313 core microbiome and the natural seawater displayed that only 1 ASV was specific to the rearing
314 water core microbiome while the 136 other ASVs were shared with the natural seawater (Fig.
315 4F). Together, these comparisons exhibited the great role of the natural seawater on the rearing
316 water microbiota, as several ASVs detected in the lagoon seawater were also detected at several
317 times of the rearing according to the larval stage and the larval health status. As we observed a
318 microbial partitioning (Fig. 2) with specific microbiotas associated with a given larval stage and
319 survival rate in the rearing water (Fig. 4), we constructed an LEfSe to investigate how the larval
320 stage, the larval health or both interacted with the active rearing water microbiota at the family
321 level.

322

323 **Biomarkers at the genus level according to the larval stages and health status**

324 Two LEfSe analysis were conducted to investigate the differentially abundant genus in the
325 rearing water according to the larval stage (Zoea or Mysis) and the larval health status (Good or
326 Bad survival) (Figs. 5A and B). A first LEfSe was constructed by analyzing 3 groups: the zoea
327 that were always healthy during the zoea stage (NTA0 Zoea Good in the Fig. 5A), the zoea that
328 were healthy only at the beginning of the zoea stage (NTSA Zoea Good, Fig. 5A); and the zoea
329 that were unhealthy at the end of the zoea stage (NTSA Zoea Bad, Fig. 5A). The second LEfSe
330 compared the rearing water samples hosting the mysis with a good survival rate (Mysis Good)
331 and the rearing water hosting the mysis with a bad survival rate (Mysis Bad). They both
332 permitted to distinguish biomarkers of each condition (Figs 5A and 5B). Thus, 11 biomarkers
333 were specific of the rearing water hosting zoea good, 7 biomarkers of the healthy zoea that
334 became unhealthy, 9 biomarkers of the unhealthy zoea, 8 of the rearing water hosting mysis with
335 a good survival rate; and 12 of the water hosting mysis with a bad survival rate. Three
336 biomarkers of the zoea that were healthy during the zoea stage (NTA0 Zoea Good) were also
337 statistically enriched in the mysis good condition: *Nautella* and *Lesingera* genera as well as an
338 unknown genus of the *Cryomorphaceae* (ASV12). The genus *Fabibacter* was a biomarker of the
339 healthy zoea (NTA0 Zoea Good), and was later found as a biomarker of the rearing water
340 hosting mysis with a bad survival rate. The HIMB11 group was statistically enriched in the water
341 with the zoea that were only healthy at the beginning of the zoea stage (NTSA Zoea Good), and
342 was also a biomarker of rearing water with unhealthy mysis. Two lineages, *Phaeodactylibacter*
343 and an unknown genus of the *Rhodobacteraceae* (ASV6), were specifically abundant in the
344 rearing water of unhealthy zoea (NTSA Zoea Bad); while they were biomarkers of the rearing water with healthy mysis. Four taxa enriched in the rearing water of the unhealthy zoea at the end of the zoea stage, were also enriched in the rearing water hosting the mysis with a bad survival rate: *Aestuariicoccus* and *Marivita* genera, an unknown genus of the NRL2 (ASV44) and an unknown genus of the *Gammaproteobacteria* (ASV19).

349

350 **Discussion**

351 In this study, we aimed to distinguish, in the rearing water, active biomarkers that were specific
352 of a given larval stage and health condition. In order to assess the metabolically active
353 biomarkers, we extracted the total RNAs from the samples. Using RNA instead of DNA allows
354 to detect recent populations and living assemblages in an ecosystem (Cristescu, 2019), as RNA
355 persistence in environment is estimated between 13 to 24h against months or years for DNA
356 (Willerslev et al., 2007; Marshall, Vanderploeg & Chaganti, 2021), although ancient RNA has
357 been found in fossils or in sediments (Orsi, Biddle & Edgcomb, 2013; Cristescu, 2019). Also,
358 several publications using cDNA metabarcoding proved that RNA seemed to be a useful tool to
359 identify living organisms as well as to perform survey and biological monitoring (Laroche et al.,
360 2018; Amarasiri et al., 2021; Miyata et al., 2021, 2022; Veilleux, Misutka & Glover, 2021). For
361 these reasons, we performed RNA extractions coupled with reverse-transcription into cDNA, to
362 detect living microbial populations inhabiting the rearing water, as these communities may
363 interact with the composition of the rearing water and with the larvae. In our study, a unique
364 protocol regarding RNA extraction, cDNA retro-transcription, sequencing and sequencing
365 analysis was applied. This is crucial as it allows to perform comparisons and to decrease bias.
366 Indeed, regarding the extraction method used, the quantity, purity and yield of RNA can differ as
367 well as the microbial diversity (Shu et al., 2014; Muto et al., 2017). The V4 hypervariable region
368 of the 16S rRNA gene has been selected for sequencing because its size, around 254 bp, is quite
369 stable among the prokaryotes and allows HiSeq sequencing (2x150 pb). Also, this region
370 produces optimal procaryote community clustering along with a suitable resolution (Caporaso et
371 al., 2011). Besides, the V4 hypervariable region of the 16S rRNA gene is often used to describe
372 the microbial diversity in shrimp related studies (for example:(Zheng et al., 2016; Hou et al.,
373 2018; Xue et al., 2018; Wang et al., 2020a; Giraud et al., 2021, 2022; Callac et al., 2022)).
374
375 * Main families of the rearing water microbiota

376 A noticeable dynamic of the active rearing water microbiota was pointed out either in the
377 presence or not of antibiotics (Figs 2 and 3), through the rearing. As the PCoA displayed
378 sampling day separated clusters (Fig. 2), it was not surprising that the PERMANOVA indicated
379 that the sampling day influenced up to 36% of the variability among the samples. Despite a clear
380 distinction of the rearing water microbiota between the water with antibiotics harboring heathy
381 larvae and the water without antibiotics presenting unhealthy larvae, several main families were
382 common between the 2 rearing conditions. The presence of main common families in the rearing
383 water where antibiotic or not was added, was similar to what was shown in the rearing water of
384 *Penaeus stylirostris* reared using water filtered on 5µm and 1µm and passed through a UV
385 chamber before filling the tanks (Callac et al., 2022). The dominant families were the
386 *Rhodobacteraceae* (*Alphaproteobacteria*), the *Alteromonadaceae* (*Gammaproteobacteria*), the
387 *Saprospiraceae* (*Bacteroidia*) and in less extent the *Litoricolaceae* (*Gammaproteobacteria*), the
388 *Cryomorphaceae* (*Bacteroidia*) and the *Flavobacteriaceae* (*Bacteroidia*) (Fig. 3). Overall, during
389 the rearing, the proportion of *Bacteroidia* increased while the part of the *Alpha*- and *Gamma-
390 propteobacteria* decreased, which was similarly highlighted in the rearing water of *Penaeus
391 stylirostris* reared using filtered and UV treated water before filling the tanks (Callac et al.,
392 2022); but also, in the rearing water of *Penaeus vannamei* (Zheng et al., 2017) and *Penaeus
393 monodon* (Angthong et al., 2020). *Rhodobacteraceae* are often detected in the rearing water of
394 marine shrimp larvae such as *P. vannamei* (Zheng et al., 2017; Heyse et al., 2021), and *P.
395 stylirostris* (Giraud et al., 2021, 2022); as well as in the control tank containing only the rearing
396 water used to rear *P. stylirostris* larvae (Callac et al., 2022). *Alteromonadaceae* have been
397 previously detected in the rearing water of *P. stylirostris* (Giraud et al., 2022) and in the rearing
398 water of *P. vannamei* larvae, until stage Mysis 1 (Zheng et al., 2017).

399 When comparing the microbial diversity of the control tank with the rearing water, through the
400 entire rearing, the microbiota dynamic was different, mostly due to the absence of larvae, food
401 and treatment (PERMANOVA and pairwise comparisons). The same trend was observed in a
402 previous study regarding the rearing water of *P. stylirostris* and its control (Callac et al., 2022).
403 The eutrophication of the rearing water with the larvae, contrary to the control water, which
404 stayed oligotrophic during the rearing, could influence the dynamic of the families presents in all
405 the conditions. Thus, the detection of the *Cryomorphaceae* and their increasing abundance at the
406 end of the rearing, especially in the rearing water with antibiotics (Fig. 3); is in accordance with
407 their features as they are often found in organic rich oceanic water (Bowman & McMeekin,
408 2015). In the same way, that might explain the prevalence of the *Litoricolaceae* in the control
409 water and in the first days of the larval rearing, as members of this family are known to grow on
410 oligotrophic medium (Rosenberg et al., 2013). Another family affiliated to the

411 *Flavobacteriaceae*, appeared in the rearing water with larvae and became among the most
412 abundant at the end of the experiment in the rearing water with antibiotics hosting the mysis with
413 a good survival rate. This trend differed from the other study done in the rearing water of *P*.
414 *stylirostris* larvae in which important larval mortalities were observed in the rearing water with
415 antibiotics or without antibiotics (Callac et al., 2022). That also differs from the study made by
416 Zheng et al. 2017 where the *Flavobacteriaceae* were present in high abundance in the rearing
417 water of *P. vannamei* larvae at the zoea stage (Zheng et al., 2017). Thus, the dynamics of the
418 bacterial families in the rearing water appeared to be related to the sampling day, the rearing
419 water quality and to the addition of antibiotics.

420

421 * Antibiotics and larval health as drivers of the rearing water microbiota?

422 Despite the dominance of several main families, the PCoA (Fig. 2) and the statistical analysis
423 (PERMANOVA and pairwise comparison) exhibited that the treatment (control *versus* rearing
424 water with antibiotics *versus* rearing water without antibiotics) influenced the active microbial
425 diversity of the rearing water and influenced up to 25.4% of the variability among the samples
426 while the survival rate accounted only for 6.5%. Even if the statistical analysis shows a bigger
427 effect of the treatment on the active microbial diversity, it is hard to untangle the effects of the
428 antibiotics addition and of the larval death rate on the rearing water microbiota. Indeed, it is
429 complex to discriminate which community was impacted by the treatment rather than by the
430 larval survival. However, it seemed that the antibiotic addition highly influenced the larval
431 survival rate (Figs 2 and 3). Antibiotics use is a worldwide habit in shrimp hatcheries as they are
432 used either to avoid larval mortalities caused by pathogenic *Vibrio* species (Holmström et al.,
433 2003; Aftabuddin et al., 2009) or for prophylactic reasons under veterinary instructions. The
434 effect of the antibiotics on the microbiota of the rearing water of aquacultured animal is poorly
435 documented, while several studies have investigated its effect on animal heath, physiology or
436 microbiota (Kim et al., 2019; Zeng et al., 2019; Holt et al., 2020; Yukgehnaish et al., 2020). To
437 this day, only one study has dealt with antibiotic effects on the rearing water microbiota of the
438 Penaeids (Callac et al., 2022). The authors showed that the antibiotic addition had a significant
439 effect on the microbial diversity of the rearing water on D1 before the larval mortalities occurred.

440 Antibiotic addition at zoea stage during the rearing of the freshwater shrimp *Macrobrachium rosenbergii*, also induced discrepancy among the abundance of the main microbial genera in comparison with a rearing without antibiotics (Ma et al., 2020).

443 Besides the influence of the antibiotic addition on the active microbial diversity of the rearing water, larval mortalities might also affect the composition of the rearing water microbiota. This might especially happen, like in our study, when massive mortalities occur (Fig. 1) and no dead larvae removal or water renewal are applied. Previous studies have proved that animal death (or death of any living organism) implied changes of their microbiota (Preiswerk, Walser & Ebert, 2018; Benbow et al., 2019). Indeed, the microbiome associated with the living host changes after death and let's place to the necrobiome, which influences its closest environment, by decomposing the host-derived organic matter (Cobaugh, Schaeffer & DeBruyn, 2015; Benbow et al., 2019). Therefore, in turn, the microbiota of the closest surrounding of the dead organisms also changes (Cobaugh, Schaeffer & DeBruyn, 2015; Finley et al., 2016; Lobb et al., 2020). In our case, in the rearing water exhibiting high mortality, we can assume that the decaying of the dead larvae can modify the rearing water composition, as well as the water microbiota with the release of the necrobiome in the rearing water. Such process could have started since D2 with the beginning of the mortalities, and continued until D9 when no living larvae remained in the tanks (tanks without antibiotic, Table 1). We can also hypothesize that among the biomarkers or ASVs specific of the unhealthy conditions, some of them were related to the necrobiome. In our study, the use of antibiotics seemed to prevent the larval mortality (Fig.1), and also appeared to influence the rearing water microbiota (Table 2) along with the larval survival rate, larval stage and possibly the necrobiome.

462

463 * Interactions between the natural seawater, the rearing water and the larval stage and health
464

465 In the light of our data, we established that various taxa of the rearing water were specific to a larval stage and of a larval health; except for the zoea with a good survival rate for which no specific ASVs were found (Fig. 4). This also exhibited a microbiota partitioning, as also shown
468 in the rearing water of *P. stylirostris* larvae (Callac et al., 2022) and *P. vannamei* larvae (Zheng et al., 2017), revealing the great importance of the larval stage and of the larval health on the rearing water microbiota. In addition, Giraud et al. (Giraud et al., 2021, 2022) have shown that a horizontal transmission occurs between the shrimp larvae and their surrounding rearing water, suggesting a putative dynamic between the larval microbiota and the rearing water microbiota.

473 According to the specific microbiota of a given larval stage and survival rate, many of the specific evidenced ASVs were previously detected in the natural seawater and in the reservoir (Fig. 4), suggesting the high importance of the lagoon and of the storage waters on the rearing water microbiota, as already shown in Callac et al. 2022. In addition, several studies have showed that multiple lineages were shared between the shrimp early life stages and the water reservoirs (Zheng et al., 2017; Wang et al., 2020b; Giraud et al., 2021, 2022), suggesting that microbial exchanges occurred between the rearing water and the larvae (Giraud et al., 2021, 2022). Such exchanges and interactions, might also occur with the necrobiome in the rearing tanks which exhibited unusual larval death. The rearing water is thus a complex ecosystem where various interactions take place among the water and also between the water and the larvae according to their stage and health status. Seeking for significant and reliable microbial biomarkers might help to monitor and to predict the fate of upcoming rearing.

485

486 * Proxy uncovering: specific biomarker identification of a given rearing condition

487 Our main objective was to unveil biomarkers at the genus level specific to a larval stage and health status, to later use them to monitor larval health and manage the rearing water.

489 In our study, we have highlighted that the use of antibiotics seemed to prevent the larval mortality (Fig. 1), and to influence the rearing water microbiota (Table 2) along with the larval survival rate and the larval stage. Together, by comparing the active microbiota of the rearing water hosting zoea or mysis with various survival rates with LEfSe analysis, we unveil specific biomarkers of a given larval stage and health (Fig 5).

494 The *Nautella* and the *Leisingera* genera were both detected as biomarkers of the healthy zoea and mysis (Fig 5). Interestingly, the genus *Nautella* has been identified as biomarker of diseased *P. vannamei* larvae and their rearing water (Zheng et al., 2016, 2017); while other studies rather exhibited this genus as a biomarker of healthy larvae and shrimps (Wang et al., 2020a; Restrepo et al., 2021). The high abundance of this controversial genus in the rearing water seemed to be in
499 our case a biomarker of healthy larvae. The genus *Leisingera*, biomarker of the rearing water
500 with healthy zoea and mysis larvae, is known to produce secondary metabolites with
501 antimicrobial activity against several *Vibrio* species (Gromek et al., 2016) and has been detected
502 in the gut of the shrimp *P. vannamei*, in the eggs of the hawaiian bobtail squid and in Pacific
503 oyster larvae (Gromek et al., 2016; Duan et al., 2021; Fallet et al., 2022). Beside *Lesingera*,
504 others genera, such as *Ruegerira*, *Alconivorax* and *Marinobacter* might have a probiotic activity
505 in the rearing water hosting the healthy zoea. Indeed, *Ruegira* exhibited antagonist effects
506 against fish vibrio such as *Vibrio anguillarum* and other bacteria isolated in a fish farm (Porsby,
507 Nielsen & Gram, 2008; Sonnenschein et al., 2017). It has been shown that the larvae of the
508 shrimp *P. indicus* had a better growth, metamorphosis rate and survival rate when fed with
509 microalgae associated with bacteria affiliated to *Alteromonas* and *Marinobacter* genera
510 (Sandhya, Sandeep & Vijayan, 2020). The addition of *Alteromonas macleolii* 0444 during the
511 rearing of oyster and scallop larvae showed a protection of the larvae during *Vibrio* challenges
512 (Kesarcodi-Watson et al., 2012). *Tenacibaculum* was significantly enriched in the rearing water
513 hosting the healthy mysis (Fig. 5). In a similar way as the *Nautella*, the genus *Tenacibaculum* has
514 been shown to be a biomarker of diseased *P. vannamei* affected by the “cotton shrimp-like”
515 disease (Zhou et al., 2019). However, *Tenacibaculum* was amongst the 6 most abundant genera
516 detected in both the healthy *P. vannamei* larvae and their rearing water (Zheng et al., 2016). As
517 for the *Nautella*, the high prevalence of *Tenacibaculum* in the rearing water with healthy mysis
518 suggests them to be a biomarker of healthy mysis. We can hypothesis the same about the
519 unknown genus related to the ASV12 and affiliated to the *Cryomorphaceae* for which no
520 metabolic or ecologic function can be inferred except a potential beneficial role for larval
521 survival. Together, these taxa: *Nautella Leisingera*, unknown genera related to ASV12,
522 *Ruegerira*, *Alconivorax*, *Marinobacter* and *Tenacibaculum* seemed to be beneficial for the larval
523 survival and maybe for their physiology (enhance immunity, metamorphosis); and might, in the
524 rearing water, outcompete the r-strategist microorganisms and/or putative opportunistic
525 pathogens.

