# Étude de la biodiversité microbienne indigène permettant l'élaboration de l'AOP “ Châteauneuf-du-Pape ” du domaine du Vieux Télégraphe et détermination de son impact lors de la vinification

Amélie Blais

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Amélie Blais. Étude de la biodiversité microbienne indigène permettant l'élaboration de l'AOP “ Châteauneuf-du-Pape ” du domaine du Vieux Télégraphe et détermination de son impact lors de la vinification. Sciences agricoles. 2022. dumas-03941412

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Université de Montpellier
Centre de formation et de recherche en Oenologie
Faculté de pharmacie

# Étude de la biodiversité microbienne indigène permettant l'élaboration de l'AOP « Châteauneuf-du-Pape » du domaine du Vieux Télégraphe et détermination de son impact lors de la vinification

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Domaine du Vieux Télégraphe
Maitre de stage : **Edouard BRUNIER**

Mémoire présenté en 2022 en vue de l'obtention du Diplôme National d'Oenologue
Par

**Amélie Blais**
Remerciements

Ce mémoire a été rendu possible par l'intervention de plusieurs personnes pendant
mon stage et pendant la rédaction de ce rapport. Je tiens à les remercier.

En premier lieu, je tiens à remercier mon maître de stage, Edouard Brunier, pour les connaissances qu'il m'a transmises ainsi que le temps qu'il m'a accordé tout au long de mon stage.

Je souhaite également remercier l'ensemble de la famille Brunier pour m'avoir permis de travailler et d'apprendre dans leur domaine ainsi que toute l'équipe du domaine du Vieux Télégraphe pour leur accueil.

J'aimerais également remercier l'équipe avec laquelle j'ai travaillé, et notamment le personnel permanent, pour leurs conseils pratiques en cave ainsi que les saisonniers et les autres stagiaires.

Je tiens à remercier l'équipe du laboratoire Excell pour les analyses microbiologiques réalisées sur l'essai.

Par ailleurs, je veux témoigner ma reconnaissance à l'équipe pédagogique du Diplôme National d'Œnologue de Montpellier pour la qualité de leurs enseignements ainsi que leur disponibilité.
# Tables des matières

## I. Introduction 1

## II. Le Vieux Télégraphe 2

2.1 Situation géographique & histoire 2

2.2 Autres domaines de la famille Brunier 3

2.2.1 Domaine de la Roquète 3

2.2.2 Domaine des Pallières 3

2.2.3 Domaine de Massaya 3

2.3 Gamme de vin 4

2.4 Commercialisation 5

## III. Viticulture 6

3.1 Présentation des appellations 6

3.1.1 AOP Châteauneuf-du-Pape 6

3.1.2 AOP Gigondas 7

1.3 AOC Ventoux 8

3.2 Caractérisation du millésime 2021 9

3.3 Le choix d'une culture raisonnée 10

3.4 Travaux en vert 11

3.3.1 L'ébourgeonnage et épamprage 11

3.3.2 L'effeuillage 11

3.3.3 L'éclaircissage 12
### 3.3.4 L'écimage, rognage

12

## 3.5 Contrôle maturité

13

## 3.6 Les vendanges

14

# IV. Les vinifications

15

## 4.1 Préparation et arrivés des raisins au chai

15

## 4.2 Préparation du pied de cuve

17

## 4.3 Vinification des vins blancs

18

## 4.4 Vinification des vins rouges

20

# Étude de la biodiversité microbienne indigène permettant l'élaboration d'une cuvée en AOP « Châteauneuf-du-Pape » et détermination de son impact lors de la vinification

# V.I Étude bibliographique

24

## 5.1.1 Fermentation Alcoolique

24

## 5.1.2 Biodiversité des levures

25

Généralité

25

Origine des levures présentes dans les moûts de raisins

26

Description des différentes souches de levures

27

# V.II Matériel et méthode

35

## 5.2.1 Mise en place de l'étude

35

## 5.2.2 Protocole expérimental

35

Récolte des raisins blancs

36

Pied de cuve

36

Itinéraire de vinification

36
Les échantillons des moûts pendant la FA

37

Analyses microbiologiques

38

## V.III Résultats et interprétations

40

### 5.3.1 Dénombrement des levures

40

Dénombrement levures totales

40

Dénombrement des levures non-Saccharomyces

42

Évolution de différentes souches de non-Saccharomyces

44

### 5.3.2 Bactéries acétiques et lactiques

47

Bactéries acétiques

47

Bactéries lactiques

48

### 5.3.3 Contrôle d'implantation de Saccharomyces cerevisiae

50

## V.IV Conclusion générale, critiques et discussions

51

### Bibliographie

53

### Annexes

56

### Résumé

62
## Liste des figures

Figure 1 : Cartes des différentes AOP du domaine du Vieux Télégraphe

Figure 2 : Gamme de vin du domaine du Vieux Télégraphe

Figure 3 : Carte des sols de l'AOP Châteauneuf-du-Pape

Figure 4 : Carte des sols de l'AOP Gigondas

Figure 5 : Carte des sols de l'AOC Ventoux

Figure 6 : Grappe de raisin atteinte de pourriture

Figure 7 : Ligne de réception des raisins (Conquêt, table vibrante, érafloir)

Figure 8 : Pied de cuve des moûts rouges

Figure 9 : Cuve « Imeca »

Figure 10 : Schéma de vinification des vins blancs

Figure 11 : Remontage

Figure 12 : Schéma de vinification des vins rouges

Figure 13 : Schéma simplifié de la FGP & de la FA

Figure 14 : Biofilm produit par *Pichia kluyveri* dans le moût en début de FA

Figure 15 : Schéma de vinification des vins blancs pour l'expérimentation au domaine du Vieux Télégraphe

Figure 16 : Évolution de la population de levure par la méthode d'Epifluorescence

Figure 17 : Graphique représentant la phase de croissance levurienne dans la littérature

Figure 18 : Évolution de la population de levure totale et non-Saccharomyces

Figure 19 : Évolution des levures non-Saccharomyces au cours de la FA

Figure 20 : Profils génétiques des contrôles d'implantation
## Liste des tableaux

Tableau 1 : Récapitulatif des différents échantillons

Tableau 2 : Récapitulatif des analyses pour chaque échantillon

Tableau 3 : Différentes concentrations en bactéries acétiques

Tableau 4 : Différentes concentrations en bactéries lactiques

## Liste des annexes

Annexe 1 : Schéma des lieux-dit de Châteauneuf-du-Pape avec un zoom sur la « Crau »

Annexe 2 : Tableaux récapitulatifs des analyses de dénombrement

Annexe 3 : Tableau récapitulatif des concentrations des levures non-Saccharomyces

Annexe 4 : Résultats du laboratoire Excell sur les rouges
## Liste des abréviations

AT : Acidité totale

AOP : Appellation d'origine protégée

ha : hectares

AOC : Appellation d'origine contrôlée

B.bruxellensis : *Brettanomyces bruxellensis*

CHR : Café, Hôtel, Restaurant

CO₂ : Dioxyde de carbone

SO₂ : Dioxyde de soufre (SO₂)

FA : Fermentation alcoolique

FGP : Fermentation glycéro-pyruvique

FML : Fermentation malo-lactique

GD : Grande distribution

H.uvarum : *Hanseniaspora uvarum*

hL : Hectolitres

kg : Kilogrammes

IMC : Intensité de la Matière Colorante

IPT : Indice de Polyphénols Totaux

QRT-PCR : PCR quantitative en temps réel

L.thermotolerans : *Lachancea thermotolerans*

LSA : Levure sèche active

4-mercapto-4-méthylpentan-2-one : 4-MMP

M.pulcherrima : *Metschnikowia pulcherrima*

m : Mètres

mm : Millimètres

OTA : Ochratoxine A

O.oeni : *Oenococcus oeni*

TAVP : Titre Alcoométrique Volumique Probable

TAV : Titre Alcoométrique Volumique

PDC : Pied de cuve

P.kluyveri : *Pichia kluyveri*

S.cerevisiae : *Saccharomyces cerevisiae*

3-sulfanylhexan-1-ol : 3-SHA

T.delbrueckii : *Torulaspora delbrueckii*

Viables non cultivables : VNC
# I. Introduction

Situé dans la commune de Bédarride à proximité de Châteauneuf-du-Pape, le domaine du Vieux Télégraphe est un domaine familial existant depuis 1891. Il couvre actuellement plus de 110 hectares (ha) sur différentes appellations, comprenant différentes géographies et pédologies.

La famille Brunier possède une philosophie bien à eux concernant la viticulture et leurs méthodes de vinifications. En effet, ils utilisent très peu d'intrant lors des vinifications et souhaitent être respectueux de l'environnement en appliquant une culture raisonnée sans pour autant appartenir au label « Agriculture Biologique ».

La fermentation alcoolique (FA) est un mécanisme complexe, réalisée principalement par des levures du type *Saccharomyces cerevisiae* (*S.cerevisiae*) mais également par d'autres levures. Edouard Brunier, très curieux, a souhaité en savoir plus sur ce processus.

Au domaine du Vieux Télégraphe, les FA ont toujours été réalisées à l'aide d'un pied de cuve, aucune levure n'y est ajoutée. En ce sens, on a voulu connaitre quelles levures étaient présentes et leurs potentiels rôles dans la vinification. C'est pourquoi nous avons décidé d'étudier la biodiversité microbienne indigène permettant l'élaboration de la cuvée « Vieux Télégraphe blanc ».

Cette étude aidera la famille Brunier à mieux connaître leurs levures présentes aux vignobles et dans la cave de vinification. Elle leur permettra, s'ils le souhaitent, d'isoler la levure qui les intéresse afin de développer au mieux ses caractéristiques.

J'ai effectué mon stage de Juillet à Novembre au domaine du Vieux Télégraphe afin de connaître leurs méthodes toutes particulières de vinifications et de découvrir la région Côte du Rhône méridionale. Cette expérience m'a offert l'opportunité d'acquérir de solides compétences pratiques dans la vinification de vins blancs et rouges ainsi que la chance d'approfondir mes connaissances théoriques.

Ainsi ce mémoire présentera dans un premier temps le domaine du Vieux Télégraphe, son histoire et ses vins. Par la suite une partie sera consacrée à la viticulture du domaine et leur choix d'une culture raisonnée. Puis une partie vinification sera introduite. Afin de réaliser mon expérimentation, une partie bibliographique regroupera l'ensemble des données nécessaires à la compréhension des micro-organismes et plus particulièrement des levures non-*Saccharomyces*. Elle sera complétée par le protocole expérimental mis en place ainsi que par les différentes analyses réalisées. Pour finir, ce mémoire se terminera par l'analyse et la discussion des résultats, suivie des différentes ouvertures qu'il sera possible de réaliser.
## II. Le Vieux Télégraphe

### 2.1 Situation géographique & histoire

Le domaine du Vieux Télégraphe, domaine historique de l'Appellation d'Origine Protégée (AOP) Châteauneuf-du-Pape, se situe dans les Côtes-du-Rhône sud et plus précisément dans la ville de Bédarride dans la région du Vaucluse.

Le vignoble est principalement situé sur et autour du lieu-dit « La Crau » en haut de la colline de Châteauneuf-du-Pape. Ce lieu-dit est reconnu pour son terroir composé d'une épaisse couche de galets roulés, laissée sur place à la fonte des glaciers alpins, bien avant la formation de la Vallée du Rhône.

Le domaine est exploité par la famille Brunier depuis six générations et plus exactement depuis 1891. C'est Henri Brunier qui lui donna naissance. Son fils Hyppolite plantera les premiers pieds de vigne sur « La Crau ». Jules le fils d'Hyppolite donnera le nom de « Vieux Télégraphe » au domaine car à l'époque un télégraphe optique était installé sur le plateau de « La Crau ».

Depuis les années 80, Daniel et Frédérique Brunier ont repris l'entreprise familiale et exploitent aujourd'hui environ 110 ha : 98 ha en appellation Châteauneuf-du-Pape dont 8ha en blanc et 15 ha en IGP Vaucluse et l'Appellation Origine Controlée (AOC) Ventoux.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Fig 1 : Cartes des différentes AOP du domaine du Vieux Télégraphe</figcaption></figure>
## 2.2 Autres domaines de la famille Brunier

### 2.2.1 Domaine de la Roquète

Le domaine de la Roquète a été racheté par la famille en Brunier en 1989, il se trouve au coeur du village de Châteauneuf-du-Pape. À l'origine il se composait de 29 ha de vignes en AOP Châteauneuf-du-Pape majoritairement planté sur les lieux-dits « Piedlong » et « Pignan » ainsi que 3 ha en vins de pays situé dans le Vaucluse. Une remise en état du vignoble et du chais de vinification a été effectué par la famille en 1998. Actuellement la Roquète compte 40ha dont 7ha en Côtes du Veutoux (Caromb et St Hippolyte le Graveyron).

Anciennement orthographié « La Roquette », le Domaine produit essentiellement des vins d'assemblages, dominé par le Grenache d'une moyenne d'âge de 40ans.

### 2.2.2 Domaine des Pallières

Les Pallières est un domaine de 135 ha dont seulement 25ha sont dédiés aux vignes. Il est situé sur les Dentelles de Montmirail dans la commune de Gigondas. Il a été acheté en 1998 par la famille Brunier en partenariat avec un des plus gros importateur et marchand de vins Américain, Kermit Lynch. L'origine du nom Pallières provient du mot « palier » faisant référence aux différences de niveaux existants entre les rangs de vignes plantés en ce lieu.

Il produit essentiellement des vins d'AOP Gigondas grâce à un terroir particulier. Le domaine est cultivé en terrasses escaliers. Le sol est en partie recouvert d'éboulis de roches calcaires provenant des Dentelles de Montmirail mixé d'une couche d'argile rouge très compacte. Le climat y est particulier, par exemple le mistral assainit le vignoble ou encore la saisonnalité des pluies très marquée. Cela permet de donner un style rude, élégant, chaleureux et minéral aux vins.

### 2.2.3 Domaine de Massaya

Le domaine de Massaya est situé dans la vallée de Beqaa au Liban, il appartient à la famille Ghosn qui redonne vit au vignoble après la guerre civile en 1992. Avec l'aide de la famille Brunier ainsi qu'avec Dominique Hebrard de la région bordelaise, les premières bouteilles ont été commercialisées en 1998.

Le domaine de Massaya se compose de deux vignobles, un à Tanaïl dans la Vallée de Beqaa. Les raisins cultivés sont destinés à la production de vin rouge et de rosé. Le deuxième se situe au Mont Liban où on retrouve les cépages blancs comme le Rolle, le Chardonnay, le Sauvignon blanc, la Clairette et la Roussanne. La production est mise en bouteille au Liban et est exportée en France, au domaine de la Roquète afin d'être étiquetée et exportée à l'étranger.
## 2.3 Gamme de vin

Les vins du domaine se décomposent en quatre gammes différentes constituées à 90 % de rouge et 10 % de blanc : les AOP Châteauneuf-du-Pape, les Pallières, l'AOC Ventoux et le Pigeoulet.

Concernant les AOP Châteauneuf-du-Pape, le domaine produit cinq cuvées différentes :

- Le Vieux Télégraphe rouge : Le vignoble est situé exclusivement sur le plateau caillouteux de la « Crau ». Ce vin est un assemblage de 65% grenache noir, 15% Mourvèdre, 15% Syrah, 5% Cinsault et Clairette. Il est élevé jusqu'à 22 mois en foudres de chêne français de 60 hectolitres (hL) avant mise en bouteille.

- Le Vieux Télégraphe blanc : Les vignes sont également situées exclusivement sur le plateau de la « Crau ». Il est issu d'un assemblage de 40% Clairette, 25 % Grenache blanc, 25% Roussanne, 10% Bourboulenc. Il est élevé pendant une année sur lie en barriques, demi-muids et foudres de 30 hL avant d'être mis en bouteille.

- Le Piedlong : Il est majoritairement constitué de vieux Grenache noir ayant en moyenne 70 ans et de Mourvèdre. Le vieux Grenache provient du lieu-dit « Piedlong » expliquant le nom de la cuvée. Il est élevé 22 mois en foudres de chêne français de 60 hL avant sa mise en bouteille.

