CFU/mL ie a total of 8.7 log₁₀ CFU) was mixed with 5.7 log₁₀ PFU (ie MOI 1.10⁻³) and incubated under constant shaking (150 rpm, 37°C). Samples from this mixture were withdrawn at specific time points to measure optical density at 600 nm and count the number of phages after serial dilutions and plating on LB agar covered with strain 536. Experiments were performed three times from independent cultures.

## Kinetic of lysis

To assess the behavior of strain 536 in presence of phage 536_P1 at different MOI, OD600 nm was recorded over time from microtiter plates. In each well, 180 µL of an exponential culture of strain 536 (OD 0.1) was mixed with 20 µL of phage 536_P1 at different concentrations (each replicated six times) to reach MOI of 0.001; 0.01; 0.1; 1 and 10. Controls included wells with phage alone, or bacteria alone or LB alone. The microplates were incubated in a microplate reader (Tecan) set at 37°C during 12h with orbital agitation. Three independent experiments were performed.

## In vitro data analysis

Models of *in vitro* data were built using similar methodology used for analyzing *in vivo* PK/PD data: parameters of mixed models were estimated using SAEM algorithm and the model selection was based on BIC. Model of phage/bacteria interactions *in vitro* was built in three steps.

First, one step growth experiments reproduced a single lysis cycle of the phage and therefore allowed to estimate the burst size (i.e. the number of virions released from each bacterium lysed) and the time of a cycle, including an eclipse period. The best fit of these one step growth data was obtained using a multiple transit compartments model. The burst size (570 virions) was estimated with acceptable precision of estimation (relative standard error <30%). The median period for a phage to produce and release new phages was estimated at 35 minutes. Second, bacterial growth was characterized from the above *in vitro* experiments exploiting the condition MOI 0 (without any phage). The bacterial doubling time was estimated at 63 minutes from the model. Third, lysis kinetics experiments (at MOI> 0) were modelled using a predator-prey model with similar structure to *in vivo* model (see equations and table of parameters below). Burst size and bacterial growth were fixed at values respectively obtained at the above first and second steps. The lysis rate (corresponding to rate between infected latent and infected productive bacteria) was fixed from one step growth experiments on 536_P1. The eclipse period
was obtained by sensitivity analysis on the transition rate *e*. The proportion of phage-resistant clones at baseline and their relative fitness were characterized from this model.

$$ \frac{dS}{dt} = \alpha \left( 1 - \frac{S + I_1 + I_2 + R}{10^{B_{max}}} \right) S - \beta VS $$

$$ \frac{dI_1}{dt} = \beta VS - eI_1 $$

$$ \frac{dI_2}{dt} = eI_1 - \delta_v I_2 $$

$$ \frac{dR}{dt} = wa \left( 1 - \frac{S + I_1 + I_2 + R}{10^{B_{max}}} \right) R $$

$$ \frac{dV}{dt} = - \beta VS + \delta_v b I_2 $$

<table><caption>Table S1. Parameter estimates of the final *in vitro* model</caption><thead><tr><th>Parameter</th><th>Name</th><th>Unit</th><th>Fixed/Estimated from</th><th>Fixed effect (rse, %)</th><th>Sd of random effect (rse, %)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Bacterial growth rate</td><td>α</td><td>min<sup>-1</sup></td><td>Coev + Lysis (MOI 0)</td><td>0.011 (-)</td><td>0 (-)</td></tr><tr><td>Initial number of susceptible</td><td>S<sub>0</sub></td><td>log<sub>10</sub> CFU mL<sup>-1</sup></td><td>Coev + Lysis (MOI 0)</td><td>7.9 (-)</td><td>0 (-)</td></tr><tr><td>Bacterial load plateau</td><td>B<sub>max</sub></td><td>log<sub>10</sub> CFU mL<sup>-1</sup></td><td>Coev + Lysis (MOI 0)</td><td>9.9 (-)</td><td>0 (-)</td></tr><tr><td>Infectivity rate</td><td>β</td><td>log<sub>10</sub> mL CFU<sup>-1</sup> min<sup>-1</sup></td><td>Lysis (MOI > 0)</td><td>9.6 (&lt;1)</td><td>0.01 (26)</td></tr><tr><td>Transition rate</td><td>e</td><td>min<sup>-1</sup></td><td>Lysis (MOI > 0)</td><td>0.02 (-)</td><td>0 (-)</td></tr><tr><td>Lysis rate</td><td>δ<sub>V</sub></td><td>min<sup>-1</sup></td><td>Dufour et al., 2017</td><td>0.5 (-)</td><td>0 (-)</td></tr><tr><td>Burst size</td><td>b</td><td>PFU CFU<sup>-1</sup></td><td>OSG</td><td>570 (-)</td><td>0 (-)</td></tr><tr><td>Initial number of resistant</td><td>R<sub>0</sub></td><td>log<sub>10</sub> CFU mL<sup>-1</sup></td><td>Lysis (MOI > 0)</td><td>6.7 (&lt;1)</td><td>0.05 (10)</td></tr><tr><td>Relative fitness</td><td>w</td><td>-</td><td>Lysis (MOI > 0)</td><td>0.49 (4)</td><td>0.27 (10)</td></tr><tr><td>Additive error on bacterial load</td><td>σ<sub>B</sub></td><td>log<sub>10</sub> PFU g<sup>-1</sup></td><td>Lysis (MOI > 0)</td><td>-</td><td>0.1 (1)</td></tr></tbody></table>

Sd: standard deviation, rse: relative standard error
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# Quatrième partie : Discussion

La première partie des travaux de recherche de ce doctorat est consacrée à l'étape se trouvant en amont de la modélisation par MNLEM : la planification du protocole. Dans la seconde partie de cette thèse, les MNLEM sont utilisés pour analyser des données de phagothérapie. Ces deux parties sont discutées successivement.

