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Thèse

Présentée et soutenue publiquement pour l'obtention du titre de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITE DE LORRAINE

Mention : « Sciences de la Vie et de la Santé »

par Ramia SAFAR

Etude toxicologique de nanoparticules polymériques
véhicules de S-nitrosoglutathion

Le 4 décembre 2015

Membres du jury :

<table><tr><td rowspan="2">Rapporteurs :</td><td>Mme Armelle BAEZA</td><td>Professeur, Université Paris Diderot, Paris</td></tr><tr><td>Mme Françoise PONS</td><td>Professeur, Université de Strasbourg, Strasbourg</td></tr><tr><td rowspan="2">Examinateurs :</td><td>M. Bertrand RIHN</td><td>Professeur, Université de Lorraine, Nancy<br/>Directeur de thèse</td></tr><tr><td>M. Olivier JOUBERT</td><td>Maître de conférences, Université de Lorraine, Nancy<br/>Co-directeur de thèse</td></tr><tr><td rowspan="2">Invités :</td><td>M. Jean-Claude ANDRE</td><td>Directeur de Recherche Emérite, INSIS CNRS, Paris</td></tr><tr><td>M. Alain LE FAOU</td><td>Professeur Emérite, Université de Lorraine, Nancy</td></tr></table>
Je dédie ce manuscrit

Aux mânes de mon père

A ma mère

A mes sœurs et mon frère

A ma belle-famille, pour son soutien durant la réalisation de ce travail

A ma petite famille, mon mari et mes enfants pour leur soutien et leur patience
Je voudrais remercier sincèrement,

Mesdames les Professeures Françoise PONS et Armelle BAEZA pour avoir accepté de
siéger dans mon jury et participé aux comités de suivi de thèse, ainsi pour leurs conseils et
observations.

Monsieur le Professeur Bertrand RIHN, mon directeur de thèse, pour l'expérience enrichissante et pleine d'intérêt qu'il m'a faite vivre durant ces trois ans.

Monsieur le Docteur Olivier JOUBERT, Maître de Conférences, mon co-directeur de thèse, pour le suivi de mon travail, ses conseils, son enseignement.

Monsieur le Professeur Emérite Alain LE FAOU, pour son aide à rédiger cette thèse et son soutien dans les moments difficiles.

Monsieur le Directeur de Recherche Emérite Jean-Claude ANDRE pour avoir accepté de participer à mon jury.
Mes remerciements s'adressent aussi à mon pays et à la Faculté de Pharmacie (Université d'ALBAATH), qui m'ont donné l'opportunité et le soutien financier pour venir en France poursuivre mes études. En particulier, je tiens à remercier Madame la Professeure Laila MASSOUH pour son aide à trouver un laboratoire d'accueil pour ma thèse, et Monsieur le Professeur Houssam ALHUSAINI (Doyen de la Faculté de Pharmacie, Université d'ALBAATH), pour le suivi de mon travail et ses conseils.

Je remercie Messieurs les Professeurs Philippe MAINCENT et Pierre LEROY, directeurs de l'EA 3452 CITHEFOR pour m'avoir accueillie au sein de leur équipe.

J'exprime également ma gratitude à l'égard de l'ensemble de l'équipe CITHEFOR pour leur gentillesse, leur sympathie qui ont favorisé mon intégration dans l'équipe. Je tiens à remercier tout particulièrement et à témoigner toute ma reconnaissance aux personnes suivantes :

Monsieur le Pofesseur Luc FERRARI pour avoir participé au comité de suivi de thèse, ainsi que pour ses conseils.

Dr.Anne SAPIN pour sa gentillesse et sa disponibilité.

Dr.Housam EIDI pour son aide à mon arrivée en France et dans l'équipe.

Dr.Carole RONZANI pour son aide pendant les deux premières années de ma thèse.

Nathalie et Pascale, pour leur écoute, leur aide, leurs réponses à mes nombreuses questions.

Je voudrais aussi remercier toutes les personnes qui ont participé de près ou de loin à mes travaux : Isabelle, Bouchra, Latifa, Razan, Emilie, Wen, Chloé, Laetitia, ....

De plus j'adresse mes remerciements aux personnes qui ont collaboré à mon travail :

Monsieur le Professeur Bernard Foliguet, directeur du Service de microscopie électronique, Faculté de médecine de Nancy.

Dr Stéphanie GRANDEMANGE, UMR CNRS/UL 7039 CRAN, Nancy.

Dr Christophe NEMOS, INSERM U 954, Nancy.

Dr Virginie MARCHAND, Biopole, Faculté de médecine de Nancy.

Dr Roudayna DIAB, UMR CNRS/UL 7565 SRSMC, Nancy.

Dr Hélène DUBOIS-POT-SCHNEIDER, UMR CNRS/UL 7565 SRSMC, Nancy.
# Travaux scientifiques

## Publications

### *Acceptées*

**Human monocyte response to S-nitrosoglutathione-loaded nanoparticles: uptake, viability, and transcriptome.**

R.SAFAR¹, C.RONZANI¹, R.DIAB, J.CHEVRIER, D.BENSOUSSAN, S.GRANDEMANGE, A.LE FAOU, B.H.RIHN, O.JOUBERT.

*Molecular Pharmaceutics*, 2015 Jan 14. IF = 4.79 (¹ co-premiers auteurs)

**Comment on: S-nitrosoglutathione (GSNO) is cytotoxic to intracellular amastigotes and promotes healing of topically treated Leishmania major or Leishmania braziliensis skin lesions**

C.RONZANI, R.SAFAR, A.LE FAOU, B.H.RIHN, O.JOUBERT.

*Journal of antimicrobial chemotherapy*, 2014 Apr 28. IF = 5,33

**Viability and gene expression responses to polymeric nanoparticles in human and rat cells**

C.RONZANI¹, R.SAFAR¹, R.DIAB, J.CHEVRIER, J.PAOLI, M.A.ABDEL-WAHHAB, A.LE FAOU, B.RIHN, O.JOUBERT.

*Cell Biology and Toxicology*, 2014 Apr 21. IF = 2,33 (¹ co-premiers auteurs)

**Uptake of Eudragit® Retard L (Eudragit® RL) Nanoparticles by Human THP-1 Cell Line and Its Effects on Hematology and Erythrocyte Damage in Rats.**

M.A.ABDEL-WAHHAB, K.G.ABDEL-WAHHAB, F.MANNAA, N.HASSAN, R.SAFAR, R.DIAB, B.FOLIGUET, L.FERRARI, B.H.RIHN.

*Materials*, 2014 Fév 18. IF = 2,24 (Annexe 8)

**Role of the PLGA polymeric matrix composition on the cellular uptake and neuroprotective property of curcumin-loaded nanoparticle**

G.D.PAKA, S.DOGGUI, A.ZAGMI, R.SAFAR, L.DAO, A.KLYMCHENKO, G.ROULLIN, O.JOUBERT, C.RAMASSAMY.

*Molecular Pharmaceutics*, IF = 4,79 (Annexe 9)

### *Soumises*

**Blood Compatibility of Multilayered Polyelectrolyte Films Containing Immobilized and Stabilized Gold Nanoparticles**

A.PALLOTTA, M.PARENT, M.LUO, I.CLAROT, R.SAFAR, O.JOUBERT, P.LEROY, A.BOUDIER.

*Advanced Healthcare Materials*, IF = 5,79
## *En préparation*

### Dose- and time- dependent responses of THP-1 cells exposed to free or encapsulated S-nitrosoglutathione. A transcriptomic comparison

R.SAFAR, A.LE FAOU, C.NEMOS, H.DUBOIS-POT-SCHNEIDER, B.H.RIHN, O.JOUBERT.

### Eudragit® polymeric nanoparticles evaluation for the oral delivery of S-nitrosoglutathione

C.PUISNEY<fnref n="1" />, R.SAFAR<fnref n="1" />, W.WU, A.SAPIN, S.GRANDEMANGE, C.NEMOS, A.LE FAOU, BH. RIHN, O.JOUBERT, L.FERRARI

## Transcriptomes

### Transcriptome study of THP-1 human monocytes following exposure for 4 h or 24 h to 50 µM S-Nitrosoglutathione, 50 and 200 µg/ml S-Nitrosoglutathione-loaded polymeric and empty Eudragit® RL nanoparticles.

C.RONZANI, R.SAFAR, B.RIHN, O.JOUBERT. GEO NCBI, 2013, accession number GSE51186

### THP-1 human monocytes transcriptome following exposure to S-nitrosoglutathione (GSNO)

R.SAFAR, C.PUISNEY, B.H.RIHN, O.JOUBERT. GEO NCBI, 2015, accession number GSE69024

### Transcriptome study of Caco-2 human intestinal cells following exposure to empty or S-nitrosoglutathione-loaded polymeric nanoparticles

C.PUISNEY, R.SAFAR, O.JOUBERT, L.FERRARI. GEO NCBI, 2015, accession number GSE69551

## Communications orales* et affichées

* *Interaction cellules/nanoparticules polymériques : apport de la toxicogénomique*

R.SAFAR, C.RONZANI, A.LE FAOU, B.RIHN, L.FERRARI, O.JOUBERT
31<sup>èmes</sup> Journées Pédagogiques Et Scientifiques de l'AE2BM, 17-18 septemnbre 2015, Nancy

* *Cell / Polymeric Nanoparticle Interactions: Toxicogenomic Input.*

R.SAFAR, C.RONZANI, R.DIAB, A.LE FAOU, L.FERRARI, BH.RIHN, O.JOUBERT
Congrès INRS “Risque chimique”, 8-10 avril 2015, Nancy.

### Cells / nanoparticles interactions: Toxicogenomics approach

C.PUISNEY, R.SAFAR, BH.RIHN, C.NEMOS, O.JOUBERT, L.FERRARI
Congrès INRS “Risque chimique”, 8-10 avril 2015, Nancy.

### In vitro study of cationized poly(caprolactone)-poly(ethylene glycol) nanoparticles

C.CHAROONGCHIT, J.SUKSIRIWORAPONG, A.SAPIN, R.SAFAR, O.JOUBERT, B.RIHN, P.MAINCENT.

<footnote n="1">¹ co-premiers auteurs</footnote>
**Action of polymeric nanoparticles on cell viability, gene expression and internalization as a function of cell line**

R.SAFAR, C.RONZANI, R.DIAB, A.LE FAOU, BH.RIHN, O.JOUBERT

The 50th Congress of the European Societies of Toxicology, Eurotox 2014, 7-10 sep 2014, Edimburg, Ecosse. (Bourses de congrès Eurotox et de la Société Française de Toxicologie)

*Interaction cellules / Nanoparticules polymériques: apport de la toxicogénomique.*

C.RONZANI, R.SAFAR, R.DIAB, J.CHEVRIER, S.GRANDEMANGE, D.BENSOUSSAN, A.LE FAOU, BH.RIHN, O.JOUBERT

Communication orale et affichée au congrès conjoint ARET/SFTG, 3 et 4 juin 2014, Paris.

*Etude toxicologique de nanoparticules, véhicules de principe actif*

R.SAFAR, C.RONZANI, R.DIAB, S.GRANDEMANGE, B.FOLIGUET, A.LE FAOU, BH.RIHN, O.JOUBERT

Journée scientifique de l'école doctorale BIOse, 6 novembre 2013, Nancy.

*What about polymeric nanoparticles and mitochondria?*

BH.RIHN, R.SAFAR, C.RONZANI, R.HUSSIEN, G.A.BROOKS, A.LE FAOU, O.JOUBERT

5th International Symposium “Nutrition, Oxygen Biology and Medicine”, 5-7 juin 2013, Paris.

**Action of polymeric nanoparticles on cell viability, gene expression and internalization as a function of cell line**

R.SAFAR, C.RONZANI, S.GRANDEMANGE, B.FOLIGUET, BH.RIHN, O.JOUBERT

5th International Symposium “Nutrition, Oxygen Biology and Medicine”, 5-7 juin 2013, Paris.

**Drug delivery nanoparticles are autophagic inducers in macrophages**

H.EIDI, O.JOUBERT, R.SAFAR, P.MAINCENT, B.H.RIHN

4th International Symposium, “Nutrition, Oxygen Biology and Medicine”, 15-17 juin 2011, Paris.
# Table des matières

<table><tr><td>Travaux scientifiques</td><td>9</td></tr><tr><td>Table des matières</td><td>13</td></tr><tr><td>Liste des figures</td><td>17</td></tr><tr><td>Liste des tableaux</td><td>19</td></tr><tr><td>Liste des abréviations</td><td>21</td></tr><tr><td>Introduction générale</td><td>23</td></tr><tr><td>Généralités</td><td>27</td></tr><tr><td>1. Définition des nanoparticules</td><td>29</td></tr><tr><td>1.1. Limites de la définition</td><td>29</td></tr><tr><td>2. Caractérisation des propriétés physicochimiques des nanoparticules</td><td>30</td></tr><tr><td>2.1. Taille et Forme</td><td>30</td></tr><tr><td>2.2. Charge de surface</td><td>30</td></tr><tr><td>2.3. Dispersion / agglomération</td><td>31</td></tr><tr><td>3. Nanoparticules et médicaments</td><td>31</td></tr><tr><td>3.1. Historique</td><td>31</td></tr><tr><td>3.2. Utilisation des nanoparticules</td><td>33</td></tr><tr><td>3.3. Marché des nanomédicaments</td><td>34</td></tr><tr><td>4. Nanotoxicologie</td><td>35</td></tr><tr><td>4.1. Introduction</td><td>35</td></tr><tr><td>4.2. Pharmacocinétiques des nanoparticules</td><td>37</td></tr><tr><td>4.3. Relations nanoparticules / cellules</td><td>38</td></tr><tr><td>4.4. Mécanismes de la toxicité des nanoparticules</td><td>41</td></tr><tr><td>4.4.1. Mécanismes physiques</td><td>41</td></tr><tr><td>4.4.2. Mécanismes chimiques</td><td>41</td></tr><tr><td>4.5. Facteurs influençant la cytotoxicité des nanoparticules</td><td>42</td></tr><tr><td>4.5.1. Taille</td><td>42</td></tr><tr><td>4.5.2. Forme</td><td>43</td></tr><tr><td>4.5.3. Charge et état de surface</td><td>43</td></tr><tr><td>4.5.4. Biodégradabilité</td><td>43</td></tr><tr><td>4.5.5. Agglomération</td><td>44</td></tr><tr><td>4.5.6. Pureté</td><td>44</td></tr><tr><td>4.5.7. Couronne protéique</td><td>45</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>4.5.8. Concentration</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.6. Méthodes d'études de toxicité des nanomatériaux</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.6.1. In vitro</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.6.2. In vivo</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.6.3. Quels modèles utiliser ? In vivo ou In vitro</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.7. Techniques d'études de toxicité des nanoparticules in vitro</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.7.1. Viabilité et cytotoxicité</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.7.2. Cytopathologie et l'internalisation</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.7.3. Etude des mécanismes moléculaires de la cytotoxicité</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.7.4. Conclusion</td>
      <td>53</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5. Eudragit® et Nanoparticules polymériques</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1. Nanoparticules polymériques</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1.1. Nature chimique des polymères</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2. Eudragit®</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.1. Structure chimique</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.2. Applications</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.1. Toxicité</td>
      <td>61</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.2. Eudragit® et la nanotechnologie - Intérêt et toxicité</td>
      <td>61</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>Objectif de travail</strong></td>
      <td><strong>65</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><strong>Partie expérimentale</strong></td>
      <td><strong>67</strong></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1. Article 1. Viability and gene expression responses to polymeric nanoparticles in human and rat cells</td>
      <td>69</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1. Résultats et conclusion</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2. Article 2. Human monocyte response to S-nitrosoglutathione-loaded nanoparticles: uptake, viability and transcriptome</td>
      <td>73</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1. Oxyde nitrique</td>
      <td>73</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.1. Donneurs d'oxyde nitrique utilisés en thérapeutique</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.2. Donneurs d'oxyde nitrique en cours de développement</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2. Introduction de l'article 2</td>
      <td>75</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4. Résultats et conclusion</td>
      <td>77</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3. Article 3. Comment on: S-nitrosoglutathione (GSNO) is cytotoxic to intracellular amastigotes and promotes healing of topically treated Leishmania major or Leishmania braziliensis skin lesions</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1. Résultats complémentaires</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1. Mise à jour des résultats</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.2. RT-PCR</td>
      <td>82</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>4. Article 4 (en préparation). Dose- and time- dependent responses of THP-1 cells exposed to free or encapsulated S-nitrosoglutathione. A transcriptomic comparison.</td><td>85</td></tr><tr><td>4.1. Introduction</td><td>85</td></tr><tr><td>4.2. Objectif:</td><td>87</td></tr><tr><td>4.3. Résultats et discussion:</td><td>88</td></tr><tr><td>4.3.1. Sélection des gènes différentiellement exprimés</td><td>88</td></tr><tr><td>4.3.2. Gènes et « pathways » communs</td><td>89</td></tr><tr><td>Discussion générale</td><td>97</td></tr><tr><td>Conclusions générales et perspectives</td><td>103</td></tr><tr><td>Annexes</td><td>107</td></tr><tr><td>Annexe 1</td><td>109</td></tr><tr><td>Annexe 2</td><td>111</td></tr><tr><td>Annexe 3</td><td>112</td></tr><tr><td>Annexe 4</td><td>114</td></tr><tr><td>Annexe 5</td><td>117</td></tr><tr><td>Annexe 6</td><td>119</td></tr><tr><td>Annexe 7</td><td>120</td></tr><tr><td>Annexe 8</td><td>121</td></tr><tr><td>Annexe 9</td><td>123</td></tr><tr><td>Références</td><td>125</td></tr></table>
Liste des figures

<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Figure 1. Répartition des utilisations des nanotechnologies dans le domaine médical</td>
      <td>32</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 2. Trois générations de nanovecteurs (Exemple des liposomes)</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 3. Principaux mode d'internalisation des NP</td>
      <td>40</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 4. Conséquences du stress oxydant induit par les nanoparticules</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 5. Constitution de la couronne protéique</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 6. Différents niveaux d'étude de la fonction cellulaire</td>
      <td>52</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 7. Arbre décisionnel pour l'évaluation toxicologique d'une nouvelle nanoparticule avant toute application biomédicale</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 8. Différents types de nanoparticules polymériques</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 9. Structure chimique de l'Eudragit® RL</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 10. Localisations intracytoplasmiques des nanoparticules d'Eudragit® RL PO</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 11. Structure chimique de S-nitrosoglutathion GSNO</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 12. Réseau de protéines correspondantes aux gènes de THP-1 dont l'expression est significativement modifiée (STRING database) après exposition de GSNO à 50µM, 4 h</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 13. Quantification de l'expression des gènes CCL4 et VEGFA par RT-PCR</td>
      <td>83</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 14. Comparaison de l'effet du temps d'exposition (4 et 24 h) à des NP vides ou chargées en GSNO sur le nombre des gènes significativement régulés par diagramme de Venn</td>
      <td>89</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 15. Comparaison de l'effet de deux doses des NP vides ou chargées en GSNO sur le nombre des gènes significativement régulés après 4 h d'exposition, par diagramme de Venn</td>
      <td>91</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 16. Comparaison de l'effet (en nombre de gènes à expression modifiée) de deux concentrations de NP chargées ou non en GSNO et de la concentration du GSNO libre corrrespondante sur les cellules THP-1 par diagrammes de Venn</td>
      <td>92</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 17. Mécanisme d'inhibition de la "cAMP-mediated signaling Pathway"</td>
      <td>95</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Figure 18. Réseau de protéines correspondantes aux gènes de THP-1 dont l'expression est significativement modifiée (STRING database) après exposition à 1,4 µM de GSNO, 4 h</td>
      <td>120</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
## Liste des tableaux

<table><tr><td>Tableau 1. Différentes formulations des Eudragit®</td><td>60</td></tr><tr><td>Tableau 2. Etudes portant sur la toxicité des nanoparticules d'Eudragit®</td><td>63</td></tr><tr><td>Tableau 3. Exemples d'indications médicales des formulations de GSNO utilisant des NP</td><td>75</td></tr><tr><td>Tableau 4. Gènes significativement impliqués dans la « pathway » “cytokine-cytokine interaction”, 50 µM GSNO, 4 h</td><td>81</td></tr><tr><td>Tableau 5. Nombre de gènes dont l'expression est modifiées pour deux valeurs de P pour chacune des conditions testées</td><td>88</td></tr><tr><td>Tableau 6. « Pathways » communes et principaux gènes mis en jeux pour les 3 conditions d'expositions (200 µg/mL de NP- ou NP+ ou GSNO 6 µM) 4 h</td><td>94</td></tr><tr><td>Tableau 7. « Pathways » communes et principaux gènes mis en jeux pour les conditions d'expositions (200 µg/mL de NP+ ou GSNO 6 µM) 4 h</td><td>96</td></tr><tr><td>Tableau 8. « Pathways » communes et principaux gènes mis en jeux pour les conditions d'expositions (200 µg/mL de NP+ ou NP-) 4 h</td><td>96</td></tr></table>
# Liste des abréviations

<table><tr><td>•NO</td><td>Oxyde nitrique</td></tr><tr><td>ADN</td><td>Acide désoxyribonucléique</td></tr><tr><td>AESA</td><td>Autorité Européenne de Sécurité des Aliments</td></tr><tr><td>ARNc</td><td>Acides ribonucléiques complémentaires</td></tr><tr><td>ARNm</td><td>Acides ribonucléiques messagers</td></tr><tr><td>BT</td><td>Bleu Trypan</td></tr><tr><td>CE</td><td>Commission Européenne</td></tr><tr><td>CMF</td><td>Cytométrie en Flux</td></tr><tr><td>CSRSE</td><td>Comité Scientifique des Risques Sanitaires et Environnementaux</td></tr><tr><td>CSRSEN</td><td>Comité Scientifique des Risques Sanitaires Emergents et Nouveaux</td></tr><tr><td>CSSC</td><td>Comité Scientifique pour la Sécurité des Consommateurs</td></tr><tr><td>DEFRA</td><td>Department for Environment, Food & Rural Affairs</td></tr><tr><td>DLS</td><td>Dynamic Light Scattering</td></tr><tr><td>EMA</td><td>Agence Européenne des Médicaments (European Medicines Agency)</td></tr><tr><td>ERO</td><td>Espèces Réactives de l'Oxygène</td></tr><tr><td>FC</td><td>Fold Change</td></tr><tr><td>GSNO</td><td>S-nitrosoglutathion</td></tr><tr><td>HSANO</td><td>S-nitrosoalbumine</td></tr><tr><td>ICCA</td><td>International Council of Chemical Associations</td></tr><tr><td>IRM</td><td>Imagerie par Résonance Magnétique</td></tr><tr><td>LCST</td><td>Lower Critical Solution Temperature</td></tr><tr><td>LDH</td><td>Lactate Déshydrogénase</td></tr><tr><td>MET</td><td>Microscopie Electronique à Transmission</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium</td></tr><tr><td>MβCD</td><td>Méthyl-β-cyclodextrine</td></tr></table>
<table><tr><td>NACNO</td><td>S-nitroso-N-acétylcystéine</td></tr><tr><td>NONOates</td><td>Diazéniumdiolates</td></tr><tr><td>NP</td><td>Nanoparticule(s)</td></tr><tr><td>NP-</td><td>Nanoparticule(s) vides</td></tr><tr><td>NP+</td><td>Nanoparticule(s) chargées en GSNO</td></tr><tr><td>PA</td><td>Principe Actif</td></tr><tr><td>Pathway</td><td>Voies de signalisation et voies métaboliques</td></tr><tr><td>PCL</td><td>PolyCaproLactone</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Polyéthylène glycol</td></tr><tr><td>PLA</td><td>Polylactate</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Poly-(lactate-co-glycolate)</td></tr><tr><td>POE</td><td>Polyoxyéthylène</td></tr><tr><td>QD</td><td>Quantum Dots</td></tr><tr><td>qRT-PCR</td><td>Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction</td></tr><tr><td>RSNOs</td><td>S-Nitrosothiols</td></tr><tr><td>SNAP</td><td>S-nitroso-N-acétylpénicillamine</td></tr><tr><td>XTT</td><td>(2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide)</td></tr></table>
# Introduction générale
Les nanotechnologies, dont les applications sont multiples, sont des domaines en développement. Elles assurent la conception, la caractérisation, la production et l'application de structures, dispositifs et systèmes dont la taille est à l'échelle nanométrique [1]. De multiples domaines sont concernés par ces avancées et, continuellement, de nouveaux dispositifs et de nouvelles applications voient le jour. En se limitant à la biologie, les nanostructures sont déjà présentes dans les produits cosmétiques, alimentaires et dispositifs médicaux comme les nanoparticules (NP) d'oxyde de titane, ainsi que dans les médicaments comme les liposomes [2].