526 Several biomarkers were detected in the rearing water of unhealthy larvae, and some were
527 present in both the rearing water with unhealthy zoea and unhealthy mysis. This is the case for
528 *Marivita* and *Aestuariicocccus* (Fig. 5). While the last genus was so far never found in shrimp
529 rearing water or shrimp microbiota, the *Marivita* were found in high abundance in ponds where
530 *Penaeus vannamei* adults and larvae were reared (Lin et al., 2017; Yang et al., 2018; Wang et al., 2020a). Even if the ecological role of *Marivita* in aquaculture ecosystem remains unknown (Lin et al., 2017), it seemed that the presence of these bacteria was related to larvae mortalities in our study. The same conclusion can be made for the unknown genus related to the ASV19

534 (*Gammaproteobacteria*) and for the unknown genus related to the ASV44 (NRL2), distinguished as biomarkers in the rearing water hosting the zoea and the mysis with bad survival rate (Fig. 5).

536 The HIMB11 was a biomarker of the healthy zoea that later became unhealthy and of the mysis with a bad survival rate (Fig. 5); this biomarker might be related to upcoming and occurring larval mortalities. *Nioella*, one of the biomarkers of the mysis with a low survival rate in the rearing water, is a genus that has been detected in the gut microbiota of *P. vannamei* affected by infection and *Nioella* seemed to be in diseased-specific associations with species related to

541 *Vibrio tubiashii* and *V. coralliilyticus* (Lu et al., 2020). Interestingly, the *Fabibacter* genus was enriched in rearing water with healthy zoea and in the rearing water hosting mysis with a bad survival rate (Fig. 5). Similarly, the *Phaeocystidibacter* and an unknown genus related to the

545 ASV6 (*Rhodobacteraceae*), were found as biomarker of the zoea with a bad survival and of the healthy mysis in the rearing water (Fig. 5). These contrasted behaviors suggest that either these biomarkers had to be used only at these specific moments of the rearing (with the specific larval health and stage of the detected biomarkers: *Phaeocystidibacter* and an unknown genus related to the ASV6) or are not reliable biomarkers of larval health.

550 One can argue that biomarkers might also reflect the observed one day larval metamorphose occurring during mysis and post-larvae transformations (D6 and D9). However, it is quite common to observe a transition phase from zoea to mysis on Day 6; and from mysis to post-larvae on Day 9 (reference Table 1). As our larval observations took place in the morning, we probably missed the metamorphosis peak occurring at D6 and D9. Indeed, as shown in the Table 1, all the larvae reached the mysis 1 stage at D7 and all the larvae from the tanks reared with antibiotics reached the post larvae stage on Day 10 (except tank C which was still transitioning mysis 3 - post larvae) (Table 1). Therefore, we can argue that the detected biomarkers were specific of a given larval stage and survival rate.

555 At the writing time, larval mortalities are still occurring in the territory's hatcheries highlighting the great importance of defining reliable proxies that can be used as early surveillance of the
561 rearing water or prior to the rearing by monitoring the lagoon seawater. Thus, these biomarkers
562 aim to help microbial management of the rearing waters by suggesting new probiotic populations
563 or beneficial taxa to improve water quality or larval health.

564 Further studies in metatranscriptomic should be done on the rearing water microbiota and on
565 both larvae and their microbiota, in order to highlight the genes that are specifically enriched
566 according to each rearing condition. Such data will allow to investigate which pathways are
567 differentially expressed according to the larval stage and health when contrasted survival rate are
568 observed.

569

570 **Conclusions**

571 Our findings exhibited that shrimp larval rearing water is a complex and dynamic ecosystem,
572 driven by several parameters: the original natural seawater, the presence or not of antibiotics, the
573 larval stage, the larval health status and maybe by the necrobiome. We also highlighted that it is
574 hard to untangle the effects of the antibiotic addition and of the larval mortalities on the rearing
575 water microbiota, especially in the case of mass mortalities occurring in the rearing water
576 without antibiotics in comparison with great survivals in the rearing condition with antibiotics. In
577 addition, our results revealed that, given a larval stage and survival rate, several active taxa were
578 specific to these considered parameters (except for the zoea with a good survival rate). Among
579 these lineages, many of them were originally detected in the natural seawater. That outcome
580 disclosed the great importance of the natural seawater microbiota on the rearing water
581 microbiota. We also showed that the necrobiome associated with dead larvae might potentially
582 impact the structure of the rearing water microbiota. The biomarker investigation allowed to
583 highlight that several genera: *Nautella*, *Leisingera*, unknown genera related to ASV12
584 (*Cryomorphaceae*), *Ruegerira*, *Alconivorax*, *Marinobacter* and *Tenacibaculum*, could potentially
585 be beneficial for the larval survival and physiology; and may, in the rearing water, overcome the
586 r-strategist microorganisms and/or putative opportunistic pathogens. Members of these genera
587 might also act as probiotics for the larvae. On the contrary, *Marivita*, *Aestuariicoccus*, an
588 unknown genus related to the ASV19 (*Gammaproteobacteria*), an unknown genus related to the
589 ASV44 (NRL2), HIMB11 and *Nioella*, appeared to be unfavorable for the larval survival and
590 could be associated with upcoming and occurring larval mortalities. To further understand the
591 role of these specific genera in the rearing water or on the larvae, several studies such as
592 metatranscriptomic analysis are needed, in particular to uncover their activities and ecological
593 role. Other analysis might be done on the detected beneficial biomarkers to test their putative
594 probiotic activities. Despite the unknown role of these specific genera during the rearing, these
595 biomarkers could be used to design specific qPCR primers and thus, be routine proxies to
596 forecast the larval health. They could be used at the beginning of the rearing and even before, in
597 the natural seawater, as an early warning investigation. Ultimately, the same proxies could also
598 help to monitor and to estimate the evolution of the larval rearing; and to further manage the
599 rearing water microbiota and select beneficial microorganisms for the larvae.

600

601 Acknowledgements

602 We sincerely acknowledge all the members of the Station Aquacole de Saint Vincent for their
603 great help before and during the experiment; and for the zootechnical, technical and analytical
604 support. Special thanks to Maxime Beauvais for his indubitably help for the sampling and
605 sample processing. We particularly thank Jean-René Maillez, Jean-Sébastien Lam and Julien Le
606 Rohellec for their precious help in the hatchery. We deeply thank Dominique Ansquer, Valentine
607 Ballan and Gwenola Plougoulen for their valuable biomolecular work. We also greatly
608 acknowledge Valérie Pérez for her valuable bioinformatic help.

609

610 References

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854

855
Figure 1

Evolution of the larval survival during the experiment

Evolution of the larval survival during the experiment compared to the reference in turquoise (e.g.: usual survival rate obtained for a specific day, calculated for each day using data of 10 years of successful rearing; Ifremer data, Pham comm. pers.).Without-A, Without-B, Without-C, correspond to the rearing water without antibiotic in the tanks A, B and C; and With-A, With-B, With-C, stand for the rearing water with antibiotic in the tanks A, B and C. D0 to D9 correspond to the day of the rearing.

<figure><img src="image_117.png" /></figure>
Figure 2

Ordination of the water samples based on the PCoA method and a Bray-Curtis dissimilarity matrix.

PCoA of the rearing water samples. The ellipses were constructed using a confidence level for a multivariate t-distribution set at 80%. For each cluster or samples outside the clusters, the larval stage and health (Good for high survival rate and Bad for high mortality rate) are noted. Each color corresponds to a sampling day in the figure and the corresponding sampling day is noted in the same color in the caption on the right side of the PCoA.
<figure><img src="image_118.png" /></figure>
Figure 3

Microbial composition of the water samples.

Relative abundance of the main prokaryotic families. The relative abundance is represented in terms of percentage of the total prokaryotic sequences per sample. Only families representing more than 1% of the overall abundance in at least 3 samples are displayed on the barplot. Resl stands for the primary reservoir sample, Resll for the secondary reservoir sample, Control stands for the control water without larvae, antibiotic nor food; Without antibiotic for the rearing water without antibiotic, With antibiotic for the rearing water supplemented with antibiotic. D0 to D8 correspond to the sampling day. Sample day are followed by A, B or C which correspond to the replicate tanks for the rearing water with or without antibiotic.

<figure><img src="image_119.png" /></figure>

PeerJ reviewing PDF | (2022:09:77963:2:0:NEW 23 Jan 2023)
Figure 4

Microbial communities associated with the specific and core microbiomes of the whole rearing experiment in the rearing water and the water storages.

**A)** Venn diagram of shared ASVs among all the rearing water samples. Coloured ellipses correspond to group-specific ASVs of the rearing water hosting in: red = nauplii, khaki = zoea with a good survival rate, green = zoea with a bad survival rate, blue = mysis with a good survival rate, purple = mysis with a bad survival rate. The overlapping area between all the ellipses, corresponds to the core microbiome composed by the 137 ASVs common to all the samples. The numbers inside the ellipses and in the overlapping zones correspond to the total number of ASVs present in the condition. **B to F)** Venn diagram of shared ASVs between the specific ASVs of the water storage (yellow ellipse = group-specific ASVs of the primary reservoir and maroon = group-specific ASVs of the secondary reservoir) and **B)** with the nauplii (red ellipse), **C)** with the zoea with a bad survival rate (khaki ellipse), **D)** with the mysis with a good survival rate (blue ellipse), **E)** with the mysis with a bad survival rate (purple ellipse). **F)** Venn diagram of the core microbiota of the rearing water and the ASVs of the water storages: in light yellow the primary reservoir and in beige the secondary reservoir.
<figure><img src="image_120.png" /></figure>
Figure 5

Differentially abundant genera according to the larval growth and survival status.

**A)** LEfSe, linear discriminant analysis (LDA) effect size, exhibiting the genera significantly more abundant in the rearing water **A**) hosting zoea that stayed healthy during the zoea stage (NTAO2 Zoea Good), hosting zoea that were healthy at the beginning of the zoea stage and unhealthy at the end (NTSA Zoea Bad, corresponding to the rearing day 2 and 3) and hosting zoea with high mortality rate at the end of the zoea stage (NTSA Zoea Bad, corresponding to the rearing day 4 to 6); **B**) hosting healthy mysis (Mysis Good) and unhealthy mysis (Mysis Bad). Genera wrote in blue are biomarkers enriched in the rearing water hosting both healthy zoea and mysis. Genera wrote in red are enriched in the rearing water hosting both unhealthy zoea and mysis. Genera wrote in purple were detected as biomarkers of the unhealthy zoea and healthy mysis. Genus wrote in brown was enriched in the rearing water hosting zoea that were healthy at the beginning of the zoea stage and unhealthy at the end and in the rearing water with unhealthy mysis.

<figure><img src="image_121.png" /></figure>
**Table 1**(on next page)

Time series of larval stage

Time series of larval stage compared to the reference larval stage index to reach each day (e.g.: usual larval stage obtained for a specific day; stage reference has been calculated for each day using data of 10 years of successful rearing; Ifremer data, Pham comm. Pers.); D0 to D9 correspond to the day of the rearing, D10 was added to show that the larvae were mostly at the Post larvae stage on D10 (excepted in tank With-C). Each color corresponds to a specific larval stage, when in black that means that the larvae were all dead in the tanks. Without-A, Without-B, Without-C, correspond to the rearing tanks without antibiotics; and With-A, With-B, With-C, stand for the rearing tanks with antibiotics. The considering larval stage was named, when more than 75% of observed the larvae
<table><thead><tr><th></th><th>D0</th><th>D1</th><th>D2</th><th>D3</th><th>D4</th><th>D5</th><th>D6</th><th>D7</th><th>D8</th><th>D9</th><th>D10</th></tr></thead><tbody><tr><td>Without-A</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Without-B</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Without-C</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>With-A</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 2</td><td>Post Larvae</td></tr><tr><td>With-B</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 2</td><td>Mysis 3</td><td>Post Larvae</td></tr><tr><td>With-C</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 2</td><td>Mysis 2</td><td>Mysis 3</td></tr><tr><td>Reference</td><td>Nauplii</td><td>Nauplii</td><td>Zoea 1</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 2</td><td>Zoea 3</td><td>Mysis 1</td><td>Mysis 2</td><td>Mysis 3</td><td>Post Larvae</td><td>Post Larvae</td></tr></tbody></table>

PeerJ reviewing PDF | (2022.09.77963.2.0:NEW 23 jan 2023)
**Table 2**

PERMANOVA

PERMANOVA using Bray-Curtis distance showing that the variation of the microbial community is explained by all the monitored variables: rearing day, treatment (control, rearing water with antibiotics, rearing water without antibiotics), larval survival rate, larval stage, larval stage and survival rate; and the combine variable rearing day and treatment.

Only 8.3% of the variability between the samples is not explained by the listed variables.

Bold values indicate significant correlation (P < 0.05).

<table><thead><tr><th></th><th>R<sup>2</sup></th><th>P-value</th></tr></thead><tbody><tr><td>Rearing day</td><td>36%</td><td><strong>0.0001</strong></td></tr><tr><td>Treatment</td><td>25.4%</td><td><strong>0.0001</strong></td></tr><tr><td>Larval survival rate</td><td>6.5%</td><td><strong>0.0001</strong></td></tr><tr><td>Larval stage</td><td>5,3%</td><td><strong>0.0001</strong></td></tr><tr><td>Larval stage and survival rate</td><td>5%</td><td><strong>0.0001</strong></td></tr><tr><td>Rearing day and treatment</td><td>13.5%</td><td><strong>0.0001</strong></td></tr><tr><td>Residual</td><td>8.3%</td><td></td></tr><tr><td>Total</td><td>100%</td><td></td></tr></tbody></table>
## VI.4- Synthèse des résultats et perspectives

La première étude (article 4) montre une eutrophisation de l'eau au cours d'élevages larvaires présentant d'importants taux de mortalités et ce avec ou sans ajout d'antibiotique. Cette augmentation de la concentration en sels nutritifs et en matière organique dissoute était également observée dans l'article 3 (chap. V, partie V.2) consacré à l'étude d'élevages larvaires en bonne santé. Ces résultats suggèrent que l'eutrophisation du milieu d'élevage n'est ni une cause ni une conséquence des mortalités larvaires observées. Cependant, elle correspond tout de même à des modifications drastiques du milieu d'élevage susceptibles d'influencer les communautés microbiennes présentes. Cela est mis en évidence par les ordonnancements des 2 études présentées dans ce chapitre avec un regroupement des échantillons en fonction du jour d'élevage. L'article 5 démontre d'ailleurs que ce facteur explique 36% de la variabilité de la diversité procaryotique observée dans les échantillons. Cependant, il met également en évidence d'autres éléments susceptibles d'influencer les communautés procaryotiques de l'eau d'élevage : l'ajout ou non d'antibiotique (25,4%), l'état de santé des larves (6,5%) et le stade de développement des larves (5%). Malgré l'impact des antibiotiques au sein des élevages, l'article 4 met en évidence, à J1, un core microbien correspondant à 97% de l'abondance relative totale des échantillons d'eau avec ou sans antibiotiques et suggère ainsi que les communautés bactériennes les plus impactées sont les communautés rares. Les bactéries majoritaires composant ce core microbien sont affiliées aux familles *Marinobacteraceae*, *Alteromonadaceae* et *Rhodobacteraceae*. En comparant les eaux d'élevages de larves à différents stades de développement et en bonne ou mauvaise santé (eaux d'élevage des larves aux stades nauplii en bonne santé, zoé en bonne santé, zoé en mauvaise santé, mysis en bonne santé, mysis en mauvaise et en très mauvaise santé), un autre core microbien composé de 54 OTUs affiliés aux familles *Alteromonadaceae*, *Rhodobacteraceae*, *Saprospiraceae*, *Litoricolaceae*, *Beggiatoaceae*, *Pseudoalteromonadaceae* et *Vibrionaceae* est mis en évidence. Parmi ces 54 OTUs, 52 sont également identifiés dans les eaux de remplissage et de réserve suggérant une forte influence de ces intrants tout au long de l'élevage. Cela est également montré par l'article 5 qui présente un core microbien partagé par l'ensemble des échantillons d'eau de 137 ASVs dont 136 sont mis en évidence dans les eaux de remplissage et de réserve. En utilisant des LEfSe, les 2 études de ce chapitre révèlent des biomarqueurs bactériens de l'état de santé des élevages. L'article 4 met ainsi en évidence, dans l'eau d'élevage, la famille des *Marinobacteraceae* comme marqueur des larves nauplii en bonne santé ainsi que les *Thalassospiraceae* et *Saprospiraceae* comme indicateurs de bonne santé des larves au stade zoé. En revanche, les *Litoricolaceae* et les *Microbacteraceae* sont respectivement identifiés comme des biomarqueurs des larves zoé et mysis en mauvaise santé. L'article 5 montre que les bactéries affiliées aux genres *Nautella*, *Leisingera*, *Ruegeria*, *Alcanivorax*, *Marinobacter* et *Tenacibaculum* sont enrichies dans l'eau d'élevage des larves en bonne santé alors que les *Marivita*, *Aestuariicoccus*, *HIMB11* et *Nioella* sont plus abondants dans l'environnement des larves en mauvaise santé. De manière intéressante, les genres *Ruegeria* et *Leisingera* avaient également été identifiés comme potentiels taxa bénéfiques dans l'article 3 présenté dans le chapitre V. Dans les 2 études de ce chapitre VI, l'identification des biomarqueurs, en amont des élevages dans les eaux de remplissage et de réserve, suggère la possibilité de mettre au point des outils de biosurveillance non invasifs de type PCR ou qPCR qui pourraient permettre une détection précoce de mortalités larvaires à venir. Cependant, ces analyses conduites à
# Chapitre VI – Caractérisation des communautés procaryotiques de l’eau d’élevage au cours de mortalités larvaires : identification de biomarqueurs

l’échelle d’une seule écloserie limitent la découverte de biomarqueurs utilisables à l’échelle du territoire, dans l’ensemble des écloseries de la Nouvelle-Calédonie. En conséquence, une méta-analyse a été réalisée en regroupant l’ensemble des échantillons considérés au cours de cette thèse. Elle est présentée dans le chapitre suivant (chap. VII).
# CHAPITRE VII

## Méta-analyse : cores microbiens et biomarqueurs bactériens
# VII- Chapitre VII – Méta-analyse : cores microbiens et biomarqueurs bactériens

Ce chapitre présente une méta-analyse incluant l'ensemble des échantillons considérés au cours de ce projet de thèse. Son objectif est de mettre en évidence de potentiels biomarqueurs bactériens de l'état de santé des élevages afin de développer des outils de biosurveillance précoces, de type PCR ou qPCR, utilisables à l'échelle du territoire. À terme, le but de cette première approche est de développer des amorces (PCR ou qPCR) permettant d'identifier des microorganismes cibles au moment du lancement des élevages (remplissage des réserves et pontes des œufs).

