<figure><img src="image_1.png" /></figure>

**Titre:** Tumeurs micro-disséquées sur puce microfluidique
**Title:**

**Auteur:** Mélina Astolfi
**Author:**

**Date:** 2015

**Type:** Mémoire ou thèse / Dissertation or Thesis

**Référence:** Astolfi, M. (2015). Tumeurs micro-disséquées sur puce microfluidique [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal]. PolyPublie.
**Citation:** https://publications.polymtl.ca/1846/

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

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**URL de PolyPublie:** https://publications.polymtl.ca/1846/
**PolyPublie URL:**

**Directeurs de recherche:** Thomas Gervais, & Anne-Marie Mes-Masson
**Advisors:**

**Programme:** Génie biomédical
**Program:**
UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL

TUMEURS MICRO-DISSÉQUÉES SUR PUCE MICROFLUIDIQUE

MÉLINA ASTOLFI

INSTITUT DE GÉNIE BIOMÉDICAL

ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL

MÉMOIRE PRÉSENTÉ EN VUE DE L'OBTENTION

DU DIPLÔME DE MAÎTRISE ÈS SCIENCES APPLIQUÉES

(GÉNIE BIOMÉDICAL)

JUIN 2015
UNIVERSITÉ DE MONTRÉAL

ÉCOLE POLYTECHNIQUE DE MONTRÉAL

Ce mémoire intitulé :

TUMEURS MICRO-DISSÉQUÉES SUR PUCE MICROFLUIDIQUE

présenté par : ASTOLFI Mélina

en vue de l'obtention du diplôme de : Maîtrise ès sciences appliquées

a été dûment accepté par le jury d'examen constitué de :

M. LESAGE Frédéric, Ph. D., président

M. GERVAIS Thomas, Ph. D., membre et directeur de recherche

Mme MES-MASSON Anne-Marie, Ph. D., membre et codirectrice de recherche

Mme CHERIET Farida, Ph. D., membre
DÉDICACE

Aux combattants du cancer, actuels et passés,
ainsi qu'à leurs proches
REMERCIEMENTS

Il y a tellement de personnes à remercier qui ont rendu possibles tous les accomplissements rapportés dans ce mémoire.

J'aimerais commencer par remercier mon directeur, Thomas Gervais, qui m'a continuellement motivée à me surpasser et à voir le côté positif de mes résultats de recherche. Il m'a aussi encouragée à présenter mes résultats à des conférences scientifiques, tant au niveau local qu'international, ce qui m'a permis de mieux m'approprier le projet et de recueillir les commentaires et suggestions de mes pairs. Je tiens aussi à remercier ma co-directrice, Anne-Marie Mes-Masson, qui m'a aidée à saisir les subtilités biologiques du projet et qui m'a chaleureusement accueillie au sein de son laboratoire. J'ai bénéficié de ses collaborations précieuses avec Dre Diane Provencher et Dr Fred Saad, des chirurgiens-oncologues du CHUM qui ont participé à l'élaboration de notre projet afin qu'il réponde le mieux possible aux besoins des patients.

Au laboratoire du CRCHUM, j'ai eu la chance de travailler avec une équipe qui avait à cœur de faire avancer ce nouveau projet. En particulier, Benjamin Péant m'a aidée à accomplir les premières étapes critiques d'optimisation de la technique de coupe du tissu et il a souvent proposé des améliorations qui se sont avérées utiles à l'avancement du projet. J'ai aussi travaillé de concert avec Jennifer Kendall-Dupont, entre autres pour développer la technique d'imagerie. Abdul Lateef a quant à lui mis au point la procédure de cytométrie en flux. Tous ensemble avec Euridice Carmona qui s'est plus récemment jointe à l'équipe, nous avons planifié et exécuté de nombreuses expériences visant à valider différentes étapes de la technique en développement. Pendant mon séjour à l'étranger et pendant ma période de rédaction, cette équipe exceptionnelle a continué de produire des résultats importants, dont certains ont servi à compléter les figures présentées dans ce mémoire. Il ne faut pas non plus oublier le travail essentiel des techniciennes et assistantes de recherche, en particulier Kim Leclerc Désaulniers, Lise Portelance et Manon de Ladurantaye, qui ont aidé à l'exécution de certaines procédures et assuré le bon fonctionnement du laboratoire. J'aimerais aussi reconnaître le travail des stagiaires qui ont travaillé de près avec l'équipe microfluidique du CRCHUM et avec moi, permettant de faire progresser plusieurs aspects du projet.

Au laboratoire de Polytechnique, je tiens à remercier Nassim Rousset qui m'a grandement aidée à améliorer ma compréhension des phénomènes microfluidiques se produisant dans nos
systèmes grâce à ses explications et aux simulations numériques qu’il a produites. Également,
j’apprécie l’aide de Mohana Marimuthu et d’Amélie St-Georges qui ont toutes deux pris le temps
de me conseiller et de m’enseigner à utiliser certains instruments.

J’ai de plus eu l’opportunité de travailler pendant quelques mois à l’étranger au sein de
l’équipe de Sabeth Verpoorte, à l’Université de Groningue aux Pays-Bas. Je veux la remercier
d’avoir eu confiance en mes capacités de chercheuse et d’avoir mis à ma disposition toutes les
ressources nécessaires à l’exécution de mes expériences. Je conserve de beaux souvenirs de ce
séjour pendant lequel j’ai évolué avec des gens qui m’ont si chaleureusement intégrée à leur groupe
de recherche.

Enfin, je veux remercier de tout cœur mes proches, en particulier mes parents, qui m’ont
soutenue tout au long de mes études et m’ont toujours encouragée à poursuive mes objectifs les
plus ambitieux. Je dois un grand merci à Olivier Battistin, mon complice de tous les jours, qui s’est
montré à l’écoute et m’a aidée à passer au travers du processus de rédaction grâce à sa bonne
humeur contagieuse.

Pour terminer, j’aimerais souligner le support financier que j’ai reçu via plusieurs bourses de recherche : bourse d’études supérieures Alexander Graham Bell du Conseil de recherche en sciences naturelles et en génie (CRSNG), bourse de maîtrise du Fonds de recherche du Québec – Nature et technologies (FRQNT), suppléments de bourse pour études à l’étranger Michael Smith du CRSNG et bourse de voyage pour stagiaires de l’organisme Cancer de l’ovaire Canada. D’autres organismes subventionnaires ont financé le projet dans son ensemble : le Consortium québécois de la recherche du médicament et la fondation Cancer de la Prostate Canada.
RÉSUMÉ

Le cancer est une maladie complexe et très difficile à éliminer, en grande partie en raison des nombreux types différents de cancers et du caractère unique de chaque individu, faisant en sorte que les patients répondent différemment à la gamme grandissante de traitements disponibles. D'associer à chaque patient le meilleur traitement possible constitue l'un des grands défis de la médecine personnalisée d'aujourd'hui. Cela permettra d'éviter les effets secondaires et les coûts liés à des traitements inefficaces. En même temps, les chances de succès seront plus élevées puisqu'en appliquant le traitement optimal plus tôt, le cancer aura moins le temps de développer les mécanismes de résistance qui le rendent de plus en plus difficile à traiter. Cependant, les modèles actuels de culture de cellules cancéreuses ne permettent pas de recréer parfaitement toutes les caractéristiques des patients qui seront ultimement traités par les chimiothérapies testées. Les modèles animaux ne répliquent pas bien le système immunitaire humain, ni la complexité et l'instabilité génétique des cancers humains alors que la plupart des modèles de culture in vitro négligent en plus le caractère tridimensionnel (3D) du tissu. Les sphéroïdes – des amas cellulaires tridimensionnels synthétisés en laboratoire – sont un modèle de tissu simple et prometteur, mais ceux formés à partir de lignées cellulaires établies ne reproduisent pas bien la complexité et les particularités des cancers de patients.

L'objectif de ce projet est de proposer une procédure permettant d'effectuer des tests de réponses aux chimiothérapies directement sur le tissu tumoral de patients, extrait par biopsie ou par chirurgie. En préservant l'architecture 3D et la composition cellulaire du tissu primaire, cette technique a le potentiel de mieux prédire la réponse du patient comparativement aux autres méthodes de culture des cellules. L'approche retenue consiste à miniaturiser les échantillons ainsi que le dispositif dans lequel ils sont gardés en culture, ce qui lui confère des avantages importants relatifs au contexte clinique dans lequel le projet s'inscrit. Premièrement, en coupant petit, il est possible d'obtenir plusieurs échantillons à partir d'une quantité minime de tissu, lesquels pourront ensuite être exposés à différentes options de traitements. Deuxièmement, en employant un système microfluidique comme dispositif d'incubation, le volume est grandement réduit, minimisant par le fait même les coûts en réactifs (par exemple, les chimiothérapies ou les marqueurs fluorescents). Enfin, la petite taille des systèmes réduit les temps de diffusion, ce qui facilite le transport d'oxygène, de nutriments et d'autres molécules jusqu'au centre du tissu.
Quatre différents types de tumeurs de souris, formées après l'injection de cellules de cancers de la prostate et de l'ovaire, ont été utilisés dans ce projet comme modèle de tissu tumoral pour mettre au point toutes les étapes de la procédure. D'abord, une technique de découpe du tissu à des tailles sous-millimétriques a été développée afin de produire de nombreux échantillons de tumeurs micro-disséquées (TMD), à partir de faibles quantités de tissu primaire. En forme de disque d'environ 300 µm de haut par 380 µm de diamètre, les TMD ont été produites en utilisant un vibratome pour couper de fines tranches de tissu ainsi qu'un poinçon à biopsie pour réduire leurs dimensions au diamètre désiré. Ensuite, les TMD ont été chargées dans une plateforme microfluidique conçue sur mesure, composée de cinq canaux indépendants, chacun muni de cinq puits où les TMD sont piégées par sédimentation. Pour évaluer la viabilité des TMD au sein de cette plateforme, trois techniques de mesure ont été adaptées à la procédure développée : 1) la microscopie confocale des cellules viables et mortes marquées avec des fluorophores de viabilité faite directement à travers le dessous de la plateforme, 2) la cytométrie en flux des échantillons fragmentés en cellules individuelles marquées avec des fluorophores d'apoptose et 3) la détection d'un biomarqueur de mortalité dans le milieu extrait des systèmes.

Les trois techniques d'analyse montrent que les quatre types de TMD restent viables tout
au long de la période d'incubation sur huit jours. Leur viabilité est généralement plus faible après
la première journée d'incubation à cause du stress causé par la procédure de coupe sur les tissu,
mais un regain de viabilité survient dès le troisième jour et est maintenu jusqu'au dernier jour
d'analyse. Le même protocole a été appliqué avec succès à du tissu de cancer de l'ovaire extrait
d'une patiente par intervention chirurgicale et l'effet d'une chimiothérapie (le carboplatine) sur la
survie du tissu a été évalué. Le tissu semble avoir répondu positivement au traitement puisqu'une
viabilité significativement plus basse a été mesurée pour les TMD traitées comparativement à celles
non traitées.

Les résultats montrent que des échantillons primaires de tumeur peuvent être maintenus en
vie au sein de la plateforme microfluidique suffisamment longtemps pour mesurer les effets de
différents traitements sur plusieurs jours. La technologie développée a le potentiel de repositionner
les patients au centre du développement de médicaments en servant d'interface entre leur tissu
cancéreux et toutes les possibilités de traitements qui s'offrent à chacun d'eux. Elle pourra aussi
servir pour certaines étapes clés de la recherche fondamentale où des tests sur du tissu humain
pourraient permettre de répondre à certaines questions jusqu'ici peu explorées en raison de l'absence d'un modèle tissulaire approprié.

Mots clés : modèles de culture cellulaire, culture organotypique, tissu primaire, microfluidique, phénomènes d'échanges sur puce, organes-sur-puce, cancer, médecine personnalisée, tests de réponse aux médicaments.
ABSTRACT

Cancer is a complex disease and very difficult to eradicate, mainly because there are many different subtypes of cancer and each individual responds differently to the increasing number of available treatments. Associating the best treatment to each and every patient is one of the greatest challenges of personalized medicine today. Personalizing treatment will enable doctors to avoid the side effects and costs related to inefficient treatments. At the same time, therapy success rates will increase by applying an efficient treatment earlier when the disease has not yet had time to develop resistance mechanisms making it more difficult to treat. However, currently available cancer cell culture models do not perfectly recreate all the characteristics of patients’ tumors that will ultimately be treated by the tested therapeutics. Animal models do not replicate the human immune system, nor the complexity and instability of human cancers, while most *in vitro* models also neglect the three dimensionality of tissue. Spheroids – laboratory-synthesized three dimensional (3D) clusters of cells – constitute a simple and promising tissue model, but those grown from established cell lines do not reproduce the complexity and characteristics of specific patients’ cancers.

The aim of the current research is to propose a new procedure whereby different drugs could be tested directly on tumor tissue extracted from patients through biopsy or surgery. By preserving the 3D architecture and cellular composition of primary tissue, this technique could potentially offer better prediction of patients’ response compared to other cell culture models. The chosen approach, which consists in miniaturizing the tissue samples and the device in which they are cultured, has many important advantages relative to the clinical application of the project. First, by cutting the tissue into small pieces, many samples are obtained from a small quantity of tissue which can then be exposed to different treatment options. Second, through the use of a microfluidic system as an incubation device, the volume is reduced, thereby minimizing the cost of reagents (for example, chemotherapy agents or fluorescent markers). Finally, the small size of the systems reduces diffusion times, which facilitates the transport of oxygen, nutrients and other molecules to the center of the tissue.

Four different types of mouse tumor xenografts – grown from human prostate and ovarian cancer cell lines – were used to establish all the steps of the procedure. First, a cutting technique was developed to produce many submillimeter-sized micro-dissected tumor samples (MDTs) from
small amounts of primary tissue. Disk-like MDTs of approximately 380 µm in diameter by 300 µm high were produced using a vibratome to cut thin slices of agar-embedded tissue followed by a biopsy punch to reduce their size to the desired diameter. Next, the MDTs were loaded into a custom designed microfluidic platform composed of five independent channels, each containing five wells where the MDTs were trapped by sedimentation. To assess MDT viability in this platform, three measurement techniques have been adapted to the procedure: 1) confocal microscopy live and dead cells labeled with viability dyes performed directly through the base of the platform, 2) flow cytometry of samples disrupted into individual cells labeled with apoptosis fluorophores, and 3) the detection of a biomarker for mortality measured in the medium extracted from the systems.

All three analytical techniques show that the four types of MDTs remain viable throughout the incubation period over eight days. Their viability is generally lower after the first day of incubation because of stress exerted on the tissue during the cutting procedure, but viability recovers by the third day and is maintained until the last day of analysis. The same protocol was successfully applied to ovarian cancer tissue removed from a patient during surgery and the effect of a chemotherapy agent (carboplatin) on the survival of the tissue was assessed. The cancer tissue seems to have responded positively to the treatment since significantly lower viabilities were measured for treated MDTs compared to the untreated group.

These results show that primary tumor samples can be kept alive within the microfluidic platform long enough to measure the effects of different treatments over several days. The technology developed has the potential to reposition patients at the center of the drug development pipeline by serving as an interface between their primary cancerous tissue and the treatment options available to each of them. It may also be used in certain key basic research steps where tests on human tissue could help to address questions that remain unanswered up to now due to the absence of an appropriate tissue model.

Keywords: cell culture models, organotypic culture, primary tissue, microfluidics, transport phenomena on chip, organs-on-chip, cancer, personalized medicine, drug testing.
TABLE DES MATIÈRES

<table><tr><td>DÉDICACE</td><td>III</td></tr><tr><td>REMERCIEMENTS</td><td>IV</td></tr><tr><td>RÉSUMÉ</td><td>VI</td></tr><tr><td>ABSTRACT</td><td>IX</td></tr><tr><td>TABLE DES MATIÈRES</td><td>XI</td></tr><tr><td>LISTE DES TABLEAUX</td><td>XIV</td></tr><tr><td>LISTE DES FIGURES</td><td>XV</td></tr><tr><td>LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS</td><td>XVIII</td></tr><tr><td>LISTE DES ANNEXES</td><td>XX</td></tr><tr><td>CHAPITRE 1 INTRODUCTION</td><td>1</td></tr><tr><td>CHAPITRE 2 MÉTHODOLOGIE</td><td>12</td></tr><tr><td>2.1 Découpe de tissus à des tailles sous-millimétriques</td><td>12</td></tr><tr><td>2.1.1 Prétraitement du tissu</td><td>12</td></tr><tr><td>2.1.1.1 Production de xénogreffes de souris</td><td>12</td></tr><tr><td>2.1.1.2 Réception de tissu tumoral humain</td><td>13</td></tr><tr><td>2.1.2 Procédure de découpe du tissu cancéreux</td><td>13</td></tr><tr><td>2.2 Plateformes microfluidiques à piégeage par sédimentation</td><td>14</td></tr><tr><td>2.2.1 Conception</td><td>14</td></tr><tr><td>2.2.2 Fabrication</td><td>16</td></tr><tr><td>2.2.3 Mode d'opération</td><td>17</td></tr><tr><td>2.3 Analyse de viabilité des TMD</td><td>19</td></tr><tr><td>2.3.1 Microscopie confocale</td><td>19</td></tr><tr><td>2.3.1.1 Marquage des échantillons avec des fluorophores de viabilité et de mortalité</td><td>21</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>2.3.1.2</td>
      <td>Acquisition d'images au centre de microscopie du CRCHUM</td>
      <td>22</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.1.3</td>
      <td>Algorithme d'analyse d'images</td>
      <td>23</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.2</td>
      <td>Cytométrie en flux</td>
      <td>24</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.3</td>
      <td>Sécrétion du marqueur de mortalité lactate déshydrogénase (LDH)</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.3.1</td>
      <td>Particularités du test LDH effectué au CRCHUM</td>
      <td>27</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>CHAPITRE 3</td>
      <td>CULTURE SUR PUCE DE TUMEURS MICRO-DISSÉQUÉES</td>
      <td>29</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1</td>
      <td>Découpe de tumeurs à des tailles sous-millimétriques</td>
      <td>29</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>Caractérisation de la plateforme microfluidique</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1</td>
      <td>Mécanisme de piégeage des TMD</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1.1</td>
      <td>Critère 1 : densité des TMD</td>
      <td>31</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1.2</td>
      <td>Critère 2 : temps de convection des TMD au-dessus du puits</td>
      <td>34</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2</td>
      <td>Contraintes de cisaillement</td>
      <td>35</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.3</td>
      <td>Stabilité des TMD dans les puits microfluidiques</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.4</td>
      <td>Transport d'oxygène et de nutriments sans perfusion</td>
      <td>39</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.4.1</td>
      <td>Calcul du rayon critique d'un tissu tumoral sphérique pour éviter l'anoxie</td>
      <td>40</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.4.2</td>
      <td>Autres considérations sur la consommation de nutriments par les TMD</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3</td>
      <td>Viabilité sur puce des tumeurs micro-disséquées</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.1</td>
      <td>Analyse de viabilité par microscopie confocale</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.2</td>
      <td>Analyse de viabilité par cytométrie en flux</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.3</td>
      <td>Analyse de sécrétion du marqueur de mortalité LDH</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.4</td>
      <td>Effets de chimiothérapies sur des TMD de tissu primaire de patients</td>
      <td>53</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>CHAPITRE 4</td>
      <td>DÉVELOPPEMENT DES TECHNIQUES DE PIÉGEAGE ET D'ANALYSE D'IMAGES EN FLUORESCENCE</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.1</td>
      <td>Processus itératif de design de la plateforme microfluidique</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.1.1</td>
      <td>Piégeage résistif</td>
      <td>57</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>4.1.2</td><td>Piégeage par sédimentation</td><td>59</td></tr><tr><td>4.2</td><td>Algorithme de segmentation d'images fluorescentes</td><td>62</td></tr><tr><td>4.2.1</td><td>Performance de l'algorithme</td><td>62</td></tr><tr><td>4.2.1.1</td><td>Module de débruitage</td><td>63</td></tr><tr><td>4.2.1.2</td><td>Module d'égalisation du signal</td><td>63</td></tr><tr><td>4.2.1.3</td><td>Module de détection des contours</td><td>65</td></tr><tr><td>4.2.1.4</td><td>Module de segmentation</td><td>67</td></tr><tr><td>4.2.2</td><td>Limites de l'algorithme</td><td>68</td></tr><tr><td>4.2.2.1</td><td>Calcul de viabilité</td><td>69</td></tr><tr><td>4.2.2.2</td><td>Causes de rejet de séquences d'images</td><td>70</td></tr><tr><td>CHAPITRE 5</td><td>DISCUSSION GÉNÉRALE</td><td>74</td></tr><tr><td>5.1</td><td>Synthèse des principaux résultats</td><td>74</td></tr><tr><td>5.1.1</td><td>Technique de découpe des tumeurs micro-disséquées</td><td>74</td></tr><tr><td>5.1.2</td><td>Comparaison des méthodes de piégeage des TMD</td><td>75</td></tr><tr><td>5.1.3</td><td>Méthodes d'analyse de viabilité</td><td>77</td></tr><tr><td>5.1.3.1</td><td>Étude de corrélation entre les résultats de viabilité mesurés par microscopie confocale et par cytométrie en flux</td><td>80</td></tr><tr><td>5.1.4</td><td>Tests de chimiothérapie sur puce</td><td>84</td></tr><tr><td>5.2</td><td>Défis à surmonter</td><td>84</td></tr><tr><td>CHAPITRE 6</td><td>CONCLUSION</td><td>88</td></tr><tr><td></td><td>LISTE DE RÉFÉRENCES</td><td>89</td></tr><tr><td></td><td>ANNEXES</td><td>96</td></tr></table>
LISTE DES TABLEAUX

Tableau 3.1: Vitesses de sédimentation dans un milieu infini, approximation de densités relatives par rapport au HBSS et de densités absolues pour différents types de tissus ....................................33

Tableau 3.2: Description des variables pour le calcul de la concentration d'oxygène dans un échantillon de tissu tumoral et dans le milieu environnant .................................................................41

Tableau 4.1: Causes possibles de variation d'intensité des cellules marquées et description de leurs effets ................................................................................................................................................64

Tableau 4.2: Raisons de rejet de séquences d'images segmentées par l'algorithme en fonction du type de xénogreffe imagé ................................................................................................................70

Tableau 5.1 : Avantages et désavantages des trois méthodes étudiées pour mesurer la viabilité des TMD ................................................................................................................................................78
LISTE DES FIGURES