- Le Télégramme : Cette cuvée est réalisée grâce la production des jeunes vignes de moins de 30 ans et des parcelles plus âgées, n'étant pas situées sur les plateaux de la « Crau » ni de « Piedlong ». Il est issu d'un assemblage de 80 % Grenache noir, 10 % Syrah, 6 % Mourvèdre et 4 % Cinsault. Il est élevé 15 à 16 mois en foudres de chêne français de 30 à 60 hL.

- Le Clos la Roquète : Les vignes sont situées sur le lieu-dit « la Roquète ». C'est un assemblage d'un tiers Roussanne, d'un tiers Clairette et d'un tiers Grenache blanc. Il est élevé sur lie en barriques et demi-muids.

La gamme des Pallières est composée de deux vins rouge d'AOP Gigondas (Les Racines et les Terrasse du diable). Elle contient également une cuvée déclassée en vin sans indication géographique (Le petit bonheur) car celui-ci ne correspond pas au cahier des charges de l'AOP Gigondas. Le domaine du Vieux Télégraphe produit également la cuvée Mégaphone, un vin rouge d'AOC Ventoux issu d'une sélection parcellaire de 6 ha près des dentelles de Montmirail. Et enfin, la gamme se termine par les cuvées Pigeoulet constituées d'un vin blanc et d'un vin rouge.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Fig 2 : Gamme de vin du domaine du Vieux Télégraphe</figcaption></figure>

Le domaine du Vieux Télégraphe vinifie l'ensemble de ses cuvées de la même façon sans exception. Les différences notables proviennent essentiellement des différents terroirs des lieux-dits. En plus de la production de vin, le domaine met en place une eau de vie, le vieux marc. Il est élevé en barrique pendant dix ans minimums.

## 2.4 Commercialisation

Les ventes des différentes cuvées se font par la vente directe au caveau ainsi qu'aux cafés, hôtels, restaurants (CHR), cavistes et grossistes. Le domaine a fait le choix de ne pas collaborer avec la grande distribution (GD) afin de maintenir son image et de rendre le produit plus « difficilement » trouvable. Le marché national atteint 35% des ventes, il continue d'augmenter ces dernières années. Concernant l'export, une grande partie de la production y est destinée. Les premiers importateurs sont les États-Unis, l'Angleterre, la Suisse et l'Allemagne. Cependant le domaine exporte dans 42 pays différents. Le Vieux Télégraphe développe également de nouvelles stratégies commerciales afin de toucher de nouveaux marchés et de valoriser leurs biens et leurs terres. L'activité principale du domaine reste la production de vin mais il est cependant intéressant de constater la diversité des produits développés attirant de nouvelle clientèle. En effet, le domaine a mis en place une production de fromage de chèvre dans leur de sa propriété des Pallières. En plus du fromage, les chèvres participent également au désherbage des vignes si nécessaire. La commercialisation du fromage se fait localement depuis 2015 et à l'heure actuelle, elle est réservée aux clients restaurateurs ainsi qu'aux employés.

En 2015 le domaine du Vieux Télégraphe lance une production d'huile d'olive afin de mettre à profit les nombreux oliviers. Les olives sont ramassées sur les différents domaines ainsi que près des vignes puis sont acheminées au moulin Castelas aux Baux de Provence. Ils sont principalement vendus aux particuliers directement au caveau.
# III. Viticulture

## 3.1 Présentation des appellations

### 3.1.1 AOP Châteauneuf-du-Pape

#### Généralités

Ce sont les Papes, lors de leur installation à Avignon au XIVe siècle, qui ont révélés le terroir de Châteauneuf-du-Pape.

Le vignoble s'étend aujourd'hui sur une superficie de 3200 ha sur toute la commune de Châteauneuf-du-Pape et certaines autres communes comme Bédarrides, Courthézon, Orange et Sorgues. L'AOP Châteauneuf-du-Pape produit annuellement environ 91 000 hL. (Châteauneuf-du-Pape)

#### Les sols

Les terroirs de l'appellation Châteauneuf-du-Pape sont constitués de plusieurs types de sols différents :

- La roche mère : constituée de dépôts calcaires Urgoniens par-dessus lesquels se sont sédimentés des sables.

- Le sous-sol : composé d'argiles rouges formés à partir de minéraux présents dans les galets roulés. Elles ont pour but premier d'alimenter en eau la vigne car celle-ci peut s'y enraciner jusqu'à trois mettre de profondeur.

- Les galets roulés : marqueur du terroir, ils permettent de restituer aux grappes de raisin la chaleur emmagasinée au cours de la journée. C'est le Rhône qui a apporté les galets roulés en agglomérant du quartzite et de la silice provenant des Alpes (Châteauneuf-du-Pape).

- Les coteaux sableux : formés par le retrait du Rhône.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Fig 3 : Carte des sols de l'AOP Châteauneuf-du-Pape</figcaption></figure>
## Le climat

Le terroir de Châteauneuf-du-Pape est influencé par un climat méditerranéen chaud, sec, aride et venté. Il se distingue par son ensoleillement tout au long de l'année et en été par sa sécheresse avec des températures pouvant atteindre facilement les 34 à 38°C. La saisonnalité des pluies est très marquée et peu nombreuse permettant de réduire le risque de maladies.

Son principal atout est le Mistral, il est souvent très apprécié des vignerons. Ce vent du Nord permet d'assainir le vignoble. En effet à l'approche des vendanges, il sèche la vigne après la pluie empêchant les maladies cryptogamiques de se développer.

## 3.1.2 AOP Gigondas

### Généralités

À l'époque, au XIIe siècle, les ordres religieux participent à l'extension de la culture de la vigne. Jusqu'au XVIIe siècle, Gigondas fait partie de la principauté d'Orange et a appartenu à la famille Rhénane de Nassau jusqu'au XIVe siècle. L'appellation locale Gigondas a été obtenu en 1971.

Le vignoble s'étend aujourd'hui sur 1 196 ha et produit en moyenne annuellement 35 000 hL. Il s'étend exclusivement sur la commune de Gigondas.

### Les sols

Le vignoble est implanté à une altitude comprise entre 160m et 400m sur les Dentelles de Montmirail à l'Est, la rivière Ouvèze à l'Ouest, le torrent du Trignon au Nord et les collines prolongeant les Dentelles au sud. Les sols y sont très variés. Ils sont composés de grandes terrasses d'argiles rouges caillouteuses d'origine Mindelienne qui vont s'étendre jusqu'aux Dentelles. Puis, en coteaux, le vignoble est marno-calcaire. Les sols de Gigondasriches en argiles, sont caractéristiques des terroirs de grands crus. (gigondas-vin.com)

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Fig 4 : Carte des sols de l'AOP Gigondas
Promotion 2020-2022</figcaption></figure>
## Le climat

Le climat du vignoble est influencé par un climat méditerranéen comme précédemment. Il est soumis à plusieurs saisons différentes, tout d'abord deux saisons sèches : une brève en hier et une longue période en été. Puis il y a deux saisons pluvieuses. La première à l'automne, où les pluies peuvent être abondantes, la seconde au printemps. Son atout principal est également le mistral.

## 1.3 AOC Ventoux

### Généralité

Dans les vignobles du Ventoux, la production de vin n'est pas nouvelle. En effet, la récente découverte d'un atelier de potier permet de faire remonter la production de vin à l'an 30 avant JC. Actuellement, le vignoble est situé sur les contreforts du Mont Ventoux, appelé également le « géant de Provence ». Il est classé réserve de la biosphère par l'Unesco. Le vignoble s'étend sur 5 900 ha, dans 51 communes à l'est de la Vallée du Rhône. Il produit en moyenne annuellement 251 000 hL (Inter-Rhône).

### Les sols

Les sols du vignoble au Ventoux sont variés et peuvent être fragmentés en trois catégories :

- L'amphithéâtre de Carpentras, situé au centre, est composé de sols détritiques recouverts par des galets roulés ou des chutes de calcaire provenant de la montagne.

- Le bassin de Malaucène plus au nord, se compose d'un mélange de sable et d'argile ocreuse.

- Le sud bordé par le vignoble du Luberon, se compose de sols rouges provenant de la dégradation du calcaire.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Fig 5 : Carte des sols de l'AOC Ventoux</figcaption></figure>
## Le climat

Le vignoble du Ventoux bénéficie de conditions climatiques homogènes et favorables à l'élaboration de vins de qualité. Le climat est principalement méditerranéen. Cependant quelques zones sont influencées par un climat méditerranéen continentale. L'ensoleillement est important sur l'ensemble du terroir. Néanmoins, il est important de noter que les précipitations peuvent être très violentes pouvant impacter l'état du vignoble, même si celles-ci restent rares.

## 3.2 Caractérisation du millésime 2021

Le millésime 2021 a été marqué par un phénomène grave ayant de lourds impacts sur la viticulture française mais également sur les productions arboricoles : le gel.

Dans la nuit du 7 au 8 avril un épisode de froid a touché la France impactant la viticulture. En effet, des températures négatives ont engendré des dégâts sur les parties vertes lors de la croissance végétative de la vigne ou lors de fortes chutes de température, directement sur le cep.

Le vent et la proximité avec le Rhône ont permis au domaine du Vieux Télégraphe et plus largement à l'ensemble de l'appellation Châteauneuf-du-Pape de limiter les dommages. Malheureusement pour les parcelles se trouvant à l'intérieur des terres, les pertes ont été plus conséquentes. La cuvée « Mégaphone » 2021 n'existera pas et la cuvée « Pigeoulet » a été fortement impactée.

Au cours de l'hiver 2021, les températures étaient supérieures à la normale. Le printemps était frais suivi par un été chaud. Les précipitations estivales se sont élevées en moyenne à 66 millimètres (mm) permettant à la vigne de ne pas souffrir d'un stress hydrique trop important. Cependant les vendanges ont été assez tardives pour les cépages rouges, retardées par les pluies de septembre, ce qui a entraîné de la pourriture de type *Botrytis cinerea* (fig 6).

Le millésime 2021 « restera dans les mémoires comme un millésime difficile. Son potentiel qualitatif est néanmoins prometteur. Les maturités ont été longues à atteindre, mais la patience sera récompensée et déjà de très jolis vins se profilent » (Denis Guthmuller, président du Syndicat Général des Côtes du Rhône).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Fig 6 : Grappe de raisin atteinte de pourriture</figcaption></figure>
### 3.3 Le choix d'une culture raisonnée

L'ensemble des vignobles de la famille Brunier ne sont pas certifiés « Agriculture Biologique » car il se réserve le droit d'utiliser un traitement curatif si besoin. Cependant les vignobles sont entretenus de façon raisonnée et durable.

D'après le journal officiel, la viticulture raisonnée « correspond à des démarches globales de gestion d'exploitation qui visent, au-delà du respect de la réglementation, à renforcer les impacts positifs des pratiques agricoles sur l'environnement et à en réduire les effets négatifs, sans remettre en cause la rentabilité économique des exploitations. Les modes de production raisonnée en agriculture consistent en la mise en œuvre de moyens techniques dans une approche globale de l'exploitation » (Décret n° 2002-631 ; 25 avril 2002)

Le domaine tente de préserver le milieu naturel en maintenant une partie de leurs terres en jachère afin de conserver l'équilibre du sol sur le long terme ainsi qu'en possédant 100 ha de forêts réparties aux alentours des vignes.

Concernant les traitements, ils sont décidés à l'échelle de la parcelle. Les doses utilisées sont faibles et raisonnées, si possible avec des composés biodégradables afin d'atteindre leur but :

- Pollution extérieure minimale

- Zéro résidu dans les vins

Afin de raisonner les traitements concernant le mildiou et l'oïdium, le domaine utilise un outil d'aide à la décision : Optidose®

Le concept d'Optidose a été développé par l'IFV depuis 1996, il permet de raisonner les doses de fongicides. Pour cela il s'appuie sur la connaissance et l'évaluation des risques phytosanitaires, le diagnostic de la performance du réglage des pulvérisateurs, l'appréciation de la biomasse et des conditions de dépôt des produits de traitements (vignevin-epicure.com). Cette méthode a permis de réduire les doses de cuivre de 1,5 kilogrammes (kg) par an et par ha.

Concernant la lutte biologique et plus particulièrement la lutte contre Eudémis et Cochylis (vers de la grappe), la technique utilisée est la « confusion sexuelle ». Elle est utilisée sur l'ensemble des parcelles du domaine. Cette technique consiste à empêché le rapprochement entre mâles et femelles. Pour cela des diffuseurs de phéromones sont installés dans les parcelles afin de limiter leur accouplement.
## 3.4 Travaux en vert

Après le « débourrement », lorsque les températures augmentent marquant la fin de la période de dormance et le début du cycle végétatif; les bourgeons se développent et s'ouvrent. La vigne est entretenue par différents travaux appelés « travaux en vert » afin de maitriser les rendements et d'améliorer la qualité des raisins. Dans cette partie on ne traitera pas du palissage car au domaine la majorité des vignes sont des gobelets non palissés.

### 3.3.1 L'ébourgeonnage et épamprage

L'ébourgeonnage et l'épamprage sont les premières opérations en vert effectuées sur la vigne. Au domaine, ces travaux sont réalisés manuellement vers la mi-mai.

L'ébourgeonnage permet de supprimer tous les bourgeons ou début de rameaux non désirés. Cela permet à la vigne de faire des économies d'énergie. De ce fait, elle pourra générer plus de sucre dans les baies ainsi qu'une concentration plus importante en composés phénoliques et aromatiques. D'un point de vue sanitaire, la suppression de bourgeons qui donnent de futurs rameaux, permet de réduire l'entassement au sein de la souche et donc de limiter le développement de maladies. Il est pratiqué principalement sur les tailles longues type Guyot.

L'épamprage consiste à supprimer les « pampres » (rameaux non fructifères) jugés inutiles sur la souche ou sur le porte-greffe. Cela a pour effet de contrôler la vigueur de la vigne ainsi qu'une meilleure aération du feuillage. De plus, cette méthode a pour but d'améliorer l'état sanitaire de la souche en réduisant les risques de contaminations primaires de mildiou.

### 3.3.2 L'effeuillage

Les vignes sont effeuillées manuellement vers la mi-juillet juste avant la véraison. Au domaine, l'effeuillage permet d'éliminer plus ou moins de feuilles au niveau des grappes situées « soleil levant » afin qu'elles soient exposées à des rayonnements moins puissants. La lumière à un effet inhibiteur sur le développement de maladie. Il ne faut cependant pas que les baies soient exposées au soleil de l'après-midi. En effet, le soleil ardent d'été peut créer des « grillures » entrainant une rigidité de la pellicule. Lorsque les baies se gorgent d'eau et de sucre, cela peut causer leur éclatement. Cela pourrait entrainer des contaminations de la grappe et potentiellement de la souche si le climat est propice. La quantité de feuille retirée va dépendre également de l'état sanitaire de la parcelle ainsi que du cépage. En effet, cette opération peut être bénéfique lors d'une année pluvieuse et humide. Les raisins pourrissent moins vite sous l'action de *Botrytis cinerea* car l'effeuillage permet une meilleure aération des grappes.
### 3.3.3 L'éclaircissage

Également appelé « vendange en vert », cette technique consiste à supprimer les grappes en trop présentes sur les souches. Cela dans le but de faciliter la maturation des grappes restantes et ainsi les rendre plus qualitatives. De plus, cette technique permet d'améliorer le microclimat de la souche. Au domaine, sa réalisation va dépendre du millésime et du rendement. Il est effectué manuellement et en même temps que l'effeuillage. La méthode consiste à garder les grappes situées le plus proche de la base du cep. En effet, ce sont les plus alimentées en métabolites de croissance car elles bénéficient de la sève montante.

Cette technique est réalisée au début de la véraison, c'est à cette période qu'elle est le plus efficace. Si l'éclaircissage est réalisé trop tardivement, il n'aura aucun impact sur la qualité des grappes car beaucoup de composés se seront déjà accumulés dans les baies. Cette opération n'est pas obligatoire si le potentiel de production (charge de la souche) a bien été estimé lors de taille d'hiver.

### 3.3.4 L'écimage, rognage

Postérieurement à la floraison, la vigne a besoin de soleil. Elle se développe entrainant une accumulation de végétation. Cette accumulation peut impacter la maturation des raisins et gêner l'aération.

