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# Exploration de la sensibilité au stress réplicatif dans les cancers du sein triple négatifs BRCA1-déficients

Imene Tabet

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Imene Tabet. Exploration de la sensibilité au stress réplicatif dans les cancers du sein triple négatifs BRCA1-déficients. Sciences du Vivant [q-bio]. Université de Montpellier, 2023. Français. NNT: . tel-04570864

HAL Id: tel-04570864

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Submitted on 7 May 2024

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THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR
DE L'UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

En Biologie Santé

École doctorale Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (CBS2)

Unité de recherche Inserm U1194 - Institut de Recherche de Cancérologie de Montpellier

Exploration de la sensibilité au stress réplicatif dans les
cancers du sein triples négatifs BRCA déficients

Présentée par Imene TABET

Le 28 avril 2023

Sous la direction de Charles Theillet

Devant le jury composé de

Dr Philippe PASERO Directeur de recherche, IGH - Montpellier

Dr Patricia KANNOUCHE, Directrice de recherche, IGR - Villejuif

Dr Marie-Jeanne PILLARE, HDR, IPBS - Toulouse

Dr Cyril RIBEYRE, HDR, IGH - Montpellier

Dr Charles THEILLET, Directeur de recherche, IRCM - Montpellier

Président

Rapporteur

Rapporteur

Invité

Directeur de thèse

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

UNIVERSITÉ
DE MONTPELLIER
Je dédie cette thèse à mon oncle Ali Hocine,

Tu étais la générosité d'une conscience qui se refuse à toute haine, et ne s'en prend qu'aux ténèbres de l'âme. Tu étais l'oncle, le père, l'ami, le camarade mais surtout l'humaniste à l'optimisme sans précédent.

« Il faut opposer au pessimisme de la raison l'optimisme de la volonté »

Antonio Gramsci
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
Remerciements

Un travail de thèse, est un travail qui implique de nombreuses personnes directement ou indirectement,
cette présente thèse n'aurait peut-être pas vu le jour sans la précieuse aide et soutient que j'ai eu la chance
d'avoir depuis le début de mon parcours universitaire, que je vais vous raconter brièvement
..................Nah, just kidding.

Je tiens d'abord à remercier les membres du jury pour avoir accepté de participer à l'évaluation de mon
travail. Merci aux rapporteurs, Dr. Patricia Kannouche et Dr. Marie-Jeanne Pillaire d'avoir accepté de
faire partie du jury et d'avoir été flexibles quant à la date de remise du manuscrit. Merci aux Dr. Philippe
Pasero et Dr. Cyril Ribeyre d'avoir accepté d'examiner mon travail encore une fois. Je tiens à vous
remercier d'avoir suivi avec intérêt mon travail durant mes 4 années de thèse et d'avoir permis de le faire
avancer. Merci pour votre disponibilité et votre esprit scientifique, qui a rendu notre collaboration très
instructive.

Cette thèse est le résultat d'une série d'évènements, qui contre toute attente ont abouti à ce que quand
même je fasse une thèse de 4 années. Cette aventure a débuté par un mail d'une étudiante désespérée, et
d'un chercheur qui consulte ses mails en plein mois de juillet, et qui plus est y répond rapidement et
favorablement, et ce fut le début d'un expérience of a lifetime, riche et agréable sous la direction de ce
même chercheur : Charles Theillet.

A **Charles**, Je vous serai à jamais reconnaissante pour la confiance que vous avez placé en moi dès mon début au sein de votre labo en tant que stagiaire, merci d'avoir décidé de m'accorder ma chance, sans laquelle je ne serais pas ici aujourd'hui. Je tiens également à vous remercier, pour l'effort que vous avez fourni et « la patience » dont vous avez fait preuve au cours de la rédaction/correction de ce manuscrit. Merci de m'avoir encadrée durant toutes ces années et d'avoir cru en moi. Merci de m'avoir laissé assez de liberté à la paillasse pour pouvoir m'épanouir dans le développement de mon projet mais sans jamais m'avoir laissée livrée à moi-même, et d'accorder du crédit à mes idées et prendre le temps de les écouter. Merci pour votre disponibilité et vos feedback constructifs qui m'ont permis non seulement de m'améliorer mais aussi de me faire prendre conscience que je pouvais faire mieux. Merci pour tous vos conseils qui ont contribués à alimenter ma réflexion. Merci de m'avoir offert l'opportunité d'être impliquée dans différents projets du laboratoire.

Je tiens à vous remercier particulièrement pour votre ouverture d'esprits, et pour toutes nos discussions
sur tous les sujets possibles et imaginables (mais soyons honnêtes c'était surtout de la géopolitique). J'ai
énormément appris grâce à vous tant sur le plus scientifique que sur pleins d'autre aspects.

Enfin, je tiens à vous remercier pour votre soutien moral indéfectible pendant les moments difficiles, je
peux sans aucune hésitation dire que sans ça je ne me serait probablement pas remise sur pieds au bon
moment.

A ma dream team « The sweet BRCA girls », merci à Esin pour les moments passés ensemble dans le
labo et en dehors, merci pour ta pertinence scientifique et ta bonne camaraderie qui m'ont étaient utiles
plus d'une fois. A **Carolina**, my dearest Mama Carolina, you've been my rock during a rough period, I'll
always be grateful for your help, sincerity, honesty, and genuine interest in me. Thank you for your
legendary sens of humor, wisdom, and love. A **Lise**, ahhhh Liiiissee, à mon petit nuage moelleux, tout
d'abords je tiens à te remercier d'avoir été assez courageuse de te lancer dans la laborieuse tache qu'est
de relire mon introduction !! merci ma chère lise de m'avoir excellement bien formé à l'expérimentation
animale, j'ai beaucoup appris à tes côtés, et je me suis beaucoup amusé. Merci d'alléger les journées
difficiles au labo, avec tes histoire de coccyx cassé, de citrouilles géantes qui te pourchassent dans ton
sommeil, et bien d'autres que je ne me permettrai pas de citer dans un document officiel, faut pas décorner
non plus :p , merci pour ton amitié, ton écoute, et tes conseils, merci pour ta motivation pour le sport,
Steak & Shake, Pelasse et Mélisande, et pour les vacances du LochNess....
Merci à **Laura Jeanson**, pour ton amitié, et pour ta présence durant la dure période du confinement. Notre collaboration « en zone » à cette période reste un moment particulier que je n'oublierai pas de sitôt.

**A tata Bea**, je ne peux te dire à quel point je m'estime chanceuse d'avoir fait ta connaissance, j'ai commencé mes premiers pas au labo en étant ta stagiaire, et après 4ans de thèse je te considère plus comme ma grande sœur. Ta disponibilité au labo est d'une valeur inestimable, et celle en dehors du labo l'est encore plus, sache que ta présence dans ma vie est d'une importance extrême ... pour ma famille lol ça les rassure que j'ai dans mon entourage une personne aussi généreuse, et aussi sincère. Merci pour tous tes conseils aussi bien sur le plan scientifique qu'autre.

**A Geneviève**, merci à toi pour ta disponibilité et patience depuis mes début en tant que stagiaire qui ne sait pas faire des western ^^ . Sans toi, l'apprentissage de nombreuses manips aurait été plus compliqué. Merci d'être toujours à cheval sur la rigueur ce qui m'a permis d'être plus exigeante et développer de bonnes pratiques. Merci aussi pour ton sens de l'humour, nos pauses café, et ton soutient moral oh comme bien précieux. Ta gentillesse et ta sincérité m'on beaucoup touché, et aidé pendant les moments difficiles. Merci d'être toujours partante lorsqu'il s'agit de faire « des blague » au labo, j'ai vraiment de très bons moments avec toi, même en dehors du labo (#Adele_#Felixe).

A mon co-équipier **Mehdi**, merci pour ta présence et ton aide durant nos années de stage/thèse ensemble dans le labo. Merci d'être mon dealer officiel de Manga et de séries (btw il me manque des chapitre de One Piece :p)

**Aux autres membres de l'équipe**, merci à Claude d'avoir accepté avec Charles, de me recevoir au sein du labo pour mon stage M2, merci aussi pour vos conseils et remarques pertinentes au cours des réunions d'équipe qui ont permis à tous nos projets y compris le mien d'avancer et d'évoluer. Merci à Stan, pour nos discussions d'après 19h30 ou des samedi/dimanche au labo ça dépend des jours ^^. Merci à Isabelle pour tes remarques et critiques constructives de mon travail, merci pour tes encouragements. Merci à Sophie pour tout le travail que tu fournis pour notre équipe et qui nous fait gagner bien du temp. Merci a Ines qui a récemment rejoint notre équipe de reprendre le flambeau, *the floor is your* !

Merci à ma tante Nacera et mon tonton Nono, pour leur hospitalité et leur soutient lorsque j'en avais le plus besoin.

Merci à tonton Majid et Isabelle, et toute la famille de l'Estaque de m'avoir ouvert la porte de chez vous, et d'avoir fait de moi l'une des votre dès mon premier jour en France.

Merci a tata Sonia et tonton Djo, pour leur gentillesse et leur présence durant mes deux années marseillaises et bien après.

**A ma famille**, Merci pour votre soutient indéfectible en toutes circonstances, merci pour vos encouragements et votre confiance, merci de me donner du courage chaque jours. A ma sœur Houda, merci de me permettre d'évoluer dans ma carrière et d'avancer dans ma vie parfois peut être au dépend de la tienne, grâce à toi je suis quelque part tranquille que Mama est *taken care of*. J'espère un jour pouvoir te montrer ma gratitude. Merci à mes autres sœurs Nafissa et Dounia et mon frère Mehdi pour vos encouragements et votre amour.

**A mes amis**: Merci à Ines et Zoko sans qui je ne serais jamais là aujourd'hui, votre amitié m'a accompagné durant tout mon parcours depuis les débuts ou j'hésitais à partir, vous étiez la lumière qui faisait dissiper mes doutes et me donnait confiance en l'avenir. Je n'oublierai jamais les journées passées au CCU, en compagnie de Ammali, à refaire le monde ou juste le critiquer.

A tous mes autres amis, merci à tous pour votre soutient et vos encouragements permanents, merci pour les moments de détentes et de décompressions, Haicheur, Nariman, Raouf, Toufik, Sabrina, Sid, Hadjer, Sara, Nora, Nabila et j'en oubli certainement.

Merci à « Calamity Jane » grâce à qui j'ai rencontré les meilleurs : Valentin, Francesco, Iliana
Et merci à « Beaucoup de Bruit pour Rien » de m'avoir permis de rencontrer Kévin (c'est mieux que la version officielle je trouve ^^.)

Le meilleur pour la fin.... Je veux remercier ma maman, la dame de fer !

**A Mama**, je veux te remercier pour tous les sacrifices que tu à fait pour moi et pour nous tous, tous ce que tu as enduré afin que nous puissions être ce que nous somme aujourd'hui, afin que je puisse devenir une femme libre et indépendante. Ta force, ton courage et ta générosité m'inspirent chaque jour. Grace à toi j'ai appris la confiance en soi, grâce à toi j'ai appris à aller de l'avant quelques soit la situation, grâce à toi j'ai appris à me relever et être forte, avoir l'esprit ouvert, et à élargir les horizons de ma pensée. Merci infiniment d'être la femme digne et courageuse que tu es.
# Table des matières
# Introduction

## I. Le cancer : Quand les cellules perdent le contrôle.................................................. 13

### A. Le cancer : un récit à travers les âges .................................................................................. 13

### B. Hallmarks du cancer : d'où vient cette perte de contrôle................................................................ 15

### C. Instabilité génomique : la boite noire du crash cellulaire ................................................................ 17

1. Découverte de l'instabilité génomique des cancers................................................................................ 17

2. L'hypothèse oncogénique................................................................................................................................................ 17

3. D'autres mécanismes induisant la transformation.................................................................................. 19

## II. Cancer du sein et cancer : généralités et enjeux de l'étude.................................................. 21

### A. Epidémiologie et généralités.................................................................................................................. 21

1. Facteur de risques.................................................................................................................................................. 21

2. Notions de sporadicité et d'hérédité cancer du sein : place des mutations BRCA1/2 ................................................ 22

### B. Cancers du sein : anatomie et classification moléculaire .................................................................................. 22

1. Anatomie de la glande mammaire................................................................................................................................................ 22

2. Classification moléculaire.................................................................................................................................................. 23

### C. Le cancer du sein triple négatif (TNBC) et le sous type basal .................................................................................. 25

## III. Cycle cellulaire et réplication de l'ADN.................................................................................. 26

### A. Le cycle cellulaire : 1=2.................................................................................................................................................. 26

1. Cycle cellulaire : régulation et progression................................................................................................................ 26

2. Points de contrôle du cycle cellulaire et maintien de l'intégrité du génome.................................................. 27

3. Dérégulation du cycle cellulaire et cancer.................................................................................................................. 28

### B. La réplication de l'ADN : ctrl C/ctrl V ? pas si simple .................................................................................. 29

1. La réplication de l'ADN : généralités.................................................................................................................. 29

2. Réplication : coordination dans le temps et dans l'espace.................................................................................. 29

3. Les étapes la réplication.................................................................................................................................................. 30

### C. Voie de synthèse des nucléotides.................................................................................................................. 32

1. Voie de synthèse des purines (Guanine &; Adenine).................................................................................. 32

2. Voie de synthèse des pyrimidines (Uracil, Thymine &; Cytosine)................................................................................ 33

3. Dérégulation de la synthèse des nucléotides et cancer.................................................................................. 34

### D. Ciblage de l'ADN dans la lutte contre le cancer .................................................................................. 35

## IV. Le stress réplicatif : oui les cellules stressent aussi !................................................................. 35

### A. Le stress réplicatif : définition et généralités.................................................................................. 36

### B. Etiologie du stress réplicatif.................................................................................................................. 37

1. Facteurs intrinsèques.................................................................................................................................................. 37

1.1. Facteurs en lien avec la structure de l'ADN................................................................................................................ 37

1.2. Facteurs limitants et critiques à la réplication................................................................................................................ 39

1.3. Altération du processus de réplication par une activation oncogénique.................................................. 41

2. Facteurs extrinsèques.................................................................................................................................................. 44

2.1. Exposition environnementale et implication dans le processus cancéreux.................................................. 44

2.2. Agents chimiques utilisés en thérapie anti cancer du sein.................................................................................. 44

a. Induction de dommages à l'ADN.................................................................................................................. 45

b. Interférence avec l'activité des réplisomes.................................................................................................................. 45

c. Inhibition de la RNR : cible de choix pour le traitement de nombreux cancers.................................................. 50

### C. La plasticité des fourches de réplication en cas de blocage.................................................................................. 57

1. Mécanismes de résolution du blocage de la réplication.................................................................................. 59
<table><tbody><tr><td>a. La réversion des fourches de réplication « fork reversal »</td><td>59</td></tr><tr><td>b. Une résection contrôlée favorise le redémarrage des fourches de réplication bloquées</td><td>61</td></tr><tr><td>c. Remodelage des fourches de réplication arrêtées/régressées par résection</td><td>61</td></tr><tr><td>d. Le clivage endonucléolytique</td><td>62</td></tr><tr><td>e. Les activités de résection génèrent de l'ADN simple brin, signal de stress réplicatif activant la voie ATR-CHK1 et le checkpoint de réplication</td><td>63</td></tr><tr><td><strong>V. Signalisation du stress réplicatif</strong></td><td><strong>65</strong></td></tr><tr><td><strong>A. La voie ATR-CHK1 et son implication dans les points de contrôle du cycle cellulaire</strong></td><td><strong>65</strong></td></tr><tr><td><strong>B. Les protéines ATR et CHK1</strong></td><td><strong>65</strong></td></tr><tr><td>1. ATR : le lanceur d'alarme en situation de stress</td><td>65</td></tr><tr><td>2. CHK1 : l'agent spécial d'ATR</td><td>67</td></tr><tr><td><strong>C. La voie ATR-CHK1 : axe central hautement régulé, impliquée dans plusieurs processus</strong></td><td><strong>67</strong></td></tr><tr><td>1. Activation et amplification du signal</td><td></td></tr><tr><td>1.1 Activation de la voie ATR-CHK1</td><td>67</td></tr><tr><td>a. Activation médiée par les ADN simples brins</td><td>67</td></tr><tr><td>b. Activation canonique via TOPBP1</td><td>68</td></tr><tr><td>c. Activation alternative via ETAA1 ou NEK</td><td>69</td></tr><tr><td>1.2. Amplification du signale et seuil d'activation</td><td>69</td></tr><tr><td>2. Fonctions de la voie ATR-CHK1 durant et en dehors de la réplication</td><td>71</td></tr><tr><td>a. Arrêt du cycle cellulaire</td><td>71</td></tr><tr><td>b. Régulation de l'allumage des origines de réplication</td><td>71</td></tr><tr><td>c. Protection contre l'épuisement des facteurs de réplication (dNTP, RPA)</td><td>73</td></tr><tr><td>d. Maintien de la stabilité des fourches et contrôle des réplisomes</td><td>74</td></tr><tr><td>e. Régulation du redémarrage des fourches et des voies de tolérance aux dommages de l'ADN</td><td>76</td></tr><tr><td>f. Réparation de l'AND</td><td>76</td></tr><tr><td><strong>VI. Systèmes de réparation de l'ADN</strong></td><td><strong>78</strong></td></tr><tr><td><strong>A. La réparation de l'ADN : généralités</strong></td><td><strong>78</strong></td></tr><tr><td><strong>B. Réparation des cassures doubles brin, résolution des fourches bloquées et reprise de réplication</strong></td><td><strong>79</strong></td></tr><tr><td>1. La réparation des cassures double brin</td><td>79</td></tr><tr><td>1.1. La réparation par Recombinaison Homologue (HR) ou voie BRCA</td><td>80</td></tr><tr><td>1.2. Lien entre la voie BRCA et la voie ATR-CHK1</td><td>82</td></tr><tr><td>2. Implication de la voie BRCA dans la gestion du stress réplicatif</td><td>82</td></tr><tr><td>2.1. Redémarrage des fourches de réplication cassées</td><td>83</td></tr><tr><td>2.2. Le redémarrage des fourches non cassées</td><td>83</td></tr><tr><td>2.3. Action post-réplicative</td><td>84</td></tr><tr><td>2.4. Protection des fourches de réplication bloquées</td><td>85</td></tr><tr><td>3. Concept de BRCAness</td><td>85</td></tr></tbody></table>

Projet de recherche (86)
# Résultats et Discussion (89)

<table><tr><td>-Introduction</td><td>90</td></tr><tr><td>-Résultats</td><td>92</td></tr></table>

1. Les modèles cellulaires BRCA1-déficients montrent une sensibilité accrue à la gemcitabine .................................... 92

2. Les modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine subissent une catastrophe réplicative .................................... 93
persistante en comparaison à leurs homologues BRCA1-proficients

3. Les cellules en catastrophe réplicative accumulent de grandes quantités d'ADN simple brin et présentent un marquage γH2AX pan-nucléaire intense .................................................................................................................... 94

4. La formation de foyers RAD51 est fortement réduite dans les modèles BRCA1-déficients et absentes dans les cellules en catastrophe réplicative. .................................................................................................................... 94

5. L'inhibition de MRE11 réduit fortement l'accumulation d'ADN simple brin et de cellules γH2AX pan-nucléaires dans les SUM-159-BRCA1-KO .................................................................................................................... 95

6. Les modèles BRCA1-déficients traités à la gemcitabine accumulent de l'ADN simple brin et glissent en mitose.................................................................................................................... 95

7. L'intensité du marquage γH2AX est accrue dans les modèles PDX qui répondent à la gemcitabine comparés aux modèles non-répondeurs. .................................................................................................................... 96

<table><tr><td>-Discussion</td><td>97</td></tr></table>

<table><tr><td>-Matériels et méthodes</td><td>100</td></tr></table>

<table><tr><td>-Figures</td><td>104</td></tr></table>

<table><tr><td>-Figures supplémentaires</td><td>111</td></tr></table>

<table><tr><td>-Bibliographie</td><td>118</td></tr></table>

<table><tr><td>-Conclusions et Perspectives</td><td>125</td></tr></table>

<table><tr><td>-Annexes</td><td>130</td></tr></table>

Annexe N°1: Triple Negative Breast Cancer with epigenetically silenced BRCA1 previously exposed to neoadjuvant chemotherapy restore RAD51 foci formation and respond poorly to olaparib .................................................... 131

Annexe N°2: Regulation of RAD51 at the Transcriptional and Functional Levels: What Prospects for Cancer Therapy? .................................................................................................................... 147

# Bibliographies (171)
Abbreviations

**53BP1**: p53 Binding Protein 1

**5-FU**: 5-Fluorouracile

**9-1-1**: Rad9-Hus1-Rad1

**ABL**: Abelson

**APC**: Adenomatous Polyposis Coli

**APH**: Aphidicoline

**ARN**: Acide Ribonucléique

**ADN**: Acide Désoxyribonucléique

**AMPL**: Amplification

**ATM**: Ataxia Telangiectasia Mutated

**ATR**: Ataxia Telangiectasia Mutated and Rad3-Related

**ATRIP**: ATR Interacting Protein

**Alt-EJ**: Alternative NHEJ

**BCR**: Breakpoint Cluster Region protein

**BIR**: Break-Induced Replication BRCA1/2: Breast Cancer 1/2

**BRCA1/2**: Breast Cancer 1/2

**BrdU**: 5-Bromo-2'-Deoxyuridine

**CDK**: Cyclin Dependant Kinase

**CDB**: Cassures Double Brins

**CHK1/2**: Checkpoint Kinase 1 / 2

**CMG**: CDC45-MCM2/7-GINS (complexe hélicase)

**CPT**: Camptothécine

**DAPI**: 4',6-diamidino-2-phénylindole

**DDR**: DNA Damage Response

**DDT**: DNA damage tolerance

**DNA-PK**: DNA Dependant Protein Kinase

**dNTPs**: deoxyribonucleotides

**DSBR**: Double Strand Break Repair

**ER**: Estrogène Receptor

**EdU**: 5-ethynyl-2'-deoxyuridine

**H2AX**: Histone 2 AX

**HBC-SS**: Hereditary Breast Cancer Site Specific

**HBOC**: Hereditary Breast Ovarian Cancer

**HER2**: Human Epidermal growth factor receptor 2

**HLA**: Human Leucocyt Antigene

**HR**: Homologous Recombination

**HU**: Hydroxyurée

**IdU**: 5-iodo-2'-deoxyuridine

**IF**: ImmunoFluoresence

**IP**: Iodure de Propidium

**KDa**: KiloDalton

**KO**: Knock-out

**LOH**: Loss Of Heterozygocy

**MMR**: MisMatch Repair

**MMEJ**: Microhomology-mediated end joining

**NER**: Nucleotide Excision Repair

**NHEJ**: Non Homologous End Joining

**ORI**: Origine de replication

**ORF**: Open Reading Frame

**PARP**: Poly(ADP-Ribose) Polymerase

**PCNA**: Proliferating Cell Nuclear Antigen

**PIKK**: Phosphatidylnositol 3 Kinase-related protein Kinase

**PTEN**: Phosphatase and TENsin homolog

**PR**: Progesterone Receptor

**RB**: RetinoBlastoma

**ROS**: Reactive Oxygen species

**RNR**: Ribo-Nucleotide Reductase

**rNTPs**: Ribonucleotides

**RPA**: Replication Protein A

**SFCs**: Sites Fragiles Communs

**siRNA**: small interfering RNA

**SDSA**: synthesis-dependent strand annealing

**SNS**: Single Nucleotide Substitution

**SSA**: Single Strand Annealing

**SSB**: Single Strand Break

**ssDNA**: Single Stranded DNA

**TADs**: Topologically Associating Domains

**TDP**: Timing Decision Point

**TLS**: TransLesion Synthesis

**TNBC**: Triple Negative Breast Cancer

**TOPBP1**: TOPoisomerase Binding Protein 1

**TSG**: Tumor Suppressor Gene

**TP53**: Tumor Protein 53

**WB**: Western Blot

**WRN**: Werner Syndrom

**WT1**: Willms Tumor

**XRCC1/2/3**: X-ray repair cross-complementing protein 1/2/3

**ZFN**: Zinc Finger Nuclease
## Liste des figures

**Figure 1.** Le papyrus chirurgical d'Edwin Smith

**Figure 2.** Hallmarks Du Cancer, Nouvelles dimensions (Hanahan 2022)

**Figure 3.** Lien entre les hallmarks du cancer et les mutations génétiques les plus fréquentes identifiées dans les cancers humains

