MRE11 est l'une des principales nucléases agissant au niveau des fourches de réplication bloquées. Initialement connue pour son action dans le remodelage des CDBs. MRE11 possède des activités endo- et exonucléase (Buis et al., 2008) et fonctionne de concert avec d'autres nucléases pour initier et promouvoir la résection aux abords des CDBs indispensable à la réparation par HR. La régulation de ses activités définit par conséquent la structure des extrémités d'ADN au niveau des CDBs et détermine la voie de réparation qui sera activée (Liao et al., 2016; Shibata et al., 2014). L'activité exonucléase de MRE11 a une polarité 3'->5', lui permettant notamment la dégradation « directe » de l'ADN néosynthétisé au niveau des fourches de réplication arrêtées et/ou régressées. MRE11 et EXO1 (une exonucléase 5'->3') sont les principales nucléases responsables de l'activité de remodelage par résection, particulièrement en l'absence des protéines BRCA1. En effet, en l'absence de BRCA1 l'ADN néosynthétisé subit une dégradation incontrôlée au niveau des fourches bloquées, un phénotype très dépendant des activités de ces exonucléases (Kolinjivadi et al., 2017; Lemaçon et al., 2017; Pasero & Vindigni, 2017; Schlacher et al., 2011). La polarité exonucléase 5'-->3' d'EXO1 nécessite l'intervention préalable d'une endonucléase au niveau des fourches de réplication pour créer la structure nécessaire à l'initiation de son activité. EEPD1 (Endonuclease/Exonuclease/Phosphatase family Domain 1) peut assurer ce clivage et initier la dégradation médiée par EXO1 (C. G. Kim et al., 2016; Y. Wu et al., 2015). Cependant, d'autres exonucléases possédant des polarités complémentaires peuvent promouvoir la résection au niveau des fourches de réplication bloquées et/ou régressées et ainsi promouvoir la reprise de réplication. On citera DNA2 exonucléase 5'->3', qui agit de concert avec l'hélicase WRN (Werner Syndrom ATP-dependent helicase) afin de catalyser le traitement contrôlé du brin régressé, menant à la suppression de la structure en patte de poulet (Thangavel et al., 2015), ce qui met potentiellement en place les bases d'une reprise de la réplication par la primase PrimPol (Mourón et al., 2013; Wan et al., 2013). L'induction de ce mécanisme n'est possible que lorsque l'hélicase RECQ1 est inhibé par PARP1. En effet, RECQ1 catalyse la migration de branches inversées et ainsi la restauration des jonctions à trois voies classiques (Berti et al., 2013) (Fig. 28).

### d) Le clivage endonucléolytique

La conversion spontanée des fourches de réplication bloquées en CDBs réparées par HR fut observée pour la première fois en 2005 (Saleh-Gohari et al., 2005). Lorsqu'une polymérase rencontre une cassure ou une région d'ADN simple brin, sa sortie de piste ou « *runoff* » aboutit à une cassure double brin à une extrémité. Cependant, cette conversion en CDB peut être catalysée par des endonucléases telles que MUS81 (Fig. 28) (Pepe & West, 2014; Regairaz et al., 2011). Dans les deux cas, les CDBs à une extrémité sont prises en charge par la voie BIR (Break Induced Recombinaison) de recombinaison homologue (Anand et al., 2013; Malkova & Ira, 2013), reposant sur une synthèse d'ADN conservative (Costantino et al., 2014; Donnianni & Symington, 2013) voir chapitre VI, section C.1. L'activité de clivage endonucléolytique participe donc activement à la réparation par recombinaison homologue (BIR) et au redémarrage des fourches (Berti et al., 2020; Thangavel et al., 2015).

**Figure 28.** (Page suivante) *Traitement nucléolytique et redémarrage des fourches de réplication bloquées. (a)* Les brins naissants aux fourches inversées sont susceptibles d'être dégradés par des nucléases telles que MRE11 (et son activateur SAMHD1), DNA2 - hélicase dépendante de WRN-, EXO1 et MUS81. La protection des fourches de réplication nécessite généralement la formation de filaments RAD51 stables, qui est favorisée par la recombinaison homologue et les facteurs FA de la voie de Fanconi. Cependant, de nombreux facteurs accessoires de la fourche, notamment CtIP, RIF1, WRNIP1, ABRO1 et DONSON, empêchent la dégradation de la fourche indépendamment du chargement de RAD51. (b) Lors d'un décrochage et/ou d'une non protection prolongé de la fourche, celles découplées
ou inversées peuvent être traitées par le complexe d'endonucléases structure spécifiques SLX4 – MUS81 – EME1. Le brin parental cassé peut subir une invasion de brins suivie d'une synthèse d'ADN conservatrice. Ce processus, connu sous le nom de réplication induite par cassure ou BIR (Break Induced Replication), nécessite des hélicases spécialisées telles que PIF1, qui peuvent remplacer ou assister l'hélicase canonique MCM, et des facteurs de recombinaison homologues tels que RAD52 et POLD3. Alternativement, l'extrémité cassée peut s'engager dans un template swiching médié par microhomologie, mécanisme de réparation récemment associé à des réarrangements chromosomiques complexes observés dans les tumeurs humaines. Enfin, et plus particulièrement lors de conflits de transcription-réplication, le brin cassé peut subir une re-hybridation (re-annealing) médié par RAD52 au brin matrice complémentaire et une religation médiée par l'ADN ligase 4 (LIG4) -XRCC4, favorisant ainsi la synthèse semi-conservatrice d'ADN à partir de la fourche de réplication restaurée. Adaptée de (Berti et al., 2020).

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

### e) Les activités de résection génèrent de l'ADN simple brin, signal de stress réplicatif activant la voie ATR-KH1 et le checkpoint de réplication.

L'activité de remodelage par résection génère de l'ADN simple brin, au même titre que les évènements de découplage hélicase-polymérase (Fig. 29) (Byun et al., 2005). Cette structure est une matrice pour la recombinaison homologue, mais c'est également le terrain d'activation canonique de la voie ATR-KH1, principal régulateur du checkpoint de réplication « intra-S » (Awasthi et al., 2015; Cimprich & Cortez, 2008; Goodarzi et al., 2003; Shiotani & Zou, 2009b; Yang, 2003). Ce mécanisme de réponse au stress réplicatif permet aux cellules de gérer les problèmes de réplication via de multiples processus : arrêt du cycle cellulaire, inhibition de l'allumage d'origines tardives, stabilisation des
fourches de réplication, contrôle des activités de remodelage (Flynn & Zou, 2011; Iyer & Rhind, 2017).

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 29.** Rôle de la résection dans la réparation des fourches de réplication et l'activation de la voie ATR-CHK1. (a) Les fourches cassées (CDB à une extrémité) peuvent subir une résection par des exonucléases (MRE11/CtIP pour l'ADN néosynthétisé, EXO1/DNA2 pour l'ADN matrice). Cela génère de l'ADN simple brin pouvant être utilisé comme matrice pour la réparation par HR. Le contrôle de l'extension de la résection passe notamment par l'interaction BRCA2-dépendante de RAD51 au niveau de l'ADN simple brin. (b) Comme vu précédemment (Fig27-28), les fourches régressées sont également le substrat de certaines exonucléases pouvant contribuer à leur redémarrage. Une protection de ces structures par BRCA2/RAD51 est également cruciale pour contrôler l'extension de la résection. (c-d) Les fourches présentant de l'ADN simple brin ou arrêtées par des obstacles tels que des Top1CC (obstacle composé par les inhibiteur de Topoisomérides) peuvent également subir une résection par MRE11, facilitant la réparation par HR et la reprise de la synthèse d'ADN. (e) Alternativement, le découplage fonctionnel hélicase-polymérase génère également de l'ADN simple brin. Toutes ces voies de remodelage et de reprise de la réplication génèrent des substrats activateurs notamment l'ADN de la vois ATR/CHK1. Adapté de (Pasero and Vindigni, 2017).</figcaption></figure>
# V. Signalisation du stress réplicatif

Le stress réplicatif est un inducteur majeur de la réponse aux dommages à l'ADN ou DDR (DNA Damage Response), dont la voie ATR-HK1 est un des deux pivots (Flynn & Zou, 2011). La production d'ADN simple brin active la voie ATR-HK1 qui active les checkpoints de phase S et G2 (Flynn & Zou, 2011; Shiotani & Zou, 2009). Cet ensemble de mécanismes coordonnés a pour but de protéger l'ADN, promouvoir sa réparation et la reprise de la réplication.

## A. La voie ATR-HK1 et son implication dans les points de contrôle du cycle cellulaire

Etant activée par un dysfonctionnement de la réplication, l'activité de la voie ATR-HK1 est restreinte aux phases S et G2 du cycle cellulaire et associée aux checkpoints de réplication (intra-S) et/ou G2/M, dont le rôle est d'assurer la fiabilité de la réplication et d'empêcher les cellules avec un génome incomplètement répliqué d'entrer en mitose (Cliby, 1998; L. Smith et al., 1998).

Dans un premier temps, nous ferons un rapide tour d'horizon des généralités fonctionnelles et structurales des protéines ATR et CHK1, puis nous nous intéresserons à l'activation moléculaire et aux différentes répercussions cellulaires du checkpoint de réplication de l'ADN.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 30. Checkpoints, progression du cycle cellulaire et voie ATR-HK1.</figcaption></figure>

## B. Les protéines ATR et CHK1

### 1. ATR : le lanceur d'alarme en situation de stress

La protéine ATR (Ataxia-Telangiectasia Mutated and Rad-3 related) appartient à la famille des Phosphatidylinositol 3 Kinase-related protein kinase (PIKK) et partage des homologies de séquence avec ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) et DNA-PK (DNA Dependant Protein Kinase) (Cimprich & Cortez, 2008). A la différence d'ATM et de DNA-PK (principalement impliquées dans la réparation des CDBs), ATR est activée par l'accumulation d'ADN simple brin (Awasthi et al., 2015). ATR est une protéine très conservée avec des orthologues chez S. Cerevisiae (Rad3) et D. melanogaster (Mei-41), dont l'expression est ubiquitaire et essentielle à la survie cellulaire (Keegan et al., 1996; Keith & Schreiber, 1995). Ainsi sur des modèles de souris transgéniques, le KO homozygote Atr est embryonnaire létal. Il est notable que les souris hétérozygotes Atr+/- montrent une incidence accrue de tumeurs bégnines et malignes illustrant le rôle suppresseur de tumeur du gène Atr (E. J. Brown & Baltimore, 2000; de Klein et al., 2000). De façon intéressante, l'effet suppresseur de tumeur d'ATR a été montré comme dose-dépendant dans des modèles de cellules cancéreuses colorectales (Fang et
al., 2004). De plus, sa déplétion partielle par siRNA aboutit à une instabilité chromosomique démontrant l'importance d'ATR dans le maintien de l'intégrité génomique (Ashley et al., 2014; Jardim et al., 2009; Jossé et al., 2014; Moiseeva et al., 2017; Rundle et al., 2017; L. I. Toledo et al., 2013).

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 31.** **Structure de la protéine ATR.** (A) En N-terminal, les domaines N- et M-HEAT composés de motifs répétés en hélices alpha permettent l'interaction avec ATRIP. Localisée dans la partie C-terminale de la protéine, la partie catalytique d'ATR se compose du domaine FAT (contenant la Thréonine 1989, transautophosphorylée durant l'activation d'ATR), du domaine kinase KD (contenant la poche d'interaction avec l'ATP) et du domaine FATC. (B). **Modèle d'activation ATR.** ATR-ATRIP forme un dimère de dimères. La liaison de l'AAD de TOPBP1 ou ETAA1 induit probablement un changement conformationnel de l'ATR qui réduit le Km de ses substrats et l'active ainsi. BRCT, extrémité BRCA1 C-Ter. Adapté de (Rao et al., 2018; Saldivar et al., 2017).</figcaption></figure>

La protéine ATR se compose de 5 domaines distincts (Fig. 31A). En N-terminal, le domaine N-HEAT contient le motif d'interaction avec la protéine ATRIP (ATR Interacting Protein), une protéine adaptatrice permettant la reconnaissance du complexe nucléoprotéique ssDNA-RPA (single stranded DNA – Replication Protein A) (Cimprich & Cortez, 2008). Ce domaine, contient également la sérine 428, dont la phosphorylation fut longuement considérée comme un des marqueurs d'activation d'ATR (Bhattacharya et al., 2009; Hilton et al., 2015). Cependant, ne corrélatant pas systématiquement à l'activité kinase d'ATR mesurée avec la phosphorylation de CHK1, la pertinence de ce marqueur fut remise en question (S. Liu et al., 2011). Le second domaine, M-HEAT lie les domaines N-HEAT et FAT comprenant la thréonine 1989 d'ATR, considérée aujourd'hui comme le marqueur de l'activité kinase de la protéine (Fig. 31A, B). La phosphorylation de la thréonine 1989 ferait suite à l'interaction d'ATR avec ATRIP aux niveaux des dommages à l'ADN, favorisant son interaction avec TOPBP1 et stimulant l'activité kinase d'ATR (S. Liu et al., 2011; Nam et al., 2011; Rao et al., 2018). La transmission du signal en aval vers les effecteurs d'ATR, met en jeu plusieurs interactions protéiques avec des acteurs clés de la DDR tels que P53, BRCA1, RAD17, RAD9 et SMC1(Bao et al., 2001; Nam et al., 2011; Rao et al., 2018).

L'activation d'ATR aboutit essentiellement à la phosphorylation du variant d'histone H2AX au niveau de la sérine 139 (γH2AX) (Ward & Chen, 2001), de RPA32 (sérines 4, 8 et 33) (S. Liu et al., 2012; Vassin et al., 2009) et évidemment de CHK1 (sérines 317 et 345) (Goto et al., 2015; Q. Liu et al., 2000; Niida et al., 2007; H. Zhao & Piwnica-Worms, 2001). Les phosphorylations d'H2AX et de RPA32 représentent des marqueurs majeurs de la présence de dommages à l'ADN, tandis que celle de CHK1, qui est le pivot de la réponse au stress réplicatif médiée par ATR, est utilisée comme un marqueur d'activation de la voie ATR-CHK1 et du stress réplicatif.
## 2. CHK1 : l'agent spécial d'ATR

La protéine CHK1 (Checkpoint Kinase 1) fut initialement découverte chez S. pombe en 1993 (Walworth et al., 1993). A l'instar d'ATR, CHK1 est exprimée de façon ubiquitaire et son inactivation totale est incompatible avec le développement embryonnaire chez la souris (Q. Liu et al., 2000; Takai et al., 2000). En réponse à un stress réplicatif, CHK1 est directement phosphorylé par ATR, enclenchant l'activation des points de contrôle (Q. Liu et al., 2000; Niida et al., 2007). Remarquablement, il a été démontré qu'un allèle supplémentaire de CHK1 augmentait la protection des cellules contre un stress réplicatif induit par une activation oncogénique (López-Contreras et al., 2012).

Le rôle prédominant de CHK1 fut élucidé au cours des années 2000 (année où sa forme humaine a été cristallographiée) (P. Chen et al., 2000). Principal effecteur d'ATR, de par les phosphorylations des sérines 317 et 345, CHK1 voit sa structure tri-dimensionnelle relaxée, ce qui permet ses interactions avec différents effecteurs dans le noyau et enclenche la signalisation du checkpoint (Goto et al., 2015; Guo et al., 2000; Han et al., 2016; Q. Liu et al., 2000; Niida et al., 2007; H. Zhao & Piwnica-Worms, 2001). Cependant, CHK1 peut être phosphorylé sur d'autres sites dans le cadre de diverses régulations. A titre d'exemple, les phosphorylations des sérines 317 et 345 par ATR sont nécessaires à l'autophosphorylation de CHK1 à la sérine 296 (souvent ciblée par les inhibiteurs de CHK1) (Okita et al., 2012). Cette modification créerait un site d'interaction avec 14-3-3y, nécessaire à la dégradation de CDC25A (Kasahara et al., 2010), qui représente un aspect clef de la réponse du checkpoint ATR-CHK1 qui sera présenté plus loin (section V.C.2.a). D'autres protéines telles que la claspine participent à l'activation et à la stabilité de CHK1 (Kumagai et al., 2004) et, réciproquement, CHK1 régule également la stabilité de la claspine (Chini et al., 2006). La localisation sub-cellulaire de CHK1, régulée par ses domaines CM1/2, participe également à la modulation de ses fonctions (J. Wang et al., 2012).

## C. La voie ATR-CHK1 : axe central hautement régulé, impliquée dans plusieurs processus

### 1. Activation et amplification du signal

#### 1.1 Activation de la voie ATR-CHK1

##### a. Activation médiée par les ADN simples brins

Nous avons vu que le recrutement de RPA sur l'ADN simple brin amorçait l'activation ATR-CHK1, lors d'un stress réplicatif. Cependant, la production d'ADN simple brin peut aussi provenir de la résection des extrémités libres d'ADN au cours de la réparation des CDBs, illustrant les crosstalks possibles entre les différentes voies de réparation (Byun et al., 2005; J. Lee & Dunphy, 2013; Limbo et al., 2011; Shiotani & Zou, 2009).

L'activation canonique d'ATR se fait *via* TOPBP1 (TOPoisomerase Binding Protein 1) qui est dépendante du chargement du complexe 9-1-1 (RAD9-RAD1-HUS1) sur l'ADN. Cette étape nécessite l'existence d'une jonction ADN double brin-ADN simple brin (5'-ssDNA-dsDNA) (Saldivar et al., 2017) (Fig.32 A). Ces structures sont naturellement présentes sur le brin retardé et peuvent également provenir d'une synthèse de primer sur le brin précoce. Alternativement, ces structures peuvent aussi être générées par les activités de résection lors du remodelage des fourches bloquées (Fig.32 B).
<figure><img src="image_43.png" /></figure>

**Figure 32.** Activation de la signalisation ATR-CHK1 par des structures spécifiques d'ADN. (A). La structure nécessaire à l'activation d'ATR médiée par TOPBP1 est une jonction ADN simple brin-ADN double brin (5' ended ssDNA-dsDNA junction). Le découplage fonctionnel hélicase-polymérase conduit à l'accumulation d'ADN simple brin. Couplé à la synthèse de primer, ce processus peut générer la structure d'ADN requise pour l'activation d'ATR canonique (via TOPBP1). (B). Lorsqu'aucun découplage hélicase-polymérase a lieu, des fourches stressées (cassées, bloquées ou régressées) subissent des activités de remodelage par des exonucléases, nécessaires à la génération des structures d'ADN (Saldivar et al., 2017).

### b. Activation canonique via TOPBP1

Dans ce mode d'activation, l'interaction ATR/RPA-ADN simple brin se fait indirectement via l'interaction entre ATR et l'adaptateur ATRIP (ATR Interacting Protein) (L. Zou & Elledge, 2003). Le recrutement d'ATR au niveau de l'ADN simple brin est nécessaire mais non suffisant à son activation. Au niveau des jonctions simple brin/double brin citées plus haut, le complexe 9-1-1 est chargé et recrute TOPBP1 de façon Rad17-RFC dépendante, puis il interagit physiquement avec le complexe ATR-ATRIP et stimule l'activité kinase d'ATR (Fig.33) (Burrows & Elledge, 2008; Kumagai et al., 2006; Mordes et al., 2008). Par ailleurs, l'interaction TOPBP1-ATR est favorisée par la trans-autophosphorylation d'ATR à la thréonine 1989. Cette phosphorylation peut être reconnue par les domaines BRCT6-8 de TOPBP1, ce qui favorise l'interaction TOPBP1-ATR et stimule, dans une boucle d'auto-activation, l'activité kinase d'ATR via le domaine AAD (ATR Activating Domain) de TOPBP1 (S. Liu et al., 2011; Nam et al., 2011).

Une fois activée, ATR phosphoryle de multiples substrats en aval, dont la kinase CHK1. Si La phosphorylation de la thréonine 1989 d'ATR est corrélée à la présence de dommages à l'ADN et à l'activité kinase d'ATR, elle n'est cependant pas nécessaire à la phosphorylation de certains substrats d'ATR suggérant l'existence de voies d'activation d'ATR indépendantes de TOPBP1 (Nam et al., 2011).

**Figure 33.** (Page suivante). Modèle d'activation d'ATR par TOPBP1. L'ADN simple brin est protégé par RPA, un complexe protéique nécessaire au recrutement du complexe ATR-ATRIP. Deux molécules d'ATR proches peuvent alors se phosphoryler en trans sur la thréonine 1989, créant un site d'interaction avec les domaines BRCT6-8 de TOPBP1, recruté de façon RFC-Rad17 et 9-1-1 dépendante au niveau d'une jonction ADN simple brin-ADN double brin adjacente. Le domaine AAD (ATR Activating Domain) de TOPBP1 stimule alors l'activité kinase d'ATR. A noter que d'autres protéines telles que RHINO ou le complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1), non présentées ici, participent également au recrutement et à l'activité de TOPBP1. Adapté de (S. Liu et al., 2011).
<figure><img src="image_44.png" /></figure>

### c. Activation alternative via ETAA1 ou NEK

Plus récemment, une activation d'ATR indépendante de TOPBP1/9-1-1 a été mise en évidence via la protéine ETAA1 (Ewing's tumor-associated antigen 1) (Niedzwiedz, 2016). ETAA1 est recruté au niveau des fourches de réplication bloquées où elle interagit directement avec RPA et peut activer ATR via son domaine AAD (ATR activating domain) (Haahr et al., 2016; Y.-C. Lee et al., 2016). Par ailleurs, une famille de protéines appelées NEK a été récemment découverte en tant qu'interacteurs et régulateurs potentiels de la voie ATR-CHK1 et de la signalisation DDR (S. Liu et al., 2013; Meirelles et al., 2014). L'existence de plusieurs régulateurs distincts d'ATR signifierait que son activation peut se faire en réponse à différents types de stress.

## 1.2. Amplification du signal et seuil d'activation

La signalisation ATR-CHK1 peut être amplifiée permettant d'accélérer ou intensifier les réponses aux points de contrôle par le biais de trois mécanismes (Fig.34).

* Une activation médiée par ETAA1, qui est indépendante des jonctions 5'-ssDNA-dsDNA, mais liée à la longueur de la région simple brin.