L'écimage consiste à couper l'apex de la vigne, limitant ainsi sa croissance végétative et favorisant le stockage des métabolites dans la baie. En outre, ils augmentent la croissance des rameaux secondaires latéraux (entre-coeur).

Le rognage est l'opération en vert permettant de couper l'excès de végétation sur les cotés de la vigne. De ce fait, le rognage permet de contrôler la croissance latéral de la souche. De plus, nous préserverons la vigne de l'ombre et de l'humidité dans le but de limiter le développement des maladies.

Au domaine du Vieux Télégraphe, l'écimage et le rognage sont effectués manuellement. Ils sont adaptés à chaque parcelle et à chaque cépage. En effet, un cépage à maturité tardive sera écimé/rongé plus tardivement ou de façon moins intense. Un écimage précoce peut provoquer la perte de jeunes feuilles et diminuer l'activité photosynthétique occasionnant un taux de sucre réduit dans les baies.
### 3.5 Contrôle maturité

Le « contrôle maturité » est la technique la plus utilisée pour le suivi de la maturité du raisin. Elle permet de déterminer la date idéale de vendange. Afin de mettre en place cette technique, le domaine du Vieux Télégraphe récolte des grappes entières, de façon aléatoire sur les pieds de raisins, sur plusieurs parties de la parcelle. Le choix de récolter en grappe entière plutôt que des baies s'explique par une meilleure représentation de la maturité de l'ensemble de la parcelle. En effet, les baies à l'intérieur des grappes ont souvent un retard de maturité par rapport aux baies positionnées à l'extérieur des grappes.

Pour réaliser les contrôles, le préleveur passe dans une rangée, cueille une grappe en alternant la rangée de gauche et la rangée de droite. Cela permet de prélever des grappes exposées au soleil à différents moments de la journée et donc qui ne sont pas forcément à la même maturité. L'opération est répétée un peu plus loin dans la parcelle. Les grappes sont ensuite ramenées à la cave, égrappées et écrasées dans un seau à la main. Cela afin d'obtenir un jus représentatif des grappes prélevées.

Le domaine réalise lui-même les analyses de la masse volumique, du taux de sucre, du Titre Alcoométrique Volumique Probable (TAVP) ainsi que la dégustation du jus et des baies. Il a été décidé de ne pas réaliser les analyses d'acidité totale, de pH et d'azote assimilable. De ce fait une analyse complète sera réalisée le jour de l'encuvage de la vendange.

La masse volumique est mesurée à l'aide d'un mustimètre. C'est un instrument de mesure comprenant un densimètre couplé à un thermomètre. Le manipulateur utilise une éprouvette adaptée à la taille du mustimètre afin de ne pas toucher le fond et les côtés. Il remplit l'éprouvette de jus et y plonge le mustimètre jusqu'à immersion totale. Une fois que le mustimètre se stabilise, on peut lire la valeur de la densité ainsi que la température. Grâce à une table de calcul et en ramenant la température à 20°C on détermine le taux de sucre ainsi que le TAVP.

Le contrôle maturité est effectué tous les deux à trois jours car il permet de contrôler l'avancée de la maturité du raisin. Pour fixer une date de vendange, le contrôle maturité seule n'est pas suffisant pour le domaine. Il est couplé à une dégustation des baies et jus de raisin. Le jus et les baies sont jugés en fonction des arômes, de la texture, de l'astringence, de l'acidité et de leur équilibre. L'évaluation gustative peut influer grandement sur la date de récolte selon le millésime. Il est donc important de noter qu'au domaine, l'équipe connait parfaitement leurs vignes et leurs terroirs. Ainsi ils se référent davantage à leurs ressentis basés, de façon empirique, sur les facteurs gustatifs plutôt que sur les analyses.
## 3.6 Les vendanges

Les dates de début de vendanges sont variables en fonction des terroirs, des cépages ainsi que du climat car les raisins n'ont pas les mêmes maturités. Le planning des vendanges est donc souvent réalisé la veille pour le lendemain. Il doit également prendre en compte la main-d'oeuvre, le matériel disponible ainsi que la distance entre les parcelles.

Les premiers cépages récoltés sont les cépages blancs : la Roussanne, le Bourboulenc, la Clairette et le Grenache blanc, suivis par la Syrah. Viennent ensuite le Grenache noir, le Cinsault et le Mourvèdre. Le vignoble de Gigondas étant souvent légèrement plus tardif, du fait de l'altitude des parcelles, est récolté en dernier.

Le cahier des charges de l'AOP Châteauneuf-du-Pape oblige à récolter le raisin manuellement. Ce n'est pas le cas du cahier des charges de l'AOP Gigondas et Ventoux. Néanmoins le domaine du Vieux Télégraphe, soucieux de la qualité des raisins, a décidé de travailler ses vignes de la même façon sans faire de distinctions entre les différentes appellations. Tout d'abord, la majorité des vignes sont taillées en Gobelet et donc ne peuvent être vendangé mécaniquement. Mais également afin de préserver la qualité de la vendange. En effet, une vendange manuelle permet de limiter la trituration et respecte l'intégrité des grappes entières.

Lors des vendanges, le domaine du Vieux Télégraphe recrute une équipe pouvant aller jusqu'à soixante-dix vendangeurs. Les raisins sont récoltés dans des seaux. Les porteurs sont en charge de vider ces seaux dans les tracteurs enjambeurs. La vendange est ensuite déversée dans des camions bennes à fond plat de faible profondeur pour ne pas tasser et donc écraser la vendange.

Les vendangeurs sont formés en début de saison pour le triage des raisins sur pied. Deux tris sont effectués. Le premier, réalisé par les vendangeurs. Il permet d'écarter les grappes non mûres, pourries, les grappillons, les feuilles et les autres débris végétaux. Un deuxième tri est effectué par les permanents du domaine directement dans les bennes des enjambeurs.

Le transport de la vendange est assuré rapidement par deux camions bennes. Si la récolte a lieu loin du chai de vinification, elle est réalisée de préférence tôt le matin pour éviter l'exposition à des températures trop élevées.
# IV. Les vinifications

Les chais de vinifications sont tous construis suivant le principe de la gravité. Elle est permise grâce à l'architecture des chais construits sur plusieurs niveaux. Elle est soit naturelle soit des aménagements ont été effectués. La gravité permet de conserver la qualité des raisins de leur réception jusqu'à leur arrivée en cuve. Grâce à la gravité, l'utilisation de pompes diminue fortement lors des opérations d'écoulage, de décuvage et de pressurage. Cela ayant pour but de réduire au maximum la trituration des raisins.

Le domaine du Vieux Télégraphe a pour principe de produire des vins de qualité. Pour cela, une attention particulière est prêtée à la qualité des raisins pour l'exprimer au mieux le terroir ainsi que les évènements survenus dans l'année. Cela afin de créer un millésime unique. De plus, la famille Brunier décide de vinifier chaque cuvée suivant le même protocole en faisant abstraction des différentes appellations.

## 4.1 Préparation et arrivés des raisins au chai

Quelques jours avant les vendanges, le chai de vinification et le quai de réception sont préparés. Il est important de noter que la famille Brunier a décidé de n'utiliser aucun produit de nettoyage afin de préserver l'environnement. Cette opération est donc d'une importance capitale afin d'éviter toutes déviations lors de la vinification des moûts.

Pour cela on commence par libérer l'espace occupé par d'éventuels palettes, cartons ou autres, dans le quai de réception afin que les camions puissent circuler jusqu'au conquêt.

Le choix de travailler en levure indigène ainsi qu'avec peu d'intrant demande une hygiène de la matière première et du chai irréprochable. Les cuves bétons sont nettoyées à l'eau, frottées à la brosse puis rincées à l'eau. Le sol est également nettoyé à l'aide du nettoyeur haute pression.

Les cuves tronconiques et les foudres sont eux nettoyés en utilisant la même méthode que les cuves bétons. Ils sont ensuite remplis d'eau puis vidés après 7-8 jours, lavés de nouveau, séchés et méchés. Les barriques et demi-muids sont également lavées à l'aide d'eau chaude sous pression en utilisant une canne Moog. Puis ils sont méchés une fois sèche.

Concernant l'arrivée de la vendange, les bennes basculantes se vident dans un conquêt à plateau vibrant qui permet de réceptionner la vendange manuelle. À la Roquète, le conquêt sur rails est équipé d'un système Bluetooth et de capteurs placés à chaque cuve.
Grâce à ce système il peut monter et se déplacer au niveau +1 du chai jusqu'à la cuve sélectionnée pour la vinification des moûts rouges (fig 7). Il peut également descendre au niveau -1, où se trouve le pressoir pour la vinification des moûts blancs. Une fois le conquêt placé, la vendange est entrainée par vibration jusqu'à la table de tri pour limiter la trituration du raisin.

Le raisin est d'abord trié deux fois à la vigne, (cf. les vendanges) puis sur la table de tri. Pour cela entre deux à cinq personnes y sont postées afin de retirer de possible branches, feuilles, insectes, corps étrangers pouvant altérer le goût du vin. Les grappes et/ou baies atteintes de pourritures, abimées et à mauvaises maturités sont également triées afin d'obtenir un état sanitaire de la vendange irréprochable.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Fig 7 : Ligne de réception des raisins (Conquêt, table vibrante, érafloir)</figcaption></figure>

En fin de journée, le matériel et le sol sont nettoyés méticuleusement sans utilisation de produit chimique. Ils sont nettoyés à l'eau, brossés, rincés et séchés au chiffon microfibre. Le matériel sera désinfecté seulement en fin de vendanges.
## 4.2 Préparation du pied de cuve

Le pied de cuve est obtenu en réalisant la macération des grappes éraflées et écrasées. Celles-ci proviennent principalement des suivis de maturité. Deux pieds de cuves sont réalisés. Le premier sera utilisé pour l'ensemencement des moûts rouges et le second pour l'ensemencement des moûts blancs.

Environ une semaine avant le début des vendanges les grappes sont placées dans un bac en inox sur roues (fig 8). Il est important que les grappes choisies soit saines et mûres.
La journée le bac est déplacé à l'extérieur du chai afin de lancer la fermentation. En fin de journée une partie des peaux grossières constituant le surnageant est retirée. Après chaque contrôle maturité, les grappes sont rajoutées au pied de cuve. Cet ajout permet d'ensemencer à nouveau le pied de cuve en flore indigène et d'y augmenter le substrat principal des levures : le sucre contenu dans les baies. On effectuera un suivi des densités/températures tous les jours, car les ajouts de raisins vont modifier la masse volumique du pied de cuve.
Lorsque celui-ci atteint une masse volumique à peu près égale à 1040 kg/m³. Le jus est filtré et soutiré dans la première cuve encuvée. Cette méthode permet de lancer la fermentation. L'ensemencement de l'ensemble des autres cuves sera effectué par l'ajout d'un volume d'une cuve déjà en fermentation (ensemencement en cascade).

Un arrêt de fermentations est un risque non négligeable. Au domaine du Vieux Télégraphe aucune Levure Sèche Active (LSA) n'est utilisée. Le pied de cuve va donc permettre de démarrer la FA de façon plus franche. En effet, il n'y aura pas ou peu de phase de latence lors du départ en fermentation car les levures du type S. cerevisiae sont déjà bien développées dans le milieu.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Fig 8 : Pied de cuve des moûts rouges</figcaption></figure>
## 4.3 Vinification des vins blancs

La vendange des cépages blancs est réalisée manuellement (cf vendanges). Elle est réalisée tôt le matin pour conserver des températures fraîches. Elle est acheminée rapidement à la cave afin d'éviter tout risque d'oxydation.

En général aucun ajout du Dioxode de Soufre ($SO_2$) n'est additionné à la vendange. Cependant un ajout peut être réalisé seulement si l'état sanitaire de la vendange l'exige. En effet, lorsque les baies sont atteintes par *Botrytis cinerea*, celui-ci va relâcher dans les moûts des laccases. Cette enzyme va catalyser la réaction d'oxydation entrainant le brunissement des moûts.

Un tri minutieux est réalisé sur la table de tri vibrante. Par la suite, les grappes entières sont directement acheminées rapidement dans la cage du pressoir pneumatique par gravité. Les rafles sont conservées pour faciliter le pressurage car elles servent de drain.

Les jus de goutte et de presse sont dirigés dans des cuves appelés « Emeca » (fig 9). Cette dernière est équipée d'un système de froid afin de refroidir le jus si besoin et éviter les monter en température.

Après 24h le moût se sépare en deux phases naturellement. Les bourbes qui sont les éléments les plus lourds vont se déposer au fond de la cuve.

Le débourbage consiste à séparer par décantation le jus clair des bourbes grossières avant fermentation.

Il permet d'affiner les arômes fermentaires et de limiter certains composés indésirables qui sont vecteurs de mauvais goût dans les vins.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Fig 9 : Cuve « Imeca »</figcaption></figure>

Cependant le débourbage ne doit pas être réalisé de façon trop sévère car il faut conserver suffisamment de nutriments pour les levures comme les lipides et l'azote assimilable.

Le jus clair est soutiré et acheminé dans des cuves en béton. Un suivi de la température et de la densité est effectué une fois par jour car la température de vinification des blancs est importante afin de ne pas oxyder le moût. Les taux d'azotes assimilables sont également corrigés en début de fermentation par de l'ajout de phosphate d'ammonium. En effet, dans la vallée du Rhône, les taux d'azote sont souvent bas et il ne faut pas risquer un arrêt de fermentation.
Pour lancer la FA, la première cuve est ensemencée par le pied de cuve. Par la suite, on effectuera un ensemencement en cascade (cf pied de cuve). Lorsque la fermentation démarre, le moût est entonné dans des foudre de 30hL, des demi-muids et des barriques pour y effectuer sa FA, sa fermentation malo-lactique (FML) et son élevage.

Il est également important de souligner qu'aucune colle n'est utilisée lors du processus de fermentation, ni avant la mise en bouteilles. En effet, le domaine a fait le choix d'utiliser le moins d'intrants oenologiques possible.

Pendant la FA, on réalise le bâtonnage plusieurs fois par semaine. Le bâtonnage à pour but de remettre en suspension des lies en homogénéisant le potentiel d'oxydo-réduction. Il permet une libération plus importante de colloïdes glucidiques de levure. De plus, il augmente la stabilité protéique du vin. Les poylysacharides de la paroi des levures stabilisent certains composés en les rendant indisponibles pour des réactions de polymérisation et de précipitation.

L'utilisation des lies prend une place importante dans les vinifications et dans l'élevage au domaine du Vieux Télégraphe. Les lies sont constituées majoritairement de mannoprotéines et de composés libérés lors de l'autolyse naturelle des levures. Elle va permettre le relargage de composés (lipides, substances azotées, acides ribonucléiques, vitamines et polyolosides) dont certains sont considérées comme des précurseurs d'arômes. Ce phénomène est long, le bâtonnage permet donc d'accélérer ce processus en apportant de la complexité au vin.

Lorsque la FA est terminée, aucun ajout de SO₂ n'est effectué afin que la FML se déclenche. La FML est le phénomène de métabolisation de l'acide malique en acide lactique par les bactéries lactiques. Elle va réduire l'acidité du vin mais permet également d'apporter une belle complexité aromatique.

Les vins vont être élevés sur lies fines pendant encore quelques mois avant d'être filtré si besoin et mis en bouteille.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Fig 10 : Schéma de vinification des vins blancs</figcaption></figure>

## 4.4 Vinification des vins rouges

La vendange des cépages rouges est également réalisée à la main. La vendange est triée minutieusement puis foulée et éraflée grâce à un érafloir couplé à un fouloir. L'éraflage n'est pas systématique, il peut être total ou partiel. Il va dépendre des parcelles et principalement de la maturité des rafles. Quand celles-ci sont de bonnes qualités et à bonnes maturités, elles apportent des tanins plus souples, de la complexité et de la fraîcheur au vin. Cependant un excès ou des rafles à mauvaise maturité peut entrainer des vins plus astringents. Un ajout de SO₂ liquide peut être réalisé suivant l'état sanitaire de la vendange directement après encuvage afin de limiter l'apport d'enzymes par *Botrytis cinerea*.