**Figure 4.** Voies vers la transformation néoplasique

**Figure 5.** Cancer du sein : taux d'incidence et de mortalité chez les femmes

**Figure 6.** Illustrations anatomiques et histologiques de la glande mammaire humaine

**Figure 7.** La classification des échantillons de cancer du sein en fonction de différences d'expression génétique

**Figure 8.** Régulation de la progression dans le cycle cellulaire par les CDK, les inhibiteurs protéiques de CDK et RB

**Figure 9.** Activation des checkpoints du cycle cellulaire par différents stimuli

**Figure 10.** Inhibition des CDK comme cible thérapeutique contre le cancer

**Figure 11.** (A). Les origines de réplication d'une cellule eucaryote vue au microscope électronique. (B). Les étapes de la synthèse d'ADN selon la phase du cycle cellulaire

**Figure 12.** Régulation spatio-temporelle de la réplication de l'ADN. (A) Un réplicon représente l'unité de base (50 à 450 kb), définie comme un segment d'ADN répliqué par une seule origine active (bleu). (B) Les unités de réplication adjacentes sont liées ensemble par des cohésines pour former un cluster de réplication

**Figure 13.** Réplicon, réplisomes et fourches de réplication eucaryotes. Haut : Schéma structural simplifié de l'unité réplicative (réplicon) eucaryote

**Figure 14.** La voie de synthèse des purines. Flèches bleus voie de novo, flèches violettes voie de recyclage

**Figure 15.** La voie de synthèse des pyrimidines. Flèches bleues voie de novo, flèches rouges voie de recyclage

**Figure 16.** Les différentes sources de stress réplicatif à travers les phases du cycle cellulaire

**Figure 17.** Collisions transcription-réplication, R-loops et impact des directions relatives des complexes, adapté de (Hamperl et al., 2017). (A). Impact de la collision des complexes convergents

**Figure 18.** Oncogènes, stress réplicatif et instabilité génomique

**Figure 19.** Illustration des causes endogènes du stress réplicatif

**Figure 20.** Lésions d'ADN d'origine chimiques, capables de causer du stress réplicatif

**Figure 21.** Les principaux inhibiteurs de la voie de synthèse des pyrimidines

**Figure 22.** Structure de la RNR et production de dNTP
**Figure 23.** Mécanisme d'action et du métabolisme intra-cellulaire de la gemcitabine (dFdC)

**Figure 24.** Principaux Mécanismes d'action de la gemcitabine et impacte sur les fourches de réplication. (A) Auto-potentialisation de la gemcitabine

**Figure 25.** Découplage hélicase/polymérase et réversion des fourches. (A). Dissociation du réplisome

**Figure 26.** Aperçu des mécanismes sous-jacents à la plasticité des fourches de réplication

**Figure 27.** Remodelage de la fourche de réplication et redémarrage pendant le stress de réplication

**Figure 28.** Traitement nucléolytique et redémarrage des fourches de réplication bloquées

**Figure 29.** Rôle de la résection dans la réparation des fourches de réplication et l'activation de la voie ATR-HK1

**Figure 30.** Checkpoints, progression du cycle cellulaire et voie ATR-HK1

**Figure 31.** Structure de la protéine ATR.

**Figure 32.** Activation de la signalisation ATR-HK1 par des structures spécifiques d'ADN (A). La structure nécessaire à l'activation d'ATR médiée par TOPBP1 est une jonction ADN simple brin-ADN double brin (5' ended ssDNA-dsDNA junction)

**Figure 33.** Modèle d'activation d'ATR par TOPBP1

**Figure 34.** Amplification de la signalisation d'ATR

**Figure 35.** Régulation du cycle cellulaire par CHK1 en réponse au stress réplicatif et dommages de l'ADN

**Figure 36.** Régulation de l'allumage des origines de réplication par la voie ATR-HK1

**Figure 37.** La signalisation ATR-HK1 à l'échelle globale protège les cellules de l'épuisement de RPA

**Figure 38.** Régulation du pool de dNTP par ATR via RNR

**Figure 39.** Régulation de la stabilité des fourches et contrôle des réplisomes par la voie ATR-HK1 63

**Figure 40.** (Page suivante). Schéma récapitulatif de la régulation de la dynamique de la fourche par la voie ATR A. Les voies ATM/ATR inhibent le déclenchement de l'origine de réplication via l'inhibition MCM2-7 et de la FANCI

**Figure 41.** (A). (Page précédente). Les différentes issues à l'activation de la réponse aux dommages à l'ADN

**Figure 42.** Principales différences dans le choix de la voie de réparation des cassures double brins (CDBs)
**Figure 43.** La voie d'activation et les étapes de la recombinaison homologue

**Figure 44.** Rôles de la recombinaison homologues au niveau des fourches de réplication
# Résumé

## Exploitation de la sensibilité au stress réplicatif dans les cancers du sein triple négatifs BRCA déficients

Environ 15% des cancers du sein triple négatif (TNBC) sont déficients en BRCA et présentent un déficit de réparation de l'ADN par recombinaison homologue (HRD) et une sensibilité accrue aux traitements génotoxiques. Nous avons émis l'hypothèse que les TNBC BRCA-déficients sont très sensibles aux médicaments induisant un stress réplicatif, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. Nos résultats montrent que les TNBC déficients en BRCA1 (BRCA1-Def), ainsi que les lignées cellulaires de cancer de l'ovaire BRCA1-Def, ont montrés une sensibilité accrue à la gemcitabine. De manière notable, la gemcitabine a induit une augmentation de la mort cellulaire dans les cellules BRCA1-Def, associée à une gestion perturbée du stress réplicatif. En effet, jusqu'à 80 % des cellules BRCA1-Def présentaient un marquage γH2AX persistant même 48 h après le lavage de la gemcitabine, par rapport à leur homologue de lignée BRCA1-WT dans laquelle le marquage diminue considérablement. De plus, les cellules BRCA1-Def traitées à la gemcitabine ont montré un déséquilibre persistant entre les cellules RPA32-positives et γH2AX-positives, suggérant un stress réplicatif non résolu dans ces cellules et la survenue d'une catastrophe réplicative dans une fraction substantielle des cellules. En outre, une fraction importante de cellules γH2AX+ présentait un marquage pan-nucléaire, dont le nombre augmentait régulièrement au fil du temps dans les cellules BRCA1-Def traitées à la gemcitabine, alors qu'il diminuait dans les cellules BRCA1-WT. Fait intéressant, près de 90% des cellules pan-nucléaires γH2AX étaient complètement négatives pour RPA32 et présentaient un fort marquage BrdU dans des conditions non dénaturantes, indiquant une accumulation importante d'ADN simple brin spécifiquement dans ces cellules. De manière notable, un nombre important de cellules γH2Ax pan-nucléaire étaient également négatives pour les foyers RAD51, mais étaient positives pour les foyers 53BP1 et FANCD2. Le paysage opposé a été observé dans les cellules BRCA1-WT dans lesquelles les cellules γH2AX pan-nucléaires étaient RAD51+, 53BP1- et FANCD2-. Ces résultats indiquent une réponse aiguë au stress réplicatif dans le contexte BRCA1-Def qui induit l'arrêt des fourches de réplication. Cela pourrait conduire à un effondrement de la fourche de réplication et éventuellement à des ruptures massives d'ADN double brin (DSB). Pour tester cette hypothèse, nous avons réalisé des expériences d'électrophorèse en champ pulsé qui ont clairement montré une accumulation importante de DSB dans les cellules BRCA1-Def 48h après le lavage de gemcitabine. Ces DSB ne résultaient pas du clivage apoptotique de l'ADN car le traitement conjoint avec la gemcitabine et l'inhibiteur de l'apoptose Z-VAD FMK n'a pas modifié le niveau de DSB, suggérant que les DSB résultaient d'une accumulation d'ADNsb non protégé. Ensuite, nous avons testé si l'accumulation d'ADNsb résultait d'une surrésection causée par une activité incontrôlée de l'exonucléase MRE11 dans la cellule BRCA-Def et avons appliqué un traitement conjoint de gemcitabine et Mirin. En fait, l'inhibition de MRE11 avec Mirin a entraîné une diminution spécifique du nombre de cellules présentant la coloration γH2AX pan-nucléaire. Enfin, nous avons noté que les cellules BRCA1-Def étaient sujettes à des glissements mitotiques conduisant à des catastrophes mitotiques illustrées par une accumulation importante de mitoses aberrantes et de micronoyaux dans ces lignées. De manière notable, les micro-noyaux ont montré une double coloration positive BrdU et γH2AX pan-nucléaire indiquant qu'ils correspondaient à la fragmentation des noyaux avec un niveau important d'ADNsb. Nous avons également pu montrer que l'hypersensibilité des cancers BRCA1-Def au stress réplicatif aigu est reproductible *in vivo* dans des modèles PDX, dont les coupes de tissus montraient un profil de marquage γH2AX pan-nucléaire, en corrélation avec leur statut de réponse à la gemcitabine. Par conséquent, nous proposons que le marquage γH2AX pan-nucléaire pourrait être un marqueur de catastrophe réplicative dans les tumeurs traitées et pourrait éventuellement être considérée comme un biomarqueur de la réponse au stress réplicatif. En conclusion, nos données montrent que les
tumeurs déficientes en BRCA sont plus sensibles au stress de réplication et accumulent des niveaux massifs d'ADN simple brin conduisant à l'épuisement du pool intracellulaire de RPA et à des DSB massifs entraînant la mort cellulaire. De plus, une fraction des cellules BRCA-Def traitées à la gemcitabine a montré un glissement mitotique entraînant la formation de micro-noyaux et une catastrophe mitotique. Ainsi, dans un contexte BRCA-Def, le traitement à la gemcitabine a combiné des conséquences létales, que sont une catastrophe réplicative massive associée à une catastrophe mitotique.

**Mots clés** : Cancer du Sein, Réplication de l'AND, Stress Réplicatif, Recombinaison Homologue, Réparation de l'AND, BRCAness.

# Abstract

## Exploring sensitivity to replicative stress in BRCA deficient Triple Negative Breast Cancer

About 30% of triple negative breast cancers (TNBC) are BRCA defective and show Homologous Recombination DNA repair Deficiency (HRD) and increased sensitivity to genotoxic drugs. We hypothesized that BRCA-defective TNBC are highly sensitive to replicative stress inducing drugs, which could open therapeutic perspectives. Our results show that BRCA1-deficient (BRCA1-Def) TNBC, as well as BRCA1-Def ovarian cancer cell lines showed increased sensitivity to Gemcitabine. Noticeably, Gemcitabine induced increased cell death in BRCA1-Def cells, associated with mediocre replicative stress management. Indeed, up to 80% of BRCA1-Def cells displayed persistent gH2AX staining even 48h after washing off Gemcitabine, compared with their BRCA1-WT counterpart in which staining had decreased significantly. Furthermore, Gemcitabine treated BRCA1-Def cells showed a persistent imbalance between RPA32-positive and gH2Ax-positive cells, suggesting unresolved replication stress in these cells and occurrence of replication catastrophe in a substantial fraction of the cells. Furthermore, an important fraction of gH2AX+ cells displayed pan-nuclear staining, which numbers steadily increased over time in Gemcitabine treated BRCA1-Def cells, while they decreased in the BRCA1-WT counterpart. Interestingly, nearly 90% of gH2AX pan-nuclear cells were completely negative for RPA32 and showed a strong BrdU staining in non-denaturing conditions, indicating an important accumulation of single stranded DNA specifically in these cells. Noticeably, an important number of cells with pan-nuclear gH2Ax staining were also negative for RAD51 foci, but were positive for both 53BP1 and FANCD2 foci. The opposite landscape was observed in the BRCA1-WT cells in which gH2AX pan nuclear cells were RAD51+ and 53BP1- and FANCD2-. These results indicate an acute replicative stress response in the BRCA1-Def context that induces replication forks arrest. This could lead to replication fork collapse and possibly massive DNA Double Strand Breaks (DSB). To test this hypothesis, we performed Pulse Field Gel Electrophoresis experiments that clearly showed important accumulation of DSBs in the BRCA1-Def cells 48h after Gemcitabine release. These DSBs did not result from the apoptotic cleavage of DNA as joint treatment with Gemcitabine and the apoptosis inhibitor Z-VAD FMK did not modify the DSB level, suggesting that DSBs resulted from an accumulation of unprotected ssDNA. Next we tested whether the accumulation of ssDNA resulted from over-resection caused by uncontrolled activity of the exonuclease MRE11 in BRCA-Def cell and applied a joint treatment of Gemcitabine and Mirin. As a matter of fact, inhibition of MRE11 with Mirin resulted in a specific decrease of the number of cells presenting the pan-nuclear gH2AX staining. Finally, we noted that BRCA1-Def cells were prone to mitotic slippage leading to mitotic catastrophes illustrated by an important accumulation of micronuclei in these cells. Noticeably, micro-nuclei showed double positive BrdU and pan nuclear gH2AX staining indicating that they corresponded to fragmentation of nuclei with elevated ssDNA content. We have also been able to show that the hypersensitivity of BRCA1-Def
cancers to acute replication stress is reproducible in vivo in PDX models, which displayed a pan-nuclear 5 gH2AX staining profiles, in accordance with their Gemcitabine response status. Hence, we propose that pan-nuclear gH2Ax staining could be a marker of replication catastrophe in treated tumors and could possibly be considered as a biomarker of the response to replicative stress.

**Keywords:** Breast Cancer, DNA Replication, Replicative Stress, Homologous Recombinaison, DNA Repair, BRCA1, BRCA2
# Introduction
# I. Le cancer : Quand les cellules perdent le contrôle

## A. Le cancer : un récit à travers les âges

Lorsqu'on parle de cancer nos interlocuteurs font souvent grise mine, le sujet n'étant pas anodin ! En effet cette maladie tant redoutée est considérée comme la seconde cause de décès au niveau mondial. Chaque année plus de 8 millions de morts dans le monde lui incombe. Outre une compréhension fragmentaire et les nombreux points d'ombre qui planent autour de ce fléau, sa fréquence toutes populations confondues le rend encore plus redoutable et pour cause, chacun d'entre nous a en moyenne entre 30 et 50% de risque d'y être directement confronté.

Bien que la communauté scientifique s'accorde à dire qu'Hippocrate (460-370 avant J-C) fut le premier à avoir décrit cette maladie, les traces les plus anciennes du cancer remontent à une époque bien plus lointaine. En effet, le squelette d'un enfant de 9 ans ayant vécu il y a plus de 120 000 ans, retrouvé dans la grotte de Lazaret près de Nice, montre des traces de tumeur osseuse. Des caractéristiques pathologiques s'apparentant au cancer sont également décrites dans des vestiges de différentes ethnies un peu partout dans le monde ; sur des tablettes en caractères cunéiformes de la bibliothèque de Ninive (Mésopotamie), au niveau de monuments funéraires étrusques (Italie), ainsi que sur des momies péruviennes ou égyptiennes.

Les premiers documents connus évoquant le cancer représentent les plus anciens traités médicaux qui nous soient parvenus, et citent certaines affections dont les descriptions sont cohérentes avec les descriptions modernes du cancer du sein. Ils sont nommés le papyrus Ebers (Règne d'Amenhotep I ; 1500 et 1600 avant J-C), et le papyrus chirurgical d'Edwin Smith. Ce dernier aurait été rédigé à l'âge des pyramides entre 3500 et 2500 avant J-C. Il y est rapporté différents types de tumeurs (peau, utérus, estomac, rectum, sein...), et on pouvait y lire la note suivante : « lorsque ces tumeurs sont froides au touché, bombées, et se propagent sur le sein, aucun traitement n'est efficace » (Fig. 1) (Brawanski, 2012; Van Middendorp et al., 2010).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 1.** Le papyrus chirurgical d'Edwin Smith. A1. Cas N°39 du document original en hiératique. A2. La transcription scientifique moderne correspondante en hiéroglyphes. Les images ont été recadrées à partir de la publication originale de Breasted. Ils contiennent des descriptions de tumeurs avec des têtes proéminentes dans le sein du patient telle que translitérées dans la publication de Harding en 2007. B. la couverture du livre THE EMPEROR OF ALL MALADIES par Siddhartha Mukherjee, 2011. Prix Pulitzer de la catégorie non fiction de la même année. Adapté de (Lukong, 2017).</figcaption></figure>
En dépit du fait que le cancer ait été évoqué dans l'Egypte ancienne il faudra attendre la Grèce antique pour en avoir une description plus précise. Hippocrate (460-370 avant J-C) a le mérite d'être le premier à faire la différence entre lésions bégnines et lésions malignes. Ses observations faites sur de nombreuses tumeurs ont permis une première classification, mais aussi de donner un nom à cette maladie ; 'Karkinos' ou carcinos –dérivé de crabe–. Les savants romains suivirent les pistes d'Hippocrate et il y eu peu de progrès en la matière pendant les trois siècles après Hippocrate (Papavramidou et al., 2010). Cependant, la médecine arabe de la fin du premier millénaire a posé les bases à l'émergence des notions de médecine moderne en cancérologie. En effet, de Rhazes (860-932) évoque dans l'ouvrage de chirurgia de nouvelles approches thérapeutiques contre le cancer. Il est suivi par Avicenne (980-1037) qui fut le premier à introduire la notion de polypectomie, jusqu'à l'imminent Avenzoar (1066-1162), qui lui décrivit avec précision les cancers de l'œsophage et du rectum, et fut le premier à suggérer l'hystérectomie pour traiter les cancers de l'utérus, les descriptions et les recommandations se faisaient de plus en plus précise et documentées (Zaid et al., 2010).

La Renaissance représente un tournant décisif dans l'histoire de toutes les sciences, médecine y compris. En effet, pendant cette période des avancées considérables (non sans entraves*) ont été réalisées et ont ouvert la voie au développement que nous connaissons de nos jours. La levée d'interdiction de l'autopsie entre le 16è et le 17è siècle a permit un gain de connaissances extraordinaires en matière d'anatomie et de physiologie. Ainsi, la découverte du système lymphatique à la même période fut un évènement central dans la compréhension de la progression de la maladie. Par ailleurs, l'invention du microscope a permis un saut qualitatif dans la manière d'aborder cette maladie et est à l'origine de l'apparition de l'anatomopathologie. L'étude des tumeurs à l'échelle microscopique a permis à J.Muller de proposer pour la première fois en 1838 l'origine cellulaire du cancer, mettant ainsi fin à la théorie de l'origine humorale adoptée et acceptée pendant plus de deux siècles** (Haggard & Smith, n.d.; Paduch, 2015).

Les premiers remèdes contre le cancer –mis à part la chirurgie– commençaient à se faire une place. En effet, grâce à la découverte des rayons X en 1895 par Wilhelm Conrad Röntgen, la radiothérapie vit le jour. En effet, en 1904 le Pr Danlos fut le premier à expérimenter la radiothérapie sur des tumeurs humaines à l'hôpital Saint Louis à Paris. Par ailleurs, le gold standard des traitements de la majorité des cancers est la chimiothérapie (Lederman, 1981).

On doit cette découverte au biologiste allemand Paul Ehrlich (Prix Nobel 1908). Après 600 tentatives il arrive enfin à développer la molécule idéale : le salvarsan (dérivé de l'arsenic) qui en premier lieu fut utilisé pour guérir la syphilis. La chimiothérapie anticancéreuse n'est devenue effective en tant que telle qu'à partir de 1940, époque à laquelle on découvrit les premières substances antagonistes de la division cellulaire et qui représentent le fondement du principe de la chimiothérapie (Sepkowitz, 2011).

Aujourd'hui plusieurs options s'offrent aux patients atteints de cancer, qui vont au-delà de la chimio et radiothérapie. Les développements de l'immunothérapie, de l'hormonothérapie et du concept de médecine personnalisée représentent des changements radicaux porteurs d'espoirs concrets qui auraient été inenvisageables ne serait-ce que 30 ans en arrière.

*Daniel Sennert (1572-1637) médecin allemand pensait que le cancer etait une maladie contagieuse, idée qui perdura pendant plus de deux siècles et qui est à l'origine du concept des hôpitaux anti-cancers.
**Hippocrate disait que le cancer était issu d'un déséquilibre entre les 4 humeurs du corps (sang, lymphe, bile jaune, bile noire) et que les tumeurs apparaissaient quand il y avait un excès de bile noire.

## B. Hallmarks du cancer : d'où vient cette perte de contrôle

Sur internet on rencontre souvent des articles --souvent erronés-- dont l'intitulé ressemble à : « découverte d'un vaccin universel contre le cancer ». Le fait que ce concept « utopique » attire beaucoup de gens est humainement compréhensible. D'un point de vue scientifique il est important aujourd'hui, d'expliquer pourquoi ça ne peut être vrai, et ce malgré les moyens humains et matériels mis en œuvre.

En effet, en dépit des très grandes avancées réalisées en recherche biomédicale et en médecine, il n'existe pas d'arme fatale capable de guérir tous les types de cancers. En termes généraux on parle « du cancer » comme s'il s'agissait d'une seule pathologie, ce qui alimente ce genre de confusions. Concrètement, ce qui fait de « cette maladie » un véritable casse-tête pour les chercheurs et les médecins, c'est sa grande hétérogénéité tout types de cancers confondus. Il serait donc plus judicieux de rassembler sous l'appellation cancer, non pas une seule pathologie, mais plusieurs dont l'étiologie, l'apparition, la progression et donc le traitement seraient complètement différents.

Outre l'hétérogénéité entre les différents types de cancers, il existe des divergences au sein d'un même type tumoral entre les différents patients, on parlera donc d'hétérogénéité inter-patients. A cette complexité vient s'ajouter l'hétérogénéité intra-tumorale, correspondant aux différentes caractéristiques que peuvent exprimer les cellules tumorales qui forment la tumeur. Ceci ajoute un niveau supplémentaire de difficulté et éloigne un peu plus l'idée d'un traitement universel. Les connaissances accumulées durant des décennies, ainsi que les grands progrès technologiques auxquels nous assistons aujourd'hui, permettent désormais d'identifier avec quasi-certitude --pour certains cancers-- les éléments à l'origine de l'apparition des évènements moléculaires et cellulaires induisant la carcinogénèse.

En effet, le processus de cancérisation aboutissant à la perte de contrôle de la prolifération cellulaire et de la croissance du pseudo-tissu résulte de nombreuses dérégulations épigénétiques et aberrations génétiques. Ces dernières, peuvent être induites par des éléments de l'environnement, des agents infectieux, l'hérédité ou encore la malchance (Tomasetti et al., 2017) rendant donc chaque cas particulier.

Néanmoins, malgré cette complexité une « short List » publiée en 2000 et actualisée en 2011, puis plus récemment en 2022 (Hanahan, 2022; Hanahan & Weinberg, 2000, 2011) propose une vision synthétique des processus hautement complexes qui sont à la base des cancers (Fig. 2).

Cette liste regroupe les principales caractéristiques responsables de la prolifération anarchique typique des différents types tumoraux les classant par grandes fonctions ou Hallmarks du cancer.

Je stratifierai ces mécanismes en fonction de leur impact sur les étapes d'initiation ou de progression tumorale. Au cours de l'initiation deux mécanismes sont prépondérants ; (i) l'autosuffisance en signaux prolifératifs (surexpression de récepteurs de croissance ou de leurs ligands), concomitante à l'extinction des signaux antiprolifératifs, (ii) l'élimination de la limite réplicative liée au raccourcissement des télomères, qui est l'horloge biologique limitant le nombre de divisions cellulaires. La perte des contrôles prolifératifs permet aux cellules cancéreuses de se multiplier au-delà des besoins physiologiques et indépendamment des signaux normaux, mais les cellules ne pourraient pas se diviser indéfiniment si elles ne contrôlaient pas la taille de leurs télomères. En effet, parce que
la machinerie de réplication ne peut pas copier les extrémités chromosomiques jusqu'au bout, les télomères se raccourcissent à chaque cycle cellulaire et peuvent atteindre une taille limite reconnue comme une cassure double brin qui active un signal de stress génomique et aboutit à l'entrée des cellules en sénescence.

