# Des données homogènes aux données hétérogènes en biologie des systèmes

Emmanuelle Becker

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## To cite this version:

Emmanuelle Becker. Des données homogènes aux données hétérogènes en biologie des systèmes. Bio-informatique [q-bio.QM]. Université de Rennes 1, 2022. tel-03906598

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Submitted on 19 Dec 2022

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UNIVERSITÉ DE RENNES

École Doctorale MathStic – Mention Informatique

Équipe de recherche DYLISS
Institut de Recherche en Informatique et Systèmes Aléatoires (IRISA)

# Des données homogènes aux données hétérogènes en biologie des systèmes

Emmanuelle BECKER

Habilitation à Diriger des Recherches
Présentée et soutenue publiquement le 14 décembre 2022

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## Composition du jury :

<table><tr><td>Anaïs BAUDOT</td><td>Directrice de recherche (MMG, Marseille), rapportrice</td></tr><tr><td>Christine BRUN</td><td>Directrice de recherche (TAGC, Marseille), examinatrice</td></tr><tr><td>Alessandra CARBONE</td><td>Prof. Sobonne Univ. (LCQB, Paris), examinatrice</td></tr><tr><td>Olivier DAMERON</td><td>Prof. Univ. Rennes (IRISA, Rennes), examinateur</td></tr><tr><td>Elisa FROMONT</td><td>Prof. Univ. Rennes (IRISA, Rennes), examinatrice</td></tr><tr><td>Alejandro MAASS</td><td>Prof. Univ. Chile (CMM, Chili), rapporteur</td></tr><tr><td>Anne SIEGEL</td><td>Directrice de recherche (IRISA, Rennes), examinatrice</td></tr><tr><td>Patricia THEBAULT</td><td>Prof. Univ. Bordeaux (LABRI, Talence), rapportrice</td></tr></table>
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Abstract

From homogeneous to heterogeneous data in systems biology

by Emmanuelle BECKER

Biological systems involve a large number of different entities, each functioning in a coordinated manner with the others. Their understanding is crucial and can be approached at different scales, from the molecular to the systemic one. The observation of all these entities in different contexts and at different scales generates a "tsunami of data", posing complex and interesting computational problems. My work focuses on the development of methods for knowledge generation and knowledge extraction from these massive data.

The manuscript is organized in three axes. The first axis deals with methods to identify interpretable, robust and replicable signatures in high dimensional unimodal data. The second axis proposes the development of a new approach to integrate multimodal data (miRNA + MRI), and to identify disease progression scores. Finally, the third axis also deals with the integration of heterogeneous data, but with a systemic approach, i.e. taking into account the known relationships between entities. The work presented illustrates the complexity of extracting information from existing databases, despite the constant efforts of the bioinformatics community to structure and unify the available information.
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# Résumé

## Des données homogènes aux données hétérogènes en biologie des systèmes

par Emmanuelle BECKER

Les systèmes biologiques font intervenir un grand nombre d'entités différentes et chacune fonctionne de façon coordonnée avec les autres. Leur compréhension est cruciale et peut être abordée à différentes échelles, de l'échelle moléculaire à l'échelle systémique. L'observation de toutes ces entités dans des contextes et à des échelles différentes génère un « tsunami de données », posant des problèmes informatiques complexes et intéressants. Mes travaux portent sur le développement de méthodes de génération de connaissances et d'extraction de connaissances à partir de cette masse de données.

Le manuscrit est organisé en trois axes. Le premier axe traite de méthodes visant à identifier des signatures interprétables, robustes et réplicables dans des données unimodales de grande dimension. Le second axe propose le développement d'une nouvelle approche pour intégrer des données multimodales (miARN + IRM), et identifier des scores de progression de maladies à partir de celles-ci. Enfin, le dernier axe traite également d'intégration de données hétérogènes, mais avec une approche systémique, c'est à dire en prenant en compte les relations connues entre entités. Les travaux présentés illustreront la complexité de l'extraction d'information de qualité des bases de données existantes, malgré les efforts constants de la communauté bioinformatique pour structurer et unifier l'information disponible.
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Acknowledgement

Je remercie tout d'abord les membres de mon jury d'avoir accepté de relire et évaluer ce document. Je sais que leurs agendas sont bien chargés, et j'apprécie à sa juste valeur le temps consacré à la relecture de ce document. Merci donc à mes trois rapportrices et rapporteurs : Anaïs Baudot, Patricia Thébault et Alejandro Maass, ainsi qu'aux examinateurs et examinatrices : Alessandra Carbone, Christine Brun, Olivier Dameron, Anne Siegel et Elisa Fromont.

Cette habilitation à diriger des recherches présente des orientations et projets auxquels j'ai participé depuis ma soutenance de doctorat en 2007. Ces travaux sont le fruit de nombreuses collaborations avec des collègues, des étudiant·e·s ou des ami·e·s que je tiens tout particulièrement à remercier.

Je remercie tout d'abord Raphaël Guérois, qui a eu l'audace de recruter une informaticienne de formation dans une unité de biologie structurale. J'ai énormément appris à son contact, tant sur la biologie structurale que sur l'encadrement des doctorant·e·s. Je souhaite également remercier Christine Brun et Alain Guénoche, qui m'ont initié à la biologie des systèmes et ont su me transmettre leur enthousiasme à étudier ces questions. Ces années à Marseille ont été très formatrices et je garde de très bons souvenirs de nos discussions. Je remercie mes équipes de recherche de l'IRSET, où j'ai eu la chance de travailler pendant mes premières années comme maîtresse de conférences à l'Université de Rennes. Enfin, je remercie l'équipe Dyliss de l'IRISA qui me permet de m'épanouir scientifiquement et de développer mes projets depuis 4 années maintenant : je souhaite à tout scientifique une équipe de recherche comme la nôtre !

J'ai eu la chance d'encadrer des étudiantes et étudiants qui m'ont aidé à progresser dans mes recherches. Je pense à Méline Wery, Virgilio Kmetzsch et Camille Juigné que j'ai eu l'opportunité de co-encadrer comme doctorante ou doctorant, et qui m'ont apporté énormément scientifiquement et humainement. Je pense aussi aux étudiants ou étudiantes de licence et master comme Sofiane, Paul, Marine, Estelle, Victoria, Thomas, Anaëlle, Hugo, Fanny, Camille, Quentin, Marc, Emmanuel et Nancy.

Certaines personnes de mon entourage scientifique ont été déterminantes dans ma capacité à m'imaginer défendre un jour cette habilitation à diriger des recherches. Je pense à Anne Siegel et Olivier Dameron : merci pour votre confiance, elle m'a beaucoup motivée et aidée ! Merci également à Claire Lemaître qui partage mon bureau et avec qui je m'étais lancée dans l'aventure : se renseigner et réfléchir aux démarches à deux, c'est beaucoup plus motivant !

Enfin, je remercie ma famille qui me soutient indéfectiblement et depuis toujours. Ce manuscrit est pour vous Benoît, Capucine, Blanche et Anatole. Et pour toi maman.
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# Contents

<table><tr><td>Abstract</td><td>iii</td></tr><tr><td>Résumé</td><td>v</td></tr><tr><td>Acknowledgement</td><td>vii</td></tr><tr><td>List of Abbreviations</td><td>xi</td></tr><tr><td>1 La science du vivant : de science des données à science des connaissances</td><td>1</td></tr><tr><td>1.1 Massification des données des sciences du vivant</td><td>1</td></tr><tr><td>1.1.1 Le séquençage ou le début de la massification des données</td><td>1</td></tr><tr><td>1.1.2 Des données interdépendantes à différentes échelles</td><td>1</td></tr><tr><td>1.1.3 Dimension des données</td><td>2</td></tr><tr><td>1.1.4 Profilages, signatures et biomarqueurs</td><td>2</td></tr><tr><td>1.1.5 Méthodes pour l'extraction de profils</td><td>3</td></tr><tr><td>1.2 Intégration à l'échelle systémique</td><td>3</td></tr><tr><td>1.2.1 Biologie des systèmes</td><td>3</td></tr><tr><td>1.2.2 Différents réseaux biologiques</td><td>4</td></tr><tr><td>1.2.3 Structuration des connaissances sur les réseaux biologiques</td><td>4</td></tr><tr><td>1.3 Le défi de la reproductibilité</td><td>8</td></tr><tr><td>1.3.1 Champ lexical de la reproductibilité</td><td>8</td></tr><tr><td>1.3.2 Aspects liés au jeux de données</td><td>11</td></tr><tr><td>1.3.3 Aspects liés aux analyses</td><td>12</td></tr><tr><td>1.4 Aperçu général du manuscrit</td><td>13</td></tr><tr><td>2 Profilage et biomarqueurs dans des données unimodales</td><td>15</td></tr><tr><td>2.1 Profilage dans des données unimodales</td><td>15</td></tr><tr><td>2.2 Remise en question des signatures unimodales sous différents angles</td><td>17</td></tr><tr><td>2.2.1 Potentiel prédictif : du profilage au biomarqueur</td><td>18</td></tr><tr><td>2.2.2 Interprétabilité biologique</td><td>20</td></tr><tr><td>2.2.3 Robustesse et généralisabilité des signatures identifiées</td><td>21</td></tr><tr><td>2.2.4 Réplicabilité des signatures identifiées</td><td>23</td></tr><tr><td>2.3 Ce que nous avons appris dans ce chapitre</td><td>26</td></tr><tr><td>3 Intégration de données multimodales</td><td>29</td></tr><tr><td>3.1 Intégration précoce via l'utilisation d'autoencodeurs variationnels</td><td>29</td></tr><tr><td>3.1.1 Scores de progression de maladie dans le cas de la DFT/SLA</td><td>29</td></tr><tr><td>3.1.2 Nouvelle approche proposée à partir d'autoencodeurs variationnels</td><td>30</td></tr><tr><td>3.2 Améliorations du modèle</td><td>32</td></tr><tr><td>3.2.1 Sélection a priori de variables</td><td>32</td></tr><tr><td>3.2.2 Introduction d'une branche de classification pour superviser le VAE</td><td>33</td></tr></table>
<table><tbody><tr><td>3.2.3</td><td>Performances du modèle proposé</td><td>33</td></tr><tr><td>3.2.4</td><td>Intérêts des différentes modalités</td><td>34</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Ce que nous avons appris dans ce chapitre</td><td>36</td></tr><tr><td>4</td><td>Approche systémique pour l'intégration de données</td><td>39</td></tr><tr><td>4.1</td><td>Systèmes biologiques et extraction de réseaux de haute qualité</td><td>39</td></tr><tr><td>4.2</td><td>Le défi de l'exhaustivité et de l'agrégation des connaissances</td><td>40</td></tr><tr><td>4.2.1</td><td>Intégration de bases de données au format BioPAX</td><td>40</td></tr><tr><td>4.2.2</td><td>Redondances dans les bases de données d'interactions protéine - protéine</td><td>41</td></tr><tr><td>4.2.3</td><td>Redondances dans les bases de données BioPAX</td><td>46</td></tr><tr><td>4.3</td><td>Le défi de l'abstraction</td><td>48</td></tr><tr><td>4.3.1</td><td>Topologie des complexes dans les données au format BioPAX</td><td>49</td></tr><tr><td>4.3.2</td><td>Extraction « à façon » dans des données au format BioPAX</td><td>50</td></tr><tr><td>4.4</td><td>Le défi de la reproductibilité et réplicabilité</td><td>52</td></tr><tr><td>4.5</td><td>Ce que nous avons appris dans ce chapitre</td><td>54</td></tr><tr><td>5</td><td>Projets et perspectives</td><td>57</td></tr><tr><td>5.1</td><td>Résumé des travaux présentés</td><td>57</td></tr><tr><td>5.2</td><td>Vers une recherche de biomarqueurs consolidée</td><td>58</td></tr><tr><td>5.3</td><td>Vers de meilleurs scores de progression de maladie exploitant les données disponibles</td><td>59</td></tr><tr><td>5.4</td><td>Vers une amélioration de la qualité et de la pertinence des interactions issus de connaissance</td><td>60</td></tr><tr><td>5.5</td><td>Vers une analyse systémique intégrative</td><td>61</td></tr><tr><td>A</td><td>Curriculum Vitae</td><td>63</td></tr><tr><td>A.1</td><td>État civil</td><td>63</td></tr><tr><td>A.2</td><td>Études, diplômes et parcours professionnel</td><td>63</td></tr><tr><td>A.3</td><td>Publications</td><td>64</td></tr><tr><td>A.4</td><td>Implication dans des projets de recherche financés</td><td>64</td></tr><tr><td>A.5</td><td>Encadrement</td><td>64</td></tr><tr><td>A.6</td><td>Tâches collectives</td><td>66</td></tr><tr><td>A.7</td><td>Enseignements et responsabilités pédagogiques</td><td>67</td></tr><tr><td>B</td><td>Liste des publications</td><td>69</td></tr><tr><td>C</td><td>Publications jointes</td><td>75</td></tr><tr><td>C.1</td><td>Contributions jointes en support au chapitre 2</td><td>75</td></tr><tr><td>C.2</td><td>Contributions jointes en support au chapitre 3</td><td>99</td></tr><tr><td>C.3</td><td>Contributions jointes en support au chapitre 4</td><td>120</td></tr><tr><td></td><td>Bibliography</td><td>141</td></tr></tbody></table>
List of Abbreviations

ADN Acide desoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

AUC Area under the curve

BDD Base de données

CI Confidence interval

DFT Démence frontotemporale

DPS Disease progression score

HUPO-PSI Human Proteome Organization Proteomics Standards Initiative

IDM Interaction detection method

IPP Interaction protéine-protéine

MI Molecular Interaction

miARN Micro-Acide ribonucléique

RNA-seq RNA sequencing

ROC Receiver operating characteristic

SLA Sclérose laterale Amyotrophique

SPARQL SPARQL Protocol and RDF Query Language

VAE Autoencodeur variationnel
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# Chapter 1

# La science du vivant : de science des données à science des connaissances

## 1.1 Massification des données des sciences du vivant

Récemment, Paul Nurse, biochimiste britannique et prix Nobel de médecine en 2001 avec Leland H. Hartwell et Tim Hunt pour leur découverte de la régulation du cycle cellulaire, publiait une tribune dans Nature intitulée « *Biology must generate ideas as well as data* », dans laquelle il soulignait que, souvent, il se rendait à un séminaire scientifique et se sentait noyé sous les données : « Rather often, I go to a research talk and feel drowned in data. Some speakers seem to think they must unleash a tsunami of data if they are to be taken seriously » (Nurse, 2021).

Le reste de ce manuscrit se concentre sur le développement de méthodes de génération de connaissances à partir de cette masse de données.

### 1.1.1 Le séquençage ou le début de la massification des données

Avec l'avènement de la génomique à haut débit, les spécialistes des sciences de la vie commencent dès les années 2000 à s'attaquer à des ensembles de données massives et à relever des défis en matière de manipulation, de traitement et de transfert d'informations qui étaient autrefois l'apanage des astronomes et des physiciens (Blake and Bult, 2006; Cannata et al., 2005). C'est cette réalité qui fait dire à Vivien Marx, en phrase d'accroche à sa tribune dans Nature en 2013 : « Biologists are joining the big data club » (Marx, 2013). De fait, d'après les estimations de Zachary Stephens dans son article « Big Data : Astronomical or genomical ? », en comparant la génomique à trois autres grands générateurs de données massives (l'astronomie, YouTube et Twitter), la génomique est soit égale, soit le plus exigeant des domaines analysés en termes d'acquisition, de stockage, de distribution et d'analyse des données (Stephens et al., 2015).

### 1.1.2 Des données interdépendantes à différentes échelles

L'accélération de l'acquisition des données en génomique par les techniques de séquençage à très haut débit est principalement responsable du tsunami de données actuel. L'accessibilité des techniques de séquençage et ses adaptations successives ont mené au développement de différentes techniques permettant de recueillir de l'information à haut débit à différentes échelles (figure 1.1) : l'échelle de la séquence, des transcrits (Wang et al., 2009a), des mécanismes de régulation de la transription (Lemmens et al., 2006; Schmidt et al., 2009), des protéines (Jiang and English, 2002;
Oda et al., 1999; Ong et al., 2002), des interactions protéique (Gavin et al., 2002; Ho et al., 2002; Ito et al., 2001; Uetz et al., 2000)... De plus, avec l'apparition des techniques de séquençage de cellules uniques et leur commercialisation, l'hétérogénéité cellulaire peut être explorée (Klein et al., 2015; Macosko et al., 2015; Picelli et al., 2013; Svensson et al., 2018). Les données ainsi disponibles à différentes échelles sont souvent analysées séparément. Pourtant, chacun des niveaux interagit avec les autres. Cette interdépendance entre données complexifie grandement leur analyse (Stephens et al., 2015).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>FIGURE 1.1: Données disponibles dans le projet ENCODE. Les données disponibles le sont à différents niveaux : conformation de la chromatine, interactions protéine-ADN, niveau d'expression des transcrits... Figure extraite de (Diehl and Boyle, 2016)</figcaption></figure>

### 1.1.3 Dimension des données

Les technologies de séquençage et criblage à haut débit ont été mises au point pour mesurer toutes les molécules d'intérêt dans un échantillon en une seule expérience (par exemple, le génome entier, les quantités de métabolites, la composition du mi-crobiome), de manière non ciblée. L'exploration n'étant pas ciblée, les données ainsi collectées concernent un très grand ensemble de variables, et le nombre de réplicas collectés est généralement très inférieur au nombre de ces variables. Ce problème, connu sous les noms de « large p small n », ou « malédiction de la dimensionnalité », limite la pertinence des statistiques classiques, développées aux cours du 20ème siècle pour de petits ensembles de données. Ainsi, les données sont nombreuses, mais leur analyse est complexe (Stephens et al., 2015).

### 1.1.4 Profilages, signatures et biomarqueurs

Le lien entre information omique disponible et phénotype observé reste complexe à mettre en évidence. Aussi, on recherche fréquemment des **profils** ou des **signatures**
d'une pathologie ou d'un autre état particulier, en ayant recours à des analyses statis-
tiques comparant un état de référence et un autre état, objet de l'étude.

Tout d'abord, on pourra parler de *profilage* dans le cadre d'analyses prospective visant à identifier l'ensemble des éléments -omiques dont la quantité varie entre les deux conditions étudiées ; les profilages permettent donc d'apprécier les effets globaux d'une condition, d'un traitement, etc... en privilégiant la sensibilité.

Dans un second temps, on parlera de *signature* ou de *biomarqueur* dans le cadre de l'identification d'un ou de plusieurs éléments dont les variations quantitatives ont un potentiel prédictif validé, que ce soit en terme de diagnostic, de pronostic, ou concernant la prédiction d'une réponse thérapeutique (Chibon, 2013). Ainsi, une *signature*, composée de *biomarqueurs*, impose une spécificité et un potentiel prédictif des variations quantitatives.

1.1.5 Méthodes pour l'extraction de profils

La technologie de séquençage la plus utilisée est celle étudiant quantitativement l'expression des transcrits (RNAseq). Pour traiter ces données d'expression, différents outils ont été développés pour identifier les transcrits différentiellement exprimés à partir de tables de comptage d'analyses RNAseq.

La majorité des méthodes font l'hypothèse que la distribution des comptages de chaque gène suit une loi binomiale négative, qui est une alternative robuste à la loi de Poisson lorsque la variance est plus importante que la moyenne. Les méthodes actuelles peuvent être divisées en méthodes paramétriques et non-paramétriques. Parmi les méthodes paramétriques, les outils les plus connus sont edgeR (Robinson et al., 2010a), DESeq (Anders and Huber, 2010) et DESeq2 (Love et al., 2014a), EBseq (Leng et al., 2013), et Cuffdiff2 (Trapnell et al., 2013). Les méthodes non-paramétriques sont moins utilisées, les outils les plus connus étant SAMseq (Li and Tibshirani, 2013) et NOIseq (Tarazona et al., 2011).

De nombreuses revues ont été consacrées à l'évaluation des performances des différentes méthodes, en particulier pour les méthodes les plus populaires comme edgeR et DESeq2. Du fait du faible écart de performance entre les méthodes, d'une étude comparative à la suivante, le classement des méthodes fluctue (Li et al., 2022; Liu et al., 2021; Schurch et al., 2016; Seyednasrollah et al., 2015; Soneson and Delorenzi, 2013). Cependant, toutes ces études soulignent le manque de spécificité des résultats, et des performances dégradées lorsque le nombre de réplicas est faible.

1.2 Intégration à l'échelle systémique

1.2.1 Biologie des systèmes

La **biologie des systèmes** peut être définie comme la modélisation informatique et mathématique des systèmes biologiques complexes. Elle se concentre sur les interactions au sein des systèmes biologiques, en utilisant une approche holistique plutôt que réductioniste, dans le but d'identifier des propriétés émergentes qu'on ne saurait identifier *via* une approche réductioniste. Ainsi, les **réseaux biologiques** sont par définition au fondement même de la biologie des systèmes, et leur mise en évidence est essentielle.
1.2.2 Différents réseaux biologiques

Le vivant s'étudiant et s'observant à différentes échelles, les réseaux biologiques se définissent également à plusieurs échelles. Ainsi, selon la sémantique associée aux entités et celle associée aux interactions entre entités, on peut définir différents type de réseaux, dont les plus fréquents sont :

* les réseaux de co-expression de gènes (entités : gènes, interactions : co-expression), qui peuvent être mis en évidence avec les méthodes populaires telles que WGCNA (Langfelder and Horvath, 2008) ou PCIT (Reverter and Chan, 2008);

* les réseaux de régulation de l'expression des gènes (entités : gènes, interactions : activation ou inhibition d'un gène par un autre), qui peuvent être mis en évidence par des approches expérimentales haut débit basées sur une immunoprécipitation de la chromatine suivie d'une hybridation sur puce (ChIP-CHIP, Lemmens et al., 2006) ou d'un séquençace (ChIP-Seq, Schmidt et al., 2009), ou de nombreuses approches bioinformatiques inférant des liens entre gènes à partir de données d'expression (pour une revue, voir Delgado and Gómez-Vela, 2019);

* les réseaux d'interactions protéine-protéine (entités : protéines, interactions : interaction physique entre 2 protéines), qui peuvent être mises en évidence par diverses approches expérimentales haut débit comme le double-hybride (Ito et al., 2001; Uetz et al., 2000) ou la purification par affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (Gavin et al., 2002; Ho et al., 2002);

* les réseaux métaboliques (entités : protéines et métabolites, interactions : réactions biochimiques et contrôle de ces réactions), principalement construits par une analyse de la littérature ou des approches expérimentales bas-débit, ou reconstruits pour des espèces moins étudiées par analogie avec d'autres réseaux métaboliques (Belcour et al., 2020; Karimi et al., 2021).

Récemment, des réseaux hétérogènes ont été introduits, qui tentent de réconcilier les différentes échelles du vivant (figure 1.2) : les différents types de réseaux sont représentés chacun par un réseau monoplex, et les différentes couches sont mises en relation les unes avec les autres *via* des relations de couplage entre entités des différentes couches (Valdeolivas et al., 2019).

1.2.3 Structuration des connaissances sur les réseaux biologiques

Il existe plusieurs formalismes permettant de structurer les connaissances actuelles sur les réseaux biologiques, dont certains prennent en compte les différentes échelles du vivant. Comme souvent dans le domaine des sciences de la vie, l'information symbolique est structurée *via* l'utilisation d'**ontologies**. L'objectif premier d'une ontologie est d'expliciter et de modéliser un ensemble de connaissances dans un domaine donné en regroupant un ensemble de concepts décrivant complètement ce domaine. Ces concepts sont liés les uns aux autres par des relations taxinomiques (hiérarchisation des concepts) d'une part, et sémantiques d'autre part. Il existe des ontologies dédiées à la description des interactions entre entités biologiques.
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

FIGURE 1.2: Représentation d'un réseau biologique hétérogène. La couche *Metabolism* représente un réseau métabolique, la couche *Proteins* représente un réseau d'interactions protéine-protéine, et la couche *Genes* représente un réseau de régulation génétique. Les arêtes reliants les différentes couches représentent les relations de couplage. Par exemple, un gène peut être transcrit en protéine, ou une protéine peut contrôler l'expression d'un gène ou catalyser une réaction chimique, ou encore la présence d'une molécule produite par une réaction chimique peut activer l'expression d'un gène, ce qui conduira à la production de la protéine correspondante.

