# Contribution of microbial genomics to cholera epidemiology

Caroline Rouard, Elisabeth Njamkepo, Marie-Laure Quilici, François-Xavier Weill

► To cite this version:

Caroline Rouard, Elisabeth Njamkepo, Marie-Laure Quilici, François-Xavier Weill. Contribution of microbial genomics to cholera epidemiology. Comptes Rendus. Biologies, 2022, 345 (1), pp.37-56. 10.5802/crbiol.77. hal-04613464

HAL Id: hal-04613464

https://hal.science/hal-04613464

Submitted on 17 Jun 2024

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
# Comptes Rendus
Biologies

Caroline Rouard, Elisabeth Njamkepo, Marie-Laure Quilici and François-Xavier Weill

**Contribution of microbial genomics to cholera epidemiology**

Volume 345, issue 1 (2022), p. 37-56

Published online: 11 May 2022

https://doi.org/10.5802/crbiol.77

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

This article is licensed under the
CREATIVE COMMONS ATTRIBUTION 4.0 INTERNATIONAL LICENSE.
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Les Comptes Rendus. Biologies sont membres du
Centre Mersenne pour l'édition scientifique ouverte
www.centre-mersenne.org
e-ISSN : 1768-3238
# Comptes Rendus
Biologies

Caroline Rouard, Elisabeth Njamkepo, Marie-Laure Quilici and François-Xavier Weill

**Contribution of microbial genomics to cholera epidemiology**

Volume 345, issue 1 (2022), p. 37-56

Published online: 11 May 2022

https://doi.org/10.5802/crbiol.77

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

This article is licensed under the
CREATIVE COMMONS ATTRIBUTION 4.0 INTERNATIONAL LICENSE.
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Les Comptes Rendus. Biologies sont membres du
Centre Mersenne pour l'édition scientifique ouverte
www.centre-mersenne.org
e-ISSN : 1768-3238
# Contribution of microbial genomics to cholera epidemiology

## Apport de la génomique microbienne à l'épidémiologie du choléra

Caroline Rouard<sup>a, ∗</sup>, Elisabeth Njamkepo<sup>a</sup>, Marie-Laure Quilici<sup>a</sup>
and François-Xavier Weill<sup>∗, a</sup>

<sup>a</sup> Institut Pasteur, Université de Paris, Unité des bactéries pathogènes entériques,
25-28 rue du Dr Roux, 75015, Paris, France

E-mails: caroline.rouard@pasteur.fr (C. Rouard),
elisabeth.njamkepo-nguemkam@pasteur.fr (E. Njamkepo),
marie-laure.quilici@pasteur.fr (M.-L. Quilici), francois-xavier.weill@pasteur.fr
(F.-X. Weill)

**Abstract.** In 2022, the burden of cholera—an acute watery diarrheal disease caused by *Vibrio cholerae* serogroup O1 (or more rarely O139) bacteria, which produce cholera toxin—remains high in many African and Asian countries. In the last few years, microbial genomics has made it possible to define the bacterial populations responsible for cholera more precisely. It has been shown that the current, seventh pandemic is due to a single lineage with a reservoir in the countries of the Bay of Bengal (India and Bangladesh). There have been several transmissions of the causal agent of cholera from this region to Africa, Asia and Latin America, suggesting a human-to-human transmission of the disease. Microbial genetics can help to fight this scourge by providing insight into cholera epidemiology and through its use in disease monitoring, thereby contributing to the achievement of the World Health Organization's goal of reducing cholera deaths by 90% by 2030.

**Résumé.** En 2022, de nombreux pays d'Afrique et d'Asie restent des foyers épidémiques de choléra, maladie diarrhéique causée par la bactérie *Vibrio cholerae* de sérogroupe O1 (ou plus rarement O139) produisant la toxine cholérique. La génomique microbienne a permis ces dernières années de mieux définir les populations bactériennes responsables du choléra. Il a ainsi été montré qu'il n'existait qu'une seule lignée génétique de *Vibrio cholerae* O1 responsable de la septième pandémie dont le réservoir se situe dans la région du golfe du Bengale (Inde et Bangladesh). Plusieurs évènements de transmission de l'agent du choléra vers l'Afrique, l'Europe ou l'Amérique latine ont été identifiés et suggèrent une transmission interhumaine de la maladie. Les données issues des travaux de génomique microbienne ainsi que son utilisation pour la surveillance globale du choléra vont permettre de mieux lutter contre ce fléau et participer à l'objectif de l'Organisation mondiale de la Santé de réduire de 90 % les décès dus à cette maladie en 2030.

<footnote>* Corresponding author.</footnote>
# Contribution of microbial genomics to cholera epidemiology

## Apport de la génomique microbienne à l'épidémiologie du choléra

Caroline Rouard<sup>a, ∗</sup>, Elisabeth Njamkepo<sup>a</sup>, Marie-Laure Quilici<sup>a</sup>
and François-Xavier Weill<sup>∗, a</sup>

<sup>a</sup> Institut Pasteur, Université de Paris, Unité des bactéries pathogènes entériques,
25-28 rue du Dr Roux, 75015, Paris, France

E-mails: caroline.rouard@pasteur.fr (C. Rouard),
elisabeth.njamkepo-nguemkam@pasteur.fr (E. Njamkepo),
marie-laure.quilici@pasteur.fr (M.-L. Quilici), francois-xavier.weill@pasteur.fr
(F.-X. Weill)

**Abstract.** In 2022, the burden of cholera—an acute watery diarrheal disease caused by *Vibrio cholerae* serogroup O1 (or more rarely O139) bacteria, which produce cholera toxin—remains high in many African and Asian countries. In the last few years, microbial genomics has made it possible to define the bacterial populations responsible for cholera more precisely. It has been shown that the current, seventh pandemic is due to a single lineage with a reservoir in the countries of the Bay of Bengal (India and Bangladesh). There have been several transmissions of the causal agent of cholera from this region to Africa, Asia and Latin America, suggesting a human-to-human transmission of the disease. Microbial genetics can help to fight this scourge by providing insight into cholera epidemiology and through its use in disease monitoring, thereby contributing to the achievement of the World Health Organization's goal of reducing cholera deaths by 90% by 2030.

**Résumé.** En 2022, de nombreux pays d'Afrique et d'Asie restent des foyers épidémiques de choléra, maladie diarrhéique causée par la bactérie *Vibrio cholerae* de sérogroupe O1 (ou plus rarement O139) produisant la toxine cholérique. La génomique microbienne a permis ces dernières années de mieux définir les populations bactériennes responsables du choléra. Il a ainsi été montré qu'il n'existait qu'une seule lignée génétique de *Vibrio cholerae* O1 responsable de la septième pandémie dont le réservoir se situe dans la région du golfe du Bengale (Inde et Bangladesh). Plusieurs évènements de transmission de l'agent du choléra vers l'Afrique, l'Europe ou l'Amérique latine ont été identifiés et suggèrent une transmission interhumaine de la maladie. Les données issues des travaux de génomique microbienne ainsi que son utilisation pour la surveillance globale du choléra vont permettre de mieux lutter contre ce fléau et participer à l'objectif de l'Organisation mondiale de la Santé de réduire de 90 % les décès dus à cette maladie en 2030.

<footnote>* Corresponding author.</footnote>
**Keywords.** Cholera, *Vibrio cholerae*, Genomic epidemiology, Whole-genome sequencing, Infectious disease.

**Mots-clés.** Choléra, *Vibrio cholerae*, Épidémiologie génomique, Séquençage à haut débit, Maladies infectieuses.

**Note.** François-Xavier Weill is the 2020 recipient of the Prix Jean-Pierre LECOCQ (applied sciences) par l'Académie des sciences / François-Xavier Weill est lauréat 2020 du Prix Jean-Pierre LECOCQ (sciences appliquées) par l'Académie des sciences.

Manuscript received 10th March 2022, accepted 28th March 2022.

# 1. Introduction

Cholera is an acute diarrheal disease that can prove fatal within hours if left untreated. It is a bacterial disease associated with two serogroups, O1 and O139, of *Vibrio cholerae*. The first description of this disease dates back to the Classical Era, and seven cholera pandemics originating in Asia have occurred since 1817 [1]. The seventh pandemic began in 1961, in Indonesia, and is currently affecting South Asia, especially the countries of the Bay of Bengal (India and Bangladesh), and many African countries, which remain important cholera hotspots. According to the World Health Organization (WHO), there are still 1.3–4 million cases and 21,000 to 143,000 deaths per year due to this infectious disease [2].

# 2. The agent of cholera

*Vibrio cholerae* was first observed in 1854 by Filippo Pacini on anatomical sections of intestinal mucosa from patients who died from cholera, but it was not until 1884 that Robert Koch isolated it and named it "Kommabacillus" in reference to the curved shape of this Gram-negative bacillus.

Historically, serogroups of *V. cholerae* have been defined on the basis of the lipopolysaccharide (LPS) O antigen present on the surface of the bacterium, and more than 200 serogroups have now been identified [3]. Most serogroups are found in environmental strains with an ecological niche in coastal waters and estuaries, often in association with zooplankton, mollusks and crustaceans, as for other species from family *Vibrionaceae* [1]. Many serogroups can cause sporadic cases or local outbreaks of mild gastroenteritis (a community foodborne illness), but only certain populations of cholera toxin-producing *V. cholerae* serogroup O1 cause cholera pandemics. Serogroup O139, which emerged in Asia in 1992 following genetic recombination between an O1 and a non-O1 strain, caused major epidemics in some

Asian countries, but has since disappeared from the continent and is now rarely isolated [4]. Two biotypes—the classical and El Tor biotypes—have been identified within serogroup O1. The El Tor biotype was identified following the isolation of a strain of this biotype in 1905 at the El Tor quarantine station in Egypt [5]. Each biotype can be further subdivided into two serotypes—Inaba and Ogawa—based on methylation of the O antigen. A third serotype, Hikojima, resulting from the simultaneous expression by the same strain of the antigenic determinants responsible for the Inaba and Ogawa specificities, has also been described, but is rarely isolated. In Bangladesh, an alternation of Ogawa and Inaba serotypes in pandemic strains has been associated with escape from host immunity [6]. Classical and El Tor biotypes were initially differentiated in the laboratory on the basis of phenotypic criteria, such as hemolysis, the agglutination of chicken red blood cells, the Voges-Prokauer reaction (evidence of ace-toin production), inhibition by polymyxin B, and lys-is by specific bacteriophages [7].

The El Tor biotype is responsible for the current cholera pandemic, the seventh since 1817; the classical biotype is believed to have caused the first six pandemics [8]. Following Koch's discovery in 1884, this classical vibrio was, indeed, isolated during the fifth and sixth pandemics. An ancient DNA analysis of the intestines of a patient who died from cholera in Philadelphia, USA, in 1849 (second or third pandemic, depending on the authors) preserved in a vial in a local museum revealed that the pathogen involved was also a *V. cholerae* of the classical biotype [9]. The transition between the two biotypes took place between 1905 and 1961, and the classical biotype seems to have completely disappeared in the 1990s. The last two clinical isolates reported were obtained in 2000, in Thailand [10]. There is currently no clear explanation for this replacement of one biotype with the other. The classical biotype of the sixth pandemic was associated with more severe clinical man-
**Keywords.** Cholera, *Vibrio cholerae*, Genomic epidemiology, Whole-genome sequencing, Infectious disease.

**Mots-clés.** Choléra, *Vibrio cholerae*, Épidémiologie génomique, Séquençage à haut débit, Maladies infectieuses.

**Note.** François-Xavier Weill is the 2020 recipient of the Prix Jean-Pierre LECOCQ (applied sciences) par l'Académie des sciences / François-Xavier Weill est lauréat 2020 du Prix Jean-Pierre LECOCQ (sciences appliquées) par l'Académie des sciences.

Manuscript received 10th March 2022, accepted 28th March 2022.

# 1. Introduction

Cholera is an acute diarrheal disease that can prove fatal within hours if left untreated. It is a bacterial disease associated with two serogroups, O1 and O139, of *Vibrio cholerae*. The first description of this disease dates back to the Classical Era, and seven cholera pandemics originating in Asia have occurred since 1817 [1]. The seventh pandemic began in 1961, in Indonesia, and is currently affecting South Asia, especially the countries of the Bay of Bengal (India and Bangladesh), and many African countries, which remain important cholera hotspots. According to the World Health Organization (WHO), there are still 1.3–4 million cases and 21,000 to 143,000 deaths per year due to this infectious disease [2].

# 2. The agent of cholera

*Vibrio cholerae* was first observed in 1854 by Filippo Pacini on anatomical sections of intestinal mucosa from patients who died from cholera, but it was not until 1884 that Robert Koch isolated it and named it "Kommabacillus" in reference to the curved shape of this Gram-negative bacillus.

Historically, serogroups of *V. cholerae* have been defined on the basis of the lipopolysaccharide (LPS) O antigen present on the surface of the bacterium, and more than 200 serogroups have now been identified [3]. Most serogroups are found in environmental strains with an ecological niche in coastal waters and estuaries, often in association with zooplankton, mollusks and crustaceans, as for other species from family *Vibrionaceae* [1]. Many serogroups can cause sporadic cases or local outbreaks of mild gastroenteritis (a community foodborne illness), but only certain populations of cholera toxin-producing *V. cholerae* serogroup O1 cause cholera pandemics. Serogroup O139, which emerged in Asia in 1992 following genetic recombination between an O1 and a non-O1 strain, caused major epidemics in some

Asian countries, but has since disappeared from the continent and is now rarely isolated [4]. Two biotypes—the classical and El Tor biotypes—have been identified within serogroup O1. The El Tor biotype was identified following the isolation of a strain of this biotype in 1905 at the El Tor quarantine station in Egypt [5]. Each biotype can be further subdivided into two serotypes—Inaba and Ogawa—based on methylation of the O antigen. A third serotype, Hikojima, resulting from the simultaneous expression by the same strain of the antigenic determinants responsible for the Inaba and Ogawa specificities, has also been described, but is rarely isolated. In Bangladesh, an alternation of Ogawa and Inaba serotypes in pandemic strains has been associated with escape from host immunity [6]. Classical and El Tor biotypes were initially differentiated in the laboratory on the basis of phenotypic criteria, such as hemolysis, the agglutination of chicken red blood cells, the Voges-Prokauer reaction (evidence of acetoin production), inhibition by polymyxin B, and lysis by specific bacteriophages [7].

The El Tor biotype is responsible for the current cholera pandemic, the seventh since 1817; the classical biotype is believed to have caused the first six pandemics [8]. Following Koch's discovery in 1884, this classical vibrio was, indeed, isolated during the fifth and sixth pandemics. An ancient DNA analysis of the intestines of a patient who died from cholera in Philadelphia, USA, in 1849 (second or third pandemic, depending on the authors) preserved in a vial in a local museum revealed that the pathogen involved was also a *V. cholerae* of the classical biotype [9]. The transition between the two biotypes took place between 1905 and 1961, and the classical biotype seems to have completely disappeared in the 1990s. The last two clinical isolates reported were obtained in 2000, in Thailand [10]. There is currently no clear explanation for this replacement of one biotype with the other. The classical biotype of the sixth pandemic was associated with more severe clinical man-
ifestations, whereas El Tor biotype strains are more frequently associated with asymptomatic infections. El Tor strains have also been associated with better adaptation to diverse environments and more efficient transmission than strains of the classical biotype [7]. Several hypotheses have been put forward to explain the success of the El Tor biotype: (i) the presence of the *Vibrio* seventh pandemic island 1 (VSP-I) and 2 (VSP-II) genomic islands [11]; (ii) a transcriptional profile different from that of the classical biotype [12, 13]; (iii) an active type VI secretion system (T6SS) [14]; and (iv) phenotypic features, such as biofilm production, higher motility than the classical biotype, and the production of acetoin and 2,3-butanediol, which maintain bacterial viability in the presence of glucose by blocking organic acid accumulation [15].

Regardless of the biotype, the pathogenicity of the bacteria is linked to the expression of two co-regulated factors for virulence: cholera toxin (CT) and toxin-coregulated pilus (TCP). TCP is expressed on the surface of the bacterium and is required for intestinal colonization. Following adhesion, CT is secreted and binds to the GM1 surface receptors of enterocytes, generating an imbalance of ion transport across the epithelial cell membrane, leading to massive fluid leakage [1]. As early as 1996, Waldor and Mekalanos showed that the *ctxA* and *ctxB* genes encoding cholera toxin were carried by a filamentous phage integrated into the *V. cholerae* chromosome—the CTX prophage (CTX*φ*)—and that the receptor for this prophage was TCP, encoded by the *tcpA* gene [16]. However, it soon became clear that strains of the classical and El Tor biotypes possess two different CTX*φ* prophages (CTX*φ*Cl and CTX*φ*Eltor or CTX*φ*-1), with different *ctxB* (*ctxB1* for classical, *ctxB3* for El Tor) and *rstR* (*rstRclas*, *rstRElTor*) genes [17].

### 3. Typing of *V. cholerae*

Since the discovery of the *V. cholerae* bacterium, many techniques have been developed for differentiating populations of this pathogen. The oldest such technique, developed in the 1950s by S. Mukerjee in India and P. Nicolle in France, is phage typing [18, 19]. This method involves differentiating between

*V. cholerae* strains on the basis of their susceptibility or resistance to different bacteriophages. Ecologically, lytic phages play a role in the regulation of *V. cholerae* populations in certain epidemiological settings [20,21]. Several phage-typing schemes based on different sets of lytic phages have been developed for the classification of vibrios within the El Tor or classical biotype [22]. However, the difficulty of establishing an international scheme, due to the nature of the phages, difficulties in interpretation and the use of different phage sets, have made studies based on this method difficult to compare. Molecular typing techniques were subsequently developed. Ribotyping has been widely used, as have pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), amplified fragment length polymorphism (AFLP) fingerprinting and multiple-locus variable number tandem repeat (VNTR) analysis [23–25]. Numerous local epidemiological studies have been carried out, but the non-standardization of the various methods used and/or of the interpretation of the results, and the lack of standardization of nomenclatures have made it difficult to analyze the results of these studies at international level [26].

The genomic era began with the publication of the first complete sequence of both chromosomes of the *V. cholerae* O1 El Tor N16961 strain in 2000 [27]. The analysis of genomic sequences, through high-throughput sequencing in particular, has made it possible to describe the gene content of this bacterium precisely and to study the relationships between different isolates at a very high resolution. This powerful technique has been progressively applied to ever larger collections of strains and has improved our knowledge of the epidemiology and global ecology of this pathogen.

### 4. Two pandemic *V. cholerae* O1 lineages

Initial genomic studies performed on a modest number of bacterial strains revealed that *V. cholerae* strains of the El Tor biotype and those of the classical biotype belonged to two different genetic lineages [28, 29]. In 2017, a study of more than 600 *V. cholerae* genomes demonstrated that only two monophyletic lineages of this pathogen, differing from each other by more than 20,000 SNPs (single-nucleotide polymorphisms), were responsible for pandemic cholera [26]. One lineage—7PET (for seventh pandemic *V. cholerae* El Tor)—was responsible
ifestations, whereas El Tor biotype strains are more frequently associated with asymptomatic infections. El Tor strains have also been associated with better adaptation to diverse environments and more efficient transmission than strains of the classical biotype [7]. Several hypotheses have been put forward to explain the success of the El Tor biotype: (i) the presence of the *Vibrio* seventh pandemic island 1 (VSP-I) and 2 (VSP-II) genomic islands [11]; (ii) a transcriptional profile different from that of the classical biotype [12, 13]; (iii) an active type VI secretion system (T6SS) [14]; and (iv) phenotypic features, such as biofilm production, higher motility than the classical biotype, and the production of acetoin and 2,3-butanediol, which maintain bacterial viability in the presence of glucose by blocking organic acid accumulation [15].