Les raisins sont vinifiés avec une macération post-fermentaire de 30 jours en moyenne pouvant s'étendre jusqu'à 40 jours pour certaines parcelles de vieux Grenache noir. Ce temps de macération est souvent déterminé par le maitre de chai grâce à la dégustation des cuves ainsi qu'avec la lecture des analyses chimiques (sucre, pH, acidité totale, azote assimilable). Elles sont réalisées en cuves bétons revêtues, bétons brutes et tronconiques bois avec contrôle de la température par drapeau.
L'ensemble des cuves sont vinifiées en levures indigènes. L'inoculation de la première cuve est faite par le pied de cuve, puis on réalisera un ensemencement en cascade (cf pied de cuve). Après ça, elles subissent une homogénéisation d'une durée d'une demi-heure le jour de l'encuvage.

Pendant la FA, un contrôle de densité et de température est réalisé tous les jours en début de journée à l'aide du mustimètre et d'un thermomètre.

Les moûts sont remontés une fois par jour pendant cinq minutes jusqu'au départ de la FA. On diminue l'apport d'oxygène en limitant au maximum la hauteur d'aspersion et en se branchant directement à la vanne.

Lorsque la fermentation a démarré, deux remontages sont effectués : un le matin et un l'après-midi, de minimum trente minutes en présence d'oxygène. Pour cela on place un bac sous la vanne du haut de la cuve, le jus s'écoule au contact de l'air puis sera pompé et dispersé au-dessus de la cuve (fig.11). Le remontage permet d'apporter de l'oxygène qui est essentiel au bon fonctionnement de la fermentation. Les levures en phase de croissance ont besoin d'oxygène pour proliférer. Une bonne aération est essentielle pour prévenir d'une éventuelle fermentation languissante ou d'un arrêt de FA. En effet, les levures vont consommer l'oxygène en synthétisant des stérols, qui est un facteur de survie important et nécessaire lors de la phase exponentielle de croissance des levures.

Tous les remontages sont effectués manuellement en binôme ou seul à l'aide d'une pompe à piston (Manzini®) ou d'une pompe à demi-lobes coaxiaux (Francesca®).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Fig 11 : Remontage</figcaption></figure>

De plus, le manque d'oxygène peut entrainer un défaut olfactif appelé « réduction » (odeurs de chou, oeuf pourrit) causé par le métabolisme soufré des levures (exemple de molécules H₂S). Le remontage permet également de faciliter l'extraction des composés phénoliques (anthocyanes et tanins) contenu dans le marc. De manière générale, les opérations d'extractions (remontages, délestages etigeages) ont pour but d'améliorer les phénomènes de libération et diffusion de ces composés.
Quand la cuve atteint son premier tiers de sa FA, un délestage peut être effectué. Le délestage n'est pas réalisé systématiquement. La famille Brunier décide de le réaliser après dégustation des cuves. Cependant il peut être fait sur la même cuve, plusieurs jours de suite.

L'objectif de cette technique est de noyer entièrement le chapeau de marc afin de favoriser les phénomènes de diffusion et d'homogénéisation. Il va donc, comme le remontage, maximiser les échanges entre la phase solide et la phase liquide pendant la macération. Cette déstructuration du marc va permettre de faciliter la libération des sucres contenus dans les pellicules de raisins.

Pour réaliser le délestage, nous soutirons l'entièreté du jus de la cuve pour le transférer dans la cuve « Imeca ». Elle va refroidir le jus jusqu'à 16-17°C. Le chapeau de marc va monter en température dans la cuve initiale pendant plusieurs heures, pour atteindre un maximum de 30°C. L'augmentation rapide de la température va permettre d'augmenter la dissolution des composés phénoliques et d'accélérer la macération. De plus, il va se tasser sous son propre poids au fond de la cuve, libérant un moût riche en sucres et polyphénols. Le jus sera renvoyé dans sa cuve initiale refroidissant le chapeau de marc.

Le délestage n'a pas d'incidence sur les principaux critères physicochimiques des moûts (TAVP, acidité totale, pH, acidité volatile) mais plutôt sur la composition polyphénolique. En effet, elle permet d'augmenter la teneur en polyphénols totaux (IPT) de 8% en moyenne et plus particulièrement les anthocyanes ainsi que l'intensité colorante (IMC) de 4% en moyenne par rapport à un remontage classique. Cependant plus de trois délestages n'est pas forcément nécessaire car cela n'entraine pas d'augmentation plus importante d'extraction mais peut à l'opposer réduire l'IMC et les anthocyanes des vins. Les vins obtenus sont un peu moins riches en tanins et sont moins polymérisés, moins réactifs vis-à-vis des protéines et donc moins astringents et plus enrobés (Vinsonneau et al., 2008).

Quand le dernier tiers de la FA est atteint les remontages sont réalisés à l'abri de l'air, afin de ne plus apporter d'oxygène. Pour cela, on se branche directement à la vanne du haut de la cuve, le jus est remonté pendant dix à quinze minutes. Néanmoins, à la suite d'une dégustation si des odeurs de réduit sont présentes, il n'est pas exclu de réaliser un remontage à l'air de cinq minutes maximums afin d'apporter une légère oxygénation.

Les moûts vont également subir un pigeage. Il consiste à enfoncer le chapeau de marc dans le jus afin d'extraire les constituants de la pellicule de raisin participant à la structure et aux qualités organoleptiques du vin. Il permet également de fractionner le chapeau de marc dans le but d'avoir une diffusion homogène de l'ensemble du marc. Il est souvent réalisé en même temps qu'un remontage fermé pour faciliter la pénétration du pigeur sans apport d'oxygène de façon à limiter l'oxydation des composés phénoliques et aromatiques.
Une fois la FA terminée, les cuves sont remontées une fois par jour à l'abri de l'air le temps de la macération post-fermentaire. Pour cela, on arrose simplement le chapeau de marc de manière à éviter la réduction et la piqûre acétique.

Quand la macération post-fermentaire est terminée, la cuve est écoulée par gravité. L'écoulage consiste à soutirer le vin (appelé jus de goutte) par gravité dans une cuve béton placée à l'étage inférieur. Par la suite, la cuve est décuvée. Le marc est sorti et envoyé par gravité dans le pressoir pneumatique à cage ouverte à l'étage inférieur. Le jus pressé (appelé jus de presse), est envoyé dans une autre cuve béton. Les jus de goutte et de presse sont assemblés après quelques jours afin que les lies des jus de presse se déposent au fond de la cuve. Les jus assemblés seront entonnés dans les foudres, les demi-muids, les barriques et les cuves tronconiques. Un léger sulfitage à 4-5 g/L peut être réalisé.

Les FML se déclenchent souvent sous marc et se termine dans les contenants en bois. Elle va entrainer une baisse de l'acidité totale (AT), une augmentation du pH ainsi qu'une sensation d'acidité moindre à la dégustation. En effet, l'acide malique a une saveur plus « dure » que l'acide lactique. De plus la FML va apporter de la complexité et du volume au vin rouge en apportant des arômes secondaires.

Les assemblages des différentes cuvées sont effectués au mois de juin qui suit la campagne de vinification. Ils sont décidés après une dégustation par la famille Brunier. L'élevage va se poursuivre encore plusieurs mois selon la cuvée souhaitée, avant la mise en bouteilles.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Fig 12 : Schéma de vinification des vins rouges</figcaption></figure>
# Étude de la biodiversité microbienne indigène permettant l’élaboration d’une cuvée en AOP « Châteauneuf-du-Pape » et détermination de son impact lors de la vinification

## V.I Étude bibliographique

Il existe deux grands types de micro-organismes intervenant dans la transformation du vin : les levures qui sont responsables de la FA & les bactéries telles que *Oenococcus oeni* (*O.oeni*) responsable de la FML.

De nombreux travaux de recherche montrent que les levures *S.cerevisiae* sont les levures majoritairement responsables de la FA. Cependant, des études plus récentes montrent que les levures non-*Saccharomyces* peuvent également participer à la fermentation. On peut donc se demander, à juste titre, l'effet qu'elles pourraient avoir sur la FA. Le but de cette étude pour mon maître de stage est de pouvoir identifier la flore indigène présente sur ses raisins et dans sa cave et de comprendre leur possible impact sur la FA.

### 5.1.1 Fermentation Alcoolique

La FA est essentiellement réalisée par les levures présentes naturellement sur la baie de raisin ou dans le chai de vinification. Elles peuvent également être d'origine exogène comme les LSA ajoutées. La FA doit être rapide afin de limiter la production d'autres micro-organismes et notamment des levures indésirables ou des bactéries lactiques et acétiques.

La fermentation des moûts est un processus biochimique complexe en milieu anaérobie dans lequel les levures ont un rôle fondamental lors de la transformation des sucres en éthanol, en dioxyde de carbone (CO₂) et en centaines d'autres produits secondaires (alcools supérieurs, glycérol, esters, etc.).

Au début de la FA, afin de permettre l'oxydation du 3-phospho-glycéraldéhyde, qui conduira à l'acide pyruvique, la réduction de la dihydroxy-acétone phospate se traduit par la production de glycérol (Neuberg, 1946). Le glycérol a deux rôles importants pendant la FA, il va permettre tout d'abord un équilibre énergétique. Le NAD+ est réduit en NADH pendant la glycolyse. La formation de glycérol permet donc de régénérer ce NAD+ grâce à l'oxydation du NADH en NAD+. Cela donne lieu à un équilibre d'oxydo-réduction intracellulaire. Lorsque la levure se trouve dans un milieu hyper-osmotique comme par exemple un moût très sucré, l'eau va être expulsée hors de la cellule. La levure produit donc une quantité de glycérol nécessaire afin de pouvoir compenser la différence de pression osmotique entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule. Cependant, une trop grande quantité de glycérol entraine une forte production NADH augmentant l'acidité volatile du vin.
Le pyruvate quant à lui, est également responsable de diverses réactions de transformation conduisant à une grande variété de produits secondaires.

Finalement, lorsque le moût est très concentré en sucre, la fermentation glycéro-pyruvique (FGP) est prioritaire puis la FA deviendra de plus en plus importante, la régénération d'NAD+ fera effectuée par l'éthanal réduisant la FGP (Fig 13). En moyenne 8% des sucres suivent la FGP contre 92% pour la FA (Lai, 2010).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Fig 13 : Schéma simplifié de la FGP & de la FA</figcaption></figure>

### 5.1.2 Biodiversité des levures

#### Généralité

La baie de raisin héberge une communauté microbienne complexe. Elle est constituée de nombreuses espèces de levures majoritairement non-*Saccharomyces*, quelques *Saccharomyces*, de bactéries et lorsque celle-ci est touchée par la pourriture, des moisissures. Cette population évolue de la nouaison jusqu'à ce que la baie atteigne sa maturité. Généralement, au stade les plus précoces, les espèces *Basidiomycètes* sont les plus dominantes. Par la suite, les espèces *Ascomycètes* se multiplient, notamment celles qui possèdent des capacités fermentaires. La diversité des levures est influencée par l'environnement du chai et évolue avec les opérations de vinification (Grangeteau, 2016).

Il est intéressant d'étudier les différentes populations de levures non-*Saccharomyces* présentes naturellement dans les moûts car elles peuvent impacter positivement ou négativement la qualité des vins via la production de composés indésirables (acide acétique, acétaldéhyde, acétate d'éthyle...) ou désirables (alcools supérieurs, thiols volatils, certains
esters...). Les levures non-*Saccharomyces* présentent un intérêt œnologique du fait de leur capacité à augmenter la complexité aromatique des vins par rapport à une fermentation réalisée uniquement avec des souches de *S.cerevisiae*. L'utilisation de certaines souches de LSA composé uniquement de *S.cerevisiae* entraine l'inhibition de la majorité des espèces non-*Saccharomyces* (Ciani et al., 2010).

## Origine des levures présentes dans les moûts de raisins

### Les baies de raisins

Comme cela est décrit au paragraphe « généralité », les baies de raisins hébergent une grande et diverse communauté de levures. Les levures les plus retrouvées sont majoritairement des non-*Saccharomyces*. Certains articles montrent que les genres les plus couramment identifiés dans les baies matures sont : *Candida*, *Hanseniaspora*, *Metschnikowia et Pichia* et dans les moûts : *Candida*, *Hanseniaspora*, *Metschnikowia et Pichia* (Grangeteau, 2016). On s'aperçoit que ce sont majoritairement les mêmes. Il est également important de noter que des levures d'altérations telles que l'espèce *Brettanomyces* peuvent être retrouvés sur les baies de raisins, celles-ci peuvent entrainer des défauts dans le vin. Sa présence peut augmenter lorsque la baie est atteinte par *Botrytis cinerea*. Concernant *S.cerevisiae*, les recherches montrent qu'une minorité est présente sur le raisin et donc que la majorité d'entre elles proviendrait d'autres sources.

### La cuverie

Le matériel de cuverie est aussi considéré comme source de levures indigènes présentes dans les moûts par les scientifiques. En effet, des recherches ont montré que de nombreuses levures ont été identifié sur le matériel de cuverie ainsi que dans l'environnement de la cave avant et pendant la période des vinifications. Les principaux genres rencontrés sont : *Aureobasidium*, *Candida*, *Cryptococcus*, *Debaryomyces*, *Hanseniaspora*, *Hansenula*, *Metschnikowia*, *Pichia*, *Rhodotorula*, *Saccharomyces et Torulaspora* (Grangeteau, 2016).
Une étude a également montré que les levures non-*Saccharomyces* peuvent persister d'un millésime à un autre et se réimplanter dans le moût l'année suivante. Le comportement des levures non-*Saccharomyces* pourraient s'apparenter à celui des levures *Saccharomyces*.

De plus, le contenant peut influencer l'environnement des micro-organismes durant les vinifications. Des observations ont montré que les cuves usagées bien entretenues n'apportaient pas de micro-organisme supplémentaire dans le moût où domine la microflore du raisin. Néanmoins les contenants en bois (barrique, demi-muid, foudre) peuvent quant à eux, contenir des micro-organismes et particulièrement des levures du type *Brettanomyces*.
En effet, le bois est un matériau poreux, qui ne peut donc pas être désinfecté par produit chimique. Les contenants en bois sont plus difficiles d'entretien et potentiellement responsables de contaminations.

## Origine hypothétique : les mouches

Le matériel de cuverie et les baies de raisins ne sont pas les seules sources de levures indigènes dans les vins. Des articles montrent que les mouches du type *Drosophila melanogaster* pourraient être vecteurs de certaines levures. En effet les levures telles que *Brettanomyces bruxellensis* ou bien *Hanseniaspora uvarum*, *Metschnikowia pulcherrima*, et *Torulaspora delbrueckii* ont été retrouvés sur des mouches dans une cave de vinification. Ces mouches pourraient donc être à l'origine de certaines levures retrouvées lors de la FA mais cela n'a pas encore été démontré (Grangeteau, 2016).

## Description des différentes souches de levures

### Saccharomyces cerevisiae

La levure *S.cerevisiae* est la levure dominante au cours de la FA, elle va permettre de transformer la totalité du sucre en éthanol.

*S.cerevisiae* est une levure eucaryote unicellulaire de forme sphérique ou ovale. Sa taille peut varier entre 1 et 9 µm en longueur et de 1 à 5 µm en largeur.

Elle survie aux conditions difficiles du moût en fermentation, c'est-à-dire, une concentration en sucre importante, un taux d'éthanol au-delà de 12% (v/v), un pH compris entre 2,8 et 3,5, une teneur faible en oxygène et des températures basses (environ 15°C). Elle est également caractérisée par la production de toxines « killer » et de métabolites inhibiteurs (SO₂, acide acétique, acide gras,...).

Grâce à la recherche et développement des laboratoires oenologiques, des LSA sont capables de finir la FA dans des conditions plus difficiles : Alcool supérieur à 14,5°, pH 3,8, etc.