Dans la nature, des structures nanométriques existent, telles celles recouvrant les feuilles de lotus qui rendent leur surface non mouillable. L'Homme les utilise depuis fort longtemps, mais de manière empirique, comme par exemple, les colorants pour les vitraux (NP d'argent apportant une coloration jaune) [3]. Les progrès technologiques ont permis de maitriser la production de nanostructures. Aussi, leur utilisation dans le domaine médical s'est-elle rapidement développée. Ces utilisations multiples amènent celles-ci au contact avec le Vivant. Cependant ce n'est que tout récemment que les études se sont intéressées à la toxicologie de ces nouveaux produits. Alors qu'en toxicologie classique, l'effet toxique d'un produit est directement lié à la dose administrée, cette notion n'est pas directement adaptable aux nanostructures. En effet, celles-ci, du fait de leur petite taille, acquièrent des propriétés nouvelles liées à l'augmentation de surface. De plus, leur rapprochement de la taille des atomes, les fait entrer dans le domaine de la physique quantique. Elles acquièrent alors des propriétés optiques, électriques, et/ou magnétiques nouvelles [1]. Par exemple : l'or, inerte chimiquement à l'échelle macroscopique, devient un catalyseur très actif pour les réactions d'oxydation du monoxyde de carbone et la synthèse du méthanol sous la forme des particules de quelques nanomètres [4]. De même, la température de fusion des NP d'or est de plus de 300 °C inférieure à celle de l'or massif [5].

Dans le domaine médical, les nanostructures sont déjà utilisées en implantologie pour améliorer les propriétés mécaniques des prothèses ou leur tolérance dans l'organisme. Le dépôt, à leur surface, de NP de silice ou de zircon améliore la reconstruction osseuse [6]. Dans le domaine du médicament les nanostructures, comme les liposomes contenant de l'Amphotéricine B (AmBisome®), permettent de diminuer la toxicité du principe actif (PA). La vaccination contre les Papillomavirus humains utilise des pseudovirus qui fournissent une meilleure antigénicité que les protéines virales isolées. Actuellement, de multiples travaux portent sur les applications
potentielles des nanostructures, non seulement en tant que porteurs de principe actif pour en
'améliorer les propriétés pharmacologiques mais aussi en en modifiant la surface, obtenir un
ciblage afin de traiter spécifiquement une lésion cancéreuse par exemple. De même en imagerie,
des progrès sont attendus pour le diagnostic et éventuellement le traitement. Au laboratoire, les
nanostructures sont employées pour permettre une miniaturisation et en même temps améliorer le
diagnostic tant en rapidité qu'en sensibilité comme, par exemple, la technique des « puces à
ADN ».

Ces nouveaux nanomatériaux peuvent présenter de nouveaux effets toxiques et poser un
danger pour la santé et l'environnement. Le manque actuel de connaissance à ce niveau conduit
donc au besoin urgent de développer des tests pour s'assurer de leur innocuité. Le rapport
bénéfice / risque de l'utilisation des nanoparticules doit donc être évalué pour toutes les
applications technologiques ou médicales*. Plus largement, les nanotechnologies se situent dans
la continuité de l'histoire du progrès industriel, mais il représente aussi un tournant : en raison
des perspectives ouvertes, de la convergence marquée entre associations et syndicats autour de la
notion de précaution, des problèmes nouveaux posés en termes de contrôle des risques. La
thématique des risques technologiques doit être traitée, entre autres, comme un problème
de communication. Il s'agit d'un révélateur de questions durables d'entente sociétale à propos de
la raison d'être ou des modalités d'existence d'activités industrielles, telles que la chimie, le
nucléaire et, désormais, les nanotechnologies**.

Ce travail de thèse s'insère dans une des thématiques de l'unité de recherche EA 3452 CITHEFOR (Cible Thérapeutique, FORmulation et expertise préclinique du médicament). Au sein de cette unité, une activité de nanotoxicologie a porté sur l'exposition de la lignée macrophagique de rat NR8383 à des NP d'Eudragit®, déjà utilisées dans l'EA. Nous avons pousuivi ce travail en comparant l'effet de NP d'Eudragit® sur cette lignée et sur une lignée monocytaire/macrophagique humaine THP-1. Par la suite, cette dernière a été seule retenue pour des études de toxicogénomique après exposition à des NP vides ou chargées en S-nitrosoglutathion. Ce composé est l'objet de plusieurs formulations à visée cardiovasculaires.

<footnote>* Claude J-R, Party MoAW. Recommandations for Toxicological Evaluation of Nanoparticle Medicinal Products. In: AFSSAPAS, editor. International Pharmaceutical Product Registration. Second ed, 2009.</footnote>

<footnote>** Chaskiel Patrick, 2014, « Des nanotechnologies au processus de précaution : vers une reformulation de la thématique des risques technologiques ? », Congrès Riodd, Bordeaux, 2-4 octobre.</footnote>
Généralités
# 1. Définition des nanoparticules

Etant donné le développement rapide des nanotechnologies une définition internationalement reconnue des «nanomatériaux» a été rendue nécessaire. Trois comités scientifiques indépendants apportent leur expertise à la Commission Européenne (CE) : le Comité Scientifique pour la Sécurité des Consommateurs (CSSC), le Comité Scientifique des Risques Sanitaires et Environnementaux (CSRSE) et le Comité Scientifique des Risques Sanitaires Emergents et Nouveaux (CSRSEN). De ces trois, le CSRSEN a réuni un panel scientifique pour établir une définition de nanomatériaux et identifier les critères à retenir pour en évaluer la sécurité [7], [2].

A la suite de ces travaux, la CE a proposé en octobre 2011 la définition suivante pour les nanomatériaux : " On entend par «nanomatériau» un matériau naturel, formé accidentellement ou manufacturé contenant des particules libres, sous forme d'agrégat ou sous forme d'agglomérat, dont au moins 50 % des particules, dans la répartition numérique par taille, présentent une ou plusieurs dimensions externes se situant entre 1 nm et 100 nm. Dans des cas spécifiques, lorsque cela se justifie pour des raisons tenant à la protection de l'environnement, à la santé publique, à la sécurité ou à la compétitivité, le seuil de 50 % fixé pour la répartition numérique par taille peut être remplacé par un seuil compris entre 1 % et 50 %." [8].

Alternativement, les matériaux doivent être considérés comme relevant de la définition si leur surface spécifique est supérieure à 60 m² / cm³. La CE a prévu une révision de la définition en se concentrant particulièrement sur la pertinence de la limite de 50% [8], [9].

## 1.1. Limites de la définition

Auffan et al. (2009) [10] ont proposé de diminuer la limite supérieure de la définition de nanoparticule (100 nm) parce que ils ont identifié des propriétés uniques dans un groupe de nanoparticules inorganiques (métalliques et d'oxydes métalliques) d'un diamètre inférieur à 30 nm. Cela était dû à des changements dans la structure cristalline ou l'augmentation du rapport surface-volume qui ont amélioré leur réactivité. Par contre, pour d'autres composés l'augmentation de taille des NP ne modifie pas leurs propriétés physico-chimiques. Pour cela, des limites supérieures de la taille des NP plus élevées ont-elles été proposées (200 nm par DEFRA (Department for Environment, Food & Rural Affairs) et 1000 nm par l'EMA (Agence Européenne des Médicaments) [11], [12].
En résumé et selon l'International Council of Chemical Associations (ICCA), aucune des
définitions des nanomatériaux actuellement disponibles n'est universellement acceptée [13] et en
fin de compte seul l'usage et/ou des considérations individuelles définissent les NP. Aussi, des
structures très variées en forme et en taille sont-elles assimilées à des NP sans tenir compte de la
limite de 100 nm officiellement établie et des objets de 200-300 nm sont couramment considérés
comme des NP.

2. Caractérisation des propriétés physicochimiques des nanoparticules

2.1. Taille et Forme

La taille et sa distribution sont des paramètres critiques qui doivent être défini pour pouvoir classer la particule étudiée comme un nanomatériau. Les autorités de régulation et les comités scientifiques des AESA (Autorité Européenne de Sécurité des Aliments) et CSSC (Comité Scientifique pour la Sécurité des Consommateurs) s'accordent sur le fait que différentes méthodes basées sur des principes différents doivent être combinés pour mesurer la taille des NP [14], [15]. Ils suggèrent une utilisation préférentielle des microscopies électroniques à balayage ou à transmission et de la microscopie à force atomique qui permettent également d'en déterminer la forme. Cependant, l'observation directe doit être combinée à d'autres techniques comme le DLS (dynamic light scattering) qui est une technique d'analyse spectroscopique permettant de mesurer le rayon hydrodynamique de NP en milieu liquide. Pour déterminer avec précision la taille d'un échantillon de NP et sa distribution (moyenne, écart-type), il faut, idéalement, un échantillon bien dispersé, et mesurer un nombre suffisant de particules. Dans le cas d'un système monodispersé, ce résultat est relativement facilement obtenu. Cependant, lorsque la polydispersité augmente, il devient nécessaire de mesurer un plus grand nombre de particules [16].

2.2. Charge de surface

La charge de surface influence la stabilité et la dispersion des NP dans la solution
aqueuse et également la réponse du système biologique (interaction avec la membrane cellulaire)
[17], avec le mucus, [18] et les protéines plasmatiques [19]. La charge de surface est déterminée
par la mesure du potentiel zêta par électrophorèse laser Doppler. Ce potentiel zêta est très
dépendant des conditions environnementales, en particulier la force ionique et le pH du milieu
[20]. Par conséquent, une procédure normalisée est nécessaire.
## 2.3. Dispersion / agglomération

L'état de dispersion d'un système de particules décrit dans quelle mesure les particules sont agglomérées. En 2009 [21], l'AESA a défini un agglomérat et un agrégat comme : «Un agglomérat est un groupe de NP maintenus ensemble par des forces faibles, tels que les forces de van der Waals ou électrostatiques. Un agrégat est un groupe de NP maintenus ensembles par des attractions fortes comme les liaisons covalentes ou métalliques ». La mise en jeux de l'ensemble de ces forces est fonction des propriétés atomiques fondamentales des atomes de surface, de la géométrie (la forme), de la taille, de la charge des NP et de la distance qui les sépare. En général, dans le cas d'un agglomérat, la surface externe est égale à la somme des aires des composants individuels, et dans le cas d'un agrégat, cette valeur est beaucoup plus petite [22]. L'environnement où se trouve les NP (pH, présence d'agent tensio-actif) ou la présence de protéines jouent un rôle dans la formation d'agglomérats [22]. Le moyen le plus simple pour évaluer l'état de dispersion d'un échantillon, c'est de mesurer la distribution de taille. L'index de polydispersité fourni par DLS donne une idée de la polydispersité. Cependant, pour sa détermination, comme pour la taille, l'utilisation de plusieurs techniques est recommandée.

# 3. Nanoparticules et médicaments

Si les NP sont déjà utilisées dans le diagnostic, la vaccination, la médecine régénérative, c'est surtout dans le domaine du médicament qu'elles ont déjà des applications et des progrès importants sont encore attendus [23] (Figure 1). Il est prévisible que les NP seront de plus en plus utilisées pour les traitements en permettant la protection d'un principe actif et éventuellement en ciblant spécifiquement le site d'action désiré (foie, lésion tumorale, ...). Actuellement, des essais in vitro ainsi que des essais cliniques sont régulièrement décrits.

## 3.1. Historique

Les premiers systèmes nanoparticulaires pour la délivrance d'un PA ont été les liposomes [24]. Par la suite, d'autres biomatériaux organiques et inorganiques ont été développés. Des systèmes liposomaux plus complexes, pour lesquels un changement de pH déclenche la libération du PA ont été introduits en 1980 [25], en même temps que des liposomes à ciblage cellules-spécifique [26]. Les premiers liposomes à longue durée de circulation ont été décrits en 1987 [27]. Par la suite, l'utilisation de polyéthylène glycol (PEG) a permis d'augmenter le temps
de circulation des liposomes en 1990 [28]. Ainsi, la doxorubicine incluse dans des liposomes
pégylées par PEG (Doxil®) a été approuvé en 1995 pour le traitement du Sarcome de Kaposi
associée au SIDA. Concurement, les NP polymériques sont utilisées à partir de 1994 [29].

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Figure 1. Répartition des utilisations des nanotechnologies dans le domaine médical
[23]</figcaption></figure>

Un des buts de l'utilisation thérapeutique des NP est d'assurer la vectorisation d'un principe actif, on distingue à l'heure actuelle trois types de vecteurs nanoparticlaires (Figure2) :

- Les vecteurs de première génération : correspondent aux nanoparticules dont la surface n'a pas été modifiée. Ils sont en général de courte durée de vie et sont rapidement éliminés de l'organisme en particulier par les macrophages après leur opsonisation.

- Les vecteurs de deuxième génération : sont des nanoparticules recouvertes de polymères hydrophiles tels que le polyéthylène glycol (PEG) ou polyoxyethylène (POE) (nanoparticules pégylées) qui préviennent leur opsonisation et augmente ainsi la demi-vie du PA.

- Les vecteurs de troisième génération : ils associent un noyau et une enveloppe de polymère polyéthylène glycol (PEG) ou polyoxyethylène (POE) portant à leur surface une molécule de reconnaissance d'une structure ou d'un récepteur membranaire. Bien que n'étant pas pour le moment disponibles, de tels systèmes pourraient apporter des grands progrès thérapeutiques.
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 2.** Trois générations de nanovecteurs (Exemple des liposomes)
http://reflexions.ulg.ac.be/cms/c_345464/fr/des-balles-magiques-contre-le-cancer?part=2
A. Première génération B. Deuxième génération C. Troisième génération (voir texte)</figcaption></figure>

**3.2. Utilisation des nanoparticules**

Les nanovecteurs permettent d'augmenter l'index thérapeutique d'un médicament en particulier en améliorant la biodisponibilité des principes actifs [30]. Ils apportent une réduction de la toxicité aiguë et des effets secondaires du PA [31], [32]. Aussi le ciblage d'un site spécifique améliore l'efficacité thérapeutique, permet également de limiter les doses administrées et peut se révéler intéressant dans le traitement de lésions cancéreuses. Ce ciblage peut se faire par plusieurs façons :

* La fonctionnalisation des NP : un ciblage spécifique peut être obtenu avec un ligand (anticorps, peptide, aptamère, petite molécule) qui reconnait spécifiquement des structures à la surface des cellules à atteindre. Par exemple, ce peut être un anticorps dirigé contre le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), surexprimé dans les cancers du côlon [33], ou de folate pour cibler les cellules cancéreuses riches en récepteurs de cette molécule [34]. Les cibles les plus étudiées comportent également les transferrines et les glycoprotéines surexprimées par les cellules tumorales [35].

* Les systèmes nanoparticulaires sensibles au pH : stable au pH physiologique (7,4), ils libèrent le PA dans l'environnement des cellules tumorales où le pH est inférieur, comme les liposomes contenant de l'homocystéine palmitoylée [36].

* Les systèmes polymériques thermosensibles : ils sont constitués d'un polymère de faible température critique de solution (LCST) qui tend à précipiter lorsque la température est
supérieure à la LCST avec libération concomitante de sa charge. Une hyperthermie localisée peut être induite dans des tumeurs par des méthodes physiques (ultrasons) ou photothermiques [37].

* Un ciblage « passif » qui utilise une caractéristique des NP, comme la charge : les cellules tumorales ont une charge de surface négative relativement plus élevée (présence de phospholipides) [38] que les cellules normales, ce qui favorise leur liaison avec des NP cationiques [39], [40].

* Des nanosystèmes (liposomes, NP polymériques) se localisent sélectivement dans des tissus dans des conditions pathologiques comme l'inflammation et les tumeurs du fait de l'augmentation de la perméabilité vasculaire [41], [42].

* Les NP peuvent être conçues pour faire pénétrer des PA à visée neurologique par le franchissement de la barrière hémato-encéphalique, comme les NP polymériques à base de cyanoacrylate [43].

### 3.3. Marché des nanomédicaments

Actuellement 33 médicaments utilisant les NP sont disponibles dans le monde, parmi ceux-ci on trouve [44], [45] :

* Liposomes (AmBisome®: Amphotericine B); liposomes pégylés (Caelyx®: Doxorubicine)

* Nanoformulations à base de phospholipides complexés à l'Amphotericine B (Abelcet®)

* Aptamère anti-VEGF pégylées (Macugen®)

* Micelles de copolymère de poly(éthylène glycol)-poly(D.L-lactide) NP contenant du paclitaxel (Genexol®) ; non disponible en France

* Paclitaxel conjugué à de l'albumine (Abraxane®)

* Virosomes, adénovirus recombinant exprimant la P53 sauvage (Gendicine®) ; non disponible en France

* NP à base de fer, utilisées pour le diagnostic en IRM

- NP d'oxyde de fer recouvert avec dextran (Feridex®) ; non disponible en France.

- NP d'oxyde de fer supramagnétique (Endorem®) commercialisation interrompue.

- NP de magnétite [N-(2-aminoéthyl)-3-aminopropyl silylée] (Lumirem®).
En juillet 2014, 169 essais cliniques étaient enregistrés auprès de la Bibliothèque nationale de médecine des États-Unis (http://clinicaltrials.gov) avec "nanoparticles" comme un seul terme de recherche alors que le même terme fournit 92639 résultats sur PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) [13]. En utilisant le même mot clé, la recherche a fourni en octobre 2015 respectivement 206 et 109995 résultats. Ceci montre la rapide expansion de la nanomédecine. Cependant étant donné le délai entre la conception d'un médicament et son arrivée en clinique, il faudra sans doute attendre une dizaine d'année avant de voir la partie la plus intéressante des formulations actuellement proposées aboutir à des traitements commercialisables [13].

# 4. Nanotoxicologie

## 4.1. Introduction

De nombreux nanomatériaux sont introduits quotidiennement dans nos vies. Par exemple, les NP d'oxyde de zinc ont actuellement de multiples utilisations industrielles et commerciales, en cosmétique, dans les produits d'hygiène cutanée ou capillaire, les crèmes solaires, ainsi que dans les céramiques, les revêtements muraux, et les peintures [46], [47]. De même, les NP de dioxyde de titane sont utilisées dans les produits cosmétiques, comme additifs alimentaires mais aussi dans les peintures et les plastiques [48], [49].

La production de nanomatériaux pourrait, d'ici à 2020, augmenter plus de 25 fois [50]. Ce développement a sans doute à la fois des effets bénéfiques et néfastes sur l'environnement et la santé des êtres vivants. Par exemple les NP produites par la combustion du fuel ou du diesel sont présentes dans l'air et leur concentration est corrélée à la survenue de maladies respiratoires, cardiovasculaires et de cancers ainsi que à une surmortalité [51]. Par conséquent, avant d'utiliser ces matériaux dans les systèmes biologiques et l'environnement, il convient d'en évaluer la biocompatibilité, la distribution dans l'environnement et en ambiance de travail et partant la toxicité.

Si le nombre d'articles portant sur les nanomatériaux a augmenté de façon rapide, la plupart des travaux portent plutôt sur leur synthèse et leurs applications et moins de 1% en étudie la toxicité [52]. L'absence d'évaluation du retentissement sur l'organisme des nanomatériaux ne peut qu'en freiner le développement. Du fait des propriétés particulières des NP, les méthodes de
la toxicologie classique ne sont pas adaptées [53] et la nanotoxicologie, plus spécifiquement dédiée à l'étude du retentissement biologique des nanomatériaux, s'est donc développée. Cette nouvelle science a cependant d'ores et déjà des limites :

* Les travaux menés tant *in vitro* que chez l'animal mettent en évidence des effets cytotoxiques ou génotoxiques des NP. Mais du fait de la très grande hétérogénéité méthodologique entres les différentes études, la comparaison et la synthèse de tous les résultats est pratiquement impossible [54], [55], [56]. En effet, cette variété porte sur :

- Les types de NP (composition), leurs paramètres physico-chimiques (taille, charge de surface, la topographie de surface, la surface spécifique) [57], et les éventuels agents de stabilisation utilisés [58].

- Les types de cellules utilisées, animales ou humaines, cellules primaires ou lignées continues [59].

- Les tests utilisés pour déterminer la toxicité [60].

- Les interférences possibles des NP avec les réactifs de l'essai [61], [62], [63].

- Les conditions d'exposition aux NP (temps et de concentration) [64].

* L'utilisation de concentrations de NP très supérieures à celles que l'on pourrait rencontrer en exposition réelle.

* Exposition aiguë, ou chez l'animal de courte durée, à des doses importantes qui ne reflète pas la situation réelle où il s'agira plutôt de contacts de longue durée à des doses faible mais susceptibles d'entraîner un effet d'accumulation et donc une toxicité au long cours [53], [55].

* Dans les travaux ne sont pas pris en compte le cycle de vie des nanomatériaux, que ce soit leur production, leur place dans le produit administré, leur distribution ou leur dégradation dans l'organisme [55].

* Les résultats des travaux tant *in vitro* que chez l'animal, quelles que soient les conditions ne sont pas représentatifs de ce qui se passe chez l'Homme et sont donc difficilement extrapolables. Ceci, d'autant plus que l'administration de NP peut entraîner un effet de dilution et éventuellement une répartition très hétérogène qui peuvent rendre l'analyse qualitative et quantitative difficile [55].