Regardless of the biotype, the pathogenicity of the bacteria is linked to the expression of two co-regulated factors for virulence: cholera toxin (CT) and toxin-coregulated pilus (TCP). TCP is expressed on the surface of the bacterium and is required for intestinal colonization. Following adhesion, CT is secreted and binds to the GM1 surface receptors of enterocytes, generating an imbalance of ion transport across the epithelial cell membrane, leading to massive fluid leakage [1]. As early as 1996, Waldor and Mekalanos showed that the *ctxA* and *ctxB* genes encoding cholera toxin were carried by a filamentous phage integrated into the *V. cholerae* chromosome—the CTX prophage (CTX*φ*)—and that the receptor for this prophage was TCP, encoded by the *tcpA* gene [16]. However, it soon became clear that strains of the classical and El Tor biotypes possess two different CTX*φ* prophages (CTX*φ*Cl and CTX*φ*Eltor or CTX*φ*-1), with different *ctxB* (*ctxB1* for classical, *ctxB3* for El Tor) and *rstR* (*rstRclas*, *rstRElTor*) genes [17].

### 3. Typing of *V. cholerae*

Since the discovery of the *V. cholerae* bacterium, many techniques have been developed for differentiating populations of this pathogen. The oldest such technique, developed in the 1950s by S. Mukerjee in India and P. Nicolle in France, is phage typing [18, 19]. This method involves differentiating between

*V. cholerae* strains on the basis of their susceptibility or resistance to different bacteriophages. Ecologically, lytic phages play a role in the regulation of *V. cholerae* populations in certain epidemiological settings [20,21]. Several phage-typing schemes based on different sets of lytic phages have been developed for the classification of vibrios within the El Tor or classical biotype [22]. However, the difficulty of establishing an international scheme, due to the nature of the phages, difficulties in interpretation and the use of different phage sets, have made studies based on this method difficult to compare. Molecular typing techniques were subsequently developed. Ribotyping has been widely used, as have pulsed-field gel electrophoresis (PFGE), amplified fragment length polymorphism (AFLP) fingerprinting and multiple-locus variable number tandem repeat (VNTR) analysis [23–25]. Numerous local epidemiological studies have been carried out, but the non-standardization of the various methods used and/or of the interpretation of the results, and the lack of standardization of nomenclatures have made it difficult to analyze the results of these studies at international level [26].

The genomic era began with the publication of the first complete sequence of both chromosomes of the *V. cholerae* O1 El Tor N16961 strain in 2000 [27]. The analysis of genomic sequences, through high-throughput sequencing in particular, has made it possible to describe the gene content of this bacterium precisely and to study the relationships between different isolates at a very high resolution. This powerful technique has been progressively applied to ever larger collections of strains and has improved our knowledge of the epidemiology and global ecology of this pathogen.

### 4. Two pandemic *V. cholerae* O1 lineages

Initial genomic studies performed on a modest number of bacterial strains revealed that *V. cholerae* strains of the El Tor biotype and those of the classical biotype belonged to two different genetic lineages [28, 29]. In 2017, a study of more than 600 *V. cholerae* genomes demonstrated that only two monophyletic lineages of this pathogen, differing from each other by more than 20,000 SNPs (single-nucleotide polymorphisms), were responsible for pandemic cholera [26]. One lineage—7PET (for seventh pandemic *V. cholerae* El Tor)—was responsible
for the seventh cholera pandemic, with strains dif-
fering from each other by only 50 to 250 SNPs de-
spite their isolation over five decades [30]. The other
lineage corresponded to strains of the classical bio-
type. Comparative genomics studies identified two
genomic islands, VSP-I and VSP-II, characteristic of
strains of the 7PET lineage [11,28]. The genes of these
islands are thought to be involved in bacteriophage
resistance and bacterial chemotaxis [31,32].

The 7PET and classical lineages have been shown
to share a common ancestor but to have differ-
ent phylogenetic histories. In particular, the seventh
pandemic strains are not directly descended from a
sixth pandemic strain [28,29]. Phylogenomic analysis
on a selection of complete genomes suggested that
the 7PET lineage might have emerged from a pre-
pandemic non-pathogenic *V. cholerae* El Tor strain,
such as those observed in the late 19th century in
the Middle East (but probably originating in Asia) [5].
These strains presumably acquired the *tcpA* gene and
then the CTX*φ*<sup>CL</sup> prophage to become pathogenic in
the early 20th century. They then acquired the VSP-I
and VSP-II islands in Indonesia before the replace-
ment of the CTX*φ*<sup>CL</sup> prophage with CTX*φ*<sup>ElTor</sup>. After
12 additional mutations, these 7PET lineage strains
spread from Indonesia to several Asian countries af-
ter 1961, marking the beginning of the seventh pan-
demic [5].

**5. Environment and cholera**

It was during the third pandemic in Great Britain
in 1853 that John Snow discovered the importance
of water in the transmission of cholera. This dis-
ease is transmitted by the fecal-oral route and is al-
ways more common in areas with poor water san-
itation [1]. In India, the first strains of the seventh
pandemic were isolated in Calcutta in the first half of
the 1960s, and cholera due to the 7PET lineage sub-
sequently became endemic in the Bay of Bengal [5].
Much of the research performed on cholera since has,
therefore, been conducted in the two countries in
this region (India and Bangladesh) in which cholera
cases occur year-round, with peaks before and after
the monsoon season [20]. Many of our concepts con-
cerning the epidemiology, transmission, treatment,
prevention and persistence of cholera in the environ-
mental reservoir are based on the particular environ-
ment in the Bay of Bengal [33]. The species *V. cholerae*

includes well-recognized human pathogens (cholera
vibrios causing cholera cases), but this species is
also a normal component of estuarine and coastal
marine ecosystems and is frequently isolated from
ponds and rivers, drinking water and households
in Bangladesh. In addition, a persistent viable but
non-culturable form (VBNC) has been identified that
can survive in adverse conditions in aquatic environ-
ments [33]. Finally, *V. cholerae* can be found associ-
ated with zooplankton in regions in which cholera
is endemic, notably attached to the chitin produced
by the crustaceans present in the zooplankton. These
various findings have led to the hypothesis of an
environmental reservoir of cholera, with a potential
translocation of the bacterium on plankton by ma-
rine currents along the coast [34]. This epidemiolog-
ical view was extensively developed in the 1970s for
other regions of the world, such as Latin America,
when *V. cholerae* was found to live in many rivers and
coastal waters. The hypothesis was then put forward
that cholera epidemics in Latin America are due to
local or locoregional strains of *V. cholerae* O1 multi-
plying after a “bloom” of plankton in favorable cli-
matic conditions [34,35]. A large-scale genomic study
including strains of various origins (clinical and en-
vironmental) isolated over a period of 40 years in
Latin America and elsewhere provided new infor-
mation about the origin of cholera epidemics. The
strains responsible for epidemic cholera in this re-
region of the world belong to the 7PET lineage, whereas
the suspected local or locoregional strains (clini-
cal and environmental)—although of serogroup O1,
El Tor biotype and possessing certain virulence de-
terminants, such as the CTXφ prophage (ctxA and
ctxB gene) and/or tcpA—belong to non-7PET lin-
eages [26]. Epidemiologically, these non-7PET lin-
eages, in association with a local aquatic environ-
ment, cause sporadic cases or limited epidemics
(without secondary transmission), sometimes over a
period of several decades (e.g., the Gulf Coast lineage
in the Gulf of Mexico in association with seafood),
whereas the 7PET lineage is associated with massive
explosive cholera epidemics. Identifications of a local
strain of *V. cholerae* O1 or of a strain belonging to the
7PET lineage therefore have different impacts on dis-
ease control strategies. Genomic studies are very im-
portant in this context, because only comparison of
the whole genomes of the strains can determine reli-
ably whether they belong to the 7PET lineage.
for the seventh cholera pandemic, with strains dif-
fering from each other by only 50 to 250 SNPs de-
spite their isolation over five decades [30]. The other
lineage corresponded to strains of the classical bio-
type. Comparative genomics studies identified two
genomic islands, VSP-I and VSP-II, characteristic of
strains of the 7PET lineage [11,28]. The genes of these
islands are thought to be involved in bacteriophage
resistance and bacterial chemotaxis [31,32].

The 7PET and classical lineages have been shown
to share a common ancestor but to have differ-
ent phylogenetic histories. In particular, the seventh
pandemic strains are not directly descended from a
sixth pandemic strain [28,29]. Phylogenomic analysis
on a selection of complete genomes suggested that
the 7PET lineage might have emerged from a pre-
pandemic non-pathogenic *V. cholerae* El Tor strain,
such as those observed in the late 19th century in
the Middle East (but probably originating in Asia) [5].
These strains presumably acquired the *tcpA* gene and
then the CTX*φ*<sup>CL</sup> prophage to become pathogenic in
the early 20th century. They then acquired the VSP-I
and VSP-II islands in Indonesia before the replace-
ment of the CTX*φ*<sup>CL</sup> prophage with CTX*φ*<sup>ElTor</sup>. After
12 additional mutations, these 7PET lineage strains
spread from Indonesia to several Asian countries af-
ter 1961, marking the beginning of the seventh pan-
demic [5].

**5. Environment and cholera**

It was during the third pandemic in Great Britain
in 1853 that John Snow discovered the importance
of water in the transmission of cholera. This dis-
ease is transmitted by the fecal-oral route and is al-
ways more common in areas with poor water san-
itation [1]. In India, the first strains of the seventh
pandemic were isolated in Calcutta in the first half of
the 1960s, and cholera due to the 7PET lineage sub-
sequently became endemic in the Bay of Bengal [5].
Much of the research performed on cholera since has,
therefore, been conducted in the two countries in
this region (India and Bangladesh) in which cholera
cases occur year-round, with peaks before and after
the monsoon season [20]. Many of our concepts con-
cerning the epidemiology, transmission, treatment,
prevention and persistence of cholera in the environ-
mental reservoir are based on the particular environ-
ment in the Bay of Bengal [33]. The species *V. cholerae*

includes well-recognized human pathogens (cholera
vibrios causing cholera cases), but this species is
also a normal component of estuarine and coastal
marine ecosystems and is frequently isolated from
ponds and rivers, drinking water and households
in Bangladesh. In addition, a persistent viable but
non-culturable form (VBNC) has been identified that
can survive in adverse conditions in aquatic environ-
ments [33]. Finally, *V. cholerae* can be found associ-
ated with zooplankton in regions in which cholera
is endemic, notably attached to the chitin produced
by the crustaceans present in the zooplankton. These
various findings have led to the hypothesis of an
environmental reservoir of cholera, with a potential
translocation of the bacterium on plankton by ma-
rine currents along the coast [34]. This epidemiolog-
ical view was extensively developed in the 1970s for
other regions of the world, such as Latin America,
when *V. cholerae* was found to live in many rivers and
coastal waters. The hypothesis was then put forward
that cholera epidemics in Latin America are due to
local or locoregional strains of *V. cholerae* O1 multi-
plying after a “bloom” of plankton in favorable cli-
matic conditions [34,35]. A large-scale genomic study
including strains of various origins (clinical and en-
vironmental) isolated over a period of 40 years in
Latin America and elsewhere provided new infor-
mation about the origin of cholera epidemics. The
strains responsible for epidemic cholera in this re-
region of the world belong to the 7PET lineage, whereas
the suspected local or locoregional strains (clini-
cal and environmental)—although of serogroup O1,
El Tor biotype and possessing certain virulence de-
terminants, such as the CTXφ prophage (ctxA and
ctxB gene) and/or tcpA—belong to non-7PET lin-
eages [26]. Epidemiologically, these non-7PET lin-
eages, in association with a local aquatic environ-
ment, cause sporadic cases or limited epidemics
(without secondary transmission), sometimes over a
period of several decades (e.g., the Gulf Coast lineage
in the Gulf of Mexico in association with seafood),
whereas the 7PET lineage is associated with massive
explosive cholera epidemics. Identifications of a local
strain of *V. cholerae* O1 or of a strain belonging to the
7PET lineage therefore have different impacts on dis-
ease control strategies. Genomic studies are very im-
portant in this context, because only comparison of
the whole genomes of the strains can determine reli-
ably whether they belong to the 7PET lineage.
<figure><img src="image_3.png" /></figure>

**Figure 1.** Dated phylogenetic tree including 1324 seventh pandemic *V. cholerae* El Tor (7PET) isolates collected between 1961 and 2017. The terminal branches of the tree are colored according to the geographic origin of the strains. The main sublineages and the various waves (according to Mutreja *et al.* [30]) are indicated.

**6. Genetic evolution and spread of the 7PET lineage**

Since reaching Southeast Asia, the causal agent of the seventh pandemic has become firmly established in the Bay of Bengal. Phylogenetic analyses have documented its evolution in this region of the world, which is currently considered to be the reservoir of this pathogen [30]. In the first large-scale genomic analysis by Mutreja *et al.* [30], only strains from the Bay of Bengal were found to capture all the genetic diversity observed within the 7PET lineage. The authors distinguished three genomic groups—waves 1, 2 and 3—among the 123 7PET strains analyzed (Figure 1). The oldest strains belonged to wave 1, and the most recent to wave 3. Several intercontinental transmission events from South Asia to America

or Africa were documented by phylogenetic analysis (Figure 2) [30].

Two major epidemics occurred in Latin America in 1991 and 2010 (Figures 1 and 2). The 1991 epidemic started on the Pacific coast of Peru and spread to almost all of South America, causing more than 1.2 million cases and 12,000 deaths before eventually dying out in 2001 [40, 41]. Several hypotheses had been put forward as to the origin of this epidemic at such a large distance from the Asian reservoir. For example, the infection may have been transported by the crew of a Chinese ship, or ballast water and sewage may have been discharged from an Asian cargo ship in the port of Lima, contaminating zoo-plankton along the Peruvian coast and leading to vibrrio multiplication following an increase in water temperature caused by El Niño; an alternative suggestion
<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Figure 1.** Dated phylogenetic tree including 1324 seventh pandemic *V. cholerae* El Tor (7PET) isolates collected between 1961 and 2017. The terminal branches of the tree are colored according to the geographic origin of the strains. The main sublineages and the various waves (according to Mutreja *et al.* [30]) are indicated.

**6. Genetic evolution and spread of the 7PET lineage**

Since reaching Southeast Asia, the causal agent of the seventh pandemic has become firmly established in the Bay of Bengal. Phylogenetic analyses have documented its evolution in this region of the world, which is currently considered to be the reservoir of this pathogen [30]. In the first large-scale genomic analysis by Mutreja *et al.* [30], only strains from the Bay of Bengal were found to capture all the genetic diversity observed within the 7PET lineage. The authors distinguished three genomic groups—waves 1, 2 and 3—among the 123 7PET strains analyzed (Figure 1). The oldest strains belonged to wave 1, and the most recent to wave 3. Several intercontinental transmission events from South Asia to America

or Africa were documented by phylogenetic analysis (Figure 2) [30].

Two major epidemics occurred in Latin America in 1991 and 2010 (Figures 1 and 2). The 1991 epidemic started on the Pacific coast of Peru and spread to almost all of South America, causing more than 1.2 million cases and 12,000 deaths before eventually dying out in 2001 [40, 41]. Several hypotheses had been put forward as to the origin of this epidemic at such a large distance from the Asian reservoir. For example, the infection may have been transported by the crew of a Chinese ship, or ballast water and sewage may have been discharged from an Asian cargo ship in the port of Lima, contaminating zoo-plankton along the Peruvian coast and leading to vibrrio multiplication following an increase in water temperature caused by El Niño; an alternative suggestion
<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

**Figure 2.** Intercontinental transmissions of the seventh pandemic lineage of *V. cholerae* El Tor (7PET). Introductions of the various 7PET sublineages from Asia to Africa, Europe and Latin America are represented by solid colored lines (or dotted lines if the direction of transmission is uncertain). Sublineages from waves 1, 2, and 3 are represented in panels A, B, and C, respectively. The dates of introduction of the different sublineages are also shown. These data were taken from the following references [26, 30, 36–39].
<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

**Figure 2.** Intercontinental transmissions of the seventh pandemic lineage of *V. cholerae* El Tor (7PET). Introductions of the various 7PET sublineages from Asia to Africa, Europe and Latin America are represented by solid colored lines (or dotted lines if the direction of transmission is uncertain). Sublineages from waves 1, 2, and 3 are represented in panels A, B, and C, respectively. The dates of introduction of the different sublineages are also shown. These data were taken from the following references [26, 30, 36–39].
was the direct transmission of strains via El Niño through a warm marine corridor linking South-East Asia to Peru across the Pacific [40, 42, 43]. An analysis of bacterial genomes identified two independent introductions of the 7PET lineage during the 1991 epidemic (Figures 1 and 2). The first, accounting for the vast majority of South American cases, involved a wave 1 sublineage called LAT-1 [26] or AFR1/LAM1 [36], the direct ancestors of which were isolated in West Africa in the late 1980s. The second introduction was due to a wave 2 sublineage called LAT-2 [26] or LAM2 [36], which was initially detected in Mexico and subsequent spread to South America. The closest ancestors of this LAM2 sublineage were identified in Asia and Eastern Europe. The second cholera epidemic to hit Latin America was in Haiti in 2010, following a catastrophic earthquake [44]. From 2010 to 2019, more than 800,000 cases and more than 9500 deaths were recorded [45]. Genomic analysis ruled out the responsibility of a local *V. cholerae* O1 lineage and incriminated the 7PET wave 3 sublineage called LAM3 [36] or LAT-3 [26] from Asia, which was probably transported from an area of endemic cholera by peacekeepers [44, 46].

Since the start of the seventh cholera pandemic in 1970, Africa has been the continent that has borne the brunt of this pandemic. Early epidemiological studies identified the main routes of introduction of this disease, which had been absent from Africa for almost 100 years, and tracked its progression during the first few years. However, the bacterial typing tools available at the time were not very discriminating for this genetically homogeneous bacterium, which made it difficult to follow its spatiotemporal spread in the long term. In 2017, we undertook a large genomic study of 1070 7PET genomes, 651 of which were of African origin. This study enabled us to document introduction events precisely and to establish the pathways of cholera spread in this region of the world [37]. Successive identifications of 11 distinct sublineages (T1, T3-T12 subsequently renamed AFR1, AFR3-AFR12 [36]) within the 7PET lineage between 1970 and 2014 revealed that the causal agent of cholera had been introduced repeatedly into Africa (at least 11 times) from South Asia, in a number of cases via the Middle East (Figures 1 and 2). In recent decades, introductions have occurred in two separate regions (West Africa or East Africa), resulting in regional epidemics with a mean

duration of 10 years (and up to 27 years of circulation for the AFR1 sublineage). The usual pattern is for one sublineage to circulate in a given region for a few years before disappearing and being replaced with a new sublineage. Two sublineages may sometimes be observed simultaneously in the same region for a short period of time. On one occasion, the same sublineage was identified in East and West Africa. This sublineage was AFR1—originally observed in North and West Africa—which was probably transmitted from Angola to Mozambique by air during troop movements in the Portuguese decolonization wars in the 1970s [37]. In 2015, a new sublineage, AFR13 (or T13) was introduced into East Africa from South Asia; it has since circulated in Uganda, Tanzania, Kenya, and Zimbabwe [38, 39, 47]. From the Horn of Africa, AFR13 spread to Yemen, causing a massive outbreak that is still active, with more than 2.5 million cases since 2016 [39, 48, 49].

The seventh pandemic also affected Europe in 1970, with epidemics in several countries until 2011, causing just over 7000 cases [36]. In a study of 172 European strains analyzed together with 1152 other 7PET strains, we traced the introduction and circulation of the 7PET lineage in Europe (Figures 1 and 2). At least eight distinct introductions were documented, mostly in Southern and Eastern Europe (Figure 2). In Eastern Europe, these outbreaks involved countries bordering the Black Sea, such as Ukraine, Romania, and Moldova, with sublineages of 7PET from South Asia. Some of these sublineages (EUR2/AFR3, EUR3/AFR4, EUR4/AFR6, EUR6/AFR8) even reached East Africa later, via the Middle East (Figure 2). *Vibrio cholerae* was imported into southern Europe several times during the 1970s, with introductions from outbreaks in North and West Africa into Portugal, Italy and Spain (sublineage EUR1/AFR1). The cholera outbreaks observed in Albania and Italy in 1994 were due to a sublineage (EUR6/AFR8) originating from Eastern Europe [36].