* La synthèse de primer (amorces) par la primase pol α ou Primpol au niveau des fourches bloquées en amont d'une polymérase arrêtée peuvent contribuer à (voir partie 3) l'amplification aussi bien sur le brin tardif que le brin précoce. L'activation de la voie ATR est alors proportionnelle au nombre d'amorces synthétisées sur le segment d'ADN simple brin d'une fourche arrêtée (Guilliam & Doherty, 2017; Mourón et al., 2013; Van et al., 2010).

* Certaines modifications post-traductionnelles d'ATR ou de ses interacteurs peuvent favoriser la mise en place de boucles d'auto-amplification de la signalisation du checkpoint. Ainsi, l'ubiquitination de RPA par PRP19 au niveau des fourches de réplication arrêtées favorise le
recrutement du complexe ATR-ATRIP, tandis qu'ATR stimule le recrutement de PRP19 au niveau de RPA (Maréchal et al., 2014). De plus, la phosphorylation de TOPBP1 (sérine 1131) par ATM favorise l'interaction TOPBP1-ATR (Yoo et al., 2007).

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

**Figure 34.** Amplification de la signalisation d'ATR. Différents mécanismes peuvent contribuer à l'amplification de la signalisation d'ATR. (A). Une activation via ETAA1 indépendante des jonctions ssDNA-dsDNA pourrait être directement proportionnelle à la longueur de la région simple brin. (B). Une synthèse d'amorces continue par pol α ou Primpol, en aval d'une polymérase bloquée multiplie les structures d'activation TOPBP1-dépendantes d'ATR. (C). Il existe également des boucles d'auto-amplification et certaines modifications post-traductionnelles pouvant amplifier le signal. A titre d'exemple, il est représenté ici la boucle d'auto-amplification par ubiquitination PRP19-dépendante de RPA (bas, gauche). (D). Certaines modifications post-traductionnelles d'ATR (T1989) et de TOPBP1 (S1131) participent également activement à l'amplification de la signalisation checkpoint. Adapté de (Saldivar et al., 2017).

Par ailleurs, l'existence de seuils d'activation a été mise en évidence. Ainsi, au cours de la synthèse d'amorces à l'origine des fragments d'Okazaki, pol α génère des structures transitoires pouvant activer ATR sur le brin tardif (Cortez, 2005; MacDougall et al., 2007). Cependant, la phosphorylation de CHK1 est négligeable en absence de stress réplicatif (Koundrioukoff et al., 2013). Des approches phosphoprotéomiques chez la levure ont montré que durant la réplication normale, l'activité kinase d'ATR (9-1-1 et DNA2 dépendante, DNA2 étant le facteur de maturation du brin tardif) suffit à la phosphorylation de nombreux substrats impliqués dans le maintien de la stabilité génomique, mais en l'absence de phosphorylation de CHK1 (Bastos de Oliveira et al., 2015). Ces études suggèrent que l'activation de la voie ATR-CHK1 se fait par palier d'incrémentation en réponse au stress réplicatif. En d'autres termes, un stress réplicatif faible, intrinsèque aux cellules (par exemple lors de la réplication des SFCs) n'est pas suffisant pour induire une phosphorylation de CHK1 et éventuellement provoquer l'arrêt du cycle cellulaire. Dans ces conditions, l'activité d'ATR reste quand même primordiale au
maintien de la stabilité génomique (activations locales au niveau des fourches stressées, par exemple aux SFCs).

## 2. Fonctions de la voie ATR-CHK1 durant et en dehors de la réplication

### a. Arrêt du cycle cellulaire

L'une des fonctions critiques de la voie ATR-CHK1 est d'arrêter le cycle cellulaire (Iyer & Rhind, 2017c; Shiotani & Zou, 2009a) fournissant aux cellules un délai pour enclencher les mécanismes de réparation de l'ADN. Une fois activée, CHK1 se dissocie de la chromatine et diffuse dans le noyau, où elle inactive par phosphorylation les phosphatases CDC25 (CDC25 A/B/C), qui sont les activateurs critiques des complexes cycline-CDK1 et 2 responsables des transitions G1/S et G2/M respectivement (Fig.8) (Donzelli & Draetta, 2003; Goto et al., 2015; Kasahara et al., 2010; Sanchez et al., 1997; Thanasoula et al., 2012). Dans le cadre du checkpoint intra-S, CHK1 phosphoryle CDC25A conduisant à son ubiquitination par SCFβ-TRCP et sa dégradation, ce qui provoque l'arrêt des cellules en phase S (Fig.8) (Jin et al., 2003; Kasahara et al., 2010). Dans le cadre de la transition G2/M, CHK1 phosphoryle CDC25B et CDC25C conduisant à leur reconnaissance par 14-3-3γ, à leur exclusion du noyau et à l'arrêt en G2 (Donzelli & Draetta, 2003; Karlsson-Rosenthal & Millar, 2006; Nilsson & Hoffmann, 2000; Schmitt et al., 2006; Sur & Agrawal, 2016). Par ailleurs, CHK1 peut également catalyser la phosphorylation et la stabilisation de WEE1, facilitant l'interaction WEE1-14-3-3γ, stimulant l'activité kinase de WEE1 et la phosphorylation des sites inhibiteurs de CDK1 et CDK2 (Dai & Grant, 2010; J. Lee et al., 2001; Patil et al., 2013; P. Saini et al., 2015) (Fig.35).

**Figure 35.** Régulation du cycle cellulaire par CHK1 en réponse au stress réplicatif et dommages de l'ADN. L'activation de CHK1 est une pierre angulaire de la régulation du cycle cellulaire : en ciblant, par différents mécanismes, les phosphatases CDC25A/B/C (dégradation de CDC25A durant la phase S et séquestration cytoplasmique de CDC25 en phase G2), la signalisation checkpoint initiée par ATR-CHK1 peut arrêter le cycle cellulaire en phase S et G2. Adapté de (da Costa et al., 2023).(Costanzo et al., 2003; Iyer & Rhind, 2017c; Karnani & Dutta, 2011; Santocanale & Diffley, 1998; Seiler et al., 2007; L. I. Toledo et al., 2013).

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

### b. Régulation de l'allumage d'origines de réplication

#### i. Inhibition de l'allumage à l'échelle globale

La voie ATR-CHK1 contribue à la régulation négative de l'allumage des origines de réplication en présence ou non de stress réplicatif exogène (Costanzo et al., 2003; Iyer & Rhind, 2017c; Karnani &
Dutta, 2011; Santocanale & Diffley, 1998; Seiler et al., 2007; L. I. Toledo et al., 2013) (Fig.37). Dans un contexte de stress réplicatif, ATR-CHK1 limite le recrutement du facteur d'initiation CDC45 sur le complexe MCM2-7, qui est nécessaire à l'activation du complexe hélicase (CMG), elle-même indispensable à l'allumage des origines de réplication (Saldivar et al., 2017). L'inhibition de l'interaction de CDC45/MCM2-7 passe par ; (1) l'inhibition de la phosphorylation de la protéine Tresline indispensable au recrutement de CDC45 (Donzelli & Draetta, 2003; Saldivar et al., 2017; Sur & Agrawal, 2016); (2) la phosphorylation par ATR de la protéine MLL (Mixed-Lineage Leukemia), induisant sa stabilisation et sa liaison à la chromatine (H. Liu et al., 2010) et l'inhibition du recrutement de CDC45. De plus, CHK1 régule négativement l'allumage des origines de réplication tout au long de la phase S en inhibant cycline A/CDK1(Nakanishi et al., 2010).

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

**Figure 36. Régulation de l'allumage des origines de réplication par la voie ATR-CHK1,** En réponse au stress réplicatif, la voie ATR-CHK1 a des actions coordonnées sur l'allumage des origines de réplication aux échelles locale et globale. Ainsi, elle contribue à l'inhibition de l'allumage d'origines tardives à l'échelle globale (rouge), principalement en inhibant le recrutement de CDC45, composant du réplisome nécessaire à l'activation des origines. Dans un même temps, la signalisation du checkpoint est permissive à l'allumage local d'origines dormantes (vert). Ces mécanismes, encore peu compris, pourraient être coordonnés par l'activité CDK régulée par l'axe ATR-PLK1-CHK1. Cette « dualité » de réponse pourrait (1) préserver les réserves de facteurs de réplication solubles et (2) permettre le sauvetage de fourches de réplication bloquées par des réplicons adjacents. Adapté (Saldivar et al., 2017).

## ii. Permissivité d'allumage à l'échelle locale

Bien que le checkpoint ATR-CHK1 inhibe globalement l'allumage des origines de réplication dans le génome, il peut dans certaines conditions contribuer à l'allumage d'origines au voisinage des fourches bloquées (Fig.36) (Ge & Blow, 2010; Saldivar et al., 2017). Ainsi, en présence de stress réplicatif, la voie ATR-CHK1 atteint un seuil d'activation lui permettant la modulation locale de certaines protéines, telles que FANCI impliquées dans l'allumage d'origines de réplication (Y.-H. Chen et al., 2015). La
coordination de ces deux types de régulations aux échelles globales et locales est essentielle à la gestion du stress réplicatif. En effet, alors que la permissivité d'un allumage local peut contribuer au sauvetage des fourches de réplication par des réplisomes adjacents, l'inhibition à l'échelle globale permet une temporisation et évite l'accumulation d'anomalies supplémentaires dans d'autres régions génomiques non répliquées (Iyer & Rhind, 2017c; Pasero & Schwob, 2000; Yekezare et al., 2013).

### c. Protection contre l'épuisement des facteurs de réplication (dNTP, RPA)

#### i. RPA (Replication Protein A)

La protéine RPA est indispensable à la protection de l'ADN simple brin, et au recrutement de facteurs de réparation de l'ADN (activation d'ATR *via* TOPBP1 et ETAA1), et d'enzymes nécessaires au remodelage des fourches bloquées (R. Chen & Wold, 2014; Y. Zou et al., 2006). Comme décrit précédemment la régulation de l'allumage des origines de réplication contribue directement à la gestion des facteurs solubles nécessaires à la réplication de l'ADN tels que RPA. Ainsi, l'inhibition à l'échelle globale de l'allumage d'origines de réplication *via* la voie ATRCHK1, contribue à préserver les stocks de nucléotides et de RPA (L. I. Toledo et al., 2013). Certaines études montrent que l'induction d'un stress réplicatif par l'aphidicoline ou l'hydroxyurée combiné à une inhibition de la voie ATRCHK1, conduit à un épuisement « exhaustion » du pool de RPA libre, également causé par l'allumage incontrôlé d'origines de réplication (Fig.37) (Fernandez-Capetillo & Nussenzweig, 2013; L. I. Toledo et al., 2013). *In fine*, l'épuisement de RPA peut conduire à une catastrophe réplicative, ce qui se traduit par une accumulation de dommages à l'ADN au niveau de ces régions d'ADN simple brin non protégées par RPA, conduisant à la mort cellulaire.

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

**Figure 37.** La signalisation ATRCHK1 à l'échelle globale protège les cellules de l'épuisement de RPA. L'inhibition de l'allumage d'origines de réplication à l'échelle globale va préserver le pool de RPA libre, et favoriser son recrutement au niveau des fourches bloquées/remodelées. Dans ces conditions, l'inhibition de la voie ATRCHK1 conduit, via l'activité CDK, à l'allumage incontrôlé d'origines de réplication et à l'épuisement des réserves de RPA libre (exhaustion). Lorsque les cellules n'ont plus assez de RPA libre, l'ADN simple brin émergeant des réplicons actifs ne peut plus être stabilisé et une importante accumulation de dommages (notamment des CDBs) a lieu. Ce seuil stress réplicatif définit la limite gérable par les cellules, au-delà duquel une catastrophe réplicative est provoquée (accumulation irréversible de dommages de l'ADN et mort cellulaire subséquente). Adapté (L. Toledo et al., 2017; L. I. Toledo et al., 2013).
## ii. Les dNTPs

La disponibilité d'une quantité suffisante de dNTPs est essentielle à une synthèse d'ADN ininterrompue (notamment via le découplage hélicase-polymérase). La déplétion de CHK1 induit un ralentissement des fourches pouvant être corrigé par une complémentation en précurseurs nucléotidiques, suggérant que son absence impacte le pool de nucléotides libres (Técher et al., 2016). En plus du contrôle de la synthèse d'ADN à l'échelle globale, le checkpoint médié par ATR-KH1 contrôle activement la synthèse de précurseurs nucléotidiques par la RNR dont elle régule positivement l'activité (Fig.38) (Puig et al., 2013). En conséquence, la synthèse de nucléotides est stimulée de deux manières différentes : (1) en favorisant la transcription de RRM2 *via* le facteur de transcription E2F1 (Buisson et al., 2015), (2) en inhibant la dégradation cycline-F/CDK-dépendante de RRM2 (D'Angiolella et al., 2012).

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

**Figure 38. Régulation du pool de dNTP par ATR via RNR.** Certains évènements tels qu'une activation oncogénique ou des défauts de signalisation checkpoint peuvent favoriser l'épuisement des réserves de nucléotides (par exemple en induisant une activation excessive des origines de réplication). L'épuisement du pool de dNTPs est une source de stress pour les cellules et altère la progression des fourches de réplication, pouvant conduire à l'apparition de dommages de l'ADN. Ce stress réplicatif active la kinase ATR qui, en retour, stimule l'activité de la ribonucléotide réductase (RNR) et par conséquent la production de dNTPs. La production de dNTPs doit cependant être limitée car un pool de nucléotides trop important est également source d'instabilité génomique. Adapté de (Pai & Kearsey, 2017).

### d. Maintien de la stabilité des fourches et contrôle des réplisomes

#### i. Inhibition de l'effondrement des fourches

ATR est essentielle au maintien de la stabilité des fourches, notamment en les protégeant contre l'effondrement en cas de blocage (Fig.39 A) (Dungrawala et al., 2015; Iyer & Rhind, 2017). L'effondrement des fourches est un processus complexe qui fait intervenir des nucléases structures spécifiques, qui ciblent les fourches arrêtées ou remodelées (De Piccoli et al., 2012; Dungrawala et al., 2015; Ragland et al., 2013). Ce clivage endonucléolytique, à l'origine de l'effondrement des fourches, peut servir de levier pour la reprise de la réplication. En effet, les CDBs qui en résultent peuvent servir d'intermédiaires à une réparation par recombinaison et permettre la reprise de la réplication (Saldivar et al., 2017). Cependant, un mauvais contrôle de ces processus de remodelage (clivage et résection excessifs) peut également avoir des conséquences délétères sur les cellules (Couch & Cortez, 2014; Quinet et al., 2017). Dans ce contexte ATR-KH1 régule activement le remodelage des fourches de
réplication par (i) la phosphorylation ATR dépendante de SMARCAL1, ce qui limite la régression des fourches de réplication (Fig.39 B) (Couch et al., 2013) ; (ii) par le biais de l'inhibition des CDKs, ce qui limite à la phase G2/M l'activation de certaines nucléases CDK dépendantes et les empêche de produire des CDBs au niveau des fourches bloquées/remodelées. CHK1 stabilise également les fourches de réplication, notamment en inhibant leur clivage et l'effondrement subséquent médié par MUS81(Forment et al., 2011; Murfuni et al., 2013; Técher et al., 2016). De plus le rôle central de CHK1 dans la gestion des fourches bloquées est souligné par les observations montrant que son inhibition/atténuation provoque un effondrement massif des fourches en phase S, ce qui n'est pas le cas pour ATR (Ragland et al., 2013). Ceci suggère, qu'en absence de ATR, CHK1 peut être activé indépendamment de celle-ci. Celle-ci pourrait passer par d'autres kinases du DDR, telles que DNA-PK qui pourrait activer partiellement CHK1 (Buisson et al., 2015).

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

**Figure 39.** Régulation de la stabilité des fourches et contrôle des réplisomes par la voie ATR-CHK1, (A). ATR et CHK1 sont essentielles à la prévention de l'effondrement des fourches médié par les activités de clivage endonucléolytiques. (B). ATR limite la régression des fourches via la phosphorylation de SMARCAL1. Par ce mécanisme, ATR protège les fourches de réplication d'un clivage par l'endonucléase à spécificité de structure SLX4, générant des cassures double brin à une extrémité à partir des fourches régressées. (C). La voie ATR-CHK1 semble également contrôler les réplisomes, et notamment pouvoir les ralentir en condition de stress réplicatif. Les mécanismes d'un ralentissement actif des fourches sont encore méconnus, mais les phosphorylations ATR-dépendantes de FANCD2 et du complexe MCM pourraient y participer tout en protégeant les fourches d'une résection excessive par MRE11. Adapté de (Saldivar et al., 2017).

## ii. Contrôle des réplisomes

En réponse au stress réplicatif, FANCD2 et le complexe MCM peuvent être phosphorylés induisant leur interaction. Celle-ci est corrélée à (1) une diminution de la vitesse des fourches de réplication et (2) une inhibition de la résection des fourches de réplication stressées par MRE11 (Fig. 39 C) (Lossaint et al., 2013). Toutes ces observations suggèrent que la signalisation ATR-CHK1 peut contrôler la progression des réplisomes, afin de prévenir des événements potentiellement délétères au niveau des fourches de réplication bloquées.

## e. Régulation du redémarrage des fourches et des voies de tolérance aux dommages à l'ADN
i. Réparation et redémarrage « sans erreur »

Nous avons vu dans la section IV.C.1.ii.b. (Fig.28) que les mécanismes de remodelage des fourches sont largement impliqués dans leur redémarrage, notamment par les voies de HR. De nombreuses observations montrent qu'ATR phosphoryle et stimule de multiples substrats impliqués dans les processus de redémarrage des fourches dits « sans erreur », basés sur RAD51 et dépendant des brins d'ADN homologues (Fig.40 D) (Berti et al., 2020; da Costa et al., 2023; Saldivar et al., 2017). Ainsi, les phosphorylations de BLM, WRN, RPA, PALB2 et XRCC3 par ATR participeraient à la réparation et au redémarrage des fourches par les mécanismes de HR, de régression, mais également de template-switching (TS), une voie de réparation utilisant temporairement l'autre brin d'ADN naissant durant le bypass d'un obstacle (Branzei & Foiani, 2007).

ii. Voies de tolérance aux dommages de l'ADN « basse-fidélité » : synthèse translésionnelle (TLS) et repriming

La voie ATR-CHK1 est également impliquée dans l'activation des voies de tolérance des dommages à l'ADN permettant de bypasser les lésions de petites tailles (section IV.C.1.i), (da Costa et al., 2023; Saldivar et al., 2017) en activant le recrutement d'ADN polymérides translésionnelles (pour détails voir revues par (Branzei & Szakal, 2016; Goodman & Woodgate, 2013; Vaisman & Woodgate, 2017; L. Zhao & Washington, 2017).

Une étape importante serait la mono-ubiquitination de PCNA sur la lysine 164, qui permet l'interaction PCNA/polymérides TLS et induirait leur recrutement au niveau des fourches de réplication bloquées (Fig.40 B) (Goodman & Woodgate, 2013; Sale, 2013; Vaisman & Woodgate, 2017; L. Zhao & Washington, 2017).

f. Réparation de l'ADN

L'un des rôles majeurs impliquant la voie ATR-CHK1 dans le maintien de l'intégrité génomique, est le
recrutement et/ou l'activation de protéines impliquées dans la réparation de l'ADN telles que les
protéines de la voie de Fanconi FANCE et FAND2 (J. Wang et al., 2007; Zhi et al., 2009) ou encore BRCA1
et RAD51 dans le cadre de la réparation par HR (Sørensen et al., 2005; Tibbetts et al., 2000). Les
mécanismes de réparation de l'ADN, (spécifiquement ceux par recombinaison) ainsi que leur liaison
avec la voie ATR-CHK1 seront détaillés dans le dernier chapitre.

**Figure 40.** (Page suivante). **Schéma récapitulatif de la régulation de la dynamique de la fourche par la voie ATR.**
**A.** Les voies ATM/ATR inhibent le déclenchement de l'origine de réplication via l'inhibition MCM2-7 et de la FANCI. Le déclenchement d'origines de réplication est indiqué par la lettre F, et les origines de réplication dormantes - licencées mais non activées - sont indiquées par la lettre D. Le réplisome est indiqué en bleu. **B.** Les fourches bloquées (l'étoile jaune) peuvent être sauvées directement par les voies de tolérance aux dommages de l'ADN ou peuvent être inversées par des protéines de remodelage de la fourche. Les deux mécanismes font appel à l'activité d'ATR pour leur mise en place, notamment la mono-ubiquitination de PCNA pour le recrutement de polymérides translésionnelles, et le recrutement de facteur de remodelage des fourches. **C.** La voie ATR module l'inversion de fourche, active les protecteurs de fourche et favorise sa stabilisation. Les fourches inversées sont des substrats pour les nucléases qui clivent l'ADN pour former des cassures double brin (CDB). **D.** Les fourches de réplication effondrées peuvent être réparées par les voies de réparation par recombinaison homologue (HR) et de réplication induite par rupture (BIR), permettant un redémarrage de la fourche et une mitose normale. Si la réparation de l'ADN n'est pas efficace,
l'effondrement de la fourche peut entraîner une instabilité génomique et une catastrophe mitotique. Adapté de (da Costa et al., 2023).

<figure><img src="image_51.png" /></figure>
# VI. Systèmes de réparation de l'ADN et reprise de la réplication

## A. La réparation de l'ADN : généralités

Le génome humain est constamment exposé à des sources de stress endogènes et exogènes susceptibles de générer des dommages à l'ADN, qui doivent être éliminés pour préserver l'intégrité et la stabilité du génome. A cet effet la réponse DDR « DNA Damage Response », hautement conservée chez tous les organismes vivants, assure la coordination entre la réparation de l'ADN et la progression dans le cycle cellulaire. La DDR est constituée d'un réseau de détection de dommages, de transduction du signal et de protéines effectrices, qui aboutit à différentes issues parfois concomitantes ; (i) activation de la transcription de certains gènes impliqués dans l'arrêt du cycle cellulaire, (ii) le déclenchement de la mort cellulaire, (iii) la réparation effective des lésions (Fig.41 A) (Zhou & Elledge2, 2000).