En effet, de plus en plus de preuves indiquent que les cellules malignes échappent partiellement aux contraintes phénotypiques originelles, et acquièrent une plasticité phénotypique leur permettant de continuer à se développer. La capacité de division 'infinie', impossible sans la capacité à reconstituer les télomères, aboutirait immanquablement à la mort cellulaire dans un système physiologique normal. Pour éviter cette issue les cellules malignes se sont dotées de mécanismes leur permettant une résistance accrue à l'apoptose (surexpression de signaux anti apoptotiques, sous expression de facteurs pro apoptotiques).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 2. Hallmarks Du Cancer, Nouvelles dimensions (Hanahan 2022).**</figcaption></figure>

Pendant le long périple qu'est la transformation tumorale, les cellules rencontrent de nombreux obstacles (manque de nutriment, O₂, thérapie anti cancer...) auxquels elles doivent faire face. En effet, le détournement des réponses au stress, leur permet de survivre dans des conditions qui seraient insupportables aux cellules saines. Ceci se traduit principalement par : une réorganisation métabolique et énergétique, l'exemple le plus parlant étant ce qui est communément appelé l'effet Warburg. Contrairement aux cellules saines qui produisent de l'énergie en métabolisant le glucose *via* l'oxygène, les cellules cancéreuses sont capables d'adopter une glycolyse aérobie même en absence d'oxygène. Bien que ce mécanisme soit moins efficace énergétiquement, il est plus rapide et génère plusieurs précurseurs intermédiaires utilisés par les cellules cancéreuses comme unités de construction pour fabriquer des protéines, de l'ADN et des lipides, nécessaires au soutien d'une prolifération rapide. Les cellules cancéreuses sont effectivement capables d'utiliser le lactate comme principale source d'énergie.

La question de l'accès à l'oxygène peut devenir critique à mesure que la tumeur grossit pour les cellules se situant au centre. A l'hypoxie s'ajoutent les besoins nutritionnels en hausse et cette situation va inciter les tumeurs à entreprendre leur propre angiogenèse ou néo-angiogenèse. Cette capacité d'auto-vascularisation leur assure l'apport de nutriments et d'oxygène, mais leur permettra également de se déplacer vers d'autres endroits du corps et d'essaimer au-delà de la localisation primaire. En effet, certaines cellules de la tumeur peuvent faire 'cavalier seul' ou s'organiser en 'petites légions'
pour partir à la recherche d'autres territoires (extravasation), en empruntant les vaisseaux sanguins et lymphatiques, et coloniser d'autres tissus (intravasation).

Mais l'exposition au système sanguin expose les cellules tumorales au système immunitaire, qui peut être un ennemi mortel. La réponse immunitaire n'est pas toujours efficace, loin s'en faut, et on peut la résumer en trois étapes : (i) élimination, (ii) équilibre et (iii) échappement. Ces trois étapes constituent une lame à double tranchant puisqu'en effet, dans un premier lieu ça permet d'éliminer les cellules tumorales présentant des antigènes, tandis que celles qui sont moins immunogènes survivent. Ainsi, la seconde étape favoriserait la sélection de certains clones qui au cours de cette période —qui peut durer des années— peuvent acquérir de nouvelles variations génétiques et épigénétiques qui les rendent résistants et leur permettent d'échapper au système immunitaire. Cet échappement consiste soit, en une sous expression d'antigène de type HLA I (favorisant la reconnaissance et la destruction des cellules anormales par les lymphocytes T cytotoxiques et les Natural Killer), l'induction d'une ignorance/tolérance immunologique en secrétant des facteurs immunosuppressifs, ou en recrutant les cellules inflammatoires anti-immunitaires.

Toutes ces caractéristiques prennent leurs origines dans des perturbations primaires au niveau génétique. L'accumulation de mutations et l'instabilité génétique qui en découle peuvent être considérées comme la boîte noire, qui met la lumière sur le pourquoi et le comment de l'installation du processus tumoral. En effet, les premiers évènements (acquis de manière progressive) touchants des acteurs clés du maintien de l'intégrité du génome (développés ci-après), constituent le point de départ de la transformation cellulaire. Ce faisant, les cellules deviennent de plus en plus permissives vis-à-vis d'éventuelles erreurs, pour ainsi aboutir à l'accumulation d'autres mutations conduisant à l'acquisition des mécanismes cités plus haut, favorisant la progression tumorale, et parfois même l'évolution vers une forme plus grave de la maladie.

### C. Instabilité génomique : la boîte noire du crash cellulaire

#### 1. Découverte de l'instabilité génomique des cancers

Bien que l'instabilité génomique des cancers n'ait été rapportée que dans la deuxième édition des hallmarks of cancer de Hanahan et Weinberg, sa première évocation remonte au 19e siècle par D. Hanseman (1891) qui fut le premier à proposer que les cellules cancéreuses possédaient un contenu chromatinien anormal. Vingt-trois ans plus tard, Theodore Boveri -- l'un des fondateurs de la théorie chromosomique de l'hérédité -- apporta en 1904 plus de précision. Dans son ouvrage, il écrit : « la prolifération tumorale est basée sur... une combinaison particulière de chromosomes incorrects, qui est la cause de cette prolifération anormale passée aux cellules filles». Les décennies suivantes ont vu naître des techniques de cytogénétiques telles que le caryotypage, qui ont permis d'identifier avec précision les différents types d'instabilités chromosomiques, telles que les pertes et gains de parties chromosomiques, les cassures, les fusions... Aujourd'hui ce type d'aberrations est recherchés en routine pour le diagnostic de nombreux cancers, comme la Leucémie Myéloïde Chronique, où la translocation entre les chromosomes 9 et 22, aboutissant la fusion des gènes BCR et ABL constitut un élément de diagnostique majeur.

#### 2. L'hypothèse oncogénique

Beaucoup de ce que nous connaissons aujourd'hui des processus de transformation oncogénique, vient des travaux de virologie tumorale, qui ont permis la découverte de gènes d'origine virale à potentiel transformant. Ces oncogènes viraux, se sont avérés être des éléments génétiques provenant des cellules infectées que les virus ont captés et intégrés à leur génome. Ainsi, ces observations ont jeté les bases du concept d'oncogènes cellulaires et du paradigme de l'origine génétique des cancers. En effet, les oncogènes cellulaires devenaient transformants suite à l'acquisition de mutations ou après
l'acquisition de réarrangements chromosomiques ou d'amplifications géniques par les cellules tumorales (Fig. 3) (D. D. Jones, 1974).

Par ailleurs, les études réalisées sur le rétinoblastome et la tumeur de Wilms (cancers pédiatriques de l'œil et des reins respectivement) ont permis l'identification des premiers anti-oncogènes (RB1 et WT1), c'est-à-dire de gènes qui ont le rôle est de limiter la prolifération et qui doivent donc être inactivés pour permettre l'apparition des tumeurs (Call et al., 1990; Knudson, 1971).

Pour résumer, deux grandes catégories de gènes sont systématiquement impliquées dans le processus carcinogénique lorsqu'ils sont dérégulés.

* Les Proto-oncogènes (mutations activatrices) : lorsque mutés, deviennent oncogènes, ils sont généralement impliqués dans la stimulation de la prolifération/division cellulaire.

* Les gènes suppresseurs de tumeurs ou anti-oncogènes (mutations inhibitrices) : majoritairement impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire (fonction inhibitrice) ainsi que dans l'induction de l'apoptose.

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

**Figure 3.** Lien entre les hallmarks du cancer et les mutations génétiques les plus fréquentes identifiées dans les cancers humains. Les 20 principaux gènes ciblés par les substitutions d'un seul nucléotide (SNS), les 10 principaux gènes amplifiés de manière focale (Ampl) et les 10 principaux gènes supprimés de manière focale (Del). Les gènes sous la rubrique "Modificateurs de la chromatine" ne pouvaient pas être facilement liés à une marque spécifique. Les oncogènes sont indiqués par des lettres vertes, les suppresseurs de tumeurs par des lettres rouges et NOTCH1 par des lettres bleues Adapté de (Macheret & Halazonetis, 2015).

Vogelstein a le premier proposé un schéma de transformation tumorale multi-étapes pour le cancer colorectal (Kinzler & Vogelstein, 1997). Ces étapes sont marquées par l'acquisition séquentielle de mutations au niveau de proto-oncogènes et/ou de gènes suppresseurs de tumeur (TSG) et aboutissent à la transformation cancéreuse des cellules saines. Une revue publiée en 1997 par ces mêmes chercheurs (Kinzler & Vogelstein, 1997), met en avant un nouveau concept dans lequel les proto-oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeur sont regroupés dans une même catégorie dite « gatekeepers », tandis que les gènes responsables du maintien de l'intégrité du génome tels que les gènes de réparation de l'ADN sont quant à eux regroupés dans la catégorie des « caretakers ». Dans cette revue, on peut entrevoir l'importance de l'ordre d'apparition des mutations sur l'une ou l'autre de ces deux catégories. En effet, tandis que deux évènements mutationnels (héréditaires ou
sporadiques) sur un même gène *gatekeeper* sont suffisants pour l'induction de la transformation, il en faut au moins trois autres si le premier épisode mutationnel a eu lieu sur un gène *caretaker* (perte du second allèle du premier gène muté puis mutations sur les deux allèles d'un gène *gatekeeper*) (Fig. 4). En plus de cette représentation basée sur l'accumulation de mutations affectant des gènes clés pour le contrôle de l'homéostasie cellulaire, la dérégulation des programmes d'expression génique est venue s'ajouter au schéma de la cancérisation. Dans l'hypothèse oncogènique, de multiples nouveaux facteurs sont à prendre en considération, notamment, que l'expression des gènes peut être affectée par de nombreux processus, qui peuvent être dérégulés dans les cancers.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 4.** Voies vers la transformation néoplasique. Milner et al, Sharan et al, décrivent différentes propriétés du gène de susceptibilité au cancer du sein BRCA2, qui pourraient correspondre à son action en tant que gène *gatekeeper* ou *caretaker*. Des mutations héritées de l'un ou l'autre type de gène peuvent prédisposer une personne au cancer, mais des modifications génétiques supplémentaires sont nécessaires pour convertir une cellule prédisposée en une cellule cancéreuse. Adapté de (Kinzler & Vogelstein, 1997).</figcaption></figure>

### 3. D'autres mécanismes induisant la transformation cellulaire

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**Notion de dosage génique : diploïdie et cancer**

L'impact de mutations hétérozygotes fut pendant longtemps sous-estimé du fait de la diploïdie des eucaryotes supérieurs. En effet, pour les caractères dits récessifs, la mutation d'un seul allèle (hétérozygote), n'altère pas ou peu l'expression de l'autre allèle. Knudson fut l'un des premiers à démontrer, que l'inactivation d'un gène de type suppresseur de tumeurs, nécessitait deux événements mutationnels distincts sur chaque allèle, ce qui fut appelé la "double hit theory" (Knudson, 1971). Or, on sait aujourd'hui que le « dosage génique » (niveau quantitatif d'expression d'un gène) est un paramètre important à la fonction d'un gène et qu'il faut le prendre en considération (Fang et al., 2004a; Lam et al., n.d.; Rice & McLysaght, 2017). En effet, certaines mutations hétérozygotes non silencieuses aboutissent parfois à une altération et/ou une limitation quantitative de la fonction d'un gène même si un allèle sur deux est intact (effet dominant négatif et haploinsuffisance respectivement). En cancérologie, une non-expression partielle d'un gène dont la perte de fonction totale est incompatible avec la survie cellulaire peut avoir des répercussions pro- ou anticancéreuses. De la même façon, des amplifications de certains oncogènes et/ou régions du génome contenant des oncogènes peuvent également altérer leur dosage génique et favoriser la cancérogenèse. Ainsi les pertes de fonctions sur les gènes suppresseurs de tumeurs couplées aux gains de fonction sur les oncogènes sont des éléments essentiels à la tumorigénèse, ce qui leur doit le nom de mutations "driver". Elles font l'objet d'une sélection évolutive à l'échelle tumorale grâce aux avantages qu'elles confèrent. Par opposition à ces mutations *driver*, celles qui s'installent dans les tumeurs et qui sont souvent dues à la permissivité induite par les drivers, sont dites "passengers". Elles sont souvent induites de manière stochastique, peu fréquentes dans une population normale, on considère qu'elles n'apportent pas ou peu d'avantages sélectifs aux tumeurs et ne produisent aucun impact direct ne pouvant être anticipé sur le phénotype cellulaire (Pon & Marra, 2015).
## Régulations épigénétiques

En plus des mutations ayant lieu sur l'ADN génomique, plusieurs autres facteurs ont été découverts récemment dont le rôle dans la régulation de l'expression génique n'est pas anodin. Par exemple ; l'expression ou le recrutement de facteurs de transcriptions spécifiques de certains gènes est un processus qui ne requiert aucun remaniement au niveau de la double hélice. D'autre part, les notions de régulation transcriptionnelle classiques ont été profondément revues depuis l'avènement des modifications épigénétiques. En effet, ces modifications, qui regroupent un vaste ensemble de processus régulateurs en absence de tout changement de la séquence d'ADN, représentent une facette majeure de la régulation de l'expression génique.

Ainsi, la méthylation de l'ADN, au même titre que les modifications post-traductionnelles des protéines histones (code histone), participent très largement au contrôle de l'expression génique, notamment via la régulation de la condensation de la chromatine (Jenuwein & Allis, 2001; B. M. Turner, 2000, 2002). Des dérégulations de ces processus sont également très courantes dans de nombreuses pathologies cancéreuses notamment les hémopathies malignes, les cancers du côlon, les cancers du sein ou de l'ovaire (Malik & Brown, 2000).

La dernière édition des hallmarks de cancer met l'accent sur l'importance de la reprogrammation épigénétique non mutationnelle. Les changements globaux du paysage épigénétique sont en effet reconnus comme une caractéristique commune à de nombreux cancers. En reproduisant ce qui se passe au cours de l'embryogenèse et du développement normal, les cellules cancéreuses peuvent reprogrammer un grand nombre de réseaux de régulation des gènes pour en modifier l'expression et favoriser l'acquisition de capacités qui leur sont favorables.

## Régulations de l'ARN et des protéines

La complexité de la régulation de l'expression génique ne s'arrête pas qu'aux mécanismes transcriptionnels. En effet, au cours de l'évolution, les eucaryotes supérieurs ont développé des mécanismes permettant de contrôler l'expression de leurs gènes à un niveau post-transcriptionnel et aussi post-traductionnel, impactant au niveau quantitatif et qualitatif l'expression génique.

Au niveau de l'ARNm, il existe plusieurs processus de régulation possibles (épissage alternatif, stabilisation, dégradation...). Parmi les plus connus, on peut citer le système de petits ARN, notamment les petits ARN interférents (ARNsi) et les micro-ARN (ARN-mi). Il s'agit d'un mécanisme de contrôle de l'expression des ARNm, via la synthèse de petits ARN non codants interférant, et qui permet une « extinction » de l'expression des gènes avant leur traduction (Kim et al., 2009; Murchison & Hannon, 2004). Les ARNmi sont également largement liés au maintien de la stabilité génomique et, plus généralement, à la cancérogenèse (Vincent et al., 2014).

Une fois traduits en protéines, les produits de gènes ne sont pas indemnes de modifications pouvant affecter leurs fonctions. En effet, des modifications post-traductionnelles aussi diverses qu'essentielles peuvent avoir un rôle critique dans la stabilité, la dégradation, ou encore l'activité catalytique des protéines. Ces processus constituent par ailleurs des éléments clés dans la régulation de l'expression génique. Dans un processus carcinogénique, chacun de ces niveaux de régulation peut être affecté. On constate alors que la complexité que, peuvent atteindre les cancers en empilant de multiples niveaux de dérégulations, augmentant considérablement le nombre de combinaisons et nous éloigne de l'illusion du contrôle.
# I. Cancer du sein et cancer : généralités et enjeux de l'étude

## A. Epidémiologie et généralités

Le cancer du sein est le cancer plus fréquent chez les femmes et représente un souci de santé publique majeur. En France, le cancer du sein représente 33% des diagnostics de cancers et 18% des décès par cancer chez les femmes (Defossez G, et al., 2019). La mortalité par cancer du sein a diminué de 1,3% par an entre 1990 et 2018. Cette amélioration peut s'expliquer par les avancées thérapeutiques (amélioration des thérapies ciblées) et surtout l'amélioration du dépistage (sensibilisation des femmes, campagnes de dépistage, amélioration des techniques d'imagerie) qui a permis une augmentation des diagnostics précoces (Fig. 5).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 5.** Cancer du sein : taux d'incidence et de mortalité chez les femmes. Panorama des cancers en France 2021, (INCa, 2021).</figcaption></figure>

### 1. Facteurs de risques du cancer du sein

De nombreuses études épidémiologiques ont été consacrées à la mise en évidence des facteurs de risques du cancer du sein. Ces facteurs peuvent être liés à l'individu (endogènes) ou liés à l'environnement et/ou au mode de vie (exogènes) (Dumitrescu & Cotarla, 2005; Kamińska et al., 2015).

* **Age** : L'incidence de cancer du sein augmente avec l'âge. Le développement de cancer du sein est significativement moins fréquent chez les femmes de moins de 45 ans. 80% des cancers du sein se développent dans la tranche d'âge 55-65 ans (Defossez G, et al., 2019)

* **Hygiène de vie** : Une association positive et dose-dépendante est trouvée entre la consommation d'alcool et le risque de développer un cancer du sein chez les femmes pré-ménopausées et post-ménopausées (Singletary & Gapstur, 2001) En termes de diète, il a été rapporté qu'un apport élevé en matières grasses, en particulier en acides gras insaturés, est faiblement associé à un risque accru de cancer du sein (Velie et al., 2000). Des études menées aux Etats-Unis et en Europe ont démontré que l'obésité et la prise de poids augmentaient le risque de cancer du sein chez les femmes ménopausées (Huang et al., 1997; Lahmann et al., 2004; Trentham-Dietz et al., n.d.).

* **Facteurs hormonaux et reproductifs** : Un taux élevé d'œstrogènes endogènes est un facteur de risque bien établi qui contribue à une incidence plus élevée de cancer. Des études prospectives ont confirmé une forte association entre l'augmentation des concentrations d'hormones sexuelles chez les femmes ménopausées et un risque plus élevé de cancer du sein
(The Endogenous Hormones and Breast Cancer Collaborative Group, 2002). En outre, des règles précoces (avant 12 ans), la nulliparité, la première grossesse tardive (après 35 ans), l'absence d'allaitement ou encore l'arrivée tardive de la ménopause (après 55 ans) sont aussi des facteurs qui augmentent le risque de cancer du sein (S. B. Brown & Hankinson, 2015).

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Prédispositions génétiques** : Des mutations sur les gènes de susceptibilité au cancer du sein tels que *BRCA1*, *BRCA2* (Breast CAncer 1 et 2), *TP53* (Tumor Protein 53), *ATM* (Ataxia Telangiectasia Mutated) ou *PTEN* (*Phosphatase and TENsin homolog*) confèrent un risque plus élevé de développer un cancer du sein héréditaire ou sporadique (mutations germinales ou somatiques respectivement) (voir ci-dessous). Ces altérations peuvent être de nature génétique ou épigénétique, et aboutissent majoritairement à un défaut dans le mécanisme de réparation des cassures doubles brin (CDB) par recombinaison homologues (HR) (**voire chapitre VI**), associé à une atténuation du déclenchement de la mort cellulaire programmée (Raimundo et al., 2020).

## 2. Notions de sporadicité et d'hérédité cancer du sein : place des mutations BRCA1/2

Les mutations germinales sur les gènes de susceptibilité au cancer du sein ne représentent que 5 à 10% de tous les cancers du sein, probablement en raison de leur faible fréquence allélique dans la population générale. Les mutations de *BRCA1* et *BRCA2* sont les déterminants génétiques de syndromes héréditaires appelés HBC-SS (*Hereditary Breast Cancer Site Specific*) ou syndrome HBOC (*Hereditary Breast Ovarian Cancer*). Ces syndromes se manifestent pour les femmes porteuses de mutations par une augmentation du risque de développer un cancer du sein ou de l'ovaire ou des deux séquentiellement. Environ 80 à 90% de tous les cancers du sein héréditaires sont liés à des mutations héréditaires de *BRCA1* et *BRCA2* (Raimundo et al., 2020).

Les syndromes héréditaires causées par des mutations du gène *BRCA1* ou *BRCA2* sont associées à plusieurs symptômes cliniques (Antoniou et al., 2003). Le premier critère de base est l'âge précoce de l'apparition du cancer du sein et/ou de l'ovaire, généralement chez des personnes de moins de 45 ans. Le deuxième critère pris en compte est l'identification de l'agrégation familiale des cas de cancer du sein et/ou de l'ovaire chez des parents de premier et deuxième degré (American Cancer Society, 2009). Une revue systématique a évalué la prévalence des mutations *BRCA* chez les patientes atteintes d'un cancer du sein dans un large éventail de populations. Parmi les patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique, le pourcentage de prévalence des mutations germinales de *BRCA* était de 2,7 % à 4,3 % (Armstrong et al., 2019). Cependant, l'interprétation des données de prévalence a été entravée par la médiocrité des rapports sur la nature germinale ou somatique des mutations. D'autres études épidémiologiques de grandes envergures et bien documentées sur la prévalence des mutations *BRCA*, héréditaires et somatiques, sont justifiées. Les mutations somatiques de ces gènes sont souvent retrouvées dans les cancers du sein de type basale décrits plus bas.

## B. Cancers du sein : Anatomie et la classification moléculaire

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

###>Anatomie de la glande mammaire

La glande mammaire humaine est constituée d'un réseau de canaux galactophores s'interconnectant et aboutissant dans l'unité terminale ducto-lobulaire (UTDL). L'UTDL est constituée d'un canal terminal et d'un lobule, l'unité fonctionnelle du sein (Fig. 6). L'UTDL est formée de deux types cellulaires principaux : les cellules luminales et les cellules myoépithéliales. Les cellules luminales sont composées
de deux sous types ; cellules luminales canalaires, qui tapissent l'intérieur des canaux, et de cellules luminales alvéolaires, qui secrètent le lait pendant la lactation. De leur côté les cellules myoépithéliales se contractent pour aider à excréter le lait pendant la lactation.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 6.** *Illustrations anatomiques et histologiques de la glande mammaire humaine. Adapté de* (Dimri et al., 2005).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

### Classification moléculaire

Le cancer du sein est une maladie hétérogène dont les caractéristiques histopathologiques et biologiques peuvent varier selon le pronostic et la réponse aux thérapies. Un certain nombre de facteurs, tels que le grade histologique, le type et la taille de la tumeur, la présence de métastases ganglionnaires, le niveau d'expression des récepteurs hormonaux (œstrogène (ER) et progestérone (PR)), mais aussi du récepteur tyrosine kinase HER2/NEU (human epidermal growth factor receptor 2, aussi appelé ERBB2) auxquels est venu récemment s'ajouter le récepteur aux androgènes (AR), influent sur le pronostic et la réponse au traitement. Une première classification en sous-types moléculaires des cancers du sein s'appuyant sur l'analyse des microarrays des échantillons de tumeurs de 42 patientes a été proposée en 2000 (Perou et al., 2000). Ensuite, la classification moléculaire du cancer du sein basée sur les profils d'expression à partir d'une plus grande cohorte a été proposée comme des perfectionnements de cette première tentative assez exploratoire (Sørlie et al., 2003). En effet, la fiabilité et l'utilité clinique d'une classification moléculaire ont été discutées à plusieurs reprises. La critique récurrente portait notamment sur les tailles des effectifs de patientes peu élevées. En 2012, Guedj et al. ont revisité la question en mettant un soin particulier à la robustesse statistique de leur approche et proposent une classification moléculaire des cancers du sein en 6 sous-groupes, essentiellement stratifiés sur l'expression des récepteurs hormonaux (ER, PR, AR) et d'une signature des gènes du cycle cellulaire (Guedj et al., 2012).

Ainsi, les 6 sous-groupes sont constitués de 4 groupes **ER+/PR+/AR+**, un groupe **ER-/PR-/AR+** et un groupe triple-negatif **ER-/PR-/AR-**) (Fig. 7). On notera que les tumeurs HER2/NEU ne constituent pas un sous-groupe transcriptionnel valide dans cette analyse. Les groupes ont été nommés en cohérence avec la classification initiale proposée par Perou et al. (2000) et Sorlie et al. (2003) ;

* **LumA** (ER+/PR+/AR+, faible prolifération)

* **NormL** (ER+/PR+/AR+, faible prolifération)

* **LumB** (ER+/PR+/AR+, l'expression d'ER élevée, forte prolifération)

* **LumC** (ER faible, PR+/AR+/fréquemment PR-, forte prolifération, 40% de la population surexprime HER2)
* mApo (AR+/ER-/PR-, constitue des cellules apocrines, 72% de la population surexprime HER2)

* BasL (ER-/PR-/AR-)

A

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

**Figure 7.** La classification des échantillons de cancer du sein en fonction des différences d'expression génétique. (A). La classification hiérarchique basée sur 256 gènes discriminants (core-signature) a délimité six sous-groupes de tumeurs homogènes. (B) Analyse en composantes principales (ACP) des échantillons selon la core-signature. Adapté de (Guedj et al., 2012).

