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# Mise au point de culture de cellules immunitaires intestinales de lapin

Mathilde Rumeau

► To cite this version:

Mathilde Rumeau. Mise au point de culture de cellules immunitaires intestinales de lapin : Outil pour évaluer l'impact fonctionnel de l'alimentation sur la co-maturation du microbiote et du système immunitaire. Immunologie. 2022. hal-03936678

HAL Id: hal-03936678

https://hal.inrae.fr/hal-03936678

Submitted on 12 Jan 2023

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# MISE AU POINT DE CULTURE DE CELLULES IMMUNITAIRES INTESTINALES DE LAPIN

Outil pour évaluer l'impact fonctionnel de l'alimentation sur la co-maturation du microbiote et du système immunitaire

Mathilde RUMEAU
Résumé

Les troubles digestifs sont les principaux responsables de l'usage d'antibiotiques en élevage cunicole, particulièrement en période post-sevrage. L'Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement (INRAE) s'est emparé de cette problématique, en développant des actions préventives pour réduire le recours à l'antibiothérapie, notamment via des approches nutritionnelles.

Intégré en amont d'un projet de plus grande ampleur, ce travail consiste à développer un modèle de culture cellulaires *in vitro* des cellules mononuclées de la *lamina propria* du caecum des lapins, compartiment principal de l'immunité digestive. Cet outil est indispensable à l'analyse des mécanismes d'action de nutriments et métabolites microbiens sur la réponse immunitaire à l'échelle cellulaire.

Pour cela des études expérimentales en laboratoire ont eu lieu sur 17 lapereaux âgés de 21 à 36 jours. Elles visaient d'abord à élaborer un protocole d'isolement et de mise en culture des cellules mononuclées de la *lamina propria*. Par la suite, les cellules ont été stimulées (Lipopolysaccharides et Phytohémagglutinine) pour déclencher une réponse immunitaire, dont l'effet a été étudié par RT-qPCR. Les recherches ont abouti à la mise au point d'un protocole de culture cellulaire robuste et éprouvé. Les stimulations ont entraîné une réponse immunitaire des cellules (surexpression de IL6 et TNF avec le LPS et de IL6, CD69 et FOXP3 avec la PHA). Ces résultats permettront d'analyser l'effet des nutriments et métabolites microbiens sur la mise en place de l'immunité digestive des lapins. Toutefois, la réponse LPS étant plus réduite qu'attendue, des études supplémentaires restent nécessaires pour optimiser le protocole de stimulation des cellules.

Mots-clés : Cellules mononuclées de la *lamina propria* ; culture cellulaire ; immunité digestive ; lapereaux ; stimulation des cellules immunitaires ; RT-qPCR

Abstract

Digestive disorders are the main cause of the use of antibiotic in rabbit breeding, particularly
around weaning. INRAE seized this issue, by developing preventive actions to reduce the
use of antibiotics, namely through nutritional approaches.

As upstream step of a larger project, this work aims to develop an *in vitro* cell culture method of *lamina propria* mononuclear cells from the rabbit caecum, main digestive immunity compartment. This tool is essential to analyse immunomodulatory impacts of nutrients and microbial metabolites at a cellular level.

To answer to this requirement, experimental studies were conducted on 17 rabbit pups aged between 21 to 36 days old. These studies' goals were to elaborate a protocol to isolate and cultivate *lamina propria* mononuclear cells. Thereafter, cells were stimulated (Lipopolysaccharides and Phytohemagglutinin) to trigger an immune response, whose effects were studied with RT-qPCR. Research led to a robust and proven cell culture protocol. Stimulations resulted in an immune response (overexpression of IL6 and TNF with LPS and IL6, CD69 and FOXP3 with PHA). These results will enable the analyses of nutrients and microbial metabolites effects on the establishment of rabbits' digestive immunity. Nonetheless, LPS's answer was weaker than expected, therefore additional studies are still necessary to optimize cell stimulations protocol.

Keywords: *Lamina propria* mononuclear cells; cell culture; digestive immunity; rabbit pups; immune cells stimulation; RT-qPCR
## Remerciements

Ce présent mémoire est le fruit d'un stage de 6 mois, de nombreuses personnes ont contribué à son aboutissement, auxquelles je souhaite adresser mes remerciements les plus sincères.

En premier lieu, je remercie ma maître de stage, Christelle KNUDSEN, ingénieur de recherche au sein de l'équipe NED, pour sa patience, sa bienveillance et son aide précieuse. Merci de m'avoir fait découvrir le monde passionnant de l'immunité digestive des lapereaux.

Je remercie également Sylvie COMBES, ingénieur de recherche de l'équipe NED et directrice adjointe de l'unité, pour sa disponibilité et son suivi tout au long du stage.

Merci à vous de m'avoir accordé votre confiance, et de me permettre de poursuivre dans ce domaine à vos côtés.

Mes sincères remerciements à ma directrice de mémoire Charlotte PAËS, enseignant-chercheur au sein de l'EI PURPAN, pour sa disponibilité et son accompagnement tout au long de ce travail. Ses précieux conseils ont contribué à orienter ma réflexion, dans la réalisation de ce mémoire mais également dans mon orientation professionnelle à venir.

Je remercie particulièrement l'ensemble des membres de l'équipe NED, et plus globalement du couloir E2, pour leur accueil, leur intégration, leur bonne humeur ainsi que leurs précieux conseils. C'est avec un immense plaisir que je partagerai d'autres de ces moments avec vous dans les années à venir.

J'adresse toute ma reconnaissance à l'ensemble du corps académique de l'EI PURPAN, pour la qualité de la formation dont j'ai pu bénéficier, leurs conseils dans le choix du parcours professionnel et l'ensemble des opportunités offertes tout au long de ma scolarité.

Enfin, je voudrais exprimer ma gratitude envers toutes les personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à l'aboutissement de ce travail.
# SOMMAIRE

## INTRODUCTION GENERALE

### PARTIE 1 : Contexte et enjeux de l'étude

1. Contexte général

2. Le système digestif du lapin

3. La muqueuse digestive

4. Maturation de la muqueuse digestive et mécanismes

5. La culture cellulaire : un outil pour l'étude des mécanismes d'action de composés alimentaires

6. Problématique

### PARTIE 2 : Démarche et méthodologie d'étude

1. Phase 1 : Optimisation de la méthode d'isolement

2. Phase 2 : Mise en place de la méthode de culture

3. Phase 3 : La stimulation des cellules en culture

4. Phase 4 : Mesure de la viabilité et prolifération cellulaires et la réponse immunitaire des LPMC

5. Phase 5 : Calcul et analyse des données

### PARTIE 3 : Résultats obtenus

1. Optimisation de la méthode d'isolement des cellules immunitaires de la *lamina propria*

2. Mise en place de la culture cellulaire

3. La stimulation des cellules immunitaires : choix des stimulants et des marqueurs de réponse

4. La réponse des cellules immunitaires de la *lamina propria* en culture à la stimulation à la PHA

5. La réponse des cellules immunitaires de la *lamina propria* en culture à la stimulation au LPS

6. Effets de l'âge des individus prélevés sur les résultats d'expérimentations

### PARTIE 4 : Discussion et proposition

1. Optimisation de la méthode d'isolement des cellules

2. Mise en place de la culture cellulaire : influence du milieu de culture

3. La stimulation des cellules immunitaires

4. Perspectives

## CONCLUSION
Sigles et abréviations

°C : Degré Celsius

% : Pour cent

µg : Microgramme

µl : Microlitre

µM : Micromolaire

µm : Micromètre

ADN : Acide désoxyribonucléique

ADNc : Acide désoxyribonucléique complémentaire

ALEA : Animal level of exposure to antimicrobials

ANR : Agence nationale de la recherche

ANSES : Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail

ARN : Acide ribonucléique

ATP : Adénosine triphosphate

BCR : Récepteur des cellules B

CD : Marqueur de différenciation

CH4 : Méthane

CLSPA : Collagénase purifiée

Cm² : Centimètre carré

CMH : Complexe majeur d'histocompatibilité

CO2 : Dioxyde de carbone

ConA : Concanavaline A

CPA : Cellule présentatrice d'antigène

CSF : Facteur de stimulation des colonies

DNase : Désoxyribonucléase

DTT : Dithiothréitol

EDTA : Acide éthylènediaminetétraacétique

EPI : Equipement individuel de protection

FACS : Tri cellulaire activé par fluorescence

g : Gramme

GALT : Gut associated lymphoid tissue

GAPDH : Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase

GenPhySE : Génétique et physiologie des systèmes d'élevage

H2 : Dihydrogène

HBSS : Solution saline de Hank

HCO3- : Ions bicarbonates

HEPES : Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique

IFN : Interféron

IL : Interleukine

IMDM : Iscove Modified Dulbecco Media

INRAE : Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement

Kg : Kilogramme
LB : Lymphocyte B

LP : Lamina propria

LPMC : Cellules mononuclées de la lamina propria

LPS : Lipopolysaccharides

LT : Lymphocyte T

Mg : Milligramme

mL : Millilitre

mm : Millimètre

mM : Millimolaire

MO : Oligosaccharides du lait

MS : Matière sèche

NaCl : Chlorure de sodium

NED : Nutrition et écosystèmes digestifs

Ng : Nanogramme

NH3 : Ammoniac

NK : Natural killer

Nm : Nanomètre

O2 : Dioxygène

PAMP : Pathogen-Associated Molecular Patterns

PBMC : Cellule mononuclée du sang périphérique

PBS : Tampon phosphate salin

PECTOUL : Pôle expérimental cunicole toulousain

pH : Potentiel hydrogène

PHA : Phytohémagglutinine

PRR : Pattern Recognition Receptors

PSM : Poste de sécurité microbiologique

PWM : Pokeweed mitogen

qPCR : Réaction de polymérisation en chaîne en temps réel

RNase : Ribonucléase

RPMI : Roswell Park Memorial Institute Medium

RT : Retro transcription

SVF : Sérum de veau fétal

TCR : Récepteur des cellules T

TEC : Tonne équivalent carcasse

TGF : Transforming Growth Factor

TLR : Récepteur Toll-like

TNF : Facteur de nécrose tumorale

UMR : Unité mixte de recherche
# Introduction générale

Au moment où la réduction de l'antibiothérapie constitue un enjeu d'ampleur européenne, l'élevage cunicole compte parmi les espèces les plus dépendantes à ces substances visant à lutter contre les infections bactériennes. En 2020, l'Animal level of exposure to antimicrobials (ALEA), qui représente le poids vif traité d'individus par rapport à la biomasse totale, s'élevait à 1,910, faisant de l'élevage cunicole l'unique filière animale dont cet indicateur reste supérieur à 1 (ANSES 2020). La moitié de ces antibiotiques sont destinés à la lutte contre les maladies digestives, parmi lesquels trois quarts sont prescrits entre 4 et 6 semaines d'âge, soit autour du sevrage des lapereaux (Chauvin et al. 2011).

La filière s'est emparée de ces enjeux dès 2011 au travers de projets de recherche regroupant plusieurs acteurs du secteur. C'est ainsi qu'ont émergé plusieurs pistes visant à améliorer la santé digestive des lapins pour réduire la dépendance aux antibiotiques. L'équipe Nutrition et Ecosystème Digestif de l'UMR GenPhySE de l'INRAE Occitanie y prend notamment part en travaillant activement sur le triptyque alimentation-microbiote-immunité des espèces monogastriques.

Des travaux récents ont montré que certains sucres du lait, les oligosaccharides, possèdent des effets bénéfiques sur la mise en place de l'immunité chez l'humain. Ces oligosaccharides régulent la composition du microbiote intestinal et modulent la réponse immunitaire de l'hôte (Moubareck 2021). La compréhension de l'action directe ou indirecte des oligosaccharides du lait de la lapine sur la maturation intestinale du lapereau est une piste intéressante dans la préservation de la santé des lapins. Toutefois aucune donnée n'est actuellement disponible chez cette espèce. C'est dans ce cadre qu'a été développé le projet ANR HoloOLIGO, dont une partie repose sur l'étude de l'impact des oligosaccharides sur la réponse immunitaire des lapereaux. Plusieurs outils sont disponibles au sein du laboratoire NED pour étudier la relation alimentation et immunité digestive. Cependant afin d'étudier les mécanismes à l'échelle cellulaire et dans un objectif de réduction des expérimentations animales, ce projet requiert une technique de culture de cellules immunitaires *in vitro*. Bien que couramment utilisée pour l'étude des composés alimentaires et leur interaction avec l'intestin et le microbiote digestif chez l'humain, cette technique n'existe pas à ce jour chez le lapin.

Dans ce cadre, la présente étude vise à mettre en place un protocole de culture et de stimulation de cellules mononuclées de la *lamina propria* (LP) caecale, compartiment principal de la réponse immunitaire digestive, des lapereaux puis d'évaluer la réponse immunitaire de ces dernières. Pour cela, douze expérimentations ont eu lieu en laboratoire, complétées par un travail bibliographique afin de mettre en regard nos études avec des travaux similaires.

Dans une première partie, nous détaillerons le fonctionnement du tractus digestif du lapin, sa maturation et ses modulations par l'environnement et l'alimentation. Dans un second temps, nous préciserons les méthodes auxquelles nous avons eu recours pour mettre en place le travail expérimental et bibliographique. Les résultats de ces expérimentations et recherches seront alors détaillés. Enfin, nous discuterons ces résultats et des propositions seront apportées. Ces dernières, issues de la confrontation de nos résultats avec la littérature permettrons d'optimiser et compléter notre étude.
# PARTIE 1 : Contexte et enjeux de l'étude
# 1 Contexte général

## 1.1 Panorama de la filière cunicole : une filière implantée avec des enjeux sanitaires majeurs

Le lapin est la sixième espèce en termes de nombre d'animaux élevés pour la consommation humaine dans l'Union européenne et se positionne en huitième position en volume de viande (Directorate General for Health and Food Safety 2017). La production de viande de lapin à l'échelle mondiale s'élevait à 1,39 millions de tonnes équivalent carcasse (TEC) en 2018, dominée par la Chine, à l'origine des deux tiers de la production (865 477 TEC). Ce pays est suivi par l'Union européenne dont la production s'élevait à 202 607 TEC en 2019, majoritairement dominée par trois pays membres qui concentrent 83% de la production européenne. En 2020, la France se place ainsi en troisième position européenne derrière l'Espagne et l'Italie avec une production de 32 600 TEC (ITAVI 2020).

En France, un élevage moyen se compose de 250 à 1 000 lapines reproductrices et repose sur le modèle naisseur-engraisseur. Les élevages ont recours aux techniques de l'insémination artificielle et de la conduite en bande dans 90% des cas. Cette organisation permet de synchroniser les stades physiologiques des animaux. Après une gestation d'une durée de 31-32 jours, la lapine donne naissance à une portée de 8-10 animaux nidicoles, incapables de se nourrir ou se déplacer seuls. En effet, à la mise bas, les lapereaux pèsent 50 g et sont partiellement immatures sensoriellement et physiologiquement. Leurs yeux ne s'ouvrent qu'à 10 jours d'âge, leur audition n'est fonctionnelle qu'entre 7 et 13 jours, de même que leurs capacités masticatrices (Figure 1). Ils sont également très sensibles aux variations de température puisqu'ils naissent dépourvus de poils. Ainsi, les lapereaux se maintiennent dans le nid pendant les 15 premiers jours de vie, au cours desquels la lapine viendra les allaiter une fois par jour (Combes et al. 2018). Les lapereaux sont sevrés, c'est-à-dire qu'ils n'ont plus accès à l'alimentation lactée, entre 28 et 36 jours d'âge (Figure 1) et seront abattus entre 70 et 73 jours à un poids moyen de 2,4 kg. Les lapines, quant à elles, ont une capacité d'environ 8,5 gestations par an. En élevage conventionnel, elles sont ainsi de nouveau inséminées dès les 10 jours suivant la mise bas (Figure 1). En moyenne, une lapine reste sur l'exploitation jusqu'à 11 mois, et peut donc sevrer 40 à 60 lapereaux (Gidenne 2015).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1 : Phases de vie en élevage cunicole adapté de Dutta, Sengupta (2018)</figcaption></figure>

Cette standardisation des élevages cunicoles s'est déroulée au cours des trente dernières années. En raison des progrès génétiques, alimentaires et d'organisation, les élevages ont nettement amélioré leurs résultats techniques : amélioration de 14% du taux de mise bas entre 1984 et 2014, augmentation du taux de viabilité en engraissement de 5%, diminution
d'un point de l'indice de consommation (Coutelet 2015). Cependant les troubles sanitaires sont encore récurrents au sein des élevages, ayant d'importantes conséquences pour les éleveurs. Les affections digestives demeurent la principale cause de morbidité et de mortalité, particulièrement en post-sevrage. En 2017, la mortalité chez les lapins de chair entre la naissance et la vente était de 25 % dont 9 % en post-sevrage immédiat, d'une diarrhée dans 95% des cas (Licois, Marlier 2020). Il paraît donc essentiel d'assurer une bonne santé digestive chez les lapereaux visant à éviter une baisse de croissance et d'efficacité alimentaire et une mortalité importante conduisant à des pertes économiques élevées pour les éleveurs.

## 1.2 Troubles digestifs et antibiotiques : une dépendance forte

Afin de préserver la santé des animaux, l'antibiothérapie est couramment employée de façon curative en élevage cunicole. D'après les résultats d'une enquête réalisée auprès de 113 élevages de lapins de chair (Chauvin et al. 2011), 50% des antibiotiques utilisés en élevage cunicole le sont contre des infections digestives dont 60-70% autour du sevrage soit entre 4 et 6 semaines d'âge. La prédominance des pathologies digestives explique ainsi en partie la forte dépendance de la filière cunicole aux antibiotiques, comparée à d'autres types de productions animales : 724 mg de produit antibiotique/kg de poids vif pour le lapin en 2011 contre 106 et 118 mg de produit/kg de poids vif pour les volailles et le porc (ANSES 2012). Or le phénomène d'antibiorésistance, qui représente la capacité des bactéries à développer une résistance face aux antibiotiques (INRA 2018), constitue aujourd'hui un problème de santé publique majeur. De fait, les productions animales sont directement concernées par les enjeux de réduction de l'usage d'antibiotiques. C'est ainsi que depuis 2012, le gouvernement français a entrepris la mise en place d'un plan EcoAntibio dont l'objectif est de diminuer l'exposition des animaux aux antibiotiques, faisant l'objet d'un second plan depuis 2017 (Ministère de l'agriculture et de la souveraineté alimentaire 2021).

Dans le secteur cunicole, cette réduction a été entamée dès décembre 2011 avec le lancement d'un plan interprofessionnel de médication raisonnée. Lorsque l'on s'intéresse à l'Animal Level of Exposure to Antimicrobials (ALEA), un indicateur d'exposition des populations animales qui fournit le rapport entre le poids vif traité et la biomasse totale, on remarque qu'entre 2011 et 2019, il a diminué de 41 % pour la filière cunicole. Ainsi, l'élevage de lapins a connu la troisième baisse la plus importante après la volaille et le porc. En revanche, elle reste aujourd'hui l'unique filière affichant un ALEA supérieur à 1, ainsi que la seule dont l'exposition aux antibiotiques ne diminue plus mais se stabilise depuis 2018 (ANSES 2020). En outre, un rapport de la commission européenne (Nunan 2022) estime que malgré la réduction d'environ 35 % de l'utilisation des antibiotiques dans les élevages cunicoles français entre 2010 et 2016, il est encore primordial de poursuivre leur réduction. Afin de préserver la santé des animaux, des alternatives à l'antibiothérapie doivent donc être développées et mises en place.

## 1.3 Stratégies alimentaires réduisant les troubles digestifs en élevage cunicole

Les travaux de l'unité mixte de recherche (UMR) Génétique physiologie et systèmes d'élevage (GenPhySE) de l'INRAE visent à comprendre les mécanismes d'établissement des caractères impliqués dans la robustesse des animaux pour les améliorer avec des leviers génétiques, nutritionnels et de conduite d'élevage. Afin de développer des alternatives aux antibiotiques, les travaux de l'unité se sont orientés autour d'actions prophylactiques touchant la conduite d'élevage et le recours à des supplémentations alimentaires (Gidenne 2018). Dans ce cadre, les travaux de l'équipe Nutrition et écosystèmes digestifs (NED), dans laquelle j'ai travaillé au cours de mon stage, s'orientent
autour du microbiote digestif, de son rôle dans la digestion, le métabolisme mais aussi la santé et l'impact de l'alimentation sur le microbiote et son hôte (INRAE 2020).