The circulation of the causal agent of cholera over the Asian continent during the seventh pandemic has not been studied. However, microbial genomics has shown that the multiple outbreaks of cholera in China since the beginning of this pandemic were linked to six introductions of *V. cholerae* O1 of the 7PET lineage from South and East Asia. Furthermore, after spreading in China, the causal agent of cholera
was the direct transmission of strains via El Niño through a warm marine corridor linking South-East Asia to Peru across the Pacific [40, 42, 43]. An analysis of bacterial genomes identified two independent introductions of the 7PET lineage during the 1991 epidemic (Figures 1 and 2). The first, accounting for the vast majority of South American cases, involved a wave 1 sublineage called LAT-1 [26] or AFR1/LAM1 [36], the direct ancestors of which were isolated in West Africa in the late 1980s. The second introduction was due to a wave 2 sublineage called LAT-2 [26] or LAM2 [36], which was initially detected in Mexico and subsequent spread to South America. The closest ancestors of this LAM2 sublineage were identified in Asia and Eastern Europe. The second cholera epidemic to hit Latin America was in Haiti in 2010, following a catastrophic earthquake [44]. From 2010 to 2019, more than 800,000 cases and more than 9500 deaths were recorded [45]. Genomic analysis ruled out the responsibility of a local *V. cholerae* O1 lineage and incriminated the 7PET wave 3 sublineage called LAM3 [36] or LAT-3 [26] from Asia, which was probably transported from an area of endemic cholera by peacekeepers [44, 46].

Since the start of the seventh cholera pandemic in 1970, Africa has been the continent that has borne the brunt of this pandemic. Early epidemiological studies identified the main routes of introduction of this disease, which had been absent from Africa for almost 100 years, and tracked its progression during the first few years. However, the bacterial typing tools available at the time were not very discriminating for this genetically homogeneous bacterium, which made it difficult to follow its spatiotemporal spread in the long term. In 2017, we undertook a large genomic study of 1070 7PET genomes, 651 of which were of African origin. This study enabled us to document introduction events precisely and to establish the pathways of cholera spread in this region of the world [37]. Successive identifications of 11 distinct sublineages (T1, T3-T12 subsequently renamed AFR1, AFR3-AFR12 [36]) within the 7PET lineage between 1970 and 2014 revealed that the causal agent of cholera had been introduced repeatedly into Africa (at least 11 times) from South Asia, in a number of cases via the Middle East (Figures 1 and 2). In recent decades, introductions have occurred in two separate regions (West Africa or East Africa), resulting in regional epidemics with a mean

duration of 10 years (and up to 27 years of circulation for the AFR1 sublineage). The usual pattern is for one sublineage to circulate in a given region for a few years before disappearing and being replaced with a new sublineage. Two sublineages may sometimes be observed simultaneously in the same region for a short period of time. On one occasion, the same sublineage was identified in East and West Africa. This sublineage was AFR1—originally observed in North and West Africa—which was probably transmitted from Angola to Mozambique by air during troop movements in the Portuguese decolonization wars in the 1970s [37]. In 2015, a new sublineage, AFR13 (or T13) was introduced into East Africa from South Asia; it has since circulated in Uganda, Tanzania, Kenya, and Zimbabwe [38, 39, 47]. From the Horn of Africa, AFR13 spread to Yemen, causing a massive outbreak that is still active, with more than 2.5 million cases since 2016 [39, 48, 49].

The seventh pandemic also affected Europe in 1970, with epidemics in several countries until 2011, causing just over 7000 cases [36]. In a study of 172 European strains analyzed together with 1152 other 7PET strains, we traced the introduction and circulation of the 7PET lineage in Europe (Figures 1 and 2). At least eight distinct introductions were documented, mostly in Southern and Eastern Europe (Figure 2). In Eastern Europe, these outbreaks involved countries bordering the Black Sea, such as Ukraine, Romania, and Moldova, with sublineages of 7PET from South Asia. Some of these sublineages (EUR2/AFR3, EUR3/AFR4, EUR4/AFR6, EUR6/AFR8) even reached East Africa later, via the Middle East (Figure 2). *Vibrio cholerae* was imported into southern Europe several times during the 1970s, with introductions from outbreaks in North and West Africa into Portugal, Italy and Spain (sublineage EUR1/AFR1). The cholera outbreaks observed in Albania and Italy in 1994 were due to a sublineage (EUR6/AFR8) originating from Eastern Europe [36].

The circulation of the causal agent of cholera over the Asian continent during the seventh pandemic has not been studied. However, microbial genomics has shown that the multiple outbreaks of cholera in China since the beginning of this pandemic were linked to six introductions of *V. cholerae* O1 of the 7PET lineage from South and East Asia. Furthermore, after spreading in China, the causal agent of cholera
was reintroduced into South and Southeast Asia five
times [50].

**7. Genomic plasticity and antibiotic resistance**

Genomics has the advantage of being able to go be-
yond the simple subtyping of strains. It opens up the
possibility of comparative genomic studies, and of
comprehensively studying the accessory genome of
pathogens, including their virulence and antibiotic
resistance determinants.

Strains belonging to different genomic groups, called “waves” by Mutreja *et al.*, have different accessory genome characteristics [30]. Thus, the chromosomal acquisition of a 100 kb conjugative and integrative element (ICE) of the SXT/R391 family encoding resistance to different classes of antibiotics is characteristic of wave 2 and 3 strains. Conversely, different truncated versions of VSP-II have been identified in wave 3 strains [37, 51]. Finally, a substitution of the CTXφ prophage has occurred in strains of the 7PET lineage over time. Thus, wave 1 strains possess the CTX-1 prophage with the *ctxB3* allele on chromosome 1, whereas wave 2 strains carry the CTX-2 prophage with the *ctxB1* allele (the classic *ctxB* allele) in tandem on chromosome 2. Finally, early wave 3 strains have CTX-3, 4, 5, or 6 prophages with the *ctxB1* allele on chromosome 1, and the most recent wave 3 strains have CTX-3b or 6b with the *ctxB7* allele [37, 51]. Some wave 3 strains also carry a satellite phage (PLE, for phage-inducible chromosomal island-like element) as a defense against ICP1, a lytic phage considered to be one of the main predominant phages of *V. cholerae* O1 in Bangladesh and the Democratic Republic of Congo [52]. Several variants (PLE 1 to PLE 10) of this satellite phage have been described in strains of the 7PET lineage isolated mainly in Asia [53, 54].

Antibiotics are still widely used in the treatment
of severe forms of cholera, although the main treat-
ment for this watery diarrhea is based on oral or
parenteral rehydration, depending on the degree of
severity. The extensive use of antibiotics in treat-
ment, or sometimes even prophylactically, has led to
the emergence of many resistance genes, jeopardiz-
ing the possible use of ciprofloxacin, doxycycline and
azithromycin, the molecules currently recommended
for the treatment of cholera [1]. In Africa, increasingly
antibiotic-resistant sublineages have been replacing

susceptible sublineages since the start of the cen-
tury [37]. The AFR9, AFR10, AFR11 and AFR12 sub-
lineages of wave 3, thus, possess a mean of five
to seven antibiotic resistance genes per strain. In
wave 3 strains, this resistance is mostly conferred by
a variant of the mobile genetic element SXT/R391,
named ICEVchInd5, which carries genes for resis-
tance to streptomycin (strA, strB), chloramphenicol
(floR), sulfonamides (sul2), trimethoprim (dfrA1) and
trimethoprim-sulfamethoxazole (sul2, dfrA1). Varia-
tions of this element due to the mobilization of in-
sertion sequences have been noted over time, with,
notably, a 10 kb deletion in the most recent wave 3
strains resulting in the loss of four antibiotic resis-
tance genes (strA, strB, floR and sul2). Other mobile
genetic elements have been observed in strains from
different waves, such as IncA/C plasmids, which con-
fer resistance to several antibiotic families depend-
ing on the resistance genes present, and the GI-15
genomic island carrying the streptomycin (aadA1)
and sulfonamide (sul1) resistance genes. A muta-
tion in a particular region (the “quinolone resistance-
determining region” or QRDR) of the gene encod-
ing the DNA gyrase A subunit, gyrA—a chromoso-
mal gene involved in bacterial DNA replication—has
been acquired by the latest wave 3 sublineages (from
AFR10 onwards) and results in resistance to nalidixic
acid. An additional mutation in the QRDR of the *parC*
gene that decreases susceptibility to ciprofloxacin
first appeared in the AFR11 sublineage. Conversely, a
mutation in the *vprA* gene leading to a restoration of
polymyxin B susceptibility appeared in India in wave
3 strains from 2012, whereas resistance to this mole-
cule has been used to distinguish the El Tor biotype
from the classical biotype since 1961 [7, 39, 55].

This evolution of antibiotic resistance coupled
with the evolution of genetic determinants of 7PET
lineage highlights the genomic plasticity of this
pandemic lineage and its adaptability. For exam-
ple, strains from the recent Zimbabwe cholera out-
break (more than 10,000 cases in 2018–2019) be-
longing to the AFR13 sublineage of wave 3 acquired,
in addition to the SXT/R391 element, an IncA/C2
plasmid carrying 14 antibiotic resistance genes, in-
cluding an extended-spectrum beta-lactamase gene
( bla _CTX-M-15_ ), rendering them highly resistant to
beta-lactams [38]. In addition to their antibiotic re-
sistance determinants, these SXT/R391 elements
have recently been implicated in resistance to bacte-
was reintroduced into South and Southeast Asia five
times [50].

**7. Genomic plasticity and antibiotic resistance**

Genomics has the advantage of being able to go be-
yond the simple subtyping of strains. It opens up the
possibility of comparative genomic studies, and of
comprehensively studying the accessory genome of
pathogens, including their virulence and antibiotic
resistance determinants.

Strains belonging to different genomic groups, called “waves” by Mutreja *et al.*, have different accessory genome characteristics [30]. Thus, the chromosomal acquisition of a 100 kb conjugative and integrative element (ICE) of the SXT/R391 family encoding resistance to different classes of antibiotics is characteristic of wave 2 and 3 strains. Conversely, different truncated versions of VSP-II have been identified in wave 3 strains [37, 51]. Finally, a substitution of the CTXφ prophage has occurred in strains of the 7PET lineage over time. Thus, wave 1 strains possess the CTX-1 prophage with the *ctxB3* allele on chromosome 1, whereas wave 2 strains carry the CTX-2 prophage with the *ctxB1* allele (the classic *ctxB* allele) in tandem on chromosome 2. Finally, early wave 3 strains have CTX-3, 4, 5, or 6 prophages with the *ctxB1* allele on chromosome 1, and the most recent wave 3 strains have CTX-3b or 6b with the *ctxB7* allele [37, 51]. Some wave 3 strains also carry a satellite phage (PLE, for phage-inducible chromosomal island-like element) as a defense against ICP1, a lytic phage considered to be one of the main predominant phages of *V. cholerae* O1 in Bangladesh and the Democratic Republic of Congo [52]. Several variants (PLE 1 to PLE 10) of this satellite phage have been described in strains of the 7PET lineage isolated mainly in Asia [53, 54].

Antibiotics are still widely used in the treatment
of severe forms of cholera, although the main treat-
ment for this watery diarrhea is based on oral or
parenteral rehydration, depending on the degree of
severity. The extensive use of antibiotics in treat-
ment, or sometimes even prophylactically, has led to
the emergence of many resistance genes, jeopardiz-
ing the possible use of ciprofloxacin, doxycycline and
azithromycin, the molecules currently recommended
for the treatment of cholera [1]. In Africa, increasingly
antibiotic-resistant sublineages have been replacing

susceptible sublineages since the start of the cen-
tury [37]. The AFR9, AFR10, AFR11 and AFR12 sub-
lineages of wave 3, thus, possess a mean of five
to seven antibiotic resistance genes per strain. In
wave 3 strains, this resistance is mostly conferred by
a variant of the mobile genetic element SXT/R391,
named ICEVchInd5, which carries genes for resis-
tance to streptomycin (*strA*, *strB*), chloramphenicol
(*floR*), sulfonamides (*sul2*), trimethoprim (*dfrA1*) and
trimethoprim-sulfamethoxazole (*sul2*, *dfrA1*). Varia-
tions of this element due to the mobilization of in-
sertion sequences have been noted over time, with,
notably, a 10 kb deletion in the most recent wave 3
strains resulting in the loss of four antibiotic resis-
tance genes (*strA*, *strB*, *floR* and *sul2*). Other mobile
genetic elements have been observed in strains from
different waves, such as IncA/C plasmids, which con-
fer resistance to several antibiotic families depend-
ing on the resistance genes present, and the GI-15
genomic island carrying the streptomycin (*aadA1*)
and sulfonamide (*sul1*) resistance genes. A muta-
tion in a particular region (the “quinolone resistance-
determining region” or QRDR) of the gene encod-
ing the DNA gyrase A subunit, *gyrA—a chromoso-
mal gene involved in bacterial DNA replication—has
been acquired by the latest wave 3 sublineages (from
AFR10 onwards) and results in resistance to nalidixic
acid. An additional mutation in the QRDR of the *parC*
gene that decreases susceptibility to ciprofloxacin
first appeared in the AFR11 sublineage. Conversely, a
mutation in the *vprA* gene leading to a restoration of
polymyxin B susceptibility appeared in India in wave
3 strains from 2012, whereas resistance to this mole-
cule has been used to distinguish the El Tor biotype
from the classical biotype since 1961 [7, 39, 55].

This evolution of antibiotic resistance coupled
with the evolution of genetic determinants of 7PET
lineage highlights the genomic plasticity of this
pandemic lineage and its adaptability. For exam-
ple, strains from the recent Zimbabwe cholera out-
break (more than 10,000 cases in 2018–2019) be-
longing to the AFR13 sublineage of wave 3 acquired,
in addition to the SXT/R391 element, an IncA/C2
plasmid carrying 14 antibiotic resistance genes, in-
cluding an extended-spectrum beta-lactamase gene
(*bla*<sub>CTX-M-15</sub>), rendering them highly resistant to
beta-lactams [38]. In addition to their antibiotic re-
sistance determinants, these SXT/R391 elements
have recently been implicated in resistance to bacte-
riophage ICP1, conferring a double selective advan-
tage on strains carrying these elements [56].

**8. Conclusion**

The important contributions of microbial genomics
over the last decade have led many public health
agencies and microbiological surveillance networks
to use this method routinely for the surveillance of
various pathogens [57]. For cholera, this technique
made it possible to demonstrate the causal role of a
single pandemic lineage (7PET) in the seventh pan-
demic and to clarify the relationships between pan-
demic strains and environmental strains from other
lineages, even though some of these other strains are
from serogroup O1 and possess the CTXφ prophage
and/or TCP. The classification of new V. cholerae O1
isolate as belonging to the 7PET lineage or an envi-
ronmental lineage is extremely useful for providing
a reliable assessment of epidemic risk, particularly
in areas in which cholera is not endemic but there
is a high risk of introduction, thereby facilitating
the deployment of appropriate control measures.
Genomic analysis can also be used for global moni-
toring of the evolution of antibiotic resistance, which
can have a major impact on treatment, as observed
for the strains of the recent epidemic in Zimbabwe.
Finally, this technique has transformed our under-
standing of the epidemiology of cholera. Indeed, the
various genomic studies on the dynamics of intro-
duction and diffusion of 7PET sublineages between
continents are in favor of a human-to-human trans-
mission of this disease. Epidemiologists were al-
ready aware of this mode of transmission for cholera
and of the wider dissemination of the classical bio-
type of cholera by humans in the 19th and 20th
centuries, via major routes of travel, with increas-
ingly rapid means of transport. Another argument

in favor of human-to-human transmission is the
spatiotemporal dynamics of the 7PET populations
in Africa, with the ultimate disappearance of the dif-
ferent sublineages and their replacement with other
sublineages from South Asia. If an environmental
reservoir existed, we would probably observe the
re-emergence of the same sublineage over time in
the same region. If there is no perennial local reser-
voir in Africa, the elimination of cholera from these
regions becomes feasible, as envisaged by the WHO
and the Global Task Force on Cholera Control (GT-
FCC), which have published a roadmap aiming to
reduce cholera deaths by 90% by 2030 [58]. However,
bacterial genomics results suggest that, in addition
to controlling the disease in Africa, the reservoir of
the pandemic 7PET lineage in the Bay of Bengal must
continue to be controlled, as it is in this region that
the pathogen evolves before spreading throughout
the world [59].

Lexicon

**Allele:** a particular form of the DNA sequence of a gene.

**Genomic island (GI):** a region of the chromosome that was probably acquired by horizontal transfer but is no longer mobile.

**Integrative and conjugative element (ICE):** a mobile, self-transferring genetic element with characteristics similar to those of plasmids and phages; an element transferred by conjugation that then integrates into the chromosome.

**Single-nucleotide polymorphism (SNP):** variation of a single nucleotide in a genetic sequence.

Conflicts of interest

Authors have no conflict of interest to declare.

French version

1. Introduction

Le choléra est une maladie diarrhéique aiguë d'origine bactérienne, associée à deux sérogroupes, O1 et O139, de l'espèce Vibrio cholerae, qui peut être mortelle en quelques heures en l'absence de prise en charge. La première description de cette maladie remonte à l'antiquité et depuis 1817 sept pandémies de choléra originaires d'Asie se sont succédé [1].

La septième pandémie a débuté en 1961 en Indonésie et à l'heure actuelle, l'Asie du Sud, en particulier les pays du golfe du Bengale (Inde et Bangladesh) et de nombreux pays d'Afrique restent des foyers importants de choléra. L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) rapporte ainsi qu'il y a toujours de 1,3 à 4 millions de cas et de 21 000 à 143 000 décès par an dus à cette maladie infectieuse [2].
riophage ICP1, conferring a double selective advan-
tage on strains carrying these elements [56].

**8. Conclusion**

The important contributions of microbial genomics
over the last decade have led many public health
agencies and microbiological surveillance networks
to use this method routinely for the surveillance of
various pathogens [57]. For cholera, this technique
made it possible to demonstrate the causal role of a
single pandemic lineage (7PET) in the seventh pan-
demic and to clarify the relationships between pan-
demic strains and environmental strains from other
lineages, even though some of these other strains are
from serogroup O1 and possess the CTXφ prophage
and/or TCP. The classification of new V. cholerae O1
isolate as belonging to the 7PET lineage or an envi-
ronmental lineage is extremely useful for providing
a reliable assessment of epidemic risk, particularly
in areas in which cholera is not endemic but there
is a high risk of introduction, thereby facilitating
the deployment of appropriate control measures.
Genomic analysis can also be used for global moni-
toring of the evolution of antibiotic resistance, which
can have a major impact on treatment, as observed
for the strains of the recent epidemic in Zimbabwe.
Finally, this technique has transformed our under-
standing of the epidemiology of cholera. Indeed, the
various genomic studies on the dynamics of intro-
duction and diffusion of 7PET sublineages between
continents are in favor of a human-to-human trans-
mission of this disease. Epidemiologists were al-
ready aware of this mode of transmission for cholera
and of the wider dissemination of the classical bio-
type of cholera by humans in the 19th and 20th
centuries, via major routes of travel, with increas-
ingly rapid means of transport. Another argument

in favor of human-to-human transmission is the
spatiotemporal dynamics of the 7PET populations
in Africa, with the ultimate disappearance of the dif-
ferent sublineages and their replacement with other
sublineages from South Asia. If an environmental
reservoir existed, we would probably observe the
re-emergence of the same sublineage over time in
the same region. If there is no perennial local reser-
voir in Africa, the elimination of cholera from these
regions becomes feasible, as envisaged by the WHO
and the Global Task Force on Cholera Control (GT-
FCC), which have published a roadmap aiming to
reduce cholera deaths by 90% by 2030 [58]. However,
bacterial genomics results suggest that, in addition
to controlling the disease in Africa, the reservoir of
the pandemic 7PET lineage in the Bay of Bengal must
continue to be controlled, as it is in this region that
the pathogen evolves before spreading throughout
the world [59].

Lexicon

**Allele:** a particular form of the DNA sequence of a gene.

**Genomic island (GI):** a region of the chromosome that was probably acquired by horizontal transfer but is no longer mobile.

**Integrative and conjugative element (ICE):** a mobile, self-transferring genetic element with characteristics similar to those of plasmids and phages; an element transferred by conjugation that then integrates into the chromosome.

**Single-nucleotide polymorphism (SNP):** variation of a single nucleotide in a genetic sequence.

Conflicts of interest

Authors have no conflict of interest to declare.