Différents vocabulaires contrôlés et ontologies spécifiques, telles que Gene Ontology (GO) (Ashburner et al., 2000; The Gene Ontology Consortium, 2019) ou Molecular Interactions (MI) (Sivade Dumousseau et al., 2018) ont été introduites dans les années 2000-2010 et ont connu un succès considérable. Des ontologies plus transversales ont vu le jour, comme l'ontologie BioPAX (Demir et al., 2010b) ou l'ontologie PSI-MI (Sivade Dumousseau et al., 2018). D'autres formats ont été introduits pour des domaines plus spécifiques, comme SBML ou CellML pour la simulation de systèmes biologiques (Clerx et al., 2020; Keating et al., 2020), SBGN pour la visualisation (Le Novère et al., 2009)... La figure 1.3, extraite de Demir et al., 2010b, présente les interdépendances entre ces différents vocabulaires et formats en 2010. De nos jours, l'initiative COMBINE (pour *COMputational *Modeling *in *BIology *NEtwork*) poursuit ce travail de coordination, et d'autres formalismes comme SBOL (Baig et al., 2020) ou NeuroML (Gleeson et al., 2010) ont rejoint l'écosystème des formats en modélisation des systèmes biologiques. Les deux paragraphes suivants détaillent les ontologies BioPAX et PSI-MI qui jouent un rôle important dans certains travaux présentés dans ce manuscrit.
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>FIGURE 1.3: Vocabulaires contrôlés, ontologies et formats liés pour la visualisation et la simulation en biologie des systèmes. L'ontologie BioPAX est centrale à la structuration des connaissances en biologie des systèmes. Figure extraite de (Demir et al., 2010b).</figcaption></figure>

## L'ontologie BioPAX

L'ontologie d'échange de voies biologiques BioPAX<fnref n="1" /> est un formalisme bien établi pour représenter les voies biologiques aux niveaux moléculaire et cellulaire, y compris les interactions (Demir et al., 2010b). Dans l'ontologie BioPAX, les quatre classes de premier niveau sont : Pathway, Interaction, Physical Entity et Gene. Deux classes sont particulièrement importantes.

* La classe Interaction représente les relations biologiques entre deux ou plusieurs entités (interactions moléculaires, contrôles et conversions).

* La classe Physical Entity englobe les petites molécules, les protéines, l'ADN, l'ARN et les complexes composé de ces éléments.

La figure 1.4-A illustre les différentes classes et sous-classes de l'ontologie BioPAX, et présente l'exemple d'un processus décrit suivant le formalisme de BioPAX (1.4-D).

Toutes les principales bases de données de référence sur les voies métaboliques sont disponibles au format BioPAX : Reactome (Gillespie et al., 2021), BioCYC (Karp et al., 2005; Romero et al., 2005), PANTHER (Mi et al., 2013; Thomas et al., 2022, 2003) ... et l'initiative PathwayCommons intègre 22 banques de données différentes et permet leur import au format BioPAX (Rodchenkov et al., 2020a). La librairie JAVA Paxtools est dédiée à l'extraction et la manipulation des fichiers au format BioPAX (Demir et al., 2013).

<footnote n="1">¹http://www.biopax.org/release/biopax-level3-documentation.pdf</footnote>
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>FIGURE 1.4: (A) Classes du format BioPAX. En vert, la classe Interactions et ses sous-classes. En bleu, les classes Gene et PhysicalEntity et ses sous-classes. En bleu à droite, les différentes propriétés d'une protéine. (B) La voie AKT visualisée avec Biocarta ; (C) représentation SBGN du même processus, et (D) formalisation correspondante avec le langage BioPAX. Figures extraite de (Demir et al., 2010b).</figcaption></figure>
## L'ontologie PSI-MI

Dans le cadre de l'initiative HUPO Proteomics Standards, une ontologie a été introduite pour unifier l'annotation des interactions protéine-protéine (Hermjakob et al., 2004; Kerrien et al., 2007; Sivade Dumousseau et al., 2018). La figure 1.5 présente un brève description des éléments de ce format. Parallèlement, un vocabulaire contrôlé structuré MI, pour *Molecular Interactions*, a été développé pour annoter de façon homogène les différentes techniques expérimentales permettant l'identification d'une interaction entre protéines.

Toutes les principales bases de données d'interactions entre protéines peuvent être téléchargées aux différents formats proposés par l'initiative HUPO Proteomics Standards (miXML ou miTab).

## 1.3 Le défi de la reproductibilité

Depuis les années 2000, plusieurs articles sont devenus célèbres pour avoir suscité la réflexion et le débat scientifique autour des questions de reproductibilité : « *Why Most Published Research Findings Are False* » (Ioannidis, 2005), « *1,500 scientists lift the lid on reproducibility* » (Baker, 2016), ou encore la couverture « *How science goes wrong* » de The Economist en 2013.

Dans son étude de 2016 (Baker, 2016), Monya Baker a notamment intérrogé 1 500 scientifiques de disciplines différentes. Parmi eux, 90% estiment que la science subit actuellement une crise de la reproductibilité, plus de 70% des chercheurs affirment avoir été incapables de reproduire l'expérience scientifique d'un autre chercheur et plus de la moitié affirment avoir échoué à reproduire l'une de leur propre expérience. D'après les scientifiques interrogés, cette crise de la reproductibilité est multi-factorielle et due à de mauvaises pratiques (reporting sélectif, faiblesses méthodologiques, fraude), un manque de transparence (non disponibilité des données brutes, des codes d'analyse), un manque de formation, d'encadrement ou de relecture, ou encore de facteurs extérieurs (variabilité des réactifs, manque de chance)... La pression de publication est également citée par plus de 80% des répondants comme facteur de non-reproductibilité.

De plus en plus de scientifiques cherchent ainsi à améliorer leurs pratiques pour améliorer la reproductibilité de leurs résultats. Cela passe par un meilleur accès aux données (initiative FAIR par exemple), aux codes (github), mais aussi par la collecte de nouveaux jeux de données afin de répondre aux mêmes questions scientifiques et par l'évaluation systématique et sincère des biais méthodologiques.

### 1.3.1 Champ lexical de la reproductibilité

Le champ lexical associé à la reproductibilité est vaste (reproductibilité, réplicabilité, répétabilité, robustesse, généralisabilité, réutilisabilité...) et la définition de certains terme a évolué au cours des dernières années.

## Définitions de Claerbout et Karrenbach (1992)

La définition initiale de la **reproductibilité** a été introduite par Jon Claerbout et Martin Karrenbach en 1992, et est encore assez fréquemment utilisée dans la littérature
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>FIGURE 1.5: Format de représentation et d'échange des interactions entre protéines. Figures extraite de (Hermjakob et al., 2004). Le type d'interaction (flèche rose) est lié à un vocabulaire contrôlé hiérarchisé décrivant les méthodes expérimentales de détection des interactions protéine-protéine.</figcaption></figure>
informatique (Claerbout J, 1992). Pour Jon Claerbout et Martin Karrenbach, la reproductibité d'une analyse est liée à la mise à disposition de tout le matériel (données + code) permettant de reproduire cette analyse : « [...] an author attaches to every figure caption a pushbutton or a name tag usable to recalculate the figure from all its data, parameters and programs. This provides a concrete definition of reproducibility in computationally oriented research. ». L'enjeu principal est donc la transparence des analyses et des résultats.

Par la suite, ce concept a été repris et étendu par d'autres. Ainsi, en 2006, Roger Peng et ses collaborateurs introduisent la définition de la **réplicabilité** qui est liée à la collecte de nouvelles données pour traiter la même question, avec obtention de résultats cohérents : « Scientific evidence is strengthened when important results are replicated by multiple independent investigators using independent data, analytical methods, laboratories and instruments ». (Peng et al., 2006)

## Définitions de l'Association for Computer Machinery (ACM)

En 2016, l'ACM (Association for Computer Machinery, association internationale dont la mission consiste à développer et soutenir la recherche scientifique et l'innovation informatique), a lancé une initiative autour de la reproductibilité 2, et a souhaité à cette occasion clarifier les différentes notions. Les différentes définitions retenues sont plus précises mais opposées aux définitions précédentes. Ainsi, pour l'ACM :

* **Reproductibilité** → La mesure peut être obtenue avec la précision indiquée par une équipe différente, un système de mesure différent, dans un lieu différent et lors de plusieurs essais. Pour les expériences informatiques, cela signifie qu'un groupe indépendant peut obtenir le même résultat en utilisant des données et codes indépendants.

* **Réplicabilité** → La mesure peut être obtenue avec la précision indiquée par une équipe différente utilisant la même procédure de mesure, le même système de mesure, dans les mêmes conditions d'exploitation, au même endroit ou à un endroit différent, lors d'essais multiples. Pour les expériences informatiques, cela signifie qu'un groupe indépendant peut obtenir le même résultat en utilisant les données et codes de l'auteur.

Ainsi, les définitions retenues par l'ACM sont opposées aux définitions précédemment utilisées, et toutes les disciplines scientifiques ne se sont pas emparées de ces nouvelles définitions (Barba, 2018; Heroux et al., n.d.). L'évolution sémantique de ces termes au cours des dernières années reste très dépendante des disciplines, et des tensions autour de ces différents concepts existent. La table 1.1, adaptée de Barba, 2018, donne un aperçu de l'usage des différents termes selon les disciplines en 2018. On remarque que la bioinformatique suit principalement les définitions de Claerbout et Karrenbach, tandis que l'informatique suit celles de l'ACM.

## Les différentes dimensions de la reproductibilité

Le projet The Turing Way 3 est un projet collaboratif ouvert dont l'objectif est de fournir toutes les informations dont les scientifiques ont besoin pour s'assurer que

<footnote>2en associant des badges à certains articles publiés par la société</footnote>

<footnote>3https://the-turing-way.netlify.app/welcome.html</footnote>
<table><caption>TABLE 1.1: Utilisation des termes reproductibilité et réplicabilité selon les disciplines, en 2018. Pour Claerbout et Karrenbach (C&K, colonne de gauche), pour l'ACM (ACM, colonne du milieu) ou pour certaines disciplines où les termes reproductibilité et réplicabilité sont utilisés de manière équivalente (colonne de droite).</caption><thead><tr><th>C&K</th><th>ACM</th><th>Equiv.</th></tr></thead><tbody><tr><td>Traitement du signal</td><td>Microbiologie, Immunologie</td><td>Sciences politiques</td></tr><tr><td>Calcul scientifique</td><td>Informatique</td><td>Economie</td></tr><tr><td>Econométrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidémiologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etudes cliniques</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Médecine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Physiologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistiques</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-informatique</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

les projets sur lesquels ils travaillent sont faciles à reproduire et à réutiliser (Community, 2022). Leurs définitions de la reproductibilité, sous la forme d'une table croisée, est parfaitement adaptée à la fois aux disciplines où la variabilité principale tient aux fluctuations d'échantillonnage et aux méthodes d'acquisition des données, ainsi qu'aux disciplines plus méthodologiques. Ainsi, ils différencient :

* **reproductibilité** → Un résultat est reproductible lorsque les mêmes analyses effectuées sur les mêmes données produisent le même résultat.

* **réplicabilité** → Un résultat est réplicable lorsque la même analyse effectuée sur différents ensembles de données produit des résultats qualitativement similaires.

* **robustesse** → Un résultat est robuste lorsque le même ensemble de données est analysé par deux codes différents pour répondre à la même question de recherche et qu'une réponse qualitativement similaire ou identique est produite.

* **généralisabilité** → La combinaison de résultats reproductibles et robustes nous permet de former des résultats généralisables.

Les définitions de The Turing Way sont donc plus proches de celles de Claerbout et Karrenbach que de celles de l'ACM, tout en étant plus précises et en permettant de différencier les différentes dimensions de la reproductibilité. Dans ce document, ce sont ces définitions qui seront utilisées.

## 1.3.2 Aspects liés au jeux de données

Dans le domaine de la bioinformatique, une première dimension des problèmes de reproductibilité est liée à la récolte de données indépendantes et à l'accès aux données elles-mêmes.

### Aspects liés à la récolte de données indépendantes : réplicabilité

Historiquement, et avant l'informatisation des données et des analyses, la réplicabilité était un enjeu existant et lié à l'acquisition d'une seconde série de données,
totalement indépendante de la première série, et avec laquelle les analyses effec-
tuées donnent des résultats cohérents. L'aquisition de cette seconde série de don-
nées, parfois appelée cohorte de réplication, est rendue nécessaire afin de minimiser
les risques de premier et de second ordre liés à toute analyse statistique. Ces anal-
yses comptent en effet des faux positifs (erreur de premier ordre), dont on cherche
à contrôler le taux, mais aussi des faux négatifs (erreur de second ordre), plus ou
moins nombreux selon la puissance du test statistique utilisé.

Les résultats obtenus sur une cohorte de réplication sont renforcés lorsque l'étude
scientifique a fait l'objet d'un pré-enregistrement. Cela signifie qu'en amont de la
collecte des données, le plan d'analyse complet (tailles de cohortes, seuils statis-
tiques, paramètres des algorithmes...) a été établi et ne sera pas modifié lors de
l'analyse. Ainsi, le pré-enregistrement des études permet de séparer clairement les
études exploratoires, grâce auxquelles on génère de nouvelles hypothèses (*hypothesis-
generating*), des études de testant des hypothèses précises (*hypothesis-testing*). Cette
séparation claire des études selon leur objet est un élément important de réponse à
la crise de la reproductibilité.

Aspects liés à l'accès aux données : reproductibilité

L'accès aux données brutes de la recherche, à des fins d'analyse de reproductibilité comme à des fins d'analyse automatique par des machines, a été considérablement amélioré par la promotion des principes FAIR. Ces principes sont issus de travaux collectifs de chercheurs, d'éditeurs, de sociétés savantes, d'universités, de bibliothécaires et d'archivistes, et sont publiés dans la revue Nature en 2016 (Wilkinson et al., 2016). Les quatre lettres du mot fair (juste, équitable) permettent de synthétiser ces principes :

* Findable : les données doivent être faciles à trouver, aussi bien par des humains que par des machines. Pour ce faire, les (méta)données doivent avoir un identificateur unique et pérenne et être enregistrées ou indexées dans un dispositif permettant de les rechercher.

* Accessible : les données FAIR ne sont pas obligatoirement des données ouvertes mais doivent dans tous les cas être récupérables par leur identifiant en utilisant un protocole standard de communication, et dans tous les cas les (méta)données sont disponibles à des conditions connues, grâce à des licences claires.

* Interoperable : l'interopérabilité implique l'utilisation de métadonnées contextuelles précises, et de contenu et de formats respectant les grands standards internationaux.

* Reusable : La réutilisation (libre, conditionnelle ou payante) doit être facilitée par l'utilisation de standards communs, grâce à des bases de données rassemblant des données vérifiées et bien décrites, directement (ré)utilisables pour la recherche ou d'autres usages.

1.3.3 Aspects liés aux analyses

Les problèmes de reproductibilité et de réplicabilité concernent également la
recherche méthodologique, c'est à dire le développement et l'évaluation de nou-
velles techniques d'analyse de données, même si la littérature à ce sujet est moins
abondante.

Dans le cadre de la bioinformatique, on trouve depuis 2010 quelques publications traitant de la non-réplicabilité des méthodes, que l'on définira comme la non-réplicabilité des bonnes performances de la méthode (Buchka et al., 2021; Jelizarow et al., 2010; Ullmann et al., 2022). Ce manque de réplicabilité est souvent dû à une évaluation trop optimiste (consciemment ou inconsciemment) de leur méthode par les auteurs de publication *via* l'optimisation du choix des caractéristiques des données, l'optimisation des paramètres des algorithmes, ou encore le choix des méthodes auxquelles se comparer (Jelizarow et al., 2010; Ullmann et al., 2022).

## 1.4 Aperçu général du manuscrit

Le manuscrit est organisé en 5 chapitres.

Dans le chapitre 2, je présenterai certains de mes travaux sur les données unimodales illustrant le continuum entre les analyses de profilage et la recherche d'une signature unimodale robuste, reproductible, et interprétable biologiquement.

Dans le chapitre 3, je présenterai une nouvelle approche pour l'identification de score de progression de maladie à partir de données multimodales. Cette nouvelle approche est particulièrement adaptée à la faible taille des cohortes, qui pose un problème aigu de dimensionnalité aux approches classiques. Pour intégrer les données multimodales, les interdépendances connues ou potentielles entre données ne sont pas modélisées.

Dans le chapitre 4, il sera également question d'intégration de données multimodales mais cette fois avec une approche systémique, c'est à dire en prenant en compte les relations connues entre entités de même nature ou de nature différentes. Les travaux présentés illustreront la complexité à extraire l'information pertinente des bases de données existantes, malgré un effort constant de la communauté bioinformatique à structurer les informations et les rendre disponibles, les ontologies et formats développés étant extrêmement complexes à manipuler.

Enfin, le chapitre 5 résumera les travaux présentés, et proposera des pistes de recherche à court terme, moyen terme et long terme en lien avec chaque thématique abordée.
<figure><img src="image_14.png" /></figure>
# Chapter 2

# Données unimodales, du profilage à la recherche de signatures robustes

Les travaux présentés dans cette section concernent l'identification de signatures dans des données omiques classiques, typiquement de type transcriptomique. Cela concerne principalement mon activité de recherche à l'IRSET, où j'étais en charge d'analyser des données omiques. Ces travaux m'ont permi d'identifier des défis plus méthodologiques et ont donc ensuite alimenté un axe de recherche sur le volet informatique que j'ai développé à l'IRISA, visant à analyser la pertinence des signatures extraites sous plusieurs angles : pertinence biologique, reproductibilité et robustesse.

## 2.1 Profilage dans des données unimodales

### Profilage de l'expression des transcrits (gènes, miARNs)

Parmi les technologies de séquençage développées depuis 10 ans, le séquençage de l'ARN reste le plus utilisé. On pourra prendre comme illustration de ceci les 13 466 citations<fnref n="1" /> de l'article introduisant la technique (Mortazavi et al., 2008).

La technologie du RNA-seq permet de quantifier dans une condition donnée le niveau d'expression de chaque transcrit (Mortazavi et al., 2008; Wang et al., 2009b). Elle reflète l'état d'une population de cellules, et peut être utilisée pour comparer une population étudiée à une population contrôle. Par la suite, cette technologie a été adaptée pour étudier les miARNs (Hafner et al., 2008), ou plus récemment les transcrits à l'échelle de la cellule unique, ce qui ouvre de nouveaux champs d'application, notamment dans le domaine médical (Kolodziejczyk et al., 2015; Wagner et al., 2016).

Pour illustrer le profilage de l'expression des transcrits, je présente un cas d'étude typique, dans lequel j'ai investigué les effets d'une molécule utilisée en chimiothérapie, le 5-fluoruracil, dont les mécanismes moléculaires sont encore largement inconnus. Dans ce travail, dont le schéma général est présenté figure 2.1, on compare le niveau d'expression de transcrits, ici des longs ARNs codants et non-codants, chez la levure dans trois conditions : croissance de levures sur un milieu riche (YPD), croissance des levures sur un milieu riche contenant du 5-fluoruracil (YPD + 5FU), croissance de levures mutées pour un gène particulier (rrp6).

<footnote n="1">¹chiffre au 03/10/2022 d'après Google Scholar</footnote>
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>FIGURE 2.1: Schéma expérimental global. Trois conditions de levures diploïdes sont testées : milieu riche (YPD), milieu riche avec ajout de 5-fluoruracil (YPD+5FU), souches mutées pour le gène *rrp6*. Les prélèvements ont lieu à *t* = 40 min et *t* = 100 min. Un séquençage des transcrits est réalisé, suivi d'une analyse statistique permettant d'identifier les transcrits différentiellement exprimés.</figcaption></figure>

Le pipeline de l'analyse de profilage est composé de trois étapes très classiques
dont les concepts principaux sont présentés ci-dessous.

1. Mapping sur le génome de référence.
Les lectures ont été mappées sur le génome de référence S. cerevisiae S288C en
utilisant TopHat version 2.0.6 (Kim et al., 2013).

2. Analyse différentielle.
Pour identifier les transcrits différentiellement exprimés, nous nous sommes concentrés sur les transcrits dont l'abondance n'était pas trop faible. Une telle étape de filtrage est recommandée car les analyses différentielles pour les transcrits ayant une très faible abondance ne sont pas solides (Bourgon et al., 2010; Rau et al., 2013). Les comptes ont été normalisés (Robinson and Oshlack, 2010), et l'analyse différentielle a été réalisée avec edgeR (Robinson et al., 2010a). L'expression différentielle a été déterminée entre les conditions et les points de temps. Les transcrits avec une valeur p corrigée inférieure à 0.05 ont été sélectionnés comme étant significativement différentiellement exprimés.

3. Clustering et enrichissement des termes de la Gene Ontology.
Différentes stratégies ont été employées pour déterminer la méthode de clustering optimale. Ceci nous a permis d'identifier la meilleure approche et le nombre de clusters optimal (k = 5). L'enrichissement des clusters en termes Biological Process de Gene Ontology (GO) a été calculé à l'aide de GoTermFinder, et les termes GO dont la valeur p corrigée était inférieure à 0.01 ont été considérés comme significatifs.

Les résultats sont présentés classiquement sous forme de clusters de co-expression
de transcrits différentiellement exprimés. Ainsi, au sein d'un cluster, on trouve des
transcrits différentiellement exprimés dont les variations d'expressions ont le même
profil dans les différentes conditions. La figure 2.2 présente les cinq clusters identifiés. Dans cette analyse, on identifie 5697 transcrits différentiellement exprimés sur 9786, soit 58% de transcrits différentiellement exprimés. Ces résultats sont cohérents avec les résultats attendus, car la déplétion du gène *rrp6* ou l'ajout de 5-fluoruracil perturbent fortement le fonctionnement de la cellule.

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

**FIGURE 2.2:** Schéma expérimental global d'une étude de profilage. Trois conditions de levures diploïdes sont testées : milieu riche (YPD), milieu riche avec ajout de 5-fluoruracil (YPD+5FU), souches mutées pour le gène *rrp6*. Les prélèvements ont lieu à *t* = 40 min et *t* = 100 min. Un séquençage des transcrits est réalisé, suivi d'une analyse statistique permettant d'identifier les transcrits différentiellement exprimés.

Parmi ces transcrits différentiellement exprimés, il n'est pas possible de distinguer ceux ayant trait au mécanisme de réponse au 5-FU de ceux participant à la réponse globale de la cellule en cas de stress. Le profilage de l'expression des gènes, parce qu'il privilégie la sensibilité de l'analyse, permet donc d'apprécier l'impact global à l'échelle de la cellule d'une condition donnée, mais ne permet pas d'en déduire facilement et finement les mécanismes sous-jacents. L'ensemble des transcrits différentiellement exprimés ne constitue pas ici une *signature*, qui impose une spécificité et un potentiel prédictif des variations quantitatives.

## 2.2 Remise en question des signatures unimodales sous différents angles

Le profilage de données omiques, et plus particulièrement le profilage de l'expression des gènes, est un outil très largement utilisé pour caractériser un état particulier
et, *via* des clusterings et des analyses d'enrichissement, identifier de possibles mé-
canismes cellulaires liés. L'analyse permettant d'identifier les éléments du profil
repose sur une analyse statistique d'approche fréquentiste, dans laquelle on sélec-
tionne classiquement les éléments avec une valeur p corrigée inférieure à 0.05 (Love
et al., 2014b; McCarthy et al., 2012; Robinson et al., 2010b). Cependant, le profi-
lage de données -omiques reste largement à visée exploratoire, et les ensembles
d'éléments -omiques identifiés comme différentiels doivent être consolidés pour
aboutir à l'identification d'une signature.