## 4.1. Protocoles en modélisation

Un protocole d'essai clinique bien choisi permet d'obtenir une bonne précision d'estimation des paramètres du modèle et donc de pouvoir répondre aux objectifs de l'étude. Deux projets de ce doctorat s'inscrivent dans le cadre du développement de méthodes pour évaluer et optimiser des protocoles à partir de la FIM. Un autre travail, plus appliqué, porte sur l'évaluation de protocoles par simulations en oncologie.

### 4.1.1. Protocoles robustes prenant en compte l'incertitude du modèle

Dans le premier travail, nous avons développé et évalué une approche de protocoles robustes tenant compte de l'incertitude du modèle, dans le cadre d'études longitudinales avec réponse binaire. Cette stratégie de planification de protocoles est basée sur la FIM, évaluée par MC/HMC. Cette approche permet de prendre en compte l'incertitude du choix de modèle en supposant plusieurs modèles de structure candidats, à partir d'un critère d'optimalité composé (Atkinson et al. 2007). Par la même occasion, nous avons proposé la possibilité de considérer un sous-ensemble de paramètres dont on cherche à maximiser la précision d'estimation, sans trop pénaliser celle des autres paramètres. Si ce sous-ensemble de paramètres contient des effets de covariables, optimiser un protocole par cette méthode aura notamment pour but d'optimiser la puissance du test de Wald pour ces effets de covariables. Cette approche de planification de protocole robuste a été évaluée par simulations pour la première fois. Cette analyse a confirmé la pertinence de cette méthode, le protocole robuste s'étant montré plus performant que les autres protocoles évalués (un protocole non-optimisé et un protocole optimisé par une approche non robuste).

Concernant la méthode permettant de s'intéresser davantage à certains paramètres au travers du critère $DD_s$, nous avons proposé une méthode permettant d'obtenir le meilleur compromis
possible entre les précisions d'estimation des deux sous-ensembles de paramètres ($\psi_S$ et $\psi_T$, respectivement les paramètres d'intérêt et les autres paramètres estimés). Notre proposition est de maximiser le produit des efficacités D et Ds, cette méthode est cependant adaptable selon l'objectif de l'étude. Nous nous sommes placés dans un cas où $\psi_S$ était identique pour chacun des modèles candidats, il serait intéressant de réaliser un autre travail avec des $\psi_S$ de différentes tailles selon le modèle candidat considéré, par exemple des modèles PKPD avec des relations concentration-effet différentes (linéaires et non-linéaires).

Le biais d'estimation obtenu lors de notre évaluation par simulations est un élément de discussion important. Différents algorithmes d'estimation, réglages d'algorithmes et différents logiciels ont été essayés afin de parvenir aux résultats les moins biaisés possibles pour l'ensemble des paramètres des différents modèles, mais un léger biais d'estimation demeure, notamment pour l'effet traitement et les paramètres du modèle exponentiel (modèle le plus complexe parmi les modèles considérés). Il serait intéressant d'effectuer une comparaison d'algorithmes d'estimation pour les modèles logistiques mixtes.

Dans l'application choisie dans ce travail, nous avons choisi de simuler des données avec un modèle parmi les autres modèles candidats. Il serait intéressant de simuler des données avec un modèle plus complexe, non considéré *a priori* lors de la planification du protocole (puis utilisé ou non lors de l'analyse des données), afin d'étudier l'apport de l'approche robuste dans un contexte plus proche de la réalité. Dans le but d'étudier la sensibilité de notre méthode, d'autres scénarios pourraient être considérés, avec plus ou moins de modèles candidats, des poids différents sur chaque modèle ou encore des problématiques de protocole plus complexes, par exemple avec davantage de temps de mesures à optimiser que dans l'application présentée. L'approche de protocole robuste est proposée dans le cadre de données binaires répétées. Cette stratégie pourrait néanmoins être appliquée à d'autres types de données, continues comme non-continues. Par exemple, le même type d'approche, prenant en compte l'incertitude du modèle en utilisant la théorie du design composé, a été appliquée aux données de comptage analysées par modèles de Poisson, en tenant compte de l'incertitude des paramètres en plus de cette du modèle (Loingeville et al. 2019). Il reste cependant à évaluer la pertinence de cette approche étendant les protocoles robustes à l'incertitude des paramètres par CTS, voire à appliquer cette méthode à d'autres types de données.

Le principal pré-requis pour utiliser une approche de planification de protocole robuste est de disposer d'une méthode adéquate pour évaluer la FIM des modèles candidats. La méthode FO permet d'évaluer efficacement la FIM pour modèles de données continues (Mentré et al. 1997),
tandis que les méthodes MC/HMC et MC/AGQ, voire QRMC/AGQ sont préférables pour les données binaires et de comptage (Riviere et al. 2016; Ueckert and Mentré 2017). La FIM a été évaluée par QRMC/AGQ pour le travail sur l’algorithme multiplicatif (sections 2.2.1 et 4.1.2.), pour un exemple d’application similaire à celui utilisé pour le développement de l’approche robuste. De plus, il serait opportun de développer une méthode permettant d’évaluer la FIM pour les modèles conjoints, dont l’utilisation en pharmacométrie est de plus en plus fréquente (Desmée et al. 2015; Tardivon et al. 2019; Yu et al. 2020).