### Brettanomyces bruxellensis

La levure *Brettanomyces bruxellensis* (*B.bruxellensis*) est considérée comme une levure d'altération. Elle produit des phénols volatils (4-éthylphénol, 4-éthylgaïacol, 4-éthylcatéchol) responsables d'odeurs désagréables dans les vins (écurie, camphre), des acides gras et d'acide acétique. Il est donc important de l'étudier afin de limiter son développement dans les moûts de raisins et les vins. *B.bruxellensis* a une forme ovale à ellipsoïdale et se reproduit par bourgeonnement, elle n'est pas sporogène. Elle peut être présente à n'importe quel stade de la vinification. Comme *S.cerevisiae*, cette levure est dite « Crabtree positive ».
L'effet « Crabtree » représente un phénomène particulier : lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu aérobie et avec un excès de glucose (par exemple le moût de raisin) la fermentation alcoolique est favorisée.

B.bruxellensis a une très forte résistance à l'éthanol. Elle peut tolérer 14,5% (v/v) d'éthanol dans les vins rouges. Sa température optimale de croissance se situe entre 25°C et 28°C cependant elle survit à basse température. De plus certaines souches présentent une très grande résistance au SO2. En effet, les sulfites vont provoquer un état viable non cultivable (VNC) c'est à dire que les levures conservent une activité métabolique mais ne peuvent plus se multiplier dans le vin. Les VNC peuvent représenter un risque car elles sont susceptibles de redevenir cultivables, par exemple en cas de baisse de SO2 actif (Pic et al., 2016).

## Torulaspora delbrueckii

Torulaspora delbrueckii (T.delbrueckii) ou anciennement Saccharomyces rosei est une levure fermentaire. C'est une levure de forme sphérique voir parfois ovoïde et ellipsoïdale d'environ 3-7 µm et donc plus petite que S.cerevisiae.

T.delbrueckii est la plus ancienne levure non-Saccharomyces proposée pour un usage industriel dans la fermentation des vins.

## Ethanol

T.delbrueckii peut produire jusqu'à 7 à 10% (v/v) d'éthanol voir jusqu'à 12% (v/v) dans certaines conditions (Cabrera et al., 1988; Herraiz et al., 1990), ce qui est plus élevé que la moyenne des levures non-Saccharomyces. De plus, elle présente une grande sensibilité à l'éthanol, même si certains articles démontrent que dans un milieu synthétique contentant 18% (v/v) d'éthanol et 0,6 g/L d'acide acétique, T.delbrueckii aurait une viabilité de 100% contre 10% pour S.cerevisiae au bout de 2h.

Cependant celle-ci serait incapable de fermenter le fructose restant (Santos et al., 2018). Sa production d'alcool modéré entrainerait la présence de sucre résiduel indésirable dans les FA, si celle-ci n'est pas accompagné de S.cerevisiae.

## Glycérol

T.delbrueckii est une levure pouvant résister à de nombreux facteurs de stress, elle est considérée comme étant osmotolérante. Sa réponse au stress osmotique diffère de S.cerevisiae. En effet, elle pourrait augmenter plus rapidement sa concentration de glycérol intracellulaire. De plus, cette hyperaccumulation de glycérol dure moins longtemps comparé à S.cerevisiae. D'après Ansell et al. (1997), le glycérol servirait uniquement dans l'ajustement osmotique mais d'interviendrait pas dans le contrôle du potentiel d'oxydoréduction intracellulaire.
## Aptitudes oenologiques

Pendant la FA, *T.delbrueckii* a un impact positif sur la qualité organoleptique des vins et en particulier car elle produit moins d'acidité volatile que *S.cerevisiae*. Cette particularité serait due à plusieurs spécificités. Tout d'abord à une faible production d'acidité volatile et de glycérol par gramme de biomasse, ainsi qu'à une faible production de biomasse. Puis grâce à une réponse au stress osmotique différente de *S.cerevisiae* (cf.Glycérol) ce qui entraine une production minoritaire d'acidité volatile et de glycérol dans le moût (Seguinot,2020).

De plus, elle est responsable d'une augmentation de la concentration en terpènes (Seguinot,2020) et en thiols volatils (Belda et al., 2017). Il a été démontré qu'elle a également un impact sur les esters d'acétates et plus particulièrement sur l'acétate isoamyle responsable d'odeurs de banane, bonbon anglais dans les vins. Cependant *T.delbrueckii* produit de l'acétate d'éthyle. Cela peut être problématique car si elle dépasse une certaine concentration (150 mg/L) dans les vins, elle est responsable d'odeur de solvant (Azzolini et al., 2012).

Néanmoins, les vins fermentés avec *T.delbrueckii* sont reconnus comme plus fruités et plus complexes aromatiquement (Chasseriaud, 2015). Il est également important de noter que *T.delbrueckii* a une forte activité enzymatique et plus particulièrement concernant la β-glucosidase impliqué dans la libération de terpène et norisoprenoides (Seguinot,2020).

Cependant la croissance de *T.delbrueckii* est fréquemment affectée négativement par *S.cerevisiae*. En effet, la compétition pour les substrats ainsi que la production de métabolites par *S.cerevisiae* inhibant sa croissance ont été évoqués (Bely et al., 2008). Un autre phénomène pouvant affecter la croissance de *T.delbrueckii* a été mis en évidence. Il est appelé « cell-cell contact ». Ce phénomène montre que la proximité ou le contact physique entre les deux espèces induit une baisse de croissance voire la mort de *T.delbrueckii* (Nissen et al.,2003).

## Lachancea thermotolerans

*Lachancea thermolerans* (*L.thermolerans*) anciennement connue sous le nom de *Kluyveromyces thermotolerans* est une levure de forme sphérique, ovoïde ou allongé. On la trouve naturellement sur les baies de raisins.

Elle est produite de façon industrielle pour les vins depuis 2012. Elle permet selon eux, d'augmenter la complexité et l'intensité des arômes ainsi que d'améliorer l'AT en produisant peu d'acidité volatile.
## Ethanol

L. thermotolerans n'a pas une forte capacité fermentaire cependant elle est capable de subsister pendant la FA jusqu'à des teneurs d'éthanol proche des 9% (v/v), au-delà, elle s'affaiblit. Cependant dans la littérature il est écrit que certaines souches peuvent se maintenir jusqu'à des teneurs en alcool avoisinant les 13% (v/v) (Ciani et al., 2010).

## Aptitudes oenologiques

L'atout majeur de L. thermotolerans est sa capacité à produire, en présence de S. cerevisiae, des concentrations importantes d'acide L-lactique en ayant les sucres comme substrat (Hranilovic et al., 2017). Cette spécificité va permette d'augmenter l'AT du vin. Elle est très intéressante dans les régions où les moûts ont souvent des pH élevés. De plus elle peut également entrainer une diminution du degré alcoolique, ce qui est non négligeable à l'heure actuelle.

Par ailleurs, cette levure a un impact positif sur le profil organoleptique du vin, par l'absence de composé aromatique indésirable. En effet, elle produit peu d'acidité volatile et plus précisément d'acide acétique. De plus, L. thermotolerans est décrite dans la littérature comme étant productrice de β-glucosidase, impliquant la libération de composés aromatiques (terpènes, norisoprenoides). D'après l'article de Zott et al. (2011), L. thermotolerans en fermentation avec S. cerevisiae produirait une forte concentration en thiols et plus particulièrement 4-mercapto-4-méthylpentan-2-one (4MMP). L'article décrit également que L. thermotolerans influence la production de plusieurs esters d'acétate ainsi que certains terpènes.

Il est intéressant de noter que cette levure est connue pour un autre usage que l'oenologie. En effet, elle est utilisée comme agent de lutte biologique fongiques sur les raisins afin d'inhiber la croissance d'Aspergillus, un champignon qui peut produire de l'Ochratoxine A (OTA).

## Pichia kluyveri

La levure Pichia kluyveri (P.kluyveri) n'est pas la levure non-Saccharomyces la plus étudiée pourtant elle présente des caractéristiques intéressantes pour la FA même si celle-ci ne peut la mener seule. C'est une levure de forme légèrement ovoïde d'environ 2 à 10 µm, elle est très difficile à distinguer de S. cerevisiae car elles ont des formes très similaires.

Elle peut être déterminée dans le moût facilement car elle crée des biofilms lors de son développement, très caractéristique (fig 14).
Cette levure évolue sans difficulté dans le moût car elle se développe dans les milieux contenant du glucose, de l'éthanol ou du glycérol. De plus, elle émet une forte résistance à des pressions osmotiques élevées. (Vicente et al., 2021)

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Fig 14 : Biofilm produit par *Pichia kluyveri* dans le moût en début de FA</figcaption></figure>

### Ethanol :

*Pichia kluyveri* a une résistante à l'éthanol de 4 à 5% (v/v), cependant elle n'est capable de consommer que du glucose. Il est donc important qu'elle se trouve en présence de *S.cerevisiae* afin que tous les sucres puissent être consommés.

De plus, une étude a montré qu'une co-inoculation de *P.kluyveri* pouvait entrainer une teneur en éthanol plus faible qu'avec une fermentation en présence exclusivement de *S.cerevisiae*. En effet, cette baisse est due au métabolisme oxydatif de *P.kluyveri* qui consomme le glucose sans former d'éthanol. Le sucre est transformé en composés secondaires tels que le glycérol. (Vicente et al., 2021)

### Glycérol :

Comme expliqué précédemment la levure va créer du glycérol, cette concentration va augmenter quand *P.kluyveri* fermente plus longtemps. Certains scientifiques ont démontré qu'une inoculation séquentielle de 48h pouvait entrainer une augmentation de glycérol de 0,33 g/L pouvant aller jusqu'à 1,3g/L au bout de 96h (Vicente et al., 2021).

### Aptitudes oenologiques

La levure *P.kluyveri* peut avoir certains impacts sur les composés aromatiques. Dans la littérature, il est a été démontré qu'elle libère des thiols et plus particulièrement l'acétate de 3-sulfanylhexan-1-ol (3-SHA) donnant des arômes de bourgeon de cassis, fruit de la passion. Elle est connue également pour réduire la teneur totale en alcools supérieurs. De plus, *P. kluyveri* présente une activité estérase, qui catalyse la formation d'esters (Vicente et al., 2021).

Une des caractéristiques la plus intéressante de la levure *P.kluyveri* est sa production de toxine tueuse. En effet, les facteurs « killer » sont des toxines produites par certaines souches de levures pouvant détruire d'autres levures ou de nombreux champignons filamenteux.
Concernant *Pkluyveri* deux toxines ont été identifiés :

- Une glycoprotéine. Elle a un effet antimycosique sur les cellules sensibles.

- Pkkp, son mécanisme d'action n'a pas encore été identifié.

Ces « facteur killer » ont un spectre d'action beaucoup plus large que celui de *S.cerevisiae*. En effet, elles seraient capables d'inhiber *Brettanomyces bruxellensis*. Cependant elle doit être utilisée avec précaution car elle est également capable d'inhiber *S.cerevisiae* dans les moûts peu acides, si celle-ci n'est pas résistante. (Vicente et al., 2021)

Finalement, il est important d'étudier soigneusement *P.kluyveri* afin d'exploiter au maximum ses capacités en faisant attention aux différents problèmes qu'elle peut engendrer dans les vins.

## Metschnikowia pulcherrima

*Metschnikowia pulcherrima* (*M.pulcherrima*) est souvent retrouvé dans les baies de raisins et en début de FA. Elle est souvent utilisée en bioprotection. La bioprotection permet de diminuer l'utilisation de SO₂ dans les vins en utilisant des souches levuriennes et/ou bactériennes sélectionnées afin de prendre le dessus sur la flore indigène.

## Ethanol

*M.pulcherrima* a un faible pouvoir fermentaire, elle produit en moyenne jusqu'à 4% (v/v) d'éthanol dû en partie à sa faible absorption d'azote et à sa sensibilité à l'éthanol (tolère entre 3 à 5% v/v). Par ailleurs, à l'aide de son métabolisme respiratoire aérobie, cette levure permet de diminuer la teneur en alcool dans les vins. Cette spécificité pourrait être très intéressante au vu du changement climatique, qui entraine des degrés alcooliques beaucoup plus importants.

## Aptitudes oenologiques

Le principal intérêt de *M.pulcherrima* pendant la FA en présence de *S.cerevisiae* est son efficacité à diminuer l'acide acétique dans les vins en limitant sa production de glycérol.

*M.pulcherrima* possède une forte activité anti-microbienne contre les espèces altérations présentes dans les moûts, du genre *Brettanomyces*, *Hanseniaspora* et *Pichia* mais pas contre *S.cerevisiae*, ce qui peut la rendre très intéressante.

Toutefois, certains scientifiques pensent qu'elle pourrait impacter négativement la croissance de *S.cerevisiae* par la production d'acide pulcherrimique.
Cet acide forme un pigment rouge insoluble appelé la pulcherrimine, en captant les ions fer III présents dans le milieu. Celui-ci devient alors hostile pour les autres micro-organismes ayant besoin de fer pour se développer (Capozzi et al., 2015). Cependant les avis divergents, en effet, Kántor et al. (2019) a démontré que *S.cerevisiae* ne serait pas altérée par ce phénomène.

Elle se caractérise également par une activité enzymatique élevée. En effet, il a été montré que cette espèce possède une forte activité glycosidique permettant la libération d'arômes variétaux.

Il est important de noter que *M.pulcherrima* en FA seule produit une forte concentration d'acétate d'éthyle (Varela et al., 2017). Néanmoins, en présence de *S.cerevisiae*, elle pourrait avoir une influence positive sur le profil aromatique des vins. En effet, certaines souches pourraient être impliquées dans la libération des thiols et dans l'augmentation de la production d'alcools supérieurs (Sadoudi et al., 2012). En conclusion, les vins fermentés en présence de *M.pulcherrima* seraient plus floraux et avec des arômes de fumé (González-Royo et al., 2015).

## Hanseniaspora uvarum

*Hanseniaspora uvarum* (H.uvarum) est une levure apiculée ovoïde allongée que l'on trouve généralement sur les raisins. Elle est souvent considérée dans le vin, comme une espèce de détérioration. *H.uvarum* se développe généralement dans les moûts peu sulfités à l'encuvage.

## Ethanol

Cette levure est capable de fermenter une partie des sucres et principalement le fructose, contrairement à *S.cerevisiae* qui a une préférence pour le glucose. Toutefois en co-inoculation, les sucres sont consommés plus rapidement, permettant d'augmenter la vitesse de la FA.

Elle ne produit pas plus de 4 à 7% (v/v) d'éthanol. Pour autant certaines souches peuvent prédominer la fermentation jusqu'à 6% (v/v) d'éthanol et continuer à se développer jusqu'à 12,5% (v/v) d'alcool. On peut donc retrouver ces levures apiculées jusqu'à la fin de la fermentation.
## Effets sur la fermentation alcoolique

La vinification en présence de *H.uvarum* a longtemps été considérée comme indésirable. En effet, cette levure est fortement productrice d'acide acétique et acétate d'éthyle. En culture mixte avec *S.cerevisiae*, la production d'acide acétique reste toutefois acceptable. Concernant, la quantité d'acétate d'éthyle, elle peut dépasser le seuil de perception. En faible quantité (concentration < 150 mg/L) elle apporte des arômes rappelant la pomme. En revanche, lorsque le seuil est dépassé, elle peut amener des odeurs de dissolvant ou de vernis à ongle indésirable dans les vins.

Plus positivement, *H.uvarum* possède une bonne activité enzymatique, comme la β-glucosidase, la xylosidase ou encore la protéase. Ces enzymes permettent d'améliorer la qualité du vin. Par exemple la β-glucosidase va permettre d'obtenir des vins plus riches en terpènes et norisoprenoides, comme expliqué précédemment (Chasseriaud, 2015).

D'autre part, certaines souches de *H.uvarum* sont faiblement productrices d'OTA. L'OTA est une mycotoxine, possédant des propriétés cancérigènes néphrotoxiques et immunodépressives lorsqu'elle est ingérée en grande quantité sur de longues périodes.