2.2.1 Potentiel prédictif : du profilage au biomarqueur

Un premier angle de consolidation peut être l'investigation du potentiel prédictif des différents éléments, en utilisant des approches de classification à partir des éléments différentiels. L'objectif est de tester la capacité des éléments, seuls ou en combinaison, à discriminer les différents états étudiés. Cette investigation est rendue nécessaire car les analyses de profilage bénéficient de réplicas biologiques permettant d'estimer des distributions et d'identifier de légers écarts de centrage de ces distributions, alors que le potentiel prédictif repose sur une valeur unique (ou des valeurs uniques dans le cas d'ensemble d'éléments).

Dans le cadre du travail de doctorat de Virgilio Kmetzsch, co-encadré avec Olivier Colliot (équipe ARAMIS, INRIA et ICM), nous avons cherché à identifier une signature à partir de miARNs circulants qui permette de caractériser la progression de la démence front-temporale (DFT) et de la sclérose latérale amyotrophique (SLA), deux maladies neuro-dégénératives actuellement sans traitement. Il existe des formes familiales de ces maladies, liées à la transmission de mutations dans certains gènes connus. Les porteurs de ces mutations développeront tôt ou tard une DFT et/ou une SLA, sans que l'on puisse prédire l'évolution de la phase pré-symptomatique à la phase symptomatique. L'identification d'une signature serait donc importante pour mieux caractériser l'état des patients pré-symptomatiques, et évaluer l'impact de potentiels traitements préventifs. Les miARNs dans le plasma sanguin sont une cible de choix pour identifier une signature car :

1. leur prélèvement se fait par prise de sang, et est donc non-invasif ;

2. les miARNs sont exceptionnellement stables dans le plasma sanguin (Arroyo et al., 2011; Mitchell et al., 2008) ;

3. les formes sporadiques et familiales d'ALS peuvent être liées à des mutations de la protéine TDP-43, qui joue un rôle important dans la bio-génèse des miARNs (Sreedharan et al., 2008).

À l'aide de données issues d'une cohorte mise en place par Isabelle Le Ber (ICM et Hopital de Paris - Pitié Salpétrière) au sein du consortium PREV-DEMALS 2, Virgilio Kmetzsch a eu accès à des données de séquençage de miARNs prélévés dans le plasma sanguin de 22 patients, 46 individus pré-sympotomatiques, c'est-à-dire présentant la mutation caractéristique des patients mais n'ayant pas encore développé de symptomes, et 43 individus témoins issus des familles des patients.

<footnote n="2">²PREV-DEMALS (https:// clinicaltrials. gov/ Identifier:NCT02590276) est une étude multicen-
trique nationale centrée sur les porteurs de la mutation C9orf72. Entre 2015 et 2017, 111 personnes
ont été suivies avec le même protocole dans quatre centres hospitaliers français (Paris, Limoges, Lille
et Rouen).</footnote>
Une analyse différentielle classique des miARNs a permi de mettre en évidence 4 miARNs différentiellement exprimés, comme illustré figure 2.3 [28].

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>FIGURE 2.3: Boxplots avec les niveaux d'expression, pour chaque groupe clinique, des quatre miRNAs identifiés comme différentiellement exprimés. Il existe une différence claire dans l'expression du miR-34a-5p entre les contrôles et les individus mutés (présymptomatiques et symptomatiques). Figure extraite de [28].</figcaption></figure>

Virgilio Kmetzsch a ensuite investigué le potentiel prédictif de ces quatre miARNs afin de déterminer s'ils pouvaient ou non être considérés comme une signature. Pour cela, il a implémenté des classifieurs basés sur une régression logistique. Les niveaux d'expression des 4 miRNAs de la signature ont été utilisés comme variables pour paramétrer trois modèles de classification binaire pour chaque comparaison : témoins vs. individus présymptomatiques, témoins vs. patients et individus présymptomatiques vs. patients. Dans le respect des bonnes pratiques (Poldrack et al., 2020), une stratégie de validation croisée stratifiée a été choisie (figure 2.4) : la boucle de validation croisée interne sert à déterminer l'hyperparamètre (coéfficient de régularisation L2), et la boucle de validation croisée externe permet d'évaluer la performance du modèle à l'aide de l'aire sous la courbe (ROC AUC <fnref n="3" />). Les résultats sont présentés sur la figure 2.5. Pour la classification des témoins vs. présymptomatiques, l'aire sous la courbe ROC est de 0.90 (IC 90% : 0.83 – 0.95). Pour la classification des témoins vs. patients, l'aire sous la courbe ROC est également de 0.90 (IC 90% : 0.82 – 0.97). Enin, pour la distinction entre pré-symptomatiques et patients, les résultats sont légèrement moins bons puisque l'aire sous la courbe ROC est de 0.80 (IC 90% : 0.67 – 0.90).

Au final, l'ajout de cette étape de classification, postérieure à l'identification de gènes différentiellement exprimés, nous permet de valider le potentiel prédictif des 4 miARNs [28]. Cependant, l'analyse présente un biais potentiel, puisque l'identification des gènes différentiellement exprimés est faite sur le même ensemble

<footnote n="3">³area under the receiver operating characteristic curve</footnote>
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>FIGURE 2.4: Schéma de validation croisée stratifiée, avec une validation croisée externe et interne à cinq folds. La boucle de validation croisée externe divise l'ensemble des données en cinq folds, utilisant quatre plis comme données d'apprentissage et un comme données de test (représenté en orange) à chacune de ses itérations. La boucle interne de validation croisée à 5 plis divise les données de formation en quatre plis pour le paramétrage du modèle et un pli de validation (représenté en vert) à chacune de ses itérations. Afin de préserver la proportion de témoins, de sujets présymptomatiques et de patients dans chaque fold, une stratification par rapport au statut clinique a été effectuée.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>FIGURE 2.5: Courbes ROC (receiver operating characteristic) pour chaque classification deux-à-deux : témoins vs. pré-symptomatiques, témoins vs. patients et pré-symptomatiques vs. patients, obtenues via une régression logistique utilisant l'expression des 4 miARNs de la signature comme variables (miR-34a-5p, miR-345-5p, miR-200c-3p et miR-10a-3p). Les intervalles de confiance sont représntés en gris et ont été obtenus en identifiant le 5ème et le 95ème percentile à partir de 2000 échantillons bootstrap.</figcaption></figure>

de données que celui utilisé pour valider le potentiel prédictif par classification. Ce point sera l'objet des sections 2.2.3 et 2.2.4.

## 2.2.2 Interprétabilité biologique

Le second angle de consolidation exploré concerne l'interprétabilité biologique des éléments identifiés. L'étude de cette interprétabilité est intéressante car la sensibilité des approches de profilage haut-débit fait qu'elles identifient des éléments pouvant être directement liés au phénotype étudié, mais aussi plus largement des éléments très indirectement liés au phénotype d'intéret.

Dans les travaux présentés dans [28], nous avons investigué la possibilité d'utiliser les éléments de la signature pour estimer la progression d'une maladie chez des patients pré-symptomatiques, afin de tester l'hypothèse que la comparaison des valeurs d'expression d'un petit ensemble de miARNs chez des témoins,
pré-symptomatiques, et patients pouvait nous renseigner sur la progression de la maladie chez les pré-symptomatiques (Kmetzsch et al., 2021).

Ainsi, à partir de la signature de 4 miARNs identifiée précédemment (2.2.1), nous avons utilisé le classifieur témoins vs. patients paramétré précédemment (2.2.1), entraîné par régression logistique avec les niveaux d'expression des patients et des témoins, puis testé avec les niveaux d'expression des individus présymptomatiques. En effet, 4 individus parmi les pré-sympotmatiques avait été identifiés par les médecins en phase de transition entre le stade pré-symptomatique et le stade symptomatique (phase prodromique). L'objectif est ici d'évaluer si les scores obtenus par ces 4 individus prodromaux étaient tous supérieurs à 0.50, indiquant une plus grande similitude avec le groupe « patient ».

Les scores obtenus par les 4 individus prodromaux sont bien supérieurs à 0.50 : 0.54, 0.75, 0.80 et 0.82. Ce résultat positif doit toutefois être nuancé au vu de la distribution des scores de tous les sujets présymptomatiques (n = 45), puisqu'on constate qu'une large fraction de ceux-ci ont un score supérieur à 0.50. La distribution sem-ble bi-modale (figure 2.6), avec un premier groupe plus proche des témoins (n = 23, score s < 0.50), et un groupe de taille équivalente plus proche des patients (n = 22, score s > 0.60). Ainsi, un suivi longitudinal serait nécessaire afin d'évaluer si les autres individus de score élevé développeront des symptômes dans un futur proche.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**FIGURE 2.6:** Scores de probabilités des pré-symptomatiques (n=45) calculés à partir de la régression logistique entre individis témoins et patients. Un score au voisinage de 0 signifie que le profil de miARNs de l'individu pré-symptomatique est proche de celui des témoins ; un score au voisinage de 1 signifie que le profil de miARNs de l'individu pré-symptomatique est proche de celui des patients.</figcaption></figure>

### 2.2.3 Robustesse et généralisabilité des signatures identifiées

L'une des limitations identifiées dans la validation du potentiel prédictif (section 2.2.1) est que les miARNs différentiellement exprimés ont été calculés avec l'ensemble des données, de ce fait les folds de test de la validation croisée ont également été utilisés dans la sélection des variables de nos modèles de classification, ce qui peut améliorer les performances de prédiction. Pour estimer ce biais possible, nous avons incorporé la sélection de variable dans le processus de validation croisée stratifié : les miARNs différentiellement exprimés ont été calculés avec edgeR en utilisant uniquement les données d'entraînement de la boucle de validation croisée externe (quatre folds sur cinq) à chaque itération. La validation croisée emboîtée a été répétée 100 fois avec différentes divisions de folds. Les résultats sont présentés sur la figure 2.7.
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>FIGURE 2.7: Nombre de fois où chaque miRNA a été trouvé différen-
tiellement exprimé par edgeR, lors d'une validation croisée stratifiée
répétée pour 100 divisions de folds différentes. Dans chaque étape
de la boucle externe de validation croisée, quatre des cinq plis ont
été utilisés pour identifier les miRNAs différentiellement exprimés.
Étant donné qu'une boucle externe est constituée de 5 folds et que
nous avons effectué 100 répétitions, 500 analyses différentielles ont
été calculées pour chaque comparaison : contrôle vs. présymptoma-
tique (A), contrôle vs. symptomatique (B), et présymptomatique vs.
symptomatique (C).</figcaption></figure>

On constate que mir-34a-5p est identifié comme différentiellement exprimé dans 100%(500/500) des comparaisons témoins vs. pré-symptomatiques, 99.4%(497/500) des comparaisons témoins vs. patients et 31.4%(157/500) des comparaison pré-symptomatique vs. patients. D'autres miARNs sont également fréquemment identifiés comme différentiels, certains faisant partie de notre signature identifiée sur le jeu de données complet comme mir-345-5p, mir-10a-3p, mir-200c-3p, mais d'autres n'ayant pas été identifiés comme tels sur le jeu de données complet comme mir-206
(2nd miARN trouvé le plus fréquemment différentiellement exprimé dans la comparaison pré-symptomatique *vs*. patients).

Le potentiel prédictif, mesuré par l'aire sous la courbe ROC, varie en fonction des comparaisons effectuées, comme présenté sur la figure 2.8. Comme attendu, les performances de classifications sont moins bonnes lorsque la sélection de variable est incorporée au processus de validation croisée stratifiée, ce qui confirme la présence d'un biais dans le calcul du potentiel prédictif décrit à la section 2.2.1.

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

FIGURE 2.8: ROC AUC obtenue pour 100 divisions de fold différentes. Le calcul des variables prédictives (miARNs différentiellement exprimés) est fait uniquement sur 4 folds de la boucle de validation externe. Les lignes rouges indiquent le 5ème et le 95ème percentile, pour former un intervalle de confiance empirique à 90% : [0.83,0.91] pour la comparaison témoins vs. pré-symptomatiques, [0.83,0.94] pour la comparaison témoins vs. patients, et [0.52,0.77] pour la comparaison pré-symptomatiques vs. patients.

### 2.2.4 Réplicabilité des signatures identifiées

Enfin, le dernier angle de consolidation est l'angle de la réplicabilité, ie. la capacité, à partir d'un jeu de données indépendant, à produire des résultats cohérents avec les résultats de l'analyse exploratoire.

Dans le cadre du travail de doctorat de Virgilio Kmetzsch, après la première analyse ayant identifié une signature de 4 miARNs, nous avons fait le choix de tester dans deux cohortes indépendantes notre signature ainsi que toutes les signatures de miRNAs circulants identifiées dans la littérature pour la même pathologie. Afin de nous prémunir des biais potentiels, le protocole d'analyse complet a été préenregistré avant la collecte des données (https://osf.io/4pw8f). La publication associée à ce travail est [35].

Chacune des deux cohortes de validation est homogène et centrée sur les porteurs de mutation dans les gènes C9orf72 ou GRN. À cette fin, nous avons sélectionné toutes les études publiées qui ont identifié des miRNAs plasmatiques comme biomarqueurs potentiels de la DFT et/ou de la SLA par une requête Pubmed :

(microRNA[Title] OR microRNAs[Title] OR miR[Title] OR miRNA[Title])
AND

(serum[Title] OR circulating[Title] OR plasma[Title])
AND

(ALS[Title] OR FTD[Title] OR amyotrophic[Title] OR frontotemporal[Title]
OR (neurodegenerative[Title] AND (frontotemporal[Title/Abstract]
OR amyotrophic[Title/Abstract]))))

NOT mice [Title/Abstract] NOT mouse [Title/Abstract]
NOT extracellular vesicles [Title]
NOT review [PT] NOT meta-analysis [PT] NOT (comment[PT])

Cette recherche a donné 19 résultats<fnref n="4" />. Deux articles ont été exclus parce qu'il s'agissait d'études de synthèse (Brennan et al., 2019; Grasso et al., 2015), un a été écarté parce qu'il était axé sur les niveaux de protéines (Freischmidt et al., 2021), et un a été exclu parce qu'il était axé sur un seul miARN provenant d'exosomes (Xu et al., 2018). Notre sélection finale comportait donc 15 articles, contenant 16 signatures suceptibles de concerner les porteurs de la mutation C9orf72, et 5 signatures susceptibles de concerner les porteurs de la mutation PGRN, certaines publications contenant plusieurs signatures, et certaines signatures pouvant s'appliquer aux deux cohortes (De Felice et al., 2014; Denk et al., 2018; Dobrowolny et al., 2021; Freischmidt et al., 2015, 2014; Grasso et al., 2019; Kmetzsch et al., 2021; Magen et al., 2021; Piscopo et al., 2018; Raheja et al., 2018; Sheinerman et al., 2017; Soliman et al., 2021; Takahashi et al., 2015; Tasca et al., 2016; Waller et al., 2017). Les résultats de ces différentes études se recoupent très peu, sans que l'on puisse déterminer si cela provient de fluctuations d'échantillonnage car les cohortes sont de faible taille, ou du fait que la majorité des études sont ciblées sur certains miARNs choisis après étude de la littérature. En effet, seules deux études ont testé tous les miARNs connus (Kmetzsch et al., 2021; Magen et al., 2021). Au total, 65 miARNs différents composent les 16 signatures testées pour la cohorte C9orf72 (DFT/ALS), et 30 miARNs composent les 5 signatures testées pour la cohorte PGRN (DFT uniquement). Les articles sélectionnés, les miARNs associés, les maladies, les types de cohortes, le nombre de patients et les méthodes d'analyse sont présentés dans le table 2.1, issue de [35].

Les résultats que nous présentons dans [35] montrent que la majorité des miARNs identifiés en lien avec l'ALS ou la DFT sont bien retrouvés différentiellement exprimés (35/65, p-valeur corrigée < 0.05), tandis que pour les miARNs spécifique-ment en lien avec la DFT, les résultats sont moins bons (5/30, p-valeur corrigée < 0.05). De même, nous montrons que le potentiel discriminant des différentes signatures est plus important pour les signatures en lien avec ALS-DFT (2.9-gauche) que pour les signatures en lien avec la DFT (2.9-droite). Deux miARNs semblent par-ticulièrement intéressants : mir-34a-5p, et mir-206. Il est intéressant de noter que ces 2 miARNs étaient parmi les mieux classés dans l'analyse de généralisation présentée dans la section 2.2.3.

Au delà de cet exemple particulier, cette étude de réplication souligne l'importance d'effectuer des études globales de réplication à partir de cohortes in-dépendantes. En effet, même dans le cas le plus favorable, une fraction importante des miARNs ne sont pas retrouvés différentiellement exprimés, et le potentiel pré-dictif des différentes signatures proposées est souvent décevant (< 0.5, c'est à dire moins bon que le pur hasard).

<footnote n="4">⁴recherche effectuée sur le portail PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), le 10 mars 2022</footnote>
<table><caption>TABLE 2.1: Selected studies investigating circulating microRNA expression (from serum or plasma) of patients with FTD or ALS.</caption><thead><tr><th>Article</th><th>Disease</th><th>Cohort</th><th>Patients, No. (discovery/replication)</th><th>Presymomatic carriers, No.</th><th>Method of analysis</th><th>Dysregulated miRNAs</th></tr></thead><tbody><tr><td>(Grasso et al., 2019)</td><td>FTD</td><td>Sporadic</td><td>10/48 split of same cohort</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 752 miRNAs</td><td>miR-663a, miR-502-3p, miR-206</td></tr><tr><td>(Piscopo et al., 2018)</td><td>FTD</td><td>Sporadic</td><td>54</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 9 miRNAs linked with apoptosis</td><td>miR-127-3p</td></tr><tr><td>(Denk et al., 2018)</td><td>FTD</td><td>Sporadic</td><td>48</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 96 miRNAs identified in preliminary study</td><td>let-7b-5p, let-7g-5p, miR-106a-5p, miR-106b-5p, miR-18b-5p, miR-223-3p, miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-301a-3p, miR-30b-5p, miR-146a-5p, miR-15a-5p, miR-22-3p, miR-320a, miR-320b, miR-92a-3p, miR-1246</td></tr><tr><td>(Kmetzsch et al., 2021)</td><td>FTD, ALS</td><td>Genetic (C9orf72)</td><td>22</td><td>45</td><td>RNA-sequencing of 2576 miRNAs</td><td>miR-34a-5p, miR-345-5p, miR-200c-3p, miR-10a-3p</td></tr><tr><td>(Sheinerman et al., 2017)</td><td>FTD, ALS</td><td>Unspecified</td><td>For each disease, 25/25 split of same cohort</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 37 brain-enriched miRNAs</td><td>miR-9/let-7e, miR-7/miR-451, miR-335-5p/let-7e (FTD) and miR-206/miR-338-3p, miR-9/miR-129-3p, miR-335-5p/miR-338-3p (ALS)</td></tr><tr><td>(Magen et al., 2021)</td><td>ALS</td><td>Mixed sporadic and genetic (C9orf72)</td><td>126/122 split of same cohort</td><td>-</td><td>RNA-sequencing of 125 miRNAs identified in longitudinal study</td><td>miR-181a-5p, miR-181b-5p</td></tr><tr><td>(Soliman et al., 2021)</td><td>ALS</td><td>Mixed sporadic and genetic (unspecified mutation)</td><td>30</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 7 miRNAs involved in ALS</td><td>miR-206, miR-143-3p, miR-142-3p</td></tr><tr><td>(Dobrowolny et al., 2021)</td><td>ALS</td><td>Mixed sporadic and genetic (unspecified mutation)</td><td>13/23</td><td>-</td><td>RNA-sequencing followed by qRT-PCR</td><td>miR-151a-5p, miR-199a-5p, miR-423-3p</td></tr><tr><td>(Raheja et al., 2018)</td><td>ALS</td><td>Mixed sporadic and genetic (C9orf72, SOD1)</td><td>23</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 191 miRNAs identified on prior study</td><td>miR-29b-3p, miR-320c, miR-34a-5p, miR-29c-3p, miR-320a, miR-22-3p, miR-1, miR-133a-3p, miR-191-5p, miR-144-5p, miR-320b, miR-423-3p, miR-192-5p, miR-133b, miR-194-5p, miR-7-1-3p, miR-19a-3p, miR-425-5p, miR-145-5p, miR-144-3p</td></tr><tr><td>(Waller et al., 2017)</td><td>ALS</td><td>Sporadic</td><td>27/23</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 750 miRNAs</td><td>miR-206, miR-143-3p, miR-374b-5p</td></tr><tr><td>(Tasca et al., 2016)</td><td>ALS</td><td>Sporadic</td><td>14</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 9 muscle-specific, inflammatory, or angiogenic miRNAs</td><td>miR-206, miR-133a, miR-133b, miR-27a</td></tr><tr><td>(Takahashi et al., 2015)</td><td>ALS</td><td>Sporadic</td><td>16/48 split of same cohort</td><td>-</td><td>Microarrays, followed by qRT-PCR of 9 miRNAs</td><td>miR-4649-5p, miR-4299</td></tr><tr><td>(Freischmidt et al., 2015)</td><td>ALS</td><td>Sporadic</td><td>18/20</td><td>-</td><td>Microarrays of 1733 miRNAs, followed by qRT-PCR of 2 miRNAs</td><td>miR-1234-3p, miR-1825</td></tr><tr><td>(Freischmidt et al., 2014)</td><td>ALS</td><td>Separate sporadic and genetic (SOD1, FUS, C9orf72)</td><td>9/13 (genetic), 14 (sporadic)</td><td>18</td><td>Microarrays of 1733 miRNAs and qRT-PCR of 4 miRNAs</td><td>miR-4745-5p, miR-3665, miR-1915-3p, miR-4530</td></tr><tr><td>(De Felice et al., 2014)</td><td>ALS</td><td>Sporadic</td><td>10</td><td>-</td><td>qRT-PCR of 1 miRNA</td><td>miR-338-3p</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_23.png" /></figure>

FIGURE 2.9: (gauche) Performances d'un ensemble de classifieurs (régression logistique) pour la cohorte C9orf72, en utilisant les 16 signatures de miRNA identifiées dans la littérature et deux méta-signatures obtenues à partir des analyses d'expression différentielle. (droite) Performances d'un ensemble de classifieurs (régression logistique) pour la cohorte PGRN, en utilisant les 5 signatures de miRNA identifiées dans la littérature et deux méta-signatures obtenues à partir des analyses d'expression différentielle. Les résultats de l'AUC ROC et les intervalles de confiance à 90% obtenus avec 2000 échantillons bootstrap sont calculés conformément à (Kmetzsch et al., 2021).

## 2.3 Ce que nous avons appris dans ce chapitre

Le profilage de données -omique reste largement exploratoire et les ensembles d'éléments -omiques identifiés comme différentiels doivent être consolidés en vue d'être utiles pour le diagnostique et de constituer une signature.

La consolidation de ces profilages passe par différents aspects :

1. l'investigation du potentiel prédictif des éléments du profil, seuls ou en combinaison, en prenant garde aux biais potentiels si l'évaluation du potentiel prédictif est faite sur le même ensemble que celui ayant identifié les éléments du profil ;

2. l'interprétatibilité biologique des éléments identifiés ;

3. une consolidation statistique permettant de répondre au défi de la reproductibilité évoqué dans la section 1.3. Dans le meilleur des cas, une analyse pré-enregistrée et une cohorte de validation indépendante sont nécessaires pour
confirmer un résultat observé lors d'une étude exploratoire, et s'assurer ainsi de sa réplicabilité.

→ **Méthodes** : analyses différentielle dans des données homogènes (unimodales) ; plan d'analyses pré-enregistrés ; re-échantillonnage ; classification ; régressions.

→ **Domaines d'application** : biologie fondamentale (données de type transcriptomique / protéomique chez l'homme ou la levure) ; biologie marine (données homogènes : transcriptomique type miARNs) ; maladies neurodégénératives et scores de progression de maladie (données transcriptomiques type miARNs).