Les mécanismes de réparation de l'ADN sont hautement spécialisés et différentiellement activés selon le type de dommage et la phase du cycle cellulaire. Le choix de la voie de réparation prend en compte l'expression ou la stabilité de certaines protéines de réparation, le niveau de compaction de la chromatine et la disponibilité des chromatides sœurs, éléments qui varient au cours du cycle cellulaire (Zhou & Elledge2, 2000). Les voies de signalisation la réparation de l'ADN sont résumées dans la **Fig.41 B**, mais dans ce qui suit ici, nous allons nous concentrer sur les mécanismes de réparation de l'ADN impliqué dans la gestion du stress réplicatif.

Comme évoqué dans le **chapitre V**, les lésions pouvant faire obstacle à la progression de la machinerie réplicative peuvent être de nature variée. Dès leur détection par les agents du DDR, les fourches de réplication sont activement bloquées afin de permettre la réparation de la séquence d'ADN en activant le mécanisme de réparation approprié (ex : activation de NER en cas de présence d'adduits à l'ADN ou de dimer de thymine). Cependant les fourches bloquées représentent en soit des structures anormales qui doivent être résolues afin que la réplication puisse reprendre. Le mécanisme central permettant le remodelage et la reprise de la réplication est la recombinaison homologue (HR), et nous allons nous y intéresser dans ce qui suit.

**Figure 41. (A). (Page suivante). Les différentes issues à l'activation de la réponse aux dommages à l'ADN.** La voie du DDR (DNA Damage Response) est un réseau de transduction de signal impliquant des senseurs (ex : le complexe MRN), des transducteurs (ex : ATM et ATR qui activent les kinases de checkpoint CHK2 et CHK1) et des effecteurs (généralement les protéines cibles de CHK2/CHK1 telles que p53 et WEE1). Plusieurs issues sont possibles suites à l'activation du DDR : arrêt du cycle cellulaire, activation de l'apoptose, activation de la transcription de certains gènes impliqués dans ces processus et réparation effective de la lésion. (B). **Vue d'ensemble des principales lésions de l'ADN et de leurs voies de réparation.** Représentation schématique de I. Réparation de rupture simple brin par réparation directe et indirecte par excision de base (BER), II. Réparation de cassure double brin par recombinaison homologue (HR) et jonction d'extrémités non homologues (NHEJ), III. Réparation d'erreur de réplication par réparation de mésappariement et (MMR) IV. Réparation des adduits d'ADN par réparation par excision de nucléotide couplée à la transcription (TC-NER) ou par réparation par excision de nucléotide génomique globale (GG-NER). Les lignes pointillées représentent le rôle régulateur d'ATM et d'ATR sur la jonction d'extrémités non homologues canonique ou alternative (c-NHEJ, alt-NHEJ). Le carré en point tillés rouge présente les mécanismes de cassure double et simple brin sur lesquels nous nous concentrons. Adapté de (Perkhofer et al., 2021; Zhou & Elledge2, 2000).
A

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_53.png" /></figure>
## B. Réparation des cassures doubles brin, résolution des fourche bloquées et reprise de réplication

### 1. Réparation des cassures double brin

Les CDBs (issues de différentes origines, notamment lors du passage de la machinerie réplicative sur une cassure simple brin ou encore lors de l'incision endonucléolytique de fourches bloquées) sont d'abord reconnues et signalées par les PIKK ; ATM, ATR et DNA-PK. L'histone H2AX est un substrat de ces 3 kinases, toutefois ATM est considérée comme le médiateur majeur de la phosphorylation de H2AX en γH2AX, en réponse aux CDBs. Plusieurs complexes tels que la machinerie de remodelage de la chromatine, MRN (MRE11/RAD50/NBS1), 53BP1 et MDC1 (Mediator of DNA Damage Checkpoint protein 1) colocalisent et interagissent avec γH2AX (Podhorecka et al., 2010) (Fig. 41. B rectangle jaune). Deux principaux mécanismes coexistent pour la réparation des CDBs ; (1) la jonction des extrémités non-homologues canonique (NHEJc), qui n'est active que sur les extrémités d'ADN franches ou ne présentant que des saillies de tailles limitées (deux à trois nucléotides maximum), (2) la recombinaison homologue (HR) qui nécessite une résection de la coupure sur une section d'ADN simple brin de quelques centaines de bases. La NHEJ est considérée comme le mécanisme majoritairement actif, car son activation est cycle cellulaire-indépendante. En revanche, la HR n'est active qu'au cours des phases S et G2, du fait de sa dépendance de la présence de séquences homologues pour une recombinaison entre chromatides sœurs. Des processus alternatifs, d'urgence, peuvent se mettre en place pour la réparation des CDBs dépendants de la résection, tels que le SSA « single strand annealing » et la jonction alternative d'extrémités ; Alt-EJ, appelée aussi a-EJ, NHEJa ou MMEJ « microhomology mediated end-joining » (Fig. 42).

Durant les phases S ou G2, un choix entre NHEJ et HR, dicté par les activités antagonistes du complexe BRCA1-CtIP (favorisant la résection des cassures) et du complexe 53BP1-RIF1-Shieldin (protégeant les extrémités contre la résection) a lieu (Bunting et al., 2010). Le complexe Shieldin est constitué des protéines REV7, SHLD1, SHLD2, SHLD3 et se localise sur les sites de CDB d'une manière dépendante de 53BP1 et RIF1 (Noordermeer et al., 2018). La structure du complexe indique clairement un rôle protecteur visant à éviter la dégradation par les exonucléases et en particulier par le complexe MRN. La fixation compétitive de BRCA1-CtIP, probablement médiée par l'ubiquitination de l'histone H2A par l'hétérodimère BRCA1-BARD1 et le remodelage de la chromatine par SMARCAD1, déplace 53BP1-Shieldin et signe l'activation de la HR, dont nous détaillerons les mécanismes plus bas (Setiaputra & Durocher, 2019). Ainsi le choix de la voie de réparation dépend fortement de la longueur des extrémités sortantes (ou de la résection d'ADNsb) au niveau de la cassure.
<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>**Figure 42.** **Principales différences dans le choix de la voie de réparation des cassures double brins (CDBs).** Celui-ci est dicté par l'existence d'une cassure franche ou présentant une saillie simple brin. Les CDBs sont réparées par la jonction d'extrémités non-homologues (NHEJ), la recombinaison homologue (HR), la jonction alternative des extrémités (Alt-EJ ou a-EJ) ou Single Strand Annealing (SSA). Adapté de (Chang et al., 2017).</figcaption></figure>

Nous allons dans ce qui suit détailler les étapes de la signalisation de la recombinaison homologue, ainsi que son implication dans la résolution des fourche bloquées.

## 1.1. La réparation par Recombinaison Homologue (HR) ou voie BRCA

Comme mentionné précédemment, la HR est active en phase S et G2 du cycle cellulaire, lorsque les chromatides sœurs sont disponibles. Cela permet à la machinerie HR de restaurer la CDB en question, en prenant la chromatide sœur sur le chromosome homologue comme modèle, ce qui en fait une réparation conservatrice (Shrivastav et al., 2008).

Suite à la reconnaissance de CDB, les étapes de la HR peuvent se résumer comme ci-dessous (Fig. 43):

**I. Le déplacement de 53BP1-RIF1-Shieldin par BRCA1-CtIP** : BRCA1 est recrutée au site de la cassure via son interaction avec NBS1. BRCA1 forme un hétérodimère avec BARD1 qui ubiquitine l'endonucléase CtIP (Yu et al., 2006). CtIP et BRCA1 délogent le complexe 53BP1-RIF1-Shieldin au niveau de la cassure, libérant l'ADN pour permettre la résection (Escribano-Díaz et al., 2013; Isono et al., 2017). Puis, CtIP coopère avec MRE11 et initie la résection de la cassure (Sartori et al., 2007; Yu et al., 2006).

**II. La résection** : La résection des CDBs par MRN (MRE11-RAD50-NBS1) en collaboration avec les nucléases EXO1 et DNA2 génèrent une séquence d'ADN simple brin (ADNsb) en 3'. Cette séquence d'ADNsb est étendue sur quelques centaines de bases grâce à l'activité hélicase de BLM qui rend les brins d'ADN accessibles à EXO1 et DNA2 en déroulant l'ADN (Nimonkar et al., 2011). Le surplomb simple brin 3' est indispensable à l'étape de recombinaison décrite ci-après.
### III. Le chargement de RAD51 : L'ADNsb résultant est rapidement protégé par la fixation de la protéine de réplication A (RPA), puis le complexe PALB2-BRCA2 s'associent à BRCA1 sur le site de la cassure (Sy et al., 2009). RAD51 est alors activement recruté sur l'ADNsb par BRCA2 et déplace RPA (Thorslund et al., 2010; Xia et al., 2006). La formation d'un filament de l'ANDsb-RAD51 favorise la recherche d'homologie et l'invasion de la chromatide sœur en formant une boucle-D (une boucle de déplacement). La stabilité et l'élongation du filament de RAD51 sur l'ADNsb sont assurées par différents complexes comprenant des paralogues de RAD51. Les paralogues de RAD51 sont assemblés en deux complexes distincts : le premier, BCDX2 formé par RAD51B, RAD51C, RAD51D et XRCC2, tandis que le second, identifié comme CX3, comporte RAD51C et XRCC3. BCDX2 agit en amont du recrutement de RAD51, tandis que CX3 est supposé intervenir après la formation du filament RAD51 afin de le stabiliser (Orhan et al., 2021). Parmi les paralogues, RAD51C et RAD51D semblent jouer des rôles primordiaux dans le chargement de RAD51 (Garcin et al., 2019).

### IV. La synthèse d'ADN : Elle est amorcée par l'extrémité 3' envahissante en utilisant l'ADN homologue comme modèle. Les polymérides proposées à cette étape sont principalement la Pol δ, suivie par les polymérides haute-fidélité Pol ε et Pol ζ (McVey et al., 2016).

### V. La résolution de la boucle-D : L'invasion de brins et la synthèse d'ADN conduisent à la formation de différentes jonctions entre les 2 séquences homologues d'ADN. Après la synthèse d'ADN amorcée par le brin envahissant, la réparation peut se dérouler via deux sous-voies appelées réparation canonique des CDBs (DSBR) et *synthesis-dependent strand annealing* (SDSA). Pendant la DSBR, une double jonction Holliday est formée qui peut être résolue par des endonucléases ou par l'hélicase BLM. Dans la voie SDSA, la boucle D étendue est interrompue par une hélicase ADN, puis l'ADN nouvellement synthétisé est associé à l'ADNsb de l'autre côté du chromosome cassé. Il s'en suit une synthèse d'ADN qui comble les trous et une ligature d'ADN) (McVey et al., 2016).

<figure><img src="image_55.png" /></figure>
**Figure 43. (Page précédente). La voie d'activation et les étapes de la recombinaison homologue.** Le schéma détaille les étapes qui suivent la dislocation du complexe 53BP1-RIF1-Shieldin jusqu'à l'invasion des brins homologues et la formation de la boucle D. D'abord le complexe MRN effectue la résection de l'extrémité 3' de l'ADN et RPA est chargé sur les extrémités d'ADNsb afin de les protéger de la dégradation. A l'étape suivante, BRCA2 est recruté par BRCA1/PALB2 et charge RAD51 sur les extrémités d'ADNsb et déloge RPA. Ensuite, le filament homo-polymérique de RAD51 est formé autour de l'ADNsb. Finalement, le filament de RAD51 dirige l'invasion de la chromatide homologue et la recherche d'homologie avec l'ADNsb. Adapté de (Orhan et al., 2021).

## 1.2. Lien entre la voie BRCA et la voie ATR-CHK1

Les voies BRCA et ATR-CHK1 représentent l'archétype des crosstalks existant au sein de la signalisation DDR, l'une ne pouvant fonctionner proprement sans l'existence de l'autre. La détection de dommages à l'ADN/stress réplicatif induit l'axe ATR-CHK1 engendrant l'activation de nombreux effecteurs, notamment les acteurs clés de la HR. Il a été démontré qu'en réponse à un stress réplicatif induit par l'hydroxyurée, la phosphorylation de BRCA1 sur la serine 1423 était principalement médiée par ATR (Tibbetts et al., 2000). ATR est également responsable de la phosphorylation de PALB2 sur la serine 59, qui est un prérequis de l'interaction optimale entre BRCA1 et PALB2 et important pour l'interaction BRCA1-PALB2-BRCA2 et le recrutement de RAD51 (Buisson et al., 2017). Le recrutement de RAD51 au niveau du site de cassure, nécessite de nombreuses modifications post traductionnelles, notamment sa phosphorylation sur les thréonines 307 et 309 *via* CHK1 (pour revue voir (Orhan et al., 2021)). Si les conversations entre ces deux voies sont plus documentées dans le sens ATR-CHK1→BRCA1, de plus en plus d'études montrent des échanges retours. À titre d'exemple, il a été démontré qu'en situation de stress réplicatif, l'action de BRCA1 était nécessaire à la phosphorylation sur la serine 317 de CHK1, signalant ainsi la mise en place du checkpoint G2/M et intra S (Yarden et al., 2002, 2012).

## 2. Implication de la voie BRCA dans la gestion du stress réplicatif

L'implication de la voie ATR-CHK1 dans l'activation et la mise en place de la voie BRCA prend tout son sens compte tenu du rôle que joue la HR dans la protection, la résolution et la réparation des fourches bloquées issues d'un stress réplicatif. En effet, les cellules HR déficientes présentent une tendance accrue aux fourches ralenties, ainsi qu'aux défauts mitotiques, même en absence de stress (Daboussi et al., 2008; Wilhelm et al., 2014) Ceci souligne le rôle de la HR dans le soutien du processus de la réplication physiologique (Daboussi et al., 2008). En accord avec ça, il a été montré que les mutants HR déficients montrent une accumulation d'ADNsb aux fourches même en absence de stress exogène (Hashimoto, Ray Chaudhuri, et al., 2010).

On note donc que la HR ou ses principaux effecteurs est fortement sollicitée en cas de stress réplicatif. Ainsi, en cas de blocage des fourches la HR permet de recharger un nouveau réplisome et de redémarrer la réplication (chapitre V, **Fig. 44**) ((Hashimoto et al., 2012; Miyabe et al., 2015; Mizuno et al., 2009; Petermann et al., 2010).

### 2.1. Redémarrage des fourches de réplication cassées (Fig.44 a)

Le redémarrage des fourches cassées fait appel au mécanisme BIR (Hashimoto et al., 2012; Mayle et al., 2015; Moriel-Carretero & Aguilera, 2010; Sotiriou et al., 2016). Celui-ci est sollicité pour la réparation des CDBs dont une seule des extrémités partage une homologie avec le duplexe homologue comme c'est souvent le cas pour les fourches de réplication cassées ou encore les télomères endommagés. En plus d'une résection extensive par EXO1 et SGS1, le BIR partage des étapes similaires aux deux sous voies de la HR (DSBR et SDSA) décrites plus haut (**section B.2.3**) (Lydeard et al., 2010; Marrero & Symington, 2010). Dans ce mécanisme, la synthèse d'ADN fait appel aux mêmes facteurs
impliqués dans la synthèse des brins précoce et tardif (le brin envahissant et complémentaire dans le BIR, respectivement) : la primase Polα et Polδ pour l'extension initiale de la synthèse, et Polε pour continuer la synthèse après 30Kb (Lydeard et al., 2010).

Suite à la formation de la boucle-D, le BIR peut s'opérer de deux manières différentes ; (i) la résolution de la jonction par des nucléases ou (ii) la migration de la D-loop (bubble-like) telle une bulle de réplication. Dans le premier cas la synthèse de l'ADN se fait de façon semi-conservative suite à la conversion de la boucle-D en fourche de réplication, tandis que dans le second elle se fait de manière conservative et donc potentiellement mutagène (ex : les brins néo-synthétisés se retrouvent sur la même molécule d'ADN) sur plusieurs milliers de paires de bases, voire sur le chromosome entier (Donnianni & Symington, 2013b; Formosa & Alberts, 1986; Pardo & Aguilera, 2012; N. Saini et al., 2013). Plusieurs étapes de dissociations et d'invasion des différents duplexes sont toutefois possibles, ce qui souligne la nature instable de ses intermédiaires (C. E. Smith et al., 2007).

## 2.2. Le redémarrage des fourches non cassées (Fig. 44 b)

Le redémarrage des fourches de réplication bloquées, ayant subi une réversion ou une régression peut s'opérer *via* la HR et ce même en absence de CDB (Lambert et al., 2005; Mizuno et al., 2009; Petermann et al., 2010). Ceci implique une dégradation des brins néosynthétisés par MRE11 et EXO1, afin d'exposer l'ADNsb et permettre le recrutement des effecteurs de la RH (RPA, RAD51, RAD52 ...), l'invasion du brin homologue, la formation de la boucle-D et le recrutement d'un nouveau réplisome capable de redémarrer la réplication (Lambert & Carr, 2013a).

Il est à noter que ce mécanisme n'est pas sans conséquence sur l'intégrité du génome. En effet, les fourches redémarrées par la RH sont plus enclines aux glissements de la réplication au niveau de micro-homologies et à la réversion de l'orientation de la réplication, causant ainsi des mutations (insertions, délétions et formation d'isochromosomes) (Lambert & Carr, 2013b). De plus, au cours de ce processus, la machinerie de recombinaison, n'est pas à l'abri d'utiliser des séquences ectopiques ou encore des matrices différentes de l'originale, ce qui augmente la probabilité de réarrangements chromosomiques (Lambert et al., 2010).

## 2.3. Action post-réplicative (Fig. 44 c)

Comme évoqué dans le **chapitre V**, le repriming des fourches par la TLS, génère une brèche d'ADNsb derrière la fourche de réplication (Lopes et al., 2006). Au cours de ce processus la HR tient un double rôle, non seulement elle favorise le contournement des lésions générant ces brèches et facilite le réamorçage de la synthèse d'ADN en aval de la lésion (González-Prieto et al., 2013), mais elle est aussi responsable de la fermeture de ces brèches, en procédant à la synthèse du brin manquant en utilisant le brin de la chromatide sœur non endommagée (template switch) (González-Prieto et al., 2013; Lopes et al., 2006).

## 2.1. Protection des fourches de réplication bloquées (Fig. 44 d, e)

De plus en plus d'études montrent l'importance du rôle de RAD51 dans la protection et la stabilisation des fourches bloquées (Hashimoto, Chaudhuri, et al., 2010; Petermann et al., 2010; Schlacher et al., 2011, 2012). De plus, les rôles de RAD51 dans l'inversion, la protection des fourches et la HR semble nécessiter des quantités différentes de protéines RAD51. En effet alors que l'inversion des fourches implique la formation de nucléofilaments de petite taille, peu stables, ou « méta-filaments », la protection des fourches et la HR mobilisent un nombre plus important de molécules RAD51 (Fig. 44 e) (Bhat & Cortez, 2018). On notera que cette fonction est indépendante de BRCA2.
<figure><img src="image_56.png" /></figure>

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure 44.** Rôles de la recombinaison homologues au niveau des fourches de réplication. (a) Réparation d'une fourche cassée. (b) Redémarrage d'une fourche dysfonctionnelle. (c) Réparation post réplicative des brèches d'ADNsb. (d) Stabilisation et protection des fourches de réplication indépendamment des fonctions de redémarrage/réparation de fourche. (e) diffèrent nombre de molécules RAD51 pour ses différentes fonctions : petit, intermédiaire et grand pour la réversion des fourches, la protection des fourches bloquées et pour la HR respectivement. En termes de mécanismes, le substrat de la RH correspond à un ADNsb exposé à la fourche cassée ou non. Adaptée de (Lambert & Carr, 2013) et (Bhat & Cortez, 2018).</figcaption></figure>
### 3. Concept de BRCAness

L'existence de patientes atteintes de cancer du sein, dont les tumeurs répondaient particulièrement bien aux traitements génotoxiques en absence de mutations germinales BRCA1/BRCA2, a suscité en 2004 la proposition par l'équipe d'Ashworth du concept de BRCAness basées sur l'identification des caractéristiques des porteurs de mutations germinales BRCA1/BRCA2 dans les tumeurs sporadiques du sein et de l'ovaire (N. Turner et al., 2004). Ainsi, la BRCAness est définie comme une phénocopie des mutations BRCA1 ou BRCA2 ou un défaut HRR existant dans une tumeur en l'absence d'une mutation germinale affectant l'un ou l'autre de ces gènes, qui conférerait une sensibilité élevée aux agents génotoxiques (Lord & Ashworth, 2016).

Outre les cancers sporadiques du sein, de l'ovaire, ce critère pourrait aussi s'appliquer à d'autres types de cancer comme le cancer du pancréas ou quelques tumeurs du poumon. La BRCAness représenterait un talon d'Achille, qui pourrait être mis à profit thérapeutiquement, en se basant sur les mécanismes moléculaires sur lesquels elle repose.

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

**Figure 45. Implications des défauts de la HR dans le cancer.** Les défauts de réparation de l'ADN (par exemple, défaut de HR dû à un déficit en BRCA1/2) peuvent contribuer à l'instabilité génomique, qui favorise la transformation maligne des cellules. Ils conduisent également à une sensibilité aux agents endommageant l'ADN. La restauration de la réparation de l'ADN (par exemple, la restauration de la réparation de l'ADN par HR due à la restauration fonctionnelle de BRCA1/BRCA2) peut conduire à une résistance acquise aux agents endommageant l'ADN. Adapté de (Dhillon et al., 2011).

Ainsi, la BRCAness pourrait conférer une sensibilité accrue à un stress réplicatif chimiquement induit et pourrait donc engendrer une létalité synthétique pharmacologique dans les cancers du sein triple négatifs BRCA déficients. Cette idée constitue le fil conducteur de mon projet de thèse, dont le but était de déterminer les bases moléculaires, pouvant mener les CSTN BRCA déficients à une hypersensibilité à un poison de la réplication tel que la Gemcitabine.
# Projet de Recherche
# Exploration de la sensibilité au stress réplicatif dans les cancers du sein triple négatifs BRCA déficients

Ce travail s'intéresse au potentiel de sensibilité au stress réplicatif dans les cancers du sein triple négatifs (TNBC), déficients pour la voie BRCA.