French version

1. Introduction

Le choléra est une maladie diarrhéique aiguë d'origine bactérienne, associée à deux sérogroupes, O1 et O139, de l'espèce Vibrio cholerae, qui peut être mortelle en quelques heures en l'absence de prise en charge. La première description de cette maladie remonte à l'antiquité et depuis 1817 sept pandémies de choléra originaires d'Asie se sont succédé [1].

La septième pandémie a débuté en 1961 en Indonésie et à l'heure actuelle, l'Asie du Sud, en particulier les pays du golfe du Bengale (Inde et Bangladesh) et de nombreux pays d'Afrique restent des foyers importants de choléra. L'Organisation mondiale de la Santé (OMS) rapporte ainsi qu'il y a toujours de 1,3 à 4 millions de cas et de 21 000 à 143 000 décès par an dus à cette maladie infectieuse [2].
## 2. L'agent du choléra

*Vibrio cholerae* fut observée pour la première fois en 1854 par Filippo Pacini sur des coupes anatomiques de muqueuses intestinales de malades morts du choléra mais ce n'est qu'en 1884 que Robert Koch l'isola et la nomma « Kommabacillus » en référence à la forme incurvée de ce bacille à Gram négatif.

Historiquement, différents sérogroupes de *V. cholerae* ont été décrits en se basant sur l'antigène O du lipopolysaccharide (LPS) présent à la surface de la bactérie et plus de 200 sérogroupes sont actuellement identifiés [3]. La plupart des sérogroupes se retrouvent chez des souches environnementales dont la niche écologique, comme pour les différentes espèces de la famille des *Vibrionaceae*, est représentée par les eaux côtières et les estuaires, souvent en association avec le zooplancton, les mollusques et les crustacés [1]. Bien que de nombreux sérogroupes puissent causer des cas sporadiques de gastro-entérites modérées ou des épidémies locales de gastro-entérite (toxi-infections alimentaires collectives), seules certaines populations du sérogroupe O1 produisant la toxine cholérique sont responsables des pandémies de choléra. Le sérogroupe O139, qui a émergé en Asie en 1992 suite à une recombinaison génétique entre une souche O1 et une souche non-O1, a été responsable d'épidémies importantes dans certains pays d'Asie mais n'a jamais quitté ce continent et n'est plus aujourd'hui que rarement isolé [4]. Au sein du sérogroupe O1, deux biotypes ont été identifiés : classique et El Tor, cette dernière dénomination faisant suite à l'isolement en 1905 d'une souche de ce biotype dans la station de quarantaine d'El Tor en Egypte [5]. Chaque biotype peut ensuite être subdivisé en deux sérotypes : Inaba et Ogawa, en lien avec la méthylation de l'antigène O. Un troisième sérotype, Hikojima, résultant de l'expression simultanée par une même souche des déterminants antigéniques responsables des spécificités Inaba et Ogawa, a également été décrit mais est rarement isolé. Au Bangladesh, une alternance des sérotypes Ogawa et Inaba chez les souches pandémiques a notamment été associée à un échappement à l'immunité de l'hôte [6]. Les biotypes classiques et El Tor ont été initialement différenciés au laboratoire sur des critères phénotypiques tels que l'hémolyse, l'agglutination des globules rouges de poulets, la réaction de Voges-Prokauer (mise en évidence de la production

d'acétoïne), l'inhibition par la polymyxine B, et la lyse par des bactériophages spécifiques [7].

Alors que le biotype El Tor est la cause de la pandémie actuelle de choléra, la septième depuis 1817, le biotype classique serait la cause des six premières pandémies [8]. Suite à la découverte de Koch en 1884, ce vibrion classique a été effectivement isolé au cours des cinquième et sixième pandémies. Récemment, une analyse d'ADN ancien sur des intestins d'un patient mort de choléra à Philadelphie, Etats-Unis, en 1849 (deuxième ou troisième pandémie suivant les auteurs) — et préservés dans un flacon dans un musée local — a révélé que l'agent pathogène impliqué était également un *V. cholerae* du biotype classique [9]. La transition entre les deux biotypes a eu lieu entre 1905 et 1961 et le biotype classique semble avoir complètement disparu au cours des années 1990. Les deux derniers isolats cliniques rapportés dans la littérature datent de 2000 en Thaïlande [10]. A l'heure actuelle, aucune explication n'a été validée pour ce remplacement. Le biotype classique de la sixième pandémie a été associé à des manifestations cliniques plus graves tandis que les souches du biotype El Tor sont plus fréquemment associées à des infections asymptomatiques. Ces dernières ont également été associées à une meilleure adaptation à des environnements variés et à une transmission plus efficace que les souches du biotype classique [7]. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer le succès du biotype El Tor : (i) la présence des îlots génomiques *Vibrio* seventh pandemic island 1 (VSP-I) et 2 (VSP-II) [11]; (ii) un profil transcriptionnel différent de celui du biotype classique [12, 13]; (iii) un système de sécrétion de type VI (T6SS) actif [14]; (iv) et des particularités phénotypiques comme la production de biofilm, une motilité supérieure à celle du biotype classique et la production d'acétoïne et de 2,3-butanediol qui, lors de la croissance en présence de glucose, maintiennent la viabilité bactérienne par un blocage de l'accumulation d'acides organiques [15].

Quel que soit le biotype, le pouvoir pathogène de la bactérie est lié à l'expression de deux facteurs régulés pour la virulence : la toxine cholérique (CT) et le « toxin-coregulated pilus » (TCP). Ce dernier, exprimé à la surface de la bactérie est requis pour la colonisation intestinale. Après adhésion, la CT est sécrétée et se lie aux récepteurs de surface GM1 des entérocytes, conduisant à un déséquilibre du trans-
## 2. L'agent du choléra

*Vibrio cholerae* fut observée pour la première fois en 1854 par Filippo Pacini sur des coupes anatomiques de muqueuses intestinales de malades morts du choléra mais ce n'est qu'en 1884 que Robert Koch l'isola et la nomma « Kommabacillus » en référence à la forme incurvée de ce bacille à Gram négatif.

Historiquement, différents sérogroupes de *V. cholerae* ont été décrits en se basant sur l'antigène O du lipopolysaccharide (LPS) présent à la surface de la bactérie et plus de 200 sérogroupes sont actuellement identifiés [3]. La plupart des sérogroupes se retrouvent chez des souches environnementales dont la niche écologique, comme pour les différentes espèces de la famille des *Vibrionaceae*, est représentée par les eaux côtières et les estuaires, souvent en association avec le zooplancton, les mollusques et les crustacés [1]. Bien que de nombreux sérogroupes puissent causer des cas sporadiques de gastro-entérites modérées ou des épidémies locales de gastro-entérite (toxi-infections alimentaires collectives), seules certaines populations du sérogroupe O1 produisant la toxine cholérique sont responsables des pandémies de choléra. Le sérogroupe O139, qui a émergé en Asie en 1992 suite à une recombinaison génétique entre une souche O1 et une souche non-O1, a été responsable d'épidémies importantes dans certains pays d'Asie mais n'a jamais quitté ce continent et n'est plus aujourd'hui que rarement isolé [4]. Au sein du sérogroupe O1, deux biotypes ont été identifiés : classique et El Tor, cette dernière dénomination faisant suite à l'isolement en 1905 d'une souche de ce biotype dans la station de quarantaine d'El Tor en Egypte [5]. Chaque biotype peut ensuite être subdivisé en deux sérotypes : Inaba et Ogawa, en lien avec la méthylation de l'antigène O. Un troisième sérotype, Hikojima, résultant de l'expression simultanée par une même souche des déterminants antigéniques responsables des spécificités Inaba et Ogawa, a également été décrit mais est rarement isolé. Au Bangladesh, une alternance des sérotypes Ogawa et Inaba chez les souches pandémiques a notamment été associée à un échappement à l'immunité de l'hôte [6]. Les biotypes classiques et El Tor ont été initialement différenciés au laboratoire sur des critères phénotypiques tels que l'hémolyse, l'agglutination des globules rouges de poulets, la réaction de Voges-Prokauer (mise en évidence de la production

d'acétoïne), l'inhibition par la polymyxine B, et la lyse par des bactériophages spécifiques [7].

Alors que le biotype El Tor est la cause de la pandémie actuelle de choléra, la septième depuis 1817, le biotype classique serait la cause des six premières pandémies [8]. Suite à la découverte de Koch en 1884, ce vibrion classique a été effectivement isolé au cours des cinquième et sixième pandémies. Récemment, une analyse d'ADN ancien sur des intestins d'un patient mort de choléra à Philadelphie, Etats-Unis, en 1849 (deuxième ou troisième pandémie suivant les auteurs) — et préservés dans un flacon dans un musée local — a révélé que l'agent pathogène impliqué était également un *V. cholerae* du biotype classique [9]. La transition entre les deux biotypes a eu lieu entre 1905 et 1961 et le biotype classique semble avoir complètement disparu au cours des années 1990. Les deux derniers isolats cliniques rapportés dans la littérature datent de 2000 en Thaïlande [10]. A l'heure actuelle, aucune explication n'a été validée pour ce remplacement. Le biotype classique de la sixième pandémie a été associé à des manifestations cliniques plus graves tandis que les souches du biotype El Tor sont plus fréquemment associées à des infections asymptomatiques. Ces dernières ont également été associées à une meilleure adaptation à des environnements variés et à une transmission plus efficace que les souches du biotype classique [7]. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer le succès du biotype El Tor : (i) la présence des îlots génomiques *Vibrio* seventh pandemic island 1 (VSP-I) et 2 (VSP-II) [11]; (ii) un profil transcriptionnel différent de celui du biotype classique [12, 13]; (iii) un système de sécrétion de type VI (T6SS) actif [14]; (iv) et des particularités phénotypiques comme la production de biofilm, une motilité supérieure à celle du biotype classique et la production d'acétoïne et de 2,3-butanediol qui, lors de la croissance en présence de glucose, maintiennent la viabilité bactérienne par un blocage de l'accumulation d'acides organiques [15].

Quel que soit le biotype, le pouvoir pathogène de la bactérie est lié à l'expression de deux facteurs régulés pour la virulence : la toxine cholérique (CT) et le « toxin-coregulated pilus » (TCP). Ce dernier, exprimé à la surface de la bactérie est requis pour la colonisation intestinale. Après adhésion, la CT est sécrétée et se lie aux récepteurs de surface GM1 des entérocytes, conduisant à un déséquilibre du trans-
port des ions à travers la membrane des cellules épi-
théliales responsable d'une fuite liquidienne massive
à l'origine de la diarrhée aqueuse du choléra [1].
Dès 1996, Waldor et Mekalanos ont montré que les
gènes *ctxA* et *ctxB* codant pour la toxine cholérique
étaient portés par un phage filamenteux intégré dans
le chromosome de *V. cholerae* — le prophage CTX
(CTXφ) — et que son récepteur était le TCP, codé
par le gène *tcpA* [16]. Il a été montré rapidement
cependant que les souches des biotypes classique et
El Tor possédaient deux prophages CTXφ différents
(CTXφ<sup>Cl</sup> et CTXφ<sup>ElTor</sup> ou CTXφ-1) avec notamment
un gène *ctxB* (*ctxB1* pour classique, *ctxB3* pour El Tor)
et un gène *rstR* (*rstR<sup>clas</sup*, *rstR<sup>ElTor</sup>*) différents selon les
biotypes [17].

3. Le typage de V. cholerae

Depuis la découverte de la bactérie V. cholerae, de
nombreuses techniques ont été mises au point pour
différencier les populations de cet agent pathogène.
La plus ancienne, développée dès les années 1950 en
Inde par S. Mukerjee et en France par P. Nicolle est la
lysotypie (ou phage typing) [18, 19], consiste à diffé-
rencier les souches de V. cholerae en fonction de leur
sensibilité ou résistance à différents bactériophages.
Sur le plan écologique, les phages lytiques jouent un
rôle dans la régulation des populations de V. cholerae
dans certains contextes épidémiologiques [20, 21].
Plusieurs schémas de lysotypie basés sur différents
jeux de phages lytiques ont été mis au point pour
classer les Vibrio au sein du biotype El Tor ou du
biotype classique [22]. Cependant la difficulté d'éta-
blir un schéma international du fait de la nature des
phages, des difficultés d'interprétation et de l'uti-
lisation de lots de phages différents ont rendu les
études utilisant cette méthode difficilement com-
parables. Par la suite, des techniques de typage mo-
léculaire ont été développées. Le ribotypage a été
largement utilisé, ainsi que l'analyse par électropho-
rèse en champ pulsé (ou PFGE pour « pulsed-field
gel electrophoresis », l'« Amplified fragment length
polymorphism (AFLP) fingerprinting » et enfin le
génotypage par « Multiple Loci Variable Number
Tandem Repeat (VNTR) Analysis » [23–25]. De nom-
breuses études épidémiologiques locales ont pu être
réalisées, cependant, la non-standardisation de ces
différentes méthodes dans la réalisation et/ou l'in-
terprétation des résultats, ainsi que le manque de

standardisation des nomenclatures ont rendu com-
plexes l'analyse des résultats de ces études au niveau
international [26].

L'ère génomique a débuté avec la publication de
la première séquence complète des deux chromo-
somes de la souche de V. cholerae O1 El Tor N16961
en 2000 [27]. L'analyse des séquences génomiques,
notamment grâce au séquençage à haut débit a per-
mis une description précise du contenu en gènes
de cette bactérie ainsi que la possibilité d'étudier
avec une très forte résolution les relations de parenté
entre les différents isolats. Cette technique puissante
a été progressivement appliquée à des collections
de souches de plus en plus importantes et a permis
d'améliorer notre connaissance de l'épidémiologie et
de l'écologie globale de ce pathogène.

4. Deux lignées pandémiques de V. cholerae O1

Les premières études génomiques, réalisées sur un
nombre modeste de souches bactériennes, ont ré-
vélé que les souches de *V. cholerae* du biotype El
Tor et celles du biotype classique appartenait à
deux lignées génétiques différentes [28, 29]. En 2017,
une étude sur plus de 600 génomes de *V. cholerae* a
démontré que seules deux lignées monophylétiques
de cet agent pathogène, différant l'une de l'autre
par plus de 20 000 « Single Nucleotide Polymor-
phisms » (SNP), étaient responsables du choléra pan-
démique [26]. La première lignée — nommée 7PET
(pour seventh pandemic *V. cholerae* El Tor) — était
responsable de la septième pandémie de choléra,
avec des souches ne différant entre elles que de 50
à 250 SNP et ce malgré leur isolement sur cinq dé-
cennies [30]. La seconde lignée correspondait aux
souches du biotype classique. Par génomique com-
parative, il a été possible d'identifier deux îlots géno-
miques, VSP-I et VSP-II, caractéristiques des souches
de la lignée 7PET [11, 28]. Des gènes de ces îlots au-
raient un rôle dans la résistance aux bactériophages
et dans le chimiotactisme bactérien [31, 32].

Il a été montré également que les lignées 7PET et
classique possèdent bien un ancêtre commun mais
qu'elles ont des histoires phylogénétiques distinctes;
en particulier les souches de la septième pandémie
ne descendraient pas directement d'une souche de
la sixième pandémie [28, 29]. Une analyse phylogé-
nomique sur une sélection de génomes complets a
proposé une émergence de la lignée 7PET à partir
port des ions à travers la membrane des cellules épi-
théliales responsable d'une fuite liquidienne massive
à l'origine de la diarrhée aqueuse du choléra [1].
Dès 1996, Waldor et Mekalanos ont montré que les
gènes *ctxA* et *ctxB* codant pour la toxine cholérique
étaient portés par un phage filamenteux intégré dans
le chromosome de *V. cholerae* — le prophage CTX
(CTXφ) — et que son récepteur était le TCP, codé
par le gène *tcpA* [16]. Il a été montré rapidement
cependant que les souches des biotypes classique et
El Tor possédaient deux prophages CTXφ différents
(CTXφ<sup>Cl</sup> et CTXφ<sup>ElTor</sup> ou CTXφ-1) avec notamment
un gène *ctxB* (*ctxB1* pour classique, *ctxB3* pour El Tor)
et un gène *rstR* (*rstR<sup>clas</sup*, *rstR<sup>ElTor</sup>*) différents selon les
biotypes [17].

3. Le typage de V. cholerae

Depuis la découverte de la bactérie *V. cholerae*, de
nombreuses techniques ont été mises au point pour
différencier les populations de cet agent pathogène.
La plus ancienne, développée dès les années 1950 en
Inde par S. Mukerjee et en France par P. Nicolle est la
lysotypie (ou phage typing) [18, 19], consiste à diffé-
rencier les souches de *V. cholerae* en fonction de leur
sensibilité ou résistance à différents bactériophages.
Sur le plan écologique, les phages lytiques jouent un
rôle dans la régulation des populations de *V. cholerae*
dans certains contextes épidémiologiques [20, 21].
Plusieurs schémas de lysotypie basés sur différents
jeux de phages lytiques ont été mis au point pour
classer les *Vibrio* au sein du biotype El Tor ou du
biotype classique [22]. Cependant la difficulté d'éta-
blir un schéma international du fait de la nature des
phages, des difficultés d'interprétation et de l'uti-
lisation de lots de phages différents ont rendu les
études utilisant cette méthode difficilement com-
parables. Par la suite, des techniques de typage mo-
léculaire ont été développées. Le ribotypage a été
largement utilisé, ainsi que l'analyse par électropho-
rèse en champ pulsé (ou PFGE pour « pulsed-field
gel electrophoresis », l'« Amplified fragment length
polymorphism (AFLP) fingerprinting » et enfin le
génotypage par « Multiple Loci Variable Number
Tandem Repeat (VNTR) Analysis » [23–25]. De nom-
breuses études épidémiologiques locales ont pu être
réalisées, cependant, la non-standardisation de ces
différentes méthodes dans la réalisation et/ou l'in-
terprétation des résultats, ainsi que le manque de

standardisation des nomenclatures ont rendu com-
plexes l'analyse des résultats de ces études au niveau
international [26].

L'ère génomique a débuté avec la publication de
la première séquence complète des deux chromo-
somes de la souche de V. cholerae O1 El Tor N16961
en 2000 [27]. L'analyse des séquences génomiques,
notamment grâce au séquençage à haut débit a per-
mis une description précise du contenu en gènes
de cette bactérie ainsi que la possibilité d'étudier
avec une très forte résolution les relations de parenté
entre les différents isolats. Cette technique puissante
a été progressivement appliquée à des collections
de souches de plus en plus importantes et a permis
d'améliorer notre connaissance de l'épidémiologie et
de l'écologie globale de ce pathogène.

4. Deux lignées pandémiques de V. cholerae O1

Les premières études génomiques, réalisées sur un
nombre modeste de souches bactériennes, ont ré-
vélé que les souches de *V. cholerae* du biotype El
Tor et celles du biotype classique appartenait à
deux lignées génétiques différentes [28, 29]. En 2017,
une étude sur plus de 600 génomes de *V. cholerae* a
démontré que seules deux lignées monophylétiques
de cet agent pathogène, différant l'une de l'autre
par plus de 20 000 « Single Nucleotide Polymor-
phisms » (SNP), étaient responsables du choléra pan-
démique [26]. La première lignée — nommée 7PET
(pour seventh pandemic *V. cholerae* El Tor) — était
responsable de la septième pandémie de choléra,
avec des souches ne différant entre elles que de 50
à 250 SNP et ce malgré leur isolement sur cinq dé-
cennies [30]. La seconde lignée correspondait aux
souches du biotype classique. Par génomique com-
parative, il a été possible d'identifier deux îlots géno-
miques, VSP-I et VSP-II, caractéristiques des souches
de la lignée 7PET [11, 28]. Des gènes de ces îlots au-
raient un rôle dans la résistance aux bactériophages
et dans le chimiotactisme bactérien [31, 32].

