvent altérer la qualité des spermatozoïdes et provoquer la maturation précoce des femelles en bassin. Une phase en bac de prématuration (Fig. 12C) peut alors s'avérer nécessaire afin de maintenir une qualité optimale des animaux. Pour cela, les géniteurs sont stockés dans des bacs circulaires de 10m³ avec de l'eau maintenue à une température de 26°C. L'eau de mer utilisée pour remplir ces bacs est préalablement décantée et filtrée sur 50µm puis renouvelée quotidiennement de 50 à 100% et aérée par bullage central. Les géniteurs obtenus sont ensuite transférés en bacs d'élevage dans la zone de maturation à l'écloserie (Fig. 12D).
### I.2.3.b- Acclimatation et maturation des géniteurs

En zone de maturation (Fig. 12D), les femelles et les mâles sont maintenus séparés et sont transférés dans des bacs circulaires d'élevage à raison de 10 à 15 individus par m². Les bacs des mâles sont maintenus à température ambiante (ou régulée à 26°C) alors que ceux des femelles sont progressivement réchauffés jusqu'à 29° (après épédonculation, voir partie 1.2.3.c) afin de garantir une maturation sexuelle optimale. Pendant cette phase d'élevage, effectuée dans une salle fermée, la photopériode est contrôlée avec une période de jour de 19h à 9h (60W) et une période de nuit de 9h à 19h. Les œufs étant naturellement pondus 3 à 4h après la tombée de la nuit, cette photopériode permet de décaler la ponte des femelles en début d'après-midi suite aux inséminations artificielles réalisées entre 9h et 10h. Les géniteurs sont nourris avec de la nourriture fraîche qui est complémentée avec des granulés commerciaux.

### I.2.3.c- Reproduction des géniteurs

Après 4 à 10 jours d acclimatation en salle de maturation, les femelles sont épédonculées. Ce processus consiste à ligaturer ou cautériser (selon l'écloserie considérée) l'un des pédoncules oculaires de la femelle. Les pédoncules oculaires contiennent des glandes endocrines libérant une hormone capable d'inhiber le développement des ovaires. L'épédonculation permet ainsi de lever cette inhibition, ce qui a pour conséquence de stimuler et d'augmenter la fréquence des maturations ovariennes et d'obtenir 3 à 4 pontes par mois au lieu d'une seule. Les premières femelles sont prêtes à être fécondées 2 à 3 jours après l'épédonculation (coloration brune-orangée de leurs ovaires). Après prélèvement par pression dorso-ventrale des spermatophores mâles, le sperme récolté est déposé au niveau du thélycum des femelles (Fig. 10A). Généralement, les spermatophores de 2 mâles sont utilisés pour inséminer une femelle. Les femelles inséminées sont ensuite placées à l'obscurité dans des pondoirs (Fig. 12E) à raison d'un ou deux individu(s) par pondoir (selon l'écloserie considérée). Lorsque la ponte est terminée (en quelques heures), les femelles sont retirées.

### I.2.3.d- Élevage larvaire en écloserie

Le lendemain de la ponte, l'éclosion ayant eu lieu, la totalité du contenu des pondoirs est récupérée. Les œufs non fécondés, les œufs fécondés non éclos, les coquilles et les larves au stade nauplius, sont ainsi recueillis. Les larves nauplii sont triées par phototropisme positif dans un éclosoir (Fig. 12F). En effet, lorsqu'une lumière est placée au-dessus de ce dernier, les larves au stade nauplius nagent en surface alors que le reste du contenu des pondoirs sédimente. Le nombre de nauplii ainsi obtenus par pondoir est déterminé par 3 comptages volumétriques. Les nauplii récupérés sont alors placés dans des bacs d'élevage en écloserie (Fig. 12G) à raison de 180 nauplii par litre d'eau. Le jour d'ensemencement des larves au stade nauplius est considéré comme le jour 0 (J0) de l'élevage larvaire (Fig. 13). Chaque écloserie possède des protocoles de traitement et de renouvellement de l'eau, de séquence alimentaire et de distribution d'antibiotiques qui leur sont propres. Ils seront détaillés dans le matériel et méthode (chap. II, partie II.1) de ce manuscrit. Le développement larvaire dure environ 10 jours pendant lesquels différents stades larvaires sont observés jusqu'à l'obtention de post-larves (Fig. 13). Les post-larves sont ainsi maintenues une dizaine de jours (P10) en élevage en écloserie avant d'être transférées en nurseries (Fig. 12H).
### I.2.3.e- Élevage post-larvaire en nurserie

En nurserie, les post-larves sont progressivement acclimatées aux conditions d'élevage en bassins. Elles sont ainsi élevées d'une à 3 semaines dans des bacs extérieurs avant d'être transférées en bassin pour le grossissement.

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

**FIGURE 12** – Zones d'élevage de crevettes en conditions contrôlées à la Station Aquacole de Saint Vincent. A) Bassins de terre en assec. B) Bassins de terre en eau. C) Bacs d'élevage en zone de prématuration. D) Bacs d'élevage en salle de maturation. E) Pondoirs. F) Éclosoirs. G) Bacs d'élevage larvaire en écloserie. H) Bacs d'élevage en nurserie (Source : Ifremer).

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

**FIGURE 13** – Succession des stades larvaires de Penaeus stylirostris.
Z1, Z2 et Z3 représentent les larves au stade zoé ; M1, M2 et M3 celles au stade mysis ; PL signifie post-larve.
## I.2.4- Présentation des stades larvaires

### I.2.4.a- Le stade larvaire nauplius

Le nauplius est le premier stade larvaire de l'ensemble des espèces de crustacés. Les nauplii sont caractérisés par un œil médian et 3 paires d'appendices natatoires. Ils n'ont pas de bouche et sont vitellotrophes, c'est-à-dire qu'ils se nourrissent des réserves vitellines de l'œuf. Le stade nauplius présente 5 à 6 sous-stades (Fig. 14) durant chacun entre 8 et 10h. La croissance se fait par mues successives, les larves nauplii ont ainsi une taille variant de 200 à 250µm (Kitani, 1986). Comme énoncé précédemment, les larves au stade nauplius présentent un phototropisme marqué qui est exploité au cours de l'élevage larvaire maîtrisé.

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>FIGURE 14 – Larves nauplii 1 à 6 (Modifié de Pham 2011).</figcaption></figure>
### I.2.4.b- Le stade larvaire zoé

Les larves nauplii se transforment en larves zoé, stade caractérisé par l'ouverture de la bouche et par la mise en place d'un tube digestif fonctionnel permettant l'alimentation. À ce stade, le céphalothorax, l'abdomen ainsi que le telson se distinguent. Les larves zoé présentent 3 sous-stades successifs allant de Z1 à Z3 et durant chacun plus de 24h. Les larves Z1 ne présentent pas de pédoncules oculaires. Ces derniers n'apparaissent qu'au stade Z2, en même temps que le rostre. Le stade Z3 se distingue par la présence d'un uropode biramé (Fig. 15). Tout comme les larves au stade nauplius, la taille augmente par mues successives et varie de 0,9 à 1,8mm (Kitani, 1986). Les larves Z1 et Z2 se nourrissent de microalgues alors que les Z3 présentent un régime alimentaire carnivore. Le protocole de nourrissage précis appliqué à l'élevage larvaire sera présenté dans le matériels et méthodes (chapitre II, partie II.1).

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>FIGURE 15 – Larves zoé 1 à 3 (Modifié de Pham 2011).</figcaption></figure>
### I.2.4.c- Le stade larvaire mysis

Les larves zoé se transforment ensuite en larves mysis, le dernier stade larvaire. Il est caractérisé par des pattes natatoires dépourvues de pinces, un appendice caudal et un rostre développé (Fig. 16). Les mysis présentent ainsi la morphologie d'une petite crevette. Alors que les larves zoé se déplacent de manière saccadée et à la verticale avec la tête en haut, les mysis se déplacent à reculons avec la tête vers le bas. À nouveau, 3 sous-stades (M1 à M3) d'environ 24h se succèdent et se distinguent par la longueur et le niveau de développement des pattes abdominales. La taille augmente par mues successives et varie de 2,6 à 3,5mm (Kitani, 1986).

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>FIGURE 16 – Larves mysis 1 à 3 (Modifié de Pham 2011).</figcaption></figure>
### I.2.4.d- Post-larves

Au bout de 10 jours d'élevage larvaire, les larves mysis 3 se métamorphosent en post-larves ayant une apparence physique similaire à celle des adultes (Fig. 17). Elles se distinguent des mysis par la présence d'appendices abdominaux utilisés pour la nage. Les différents stades de post-larves sont identifiés par le nombre et la disposition de leurs épines rostrales. Le stade post-larvaire PLi est ainsi calculé par la relation $i = x - y$ où x et y désignent respectivement le nombre d'épines rostrales en position supérieure et inférieure. L'âge des post-larves est lui déterminé par le nombre de jour écoulé depuis la métamorphose (Pham 2011).

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>FIGURE 17 – Post-larve (Modifié de Pham 2011).</figcaption></figure>

## I.3- Le microbiote ou les microorganismes au service de leur hôte

### I.3.1- Historique et définitions

#### I.3.1.a- Les 3 phases majeures de la microbiologie

Au cours des 4 derniers siècles, la microbiologie s'est développée en 3 phases majeures : l'observation, l'expérimentation et la spécialisation (Fig. 18). La phase d'observation a été initiée en 1668 par Antoine van Leeuwenhoek qui observe pour la première fois, sous microscope, des microorganismes qu'il appelle alors des « animalcules ». À la suite de cette prise de conscience d'un nouveau monde invisible à l'œil nu, il faudra attendre le 19ème siècle et les travaux de Louis Pasteur et Robert Koch pour entrer dans la phase d'expérimentation de la microbiologie. Cette période a mis en évidence le rôle des microorganismes dans certaines maladies ainsi que dans la fermentation alimentaire. Les premières hypothèses selon lesquelles certains microorganismes pourraient être bénéfiques sont émises et les premières méthodes de culture ainsi que la pasteurisation sont mises au point. Au début du 20ème siècle, observés par des microscopes de plus en plus performants, comme les microscopes électroniques, les microorganismes sont classés, par Édouard Chatton (Chatton 1937), en procaryotes (sans noyau cellulaire) et eucaryotes (avec noyau cellulaire) conduisant à des classifications microbiennes toujours plus précises. Un peu plus tard, dans les années 1940, Sergei Winogradsky met en évidence le rôle des microorganismes des sols et des eaux dans la transformation des composés minéraux (Winogradsky 1949). En parallèle, le scientifique hollandais Martinus Beijerinck parvient à isoler des souches bactériennes sulfato-réductrices et décrit ainsi l'implication des procaryotes dans la fixation de l'azote. Ces travaux représentent la spécialisation de la microbiologie dans l'écologie et donnent ainsi naissance à l'écologie microbienne. Au cours de la 2de moitié du 20ème siècle, la microbiologie continue sa spécialisation au sein de différents domaines tels que la physiologie, la biochimie, la génétique, etc. En 1977, Carl Woese et George Fox combinent
pour la première fois la microbiologie et la biologie moléculaire en utilisant le gène codant pour l'ARN ribosomique 16S (ARNr 16S) comme marqueur moléculaire pour classifier les procaryotes. Leurs travaux conduisent à la définition de 2 règnes parmi ces derniers : les *Eubacteria*, renommées plus tard *Bacteria*, et les *Archaebacteria*, classiquement nommées les *Archaea* (Woese & Fox 1977). Leur approche moléculaire est ensuite étendue au gène codant pour l'ARNr 18S pour les eucaryotes et devient la référence pour la classification des organismes vivants. En parallèle des travaux de Woese et Fox, au début des années 1980, une méthode permettant de déterminer la séquence nucléotidique d'un gène est mise au point, ce sont les débuts du séquençage. Depuis le début du 21ème siècle, grâce à la spécialisation de la microbiologie dans la biologie moléculaire ainsi que le développement de la bioinformatique et du séquençage haut débit, on assiste à l'essor des méthodes haut débit dites « omics » (Fig. 19). Elles permettent d'étudier le contenu génétique (génomique), les ARNs transcrits (transcriptomique) ainsi que les protéines (protéomique) et les métabolites produits (métabolomique) à l'échelle d'un organisme unique mais aussi d'une communauté (méta-génomique, méta-transcriptomique, etc.). Les progrès récents dans ce domaine permettent même une application des méthodes « omics » à l'échelle d'une seule cellule (Lee et al. 2020).

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>FIGURE 18 – Bref historique de la microbiologie.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>FIGURE 19 – État des lieux des méthodes « omics » (Adapté de Santiago-Rodriguez & Hollister 2021).</figcaption></figure>

### I.3.1.b- Caractérisation de l'holobionte

L'ensemble des travaux menés en microbiologie depuis plus de 300 ans ont permis de mettre en évidence la diversité métabolique et physiologique des microorganismes. Ces derniers ont été découverts dans tous les milieux étudiés sur Terre et se sont avérés essentiels à ces environnements. En effet, bien qu'il reste de nombreuses espèces microbiennes à découvrir, les microorganismes représentent une large part de la diversité génétique terrestre (Mora et al. 2011). Ils sont capables de produire des molécules entrant dans la composition de l'atmosphère ainsi que de catalyser des réactions essentielles des cycles biogéochimiques, processus permettant l'homéostasie de la biosphère (Whitman et al. 1998; Falkowski et al. 2008). Au-delà de l'intérêt écologique des microorganismes, leur capacité à coloniser divers autres organismes a également été mise en évidence. En effet, dès les années 1940, le microbiologiste Robert Hungate isole et cultive des bactéries anaérobies strictes associées au rumen de bovins et qui s'avèrent essentielles à la digestion de ces animaux. En parallèle, des lignées d'animaux de laboratoire dépourvus de microorganismes sont développées pour limiter les risques de contaminations pathogènes au cours des expérimentations. Les termes de microbiote et de microbiome apparaissent ainsi au cours de la 2^de^ moitié du 20^ème^ siècle pour désigner l'assemblage des microorganismes (microbiote) et de leurs génomes associés (microbiome) présents dans un environnement donné (Lane-Petter 1962; Whipps et al. 1988; Marchesi & Ravel 2015; Prescott 2017) (Fig. 18). Depuis 2006, le développement des méthodes « omics » couplé aux nouvelles approches de biologie moléculaire et de séquençage permettent une étude approfondie des communautés microbiennes associées à l'ensemble du règne du vivant. Ces recherches ont montré que les
microorganismes sont capables de coloniser n'importe quel tissu composé par des cellules épithéliales et en contact avec l'environnement extérieur (système digestif, voies respiratoires, cavité buccale, tractus reproducteur, peau...). Un seul organisme peut ainsi abriter plusieurs microbiotes ayant chacun des compositions et des fonctions particulières résultant d'une longue co- évolution entre l'hôte et ses communautés microbiennes (Huttenhower et al. 2012).