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure 1.1: Diagramme de l'approche proposée pour orienter le choix de traitement anti-cancer en médecine personnalisée</td>
      <td>7</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.1: Procédure de découpe du tissu cancéreux pour l'insertion dans les systèmes microfluidiques</td>
      <td>14</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.2: Conception de la plateforme microfluidique</td>
      <td>15</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.3: Moules utilisés pour fabriquer les plateformes microfluidiques</td>
      <td>16</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.4: Assemblage de la plateforme microfluidique</td>
      <td>17</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.5: Aperçu de la procédure pour changer le milieu et en collecter des fractions</td>
      <td>19</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.6: Principe de sectionnement optique en microscopie confocale</td>
      <td>20</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.7: Mécanismes d'action des deux fluorophores utilisés pour distinguer les cellules viables des cellules mortes</td>
      <td>21</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.8: Spectres d'excitation et d'émission associés au CTG et au PI</td>
      <td>23</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.9: Principe de fonctionnement d'un cytomètre en flux</td>
      <td>25</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.10: Principe de fonctionnement du test de détection du marqueur de mortalité LDH</td>
      <td>26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2.11: Justification du temps de demi-vie utilisé pour corriger les mesures de LDH</td>
      <td>27</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3.1: Diamètres des TMD mesurés sur les projections maximales des séquences d'images acquises par microscopie confocale</td>
      <td>30</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3.2: Définition des variables et des dimensions du système pour le calcul de la contrainte de cisaillement maximale</td>
      <td>35</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3.3: Profil de la concentration d'oxygène à l'intérieur et autour d'un échantillon sphérique de tissu en fonction du rayon tel que défini dans les deux sous-domaines du problème</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3.4: Compilation des résultats de viabilité des TMD de quatre types de xénogreffes de souris, mesurés par microscopie confocale sur une période de huit jours suivant la récolte</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3.5: Compilation des résultats de viabilité des TMD de quatre types de xénogreffes de souris, mesurés par cytométrie en flux sur une période de huit jours suivant la récolte</td>
      <td>50</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure A.1: Production de tranches de tissu de foie (PCLS)</td>
      <td>97</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.2: Procédure de coupe des tranches de tissu de foie pour l'insertion dans les systèmes microfluidiques</td>
      <td>98</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.3: Incubateur maison utilisé pour cultiver les TMDF</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.4: Spectres d'excitation à deux photons et d'émission de fluorescence associés pour le PI et la fluorescéine (FITC)</td>
      <td>103</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.5: Taux de mortalité pour les TMDF de foie de rat et pour les PCLS mesurés comme des taux de sécrétion du biomarqueur de mortalité LDH sur une période de 45 heures après le début de l'incubation</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.6: Taux de sécrétion de LDH en fonction du temps pour des PCLS d'expériences antérieures</td>
      <td>108</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.7: Viabilité des TMDF après 24 et 45 heures d'incubation, mesurée par microscopie confocale sur les échantillons marqués à la calcéine AM et au PI</td>
      <td>109</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.8: Comparaison de la profondeur d'imagerie de la microscopie à deux photons par rapport à celle de la microscopie confocale</td>
      <td>111</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.9: Images d'un échantillon de tissu de foie non marqué, excité à différentes longueurs d'onde allant de 780 à 1000 nm</td>
      <td>112</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.10: Effet du mouvement sur la qualité de l'image</td>
      <td>113</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure A.11: Rythme de formation des métabolites de la 7-HC à différentes périodes d'incubation pour des TMDF dans les microsystèmes ou pour des PCLS dans une plaque à 12 puits</td>
      <td>115</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS

2D Deux dimensions ou bidimensionnel(le)

3D Trois dimensions ou tridimensionnel(le)

7-EC 7-ethoxycoumarine, composante utilisée pour étudier le métabolisme de phase I du foie

7-HC 7-hydroxycoumarine, métabolite de la 7-EC et composante utilisée pour étudier le métabolisme de phase II du foie

7-HC-G Forme glucuronisée de la 7-HC (métabolite de phase II)

7-HC-S Forme sulfatée de la 7-HC (métabolite de phase II)

ADN Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

CLHP Chromatographie en phase liquide à haute performance, en anglais : high-performance liquid chromatography (HPLC)

CRCHUM Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal

CRSNG Conseil de recherche en sciences naturelles et en génie

CTG CellTracker® Green CMFDA, marqueur fluorescent vert des cellules viables

DAPI 4',6'-diamidino-2-phénylindole, agent intercalant d'ADN qui marque en bleu toutes les cellules viables et mortes

DRAQ5™ 1,5-bis{[2-(di-methylamino) ethyl]amino}-4, 8-dihydroxyanthracene-9,10-dione, agent intercalant d'ADN qui marque en rouge lointain toutes les cellules viables et mortes

FBS Sérum de veau fœtal, de l'anglais : fetal bovine serum, supplément de milieu
FRQNT Fonds de recherche du Québec – Nature et technologies

HBSS De l'anglais : *Hank's Buffered Saline Solution*, solution saline de préservation utilisée pour le tissu cancéreux

LMP De l'anglais : *low melting point*, se dit de l'agarose à faible point de fusion.

OSE De l'anglais : *ovarian surface epithelial*, se dit du milieu utilisé pour incuber le tissu cancéreux ovarien

RPMI 1640 Développé au *Roswell Park Memorial Institute*, se dit du milieu utilisé pour incuber le tissu cancéreux de prostate

PDMS Polydiméthylsiloxane, élastomère transparent utilisé pour fabriquer les plateformes microfluidiques

PI Iodure de propidium, de l'anglais *propidium iodide*, agent intercalant de l'ADN qui marque en rouge les cellules mortes seulement

PMMA Polyméthacrylate de méthyle, plastique transparent

PCLS Tranches de foie de rat, de l'anglais *precision-cut liver slices*, d'un diamètre de 4 à 5 mm et d'une épaisseur de 250 µm.

TMD Tumeur micro-disséquée (en anglais : *micro-dissected tumor (MDT)*)

TMDF Tissu micro-disséqué de foie

UMCG University Medical Center of Groningen, centre médical universitaire de la ville de Groningue, aux Pays-Bas.

UW « *University of Wisconsin* », décrit le milieu de préservation utilisé pour le tissu de foie de rat.

WME De l'anglais : *William's Medium E*, se dit du milieu d'incubation pour les TMDF de foie.
LISTE DES ANNEXES

<table><tr><td>Annexe A – Culture sur puce de micro-fragments de foie</td><td>96</td></tr></table>
# CHAPITRE 1 INTRODUCTION

Le cancer, la maladie la plus meurtrière au Canada, est responsable de 30% de tous les décès [1], et ce, malgré la multitude de traitements disponibles. Si les techniques de diagnostic et de soin ne sont pas significativement améliorées, il faut s'attendre à ce que plus de deux personnes sur cinq soient atteintes du cancer au cours de leur vie et à ce qu'une personne sur quatre décède de cette maladie. La variabilité de la réponse des patients aux médicaments [2] et l'épuisement des patients et des proches [3] face au fardeau de la maladie et à l'application de thérapies parfois inefficaces pointent vers la nécessité d'une approche plus personnalisée de traitements. Ce projet a pour but de développer une nouvelle technique de culture de tissu tumoral qui pourrait être utilisée à la fois comme un modèle préclinique plus représentatif des tumeurs humaines pour le développement de nouveaux médicaments et éventuellement comme un test clinique pour prédire la réponse individuelle de patients aux traitements anti-cancer existants.

Au cours des 30 dernières années, la découverte de centaines de gènes et mutations impliqués dans l'évolution de différents types de cancers a radicalement changé l'approche du traitement de la maladie [4], [5]. Certaines prédispositions génétiques au cancer ont été identifiées et s'avèrent extrêmement utiles pour le suivi de patients à risque. Par exemple, une mutation d'un des deux gènes suppresseurs de tumeur BRCA1 ou BRCA2 augmente drastiquement chez les femmes le risque de développer un cancer du sein ou de l'ovaire au cours de leur vie [6]. Grâce à une compréhension améliorée des voies de signalisation menant à un comportement néoplasique des cellules, de nombreuses cibles thérapeutiques potentielles ont aussi été identifiées [4]. Or, à l'exception de quelques traitements qui ont eu un impact clinique significatif sur la survie de groupes de patients bien spécifiques, par exemple les inhibiteurs de PARP pour les personnes ayant des cancers BRCA-mutés [7], la plupart des patients ne peuvent toujours pas bénéficier de traitements ciblés.

Pour orienter le choix de thérapies anti-cancer, il existe donc deux grandes visions de la médecine personnalisée. La première, basée sur les statistiques, cherche à trouver un marqueur biologique (ou biomarqueur) chez les patients à traiter qui serait un indicateur d'une probabilité augmentée de réponse à certains médicaments. Actuellement, malgré une recherche intensive en ce sens, un très faible nombre de ces biomarqueurs a été répertorié et est utilisé en milieu clinique [4]. Les oncologues disposent donc de peu d'outils pour les aider à choisir la meilleure
chimiothérapie pour chaque patient. Par exemple, BRCA1 et BRCA2 sont des biomarqueurs indicateurs d'une probabilité augmentée de réponse aux inhibiteurs de PARP. Cependant, à cause du caractère spécifique de chaque individu, tous les patients BRCA-mutés ne répondent pas nécessairement à la thérapie proposée [7]. Pour compenser ces limites, la deuxième vision de la médecine personnalisée consiste plutôt à tester empiriquement différentes chimiothérapies sur du matériel biologique provenant de chaque individu atteint d'un cancer. Cette option est généralisable à plusieurs types de cancers et elle pourrait être tentée dans la majorité des cas où l'approche par les biomarqueurs se serait avérée peu concluante. Elle pourrait même être utilisée en complémentarité avec les biomarqueurs pour valider un choix de traitement basé sur ceux-ci.

Ce projet de maîtrise s'inscrit dans cette deuxième vision de la médecine personnalisée. Le matériel tumoral primaire peut être collecté sous plusieurs formes chez les patients atteints de cancer, notamment par les cellules tumorales circulantes, les ascites (l'accumulation de liquide dans l'abdomen pouvant contenir des cellules cancéreuses) et les tumeurs elles-mêmes. Bien que les deux premiers types soient les plus simples à extraire soit par une prise de sang ou par une paracentèse, ils ne sont présents que dans une faible proportion des patients et apparaissent généralement à un stade avancé de la maladie [8], [9]. En revanche, les cancers à tumeur solide composent environ 90% de tous les cancers [10]. Des échantillons de tumeur peuvent être obtenus par biopsie ou à la suite d'une procédure chirurgicale, et ce projet vise à démontrer que ces tumeurs solides peuvent être cultivées dans un microsystème conçu sur mesure et être utilisées comme un nouveau modèle de culture cellulaire plus représentatif de la complexité biologique du cancer.

Comme le témoigne le faible taux de succès – seulement 6,7% – des médicaments anti-cancer en phase clinique [11], les modèles précliniques actuels sont défaillants puisqu'ils ne permettent pas de prédire correctement quels médicaments devraient être rejetés des étapes subséquentes de développement, ni de déterminer pour quel sous-groupe de patients les nouveaux traitements ont le plus de chances de produire un effet positif [12]–[14]. En biologie du cancer, la lignée cellulaire établie est le modèle le plus communément étudié en raison de sa simplicité d'utilisation, de sa rapidité à produire des résultats, de la reproductibilité des résultats générés ainsi que de la disponibilité de plusieurs types de cellules bien caractérisées [14], [15]. À l'origine, les lignées cellulaires humaines ont toutes été dérivées de cellules extraites de patients, mais les conditions de propagation de ces cellules dans des boîtes de pétri sont très différentes du microenvironnement présent *in vivo* [15]. En effet, les cellules se reproduisent en monocouche sur
un substrat de plastique, sans être exposées aux composantes de la matrice extracellulaire normale. Cette configuration bidimensionnelle n'encourage pas les interactions cellulaires et moléculaires (sécrétion de facteurs de croissance, d'hormones, d'interleukines, expression de molécules d'adhésion, etc.) qui sont caractéristiques des tissus 3D [16], [17]. Après plusieurs passages, seulement un sous-groupe de cellules ayant réussi à s'adapter aux nouvelles conditions de culture est représenté dans la lignée cellulaire résultante.

Le modèle animal murin est aussi largement utilisé en étude préclinique du cancer tant pour la formation de xénogreffes que pour l'étude de la tumorigénèse grâce à des souris génétiquement modifiées. Les xénogreffes sont des masses cancéreuses produites en injectant des cellules tumorales humaines dans le flanc (sous-cutané) ou dans une région du corps pertinent au cancer étudié (orthotopique) de souris immunodéficientes [14], [15]. La formation de xénogreffes se fait relativement rapidement et de manière reproductible pour plusieurs types de lignées cellulaires, ce qui permet d'étudier l'effet de différentes thérapies sur le comportement des tumeurs (initiation, croissance, métastase) au sein d'une cohorte de plusieurs souris presque identiques. Elles ajoutent des dimensions intéressantes à l'étude du cancer : tridimensionnalité des tumeurs, vascularisation, interactions avec la matrice extracellulaire et le stroma des souris, puis exposition aux hormones et aux autres facteurs sécrétés par les souris localement ou de manière systémique [12], [15], [18]. Cependant, en plus des questions éthiques soulevées par ce type de culture, les souris immunodéficientes ne reproduisent pas le rôle important du système immunitaire dans la progression du cancer [12], [14]–[16]. Des cellules primaires de patients peuvent aussi être transplantées dans ce modèle, mais elles peuvent prendre beaucoup de temps à développer une masse cancéreuse et de surcroît, ne forment aucune xénogreffe dans une proportion importante de cas [14], [15]. Quant aux souris génétiquement modifiées, même si elles sont utiles pour étudier des voies de signalisations particulières impliquées dans le cancer, elles sont coûteuses à développer [14]. Enfin, autant les souris génétiquement modifiées que les xénogreffes ne représentent pas tous les types de cancers et ne reflètent pas suffisamment bien la complexité et l'instabilité génétique des carcinomes humains [12], [14], [15]. De plus, les résultats obtenus avec ces deux catégories de modèles murins resteront toujours affectés par les différences inter-espèces entre la souris et l'humain [15], [18].

La tridimensionnalité des tissus est de plus en plus reconnue comme un aspect important des modèles cellulaires [16]–[18]. Même si des défis subsistent concernant les modèles cellulaires
3D, en particulier la possibilité de les cultiver *in vitro* pendant de longues périodes et de les imager en profondeur [17], ils sont de plus en plus utilisés comme modèles alternatifs pour l'étude du cancer. Les sphéroïdes, soit des amas de cellules cancéreuses formés *in vitro*, sont actuellement largement étudiés pour mieux représenter la tridimensionnalité des tumeurs solides humaines. Les cellules cultivées dans des sphéroïdes ont été associées à des niveaux d'expression génique plus près des niveaux d'expression trouvés dans les tumeurs [19], [20]. La tridimensionnalité des sphéroïdes et de d'autres types de tissu 3D limite le transport massique diffusif de toutes les molécules consommées ou produites par les cellules comme les nutriments, les déchets cellulaires, ou d'autres molécules de signalisation sécrétées. Des gradients de différentes molécules telles l'oxygène se forment donc au sein du tissu, entraînant l'expression de phénotypes différents en fonction de la position des cellules dans le tissu, ce qui reproduit mieux la situation d'hétérogénéité retrouvée *in vivo* [16], [18]. Des modèles de sphéroïdes de plus en plus complexes composés d'un mélange de cellules cancéreuses et de cellules stromales sont également en développement pour refléter l'hétérogénéité cellulaire des tumeurs humaines [16]. Toutefois, la complexité et les particularités des tissus humains demeurent inégalées par toutes les techniques de génie tissulaire actuellement disponibles. D'ailleurs, l'impossibilité de reproduire fidèlement toutes les spécificités (mutations génétiques, profil d'expression génique, microenvironnement, hétérogénéité, etc.) du cancer d'un patient en particulier limite grandement l'utilité en médecine personnalisée de ces modèles de culture 3D [21].

Au lieu de tenter de recréer la complexité des tissus tumoraux à partir de lignées cellulaires cultivées en 3D, une approche alternative de laquelle s'inspire ce projet de maîtrise consiste à cultiver directement le tissu extrait des patients [22]. Ce type de culture organotypique, c'est-à-dire qui préserve l'architecture de l'organe d'origine, permet aux différentes sous-populations cellulaires de continuer à se développer *ex vivo* au sein de leur matrice 3D originale. Malgré les difficultés liées à l'accès aux tissus de patients ainsi qu'à la viabilité limitée des échantillons produits, ce type de culture présente le meilleur potentiel de refléter *in vitro* la complexité et les spécificités des cancers humains [21], [22]. Il est généralement admis qu'en l'absence de vascularisation fonctionnelle, ces tissus doivent être coupés à des tailles sous-millimétriques, au moins dans une dimension, pour favoriser la diffusion de nutriments jusqu'au centre du tissu et assurer une viabilité globale acceptable. Tel est le cas, par exemple, pour les minces tranches de
tissu organotypique [22], [23] produites à l'aide d'un instrument qui contrôle précisément la hauteur de coupe, comme un vibratome.

En plus de faciliter le transport diffusif [18], la miniaturisation des procédés comporte de nombreux avantages. Des quantités minimes d'échantillon et de réactifs peuvent être employées [24]. Ceci constitue un avantage important pour l'application envisagée en médecine personnalisée puisque seulement de petits volumes d'échantillons biologiques primaires sont disponibles [25] et les composantes médicamenteuses testées sont souvent coûteuses [26]. Les petits volumes permettent aussi de concentrer les composantes sécrétées par les échantillons, ce qui est bénéfique à la fois pour préserver les processus de signalisation entre les cellules [18] et pour maintenir des concentrations détectables de certaines molécules à analyser [24]. De plus, une caractéristique importante des microsystèmes est que les fluides qui y circulent suivent un flux laminaire – donc sans turbulences – et la plupart du temps sans effets inertiels (écoulements dits de Stokes) [24], [27]. Le comportement du fluide et des particules y circulant est donc totalement déterministe et peut être décrit sous la forme d'une équation différentielle linéaire, ce qui le rend modélisable par des techniques analytiques classiques. Enfin, la miniaturisation permet de tester plusieurs conditions en parallèle sur de petites surfaces, ce qui réduit le nombre d'instruments nécessaires à l'analyse et facilite l'automatisation des procédés mis au point [24].

Il est possible de créer des structures tridimensionnelles sous-millimétriques pour la culture de cellules ou de tissus en employant différentes techniques de microfabrication. La photolithographie mise au point pour la microélectronique permet de graver avec précision dans un substrat de silicium un réseau miniature de tranchées et de trous où les cellules peuvent être cultivées. Plus communément, des techniques similaires sont employées pour créer des motifs surélevés sur des plaques de silicium servant ensuite de moule négatif pour produire plusieurs répliques du même dispositif en polydiméthylsiloxane (PDMS), un polymère flexible [18], [28]. Après le démoulage du morceau de PDMS comportant des motifs et son assemblage avec une lame de verre ou un morceau de PDMS lisse, un réseau de canaux microfluidiques est créé. D'autres techniques de microfabrication, comme l'impression 3D [29] et le micro-usinage contrôlé par ordinateur [30], peuvent aussi être employées pour produire des moules aux motifs plus larges. Le PDMS est biocompatible, transparent et perméable aux gaz, ce qui en fait un matériau idéal pour la culture de matériel biologique [31].
Tous les modèles cellulaires décrits ci-dessus ont déjà été cultivés au sein de puces microfluidiques faites sur mesure pour répondre aux besoins de différentes applications. Par exemple, des chercheurs ont conçu différentes configurations microfluidiques pour la culture de cellules en perfusion dynamique, imitant mieux la circulation sanguine autour des tumeurs [32], [33]. Pour en plus tenir compte de la tridimensionnalité des tissus, plusieurs techniques ont été proposées pour produire des sphéroïdes directement sur puce en vue de les exposer à différentes chimiothérapies [34]–[36]. D'autres ont plutôt opté pour la formation de sphéroïdes par des techniques plus traditionnelles, puis ont employé des microsystèmes pour piéger et effectuer des tests de réponse aux médicaments sur puce [30], [37]. En ce qui concerne les cellules primaires, plusieurs systèmes emploient des effets hydrodynamiques particuliers et des propriétés d'adhésion spécifiques aux cellules cancéreuses pour isoler les cellules tumorales circulantes des autres cellules sanguines [38]–[41]. Une étude récente par Peterson *et al.* [42] a vérifié l'expression de biomarqueurs dans des cellules cancéreuses d'ascites capturées dans un microsystème. Parallèlement, certains groupes ont démontré la faisabilité de cultiver directement sur puce de minces tranches de tissu vivant prélevés d'un animal [43], [44]. Toutefois, même si la plupart des cancers se forment dès leur initiation en masses solides, très peu de groupes de recherche ont développé des systèmes microfluidiques capables d'interroger des fragments de tissu cancéreux primaire. Hattersley *et al.* [45], [46] ont développé un système simple où des biopsies de patients d'environ 4 mm³ ont été incubées avec une perfusion lente de milieu dans une chambre de 3 mm de diamètre, puis été exposées à des chimiothérapies. Des résultats intéressants de viabilité sur sept à neuf jours et de réponse aux traitements ont été obtenus, mais ceux-ci sont très variables et difficiles à interpréter. De plus, chaque plateforme ne peut accommoder qu'un échantillon exposé à une seule condition, ce qui risque de rendre la procédure ardue lorsque de nombreux échantillons doivent être traités simultanément et perfusés individuellement. Chang *et al.* [47] ont quant à eux développé un microsystème élégant basé sur le design d'une plaque à 96 puits où différentes régions d'une seule tranche de tissu ou d'une biopsie peuvent être exposées à plusieurs conditions différentes à la fois. Cela a le potentiel de simplifier la procédure par l'utilisation d'une seule pompe pour la perfusion, mais il reste à démontrer que les interactions croisées de cellules de différentes régions traitées n'ont pas d'effet significatif sur la réponse du tissu.

Une approche différente a été adoptée dans le cadre de ce projet de maîtrise. D'abord, une méthode de découpe du tissu cancéreux en de nombreux échantillons sous-millimétriques
individuels, que nous avons nommés tumeurs micro-disséquées (TMD) et micro-dissected
tumors (MDTs) en anglais, a été développée. Une plateforme microfluidique simple a été conçue
au sein de laquelle les TMD peuvent être piégées par sédimentation et incubées sans perfusion
pendant une période allant jusqu'à au moins huit jours. La non-nécessité de perfuser, rendue
possible grâce à la petite taille des échantillons, simplifie grandement l'utilisation de ces systèmes
qui peuvent être conservés dans un incubateur à cellules normalement trouvé dans tous les
laboratoires de biologie cellulaire. Le dispositif d'incubation reproduisant les dimensions et
certaines fonctions de la vasculature des tissus permet de contrôler précisément la position des
TMD et le milieu les entourant ainsi que d'employer de petits volumes de réactifs coûteux. La
capacité de couper le tissu en de nombreux fragments devrait permettre d'effectuer plusieurs
tests – en parallèle et sans interaction croisée entre les différentes conditions – sur le volume limité
de tissu tumoral primaire typiquement obtenu des patients (Figure 1.1).

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

**Figure 1.1:** Diagramme de l'approche proposée pour orienter le choix de traitement anti-cancer en médecine personnalisée. 1) Le tissu tumoral est extrait du patient et coupé en tumeurs micro-disséquées (TMD). 2) Les TMD sont piégées et cultivées dans un système microfluidique. 3) Les chimiothérapies à tester sont appliquées dans des canaux indépendants en gardant un contrôle non traité. 4) Après une période d'incubation avec les chimiothérapies, les TMD sont analysées pour identifier le traitement le plus efficace. 5) Selon les résultats de la procédure, l'équipe médicale adopte une stratégie de traitement adaptée au patient.
## Objectifs de recherche

L'objectif principal de ce projet de recherche est de proposer une nouvelle méthode de culture d'échantillons primaires de tissu tumoral pouvant servir à prédire la réponse de patients à différents traitements, dont la chimiothérapie. Cet objectif principal peut être traduit en cinq sous-objectifs énumérés ci-dessous.

* Objectif 1 : Développer une méthode de découpe des tumeurs à des tailles sous-millimétriques.

* Objectif 2 : Concevoir une plateforme microfluidique pouvant piéger des TMD et les exposer à différentes conditions de culture.

* Objectif 3 : Calculer l'effet de la taille du tissu sur la formation de zones dépourvues d'oxygène dans un modèle simplifié de consommation d'oxygène.

* Objectif 4 : Évaluer la viabilité des TMD formées à partir de différents types de tumeurs de souris sur une période de huit jours.

* Objectif 5 : Effectuer des tests préliminaires de réponse aux chimiothérapies avec du tissu extrait de patients atteints du cancer.