Enfin, il est intéressant de noter, que lorsque *S.cerevisiae* et *H.uvarum* sont en co-inoculation, la population de *H.uvarum* est en déclin, plusieurs explications ont été évoquées dans la littérature. Tout d'abord, la consommation des nutriments par *S.cerevisiae* entrainerait le déclin de la population de *H.uvarum*. Une deuxième explication plus hypothétique a été émise par les chercheurs, ils ont remarqué que les métabolites sécrétés par *S.cerevisiae* pouvaient être une cause de la baisse de la population de *H.uvarum*. Toutefois une analyse approfondie de ses métabolites ainsi que de leur mécanisme d'action doit être réalisée (Wang, 2015).
# V.II Matériel et méthode

## 5.2.1 Mise en place de l'étude

L'étude va permettre d'analyser la biodiversité microbienne indigène et de déterminer son impact lors de la vinification. Elle sera étudiée d'abord sur les raisins blancs, sur le pied de cuve puis à différents stades de la vinification des blancs.

Le domaine du Vieux Télégraphe vinifie exclusivement ses raisins à l'aide de levures indigènes avec ensemencement d'un pied de cuve, comme expliqué dans les parties précédentes. De ce fait il n'était pas envisageable d'utiliser une cuve témoin vinifiée par des LSA pour comparer l'effet des levures indigènes par rapport à la cuve témoin. En effet, ces levures pourraient altérer l'environnement de la cave et modifier le profil des levures déjà présentes. De plus ce n'est pas dans l'idée de la famille Brunier d'utiliser des intrants oenologiques. Nous avons donc choisi de réaliser une étude avec une partie bibliographie bien développée afin de pouvoir répondre au mieux à la problématique souhaitée par mon maitre de stage.

L'étude ne traitera pas d'un cépage en particulier mais les raisins blancs proviendront exclusivement du terroir de la « Crau » à Châteauneuf-du-Pape (cf annexe 1).

Lors de ce projet, aucune dégustation n'est prévue, car n'ayant pas plusieurs cuves avec différentes modalités, il n'était pas pertinent d'organiser une dégustation. Cependant afin de pouvoir analyser les résultats et émettre des hypothèses il est intéressant de connaitre le profil organoleptique décrit sur la fiche technique de la cuvée « Vieux Télégraphe blanc ». La cuvée est présentée comme étant très expressive au nez, dévoilant des arômes floraux comme l'acacia, le chèvrefeuille, le genêt, ainsi qu'un très léger fruité : fruits blancs, avec un fond minéral et des arômes secondaires et tertiaires.

## 5.2.2 Protocole expérimental

L'objectif de ce mémoire est d'étudier les populations de levures et de bactéries présentes dans les raisins et d'observer leur évolution dans le pied de cuves et dans plusieurs échantillons correspondant à différents stades de vinification. Le protocole a été réalisé avec l'aide du laboratoire Excell qui s'occupe des analyses microbiologiques. Il est important de noter que ce protocole a été difficile à mettre en oeuvre car les FA ont été extrêmement rapides cette année. De plus, je n'étais pas sur place tous les jours car je vinifiais sur un chai différent de celui où a été effectuée l'étude. De ce fait, certaines analyses n'ont pas pu être réalisées correctement et notamment sur les vins rouges. En effet, nous voulions les analyser mais les résultats ne sont pas cohérents et difficiles à exploiter.

En conséquence ce mémoire présentera exclusivement les travaux sur les vins blancs. Néanmoins les résultats des vins rouges sont présentés dans l'annexe 4.
## Récolte des raisins blancs

Le premier échantillon de raisins a été prélevé dans différentes parcelles de blancs des cépages Grenache blanc, Clairette, Roussanne, et Bourboulenc. Le but étant de représenter au mieux le lieu-dit « la Crau ». Nous avons récolté les raisins en utilisant la même méthode que pour le contrôle maturité. Les grappes sont ramassées au hasard sur plusieurs rangés et dans différentes parcelles. Elles sont envoyées au laboratoire pour y effectuer les différentes analyses traitées dans la partie suivante.

## Pied de cuve

Le pied de cuve est préparé à partir des raisins ayant servi à réaliser le contrôle maturité (cf préparation du pied de cuve). L'échantillon correspondant est prélevé juste avant l'ensemencer du pied de cuve, et envoyé au laboratoire.

## Itinéraire de vinification

L'itinéraire de vinification est légèrement différent de celui exposé dans la vinification des blancs car celle-ci se passe au chai du Vieux Télégraphe. Là-bas un remontage est effectué avant le début de la FA, et les entonnages sont réalisés en milieu de FA à une masse volumique d'environ 1050 kg/m³.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Fig 15 : Schéma de vinification des vins blancs pour l'expérimentation au domaine du Vieux Télégraphe</figcaption></figure>
## Les échantillons des moûts pendant la FA

Pour prélever les moûts, un protocole bien spécifique a été mis en place par le laboratoire. Les échantillons sont récupérés dans une bouteille plastique écrasée. On les remplit à ras bord, on ferme le bouchon, et on relâche la pression sur la bouteille afin d'y incorporer le moins d'air possible. Cette technique permet d'éviter l'explosion de la bouteille par le dégagement de CO₂ lors du transport jusqu'au laboratoire.

Ce protocole a été réalisé pour tous les échantillons, même lorsqu'ils n'étaient pas encore en fermentation. Nous avons prélevé plusieurs échantillons différents pendant la FA. Pour simplifier la lecture, les échantillons sont regroupés dans le tableau suivant :

<table><caption>Tab 1 : Récapitulatif des différents échantillons</caption><thead><tr><td>Nom de l'échantillon</td><td>Masse volumique (kg/m³)</td><td>Contenant</td><td>Stade de vinification</td></tr></thead><tbody><tr><td>Raisins Blancs</td><td></td><td></td><td>X</td></tr><tr><td>Pied de cuve blanc (PDC)</td><td>X</td><td>X</td><td>Milieu de fermentation avant encemensement</td></tr><tr><td>Échantillon 1 (Ech 1)</td><td>1093</td><td></td><td>Début de FA</td></tr><tr><td>Échantillon 2 (Ech 2)</td><td>1056</td><td>Cuve béton</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 3 (Ech 3)</td><td>1050</td><td></td><td>Milieu de FA</td></tr><tr><td>Échantillon 4 (Ech 4)</td><td>1010</td><td>Foudre de 20 hL</td><td>Fin de FA</td></tr><tr><td>Échantillon 5 (Ech 5)</td><td>990</td><td>Foudre de 20 hL</td><td>FA terminée</td></tr></tbody></table>
## Analyses microbiologiques

Le laboratoire choisi pour réaliser les analyses est Excell, qui se trouve à Floirac, près de Bordeaux. Excell dispose d'outils innovants permettant de réaliser l'ensemble des techniques microbiologiques. La première méthode utilisée est le dénombrement des levures totales et non-*Saccharomyces* sur milieu gélosé spécifique. Le milieu gélosé va permettre le développement des micro-organismes sur milieu nutritif gélosé. Seuls les micro-organismes vivants et cultivables c'est-à-dire capables de se multiplier sur le milieu vont se développer et donner des colonies.

Les bactéries acétiques et lactiques ainsi que la population de levures totales est dénombrées à l'aide de la méthode de l'épifluorescence. Le principe de cette technique est de rendre fluorescentes les cellules viables en utilisant leur activité estérase intracellulaire et un substrat l'acétate de fluorescéine (substrat d'estérase). Les cellules viables vont hydrolyser l'acétate de fluorescéine et libérer la fluorescéine fluorescente. Les cellules viables seront vertes sur fond noir et les mortes ne seront pas visibles (labexcell).

Cette technique, contrairement au dénombrement sur milieu gélosé spécifique, comprend la quantité de levures viables cultivables et viables non cultivables dans notre milieu.

Les *Brettanomyces* ont été détecté tout d'abord en utilisant la méthode par culture sur milieu sélectif comme expliqué précédemment puis dénombrer par PCR quantitative en temps réel (QRT-PCR). La particularité de cette méthode est de pouvoir faire une quantification absolue des *Brettanomyces* après détection. Le principe général repose sur la quantification d'un composé fluorophore dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité d'amplicons (portion d'ADN définie par un couple d'amorces) générés pendant la réaction de PCR.

Afin de contrôler si *S.cerevisiae* s'est bien implanté dans le milieu, des contrôles d'implantations ont été réalisés en début et une fois la FA terminée. Pour cela, une PCR classique inter-δ est réalisée. Cette technique particulière de PCR consiste à amplifier les séquences inter-δ des souches de *S.cerevisiae*, c'est-à-dire les portions du génome présentes entre les séquences δ. Ceci va permettre d'identifier les différentes souches spécifiques de *S.cerevisiae* car la répartition des séquences δ sur le génome sont propres à chaque souche.

Pour terminer, nous quantifions un certain nombre de levures non-*Saccharomyces* qui sont : *Torulaspora delbrueckii*, *Lachancea thermotolerans*, *Metschnikowa pulcherrima*, *Hanseniaspora uvarum*. Pour déterminer les quantités exactes de ces levures, la méthode par QRT-PCR est utilisée. Nous avons réalisé cette analyse microbiologique sur deux échantillons en début & milieu de FA.
Afin de faciliter la compréhension, les analyses réalisées sur chaque échantillon sont regroupées dans le tableau récapitulatif suivant :

<table><caption>Tab 2 : Récapitulatif des analyses pour chaque échantillon</caption><thead><tr><th>Analyses réalisés</th><th>Raisins blanc</th><th>PDC</th><th>Ech 1</th><th>Ech 2</th><th>Ech 3</th><th>Ech 4</th><th>Ech 5</th></tr></thead><tbody><tr><td>Dénombrement de levure non-Saccharomyces sur milieu gélosé en UFC/mL</td><td>X</td><td>X</td><td></td><td></td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement de levures totales sur milieu gélosé en UFC/mL</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement de levures Brettanomyces par QRT-PCR en cell/mL</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement de levures non-Saccharomyces par QRT-PCR en cell/mL</td><td></td><td></td><td>X</td><td>X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Population de levure par la méthode d'épifluorescence en cell/mL</td><td>X</td><td>X</td><td></td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Population en bactéries lactiques par la méthode d'épifluorescence cell/mL</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Population en bactérie acétique par la méthode d'épifluorescence cell/mL</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td>X</td><td></td></tr><tr><td>Controle d'implantation des levures Saccharomyces</td><td></td><td></td><td></td><td>X</td><td></td><td></td><td>X</td></tr></tbody></table>
# V.III Résultats et interprétations

## 5.3.1 Dénombrement des levures

### Dénombrement levures totales

L'ensemble des résultats sont présentés à l'aide d'histogrammes afin de faciliter la lecture (résultats complet en annexe 2). Ici, les résultats sont obtenus grâce à la méthode d'épifluorescence. Les populations de levures étudiées au sein de chaque échantillon sont viables : c'est-à-dire que les levures présentes dans le milieu ont toutes les capacités pour s'adapter au milieu, pour se reproduire et former des colonies.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Fig 16 : Évolution de la population de levures par la méthode d'épifluorescence</figcaption></figure>

La figure 17 illustre la population initiale au sein de la baie de raisin, du pied de cuve et son l'évolution au cours de la fermentation. Nous constatons que la concentration de levure est assez importante dans la baie de raisin. Cela peut apporter une grande diversité de levures lors de la FA provenant de ces baies.
On remarque également que l'évolution de la population levurienne suit une courbe de croissance normale (fig 18). L'échantillon 2 et 3 représente la phase II c'est-à-dire la phase linéaire. En effet la concentration mesurée est la même à la masse volumique de 1050 kg/m³ et à 1056 kg/m³. L'échantillon 4 représente le début de la phase de déclin, car nous remarquons une diminution de la concentration en levures.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Fig 17 : Graphique représentant la phase de croissance levurienne</figcaption></figure>

Les résultats de la figure 17 nous confirment également la bonne implantation et la bonne utilisation du pied de cuve lors des vinifications. En effet, nous remarquons que l'échantillon « PDC » a une concentration d'environ $10^7$ cell/mL, ce qui est proche de la population idéale atteignable dans un moût en fermentation à l'issue de la phase de croissance exponentielle. Grâce à cette méthode, aucune fermentation languissante ou arrêt de fermentation n'a eu lieu lors de cette campagne de vinification.

On constate sur la figure 18 des concentrations en levures totales plus faible pour chaque échantillon par rapport à la figure 16. Deux techniques ont été utilisés pour dénombrer la population de levures totales : la méthode sur milieu gélosé et la méthode d'épifluorescence. L'épifluorescence permet de déterminer les viables cultivables et non cultivables, ce qui explique la différence de concentration entre les deux techniques. Les levures VNC sont toujours actives métaboliquement mais sont incapable de se multiplier sur milieux gélosés. Il est important de noter qu'une levure VNC peut redevenir cultivable si les conditions environnementales le permettent.
# Dénombrement des levures non-Saccharomyces

Dans cette partie, nous allons nous intéresser au rapport de levures *Saccharomyces* et non-*Saccharomyces* dans nos différents échantillons (tableau des résultats en annexe 2).
La figure 19 montre le pourcentage de levure *Saccharomyces* et non-*Saccharomyces* par rapport à la quantité totale de levure dénombrés dans le milieu. Le pourcentage de *Saccharomyces* dans les échantillons correspond à la différence des levures totales et des levures non-*Saccharomyces*.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Fig 18 : Évolution de la population de levure totale et non-Saccharomyces</figcaption></figure>

La population de la baie de raisin à maturité atteint 7 x 10⁴ UFC/baie, ce qui est proche du maximal trouvé dans la littérature. On remarque que les levures non-*Saccharomyces* ne sont pas majoritaires comme décrit par les chercheurs. Il est important de noter que le milieu de culture choisi pour dénombrer les levures totales inhibe les bactéries acétiques, lactiques et les moisissures. On peut donc exclure une contamination du milieu. Nous pouvons émettre des hypothèses concernant ce résultat. Tout d'abord une erreur a pu être commise par le laboratoire, altérant les résultats. D'autre part ne connaissant pas le milieu de culture utilisé pour le développement des non-*Saccharomyces*, celui-ci pourrait être en mesure d'inhiber une partie de ces levures.

D'après la figure 19 dans l'échantillon « PDC blanc » on identifie 60% de levures *Saccharomyces* contre 40% de non-*Saccharomyces*. On remarque une forte augmentation de la population de levures non-*Saccharomyces*. Cet accroissement pourrait provenir de la baie de raisin car celle-ci contient une population importante de levures.
L'environnement de la cave peut également influer sur cette population. En effet, le pied de cuve est éraflé, écrasé, dans un bac laissé dans la cave (cf préparation du pied de cuve).

En sachant que le pied de cuve fermente correctement nous en déduisons que les levures restantes sont de types *Saccharomyces cerevisiae* car se sont les levures majoritairement responsables de la FA et elles ont été identifié lors du contrôle d'implantation (cf contrôle d'implantation).

L'échantillon 3 correspond au milieu de la FA, on remarque que les *Saccharomyces* se sont bien implantées dans le milieu car elles représentent 71% des levures, ce qui permet de ne pas rencontrer de difficultés particulières pendant la FA.

Au vu de la proportion de non-*Saccharomyces* (21%), elles ont permis de fermenter les premiers degrés alcooliques et donc d'apporter plus de complexité au vin que nous détaillerons dans la partie suivante. Cependant elles sont en phase de déclin arrivant au bout de leur capacité fermentaire.

Aucune levure non-*Saccharomyces* n'est présente dans l'échantillon 4. Le milieu étant trop toxique elles peuvent plus se développer et meurent. En effet, la concentration trop élevée en éthanol est le principal facteur d'inhibition des levures non-*Saccharomyces*, qui généralement tolère difficilement des concentrations au-dessus de 10% (v/v).

Il est important de noter que *Brettanomyces Bruxellensis* fait partie de l'exception, étant une levure non-*Saccharomyces* résistant jusqu'à 14,5% d'éthanol. Cela explique en partie sa capacité à se développer même dans les vins finis.