La toxicité des NP dépend de leur composition chimique mais aussi de leur taille et de leur forme. De nombreuses NP n'ont pas fait la preuve d'une toxicité comme les NP d'or
fonctionnalisées avec des chaines anioniques [65], [66]. Par contre, les quantum dots (QD) de séléniure de cadmium sont toxiques par la libération de Cd²⁺ mais elles deviennent non toxiques après enrobage [67]. Les NP d'oxyde de cérium ou d'oxyde d'yttrium ont un effet bénéfique sur la santé du fait de leur effet antioxydant puisqu'elles limitent la production des espèces réactives de l'oxygène (ERO) dans les cellules nerveuses [68].

## 4.2. Pharmacocinétiques des nanoparticules

L'Homme est exposé aux nanomatériaux qu'ils proviennent de l'environnement ou de l'administration volontaire, médicale ou non. Ce contact peut rester superficiel (cosmétique) ou se traduire par une pénétration dans les voies respiratoires par inhalation, digestive par ingestion, transcutanée, ou directement dans le sang par injection [69], [70]. Après pénétration des NP dans le corps, leur petite taille favorise leur diffusion. Leur capacité à franchir les barrières anatomiques peut avoir de multiples conséquences du fait d'interactions avec les organes et les tissus.

Après administration per os les NP peuvent traverser le tractus gastro-intestinal et être excrété par les fèces mais aussi être absorbé par la muqueuse gastro-intestinale, pénétrer dans la circulation générale [71]. Du fait du transit et du renouvellement constant de l'épithélium, la présence de NP dans le tube digestif ne peut être que transitoire [72], [69]. Après translocation dans la circulation sanguine, les NP peuvent essaimer dans tout l'organisme et être retrouvées dans les ganglions lymphatiques, les reins, les poumons, le foie et le cerveau, et peuvent également être trouvées dans l'estomac et l'intestin grêle [73], [74]. Après administration orale de NP de PLGA (poly (acides D, L-lactique-co-glycolique) de 200 à 300 nm de diamètre par voie orale chez la souris, environ 40% de ces particules ont été localisées dans le foie après sept jours. Le reste était présent dans le cerveau et les reins sans toxicité apparente [75]. L'absorption intestinale est liée à la taille des NP, à la chimie de surface, à la charge, à la durée de l'administration et à la dose [72]. Par exemple, la pénétration de particules de polystyrène de 50 nm à 3 µm diminue avec l'augmentation de la taille et devient nulle pour les particules les plus grosses [74].

Après inhalation, les particules se déposent à différents étages de l'arbre pulmonaire du fait de 3 facteurs qui sont : l'anatomie des voies respiratoires, l'écoulement de l'air, les caractéristiques aérodynamiques des particules et leur taille. Les plus grosses (5-30 µm) se
déposent dans le nasopharynx. Les particules plus petites (1-5 µm), sont piégées par le mucus de l'arbre trachéo-bronchique, et éliminées par la clairance mucociliaire. Enfin, les particules restantes submicrométriques (<1 µm) et des nanoparticules (<100 nm) pénètrent jusqu'au fond des alvéoles [52]. A partir de là, elles peuvent essaimer dans les poumons, le cœur, le foie, la rate et le cerveau.

Les NP peuvent gagner le système nerveux central en franchissant la barrière hématoencéphalique. La perméation de cette barrière, négativement chargée, dépend principalement de la charge des NP ; les particules cationiques pénètrent mieux que celles qui sont neutres ou anioniques [76].

Les NP peuvent également être en contact avec la cornée. A la surface de celle-ci, les NP sont éliminées par le liquide lacrymal et gagnent le rhinopharynx et la voie digestive. Cependant, elles peuvent provoquer une irritation transitoire avec érythème et production de pus [77], [78].

Une fois que les NP sont dans la circulation générale, leur élimination se fait généralement par voie urinaire, comme les nanotubes de carbones fonctionnalisés par des groupements hydroxyles ou ammonium administrées par voie intraveineuse [79]. Cependant, leur élimination peut également se faire par les glandes mammaires, la salive, et le sperme.

### 4.3. Relations nanoparticules / cellules

A la surface de la cellule, les NP entrent en contact avec une couche d'oligosaccharides chargés négativement. Elle peut agir comme récepteur pour l'internalisation des macromolécules, ou comme répulsif, prévenant ainsi l'internalisation des NP. Les protéoglycanes des membranes cellulaires jouent aussi un rôle clé dans la liaison des lipoprotéines qui sont de taille nanométriques. L'hétérogénéité des charges électriques à la surface cellulaire ajoute à la complexité. Il est communément admis que les NP chargées positivement se lient aux zones négativement chargées tels les héparane sulfates [80]. Cette adhésion peut être non spécifique et initiée par des forces de Van der Waals, les charges électrostatiques, ou les effets de tension interfaciale, et ne conduit pas obligatoirement à une internalisation.

La pénétration cellulaire n'est pas nécessaire pour que les NP fassent preuve de cytotoxicité. Par exemple, des NP métalliques endommagent les cellules indirectement par
productions d'ERO, par réaction avec l'eau ou l'oxygène présent dans le milieu environnant. Lorsque la production d'ERO est supérieure à la capacité de détoxification cellulaire, il en résulte un stress oxydant qui peut endommager la cellule [81].

Du fait de leur petite taille, les NP ne pénètrent pas par phagocytose, mécanisme spécifique des macrophages et polynucléaires, à moins de la formation d'agrégats ou d'une opsonisation de la particule. La voie principale de pénétration des NP dans les cellules est l'endocytose qui peut jouer pour tous les types cellulaires y compris les hématies [82]. Endocytose peut être soit active (dépendant de ATP) ou passive (ne comporte pas la machinerie de la cellule). Une translocation à travers la membrane selon un mécanisme passif a été décrite pour des NP de silice [83]. L'endocytose active fait appel à 3 mécanismes principaux [80] (Figure 3):

- La pinocytose est un mécanisme actif dédié essentiellement à la pénétration de liquide et de substances solubles dans une vacuole qui peut enfermer des NP de petites tailles.

- L'endocytose cavéoline dépendante, la cavéoline s'associe aux radeaux de cholestérol entraînant un courbure de la cellule aboutissant à une invagination qui par fermeture du col sous l'action de la dynamine à GTP [84] aboutit à la formation de vésicules de 60 à 80 nm [85] libérées dans le cytoplasme. Celles-ci ne fusionnent pas avec les lysozymes, protégeant son contenu d'une dégradation acide. Ce que peut protéger certains NP ou PA de la dégradation.

- L'endocytose clathrine-dépendante est caractérisée par un dépôt de clathrine à la face interne de la membrane cytoplasmique après liaison à la « adaptator protein 2 (AP2) » formant une couche dense visible en microscopie électronique. Il se produit une invagination de la membrane et formation rapide d'une vésicule de 100 à 200 nm. Ces vésicules fusionnent avec les lysosomes.

L'entrée cellulaire des NP reste un mécanisme important qui peut déclencher des effets indésirables [86]. Selon le type de cellule [87] et les propriétés physico-chimiques des NP telles que la taille et la forme [88], [89] et leur chimie de surface [90], les voies de pénétration peuvent différer bien que plusieurs voies puissent exister en parallèle [91].

Après pénétration dans une cellule, les NP peuvent persister pendant une longue période ou quitter les cellules, éventuellement se déplacer vers une autre cellule sans être modifiées, insérées par exemple dans un exosome [92].
Four main endocytosis mechanisms for cells to exchange materials with the extra cellular media, include phagocytosis, pinocytosis, caveolae endocytosis and clathrin mediated endocytosis, each producing different sized vesicles, and using different materials during vesicle formation.

<table><caption>Figure 3. Principaux mode d'internalisation des NP [80]</caption><thead><tr><th>Phagocytosis</th><th>Pinocytosis</th><th>Caveolae endocytosis</th><th>Clathrin mediated endocytosis (CME)</th></tr></thead><tbody><tr><td><img src="phagocytosis_image.png" alt="A cell with an actin cytoskeleton and vesicles"></td><td><img src="pinocytosis_image.png" alt="A cell with actin filaments and vesicles"></td><td><img src="caveolae_image.png" alt="A cell with caveolae, cholesterol rafts, and vesicles"></td><td><img src="clathrin_image.png" alt="A cell with clathrin, AP-2, and vesicles"></td></tr><tr><td>Vesicle size: ≥ 500 nm<br>Only occurs in specific cells (i.e. macrophages), which actively wrap their membrane around the material. Can be aided by actin microfilaments, and requires signals for activation.</td><td>Vesicle size: 0.5-5 µm<br>Non-specific, used to transport fluids and materials. Actin filaments can help elongate the vesicle resulting in larger sizes.</td><td>Vesicle size: 60-80 nm<br>Caveolin incorporates itself within cholesterol rafts in membrane inducing curvature. The vesicle is then released from the membrane by dynamin via GTP hydrolysis.</td><td>Vesicle size: 100-120 nm<br>Adaptor protein 2 (AP-2) and clathrin bind together to form a cage on the exterior of the inner monolayer of the cell membrane, dragging it to form the vesicle, released by dynamin via GTP hydrolysis.</td></tr></tbody></table>
## 4.4. Mécanismes de la toxicité des nanoparticules

### 4.4.1. Mécanismes physiques

Du fait de leur taille, les plus petites NP peuvent atteindre les endroits où les plus grosses particules ne peuvent pas entrer, comme dans certains cas le noyau [54] et pourrait s'insérer dans le sillon de l'ADN et provoquer des altérations comme par exemple les NP d'or de 1,4 nm [93].

La présence des NP intracellulaire peut amener des altérations de la morphologie en particulier en affectant la structure du cytosquelette [94], [95], celle-ci étant dépendante de la concentration de particules. Cependant, le mécanisme et ses conséquences n'ont pas été étudiés en profondeur. Il est donc important pour toutes les nouvelles NP qui pénètrent dans la cellule d'en déterminer la voie d'endocytose et leur localisation intracellulaire et la concentration intracellulaire maximale admissible [54].

La lyse cellulaire, mécanisme mal connu, serait lié à une réaction électrostatique des groupements silanol à la surface des NP de silice, par exemple, avec des groupements ammonium de la membrane des hématies dont la déformation entraînerait la rupture [96].

### 4.4.2. Mécanismes chimiques

Un des mécanismes les plus étudiés et sans doute le plus important est la production d'ERO [50]. Le lien entre les niveaux d'ERO et l'induction d'effets toxiques est toutefois dépendant du type cellulaire et le seuil de toxicité n'est donc pas clairement défini [97].

En général, les faibles augmentations transitoires d'ERO sont bien tolérées par la plupart des lignées cellulaires, alors que des niveaux plus élevés persistants sont susceptibles d'entraîner des dommages cellulaires [54]. La cellule ne peut pas maintenir un potentiel redox physiologique ce qui entraîne des lésions de l'ADN, des dérèglements des mécanismes de signalisation cellulaire avec à terme une apoptose, une nécrose, une autophagie ou un risque de cancérisation [98], [70] (Figure 4).
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 4. Conséquences du stress oxydant induit par les nanoparticules D'après [70]</figcaption></figure>

## 4.5. Facteurs influençant la cytotoxicité des nanoparticules

### 4.5.1. Taille

La taille des NP joue un rôle essentiel dans leur entrée dans la cellule, les voies d'endocytose utilisées et la réponse physiologique des cellules [50], [88]. En général, les NP de petites tailles sont plus toxiques que les grandes. La surface spécifique peut expliquer cette relation inverse [10]. Par exemple, les NP d'argent de 10 nm sont plus toxiques que celles de 50 et 100 nm en termes de viabilité cellulaire, génération d'espèces réactives de l'oxygène et modifications morphologiques [99]. Cependant, l'inverse est également possible et des NP d'or de 1,4 nm induisent une toxicité plus sévère dans les tissus conjonctifs, les fibroblastes et les cellules épithéliales que les plus petites (0,8 nm et 1,2 nm) ou les plus grandes (1,8 nm et 15 nm). De plus, les mécanismes de la toxicité sont différents, les NP de 1,4 nm provoquent une nécrose des cellules et celles de 1,2 nm une apoptose. Cette observation a été rattachée au fait que les NP d'or de 1,4 nm s'insèreraient dans le grand sillon de l'ADN et provoqueraient sa fragmentation [93]. Le pouvoir hémolytique des NP de silice augmente avec leur taille. Ce mécanisme, mal connu, serait lié à une réaction électrostatique des groupements silanol à la surface des NP avec des groupes ammonium de la membrane des hématies : les plus grosses particules adhèreraient à
une grande surface de la membrane cellulaire et déformeraient la membrane entraînant sa rupture
[96].

4.5.2. Forme

Son effet est peu étudié mais les NP en forme de bâtonnet sont en général plus toxiques que celles sphériques. Par exemple, les nanofibres de carbone n'affectent pas la viabilité des kératinocytes de souris à la différence des nanotubes de carbone multi- ou simple-parois. De plus, les nanotubes à parois multiples entraînent la production de trois fois plus d'espèces réactives de l'oxygène que ceux à simple paroi [100]. De même, l'internalisation des NP d'or en forme de bâtonnet est supérieure à celles sphériques [89]. La raison pourrait être liée à une plus grande surface de contact avec les récepteurs de la membrane cellulaire [101].

4.5.3. Charge et état de surface

La charge des NP, qui influe directement sur leur interaction avec la surface cellulaire, a une grande importance pour déterminer la stabilité des NP et éviter leur agrégation. En général, les particules cationiques sont considérées comme les moins stables et posséder un plus grand pouvoir cytotoxique [102]. Ceci a été montré aussi bien avec des NP polymériques [103] qu'avec des NP d'or [68]. *In vivo*, les NP polymériques chargées positivement ont été trouvées dans les macrophages après injection intraveineuse chez la souris à la différence de celles chargées négativement [104].

Il a été montré que la modification de la surface des NP a un effet sur la toxicité, comme par exemple les NP d'argent fonctionnalisées avec galactose ou mannose étaient moins toxiques que celles avec éthylène glycol ou citrate [105].

4.5.4. Biodégradabilité

La plupart des nanomatériaux communs ne sont pas biodégradables et persistent ou s'accumulent dans les tissus ou les cellules. Ils peuvent ainsi demeurer des années dans l'arbre respiratoire en provoquant des atteintes chroniques voire une cancérogenèse [52]. Mais une réponse aiguë peut également être observée du fait d'une dégradation rapide comme par exemple les NP d'oxydes de zinc ou de fer qui relarguent des ions métalliques avant ou après l'internalisation dans les cellules [106].
### 4.5.5. Agglomération

Leur effet sur la santé humaine est peu étudié. Si l'agglomération des NP dans le milieu extérieur diminue l'exposition aux NP dans l'organisme elle peut avoir un effet favorable. Dans les poumons, l'agglomération des NP réduit leur passage à travers les barrières anatomiques et de ce fait réduit l'essaimage dans l'organisme. Au niveau cellulaire, l'internalisation et la distribution intracellulaire sont affectées par l'agglomération [22]. Les NP d'argent de taille inférieure à 100 nm peuvent être trouvées dans les mitochondries ou le noyau, alors que les agglomérats restent dans le cytoplasme [107]. Les tailles des agglomérats de NP et leurs répartitions peuvent varier en fonction du milieu de culture, la concentration des NP et la durée d'incubation [108], et les taux de dissolution des NP dispersés et agglomérés diffèrent, comme il a été rapporté pour des NP d'argent [109]. En plus, la sédimentation des NP agglomérées peut augmenter l'exposition et donc la toxicité [110].

### 4.5.6. Pureté

Comme la plupart des NP sont hydrophobes, il faut stabiliser leur suspension en milieu aqueux avec des agents tensioactifs, des revêtements de polymère ou des groupes fonctionnels. Par exemple, des NP d'or sont généralement fonctionnalisées avec du citrate. Ces stabilisants et ces groupes fonctionnels peuvent causer des effets toxiques et éventuellement des réponses immunes [111].

Donc, au cours de la préparation de NP, il est impératif que le produit final utilisé soit aussi pur que possible. Toutes les impuretés telles que des ions métalliques ou des stabilisants organiques peuvent diminuer la viabilité cellulaire, même lorsque les NP elles-mêmes sont 100% biocompatibles. Ainsi, jusqu'à 15% de métal résiduel ont été trouvés dans des échantillons purifiés [112]. Une purification supplémentaire (dialyse par exemple) peut surmonter ce problème, mais les stratégies utilisées peuvent, elles-mêmes, introduire de nouveaux contaminants ou affecter la stabilité des NP [112]. La conservation des NP peut entraîner leur dégradation et la libération d'ions métalliques entrant dans leur composition. Par exemple, le cetylmethylammonium bromide (CTAB) utilisé pour stabiliser les NP d'or induit une forte cytotoxicité quand il se détache de leur surface [113]. Donc, avant leur utilisation, une caractérisation complète des NP et des éventuels contaminants est très importante pour pouvoir interpréter correctement les effets cytotoxiques.
4.5.7. Couronne protéique

Une fois les NP dans un milieu biologique, elles adopteront une identité biologique avec la formation d'une couronne de protéines et de petites molécules (telles que des acides aminés et des sucres) sur leur surface [114] [115]. Les protéines peuvent adhérer fortement (Figure 5) en établissant des relations physiques ou chimiques et constituent une couronne « dure » qui se forme rapidement en quelques secondes [116]. D'autres protéines ont une interaction faible avec la surface des NP et forment une couronne « molle ». Cette couronne secondaire peut prendre des heures à atteindre un équilibre avec l'environnement [117].

Les propriétés physiques des NP, y compris la taille, la forme et la chimie de surface principalement l'hydrophobie et la charge de surface affectent la composition de la couronne finale [118], [119], [120], et la toxicité qu'elle médie. La composition du milieu de culture cellulaire a des effets profonds sur la cinétique et la constitution de la couronne protéique [121]. La composition en protéines de la couronne, n'est pas le reflet de leur concentration dans le sérum. Ceci laisse à penser que cette couronne ne se constitue pas au hasard mais est directement dépendante du type de NP.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 5. Constitution de la couronne protéique
[117]</figcaption></figure>

Les protéines interagissant avec les NP subissent des changements conformationnels [122], [123] qui pourrait modifier leur antigénicité et elles pourraient alors être reconnues comme protéines du non-soi contre lesquels l'organisme déclencherait une réaction immunitaire
qui pourrait être l'origine d'une auto-immunité. La variation de composition des protéines sériques attachées à des NP d'or et d'argent, peut affecter directement la voie d'endocytose qu'elles utilisent ainsi que leur degré de cytotoxicité [124]. Cependant, cette couronne protéique peut augmenter le degré de biocompatibilité de NP et les rendre moins toxiques. Ainsi, la cytotoxicité de nanotubes de carbone à simple paroi ou de nanofeuillets d'oxyde de graphène est réduite quand ceux-ci sont en présence de sérum de veau fœtal [125]. Cependant, pour le moment il n'a pas été montré que la toxicité était directement liée à la composition en protéines de la couronne du fait de leurs fonctions, mais il a été montré que la quantité totale de protéines liées aux NP influait sur leur temps de circulation, leur distribution dans l'organisme et l'éventuelle inflammation dans leur lieu de rétention [126].

#### 4.5.8. Concentration

A masse égale, la dose toxique des NP est inférieure à celle de particules micrométriques, pour un même matériau considéré. La toxicité des NP reste bien entendu dose dépendante. En revanche, établir une corrélation entre les concentrations utilisées *in vitro* dans les modèles cellulaires ou *in vivo* chez l'animal et la concentration admissible ou utilisable chez l'Homme est difficile [127]. Il a été proposé que pour les essais *in vitro* avec une nouvelle particule pour laquelle aucune information sur la toxicité n'est disponible, une concentration maximum de 1 mg/mL soit utilisée ce qui correspond à 80 g pour un homme de 70 kg avec un volume sanguin de 5,6 L. En fait, dans les essais cliniques, le choix de la dose de NP est directement dépendant de celle souhaitée pour le PA auxquelles il est associé et il est peu tenu compte d'une éventuelle toxicité de NP seules. En plus, dans les travaux *in vitro* et chez l'animal, des gammes de concentrations de NP sont utilisées avec un seuil maximum bien au-delà de la quantité qui pourrait être administrée. Enfin, dans les travaux, la quantité de NP utilisée est ramenée à la concentration, par exemple en µg/mL, sans tenir compte du nombre de particules utilisées alors que cette valeur peut varier dans de très grandes proportions selon la taille des particules [128].

### 4.6. Méthodes d'études de toxicité des nanomatériaux

Comme pour chaque nouvelle matière susceptible d'être en contact avec le Vivant des études des effets biologiques et toxiques des NP doivent être effectuées [129]. Celles-ci peuvent être menées soit *in vitro* sur des modèles cellulaires soit *in vivo*, le plus souvent chez le rongeur.
### 4.6.1. *In vitro*

#### Choix de la lignée

Il est d'une grande importance. Du fait du très grand choix de lignées disponibles, il est possible de travailler sur des cellules proches de celles susceptibles d'être en contact avec les NP. En effet, différentes lignées, même physiologiquement proches peuvent réagir très différemment pour le même type de nanomatériau [130]. Les lignées cellulaires peuvent être plus ou moins sensibles à l'exposition aux NP du fait de leur appartenance à deux espèces différentes (rat/homme) ou de leur origine au sein d'une même espèce (cellules d'origine cancéreuses) ou de leur provenance de tissus différents (cellules épithéliales, neuronales, macrophages, etc.). Aussi, la sensibilité ou la réaction des cellules aux NP peut différer grandement du fait de variations de voies métaboliques des récepteurs membranaires, les antioxydants et de leur capacité de réparation de l'ADN [131]. Les difficultés que représentent les lignées primaires font qu'elles ne sont que très rarement utilisées.

Les modèles de coculture peuvent apporter des informations sur les interactions entre cellules et aider à la compréhension de phénomènes *in vivo*. En général, les applications envisagées pour les NP étudiées doivent amener à choisir la lignée cellulaire. Par exemple, si une administration IV est prévue, l'étude portera sur les cellules endothéliales et les macrophages, les premiers en contact avec les NP, mais également sur les cellules de l'organe ou du tissu cible [54].

Les avantages des modèles cellulaires [129], [132], [133] :

* Révélation des effets primaires sur les cellules cibles en l'absence d'effets secondaires causés par l'inflammation.

* Absence de facteurs physiologiques présents lors d'études chez l'animal.

* Etudes de viabilité et détermination des mécanismes moléculaires de la cytotoxicité.

* Résultats obtenus rapidement et à moindre coût.

* Préparations d'études ultérieures menées *in vivo*.

* Manipulations faciles à contrôler permettant de limiter la variabilité entre les manipulations.
* Limitation de la quantité de déchets toxiques générés.

* Possibilité d'utiliser des lignées cellulaires transgéniques.

* Absence de problème éthique dans la mesure où le travail n'est pas fait sur des cellules primaires.