Chez le lapin, plusieurs pistes alimentaires ont été étudiées en post-sevrage pour réduire les troubles digestifs, notamment l'apport en fibres (Fortun-Lamothe, Gidenne 2003). A tire d'exemple, une diminution de lignine et de cellulose dans la ration de 19 à 15 % augmente le risque de morbidité et de mortalité de 18 à 28 % chez le lapin en croissance (Gidenne, Lebas 2002). Des recommandations nutritionnelles sur les apports en fibres en post-sevrage ont ainsi été formulées. Un autre levier alimentaire pour préserver la santé digestive concerne la régulation de l'ingestion (Boisot, Licois, Gidenne 2003). La limitation de l'ingestion de 20-30% durant les 3 semaines qui suivent le sevrage limite les troubles digestifs du lapin en croissance avec une réduction de la mortalité entre 5 et 20% selon les études (Gidenne 2015). Cette réduction est associée à une modulation de la composition et de l'activité du microbiote (Knudsen et al. 2021) ainsi que de l'immunité intestinale de l'hôte (Knudsen et al. 2015). La période pré-sevrage a également fait l'objet de plusieurs études. Durant cette période, l'alimentation du lapereau est majoritairement composée du lait maternel, complétée de façon croissante par une ingestion d'aliments solides à compter de 18 jours d'âge (Figure 2). Favoriser l'ingestion précoce d'aliments solides pourrait accélérer la maturation intestinale (4). Dans ce cadre, des travaux du laboratoire ont permis d'induire un début d'ingestion solide à des stades précoces (J7), permettant une modulation anticipée de la composition microbienne caecale (Paës et al. 2020). Agir en amont du sevrage apparaît donc comme une voie potentielle pour préparer les lapereaux à la période de stress qui suit.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 2 : Ingestion des lapereaux avant le sevrage (Gidenne, Lebas 2005)</figcaption></figure>

Afin d'être en mesure de réaliser de tels projets de recherches, les connaissances sur la physiologie digestive de l'espèce cunicole sont un prérequis.

# 2 Le système digestif du lapin

## 2.1 Anatomie du tractus digestif du lapin

Les lapins sont des herbivores monogastriques appartenant à l'ordre des lagomorphes. Leur tube digestif, composé d'une succession d'organes et de glandes sécrétoires, s'étend sur 5 à 7,5 mètres de long. Il est agencé comme suit : bouche, œsophage, estomac, intestin grêle (lui-même composé de trois segments successifs : le duodénum, le jéjunum et l'iléon), suivis du caecum, côlon, rectum et anus (Figure 3). Les termes proximal et distal correspondent respectivement aux parties hautes ou basses du tube digestif. Ils peuvent être évoqués pour le tube digestif dans sa globalité de même que pour délimiter les différentes parties d'un organe.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 3 : Anatomie générale et caractéristiques moyennes du tube digestif du lapin (Gidenne, Lebas 2006)</figcaption></figure>

Le bol alimentaire subit trois grands types de digestion : la digestion mécanique au cours de laquelle la motricité des organes va réduire la taille des particules alimentaires et les mélanger, la digestion enzymatique et la digestion biologique. Les enzymes endogènes, c'est-à-dire propres au lapin, dégradent en partie haute les aliments les plus digestes, soit l'amidon, les protéines, les sucres et les lipides. Les aliments restants seront digérés dans le caecum et le côlon proximal par le microbiote (digestion biologique) avant d'arriver dans le côlon distal pour être excrétés sous forme de fèces dures ou de caecotrophes (Gidenne, Lebas 2006). La partie proximale du tube digestif de l'espèce cunicole présente un fonctionnement sensiblement identique aux autres monogastriques. Brièvement la digestion enzymatique débute à partir du premier segment du tube digestif, la bouche. La lyse chimique se poursuit alors dans l'estomac pendant 3 à 6 heures, au cours desquelles le bol alimentaire est transformé en chyme gastrique (Davies, Rees Davies 2003). La digestion gastrique, incomplète, se poursuit dans l'intestin grêle où les aliments séjournent durant 1 heure 30. La digestion réalisée par le matériel enzymatique de l'hôte est donc partielle, elle n'agit que très peu sur l'hydrolyse des glucides complexes, les glucides simples étant les seuls à être hydrolysés grâce à des amylases pancréatiques (Gidenne 2015; Read 2016).

## 2.2 Le caecum : un fermenteur développé chez le lapin

L'environnement digestif des lapins est favorable aux micro-organismes avec une vitesse de transit lente, un pH acide à neutre, une humidité importante, une température élevée. Une relation hôte/microbiote de type symbiose se met alors en place permettant au lapin de retirer des nutriments de certains aliments qu'il ne peut digérer seul. On parle d'écosystème digestif, qui se définit comme le lieu d'interaction entre un biotope (le tractus digestif) et les espèces présentes en son sein (biocénose) (Gidenne et al. 2008). Bien que majoritairement présente dans les segments distaux du tube digestif, on dénombre également une population microbienne au sein des segments proximaux. Ainsi, chez l'adulte, on retrouve $10^{11}$ à $10^{12}$ bactéries/g dans le caecum-colon contre $10^6$ à $10^8$ bactéries/g dans l'iléon et $10^4$ à $10^6$ bactéries/g dans l'estomac. Cette répartition fait du caecum l'organe clé de la digestion biologique (Combes et al. 2011).

Le caecum des lapins est extrêmement volumineux, représentant 9% de la longueur totale du tube digestif contre 1% chez les porcs (Merchant et al. 2010). Cet organe complexe se divise en trois portions : *ampulla coli* où le colon proximal émerge, le *corpus ceci* avec 18 à 22 renflements et la portion terminale (Carabaño et al. 2010). De plus on distingue la présence de deux structures uniques à l'espèce : le *sacculus rotondus* situé en amont du
caecum ainsi que l'appendice vermiforme, qui n'est pas unique au lapin mais est particulièrement développé chez cette espèce dans la partie distale du caecum (Merchant et al. 2010).

L'essentiel (70%) de la matière sèche (MS) retrouvée dans la partie basse du tube digestif correspond aux fibres (lignine, cellulose, pectines ...), que les enzymes de l'hôte sont incapables d'hydrolyser, suivi des composés azotés (15 % de la MS) (Combes et al. 2013). C'est alors qu'intervient le microbiote intestinal et son activité enzymatique. Les espèces hydrolytiques métabolisent les polymères complexes, grâce à leurs hydrolases, produisant des composés plus petits (oses, acides aminés ...). Ces derniers deviennent des substrats pour les espèces fermentatives permettant la production de leurs protéines et enzymes. Des co-produits résultent de ces fermentations, à savoir des acides gras volatils (acide acétique, propionique et butyrique principalement), des gaz (CO2, CH4, H2), de l'ammoniac (NH3) issus de la protéolyse ainsi que des métabolites intermédiaires (acide lactique, succinique, formique). A travers ce mécanisme, le microbiote contribuerait à l'apport de 30-50% des besoins énergétiques des lapins adultes (Gidenne 2015). Certaines particules non digérées ainsi que les bactéries qui se sont développées dans le caecum grâce aux fermentations, sont évacuées vers le côlon. Cet organe présente la seconde particularité des lapins, à savoir le rôle dual du côlon proximal. En effet, le contenu ingéré par les lapins aura une destination différente dans la partie distale du tube digestif selon les transformations qu'il aura subi au cours de son passage dans le tube digestif :

* Les particules de faibles tailles et les liquides sont stockés dans le caecum. Ce contenu caecal subit une faible transformation dans le côlon, formant des fèces molles riches en nutriments, qui seront recouvertes d'un mucus protecteur sur des grappes de 5-10 pelotes, les caecotrophes ;

* Les aliments fibreux supérieurs à 0.5 mm subiront une forte activité du côlon, avec une sécrétion d'enzymes pour la dégradation et l'absorption des nutriments issus de leur activité, à l'origine des fèces dures (Johnson-Delaney 2006).

Les caecotrophes seront ensuite ingérés par les lapins. Ils sont composés pour moitié de microorganismes, avec une composition semblable à celle du caecum. Les caecotrophes échappent à la digestion gastrique, la couche de mucus dont ils sont recouverts les protège de l'acidité gastrique. De fait, ils peuvent se maintenir dans l'estomac durant 6 à 8 heures tout en conservant le processus de fermentation microbienne qui s'y déroule. La caecotrophie permet ainsi au lapin d'assimiler les nutriments issus du métabolisme microbien contribuant à 15 à 70 % de l'azote ingéré par les individus selon la composition de leur ration (Varga 2014).

Le microbiote présente donc un rôle clé dans la digestion chez le lapin. De fait, le tube digestif doit développer une tolérance envers les microorganismes commensaux, tout en étant en mesure de se protéger contre d'éventuels pathogènes. Ces derniers sont une menace constante puisque le tube digestif est en contact permanent avec le milieu extérieur à travers les aliments qui y circulent.

# 3 La muqueuse digestive

Ainsi, outre ses fonctions digestives, incluant la transformation des aliments en nutriments, leur absorption et la sécrétion des déchets, le système digestif a une fonction barrière visant à protéger l'organisme d'éventuelles agressions.

## 3.1 Des barrières physiques et chimiques pour une défense optimale

L'intestin est constitué de quatre couches distinctes (Figure 4) : la muqueuse directement au contact du bol alimentaire ; la sous-muqueuse, tissu conjonctif connecté avec des vaisseaux sanguins, lymphatiques et un plexus nerveux ; la musculeuse externe avec plusieurs couches musculaires ; la séreuse qui relie l'ensemble à la membrane de la cavité
abdominale. Nous allons nous intéresser particulièrement à la muqueuse intestinale, intermédiaire direct entre l'hôte et la lumière intestinale et qui exerce un grand nombre de fonctions essentielles à l'organisme. Il convient dans un premier temps de distinguer sa structure qui se divise en trois segments :

* L'épithélium est le premier segment, constitué d'une couche de plusieurs types cellulaires jointifs et structurellement organisés en cryptes. Ces cellules permettent d'augmenter la surface d'absorption des aliments mais jouent également un rôle barrière prépondérant ;

* La lamina propria, un tissu conjonctif constitué de nombreuses cellules impliquées dans la défense immunitaire ;

* La muqueuse musculaire, mince couche de muscle lisse (Newberry, Gustafsson 2016).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 4 : Anatomie du tube digestif adapté de Newberry, Gustafsson (2016)</figcaption></figure>

Certaines caractéristiques de l'intestin et de son épithélium permettent une protection du tube digestif avant même l'intervention du système immunitaire. Il peut s'agir de barrières physiques telles que les jonctions cellulaires entre les cellules épithéliales qui empêchent le passage de certains agents pathogènes, le péristaltisme intestinal qui a lieu durant la digestion et qui favorise l'élimination des pathogènes en empêchant qu'ils ne se fixent sur les cellules épithéliales, ou encore le renouvellement permanent des cellules épithéliales par les cellules souches présentes dans les cryptes intestinales qui permet la pérennité des fonctions des différentes cellules. Il existe également des barrières chimiques. En effet, certains types de cellules produisent des substances visant au maintien de l'homéostasie intestinale. C'est le cas des cellules de Paneth qui sécrètent des substances bactériolytiques ou bactériostatiques ainsi que des peptides antimicrobiens. Les cellules caliciformes sécrètent du mucus, qui protège la surface des entérocytes, afin d'éviter que les pathogènes ne s'y logent. Ce mucus est également composé de substances antimicrobiennes naturelles (lysozyme, lactoferrine ...) (Fortun-Lamothe, Boullier 2007).

Lorsque ces éléments sont insuffisants, le système immunitaire prend le relais dans la défense de l'organisme.

## 3.2 Le GALT : un tissu immunitaire majeur

A l'instar de nombreuses muqueuses de l'organisme, la muqueuse intestinale est associée à un tissu lymphoïde, qu'on appelle GALT (Gut associated lymphoid tissue). Plusieurs structures immunitaires sont détectables au sein de ce dernier qu'on peut diviser en deux types de sites principaux : les sites inducteurs qui détectent les agressions extérieures et enclenchent la défense immunitaire, qui sera ensuite orchestrée par les sites effecteurs. Ces sites inducteurs représentent un système organisé en follicules lymphoïdes structurés en dômes, séparés entre eux par des espaces inter folliculaires auxquels appartiennent
notamment les plaques de Peyer (Murphy, Weaver 2018) (Figure 5). Les sites effecteurs sont quant à eux diffus au sein de la *lamina propria* et de l'épithélium.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5 : Représentation de la structure du GALT avec les plaques de Peyer (Mowat 2003). TDA : zone reliée au thymus ; SED : dôme sub-épithélial</figcaption></figure>

Les organes spécifiques au lapin que sont l'appendice vermiforme et le *sacculus rotundus* (Figure 6), sont également des sites inducteurs et contiennent plusieurs centaines de follicules (Fortun-Lamothe, Boullier 2007). A eux deux, ils représentent plus de 50% du tissu lymphoïde intestinal du lapin (Arrazuria et al. 2018).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 6 : Localisation des sites immunitaires inducteurs digestifs matérialisés par les zones grisées (Fortun-Lamothe, Boullier 2007)</figcaption></figure>

Bien que l'ensemble des couches intestinales collaborent en favorisant la circulation des anticorps et cellules immunitaires, la *lamina propria* est le compartiment principal de l'immunité digestive (Mowat 2003), présentant une grande diversité de types de cellules immunitaires, et est le principal site de la réponse effectrice intestinale. A la différence des plaques de Peyer, qui ont un contact direct avec la lumière intestinale, la *lamina propria* n'a aucun contact avec celle-ci. De fait, cette zone est drainée par les vaisseaux lymphatiques, permettant de communiquer avec les autres tissus, notamment par le transport de cellules jouant un rôle dans l'immunité (Wagner et al. 2021).

De la même manière que dans le reste de l'organisme, on peut séparer la réponse immunitaire de la muqueuse digestive en deux temps : la première ligne de défense est représentée par les cellules de l'immunité innée, non spécifiques, c'est-à-dire que leur mode d'action est identique envers l'ensemble des pathogènes. On les retrouve dans l'ensemble du tube digestif et elles agissent rapidement après apparition du danger. La seconde ligne de défense repose sur l'immunité adaptative, dont les cellules sont spécifiques à certains antigènes. Cette dernière s'appuie sur les différents sites immunitaires de l'organisme : les sites inducteurs où les cellules doivent identifier et/ou
capturer l'agent infectieux avant d'être activées et de se diriger vers les sites effecteurs où seront neutralisés ou détruits ces agents pathogènes (Drouet-Viard, Fortun-Lamothe 2002). L'ensemble des cellules immunitaires ont une origine commune (Figure 7) : les cellules souches pluripotentes de la moelle osseuse. Ces dernières sont à l'origine de deux lignées cellulaires immunitaires : la lignée myéloïde et la lignée lymphoïde, auxquelles appartiennent des cellules avec des destinations et des rôles différents dans l'immunité (Murphy, Weaver 2018). Les cellules de la moelle osseuse sont également à l'origine de deux autres types cellulaires : les plaquettes et les érythrocytes (globules rouges) que nous ne détaillerons pas ici, n'ayant pas une fonction immunitaire.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 7 : Origine des cellules immunitaires d'après Murphy, Weaver (2018)</figcaption></figure>

## 3.3 La lignée myéloïde : première ligne de défense du GALT

Les progéniteurs myéloïdes communs vont être à l'origine de certains leucocytes de l'immunité innée qui seront ensuite transportés de la moelle osseuse vers le sang et les tissus. Ces leucocytes sont les neutrophiles, éosinophiles et basophiles qui entrent dans la catégorie des granulocytes, les monocytes qui se différencient en macrophages à leur arrivé dans les tissus, les mastocytes et les cellules dendritiques. Ils sont distribués dans l'ensemble de l'organisme. Lors d'une agression, ils entrent en action et se rassemblent sur le site où se situe le danger. Ces cellules interagissent entre elles et sont toutes impliquées dans la phagocytose, leur rôle étant d'ingérer les microorganismes mais aussi les cellules en apoptose (non abordé ici) (Drouet-Viard, Fortun-Lamothe 2002). La phagocytose est conditionnée par la reconnaissance des pathogènes qui est limitée à certains types cellulaires : les macrophages, neutrophiles et cellules dendritiques. Ces différents types cellulaires possèdent des récepteurs de reconnaissance de motifs microbiens (Pattern Recognition Receptors PRR) très peu variés capables de reconnaître des motifs moléculaires associés aux pathogènes (Pathogen-Associated Molecular Patterns PAMP) qu'on retrouve à la surface de micro-organismes. Après cette reconnaissance par les capteurs, ces cellules peuvent produire des molécules médiatrices, cytokines et chimiokines, qui transmettront alors un signal inflammatoire aux autres cellules de l'immunité (Murphy, Weaver 2018). Les éosinophiles et basophiles, appartiennent au même groupe de cellules que les neutrophiles, à savoir les granulocytes, mais leur rôle de phagocytose est limité aux microorganismes volumineux.

Tandis que les neutrophiles sont détruits après avoir joué leur rôle, les macrophages et les cellules dendritiques poursuivront leur activité avec une implication dans le déclenchement de la seconde ligne de défense, la réponse adaptative. On les appelle communément
cellules présentatrices d'antigènes (CPA), puisqu'elles vont présenter les produits de digestion des pathogènes, c'est-à-dire les antigènes, aux cellules de l'immunité adaptative (Drouet-Viard, Fortun-Lamothe 2002).

## 3.4 La lignée lymphoïde : des cellules activées au sein du GALT

Les cellules de la lignée lymphoïde vont donner naissance aux lymphocytes B et T, aux cellules natural killer (NK) impliquées dans la défense face aux cellules tumorales, ainsi qu'aux cellules lymphoïdes innées sécrétrices notamment de médiateurs de l'inflammation. Les lymphocytes B et T quittent la moelle osseuse pour rejoindre des organes lymphoïdes primaires à savoir le thymus et l'appendice vermiforme, au sein desquels ils vont devenir matures, phénomène appelé la lymphopoïèse (Drouet-Viard, Fortun-Lamothe 2002). Au cours de cette maturation, les cellules synthétisent des molécules, situées sur leur surface, qui deviendront des récepteurs et marqueurs de surface. Ces récepteurs prénommés BCR (récepteur des cellules B) et TCR (récepteur des cellules T), des lymphocytes B et T respectivement, déterminent leur spécificité envers certains antigènes et sont indispensables à leur activation future. En effet, après leur maturation, ils migrent vers les organes lymphoïdes secondaires que sont la rate, les ganglions lymphatiques et les tissus lymphatiques du GALT par l'intermédiaire des vaisseaux sanguins et lymphatiques (Figure 8). Ils sont alors stimulés au sein de ces derniers, induisant leur prolifération.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 8 : Localisation des organes lymphoïdes primaires et secondaires du lapin (Fortun-Lamothe, Boullier 2007)</figcaption></figure>

Cette stimulation fait suite à l'interaction de leurs récepteurs avec les antigènes cibles présentés par les cellules présentatrices d'antigène ou présents à la surface de certains pathogènes (Gidenne 2015). De fait, on distingue 2 types de réponses immunitaires adaptatives en fonction du type de lymphocytes :

* La réponse à médiation humorale est réalisée par les lymphocytes B, qui ont la capacité de reconnaître les pathogènes à développement extracellulaire (présentant un antigène à leur surface) grâce à leur BCR. La majorité de ces lymphocytes se transforment en plasmocytes, à l'origine d'anticorps appelés immunoglobulines. Chaque plasmocyte ne peut produire qu'un type d'immunoglobuline. Les lymphocytes restants se transforment en cellules mémoires qui pourront agir plus rapidement lors de prochaines infections par le même pathogène.

* La réponse à médiation cellulaire réalisée par les lymphocytes T. Ces derniers doivent rencontrer les CPA précédemment décrites, qui exposent les peptides microbiens produits par la phagocytose sur leur membrane au sein d'une structure moléculaire appelée complexe majeur d'histocompatibilité (CMH).

On distingue deux grands types de marqueurs de surface des lymphocytes T, selon le marqueur de différenciation (CD) qu'ils expriment à leur surface : les lymphocyte T
CD8+ sont impliqués dans l'élimination des cellules considérées étrangères, les lymphocytes T CD4+ ont une activité régulatrice visant à aider d'autres cellules immunitaires à exercer leur rôle. Parmi ces cellules CD4+ on distingue les lymphocytes T helper, qui contribuent à la différenciation des lymphocytes B et les lymphocytes T regulatory qui inhibent cette différenciation. De même que pour les lymphocytes B, une partie des lymphocytes T seront des cellules mémoires. En revanche, l'autre partie de ces lymphocytes T ne produira pas d'anticorps mais des molécules protéiques, les cytokines, messagers chimiques du système immunitaire. Ces dernières sont produites par un grand nombre de cellules de l'immunité et on en distingue quatre familles, les interleukines (Ils), les facteurs de nécroses tumorales (TNFs), les interférons (IFNs) et les facteurs de stimulation des colonies (CSFs) (Drouet-Viard, Fortun-Lamothe 2002).

# 4 Maturation de la muqueuse digestive et mécanismes

Le sevrage, c'est-à-dire la transition entre une alimentation lactée et une alimentation solide affecte le tube digestif et la digestion et contribue à la maturation du système immunitaire et du microbiote (Carabaño et al. 2010).