Une entité vivante composée d'un hôte et de l'ensemble de ses microorganismes associés est définie comme un holobionte (Faure et al. 2018). Ce concept est étroitement lié aux notions de mutualisme, de parasitisme et de commensalisme ; toutes regroupées sous le terme de symbiose qui désigne une interaction entre différents organismes où au moins l'une des parties dépend de cette association (Leung et al. 2021). Dans le cas où la symbiose est bénéfique à l'ensemble des organismes impliqués, on parle de mutualisme. Inversement, le parasitisme désigne une interaction néfaste pour l'un des organismes et bénéfique pour l'autre. Enfin, la notion de commensalisme fait référence à une association bénéfique pour l'une des parties mais sans effet sur l'autre (Martin & Schwab 2012; Leung et al. 2021). La symbiose peut être épibiotique dans le cas où le symbionte vit à la surface de l'hôte ou endobiotique si l'organisme symbiotique vit à l'intérieur des cellules ou des tissus de l'autre organisme. Un holobionte résulte de l'équilibre des multiples interactions entre l'hôte et ses communautés microbiennes provenant de ses parents (transmission verticale) ou de son environnement de vie (transmission horizontale). Cette notion d'état d'équilibre, aussi appelée homéostasie, s'oppose à la dysbiose qui fait état d'un déséquilibre au sein d'une communauté (Petersen & Round 2014). Dans le cas des communautés microbiennes, la dysbiose peut être caractérisée de 3 manières différentes (Fig. 20) :

- par la prédominance d'une espèce pathogène (ou opportuniste)

- par une perte de diversité des communautés microbiennes

- par la perte de communautés microbiennes bénéfiques.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>FIGURE 20 – Visualisation du phénomène de dysbiose (Adapté de Petersen & Round 2014).</figcaption></figure>
## I.3.2- Le microbiote intestinal humain

Le microbiote le plus connu et le plus étudié à ce jour est le microbiote intestinal humain. Les connaissances accumulées sur ce dernier ont montré le rôle essentiel des communautés microbiennes sur la physiologie et le maintien de la bonne santé de l'hôte et ont conduit à l'étude du microbiote d'autres espèces.

### I.3.2.a- Quelques données clés

En moyenne, les recherches portant sur notre microbiote intestinal ont dénombré 10¹³ procaryotes capables de coloniser notre système digestif. Ils représentent au total un poids moyen de 1,5 à 2kg chez adulte. Les bactéries constituent ainsi environ 90% des microorganismes établis de l'estomac au côlon (Cassard & Thomas 2022). Considérant les conditions abiotiques du tube digestif (pH, disponibilités en substrats, anaérobiose), la majorité de ces communautés bactériennes sont complexes à cultiver. Les premières études portant sur le microbiote intestinal, et utilisant des techniques de biologie moléculaire et de séquençage, ont d'ailleurs mis en évidence plus de 80% de procaryotes qui n'avaient jamais été cultivés auparavant (Eckburg et al. 2005). Depuis, une grande partie de ces bactéries a pu être identifiée et ces dernières ont majoritairement été affiliées aux *Firmicutes*, aux *Bacteroidetes* ainsi qu'aux *Actinobacteria* (Turnbaugh et al. 2007). En une vingtaine d'années, le rôle essentiel des procaryotes du microbiote intestinal humain a clairement été mis en évidence avec des implications dans une multitude de processus physiologiques tels que la digestion, la synthèse de vitamines et de nutriments, la mise en place et l'activité du système immunitaire, le développement du système nerveux, le comportement, etc. Nous aborderons ici les 2 exemples les plus documentés : l'implication du microbiote intestinal dans la digestion des polysaccharides et dans l'immunité.

### I.3.2.b- Rôle du microbiote intestinal humain dans la digestion et l'immunité

Notre régime alimentaire étant grandement constitué de produits d'origine végétale (céréales, fruits, légumes, etc.), il est très riche en polysaccharides, aussi appelés carbohydrates. Ces derniers sont des assemblages de plusieurs monosaccharides (ou oses) reliés entre eux par des liaisons dites glycosidiques. Lors de la digestion, ces liaisons doivent être clivées par des enzymes appelées CAZymes (carbohydrate active enzymes). Le génome humain ne code que pour une dizaine de CAZymes qui interviennent au niveau de l'intestin grêle et ne ciblent qu'un nombre restreint de polysaccharides. En revanche, les bactéries présentes dans le côlon codent pour plus de 10 000 CAZymes (Cantarel et al. 2012) et permettent ainsi de dégrader les polysaccharides non digérés en monosaccharides qu'elles fermentent ensuite en différents sous-produits. Une part importante de ces sous-produits est représentée par les acides gras à chaîne courte comme le butyrate, l'acétate et le propionate (Fig. 21). Ils constituent jusqu'à 10% de nos apports énergétiques journaliers et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme la stimulation de la croissance des cellules du côlon et la modulation des dépenses énergétiques (McNeil 1984; Oliphant & Allen-Vercoe 2019).
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>FIGURE 21 – Implication du microbiote intestinal humain dans la digestion.</figcaption></figure>

Au-delà de son importance dans la digestion, le microbiote intestinal est également largement connu pour son implication dans le système immunitaire (Fig. 22). Chez l'Homme, l'immunité au niveau du système digestif est d'abord assurée par les cellules épithéliales intestinales qui produisent des molécules antimicrobiennes et du mucus constituant une barrière à l'entrée des pathogènes. Par la production de divers métabolites comme les acides gras à chaînes courtes évoqués précédemment, les bactéries du microbiote intestinal sont capables d'agir sur ces cellules épithéliales et modulent l'épaisseur et la qualité du mucus ainsi que l'expression de certains peptides antimicrobiens (Kamada et al. 2013). Le microbiote agit également directement sur la différenciation et la stimulation des cellules immunitaires (différenciation des lymphocytes T, stimulation de la sécrétion d'anticorps par les lymphocytes B, stimulation des phagocytes par production de peptidoglycanes, etc.). Au-delà de son action sur le système immunitaire, le microbiote peut également directement agir sur l'introduction de pathogènes par compétition « passive » (utilisation de nutriments essentiels, prolifération rapide au sein d'une niche écologique, etc.) ou « active » (production de métabolites affectant l'expression des gènes de virulence, production de molécules antimicrobiennes, production de toxines, etc.) (Ghoul & Mitri 2016). Par exemple, la bactérie *Bacteroides thetaiotoamicron* catabolise la mucine, protéine entrant dans la composition du mucus, pour produire du fucose qui inhibe l'expression des facteurs de virulence chez *Escherichia coli*.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**FIGURE 22** – Implication du microbiote intestinal humain dans l'immunité (Schéma simplifié de Kamada et al. 2013).</figcaption></figure>

## I.3.3- Microbiote d'espèces aquacoles d'intérêt économique

La prise de conscience de l'importance du microbiote dans la physiologie de l'hôte, ainsi que les perspectives thérapeutiques en santé humaine qui en découlent, ont conduit à une augmentation du nombre d'études portant sur les communautés microbiennes associées aux espèces d'intérêt agro-économique. En effet, de nombreux projets visent désormais à améliorer les rendements et la durabilité des productions agro-alimentaires *via* la maîtrise des microorganismes associés aux espèces élevées ainsi qu'à leur environnement. De par son rôle socio-économique majeur, l'aquaculture est désormais également concernée par ces nouvelles problématiques.

### I.3.3.a- Microbiote et poissons

Comme beaucoup d'animaux marins ayant une phase larvaire, l'établissement des communautés microbiennes intestinales chez les poissons a lieu au cours du développement larvaire, au moment de l'ouverture de la bouche. À cette étape, les larves internalisent les microorganismes présents dans l'eau d'élevage et dans la nourriture ainsi que ceux associés à la surface (chorion) des œufs (Vargas-Albores et al. 2021). Une étude portant sur le Discus commun (*Symphysodon aequifasciatus*) suggère également une transmission verticale de certaines bactéries provenant du mucus des géniteurs (Sylvain & Derome 2017). Au stade
adulte, les communautés bactériennes du tube digestif des poissons, qu'ils soient marins ou d'eau douce, se regroupent en quelques phyla majoritaires : *Proteobacteria*, *Actinobacteria*, *Bacteroidetes*, *Firmicutes* et *Fusobacterium* (Nayak 2010). Les poissons marins présentent quant à eux d'importantes proportions de bactéries affiliées aux genres *Vibrio*, *Pseudomonas*, *Archomobacter*, *Corynebacterium*, *Alteromonas*, *Flavobacterium* et *Micrococcus* (Nayak 2010).

Malgré de nombreuses similitudes, des variations inter- et intra- espèces sont constatées tant au niveau de la structure que de la composition du microbiote intestinal. En effet, plusieurs facteurs tels que le stade de développement, l'alimentation et l'état de santé des animaux ainsi que les pratiques d'élevage et les conditions environnementales sont susceptibles de moduler les communautés bactériennes du tube digestif des poissons (Nayak 2010; Yukgehnaish et al. 2020; Vargas-Albores et al. 2021).

Au niveau fonctionnel, une étude comparative portant sur 2 espèces de poissons, (Tilapia nilotica, Ictalurus punctatus) a mis en évidence que les organismes présentant un microbiote intestinal enrichi en bactéries anaérobies produisaient plus de vitamine B₁₂ suggérant que ces microorganismes sont impliqués dans la synthèse d'éléments essentiels (Sugita et al. 1990). Le développement d'un organisme modèle, le poisson zèbre (Danio rerio), dépourvu de communautés microbiennes a également permis de mettre en évidence plusieurs autres rôles clés. En effet, l'absence de colonisation microbienne du tube digestif chez le poisson zèbre entraîne un disfonctionnement des cellules épithéliales intestinales, une baisse de l'assimilation des nutriments, un métabolisme altéré, une immunosuppression, une sensibilité accrue aux pathogènes, une croissance réduite, des comportements différents et des taux de mortalité plus importants (Nayak 2010; Vargas-Albores et al. 2021).

Récemment, une étude a été menée sur les microorganismes associés aux branchies et à la peau de sérioles (Yellowtail kingfish) (Legrand et al. 2018). En comparant des individus sains ou atteints d'une entérite chronique, ils ont constaté un enrichissement de bactéries affiliées au phylum *Actinobacteria* dans les tissus des poissons malades montrant un lien entre l'état de santé intestinale des animaux et leur microbiote branchial et épidermique. Cette première étude offre ainsi de nouvelles perspectives dans la recherche de biomarqueurs non invasifs pour faciliter les diagnostiques sanitaires chez les poissons et potentiellement chez d'autres espèces d'intérêt aquacole.

### I.3.3.b- Microbiote et bivalves (mollusques)

La production aquacole mondiale de mollusques est dominée par les bivalves marins (FAO 2022) (Fig. 23). Les communautés microbiennes associées à ces organismes sont tissu-dépendantes (tube digestif, hémolymphe, branchies, etc.) suggérant des rôles physiologiques distincts pour chaque microbiote (Lokmer et al. 2016; Pierce & Ward 2018; Offret et al. 2022). Peu importe l'espèce de bivalves considérée, 2 phyla bactériens majoritaires sont mis en évidence au sein du microbiote intestinal de ces animaux : *Proteobacteria* et *Cyanobacteria* (Pierce & Ward 2018). Néanmoins, la mise en évidence de cyanobactéries, microorganismes autotrophes, paraît surprenante et plusieurs études relatives aux bivalves marins ne considèrent pas ce phylum (Offret et al. 2020; 2022). D'autres phyla ont également été mis en évidence dans le microbiote intestinal de plusieurs espèces d'huîtres, de moules et de palourdes : *Tenericutes*, *Bacteroidetes*, *Actinobacteria*, *Firmicutes*, *Chlamydiae*, *Fusobacteria*, *Spirochaetes*, *Chloroflexi*, *Planctomycetes* et *Verrucomicrobia* (Pierce & Ward 2018).

Comme pour les poissons, le microbiote intestinal des bivalves présente des variations de composition et d'abondance relative attribuées à différents facteurs exogènes et
endogènes. En effet, les conditions environnementales liées aux marées, aux saisons et à la température ainsi qu'aux pollutions chimiques et plastiques sont susceptibles de moduler les microorganismes associés au tube digestif des animaux (Pierce & Ward 2018; Offret et al. 2020; 2022). L'alimentation est également un facteur exogène capable d'influencer le microbiote intestinal des bivalves (Pierce & Evan 2019). Des facteurs endogènes comme l'espèce, le stade de développement et l'état de santé des animaux sont aussi considérés comme de potentiels sources de variabilité microbienne (Pierce & Ward 2018; Paillard et al. 2022).

Quelques études portant sur les microorganismes associés aux branchies et à l'hémolympe des bivalves sont disponibles et montrent une forte abondance de bactéries affiliées aux phyla *Proteobacteria* et *Bacteroidetes* dans ces tissus (Pierce & Ward 2018). Plusieurs études suggèrent que les microbiotes branchiaux et hémolymphatiques sont fortement influencés par l'environnement (Lokmer et al. 2016) avec une contribution importante de la température (Lokmer & Wegner 2015). Cependant, Lokmer et al. (2016) ont émis l'hypothèse que ces communautés microbiennes pourraient également être modulées par des facteurs intrinsèques à l'hôte tels que l'état de santé. Par exemple, une chute de la diversité des bactéries branchiales chez l'huître, *Crassostrea gigas*, a été mise en évidence suite à l'infection expérimentale des animaux à *Vibrio* sp.. Une augmentation de l'abondance relative de bactéries affiliées au genre *Arcobacter* a également été constatée suggérant que la capacité du microbiote des branchies à rester stable pourrait conférer une résistance à certaines maladies (Lokmer & Wegner 2015).

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

**FIGURE 23** – Espèces de mollusques les plus cultivées en aquaculture en 2022 (Source : FAO 2022).

Les 8 espèces les plus cultivées (84%) sont des bivalves marins.

### I.3.3.c- Microbiote et crustacés marins

Les études portant sur le microbiote intestinal de différentes espèces de crabes (Eriocheir sinensis, Portunus trituberculatus, Scylla sp.), de langoustes (Panulirus sp.) et de homards (Homarus gammarus) rapportent que les bactéries associées au tube de digestif de ces animaux sont majoritairement affiliées aux phyla *Proteobacteria* et *Bacteroidetes*. Des abondances relatives plus faibles de *Tenericutes*, *Actinobacteria* et *Firmicutes* sont également observées (Zhang et al. 2016a; Ding et al. 2017; Sun et al. 2018a; Yang et al. 2019; Sun et al. 2020; Guo et al. 2021; Holt et al. 2021; Lein et al. 2022). Ces phyla ont également été mis en évidence chez les larves du crabe *P. trituberculatus* (Lu et al. 2022).

Comme précédemment, les variations du microbiote intestinal des crustacés sont liées à divers facteurs exogènes et endogènes. Parmi les facteurs exogènes, l'environnement et les méthodes d'élevage sont les plus énoncés chez plusieurs espèces (Holt et al. 2020; Zhang et al. 2016a; Lein et al. 2022). Par exemple, Holt et al. (2020) ont montré une augmentation de la diversité procaryotique intestinale chez des homards élevés en mer en comparaison à des
homards élevés en bassin. En conséquence, les auteurs suggèrent un impact positif sur la croissance et la résistance des animaux au vu des meilleures performances constatées lors des élevages en mer. L'alimentation utilisée au cours de l'élevage est également susceptible d'influencer le microbiote intestinal des crustacés. En effet, malgré la persistance d'un core microbien (80% de similarités), c'est-à-dire d'un ensemble de microorganismes communs à tous les échantillons étudiés (Shade & Handelsman 2012), une étude comparative de crabes *E. sinensis* mâles et femelles nourris avec différents régimes alimentaires montre un enrichissement de certaines communautés bactériennes entre les animaux nourris avec des régimes alimentaires distincts (Sun et al. 2020). En étudiant des crabes *P. trituberculatus* nourris avec différentes concentrations de lipides (5, 10 et 15%), Sun et al. (2018a) remarquent des taux de survie plus faibles chez les individus nourris avec le plus fort taux de lipides. Cette observation est associée à un enrichissement du tube digestif des animaux en bactéries pathogènes opportunistes affiliées aux *Vibrionaceae* et aux *Rickettsiales*. Inversement, en enrichissant la nourriture de crabes *E. sinensis*, avec du L-tryptophane (acide aminé essentiel), Yang et al. (2019) observent des survies améliorées après infection expérimentale des animaux. Ils remarquent également une augmentation de l'abondance relative de certains taxa bactériens ainsi qu'un enrichissement des fonctions microbiennes associées au métabolisme énergétique, au métabolisme des carbohydrates et au métabolisme des acides aminés impliquant un potentiel rôle du microbiote intestinal du crabe dans la digestion ainsi que dans l'immunité. Hormis l'état de santé des animaux, d'autres facteurs endogènes comme l'âge et le stade de développement des individus ainsi que le développement des organes ont été mis en évidence (Ooi et al. 2017; Lein et al. 2022). Les effets de différents stress ont également été testés. Des crabes *E. sinensis* soumis à des stress thermiques ou oxydatifs montrent un enrichissement de leur microbiote intestinal en pathogènes opportunistes (Guo et al. 2021; Li et al. 2023). Ainsi, Li et al. (2023) émettent l'hypothèse que la dysbiose causée par le stress des animaux contribue à réduire l'implication du microbiote intestinal dans la digestion. Au-delà du stress, les infections pathogènes peuvent également impacter les communautés microbiennes des crustacés. Par exemple, en observant le microbiote intestinal de crabes *E. sinensis* après infection au virus du syndrome white spot (WSSV, White Spot Syndrom Virus), Ding et al. (2017) observent une augmentation de plusieurs bactéries pathogènes : *Arcobactera*, *Aeromonas* et *Cyanobacteria*. Ils précisent que ces taxa sont aussi présents chez les individus contrôles non infectés mais dans des abondances relatives moindres et concluent qu'une infection virale pourrait affaiblir le système immunitaire de l'hôte et entraîner une prolifération des communautés microbiennes.