### 4.6.2. *In vivo* :

Ils permettent les études sur un organisme entier, d'en contrôler l'administration et étudier la distribution du produit administré dans l'organisme, la toxicité pour les organes, et doivent être un préalable à toute administration chez l'Homme. La bio-distribution et la cinétique toxique ne peuvent être étudiées que sur un animal entier. Les travaux chez l'animal permettent d'établir des données sur les dépôts dans les voies pulmonaires après inhalation, de déterminer des toxicités dermiques ou gastro-intestinales, d'étudier la dissémination des NP à partir d'un site d'administration. Les retentissements de l'administration des NP sur l'organisme peut mettre en évidence des altérations des fonctions cardiaques, neurologiques et immunologiques [50].

### 4.6.3. Quels modèles utiliser ? *In vivo* ou *In vitro* ?

Les premières études d'un nouveau produit sont réalisées sur cellules car elles permettent de montrer aisément un éventuel pouvoir cytotoxique, d'étudier les relations concentrations/effets et de définir un premier seuil de toxicité. Cependant, malgré les résultats importants que peuvent apporter les lignées cellulaires, les conditions sont fort éloignées de celles régnant *in vivo* où jouent des données de distribution, de concentration locale, de cinétique d'élimination, de phénomènes inflammatoires et de réponses tissulaires coordonnées au produit administré [133]. Les principaux problèmes posés par l'utilisation de cultures cellulaire sont :

* Les essais pour déterminer la viabilité cellulaire peuvent fournir des résultats erronés du fait d'interaction des nanomatériaux utilisés avec les colorants [60], [62], [63]. Par exemple, les nanotubes de carbone interagissent avec le test de rouge neutre [50].

* Lors des études de cytotoxicité, les cultures cellulaires sont influencés par les fluctuations de l'environnement externe (température, concentrations des déchets, le pH), et il faut multiplier les essais pour obtenir des résultats valables [50].

* L'utilisation de différentes lignées pose le problème du comportement vis-à-vis des NP qui peut varier grandement (réaction au contact, internalisation, localisation intracellulaire) d'une lignée à l'autre.
* L'utilisation de cellules humaines ou animales peut également se traduire par des effets différents [131].

* La plupart des lignées continues proviennent de lésions cancéreuses ou sont des lignées primaires immortalisées. Elles sont aneuploïdes, ont des voies de signalisation modifiées du fait de leur prolifération continue et peuvent être, par exemple, devenues résistantes à un produit qui est toxique pour la cellule saine, euploïde [134].

Aussi la pertinence des études *in vitro* à la situation *in vivo* en nanotoxicologie est discutée [135]. Cependant, on peut faire varier les conditions expérimentales, pour étudier les interactions cellules/cellules, en modifiant par exemple l'état de polarisation des macrophages [136], [137]. Ainsi des systèmes mettant en jeu des cocultures complexes [138], [139] sont actuellement en développement [140] et devraient apporter des résultats plus proches des conditions physiologiques *in vivo*.

Les études sur l'animal ont leurs propres limites. Les doses qui leur sont administrées n'ont souvent aucun rapport avec la situation réelle ni en quantité ni en durée d'exposition. La réponse d'un animal à un toxique peut être très différente de celle d'un humain. Les animaux de laboratoire proviennent d'élevages contrôlés et peuvent éventuellement être consanguins pour limiter les effets variations inter-individus.

Bien que les deux systèmes, cellulaires et animaux soient complémentaires et incontournables, il faut bien en connaître les limites.

## 4.7. Techniques d'études de toxicité des nanoparticules *in vitro*

### 4.7.1. Viabilité et cytotoxicité

La viabilité cellulaire après contact avec des NP peut être étudiée par des tests qui déterminent un ou plusieurs paramètres cellulaires. Ces tests mesurent une toxicité aiguë. Ils contribuent à la compréhension des mécanismes toxiques. Par exemple :

* Bleu trypan, détermine l'intégrité de la membrane cellulaire et évalue la prolifération ou la lyse cellulaire. Il est considéré comme le test le moins sensible [141].

* Rouge neutre : son accumulation dans les lysosomes est indicatrice de la viabilité cellulaire.
* Activité lactate déshydrogénase soluble (LDH), reflet des lésions cellulaires, est couramment utilisée [142].

* Sels de Tétrazolium (MTT, WST, MTS, XTT) qui déterminent l'activité succinate déshydrogénase mitochondriale (enzyme de la voie respiratoire) est la méthode la plus utilisée.

* Test au BrdU (bromodésoxyuridine) mesure la synthèse de l'ADN par incorporation de cette base.

Comme ces tests mesurent des paramètres différents, il peut être intéressant d'en pratiquer au moins deux en parallèle (par exemple Bleu trypan et MTT). Cependant, étant donné que le choix des tests est plutôt le fait de l'opérateur, une standardisation du choix et de la mise en œuvre des tests de cytotoxicité est souhaitable. Etant donné la très grande variété des NP et de leurs effets, différents temps d'exposition avant la mesure de l'effet toxique doivent pouvoir être étudiés du fait de l'existence d'effets transitoires ou retardés de plusieurs jours [54].

### 4.7.2. Cytopathologie et l'internalisation

La microscopie électronique à transmission (MET) permet de visualiser la localisation des NP dans les cellules et de vérifier la déformation éventuelle des organites intracellulaires. Les images obtenues peuvent donner une idée *i*) du mécanisme d'internalisation par visualisation de la formation de puits recouverts de clathrine par exemple, mais aussi *ii*) du mécanisme de toxicité des NP comme l'autophagie par observation de formation de phagosomes [143].

La cytométrie en flux (CMF) permet de quantifier l'internalisation en utilisant des NP marquées par un flurochrome. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques permet d'identifier le ou les mécanismes d'entrée des NP. L'utilisation de ces mêmes NP fluorescentes permet d'utiliser la microscopie confocale qui permet de visualiser l'internalisation.

Exemples d'inhibiteurs spécifiques de l'endocytose:

* Energie dépendant: azide de sodium ou incubation à 4°C.

* Phagocytose: cytochalasine D.

* Voie clathrine dépendante: chlorpromazine et méthode d'épuisement du potassium

* Voie cavéoline dépendante: génistéine et la filipine III.
Les inhibiteurs peuvent également causer des effets secondaires sur d'autres processus cellulaires [144]. Par exemple, la MβCD extrait le cholestérol de la membrane, empêchant l'endocytose cholestrol dépendante et cavéoline dépendante. Cependant, l'élimination du cholestérol altère la structure et la fluidité de la membrane, ce qui à son tour affecte la pinocytose, l'endocytose clathrine-dépendante et d'autres processus comme la déformation des protéines [145].

Des expériences *in vitro* peuvent reproduire les conditions cellulaires dans le corps et peuvent utiliser une gamme de techniques analytiques pour déterminer les effets spécifiques sur les cellules, mais l'obtention d'idées mécanistes détaillées est difficile. Pour contourner cette limitation, des membranes modèles ont également été utilisés pour étudier les effets des NP. De tels modèles de systèmes de membrane sont conçus [146], [147].

### 4.7.3. Etude des mécanismes moléculaires de la cytotoxicité

#### 4.6.4.1. Tests de génotoxicité

Les NP peuvent induire une génotoxicité par l'interaction directe des NP avec le matériel génétique, par dommages indirects à partir d'ERO dont la production serait induite par les NP, ou par des ions toxiques libérés par les NP [148]. Les tests les plus utilisés [131] sont :

- Test de comète

- Test du micronoyau

- Test des aberrations chromosomiques

- Test de mutation bactérienne inverse

#### 4.6.4.2. Toxicogénomique

La toxicogénomique résulte de la fusion de la toxicologie classique avec la génomique fonctionnelle [129], [149].

• Puces à ADN « microarrays »

Elles permettent l'étude globale de l'expression de l'ensemble des gènes de la cellule (identification et quantification) par hybridation des ARNm à des sondes spécifiques. Il est ainsi possible d'étudier l'action d'un composé toxique par comparaison à un témoin non exposé. Ce niveau d'étude est intermédiaire entre la génomique et la protéomique [150] (Figure 6) où les ARN messagers synthétisés représentent une base pour l'adaptation de la cellule à son
environnement via la synthèse des protéines. L'analyse des résultats est très complexe et fait appel à des logiciels pour en faciliter l'interprétation.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 6. Différents niveaux d'étude de la fonction cellulaire [150]</figcaption></figure>

L'analyse comporte essentiellement 3 étapes:

- Normalisation: pour éliminer les sources de variations des expressions

- Détection de gènes différentiellement exprimés : avec des filtres selon le choix des paramètres statistiques et biologiques.

- Interprétation biologique: permet de déterminer les conséquences métaboliques et signalétiques pour les cellules de l'expression différentielle des gènes.

• PCR quantitative

L'expressions des gènes les plus intéressants peut être confirmée et affinée par qRT-PCR (une étape de transcription inverse suivie d'une PCR quantitative) [151]. La qRT-PCR peut aussi être utilisés directement, sans passer par l'étape de puces à ADN, pour étudier des gènes que l'on sait être essentiels. Elle permet également des études comparatives de cinétiques et des doses en faisant varier les conditions d'exposition aux NP par exemple.
* Autres techniques

L'analyse des gènes exprimés peut aussi se faire par northern-blot pour les ARNm ou par western-blot pour les protéines [151].

4.7.4. Conclusion

Malgré la performance des outils à la disposition des laboratoires désirant investiguer le pouvoir toxique des NP, il n'existe pour le moment pas de standardisation de ces études. Les résultats fournis sont générés par des études individuelles, où quelques paramètres spécifiques ont été suivis pour un certain type de NP avec un certain type de cellule et pour cela ils sont difficilement comparables. Des protocoles précis devraient être fournis, prenant en compte la nature des NP et l'utilisation qu'il est prévu d'en faire. La **Figure 7** [54] fournit une démarche raisonnable pour l'étude de la toxicité d'une NP avant son utilisation chez l'Homme. Cependant, de telles recommandations restent à établir pour le choix des techniques utilisées, recommandations complexes puisqu'elles devront tenir compte de la nature des NP (biodégradabilité), de leur utilisation (voie externe, voie digestive...), de la durée d'exposition (ponctuelle, chronique).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 7. Arbre décisionnel pour l'évaluation toxicologique d'une nouvelle nanoparticule avant toute application biomédicale</figcaption></figure>
# 5. Eudragit® et Nanoparticules polymériques

L'Eudragit®, est un ensemble de polymères d'acides acryliques et méthacryliques développés par la société EVONIK Industries AG (Darmstadt, Germany). Certains de ceux-ci sont utilisés pour fabriquer des nanoparticules polymériques qui se différencient des autres en particulier par leur absence de biodégradabilité.

## 5.1. Nanoparticules polymériques

Les NP polymériques sont de compositions et de structures variées. Elles peuvent être sous forme de micelles, de dendrimères, de nanoparticules, de polymersomes, de polyplexes, de systèmes polymères hybrides et de polymères conjugués [152] (Figure 8). Toutes ces formes ont été proposées, et certaines utilisées, pour des études précliniques et cliniques comme le Livatag® (essai clinique de phase III) [153]. Dans ces études le PA peut être conjugué à la surface des NP, ou libre dans ce cas encapsulé.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 8. Différents types de nanoparticules polymériques [152]</figcaption></figure>
* **NP polymériques solides**: elles sont sous forme de nanosphères ou de nanocapsules au sein desquelles le PA est piégé ou encapsulé. Plusieurs polymères sont utilisés pour préparer ce type de NP nues ou pégylées comme les NP de PLGA chargées en paclitaxel [154]

* **Micelles polymériques**: les copolymères di- ou tri-blocs amphiphiles ont la capacité de s'auto-assembler en sphères de taille nanométrique. La partie hydrophobe formant le noyau, permet l'encapsulation d'un PA, tandis que la partie hydrophile du copolymère forme l'enveloppe et apporte des propriétés de furtivité qui permet une certaine persistance de la micelle dans la circulation sanguine, comme le NK-911® (micelles de PEG-polyaspartate avec doxorubicine) pour le traitement anticancéreux (essai clinique de phase II).

* **Dendrimères**: ce sont des macromolécules formant une arborescence à partir d'un noyau central. Le PA peut être soit encapsulé dans le noyau, soit conjugué au polymère comme, par exemple, les dendrimères de poly(glycerol-succinic acid) nanovecteur de camptothecine dans le traitement anticancéreux [155].

* **Polymersomes**: ils ont une structure semblable à celle de liposomes mais possèdent une plus grande stabilité, une plus importante capacité de stockage et un temps de circulation prolongé. Les polymersomes chargés en doxorubicine ont la capacité de retarder la croissance de tumeur comme le DOXIL® qui est déjà commercialisé [156].

* **Polyplexes**: un acide nucléique (un gène ou un siRNA) est condensé et/ou complexés par des interactions électrostatiques avec les groupements cationiques du polymère et protégé d'une dégradation enzymatique, comme le siRNA délivré par un complexe de polymère de triméthyle-chitosan-cystéine modifié par du galactose [157].

* **Systèmes hybrides polymériques**: ce sont des combinaisons de NP polymériques avec de liposomes, ou avec des agents tensio-actifs, comme le système polymère (alginate de sodium) / agent tensioactif anionique (sulfosuccinate de dioctylsodium).

* **Polymères conjugués** qui associent des polymères solubles dans l'eau à des PA ou des protéines. Ceci modifie le profil pharmacocinétique du PA, et ces structures sont considérées comme de nouvelles entités chimiques comme IT-101 (polycyclodextrin-camptothecine) utilisé dan un essai clinique de phase I.
### 5.1.1. Nature chimique des polymères

Les polymères utilisés peuvent être d'origine naturelle (chitosan) ou synthétiques, ces derniers peuvent utiliser des monomères organiques naturels (poly acide lactique) ou synthétiques (acide acrylique). Les NP peuvent être composées d'un seul type de polymère, d'une combinaison avec un autre polymère ou conjugué à d'autres molécules. En général, les polymères synthétiques sont plus homogènes en composition et ont donc une plus grande pureté que les polymères naturels et leur préparation est plus reproductible [153].

**Polymères naturels** : ils doivent être biocompatibles, présenter une faible antigénicité et être peu cytotoxiques. Les plus utilisés sont :

- Gélatine dérivée de collagène animal et insoluble dans les solvants organiques. Les NP de gélatine, chargées en amoxicilline, ont été proposées pour le traitement de *H. pylori* [158].

- Chitosan, polysaccharide mucoadhésif, possède des propriétés antimicrobiennes, immunoadjuvantes et antitumorales potentielles [159].

**Polymères synthétiques** : sont plus faciles à manipuler. Polylactate (PLA), polyglycolate, poly-(lactate-co-glycolate) (PLGA), polycaprolactone (PCL) et Eudragit® sont couramment utilisés. Ils peuvent être biodégradables (polylactate) ou non (Eudragit®). Le PLGA approuvé par la FDA et l'EMA pour l'administration parentérale, car il est biocompatible, biodégradable et pratiquement dénué de toxicité d'autant plus qu'il est décomposé dans l'organisme en acides lactique et glycolique métabolites naturels. Les NP de PLGA sont fréquemment utilisés pour l'encapsulation de divers PA anticancéreux (paclitaxel, doxorubicine, 9-nitrocamptothécine, cisplatine, ...) [160].

## 5.2. Eudragit®

### 5.2.1. Structure chimique

Eudragit® est le nom commercial d'un ensemble de polymères dont la composition de base consiste en deux monomères, les acides acrylique et méthacrylique ou leurs esters, et commercialisés par la société EVONIK (Figure 9). Ces Poly-(méth)acrylates sont disponibles sous différentes formes : dispersions aqueuses, solutions organiques, granulés ou poudres [161]. Les structures des poly-(méth)acrylates sont modifiées pour diverses applications
pharmaceutiques par l'introduction de groupements dans la chaine de polymère, créant ainsi
plusieurs formes chimiques distinctes chacune ayant des caractéristiques qui leurs sont propres
(Tableau 1). Par exemple, pour les Eudragit® S et L, les groupes carboxyle ne sont pas ionisés
dans des environnements à pH bas, tel celui de l'estomac et le polymère reste insoluble. Dans
l'intestin, le pH plus élevé (> 5) provoque l'ionisation de ce groupement ce qui permet la
libération du PA. L'Eudragit® L est utilisé pour une libération de médicaments dans l'intestin,
tandis que l'Eudragit® S l'est pour une libération colique [162], [163]. De même, les deux
copolymères Eudragit® RL et RS ne diffèrent que par leur teneur en groupes ammonium
quaternaire : le rapport molaire des acrylates d'éthyle, méthacrylate de méthyle et méthacrylate
d'éthyle triméthylammonium est environ 1/2/0,2 pour l'Eudragit® RL et 1/2/0,1 pour l'Eudragit®
RS. Par conséquent l'Eudragit® RL est plus perméable que l'Eudragit® RS, mais les deux sont
utilisés dans les applications à libération retardée pH-indépendante [163].

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 9. Structure chimique de l'Eudragit® RL
[162]</figcaption></figure>

Les Eudragit® ne sont pas biodégradables. Ils ne sont ni absorbés par la muqueuse intestinale, ni métabolisés *in vivo* mais éliminés sans biotransformation [164]. En fait, l'absence d'absorption de l'Eudragit® est en accord avec les exigences des organismes de réglementation (FDA, AESA) qui veut que les substances utilisées dans des formulations administrées *per os* de masse moléculaire supérieurs à 1000 g/mol soient très peu absorbées par le tractus gastro-intestinal [162].
### 5.2.2. Applications

Du fait de leurs excellentes propriétés de formation de films (liée à une grande flexibilité, les taux de transition vapeur/ eau faible et d'une forte capacité d'adsorption de pigments), les applications principales des Eudragit® dans l'industrie pharmaceutique est la libération de principe actif adaptée aux besoins ou leur protection de l'environnement en particulier l'humidité et la lumière [163].

Différentes familles d'Eudragit® sont proposées en fonction des applications (Tableau1):

* **Formulations entériques** : Les Eudragit® L et S assurent une augmentation de l'efficacité des médicaments du fait d':

- une libération du PA en fonction de pH, avec ciblage intestinal ou colique,

- une protection de PA sensibles au pH acide gastrique,

- une protection de la muqueuse gastrique contre des PA agressifs,

- une bonne stabilité au stockage.

* **Formulation protectrice** : L'Eudragit® E permet :

- une protection de PA sensible à l'humidité et la lumière,

- un masquage de goûts ou d'odeurs indésirables,

- une réalisation de surfaces lisses et brillantes et d'enrobages colorés de comprimés.

* **Formulations à libération prolongée** : Les Eudragit® RS et RL assurent une libération contrôlée du principe actif dans le temps.

Les principales indications des polymères d'Eudragit® sont des administrations de médicaments par voie buccale ou sublinguale, par voie vaginale, par voie transdermique, et la délivrance intestinale et colique de médicaments.
<table><caption>Tableau 1. Différentes formulations des Eudragit®</caption><thead><tr><th>Formulation</th><th>Nature du polymère</th><th>Composition élémentaire</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="3">Formulations entériques</td></tr><tr><td>Eudragit® L 30 D-55</td><td rowspan="6">Copolymères anioniques</td><td>Acide méthacrylique : groupe fonctionnel</td></tr><tr><td>Eudragit® L 100-55</td><td>Acide méthacrylique et acrylate d'éthyle</td></tr><tr><td>Eudragit® L 100</td><td rowspan="4">Acide méthacrylique et méthacrylate de méthyle dans un rapport molaire de 1/1 pour l'Eudragit® L, et de 1/2 pour l'Eudragit® S.</td></tr><tr><td>Eudragit® L 12.5</td></tr><tr><td>Eudragit® S 100</td></tr><tr><td>Eudragit® S 12.5</td></tr><tr><td>Eudragit® FS 30 D</td><td>Acrylate de méthyle, méthacrylate de méthyle et acide méthacrylique</td></tr><tr><td colspan="3">Formulation protectrice</td></tr><tr><td>Eudragit® E 100</td><td rowspan="3">Copolymères cationiques</td><td rowspan="3">Méthacrylate de diméthylaminoéthyle, de butyle et de méthyle.</td></tr><tr><td>Eudragit® E 12.5</td></tr><tr><td>Eudragit® E PO</td></tr><tr><td colspan="3">Formulations à libération prolongée</td></tr><tr><td>Eudragit® RL 100</td><td rowspan="8">Copolymères cationiques</td><td>Acrylate d'éthyle, méthacrylate de méthyle et contenu faible en ester de l'acide méthacrylique porteur de groupements ammonium quaternaire.</td></tr><tr><td>Eudragit® RL PO</td><td rowspan="8">Le rapport molaire de l'acrylate d'éthyle, du méthacrylate de méthyle et du méthacrylate d'éthyle triméthylammonium est d'environ : 1/2/0,2 pour l'Eudragit® RL et 1/2/0,1 pour l'Eudragit® RS.</td></tr><tr><td>Eudragit® RL 30 D</td></tr><tr><td>Eudragit® RL 12.5</td></tr><tr><td>Eudragit® RS 100</td></tr><tr><td>Eudragit® RS PO</td></tr><tr><td>Eudragit® RS 30 D</td></tr><tr><td>Eudragit® RS 12.5</td></tr><tr><td>Eudragit® NE 30 D</td><td rowspan="3">Copolymères neutres</td><td rowspan="3">Acrylate d'éthyle et méthacrylate de méthyle</td></tr><tr><td>Eudragit® NE 40 D</td></tr><tr><td>Eudragit® NM 30 D</td></tr></tbody></table>
### 5.2.1. Toxicité

Selon les autorités administratives (FDA, EMA), les évaluations des excipients ne sont généralement pas effectuées séparément des PA. Aucune ADI (Acceptable Daily Intake) n’est disponible pour les polymères d’Eudragit® en Europe ou aux Etats-Unis, mais les quantités maximum admissibles des excipients dans les formulations sont disponibles dans la base des données des ingrédients inactifs (http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm).

Les données toxicologiques fournies par Evonik sur l’Eudragit® RL et RS montrent une très faible toxicité aiguë tant orale que cutanée. En fait, Eudragit® RS est bien toléré lorsqu’il est administré à des chiens par gavage pendant 28 jours jusqu’à 1000 mg/kg de poids/jour, et de même à des rats pendant 26 semaines à des doses de 200, 500 et 1000 mg/kg de poids/jour (Life Science Research, England, 1986). Les polymères ne sont pas irritant pour la peau et les yeux des animaux de laboratoire (BSL Bioservice, Germany, 2001). Les résultats des tests de génotoxicité (test d’Ames, survenue de lymphome chez la souris, test du micronoyau) ne sont pas en faveur d’un pouvoir mutagène. Aucun effet cytotoxique n’a été observé (RCC-CCR, Germany, 2003).