## Organisation générale du mémoire

Le mémoire est organisé en six chapitres, incluant celui-ci dans lequel une revue de la littérature est faite pour positionner le projet dans le contexte actuel de la recherche et préciser les domaines d'application possibles de l'approche proposée. Les avantages et inconvénients des différentes méthodes de culture de cellules cancéreuses sont décrits dans le contexte de la médecine personnalisée en mettant l'accent sur l'importance de la tridimensionnalité pour mieux représenter la réalité des tumeurs solides. Des exemples de systèmes microfluidiques utilisés pour l'étude du cancer montrent comment l'approche proposée se distingue de l'état actuel des connaissances dans le domaine du génie tissulaire sur puce. Enfin, les objectifs du projet sont exposés à la fin de ce premier chapitre.

Le Chapitre 2 présente les aspects théoriques ainsi que les détails expérimentaux des différentes méthodes utilisées pour répondre aux objectifs de recherche. C'est dans ce chapitre que sont décrits en détails la méthode de découpe de micro-fragments de tissus ainsi que le design final
retenu de la plateforme microfluidique. Les principales méthodes d'analyse de la viabilité des TMD étudiées dans ce projet sont aussi présentées.

Le Chapitre 3, au cœur du mémoire, présente les résultats principaux concernant la culture sur puce de TMD. La reproductibilité de la méthode de découpe des tumeurs y est d'abord présentée. Ensuite, le mécanisme de piégeage des TMD est décrit, incluant le calcul des contraintes maximales de cisaillement s'appliquant sur les échantillons à l'intérieur du système et l'évaluation des conditions assurant la stabilité des TMD dans les puits microfludiques. Suivent les calculs de la distribution d'oxygène à l'intérieur et autour d'un morceau sphérique de tumeur, permettant de trouver une approximation de rayon critique du tissu tumoral au-dessus duquel les cellules au centre de l'échantillon risquent de manquer d'oxygène. Le chapitre se poursuit avec une étude de la viabilité, au cours d'une période de huit jours, des TMD produites à partir de quatre types de xénogreffes de souris de cancers de la prostate et de l'ovaire. Enfin, une étude préliminaire effectuée sur le tissu tumoral extrait d'une patiente atteinte du cancer de l'ovaire est montrée.

Le Chapitre 4 décrit le développement des techniques de piégeage et d'analyse d'images en fluorescence. Le processus itératif ayant mené au design final de la plateforme microfluidique est d'abord détaillé. Ensuite, l'algorithme de segmentation des images fluorescentes ainsi que ses limites sont décrits.

Une discussion critique de tous les résultats est réalisée au Chapitre 5. En particulier, une comparaison est faite des multiples techniques de mesure de viabilité explorées. Les limites des techniques développées sont détaillées et des pistes d'amélioration sont proposées.

Au Chapitre 6, le mémoire se conclut par un bref résumé des principaux résultats. Les impacts sociaux-économiques potentiels du projet sont finalement explorés.

L'Annexe A présente les principaux résultats générés dans le cadre d'un stage de trois mois à l'Université de Groningue, dans le laboratoire de Dre Sabeth Verpoorte aux Pays-Bas. Ce stage a été effectué grâce au supplément Michael-Smith offert à certains étudiants détenteurs de la bourse Alexander Graham-Bell du CRSNG. La procédure de coupe et d'incubation dans les plateformes microfluidiques a été adaptée à du tissu de foie de rat, puis la viabilité et l'état métabolique du tissu ont été étudiés à l'aide de plusieurs techniques qui pourraient aussi s'avérer utiles pour l'étude du cancer.
## Contributions détaillées

Le projet multidisciplinaire présenté dans ce mémoire a nécessité l'exécution de nombreuses étapes qui n'auraient pas pu être réalisées par une seule personne. De par la nature fragile des échantillons biologiques, ceux-ci devaient être traités et utilisés rapidement. Pour maximiser le nombre d'analyses faites à partir d'un seul morceau de tumeur, la procédure se devait d'être faite en équipe.

L'auteure a bénéficié des installations et expertises des établissements d'attache de son directeur et de sa co-directrice: l'École Polytechnique de Montréal pour la conception, la fabrication et la caractérisation des plateformes microfluidiques ainsi que le CRCHUM pour l'accès aux laboratoires de biologie cellulaire et aux instruments de mesure grâce auxquels le tissu cancéreux a pu être étudié.

Au départ, l'auteure a poursuivi le travail initié par des étudiants au baccalauréat ayant travaillé à sur le projet par le passé. La technique de coupe avait été explorée au CRCHUM en utilisant des échantillons de reins de souris, mais n'avait jamais été appliquée à du tissu cancéreux dans ce laboratoire. La viabilité de ces tissus primaires n'avait pas non plus été mesurée, ni optimisée. L'auteure a travaillé en début de projet à standardiser et à modifier les conditions de coupe pour améliorer la reproductibilité de la taille et de la viabilité des échantillons produits. En particulier, la technique a été grandement améliorée par l'usage d'un poinçon à biopsie pour réduire le diamètre des tranches de tissu et obtenir des échantillons aux dimensions similaires à celles des sphéroïdes matures. L'auteure a aidé à la préparation des injections de cellules pour former les xénogreffes de souris, mais la plupart du temps, cela a été accompli par Jennifer Kendall-Dupont aidée des techniciennes de laboratoire. Les souris ont été suivies par Kim Leclerc Désaulniers et d'autres membres du personnel de l'animalerie du CRCHUM. Au tout début, une fois la xénogreffe récoltée, l'auteure procédait seule à produire les TMD et à les charger dans les microsystèmes. Au fil du temps, Dr Benjamin Péant, Jennifer Kendall-Dupont et Dr Abdul Lateef, entre autres, se sont joints à l'équipe, permettant d'augmenter radicalement le nombre d'échantillons produits et analysés. Quant aux systèmes microfluidiques produits à l'École Polytechnique de Montréal, l'auteure a commencé par employer les dispositifs que d'autres avaient fabriqués par le passé pour ensuite concevoir son propre dispositif qui est encore utilisé à ce jour. La procédure de microscopie confocale a été mise au point à la Plateforme d'imagerie
cellulaire du CRCHUM par l'auteure avec l'aide de Jennifer Kendall-Dupont. Elles se sont
partagé la tâche de marquer et d'imager les échantillons. L'auteure a elle-même développé
l'algorithme de segmentation des séquences d'images fluorescentes acquises en microscopie
confocale. Le Dr Abdul Lateef a mis au point et exécuté la technique de cytométrie en flux.
L'auteure a optimisé la technique de détection du biomarqueur de mortalité LDH et en a exploré
les limites.

Au cours du stage à l'étranger à l'Université de Groningue, l'auteure a obtenu des
échantillons de foie déjà tranchés de l'équipe de Dre Geny Groothuis. Elle a elle-même accompli
le reste de la procédure de coupe, de chargement et d'incubation. Pieter Oomen l'a aidée à se
familiariser avec certains instruments et procédures alors que Viktoriia Starokozhko lui a montré
la technique de détection du marqueur de mortalité LDH. Le système de chromatographie en phase
liquide à haute précision a été préparé par Marina de Jager et Jan Visser alors que l'auteure s'est
surtout occupée de recueillir les échantillons pour l'analyse. Les tests de microscopie à deux
photons ont été accomplis par l'auteure et par Dr Maciej Skolimowski, aidés de Klaas Sjollema du
Centre de microscopie du centre médical universitaire de Groningue (UMCG Microscopy and
Imaging Center). La microscopie confocale a été faite par l'auteure, aidée de Pieter Oomen et du
Dr Maciej Skolimowski.

Tous les résultats présentés dans ce mémoire ont été organisés, mis en figure et interprétés
par l'auteure.
# CHAPITRE 2 MÉTHODOLOGIE

Ce chapitre présente toutes les techniques exécutées en laboratoire ayant permis de répondre aux objectifs de recherche. D'abord est présentée la méthode de coupe du tissu employant un vibratome et un poinçon à biopsie pour générer des TMD. Ensuite, les plateformes microfluidiques utilisées pour incuber les TMD sont décrites et leur mode de fonctionnement est expliqué. Enfin, les principes généraux de fonctionnement des trois différentes techniques d'analyse de la viabilité sont exposés et les détails expérimentaux sont fournis pour chacune d'elles. Les conditions particulières des expériences menées et les détails des techniques d'analyse explorées pendant le stage à Groningue sont plutôt décrits à la section A.1 de l'Annexe A.

## 2.1 Découpe de tissus à des tailles sous-millimétriques

### 2.1.1 Prétraitement du tissu

#### 2.1.1.1 Production de xénogreffes de souris

Des xénogreffes de souris ont été utilisées comme modèle de tissu tumoral, afin d'évaluer la méthode de coupe, la méthode de chargement ainsi que la viabilité des échantillons après leur incubation dans les microsystèmes. Quatre différentes lignées de cellules cancéreuses humaines ont été utilisées pour former les xénogreffes : deux lignées dérivées de tumeurs de cancer de la prostate (22Rv1 et PC3, American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, É.-U.) ainsi que deux lignées dérivées d'une tumeur (TOV112D) ou d'une ascite (OV90) de cancer de l'ovaire, provenant du laboratoire de la Dre Mes-Masson [48]. Pour former les xénogreffes, les suspensions cellulaires obtenues après l'amplification des cellules dans des cultures en monocouche sont mélangées à volume égal avec du Matrigel® liquide (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, É.-U.) avant d'être injectées dans le flanc de souris immunodéficientes (Charles River Development, Burlington, MA, É.-U.) mâles pour les cellules de prostate ou femelles pour celles d'ovaire. Des tumeurs solides se forment et sont récoltées après une période de croissance variant de 21 à 70 jours dépendamment de la lignée cellulaire injectée.
### 2.1.1.2 Réception de tissu tumoral humain

À travers une étroite collaboration avec des chirurgiens du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM), notamment Dre Diane Provencher de l'unité de gynécologie oncologique, et grâce au consentement des patientes, certains spécimens de tissu tumoral humain de cancer de l'ovaire ont été obtenus à la suite de chirurgies de cytoréduction. Les spécimens ont été transportés sur la glace jusqu'au laboratoire où la procédure de coupe a été entamée aussitôt que possible.

## 2.1.2 Procédure de découpe du tissu cancéreux

Les tumeurs ont dû être coupées à des tailles sous-millimétriques afin d'être insérées dans les microsystèmes. Pour produire de tels échantillons, nommés « tumeurs micro-disséquées » (TMD), la xénogreffe de souris ou le tissu tumoral humain est d'abord coupé en minces fragments (~1 mm de large par 5 mm de long), tel que montré à la *Figure 2.1A*. Ceux-ci sont ensuite coulés dans de l'agarose à bas point de fusion (en anglais : *low melting point (LMP) agarose*, 3,7% masse/volume, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, É.-U.) supplémentée avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, É.-U.) et gardée liquide entre 40 et 45°C (*Figure 2.1B*). Les échantillons sont ensuite mis sur la glace pendant au moins 30 minutes pour permettre à l'agarose de se solidifier et de former une structure de support autour du fragment de tissu (*Figure 2.1C*). Plusieurs blocs d'agarose contenant du tissu sont repositionnés à la verticale, collés sur le support d'un vibratome traditionnel (The Vibratome Company Inc., St. Louis, MO, É.-U.) et placés dans une solution saline équilibrée de Hank (en anglais : *Hank's balanced salt solution (HBSS)*, #311-516-CL, Wisent Inc., St-Bruno-de-Montarville, QC, Canada) gardée à 15°C et supplémentée avec 10% de FBS, 55 mg/L de gentamicine (idem) et 600 µg/L d'amphotéricine B (idem). Des minces tranches de 300 µm d'épais sont ensuite produites avec un vibratome (*Figure 2.1D* et *Figure 2.1E*). Les tranches de tissu entouré d'agarose ainsi obtenues sont gardées dans la même solution jusqu'à ce que les TMD soient générées en utilisant un poinçon à biopsie de 500 µm de diamètre (Zivic Instruments, Pittsburgh, PA, É.-U.), tel que montré à la *Figure 2.1F*. Ces TMD de forme discoïdale sont alors prêtes à être chargées dans les systèmes (*Figure 2.1G*).
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 2.1: Procédure de découpe du tissu cancéreux pour l'insertion dans les systèmes microfluidiques. A) Coupe au scalpel d'une xénogreffe de souris en minces fragments. B) Coulage d'un fragment de tissu dans de l'agarose LMP gardée liquide entre 40 et 45°C. C) Création d'une structure de support autour du tissu par la solidification de l'agarose à 4°C. D) Positionnement à la verticale des fragments de tissu et collage des blocs d'agarose sur le support du vibratome. E) Production de minces tranches de tissu au vibratome. F) Coupe finale d'une tranche de tissu à l'aide d'un poinçon à biopsie de 500 µm de diamètre pour produire une TMD. G) Insertion de TMD dans l'entrée d'un système microfluidique.</figcaption></figure>

## 2.2 Plateformes microfluidiques à piégeage par sédimentation

### 2.2.1 Conception

La configuration de la plateforme microfluidique conçue est montrée à la Figure 2.2A. La plateforme est composée de deux niveaux fluidiques : le niveau supérieur montré en contours noirs où les TMD et le milieu circulent, et le niveau inférieur montré en rouge où les TMD sédimentent. La vue de côté d'une TMD circulant dans un canal jusqu'à son piège est schématisée à la Figure 2.2B. Chaque plateforme comporte cinq canaux indépendants sur une surface de seulement 2,5 cm par 7,5 cm équivalente à celle d'une lame de microscope standard. Chaque canal (ou système) comporte cinq pièges, ce qui permet à une plateforme de contenir jusqu'à 25 TMD et de tester jusqu'à cinq conditions de traitement différentes. La longueur (78 mm) a été choisie pour que les échantillons puissent être contrôlés en utilisant une micropipette de 20 µL. Les cinq pièges sont
également répartis tout le long du canal, ce qui maximise la quantité de nutriments auxquels les TMD ont accès dans des conditions sans perfusion. Chaque canal est disposé en serpentin afin qu’il puisse être observé en entier sous un stéréomicroscope de faible magnification. Les canaux ont une section transverse carrée de 600 µm par 600 µm alors que les pièges à fond carré ont des dimensions de 600 µm de large par 500 µm de profond. Chaque canal a donc un volume total de 29 µL. Ces dimensions peuvent accueillir des TMD de forme discoïdale d’environ 380 µm de diamètre par 300 µm de haut.

Tel que montré à la *Figure 2.2C*, l'entrée de chaque système comporte un microréservoir qui facilite le chargement des TMD dans le système. Le bas du microréservoir est au même niveau que le canal microfluidique avec lequel il connecte, soit légèrement plus enfoncé que le reste de l'entrée.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 2.2:** Conception de la plateforme microfluidique. A) Vue de haut de la plateforme comportant cinq canaux indépendants (contours noirs), chacun contenant cinq pièges microfluidiques (rouge). B) Vue de côté d'une TMD circulant dans le canal jusqu'à un piège, incluant les dimensions principales en micromètres. C) Vue 3D d'un système avec une entrée, une sortie, et un microréservoir situé au fond de l'entrée.</figcaption></figure>
### 2.2.2 Fabrication

Deux moules ont été utilisés pour fabriquer les plateformes : le premier comporte les motifs pour former les deux niveaux fluidiques, soit les canaux et les pièges (Figure 2.3A), et le deuxième comporte des piliers de 3 mm et de 2 mm de diamètre pour produire des trous dans la couche moulée, servant d'entrées et de sorties aux canaux (Figure 2.3B). Ces moules en polyméthacrylate de méthyle (PMMA) sont micro-usinés en utilisant des fraises de surfaçage de 1 mm et de 3,57 mm de diamètre respectivement, opérées par une machine-outil à commande numérique (CNC, Laboratoire de nanorobotique du professeur Sylvain Martel).

A

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 2.3: Moules utilisés pour fabriquer les plateformes microfluidiques. A) Modèle du premier moule en PMMA avec des motifs pour former les canaux et les pièges de la couche de PDMS du bas de la plateforme. B) Modèle du deuxième moule en PMMA avec des piliers pour former les trous d'entrée et de sortie de la couche de PDMS du haut de la plateforme.</figcaption></figure>

B

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Du PDMS liquide (Sylgard® 184 silicone elastomer kit, Dow Corning, Midland, MI, É.-U.), préparé à un ratio massique de monomères de base pour agent durcissant de 10:1, est versé dans chaque moule, dégazé, puis cuit à 80°C pendant 1,5 heures. Une masse précise de PDMS, soit 3,3 g, est utilisée dans le premier moule pour assurer une épaisseur reproductible du bas de la plateforme. Après démoulage, les deux couches de PDMS sont activées en utilisant un générateur de plasma atmosphérique (« Dyne-a-mite », Enercon, Menomonee Falls, WI, É.-U.), alignées, puis collées ensemble. Des cylindres creux en nylon (#91145A138, McMaster-Carr, Elmhurst, IL, É.-U.) sont finalement insérés dans les entrées des systèmes pour former des réservoirs plus hauts. Ceux-ci facilitent la procédure de changement de milieu, empêchent les débordements et peuvent contenir un petit volume de milieu supplémentaire (généralement 20 à 30 µL) pendant l'incubation
pour éviter qu'une éventuelle évaporation ne ruine l'expérience en faisant pénétrer de l'air dans les systèmes. La Figure 2.4 montre comment les différentes parties de la plateforme sont assemblées entre elles.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 2.4: Assemblage de la plateforme microfluidique. A) Vue éclatée des parties du système : 1- la couche de PDMS inférieure comprenant les canaux et les pièges, 2- la couche de PDMS supérieure comprenant les cinq trous d'entrée et les cinq trous de sortie, et 3- les cinq réservoirs d'entrée. B) Schéma d'une plateforme microfluidique complète assemblée. C) Photographie d'une plateforme fabriquée et assemblée.</figcaption></figure>

### 2.2.3 Mode d'opération

Une fois fabriqués, les microsystèmes sont traités pour recevoir les TMD. D'abord, l'air est retiré des systèmes en utilisant de l'éthanol pur (100%), solvant pour lequel le PDMS a une mouillabilité élevée. Sans vider les canaux, l'éthanol pur est ensuite remplacé par un mélange éthanol-eau (70%/30%) pendant 10 minutes afin de stériliser les systèmes.

Avant de recevoir le tissu cancéreux, les surfaces des canaux sont traitées avec une solution stérile de 10 mg/mL de copolymère tribloc Pluronic® F-108 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
É.-U.), laissée pour incuber dans une chambre humide à 37°C pendant au moins une heure ou jusqu'au lendemain. Les molécules de Pluronic® F-108 sont composées de deux queues hydrophiles et d'une tête hydrophobe qui se lie au PDMS à travers des interactions hydrophobes. Ce traitement vise à prévenir l'adhésion de cellules et l'adsorption de protéines à la surface du PDMS grâce à l'encombrement stérique provoqué par les queues des molécules de Pluronic® F-108 [49]. En cas de formation de bulles dans les systèmes, les étapes de traitement avec l'éthanol sont répétées. Les systèmes sont finalement rincés et remplis de HBSS, puis sont placés dans une chambre humide à l'intérieur d'un incubateur à cellules, prêts à recevoir des TMD.

Une fois les TMD produites, les plateformes sont retirées de l'incubateur et placées sous un stéréomicroscope pour procéder à l'étape de chargement du tissu. Pour éviter la perte d'échantillons dans l'entrée, le cylindre creux peut être retiré en laissant du milieu dans l'entrée. Cinq TMD sont collectées en utilisant une micropipette de 20 µL, puis sont déposées dans le microréservoir au fond de l'entrée (Figure 2.2C). En aspirant à la sortie du canal en utilisant la même micropipette, un débit est induit et les TMD sont emportées à l'intérieur du canal. En étant positionnées dans le microréservoir, les TMD sont soumises à un débit plus élevé que si elles étaient placées ailleurs dans l'entrée. Soit en aspirant ou soit en expulsant du liquide à la sortie du système, les TMD sont conduites jusqu'aux pièges. Le débit est arrêté pendant une à deux secondes lorsqu'une TMD est positionnée au-dessus d'un piège vide afin qu'elle puisse y sédimenter. Après le chargement des cinq TMD dans un système, le cylindre d'entrée est réinséré, puis le HBSS est remplacé avec du milieu de culture : soit du milieu OSE (#316-031-CL, Wisent Inc., St-Bruno, Canada) pour les TMD de cancer de l'ovaire ou soit du milieu RPMI 1640 (#350-045-CL, Wisent Inc., St-Bruno, Canada) pour les TMD de cancer de la prostate. Les milieux OSE et RPMI 1640 sont tous deux supplémentés avec 10% de FBS, 55 µg/mL de gentamicine et 0,6 µg/mL d'amphotéricine B, et préchauffés à 37°C. Avec environ 20 µL de milieu dans les entrées, les plateformes chargées sont remplacées dans une chambre humide, à l'intérieur de l'incubateur à cellules (37°C, 95% air ambiant, 5% CO₂).

Pour procéder au changement de milieu, le réservoir d'entrée est vidé, puis le milieu de remplacement est ajouté dans l'entrée. Le milieu restant dans les canaux est aspiré de la sortie à l'aide d'une pipette de 20 µL. Ce faisant, le nouveau milieu pénètre graduellement dans le système. Tel que montré à la Figure 2.5, un volume de 60 µL est retiré de la sortie pour assurer que la totalité du système (volume total de 29 µL) soit rempli de nouveau milieu.
Le milieu de culture est changé à plusieurs reprises au cours d'une expérience, généralement après un, trois, six et huit jours d'incubation. Dans certaines expériences, le milieu contient en plus des agents chimiques dont l'effet sur la viabilité des échantillons doit être évalué. Dans certains cas, les fractions de milieu ainsi collectées à différents points dans le temps sont conservées pour l'analyse de molécules sécrétées par les TMD pendant la période d'incubation ou pour conserver les cellules mortes qui auraient pu se détacher des TMD et sortir des pièges.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 2.5: Aperçu de la procédure pour changer le milieu et en collecter des fractions. Le schéma n'est pas à l'échelle.</figcaption></figure>

## 2.3 Analyse de viabilité des TMD

Trois techniques ont été employées avec succès pour mesurer la survie des TMD sur une période de huit jours : la microscopie confocale sur des TMD marquées pour différencier les cellules viables des cellules mortes, la cytométrie en flux pour catégoriser les cellules des TMD en trois groupes selon leur stade de mortalité (viables, en apoptose précoce, ou en apoptose tardive ou mortes), et la détection du marqueur de mortalité (lactate déshydrogénase, LDH) dans les fractions de milieu retirées des systèmes.

### 2.3.1 Microscopie confocale

La microscopie confocale a été employée pour évaluer la distribution spatiale de la viabilité à différentes profondeurs au sein du tissu 3D. Sachant que la session d'imagerie pourrait affecter la viabilité des TMD à cause de l'exposition aux conditions ambiantes hors de l'incubateur et de l'effet des lasers sur le tissu, chaque TMD n'a été imagée qu'une seule fois, sauf pour les TMD de tissu humain à la section 3.4 disponibles en plus petites quantités. De multiples systèmes différents
ont donc été imagés à différents temps d’analyse pour refléter l’évolution de la survie des échantillons. Pour discriminer les cellules viables des cellules mortes, deux fluorophores de viabilité peuvent être employés, tel que détaillé à la section 2.3.1.1.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 2.6: Principe de sectionnement optique en microscopie confocale. A) Schéma simplifié d'un microscope confocal inversé qui image un échantillon piégé dans un système microfluidique (vue de côté), montrant le trajet de la lumière à travers ses principales composantes optiques. Schéma adapté de « Diagram of confocal principle » par Danh licensé sous CC BY-SA 3.0 [50]. B) Tranches optiques d'une TMD résultant de l'acquisition au microscope confocal en modifiant la position du plan focal dans l'échantillon. C) Représentation 2D (nommée projection maximale) des tranches optiques montrées en B dans laquelle les zones les plus intenses du spécimen sur toute sa profondeur sont visualisées.</figcaption></figure>

Ce type de microscopie rend possible le sectionnement optique des échantillons grâce au sténopé placé devant les détecteurs qui élimine toute la lumière fluorescente qui ne provient pas du plan focal. Tel que montré à la *Figure 2.6A*, la lumière de la source (lignes bleues) est focalisée par l'objectif et traverse la mince couche de PDMS formant le bas de la plateforme pour exciter les fluorophores de l'échantillon tandis que la lumière fluorescente émise (lignes vertes) repasse par l'objectif, est réfléchie par le miroir dichroïque et passe par le sténopé pour atteindre le détecteur. La lumière fluorescente ne provenant pas du plan focal (lignes grises pointillées) est bloquée au
sténopé et ne parvient pas au détecteur. Cependant, la majorité de la fluorescence diffusée par le tissu n'est pas captée par le détecteur, même si elle provenait originalement du plan focal, ce qui limite la profondeur de pénétration de ce type de microscopie.