Près de 15% des cancers du sein sont des TNBC, forme agressive et métastatique, pour laquelle il n'existe pas encore de thérapie ciblée validée. Près de 25% des TNBC présentent une déficience de la réparation des cassures par recombinaison homologue, aussi appelée HRD. Celle-ci est reliée à l'invalidation des gènes BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD51B, RAD51C ou RAD51D et est associée à une sensibilité accrue aux drogues génotoxiques telles que les sels de platine et les inhibiteurs de PARP (PARPi).

Cet état de sensibilité, également nommée BRCAness, se traduirait par la survenue d'un stress réplicatif aigu, dont la compréhension des mécanismes exacts et l'identification des éléments qui l'entourent constituerait une cible thérapeutique non négligeable.

En effet, il est aujourd'hui primordial d'explorer de nouvelles pistes permettant d'offrir aux patientes atteintes de cette grave maladie une opportunité thérapeutique plus prometteuse. Mis à part les patientes TNBC avec une mutation germinale de BRCA1 et pouvant donc bénéficier des PARPi comme traitement, celles portant des mutations somatiques sur ce gène sont encore aujourd'hui traitées avec de la chimiothérapie systémique, pour laquelle aucune alternative thérapeutique n'est proposée en cas de récidive.

Mon projet de thèse s'inscrit dans un registre translationnel, au cours duquel j'ai entrepris de caractériser les mécanismes moléculaires mis en place lors d'un stress réplicatif aiguë induit par la gemcitabine dans un contexte BRCA1 proficient (BRCA1-Prof) et BRCA1 déficient (BRCA1-def).

Mon modèle d'études consistait en des lignées cellulaires de cancer du sein triple négatif BRCA1 WT (SUM159) ainsi que leur contrepartie CRISPR-Cas9-BRCA1 KO, et des lignées d'ovaire pourvues d'une mutation delta-q-11 de BRCA1 (UWB1-289) et leur contrepartie dans laquelle BRCA1 a été re-exprimé de manière ectopique.

Dans un premier temps, nous avons montré que les lignées BRCA1-def étaient plus sensibles à la gemcitabine et subissaient plus de mort apoptotique. Cette observation est consolidée par le blocage des cellules BRCA1-def en phase G1 du cycle cellulaire ainsi qu'une forte accumulation de la fraction sub-G1. L'évaluation de la cinétique de réponse au stress réplicatif, à montrer une importante accumulation d'ADN simple brin dans les modèles BRCA1-def et leur entrée en catastrophe réplicative. En revanche, dans les modèles BRCA1-prof, la réponse au stress réplicatif semble résolue à la fin de cinétique.

Nous avons également pu observer qu'en plus du profil de marquage γH2AX classique (en foci) on observait également une fraction de cellule présentant un marquage γH2AX homogène couvrant tout le noyau ou pan-nucléaire. Notablement, la proportion de cellules avec un marquage γH2AX pan-nucléaire était significativement plus élevée dans les modèles BRCA1-def comparés aux BRCA1-prof.
La signification de ce type de marquage n'est pas claire et est débattue dans la littérature, mais nous avons pu l'associer à une étape tardive de la catastrophe réplicative compte tenu de la forte accumulation d'ADN simple brin dans les cellules présentant ce marquage.

De façon originale, nos résultats montrent l'implication de l'exonucléase MRE11 dans l'accumulation des AND simples brins. Ceci se distingue des données de la littérature qui privilégient la formation de "ssDNA gaps" ou brèches d'ADN simple brin, due à une suractivation de PRIMPOL.

De plus, j'ai démontré que les cellules BRCA1-def tendaient à glisser en mitose, et faire des catastrophes mitotiques, dont la plupart découlent des cellules ayant passé par la catastrophe réplicative au cours de la phase S, et produisent des micronoyaux chargés en ADN simple brin.

Les cellules BRCA1-def traitées à la gemcitabine cumulent donc la catastrophe réplicative et la catastrophe mitotique.

Enfin, j'ai démontré que le marquage γH2AX pan-nucléaire caractérisait les cellules en catastrophe réplicative et pourrai être un marqueur de réponse à la gemcitabine *in vivo*.

Ce travail dont les résultats sont aboutis est en cours de rédaction pour être soumis dans un journal scientifique. Cependant, prise par le temps, je présente dans ce manuscrit de thèse une version "draft" rédigée en français.

Enfin, au cours de ma thèse, j'ai eu l'opportunité de participer un projet parallèle ayant pour trait la résistance aux PARPi, dans lequel j'ai contribué à la réalisation de certaines expérimentations *in vivo*, et assister mon amie Carolina Velázquez au cours de ses premiers pas en expériences d'immunofluorescence, de FACS et de western blot. Ce travail, a fait l'objet d'une publication intitulée : « BRCA1-methylated triple negative breast cancers previously exposed to neoadjuvant chemotherapy form RAD51 foci and respond poorly to olaparib » parue dans le journal *Frontiers in Oncology* en 2023, et qui est joint à cette présente thèse.
Résultats &
Discussion
Introduction

Le cancer du sein triple négatif (TNBC en anglais) est le sous-type de cancer du sein le plus agressif (Carey et al., 2010 ; Dent et al., 2007; Yin et al., 2009), en lien avec des récidives plus précoces et un potentiel métastatique élevé (Carey et al., 2010; Dignam et al., 2009; Rouzier et al., 2005). Du fait d'options limitées en termes de thérapies ciblées, le traitement de base des TNBC reste à ce jour principalement basé sur la chimiothérapie (Bianchini et al., 2016; Denkert et al., 2017). Les TNBCs représentent environ 15% des cancers du sein et ont pour caractéristique de compter la proportion la plus élevée de tumeurs du sein avec une déficience de la voie BRCA (Foulkes et al., 2003; Lakhani et al., n.d.; Stephens et al., 2012). La voie BRCA tient son nom des gènes BRCA1 et BRCA2, qui sont des déterminants génétiques majeurs de la prédisposition au cancer du sein ou de l'ovaire, mais aussi des acteurs clés de la voie de réparation de l'ADN par recombinaison homologue (HR) (Guttmacher et al., 2003 ; Jbhannsson et al., 1997 ; Lord & Ashworth, 2016 ; Venkitaraman, 2002). Les tumeurs présentant une déficience de la voie BRCA sont donc caractérisées par un défaut de la réparation de l'ADN par HR et une instabilité génétique élevée (Helleday et al., 2014 ; Roy et al., 2012). A l'origine, la déficience de la HR (HRD) a été associée à la détection de mutations constitutionnelles ou somatiques affectant les gènes BRCA1 et BRCA2. Depuis quelques années la définition de la HRD été étendue aux mutations inactivatrices touchant d'autres gènes de la voie BRCA tels que PABLB2, RAD51B, RAD51C ou RAD51D, ainsi qu'à l'inactivation épigénétique (hyperméthylation du promoteur) de BRCA1, PALB2 et RAD51B(Couch et al., 2015 ; Stephens et al., 2012). Ainsi la fraction de TNBCs présentant une HRD est actuellement estimée à près de 30%, mais remarquablement dans la majorité des cas la déficience est liée à une mutation ou une hyperméthylation affectant BRCA1 (Glodzik et al., 2020 ; Jacot et al., 2020).

Outre l'instabilité génétique, le défaut de fonctionnement de la HR confère aux tumeurs porteuses de
ce phénotype une sensibilité accrue aux sels de platine et aux inhibiteurs de PARP (PARPi) (Denkert et
al., 2017; Farmer et al., 2005; Robson et al., 2017; Turner et al., 2005; Tutt et al., 2010). La sensibilité
exceptionnelle des tumeurs HRD aux PARPi a été reliée au rôle central des enzymes PARP1 et PARP2
dans la signalisation des dommages à l'ADN et le recrutement des acteurs de la réparation (Ray
Chaudhuri & Nussenzweig, 2017; Yélamos et al., 2008). L'inactivation de PARP1/2 dans un contexte de
déficience BRCA a donc été proposée comme induisant une relation synthétique létale (Bryant et al.,
2005; Fong et al., 2009). Concernant les sels de platine, les adduits inter et intra-brins qu'ils produisent,
s'ils ne sont pas éliminés par la réparation NER, sont susceptibles de provoquer des cassures double
brin de l'ADN, lésions toxiques dont la réparation est mal assurée dans un contexte HRD, expliquant la
sensibilité de ces tumeurs.
Toutefois, des données récentes indiquent que la fonction de la HR ne se limite pas à la réparation des cassures double brin à l'ADN, mais que certains de ses acteurs clés tels que RAD51, BRCA2 ou BRCA1 interviennent dans la protection et la réparation des fourches de réplication bloquées (Hashimoto et al., 2010; Kolinjivadi et al., 2017; Schlacher et al., 2011, 2012; Ying et al., 2012). De plus, l'implication de la voie BRCA est renforcée par les études montrant que les cellules HRD manifestaient un ralentissement global des fourches de réplication, ainsi que par les multiples interactions fonctionnelles entre ATR, messager essentiel de la réponse aux défauts de la réplication, et BRCA1 ou PALB2 (Buisson et al., 2017; Saldivar et al., 2017; Sørensen et al., 2005; Tibbetts et al., 2000).

Le blocage de la progression des fourches de réplication, résumé sous le terme stress réplicatif, peut résulter de multiples causes, exogènes ou endogènes, et selon son extension ou sa complexité avoir des conséquences importantes sur la stabilité du génome, ainsi que sur la viabilité cellulaire (Zeman & Cimprich, 2014). Il a été montré qu'une activation oncogénique aberrante induisait un stress réplicatif (Halazonetis et al., n.d.; Hills & Diffley, 2014; Macheret & Halazonetis, 2015). On peut anticiper que les conséquences sur l'intégrité du génome d'un stress réplicatif oncogénique pourraient être plus sévères dans un contexte de HRD, ce qui expliquerait les profils génomiques fortement remaniés de ces tumeurs (Hills & Diffley, 2014; Kotsantis et al., 2018).

Sur la base de l'implication de la voie BRCA dans la protection et/ou la réparation des fourches de réplication bloquées, nous avons fait l'hypothèse que les tumeurs HRD pourraient être hautement sensibles à un traitement provoquant un stress réplicatif aigu. Nous nous sommes plus spécifiquement intéressés à une HRD liée à une perte ou atténuation de la fonction de BRCA1 en raison de l'importance du rôle de BRCA1 dans la réponse au stress réplicatif et de la prévalence des inactivations génétiques ou épigénétiques de BRCA1 dans les TNBC. Dans la présente étude nous nous sommes intéressés à la réponse à un stress réplicatif aigu induit par la gemcitabine dans des modèles cellulaires BRCA1-déficients en comparaison avec leur homologues BRCA1-proficients. Le choix de la gemcitabine est justifié parce que la molécule agit exclusivement comme un poison de la réplication. Nos résultats confirment que les cellules BRCA1-déficientes sont plus sensibles à la gemcitabine et la proportion de cellules entrant en catastrophe réplicative est plus élevée que dans les cellules BRCA1-proficientes. Remarquablement, la fraction de cellules en catastrophe réplicative reste élevée jusqu'à 72h après lavage de la drogue dans les cellules BRCA1-déficientes. Ces cellules se caractérisent par une accumulation d'ADN simple brin dans leurs noyaux, associée à un marquage γH2AX pan-nucléaire intense et une absence de foyers RPA. Ceci suggère un défaut de protection des séquences d'ADN simple brin dans ces cellules, qui est confirmée par l'absence de foyers RAD51 dans nos modèles BRCA1-déficients. Dans les cellules BRCA1-proficientes le nombre de cellules en catastrophe réplicative baisse rapidement pour disparaitre à 48h. La grande majorité des cellules présentent des foyers γH2AX,
ainsi que des foyers RPA et des foyers RAD51. Cette forte accumulation d'ADN simple brin non protégé dans les cellules BRCA1-déficientes traitées à la gemcitabine se traduit par une fragmentation élevée de l'ADN. De façon intéressante, la quantité d'ADN simple brin accumulée dans les cellules BRCA1-déficientes sous gemcitabine est significativement réduite par l'addition d'un inhibiteur de MRE11 (Mirin). Ceci indique que la catastrophe réplicative observée dans les cellules BRCA1-déficientes résulte d'une résection incontrôlée de l'ADN naissant par MRE11 en absence de BRCA1 et RAD51. De plus, nous avons démontré que les cellules BRCA1-déficientes glissaient en mitose après traitement à la gemcitabine produisant des micro-noyaux chargés en ADN simple brin et présentant un marquage γH2AX intense et homogène. Le glissement en mitose de cellules en catastrophe réplicative suggère donc une déficience du point de contrôle G2/M dans les cellules BRCA1-deficientes. A noter que nous avons observé un phénotype équivalent dans les cellules BRCA1-proficientes en utilisant un traitement combinant gemcitabine et un inhibiteur de CHK1.

# Résultats

## Les modèles cellulaires BRCA1-déficients montrent une sensibilité accrue à la gemcitabine

Afin de vérifier si une déficience reliée au gène *BRCA1* (mutation ou hyperméthylation de son promoteur) était associée à une sensibilité accrue au stress réplicatif, nous avons mesuré, dans 4 modèles cellulaires de TNBC plus un modèle cellulaire de cancer de l'ovaire, les IC50 à la gemcitabine, qui est un poison de la réplication communément utilisé en clinique. Les lignées cellulaires se répartissent en deux modèles BRCA1-proficients (SUM-159, BT-549) et 3 modèles déficients (MDA-MB-436, HCC38 et OVCAR8). On notera que si MDA-MB-436 est *BRCA1*-nulle (mutation 5396+1G) (Elstrodt et al., 2006), les lignées HCC38 et OVCAR8 présentent une hyperméthylation du promoteur *BRCA1*, qui se traduit par une réduction sensible de son niveau d'expression dans les HCC38 et son extinction dans les OVCAR8 (**Sup Fig 1A**). Remarquablement, les IC50 des lignées MDA-MB-436 (*BRCA1*-nulle) et OVCAR8 (*BRCA1*-méthylée) sont entre 3 à 10 fois inférieurs à ceux mesurés pour les modèles BRCA1-WT SUM-159 et BT-549. Par contre, HCC38, dont l'expression protéique de BRCA1 est juste réduite du fait d'une méthylation hémizygote de *BRCA1*, présente un IC50 équivalent à celui des modèles BRCA1-WT (**Sup Fig 1A, B**). Globalement ces résultats suggéraient qu'une déficience *BRCA1* pouvait induire une sensibilité accrue à la gemcitabine, ce que nous avons voulu vérifier en construisant des modèles isogéniques *BRCA1*-WT vs. *BRCA1*-KO. A cet effet, nous avons isolé un clone SUM-159 *BRCA1*-KO en utilisant la technologie CRISPR. Du fait d'une série de délétions (indels) dans l'exon 11 décalant le cadre de lecture, le clone SUM-159 *BRCA1*-KO que nous avons retenu comme modèle n'exprime plus *BRCA1* (**Fig 1A**). De plus, le clone SUM-159 *BRCA1*-KO est beaucoup plus
sensible à la gemcitabine que son homologue SUM-159 BRCA1-WT et, outre une réduction de l'IC50 (Fig 1B), il présente une mortalité cellulaire 5 fois plus élevée que les BRCA1-WT au même temps de traitement (Fig 1C). Cette différence de mortalité est aussi observable dans d'autres modèles BRCA1-déficients que nous avons testés comme l'indique la proportion de Sub-G1 qui est plus importante dans ces dernières (Sup Fig 1C, D, E, F). Enfin, il est à noter que si les SUM-159 BRCA1-WT reprennent globalement le cycle cellulaire 48h après traitement, les SUM-159 BRCA1-KO restent bloqué en S et en G2/M (Fig 1D, E).

Les modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine subissent une catastrophe réplicative persistante en comparaison à leurs homologues BRCA1-proficients

Nous avons cherché à savoir si la forte sensibilité des modèles BRCA1-déficients à la gemcitabine était associée à une augmentation significative du nombre de cellules en catastrophe réplicative. La catastrophe réplicative a été proposée comme un état où les cellules accumulent une quantité d'ADN simple brin trop élevée pour que les mécanismes de protection puissent faire face, du fait d'une titration de la protéine RPA disponible par l'ADN simple brin, dont une fraction importante reste sans protection (L. Toledo et al., 2017 ; L. I. Toledo et al., 2013). Ceci peut être révélé dans une analyse FACS grâce à un co-marquage avec des anticorps spécifiques contre γH2AX et RPA. En situation de stress réplicatif contrôlé les marquages γH2AX et RPA s'équilibrent, γH2AX révélant les lésions à l'ADN, RPA les protéines mobilisées sur l'ADN simple brin. Toutefois, un marquage RPA sensiblement inférieur à celui de γH2AX dénote un stress aigu et si cette situation perdure aboutit à une catastrophe réplicative (L. Toledo et al., 2017 ; L. I. Toledo et al., 2013). Nous avons exposé les cellules SUM-159 BRCA1-WT et SUM-159 BRCA1-KO à 100nM de gemcitabine pendant 24h et prélevé des échantillons cellulaires 2h, 8h, 24h et 48h après avoir lavé la drogue. Les différents échantillons ont été co-marqués avec des anticorps dirigés contre γH2AX et RPA, puis analysés par FACS. Les résultats révèlent un déséquilibre du rapport γH2AX/RPA à 2h et 8h dans les SUM-159 BRCA1-WT suivi d'un retour à l'équilibre à 24h et 48h et d'une réduction progressive du niveau de marquage γH2AX et RPA (Fig 2A). Par contraste les SUM-159 BRCA1-KO montrent une fraction de cellules marquées pour γH2AX nettement supérieure à celle marquées RPA et cette situation persiste entre 2h et 48h (Fig 2B). Ceci suggère fortement que les SUM-159 BRCA1-KO exposées à la gemcitabine subissent une catastrophe réplicative. Nous avons procédé à des marquages immunofluorescence et quantifié les cellules γH2AX-positives et RPA-positives aux mêmes temps de cinétique après traitement. Ces résultats confirment les observations FACS et montrent un important déséquilibre du rapport γH2AX/RPA avec une réduction progressive des cellules RPA-positives entre 24 et 48h dans les SUM-159 BRCA1-KO en comparaison avec les SUM-
159 BRCA1-WT (Fig 2C, D, E, F). Nous avons analysé d'autres couples de cellules BRCA1-proficientes vs. BRCA1-déficientes et observé une tendance confirmée des modèles BRCA1-déficients à accumuler des cellules en catastrophe réplicative γH2AX +/RPA- (Fig 2 G, H, I, J; Sup Fig 2). Ces résultats montrent donc qu'une fraction importante des cellules de TNBC BRCA1-déficientes subissent une catastrophe réplicative après traitement à la gemcitabine.

## Les cellules en catastrophe réplicative accumulent de grandes quantités d'ADN simple brin et présentent un marquage γH2AX pan-nucléaire intense

Une analyse quantitative des données d'immunofluorescence révèle qu'une partie non-négligeable des cellules γH2AX positives présentent un marquage pan-nucléaire homogène plutôt que sous forme de foyers (Fig 3A, B, C). Remarquablement, la proportion de cellules γH2AX pan-nucléaires était en cohérence avec la fraction de cellules suspectées de subir une catastrophe réplicative. Ce profil est plus fréquent dans les SUM-159 BRCA1-KO que dans les SUM-159 BRCA1WT représentant respectivement 50% des cellules γH2AX positives à 48h dans les BRCA1-KO, contre 25% dans les BRCA1WT (Fig 2A-D, Fig 3A-C, Sup Fig 3A, C). De plus, environ 40% des cellules SUM-159 BRCA1-KO avec un marquage γH2AX pan-nucléaire ne présentent aucun signal RPA à +48h, contre seulement 17% des SUM-159 BRCA1WT présentant ce profil (Fig 3D-F, Sup Fig 3B, D). Enfin, il est à noter, qu'outre l'absence de signal RPA, les cellules γH2AX pan-nucléaires montrent une forte accumulation d'ADN simple brin révélée par un marquage BrdU intense en condition non dénaturante (Fig 3 G-J). L'ensemble de ces résultats indiquent donc qu'un signal γH2AX pan-nucléaire apparaît comme un marqueur fiable de cellules en catastrophe réplicative dans nos modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine.

## La formation de foyers RAD51 est fortement réduite dans les modèles BRCA1-déficients et absente dans les cellules en catastrophe réplicative.

RAD51 est recruté sur les sites de cassures double brin par BRCA2 et agit comme un effecteur essentiel de la HR (Orhan et al., 2021). RAD51 est aussi impliqué dans la protection des fourches de réplication bloquées, dont il favorise la réversion et si les conditions le permettent la réparation (Mijic et al., 2017; Zellweger et al., 2015). Nous avons donc procédé à une mesure cinétique (2h, 8h, 24h, 48h après lavage de la drogue) par immunofluorescence de la formation des foyers BRCA1, BRCA2, RAD51 et 53BP1 dans nos modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine, en comparaison avec les modèles BRCA1-proficients dans les mêmes conditions. De façon attendue, les foyers BRCA1, BRCA2 et RAD51 sont fortement réduits à tous les points de la cinétique dans les SUM-159 BRCA1-KO par rapport aux SUM-159 BRCA1WT (Sup Fig 4 A-D). Des résultats très similaires sont notables dans les UWB1.289 PT
(*BRCA1*-mut) comparée avec les UWB1.289+*BRCA1* (**Sup Fig 4 E-F**). A l'inverse on observe une forte augmentation des foyers 53BP1 dans les modèles *BRCA1*-déficients (**Sup Fig 4C, D, F**).

Nous avons donc vérifié les profils de marquage RAD51 des cellules γH2AX pan-nucléaires après exposition à la gemcitabine et il est notable que la majorité d'entre elles ne présentent pas de foyers RAD51. De plus, les cellules γH2AX+/RAD51- sont, à l'instar des cellules γH2AX+/RPA-, prévalentes dans les SUM-159 *BRCA1*-KO par rapport aux SUM-159 BRCA1WT (**Fig 4A, B**). Par contre, les cellules γH2AX pan-nucléaires chez les SUM-159 *BRCA1*-KO montrent de forts marquages pour les foyers 53BP1 et FANCD2 (**Fig 4C-F**). Il ressort donc de ces observations que les cellules en catastrophe réplicative présentant un marquage γH2AX pan-nucléaires sont négatives pour RPA et RAD51 et fortement positives pour 53BP1 et FANCD2.