Il a été montré également que les lignées 7PET et
classique possèdent bien un ancêtre commun mais
qu'elles ont des histoires phylogénétiques distinctes;
en particulier les souches de la septième pandémie
ne descendraient pas directement d'une souche de
la sixième pandémie [28, 29]. Une analyse phylogé-
nomique sur une sélection de génomes complets a
proposé une émergence de la lignée 7PET à partir
de souches de *V. cholerae* El Tor pré-pandémiques non pathogènes comme celles observées à la fin du 19ème siècle au Moyen Orient (mais probablement originaires d'Asie) [5]. Ces souches auraient acquis le gène *tcpA* puis le prophage *CTXφ*<sup>Cl</sup> pour devancer pathogènes au début du 20ème siècle. Ellesuraient ensuite acquis les îlots VSP-I et VSP-II en Indonésie avant la substitution du prophage *CTXφ*<sup>ElTor</sup>. Après 12 mutations additionnelles, ces souches de la lignée 7PET se seraient, après 1961, propagées d'Indonésie vers plusieurs pays d'Asie, marquant ainsi le début de la septième pandémie [5].

**5. Environnement et choléra**

C'est au cours de la troisième pandémie qui toucha
la Grande-Bretagne en 1853 que John Snow décou-
vrit l'importance de l'eau dans la transmission du
choléra. Cette maladie transmise par voie féco-orale
est toujours plus commune dans les zones où l'as-
sainissement de l'eau est insuffisant [1]. En Inde, les
premières souches de la septième pandémie ont été
isolées à Calcutta dans la première moitié des an-
nées 1960 puis le choléra causé par la lignée 7PET
est devenu endémique dans le golfe du Bengale [5].
Une grande partie de la recherche sur le choléra s'est
donc déroulée par la suite dans les deux pays de cette
région (Inde et Bangladesh) où les cas de choléra
existent toute l'année avec des pics avant et après
la mousson [20]. De nombreux concepts concernant
l'épidémiologie, la transmission, les traitements et
la prévention ainsi que la persistance dans le réser-
voir environnemental reposent sur cet environne-
ment particulier du golfe du Bengale [33]. Or si l'es-
pèce *V. cholerae* inclut des pathogènes humains bien
reconnus (vibrions cholériques à l'origine des cas de
choléra), elle appartient également aux écosystèmes
des estuaires et zones marines côtières et peut fré-
quemment être isolée dans les étangs et les rivières,
l'eau potable et dans les foyers au Bangladesh. De
plus une forme persistante viable mais non culti-
vable (VBNC pour « viable but nonculturable ») lui
permettant de survivre aux conditions défavorables
de l'environnement aquatique a été identifiée [33].
Enfin, elle a été associée avec le zooplancton dans
les régions d'endémie de choléra avec notamment
un attachment à la chitine produite par les crus-
tacés de ce plancton. Ces différents arguments ont
amené l'hypothèse d'un réservoir environnemental

du choléra avec une potentielle translocation de la
bactérie sur le plancton par les courants marins le
long des côtes [34]. Cette vue de l'épidémiologie a
été largement développée dans les années 1970 pour
d'autres régions du monde comme l'Amérique la-
tine, lorsqu'il a été montré que V. cholerae vivait
dans de nombreuses rivières et eaux côtières. L'hy-
pothèse selon laquelle les épidémies de choléra sur
ce continent seraient dues à des souches locales
ou loco-régionales de V. cholerae O1 avec une mul-
tiplication de ces bactéries suite à un « bloom »
du plancton dans des conditions climatiques favo-
rables avait donc été émise [34,35]. Récemment, une
'étude génomique à large échelle comprenant des
souches d'origines diverses (cliniques et environne-
mentales) isolées sur 40 ans en Amérique latine et
ailleurs dans le monde a permis d'apporter de nou-
velles réponses sur l'origine des épidémies de cho-
léra. Ainsi, les souches responsables du choléra épi-
démique dans cette région du monde appartiennent
à la lignée 7PET alors que les souches locales ou
loco-régionales suspectées (cliniques et environne-
mentales), bien qu'étant de sérogroupe O1, de bio-
type El Tor et possédant pour certaines des détermi-
nants de virulence tels que le prophage CTXφ (gènes
ctxA et ctxB) et/ou tcpA, appartiennent à d'autres li-
gnées que 7PET [26]. Du point de vue épidémiolo-
gique, ces dernières lignées en lien avec un environ-
nement aquatique local causent des cas sporadiques
ou des épidémies limitées (sans transmission secon-
daire) parfois sur plusieurs décennies (par exemple
la lignée Gulf Coast dans le golfe du Mexique en lien
avec des fruits de mer) alors que la lignée 7PET est as-
sociée à des épidémies de choléra massives et explo-
sives. L'identification d'une souche locale de V. chole-
ræ O1 ou d'une souche appartenant à la lignée 7PET
a donc un retentissement différent sur les stratégies
de contrôle de la maladie. La place de la génomique
est très importante dans ce cadre puisque seule cette
technique, basée sur la comparaison de l'ensemble
du génome des souches, permet d'affirmer leur ap-
partenance à la lignée 7PET.

**6. Evolution génétique et diffusion de la lignée 7PET**

Après avoir atteint l'Asie du Sud-Est, l'agent de la
septième pandémie s'est implanté durablement dans
le golfe du Bengale. Les analyses phylogénétiques
de souches de *V. cholerae* El Tor pré-pandémiques non pathogènes comme celles observées à la fin du 19ème siècle au Moyen Orient (mais probablement originaires d'Asie) [5]. Ces souches auraient acquis le gène *tcpA* puis le prophage *CTXφ*<sup>Cl</sup> pour devancer pathogènes au début du 20ème siècle. Ellesuraient ensuite acquis les îlots VSP-I et VSP-II en Indonésie avant la substitution du prophage *CTXφ*<sup>Cl</sup> par *CTXφ*<sup>ElTor</sup>. Après 12 mutations additionnelles, ces souches de la lignée 7PET se seraient, après 1961, propagées d'Indonésie vers plusieurs pays d'Asie, marquant ainsi le début de la septième pandémie [5].

**5. Environnement et choléra**

C'est au cours de la troisième pandémie qui toucha
la Grande-Bretagne en 1853 que John Snow décou-
vrit l'importance de l'eau dans la transmission du
choléra. Cette maladie transmise par voie féco-orale
est toujours plus commune dans les zones où l'as-
sainissement de l'eau est insuffisant [1]. En Inde, les
premières souches de la septième pandémie ont été
isolées à Calcutta dans la première moitié des an-
nées 1960 puis le choléra causé par la lignée 7PET
est devenu endémique dans le golfe du Bengale [5].
Une grande partie de la recherche sur le choléra s'est
donc déroulée par la suite dans les deux pays de cette
région (Inde et Bangladesh) où les cas de choléra
existent toute l'année avec des pics avant et après
la mousson [20]. De nombreux concepts concernant
l'épidémiologie, la transmission, les traitements et
la prévention ainsi que la persistance dans le réser-
voir environnemental reposent sur cet environne-
ment particulier du golfe du Bengale [33]. Or si l'es-
pèce V. cholerae inclut des pathogènes humains bien
reconnus (vibrions cholériques à l'origine des cas de
choléra), elle appartient également aux écosystèmes
des estuaires et zones marines côtières et peut fré-
quemment être isolée dans les étangs et les rivières,
l'eau potable et dans les foyers au Bangladesh. De
plus une forme persistante viable mais non culti-
vable (VBNC pour « viable but nonculturable ») lui
permettant de survivre aux conditions défavorables
de l'environnement aquatique a été identifiée [33].
Enfin, elle a été associée avec le zooplancton dans
les régions d'endémie de choléra avec notamment
un attachment à la chitine produite par les crus-
tacés de ce plancton. Ces différents arguments ont
amené l'hypothèse d'un réservoir environnemental

du choléra avec une potentielle translocation de la
bactérie sur le plancton par les courants marins le
long des côtes [34]. Cette vue de l'épidémiologie a
été largement développée dans les années 1970 pour
d'autres régions du monde comme l'Amérique la-
tine, lorsqu'il a été montré que V. cholerae vivait
dans de nombreuses rivières et eaux côtières. L'hy-
pothèse selon laquelle les épidémies de choléra sur
ce continent seraient dues à des souches locales
ou loco-régionales de V. cholerae O1 avec une mul-
tiplication de ces bactéries suite à un « bloom »
du plancton dans des conditions climatiques favo-
rables avait donc été émise [34,35]. Récemment, une
 étude génomique à large échelle comprenant des
souches d'origines diverses (cliniques et environne-
mentales) isolées sur 40 ans en Amérique latine et
ailleurs dans le monde a permis d'apporter de nou-
velles réponses sur l'origine des épidémies de cho-
léra. Ainsi, les souches responsables du choléra épi-
démique dans cette région du monde appartiennent
à la lignée 7PET alors que les souches locales ou
loco-régionales suspectées (cliniques et environne-
mentales), bien qu'étant de sérogroupe O1, de bio-
type El Tor et possédant pour certaines des détermi-
nants de virulence tels que le prophage CTXφ (gènes
ctxA et ctxB) et/ou tcpA, appartiennent à d'autres li-
gnées que 7PET [26]. Du point de vue épidémiolo-
gique, ces dernières lignées en lien avec un environ-
nement aquatique local causent des cas sporadiques
ou des épidémies limitées (sans transmission secon-
daire) parfois sur plusieurs décennies (par exemple
la lignée Gulf Coast dans le golfe du Mexique en lien
avec des fruits de mer) alors que la lignée 7PET est as-
sociée à des épidémies de choléra massives et explo-
sives. L'identification d'une souche locale de V. chole-
ræ O1 ou d'une souche appartenant à la lignée 7PET
a donc un retentissement différent sur les stratégies
de contrôle de la maladie. La place de la génomique
est très importante dans ce cadre puisque seule cette
technique, basée sur la comparaison de l'ensemble
du génome des souches, permet d'affirmer leur ap-
partenance à la lignée 7PET.

**6. Evolution génétique et diffusion de la lignée 7PET**

Après avoir atteint l'Asie du Sud-Est, l'agent de la
septième pandémie s'est implanté durablement dans
le golfe du Bengale. Les analyses phylogénétiques
ont documenté son évolution dans cette région du monde considérée actuellement comme le réservoir de ce pathogène [30]. Lors de la première analyse génomique d'ampleur de Mutreja *et al.* [30], seules les souches du golfe du Bengale possédaient l'ensemble de la diversité génétique observée au sein de la lignée 7PET. Les auteurs avaient distingué trois groupes génomiques, appelés vague (« wave ») 1, vague 2 et vague 3, parmi les 123 souches de lignée 7PET analysées (Figure 1). Les souches les plus anciennes appartenait à la vague 1 et les plus récentes à la vague 3. Plusieurs évènements de transmission intercontinentale de l'Asie du Sud vers l'Amérique ou l'Afrique ont ensuite été documentés grâce à l'analyse phylogénétique (Figure 2) [30].

En Amérique latine, deux épidémies majeures ont eu lieu en 1991 et 2010 (Figures 1 et 2). L'épidémie de 1991 a débuté sur la côte pacifique du Pérou avant d'atteindre la quasi-totalité de l'Amérique du Sud totalisant plus de 1,2 million de cas et 12 000 morts avant de s'éteindre en 2001 [40, 41]. Plusieurs hypothèses avaient été émises quant à l'origine de cette épidémie survenant à grande distance du réservoir asiatique telles l'équipage d'un bâtiment chinois, le déversement d'eau de ballast et d'égout d'un cargo asiatique dans le port de Lima avec une contamination du zooplancton tout le long de la côte péruvienne et sa multiplication suite à une augmentation de la température de l'eau causée par El Niño ou bien la transmission directe de souches via El Niño par l'intermédiaire d'un couloir marin chaud reliant l'Asie du Sud-Est au Pérou à travers le Pacifique [40, 42, 43]. L'analyse des génomes bactériens a en fait identifié deux introductions indépendantes de la lignée 7PET au cours de l'épidémie de 1991. La première, représentant la grande majorité des cas sud-américains, était due à une sous-lignée appartenant à la vague 1, nommée LAT-1 [26] ou AFR1/LAM1 [36], dont les ancêtres directs ont été isolés en Afrique de l'Ouest à la fin des années 1980. La seconde introduction était due à une sous-lignée appartenant à la vague 2, nommée LAT-2 [26] ou LAM2 [36], et observée initialement au Mexique avant de diffuser ensuite en Amérique du Sud. Les ancêtres les plus proches de cette sous-lignée LAM2 ont été identifiés en Asie et en Europe de l'Est. La deuxième épidémie de choléra qui a frappé l'Amérique latine est celle survenue à Haïti en 2010 au décours d'un tremblement de terre catastrophique [44]. De 2010 à 2019, plus de 800 000

cas et plus de 9500 morts ont été répétoriés [45]. L'analyse génomique a permis d'éliminer la responsabilité d'une lignée locale de *V. cholerae* O1 et d'incriminer la sous-lignée de 7PET nommée LAT-3 [26] ou LAM3 [36] vraisemblablement apportée par des Casques bleus venant d'une zone d'endémie cholérique en Asie du Sud [44, 46].

Depuis son introduction en 1970, l'Afrique est devenue le continent supportant la majorité du fardau de cette septième pandémie de choléra. Les premières études épidémiologiques ont permis de déterminer les principales voies d'introduction de cette maladie — qui avait alors disparu de ce continent depuis près de 100 ans — et d'en suivre la progression pendant les premières années. Mais les outils de typage bactérien disponibles à l'époque n'étaient que peu discriminants pour cette bactérie génétiquement homogène, le suivi de sa propagation temporo-spatiale sur le long terme n'a pu être réalisé. En 2017, nous avons entrepris une vaste étude génomique incluant 1070 génomes de 7PET (dont 651 d'origine africaine), qui a permis de documenter précisément les évènements d'introduction et d'établir les voies de propagation du choléra dans cette région du monde [37]. L'identification successive de 11 sous-lignées distinctes (T1, T3-T12 puis renommées AFR1, AFR3-AFR12 [36]) au sein de la lignée 7PET entre 1970 et 2014, a révélé que l'agent du choléra y a été régulièrement introduit (au moins 11 fois) à partir d'Asie du Sud et dans un certain nombre de cas via le Moyen-Orient (Figures 1 et 2). Depuis les dernières décennies, les introductions ont lieu dans deux régions exclusives (Afrique de l'Ouest ou Afrique de l'Est) et sont à l'origine d'épidémies régionales d'une durée moyenne de 10 ans (et jusqu'à 27 ans de circulation pour la sous-lignée AFR1). Le profil habituel est la circulation d'une sous-lignée dans une région donnée pendant quelques années avant qu'elle ne disparaisse et soit remplacée par une nouvelle. Deux sous-lignées peuvent parfois être observées simultanément pendant une brève période de temps au sein d'une même région. En une seule occasion, une même sous-lignée a été identifiée en Afrique de l'Est et de l'Ouest. Il s'agissait de AFR1 — initialement observée en Afrique du Nord et de l'Ouest — qui a vraisemblablement été transmise d'Angola au Mozambique par voie aérienne lors de mouvements de troupes pendant des guerres de décolonisation du Portugal
ont documenté son évolution dans cette région du monde considérée actuellement comme le réservoir de ce pathogène [30]. Lors de la première analyse génomique d'ampleur de Mutreja *et al.* [30], seules les souches du golfe du Bengale possédaient l'ensemble de la diversité génétique observée au sein de la lignée 7PET. Les auteurs avaient distingué trois groupes génomiques, appelés vague (« wave ») 1, vague 2 et vague 3, parmi les 123 souches de lignée 7PET analysées (Figure 1). Les souches les plus anciennes appartenait à la vague 1 et les plus récentes à la vague 3. Plusieurs évènements de transmission intercontinen tale de l'Asie du Sud vers l'Amérique ou l'Afrique ont ensuite été documentés grâce à l'analyse phylogénétique (Figure 2) [30].

En Amérique latine, deux épidémies majeures ont eu lieu en 1991 et 2010 (Figures 1 et 2). L'épidémie de 1991 a débuté sur la côte pacifique du Pérou avant d'atteindre la quasi-totalité de l'Amérique du Sud totalisant plus de 1,2 million de cas et 12 000 morts avant de s'éteindre en 2001 [40, 41]. Plusieurs hypothèses avaient été émises quant à l'origine de cette épidémie survenant à grande distance du réservoir asiatique telles l'équipage d'un bâtiment chinois, le déversement d'eau de ballast et d'égout d'un cargo asiatique dans le port de Lima avec une contamination du zooplancton tout le long de la côte péruvienne et sa multiplication suite à une augmentation de la température de l'eau causée par El Niño ou bien la transmission directe de souches via El Niño par l'intermédiaire d'un couloir marin chaud reliant l'Asie du Sud-Est au Pérou à travers le Pacifique [40, 42, 43]. L'analyse des génomes bactériens a en fait identifié deux introductions indépendantes de la lignée 7PET au cours de l'épidémie de 1991. La première, représentant la grande majorité des cas sud-américains, était due à une sous-lignée appartenant à la vague 1, nommée LAT-1 [26] ou AFR1/LAM1 [36], dont les ancêtres directs ont été isolés en Afrique de l'Ouest à la fin des années 1980. La seconde introduction était due à une sous-lignée appartenant à la vague 2, nommée LAT-2 [26] ou LAM2 [36], et observée initialement au Mexique avant de diffuser ensuite en Amérique du Sud. Les ancêtres les plus proches de cette sous-lignée LAM2 ont été identifiés en Asie et en Europe de l'Est. La deuxième épidémie de choléra qui a frappé l'Amérique latine est celle survenue à Haïti en 2010 au décours d'un tremblement de terre catastrophique [44]. De 2010 à 2019, plus de 800 000

cas et plus de 9500 morts ont été répertoriés [45]. L'analyse génomique a permis d'éliminer la responsabilité d'une lignée locale de *V. cholerae* O1 et d'incriminer la sous-lignée de 7PET nommée LAT-3 [26] ou LAM3 [36] vraisemblablement apportée par des Casques bleus venant d'une zone d'endémie cholérique en Asie du Sud [44, 46].

Depuis son introduction en 1970, l'Afrique est devenue le continent supportant la majorité du fardau de cette septième pandémie de choléra. Les premières études épidémiologiques ont permis de déterminer les principales voies d'introduction de cette maladie — qui avait alors disparu de ce continent depuis près de 100 ans — et d'en suivre la progression pendant les premières années. Mais les outils de typage bactérien disponibles à l'époque n'étaient que peu discriminants pour cette bactérie génétiquement homogène, le suivi de sa propagation temporo-spatiale sur le long terme n'a pu être réalisé. En 2017, nous avons entrepris une vaste étude génomique incluant 1070 génomes de 7PET (dont 651 d'origine africaine), qui a permis de documenter précisément les évènements d'introduction et d'établir les voies de propagation du choléra dans cette région du monde [37]. L'identification successive de 11 sous-lignées distinctes (T1, T3-T12 puis renommées AFR1, AFR3-AFR12 [36]) au sein de la lignée 7PET entre 1970 et 2014, a révélé que l'agent du choléra y a été régulièrement introduit (au moins 11 fois) à partir d'Asie du Sud et dans un certain nombre de cas via le Moyen-Orient (Figures 1 et 2). Depuis les dernières décennies, les introductions ont lieu dans deux régions exclusives (Afrique de l'Ouest ou Afrique de l'Est) et sont à l'origine d'épidémies régionales d'une durée moyenne de 10 ans (et jusqu'à 27 ans de circulation pour la sous-lignée AFR1). Le profil habituel est la circulation d'une sous-lignée dans une région donnée pendant quelques années avant qu'elle ne disparaisse et soit remplacée par une nouvelle. Deux sous-lignées peuvent parfois être observées simultanément pendant une brève période de temps au sein d'une même région. En une seule occasion, une même sous-lignée a été identifiée en Afrique de l'Est et de l'Ouest. Il s'agissait de AFR1 — initialement observée en Afrique du Nord et de l'Ouest — qui a vraisemblablement été transmise d'Angola au Mozambique par voie aérienne lors de mouvements de troupes pendant des guerres de décolonisation du Portugal
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

**FIGURE 1.** Arbre phylogénétique daté comprenant 1324 souches, isolées entre 1961 et 2017, de la lignée pandémique de *V. cholerae* El Tor (7PET). Les branches terminales de l'arbre sont colorées en fonction de l'origine géographique des souches. Les principales sous-lignées ainsi que les différentes vagues (« wave » d'après Mutreja *et al.* [30]) sont indiquées.

au cours des années 1970 [37]. Depuis 2015, une nouvelle sous-lignée, AFR13 (ou T13), a été introduite d'Asie du Sud en Afrique de l'Est, où elle circule depuis en Ouganda, Tanzanie, Kenya, et Zimbabwe [38, 39, 47]. A partir de la Corne de l'Afrique, AFR13 a causé la gigantesque épidémie du Yémen toujours active avec plus de 2,5 millions de cas depuis 2016 [39, 48, 49].