Les études cliniques chez l’homme avec des formulations pharmaceutiques contenant de l’Eudragit® RL ou RS ont montré l’absence d’effets indésirables qui pourrait être liés à ces polymères. Ils ne sont pas dégradés dans le corps humain et sont insensibles à l’action des sucs gastriques et des enzymes digestives comme la pepsine, la trypsine, la chymotrypsine, l’amylase et la lipase. Cependant, l’administration à long terme de doses élevées d’Eudragit® RL et RS (>200 mg/kg/j) peut influencer l’absorption des aliments ainsi que l’équilibre de l’eau et des électrolytes [162].

### 5.2.2. Eudragit® et la nanotechnologie - Intérêt et toxicité

Du fait de ses propriétés et des différentes formes disponibles, l'Eudragit® est un bon candidat dans le domaine des NP en particulier :

* Formation de NP d'Eudragit® soit pour utilisations telles quelles soit pour les inclure dans des dispositifs médicaux comme les stents pour une libération prolongée de PA (Eudragit® S100 / [165])

* Ciblage colique de médicaments (Eudragit® FS 30/ [166]).
* Enrobage de NP pour éviter une libération brutale d'un PA.

* Protection d'un PA facile à dégrader ou insoluble ou non absorbé [167]

Les NP d'Eudragit® sont très utilisées en recherche thérapeutique, avec des applications aussi variées, et les travaux portent sur leur caractérisation, la détermination de la meilleure formulation, le mode de libération de PA, les effets biologiques de complexes NP/PA [167]. Cependant, peu d'études se sont intéressées à la toxicité des NP. Les données disponibles sur la toxicité des d'Eudragit® sont résumées dans le **Tableau 2** où sont précisées les informations sur le type d'Eudragit®, le PA utilisé, le modèle cellulaire ou animal et les tests utilisés, les doses testées et enfin les principaux résulats.

On peut remarquer en général que :

* La majorité des études ont été in vitro, seules 2 études in vivo en utilisant les souris comme modèle animal [184], [185].

* La totalité des études in vitro ont utilisé des lignées continues et se sont intéressées à la diminution de toxicité des molécules anticancéreuses après encapsulation.

* Le plus souvent seuls les tests de toxicité « classiques » (MTT surtout, LDH, BT) ont été utilisés pour mesurer la cytotoxicité, et seules 2 études ont étudié les mécanismes des effets cellulaires des NP d'Eudragit® [168], [143].

* La toxicité de NP vides est peu étudiée (seulement 3 études) [170], [168], [178]. La très grande majorité des études ont porté sur la comparaison des toxicités du PA seul ou encapsulé.

* Le mode d'internalisation des NP dans les cellules a été étudié mais dans le but d'en expliquer l'effet biologique et non de comprendre le mécanisme de cette internalisation.

* Deux études ont évalué la génotoxicité des NP préparées [167], [179].

En conclusion, les NP d'Eudragit® sont généralement dépourvues de cytotoxicité à des doses moyennes (jusqu'à 800-1000 µg/mL) et la toxicité est faible à forte dose (> 1000 µg/mL) sauf pour les NP/Eudragit® RS qui ont une forte toxicité (80%) à une dose de 400 µg/mL in vitro [103] et sont considérées comme dénuées d'effet toxique in vivo aux doses recommandées.
<table><caption>Tableau 2. Etudes portant sur la toxicité des nanoparticules d'Eudragit®</caption><thead><tr><td>Type de polymère</td><td>Principe actif</td><td>Modèle cellulaire / animal</td><td>Tests</td><td>Doses</td><td>Principaux résultats</td><td>Référence</td></tr></thead><tbody><tr><td>Eudragit® RLPO</td><td>GSNO</td><td>A10</td><td>MTT</td><td>3 mg/mL</td><td>Absence de toxicité pour les NP vides et chargées en GSNO</td><td>[169]</td></tr><tr><td>Eudragit® RLPO</td><td>GSNO</td><td>THP-1</td><td>WST-1, BT</td><td>De 6 à 200 µg/mL</td><td>Absence de toxicité<br>Augmentation de l'activité mitochondriale pour les NP chargées en GSNO / prolifération pour les NP vides</td><td>[91]</td></tr><tr><td>Eudragit® RLPO</td><td>Aucun</td><td>NR8383<br>THP-1</td><td>MTT, WST-1<br>BT</td><td>De 6 à 200 µg/mL</td><td>Faible toxicité (70% -200 µg/mL) pour NR8383 :<br>Absence de toxicité pour THP1 (prolifération)</td><td>[170]</td></tr><tr><td>Eudragit® E</td><td>Silibinin</td><td>KB</td><td>MTT<br>ERO<br>Apoptose<br>Test Comet</td><td>De 5 à 50 µg/mL</td><td>Toxicité dose-dépendante (NP chargées en PA)<br>Augmentation de ROS<br>Teste de génotoxicité positive</td><td>[167]</td></tr><tr><td>Eudragit® RS100/S100</td><td>Raloxifene</td><td>MCF-7</td><td>MTT<br>BT</td><td>Doses correspondant aux (1-5 µM) de PA</td><td>(85%) Faible toxicité à la dose correspondante 5µM de PA</td><td>[171]</td></tr><tr><td>Eudragit® RS100</td><td>Glycofurol</td><td>A-253</td><td>XTT</td><td>De 0.5 à 2 µM</td><td>Absence de toxicité</td><td>[172]</td></tr><tr><td>Eudragit® RS100</td><td>Aucun</td><td>HMEC184<br>MCF-7<br>MDA-MB-231</td><td>WST<br>BrdU</td><td>De 3 à 100 µg/mL</td><td>Absence de toxicité<br>prolifération avec niveau moins pour le MCF-7</td><td>[168]</td></tr><tr><td>Eudragit® L100-55</td><td>Oméprazole</td><td>Caco-2</td><td>MTT</td><td>De 25 à 800 µg/mL</td><td>Toxicité dose et temps dépendante (70%) pour 800 µg/mL</td><td>[173]<br>[174]</td></tr><tr><td>Eudragit® S100</td><td>Ovalbumine</td><td>Caco-2</td><td>MTT</td><td>De 0.05 à 2 mg/ml</td><td>Toxicité à partir de 1mg/ml (75%)</td><td>[175]</td></tr><tr><td>Eudragit® L100</td><td>Diclofenac Na</td><td>Caco-2</td><td>MTT</td><td></td><td>Faible toxicité >80%</td><td>[176]</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><td>Type de polymère</td><td>Principe actif</td><td>Modèle cellulaire / animal</td><td>Tests</td><td>Doses</td><td>Principaux résultats</td><td>Référence</td></tr></thead><tbody><tr><td>Eudragit® RSPO</td><td>+/- Héparine</td><td>NR8383</td><td>GSH/ERO<br>MTT/BT<br>Apoptose</td><td>De 25 à 400 µg/mL</td><td>Diminution de GSH<br>Augmentation d'ERO<br>Cytotoxicité dose dépendante (20% pour 400 µg/mL)</td><td>[143]<br>[103]</td></tr><tr><td>Eudragit® RL100<br>(seule ou mélangé avec PLGA)</td><td>CyclosporineA</td><td>L929</td><td>MTT</td><td>De 0.125 à 0.5 mg/ml</td><td>Absence de toxicité (&gt;80%)</td><td>[177]</td></tr><tr><td>Eudragit® S100</td><td>Aucun</td><td>VK2/E6E7<br>HeLa</td><td>MTT</td><td>De 0.01 à 1 mg/ml</td><td>Absence de cytotoxicité</td><td>[178]</td></tr><tr><td>Eudragit® S100</td><td>Curcumine</td><td>HT-29</td><td>MTT<br>Test comète</td><td></td><td>Absence de cytotoxicité et de génotoxicité</td><td>[36, 179]</td></tr><tr><td>Eudragit® RS100</td><td>Glutathion</td><td>HaCat<br>RAW264.7</td><td>MTT</td><td>0-500µg/mL</td><td>Absence de cytotoxicité</td><td>[180]</td></tr><tr><td>Eudragit® S100<br>(mélange avec PLGA)</td><td>Ténofovir/<br>Ténofovir diso-<br>proxil fumarate</td><td>VK2/E6E7<br>End1/E6E7</td><td>MTS, LDH</td><td>De 25 à 10000 µg/mL</td><td>Toxicité significative pour la plus forte concentration</td><td>[181]</td></tr><tr><td>Eudragit® S100<br>(enrobage de NP)</td><td>Cisplatine</td><td>HCT-116</td><td>Rouge neutre</td><td>De 0.01 à 1000 µg/mL</td><td>Toxicité dose et temps dépendante</td><td>[182]</td></tr><tr><td>NP d'Eudragit® RS<br>avec une couche de<br>Poly méthyl<br>méthacrylate PMMA</td><td>Métronidazole</td><td>Caco-2</td><td>MTT</td><td>De 25 à 800 mg/L</td><td>Absence de toxicité<br>85% pour les doses 400-800 mg/L</td><td>[183]</td></tr><tr><td>Eudragit® L 100-55<br>(enrobage des NP de PMMP)</td><td>Antigène (HIV-1<br>Tat)</td><td>Souris</td><td></td><td>60 µg/animal</td><td>Pas de toxicité chez l'animal</td><td>[184]</td></tr><tr><td>Eudragit® L 100-55<br>(enrobage des NP de PMMP)</td><td>Lysozyme<br>Trypsine<br>Antigène (HIV-1<br>Tat)</td><td>HL3T1<br>HeLa<br>MDDC<br>Souris</td><td>MTT</td><td>De 10 à 500 µg/mL</td><td>Absence de cytotoxicité (&gt; 80% pour 500 µg/mL)<br>Pas de toxicité chez l'animal</td><td>[185]</td></tr></tbody></table>
# Objectif de travail
L'EA 3452 développe des vecteurs synthétiques par préparation de NP polymériques vecteurs de médicaments, comme l'héparine de bas poids moléculaire et les donneurs de NO. Dans ce contexte, la plate-forme de toxicologie moléculaire de l'EA cherche à mieux comprendre les interactions NP / cellules. Ceci va plus loin qu'une simple étude de cytotoxicité, puisque l'on cherche à comprendre au mieux le mécanisme d'action des nanoparticules d'intérêt dans un modèle *in vitro*.

Objets de cette étude :

- NP d'Eudragit® vides et chargées en PA, S-nitrosoglutathion (GSNO).

- Des lignées monocytaires / macrophagiques.

Objectifs :

- Etude toxicologique de la réponse cellulaire aux NP et mieux comprendre les interactions NP / cellules par analyse génomique.

- Différentiation entre l'effet nanoparticulaire et l'effet GSNO.

- Effet thérapeutique du GSNO.
# Partie expérimentale
Le second chapitre de ce manuscrit est consacré à nos travaux expérimentaux. Ils sont présentés sous forme de trois articles, dans un ordre chronologique, chacun étant précédé d'une introduction et suivi d'une conclusion qui résume les principaux résultats obtenus et auxquels sont ajoutés éventuellement des données complémentaires (non publiées). Une quatrième partie est un projet d'article portant sur une analyse supplémentaire des résultats de l'article 2.

Dans un premier temps, nous avons étudié l'impact des NP vides sur deux modèles cellulaires (de rat et d'Homme) en termes de viabilité cellulaire en utilisant les tests de viabilité classique (MTT, WST, BT) et d'expressions des gènes par qRT-PCR.

Dans un second temps, nous avons étudié la viabilité cellulaire, l'internalisation de ces NP et l'expression des gènes ont été étudiées avec la seule lignée humaine après exposition à des NP vides ou chargées en PA, S-nitrosoglutathion (GSNO). Des NP marquées au Rouge Nil ont été utilisées pour montrer l'internalisation des NP par CMF et la microscopie de confocale. L'analyse globale d'expression des gènes a été réalisée à partir de puces à ADN d'Agilent à l'aide de plusieurs logiciels et de bases des données.
# 1. *Article 1*. Viability and gene expression responses to polymeric nanoparticles in human and rat cells

Des études antérieures pour évaluer les effets des NP de l'Eudragit® RS PO ont été menées dans notre groupe sur la lignée de macrophages alvéolaires de rat NR8383 d'une part [103] et sur les cellules épithéliales humaines HMEC de l'autre [168]. Des résultats opposés ont été obtenus : une toxicité mitochondriale et une induction de l'autophagie avec les macrophages de rat et une stimulation de l'activité mitochondriale avec les cellules épithéliales humaines. Cette différence de réponse pouvait être liée au fait que ces deux études avaient été menées dans deux laboratoires différents, avec deux protocoles expérimentaux différents. Nous avons donc décidé de reprendre ce travail et nous avons comparé l'exposition de deux lignées monocytaires / macrophagiques, une de rat (NR8383) et l'autre humaine (THP-1) à des NP d'Eudragit® RL PO en respectant les mêmes conditions (culture, concentrations utilisées et temps d'exposition). Cette dernière nanoformulation, peu différente chimiquement de la forme RS PO, a été mise au point dans l'EA 3452 pour encapsuler des principes actifs aussi différents que l'héparine et le S-nitrosoglutathion (GSNO) et avec ce dernier composé, c'est le polymère Eudragit® RL PO qui a permis d'obtenir le meilleur taux d'encapsulation. Le choix des modèles de lignées monocytaires / macrophagiques était justifié du fait de l'utilisation courante de ces cellules pour l'évaluation de la cytotoxicité de NP. En effet, en raison de leur capacité à traverser les barrières physiologiques, de leur activité phagocytaire, et de leur potentiel métabolique, les macrophages jouent un rôle essentiel dans la détermination du devenir des particules étrangères au sein de l'organisme dans le cadre de la réponse immunitaire innée.

La viabilité cellulaire a été déterminée après 24 h d'exposition aux NP par la mesure de l'activité de la succinate déshydrogénase mitochondriale avec les tests au MTT et au WST-1. La croissance des cellules a été évaluée avec le test au bleu trypan. L'expression précoce (après 4 h d'exposition aux NP) de neuf gènes impliqués dans des voies de souffrance cellulaire a été évaluée par RT-qPCR : *NCF1* (stress oxydant), *NFKB*, *TNFA*, *IL6* et *IL1B* (inflammation), *ATG16L* (autophagie) et *PDCD4*, *BCL2*, et *CASP8* (équilibre apoptotique).
# Viability and gene expression responses to polymeric nanoparticles in human and rat cells

Carole Ronzani · Ramia Safar · Roudayna Diab · Jérôme Chevrier · Justine Paoli · Mosaad A. Abdel-Wahhab · Alain Le Faou · Bertrand H. Rihn · Olivier Joubert

Received: 4 December 2013 / Accepted: 1 April 2014 / Published online: 21 April 2014
© Springer Science+Business Media Dordrecht 2014

**Abstract** Applications of polymeric nanoparticles (NP) in medical fields are rapidly expanding. However, the influence of polymeric NP on cell growth and functions is widely underestimated. Therefore, we have studied cell and polymeric NP interactions by addressing two cell types with two endpoints (viability and gene expressions). Rat NR8383 and human THP-1 monocytic cell lines were exposed to 6 to 200 µg/mL of Eudragit® RL NP for 24 h, and cellular viability was estimated using MTT, WST-1, and trypan blue tests. A decrease of viability was observed with NR8383 cells (down to 70 % for 200 µg/mL), and on the contrary, an increase with THP-1 cells (up to 140 % for 200 µg/mL). Differential expression of genes involved in oxidative damage

(NCF1), inflammation (NFKB, TNFA, IL6, IL1B), autophagy (ATG16L), and apoptotic balance (PDCD4, BCL2, CASP8) was analyzed. ATG16L, BCL2, and TNFA were up-regulated in NR8383 cells, which are consistent with an induction of autophagy and inflammation. On the other hand, NCF1, NFKB, and IL1B were down-regulated in THP-1 cells, which may contribute to explain the increase of cellular viability. Our results show that (1) the toxic potency of NP is dependent on the cellular model used and (2) mechanistic toxicology should be the corner stone for the evaluation of NP hazard.

**Keywords** Autophagy · Inflammation · Macrophages · Oxidative stress · Polymeric nanoparticles · Toxicogenomic

## Introduction

The aim of the nano-packaging of drugs is to improve their biodistribution and to reduce their toxicity by increasing their therapeutic index (Kumari et al. 2010). Eudragit®, a non-biodegradable polycationic copolymer of acrylic and methacrylic acid esters bearing quaternary ammonium groups, is insoluble at physiologic pH and of limited swelling. It is then a good vehicle for drug dispersion. Eudragit® is available in various subtypes, including Eudragit® RS and RL, which differ slightly by their physicochemical characteristics. Eudragit® RS or Eudragit® RL nanoparticles (NP) containing low-

Ronzani Carole and Safar Ramia contributed equally to this work.

C. Ronzani · R. Safar · R. Diab · A. Le Faou · B. H. Rihn · O. Joubert (✉)
Faculté de Pharmacie, EA 3452 CITHÉFOR,
Université de Lorraine, 5 rue Albert Lebrun, 54000 Nancy,
France
e-mail: olivier.joubert@univ-lorraine.fr

J. Chevrier · J. Paoli
Faculté de Médecine, Service Commun de Microscopie,
Université de Lorraine, Nancy, France

A. Le Faou
Faculté de Médecine de Nancy, Université de Lorraine,
Nancy, France

M. A. Abdel-Wahhab
Food Toxicology & Contaminants, Department National
Research Center, Cairo, Egypt
molecular-weight heparin (Jiao et al. 2002) or cyclo-
sporine (Ubrich et al. 2005) have been tested per os
in vivo. Due to their positive charges, Eudragit® RS
and RL NP persist on the corneal surface which permit
a prolonged ocular release of drugs such as ibuprofen
(Pignatello et al. 2002).

Deleterious effects of NP on cells and organisms
have been described (Stone and Donaldson 2006). The
biological activity of nanomaterials cannot be extrapo-
lated straightforwardly from their chemical and physical
properties. The mechanism of nanomaterial toxicity is
only partially elucidated, and it is possible that more
than one is involved such as oxidative stress, inflamma-
tory response, apoptosis, and autophagy (De Stefano
et al. 2012). Elucidating the molecular mechanisms by
which nanosized particles induce activation of cell sig-
naling pathways is a critical issue before any clinical
application to be put into practice. For this purpose,
toxicogenomic and transcriptomic studies are recom-
mended, and national and supranational regulatory
agencies have proposed to conduct, as far as possible,
mechanistic studies using gene expression assays
(Claude 2009; National Research Council US 2007).

In this context, previous studies in our group to
evaluate the effects of Eudragit® RS NP have been
conducted on macrophage rat cells on one side (Eidi
et al. 2010) and epithelial human cells on the other
(Hussien et al. 2013). Discrepant results have been
obtained with these two cell lines with autophagy on
rat macrophage and a stimulatory effect on human epi-
thelial cells. As these studies have been conducted in
two different locations, differences in exposure condi-
tions may have modified the responses (Monopoli et al.
2012).

Thus, to eliminate such a confounding factor, we
have undertaken a comparison of exposition to NP of
Eudragit® RL PO (ENP) on two monocytic/
macrophagic cell lines, one of rat (NR8383) and the
other of human (THP-1) exactly in the same conditions.
This novel nanoformulation was already in use in our
research team. The choice of monocytic/macrophagic
cell models is justified by their current use for the
evaluation of NP cytotoxicity (Lanone et al. 2009;
Oberdorster et al. 2005). Indeed, because of their capac-
ity to cross physiological barriers, phagocytic activity,
and metabolic potential, macrophages play a crucial role
in determining the biopersistence of foreign particles
and in the innate immune response. For this study, we
have evaluated cell viability using the measure of

NAD(P)H-dependent cellular oxidoreductase enzymes activity using both the MTT and WST-1 tests which may give different results and cell growth with trypan blue (Eidi et al. 2010). The early expression (at 4 h) of nine relevant genes involved in the pathways leading to toxicity was assessed: oxidative stress (NCF1), inflammation (NFKB, TNFA, IL6, IL1B), autophagy (ATG16L), and apoptotic balance (PDCD4, BCL2, CASP8).

**Materials and methods**

Reagents

Eudragit® RL PO (MW=150,000 Da [CAS number: 33434-24-1]) was a gift from Evonik Polymers (Darmstadt, Germany). Pluronic F68 [11104-97-5] was from Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France). RPMI 1640 medium was from GIBCO (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), DMEM from PAA Laboratories (GE Healthcare, Vélizy-Villacoublay, France), and fetal bovine serum from Eurobio (Eurobio, Les Ulis, France). Penicillin [113-98-4], streptomycin [128-46-1], amphotericin B [1397-89-3], L-glutamine [78354-52-6], 3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) [57360-69-7], and trypan blue solution were from Sigma Aldrich. 4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1) was from Roche Applied Sciences (Penzberg, Germany).

Cell culture

Human THP-1 (ATCC®, TIB-202™, Manassas, VA, USA) non-adherent monocyte cell line was grown in RPMI 1640 medium. The NR8383 rat cell line (ATCC®, CRL 2192™) with a 50 % adherent and 50 % floating cell phenotype was grown in DMEM supplemented with 2 mM of L-glutamine. To both culture media, 10 % of heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U/mL of penicillin, 100 µg/mL of streptomycin, and 0.25 µg/mL of amphotericin B were added. Cells were grown at 37 °C under 5 % CO₂ atmosphere and split every 3 days.

Preparation of ENP

ENP were prepared using the double emulsion/solvent
evaporation technique from three phases according to
Bodmeier et al. (1991) with slight modifications. In brief, the internal aqueous phase consisted of 0.5 mL of 0.1 % aqueous solution of Pluronic® F68 (w/v). The organic phase was a 10 % solution (w/v) of Eudragit® RL PO in 5 mL of dichloromethane (Laurylab, Saint Fons, France). The external aqueous phase consisted of 20 mL of 0.1 % Pluronic® aqueous solution. The primary water/oil emulsion was prepared by sonication using a 3-mm probe (Vibracell 75022, Bioblock, Illkirch, France) at 40 % maximal amplitude for 1 min. This primary emulsion was put into the external aqueous phase, and a secondary emulsification was carried out by sonication using a 6-mm probe (Vibracell 75022, Bioblock) at 80 % maximal amplitude for 30 s leading to a double water/oil/water emulsion. The dichloromethane was eliminated using a rotary evaporator (R-144, Büchi, Flawil, Switzerland) at 100 rpm for 10 min. ENP were collected by ultracentrifugation (Beckman, Miami, FL, USA) at 186,000×g for 30 min. The pellet was suspended by mechanical agitation in the medium used for experimentations.

## Characterization of ENP

The hydrodynamic diameter and size distribution of ENP, expressed as polydispersity index (Pdl), were measured using dynamic light scattering (DLS; Zetasizer™ 3000E, Malvern Instruments Worcestershire, UK) and were calculated from the number distribution graph. Zeta potential was calculated using the Smoluchowski's equation (Sze et al. 2003). All measurements were performed in triplicate at 25 °C.