## L'inhibition de MRE11 réduit fortement l'accumulation d'ADN simple brin et de cellules γH2AX pan-nucléaires dans les SUM-159-BRCA1-KO

La forte augmentation de cellules en catastrophe réplicative, caractérisées par une accumulation d'ADN simple brin non protégé, dans nos modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine pouvait être en lien avec une résection non contrôlée des fourches de réplication bloquées, par la nucléase MRE11. En effet, la résection par MRE11 joue un rôle essentiel dans le redémarrage des fourches bloquées et les cellules BRCA1-déficientes traitées à la gemcitabine présentent un contexte favorable à une activité non contrôlée de MRE11 (absence de RPA et/ou de RAD51, faible recrutement de BRCA1 et BRCA2) (Hashimoto et al., 2010 ; Schlacher et al., 2011; Ying et al., 2012). Pour tester cette hypothèse nous avons exposé nos modèles cellulaires à 100nM de gemcitabine +/- 50nM de Mirin, un inhibiteur spécifique de MRE11. Notablement, l'inhibition de MRE11 dans les SUM-159 BRCA1WT a très peu d'effet sur le nombre de cellules BrdU+ et γH2AX pan-nucléaires (**Figure 5A-D**). Par contre dans les SUM-159 BRCA1-KO l'addition de Mirin induit une réduction significative du nombre de cellules BrdU+ et des cellules γH2AX-foci+ et une quasi-disparition des cellules γH2AX pan-nucléaires (**Figure 5E-H**). Ces résultats suggèrent donc fortement que l'accumulation d'ADN simple brin observée dans les cellules BRCA1-déficientes traitées à la gemcitabine résulte, au moins en partie, d'une résection incontrôlée des fourches de réplication bloquées par MRE11 et que cette sur-résection pourrait être une étape clé dans la génération de la catastrophe réplicative.

## Les modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine accumulent de l'ADN simple brin et glissent en mitose

La présence reproductible de micro-noyaux dans les cultures cellulaires des modèles BRCA1-déficientes après traitement à la gemcitabine suggérait qu'une fraction d'entre elles produisaient des catastrophes mitotiques, ce qui était en cohérence avec leur tendance à s'accumuler en G2/M (**Fig 1E**).
Afin d'objectiver un glissement en mitose, nous avons synchronisé les cellules en les bloquant en G1 avec un pulse de palbociclib (CDK4/6 inhibiteur) de 24h. Après lavage du palbociclib, 80 à 90% des cellules progressent en phase dans le cycle et atteignent le début de la phase S après 8h, temps auquel nous avons ajouté 1µM de gemcitabine pour 3h (Sup Fig 5A). Après lavage de la gemcitabine nous avons suivi la progression dans le cycle des cellules et noté que les SUM-159 BRCA1-KO s'accumulaient en phase M 72h et 96 h après la fin du traitement, alors que les SUM-159 BRCA1WT semblaient revenir à un cycle normal dans les mêmes conditions (Fig 6A, B). L'accumulation des SUM-159 BRCA1-KO en phase M 48 à 72h après lavage de la gemcitabine suggérait un glissement en mitose et était remarquablement similaire au profil de cycle cellulaire observé dans les SUM-159 BRCA1WT et les SUM-159 BRCA1-KO traitées avec une combinaison de 25nM de gemcitabine + 50nM d'inhibiteur de CHK1 (PF-0477736) (Fig 6C, D). Le glissement en mitose des cellules exposées au PF-0477736 s'explique par l'inhibition du point de contrôle en G2 et la perte du blocage de la progression dans le cycle normalement activé par la kinase CHK1 (Neizer-Ashun & Bhattacharya, 2021 ; Yarden et al., 2002, 2012). Ces résultats suggèrent donc un défaut du point de contrôle G2 dans nos modèles BRCA1-déficients. Outre le glissement en mitose des cellules exposées à la gemcitabine, nous avons quantifié les différentes formes de catastrophes mitotiques tels que les divisions multipolaires, les ponts anaphases et les micronoyaux (Fig 6, F, G, H). Il ressort que les mitoses catastrophiques sont 3 fois plus fréquentes dans les SUM-159 BRCA1-KO que dans les SUM-159 BRCA1WT, représentant respectivement 70% contre 20% des mitoses (Fig 6G). De plus, nous avons noté que, dans les SUM-159 BRCA1-KO, 30% des micro-noyaux montraient un double marquage γH2AX pan-nucléaire et BrdU suggérant qu'ils provenaient de cellules en catastrophe réplicative qui étaient passées en mitose (Fig 6I). Comme l'inhibition de MRE11 réduit significativement la fraction de cellules en catastrophe réplicative dans les SUM-159 BRCA1-KO, nous avons vérifié l'impact de la Mirin sur le nombre de micronoyaux (Fig 5J, K). Si l'addition de Mirin a peu d'effet dans les SUM-159 BRCA1WT, elle induit une réduction spectaculaire de 50% des micro-noyaux dans les SUM-159 BRCA1-KO, renforçant l'hypothèse que les micro-noyaux pourraient provenir, au moins en partie, de cellules en catastrophe réplicative (Fig 6I, J, K). Une fraction des micro-noyaux pouvant aussi provenir d'une fragmentation nucléaire apoptotique, nous avons vérifié si l'inhibiteur d'apoptose Z-vad-FMK avait un effet. De façon intéressante, l'ajout du Z-vad induit une réduction beaucoup plus nette (3 à 4 fois) des micro-noyaux dans les SUM159 BRCA1WT, que dans les SUM159 BRCA1-KO (1,5 fois), indiquant qu'ils ne sont pas majoritairement d'origine apoptotique dans les modèles BRCA1-KO (Fig 6L, M). Ces résultats nous ont incité à vérifier l'impact de l'apoptose sur le niveau de fragmentation de l'ADN dans nos modèles après traitement à la gemcitabine. La mesure par électrophorèse à champ pulsé de la fraction d'ADN fragmenté montre un taux de fragmentation deux fois plus élevé dans les BRCA1-KO que les BRCA1WT. Par contre, il est notable que l'ajout de Zvad n'induit pas de réduction du taux de fragmentation de
l'ADN dans les *BRCA1WT* et *BRCA1-KO* (**Fig 6N**). Nos résultats indiquent que les cellules *BRCA1-KO* après traitement à la gemcitabine accumulent de l'ADN simple brin fragmenté et une partie de ces cellules glisse en mitose et forme des micro-noyaux. Ces micro-noyaux chargé en ADN simple brin étaient donc susceptibles d'activer la réponse interféron induite par la présence d'ADN cytoplasmique, ce que nous avons pu confirmer en déterminant qu'ils présentaient un immuno-marquage cGAS+ (**Sup Fig 6**).

**L'intensité du marquage γH2AX est accru dans les modèles PDX qui répondent à la gemcitabine comparés aux modèles non-répondeurs.**

Nos résultats sur modèles cellulaires montrant que le marquage γH2AX pan-nucléaire était un indicateur fiable de la catastrophe réplicative, nous avons voulu vérifier si le niveau de marquage γH2AX pouvait être en lien avec la réponse dans des modèles PDX de TNBC traitées à gemcitabine. Nous avons sélectionné trois modèles PDX 15b0018, b3804, b4122 dont nous avons établi la réponse à la gemcitabine (**Fig 7**). Chaque PDX a été greffée en sous-cutané sur 2 x 8 souris (bras test et bras contrôle) et la gemcitabine administrée par injection intra-péritonéale à 50mg/kg, 2 fois/semaine pendant 4 semaines. Le marquage γH2AX a été déterminé par immunofluorescence sur des coupes de tumeurs fixées en PFA prélevées juste après la dernière injection de gemcitabine, ou du véhicule.

Notablement, chaque modèle montre un niveau de réponse au traitement différent, réponse complète pour la PDX b4122, stabilisation avec reprise de la croissance en fin de traitement pour b3804 et progression pour la 15b0018 (**Fig 7B**). Par contre, le marquage γH2AX suit une tendance inverse, faible dans la 15b0018, intermédiaire dans la b3804 et le plus élevée dans la b4122 (**Fig 7C, D**), suggérant que l'intensité du marquage γH2AX pourrait fournir une information sur la sensibilité à la gemcitabine d'une tumeur, et ce même à l'état basal sans traitement (**Fig 7**).

Discussion

Les données présentées dans ce travail montrent que les cellules de TNBC présentant une déficience de *BRCA1* sont plus sensibles à la gemcitabine subissent une catastrophe réplicative et meurent massivement. La catastrophe réplicative résulte de l'accumulation de hauts niveaux d'ADN simple brin en conjonction avec une un épuisement du pool RPA (L. I. Toledo et al., 2013). Il en résulte un défaut de protection de ces séquences d'ADN simples brins et leur fragmentation. De façon originale, nos données démontrent que l'accumulation d'ADN simple brin était la conséquence d'une activité incontrôlée de MRE11. MRE11 est une exonucléase 3'-5' essentielle à la réparation des cassures doubles brins par recombinaison homologue, qui assure la résection des sites de cassures et dont l'activité est strictement régulée par BRCA1 et RAD51(Chapman et al., 2012; Shibata et al., 2014; Shrivastav et al., 2008). En situation de stress réplicatif, la fonction de MRE11 semble restreinte à la résection des brins naissants associés aux fourches inversées, qui sont des structures dites en "pied de
poule" faisant pauser la réplication (Bhat & Cortez, 2018; F. B. Couch & Cortez, 2014; Quinet et al., 2017). L'inversion des fourches est catalysée par l'action conjointe de SMARCAL1, ZRANB3 et HTLF et l'activité MRE11 dépend de l'inversion des fourches (Quinet et al., 2017). Remarquablement, nos résultats impliquant MRE11 dans l'accumulation d'ADN simple brin dans les cellules BRCA1-déficientes se distinguent des travaux du groupe de Sharon Cantor. Ces auteurs montraient que la sensibilité des modèles BRCA-déficients au PARPi olaparib était la conséquence d'une accumulation de "single stranded DNA gaps (ss-gaps)" ou brèches ADN simple brin résultant d'un défaut d'arrêt de la réplication et excluaient l'implication d'une sur-résection par MRE11 (Cong et al., 2021; Panzarino et al., 2021). La formation accrue de ss-gaps a aussi été observée dans des modèles BRCA-déficients suite à un traitement au cisplatine, et on notera que d'autres auteurs ont lié la production de ces gaps à l'activité PRIMPOL(Quinet et al., 2020b, 2021 ; Tirman et al., 2021). Celle-ci permet de réamorcer la synthèse d'ADN en aval d'une fourche bloquée et laisse une brèche qui est normalement comblée par des polymérides translésionnelles (Mourón et al., 2013). Certains auteurs proposent que l'amorçage PRIMPOL serait un mécanisme exclusif de l'inversion de fourche et, en fait, la réprimerait (Quinet et al., 2021). PRIMPOL serait donc un mécanisme préférentiellement mis en œuvre pour le contournement des lésions à l'ADN, dont la forte implication après traitement au cisplatine apparaît logique. L'amorçage PRIMPOL a aussi été proposé comme mécanisme majoritaire avec les PARPi, dont on a montré qu'ils réduisaient la réversion des fourches (Quinet et al., 2020a). L'accumulation d'ADN simple brin résultant de l'activité non régulée de MRE11 suggère fortement que le mécanisme dominant serait au contraire l'inversion de fourches et non l'amorçage PRIMPOL dans nos modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine. Les explications pourraient être liées à (i) la déficience BRCA1 de notre modèle, (ii) l'impact sur la réplication de la gemcitabine.

Nous avons effectivement choisi d'étudier l'impact du stress réplicatif sur des modèles BRCA1
déficients, car ils représentent de 15 à 20% des TNBC, alors que les mutations BRCA2 y sont
minoritaires (Foulkes et al., 2003; Lakhani et al., n.d.; Stephens et al., 2012). La régulation négative de
PRIMPOL par BRCA2 suggérerait une possible différence entre les modèles BRCA2-déficients et BRCA1-
déficients concernant l'activation préférentielle de PRIMPOL ou de l'inversion de fourche. De plus, il a
été démontré qu'une mutation dans le domaine C-terminale de liaison à l'ADN double simple de BRCA2
était spécifiquement associée à une augmentation des ssDNA-gaps suite au traitement avec PARPi ou
le cisplatine et soulignait une sensibilité accrue à ces molécules (Vugic et al., 2023). Ceci suggère que
dans un contexte BRCA2-déficient, PRIMPOL n'étant plus régulé, le réamorçage pourrait devenir un
mécanisme dominant. Dans un contexte BRCA1-déficient par contre, on pourrait supposer que BRCA2,
dont nous avons noté un recrutement réduit mais pas absent dans notre modèle BRCA1 déficient, la
répression de PRIMPOL pourrait persister. De plus, la réversion des fourches, catalysée par SMARCAL1,
ZRANB3, HTLF et aussi RAD51, est considérée comme indépendante de BRCA1 et BRCA2 (Petermann
et al., 2010; Zellweger et al., 2015). L'ensemble de ces données suggèrent donc que la déficience
BRCA1 pourrait constituer un contexte plus favorable à l'inversion de fourche. Cette hypothèse
pourrait être tempérée par les observations de (Cong et al., 2021) montrant un nombre de ss-DNA
gaps proportionnel à la concentration d'olaparib appliquée dans un modèle murin BRCA1-déficient.
Mais on soulignera qu'il a été proposé que les PARPi inhibaient l'inversion des fourches (Berti et al.,
2013; Ray Chaudhuri et al., 2012; Tirman et al., 2021). Ceci relance l'hypothèse d'une possible
spécificité d'action de la gemcitabine, qui partage avec l'hydroxurée (HU) l'inhibition de la biosynthèse
des pyrimidines. Or, il a été montré que la HU pouvait induire des ss-gaps dans un contexte BRCA2-
déficient (Vugic et al., 2023) Toutefois, la gemcitabine peut s'incorporer dans l'ADN, bloquer
l'élongation des chaines et, par là-même, la progression du réplisome (Cerqueira et al., 2007). Il est donc possible que dans un contexte où PRIMPOL reste régulée, la gemcitabine induise préférentiellement l'inversion de fourche et produise un contexte favorable à la sur-résection par MRE11. On notera qu'à notre connaissance notre étude est la première à s'intéresser à l'impact de la gemcitabine sur la réplication dans un contexte BRCA-déficient.

De Plus, nos résultats indiquent que les cellules BRCA1-déficientes traitées à la gemcitabine présentent une tendance accrue à glisser en mitose et à produire des catastrophes mitotiques et, plus particulièrement, des micro-noyaux présentant un marquage BrdU intense. De façon intéressante, l'inhibition de MRE11 réduit significativement le nombre de micro-noyaux dans les cellules BRCA1-déficientes. Ces résultats sont en faveur d'un glissement en mitose d'une partie des cellules en catastrophe réplicative et en cohérence avec des données récentes montrant l'implication de MRE11 dans la progression en mitose de cellules présentant des fourches bloquées (Hashimoto & Tanaka, 2022). Nos données indiquent donc que, outre son implication dans l'accumulation d'ADN simple brin et l'entrée en catastrophe réplicative, MRE11 favoriserait la formation de catastrophes mitotiques dans les cellules BRCA1-déficientes. Par ailleurs il a été proposé que BRCA1 phosphorylerait CHK1 et pourrait impacter sur l'activation du point de contrôle G2/M, constituant une explication complémentaire du glissement en mitose de nos modèles BRCA1-déficients après exposition à la gemcitabine (Yarden et al., 2002b, 2012b).

Nous avons aussi mis en évidence une fragmentation importante de l'ADN dans nos modèles BRCA1-déficients après traitement à la gemcitabine en comparaison avec les cellules BRCA1-proficientes. La fragmentation de l'ADN associée à un stress réplicatif aigu est généralement attribuée à l'effondrement des fourches de réplication bloquées (Harper et al., 2010). Cette hypothèse a été mise en question par (Panzarino et al., 2021), qui ont montré qu'un traitement par l'inhibiteur de caspases Zvad induisait une nette réduction des cassures à l'ADN, les amenant à proposer que la fragmentation de l'ADN dans leur système expérimental résultait d'un processus apoptotique. Ceci contraste avec nos résultats, qui ne montrent aucun impact du Z-vad sur la fragmentation de l'ADN et un effet limité sur la formation de micro-noyaux dans les cellules BRCA1-déficientes, infirmant l'hypothèse de la fragmentation de l'ADN résultant de l'entrée en apoptose des cellules dans notre système.

Enfin, nos résultats montrent que les cellules en catastrophe réplicative, définies par un marquage BrdU intense en condition non dénaturante et une absence de signal RPA, se distinguent par leur marquage γH2AX pan-nucléaire. Ce marquage a été associé à une accumulation de dommages à l'ADN dans des cellules soumises à un stress génotoxique ou à des cellules pré-apoptotiques (Gagou et al., 2010a, 2010b; Meyer et al., 2013; Moeglin et al., 2019; Podhorecka et al., 2010). Remarquablement, nos données montrent que l'augmentation du nombre de cellules BrdU positives précède celle des cellules γH2AX pan-nucléaires. Ceci suggère que le marquage γH2AX pan-nucléaire répond à l'accumulation de l'ADN simple brin et possiblement à sa fragmentation dans les cellules en catastrophe réplicative. Ainsi l'intensité du marquage γH2AX pan-nucléaire pourrait être un indicateur de la sensibilité de tumeurs à la gemcitabine, ce que nous avons voulu vérifier sur des modèles PDX de TNBC. Remarquablement, les tumeurs montrant le marquage γH2AX le plus intense sont celles présentant la meilleure réponse au traitement, ce qui suggère que γH2AX pourrait servir de biomarqueur de la réponse à un traitement induisant du stress réplicatif.

En conclusion, nos données montrant la sensibilité élevée des cellules de TNBC BRCA1-déficientes à la gemcitabine, du fait de leur entrée en catastrophe réplicative suivie d'une catastrophe mitotique,
pourraient avoir des implications intéressantes en clinique. En effet, il est désormais acté que les
cancers BRCA-déficients sont plus sensibles aux sels de platine faisant évoluer le traitement. Toutefois,
la gemcitabine ou ses dérivés restent très peu utilisés, la plupart du temps en trois ou quatrième ligne
de traitement.

Matériels et méthodes

1. Culture cellulaire

Toutes les lignées cellulaires ont été cultivées à 37°C /5% CO2 dans les milieux appropriés. Les lignées cellulaires SUM159 et SUM149 TNBC, un don généreux du Dr S Ethier (MUSC, Charleston, SC), ont été maintenues dans le milieu F-12 de Ham (Gibco™, Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France) complété par 5% de FBS, 10 µg/ml d'insuline, 1µg/ml d'hydrocortisone et 1% d'antibiotique-antimycotique (100X) (Gibco™, Fisher Scientific, ESllkirch-Graffenstaden, France). La lignées cellulaires UWB1.289PT et UWB1.289 +BRCA1 ont étés obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (CRL-2945 et CRL-2946 respectivement) et maintenue dans le mélange 50% RPMI-1640 (Gibco™), 50% MEGM (MEGM Bullet Kit ; CC-3150, Lonza, Basel, Suisse) et complétée avec 3% FBS, 1% Antibiotic-antimycotic (100X) (Gibco™, Fisher Scientific, Illkirch Graffenstaden, France). Les lignées cellulaires BT-549 et MDA-MB-436 TNBC ont étés obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (HTB-122 et HTB-130 respectivement), et maintenues dans le milieu DMEM (Gibco™, Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France) complété par 10% de FBS et 1% d'antibiotique-antimycotique (100X) (Gibco™, Fisher Scientific, ESllkirch-Graffenstaden, France). Les lignées cellulaire HCC-38 et OVCAR8 (TNBC et ovaires respectivement) ont étés obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (CRL-2314 et HTB-161 respectivement), et maintenues dans le milieu RPMI (Gibco™, Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France) complété par 10% de FBS, 10 µg/ml d'insuline, et 1% d'antibiotique-antimycotique (100X) (Gibco™, Fisher Scientific, ESllkirch-Graffenstaden, France).

Pour la génération CRISPR-Cas9 de clones SUM-159 BRCA1KO, les cellules SUM-159 ont d'abord été transduites avec un vecteur plasmidique lentiviral contenant l'expression de SpCas9 inductible par la doxycycline. La transduction lentivirale a été réalisée sur des cultures cellulaires confluentes à 70%. Les particules virales ont été ajoutées dans le milieu frais contenant 8µg/ml de polybrène. Après 16h, le milieu a été changé. Le jour suivant, les cellules ont été sélectionnées avec 2µg/ml de puromycine pendant 5 jours. Ensuite, les cellules ont été transduites comme décrit ci-dessus avec deux vecteurs plasmidiques lentiviraux pour l'expression de sgBRCA1 (don de Yea-Lih Lin, IGH, Montpellier). Après transduction lentivirale, les cellules ont été sélectionnées avec 400µg/ml de G418 pendant 10 jours et l'expression de Cas9 a été réalisée en traitant une population de cellules avec 1µg/ml de doxycycline pendant 6 jours. Les cellules ont ensuite été clonées et les clones vérifiés pour le KO BRCA1 par séquençage Sanger et western blot. Toutes les lignées cellulaires et les clones sélectionnés ont été génétiquement typés par l'authentification des lignées cellulaires d'Eurofins Genomics (Eurofins Genomics, Les Ulis)

2. Immunofluorescence

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Lignées cellulaires :
Environs $0.05 \times 10^6$ cellules ont été cultivées (dans les conditions citées plus haut) sur des lamelles de 12 mm de diamètre dans des plaques de 24 puits pendant 24 heures, pour ensuite être traitées à la concentration IC50 prédéterminée de gemcitabine (Gemzar, Lilly 7502).

-Pour les expériences d'évaluation du niveau d'ADN simple brin les cellules ont été incubées pendant 24h avec $10\mu M$ de BrdU, avant le traitement à la gemcitabine.

-Pour les expériences d'inhibition de MRE11, les cellules ont étés incubées avec $50\mu M$ de Mirin (MCE-HY-117693) pendant 4h préalablement au traitement à la gemcitabine. La Mirin est maintenue pendant les 24h de gemcitabine.