Finalement nous avons bien observé que la population de non-*Saccharomyces* augmente de la baie de raisins jusqu'au milieu de la FA. De ce fait, il est intéressant de s'interroger quant à l'origine de ces levures. Pour cela il aurait été judicieux d'identifier les levures présentes dans la cave avant la campagne de vinification et sur les baies de raisins. Ces résultats nous auraient permis d'identifier celles présentes dans l'environnement de la cave ainsi qu'au vignoble, de les comparer avec les résultats de la partie suivante et de déterminer leur provenance.
## Évolution de différentes souches de non-Saccharomyces

Dans cette partie, nous allons déterminer quelles sont les souches de levures non-Saccharomyces présentes dans deux échantillons correspondant au début de FA et au milieu de FA (tableau des résultats en annexe 3). À partir des différentes levures nous allons émettre des hypothèses quant à leur impact sur la fermentation et sur le vin fini. En effet, les résultats de dénombrement seuls ne suffiront pas à affirmer leur réel impact sur la FA.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Fig 19 : Évolution des levures non-Saccharomyces au cours de la FA</figcaption></figure>

* *Torulaspora delbrueckii*

Concernant *T.delbrueckii* nous remarquons d'après la figure 20, que sa concentration est moyenne en début de FA puis baisse en fin de FA. Ce résultat est cohérent avec la littérature, cette levure fermente jusqu'à 12% d'éthanol (v/v). Elle est donc présente lors du début de fermentation mais sa quantité diminue car le milieu devient trop toxique. En effet, elle présenterait une grande sensibilité à l'alcool. De plus, en milieu de FA, elle fait partie des plus petites concentrations de levures présentes dans notre milieu, par exemple *H.uvarum* atteint environ 8 x 10⁶ cell/mL. La croissance de *T.delbrueckii* peut éventuellement être affectée par la présence de *S.cerevisiae*. Dans la littérature cela peut être dû à deux choses : la compétition pour les substrats ainsi que la production de métabolites par *S.cerevisiae* ou le « cell-cell contact ». Afin de démontrer ces hypothèses il serait intéressant de réaliser deux expériences. La première en co-inoculant sur moût *S.cerevisiae* et *T.delbrueckii* isolé du raisin. La deuxième consiste à séparer les deux espèces par une membrane perméable aux métabolites et imperméable aux levures. Ces deux expériences pourront démontrer quelle est influence de *S.cerevisiae* sur *T.delbrueckii*.
A propos de son impact sur la qualité organoleptique des vins, nous savons qu'elle produit moins d'acidité volatile que *S.cerevisiae*, grâce à sa réponse au stress osmotique légèrement différente. De plus, cette levure augmente la concentration en thiols volatil. Toutefois, dans notre expérimentation les cépages majoritaires sont le Grenache blanc et la Clairette qui ne contiennent pas ou peu de précurseurs de thiols, donc l'impact sera très limité.

Il a également été décrit dans la littérature que *T.delbrueckii* augmente la concentration en terpène dans les vins. Il est donc possible que cette levure influence l'aromatique de notre cuvée car celle-ci est souvent caractérisée par des arômes floraux dont les terpènes sont responsables. Par ailleurs, *T.delbrueckii* influence également la concentration d'esters d'acétates dont l'acétate isoamyle particulièrement. Cependant les esters d'acétate diminuent avec l'élevage de ce fait l'impact sera également limité sur ce paramètre.

Malheureusement, aucune de ces hypothèses ne peut être confirmée. En effet, il faudrait utiliser une cuve levuré avec *T.delbrueckii* et *S.cerevisiae* et une cuve témoin en levure indigène afin de réaliser une dégustation à l'aveugle. Cette technique permet d'établir s'il y a une différence significative entre les modalités. De plus, il faudrait déterminer le profil aromatique de la modalité et du témoin dans le but d'identifier quelles sont les différences significatives.

* Lachancea thermotolerans

D'après la figure 20 nous observons que la concentration en levures *L.thermotolerans* est du même ordre de grandeur que *T.delbrueckii* en début et milieu de FA. Ce résultat est en concordance avec la littérature. En effet *L.thermotolerans* est capable de subsister dans les moûts allant jusqu'à environ 9% d'éthanol (v/v), au-delà elle s'affaiblît.

L'atout majeur de *T.delbrueckii* est sa forte production d'acide L-lactique à partir de sucre avec une production d'acidité volatile négligeable. Pour le domaine du Vieux Télégraphe cette levure pourrait avoir un impact très positif. Elle permet d'augmenter l'AT et de diminuer les degrés alcooliques, améliorant l'équilibre des vins. En effet, le domaine se situe dans une région chaude avec des vins généralement moins acides apparentés à de forts degrés alcooliques. Ce potentiel déséquilibre ne fera que s'accentuer dans le contexte de réchauffement climatique que nous traversons actuellement. La recherche autour de la « bioacification » peut être une solution pour conserver l'équilibre des vins à fort titre alcoométrique volumique (TAV) sans ajout exogène de produits acidifiants.

L'utilisation de *L.thermotolerans* au stade préfermentaire ne créera pas de compétition avec *S.cerevisiae* lors de son implantation afin de réaliser la FA.
De même, la production d'acide L-lactique en amont de la FML par *L.thermotolerans* n'impactera pas négativement *O.oeni* lors de sa FML.

Pour terminer, comme pour la levure précédente, elle libère des thiols et plus particulièrement du 4-MMP, ce qui est plutôt rare pour une non-*Saccharomyces*. Mais son impact sera très limité du fait des cépages utilisés pour réaliser la cuvée « Vieux Télégraphe blanc ».

* Hanseniaspora uvarum

On observe qu'*H.uvarum* est la levure non-*Saccharomyces* la plus présente dans notre moût. En effet nous avons une concentration de 2,4 x 10⁸ cell/mL en début de FA et 7,9 x 10⁶ cell/mL en milieu de FA. Cependant cette levure apiculée n'est généralement pas recherchée par les vignerons. Effectivement, cette levure est fortement productrice d'acide acétique et d'acétate d'éthyle. Cependant l'acidité volatile reste au dessus du seuil de perception, et n'a pas non plus été détectée lors des dégustations quotidiennes pendant la période de vinification.

Dans la littérature, il est démontré que *S.cerevisiae* peut inhiber la croissance de *H.uvarum*. Les métabolites quelle secrète peuvent être à l'origine de cette baisse. Toutefois, *H.uvarum* est la levure non-*Saccharomyces* la plus présente dans le moût. Cela peut s'expliquer du fait que certaines souches peuvent dominer la fermentation jusqu'à 6% (v/v) d'éthanol et de croître jusqu'à 12,5% (v/v) d'alcool.

Néanmoins *H.uvarum* bénéficie d'une bonne activité enzymatique. Ce qui permet d'obtenir des vins plus riches en composés aromatiques et plus particulièrement en terpènes. Cette spécificité peut être bénéfique pour le vin seulement si la production d'acide acétique et d'acétate d'éthyle reste limitée comme dans notre cuvée.

* Pichia kluyveri & Metschnikowa pulcherrima

Selon la figure 20, *P.kluyveri* et *M.pulcherrima* ne sont pas présentes dans notre milieu. Il a été démontré que *P.kluyveri* a un impact positif sur la qualité aromatique des vins grâce à son activité esterase. Cependant, elle possède un facteur killer pouvant inhiber *B.bruxellensis* mais aussi *S.cerevisiae*.

De même, *M.pulcherrima* a aussi un impact positif sur la qualité aromatique des vins grâce à son activité glucosidase. De plus elle possède une forte activité anti-microbienne (cf bibliographie). En revanche, la synthèse d'acide pulcherrimique par cette même souche pourrait impacter le développement de *S.cerevisiae*.
Au domaine du Vieux Télégraphe, l'ensemble des fermentations étant réalisées par des levures indigènes, il est donc bénéfique de ne pas avoir de souches dans le milieu pouvant potentiellement nuire au développement de *S.cerevisiae*.

* Brettanomyces Bruxellensis

Pour conclure cette partie, nous avons également réalisé des analyses sur tous les échantillons dans le but de déterminer la présence de *B. Bruxellensis*. Aucun ne s'est révélé positif. On peut donc conclure qu'aucune souche n'est présente au vignoble ni dans la cave.

*B.Bruxellensis* est considéré comme une souche d'altération car elle est productrice de phénols volatils. Il est donc important de connaitre son origine si sa présence s'avère positive. Ceci dans le but de préserver la qualité organoleptique du vin et de mettre en place des mesures correctives. Pour cela, il existe des moyens physiques comme la filtration stérilisante ou divers traitements thermiques mais aussi un traitement au chitosane.

### 5.3.2 Bactéries acétiques et lactiques

#### Bactéries acétiques

Les bactéries acétiques et plus précisément *Acétobacter aceti* sont très importantes en oenologie. En présence d'oxygène les bactéries acétiques, ayant un métabolisme respiratoire, se multiplient et transforment l'alcool en acide acétique et en acétate d'éthyle : il s'agit de la piqûre acétique.

L'acide acétique étant le composé majoritaire de l'acidité volatile, l'évolution de la population en bactéries acétiques ainsi que leur production d'acide acétique est à surveiller de près.

Elles se développent principalement après le déclin *S.cerevisiae* lors de la phase de latence en FA et FML ou lors du vieillissement.

<table><caption>Tab 3 : Différentes concentrations en bactéries acétiques</caption><thead><tr><td></td><td>Concentration en bactéries acétiques par la méthode de l'épifluorescence</td><td>Concentration en bactéries acétiques par la méthode de culture sur milieu gélosé</td></tr></thead><tbody><tr><td>Raisins blanc</td><td>&lt; 8,9E+04 cell/baie</td><td></td></tr><tr><td>PDC</td><td>&lt; 8,9E+04 cell/mL</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 1</td><td></td><td>3E+04 cell/mL</td></tr><tr><td>Échantillon 2</td><td>&lt; 8,9E+05 cell/mL</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 3</td><td>&lt; 8,9E+06 cell/mL</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 4</td><td>&lt; 8,9E+06 cell/mL</td><td></td></tr></tbody></table>
D'après le tableau 3 les concentrations de bactéries acétiques dans chaque échantillon sont en dessous du seuil de détection. À la masse volumique de 1093 kg/m³ (échantillon 1), on observe une population de 3 x 10⁴ cell/mL de bactéries acétiques. A cette masse volumique, la phase de croissance exponentielle de *S.cerevisiae* débute : la concentration en bactérie acétique n'augmentera pas voir diminuera lors de la FA tant que *S.cerevisiae* colonisera le milieu.

Nous remarquons que les seuils de détection augmentent pour les échantillons 2,3 et 4 laissant penser que la concentration en bactéries acétiques augmente aussi dans le milieu. À des concentrations telles que 10⁵ cell/mL (échantillon 2) et 10⁶ cell/mL (échantillon 3,4), il est hautement improbable de ne pas avoir de conséquence sur le vin. Or, pendant les vinifications, nous n'avons pas détecté d'augmentation de l'acidité volatile ni avec les analyses chimiques de routines, ni par dégustation.

Sans résultat plus précis sur les concentrations en bactéries acétiques dans ces divers échantillons, il est difficile de conclure quant à l'impact du développement des bactéries acétiques (principalement *acétobacter acéti* dans le cadre d'une vendange saine).

Il est important de noter que la production d'acidité volatile lors de la FA est un phénomène normal provenant du métabolisme de *S.cerevisiae* à des concentrations comprises en 0,1 et 0,3 g/L d'H₂SO₄. Toute augmentation au-dessus de ce seuil de 0,3g/L de H₂SO₄ est à surveiller.

## Bactéries lactiques

Les bactéries lactiques sont des bactéries fermentaires de type *Oenococcus oeni*. Elles sont responsables de la FML dans les vins.

Cette seconde fermentation traduit la métabolisation de l'acide L-malique en acide L-lactique par *Oenococcus oeni*. La FML est recherchée particulièrement dans les vins rouges. L'acide malique ayant un goût métallique et vert, il renforce la dureté et l'astringence des tannins des vins rouges. Pour les vins blancs, cela dépend du profil souhaité. L'acide malique possédant deux fonctions acides carboxyliques et l'acide lactique une seule. La FML a pour conséquence de diminuer la sensation acide dans les vins, substituant la fraîcheur à la rondeur pour les vins blancs. Ici, tous les vins blancs analysés ont subi une FML en foudre de 20hL.

La FML s'accompagne aussi de production de molécules aromatiques tels que l'acétoïne et le diacétile conférant des notes beurrés, lactés, amande en fonction des concentrations.

Les bactéries lactiques, elles aussi peuvent produire de l'acide acétique en ayant le glucose comme substrat. Il s'agit de la piqûre lactique : détectable soit par une augmentation de l'acidité volatile soit par la production d'acide D-Lactique.
C'est pourquoi avant la FML nous nous assurons par analyse chimique que l'entièreté des sucres fermentescibles aient été consommées par S.cerevisiae lors de la FA.

<table><caption>Tab 4 : Tableau des différentes concentrations en bactéries lactiques</caption><thead><tr><td></td><td>Concentration en bactéries lactiques par la méthode de l'épifluorescence</td><td>Concentration en bactéries lactiques par la méthode de culture sur milieu gélosé</td></tr></thead><tbody><tr><td>Raisins blanc</td><td>&lt; 8,9E+04 cell/baie</td><td></td></tr><tr><td>PDC</td><td>&lt; 8,9E+04 cell/mL</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 1</td><td></td><td>4E+04 cell/mL</td></tr><tr><td>Échantillon 2</td><td>&lt; 8,9E+05 cell/mL</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 3</td><td>&lt; 8,9E+06 cell/mL</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon 4</td><td>&lt; 8,9E+06 cell/mL</td><td></td></tr></tbody></table>

Dans ce tableau, nous observons en premier, une concentration de 4 x 10⁴ cell/mL à une masse volumique de 1093 kg/m³ (échantillon 1). Cela est normal, les bactéries lactiques se développeront uniquement lors de la phase de déclin des *S.cerevisiae* en fin de FA. Le temps de développement de *O.oeni* est à l'origine de la phase de latence entre la FA et la FML.

Cependant, de manière analogue aux analyses des bactéries acétiques, les seuils de détections augmentent au fur et à mesure de la FA.

Nous savons que pour initier la FML, une concentration minimale de 10⁶ cell/mL de bactéries lactiques est nécessaire. Avec cette précision de résultats nous ne pouvons pas savoir si en fin de FA (échantillon 4) l'évolution de la concentration bactéries lactiques est suffisante pour que la FML puisse se déclencher rapidement et ainsi écourter la phase de latence. Il est à rappeler que cette phase de latence est aussi bénéfique aux micro-organismes indésirables tels que *Brettanomyces bruxellensis* et *Acetobacter acéti*

Il aurait été judicieux de réaliser une nouvelle analyse peu après la fin de la FA avec une précision suffisante afin pouvoir statuer sur le développement de *O.oeni* au sein de ces échantillons.

Après analyse des résultats concernant les bactéries acétiques et lactiques, il est difficile d'appréhender ce manque de précision avec la méthode par épifluorescence : celle-ci nous ayant déjà permis d'obtenir des résultats précis au dixième sur des concentrations de 10⁴ cell/mL (pour des levures). Le laboratoire Excell n'ayant pas pu renseigner dans le détail sur leur protocole, nous émettons l'hypothèse que les bactéries (environ 0,5/1µm) étant bien plus petites que les levures (environ 10µm), leur détection avec précision peut s'avérer plus complexe.
### 5.3.3 Contrôle d'implantation de Saccharomyces cerevisiae

Il a été décidé de réaliser deux contrôles d'implantations :

- Sur l'échantillon 2 en milieu de FA

- Sur l'échantillon 5 lorsque la FA était terminée

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Fig 20 : Profils génétiques des contrôles d'implantations</figcaption></figure>

Sur la figure 21 la première bande à gauche établie par le marqueur de poids moléculaire montre les différents profils que l'on peut obtenir en fonction de la taille. En effet, le marqueur de poids moléculaire permet de repérer et de comparer les différents profils de bandes sur le gel d'agarose.

D'après les profils génétiques, on observe avec facilité l'obtention de bandes différentes pour nos échantillons 2 et 5. En effet, on constate que toutes les bandes ne sont pas repérées au même niveau, attestant de séquences inter-δ différentes. Néanmoins, on retrouve quelques similitudes par exemple au poids moléculaire 50, 850 et 1000 on observe les deux mêmes bandes présentes sur nos deux échantillons.