Comme pour les autres espèces d'intérêt aquacole présentées précédemment, des études portant sur les communautés microbiennes associées à d'autres organes des crustacés ont également été publiées. En étudiant des crabes *Scylla paramamosain*, Sun et al. (2018b) sont parvenus à inactiver, par ARNi, 2 oxydases (SpDUOX1 et 2, normalement exprimées au cours d'une infection bactérienne). Cette inactivation conduit à une augmentation de bactéries pathogènes opportunistes affiliées aux *Flavobacterium* et *Acinetobacter* suggérant que les oxydases jouent un rôle dans le maintien de l'homéostasie du microbiote de l'hémolymphé. Zhang et al. (2020) concluent également que la bonne santé de *S. paramamosain* est liée à la capacité de l'animal à maintenir une faible abondance microbienne dans l'hémolymphé. Ils émettent également l'hypothèse que la majorité des bactéries de l'hémolymphé provient de l'intestin et de l'hépatopancréas et non de l'environnement extérieur.
## I.3.4- Le microbiote des crevettes, de la larve à l'adulte

Dans ce contexte, les crevettes sont étudiées dans le but de mettre en évidence un microbiote optimal qu'il serait possible d'influencer par des techniques d'élevage et ainsi limiter la sensibilité des animaux aux potentiels pathogènes microbiens.

### I.3.4.a- Le microbiote larvaire

Les larves de crevettes élevées en aquaculture peuvent être soumises à des mortalités causées par des pathogènes bactériens (Vibrio harveyi, V. splendidus, etc.), des mycoses (Legenidium sp., Sirolpidium sp., etc.), des protozoaires (Zoothamnium, Vorticella, etc.) ainsi que des virus (Baculovirus penaei, IHHNV, WSSV, etc.) (Lightner et al. 1989; Karunasagar et al. 2001; Austin & Zhang 2006). Les premiers stades de vie de la crevette peuvent également être impactés par des syndromes dont les causes ne sont pas établies comme les syndromes zoé 2 ou mysis (Vandenberghe et al. 1999; Sathish Kumar et al. 2017). Malgré cette sensibilité des larves de crevettes en contexte aquacole, leur microbiote n'a été que très peu étudié en utilisant les nouvelles techniques de séquençage et de bioinformatique. En effet, à ce jour, les recherches se focalisent sur le microbiote intestinal des juvéniles et des adultes alors que très peu d'études portant sur les communautés microbiennes larvaires et leur environnement sont recensées (Zheng et al. 2017; Xue et al. 2018; Wang et al. 2020a; b) (Tab. 1). Par séquençage des ADNs bactériens extraits, ces recherches se concentrent sur l'étude des communautés procaryotiques associées aux larves de Penaeus vannamei et à leur environnement.

<caption>TABLEAU 1 – Principales publications traitant du microbiote larvaire de crevettes d'intérêt aquacole et utilisant une technique de séquençage.</caption>

Les méthodologies décrites sont détaillées dans le chapitre III (partie III.2.2) et en annexe (annexes 1 à 3).

<table><thead><tr><td>PUBLICATION</td><td>ESPÈCE ETUDIÉE</td><td>STADES LARVAIRES</td><td>EAU ET NOURRITURE</td><td>MÉTHODOLOGIE</td></tr></thead><tbody><tr><td>Zheng et al. 2017</td><td>P. vannamei</td><td>- Zoé 1 & 3<br/>- Mysis 1 & 3<br/>- Post-larve 1, 3 & 6</td><td>Eau d'élevage associée</td><td>Métabarcoding des ADNs extraits et séquencés par 454 (région V3-V6)</td></tr><tr><td>Xue et al. 2018</td><td>P. vannamei</td><td>- Nauplii<br/>- Zoé 2<br/>- Mysis 1<br/>- Post-larve</td><td></td><td>Métabarcoding des ADNs extraits et séquencés par 454 (région V4)</td></tr><tr><td>Wang et al. 2020a</td><td>P. vannamei</td><td>- Nauplii<br/>- Zoé 2<br/>- Mysis 2<br/>- Post-larve 2</td><td>Eau d'élevage associée Nourriture</td><td>Métabarcoding des ADNs extraits Illumina HiSeq (région V4)</td></tr><tr><td>Wang et al. 2020b</td><td>P. vannamei</td><td>- Nauplii<br/>- Zoé 1, 2 & 3<br/>- Mysis<br/>- Post-larve</td><td></td><td>Métabarcoding des ADNs extraits et séquencés par Illumina MiSeq (région V4)</td></tr></tbody></table>
Bien que ces études utilisent des méthodologies différentes pour étudier le microbiote larvaire, de nombreuses similitudes se dégagent ; notamment concernant les communautés microbiennes prédominantes. En effet, toutes concluent que les *Proteobacteria* (essentiellement *Alphaproteobacteria* et *Gammaproteobacteria*) et les *Bacteroidetes* sont les phyla bactériens les plus abondants au sein des échantillons prélevés (Zheng et al. 2017; Xue et al. 2018; Wang et al. 2020a; b) (Fig. 24). Des proportions importantes d'Actinobacteria (Zheng et al. 2017; Xue et al. 2018; Wang et al. 2020b), de Firmicutes (Xue et al. 2018; Wang et al. 2020a) et de Chloroflexi (Wang et al. 2020b) sont également mises en évidence. Bien que des communautés microbiennes communes se détachent et persistent au cours de l'élevage, tous les auteurs remarquent des variations importantes des microorganismes procaryotiques associés aux larves et à leur environnement au cours du développement. Dans un premier temps, des différences de richesse et d'équitabilité sont mises en évidence (Wang et al. 2020a,b). Ces termes désignent respectivement le nombre de communautés microbiennes en présence et l'uniformité de ces communautés au sein des échantillons, indiquant ainsi des variations de la diversité procaryotique au cours de l'élevage (ces notions seront détaillées dans le chapitre II, partie III.5.3, Tab. 8). Au niveau taxonomique, des modifications sont également constatées. Par exemple, dans l'eau d'élevage, Zheng et al. (2017) remarquent une augmentation significative des *Flavobacteriaceae* au moment du stade zoé, des *Actinobacteria* au stade mysis et des *Microbacteriaceae* au stade post-larve (Fig. 25). De la même manière, Wang et al. (2020a) parviennent, grâce à une analyse discriminante linéaire (LDA) avec effet de taille (Linear discriminant analysis with Effect Size, LEfSe), à mettre en évidence des genres bactériens spécifiquement enrichis dans les larves selon le stade de développement. Ils démontrent ainsi que les genres Vibrio, Pseudoalteromonas, Thalassolituus et Kordia sont enrichis au stade nauplii, que Gilvibacter prédomine dans les larves zoé, que Tenacibaculum et Shimia sont plus abondants dans les larves mysis et que les post-larves sont dominées par les Thalassotalea. Néanmoins, les auteurs précisent que malgré une grande variation de la taxonomie microbienne au cours de l'élevage, une stabilité phylogénétique est conservée. Ils démontrent également que le microbiote larvaire est largement influencé par l'eau d'élevage, surtout au moment du stade zoé où l'ouverture de la bouche a lieu. Ils émettent ainsi l'hypothèse qu'à partir de ce stade de développement des communautés microbiennes spécifiques sont recrutées dans l'eau d'élevage par le système digestif immature des larves. Ils remarquent d'ailleurs que les microalgues du régime alimentaire des larves entraînent un apport non négligeable de bactéries du genre Nautella au sein du microbiote des larves aux stades nauplii et zoé. De manière intéressante, ce genre bactérien est également mis en évidence par Zheng et al. (2017) mais dans un contexte totalement différent. En effet, en recherchant des biomarqueurs microbiens de l'état de santé des larves dans leur eau d'élevage, les auteurs concluent que les Nautella sont des indicateurs d'un mauvais état de santé alors que les Meridianimaribacter sont des indicateurs d'un bon état de santé.

En conclusion, malgré le faible nombre d'études portant sur le microbiote larvaire des crevettes en contexte aquacole, il a été montré que les communautés procaryotiques associées aux larves sont influencées par le stade de développement ainsi que par l'environnement des animaux aussi bien au niveau de l'eau d'élevage que de l'alimentation. Cependant, les recherches menées concernent essentiellement la crevette P. vannamei. Or, il a été montré que l'acquisition du microbiote pouvait être espèce-dépendante (Hansen & Olafsen 1999; Maraci et al. 2021). De plus, les études mentionnées se focalisent sur l'analyse des ADNs bactériens et ne prennent ainsi pas en compte uniquement la fraction active de la
diversité microbienne. L'analyse des ARNs totaux permettrait de déterminer plus précisément les communautés procaryotiques impliquées et d'affiner les recherches menées sur le microbiote associé aux élevages larvaires de crevette (Yates et al. 2021).

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

**FIGURE 24** – Communautés microbiennes majoritaires mises en évidence dans la littérature traitant des microorganismes associés aux larves de crevettes, *Penaeus vannamei*, et à leur environnement. Traduit et adapté de A) Zheng et al. 2017, B) Xue et al. 2018, C) Wang et al. 2020a et D) Wang et al. 2020b.

WH et WD désignent respectivement des échantillons d'eau d'élevage de larves en bonne et en mauvaise santé. SH et SD désignent respectivement des larves en bonne et en mauvaise santé. N5, Z2, M1, M2, P1 et P2 désignent respectivement des larves aux stades nauplii 5, zoé 2, mysis 1, mysis 2, post-larve 1 et post-larve 2. SM2, SP2, AL et AR désignent des sources de nourriture (SM2 pour particules à mysis 2, SP2 pour particules à post-larve, AL pour algue et AR pour larves d'Artemias sp.).
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

**FIGURE 25** – Familles bactériennes mises en évidence par Zheng et al. (2017) dans l'eau d'élevage des larves aux stades zoé 1 (Z1), zoé 3 (Z3), mysis 1 (M1), mysis 3 (M3), post-larve 1 (P1), post-larve 3 (P3) et post-larve 6 (P6) (Traduit de Zheng et al. 2017).

L'eau des larves zoé et mysis a été échantillonnée en triplicat (1 à 3) ou en duplicat (1 et 2). L'eau d'élevage avant introduction des larves est désignée par J0. Les familles bactériennes notées en rouge sont celles dont les abondances sont statistiquement différentes entre les stades. Le terme « unknown » signifie que l'assignation taxonomique jusqu'au niveau de la famille n'était pas possible.

### I.3.4.b- Microbiote et crevettes adultes

Les études portant sur les communautés microbiennes associées aux crevettes adultes et juvéniles se focalisent sur le microbiote intestinal. Cela s'explique par son rôle essentiel dans la physiologie de l'hôte, mais également par le fait que sa diversité est bien plus importante comparée à celle du microbiote d'autres tissus comme l'hépatopancréas, les branchies ou même l'organisme entier (Cornejo-Granados et al. 2018). Comme pour le microbiote larvaire, les microorganismes associés au système digestif des crevettes adultes sont largement dominés par des bactéries affiliées aux phyla des *Proteobacteria* ainsi qu'aux *Firmicutes*, *Actinobacteria* et *Bacteroidetes* dans des proportions moins importantes (Li et al. 2018; Cornejo-Granados et al. 2018). Malgré ces communautés prédominantes, les crevettes sont également associées à des bactéries plus spécifiques dont l'abondance peut varier selon différents facteurs.

Tout d'abord, le microbiote intestinal de différentes espèces de crevettes d'eau douce et marines est largement influencé par la croissance des animaux (Cornejo-Granados et al. 2018). Par exemple, au cours des 20 premiers jours d'élevage post-larvaires de *P. vannamei*, une prédominance de la famille des *Vibrionaceae* est observée puis disparaît ensuite totalement pour laisser place aux *Intraspongiaceae* et aux *Rhodobacteraceae* (Garibay-Valdez et al. 2020). Zeng et al. (2017) montrent que la diversité des communautés microbiennes intestinales augmente entre les post-larves et les adultes de *P. vannamei* avec une diminution de la prévalence des *Proteobacteria* au cours du grossissement. Ils démontrent également que des microorganismes spécifiques et communs existent entre les post-larves et les adultes suggérant l'existence de communautés modulables et d'un core microbien persistant tout au long de la vie de l'animal. En comparant des crevettes *P. vannamei* élevées sous les mêmes
conditions mais présentant des taux de croissance différents, Xiong et al. (2017) suggèrent que les variations microbiennes observées sont dues à des variations de l'activité digestive des animaux. Cela est également fortement lié au régime alimentaire de la crevette qui change tout au long de son cycle de vie. Des études montrent d'ailleurs que la composition lipidique et glucidique de l'alimentation de P. vannamei est susceptible d'influencer la composition du microbiote intestinal à l'âge adulte. En effet, en comparant des crevettes nourries avec des sources lipidiques variées ou uniques, Zhang et al. (2014a) remarquent que la diversification des lipides dans l'alimentation entraîne un meilleur rendement de croissance, corrélé à une plus forte abondance de la famille des Rhizobiaceae ; et ce malgré l'existence de communautés microbiennes communes. De la même manière, des crevettes P. vannamei nourries avec des sources glucidiques différentes présentent des microbiotes intestinaux distincts malgré une large prédominance de Proteobacteria (Qiao et al. 2017). Les crevettes nourries avec de l'aliment enrichi en fécule de maïs et présentant un plus faible taux de survie arborent ainsi un microbiote enrichi en pathogènes opportunistes contrairement aux crevettes nourries avec des aliments enrichis en glucose ou en sucrose. Au-delà du régime alimentaire, les techniques d'élevage peuvent également influencer les communautés microbiennes associées aux animaux (Huang et al. 2018). En effet, des crevettes P. vannamei adultes récoltées en milieu naturel présentent un microbiote plus diversifié que celui des crevettes adultes de la même espèce, prélevées en élevage (Cornejo-Granados et al. 2017). De plus, plusieurs études montrent que la composition microbienne des intestins et des sédiments des bassins d'élevage des crevettes sont similaires (Cornejo-Granados et al. 2018; Huang et al. 2018; Fan et al. 2019). De la même manière, la qualité de l'eau d'élevage ainsi que la fréquence de renouvellement de cette eau sont également susceptibles de modifier le microbiote des animaux (Huang et al. 2018; Chen et al. 2019). Des études montrent l'impact de variations de température (Al-Masqari et al. 2022) et de salinité (Zhang et al. 2016b) sur le microbiote intestinal des crevettes P. vannamei. Enfin, un facteur important étroitement lié avec le microbiote intestinal des crevettes est l'état de santé des animaux. Xiong et al. (2015) démontrent d'ailleurs que 38 familles bactériennes sont différentiellement abondantes dans le tube digestif entre des crevettes P. vannamei en bonne et en mauvaise santé. Les auteurs indiquent également que la gravité de la dégradation de l'état de santé des animaux est fortement liée aux changements microbiens observés.