## 4.1 Maturation immunitaire de l'hôte

Des études chez la souris ont montré qu'à la naissance, les animaux sont dépourvus d'un certain nombre de structures impliquées dans le rôle de barrière de la muqueuse épithéliale. De fait, les cryptes intestinales se développent aux alentours de 10-12 jours après la naissance. C'est à ce moment qu'apparaissent les capacités digestives et de barrière de la muqueuse intestinale, grâce au développement des cellules souches, des entérocytes et des cellules endocrines. À l'inverse, les cellules caliciformes, à l'origine du mucus, sont présentes à la naissance mais leur capacité de sécrétion est très réduite au cours des premiers jours de vie. Cette absence de barrières chimiques et physiques au début de la vie rend le nouveau-né particulièrement vulnérable (Wagner et al. 2021). Cette vulnérabilité est renforcée par l'immaturité du système immunitaire, qui n'est en rien semblable à celui des individus adultes. Chez le lapin, nous savons que le premier tissu lymphoïde à devenir mature est l'appendice vermiforme, dès la première semaine d'âge, cependant les autres follicules lymphoïdes continuent leur développement jusqu'à 5 à 6 semaines d'âge (Knight, Winstead 1997).

Très peu de données sont disponibles sur la maturation immunitaire digestive chez le lapin. Chez la souris, le nombre total des cellules hématopoïétiques (marqueur de surface CD45+) digestives (intestin grêle) augmente durant les premiers jours de vie puis se stabilise pour connaître une seconde augmentation seulement après le sevrage. Parmi ces cellules, celles de la lignée myéloïde sont déjà présentes à la naissance et leur nombre ne connaît pas de changement (Torow et al. 2015). Les cellules de l'hématopoïèse fœtale sont ainsi progressivement substituées par les macrophages de l'hématopoïèse adulte (Torow et al. 2017).

Les lymphocytes T et B en revanche ne commencent à peupler les organes lymphoïdes secondaires qu'après la naissance. Leur présence augmente durant les deux premiers jours de vie puis une différence s'opère entre les lymphocytes B qui continuent d'augmenter pendant trois semaines et les lymphocytes T dont le nombre se stabilise jusqu'au sevrage. Cependant bien qu'exposés à une grande quantité d'antigènes alimentaires, ces lymphocytes restent au stade naïf jusqu'à 3 semaines de vie. Ainsi, la proportion de lymphocytes naïfs est bien plus importante chez les jeunes souris que les adultes (Torow et al. 2017). De plus, chez la souris, jusqu'à 11 à 28 jours, les lymphocytes T ne sont
observés que dans les plaques de Peyer, avant de migrer également vers la lamina propria. Des variations numériques et phénotypiques sont également observées au sein des différents types cellulaires. A titre d'exemple chez les nouveaux nés, la proportion de lymphocytes T CD8+ est faible, avec par conséquent un ratio CD4+/CD8+ élevé. Ainsi, au début de la vie, les lymphocytes T sont principalement de type helper, lymphocytes T CD4+, alors que les cytotoxiques, lymphocytes T CD8+, sont une minorité (Torow et al. 2017). En revanche, le taux de cellules CD8+ augmente grandement après la naissance dans le sang périphérique, la rate et les ganglions lymphatiques, diminuant de fait le ratio CD4+/CD8+ (Jeklova, Leva, Faldyna 2007).

Parallèlement à cette évolution du GALT, le microbiote des lapereaux connaît d'importantes modifications.

## 4.2 Maturation du microbiote intestinal

L'ensemble des surfaces de l'organisme qui sont en contact direct avec l'environnement extérieur hébergent des microorganismes. Le tube gastro-intestinal est de loin celui qui en arbore le plus (Fortun-Lamothe, Boullier 2007). Les espèces présentes dépendent majoritairement des facteurs physicochimiques du milieu puisque chaque espèce présente des caractéristiques physiologiques propres (températures, pH, humidité ...). La diversité microbienne et les taxons en présence varient au cours du temps. La quantité de bactéries présente dans le caecum augmente de 10⁹ bactéries/g à 2 jours d'âge à 10¹¹-10¹² bactéries/g à 21 jours d'âge (Gidenne et al. 2008). Il s'agit principalement de bactéries anaérobies strictes et facultatives, en proportion équivalente jusqu'à la troisième semaine de vie. Puis la proportion des bactéries anaérobies facultatives diminue avant de disparaître totalement après le sevrage. Leur implantation est modulée principalement par l'environnement direct des lapereaux (nid, contact avec la mère ...) et l'alimentation. Combes et al. (2013) ont ainsi montré qu'au cours du temps, on observe une succession écologique. Jusqu'à l'âge de 49 jours la communauté bactérienne est complexe et hétérogène entre les individus puis elle s'homogénéise et se stabilise à 70 jours d'âge, traduisant une certaine inertie. Ainsi, jusqu'à 49 jours d'âge, la communauté microbienne semble plastique.

La littérature s'accorde sur l'influence directe et indirecte du microbiote sur l'immunité. Du fait de sa présence à la surface de la muqueuse intestinale, il exerce une fonction de barrière. La comparaison de rongeurs axéniques, dont le tube digestif est rendu stérile par la réalisation d'une césarienne au sein d'un film plastique stérile, à des rongeurs conventionnels a montré l'influence de la flore intestinale sur le développement immunitaire de l'hôte. En effet, les antigènes traversent la muqueuse digestive beaucoup plus facilement chez les animaux axéniques. De plus, le microbiote induit une compétition pour les nutriments, qui ne sont plus disponibles pour les autres micro-organismes (exclusion compétitive), phénomène appelé antagonisme bactérien. Enfin, lors de la fermentation, certains composants produits ont des fonctions antimicrobiennes qui inhibent la croissance des organismes pathogènes (Berg 1996). Mais le microbiote agit également de façon indirecte en contribuant à la maturation du système immunitaire de l'individu (Sekirov, Finlay 2009). A titre d'exemple, Shanmugam et al. (2005) ont ligaturé l'appendice vermiforme de lapereaux à leur naissance pour empêcher toute implantation de micro-organismes dans cet organe. Ils ont alors remarqué une très faible diversification des anticorps chez les lapins de 12 semaines. De fait, certaines espèces du microbiote se caractérisent par la présence de polysaccharides sur leur paroi. Ces derniers font partis des PAMP qui vont donc stimuler le système immunitaire, contribuant ainsi à la mise en place du répertoire d'anticorps.

Al Nabhani et al. (2019) ont mis en avant, chez la souris, l'importance de l'exposition au microbiote dans une fenêtre de temps se situant peu après la naissance jusqu'au sevrage.
C'est au cours de cette période que le microbiote a un impact prépondérant sur la maturation du système immunitaire. L'ensemble de ces éléments convergent vers l'existence d'une fenêtre d'action, qui se situerait entre 0 à 49 jours d'âge chez les lapins, pour moduler le microbiote digestif et in fine la maturation du système immunitaire. Des leviers extrinsèques (alimentation, environnement direct, microbiote de la lapine) et intrinsèques (état physiologique du lapereau, pH et potentiel redox digestifs) induisant sa modulation ont été soulevés. Dans la suite de ce mémoire nous nous intéresserons particulièrement aux facteurs alimentaires issus du lait maternel.

## 4.3 Lait maternel et composés favorisant la maturation digestive

Durant les premières semaines de vie, les lapereaux consomment exclusivement du lait. Composé notamment de protéines, lipides, glucides, facteurs de croissance et antimicrobiens, il fournit au jeune des composés nutritionnels et immunologiques essentiels. De fait, certains de ces composés contribuent à une immunité passive (cellules immunitaires, cytokines, anticorps, peptides anti-microbiens) puisqu'ils sont d'origine exogène (lait). En parallèle, à la naissance le nouveau-né rencontre un certain nombre de microorganismes dont les taxons adaptés vont coloniser son tractus digestif. En effet, si le milieu leur est favorable (enzymes adaptées à la digestion des nutriments disponibles, pH, peptides antimicrobiens ...) des taxons bactériens vont pouvoir s'implanter (Ayechu-Muruzabal et al. 2018).

Dès les années 1930, certains chercheurs ont porté leur attention sur une classe particulière de molécules : les oligosaccharides du lait (MO, pour milk oligosaccharides), pour leur rôle immunomodulateur. Il s'agit de polymères contenant de 3 à 10 sucres simples appelés monosaccharides dans la chaine principale. Actuellement, plus de 180 oligosaccharides ont été décrits. Ces oligosaccharides du lait (MO) sont un assemblage de seulement 5 monosaccharides : glucose, galactose, N-acétylglucosamine, fucose et acide sialique reliés entre eux par des liaisons glycosidiques (Figure 9) (McGuire, McGuire, Bode 2017). Cette diversité de structure est à l'origine du nombre important d'oligosaccharides du lait et détermine leurs fonctions respectives. Dans le lait humain, on les trouve à une concentration de 5-15 g/l (22-24 g/l pour le colostrum), ce qui en fait le troisième composé solide majoritaire après le lactose et les lipides (Di Nardo, Salamone 2020).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 9 : Structure des oligosaccharides du lait composés d'une chaine principale (MOS Core) à laquelle peuvent s'ajouter des résidus fucosylés (formant les MO neutres) ou sialylés (formant les MO acides) (Ayechu-Muruzabal et al. 2018)</figcaption></figure>

Les oligosaccharides ne sont pas dégradés par les enzymes de l'hôte et représentent des substrats pour le microbiote. Ils jouent ainsi un rôle de prébiotiques, ingrédients fermentescibles utilisés sélectivement par les microorganismes de l'hôte exerçant un effet bénéfique sur la santé (Gibson et al. 2017). Plusieurs fonctions des oligosaccharides présents dans le lait humain ont ainsi pu être démontrées. Tout d'abord, ils exercent un rôle indirect en tant que prébiotiques. Les produits issus de leur fermentation, que sont les acides acétiques et lactiques, diminuent le pH, permettant le développement d'un
environnement favorable aux microorganismes bénéfiques. De plus la fermentation par les microorganismes produit des métabolites sources d'énergie pour les cellules épithéliales permettant ainsi la maturation de la fonction de barrière épithéliale (Moubareck 2021). Les oligosaccharides du lait exercent également une fonction directe, avec un rôle antimicrobien et antiadhésif. Leur structure mime les récepteurs présents à la surface de la muqueuse intestinale, normalement utilisés par certains pathogènes pour contaminer le tube digestif. La présence des MO empêche donc à ces pathogènes d'adhérer à la muqueuse intestinale (Bode 2012). Enfin, des études sur des cellules humaines ont montré que les MO du lait humain ont la capacité de se lier aux récepteurs des cellules dendritiques, résultant en une régulation de la réponse immunitaire. De même, plusieurs études ont montré chez l'humain une diminution des molécules pro-inflammatoires lorsqu'elles étaient incubées avec des oligosaccharides du lait humain (Ayechu-Muruzabal et al. 2018).

Cependant, à ce jour la composition en oligosaccharides du lait chez le lapin est inconnue, de même qu'aucune donnée sur l'impact des oligosaccharides du lait de lapine sur la maturation digestive du lapereau n'est disponible. Un volet du projet ANR HoloOligo, porté par l'équipe NED, dans lequel s'insère mon stage vise à combler ce déficit et à évaluer l'impact direct et indirect des MO sur la maturation immunitaire du lapereau. Cette évaluation se fera notamment via une évaluation *in vitro* de l'impact des MO sur les cellules immunitaires de la *lamina propria*, plus grand compartiment de l'immunité digestive. En amont du projet, plusieurs mises au point sont alors nécessaires, parmi lesquelles la culture de cellules immunitaires de la *lamina propria* du caecum du lapin. Le projet de mon stage de fin d'études s'inscrit dans ce cadre.

# 5 La culture cellulaire : un outil pour l'étude des mécanismes d'action de composés alimentaires

La culture cellulaire se définit comme la conservation et la multiplication de cellules animales et végétales, dans des conditions se rapprochant au maximum des conditions physiologiques permettant au minimum le maintien des cellules (Moreau 2021).

Depuis plusieurs décennies, cette technique *in vitro* est largement utilisée pour sa simplicité, qui la rend plus reproductible que les modèles d'étude *in vivo* (Rodriguez-Hernandez et al. 2014), mais en fait néanmoins un modèle réducteur, parfois peu représentatif. De même, les considérations éthiques qui émergent ces dernières années tendent à réduire les expérimentations sur animaux vivants. Ces modèles ont notamment un franc succès pour l'étude des composés alimentaires et leur interaction avec l'intestin et le microbiote digestif chez l'humain. Les cultures cellulaires ont, entre autres, permis d'étudier les capacités antioxydantes et anti-inflammatoires de produits naturels tels que certains fruits, végétaux ou même le lait humain (Verhoeckx et al. 2015).

En revanche, bien que cette pratique soit grandement documentée, elle nécessite un grand nombre de mesures et précautions qui peuvent pénaliser sa réalisation si elles ne sont pas respectées.

## 5.1 Une méthode exigeante

La culture cellulaire repose sur la manipulation de cellules eucaryotes ainsi que des réactifs présentant une toxicité cellulaire à certaines doses, ce qui requiert des points de vigilances particuliers. De plus, la réussite de la culture cellulaire repose sur un environnement aseptique, visant à éviter toute contamination des cellules par des microorganismes extérieurs, ce qui causerait la mort cellulaire et/ou des résultats erronés. En regard des produits utilisés, le laboratoire de l'équipe NED doit respecter le confinement de niveau L2, qui concerne les agents biologiques non pathogènes pour l'humain et sans danger pour l'environnement. Ainsi l'ensemble des manipulations ont lieu dans une salle fermée et ventilée, dédiée à la culture cellulaire. Dès qu'un agent pénètre dans cette salle, il doit se vêtir des équipements individuels de protection (EPI) c'est à dire des gants, une blouse et
des surchausses. Ces équipements assurent sa protection mais également le respect des conditions stériles, en réduisant le risque d'introduction de microorganismes extérieurs (Segeritz, Vallier 2017). Enfin, les manipulations ont lieu sous un Poste de sécurité microbiologique (PSM). Cette enceinte ventilée protège l'utilisateur et l'environnement des dangers liés aux aérosols dans la manipulation de micro-organismes ou cellules potentiellement dangereux. Elle permet également de préserver les cellules en culture de toutes contaminations extérieures. Tout objet introduit sous le PSM doit avoir été stérilisé au préalable (ThermoFisherScientific 2022).

Au-delà des exigences d'expérimentation, il faut fournir aux cellules les conditions adéquates à leur développement *in vitro*. En effet, plusieurs paramètres influencent la capacité des cellules à présenter un caractère viable en culture. Les cellules animales sont très sensibles aux conditions physicochimiques que sont la température, le pH et l'oxygène. Ainsi de nombreuses mesures doivent être respectées, certaines sont communes à toutes les expérimentations de culture cellulaire :

* pH : la plupart des cellules requièrent un pH situé entre 7,2 et 7,4 ;

* Oxygène (O2) : le taux nécessaire dépend du type de cellule, on le situe entre 20% et 80% ;

* Température : la plupart des cellules issues de mammifères requièrent une température entre 36 et 37°C. Une température trop importante (supérieure à 38°C) entraine la mort cellulaire, à l'inverse en dessous de 35°C on observe un ralentissement de l'activité cellulaire jusqu'à l'arrêt de la culture ;

* Osmolarité : la pression osmotique est essentielle à la croissance des membranes, aux métabolismes et aux transports des ions. Il faut respecter les valeurs rencontrées dans l'organisme dont sont issues les cellules et les maintenir ;

* Dioxyde de carbone (CO2), bicarbonate : ces éléments exercent un rôle de tampon en équilibrant la quantité de HCO3-, des ions qui diminuent le pH (Rodriguez-Hernandez et al. 2014).

Lors de la culture cellulaire à faible échelle, il est possible de réguler ces paramètres par l'utilisation d'un incubateur au sein duquel sont placées les cellules. Ce dernier permet de contrôler la température, et les taux d'oxygène et de CO2 qui permet à son tour la régulation du pH.

## 5.2 Choix du milieu de culture, paramètre clé

Le milieu de culture est l'un des paramètres les plus critiques. Ce dernier permet la survie et la prolifération des cellules de même que l'expression des fonctions cellulaires puisqu'il contient des nutriments, hormones, facteurs de croissances s'approchant au maximum des conditions fournies aux cellules *in vivo*. De fait, le choix du milieu de culture exercera une influence majeure sur le déroulé des recherches (Yao, Asayama 2017). L'ensemble des milieux de culture disponibles contiennent des composants de bases :

* Acides aminés : essentiels et non essentiels, nécessaires à la synthèse des protéines et donc à la croissance des cellules ;

* Vitamines : facilitent la prolifération des cellules ;

* Glucides : sources d'énergie comme le glucose ;

* Sels inorganiques : permettent de réguler le potentiel membranaire ;

* Oligo éléments : fer, potassium, magnésium, zinc ... ;

* Hormones ;

* Agent tampon : régule le pH.
On distingue les milieux de culture naturels et artificiels. Les premiers ne contiennent que des fluides biologiques naturels, sujets aux variations entre lots, les rendant peu reproductibles et expliquant que nous n'y ayons pas eu recours. A l'inverse, les milieux de culture artificiels sont des préparations industrielles, standardisées. Il en existe une diversité dont la composition est plus ou moins adaptée au type de cellules en culture (Verma, Verma, Singh 2020).

A ces milieux de culture, il est également possible d'ajouter du sérum issu d'animaux. Son rôle est de stimuler la prolifération puisque c'est une source de minéraux, lipides et hormones. Le plus couramment utilisé est le sérum de veau fœtal (SVF), très concentré en facteurs stimulant la croissance et contenant peu de facteurs inhibant la croissance cellulaire. A titre d'exemple, les protéines qu'il contient ainsi que les minéraux augmentent l'adhérence des cellules au support, les hormones permettent la croissance des cellules et les facteurs de croissance sont un support à l'expression des fonctions cellulaires. Les milieux peuvent également être supplémentés avec du 2-mercaptoéthanol, un composé chimique dont l'action n'a pas encore été déterminée avec précision, il est cependant acquis qu'il permet de lutter contre la toxicité des radicaux libres (Thermofisher 2022a), molécules pouvant léser les cellules lorsque produites en quantité excessive. De plus, plusieurs études ont montré que son ajout en quantités minimes (µM) dans le milieu de culture améliorait la réponse des cellules aux conditions fournit en culture contribuant à la croissance et l'activité des cellules immunitaires *in vitro*, notamment chez le lapin (Click 2014).

## 5.3 La culture cellulaire : culture primaire ou lignées cellulaires

On distingue les cultures de cellules primaires des lignées cellulaires. Les premières sont obtenues directement à partir des tissus par une digestion mécanique, chimique et/ou enzymatique puis mises en culture. Puisqu'elles sont directement issues de l'organisme, elles ont un phénotype cellulaire proche de l'in vivo mais présentent l'inconvénient de ne se développer que faiblement. Elles ne peuvent réaliser qu'un nombre limité de divisions avant d'entrer en sénescence. De plus elles sont de nature assez hétérogènes (rendant leur culture d'autant plus complexe). A titre d'exemple, au sein des cellules de cultures primaires, certaines sont dites adhérentes puisqu'elles s'attachent aux surfaces, tandis que d'autres sont dites en suspension, sans nécessité de surface, un milieu liquide leur suffisant pour se développer (Verhoeckx et al. 2015). Ces différences d'exigences compliquent également le choix d'un milieu/plaque/conditions adéquats pour toutes les cellules en présence. Pour pallier ces différents inconvénients, il est possible de recourir à des lignées cellulaires. Dans la majorité des cas, il s'agit de cellules cancéreuses, qui n'ont pas besoin de support pour se développer et ont de plus grandes capacités de prolifération. De même il est possible de modifier des cellules non cancéreuses en leur injectant un virus ou une substance chimique avec un pouvoir de transmission tumorale. Ces lignées cellulaires présentent de nombreux avantages : elles fournissent un grand nombre de cellules homogènes, peuvent être conservées congelées tout en gardant leur viabilité lors de l'étape de décongélation et ne sont pas sujettes à la sénescence (Alberts et al. 2002). En revanche, elles sont sujettes à des modifications phénotypiques, ce qui les éloigne des caractéristiques d'origine de l'organisme (Verhoeckx et al. 2015). Ainsi, ces spécificités doivent être prises en compte avant la mise en place et le choix du type de culture cellulaire (Tableau 1).
<table><caption>Tableau 1 : Synthèse des avantages et inconvénients des deux méthodes de culture cellulaires en 2D</caption><thead><tr><td></td><td>Culture primaire</td><td>Lignées cellulaires</td></tr></thead><tbody><tr><td>Représentativité in vivo</td><td>+</td><td>-</td></tr><tr><td>Facilité de mise en œuvre</td><td>-</td><td>++</td></tr><tr><td>Coût</td><td>++</td><td>+</td></tr><tr><td>Uniformité des cellules entre expérimentations</td><td>-</td><td>++</td></tr><tr><td>Prolifération</td><td>-</td><td>++</td></tr></tbody></table>

# 6 Problématique

L'élevage cunicole est concerné par le plan national de réduction de l'utilisation des antibiotiques, en raison de son recours massif à ces derniers, particulièrement durant la période péri-sevrage. Au cours de cette étape, les lapereaux connaissent un stress physiologique important, favorable au développement de troubles digestifs. C'est dans ce contexte que se sont développés les travaux visant à étudier le rôle de l'alimentation dans la modulation de l'immunité digestive.