L'optimisation de protocole adaptatif par la FIM est aussi une approche qui mérite d'être développée. L'apport de cette approche a d'ailleurs été étudié pour une application en oncologie (Lestini et al. 2015). Ce travail avait montré qu'utiliser la FIM empirique, obtenue à partir de données issues d'une première étape, permettait de choisir efficacement le protocole de la deuxième étape. Cela permettait finalement d'aboutir à une estimation de paramètres plus précise et moins biaisée qu'avec un protocole à une étape, notamment lorsque les paramètres étaient mal choisis pour la planification de la première étape. Ce type d'approche est compatible avec l'approche robuste présentée dans cette thèse. Pour ce faire, la première étape est planifiée selon la méthode présentée dans l'article, avec plusieurs modèles candidats et un poids identique pour chacun des modèles définis, en tenant éventuellement compte de l'incertitude des paramètres de chaque modèle. A la fin de la première étape du protocole, les données obtenues par les $M(m = 1, ..., M)$ sont décrites par les modèles candidats. Afin de planifier la seconde étape, les poids de chacun des modèles $w_m$ sont redéfinis à partir des AIC obtenues, selon le principe du *model averaging* (équation 36) :

$$w_m = \frac{e^{-\frac{AIC_m - AIC_{min}}{2}}}{\sum_{m=1}^{M} e^{-\frac{AIC_m - AIC_{min}}{2}}}, \quad (36)$$

avec $AIC_m$, l'AIC du modèle candidat $m$ et $AIC_{min}$ l'AIC du modèle le plus parcimonieux (avec l'AIC le plus bas). Les valeurs de paramètres sont aussi mises à jour pour la planification de la seconde étape de l'étude.

### 4.1.2. Algorithmes multiplicatifs

Dans l'article discuté ci-dessus (section 4.1.1.), la planification de protocole est réalisée selon une approche combinatoire (en évaluant tous les protocoles possibles puis en choisissant le meilleur). L'approche robuste est néanmoins compatible avec l'utilisation d'un algorithme
d'optimisation de protocole, dès lors que cet algorithme puisse converger vers le protocole
optimal selon le critère d'optimalité utilisé.

Le second travail sur les protocoles consistait à étendre l'utilisation d'algorithmes multiplicatifs
à l'optimisation de protocoles d'études longitudinales fondée sur la FIM pour les modèles
mixtes. Cet algorithme possède de multiples avantages tels que sa simplicité de fonctionnement
et d'intégration aux différents problèmes d'optimisation de protocole. Lors de l'utilisation
d'algorithmes multiplicatifs, l'espace de design est exploré de manière discrète, à partir de
contraintes de design énoncées avant calcul. A partir de ces contraintes sont donc énoncés les
protocoles élémentaires possibles de manière combinatoire (de même que pour le premier
travail présenté section 2.1.), avec une FIM associée à chaque protocole. Ce sont en fait les
poids associés à chaque design élémentaire qui sont optimisés par l'algorithme. Les poids
finaux sont alors les proportions de sujets à allouer aux designs élémentaires correspondants.
Cet algorithme est applicable à différents types de données et de modèles, dès lors qu'une
méthode permettant d'évaluer la FIM de manière adéquate est disponible. Nous avons illustré
l'intérêt de cet algorithme dans deux exemples. Le premier était une optimisation de temps de
mesure et de doses pour un modèle de réponse continue avec une FIM évaluée par FO. Le
second était une optimisation de temps de mesure pour un modèle de données binaires répétées
(similaire à l'un de ceux utilisés pour le premier travail au cours duquel la FIM était évaluée
par MC/HMC), avec une FIM évaluée par QRMC/AGQ, une méthode récente permettant
d'évaluer la FIM efficacement pour des modèles de réponses continues et discrètes et plus
rapidement que par MC/HMC pour des modèles avec un nombre réduit d'effets aléatoires, ce
qui était le cas ici (Ueckert and Mentré 2015).

Dans la première application, nous avons montré que l'utilisation de cet algorithme permet
d'optimiser à la fois des temps de mesures et des doses. Cela pourrait être étendu à d'autres
éléments de protocoles tels que le nombre de temps de mesure ou des modalités
d'administration différentes.