Ainsi, les crevettes en élevage sont soumises tout au long de leur développement et de leur grossissement à de nombreux facteurs endogènes ou exogènes (Fig. 26). Ces facteurs de sélection exercent une pression sur leur microbiote intestinal qui est ainsi modulé selon les besoins physiologiques de l'animal (Xiong et al. 2017). Deux mécanismes de sélection sont possibles. Les microorganismes peuvent directement être impactés par le facteur de sélection. Par exemple, une communauté est sélectionnée dans un milieu à une certaine salinité et / ou à une certaine température du fait de ses capacités de croissance dans cet environnement. Inversement, l'hôte peut être impacté par le facteur de sélection et entraîner un bouleversement du microbiote. Par exemple, des variations de salinité et / ou de température entraînent un stress de l'hôte résultant en la modification de ses communautés microbiennes.
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**FIGURE 26** – Facteurs susceptibles d'influencer le microbiote intestinal des crevettes adultes.</figcaption></figure>

Bien que le microbiote intestinal associé aux crevettes adulte soit le plus étudié, plusieurs études ont été publiées sur l'analyse des communautés microbiennes associées à l'hémolymphe, à l'hépatopancréas ainsi qu'aux branchies de différentes espèces de pénéides. En comparant les microorganismes associés aux intestins et à l'hépatopancréas de *P. vannamei*, *Cornejo-Granados et al.* (2017) remarquent une diversité bactérienne plus faible dans l'hépatopancréas et une dominance de taxa affiliés aux genres *Pseudomonas*, *Vibrio* et *Escherichia*. Les auteurs mettent également en évidence des compositions procaryotiques hépatopancréatiques distinctes entre des crevettes sauvages ou élevées ainsi qu'entre des crevettes saines ou infectées à *V. parahaemolyticus*, suggérant un impact des conditions d'élevage et de l'état de santé des animaux sur ces microorganismes. Pour aller plus loin, des expérimentations ont été menées en inactivant la réponse immunitaire humorale de crevettes *P. japonicus* et *P. vannamei* (Fagutao et al. 2009; Wang et al. 2014). Fagutao et al. (2009) inactivent la prophénol-oxidase, initiatrice de cascades de réactions immunitaires, alors que Wang et al. (2014) inactivent la lectine de type-C qui participe à la reconnaissance des pathogènes. Les 2 études constatent une prolifération des microorganismes présents dans l'hémolymphe ainsi qu'une mortalité accrue des animaux. Récemment, un article sur le microbiote branchial de *P. vannamei* met en évidence une modification des communautés microbiennes de ce tissu suite à une infection à *V. parahaemolyticus* affectant l'hépatopancréas, ouvrant ainsi la voie à la recherche de méthodes de détection biosanitaire moins invasives chez les crevettes d'intérêt aquacole (Lv et al. 2020).
## I.4- Analyses multivariées et méta-analyses pour étudier le microbiote

### I.4.1- Définitions

#### I.4.1.a- Analyses multivariées

Les analyses multivariées consistent en l'analyse statistique simultanée de plusieurs variables et permettent ainsi la visualisation et l'exploration de données multidimensionnelles. La notion de dimension statistique fait référence au nombre d'attributs d'un ensemble de données. Prenons l'exemple de l'analyse des communautés microbiennes associées à un organisme et son environnement. Ces dernières sont susceptibles d'être modifiées sous l'influence de processus multifactoriels. Il est donc nécessaire de multiplier le nombre d'individus et de facteurs considérés lors de l'analyse du microbiote afin de tenir compte de la complexité des interactions et des variabilités existantes. En conséquence, des tableaux contenant plus de 2 variables (régime alimentaire, caractéristiques du milieu de vie, usage d'antibiotique, stade de développement, état de santé de l'hôte...) réparties au sein de plus de 2 unités statistiques (plusieurs individus, plusieurs échantillons environnementaux) sont obtenus. En d'autres termes, l'analyse du microbiote génère des jeux de données à plusieurs dimensions à partir desquels différentes analyses multivariées aux objectifs multiples peuvent être réalisées. En effet, lorsque ces dernières sont descriptives ou exploratoires, l'objectif est de structurer et de résumer le jeu de données en réduisant le nombre de dimensions de celui-ci. Les variables considérées ont alors toutes le même poids au sein de l'analyse. En revanche, lorsque les analyses multivariées sont explicatives ou décisionnelles, l'objectif est d'établir un lien de causalité ou de corrélation entre une variable dite dépendante et plusieurs variables explicatives indépendantes (Ramette 2007). Il existe ainsi une multitude d'analyses multivariées dont le choix dépend du questionnement scientifique, de la nature des données et du nombre de tableaux qui les contiennent (Tab. 2).

#### I.4.1.b- Méta-analyses

La méta-analyse est définie comme une analyse statistique qui combine ou intègre les résultats de plusieurs expérimentations indépendantes mais considérées comme comparables (Glass 1976). Cette méthode analytique est utilisée depuis plus de 50 ans et est actuellement reconnue comme le niveau de preuve le plus élevée dans le domaine de la recherche médicale (Haidich 2010) (Fig. 27). Les analyses multivariées sont utilisées en routine lors de l'étude du microbiote. Lorsque ces analyses multivariées sont combinées à des méta-analyses, un grand nombre de paramètres expérimentaux peuvent être considérés et ainsi augmenter la résolution spatio-temporelle et la précision des études portant sur le microbiote.
<table><caption>TABLEAU 2 – Liste non exhaustive des analyses multivariées les plus utilisées pour l'analyse du microbiote.</caption><thead><tr><td>OUTIL</td><td>TYPE D'ANALYSE</td><td>NOMBRE DE TABLEAUX</td><td>TYPE DE VARIABLE</td><td>PRINCIPE</td></tr></thead><tbody><tr><td>Analyse en Composantes Principales (ACP)</td><td>Exploratoire</td><td>1</td><td>Variables quantitatives</td><td>Analyse et visualisation de la corrélation ou de la covariance</td></tr><tr><td>Analyse en Coordonnées Principales (PCoA), Non-Metric Dimensionnal Scaling (NMDS)</td><td>Exploratoire</td><td>1</td><td>Matrice de distances</td><td>Analyse et visualisation d'une matrice de distance entre individus.</td></tr><tr><td>Analyse des Correspondances Multiples (ACM)</td><td>Exploratoire</td><td>1</td><td>Variables qualitatives</td><td>Pendant qualitatif de l'ACP.</td></tr><tr><td>Analyse Factorielle Multiple (AFM)</td><td>Exploratoire</td><td>>2</td><td>Tableaux de variables quantitatives et / ou tableaux de variables qualitatives</td><td>Visualisation simultanée de plusieurs tableaux de variables de nature différente.</td></tr><tr><td>Méthodes de classification (Classification Ascendante Hiérarchique ou CAH, k-means...)</td><td>Exploratoire</td><td>1</td><td>Variables quantitatives</td><td>Partitionnement des données dans des clusters selon leur degré de similarité.</td></tr><tr><td>Modélisation statistique (régression, ANOVA...)</td><td>Décisionnelle (Causalité)</td><td>1</td><td>Une variable à expliquer et plusieurs variables explicatives quantitatives ou qualitatives</td><td>Description des processus générant les données et estimation de prédictions.</td></tr><tr><td>Analyse Canonique des Corrélations</td><td>Décisionnelle (Corrélation) ou Exploratoire</td><td>2</td><td>Deux tableaux de variables quantitatives</td><td>Analyser les corrélations existantes entre 2 tableaux.</td></tr><tr><td>Analyse Canonique des Correspondances (ACC)</td><td>Décisionnelle (Causalité) ou Exploratoire</td><td>2</td><td>Un tableau de contingence et un tableau explicatif de variables quantitatives ou qualitatives</td><td>Analyser les liens unimodaux existant entre 2 tableaux.</td></tr><tr><td>Analyse de Redondance (RDA)</td><td>Décisionnelle (Causalité)</td><td>2</td><td>Un tableau de contingence et un tableau explicatif de variables quantitatives ou qualitatives</td><td>Analyser les liens linéaires existant entre 2 tableaux.</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**FIGURE 27** – Pyramide de la hiérarchie des preuves en recherche médicale (Modifié de Heidich 2010).</figcaption></figure>

## I.4.2- Méta-analyses pour l'étude du microbiote des crevettes

Au cours des 5 dernières années, 3 méta-analyses ont été conduites afin d'étudier le microbiote associé à des crevettes marines et d'eau douce. En 2018, la première méta-analyse a été publiée par Cornejo-Granados et al. (2018). Ils identifient 16 publications traitant du microbiote des crevettes dans la littérature et extraient 199 échantillons (Fig. 28, Tab. 3). Les auteurs démontrent par l'analyse de l'ensemble de ces échantillons que le facteur biologique influençant le plus le microbiote associé aux crevettes est l'environnement (marin ou eau douce). En effet, ils montrent que les *Proteobacteria* constituent 88,6% de l'abondance relative totale du microbiote des crevettes marines alors qu'ils ne représentent que 52,4% du microbiote des crevettes d'eau douce. Inversement, les *Firmicutes* sont plus abondants chez les espèces d'eau douce (32,1%) par rapport aux espèces marines (1,2%). Les auteurs concluent également que les familles *Rhodobacteraceae*, *Vibrionaceae*, *Helicobacteraceae* et *Pseudoalteromonadaceae* dominent les échantillons provenant de l'environnement marin alors que les *Oxalobacteraceae*, les *Comamonadaceae* et les *Bacillaceae* sont prépondérants dans les crevettes d'eau douce. En considérant uniquement les échantillons de crevettes marines, ils identifient d'autres facteurs biologiques susceptibles d'influencer la diversité du microbiote : le mode de vie, le tissu, le stade de développement et l'état de santé. En effet, ils mettent d'abord en évidence une diversité bactérienne accrue chez les animaux sauvages comparés aux animaux de laboratoire et d'élevage. Ils montrent ensuite que la diversité bactérienne est plus grande chez les adultes comparés aux autres stades de développement, dans les intestins en comparaison des autres organes et chez les individus sains par rapport aux individus en mauvaise santé. Grâce à cette méta-analyse, Cornejo-Granados et al. (2018) parviennent ainsi, avec une analyse unique, à identifier une multitude de facteurs influençant le microbiote associé aux crevettes tout en hiérarchisant l'importance de contribution de ces facteurs.
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**FIGURE 28** – Répartition des échantillons considérés par la méta-analyse de Cornejo-Granados et al. (2018) selon A) la provenance, B) le stade de développement, C) l'état de santé, D) le tissu d'extraction et E) les différentes espèces de crevettes étudiées.</figcaption></figure>

<caption>**TABLEAU 3** – Techniques utilisées par les études considérées dans la méta-analyse de Cornejo-Granados et al. (2018).</caption>

Les méthodologies décrites sont détaillées dans le chapitre III (partie III.2.2) et en annexe (annexes 1 à 3).

<table><thead><tr><th>RÉGION HYPERVARIABLE<br>Du gène codant pour<br>l'ARNr 16S</th><th>TECHNOLOGIES DE SÉQUENÇAGE</th><th>NOMBRE<br>D'ÉTUDES</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">V1-V2</td><td>Illumina MiSeq</td><td>2</td></tr><tr><td>Roche 454</td><td>1</td></tr><tr><td>V2-V3</td><td>Ion Torrent</td><td>1</td></tr><tr><td>V1-V3</td><td>Ion Torrent</td><td>1</td></tr><tr><td rowspan="2">V3-V4</td><td>Roche 454</td><td>3</td></tr><tr><td>Illumina MiSeq</td><td>1</td></tr><tr><td>V3-V6</td><td>Roche 454</td><td>2</td></tr><tr><td>V4-V5</td><td>Illumina MiSeq</td><td>4</td></tr><tr><td>V2, V3, V4, V5, V6-V7, V8, V9</td><td>Ion Torrent</td><td>1</td></tr></tbody></table>
En 2018, Yu et al. (2018) publient également une méta-analyse portant sur le microbiote des crevettes. Ils se focalisent sur des études considérant les communautés procaryotiques larvaires mais aussi intestinales de P. vannamei juvéniles et adultes. Ils sélectionnent ainsi 5 études représentant un total de 99 échantillons (Fig. 29, Tab4). Les auteurs mettent en évidence 5 phyla bactériens majoritaires (Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Planctomycetes, Tenericutes) ayant des abondances variables selon l'état de santé des animaux. Par exemple, les Gammaproteobacteria sont enrichies dans les échantillons de crevettes en mauvaise santé alors que les Alphaproteobacteria et les Actinobacteria tendent à diminuer dans ces mêmes échantillons en comparaison des animaux en bonne santé. Yu et al. (2018) remarquent également que la diversité du microbiote est diminuée chez les individus malades par rapport aux individus sains. Néanmoins, ils précisent que les individus malades et les cohortes saines associées présentent des microbiotes plus similaires que les différents stades de développement considérés. En utilisant une méthode de modélisation prédictive (randomForest, ensemble de méthodes de classification et régression visant à construire un arbre décisionnel), les auteurs mettent en évidence 11 ordres bactériens identifiés comme des biomarqueurs universels de mauvaise santé chez les crevettes (Alteromonadales, Aeromonadales, Thiotricales, Oceanospirillales, Caulobacterales, Pseudanabaenales, Caldilineales, Chlamydiales, Cytophagales, Actinomycetales, Acidimicrobiales). Ils remarquent que l'abondance relative de ces taxa varie entre les individus en bonne et en mauvaise santé. Par exemple, les Acidimicrobiales et les Actinomycetales sont toujours en plus petite proportion chez les individus malades et inversement pour les Aeromonadales et les Alteromonadales. Cette nouvelle méta-analyse permet ainsi d'identifier pour la première fois de potentiels biomarqueurs bactériens de l'état de santé d'une espèce de crevette d'intérêt aquacole. Cependant, ces indicateurs ont été mis en évidence à partir de prélèvements intestinaux nécessitant le sacrifice des animaux, compliquant ainsi leur utilisation en routine pour contrôler l'état de santé des crevettes.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**FIGURE 29** – Répartition des échantillons considérés par la méta-analyse de Yu et al. (2018) selon A) le stade de développement et B) l'état de santé des animaux étudiés.

WFS désigne le white feces syndrome et AHPND désigne la maladie de la nécrose hépatopancréatique aigue.</figcaption></figure>
<caption>**TABLEAU 4** – Techniques utilisées par les études considérées dans la méta-analyse de Yu et al. (2018).</caption>

Les méthodologies décrites sont détaillées dans le chapitre III (partie III.2.2) et en annexe (annexes 1 à 3).