Les sous-types diffèrent aussi par leur complexité génomique, les altérations génétiques et le pronostic. Les patientes atteintes de tumeurs BasL et mApo ont un taux faible de positivité en ER et en PR, ainsi qu'une fréquence élevée de tumeurs de haut grade, contrairement aux LumA et NormL qui présentent des profils inverses (Guedj et al., 2012; Sørlie et al., 2003).

L'incidence des mutations TP53 est aussi une caractéristique différenciante, puisqu'elle atteint un maximum de 83 % dans le sous-groupe BasL et seulement 4 % dans les tumeurs NormL et LumA. Enfin, il a été noté que les sous-groupes BasL et mApo présentaient un taux de rechutes métastatiques à 5 ans plus élevé que les LumA ou NormL (**Tableau 1**).

Cependant, les classifications moléculaires, construites sur des différences d'expression génique ou de caractéristiques génomiques, n'ont pas réellement convaincu en clinique, leur mise en pratique étant jugée lourde et d'un bénéfice modeste comparée à une classification sur la base de paramètres immunohistochimiques classiquement testés en routine. Ainsi, les tumeurs sont typées selon l'expression des récepteurs aux œstrogènes et à la progestérone (ER/PR), du récepteur HER2 et du marqueur de prolifération KI67 débouchant, entre autres, sur la définition des cancers du sein triples négatifs (ER-/PR-/HER2-) (Goldhirsch et al., 2011). On notera que l'expression du récepteur aux androgenes (AR) n'est pas systématiquement testée, malgré quelques discussions.
<table><caption>**Tableau 1. Classification des cancers du sein et caractéristiques des différents sous-groupes. Adapté de (Guedj et al., 2012).**</caption><thead><tr><th>Variable</th><th>p-value</th><th>BasL</th><th>mApo</th><th>LumC</th><th>LumB</th><th>LumA</th><th>NormL</th></tr></thead><tbody><tr><td>Total</td><td></td><td>53</td><td>39</td><td>48</td><td>66</td><td>61</td><td>88</td></tr><tr><td>ER+ (IHC)</td><td>1.00E-50</td><td>5 (10%)</td><td>1 (3%)</td><td>37 (84%)</td><td>63 (98%)</td><td>58 (97%)</td><td>81 (93%)</td></tr><tr><td>ER- (IHC)</td><td></td><td>46 (90%)</td><td>35 (97%)</td><td>7 (16%)</td><td>1 (2%)</td><td>2 (3%)</td><td>6 (7%)</td></tr><tr><td>PR+ (IHC)</td><td>2.00E-25</td><td>4 (8%)</td><td>1 (3%)</td><td>25 (54%)</td><td>43 (67%)</td><td>53 (88%)</td><td>62 (71%)</td></tr><tr><td>PR- (IHC)</td><td></td><td>48 (92%)</td><td>34 (97%)</td><td>21 (46%)</td><td>21 (33%)</td><td>7 (12%)</td><td>25 (29%)</td></tr><tr><td>ERBB2+ (IHC)</td><td>9.00E-19</td><td>3 (7%)</td><td>19 (68%)</td><td>10 (26%)</td><td>5 (11%)</td><td>0 (0%)</td><td>0 (0%)</td></tr><tr><td>ERBB2- (IHC)</td><td></td><td>43 (93%)</td><td>9 (32%)</td><td>28 (74%)</td><td>41 (89%)</td><td>37 (100%)</td><td>74 (100%)</td></tr><tr><td>AR+ (EXP)</td><td>2.00E-57</td><td>2 (4%)</td><td>32 (82%)</td><td>47 (98%)</td><td>63 (95%)</td><td>61 (100%)</td><td>88 (100%)</td></tr><tr><td>AR- (EXP)</td><td></td><td>51 (96%)</td><td>7 (18%)</td><td>1 (2%)</td><td>3 (5%)</td><td>0 (0%)</td><td>0 (0%)</td></tr><tr><td>P53mut</td><td>1.00E-15</td><td>29 (83%)</td><td>13 (72%)</td><td>24 (69%)</td><td>5 (16%)</td><td>1 (4%)</td><td>1 (5%)</td></tr><tr><td>P53wt</td><td></td><td>6 (17%)</td><td>5 (28%)</td><td>11 (31%)</td><td>27 (84%)</td><td>27 (96%)</td><td>21 (95%)</td></tr><tr><td>SBR Grade 1</td><td>8.00E-11</td><td>0 (0%)</td><td>0 (0%)</td><td>0 (0%)</td><td>0 (0%)</td><td>7 (12%)</td><td>23 (27%)</td></tr><tr><td>SBR Grade 2</td><td>2.00E-13</td><td>6 (11%)</td><td>8 (21%)</td><td>21 (47%)</td><td>38 (58%)</td><td>44 (77%)</td><td>53 (62%)</td></tr><tr><td>SBR Grade 3</td><td>4.00E-26</td><td>47 (89%)</td><td>30 (79%)</td><td>24 (53%)</td><td>28 (42%)</td><td>6 (11%)</td><td>9 (11%)</td></tr><tr><td>Rechute métastatique (5 ans)</td><td>0.001</td><td>17 (36%)</td><td>14 (38%)</td><td>11 (34%)</td><td>15 (26%)</td><td>9 (20%)</td><td>6 (8%)</td></tr></tbody></table>

### C. Cancer du sein triple négatif (TNBC) et le sous-type basal

Les patientes atteintes de cancer du sein triple négatif représentent environ 15% des nouveaux cas de cancer du sein, ce qui correspond à environ 9 000 cas par an en France. Les TNBCs affectent en moyenne des femmes plus jeunes (moins de 40 ans dans certains cas), sont associées à une histologie agressive et un mauvais pronostic. Elles se caractérisent par l'impossibilité de traitement aux thérapies endocriniennes et une fréquence élevée de mutations héréditaires et sporadiques de *BRCA1* (Bauer et al., 2007). Dans une revue systématique les auteurs ont trouvé que parmi les populations TNBC, le pourcentage de prévalence des mutations germinales de *BRCA1/BRCA2* variait de 9,3 % (Australie) à 15,4 % (Etats-Unis) (Armstrong et al., 2019). Le taux de mutations *BRCA1/BRCA2* varie selon l'origine ethnique et peut ainsi atteindre près de 25% dans certains groupes de Juifs ashkénazes (Comen et al., 2011). Il existe de plus en plus de données suggérant un lien entre la voie BRCA1 et les cancers du sein de type basal. La majorité des tumeurs chez les porteurs de la mutation germinale *BRCA1*, en particulier celles diagnostiquées avant 50 ans, présentent des caractéristiques morphologiques similaires à celles décrites dans les cancers de type basal telles que l'expression des cytokératines basales, mutations *TP53* et classifications basées sur les microarrays.

Ainsi, les cancers sporadiques de type basal présentent des profils d'altérations génétiques similaires à ceux des tumeurs survenant chez les porteurs de la mutation *BRCA1*. Bien que ces tumeurs soient dépourvues de mutations somatiques *BRCA1*, cette ressemblance peut en partie être due au dysfonctionnement de la voie BRCA dans ces tumeurs. Ce défaut commun des tumeurs basales pourrait être une cible thérapeutique (voir VI.C.2) (Farmer et al., 2005 ; N. Turner et al., 2005).
### **III. Cycle cellulaire et réplication de l'ADN**

#### A. Le cycle cellulaire : 1=2

##### 1. Le cycle cellulaire : régulation et progression

Le cycle cellulaire est un processus multi-étapes au cours duquel les cellules se divisent après avoir dupliqué leur ADN. On distingue 4 étapes ou phases; (i) G0/G1 (croissance, activité métabolique normale, intégration de signaux de prolifération, préparation à la réplication) durant laquelle les cellules sont diploïdes (2N), (ii) S (ou synthèse) durant laquelle l'ADN est répliqué et les cellules passent d'un état 2N à 4N, (iii) G2 de préparation à la division où l'ADN est vérifié et sa synthèse parfois complétée, (iv) M (mitose) où l'ADN se condense en chromosomes, la membrane nucléaire se dissout (prophase), les chromosomes se rassemblent (métaphase), puis migrent aux pôles (anaphase), s'en suit la division (télophase) menant à la séparation de la cellule mère en deux cellules filles identiques. La progression d'une phase à la suivante est contrôlée par une série de cascades signalétiques rythmées par des complexes protéiques formés d'une kinase dépendante de la cycline (CDK) et d'une cycline qui en régule l'activité (Basu et al., 2022). Chaque étape est contrôlée par un couple cycline/CDK spécifique dont les associations séquentielles contrôlent la progression dans les différentes phases du cycle (Fig. 8) (John et al., 2001 ; Malumbres, 2014; Malumbres & Barbacid, 2005).

Les CDK activées vont phosphoryler des effecteurs essentiels au bon déroulement de chaque phase. Le niveau d'expression des cyclines durant le cycle cellulaire est régulé via les complexes E3-ubiquitine ligase APC et SCF qui contrôlent leur dégradation par le protéasome (Cardozo & Pagano, 2004 ; Peters, 1998; Vodermaier, 2004). Par ailleurs, l'activité des complexes cyclines/CDK, et donc la progression dans le cycle cellulaire, est aussi régulée négativement par des inhibiteurs de CDK (CKI)CDKN1A, B, C (p21, p27, p57) ou CDKN2A, B, C (p14, p15, p16) (Besson et al., 2008).

En résumé, l'équilibre entre activation, stabilité et inhibition des CDK est donc essentiel au bon déroulement du cycle cellulaire, c'est-à-dire entrée et progression d'une phase à la suivante dans le respect du programme. Nous verrons ci-dessous le rôle des contrôles au cours de la phase S et de la progression en mitose et leur importance pour l'intégrité et la stabilité du génome.

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

**Figure 8. Régulation de la progression dans le cycle cellulaire par les CDK, les inhibiteurs protéiques de CDK et RB.** Checkpoint du cycle cellulaire G1 à S : En réponse aux facteurs de croissance, des cyclines de type D sont produites et les CDK4/6 sont activées, provoquant l'inactivation de phospho-RB (pRB). La libération d'E2F lève la répression transcriptionnelle E2F dépendante entraînant la synthèse de cycline A/E, l'activation de CDK2, l'hyper-phosphorylation de pRB par CDK2 et cycline A/CDK2 en G1 et à la limite G1-S respectivement. Transition G2/M. Au cours de G2 : le complexe cycline B/CDK1 est inactivé par phosphorylation via les kinases Wee1 et Myt1. (O. Trèdan et al., 2017).
## 2. Points de contrôle du cycle cellulaire et maintien de l'intégrité du génome

Le cycle cellulaire est ponctué par un ensemble de points de contrôles ayant pour finalité la vérification du bon déroulement de la synthèse de l'ADN et que tout le génome soit correctement dupliqué avant de progresser en mitose (Fig. 9) ;

*   **Point de Contrôle en G1 (restriction point)** ; permet la vérification de l'assemblage correct des complexes de réplication, assurant ainsi un démarrage coordonné et contrôlé de la réplication après entrée en phase S. Le passage en phase S fait suite à la phosphorylation de RB (par le complexe cycline D/CDK4-6), ce qui induit la libération du facteur de transcription E2F et permet l'expression de nombreux gènes indispensables à la transition G1→S (Harbour et al., 1999).

*   **Points de contrôle intra S** : L'expression progressive de la cycline A et son association à CDK2 régulent la progression en phase S, dont l'entrée est arrêtée en cas de blocage de la réplication. (Voie ATR-CHK1, chapitre V). Une fois les obstacles gênant la réplication éliminés, la synthèse d'ADN peut reprendre, et l'association de la cycline A à la CDK1 marque la fin de la phase S et l'entrée en phase G2, (Matsuoka et al., 2000 ; H. Zhao & Piwnica-Worms, 2001).

*   **Point de contrôle en G2/M** : son rôle est d'éviter que la cellule progresse en mitose avec un génome partiellement dupliqué ou présentant des cassures d'ADN, les deux cas de figures pouvant mener à une cascade de remaniements génétiques aberrants et une instabilité du génome. L'entrée en mitose est régie par l'association Cycline B/CDK1 (Malumbres & Barbacid, 2005, 2009). La diminution de l'activité de CDK1 via la dégradation de la cycline B par APC/C permet la mise en place du point de contrôle de l'assemblage du fuseau, qui veille à la bonne ségrégation des chromosomes (Gavet & Pines, 2010).

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 9. (Page suivante) Activation des checkpoints du cycle cellulaire par différents stimuli.**</figcaption></figure>

Le rôle clé des protéines des checkpoints est de détecter les dommages à l'ADN et d'envoyer un signal pour retarder la progression du cycle cellulaire jusqu'à ce que l'ADN endommagé soit réparé. Ainsi l'activation de ces différents points de contrôle représente l'élément majeur du maintien de l'intégrité du génome et constitue une barrière contre le processus de cancérisation.
Les mécanismes de rétrocontrôle du cycle cellulaire *via* les inhibiteurs des complexes cycline/CDK et/ou une signalisation apoptotique sont des processus largement impliqués dans l'inhibition de la cancérisation, et dont le signal activateur principal est l'ADN endommagé. L'arrêt du cycle cellulaire, en cas de dommages subit par l'ADN, permet aux cellules de tenter de le réparer, évitant ainsi la progression d'une cellule porteuse de matériel génétique défectueux vers la mitose. Si la réparation de l'ADN ne peut pas être complétée avec succès, P53 active les gènes de l'apoptose et oriente les cellules vers la mort cellulaire programmée.

En résumé, les checkpoints offrent un mécanisme de sécurité pour assurer l'intégrité génomique de la cellule parentale aux cellules filles. La cascade de transduction du signal de l'activation des checkpoints converge finalement vers l'inhibition des CDKs, ce qui indique que leurs fonctions jouent des rôles clés dans la prolifération cellulaire et ainsi la progression tumorale.

### 3. Dérégulation du cycle cellulaire et cancer

De multiples dérégulations, considérées comme avantageuses, car permettant de contourner ou contrecarrer les mécanismes de rétrocontrôle du cycle cellulaire, sont observés dans les cellules cancéreuses. Elles consistent essentiellement en des suractivations des régulateurs positifs incluant des amplifications des gènes codant pour les cyclines (CCND1, CCND2, CCNE1 et CCNE2) ou CDK (CDK4), ou à des atténuations/pertes de fonctions des régulateurs négatifs (mutations ou délétions de CDKN2/INK4, KIP (Beroukhim et al., 2010; Casimiro et al., 2012; Deshpande et al., 2005; Gil & Peters, 2006; W. Y. Kim & Sharpless, 2006; Roussel, 1999; G. H. Williams & Stoeber, 2012) Se basant sur ces dysfonctionnements, une multitude de molécules ciblant la régulation du cycle cellulaire (principalement des inhibiteurs de CDK) sont utilisées aujourd'hui pour le traitement de plusieurs cancers (Fig. 10).

Ainsi, un contrôle précis du cycle cellulaire, et notamment de l'étape critique de la réplication de l'ADN, représente par conséquent une barrière majeure au déclenchement d'un processus oncogénique.

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

**Figure 10.** Inhibition des CDK comme cible thérapeutique contre le cancer. De nombreuses molécules ciblant l'activité des différentes CDK ont été développées dont le but et de stopper la prolifération cellulaire. Certains de ces inhibiteurs, notamment le palbociclib, ribociclibe et abemaciclib (inhibiteurs de CDK4/6) sont aujourd'hui couramment utilisées en association avec l'hormonothérapie pour le traitement des cancers du sein avancés ER+/PR+/HER2- (Riess et al., 2021).
## B. La réplication de l'ADN : ctrl C/ctrl V ? pas si simple !

### 1. La réplication de l'ADN : généralités

La réplication de l'ADN est une étape critique car elle doit assurer la duplication fidèle du génome afin que les deux cellules filles héritent d'un patrimoine génétique identique (Fig. 11). A cet effet, les eucaryotes supérieurs ont acquis de multiples mécanismes régulateurs au cours de l'évolution que je vais décrire ci-après.

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

**Figure 11.** (A). Les origines de réplication d'une cellule eucaryote vue au microscope électronique. (B). Les étapes de la synthèse d'ADN selon la phase du cycle cellulaire. La réplication de l'ADN, initiée au début de la phase S, se fait de manière semi-conservative et permet la duplication de l'ADN en vue de la division cellulaire (mitose, M) et assure la transmission d'un matériel génétique identique aux deux cellules filles. Adaptée de (PLNT 3140 Introductory Cytogenetics – 2022).

### 2. La réplication de l'ADN : coordination dans le temps et dans l'espace

Le contrôle de la réplication dans l'espace est rendu possible grâce à la restriction de son initiation à certaines séquences d'ADN nommées ORI (Origines de Réplication). Alors que chez la levure S. *Cerevesea* les origines de réplications correspondent à des séquences consensus, chez les mammifères, ces séquences consensus n'ont pas été identifiées, rendant plus difficile la caractérisation des ORI. Cependant, on a pu déterminer qu'environ 50,000 origines de réplication étaient réparties dans le génome humain et étaient activées au cours de la phase S (Creager et al., 2015; Leonard & Mechali, 2013; Méchali, 2010). Une régulation temporelle et géographique stricte de l'activation des origines de réplication (*firing*) est indispensable afin d'assurer une coordination fluide de leur progression le long des chromatides. La coordination dans le temps, suit un programme appelé TDP (*Timing Decision Point*) établi durant la phase G1 et éteint en phase G2 (Dimitrova & Gilbert, 1999; Rhind & Gilbert, 2013). En bref, on classe les origines de réplication en fonction de leur timing d'allumage durant la phase S, « précoces » et « tardives », réparties dans des domaines chromatiniens distincts. Les origines précoces sont retrouvées dans régions chromatiniennes décondensées (euchromatine), riches en gènes et fortement transcrites, alors que les origines tardives sont localisées dans des régions moins denses en gènes, plus faiblement transcrites et plus condensées (hétérochromatine) (Gilbert, 2001; LIMA-DE-FARIA & JAWORSKA, 1968; Rhind & Gilbert, 2013; Sadoni et al., 1999). On note donc une corrélation entre l'activité transcriptionnelle et la réplication, qui s'explique, entre autre, par l'accessibilité plus importante de l'ADN dans l'euchromatine par rapport à l'hétérochromatine. S'ajoute à cela l'organisation tridimensionnelle de la chromatine sous forme de domaines topologiques associés (*Topologically Associated Domains* ou TADs), qui regroupent selon leur temporalité des origines distantes ou même situées sur des chromosomes différents dans un même domaine chromatinien tridimensionnel (Al Ahmad Nachar & Rosselli, 2022) (Fig. 12).
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 12.** Régulation spatio-temporelle de la réplication de l'ADN. (A) Un réplicon représente l'unité de base (50 à 450 kb), définie comme un segment d'ADN répliqué par une seule origine active (bleu). (B) Les unités de réplication adjacentes sont liées ensemble par des cohésines pour former un cluster de réplication. Les origines du même cluster de réplication se déclenchent en même temps soit tôt (vert) soit tard (rouge). Plusieurs clusters de réplication lancés en même temps forment un domaine de réplication. (C) Les foyers de réplication précoce (≈ domaines de réplication) sont situés vers la partie antérieure du noyau (vert). Ils sont répliqués au début de la phase S et organisés en TAD. Les foyers de réplication tardive sont situés plus vers la lame nucléaire donc organisés en LAD (rouge) et sont répliqués à la fin de la phase S. Adaptée de (Al Ahmad Nachar & Rosselli, 2022).</figcaption></figure>

### 3. Les étapes de la réplication

Une fois toutes les conditions réunies, les origines de réplication se transforment en sites ou plates-formes de regroupement de protéines préparant l'initiation de la réplication (Fig. 13), qui a lieu en deux étapes :

#### ➤ Le « Licensing » des origines de réplication

Cette étape fait suite à la baisse de l'activité CDK4/6 en phase G1 (Bleichert et al., 2017; Dimitrova & Gilbert, 1999), et où les protéines du complexe de pré-réplication (pré-RC) sont recrutées au niveau des origines de réplication. Séquentiellement, l'hexamère ORC (Origin Recognition Complex) lie l'ADN et recrute CDC6. Un premier complexe hexamérique MCM2-7 (Mini Chromosome Maintenance) est alors recruté de façon CDT1-dépendante, et les sous-unités CDC6 et CDT1 sont alors relâchées de la chromatine (Ticau et al., 2015). Le (re)recrutement de facteurs CDC6 et CDT1 facilite l'association d'un second hexamère MCM2-7 adjacent au premier (Remus et al., 2009). Les facteurs CDT1, CDC6 et le complexe ORC sont relâchés de la chromatine, indiquant que les pré-RC sont « licensés » et prêts à être activés. Le bon déroulement de cette étape est crucial au maintien de l'intégrité génomique (Neelsen et al., 2013), car elle constitue un prérequis à l'activation des origines de réplication qui aura lieu en phase S (Remus & Diffley, 2009).

#### ➤ Allumage (firing) des origines de réplication

D'autres facteurs protéiques (CDC45-GINS) permettant la constitution du complexe d'hélicases CMG (CDC45/MCM2_7/GINS), qui forme un anneau autour de l'ADN. Les activités kinases de la transition G1-S (CDK2 et CDC7-DBF4) vont activer les hélicases et permettre l'allumage (firing) des origines de réplication (Burgers & Kunkel, 2017; Douglas et al., 2018; Masai & Arai, 2002; Sheu & Stillman, 2010).
Les brins d'ADN sont alors séparés par les complexes hélicases CMG, permettant le recrutement des ADN polymérase et le démarrage de la synthèse d'ADN.

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

## Elongation de la synthèse d'ADN et terminaison

Une fois la réplication initiée, sa progression se fait de manière bi-directionnelle à partir des origines de réplication (Takahashi, 1987). Deux complexes protéiques de synthèse d'ADN (réplisomes) progressent dans des directions opposées à partir de ORI, procédant à la duplication d'un réplicon. La structure nucléoprotéique formée par le réplisome et l'ADN forme la fourche de réplication, qui progresse de manière unidirectionnelle à partir de l'origine de réplication dont elle est issue. La synthèse d'ADN est toujours effectuée dans le sens 5'-> 3', impliquant l'existence d'un brin « précoce » (leading strand), synthétisé en continu dans le sens de la réplication et d'un brin « tardif » (lagging strand), répliqué dans le sens inverse à la progression de la fourche, grâce à la synthèse d'amorces d'ARN transitoires par une primase (ADN Pol α) (Jain et al., 2018).

La rencontre de deux fourches de réplication progressant dans des directions opposées à partir d'origines distinctes engendre la dissociation des réplisomes de la chromatine ainsi que leur propre dissociation correspondant à l'étape de terminaison (Bailey et al., 2015; Gambus, 2017).

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

**Figure 13.** Réplicon, réplisome et fourche de réplication eucaryotes. Haut : Schéma structural simplifié de l'unité réplicative (réplicon) eucaryote. L'allumage d'une origine de réplication, induit la progression des fourches de réplication (réplisome + ADN) de manière bidirectionnelle jusqu'à la rencontre d'un signal de terminaison (rencontre avec une fourche issue d'un réplicon adjacent). La synthèse d'ADN par les ADN polymérase est toujours effectuée dans le sens 5' → 3' à partir de la lecture des brins matrices se faisant dans le sens 3' → 5'. Ce fait implique l'existence d'un brin précoce et d'un brin tardif, synthétisés respectivement dans le même sens et le sens inverse de la progression de la fourche. Le brin tardif nécessite l'activité d'une primase pour la synthèse d'amorces d'ARN afin d'initier la réplication par l'ADN polymérase de chaque fragment d'Okazaki. Bas : structure moléculaire d'une fourche de réplication, adapté de (Burgers & Kunkel, 2017). Le complexe hélicase CMG (CDC45/MCM2-7/GINS) ouvre la route au réplisome en déshybridant les brins d'ADN. L'ADN simple brin issu de l'activité hélicase est protégé par RPA. En aval, les complexes ADN polymérase/PCNA procèdent à la synthèse d'ADN à partir des amorces synthétisées par l'ADN polymérase alpha. Cela donne lieu aux fragments d'Okazaki, synthétisés dans le sens inverse de progression de la fourche au niveau du brin tardif
### C. Voies de synthèse des nucléotides

La première étape de la synthèse de l'ADN et de l'ARN chez l'homme (et probablement chez tous les êtres vivants) implique la formation des ribonucléotides ; Purines et Pyrimidines. Outre leur rôle principal comme unité de base des acides nucléiques au sein d'une cellule, les nucléotides présentent d'autres fonctions : énergétique (ATP et GTP), composant de coenzymes (NAD et FAD) ou encore comme second messager dans la transduction du signal (cAMP et cGMP).