### 2.3.1.1 Marquage des échantillons avec des fluorophores de viabilité et de mortalité

Pour évaluer la viabilité des TMD, les échantillons sont marqués en utilisant deux fluorophores : le CellTracker® Green diacétate de 5-chloromethylfluorescéine (CTG CMFDA, #C2925, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, É.-U.) et l'iodure de propidium (en anglais : *propidium iodide* (PI), #P4864, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, É.-U.). Tel que schématisé à la Figure 2.7, le CTG est une molécule qui devient fluorescente une fois les groupements acétate clivés par des enzymes, plus particulièrement les estérase, actives à l'intérieur des cellules viables [51]. La membrane cellulaire est imperméable à la forme clivée de la molécule, et donc le signal fluorescent est retenu à l'intérieur de la cellule. Le PI, quant à lui, peut seulement pénétrer à l'intérieur des cellules en apoptose tardive ou des cellules mortes, une fois la membrane cellulaire endommagée. Ce marqueur s'intercale entre les bases des acides nucléiques, ce qui provoque une intensification de son signal fluorescent de 20 à 30 fois [52]. En combinant les deux marqueurs, il est possible de classer les cellules en deux groupes : les cellules viables dont le cytoplasme est marqué par le CTG et les cellules mortes dont le noyau et l'ARN sont marqués par le PI.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 2.7: Mécanismes d'action des deux fluorophores utilisés pour distinguer les cellules viables des cellules mortes.</figcaption></figure>
La 7-aminoactinomycine D (7-AAD) est une molécule qui marque aussi sélectivement l'ADN des cellules mortes. Son mécanisme d'action est très similaire à celui du PI. Cet agent a été utilisé dans quelques expériences en remplacement du PI.

Les échantillons sont marqués séquentiellement avec des solutions de HBSS contenant soit du CTG (5 µM), soit une combinaison de CTG et de PI (1,5 µM). Ces solutions sont simplement ajoutées aux systèmes en suivant le protocole de changement de milieu décrit plus haut (section 2.2.3). Les TMD incubent ainsi avec le CTG pendant au moins 45 minutes, puis 30 minutes additionnelles avec les deux marqueurs. Ensuite, les systèmes sont rincés deux fois avec du HBSS afin de minimiser le signal de fond pouvant provenir de la fluorescence moins intense des molécules de PI non liées à l'ADN. Les molécules de CTG en excès et non clivées par les estérases des cellules viables ne devraient pas fluorescer, mais elles sont tout de même évacuées des systèmes lors des rinçages.

### 2.3.1.2 Acquisition d'images au centre de microscopie du CRCHUM

Toutes les images de TMD ont été acquises en utilisant un microscope confocal inversé de type Leica TCS SP5 II (Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne) muni d'un objectif 20X (sans liquide d'immersion). Pour minimiser la détection de signal d'autofluorescence des échantillons, des seuils supérieurs sont déterminés pour les paramètres d'acquisition, soient l'intensité du laser et le gain des détecteurs. Ces seuils sont choisis au début de chaque expérience en imageant d'abord des TMD non marquées et en s'assurant que seulement un très faible signal soit détecté. Les TMD marquées, toujours positionnées dans leurs puits, sont ensuite imagées en tranches optiques espacées de 10 µm et ce, directement à travers la mince couche de PDMS formant le bas de la plateforme. Le CTG et le PI sont excités séquentiellement en utilisant des lasers de 488 nm et de 561 nm, et leur signal est collecté aux plages de longueurs d'onde 500-550 nm et 600-700 nm, respectivement (Figure 2.8). Les projections maximales, soit la superposition de toutes les tranches optiques d'un même échantillon en une seule image représentant les zones les plus intenses du spécimen sur toute sa profondeur, sont produites pour chaque TMD (Figure 2.6B et Figure 2.6C).
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 2.8: Spectres d'excitation et d'émission associés au CTG (A) et au PI (B). Les longueurs d'onde des lasers et les plages de détection employées lors de l'acquisition des deux signaux sont superposées aux graphiques. Graphiques produits à l'aide de l'outil Fluorescence SpectraViewer de Thermo Fisher Scientific [53].</figcaption></figure>

### 2.3.1.3 Algorithme d'analyse d'images

L'algorithme d'analyse des images de TMD a été réalisé à l'aide de MATLAB (MathWorks®, Natick, MA, É.-U.), un langage de programmation de haut niveau, muni du module « Image Processing Toolbox™ ». Pour quantifier la viabilité, l'algorithme calcule le ratio de l'aire occupée par les cellules viables (marquées avec le CTG) sur l'aire totale occupée par toutes les cellules détectées (marquées avec le CTG ou le PI). Les étapes principales exécutées par l'algorithme pour chacune des séquences d'images sont résumées ci-dessous.

1. Réduire le bruit en appliquant un filtre médian.

2. Égaliser le signal dans les canaux du CTG et du PI en réduisant l'intensité dans les zones au signal élevé et en augmentant l'intensité dans les zones plus sombres.

3. Déterminer les contours des signaux rouge et vert par le calcul du Laplacien des images.

4. Appliquer la méthode de seuillage d'Otsu seulement aux pixels correspondant aux contours trouvés à l'étape 3. Ceci a pour effet d'équilibrer la contribution des pixels du signal de fond avec celle des pixels du signal à segmenter pour la détermination du seuil. La méthode d'Otsu trouve la valeur d'intensité optimale (seuil) qui sépare les pixels en deux classes tout en minimisant la variance intra-classe.
5. Binariser la séquence d'images en utilisant un double seuil pour chacun des deux signaux :

a. Appliquer un seuil équivalent à 75% du signal de saturation à la séquence obtenue de l'étape 1 afin de détecter tout le signal de saturation.

b. Appliquer le seuil trouvé à l'étape 4 à la séquence obtenue de l'étape 2 afin de détecter tout le signal plus faible présent.

c. Unir les régions détectées en a) et en b).

6. Si les signaux segmentés pour le CTG et pour le PI se superposent pour un pixel spécifique, vérifier l'intensité des deux signaux à ce pixel d'intérêt dans l'image originale et assigner une fraction de l'unité d'aire à chacun d'eux suivant la formule suivante :

$$ \text{Fraction de l'aire du signal 1} = \frac{\text{intensité du signal 1 au pixel d'intérêt}}{\text{intensité du signal 1} + \text{intensité du signal 2}} $$

7. Calculer la viabilité globale de chaque échantillon en déterminant le ratio de l'aire du signal CTG-positif sur la somme des aires des signaux CTG-positif et PI-positif.

### 2.3.2 Cytométrie en flux

Cette technique a été mise au point dans le laboratoire de Dre Mes-Masson au CRCHUM par le Dr Abdul Lateef. Toute l'acquisition de données par cette technique a été menée par celui-ci et à quelques occasions, l'auteure de ce mémoire a pu y participer. Les données telles que présentées dans ce mémoire ont été mises en forme et analysées par l'auteure.

La cytométrie en flux est la technique standard employée pour évaluer la viabilité de cellules individuelles. Pour ce faire, une suspension cellulaire doit être incubée avec des fluorophores qui marquent préférentiellement différents stades de mortalité. Ensuite, l'instrument permet de mesurer l'intensité fluorescente de chaque cellule qui passe à l'intérieur de la gaine liquide, devant les lasers (Figure 2.9A). Le profil de diffusion de la lumière (diffusion vers l'avant et sur le côté) est enregistré, ce qui permet d'éliminer de l'analyse toutes les particules indésirables, telles que des fragments de cellules, des poussières, ainsi que des doublets de cellules.
<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Figure 2.9: Principe de fonctionnement d'un cytomètre en flux. A) Une suspension cellulaire (échantillon) est hydrofocalisée par la buse du système de sorte que les cellules circulent une à une à l'intérieur de la gaine liquide. Lorsqu'une cellule passe au niveau du faisceau laser, la lumière diffusée par la cellule est captée par les détecteurs FSC et SSC alors que la lumière fluorescente émise par une cellule marquée est mesurée par d'autres détecteurs (non illustrés). Schéma adapté de « Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS) showing positive cell selection » par Sari Sabban, licensé sous CC BY-SA 3.0 [54]. B) Exemple d'acquisition de données pour des cellules marquées avec l'Annexine V et la 7-AAD, permettant de les catégoriser en trois groupes (rectangles vert, jaune et rouge) selon l'intensité de la fluorescence mesurée pour chaque fluorophore.

Cette technique a été adaptée à notre procédure et employée pour valider les résultats de microscopie confocale. Les TMD sont marquées à l'intérieur des systèmes microfluidiques en utilisant les marqueurs fluorescents d'apoptose : l'annexine V et la 7-AAD (PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I, #559763, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, É.-U.). Pour extraire les TMD des systèmes, les deux couches de PDMS peuvent être décollées et séparées l'une de l'autre (grâce à notre procédé plasma résultant en une adhésion réversible entre les deux couches de PDMS) et ce, sans affecter la position des TMD dans leurs pièges. Toutes les cinq TMD d'un seul système sont retirées de leurs puits à l'aide d'une micropipette et sont groupées dans le même tube pour l'analyse. Le tissu est ensuite incubé avec de la collagénase IV afin que l'action de l'enzyme aidée par l'action mécanique du pipetage répété désagrège le tissu en cellules individuelles. Celles-ci sont mélangées à toutes les fractions de milieu du même système collectées au cours de l'expérience (Figure 2.5). Ceci assure que les cellules qui auraient été extraites des systèmes pendant les changements de milieu (également marquées) soient prises en compte pendant
l'analyse. Les petits fragments de cellules et les doublets sont retirés de l'analyse. Tel que montré à la *Figure 2.9B*, chaque cellule est associée à l'un des trois stades de viabilité selon son marquage fluorescent : en apoptose précoce (marquée par l'annexine V seulement – rectangle jaune), en apoptose tardive ou morte (doublement marquée par la 7-AAD et l'annexine V, ou seulement marquée par la 7-AAD – rectangle rouge), et viable (non marquée – rectangle vert). Certaines TMD sont soumises au même protocole, mais sans l'étape de marquage. Elles sont utilisées, avec les contrôles positifs, pour ajuster le gain des détecteurs et les seuils de détection.

### 2.3.3 Sécrétion du marqueur de mortalité lactate déshydrogénase (LDH)

Cette procédure a été établie pour mesurer la présence d'un biomarqueur de mortalité cellulaire dans le milieu entourant les TMD. Le biomarqueur choisi est une enzyme cytoplasmique, la LDH, qui s'échappe des cellules mortes et peut être mesurée dans le milieu collecté à la sortie d'un système. Cette technique a été employée par d'autres groupes étudiant des échantillons de tissu *ex vivo* [45], [55] puisqu'elle permet un suivi de la mort cellulaire dans le temps. Nous présenterons ici des résultats permettant de comparer cette méthode aux deux introduites précédemment (microscopie confocale et cytométrie en flux).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 2.10: Principe de fonctionnement du test de détection du marqueur de mortalité LDH.</figcaption></figure>

A) La LDH est relâchée des cellules mortes dans le milieu. Après l'ajout de lactate à la solution, la LDH provoque la transformation du sel de tétrazolium (INT) ou la résazurine en une forme détectable par mesure d'absorbance (formazan) [56] ou de fluorescence (résorufine) [57].

B) Photographie d'une portion de plaque à 96 puits où des fractions de milieu ont été incubées avec le mélange de réaction du kit de détection de LDH par absorbance, montrant différentes absorbances des solutions associées à des quantités différentes de LDH relâchées dans le milieu par les TMD en fonction du jour de prélèvement dans le système microfluidique.
### 2.3.3.1 Particularités du test LDH effectué au CRCHUM

Tel qu’illustré à la Figure 2.5, des fractions de milieu (60 µL) sont collectées aux différents temps d’analyse en changeant le milieu d’un même système pour suivre l’évolution de la sécrétion du marqueur de mortalité dans le temps. Tous les échantillons de milieu ainsi récoltés sont conservés à 4°C jusqu’au dernier jour d’analyse. Ce jour-là, les cinq TMD du système suivi sont collectées et digérées – en suivant la même procédure (décrite à la section 2.3.2) que pour les échantillons passés en cytométrie – puis sont lysées pour libérer toute la LDH restante dans les cellules jusque-là viables de l’échantillon.

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Figure 2.11: Justification du temps de demi-vie utilisé pour corriger les mesures de LDH. Courbe bleue : moyenne de la quantité de LDH mesurée pour quatre différents échantillons de cellules lysées en fonction du temps de conservation à 4°C; courbe orange : courbe théorique d’une décroissance exponentielle pour un temps de demi-vie de cinq jours. Les barres d’erreur représentent ± l’écart-type sur quatre mesures de LDH d’échantillons différents.

La LDH présente dans chaque fraction de milieu et dans le tissu lysé est quantifiée à l’aide d’un kit de détection en absorbance (Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH), #04744926001, Roche Diagnostics, Basel, Suisse) en utilisant 50 µL d’échantillon, 100 µL de mélange de réaction et 50 µL de solution d’arrêt. Pendant la période d’incubation d’environ 30 minutes à 37°C avec le mélange de réaction, la LDH présente dans la solution induit la conversion d’une molécule incolore, le sel de tétrazolium (INT), en une composante rouge, le sel de formazan, détectable à l’aide d’un lecteur d’absorbance à 490 nm (Figure 2.10A) [56]. Chaque mesure est associée à une quantité de LDH grâce à une courbe standard. En général, les échantillons lysés contiennent beaucoup plus de LDH que les fractions de milieu. Dans ces circonstances, ils sont dilués afin que
l'absorbance mesurée demeure dans la portion linéaire de la courbe standard. Le temps de demi-vie de la LDH conservée à 4°C est estimé à cinq jours (Figure 2.11). Pour tenir compte de la dégradation (supposée exponentielle) de l'enzyme, les mesures d'absorbance sont divisées par le facteur de correction $0,87^n$, où n est le nombre de jours s'étant écoulés entre l'extraction du milieu du système et le jour de la quantification de la LDH. Chaque mesure est de plus normalisée par rapport à la somme des quantités de LDH mesurées dans tous les échantillons d'un même système. Puisque la quantité de LDH relâchée est proportionnelle à la mortalité cellulaire, les données sont présentées comme un taux de mortalité (pourcentage de mort par jour).
# CHAPITRE 3 CULTURE SUR PUCE DE TUMEURS MICRO-DISSÉQUÉES

Ce chapitre met en lumière tous les résultats générés pour répondre aux objectifs de ce projet de maîtrise. D'abord, la distribution de la taille des TMD est montrée pour différents types de xénogreffe. Ensuite, la plateforme microfluidique est caractérisée : le mécanisme de piégeage est décrit en détails, la contrainte de cisaillement maximale exercée sur le tissu est calculée, les conditions de stabilité des TMD dans leur piège sont discutées et le transport de nutriments dans le système microfluidique est étudié à l'aide d'un modèle simple de diffusion et de consommation d'oxygène. De plus, l'analyse de viabilité des quatre différents types de TMD est faite par trois techniques d'analyse complémentaires. Enfin sont montrés les résultats d'un test préliminaire de réponse du tissu cancéreux primaire d'une patiente à un traitement de chimiothérapie effectué au sein de la plateforme.

## 3.1 Découpe de tumeurs à des tailles sous-millimétriques

Toute la procédure impliquant le sectionnement, le chargement dans les plateformes microfluidiques et l'incubation sur plusieurs jours a d'abord été optimisée en utilisant quatre types de xénogreffes de souris formées de cellules de cancers de la prostate (22Rv1 et PC3) et de l'ovaire (OV90 et TOV112D). Comparé au modèle de sphéroïdes utilisé précédemment [30], ce modèle de tumeur ajoute deux niveaux de complexité qui faciliteront ensuite la transition vers l'utilisation de tissu humain de patients. Premièrement, les xénogreffes doivent être extraites de la souris et être maintenues en vie dans un environnement différent *in vitro*, au sein des plateformes microfluidiques. Deuxièmement, les tumeurs de souris doivent être sectionnées en de multiples échantillons sous-millimétriques pouvant être insérés dans plusieurs systèmes microfluidiques.

Des TMD de tailles reproductibles ont été obtenues en découpant des minces tranches de tissu d'environ 300 µm d'épais à l'aide d'un vibratome, puis en coupant davantage les tranches en petits disques à l'aide d'un poinçon à biopsie de 500 µm de diamètre. Le diamètre rapporté pour chaque TMD correspond à la moyenne de deux mesures perpendiculaires de la largeur prises sur la projection maximale de la séquence d'images acquise au microscope confocal.

La Figure 3.1A montre la médiane des mesures de diamètre, groupées par type de TMD. Une légère variation du diamètre en fonction du type de tissu peut être observée en plus d'une
importante variabilité pour un même type de tissu. Ces différences peuvent être dues aux propriétés mécaniques variables des tissus tumoraux, en particulier leur élasticité [58]. On s'attend à ce qu'un tissu plus élastique s'étire davantage lors du sectionnement à cause de la force de compression appliquée par le poinçon à biopsie sur celui-ci. Après avoir été sectionné, le tissu reprendrait sa configuration initiale relaxée, ce qui aurait pour effet de produire une TMD plus petite que dans le cas d'un tissu moins élastique. Une autre cause possible de fluctuations du diamètre provient de la réduction graduelle du diamètre du poinçon causée par son usure.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 3.1: Diamètres des TMD mesurés sur les projections maximales des séquences d'images acquises par microscopie confocale. A) Superposition des mesures individuelles pour chaque TMD (cercles bleus, l'éparpillement en x est fonction de la densité des points à un diamètre donné) et du diagramme de quartiles (médiane : ligne noire épaisse et quartiles : bords inférieur et supérieur de la boîte noire) pour chaque type de tissu analysé. B) Histogramme (barres bleues) de tous les diamètres mesurés pour un nombre total (n) de 519 TMD, indépendamment du type de tissu et ajustement gaussien de la distribution (courbe rouge).</figcaption></figure>

La Figure 3.1B montre l'histogramme de tous les diamètres mesurés indépendamment du type de tissu. La distribution semble suivre une loi gaussienne de moyenne (μ) égale à 381 μm et d'écart-type (σ) égal à 47 μm. 90% des TMD avaient donc un diamètre entre 303 μm et 458 μm. La hauteur des TMD n'a toutefois pas été mesurée, mais le déplacement vertical de coupe au vibratome a toujours été fixé à 300 μm. La hauteur des TMD devrait donc être près de cette valeur, faisant des TMD des échantillons cylindriques de rapport d'aspect (hauteur/diamètre) près de 1. La
taille des TMD s'apparente donc à celle de sphéroïdes matures après sept jours de formation en gouttelettes suspendues (voir Tableau 3.1).

En réponse à l'objectif 1 du projet de maîtrise, la procédure de coupe a donc permis de produire des TMD de forme discoïdale aux dimensions reproductibles d'environ 380 µm de diamètre par 300 µm de haut. La taille assez uniforme des TMD facilite leur manipulation et permet de concevoir des systèmes d'incubation mieux adaptés. Ces dimensions peuvent être utiles pour effectuer des simulations numériques nécessaires à la caractérisation complète du mode de piégeage et de la stabilité des TMD dans leurs puits, entre autres. La prochaine section caractérise le système dans lequel sont cultivées les TMD, plus particulièrement ce qui leur permet d'être piégées de manière stable et de survivre au sein du microsystème conçu dans le cadre de ce projet.

## 3.2 Caractérisation de la plateforme microfluidique

### 3.2.1 Mécanisme de piégeage des TMD

Une fois positionnée au-dessus d'un puits microfluidique, il a été observé expérimentalement qu'une TMD sédimente jusqu'au fond de celui-ci en une à deux secondes. Deux conditions doivent être respectées pour que le piégeage par sédimentation se produise : les TMD doivent être d'une densité supérieure à celle du milieu environnant et le temps de sédimentation doit être inférieur au temps de convection au-dessus des pièges.

#### 3.2.1.1 Critère 1 : densité des TMD

Premièrement, les cellules sont sensiblement plus denses que le milieu dans lequel on les cultive, ce qui remplit la première condition. Les organelles et les protéines qu'elles contiennent sont simplement plus denses qu'une solution isotonique. D'ailleurs, cette caractéristique est exploitée dans les cultures en boîtes de Pétri où les cellules doivent sédimenter au fond de la boîte afin de former un tapis cellulaire en adhérant à la surface.

L'équation décrivant la vitesse en régime permanent d'une sphère qui sédimente dans un compartiment infini de fluide (équation 3-1) peut être dérivée de la deuxième loi de Newton, tel que montré ci-dessous, en considérant la force de friction ($F_{friction}$) s'opposant à la force gravitationnelle ($F_{gravité}$) exercée sur une particule sphérique.
$$ \sum F = m \cdot a \qquad F: \text{force} $$

m: masse

m<sub>eff</sub>: masse effective de la particule

a: accélération

d: diamètre de la particule sphérique

η: viscosité du fluide

v: vitesse de la particule

t: temps

Δρ: densité effective, ρ<sub>particule</sub> - ρ<sub>milieu</sub>

$$ F_{\text{friction}} + F_{\text{gravité}} = m_{\text{eff}} \cdot a $$

$$ -3\pi\eta d \cdot v + m_{\text{eff}}g = m_{\text{eff}} \cdot \frac{dv}{dt} $$

$$ v_{\text{sed}} = \frac{\Delta \rho g \left( \frac{\pi d^3}{6} \right)}{3\pi\eta d} \left( 1 - e^{-3\pi\eta dt / \left( \frac{\Delta\rho\pi d^3}{6} \right)} \right) $$

En régime permanent :

$$ v_{\text{sed}} = \frac{\Delta \rho g d^2}{18\eta} \qquad (3-1) $$

Cette équation montre qu'à densités égales, des sphères plus grandes sédimentent beaucoup plus rapidement, proportionnellement à leur diamètre au carré. Cela explique pourquoi cette approche de piégeage est applicable pour les TMD ($d \sim 380 \ \mu\text{m}$) et paraît bien moins intéressante pour les cellules individuelles ($d \sim 10 \ \mu\text{m}$), qui sédimentent environ 1500 fois moins vite dans un milieu infini. La technique de piégeage par sédimentation est donc plus attrayante pour des morceaux de tissu de diamètre supérieurs à quelques centaines de micromètres, tels que les TMD.

Cependant, dans le cas du microsystème à l'étude, l'équation 3-1 doit être corrigée pour les dimensions finies du milieu entourant les TMD. En effet, puisque la largeur des puits microfluidiques de 600 µm est seulement légèrement plus grande que le diamètre des TMD, les côtés des puits ralentissent significativement le processus de sédimentation en ajoutant une composante de friction au mouvement des particules. Néanmoins, il a été observé expérimentalement que les TMD sédimentent typiquement jusqu'au fond des puits – sur une distance totale de 500 µm – en moins de deux secondes. Leur vitesse de sédimentation vaut donc plus de 0,25 mm/s, ce qui est au plus 7,5 fois plus lent que la vitesse moyenne de 1,86 mm/s mesurée en milieu infini (Tableau 3.1).