For transmission electron microscopy (TEM), a drop of ENP suspension was deposited onto a carbon-coated copper grid, and after drying, it was negatively stained by uranyl acetate 3 % in bidistilled water. Preparations were observed with a CM12 microscope (Philips, Eindhoven, The Netherlands) operated at 80 kV. ENP diameter was determined on 114 round objects. For scanning electron microscopy (SEM), a drop of ENP suspension was deposited on a plastic cover slip and let to dry (Thermanox® 174950, Merck Eurolab, Strasbourg, France). The cover slips were then coated under a vacuum with gold-palladium for 100 s (Polaron SC7640, Thermo VG Scientific, England). Preparations were observed with a Stereoscan 240S/N, (Léo, Rueil-Malmaison, France) at 15 kV.

## Evaluation of cell viability

Cells were seeded in 96-well plates with 5×10³ cells per well. After overnight incubation, plates were centrifuged (300×g, 20 min), and the medium was removed by aspiration. Fresh medium was added, and cells were incubated for 24 h with 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, and 200 µg/mL of ENP. Six wells were used per culture condition, and experiments were repeated thrice. After 24 h, the cell viability was checked using MTT and WST-1 assays, performed according to manufacturer's protocols. Absorbance was measured at 540 and 450 nm with reference wavelengths of 690 and 620 nm, respectively. Numbers of dead and alive cells were estimated by microscopy (objective ×40) in Glasstic® Slides 10 (Kova International, Garden Grove, CA) using trypan blue.

## Gene expression analysis by real-time PCR (qRT-PCR)

Expression of the following genes by rat cells and their counterpart by human cells was measured: neutrophil cytosolic factor 1 (NCF1), nuclear factor kappa B (NFKB), autophagy related 16-like (ATG16L), programmed cell death 4 (PDCD4), B-cell CLL/lymphoma 2 (BCL2), caspase 8 (CASP8), tumor necrosis factor-alpha (TNFA), interleukin 1 beta (IL1B), and interleukin 6 (IL6). Total RNA was extracted from 1.5×10⁶ THP-1 and NR8383 cells unexposed or exposed for 4 h to 50 and 200 µg/mL of ENP by TRIzol® Reagent (Invitrogen, La Jolla, CA). RNA purity and degradation were checked by spectrophotometry using BioSpec-nano (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan) and capillary electrophoresis using RNA 6000 Nano® kit and the Bioanalyzer™ 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). The complementary DNA (cDNA) synthesis was performed with 100 ng of total RNA using the iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France) following the manufacturer's protocol. Gene expressions were determined by qRT-PCR with the iQ™ SYBR Green® Supermix (Bio-Rad) in a Stratagene Mx3000p system (Agilent Technologies). Briefly, 4 µL of each cDNA sample was amplified in a PCR reaction (final volume of 20 µL) containing 10 µL of PCR reagent and 300 nM of each two primers (Tables 1 and 2). For all the samples, the following conditions were used: an initial heat-denaturing step at 95 °C for 5 min followed by 40 cycles of 95 °C for 15 s, annealing at 60 °C for 40 s, and elongation and signal
<table><caption>**Table 1** Primers used for gene expression analysis in NR8383 rat cells</caption><thead><tr><th>Functional class</th><th>Gene</th><th>Sequence</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>RPL13 (internal control)</td><td>F: 5'-CCCTCCACCCTATGACAAGA-3'<br>R: 5'-GGTACTTCCACCCGACCTC-3'</td></tr><tr><td>Oxidative stress</td><td>NCF1</td><td>F: 5'-CTTGTAATTCCCGCATTGCT-3'<br>R: 5'-GCCTCGTATGTCTTTGATGC-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>NFKB</td><td>F: 5'-TTCGGAACTGGGCAAATGTT-3'<br>R: 5'-ACACGTAGCGGAATCGAAAT-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>TNFA</td><td>F: 5'-TAGCCCATGTTGTAGCAAACC-3'<br>R: 5'-GATGGCAGAGAGGAGGTTGA-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>IL1B</td><td>F: 5'-AGCAGCTTTCGACAGTGAGG-3'<br>R: 5'-AAAGAAGGTGCTTGGGTCCT-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>IL6</td><td>F: 5'-TAGTCCTTCCTACCCCAACTTCC-3'<br>R: 5'-GGTTTGCCGAGTAGACCTCA-3'</td></tr><tr><td>Autophagy</td><td>ATG16L</td><td>F: 5'-CTTGTAATTCCCGCATTGCT-3'<br>R: 5'-GCCTCGTATGTCTTTGATGC-3'</td></tr><tr><td>Apoptosis</td><td>PDCD4</td><td>F: 5'-GGTGTGCCCGTGTTGGCAGT-3'<br>R: 5'-GGCCCACCAATCGTGGTGCT-3'</td></tr><tr><td>Apoptosis</td><td>BCL2</td><td>F: 5'-GAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3'<br>R: 5'-GCATCCCAGCCTCCGTTAT-3'</td></tr><tr><td>Apoptosis</td><td>CASP8</td><td>F: 5'-GGTTTCTGCCTACAGGGTTA-3'<br>R: 5'-TCGTAATCGTCGATCCTTCC-3'</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Table 2** Primers used for gene expression analysis in THP-1 human cells</caption><thead><tr><th>Functional class</th><th>Gene</th><th>Sequence</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>ACTB (internal control)</td><td>F: 5'-TTGGCAATGAGCGGTTC-3'<br>R: 5'-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3'</td></tr><tr><td>Oxidative stress</td><td>NCF1</td><td>F: 5'-AGAGTACCGCGACAGACATC-3'<br>R: 5'-TAGTTGGGCTCAGGGTCTTC-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>NFKB</td><td>F: 5'-CAGCCCCAGAAACAGCTGAT-3'<br>R: 5'-ACCAGGTCCACCTCGATCTT-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>TNFA</td><td>F: 5'-TAGCCCATGTTGTAGCAAACC-3'<br>R: 5'-GATGGCAGAGAGGAGGTTGA-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>IL1B</td><td>F: 5'-TGAAGTGCTCCTTCCAGGAC-3'<br>R: 5'-TCGTTATCCCATGTGTCGAA-3'</td></tr><tr><td>Inflammation</td><td>IL6</td><td>F: 5'-CAATTCTGGTATTCTTTCCCA-3'<br>R: 5'-GCAAGTCTCCTCATTGAATCC-3'</td></tr><tr><td>Autophagy</td><td>ATG16L</td><td>F: 5'-TTTGGGAGACGCTCTGTCTC-3'<br>R: 5'-AGTAACCGGGAACCTGGACT-3'</td></tr><tr><td>Apoptosis</td><td>PDCD4</td><td>F: 5'-AGACCAAATGAAAAGAGGTTATGAG-3'<br>R: 5'-GCCCCTTGAAGGACAAAGAT-3'</td></tr><tr><td>Apoptosis</td><td>BCL2</td><td>F: 5'-GAGGATTGTGGCCTTCTTTG-3'<br>R: 5'-GCATCCCAGCCTCCGTTAT-3'</td></tr><tr><td>Apoptosis</td><td>CASP8</td><td>F: 5'-GAAAGGGTGGAGCGGATTAT-3'<br>R: 5'-GCTTCCTTTGCGGAATGTAG-3'</td></tr></tbody></table>
acquisition at 72 °C for 40 s. To confirm the amplification of specific transcripts, melting curve profiles were produced at the end of each reaction, and if two or more peaks were present, the corresponding results were excluded. Water was used for negative controls for each PCR run. For each gene, amplifications were performed from three independently prepared samples. Gene expression levels were normalized by comparison to ribosomal protein L13 (RPL13) and actin, beta (ACTB) housekeeping genes, used as references for NR8383 and THP-1, respectively. Fold changes (FC) of gene expression were calculated by $2^{-\Delta\Delta C_t}$ method (Peirson et al. 2003).

## Statistical analysis

Particle size and cell viability data are presented as means±standard deviation or standard error of the mean (SE), respectively. For the latter, statistical differences were determined by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey-Kramer test, using the RLPlot software™. Regarding qRT-PCR, FC were calculated by the ratio exposed/unexposed cells, and results were expressed as means±SE. Statistical differences between control and exposed cells were determined by ANOVA followed by Dunnett's test.

## Results

### Nanoparticle characterization

The mean hydrodynamic diameter of ENP as determined by DLS from three independent preparations is 185±70 nm with a polydispersity index of 0.190±0.023. The zeta potential was +56±3 mV. ENP appeared as round bodies in SEM (Fig. 1a) and TEM (Fig. 1b) with an average diameter of 142±60 nm. The difference between these two values can be explained by both the difference between hydrodynamic (with ions) and physical diameter (no water), as well as a shrinking of the particles due to desiccation by the treatment before TEM observation (Wu et al. 2005).

### Cell viability

ENP exposure for 24 h decreased the viability of NR8383 cells in a dose-dependent manner with both MTT and WST-1 tests (Fig. 2a, b) down to 70% of the

control for 200 µg/mL. In parallel, a significant decrease in the number of NR8383 rat cells (down to 70% of control after exposition to 200 µg/mL) was observed with the trypan blue test (Fig. 2c). In contrast, under the same conditions, a dose-dependent increase in cellular viability of THP-1 human cells up to 140% was observed with MTT (Fig. 2a) and of 130% with WST-1, although a plateau was reached at 12.5 µg/mL (Fig. 2b). In parallel, a dose-dependent increase in the growth of THP-1 human cells was evident with the trypan blue test reaching 160% of the control for the highest concentration of ENP (Fig. 2c).

### Gene expression analysis

After 4 h, pro-autophagic *ATG16L* and anti-apoptotic *BCL2* genes were significantly up-regulated in rat cells. On the contrary, pro-apoptotic *PDCD4* was significantly down-regulated, but no significant change in *NCF1*, *NFKB*, *IL1B*, and *CASP8* expression was observed (Fig. 3a and Table 3). In human cells, *NCF1*, *NFKB*, and *IL1B* were down-regulated, while expression of *ATG16L* and *CASP8* was not significantly modified, and *PDCD4* and *BCL2* were only moderately down-regulated (Fig. 3b and Table 3). The only common results were for *TNFA* which was significantly up-regulated in both cell lines, while *IL6* was not expressed. In most cases, the expressions of genes were more pronounced whether up or down for exposition to 200 or 50 µg/mL, respectively. The only exceptions were expressions of *TNFA* and *BCL2* in NR8383 cells significantly higher for the low concentration.

## Discussion

When exposed to ENP, the rat and human cell lines behave differently in terms of viability, growth, and gene expression. An identical reduction of viability and growth by ENP of NR8383 has been also observed with the chemically related polymeric Eudragit® RS NP which were of a lower zeta value and of a smaller size because of preparation by nanoprecipitation (Eidi et al. 2010). However, these NP have a stimulatory effect on human mammary epithelial cells (Hussien et al. 2013) just as the one we have observed in our THP-1 model. The interactions of NP with cells involve complex phenomena as chemical composition, charge, size of NP, and the cellular model used play a role. For example,
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Fig. 1** Electron microscopy of ENP. **a** SEM, particles appear as spherical structures of dispersed diameter. **b** TEM, some round structure present a clear center which may correspond to a cavity</figcaption></figure>

aluminum metal NP exhibit greater toxicity than aluminum oxide NP (Wagner et al. 2007), positive polyethylene glycol polymeric NP were more cytotoxic than the neutral and negative ones (Bhattacharjee et al. 2013), and the smaller TiO₂ NP (55 versus 321 nm) were the most toxic (Scherbart et al. 2011); all these three results obtained on NR8383. As in the last study, NP size is of importance, as small gold NP (25 nm) enter HeLa cells and are cytotoxic, while large aggregates adhere to the cell surface and cause an increase in cell growth (Cui et al. 2012). However, the mechanism of the induction of cell proliferation by NP is not well known, and Hussien et al. (2013) have proposed three modes of action: (1) binding to cluster of cells and inducing an arrangement in an epithelium-like structure, (2) binding to NP of proteins of the culture medium (e.g., growth factors) which are brought to the cell surface, and (3) increase of the mitochondrial volume (Hussien et al. 2013). Targeted cells, considering either the tissue or the species they come from, react differently to contact with NP. Toxicity of polyethylene glycol polymeric NP and fullerenes C₆₀ differed as being less toxic for NR8383 rat macrophage than for phagocytic cells (coelomocytes) of *Lumbricus rubellus* (van der Ploeg et al. 2014). In the same way, coelomocytes from *Eisenia fetida* were more sensitive to silver NP than THP-1 cells (Hayashi et al. 2012). It has also been observed that mouse macrophage (RAW 264.7) and human lung epithelial (BEAS-2B) were more sensitive to cationic polystyrene nanospheres than human microvascular endothelial (HMEC), mouse hepato-ma (HEPA-1), or rat pheochromocytoma (PC-12) cell lines (Xia et al. 2008).

In NR8383, ENP toxicity may be related to an induced oxidative stress (Nel et al. 2006). Interaction of reactive oxygen species (ROS) with lipids, proteins, or

DNA may explain cytotoxic effects of NP. Such an oxidative stress could activate specific signaling pathways, including MAP kinases and transcription factors sensitive to the redox potential as NF-κB, leading to the synthesis of pro-inflammatory cytokines. This may explain the increase in the expression of *TNFA*, even if no change was found in the expression of *NFKB* and *IL1B*. However, one would have expected a change in *NCF1* expression, which was not the case (Fig. 3a). Thus, the oxidative stress may not be responsible for the toxicity of ENP to NR8383. On the contrary, the downregulation of *PDCD4* (pro-apoptotic gene) and the activation of *BCL2* (anti-apoptotic gene) and *ATG16L* (autophagic gene) may indicate that the toxicity of ENP is expressed through autophagy. Indeed, an inverse relationship between an activation of the genes involved in autophagy and a repression of those involved in apoptosis may correspond to a switch from apoptosis to autophagy (Luo and Rubinsztein 2007; Shimizu et al. 2004). As Eidi et al. (2012), who used Eudragit® RS NP, we have observed an overexpression of *ATG16L* and a downregulation of *PDCD4* in NR8383 in favor of a cytotoxicity autophagy mediated, which has been also described with manganese (Ngwa et al. 2011) or gold (Ma et al. 2011) NP.

Growth stimulation of THP-1 after ENP exposure is correlated with a different expression profile of the chosen genes. As expected, anti-apoptotic (*BCL2*), pro-apoptotic (*PDCD4*, *CASP8*), and autophagy related (*ATG16L*) genes were either poorly or moderately under-expressed. The downregulation of *NCF1* could prevent antioxidant activity in THP-1, thus permitting an increase in cellular viability and growth. The downregulation of *NFKB* and *IL1B* may also impact cell stimulation. These results are in line with those of Niu et al. (2011) who showed an inhibition or an absence of
**Fig. 2** Incidence of ENP exposure on NR8383 and THP-1 cell viability (a MTT test, b WST-1 test) and growth (c trypan blue assay). Data are expressed as mean±SE of three replicates. The statistical analysis was performed on the results from NR8383 on one hand, and on the results from THP-1 on the other hand. Groups not sharing the same letter (a and b for NR8383; c and d for THP-1) are different at the 95 % level (ANOVA following Tukey-Kramer method)

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

activation of *NFKB* as well as *IL1B* in cardiomyocytes pretreated with cerium oxide NP after exposition to cigarette smoke extracts (Niu et al. 2011).

The TNF-α cytokine initiates various cellular responses through distinct signal transduction pathways (Xiong et al. 2013). The overexpression of *TNFA* is
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Fig. 3** Gene expression changes in response to ENP exposure of a NR8383 rat cells and b THP-1 human cells. Cells have been exposed to 50 and 200 µg/mL of ENP for 4 h. Results were presented as fold change as compared to control±SE using ANOVA followed by Dunnett's test</figcaption></figure>

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Table 3** Gene expression changes in response to ENP exposure of NR8383 and THP-1</figcaption></figure>

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="2">NR8383</th><th colspan="2">THP-1</th></tr><tr><th>50 µg/mL</th><th>200 µg/mL</th><th>50 µg/mL</th><th>200 µg/mL</th></tr></thead><tbody><tr><td>NCF1</td><td>1.05±0.12</td><td>0.88±0.11</td><td>0.89±0.02*</td><td>0.67±0.06***</td></tr><tr><td>NFKB</td><td>1.07±0.14</td><td>0.91±0.04</td><td>0.89±0.05**</td><td>0.38±0.05***</td></tr><tr><td>IL1B</td><td>0.79±0.24</td><td>0.58±0.17</td><td>0.67±0.12*</td><td>0.23±0.07***</td></tr><tr><td>ATG16L</td><td>1.20±0.06*</td><td>1.24±0.11**</td><td>1.14±0.07</td><td>1.07±0.07</td></tr><tr><td>PDCD4</td><td>0.73±0.07***</td><td>0.52±0.05***</td><td>1.02±0.05</td><td>0.80±0.12*</td></tr><tr><td>BCL2</td><td>1.91±0.45**</td><td>1.50±0.10</td><td>0.83±0.11</td><td>0.76±0.10*</td></tr><tr><td>CASP8</td><td>1.14±0.25</td><td>0.95±0.16</td><td>1.16±0.15</td><td>0.80±0.12</td></tr><tr><td>TNFA</td><td>1.58±0.04***</td><td>1.27±0.12**</td><td>1.31±0.05**</td><td>1.52±0.14***</td></tr><tr><td>IL6</td><td>Unexpressed</td><td>Unexpressed</td><td>Unexpressed</td><td>Unexpressed</td></tr></tbody></table>

Cells have been exposed to 50 and 200 µg/mL of ENP for 4 h. Results are presented as fold change as compared to control ± SE. Statistically significant differences at * *P* < 0.05, ** *P* < 0.01, *** *P* < 0.001 when compared to control as determined by ANOVA followed by Dunnett's test
puzzling as it has been observed with either
growth inhibition (NR8383) or activation (THP-
1). However, such different expressions under dif-
ferent conditions have been already reported. The
cytotoxicity of polyethylene glycol polymeric NP
was accompanied by an increase of TNF-α pro-
duction in NR8383 and Caco-2 human intestinal
cells (Bhattacharjee et al. 2012). On the contrary,
although PLGA NP did not trigger a significant
toxicity in RAW 264.7 mouse macrophages, an
induction of TNF-α was the initial response to
its exposure.

Such differences in cellular and molecular responses
between NR8383 and THP-1 exposed to the same ENP
was not completely unexpected, as it is in accordance
with previous results (Eidi et al. 2010; Hussien et al.
2013). These two cell lines, besides originating from
different species, do not have the same phenotype, as
THP-1 are non-adherent cells, whereas NR8383 exhibit
as 50 % of adherent and 50 % of non-adherent cells
whatever culture conditions and thus cannot be separat-
ed. Although NR8383 and THP-1 do have both the
capacity to internalize ENP (data not shown), the mech-
anism of penetration of NP and if it contributes to
differences in the activation of signaling pathways is
not known.

Conclusion

Marked physiological and metabolic differences were
observed between the responses of rat NR8383 and
human THP-1 to an exposition to ENP. For the former,
ENPs are clearly cytotoxic likely by induction of au-
tophagy, while for the latter, a cell stimulation is ob-
served. These results point out the utmost importance of
the choice of a cell model for in vitro evaluation of NP
toxicity. A more complete understanding of the meta-
bolic processes involved in response to NP is necessary
if utilization in vivo is to be anticipated. For this pur-
pose, analysis of the complete transcriptome would be
very valuable.

**Acknowledgments** This work was supported by the Agence Nationale de la Recherche (ANR NanoSNO). Ramia Safar is the recipient of a PhD grant from the Ministry of Higher Education of Syria.

**Conflicts of interest** The authors declare no conflict of interest.

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## 1.1. Résultats et conclusion

Les NP utilisées dans cette étude sont des objets sphériques d'un diamètre moyen de 186 ±70 nm tels que déterminés par microscopies électroniques à balayage (MEB) et à transmission (MET). Leur charge, mesurée par DLS, est positive (+56 ±3 mV). En revanche, la taille des NP dans le milieu de culture complémenté par le SVF a augmenté et sont devenues micrométriques (1,5 – 2 µm), cela n'était pas observé avec le milieu de culture sans SVF.

Les NP pénètrent dans les deux types de cellules étudiées et sont présentes dans le cytoplasme aussi bien des NR8383 que des THP-1 comme le montrent les images de microscopie électronique à transmission (Figure 10) (l'image de THP-1 a été publiée dans l'article 2).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 10. Localisations intracytoplasmiques des nanoparticules d'Eudragit® RL PO Cellules NR8383 et THP-1 ; Microscopie électronique à transmission
En haut : contrôles ; en bas : après exposition à 200 µg/mL de NP pendant, 2 h</figcaption></figure>
Les NP entraînent une diminution de la viabilité des NR8383 (jusqu'à 70 % pour 200 µg/mL) et, au contraire, une augmentation de la viabilité et de la croissance des THP-1 (jusqu'à 140 % pour 200 µg/mL).

Dans les cellules NR8383, la surexpression de *BCL2* et la sous-expression de *PDCD4* sont en faveur d'une répression de l'apoptose. Au contraire, l'augmentation de l'expression d'*ATG16 L* est compatible avec une induction de l'autophagie. D'autre part, la sous-expression de *NCF1*, *NFKB* et *IL1B* dans les cellules THP-1 peut contribuer à expliquer l'augmentation de la viabilité et de la croissance cellulaires. Ces résultats indiquent que la toxicité et l'activation cellulaire *in vitro* en réponse à l'exposition aux NP sont dépendantes du modèle cellulaire utilisé. Du fait de la confirmation des résultats précédemment obtenus et plus précisément de l'effet toxique des NP sur les cellules NR8383, la poursuite de l'étude s'est limitée à la lignée THP-1 qui est d'origine humaine et pour lesquelles, comme pour les cellules épithéliales HMEC, les NP n'ont qu'un effet toxique limité. Afin de mieux comprendre les processus métaboliques impliqués dans la réponse aux NP, l'étude des mécanismes d'internalisation et des analyses transcriptomiques ont été entreprises.
## 2. Article 2. Human monocyte response to S-nitrosoglutathione-loaded nanoparticles: uptake, viability and transcriptome

Ce travail avait pour objectif de comparer les réponses des cellules THP-1 aux NP utilisées dans l'étude précédente vides ou chargées en GSNO, molécule qui est donneur d'oxyde nitrique (•NO) qui a été retenu pour les travaux au sein de l'EA 3452. Notre étude a porté sur les tests de viabilité, mais aussi sur les mécanismes de pénétration des NP dans la cellule et l'analyse des transcriptomes avec les puces à ADN « microarrays ».

### 2.1. Oxyde nitrique

L'oxyde nitrique (•NO) est un radical, molécule spontanément très réactive en particulier avec l'oxygène et l'azote. A l'état gazeux, il est utilisé en clinique pour le traitement du syndrome de détresse respiratoire et de l'hypertension pulmonaire persistante du nouveau-né [186]. Dans l'organisme, il est impliqué dans des nombreuses voies de signalisation physiologiques et physiopathologiques. Il est produit par plusieurs types cellulaires comme les macrophages, les hépatocytes, les cellules endothéliales et les neurones. Libéré par les macrophages activés, le •NO a un rôle clé dans la défense contre les cellules tumorales et les agents pathogènes, bactéries, virus et parasites [187]. Une diminution de production de •NO est observée au cours du vieillissement et de nombreuses conditions pathologiques, comme le diabète, la fibrose hépatique, les maladies cardiovasculaires, les maladies neurodégénératives et plusieurs cancers [188].