→ **Collaborations** : Mickaël Primig et Fatima Smagulova dans le cadre de mon travail à l'IRSET (IRSET, Inserm) ; Julien Bobe et Violette Thermes au Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons (LPGP - INRAe) dans le cadre du projet européen PhénoMiR ; Olivier Colliot à l'Institut du Cerveau (ICM - Inserm, CNRS, AP-HP - Hôpital Pitié-Salpêtrière) et Inria (équipe-projet Aramis) dans le cadre de l'Inria Project Lab (IPL) Neuromarker.

→ **Travaux en lien** : [35] , [28] , [26] , [20] , [15] , [14] , [11] .

→ **Publications jointes en support en Annexe C** :

[35] Kmetzsch V, Latouche M, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Le Ber I, Colliot O and **Becker E**.

Validation of circulating microRNA signatures as biomarkers in genetic frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis.

accepted in Annals of Clinical and Translational Neurology

Kmetzsch V, Anquetil V, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Jornea L, Forlani S, Couratier P, Wallon D, Pasquier F, Robil N, PREV-DEMALS study group; de la Grange P, Moszer I, Le Ber I, Colliot O, **Becker E**.

Plasma microRNA signature in presymptomatic and symptomatic subjects with C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis.

J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2021.
<figure><img src="image_24.png" /></figure>
# Chapter 3

# Intégration de données multimodales pour l'estimation de scores de progression de maladie

Les travaux présentés dans cette section concernent l'identification de signatures dans des données hétérogènes voire multimodales. L'hypothèse sous-jacente est que la combinaison de données hétérogènes/multimodales permet de prendre en compte plusieurs aspects de la réalité biologique et permet ainsi d'identifier des signatures de meilleure qualité qu'avec des données unimodales (chapitre 2). Cela concerne principalement mon activité de recherche dans le cadre d'une collaboration entre Dyliss et l'Institut du Cerveau (ICM - Paris, dans le cadre de l'IPL Neuromarker et du co-encadrement de la thèse de Virgilio Kmetzsch), visant à analyser conjointement des données de type -omique et des données d'imagerie médicale de type IRM/T1.

## 3.1 Intégration précoce *via* l'utilisation d'autoencodeurs variationnels

### 3.1.1 Scores de progression de maladie dans le cas de la DFT/SLA

Au cours des dernières années, de nombreuses approches ont été développées pour la modélisation de la progression des maladies à partir de données, comme les modèles basés sur les événements (EBM) (Fonteijn et al., 2012; Venkatraghavan et al., 2019), différents algorithmes basés sur des régressions logistiques de trajectoires des biomarqueurs (Jedynak et al., 2012; Mehdipour Ghazi et al., 2021), les modèles non linéaires à effets mixtes (Koval et al., 2021; Schiratti et al., 2017), les réseaux de neurones récurrents (Mehdipour Ghazi et al., 2019), et bien d'autres encore (Aksman et al., 2019; Garbarino et al., 2019; Lorenzi et al., 2019; Marinescu et al., 2019).

La plupart de ces approches nécessitent des données longitudinales. En effet, parmi les modèles proposés, seuls les modèles basés sur les évènements (EBM) permettent d'inférer un score de progression de maladie à partir de données transversales (Fonteijn et al., 2012; Venkatraghavan et al., 2019). Ces modèles explorent la séquence temporelle dans laquelle les biomarqueurs deviennent anormaux au cours d'une maladie. Ils ont été appliqués avec succès à diverses maladies, notamment la maladie d'Alzheimer : (Archetti et al., 2019; Firth et al., 2020; Fonteijn et al., 2012; Oxtoby et al., 2018; Venkatraghavan et al., 2019; Young et al., 2014), la sclérose en plaques : (Dekker et al., 2020; Eshaghi et al., 2018), la maladie de Parkinson : (Oxtoby et al., 2021), la maladie de Huntington : (Wijeratne et al., 2021) ainsi que la DFT : (Ende et al., 2021; Panman et al., 2021) et la SLA : (Gabel et al., 2020). Cependant,
dans ces travaux, les EBMs ont été appliqués à un nombre relativement faible de variables (généralement entre 10 et 50) et on ignore si ils seraient performants dans des dimensions plus élevées.

Malgré l'importance reconnue de l'estimation de la progression des maladies neurodégénératives, la recherche s'est concentrée principalement sur les pathologies de prévalence élevée. Les solutions existantes sont donc inadéquates pour modéliser les maladies rares avec des données transversales de grande dimension, pour trois raisons principales.

1. Des données longitudinales sont nécessaires pour la grande majorité des approches. Cependant, certaines maladies neurodégénératives comme la DFT et la SLA sont des maladies à évolution lente dans la phase pré symptomatique, ce qui empêche la collecte de données longitudinales significatives.

2. La plupart des méthodes publiées bénéficient de grands échantillons, qui ne sont pas disponibles pour les pathologie de faible prévalence.

3. Enfin, il n'est pas évident que les modèles basés sur les événements, seules méthodes adaptées aux données transversales, puissent être appliqués de manière robuste aux données d'expression de miARNs de grande dimension, qui comprennent des centaines de biomarqueurs.

### 3.1.2 Nouvelle approche proposée à partir d'autoencodeurs variationnels

Dans le cadre du travail de doctorat de Virgilio Kmetzsch, co-encadré avec Olivier Colliot (équipe INRIA Aramis et ICM), nous avons proposé une méthode d'inférence d'un score de progression de la maladie (un trait latent) basé sur des autoencodeurs variationnel (VAE) non-supervisés [31] puis supervisés [34], entraînés avec des données de neuroimagerie et de miARNs et adaptée à une dimensionnalité défavorable des données : beaucoup de variables et peu d'individus.

Notre étude a porté sur 110 individus, répartis en trois groupes : 22 patients DFT/SLA, 45 pré-symptomatiques et 43 témoins. Tous les individus disposaient de données transcriptomiques constituées des niveaux d'expression de 589 miRNAs. Cependant 91 personnes seulement (14 patients, 40 pré-symptomatiques et 37 témoins) disposaient également de données de neuro-imagerie, consistant en des volumes de matière grise extraits d'une IRM incluant 68 régions corticales d'intérêt (ROI) et 18 ROI sous-corticales, ainsi que le volume intracrânien total estimé, soit 87 caractéristiques d'imagerie. Le nombre total de variables mesurées par patient est donc de 589 (miARNs) + 87 (IRM) pour les individus avec données d'imagerie, et 589 (miARNs) pour les individus sans données d'imagerie. La DFT et l'ALS étant des pathologies à évolution lente, nous ne disposons pas de données longitudinales.

Afin de palier à la faible taille de la cohorte, le formalisme des VAEs a été sélectionné, car les VAEs sont de puissants modèles génératifs qui projettent les données dans un espace latent régularisé de faible dimension, et il a été démontré qu'ils sont efficaces dans des contextes de haute dimension et de faible taille d'échantillon (Chadebec et al., 2021). Ces modèles ont déjà été utilisés avec des données multimodales (Antelmi et al., 2019), mais pas dans le but de déduire un score de progression de maladie (DPS pour disease progression score). Virgilio Kmetzsch a proposé deux modèles de VAEs : un modèle non supervisé dans [31], puis un modèle supervisé dans [34]. La figure 3.1 présente l'approche retenue, en trois étapes :
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>FIGURE 3.1: Nouvelle méthode proposée pour le calcul d'un score de progression de la maladie. (1) La première étape consiste à paramétrer avec un ensemble d'apprentissage un autoencodeur variationnel pour déterminer un espace latent de faible dimension. Cette étape peut inclure une branche de supervision, comme proposé dans [34], ou non, comme proposé dans [31]. (2) Définition d'une trajectoire dans l'espace latent, à l'aide des coordonnées des individus de l'ensemble d'apprentissage. Dans [31], la trajectoire est une ligne droite passant par les centroïdes des groupes témoins et patients, dans [34] c'est une courbe principale définissant une trajectoire témoins → présymptomatiques → patients. (3) Pour les individus de l'ensemble de test, calcul de leur coordonnées dans l'espace latent puis projection orthogonale de celles-ci sur la trajectoire précédemment déterminée afin de produire un score de progression de la maladie.</figcaption></figure>

1. Etape 1, estimation d'un espace latent de faible dimension à partir d'un VAE. L'architecture d'un auto-encodeur variationnel est composée d'un encodeur probabiliste et d'un décodeur probabiliste. L'encodeur projette une donnée d'entrée $x$ dans un vecteur de moyennes et un vecteur de log-variances, qui paramétrisent une distribution Gaussienne permettant d'obtenir la représentation latente $z$ de $x$. A l'inverse, le décodeur renvoie la représentation latente $z$ dans l'espace initial. Dans [31,34], nous avons utilisé un espace latent de dimension 2. La dimension de l'espace initial varie selon que l'on introduit une étape préalable de sélection de variables ou non (voir 3.2.1) (de 155 à 677). Enfin, dans [34], nous avons introduit une branche de supervision de l'encodeur à cette étape (voir 3.2.2).

2. Etape 2, définition de la trajectoire.
Une fois le modèle entraîné, tous les individus de l'ensemble d'apprentissage sont encodés dans l'espace latent. Une première approximation naïve de trajectoire de la maladie peut être obtenue par une ligne droite passant par le centroïde des groupes témoins et patients, comme nous l'avons fait dans [31]. Par la suite, ce modèle a été raffiné et cette ligne droite a été utilisée en initialisation d'une recherche de courbe principale définissant une trajectoire témoins → présymptomatiques → patients [34]. Une courbe principale est
une courbe unidimensionnelle lisse passant par le milieu de groupes de points donnés, et peut être calculée par l’algorithme décrit dans Hastie and Stuetzle, 1989.

3. Etape 3, calcul du score de progression de la maladie (DPS).
Les individus de l'ensemble de test sont encodés dans l'espace latent, et la projection orthogonale de leur représentation latente sur la trajectoire calculée précédemment permet de déduire le score associé à l'individu.

## 3.2 Améliorations du modèle

### 3.2.1 Sélection *a priori* de variables

Certains sujets ne disposent que de données transcriptomiques (n=19), sans données d'imagerie. Dans [31], nous avons montré que ces sujets pouvaient être utilisés afin de sélectionner les variables de transcriptomique les plus intéressantes (feature selection), et que cette sélection améliore les performances du VAEs. Dans cette étude, les sujets ont été divisés en deux ensembles de données : 19 sujets avec uniquement des données de miARNs, utilisés comme ensemble de découverte pour la sélection de variables (analyse différentielle, 68 miARNs avec les p-valeurs les plus faibles sélectionnés), et 91 sujets avec des données multimodales de neuroimagerie et de miARNs, utilisés comme entrées pour le VAE.

Cette sélection *a priori* de variables améliore la performance du VAE, ce qui est illustré sur la figure 3.2, où on constate une meilleure séparation des distributions des scores inférés pour les trois groupes composant notre cohorte (patients, présymptomatiques et témoins), en comparant les performances du modèle dans le cas où les données de miARNs sont de dimension *n* = 589 (gauche) où *n* = 68 après sélection de certaines variables sur un ensemble indépendant de 19 individus (droite).

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>FIGURE 3.2: Distribution des scores de progression de la maladie en fonction du statut clinique, obtenues par validation croisée 5-fold avec 91 individus, en utilisant (A) les 589 miRNAs et les 87 ROIs de l'imagerie T1 et (B) 68 miRNA sélectionnés et les 87 ROIs de l'imagerie T1.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>FIGURE 3.3: Distribution des scores de progression de la maladie en fonction du statut clinique, obtenues par validation croisée 5-fold avec 91 individus après introduction d'une branche de supervision, en utilisant 68 miRNA sélectionnés, 87 ROIs de l'imagerie T1, ainsi que l'âge (pour l'encodeur) et le statut clinique (pour le classifieur).</figcaption></figure>

### 3.2.2 Introduction d'une branche de classification pour superviser le VAE

Dans [34], nous introduisons une branche de classification à l'encodeur, de façon à exploiter notre connaissance qualitative de l'état clinique des patients (témoin, pré-symptomatique ou patient). Brièvement, lors du paramétrage du VAE, nous cherchons à minimiser l'erreur définie par :

$$ \mathcal{L} = \alpha_1 \cdot \mathcal{L}_r(x, \hat{x}) + \alpha_2 \cdot \mathcal{L}_{KL}(q_{\phi}(z|x), p(z)) + \alpha_3 \cdot \mathcal{L}_c(y, \hat{y}), $$

dont le premier terme $\mathcal{L}_r$ représente l'erreur de reconstruction, le second terme $\mathcal{L}_{KL}$ $\mathcal{L}_{KL}$ est la divergence de Kullback-Leibler, communément utilisée pour mesurer la différence entre deux distributions de probabilités, et $\mathcal{L}_c$ est un terme de cross-entropie qui pénalise les erreurs de classification. Les deux premiers termes sont classiques des autoencodeurs variationnels, tandis que le dernier terme est ajouté spécifiquement afin de pouvoir superviser notre VAE [34]. Chaque terme est contrôlé par un hyperparamètre $\alpha_k$ du modèle, de façon à ce que $\sum_{k=1}^3 \alpha_k = 1$. Les hyperparamètres ont été fixés à $\alpha_1 = 0.2$, $\alpha_2 = 0.2$ et $\alpha_3 = 0.6$. Toutefois, nous montrons dans [34] que les résultats sont relativement stables lorsqu'on modifie la valeur des hyperparamètres (différentes combinaisons testées avec $0.1 \le \alpha_1 \le 0.3$, $0.1 \le \alpha_2 \le 0.3$ et $0.5 \le \alpha_3 \le 0.8$).

L'introduction de cette branche de supervision améliore la performance du VAE, ce qui est illustré sur la figure 3.3, où on constate une meilleure séparation des distributions des scores inférés pour les trois groupes composant notre cohorte (patients, prés-symptomatiques et témoins).

### 3.2.3 Performances du modèle proposé

Dans [34], les performances du nouveau modèle proposé ont été calculées à partir des données de la cohorte DFT/SLA sur une centaine de folds randomisés ($n = 91$ individus avec des données de miARNs et imagerie). Pour chaque fold, les données de 73 individus sont utilisées pour paramétrer le modèle, et les données de 18 individus sont utilisées pour prédire un score de progression de maladie (figure 3.4).

Afin d'évaluer la pertinence des score prédits, et en l'absence de vérité terrain, nous avons proposé d'évaluer les performances du DPS prédit en l'utilisant pour
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>FIGURE 3.4: Les données de 73 individus sont utilisées pour paramétrer le modèle, et les données de 18 individus sont utilisés pour prédire un score de progression de maladie. (a) Coordonnées des 73 points de l'ensemble d'apprentissage dans l'espace latent et la courbe principale suivant la trajectoire témoins, présymptomatiques, patients. (b) Coordonnées des 18 points de l'ensemble de test, et la courbe principale précédemment déterminée. (c) Projection orthogonale des coordonnées des 18 points de l'ensemble de test sur la courbe principale pour le calcul du DPS.</figcaption></figure>

faire des comparaisons 2 à 2 entre les différents groupes et en calculant l'aire sous la courbe ROC pour ces différentes comparaisons. Les courbes ROC sont présentées figure 3.5.

Les résultats obtenus sont très bons pour séparer les patients des deux autres groupes : AUC = 0.98 ± 0.05 pour la comparaison témoins vs. patients, et AUC = 0.96 ± 0.07 pour la comparaison présymptomatiques vs. patients. La comparaison entre témoins et pré-symptomatiques donne des résultats acceptables : AUC = 0.73 ± 0.13. Ces résultats sont meilleurs que ceux obtenus en appliquant une stratégie similaire à partir d'un score de progression de maladie construit par un modèle basé sur des évènements (EBMs), seule autre stratégie possible en l'absence de données longitudinales (figure 3.5). Les différences de performances sont importantes, mesurée en variation de l'aire sous la courbe ROC : -0.07 pour la comparaison témoins pré-symptomatiques, -0.09 pour la comparaison témoins vs. patients, et -0.11 pour la comparaison pré-symptomatiques vs. patients.

### 3.2.4 Intérêts des différentes modalités

Afin d'évaluer l'intérêt de chacune des modalités : miARNs ($n = 589$ ou $n = 68$, selon que l'on applique une sélection de variables ou non), imagerie médicale ($n = 87$) et donnée démographique ($n = 0$ dans [31] et $n = 1$ lorsqu'on utilise l'âge dans [34] ), nous avons évalué séparément chacune des modalités dans le modèle [34] . Les résultats sont présentés dans la table 3.1.

Brièvement, on note que les miARNs sont la modalité la plus informative pour séparer les témoins des pré-symptomatiques, tandis que les données de neuro-imagerie sont les plus informatives pour séparer les pré-symptomatiques des patients. Les données démographiques sont ici réduites à une seule variable, l'âge. On notera que le groupe des patients dans la cohorte étudiée est sensiblement plus âgé que les deux autres groupes (voir les paramètres démographiques dans [31] ), d'où les résultats corrects de l'âge pour séparer les patients des deux autres groupes. Dans
<figure><img src="image_29.png" /></figure>

FIGURE 3.5: Courbes ROC (receiver operating characteristic) moyennes pour les comparaisons 2 à 2 entre groupes (100 splits aléatoires), pour notre VAE supervisé (courbe bleue) et pour un modèle de type EBM (pointillés noirs). Les zones colorées correspondent à une déviation standard. La ligne rouge indique le hasard.

l'ensemble, les différentes modalités semblent donc capturer des aspects complémentaires du score de progression global.
<table><caption>TABLE 3.1: Moyenne et écart-type de l'aire sous la courbe ROC (co-horte DFT/ALS), calculés à partir de 100 folds différents, pour évaluer l'impact de chaque modalité unique.</caption><thead><tr><th>Comparaison</th><th>miRNAs</th><th>neuroimagerie</th><th>démographie (âge)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Témoin vs. Pré-sympto</td><td>0.73 ± 0.12</td><td>0.60 ± 0.15</td><td>0.40 ± 0.13</td></tr><tr><td>Témoin vs. Patient</td><td>0.81 ± 0.18</td><td>0.97 ± 0.04</td><td>0.81 ± 0.14</td></tr><tr><td>Pré-sympto vs. Patient</td><td>0.67 ± 0.19</td><td>0.96 ± 0.05</td><td>0.91 ± 0.09</td></tr></tbody></table>

## 3.3 Ce que nous avons appris dans ce chapitre

Il existe un besoin de définir des scores de progression de maladie qui soient adaptés aux maladies de faible prévalence et d'évolution lente. La faible prévalence limite la taille des cohortes étudiées, tandis que l'évolution lente rend le recueil de données longitudinales pour alimenter les cohortes irréaliste.

Nous avons proposé un nouveau modèle permettant d'utiliser des données multimodales transversales basé sur des auto-encodeurs variationnels en 3 étapes : (1) estimation de l'espace latent, (2) définition dans l'espace latent d'une courbe définissant la progression de la maladie ; et enfin (3) estimation du DPS d'un individu par projection orthogonale de ses coordonnées dans l'espace latent sur la courbe principale de la trajectoire. Pour ce modèle, nous avons montré :

1. que dans le cas de la démence fronto-temporale (DFT) et de la sclérose latérale amyotrophique (ALS), le modèle proposé est plus performant que le modèle à base d'évènements (EBM) ;

2. que l'introduction d'une étape préliminaire de sélection de variables permet d'améliorer les performances du modèle ;

3. que l'introduction d'une branche de classification dans le VAE (VAE supervisé) permet d'améliorer les performances du modèle ;

4. que les différents types de données d'entrée (miARNs et imagerie) sont complémentaires.

→ **Méthodes** : analyse conjointe de données multimodales ; apprentissage ; classification ; autoencodeurs variationnels ; scores de progression de maladie.

→ **Domaines d'application** : maladies neurodégénératives et scores de progression de maladie (données hétérogènes : imagerie médicale + transcriptomique type miARNs).

→ **Collaborations** : Olivier Colliot à l'Institut du Cerveau (ICM - Inserm, CNRS, AP-HP - Hôpital Pitié-Salpêtrière) et Inria (équipe-projet Aramis) dans le cadre de l'Inria Project Lab (IPL) Neuromarker.

→ **Travaux en lien** : [31] [34]
→ **Publications jointes en support en Annexe C :**

[31] Kmetzsch V, **Becker E**, Saracino D, Anquetil V, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Le Ber I, Colliot O and the PREV-DEMALS study group.
A multimodal variational autoencoder for estimating progression scores from imaging and microRNA data in neurodegenerative diseases.
SPIE Medical Imaging 2022, 2022

[34] Kmetzsch V, **Becker E**, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Le Ber I, and Colliot O.
Disease progression score estimation from multimodal imaging and mi-croRNA data using supervised variational autoencoders.
accepted in IEEE J Biomed Health Inform
<figure><img src="image_30.png" /></figure>
# Chapter 4

## Approche systémique pour l'intégration de données unimodales et multimodales

Les travaux présentés dans cette section concernent l'intégration de données homogènes ou hétérogènes avec une approche systémique, c'est à dire en modélisant les relations connues entre les différentes variables (contrairement aux chapitres 2 et 3). Ces relations connues sont issues de bases de données de connaissances.

Lors de mon séjour post-doctoral à Marseille et avec l'aide de Christine Brun (IBDM puis TAGC) et Alain Guénoche (IML), j'ai travaillé sur l'analyse de l'interactome de différentes espèces dans le but d'analyser la topologie de cet interactome et d'en déduire des informations fonctionnelles sur les protéines qui le composent.

Plus récemment, au cours des 3 dernières années au sein de l'équipe Dyliss, j'ai été amenée à travailler sur l'extraction et l'analyse des réseaux biologiques adaptés à différentes problématiques, notamment dans le cadre des stages de master de Camille Juigné et Marc Melkonian, co-encadrés avec Gwenaël Rabut (INSERM, IGDR) et Olivier Dameron (IRISA, Dyliss), ainsi que dans le cadre de la thèse de Camille Juigné, que je co-encadre avec Florence Gondret (INRAe, UMR Pegase).

### 4.1 Systèmes biologiques et extraction de réseaux de haute qualité

L'intégration de données biologique homogènes ou hétérogènes peut être envisagée sous un aspect systémique, en intégrant la connaissance des relations entre entités. Cependant, extraire la connaissance adéquate des différentes banques de données et trouver un formalisme de représentation adéquat reste un sujet de recherche.

Le premier défi pour l'extraction de réseaux de qualité est celui de l'exhaustivité et de l'agrégation des connaissances. En effet, les données biologiques étant fragmentées dans plusieurs bases, recouper et regrouper les informations contenues dans ces bases est un premier challenge (Aranda et al., 2011; Porras et al., 2020; Schreiber et al., 2019; Villaveces et al., 2015). Le second défi est celui de l'abstraction. En effet, il n'existe actuellement pas de formalisme unifié pour traiter l'information biologique de nature différente ou à différentes échelles (Schreiber et al., 2019). L'abstraction choisie doit de plus être en adéquation avec la problématique biologique associée : une extraction ciblée de certaines connaissances, représentées par un formalisme *via* lequel une analyse est possible. Enfin, le dernier défi est celui de la reproductibilité,
pour déterminer quelles connaissances sont fiables parmi les nombreuses connaissances qui peuplent les bases de données (Alonso-López et al., 2016; Alonso-López et al., 2019; Szklarczyk et al., 2021).

## 4.2 Le défi de l'exhaustivité et de l'agrégation des connaissances

Les informations sur les interactions entre entités biologiques sont collectées dans de nombreuses bases de données primaires avec leur propre thématique et leur propre processus de curation. Afin de limiter l'impact de cet éparpillement de l'information, la communauté s'est organisée afin de standardiser des formats communs, tels que PSI-MI (Hermjakob et al., 2004), BioPAX (Demir et al., 2010a) etc... Cependant, l'adoption de ces formats par la communauté ne solutionne pas tous les problèmes. L'adoption de formats communs par la communauté facilite l'agrégation des connaissances en résolvant le problème d'interopérabilité, afin de fournir des ensembles de données plus exhaustifs. Cependant, le fait que ces interactions soient stockées dans plusieurs bases complémentaires soulève un problème d'intégration. Le fait que ces bases se recouvrent partiellement soulève un problème de redondance, qu'il faut détecter et supprimer correctement.