Un projet visant à évaluer le rôle des oligosaccharides du lait dans la maturation de l'holobionte s'est notamment développé au sein de l'équipe NED, UMR GenPhySE de l'INRAE. L'étude *in vivo*, directement sur les lapereaux est une pratique connue au sein du laboratoire mais il est difficile d'évaluer les mécanismes à l'échelle cellulaire via cette méthodologie. De fait, les techniques *in vitro* sont également sollicitées. Parmi ces techniques, les organoïdes, des cultures cellulaires en trois dimensions, peuvent être pratiquées. En revanche, elles sont majoritairement réservées à l'étude des cellules épithéliales. Afin d'étudier la réponse immunitaire, les cellules immunitaires mononuclées de la *lamina propria* (LPMC), c'est-à-dire les cellules du système immunitaire composées d'un noyau unique à savoir les lymphocytes, macrophages, cellules dendritiques, monocytes présentés en Figure 7 (Feldman, Friedman, Brandt 2020) seront étudiées via des cultures primaires. Cette pratique, bien que largement démocratisée dans le milieu de la recherche, n'est pas documentée chez l'espèce cunicole, or un certain nombre de spécificités sont à intégrer (pH, osmolarité, etc ...) nécessitant des mises au point. Face à ces constats, une problématique émerge :

Comment cultiver et stimuler des cellules immunitaires de la *lamina propria* caecale des lapereaux *in vitro*, dans le but d'obtenir un modèle de culture cellulaire robuste et éprouvé ?
De cette problématique, ont émané deux objectifs :

1. La mise en place de la méthode de culture cellulaire pour obtenir :

* Des cellules viables ;

* Des cellules fonctionnelles pendant un temps suffisant pour les étudier ;

* A partir d'un protocole simple et rapide à mettre en place.

2. Le choix des stimulations immunitaires : lorsque les cellules immunitaires sont au repos, elles ne produisent qu'une faible quantité de cytokines et leur prolifération est limitée. Il est alors impossible de déterminer la réponse immunitaire des cellules cultivées. Pour poursuivre l'objectif initial, visant à déterminer l'effet des oligosaccharides sur les cellules immunitaires de la *lamina propria* caecale, il faut pouvoir observer des modulations de cette réponse immunitaire (Ai et al. 2013).

L'enjeu final de cette étude est de pouvoir étudier, par la suite, les effets de composants du lait de la lapine sur le développement post-natal de l'immunité des lapereaux.
# PARTIE 2 : Démarche et méthodologie d'étude
Problématique : Comment cultiver et stimuler des cellules immunitaires de la lamina propria caecale des lapereaux in vitro, dans le but d'obtenir un modèle de culture cellulaire robuste et éprouvé ?

<table><thead><tr><th colspan="4">Isolement des LPMC caecale des lapereaux</th></tr><tr><th>Objectifs</th><th>Expérimentation</th><th>Outils de mesure</th><th>Analyse des données</th></tr></thead><tbody><tr><td>Obtenir des LPMC viables en nombre suffisant</td><td><strong>Protocole 1</strong><br>Comparaison des <strong>milieux de digestion enzymatique</strong><br>Digestion enzymatique IMDM<br>Digestion enzymatique PBS</td><td>Mesure de luminescence<br>Nombre de cellules</td><td>Tests statistiques non paramétriques<br>R</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th colspan="4">Mise en place de la culture cellulaire LPMC caecale des lapereaux</th></tr><tr><th>Objectifs</th><th>Expérimentation</th><th>Outils de mesure</th><th>Analyse des données</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Maintenir les LPMC caecale des lapereaux isolées en culture, dans un état viable pendant un temps propice à leur étude</td><td><strong>Protocole 2</strong><br>Comparaison des <strong>milieux de culture</strong><br>Milieu de culture IMDM supplémenté<br>Milieu de culture RPMI supplémenté</td><td>Mesure de luminescence<br>Nombre de cellules</td><td>Mise en regard des résultats avec les caractéristiques (prix, disponibilité, utilisation) de chaque milieu</td></tr><tr><td><strong>Protocole 3</strong><br>Analyse de la supplémentation du milieu de culture en 2-mercaptoéthanol<br>Milieu de culture IMDM supplémenté en 2-mercaptoéthanol<br>Milieu de culture IMDM non supplémenté en 2-mercaptoéthanol</td><td>Mesure de luminescence<br>Nombre de cellules</td><td>Tests statistiques non paramétriques<br>R</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Figure 10 : Schéma méthodologique</caption><thead><tr><th colspan="4">Stimulation des LPMC caecale des lapereaux en culture</th></tr><tr><th colspan="4">Etape préliminaire de fouille bibliographique</th></tr><tr><th>Objectifs</th><th colspan="2">Procédures</th><th>Outils</th></tr></thead><tbody><tr><td>Mettre en place les protocoles de stimulation des LPMC caecale des lapereaux en culture</td><td colspan="2">Stimulants pour les LPMC caecale des lapereaux<br>Quelle dose de stimulant ?<br>Quelle durée de stimulation ?<br>Comment analyser leurs effets ?</td><td>Pub Med<br>Google Scholar<br>Reuters</td></tr><tr><td rowspan="2">Stimuler les LPMC caecale des lapereaux en culture pour déclencher une réponse immunitaire</td><th>Expérimentation</th><th>Outils de mesure</th><th>Analyse des données</th></tr><tr><td><strong>Protocole 4</strong><br>PHA<br>2 µg/ml<br>24 h<br>48 h<br>72 h</td><td>Mesure de luminescence<br>Nombre de cellules<br>Extraction d'ARN<br>Transcription inverse<br>RT-qPCR</td><td>Tests statistiques non paramétriques<br>R</td></tr><tr><td></td><td><strong>Protocole 5</strong><br>LPS<br>1 µg/ml<br>2 h<br>4 h<br>6 h</td><td>Mesure de luminescence<br>Nombre de cellules<br>Extraction d'ARN<br>Transcription inverse<br>RT-qPCR</td><td>Tests statistiques non paramétriques<br>R</td></tr></tbody></table>
# 1 Phase 1 : Optimisation de la méthode d'isolement

## 1.1 Animaux et matériel biologique nécessaire à l'isolement des cellules

Les lapereaux de 21/22 ou 35/36 jours d'âge sont issus du Pôle expérimental cunicole toulousain (PECTOUL). L'euthanasie des animaux (n=17) est réalisée par percussion de la boîte crânienne suivie d'une saignée. Une dissection de l'appareil digestif des animaux permet ensuite de prélever et peser le caecum accompagné de l'appendice caecale, en réalisant une section avant la jonction iléo-caecale et au niveau de la jonction avec le colon. Le caecum est transféré dans une solution de tampon phosphate salin (PBS) dont la concentration en sels minéraux correspond à celle de l'organisme permettant de maintenir le tissu dans un milieu isotonique.

Avant de procéder aux digestions chimiques, le tissu est nettoyé et préparé afin de maximiser l'action des enzymes (Annexe 1). Pour cela nous avons retiré le tissu adipeux mésentérique, l'appendice vermiforme et une section de 1 cm autour de la jonction iléo-caecale afin de travailler uniquement sur du tissu caecal, avant de le diviser en plusieurs morceaux de 3 à 4 cm de long. Enfin, une ouverture longitudinale suivie de plusieurs rinçages dans du PBS permet de retirer le contenu caecal. Nous avons ainsi obtenu un tissu sans trace de contenu digestif visible qui est ensuite pesé pour homogénéiser les quantités de tissus utilisés lors des différentes manipulations. Ces informations sont disponibles en Annexe 2.

## 1.2 Isolement des cellules mononuclées de la lamina propria

La lamina propria se compose d'une diversité de types cellulaires, dont les cellules immunitaires mononuclées de la lamina propria (LPMC), c'est-à-dire les lymphocytes, macrophages, monocytes et cellules dendritiques (Figure 7), qu'il convient d'isoler. Afin d'isoler les LPMC nous avons eu recours à une méthode combinant des actions mécaniques, chimiques, et enzymatiques (Figure 11) adaptée de Weigmann et al. (2007). Le protocole de Weigmann et al. (2007) a notamment fait l'objet de nombreuses adaptations au sein de divers articles de recherches, c'est également ce qui a été entrepris lors de la première étape du travail. En effet, plusieurs aspects méritent d'être pris en compte : les différences d'espèces entre ces protocoles et notre expérimentation, l'organe où sont prélevées les cellules n'est pas le même, les conditions de réalisation sont différentes (laboratoire, matériel, expérimentateur ...). De plus, une partie des réactifs peuvent endommager la viabilité ou diminuer l'expression des marqueurs de surface des cellules en cas d'action prolongée. Ainsi, en amont du stage, plusieurs manipulations ont été conduites, afin d'analyser les effets de ces réactifs et d'optimiser leur utilisation.

Fort de ces mises au point préalable, nous avons procédé au retrait de l'épithélium. Pour ce faire, le tissu a été redécoupé en morceaux de 1 cm² environ pour favoriser la lyse chimique. Ces morceaux ont été incorporés dans 5ml d'une solution de digestion chimique, dite prédigestion, par le biais de deux incubations successives de 20 minutes sous agitation à 37 °C. Cette étape permet d'éliminer le mucus et les cellules épithéliales. La solution se compose d'HBSS (solution saline sans calcium et magnésium) additionnée de 5mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA Sigma AM9260G) et 1 mM de Dithiothreitol (DTT Sigma 10197777001). L'EDTA est un chélateur de calcium qui détruit les cadhérines, protéines à l'origine de jonctions adhérentes calcium dépendantes entre les cellules. Le DTT permet quant à lui de réduire les ponts disulfures des protéines. Après chacune des deux incubations, le tissu a été filtré à travers des tamis cellulaires de 100 µm. Les cellules épithéliales qui sont passées au travers de ces filtres n'ont pas été conservées.

Ensuite nous avons procédé à la digestion de la lamina propria et de la musculeuse afin d'en extraire les cellules. En amont, le tissu a été rincé deux fois dans du PBS à 37°C sous agitation, afin d'éliminer l'EDTA résiduel qui inhibe les activités enzymatiques. Le tissu a
ensuite été découpé en morceaux de 1 mm pour favoriser l'action des enzymes lors de la
double incubation de 20 minutes dans 5 mL d'une solution de digestion à 37 °C sous
agitation. Cette dernière est composée de 0,12 U/ml de collagénase D, 3 U/ml de
désoxyribonucléase (DNase) I et 1 480 U/ml de dispase II. La collagénase D (Sigma
11088866001) est une enzyme qui favorise la rupture des liaisons peptidiques du
collagène, protéine structurante de la lamina propria. La DNase I (Sigma 10104159001)
permet d'éliminer les molécules d'Acide désoxyribonucléique (ADN) issues des cellules
lysées, présentes dans la suspension cellulaire qui collent les cellules entre elles. Enfin, la
dispase II (Sigma D4693-1G) est une protéase qui favorise le clivage des protéines
impliquées dans la structure du tissu, comme la fibronectine et le collagène notamment.
Les enzymes ont été diluées dans deux solutions distinctes dans le protocole 1 : du PBS et
du milieu de culture IMDM. Pour les autres protocoles à la suite le PBS a été retenu.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 11 : Protocole d'isolement des cellules mononuclées de la lamina propria</figcaption></figure>

Après chacune des deux étapes de digestion enzymatique, nous avons filtré les solutions de digestion à travers un filtre de 40 µm et obtenu une solution contenant les cellules de la lamina propria qui ont ensuite été lavées deux fois dans du PBS 3% SVF. L'étape suivante
a consisté à purifier les cellules mononuclées de la *lamina propria*, dont font partie les cellules immunitaires comme les macrophages, lymphocytes, monocytes, cellules dendritiques via un gradient de densité au Percoll (densité de 1, 130 g/ml). Ce dernier repose sur la différence de densité entre les types cellulaires (Figure 12).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 12 : Graphique des densités des différents types cellulaires issu de l'étude de Yu et al. (2017) sur les cellules sanguines</figcaption></figure>

Pour ce faire, nous avons suspendu les cellules dans une solution à 40% de Percoll (densité de 1, 05 g/ml) que nous avons ensuite superposé sur une solution à 80 % de Percoll (densité de 1, 10 g/ml) avant centrifugation. A l'issue de cette étape, il est possible de distinguer trois phases cellulaires dans les tubes (Yu et al. 2017):

* Dans la partie supérieure du tube se trouve une couche de cellules épithéliales, des débris cellulaires et cellules mortes ;

* Les LPMC sont visibles dans un anneau blanc à l'interface entre les 2 phases de Percoll ;

* Les érythrocytes sont visibles dans un anneau rouge sous-jacent (Figure 13).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 13 : Phases cellulaires observées après centrifugation dans le gradient de Percoll</figcaption></figure>

Nous avons récolté et lavé la phase contenant les LPMC dans du PBS 3% SVF. Les LPMC ont ensuite été comptées (Invitrogen Countess 3). A l'issue de cet isolement, nous obtenons un isolat, à savoir des cellules issues d'un lapin.

## 2 Phase 2 : Mise en place de la méthode de culture

Deux milieux habituellement utilisés pour la culture de cellules mononuclées de la *lamina propria* chez la souris et l'homme ont été comparés dans le protocole 2 : le milieu RPMI-1640 supplémenté (Roswell Park Memorial Institute – 1640), classiquement utilisé pour la
culture de lymphocytes (Marafini et al. 2015) et le milieu IMDM supplémenté (Iscove Modified Dulbecco Media), plus favorable aux macrophages (Schreurs et al. 2021). Ces milieux commerciaux sont donc tous deux adaptés aux cellules hématopoïétiques chez l'homme et la souris mais leur composition varie (Annexe 3). Nous les avons ensuite modifiés par l'ajout de SVF et d'antibiotiques comme indiqué dans le Tableau 2 (Arora 2013). Le milieu IMDM a été supplémenté ou non avec 50 µM de 2-mercaptoéthanol (Sigma M3148 ; dilution 1 :280 dans du PBS) dans le protocole 3. Pour l'ensemble des protocoles 4 à 5 le milieu IMDM avec 2-mercaptoéthanol a été utilisé.

<table><caption>Tableau 2 : Composition des milieux de culture testés</caption><thead><tr><th></th><th>Type de milieu</th><th>Antibiotiques</th><th>Sérum</th><th>Protocoles</th></tr></thead><tbody><tr><td>Gibco Milieu RPMI-1640 (Fisher)</td><td>Milieu commercial</td><td>Streptomycin (100µg/ml)<br>Gentamycin (50µg/ml)<br>Penicillin (100µg/ml)</td><td>10 % SVF</td><td>2</td></tr><tr><td>Gibco IMDM avec 2-mercaptoéthanol (Fisher)</td><td>Milieu commercial</td><td>Gentamycin (6 µg/mL)<br>2-mercaptoethanol (50 µM)</td><td>10 % SVF</td><td>1, 2, 3, 4, 5</td></tr><tr><td>Gibco IMDM sans 2-mercaptoéthanol (Fisher)</td><td>Milieu commercial</td><td>Gentamycin (6 µg/mL)</td><td>10 % SVF</td><td>3</td></tr></tbody></table>

A partir des données de comptage cellulaire obtenues précédemment, les cellules ont été mises en solution dans les milieux de culture à une concentration de 1.10⁶ cellules/ml. Ces solutions ont ensuite été transférées dans des plaques de culture 96 puits à fond plat, comme indiqué en Annexe 4, avec 100 µl de solution par puit soit environ 100 000 cellules.

# 3 Phase 3 : La stimulation des cellules en culture

## 3.1 Recherches bibliographiques

Les recherches bibliographiques ont été réalisées à partir des bases de données PubMed, Web of Science et Googlescholar, à l'aide des mots clés suivants : « immune cell stimulation » ; « lymphocyte proliferation » ; « mitogen » ; « culture cell activation » ; « culture cell cytokine production ». Parmi les articles obtenus, n'ont été retenus que ceux portant sur des espèces et organes proches de notre étude. Ainsi, nous avons utilisé la littérature traitant de l'humain, des porcs, des bovins, des souris et des rats et dans quelques cas des lapins, les données sur cette espèce étant rares ou anciennes. Un autre critère a été pris en compte : le type de cellules, la sélection s'est portée uniquement sur les cultures primaires de cellules immunitaires du sang périphérique et de cellules immunitaires de la lamina propria (« PBMC » et « LPMC » respectivement).

Au total, huit articles ont été retenus (Tableau 3). Les informations extraites portaient sur l'espèce, l'origine des cellules, la méthode de culture cellulaire, le protocole de stimulation des cellules. Ce dernier point inclut les types de stimulants, les doses utilisées, les temps d'incubation avec le stimulant, les méthodes d'analyse des effets de ces stimulants. Une liste des possibilités a donc été dressée, puis mise en relation avec les adaptations possibles au sein du laboratoire (matériel et produits disponibles, connaissance des méthodes ...).
<table><caption>Tableau 3 : Liste des articles conservés lors de la recherche bibliographique</caption><thead><tr><td>PMID/DOI</td><td>Auteur</td><td>Titre</td><td>Année</td><td>Revue</td></tr></thead><tbody><tr><td>23985769</td><td>Ai W et al</td><td>Optimal method to stimulate cytokine production and its use in immunotoxicity assessment</td><td>2013</td><td>International Journal of Environmental Research and Public Health</td></tr><tr><td>29882146</td><td>Corsini E et al</td><td>Evaluating Cytokines in Immunotoxicity Testing</td><td>2018</td><td>Springer</td></tr><tr><td>10525434</td><td>House R</td><td>Theory and Practice of Cytokine Assessment in Immunotoxicology</td><td>1999</td><td>Methods</td></tr><tr><td>10918516</td><td>House R</td><td>An overview of in vitro/ex vivo assays for preclinical evaluation of immunomodulation</td><td>2000</td><td>Human &amp; Experimental Toxicology</td></tr><tr><td>12667688</td><td>Trickett A et al</td><td>T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads</td><td>2003</td><td>Journal of Immunological Methods</td></tr><tr><td>26973760</td><td>Norian N et al</td><td>Evaluation of proliferation and cytokines production by mitogen-stimulated bovine peripheral blood mononuclear cells</td><td>2015</td><td>Veterinary research forum</td></tr><tr><td>10.15171/ijbsm.2017.06</td><td>Molaae N et al</td><td>Evaluating the Proliferation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using MTT Assay</td><td>2017</td><td>International Journal of Basic Science in Medicine</td></tr><tr><td>8958226</td><td>Boirivant M et al</td><td>Stimulated human lamina propria T cells manifest enhanced Fas-mediated apoptosis.</td><td>1996</td><td>Journal of Clinical Investigation</td></tr></tbody></table>

## 3.2 Stimulation in vitro des LPMC de lapin

Les LPMC ont été stimulées avec la lectine mitogène Phytohemagglutinin (Invitrogen™ eBioscience™ Phytohemagglutinin-L (PHA-L) Solution (500X)) (2 µg/ml, Protocole 4, n = 5 isolats) et le mitogène inflammatoire Lipopolysaccharide (LPS E.Coli O111:B4 Poudre lyophilisée soluble dans l'eau à 1 mg/ml) (1 µg/ml, Protocole 5, n = 4 isolats). Ces stimulants sont incorporés directement au sein du milieu de culture. Des LPMC contrôles non stimulées issus des mêmes isolats ont été mis en culture de façon concomitante. Dans la mesure du possible, deux réplicats techniques ont été analysés par modalités (LPS/PHA/Control), par temps et par isolat (Tableau 4). Après 0, 24, 48 et 72 heures (Protocole 4) et 0, 2, 4 et 6 heures (Protocole 5) la viabilité cellulaire a été mesurée (4.1). Afin d'évaluer l'expression de gènes en réponse aux stimulations, les cellules en culture ont été collectées après 0, 24, 48 et 72 heures (Protocole 4) et 0, 2, 4 et 6 heures (Protocole 5) de culture et suspendues dans du Trizol (TRI Reagent ©) avant d'être congelées à une température de -80°C. Ce tampon de lyse brise les membranes des cellules libérant les acides nucléiques et inhibe les ribonucléases (RNases) permettant de protéger les acides ribonucléiques (ARNs) de la dégradation.