Dans un premier temps, la diversité procaryotique globale des échantillons d'élevage (eau d'élevage et larves de J0 à J9) a été évaluée et comparée par des NMDS (non-metric dimensional scaling) basées sur différentes matrices de distances obtenues à partir des données normalisées par les méthodes DESeq2 ou CPM (chap. III, parties III.4.2.b et III.4.2.c). Dans un second temps, les ASVs communs à l'ensemble des eaux d'élevage et des larves ont été recherchés afin de mettre en évidence les cores microbiens associés à chaque condition. Enfin, l'identification de biomarqueurs a consisté en une analyse des ASVs différentiellement abondants entre les larves en bonne et en mauvaise santé ainsi qu'entre les eaux d'élevage hébergeant ces larves.

## VII.1- Normalisation par les méthodes DESeq2 et CPM et ordonnancements de l'ensemble des échantillons d'élevage

### VII.1.1- Rappel des méthodes d'analyse de la diversité bêta

Le premier objectif de cette méta-analyse était de comparer la diversité procaryotique totale de l'ensemble des échantillons d'élevage considérés au cours de cette thèse. Ces échantillons ont été séquencés au cours de 3 séquençages distincts, réalisés à des profondeurs différentes (chap. IV, partie IV.1.1) et menant à des librairies de tailles variables (chap. III, partie III.4.1) au sein de la table globale finale (taille minimale = 12 744 séquences, taille maximale = 2 279 931 séquences). Une normalisation des données a donc d'abord dû être réalisée. La méthode de normalisation par CPM (chap. III, partie III.4.2.b), utilisée pour les autres analyses de ce projet, a été envisagée. Cependant, elle se base sur les proportions et ne permet donc pas de corriger correctement la surdispersion d'un jeu de données (chap. III, partie III.4.3). Nous avons donc considéré une seconde méthode de normalisation, DESeq2 (chap. III, partie III.4.2.c), afin de comparer les résultats obtenus par ces 2 approches et ainsi choisir la stratégie la plus adaptée aux données utilisées. Pour chaque table d'ASVs obtenue (normalisée par CPM ou normalisée par DESeq2), différentes matrices de distances (Bray-Curtis, Jaccard, UniFrac, weighted UniFrac) (chap. II, partie II.6) ont été construites pour ensuite effectuer des analyses d'ordonnancement par NMDS.

La NMDS est une analyse multivariée visant à réduire les dimensions d'un jeu de données. Elle a ainsi pour objectif de représenter, dans un graphique en 2D, une matrice de distances multidimensionnelle calculée à partir de la table d'ASVs d'intérêt (chap. I, partie I.4.1.a). La construction de cette matrice de distances permet d'évaluer la ressemblance des échantillons entre eux. Une distorsion des distances, résultant de la réduction de dimensions
entraînée par la NMDS, peut impacter les interprétations biologiques effectuées à partir des ordonnancements obtenus. En conséquence, une valeur de stress est calculée pour évaluer l'effet de la transformation graphique sur la représentation des distances. Si cette valeur est inférieure à 0,1 alors les distances ne sont pas impactées par la réduction de dimensionnalité. Inversement, si le stress est supérieur à 0,2 alors la NMDS conduit à des interprétations biologiques fausses et une autre analyse multivariée doit être utilisée (PCoA par exemple). En revanche, si la valeur de stress est comprise entre 0,1 et 0,2 alors la transformation graphique impacte la représentation des distances mais les interprétations biologiques peuvent être correctes. Dans ce dernier cas, une approche comparative de différentes NMDS, construites à partir de différentes matrices de distances, permet ainsi de considérer l'ensemble des résultats possibles.

## VII.1.2- Interprétation des résultats

Les NMDS réalisées à partir des matrices de distance de Jaccard, UniFrac et Bray-Curtis apportent des conclusions similaires quelle que soit la méthode de normalisation considérée (DESeq2 ou CPM) (Fig. 55). En effet, dans les 2 cas, 2 groupes principaux se distinguent. Ils correspondent aux échantillons des élevages de la SASV (Station Aquacole de Saint Vincent, campagnes M1, M3 et M4) et des écloseries privées (E1 et E2). Plus spécifiquement, les échantillons récoltés au cours des campagnes M1 et M3, réalisées en septembre (saison fraîche) et novembre 2018 (saison intermédiaire), se différencient de ceux récoltés pendant la campagne M4, réalisée en février 2019 (saison chaude). Ce regroupement d'échantillons pourrait s'expliquer par des variations saisonnières impactant les communautés procaryotiques associées aux élevages. Cependant, il est probable que ces différences résultent également des biais de profondeur de séquençage persistant malgré les normalisations appliquées (chap. III, partie III.4.1). En parallèle, une séparation des échantillons des écloseries privées 1 et 2 (campagnes E1 et E2) est également observée et suggère que les larves et les eaux issues d'une même écloserie présentent des communautés procaryotiques similaires. Cela pourrait s'expliquer par l'influence des eaux de remplissage provenant de baies géographiquement éloignées mais aussi par les différents protocoles d'élevage utilisés dans les écloseries (antibiotique, nourriture, traitement de l'eau, volume des bacs d'élevage, etc.) (chap. II, partie II.1).

En observant la NMDS basée sur la matrice de distances weighted UniFrac obtenue à partir des données normalisées par la méthode DESeq2 (Fig. 55A), une distinction des échantillons de la SASV est toujours visible mais les échantillons des écloseries privées se confondent. Contrairement aux élevages suivis dans les écloseries privées, les élevages considérés au cours des campagnes à la SASV ont été confrontés à des épisodes de fortes mortalités larvaires ou ont montré un développement larvaire ralenti (Tab. 12). L'ordonnancement weighted UniFrac basée sur les données DESeq2 pourrait ainsi montrer un effet de l'état de santé des élevages sur les compositions microbiennes des échantillons. Cependant, certains élevages conduits au cours de la campagne M4 ont montré des taux de survie similaires ou supérieurs aux valeurs de référence et cette distinction pourrait ainsi résulter des différents antibiotiques (érythromycine à la SASV, oxytetracycline dans les écloseries privées) ou volumes des bacs d'élevage (100l à la SASV, 10 m³ dans les écloseries privées) utilisés par la SASV et les écloseries privées.

La NMDS basée sur la matrice de distances weighted UniFrac obtenue à partir des données normalisées par CPM (Fig. 55B) ne permet pas une visualisation claire à cause
d'échantillons divergents. Cela peut être expliqué par une surdispersion encore trop importante au sein du jeu de données malgré la normalisation appliquée. En conclusion, il semblerait que la méthode de normalisation par DESeq2 soit la plus adaptée aux données considérées et elle sera conservée pour la suite de la méta-analyse ; à l'exception des analyses réalisées avec ANCOM-BC (Mandal et al. 2015; Lin & Peddada 2020) qui possède une méthode de normalisation propre.

<figure><img src="image_122.png" /><figcaption>**FIGURE 55** – NMDS (Non-Metric Dimensionnal Scaling) basées sur des matrices de distances de Jaccard, Bray-Curtis, UniFrac ou weighted UniFrac obtenues à partir des données d'élevage normalisées par A) la méthode DESeq2 ou B) la méthode CPM.</figcaption></figure>

Les échantillons récoltés au sein des élevages réalisés à la SASV (campagnes M1, M3 et M4) sont représentés en noir, rouge et orange alors que ceux prélevés au cours des campagnes dans les écloseries privées (E1 et E2) sont représentés en vert et en bleu.
TABLEAU 12 – Taux de survie des bacs d'élevage suivis au cours des campagnes M1 (encadrées en noir), M3 (encadrées en rouge), M4 (encadrées en orange), E1 (encadrées en vert) et E2 (encadrées en bleu).

Les taux de survie sont quotidiennement calculés de J0 (jour d'ensemencement des larves dans les bacs d'élevage) à J9 (transition au stade post-larve). Les taux de survie indiqués dans le tableau sont ceux relevés au dernier jour d'élevage d'observation de larves vivantes. Si le jour indiqué est inférieur à 9 alors la totalité des larves du bac considéré étaient mortes le jour suivant. Le dernier jour d'observation de larves vivantes est indiqué dans la colonne « Jour ». Les taux de survie notés en rouge correspondent aux échantillons des élevages considérés comme étant en mauvaise santé (larves n'ayant pas survécu jusqu'à J9 ou plus de 5% de différence avec le taux de survie attendu à J9, 70%, soit un seuil fixé à 66,5%). Le stade de développement des larves présentant un taux de survie attendu à J9 est précisé dans la colonne « stade larvaire à J9 ». Plusieurs conditions, réalisées en triplicats, ont été considérées selon le traitement de l'eau d'élevage (traitée, T ou non traitée, NT) et l'ajout ou non d'antibiotique (A0 pour ajout à partir de J0, A3 pour ajout à partir de J3 ou SA pour sans antibiotique). Les campagnes E1 et E2 ont été réalisées dans des écloseries privées ayant chacune un protocole d'élevage spécifique décrit dans le chapitre II (parties II.1.2 et II.1.3). Dans ces écloseries, 2 suivis d'élevages larvaires consécutifs ont été réalisés (A et B).

<table><thead><tr><th>CAMPAGNE</th><th>CONDITION</th><th>JOUR</th><th>NUMÉRO DE RÉPLICAT</th><th>TAUX DE SURVIE (%)</th><th>STADE LARVAIRE À J9</th></tr></thead><tbody><tr><td>M1</td><td>TA3</td><td>4</td><td>1</td><td>25,56</td><td></td></tr><tr><td>M1</td><td>TA3</td><td>4</td><td>2</td><td>25,56</td><td></td></tr><tr><td>M1</td><td>TA3</td><td>3</td><td>3</td><td>23,89</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>TA0</td><td>9</td><td>1</td><td>14,44</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>TA0</td><td>9</td><td>2</td><td>16,11</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>TA0</td><td>9</td><td>3</td><td>56,67</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>TSA</td><td>9</td><td>1</td><td>21,11</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>TSA</td><td>9</td><td>2</td><td>41,67</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>TSA</td><td>9</td><td>3</td><td>31,11</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>NTA0</td><td>9</td><td>1</td><td>62,78</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>NTA0</td><td>9</td><td>2</td><td>59,44</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>NTA0</td><td>9</td><td>3</td><td>56,11</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>NTSA</td><td>9</td><td>1</td><td>5,56</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>NTSA</td><td>9</td><td>2</td><td>12,22</td><td></td></tr><tr><td>M3</td><td>NTSA</td><td>9</td><td>3</td><td>15,56</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>TA3</td><td>9</td><td>1</td><td>66,67</td><td>Mysis 2 – Mysis 3</td></tr><tr><td>M4</td><td>TA3</td><td>9</td><td>2</td><td>57,22</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>TA3</td><td>9</td><td>3</td><td>53,89</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>TSA</td><td>7</td><td>1</td><td>1,67</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>TSA</td><td>9</td><td>2</td><td>12,22</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>TSA</td><td>9</td><td>3</td><td>33,33</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>NTA0</td><td>9</td><td>1</td><td>72,22</td><td>Mysis 2 – Mysis 3</td></tr><tr><td>M4</td><td>NTA0</td><td>9</td><td>2</td><td>73,89</td><td>Mysis 2 – Mysis 3</td></tr><tr><td>M4</td><td>NTA0</td><td>9</td><td>3</td><td>85</td><td>Mysis 2 – Mysis 3</td></tr><tr><td>M4</td><td>NTA3</td><td>9</td><td>1</td><td>79,44</td><td>Mysis 2 – Mysis 3</td></tr><tr><td>M4</td><td>NTA3</td><td>9</td><td>2</td><td>81,67</td><td>Mysis 2 – Mysis 3</td></tr><tr><td>M4</td><td>NTA3</td><td>9</td><td>3</td><td>40,56</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>NTSA</td><td>8</td><td>1</td><td>7,22</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>NTSA</td><td>8</td><td>2</td><td>6,67</td><td></td></tr><tr><td>M4</td><td>NTSA</td><td>8</td><td>3</td><td>14,44</td><td></td></tr><tr><td>E1</td><td>Suivi A</td><td>9</td><td>1</td><td>94,74</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E1</td><td>Suivi A</td><td>9</td><td>2</td><td>81,58</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E1</td><td>Suivi A</td><td>9</td><td>3</td><td>68,42</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E1</td><td>Suivi B</td><td>9</td><td>1</td><td>73,68</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E1</td><td>Suivi B</td><td>9</td><td>2</td><td>78,95</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E1</td><td>Suivi B</td><td>9</td><td>3</td><td>68,42</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E2</td><td>Suivi A</td><td>9</td><td>1</td><td>86,59</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E2</td><td>Suivi A</td><td>9</td><td>2</td><td>91,55</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E2</td><td>Suivi A</td><td>9</td><td>3</td><td>87,10</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E2</td><td>Suivi B</td><td>9</td><td>1</td><td>76,97</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E2</td><td>Suivi B</td><td>9</td><td>2</td><td>84,65</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr><tr><td>E2</td><td>Suivi B</td><td>9</td><td>3</td><td>84,64</td><td>Mysis 3 – Post-larve</td></tr></tbody></table>
## VII.2- Recherche de cores microbiens

### VII.2.1- Identification des ASVs

Une comparaison des cores microbiens associés aux échantillons d'eau d'élevage et de larves a permis de mettre en évidence 9 ASVs spécifiquement associés à l'ensemble des échantillons d'eau, 3 ASVs uniquement identifiés dans les échantillons de larves et 5 ASVs communs à l'ensemble des échantillons d'élevage, soit un total de 17 ASVs (Fig. 56A). L'ensemble de ces ASVs est affilié au phylum des *Proteobacteria* et plus spécifiquement aux classes des *Alphaproteobacteria* et des *Gammaproteobacteria*. Ces observations sont en accord avec les études intégrées dans les chapitres IV à VI (Giraud et al. 2021; 2022; In prep.; Callac et al. 2022; In review) ainsi qu'avec la littérature présentée dans le chapitre I (partie I.3.4). En effet, ces recherches montrent une prédominance de bactéries affiliées aux *Proteobacteria* au sein du microbiote associé aux élevages de différentes espèces de crevettes (Cornejo-Granados et al. 2018) et ce à tous les stades larvaires (Zheng et al. 2017; Xue et al. 2018; Wang et al. 2020a; b; Giraud et al. 2021; 2022; Callac et al. 2022), post-larvaires (Garibay-Valdez et al. 2020), juvéniles (Xiong et al. 2014; Li et al. 2018) et adultes (Zeng et al. 2017).

Parmi les 17 ASVs mis en évidence, 8 ont été identifiés comme appartenant à la famille des *Rhodobacteraceae* (6 ASVs spécifiques aux eaux d'élevage et 2 communs aux eaux et aux larves, Fig. 56B et 56D). Ces bactéries sont connues pour leur diversité métabolique et écologique et sont mises en évidence dans des écosystèmes divers allant du sol aux plantes en passant par les eaux douces et marines (Garrity et al. 2015). Wang et al. (2020b) ont suggéré que les *Rhodobacteraceae*, acquises au moment de l'ouverture de la bouche des larves au stade zoé, persistaient tout au long de la vie des animaux et appartenaient ensuite au microbiote intestinal des crevettes adultes de *P. vannamei*, renforçant ainsi les hypothèses émises dans le chapitre IV quant au maintien de certains microorganismes procaryotiques au cours du développement de *P. stylirostris*. Les auteurs proposent également que ces procaryotes pourraient être impliqués dans les processus de digestion et d'inhibition de pathogènes et ainsi constituer une potentielle source de bactéries probiotiques.

Au-delà des *Rhodobacteraceae* mises en évidence dans le core microbien des eaux d'élevage, 3 ASVs affiliés à la famille des *Stappiaceae* et aux genres *Alcanivorax* et *Litoricola*, ont également été trouvés (Fig. 55B). À notre connaissance, les *Stappiaceae* ont uniquement été mises en évidence dans les eaux contrôle de l'étude 4 présentée dans le chapitre VI (partie VI.2). Cependant, les membres de cette famille bactérienne ont longtemps été considérés comme appartenant aux *Rhodobacteraceae* (Hördt et al. 2020), ce qui pourrait expliquer leur non identification en contexte aquacole. En effet, l'ordre des *Rhizobiales*, dont font partie les *Stappiaceae*, a été mis en évidence dans les branchies de crevettes *P. vannamei* adultes (Lv et al. 2020) et dans le microbiote intestinal de plusieurs espèces de poissons (Ikeda-Ohtsubo et al. 2018) suggérant qu'ils pourraient également appartenir aux populations procaryotiques associées à l'environnement d'élevage des larves de *P. stylirostris*. Le genre *Alcanivorax*, connu pour ses capacités à utiliser les hydrocarbures comme substrat (Golyshin et al. 2002), a été isolé à partir de sédiments de bassins de crevettes adultes (Rahul et al. 2014) et a été identifié dans les intestins de langoustes juvéniles (Ooi et al. 2017). Dans cette dernière étude, il a été suggéré que les membres de ce genre bactérien pourraient jouer un rôle dans le métabolisme des lipides de leur hôte (Ooi et al. 2017). Le genre *Litoricola* a été mis en évidence comme dominant dans l'eau et les sédiments de crevettes *P. vannamei* juvéniles où
il était positivement corrélé aux paramètres physiologiques des animaux (activité superoxide dismutase, activité anti-bactérienne, capacité antioxydante totale) (Huang et al. 2018). Les auteurs ont suggéré que ces bactéries, présentes dans l'environnement d'élevage, étaient capables de stimuler le système immunitaire des animaux.