La septième pandémie a touché également l'Europe en 1970, avec des épidémies dans plusieurs pays jusqu'en 2011 ayant causé un peu plus de 7000 cas [36]. Dans une étude regroupant 172 souches européennes analysées avec 1152 autres souches de 7PET, nous avons retracé l'introduction et la circulation de cette lignée en Europe (Figures 1 et 2). Au moins huit introductions distinctes ont été documentées, majoritairement en Europe du Sud et de l'Est (Figure 2). En Europe de l'Est, ces épidémies concernaient les pays riverains de la mer Noire, telles

l'Ukraine, la Roumanie et la Moldavie avec des sous-lignées de 7PET en provenance d'Asie du Sud. Certaines de ces sous-lignées (EUR2/AFR3, EUR3/AFR4, EUR4/AFR6, EUR6/AFR8) ont même atteint par la suite l'Afrique de l'Est à partir d'un carrefour moyen-oriental (Figure 2). En Europe du Sud, au cours des années 1970, le vibrion cholérique a été importé plusieurs fois à partir de foyers épidémiques d'Afrique du Nord et de l'Ouest vers le Portugal, l'Italie et l'Espagne (sous-lignée EUR1/AFR1). En 1994, les épidémies de choléra ayant touché l'Albanie et l'Italie étaient dues à une sous-lignée (EUR6/AFR8) cette fois-ci provenant d'Europe de l'Est [36].

Il n'existe pas d'étude sur la circulation de l'agent du choléra à travers le continent asiatique au cours de la septième pandémie. Cependant la génomique microbienne a permis de montrer que les multiples épidémies de choléra en Chine depuis le début de cette pandémie étaient liées à six introductions de
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

**FIGURE 1.** Arbre phylogénétique daté comprenant 1324 souches, isolées entre 1961 et 2017, de la lignée pandémique de *V. cholerae* El Tor (7PET). Les branches terminales de l'arbre sont colorées en fonction de l'origine géographique des souches. Les principales sous-lignées ainsi que les différentes vagues (« wave » d'après Mutreja *et al.* [30]) sont indiquées.

au cours des années 1970 [37]. Depuis 2015, une nouvelle sous-lignée, AFR13 (ou T13), a été introduite d'Asie du Sud en Afrique de l'Est, où elle circule depuis en Ouganda, Tanzanie, Kenya, et Zimbabwe [38, 39, 47]. A partir de la Corne de l'Afrique, AFR13 a causé la gigantesque épidémie du Yémen toujours active avec plus de 2,5 millions de cas depuis 2016 [39, 48, 49].

La septième pandémie a touché également l'Europe en 1970, avec des épidémies dans plusieurs pays jusqu'en 2011 ayant causé un peu plus de 7000 cas [36]. Dans une étude regroupant 172 souches européennes analysées avec 1152 autres souches de 7PET, nous avons retracé l'introduction et la circulation de cette lignée en Europe (Figures 1 et 2). Au moins huit introductions distinctes ont été documentées, majoritairement en Europe du Sud et de l'Est (Figure 2). En Europe de l'Est, ces épidémies concernaient les pays riverains de la mer Noire, telles

l'Ukraine, la Roumanie et la Moldavie avec des sous-lignées de 7PET en provenance d'Asie du Sud. Certaines de ces sous-lignées (EUR2/AFR3, EUR3/AFR4, EUR4/AFR6, EUR6/AFR8) ont même atteint par la suite l'Afrique de l'Est à partir d'un carrefour moyen-oriental (Figure 2). En Europe du Sud, au cours des années 1970, le vibrion cholérique a été importé plusieurs fois à partir de foyers épidémiques d'Afrique du Nord et de l'Ouest vers le Portugal, l'Italie et l'Espagne (sous-lignée EUR1/AFR1). En 1994, les épidémies de choléra ayant touché l'Albanie et l'Italie étaient dues à une sous-lignée (EUR6/AFR8) cette fois-ci provenant d'Europe de l'Est [36].

Il n'existe pas d'étude sur la circulation de l'agent du choléra à travers le continent asiatique au cours de la septième pandémie. Cependant la génomique microbienne a permis de montrer que les multiples épidémies de choléra en Chine depuis le début de cette pandémie étaient liées à six introductions de
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**FIGURE 2.** Transmissions intercontinentales de la lignée pandémique de *V. cholerae* El Tor (7PET). Les introductions des différentes sous-lignées de 7PET de l'Asie vers l'Afrique, l'Europe et l'Amérique latine sont représentées par des lignes colorées pleines (ou en pointillé en cas de direction incertaine). Les sous-lignées appartenant aux vagues 1, 2 et 3 sont représentées dans les panels A, B, et C, respectivement. Les dates d'introduction des différentes sous-lignées sont également indiquées. Ces données sont issues des références suivantes [26, 30, 36–39].
<figure><img src="image_9.png" /></figure>

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**FIGURE 2.** Transmissions intercontinentales de la lignée pandémique de *V. cholerae* El Tor (7PET). Les introductions des différentes sous-lignées de 7PET de l'Asie vers l'Afrique, l'Europe et l'Amérique latine sont représentées par des lignes colorées pleines (ou en pointillé en cas de direction incertaine). Les sous-lignées appartenant aux vagues 1, 2 et 3 sont représentées dans les panels A, B, et C, respectivement. Les dates d'introduction des différentes sous-lignées sont également indiquées. Ces données sont issues des références suivantes [26, 30, 36–39].
V. cholerae O1 de la lignée 7PET depuis l'Asie du Sud et de l'Est. De plus, après propagation dans ce pays, l'agent du choléra a été réintroduit de Chine en Asie du Sud et du Sud-Est à cinq reprises [50].

## 7. Plasticité génomique et résistance aux antibiotiques

Les avantages de l'outil génomique vont au-delà de la possibilité de sous-typage des souches en permettant d'effectuer des études de génomique comparative et ainsi d'étudier de manière exhaustive le génome accessoire des agents pathogènes et notamment les déterminants de virulence et ceux de la résistance aux antibiotiques.

Les souches appartenant aux différents groupes génomiques, appelés vagues (« wave ») par Mutreja *et al.* présentent des caractéristiques différentes au niveau de leur génome accessoire [30]. Ainsi, l'acquisition chromosomique d'un élément conjugatif et intégratif (ICE) de 100 kb de la famille des SXT/R391 codant la résistance à différentes classes d'antibiotiques est caractéristique des souches des vagues 2 et 3. D'autre part, différentes versions tronquées du VSP-II ont été identifiées chez les souches de la vague 3 [37, 51]. Enfin, une substitution du prophage CTXφ a eu lieu chez les souches de la lignée 7PET au cours du temps. Les souches de la vague 1 possédaient ainsi un prophage CTX-1 avec l'allèle *ctxB3* sur le chromosome 1, tandis que les souches de la vague 2 portaient le prophage CTX-2 avec l'allèle *ctxB1* (allèle *ctxB* classique) en tandem sur le chromosome 2. Enfin, les souches du début de la vague 3 ont un prophage de type CTX-3, 4, 5 ou 6 avec l'allèle *ctxB1* sur le chromosome 1 et les souches les plus récentes de la vague 3 présentent un CTX-3b ou 6b avec l'allèle *ctxB7* [37, 51]. Certaines souches de la vague 3 sont également porteuses d'un phage satellite (nommé PLE pour phage-inducible chromosomal island-like element) leur permettant de lutter contre ICP1, un phage lytique considéré comme un des principaux phages prédateurs de V. cholerae O1 au Bangladesh mais aussi en République Démocratique du Congo [52]. Plusieurs variants (PLE 1 à PLE 10) de ce phage satellite ont été décrits chez des souches de la lignée 7PET isolées majoritairement en Asie [53, 54].

Les antibiotiques restent largement utilisés dans le traitement des formes sévères de choléra même si le traitement principal de cette diarrhée aqueuse

repose sur la réhydratation orale ou parentérale selon le degré de gravité. L'utilisation importante des antibiotiques en thérapeutique ou quelquefois même en prophylaxie a conduit à l'émergence de nombreuses résistances, mettant en péril l'utilisation possible de la ciprofloxacine, la doxycycline et l'azithromyine, les molécules actuellement recommandées [1]. En Afrique, des sous-lignées de plus en plus résistantes aux antibiotiques ont remplacé les sous-lignées sensibles à partir des années 2000 [37]. Les sous-lignées AFR9, AFR10, AFR11 et AFR12 de la vague 3 possèdent ainsi de 5 à 7 gènes de résistance aux antibiotiques en moyenne par souche. Cette résistance est portée majoritairement pour les souches de la vague 3 par un variant de l'élément génétique mobile SXT/R391, nommé ICEVchInd5, qui possède les gènes de résistance à la streptomycine (*strA*, *strB*), au chloramphénicol (*floR*), aux sulfamides (*sul2*), au triméthoprime (*dfrA1*) et au triméthoprime-sulfamethoxazole (*sul2*, *dfrA1*). Des variations de cet élément dues à la mobilisation de séquences d'insertion ont été notées au cours du temps avec notamment une délétion de 10 kb chez les souches les plus récentes de la vague 3 entraînant la perte de quatre gènes de résistance aux antibiotiques (*strA*, *strB*, *floR* et *sul2*). D'autres éléments génétiques mobiles ont été observés chez des souches des différentes vagues comme les plasmides de type IncA/C entraînant des résistances à plusieurs familles d'antibiotique en fonction des gènes de résistance, ou l'ilot génomique GI-15 portant les gènes de résistance à la streptomycine (*aadA1*) et aux sulfamides (*sul1*). Une mutation dans une région particulière (nommée « Quinolone Region Determining Resistance » ou QRDR) du gène codant la sous-unité A de l'ADN gyrase, *gyrA*, — un gène chromosomique impliqué dans la réplication de l'ADN bactérien — a été acquise par les dernières sous-lignées de la vague 3 (à partir d'AFR10) et entraîne une résistance à l'acide nalidixique. Une mutation supplémentaire dans le QRDR du gène *parC*, entraînant une diminution de la sensibilité à la ciprofloxacine est apparue pour la première fois avec la sous-lignée AFR11. A contrario, une mutation dans le gène *vprA* entraînant une restauration de la sensibilité à la polymyxine B est apparue en Inde chez les souches de la vague 3 à partir de 2012, alors que la résistance à cette molécule était l'un des moyens d'identification du biotype El Tor par rapport au classique depuis 1961 [7, 39, 55].
V. cholerae O1 de la lignée 7PET depuis l'Asie du Sud et de l'Est. De plus, après propagation dans ce pays, l'agent du choléra a été réintroduit de Chine en Asie du Sud et du Sud-Est à cinq reprises [50].

## 7. Plasticité génomique et résistance aux antibiotiques

Les avantages de l'outil génomique vont au-delà de la possibilité de sous-typage des souches en permettant d'effectuer des études de génomique comparative et ainsi d'étudier de manière exhaustive le génome accessoire des agents pathogènes et notamment les déterminants de virulence et ceux de la résistance aux antibiotiques.

Les souches appartenant aux différents groupes génomiques, appelés vagues (« wave ») par Mutreja et al. présentent des caractéristiques différentes au niveau de leur génome accessoire [30]. Ainsi, l'acquisition chromosomique d'un élément conjugatif et intégratif (ICE) de 100 kb de la famille des SXT/R391 codant la résistance à différentes classes d'antibiotiques est caractéristique des souches des vagues 2 et 3. D'autre part, différentes versions tronquées du VSP-II ont été identifiées chez les souches de la vague 3 [37, 51]. Enfin, une substitution du prophage CTXφ a eu lieu chez les souches de la lignée 7PET au cours du temps. Les souches de la vague 1 possédaient ainsi un prophage CTX-1 avec l'allèle *ctxB3* sur le chromosome 1, tandis que les souches de la vague 2 portaient le prophage CTX-2 avec l'allèle *ctxB1* (allèle *ctxB* classique) en tandem sur le chromosome 2. Enfin, les souches du début de la vague 3 ont un prophage de type CTX-3, 4, 5 ou 6 avec l'allèle *ctxB1* sur le chromosome 1 et les souches les plus récentes de la vague 3 présentent un CTX-3b ou 6b avec l'allèle *ctxB7* [37, 51]. Certaines souches de la vague 3 sont également porteuses d'un phage satellite (nommé PLE pour phage-inducible chromosomal island-like element) leur permettant de lutter contre ICP1, un phage lytique considéré comme un des principaux phages prédateurs de V. cholerae O1 au Bangladesh mais aussi en République Démocratique du Congo [52]. Plusieurs variants (PLE 1 à PLE 10) de ce phage satellite ont été décrits chez des souches de la lignée 7PET isolées majoritairement en Asie [53, 54].

Les antibiotiques restent largement utilisés dans le traitement des formes sévères de choléra même si le traitement principal de cette diarrhée aqueuse

repose sur la réhydratation orale ou parentérale selon le degré de gravité. L'utilisation importante des antibiotiques en thérapeutique ou quelquefois même en prophylaxie a conduit à l'émergence de nombreuses résistances, mettant en péril l'utilisation possible de la ciprofloxacine, la doxycycline et l'azithromyine, les molécules actuellement recommandées [1]. En Afrique, des sous-lignées de plus en plus résistantes aux antibiotiques ont remplacé les sous-lignées sensibles à partir des années 2000 [37]. Les sous-lignées AFR9, AFR10, AFR11 et AFR12 de la vague 3 possèdent ainsi de 5 à 7 gènes de résistance aux antibiotiques en moyenne par souche. Cette résistance est portée majoritairement pour les souches de la vague 3 par un variant de l'élément génétique mobile SXT/R391, nommé ICEVchInd5, qui possède les gènes de résistance à la streptomycine (*strA*, *strB*), au chloramphénicol (*floR*), aux sulfamides (*sul2*), au triméthoprime (*dfrA1*) et au triméthoprime-sulfamethoxazole (*sul2*, *dfrA1*). Des variations de cet élément dues à la mobilisation de séquences d'insertion ont été notées au cours du temps avec notamment une délétion de 10 kb chez les souches les plus récentes de la vague 3 entraînant la perte de quatre gènes de résistance aux antibiotiques (*strA*, *strB*, *floR* et *sul2*). D'autres éléments génétiques mobiles ont été observés chez des souches des différentes vagues comme les plasmides de type IncA/C entraînant des résistances à plusieurs familles d'antibiotique en fonction des gènes de résistance, ou l'ilot génomique GI-15 portant les gènes de résistance à la streptomycine (*aadA1*) et aux sulfamides (*sul1*). Une mutation dans une région particulière (nommée « Quinolone Region Determining Resistance » ou QRDR) du gène codant la sous-unité A de l'ADN gyrase, *gyrA*, — un gène chromosomique impliqué dans la réplication de l'ADN bactérien — a été acquise par les dernières sous-lignées de la vague 3 (à partir d'AFR10) et entraîne une résistance à l'acide nalidixique. Une mutation supplémentaire dans le QRDR du gène *parC*, entraînant une diminution de la sensibilité à la ciprofloxacine est apparue pour la première fois avec la sous-lignée AFR11. A contrario, une mutation dans le gène *vprA* entraînant une restauration de la sensibilité à la polymyxine B est apparue en Inde chez les souches de la vague 3 à partir de 2012, alors que la résistance à cette molécule était l'un des moyens d'identification du biotype El Tor par rapport au classique depuis 1961 [7, 39, 55].
Cette évolution des résistances aux antibiotiques couplée à l'évolution des déterminants génétiques montre la plasticité génomique de la lignée pandémique 7PET et son adaptabilité. Ainsi les souches de la récente épidémie de choléra au Zimbabwe (plus de 10 000 cas en 2018-2019) appartenant à la sous-lignée AFR13 de la vague 3 ont acquis en plus de l'élément SXT/R391 un plasmide de type IncA/C2 portant 14 gènes de résistance aux antibiotiques, dont un gène de bêta-lactamase à spectre étendu (blaCTX-M-15) les rendant hautement résistantes aux bêta-lactamines [38]. En plus de leurs déterminants de résistance aux antibiotiques, ces éléments SXT/R391 ont été récemment impliqués dans la résistance au bactériophage ICP1, donnant ainsi aux souches les portant un double avantage sélektif [56].

## 8. Conclusion

L'importance prise par la génomique microbienne au cours de ces dix dernières années a conduit de nombreuses agences de santé publique et réseaux de surveillance microbiologique à utiliser cette méthode en routine pour la surveillance de nombreux agents pathogènes [57]. Pour le choléra, cette technique a permis l'identification d'une seule lignée pandémique (7PET) au cours de la septième pandémie et a clarifié les relations entre la souche pandémique et les souches environnementales qui appartiennent à d'autres lignées, bien que certaines parmi ces dernières soient de sérogroupe O1 et posèdent le prophage CTXφ et/ou le pilus TCP. Cette célétorisation en lignée 7PET ou en lignées environnementales pour tout nouvel isolement de souche de V. cholerae O1 est extrêmement utile pour définir avec certitude le risque épidémique — en particulier dans les régions non endémiques pour le choléra mais à fort risque d'introduction — et ainsi de déployer des mesures de contrôle adaptées. L'analyse génomique permet également de surveiller globalement l'évolution de la résistance aux antibiotiques qui peut impacter très fortement la thérapeutique comme dans le cadre des souches de la récente épidémie du Zimbabwe. Enfin, cette technique a transformé notre compréhension de l'épidémiologie du choléra. En effet, les différentes études génotiques sur la dynamique d'introduction et de diffusion des sous-lignées de 7PET entre continents

sont en faveur d'une transmission interhumaine de la maladie. Cette transmission du choléra et sa diffusion à plus grande échelle par l'homme étaient déjà connues par les épidémiologistes du 19ème et 20ème siècle pour le choléra de type classique qui empruntait les grands axes de circulation avec des moyens de transport de plus en plus rapides. Un autre point en faveur de cette transmission interhumaine est la dynamique temporo-spatiale des populations 7PET en Afrique avec *in fine* la disparition des différentes sous-lignées et leur remplacement par d'autres sous-lignées en provenance d'Asie du Sud. Dans le cas d'un réservoir environnemental, on observerait probablement la réémergence au cours du temps dans une même région d'une même sous-lignée. Sans réservoir local pérenne en Afrique, l'élimination du choléra de ces régions devient réalisable ainsi que l'envisage l'OMS et la GTFCC (« Global Task Force on Cholera Control ») qui ont édité une feuille de route visant à réduire de 90% les décès dus au choléra en 2030 [58]. Cependant, les résultats issus des travaux de génomique bactérienne suggèrent qu'en dehors du contrôle de la maladie en Afrique il faut continuer à lutter contre le réservoir de la lignée pandémique 7PET dans le golfe du Bengale, car c'est dans cette région que l'agent pathogène évolue et se diffuse ensuite de par le monde [59].

## Lexique

**Allèle** : forme particulière de la séquence ADN d'un gène.

**Îlot génomique** (*Genomic Island*, GI) : région du chromosome probablement acquise par transfert horizontal mais qui n'est plus mobile.

**Element conjugatif et intégratif** (*Integrative and conjugative element*, ICE) : élément génétique mobile auto-transférable qui possède des caractéristiques proches de celles des plasmides et des phages; élément transféré par conjugaison qui s'intègre ensuite dans le chromosome.

**Polymorphisme nucléotidique** (*Single nucleotide polymorphism*, SNP) : variation d'un seul nucléotide dans une séquence génétique.

## Conflit d'intérêt

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer.
Cette évolution des résistances aux antibiotiques couplée à l'évolution des déterminants génétiques montre la plasticité génomique de la lignée pandémique 7PET et son adaptabilité. Ainsi les souches de la récente épidémie de choléra au Zimbabwe (plus de 10 000 cas en 2018-2019) appartenant à la sous-lignée AFR13 de la vague 3 ont acquis en plus de l'élément SXT/R391 un plasmide de type IncA/C2 portant 14 gènes de résistance aux antibiotiques, dont un gène de bêta-lactamase à spectre étendu (blaCTX-M-15) les rendant hautement résistantes aux bêta-lactamines [38]. En plus de leurs déterminants de résistance aux antibiotiques, ces éléments SXT/R391 ont été récemment impliqués dans la résistance au bactériophage ICP1, donnant ainsi aux souches les portant un double avantage sélektif [56].