Deux versions de l'algorithme ont été programmées, la première en langage R et la seconde en
C. L'algorithme écrit en C a montré de meilleures performances en temps de calcul que celui
en R pour les différentes applications étudiées. Par exemple, pour l'optimisation des poids des
1932 protocoles élémentaires différents dans la première application, le temps de calcul était de
31 s en R contre 432 s en C. L'algorithme écrit en C plutôt qu'en R devrait donc montrer un
intérêt particulier lorsque le nombre protocoles élémentaires possibles est très grand, par
exemple au-delà de 100 000.
Les preuves de monotonie et de convergence vers le protocole D-optimal ont été fournies précédemment, pour tout $\lambda$ (le paramètre de calibration) compris entre 0 et 1 (Yu 2010). Proposer ces démonstrations détaillées dans le manuscrit pourrait faciliter sa lecture. Nous avons choisi de fixer le paramètre de calibration à 0.99, cette valeur nous ayant permis d'obtenir la convergence de l'algorithme pour nos différentes applications. La sensibilité de l'algorithme à ce paramètre de calibration aurait pu être étudiée. Dans nos exemples, les protocoles ont été optimisés selon le critère D pour lequel la preuve de convergence des algorithmes multiplicatifs a été établie, tout comme pour les critères A et C (Yu 2010). Le calcul du critère Ds (obtenu à partir du déterminant d'une partie de la FIM) étant proche de celui du critère D, il pourrait aussi être utilisé lors d'optimisation de protocoles par algorithme multiplicatif. Il a par ailleurs été montré que les algorithmes multiplicatifs étaient compatibles avec l'utilisation de critères d'optimalité combinant deux critères (Holland-Letz 2017). Le critère DDs, utilisé dans le premier travail (section 2.1.), pourrait donc aussi être utilisé pour trouver les poids optimaux de chaque protocole élémentaire avec l'algorithme multiplicatif. Il serait intéressant d'évaluer la capacité des algorithmes multiplicatifs à optimiser des protocoles selon des critères robustes, utilisés en cas d'incertitude du modèle (par exemple, le critère CD (voir section 2.1.)), des paramètres (par exemple le critère ED) ou des deux (par exemple, le critère CDE). Par ailleurs, il serait intéressant d'étendre l'utilisation de cet algorithme à l'optimisation de variables dans d'autres contextes, par exemple dans les modèles décrivant des données répétées non longitudinales. Nous avons observé que l'utilisation de cet algorithme permet d'obtenir un design pouvant être composé de plusieurs protocoles élémentaires informatifs, ce qui est difficilement réalisable lors d'optimisation combinatoire, comme par exemple dans le premier travail (section 2.1.), où tous les individus étaient affectés à un seul protocole élémentaire. Pour cet exemple commun aux travaux exposés en sections 2.1. et 2.2., l'algorithme multiplicatif a permis de trouver un design D-optimal composé de trois protocoles élémentaires différents. Une des limites du travail présenté est l'absence de comparaison à d'autres algorithmes, par exemple à l'algorithme de Fedorov-Wynn. Des comparaisons pourraient être effectuées à l'avenir, tant en termes de conception, d'utilisation (par exemple, FW nécessite de fournir un protocole initial contrairement aux algorithmes multiplicatifs) que de résultats (protocole optimal et temps de calcul notamment).

Afin d'éviter de passer à côté de protocoles efficaces avec l'algorithme multiplicatif, il est souhaitable, lorsque cela est possible, de définir des contraintes permettant d'évaluer un nombre suffisamment important de protocoles, tout en tenant compte du temps de calcul nécessaire à
l'évaluation de la FIM par protocole élémentaire. Ceci est notamment important pour les méthodes d'évaluation de la FIM pour modèles de données discrètes (telles que QRMC/AGQ ou MC/HMC), beaucoup plus coûteuses en temps de calcul que la méthode FO qui est adaptée aux modèles peu complexes pour données continues. L'algorithme développé dans ce travail requiert une discrétisation de l'espace de design, ce qui permet de trouver le protocole D-optimal dans cet espace défini. L'utilisation d'un algorithme permettant de chercher un design dans un espace continu peut permettre de trouver un protocole plus efficace. Cependant, l'optimisation en temps ou en doses continus peut conduire à des protocoles difficilement réalisables en clinique.

L'algorithme développé dans le cadre de ce travail sera intégré dans la prochaine version de PFIM, PFIM 5.0 (Seurat et al. 2019). Le programme PFIM a été reprogrammé entièrement, une version alpha est actuellement disponible sous forme de librairie R. et la version beta est prévue au cours du premier semestre 2021. Comme indiqué dans la section 2.2.2., la modularité de la programmation orientée-objet permettra d'intégrer de nouvelles fonctions dans le programme à chaque nouvelle version.

Parmi les nouvelles fonctionnalités à intégrer à PFIM 5.0., certaines méthodes ont été développées et ont fait l'objet de publications, mais ne sont pas encore disponibles dans les programmes de planification de protocole. Il existe au moins 3 méthodes permettant d'évaluer adéquatement la FIM pour des modèles de données discrètes : MC/HMC (Riviere et al. 2016), MC/AGQ (Ueckert and Mentré 2017) et QRMC/AGQ (Ueckert and Mentré 2015), il pourrait être intéressant de comparer ces méthodes afin de déterminer la ou lesquelles il serait préférable d'intégrer au programme. Dans la version actuelle, il est uniquement possible d'optimiser un protocole selon le critère D, c'est-à-dire de chercher le protocole permettant d'obtenir les meilleures précisions d'estimations de l'ensemble des paramètres, pour un modèle et ses valeurs de paramètres donnés. Comme expliqué en sections 1.2.1.2, 2.1, et plus haut dans cette section, d'autres critères d'optimalités peuvent avoir leur intérêt pour répondre à d'autres objectifs. Par exemple, le critère DDs serait intéressant à intégrer au logiciel, pour les cas où l'objectif serait de chercher un protocole permettant une estimation précise de certains paramètres sans sacrifier la précision des autres paramètres. Sont aussi à intégrer dans PFIM les développements méthodologiques concernant les designs robustes, en cas d'incertitude du modèle et/ou des paramètres (Loingeville et al. 2019). Vérifier la convergence des algorithmes vers le protocole optimal selon les différents critères d'optimalité est cependant nécessaire avant la mise à disposition de ces approches.
De nouveaux algorithmes d'optimisation pourraient aussi être proposés dans PFIM, notamment pour l'optimisation dans un espace de design continu. Par exemple, *Particle Swarm Optimization* (PSO), une métaheuristique d'algorithme dont plusieurs applications d'optimisation de protocoles d'études biomédicales ont été effectuées (Qiu et al. 2014). Cette méthode a été étendue et adaptée aux études longitudinales analysées par modèles mixtes, dans le cadre d'une collaboration entre le département de biostatistiques de l'Université de Los Angeles et notre équipe et un article est soumis dans *Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics)*. Un autre algorithme, développé dans notre équipe, dérivé de l'algorithme de Metropolis-Hastings et nommé PGBO (*Population Genetics-Based Optimizer*) pourrait aussi être intégré dans PFIM 5.0. (Bauer et al. 2014).