Dans les larves, le core microbien mis en évidence est affilié aux genres *Pseudoalteromonas* et *Vibrio* (Fig. 56B). Les *Pseudoalteromonas* sont considérées comme des sources prometteuses de probiotiques en aquaculture car elles synthétisent des molécules antimicrobiennes et présentent des propriétés algicides (Longeon et al. 2004). En Nouvelle-Calédonie, la souche de *Pseudoalteromonas* NC201 a d'ailleurs montré un potentiel probiotique dans les élevages larvaires de *P. stylirostris* (Pham et al. 2014; Sorieul et al. 2018; 2019). Le genre *Vibrio* a été identifié au sein d'élevages d'espèces de crevettes distinctes à différents stades de développement suggérant que ce genre est présent tout au long de la vie des animaux quel que soit leur état de santé (Vandenberghe et al. 1999; Zheng et al. 2017; Cornejo-Granados et al. 2018; Wang et al. 2020a).

Le genre bactérien *Nautella*, mis en évidence dans le core microbien associé à l'ensemble des échantillons d'élevage (Fig. 56C), a été identifié comme enrichi dans les larves de *P. vannamei* en mauvaise santé, et a ainsi été proposé comme biomarqueur de la dégradation de l'état de santé des animaux (Zheng et al. 2017). Cependant, son identification au sein d'élevages larvaires sains (Xue et al. 2018; Wang et al. 2020a) suggère, comme pour les *Vibrios*, que les membres du genre *Nautella* appartiennent au core microbien des larves de crevettes de *P. stylirostris* indépendamment de l'état de santé des élevages. Il est néanmoins possible que certaines espèces affiliées à ces genres puissent devenir néfastes sous certaines conditions et entraîner une dégradation de la santé des animaux (Egan & Gardiner 2016). Enfin, la mise en évidence d'ASVs affiliées aux genres *Alteromonas* et *Aestuariibacter* dans le core microbien de l'ensemble des échantillons d'élevage (Fig. 56C) renforce nos hypothèses quant à l'appartenance de ces taxa bactériens au core microbien des élevages de *P. stylirostris* (article 1, chap. IV, partie IV.1).
A

Core microbien
eaux d'élevage

9

5

3

Core microbien
larves

Core microbien
tous échantillons

B

<table><thead><tr><th></th><th>RÈGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="10">Core<br>microbien<br>eaux<br>d'élevage</td><td>ASV83</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhizobiales</td><td>Stappiaceae</td><td>Unknown</td></tr><tr><td>ASV28</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Aestuariicoccus</td></tr><tr><td>ASV42</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Cognatishimia</td></tr><tr><td>ASV15</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>HiMB11</td></tr><tr><td>ASV35</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Ruegeria</td></tr><tr><td>ASV110</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Unknown</td></tr><tr><td>ASV136</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Unknown</td></tr><tr><td>ASV41</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Oceanospirillales</td><td>Alcanivoraceae</td><td>Alcanivorax</td></tr><tr><td>ASV21</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Oceanospirillales</td><td>Litoricolaceae</td><td>Litoricola</td></tr></tbody></table>

C

Core
microbien
larves

<table><thead><tr><th></th><th>RÈGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>ASV143</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV1</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV65</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Vibrionaceae</td><td>Vibrio</td></tr></tbody></table>

D

<table><thead><tr><th></th><th>RÈGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">Core<br>microbien<br>tous<br>échantillons</td><td>ASV12</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Nautella</td></tr><tr><td>ASV25</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Unknown</td></tr><tr><td>ASV3</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>Aestuariibacter</td></tr><tr><td>ASV4</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>Alteromonas</td></tr><tr><td>ASV30</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Vibrionaceae</td><td>Vibrio</td></tr></tbody></table>

FIGURE 56 – A) Diagramme de Venn des ASVs mis en évidence dans les cores microbiens des eaux d'élevage, des larves et de l'ensemble des échantillons. Taxonomie des ASVs identifiés dans les cores microbiens B) des eaux d'élevage, C) des larves et D) de l'ensemble des échantillons d'élevage (communs eaux et larves).

VII.2.2- Influence des intrants

Les 17 ASVs mis en évidence par les analyses de core microbien ont été recherchés dans les eaux de remplissage et de réserve ainsi que dans les œufs de l'ensemble des élevages, afin d'évaluer s'ils étaient déjà présents au moment de l'ensemencement des larves (Tab. 13). À l'exception de l'ASV42, absent des eaux de remplissage et de réserve de l'écloserie privée 2 (campagne E2), l'ensemble des ASVs appartenant au core microbien des eaux d'élevage sont mis en évidence dès le remplissage des réserves de l'ensemble des écloseries. Ces ASVs semblent ensuite persister dans les élevages malgré les traitements d'eau (chap. II, partie II.1). De la même manière, les ASVs appartenant au core microbien des larves sont présents en amont des élevages larvaires, dans les œufs ainsi que dans les eaux de réserve, suggérant une persistance de communautés procaryotiques acquises dès le début de la vie des larves et renforçant les hypothèses émises dans le chapitre IV quant au maintien de certains taxa bactériens au cours du développement de *P. stylirostris*. Enfin, les ASVs appartenant au core microbien de tous les échantillons sont également identifiés dès le début de l'élevage. Ainsi, les 17 ASVs considérés sont mis en évidence dans la quasi-totalité des eaux de remplissage (provenant du lagon), des eaux de réserve (alimentant les bacs d'élevage) et des œufs. Ces résultats soulignent l'importance des intrants dans le devenir des communautés microbiennes des élevages.
<caption>**TABLEAU 13** – Comptages non normalisés des ASVs identifiés dans les cores microbiens des eaux d'élevage, des larves et de l'ensemble des échantillons d'élevage.</caption>

Seuls les eaux de remplissage (lagon), les eaux de réserve et les œufs sont considérés (intrants initiaux). Lorsque plusieurs échantillons d'un même intrant étaient disponibles, une moyenne a été calculée. L'ASV42, noté en gras, est le seul ASV, identifié dans le core microbien des eaux d'élevage, qui n'est pas identifié dans toutes les eaux de remplissage et de réserve. En effet, il est présent dans les eaux de remplissage et de réserve des campagnes M1, M3, M4 (élevages réalisés à la SASV) et E1 (élevages réalisés dans l'écloserie privée 1) mais absent pour la campagne E2 (élevages réalisés dans l'écloserie privée 2).

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2"></th><th colspan="3">M1</th><th colspan="3">M3</th><th colspan="3">M4</th><th colspan="3">E1</th><th colspan="3">E2</th></tr><tr><th>Lagon</th><th>Réserve</th><th>Œufs</th><th>Lagon</th><th>Réserve</th><th>Œufs</th><th>Lagon</th><th>Réserve</th><th>Œufs</th><th>Lagon</th><th>Réserve</th><th>Œufs</th><th>Lagon</th><th>Réserve</th><th>Œufs</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="10">Core microbien des eaux d'élevage</td><td>ASV15</td><td>606</td><td>174</td><td>19</td><td>895</td><td>484</td><td>1</td><td>15347</td><td>6620</td><td>696</td><td>54765</td><td>11280</td><td>26</td><td>12072</td><td>4787</td><td>128</td></tr><tr><td>ASV21</td><td>531</td><td>684</td><td>28</td><td>650</td><td>362</td><td>14</td><td>4177</td><td>14434</td><td>369</td><td>27875</td><td>10955</td><td>52</td><td>11425</td><td>8143</td><td>166</td></tr><tr><td>ASV28</td><td>3</td><td>213</td><td>0</td><td>16</td><td>39</td><td>5</td><td>19</td><td>101</td><td>61</td><td>96</td><td>61</td><td>2</td><td>312</td><td>117</td><td>27</td></tr><tr><td>ASV35</td><td>6</td><td>3</td><td>12</td><td>5</td><td>6</td><td>6</td><td>43</td><td>93</td><td>297</td><td>204</td><td>160</td><td>150</td><td>182</td><td>56</td><td>940</td></tr><tr><td>ASV41</td><td>177</td><td>114</td><td>19</td><td>35</td><td>114</td><td>1</td><td>682</td><td>3979</td><td>252</td><td>729</td><td>2346</td><td>19</td><td>1146</td><td>375</td><td>6</td></tr><tr><td><strong>ASV42</strong></td><td><strong>90</strong></td><td><strong>126</strong></td><td><strong>88</strong></td><td><strong>4</strong></td><td><strong>206</strong></td><td><strong>183</strong></td><td><strong>40</strong></td><td><strong>1169</strong></td><td><strong>933</strong></td><td><strong>93</strong></td><td><strong>173</strong></td><td><strong>12871</strong></td><td><strong>0</strong></td><td><strong>0</strong></td><td><strong>7</strong></td></tr><tr><td>ASV53</td><td>24</td><td>9</td><td>9</td><td>1</td><td>3</td><td>27</td><td>29</td><td>63</td><td>175</td><td>34</td><td>26</td><td>3323</td><td>12</td><td>1</td><td>35</td></tr><tr><td>ASV83</td><td>111</td><td>69</td><td>4</td><td>34</td><td>185</td><td>2</td><td>6182</td><td>656</td><td>40</td><td>72</td><td>2203</td><td>0</td><td>5907</td><td>920</td><td>3</td></tr><tr><td>ASV110</td><td>111</td><td>6</td><td>6</td><td>32</td><td>20</td><td>3</td><td>624</td><td>849</td><td>198</td><td>1926</td><td>1141</td><td>2</td><td>116</td><td>6</td><td>4</td></tr><tr><td>ASV136</td><td>108</td><td>75</td><td>15</td><td>7</td><td>191</td><td>3</td><td>174</td><td>1416</td><td>4237</td><td>76</td><td>252</td><td>64</td><td>47</td><td>25</td><td>5</td></tr><tr><td rowspan="3">Core microbien des larves</td><td>ASV1</td><td>21</td><td>6</td><td>33</td><td>12</td><td>3</td><td>44</td><td>54</td><td>89</td><td>732</td><td>442</td><td>306</td><td>6263</td><td>314</td><td>185</td><td>3305</td></tr><tr><td>ASV65</td><td>24</td><td>9</td><td>141</td><td>64</td><td>86</td><td>211</td><td>65</td><td>95</td><td>876</td><td>84</td><td>16</td><td>8769</td><td>53</td><td>1</td><td>747</td></tr><tr><td>ASV143</td><td>36</td><td>9</td><td>17</td><td>13</td><td>6</td><td>30</td><td>35</td><td>76</td><td>621</td><td>28</td><td>39</td><td>2089</td><td>27</td><td>12</td><td>96</td></tr><tr><td rowspan="5">Core microbien des échantillons d'élevage</td><td>ASV3</td><td>51</td><td>93</td><td>489</td><td>143</td><td>314</td><td>351</td><td>106</td><td>644</td><td>57686</td><td>725</td><td>628</td><td>29530</td><td>539</td><td>171</td><td>1988</td></tr><tr><td>ASV4</td><td>48</td><td>39</td><td>472</td><td>6</td><td>124</td><td>1195</td><td>95</td><td>287</td><td>17228</td><td>673</td><td>750</td><td>25837</td><td>1044</td><td>1541</td><td>97335</td></tr><tr><td>ASV12</td><td>30</td><td>126</td><td>27</td><td>5</td><td>12</td><td>28</td><td>68</td><td>272</td><td>904</td><td>100</td><td>64</td><td>372</td><td>77</td><td>11</td><td>5481</td></tr><tr><td>ASV25</td><td>72</td><td>30</td><td>6</td><td>17</td><td>30</td><td>4</td><td>17</td><td>29</td><td>215</td><td>104</td><td>93</td><td>115</td><td>21</td><td>12</td><td>423</td></tr><tr><td>ASV30</td><td>99</td><td>201</td><td>314</td><td>47</td><td>35</td><td>473</td><td>188</td><td>191</td><td>14998</td><td>169</td><td>56</td><td>27026</td><td>225</td><td>3</td><td>782</td></tr></tbody></table>

## VII.3- ASVs différentiellement abondants en fonction de l'état de santé des élevages

Dans l'objectif de mettre en évidence de potentiels biomarqueurs bactériens de l'état de santé des élevages, des analyses de différentiels d'abondance d'ASVs ont été effectuées en utilisant le package R ANCOMBC (Mandal et al. 2015; Lin & Peddada 2020). Bien que des LEfSe (analyse linéaire discriminante avec effet de taille) aient été utilisées pour les études présentées dans les chapitres V et VI (parties V.2, VI.2 et VI.3), la méthode ANCOM-BC a été préférée au cours de la méta-analyse, sur les conseils du Service Bioinformatique de l'Ifremer (SeBiMER), en raison du nombre important d'échantillons considérés.

### VII.3.1- ASVs différentiellement abondants dans les eaux d'élevage

Dans un premier temps, les ASVs différentiellement abondants, selon le stade de développement des larves et leur état de santé, ont été mis en évidence en considérant uniquement les échantillons d'eau d'élevage. Les larves ont été considérées comme étant en mauvaise santé (en rouge dans le Tab. 12) si leur élevage n'a pas pu être conduit jusqu'au dernier jour de développement larvaire (J9) ou si les taux de survie étaient inférieurs aux valeurs attendues (plus de 5% d'écart par rapport à la valeur attendue, 70% à J9, c'est-à-dire une survie à J9 inférieure à 66,5%). Au total, 4 listes d'ASVs différentiellement abondants ont été obtenues. Elles correspondent aux ASVs dont les abondances sont significativement différentes entre les eaux hébergeant des larves aux stades 1) nauplii en bonne et en mauvaise santé, 2) zoé en bonne et en mauvaise santé, 3) zoé / mysis (larves en transition) en bonne et en mauvaise santé et 4) mysis en bonne et en mauvaise santé.
Dans un second temps, la construction d'un graphique UpSetR (Conway et al. 2017) a mis en évidence les ASVs communs ou spécifiques entre les 4 listes précédemment identifiées (nommées Nauplii, Zoé, Zoé/Mysis et Mysis dans la Fig. 57). L'approche UpSetR a été préférée au diagramme de Venn car elle permet une représentation plus claire d'un plus grand nombre d'ensembles (Conway et al. 2017). Ainsi, 184 ASVs sont identifiés comme étant différentiellement abondants entre les eaux d'élevage des larves en bonne et en mauvaise santé tout au long du développement des animaux (Fig. 57). L'abondance relative moyenne de ces 184 ASVs a été calculée (Fig. 58) permettant de mettre en évidence 121 ASVs avec une abondance plus importante dans les échantillons d'eau des élevages en bonne santé (Fig. 58A) et 63 ASVs majoritairement identifiés dans les eaux des élevages en mauvaise santé (Fig. 58B).

L'objectif de cette première méta-analyse est de mettre en évidence des biomarqueurs de l'état de santé des élevages, identifiables dans toutes les écloseries du territoire à n'importe quel moment du développement larvaire ; ainsi seuls ces 184 ASVs ont été conservés pour la suite de l'étude. Néanmoins, il serait intéressant de répéter les analyses présentées dans ce chapitre en considérant les autres ensembles d'ASVs mis en évidence par le graphique UpSetR (Fig. 57). Une telle approche pourrait permettre d'identifier des biomarqueurs spécifiques de chaque stade de développement larvaire par exemple.

<figure><img src="image_123.png" /><figcaption>**FIGURE 57** – Comparaison des ASVs différentiellement abondants dans les eaux d'élevage en fonction du stade larvaire et de l'état de santé des animaux.</figcaption></figure>

Les conditions Nauplii, Zoé, Mysis et Zoé_Mysis correspondent respectivement aux ASVs différentiellement abondants entre les eaux hébergeant des larves aux stades nauplii en bonne et en mauvaise santé, zoé en bonne et en mauvaise santé, mysis en bonne et en mauvaise santé et zoé / mysis (larves en transition) en bonne et en mauvaise santé. Chaque point unique coloré désigne les ASVs spécifiques d'une condition (par exemple, 886 ASVs sont uniquement différentiellement abondants entre les eaux hébergeant des larves nauplii en bonne et en mauvaise santé). Plusieurs points colorés indiquent que les ASVs sont communs à plusieurs conditions (par exemple, 258 ASVs sont différentiellement abondants dans les eaux hébergeant des larves nauplii en bonne et en mauvaise santé mais aussi dans les eaux avec des larves au stade zoé en bonne et en mauvaise santé). Chaque ensemble d'ASV est désigné comme étant un set. Ainsi, un set de 184 ASVs est différentiellement exprimé dans les eaux tout au long du développement larvaire selon l'état de santé des animaux.
<figure><img src="image_124.png" /><figcaption>**FIGURE 58** – Abondances relatives moyennes des ASVs différentiellement abondants mis en évidence par ANCOM-BC (184 ASVs). A) 121 ASVs plus abondants dans les eaux des élevages en bonne santé (bleu) par rapport aux élevages en mauvaise santé (rouge). B) 63 ASVs plus abondants dans les eaux des élevages en mauvaise santé (rouge) par rapport aux élevages en bonne santé (bleu).</figcaption></figure>

L'abondance relative moyenne des ASVs a été calculée en utilisant la fonction « get_group_abundance » du package R microbiomeutilities (Lahti & Shetty 2020). Ainsi les abondances relatives des ASVs ont été calculées en moyennant l'ensemble des données des eaux des élevages en mauvaise santé, d'une part, et l'ensemble des données des eaux des élevages en bonne santé, d'autre part.
## VII.3.2- ASVs différentiellement abondants dans les larves

En utilisant la même stratégie d'analyse pour les échantillons de larves que celle précédemment utilisée pour les échantillons d'eau d'élevage, 193 ASVs différentiellement abondants en fonction de l'état de santé des animaux ont été mis en évidence à chaque étape du développement larvaire (Fig. 59). Parmi ces 193 ASVs, 118 étaient majoritairement présents dans les larves en bonne santé (Fig. 60A) contre 75 dans les larves en mauvaise santé (Fig. 60B).