<table><thead><tr><td>RÉGION HYPERVARIABLE du gène codant pour l'ARNr 16S</td><td>TECHNOLOGIE DE SEQUENÇAGE</td><td>NOMBRE D'ETUDES</td></tr></thead><tbody><tr><td>V3-V4</td><td>Illumina MiSeq</td><td>3</td></tr><tr><td>V3-V6</td><td>Roche 454</td><td>1</td></tr><tr><td>V4</td><td>Illumina MiSeq</td><td>1</td></tr></tbody></table>

Plus récemment, en 2022, Sha et al. (2022) ont également cherché à identifier des taxa bactériens indicateurs d'un mauvais état de santé chez P. vannamei. Pour arriver à cet objectif, les auteurs rassemblent les données issues de 10 études portant sur le microbiote intestinal de cette espèce. Ils considèrent ainsi 261 échantillons (Fig. 30, Tab. 5). Les auteurs remarquent une grande variabilité des phyla dominants (Proteobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria) et attribuent ces variations à l'état de santé et au stade de développement des animaux. Ils montrent aussi que les Actinobacteria augmentent chez les crevettes en bonne santé. Ces 2 premières conclusions rejoignent les observations précédemment faites par Yu et al. (2018). En revanche, Sha et al. (2022) ne remarquent aucune variation en termes de diversité bactérienne. En sélectionnant au hasard 171 échantillons, les auteurs mettent au point un modèle prédictif. Ils identifient alors 18 taxa bactériens communs à l'ensemble des individus malades et dont l'abondance varie au sein des échantillons (Cellvibrionales, Erysipelotrichaceae, Rubritaleaceae, Propionibacteriaceae, Flavobacteriaceae, Rhizobiacea, Spongiimonas, Photobacterium, 2 Pseudoalteromonas, 2 Vibrio, Gloeobacter, Candidatus Bacilloplasma, Silicimonas, Bauldia, Fulvivirga, Actibacterium). Les auteurs concluent finalement que leur modèle est fiable à 90% en prédisant l'état de santé des 90 échantillons non considérés lors de la construction du modèle. Comme l'étude précédente, il est cependant important de noter que ces bioindicateurs ont été identifiés à partir d'échantillons intestinaux.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**FIGURE 30** – Répartition des échantillons considérés par la méta-analyse de Sha et al. (2022), selon A) le stade de développement et B) l'état de santé des animaux étudiés.</figcaption></figure>
<caption>**TABLEAU 5** – Techniques utilisées par les études considérées dans la méta-analyse de Sha et al. (2022).</caption>

Les méthodologies décrites sont détaillées dans le chapitre III (partie III.2.2) et en annexe (annexes 1 à 3).

<table><thead><tr><th>RÉGION HYPERVARIABLE du gène codant pour l'ARNr 16S</th><th>TECHNOLOGIES DE SEQUENÇAGE</th><th>NOMBRE D'ETUDES</th></tr></thead><tbody><tr><td>V1-V2</td><td>Ion Torrent</td><td>1</td></tr><tr><td>V3-V4</td><td>Illumina MiSeq</td><td>6</td></tr><tr><td>V3-V6</td><td>Roche 454</td><td>1</td></tr><tr><td rowspan="2">V4</td><td>Illumina MiSeq</td><td>1</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>1</td></tr></tbody></table>

### I.4.3- Limites des méta-analyses

Malgré l'avancement que représentent les méta-analyses dans la compréhension de la dynamique du microbiote associé à des crevettes d'intérêt aquacole, il est nécessaire d'évoquer plusieurs limites. Cornejo-Granados et al. (2018) le soulignent d'ailleurs dans leur étude. En effet, en prenant en compte l'ensemble des facteurs susceptibles d'influencer le microbiote des animaux considérés, ils mettent en évidence que les 3 premières variables impactant la structure des communautés procaryotiques ne sont pas des facteurs biologiques mais des facteurs liés à la méthode expérimentale. Le choix de la région hypervariable du gène codant pour l'ARNr 16S est ainsi le premier facteur expliquant les variabilités du microbiote suivi par le choix des amorces utilisées et de la technologie de séquençage employée (ces notions seront abordées dans le chapitre III, partie III.2 et en annexe). De plus, aucune des méta-analyses présentées ne prend en compte les biais analytiques pouvant être liés au choix du kit d'extraction des ADNs. Or, Xue et al. (2018) ont montré que cela pouvait entraîner des différences concernant les microorganismes mis en évidence au cours des analyses microbiennes en aval. Ainsi la résolution des méta-analyses pourrait être grandement augmentée en considérant des échantillons traités de la même manière et séquencés avec la même technologie. Cela permettrait de réduire les biais expérimentaux pour mieux mettre en évidence les facteurs biologiques en jeu. Dans le cas des études portant sur la recherche de bioindicateurs microbiens de l'état de santé des animaux, il semble également important d'essayer d'identifier des indicateurs autres que ceux intrinsèques à l'animal pour pouvoir développer des méthodes (outils de détection) facilement utilisables en routine.
# CHAPITRE II

## Matériels et méthodes
## II- Chapitre II – Matériels et méthodes

### II.1- Élevages larvaires réalisés dans le cadre de cette thèse et échantillonnages

Les échantillons analysés au cours de ce projet de thèse ont été récoltés lors de plusieurs campagnes de prélèvements conduites entre septembre 2018 et mai 2021 au sein de différentes écloseries du territoire (Fig. 31). Au total, 3 écloseries ont été considérées : l'écloserie basée à la Station Aquacole de Saint Vincent (SASV) à Boulouparis et 2 écloseries privées. Globalement, ces écloseries suivent le protocole d'élevage larvaire décrit dans le chapitre I (partie I.2.3.d) ; c'est-à-dire des inséminations artificielles réalisées avec des géniteurs élevés en bassins de terre puis un ensemencement des larves obtenues (180 nauplii / l) dans des bacs d'élevage remplis avec de l'eau de mer traitée et provenant du lagon. Cependant, chacune des écloseries présente des spécificités détaillées ci-dessous.

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>FIGURE 31 – Chronologie des campagnes de prélèvements des échantillons analysés au cours du projet de thèse.</figcaption></figure>
## II.1.1- Élevage larvaire à la Station Aquacole de Saint-Vincent (SASV)

### II.1.1.a- Traitement de l'eau de la baie de Saint Vincent aux bacs d'élevage larvaire

À la SASV, l'eau de mer du lagon est pompée à travers une crépine, de la baie de Saint Vincent (Boulouparis) vers une réserve primaire extérieure de 800m³ (Fig. 32A). Dans cette réserve, l'eau est décantée pendant 2 à 5 jours avant de passer par un filtre à sable et un filtre à poche de 10µm. Elle est ensuite stockée dans une réserve secondaire intérieure de 50m³. Un système de recirculation de l'eau, impliquant un écumeur et des filtres à poche de 10 et 5µm, est alors appliqué pendant 3 jours. À sa sortie de la réserve secondaire, l'eau est filtrée par un filtre à poche de 1µm avant de passer par une chambre UV (ultra-violet) et un échangeur thermique où elle est chauffée à 30°C (Fig. 32B). À J0, l'eau ainsi traitée est utilisée pour remplir des bacs d'élevage larvaire de 100l où 5g.m⁻³ d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) sont ajoutés quelques heures avant l'ensemencement des larves. Pendant toute la durée du développement larvaire, de J0 à J9, aucun renouvellement d'eau n'a lieu et un bullage central ainsi qu'une photopériode contrôlée (14h jour / 10h nuit) sont appliqués. La température de l'eau est également maintenue à 30°C (±1°C) grâce à des résistances chauffantes et un aérotherme. À partir de J3, 2ppm d'érythromycine (antibiotique) sont ponctuellement ajoutés (J5, J7, J9) dans les bacs d'élevage larvaire (Fig. 33). Ce protocole est celui classiquement utilisé à la SASV. Cependant, des élevages larvaires basés sur des protocoles différents en termes de traitement de l'eau et d'ajout d'antibiotiques ont été analysés au cours de ce projet de thèse. Concernant le traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire, des essais ont été réalisés en supprimant le processus de recirculation appliqué dans la réserve secondaire ainsi que le passage par la chambre UV. Ainsi, seuls le passage sur 5µm avant le remplissage des bacs d'élevage ainsi que le bullage central et l'ajout d'EDTA ont été conservés (Fig. 32B). Les échantillons récoltés au cours de ces élevages seront nommés « non traités » (NT) au moment de l'analyse des résultats (en opposition aux échantillons « traités » nommées T). Concernant l'usage de l'érythromycine, des essais sans ajout d'antibiotique et avec ajout d'antibiotique à J0, J3, J5, J7 et J9 ont été effectués (Fig. 33). Les échantillons concernés seront respectivement nommés « sans antibiotique » (SA) et « antibiotique J0 » (A0) en opposition à « antibiotique J3 » (A3) (Tab. 6).

<table><caption>TABLEAU 6 – Détails des élevages larvaires réalisés à la Station Aquacole de Saint Vincent et analysés au cours du projet de thèse.</caption><thead><tr><td>CAMPAGNES</td><td>ÉLEVAGES LARVAIRES</td></tr></thead><tbody><tr><td>M1 (septembre 2018)</td><td>- Eau traitée avec antibiotique à J3 (TA3)</td></tr><tr><td>M3 (novembre 2018)</td><td>- Eau traitée avec antibiotique à J0 (TA0)<br/>- Eau traitée sans antibiotique (TSA)<br/>- Eau non traitée avec antibiotique à J0 (NTAO)<br/>- Eau non traitée sans antibiotique (NTSA)</td></tr><tr><td>M4 (février 2019)</td><td>- Eau traitée avec antibiotique à J3 (TA3)<br/>- Eau traitée sans antibiotique (TSA)<br/>- Eau non traitée avec antibiotique à J0 (NTAO)<br/>- Eau non traitée avec antibiotique à J3 (NTA3)<br/>- Eau non traitée sans antibiotique (NTSA)</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_43.png" /></figure>

**FIGURE 32** – Traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire utilisé à la Station Aquacole de Saint Vincent. A) Vue aérienne de la station. B) Circuit détaillé du traitement de l'eau.
## II.1.1.b- Nourrissage des larves à la SASV

Le nourrissage des larves commence à J1 avec des microalgues congelées *Tetraselmis* sp. (Fig. 33). De J2 à J4, les larves zoé 1 et 2 sont ensuite nourries avec des microparticules de 5 à 50µm (aliment commercial sous forme de granulés) à raison de 6 fois par jour. L'alimentation algale est également maintenue et donnée 1 fois par jour au cours de cette période. De J5 à J9, les larves zoé 3 et mysis ainsi que les premières post-larves sont nourries avec des microparticules de 50 à 100µm. L'alimentation algale est alors remplacée par une supplémentation en proies vivantes (80 nauplii d'Artemia sp. / larve / jour). Pendant tout le déroulé de l'élevage larvaire, la période de nourrissage s'étend de 6h à 20h. L'alimentation étant dépendante du stade larvaire, le protocole de nourrissage présenté est ajusté selon le développement des animaux.

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**FIGURE 33** – Protocoles d'élevages larvaires réalisés à la Station Aquacole de Saint Vincent. A) Antibiotique (érythromycine) ajouté à J3, J5, J7 et J9. B) Antibiotique ajouté à J0, J3, J5, J7 et J9. C) Pas d'ajout d'antibiotique.</figcaption></figure>

Tous les protocoles utilisent la même séquence alimentaire (microparticules, microalgues *Tetraselmis* sp. et larves d'Artemia sp.) présentée en bas de la figure, mais elle peut être adaptée selon le développement larvaire.
## II.1.2- Élevage larvaire à l'écloserie privée 1

### II.1.2.a- Traitement de l'eau de la baie aux bacs d'élevage larvaire

Deux élevages larvaires consécutifs (A et B) ont été analysés lors de la campagne de prélèvements (E1) réalisée à l'écloserie privée 1. Ces élevages ont été réalisés avec une même eau d'élevage mais avec des larves issues de 2 pontes successives (lots de géniteurs différents). Chaque élevage a été conduit en triplicats.

Dans cette écloserie, l'eau de mer lagonaire est pompée et filtrée par un filtre à sable avant d'être acheminée vers une réserve primaire extérieure de 180m³. Dans cette réserve, un système de dégazage est utilisé afin d'augmenter le pH de l'eau qui est également recirculée sur un écumeur. Après 3 jours, l'eau est filtrée par une succession de filtres à poche de 25, 10, 5 et 1µm, puis est stockée dans une réserve secondaire intérieure de 150m³. Un processus de recirculation de l'eau, impliquant une chambre UV et un échangeur thermique (28°C), est alors appliqué pendant environ 2 jours. À J0, l'eau ainsi traitée est utilisée pour remplir des bacs d'élevage larvaire de 10m³ où 15g.m⁻³ d'EDTA sont ajoutés quelques heures avant l'ensemencement des larves (Fig. 34). Pendant toute la durée du développement larvaire, de J0 à J9, aucun renouvellement d'eau n'a lieu et un bullage central ainsi qu'une photopériode contrôlée (14h jour / 10h nuit) sont appliqués. Grâce à des résistances chauffantes, la température est augmentée à 30°C au moment de la transition entre les stades larvaires nauplius et zoé (entre J1 et J2) puis est maintenue constante jusqu'à la fin du développement des animaux. À partir de J4, et jusqu'à J9, de l'oxytetracycline (OTC) (antibiotique) est ajoutée quotidiennement dans tous les bacs d'élevage larvaire. Une première dose de 70ppm est utilisée à J4, puis les doses sont réduites à 17ppm les jours suivants (Fig. 35).

### II.1.2.b- Nourrissage des larves à l'écloserie privée 1

À J1, des microparticules de type CAR (aliment commercial sous forme de granulés) sont ajoutées dans les bacs. Ensuite, tout au long de l'élevage, 3 mélanges distincts de différents types de microparticules (taille et valeurs nutritionnelles) sont utilisés en fonction du stade de développement larvaire des animaux (stades zoé, transition entre les stades zoé et mysis, stades mysis et post-larve). Entre J4 et J5, au moment de la transition entre les stades larvaires zoé 2 et 3, des larves d'Artemia sp. congelées sont ajoutées à l'alimentation (Fig. 35). La nourriture est donnée toutes les 2h sur une période de nourrissage s'étendant de 4h à 22h, en alternant microparticules et larves d'Artemia sp..
<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**FIGURE 34** – Traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire utilisé à l'écloserie privée 1.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**FIGURE 35** – Protocole d'élevage larvaire appliqué à l'écloserie privée 1.
L'antibiotique, oxytétracycline (OTC), est ajouté de J4 à J9. Le protocole de nourrissage est composé de différents types de microparticules (CAR, Mix1, Mix2, Mix3) ainsi que de larves d'Artemia sp..</figcaption></figure>
## II.1.3- Élevage larvaire à l'écloserie privée 2

### II.1.3.a- Traitement de l'eau de la baie aux bacs d'élevage larvaire

Deux élevages larvaires consécutifs (A et B) ont été analysés lors de la campagne de prélèvements (E2) réalisée à l'écloserie privée 2. Ces élevages ont été réalisés avec une même eau d'élevage mais avec des larves issues de 2 pontes successives (lots de géniteurs différents), comme pour l'écloserie 1. Chaque élevage a été conduit en triplicats.

Dans l'écloserie privée 2, l'eau de mer lagonaire pompée est directement acheminée vers une réserve primaire extérieure de 140m³. L'eau y est décantée pendant 3 jours avant d'être filtrée par un filtre à sable et stockée dans une réserve secondaire intérieure de 120m³. Un système de recirculation de l'eau, impliquant un filtre à poche de 5µm, une chambre UV, un écumeur et un filtre à charbon actif, est alors appliqué pendant 3 à 4 jours. À sa sortie de la réserve secondaire, l'eau est chauffée à 29°C par un échangeur thermique (Fig. 36). À J0, des bacs d'élevage larvaire de 10m³ sont remplis avec 7m³ d'eau ainsi traitée et 10g.m⁻³ d'EDTA sont ajoutés quelques heures avant l'ensemencement larvaire. Contrairement aux écloseries précédentes, un complément d'eau de 3m³ est effectué à J3. Ce complément nécessite un nouvel ajout d'EDTA à 10g.m⁻³. Pendant toute la durée du développement larvaire, de J0 à J9, un bullage central ainsi qu'une photopériode contrôlée (14h jour / 10h nuit) sont appliqués. La température est également maintenue constante grâce à des résistances chauffantes. À partir de J3, et jusqu'à J9, de l'oxytétracycline (OTC) (antibiotique) est ajoutée quotidiennement dans tous les bacs d'élevage larvaire. Une première dose de 75ppm est utilisée à J3, puis les doses sont réduites à 13,5ppm les jours suivants (Fig. 37).