### 4.2.1 Intégration de bases de données au format BioPAX

Les formats de données tels que BioPAX (Demir et al., 2010a) ont été introduits afin d'exprimer avec une grande finesse la réalité des connaissances sur les processus biologiques à différentes échelles, de l'échelle moléculaire à l'échelle cellulaire. Son principal avantage est d'éviter l'éparpillement d'informations dans différentes bases de données qui ne seraient pas interopérables. L'interopérabilité facilite (1) l'échange d'informations et donc leur agrégation, et (2) leur utilisation en permettant d'avoir des procédures de traitement et librairies de fonctions qui fonctionnent sur différentes bases de données. Ainsi, grâce à l'interopérabilité du format BioPAX, des millions d'interactions organisées au sein de centaines de voies sont disponibles, pour de nombreux organismes (Demir et al., 2010a). Nous assistons à une croissance rapide des sources de données au format BioPAX librement disponibles, parmi lesquelles Reactome (Fabregat et al., 2016), Panther (Mi et al., 2013; Thomas et al., 2022, 2003), BioCyc (Karp et al., 2005; Romero et al., 2005), HPRD (Peri et al., 2003)...ainsi que des librairies pour leur utilisation (Bauer-Mehren et al., 2009; Demir et al., 2013).

Dans le cadre d'un projet de recherche dédié à l'étude des voies métabolique et de leur régulation, nous avons d'abord considéré individuellement 21 bases de données sources au format BioPAX collectées sur Pathway Commons (Rodchenkov et al., 2020b). Nous avons développé une bibliothèque python open source, PAX2GRAPHML [29], qui fournit un moyen générique de filtrer les interactions et de manipuler les réseaux sous forme de graphes à partir de n'importe quelle source de données BioPAX. Elle permet un import et une exploitation simplifiés et efficaces des sources de données BioPAX. Elle fournit deux types d'abstractions discutées au chapitre 4.3 pour représenter l'information contenue dans les fichiers BioPAX au moyen de graphes. Le format choisi pour représenter ces graphes est le format GraphML, basé sur XML, qui se compose d'un langage pour décrire les propriétés structurelles d'un graphe,
et d'extensions flexibles pour ajouter des données spécifiques à une application<fnref n="1" />. Ce format est compatible avec de nombreuses libraires de graphe Python et R, ce qui permettra ensuite de profiter de la puissance de calcul de ces librairies pour analyser les graphes extraits (Csardi and Nepusz, 2006; Hagberg et al., 2008).

Puisqu'il existe de nombreuses sources au format BioPAX, notamment sur le site de PathwayCommons, deux schémas d'intégration sont disponibles *via* PAX2GRAPHML :

* Import de chaque source de données au format BioPAX vers un graphe en GraphML, puis fusion des graphes sélectionnés : **procédure import multiple** → **fusion**.

Cette procédure chronophage a été exécutée sur une machine virtuelle avec 48G de RAM et a duré plus d'une semaine. Aussi, pour faciliter la visualisation des résultats de cette procédure, les fichiers générés sont également téléchargeables sur le site PAX2GRAPHML en tant que ressources de données prêtes à l'emploi et mise à jour automatiquement à l'aide de BIOMAJ (Filangi et al., 2008), un logiciel de synchronisation et de traitement automatisé des banques de données.

* Import du fichier global de PathwayCommons pour générer un unique graphe, puis filtrage de celui-ci pour ne conserver que les sources qui nous intéressent : **procédure import unique** → **filtrage**.

Après import du graphe généré par PAX2GRPAHML d'après le fichier global de PathwayCommons, un filtrage peut être appliqué pour générer des fichiers GraphML ne contenant que les sources sélectionnées. Grâce à la disponibilité au téléchargeement sur le site de PAX2GRPAHML du fichier GraphML de PathwayCommons global, les utilisateurs peuvent ainsi sélectionner n'importe quel sous-ensemble de bases de données, ou filtrer en fonction d'autres propriétés des sommets du graphe.

La table 4.1, issue de [29], présente les différents schémas d'agrégation et leur résultats. On distingue dans la première section (1) le fichier global de PathwayCommons, et (2 à 11) les fichiers individuels correspondant à chaque source de données au format BioPAX disponible sur PathwayCommons. La section suivante, (1) - (2) - (7), illustre la procédure import unique → filtrage, puisqu'on part du fichier global de PathwayCommons (1), duquel on retire les sources CTD (2) et Mirtarbase (7). Enfin, la dernière section présente la procédure import multiple → fusion.

### 4.2.2 Redondances dans les bases de données d'interactions protéine - protéine

Dans le cas des bases d'interactions protéine-protéine, plusieurs méta-bases de données agrègent les bases de données primaires pour fournir des ensembles de données plus exhaustifs. Ceci a été rendu possible par l'adoption du format miTab, le format d'export des interactions défini par PSI-MI (1.2.3), et l'utilisation commune de l'ontologie MI qui décrit les méthodes de détection des interactions par toutes les bases de données primaires. Cependant, les bases de données primaires sont partiellement redondantes car certaines publications rapportant des interactions sont intégrées dans plusieurs bases de données primaires. La simple agrégation peut donc introduire un biais si ces redondances ne sont pas identifiées et éliminées. Pour surmonter ces biais, les méta-bases de données s'appuient sur le

<footnote n="1">¹http://graphml.graphdrawing.org/</footnote>
<table><caption>TABLE 4.1: Données disponibles dans Pathway Commons (PC) et leur transformation en graphes de réactions régulées avec PAX2GRAPHML. Les sommets sont soit des réactions soir des entités (protéines, petites molécules...). Ces graphes peuvent être téléchargés sur le site de PAX2GRAPHML.</caption><thead><tr><th>sources de données</th><th>sommets</th><th>dont réactions</th><th>dont entités</th><th>arêtes</th></tr></thead><tbody><tr><td>(1) PC* all sources</td><td>636,038</td><td>543,880</td><td>92,158</td><td>1,320,090</td></tr><tr><td>(2) CTD</td><td>84,267</td><td>58,498</td><td>25,769</td><td>174,110</td></tr><tr><td>(3) HumanCyc</td><td>8,165</td><td>4,160</td><td>4,005</td><td>24,633</td></tr><tr><td>(4) INOH</td><td>6,792</td><td>4,652</td><td>2,140</td><td>16,222</td></tr><tr><td>(5) Intact**</td><td>2,187</td><td>563</td><td>1,624</td><td>2,869</td></tr><tr><td>(6) KEGG***</td><td>4,696</td><td>3,123</td><td>1,573</td><td>14,093</td></tr><tr><td>(7) Mirtarbase</td><td>413,366</td><td>395,703</td><td>17,663</td><td>776,342</td></tr><tr><td>(8) Panther</td><td>4,198</td><td>1,862</td><td>2,336</td><td>6,870</td></tr><tr><td>(9) PID</td><td>14,043</td><td>8,850</td><td>5,193</td><td>22,203</td></tr><tr><td>(10) Reactome</td><td>37,976</td><td>16,435</td><td>21,541</td><td>67,118</td></tr><tr><td>(11) Reconx</td><td>10,321</td><td>6,061</td><td>4,260</td><td>39,888</td></tr><tr><td>(1) - (2) - (7)</td><td>159,895</td><td>93,983</td><td>65,912</td><td>391,893</td></tr><tr><td>(9) + (3)</td><td>19,632</td><td>11,255</td><td>8,377</td><td>30,291</td></tr><tr><td>(9) + (3) + (6)</td><td>24,197</td><td>14,379</td><td>9,818</td><td>36,748</td></tr><tr><td>(9) + (3) + (6) + (10)</td><td>53,425</td><td>23,729</td><td>29,696</td><td>89,034</td></tr></tbody></table>

format unifié PSI-MI et l'ontologie MI, mais cette stratégie ne tire pas pleinement parti de la richesse sémantique de l'ontologie MI pour détecter les redondances, ce qui conduit à ne pas détecter un certain nombre de redondances.

Dans le cadre du stage de Master 2 de Camille Juigné puis de Marc Melkonian, co-encadré avec Gwenaël Rabut (Institut de Génétique et Développement de Rennes), nous avons proposé une définition claire de la redondance entre entrées des différentes bases de données (curation events), en exploitant la richesse sémantique de l'ontologie MI [30].

Formellement, considérons une paire de protéines (A, B). Les bases de données primaires telles que BioGRID ou IntAct peuvent fournir plusieurs entrées (ie. curation events) correspondant à cette paire de protéines, qui diffèrent par la méthode de détection, l'identifiant PubMed, ou les deux. Une entrée dans ces bases de données peut donc être définie par un quadruplet

$$ (A, B, M_i, P_x) $$

où A et B sont les protéines, $M_i$ est la méthode de détection (IDM pour Interaction Detection Method), et $P_x$ est l'identifiant PubMed de l'article original décrivant leur interaction. Lorsque deux entrées ne diffèrent que par la méthode de détection, cela devrait signifier que l'article original a observé l'interaction plusieurs fois avec des techniques expérimentales différentes. Lorsque deux entrées ne diffèrent que par l'identifiant PubMed, cela signifie que l'interaction a été reproduite dans deux études distinctes utilisant la même méthode de détection.

<footnote>* 'PC' version 12, 09/2019. ** Intact restricted to complexes *** KEGG 07/2011 (only human, hsa* files)</footnote>
Pour les méta-bases de données telles que APID, alimentées par l'agrégation d'autres bases de données, une entrée peut être définie par un quintuplet (A, B, Mᵢ, Pₓ, Dₐ) où Dₐ indique la base de données primaire indexant l'interaction. Nous considérons que deux entrées Eᵢ et Eⱼ présentent une **redondance explicite** si et seulement si :

$$ \begin{cases} E_i = (A, B, M_i, P_x, D_a) \\ E_j = (A, B, M_j, P_x, D_b) \end{cases} $$

tandis que Eᵢ et Eⱼ présentent une **redondance implicite** si et seulement si :

$$ \begin{cases} E_i = (A, B, M_i, P_x, D_a) \\ E_j = (A, B, M_j, P_x, D_b) \\ M_i \text{ est un ancêtre (parent direct ou indirect) de } M_j \end{cases} $$

Il faut remarquer que la redondance explicite est symétrique, tandis que la redondance implicite est antisymétrique et dans la définition précédente, Eᵢ n'apporte aucune information supplémentaire par rapport à Eⱼ même si on a l'impression (trompeuse) que Eᵢ et Eⱼ font appel à des méthodes de détection différentes. La redondance explicite correspond à ce qui est actuellement détecté par les méta-bases, et la redondance implicite est en général ignorée.

La figure 4.1 illustre les différents cas de figures. Pour un triplet (A, B, Pₓ) commun à deux entrées, on distinguera le cas où (violet, panel B) chaque entrée correspond à une méthode de détection distincte, et il n'y a pas de redondance mais bien 2 détections rapportées dans une même publication; (jaune, panel C) les deux entrées ont la même méthode de détection, l'information est donc explicitement redondante; (bleu, panel D) les deux entrées ont deux méthodes de détection différentes, mais l'une d'elle est un ancêtre de l'autre : ce cas de figure signifie que les bases de données primaires ont annoté une même détection avec deux termes de précision différente dans l'ontologie MI, et l'information est implicitement redondante.

Après avoir proposé une définition précise de la redondance explicite et implicite, nous avons montré que les deux peuvent être facilement détectées en utilisant les technologies du Web Sémantique [30]. Nous avons poursuivi ce travail afin d'identifier la proportion de redondances explicites et implicites présentes dans les méta-bases de données d'interactions, et de quantifier l'impact de l'élimination de ces redondances. Au sein de la méta-base de données APID, nos résultats montrent que si les redondances explicites ont été détectées par le processus d'agrégation d'APID, environ 15% des entrées APID sont implicitement redondantes et devraient être éliminées lors du processus d'agrégation.

Une analyse fine de ces redondances implicites montrent qu'elles résultent principalement de l'agrégation de bases de données primaires distinctes (redondance inter-bases, 91% et 95% des redondances implicites respectivement chez l'homme et la levure), alors qu'une faible proportion est détectée entre entrées d'une même bases de données (redondances intra-base). Les tables 4.2 et 4.3 présentent une analyse de l'origine de ces redondances implicites inter-bases, qui souligne que des redondances implicites sont observées entre quasiment tous les couples de bases de données primaires. Le couple de bases de données qui génère la plus grande partie des redondances implicites est BioGRID et IntAct, à la fois chez l'homme et chez la levure, ce qui est cohérent avec le fait que ce sont les deux bases de données sources qui contribuent le plus à APID.
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>FIGURE 4.1: Illustration des différents types de redondance entre bases de données primaires. (A) Curation events provenant de deux bases primaires (DB_1 et DB_2). En fonction de la méthode de détection de l'interaction du curation event dans DB_1 et DB_2, on peut identifier qu'il n'y a pas de redondance (violet), une redondance explicite (jaune), ou une redondance implicite (bleu). Les représentations de l'ontologie Molecular Interactions associées aux différents cas de figures sont présentées dans les panels (B), (C) et (D). Figure extraite de [30].</figcaption></figure>

Le fait que des redondances implicites soient observées entre des termes très différents de l'ontologie PSI-MI suggère que les différentes bases de données primaires ont des politiques différentes en matière d'annotation des méthodes de détection d'interactions (IDM), comme cela a déjà été noté pour IntAct et BioGRID (Alonso-López et al., 2016). En effet, nous avons observé qu'IntAct et DIP utilisent un large éventail d'IDMs pour les PPIs (165 pour IntAct et 89 pour DIP), tandis que BioGRID, HPRD et BioPlex en utilisent beaucoup moins (12, 3 et 1 IDM, respectivement) et des IDM plus généraux. Ainsi, les fortes divergences dans les politiques d'annotation des bases de données sont la principale source des redondances implicites entre les bases de données.

Dans l'ensemble, nous avons observé dans [30] que la redondance implicite (i) se produit entre un large éventail de termes de l'ontologie PSI-MI, quelle que soit l'espèce, (ii) résulte principalement de l'intégration de différentes bases de données primaires primaires différentes avec des politiques d'annotation différentes, et (iii) se produit pour toutes les bases de données. Par conséquent, si l'intégration de différentes bases de données PPI est nécessaire pour mieux couvrir l'interactome, une attention particulière doit être portée à la détection des les redondances implicites généralisées entre les bases de données.

Pour cela, la Human Proteome Organization Proteomics Standards Initiative (HUPO-PSI) a mis au point la spécification PSICQUIC et des services web qui facilitent l'extraction de données de plusieurs bases de données, aident à la gestion des données et qui facilitent leur intégration, mais ne traitent pas de la détection de la redondance (Aranda et al., 2011; Toro et al., 2013). De plus, dans plusieurs (méta-)bases de données, les IPPs sont annotées par un score de confiance, qui est calculé en utilisant le nombre de preuves expérimentales indépendantes et la nature des IDMs (Villaveces et al., 2015). Pour être pertinents, ces algorithmes nécessitent des jeux de données fiables et non redondants. Par conséquent, plusieurs bases de données
<table><caption>TABLE 4.2: Origine des redondances implicites chez l'homme. La base de donnée (BDD) utilisant le terme le moins précis est indiquée dans la colonne de gauche.</caption><thead><tr><th>BDD utilisant<br>le PSI-MI ancetre</th><th>BDD utilisant<br>le PSI-MI enfant</th><th>Occurrences des<br>red. implicites</th><th>Pourcentage des<br>red. implicites</th></tr></thead><tbody><tr><td>BioGRID</td><td>IntAct</td><td>90368</td><td>84.95%</td></tr><tr><td>BioGRID</td><td>BioGRID</td><td>9030</td><td>8.49%</td></tr><tr><td>HPRD</td><td>IntAct</td><td>5309</td><td>4.99%</td></tr><tr><td>BioGRID</td><td>DIP</td><td>1049</td><td>0.99%</td></tr><tr><td>IntAct</td><td>IntAct</td><td>440</td><td>0.41%</td></tr><tr><td>IntAct</td><td>BioGRID</td><td>73</td><td>0.07%</td></tr><tr><td>DIP</td><td>BioGRID</td><td>43</td><td>0.04%</td></tr><tr><td>DIP</td><td>IntAct</td><td>31</td><td>0.03%</td></tr><tr><td>DIP</td><td>DIP</td><td>18</td><td>0.02%</td></tr><tr><td>IntAct</td><td>DIP</td><td>12</td><td>0.01%</td></tr><tr><td>Intra-database red.</td><td></td><td>9488</td><td>8.92%</td></tr><tr><td>Inter-database red.</td><td></td><td>96885</td><td>91.08%</td></tr></tbody></table>

<table><caption>TABLE 4.3: Origine des redondances implicites chez la levure. La base de donnée (BDD) utilisant le terme le moins précis est indiquée dans la colonne de gauche.</caption><thead><tr><th>BDD utilisant<br>le PSI-MI ancetre</th><th>BDD utilisant<br>le PSI-MI enfant</th><th>Occurrences des<br>red. implicites</th><th>Pourcentage des<br>red. implicites</th></tr></thead><tbody><tr><td>BioGRID</td><td>IntAct</td><td>33426</td><td>71.52%</td></tr><tr><td>BioGRID</td><td>DIP</td><td>10091</td><td>21.59%</td></tr><tr><td>BioGRID</td><td>BioGRID</td><td>2075</td><td>4.44%</td></tr><tr><td>DIP</td><td>IntAct</td><td>426</td><td>0.91%</td></tr><tr><td>DIP</td><td>BioGRID</td><td>383</td><td>0.82%</td></tr><tr><td>IntAct</td><td>IntAct</td><td>244</td><td>0.52%</td></tr><tr><td>IntAct</td><td>BioGRID</td><td>81</td><td>0.17%</td></tr><tr><td>IntAct</td><td>DIP</td><td>9</td><td>0.02%</td></tr><tr><td>DIP</td><td>DIP</td><td>4</td><td>0.01%</td></tr><tr><td>Intra-database red.</td><td></td><td>2323</td><td>4.97%</td></tr><tr><td>Inter-database red.</td><td></td><td>44416</td><td>95.03%</td></tr></tbody></table>

primaires ont décidé de coordonner leurs efforts de curation dans le cadre du consortium consortium IMEx afin de fournir un ensemble unique et non redondant de données d'interactions protéiques annotées de manière homogène (Orchard et al., 2012; Porras et al., 2020). Les principales bases de données du consortium IMEx coordonnent et partagent leurs efforts de curation afin de produire un ensemble de données non redondantes de preuves expérimentales d'IPP (Orchard et al., 2012). Les membres d'IMEx utilisent des règles de curation pour harmoniser leur processus d'annotation. L'unicité des entrées est assurée en imposant qu'une publication ne soit intégrée que dans une seule base de données, et toutes les données sont centralisées dans IntAct. Ce travail du consortium IMEx et le nôtre, basés sur les technologies du Web Sémantique, soulignent la nécessité d'une approche générale pour assembler des ensembles de données d'interactions non redondantes.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>FIGURE 4.2: Différentes représentation du complexe composé de 3 partenaires A, B et C. Sur la première ligne: (gauche) un complexe dont les composants sont A et le complexe B-C; (milieu) un complexe dont les composants sont B et le complexe A-C; (droite) un complexe dont les composants sont le complexe A-B et C. Sur la seconde ligne, un complexe aplani dont les composants sont A, B et C.</figcaption></figure>

### 4.2.3 Redondances dans les bases de données BioPAX

Nos travaux sur les bases de données au format BioPAX (Demir et al., 2010a), et notamment sur Reactome (Fabregat et al., 2016), dans la cadre de la thèse de Camille Juigné, nous ont permis d'identifier de la redondance implicite dans les données de Reactome. Ici, c'est une utilisation très répandue mais non-conforme aux spécifications du format BioPAX qui induit une redondance entre certains complexes, et ce point particulier sera discuté dans la partie 4.3.1.

Camille Juigné a pu identifier des complexes redondants au sein de Reactome. Ces redondances sont implicites car elles sont masquées par une description arborescente différente des composants des complexes, comme le montre l'illustration 4.2. Pour un complexe composé de 3 partenaires (A, B, C), nous avons trouvé au sein de Reactome humain des redondances sous la forme (A, (B, C)), ou (B, (C, A)), ou ((A, B), C), les quantités stochiométriques des différentes partenaires étant équivalentes dans les différentes descriptions. Il s'agit donc de redondances implicites non détectées.

On notera que, comme nous le discuterons dans la section 4.3, selon les spécifications du format BioPAX depuis BioPAX2.0, la seule forme correcte pour ce complexe est sa version aplanie (A, B, C), dont l'utilisation évite ces redondances implicites. C'est donc le non-respect de ces spécifications qui entraîne cette redondance implicite dans les fichiers BioPAX de la banque Reactome.

Les travaux de Camille Juigné ont abouti à la détection de nombreuses redondances dans la base de données Reactome [33]. Les redondances peuvent être détectées entre des paires d'entités mais peuvent se produire entre plus de deux entités, comme l'illustre la figure 4.2 avec 3 complexes équivalents. Dans cet exemple, 3 redondances ($X_1, X_2$), ($X_2, X_3$), ($X_1, X_3$) sont ainsi détectées, correspondant à la taille d'une clique maximale à 3 sommets.
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>FIGURE 4.3: Différentes représentation d'un même complexe au sein de Reactome. (a) le participant p-STATs R-HSA-1433413 participe au complexe principal avec une stoechiométrie de 2. (b) le participant p-STATs R-HSA-1433413 participe au complexe principal via un sous-complexe composé de p-STATs R-HSA-1433413 en 2 exemples.</figcaption></figure>

Parmi les 14 987 complexes de la base Reactome originale, Camille Juigné a écrit une requête SPARQL qui a identifié 137 paires de complexes redondants, impliquant 249 complexes distincts. Ces redondances constituaient 121 cliques maximales de complexes équivalents (taille de la clique allant de 2 à 6 complexes), ce qui correspond à 128 complexes en excès. En d'autres termes, nous avons mis en évidence 121 groupes de 2 à 6 complexes redondants que nous avons identifiés en recherchant les paires de complexes redondants. Ces redondances sont explicites, car elles ne sont pas masquées par une définition arborescente des composants des complexes.

Après avoir aplani les complexes représentés récursivement, la requête a permis d'identifier 217 paires de complexes redondants impliquant 347 complexes distincts. Ils constituaient 164 cliques maximales de complexes équivalents (taille de la clique comprise entre 2 et 6), correspondant à 183 complexes en excès. La procédure d'aplanissement, en remplaçant la représentation arborescente des complexes par une représentation plane des complexes, a permis de détecter davantage de redondances. Ces redondances étaient implicites, puisqu'elles étaient masquées par une définition arborescente des composants des complexes, et sont devenues explicites avec la description plane des composants des complexes.

La figure 4.3 illustre un exemple de redondance identifiée : dans cet exemple, l'un
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>FIGURE 4.4: Sous-ensemble de relations permettant de décrire un complexe conformément à l'ontologie BioPAX</figcaption></figure>

des participant participe au complexe principal soit en tant que participant direct en 2 exemplaires (coef. stoechiométrique = 2), soit sous forme d'un sous complexe (homo-dimère).

## 4.3 Le défi de l'abstraction

Des ontologies telles que BioPAX ont été introduites afin d'exprimer avec une grande finesse la réalité des connaissances sur les processus biologiques à différentes échelles (de l'échelle moléculaire et à l'échelle cellulaire). L'ontologie BioPAX est qualitative, très riche et expressive, et parvient à concilier les différentes échelles de description de l'information biologique. Cette expressivité raffinée complexifie énormément l'extraction d'informations pertinentes de données stockées au format BioPAX. À titre d'exemple, la figure 4.4 illustre simplement une création de complexe entre Ca2+ et un dimère d'ANO2. On peut constater que l'information utile est structurée via de nombreuses relations qui stockent chacune une partie précise de l'information. Ainsi la manipulation de ce format de données riche et orienté vers la connaissance, qui capture finement la complexité des réseaux biologiques, nécessite des outils appropriés.