<table><caption>Tableau 4 : Conditions testées pour les stimulations des cellules immunitaires en culture</caption><thead><tr><th></th><th colspan="4">PHA</th><th colspan="4">LPS</th></tr><tr><th>Dose</th><td colspan="4">2 µg/ml</td><td colspan="4">1 µg/ml</td></tr><tr><th>Durée d'incubation</th><th>0 h</th><th>24 h</th><th>48 h</th><th>72 h</th><th>0 h</th><th>2 h</th><th>4 h</th><th>6 h</th></tr></thead></table>
# 4 Phase 4 : Mesures de la viabilité et prolifération cellulaires et la réponse immunitaire des LPMC

## 4.1 Mesures et analyses de prolifération

Lors de chaque manipulation, un suivi microscopique x40 et x100 des cellules a été réalisé (Nikon ECLIPSE Ts2). La viabilité des cellules a été mesurée en dupliquat ou tripliquat par une méthode de luminescence à l'aide du réactif CellTiter-glo Reagent®. Cette méthode repose sur la réaction luciférase, qui est la mono-oxygénation de la luciférine présente dans le réactif CellTiter-glo Reagent®, qui produit de l'énergie sous forme de luminescence. L'Adénosine triphosphate (ATP) est un co-facteur indispensable de cette réaction or seules les cellules vivantes synthétisent de l'ATP. De fait, les niveaux d'ATP sont mesurés de façon indirecte à l'aide du kit, et le signal lumineux obtenu est proportionnel au nombre de cellules vivantes. Brièvement, 100 µl de CellTiter-glo Reagent® sont ajoutés par puits. La luminescence est ensuite mesurée sur un intervalle d'une seconde à l'aide d'un luminomètre (Promega Glomax).

## 4.2 Mesure de l'expression des gènes : RT-qPCR

### 4.2.1 Extraction d'ARN

Les ARNs des cellules ont été extraits à l'aide du kit Direct-zol RNA microprep (ZymoResearch). Brièvement, les cellules ont tout d'abord été lysées et l'ARN libéré via l'utilisation de Trizol (TRI Reagent ©) et d'une lyse mécanique à la pipette (3.2). Les ARNs ont ensuite été purifiés sur des colonnes de silice. Les acides nucléiques ont en effet une affinité forte avec la silice, séparant ces derniers des autres éléments cellulaires (protéines, impuretés ...) lors des phases de rinçage et centrifugation. L'utilisation d'éthanol dans les tampons de lavage favorise cette liaison. Les acides nucléiques ont ensuite été traités à la DNase permettant d'éliminer les ADNs contaminants. Enfin les ARNs sont élués avec de l'eau DNase/RNase-Free. Ces enzymes, sont largement présentes dans notre environnement, ainsi toutes les manipulations ont été réalisées avec des réactifs et matériaux RNase free.

Enfin, la quantité d'ARN extrait ainsi que sa pureté ont été analysées à l'aide du Nanodrop 8000. Cet appareil permet un dosage spectrophotométrique, qui mesure l'absorbance des échantillons. Les bases nucléiques de l'ARN absorbent à la longueur d'onde 260 nm, l'absorbance obtenue est donc proportionnelle à la quantité présente dans l'échantillon. De plus, l'étude des longueurs d'onde 230 nm et 280 nm fournissent des ratios permettant d'indiquer d'éventuelles contaminations protéiques ou par de l'ADN.

### 4.2.2 Transcription inverse

La transcription inverse est une technique visant à synthétiser de l'ADN complémentaire (ADNc) à partir de l'ARN extrait précédemment via l'utilisation de la transcriptase inverse, une enzyme ADN polymérase ARN dépendante. Pour cela, le kit GoScript™ Reverse Transcriptase Random Primers (Promega) a été utilisé. Après une première étape de dénaturation, qui rend l'ARN plus accessible aux enzymes, ce dernier a été mis en contact avec un mix contenant l'enzyme, un tampon contenant des amorces non spécifiques indispensables à la fixation de l'enzyme au brin d'ARN et de l'eau nuclease free. Le mélange a été incubé dans le thermocycleur SimpliAmp™ (ThermoFisher Scientific).

### 4.2.3 La PCR quantitative

La qPCR est un outil permettant d'évaluer l'expression relative de gènes dans les échantillons. Elle repose sur la mesure des acides ribonucléiques présents dans le domaine intracellulaire des cellules, qui résultent de la transcription des gènes pour produire en fine
des cytokines ou marqueurs cellulaires, dans le cas de notre étude. Brièvement, les échantillons d'ADNc et un contrôle négatif (eau Milli-Q®) ont été déposés en dupliquat (1 µl/puits) dans une plaque 384 puits. Un mix composé des amorces pour un gène d'intérêt, de l'eau et du Power SYBR™ Green PCR Master Mix (ThermoFisher Scientific) est ensuite ajouté. Ce master mix est lui-même composé d'un tampon, de désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), d'une enzyme, l'ADN polymérase thermorésistante et d'un marqueur de fluorescence, le SYBR Green. Les échantillons sont ensuite soumis à 40 cycles de variation de température durant lesquels se succèdent une phase de 15 secondes à 95°C et une phase d'1 minutes à 60 °C, décrit en Figure 14, au sein du système de PCR en temps réel QuantStudio 6 (ThermoFisher Scientific). Le SYBR Green a la capacité de se lier à l'ADN double brin puis une fois lié d'émettre un signal fluorescent. A chaque cycle l'intensité de fluorescence est mesurée, cette dernière étant proportionnelle à la quantité d'amplicons produits, qui dépend elle-même de la quantité d'ARN présente initialement dans le mélange (Adams 2020).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 14 : Détail du déroulé d'un cycle de PCR</figcaption></figure>

Afin d'analyser les résultats de qPCR, un ou des gènes de référence, également appelés gènes de ménage, sont nécessaires pour normaliser la quantité d'ADNc entre échantillons. Ces gènes doivent répondre à plusieurs critères : être fortement exprimés dans le tissu d'intérêt et être stable entre individus et indépendamment des conditions expérimentales (Ho-Pun-Cheung, Cellier, Lopez-Crapez 2008). Plusieurs gènes de référence ont été sélectionnés sur la base de précédentes études effectuées par l'équipe NED chez le lapin. L'efficacité de ces derniers a été mesurée, en même temps que celle des amorces des gènes d'intérêt (4.2.4). GAPDH (Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase), impliqué dans le métabolisme du glucose, a été sélectionné pour nos études.

### 4.2.4 Design des amorces et mesure de l'efficacité d'amplification

Pour amplifier une séquence d'ADN, le mélange réactionnel contient notamment des amorces, courtes séquences d'ADN simples brin. Elles délimitent la zone à amplifier en permettant la fixation de la polymérase. Les produits de la réaction PCR sont nommés amplicons. Afin de garantir une amplification spécifique, la définition de la séquence des amorces (ou design des amorces) respecte les critères suivants :

* Complémentarité des amorces à la séquence du gène cible ;

* Spécificité : la réaction PCR ne doit permettre la production que d'un seul amplicon ;

* Efficacité : la réaction PCR doit respecter un doublement de la production d'amplicon à chaque cycle, afin de permettre une quantification.

Pour cela nous avons suivis les étapes suivantes. Premièrement, les noms officiels des gènes d'intérêts ont été identifiés à l'aide du site GeneCards® (Weizmann Institute of Science 2022). C'est à partir de ces derniers que les séquences des gènes utilisés pour le
design des amorces ont été récupérées sur le site NCBI (National Library of Medicine 2022) sur la partie codante de l'ADN en fixant les contraintes suivantes :

* Exclusion des 200 premières bases codantes du gène qui sont sujettes à la dégradation ;

* Taille des produits PCR entre 100 et 150 paires de bases ;

* Faible complémentarité pour éviter que l'amorce ne se lie à elle-même ou à d'autres amorces ;

* Design sur 2 exons séparés au minimum d'un intron de plus de 500 paires de bases (l'ADNc ne contient pas d'introns à la différence de l'ADN génomique, en cas de contamination par ce dernier, le temps d'élongation ne sera pas suffisant pour amplifier la séquence génomique) ;

* Présence d'acides nucléiques guanine et cytosine entre 30 et 70% ainsi que leur présence dans les 5 dernières paires de bases de l'amplicon (ces acides nucléiques ont une grande affinité puisqu'ils ont 3 liaisons hydrogènes).

Les séquences détaillées de ces amorces se trouvent en Annexe 5, il s'agit de gènes codant pour des cytokines, molécules peptidiques produites par certains types de cellules immunitaires lors de leur activation, et des marqueurs, présents à la surface de cellules immunitaires, dont l'étude permet de déterminer les types cellulaires présents.

Il est nécessaire de valider les efficacités et spécificités des amorces synthétisées, mais aussi ceux couramment utilisés au laboratoire pour d'autres tissus/cellules, avant de pouvoir les utiliser sur nos cellules d'intérêt. Pour cela une gamme de dilution sériée d'ADNc, (7 points de gammes, dilution au ½ de l'ADNc pur 1/355) a été utilisée. L'ADNc utilisé provenait de cellules immunitaires de la *lamina propria* caecale d'un lapin de 21 jours préalablement congelées. Après qPCR, la gamme a été analysée selon la méthode d'expression des gènes décrite en 5.1.2. Les données ont ensuite été analysées à l'aide du logiciel QuantStudio™ 6. L'efficacité a été déterminée pour chaque paire d'amorces selon la formule : $E(\%) = 100 * (10^{-\frac{1}{pente}} - 1)$ à partir du coefficient directeur de la courbe standard (valeur Ct en fonction du log des quantités relatives d'ADNc des dilutions). Si l'efficacité est de 100% cela signifie que le nombre de copies de l'amplicon ciblé double à chaque cycle. Certaines amorces peuvent ne pas s'hybrider (E < 100%) ou au contraire il peut y avoir une co-amplification de produits non spécifiques (E > 100%). Dans notre cas, les critères de sélection ont été les suivants : 85% < E < 110%, courbe de dissociation présentant un pic unique, 0,9 < R² < 1, amplification non spécifique dans l'eau.

# 5 Phase 5 : Calcul et analyse de données

## 5.1 Traitement des données

### 5.1.1 Nombre de cellules au cours du temps : données de luminescence

Les résultats obtenus correspondent à une unité relative de lumière, proportionnelle au nombre de cellules. Un exemple est disponible en Annexe 6. Afin d'évaluer l'évolution au cours du temps des cellules en culture, nous avons normalisé les données par rapport au temps initial de mise en culture (T0), point connu à 100 000 cellules.

### 5.1.2 Expression relative des gènes : données de qPCR

Les résultats obtenus après les cycles d'amplification ont été analysés avec le logiciel QuantStudio™ 6. Le cycle seuil (Ct), correspond au nombre de cycles d'amplification nécessaires pour que la fluorescence atteigne une valeur seuil prédéfinie. L'expression de
chacun des gènes au sein des échantillons a été calculée par la méthode des $2^{-\Delta\Delta Ct}$. La moyenne des Ct de chaque échantillon a été calculée puis standardisée en fonction de la moyenne des Ct du gène de référence GAPDH de l'échantillon correspondant, c'est le ΔCt. Ensuite, la formule suivante $\Delta Ct$ échantillon - $\Delta Ct$ calibrateur a permis d'obtenir $\Delta\Delta Ct$ qui correspond à la normalisation par rapport à un échantillon choisi pour chaque gène. Dans notre cas, le calibrateur était l'échantillon T0 pour chaque isolat, permettant de comparer l'ensemble des échantillons pour un même isolat par rapport à ce dernier. C'est alors que nous avons été en mesure de déterminer l'expression relative par la formule $2^{-\Delta\Delta Ct}$, 2 correspond à l'efficacité théorique (doublement de la quantité d'ADNc à chaque cycle). Nous obtenons alors l'expression des gènes de chaque échantillon relativement au calibrateur T0 dont la valeur est fixée à 1.

## 5.2 Analyse des données avec le logiciel R

L'ensemble des analyses statistiques ont été réalisées à partir du logiciel R. Les données de luminescence et de RT-qPCR des protocoles 4 et 5 ont été analysées à l'aide de tests non paramétriques en raison de l'hétérogénéité des variances. L'effet du temps sur l'expression des gènes des protocoles 4 et 5 a été étudié à l'aide du test de Kruskal-Walis pour les échantillons non traités ainsi que les échantillons traités à la PHA (essai 4) ou au LPS (essai 5). Ensuite, les expressions relatives des échantillons traités ont été comparées aux échantillons non traités aux temps d'incubation 24, 48 et 72 heures (essai 4) et 2, 4 et 6 heures (essai 5) à l'aide du test Kruskal-Walis suivi d'un test de Wilcoxon pour comparer le traitement intra-temps. Pour les résultats de luminescence, l'effet du temps sur les échantillons non traités a été analysé par un test de Kruskal-Walis, de même que l'effet du temps sur les échantillons traités au LPS/PHA. Par la suite, l'effet du traitement sur le nombre de cellules a été étudié avec un test de Kruskal-Walis entre les échantillons traités ou non traités aux temps d'incubation 24, 48 et 72 heures (essai 4) et 2, 4 et 6 heures (essai 5), également suivi d'un test de Wilcoxon pour une analyse du traitement intra-temps. Nous avons également étudié les données portant sur le nombre de cellules obtenues selon l'âge des individus et la quantité de tissu prélevée. Ces dernières ont été analysées à l'aide d'un test paramétrique de Student, pour étudier si la variable âge des individus avait un impact sur le rendement d'isolement des cellules (nombre de cellules/poids tissu). Enfin nous avons étudié l'effet de l'âge sur l'expression des gènes des protocoles 4 et 5 pour les échantillons traités à la PHA (essai 4) ou au LPS (essai 5) à l'aide du test de Kruskal-Walis suivi d'un test de Wilcoxon pour comparer l'effet âge intra-temps.

Les différences étaient considérées significatives pour les p-valeurs < 0,05 tandis que les différences avec 0,05 < p-valeurs < 0,1 étaient considérées comme une tendance.
# PARTIE 3 : Résultats obtenus
# 1 Optimisation de la méthode d'isolement des cellules immunitaires de la lamina propria

Nous souhaitons, à travers le protocole 1, optimiser la solution de digestion enzymatique utilisée au cours de l'isolement des cellules (enzymes diluées dans du PBS contre IMDM). L'objectif était d'obtenir des cellules mononucléées de la *lamina propria* vivantes avant la mise en culture et viables ensuite en culture. Avant la mise en culture, nous avons obtenu 9 millions de cellules vivantes avec la digestion dans du PBS et 11,8 millions de cellules vivantes avec la digestion dans l'IMDM supplémenté. Les tests statistiques n'ont pas pu être effectués au vu du faible effectif (n = 1), mais il ne semble pas y avoir de différence forte entre les deux solutions de digestions sur le nombre de cellules obtenues.

De plus, les mesures de viabilité des cellules en culture, mesurées par la méthode de luminescence (4.1), indiquent une augmentation du nombre de cellules au cours du temps d'incubation (Figure 15, p-temps PBS < 0, 05 et p-temps IMDM < 0, 05). Cette augmentation au cours du temps indique qu'il y a prolifération dans ces deux solutions de digestion. La prolifération des cellules est un critère attendu, ce contrôle sera donc reproduit de façon systématique lors des prochaines expérimentations.

Cependant, la composition de la solution de digestion enzymatique n'a pas eu d'effet sur la viabilité au cours de la culture (Figure 15, p-milieu de digestion > 0, 1).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 15 : Effet de la composition de la solution de digestion enzymatique sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules par puits en fonction du temps, n = 1 lapereau, n = 4 puits/temps/modalités (réplicats techniques). Intra-temps, # : p < 0, 1.</figcaption></figure>

Nous ne pouvons donc pas conclure sur une efficacité supérieure d'un des milieux de digestion enzymatique. Ainsi, pour les prochaines expérimentations, le milieu de digestion enzymatique composé de PBS a été retenu.

# 2 Mise en place de la culture cellulaire

## 2.1 Choix du milieu de synthèse

Cette étape (protocole 2) visait à choisir le milieu le plus adéquat pour la culture des cellules immunitaires de la *lamina propria* du caecum du lapin. Ce milieu devant permettre aux cellules de se maintenir en culture pendant un temps suffisant pour la réalisation d'expérimentation. Les tests statistiques n'ont pas pu être effectués au vu du faible effectif
(n = 2) mais il ne semble pas y avoir de différence forte entre les deux milieux sur la viabilité en culture au cours du temps (Figure 16).

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Figure 16 : Effet du milieu de culture sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre moyen de cellules en fonction du temps (h) et du milieu de culture. Chaque courbe représente un lapin pour un milieu de culture, n = 2 lapereaux par milieu de culture et n = 3 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques).

Le reste des expérimentations s'est déroulé au sein du milieu IMDM supplémenté, ce dernier présentant des opportunités pour d'éventuelles expérimentations futures (2.1).

## 2.2 Supplémentation en 2-mercaptoéthanol

Dans la littérature, certains milieux de cultures primaires de cellules immunitaires sont supplémentés avec du 2-mercaptoéthanol pour ses propriétés stimulatrices des cultures primaires. Son impact a été testé dans le cadre du protocole 3. L'ajout de ce composé chimique au IMDM n'affecte pas la viabilité des cellules (Figure 17, p-Milieu > 0, 1). Nous constatons cependant une séparation entre les deux lapins utilisés (Individu 0.2 et individu 0.3).

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Figure 17 : Effet du 2-mercaptoéthanol sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont présentées en nombre de cellules, n = 2 lapereaux par milieu de culture et par temps, n = 2 puits/temps/modalités/lapereau 02 et n = 4 puits/temps/modalités/lapereau 03 (réplicats techniques). IMDM2me = milieu IMDM supplémenté avec 50 µM de 2-mercaptoéthanol.
Pour le lapin 02, la dilution 50 mM du 2-mercaptoéthanol utilisée avait été effectuée plusieurs semaines auparavant alors que pour le lapin 03 la dilution datait du jour même. Le 2-mercaptoéthanol était donc potentiellement dégradé pour le lapin 02. En ne prenant en compte que le lapin 03, le nombre de cellules augmente avec le temps pour les échantillons dans le milieu de culture sans 2-mercaptoéthanol (Figure 18, p-temps IMDM < 0, 05) et avec 2-mercaptoéthanol (Figure 18, p-temps IMDM2-me < 0, 05). De façon globale, le 2-mercaptoéthanol n'affecte pas la viabilité des cellules (Figure 18, p-milieu > 0,1). Cependant à 72h, le nombre de cellules tend à être plus élevé avec le 2-mercaptoéthanol que sans (p-value < 0, 1).

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 18 : Effet du 2-mercaptoéthanol sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont présentées en nombre de cellules, n = 1 lapereau par milieu de culture et par temps et n = 4 puits/temps/modalités (réplicats techniques). Intra-temps, # : p < 0, 1.</figcaption></figure>

Notre observation d'une légère augmentation du nombre de cellules avec la supplémentation en 2-mercaptoéthanol nous a entraîné à retenir cette condition pour la suite des protocoles.

# 3 La stimulation des cellules immunitaires : choix des stimulants et des marqueurs de réponse

## 3.1 Bilan des recherches bibliographiques : molécules, doses et durées de stimulation

Les articles sélectionnés nous ont permis de faire un état des lieux des molécules disponibles pour stimuler les cellules immunitaires en culture. Pour chacune nous avons déterminé les cellules envers lesquelles leur action était dirigée, la dose et la durée d'incubation nécessaires pour observer une réponse ainsi que le type de réponse auquel nous devions nous attendre.

Les recherches bibliographiques ont mis en avant deux méthodes principales de stimulation des cellules immunitaires : l'utilisation de mitogènes non spécifiques ou le recours à des anticorps pouvant se lier à des récepteurs spécifiques des cellules immunitaires (Lawlor et al. 2021). Ces derniers reposent sur un processus physiologique identique à celui utilisé par les cellules présentatrices d'antigènes. Néanmoins, ils sont spécifiques puisque dirigés vers des récepteurs propres à un type cellulaire. Or des travaux en cours au laboratoire nous permettent de dire que les cellules que nous isolons présentent une grande diversité, avec notamment des lymphocytes T et B, des macrophages, des cellules dendritiques et des mastocytes. Compte tenu de cette diversité cellulaire en présence, nous avons préféré
une approche plus globale dans un premier temps, les mitogènes nous ont donc semblé plus adaptés. Il s'agit de protéines pouvant se lier spécifiquement à un groupement glucidique présent au sein des récepteurs des cellules immunitaires. Ces mitogènes sont issus de plantes ou de bactéries comme l'indique le Tableau 5.