Le temps de sédimentation de quelques TMD, dont le diamètre avait préalablement été mesuré, a été chronométré sur une distance de 5 cm, dans un tube de 1,1 cm de large. Le ratio du diamètre de la particule sur le diamètre du tube vaut ~0,035, alors l'effet du bord du tube a pu être négligé. La vitesse de sédimentation calculée correspond donc à celle dans un milieu infini. De ces mesures de vitesse, la densité du tissu a été approximée à l'aide de l'équation 3-1 en supposant une
particule sphérique d'un diamètre correspondant à celui trouvé pour chaque TMD. Le Tableau 3.1 regroupe les moyennes de vitesses de sédimentation, de diamètres et les approximations des densités correspondantes pour différents types de tissu.

<table><caption>Tableau 3.1: Vitesses de sédimentation dans un milieu infini ($v_{sed,inf}$), approximation de densités relatives ($\Delta\rho$) par rapport au HBSS et de densités absolues ($\rho$) pour différents types de tissus</caption><thead><tr><th>Type de tissu</th><th><i>v</i><sub>sed,inf</sub><br>(mm/s)</th><th><i>d</i><br>(µm)</th><th>Δ<i>ρ</i><br>(kg/m<sup>3</sup>)</th><th><i>ρ</i><br>(kg/m<sup>3</sup>)</th><th><i>n</i></th></tr></thead><tbody><tr><td>TMD 22Rv1 (jour 1)</td><td>1,92 ± 0,67</td><td>385 ± 31</td><td>21 ± 6</td><td>1027 ± 6</td><td>14</td></tr><tr><td>TMD PC3 (jour 1)</td><td>0,77 ± 0,18</td><td>350 ± 15</td><td>10 ± 2</td><td>1016 ± 2</td><td>5</td></tr><tr><td>TMD OV90 (jour 1)</td><td>2,08 ± 0,48</td><td>392 ± 26</td><td>22 ± 6</td><td>1028 ± 6</td><td>7</td></tr><tr><td>Moyenne TMD</td><td>1,59 ± 0,71</td><td>376 ± 22</td><td>18 ± 7</td><td>1024 ± 7</td><td></td></tr><tr><td>Sphéroïde OV90 (jour 7)</td><td>2,77 ± 0,3</td><td>412 ± 43</td><td>27 ± 6</td><td>1033 ± 6</td><td>20</td></tr><tr><td>Sphéroïde TOV112D (jour 7)</td><td>1,78 ± 0,54</td><td>366 ± 79</td><td>22 ± 6</td><td>1028 ± 6</td><td>29</td></tr><tr><td>Moyenne sphéroïdes</td><td>2,27 ± 0,70</td><td>389 ± 33</td><td>25 ± 4</td><td>1031 ± 4</td><td></td></tr><tr><td>Moyenne TMD et sphéroïdes</td><td>1,86 ± 0,72</td><td>381 ± 24</td><td>21 ± 6</td><td>1027 ± 6</td><td></td></tr></tbody></table>

Chaque mesure est exprimée par la moyenne pour un nombre ($n$) d'échantillons ± l'écart-type. Les moyennes et écart-types des trois mesures de TMD, des deux mesures de sphéroïdes et du total des cinq mesures de tissus sont aussi montrées.

Il est intéressant de noter que la densité trouvée pour les TMD de xénogreffe OV90 au premier jour après la récolte est très similaire à la densité trouvée pour les sphéroïdes formés du même type de cellule après sept jours de culture en gouttelettes suspendues. On peut donc s'attendre à ce que ces deux types de tissus sédimentent de manière similaire dans les microsystèmes. À l'exception des TMD de xénogreffe PC3, toutes les densités relatives trouvées pour les différents types de tissus, autant pour les TMD que pour les sphéroïdes, se situent autour de la moyenne de 21 kg/m³. Cette densité relative a été calculée par rapport au HBSS, soit le milieu de chargement des TMD dans la plateforme. On trouve donc une densité absolue moyenne du tissu autour de 1027 kg/m³ étant donné une densité approximative du HBSS de 1006 kg/m³. L'expérience a été répétée à deux reprises pour les TMD de xénogreffe 22Rv1, et des résultats très similaires ont été obtenus (22 ± 8 kg/m³ à la première expérience et 21 ± 5 kg/m³ à la deuxième). Il pourrait être intéressant de répéter l'expérience pour des TMD de xénogreffe PC3 afin de vérifier si la densité relative plus de deux fois plus faible est une caractéristique intrinsèque de ce type de tissu et, si tel est le cas, de tenter d'identifier la cause de cette différence. Une cause possible pourrait être une plus faible densité cellulaire du tissu. Dans tous les cas, cette différence de densité
pourrait être exploitée pour valider expérimentalement, avec plus d'un point, certains résultats de simulation, tels que le débit minimal d'éjection des particules des puits qui est fonction de la densité du tissu.

### 3.2.1.2 Critère 2 : temps de convection des TMD au-dessus du puits

Pour remplir le deuxième critère, soit que le temps de convection au-dessus du puits soit supérieur au temps de sédimentation, les TMD ont été manipulées à l'aide d'une micropipette contrôlée par l'utilisateur. Celui-ci a pu choisir la direction de mouvement des TMD dans le canal en aspirant ou en expulsant du liquide à la sortie du microsystème, et a pu les arrêter lorsqu'elles étaient positionnées au-dessus d'un puits pour leur laisser le temps de sédimenter jusqu'au fond. Cette méthode s'est avérée rapide et efficace. Cinq TMD ont généralement pu être piégées dans un système en moins d'une minute.

Si une approche automatisée avait plutôt été adoptée où les TMD avaient été contrôlées à débit constant par une pompe connectée au canal, l'étape de chargement aurait été plus longue et le taux de succès aurait probablement été plus faible. D'abord, un débit assez lent aurait été fixé, afin de s'assurer que le temps de convection demeure plus grand que le temps de sédimentation pour la majorité des TMD malgré des variations de taille et de densité. En supposant qu'une particule ayant sédimenté sur une distance correspondant à son demi-diamètre (190 µm) avant d'avoir traversé le puits se trouve piégée, le temps de sédimentation moyen à respecter serait d'environ 1,6 secondes pour une particule moins dense ($\Delta\rho$ = 10 kg/m³) ou de 0,6 secondes pour une particule plus dense ($\Delta\rho$ = 27 kg/m³). Ces temps de sédimentation ont été trouvés en utilisant les vitesses de sédimentation en milieu infini (équation 3-1) divisées par un facteur 7,5 pour tenir compte des dimensions finies du système. Afin d'assurer la capture d'une majorité de TMD, le temps de sédimentation pour les particules de densité plus faible a été utilisé pour calculer le débit de 8,1 µL/min qui devrait être appliqué dans le système. Le volume total du canal étant égal à 29 µL, le processus de chargement automatisé prendrait environ 3,5 minutes pour faire avancer les TMD de l'entrée du canal jusqu'au dernier piège. En plus de prendre plus de temps que la méthode manuelle, cette méthode automatisée risquerait d'entraîner le piégeage de plusieurs échantillons dans un même puits. Aussi, certains types de tumeurs ont plus tendance à adhérer aux surfaces des canaux, ce qui poserait davantage problème à faible débit par la méthode automatisée.
Pour être piégées par sédimentation, les TMD doivent donc être plus denses que le milieu de chargement et avoir suffisamment de temps, soit une à deux secondes, pour se déposer au fond des pièges. La première condition est respectée par la nature même des TMD dont la densité a été approximée à 1027 kg/m³ en se basant sur des résultats expérimentaux de sédimentation en milieu infini. La deuxième condition est aussi facilement respectée par l'usager lors du chargement manuel des TMD dans les microsystèmes. Les forces de cisaillement et d'éjection auxquelles sont soumises les TMD une fois piégées sont traitées dans les prochaines sections.

### 3.2.2 Contraintes de cisaillement

Le microsystème conçu prévient contre des forces de cisaillement trop élevées autour du tissu qui pourraient endommager les cellules à sa surface ou favoriser sa fragmentation. En effet, les TMD ont été soumises à de très petites contraintes de cisaillement, même à des débits relativement élevés. Pour trouver une valeur limite supérieure à cette contrainte, elle a été calculée sur la paroi inférieure du canal, au point (p) indiqué à la Figure 3.2 où la dérivée du profil de vitesse dans la section transverse est à son maximum à cause d'un écoulement de Hagen-Poiseuille.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 3.2: Définition des variables et des dimensions du système pour le calcul de la contrainte de cisaillement maximale. A) Vue de côté du canal et d'un puits où une TMD est piégée. B) Section transverse du canal prise dans la zone canal et définition du système d'axes. Le point (p) indique l'endroit où la contrainte de cisaillement est calculée.</figcaption></figure>

Le profil de vitesse $v_x(y, z)$ dans un canal à section carrée de largeur $W$ est représenté par l'équation 3-2, dérivée des équations de Navier-Stokes en posant des vitesses nulles aux parois comme conditions aux frontières (voir la définition du système d'axes à la Figure 3.2) [59]. $\Delta P$ est
la variation de pression entre l'entrée et la sortie du canal, $\eta$ est la viscosité dynamique du milieu et $L$ est la longueur totale du canal.

$$v_x(y, z) = \frac{4W^2 \Delta P}{\pi^3 \eta L} \sum_{n \text{ impairs}} \frac{1}{n^3} \left[ 1 - \frac{\cosh\left(\frac{n\pi y}{W}\right)}{\cosh\left(\frac{n\pi}{2}\right)} \right] \sin\left(\frac{n\pi z}{W}\right) \quad (3-2)$$

Le cisaillement maximal dans tout le système se trouve au centre des parois du canal, c'est-à-dire aux coordonnées $(y, z) = (0, 0)$, $(W/2, W/2)$, $(-W/2, W/2)$ et $(0, W)$. La contrainte de cisaillement sur une surface se calcule comme la viscosité multipliée par le gradient de la vitesse du fluide dans la direction perpendiculaire à la surface, tel que décrit à l'équation 3-3 [60]. La contrainte au point $p = (0, 0)$ peut être calculée comme suit.

$$\sigma_{zx}(y, z) = \eta \frac{\partial v_x}{\partial z} \quad (3-3)$$

$$\sigma_{zx}(y, z) = \frac{4W^2 \Delta P}{\pi^3 L} \sum_{n \text{ impairs}} \frac{\pi}{n^2 W} \left[ 1 - \frac{\cosh\left(\frac{n\pi y}{W}\right)}{\cosh\left(\frac{n\pi}{2}\right)} \right] \cos\left(\frac{n\pi z}{W}\right)$$

$$\sigma_{zx}(0, 0) = \frac{4W^2 \Delta P}{\pi^3 L} \sum_{n \text{ impairs}} \frac{\pi}{n^2 W} \left[ 1 - \frac{1}{\cosh\left(\frac{n\pi}{2}\right)} \right] \quad (3-4)$$

Supposons une variation de pression entre l'entrée et la sortie du canal de 85,6 Pa associée à un débit de 5 µL/s, représentatif du débit maximal imposé lors de la procédure de changement de milieu. Pour la largeur de canal (W) égale à 600 µm, la contrainte de cisaillement sur la paroi calculée à l'aide de l'équation 3-4 vaut 0,22 Pa ou 2,2 dyne/cm². Cette valeur est prise dans la région du dispositif où la vitesse est maximale. En effet, le changement de hauteur du canal de $h_1$ à $h_2$ au niveau des puits (Figure 3.2) provoque un ralentissement de la vitesse du fluide au-dessus de l'échantillon. La valeur calculée ci-dessus peut donc être considérée comme une valeur plafond pour la contrainte de cisaillement sur les TMD. Elle est en-dessous des valeurs critiques d'environ 10 dyne/cm² causant la mort de certaines cellules de mammifères [61] et bien en-deçà de valeurs d'environ 3000 dyne/cm² causant le détachement de monocouches de cellules de fibroblastes [62]. Pendant le chargement des TMD, les contraintes de cisaillement exercées sur les surfaces du tissu
sont aussi considérées très faibles puisque les TMD circulent avec le courant et ainsi, la vitesse relative des TMD par rapport au fluide entre la surface du tissu et la paroi du canal tend vers zéro.

En somme, autant au moment du chargement des TMD qu'au moment où le milieu est renouvelé dans les systèmes, les TMD ne sont soumises qu'à de faibles contraintes de cisaillement. Ceci est une conséquence directe du mode de piégeage choisi où les échantillons se trouvent protégés à l'intérieur de leur puits microfluidique, même lorsque des débits élevés sont imposés dans le canal. Une autre caractéristique intéressante des systèmes résultant de ce mode de piégeage est la stabilité des TMD dans les systèmes, tel que détaillé à la prochaine section.

### 3.2.3 Stabilité des TMD dans les puits microfluidiques

La position des TMD au fond des puits est très stable, à moins que des hauts débits ne soient appliqués. Avec l'augmentation de la vitesse du fluide dans les canaux, des effets inertiels pourraient entraîner l'éjection des TMD.

Le nombre de Reynolds (équation 3-5) représente le ratio des forces inertielles sur les forces visqueuses et il peut être utilisé pour déterminer quelles forces dominent dans le système à différents débits. Dans les systèmes à l'étude, il est difficile de caractériser complètement la vitesse autour des échantillons. On peut tout de même trouver des approximations des bornes supérieure et inférieure à la valeur du nombre de Reynolds en constatant que la vitesse dans la zone du puits ne peut pas dépasser la vitesse au sein du canal de hauteur $h_1 = W = 0,6$ mm, ni être inférieure à la vitesse qui serait trouvée dans un canal de hauteur $h_2 = 1,1$ mm (définitions de $h_1$ et $h_2$ à la Figure 3.2). La longueur caractéristique ($L_c$) utilisée est la hauteur $h_2$ de la zone du piège. $v$ est la vitesse moyenne, $Q$ est le débit, puis $\rho$ et $\eta$ sont respectivement la densité et la viscosité dynamique du milieu.

$$ Re = \frac{\rho v L_c}{\eta} \qquad (3-5) $$

$$ \frac{\rho Q}{W \eta} < Re < \frac{\rho Q h_2}{W^2 \eta} $$
Ainsi, on trouve que le régime est laminaire et les forces visqueuses dominent jusqu'à un débit d'environ 2 à 3,6 µL/min (Re < 0,1) tandis que le régime reste laminaire et les forces inertielles dominent lorsque le débit dépasse environ 200 à 360 µL/min (Re > 10).

L'un des effets inertiels pouvant provoquer l'éjection du tissu est le gradient de pression qui se développe entre l'échantillon et le canal en suivant le principe de Bernoulli. Ce gradient peut créer suffisamment de portance sur l'échantillon pour vaincre la force gravitationnelle et les autres effets hydrodynamiques agissant à maintenir la TMD au fond du puits. La libération des échantillons de leurs puits a été observée expérimentalement à des débits supérieurs à 800 µL/min. Le débit maximal induit dans les canaux à l'aide d'une micropipette est de 5 µL/s = 300 µL/min. À ce régime d'opération, les échantillons restent dans les puits même si les effets inertiels dominent. La géométrie des puits confine donc suffisamment les échantillons de sorte qu'ils ne sont pas libérés à des débits normaux d'opération.

Cette stabilité dépendante du débit pourrait être utilisée, au besoin, pour extraire les échantillons du microsystème pour fins d'analyse externe ou pour les acheminer dans un autre module microfluidique, à condition que les surfaces du dispositif soient suffisamment bien traitées pour prévenir l'adhérence des MDT au fond des puits.

La résistance hydraulique totale des microsystèmes conçus est de $1,71 \times 10^{10}$ Pa s/m$^3$. Pour induire un débit de 800 µL/min pouvant éjecter les particules, il faudrait générer une différence de pression ($\Delta P$) de 0,2 kPa. Cette différence de pression est difficile à produire par simple perturbation de la plateforme. Par exemple, il faudrait ajouter du liquide jusqu'à une hauteur de 2 cm dans l'entrée du système pour créer une telle pression. En cas d'inclinaison du système, deux effets se combinent pour favoriser l'éjection des particules. Premièrement, un débit est induit à cause de la différence de hauteur de la colonne de liquide entre l'entrée et la sortie espacées de 17 mm. Deuxièmement, la composante de la force gravitationnelle s'opposant à la force d'éjection est réduite. Par exemple, pour un angle de 45°, une différence de pression de 0,12 kPa serait induite, insuffisante à elle seule pour entraîner l'éjection. Toutefois, à cet angle, la composante de la force gravitationnelle s'opposant à l'éjection correspondrait à seulement 70% de la force gravitationnelle totale s'appliquant sur le tissu. Ces deux effets additionnés pourraient entraîner l'éjection, mais la plateforme devrait être inclinée à un angle d'environ 50° en supposant une relation directe de
proportionnalité entre le débit d'éjection minimal et l'amplitude de la composante de la force gravitationnelle s'opposant à l'éjection.

Enfin, il peut être conclu que le piégeage des échantillons est stable dans les microsystèmes : les échantillons peuvent résister aux débits normaux induits lors de la procédure de changement de milieu ainsi qu'à des perturbations légères lors de la manipulation des plateformes. Cela constitue une amélioration importante comparativement aux systèmes à piégeage résistif précédemment utilisés au laboratoire, tel que discuté à la section 4.1.

En réponse à l'objectif 2, une plateforme microfluidique a été conçue pour permettre de piéger les TMD de manière stable en minimisant les contraintes de cisaillement. Chaque plateforme, de par sa conception, permet d'exposer les TMD piégées à différentes conditions grâce aux cinq canaux indépendants qu'elle comporte (voir la section 2.2 pour une description détaillée du design).

### 3.2.4 Transport d'oxygène et de nutriments sans perfusion

Au sein de la plateforme, la diffusion entre le canal du haut et l'intérieur des puits permet aux TMD d'obtenir des nutriments, d'être exposées aux agents chimiques du milieu et de disposer de leurs déchets cellulaires. Après l'ajout de milieu frais dans les canaux, les nutriments du canal diffusent graduellement jusque dans les puits pour être consommés par les TMD alors que les déchets produits diffusent dans la direction opposée vers l'extérieur des puits. Puisque le temps de diffusion d'une molécule dépend en partie de sa taille, des petites molécules comme des ions diffusent rapidement dans les puits alors que des molécules plus larges comme le glucose prennent plus de temps à diffuser jusqu'aux TMD. En suivant l'approximation du temps de diffusion décrite à l'équation 3-6 [59], une molécule de glucose ayant une constante de diffusion (D) dans l'eau de 600 µm²/s prendrait approximativement 3,5 minutes à diffuser sur une distance totale (x) de 500 µm jusqu'au fond d'un puits. Les petites dimensions du système facilitent donc le transport par diffusion des nutriments qui se fait dans des délais raisonnables.

$$t \approx \frac{x^2}{2D} \qquad (3-6)$$
### 3.2.4.1 Calcul du rayon critique d'un tissu tumoral sphérique pour éviter l'anoxie

Les premières analyses de l'effet de l'hypoxie sur la mort cellulaire dans des tissus tumoraux remontent à plus d'un demi-siècle. En 1955, Thomlinson et Gray [63] ont étudié expérimentalement la distribution de mort cellulaire dans des échantillons de tumeurs de poumons prélevés par chirurgie. Ils ont constaté que le pourtour de leurs échantillons cylindriques était majoritairement vivant alors que leur cœur montrait des signes de mort cellulaire abondante. Par un modèle de diffusion simple, ils ont fait le calcul théorique approximatif de la distribution d'oxygène à l'intérieur des tissus étudiés en supposant une constante de diffusion dans le milieu et dans le tissu correspondant à celle du dioxygène dans l'eau.

En considérant une réaction d'ordre 0 où le rythme de consommation d'oxygène ne dépend pas de sa concentration, ils ont trouvé une relation entre le rayon critique calculé pour éviter l'anoxie (déplétion complète d'oxygène) au centre du tissu et le rayon des structures cylindriques de tumeurs mesuré expérimentalement à partir de coupe histologiques. Un raisonnement similaire, présenté ci-dessous, peut être suivi pour calculer de manière approximative le rayon critique d'échantillons de tumeur de forme sphérique.

Pour résoudre ce problème, deux sous-domaines délimités par la surface de l'échantillon sphérique doivent être considérés. Dans le premier sous-domaine du tissu, il y a diffusion et consommation d'oxygène. Dans le second sous-domaine du milieu environnant, l'oxygène diffuse seulement. Les variables utilisées pour la résolution du problème sont décrites dans le Tableau 3.2.
<table><caption>Tableau 3.2: Description des variables pour le calcul de la concentration d'oxygène dans un échantillon de tissu tumoral et dans le milieu environnant</caption><thead><tr><td>Variable</td><td>Description</td><td>Valeur</td><td>Source</td></tr></thead><tbody><tr><td>C<sub>max</sub></td><td>Concentration maximale de dissolution de l'oxygène dans l'eau à 37°C et à 0,2 atm.</td><td>0,20 mol/m<sup>3</sup></td><td>Loi de Henry [64]</td></tr><tr><td>Q = q/ρ</td><td>Débit maximal de consommation d'oxygène pour une masse humide de tissu cancéreux</td><td>25 µL O<sub>2</sub>/g/min = 1,70 x 10<sup>-5</sup> mol/kg/s</td><td>[65]</td></tr><tr><td>ρ</td><td>Densité moyenne du tissu cancéreux</td><td>1027 kg/m<sup>3</sup></td><td>§ 3.2.1.1</td></tr><tr><td>D<sub>T</sub></td><td>Constante de diffusivité de l'oxygène dans le tissu cancéreux à 37°C</td><td>1,75 x 10<sup>-9</sup> m<sup>2</sup>/s</td><td>[66]</td></tr><tr><td>D<sub>M</sub></td><td>Constante de diffusivité de l'oxygène dans l'eau à 37°C</td><td>~2,6 x 10<sup>-9</sup> m<sup>2</sup>/s</td><td>[67]</td></tr><tr><td>q</td><td>Débit maximal de consommation d'oxygène pour un volume de tissu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R<sub>crit</sub></td><td>Rayon critique du tissu de forme sphérique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C<sub>T</sub>(r)</td><td>Concentration d'oxygène dans le tissu à un rayon r &lt; R<sub>crit</sub></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C<sub>M</sub>(r)</td><td>Concentration d'oxygène dans le milieu environnant à un rayon r &gt; R<sub>crit</sub></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C<sub>0</sub></td><td>Concentration à la surface du tissu</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
### 3.2.4.1.1 Sous-domaine du tissu

Considérons un échantillon sphérique dans un milieu infini aqueux saturé d'oxygène. Sans perfusion, l'équation de convection-diffusion se simplifie à ses termes de diffusion, mais un terme (q) est soustrait pour tenir compte de la consommation continuelle d'oxygène par les cellules. Dans ce modèle simplifié de réaction d'ordre 0, q est une constante qui ne dépend ni du temps, ni de la concentration d'oxygène présente, ni de la position dans le tissu. En régime permanent ($\partial C / \partial t = 0$) et après avoir développé l'expression de l'opérateur laplacien en coordonnées sphériques où les termes relatifs aux angles $\theta$ et $\varphi$ ne sont pas retenus puisque la concentration varie seulement suivant le rayon (r), l'équation se simplifie et peut être résolue pour $C(r)$ en intégrant deux fois.

$$ \frac{\partial C}{\partial t} = D \nabla^2 C - q \quad (3-7) $$

$$ 0 = D_T \frac{1}{r^2} \frac{\partial}{\partial r} \left( r^2 \frac{\partial C_T}{\partial r} \right) - q $$

$$ \text{1ère intégration :} \qquad r^2 \frac{\partial C_T}{\partial r} = \frac{qr^3}{3D_T} + A $$

$$ \text{2e intégration :} \qquad C_T(r) = \frac{qr^2}{6D_T} + \frac{A}{r} + B $$