D'autres méthodes en optimisation de protocoles nécessitent d'être développées. Aujourd'hui dans PFIM 4.0., il est possible de prédire la puissance du test de Wald pour des covariables catégorielles à partir de la FIM. Il est envisagé d'étendre cette fonctionnalité aux covariables continues, en supposant une distribution *a priori* de ces covariables au sein de la population. Les logiciels d'estimations de paramètres en pharmacométrie tels que Monolix permettent de définir des distributions logit-normale et probit-normale, il serait intéressant de pouvoir utiliser ces distributions dans PFIM. De même, il serait utile de prendre en compte les données sous la limite de quantification lors de l'évaluation et de l'optimisation de protocoles, la vraisemblance se calculant différemment pour ce type de données (Ahn et al. 2008). L'inverse de la FIM étant la borne inférieure de la matrice de variance-covariance, une pratique courante consiste à utiliser la FIM pour trouver le protocole optimal puis simuler des jeux de données pour vérifier que ce protocole permet réellement de répondre à l'objectif. Il serait intéressant, soit d'intégrer un outil de simulation dans PFIM soit de développer son interopérabilité avec des outils permettant de le faire. Un objectif du programme DDMoRe (http://www.ddmore.eu/) est de faciliter le passage entre les différents programmes utilisés en pharmacométrie, d'estimation de paramètres et d'optimisation de protocole. A ce sujet, le programme Pumas vise à intégrer l'ensemble de ces fonctionnalités (http://dev.pumas.ai/) et un outil d'évaluation et optimisation de protocoles est aussi disponible dans la version actuelle de NONMEM (NONMEM 7.5.).

### 4.1.3. Comparaison de protocoles pour évaluer la décroissance tumorale précoce

Pour évaluer un nombre restreint de protocoles, l'approche par simulations est préférable à celle basée sur la FIM, comme expliqué section 1.2.2. Nous avons donc appliqué cette approche en
oncologie, où l'objectif était de comprendre quels protocoles étaient préférables afin de montrer
l'efficacité d'une nouvelle combinaison de molécules sur la décroissance tumorale à 8 semaines
de traitement (ETS8), par rapport au traitement de référence. Le traitement de référence
considéré était le cetuximab (C) à dose standard et la nouvelle combinaison testée était le
cetuximab (à dose standard ou inférieure) et une nouvelle molécule M (à dose standard fixée).
Nous avons simulé des données de taille tumorale à partir d'un modèle de croissance tumorale
incluant l'effet propre de chaque molécule ainsi que l'interaction entre les deux drogues. Pour
chaque protocole, trois scénarios ont été étudiés : pas d'effet de M (afin d'investiguer l'erreur
de type 1), additivité de C et M et synergie de C et M. Dans ce travail, nous avons montré qu'un
protocole à 1 bras, c'est-à-dire la comparaison des résultats du bras expérimental (ici la
combinaison des deux anticancéreux à la dose standard) à une valeur de référence obtenue à
partir d'une étude précédente, permet de maximiser la puissance statistique pour montrer un
effet de la nouvelle thérapie. Cependant, ce type de protocole nécessite de faire l'hypothèse de
connaître la valeur à laquelle se comparer pour le traitement de référence. Cela est possible si
les conditions (caractéristiques des patients, prise en charge médicale, techniques analytiques,
etc.) dans lesquelles a été obtenue la valeur de référence sont similaires à celles de la nouvelle
étude, or ces conditions peuvent évoluer, en particulier en oncologie. En effet, nous avons
montré qu'une erreur sur cette valeur de référence conduit à une inflation de l'erreur de type 1,
voire à une réduction de la puissance si la valeur de référence choisie est plus élevée que la
vraie valeur. Un protocole incluant un bras avec traitement de référence est donc préférable, ce
qui a aussi été montré dans d'autres cadres (Viele et al. 2014). Des protocoles à deux bras (la
référence C vs. la combinaison C+M aux doses standards) et quatre bras (C vs. C+M avec
différentes doses de C possibles) ont été étudiés. Pour un même nombre total de patients, le
protocole à deux bras permettait d'atteindre une meilleure puissance statistique que celui à
quatre bras (en cas d'additivité, 69 % vs. 26 %). Un protocole à quatre bras permettait cependant
une meilleure exploration de la relation exposition médicamenteuse-effet ainsi qu'un choix de
dose de C plus pertinent pour la combinaison C+M. De plus, dans le scénario de synergie entre
les deux molécules, la puissance atteinte pour détecter un effet supérieur de la combinaison était
supérieure à 60 %, rendant ainsi ce choix de protocole potentiellement pertinent.

Nous avons aussi comparé les résultats obtenus à partir des tests statistiques réalisés avec les
valeurs continues à ceux obtenus avec ces valeurs catégorisées en fonction de la valeur de
décroissance tumorale à 8 semaines, tel que cela peut être fait pour les critères RECIST
(Eisenhauer et al. 2009). Dans notre exemple, la puissance pour détecter un effet de la
combinaison dans un protocole à deux bras (essai contrôlé randomisé classique) était de 69 %
en utilisant les valeurs continues, contre 47 % en utilisant une réponse binaire de type
répondeur/non répondeur selon la valeur d'ETS8. Cela montre, en accord avec d'autres études,
que l'utilisation des critères RECIST n'est pas optimale dans les études cliniques en oncologie
(Sharma et al. 2012).