<table><caption>Tableau 5 : Origine des principaux mitogènes utilisés dans la stimulation des cellules immunitaires</caption><thead><tr><td>Mitogène</td><td>Origine</td><td>Principales cellules cibles</td></tr></thead><tbody><tr><td>Phytohemagglutinin (PHA)</td><td>Haricots rouges</td><td>Lymphocytes T</td></tr><tr><td>Wheat germ agglutinin</td><td>Germes de blé</td><td>Lymphocytes T</td></tr><tr><td>Concanavalin A (ConA)</td><td>Pois blanc</td><td>Lymphocytes T</td></tr><tr><td>Pokeweed mitogen (PWM)</td><td>Raisins d'Amérique</td><td>Lymphocytes T et B</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Bactéries Gram -</td><td>Lymphocytes B et cellules innées</td></tr></tbody></table>

Il convient toutefois de distinguer les lectines mitogènes des mitogènes inflammatoires dont le mode d'action diffère. Les lectines mitogènes se lient à des glucides qui sont sensiblement identiques entre les différents récepteurs des cellules immunitaires. Ces mitogènes sont alors appelés des activateurs polyclonaux, qui activent notamment les lymphocytes indépendamment de leur spécificité antigénique (Corsini, House 2018). Après liaison avec les récepteurs des cellules immunitaires, les lectines mitogènes vont enclencher une cascade de signaux visant à induire la mitose des cellules (Mak, Saunders 2006). Les mitogènes inflammatoires, auxquels le LPS appartient, n'induisent pas la mitose mais une inflammation après fixation sur les récepteurs PAMPs des cellules de l'immunité. Les articles de Molaae et al. (2017), Norian, Delirezh, Azadmehr (2015) ainsi que Ai et al. (2013) décrivent des expérimentations sur des cultures cellulaires du sang périphérique humains, bovins et de rats respectivement, utilisant différents stimulants à plusieurs doses et durées d'incubation (Tableau 6).

<table><caption>Tableau 6 : Conditions testées au sein des articles ayant recours à la stimulation par lectines mitogènes et mitogènes inflammatoires. PHA = phytohemagglutinin, ConA = concanavalin A, LPS = lipopolysaccharides, PWM = pokeweed mitogen</caption><thead><tr><th></th><th>Molaae et al., 2017</th><th>Norian, Delirezh, et Azadmehr, 2015</th><th>Ai et al., 2013</th></tr></thead><tbody><tr><th scope="row">Espèces</th><td>Humains</td><td>Bovins</td><td>Rats</td></tr><tr><th scope="row">Stimulants</th><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row">PHA</th><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><th scope="row">ConA</th><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><th scope="row">PWM</th><td></td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><th scope="row">LPS</th><td>X</td><td></td><td>X</td></tr><tr><th scope="row">PHA-ConA</th><td>X</td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row">PHA-LPS</th><td>X</td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row">ConA-LPS</th><td>X</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th colspan="4">Doses (µg/ml)</th></tr></thead><tbody><tr><td>0, 5</td><td></td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>1</td><td></td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>2, 5</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>5</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>10</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td></tr><tr><td>20</td><td>X</td><td></td><td></td></tr><tr><th colspan="4">Durée d'incubation (h)</th></tr><tr><td>2</td><td></td><td></td><td>X</td></tr><tr><td>4</td><td></td><td></td><td>X</td></tr><tr><td>6</td><td></td><td></td><td>X</td></tr><tr><td>8</td><td></td><td></td><td>X</td></tr><tr><td>10</td><td></td><td></td><td>X</td></tr><tr><td>24</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>48</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>72</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>96</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>120</td><td></td><td>X</td><td></td></tr></tbody></table>

Les résultats de l'étude de Molaae et al. (2017) indiquent une prolifération majeure des cellules pour une stimulation durant 72 heures avec 5µg/ml d'une combinaison des lectines mitogènes PHA-ConA. L'étude de Norian, Delirezh, Azadmehr (2015) indique, quant à elle, que la lymphoprolifération est maximale lors de 96 heures d'incubation avec 2,5 µg/ml avec la PHA contre 5 µg/ml de ConA. Enfin l'étude de Ai et al. (2013) démontre le rôle pro inflammatoire du LPS, dont l'action est efficace sur de courtes durées. Ces données nous ont permis de choisir le LPS et la PHA dont les conditions d'essais sont décrites dans la méthodologie des protocoles 4 et 5.

## 3.2 Bilan des recherches bibliographiques : choix des indicateurs de réponse à la stimulation

Dans leurs articles, Norian, Delirezh, Azadmehr (2015) ainsi que Ai et al. (2013) ont recours à l'étude de la production de cytokines pour évaluer la réponse à la stimulation. Pour rappel, les cytokines sont des molécules peptidiques produites par certains types de cellules immunitaires lors de leur activation. Les cinétiques d'induction sont variables selon les stimulants et les cytokines étudiées. Norian, Delirezh, Azadmehr (2015) indique que la PHA stimule les lymphocytes. C'est ce qui explique que dans les résultats de l'étude, PHA favorise la production d'IL2, IL4, IL5, IL6, IL10, IFNγ et IL17a, des cytokines produites majoritairement par les lymphocytes activés. L'étude de Ai et al. (2013) montre que le LPS induit principalement la production de TNFα à partir de 4 heures, IL10 à partir de 6 heures, IL4 à partir de 6 heures. Nous avons exploité ces résultats afin d'établir la liste des cytokines à étudier. Cette dernière a été complétée par des molécules pertinentes au regard des résultats attendus par la stimulation au PHA et LPS (3.3).
## 3.3 L'étude des marqueurs de réponse à la stimulation : évaluation des couples d'amorces de qPCR

Afin de détecter la présence de ces molécules sélectionnées, il nous est nécessaire de disposer d'outils moléculaires. A défaut de pouvoir étudier les protéines, techniques plus coûteuses, nous avons étudié l'expression des gènes codant pour nos molécules d'intérêt, par RT-qPCR. En amont, l'efficacité d'amorces préalablement utilisées au laboratoire pour 23 gènes dont 7 gènes de référence, a été évaluée. Plusieurs couples d'amorces pour 5 gènes ont été dessinés au cours du stage pour venir compléter le catalogue de gènes disponibles, leurs séquences sont disponibles en Annexe 5. Ainsi, au total 33 couples d'amorces ont été évalués dont 24 ont pu être validés (85% < E < 110% et 0,9 < R² < 1, amplification non spécifique de l'eau et un pic unique à l'analyse de la courbe de dissociation). Pour les gènes avec plusieurs couples d'amorces validés, le couple avec la meilleure efficacité a été retenu. Les amorces pour 21 gènes différents ont ainsi été retenues (Tableau 7).

<table><caption>Tableau 7 : Liste des gènes testés en amont de la qPCR. L'ensemble des amorces non valides ont été écartées de l'étude. Une partie des amorces valides ont été utilisées sur nos échantillons, les autres permettront la réalisation de manipulations ultérieures.</caption><thead><tr><td>Amorces</td><td>Gènes</td><td>Efficacité</td><td>R²</td><td>Analyse de la courbe de dissociation</td><td>Bilan</td></tr></thead><tbody><tr><td>GAPDH</td><td>GAPDH</td><td>90,09</td><td>0,98</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>HPRT</td><td>HPRT1</td><td>145,40</td><td>0,86</td><td>Épaulement</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>B2M</td><td>B2M</td><td>110,35</td><td>0,94</td><td>Pic unique</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>ATP5B</td><td>ATP5F1B</td><td>110,98</td><td>0,86</td><td>Pic unique</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>HMBS</td><td>HMBS</td><td>86,00</td><td>0,98</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>PGK1</td><td>PGK1</td><td>92,59</td><td>0,94</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>TOP1</td><td>TOP1</td><td>92,765</td><td>0,99</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>TNFα</td><td>TNF</td><td>99,78</td><td>0,97</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IL2</td><td>IL2</td><td>142,01</td><td>0,34</td><td>Épaulements, amplification tardive</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>IL1b</td><td>IL1b</td><td>87,96</td><td>0,99</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IL4</td><td>IL4</td><td>85,67</td><td>0,99</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IL6</td><td>IL6</td><td>89,969</td><td>0,98</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IL8</td><td>CXCL8</td><td>94,68</td><td>0,98</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IL10</td><td>IL10</td><td>104,46</td><td>0,92</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IL17</td><td>IL17A</td><td>91,92</td><td>0,99</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>IL22</td><td>IL22</td><td>79,82</td><td>0,89</td><td>Plusieurs pics</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>CCL2</td><td>CCL2</td><td>98,63</td><td>0,97</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>TGF-β</td><td>TGFB1</td><td>87,52</td><td>0,90</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>IFN-γ</td><td>IFNG</td><td>139,71</td><td>0,80</td><td>Plusieurs pics</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>CD11b V1</td><td>ITGAM</td><td>91,55</td><td>0,91</td><td>Épaulement</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>CD11b V2</td><td>ITGAM</td><td>96,27</td><td>0,95</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>CD11c V1</td><td>ITGAX</td><td>105,51</td><td>0,95</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>CD11c V2</td><td>ITGAX</td><td>74,94</td><td>0,99</td><td>Pic unique</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>CD11c V3</td><td>ITGAX</td><td>88,16</td><td>0,97</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>CD69 V1</td><td>CD69</td><td>90,76</td><td>0,97</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>CD69 V2</td><td>CD69</td><td>88,05</td><td>0,96</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>FOXP3 V1</td><td>FOXP3</td><td>82,64</td><td>0,98</td><td>Pic unique</td><td>Non valide</td></tr><tr><td>FOXP3 V2</td><td>FOXP3</td><td>87,18</td><td>0,94</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>JCHAIN V1</td><td>JCHAIN</td><td>90,35</td><td>0,98</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>JCHAIN V2</td><td>JCHAIN</td><td>93,39</td><td>0,93</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>TLR2</td><td>TLR2</td><td>97,92</td><td>0,95</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>TLR4</td><td>TLR4</td><td>97,80</td><td>0,97</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>TLR5</td><td>TLR5</td><td>88,72</td><td>0,93</td><td>Pic unique</td><td>Valide</td></tr><tr><td>CD14</td><td>CD14</td><td>76,68</td><td>0,87</td><td>Plusieurs pics</td><td>Non valide</td></tr></table>

### 3.4 Concentration en ARN au sein des prélèvements des cellules stimulées

Au total, l'ARN de 175 échantillons de culture cellulaire a été extrait. Leur concentration en ARN s'échelonnait de 1 ng/µl à 27 ng/µl (Annexe 7) or il est conseillé de disposer de 25 ng d'ARN par réaction qPCR (Plateforme génomique IRIC 2022). Ces faibles quantités ne nous ont permis d'étudier l'expression que d'une partie des gènes initialement retenus (3.3). Ainsi, pour étudier l'effet de la PHA, nous avons sélectionné 8 marqueurs d'intérêts, il s'agit d'IL1β, IL6, IL17a et TNFα, des cytokines pro-inflammatoire, TGFβ, une cytokine anti-inflammatoire ainsi que CD69, marqueur des lymphocytes T et JCHAIN, marqueur des lymphocytes B mais également une molécule intervenant dans la régulation de la réponse inflammatoire à savoir FOXP3, marqueur des lymphocytes T régulateurs. Pour LPS, nous avons étudiés 7 marqueurs d'intérêts, parmi lesquels des cytokines inflammatoires à savoir
IL1β, IL6, IL8 et TNFα. A ces dernières se sont ajoutées des molécules anti-inflammatoires, la cytokine IL10 qui inhibe l'activité de certains lymphocytes T ainsi que TGFβ qui régule le système immunitaire. Enfin nous avons étudié le récepteur TLR4, principalement présent à la surface des macrophages, qui reconnaît les PAMPs et induit la production de cytokines.

# 4 La réponse des cellules immunitaires de la lamina propria en culture à la stimulation à la PHA

## 4.1 Impact sur la viabilité et la prolifération cellulaire

Dans le groupe Control comme PHA, le nombre de cellules viables augmente au cours du temps d'incubation (Figure 19, p-temps PHA < 0, 05 et p-temps control < 0, 05). Le traitement à la PHA n'a pas eu d'effet global sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture (p-traitement > 0, 1), cependant après 48 heures de culture, le nombre de cellules tend à être plus élevé dans le lot PHA par rapport au lot Control (p < 0, 1).

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

Figure 19 : Effet du traitement à la PHA sur la viabilité et la prolifération des cellules immunitaires de la lamina propria en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules, n = 5 lapereaux par temps et par traitements (réplicats biologiques). Intra-temps # : p < 0, 1. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre diffèrent (p < 0, 05) avec les lettre grises associées au lot Control et les vertes au lot PHA.

## 4.2 Expression des gènes codant pour les cytokines en réponse à la stimulation

Une deuxième étape a consisté à déterminer l'effet de la PHA sur l'expression des gènes codant pour les cytokines à l'aide de la technique de RT-qPCR (Figure 20).

Dans le lot Control, le temps de culture a un effet sur l'expression des gènes IL17, IL1β et TNF. L'expression de TNF et d'IL1β diminue au cours du temps, tandis que l'expression d'IL17 ne diminue qu'entre 24 et 72 heures de culture (p < 0, 05).

Dans le lot PHA, le temps de culture impacte l'expression d'IL6, IL1β et TNF. Ces deux derniers diminuent au cours du temps tandis qu'IL6 semble augmenter pour se stabiliser à partir de T24 (p-value T24 vs T48 > 0, 1 ; p-value T24 vs T72 > 0, 1).

La stimulation au PHA impacte significativement l'expression de la cytokine pro-inflammatoire IL6 (p-Traitement < 0, 05) celle-ci étant supérieure dans le lot PHA par rapport au lot Control à 24, 48 et 72 heures de culture. En revanche, aucun effet de la stimulation n'a pu être identifié pour les quatre autres gènes à savoir IL-17, TGF-β, TNF et IL-1β (Figure 20).
<figure><img src="image_20.png" /></figure>

Figure 20 : Effet du traitement à la PHA sur l'expression relative des cytokines des cellules en culture au cours du temps. Intra-temps * : p < 0,05 entre les échantillons Control et PHA. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre différent (p-value < 0,05) avec les lettres grises associées au lot Control et les lettres vertes au lot PHA. n = 4 individus, n = 3 individus pour le gène IL17, n = 2 individus pour le gène TNF et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques)

## 4.3 Expression des gènes codant pour les marqueurs cellulaires de l'immunité en réponse à la stimulation

L'effet du stimulant PHA a également été étudié sur l'expression des gènes des marqueurs lymphocytaires CD69, FOXP3 et JCHAIN. Le temps de culture n'influence pas l'expression du gène FOXP3 tandis qu'il affecte l'expression des gènes JCHAIN et CD69 pour les lots PHA et Control (p-temps PHA et p-temps Control < 0,05). L'expression de CD69 diminue ainsi au cours du temps dans le lot Control.

De façon globale, l'expression de CD69 et FOXP3 est significativement plus importante lorsque les échantillons sont traités à la PHA (p-traitement < 0,05) par rapport au lot Control. En analyse par temps de mesure, après 72 heures de culture seule l'expression de CD69 tend à être plus élevée dans le lot PHA, (p-value < 0,1). A l'inverse le traitement n'a aucun effet sur l'expression du gène JCHAIN (Figure 21).
<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Figure 21 : Effet du traitement à la PHA sur l'expression relative des marqueurs cellulaires des cellules en culture au cours du temps. Intra-temps # : p < 0, 1 entre les échantillons Control et PHA. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre diffèrent (p < 0, 05) avec les lettres grises associées au lot Control et les vertes au lot PHA, n = 3 individus, n = 2 individus pour le gène FOXP3 et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques).

# 5 La réponse des cellules immunitaires de la lamina propria en culture à la stimulation au LPS

## 5.1 Impact sur la viabilité et la prolifération cellulaire

Pour le lot Control comme LPS, il n'y a pas de modification de la viabilité et de la prolifération des cellules au cours du temps (Figure 22, p-temps Control et p-temps LPS > 0, 1). Le traitement au LPS n'a pas non plus d'effet sur la viabilité et la prolifération des cellules (p-traitement > 0, 1).

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

Figure 22 : Effet du traitement au LPS sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture au cours du temps. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules, n = 4 individus par temps et par traitements (réplicats biologiques).
## 5.2 Expression des gènes codant pour les cytokines en réponse à la stimulation

Dans un second temps nous avons analysé l'effet d'un traitement au LPS et du temps sur l'expression des gènes codants pour les cytokines (Figure 23) à l'aide des mesures de RT-qPCR.

Le temps influence globalement l'expression du gène IL6 au sein des échantillons Control. De même, on observe une diminution significative de l'expression du gène IL1β entre la mesure T0 et T2 (p-value < 0,05).

L'expression d'IL6 est plus importante avec une stimulation des cellules au LPS (p-traitement < 0,05) et tend à l'être pour TNF (p-traitement < 0,1). Pour IL6, cette différence est significative pour tous les temps de mesure (p-value < 0,05). En revanche, les autres cytokines ne sont pas impactées par la stimulation au LPS.

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**Figure 23** : Effet du traitement au LPS sur l'expression relative des gènes codant pour les cytokines des cellules immunitaires de la lamina propria en culture au cours du temps. Intra-temps * : p-value < 0,05 entre les échantillons Control et LPS. Intra-lot, les temps n'ayant pas la même lettre différent (p < 0,05) avec les lettres grises associées au lot Control et les rouges au lot LPS. n = 4 individus, n = 3 individus pour IL6 et TGFβ et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques).
## 5.3 Expression du gène codant pour le récepteur membranaire TLR4 en réponse à la stimulation au LPS

L'expression du gène codant pour le récepteur membranaire TLR4, a également été étudiée. Ni le LPS ni le temps intra-lot n'ont d'effet sur l'expression de ce dernier (p-traitement, p-temps LPS et p-temps Control > 0, 1 ; Figure 24).

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Figure 24 : Effet du traitement au LPS sur l'expression relative du gène TLR4 des cellules immunitaires de la lamina propria en fonction du temps de culture, n = 3 individus et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques).

# 6 Effets de l'âge des individus prélevés sur les résultats d'expérimentations

## 6.1 Effet de l'âge des individus sur le nombre de cellules isolées

Le nombre de cellules varie grandement entre les 14 individus de l'étude. Contraints d'utiliser des individus plus âgés au cours des expérimentations menées, nous avons par la suite souhaité évaluer l'effet de l'âge sur le nombre de cellules obtenus après isolement (Annexe 8). Les lapins ont été séparés en deux groupes :

* Animaux non sevrés de 21 à 22 jours ;

* Animaux sevrés de 35 à 36 jours.

Le nombre moyen de cellules obtenues après l'isolement des lapins âgés de 21-22 jours s'élève à 4 027 250 cellules contre 9 930 000 cellules pour le groupe âgé de 35-36 jours. Aucune différence significative n'est observée entre les 2 groupes (p-Age > 0, 1) comme l'illustre la Figure 25 (A).

Pour compléter ces données, le rendement cellulaire qui correspond au nombre de cellules obtenues par poids de tissus prélevé, a été étudié (Annexe 2). Parmi les 14 individus utilisés, le poids de tissu prélevé connu n'a été renseigné que pour 11 individus. La moyenne est plus élevée pour les individus de 21-22 jours avec 2 479 828 cellules par g de tissu prélevé contre 1 612 398 cellules par g de tissu prélevé pour les individus de 35-36 jours. Cependant aucune influence significative de l'âge sur ce rendement cellulaire n'a pu être observée (Figure 25 (B)).
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Figure 25 : (A) Effet de l'âge sur le nombre de cellules obtenues à l'issu de l'isolement, n = 8 lapereaux lot 21-22 jours, n = 6 lapereaux lot 35-36 jours. Les valeurs sont représentées en nombre de cellules. (B) Effet de l'âge sur le rendement cellulaire (nombre de cellules/g de tissu prélevé) à l'issu de l'isolement, n = 6 lapereaux lot 21-22 jours, n = 5 lapereaux lot 35-36 jours, les valeurs sont représentées en nombre de cellules par g de tissu. Un point correspond à un individu, les boxplots représentent la variabilité entre individus d'un même lot.

## 6.2 Effet de l'âge des individus sur l'expression des gènes d'intérêt

Le système immunitaire connaissant d'importantes modifications lors des premiers jours de vie des lapereaux, il est possible qu'en fonction de l'âge des individus, les types cellulaires isolés à partir du tissu varient et aient des phénotypes différents. Afin d'étudier cette hypothèse, l'effet de l'âge des individus a été évalué sur l'expression de l'ensemble des gènes étudiés à l'exception de FOXP3, dont les réplicats biologiques sont trop faibles.

Dans le groupe traité à la PHA, les individus de 21-22 jours tendent à avoir une plus forte expression du gène TGFβ (p-Age < 0, 1 ; Figure 26 (A)). De même les individus de 21-22 jours expriment en quantité significativement plus importante le gène JCHAIN (p-Age < 0, 05 ; Figure 26 (B)).