Identifier un formalisme expressif et informatiquement exploitable est un défi lorsqu'on s'intéresse à différentes échelles biologiques simultanément. Deux problématiques s'entremêlent ici :

1. l'extraction ciblée du sous-ensemble d'informations pertinentes pour un problème donné ;

2. le choix du formalisme pour représenter l'information disponible, de façon à ce que des analyses informatiques puissent analyser les propriétés du systèmes ou inférer des résultats.

La section 4.3.1 présente un outil permettant d'aborder la complexité de BioPAX. La section 4.3.2 présente un outil permettant d'aborder la complexité de la réalité biologique.
4.3.1 Topologie des complexes dans les données au format BioPAX

Les complexes sont définis dans BioPAX comme des entités physiques composées d'autres entités physiques : « *physical entities whose structure is comprised of other physical entities bound to each other non-covalently, at least one of which is a macromolecule (e.g. protein, DNA, or RNA)* » . La spécification BioPAX mentionne cependant explicitement que les complexes ne doivent pas être définis de manière récursive ou arborescente : « *complexes should not be defined recursively [...] i.e. a complex should not be a component of another complex. [...] Exceptions are black-box complexes (i.e. complexes in which the component property is empty), which may be used as components of other complexes because their constituent parts are unknown* » .

Cette contrainte a été introduite lors du passage de la norme BioPAX1.0 à la
norme BioPAX2.0, et la justification donnée pour l'introduction de cette contrainte
était que l'utilisation d'une arborescence pourrait être interprétée par certains util-
isateurs comme un ordre dans l'assemblage macromoléculaire : « *The reason for keep-
ing complexes flat is to signify that there is no information stored in the way complexes are
nested, such as assembly order. Otherwise, the complex assembly order may be implicitly en-
coded and interpreted by some users, while others created hierarchical complexes randomly,
which could lead to data loss.* ». L'introduction de cette contrainte a également un effet
direct sur la topologie du graphe des relations BioPAX puisqu'elle permet de rap-
procher les différentes entités participant à un complexe.

Toutes les principales bases de données de référence sur les voies métaboliques sont disponibles au format BioPAX. Parmi elles, Reactome est une base de données décrivant les voies biologiques, disponible en ligne, gratuite, et d'excellente qualité du fait d'un processus de curation efficace (Gillespie et al., 2021). Dans le cadre des travaux de thèse de Camille Juigné, nous avons noté la présence de nombreux complexes décrits de façon récursive dans l'export BioPAX de Reactome. Leur présence dans Reactome pose problème, non seulement car ils ne sont pas conformes aux spécifications BioPAX, mais aussi car ils ont un effet important sur la topologie du graphe des relations BioPAX en allongeant artificiellement les chemins entre des entités participant à un même complexe. Ainsi, dans la figure 4.5, le plus court chemin entre PCNA et DNA2 est de longueur 8, alors que ces 2 protéines participent au même complexe R-HSA-68466 (Okazaki fragment-Flap-RPA heterotrimer-dna2). Il est intéressant de noter que ces complexes invalides ne sont pas détectés par le validateur BioPAX 2 (Rodchenkov et al., 2013).

En utilisant des requêtes SPARQL, les travaux de Camille Juigné montrent que la base de données Reactome contiennent une grande fraction de complexes définis récursivement, c'est-à-dire dont les participants contiennent au moins un complexe [33]. Nous avons quantifié la fraction de complexes invalides avant de corriger ceux-ci. Les résultats sont présentés dans la table 4.4 : environ 39% des complexes Reactome humains sont invalides car définis récursivement. L'importante fraction de complexes invalides n'est pas spécifique à l'homme et se retrouve avec toutes les espèces testées présentes dans Reactome : les 13 espèces testées présentent toutes entre 30% (Plasmodium falciparum) et 40% (Sus scrofa, Bos taurus, Canis familiaris, Gallus gallus) de complexes invalides.

On note que cette définition arborescente des complexes peut être profonde. La fig-
ure 4.6 présente la distribution de la profondeur de définition des complexes chez

<footnote n="2">²https://biopax.baderlab.org/check</footnote>
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>FIGURE 4.5: Complexe R-HSA-68466 défini récursivement sur 10 niveaux dans la base de données Reactomev81 chez *H. Sapiens*. Les complexes sont en bleu, les protéines et petites modélculles en rose.</figcaption></figure>

l'homme. On constate la présence de complexes de profondeur 0, qui correspondent aux black-box complexes, des complexes de profondeur 1, qui sont conformes aux spécifications BioPAX, mais aussi de nombreux complexes non valides (tous ceux dont la profondeur est supérieure ou égale à 2). Dans la bases de données Reactome humaine, la profondeur maximale atteint 10 imbrications, pour un exemple, voir figure 4.5.

La correction de ces complexes invalides mène à une représentation aplanie de ces complexes : toutes les entités physiques participant au complexe sont alors ex-plicitement listées *via* la propriété component. Elle a pour effet direct et immédiat d'augmenter significativement le nombre d'entités listées *via* la propriété component [33]. À titre d'exemple, chez l'Homme, le nombre moyen d'entités participant di-rectement à un complexe est de 2.2 avant la correction et de 4.3 après la correction. Chez l'Homme, le plus gros complexe est constitué de 65 entités avant correction, contre 151 après. Dans [33], nous montrons que les résultats chez les autres es-pèces sont similaires. (table 4.4).

### 4.3.2 Extraction « à façon » dans des données au format BioPAX

En préparation au travail de thèse de Camille Juigné, nous avons conçu l'outil PAX2GRAPHML afin d'extraire des sous-ensembles de données à partir de fichiers au format BioPAX [29]. Dans l'outil PAX2GRAPHML, il est possible d'extraire des données selon (i) les bases de données sources, que l'on peut choisir et combiner à façon lors de l'import, mais aussi (ii) en filtrant les graphes obtenus, en se basant sur certaines propriétés.
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>FIGURE 4.6: Profondeur de définition récursive des complexes dans la base de données Reactomev81 chez *H. Sapiens*.</figcaption></figure>

<table><caption>TABLE 4.4: Pour chaque organisme dans la base de données Reactome : le nombre d'entités physique de type Complexes présentes, le nombre et la fraction de celles-ci étant définies de façon invalide, puis le nombre moyen de participants à un complexe avant et après la procédure de correction.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Organisme</th><th rowspan="2">Complexes</th><th rowspan="2">dont invalides</th><th colspan="2">Ave. direct components</th></tr><tr><th>before fixing</th><th>after fixing</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>homo sapiens</i></td><td>14987</td><td>5833 (39%)</td><td>2.2 (std 2.6) max 65</td><td>4.3 (std 8.7) max 151</td></tr><tr><td><i>mus musculus</i></td><td>10707</td><td>4235 (39%)</td><td>2.3 (std 2.9) max 65</td><td>4.5 (std 9.0) max 151</td></tr><tr><td><i>sus scrofa</i></td><td>9022</td><td>3638 (40%)</td><td>2.3 (std 2.9) max 65</td><td>4.7 (std 9.4) max 151</td></tr><tr><td><i>bos taurus</i></td><td>9412</td><td>3773 (40%)</td><td>2.3 (std 2.9) max 65</td><td>4.6 (std 9.2) max 147</td></tr><tr><td><i>s. cerevisiae</i></td><td>1662</td><td>517 (31%)</td><td>2.5 (std 3.3) max 50</td><td>6.0 (std 12.4) max 106</td></tr><tr><td><i>c. elegans</i></td><td>4350</td><td>1560 (36%)</td><td>2.4 (std 3.3) max 64</td><td>5.0 (std 10.4) max 149</td></tr><tr><td><i>canis familiaris</i></td><td>8945</td><td>3601 (40%)</td><td>2.3 (std 3.0) max 65</td><td>4.7 (std 9.4) max 151</td></tr><tr><td><i>danio rerio</i></td><td>8618</td><td>3391 (39%)</td><td>2.3 (std 3.0) max 65</td><td>4.7 (std 9.5) max 150</td></tr><tr><td><i>d. discoideum</i></td><td>2366</td><td>792 (33%)</td><td>2.4 (std 2.8) max 50</td><td>5.3 (std 9.8) max 103</td></tr><tr><td><i>d. melanogaster</i></td><td>5361</td><td>1955 (36%)</td><td>2.4 (std 3.0) max 64</td><td>4.8 (std 9.7) max 149</td></tr><tr><td><i>gallus gallus</i></td><td>8046</td><td>3244 (40%)</td><td>2.3 (std 2.8) max 65</td><td>4.7 (std 9.4) max 149</td></tr><tr><td><i>p. falciparum</i></td><td>875</td><td>264 (30%)</td><td>2.4 (std 3.6) max 50</td><td>5.4 (std 11.9) max 103</td></tr><tr><td><i>rattus norvegicus</i></td><td>9645</td><td>3780 (39%)</td><td>2.3 (std 2.9) max 65</td><td>4.5 (std 9.2) max 151</td></tr></tbody></table>

L'outil PAX2GRAPHML abstrait l'information sous forme d'un graphe de « réactions régulées », tel que décrit par Blavy et al., 2014. Une réaction régulée est un motif centré sur un sommet représentant une réaction et associé à ses métadonnées de réaction.

Ce sommet de type reaction est lié à un ou plusieurs sommets de type substrat et produits. Si nécessaire, le sommet de type reaction peut également être lié à des sommets de type régulateurs, qu'il s'agisse d'activateurs, d'inhibiteurs ou de modulateurs. Le graphe de réactions régulées est un graphe dirigé. Les substrats et les régulateurs sont des entrées des réactions. Les produits sont les sorties des réactions. Tous les nœuds sont également associés à leurs propres métadonnées. La figure 4.7 présente un exemple type d'un motif de réaction régulée. Les réactions biochimiques et les régulations sont décrites de manière homogène par
des réactions régulées qui impliquent des substrats, des produits, des activateurs, des inhibiteurs et des modulateurs comme éléments. Dans le graphe de réactions régulées, les molécules et les réactions sont représentées par des sommets étiquetés (typés).

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>FIGURE 4.7: Deux niveaux d'abstraction utilisées pour interpréter des données de fichiers BioPAX sous forme de graphe : (1) graphe de réactions régulées sur la ligne (2), et graphe d'influence sur la ligne (3). Trois stipes de réactions types sont modélisées : une activation (colonne 1), une réaction contrôlée par une enzyme (colonne 2), et une réaction non contrôlée (colonne 3). Figure extraite de (Blavy et al., 2014)</figcaption></figure>

Afin de faciliter l'interprétation de la causalité au sein du graphe de réactions régulées (Chindelevitch et al., 2012), un niveau d'abstraction supplémentaire est proposé, afin de retirer du graphe les sommets correspondants au réactions, pour ne conserver que des sommets qui seraient des substrats, produits et régulateurs au sein d'un graphe dirigé où les interactions sont étiquetées avec des influences positives et négatives. Le graphe d'influence calculé utilise deux classes de sommets et chaque composé impliqué dans une réaction est décrit par deux sommets : l'un des sommets représente la disponibilité (ie. la contribution du composé à la vitesse de réaction) et l'autre la quantité (ie. la concentration du composé). Le modèle générique de transformation des réactions régulées en graphe d'influence suit les principes décrits et illustré par la figure 4.7, extraite de Blavy et al., 2014.

## 4.4 Le défi de la reproductibilité et réplicabilité

Le dernier défi associé à l'extraction de réseaux de haute qualité concerne leur **reproductibilité / réplicabilité**. Ce défi englobe une composante liée à la reproductibilité ou réplicabilité des analyses biologiques qui mettent en évidence les relations entre
entités, et englobe également une composante informatique qui est liée à la reproductibilité ou réplicabilité du processus d'extraction des réseaux, ce qui suppose une utilisation pertinente des formats et structures de données sous-jacentes.

## Vers la quantification d'un interactome reproductible

Les interactions entre protéines peuvent être étudiées à l'aide de nombreuses méthodes de détection des interactions, selon des approches biophysiques (par exemple, la cristallographie), biochimiques (par exemple, la purification par affinité) ou génétiques (par exemple, par double hybride). Il est important de noter que, puisque les différentes méthodes de détection sondent les interactions protéine-protéine de manière différente, elles produisent des résultats complémentaires qui, souvent, ne se recoupent pas entièrement. Par exemple, certaines méthodes de détection sont conçues pour détecter des interactions binaires (par exemple, le double hybride), tandis que d'autres sondent les interactions de groupes de protéines assemblées en complexes (par exemple, la purification par affinité). De plus, du fait de contraintes expérimentales, chaque méthode de détection génère des interactions faussement positives ou inversement ne détecte pas certaines interactions. De ce fait, des observations multiples d'une interaction avec différentes techniques renforcent la confiance dans cette interaction.

La construction d'un interactome fiable exige donc de combiner les données d'interaction produites par plusieurs preuves expérimentales indépendantes afin de réduire les faux positifs. Une solution alternative consiste à utiliser des scores de confiance des interactions, mais ce score est dépendant entre autre du nombre de preuves expérimentales indépendantes et de la nature des méthodes de détection d'interaction (IDM) (Villaveces et al, 2015). Pour être pertinents, ces méthodes de score nécessitent des jeux de données expérimentales fiables et non redondants.

Dans les travaux de Camille Juigné et Marc Melkonian, nous avons pu détecter les redondances explicites et implicites dans les réseaux d'interactions entre protéines, et nous avons ainsi pu éliminer toutes les redondances artificielles contenues dans l'agrégation des bases de données primaire d'APID. De cet ensemble de données d'interactions non-redondant, nous pouvons déduire un interactome reproductible ou réplicable, c'est à dire dans lequel chaque interaction entre protéine est supportée par au moins deux preuves expérimentales distinctes.

Nous avons montré que la détection de la redondance entre les curation events a un impact important sur la taille de l'interactome reproductible [30]. Pour l'Homme, l'interactome reproductible passe de 159192 à 70554 interactions reproductibles, ce qui correspond à une baisse de 55.7% (dont -30.3% due à l'élimination des redondances explicites et -25.4% due à l'élimination des redondances implicites). Pour la levure, l'impact des redondances est encore plus important, avec une chute de l'interactome reproductible de 52313 interactions reproductibles à 21311 après suppression des redondances explicites et implicites, ce qui correspond à une diminution de -59.3% de la taille de l'interactome reproductible (dont -23,1% dus aux redondances explicites et -36,2% dus aux implicites). Les résultats complets sont donnés dans la table 4.5 issue de [30]. Au final, nos travaux soulignent qu'un grand nombre d'interactions considérées comme reproductibles repose en fait sur des artefacts d'intégration.
<table><caption>TABLE 4.5: Impact de la suppression des redondances explicites et implicites sur le nombre d'événements de curation et sur la taille de l'interactome reproductible, pour l'Homme et la levure. La taille de l'interactome reproductible compte le nombre de couples de pro- téines (A, B) dont l'interaction est soutenue par au moins 2 curation events.</caption><thead><tr><th></th><th>Human</th><th>Yeast</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="3"><strong>Curation events</strong></td></tr><tr><td>Nombre de curation events initial</td><td>665,484</td><td>293,293</td></tr><tr><td>... après élimination des red. explicites</td><td>534,140</td><td>229,630</td></tr><tr><td>... après élimination des red. explicites + implicites</td><td>460,149</td><td>189,364</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Taille apparente de l'interactome reproductible</strong></td></tr><tr><td>Nombre de curation events initial</td><td>159,192</td><td>52,313</td></tr><tr><td>... après élimination des red. explicites</td><td>111,009</td><td>40,235</td></tr><tr><td>... après élimination des red. explicites + implicites</td><td>70,554</td><td>21,311</td></tr></tbody></table>

## 4.5 Ce que nous avons appris dans ce chapitre

L'extraction de réseaux biologiques à partir des données multi-échelles soulève différents problèmes :

1. la recherche d'exhaustivité induit une problématique liée à l'agrégation des données, dont nous avons montré qu'elle nécessite une prise en compte très fine des ontologies riches décrivant les données, notamment afin de supprimer les redondances.

2. la recherche de l'abstraction permettant au mieux de répondre à une question donnée, dont nous avons montré qu'elle nécessite de maîtriser finement les spécifications des ontologies décrivant les données, et le développement d'outils *ad-hoc* pour extraire une information ciblée.

3. le recherche d'information fiable et reproductible, pour laquelle nous avons montré l'intérêt de prendre en compte toute la richesse des ontologies développées. Mes contributions ont permis d'identifier finement les redondances entre les entrées des différentes bases de données, et ainsi de quantifier la reproductibilité des interactions définissant un interactome.

→ **Méthodes :** Web Sémantique, ontologies, requêtes SPARQL, méthodes de parcours de graphe.

→ **Domaines d'application :** agro-écologie, biologie fondamentale.

→ **Collaborations :** Chrsitine Brun et Alain Guénoche (Marseille) ; Florence Gondret et François Moreews (UMR Pegase), Olivier Dameron et Anne Siegel (équipe Dyliss)

→ **Travaux en lien :** [33], [30], [29], [18], [08], [07], [05].

→ **Publications jointes en support en Annexe C :**
[33] Juigné C, Dameron O, Moreews F, Gondret F and **Becker E**.

Detection and correction of non-conformities and redundancies in complexes of molecules in *BioPAX*.

Actes JOBIM 2022, Rennes, 5-8 juillet 2022

[30] Melkonian M, Juigné C, Dameron O, Rabut G* and **Becker E***.

*Towards a reproducible interactome: semantic-based detection of redundancies to unify protein-protein interaction databases.*

Bioinformatics, 2022.

[29] Moreews F, Simon H, Siegel A, Gondret F, **Becker E**.

PAX2GRAPHML : a python library for large-scale regulation network
analysis using *BioPAX*.

Bioinformatics, 2021.
<figure><img src="image_38.png" /></figure>
# Chapter 5

# Projets et perspectives

## 5.1 Résumé des travaux présentés

Dans les travaux présentés au chapitre 2 sur la détection de signatures dans des données unimodales, nous avons vu que les analyses classiques de profilage n'adressent pas le problème de la spécificité des biomarqueurs, ni celui du potentiel prédictif et de l'interprétabilité biologique. Les stratégies de recherche actuelles privilégient en effet l'acquisition rapide de nouvelles données, puis leur analyse par des méthodes statistiques qui, du fait de la dimensionnalité défavorable des données-omiques, génèrent des faux positifs et des faux négatifs. Il existe donc une réelle nécessité scientifique à développer des méthodes permettant de consolider ces résultats de profilage pour en faire des biomarqueurs fiables. Les travaux présentés proposent des variations méthodologiques *a priori* pour remettre en question une signature afin de s'assurer de sa solidité. Ils soulignent également la nécessité de répliquer *a posteriori* les résultats avec des cohortes de validation indépendantes et un design expérimental pré-enregistré.

Ces travaux se poursuivent dans le chapitre 3 en passant de l'unimodal au multimodal, en intégrant dans notre cas des données-omiques de type miARN et des données d'imagerie médicale de type IRM-T1. Tout comme dans le chapitre 2, nous avons développé une méthode adaptée à une dimensionnalité défavorable des données, en nous intéressant aux cas des cohortes de petite taille sans données longitudinales. De plus, nous avons là encore souhaité intégrer les données avec une existence d'interprétabilité biologique, ce qui nous a conduit à développer une méthode de prédiction de score de progression de maladie. Avec l'essor des données médicales et de la santé numérique, il est en effet important de développer des méthodes cohérentes avec la réalité des données disponibles, c'est à dire intégrer leurs problèmes de temporalité et de dimensionnalité. Les travaux présentés proposent une nouvelle méthode basée sur des autoencodeurs variationnels supervisés pour réduire la dimensionnalité des données et ainsi calculer des scores de progression de maladies à partir de données multimodales, sur des cohortes de petite taille, et en l'absence de données longitudinales. Les résultats obtenus sont prometteurs.

Le chapitre 4 s'intéresse également à l'intégration de données hétérogènes, mais avec une approche différente. Contrairement au chapitre 3 où les variables sont considérées comme indépendantes les unes des autres, le chapitre 4 est basé sur une approche systémique, c'est à dire en prenant compte et modélisant des relations entre les différentes variables. Or, le volume de données et de connaissances générées à différentes échelles au cours de ces 20 dernières années est tel que la représentation unifiée de ces connaissances, leur stockage, puis leur extraction est en soi un sujet de recherche. Mes travaux présentés au chapitre 4 proposent des approches pour
extraire des réseaux de meilleure qualité à partir des formats complexes de modélisation des connaissances biologiques.

## 5.2 Vers une recherche de biomarqueurs consolidée

Les travaux présentés soulignent que le *profilage* de données -omique reste large-
ment exploratoire et les ensembles d'éléments -omiques identifiés comme différen-
tiels doivent être consolidés en vue d'être utiles pour le diagnostic et de constituer
une *signature* intéressante.

À court terme, il me semble important de développer un pipeline d'analyse
unifié, qui intègre une analyse différentielle basée sur les meilleurs outils disponibles
(Love et al., 2014a; Robinson et al., 2010a), mais qui intègre également les méthodes
permettant d'investiguer le potentiel prédictif des éléments du profil, seuls ou en
combinaison, en prenant garde aux biais potentiels si l'évaluation du potentiel pré-
dictif est faite sur le même ensemble que celui ayant identifié les éléments du profil.
Ce pipeline devrait donc intégrer des méthodes de re-échantillonnage, comme dans
l'analyse de généralisabilité présentée dans 2.2.3, ainsi que des méthodes de classi-
fication simples, comme présentées dans l'analyse du potentiel prédictif dans 2.2.1.
Ce pipeline pourra être utilisé par dans de nombreux projets par la suite.

À moyen terme, je pense qu'il est important d'approfondir la question de la spécificité des biomarqueurs. Dans les travaux présentés dans ce mémoire, la spécificité des biomarqueurs est abordée par la prisme des analyses des courbes ROC des comparaisons 2 à 2 (2.2.1). La spécificité de la signature est donc évaluée uniquement à l'échelle du schéma expérimental actuel, et rien ne permet de savoir si les éléments de la signature ne font pas partie d'autres signatures, mises en évidence par d'autres études (antérieures ou futures). On pourrait ainsi imaginer qu'un miARN soit identifié comme faisant partie de plusieurs signatures différentes, tout en ayant un potentiel prédictif au sein de chaque analyse pour discriminer les groupes témoins et traités. Afin d'aborder cette question, nous disposons des données du projet européen Phenomir (auquel j'ai participé, en collaboration avec Julien Bobe du LPGP INRAe), au sein duquel 12 analyses différentes ont été conduites afin d'identifier des biomarqueurs qui concernent les conditions de santé et d'élevage de truites arc-en-ciel parmi les miARNs circulants. L'extraction et le séquençage ont été réalisés conjointement, et l'identification des profils a été effectuée selon le même schéma d'analyse, afin que les résultats soient comparables. La comparaison des signatures obtenues pourra nous permettre au sein de ce projet d'aborder par un autre prisme la notion de spécificité des biomarqueurs.

Enfin, à plus long terme, la question de la reproductibilité des profils et signa-
tures m'intéresse particulièrement. Dans les travaux de validation de Virgilio Kmet-
zsch présentés dans la section 2.2.4, nous notons qu'une part importante des mi-
ARNs identifiés comme faisant partie d'une signature sont bien retrouvés comme
différentiellement exprimés dans une analyse de validation indépendante (35/65
pour la cohorte homogène C9orf72). Ces miARNs proviennent d'études différentes,
et aucune étude n'identifie de signature parfaitement reproductible. Au vu de ces
résultats, on peut se poser la question de savoir si certaines signatures sont plus
reproductibles que d'autres. Si tel est le cas, est-ce uniquement lié au nombre et à
la taille des cohortes, ou peut-on lier cela (i) au type d'objets biologiques étudiés (transcrits de gènes, miARNs...), (ii) à la méthode quantitative utilisée (méthodes haut-débit, bas débit), (iii) à la prise en compte de connaissances a priori, ou (iv) au choix de la méthode d'analyse bioinformatique et au soin accordé à la consolidation de la signature. Cette question est essentielle afin de mieux calibrer les méthodes de recherche de biomarqueurs, et de diminuer la part de faux-positifs présente dans la littérature scientifique (Ioannidis, 2005) et dénoncée par la communauté scientifique (Baker, 2016).