Les ribonucléotides sont essentiellement produits via deux voies endogènes : (i) la voie *de novo* multi-étapes à forte intensité énergétique, utilisant de petites molécules telles que le dioxyde de carbone, les acides aminés et les sucres riboses comme précurseurs, (ii) la voie de « recyclage » à consommation énergétique plus faible, dont les principaux substrats sont les bases et les nucléosides issus de la dégradation de l'ADN et l'ARN. Les voies de la synthèse *de novo* des purines et des pyrimidines sont principalement régulées par les concentrations de leurs propres produits, qui inhibent la production ultérieure. Cette forme de régulation assure un approvisionnement adéquat en nucléotides tout en évitant leur surproduction (Lane & Fan, 2015).

Le but de la synthèse des nucléotides étant de créer huit types distincts de nucléotides (UTP, dTTP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, ATP, dATP), chacun contenant trois parties modulaires (sucre, base azotée et phosphate), le processus est assez complexe. Pour simplifier, les voies de biosynthèse *de novo* des purines et des pyrimidines partagent un point commun : le 5-phosphoribose-1-pyrophosphate (PRPP) qui est la forme activée du ribose dérivé du ribose 5-phosphate sur lequel seront fixés les cycles puriques ou pyrimidiques. Le PPRP est produit par l'axe oxydatif et non oxydatif de la voie des pentoses phosphates (PPP) parallèle à la glycolyse (Qian et al., 2018). Les deux voies divergent ensuite pour former deux groupes de nucléotides, ce qui fait intervenir différentes enzymes et substrats, et qui a lieu en plusieurs étapes décrites comme suit.

#### 1. Synthèse des Purines (Adénine & Guanine)

Les purines sont synthétisées sous forme de ribonucléotides (base azotée + sucre ribose + phosphate) et non sous forme de bases libres. Les deux nucléotides puriques (Adénine et Guanine) sont dérivés du même précurseur ; inosine-5'-monophosphate (IMP). A la différence de la synthèse des pyrimidines, toutes les réactions de la synthèse des purines se produisent dans le cytosol, et le cycle purine est directement construit sur le ribose activé, PRPP. Le cycle purique est synthétisé à partir de divers substrats, tels que la glutamine, la glycine, le bicarbonate et le N10-formyl-tétrahydrofolate (THF). Après une réaction en 10 étapes, l'inosine monophosphate (IMP) est produit et converti en guanosine monophosphate (GMP) (via les enzymes inosine monophosphate déshydrogénase (IMPDH) et guanosine monophosphate synthétase (GMPS)) ou adénosine monophosphate (AMP) (par réactions impliquant l'adénylosuccinate synthase (ADSS) et l'adénylosuccinate lyase (ADSL)). Une fois formés, les ribonucléosides triphosphates (NTP) produits *de novo* peuvent être utilisés pour la synthèse d'ARN (Fig. 14) (Villa et al., 2019).
## De novo purine synthesis

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Purine salvage pathway</figcaption></figure>

**Figure 14.** La voie de synthèse des purines. Flèches bleues voie de novo, flèches violettes voie de recyclage. Schéma des voies de novo et de recyclage des purines. L'aboutissement de la voie des pentoses phosphates (PRPP) représente l'axe central de la voie de synthèse des purines. Le PRPP subit de nombreuses modifications en plusieurs étapes, impliquant l'intervention d'acides aminés Glutamine, Glycine et Aspartate, ainsi que de nombreuses enzymes. Enzymes de synthèse des purines ; **PPAT**: Phosphoribosyl Pyrophosphate Amido-Transférase, **GART**: Glycinamide Ribonucléotide Transformylase, **PFAS**: Phosphoribosyl Formyl-glycinamidine Synthase, **PAICS**: Phosphoribosyl Amino-Imidazole Carboxylase et Phosphoribosyl Amino-imidazole-Succinocarboxamide Synthase, **ADSL**: Adénylosuccinate Lyase, **ATIC**: 5-Aminoimidazole-4-Carboxamide Ribonucléotide Formyltransférase, **IMPDH**: Inosine Monophosphate Déshydrogénase, **GMPS**: Guanine Monophosphate Synthase, **ADSS**: Adénylosuccinate Synthase, **HPRT**: Hypoxanthine phosphoribosyl-Transférase, **APRT**: Adénine Phosphoribosyl-Transférase. Cette cascade de signalisation aboutit à la formation des bases puriques Adénine, Guanine et Hypoxanthine, toutes les trois converties en AMP, GMP et IMP respectivement au cours de la voie de recyclage. Adapté de (Villa et al., 2019a).

## 2. Synthèse des Pyrimidine (Uracil, Thymine & Cytosine)

Contrairement aux purines, les pyrimidines sont d'abord synthétisées sous forme de bases libres, à partir de glutamine, de bicarbonate et d'aspartate. Le cycle pyrimidique ainsi assemblé, est ensuite attaché au PRPP à travers six réactions. Les trois premières réactions de la voie de synthèse de novo sont catalysées par une enzyme cytosolique tricatalytique, la carbamoyl phosphate synthétase 2/aspartate transcarbamylase/dihydroorotase (CAD), qui produit le dihydroorotate. Le dihydroorotate pénètre ensuite dans les mitochondries, où il est oxydé en orotate par la dihydroorotate déshydrogénase (DHODH). Puis l'UMP synthétase (UMPS) convertit l'orotate par deux réactions catalytiques en uridine monophosphate (UMP) et en Uridine triphosphate (UTP) via l'ajout de deux groupement phosphate. Enfin la CTP synthase transforme l'UTP en CTP grâce à l'ajout d'un groupement amine. A ce stade, les produits de cette cascade peuvent être utilisés pour la synthèse de l'ARN au même titre que les GTP et ATP. Cependant, les ribonucléotides doivent être réduits en désoxyribonucléotides par la Ribonucléotide Réductase (RNR), pour servir de précurseurs à la synthèse de l'ADN, aboutissant à la production de dCTP et dTTP (Fig. 15) (Okesli et al., 2017).

**Figure 15.** (Page suivante) La voie de synthèse des pyrimidines. Flèches bleues voie de novo, flèches rouges voie de recyclage. Au même titre que la voie de synthèse des purines, celle des pyrimidines utilise le PRPP comme substrat de départ, qui est ensuite transformé en une série d'intermédiaires métaboliques par le biais de nombreuses enzymes. Contrairement à la synthèse des purines qui est localisée à 100% dans le cytoplasme, la synthèse des pyrimidines comporte une étape ayant lieu dans la mitochondrie. Enzymes de synthèse des pyrimidines ; **CAD**: Carbamoyl-phosphate-synthétase 2/Aspartate-transcarbamylase 3/Dihydroorotase, **DHODH**: Dihydro-Orotate Dés-Hydrogénase, **UMPS**: Uridine-Mono-Phosphate Synthase, **CTPS**: Cytidine-Tri-Phosphate Synthase, **RNR**: Ribonucléotide Reductase, **TS**: Thymidylate Synthase. A la différence des purines, les bases pyrimidiques sont réduites par le biais de la RNR produisant les désoxyribonucléotides dCTP, et dTTP (après action de la TS) (Okesli et al., 2017).
<figure><img src="image_24.png" /></figure>

### 3. Dérégulation de la synthèse des nucléotides et cancer

Les cellules en prolifération actives, telles que les cellules cancéreuses, sont de fortes consommatrices des produits de bio-synthèse des nucléotides. Les mécanismes expliquant le passage métabolique d'un taux normal à un taux élevé de synthèse de novo des nucléotides dans les cellules cancéreuses impliquent des modifications coordonnées au niveau du métabolisme et des axes de signalisation qui régissent cette voie.

En effet, les cellules cancéreuses reprogramment leur métabolisme pour augmenter l'efficacité de la synthèse de novo des nucléotides, afin de subvenir aux besoins accrus pour leur croissance et prolifération. Cependant, les événements moléculaires par lesquels les oncogènes ou les gènes suppresseurs de tumeur modulent ces voies métaboliques ne sont pas complètement élucidés. On peut toutefois en distinguer deux types : 1) les événements moléculaires à court terme impliquant la modification post-traductionnelle des protéines, 2) les événements moléculaires à long terme impliquant une dérégulation au niveau transcriptionnel (Villa et al., 2019).

De ce fait, une activation plus importante des enzymes de la synthèse de novo des nucléotides, n'est qu'une des conséquences de la transformation oncogénique résultant de la dérégulation combinée des oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs, dont le **Tableau. 2**, dresse une liste non-exhaustive (Villa et al., 2019).

<table><thead><tr><th>Nature de la régulation</th><th>Régulateurs</th><th>Description du mécanisme moléculaire</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Court terme</td><td>RAS/ERK</td><td>ERK phosphoryle directement CAD sur T456 et stimule son activité.</td><td></td></tr><tr><td>PI3K/AKT/mTORC1</td><td>TORC1, par phosphorylation médiée par S6K1 de CAD sur S1859, améliore le flux de synthèse de pyrimidines. La phosphorylation médiée par AKT de TKT sur Thr382 améliore la disponibilité de PRPP pour la synthèse de nucléotides. AKT phosphoryle NADK sur S44/S46 pour stimuler la production de NADP(H), un cofacteur essentiel pour la synthèse de nucléotides.</td><td></td></tr><tr><td>SIRT3</td><td>L'inactivation de SIRT3 favorise la synthèse de novo de nucléotides glutamine-dépendante en partie par l'hyperactivation de signalisation mTORC1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MYC-eIF4E</td><td>Au cours de la tumorigénèse induite par MYC, eIF4E contrôle la traduction de l'ARNm de PRPS2 via un élément</td><td></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td>régulateur agissant en cis et augmente la synthèse des nucléotides.</td></tr><tr><td>mTORC1</td><td>La signalisation mTORC1, par le biais de l'activation d'ATF4, stimule l'expression de MTHFD2 nécessaire à l'incorporation d'une unité de carbone formyle dans le cycle purine.</td></tr><tr><td>PTEN</td><td>La perte de PTEN stimule la synthèse de novo de pyrimidine par activation de la signalisation mTORC1.</td></tr><tr><td>P53</td><td>p53 muté améliore l'expression des gènes du métabolisme des nucléotides.</td></tr><tr><td>YAP1</td><td>YAP1 alimente la synthèse de novo des nucléotides via (1) la stimulation de l'expression de la glutamine synthétase (GLUL) et (2) la stimulation de l'expression du transporteur de glucose 1 (GLUT1).</td></tr><tr><td>K-RAS & LKB1</td><td>L'activation simultanée de KRAS et la perte de LKB1 stimulent la synthèse de novo de pyrimidine en augmentant l'expression de la carbamoyl phosphate synthétase 1 (CPS1).</td></tr></table>

Long terme

**Tableau 2. Oncogènes et suppresseurs de tumeurs impliqués dans la régulation à court et à long terme de la synthèse de novo des nucléotides dans les cellules tumorales.** Abréviations : ERK, kinase régulée par le signal extracellulaire ; SIRT3, désacétylase dépendante du NAD sirtuine-3, mitochondriale ; RPIA, ribose 5-phosphate isomérase A ; eIF4E, facteur d'initiation de la traduction eucaryote 4E ; PRPS2, phosphoribosyl-pyrophosphate synthétase 2 ; MTHFD2, méthylène tétrahydrofolate déshydrogénase 2 ; CPS1, carbamoyl phosphate synthétase-1 ; GLUL, glutamine synthétase ; TKT, transcétolase ; PKM1, pyruvate kinase M1. Adapté de (Elodie Villa et al, 2019).

## D. Ciblage de l'ADN dans la lutte anti cancer

Le ciblage de la molécule d'ADN dans le cadre de la thérapie anticancer fut l'une des premières pistes thérapeutiques proposées. Il est à noter que sa relevance reste très actuelle. Ces stratégies thérapeutiques peuvent être catégorisées selon leur action qui peut entraver soit (i) la structure et la stabilité des molécules d'ADN/ARN, (ii) la réplication de l'ADN, (iii) la synthèse des nucléotides, ou encore (ivii) l'activation des checkpoints du cycle cellulaire et la réparation d'ADN. Ces stratégies thérapeutiques, dont les mécanismes seront abordés dans le chapitre suivant, partagent le point commun d'aboutir à la génération d'un stress réplicatif dont l'intensité et les conséquences diffèrent selon les substances utilisées et le contexte moléculaire de la tumeur. En résumé, le ciblage des voies de synthèse des purines et des pyrimidines représente une cible importante de l'arsenal thérapeutique en cancérologie.

## IV. Le stress réplicatif : oui les cellules stressent aussi !

En plus du potentiel mutagène inhérent à la réplication de l'ADN, la survenue d'erreurs de réplication (jusqu'à $10^5$ par jour, par cellule) peut être amplifiée sous l'effet d'insultes exogènes qui seront exposées ci-après (Fig. 16). Cependant, des facteurs de stress endogènes peuvent aussi être en cause. Ces erreurs représentent une source d'instabilité génomique qui doit être constamment surveillée et prise en charge par les cellules dans un contexte physiologique, afin d'assurer une réplication complète et précise de l'ADN et ainsi garantir la stabilité du génome.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 16.** Les différentes sources de stress réplicatif à travers les phases du cycle cellulaire. Schéma résumant les obstacles possibles pouvant affecter la progression des fourches et induire un arrêt de la réplication.</figcaption></figure>

## A. Le stress réplicatif : définition et généralités

Tout événement ayant pour conséquence de ralentir, bloquer et/ou interrompre la réplication de l'ADN est identifié sous l'appellation de stress réplicatif (Zeman & Cimprich, 2014). En effet, les fourches de réplication peuvent rencontrer des obstacles de diverses natures durant leur progression, qui peuvent mettre en cause la stabilité du génome (Magdalou et al., 2014; Mazouzi et al., 2014; Zeman & Cimprich, 2014). De ce fait, le stress réplicatif peut être chronique dans les cellules cancéreuses, du fait de la perte de gènes dont la fonction participe à la protection et/ou la réparation des fourches de réplication bloquées (Macheret & Halazonetis, 2015).

Le terme stress réplicatif ne se réfère pas à une structure physique spécifique, telle une cassure d'ADN, mais à une condition cellulaire générale. Cependant, comme nous le verrons dans les prochains paragraphes, le stress réplicatif peut avoir des répercussions localement au niveau du site de blocage et aussi au niveau du contrôle du cycle cellulaire et de la réparation de l'ADN. Le stress réplicatif est défini comme un ralentissement et/ou l'arrêt des fourches de réplication, concomitant au blocage de l'allumage de nouvelles origines de réplication, accompagné d'une accumulation d'ADN simple brin, qui en constitue la caractéristique principale (L. Zou & Elledge, 2003). En effet, le niveau d'ADN simple brin généré au cours du stress réplicatif est plus important, que celui produit normalement au cours de la réplication du brin tardif, et c'est pourquoi il en résulte l'activation du checkpoint intra S.

Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer la génération de ces brèches d'ADN simple brin. Celles-ci pourraient résulter d'un découplage entre polymérides et hélicases, qui continuent leur progression et finissent par buter sur l'obstacle (Ball et al., 2005; Byun et al., 2005), ou être le produit d'une action nucléolytique sur l'ADN au niveau des fourches bloquées (Ubhi & Brown, 2019).

L'induction de cassures d'ADN durant le passage d'une fourche de réplication sur une lésion non réparée peut également conduire à l'apparition d'ADN simple brin (LAMBERT et al., 2007). De plus, en cas de stress réplicatif élevé, l'effondrement des fourches bloquées peut provoquer des cassures au niveau des séquences ADN simple brin et générer des cassures double brin (CDBs). Ceci empêche le redémarrage des fourches de réplication et favorise la mutagenèse et l'instabilité du génome. En effet,
ces brèches sont fréquemment prises en charge et comblées par le recrutement de polymérides translésionnelles, peu fidèles et à fort potentiel mutagène. A défaut, un ADN incomplètement répliqué peut persister en mitose et être générateur de cassures secondaires et de réarrangements chromosomiques (Gisselsson et al., 2000).

## B. Etiologie du stress réplicatif

Au niveau cellulaire, l'une des premières réactions induites en réponse au stress réplicatif, est l'activation de la voie ATR-HK1, une branche clé de la voie DDR (DNA Damage Response), dont l'accumulation d'ADN simple brin est l'élément déclencheur principal (Flynn & Zou, 2011). Les nombreux rôles de ce checkpoint visent à stabiliser les fourches bloquées, éviter leur effondrement, favoriser la résolution des problèmes et la reprise de la réplication afin de maintenir l'intégrité génomique (Iyer & Rhind, 2017; Shiotani & Zou, 2009, 2009). La source originelle des anomalies causant le stress réplicatif dicte par la suit, le choix de la réponse cellulaire ainsi que des voies de réparations à activer (Ubhi & Brown, 2019). Dans les sections qui suivent, j'aborderai les différentes sources pouvant être à l'origine du stress réplicatif. L'activation de l'axe ATR-HK1 en réponse au stress réplicatif fera l'objet d'un chapitre entier (chapitre V).

### 1. Facteurs intrinsèques

#### 1.1. Facteurs en lien avec la structure de l'ADN

##### Les Dommages à l'ADN et le Stress Oxydatif

Les dommages non réparés de l'ADN représentent la source de stress réplicatif la plus commune. Celles-ci peuvent être de natures variées. Ainsi, des espaces ou des régions flanquées d'ADN simple brin, situées sur le passage de la machinerie de réplication, peuvent être passivement convertis en CDBs (Kuzminov, 2001; Zeman & Cimprich, 2014), qui sont les lésions à l'ADN les plus toxiques (Gavande et al., 2016; Khanna & Jackson, 2001; Rassool & Tomkinson, 2010). D'autres dommages de l'ADN résultant d'une labilité naturelle - dimères de thymine, adduits intra- ou inter-bins, sont aussi des sources de stress réplicatif. Ces lésions peuvent être engendrées spontanément (intermédiaire de réparation de l'ADN) ou par le biais d'agents exogènes (UVs, chimiothérapie...).

Une source supplémentaire non négligeable de lésions à l'ADN réside dans la génération d'espèces réactives de l'oxygène (EROs ou ROS pour Reactive Oxygen Species), notamment les radicaux hydroxyles (OH•) et anions superoxydes (O₂•−) générés au cours du métabolisme oxydatif mitochondrial (Ciccia & Elledge, 2010; Ozeri-Galai et al., 2008). Les ROS peuvent causer des dommages oxydatifs à l'ADN, des sites abasiques, et des cassures simple brin (Ammazzalorso et al., 2010) liées à la mutagenèse, la sénescence cellulaire, et le vieillissement (BACHRATI & HICKSON, 2003).

##### L'incorporation de ribonucléotides pendant la réplication

L'importance de l'exactitude de reproduction de l'ADN au cours de sa synthèse est illustrée par la très haute-fidélité de reconnaissance des appariements base-base des polymérides réplicatives (delta et epsilon). Néanmoins, leur capacité de discernement entre désoxyribonucléotides (dNTPs) et ribonucléotides (rNTPs) peut être mise en défaut. Il peut très occasionnellement en résulter l'incorporation de rNTPs dans l'ADN par les ADN polymérides, ce qui modifie la géométrie de la double hélice et peut arrêter et/ou d'induire l'effondrement des fourches de réplication (J. S. Williams & Kunkel, 2014).
➤ Les structures non conventionnelles de l'ADN

Certaines séquences d'ADN sont difficiles à répliquer et représenter des obstacles à franchir pour la machinerie réplicative, ce qui en fait des sources intrinsèques de stress réplicatif. Il s'agit de séquences riches en Guanine susceptibles de former des structures G-quadruplex (G4s), caractérisée par un repliement local à 4 brins d'une séquence d'ADN riche en guanine (Billard & Poncet, 2019; Gadaleta & Noguchi, 2017; Kaushal & Freudenreich, 2019; Poggi & Richard, 2021; Spiegel et al., 2020). Les G-quadruplex sont souvent retrouvées dans les régions promotrices des gènes, ce qui a suscité la proposition qu'elles pouvaient intervenir dans la régulation transcriptionnelle (Bochman et al., 2012; Huppert & Balasubramanian, 2007). De plus, il a été suggéré qu'elles pourraient également contribuer à la régulation de l'initiation de la réplication (Besnard et al., 2012). Cependant, le repliement secondaire local de la séquence d'ADN représente un obstacle physique pour les fourches de réplication, engendrant leur ralentissement et/ou blocage, pouvant aboutir à la génération de cassures double brin (De & Michor, 2011; N. Saini et al., 2013; Sarkies et al., 2010; Sun & Hurley, 2010).

D'autres motifs spécifiques et structures non canoniques peuvent faire entrave à la progression de la machinerie réplicative résultant dans des désordres équivalents à ceux décrits ci-dessus ; il s'agit des triplexes, repliements cruciformes ou hairpins (structure en épingle à cheveux) (N. Saini et al., 2013).

➤ Les sites fragiles communs (SFCs)

Certaines régions du génome des vertébrés, appelées SCFs (Sites Fragiles Communs), sont particulièrement sensibles (susceptibles) à la génération d'un stress réplicatif. Ces régions ont été identifiée du fait de la fréquence élevée de cassures chromosomiques après un stress réplicatif induit par un traitement avec un inhibiteur de la réplication. La raison précise de leur fragilité reste débattue (Franchitto, 2013), mais le modèle faisant consensus propose que ces régions seraient difficiles à répliquer et présenteraient une faible densité en origines de réplication (Letessier et al., 2011; Ozeri-Galai et al., 2011). En condition de stress réplicatif, ce déficit local en origine de réplication aboutirait à une sous-réplication de ces régions, conduisant à leur cassure durant la séparation des chromosomes en mitose. Cette sous-réplication est d'autant plus accentuée que ces régions sont denses en séquences riches en A-T, favorisant l'apparition de structures secondaires d'ADN (Franchitto, 2013; Zlotorynski et al., 2003). De plus, la localisation au niveau des SFCs de gènes particulièrement longs pourrait favoriser les collisions entre les machineries de réplication et de transcription, ainsi que la formation de R-loop. Ces structures représentent une source à part entière de stress réplicatif (discutées un peu plus bas et pourraient aussi participer à la fragilité de ces sites (Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006; Durkin & Glover, 2007; Glover et al., 1984; Gorgoulis et al., 2005; Le Tallec et al., 2014; Le Tallec et al., 2013).

Par ailleurs, les SFCs sont sujets à des délétions ou à des pertes d'hétérozygotie (LOH) lorsque les cellules sont traitées avec des inhibiteurs de l'ADN polymérase ou présentent un déséquilibre de leurs pools de nucléotides (Durkin & Glover, 2007; Glover et al., 1984). La surexpression d'oncogènes dans des systèmes de culture tissulaire modèles, induit des suppressions génomiques ou LOH dans les SCFs, ce qui mime exactement les changements génomiques observés lorsque ces tissus sont traités avec de l'aphidicoline ou de l'hydroxyurée (Arlt et al., 2009, 2011; Di Micco et al., 2006). Les SFCs sont très fréquemment ciblées dans les lésions précancéreuses et les cancers humains (Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006; Gorgoulis et al., 2005; Tsantoulis et al., 2008), apportant l'un des meilleurs
arguments en faveur de l'hypothèse qui stipule que le stress réplicatif est prévalent dans les cancers humains et entraîne une instabilité génomique.

## 1.2. Facteurs limitants et critiques à la réplication

### Le pool de dNTPs

Les différentes sources de stress réplicatif citées plus haut, sont généralement responsables de dommages provoquant un stress réplicatif localisé, cependant, un stress à l'échelle du génome peut être induit par la déplétion des pools de nucléotides (Lyu et al., 2019; Mazouzi et al., 2016).

