# Intérêt des champignons telluriques dans des processus de bioremédiation de sols pollués par des hydrocarbures aromatiques polycycliques

Catherine Rafin, Etienne Veignie, Patrice Woisel, Fabrice Cazier

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Catherine Rafin, Etienne Veignie, Patrice Woisel, Fabrice Cazier. Intérêt des champignons telluriques dans des processus de bioremédiation de sols pollués par des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Environnement, Ingénierie & Développement, 2004, N°33 - 1er Trimestre 2004, pp.7-11. 10.4267/dechets-sciences-techniques.2055. hal-03177465

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# INTÉRÊT DES CHAMPIGNONS TELLURIQUES DANS DES PROCESSUS DE BIOREMEDIATION DE SOLS POLLUES PAR DES HYDROCARBURES AROMATIQUES POLYCYCLIQUES

Catherine Rafin*, Etienne Veignie*, Patrice Woisel**, Fabrice Cazier***

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants ubiquistes et persistants dont certains posent de réels problèmes pour l'environnement et la santé publique. Parmi les différentes techniques de réhabilitation actuellement disponibles, la bioremé-diation s'est développée lors de ces dernières décades comme une alternative rentable et prometteuse. De nombreuses études ont mis en évidence l'aptitude des champignons de type lignolytique à dégrader les HAP. Cependant, l'origine non tellurique de ces champignons les rend peu compétitifs par rapport à la microflore endogène du sol. Dans une optique de bioremédiation, nous avons conduit des travaux de recherche afin d'uti-liser le potentiel biotechnologique de champignons tel-luriques et en particulier de *Fusarium solani*.

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) are ubiqui-tous and persistent pollutants that cause great envi-ronmental and health concern, because of their geno-toxic and carcinogenic properties. Among the pro-cesses whereby these compounds are removed from the environment, microbial degradation plays a major role in the remediation of contaminated sites. Numerous biodegradation studies have been done on fungi, especially on various white rot fungi such as *Phanerochaete chrysosporium*, under *in vitro* and *in vivo* conditions. The installation of these foreign fungi in non sterile soils are quite hazardous due to intense nega-tive interactions with indigenous soil microorganisms. Optimising the degradation of PAH by the indigenous microbial community that had already been adapted to the soil habitat would be probably more economi-cal and equally efficient. In our studies, we focused therefore on the ability of telluric fungi for PAH field bioremediation processes. In particular, we isolated a Deuteromycete fungus *Fusarium solani* that was able to grow in liquid medium with benzo[a]pyrene as sole carbon source and to mineralise this PAH. In a batch

fermentor, [7,10-¹⁴C]benz[a]pyrene mineralization occurred rapidly at early stages of fermentation (15 hr) during the germination of fungal spores and was not a continuous process as mineralization occurred in a biphasic pattern. Moreover, *Fusarium solani* showed an average rate of mineralization about 65 µg/g dry weight/day within 11 days of incubation, comparable as mineralization rate obtained with a white rot fun-gus *Phanerochaete chrysosporium*.

## INTRODUCTION

Les hydrocarbures aromatiques polycycliques représen-tent une classe de polluants très étudiés, inscrits depuis 1976 sur la liste des polluants prioritaires établis par l'American environmental protection agency (USEPA). Ces polluants, qui proviennent soit de sources natu-relles soit de sources anthropogéniques, sont des com-posés hydrophobes très persistants dans les différents compartiments de l'environnement (atmosphère, sol, sédiment, eaux continentales et marines). Ils représen-tent un risque pour l'environnement et la santé humai-ne en raison des propriétés toxiques (génotoxicité et immunotoxicité) de certaines de ces molécules.

Les HAP, émis dans l'environnement et transportés par voie atmosphérique ou aqueuse, peuvent subir plusieurs phénomènes abiotiques conduisant à leur transforma-tion tels que la volatilisation, la photo-oxydation, la sédimentation, l'oxydation chimique. Les phénomènes biotiques, tels que la biodégradation ou la biomagnifica-tion, représentent les phénomènes prépondérants de la transformation des HAP, en particulier dans les sols et les sédiments [1]. La biodégradation est en réalité un phénomène naturel basé sur le rôle important des microorganismes dans l'environnement, en tant

<footnote>*Université du Littoral Côte d'Opale (ULCO)</footnote>

<footnote>**ULCO, Laboratoire de synthèse organique et environnemental,</footnote>

<footnote>***ULCO, Centre commun de mesure</footnote>
qu'agents biogéochimiques, inter-
venant dans la conversion partiel-
le ou totale de molécules orga-
niques complexes en métabolites
allant parfois jusqu'à la produc-
tion de CO₂ et d'H₂O. Dans ce
cas, le terme de minéralisation est
alors employé. La bioremédiation,
procédé biotechnologique qui est
l'utilisation intentionnelle de la
diversité du métabolisme des
microorganismes, consiste à sti-
muler ces phénomènes naturels
pour en augmenter l'efficacité et
le rendement [2].