## 5.3 Vers de meilleurs scores de progression de maladie exploitant les données disponibles

Il existe un besoin de définir des scores de progression de maladie qui soient adaptés aux nombreuses maladies de faible prévalence et d'évolution lente, et nous avons été confrontés à ce problème dans le cadre de l'étude de deux pathologies neurodégénératives. La faible prévalence limite la taille des cohortes disponibles, tandis que l'évolution lente rend le recueil de données longitudinales pour alimenter les cohortes irréaliste. Dans les travaux présentés, nous avons notamment proposé une nouvelle approche pour cela, basée sur l'utilisation d'auto-encodeurs variationnels supervisés.

À court terme, il est nécessaire de consolider et pérenniser la nouvelle approche développée et de la traduire en un package python. Cette solution n'a pas été retenue de prime abord car les données du projet sur lequel la méthode était appliquée ne sont pas publiques et ne peuvent pas être publiées sur GitHub, pour des raisons de confidentialité. Cependant, au vu des résultats prometteurs obtenus par l'approche et au vu de sa généricité, il est important de pouvoir la mettre en œuvre et la distribuer facilement. Ce package pourra servir à évaluer la méthode de façon plus robuste sur d'autres maladies. De plus, d'autres projet, en collaboration avec le CHU de Rennes, pourrait bénéficier de la même approche ou d'une adaptation de celle-ci, comme le projet PhenoCYP porté par Camille Tron et cherchant à caractériser la capacité hépatique résiduelle de patients à partir de données multi-modales de grande dimension. Une demande a été déposée dans le cadre du réseau des ingénieurs CNRS du Programme National de Recherche en Intelligence Artificielle (PNRIA) pour poursuivre ce travail.

À moyen terme, la consolidation des résultats obtenus passe par une application à d'autres pathologies. Afin d'analyser l'impact de la faible taille des cohortes sur les résultats obtenus, il faudrait étudier une pathologie de prévalence plus importante afin de disposer de cohortes de plus grande taille, pour ensuite simuler l'impact de cohorte de faible taille. De plus, afin d'évaluer la pertinence du score obtenu, il serait intéressant de d'avoir une vérité de terrain à laquelle se comparer. Dans le cadre de la maladie d'Alzheimer, des cohortes de grande tailles sont disponibles, et certaines incluent des données d'imagerie médicale et de transcriptomique. C'est une piste à explorer afin de consolider les premiers résultats obtenus.

À plus long terme, j'aimerais poser la question de l'intégration de connaissances a priori pour améliorer le modèle proposé. L'hypothèse sous-jacente est de compenser la faible taille des cohortes par l'intégration de connaissances. Différentes informations peuvent être intégrées, comme par exemple pour les miARNs leur
localisation chromosomique, leurs gènes ou séquences cibles... Le principal défi sera d'identifier clairement quelles connaissances prendre en compte et comment les intégrer dans le modèle. Enfin, la question des modalités prises en compte se pose également. Dans le schéma proposé, les modalités prises en compte sont de l'imagerie médicale et des données de séquençage de miARNs circulant dans le plasma sanguin, et celles-ci semblent pertinentes car nous étudions une maladie neuro-dégénérative (d'où l'importance des données d'imagerie cérébrale) et dont les formes sporadiques et familiales peuvent être liées à des mutations de la protéine TDP-43, qui joue un rôle important dans la biogénèse des miARNs (Sreedharan et al., 2008) (d'où l'étude des miARNs). Les modalités prises en compte sont donc liées à la pathologie étudiée, et il sera nécessaire d'intégrer d'autres modalités pour répondre à d'autres problèmes ou pour améliorer les résultats en prenant plus de deux modalités en entrée. Ces travaux pourraient être menés dans le cadre du PEPR Santé Numérique.

## 5.4 Vers une amélioration de la qualité et de la pertinence des interactomes issus de connaissance

À court terme, les travaux réalisés pour identifier un interactome reproductible peuvent être raffinés afin de différencier reproductibilité et réplicabilité, de façon analogue aux définitions de Claerbout et Karrenbach pour l'informatique (Claerbout J, 1992). Plus précisément, il s'agit de différencier ce qui est reproductible de ce qui est réplicable, selon les techniques de mise en évidence utilisées (technique identique ou différentes) et selon le nombre d'équipes ayant mis en évidence l'interaction (même équipe ou deux équipes différentes).

À moyen terme, les travaux réalisés afin de mettre en évidence les interactions reproductibles chez la levure et chez l'homme nous permettent d'aborder la question de la complémentarité des méthodes de détection des interactions protéine-protéine. Plus précisément, je souhaite explorer la question suivante : lorsqu'une interaction est mise en évidence par deux techniques très différentes l'une de l'autre, peut-on déduire des propriétés telle qu'un niveau de confiance ou une affinité pour cette interaction ? Il s'agit en quelque sorte de savoir si l'on peut généraliser les résultats décrits dans Braun et al., 2009, dans lesquels un score de confiance standardisé est déduit des résultats de 4 méthodes de détection haut débit complémentaires. Je propose de répondre à cette question en analysant toutes les interactions reproductibles, une fois les redondances explicites et implicites éliminées. Pour ces interactions, nous pourrons extraire les couples de méthodes de détection, et mesurer (i) la (di)similarité sémantique entre ces termes de l'ontologie Molecular Interaction, et (ii) des mesures d'information mutuelles. Ces valeurs pourront ensuite être comparées à (i) des métriques de fiabilité des interactions protéine-protéines utilisées par certaines banques comme STRING (Szklarczyk et al., 2021) ; (ii) la présence de d'une interaction entre orthologues des deux partenaires chez des espèces proches ou plus distantes, témoignant ainsi d'une stabilité évolutive de cette interaction ; et enfin (iii) à l'abondance de chacun des deux partenaires de l'interaction in-vivo, car on peut supposer pour certaines méthodes un biais technique favorisant la détection des interactions les plus abondantes.

Enfin, à plus long terme, se pose la question de l'utilisation de ces informations dans les scores de confiance des interactions. En effet, certaines bases de données
comme STRING (Szklarczyk et al., 2021), IntAct (Kerrien et al., 2012) ou HIPPIE (Alanis-Lobato et al., 2017) fournissent un score de confiance associé à chaque interaction. Ces scores sont souvent une combinaison de différents sous-scores, chacun étant calculé d'une manière spécifique. La plupart de ces scores prennent en compte le nombre de publications soutenant une interaction comme élément de leur score. Cependant, cette mesure du nombre de publications pourrait être remplacée par le nombre de preuves expérimentales non redondantes.

À long terme également se pose la question de l'impact des résultats spectaculaires d'AplhaFold2-multimer sur la topologie et la définition des interactomes (Evans et al., 2022). À l'heure actuelle, il est possible de prédire la conformation d'un complexe entre protéines à partir de la séquence des deux partenaires, avec une fiabilité largement supérieure à ce qui était fait auparavant. Deux questions se posent :

1. AlphaFold-multimer pourrait-il être utilisé pour prédire des interactions, par exemple en interprétant le score de confiance par résidu (per-residue confidence score, pLDDT) associé aux prédictions ? Si oui, quelle est la fiabilité de ces prédictions et comment les intégrer avec les informations existantes ? Si les prédictions s'avéraient fiables, cela pourrait nous permettre de prédire des interactions fiables à grande échelle, et ainsi mieux appréhender la topologie globale de l'interactome en réduisant drastiquement le nombre de faux négatifs.

2. Lorsqu'une protéine interagit avec plusieurs partenaires, la modélisation struc- turale faite par AlphaFold2-multimer devrait permettre de déterminer si les interactions sont mutuellement exclusives entre elles (XOR) ou peuvent avoir lieu simultanément (OR/AND). De ce fait, on peut envisager une contextu- alisation ou un enrichissement des interactomes avec ces informations, tout comme on peut envisager des adaptations des méthodes d'analyse des inter- actomes qui tiendraient compte de ces informations.

## 5.5 Vers une analyse systémique intégrative

L'approche systémique permet de prendre en compte les relations connues entre entités dans le schéma d'analyse globale. Du fait de cette approche « entités » et « relations entre entités », le formalisme des graphes est souvent utilisé pour établir des modèles. Pour autant, dans le cas de données hétérogènes, l'extraction de la connaissance sous-jacente, tout comme la recherche de l'abstraction permettant au mieux de répondre à une question donnée, restent des sujets délicats.

À court terme, nos projets de recherche en cours nous conduisent à nous in- téresser à la bonne méthode pour extraire de sources de données au format BioPAX les informations concernant un sous-ensemble d'entités hétérogènes d'intérêt. Dans le cadre de la thèse de Camille Juigné, ces informations hétérogènes sont de type transcriptomique et de type métabolomique. Pour identifier nos données transcrip- tomiques dans les données au format BioPAX, nous pouvons nous baser sur les identifiants HGNC, lesquels sont liés aux entités ProteinReference de BioPAX, à par- tir desquelles on peut identifier les différences instances présentes *via* les relations entityRef. Pour les données de type métabolomique, le schéma d'intégration est plus complexe car nos données d'entrée ne possèdent pas d'identifiants non-ambigu.
Il sera donc nécessaire de rechercher les chaînes de caractères correspondant à nos
différents métabolites dans la base de données ChEBI. Les identifiants ChEBI pour-
ront ensuite nous permettre de retrouver les entités SmallMoleculeReference de
BioPAX correspondantes, à partir desquelles on pourra identifier les instances présentes
via les relations entityReference. Ce travail est en cours de réalisation.

À moyen terme, une fois que nous serons capables d'identifier les sommets
d'intérêt dans les données BioPAX, nous souhaitons poser la question de la meilleure
stratégie pour identifier les entités qui contrôleraient simultanément ces différentes
entités. Autrement dit, il s'agira d'identifier au sein des réseaux extraits de la con-
naissance BioPAX les régulateurs ou ensembles minimaux couvrants de régulateurs
contrôlant notre ensemble de cibles. Un premier verrou méthodologique est le
choix de l'abstraction représentant les connaissances, et nous envisageons à ce sujet
différentes approches : (i) ne pas abstraire les informations et utiliser des requêtes
SPARQL pour calculer itérativement des métriques et indices ; (ii) ne pas abstraire
les informations et utiliser une base de donnée orientée graphe pour représenter
le sous-réseau extrait et l'interroger ; et enfin (iii) utiliser des abstractions de plus
haut niveau, comme les graphes de réactions régulées ou les graphes d'influences
présentés dans 4.3. Les méthodes d'analyse de ces différents réseaux sont variées :
marches aléatoire avec redémarrage à l'origine, avec pondération ou non des arêtes,
avec redémarrage totalement aléatoire ou guidé, arbres de Steiner, parcours en
largeur... Celles-ci nécessiteront d'être adaptées à notre objectif de recherche de
contrôleurs et évaluées.

À long terme, cette méthode pourrait conduire au développement d'un outil per-
mettant de coupler des données de transcriptomique et de métabolomique avec une
approche complémentaire de celle d'outils actuels tels que Diablo au sein de la suite
mixOmics (Singh et al., 2019), dont l'objectif principal est l'exploration et l'intégration
d'ensembles de données biologiques, avec un accent particulier sur la sélection des
variables. La recherche et l'identification de contrôleurs ou d'ensembles minimaux
de contrôleurs pour ces différentes variables permettrait en effet une compréhension
et une interprétabilité plus importante.
Enfin, j'aimerai beaucoup à plus long terme travailler à la question plus générale des
nouveaux schémas d'intégration de données, adaptés aux données multi-omiques
ou aux données multi-modales. Le cadre de travail de l'équipe Dyliss est partic-
ulièrement propice à ces développements, de par la présence de collaborateurs spé-
cialistes des schémas d'intégration de données, et de collègues spécialistes de la bi-
ologie des systèmes à différents niveaux.
# Appendix A

# Annexe A : Curriculum Vitae

## A.1 État civil

Emmanuelle BECKER, née le 22/12/1980 à Saint-Avold (57), mariée, 3 enfants.

Coordonnées professionnelles

Equipe Dyliss
Irisa / Inria Rennes-Bretagne Atlantique
Campus de Beaulieu, 35042 Rennes cedex
emmanuelle.becker@univ-rennes1.fr

Page personnelle : https://www-dyliss.irisa.fr/team-members/emmanuelle-becker/

## A.2 Études, diplômes et parcours professionnel

**2018-2021** **Maîtresse de conférences** UNIV. RENNES 1
Équipe de recherche : Dyliss, dirigée par O. Dameron (IRISA)
Équipe pédagogique : Bioinformatique et Biostatistiques (SVE)

**2009-2017** **Maîtresse de conférences** UNIV. RENNES 1
Équipe de recherche : Remede, dirigée par M. Primig (IRSET)
Équipe pédagogique : Bioinformatique et Biostatistiques (SVE)

**2007-2009** **Chercheuse post-doctorante** UNIV. DE LA MÉDITERRANNÉE
Sujet : *Réseaux d'interactions protéine-protéine*, encadré par C. Brun, chargée de recherche CNRS.
Laboratoire : TAGC, Inserm UMR 1090 Marseille.

**2008** **Qualification aux fonctions de maître-sse de conférences** en sections 27, 64 et 65.

**2003-2007** **Doctorat de bioinformatique** UNIV. PIERRE & MARIE CURIE
Titre : *Prédictions bioinformatiques des propriétés des domaines de reconnaissance peptidique*. Directeur : Raphaël Guérois.

**2002-2003** **DEA de bioinformatique** UNIV. PIERRE & MARIE CURIE
Spécialité : *Analyse de Génomes et Modélisation Moléculaire*

**2000-2002** **Licence et maîtrise d'informatique** ENS DE LYON
Spécialité : *Magistère d'Informatique et Modélisation*.
## A.3 Publications

En bioinformatique comme en biologie, l'ordre des auteurs est codifié. En particulier, les auteurs en dernières positions sont les personnes qui ont supervisé le travail. En bioinformatique, les publications se font majoritairement par des soumissions dans des journaux plutôt que des participations à des conférences, notamment pour toucher une audience plus large. La liste complète est disponible en Annexe B.

* Depuis ma thèse, j'ai publié 35 articles, dont :

– 31 articles de journaux

– 3 articles de conférences nationales ou internationales

– 1 article de revue

– 8 en première autrice et 5 en dernière autrice.

* Les doctorant·e·s que j'ai encadré ont publié 4 articles en premier·e aut·eur·rice (+ 2 articles de conférences nationale/internationale).

## A.4 Implication dans des projets de recherche financés

Je participe ou j'ai participé aux projets de recherche financés suivants :

* 2023-2027 : Encadrement prévu d'un ou une doctorant.e dans le cadre de l'ANR Endovire (porteur : Nathalie Volkoff)

* 2020-2023 : Encadrement de la thèse de Camille Juigné dans le cadre d'un financement INRAe MP DigitBio et Région Bretagne (porteurs : Florence Gondret et Emmanuelle Becker)

* 2020-2021 : Encadrement d'un ingénieur dans le cadre du projet européen PhenoMir (porteur : Julien Bobe)

* 2019-2022 : Encadrement de la thèse de Virgilio Kmetzsch dans le cadre du programme Inria Project Lab Neuromarker (porteur : Olivier Colliot)

* 2018 : Fiancement d'un stage de M2 dans le cadre du projet Ubiq (porteurs : Gwenaël Rabut et Emmanuelle Becker)

## A.5 Encadrement

Je co-encadre actuellement une doctorante (début de thèse 2020) et j'ai co-encadré deux doctorant·e·s ayant soutenu en 2020 et 2022. J'ai précédemment encadré un ingénieur, et 14 étudiant·e·s de licence (2), master 1 (5), master 2 (6) ou erasmus traineeship (1).

* Encadrements en cours (1 doctorante):

– Camille Juigné, **doctorante**, 3 ans (2020-2023)

Titre : *Analyse de données biologiques hétérogènes modélisées avec des graphes multiplex pour comprendre l'efficacité alimentaire.*

Co-encadrement avec Florence Gondret, taux réel 50 %.
Production : 1 publication (Bioinformatics), 1 article soumis, 2 articles en cours de rédaction, 1 exposé oral lors d'une conférence (JOBIM 2022).

* **Encadrements passés (2 doctorant·e·s, 1 ingénieur) :**

- Virgilio Kmetzsch, **doctorant**, 3 ans (2019-2022)

Titre : Analyse multimodale de données génomiques et de neuroimagerie dans la démence fronto-temporale.

Co-encadrement avec Olivier Colliot, taux réel 50 %.

Production : 3 publications de journaux (JNNP, JHBI et ACTN), 1 publication de conférence (SPIE Medical Imaging 2022), 2 exposés oraux lors de conférences (SPIE Medical Imaging 2022 et JOBIM 2022).

Soutenue le 26 septembre 2022.

- Léo Milhade, **ingénieur**, 10 mois (2020-2021)

Titre : Mise en place de workflow pour la recherche de micro-ARNs caractéristiques de conditions phénotypiques chez la truite.

Co-encadrement avec Julien Bobe, taux réel 80 %.

Production : package prostPostProcess + résultats en cours de valorisation

- Méline Wery, **doctorante**, 3 ans (2017-2020)

Titre : intégration de données et analyse basée sur le raisonnement à chaque étape du développement de médicament.

Co-encadrement avec Anne Siegel, Olivier Dameron et Charles Bettembourg, taux réel 25 %.

* **Encadrements de stagiaires (14) :**

- Nancy D'Arminio, erasmus traineeship de 4 mois - pré-doctorat (2021) : extraction automatique de relations entre les ubiquitines ligases de la levure et leurs protéines subtrats d'après la littérature (taux 50%).

- Emmanuel Clostres, stage de 6 mois niveau M2 (2021) : implication des miARNs dans les interactions plantes-rhizomicrobiome : automatisation de la recherche et l'identification de gènes cibles bactériens (taux 25%)

- Marc Melkonian, stage de 6 mois niveau M2 (2020) : detection of redundancies in protein-protein interaction databases encoded by different PSI-MI identifiers using semantic web technologies (taux 75%)

Production : 1 publication (Bioinformatics)

- Quentin Delhon, stage de 6 mois niveau M2 (2020) : Discovery of key genes in multi-layered biological graphs (taux 75%).

Production : développements au sein de l'outil pax2graphml

- Camille Juigné, stage de 6 mois niveau M2 (2019) : intégration de données et analyse formelle du réseau d'interactions entre enzymes d'ubiquitination (taux 75%).
- Fanny Casse, stage de 6 mois niveau M2 (2019) : *régulation par les miARNs des gènes régulant la fécondité et le développement embryonnaire précoce chez le poisson médaka* (taux 33%)

- Hugo Simon, stage de 2 mois niveau L3 (2019) : *analyses topologiques des réseaux de régulation et métaboliques* (taux 75%).
  Production : une partie de l'outil pax2graphml + associé à 1 publication (Bioinformatics)

- Anaëlle Caillarec-Joly, stage de 2 mois niveau M1 (2017) : *Modélisation quantitative de la stéroïdogénèse chez la lignée H295R : étude de l'impact de perturbations du système* (taux 75%)
  Production : associée à 1 publication (Bioinformatics)

- Thomas Chaussepied, stage de 2 mois niveau M1 (2017) : *Impact des antalgiques sur le développement des organes de la sphère uro-génitale chez le fœtus* (taux 50%)

- Victoria Potdevin, stage de 2 mois niveau M1 Agronome (2016) : *classification de signatures toxico-génomique* (taux 75%).

- Estelle Lecluze, stage de 6 mois niveau M2 (2015) : *Implémentation de modèles prédictifs pour l'identification et la classification de nouveaux perturbateurs endocriniens* (taux 50%)

- Marine Brenet, stage de 2 mois niveau L3 (2015) : *Identification des gènes impliqués dans la sporulation chez la levure* (taux 50%)

- Paul Guéguen, stage de 2 mois niveau M1 (2014) : *Classification de données massives de toxico-génomique par des méthodes de clustering chevauchant et d'optimisation du critère de modularité de Newman* (taux 75%)

- Sofiane Omari, stage de 2 mois niveau M1 (2014) : *Etude de la sporulation chez la levure par intégration de données de transcriptomique et de protéomique quantitative* (taux 50%)

## A.6 Tâches collectives

Je suis co-responsable du comité programme d'une conférence nationale, et j'ai été membre du comité de programme de 3 conférences dont 2 internationales. J'ai également participé à 5 commissions de sélection (postes CR ou MCU) et 1 jury de thèse.

* Conférences (4) :

- co-responsable du comité de programme de la conférence Jobim 2022 (Rennes)

- membre du comité de programme de la conférence Jobim 2021 (Paris)

- membre du comité de programme de la conférence BBCC20 (en ligne)

- membre du comité de programme de la conférence NETTAB/BBCC 2019 (joint meeting, Salerno)
* Comités de sélection (4) :

- membre du comité de sélection du poste de chargé de recherche CR24 INRAe profils « IA et signalisation » et « Génomique comparée des poissons » (2022)

- membre du comité de sélection du poste de maître-sse de conférences de l'Université d'Aix-Marseille profil « Bioinformatique et Génomique » (2021)

- membre du comité de sélection du poste de maître-sse de conférences de l'Université de Lyon profil « Biochimie et interactions biomoléculaires » (2021)

- membre du comité de sélection du poste de maître-sse de conférences de l'Université de Rennes profil « Modélisation des systèmes biologiques et biostatistiques » (2019)

* Jurys de thèse (1) :

- Examinatrice de la thèse de Saran PANKAEW : *Study of impact of Pten-loss in leukemic development of T cell: Boolean modelling and transcriptomic analysis at single-cell resolution* (Aix-Marseille Université, 2022)

* Au sein du laboratoire (2) :

- participation au jury de sélection des doctorant·e·s pour les bourses Moyens Incitatifs (2020)

- membre du conseil scientifique de Biogenouest (réseau des 37 plates-formes technologiques du Grand Ouest en sciences du vivant et de l'environnement).

## A.7 Enseignements et responsabilités pédagogiques

Ces cinq dernières années, je suis ou j'ai été responsable de 8 UE et je suis co-responsable du master de bioinformatique.

* Responsabilités actuelles (6 UEs, 1 formation):

- **co-responsable du master mention Bioinformatique depuis 2017**
Après 8 années en tant qu'intervenante dans le master de bioinformatique, j'en ai pris la co-responsabilité en 2017 en défendant une mention de bioinformatique. Cette responsabilité a notamment impliqué de monter de nouvelles maquettes (passant de 1 à 3 parcours), de monter un co-portage entre les UFRs SVE et Médecine de l'Université, et de mettre en place un accord Erasmus+. Le nombre d'étudiant·e·s a fortement augmenté dans cette période (de 20-25 à 40-50).