Du fait de ses propriétés, •NO a de multiples utilisations potentielles en thérapeutique (cardiaque, vasculaire...). Cependant, une administration systémique de •NO n'est pas envisageable du fait de sa très courte demi-vie (1-5 s) [188], [189]. Aussi, les travaux actuels portent-ils sur l'utilisation de molécules qui libèrent le •NO, mais celles-ci sont elles-mêmes instables. Pour les protéger et assurer une libération retardée et continue de •NO, leur encapsulation dans des nanoparticules est la principale option retenue [190], [191].

Les molécules donneuses de •NO appartiennent à différentes familles chimiques qui libèrent la molécule soit directement soit indirectement avec formation d'un composé intermédiaire qui libèrera secondairement le •NO.
### 2.1.1. Donneurs d'oxyde nitrique utilisés en thérapeutique

Les donneurs de •NO comme la nitroglycérine, ainsi que d'autres nitrates organiques comme le dinitrate d'isosorbide, sont utilisés depuis longtemps dans le traitement d'urgence de l'angine de poitrine ou de l'hypertension artérielle. Administrés par différentes voies : perlinguale, orale ou intraveineuse, leur demi-vie est courte et ils sont rapidement métabolisés. Leur utilisation au long cours est limitée par l'induction d'un stress oxydant et l'émergence d'une tolérance qui en diminue l'efficacité [192].

### 2.1.2. Donneurs d'oxyde nitrique en cours de développement

Les molécules donneuses de •NO actuellement développés sont les diazéniumdiolates (NONOates), les composés porteurs d'un groupement -C=NOH, les complexes fer-dinitrosyle et les S-nitrosothiols [193]. Ces derniers ont pour formule générale RSNO où R désigne une protéine, un peptide ou un aminoacide. Ils sont caractérisés par une liaison covalente entre le thiol réduit d'un résidu cystéinyl et l'oxyde nitrique. Leurs demi-vies vont de 45 min à 2h [194]. Ils n'induisent ni stress oxydant ou nitrosant, ni tolérance [195]. On distingue deux types de RSNO : ceux de masses moléculaires élevées comme la S-nitrosohémoglobine et la S-nitrosoalbumine (HSANO) et ceux de masses moléculaires faibles comme le S-nitrosoglutathion (GSNO) (Figure 11) et la S-nitroso-*N*-acétylcystéine (NACNO). Le GSNO et la HSANO sont des composés physiologiques dont la concentration plasmatique est de l'ordre de quelques µM [196]. Les RSNOs sont rapidement dégradés dans les milieux biologiques. Le GSNO est l'un des premiers S-nitrosothiols à avoir été utilisé dans des essais cliniques. Peu toxique, il est facile à synthétiser, à isoler et à contrôler selon des critères pharmaceutiques [197]. Mais du fait de sa dégradation rapide, enzymatique in vivo, ou sous l'action de la lumière et de la température, aucun essai clinique de phase III n'a été, pour le moment, effectué. Dans le but d'améliorer la biodisponibilité de •NO, des essais de production in situ ou d'encapsulation de GSNO ont été menés avec, entre autres, des nanoparticules polymériques (Tableau 3), des cyclodextrines et des NP d'or.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 11. Structure chimique de S-nitrosoglutathion GSNO</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 3. Exemples d'indications médicales des formulations de GSNO utilisant des NP</caption><thead><tr><th>Formulation</th><th>Objectif thérapeutique</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="3"><strong>Formulations contenant du GSNO</strong></td></tr><tr><td>NP polymérique</td><td>Cardiovasculaire</td><td>[169]</td></tr><tr><td>Oligosaccharide-chitosan</td><td>Maladie de Crohn</td><td>[198]</td></tr><tr><td>NP polymériques greffées avec vitamine A</td><td>Hépatique (fibrose)</td><td>[199]</td></tr><tr><td>NP polymérique</td><td>Chimiotherapie</td><td>[188]</td></tr><tr><td>Implant polymérique sous-cutanés</td><td>Cardiovasculaire</td><td>[200]</td></tr><tr><td>Stents recouvert de NP polymériques</td><td>Cardiovasculaire</td><td>[201]</td></tr><tr><td colspan="3"><strong>Formulation produisant du GSNO</strong></td></tr><tr><td>Hydrogel avec NP S-nitrosoNacétylcysteine + GSH</td><td>Cardiovasculaire</td><td>[202]</td></tr><tr><td>NP-NO + GSH</td><td>Anti-infectieux</td><td>[203]</td></tr><tr><td>NP-NO + GSH</td><td>Cardiovasculaire</td><td>[204]</td></tr></tbody></table>

## 2.2. Introduction de l'article 2

Dans ce travail, la viabilité cellulaire, l'internalisation des NP et les niveaux d'expression des gènes ont été étudiés. Après 24 h d'exposition, nous avons évalué l'activité mitochondriale des cellules par le test WST-1, la croissance cellulaire par le bleu trypan. L'internalisation des NP marquées au rouge Nil a été vérifiée par la microscopie confocale après 2 h de contact. Avec les mêmes NP marquées, nous avons étudié le mécanisme de cette internalisation en utilisant plusieurs inhibiteurs spécifiques par cytométrie en flux. L'utilisation de la microscopie électronique à transmission a permis de bien préciser la localisation des NP. Enfin, une première analyse des transcriptomes des THP-1 exposés aux NP vides (NP-), aux NP chargées en GSNO (NP+) ainsi qu'au GSNO seul a été réalisée.
# Human Monocyte Response to S-Nitrosoglutathione-Loaded Nanoparticles: Uptake, Viability, and Transcriptome

Ramia Safar,†,‡ Carole Ronzani,†,‡ Roudayna Diab,† Jérôme Chevrier,§ Danièle Bensoussan,∥
Stéphanie Grandemange,⊥ Alain Le Faou,†,# Bertrand H. Rihn,† and Olivier Joubert*†

## S Supporting Information

**ABSTRACT:** S-Nitrosoglutathione (GSNO) is a good candidate for nitric oxide (NO•) delivery, and its nano- formulation improves NO• stability and bioavailability. We have compared the effect of empty Eudragit nanoparticles (eENP), GSNO-loaded ENP (gENP), and free GSNO on THP-1 human monocytic cell line. We investigated cellular viability and growth by WST-1 and trypan blue tests. ENP uptake was studied using transmission electron microscopy, confocal microscopy, and flow cytometry. Transcriptomic profiles were obtained using microarray. ENP entered cells by clathrin- and caveolae-mediated endocytosis. Exposure to either free GSNO or gENP induced an activation of genes from the same clusters, in favor of intracellular delivery of GSNO by ENP. GSNO nanoformulation might be a therapeutic option for NO• delivery.

**KEYWORDS:** S-nitrosoglutathione, polymeric nanoparticles, monocytes, transcriptome, endocytosis, toxicogenomic, nitric oxide, uptake, toxicity

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

## 1. INTRODUCTION

Nitric oxide (NO•) plays a pivotal role in mammalian organisms through a variety of mechanisms due to its reactivity, but it has a very short half-life of less than 1 s in blood.¹ If a therapeutic use is to be developed, it should be delivered as a prodrug such as organic nitrate. However, these compounds induce oxidative stress and are poorly tolerated. On the contrary, S-nitrosoglutathione (GSNO [CAS number: 57564-91-7]), generated by the interaction of NO• with reduced glutathione by S-nitrosylation, is a safe and potent *in vivo* NO• donor. It is considered one of the most effective nitrosating agents, with potential therapeutic applications in diabetes, neurodegenerative diseases, cancers, and cardiovascular illness.² Besides, GSNO may have a potent direct or indirect antimicrobial activity.³,⁴

However, GSNO is of limited stability in aqueous solution and degrades readily under the action of light and temperature. Thus, to improve NO• stability and increase its bioavailability, the incorporation of GSNO in nanocomposite implants⁵ or polymeric nanocarriers⁶ has been proposed. For this purpose, we have developed a nanoformulation of GSNO by its inclusion into Eudragit polymeric nanoparticles (ENP), a nonbiodegradable copolymer of acrylic and methacrylic acid

esters that has been already used *in vivo* for the delivery of low molecular weight heparin⁷ or cyclosporine.⁸

However, if such GSNO containing formulations are to be used in therapeutics, their lack of toxicity as well as an absence of undesirable effects has to be ascertained. As recommended by national and supranational regulatory agencies⁹,¹⁰ a first hint of an absence of toxicity can be brought by transcriptomic analysis of human cell exposed to such formulation. Thus, we have studied the cellular consequences of exposure of THP-1, a human monocytic cell line, to empty (eENP) and GSNO-loaded ENP (gENP). The internalization mode of ENP was determined. The effect of both eENP and gENP on molecular response was assessed by transcriptomic analysis and compared to the one after exposure to free GSNO.

## 2. MATERIALS AND METHODS

**2.1. Chemicals.** Eudragit RL PO (MW = 150 000 Da [CAS number: 33434-24-1]) was a gift from Evonik Polymers

Received: September 22, 2014

Revised: December 17, 2014

Accepted: December 23, 2014

Published: December 23, 2014

<footnote>†Faculté de Pharmacie de Nancy, EA 3452 Cithéfor, Université de Lorraine, France</footnote>

<footnote>§Faculté de Médecine, Service Commun de Microscopie, Université de Lorraine, France</footnote>

<footnote>∥Unité de Thérapie Cellulaire et tissus, CHU de Nancy, Vandœuvre-lès-Nancy, France</footnote>

<footnote>⊥CRAN Campus sciences, UMR 7039 CNRS/UL, Université de Lorraine, France</footnote>

<footnote>#Faculté de Médecine de Nancy, Université de Lorraine, France</footnote>
(Darmstadt, Germany). Pluronic F68 [11104-97-5] was from Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France), and dichloromethane (DCM) [75-09-2] was from Laurylab (Saint Fons, France). RPMI 1640 medium was from GIBCO, Hoechst 33342 [23491-52-3] (2'-[4-ethoxyphenyl]-S-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,S'-bi-1H-benzimidazole trihydrochloride trihydrate) from Invitrogen (Val de Reuil, France), and fetal bovine serum from Eurobio (Les Ulis, France). Penicillin [113-98-4], streptomycin [128-46-1], amphotericin B [1397-89-3], 3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,S-diphenyltetrazolium bromide (MTT) [57360-69-7], Nile Red [7385-67-3], trypan blue solution [72-57-1], cytochalasin D [22144-77-0], chlorpromazine [69-09-0], genistein [446-12-0], and sodium azide (NaN₃) [26628-22-8] were from Sigma-Aldrich. 4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1) [150849-52-8] was from Roche Applied Sciences (Penzberg, Germany). TRIzol Reagent was from Invitrogen (La Jolla, CA). S-Nitrosoglutathione (GSNO) was synthesized by W. Wu and R. Schneider in LRGP UPR-CNRS 3349 laboratories (Lorraine University, France).

**2.2. Cell Culture.** Human THP-1 monocytic cell line was obtained from American Type Culture Collection (ATCC, TIB-202, Manassas, VA, USA). Cells were grown at 37 °C under 5% CO₂ atmosphere in RPMI 1640 medium supplemented with 10% of heat-inactivated fetal bovine serum, 100 U/mL of penicillin, 100 µg/mL of streptomycin, and 0.25 µg/mL of amphotericin. They were split every 3 days.

**2.3. Preparation of Nanoparticles.** ENP were prepared using the double emulsion/solvent evaporation technique from three phases as previously described.¹¹ In brief, the internal aqueous phase consisted of 0.5 mL of 0.1% aqueous solution of Pluronic F68 (w/v), the organic phase was a 10% solution (w/v) of Eudragit RL PO in 5 mL of DCM, and the external aqueous phase consisted of 20 mL of 0.1% Pluronic F68 aqueous solution. The primary water/oil emulsion was prepared by sonication, added to the external aqueous phase, and a secondary emulsification was carried out by sonication leading to a double water/oil/water emulsion. The DCM was eliminated using a rotary evaporator (R-144, Büchi, Flawil, Switzerland). ENP were collected by ultracentrifugation at 186000g for 30 min. The pellet of ENP was suspended in the medium used for experimentations by mechanical agitation.

Using the same protocol, gENP were prepared accordingly by adding 10 mg of GSNO to the internal aqueous phase and Nile Red-labeled ENP by adding 6.25 mg of the dye to the organic phase.

**2.4. Characterization of Nanoparticles.** The hydrodynamic diameter and size distribution of ENP, expressed as polydispersity index, were measured using dynamic light scattering (DLS, Zetasizer 3000E, Malvern Instruments Worcestershire, U.K.) and were calculated from the number distribution graph. Zeta potential was calculated using the Smoluchowski equation.¹² All measurements were performed in triplicate at 25 °C.

GSNO encapsulation efficiency was measured by determining the amount of entrapped drug ($E_{drug}$) using a liquid-liquid extraction method. Briefly, a defined volume of gENP suspension was ultracentrifuged at 186000g for 30 min. The pellet was resuspended in 1 mL of freshly prepared phosphate-buffered saline (PBS, pH = 7.4) to which 2.5 mL of DCM was added, and the volume was adjusted at 12.5 mL using PBS. After agitation for 6 min the suspension was centrifuged at 2800g for 10 min at 4 °C. GSNO was dosed in the aqueous

phase. The same procedure was applied to an equal volume of the total suspension of gENP before ultracentrifugation in order to determine the drug total amount ($T_{drug}$). GSNO encapsulation efficiency (EE %) was expressed as

$$EE = \frac{E_{drug}}{T_{drug}} \times 100$$

GSNO was dosed by colorimetry using the Griess-Saville reagent¹ and the nitrate formed by the degradation of GSNO using the Griess reagent.

**2.5. Cell Viability and Growth.** Cells were seeded in 96-well plates with 5 × 10³ cells per well. After overnight incubation, plates were centrifuged (300g, 20 min), and the medium was removed by aspiration. Fresh medium was added, and cells were incubated with 0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, and 200 µg/mL of eENP or gENP for 24 h. Six wells were used per culture condition, and experiments were repeated thrice. The cell viability was checked using WST-1 assay, performed according to manufacturer's protocols, and dead and alive cells were enumerated using trypan blue test, as previously described.¹¹

**2.6. Cellular Uptake Study.** **2.6.1. Transmission Electron Microscopy.** Briefly, THP-1 cells were seeded in 6-well plates at a density of 3 × 10⁵ cells/mL and exposed on the following day to 200 µg/mL of eENP for 2 h. As previously described,¹³ cells were then immediately collected by centrifugation and fixed with ice-cold 2.5% glutaraldehyde for 2 h, postfixed in 1% OsO₄ for 1 h at room temperature, dehydrated by increasing concentrations of ethanol, and finally treated with propylene oxide and included in EMbed 812 resin. Ultrafine (90 nm) sections were obtained with an ultramicrotome (Reichert-Yung), deposited on a copper grid, and colored with uranyl acetate and lead citrate using the conventional techniques. Grids were examined with the electron microscope CM 12 Philips (Eindhoven, The Netherlands) operated at 80 kV.

**2.6.2. Confocal Laser Scanning Microscopy.** Cells were seeded on 24-well plates at a density of 3 × 10⁵ cells/well and incubated overnight. After exposure to 200 µg/mL of Nile Red-labeled ENP for 2 h, cells were then washed thrice with PBS and treated with picric acid-formaldehyde (PAF, 4% v/v in PBS) in the dark at room temperature for 10 min. The cells were then washed three times with PBS and treated for 10 min with Hoechst 33342 in the dark at room temperature. Finally, cells were washed thrice with distilled water, allowed to dry at room temperature, and conserved in the dark at 4 °C. Observation was made at ×63 magnification by immersion using the TCS SP2 microscope (Leica, Bensheim, Germany).

**2.6.3. Flow Cytometry.** Cells were seeded at a density of 3 × 10⁵ cells/mL in 24-well plates and incubated overnight prior to the exposure to 200 µg/mL of Nile Red-labeled ENP for 2 h. Cells were then collected by aspiration, thoroughly rinsed twice with PBS, and finally suspended in 1% bovine serum albumin containing PBS. Cell-associated fluorescence was detected by flow cytometry (FACSCalibur, Becton Dickinson, BD Bioscience). Excitation and emission wavelengths were 488 and 585 nm, respectively.¹⁴ The results are reported as the mean of the fluorescence intensity distribution obtained by analyzing 10000 cells. Energy dependent internalization was studied by preincubating the cells at 4 °C for 30 min or with 100 mM NaN₃ for 1.5 h prior to the addition of Nile Red-labeled ENP. For identifying the modes of internalization, cells were incubated for 1.5 h at 37 °C with 20 µM cytochalasin D, 10
<table><caption>Table 1. Characterization of Empty, GSNO-Loaded, and Nile Red-Labeled ENP<sup>a</sup></caption><thead><tr><th>ENP</th><th>diam<sup>b</sup> (nm)</th><th>PdI<sup>c</sup></th><th>zeta potential (mV)</th><th>EE<sup>d</sup> (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>empty ENP</td><td>185.32 ± 70.44</td><td>0.190 ± 0.023</td><td>+56.49 ± 3.95</td><td></td></tr><tr><td>GSNO-loaded ENP</td><td>207.94 ± 34.72</td><td>0.175 ± 0.034</td><td>+58.25 ± 1.70</td><td>49.33 ± 1.37</td></tr><tr><td>Nile Red-labeled ENP</td><td>207.73 ± 41.67</td><td>0.192 ± 0.031</td><td>+55.32 ± 2.50</td><td></td></tr></tbody></table>

<sup>a</sup>All data are the mean ± standard deviation of n = 3 to 5 independent preparations. <sup>b</sup>Calculated from the number distribution graph. <sup>c</sup>PdI = polydispersity index. <sup>d</sup>EE = encapsulation efficiency.

µg/mL chlorpromazine, or 200 µM genistein<sup>14,15</sup> prior to the addition of Nile Red-labeled ENP. The absence of any toxicity of these three inhibitors was verified after incubation of the cells with the same concentrations of each for 3.5 h (Supporting Information S1). The negative control was eENP-exposed cells and the positive one Nile Red-labeled ENP-exposed cells. The results are expressed as percent of uptake using the positive control as reference (100%).

**2.7. Microarray Study.** Total RNA was extracted by TRIzol Reagent from cells exposed to 50 µM free GSNO, 200 µg/mL of eENP, or 200 µg/mL of gENP for 4 h. Unexposed cells were used as control. The quality of the extracted RNA was assessed by spectrophotometry (A<sub>260nm</sub>/A<sub>280nm</sub> > 1.8, BioSpec-nano, Shimadzu) and capillary electrophoresis using RNA 6000 Nano (RIN > 9, 2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA). cRNA synthesis from cDNA and Cy3-dye labeling and microarray hybridization were carried out with 100 ng of total RNA according to the manufacturer's protocol (One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis, version 6.6). Microarray slides were scanned by Agilent DNA microarray scanner (SurePrint G3 Human GE v2 8 × 60K, Agilent Technologies). Acquisition of images and quantification of fluorescence signal as well as primary data analysis were performed using the Agilent Feature Extraction Software. Data were first normalized with the LOWESS method, and stringent filtering criteria were then used to identify genes whose expression level was significantly modified as compared to control. The means of at least three determinations for each condition were compared by the modified Student's t test (p ≤ 0.001). For a given gene, FC (fold change) of expression ≥2.0 or ≤0.5 under one condition of exposure of cells in reference to the control was calculated. The analyzed genes displayed acceptable False Discovery Rate (<20%) according to Benjamini et al. (2001).<sup>16</sup> The selected genes were analyzed according to Gene Ontology (GO) terms and functions using (i) the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID; http://david.abcc.ncifcrf.gov) and (ii) the Genecard Database. Genes were grouped among clusters according to the functional pathways as defined in the DAVID database. The raw data of the microarrays are available on Gene Expression Omnibus database (GEO, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), using the GSE51186 accession number.

**2.8. Statistical Analysis.** Cell viability and cellular uptake data are presented as means ± standard error of the mean (SE) of three replicates. Statistical differences were determined by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey-Kramer test for cell viability, and by ANOVA followed by Dunnett's test for cellular uptake, using the RLPlot software.

## 3. RESULTS

**3.1. Nanoparticle Characterization.** The mean hydrodynamic diameters of eENP, gENP, and Nile Red-labeled ENP determined by DLS from three independent preparations were

185 ± 70 nm, 207 ± 34 nm, and 207 ± 41 nm, respectively (Table 1). The three types of ENP were positively charged (around +56 mV). The encapsulation efficiency for the gENP was 49.33 ± 1.37%.

**3.2. Cell Viability and Growth.** After exposure to 12.5, 25, 50, 100, and 200 µg/mL of eENP for 24 h, a significant increase of 20 to 40% of cell viability compared to the control was observed by WST-1 test, as well as with 50, 100, and 200 µg/mL of gENP (Figure 1A). The trypan blue test (Figure 1B)

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 1.** Incidence of empty ENP and GSNO-loaded ENP exposure on THP-1 cell viability (A: WST-1 test) and growth (B: trypan blue assay). Data are expressed as mean ± SE of three replicates. Groups not sharing the same letter are different on the 95% level (ANOVA following the Tukey-Kramer method).</figcaption></figure>

showed a dose-dependent increase of 40 to 60% of growth after incubation of cells with 50, 100, and 200 µg/mL of eENP. On the contrary, such a stimulation of growth was not observed with gENP.

**3.3. Cellular Uptake.** Following incubation of cells with 200 µg/mL of Nile Red-labeled ENP for 2 h, intracellular ENP were visible as red spots in the cytoplasm (Figure 2B), whereas no such red spots were visible in the control experiment (Figure 2A). The nucleus remains free of any particles. When cells were exposed to unlabeled ENP or to Nile Red, no
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 2.** Cellular uptake of ENP studies. Confocal microscopy: (A) unexposed cells and (B) cells exposed to 200 µg/mL of Nile Red-labeled ENP for 2 h. Flow cytometry of cells incubated with 200 µg/mL of Nile Red-labeled ENP for 2 h: (C) preincubation of cells at 4 °C for 30 min or with NaN₃ for 1.5 h and (D) preincubation with internalization inhibitors. Transmission electron microscopy of cells exposed to 200 µg/mL of empty ENP for 2 h: (E) internalized ENP (arrows); (F) internalized ENP surrounded by a membrane (1), external ENP free (2), or adherent to cell surface (3).</figcaption></figure>

fluorescence was observed (data not shown). TEM observations have confirmed the presence of ENP in the cytoplasm either isolated or clumped, as round clear objects embedded in electron dense material (Figure 2E). Same objects are present, free or in contact with cell surface (Figure 2F). Incubation at 4 °C or with NaN₃ (metabolic inhibitor) reduced the fluorescence of cells exposed to Nile Red-labeled ENP at 53% and 47% of the positive control, respectively (Figure 2C). While cytochalasin D (inhibitor of phagocytosis) did not induce any significant decrease of cell-associated fluorescence, chlorpromazine (inhibitor of clathrin-mediated endocytosis) and genistein (inhibitor of caveolae-mediated endocytosis) were responsible for a significant reduction at 60% and 53% of the positive control, respectively (Figure 2D).