Après 24h de traitement, la gemcitabine est lavée et les cellules sont remises dans un milieu frais selon la cinétique suivante : 2h, 8h, 24h, 48h. A la fin de chaque time laps, les cellules sont préparées comme suit.

Afin de visualiser uniquement les protéines liées à la chromatine, une extraction douce permettant la dégradation des protéines solubles est d'abord réalisée avant l'étape de fixation dans du PBS ; 0,4% Triton, 5min à 4°C. les cellules sont ensuite soumises aux étapes suivantes : (1) fixation dans du PBS ; 4% PFA, 30 minutes à température ambiante (TA). (2) Blocage/Perméabilisation (PBS ; 3% BSA + 0.2% Triton, 1h à TA), (3) incubation avec les anticorps primaires sur la nuit à 4°C (4) puis avec les anticorps secondaires (30min à TA) (dilués dans le tampon de blocage). Trois lavages de 5min ont été réalisés entre chaque étape avec du PBS. Les lamelles contenant les cellules sont enfin montées sur des lames avec du milieu de montage contenant du DAPI permettant la coloration des noyaux, et ensuite conservées à 4°C. Les anticorps utilisés et leurs dilutions sont décrits dans le **tableau 1**. Les images d'immunofluorescence ont été acquises à l'aide d'un microscope Zeiss Axioimager M2 Apotome2, avec les objectifs 40X et 63X et générées à l'aide du logiciel Zeiss Blue. Pour chaque expérience plus de 200 noyaux parmi ceux présentant $\ge 10$ foyers/noyau des protéines cibles sont quantifiées. Au moins trois réplicas biologiques (traités à la fois par véhicule et par gemcitabine) ont été analysés.

## Pour les tissus tumoraux :

Des sections de $6\mu m$ ont été préparées à partir de tissus fixés/incorporés dans la paraffine (24h, dans un bain de paraformaldéhyde, puis 24h dans un bain d'éthanol 96%), et montées sur des lames de microscope Fisherbrand™ Superfrost™ Plus (Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France) et stockées à -20°C jusqu'à leur utilisation. Les sections tumorales sont d'abord déparaffinées (i) et les cibles protéiques démasquées(ii) ce qui se fait comme suit : (i) les lames contenant les sections tumorales sont incubées à 56°C pendant 30 minutes puis placées dans 3 bains de Xylène successifs (le premier 10 minutes et les deux suivants 5 minutes chacun). Les lames sont ensuite réhydratées dans 3 bains d'éthanol, puis dans un bain d'eau pendant 5 minutes dans chacun (3 bains d'éthanol successif à concentration décroissante 100%, 95% et 70%). (ii) Les lames sont ensuite placées dans des coplin jar contenant un tampon citrate 10X à PH6 à 95-98°C pendant 20 minutes.

Les sections tumorales sont ensuite soumises aux mêmes étapes que celles suivies pour les cellules à partir de celle du blocage jusqu'à montage.

# 3. Cytométrie en flux

## A. Analyse du cycle cellulaire et de l'intensité du stress replicatif

Environs $0.7 \times 10^6$ cellules sont cultivées (dans les conditions citées plus haut) dans des boites de culture de 10cm de diamètre pendant 24h. Un pulse d'EdU ($10\mu M$, 30min) permettant l'étude de la
progression des cellules dans le cycle cellulaire, est effectué avant le traitement par la gemcitabine. Après 24h de traitement, la gemcitabine est lavée et les cellules sont remises dans un milieu frais selon la cinétique suivante : 2h, 8h, 24h, 48h. A la fin de chaque time laps, les cellules sont préparées comme suit.

Les cellules de chaque échantillon sont trypsinées, mélangées à leur surnageant respectif et centrifugées à 1200rpm pendant 5min. les culots cellulaires sont ensuite soumis à la même étape de pré-extraction des protéines solubles réalisée pour l'IF (PBS ; 0,4% Triton, 5min à 4°C). Après centrifugation (1200rpm/5min) les noyaux sont ensuite fixés (PBS ; 4% PFA, 30min à TA), puis perméabilisés/bloquées (PBS ; 1% BSA, 1X saponine, 20min à TA). S'en suit l'incubation des noyaux avec les anticorps primaires (tableau 1) et secondaires (1h à TA, 30min à TA respectivement). Les anticopies primaires et secondaires sont dilués dans la solution de perméabilisation/blocage, et des lavages/centrifugations entres ces deux étapes sont réalisés par l'ajout d'une solution de PBS ; 1% BSA. Pour le suivi de la progression des cellules dans le cycle cellulaire, nous avons utilisé le kit EdU Click-it de Termofisher Scientific en suivant les mêmes étapes tel que préconisé dans le protocole fournis avec le kit. Les noyaux sont enfin repris dans du PBS, 1% BSA+1µg/ml DAPI.

Les noyaux ont été analysés avec un cytomètre Gallios Flow (Beckman Coulter) à un débit < 500 évènements/sec. Une exclusion des débris basée sur FS/SS a été mise en place et les doublets ont été exclus à l'aide du graphique DAPI (hauteur/aire). Les P.M.T.s sont restés rigoureusement les mêmes pour chaque couleur au cours de l'acquisition des données. 10 000 cellules ont été analysées par échantillon (débris et doublets exclus). Toutes les expériences ont été réalisées au moins 3 fois indépendamment. Toutes les options de représentations (couleurs/densités) sont strictement identiques entre les conditions d'une même expérience.

## B. Détection et quantification du Sub-G1

Après avoir été trypsinées, les cellules ont étés récupérées avec leur surnageants respectifs. Toutes les centrifugations ont été réalisées à 1800rpm (5min). Les cellules ont ensuite été fixées (PBS ; 4% PFA 25min, TA). Enfin les noyaux sont resuspendus PBS ; 1% BSA1+µg/mL DAPI, et les cellules ont été analysées (débris et doublets non exclus) comme décrit précédemment. 10,000 évènements ont été analysés pour chaque échantillon. Toutes les expériences ont été effectuées 3 fois indépendamment. Le contenu d'ADN est représenté en abscisse (échelle logarithmique), facilitant la visualisation et la quantification des populations en Sub-G1

## C. Quantification de l'apoptose (Annexine V/PI)

Après êtres trypsines, les cellules ont étés récupérées avec leur surnageants respectifs. Toutes les centrifugations ont été réalisées à 1800rpm (5min). Les cellules sont ensuite lavées avec du PBS froid, centrifugées puis lavées une nouvelles fois avec 1 ml de tampon BBA (Binding Buffer (0.2µm Hepes sterile filtré à pH 7.4, 1.4M NaCl, 25mM CaCl2) froid et distribuées dans les tubes de facs. Chaque échantillon est ensuite repris dans 50µL de BBA contenant 1µL d'annexine V, ou 0.02µg de Propidium Iodide (PI), ou les deux. Apres les 30min d'incubation, 200µL de PBS sont ajoutés à chaque échantillons, et les cellules ont étés analysées comme décrit précédent.

# 4. Teste de viabilité cellulaire

Toutes les expériences ont été réalisées dans des plaques 96 puits à fond plat (Starsted). 1500 cellules (190µL) /puit ont été ensemencées et laissées pendant 24h pour adhérence. Des dilutions en série des drogues ont été effectuées et les cellules ont été traitées en triplicat avec 10µL de drogues
(concentrations indiquées sur les graphiques). Après 48 heures de traitement, 10µL/puit de solution CCK8 (Cell Counting Kit-8 (CCK-8), GLPBIO, GK10001) sont ajoutés, et les plaques sont incubées à 37°C pendant 4h. une homogénéisation douce du milieu dans chaque puit est réalisée avant la lecture de la DO (450nm) par un spectromètre (PheraStar). Les données ont été exportées dans Excel et des courbes de survie ont été tracées à partir des triplicats biologiques : le triplicat contrôle non traité correspondant à lignée a été utilisé pour normaliser la courbe correspondante. La fraction de survie (%) à chaque point a été calculée comme suit : **Viabilité cellulaire (%) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100**.

* **As** = absorbance du puits expérimental (absorbance des cellules, milieu, CCK8 et puits du composé à tester).

* **Ab** = absorbance du puits blanc (absorbance des puits contenant le milieu et la CCK8)

* **Ac** = contrôle de l'absorbance du puits (absorbance des puits contenant des cellules, du milieu et du CCK8)

## 5. Extraction des protéines et Western Blotting

Afin d'extraire les protéines les culots de lignées cellulaires sont lysés sur de la glace pendant 30 minutes dans du Tris-HCl pH7.4 50mM, NaCl 100mM, NaF 50mM, β-glycérophosphate 40mM, EDTA 5mM, Triton X100 1%, Aprotinin 10mg/ml, PMSF 100mM, Leupeptin 181 1mM, Pepstatin 1mM, puis centrifugés afin de se débarrasser des débris (10.000 rpm 10min). Les concentrations en protéines ont été mesurées à l'aide du kit BCA (Fisher Scientific, Illkirch-Graffenstaden, France). 60µg d'extrait protéique sont ensuite chargé sur un gel SDS- PAGE pour l'électrophorèse, puis transférés sur des membranes de nitrocellulose (Amersham, Velizy-Villacoublay, France) et incubés pendant une nuit à 4°C avec les anticorps primaires (tableau 2). Les membranes sont ensuite lavées et incubées avec les anticorps secondaires appropriés selon l'espèce des anticorps primaires (dilués dans du PBS-Tween ; 5% lait sec non gras, pendant 1h à TA) et révélées par incubation avec le substrat HRP chimiluminescent (Sigma Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France).

## 6. Électrophorèse en champ pulsé

Des culots de cellules traitées (même nombre de cellules pour chaque condition) ont été mélangés avec 1% d'agarose préchauffée à 50°C puis coulés dans des moules sans introduire des bulles. Les échantillons ont été incubés dans un tampon de lyse (100mM EDTA pH8, 0.2% sodium lauryl sarcosine, 1mg/ml protéinase K) pendant 24h à 37°C. Les échantillons « plugs » ont ensuite étés rincés 3 fois avec un tampon de lavage (20mM Tris, 50mM EDTA pH9), puis placés dans les puits d'un gel d'agarose à 1% (dans une cuve contenant du tampon de migration ; 0.25x TBE). Un courant de champ pulsé est envoyé pendant 24h afin de séparer l'ADN total de l'ADN fragmenté. A la fin d'électrophorèse, l'ADN est marqué avec du Syber Green et pris en photo sous la lampe UV. La quantité d'ADN fragmenté a été mesurée en normalisant par rapport à l'intensité de l'ADN total.

## 7. Modèles PDX TNBC et HGSOC et traitement in vivo

La mise en place des modèles PDX de TNBC et de cancer ovarien a été réalisée comme décrit (Colombo et al., 2015 ; Dumanoir et al., 2014). Les modèles PDX utilisés sont décrits dans le tableau 1 de l'article mis en annexe (Velazquez et al., 2023). L'étude a été examinée et approuvée par les comités d'éthique pour les expérimentations animales de l'Université de Montpellier (CEEA-LR-12028). Une description
plus détaillée de la procédure peut être trouvée dans les méthodes supplémentaires de l'article mis en annexe (Velazquez et al., 2023).

<table><caption>Tableau 1 : anticorps utilisés en immunofluorescence</caption><thead><tr><th>Anticorps lair</th><th>Espèce</th><th>Dilution</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td>BRCA1</td><td>souris</td><td>1/300</td><td>Santa Cruz sc-6954</td></tr><tr><td>BRCA2</td><td>Lapin</td><td>1/500</td><td>Bethyl A303-434A</td></tr><tr><td>FANCD2</td><td>Lapin</td><td>1/500</td><td>Abcam ab108928</td></tr><tr><td>cGAS</td><td>Lapin</td><td>1/800</td><td>CST 15102</td></tr><tr><td>Geminin</td><td>Lapin</td><td>1/200</td><td>CST 52508</td></tr><tr><td>53BP1</td><td>Lapin</td><td>1/2000</td><td>Novus Biological NB100-304</td></tr><tr><td>RAD51</td><td>Lapin</td><td>1/300</td><td>Merck PC130</td></tr><tr><td>RPA32</td><td>souris</td><td>1/200</td><td>Abcam ab2175</td></tr><tr><td>RPA Ser4/8</td><td>souris</td><td>1/800</td><td>CST 83745</td></tr><tr><td>γH2AX</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>CST 9718</td></tr><tr><td>Histone 3 Phospho</td><td>Lapin</td><td>1/50</td><td>CST 9701</td></tr><tr><td>Anti-BrdU</td><td>souris</td><td>1/200</td><td>BD 347580</td></tr><tr><td>αTubuline</td><td>souris</td><td>1/1000</td><td>Sigma T6557</td></tr><tr><th>Anticorps IIair</th><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488</td><td>souris</td><td>1/1000</td><td>Abcam b150113</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 555</td><td>lapin</td><td>1/1000</td><td>Abcam ab150078</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 2 : anticorps utilisés en Western Blot</caption><thead><tr><th>Anticorps lair</th><th>Espèce</th><th>Dilution</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td>BRCA1</td><td>Lapin</td><td>1/500</td><td>CST 9010</td></tr><tr><td>BRCA2</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>Bethyl A303-434A</td></tr><tr><td>RAD51</td><td>Lapin</td><td>1/1000</td><td>CST 8875</td></tr><tr><td>CHK1</td><td>Lapin</td><td>1/200</td><td>Santa Cruz SC-8408</td></tr><tr><td>CHK1 P345</td><td>Lapin</td><td>1/2000</td><td>CST 2348</td></tr><tr><td>ATR</td><td>Lapin</td><td>1/300</td><td>CST 13934</td></tr><tr><td>ATR P1928</td><td>souris</td><td>1/200</td><td>CST 2853</td></tr><tr><th>Anticorps IIair</th><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris-HRP</td><td>souris</td><td>1/10000</td><td>CST 70745</td></tr><tr><td>Anti-lapin-HRP</td><td>lapin</td><td>1/10000</td><td>CST 7076</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**Figure 1. Les modèles cellulaires BRCA1-déficients montrent une sensibilité accrue à la gemcitabine.** A. Western blot montrant le profil d'expression basale des principales protéines de la HR dans les SUM-159 *BRCA1WT* et SUM-159 *BRCA1-KO*. Les protéines analysées sont mentionnées à gauche, et les poids moléculaires en kDa à droite. B. Courbe de réponse à la gemcitabine dans les SUM-159 *BRCA1WT* (noir) et SUM-159 *BRCA1-KO* (rouge). C. Pourcentage de mort cellulaire analysé par FACS des fractions positives pour AnnexinV/Pi à 24h, 48h et 72H après traitement à la gemcitabine dans les SUM-159 *BRCA1WT* (trait noir) et SUM-159 *BRCA1-KO* (trait rouge). D, E. Pourcentage des fractions de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire analysé par FACS dans les SUM-159 *BRCA1WT* (histogramme noire et gris) et SUM-159 *BRCA1-KO* (histogramme rouge et saumon) respectivement. Les données sont présentées en ratio du nombre de cellules traitées sur le nombre de cellules non traité dans chaque phase du cycle. Toutes les expériences on été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).</figcaption></figure>
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**Figure 2.** Les cellules BRCA1-déficientes montrent une accumulation significative de cellules en catastrophe réplicative. A, B. Pourcentage des fractions de cellules SUM-159 *BRCA1WT* et SUM159 *BRCA1-KO* marquées γH2AX (barres rouges) et RPA (barres vertes) analysé par FACS. C, D. Quantification des marquages par immunofluorescence de cellules positives pour γH2AX (rouge), RPA (vert) dans les cellules SUM-159 *BRCA1WT* et SUM159 *BRCA1-KO*. E, F. Microscopies représentatives des marquages γH2AX (rouge) et RPA (vert), par immunofluorescence dans les SUM-159 *BRCA1WT* et SUM159 *BRCA1-KO*. G, H. Quantification des marquages par immunofluorescence de cellules positives pour γH2AX (rouge), RPA (vert) dans les cellules UWB1.289-BRCA1 (expression ectopique de la version WT de BRCA1) et UWB1.289 parentales (mutation exon 11). I, J. Microscopies représentatives des marquages γH2AX (rouge) et RPA (vert), par immunofluorescence dans les UWB1.289-BRCA1 et UWB1.289 Pt. Toutes les expériences ont été réalisée au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).

10γ
A

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**Figure 3.** Le marquage γH2AX pan-nucléaire correspond aux cellules en catastrophe réplicative. A, B. Marquage γH2AX dans les SUM-159 *BRCA1WT* et SUM-159 *BRCA1-KO* respectivement. C. Quantification des cellules avec un marquage γH2AX en foyers (pointillés rouges) ou pan-nucléaire (rouge plein). D, E, F. Microscopies représentatives de co-marquage γH2AX et RPA32 dans les SUM-159 *BRCA1WT* et SUM-159 *BRCA1-KO* respectivement, et quantification des signaux (F). G, H. Microscopies représentatives de co-marquages BrdU et RPA32 dans les SUM-159 *BRCA1WT* et SUM-159 *BRCA1-KO* respectivement. I, J. Quantification des signaux BrdU et des co-marquages BrdU/RPA32, BrdU/γH2AX pan-nucléaires dans les SUM-159 *BRCA1WT* et SUM-159 *BRCA1-KO*. Toutes les expériences ont été réalisées au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>C</figcaption></figure>

<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>E</figcaption></figure>

<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>B</figcaption></figure>

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>D</figcaption></figure>

<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>F</figcaption></figure>

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

Figure 4. La formation de foyers RAD51 est fortement réduite dans les modèles BRCA1-déficients et absente dans les cellules en catastrophe réplicative. A, C, E. Quantification des cellules γH2AX pan-nucléaire positives/RAD51 négatives (A, histogramme violet), γH2AX pan-nucléaire positives/53BP1 positives (C, histogramme orange), et γH2AX pan-nucléaire positives/FANCD2 positives (E, histogramme rose), dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO. B, D, F. Microscopies représentatives des co-marquages γH2AX (rouge)/RAD51 (vert) (B), γH2AX (rouge)/53BP1 (Vert) (D), et γH2AX (rouge)/FANCD2 (vert) (F) 48h après lavage de la gemcitabine, dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO. Toutes les expériences ont été réalisée au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
<figure><img src="image_87.png" /></figure>

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Figure 5. L'inhibition de MRE11 réduit fortement l'accumulation d'ADN simple brin et de cellules γH2AX pan-nucléaires dans les SUM-159 BRCA1-KO. A et E. Microscopies représentatives des co-marquages et γH2AX (rouge)/BrdU (vert) 48h après lavage de gemcitabine, ou gemcitabine+mirin, dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO respectivement. B et F. Quantification des cellules BrdU positives (histogramme vert) après traitement à la gemcitabine (barres vertes) ou gemcitabine+mirine (barres vertes rayées) dans les SUM-159 BRCA1WT (B) et SUM-159 BRCA1-KO (F). C et G. Quantification des cellules γH2AX positives (histogramme rouge) après traitement à la gemcitabine (barres rouges) ou gemcitabine+mirine (barres rouges rayées) dans les SUM-159 BRCA1WT (C) et SUM-159 BRCA1-KO (G). D et H. Quantification des cellules γH2AX pan-nucleaires positives (histogramme rouge) après traitement à la gemcitabine (barres rouges) ou gemcitabine+mirine (barres rouges rayées) dans les SUM-159 BRCA1WT (D) et SUM-159 BRCA1-KO (H). Toutes les expériences ont été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
A

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Figure 6. SUM-159 BRCA1-KO traités à la gemcitabine accumulent de l'ADN simple brin et glissent en mitose, et subissent des catastrophes mitotiques. A, B, C, D. Pourcentage des fractions de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire après synchronisation analysé par FACS dans les SUM-159 BRCA1WT (histogramme noire et gris) et SUM-159 BRCA1-KO (histogramme rouge et saumon), traitées à la gemcitabine (A, B) ou gemcitabine+CHK1i (C, D). Les données sont présentées en ratio du nombre de cellules traitées sur le nombre de cellules non traitées dans chaque phase du cycle. E. Pourcentage de mort cellulaire analysé par FACS des fractions positives pour AnnexinV/Pi à 24h, 48h et 72H après traitement à la gemcitabine (trait plein) ou gemcitabine+CHK1i (trait discontinu) dans les SUM-159 BRCA1WT (trait noir) et SUM-159 BRCA1-KO (trait rouge. F, G, H. Microscopies représentatives de catastrophes mitotiques et de micronoyaux (F et H respectivement), et quantification des mitoses catastrophiques dans les SUM-159 BRCA1WT (trait noir) et SUM-159 BRCA1-KO (trait rouge). I. Microscopies représentatives du co-marquage BrdU/ γH2AX pan-nucleaires dans les micronoyaux dans les SUM-159 BRCA1-KO. J, K. Quantification des micronoyaux après traitement à la gemcitabine ou gemcitabine+mirin dans les SUM-159 BRCA1WT (J) et SUM-159 BRCA1-KO (K). L, M. Quantification des micronoyaux après traitement gemcitabine ou gemcitabine+Z-Vad dans les SUM-159 BRCA1WT (L) et SUM-159 BRCA1-KO (M). N. Quantification des cassures de l'ADN post traitement gemcitabine ou gemcitabine+Z-Vad SUM-159 BRCA1WT (barres noires) et SUM-159 BRCA1-KO (barres rouges). Toutes les expériences ont été réalisée au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
A

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Figure 7. L'intensité du marquage γH2AX est accru dans les modèles PDX qui répondent à la gemcitabine comparés aux modèles non-répondeurs. A, B. Courbes de réponse des PDXs 15b018 (trait bleu), b3804 (trait violet) et b4122 (trait vert), traités au véhicule (A) ou gemcitabine (B). Les données représentent l'évolution du volume tumoral au cours du temps de traitement. C et D. Microscopies représentatives des coupes de tissus de PDXs marquées avec γH2AX après traitement au véhicule ou à la gemcitabine (C) et quantification du nombre de cellules γH2AX positives pour les PDXs 15b018 (Barres bleus), b3804 (Barres violètes) et b4122 (Barres vertes) après traitement au véhicule ou à la gemcitabine.
# Figures
# Supplémentaires
A

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BRCA1WT

BRCA1-Nul

BRCA1-Me

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<figure><img src="image_118.png" /><figcaption>Figure Sup 1. Les modèles cellulaires BRCA1-déficients montrent une sensibilité accrue à la gemcitabine.</figcaption></figure>