La réplication de l'ADN nécessite la présence en quantité suffisante d'un certain nombre de facteurs. Le plus évident est la mise à disposition des fourches de réplication, d'un pool nucléotidique non limitant et équilibré (Poli et al., 2012). En effet, un déséquilibre ou un épuisement du pool de nucléotides aboutit à un ralentissement, voire un arrêt des fourches de réplication. En l'absence d'obstacle physique aux fourches de réplication, ce stress par manque de nucléotides est particulièrement propice aux évènements de découplage hélicase-polymérase évoqués plus haut (Byun et al., 2005; Jossen & Bermejo, 2013). Nous reviendrons sur l'épuisement du pool de nucléotides dans la section 2.2.b et 2.2.c de ce chapitre.

### Les protéines histones, et la protéine RPA

Les nucléotides ne sont pas les seuls éléments constitutifs de base, nécessaires à la réplication, dont la disponibilité limitée peut pousser la réplication à caler. La réplication de l'ADN dans les cellules nécessite une synthèse concomitante de protéines, histones et protéines associées à la chromatine qui composent le réplisome (Groth et al., 2007).

Une déficience quantitative en ces protéines nécessaires à la gestion structurale de l'ADN naissant est limitante durant la réplication et peut par conséquent représenter une source de stress réplicatif à part entière (Aguilera & García-Muse, 2013; Alabert et al., 2014; Mei et al., 2017; Nelson et al., 2002). Une telle déficience durant la réplication peut être le résultat de perturbations au niveau génétique et épigénétique ou, de façon non exclusive, provenir d'une suractivation de la réplication provoquant un déséquilibre entre le nombre de fourches de réplication activées et la synthèse des histones. De tels déséquilibres sont envisageables lors du processus oncogénique (Mejlvang et al., 2014). (Cet aspect sera abordé un peu plus bas dans la partie « dérégulation de la réplication par activation oncogénétique »).

Une autre protéine d'importance majeure durant la réplication, et plus particulièrement en cas de stress réplicatif est la protéine RPA (Replication Protein A). La protéine RPA se lie à l'ADN simple brin dans le but de le protéger et le stabiliser. En effet, l'ADN simple brin représente une structure fragile et instable, qui dès qu'il se forme est immédiatement stabilisé par RPA, empêchant (1) son réappariement avec d'autres séquences d'ADN simple brin et (2) qu'il soit endommagé ou dégradé (R. Chen & Wold, 2014; Prakash & Borgstahl, 2012; Y. Zou et al., 2006). RPA est abondante dans le noyau des cellules et on estime que sa quantité à l'état libre est en excès d'un facteur 6 à 10 par rapport aux quantités requises pour une réplication non perturbée (L. Toledo et al., 2017). Cependant, sous certaines conditions de stress réplicatif aigu, le pool de RPA libre d'une cellule peut s'épuiser. Ceci peut être observé en cas d'exposition des cellules à des poisons de la réplication, qui entraînent une accumulation massive d'ADN simple brin saturant le pool de RPA disponible dans la cellule. Cette
condition appelée épuisement (exhaustion) du pool de RPA peut conduire à une catastrophe réplicative, caractérisée par l'accumulation de dommages à l'ADN au niveau des séquences d'ADN simple brin non protégées par RPA (L. I. Toledo et al., 2013). Voir chapitre V.

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

Les collisions transcription-réplication et R-loop

La réplication de l'ADN utilise la même matrice que la transcription, ce qui peut aboutir à des interférences, voire des collisions entre les complexes de transcription et les fourches de réplication. L'analyse des origines de réplication et des unités de transcription à travers l'évolution suggère que les organismes ont développé des mécanismes pour limiter ces conflits (Brewer, 1988; Brewer & Fangman, 1988; Evertts & Coller, 2012). Dans les cellules de mammifères s'est développé un programme de régulation spatio-temporelle de l'allumage des origines de réplication, afin d'éviter ces potentielles interférences (Knott et al., 2009a, 2009b; Sasaki et al., 2006).

Comme évoqué précédemment, les SFCs sont les loci génomiques fréquemment enrichis en gènes de grande taille (Le Tallec et al., 2013; D. I. Smith et al., 2006), dont la transcription peut s'étendre sur les phases G1 et S du cycle cellulaire et parfois même se prolonger dans le cycle cellulaire suivant. Cette caractéristique augmente donc la probabilité que les machineries de réplication et de transcription (ayant les mêmes polarités directionnelles) se rencontrent physiquement et interfèrent sur l'activité de l'une et l'autre (Helmrich et al., 2011). En dehors des SFC les collisions transcription-réplication peuvent représenter une source importante de stress réplicatif dans les loci abondamment transcrits tels que les ERFs (Early Replicating Fragile sites) (Barlow et al., 2013). Ce type d'anomalie représente à lui seul un domaine d'étude à part entière, dont je n'évoquerais que quelques généralités.

Ce phénomène peut être induit par des déficiences de la machinerie de maturation des ARNm transcrits (Domínguez-Sánchez et al., 2011; X. Li & Manley, 2005; Paulsen et al., 2009; Stirling et al., 2012; Wahba et al., 2011), qui privilégient la formation de structures hybrides ADN-ARN stables les R-loops (Costantino & Koshland, 2015). Il a été récemment montré que les collisions transcription-réplication n'aboutissent à l'induction de cassure double brin que si le complexe transcriptionnel comprend une R-loop (Hamperl et al., 2017). Par ailleurs, les collisions entre réplisome et complexe transcriptionnel peuvent théoriquement avoir lieu de façon co-directionnelle ou convergente. De récentes études ont montré que le sens des collisions régulait non seulement le niveau des R-loop formées, mais également l'activation différentielle des voies ATM-CHK2 et ATR-CHK1 (collisions co-directionnelles -->CDBs-->ATM/CHK2, collisions convergentes-->augmentation de R-loops-->ATR/CHK1) (Fig. 17) (Hamperl et al., 2017; Kotsantis et al., 2018).

Par ailleurs, l'orientation des collisions transcription-réplication détermine aussi les contraintes topologiques de l'ADN dans les régions où elles ont lieu. En effet, les machineries transcriptionnelles et réplicatives séparent les brins d'ADN lors de leur progression, induisant des supertours positifs dans les régions situées en amont. Ainsi des contraintes topologiques s'accumulent au niveau de l'ADN séparant les complexes de transcription et de réplication convergents, avant même leur collision (Lin & Pasero, 2012). Ces contraintes topologiques peuvent être accompagnées d'une compaction de la chromatine (Castellano-Pozo et al., 2013). Malgré l'activité des enzymes de relaxation de l'ADN (topoisomérides) chargées de gérer ces contraintes topologiques (Champoux, 2001; Leppard & Champoux, 2005; J. C. Wang, 2002), la convergence des réplisomes et des complexes transcriptionnels
représente donc une source intrinsèque de stress réplicatif et d'instabilité génomique (Bermejo et al., 2009; Kotsantis et al., 2018; Tuduri et al., 2009).

A Collisions transcription-réplication
Convergentes

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

Augmentation des R-loops
Activation de l'axe ATR/CHK1

B Collisions transcription-réplication
bidirectionnelles

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

**Figure 17.** *Collisions transcription-réplication, R-loops et impact des directions relatives des complexes, adapté de (Hamperl et al., 2017). (A). Impact de la collision des complexes convergents.*

Ce cas de figure aboutirait au ralentissement et/ou l'arrêt de la fourche de réplication, une augmentation de la R-loop et une activation de la voie ATR-CHK1. (B). **Impact potentiel des collisions co-directionnelles.** Ces collisions co-directionnelles (le réplisome « rattrapant » l'ARN polymérase) se solderaient par une résolution progressive de la R-loop, mais pourraient dans certains cas induire une CDB, activant la voie ATM-CHK2.

### 1.3. Altération du processus de réplication par une activation oncogénique

La relation entre les dommages à l'ADN induit par une activation oncogénétique et le stress réplicatif, se pose en termes de la poule et l'œuf. Néanmoins, la capacité des oncogènes à induire un stress réplicatif a été bien documentée dans des modèles cellulaires (Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006). Les mécanismes par lesquels les oncogènes induisent un stress réplicatif n'ont toutefois pas été clairement définis, bien que nombre de pistes prometteuses aient été proposées. Il faut souligner qu'on ne peut pas exclure que différents oncogènes induisent un stress réplicatif *via* différents mécanismes, et que même un seul oncogène pourrait induire un stress de réplicatif par plus d'un mécanisme (Halazonetis et al., 2015).

En effet, tous les mécanismes décrits ci-dessus ont pu être observé dans des conditions de perturbations oncogénétiques. De plus, ces observations ont été corroborées avec les conséquences de l'utilisation de divers inducteurs exogènes de stress réplicatif aboutissant aux différents mécanismes cités plus haut.
En premier lieu, il a été démontré qu'une activation oncogénique pouvait stimuler la voie ATR/CHK1 aboutissant à la formation de foyers gH2AX (forme phosphorylée de l'histone H2AX) et 53BP1 (protéines majeures des DDR, utilisées comme marqueurs de dommages à l'ADN) (Bartkova et al., 2006). L'apparition de cassures double brin associées à une activation oncogénique a été observée et leur nombre baisse suite à l'ajout d'aphidicholine (inhibiteur d'ADN polymérase). Ceci suggère fortement que les CDBs formées suite à cette suractivation oncogénique sont en lien avec la réplication (Bartkova et al., 2006). En effet, des expériences de DNA combing, ont permis de démontrer que les oncogènes activés induisaient une augmentation de la fraction de fourches bloquées, une diminution de la vitesse des fourches de réplication, une augmentation de l'asymétrie des fourches et une diminution de la distance inter-origine (Bartkova et al., 2006; Bester et al., 2011; Costantino et al., 2014; Di Micco et al., 2006; D. D. Jones, 1974; Srinivasan et al., 2013). Un ralentissement de la progression et l'asymétrie des fourches représentent probablement leur décrochage et/ou leur effondrement, alors que la diminution de la distance inter-origine peut représenter un allumage compensatoire d'origines dormantes et/ou une dérégulation de l'allumage de ces dernières. Effectivement, il n'est pas forcément surprenant que la régulation de l'activation des origines de réplication soit perturbée dans un contexte d'activation oncogénique, étant donné que la régulation de ce processus est régie par l'activité des CDK, qui est souvent dérégulée dans un tel contexte.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>**Figure 18. Oncogènes, stress réplicatif et instabilité génomique.** L'activation d'oncogènes et/ou la perte de fonction de suppresseurs de tumeurs (TSG) (P53, RB, INK4...) peuvent conduire à la dérégulation du licensing et de l'activation des origines (ORI) de réplication. Cette dérégulation, qu'elle soit positive ou négative, induit des phénotypes, participant à l'instabilité génomique. Adapté de (Hills and Diffley, 2014).</figcaption></figure>
D'une manière générale, la formation des complexes de pré-réplication (pré-RC) est inhibée par les CDK et, par conséquent, le *licensing* d'origines est limitée à la phase G1 du cycle cellulaire. En revanche, la formation des complexes de progression (CPR) dépend de l'activité des CDK et a lieu à la transition G1/S et pendant la phase S (Bell & Dutta, 2002; Diffley, 2001, 2011; Nishitani & Lygerou, 2002). Parce qu'une dérégulation oncogénique impacte fréquemment les CDK, les étapes décrites ci-dessus pourraient potentiellement être compromises dans les cellules cancéreuses. Cette dérégulation du programme de réplication peut aboutir à une sous-utilisation ou une surutilisation des origines de réplication. Dans les deux cas, les processus engendrés peuvent mener à l'induction de dommages de l'ADN, favorisant l'instabilité génomique (Fig. 18) (Hills & Diffley, 2014; Kotsantis et al., 2018).

Une sous-utilisation des origines de réplication peut conduire à une instabilité génomique, notamment au niveau des régions SFCs (Debatisse et al., 2012; Letessier et al., 2011; Ozeri-Galai et al., 2011), leur faible densité impliquant une progression des fourches sur de longues distances. L'impossibilité d'activer d'autres origines pour compléter la réplication de ces régions lorsque des fourches se bloquent peut alors entraîner une sous-réplication et une fragilisation de ces sites (Hills & Diffley, 2014; Kotsantis et al., 2018).

A l'inverse, une sur-activation d'origines peut mener à l'épuisement de facteurs critiques pour la réplication. À titre d'exemple, il a été montré que des systèmes cellulaires surexprimant *KRAS* et *CCNE1* était fréquemment associés à une diminution de la vitesse de progression des fourches. Cela s'accompagne souvent d'une diminution de la distance inter-origine (liée à un allumage d'origine accru), une asymétrie de fourche et une augmentation des CDBs (Bester et al., 2011; Costantino et al., 2014; Di Micco et al., 2006; D. D. Jones, 1974). Ainsi, l'activation oncogénique entraine une dérégulation au niveau de la progression du cycle cellulaire, sans que toutefois les cellules concernées activent toutes les voies nécessaires à une progression « correcte » dans le cycle cellulaire. En résumé, l'entrée dans le cycle cellulaire associée à une activation non coordonnée des voies nécessaires à la réplication de l'ADN induit une déplétion du pool de nucléotides, mais également d'autres facteurs tels que les protéines histones ou RPA. Ce processus peut conduire *in fine* à un ralentissement des fourches et être générateur de stress réplicatif. De ce fait, le stress réplicatif et, par voie de conséquences, l'instabilité génomique globale peut résulter d'une déplétion nucléotidique, qui est elle-même engendrée par une suractivation des origines de réplication, pourrait représenter un des moteurs de la transformation cancéreuse (Bester et al., 2011). En plus de la déplétion des pools de nucléotides, un excès d'allumage d'origines de réplication peut aussi favoriser les collisions transcription-réplication (Fig. 19) (R. M. Jones et al., 2013).

<figure><img src="image_30.png" /></figure>
**Figure 19. (page précédente). Illustration des causes endogènes du stress réplicatif.** Le stress réplicatif résulte d'obstacles endogènes ou exogènes à la réplication de l'ADN. L'activation accrue d'origine (cercles roses + la lettre F) peut être causée par une activation d'oncogènes ou une perte de gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui provoquent une déplétion des dNTP, et entrave la progression de la réplication de l'ADN en cours. Différents types de dommages à l'ADN d'origine exogènes ou endogènes engendre un stress réplicatif s'ils ne sont pas réparés. Les séquences d'ADN répétitives, la réhybridation de l'ARN naissant à l'ADN, la formation de R-loop, l'incorporation de ribonucléotides ainsi que les structures secondaires d'ADN telles que les hairpins et les G-quadruplexes posent un défi à la réplication de l'ADN et sont des causes endogènes majeures de stress réplicatif même dans les cellules saines. Enfin, les collisions entre complexes de réplication et de transcription sont aussi des causes de stress de réplicatif. L'hélicase est représentée en jaune, l'ADN polymérase en bleu, les molécules d'ARN nouvellement synthétisées en violet. Les flèches rouges et bleues indiquent la direction de la synthèse continue d'ADN sur le brin précoce et la synthèse discontinue d'ADN sur le brin en retardé respectivement. (da Costa et al., 2023).

## 2. Facteurs extrinsèques

### 2.1. Exposition environnementale et implication dans le processus cancéreux

Outre les facteurs intrinsèques de nombreux facteurs externes, physiques ou chimiques cytotoxiques pour la plupart et utilisés comme molécules thérapeutiques, peuvent provoquer un stress réplicatif (Zhu et al., 2020).

Certains de ces facteurs physiques et chimiques font partie de notre quotidien, tels que les rayonnements ultravioletes (UVs) dont la principale source est le soleil. Les UVs peuvent être à l'origine de diverses lésions de l'ADN, notamment les dimères de pyrimidine et des photo-produits 6-4 (Sinha & Häder, 2002). Ces lésions modifient la structure des bases d'ADN et peuvent conduire à l'apparition de cassures simple brin, pouvant elles-mêmes être converties en CDB lors de la réplication (Harper et al., 2010). Par ailleurs, une étude publiée en 2020 a réussi à identifier des caractéristiques de stress réplicatif (augmentation du nombre de cellules en phase S, activation de l'axe ATR/CHK1, formation de foyers 53BP1...) en lien avec l'exposition à la *Thirdhands* (THS) ou fumée de cigarette tertiaire, une toxine nouvellement décrite qui persiste dans l'environnement intérieur longtemps après l'extinction des cigarettes (Sarker et al., 2020). Si le potentiel carcinogène de ces deux facteurs est largement reconnu, notamment en raison de leur potentiel génotoxique, il n'en va pas de même pour certaines molécules auxquelles nous sommes communément exposées.

En effet, un effet inducteur de stress réplicatif a été associé à certains pesticides d'origine chimique couramment utilisés en agriculture. Ces pesticides peuvent induire le stress réplicatif soit en modifiant directement l'ADN, soit par un mécanisme indirect. Ainsi le fongicide captan (famille des phtalamides) modifie la structure chimique des bases azotées, mais est aussi capable de ralentir la progression des fourches de réplication indépendamment de toute lésion (Fernandez-Vidal et al., 2019). Cependant, l'effet le plus documenté est l'induction d'un stress oxydatif important impliquant l'accumulation de EROs et ERNs (Espèces Réactives à l'azote), qui provoquent l'oxydation des acides nucléiques (entre autres conséquences) causant ainsi un stress réplicatif (Sule et al., 2022).

### 2.2. Agents chimique utilisés en thérapie anti cancer du sein

Les molécules utilisées en thérapie anticancer peuvent causer du stress réplicatif en agissant à différents niveaux sur l'ADN. Pour simplifier, ces agents induisent et/ou augmentent le stress réplicatif selon deux mécanismes principaux : (i) l'induction de dommages à l'ADN (adduits à l'ADN, blocage des topoisomérides...), (ii) en interférant avec l'activité du réplisome (inhibition des ADN polymérides,
inhibition de la synthèse des nucléotides) (Fig. 20). Ici, nous ferons un rapide tour d'horizon des principaux inducteurs chimiques induisant le stress réplicatif utilisés dans les cancers du sein.

a. Induction de dommage à l'ADN

❖ Modification de la structure d'ADN via la formation d'adduits

Certains agents alkylants tel que le cyclophosphamide (traitement de référence des cancers du sein triple négatifs en combinaison avec 5-FU et l'épirubicine cité plus bas) et dérivés à base de sels de platine tels que le cisplatine et le carboplatine (phase 2, phase 2 et 3 respectivement) (Byrski et al., 2012; Champoux, 2001; Y. Li et al., 2022; Ubhi & Brown, 2019), peuvent se lier de façon covalente aux bases d'ADN, induisant des adduits intra- et inter-brins (Fichtinger-Schepman et al., 1985; Johnstone et al., 2014) qui empêchent le déroulement et la séparation des brins d'ADN, et par conséquent sont des obstacles à la progression des complexes de transcription et de réplication (Harder & Rosenberg, 1970). Ce mécanisme d'action mène à des effets cytostatiques (blocage du cycle cellulaire) et cytotoxiques (induction de l'apoptose) (Desoize, 2002). Une fois formés, ces adduits font partie intégrante du brin matrice, et entraînent donc le ralentissement ou le blocage de la progression des fourches de réplication (Forment & O'Connor, 2018; Zhang et al., 2016). Les adduits sont gérés par diverses voies de réparation de l'ADN incluant le MMR (Miss Match Repair) (Sedletska et al., 2007), le NER (Nucleotide Excision Repair) (Köberle et al., 1999) mais aussi la voie de recombinaison homologue (HR) (**voir chapitre VI section B.2**) (Borst et al., 2008). En plus de ces voies de réparation, les lésions induites par les sels de platine peuvent également être « contournées » par la synthèse d'ADN translésionnelle ou *Trans-Lesion Synthesis* (TLS) (**voir section C.a.i de ce présent chapitre IV**) (Alt et al., 2007).

❖ Inhibiteurs de topoisomérides

Les enzymes de remodelage chromatinien de la famille des topoisomérides font partie des protéines dont le bon fonctionnement est indispensable à la réplication (Champoux, 2001; Pommier et al., 2010). Ces protéines contrôlent la topologie de l'ADN au cours de la réplication et de la transcription, en catalysant le clivage et la religation d'un ou des deux brins d'ADN. Il existe 3 types de topoisomérides chez l'Homme : les type IA (Topo3α/β), les types IIA (Topo II α/β) et les types IB (Topo I et Topo I mitochondriale)(Y. Xu & Her, 2015). Les topoisomérides I et II sont les cibles de médicaments anticancers (Pommier, 2013). Notamment dans le cancer du sein triple négatif l'épirubicine (inhibiteur de Topo II) fait partie du cocktail standard (FEC-100) administré en première ligne. L'épirubicine peut en effet causer du stress réplicatif, en s'intercalant entre les paires de bases nucléotidiques au niveau des anneaux plans de l'ADN, formant ainsi des complexes stables (Mouridsen et al., 1990). Ceci induit l'arrêt de la réplication et de la transcription, mais encore, les complexes ADN/Topo II constituent une contrainte physique qui conduit à une torsion de la molécule d'ADN induisant des cassures doubles brin irréversibles (Ju et al., 2006).

b. Interférence avec l'activité du réplisome

❖ Inhibition des ADN polymérides

Les inhibiteurs de polymérides ne font pas encore partie des stratégies thérapeutiques du cancer du sein, cependant certaines molécules sont en développement préclinique ; CD437 et Zelpolib (G. Chen & Jens Zeller, 1992; Rankin et al., 1989). L'une des molécules inhibitrices des ADN polymérides la plus
caractérisée, mais dont le développement clinique a été abandonné (faible solubilité et
pharmacocinétiques défavorables) est l'aphidicoline (APH)(Sessa et al., 1991). C'est une molécule
antibiotique de la famille des tetracyclines, inhibant les ADN polymérides α, ε et δ (Cheng & Kuchta,
1993). Elle se fixe au niveau du site actif des ADN polymérides et induit la rotation d'une guanine sur
le brin matrice, bloquant sélectivement l'incorporation de la cytosine correspondante sur le brin
synthétisé (Baranovskiy et al., 2014). En bloquant la progression des ADN polymérides sans affecter
l'activité hélicase, l'APH induit un découplage hélicase-polymérase générant de longs tronçons d'ADN
simple brin (Byun et al., 2005; D. J. Chang et al., 2006). Ces caractéristiques font de l'APH une molécule
idéale dans les expérimentations visant à mieux comprendre les évènements ayant lieu lors du
processus réplication.

❖ Inhibition de la synthèse des nucléotides

Comme discuté précédemment, le métabolisme des nucléotides joue un rôle crucial dans la
carcinogenèse et la progression tumorale. Les cellules cancéreuses, du fait de leur prolifération
soutenue, doivent produire une grande quantité de nucléotides pour la synthèse d'ADN et d'ARN, afin
d'alimenter leur activité proliférative soutenue. En conséquence, le métabolisme des nucléotides est
une cible semi-sélective pour le traitement du cancer (H. liang Wu et al., 2022).

Ainsi, le rationnel derrière le ciblage des voies de synthèse des nucléotides consiste à bloquer la
réplication de l'ADN et ainsi induire un stress réplicatif. Les agents ciblant le métabolisme des
nucléotides peuvent être classés en trois catégories principales ; les analogues de purine, les analogues
de la pyrimidine et les inhibiteurs enzymatiques métaboliques, en fonction de leurs structures et
mécanismes (Parker, 2009).