<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>**FIGURE 59** – ASVs différentiellement abondants dans les larves en fonction du stade larvaire et de l'état de santé des animaux.</figcaption></figure>

Les conditions Nauplii, Zoé, Mysis et Zoé_Mysis correspondent respectivement aux ASVs différentiellement abondants entre les larves au stade nauplii en bonne et en mauvaise santé, au stade zoé en bonne et en mauvaise santé, au stade mysis en bonne et en mauvaise santé et aux stades zoé / mysis (larves en transition) en bonne et en mauvaise santé. Chaque point unique coloré désigne les ASVs spécifiques d'une condition (par exemple, 668 ASVs sont uniquement différentiellement abondants entre les larves nauplii en bonne et en mauvaise santé). Plusieurs points colorés indiquent que les ASVs sont communs à plusieurs conditions (par exemple, 288 ASVs sont différentiellement abondants dans les larves nauplii en bonne et en mauvaise santé mais aussi dans les larves au stade zoé en bonne et en mauvaise santé). Chaque ensemble d'ASV est désigné comme étant un set. Ainsi, un set (ou ensemble) de 193 ASVs est différentiellement exprimé dans les larves tout au long de leur développement en fonction de leur état de santé.
<figure><img src="image_126.png" /><figcaption>**FIGURE 60** – Abondances relatives moyennes des ASVs différentiellement abondants mis en évidence par ANCOM-BC (193 ASVs). A) 118 ASVs plus abondants dans les larves en bonne santé (bleu) par rapport aux larves en mauvaise santé (rouge). B) 75 ASVs plus abondants dans les larves en mauvaise santé (rouge) par rapport aux larves en bonne santé (rouge).</figcaption></figure>

L'abondance relative moyenne des ASVs a été calculée en utilisant la fonction « get_group_abundance » du package R microbiomeutilities (Lahti & Shetty, 2020). Ainsi les abondances relatives des ASVs ont été calculées en moyennant l'ensemble des données des larves en mauvaise santé, d'une part, et l'ensemble des données des larves en bonne santé, d'autre part.

## VII.3.3- Comparaison des ASVs différentiellement abondants

Les analyses précédentes nous ont permis d'identifier 4 listes d'ASVs distinctes. Elles correspondent aux 121 ASVs plus abondants dans les eaux des élevages en bonne santé (Fig. 58A), aux 63 ASVs plus abondants dans les eaux des élevages en mauvaise santé (Fig. 58B), aux 118 ASVs plus abondants dans les larves en bonne santé (Fig. 60A) et aux 75 ASVs plus abondants dans les larves en mauvaise santé (Fig. 60B). Ces listes ont ensuite été comparées dans l'objectif d'identifier les ASVs communs ou partagés entre les eaux et les larves en fonction de l'état de santé des élevages. Pour cela, un graphique UpSetR a été construit (Fig.
61). Au total 310 ASVs ont ainsi été mis en évidence dont 189 sont associés aux élevages en bonne santé (71 dans les eaux, 68 dans les larves et 50 communs aux eaux et aux larves) et 121 sont associés aux élevages en mauvaise santé (58 dans les eaux, 46 dans les larves et 17 communs aux eaux et aux larves).

<figure><img src="image_127.png" /><figcaption>**FIGURE 61** – Nombre d'ASVs présents dans les eaux d'élevage ou dans les larves en fonction de l'état de santé des animaux.</figcaption></figure>

Les conditions Eau et Larves correspondent respectivement aux ASVs plus abondants dans les eaux des élevages en bonne ou en mauvaise santé et aux ASVs plus abondants dans les larves en bonne ou en mauvaise santé. Chaque point unique coloré désigne les ASVs spécifiques d'une condition (par exemple, 71 ASVs sont uniquement identifiés dans les eaux des élevages en bonne santé). Plusieurs points colorés indiquent que les ASVs sont communs à plusieurs conditions (par exemple, 50 ASVs sont communs aux eaux et aux larves des élevages en bonne santé). Chaque ensemble d'ASV est désigné comme étant un set.

## VII.4- Influence des intrants et identification de potentiels biomarqueurs

### VII.4.1- Biomarqueurs des élevages en bonne santé

Dans l'objectif de déterminer les potentielles communautés procaryotiques bénéfiques aux élevages, les 189 ASVs identifiés comme étant plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en bonne santé (Fig. 61) ont été considérés. Nous avons cherché si ces ASVs étaient mis en évidence dans les intrants (eau de remplissage du lagon, eau de réserve, œufs et nourriture) de l'ensemble des élevages analysés au cours de cette thèse (Fig. 62). À partir des résultats obtenus, une première sélection a été effectuée en éliminant les ASVs présents dans les intrants des élevages en mauvaise santé ; l'objectif étant d'identifier des communautés potentiellement bénéfiques présentes dès le démarrage des élevages larvaires. Ensuite, une seconde sélection a été réalisée en conservant les ASVs présents dans au moins un type d'intrant (eau de remplissage, eau de réserve, œufs,
microparticules et larves d'Artemia sp.) pour l'ensemble des élevages en bonne santé (uniquement campagnes E1 et E2) (Fig. 63). Cette stratégie analytique a permis d'identifier les ASVs plus abondants dans les élevages en bonne santé, présents dans les intrants de ces élevages et absents des intrants des élevages en mauvaise santé (Fig. 63). Plus spécifiquement, 33 ASVs (parmi 71 ASVs) sont identifiés dans les échantillons d'eau, 29 ASVs (parmi 68) sont mis en évidence dans les échantillons de larves et 28 ASVs (parmi 50 ASVs) sont communs aux échantillons d'eau et de larves (Fig. 63). Enfin, les ASVs qui n'ont pas pu être affiliés au-delà de la classe n'ont pas été considérés pour la suite des analyses. Ainsi 29 ASVs ont été considérés comme potentiels biomarqueurs des eaux des élevages en bonne santé (Tab. 14), 27 ASVs ont été identifiés comme des biomarqueurs putatifs des larves des élevages en bonne santé (Tab. 15) et 28 ASVs ont été mis en évidence comme biomarqueurs communs aux eaux et aux larves des élevages en bonne santé (Tab. 16) ; soit un total de 84 ASVs.

<figure><img src="image_128.png" /></figure>

**FIGURE 62** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 189 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en bonne santé.

Les intrants (eau de remplissage provenant du lagon, eau de réserve, œufs, microalgues, microparticules et larves d'Artemia sp.) de l'ensemble des élevages suivis au cours des campagnes d'échantillonnage M1, M3, M4, E1 et E2 ont été considérés. Les 189 ASVs considérés correspondent aux ASVs identifiés par la figure 61 (71 ASVs plus abondants dans les eaux d'élevage en bonne santé, 68 ASVs plus abondants dans les larves en bonne santé, 50 ASVs plus abondants dans les eaux et dans les larves des élevages en bonne santé).
<figure><img src="image_129.png" /></figure>

**FIGURE 63** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 90 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en bonne santé, absents des intrants des élevages en mauvaise santé (campagnes M1, M3 et M4 réalisées à la SASV) et présents dans au moins un type d'intrant de l'ensemble des élevages en bonne santé (campagnes E1 et E2 réalisées dans les écloseries privées 1 et 2).

Une sélection des ASVs absents des intrants des élevages en mauvaise santé et présents dans au moins un type d'intrant de l'ensemble des élevages en bonne santé a été effectuée à partir des 189 ASVs identifiés dans la figure 62. Cette étape a permis de sélectionner les 90 ASVs présentés ici. Parmi ces 90 ASVs, 33 sont identifiés dans les échantillons d'eau (à gauche), 29 dans les larves (au milieu) et 28 sont communs aux eaux et aux larves (à droite).
<caption>TABLEAU 14 – Taxonomie des 29 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs de la bonne santé des élevages dans les échantillons d'eau.</caption>

Les ASVs mis en évidence dans la figure 63 et non affiliés après la classe n'ont pas été considérés dans ce tableau. Les taxa en rouge n'ont pas été identifiés en contexte aquacole avant cette méta-analyse.

<table><thead><tr><th></th><th>RÈGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>ASV32</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>ASV32</td></tr><tr><td>ASV1760</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>ASV1760</td></tr><tr><td>ASV705</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>ASV705</td></tr><tr><td>ASV300</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>Owenweeksia</td></tr><tr><td>ASV278</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>Owenweeksia</td></tr><tr><td>ASV398</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Flavobacteriaceae</td><td>ASV398</td></tr><tr><td>ASV1308</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Flavobacteriaceae</td><td>Flavobacterium</td></tr><tr><td>ASV3244</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Flavobacteriaceae</td><td>Pseudofulvibacter</td></tr><tr><td>ASV479</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>NS9</td><td>ASV479</td></tr><tr><td>ASV699</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>NS9</td><td>ASV699</td></tr><tr><td>ASV1294</td><td>Bacteria</td><td>Bdellovibrionota</td><td>Bdellovibrionia</td><td>Bdellovibrionales</td><td>Bdellovibrionaceae</td><td>OM27</td></tr><tr><td>ASV559</td><td>Bacteria</td><td>Patescibacteria</td><td>Gracilibacteria</td><td>Absconditabacteriales</td><td>ASV559</td><td>ASV559</td></tr><tr><td>ASV1974</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Caulobacterales</td><td>Hyphomonadaceae</td><td>ASV1974</td></tr><tr><td>ASV430</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Puniceispirillales</td><td>SAR116</td><td>ASV430</td></tr><tr><td>ASV424</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Ascidiaceihabitans</td></tr><tr><td>ASV2340</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>ASV2340</td></tr><tr><td>ASV2660</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>ASV2660</td></tr><tr><td>ASV1620</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Epibacterium</td></tr><tr><td>ASV1946</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Phaeobacter</td></tr><tr><td>ASV2672</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodospirillales</td><td>Terasakiellaceae</td><td>ASV2672</td></tr><tr><td>ASV752</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Sphingomonadales</td><td>Sphingomonadaceae</td><td>Erythrobacter</td></tr><tr><td>ASV1879</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Sphingomonadales</td><td>Sphingomonadaceae</td><td>Erythrobacter</td></tr><tr><td>ASV150</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>Aestuariibacter</td></tr><tr><td>ASV609</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Burkholderiales</td><td>Burkholderiaceae</td><td>Burkholderia</td></tr><tr><td>ASV1707</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Nitrosococcales</td><td>Methylophagaceae</td><td>Methylophaga</td></tr><tr><td>ASV227</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Nitrosococcales</td><td>Methylophagaceae</td><td>Methylophaga</td></tr><tr><td>ASV196</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Nitrosococcales</td><td>Methylophagaceae</td><td>Methylophaga</td></tr><tr><td>ASV551</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Oceanospirillales</td><td>Saccharospirillaceae</td><td>Thalassolituus</td></tr><tr><td>ASV3441</td><td>Bacteria</td><td>Verrucomicrobiota</td><td>Verrucomicrobiae</td><td>Opitutales</td><td>Puniceicoccaceae</td><td>Pelagicoccus</td></tr></tbody></table>
<caption>TABLEAU 15 – Taxonomie des 27 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs de la bonne santé des élevages dans les échantillons de larves.</caption>

Les ASVs mis en évidence dans la figure 63 et non affiliés après la classe n'ont pas été considérés dans ce tableau. Les taxa en rouge n'ont pas été identifiés en contexte aquacole avant cette méta-analyse.

<table><thead><tr><th></th><th>RÈGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>ASV6987</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Bacteroidales</td><td>Muribaculaceae</td><td>ASV6987</td></tr><tr><td>ASV2477</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>ASV2477</td></tr><tr><td>ASV717</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>ASV717</td></tr><tr><td>ASV1257</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Cytophagales</td><td>Amoebophilaceae</td><td>ASV1257</td></tr><tr><td>ASV3816</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>ASV3816</td></tr><tr><td>ASV3574</td><td>Bacteria</td><td>Bdellovibrionota</td><td>Bdellovibrionia</td><td>Bacteriovoracales</td><td>Bacteriovoracaceae</td><td>Peredibacter</td></tr><tr><td>ASV5459</td><td>Bacteria</td><td>Dependentiae</td><td>Babeliae</td><td>Babeliales</td><td>ASV5459</td><td>ASV5459</td></tr><tr><td>ASV1258</td><td>Bacteria</td><td>Desulfobacterota</td><td>Desulfuromonadia</td><td>Bradymonadales</td><td>ASV1258</td><td>ASV1258</td></tr><tr><td>ASV2524</td><td>Bacteria</td><td>Firmicutes</td><td>Bacilli</td><td>Erysipelotrichales</td><td>Erysipelotrichaceae</td><td>Turicibacter</td></tr><tr><td>ASV201</td><td>Bacteria</td><td>Fusobacteriota</td><td>Fusobacteriaia</td><td>Fusobacteriales</td><td>Fusobacteriaceae</td><td>Fusobacterium</td></tr><tr><td>ASV1335</td><td>Bacteria</td><td>Planctomycetota</td><td>Phycisphaerae</td><td>Phycisphaerales</td><td>Phycisphaeraceae</td><td>SM1A02</td></tr><tr><td>ASV3168</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Asciidiaceihabitans</td></tr><tr><td>ASV1234</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Asciidiaceihabitans</td></tr><tr><td>ASV1992</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Litorimicrobium</td></tr><tr><td>ASV3690</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Litorimicrobium</td></tr><tr><td>ASV395</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>Alteromonas</td></tr><tr><td>ASV1401</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>Alteromonas</td></tr><tr><td>ASV184</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>ASV184</td></tr><tr><td>ASV6649</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>ASV6649</td></tr><tr><td>ASV998</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>Salinimonas</td></tr><tr><td>ASV1150</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV170</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Burkholderiales</td><td>Burkholderiaceae</td><td>Burkholderia</td></tr><tr><td>ASV769</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Burkholderiales</td><td>Oxalobacteraceae</td><td>Massilia</td></tr><tr><td>ASV380</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Neisseriales</td><td>Neisseriaceae</td><td>ASV380</td></tr><tr><td>ASV80</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Pseudomonadales</td><td>Pseudohongiellaceae</td><td>Pseudohongiella</td></tr><tr><td>ASV787</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Salinisphaerales</td><td>Salinisphaeraceae</td><td>Salinisphaera</td></tr><tr><td>ASV476</td><td>Bacteria</td><td>Synergistota</td><td>Synergistia</td><td>Synergistales</td><td>Synergistaceae</td><td>Fretibacterium</td></tr></tbody></table>
<caption>TABLEAU 16 – Taxonomie des 28 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs de la bonne santé des élevages dans les échantillons d'eau et de larves.</caption>

Les ASVs mis en évidence dans la figure 63 et non affiliés après la classe n'ont pas été considérés dans ce tableau. Les taxa en rouge n'ont pas été identifiés en contexte aquacole avant cette méta-analyse.

<table><thead><tr><th></th><th>RÈGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>ASV200</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Bacteroidales</td><td>Porphyromonadaceae</td><td>Porphyromonas</td></tr><tr><td>ASV369</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>ASV369</td></tr><tr><td>ASV359</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Aureispira</td></tr><tr><td>ASV199</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Aureispira</td></tr><tr><td>ASV1700</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Lewinella</td></tr><tr><td>ASV84</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Phaeodactylibacter</td></tr><tr><td>ASV20</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Saprospira</td></tr><tr><td>ASV1487</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Saprospira</td></tr><tr><td>ASV845</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Cytophagales</td><td>Cyclobacteriaceae</td><td>Roseivirga</td></tr><tr><td>ASV181</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>ASV181</td></tr><tr><td>ASV19</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Cryomorphaceae</td><td>Owenweeksia</td></tr><tr><td>ASV567</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>Flavobacteriaceae</td><td>Kordia</td></tr><tr><td>ASV39</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Flavobacteriales</td><td>NS9</td><td>ASV39</td></tr><tr><td>ASV2377</td><td>Bacteria</td><td>Bdellovibrionota</td><td>Bdellovibrionia</td><td>Bdellovibrionales</td><td>Bdellovibrionaceae</td><td>OM27</td></tr><tr><td>ASV246</td><td>Bacteria</td><td>Bdellovibrionota</td><td>Bdellovibrionia</td><td>Bdellovibrionales</td><td>Bdellovibrionaceae</td><td>OM27</td></tr><tr><td>ASV141</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>ASV141</td></tr><tr><td>ASV31</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>ASV31</td></tr><tr><td>ASV852</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV934</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV372</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV410</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV1054</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV1585</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV391</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Pseudoalteromonadaceae</td><td>Pseudoalteromonas</td></tr><tr><td>ASV97</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Cellevibrionales</td><td>Cellvibrionaceae</td><td>Aestuariicella</td></tr><tr><td>ASV26</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Cellevibrionales</td><td>Halieaceae</td><td>Halioglobus</td></tr><tr><td>ASV1261</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Cellevibrionales</td><td>Spongiibacteraceae</td><td>BD1-7</td></tr><tr><td>ASV919</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Nitrosococcales</td><td>Methylophagaceae</td><td>ASV919</td></tr></tbody></table>
Sur l'ensemble des 84 ASVs identifiés par cette analyse, 11 ont été affiliés à la famille des *Rhodobacteraceae* (Tab. 14 à 16) renforçant l'hypothèse de Wang et al. (2020b) selon laquelle un enrichissement en *Rhodobacteraceae* pourrait être bénéfique à la santé des larves de crevettes pénéides. Le genre *Phaeobacter*, affilié aux *Rhodobacteraceae* et identifié dans les eaux des élevages en bonne santé (Tab. 14), a d'ailleurs été suggéré comme potentiel probiotique pour l'aquaculture (Sonnenschein et al. 2021). De la même manière, 8 ASVs affiliés aux *Pseudoalteromonas* ont été mis en évidence dans les eaux et les larves en bonne santé (Tab. 15 et 16) confirmant leur action probiotique au sein des élevages larvaires de *P. stylirostris* en Nouvelle-Calédonie (Pham et al. 2014; Sorieul et al. 2018; 2019). D'autres taxa bactériens bénéfiques ont également été mis en évidence lors de cette analyse : 3 ASVs affiliés aux *Bdellovibrionaceae* (Clade OM27) (Tab. 14 et 16) et 1 aux *Bacteriovoraceae* (*Peredibacter*) (Tab. 15). Ce sont des bactéries prédatrices appelées « BALOs » (*Bdellovibrio* and like organisms) et considérées comme de potentiels antibiotiques vivants utilisables en aquaculture (Bratanis et al. 2020). Leurs activités de prédation envers différentes souches de *Vibrio* pathogènes en font un sujet d'étude important en crevetticulture (Bratanis et al. 2020).