A et B sont des constantes d'intégration dont les valeurs peuvent être trouvées en utilisant les conditions aux frontières. Premièrement, puisqu'on veut trouver le rayon critique du tissu ($R_{crit}$) tel que l'oxygène consommé par celui-ci soit tout juste égal à l'oxygène disponible par diffusion, la concentration à $r = 0$ en régime permanent vaut 0. Deuxièmement, on pose une concentration quelconque $C_T(R_{crit}) = C_0$ à la surface du tissu. Pour respecter la première condition, il faut que $A = B = 0$. À partir de la seconde condition, on trouve l'équation 3-8.

$$ C_0 = \frac{q R_{\text{crit}}^2}{6 D_T} \quad (3-8) $$

La concentration d'oxygène dans le sous-domaine du tissu suit donc la relation décrite à l'équation 3-9.
$$
\text{Sous-domaine tissu :} \\
(r < R_{\text{crit}}) \qquad C_{\text{T}}(r) = \frac{qr^2}{6D_{\text{T}}} \qquad (3-9)
$$

3.2.4.1.2 Sous-domaine du milieu environnant

Dans le sous-domaine du milieu environnant à l'extérieur du tissu, le terme *q* de l'équation 3-7 tombe à zéro puisqu'il n'y a aucune cellule dans cette région pour consommer l'oxygène. Une fois développée, l'expression simple peut encore être résolue pour *C(r)* en intégrant deux fois.

$$
0 = D_M \frac{1}{r^2} \frac{\partial}{\partial r} \left( r^2 \frac{\partial C_M}{\partial r} \right)
$$

1ère intégration :
$$ \frac{\partial C_M}{\partial r} = \frac{E}{r^2} $$

2e intégration :
$$ C_M(r) = F - \frac{E}{r} $$

E et F sont des constantes d'intégration dont les valeurs peuvent être trouvées en utilisant les conditions aux frontières à l'extérieur du tissu. Premièrement, la concentration à l'infini vaut la concentration maximale d'oxygène dissout dans l'eau à 37°C ($C_{max}$) à pression ambiante partielle d'oxygène dans un incubateur à cellules (0,20 atm) et deuxièmement, la continuité du profil de concentration exige que la concentration à l'interface avec le tissu ($C_M(R_{crit})$) vaille encore la concentration arbitraire $C_0$. La concentration d'oxygène dans le sous-domaine du milieu environnant suit donc la relation décrite à l'équation 3-10.
$$1^{\text{ère}} \text{ condition :} \qquad F = C_{\text{max}}$$

$$2^{\text{e}} \text{ condition:} \qquad E = R_{\text{crit}}(C_{\text{max}} - C_0)$$

$$\text{Sous-domaine milieu :} \qquad (r > R_{\text{crit}}) \qquad C_{\text{M}}(r) = C_{\text{max}} - \frac{R_{\text{crit}}(C_{\text{max}} - C_0)}{r} \qquad (3-10)$$

Pour respecter un bilan massique (conservation des espèces en présence), les concentrations ainsi que les flux de molécules des deux sous-domaines doivent être égaux à l'interface $r = R_{\text{crit}}$.

$$\text{Condition de} \\ \text{continuité des flux :} \qquad -D_{\text{T}} \left. \frac{\partial C_{\text{T}}}{\partial r} \right|_{r=R_{\text{crit}}} = -D_{\text{M}} \left. \frac{\partial C_{\text{M}}}{\partial r} \right|_{r=R_{\text{crit}}}$$

$$\frac{q R_{\text{crit}}}{3} = \frac{D_{\text{M}}(C_{\text{max}} - C_0)}{R_{\text{crit}}}$$

$$\text{En utilisant } C_0 \text{ de} \\ \text{l'équation 3-8 :} \qquad \frac{q R_{\text{crit}}}{3} = \frac{D_{\text{M}} \left( C_{\text{max}} - \frac{q R_{\text{crit}}^2}{6 D_{\text{T}}} \right)}{R_{\text{crit}}}$$

$$R_{\text{crit}} = \sqrt{\frac{6 D_{\text{T}} D_{\text{M}} C_{\text{max}}}{\rho Q (2 D_{\text{T}} + D_{\text{M}})}} \qquad (3-11)$$

Le profil de la concentration d'oxygène suivant le rayon allant du centre vers l'extérieur de l'échantillon est tracé à la Figure 3.3. Pour un rayon infini, la concentration vaut la concentration maximale de dissolution de l'oxygène dans l'eau ($C_{\text{max}}$). En s'approchant du tissu, la concentration décroit suivant une relation proportionnelle à $1/r$ (équation 3-10). Puis à la surface avec le tissu, à $r = R_{\text{crit}}$, le régime change et la concentration devient plutôt proportionnelle à $r^2$ (équation 3-9).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 3.3: Profil de la concentration d'oxygène à l'intérieur et autour d'un échantillon sphérique de tissu en fonction du rayon tel que défini dans les deux sous-domaines du problème. Les unités des axes sont arbitraires.</figcaption></figure>

En appliquant dans l'équation 3-11 les valeurs numériques compilées au Tableau 3.2, un rayon critique de $R_{crit} = 226 \ \mu m$ est trouvé. Ainsi, selon ce modèle, il serait impossible de maintenir en vie un échantillon sphérique de tumeur ayant un diamètre supérieur à $2R_{crit} \approx 450 \ \mu m$. Par ailleurs, la sphère est la géométrie qui permet le transport diffusif le plus rapide comparativement à d'autres géométries de dimensions caractéristiques $2R_{crit}$. Par exemple, le temps caractéristique de diffusion dans une tranche plane de tissu d'épaisseur $2R_{crit}$ est quatre fois plus grand que pour une sphère de même diamètre. Ce calcul théorique constitue donc la justification fondamentale du concept de découpe d'échantillons de tumeurs à des dimensions inférieures au seuil critique d'anoxie pour maximiser la viabilité du tissu. Elle justifie aussi le choix de ne pas perfuser le tissu sachant que cela simplifie grandement le protocole expérimental. En effet, l'ajout de perfusion nécessiterait la présence de pompes seringues et de connections fluidiques encombrantes à l'intérieur de l'incubateur.

De plus, l'effet de la perfusion peut être évalué grâce au modèle précédent. En présence de perfusion, le transport diffusif se trouve augmenté vers la surface de l'échantillon grâce à l'apport convectif de nutriments vers celle-ci. À la limite, lorsque la convection est très rapide, la diffusivité efficace des nutriments dans le milieu environnant tend vers l'infini (le transport se fait à travers une couche limite diffusive d'épaisseur négligeable). Dans cette situation, l'équation 3-11 se réduit à l'équation 3-12 ci-dessous.
$$R_P = \sqrt{\frac{6D_T C_{\max}}{\rho Q}} \approx \sqrt{3} R_{SP} \quad (3-12)$$

$R_P$ est le rayon critique perfusé et $R_{SP}$ est le rayon critique sans perfusion. Ainsi, selon ce modèle, la perfusion rapide des échantillons aurait pour effet de permettre la survie sans anoxie d'échantillons de diamètres 1,7 fois plus grands. Nos échantillons étant inférieurs en taille à $R_{SP}$, nous justifions ainsi la décision de ne pas perfuser les échantillons dans les expériences présentées.

En réalité, les TMD sont piégées dans un microsystème en PDMS et non dans un milieu infini de fluide. Toutefois, puisque le PDMS a une constante de diffusivité pour l'oxygène très similaire à celle de l'eau et puisque la concentration maximale de dissolution de l'oxygène dans le PDMS est plus grande (~0,9 mol/m³ [68]), la présence d'un microsystème en PDMS autour du tissu ne devrait pas diminuer la valeur du rayon critique trouvé. Aussi, il est connu que les cellules peuvent moduler leur consommation d'oxygène en fonction des concentrations disponibles [69], leur permettant ainsi de survivre dans des environnements pauvres en oxygène, ce qui n'a pas été tenu en compte dans ce calcul et aurait pour effet d'augmenter le rayon critique. Le modèle développé dans les équations 3-7 à 3-11 constitue donc une approximation permettant de calculer le rayon minimum à partir duquel l'anoxie devient possible. Les variables les plus incertaines du modèle théorique sont $Q$ et $\rho$ qui peuvent varier d'un type de tumeur à un autre.

En réponse au quatrième objectif de recherche, la détermination du profil de concentration d'oxygène dans le tissu et autour de celui-ci a permis de trouver un rayon critique au-dessus duquel le tissu tumoral risque de manquer d'oxygène. Ce rayon critique de 226 µm est supérieur au rayon moyen des TMD de 190 µm, ce qui permet de conclure que les échantillons produits ont tout juste la bonne taille pour éviter l'hypoxie, même en l'absence de perfusion. Des simulations numériques pourraient permettre de valider ces résultats à l'aide d'un modèle plus complet de la consommation d'oxygène.

### 3.2.4.2 Autres considérations sur la consommation de nutriments par les TMD

Puisque le PDMS est perméable aux gaz, un afflux d'oxygène est présent en permanence dans les microsystèmes malgré l'absence de perfusion. Cependant, les autres nutriments du milieu sont consommés jusqu'à leur épuisement ou jusqu'à ce que le milieu soit changé. Dans ce cas, à
cause de la géométrie particulière du microsystème à l'étude, une solution analytique simple n'existe pas et des simulations numériques devraient être produites pour étudier la consommation de glucose et d'autres nutriments par les TMD. Pour éviter l'épuisement des nutriments et l'accumulation des déchets, le milieu a été changé fréquemment au cours des expériences, généralement un, trois, six et huit jours après le chargement des TMD dans les systèmes. Sachant que des sphéroïdes de plus de 4000 cellules peuvent survivre pendant au moins sept jours dans une gouttelette de 16 µL (~2,3 µL/sphéroïde/jour) [30], une fréquence de changement de milieu allant de un à trois jours semblait raisonnable pour nos microsystèmes contenant 29 µL de milieu et cinq TMD (5,8 à 1,9 µL/TMD/jour).

En raison de la tridimensionnalité du tissu et de la consommation continuelle des nutriments par les cellules, des gradients de nutriments existent au sein de la TMD de la surface externe jusqu'au centre. Ces gradients sont désirables dans un modèle cellulaire, puisqu'ils sont similaires aux gradients naturels existant au sein du tissu *in vivo* [18]. Ces différentes concentrations des molécules peuvent entraîner des variations du comportement physiologique des cellules dans différentes régions du tissu [18], [63]. Les équations développées dans cette section montrent que la petite taille des TMD leur permet d'avoir accès à suffisamment d'oxygène dans un microsystème non perfusé. Toutefois, le milieu doit tout de même être changé fréquemment pour assurer que les autres nutriments ne s'épuisent pas du milieu et pour vider celui-ci des déchets cellulaires produits pendant l'incubation.

## 3.3 Viabilité sur puce des tumeurs micro-disséquées

Après avoir montré que les tumeurs peuvent être coupées de manière reproductible et validé qu'elles peuvent être piégées au sein d'un système microfluidique, il restait à valider expérimentalement que les TMD peuvent être maintenues en vie suffisamment longtemps pour que l'effet de chimiothérapies puisse être évalué dans des expériences subséquentes. Dans un contexte clinique, l'évaluation de l'efficacité de chimiothérapies devrait se faire rapidement afin que le résultat du test puisse aider à choisir la thérapie la plus appropriée, et ce dans le but d'initier le traitement du patient dès que possible. Il est aussi important que le tissu primaire cultivé *in vitro* soit traité dans des délais brefs afin d'éviter qu'un processus de différentiation des cellules se produise en réponse aux nouvelles conditions de culture. Ces critères ont permis de fixer la limite de l'étude de viabilité à huit jours.
Une fois le protocole établi et le système microfluidique optimisé (voir section 4.1), trois techniques complémentaires d'analyse de viabilité ont été adaptées à notre procédure et utilisées pour mesurer la survie des TMD au sein de la plateforme : la microscopie confocale des cellules viables et mortes, la cytométrie en flux pour séparer les cellules composant les TMD selon leur stade de mortalité (viable, apoptose précoce, apoptose tardive) et la détection du marqueur de mortalité LDH dans les fractions de milieu extraites des systèmes. Ces trois techniques présentent des avantages et inconvénients qui leur sont propres, tel que détaillé à la section de discussion 5.1.3.

Tel que présenté à l'Annexe A, la procédure de coupe et d'incubation dans les plateformes microfluidiques a été adaptée à du tissu de foie de rat lors du stage dans le laboratoire de Dre Verpoorte, aux Pays-Bas. Cela a permis d'explorer plusieurs techniques d'analyse qui pourraient aussi s'avérer utiles pour l'étude du cancer. En plus de l'analyse de viabilité faite par la détection de la LDH sécrétée dans le milieu et par microscopie confocale des échantillons marqués, les tissus micro-disséqués de foie (TMDF) ont été imagés par microscopie à deux photons et leur métabolisme a été évalué grâce à la séparation et à la détection de molécules par chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP).

### 3.3.1 Analyse de viabilité par microscopie confocale

La viabilité des échantillons a été évaluée en mesurant la fluorescence des cellules marquées avec des fluorophores de viabilité et de mortalité (CTG et PI, respectivement) par microscopie confocale. L'imagerie des échantillons s'est faite directement à travers la mince couche inférieure de la plateforme faite de PDMS transparent. Tel que détaillé à la section 4.2 du Chapitre 4, les pourcentages de viabilité et de mort cellulaire ont été trouvés par un algorithme d'analyse des séquences d'images, programmé pour trouver automatiquement le seuil à appliquer dans les deux canaux de fluorescence afin de distinguer le signal (provenant des cellules marquées) du bruit de fond et pour calculer le ratio de l'aire de chacun des deux signaux sur l'aire totale détectée.

La Figure 3.4 présente l'évolution de la viabilité des échantillons sur huit jours d'incubation dans les plateformes. Ces résultats montrent que les TMD de xénogreffe demeurent très viables tout au long de l'expérience, avec des viabilités moyennes au-dessus de 60% pour tous les types de tissus analysés. De plus, aucune baisse significative de viabilité n'a été mesurée sur cette période d'analyse, ce qui semble indiquer que les microsystèmes n'affectent pas les échantillons et que les conditions de culture sont suffisantes pour maintenir le tissu en vie.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 3.4: Compilation des résultats de viabilité des TMD de quatre types de xénogreffes de souris, mesurés par microscopie confocale sur une période de huit jours suivant la récolte. La fraction viable de la population a été mesurée comme le ratio de l'aire occupée par les cellules viables (marquées avec le CTG) sur l'aire totale occupée par toutes les cellules marquées tandis que la fraction morte a été mesurée comme le ratio de l'aire des cellules en apoptose tardive ou mortes (marquées avec le PI) sur l'aire totale. Un total de 447 TMD ont été analysées pour produire ce graphique. Chaque barre d'erreur indique ± l'erreur type de la moyenne d'au moins deux expériences indépendantes. Pour chaque barre représentée, n représente le nombre de TMD analysées et E le nombre d'expériences indépendantes effectuées avec des xénogreffes provenant de souris différentes. Les images ont été acquises conjointement par Jennifer Kendall-Dupont et l'auteure, puis ont été traitées et analysées par l'auteure.</figcaption></figure>

### 3.3.2 Analyse de viabilité par cytométrie en flux

Toutes les données présentées dans cette sous-section ont été acquises par Dr Abdul Lateef. Pour valider les résultats de microscopie confocale, l'étude de viabilité a été faite en parallèle par cytométrie en flux après avoir marqué les TMD avec l'annexine V et la 7-AAD, puis dissocié le tissu en cellules individuelles. Les cellules non marquées ont été considérées viables, celles marquées avec l'annexine V, en apoptose précoce et celles marquées seulement à la 7-AAD ou doublement marquées, en apoptose tardive ou mortes. Tel que montré à la Figure 3.5, la viabilité
mesurée au premier jour était plus basse qu'aux jours subséquents d'analyse, en particulier pour les TMD de PC3 et de OV90. En raison de l'importante variabilité des résultats, cette tendance n'est toutefois pas significative au seuil alpha égal à 5%. Au premier jour après la récolte, les échantillons peuvent paraître moins viables, puisqu'ils ne se sont pas complètement rétablis de la procédure de découpe du jour précédent. Au fil du temps, les cellules viables prolifèrent alors que les cellules mortes disparaissent, soit parce qu'elles se désagrègent en petits fragments non détectables ou soit parce qu'elles sont relâchées du tissu. Néanmoins, cette technique d'analyse montre que les TMD regagnent en viabilité dès le jour 3 à partir duquel tous les types de tumeurs analysés ont une viabilité moyenne supérieure à 57%.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 3.5: Compilation des résultats de viabilité des TMD de quatre types de xénogreffes de souris, mesurés par cytométrie en flux sur une période de huit jours suivant la récolte. Les cellules analysées ont été séparées en trois groupes : les cellules viables (non marquées), les cellules en apoptose précoce (marquées avec l'annexine V) et les cellules en apoptose tardive ou mortes (marquées avec l'annexine V et la 7-AAD, ou avec la 7-AAD seulement). Chaque barre d'erreur (sur la fraction viable de la population) représente ± l'erreur type de la moyenne d'au moins deux expériences indépendantes. E représente le nombre d'expériences indépendantes avec des xénogreffes de souris différentes effectuées pour chaque barre représentée. Toutes les données ont été acquises par le Dr Abdul Lateef, puis ont été compilées et interprétées par l'auteure.</figcaption></figure>
De manière générale, les résultats de microscopie confocale concordent bien avec ceux de
cytométrie, sauf au jour 1 pour les TMD de PC3 et de OV90. Notons que la cytométrie catégorise
les cellules en trois groupes, tandis que la microscopie sépare la population en seulement deux
groupes. La différence la plus marquée entre les résultats de cytométrie et ceux de microscopie
confocale s'est produite pour les types de TMD ayant une plus grande proportion de cellules en
apoptose précoce. En détectant les cellules en apoptose précoce en plus de celles en apoptose
tardive, la méthode de cytométrie peut détecter les cellules en processus de mort sur un intervalle
de temps plus long, dès l'initiation de l'apoptose jusqu'à la fragmentation de la cellule morte. En
revanche, il est possible que les cellules en stade précoce d'apoptose puissent encore métaboliser
le CTG et produire un signal de viabilité dans les échantillons de microscopie. Cette différence
importante de marquage des échantillons peut expliquer en partie les différences entre les résultats
des deux modalités d'analyse. Une étude plus exhaustive de la corrélation entre les deux techniques
est présentée à la section 5.1.3.1.

3.3.3 Analyse de sécrétion du marqueur de mortalité LDH

La LDH sécrétée par les TMD est proportionnelle au nombre de cellules mortes. Elle a été
mesurée dans les fractions de milieu collectées à la sortie des systèmes et normalisée à la quantité
totale mesurée pour un même système au cours de toute la période d'analyse. Ainsi, le taux de
mortalité des mêmes échantillons a pu être suivi dans le temps jusqu'au dernier jour d'analyse. Tel
que montré à la *Figure 3.6*, les profils de sécrétion du marqueur de mortalité LDH sont similaires
pour les quatre types de xénogreffes, avec un plus haut taux de mortalité au jour 1, puis des taux
beaucoup plus faibles aux jours subséquents. Ceci indique qu'une importante proportion de cellules
est morte pendant les 24 premières heures suivant la coupe, en particulier pour les TMD de PC3,
ce qui concorde bien avec les résultats plus faibles de viabilité mesurés au jour 1 par cytométrie.
Les échantillons ont vraisemblablement été affectés par la procédure de coupe et ont continué à
mourir pendant le premier jour d'incubation. Aux jours subséquents, les faibles taux de mortalité
corroborent les résultats des deux autres techniques d'analyse, soit que les TMD survivent à
l'intérieur de la plateforme microfluidique, même sans perfusion. À la toute fin de la période
d'incubation, les TMD ont été collectées et intentionnellement lysées pour libérer toute la LDH
restante. De très hautes concentrations de LDH ont été mesurées dans ces échantillons finaux,
indiquant qu'une grande proportion des TMD était encore viable au terme de la période de huit jours.

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Figure 3.6: Taux de mortalité des TMD formées des quatre types de xénogreffes, mesurés comme des taux de sécrétion du biomarqueur de mortalité LDH sur une période de huit jours suivant la récolte. Les résultats sont corrigés pour la dégradation de l'enzyme pendant la période de conservation à 4°C et sont normalisés à la quantité totale de LDH mesurée pour un même système tout au long de l'expérience du jour 1 jusqu'au dernier jour d'analyse. Les barres d'erreur représentent ± l'écart-type sur la moyenne de trois systèmes indépendants d'une seule expérience.

Cette technique offre des résultats intéressants, mais a nécessité plusieurs étapes d'optimisation et comporte encore des limites. En effet, le sérum présent dans les échantillons contenait une quantité basale de LDH, produisant un signal de fond indésirable pouvant cacher la présence de faibles concentrations de LDH sécrétée par les TMD. En retirant un plus petit volume de milieu des microsystèmes (60 µL), des concentrations détectables de LDH sécrétée par les TMD ont été obtenues dans les fractions de milieu malgré le bruit de fond causé par le sérum. De plus, certaines composantes du milieu de culture telles que le pyruvate inhibaient la réaction de conversion qui produit le formazan rouge. Pour contrer cet effet, certains paramètres du test ont dû être modifiés par rapport à ce qui était suggéré par le manufacturier : augmentation du ratio volumique de réactif pour échantillon et hausse du temps et de la température de réaction. Enfin, après avoir réalisé que la LDH se dégradait significativement pendant la période de conservation à 4°C, le taux de dégradation de l'enzyme a été mesuré expérimentalement et un facteur de correction
a été appliqué aux mesures (Figure 2.11). Une solution alternative à ce problème de dégradation pourrait être d'ajouter un inhibiteur de protéases aux fractions de milieu une fois retirées des systèmes, puis de conserver les échantillons au réfrigérateur ou au congélateur jusqu'au moment de l'analyse.

Un autre élément important à considérer est la dégradation de l'enzyme LDH se produisant à l'intérieur des systèmes, avant même que les fractions de milieu soient prélevées. Vu que l'activité enzymatique est plus importante à température plus élevée, cette dégradation à 37°C est probablement plus importante encore que celle se produisant lors de la conservation à 4°C. Une étude de la dégradation de l'enzyme LDH dans du sang d'agneau montre que son temps de demi-vie se situe entre 7 et 48 heures, dépendamment de la forme de LDH (isoenzyme) étudiée [70]. Pour minimiser l'influence de cette dégradation sur les résultats dans les expériences futures, les fractions de milieu devraient être collectées à intervalles très réguliers et suffisamment rapprochés pour limiter la dégradation tout en s'assurant que les fractions collectées aient des concentrations détectables de LDH sécrétée.

Pour répondre à l'objectif 4, la viabilité de quatre différents types de TMD a été évaluée par trois méthodes d'analyse complémentaires sur une période de huit jours. Toutes les méthodes indiquent que les TMD étaient majoritairement viables dès le troisième jour d'incubation. Une comparaison complète des trois méthodes d'analyse est proposée à la section de discussion 5.1.3, incluant une corrélation des résultats de cytométrie en flux avec ceux de microscopie confocale.

## 3.4 Effets de chimiothérapies sur des TMD de tissu primaire de patients

Grâce à une étroite collaboration entre la Dre Mes-Masson et certains chirurgiens du centre hospitalier universitaire de l'Université de Montréal (CHUM), en particulier la Dre Diane Provencher et le Dr Fred Saad, la procédure a pu être testée à quelques reprises avec du tissu primaire extrait de patients consentants. Les différents morceaux de tissu tumoral ont été sectionnés en échantillons sous-millimétriques en suivant la même procédure précédemment optimisée. Les propriétés mécaniques (élasticité et dureté) du tissu paraissaient plus hétérogènes que pour le tissu de xénogreffe de souris, ce qui a réduit l'efficacité de la procédure de coupe. Néanmoins, les TMD
produites ont été chargées sans difficulté dans les systèmes microfluidiques où elles ont été cultivées pendant quelques jours.