A. Western blot montrant le profil d'expression basale des principales protéines de la HR dans les SUM-159, BT-549 (*BRCA1WT*) et MD-AMB-436, HCC38 et OVCAR8 (*BRCA1-def*). Les protéines analysées sont mentionnées à gauche, et les poids moléculaires en kDa à droite.
B. Courbe de réponse à la gemcitabine les SUM-159, BT-549 (traits noirs, BRCA1WT) et MDA-MB-436, HCC38 et OVCAR8 (traits rouges, *BRCA1-def*).
C, D, E, F. Pourcentage des cellules dans chaque phase du cycle cellulaire +la fraction SubG1 analysé par FACS : SUM-159 *BRCA1WT* (C) et SUM-159 *BRCA1-KO* (D) BT-549 (E) et les MDA-MB-436 (F). Les données sont présentées en pourcentage de cellules dans chaque phase du cycle à 24h et 48H après traitement au véhicule ou gemcitabine. Toutes les expériences ont été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
<figure><img src="image_119.png" /></figure>

**Figure Sup 2.** Les cellules BRCA1-déficientes montrent une accumulation significative de cellules en catastrophe réplicative. A et F. Western blot montrant le profil d'expression basale des principales protéines de la HR dans les SUM-159 BRCA1WT, SUM-159 BRCA1-KO, SUM-159 BRCA1-KO résistantes à l'olaparib (Ola Res), SUM-149 Pt (BRCA1-mut) SUM-149 résistantes à l'olaparib (réversion activatrice de BRCA1), UWB1-289 Pt (Delta BRCA1), UWB1-289+BRCA1 (Expression ectopique de BRCA1 (A), BT-549 (BRCA1 WT) et MDA-MB-436 (BRCA1 nul) (F). Les protéines analysées sont mentionnées à gauche, et les poids moléculaires en kDa à droite. B, C, D, E. Quantification des marquages par immunofluorescence de cellules positives pour γH2AX (rouge), RPA (vert) dans les cellules SUM-159 BRCA1-KO, SUM-159 BRCA1-KO résistantes à l'olaparib (B), SUM-149 Pt (BRCA1-mut) SUM-149 résistantes à l'olaparib (C), BT-549 (D) et MDA-MB-436 (E). Les données sont présentées en pourcentage de cellules γH2AX positives et RPA32 positive en condition NT, et à +2h, 8h, 24h et 48h après lavage de la gemcitabine. Toutes les expériences ont été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
<figure><img src="image_120.png" /></figure>

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**Figure Sup 3.** Le marquage γH2AX pan-nucléaire correspond aux cellules en catastrophe réplicative. A et C. Quantification des cellules avec un marquage γH2AX en foyers (pointillés rouges) ou pan-nucléaire (rouge plein) dans les UWB1-289+BRCA1 (noir, expression ectopique de BRCA1), les UWB1-289 Pt (rouge, delta BRCA1) (A), et dans les SUM-149 résistantes à l'olaparib (noir, BRCA1 revert), et les SUM-149 Pt (rouge, BRCA1 mut) (C). **B.** Quantification Co-marquage γH2AX pan-nucléaire et RPA32 dans les UWB1-289+BRCA1 (noir, expression ectopique de BRCA1), les UWB1-289 Pt (rouge, delta BRCA1) (B), et dans les SUM-149 résistantes à l'olaparib (noir, BRCA1 revert), et les SUM-149 Pt (rouge, BRCA1 mut) (D). Les données sont présentées en pourcentage de cellules γH2AX pan-nucléaire positives et RPA32 positives, à NT, 24h, et 48h après lavage de la gemcitabine. Toutes les expériences ont été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
A

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F

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Figure Sup 4. La formation de foyers BRCA1, BRCA2 et RAD51 est fortement réduite dans les modèles BRCA1-déficients et est remplacé par des foyers 53BP1. A et C. Microscopies représentatives des marquages BRCA1, BRCA2 (vert), RAD51 et 53BP1 (rouge) dans les SUM-159 BRCA1WT (A) et SUM-159 BRCA1-KO (C). B, D, E, F. Quantification des cellules positives pour BRCA1, BRCA2 (histogrammes verts) RAD51 (histogramme bleu), et 53BP1 (histogramme orange) dans les SUM-159 BRCA1WT (B), les SUM-159 BRCA1-KO (D), les UWB1-289+BRCA1 (expression ectopique de BRCA1) (E), les UWB1-289 Pt (delta BRCA1) (F). Les données sont présentées en pourcentage de cellules BRCA1, BRCA2, RAD51 et 53BP1 positives dans la condition NT, et à + 2h, 8h, 24h et 48h après lavage de la gemcitabine. Toutes les expériences ont été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
A

<figure><img src="image_130.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_131.png" /></figure>

<figure><img src="image_132.png" /></figure>

C

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SUM-159 BRCA1WT

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SUM-159 BRCA1-KO

D

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SUM-159 BRCA1WT

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SUM-159 BRCA1-KO

E

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SUM-159 BRCA1WT

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SUM-159 BRCA1-KO

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SUM-159 BRCA1-KO

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F

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PI

Annexin V

G

<figure><img src="image_142.png" /></figure>

**Figure Sup 5.** Les modèles BRCA1-déficients glisse en mitose et meurent de catastrophes mitotiques. A, B. Protocole expérimentale de synchronisation des cellules avant traitement à la gemcitabine (A), et exemple représentatif des résultats obtenus par FACS (B). C. Microscopies représentatives des aberrations nucléaires observées après traitement à la gemcitabine dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO. D. Quantification des cellules marquées RPA-pSer4/8 par immunofluorescence dans les SUM-159 BRCA1WT les SUM-159 BRCA1-KO. E. Comparaison des pourcentages de cellules en phase G1 (trait vert), S (trait bleu) et G2 (trait rose), a celui des cellules mortes par apoptose (trait rouge) dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO. F. Exemple représentatif des résultats obtenus par FACS des pourcentages de cellules mortes (Annexin V+/PI+) après traitement à gemcitabine ou gemcitabine+Z-VAD dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO. G. Gel d'électrophorèse en champs pulsé dans les SUM-159 BRCA1WT et SUM-159 BRCA1-KO. Toutes les expériences ont été réalisé au moins 3 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
<figure><img src="image_143.png" /></figure>

<figure><img src="image_144.png" /></figure>

**Figure Sup 6.** Les micronoyaux formés sont C-Gas positifs. A, B. Microscopies représentatives des co-marquages γH2AX pan-nucléaire et C-Gas au niveau des micronoyaux (A), et leur quantification dans les SUM-159 *BRCA1WT* et les SUM-159 *BRCA1-KO* (B). L'expérience ont été réalisé au 2 fois, les barres d'erreurs représentent l'écart type de la moyenne (SEM).
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Conclusions et
perspectives
# I. Conclusion

Ces cinq dernières années ont vu apparaitre un changement de paradigme majeur en ce que concerne la réponse aux traitements génotoxiques dans les tumeurs HRD. En effet on a longtemps considéré que la source majeure de toxicité de cette classe de molécules était liée aux cassures d'ADN double brin non ou mal réparées dans un contexte BRCA déficient (BRCA-def).

Cependant, un nombre croissant de travaux rapportent l'existence de résistance à ces traitements, notamment concernant le cisplatine et les inhibiteurs de PARP (PARPi) dans des cas d'HRD confirmée et soulignent l'implication de plusieurs acteurs clés de la HR dans la gestion du stress réplicatif, notamment dans la protection des fourches de réplication bloquées.

Récemment plusieurs auteurs ont proposé que la principale source de toxicité du cisplatine ou des PARPi dans des modèles BRCA2-def était associée à l'accumulation de « single stranded DNA-gaps » ou brèches d'ADN simple brin (Cong et al., 2021; Panzarino et al., 2021). Notablement, le nombre de gaps accumulés après traitement est en lien avec la sensibilité aux PARPi et sels de platine. A l'inverse, la suppression des gaps est associée à une résistance. L'inversion de fourches ne semble pas entrer en ligne de compte et certains auteurs excluent l'implication de la résection des brins naissants par MRE11 dans l'accumulation d'ADN simple brin (Cong et al., 2021; Panzarino et al., 2021). Ceci pourrait s'expliquer par les observations montrant que l'inhibition de PARP1/2 est associée à la réduction (voire l'inhibition) de l'inversion des fourches bloquées, favorisant la reprise de la réplication par « repriming » ou réamorçage par PRIMPOL (Berti et al., 2013; Ray Chaudhuri et al., 2012; Tirman et al., 2021). D'autres études démontrant une augmentation des transcrits PRIMPOL concomitante à l'augmentation des ss-gaps dans les cellules BRCA-def traitées avec des concentrations croissantes de cisplatine vont dans le même sens. L'amorçage par PRIMPOL, primase appartenant au *DNA Damage Tolerance mechanism* (DDT), relance la synthèse d'ADN en aval d'une fourche bloquée par une lésion physique, mais elle laisse une brèche qui doit être comblée soit par « *Trans Lesion Synthesis* » (TLS) ou « *Template switching* » (TS) (Mourón et al., 2013; Tirman et al., 2021).

Dans mon travail de thèse, j'ai montré que les cellules TNBC BRCA1-def étaient plus sensibles au stress réplicatif induit par la gemcitabine et mouraient massivement, en comparaison avec les cellules BRCA1-prof. Cette sensibilité se traduisait essentiellement par une catastrophe réplicative non résolue au cours du temps. Mes résultats se distinguent de ceux de Cong et al., et Panzarino et al., car ils montrent l'implication majeure de la surrésection par MRE11 dans survenue de cette catastrophe réplicative. MRE11, qui est strictement régulée par BRCA1 et RAD51 et dont le rôle est d'assurer la résection des sites de cassures double brin (Chapman et al., 2012; Shibata et al., 2014; Shrivastav et al., 2008; Singh et al., 2022), est en cas de fourches de réplication bloquées restreinte à la résection des brins naissants associés aux fourches inversées (Hashimoto et al., 2010; Oh & Symington, 2018; Ying et al., 2012). Certains auteurs suggèrent que l'inversion des fourches et le réamorçage par PRIMPOL seraient mutuellement exclusifs (Quinet et al., 2021). De plus, il semble que le réamorçage PRIMPOL serait préférentiellement activé pour le contournement de lésions de l'ADN, telles que celles causées les sels de platine ou les PARPi. On peut donc s'interroger sur les différences de réponse induites par les sels de platine ou les PARPi, en comparaison avec les perturbateurs du pool de nucléotides tels que la HU ou la gemcitabine. En effet, mes résultats montrant l'implication de MRE11 dans l'accumulation des ADNs simples brins, dans nos modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine, suggèrent fortement que le mécanisme dominant serait l'inversion de fourches plutôt que l'amorçage PRIMPOL. Les explications pourraient être liées à (i) la déficience BRCA1 plutôt que BRCA2 de notre modèle, (ii) le mode d'action de la gemcitabine et son impact sur la réplication.

Nous avons effectivement choisi d'étudier l'impact du stress réplicatif sur des modèles BRCA1 déficients, car ils représentent de 15 à 20% des TNBC, alors que les mutations BRCA2 y sont minoritaires (Foulkes et al., 2003; Lakhani et al., n.d.; Stephens et al., 2012).
La régulation négative de PRIMPOL par l'association de BRCA2 à MCM10 suggérerait une possible différence entre les modèles BRCA2-déficients et BRCA1-déficients concernant l'activation préférentielle de PRIMPOL ou de la réversion de fourche en cas de stress réplicatif (Kang et al., 2021). De plus, il a été démontré qu'une mutation dans le domaine C-terminale de liaison à l'ADN simple brin de BRCA2 était spécifiquement associée à une augmentation des ssDNA-gaps suite au traitement avec PARPi ou cisplatine (Vugic et al., 2023). En revanche, **ces mutants BRCA2 C-terminale ne produisaient pas de gaps en présence de HU** et par conséquent y étaient résistants. Ceci suggère que pour une même mutation au niveau de BRCA2, **le traitement au PARPi et cisplatine n'active pas le même mécanisme que la HU, appuyant l'importance de mettre en place des expériences différentielles pour ces deux types de molécules.**

Par ailleurs, dans un contexte BRCA1-déficient, on pourrait supposer que BRCA2, dont nous avons noté la présence en western blot dans notre modèle BRCA1-déficient (au même niveau que les modèles BRCA1-proficients), ainsi que la formation réduite, mais pas absente de foci, la répression de PRIMPOL pourrait persister. De plus, la réversion des fourches, catalysée par SMARCAL1, ZRANB3, HTLF et aussi RAD51, est considérée comme indépendante de BRCA1 et BRCA2. L'ensemble de ces données suggèrent donc que la déficience BRCA1 pourrait constituer un contexte plus favorable à la réversion de fourche qu'au réamorçage PRIMPOL.

Ceci relance l'hypothèse d'une possible spécificité de la gemcitabine, qui partage avec l'hydroxurée (HU) l'inhibition de la biosynthèse des pyrimidines (Huff et al., 2022). Toutefois, la gemcitabine est incorporée au cours de la réplication de l'ADN, bloquant l'élongation des chaines et, par là-même, la progression du réplisome (Cerqueira et al., 2007). Ceci rend encore moins probable la possibilité d'action de PRIMPOL, dont le mode d'action principal dépend de la disponibilité de dNTPs en concentrations suffisantes, ainsi que de la possibilité d'amorcer la synthèse d'amorces, ce qui est rendu impossible par l'action terminateur de chaine de la gemcitabine. On peut en conclure que les mécanismes d'action de la gemcitabine sont globalement plus favorables à l'inversion de fourches et donc à la sur-résection par MRE11.

Nos résultats indiquent aussi que les cellules BRCA1-déficientes traitées à la gemcitabine présentent une tendance accrue à glisser en mitose et à produire des catastrophes mitotiques et, plus particulièrement, des micro-noyaux présentant un marquage BrdU intense. De façon intéressante, l'inhibition de MRE11 réduit significativement le nombre de micro-noyaux dans les cellules BRCA1-déficientes. Ces résultats sont en faveur d'un glissement en mitose d'une partie des cellules en catastrophe réplicative et en cohérence avec des données récentes montrant l'implication de MRE11 dans la progression en mitose de cellules présentant des fourches bloquées (Hashimoto & Tanaka, 2022). Nos données indiquent donc que, outre son implication dans l'accumulation d'ADN simple brin et l'entrée en catastrophe réplicative, MRE11 favoriserait la formation de catastrophes mitotiques dans les cellules BRCA1-déficientes. Par ailleurs, il a été proposé que BRCA1 phosphorylerait CHK1 sue la serine 317 et pourrait jouer un rôle dans la régulation du point de contrôle G2/M, constituant une explication complémentaire du glissement en mitose de nos modèles BRCA1-déficients après exposition à la gemcitabine.

Nous avons aussi mis en évidence une fragmentation importante de l'ADN dans nos modèles BRCA1-déficients après traitement à la gemcitabine en comparaison avec les cellules BRCA1-proficientes. La fragmentation de l'ADN associée à un stress réplicatif aigu est généralement attribuée à l'effondrement des fourches de réplication bloquées (Harper et al., 2010). Cette hypothèse a été remise en question par Panzarino et col (2021), qui ont montré qu'un co-traitement camptothecine (CPT)+l'inhibiteur de caspases (Z-VAD) supprimait entièrement les cassures à l'ADN, suggérant que les cassures observées sous CPT seul, étaient principalement dues à une fragmentation apoptotique de l'ADN. Par contre, nos résultats ne montrent aucun impact du Z-VAD sur la fragmentation de l'ADN en présence de gemcitabine et a un effet limité sur la formation de micro-noyaux dans les cellules BRCA1-
déficientes, infirmant dans notre système, l'hypothèse selon laquelle la fragmentation de l'ADN résulterait de l'entrée des cellules en apoptose.

Enfin, nos résultats montrent que les cellules en catastrophe réplicative, définies par un marquage BrdU intense en condition non dénaturante et une absence de signal RPA, se distinguent par leur marquage γH2AX pan-nucléaire. Ce marquage a été associé à une accumulation de dommages à l'ADN dans des cellules irradiées ou en stress réplicatif ou à des cellules pré-apoptotiques (Gagou et al., 2010; Meyer et al., 2013; Moeglin et al., 2019). Remarquablement, nos données montrent que l'augmentation du nombre de cellules BrdU positives précède celle des cellules γH2AX pan-nucléaire. Ceci suggère que le marquage γH2AX pan-nucléaire répond à l'accumulation de l'ADN simple brin et possiblement à sa fragmentation dans les cellules en catastrophe réplicative. Ainsi, l'intensité du marquage γH2AX pan-nucléaire pourrait être un indicateur de la sensibilité de tumeurs à la gemcitabine, ce que nous avons voulu vérifier sur des modèles PDX de TNBC. Remarquablement, les tumeurs montrant le marquage γH2AX le plus intense sont celles présentant la meilleure réponse au traitement, ce qui suggère que γH2AX pourrait servir de biomarqueur de la réponse à un traitement induisant du stress réplicatif.

## II. Perspectives

Mon travail de thèse démontre la sensibilité des cellules de TNBC BRCA1-déficientes au stress réplicatif induit par la gemcitabine. La confrontation de mes résultats à la littérature m'amène à proposer des hypothèses qu'il serait intéressant d'explorer :

### 1- l'inversion de fourches constitue-t-elle le mécanisme de réponse majeur au stress induit par la gemcitabine dans un contexte BRCA1-déficient ?

Mes données suggèrent que l'inversion de fourches serait une réponse majeure à un traitement par la gemcitabine dans un système BRCA1-déficient, mais il reste à déterminer si ceci est effectivement exclusif de la formation de ss-gaps. La vérification de cette hypothèse nécessite de réaliser des expériences de *spreading* ou de fibres en présence ou non de nucléase S1 tel que décrit par Panzarino et al., et Cong et al. De plus, il serait bon de vérifier les niveaux des transcrits PRIMPOL dans nos modèles traités à la gemcitabine, ainsi que son association à la chromatine. Il serait aussi intéressant de déterminer le taux de fourches inversées par microscopie électronique et de comparer avec un traitement au cisplatine ou PARPi.

### 2- Estimation de l'étendu de l'impact de MRE11 dans le processus de résection

Plusieurs études décrivent l'implication de différents agents dans le recrutement de MRE11 au niveau des fourches bloquées/reversées tels que : CHD4, PTIP ou encore PARP14. Il serait intéressant d'évaluer l'implication de ces protéines dans le recrutement de MRE11 dans nos modèles BRCA1-déficients suite à un traitement à la gemcitabine. Par ailleurs, il est bien connu que MRE11 à lui seul ne peut réséquer l'ADN sur de longues distances en raison de sa faible processivité, ce qui implique l'action subséquente de EXO1. Il serait judicieux, en effet, d'estimer l'entendu de l'effet de résection de MRE11 dans nos modèles BRCA1-déficients en procédant à des manips ou l'on déplète MRE11, EXO1 ou les deux en même temps, en présence de gemcitabine, et de PARPi/cisplatine.

### 3- La place de MUS81 dans le processus de résection, ou d'incision des fourches bloquées.

Le rôle de MUS81 dans la gestion du stress réplicatif est bien décrit dans un contexte BRCA2-déficient. L'incision par MUS81 a été impliquée dans des situations de fourches bloquées sur la durée, associées à une inversion, résection partielle et sans reprise de la réplication. En effet, l'absence de stabilisation et de protection des fourches bloquées en absence de BRCA2, favorise une hyper-fragmentation de l'ADN suite à une sur-résection par MRE11 et EXO1. Afin de sortir de cet état d'hyper fragmentation, les fourches bloquées nécessitent d'être incisées par MUS81 pour relancer la réplication et ainsi résister au stress réplicatif. De plus, il a été démontré que la déplétion de MUS81 resensibilisait les
tumeurs HR proficientes à l'olaparib, soulignant le rôle important que joue cette nucléase dans la réparation par HR des lésions causées par PARPi. L'absence d'information quant au rôle de MUS81 dans un contexte BRCA1-déficients en fait une piste intéressante à explorer, notamment dans nos modèles.

4- La signification du marquage γH2AX pan-nucléaire dans le cadre de la réversion des fourches. L'un des principaux résultats de ce projet de thèse revient à l'association du marquage γH2AX pan-nucléaire à la sur-résection de l'ADN par MRE11 et la catastrophe réplicative. Cela amène la question sur l'existence d'un lien entre ce type de marquage et l'inversion de fourches bloquées ? Afin de répondre à cette question, il serait intéressant d'inhiber ce processus via la déplétion de SMARCAL1 en présence de gemcitabine, et d'évaluer par la suite en immunofluorescence le marquage γH2AX. Par ailleurs, l'apparition de ce marquage est-elle spécifique à l'utilisation de la gemcitabine et d'autres molécules du même type ? En effet, dans un projet parallèle au sein du labo, le traitement des modèles BRCA1-déficients par l'olaparib n'induisait pas le marquage γH2AX pan-nucléaire, suggérant une spécificité potentielle à la gemcitabine. Néanmoins, ceci doit être confirmé en reproduisant les manips avec des concentrations supérieures d'olaparib afin d'écarter l'éventualité qu'il s'agit d'un processus concentration-dépendant.

5- Utilité du marquage γH2AX pan-nucléaire sur le plan clinique.

Enfin, nos expériences in vivo sur des xénogreffes de patientes TNBC (PDX), ont montré un possible lien entre le taux de cellules avec un marquage γH2AX pan-nucléaire et la réponse à la gemcitabine. En effet, les tumeurs répondant le mieux à la gemcitabine étaient celles présentant le marquage γH2AX pan-nucléaire le plus élevé. Ceci suggère que le marquage γH2AX pan-nucléaire pourrait constituer un biomarqueur de la réponse à la gemcitabine. La robustesse de ce marquage en relation avec la réponse au traitement doit être davantage testée sur des coupes de tumeurs, notamment des biopsies de patientes chemo-naïves, avant et après traitement.
# Annexes
Annexe 1.