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

**Figure 20.** Lésions d'ADN d'origine chimiques, capables de causer du stress réplicatif. Ce schéma illustre les lésions causées par les agents chimiques les plus utilisés en thérapie anticancer, notamment dans le traitement du cancer du sein. Les adduits intra-brin et inter-brin (Intra-Strand Crosslinks ; ISC, Inter-Strand Crosslinks ; ICL) respectivement, résultant de l'utilisation du cyclophosphamide et les sels de platine, (Me) indique les base alkylées/modifiées. L'inhibition des enzymes liées à la réplication : topoisomérase I et II (Topo I et II) via la camptothecine et l'epirubicine respectivement engendre la formation de structures ADN-Protéines stables ; ADN polymérase (DNA Pol) via l'aphidicoline (APH) bloque la synthèse d'ADN ; Ribo-Nucléotide Réductase (RNR) via l'Hydroxy-Urée (HU) et la gemcitabine qui inhibent respectivement la sous-unité 2 et 1 de la RNR, causant une déplétion du pool de nucléotides (dNTP). Adapté de(Vesela et al., 2017).
Il existe plus de 20 nucléotides et analogues de nucléotides approuvés, couramment utilisés dans les chimiothérapies anticancéreuses, qui représentent près de 20% de toutes les molécules utilisées dans le traitement des cancers (Parker, 2009). Ces nucléosides synthétiques, sont incorporés dans la molécule d'ADN/ARN au cours de leur synthèse, ce qui inhibent leur elongation. Ceci est rendu possible grâce au remplacement du fragment désoxyribose par des modifications non fonctionnelles telles que l'azide ou l'hydrogène (Shelton et al., 2016). Cependant, Les nouvelles générations de nucléosides sont plus sophistiquées et présentent des propriétés métaboliques supplémentaires améliorant leur cytotoxicité cellulaire. Par exemple, en plus de bloquer la synthèse d'ARN, l'analogue de l'adénosine 8-amino-adénosine provoque une crise énergétique et induit la mort cellulaire en diminuant les concentrations intracellulaires d'adénosine triphosphate (ATP) (Berdis, 2008). Les analogues de purine et de pyrimidine utilisés dans le traitement du cancer sont résumés dans le **tableau 3**, ainsi que leurs indications et mécanismes d'action mis en jeu.

<table><caption>Tableau 3. Médicaments anticancéreux ciblant le métabolisme des nucléotides.</caption><thead><tr><th>Nom de la molécule</th><th>Indication</th><th>Mécanisme d'action</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="3"><strong>Analogues de purines</strong></td></tr><tr><td>Mercaptopurine/ Thioguanine</td><td>Leucémie Lymphoblastique aigue</td><td>Analogue purique ; La 6-mercaptopurine est convertie en 6-thioguanine, qui est ensuite incorporée dans l'ADN</td></tr><tr><td>Nelarabine</td><td>Leucémie lymphoblastique aigu à cellules T, lymphome à cellules T</td><td>Analogue purique ; incorporation dans l'ADN entraînant la terminaison de la chaîne</td></tr><tr><td>Pentostatin</td><td>Leucémie à tricholeucocytes</td><td>Analogue purique ; inhibe l'adénosine désaminase entraînant une accumulation intracellulaire du métabolite de la désoxyadénosine triphosphate</td></tr><tr><td>8-amino-adenosine</td><td>Le myélome multiple</td><td>Analogue purique ; diminue le pool d'ATP intracellulaire, entraîne phosphorylation de l'ARN polymérase II, s'incorpore dans l'ARNm, conduisant à la terminaison de la transcription</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Analogues de pyrimidines</strong></td></tr><tr><td>Cytarabine</td><td>Leucémie aiguë myéloïde, Leucémie lymphoblastique aigue, Leucémie myéloïde chronique</td><td>Analogues de pyrimidine ; incorporation compétitive dans l'ADN entraînant l'inhibition de l'ADN polymérase</td></tr><tr><td>Floxuridine</td><td>Cancer colorectal, métastases hépatiques du cancer colorectal</td><td>Incorporation dans l'ADN mais pas ARN ; catabolisme en fluorouracile</td></tr><tr><td>Fluorouracile (et prodrogues Capécitabine)</td><td>Cancer colorectal, sein, et tête et cou</td><td>Analogue de l'uracile ; mauvaise incorporation dans l'ADN et l'ARN (comme FdUTP ou FUTP respectivement) ; l'inhibition de la thymidylate synthase (sous forme de FdUMP), entraînant des dommages à l'ADN dus au déséquilibre du pool de dNTP ; éventuellement altération des voies de l'ARN</td></tr><tr><td>Trifluridine/tipiracil</td><td>Cancer colorectale</td><td>La trifluridine est un analogue de la thymidine ; la forme monophosphorylée inhibe la thymidylate synthase ; la forme triphosphorylée s'intègre dans l'ADN</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNR (Gemcitabine, fludarabine, clofarabine, cladribine)</td><td colspan="2">Voir tableau 4</td></tr></tbody></table>
Dans la section qui suit, nous allons nous concentrer sur le ciblage des différentes enzymes impliquées dans la synthèse des nucléotides, et plus particulièrement celles en lien avec la synthèse des pyrimidines, dont la relevance est centrale dans mon projet de thèse.

→ **Inhibition des voies de synthèse des purines et pyrimidines**

Cibler l'une des deux voies de synthèse de nucléotidique (purines ou pyrimidines) va générer un déséquilibre du pool de nucléotides, en diminuant les niveaux d'un groupe par rapport à l'autre. Le rapport entre les deux pools étant finement régulé, le déséquilibrer peut provoquer un stress réplicatif et augmenter la mutagenèse. C'est donc une lame à double tranchant pour les tumeurs, une mutagenèse ménagée pouvant être associée à la sélection de variants avantageux, mais exacerbée par le biais d'agents externes elle peut induire la mort cellulaire (Kohnken et al., 2015a; J. Wang et al., 2016).

L'une des premières molécules approuvées par la FDA pour le traitement du cancer était l'inhibiteur de purine 6-mercaptopurine (6 MP). Le 6-MP inhibe la première enzyme de la biosynthèse *de novo* des purines, 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphatase (Kohnken et al., 2015) ainsi que l'enzyme de recyclage des purines, l'hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (Pavlova & Thompson, 2016). Il existe également des inhibiteurs spécifiques de l'inosine monophosphate déshydrogénase (IMPDH) (mizoribine, merimepodib, mycophenolic mofetil...) (Naffouje et al., 2019) mais dont l'utilisation est plus fréquente en thérapie antivirale (Tong et al., 2018).

Parmi les inhibiteurs communs aux deux voies de biosynthèse des purines et pyrimidines, on retrouve le méthotrexate et le pemetrexed. Les deux composés interfèrent avec l'action de la Di-Hydro-Folate-Reductase (DHFR), l'enzyme responsable de la conversion du dihydrofolate en tétrahydrofolate, nécessaire à la synthèse des précurseurs de purines et de thymines (Goldman & Matherly, 1985). En plus de l'action inhibitrice sur la DHFR, le pemetrexed peut également agir sur la thymidylate synthase, l'enzyme responsable de la méthylation de dUMP en dTMP, perturbant ainsi la synthèse des thymines (M. Zhao et al., 2019).

Contrairement aux inhibiteurs du métabolisme des purines, le nombre d'inhibiteurs ciblant la voie de synthèse des pyrimidines est plus élevé. On note au moins un inhibiteur pour chaque étape majeure (enzyme) de la biosynthèse des pyrimidines, que je détaillerai ci-dessous (Fig. 21).

**CAD** : enzyme trifonctionnelle (Carbamoyl phosphate synthetase (CPSase), Aspartate transcarbamoylase (ATCase), et Dihydroorotase (DHOase)) qui catalyse les trois premières étapes (décrites le **chapitre III section C.3**). La CAD représente « le verrou » régulateur de la voie de synthèse des pyrimidines grâce au rétrocontrôle principalement porté par l'ATCase, qui permet d'équilibrer les niveaux de purines et de pyrimidines. En effet, l'activité ATCase de la CAD est activée par les purines (GTP et ATP) tandis qu'elle est inhibée par les produits finaux de la voie de synthèse des pyrimidines à savoir le dCTP et le dUTP (Cockrell et al., 2013; Rabinowitz et al., 2008). En raison du rôle clé de la CAD dans la synthèse des pyrimidines, son activité est souvent amplifiée dans les cellules cancéreuses pour répondre à la forte demande en nucléotides, ce qui fait potentiellement d'elle une cible thérapeutique intéressante (Aoki & Weber, 1981). Le N-phosphonacétyl-L-aspartate (PALA), un analogue de l'intermédiaire de réaction de l'ATCase, dont les essais en tant que médicament anticancéreux ont échoué, car le traitement est fréquemment associé à l'amplification du gène CAD et une résistance
(Grem et al., 1988), a cependant été récemment testé comme un anti malaria avec des résultats prometteurs (C. Wang et al., 2022).

**DHODH** : la quatrième étape dans la voie de biosynthèse *de novo* des pyrimidines a lieu au niveau de la mitochondrie et est catalysée par l'enzyme **Di-Hydro-Orotate-Déshydrogénase** (DHODH) dont le rôle principal est de convertir le dihydroorotate en orotate. Souvent hyperexprimée dans différents cancers (en particulier dans les hépatocarcinomes) (Y. Zhou et al., 2021). L'implication de la DHODH dans la progression tumorale a été mise en évidence pour la première fois en 1959 (SMITH et al., 1960; L. H. Smith & Baker, 1959), ce qui suscita beaucoup d'intérêt et conduisit au développement du premier inhibiteur spécifique de cette enzyme ; le Brequinar (Dexter et al., 1985; Schwartsmann et al., 1990).

En effet, s'agissant d'une enzyme pléiotrope, la dérégulation de son activité engendre non seulement un stress réplicatif *via* un déséquilibre du pool de pyrimidine (baisse des dTTP), mais aussi un stress oxydatif, un stress ribosomal ainsi qu'une dérégulation de certaines modifications post traductionnelles des protéines (Boukalova et al., 2020). Plusieurs études précliniques ont montré une sensibilité des tumeurs au Brequinar (inhibition de la croissance tumorale), en particulier dans les tumeurs surexprimant la DHODH (Lolli et al., 2018; Madak et al., 2019; Sykes, 2018). Cependant, le développement clinique du Brequinar en tant que thérapie anticancer a été abandonné. D'autres inhibiteurs de la DHODH, tels que le Teriflunomide et le Leflunomide, ont été approuvés par la FDA pour le traitement de certaines maladies auto-immunes (sclérose multiple, polyarthrite rhumatoïde et psoriasis) (Fragoso & Brooks, 2015) et on notera que le second est actuellement en essais cliniques de phase I et II pour le traitement de cancer du sein triple négatif (NCT03709446).

**TS: la Thymidylate Synthase (TS)** est la seule enzyme capable de catalyser la méthylation réductrice du désoxyuridine monophosphate (dUMP) en désoxythymidine monophosphate (dTMP), avec le folate réduit 5,10-méthylènetétrahydrofolate (CH2 THF) comme donneur de méthyle (Brandt & Chu, 1997; Rose et al., 2002). C'est, en effet, l'unique moyen de production intracellulaire *de novo* des dTTP, ce qui a rendu son inhibition l'une des stratégies chimiothérapeutiques les plus efficace de nos jours (utilisé dans les cancers colorectaux, les cancers gastriques, les cancers rénaux et le cancer du sein) (Wilson et al., 2014). Le développement des inhibiteurs de la TS a fait suite à la découverte par Rutman et coll en 1954 de la consommation élevée d'uracile exogène par les hépatomes de rat, indiquant que le métabolisme de l'uracile jouait un rôle important dans la cancérogenèse *in vivo* (RUTMAN et al., 1954). Ceci mena à la synthèse du Fluoro-Uracile (FU) par Heidelberger et collègues et l'approbation par la FDA du 5-FU en 1960 (HEIDELBERGER et al., 1957). Il s'agit donc d'un analogue modifié de l'uracile (atome de fluor à la place d'un atome d'hydrogène en position C-5) qui une fois à l'intérieur de la cellule peut être converti en différentes formes métaboliques actives ; fluorodésoxyuridine monophosphate (FdUMP), fluorodésoxyuridine triphosphate (FdUTP) et triphosphate de fluorouridine (FUTP) (Diasio & Harris, 1989). Le FdUMP se lie au site de liaison des nucléotides de la TS, formant un complexe ternaire stable avec l'enzyme et le CH2 THF (donneur de groupement méthyle), bloquant la liaison du substrat normal dUMP et inhibant ainsi la synthèse de dTMP (Santi et al., 1974; Sommer & Santi, 1974). L'épuisement du dTMP entraîne une déplétion du dTTP et provoque un déséquilibre de niveaux avec les autres désoxynucléotides (dATP, dGTP et dCTP) à travers divers mécanismes de rétrocontrôle. Ce déséquilibre (en particulier le rapport dATP/dTTP) perturbe gravement la synthèse et la réparation de l'ADN entraînant des dommages à l'ADN (Houghton et al., 1995; Yoshioka et al., 1987). En outre, l'inhibition de la TS entraîne une accumulation de dUMP, qui pourrait par la suite
entraîner une augmentation des taux de dUTP. Le dUTP et le FdUTP peuvent être mal incorporé dans l'ADN et ainsi accentuer le stress réplicatif et les dommages à l'ADN. De plus, les autres dérivés métaboliques du 5-FU (FUMP, FUDP, FUTP) peuvent aussi s'incorporer dans l'ARN et causer d'autres dommages au niveau de l'ARN (Aherne et al., 1996; Mitrovski et al., 1994). Le 5-FU (souvent en combinaison avec d'autres composés) fait partie de l'arsenal standard du traitement de nombreux cancers dont le cancer du sein, mais il existe également d'autres molécules inhibant la TS telle que la capecitabine approuvée depuis 1998 pour le traitement de certains types de cancers du sein et de l'ovaire (Baena-Cañada et al., 2010).

**RNR** : l'inhibition de la **Ribo-Nucleotide Reductase** constitue une cible majeure dans le traitement de nombreux cancer notamment le cancer du pancréas ; en effet la Gemcitabine représente à nos jours l'une des rares options suffisamment efficaces contre cette maladie très agressive. Les fonctions de la RNR et les mécanismes d'action de ses inhibiteurs sont détaillés dans ce qui suit.

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 21.** Les principaux inhibiteurs de la voie de synthèse des pyrimidines. Ici sont représentés les inhibiteurs des principale enzymes impliquées dans la synthèse des pyrimidines. Adapté de (Okesli et al., 2017).</figcaption></figure>

### c. Inhibition de la RNR : cible de choix pour le traitement de nombreux cancers

* **Structure et fonction de la RNR**

Le passage de l'état de ribonucléoside diphosphate (NDP) à celui de désoxy-ribonucléosides diphosphate (dNDP) représente une étape limitante au cours de la synthèse des nucléotides, où le carbone en position 2' du NDP est réduit par le biais d'une enzyme hautement conservée, présente chez tous les organismes vivants : la Ribo-Nucleotide Reductase ou RNR (Stubbe et al., n.d.). Chez les mammifères, la RNR est composée de deux sous-unités ; RRM1 et RRM2 (N. C. Brown et al., 1969; N. C. Brown & Reichard, 1969). La grande sous-unité RRM1 (sous-unité α) comprend le site catalytique (site C) et deux sites allostériques, le site d'activité (Site A) et le site de spécificité (site S). La petite sous-unité RRM2 (sous-unité β) contient le cofacteur radicalaire tyrosyle-diferrique (YV) qui initie la réduction des nucléotides via une voie putative de transfert d'électrons couplés à des protons à environ 35 Å de distance (N. C. Brown et al., 1969). Les deux sous unités s'associent pour former une holoenzyme, dont l'activité est principalement enclenchée en phase S permettant ainsi d'alimenter les cellules en dNTPs (dNDPs phosphorylés par la Nucleoside-Di-Phosphate-Kinase NDPK) nécessaires à la réplication et la réparation de l'ADN (Huff et al., 2022).
Récemment, une nouvelle forme de RRM2 a été mise en évidence nommée p53R2 dont l'expression est P53 dépendante (induite en cas de dommages à l'ADN). Son activité en dehors de la phase S dans des cellules quiescentes et post-mitotiques, a permis de résoudre la question de savoir comment la réparation de l'ADN dans les cellules quiescentes était soutenue en absence de RRM2, qui est strictement exprimée en phase S. De plus, Cette activité extra phase S permet de maintenir des niveaux suffisants de dNTP pour soutenir la réplication de l'ADN mitochondrial (Pontarin et al., 2011; Tanaka et al., 2000). De ce fait, la biosynthèse de novo des dNTP médiée par la RNR est essentielle pour maintenir l'intégrité tant du génome nucléaire, que du génome mitochondrial (Fig.22).

## Régulation de l'activité de la RNR

L'activité de la RNR est régulée au niveau **transcriptionnel** et de l'**organisation allostérique**. Chez les mammifères le niveau de protéines RNR est contrôlé de manière cycle cellulaire dépendante et son activité est essentiellement induite pendant la phase S (A. Chabes & Thelander, 2000; Engström et al., 1985; Eriksson et al., 1984). L'expression du gène *RRM1* est principalement régulée transcriptionnellement, négligeable en G0/G1 et culminant en phase S (Johansson et al., 1998), cependant le niveau de la protéine RRM1 est constant tout au long du cycle cellulaire du fait de sa longue demi-vie (Engström et al., 1984, 1985; Håkansson et al., 2006). A l'instar de RRM1, l'expression de *RRM2* est régulée au niveau transcriptionnel, par contre la protéine RRM2 est ciblée à la sortie de la phase S par deux ubiquitines ligases, la Skp1/Complexe Cullin/F-box (SCF) et le complexe promoteur d'anaphase (APC) qui l'oriente vers la dégradation en phase G2 et en M/G1 respectivement (A. L. Chabes et al., 2003; D'Angiolella et al., 2012a). En revanche, P53R2, est exprimée en continu tout au long du cycle cellulaire. En cas de dommage à l'ADN, P53R2 est induit transcriptionnellement d'une manière p53-dépendante, forme une holoenzyme active avec RRM1, et fournit les dNTPs nécessaires à la réparation de l'ADN (Guittet et al., 2001; Nordlund & Reichard, 2006; Tanaka et al., 2000).

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

**Figure 22. Structure de la RNR et production de dNTP.**

Chez les mammifères, la fonction principale de la RNR consiste en la réduction du carbone 2' des NDP pour générer des dNDP qui sont ensuite phosphorylés par la nucléoside diphosphate kinase, produisant des dNTP pour la réplication et la réparation de l'ADN nucléaire et mitochondrial. La RNR se compose d'une sous-unité α codée par RRM1 (bleu) et d'une sous-unité β codée par RRM2 (rose) ou P53R2 (vert). L'association des deux sous unités forme un hétéro-oligomère, α2β2 constituant l'enzyme active. La sous-unité α contient le site catalytique (C), un site d'activité (A) qui régit l'activité RNR globale par des interactions avec le dATP (inhibiteur) ou l'ATP (stimulateur) et un site de spécificité (S) qui détermine le choix du substrat à réduire. Chaque sous-unité β contient un centre de fer dinucléaire à pont μ-oxo (Fe-O-Fe) et un radical tyrosyle de protéine (Y-O•) qui est transféré au site α C pour la catalyse. La production de dNTP pour la synthèse et la réparation d'ADN nucléaire est régit par le couple RRM1/RRM2. La synthèse des dNTPs nécessaires à la synthèse de l'ADN mitochondrial et la réparation d'ADN nucléaire hors phase S est catalysée par le couple RRM1/P53R2. Adapté de (Aye et al., 2014).
Une fois produite, les sous unités de la RNR s'associent pour former une holoenzyme fonctionnelle, et il est généralement admis qu'une RNR catalytiquement active se constitue au minimum d'un complexe α2β2. La modulation allostérique implique la liaison d'effecteurs aux deux sites allostériques de la sous unité α et globalement, l'activité de la RNR est contrôlée par la liaison de l'ATP/dATP au site A, dont l'activation n'est possible que lorsque les niveaux intracellulaires de dATP sont bas (Hofer et al., 2012; Nordlund & Reichard, 2006). Des rapports dATP/ATP élevés sont associés à l'inhibition de la sous unité α qui prend alors la forme inactive d'hexamère. La localisation subcellulaire de la RNR pourrait constituer un niveau de contrôle supplémentaire, mais cet aspect de la RNR reste controversé chez les mammifères. La majorité des sous unités RRM1 et RRM2 sont constitutivement localisées dans le cytoplasme et produisent des dNTPs qui se diffusent dans le noyau pour alimenter la réplication de l'ADN (Engström et al., 1984; Pontarin et al., 2008). Cependant, de plus en plus d'études démontrent qu'en cas de dommages à l'ADN, RRM1 et RRM2 pourraient être transloquées vers le noyau ou elles s'accumuleraient sur les sites de dommages (D'Angiolella et al., 2012a; Niida et al., 2010).

* RNR, dommages à l'ADN et cancer

Les gènes de la RNR figurent parmi les premiers gènes identifiés, dont l'expression peut être induite par les dommages à l'ADN (Elledge et al., 1993). Dans les cellules de rongeurs, l'exposition à certains génotoxiques tels que les UVs induit une augmentation du niveau d'expression de *Rrm1* et *Rrm2* d'environ 10 fois (Filatov et al., 1996; Hurta & Wright, 1992). L'orthologue de *RRM1/2*, *P53R2* illustre ce lien entre la réponse aux dommages à l'ADN et l'activité RNR, dans la mesure où son expression est induite par p53 en cas de dommage à l'ADN (Nakano et al., 2000; Tanaka et al., 2000b). De plus, la protéine P53R2 est stabilisée suite à sa phosphorylation par ATM en cas de dommages à l'ADN (Chang et al., 2008).

En fait il apparaît que l'activité RNR impacte sur le choix de la voie de réparation qui sera activée en réponse aux dommages à l'ADN (Burkhalter et al., 2009; Moss et al., 2010). En effet, l'induction de l'activité RNR stimule la production de dNTP et alimente la synthèse de l'ADN pendant la réparation par recombinaison homologue (HR), tandis que son inhibition favorise la réparation des cassures par la jonction d'extrémités non homologues (NHEJ), qui ne nécessite pas de synthèse d'ADN importante (Burkhalter et al., 2009). Cependant, l'augmentation du pool de dNTP médiée par une suractivation de la RNR s'accompagne d'un taux de mutation plus élevé, qui peut résulter d'une fidélité réduite des polymérides réplicatives et/ou de l'activation de la synthèse d'ADN translésionnelle (TLS) qui représente une voie de synthèse/réparation d'ADN mutagène et qui peut être activée par des pools déséquilibrés de dNTP (A. L. Chabes et al., 2003; Gon et al., 2011).

Étant donné que des niveaux de dNTP appropriés sont essentiels à l'intégrité génomique, on comprend qu'une dérégulation de la RNR puisse être mutagène (A. L. Chabes et al., 2003; Gon et al., 2011; Mathews, 2006).

Une recherche sur la base de données ONCOMINE montre que *RRM2* figure parmi les 10 % de gènes les plus surexprimés dans 73/168 cancers analysés. Il s'agit notamment des sarcomes, des cancers de la vessie, du cerveau et du système nerveux central, du sein, colorectaux, du foie et des poumons. De même, *RRM1* figure parmi les 10 % de gènes les plus surexprimés dans 30/170 études, y compris le cancer du cerveau et du système nerveux central, le cancer du poumon et les sarcomes. En revanche, *P53R2* figurait parmi les 10 % de gènes les plus surexprimés dans seulement 5/90 études, ce qui n'est
qu'une demie surprise puisque son expression dépend de p53 qui est muté dans la majorité des tumeurs agressives (Aye et al., 2015).

Logiquement la biosynthèse *de novo* de dNTP médiée par la RNR peut être essentielle à la survie des cellules tumorales, dans la mesure où elle soutient les mécanismes de réparation de l'ADN. Une activité soutenue de la RNR protègera les cellules cancéreuses des stress induits par les chimiothérapies génotoxiques. Ainsi, la surexpression de *RRM1* est corrélée à une mauvaise réponse aux sels de platine, ainsi qu'à la gemcitabine(Gong et al., 2012; Nakahira et al., 2007; Ohtaka et al., 2008). De même, une surexpression de *RRM2* est corrélée à la résistance à de nombreuses thérapies génotoxiques telles que le 5-FU, les sels de platine, voir même la radiothérapie, en plus d'être corrélée à un potentiel invasif plus élevé *in vitro* (Akita et al., 2009; Bepler et al., 2008; Ceppi et al., 2006; Dong et al., 2014; Reynolds et al., 2009; Rodriguez et al., 2011a, 2011b).

* **Inhibition de la RNR comme cible thérapeutique anti-cancer**

Au cours de la phase S du cycle cellulaire, l'expression de la RNR est élevée, faisant d'elle une cible médicamenteuse intéressante pour les maladies prolifératives, dont le cancer (Greene et al., 2020; Ohtaka et al., 2008; Wijerathna et al., 2011). La majorité des médicaments anticancéreux ciblant la RNR sont des analogues nucléosidiques qui imitent la structure chimique des substrats naturels (Baker et al., 1991a; Gandhi et al., 2001; Heinemann et al., 1992a; Nuno M. F. S. A. Cerqueira & Ramos, 2007; Parker et al., 1991).