Lors de l'évaluation de protocole par simulations d'essais cliniques, il est recommandé de se
rapprocher du contexte réel de l'étude que l'on veut étudier, par exemple en incluant les écarts
au protocole théorique (mauvaise adhérence à la thérapie, données manquantes, sorties d'étude,
temps de mesure différents de ceux initialement prévus, etc.) (Sheiner 2002). Ces éléments
n'ont pas été pris en compte dans cette étude de simulation afin de faciliter l'analyse et
l'interprétation des résultats, et parce que ces écarts au protocole sont rares dans les 8 premières
semaines de thérapie, leur prise en compte aurait donc eu un faible impact sur les résultats.

Ici, les protocoles considérés étaient relativement classiques, mais d'autres possibilités auraient
pu être envisagées. Il aurait par exemple été intéressant d'étudier un protocole à 2 bras avec
davantage de sujets dans le bras expérimental (C+M) que dans le bras contrôle (C). Un essai
adaptatif aurait aussi été intéressant à évaluer dans ce cadre. Lors de la première étape, deux
bras seraient considérés : un bras pour la combinaison aux doses standard C+M et un bras
contrôle C. Lors d'une analyse intermédiaire, selon un critère défini, par exemple fondé sur une
différence d'ETS8 minimale et/ou sur une p-valeur du test de Wilcoxon, l'étude serait arrêtée
pour futilité ou continuée, soit avec les deux mêmes bras, soit en ajoutant la possibilité d'étudier
la combinaison avec une dose inférieure de C (afin de limiter la toxicité) si l'effet de la
combinaison est déjà montré à la fin de la première étape.

De manière générale dans les études cliniques sur une nouvelle combinaison, lorsque cela est
possible d'un point de vue éthique, il est préférable de choisir un protocole randomisé à
plusieurs bras afin d'identifier au mieux les effets de chaque molécule de la combinaison
considérée, notamment lorsque l'étude porte sur une nouvelle combinaison de drogues dont une
est le traitement de référence (LoRusso et al. 2010).

4.2. Modélisation de l'interaction bactériophages/bactéries
pour le traitement de la pneumonie

Les bactériophages font partie des solutions envisageables pour contrer l'émergence des
résistances bactériennes aux antibiotiques. A partir de données issues d'une série d'expériences
*in vitro* et chez un modèle murin d'infection pulmonaire, nous avons construit un modèle
permettant notamment de comprendre les interactions phages-bactéries, et de comparer
l'efficacité de la phagothérapie selon différentes modalités d'administration. Ce modèle a été
construit en plusieurs étapes, à partir de données provenant de différentes expériences. C'est à
notre connaissance la première fois que l'on dispose d'une telle richesse de données, en quantité
(total de 81 expériences *in vitro* et 241 souris) et en diversité (3 types d'expériences *in vitro* et
deux *in vivo*) pour un même couple phage-bactérie afin de comprendre leur interaction à l'aide
d'un modèle mathématique.

A partir de données *in vitro*, ont été déterminées des paramètres concernant le cycle d'infection de la bactérie *E.coli* 536 par le bactériophage 536_P1. Par exemple, le *burst size*, c'est-à-dire le nombre de phages libérés à chaque bactérie lysée, a été estimé grâce aux données de *one step growth*. Les paramètres de durée du cycle infectieux (environ 30 minutes) ont été estimés, l'identification de la phase de latence médiane et de la phase d'éclipse médiane pourrait cependant être meilleure grâce à des expériences avec et sans chloroforme, celui-ci permettant de détecter les phages intra-bactériens en plus des phages libres (Rabinovitch et al. 1999). D'autres paramètres ont été estimés à partir des données *in vitro* (expériences de cinétique de lyse et de co-évolution), par exemple le taux d'infectivité (c'est-à-dire la probabilité de rencontre entre phage et bactérie) et les paramètres de résistance (fréquence de fluctuation et valeur sélective). Ces paramètres ont cependant été ré-évalués pour les expériences *in vivo*.

Chez la souris non infectée, la PK des phages a été évaluée à la suite de l'administration IT ou
IV d'une dose connue de bactériophages (10⁸ PFU). Pour ces expériences, une mesure de la
concentration de phage était effectuée uniquement lors du sacrifice des souris. L'analyse de ces
données par modèles mixtes fournissait des paramètres incohérents, nous avons donc choisi
d'analyser celles-ci par naïve pooled data, méthode consistant ici à rassembler toutes les
données de souris par voie d'administration et de considérer celles-ci comme un individu. Cette
méthode, bien que potentiellement biaisée et moins puissante que les modèles mixtes (Wang et
al. 2018), nous a permis d'obtenir des paramètres PK cohérents par rapport à ceux retrouvés
dans la littérature et de détecter une différence de vitesse d'élimination entre les deux voies IT
et IV, les phages se distribuant probablement davantage plus profondément dans les alvéoles
pulmonaires après administration IT (Morello et al. 2011; Oechslin et al. 2017).