### II.1.3.b- Nourrissage des larves à l'écloserie privée 2

Les larves aux stades zoé 1 et 2 (de J1 à J4) sont nourries avec des microparticules CAR (identiques à celles de l'écloserie 1) ainsi qu'avec des microalgues *Tetraselmis* sp. fraîches. Comme pour l'écloserie privée 1, différents mélanges de différents types de microparticules (taille et valeurs nutritionnelles) sont utilisés au cours de l'élevage en fonction du stade de développement des larves. Un premier mix est ainsi utilisé pour nourrir les larves de la fin du stade zoé jusqu'au stade mysis 2. Un second mix est ensuite donné aux larves jusqu'à la fin de l'élevage. Au moment de la transition zoé / mysis, des larves d'Artemia sp. congelées remplacent l'alimentation algale (Fig. 37). Comme pour l'écloserie 1, la nourriture est donnée toutes les 2h sur une période de nourrissage s'étendant de 5h à 23h, en alternant microparticules et microalgues fraîches ou larves d'Artemia sp. congelées.
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**FIGURE 36** – Traitement de l'eau de remplissage des bacs d'élevage larvaire utilisé à l'écloserie privée 2.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**FIGURE 37** – Protocole d'élevage larvaire appliqué à l'écloserie privée 2.</figcaption></figure>

À la différence de l'écloserie de la Station Aquacole de Saint Vincent et de l'écloserie privée 1, 3 m³ d'eau sont ajoutés à J3 (goutte bleue sur le schéma). L'antibiotique, oxytetracycline (OTC), est ajouté de J3 à J9. Le protocole de nourrissage est composé de différents types de microparticules (CAR, Mix1, Mix2) ainsi que de microalgues, *Tetraselmis* sp., et de larves d'Artemia sp..
## II.2- Échantillonnages

Comme évoqué précédemment, les échantillons issus de plusieurs campagnes de prélèvements ont été analysés au cours de ce projet de thèse (Fig. 31, partie II.1). Les campagnes M1, M3 et M4 ont concerné des élevages larvaires réalisés à la SASV (Tab. 6, partie II.1.1.a) alors que les campagnes E1 et E2 ont été réalisées dans des élevages larvaires de 2 écloseries privées du territoire. En mai 2021, une campagne d'échantillonnage des géniteurs a également été mise en place à la SASV dans l'objectif de récolter des échantillons d'organes reproducteurs de géniteurs mâles et femelles ainsi que des œufs et des nauplii obtenus par fécondation biparentale de ces géniteurs. Dans cette partie, nous allons détailler les protocoles d'échantillonnage appliqués dans l'ensemble des élevages larvaires ainsi que ceux utilisés au cours de l'échantillonnage des géniteurs.

### II.2.1- Échantillonnages en élevage larvaire

#### II.2.1.a- Échantillons d'eau

Pour chaque écloserie considérée, des échantillons d'eau de mer lagonaire, d'eau de réserve primaire et d'eau de réserve secondaire ont été prélevés. Ces échantillonnages ont été effectués en amont des élevages, avant et après chaque traitement, en utilisant des pots de prélèvement en polyéthylène opaque de 2l préalablement acidifiés (acide chlorhydrique, HCl 10%) et rincés à l'eau ultra-pure. Ensuite, au cours de l'ensemble des élevages larvaires considérés, 1l d'eau sans larve a été quotidiennement prélevé dans chaque bac avant nourrissage en utilisant des pots de prélèvement (identiques à ceux ci-dessus) et des casques désinfectés avec une maille de 200µm permettant de ne pas prélever de larves (Fig. 38). Pour chaque campagne d'échantillonnage, un bac contrôle équipé d'un bullage central et contenant la même eau que les bacs d'élevage mais sans larves ni nourriture, a été considéré et échantillonné de la même manière que les bacs d'élevage larvaire. Tous les échantillons d'eau récoltés ont été filtrés sur 0,22µm (S-PAK membrane filters, Milipore) en utilisant des unités de filtration montées sur des bouteilles en verre de 1,5l préalablement autoclavées (20min, 121°C) et calcinées (6h, 450°C) (Fig. 39). Les filtres obtenus ont été conservés à -80°C dans des tubes DNase / RNase free de 2ml jusqu'aux analyses de biologie moléculaire. De l'eau filtrée a aussi été sous-échantillonnée dans des flacons stériles en polyéthylène de 40ml conservés à -20°C jusqu'aux dosages de sels nutritifs (SRP - Soluble Reactive Phosphorus, phosphates et TAN - Total Ammonia Nitrogen, ammonium). Des flacons en verre de 50ml préalablement acidifiés (HCl 10%), rincés à l'eau ultra-pure et calcinés (6h, 450°C), ont également été remplis avec le filtrat et conservés à 4°C jusqu'aux analyses de matière organique dissoute colorée (CDOM) qui ont été effectuées au plus tard dans la semaine suivant les prélèvements.
<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**FIGURE 38** – Casque de prélèvement de l'eau.
Un casque est muni d'une maille de 200µm permettant de prélever de l'eau sans prélever des larves.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**FIGURE 39** – Poste de filtration des échantillons d'eau.</figcaption></figure>

## II.2.1.b- Échantillons de larves

En amont de chaque élevage, le jour précédant l'ensemencement des larves dans les bacs (J-1), des échantillonnages d'œufs ont été effectués en sélectionnant au hasard plusieurs pondoirs. Ensuite, de J0 à J9, des prélèvements quotidiens de larves ont été réalisés dans chaque bac considéré. L'ensemble de ces prélèvements ont été réalisés selon le protocole suivant : environ 500 œufs ou une centaine de larves contenus dans 1l d'eau ont été concentrés sur une maille de 120µm, préalablement désinfectée, puis récoltés grâce à des pinces ou spatules stériles. Tous les échantillons prélevés ont été conservés à -80°C dans des tubes DNase / RNase free de 2ml jusqu'aux analyses de biologie moléculaire.

### II.2.1.c- Échantillons de nourriture

Toutes les sources de nourriture de l'ensemble des élevages larvaires considérés ont été prélevées au moment de leur premier ajout dans la séquence alimentaire en utilisant des pinces ou spatules stériles. Les échantillons ont été collectés dans des tubes DNase / RNase free de 2ml et conservés à -80°C jusqu'aux analyses de biologie moléculaire.
## II.2.2- Échantillonnages des géniteurs

En mai 2021, une campagne d'échantillonnages des géniteurs a été réalisée à la SASV dans le but d'étudier de potentiels phénomènes de transmission verticale des communautés procaryotiques. Pour cela, 3 familles biparentales ont été considérées en inséminant artificiellement 3 femelles avec 3 mâles. Le jour des fécondations, des pondoirs de 100l ont été remplis avec de l'eau de mer traitée selon le protocole de la SASV (II.1.1.a). Cette eau a été échantillonnée comme décrit précédemment (II.2.1.a). Après les inséminations artificielles, les femelles ont été individuellement placées à l'obscurité dans les pondoirs et les mâles ont été sacrifiés dans bain de glace puis disséqués afin de récupérer leurs organes reproducteurs. Après la ponte, les femelles ont également été sacrifiées dans un bain de glace puis disséquées. Toutes les dissections ont été réalisées avec du matériel stérile et les organes prélevés ont été rincés à l'eau de mer stérile. En parallèle, une centaine d'œufs a été prélevée dans chaque pondoir. Le jour suivant, après éclosion, une centaine de nauplii a également été récoltée pour chaque famille biparentale considérée (Fig. 40). Les échantillonnages d'œufs et de larves ont été effectués selon le protocole détaillé dans la partie précédente (II.2.1.b). L'ensemble des échantillons obtenus ont été conservés à -80°C dans des tubes DNase / RNase free de 2ml jusqu'aux analyses de biologie moléculaire.

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>FIGURE 40 – Protocole d'échantillonnage employé lors de la campagne géniteurs en mai 2021 à la Station Aquacole de Saint Vincent.</figcaption></figure>
## II.3- Paramètres zootechniques

### II.3.1- Taux de survie larvaire

Les taux de survie larvaire ont été quotidiennement déterminés grâce à des comptages volumétriques (moyenne de 3 comptages par bac d'élevage larvaire). Ils ont ensuite été calculés en utilisant la relation suivante :

$$ \frac{n}{N} \times 100 $$

avec n la moyenne des 3 comptages volumétriques effectués au jour d'élevage considéré et N le nombre de larves ensemencées dans le bac considéré à J0 (~ 180 larves / litre).

### II.3.2- Indice de croissance

Des observations quotidiennes sous loupe binoculaire ont également permis de calculer l'indice de croissance larvaire pour chaque bac d'élevage considéré en utilisant la relation modifiée de Maddox & Manzi (1976) :

$$ \frac{0 \times \text{Nii} + 1 \times \text{Z1} + 2 \times \text{Z2} + 3 \times \text{Z3} + 4 \times \text{M1} + 5 \times \text{M2} + 6 \times \text{M3} + 7 \times \text{PL}}{n} $$

avec Nii, Z1, Z2, Z3, M1, M2, M3 et PL, le nombre de larves observées aux stades nauplii, zoé 1, zoé 2, zoé 3, mysis 1, mysis 2, mysis 3 et post-larve, et n le nombre total de larves observées.

## II.4- Paramètres de qualité physico-chimique de l'eau

### II.4.1- Température, pH et salinité

Pour chaque échantillon d'eau prélevé dans les écloseries privées, les données de température, pH et salinité ont quotidiennement été mesurées en utilisant une sonde multiparamètre pH/Cond 3320 (Mettler Toledo).

### II.4.2- Paramètres de matière organique dissoute colorée (CDOM)

Les paramètres CDOM ont été mesurés dans une cuve en quartz de 10cm avec un spectrophotomètre (Shimadzu© UV-1800) connecté au logiciel UV Probe (v2.61). Une lecture spectrale s'étendant de 200 à 700nm avec un pas de 1nm a été faite après avoir effectué un auto-zéro avec de l'eau ultra-pure. Au total, quatre paramètres CDOM ont été considérés :

- les coefficients d'absorption

- les pentes spectrales S<sub>275-295</sub> et S<sub>350-400</sub>

- le ratio des pentes spectrales (Slope Ratio, SR)

- le coefficient d'absorption à 325nm.

En premier lieu, les coefficients d'absorption ont été calculés de la manière suivante :

$$ a\lambda = \frac{2,303 \times A\lambda}{L} $$

avec 2,303 le facteur de transformation des logarithmes décimaux en logarithmes népériens, Aλ l'absorbance mesurée à la longueur d'onde λ (de 200 à 700nm) et L la longueur du trajet optique (10cm).
Ensuite, les pentes des courbes d'évolution de ces coefficients d'absorption de 275 à 295nm ($S_{275-295}$) et de 350 à 400nm ($S_{350-400}$) ont été déterminées. Le ratio entre ces 2 pentes, correspondant au ratio entre les molécules de petits et de hauts poids moléculaires, a ainsi été calculé :

$$SR = \frac{S_{275-295}}{S_{350-400}}$$

Enfin, le coefficient d'absorption à 325nm a également été déterminé car il est considéré comme un indicateur de la concentration relative en CDOM (Sadeghi-Nassaj et al. 2018).

## II.4.3- Dosage des sels nutritifs

Deux types de dosages des sels nutritifs ont été réalisés à partir des échantillons d'eau prélevés : TAN (total ammonium nitrogen, NH₃-N et NH₄⁺) et SRP (soluble reactive phosphorus, PO₄³⁻, HPO₄²⁻ et H₂PO₄⁻). Pour effectuer ces analyses, les échantillons ont été décongelés à température ambiante et des flacons en verre de 50ml préalablement acidifiés (HCl 10%), rincés à l'eau ultra-pure et mis à sécher à l'air libre ont été utilisés. Pour chaque dosage, une gamme étalon de concentration connue a été réalisée en amont des analyses (gammes allant de 0 à 40µM de NH₄⁺ pour les dosages TAN et de 0 à 10µM de PO₄³⁻ pour les dosages SRP).

### II.4.3.a- Dosage des TAN (Total Ammonium Nitrogen, NH₃-N et NH₄⁺)

Les dosages TAN ont été effectués selon la méthode fluorimétrique de Holmes et al. (Holmes et al. 1999) après préparation du réactif (Tab. 7). Après ajout de 10ml de ce réactif à 40ml de chaque échantillon, la réaction a été incubée à l'obscurité pendant 6h à température ambiante. Après lecture au spectrofluoromètre (Shimadzu©, RF-6000) avec une cuve en méthacrylate de 1cm (longueur d'onde d'excitation = 365nm, longueur d'onde d'émission = 425nm), les concentrations en ammonium ont été calculées avec la relation suivante :

$$[\text{TAN}] = \frac{A}{a}$$

avec A la valeur d'absorbance de l'échantillon après soustraction de la valeur d'absorbance du blanc de réaction (réactif ajouté à de l'eau de mer artificielle NaCl à 600mM, NaHCO₃ à 2,4mM, eau ultra-pure) et a la pente de la gamme étalon.

### II.4.3.b- Dosage des SRP (Soluble Reactive Phosphorus, PO₄³⁻, HPO₄²⁻ et H₂PO₄⁻)

Les dosages SRP ont été effectués d'après la méthode colorimétrique d'Aminot & Kérouel (2004) selon Murphy & Riley (1962). Après préparation des 2 réactifs d'intérêt (Tab. 7), 2ml de chacun de ces réactifs ont successivement été ajoutés à 40ml de chaque échantillon, et la réaction a eu lieu à l'obscurité pendant 7min. Après lecture au spectrophotomètre UV (Shimadzu© UV-1800) avec une cuve en verre de 10cm, les concentrations en phosphate ont été calculées avec la relation suivante :

$$[\text{SRP}] = \frac{A}{a}$$
avec A la valeur d'absorbance de l'échantillon après soustraction de la valeur d'absorbance du blanc de réaction (réactifs ajoutés à de l'eau de mer artificielle NaCl à 600mM, NaHCO₃ à 2,4mM) et a la pente de la gamme étalon.