De nombreuses petites molécules ont été développées pour inhiber la RNR. Les inhibiteurs anticancéreux les plus importants peuvent être divisés en deux classes, ceux qui ciblent la sous-unité RRM1, comme la Gemcitabine et la Clofarabine, et ceux qui ciblent la sous-unité RRM2, comme l'hydroxyurée. Ces derniers agissent en compromettant l'intégrité du centre radicalaire tyrosyl-differrique, soit en dégradant l'électron radical comme la HU ou en chélatant le fer comme c'est le cas pour la triapine (Agrawal & Sartorelli, 1978; Cory et al., 1994, 1995; Lassmann et al., 1992; Nigović et al., 2005). **Le tableau 4** résume certaines molécules inhibitrices de RRM1 et RRM2 utilisées en monothérapie, ainsi que leurs mécanismes d'action. Dans ce qui suit, je vais détailler le mode d'action de la gemcitabine, molécule principalement utilisée dans mon projet de thèse, ses conséquences sur la structure et la réplication de l'ADN, ainsi que les processus déclenchés suite à son utilisation.

La gemcitabine est l'un des premiers analogues nucléosidiques ciblant la sous unité α de la RNR à être cliniquement approuvé (Gemzar), et qui continue d'être un traitement de première ligne contre les cancers du pancréas, de la vésie et du poumon. Elle est aussi utilisée comme traitement de seconde ligne pour les cancers de l'ovaire (en combinaison avec le cisplatine) ainsi que les cancers du sein métastatiques (en combinaison avec le paclitaxel) (Manegold et al., 2000).
<table><caption>Tableau 4. Inhibiteurs de RNR approuvés par la FDA et leurs applications anticancéreuses. Adapté de (Huff et al., 2022).</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Mécanisme cellulaire</td><td>Sous unités RNR ciblé</td><td>Mécanisme d'inhibition de la RNR</td><td>Indication en monothérapie</td><td>Indication en combinaison</td></tr></thead><tbody><tr><td>Gemcitabine</td><td>Interfère avec la synthèse /réparation de l'ADN</td><td>RRM1</td><td>Alkylation irréversible du site C</td><td>Cancer du pancréas Hors AMM : cholangiocarcinome et autres cancers des voies biliaires</td><td>Avec nab-paclitaxel : Cancer du pancréas<br>Avec cisplatine : Cancer de la vésie avancé ou métastatique, cancer du poumon non à petites cellules avancé ou métastatique<br>Avec carboplatine : Cancer des ovaires<br>Avec paclitaxel : Cancer du sein métastatique</td></tr><tr><td>Fludarabine</td><td>Interfère avec la synthèse /réparation de l'ADN</td><td>RRM1</td><td>Induit la formation d'hexamères inactifs α6</td><td>Leucémie lymphocytaire chronique</td><td>Avec cyclophosphamide, mitoxantrone, dexaméthasone, et rituximab : Lymphome non hodgkinien<br>Avec cyclophosphamide, mitoxantrone, dexaméthasone, et GCSF : leucémie myéloïde aigue.</td></tr><tr><td>Cladribine</td><td>Interfère avec la synthèse /réparation de l'ADN</td><td>RRM1</td><td>Induit la formation d'hexamères inactifs α6</td><td>Leucémie à tricholeucocytes<br>Leucémie lymphoïde chronique B</td><td></td></tr><tr><td>Clofarabine</td><td>Interfère avec la synthèse /réparation de l'ADN</td><td>RRM1</td><td>Induit la formation d'hexamères inactifs α6</td><td>Leucémie aiguë lymphoblastique récidivante ou réfractaire</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyurea</td><td>Chelateur de radicaux</td><td>RRM2</td><td>Éteint le centre radical</td><td>Leucémie myéloïde chronique</td><td></td></tr></tbody></table>
## Gemcitabine : mode d'action

Il s'agit d'un mime structurel de la Cytidine avec la substitution de deux atomes de fluor en position C2 du cycle ribose (dFdC). Comme tous les antimétabolites ciblant RRM1, la gemcitabine est administrée sous sa forme nucléosidique (forme perméable à la membrane, mais inactive), qui une fois à l'intérieur de la cellule subit plusieurs phosphorylations (Mono, di, et triphosphates ; dFdCMP, dFdCDP, dFdCTP respectivement) (Plunkett et al., 1995). La forme diphosphate active (dFdCDP) se lie au site catalytique (Site C) de la sous-unité α dans une conformation altérée comparé au CDP naturel (H. Xu et al., 2006), ce qui se traduit par la formation d'un complexe covalent entre le site C et le sucre de dFdCDP (J. Wang et al., 2007). Bien que la gemcitabine soit présentée comme une molécule ciblant la sous-unité α de RRM1, le substrat dFdCDP ne peut inactiver la RNR sans la présence de la sous-unité β. En effet, comme évoqué précédemment, l'activation catalytique de la RNR est déclenchée par le transfert direct d'électrons couplés aux protons, entraînant la formation transitoire de C-S• (siteC lié au siteS oxydé) qui initie la réduction du NDP lié au site S. Le dFdCDP, en tant qu'analogue de substrat, peut interagir avec le C-S• pour former un intermédiaire réactif capable d'alkyler irréversiblement la sous unité α qui se lie de façon covalente au sucre de ce dernie r (J. Wang et al., 2007). En plus de l'inhibition de la RNR par la forme diphosphate, la forme triphosphate de la gemcitabine (dFdCTP) peut remplacer le dCTP et être incorporé à l'ADN au cours de la réplication, conduisant à son arrêt (Baker et al., 1991b; Heinemann et al., 1992b; Ono et al., 2016). Étant donné que la forme diphosphate dFdCDP inhibe la RNR et épuise la concentration de dNTP naturel dans la cellule, les niveaux de dCTP diminuent. Comme le dCTP est un inhibiteur de rétroaction naturel de la Désoxy-Cytidine Kinase (DCK ; enzyme responsable de la première phosphorylation du dFdC en dFdCMP), l'épuisement du pool de dNTP conduit à la production accrue de gemcitabine triphosphate de sorte qu'elle peut entrer en compétition avec le dCTP pour l'incorporation dans les brins d'ADN. De cette manière, la cytotoxicité de la gemcitabine s'auto-potentialise (Fig.23) (Heinemann et al., 1992; Plunkett et al., 1995, 1996).

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

**Figure 23. Mécanisme d'action et du métabolisme intra-cellulaire de la gemcitabine (dFdC).** Le dFdCMP (gemcitabine monophosphate) après action de la DCK (Deoxy-Cytidine Kinase) ; dFdCDP : gemcitabine diphosphate, après action de la NMPK (Nucléoside Monophosphate Kinase) ; dFdCTP : gemcitabine triphosphate, après action de la NDPK (Nucléoside Di-phosphate Kinase) ; et dFdU : 2,2-difluoro-2-désoxyuridine, qui le produit résultant de la désamination via la CDA (Cytidine Des-Aminase), et qui représente la forme de détoxification de la gemcitabine. Adaptée de (Hawryłkiewicz & Ptaszyńska, 2021).
* **Gemcitabine, inducteur de stress réplicatif majeur**

Le déséquilibre du pool de dNTP induit par l'inhibition de la RNR *via* la gemcitabine et ses dérivés, est une source de stress réplicatif qui bloque la progression de la machinerie réplicative. Néanmoins, les principales toxicités liées à l'utilisation de cette molécule proviennent de son effet terminateur de chaîne d'ADN (De Sousa Cavalcante & Monteiro, 2014), du fait de l'incorporation d'un dNTP unique après le dFdCDP qui bloque l'élongation du brin en question (Fig. 24, A et B) (Plunkett et al., 1995). Cette position non terminale de la gemcitabine rend non seulement les ADN polymérides incapables de procéder, mais lui permet également d'être masquée, inhibant ainsi sa suppression par les systèmes de réparation de l'ADN, ce qui aboutit in fine à l'arrêt de la machinerie réplicative (Huang et al., 1991).

* **Conséquences sur les fourches de réplication**

Indépendamment de l'inhibition de la RNR et de la terminaison de chaîne, la gemcitabine favorise le découplage polymérase/hélicase abordé précédemment (Byun et al., 2005). L'hélicase continue sa progression tout en déroulant l'ADN, ce qui génère des régions riches en ADN simple brin. Ceci enclenche la réponse aux dommages à l'ADN ou DDR caractérisée par le recrutement d'effecteurs dont le rôle est de protéger l'ADN, d'empêcher les fourches bloquées de s'effondrer et de jeter les bases d'une reprise de la réplication. Ainsi, les protéines RPA et TopBP1 sont recrutées sur l'ADN simple brin et enclenchent l'activation de l'axe ATR/CHK1 dont les principales conséquences sont l'arrêt de l'allumage des origines de réplication dormantes *via* CHK1 et la régression des fourches bloquées.

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

**Figure 24.** **Principaux Mécanismes d'action de la gemcitabine et impacte sur les fourches de réplication.**
**(A) Auto-potentialisation de la gemcitabine.** La gemcitabine diphosphate (dFdCDP) se lie de manière covalente au site S de la RNR, et induit son inactivation. Cette inhibition réduit le pool de dNTP ainsi que l'activité désoxycytidylate désaminase (dCTD), ce qui rend la gemcitabine plus susceptible d'être activée par les enzymes métabolisant les nucléotides et donc incorporée dans l'ADN. **(B). Représentation de l'activité terminaison de chaîne masquée de la gemcitabine.** Dans ce mécanisme, l'ADN polymérase incorpore la gemcitabine triphosphate (dFdCTP) lors de la synthèse de l'ADN, ensuite, un autre nucléotide triphosphate (dNTP) est incorporé, rendant la polymérase incapable de continuer la synthèse, induisant ainsi la terminaison de la chaîne. **(C). Conséquences de la gemcitabine sur les fourches de réplication.** Le déséquilibre du pool de dNTP induit par l'inhibition de la RNR conduit au blocage de la machinerie réplicative et au découplage hélicase/polymérase, ce qui engendre l'apparition d'ADN simple brin. L'un des mécanismes plausibles pouvant être mis en place suite à ces évènements et la réversion de la fourche de réplication bloqué. En vert : ADP Pol, en rose : le complexe helicase CMG, en jaune : RPA. Adapté de (De Sousa Cavalcante & Monteiro, 2014; Warren & Eastman, 2020b).
Bien que de nombreuses réponses cellulaires liées à l'incorporation de la gemcitabine soient connues, les voies exactes en aval ne sont pas encore bien comprises. Néanmoins, dans ce contexte (déplétion du pool de nucléotides, découplage hélicase/polymérase) le scénario le plus probable serait la régression/reversion des fourches bloquées (Warren & Eastman, 2020b). Ce mécanisme consiste en la formation d'une structure temporaire en « patte de poulet », un motif équivalent à une jonction de Holliday « four way junction », dont le but ultime est de suspendre activement la synthèse d'ADN dans des conditions défavorables et ainsi contribuer à l'ajustement de la vitesse de la fourche pendant le stress réplicatif (Cortez, 2019; Neelsen & Lopes, 2015) (Fig.24 et 25). Cependant, l'effet de la gemcitabine est irréversible et n'induit pas de lésions à proprement parler, rendant vaine toute tentative de réparation ou reprise de la réplication. Les conséquences en sont un blocage des fourches non résolues, ce qui favorise leur clivage endonucléolytique et favorise l'apparition de CDBs. Les modifications induites par la gemcitabine sont telles, que les fourches peuvent d'emblée s'effondrer, en absence de toute possibilité de reprise de réplication.

<figure><img src="image_36.png" /></figure>

**Figure 25. Découplage hélicase/polymérase et réversion des fourches. (A). Dissociation du réplisome.**
Dans les cellules eucaryotes, l'ADN parental est déroulé par le complexe hélicase CMG (CDC45/MCM2-7/GINS). Il est ensuite répliqué par les polymérides des brins précoces et tardifs Polε et Polδ. PCNA est un homotrimère qui encercle l'ADN et est essentiel pour la processivité des polymérides réplicatives. Les lésions de l'ADN ou d'autres sources de stress réplicatif (triangle rouge) peuvent temporairement bloquer la polymérase du brin matrice, sans affecter le mouvement du complexe CMG. Il en résulte le découplage des réplisomes, qui conduit à l'accumulation de segments d'ADN simple brin rapidement recouverts par (RPA). Ce processus est considéré comme étant un prérequis au processus de réversion des fourches. (B). **Micrographie électronique représentative montrant l'image d'une fourche de réplication inversée.** D, brin fille ; P, brin parental ; R, bras inversé. Le carré rouge indique la structure en patte de poulet. Adaptée (Saldivar et al., 2017).

C. La plasticité des fourches de réplication en cas de blocage

Les fourches de réplication bloquées représentent des entités dynamiques, dont le but primaire est de
bloquer momentanément la machinerie réplicative afin de permettre la levée de l'obstacle en
question. Cette remarquable plasticité se traduit par la modulation du déclenchement des origines de
la réplication, de l'architecture des fourches de réplication et de l'organisation fonctionnelle de la
machinerie réplicative en réponse au stress réplicatif (Fig. 26, 27). Des mécanismes de remodelage des fourches bloquées visent à promouvoir leur protection et la reprise de la synthèse d'ADN (Berti et al., 2020; Pasero & Vindigni, 2017). Parmi ces mécanismes de remodelage des fourches bloquées, figure le processus (cité plus haut) de réversion des fourches de réplication dont le découplage du réplisome semble être un prérequis à sa mise en place lors d'un stress réplicatif accru (Zellweger et al., 2015).

Deux autres mécanismes de remodelage sont principalement observés en réponse au blocage des fourches : la dégradation d'ADN (communément appelée résection des fourches) et le clivage endonucléolytique ou incision des fourches, les deux processus pouvant survenir avec ou sans reversions des fourches (Berti et al., 2020).

Ci-dessous, nous allons décrire ces différents processus, avec une attention particulière portée à la résection et le clivage des fourches, et leur rôle dans la reprise de la réplication. En effet, en générant des extrémités d'ADN simple brin, la résection joue un rôle critique non seulement dans le sauvetage des fourches de réplication par recombinaison homologue, mais également dans l'activation du checkpoint de réplication médiée par la voie ATR-CHK1 (Pasero & Vindigni, 2017). Cette voie fera l'objet d'une description détaillée dans le chapitre suivant.

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 26.** Aperçu des mécanismes sous-jacents à la plasticité des fourches de réplication. L'ADN simple brin (ssDNA) produit par le découplage de la fourche de réplication conduit à sa protection par les protéines RPA et RAD51. Les fourches découplées peuvent être redémarrées en réamorçant la synthèse d'ADN, qui est suivie d'un remplissage post-réplicatif des lacunes (en haut). Alternativement, les fourches bloquées peuvent subir un remodelage transitoire (inversion) en une jonction à quatre voies, appelée fourche inversée (ou "patte de poulet" ; milieu), et/ou une rupture par des nucléases spécifiques à la structure (non illustrées), appelée incision de la fourche (en bas), qui nécessite alors des mécanismes complexes pour restaurer l'intégrité de la fourche et relancer la synthèse d'ADN. Ces différentes étapes et options de plasticité de la fourche sont présentées avec plus de détails dans les **Figures 27 et 28**. Adapté de (Berti et al., 2020).</figcaption></figure>
# 1. Mécanismes de résolution des fourches bloquées et de reprise de la réplication

Il existe différents mécanismes pouvant contribuer à maintenir ou à redémarrer la réplication en cas d'arrêt prématuré de l'élongation des brins d'ADN. Ces processus sont activés par les spécificités structurales des fourches stressées et conduisent à la réparation et à la reprise de la synthèse d'ADN via plusieurs voies (Fig. 26, 27) (Berti et al., 2020; Pasero & Vindigni, 2017). Ces voies impliquent le recrutement d'un ensemble spécifique de facteurs accessoires en fonction du type de dommage, de la durée du blocage de la réplication, de la survenue d'une inversion de la fourche et de la rupture accidentelle ou de l'incision programmée de la fourche.

On peut ainsi distinguer deux catégories globales de mécanismes de résolution des fourches bloquées :
(i) les mécanismes de tolérance aux dommages enclenchés par les lésions/obstacles de petite taille,
(ii) des mécanismes de remodelage des fourches bloquées enclenchés par les lésions/obstacles de plus grande taille. Il est important de souligner l'existence de compétition dans la mise en place de ces différents processus (Vallerga et al., 2015).

## (i) Les mécanismes de tolérance aux dommages à l'ADN (DDT)

Certaines lésions de l'ADN de taille réduite (dimères de thymine induits par les UVs, adduits de platine...) permettent en général la progression du complexe hélicase CMG, mais bloquent la progression des polymérides réplicatives (δ et ε). Dans ce contexte spécifique, certaines voies de tolérance aux dommages de l'ADN peuvent contribuer au contournement ou « *bypassing* » de la lésion afin de conserver la progression de la synthèse d'ADN (Goodman & Woodgate, 2013; Makridakis & Reichardt, 2012). Ces voies de tolérance se divisent en deux stratégies : synthèse d'ADN Trans-Lesionnelle (TLS) et réamorçage ou « *repriming* » de la réplication. Le premier a lieu grâce au recrutement de polymérides translésionnelles capables de continuer la synthèse d'ADN malgré la présence de lésion sur le brin matrice, mais leur fiabilité est moindre comparées aux polymérides réplicatives (McCulloch & Kunkel, 2008). Le second est médié par la primase PrimPol, dont le recrutement au niveau de fourches découplées permet la synthèse d'une amorce en aval de la lésion et la reprise de la réplication en laissant un segment d'ADN simple brin (« *gap* ») au niveau de la lésion (Acosta et al., 2020; Bianchi et al., 2013; Guilliam & Doherty, 2017; Mourón et al., 2013). Ces gaps peuvent être réparés *a posteriori* par synthèse translésionnelle ou *template switching*, afin d'assurer une réplication du génome complète avant l'entrée en mitose.

## (ii) Les mécanismes de remodelage des fourches bloquées : inversion, résection et incision/clivage endonucléolytique.

Les obstacles plus imposants ne permettent pas la progression du complexe hélicase CMG et induisent le blocage des fourches, imposant ainsi la mise en place de leur remodelage. Si ces mécanismes visent à promouvoir la reprise de la synthèse d'ADN, leur dérégulation peut entrainer une instabilité génomique (Berti et al., 2020; R. M. Jones & Petermann, 2012; Neelsen & Lopes, 2015; Pasero & Vindigni, 2017a; Quinet et al., 2017).

### a) La réversion des fourches de réplication
Comme évoqué précédemment, à l'approche d'un obstacle et avant l'induction d'une CDB, certaines fourches de réplication peuvent également régresser en une structure dite en « patte de poulet » (Fig. 27) (Couch & Cortez, 2014; Quinet et al., 2017a). L'initiation efficace de ce mécanisme nécessite l'intervention (BRCA2-independante) de la recombinase RAD51, ce qui induit le ré-appariement des deux brins d'ADN néosynthétisés (Bhat & Cortez, 2018; Lemaçon et al., 2017; Mason et al., 2019; Scully et al., 2019; Zellweger et al., 2015). L'inducteur majeur de la reversion des fourches est la présence d'ADN simple brin au niveau des fourches bloquées, qui signale le recrutement de nombreux effecteurs. En effet, l'accumulation d'ADN simple brin est en lien avec la poly-ubiquitination de PCNA, qui permet le recrutement de ZRANB3 (Vujanovic et al., 2017). Par ailleurs, le recrutement de RPA sur ces ADNs simples brins favorise le recrutement de SMARCAL1, qui agira comme médiateur de la réversion des fourches (Bétous et al., 2012; Couch et al., 2013). HLTF, autre ADN translocase hautement conservée, a également été identifié dans le processus de réversion des fourches. Elle contribue à la poly-ubiquitination de PCNA (Bétous et al., 2013). L'initiation de la réversion des fourches s'appuie principalement sur la compétition entre RAD51 et RPA, RADX, FBH1 ou RECQ5, qui ont toutes pour spécificité de se lier à l'ADN simple brin (Chappidi et al., 2020).

<figure><img src="image_38.png" /></figure>
**Figure 27. (Page précédente). Remodelage de la fourche de réplication et redémarrage pendant le stress de réplication. (a).** Après le décrochage et le découplage de la fourche RPA est partiellement remplacée par la recombinase RAD51, conduisant à la formation d'un filament métastable de RAD51 (courts tronçons de monomères RAD51, séparés par des molécules résiduelles RPA). Avec la polyubiquitylation de PCNA (PolyUb) et le recrutement des translocases d'ADN spécialisées SMARCAL1, ZRANB3 et le facteur de transcription de type hélicase (HLTF), ces filaments RAD51 métastables favorisent l'inversion de la fourche bloquée. Après l'inversion, les filaments RAD51 stables sur le bras régressé protègent les fourches inversées de la dégradation nucléolytique (voir figure 28). La liaison de RAD51 en amont et en aval de l'inversion de la fourche est modulée par les activités anti-recombinase de l'hélicase RECQ5 et de l'hélicase FBH1. L'accumulation d'ADNss conduit à l'activation de ATR, ce qui limite localement l'inversion de la fourche médiée par SMARCAL1, mais permet globalement le remodelage et le ralentissement des fourches actives à proximité. (b). Après la réparation des lésions sur le brin matrice, les fourches inversées peuvent être redémarrées par la migration de la branche inversée médiée par RECQ1, qui est transitoirement inhibée PARP1. Alternativement, les fourches inversées peuvent être redémarrées par le déroulement de l'ADN médié par DNA2 – WRN et la résection contrôlée. La protéine primase PrimPol peut favoriser le redémarrage de la synthèse de l'ADN. (c). Le redémarrage des fourches peut également être activé par son réamorçage, qui entre en compétition avec l'inversion des fourches. Dans ce cas, les lésions sont tolérées par le réamorçage médié par PrimPol de la synthèse d'ADN et le redémarrage de la réplication sur le brin principal bloqué, suivi d'un remplissage post-réplicatif de la brèche d'ADNss par « template swiching » ou synthèse translésionnelle (TLS). Adapté de (Berti & Lopes 2020).

Plusieurs mécanismes contrôlant la stabilité des fourches régressées sont alors impliqués dans leur redémarrage ou leur effondrement (Fig. 27) (Kolinjivadi et al., 2017; Quinet et al., 2017). On peut citer les fonctions antagonistes de PARP1 et RECQ1, inhibant et stimulant respectivement le redémarrage des fourches depuis leur état régressé (Berti et al., 2013; Ray Chaudhuri et al., 2012). L'interaction BRCA2-dépendante de RAD51 au niveau des fourches régressées stabilisent également l'ADN néosynthétisé, en limitant sa dégradation par les exonucléases (Kolinjivadi et al., 2017). De façon globale, la réversion des fourches de réplication représente un « mécanisme de défense dynamique » protégeant de façon transitoire les fourches d'une collision avec un obstacle (Neelsen & Lopes, 2015). En régressant, la fourche de réplication donne du temps aux mécanismes cellulaires pour résoudre l'anomalie de l'ADN localisée en aval. Cependant, un mauvais contrôle du processus de réversion (par exemple en l'absence de BRCA2), peut aboutir à la persistance de ces structures et à leur clivage/incision (Couch & Cortez, 2014; Pasero & Vindigni, 2017; Quinet et al., 2017), par des endonucléases telles que MUS81, engendrant des CDB et une instabilité génomique (Fig. 28 (Kolinjivadi et al., 2017; Lemaçon et al., 2017; Quinet et al., 2017).

**b) Une résection contrôlée favorise le redémarrage des fourches de réplication bloquées**

Certaines études ont montré il y a plus d'une décennie que l'activité de MRE11 promouvait la reprise de la réplication des fourches bloquées (Trenz et al., 2006). La résection au niveau des fourches de réplication bloquées et/ou inversées est donc un mécanisme critique à la mise en place de la réparation par recombinaison homologue et la reprise de l'activité réplicative des fourches (Fig. 27) (Pasero & Vindigni, 2017; Thangavel et al., 2015; Yeeles et al., 2013). Cependant, la régulation de la résection est primordiale pour assurer un redémarrage effectif des fourches et éviter une dégradation excessive de l'ADN, entrainant des conséquences délétères (Pasero & Vindigni, 2017; Sidorova, 2017; Thangavel et al., 2015; Y. Wu et al., 2015; Yeeles et al., 2013; Yeo et al., 2014).

**c) Remodelage des fourches de réplication arrêtées/inversées par résection**