Dans le groupe traité au LPS, chez les individus de 21-22 jours le gène IL8 tend à être plus exprimé (p-Age < 0, 05 ; Figure 27 (A)). A l'inverse la quantité d'ARN issue des gènes TGFβ et TNF est significativement supérieure chez les individus de 35-36 jours (p-Age < 0, 05 ; Figure 27 (A)). Ce phénomène est également observé pour le récepteur membranaire TLR4 (p-Age < 0, 05 ; Figure 27 (B)).
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Figure 26 : (A) Effet de l'âge sur l'expression relative des gènes des cytokines des cellules traitées à la PHA au cours du temps, n = 2 individus de 21-22 jours, n = 2 individus de 35-36 jours, n = 1 individu par âge pour le gène TNF, n = 2 individus de 21-22 jours et 1 individus de 35-36 jours pour IL17 et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). (B) Effet de l'âge sur l'expression relative des marqueurs cellulaires des cellules en culture traitées à la PHA au cours du temps. n = 1 individu de 21-22 jours, n = 2 individus de 35-36 jours et n = 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques).
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Figure 27 : (A) Effet de l'âge sur l'expression relative des cytokines des cellules en culture traitées au LPS au cours du temps. n = 2 individus de 21-22 jours, n = 2 individus de 35-36 jours, n = 1 individu de 35-36 jours pour les gènes IL6 et TGFβ et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques). (B) Effet de l'âge sur l'expression relative du récepteur membranaire TLR4 des cellules en culture traitées au LPS au cours du temps. n = 2 individus de 21-22 jours, n = 1 individu de 35-36 jours et n = 1 ou 2 puits/temps/modalités/lapereaux (réplicats techniques).
# PARTIE 4 : Discussion et propositions
L'objectif principal de ce travail était de mettre au point une méthode de culture de cellules immunitaires de la *lamina propria* du caecum des lapereaux. L'enjeu étant par la suite d'avoir un modèle *in vitro* adapté à l'étude des interactions entre ces cellules immunitaires et des composés nutritionnels ou microbiens. Pour ce faire, l'étude s'est déroulée autour de deux objectifs :

1. La mise en place de la méthode de culture cellulaires pour obtenir :

* Des cellules viables ;

* Des cellules fonctionnelles pendant un temps suffisant pour les étudier ;

* A partir d'un protocole simple et rapide à mettre en place.

2. Le choix des stimulations immunitaires : Lorsque les cellules immunitaires ne sont pas stimulées, comme c'est le cas lorsqu'elles sont en culture, elles ne produisent qu'une faible quantité de cytokines. Pour évaluer une modulation de la capacité de réponse immunitaire de ces cellules il est nécessaire d'activer leur mécanisme immunitaire par une stimulation appropriée. Il conviendra ainsi de définir la nature du stimulant permettant l'activation spécifique du type de réponse immunitaire visé, la concentration et le temps d'exposition. In fine, au laboratoire il s'agira d'évaluer les effets des oligosaccharides du lait maternel sur la réponse immunitaire de la *lamina propria* caecale du nouveau-né.

# 1 Optimisation de la méthode d'isolement des cellules

## 1.1 Choix méthodologique

L'objectif de cette phase était d'optimiser le protocole d'isolement des cellules immunitaires de la *lamina propria* du caecum des lapereaux, plus spécifiquement la phase de digestion enzymatique de la *lamina propria*, afin de maximiser le nombre de cellules vivantes isolées ainsi que leur viabilité en culture. Lors de la phase de digestion, l'action des enzymes peut altérer la viabilité cellulaire. Ainsi, diluer ces dernières dans un milieu de culture riche, composé de nutriments indispensables aux cellules, peut avoir un effet protecteur et améliorer la viabilité cellulaire comme appliqué dans de nombreuses études (Lee et al. 2009; Webster et al. 2020; Junker et al. 2009).

Bien que le nombre de cellules obtenues ait été légèrement supérieur numériquement à l'issu de la digestion au sein du milieu de culture IMDM (solution riche) comparativement à la digestion dans le PBS (solution pauvre), nos résultats n'ont pas mis en évidence d'effet de la composition de la solution de digestion sur la viabilité des cellules une fois mises en culture.

Il n'existe à notre connaissance aucune étude comparant, tel que nous l'avons fait, deux solutions de digestion enzymatique pour l'isolement de cellules de la lamina propria. Cependant, Lefrançois, Lycke (2001) suggèrent pour l'isolement de cellules de la *lamina propria* de l'intestin grêle de la souris que, plus l'incubation enzymatique est longue, plus une incubation dans un milieu de culture (RPMI-1640) plutôt qu'un tampon salin (HBSS et HEPES ici) est préférable. Cependant, dans cette étude, l'incubation enzymatique était de 2 x 1 heure, ce qui est bien supérieur à l'incubation de 2 x 20 minutes à laquelle nous avons procédé.

L'ampleur de l'amélioration étant faible compte tenu du coût ajouté induit par l'utilisation d'un milieu de culture commercial supplémenté en SVF, nous avons fait le choix de maintenir la digestion enzymatique dans le PBS pour les protocoles ultérieurs.
## 1.2 Limites du protocole appliqué et perspectives d'optimisations ultérieures

A notre connaissance ce protocole est le premier mis au point pour l'isolement des cellules immunitaires de la LP dans l'espèce cunicole (Annexe 9). Celui-ci est fonctionnel mais reste perfectible. Comme expliqué précédemment, les enzymes utilisées dans la solution de digestion, dispase II, DNAse I et collagénase D, peuvent affecter la viabilité et la fonctionnalité des cellules. Schreurs et al. (2017) ont montré que la libérase TL, mélange de Collagénase I et Collagénase II, utilisée comme substitut de la collagénase D, réduisait significativement l'expression du marqueur de surface CD4+ comparativement à la collagénase D lors de l'isolement de LPMC humain. A l'inverse l'étude de Bargalló et al. (2014), présentée comme une optimisation du protocole sur lequel repose nos expérimentations (Weigmann et al. 2007), indique un rendement cellulaire et une viabilité supérieurs avec une digestion avec la libérase suivie d'une digestion mécanique comparativement à une digestion avec la collagénase D. Toutefois, plusieurs étapes du protocole ont été modifiées dans cette étude, qui ont également pu jouer sur les résultats observés. McManus et al. (2019) ont quant à eux eu recours à la collagénase E, qui permettrait d'isoler les cellules sans avoir recours à la DNAse. Leur étude compare le nombre de lymphocytes viables obtenus à l'issu de l'isolement des cellules mononuclées du colon de souris par digestion enzymatique avec la collagénase E ou la collagénase D, accompagnée ou non d'un traitement à la DNAse. La méthode d'isolement à la collagénase E sans DNAse est celle qui présente le nombre de lymphocytes viables le plus élevé. Enfin, l'utilisation du Percoll, réactif qui peut s'avérer agressif envers les cellules, est également remise en question, Goodyear et al. (2014) considérant par exemple qu'il serait préférable d'éliminer cette étape en raison de ses conséquences délétères sur le nombre de cellules viables obtenues. Néanmoins cette étape du gradient de densité présente un intérêt particulier pour la culture cellulaire puisqu'il permet d'éliminer les débris et déchets (Lecuyer 2022).

Au fil des manipulations, nous avons également connu une diminution du nombre de cellules obtenues après isolement, comme précisé en Annexe 8. En particulier, lors de trois expérimentations nous avons été contraints de pooler les cellules isolées de deux individus afin d'en avoir une quantité suffisante pour la stimulation. Plusieurs hypothèses ont émergé quant à la cause de ce phénomène :

Le nombre de cellules obtenues après isolement varie fortement d'un individu à un autre chez la souris (Lecuyer 2022). Nous pouvons donc émettre l'hypothèse que ce phénomène de variabilité inter-individu s'applique également au lapin. L'âge des animaux peut également impacter le taux de récupération cellulaire, bien que dans notre cas nous n'ayons pas observé d'effets significatifs (6.1).

Au cours des différentes manipulations, nous avons utilisé divers lots d'enzymes. Or l'activité enzymatique varie entre lots. Les quantités de chacune ont donc été ajustées sur la base de leur activité enzymatique afin de maintenir des niveaux identiques d'activité entre les manipulations. Cependant pour la collagénase D les niveaux de contaminations, dont les détails sont connus à la réception des produits, varient également entre les lots. Ainsi, l'activité enzymatique de la collagénase reste identique puisque nous ajustons les quantités, mais l'activité des contaminants, qui agissent également, varie. La collagénase étant extraite à partir de la bactérie *Clostridium histolyticum*, des contaminations par la clostripaine, la trypsine ainsi que des protéases soit des enzymes catalysant la lyse des protéines sont présentes (Roche 2021). Hermanowicz et al. (1985) ont voulu déterminer si ces substances, présentes au cours de l'utilisation de la collagénase, pouvaient avoir un effet immunomodulateur. Pour cela, ils ont incubé des cellules mononuclées du sang périphérique humain soit en présence de collagénase soit dans un milieu de culture. Ils ont observé une diminution de l'activité cytotoxique des cellules incubées dans la collagénase, associée à une réduction du nombre de cellules obtenues ainsi que de la viabilité à hauteur
de 11 %, cette viabilité étant probablement affectée par l'activité des protéases contenues dans la collagénase. Trapecar et al. (2017) ont quant à eux comparé l'effet de quatre types de collagénase dont la collagénase CLSPA, hautement purifiée, sur les lymphocytes issus d'amygdales humains. Cette dernière est celle qui a le moins d'impact sur l'expression des 38 marqueurs de surface des lymphocytes T CD4+ testés lors de l'étude. Cette même expérimentation réalisée sur la partie terminale du côlon humain a également montré une meilleure préservation de certains marqueurs de surface avec l'enzyme CLSPA. De fait, l'adaptation des quantités de collagénase à chaque changement de lot ne permet pas de lutter contre d'éventuels effets négatifs de ces contaminants, seule l'utilisation de collagénase purifiée permet ceci.

Après l'étape de digestion, les filtres 40 µm avaient tendance à se colmater. Ceci pourrait être un indicateur d'une mauvaise digestion (résidus présents) ou d'une mort cellulaire plus importante. De même, lors de la dégradation des tissus, de l'ADN cellulaire est libéré. Ce dernier peut colmater et Trapecar et al. (2017) ont montré que l'augmentation de la quantité de DNAse pouvait réduire cette viscosité. Cette variabilité d'efficacité est un frein, qui pourrait expliquer les différences importantes quant au nombre de cellules obtenues à l'issue des isolements. De nouveau, il est nécessaire d'adapter le protocole à chaque réception d'un nouveau lot d'enzyme. Pour ce faire, nous connaissons la quantité d'enzyme nécessaire à la solution de digestion ainsi que l'activité enzymatique du réactif, nous adaptons donc les quantités. Particulièrement lorsqu'il s'agit de la collagénase, en raison des dommages qu'elle pourrait causer lorsqu'introduite en quantités excessives.

Une troisième hypothèse porte sur le gradient de Percoll. De même que pour les enzymes du milieu de digestion, ses propriétés (densité, viscosité, osmolarité, conductivité et pH) varient entre les lots. Les volumes ont été ajustés pour maintenir des niveaux de densité identiques entre les manipulations, mais les autres paramètres sont susceptibles de varier, ces variations étant tout de même assez faibles, ce qui ne devrait donc pas avoir un effet trop important. Après l'étape de centrifugation dans le gradient de Percoll, les différentes phases composées de types cellulaires distincts sont clairement distinguables. Lors des dernières manipulations, qui se sont caractérisées par un faible rendement cellulaire, nous pouvions observer une quantité plus importante de cellules dans la phase supérieure du gradient de Percoll. Nous soupçonnons donc la présence de certaines cellules immunitaires dans cette phase. Ces dernières seraient ainsi mélangées avec les débris et les cellules épithéliales et ne seraient donc pas récoltées au cours de l'étape suivante. Ce phénomène pourrait être dû aux propriétés du gradient mais également aux variabilités entre les lots d'enzymes de l'étape de digestion, qui pourraient entrainer le blocage des cellules immunitaires dans une matrice extracellulaire.

> Les diverses adaptations ont permis d'aboutir à un protocole d'isolement des cellules immunitaires de la *lamina propria* intestinale du lapin fonctionnel (Annexe 9). La variabilité est inhérente à ce type d'expérimentations, mais certains paramètres peuvent amplifier cette dernière : la collagénase est contaminée par d'autres protéases qui peuvent dégrader les cellules immunitaires, afin de réduire cet aspect il semblerait judicieux d'essayer le protocole avec une collagénase purifiée ; le Percoll est également variable d'un lot à l'autre mais il n'existe pas de substituts possibles, cependant il semblerait qu'une augmentation de DNAse puisse permettre d'adapter cette étape.

## 2 Mise en place de la culture cellulaire : influence du milieu de culture

### 2.1 Le choix du milieu de synthèse

Les LPMC ainsi isolées sont constituées d'une grande variété de types cellulaires. Environ 15 % de ces cellules sont immunitaires, avec, par ordre d'abondance des macrophages, cellules dendritiques, monocytes et lymphocytes B (Knudsen et al. 2022). La mise en
culture réalisée est donc complexe dans la mesure où il s'agit d'une culture primaire de types cellulaires variés auxquels nous devons fournir un environnement de culture adéquate.

Nous avons comparé deux milieux de culture commerciaux tous deux adaptés aux cellules hématopoïétiques à savoir le milieu RPMI-1640 supplémenté (Roswell Park Memorial Institute – 1640), classiquement utilisé pour la culture de lymphocytes (Marafini et al. 2015) et le milieu IMDM supplémenté (Iscove Modified Dulbecco Media), plus favorable aux macrophages (Schreurs et al. 2021). Leur comparaison ne nous a pas permis de mettre en évidence de différences de viabilité et de prolifération des cellules en culture. Notre choix s'est donc porté sur le milieu présentant le plus d'opportunités pour de futures manipulations. En effet le milieu IMDM est celui utilisé dans l'étude de Schreurs et al. (2021) permettant la coculture avec des organoïdes intestinaux, culture cellulaire en trois dimensions. L'équipe NED mettant en œuvre la culture d'organoïdes, la coculture pourrait être une perspective de travail pertinente. De plus, la concentration en calcium (Ca2+) du milieu IMDM s'élève à 1,49 mM contre 0,42 mM dans le milieu RPMI. Cette différence favoriserait l'expression des cytokines, marqueurs essentiels pour la suite des expérimentations, après stimulation (PMA/ionomycin) des lymphocytes de la *lamina propria* du colon de souris en culture (Zimmermann, Radbruch, Chang 2015). De plus, il semblerait que les lymphocytes issus des ganglions mésentériques de lapin prolifèrent 3 à 10 fois plus dans le milieu IMDM supplémenté (3,2 mg/ml albumine, 32 µg/ml transferrine, 10%g/ml insuline, 0,0012 µg/ml zinc chloride, 5.10⁻⁵ mM 2-mercaptoéthanol et 0.1 % de SVF) que le milieu RPMI (Stiekema, Kapsenberg 1987).

## 2.2 Supplémentation en 2-mercaptoéthanol

La supplémentation en 2-mercaptoéthanol reste une technique controversée, son utilisation est recommandée par certains mais proscrite par d'autres pour la prolifération des cellules en cultures primaires. Quelques imprécisions demeurent quant à son mode d'action, mais il est acquis qu'il permet de lutter contre la toxicité des radicaux libres (Thermofisher 2022a). Ces molécules produites par l'organisme et des facteurs externes peuvent léser les cellules lorsque produite en quantité excessive. Lors du protocole 3, nous avons comparé l'ajout ou non du 2-mercaptoéthanol au sein du milieu de culture choisi, l'IMDM.

Un premier constat a émergé face à l'observation de nos résultats avec une diminution majeure du taux de survie des cellules lorsque la dilution du 2-mercaptoéthanol préalable à la supplémentation n'était pas extemporanée, ceci s'explique par la faible stabilité du 2-mercaptoéthanol (Thermofisher 2022a). Liu et al. (1996) ont étudié l'effet de l'ajout du 2-mercaptoéthanol (50 mM) aux milieux de culture. L'étude portait sur plusieurs espèces, l'humain, le lapin, le rat et la souris. Les résultats sont variables, cependant chez le lapin la prolifération cellulaire était supérieure lorsque le milieu de culture contenait du 2-mercaptoéthanol. Malgré une absence d'effet significatif global du 2-mercaptoéthanol sur la viabilité cellulaire dans notre étude, le nombre de cellules est numériquement plus élevé avec ce réactif chimique après 72 heures de culture (dernier point de mesure). Ces résultats concordent donc avec ceux de (Liu et al. 1996). De fait, nous avons choisi, à partir du protocole 3, de réaliser l'ensemble des expérimentations avec des milieux de culture IMDM supplémentés en 2-mercaptoéthanol en veillant à réaliser la dilution du produit au moment des manipulations.

## 2.3 Des limites à l'optimisation de la culture cellulaire

De même que pour l'isolement cellulaire, à notre connaissance ce protocole est le premier mis au point pour la culture des cellules immunitaires de la LP dans l'espèce cunicole. Celui-ci est fonctionnel mais reste perfectible et présente certaines limites. Premièrement, bien que le milieu de culture auquel nous avons recours soit un milieu de synthèse, certains facteurs ne sont pas maitrisables. En effet, nous supplémentons ce milieu en sérum de
veau fœtal (SVF) qui permet de stimuler la prolifération tout en étant source de minéraux, lipides et hormones (Cesari 2021). Il s'agit d'un fluide biologique d'origine animale dont, au même titre que les milieux de culture d'origine naturelle, la composition exacte est inconnue et différente entre chaque lot, pouvant ainsi induire de la variabilité entre les expérimentations. Les enjeux de bien-être animal et de réduction du recours à l'expérimentation animale mis en avant par la communauté scientifique et civile amènent également à remettre en question l'utilisation de produits d'origine animale, comme le SVF, dans les expérimentations *in vitro*. Certains auteurs proposent ainsi de remplacer le SVF par d'autres composants tels que l'albumine, la transferrine, l'insuline et le zinc (Stiekema, Kapsenberg 1987).

Le support de culture peut également s'avérer décisif dans la réussite de la culture cellulaire. On distingue notamment les plaques de culture à fond rond des plaques de culture à fond plat, ces dernières étant celles que nous avons utilisées au cours de l'étude. Celles-ci peuvent cependant entrainer un effet « de bord ». Les cellules s'agglutinent ainsi dans les bords des puits, réduisant l'accès aux molécules du milieu de culture. Les plaques à fond rond permettent un meilleur accès aux substances introduites dans le milieu de culture. Cet aspect n'est pas négligeable pour l'obtention d'une réponse homogène aux stimulants dans la culture cellulaire, mais aussi aux composés alimentaires et microbiens qui seront testés par la suite. L'étude de Herva (1977) propose une comparaison des plaques à fond rond et plat à partir d'une culture mixte de lymphocytes humains. Pour ce faire, ils ont mesuré la prolifération des cellules en culture ainsi que leur réponse à la stimulation. Ils ont montré que l'utilisation de plaque de culture à fond plat requiert un grand nombre de cellules ou d'augmenter la dose de stimulant. A l'inverse les plaques de culture à fond rond permettent aux cellules d'entrer en contact, ce qui favorise leur prolifération et diminue le nombre de cellules nécessaires. De plus Sloane et al. (1978) ont comparé la culture de lymphocytes du sang périphérique bovins stimulés dans les deux types de plaque de culture. Leur résultat démontre que lors d'une stimulation à la tuberculine, extrait de bacilles tuberculeux, les plaques à fond rond augmentent significativement la réponse des lymphocytes. Dans le cadre d'une stimulation par substances mitogènes (PHA, ConA et PWM), la réponse est légèrement plus élevée dans les plaques à fond rond mais la différence n'est pas significative.

> Nous avons donc opté pour le milieu de culture IMDM, en partie sur la base bibliographique, puisque la variabilité inter-expérimentation était importante. Après le choix de ce milieu, nous avons décidé de supplémenter ce dernier avec du 2-mercaptoéthanol, puisque le nombre de cellules après 72h de culture était plus élevé avec ce dernier. Toutefois, de nombreux autres paramètres peuvent influencer les conditions de culture, parmi ces derniers les plaques de culture à fond rond devraient être prochainement testées au laboratoire NED.

# 3 La stimulation des cellules immunitaires

## 3.1 Exploration bibliographique : choix des stimulants et marqueurs de réponse

La phase de recherche bibliographique a permis d'obtenir une base de données fournie quant aux différentes techniques de stimulation envisageables. Notre choix a dans un premier temps été orienté par nos contraintes techniques. Certains outils étaient ainsi difficilement applicables à (i) l'espèce cunicole et (ii) aux études de types cellulaires variés. C'est le cas de la méthode de stimulation aux anticorps qui sont spécifiques de certaines cellules immunitaires. De plus, il s'avère particulièrement complexe de trouver des anticorps spécifiques pour l'espèce cunicole. Cette méthode a donc été écartée.

D'autre part, la faible quantité de cellules à notre disposition a limité le nombre de stimulations testées. Notre choix s'est donc porté sur deux types de stimulants induisant chacun une réponse différente : une lectine mitogène qui induit une mitose et un stimulant
inflammatoire, le LPS, à l'origine d'une réponse inflammatoire. Parmi l'ensemble des mitogènes, la PHA fait partie des plus utilisés et la dose nécessaire à l'induction d'une réponse est souvent parmi les plus faibles.

## 3.2 Les effets de la stimulation à la PHA

Les études antérieures s'accordent à dire que la PHA permet la prolifération cellulaire après 72 heures de culture, principalement des lymphocytes T (Molaae et al. 2017; Verhoeckx et al. 2015). Cependant, nous n'avons pas observé d'effet de la PHA sur la prolifération des cellules. Ce phénomène pourrait s'expliquer par l'hétérogénéité de notre population cellulaire. Le mitogène PHA cible principalement les lymphocytes. Or récemment une analyse single cell a eu lieu au laboratoire NED qui montre que les populations cellulaires majoritairement isolées de la *lamina propria* du caecum sont des macrophages et cellules dendritiques (Knudsen et al. 2022). Nous pouvons donc nous demander ce qu'il en est de l'effet de la PHA sur ces types cellulaires.