## 8. Conclusion

L'importance prise par la génomique microbienne au cours de ces dix dernières années a conduit de nombreuses agences de santé publique et réseaux de surveillance microbiologique à utiliser cette méthode en routine pour la surveillance de nombreux agents pathogènes [57]. Pour le choléra, cette technique a permis l'identification d'une seule lignée pandémique (7PET) au cours de la septième pandémie et a clarifié les relations entre la souche pandémique et les souches environnementales qui appartiennent à d'autres lignées, bien que certaines parmi ces dernières soient de sérogroupe O1 et posèdent le prophage CTXφ et/ou le pilus TCP. Cette célétorisation en lignée 7PET ou en lignées environnementales pour tout nouvel isolement de souche de V. cholerae O1 est extrêmement utile pour définir avec certitude le risque épidémique — en particulier dans les régions non endémiques pour le choléra mais à fort risque d'introduction — et ainsi de déployer des mesures de contrôle adaptées. L'analyse génomique permet également de surveiller globalement l'évolution de la résistance aux antibiotiques qui peut impacter très fortement la thérapeutique comme dans le cadre des souches de la récente épidémie du Zimbabwe. Enfin, cette technique a transformé notre compréhension de l'épidémiologie du choléra. En effet, les différentes études génotomiques sur la dynamique d'introduction et de diffusion des sous-lignées de 7PET entre continents

sont en faveur d'une transmission interhumaine de la maladie. Cette transmission du choléra et sa diffusion à plus grande échelle par l'homme étaient déjà connues par les épidémiologistes du 19ème et 20ème siècle pour le choléra de type classique qui empruntait les grands axes de circulation avec des moyens de transport de plus en plus rapides. Un autre point en faveur de cette transmission interhumaine est la dynamique temporo-spatiale des populations 7PET en Afrique avec *in fine* la disparition des différentes sous-lignées et leur remplacement par d'autres sous-lignées en provenance d'Asie du Sud. Dans le cas d'un réservoir environnemental, on observerait probablement la réémergence au cours du temps dans une même région d'une même sous-lignée. Sans réservoir local pérenne en Afrique, l'élimination du choléra de ces régions devient réalisable ainsi que l'envisage l'OMS et la GTFCC (« Global Task Force on Cholera Control ») qui ont édité une feuille de route visant à réduire de 90% les décès dus au choléra en 2030 [58]. Cependant, les résultats issus des travaux de génomique bactérienne suggèrent qu'en dehors du contrôle de la maladie en Afrique il faut continuer à lutter contre le réservoir de la lignée pandémique 7PET dans le golfe du Bengale, car c'est dans cette région que l'agent pathogène évolue et se diffuse ensuite de par le monde [59].

## Lexique

**Allèle** : forme particulière de la séquence ADN d'un gène.

**Îlot génomique** (*Genomic Island*, GI) : région du chromosome probablement acquise par transfert horizontal mais qui n'est plus mobile.

**Element conjugatif et intégratif** (*Integrative and conjugative element*, ICE) : élément génétique mobile auto-transférable qui possède des caractéristiques proches de celles des plasmides et des phages; élément transféré par conjugaison qui s'intègre ensuite dans le chromosome.

**Polymorphisme nucléotidique** (*Single nucleotide polymorphism*, SNP) : variation d'un seul nucléotide dans une séquence génétique.

## Conflit d'intérêt

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à déclarer.
## References

[1] J. D. Clemens, G. B. Nair, T. Ahmed, F. Qadri, J. Holmgren, "Cholera", *The Lancet* **390** (2017), p. 1539-1549.

[2] M. Ali, A. R. Nelson, A. L. Lopez, D. A. Sack, "Updated global burden of cholera in endemic countries", *PLoS Negl. Trop. Dis.* **9** (2015), article no. e0003832.

[3] S. N. Chatterjee, K. Chaudhuri, "Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae", *Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Basis Dis.* **1639** (2003), p. 65-79.

[4] M. J. Dorman, D. Domman, M. I. Uddin, S. Sharmin, M. H. Afrad, Y. A. Begum, F. Qadri, N. R. Thomson, "High quality reference genomes for toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae serogroup O139. 1", *Sci. Rep.* **9** (2019), article no. 5865.

[5] D. Hu, B. Liu, L. Feng, P. Ding, X. Guo, M. Wang, B. Cao, P. R. Reeves, L. Wang, "Origins of the current seventh cholera pandemic", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **113** (2016), p. E7730-E7739.

[6] I. M. Longini Jr., M. Yunus, K. Zaman, A. K. Siddique, R. B. Sack, A. Nizam, "Epidemic and endemic cholera trends over a 33-year period in Bangladesh", *J. Infect. Dis.* **186** (2002), p. 246-251.

[7] J. B. Kaper, J. G. Morris, M. M. Levine, "Cholera", *Clin. Microbiol. Rev.* **8** (1995), p. 48-86.

[8] P. Bourdelais, A. Dodin, *Visages du Choléra*, Belin, Paris, 1987.

[9] A. M. Devault, G. B. Golding, N. Waglechner, J. M. Enk, M. Kuch, J. H. Tien, M. Shi, D. N. Fisman, A. N. Dhody, S. Forrest, K. I. Bos, D. J. D. Earn, E. C. Holmes, H. N. Poinar, "Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849", *New Engl. J. Med.* **370** (2014), p. 334-340.

[10] A. Siriphap, P. Leekitcharoenphon, R. S. Kaas, C. Theethakaw, F. M. Aarestrup, O. Sutheinkul, R. S. Hendriksen, "Characterization and genetic variation of Vibrio cholerae isolated from clinical and environmental sources in Thailand", *PLoS One* **12** (2017), article no. e0169324.

[11] M. Dziejman, E. Balon, D. Boyd, C. M. Fraser, J. F. Heidelberg, J. J. Mekalanos, "Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **99** (2002), p. 1556-1561.

[12] G. Jonson, A.-M. Svennerholm, J. Holmgren, "Expression of virulence factors by classical and El Tor Vibrio cholerae in vivo and in vitro", *FEMS Microbiol. Lett.* **74** (1990), p. 221-228.

[13] S. Beyhan, A. D. Tischler, A. Camilli, F. Yildiz, "Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae O1", *Infect. Immun.* **74** (2006), p. 3633-3642.

[14] B. Kostiuk, F. J. Santoriello, L. Diaz-Satizabal, F. Bisaro, K.-J. Lee, A. N. Dhody, D. Provenzano, D. Unterweger, S. Pukatzki, "Type VI secretion system mutations reduced competitive fitness of classical Vibrio cholerae biotype", *Nat. Commun.* **12** (2021), article no. 6457.

[15] S. S. Yoon, J. J. Mekalanos, "2,3-butanediol synthesis and the emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype", *Infect. Immun.* **74** (2006), p. 6547-6556.

[16] M. K. Waldor, J. J. Mekalanos, "Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin", *Science* **272** (1996), p. 1910-1914.

[17] E. J. Kim, D. Lee, S. H. Moon, C. H. Lee, D. W. Kim, "CTX Prophages in Vibrio cholerae O1 Strains", *J. Microbiol. Biotechnol.* **24** (2014), p. 725-731.

[18] S. Mukerjee, D. K. Guha, U. G. Roy, "Studies on typing of cholera by bacteriophage. Part I. Phage typing of Vibrio cholerae from Calcutta epidemics", *Ann. Biochem. Exp. Med.* **17** (1957), p. 161-176.

[19] P. Nicolle, J. Gallut, L. Le Minor, "Lysogenic, phagotyping, serological and biochemical study (cholera-red reaction and search for lysine decarboxylase) of a collection of Vibrio cholerae and vibrio El-Tor", *Ann. Inst. Pasteur.* **99** (1960), p. 664-671.

[20] S. M. Faruque, I. B. Naser, M. J. Islam, A. S. G. Faruque, A. N. Ghosh, G. B. Nair, D. A. Sack, J. J. Mekalanos, "Seasonal epidemics of cholera inversely correlate with the prevalence of environmental cholera phages", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **102** (2005), p. 1702-1707.

[21] S. M. Faruque, M. J. Islam, Q. S. Ahmad, A. S. G. Faruque, D. A. Sack, G. B. Nair, J. J. Mekalanos, "Self-limiting nature of seasonal cholera epidemics: role of host-mediated amplification of phage", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **102** (2005), p. 6119-6124.

[22] S. Mukerjee, "Bacteriophage typing of cholera", *Bull. World Health Organ.* **28** (1963), p. 337-345.

[23] M. L. Lizárraga-Partida, M.-L. Quilici, "Molecular analyses of Vibrio cholerae O1 clinical strains, including new nontoxigenic variants isolated in Mexico during the cholera epidemic years between 1991 and 2000", *J. Clin. Microbiol.* **47** (2009), p. 1364-1371.

[24] R. Lan, P. R. Reeves, "Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism", *J. Clin. Microbiol.* **40** (2002), p. 172-181.

[25] S. Rebaudet, M. A. Mengel, L. Koivogui, S. Moore, A. Mutreja, Y. Kande, O. Yattara, V. Sarr Keita, B.-M. Njanpop-Lafourcade, P.-E. Fournier, E. Garnotel, S. Keita, R. Piarroux, "Deciphering the origin of the 2012 cholera epidemic in Guinea by integrating epidemiological and molecular analyses", *PLoS Negl. Trop. Dis.* **8** (2014), article no. e2898.

[26] D. Domman, M.-L. Quilici, M. J. Dorman, E. Njamkepo, A. Mutreja, A. E. Mather, G. Delgado, R. Morales-Espinosa, P. A. D. Grimont, M. L. Lizárraga-Partida, C. Bouchier, D. M. Aanensen, P. Kuri-Morales, C. L. Tarr, G. Dougan, J. Parkhill, J. Campos, A. Cravioto, F.-X. Weill, N. R. Thomson, "Integrated view of Vibrio cholerae in the Americas", *Science* **358** (2017), p. 789-793.

[27] J. F. Heidelberg, J. A. Eisen, W. C. Nelson, R. A. Clayton, M. L. Gwinn, R. J. Dodson, D. H. Haft, E. K. Hickey, J. D. Peterson, L. Umayam, S. R. Gill, K. E. Nelson, T. D. Read, H. Tetelin, D. Richardson, M. D. Ermolaeva, J. Vamathevan, S. Bass, H. Qin, I. Dragoi, P. Sellers, L. McDonald, T. Utterback, R. D. Fleishmann, W. C. Nierman, O. White, S. L. Salzberg, H. O. Smith, R. R. Colwell, J. J. Mekalanos, J. C. Venter, C. M. Fraser, "DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae", *Nature* **406** (2000), p. 477-483.

[28] J. Chun, C. J. Grim, N. A. Hasan, J. H. Lee, S. Y. Choi, B. J. Harvey, E. Taviani, Y.-S. Jeon, D. W. Kim, J.-H. Lee, T. S. Brettin, D. C. Bruce, J. F. Challacombe, J. C. Detter, C. S. Han, A. C. Munk, O. Chertkov, L. Meincke, E. Saunders, R. A. Walters, A. Huq, G. B. Nair, R. R. Colwell, "Comparative genomics re-
## References

[1] J. D. Clemens, G. B. Nair, T. Ahmed, F. Qadri, J. Holmgren, "Cholera", *The Lancet* **390** (2017), p. 1539-1549.

[2] M. Ali, A. R. Nelson, A. L. Lopez, D. A. Sack, "Updated global burden of cholera in endemic countries", *PLoS Negl. Trop. Dis.* **9** (2015), article no. e0003832.

[3] S. N. Chatterjee, K. Chaudhuri, "Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae", *Biochim. Biophys. Acta BBA - Mol. Basis Dis.* **1639** (2003), p. 65-79.

[4] M. J. Dorman, D. Domman, M. I. Uddin, S. Sharmin, M. H. Afrad, Y. A. Begum, F. Qadri, N. R. Thomson, "High quality reference genomes for toxigenic and non-toxigenic Vibrio cholerae serogroup O139. 1", *Sci. Rep.* **9** (2019), article no. 5865.

[5] D. Hu, B. Liu, L. Feng, P. Ding, X. Guo, M. Wang, B. Cao, P. R. Reeves, L. Wang, "Origins of the current seventh cholera pandemic", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **113** (2016), p. E7730-E7739.

[6] I. M. Longini Jr., M. Yunus, K. Zaman, A. K. Siddique, R. B. Sack, A. Nizam, "Epidemic and endemic cholera trends over a 33-year period in Bangladesh", *J. Infect. Dis.* **186** (2002), p. 246-251.

[7] J. B. Kaper, J. G. Morris, M. M. Levine, "Cholera", *Clin. Microbiol. Rev.* **8** (1995), p. 48-86.

[8] P. Bourdelais, A. Dodin, *Visages du Choléra*, Belin, Paris, 1987.

[9] A. M. Devault, G. B. Golding, N. Waglechner, J. M. Enk, M. Kuch, J. H. Tien, M. Shi, D. N. Fisman, A. N. Dhody, S. Forrest, K. I. Bos, D. J. D. Earn, E. C. Holmes, H. N. Poinar, "Second-pandemic strain of Vibrio cholerae from the Philadelphia cholera outbreak of 1849", *New Engl. J. Med.* **370** (2014), p. 334-340.

[10] A. Siriphap, P. Leekitcharoenphon, R. S. Kaas, C. Theethakaw, F. M. Aarestrup, O. Sutheinkul, R. S. Hendriksen, "Characterization and genetic variation of Vibrio cholerae isolated from clinical and environmental sources in Thailand", *PLoS One* **12** (2017), article no. e0169324.

[11] M. Dziejman, E. Balon, D. Boyd, C. M. Fraser, J. F. Heidelberg, J. J. Mekalanos, "Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **99** (2002), p. 1556-1561.

[12] G. Jonson, A.-M. Svennerholm, J. Holmgren, "Expression of virulence factors by classical and El Tor Vibrio cholerae in vivo and in vitro", *FEMS Microbiol. Lett.* **74** (1990), p. 221-228.

[13] S. Beyhan, A. D. Tischler, A. Camilli, F. Yildiz, "Differences in gene expression between the classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae O1", *Infect. Immun.* **74** (2006), p. 3633-3642.

[14] B. Kostiuk, F. J. Santoriello, L. Diaz-Satizabal, F. Bisaro, K.-J. Lee, A. N. Dhody, D. Provenzano, D. Unterweger, S. Pukatzki, "Type VI secretion system mutations reduced competitive fitness of classical Vibrio cholerae biotype", *Nat. Commun.* **12** (2021), article no. 6457.

[15] S. S. Yoon, J. J. Mekalanos, "2,3-butanediol synthesis and the emergence of the Vibrio cholerae El Tor biotype", *Infect. Immun.* **74** (2006), p. 6547-6556.

[16] M. K. Waldor, J. J. Mekalanos, "Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin", *Science* **272** (1996), p. 1910-1914.

[17] E. J. Kim, D. Lee, S. H. Moon, C. H. Lee, D. W. Kim, "CTX Prophages in Vibrio cholerae O1 Strains", *J. Microbiol. Biotechnol.* **24** (2014), p. 725-731.

[18] S. Mukerjee, D. K. Guha, U. G. Roy, "Studies on typing of cholera by bacteriophage. Part I. Phage typing of Vibrio cholerae from Calcutta epidemics", *Ann. Biochem. Exp. Med.* **17** (1957), p. 161-176.

[19] P. Nicolle, J. Gallut, L. Le Minor, "Lysogenic, phagotyping, serological and biochemical study (cholera-red reaction and search for lysine decarboxylase) of a collection of Vibrio cholerae and vibrio El-Tor", *Ann. Inst. Pasteur.* **99** (1960), p. 664-671.

[20] S. M. Faruque, I. B. Naser, M. J. Islam, A. S. G. Faruque, A. N. Ghosh, G. B. Nair, D. A. Sack, J. J. Mekalanos, "Seasonal epidemics of cholera inversely correlate with the prevalence of environmental cholera phages", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **102** (2005), p. 1702-1707.

[21] S. M. Faruque, M. J. Islam, Q. S. Ahmad, A. S. G. Faruque, D. A. Sack, G. B. Nair, J. J. Mekalanos, "Self-limiting nature of seasonal cholera epidemics: role of host-mediated amplification of phage", *Proc. Natl. Acad. Sci. USA* **102** (2005), p. 6119-6124.

[22] S. Mukerjee, "Bacteriophage typing of cholera", *Bull. World Health Organ.* **28** (1963), p. 337-345.

[23] M. L. Lizárraga-Partida, M.-L. Quilici, "Molecular analyses of Vibrio cholerae O1 clinical strains, including new nontoxigenic variants isolated in Mexico during the cholera epidemic years between 1991 and 2000", *J. Clin. Microbiol.* **47** (2009), p. 1364-1371.

[24] R. Lan, P. R. Reeves, "Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism", *J. Clin. Microbiol.* **40** (2002), p. 172-181.

[25] S. Rebaudet, M. A. Mengel, L. Koivogui, S. Moore, A. Mutreja, Y. Kande, O. Yattara, V. Sarr Keita, B.-M. Njanpop-Lafourcade, P.-E. Fournier, E. Garnotel, S. Keita, R. Piarroux, "Deciphering the origin of the 2012 cholera epidemic in Guinea by integrating epidemiological and molecular analyses", *PLoS Negl. Trop. Dis.* **8** (2014), article no. e2898.

[26] D. Domman, M.-L. Quilici, M. J. Dorman, E. Njamkepo, A. Mutreja, A. E. Mather, G. Delgado, R. Morales-Espinosa, P. A. D. Grimont, M. L. Lizárraga-Partida, C. Bouchier, D. M. Aanensen, P. Kuri-Morales, C. L. Tarr, G. Dougan, J. Parkhill, J. Campos, A. Cravioto, F.-X. Weill, N. R. Thomson, "Integrated view of Vibrio cholerae in the Americas", *Science* **358** (2017), p. 789-793.

[27] J. F. Heidelberg, J. A. Eisen, W. C. Nelson, R. A. Clayton, M. L. Gwinn, R. J. Dodson, D. H. Haft, E. K. Hickey, J. D. Peterson, L. Umayam, S. R. Gill, K. E. Nelson, T. D. Read, H. Tetelin, D. Richardson, M. D. Ermolaeva, J. Vamathevan, S. Bass, H. Qin, I. Dragoi, P. Sellers, L. McDonald, T. Utterback, R. D. Fleishmann, W. C. Nierman, O. White, S. L. Salzberg, H. O. Smith, R. R. Colwell, J. J. Mekalanos, J. C. Venter, C. M. Fraser, "DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae", *Nature* **406** (2000), p. 477-483.

[28] J. Chun, C. J. Grim, N. A. Hasan, J. H. Lee, S. Y. Choi, B. J. Harvey, E. Taviani, Y.-S. Jeon, D. W. Kim, J.-H. Lee, T. S. Brettin, D. C. Bruce, J. F. Challacombe, J. C. Detter, C. S. Han, A. C. Munk, O. Chertkov, L. Meincke, E. Saunders, R. A. Walters, A. Huq, G. B. Nair, R. R. Colwell, "Comparative genomics re-
veals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009), p. 15442-15447.

[29] L. Feng, P. R. Reeves, R. Lan, Y. Ren, C. Gao, Z. Zhou, Y. Ren, J. Cheng, W. Wang, J. Wang, W. Qian, D. Li, L. Wang, “A recalibrated molecular clock and independent origins for the cholera pandemic clones”, PLoS One 3 (2008), article no. e4053.

[30] A. Mutreja, D. W. Kim, N. R. Thomson, T. R. Connor, J. H. Lee, S. Kariuki, N. J. Croucher, S. Y. Choi, S. R. Harris, M. Lebens, S. K. Niyogi, E. J. Kim, T. Ramamurthy, J. Chun, J. L. N. Wood, J. D. Clemens, C. Czerkinsky, G. B. Nair, J. Holmgren, J. Parkhill, G. Dougan, “Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic”, Nature 477 (2011), p. 462-465.