Les données issues d'études chez la souris infectée étaient particulièrement innovantes et
informatives. Les bactéries étant bioluminescentes, des données longitudinales de charge
bactérienne au niveau pulmonaire étaient produites et ont pu largement aider à la description de
l'évolution de l'infection. Alors que les MNLEM semblent être l'outil idoine pour décrire les
données issues de cette technologie, ils sont à notre connaissance encore peu utilisés pour ces
analyses. Les souris infectées étaient réparties dans 6 groupes de traitement par phage
différents : non traitées (contrôle), par voie IV à dose faible (IV Lo) ou intermédiaire (IV Med)
ou par voie IT à dose faible (IT Lo), intermédiaire (IT Med) ou haute (IT Hi). Le modèle final
décrivant ces données était composé d'équations différentielles ordinaires permettant
d'expliquer l'évolution de la charge bactérienne et la cinétique des phages au niveau
pulmonaire, en décrivant les interactions entre phages et bactéries. Ce modèle prenait en compte
d'autres composantes comme la cinétique propre du phage (telle que décrite chez la souris non
infectée) ou le rôle de l'immunité innée dans le contrôle de l'infection. Le modèle a également
décrit la probabilité de survie des souris de manière conjointe à la charge bactérienne
longitudinale.

On remarque une forte hétérogénéité d'inoculum bactérien réel, alors que celui-ci était
théoriquement similaire pour l'ensemble des souris. Cela est probablement lié au mode
d'inoculation choisi, par voie intratrachéale, cette manipulation étant plus sujette à une
variabilité inter-souris. La variabilité était par exemple moindre lors d'expériences précédentes
menées sur le même type de souris, mais par inoculation intranasale (Dufour et al. 2015). Cette
variabilité d'inoculum a finalement été estimée au sein du modèle, et a permis d'expliquer des
profils très variés d'évolution de charge bactérienne, pour le groupe contrôle comme pour les
différents groupes traités par phages. Elle permet aussi d'appréhender la phagothérapie d'un
point de vue plus proche d'une réalité clinique où les charges bactériennes sont différentes lors
de l'administration.

Lors de la construction du modèle, l'ajout d'un compartiment de bactéries réfractaires aux
phages a permis d'assurer une meilleure description des données observées, notamment chez
certaines souris présentant un « rebond » de la charge bactérienne après 24 h. Ce phénomène
avait aussi été observé *in vitro* lors des expériences de cinétique de lyse et de co-évolution, 10
heures après la mise en contact des phages et des bactéries. Au sein de ces bactéries dites
réfractaires, sont probablement regroupées les bactéries résistantes au phages et celles non
atteintes par les phages pour des problèmes de répartition spatiale.

On remarque que certains paramètres ont été estimés à des valeurs différentes chez la souris par
rapport à celles estimées *in vitro*, notamment le taux d'infectivité β et le taux de lyse
bactérienne k. Cela s'explique par la différence de milieu entre ces deux types d'expériences et
surtout au rôle important de l'immunité de l'hôte sur l'évolution de la charge bactérienne.
La caractérisation de l'interaction phage-bactérie chez la souris, bien qu'acceptable, pourrait être améliorée par une technologie permettant de suivre le compte pulmonaire de phages de façon longitudinale plutôt qu'au temps de sacrifice uniquement. Le modèle intègre à la fois l'interaction phage-bactérie, mais aussi, de manière relativement simpliste, le rôle de la réponse immunitaire sur la charge bactérienne. Le suivi de marqueurs de l'immunité pourrait aider à caractériser le rôle des défenses de l'hôte de manière plus fine (Roach et al. 2017).

Le modèle développé et les simulations effectuées à partir du modèle permettent d'aider à la compréhension des différences entre les groupes. Pour un inoculum létal (survie de 0 % à 48 h) chez une souris non traitée (correspondant à $10^7$ CFU/g), le temps après administration nécessaire à l'obtention d'une concentration de phage supérieure à 9 log est différent selon la voie d'administration IV ou IT et peu différent selon la dose (2,4 h pour IT Hi vs. 5,1 h pour IV Me vs. 6,0 h pour IV Lo). Cela peut conduire à un délai différent pour le contrôle de la charge bactérienne voire à l'impossibilité de réduire cette charge bactérienne durablement, donc à une survie légèrement moins importante à 48 h dans le groupe IV Lo par rapport à IT Hi (66 % vs. 75 %). L'utilisation d'un modèle conjoint, en plus de permettre de réaliser des simulations de survie facilitant l'explication, a l'avantage de corriger les biais potentiels dans l'estimation des paramètres longitudinaux, comme expliqué dans la section 1.1.2.

Le modèle mathématique construit pourrait permettre d'aider au choix de dose et de voie d'administration pour la planification de protocoles de futures études de phagothérapie, et à terme pour les cliniciens. La structure du modèle mathématique construit servira aussi à la description de futures données issues d'expérimentations similaires. Les perspectives en termes d'expérimentation animale en phagothérapie sont d'étudier l'évolution de la charge bactérienne chez l'animal traité par un cocktail de plusieurs phages, dans le but de limiter le phénomène de résistance aux phages et donc d'accroître l'efficacité de ce traitement. L'ensemble de ces études permettront d'optimiser la prise en charge de pneumonies bactériennes par les bactériophages en clinique, en termes de choix du phage (ou des phages pour un cocktail) et du schéma d'administration.