Triple Negative Breast Cancer with epigenetically
silenced BRCA1 previously exposed to neoadjuvant
chemotherapy restore RAD51 foci formation and
respond poorly to olaparib
BRCA1-methylated triple negative breast cancers previously exposed to neoadjuvant
chemotherapy form RAD51 foci and respond poorly to olaparib

Carolina Velazquez1, Esin Orhan1, Imene Tabet1, Lise Fenou1, Béatrice Orsetti1, José Adélaïde2,
Arnaud Guille2, Simon Thézénas3, Evelyne Crapez4, Pierre-Emmanuel Colombo1,5, Max Chaffanet2,
Daniel Birnbaum2, Claude Sardet1, William Jacot1,6, Charles Theillet1.

Résumé

Dans cette étude, nous avons évalué la sensibilité des cancers du sein triple négatif (TNBC) avec une inactivation épigénétique du gène BRCA1 (hyperméthylation du promoteur, nommée ci-après BRCA1-Me) à l'olaparib (inhibiteur de PARP).

Les TNBC représentent 15% de tous les cancers du sein, son sous-type le plus agressif et un risque de rechutes précoces. Seule une minorité des TNBC bénéficie de thérapies ciblées (Elias, 2010). Il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques à leur destination.

De façon intéressante près de 30% des TNBC présente potentiellement une déficience de la réparation par recombinaison homologue (HRD) (Couch et al., 2015). La HRD a été originellement associée aux mutations germinales provoquant la perte de fonction des gènes BRCA1 ou BRCA2, lesquels jouent des rôles clés dans cette voie (Lord & Ashworth, 2016). La recombinaison homologue (HR) est un mécanisme essentiel de réparation des cassure double brin (CSB) à l'ADN (Lord & Ashworth, 2016) et sa perte de fonctionnalité ou déficience (HRD) a été associée à une sensibilité accrue aux sels de platine (Hastak et al., 2010; Silver et al., 2010), mais aussi aux inhibiteurs de PARP (PARPi) (Rottenberg et al., 2008). L'identification des tumeurs présentant une HRD pourrait être importante en termes d'indications thérapeutiques. Ici, nous nous intéressons à une meilleure définition de la population 78 susceptible de répondre à un traitement à base de PARPi. En effet, la question d'étendre le statut HRD au-delà des patientes porteuses de mutations germinales BRCA1/BRCA2 est activement étudiée et il a récemment été décidé d'y incorporer les tumeurs présentant des mutations somatiques BRCA1/BRCA2 (Couch et al., 2015). Cependant, la question de l'extension à des modifications somatiques, génétiques ou épigénétiques, affectant d'autres gènes de la voie HR reste posée. C'est particulièrement le cas des tumeurs présentant une inactivation du gène BRCA1 due à l'hyperméthylation du promoteur, qui représentent entre 15 et 20 % des TNBC (Glodzik et al., 2020; Jacot et al., 2013). Toutefois la réalité de la HRD dans ces tumeurs est l'objet de discussions, surtout pour les tumeurs ayant été exposées à un traitement cytotoxique (Menghi et al., 2022). Ces questions soulignent l'importance de disposer d'un test fiable permettant d'identifier la HRD dans une tumeur. Plusieurs approches génétiques sont disponibles s'appuyant sur le séquençage ciblé des gènes de la HR, en combinaison avec la détermination des profils de réarrangements génomiques caractéristiques de la HRD (Davies et al., 2017; Drews et al., 2022; Menghi et al., 2022; Polak et al., 2017). Ces réarrangements correspondent à des « cicatrices génétiques » résultant des mécanismes de réparation défectueux et plusieurs « scores génomiques » HRD, corrélés à la présence de mutations BRCA1 ou BRCA2, ont été définis (Davies et al., 2017). Cependant, les cancers BRCA-déficients développent fréquemment une résistance aux traitements associée à différents événements moléculaires débouchant sur la restauration de la HR (D'Andrea, 2018; Dias et al., 2021). Par conséquent, la perte de fonction HR dans les tumeurs HRD précédemment exposées à un traitement génotoxique est
susceptible d'être révertée et ce point a été spécifiquement soulevé pour les TNBC BRCA1-Me, dont la sensibilité au PARPi reste en doute (Menghi et al., 2022; ter Brugge et al., 2016).

C'est pourquoi nous avons testé, dans le cadre d'un essai in vivo, la sensibilité de 8 modèles PDX, comprenant 7 TNBC (2 BRCA1-WT, 4 BRCA1-méthylés (BRCA1-Me), 1 BRCA1-Mut) et 1 carcinome ovarien séreux de haut grade (HGSOC) BRCA1-Mut, à l'inhibiteur PARP olaparib et au carboplatine (CBP). En corollaire, nous avons interrogé le statut HRD des modèles PDX testés et utilisé les foyers nucléaires BRCA1, RAD51, γH2AX et 53BP1 dans le PDX traité à l'olaparib comme un marqueur de la fonctionnalité de la RH et de la réponse aux dommages à l'ADN. En effet, dans les cellules HR-fonctionnelles les protéines BRCA1 et RAD51 forment des agrégats au niveau des sites de cassures à l'ADN, lesquels sont détectables par 79 immunofluorescence sous forme de foyers nucléaires. La présence de ces foyers signe pour une HR fonctionnelle, leur absence pour une HRD. De façon intéressante, les modèles PDX présentant une formation réduite des foyers BRCA1 et RAD51 correspondaient aux répondeurs à l'olaparib, tandis que les non-répondeurs étaient tous positifs pour les foyers RAD51. Il est à noter que les trois PDX BRCA1-Me établies à partir de tumeurs n'ayant pas répondu à la chimiothérapie néoadjuvante (NACT) ont progressé sous olaparib et se sont avérées positives pour les foyers RAD51. Ces résultats suggéraient que, malgré une expression fortement réduite de la protéine BRCA1 ces tumeurs BRCA1-Me présentaient une réparation HR fonctionnelle (au minimum partiellement) expliquant leur absence de sensibilité à l'olaparib. Nous nous sommes donc demandés si la capacité à former des foyers RAD51 dans ces modèles BRCA1-Me pouvait correspondre à une restauration de la réparation HR suite à l'exposition au traitement néoadjuvant. Nous avons donc isolé des clones résistants à l'olaparib à partir de 3 lignées cellulaires BRCA1, dont nous avons analysé la formation des foyers BRCA1, RAD51, 53BP1 et γH2AX. Remarquablement, tous les variants résistants à l'olaparib ont montré une capacité accrue à former des foyers BRCA1 et RAD51, suggérant que l'acquisition de la résistance à l'olaparib dans ces modèles cellulaires s'appuyait sur une restauration fonctionnelle minimale de la HR. Sur la base de ces résultats nous proposons que la résistance à l'olaparib des modèles PDX BRCA1-Me, préalablement exposées à la NACT, pouvait s'appuyer sur la restauration de la HR suite au traitement. Ceci suggère que les inhibiteurs de PARP ne sont pas une indication adaptée pour les TNBC BRCA1-Me et qu'il serait avisé de déterminer la fonctionnalité de la HR dans ces tumeurs avant d'engager le traitement. En effet, notre travail appuie la pertinence de l'utilisation des tests basés sur la formation de foyers BRCA1 et RAD51 pour déterminer la fonctionnalité de la HR, dont nous avons montré la pertinence en tant que biomarqueurs prédictifs de la réponse aux PARPi et, dans une moindre mesure aux sels de platine dans les TNBC.

Ma contribution dans ce travail a consisté en la réalisation de certaines expériences *in vivo* (greffes des tumeurs, traitement, suivi, sacrifices et échantillonnage biologique ...), ainsi que la réalisation des certaines immunofluorescences.
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OPEN ACCESS

EDITED BY
Chunyan Dong,
Tongji University, China

REVIEWED BY
Federica Guffanti,
Mario Negri Institute for Pharmacological
Research (IRCCS), Italy
Guang Peng,
University of Texas MD Anderson Cancer
Center, United States
Yinlong Yang,
Fudan University, China
Pete Simpson,
The University of Queensland, Australia

*CORRESPONDENCE
Charles Theillet
✉ charles.theillet@inserm.fr

¹These authors have contributed equally to
this work

SPECIALTY SECTION
This article was submitted to
Breast Cancer,
a section of the journal
Frontiers in Oncology

RECEIVED 15 December 2022
ACCEPTED 03 March 2023
PUBLISHED 17 March 2023

**CITATION**
Velazquez C, Orhan E, Tabet I, Fenou L, Orsetti B, Adélaïde J, Guille A, Thézénas S, Crapez E, Colombo P-E, Chaffanet M, Birnbaum D, Sardet C, Jacot W and Theillet C (2023) BRCA1-methylated triple negative breast cancers previously exposed to neoadjuvant chemotherapy form RAD51 foci and respond poorly to olaparib. *Front. Oncol.* 13:1125021.
doi: 10.3389/fonc.2023.1125021

**COPYRIGHT**
© 2023 Velazquez, Orhan, Tabet, Fenou, Orsetti, Adélaïde, Guille, Thézénas, Crapez, Colombo, Chaffanet, Birnbaum, Sardet, Jacot and Theillet. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms.

# BRCA1-methylated triple negative breast cancers previously exposed to neoadjuvant chemotherapy form RAD51 foci and respond poorly to olaparib

Carolina Velazquez¹, Esin Orhan¹, Imene Tabet¹, Lise Fenou¹, Béatrice Orsetti¹, José Adélaïde², Arnaud Guille², Simon Thézénas³, Evelyne Crapez⁴, Pierre-Emmanuel Colombo¹,⁵, Max Chaffanet², Daniel Birnbaum², Claude Sardet¹, William Jacot¹,⁶ and Charles Theillet¹*

¹Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier, IRCM U1194, Montpellier University, INSERM, ICM, CNRS, Montpellier, France, ²Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille, CRCM UMR1068, Aix-Marseille University, IPC, CNRS, Marseille, France, ³Biometry Unit, Institut du Cancer de Montpellier, Montpellier, France, ⁴Unité de Recherche Translationnelle, Institut du Cancer de Montpellier, Montpellier, France, ⁵Oncological Surgery, Institut du Cancer de Montpellier, Montpellier, France, ⁶Clinical Oncology, Institut du Cancer de Montpellier, Montpellier, France

**Background:** About 15% of Triple-Negative-Breast-Cancer (TNBC) present silencing of the BRCA1 promoter methylation and are assumed to be Homologous Recombination Deficient (HRD). BRCA1-methylated (BRCA1-Me) TNBC could, thus, be eligible to treatment based on PARP-inhibitors or Platinum salts. However, their actual HRD status is discussed, as these tumors are suspected to develop resistance after chemotherapy exposure.

**Methods:** We interrogated the sensitivity to olaparib vs. carboplatin of 8 TNBC Patient-Derived Xenografts (PDX) models. Four PDX corresponded to BRCA1-Me, of which 3 were previously exposed to NeoAdjuvant-Chemotherapy (NACT). The remaining PDX models corresponded to two BRCA1-mutated (BRCA1-Mut) and two BRCA1-wild type PDX that were respectively included as positive and negative controls. The HRD status of our PDX models was assessed using both genomic signatures and the functional BRCA1 and RAD51 nuclear foci formation assay. To assess HR restoration associated with olaparib resistance, we studied pairs of BRCA1 deficient cell lines and their resistant subclones.

**Results:** The 3 BRCA1-Me PDX that had been exposed to NACT responded poorly to olaparib, likewise BRCA1-WT PDX. Contrastingly, 3 treatment-naïve BRCA1-deficient PDX (1 BRCA1-Me and 2 BRCA1-mutated) responded to olaparib. Noticeably, the three olaparib-responsive PDX scored negative for BRCA1- and RAD51-foci, whereas all non-responsive PDX models, including the 3 NACT-exposed BRCA1-Me PDX, scored positive for RAD51-foci. This
suggested HRD in olaparib responsive PDX, while non-responsive models were
HR proficient. These results were consistent with observations in cell lines
showing a significant increase of RAD51-foci in olaparib-resistant subclones
compared with sensitive parental cells, suggesting HR restoration in these
models.

**Conclusion:** Our results thus support the notion that the actual HRD status of *BRCA1-Me* TNBC, especially if previously exposed to chemotherapy, may be questioned and should be verified using the *BRCA1- and RAD51-foci* assay.

KEYWORDS

TNBC, BRCA1 methylation, RAD51, nuclear foci, HRD (homologous recombination deficiency)

Background

Triple-negative breast cancers (TNBCs) represent 15% of all breast cancers and its most aggressive subtype (1, 2). Despite good initial chemosensitivity, these tumors show early relapse (1, 3) and, until recently, in the absence of validated drugs only a minority of TNBC were eligible for targeted therapies, thus, stressing the need to develop novel approaches (4).

Another interesting characteristic of TNBC is that this subtype
comprises the largest fraction of BRCA deficient breast tumors (5,
6). BRCA deficiency was originally shown to result from coding
mutations affecting the *BRCA1* or *BRCA2* genes, which are the
principal determinants of genetic predisposition to breast and
ovarian cancers and play central role in Homologous
Recombination (HR) Repair, also called BRCA pathway (7). HR
is an essential and accurate DNA repair pathway (7, 8) and,
noticeably, tumors with an HR deficiency (HRD) show elevated
genetic instability (9) and accrued sensitivity to DNA cross linking
agents such as platinum salts (10, 11). Accordingly, it has been
proposed to include platinum in the standard of care of TNBC (12).
Furthermore, over the past decade, it has been demonstrated that
breast tumors with germline *BRCA1* or *BRCA2* mutations are
exquisitely sensitive to PARP inhibitors, as part of a synthetic
lethal interaction (13–16).

While germline *BRCA1* or *BRCA2* mutations have, until
recently, been the only validated indications for PARPi-based
therapy in breast and ovarian cancer, it has become clear that
they were not the sole causes of an HRD phenotype. Indeed, HRD
has also been associated with somatic mutations and/or epigenetic
silencing affecting the *BRCA1* and *BRCA2* genes, as well as other
genes in the pathway, such as *PALB2*, *RAD51B*, *RAD51C* or
*RAD51D* (5, 6). Because of their obvious clinical implications, the
questions of the actual number of TNBC presenting HRD and the
best approach to detect them have drawn increasing attention.
Whole Genome Sequencing of large cohorts of breast and ovarian
cancers have revealed that BRCA-deficient tumors presented
specific patterns of genomic rearrangements, corresponding to
scars left behind in the tumor genome by faulty repair (17).

Different genomic signatures (HRDetect, HRD-score, Tandem
Duplicator Phenotype, copy number signatures) were established
and used to stratify TNBCs and ovarian cancers (17-20). Some of
these signatures showed strong association with BRCA1/2
mutations (germline or somatic), as well as epigenetic silencing of
BRCA1 (17-19, 21). Consequently, the fraction of TNBC with an
HRD phenotype, which initially was estimated to range 2.7-17.5%
(22, 23), when only germline BRCA1/2 mutations were taken into
account, raised up to 35% on the basis of genomic signatures (17-
19, 21). Interestingly, tumors with an HRD genomic profiles were
associated with better response to therapy and a more favorable
disease outcome (24-27).

Hence, the extension of current PARPi-based therapy
indications in TNBC beyond patients bearing germline BRCA1/2
mutations has become a major question. In particular, the actual
sensitivity of tumors with epigenetically silenced BRCA1 gene due
to the hypermethylation of its promoter is of particular interest, as
they represent an appreciable 15 to 20% of TNBC (19, 21, 28), but
has led to conflicting conclusions (27, 29-32). In particular, the
actual BRCA-deficiency of post-treatment residual BRCA1-
hypermethylated tumors and their subsequent recurrences has
been questioned (31). This point concurs with observations made
in different model systems showing that BRCA-deficient tumors
rapidly acquire treatment resistance and, in most cases, resistance is
due to the partial or complete restoration of HRR upon exposure to
either platinum or PARPi (33, 34). Thus, the actual sensitivity of
TNBC showing all signs of HRD and, particularly, those with
BRCA1 hypermethylation that have been previously exposed to
chemotherapy in the course of the disease could be questioned
(31, 35).

To this aim, we tested in the present study the sensitivity of 8
PDX models, comprising 7 TNBC (2 *BRCA1*-WT, 4 *BRCA1*-
methylated (*BRCA1*-Me), 1 *BRCA1*-Mut) and 1 *BRCA1*-Mut High
Grade Ovarian Serous Ovarian Carcinoma (HGSOC), to the PARP
inhibitor olaparib and to carboplatin (CBP). Of the 8 PDX models
tested, 3 showed stable disease (SD), while the 5 others progressed
under olaparib. PDX models that responded to olaparib were all
treatment naïve and corresponded to 2 *BRCA1*-mutated and one
BRCA1-methylated PDX. The five non-responsive PDX comprised 2 BRCA1 wild type and 3 BRCA1-methylated that, noticeably, were established from TNBC tumors that responded poorly to neoadjuvant chemotherapy (NACT). We, thus, interrogated the HRD status of the tested PDX models and used BRCA1, RAD51, γH2AX and 53BP1 nuclear foci in olaparib treated PDX as read-outs of HR functionality and of DNA damage response. PDX models with reduced BRCA1 and RAD51 foci formation corresponded to olaparib responders, whereas non-responders were all RAD51-foci positive. Remarkably, the three BRCA1-Me PDX established from tumors that responded poorly to NACT were RAD51-foci-positive and progressed under olaparib. This suggested that, despite severely reduced BRCA1 protein expression, HR remained at least partially functional in these models, thus precluding their sensitivity to olaparib. We treated BRCA1 deficient cell lines with olaparib and derived resistant variants. We observed increased BRCA1 and RAD51 foci formation in olaparib resistant variants. The data presented herein suggest that tumors with epigenetically silenced BRCA1 that have been exposed to genotoxic treatment show poor response to olaparib and exhibit BRCA1 and RAD51 foci formation capacity compatible with HR proficiency. Our data, thus, suggest that olaparib may not be a good indication in tumors with epigenetically silenced BRCA1 and supports the implementation of BRCA1 and RAD51 nuclear foci assay as functional read out of HR deficiency in TNBC.

## Materials and methods

### TNBC and HGSOC PDX models and in vivo treatment

TNBC and Ovarian cancer PDX models establishment was as described (36, 37). PDX models used are described in Table 1. The study was reviewed and approved by the ethics committees for animal experimentations of the University of Montpellier (CEEA-LR-12028). PDX models were established from fresh tumor fragments obtained from the Pathology Department at the Comprehensive Cancer Center of Montpellier (ICM) after

informed consent of the patients. Establishment of PDX models was reviewed and approved by the institutional review board. Approximately 50 mm³ PDX fragments were grafted subcutaneously into the flank of 3-4week old Swiss-nude female mice (Charles Rivers, Saint-Germain-sur-l'Arbresle, France). The present study comprised three experimental arms; vehicle, olaparib and Carboplatin (CBP) treatment comprising 6 to 8 mice per arm. When median tumor volume reached 100-150mm³, mice were randomly distributed in the two arms and treatment was started. Olaparib (Lynparza, AstraZeneca) was administered orally 5 times/week for 5 weeks at 100 mg/kg. CBP (Accord Healthcare, Middlesex, UK) was administered by intra-peritoneal (IP) injection twice per week for 4 weeks at 50 mg/kg CBP. At treatment end, mice were euthanized to collect tumor samples for further biochemical (RNA and proteins) or histological analyses. Some mice were kept for tumor volume monitoring.

### MS-PCR

CpG methylation patterns at the BRCA1 promoter were determined using the MS-PCR assay as previously described (28).

### Array-CGH

For each PDX sample, the genomic profile was established by using aCGH onto high-resolution 4 × 180 K CGH-microarrays (SurePrint G3-Human CGH-Microarray, Agilent Technologies). Human female DNA was used as reference (G152A, Promega, Madison, WI, USA). Both experimental and analytic methods have been previously described (38). All probes for aCGH were mapped according to the Genome Reference Consortium Human Build 37 (CGCh37/Hg19; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001405.13/). We used two different threshold values (log2 ratio > 0.5 and 1.0) to distinguish low- (gain/) from high-amplification) and (log2 ratio < -0.3 and -1) to distinguish simple loss from deletion CAN (Copy Number Alterations), respectively. Percentage of altered genome was the number of

<table><caption>TABLE 1 Principal bio-clinical characteristics of the patient tumors from which the PDX models were derived.</caption><thead><tr><th>PDX ID</th><th>BRCA1 Status</th><th>Cancer type</th><th>Grade or Stage</th><th>NACT</th><th>Type of NACT</th><th>response to NACT</th><th>RFS months</th><th>OS months</th></tr></thead><tbody><tr><td>b1995</td><td>WT</td><td>TNBC</td><td>SBR III</td><td>No</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&gt;120</td><td>&gt;120</td></tr><tr><td>b3804</td><td>WT</td><td>TNBC</td><td>SBR III</td><td>yes</td><td>Taxol+ avastin</td><td>Poor response</td><td>&gt;120</td><td>&gt;120</td></tr><tr><td>b3977</td><td>Me/Me</td><td>TNBC</td><td>SBR III</td><td>yes</td><td>FEC+T</td><td>refractory</td><td>5</td><td>9</td></tr><tr><td>b4122</td><td>Me/Me</td><td>TNBC</td><td>SBR III</td><td>No</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&gt;120</td><td>&gt;120</td></tr><tr><td>15b0018</td><td>Me/Me</td><td>TNBC</td><td>SBR II</td><td>yes</td><td>FEC+T</td><td>Poor response</td><td>35</td><td>&gt;60</td></tr><tr><td>15b1516</td><td>U/Me</td><td>TNBC</td><td>SBR III</td><td>yes</td><td>FEC+T</td><td>refractory</td><td>7</td><td>8</td></tr><tr><td>Tm168</td><td>Mut pS1524fs</td><td>TNBC</td><td>SBR III</td><td>No</td><td>NA</td><td>NA</td><td>3</td><td>7</td></tr><tr><td>010047</td><td>Mut Del exon 8-13</td><td>HGSOC</td><td>Stage IV</td><td>No</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&gt;145</td><td>&gt;145</td></tr></tbody></table>

WT, wild type; Me/Me both alleles methylated. U/Me hemi methylation. TNBC, triple negative breast cancer; HGSOC, High grade serous ovarian carcinoma. NC, not communicated; NA, not applicable; NACT, neoadjuvant chemotherapy; FEC, Fluorouracy. Epirubicin. Cyclophosphamide; RFS, recurrence free survival; OS, Overall Survival.