[31] B. W. Davies, R. W. Bogard, T. S. Young, J. J. Mekalanos, “Coordinated regulation of accessory genetic elements produces cyclic di-nucleotides for V. cholerae virulence”, Cell 149 (2012), p. 358-370.

[32] S. G. Murphy, B. A. Johnson, C. M. Ledoux, T. Dörr, “Vibrio cholerae mysterious seventh Pandemic island (VSP-II) encodes novel Zur-regulated zinc starvation genes involved in chemotaxis and cell congregation”, PLoS Genet. 17 (2021), article no. e1009624.

[33] D. A. Sack, A. K. Debes, J. Ateudjieu, G. Bwire, M. Ali, M. C. Ngwa, J. Mwaba, R. Chilengi, C. C. Orach, W. Boru, A. A. Mohamed, M. Ram, C. M. George, O. C. Stine, “Contrasting epidemiology of cholera in Bangladesh and Africa”, J. Infect. Dis. 224 (2021), p. S701-S709.

[34] R. R. Colwell, “Global climate and infectious disease: the cholera paradigm”, Science 274 (1996), p. 2025-2031.

[35] E. K. Lipp, A. Huq, R. R. Colwell, “Effects of global climate on infectious disease: the cholera model”, Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002), p. 757-770.

[36] M. Oprea, E. Njamkepo, D. Cristea, A. Zhukova, C. G. Clark, A. N. Kravetz, E. Monakhova, A. S. Ciontea, R. Cojocaru, J. Rauzier, M. Damian, O. Gascuel, M.-L. Quilici, F.-X. Weill, “The seventh pandemic of cholera in Europe revisited by microbial genomics”, Nat. Commun. 11 (2020), article no. 5347.

[37] F.-X. Weill, D. Domman, E. Njamkepo, C. Tarr, J. Rauzier, N. Fawal, K. H. Keddy, H. Salje, S. Moore, A. K. Mukhopadhyay, R. Bercion, F. J. Luquero, A. Ngandjio, M. Dosso, E. Monakhova, B. Garin, C. Bouchier, C. Pazzani, A. Mutreja, R. Grunow, F. Sidikou, L. Bonte, S. Breurec, M. Damian, B.-M. Njanpop-Lafourcade, G. Sapriel, A.-L. Page, M. Hamze, M. Henkens, G. Chowdhury, M. Mengel, J.-L. Koeck, J.-M. Fournier, G. Dougan, P. A. D. Grimont, J. Parkhill, K. E. Holt, R. Piarroux, T. Ramamurthy, M.-L. Quilici, N. R. Thomson, “Genomic history of the seventh pandemic of cholera in Africa”, Science 358 (2017), p. 785-789.

[38] T. Mashe, D. Domman, A. Tarupiwa, P. Manangazira, I. Phiri, K. Masunda, P. Chonzi, E. Njamkepo, M. Ramudzulu, S. Mtapuri-Zinyowera, A. M. Smith, F.-X. Weill, “Highly resistant cholera outbreak strain in Zimbabwe”, New Engl. J. Med. 383 (2020), p. 687-689.

[39] F.-X. Weill, D. Domman, E. Njamkepo, A. A. Almesbahi, M. Najı, S. S. Nasher, A. Rakesh, A. M. Assiri, N. C. Sharma, S. Kariuki, M. R. Pourshafie, J. Rauzier, A. Abubakar, J. Y. Carter, J. F. Wamala, C. Seguin, C. Bouchier, T. Malliavin,

B. Bakhshi, H. H. N. Abulmaali, D. Kumar, S. M. Njoroge, M. R. Malik, J. Kiiru, F. J. Luquero, A. S. Azman, T. Ramamurthy, N. R. Thomson, M.-L. Quilici, “Genomic insights into the 2016–2017 cholera epidemic in Yemen”, Nature 565 (2019), p. 230-233.

[40] J. Kumate, J. Sepúlveda, G. Gutiérrez, “Cholera epidemiology in Latin America and perspectives for eradication”, Bull. Inst. Pasteur. 96 (1998), p. 217-226.

[41] World Health Organization, Wkly. Epidemiol. Rec. 77 (2002), no. 31, p. 257-268.

[42] J. Martinez-Urtaza, J. Trinanes, N. Gonzalez-Escalona, C. Baker-Austin, “Is El Niño a long-distance corridor for waterborne disease?”, Nat. Microbiol. 1 (2016), article no. 16018.

[43] A. Smirnova, N. Sterrett, O. J. Mujica, C. Munayco, L. Suárez, C. Viboud, G. Chowell, “Spatial dynamics and the basic reproduction number of the 1991–1997 cholera epidemic in Peru”, PLoS Negl. Trop. Dis. 14 (2020), article no. e0008045.

[44] L. S. Katz, A. Petkau, J. Beaulaurier, S. Tyler, E. S. Antonova, M. A. Turnsek, Y. Guo, S. Wang, E. E. Paxinos, F. Orata, L. M. Gladney, S. Stroika, J. P. Folster, L. Rowe, M. M. Freeman, N. Knox, M. Frace, J. Boncy, M. Graham, B. K. Hammer, Y. Boucher, A. Bashir, W. P. Hanage, G. Van Domselaar, C. L. Tarr, “Evolutionary dynamics of Vibrio cholerae O1 following a single-source introduction to Haiti”, mBio 4 (2013), no. 4, article no. e00398-13.

[45] Pan American Health Organization, World Health Organization, “Epidemiological Update Cholera. 11 October 2018, Washington, D.C. PAHO/WHO”, 2018, http://www.paho.org/.

[46] C.-S. Chin, J. Sorenson, J. B. Harris, W. P. Robins, R. C. Charles, R. R. Jean-Charles, J. Bullard, D. R. Webster, A. Kasarskis, P. Peluso, E. E. Paxinos, Y. Yamaichi, S. B. Calderwood, J. J. Mekalanos, E. E. Schadt, M. K. Waldor, “The origin of the Haitian cholera outbreak strain”, New Engl. J. Med. 364 (2011), p. 33-42.

[47] G. Bwire, D. A. Sack, M. Almeida, S. Li, J. B. Voeglein, A. K. Debes, A. Kagirita, A. W. Buyinza, C. G. Orach, O. C. Stine, “Molecular characterization of Vibrio cholerae responsible for cholera epidemics in Uganda by PCR, MLVA and WGS”, PLoS Negl. Trop. Dis. 12 (2018), article no. e0006492.

[48] A. Camacho, M. Bouhenia, R. Alyusfi, A. Alkohlani, M. A. M. Najı, X. de Radiguès, A. M. Abubakar, A. Almoalmi, C. Seguin, M. J. Sagrado, M. Poncin, M. McRae, M. Musoke, A. Rakesh, K. Porten, C. Haskew, K. E. Atkins, R. M. Eggo, A. S. Azman, M. Broekhuijsen, M. A. Saatcioglu, L. Pezzoli, M.-L. Quilici, A. R. Al-Mesbahy, N. Zagaria, F. J. Luquero, “Cholera epidemic in Yemen, 2016–18: an analysis of surveillance data”, Lancet Glob. Health 6 (2018), p. e680-e690.

[49] World Health Organization Eastern Mediterranean Regional Office (WHO EMRO), “Cholera situation in Yemen - WHO-EM/CSR/434/E”, 2021, www.emro.who.int.

[50] X. Didelot, B. Pang, Z. Zhou, A. McCann, P. Ni, D. Li, M. Achtman, B. Kan, “The role of China in the global spread of the current cholera pandemic”, PLoS Genet. 11 (2015), article no. e1005072.

[51] E. J. Kim, C. H. Lee, G. B. Nair, D. W. Kim, “Whole-genome sequence comparisons reveal the evolution of Vibrio cholerae O1”, Trends Microbiol. 23 (2015), p. 479-489.

[52] C. M. Boyd, A. Angermeyer, S. G. Hays, Z. K. Barth, K. M.
veals mechanism for short-term and long-term clonal transitions in pandemic Vibrio cholerae”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009), p. 15442-15447.

[29] L. Feng, P. R. Reeves, R. Lan, Y. Ren, C. Gao, Z. Zhou, Y. Ren, J. Cheng, W. Wang, J. Wang, W. Qian, D. Li, L. Wang, “A recalibrated molecular clock and independent origins for the cholera pandemic clones”, *PLoS One* 3 (2008), article no. e4053.

[30] A. Mutreja, D. W. Kim, N. R. Thomson, T. R. Connor, J. H. Lee, S. Kariuki, N. J. Croucher, S. Y. Choi, S. R. Harris, M. Lebens, S. K. Niyogi, E. J. Kim, T. Ramamurthy, J. Chun, J. L. N. Wood, J. D. Clemens, C. Czerkinsky, G. B. Nair, J. Holmgren, J. Parkhill, G. Dougan, “Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic”, Nature 477 (2011), p. 462-465.

[31] B. W. Davies, R. W. Bogard, T. S. Young, J. J. Mekalanos, “Coordinated regulation of accessory genetic elements produces cyclic di-nucleotides for V. cholerae virulence”, Cell 149 (2012), p. 358-370.

[32] S. G. Murphy, B. A. Johnson, C. M. Ledoux, T. Dörr, “Vibrio cholerae mysterious seventh Pandemic island (VSP-II) encodes novel Zur-regulated zinc starvation genes involved in chemotaxis and cell congregation”, PLoS Genet. 17 (2021), article no. e1009624.

[33] D. A. Sack, A. K. Debes, J. Ateudjieu, G. Bwire, M. Ali, M. C. Ngwa, J. Mwaba, R. Chilengi, C. C. Orach, W. Boru, A. A. Mohamed, M. Ram, C. M. George, O. C. Stine, “Contrasting epidemiology of cholera in Bangladesh and Africa”, J. Infect. Dis. 224 (2021), p. S701-S709.

[34] R. R. Colwell, “Global climate and infectious disease: the cholera paradigm”, Science 274 (1996), p. 2025-2031.

[35] E. K. Lipp, A. Huq, R. R. Colwell, “Effects of global climate on infectious disease: the cholera model”, Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002), p. 757-770.

[36] M. Oprea, E. Njamkepo, D. Cristea, A. Zhukova, C. G. Clark, A. N. Kravetz, E. Monakhova, A. S. Ciontea, R. Cojocaru, J. Rauzier, M. Damian, O. Gascuel, M.-L. Quilici, F.-X. Weill, “The seventh pandemic of cholera in Europe revisited by microbial genomics”, Nat. Commun. 11 (2020), article no. 5347.

[37] F.-X. Weill, D. Domman, E. Njamkepo, C. Tarr, J. Rauzier, N. Fawal, K. H. Keddy, H. Salje, S. Moore, A. K. Mukhopadhyay, R. Bercion, F. J. Luquero, A. Ngandjio, M. Dosso, E. Monakhova, B. Garin, C. Bouchier, C. Pazzani, A. Mutreja, R. Grunow, F. Sidikou, L. Bonte, S. Breurec, M. Damian, B.-M. Njanpop-Lafourcade, G. Sapriel, A.-L. Page, M. Hamze, M. Henkens, G. Chowdhury, M. Mengel, J.-L. Koeck, J.-M. Fournier, G. Dougan, P. A. D. Grimont, J. Parkhill, K. E. Holt, R. Piarroux, T. Ramamurthy, M.-L. Quilici, N. R. Thomson, “Genomic history of the seventh pandemic of cholera in Africa”, Science 358 (2017), p. 785-789.

[38] T. Mashe, D. Domman, A. Tarupiwa, P. Manangazira, I. Phiri, K. Masunda, P. Chonzi, E. Njamkepo, M. Ramudzulu, S. Mtapuri-Zinyowera, A. M. Smith, F.-X. Weill, “Highly resistant cholera outbreak strain in Zimbabwe”, New Engl. J. Med. 383 (2020), p. 687-689.

[39] F.-X. Weill, D. Domman, E. Njamkepo, A. A. Almesbahi, M. Naji, S. S. Nasher, A. Rakesh, A. M. Assiri, N. C. Sharma, S. Kariuki, M. R. Pourshafie, J. Rauzier, A. Abubakar, J. Y. Carter, J. F. Wamala, C. Seguin, C. Bouchier, T. Malliavin,

B. Bakhshi, H. H. N. Abulmaali, D. Kumar, S. M. Njoroge, M. R. Malik, J. Kiiru, F. J. Luquero, A. S. Azman, T. Ramamurthy, N. R. Thomson, M.-L. Quilici, “Genomic insights into the 2016–2017 cholera epidemic in Yemen”, Nature 565 (2019), p. 230-233.

[40] J. Kumate, J. Sepúlveda, G. Gutiérrez, “Cholera epidemiology in Latin America and perspectives for eradication”, Bull. Inst. Pasteur. 96 (1998), p. 217-226.

[41] World Health Organization, Wkly. Epidemiol. Rec. 77 (2002), no. 31, p. 257-268.

[42] J. Martinez-Urtaza, J. Trinanes, N. Gonzalez-Escalona, C. Baker-Austin, “Is El Niño a long-distance corridor for waterborne disease?”, Nat. Microbiol. 1 (2016), article no. 16018.

[43] A. Smirnova, N. Sterrett, O. J. Mujica, C. Munayco, L. Suárez, C. Viboud, G. Chowell, “Spatial dynamics and the basic reproduction number of the 1991–1997 cholera epidemic in Peru”, PLoS Negl. Trop. Dis. 14 (2020), article no. e0008045.

[44] L. S. Katz, A. Petkau, J. Beaulaurier, S. Tyler, E. S. Antonova, M. A. Turnsek, Y. Guo, S. Wang, E. E. Paxinos, F. Orata, L. M. Gladney, S. Stroika, J. P. Folster, L. Rowe, M. M. Freeman, N. Knox, M. Frace, J. Boncy, M. Graham, B. K. Hammer, Y. Boucher, A. Bashir, W. P. Hanage, G. Van Domselaar, C. L. Tarr, “Evolutionary dynamics of Vibrio cholerae O1 following a single-source introduction to Haiti”, mBio 4 (2013), no. 4, article no. e00398-13.

[45] Pan American Health Organization, World Health Organization, “Epidemiological Update Cholera. 11 October 2018, Washington, D.C. PAHO/WHO”, 2018, http://www.paho.org/.

[46] C.-S. Chin, J. Sorenson, J. B. Harris, W. P. Robins, R. C. Charles, R. R. Jean-Charles, J. Bullard, D. R. Webster, A. Kasarskis, P. Peluso, E. E. Paxinos, Y. Yamaichi, S. B. Calderwood, J. J. Mekalanos, E. E. Schadt, M. K. Waldor, “The origin of the Haitian cholera outbreak strain”, New Engl. J. Med. 364 (2011), p. 33-42.

[47] G. Bwire, D. A. Sack, M. Almeida, S. Li, J. B. Voeglein, A. K. Debes, A. Kagirita, A. W. Buyinza, C. G. Orach, O. C. Stine, “Molecular characterization of Vibrio cholerae responsible for cholera epidemics in Uganda by PCR, MLVA and WGS”, PLoS Negl. Trop. Dis. 12 (2018), article no. e0006492.

[48] A. Camacho, M. Bouhenia, R. Alyusfi, A. Alkohlani, M. A. M. Naji, X. de Radiguès, A. M. Abubakar, A. Almoalmi, C. Seguin, M. J. Sagrado, M. Poncin, M. McRae, M. Musoke, A. Rakesh, K. Porten, C. Haskew, K. E. Atkins, R. M. Eggo, A. S. Azman, M. Broekhuijsen, M. A. Saatcioglu, L. Pezzoli, M.-L. Quilici, A. R. Al-Mesbahy, N. Zagaria, F. J. Luquero, “Cholera epidemic in Yemen, 2016–18: an analysis of surveillance data”, Lancet Glob. Health 6 (2018), p. e680-e690.

[49] World Health Organization Eastern Mediterranean Regional Office (WHO EMRO), “Cholera situation in Yemen - WHO-EM/CSR/434/E”, 2021, www.emro.who.int.

[50] X. Didelot, B. Pang, Z. Zhou, A. McCann, P. Ni, D. Li, M. Achtman, B. Kan, “The role of China in the global spread of the current cholera pandemic”, PLoS Genet. 11 (2015), article no. e1005072.

[51] E. J. Kim, C. H. Lee, G. B. Nair, D. W. Kim, “Whole-genome sequence comparisons reveal the evolution of Vibrio cholerae O1”, Trends Microbiol. 23 (2015), p. 479-489.

[52] C. M. Boyd, A. Angermeyer, S. G. Hays, Z. K. Barth, K. M.
Patel, K. D. Seed, "Bacteriophage ICP1: a persistent predator of Vibrio cholerae", *Annu. Rev. Virol.* **8** (2021), p. 285-304.

[53] B. J. O'Hara, Z. K. Barth, A. C. McKitterick, K. D. Seed, "A highly specific phage defense system is a conserved feature of the Vibrio cholerae mobilome", *PLoS Genet.* **13** (2017), article no. e1006838.

[54] A. Angermeyer, S. G. Hays, M. H. T. Nguyen, F.-T. Johura, M. Sultana, M. Alam, K. D. Seed, "Evolutionary sweeps of subviral parasites and their phage host bring unique parasite variants and disappearance of a phage CRISPR-Cas system", *mBio* (2022), article no. e0308821.

[55] P. Samanta, P. Ghosh, G. Chowdhury, T. Ramamurthy, A. K. Mukhopadhyay, "Sensitivity to Polymyxin B in El Tor Vib-

*rio cholerae* O1 strain, Kolkata, India", *Emerg. Infect. Dis.* **21** (2015), p. 2100-2102.

[56] K. N. LeGault, S. G. Hays, A. Angermeyer, A. C. McKitterick, F. Johura, M. Sultana, T. Ahmed, M. Alam, K. D. Seed, "Temporal shifts in antibiotic resistance elements govern phage-pathogen conflicts", *Science* **373** (2021), article no. eabg2166.

[57] K. S. Baker, "Microbe hunting in the modern era: reflecting on a decade of microbial genomic epidemiology", *Curr. Biol.* **30** (2020), p. R1124-R1124.

[58] Global Task Force on Cholera Control, "Ending cholera, a global roadmap to 2030", 2017, https://www.gtfcc.org/wp-content/uploads/2019/10/gtfcc-ending-cholera-a-global-roadmap-to-2030.pdf.

[59] K. Kupferschmidt, "Genomes rewrite cholera's global story", *Science* **358** (2017), p. 706-707.
Patel, K. D. Seed, "Bacteriophage ICP1: a persistent predator of *Vibrio cholerae*", *Annu. Rev. Virol.* **8** (2021), p. 285-304.

[53] B. J. O'Hara, Z. K. Barth, A. C. McKitterick, K. D. Seed, "A highly specific phage defense system is a conserved feature of the *Vibrio cholerae* mobilome", *PLoS Genet.* **13** (2017), article no. e1006838.

[54] A. Angermeyer, S. G. Hays, M. H. T. Nguyen, F.-T. Johura, M. Sultana, M. Alam, K. D. Seed, "Evolutionary sweeps of subviral parasites and their phage host bring unique parasite variants and disappearance of a phage CRISPR-Cas system", *mBio* (2022), article no. e0308821.

[55] P. Samanta, P. Ghosh, G. Chowdhury, T. Ramamurthy, A. K. Mukhopadhyay, "Sensitivity to Polymyxin B in El Tor Vib-

*rio cholerae* O1 strain, Kolkata, India", *Emerg. Infect. Dis.* **21** (2015), p. 2100-2102.

[56] K. N. LeGault, S. G. Hays, A. Angermeyer, A. C. McKitterick, F. Johura, M. Sultana, T. Ahmed, M. Alam, K. D. Seed, "Temporal shifts in antibiotic resistance elements govern phage-pathogen conflicts", *Science* **373** (2021), article no. eabg2166.

[57] K. S. Baker, "Microbe hunting in the modern era: reflecting on a decade of microbial genomic epidemiology", *Curr. Biol.* **30** (2020), p. R1124-R1124.

[58] Global Task Force on Cholera Control, "Ending cholera, a global roadmap to 2030", 2017, https://www.gtfcc.org/wp-content/uploads/2019/10/gtfcc-ending-cholera-a-global-roadmap-to-2030.pdf.

[59] K. Kupferschmidt, "Genomes rewrite cholera's global story", *Science* **358** (2017), p. 706-707.