Depuis plus de 30 ans, les
recherches sur la dégradation
microbienne des hydrocarbures
aromatiques polycycliques ont
permis d'isoler de nombreux
genres et espèces de bactéries et
de champignons capables de
dégrader des HAP de faible poids
moléculaires (composés conte-
nant 3 cycles ou moins).

Relativement peu de microorga-

nismes sont capables de dégrader les HAP de haut poids moléculaire (tel que le benzo[a]pyrène ou BaP) qui persisent dans l'environnement indiquant une relative résistance à la dégradation tant chimique que biologique [3]. Parmi les microorganismes étudiés, certains champignons présentent des potentialités intéressantes pour la dégradation des HAP de haut poids moléculaire dans les sols pollués. De plus, le caractère invasif du mycélium leur permet d'augmenter à la fois le volume de sol prospecté et la surface de contact avec ces molécules insolubles [4]. Dans une optique de bioremédiation, l'originalité de notre approche consiste donc à utiliser le potentiel biotechnologique des champignons.

## ISOLEMENT ET SCREENING

### Isolement de souches fongiques telluriques

L'objectif de cette étude a été de réaliser, dans un premier temps, une collection de souches fongiques isolées de sols pollués. La microflore fongique isolée à partir de sols (contaminés artificiellement par du fioul) est consti-

<table><caption>Tableau I - Champignons telluriques isolés de sol –
après enrichissement par du fioul</caption><thead><tr><td>Classe</td><td>Ordre</td><td>Genre</td></tr></thead><tbody><tr><td>Zygomycotina</td><td>Mucorales</td><td>Mucor</td></tr><tr><td>Ascomycotina</td><td>Eurotiales</td><td>Penicillium</td></tr><tr><td>Deuteromycotina</td><td>Hyphales</td><td>Fusarium<br/>Trichoderma</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Fig. 1. Biomasse mycélienne des souches isolées après 27 jours de culture en milieu minéral additionné de benzo[a]pyrène (M : Mucor, P : Penicillium, T : Trichoderma, F : Fusarium).</figcaption></figure>

tuée majoritairement de populations fongiques non ligni-
nolytiques (tableau 1).

## Étude de l'aptitude de ces isolats à croître en présence de BaP comme seule source de carbone

Ces souches présentent des aptitudes variables à croître en milieu minéral en présence de benzo[a]pyrène comme seule source de carbone. Introduites dans le milieu de culture sous forme de spores, la germination des champignons se produit rapidement à partir des réserves présentes dans les spores. Les souches potentiellement capables d'utiliser le benzo[a]pyrène pour leur métabolisme produisent ensuite une biomasse plus importante (fig. 1).

Cette première expérimentation nous a permis de sélectionner une souche F33, identifiée comme étant un isolat de *Fusarium solani* (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, The Netherlands) capable de produire une biomasse significative en présence de BaP comme seule source de carbone [5]. Pour valider le choix de cet isolat, une étude de la métabolisation de BaP radiomarqué a été réalisée.

## ÉTUDE CINÉTIQUE DE LA MINERALISATION DU BAP PAR FUSARIUM SOLANI EN FERMENTEUR

L'étude de la métabolisation du BaP, conduite en fer-
menteur en conditions cométaboliques, souligne l'apti-
tude du *Fusarium solani* à minéraliser rapidement cette
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Fig. 2. Cinétique de croissance de *Fusarium solani* F33 en fermenteur contenant 1,6 l de milieu minéral additionné de 302 mg de [7,10-¹⁴C]benzo[a]pyrene. Symboles : △, ¹⁴CO₂ libéré, ☐, protéines du mycélium, ●, concentration en glucose.</figcaption></figure>

molécule (fig. 2). Dans les conditions de culture retenues, la souche présente une courbe de croissance et de consommation du glucose classique. La minéralisation du BaP se produit selon une courbe bimodale correspondant d'une part à la phase exponentielle de croissance et à la phase de déclin du champignon [6]. Le taux moyen de minéralisation du BaP obtenu (environ 65 µg/g biomasse/jour) est comparable aux taux obtenus avec les champignons de la pourriture blanche, champignons très étudiés en bioremédiation [7].