## 4.3. Conclusion générale

Ces travaux de doctorat sont inscrits dans la continuité des développements méthodologiques autour de la FIM. Nous avons dans ce cadre développé une approche de protocole robuste en cas d'incertitude du modèle et un algorithme pour l'optimisation de protocole d'études analysées par MNLEM. Ces outils serviront donc pour la planification de protocoles d'études
longitudinales, l’algorithme développé étant intégré à la nouvelle version du logiciel PFIM, dont la version alpha est disponible. L’utilisation de l’approche de protocole robuste pourra aussi être facilitée lorsqu’elle sera intégrée dans PFIM. Une application d’évaluation de protocoles en phase précoce d’essai sur une combinaison d’anticancéreux a aussi été effectuée, de manière à montrer les avantages et inconvénients de différents designs et ainsi aider aux choix des cliniciens dans ce cadre. Nous avons utilisé les MNLEM pour décrire l’interaction entre les phages et les bactéries. Le modèle construit aidera à planifier les prochaines études en phagothérapie. Certaines expériences pourront d’ailleurs être planifiées à l’aide de PFIM, éventuellement en utilisant la méthodologie des protocoles robustes, car une incertitude sur les modèles et les valeurs de paramètres pourrait être importante pour de nouveaux couples phages/bactéries et de nouveaux modèles animaux.

Nous espérons avoir démontré l’intérêt de la planification de protocoles, en utilisant la FIM ou les simulations, ainsi que l’intérêt des MNLEM dans les études longitudinales afin de contribuer au progrès en santé publique.
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# Titre : Modélisation de données longitudinales : protocoles robustes dans les essais cliniques, interactions bactériophages/bactéries

**Résumé** : En amont de la modélisation de données d'études longitudinales par modèles non linéaires à effets mixtes (MNLEM), il est nécessaire de planifier des protocoles informatifs. Une approche efficace se base sur l'utilisation de la matrice d'information de Fisher (FIM). L'évaluation et l'optimisation de protocoles nécessite des connaissances a priori sur le modèle. Si le modèle est finalement différent du modèle supposé a priori, cela peut conduire à un protocole sous-optimal. Le premier travail de thèse propose une approche de protocole robuste tenant compte de l'incertitude du modèle. Différents algorithmes sont utilisés pour l'optimisation de protocole basée sur la FIM. Les algorithmes multiplicatifs permettent l'optimisation de protocoles en s'appuyant sur une discrétisation de l'espace et donner un poids plus important aux protocoles les plus informatifs. Ce type d'algorithme a démontré son efficacité pour des modèles de régression individuelle. Dans le cadre de cette thèse, ils ont été appliqués aux MNLEM. L'utilisation de simulations d'essais cliniques (CTS) permet de comparer un nombre restreint de protocoles. Un projet d'application a été conduit en immuno-oncologie pour l'étude d'une combinaison de deux médicaments en phase précoce de développement clinique. Le critère de jugement utilisé était basé sur les tailles de tumeurs individuelles prédites à partir d'un modèle d'inhibition de la croissance tumorale. Dans ce cadre, des protocoles à un, deux ou quatre bras de traitement ont été comparés par CTS. Dans le contexte de la propagation des bactéries multi-résistantes, les bactériophages (des virus qui n'infectent que les bactéries) suscitenent de plus en plus d'intérêt. Il est néanmoins nécessaire de déterminer les modalités optimales d'administration des phages avant que l'on puisse proposer un traitement chez l'homme. Une série d'expériences in vitro et in vivo ont été conduites et l'ensemble des données a permis de construire un modèle mathématique qui caractérise l'interaction phage-bactérie et qui a permis de quantifier l'efficacité de la phagothérapie en fonction de la dose et de la voie d'administration.

**Mots clefs** : modèles non linéaires à effets mixtes ; études longitudinales ; optimisation de protocoles ; matrice d'Information de Fisher ; algorithmes multiplicatifs ; modèles d'inhibition de la croissance tumorale ; bactériophages ; modèles de cinétique bactérienne ; modèles de dynamique virale

# Title: Longitudinal data modeling: robust protocols in clinical trials, bacteriophages/bacteria
interactions

**Abstract:** Prior to data modeling of longitudinal studies using nonlinear mixed effects models (NLMEM), informative protocols need to be planned. An effective approach is based on the use of the Fisher Information Matrix (FIM). The evaluation and optimization of protocols requires a priori knowledge of the model. If the model is ultimately different from the a priori assumed model, this may lead to a sub-optimal protocol. The first thesis work proposes a robust design approach taking into account the model uncertainty. Different algorithms are used for design optimization based on FIM. Multiplicative algorithms allow design optimization based on discretization of the design space and give more importance to the most informative protocols. This type of algorithm has demonstrated its effectiveness for individual regression models. In this thesis, they have been applied to NLMEM. The use of clinical trial simulations (CTS) allows the comparison of a small number of designs. An application project was conducted in immuno-oncology for the study of a combination of two drugs in early clinical development. The endpoint used was based on individual tumor sizes predicted from a tumor growth inhibition model. Designs with one, two or four treatment arms were compared by CTS. In the context of the spread of multi-resistant bacteria, bacteriophages (viruses that only infect bacteria) are of increasing interest. Nevertheless, it is necessary to determine the optimal phage administration scheme before treatment can be proposed in humans. A series of *in vitro* and *in vivo* experiments have been conducted and all the data has made it possible to build a mathematical model that characterizes the phage-bacteria interaction and that quantifies the effectiveness of phagotherapy depending on the dose and the route of administration.

**Keywords:** nonlinear mixed effects models ; longitudinal studies ; optimal design ; Fisher information matrix ; multiplicative algorithms ; tumor growth inhibition models ; bacteriophages ; bacterial kinetics models ; viral dynamics models