Cependant, nos observations, au microscope, des cultures cellulaires stimulées au PHA ont montré des agrégats de cellules, témoignant de la prolifération des lymphocytes. Il se pourrait que ces cellules agrégées soient plus difficiles à lyser par le kit d'extraction d'ARN et engendre donc un biais de la mesure.

Parmi l'ensemble des cytokines étudiées, à savoir IL1β, IL6, IL17a, TGFβ et TNF, la PHA n'a eu un effet significatif que sur la production d'IL6, en augmentant significativement l'expression de cette cytokine et ce dès 24 heures de culture. Cette cytokine peut être produite par différents types cellulaires, parmi lesquels les lymphocytes, macrophages et cellules dendritiques. Nos résultats s'accordent donc avec ceux de Ai et al. (2013) qui montrent une production importante d'IL6 après 8 heures de stimulation à la PHA. Toutefois, l'absence d'effets sur l'expression des autres gènes est surprenante. En effet, au sein de l'organisme, TGFβ est notamment sécrétée par les lymphocytes T, nous aurions donc pu nous attendre à une surexpression de ce gène comme observé par Ai et al. (2013) qui ont constaté une augmentation de la production de TGFβ, à partir de 6 heures de stimulation des cellules immunitaires du sang périphérique du rat. De même Molaae et al. (2017), ont observé que parmi la PHA, ConA, LPS, PHA-ConA, PHA-LPS et LPS-ConA, la PHA est le mitogène induisant la production la plus importante de TNF, principalement sécrété par les lymphocytes T et macrophages, après 72 heures de culture. Ces résultats sont en accord avec nos observations précédentes, les lymphocytes semblent se trouver en minorité dans nos cultures cellulaires, ce qui a été montré par Knudsen et al. (2022) et qui expliquerait l'absence d'expression de ces gènes. Pour remédier à cela il pourrait être cohérent d'utiliser des stimulants ciblant prioritairement les macrophages.

Nous avons également mesuré l'expression de marqueurs cellulaires des lymphocytes B (JCHAIN), des lymphocytes T (CD69), des lymphocytes T régulateurs (FOXP3). L'expression de JCHAIN n'est pas modulée par la stimulation à la PHA. Ceci est en accord avec la bibliographie, PHA stimulant faiblement les lymphocytes B (Norian, Delirezh, Azadmehr 2015). La quantité plus grande au sein des lots PHA de CD69, marqueur précoce d'activation des lymphocytes T, et de FOXP3 semble confirmer l'action de la PHA sur les lymphocytes T malgré l'absence d'effet sur TGFβ et IL17 que nous observons. Ainsi, nous pouvons supposer que les mesures à 72 heures sont prématurées. Norian, Delirezh, Azadmehr (2015) mesurent la production de cytokines des cellules immunitaires du sang périphérique bovin après 4 jours de stimulation avec 2,5 µg/ml de PHA. Leurs résultats, montrent bien la présence importante d'IL17 et IL6.

Enfin, malgré l'absence d'effet global de la PHA la mesure de l'expression relative, qui permet de comparer la quantité d'ARN des gènes cibles entre les lots, présente une forte variabilité entre les lots traité et control. Cet aspect semble indiquer que la PHA exerce bien
une action sur les cellules qui, d'après nos hypothèses, reste faible en raison du nombre limité des cellules présentes, de la durée d'incubation ou des difficultés d'extraction d'ARN.

Nous avons donc mis au point un protocole de stimulation des cellules mononuclées de la *lamina propria* du caecum de lapereaux avec la PHA (Annexe 10). Cette stimulation à la PHA a un effet sur l'expression de IL6, CD69 et FOXP3. Ces cytokines sont donc des bons marqueurs de réponse, que nous pourrons utiliser par la suite pour évaluer l'impact de composés nutritionnels ou microbiens sur leur expression.

L'utilisation d'un stimulant plus spécifique aux macrophages et cellules dendritiques ou l'augmentation du temps d'incubation avec la PHA pourraient augmenter l'expression relative des gènes d'intérêt transcrit.

## 3.3 Les effets de la stimulation au LPS

Le LPS est connu pour activer une grande variété de types cellulaires et déclencher une réponse inflammatoire importante même à faible dose (Thermofisher 2022b; Mamat et al. 1999). Cependant ce dernier n'a pas eu d'effet significatif sur la viabilité et la prolifération des cellules en culture. Ces résultats pourraient s'expliquer par la courte durée de stimulation, laissant peu de temps aux cellules pour proliférer. Toutefois, même après 96 heures de culture, l'effet du LPS sur la lymphoprolifération n'est pas significatif (Molaae et al. 2017).

Dans nos essais, le LPS augmente significativement l'expression d'IL6 et dans une moindre mesure de TNF, mais n'a aucun effet sur les autres cytokines mesurées (IL1β, IL8, IL10, TGFβ). Ai et al. (2013) ont montré que le LPS augmente significativement la sécrétion de TNF et IL10 en 2-6 heures, mais n'a pas d'effet sur IL6, ce qui n'est pas notre cas. Cependant, cette étude a également montré que le LPS n'a aucun effet sur TGFβ, confirmant nos résultats.

La stimulation au LPS a donc induit une réponse inflammatoire de faible ampleur dans notre expérience. Plusieurs paramètres pourraient expliquer ce phénomène. Tout d'abord il existe une variabilité forte de réponse selon la souche bactérienne d'où provient le lipopolysaccharide. La distinction entre ces souches repose sur la variabilité dans la structure moléculaire du LPS, situé sur la membrane des bactéries, qui entraine une différence dans leur mode d'action (Farhana, Khan 2022). En effet la structure du motif microbien joue un rôle central dans sa détection par les cellules immunitaires et toute modification va changer la réponse induite. Dans notre cas il s'agit de la souche E.Coli O111:B4, qui induit une réponse inflammatoire modérée, ce qui pourrait expliquer nos résultats (Hwang, Kruzel, Actor 2016; Calatayud et al. 2019). Un changement vers une souche plus virulente pourrait donc être envisagé ou nous pourrions également augmenter la dose de LPS. Le recours à ces deux options nécessite toutefois de veiller à ne pas induire d'emballement de la réponse. En effet, un tel emballement pourrait masquer les effets éventuels de composés nutritionnels ou microbiens testés par la suite.

Nous avons donc mis au point un protocole de stimulation des cellules mononuclées de la *lamina propria* du caecum de lapereaux avec le LPS (Annexe 11). Cette stimulation au LPS a un effet sur l'expression de IL6 et TNF. Ces cytokines sont donc des bons marqueurs de réponse, que nous pourrons utiliser par la suite pour évaluer l'impact de composés nutritionnels ou microbiens sur leur expression.

L'utilisation d'une autre souche de LPS plus virulente ou l'augmentation de la dose utilisée pourraient augmenter l'expression relative des gènes d'intérêt.
## 3.4 Effets de l'âge des individus sur la réponse aux stimulations

Compte tenu de la disparité de l'âge des animaux prélevés, nous voulions également déterminer si cela impactait la réponse des cellules aux différents stimulants. Aucun effet de l'âge n'a été observé sur la viabilité des cellules isolées, malgré un niveau numérique plus élevé à 35-36 jours en lien avec un poids de tissu prélevé plus important.

Nous avons également analysé l'effet de l'âge sur l'expression des gènes. Les niveaux d'expression étant normalisés par lapin respectivement au lot control à T0 nous n'avons pas pu déterminer l'effet de l'âge sur l'expression des gènes après isolement des cellules et avant stimulation.

Dans le lot traité au LPS, la surexpression d'IL8 comparativement au niveau basal T0 tend à être plus importante chez les individus de 21-22 jours comparativement aux individus de 35-36 jours et inversement, elle est significativement plus importante chez les individus de 35-36 jours pour TLR4, TNF et TGFβ. Cette surexpression de TLR4 en réponse à la stimulation chez les individus de 35-36 jours pourrait indiquer que ces derniers ont un système immunitaire plus mature. En effet, Pan et al. (2011) ont montré que la quantité de TLR4 chez les porcelets de 8 jours est assez élevée dans l'ensemble des organes, puis elle diminue à 18 jours avant d'augmenter de nouveau autour de 30-35 jours. Ils en ont conclu que durant les premiers jours de vie, le colostrum fournit des anticorps maternels, expliquant le niveau élevé, puis les porcelets commencent à constituer leur propre système immunitaire, particulièrement au moment du sevrage soit autour de 30 jours d'âge chez les porcelets.

Nous savons également que la quantité de lymphocytes T CD4+ augmente dans la lamina propria de 11 à 28 jours chez la souris. Ils sont principalement naïfs au plus jeune âge puis deviennent des lymphocytes T mémoire (Torow et al. 2015). Ces lymphocytes T helper (CD4+) produisent notamment d'importantes quantités d'IL10 et TNF, bien qu'exprimés par une grande variété de types cellulaires, pouvant expliquer la surexpression de ce dernier chez les individus de 35-36 jours. En outre, l'évolution des proportions des différents types cellulaires avec l'âge, bien que documenté chez la souris, reste à définir chez le lapin.

> Puisque nos résultats indiquent que l'âge n'a pas d'effet sur le nombre de cellules isolées, ce paramètre n'est pas un critère limitant pour l'optimisation du protocole. Cependant, il y a bien un effet de l'âge, parfois marqué, sur les expressions de gènes lors de la mise en culture. C'est un paramètre à prendre en compte dans les études ultérieures, ainsi qu'une évaluation de l'effet de l'âge à T0 pour déterminer cet effet in vivo.

## 3.5 Limites de la fiabilité des résultats obtenus par qPCR

La quantité d'ARN obtenue après extraction est faible allant de 1 ng/µl à 27 ng/µl. Or il est conseillé de disposer d'environ 25 ng/µl d'ADNc par réaction qPCR, soit 25 ng d'ARN en supposant que la rétrotranscription soit efficace à 100% (Plateforme génomique IRIC 2022).

Cette faible quantité d'ARN extrait n'a pas permis de normaliser, par la dilution, les quantités d'ARN entre échantillons. La normalisation consiste à exprimer les gènes d'intérêt en fonction d'un gène de référence, choisi pour son caractère indispensable à la viabilité de la cellule et donc exprimé en quantité stable indépendamment du tissu, de l'individu et de l'expérimentation. Cette absence de dilution est pénalisante pour le choix du/des gènes de référence. En effet, ces gènes de référence doivent avoir une expression stable entre tous les individus et toutes les conditions expérimentales. Or l'absence de normalisation des quantités d'ARN empêche de vérifier si les variations sur l'expression des gènes de références sont dues à des différences de quantités initiales d'ARN ou de différences d'expressions vraies. Nous avons donc émis l'hypothèse, sur la base de la bibliographie, que GAPDH était un gène de référence fiable, sans pour autant avoir pu s'en assurer pour nos échantillons (He et al. 2022; Zhou et al. 2018; Leonardi et al. 2015). Malgré la puissance de cette hypothèse, notamment basée sur l'étude de He et al. (2022) qui montre la stabilité
de GAPDH dans le caecum des lapins, l'utilisation de ce gène de référence est remise en question pour les cultures primaires. L'étude de Tanaka et al. (2017) a montré que le gène GAPDH pouvait fausser les résultats dans le cadre de l'analyse de macrophages de la moelle osseuse de souris stimulés au LPS. Ils ont mis en avant certains gènes de référence qui s'avèrent plus stables que GAPDH, pourtant souvent utilisé comme gène de référence. Il est donc indispensable d'évaluer la stabilité des gènes de référence avant toute expérimentation et d'identifier le plus adéquate.

Un autre point dont il faut tenir compte est la méthode de normalisation que nous avons utilisée. Notre choix méthodologique a consisté à utiliser un calibrateur, échantillon par rapport auquel l'ensemble des autres échantillons sont normalisés, différent pour chaque individu puisqu'il s'agit de l'échantillon au temps 0 par individu. Il s'agit d'une normalisation par individu, point important pour interpréter les résultats des études.

Enfin la faible quantité d'ARN obtenu a limité fortement le nombre de gènes étudiés, et nous en avons sélectionné uniquement 8 pour la PHA et 7 pour le LPS limitant ainsi notre capacité à explorer la réponse immunitaire. Cette sélection a reposé sur la bibliographie.

# 4 Perspectives

## 4.1 Isolement des cellules

Le nombre de cellules isolées était parfois inférieur à nos attentes, pénalisant le nombre de réplicats techniques et de modalités testées. En outre, au-delà des optimisations techniques, la question de l'organe d'étude a été soulevée. Nous avons choisi d'étudier le caecum puisque cet organe qui héberge la plus grande diversité microbienne du type digestif est le lieu prépondérant des fermentations et des interactions hôte-microbiote. Cependant ce dernier présente une lamina propria très fine avec une proportion de cellules CD45 positives parmi les LPMC de 15% (Knudsen et al. 2022). Chez le lapin, l'appendice vermiforme est particulièrement développé et présente l'avantage d'être un organe lymphoïde en prolongement du caecum. Il constituerait une alternative pertinente. Des études récentes auxquelles j'ai participé au sein du laboratoire ont ainsi pu mettre en évidence un isolement numérique plus important de cellules sur ce tissu avec une forte proportion de cellules immunitaires (50% de cellules CD45+ ; (Knudsen et al. 2022)). En outre, en analyses par cytométrie de flux, sur la base de la taille et de la granulométrie ces cellules s'apparenteraient en majorité à des lymphocytes, en accord avec la nature de ce tissu. L'appendice vermiforme pourrait donc être utilisé en complémentarité du caecum, ce dernier étant principalement constitué des macrophages et cellules dendritiques, afin d'obtenir une diversité de cellules.

Enfin, l'isolement des cellules à partir de tissus congelés pourrait être envisagé. En effet, Konnikova et al. (2018) n'ont pas montré de différence significative quant au nombre et à la viabilité de cellules CD45+ isolées, ni de différences dans le ratio CD4+/CD8+ en cytométrie de flux en comparant des cellules mononucléées de la lamina propria isolées à partir de tissus frais ou congelés humains. Cette démarche permettrait de dissocier les étapes de prélèvements des tissus et d'isolement, permettant ainsi de s'affranchir de la contrainte de disponibilité des animaux mais aussi d'effectifs de prélèvements réduits du fait de la complexité de l'isolement par la suite.

## 4.2 Méthodes d'évaluation de l'impact des stimulations

Afin de pallier les manques d'ARN, matières premières des RT-qPCR, les cytokines et marqueurs d'intérêt pourraient être étudiés à l'échelle protéique. L'ADN est transcrit en ARN, étudié par la RT-qPCR, puis cet ARN est traduit en protéine. Ces protéines secrétées
peuvent être dosées par la technique ELISA dans le milieu de culture (domaine extra-cellulaire) (Corsini, House 2018). Cette approche est ainsi complémentaire de la RT-qPCR permettant l'évaluation de l'expression de gènes dans le domaine intra-cellulaire. Ainsi ce test permet de passer du domaine intracellulaire, où l'on prélève l'ARN situé au sein de la cellule, au domaine extracellulaire pour étudier les protéines. Des tests ELISA sont en cours au sein du laboratoire pour mettre au point notamment l'étude des cytokines IL-17 (stimulation PHA) et TNF (stimulation LPS).

Enfin, il serait pertinent d'utiliser des méthodes comme la cytométrie de flux pour déterminer les types cellulaires en présence dans nos isolats. Cette méthode a recours à des anticorps liés à des fluorochromes ciblant des marqueurs spécifiques à certains types cellulaires. Ceci permettrait, en amont de la culture, un meilleur ciblage des marqueurs (cytokines ou autres) à étudier selon les types cellulaires en présence. Cette technique pourrait également s'appliquer après la culture afin d'évaluer quels sont les types cellulaires qui ont proliférés. La disponibilité en anticorps spécifiques au lapin reste toutefois limitée.

## 4.3 Applications aux évaluations d'impacts de composés nutritionnels ou microbiens

Les résultats obtenus dans ce travail sont le point de départ d'un projet plus large (HoloOLIGO) portant sur l'espèce cunicole mais également porcine et visant notamment à évaluer l'impact des oligosaccharides du lait sur la maturation et le phénotype des cellules immunitaires de la *lamina propria*. Avant de procéder à l'étape d'étude de l'impact des oligosaccharides, de nombreux paramètres doivent encore être étudiés, la dose, la quantité d'incorporation mais surtout les modalités d'incorporation des oligosaccharides. En effet, les oligosaccharides pourraient jouer un rôle préventif lorsqu'incorporé en amont de la stimulation. Dans ce cas, les résultats de la stimulation seraient comparés à des échantillons n'ayant reçus aucun oligosaccharide afin d'observer s'il existe une différence dans la réponse immunitaire, au travers de l'analyse de l'expression des gènes. Dans le cas inverse, d'incorporation des oligosaccharides en aval de la stimulation, une diminution d'expression des gènes devrait être observée.

A la lumière de cette expérience, des recommandations peuvent être émises pour de futures mises en culture. Afin d'homogénéiser les expérimentations, un âge spécifique doit être défini pour le choix des réplicats biologiques. De plus, pour réaliser les mesures de viabilité cellulaire, à l'aide de la technique de luminescence, trois réplicats techniques sont suffisants. Enfin, les mesures de réponse à la stimulation ont été réalisées à partir de deux réplicats techniques voire, lorsque le nombre de cellules ne le permettait pas, un réplicat technique. Si le nombre de cellules obtenues après isolement le permet, la réalisation de quatre réplicats techniques permettrait d'augmenter la précision des résultats.
Conclusion générale

L'ambition nationale de réduction des antibiotiques dans les élevages a initié d'importants projets dans les filières animales. Fortement dépendante de ces substances de lutte contre les bactéries pathogènes ou opportunistes, l'élevage cunicole fait partie des précurseurs dans le déploiement de ces recherches. C'est donc tout naturellement que l'équipe NED de l'UMR GenPhySE de l'INRAE, déjà impliquée dans un grand nombre de projets, s'est tournée vers l'étude des oligosaccharides du lait, dont le rôle immunomodulateur a été montré chez d'autres mammifères. Un tel travail de recherche requiert l'utilisation d'outils permettant d'étudier ces mécanismes à l'échelle cellulaire sur des cellules primaires, c'est-à-dire directement issues des tissus de l'individu. Toutefois ce type de méthode *in vitro* n'existe pas chez le lapin. Ce mémoire avait donc pour objectif de développer un protocole de culture et de stimulation des cellules mononuclées de la *lamina propria* (LPMC) du caecum des lapereaux *in vitro*. Dans un premier temps nous avons défini la méthode d'isolement des LPMC permettant d'obtenir un rendement ainsi qu'une viabilité cellulaire propice à la réalisation d'expérimentations. Fort de cet isolement, il a été nécessaire de décider des conditions de culture et de stimulation.

La réalisation de 12 expérimentations sur 17 individus a permis de mettre au point le premier protocole d'isolement et de culture de cellules mononuclées de la *lamina propria* du caecum des lapins. L'analyse de l'ensemble des données démontre une forte variabilité inter-individuelle de cette technique. Bien que ces différences observées soient intrinsèquement liées à ce type d'expérimentation, certains paramètres peuvent être optimisés pour réduire une partie de cette variabilité.

Afin de connaitre la réponse immunitaire induite par la stimulation LPS et PHA des cellules en culture, les niveaux de transcription des gènes codants pour des molécules de l'immunité ont été mesurés par la technique de RT-qPCR. Le nombre de gènes dont les niveaux de transcription sont impactés significativement par les traitements est faible. Ces résultats suggèrent que les méthodes de stimulation pourraient être mieux adaptées à nos conditions de culture (dose de stimulants, durée d'incubation, souche de LPS). De plus, les niveaux d'expression des gènes des cellules cultivées sont différents selon l'âge des lapins prélevés. Ce phénomène pourrait être dû à des variations de proportions de type cellulaire et de phénotypes des cellules en présence, avec des cellules plus matures à 35 qu'à 21 jours d'âge au sein d'un même type cellulaire. L'étude de l'évolution des proportions des différents types de cellules immunitaires de la *lamina propria* apporterait des éléments de compréhension supplémentaires à ces recherches. L'étude semble tout de même indiquer que les cellules sont réceptives à la stimulation, cette dernière devant être adaptée afin de concorder au mieux avec les cellules isolées.

Par conséquent, cette technique va permettre l'étude de l'impact des oligosaccharides du lait de la lapine sur la maturation du microbiote intestinal et du système immunitaire des nouveaux nés. Elle s'inscrit dans un objectif plus large pour, à terme, définir de nouvelles stratégies alimentaires pour les lapereaux, permettant en fine d'améliorer leur santé et de prévenir des maladies qui surviennent en post-sevrage.
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