- **responsable de 6 UEs de licence ou master** (détails ci-dessous) pour lesquelles j'ai crée les supports actuels.
* Détails des unités d'enseignement en responsabilité (5 dernières années):

- Atelier de biostatistiques 1

Années en responsabilité de l'UE : depuis 2012 - en cours

Public visé : L2 Sciences de la Vie (SVE)

- Advanced R for data Analysis (cours en langue anglaise)

Années en responsabilité de l'UE : depuis 2017 - en cours

Public visé : M1 Bioinformatique (SVE) + M1 Ecologues (OSUR)

- Programmation orientée objet en bioinformatique

Années en responsabilité de l'UE : depuis 2012 - en cours

Public visé : M1 Bioinformatique (SVE)

- Réseaux biologiques

Années en co-responsabilité de l'UE : depuis 2012 - en cours (responsabilité partagée avec Anne Siegel)

Public visé : M2 Bioinformatique (SVE)

- Introduction to computational ecology (cours en langue anglaise)

Années en responsabilité : depuis 2017 - en cours (responsabilité partagée avec Frédéric Hamelin)

Public visé : M2 Ecologues parcours EFCE et MODE (OSUR)

- Method (cours en langue anglaise)

Années en responsabilité : depuis 2019 - en cours

Public visé : M2 Informatique parcours SIF (ISTIC)

- Maths 2 : statistiques appliquées

Années en responsabilité de l'UE : 2016 - 2020

Public visé : L3 Informatique (ENS Rennes)

- Outils bioinformatiques

Années en responsabilité de l'UE : 2012 - 2018

Public visé : L2 Sciences de la Vie (SVE)

* Autres activités :

- participation aux portes ouvertes et salon de l'étudiant ;

- travail autour d'un référentiel de compétences en bio-statistiques ;

- cours à l'Université de Salerne en 2018 et 2019 dans le cadre de l'accord Erasmus+ (12h par semaine).
# Appendix B

# Annexe B : Liste des publications

En bioinformatique comme en biologie, l'ordre des auteurs est codifié. En particulier, les auteurs en dernières positions sont les personnes qui ont supervisé le travail. En bioinformatique, les publications se font majoritairement par des soumissions dans des journaux plutôt que des participations à des conférences, notamment pour toucher une audience plus large.

Depuis ma thèse, j'ai publié 35 articles, dont 8 en première autrice et 5 en dernière autrice. Les doctorant·e·s que j'encadre ou que j'ai encadré ont publié 4 articles en premier·e aut·eur·rice (+ 2 articles de conférences nationale/internationale).

Afin de faciliter la lecture de la liste de publication, j'utilise un code couleur permettant de différencier les contributions en lien avec le chapitre 2, le chapitre 3 ou le chapitre 4. Les contributions de type journaux, conférences ou articles de revue sont présentées successivement.

## Articles de journaux (31)

[35] Kmetzsch V, Latouche M, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Garreau T, Le Ber I, Colliot O and **Becker E**.
*Validation of circulating microRNA signatures as biomarkers in genetic frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis.*
*accepted in Annals of Clinical and Translational Neurology*

[34] Kmetzsch V, **Becker E**, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Le Ber I, and Colliot O.
*Disease progression score estimation from multimodal imaging and microRNA data using supervised variational autoencoders.*
*accepted in IEEE J Biomed Health Inform*

[32] Petit F*, Jamin S, Kernanec P-Y, **Becker E**, Halet G, and Primig M*.
*EXOSC10/Rrp6 is essential for the eight-cell embryo/morula transition.*
*Dev. Biol, 2022*

[30] Melkonian M, Juigné C, Dameron O, Rabut G* and **Becker E***.
*Towards a reproducible interactome: semantic-based detection of redundancies to unify protein-protein interaction databases.*
*Bioinformatics, 2022.*
[29] Moreews F, Simon H, Siegel A, Gondret F, **Becker E**. PAX2GRAPHML : a python library for large-scale regulation network analysis using BIOPAX. Bioinformatics, 2021.

[28] Kmetzsch V, Anquetil V, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Jornea L, Forlani S, Couratier P, Wallon D, Pasquier F, Robil N, PREV-DEMALS study group; de la Grange P, Moszer I, Le Ber I, Colliot O, **Becker E**. Plasma microRNA signature in presymptomatic and symptomatic subjects with C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2021.

[27] Leverrier-Penna S, Michel A, Lecante LL, Costet N, Suglia A, Desdoits-Lethimonier C, Boulay H, Viel R, Chemouny JM, **Becker E**, Lavoué V, Rolland AD, Dejucq-Rainsford N, Vignneau C, Mazaud-Guittot S. Exposure of human fetal kidneys to mild analgesics interferes with early nephrogenesis. FASEB J, 2021

[26] Xie B, **Becker E**, Stuparevic I, Wery M, Descrimes M, Morillon A, and Primig M. The anti-cancer drug 5-fluorouracil affects cell cycle regulators and long non-coding RNAs with regulatory potential in yeast. RNA Biology 2019.

[25] Darde T, Gaudriault P, Beranger R, Lancien C, Caillarec-Joly A, Sal-lou O, Bonvallot N, Costet N, Chevrier C, Mazaud-Guittot S, Jégou B, Collin O, **Becker E**, Rolland A-D and Chalmel F. TOXsIgN : A public repository for toxicological signatures at the IRSET. Bioinformatics, 2018

[24] Leverrier-Penna S, Mitchell RT, **Becker E**, Lecante L, Ben Maamar M, Lavoué V, ristensen DM, Jégou B, Dejucq-Rainsford N, Mazaud-Gittot S. Ibuprofen is deleterious for the development of first trimester human fetal ovary ex vivo. Human Reprod, 2018

[23] Houzet L, Pérez-Losada M, Matusali G, Deleage C, Dereuddre-Bosquet N, Satie AP, Aubry F, **Becker E**, Jégou B, Le Grand R, Keele BF, Crandall KA and Dejucq-Rainsford N. Seminal SIV in cynomolgus macaques is dominated by virus originating from multiple genital organs. Journal of Virology, 2018
[22] Dugay F, Llamas-Gutierrez F, Gournay M, Medane S, Mazet F, Christian-Chiforeanu D, **Becker E**, Lamy R, Léna H, Rioux-Leclercq N, Belaud-Rotureau MA and Cabilic F.
*Clinicopathological characteristics of ROS1- and RET-rearranged NSCLC in caucasian patients. Data from a cohort of 713 non-squamous NSCLC lacking KRAS/EGFR/HER2/BRAF/PIK3CA/ALK alterations.*
*Oncotarget*, 2017

[21] **Becker E**, Com E, Lavigne R, Guilleux M-H, Evard B, Pineau C and Primig M.
*The protein expression landscape of mitosis and meiosis in diploid budding yeast.*
*J. Proteomics*, 2017

[20] Hao* C, Gely-Pernot* A, Kervarrec C, Boudjema M, **Becker E**, Khil P, Tevosian S, Jégou B and Smagulova F.
*Exposure to the widely used herbicide atrazine results in deregulation of global tissue-specific RNA transcription in the third generation and is associated with a global decrease of histone trimethylation in mice.*
*Nucleic Acids Research*, 2016

[19] Xie B, Horecka J, Chu A, Davis RW, **Becker E** and Primig M.
*Ndt80 activates the meiotic ORC1 transcript isoform and SMA2 via a bidirectional middle sporulation element in Saccharomyces cerevisiae*.
*RNA Biology*, 2016.

[18] Chapple C E, Robisson B, Spinelli L, Guien C, **Becker E**, Brun C.
*Extreme multifunctional proteins identified from a human protein interaction network.*
*Nature Communications*, 2015

[17] Darde T, Sallou O, **Becker E**, Evrard B, Monjeau C, Le Bras Y, Jégou B, Collin O, Rolland A and Chalmel F.
*The ReproGenomics Viewer: an integrative cross-species toolbox for the reproductive science community.*
*Nucleic Acids Research*, Web-Server issue, 2015

[16] Liu* Y, Stuparevic* I, Xie B, **Becker E**, Law M and Primig M.
*The conserved histone deacetylase Rpd3 and the DNA binding regulator Ume6 repress BOI1's meiotic transcript isoform during vegetative growth in Saccharomyces cerevisiae.*
*Mol. Microbiology*, 2015.
*Corrected in Mol. Microbiology, 2015, Volume 99, Issue 1, 217.*

[15] Gely-Pernot* A, Hao* C, **Becker E**, Stuparevic I, Kervarrec C, Chalmel F, Primig M, Jégou B and Smagulova F.
*Worldwide used herbicide atrazine affects meiosis in male mice.*
*BMC Genomics*, 2015.
**Becker E**, Liu Y, Lardenois A, Walther T, Horecka J, Stuparevic I,

[14] Law M, Lavigne R, Evrard E, Demougin P, Riffle M, Strich R, Davis R W, Pineau C and Primig M.

*Integrated RNA- and protein profiling of fermentation and respiration in diploid budding yeast provides insight into nutrient control of cell growth and development.*

J. of Proteomics, 2015

[13] Petit* F G, Kervarrec* C, Jamin* S P, Smagulova F, Hao C, **Becker E**, Jégou B, Chalmel F and Primig M.

*Combining RNA- and Protein Profiling Data With Network Interactions Yields Clues About Gene Function in Mouse and Human Spermatogenesis*

[12] Stuparevic I, **Becker E**, Law M and Primig M.

*The histone deacetylase Rpd3/Sin3/Ume6 complex represses an acetate inducible isoform of VTH2 in fermenting budding yeast cells.*

FEBS Letters, 2015

[11] Lardenois A*, **Becker E***, Walther T*, Law M, Demougin P, Strich R and Primig M.

*Global alterations of the transcriptional landscape during budding yeast growth and development in the absence of Ume6-dependant chromatin modification.*

Mol. Genet. Genomics, 2015

Lardenois A*, Stuparevic I*, Liu Y*, Law M J, **Becker E**, Smagulova

[10] F, Waern K, Guilleux M-H, Horecka J, Chu A, Kervarrec C, Strich R, Snyder M, Davis R W, Steinmetz L M, and Primig M.

*The conserved histone deacetylase Rpd3 and its DNA binding subunit Ume6 control dynamic transcript architecture during mitotic growth and meiotic development.*

Nucleic Acids Research, 2014

[09] Lavigne R, **Becker E**, Liu Y, Evrard B, Lardenois A, Primig M and Pineau C.

*Direct iterative protein profiling (DIPP) - an innovative method for large-scale protein detection applied to budding yeast mitosis.*

Mol Cell Proteomics, 2012

[08] **Becker E***, Robisson B*, Chapple CE, Guénoche A and Brun C.

*Multifunctional proteins revealed by overlapping clustering in protein interaction network.*

Bioinformatics, 2012
[07] Souiai O*, **Becker E***, Prieto C, Benkahla A, De las Rivas J and Brun C.
*Functional integrative levels in the human interactome recapitulate organ organization.*
PLoS One, 2011

[06] Aucher W*, **Becker E***, Ma E, Miron S, Martel A, Ochsenbein F, Marsolier-Kergoat M-C and Guerois R.
*A strategy for interaction site prediction between phospho-binding modules and their partners identified from proteomic data.*
Mol Cell Proteomics, 2010

[04] **Becker E**, Cotillard A, Meyer V, Madaoui H, Guerois R.
*HmmKalign : a tool for generating sub-optimal HMM alignments.*
Bioinformatics, 2007

[03] **Becker E***, Meyer V*, Madaoui H, Guerois R.
*Detection of a tandem BRCT in Xrs2 and Nbs1 with functional implications in the DNA damage response.*
Bioinformatics, 2006

[01] Mousson F, Lautrette A, Thuret JY, Agez M, Courbeyrette R, Amigues B, **Becker E**, Neumann JM, Guerois R, Mann C, Ochsenbein F.
*Structural basis for the interaction of Asf1 with histone H3 and its functional implications.*
Proc Natl Acad Sci U S A, 2005.

## Articles de conférences nationales ou internationales avec comité de lecture (3)

[33] Juigné C, Dameron O, Moreews F, Gondret F and **Becker E**.
*Detection and correction of non-conformities and redundancies in complexes of molecules in BioPAX.*
Actes JOBIM 2022, Rennes, 5-8 juillet 2022

[31] Kmetzsch V, **Becker E**, Saracino D, Anquetil V, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Le Ber I, Colliot O and the PREV-DEMALS study group.
*A multimodal variational autoencoder for estimating progression scores from imaging and microRNA data in neurodegenerative diseases.*
SPIE Medical Imaging 2022, 2022

[05] **Becker E**., Guénoche A. and Brun C.
*Systèmes de classes chevauchantes pour la recherche de protéines multi-fonctionnelles.*
Actes JOBIM 2009, p.49-54, Nantes, 9-11 juin 2009

## Articles de revue (1)
[02] Madaoui H, **Becker E**, Guérois R
*Sequence search methods and scoring functions for the design of protein structures.*
Methods in Molecular Biology, 2006
# Appendix C

# Annexe C : Publications jointes

## C.1 Contributions jointes en support au chapitre 2

[28]

Kmetzsch V, Anquetil V, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Jornea L, Forlani S, Couratier P, Wallon D, Pasquier F, Robil N, PREV-DEMALS study group; de la Grange P, Moszer I, Le Ber I, Colliot O, **Becker E**.

*Plasma microRNA signature in presymptomatic and symptomatic subjects with C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis.*

J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2021.

[35]

Kmetzsch V, Latouche M, Saracino D, Rinaldi D, Camuzat A, Gareau T, Le Ber I, Colliot O and **Becker E**.

*Validation of circulating microRNA signatures as biomarkers in genetic frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis.*

Annals of Clinical and Translational Neurology, 2022.
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OPEN ACCESS

Original research

# Plasma microRNA signature in presymptomatic and symptomatic subjects with C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis

Virgilio Kmetzsch<sup>1,2</sup>, Vincent Anquetil,<sup>2</sup> Dario Saracino,<sup>1,2,3,4</sup> Daisy Rinaldi,<sup>2,3,4</sup> Agnès Camuzat,<sup>2,5</sup> Thomas Gareau,<sup>2</sup> Ludmila Jornea,<sup>2</sup> Sylvie Forlani,<sup>2</sup> Philippe Couratier,<sup>6</sup> David Wallon,<sup>7</sup> Florence Pasquier,<sup>8</sup> Noémie Robil,<sup>9</sup> Pierre de la Grange,<sup>9</sup> Ivan Moszer,<sup>2</sup> Isabelle Le Ber,<sup>2,3,4,10</sup> Olivier Colliot,<sup>1,2</sup> Emmanuelle Becker,<sup>11</sup> The PREV-DEMALS study group

► Additional material is published online only. To view please visit the journal online (http://dx.doi.org/10.1136/ jnnp-2020-324647).

For numbered affiliations see end of article.

**Correspondence to**

Dr Emmanuelle Becker, Dyliss team, Irisa / Inria Rennes-Bretagne Atlantique, Campus de Beaulieu, 35042 Rennes Cedex, France; emmanuelle.becker@univ-rennes1.fr

Received 20 July 2020
Revised 30 September 2020
Accepted 27 October 2020
Published Online First 25 November 2020

## ABSTRACT

**Objective** To identify potential biomarkers of preclinical and clinical progression in chromosome 9 open reading frame 72 gene (C9orf72)-associated disease by assessing the expression levels of plasma microRNAs (miRNAs) in C9orf72 patients and presymptomatic carriers.

**Methods** The PREV-DEMALS study is a prospective study including 22 C9orf72 patients, 45 presymptomatic C9orf72 mutation carriers and 43 controls. We assessed the expression levels of 2576 miRNAs, among which 589 were above noise level, in plasma samples of all participants using RNA sequencing. The expression levels of the differentially expressed miRNAs between patients, presymptomatic carriers and controls were further used to build logistic regression classifiers.

**Results** Four miRNAs were differentially expressed between patients and controls: miR-34a-5p and miR-345-5p were overexpressed, while miR-200c-3p and miR-10a-3p were underexpressed in patients. MiR-34a-5p was also overexpressed in presymptomatic carriers compared with healthy controls, suggesting that miR-34a-5p expression is deregulated in cases with C9orf72 mutation. Moreover, miR-345-5p was also overexpressed in patients compared with presymptomatic carriers, which supports the correlation of miR-345-5p expression with the progression of C9orf72-associated disease. Together, miR-200c-3p and miR-10a-3p underexpression might be associated with full-blown disease. Four presymptomatic subjects in transitional/prodromal stage, close to the disease conversion, exhibited a stronger similarity with the expression levels of patients.

**Conclusions** We identified a signature of four miRNAs differentially expressed in plasma between clinical conditions that have potential to represent progression biomarkers for C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. This study suggests that dysregulation of miRNAs is dynamically altered throughout neurodegenerative diseases progression, and can be detectable even long before clinical onset.

**Trial registration number** NCT02590276.

## INTRODUCTION

Frontotemporal dementia (FTD) designates neurodegenerative dementias characterised by progressive behavioural, executive and language impairments.¹ Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a degenerative disease of motor neurons that leads to progressive muscle atrophy and motor deficit. FTD and ALS form a clinical continuum, as these two diseases may be associated in the same patients (FTD-ALS) or within families. They also share common pathological mechanisms and genetic causes.² The most frequent genetic cause of familial FTD and ALS is a hexanucleotide (GGGGCC) repeat expansion in the chromosome 9 open reading frame 72 (C9orf72) gene.³ ⁴ This autosomal dominant mutation may cause neurodegeneration through C9orf72 loss of function, aggregation of mutant RNA in nuclear foci and of dipeptide repeats generated by repeat-associated non-AUG translation, ultimately leading to pathological inclusions of TAR-DNA binding protein 43 (TDP-43).⁵

There are no effective treatments available in C9orf72 disease to date, but several promising trials including antisense therapies are being developed. Presymptomatic C9orf72 carriers represent an optimal target population for the development of new therapeutic interventions for FTD and ALS.⁶ ⁷ Therefore, it is of paramount importance to identify biomarkers of preclinical progression for FTD and ALS, which could be used to initiate and monitor potential disease-modifying treatments before any irreversible brain damage has occurred.

There is increasing evidence that microRNA (miRNA) expression in body fluids, such as plasma/serum⁸ or cerebrospinal fluid (CSF),⁹ correlates with the diagnosis and progression of many neurodegenerative diseases, including FTD¹⁰ and ALS.¹¹ MicroRNAs are a class of small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression by promoting translational repression and messenger RNA degradation.¹² Since TDP-43 promotes miRNA biogenesis,¹³ the dysregulation of TDP-43 activity associated with FTD and ALS pathogenesis could impact miRNA expression levels.¹⁴ Notably,

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► http://dx.doi.org/10.1136/ jnnp-2020-325478

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© Author(s) (or their employer(s)) 2021. Re-use permitted under CC BY-NC. No commercial re-use. See rights and permissions. Published by BMJ.

**To cite:** Kmetzsch V, Anquetil V, Saracino D, et al. *J Neurol Neurosurg Psychiatry* 2021;92:485–493.
miRNAs originating from neurons and glial cells are released through extracellular vesicles, especially exosomes, and can be measured in different body fluids, including CSF and plasma.<sup>15</sup> Aberrant expression of miRNAs can be thus non-invasively detected in easily accessible body compartments, such as blood plasma, and potentially serve as biomarkers.<sup>16</sup>

Previous studies have explored selected plasma miRNAs as biomarkers for FTD/ALS<sup>17</sup> or FTD<sup>18 19</sup> using quantitative real-time PCR. Two of them have analysed the expression of a limited number of candidate miRNAs: nine miRNAs linked with apoptosis<sup>18</sup> or 37 brain-enriched miRNAs.<sup>17</sup> A wider miRNA profiling study<sup>19</sup> analysed 752 miRNAs, as a first attempt to perform an unbiased assessment of circulating miRNAs in patients with FTD. In addition, a more recent study<sup>20</sup> assessed the expression levels of 2313 miRNAs in a merged cohort of patients with FTD with different genetic forms (C9orf72, MAPT, GRN, TBK1) or with sporadic forms, by next generation RNA sequencing (RNA-seq). However, results among different studies have been conflicting so far, probably due to the heterogeneity of cohorts with respect to the underlying pathology (genetic or sporadic). Besides, these studies only compared healthy controls and symptomatic patients, focussing on evaluating potential diagnostic biomarkers. To date, no studies have evaluated plasma miRNAs as progression biomarkers for FTD or ALS in presymptomatic individuals.

The present work aims at investigating expression levels of plasma miRNAs in a large homogeneous genetic cohort of C9orf72 mutation carriers, both in the presymptomatic and in the clinical phases, to identify potential non-invasive biomarkers of preclinical and clinical progression in C9orf72-associated FTD and ALS. We hypothesise that performing large scale RNA-seq analyses in plasma samples, without a priori assumptions, will reveal significant differences in miRNA expression levels between healthy controls, presymptomatic and symptomatic mutation carriers.

# MATERIAL AND METHODS

## Participants

PREV-DEMALS (https://clinicaltrials.gov/) Identifier: NCT02590276) is a national multicentric study focussed on C9orf72 mutation carriers. Between 2015 and 2017, 111 individuals were investigated with the same protocol in four French university hospitals (Paris, Limoges, Lille and Rouen), as previously described.<sup>6 21</sup> Written informed consents were obtained from all participants.

This cohort included 22 patients (15 FTD, 4 FTD/ALS and 3 ALS) carrying a C9orf72 expansion and 89 asymptomatic first-degree relatives of C9orf72 patients (who have 50% risk to carry the mutation), out of 64 families. A pathogenic expansion was detected in 46 of them, denoted as the ‘presymptomatic group’. The control group was formed by the 43 asymptomatic individuals that did not carry an expansion.

At inclusion, each participant's cognitive and behavioural clinical status was assessed based on standardised interview with relatives, comprehensive neurological examination, an extensive neuropsychological battery assessing all cognitive domains (including, notably, mini-mental state examination, Frontal Assessment Battery, Mattis Dementia Rating Scale and Ekman faces test) and behavioural scales (including Frontal Behavioural Inventory and Apathy Evaluation Scale) (table 1). The cognitive and behavioural evaluations and their scores have been described in more detail elsewhere<sup>6 21</sup> and in online supplemental appendix A1. Neuromuscular function was thoroughly

evaluated by means of quantitative motor testing according to Medical Research Council muscle scale, assessment of upper and lower motor neuron signs and administration of ALS-FRS (ALS-Functional Rating Scale), evaluating the degree of functional impairment. All participants underwent a systematic standardised interview to investigate the presence of cramps, fatigue, muscle pain, muscle weakness, muscle stiffness or fasciculations. Electromyography was proposed to the participants with even subtle motor signs or complaints.

One participant was excluded because mild cerebellar syndrome was detected at a neurological examination, after inclusion. Thus, the present study comprises 110 individuals (22 patients, 45 presymptomatic carriers and 43 healthy controls), all of which underwent plasma sampling at their inclusion. The demographic and clinical characteristics of the studied population are shown in table 1.

The participants have then been clinically followed after their inclusion during a 3-year period, from 2017 to 2020. Four out of the 45 C9orf72 presymptomatic carriers have developed subtle frontal cognitive and/or behavioural changes and/or motor signs/symptoms during this period, without fitting diagnostic criteria for FTD or ALS, suggesting they were in the transitional ‘prodromal’ phase at the moment of or just after their inclusion visit. These cases are described in online supplemental appendix A2. All analyses in the presymptomatic group were performed with (n=45) and without (n=41) the four prodromal subjects. We also analysed these cases separately in an additional complementary approach.

## Plasma collection and preparation

Blood samples were collected on EDTA using the same standardised collection and handling procedures for all participants across the centres. The mean disease duration at sampling was 6.2±4.0 years in the patients' group. All were in fasted state. All samples were centralised at the ICM DNA and cell bank, and processed using the same protocol. Plasma was extracted at room temperature after centrifugation of blood samples at 2500 rpm for 10 min. Aliquots of 1 mL were stored in polypropylene tubes at -80°C.

## MiRNA extraction and sequencing

MiRNA extraction was performed with a miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) following the manufacturer's instructions. We used 200 µL of plasma quickly melted and directly added to 1 mL of QIAzol solution. MiRNAs were eluted in 14 µL of water; 5 µL were used for miRNA sequencing library preparation with QIAseq miRNA Library Kit (Qiagen) according to the manufacturer's protocol.

MiRNA sequencing was performed on Illumina NovaSeq 6000 in three independent batches, targeting a minimum of 10 million mapped reads per sample. Since batch effects may have a critical impact in high-throughput experiments, we randomly assigned each individual to one batch, equally distributing clinical status (control, presymptomatic and patient) and centres (Paris, Limoges, Lille and Rouen), to allow adjusting for batch effects during data analysis. Online supplemental table A1 describes the distribution of subjects across batches.

## Raw reads to miRNA counts computation pipeline

Quality control of raw reads was performed with FastQC (Andrews S. 2010, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc). UMI-tools<sup>22</sup> and Cutadapt<sup>23</sup> were used respectively to extract UMIs and suppress adapting sequences as well as