L'ordre des *Cytophagales*, mis en évidence par la famille des *Amoebophilaceae* (Tab. 15) et des *Cyclobacteriaceae* (Tab. 16), est impliqué dans la dégradation de molécules organiques en milieu marin (Reichenbach 1992). Ces microorganismes pourraient ainsi participer à la digestion des larves ou jouer un rôle dans le contrôle de la qualité de l'environnement d'élevage en dégradant la matière organique accumulée. De la même manière, 10 ASVs affiliés aux *Chitinophagales* (*Saprospiraceae*, Tab. 14 à 16) ont été mis en évidence dans les eaux et les larves des élevages en bonne santé. Les membres de cet ordre bactérien sont capables de dégrader la chitine, composant essentiel de la cuticule des crevettes (Fernández-Gómez et al. 2013). Il est possible que les *Chitinophagales* régulent l'accumulation de cette molécule dans les eaux d'élevage (en conséquence de l'accumulation de larves mortes et de mues de larves) ou soient impliquées dans la mue des larves, facilitant ainsi les passages de stades larvaires.

Les *Rhodospirillales* (*Terasakiellaceae*, Tab. 14), les *Bradymonadales* (Tab. 15) et les *Cellvibrionales* (*Cellvibrionaceae*, *Halieaceae*, *Spongiibacteraceae*, Tab. 16) ont respectivement été identifiées dans l'estomac (Restrepo et al. 2021), les intestins (Lee et al. 2022) et les fèces (Amoah et al. 2020) de crevettes *P. vannamei* adultes soumises à des infections expérimentales au *Vibrio parahaemolyticus*. Il a été suggéré que ces ordres bactériens conféraient aux animaux une protection contre les infections pathogènes (Restrepo et al. 2021; Lee et al. 2022). Dans l'ensemble des échantillons des élevages en bonne santé, des ASVs affiliés à l'ordre des *Flavobacteriales* ont également été identifiés (7 *Cryomorphaceae*, Tab. 14 à 16 ; 4 *Flavobacteriaceae*, Tab. 14 et 16 ; 3 *NS9*, Tab. 14 et 16). Ceci est en accord avec les observations de Zheng et al. (2017) qui ont montré une augmentation de l'abondance relative des bactéries affiliées à cet ordre dans les larves de *P. vannamei* en bonne santé. Les genres *Pseudofulvibacter* (Tab. 14) et *Kordia* (Tab. 16) (famille *Flavobacteriaceae*) ont d'ailleurs été identifiés dans des larves nauplii de *P. vannamei* en bonne santé (Wang et al. 2020a; Wang et al. 2020b). Le genre *Owenweeksia*, appartenant à la famille des *Cryomorphaceae*, a été mis en évidence dans l'eau d'élevage de crevettes *P. vannamei* adultes où il a été suggéré de stimuler la réponse immunitaire des animaux (Huang et al. 2018).

Outre les *Flavobacteriales*, les ordres *Oceanospirillales* (*Saccharospirillaceae*, Tab. 14) et *Pseudomonadales* (*Pseudohongiellaceae*, Tab. 15) ont également été identifiés chez d'autres espèces de crevettes marines (*P. vannamei*, *P. monodon*, *Alvinocaris longirostris*) en
bonne santé (Cornejo-Granados et al. 2018; Lv et al. 2020; Valle-Gough et al. 2022). Nous avions d'ailleurs suggéré que les membres des Oceanospirillales appartenait au core microbien des larves de P. stylirostris en bonne santé (article 3, chap. V, partie V.2). Le genre Thalassolituus (Saccharospirillaceae, Tab. 14) a également été mis en évidence chez des larves nauplii saines de P. vannamei (Wang et al. 2020a). D'autres ordres bactériens tels que les Sphingomonadales (Sphingomonadaceae, Tab. 14), les Fusobacteriales (Fusobacteriaceae, Tab. 15), et les Burkholderiales (Burkholderiaceae, Tab. 14 et 15 ; Oxalobacteriaceae, Tab. 15), ont déjà été identifiés chez des crevettes pénéides en bonne santé et pourraient également être source de bactéries bénéfiques aux élevages larvaires de P. stylirostris (Zhang et al. 2014b; Zeng et al. 2017; Callac et al. 2022).

Certains taxa mis en évidence par cette méta-analyse n'ont pas encore été identifiés en contexte aquacole (identifiés en rouge Tab. 14 à 16) et des analyses supplémentaires seront nécessaires pour comprendre leur rôle dans les élevages larvaires en Nouvelle-Calédonie.

Malgré les nombreuses pistes proposées par cette première méta-analyse, il est important de rappeler que la majorité des échantillons des élevages ne présentant pas de mortalités ont été séquencés avec une profondeur de séquençage plus élevée que les échantillons des élevages identifiés comme étant en mauvaise santé. Il est ainsi possible que certaines bactéries n'aient pas été mises en évidence dans les élevages soumis à de fortes mortalités à cause de biais expérimentaux. La base de données construite au cours de cette thèse devra donc être complétée avec d'autres données issues d'élevages en bonne santé ou non et séquencées à la même profondeur.

## VII.4.2- Biomarqueurs des élevages en mauvaise santé

La même démarche analytique que celle employée pour la mise en évidence de biomarqueurs de bonne santé larvaire a été utilisée pour étudier les 121 ASVs identifiés comme majoritairement abondants dans les eaux et les larves des élevages en mauvaise santé (Fig. 64). Ainsi nous avons d'abord observé le profil de présence / absence de ces ASVs dans l'ensemble des intrants des élevages considérés (Fig. 64). Ensuite, les ASVs absents des intrants des élevages en bonne santé et présents dans au moins un type d'intrant (eau de remplissage, eau de réserve, œufs, microalgues, microparticules, larves d'Artemia sp.) de tous les élevages en mauvaise santé ont été sélectionnés. Au total, 6 ASVs sont identifiés comme potentiels biomarqueurs des mortalités dans l'eau, 5 sont mis en évidence dans les larves et 2 sont communs aux eaux et aux larves (Fig. 65). En ne considérant que les ASVs affiliés au-delà de la classe, 3 ASVs ont été identifiés comme plus abondants dans les eaux des élevages en mauvaise santé et uniquement présents dans les intrants de ces élevages, 4 dans les larves et 2 communs aux eaux et aux larves (Tab. 17). Ces ASVs sont affiliés au clade OM27 (Bdellovibrionaceae), aux familles Nanocystaceae et Alteromonadaceae ainsi qu'aux genres Portibacter (Saprospiraceae), Ponticaulis (Hyphomonadaceae), Oceanococcus (Solimonadaceae), Turicella (Corynebacteriaceae), P30B-42 (Myxococcaceae) et Celeribacter (Rhodobacteraceae) (Tab. 17). Cependant, bien que ces microorganismes soient identifiés en milieu marin (à l'exception du genre Turicella affilié à la famille Corynebacteriaceae qui avait été identifiée dans l'article 2 présentée dans le chapitre IV, partie IV.2.2), aucune donnée n'est disponible dans la littérature quant à un potentiel effet néfaste de ces bactéries sur la santé des animaux marins. Des études supplémentaires seront donc nécessaires pour identifier leur rôle et leur implication potentielle dans les mortalités larvaires de P. stylirostris.
Dans un premier temps, des amorces PCR ou qPCR visant à identifier les genres bactériens mis en évidence pourraient être développées. Elles permettraient d'effectuer une recherche systématique de ces communautés au cours des élevages, et ainsi établir une potentielle corrélation entre la présence des genres identifiés et les mortalités larvaires. Dans un second temps, des méthodes de culture des microorganismes identifiés pourraient être développées pour expérimentalement valider un lien de causalité entre la présence des genres identifiés et les mortalités larvaires.

De manière intéressante, le clade OM27 mis en évidence par cette analyse avait déjà été énoncé dans la partie précédente (et dans le chap. V) comme étant potentiellement bénéfique (car appartenant aux *Bdellovibrionaceae*). Cependant ce clade est phylogénétiquement très divers (Orsi et al. 2016) et des taxa bactériens à la fois néfastes et bénéfiques pourraient être identifiés. De la même manière, les genres *Portibacter* et *Celeribacter* appartiennent respectivement aux familles des *Saprospiraceae* et des *Rhodobacteraceae*, qui ont précédemment été identifiées comme source de microorganismes potentiellement favorables à la santé des élevages. Cependant, les genres *Portibacter* et *Celeribacter* n'ayant pas été mis en évidence dans les élevages en bonne santé, certaines bactéries affiliées à ces familles (*Saprospiraceae* et *Rhodobacteraceae*) pourraient donc avoir un effet négatif sur les élevages.

Il est important de nuancer les résultats obtenus par cette analyse. En effet, les potentiels biomarqueurs bactériens de la mauvaise santé des élevages larvaires ont été identifiés à partir des données de l'écloserie de la SASV et pourraient aussi refléter des communautés procaryotiques géographiquement spécifiques. De plus, les protocoles d'élevage de la SASV (antibiotique différent, petits volumes d'élevage, nourriture différente) ainsi que les biais de profondeurs de séquençage pourraient également expliquer les différences. En conséquence, le jeu de données devra être complété avec des données relatives à des élevages en mauvaise santé réalisés dans les écloseries privées 1 et 2 (ou autres écloseries privées du territoire) ou à des élevages en bonne santé réalisés à la SASV.
<figure><img src="image_130.png" /></figure>

**FIGURE 64** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 121 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en mauvaise santé.

Les intrants (eau de remplissage provenant du lagon, eau de réserve, œufs, microalgues, microparticules et larves d'Artemia sp.) de l'ensemble des élevages suivis au cours des campagnes d'échantillonnage M1, M3, M4, E1 et E2 ont été considérés. Les 121 ASVs considérés correspondent aux ASVs identifiés dans la figure 61 (46 ASVs plus abondants dans les eaux d'élevage en mauvaise santé, 58 ASVs plus abondants dans les larves en mauvaise santé, 17 ASVs plus abondants dans les eaux et dans les larves des élevages en mauvaise santé).
<figure><img src="image_131.png" /></figure>

**FIGURE 65** – Suivi de la présence / absence, dans les intrants, des 13 ASVs les plus abondants dans les échantillons d'eau et de larves des élevages en mauvaise santé, absents des intrants des élevages en bonne santé (campagnes E1 et E2 réalisées dans les écloseries privées 1 et 2) et présents dans au moins un type d'intrant de l'ensemble des élevages en mauvaise santé (campagnes M1, M3 et M4 réalisées à la SASV).

Une sélection des ASVs absents des intrants des élevages en bonne santé et présents dans au moins un type d'intrant de l'ensemble des élevages en mauvaise santé a été effectuée à partir des 121 ASVs identifiés dans la figure 64. Cette étape a permis de sélectionner les 13 ASVs présentés ici. Parmi ces 13 ASVs, 6 sont identifiés dans les échantillons d'eau (à gauche), 5 dans les larves (au milieu) et 2 sont communs aux eaux et aux larves (à droite).

<caption>**TABLEAU 17** – Taxonomie des 9 ASVs mis en évidence comme potentiels biomarqueurs d'une dégradation de l'état de santé larvaire.</caption>

Les ASVs mis en évidence dans la figure 65 et non affiliés après la classe et / ou uniquement mis en évidence dans un intrant de nourriture n'ont pas été considérés dans ce tableau.

<table><thead><tr><th></th><th></th><th>RÉGNE</th><th>PHYLUM</th><th>CLASSE</th><th>ORDRE</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">EAU</td><td>ASV11487</td><td>Bacteria</td><td>Bacteroidota</td><td>Bacteroidia</td><td>Chitinophagales</td><td>Saprospiraceae</td><td>Portibacter</td></tr><tr><td>ASV11661</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Alteromonadales</td><td>Alteromonadaceae</td><td>ASV11661</td></tr><tr><td>ASV11915</td><td>Bacteria</td><td>Bdellovibrionota</td><td>Bdellovibrionia</td><td>Bdellovibrionales</td><td>Bdellovibrionaceae</td><td>OM27</td></tr><tr><td rowspan="5">LARVES</td><td>ASV10066</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Caulobacterales</td><td>Hyphomonadaceae</td><td>Ponticaulis</td></tr><tr><td>ASV11527</td><td>Bacteria</td><td>Myxococcota</td><td>Polyangia</td><td>Nannocystales</td><td>Nannocystaceae</td><td>ASV11527</td></tr><tr><td>ASV11656</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Gammaproteobacteria</td><td>Salinisphaerales</td><td>Solimonadaceae</td><td>Oceanococcus</td></tr><tr><td>ASV12669</td><td>Bacteria</td><td>Actinobacteriota</td><td>Actinobacteria</td><td>Corynebacteriales</td><td>Corynebacteriaceae</td><td>Turicella</td></tr><tr><td>ASV11474</td><td>Bacteria</td><td>Myxococcota</td><td>Myxococcia</td><td>Myxococcales</td><td>Myxococcaceae</td><td>P3OB-42</td></tr><tr><td>EAU &amp; LARVES</td><td>ASV12284</td><td>Bacteria</td><td>Proteobacteria</td><td>Alphaproteobacteria</td><td>Rhodobacterales</td><td>Rhodobacteraceae</td><td>Celeribacter</td></tr></tbody></table>
# CHAPITRE VIII

## Conclusions générales
# VIII- Chapitre VIII – Conclusions générales

Depuis le début des années 1990, l'aquaculture est un secteur économique en constante augmentation et contribue actuellement à la moitié de la production mondiale d'animaux aquatiques. En 2020, parmi l'ensemble des espèces aquacoles élevées, la crevette à pattes blanches, *Penaeus vannamei*, était l'espèce la plus produite ; démontrant ainsi la part importante des activités crevetticoles au sein des marchés aquacoles mondiaux. En Nouvelle-Calédonie, l'aquaculture de la crevette bleue du Pacifique, *P. stylirostris*, initiée au début des années 1970, représente le premier exportateur agro-alimentaire du territoire et le deuxième secteur économique toutes activités confondues (après le nickel). Cependant, des mortalités larvaires observées dans les écloseries de l'île freinent le développement de la filière et constituent une menace pour la pérennité des activités. Une dysbiose des communautés microbiennes associées aux élevages larvaires, liée à des modifications physico-chimiques de l'eau, pourrait moduler l'état de santé des larves et ainsi être à l'origine des mortalités observées. Dans ce contexte, cette thèse a d'abord eu pour objectif de caractériser les populations procaryotiques impliquées au cours de la mise en place du microbiote larvaire ainsi que les facteurs (environnement, contribution des géniteurs) les modulant. Dans un second temps, les communautés associées aux larves et à leur environnement ont été étudiées au cours d'élevages larvaires impactés ou non par des épisodes de mortalités, élevages considérés comme étant en mauvaise ou en bonne santé. Enfin, une méta-analyse a été effectuée en regroupant les données issues d'élevages larvaires conduits dans différentes écloseries de Nouvelle-Calédonie et présentant des états de santé variables. Pour chaque étude réalisée, les communautés procaryotiques associées aux intrants : eau de remplissage provenant du lagon, eau de réserve, œufs et nourriture, ont également été considérées.

## VIII.1- Synthèse, discussion et perspectives

### VIII.1.1- Transmissions horizontales et verticales au cours de la mise en place du microbiote larvaire

Les premiers travaux de cette thèse se sont intéressés à la colonisation procaryotique des œufs et des premiers stades larvaires (nauplii) de *P. stylirostris* (chap. IV). Ils ont mis en évidence des communautés bactériennes actives communes aux œufs, aux larves nauplii et à leur eau d'élevage suggérant l'existence de transmissions microbiennes horizontales. Peu d'études concernant les jeunes stades larvaires de crustacés sont disponibles. Cependant, Verscheure et al. (2000) et Nyholm (2020) ont montré que de tels processus de transmission horizontale étaient impliqués chez les poissons lors de la mise en place des communautés microbiennes épibiotiques des œufs. En effet, ces derniers sont considérés comme étant axéniques (totalement dépourvus de microorganismes) au moment de la ponte et sont ensuite rapidement colonisés par les microorganismes présents dans l'eau environnante (Verschuere et al. 2000). Une colonisation microbienne dense et diverse, sans espèces pathogènes, est d'ailleurs considérée comme une barrière de protection favorable pour le développement embryonnaire (Verschuere et al. 2000), et pourrait même être impliquée dans les échanges de nutriments et d'oxygène avec l'extérieur (Nyholm, 2020). Les communautés microbiennes épibiotiques, acquises au cours du développement
embryonnaire et des premiers stades larvaires, pourraient également moduler l'endobiote des animaux par une internalisation de certaines communautés au moment de l'ouverture de la bouche (Nyholm, 2020). Ces résultats suggèrent donc une influence durable de l'environnement d'élevage sur les microorganismes associés aux larves au cours des élevages.

Nos analyses des communautés procaryotiques associées aux œufs, aux nauplii et aux organes reproducteurs de leurs géniteurs, mettent en évidence de potentielles transmissions verticales contribuant également à l'acquisition des premiers microorganismes symbiotiques. Ces mécanismes ont déjà été mis en évidence chez les Vertébrés (Cho & Blaser 2012) et les Invertébrés (Larenas et al. 2003; Sylvain & Derome 2017; Nyholm 2020). Chez les crevettes *P. monodon* et *P. vannamei*, des analyses par microscopie et par PCR nichée ont respectivement montré une transmission verticale du virus du White Spot Syndrom (WSSV) (Lo et al. 1997) et du virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (IHHNV) (Motte et al. 2003). Nos résultats suggèrent que le microbiote associé aux œufs et aux premiers stades larvaires de *P. stylirostris* résulte d'interactions microbiennes complexes entre l'environnement d'élevage et les communautés transmises par les géniteurs. Cependant des études complémentaires seront nécessaires pour confirmer la possibilité d'une transmission verticale du microbiote comme cela a été démontré chez l'humain (Cho & Blaser 2012). Des expérimentations comparant le microbiote d'œufs évoluant dans des eaux différentes ou d'œufs obtenus à partir de géniteurs élevés dans des conditions diverses (lieu d'élevage, température, exposition à des stress biotiques ou abiotiques, différentes régimes alimentaires, espèces sauvages ou cultivées, etc.) pourraient permettre de mieux évaluer les transmissions microbiennes ayant lieu au cours de la mise en place du microbiote larvaire. Le développement de familles gnotobiotiques (animaux élevés en condition axénique et exposés à une sélection connue de communautés microbiennes), bien que techniquement complexe à accomplir, pourrait également apporter une plus grande compréhension sur l'acquisition des premières communautés procaryotiques larvaires mais aussi renseigner sur le rôle de ces microorganismes dans la physiologie des animaux (Basic & Bleich 2019).