Pour l'expérience montrée à la *Figure 3.7*, le tissu a été préparé avec succès le même jour que la chirurgie de la patiente atteinte d'un carcinome séreux de l'ovaire de haut grade. Au total, 25 TMD ont été produites et chargées dans cinq systèmes. Trois de ces systèmes ont été utilisés comme contrôles alors que les deux autres systèmes ont reçu un traitement de carboplatine à une concentration de 336 µM, correspondant à 25 fois la concentration inhibitrice médiane (CI50) de la lignée cellulaire OV90 cultivée *in vitro* en un tapis cellulaire 2D. Le traitement a été initié après une journée de culture, renouvelé la journée suivante, puis retiré à la troisième journée de culture (*Figure 3.7A*). Une période de récupération de cinq jours sans traitement a suivi. Seule la technique d'analyse de viabilité par microscopie confocale a été employée pour ces échantillons étant donné le petit nombre de TMD obtenues. Les mêmes échantillons ont été imagés au jour 3 et au jour 8, tant pour les échantillons traités que pour les échantillons contrôles.

Le tissu semble avoir répondu positivement au traitement, puisqu'une viabilité significativement plus faible (valeur-p égale à 0,03 obtenue en effectuant un test de Student non pairé) a été calculée pour les TMD traitées comparativement à celles non traitées au jour 3 (*Figure 3.7B*). Ces résultats sont prometteurs, puisque la patiente de qui provenait le tissu a reçu un traitement adjuvant de trois cycles de carboplatine-taxol et était en rémission sept mois après sa chirurgie cytoréductive. Toutefois, après la période de récupération de cinq jours, les TMD cultivées *in vitro* avaient une proportion de cellules viables comparable à celle des échantillons du groupe contrôle. Au cours de cette période, les cellules mortes ont probablement eu le temps d'être relâchées des TMD et de se fragmenter, de sorte que la plupart des cellules mortes présentes dans les puits au jour 3 (*Figure 3.7C*) sont absentes des puits au jour 8 (*Figure 3.7D*). Les cellules ayant survécu au court traitement de carboplatine appliqué dans les microsystèmes ont quant à elles proliféré et occupent une proportion importante des puits au huitième jour de culture.
A

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

D

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Figure 3.7: Évaluation de l'effet de la carboplatine sur des TMD de tissu tumoral extrait d'une patiente atteinte du cancer de l'ovaire. A) Aperçu de la procédure de traitement des TMD avec de la carboplatine, incluant une période de traitement du jour 1 au jour 3 suivie d'une période de récupération sans traitement du jour 3 au jour 8. B) Scores de viabilité calculés à partir des séquences d'images acquises au microscope confocal pour les échantillons traités avec le carboplatine et pour les contrôles non traités. Les barres d'erreur représentent ± l'erreur type de la moyenne d'au moins cinq TMD individuelles d'une même condition. C) Projections maximales représentatives de séquences d'images acquises au microscope confocal des TMD du groupe contrôle et du groupe traité, immédiatement après la période de traitement avec le carboplatine, au jour 3. *différence significative (valeur-p = 0,03). D) Projections maximales pour les mêmes TMD des deux groupes (contrôle et traité) après les cinq jours de récupération, au jour 8.
Il faut toutefois nuancer ces résultats en notant que des résultats significatifs ont été obtenus
au jour 3 en incluant les résultats de neuf TMD par condition (certaines TMD ont été retirées de
l'analyse à cause de problèmes de segmentation par l'algorithme d'analyse d'images). En raison
de l'importante variabilité entre les résultats de TMD d'une même condition, un nombre plus faible
de TMD n'aurait pas donné de résultat significatif au même seuil alpha égal à 5%. De plus, dans
les situations où les mêmes échantillons sont marqués et imagés à deux reprises, il serait préférable
d'employer des fluorophores différents pour les cellules viables afin que le signal de la deuxième
lecture ne soit pas influencé par le signal résiduel de la première lecture.

En réponse au cinquième objectif de ce projet de maîtrise, un premier test de traitement
appliqué directement sur du tissu cancéreux primaire d'une patiente a été accompli au sein de la
plateforme microfluidique. Ce test semble très prometteur, puisqu'il a montré que du tissu humain
peut être coupé en suivant la procédure décrite dans ce mémoire et cultivé à l'intérieur de la
plateforme microfluidique développée. De plus, le tissu est demeuré viable dans le groupe contrôle
tout au long de la période d'incubation sur huit jours. Tel que montré en utilisant du carboplatine
dans cette expérience préliminaire, des traitements peuvent aussi être appliqués dans les canaux et
leur effet sur la viabilité du tissu peut être mesuré par une analyse en microscopie confocale. Toutes
ces étapes restent tout de même à valider avec un nombre plus important d'échantillons humains
et en utilisant les deux autres techniques d'analyse mises au point dans le cadre de ce projet.
# CHAPITRE 4 DÉVELOPPEMENT DES TECHNIQUES DE PIÉGEAGE ET D'ANALYSE D'IMAGES EN FLUORESCENCE

Deux étapes importantes de développement et d'optimisation qui n'ont pas été décrites dans les chapitres précédents sont détaillées ici. La première a trait au processus itératif ayant mené au design final de la plateforme microfluidique à piégeage par sédimentation décrite à la section 2.2 et caractérisée à la section 3.2. La seconde concerne l'algorithm de segmentation d'images fluorescentes développé pour analyser les séquences d'images acquises par microscopie confocale tout au long du projet.

## 4.1 Processus itératif de design de la plateforme microfluidique

La plateforme microfluidique a évolué au cours de l'avancement du projet. Des plateformes conçues par le passé ont d'abord été testées, puis un nouveau modèle a été proposé en incorporant les meilleurs aspects des designs précédents révélés à chaque étape du processus itératif.

### 4.1.1 Piégeage résistif

Dans un premier temps, les systèmes à piégeage résistif de Das et al. [30] ont été testés. Tel que montré à la Figure 4.1, ces systèmes sont composés d'un canal central (vert) avec des zones d'étranglement pour piéger les échantillons et d'un canal de contournement (blanc). Lorsqu'un sphéroïde ou une TMD arrive à l'intersection entre le canal central et la voie de contournement, il suit préférentiellement la voie de plus faible résistance hydraulique, soit vers le piège si celui-ci est vide, soit vers la voie de contournement lorsqu'un sphéroïde ou une TMD est déjà piégé. Effectivement, la présence d'un échantillon dans la zone d'étranglement augmente la résistance hydraulique du canal central ($R_p$) et le canal de contournement devient alors la voie de plus faible résistance. Le ratio de résistances entre le piège et le canal de contournement, $R_p/R_c$, doit être inférieur à un et suffisamment faible pour maintenir un taux de piégeage intéressant, mais aussi suffisamment élevé afin d'éviter que plusieurs échantillons se retrouvent dans le même piège. De plus, les dimensions de la zone d'étranglement doivent être assez petites pour empêcher la déformation et le passage de l'échantillon à travers le piège. Dans ce type de système, les pièges sont au même niveau que le canal de chargement.
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 4.1: Mécanisme de piégeage résistif. A) Schéma d'un système à piégeage résistif avec vue agrandie sur un piège et une voie de contournement. Les pièges résistifs sont montrés le long du canal central en vert et la voie de contournement est montrée en blanc. B) Schéma électrique équivalent montré pour une succession de deux pièges : $R_p$ correspond à la résistance hydraulique du piège et $R_c$ correspond à la résistance hydraulique du canal de contournement.</figcaption></figure>

Dans le cadre de ce projet, une version multiplexée du système montré à la Figure 4.1 a été employée. Essentiellement, la largeur du canal central et la longueur des pièges ont été réduites dans la version multiplexée, afin d'augmenter le nombre d'échantillons piégés sur une seule lame de microscope. Au total, huit canaux comportant chacun huit pièges se trouvent sur une lame. Cette haute densité de canaux et de pièges rendait toutefois les systèmes difficiles à manipuler et à charger avec des échantillons. Des exemples de problèmes rencontrés sont répertoriés à la Figure 4.2 incluant le chargement de plusieurs sphéroïdes dans un même piège, l'obstruction d'un canal par plusieurs sphéroïdes, le déplacement du sphéroïde lors de la manipulation de la plateforme, la difficulté à piéger des sphéroïdes légèrement plus larges et la déformation d'un sphéroïde traversant zone d'étranglement d'un piège. Les problèmes les plus incommodants ont été le déplacement des échantillons lors du transport des plateformes à cause du flux de refoulement de la sortie vers l'entrée se produisant à la moindre inclinaison des systèmes ainsi que la perte d'échantillons à travers la zone d'étranglement du piège, en particulier lors de la fragmentation de ceux-ci après l'application d'un traitement.
<figure><img src="image_27.png" /></figure>

Figure 4.2: Problèmes de chargement et de manipulation des échantillons dans la plateforme multiplexée à piégeage résistif. A) Sphéroïde chargé correctement, B) deux sphéroïdes chargés dans le même piège, C) plusieurs sphéroïdes obstruant le canal principal, D) sphéroïde déplacé dû au flux de refoulement lors de la manipulation de la plateforme, E) sphéroïde trop large pour occuper le piège et F) sphéroïde déformé passant par la zone d'étranglement du piège.

## 4.1.2 Piégeage par sédimentation

Pour contrer plusieurs des difficultés rencontrées avec la plateforme à piégeage résistif, une nouvelle technique de piégeage a été étudiée. Les principales itérations de fabrication des systèmes à piégeage par sédimentation sont montrées à la Figure 4.3.

D'abord, le mécanisme de piégeage a été validé en utilisant le système à deux puits (design de Sina Fartoumi, Figure 4.3A), mais les pièges rectangulaires étaient trop larges, ce qui nuisait à la stabilité des échantillons et favorisait la formation de bulles. L'expulsion complète de l'air lors des étapes de préparation y était aussi ardue en raison des coins à angle droit ainsi que la rugosité canaux et des puits. De plus, les puits et les canaux étaient moulés dans des couches différentes de PDMS, ce qui ajoutait une étape d'alignement pouvant compromettre la qualité et la reproductibilité de l'assemblage. La Figure 4.4A montre un exemple d'un puits rectangulaire mal aligné avec le canal du dessus (représenté par les lignes verticales à gauche de l'image). Enfin, la hauteur des canaux n'était pas uniforme. La rugosité et la hauteur variable des canaux étaient provoquées par la méthode de fabrication du moule par photolithographie, mal adaptée à la fabrication de structures ayant des dimensions de plusieurs centaines de micromètres. La photolithographie est généralement utilisée pour fabriquer des structures beaucoup plus petites. Le micro-usinage assisté par ordinateur, employé par la suite pour la fabrication des moules, est mieux adapté avec un contrôle précis des dimensions autant sur l'axe de la hauteur que sur les deux autres axes. Le fini de surface peut aussi être raffiné, jusqu'à un degré acceptable, en modifiant les paramètres d'usinage. Le micro-usinage élimine donc les deux inconvénients rencontrés avec la photolithographie pour des structures aux dimensions près du millimètre.
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 4.3: Évolution du design des microsystèmes à piégeage par sédimentation. A) Vue de haut d'un système unique avec deux pièges rectangulaires dont les contours sont rehaussés en rouge (design de Sina Fartoumi). B) Vue de haut d'un système unique avec 25 puits cylindriques dont les contours sont rehaussés en rouge (design de Simon Bolduc Beaudoin). C) Vue de haut inclinée d'une plateforme multiplexée à cinq systèmes, chacun comportant cinq puits à base carrée. Des défauts de fabrication sont montrés : connexions indésirables entre les systèmes (ovales bleus) et un trou de sortie de forme irrégulière (flèche blanche). D) Vue de haut inclinée d'une plateforme multiplexée à cinq systèmes avec résolution des problèmes soulignés en C (design de l'auteure).</figcaption></figure>

La Figure 4.4 montre qu’un fini beaucoup plus lisse des côtés du puits a été obtenu par micro-usinage (B et C) comparativement aux résultats de photolithographie (A). En plus, le micro-usinage nécessite une moins grande spécialisation du personnel qui n’a pas besoin d’apprendre les techniques de fabrication en salle blanche.

Ensuite, un système de 25 puits cylindriques de 500 µm de diamètre (design de Simon Bolduc Beaudoin, Figure 4.3B) a été testé. Les échantillons sédimentaient très lentement au sein de ce système en raison de la distance réduite entre les échantillons et le mur du puits. Tout comme la version précédente de plateforme à piégeage par sédimentation, celle-ci nécessitait aussi l’alignement des pièges avec le canal principal lors de l’assemblage. Les moules de ce système, les premiers à être fabriqués par micro-usinage, ont tout de même aidé à valider la pertinence de poursuivre avec cette méthode de fabrication vu le caractère lisse des canaux et le contrôle de la hauteur des structures. Avec une maîtrise plus grande de la machine-outil à commande numérique,
il a été possible de superposer les motifs des canaux et des pièges dans un même moule, éliminant
le besoin d'aligner les pièges avec les canaux dans les prochaines itérations du design.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 4.4: Comparaison du fini de surface des systèmes selon la méthode de fabrication du moule. A) Photographie d'un puits rectangulaire dont le moule a été fabriqué par photolithographie. B et C) Photographies de puits carrés dont le moule a été fabriqué par micro-usinage. Note : des TMD sont piégées dans les puits. Barres d'échelle ≈ 200 µm.</figcaption></figure>

Les tests initiaux avec les deux systèmes précédents montraient bien que les puits
cylindriques ralentissaient trop le processus de sédimentation des TMD alors que les puits
rectangulaires piégeaient les échantillons à un rythme plus raisonnable. Toutefois, les dimensions
optimales des pièges restaient à être identifiées. Le prochain système (design de l'auteure, non
illustré) était composé de cinq pièges rectangulaires ayant une hauteur de 500 µm, une largeur de
500 µm et une longueur allant de 500 à 700 µm à intervalles de 50 µm. Le piège de 600 µm de
long offrait le meilleur compromis entre vitesse de sédimentation et stabilité des TMD.

Dans le système suivant (design de l'auteure, *Figure 4.3C*), la section transverse du canal
principal a été augmentée à 600 µm pour faciliter la circulation des échantillons jusqu'aux pièges.
Les dimensions finales des pièges étaient donc de 600 µm de long, 600 µm de large et 500 µm de
profond. Un microréservoir (*Figure 2.2*) a aussi été créé dans l'entrée pour faciliter le chargement
des échantillons dans le canal. Ce système offrait une bonne performance pour piéger les
échantillons et les maintenir en place tout au long de la période d'incubation, mais certains défauts
de fabrication demeuraient, tels que soulignés à la *Figure 4.3C*. Des connexions indésirables se
produisaient entre les canaux des différents systèmes d'une même plateforme au moment de
l'assemblage. Aussi, les trous d'entrée et de sortie avaient des dimensions et positions variables
puisqu'ils étaient percés manuellement dans une couche de PDMS vierge pour former le haut de la
plateforme. Ces problèmes ont été résolus dans le design final (*Figure 4.3D*) : premièrement, en
modifiant le parcours de la fraise de surfaçage de la machine-outil afin d'empêcher que d'éventuels défauts de fabrication ne compromettent l'étanchéité des canaux et deuxièmement, en fabriquant un moule pour la couche supérieure de PDMS afin d'assurer la reproductibilité de la position et de la taille des trous d'entrée et de sortie. Ces dernières modifications ont simplifié et accéléré la procédure de fabrication tout en facilitant la manipulation des plateformes par les utilisateurs finaux.

Une amélioration continue de la plateforme microfluidique a permis l'adoption d'un design final qui a bien répondu aux besoins de ce projet de maîtrise et qui continue à être utilisé à ce jour par l'équipe du CRCHUM.

## 4.2 Algorithme de segmentation d'images fluorescentes

L'algorithme de segmentation d'images fluorescentes a été développé pour calculer la viabilité des TMD. Par le passé, pour l'analyse de viabilité de sphéroïdes à partir de séquences d'images acquises au microscope confocal, un algorithme de compte automatique combiné au compte manuel des cellules viables et mortes avait été utilisé. Cependant, cette méthode n'a pas pu être employée pour l'analyse des TMD, puisqu'il était souvent difficile de distinguer les cellules individuelles marquées formant le tissu. De plus, une telle approche semi-automatisée aurait demandé beaucoup de temps vu le nombre d'échantillons analysés. L'approche retenue a plutôt été de calculer l'aire relative du signal provenant des cellules viables par rapport à toutes les cellules viables et mortes détectées. Tel que décrit à la section 4.2.1, cela a nécessité l'exécution de quelques opérations sur les images, pour s'assurer de détecter la majorité du signal présent sans toutefois le sur-segmenter. L'algorithme développé comporte tout de même certaines limites, qui sont discutées à la section 4.2.2.

### 4.2.1 Performance de l'algorithme

L'algorithme devait être conçu de manière à minimiser l'intervention de l'usager lors de la détermination des seuils de segmentation, tout en maintenant une vitesse d'exécution acceptable. L'algorithme effectue une segmentation automatique des images, sans aucune intervention de l'usager, mais une vérification finale est nécessaire pour s'assurer qu'aucun problème ne soit survenu. En moyenne, le temps d'exécution de l'algorithme pour une séquence d'images complète est d'environ 3,5 secondes (exécuté avec un ordinateur muni d'un processeur Intel® Core™
i7-4500U à 1,8 GHz et de 16 GB de mémoire vive), considérant des séquences de 18 tranches optiques acquises pour les deux canaux de fluorescence à une résolution de 512 par 512 pixels.

L'algorithme est composé de quatre modules principaux incluant le débruitage, l'égalisation, la détection des contours et la segmentation du signal. La pertinence de chacun d'eux est détaillée et des exemples concrets d'application sont donnés dans les sections ci-dessous.

### 4.2.1.1 Module de débruitage

Pour raccourcir le temps d'acquisition, les images ont été acquises rapidement (400 lignes par seconde) et avec une résolution moyenne de 512 x 512 pixels. Pour éviter d'endommager les échantillons ou de photoblanchir les fluorophores, l'intensité des lasers a été maintenue basse alors que le gain des photomultiplicateurs (PMT) était généralement élevé. Vu le faible nombre de photons atteignant les détecteurs en microscopie confocale, phénomène amplifié par la vitesse rapide d'acquisition dans nos expériences, il en résulte des images légèrement dégradées par du bruit de Schottky (en anglais, *shot noise*). Ce type de bruit est dû à la variation statistique, suivant une loi de Poisson, du nombre de photons pouvant être détecté pendant un intervalle de temps donné. D'autres sources de bruit peuvent avoir affecté le signal, tels que des fluctuations dans l'intensité du laser ou du bruit électronique dans l'instrumentation [71].

Ce module a donc été créé pour éviter que les étapes subséquentes de l'algorithme ne soient trop affectées par le bruit présent dans les images. Un simple filtre médian, de taille 3 x 3, a été employé dans toutes les images. L'intensité de chacun des pixels a ainsi été ramenée à la médiane de l'intensité de son voisinage de neuf pixels (incluant le pixel d'intérêt), ce qui a pour effet d'atténuer les variations d'intensité causées par le bruit sans toutefois rendre les contours des zones marquées trop flous. Pour minimiser la perte de signal due à cette opération de débruitage, le filtre n'a pas pu être grossi davantage sachant que les groupes de pixels de moins de la moitié de l'aire totale du filtre seraient perdus par cette opération. [72]

### 4.2.1.2 Module d'égalisation du signal

Les séquences d'images acquises présentaient des zones marquées d'intensités variables à cause des effets énumérés dans le *Tableau 4.1* qui s'additionnent les uns aux autres. L'effet de diminution de l'intensité selon la profondeur du plan d'imagerie dans le tissu, causé par la tridimensionnalité de celui-ci, aurait théoriquement pu être corrigé en connaissant exactement la
géométrie des échantillons. Par exemple, en considérant des échantillons cylindriques, l'intensité d'excitation aurait pu être augmentée avec la profondeur d'imagerie pour compenser l'absorption de la lumière par le tissu. En pratique, cela aurait été difficile à implémenter puisque la forme des échantillons varie et s'apparente souvent d'avantage à une sphère déformée qu'à un cylindre. En plus, cela aurait nécessité le réglage de paramètres additionnels par l'utilisateur pour chaque TMD imagée. Des imperfections d'exécution auraient nécessairement causé d'autres variations d'intensité, alors cette approche a été rejetée dès le départ. La diffusion limitée des marqueurs à travers le tissu 3D ne peut pas être complètement éliminée non plus. L'intensité variable d'une cellule à une autre est attribuable à une cause biologique qui ne peut pas être corrigée, à moins d'adopter une autre approche de marquage. Par exemple, toutes les cellules pourraient être marquées avec le marqueur DAPI ou DRAQ5™ qui traversent les membranes intactes pour marquer l'ADN des cellules viables et des cellules mortes alors que les cellules mortes pourraient en plus être marquées par le PI ou par un autre marqueur équivalent. Puisque l'intensité de ces agents intercalant d'ADN ne dépend pas du métabolisme de la cellule, l'intensité du signal serait moins variable d'une cellule à une autre. Le marquage au CTG présente toutefois l'avantage de marquer spécifiquement les cellules viables. Ce marqueur est d'autant plus intéressant grâce à sa non-toxicité et sa disponibilité dans plusieurs couleurs différentes, ce qui pourrait permettre d'effectuer deux lectures de viabilité sur les mêmes TMD à des temps différents.

<table><caption>Tableau 4.1: Causes possibles de variation d'intensité des cellules marquées et description de leurs effets</caption><thead><tr><th>Causes</th><th>Effets</th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>Absorption et diffusion de la lumière par le tissu 3D</td><td><ul><li>Diminution de l'intensité détectée selon la profondeur du plan d'imagerie dans le tissu</li></ul></td><td></td></tr><tr><td>Diffusion limitée des marqueurs à travers le tissu 3D</td><td><ul><li>Diminution de l'intensité de marquage selon la distance entre la surface du tissu et le point imagé</li><li>Diminution de l'intensité de marquage sur la face d'un échantillon ayant adhéré à un côté du piège</li></ul></td><td></td></tr><tr><td>Variation du métabolisme entre différentes cellules viables</td><td><ul><li>Intensité de marquage variable d'une cellule à une autre, en particulier pour le CTG</li></ul></td><td></td></tr></tbody></table>
Vu l'impossibilité de corriger les variations d'intensité observées dans les images au
moment de l'acquisition, ce module de l'algorithme a été créé pour équilibrer le signal dans chacun
des canaux, afin que tous les pixels à segmenter soient d'intensités similaires. L'approche choisie
consiste à multiplier l'image par l'inverse de la version floutée d'elle-même, obtenue en appliquant
un filtre moyenneur à symétrie circulaire ayant six pixels de rayon. Cela rehausse les zones
d'intensité plus faible, tel que montré à la Figure 4.5. Les zones saturées de signal retombent
toutefois à 0, mais les pixels associés sont tout de même segmentés grâce aux deux seuils employés
dans le module de segmentation (section 4.2.1.4).