En fin de fermentation, le bilan carboné du [14C]BaP indique que 1,2 % du BaP est libéré sous forme de ¹⁴CO₂, 5,3 % est incorporé dans la biomasse, 0,5 % se retrouve dans la phase aqueuse et 85 % est détecté dans l'extrait dichlorométhane/acétate d'éthyle. Le taux non négligeable de radioactivité retrouvé dans la biomasse semble indiquer que ce champignon utilise le BaP comme source de carbone.
Parallèlement, nous avons mené une étude en microscopie à fluorescence qui souligne la présence de petites

vésicules, sites d'une forte
fluorescence liée à l'incor-
poration du BaP ou de l'un
de ses métabolites, locali-
sées dans le mycélium du
champignon. D'après la lit-
térature, les champignons
métabolisent les HAP grâce
à deux voies d'oxydation [8]
(fig. 3). Le premier mécanis-
me fait intervenir des sys-
tèmes enzymatiques extra-
cellulaires (de type Lignines
Peroxydases [LiP],
Peroxydases Manganèse-
dépendantes [MnP] et
Laccases) mis en œuvre
chez les champignons ligni-
nolytiques (White Rot
Fungi ou champignons de la
pourriture blanche). Le
second mécanisme met en

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Fig. 3. Voies métaboliques microbiennes de dégradation des HAP.</figcaption></figure>
œuvre un complexe multienzymatique intracellulaire à cytochrome P450.

La localisation intracellulaire du BaP dans les hyphes de *Fusarium solani* semblerait indiquer plutôt l'implication d'un système enzymatique de type cytochrome P450, qui sont des hémaprotéines localisées dans le réticulum endoplasmique. Afin de confirmer cette hypothèse, nous avons étudié la minéralisation du BaP en présence d'un inhibiteur spécifique des cytochromes P450, le 1-aminobenzotriazole (fig. 4).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Fig. 4.** Evolution du $^{14}CO_2$ libéré à partir de [7,10-$^{14}$C]benzo[a]pyrene après 10 jours d'incubation d'une culture de *Fusarium solani* en milieu minéral. Symboles : ●, témoin sans inhibiteur ; ■, en présence du 1-aminobenzotriazole ajouté après 48 heures d'incubation.</figcaption></figure>

D'après la figure 4, la diminution de la quantité de $^{14}CO_2$ semble confirmer l'implication d'une enzyme, contenant un hème dans son cycle catalytique, qui pourrait appartenir à la famille des cytochromes P450 compte tenu de

la nature de l'inhibiteur utilisé [5]. L'ensemble de ces résultats montre une nouvelle potentialité pour la dégradation du BaP d'une souche de *Fusarium solani*, ce qui, dans l'état actuel de nos connaissances, n'a jamais été décrit.

## RECHERCHE ET IDENTIFICATION DES MÉTABOLITES DU BAP

De plus, en fin de fermentation, nous avons pu obtenir des quantités suffisantes de métabolites permettant leur identification. Deux principaux métabolites ont été identifiés comme étant la 1,6-benzo[a]pyrène quinone et la 3,6-benzo[a]pyrène quinone (fig. 5).

Bien que ces deux métabolites aient déjà été décrits comme produits de métabolisation du BaP par des champignons utilisant les cytochromes P450, l'originalité de ce résultat réside dans le fait que cette métabolisation ne s'accompagne pas de la production de composés polaires (tels que les dihydrodiols) caractéristiques de l'action d'une monooxygénase à P450 [9]. Néanmoins, ce résultat n'exclut pas l'implication d'un cytochrome P450 mais indiquerait un mode de fonctionnement radicalaire dans la dégradation du benzo[a]pyrène [10].