<table><caption>**TABLEAU 7 – Composition des réactifs des dosages TAN (Total Ammonium Nitrogen) et SRP (Soluble Reactive Phosphorus).**</caption><tr><td>RÉACTIF TAN</td><td>- Borax 3,90.103mM<br/>- Sulfite de sodium 3,11.10<sup>1</sup>mM<br/>- Orthophtalaldéhyde 1,46.10<sup>2</sup>mM</td></tr><tr><td>RÉACTIF SRP 1</td><td>- Acide ascorbique 2,84.10<sup>2</sup>mM<br/>- Acide sulfurique 2,9.10<sup>-3</sup>mM</td></tr><tr><td>RÉACTIF SRP 2</td><td>- Heptamolybdate d'ammonium tétrahydraté 2,10.10<sup>1</sup>mM<br/>- Oxytartrate d'antimoine de potassium 0,18.10<sup>1</sup>mM<br/>- Acide sulfurique 2,9.10<sup>-3</sup>mM</td></tr></table>

## II.5- Méthodes de biologie moléculaire et évaluation de la diversité microbienne active

### II.5.1- Extractions ARNs, rétrotranscriptions ADNc et séquençage

Les extractions d'ARNs ont été réalisées en utilisant le RNeasy PowerWater kit (Qiagen) pour les échantillons d'eau et le RNeasy minikit (Qiagen) pour les autres échantillons (œufs, larves et nourriture). Les ARNs ainsi extraits ont ensuite été rétro-transcrits en ADNc (ADN complémentaire) en ajoutant 200ng d'ARNs à un réactif (tampon 5X, dNTP 10mM, random hexamers 50µM, « reverse »-transcriptase M-MLV (PROMEGA) 200µl⁻¹, eau RNase / DNase free). La réaction de rétro-transcription a été réalisée dans un thermocycleur pendant 10 minutes à 25°C, 2h à 42°C et 5min à 85°C. Pour les campagnes de prélèvements réalisées avant mars 2020, les ADNc ainsi obtenus ont été envoyés pour séquençage. Cependant, en raison de la crise sanitaire de la COVID-19, les temps d'envoi des échantillons au séquenceur ont été allongés (plus de 3 semaines). En conséquence, pour les échantillons récoltés après mars 2020, une seconde étape de rétro-transcription utilisant le Second Strand cDNA Synthesis kit (ThermoFisher) a été ajoutée afin d'obtenir des ADNc double brin plus stables. Quelle que soit la méthode utilisée précédemment, les échantillons ont été envoyés à la plateforme de séquençage MrDNA (Shallowater, TX, USA) dans l'objectif d'amplifier et de séquencer la région V4 du gène codant pour l'ARNr 16S en utilisant les amorces 515F/806R (Caporaso et al. 2011). Au total, 3 séquençages Illumina HiSeq 2x150pb « paired-end » ont été réalisés en :

- février 2019 : campagnes M1 et M3 (profondeur de séquençage = 20k)

- novembre 2019 : campagnes M3 et M4 (profondeur de séquençage = 50k)

- juillet 2021 : campagnes écloseries privées et géniteurs (profondeur de séquençage = 50k, la notion de profondeur de séquençage sera abordée dans le chapitre III, partie III.4.1).
## II.5.2- Traitement des données de séquençage

À l'heure actuelle, de nombreux outils permettent de traiter les données de séquençage dans l'objectif de déterminer la diversité microbienne associée aux échantillons. La première étape de ce projet de thèse a donc été de choisir l'outil le plus adapté. Ce travail sera présenté dans le chapitre III de ce manuscrit. Cependant, dans cette partie, nous allons brièvement détailler la méthode sélectionnée pour analyser l'ensemble des données de séquençage récoltées.

Les séquences obtenues ont d'abord été démultiplexées en utilisant l'outil fastqSplitter disponible sur le site internet de la plateforme de séquençage MrDNA (https://www.mrdnalab.com/mrdnafreesoftware/fastq-splitter.html). Le package DADA2 (Callahan et al. 2016) implémenté dans le logiciel RStudio (RStudio Team, 2020) a ensuite été utilisé. Les séquences démultiplexées ont été filtrées en utilisant la fonction « filterAndTrim » avec une erreur attendue fixée à 2. Un modèle d'erreur a ensuite été établi à partir de ces séquences avec la fonction « learnErrors ». La fonction « dada » a permis l'inférence des ASVs (Amplicon Sequence Variants définis dans le chapitre III, partie III.3.3.a). Une étape de suppression des chimères basée sur la méthode « consensus » a été réalisée en utilisant la fonction « removeBimeraDenovo ». La taxonomie des séquences finales a été assignée grâce à la fonction « assignTaxonomy » et la base de données SILVA 138 (Quast et al. 2013). Enfin, les données obtenues ont été normalisées avec la méthode CPM (Count Per Million définie dans le chapitre III, partie III.4.2.b) en utilisant la fonction « normalize » du package phyloseq (McMurdie & Holmes 2013) dans RStudio. L'ensemble de ces étapes seront détaillées dans le chapitre III (parties III.3.2 et III.4.2.b).

## II.5.3- Analyses de la diversité microbienne

Les indices de diversité ont été calculés en utilisant la fonction « plot_richness » implémentée dans le package phyloseq (McMurdie & Holmes 2013) sous RStudio. Au total, 4 indices de diversité ont été considérés : Chao1, ACE (Abundance-based Coverage Estimator), Shannon et inverse Simpson (Tab. 8).

En utilisant la méthode de Ward, le package vegan (Oksanen et al. 2020) a permis la construction de dendrogrammes à partir de matrices de distance de Bray-Curtis. Les analyses en coordonnées principales (PCoA) ont été réalisées avec les fonctions « ordinate » et « plot_ordination » du package phyloseq. Les analyses discriminantes (LDA) avec effet de taille (LEFSe : Linear discriminant analysis with Effect Size) et les corrélogrammes ont été construits en utilisant respectivement le package microbiomeMarker (Cao, 2020) et le package microeco (Liu et al. 2021). L'outil proposé par le site internet jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html) a permis de mettre au point les diagrammes de Venn. Enfin, des tests statistiques non-paramétriques de Kruskal-Wallis et des tests post-hoc de Wilcoxon ont été effectués en utilisant le package rstatix. Les différences ont été considérées comme significatives lorsque la *p*-value était inférieure à 0,05.
<caption>TABLEAU 8 – Présentation des indices de diversité utilisés au cours de cette thèse (Traduit de Kim et al. 2017).</caption>

Les termes ASVs (Amplicon Sequence Variants) et OTUs (Operationnal Taxonomic Units) sont détaillés dans le chapitre III (partie III.3.3.a).

<table><thead><tr><th>INDICES DE DIVERSITÉ</th><th>DESCRIPTION</th><th>CALCUL</th><th>RÉFÉRENCE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Chao1</td><td>Estimation de la richesse (nombre d'ASVs ou d'OTUs présents dans un échantillon)</td><td>S<sub>Chao1</sub> = S<sub>obs</sub> + <sup>F<sub>1</sub>(F<sub>1</sub> - 1)</sup>/<sub>2(F<sub>2</sub> + 1)</sub></td><td>Chao 1984</td></tr><tr><td>ACE (Abundance-based Coverage Estimator)</td><td>Estimation de la richesse</td><td>S<sub>ACE</sub> = S<sub>abund</sub> + <sup>S<sub>rare</sub></sup>/<sub>C<sub>ACE</sub></sub> + <sup>F<sub>A</sub></sup>/<sub>C<sub>ACE</sub></sub>V<sub>ACE</sub><sup>2</sup></td><td>Chao &amp; Lee 1992<br>Chao &amp; Yang 1993</td></tr><tr><td>Shannon</td><td>Estimation de la richesse et de l'équitabilité (uniformité des ASVs ou des OTUs au sein d'une communauté)</td><td>H = &sum;<sub>i=1</sub><sup>S</sup> (p<sub>i</sub> ln p<sub>i</sub>)<br>S : nombre d'ASVs ou d'OTUs<br>p<sub>i</sub> : abondance relative de l'ASV ou de l'OTU i dans un échantillon</td><td>Lemos et al. 2011<br>Magurran 2004</td></tr><tr><td>Inverse Simpson</td><td>Estimation de la richesse et de l'équitabilité</td><td>D = <sup>1</sup>/<sub>&sum;<sub>i=1</sub><sup>S</sup> p<sub>i</sub><sup>2</sup></sub></td><td>Simpson 1949<br>Lemos et al. 2011</td></tr></tbody></table>

## II.6- Méta-analyse

Pour chaque condition d'élevage considérée, une table d'ASVs a été construite en utilisant le package DADA2 (Callahan et al. 2016) selon le protocole décrit précédemment (chap. II, partie II.5.2). Toutes les tables obtenues ont été fusionnées avec la fonction merge sous Rstudio (RStudio Team, 2020), en considérant les ASVs spécifiques et communs à chaque table. Dans l'objectif de regrouper des séquences génétiquement et écologiquement similaires, la table globale produite a été traitée avec l'outil dbOTU3, disponible sous qiime (Olesen et al. 2017). Les séquences finalement obtenues ont été taxonomiquement assignées en utilisant la base de données SILVA 138 spécifique de la région V4 (Quast et al. 2013). Un arbre phylogénétique a été construit avec qiime en utilisant la méthode fasttree (Price et al. 2009). Une table d'ASVs finale contenant 14819 ASVs et 833 échantillons (eau d'élevage, larves, eau contrôle, œufs, eau de réserve, eau de remplissage provenant du lagon, nourriture) a ainsi été produite.

Dans un premier temps, seules les données d'élevage (eau d'élevage et larves de J0 à J9) ont été considérées. Après normalisation par la méthode DESeq2 (Anders & Huber 2010) ou par la méthode CPM (chap. III, parties III.4.2.b), des NMDS (non-metric dimensional scaling) basées sur différentes matrices de distances (Bray-Curtis, Jaccard, UniFrac et weighted UniFrac) (Fig. 41) ont été construites avec les fonctions « ordinate » et « plot_ordination » du package phyloseq (McMurdie & Holmes 2013). Les cores microbiens basés sur la présence / absence des ASVs et associés à l'ensemble des échantillons d'eau d'élevage ou de larves ont été mis en évidence puis comparés par un diagramme de Venn construit avec l'outil jvenn (http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html). Les ASVs différentiellement abondants par stade larvaire en fonction de l'état de santé des élevages
ont ensuite été mis en évidence à l'aide de l'outil ANCOM-BC (Mandal et al. 2015; Lin & Peddada 2020) disponible dans le package ANCOMBC sous RStudio. Des graphiques construits avec le package UpSetR (Conway et al. 2017) ont ensuite permis de mettre en évidence des ASVs partagés ou spécifiques entre les larves en bonne ou en mauvaise santé et les eaux d'élevage hébergeant ces larves en bonne ou mauvaise santé. Les abondances relatives des ASVs mis en évidence par les graphiques UpSetR ont été calculées en utilisant le package microbiomeutilities (Lahti & Shetty 2020).

Dans un second temps, grâce à des heatmaps construites avec le package ggplot2 (Wickham, 2016), un suivi de l'ensemble des ASVs mis en évidence a été effectué en considérant les intrants (eau de remplissage provenant du lagon, eau de réserve, œufs, microalgues, microparticules et larves d'Artemia sp.) de tous les élevages.

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>**FIGURE 41** – Méthodes de calcul des distances de Bray-Curtis, Jaccard, weighted UniFrac et UniFrac entre les échantillons A et B (Éch A et Éch B). Les distances de Bray-Curtis et weighted UniFrac se basent sur A) l'abondance des ASVs (Amplicon Sequence Variant, notion détaillée dans le chapitre III, partie III.3.3.a) (ou des OTUs, Operationnal Taxonomic Unit, notion détaillée dans le chapitre III, partie III.3.3.a). Les distances de Jaccard et UniFrac se basent sur la B) présence/absence des ASVs (ou des OTUs). Les distances weighted UniFrac et UniFrac se basent également sur C) l'arbre phylogénétique associé aux ASVs (ou aux OTUs).</figcaption></figure>

La distance weighted UniFrac utilise le poids des branches. Toutes les branches spécifiques (ASV ou OTU uniquement identifié dans un échantillon) ont un poids égal à 1. Lorsque les branches sont partagées (ASVs ou OTUs identifiés dans les 2 échantillons), le poids est calculé selon l'abondance spécifique des ASVs (ou des OTUs) et leur abondance totale. Pour toutes les distances, plus la valeur calculée est faible, plus les compositions microbiennes des échantillons associés sont proches. Les méthodes basées sur l'abondance des ASVs (ou OTUs) (Bray-Curtis et weighted UniFrac) sont sensibles à la méthode de normalisation choisie. Les méthodes basées sur la présence / absence des ASVs (ou OTUs) (Jaccard et UniFrac) mènent souvent à des interprétations biologiques similaires.
# CHAPITRE III

De l'échantillon aux analyses de diversité : choix d'une méthode optimale
### III- Chapitre III – De l'échantillon aux analyses de diversité : choix d'une méthode optimale

La première partie de ce travail de thèse a consisté à choisir une méthode d'analyse permettant de passer des échantillons récoltés aux analyses de diversité microbienne qui seront présentées dans les chapitres IV à VII. En effet, l'essor technologique et bioinformatique de ces dernières années a conduit à une multiplication des outils disponibles concernant, non seulement, les méthodes d'extraction d'ADN et d'ARN, mais aussi de séquençage de ces acides nucléiques. Diverses méthodes d'analyse et de normalisation des données de séquençage ont également vu le jour. Un premier travail de recherche a donc consisté à comprendre les méthodes à disposition pour choisir la démarche la plus optimale. Dans ce chapitre, nous expliquerons ainsi le choix d'étudier les communautés procaryotiques actives, puis nous aborderons un bref historique des méthodes de séquençage qui ont mené à l'essor du métabarcoding. La technologie de séquençage Illumina, utilisée au cours de ce projet de thèse, sera également détaillée. Enfin, nous présenterons les principales méthodes disponibles pour analyser les résultats de séquençage, mais aussi pour normaliser les données finalement obtenues. À chaque étape, les choix faits au cours de cette thèse seront présentés.

#### III.1- ARN et ADNc pour étudier les communautés microbiennes actives

Au cours de cette thèse, les ARNs totaux de l'ensemble des échantillons ont été extraits puis rétro-transcrits en ADNc dans l'objectif d'étudier les communautés procaryotiques actives. En effet, en conséquence de sa courte durée de vie, l'ARN est considéré comme un meilleur outil pour détecter les populations microbiennes récentes ou pour mettre en évidence des assemblages de microorganismes vivants (Cristescu 2019). Pour ces raisons, l'analyse des procaryotes actifs a été recommandée dans le cadre d'expérimentations consacrées à la surveillance biologique des communautés microbiennes (Yates et al. 2021). Il existe différents types d'ARNs impliqués dans la synthèse et la régulation protéiques : l'ARN messager (ARNm), l'ARN de transfert (ARNt) et l'ARN ribosomique (ARNr). L'ARNm est transcrit à partir de l'ADN puis traduit en protéines sous l'action des ARNm et des ARNr. Chez les procaryotes, il existe d'autres ARNs non codant et impliqués dans la régulation de l'expression protéique, appelés small RNA (sRNA) (Brosnan & Voinnet 2009).

#### III.2- Le séquençage

Dans son sens littéral, le séquençage consiste à déterminer l'ordre linéaire des composants d'une macromolécule. Il englobe ainsi aussi bien la détermination de l'ordre des acides aminés au sein d'une protéine que des nucléotides d'un acide nucléique.

##### III.2.1- Historique du séquençage

Les prémices du séquençage des acides nucléiques ont débuté en 1965 avec Robert Holley qui parvient à déterminer la séquence de l'ARNt<sup>Ala</sup> (alanine) d'une souche de levure en utilisant une combinaison d'enzymes et de ribonucléases. En 1972, grâce à une succession de réactions enzymatiques couplées à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide, Walter
Fiers isole chaque nucléotide d'un gène et déduit ainsi sa séquence. Le tournant majeur du séquençage a lieu en 1977 lorsque Frederick Sanger propose une nouvelle méthode basée sur le radiomarquage de nucléotides modifiés (Fig. 42 et Annexe 1). Sa méthode est ensuite améliorée et automatisée par Leroy Hood et Michael Hunkapiller qui utilisent des désoxyribonucléotides fluoromarqués pour permettre une analyse informatique du signal lumineux (Annexe 1). En 1996, une nouvelle méthode de séquençage appelée pyroséquençage est développée en se basant sur l'émission de pyrophosphate lors de la synthèse d'un brin d'ADN (Annexe 2). Elle sera automatisée en 2005 par le système Roche-454 et permet alors le séquençage simultané de plusieurs molécules d'ADN. Cette étape clé marque ainsi le début du séquençage haut débit (ou NGS pour Next Generation Sequencing) et de la 2ème génération de séquençage (Fig. 42 et Tab. 9). Cette dernière comprend aussi les séquençages Illumina et IonTorrent (Annexe 3) qui ont respectivement vu le jour en 2007 et 2010. Depuis 2010, de nouvelles technologies de séquençage haut débit dites de 3ème génération ont été développées (PacBio ou Nanopore par exemple). La 2ème génération de séquençage englobe les technologies nécessitant une étape d'amplification des molécules d'ADN par PCR (Polymerase Chain Reaction). Elle s'oppose à la 3ème génération qui comprend les technologies permettant le séquençage d'une seule molécule d'ADN (Desai & Jere 2012). Dans le cadre de cette thèse, nous ne détaillerons que l'une des technologies de séquençage de 2ème génération, le séquençage Illumina que nous avons utilisé.