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 4.5: Exemple d'exécution du module d'égalisation appliqué au signal vert d'une TMD.</figcaption></figure>

<caption>A) Signal vert d'une tranche optique de TMD. B) Version floutée et inversée de l'image en A.</caption>

<caption>C) Résultat de la multiplication de l'image en A par l'image en B.</caption>

4.2.1.3 Module de détection des contours

Ce module a été créé pour augmenter la contribution du signal provenant des cellules
marquées aux valeurs prises en compte par la méthode d'Otsu pour déterminer le seuil d'intensité
segmentation. Cela est particulièrement important en présence de bruit de fond élevé. Dans une
telle situation, le nombre de pixels correspondant au signal à segmenter peut devenir moins
significatif comparativement aux nombreux pixels correspondant au bruit de fond, empêchant
l'algorithme de fonctionner comme il se devrait. Un exemple est montré à la Figure 4.6. On
remarque d'abord que l'image à segmenter comporte un bruit de fond élevé, même après avoir été
débruitée (Figure 4.6A). La méthode d'Otsu appliquée directement à l'image égalisée donne un
résultat largement insatisfaisant : pratiquement tout le signal de fond a été segmenté (Figure 4.6B).
Cela est en partie attribuable au fait que le signal de fond se trouve légèrement amplifié lors de
l'étape d'égalisation du signal. Effectivement, lorsque la méthode d'Otsu est appliquée à l'image
originale, après débruitage et sans égalisation du signal, le résultat de segmentation est
sensiblement meilleur dans ce cas-ci (Figure 4.6C). Malgré tout, le seuil trouvé a été trop bas, ce qui a causé la segmentation d'une partie du bruit de fond et la sur-segmentation des pourtours des zones marquées. En appliquant l'algorithme développé, qui trouve d'abord les contours du signal égalisé (Figure 4.6D) en appliquant un filtre laplacien [72], puis effectue le calcul de seuil par la méthode d'Otsu seulement aux pixels correspondant à des contours, le résultat est bien plus représentatif du signal observé (Figure 4.6E). Les contours ont été bien délimités et très peu de bruit de fond a été segmenté.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 4.6: Exemple d'exécution du module de détection des contours appliqué au signal vert d'une TMD. A) Signal vert filtré et égalisé d'une tranche optique de TMD. B) Résultat de segmentation suivant la méthode d'Otsu appliquée directement à l'image en A. C) Résultat de segmentation suivant la méthode d'Otsu appliquée directement à l'image originale, après débruitage mais sans égalisation du signal. D) Résultat de la détection de contours réalisée en appliquant un filtre laplacien sur l'image en A, puis en retenant les pixels dont la valeur est supérieure au 95ᵉ percentile de l'intensité des pixels de l'image résultante. E) Résultat de segmentation suivant la méthode d'Otsu appliquée seulement aux valeurs de l'image en A correspondant aux contours détectés en D; le seuil trouvé étant appliqué à toute l'image en A. Bordures ajoutées pour fins de clarté.</figcaption></figure>
### 4.2.1.4 Module de segmentation

Dans chacune des séquences d'images, deux seuils sont employés pour chaque couleur de signal fluorescent. L'un des seuils est simplement fixé à 75% de la valeur de saturation, soit à 191 pour une image ayant 256 niveaux de gris. L'autre seuil est trouvé par la méthode d'Otsu appliquée seulement aux pixels sur les contours des zones marquées, tel que détaillé à la section 4.2.1.3. La méthode d'Otsu suppose que deux groupes de pixels composent l'image : celui du signal à segmenter et celui du signal de fond. La méthode cherche la valeur de seuil qui sépare les pixels en deux classes en fonction de leur intensité et qui maximise la variance inter-classe, ce qui revient à minimiser la variance au sein de chaque classe. Le premier seuil est appliqué directement à l'image originale alors que le deuxième est appliqué à l'image égalisée. Les zones ainsi segmentées sont unies, puis l'aire est calculée pour le signal vert et le signal rouge afin d'effectuer le calcul final de viabilité.

Tel que montré à la *Figure 4.7*, l'algorithme développé permet de détecter les zones d'intensité plus faible qui ne sont pas détectées en appliquant la méthode d'Otsu seule. L'image représente une tranche optique de TMD qui a été prise à une profondeur de 40 µm dans le tissu, où certaines zones au centre de l'échantillon deviennent à peine visibles ou ne peuvent plus être imagées à cause de l'absorption et de la diffusion de la lumière par l'échantillon et du marquage supposé plus faible dans cette région. D'autres groupes de cellules sur le pourtour de l'échantillon ont visiblement métabolisé la molécule de CTG davantage et apparaissent beaucoup plus intenses. Autant les zones très intenses que les cellules apparaissant moins intenses ont été détectées dans les deux canaux de fluorescence, ce qui montre que l'algorithme réussit à compenser, jusqu'à un certain degré, les causes de variation d'intensité de signal énumérées au *Tableau 4.1*.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 4.7: Exemple d'exécution de l'algorithme de segmentation sur les signaux vert et rouge d'une TMD. A) Superposition des signaux vert et rouge d'une tranche optique de TMD. B) Résultat de segmentation du signal vert suivant la méthode d'Otsu appliquée directement à l'image en A, après débruitage mais sans égalisation du signal. C) Résultat de segmentation du signal vert utilisant l'algorithme développé. D) Résultat de segmentation du signal rouge suivant la méthode d'Otsu appliquée directement à l'image en A, après débruitage mais sans égalisation du signal. E) Résultat de segmentation du signal rouge utilisant l'algorithme développé.</figcaption></figure>

## 4.2.2 Limites de l'algorithme

Malgré une performance acceptable dans une grande majorité (plus de 90%) des images, l'algorithme comporte certaines limites. D'abord, l'algorithme calcule la viabilité en mesurant un ratio de l'aire des cellules viables sur l'aire totale détectée, mais ne corrige pas pour les différences d'aires qui pourraient exister entre les cellules viables et les cellules mortes résultant du choix des fluorophores. Aussi, l'algorithme a moins bien performé pour certaines séquences d'images, généralement en raison d'un signal de fond vert trop élevé ou d'un mauvais marquage du tissu.
### 4.2.2.1 Calcul de viabilité

Le calcul de viabilité effectué par l'algorithmesuppose qu'une cellule morte et une cellule viable émettent un signal fluorescent d'aires similaires. Les marqueurs utilisés dans nos expériences ne garantissent pas la satisfaction de cette condition, ce qui constitue une limite à la procédure développée.

La totalité du cytoplasme des cellules viables devrait être marquée par le CTG tandis que surtout le noyau des cellules mortes devrait être marqué par le PI. Le PI pourrait aussi marquer le cytoplasme des cellules si elles contiennent beaucoup d'ARN [73]. On s'attend quand même à ce qu'en moyenne, une plus petite aire soit détectée pour les cellules mortes. L'algorithmepuisqu'il ne corrige pas pour cette différence d'aire dans son état actuel, pourrait surestimer la viabilité des échantillons. Cependant, lors de la comparaison avec les résultats de cytométrie en flux pour des échantillons d'une même expérience traités de façon identique et analysés au même moment, les résultats de viabilité trouvés par l'algorithmean été surestimés 17 fois, sous-estimés 20 fois et estimés correctement à moins de 5% de différence 10 fois. La moyenne des différences de pourcentage de viabilité a été seulement légèrement supérieure à 0, avec une valeur d'environ 3%. Cela laisse croire que la méthode de microscopie confocale combinée à la segmentation automatique par l'algorithme ne suretime pas beaucoup la viabilité.

Puisque l'aire différentielle du noyau comparé à la cellule complète varie d'un type de cellule à un autre, la façon la plus directe de corriger cette erreur serait d'employer des fluorophores de viabilité et de mortalité qui marquent tous les deux la même portion des cellules, soit le noyau ou le cytoplasme. La combinaison DRAQ5™ et TO-PRO®-3, qui marquent spécifiquement l'ADN de toutes les cellules et des cellules mortes, respectivement, serait intéressante à tester mais ne permettrait de mesurer la viabilité qu'une seule fois sur les échantillons, puisque que DRAQ5™ s'intercale dans l'ADN des cellules viables et risque de perturber leur fonctionnement normal. Une autre alternative serait d'utiliser le CTG pour marquer les cellules viables en combinaison avec un fluorophore qui marque le cytoplasme des cellules mortes, tel que le marqueur LIVE/DEAD® Fixable Far Red Dead Cell Stain. En plus, cette procédure permettrait de marquer les cellules à une deuxième reprise utilisant un marqueur CellTracker™ d'une couleur différente, orange par exemple.
Ainsi, le problème de différence d'aire entre une cellule viable et une cellule morte, qui entraîne peut-être une légère surestimation de la viabilité par l'algorithme, pourrait être réglé en choisissant des fluorophores différents qui marquent le même compartiment cellulaire.

### 4.2.2.2 Causes de rejet de séquences d'images

Des 809 séquences d'images traitées par l'algorithme, seulement 71 ont été rejetées de l'analyse, dont 36 en raison d'une segmentation jugée inefficace lors de la vérification par l'utilisateur. Le taux de succès de segmentation a donc atteint 95,6%. Les principales raisons de rejet et leur occurrence pour chacun des types de xénogreffe sont résumées dans le Tableau 4.2.

<table><caption>Tableau 4.2: Raisons de rejet de séquences d'images segmentées par l'algorithme en fonction du type de xénogreffe imagé</caption><thead><tr><th rowspan="2">Catégorie de rejet</th><th colspan="5">Occurrence (%)</th></tr><tr><th>Globale</th><th>22Rv1</th><th>PC3</th><th>OV90</th><th>TOV112D</th></tr></thead><tbody><tr><td>Segmentation du signal de fond vert</td><td>4,20</td><td>0</td><td>0,58</td><td>9,12</td><td>3,63</td></tr><tr><td>Segmentation du signal de fond rouge</td><td>0,25</td><td>0,63</td><td>0</td><td>0</td><td>0,52</td></tr><tr><td>Signal faible dans les deux canaux</td><td>3,58</td><td>0</td><td>1,75</td><td>8,07</td><td>1,55</td></tr><tr><td>Présence d'une particule fluorescente indésirable</td><td>0,74</td><td>0,01</td><td>0</td><td>1,05</td><td>1,04</td></tr><tr><td>Toutes catégories</td><td>8,77</td><td>0,64</td><td>2,33</td><td>18,24</td><td>6,74</td></tr></tbody></table>

La principale raison de rejet a été la sur-segmentation du signal vert à cause d'un bruit de fond élevé. Toutefois, ceci ne s'est surtout produit que pour les xénogreffes de type OV90 et TOV112D, toutes deux formées de cellules de cancer de l'ovaire. Il semblerait que dans certaines situations, les membranes cellulaires des cellules cancéreuses deviennent perméables aux molécules fluorescentes produites suite au clivage des groupements acétate du CTG. Ceci provoquerait une dissipation des molécules fluorescentes dans le milieu environnant de la TMD, entraînant une diminution du contraste entre les cellules viables marquées et l'environnement. Dans ces circonstances, l'algorithme arrive plus difficilement à distinguer le signal des cellules de celui qui a été relâché dans le milieu, ce qui peut donner une lecture de viabilité faussée. Un exemple de sur-segmentation du signal vert est montré dans la Figure 4.8. Malgré la défaillance de l'algorithme développé, celui-ci performe tout de même mieux que la méthode d'Otsu appliquée seule.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 4.8: Exemple d'image avec bruit de fond vert élevé et segmentations erronées résultantes.

A) Projection maximale de toutes les tranches optiques, barre d'échelle = 100 µm. B) Tranche optique à 20 µm de profondeur dans le tissu, canal vert. C) Segmentation résultante pour l'image montrée en B en utilisant l'algorithme développé. D) Segmentation résultante pour l'image montrée en B en utilisant la méthode d'Otsu non modifiée. Bordures ajoutées pour fins de clarté.</figcaption></figure>

La sur-segmentation du signal rouge s'est aussi produite dans quelques cas. Toutefois, cette
sur-segmentation n'a pas été causée par un signal de fond trop élevé. Effectivement, les précautions
qui avaient été prises pour minimiser le signal de fond rouge, soit l'utilisation de milieu sans phénol
rouge ainsi que le double rinçage des systèmes suite au marquage des échantillons avec les
solutions de CTG et de PI, se sont avérées très efficaces. La sur-segmentation, dans ce cas, était
plutôt due à une quasi-absence de signal dans le canal rouge à travers toute la séquence d'images.
La méthode d'Otsu cherche tout de même à trouver le seuil qui sépare les pixels en deux groupes
en fonction de leur intensité. Dans certains rares cas comme celui montré à la Figure 4.9,
l'algorithme segmente un très faible signal résiduel se trouvant dans les puits microfluidiques ainsi
qu'un bruit non perceptible dans les images. Pour éviter cette situation, une condition d'intensité
minimale du 99,99% percentile de l'image pourrait être ajoutée, par exemple, afin de vérifier qu'un
véritable signal soit présent dans l'image avant de procéder à la segmentation. Ainsi, on accepterait
de perdre le signal seulement si celui-ci représente moins de 0,01% de tous les pixels de la
séquence, ce qui correspond à moins de 400 pixels par séquence de 15 tranches optiques (de 512 par 512 pixels). La valeur précise du percentile ainsi que la valeur de l'intensité minimale pourraient être déterminées à l'aide de la banque d'images disponible, afin de s'assurer que l'algorithme suive son cours dès qu'un faible signal provenant des cellules marquées est présent dans la séquence.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 4.9: Exemple d'image où l'absence de signal rouge provoque une segmentation erronée.</figcaption></figure>

A) Projection maximale de toutes les tranches optiques, barre d'échelle = 100 µm. B) Tranche optique à 20 µm de profondeur dans le tissu, canal rouge. C) Segmentation résultante pour l'image montrée en B en utilisant l'algorithme développé. D) Segmentation résultante pour l'image montrée en B en utilisant la méthode d'Otsu non modifiée.

Les deux autres catégories de rejet recensées et illustrées à la Figure 4.10 étaient dues à des problèmes expérimentaux, et non à des problèmes de segmentation par l'algorithme. Premièrement, certaines TMD paraissaient très faiblement marquées par les deux fluorophores. Bien que l'algorithme se soit comporté correctement pour ces images, le résultat n'a pas été conservé vu la faible proportion de cellules marquées. Le marquage de faible intensité se produit souvent lorsque les puits sont complètement remplis de cellules ou lorsque les TMD ont adhéré au fond du piège. Dans les deux cas, les cellules au fond du puits ont moins directement accès aux fluorophores qui doivent diffuser à travers le tissu pour atteindre certaines portions de celui-ci qui
se trouvent dans la zone imageable par microscopie confocale inversée. Néanmoins, cela n'a posé
problème que dans environ 4% des séquences d'images. Deuxièmement, des particules
fluorescentes ont été repérées dans les images à quelques reprises. Lorsqu'elles composaient plus
d'environ 10% du signal, les images correspondantes ont été rejetées. Ces particules peuvent être
des fragments de plastique provenant des embouts de pipette ou des poussières s'étant déposées
dans l'entrée des systèmes lors de leur manipulation en dehors de la hotte biologique.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 4.10: Autres exemples d'images rejetées de l'analyse. A) Projection maximale d'une TMD ayant une faible proportion de cellules marquées. B) Projection maximale d'une TMD piégée avec une particule fluorescente indésirable. Barres d'échelle = 100 µm.</figcaption></figure>

Pour les deux xénogreffes du cancer de l'ovaire, OV90 et TOV112D, des taux de rejet plus élevés ont été répertoriés. Un bruit de fond vert élevé a été observé dans les séquences d'images, ce qui a affecté la performance de l'algorithme dans 6,9% des cas. En plus, pour la xénogreffe OV90, le marquage semblait très faible pour une proportion importante (8%) d'échantillons. Néanmoins, l'algorithme de viabilité a permis d'estimer la viabilité de manière plus quantitative et en tenant compte de l'ensemble de la séquence d'images acquise en microscopie confocale.
# CHAPITRE 5 DISCUSSION GÉNÉRALE

Cette discussion vise à mettre les résultats des chapitres Chapitre 3 et Chapitre 4 en perspective, ainsi qu’à proposer des modifications aux méthodes employées qui pourraient être implémentées pour corriger certaines limites des techniques développées.

## 5.1 Synthèse des principaux résultats

### 5.1.1 Technique de découpe des tumeurs micro-disséquées

La technique de découpe du tissu en échantillons sous-millimétriques a été mise à l'épreuve en utilisant plusieurs types de tissus différents, incluant du tissu cancéreux provenant de xénogreffes de souris ou de tumeurs de patients (sections 3.1 et 3.4) et du tissu de foie de rat (Annexe A). Deux types de xénogreffes de cancer de prostate (22Rv1 et PC3) et deux types de xénogreffes de cancer de l'ovaire (OV90 et TOV112D) dont les résultats sont montrés dans ce mémoire ont été testés en plus de quatre autres types de xénogreffes utilisés dans le cadre d'autres projets<fnref n="1" /> qui ont été subventionnés en partie grâce aux résultats initiaux de la présente étude. De plus, cinq échantillons de tumeurs humaines obtenues de patients (trois échantillons de tissu ovarien, deux de tissu prostatique) ont été préparés avec succès par l'équipe du CRCHUM en suivant la même procédure. Les TMD ainsi produites ont toutes été chargées avec succès dans les plateformes microfluidiques à piégeage par sédimentation. Les pertes de TMD pendant le chargement étaient négligeables. Dans une expérience typique effectuée avec une portion d'une seule xénogreffe de souris d'un volume d'environ 500 à 1000 mm³, 250 TMD peuvent être produites et chargées dans 50 canaux indépendants en moins de six heures. Celles-ci peuvent ensuite être exposées à des conditions différentes ou utilisées pour effectuer des mesures par des techniques complémentaires d'analyse. Le nombre important d'analyses indépendantes pouvant être accomplies à partir d'une seule xénogreffe de souris a le potentiel de réduire le nombre d'animaux utilisés en recherche sur le cancer.

<footnote n="1">¹ CANADIAN UROLOGIC ONCOLOGY GROUP – ABBOTT LABORATORIES PROSTATE CANCER RESEARCH GRANTS: "Technical improvements in biopsy processing and microfluidics analysis in prostate cancer"; CCSRI - INNOVATION GRANT: "Microfluidic based empirical testing versus predictive biomarkers to stratify cancer care in ovarian cancer patients".</footnote>
Depuis l'optimisation des techniques d'analyse, au cours de la dernière année, un grand total de 1160 systèmes indépendants (ou l'équivalent de 232 plateformes de la taille d'une lamelle de verre) ont été utilisés par l'équipe du CRCHUM et 6266 TMD ont été produites pour différentes expériences. Environ le tiers de ces échantillons a servi directement à produire les résultats présentés dans ce mémoire tandis que le reste a servi au développement parallèle de d'autres tests. Pour l'étude exhaustive de viabilité sur quatre types de xénogreffes montrée dans ce mémoire, 24 xénogreffes de souris ont été disséquées au total et analysées selon la méthode présentée. Ce grand nombre de répétitions permet d'assurer un niveau de confiance élevé quant à la robustesse de l'approche

La technique de découpe a permis de produire des TMD de tailles reproductibles, d'un diamètre moyen d'environ 380 µm. Cette taille est similaire à celle de sphéroïdes matures après quatre à sept jours de formation en gouttelettes suspendues [20], [30], ce qui devrait faciliter la transition entre les deux méthodes de culture. Ce diamètre est très près du diamètre maximal de 400 µm de la portion viable de tumeurs cylindriques non vascularisées mesuré dans des coupes histologiques de cancers du poumon [63]. Ce diamètre est aussi sensiblement inférieur au diamètre critique d'environ 450 µm trouvé grâce au calcul théorique simplifié de la distribution d'oxygène dans un échantillon de tissu cancéreux sphérique (section 3.2.4.1). Ces observations nous mènent à croire que le choix de taille des TMD produites est tout juste le bon pour leur permettre de survivre au sein des microsystèmes en l'absence de vascularisation interne du tissu et de perfusion. Autrement dit, l'échantillon est suffisamment massif pour contenir un grand nombre de cellules possédant une organisation tissulaire et pour imiter les gradients de nutriments se produisant naturellement dans les tissus *in vivo*, tout en étant assez petit pour survivre dans des conditions de transport passif de nutriments.

## 5.1.2 Comparaison des méthodes de piégeage des TMD

Deux types de piégeage des TMD ont été étudiés au cours du projet de maîtrise : le piégeage résistif et le piégeage par sédimentation. Par la première méthode, les échantillons se positionnent automatiquement dans des rétrécissements du canal central grâce à un ratio judicieusement choisi de résistances entre les pièges et le canal de contournement (voir la Figure 4.1). Par la deuxième méthode, les échantillons doivent être manuellement positionnés, à l'aide d'une micropipette servant à contrôler le débit, au-dessus des puits pour ensuite s'y piéger (voir la Figure 2.2). Le
piégeage par sédimentation, qui demande plus de manipulations de l'utilisateur, paraît tout de même supérieur au piégeage résistif pour deux raisons principales.

* **Stabilité de piégeage** : les échantillons piégés dans les puits microfluidiques restent généralement en place tout au long de l'expérience, peu importe dans quelle direction circule le milieu. Des débits élevés d'environ 800 µL/min doivent être induits dans le canal pour que les échantillons sortent de leur piège. Une légère inclinaison de la plateforme dans un sens comme dans l'autre ne peut donc pas provoquer l'éjection des échantillons, ce qui constitue une amélioration majeure comparativement aux systèmes résistifs pour lesquels un simple flux de refoulement provoqué par une légère perturbation de la plateforme pendant sa manipulation peut provoquer le déplacement et la perte des échantillons. Aussi, une plus grande certitude sur le positionnement des échantillons découle de cette caractéristique, ce qui facilite le suivi des mêmes échantillons dans le temps.

* **Forces de cisaillement faibles** : une fois piégées dans un puits, les TMD sont soumises à de très petites forces de cisaillement de l'ordre d'environ 2 dyne/cm² au maximum. Les risques que les échantillons se déforment ou se fragmentent sous ces forces sont donc réduits. Des échantillons structurellement fragilisés sous l'effet de chimiothérapies ont aussi moins de chances d'être perdus en raison de l'effet combiné de la stabilité de piégeage et des faibles forces de cisaillement.

Le désavantage principal du piégeage par sédimentation est le manque d'automatisation de la procédure de chargement. Une approche différente et intéressante à investiguer est le piégeage inertiel réalisé par Chung *et al.* [74] pour l'orientation et le piégeage d'embryons de drosophiles dont la taille est similaire aux TMD. Le chargement se fait à haut débit et permet de charger des centaines d'embryons dans un seul système en quelques minutes. La haute pression d'injection appliquée lors du chargement provoque une déformation du PDMS qui élargit l'entrée des pièges. Lorsque la pression est réduite, le PDMS reprend sa forme originale et les embryons se trouvent piégés. Ce mécanisme de verrouillage des échantillons pourrait être exploité dans une version améliorée des systèmes à piégeage résistif, par exemple. Toutefois, même si la méthode de piégeage développée par Chung *et al.* semble très attrayante à cause de la haute densité de piégeage qu'elle accomplit en peu de temps, elle ne répond pas bien aux besoins spécifiques de l'application visée ici pour laquelle les échantillons de tumeur doivent être chargés dans des systèmes différents
qui pourront être traités de manière indépendante avec des chimiothérapies. D'employer cette méthode de chargement avec de nombreux systèmes dans lesquels un petit nombre d'échantillons serait injecté est envisageable, mais semble contre-productif, puisqu'un certain temps devrait être investi à faire pénétrer les échantillons dans les canaux et à brancher chaque microsystème au générateur de pression. En outre, lors de la séance d'imagerie, il y aurait des pertes de temps à identifier dans quels pièges les échantillons auraient été capturés. En plus de nécessiter des instruments spécialisés pour générer une pression importante dans les systèmes, cette approche ne serait pas nécessairement plus rapide que celle de piégeage par sédimentation retenue.

Étant donné la grande simplicité du design choisi dans le cadre de ce projet, les plateformes sont extrêmement faciles à manufacturer et restent simples à opérer en employant des instruments (une micropipette et un stéréomicroscope) que les biologistes ont déjà l'habitude d'utiliser. Cela explique en partie pourquoi elles ont déjà été adoptées dans plusieurs sous-projets qui occupent, à l'heure actuelle, quatre chercheurs au CRCHUM.

### 5.1.3 Méthodes d'analyse de viabilité

Trois méthodes d'analyse de viabilité ont été testées en parallèle sur les échantillons de xénogreffe de souris. Le Tableau 5.1 résume les avantages et désavantages des différentes méthodes relativement à notre application.