## CONCLUSION

Bien que la bioremédiation soit considérée comme une alternative prometteuse pour la réhabilitation des sols pollués, la réussite d'une telle stratégie est souvent freinée par les capacités limitées des microorganismes à dégrader les HAP de haut poids moléculaire. Dans le cadre de ces travaux, nous avons sélectionné à partir de sols pollués un isolat de *Fusarium solani* capable de dégrader, en culture liquide, le benzo[a]pyrène, HAP de haut poids moléculaire. D'autres études conduites en présence de BaP marqué nous ont également permis de mettre en évidence l'aptitude de cette souche à minéra-

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Fig. 5.** Profils d'élution d'HPLC, spectres d'absorption UV et structures chimiques des métabolites de benzo[a]pyrène produits par *Fusarium solani*. (A) Métabolite I, 1,6-benzo[a]pyrène quinone ; (B) Métabolite II, 3,6-benzo[a]pyrène quinone.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>
liser le [7,10-¹⁴C]benzo[a]pyrène avec des taux moyens de minéralisation comparables aux taux obtenus avec les champignons de la pourriture blanche, champignons très étudiés en bioremédiation. De plus, outre son avantage d'être d'origine tellurique, ce champignon présente une certaine capacité à mobiliser et à incorporer le BaP qui est une molécule connue pour être peu biodisponible. Enfin, l'étude de la métabolisation du BaP par Fusarium solani a permis d'identifier dans un premier temps deux métabolites appartenant à la famille des benzo[a]pyrene-quinones. Ces métabolites présentent l'intérêt d'être des composés beaucoup moins polaires que les produits de dégradation du BaP habituellement obtenus par l'action de systèmes enzymatiques de type P450. Dans une perspective de développement de protocole de bioremédiation, différents axes de recherche doivent nous conduire à optimiser les conditions de dégradation des HAP par voie fongique et à compléter nos connaissances sur les voies métaboliques de cet isolat de Fusarium solani, en particulier via la caractérisation de nouveaux métabolites du BaP.

Catherine Rafin*, Etienne Veignie*, Patrice Woisel**, Fabrice Cazier***

Références

[1] Sims, J. L., Sims, R. C., Matthews, J. E. 1990. *Approach to remediation of contaminated soil*. Haz. Waste Haz. Mater. 7, 117-148.

[2] Cerniglia, C. E. 1992. *Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons*. Biodegrad. 3, 351-368.

[3] Juhasz, A. L., Naidu, R. 2000. *Bioremediation of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons : a review of the microbial degraation of benzo[a]pyrene*. Int. Biodet. Biodegrad. 45, 57-88.

[4] Bennett, J. W. and Faison, B. D. 1997. *Use of fungi in biodegradation*. In Hurst, C. J., Knudsen, G. R., McInerney, M. J., Stetzenbach, L. D., Walter, M. V. (editors). Manual of Environmental Microbiology, ASM Press, Washington, pp. 758-765.

[5] Rafin, C., Potin, O., Veignie, E., Lounes-Hadj Sahraoui, A., Sancholle, M. 2000. *Degradation of benzo[a]pyrene as sole carbon source by a non white rot fungus, Fusarium solani*. Polycycl. Arom. Compds. 21, 311-329.

[6] Veignie, E., Rafin, C., Woisel, P., Lounes-Hadj Sahraoui, A., Cazier, F. 2002. *Metabolization of the polycyclic aromatic hydrocarbon benzo[a]pyrene by a non-white rot fungus (Fusarium solani)* in batch reactor. Polycycl. Arom. Compds. 22, 87-97.

[7] Sanglard, D., Leisola, M. S. A. and Fiechter, A. 1986. *Role of extracellular ligninases in biodegradation of benzo[a]pyrene by Phanerochate Enzyme Microb. Technol. 8, 209-212.*

[8] Augustin, J., Muncnerova, D. 1994. *Degradation pathways of aromatic hydrocarbons in fungi and bacteria*. Biologia 49, 289-299.

[9] Cerniglia, C. E. and Gibson, D. T. 1979. *Oxidation of benzo[a]pyrene by the filamentous fungus Cunninghamella elegans*. J. Biol. Chem. 254, 12174-12180.

[10] Cavalieri, E. L., Rogan, E. G. 1995. *Central role of radical cations in metabolic activation of polycyclic aromatic hydrocarbons*. Xenobiotica 25, 677-688.

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<footnote>*Université du Littoral Côte d'Opale (ULCO), 50, rue Ferdinand Buisson, BP 699, 62228 Calais Cedex</footnote>

<footnote>**ULCO, Laboratoire de Synthèse Organique et Environnement, MREID, 145, Avenue Maurice Schumann, 59140 Dunkerque</footnote>

<footnote>***ULCO, Centre Commun de Mesure, MREID, 59140 Dunkerque</footnote>