## III.2.2- Le séquençage Illumina

Le séquençage Illumina est un processus de séquençage par synthèse qui consiste tout d'abord à liguer des adaptateurs à chaque extrémité de la séquence nucléotidique d'intérêt. Ces adaptateurs sont complémentaires d'oligonucléotides fixés sur une « flowcell » et permettent ainsi l'hybridation de la molécule d'intérêt sur cette dernière. Après hybridation, le brin complémentaire de la séquence d'intérêt est synthétisé et les séquences non fixées sur la flowcell sont lavées. Les brins d'ADN sont ensuite amplifiés par une succession d'amplifications par pont conduisant à la formation de clusters de séquence nucléotidiques identiques sur la flowcell. Les brins anti-sens («reverse») sont alors clivés et éliminés. Le brin sens («forward») est séquencé par l'ajout de dNTP fluoromarqués dont le signal lumineux est enregistré à chaque incorporation. Une fois le brin sens séquencé, les brins non fixés à la flowcell sont éliminés et une nouvelle amplification par pont a lieu. Les brins sens sont clivés et lavés afin de permettre le séquençage du brin anti-sens (Fig. 43). Plusieurs séquençages Illumina HiSeq (2x150pb) (Tab. 9) ont été réalisés pour analyser les données récoltées dans le cadre de ce projet.
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>FIGURE 42 – Historique du séquençage.</figcaption></figure>

<table><caption>TABLEAU 9 – Comparaison des technologies de séquençage de 2ème génération.
Les technologies Roche-454 et IonTorrent sont détaillées en annexe.</caption><thead><tr><td></td><td>Longueur des séquences (pb)</td><td>Nombre maximum de séquences / séquençage</td><td>Nombre maximum d'échantillons / séquençage</td><td>Temps</td></tr></thead><tbody><tr><td>Roche-454</td><td>700 à 800</td><td>1M</td><td>384</td><td>24h</td></tr><tr><td>IonTorrent</td><td>200 à 400</td><td>400 000 à 5,5M</td><td>96</td><td>2 à 7h</td></tr><tr><td>Illumina MiSeq</td><td>250 à 600 (2 x 250 ou 2 x 300)</td><td>25M</td><td>384</td><td>4 à 55h</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>50 à 500 (2 x 50 à 2 x 250)</td><td>3.10<sup>9</sup></td><td>384</td><td>29h à 11j</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>FIGURE 43 – Séquençage Illumina.</figcaption></figure>
## III.2.3- Le métabarcoding

Le développement du séquençage haut débit a permis l'essor des méthodes « omics » mentionnées en introduction (chapitre I, partie I.3.1.a). La capacité des technologies de 2ème génération à séquencer simultanément différentes séquences d'intérêt a particulièrement contribué au développement du métabarcoding qui a été utilisé au cours de cette thèse. Le métabarcoding est un descendant direct du barcoding qui consiste en l'identification taxonomique d'un organisme à partir d'une séquence d'ADN hautement conservée et séquencée. Dans le cas du métabarcoding, l'identification se fait à l'échelle d'une communauté entière et nécessite de choisir un gène marqueur à amplifier et séquencer. Ce dernier consiste en une séquence d'ADN suffisamment variable pour distinguer taxonomiquement les organismes entre eux mais aussi suffisamment ubiquitaire et conservée pour permettre son amplification fiable et universelle. Idéalement, cette séquence doit également ne pas subir de transferts horizontaux et être présente en simple copie dans le génome des organismes. Dans le cas d'études de populations procaryotiques, comme celle réalisée au cours de cette thèse, le gène codant pour la petite sous-unité du ribosome, l'ARNr 16S, est massivement utilisé. Ce gène, d'une longueur totale d'environ 1500 pb, possède 9 régions variables et 10 régions conservées d'une longueur variant de 30 à plus de 100 pb. Les régions conservées permettent la mise au point de couples d'amorces universels de référence et encadrent les régions variables qui sont ainsi amplifiées pour permettre de distinguer les procaryotes entre eux (Fig. 44). Le gène codant pour l'ARNr 16S est également ubiquitaire et peu soumis aux transferts horizontaux. Son principal inconvénient est qu'il est présent en multi copies (1 à 15 copies) dans le génome et ne permet donc qu'une estimation approximative de l'abondance relative des communautés présentes au sein des échantillons (Kembel et al. 2012). Dans le cadre de cette thèse, la région hypervariable V4 du gène codant pour l'ARNr 16S a été amplifiée et séquencée pour l'ensemble des échantillons considérés en utilisant le couple d'amorces 515F/806R (Caporaso et al. 2011) (Fig. 44).

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>**FIGURE 44** – Structure du gène codant pour l'ARNr 16S.</figcaption></figure>
## III.3- Différentes stratégies d'analyses des résultats de séquençage

Une fois le séquençage réalisé, toutes les séquences détectées, aussi appelées reads, sont stockées dans des fichiers au format FASTQ selon des normes établies (Fig. 45). Il existe différentes méthodes d'analyse des données ainsi obtenues. L'enjeu de ces méthodes est de réussir à extraire, à partir des fichiers FASTQ, une table de comptage regroupant l'ensemble des échantillons et l'ensemble des séquences taxonomiquement affiliées. Dans cette partie, nous aborderons 2 stratégies distinctes : FROGS et DADA2 (Callahan et al. 2016; Escudié et al. 2018).

@D00420:214: HTWLWBCX2:2:1101:1203:2114 1:N:0:GTTTAG
GGACTACGGGGGTATCTAATCCTCTTCGATC...
+
FCDEDBCAFFAECBCCDGGGAF.A@FDCBA...
@D00420:214: HTWLWBCX2:2:1101:1143:2155 1:N:0:GTTTAG
GGACTACGGGGGTATCTAATCCTCTTCGATC...
+
FBCEDFBCAFEACBFCDGEGAF@.AFDCBA...

<table><caption>**FIGURE 45** – Exemple d'un fichier FASTQ contenant deux séquences.</caption><thead><tr><th>D00420</th><th>Séquenceur</th></tr></thead><tbody><tr><td>214</td><td>Identité du run</td></tr><tr><td>HTWLWBCX2:2:1101:1203:2114</td><td>Identification de la Flow Cell et positionnement sur la Flow Cell</td></tr><tr><td>1</td><td>Read 1 (« forward », brin sens) ou 2 (« reverse », brin anti-sens)</td></tr><tr><td>N</td><td>Y si read ne passe pas filtre sinon N</td></tr><tr><td>0</td><td>0 pour HiSeq</td></tr><tr><td>GTTTAG</td><td>Index</td></tr><tr><td>GGACTACG</td><td>Amorce</td></tr><tr><td>GGGGTATCTAATCC...</td><td>Séquence</td></tr><tr><td>FCDEDBCAFFAE...</td><td>Score qualité</td></tr></tbody></table>

Chaque séquence est identifiée par un symbole « @ ». La première ligne permet d'identifier la machine de séquençage. Elle est suivie de la séquence nucléotidique puis des scores qualités associés à chaque base (séparés par un symbole « + »). Chaque échantillon est associé à un barcode (index), qui est un fragment de 8 nucléotides commun à toutes les séquences d'un même échantillon.

### III.3.1- La méthode FROGS : Find Rapidly OTUs using Galaxy Solution

FROGS est un pipeline écrit sous python 2.7 et implanté dans la plateforme internet Galaxy, qui propose des workflows reproductibles pour l'analyse intensive de données (Escudié et al. 2018). FROGS permet, à l'aide de treize outils, et sans connaissance du langage informatique, le traitement de données de séquençage issues de Roche-454 (pyroséquençage) et Illumina. Ce workflow est capable de traiter des séquences de différents types (pairées ou non, démultiplexées ou non, avec ou sans amorces) via une succession de six étapes décrites ci-dessous : démultiplexage, pré-traitement, clustering, suppression des chimères, filtres et assignation taxonomique (Fig. 46).
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>FIGURE 46 – Schéma du workflow FROGS implanté dans la plateforme GALAXY (Escudié et al. 2018).</figcaption></figure>
### III.3.1.a- Démultiplexage

Par définition, le démultiplexage est une opération consistant à séparer des signaux distincts, préalablement combinés, et à les répartir sur les voies auxquelles ils sont destinés. Dans le cas de données de séquençage, les signaux correspondent aux séquences et les voies de destination peuvent être considérées comme les échantillons. L'étape de démultiplexage permet ainsi d'obtenir plusieurs fichiers FASTQ contenant chacun l'ensemble des séquences d'un seul et unique échantillon (Péricard, 2017). L'outil « Demultiplex reads » proposé par FROGS est un algorithme qui compare les barcodes (index) entre un fichier de référence (au format tabular) et les séquences d'intérêt contenus dans un fichier FASTQ. Lorsqu'une correspondance est trouvée, le programme attribue la séquence à l'échantillon correspondant. Il est possible de personnaliser cette étape en précisant le nombre maximum de nucléotides différents attendus entre les barcodes associés à la séquence et à la référence. La position où se trouve le barcode (« forward » ou sens, «reverse » ou anti-sens, ou les 2) peut également être précisée.

### III.3.1.b- Pré-traitement

Une fois les séquences démultiplexées, FROGS propose une étape de pré-traitement destinée à filtrer et nettoyer les séquences grâce à l'outil « Pre-process reads ». Dans un premier temps, les séquences pairées sont assemblées (« merge paired-ends ») en utilisant la méthode implémentée dans le logiciel FLASH (Fast Length Adjustment of SHort reads) (Magoc & Salzberg 2011). Cette approche permet de trouver l'alignement optimal entre des séquences pairées et de les assembler en considérant tous les alignements stricts possibles. Pour chaque chevauchement, un ratio est calculé entre le nombre de nucléotides différents au sein de l'alignement et la longueur de ce dernier. L'alignement présentant le plus petit ratio est considéré comme optimal. L'outil « Pre-process » permet ensuite de retirer les amorces présentes sur la séquence et de supprimer les séquences ne contenant pas ces amorces *via* la méthode dérivée du programme en lignes de commande Cutadapt (Martin, 2011). Cet outil, essentiellement utilisé sur des séquences courtes (<100 paires de bases), aligne les séquences avec un fichier de référence contenant l'ensemble des adaptateurs. Deux algorithmes sont possibles selon la position de l'adaptateur. Dans les deux cas, l'alignement le plus long est considéré comme optimal. Comme pour l'outil FLASH, un taux d'erreur est calculé en fonction du nombre de nucléotides différents et de la longueur de l'alignement. Si le taux d'erreur est inférieur à un taux fixé au préalable, l'adaptateur est tronqué. Les données sont ensuite nettoyées en utilisant des critères de taille établis par l'expérimentateur et dépendants du couple d'amorces choisi pour le séquençage. Ces critères concernent les tailles maximales et minimales des amplicons. Les séquences présentant des ambiguïtés sont retirées au cours de cette étape. Enfin, au cours du pré-traitement, les séquences sont dérépliquées. Cette étape consiste à associer les séquences identiques entre elles à 100% (Péricard, 2017).

### III.3.1.c- Clustering

Une fois les séquences nettoyées et dé-répliquées, elles sont regroupées en clusters appelés OTUs (Operational Taxonomic Units ou Unités Taxonomique Opérationnelle). Un OTU est composé de séquences identiques entre elles à un certain seuil, souvent 97%. Cette notion sera approfondie dans la partie suivante du manuscrit (III.3.3). L'étape de regroupement dans FROGS, réalisée grâce à l'outil « Clustering swarm », est basée sur une méthode en deux phases appelée Swarm (Mahé et al. 2014). Une première phase de croissance consiste à
placer l'amplicon le plus abondant comme point de départ d'un OTU vide. Un seuil de regroupement des séquences (paramètre *d*) égal à 1 est alors fixé. Ce seuil signifie que le nombre de différences entre les séquences regroupées est inférieur ou égal à 1. Selon ce paramètre, un alignement optimal est cherché entre l'amplicon central et l'ensemble des séquences restantes. Quand un alignement est trouvé, la séquence est sortie du pool et mise dans l'OTU. Cette étape est répétée jusqu'à ce que l'ensemble des séquences soit assigné à un OTU que l'on appelle à ce stade un pré-cluster. Une fois ces pré-clusters formés, la méthode est répétée en prenant un paramètre *d* égal à 3 afin d'obtenir les OTUs finaux.

### III.3.1.d- Suppression des chimères

Une chimère est un artefact de PCR qui survient lorsque l'amplification n'aboutit pas. L'oligonucléotide formé peut alors être utilisé en tant qu'amorce d'une autre région de l'ADN aboutissant à l'amplification de brins d'ADNs chimériques (Fig. 47). FROGS détecte ces chimères grâce à l'outil « Remove Chimeras » basé sur l'algorithme UCHIME (Edgar et al. 2011) implémenté dans VSEARCH (Rognes et al. 2016). Les chimères sont identifiées selon une méthode dite « consensus », c'est-à-dire qu'elles sont recherchées dans chaque échantillon séparément puis éliminées si elles sont trouvées dans l'ensemble du jeu de données. L'identification des chimères se base sur une méthode de novo. Les séquences sont classées par ordre décroissant d'abondance. Chaque séquence est divisée en quatre fragments. Ces fragments sont ensuite alignés avec de potentielles séquences parentes selon un alignement global aussi appelé méthode de Needleman-Wunsch (Needleman & Wunsch 1970). Les séquences parentes sont considérées comme les amplicons deux fois plus abondants que la séquence d'intérêt (Fig. 48).

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>FIGURE 47 – Formation d'une séquence chimérique au cours du processus PCR.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>FIGURE 48 – Processus d'identification des chimères</figcaption></figure>

### III.3.1.e- Filtres

Les OTUs formés précédemment et débarrassés des séquences chimériques sont ensuite filtrés selon des critères d'abondance et d'affiliation taxonomique. Dans le cas de l'utilisation du contrôle PhiX Illumina, l'élimination de séquences considérées comme contaminantes est également possible. Tous les filtres sont personnalisables par l'utilisateur et appliqués séparément. Les OTUs identifiés par au moins un filtre sont éliminés. Cette étape est réalisée grâce à l'outil « Filters ».

### III.3.1.f- Assignation taxonomique

Une fois les OTUs filtrés et nettoyés, une assignation taxonomique est réalisée avec l'outil « OTU Affiliation » en alignant les séquences obtenues avec une base de données de référence. Pour les études de communautés procaryotiques, les bases de données SILVA sont utilisées (Quast et al. 2013; Glöckner et al. 2017). Deux méthodes peuvent être utilisées : blastn+ (Camacho et al. 2009) ou RDP (Recombination Detection Progrtam) (Martin & Rybicki 2000).

### III.3.2- La méthode DADA2 : Divise Amplicon Denoise Algorithm

DADA2 est un package R open-source (également disponible sous QIIME2) destiné à traiter et corriger les données de séquençage Illumina (Callahan et al. 2016). Contrairement à la méthode FROGS, DADA2 accepte uniquement des séquences débarrassées de tout adaptateur (amorce) ou barcode (index) et démultiplexées, avec les fichiers « forward » (sens) et « reverse » (anti-sens) dans le même ordre. L'utilisation de DADA2 nécessite donc une étape préalable de démultiplexage qui n'est pas implémentée dans le package. Pour cette thèse, les fichiers FASTQ traités n'avaient pas été démultiplexés et l'outil FastqSplitter proposé par le prestataire de séquençage MrDNA a donc été utilisé