## VIII.1.2- Eutrophisation du milieu d'élevage

Une eutrophisation de l'eau d'élevage a été mise en évidence au cours du développement larvaire aussi bien dans les élevages en bonne santé que dans les élevages soumis à des épisodes de mortalités massives (chap. V et VI). Elle est marquée par une augmentation de la concentration en sels nutritifs (ammonium et phosphate) et en matière organique dissoute colorée (CDOM). Aucun renouvellement d'eau n'ayant lieu au cours des 10 premiers jours d'élevage larvaire, elle résulte de l'accumulation, dans l'eau, de fèces, de nourriture non ingérée, de larves mortes et de mues de larves. Dans les élevages en bonne santé des écloseries privées 1 et 2 (campagnes E1 et E2), l'eutrophisation s'accompagne d'une diminution du pH (non mesuré lors des suivis à la Station Aquacole de Saint Vincent, SASV) qui pourrait être causée par une augmentation des activités bactériennes et larvaires menant à une diminution de l'oxygène et à une augmentation de la concentration en CO₂ dans le milieu (Smith & Schindler 2009). Cependant, le bullage central appliqué à tous les bacs d'élevage permet de limiter ce phénomène. En parallèle, une diminution du SR (ratio des pentes spectrales) a également été observée dans l'ensemble des élevages et reflète une modification de la composition de la matière organique dissoute dans l'eau (Helms et al. 2009). Dans les élevages des écloseries privées, des augmentations drastiques de la concentration en CDOM ainsi qu'une diminution brutale du pH et du SR ont été observées au
lendemain du premier ajout d'antibiotiques et de larves d'Artemia sp., au moment du passage des stades larvaires de zoé 2 à zoé 3. Il est difficile de déterminer la cause de ces shifts, et des analyses par chromatographie ou par spectrométrie de masse seront nécessaires pour identifier et quantifier des molécules organiques d'intérêt (protéines, sucres, acides gras, etc.) dans les élevages, et ainsi comprendre leur implication dans la santé des larves. Bien que cette évolution de la qualité de l'eau d'élevage soit attendue et qu'elle ne semble pas être à l'origine des mortalités larvaires observées en Nouvelle-Calédonie, elle pourrait cependant, fortement influencer les communautés microbiennes associées à l'eau et aux larves et ainsi indirectement impacter la santé des animaux (Yang et al. 2018).

## VIII.1.3- Évolution du microbiote des élevages au cours du développement larvaire

La caractérisation quotidienne de l'environnement microbien d'élevages en bonne et en mauvaise santé a mis en évidence que le jour d'élevage, associé à l'environnement physico-chimique et à l'eutrophisation progressive du milieu, l'ajout d'antibiotique, le stade de développement larvaire et l'état de santé des larves influençaient les communautés procaryotiques associées aux élevages (chap. V et VI). Cependant ces facteurs n'expliquent pas la totalité des variations microbiennes observées. En effet, les communautés procaryotiques associées à des élevages en bonne santé présentaient un nombre réduit de corrélations avec les paramètres physico-chimiques de l'eau d'élevage au moment du stade zoé (article 3, chap. V). De plus, 8,3% de la variabilité microbienne n'ont pas été expliqués lors de l'analyse de l'eau d'élevages soumis à des épisodes de mortalités larvaires (article 5, chap. VI). Sachant que la co-occurrence de processus écologiques déterministes et stochastiques a été suggérée d'impacter les communautés microbiennes présentes dans les systèmes aquacoles (Verschuere et al. 2000) et plus particulièrement au niveau larvaire (Vadstein et al. 2018a; Heyse et al. 2021), il est possible que de tels processus soient également impliqués dans les élevages larvaires de P. stylirostris. Les facteurs déterministes sont définis comme ayant une relation dose-réponse claire et sont considérés comme non aléatoires (Zhou & Ning 2017; Verschuere et al. 2000). En aquaculture, ces processus incluent majoritairement les paramètres physico-chimiques tels que la température, la salinité, la concentration en oxygène et la concentration en nutriments, mais peuvent également englober les phénomènes de concurrence, de prédation et de mutualisme existant entre les microorganismes (Zhou & Ning 2017). En parallèle, les processus stochastiques supposent que l'ensemble des communautés microbiennes sont écologiquement et fonctionnellement équivalentes et que les modifications des communautés résultent du hasard (Zhou & Ning 2017) (Fig. 66). Verschuere et al. (2000) parlent même de microorganismes présents « au bon endroit et au bon moment ». Ainsi, en Nouvelle-Calédonie, l'eutrophisation du milieu d'élevage, l'ajout d'antibiotique, le pH, la température, le développement larvaire et l'état de santé des larves sont des processus déterministes pouvant exercer des pressions de sélection sur les communautés microbiennes associées aux élevages larvaires de P. stylirostris. Il est également possible que des processus stochastiques puissent être impliqués même si de nombreux facteurs déterministes n'ont potentiellement pas été pris en compte au cours de nos expérimentations. Par exemple, Wang et al. (2020b) ont remarqué une augmentation des processus stochastiques (dispersion) au moment de l'ouverture de la bouche des larves de P. vannamei au passage du stade zoé. Au cours de ce projet, nous avons également émis l'hypothèse que les phénomènes stochastiques pouvaient être plus importants au cours de
ce stade (chap. V). Cependant, des analyses supplémentaires devront être réalisées pour évaluer l'occurrence de tels processus écologiques d'assemblages microbiens au sein des élevages. Il existe 3 méthodes d'analyse principales qu'il serait intéressant de développer (Zhou & Ning 2017):

- Les analyses multivariées de type analyse canonique des correspondances (ACC ou CCA), analyse de redondances (RDA) (Tab. 2, chap. I, partie I.4.1.a) ou analyse de partitionnement de la variance.

- L'utilisation de modèles mathématiques basés sur la théorie neutre qui soutient que la plupart des modifications génétiques n'affectent pas la fitness des individus et que, par conséquent, elles résultent de processus stochastiques (Duret, 2008).

- L'utilisation de modèles nuls qui, grâce à des permutations aléatoires des données, génèrent des modèles stochastiques statistiquement attendus (Zhou & Ning 2017).

Malgré les variations microbiennes observées dans les élevages, la méta-analyse effectuée (chap. VII) a mis en évidence des cores microbiens associés à l'ensemble des échantillons d'eau d'élevage et de larves considérés au cours de cette thèse (chap. VII, partie VII.2). Plus spécifiquement, 9 ASVs sont partagés par les échantillons d'eau d'élevage, 3 ASVs sont communs aux larves et 5 ASVs sont identifiés dans tous les échantillons (Fig. 56, chap. VII, partie VII.2.1). Ces résultats mettent en évidence la présence de certaines communautés microbiennes (affiliées aux familles *Rhodobacteraceae*, *Vibrionaceae*, *Stappiaceae*, *Alcanivoraceae*, *Litoricolaceae*, *Pseudoalteromonadaceae* et *Alteromonadaceae*) tout au long du développement larvaire dans l'ensemble des élevages considérés indépendamment de leur état de santé, et confortent ainsi les hypothèses faites précédemment quant à une persistance de communautés procaryotiques spécifiques au cours de la vie des crevettes. Comme pour l'étude des transmissions microbiennes horizontales et verticales, le développement de familles gnotobiotiques pourrait permettre de comprendre le rôle de chacune de ces familles au cours du développement larvaire de *P. stylirostris*.

La notion de core microbien est sujet à débat et plusieurs méthodes ont été décrites pour pouvoir l'identifier (Shade & Handelsman 2012). Comme pour les études présentées dans les chapitres IV à VI, la méthode d'appartenance basée sur la présence / absence des ASVs a été utilisée au cours de la méta-analyse. Mais les méthodes basées sur l'abondance relative des ASVs, leur phylogénie, leur persistance au cours du temps ou leurs interactions auraient pu être employées (Fig. 67) (Shade & Handelsman 2012). Il est possible qu'en considérant l'une de ces méthodes, d'autres communautés procaryotiques puissent être mises en évidence. En effet, les différences de profondeurs de séquençage, qui ont été mentionnées dans le chapitre IV (partie IV.1.1), ainsi que les biais expérimentaux relatifs au métabarcoding (abordés dans la partie VIII.2.2 de ce chapitre) peuvent impacter la mise en évidence de communautés communes et introduire des biais d'abondances relatives des ASVs. Une approche combinant plusieurs méthodes pourrait permettre de pallier à ce problème et compléter les premiers résultats obtenus. L'identification du core microbien est considérée comme une première étape essentielle pour définir des communautés microbiennes saines et permettre ensuite des analyses comparatives (Shade & Handelsman 2012). Au regard de ces informations, il serait également pertinent d'identifier séparément les cores microbiens associés aux élevages en bonne et en mauvaise santé.
<figure><img src="image_132.png" /><figcaption>**FIGURE 66** – Processus écologiques déterministes et stochastiques d'assemblages de communautés microbiennes (adapté de Zhou & Ning 2017).</figcaption></figure>

Chaque cercle numéroté correspond à une espèce microbienne. Les cercles avec une lettre correspondent à un ancêtre commun. Les processus de sélection, de dispersion, de diversification et de dérive écologique sont présentés dans les figures A à D. Chaque processus suppose l'absence d'autres processus d'assemblages de communautés microbiennes. A) **Processus de sélection**. Chaque environnement possède des caractéristiques qui vont être préférées par différentes espèces. Le premier environnement (Env I) sélectionne ainsi les espèces 1, 2 et 3 alors que le second environnement (Env II) sélectionne les espèces 4, 5 et 3. La sélection est dite homogène lorsque les processus de sélection sont identiques au sein d'un même environnement et hétérogène lorsque les processus de sélection divergent entre 2 environnements distincts. B) **Processus de dispersion**. La dispersion est dite homogène si les espèces sont dispersées entre des environnements distincts. Un fort processus de dispersion mène à des assemblages microbiens homogènes et ce même si les environnements présentent des caractéristiques différentes. Les espèces peuvent être dispersées au sein d'un même environnement en fonction de leur ordre d'arrivée (effet de priorité). Lorsque les espèces 1, 3 et 5 arrivent en premier dans l'environnement 1 (Env I) elles occupent l'ensemble des niches écologiques disponibles alors que l'inverse se produit si les espèces 2, 4 et 6 arrivent en premier. Le dernier processus de dispersion inclut peu de dispersion d'espèces et conduit à des communautés différentes au sein d'environnements identiques. C) **Processus de diversification**. Deux communautés identiques dans un même environnement et soumises à des phénomènes aléatoires de mutations génétiques conduisent à différentes nouvelles espèces. D) **Processus de dérive**. Les espèces occupent un environnement donné uniquement sous l'effet du hasard. E) La sélection est un processus d'assemblage des communautés microbiennes purement déterministe alors que la dérive écologique est un processus purement stochastique. Les processus de dispersion et de diversification sont considérés comme stochastiques mais peuvent être déterministes sous certaines conditions.
<figure><img src="image_133.png" /><figcaption>**FIGURE 67** – Méthodes de détermination du core microbien (adapté de Shade & Handelsman, 2012). A) La méthode basée sur la présence / absence des OTUs (ou ASVs) (appartenance) met en évidence les OTUs présents dans l'ensemble des échantillons. B) La méthode basée sur les abondances relatives met en évidence les OTUs ayant des abondances similaires au sein des échantillons. C) La méthode basée sur la phylogénie met en évidence des lignées microbiennes communes entre les échantillons. D) La méthode basée sur la persistance met en évidence les OTUs persistant au cours d'une série temporelle. E) La méthode basée sur les interactions entre les OTUs (connectivité) met en évidence les OTUs ayant des interactions similaires entre 2 échantillons.</figcaption></figure>
## VIII.1.4- Influence des intrants

Afin d'identifier l'origine des ASVs mis en évidence au cours de l'analyse des cores microbiens, des suivis des ASVs ont été effectués dans les intrants intiaux des élevages, à savoir les œufs, les eaux du lagon ayant servi à remplir les réserves et les eaux de réserve contenant l'eau traitée servant à remplir les bacs d'élevage (chap. VII, partie VII.2.2). Ces analyses ont montré que la quasi-totalité des ASVs identifiés tout au long du développement larvaire étaient déjà présents en amont des élevages dès le remplissage des réserves suggérant un rôle fondamental de l'eau de mer lagonaire sur les assemblages microbiens au sein des écloseries. Cette influence des intrants initiaux a également été mise en évidence lors de la recherche de biomarqueurs bactériens de la santé des élevages (chap. VII, partie VII.4). Même si ces communautés ont aussi été mises en évidence dans la nourriture, leur présence dès le début de l'élevage suggère une influence plus importante de l'eau de mer lagonaire et des œufs (qui sont eux-mêmes sous l'influence de leurs géniteurs). Ceci est en accord avec Heyse et al. (2021) qui ont montré que la nourriture et les renouvellements d'eau, initiés à partir du 7ème jour d'élevage larvaire de P. vannamei, ne contribuaient qu'à 10% du microbiote total de l'eau d'élevage suggérant un impact encore plus important de l'eau de remplissage des bacs. À l'heure actuelle aucune donnée n'existe quant à l'écologie microbienne des microorganismes associés aux eaux lagonaires pompées par les écloseries du territoire. Pourtant, une compréhension approfondie de ces écosystèmes pourrait permettre de mieux appréhender les interactions microbiote - environnement - écloseries. Ainsi, cette thèse offre de nouvelles perspectives de travail quant à un suivi annuel des baies de chaque écloserie du territoire. La mise en évidence de communautés potentiellement essentielles aux élevages et présentes en amont du remplissage des bacs ouvre également la voie pour la mise au point de méthodes de détection précoce (type PCR ou qPCR) de biomarqueurs bactériens de la santé des élevages.

## VIII.1.5- Biomarqueurs bactériens de la santé des élevages larvaires

### VIII.1.5.a- Biomarqueurs bactériens de bonne santé : vers la maîtrise des communautés procaryotiques associées aux élevages et identification de potentiels nouveaux probiotiques

De nombreux biomarqueurs bactériens des élevages larvaires en bonne santé ont été mis en évidence à différentes échelles taxonomiques (de l'ASV au genre) (chap. V, VI et VII). Certains de ces biomarqueurs ont été identifiés comme de potentiels microorganismes bénéfiques pour l'aquaculture. Par exemple, dans l'article 3 présenté dans le chapitre V, une succession de communautés procaryotiques bénéfiques a été mise en évidence au cours du développement larvaire aussi bien dans les larves que dans leur eau d'élevage. Ces microorganismes pourraient jouer des rôles clés à certains moments du développement larvaire expliquant leur enrichissement ponctuel. Les mortalités larvaires pourraient ainsi résulter d'une absence de certaines communautés procaryotiques impliquées dans des processus physiologiques essentiels tels que la digestion ou l'immunité. En effet, Wang et al. (2020b) ont suggéré que certaines bactéries affiliées à la famille des Rhodobacteraceae pourraient être sélectionnées au moment de l'ouverture de la bouche par le système digestif immature des larves au stade zoé et ainsi aider leur digestion. Les auteurs ont également émis l'hypothèse que ces communautés pouvaient être impliquées dans l'immunité et assurer un rôle de protection contre les pathogènes. Chez les crevettes, l'immunité est principalement
assurée par les hémocytes (cellules circulant dans l'hémolymph)e) et cible un large spectre de pathogènes (Fontaine & Lightner 1973). Après une étape de reconnaissance des motifs moléculaires associés aux pathogènes par des récepteurs PRR (Pathogen Recognition Receptor) situés à la surface des hémocytes, des cascades moléculaires sont initiées induisant ainsi des réponses cellulaires (phagocytose, activation métabolique oxydative) et humorales (encapsulation des pathogènes par mélanisation, limite de diffusion des pathogènes par coagulation, production de peptides antimicrobiens) (Bayne 1990; Campa-Córdova et al. 2002; Bachere et al. 2004; Theopold et al. 2004; Jiravanichpaisal et al. 2006; Destoumieux-Garzón et al. 2016) (Fig. 68). Une étude menée par Jiravanichpaisel et al. (2007) a montré que le nombre d'hémocytes augmentaient au cours du développement larvaire des crevettes et était en lien avec une augmentation des transcrits des gènes de la prophénol oxydase (impliquée dans l'initiation de cascades moléculaires) ainsi que de différents peptides antimicrobiens (Pénéidines, Crustines, etc.). Ainsi, l'environnement microbien disponible au moment de l'activation des différents gènes immunitaires pourraient être crucial pour les larves. Une étude récente a d'ailleurs montré qu'une exposition précoce de larves d'huître, *Crassostrea gigas*, à un environnement microbien riche issu de l'environnement d'élevage d'adultes en bonne santé permettait une augmentation de l'activité immunitaire des larves. Cette immunité renforcée est ensuite conservée à l'âge adulte sur 2 générations et permet une résistance accrue des animaux à des infections virales expérimentales (Fallet et al. 2022). Ce processus, appelé « shaping immunitaire », pourrait être appliqué au sein des élevages larvaires de *P. stylirostris*. Un enrichissement des milieux d'élevage larvaire avec des communautés microbiennes identifiées comme bénéfiques pourrait être envisagé afin de renforcer le système immunitaire des larves et prévenir les épisodes de mortalités massives. Un tel « shaping immunitaire » pourrait également être mis en place en appliquant des stress abiotiques (augmentations temporaires de la température de l'eau, stress salin). Inversement, l'exposition des larves à des motifs moléculaires pathogènes, aussi appelé « priming immunitaire » ou pseudo-vaccination, pourrait permettre de stimuler le système immunitaire des animaux et améliorer leur survie (Flegel, 2019). Des analyses intégrées de transcriptomiques et de métabarcoding permettront d'explorer les interactions existantes entre le système immunitaire des larves de *P. stylirostris* et le microbiote des élevages.