En conclusion, la lecture de la PCR inter-δ indique deux profils génétiques différents pour nos échantillons 2 et 5. Nous savons que ces deux profils correspond à des *S.cerevisiae* car ils se sont avérés positifs dans les résultats du laboratoire (cf. Annexe 4). Toutefois, le laboratoire n'a pas précisé de quelle souche de *S.cerevisiae* il s'agit dans les deux cas. Il aurait été intéressant de connaitre ce résultat afin de se renseigner sur leurs différentes caractéristiques. Néanmoins, le fait qu'elles soient différentes nous montre que dans un moût en levures indigènes il existe un nombre important de souches de *S.cerevisiae* lors de la FA.
V.IV Conclusion générale, critiques et discussions

Mon mémoire porte sur l'étude de la biodiversité microbienne indigène et son potentiel impact lors de la vinification. Notre souhait avec Edouard Brunier était de mieux connaitre cette population, tant à la vigne qu'à la cave afin d'en savoir plus sur son environnement de travail. Dans cette étude, nous avons dénombrées les différentes levures et bactéries indigènes présentes. Puis effectué un zoom plus précis sur les levures non-*Saccharomyces* indigènes.

D'après les recherches bibliographiques, les levures non-*Saccharomyces* peuvent avoir un rôle important principalement en début de FA car elles sont beaucoup plus sensibles à l'alcool que *S.cerevisiae*. En effet, elles peuvent impacter positivement les moûts en fermentation grâce à leurs diverses activités enzymatiques (glycosidase, estérase entre autres) ou par leurs caractéristiques spécifiques.

Nos résultats nous montrent une population de levures totales importantes sur le raisin ainsi que tout le long de la FA. Nous avons constaté que le pied de cuve est composé à 40% de levure non-*Saccharomyces*. Cela représente une proportion non négligeable de levure non-*Saccharomyces* lors de son implantation. Bien que ce pied de cuve soit avancé dans sa fermentation au moment de l'innoculation, l'apport journalier de vendange fraiche permet un apport constant de levure non-*Saccharomyces* viable et cultivable.

Avec ce constat, nous pouvons affirmer l'impact des levures non-*Saccharomyces* lors de la fermentation des vins blancs du domaine du Vieux Télégraphe. Cependant, cette population étant très diverse (*L.thermotolerans*, *T.delbrueckii*, *H.uvarum*), on ne peut définir le rôle de chaque souche lors de la FA. Nous ne pouvons effectuer que des hypothèses à ce sujet.
Parmi ces souches non-*Saccharomyces*, la confirmation que *B.bruxellensis* n'est pas présente sur la baie de raisin est bienvenue.

Dans un autre temps, nous avons aussi étudié la population en bactéries lactiques et acétiques.
Ces résultats manquant de précision, nous ne pouvons pas conclure.

Toutefois, d'un point de vue empirique, l'ensemble des FML se sont bien passées, l'entièreté de l'acide L-malique a été métabolisé en acide L-lactique, les temps de latence ont été faible et nous n'avons pas constaté une augmentation significative de l'acidité volatile.

Dans ce mémoire, nous avons décelé l'importance des levures non-*Saccharomyces* dans la première partie de la FA mais aussi la complexité de leurs interactions. En effet, dans un milieu sans concurrence, leur comportement et facile à prévoir. Néanmoins, en présence d'autres souches, le « cell-cell contact », la synthèse de molécules inhibitrices, la présence de facteurs « killers » ainsi que leur différente tolérance à l'alcool rendent l'interprétation de leur bénéfice ou risque difficile à déterminer.
Cet essai n'est pas exempt de toutes critiques, les résultats ne sont pas scientifiquement interprétables. En effet, chaque levure analysée ne représente pas une modalité à part entière. Il aurait fallu isoler chaque levure et la vinifier séparément afin qu'elle représente une modalité. De plus, pour être recevable d'un point de vue analytique, cette expérience aurait dû avoir 1 à 2 répétitions pour chaque modalité. Une répétition du témoin est également préférable afin d'assurer la répétabilité des résultats.

De plus, le protocole n'était pas maitrisé. N'étant pas présente sur le site de vinification, le suivi des fermentations ainsi que le prélèvement des échantillons n'ont pas été réalisés correctement. De même, la communication avec le laboratoire Excell n'était pas optimale car nous passions par le laboratoire oenologique de Châteauneuf-du-Pape. Il aurait fallu être en contact direct avec le laboratoire Excell avant les vinifications afin d'optimiser le protocole. En effet, certaines analyses ont été effectué alors qu'elle n'était pas nécessaire.

Dans le prolongement de cet essai, il pourrait être intéressant d'effectuer le même travail d'identification sur les levures *Saccharomyces cerevisiae*. En effet, cela permettrait de caractériser celles qui pourraient être les mieux adaptées aux conditions de vinification et au profil souhaité. Par la suite, il faudrait tester une *Saccharomyces cerevisiae* et une non-*Saccharomyces* ensemble à l'aide de micro-vinification afin de s'assurer que la FA soit réalisée sans problème (arrêt de FA, FA languissante,...). L'année suivante, le laboratoire produirait une ou plusieurs « crème de levure » avec les levures les plus performantes testées. Une nouvelle expérimentation peut être réalisée en prenant pour témoin une cuve en levure indigène et une cuve levurée à l'aide de la « crème de levure ». La modalité « crème de levure » doit être répétée au minimum 2 fois afin d'assurer la répétabilité des résultats. Cet essai permettrait de comparer l'effet de la levure non-*Saccharomyces* choisie en présence de *S.cerevisiae* par rapport à une fermentation classique en indigène.

Cette « crème de levure » aurait pour but de sécuriser les FA tout en ayant la biodiversité issue de leur propre vignoble. Pour le domaine du Vieux Télégraphe, cette alternative pourrait être appliquée lors des années à forte pression cryptogamique sans craindre de dénaturer leur environnement de vinification. En effet, le laboratoire Excell met en collection les levures sélectionnées afin de produire la « crème de levure » les années difficiles.

Pour conclure, cette étude m'a donné l'occasion d'en apprendre plus sur les levures non-*Saccharomyces*. Elle a permis de me faire réfléchir quant à l'importance de ces levures lors des vinifications et des possibles alternatives qu'elles représentent en tant que future professionnelle. Merci à l'équipe du Vieux Télégraphe de m'avoir ouvert leur porte et partager leur savoir-faire.
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# Annexes

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Annexe 1 : Schéma des lieux-dit de Châteauneuf-du-Pape avec un zoom sur la « Crau »</figcaption></figure>
Annexe 2 : Tableaux récapitulatifs des analyses de dénombrement

<table><thead><tr><th></th><th>Population levure cell/mL</th><th>Technique utilisée : Epifluorescence</th></tr></thead><tbody><tr><td>Raisins blancs</td><td>3,50E+05</td><td></td></tr><tr><td>PDC blanc</td><td>4,80E+07</td><td></td></tr><tr><td>Ech 1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ech 2</td><td>1,80E+08</td><td></td></tr><tr><td>Ech 3</td><td>1,80E+08</td><td></td></tr><tr><td>Ech 4</td><td>6,20E+07</td><td></td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th></th><th>Dénombrement levure<br/>Saccharomyces<br/>UFC/mL</th><th>Dénombrement levure non-Saccharomyces<br/>UFC/mL</th><th>Dénombrement levures totales<br/>UFC/mL</th><th>Technique utilisée:<br/>Dénombrement<br/>sur milieu gélosé</th></tr></thead><tbody><tr><td>Raisins blancs</td><td>6,90E+04</td><td>1,00E+03</td><td>7,00E+04</td><td></td></tr><tr><td>PDC blanc</td><td>3,00E+05</td><td>2,00E+05</td><td>5,00E+05</td><td></td></tr><tr><td>Ech 1</td><td></td><td></td><td>4,00E+07</td><td></td></tr><tr><td>Ech 2</td><td></td><td></td><td>4,00E+07</td><td></td></tr><tr><td>Ech 3</td><td>5,00E+07</td><td>2,00E+07</td><td>7,00E+07</td><td></td></tr><tr><td>Ech 4</td><td>8,00E+07</td><td>0,00E+00</td><td>8,00E+07</td><td></td></tr></tbody></table>

Annexe 3 : Tableau récapitulatif des concentrations des levures non-Saccharomyces

<table><thead><tr><th></th><th>Qté en cell/mL</th><th>Début de FA</th><th>Milieu de FA</th></tr></thead><tbody><tr><td>Torulaspora<br/>delbrueckii</td><td></td><td>2,30E+05</td><td>8,50E+03</td></tr><tr><td>Lachancea<br/>thermotolerans</td><td></td><td>1,30E+05</td><td>3,10E+03</td></tr><tr><td>Pichia kluyveri</td><td></td><td>Inférieur à la Limite<br/>de quantification</td><td>Inférieur à la Limite<br/>de quantification</td></tr><tr><td>Metschnikowa<br/>pulcherrima</td><td></td><td>Non détecté</td><td>Non détecté</td></tr><tr><td>Hanseniaspora<br/>uvarum</td><td></td><td>2,40E+08</td><td>7,90E+06</td></tr></tbody></table>
Annexe 4 : Résultats du laboratoire Excell des rouges

excell
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<table><tr><td>Référence Laboratoire</td><td>21145147</td><td>21145148</td><td>21145149</td></tr><tr><td>(c) Identification du prélèvement</td><td>Echantillon n° 4</td><td>Echantillon n° 5</td><td>Echantillon n° 6</td></tr><tr><td>(c) Appellation</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>(c) Matrice</td><td>Mout en<br/>fermentation Blanc</td><td>Mout en<br/>fermentation Blanc</td><td>Mout en<br/>fermentation Rouge</td></tr><tr><td>(c) Millésime</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Date de réception</td><td>22/09/2021</td><td>22/09/2021</td><td>22/09/2021</td></tr><tr><td>Date fin d'analyse</td><td>01/10/2021</td><td>29/10/2021</td><td>01/10/2021</td></tr><tr><td>(c) Volume</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>(c) Site de prélèvement</td><td>Vieux Télégraphe</td><td>Vieux Télégraphe</td><td>Vieux Télégraphe</td></tr><tr><td>(c) Informations complémentaires</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></table>

<table><thead><tr><th>Paramètre / Méthode</th><th>Résultats</th><th>Unité</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Analyses microbiologiques</strong></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement bactéries acétiques</td><td>3 E+04/mL</td><td>&lt;1 E+03/mL</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td>UFC</td></tr><tr><td>Dénombrement bactéries lactiques</td><td>4 E+04/mL</td><td>&lt;1 E+03/mL</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td>UFC</td></tr><tr><td>Dénombrement levures</td><td>4 E+07/mL</td><td>1 E+08/mL</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td>UFC</td></tr><tr><td>Q-PCR Brettanomyces</td><td>Non détecté</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Torulaspora delbrueckii</td><td>2.3 E+05</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrôle d'implantation levures Sacch. Cer PCR</td><td></td><td>Positif</td></tr><tr><td>Q-PCR Lachancea thermotolerans</td><td>1.3 E+05</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Pichia Kluyveri</td><td>&lt;LQ</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Metschnikowia pulcherrima</td><td>Non détecté</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Metschnikowia fructicola</td><td>-</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Hanseniaspora uvarum</td><td>2.4 E+08</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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<table><tr><td>Référence Laboratoire</td><td>21145150</td><td>21145837</td><td>21145838</td></tr><tr><td>(c) Identification du prélèvement</td><td>Echantillon n° 7</td><td>Echantillon n°9 - Densité 1010</td><td>Echantillon n°8 - Densité 1056</td></tr><tr><td>(c) Appellation</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>(c) Matrice</td><td>Mout en fermentation Rouge</td><td>Mout en fermentation Rouge</td><td>Mout en fermentation Blanc</td></tr><tr><td>(c) Millésime</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Date de réception</td><td>22/09/2021</td><td>24/09/2021</td><td>24/09/2021</td></tr><tr><td>Date fin d'analyse</td><td>01/10/2021</td><td>29/09/2021</td><td>29/09/2021</td></tr><tr><td>(c) Volume</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>(c) Site de prélèvement</td><td>Vieux Télégraphe</td><td>Vieux Télégraphe</td><td>Vieux Télégraphe</td></tr><tr><td>(c) Informations complémentaires</td><td>-</td><td>Edouard Brunier 23/09</td><td>Edouard Brunier 23/09</td></tr></table>

<table><thead><tr><th>Paramètre / Méthode</th><th>Résultats</th><th>Unité</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Analyses microbiologiques</strong></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement bactéries acétiques</td><td>&lt;1 E+03/mL</td><td>UFC</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement bactéries lactiques</td><td>&lt;1 E+03/mL</td><td>UFC</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement levures non-Saccharomyces</td><td>&lt;10/mL</td><td>UFC</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dénombrement levures</td><td>2 E+08/mL</td><td>4 E+07/mL</td></tr><tr><td>Culture sur milieu gélosé spécifique</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Population bactéries acétiques</td><td>&lt;8.9 E+04</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>Microscopie à épifluorescence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Population levures</td><td>1.2 E+08</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>Microscopie à épifluorescence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Population bactéries lactiques</td><td>&lt;8.9 E+04</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>Microscopie à épifluorescence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Brettanomyces</td><td>Non détecté</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Torulaspora delbrueckii</td><td>&lt;LQ</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contrôle d'implantation levures Sacch. Cer PCR</td><td></td><td>Positif</td></tr><tr><td>Q-PCR Lachancea thermotolerans</td><td>1.5 E+03</td><td>3.1 E+03</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Pichia kluyveri</td><td>&lt;LQ</td><td>&lt;LQ</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Metschnikowia pulcherrima</td><td>Non détecté</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-PCR Metschnikowia fructicola</td><td>-</td><td>Cell/mL</td></tr><tr><td>PCR quantitative</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Laetitia ETOURNEAU, Responsable
Laboratoire

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Résumé

Le domaine du Vieux Télégraphe, domaine historique de AOP Châteauneuf-du-Pape, se situe dans les Côtes-du-Rhône. C'est un domaine familial existant depuis six générations. Au domaine, les FA sont toujours réalisées en levures indigènes, afin de respecter la philosophie de la famille Brunier. En effet, ils attachent beaucoup de valeur au respect de l'environnement et du produit. Pour ça, il cherche à limiter au maximum les intrants. Leur but est de conduire les fermentations en étant le moins interventionniste possible. De ce fait, le domaine a décidé d'étudier la biodiversité microbienne permettant l'élaboration de la cuvée « Vieux Télégraphe blanc ».

Nous avons dénombré, du raisin jusqu'à la fin de fermentation, la population de levure totale, de non-*Saccharomyces*, et de bactéries lactiques et acétiques. Nous avons également identifié les différentes levures non-*Saccharomyces* présente dans le milieu. Cette étude a montré une concentration importante en levures *Saccharomyces* ainsi qu'en non-*Saccharomyces*. De plus, on a identifié de nombreuses levures non-*Saccharomyces*. Nous avons émis des hypothèses quant à leur l'impact sur la fermentation alcoolique à l'aide de la bibliographie. En effet, notre étude ne permet pas d'être scientifiquement interprétables. Il faudrait pour cela réaliser une autre expérimentation basée sur les observations effectuées afin de répondre entièrement à la problématique.

Mot clés : Levures indigènes, fermentation alcoolique, diversité, impact, vins blancs

Abstract

The domain of Vieux Télégraphe, a historic AOP Châteauneuf-du-Pape estate, is located in the Côtes-du-Rhône. It's a family estate that exist for six generations. At the domain, alcoholic fermentations are always carried out with native yeasts, in order to respect the Brunier family philosophy. Indeed, they attach a lot of value to the respect of the environment and the product. For that, they try to limit their inputs as much as possible. Their goal is to conduct the fermentations with the least possible intervention. For this reason, the domain decided to study the microbial biodiversity allowing the elaboration of the « Vieux Télégraphe » white wine.

We counted the population of total yeast, non-*Saccharomyces* yeasts, lactic and acetic bacterias from the grape to the end of fermentation. We also identified the different non-*Saccharomyces* yeasts present in the must. This study showed a significant concentration of *Saccharomyces* yeasts as well as non-*Saccharomyces*. In addition, many non-*Saccharomyces* yeasts were identified. We hypothesized their impact on alcoholic fermentation using the literature. However, our study doesn't allow a scientific interpretation. It would be necessary to carry out another experiment based on the observations we made in order to fully solve the problem.

Keywords : Native yeasts, alcoholic fermentation, diversity, impact, white wines