Les biomarqueurs de la bonne santé des élevages pourraient également permettre la recherche et la mise au point de nouvelles souches probiotiques. Par exemple, de nombreux ASVs (ASV1150, ASV852, ASV934, ASV372, ASV410, ASV1054, ASV1585, ASV391) affiliés au genre bactérien des *Pseudoalteromonas* ont été mis en évidence (chap. VII, partie VII.4.1). Or la souche *Pseudoalteromonas* NC201 a déjà montré un potentiel probiotique prometteur dans les élevages larvaires de *P. stylirostris* confortant ainsi nos hypothèses (Pham et al. 2014; Sorieul et al. 2018; 2019). Nos analyses ont également montré une abondance relative plus importante de bactéries prédatrices affiliées aux *Bdellovibrionales* et ayant des effets antagonistes contre différentes espèces de *Vibrio* pathogènes dans les élevages de *P. vannamei* (Cao et al. 2015; 2019). Ces bactéries, considérées comme des antibiotiques vivants, pourraient être développées pour une utilisation en élevage larvaire en Nouvelle-Calédonie. De la même manière, la mise en évidence de nombreuses bactéries affiliées aux *Saprospiraceae* dans les élevages en bonne santé pourraient mener à la découverte de souches bénéfiques. De par leur activité chitinolytique, ces microorganismes pourraient favoriser la dégradation des cuticules suite à la mue et ainsi limiter l'accumulation de matière organique dans l'eau. D'autres bactéries potentiellement bénéfiques ont été mises en évidence et des études complémentaires seront nécessaires pour confirmer ou infirmer leur
rôle dans les élevages. Le développement de cocktails de probiotiques ou de séquences de probiotiques différemment distribués au cours de l'élevage, et spécifiquement dirigés pour améliorer la qualité de l'eau ou la qualité des larves, pourraient permettre d'améliorer la santé des élevages larvaires mais aussi de s'affranchir des antibiotiques. En effet, comme mentionné par Verschuere et al. (2000), les antibiotiques, même utilisés de manière prophylactique, ne permettent pas un contrôle complet du microbiote et peuvent même, dans certains cas, entraîner une altération négative de l'écosystème microbien voire favoriser le développement de souches antibiorésistantes (Karunasagar et al. 1994; Cabello 2006). Ils limitent cependant le développement de microorganismes à stratégie r (développement rapide, sans spécification ou compétition) en élevage larvaire. En aquaculture, il est reconnu que les techniques employées (traitement de l'eau, antibiotique, eutrophisation) favorisent le développement de ces bactéries, souvent pathogènes, au détriment des bactéries à stratégie k (développement moins rapide, spécification et compétition) (Vadstein et al. 2018b). La mise au point de différentes souches probiotiques pouvant être distribuées selon une séquence précise pourrait limiter les niches écologiques disponibles au développement de microorganismes pathogènes et ainsi améliorer la santé des élevages tout en limitant l'utilisation des antibiotiques. D'autres méthodes, telles que l'utilisation de peptides antimicrobiens dans l'eau d'élevage, sont aussi développées en aquaculture pour limiter les antibiotiques (Flegel, 2019) et pourraient être envisagées au sein des élevages larvaires de P. stylirostris.

<figure><img src="image_134.png" /><figcaption>**FIGURE 68** – Réponse immunitaire chez les crevettes pénéides (Simplifié de Tassanakajon et al. 2013).</figcaption></figure>

Les pathogènes (en rouge) sont reconnus par les PRR (pathogen recognition receptor) qui initient des cascades moléculaires à l'origine de réponses cellulaires et humorales.
## VIII.1.5.b- Biomarqueurs bactériens de mauvaise santé : outils de détection des mortalités à venir

Au-delà des communautés potentiellement bénéfiques, il est également possible que les mortalités larvaires résultent de la présence de bactéries pathogènes et / ou opportunistes. Des biomarqueurs bactériens de la mauvaise santé des élevages ont donc aussi été recherchés. Dans l'objectif de développer des outils de détection précoces utilisables avant le début des élevages larvaires dans l'ensemble des écloseries du territoire, nous avons sélectionnés les ASVs significativement plus abondants dans les élevages en mauvaise santé et uniquement présents dans les intrants de ces élevages (absents des intrants en bonne santé). Par cette approche, 6 genres bactériens ont été identifiés : *Portibacter*, *Ponticaulis*, *Oceanococcus*, *Turicella*, *P3OB-42* et *Celeribacter*. Le développement d'amorces spécifiques de ces genres pourrait permettre la mise au point de méthodes de détection de type PCR ou qPCR réalisables en amont du début des élevages larvaires et utilisables à l'échelle de toutes les écloseries. La détection de ces biomarqueurs dans les intrants et dans les élevages pourrait signaler de potentielles mortalités à venir. Bien que cette méthode ne permette pas de solutionner directement les mortalités larvaires, elle pourrait éviter des pertes économiques importantes en prévenant le lancement d'élevages voués à l'échec. Sur le long terme, le développement de techniques d'élevage pour limiter ou empêcher la propagation de ces microorganismes pourrait également aider la filière. Le développement d'amorces plus spécifiques à chaque écloserie est aussi envisageable. Par exemple, les genres *Marivita*, *Aestuariicoccus* et *Nioella* (article 5, chap.VI, partie VI.3) pourraient être des biomarqueurs spécifiques de la mauvaise santé des élevages à la SASV. Cependant, ces propositions ne sont que des hypothèses et peu de données sont disponibles dans la littérature sur ces genres bactériens. Des analyses complémentaires et des validations expérimentales devront être réalisées pour confirmer ou infirmer leur rôle dans la mauvaise santé des élevages. Dans un premier temps, une recherche systématique de ces communautés procaryotiques au cours des élevages pourrait permettre d'établir une potentielle corrélation entre la présence des genres identifiés et les mortalités larvaires. Dans un second temps, des méthodes de culture des bactéries identifiées pourraient être développées pour expérimentalement valider un lien de causalité entre la présence des genres identifiés et les mortalités larvaires. De plus, des analyses devront être consacrées à l'étude des profils de variations d'abondance de ces biomarqueurs au cours du développement larvaire. Des analyses multivariées de type ACC ou RDA pourraient également être effectuées pour évaluer les liens existants entre les paramètres physico-chimiques de l'eau d'élevage et les communautés procaryotiques identifiées par la méta-analyse.

Des processus plus complexes pourraient être impliqués dans les mortalités larvaires. Par exemple, des bactéries appartenant au core microbien des larves pourraient passer d'un mode de vie commensal à un statut de pathogène sous l'effet de facteurs de stress ou de modifications environnementales (Egan & Gardiner 2016). De la même manière, l'eutrophisation progressive du milieu d'élevage combinée à l'utilisation prophylactique d'antibiotique peuvent favoriser le développement de bactéries opportunistes ou pathogènes dans l'eau des larves et ainsi déséquilibrer le ratio d'abondance entre les bactéries bénéfiques et néfastes (Vadstein et al. 2018a). Les mortalités larvaires pourraient ainsi résulter d'actions synergiques d'un consortium de microorganismes. Par exemple, chez l'huître *C. gigas*, le POMS (Pacific Oyster Mortality Syndrome) résulte d'une infection virale à OsHV-1 combinée à une dysbiose du microbiote total des animaux (de Lorgeril et al. 2018). Le virus cible les hémocytes et entraîne une modification du profil de transcription des
peptides antimicrobiens menant ainsi à une prolifération de bactéries opportunistes puis à une septicémie. Cette étude montre que des maladies polymicrobiennes peuvent affecter les élevages aquacoles. En ce sens, une étude de l'ensemble des microorganismes du microbiote des élevages larvaires de *P. stylirostris* permettrait d'approfondir la compréhension des interactions hôte – microbiote. En effet, différents microorganismes peuvent, *via* une dysbiose, impacter la santé des animaux. Ainsi Xiong et al. (2018) ont montré que des crevettes *P. vannamei* juvéniles infectées avec le WSSV (White Spot Syndrom Virus) présentaient une dysbiose des communautés micro-eucaryotiques (protozoaires et microalgues) de leur microbiote intestinal. Ils ont également mis en évidence qu'il était possible de quantifier le degré de gravité de la maladie en se basant sur les profils de variations de certains taxons de micro-eucaryotes indiquant ainsi que ces microorganismes pouvaient aussi être des biomarqueurs de l'état de santé des crevettes. Au niveau fongique, une infection expérimentale des crevettes *P. vannamei* adultes par la microsporidie, *Enterocytozoon hepatopenai*, a entrainé une dysbiose des communautés bactériennes et fongiques associées à leur hépatopancréas (López-Carvallo et al. 2022). Enfin, Zhou et al. (2022) ont étudié le virome de crevettes géantes d'eau douce, *Macrobrachium rosengergii*. Ils ont remarqué une abondance virale beaucoup plus importante dans les branchies, l'hépatopancréas et les muscles des animaux affectés par un retard de croissance (GRD, growth retardation disease) dont la cause n'avait pas encore été identifiée. L'étude approfondie de l'ensemble des microorganismes associés aux élevages larvaires de *P. stylirostris* pourrait donc permettre de mieux comprendre les épisodes de mortalités massives.

## VIII.2- Points de discussion et limites de l'étude

### VIII.2.1- Communautés procaryotiques actives

Au cours de cette thèse, les communautés procaryotiques actives (Stoeck et al. 2007) associées aux élevages larvaires de *P. stylirostris* ont été analysées en réalisant des extractions d'ARNs suivies de rétrotranscriptions en ADNc et de séquençages Illumina HiSeq du gène codant pour l'ARNr 16S (chap. III, partie III.1). Cette approche a été utilisée car elle est recommandée dans le cadre d'études visant à établir des diagnostiques de santé et à mettre en évidence les assemblages microbiens vivants au sein d'un écosystème d'intérêt (Yates et al. 2021). Bien que l'ARN soit considéré comme une molécule instable, il permet, contrairement à l'ADN, de limiter la détection de faux négatifs (microorganismes absents d'un écosystème mais détectés par l'analyse) et de faux positifs (microorganismes présents dans un écosystème mais non détectés par l'analyse) (Cristescu 2019). Alors que l'ADN permet de mettre en évidence les communautés microbiennes actives, dormantes et mortes, l'ARN permet d'identifier uniquement les microorganismes dormantes ou actifs et donc vivants. En effet, un microorganisme dormant conserve une machinerie cellulaire réduite menant à une faible transcription de certains ARNs pouvant être détectés lors des analyses par extractions d'ARN (Blagodatskaya & Kuzyakov 2013). Certaines bactéries du sol sont même capables de passer rapidement d'un état actif à un état inactif et sont dites potentiellement actives (Blagodatskaya & Kuzyakov 2013). Ces constatations soulèvent un débat quant à l'utilisation des termes actifs (Stoeck et al. 2007) ou vivants (Cristescu 2019; Yates et al. 2021) pour désigner correctement les communautés microbiennes mises en évidence par les approches ARN. De manière générale, les approches par analyses de l'ARN ou de l'ADN ne mènent pas
aux mêmes conclusions biologiques et il est recommandé de combiner les 2 méthodes pour mieux comprendre les assemblages microbiens vivants ou morts de l'écosystème étudié (Stoeck et al. 2007). Cependant, pour des raisons budgétaires cela n'a pas pu être considéré dans le cadre des travaux présentés ici. Dans l'objectif de construire une base de données regroupant plusieurs élevages issus d'écloseries différentes et présentant des taux de survie contrastés, l'approche ARN a donc été choisie pour la caractérisation des communautés microbiennes associées aux élevages et la mise en évidence de biomarqueurs.

## VIII.2.2- Biais expérimentaux

Les projets de métabarcoding peuvent présenter des biais et des limites dont il est important d'avoir conscience. En effet, les choix concernant la méthode d'extraction des acides nucléiques, la région à séquencer du gène codant pour l'ARNr 16S, la technologie de séquençage, les analyses des données de séquençage et la normalisation de ces données peuvent chacun biaiser les conclusions biologiques finales. Par exemple, Xue et al. (2018) ont montré que les microorganismes mis en évidence pouvaient varier selon le kit d'extraction d'ADN utilisé et suggèrent que certaines communautés pourraient être avantagées par certaines méthodes d'extraction et ainsi biaiser les interprétations biologiques. Au cours de cette thèse, des kits d'extraction différents et adaptés à chaque type d'échantillon ont donc été utilisés (chap. II, partie II.5.1). Il a également été montré que le choix de la région hypervariable du gène codant pour l'ARNr 16S pouvait influencer l'amplification des séquences et leur assignation taxonomique et ainsi impacter les assemblages microbiens mis en évidence en aval (Soergel et al. 2012; Ghyselinck et al. 2013). Cependant, l'amplification de la région hypervariable V4 est recommandée pour les analyses de séquençage « short reads » (50 à 300pb) car elle est considérée comme plus stable pour étudier les communautés procaryotiques (Ghyselinck et al. 2013). De plus, l'utilisation du couple d'amorces 515F/806R au cours de cette thèse, permet un regroupement optimal des séquences courtes de procaryotes (Caporaso et al. 2011). Au-delà de ces biais expérimentaux, des erreurs de séquençage peuvent également impacter les analyses de diversité. En effet, l'étape d'amplification PCR requise par les technologies de 2ème génération peut aboutir à la formation de chimères (Fig. 47, chap. III, partie III.3.1.d) et il a été montré que le séquençage Illumina HiSeq présentait un taux d'erreur médian de 0,112% (Stoler & Nekrutenko 2021). L'algorithme DADA2 a d'ailleurs été créé pour pallier à ces erreurs mais possède ses propres limites puisque son utilisation peut mener à une surestimation de la diversité microbienne (Callahan et al. 2016). Pour limiter cette dernière, l'algorithme dbOTU3 (Olesen et al. 2017) a été utilisé sur le jeu de données final avant de réaliser la méta-analyse (chap. VII). La prise en compte de l'ensemble de ces biais et de ces limites permet de diminuer les erreurs d'interprétations biologiques. Pour aller plus loin, une approche par séquençage « long read » (> 300pb) ou par approche culturale (bien que moins de 1% de la diversité total soit cultivable) pourrait permettre une compréhension approfondie des écosystèmes microbiens des élevages larvaires de *P. stylirostris* en Nouvelle-Calédonie. Par exemple, la mise au point de techniques de culture des microorganismes chitinolytiques permettrait d'étudier plus en détails les *Chitinophagales* qui ont largement été mises en évidence au cours des travaux de cette thèse. De telles approches expérimentales ont déjà permis de caractériser les populations de *Vibrio* colonisant l'hépatopancréas et l'hémolymphpe de *P. vannamei* adultes en bonne santé ainsi que celles associées à des larves et des post-larves de *P. vannamei* en mauvaise santé (Gomez-Gil et al. 1998; Vandenberghe et al. 1999).
## VIII.2.3- Un jeu de données à compléter

Comme expliqué dans le chapitre VII (partie VII.4.2), le jeu de données utilisé au cours de cette thèse devra être amélioré en vue de futures analyses. En effet, le manque de données relatives à des élevages en bonne santé à la SASV et en mauvaise santé dans les écloseries privées entraîne un biais sur la mise en évidence de biomarqueurs qui pourraient être écloserie-dépendants. De plus, les protocoles d'élevage étant spécifiques à chaque écloserie, les variations microbiennes observées pourraient résulter de différences concernant les protocoles alimentaires, les antibiotiques utilisés et les eaux de remplissage des bacs provenant d'environnements lagonaires géographiquement éloignés. L'implémentation de nouvelles données permettrait de compléter le jeu de données existant et de mieux appréhender la contribution de chaque facteur. Dans cet objectif, des campagnes d'échantillonnages ont été menées dans une autre écloserie privée de Nouvelle-Calédonie (écloserie privée 3) en juillet 2021 ainsi qu'à la SASV en novembre 2021. Au cours de chacune de ces campagnes, les élevages considérés ont montré des taux de survie contrastés. Les données issues de ces prélèvements pourraient ainsi permettre une résolution plus fine des biomarqueurs bactériens.

## VIII.3- Conclusion

Pour conclure, les travaux de cette thèse ont permis, pour la première fois, de mieux comprendre les interactions hôte – microbiote – environnement au sein des élevages larvaires de *P. stylirostris* en Nouvelle-Calédonie (Fig. 69). Comme schématisé dans la figure 69, nous avons mis en évidence que des transmissions microbiennes horizontales et verticales pouvaient être impliquées au moment de la mise en place du microbiote larvaire et potentiellement durablement impacter les communautés procaryotiques associées aux élevages. Cette hypothèse est renforcée par l'identification d'un core microbien commun à l'ensemble des échantillons d'élevage (plus de 700 échantillons) analysés au cours de cette thèse et provenant d'écloseries différentes soumises ou non à des épisodes de mortalités larvaires. Au cours du développement larvaire, nous avons montré que l'eutrophisation du milieu, l'ajout d'antibiotique, le stade de développement des larves ainsi que leur état de santé modulaient les communautés de procaryotes associés aux larves et à leur milieu d'élevage (Fig. 69). Cependant, des analyses supplémentaires seront nécessaires pour évaluer l'occurrence de processus stochastiques d'assemblages des communautés microbiennes. Enfin, des biomarqueurs bactériens de l'état de santé des larves ont été mis en évidence et devraient permettre de développer des outils de détection de type PCR ou qPCR qui pourront être utilisés pour évaluer le devenir des élevages larvaires à partir des communautés bactériennes associées aux intrants. Bien que des variations microbiennes aient été observées entre les élevages en bonne et en mauvaise santé, il est difficile de déterminer si ces modifications sont une cause ou une conséquence des mortalités larvaires. En conséquence, il n'est donc pas possible de répondre de manière dichotomique (oui ou non) à la question scientifique posée dans l'introduction générale de ce manuscrit (les variations des communautés procaryotiques associées aux élevages pourraient-elles expliquer les mortalités larvaires observées ?). Cependant, cette thèse constitue une première étape dans la compréhension des assemblages microbiens associés aux larves et à leur environnement. Elle permet également de souligner le rôle important des intrants d'eau de mer lagonaire
dans la réussite des élevages et offre de nombreuses perspectives de travail visant à maîtriser
les communautés procaryotiques associées aux élevages larvaires de *P. stylirostris*.

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**FIGURE 69** – Schéma bilan résumant les Interactions hôte – microbiote – environnement au sein des élevages de *Penaeus stylirostris*.

Cette figure synthétise les résultats obtenus par les travaux de cette thèse. Les flèches pleines représentent ce qui a été démontré et les flèches en pointillés représentent les hypothèses qui ont été faites.
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