**3.4. Transcriptome Analysis.** Exposure of cells to free GSNO, eENP, or gENP induces significant modifications of the expression of 266, 110, and 142 genes, respectively, the majority of which being upregulated (Table 2). The three

<table><caption>**Table 2.** Total Number of THP-1 Genes at Least Twofold Up- or Downregulated (p < 0.001) after Exposure to Free GSNO, Empty ENP, or GSNO-Loaded ENP</caption><thead><tr><th></th><th>free GSNO<br>50 µM</th><th>empty ENP, 200<br>µg/mL</th><th>GSNO-loaded ENP,<br>200 µg/mL</th></tr></thead><tbody><tr><td>all</td><td>266</td><td>110</td><td>142</td></tr><tr><td>upregulated</td><td>215</td><td>82</td><td>140</td></tr><tr><td>downregulated</td><td>51</td><td>28</td><td>2</td></tr></tbody></table>

different exposure modes gave different expression profiles (Figure 3). However, the genes belonging to the “Transcription”, “Nucleus”, “Cell structure”, “Metabolic process”, “Cell cycle”, and to a variable degree “Oxidative stress” clusters were overexpressed for the three exposure modes. Only free GSNO and gENP induced an activation of genes from the three clusters “Zinc and metal ion binding”, “Mitochondrion”, and “Immune response and cell activation”, although for the latter the number of genes overexpressed is higher with free GSNO (18 genes), and particularly CCL4, CCL3, CCL20, INHBA, VEGFA, and IL23A (Supporting Information S2). In contrast, gENP induced the most important overexpression of genes among the clusters “Metabolic process” (26 genes) and “Mitochondrion” (6 genes). Within the “Metabolic process” cluster, many of the upregulated genes encode glycoprotein or protein involved in the glycosylation process (CLEC12A, BMP8B, PIGS, GUSBP11, CSGALNACT2, PFKFB3), spliceosome pathway (SF3B2, DHX38, SRSF2), insulin signaling pathway (INSL4), and protein trafficking (CCZ1, VPS35), suggesting that a large number of metabolic processes are affected (Supporting Information S6). Within the cluster “Mitochondrion”, SDHA, a subunit of succinate dehydrogenase complex, and ETFA, an electron acceptor for several dehydrogenases of the mitochondrial respiratory chain, were overexpressed (Supporting Information S6). On the contrary, eENP strongly activated genes belonging to the cluster “Chromosomal part” (13 genes), including 12 upregulated genes involved in the constitution of histones, and to the cluster “Proliferation” (5 genes; AMD1, DYRK1A, MAPK9, RPS6KB1, and FGFR1) (Supporting Information S4). Both eENP and gENP activated genes among the cluster “Catabolic process” and caused significant changes in genes involved in cell structure such as cytoskeleton organization (Supporting Information S4 and S6). Expressions of genes of the Wnt signaling pathway were also modified by eENP (DISC1) and gENP (FRAT1 and TLE1). Among the cluster “Endocytosis”, most of the upregulated genes were involved in cellular trafficking, as MYOF, MYOSA, and RAB11FIP1 for eENP and NSF and OSBLPS for gENP. The FLOT2 gene, implicated in formation of caveolae vesicles, had also its expression increased by gENP treatment (Supporting Information S4 and S6).

## 4. DISCUSSION

Physicochemical properties of nanoparticles such as size, shape, and surface (charge and coating) play a significant role in determining their uptake mechanism and their intracellular outcome.¹⁷,¹⁸ In our study, both TEM and CLSM show ENP inside vacuoles in cytoplasmic compartment. The absence of any alteration of cellular structures is in favor of an absence of cytotoxicity. This is related to their mode of penetration, which occurs via endocytosis. This energy dependent process is strongly inhibited at low temperature and by NaN₃. However, the inhibition of penetration is not complete, and the remaining apparent activity may be related either to an energy independent internalization¹⁴ or to the presence of ENP adherent to the cell surface. The partial inhibition of ENP penetration by chlorpromazine or genistein indicates that the internalization is the consequence of endocytosis through at least two different pathways, clathrin- and caveolae-mediated pathways. Phagocytosis is not involved as the cytochalasin D has no effect on ENP penetration. This is not surprising as the size of the ENP, of about 200 nm, is too small to be taken up by phagocytosis, whereas it is compatible with a penetration by
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 3.** Functional classification of significantly up- and downregulated genes. Exposure to (A) 50 µM GSNO; (B) 200 µg/mL of empty ENP; (C) 200 µg/mL of GSNO-loaded ENP. Black bars: upregulated genes. Gray bars: downregulated genes.</figcaption></figure>

endocytosis.¹⁹,²⁰ The existence of simultaneously acting pathways has been reported in human embryonic kidney cell

line by Huang et al. (2013).¹⁵ They described an uptake of polyplex nanoparticles (same size (80–180 nm) and zeta
potentials compared to ours) using both clathrin- and caveolae-mediated endocytosis. ENP uptake studies have been made with two different nanoparticles, eENP and Nile Red-labeled ENP. As eENP, Nile Red-labeled ENP, and gENP have about the same size (180 to 200 nm) and the same surface charge, one could confidently consider that they should behave the same way and use the same mechanisms for entering cells.

An increase of metabolic activity and growth of THP-1 cells after contact with eENP has been already described in our laboratory.¹¹ This phenomenon has also been observed by Hussien et al. (2013)²¹ using human epithelial cells and nanoparticles of the same chemical raw composition, namely, Eudragit RS. These authors have related this increase to an augmentation of mitochondrial volume and activity. In our study, this relation was not confirmed, as genes belonging to the “Mitochondrion” cluster did not have any noticeable expression modification. The increase in mitochondrial enzymatic activity may be related to cell proliferation with an increase in mitochondrion number. This increased metabolic activity is related to upregulation of genes involved in cell proliferation and metabolism belonging to clusters “Transcription”, “Nucleus”, “Chromosomal part”, “Metabolic process”, and “Proliferation”. The proliferation of THP-1 after incubation with eENP is associated with an upregulation of *FGFR1*. In the same way, Ting et al. (2013)²² have observed that heparin-nanoceria formed active ternary complexes with FGF2 and FGFR1 inducing BaF32 myeloid B cell proliferation. An activation of genes involved in histone rearrangement as observed with eENP is in favor of an alteration of the cell cycle as it has been reported for human aortic endothelial cells in which poly(amido amine) dendrimers and silica nanoparticles induce a modification of many histone gene expressions.²³ In breast epithelial cells, Eudragit RS nanoparticles caused significant changes among genes involved in apicolateral plasma membrane organization, cell-cell junction, cell-cell adhesion, and apical junction complex organization.²¹ These authors suggest that this effect on cell organization may contribute to explain the increase of cell growth. In our model, ENP also caused significant changes in expression of genes involved in cell structure such as cytoskeleton organization. Thus, incubation with nanoparticles, although apparently not showing any toxic effect, may alter the development of cells that should be taken into account.

Free GSNO at 50 µM highly modifies the gene expressions, particularly those among the cluster “Chromosomal part” which are downregulated. These effects of GSNO have been already reported in prokaryotes and eukaryotes. GSNO alters zinc metabolism in *Staphylococcus aureus* at 150 µM,²⁴ methionine biosynthesis in *Escherichia coli* at 200 µM,²⁵ and *Rhodobacter sphaeroides* at 1 mM.²⁶ Several transcriptional factor genes are upregulated in U937 human monocytes by GSNO at 400 µM.²⁷ It has to be noted that in these studies the concentrations of GSNO are higher than the one we have used. However, a strong effect on THP-1 cells of this compound, free of loaded in ENP, has been observed. Although differences in the profiles between GSNO and gENP have been observed, exemplified by the “Chromosomal part” cluster, strong resemblances are to be noted even if the number of overexpressed genes is different. The following clusters are concerned: “Transcription”, “Metabolic process”, “Immune response and cell activation”, and “Induction of apoptosis”. This is in favor of an action of GSNO, even included in ENP. The differences of gene expression between both profiles

obtained with free GSNO and ENP-associated GSNO may be due to the different final doses of available GSNO. First, a relatively high concentration of free GSNO is necessary for an effect to be observed, as NO• donor degrades readily in solution with a short half-life of 45 min to 2 h.²⁸ Second, the concentration of GSNO in the complex with ENP is only 6 µM, and, even if its penetration is facilitated, it may be released slowly in the cell. Third, when in contact with gENP, cells are subjected to the effect of drug and vehicle, and some of the alterations of gene profile may be due to the carrier ENP such as genes of the cluster “Catabolic process” which expression is not modified by GSNO alone. Making a comparison of transcriptomes at the same GSNO concentration is not possible. Indeed, increasing the content of GSNO into ENP to achieve the high dose of 50 µM led to the use of too high a dose of ENP that might be toxic by itself. On the other hand a low dose of 6 µM of free GSNO would impair any observation of effect, as GSNO is highly reactive and disappears rapidly from the medium.

In contrast to eENP, gENP did not induce an increase of cell growth, and the number of upregulated genes involved in proliferation was far lower; noticeably *FGFR1* was not upregulated. The addition of GSNO to ENP modifies the expression of genes. While the growth was not stimulated, the cell viability was enhanced. This is to be related to an upregulation of genes involved in “Mitochondrion” and “Metabolic process” clusters. In particular, the upregulation of *SDHA* and *ETFA* suggests an increase of mitochondrial activity. Thus, the inclusion of GSNO into ENP may have a direct effect on mitochondria, stimulating their metabolism. Such an increase has been reported with curcumin nanoparticles in a rat model of Huntington's disease, making this compound a promising therapy for this disease.²⁹ In the same way, the use of nanoquercetin may protect mitochondrial integrity and functions by controlling succinate dehydrogenase activity in gastric inflammation induced by ethanol in rat.³⁰ In our study, as free GSNO activated the same gene cluster as gENP, one may consider that the enhancement of metabolism by gENP is related to the intracellular presence of GSNO. The absence of enhancement of growth with this compound corresponds to a small number or an absence of activated genes in the cluster “Nucleus” and “Chromosomal part”, respectively.

Free GSNO activates genes among the clusters “Immune response and activation” and “Oxidative stress” as does gENP, although to a lesser extent, which may be due to a lower concentration and a delayed intracellular liberation. This activity may be related to a stimulation of innate immunity and play a role in antimicrobial defense.⁴ Thus, this compound may act at two levels, stimulation of defenses and degradation of intracellular microorganisms by a direct activity of the liberated NO•.

## 5. CONCLUSION

GSNO, a donor of NO•, either free of encapsulated in ENP, has a strong cellular effect on monocytic cell line by activating them and stimulating their metabolism possibly related to an enhancement of an innate immune response. Even if gENP has a lower action on cell metabolism, the main properties of GSNO are retained, and consequently Eudragit nanoparticles are a good candidate for a delivery of NO• *in vivo* for local or digestive administration. Thus, encapsulated GSNO may prove a therapeutic option not only for stimulating immune defenses, although moderately in our model, but also for delivering the
active compound for the treatment of diseases with
mitochondrial dysfunction such as ulcers,³¹ and perhaps to
contribute to eliminate intracellular microorganisms.

■ ASSOCIATED CONTENT

S Supporting Information

Figure (S1) depicting dose-dependent effects of endocytosis inhibitors on THP-1 human cell viability using WST-1 assay. Tables (S2–S7) including modified genes identified in microarray analysis in response to 4 h exposure to 50 µM GSNO (S2, S3), 200 µg/mL empty ENP (S4, S5), and 200 µg/ mL GSNO-loaded ENP (S6, S7). This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

■ AUTHOR INFORMATION

Corresponding Author

*Faculté de Pharmacie, 5 rue Albert Lebrun, 54000 Nancy,
France. Phone: (+33) 3 83 68 22 88. E-mail: olivier.joubert@
univ-lorraine.fr.

Author Contributions

‡R.S. and C.R. contributed equally to this work.

Notes

The authors declare no competing financial interest.

■ ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by the Agence Nationale de la
Recherche (ANR NanoSNO). R.S. is the recipient of a PhD
grant from the Ministry of Higher Education of Syria. The
authors thank Wen Wu and Raphaël Schneider for GSNO
synthesis, as well as Housam Al Hussaini for its contribution.

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Supplementary data S1

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>B)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>C)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

S1: Dose-dependent effects of endocytosis inhibitors on THP-1 human cell viability. Cells were exposed to increasing concentrations of cytochalasin-D (A), chlorpromazin (B) and genistein (C) 3.5 h and cell viability was assessed at this time, using the WST-1 assay, as described in Experimental section. Data are mean ± SEM of three replicates.

Supplementary data S2: Confocal microscopy
<table><caption>**Table S3.** Up-regulated genes identified in microarray analysis in response to 4h exposure with 50 µM of GSNO</caption><thead><tr><th>Gene</th><th>Description</th><th>Function</th><th>AGILENT_ID</th><th>FC</th><th>p value</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="6"><em>Transcription (GO:0006350)</em></td></tr><tr><td>NAB1</td><td>NGFI-A binding protein 1<br>(EGR1 binding protein 1)</td><td>transcriptional repressor for<br>factors EGR1 and EGR2</td><td>A_23_P209805</td><td>2.19</td><td>3.46E-04</td></tr><tr><td>RBAK</td><td>RB-associated KRAB zinc finger</td><td>repress E2F-dependent and<br>promote AR-dependent<br>transcription</td><td>A_24_P72394</td><td>2.07</td><td>6.20E-04</td></tr><tr><td>MIER1</td><td>mesoderm induction early<br>response 1 homolog (Xenopus<br>laevis)</td><td>transcriptional repressor</td><td>A_24_P230916</td><td>2.07</td><td>8.52E-04</td></tr><tr><td>NCOA7</td><td>nuclear receptor coactivator 7</td><td>transcriptional activities of<br>several nuclear receptors</td><td>A_24_P12435</td><td>2.75</td><td>9.79E-04</td></tr><tr><td>NFIX</td><td>Nuclear Factor I/X (CCAAT-<br>Binding Transcription Factor)</td><td>activating transcription and<br>replication</td><td>A_33_P3884230</td><td>3.44</td><td>1.89E-04</td></tr><tr><td>NXT2</td><td>Nuclear Transport Factor 2-<br>Like Export Factor 2</td><td>trafficking of molecules<br>between the cytoplasm and<br>nucleus</td><td>A_33_P3366575</td><td>3.08</td><td>9.11E-04</td></tr><tr><td>PNRC1</td><td>proline-rich nuclear receptor<br>coactivator 1</td><td>signal transduction</td><td>A_33_P3279831</td><td>4.11</td><td>8.00E-04</td></tr><tr><td>STAT4</td><td>signal transducer and activator<br>of transcription 4</td><td>signal transduction, activation<br>of transcription, involved in<br>IL12 signaling</td><td>A_23_P305198</td><td>5.36</td><td>3.29E-05</td></tr><tr><td>PRPF4B</td><td>PRP4 Pre-MRNA Processing<br>Factor 4 Homolog B (Yeast)</td><td>signal transduction</td><td>A_33_P3337034</td><td>2.49</td><td>7.55E-04</td></tr><tr><td>ZBTB37</td><td>zinc finger and BTB domain<br>containing 37</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_23_P137504</td><td>2.62</td><td>8.91E-04</td></tr><tr><td>ZNF517</td><td>zinc finger protein 517</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_24_P944320</td><td>2.22</td><td>7.52E-04</td></tr><tr><td>ZNF778</td><td>zinc finger protein 778</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_32_P78783</td><td>2.14</td><td>9.84E-05</td></tr><tr><td>ZBTB10</td><td>Zinc Finger And BTB Domain<br>Containing 10</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_33_P3613000</td><td>3.33</td><td>8.43E-05</td></tr><tr><td>ZNF407</td><td>Zinc Finger Protein 40</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_33_P3414402</td><td>3.03</td><td>5.36E-04</td></tr><tr><td>ZNF519</td><td>Zinc Finger Protein 519</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_19_P00320543</td><td>2.89</td><td>4.01E-04</td></tr><tr><td>MED1</td><td>Mediator Complex Subunit 1</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_33_P3210423</td><td>2.41</td><td>4.62E-04</td></tr><tr><td>RAI1</td><td>Retinoic Acid Induced 1</td><td>transcriptional regulation</td><td>A_33_P3320499</td><td>2.84</td><td>1.78E-04</td></tr><tr><td>ZNF280D</td><td>Zinc Finger Protein 280D</td><td>transcription factor</td><td>A_33_P3262794</td><td>2.34</td><td>7.08E-04</td></tr><tr><td>RFX8</td><td>RFX Family Member 8, Lacking<br>RFX DNA Binding Domain</td><td>transcription factor</td><td>A_19_P00319745</td><td>2.98</td><td>4.54E-05</td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Runt-Related Transcription<br>Factor 1</td><td>transcription factor</td><td>A_33_P3211809</td><td>2.80</td><td>5.56E-04</td></tr><tr><td>JMJD1C</td><td>Jumonji Domain Containing 1C</td><td>central role in histone code</td><td>A_23_P427217</td><td>2.36</td><td>6.73E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><em>Nucleus</em></td></tr><tr><td>CBX1</td><td>chromobox homolog 1</td><td>association of heterochromatin<br>with nuclear membrane</td><td>A_24_P298174</td><td>2.20</td><td>6.66E-04</td></tr><tr><td>HNRNPA3</td><td>Heterogeneous Nuclear<br>Ribonucleoprotein A3</td><td>cytoplasmic trafficking of RNA</td><td>A_24_P269895</td><td>2.01</td><td>8.16E-04</td></tr><tr><td>HNRNPA2B1</td><td>Heterogeneous Nuclear<br>Ribonucleoprotein A2/B1</td><td>with pre-mRNA processing,<br>forms ribonucleosomes</td><td>A_33_P3362891</td><td>3.07</td><td>8.32E-04</td></tr><tr><td>SF3B1</td><td>Splicing Factor 3b, Subunit 1,<br>155kDa</td><td>forms small nuclear<br>ribonucleoproteins complex</td><td>A_23_P368393</td><td>2.61</td><td>5.52E-04</td></tr><tr><td>ARL5B</td><td>ADP-ribosylation factor-like 5B</td><td>binds and exchanges GTP and<br>GDP</td><td>A_24_P943997</td><td>3.62</td><td>1.19E-04</td></tr></tbody></table>
<table><tbody><tr><td>CEP120</td><td>Centrosomal Protein 120kDa</td><td>role in centriole duplication during mitosis</td><td>A_33_P3316318</td><td>2.92</td><td>7.02E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Chromosomal rearrangement</strong></td></tr><tr><td>BRWD1</td><td>bromodomain and WD Repeat Domain Containing 1</td><td>chromatin remodeling</td><td>A_33_P3395713</td><td>3.32</td><td>1.86E-04</td></tr><tr><td>BRD4</td><td>Bromodomain Containing 4</td><td>chromosomal dynamics during mitosis</td><td>A_33_P3373745</td><td>3.83</td><td>8.30E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Proto-oncogene</strong></td></tr><tr><td>AFF4</td><td>AF4/FMR2 Family, Member 4</td><td>transcription factor</td><td>A_24_P8318</td><td>2.25</td><td>9.31E-04</td></tr><tr><td>BCL3</td><td>B-cell CLL/lymphoma 3</td><td>transcription of NF-kappa-B target genes</td><td>A_23_P4662</td><td>4.11</td><td>4.77E-04</td></tr><tr><td>SET</td><td>SET nuclear oncogene; similar to SET translocation</td><td>transcription, nucleosome assembly, histone chaperoning</td><td>A_23_P217015</td><td>4.98</td><td>3.32E-04</td></tr><tr><td>NR4A3</td><td>nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3</td><td>transcriptional activator</td><td>A_23_P398566</td><td>5.54</td><td>7.39E-06</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Regulation of Ras protein signal transduction (GO:0046578)</strong></td></tr><tr><td>RABGAP1L</td><td>RAB GTPase activating protein 1-like</td><td>-</td><td>A_24_P316005</td><td>2.11</td><td>7.25E-04</td></tr><tr><td>RIT1</td><td>Ras-Like Without CAAX 1</td><td>Ras-related GTPases, regulating p38 MAPK-dependent signaling</td><td>A_33_P3394075</td><td>3.83</td><td>6.37E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Ankyrin (IPR002110)</strong></td></tr><tr><td>AGAP7</td><td>ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 7</td><td>GTPase-activating protein</td><td>A_24_P729905</td><td>2.66</td><td>3.52E-04</td></tr><tr><td>ANKRD18B</td><td>Ankyrin Repeat Domain 18B</td><td>-</td><td>A_21_P0013674</td><td>2.64</td><td>1.14E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Zinc and metal ion binding</strong></td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Zinc ion binding (GO:0008270)</strong></td></tr><tr><td>LONRF1</td><td>LON peptidase N-terminal domain and ring finger 1</td><td>-</td><td>A_23_P94216</td><td>4.19</td><td>4.17E-04</td></tr><tr><td>ZC3H12C</td><td>zinc finger CCCH-type containing 12C</td><td>function as RNase</td><td>A_23_P388993</td><td>2.46</td><td>4.26E-04</td></tr><tr><td>ZFC3H1</td><td>zinc finger, C3H1-type containing</td><td>-</td><td>A_23_P332908</td><td>2.38</td><td>2.63E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Metal ion binding (GO:0046872)</strong></td></tr><tr><td>PDE4B</td><td>phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila)</td><td>many physiological processes</td><td>A_23_P74278</td><td>4.95</td><td>1.62E-04</td></tr><tr><td>GEM</td><td>GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle</td><td>regulatory protein, signal transduction at the plasma membrane</td><td>A_23_P257043</td><td>5.50</td><td>4.38E-04</td></tr><tr><td>MTF1</td><td>Metal-Regulatory Transcription Factor 1</td><td>activates metallothionein I promoter, binds to metal responsive element (MRE)</td><td>A_33_P3294237</td><td>2.17</td><td>2.32E-04</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Cell structure</strong></td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Integral to membrane (GO:0016021)</strong></td></tr><tr><td>CNST</td><td>Consortin, Connexin Sorting Protein</td><td>targeting of connexins to the plasma membrane</td><td>A_33_P3376379</td><td>4.00</td><td>4.34E-04</td></tr><tr><td>C12orf51</td><td>chromosome 12 open reading frame 51</td><td>-</td><td>A_19_P00805705</td><td>2.81</td><td>7.13E-05</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>Cytoskeletal part (GO:0044430)</strong></td></tr><tr><td>CDC42EP3</td><td>CDC42 Effector Protein (Rho</td><td>organization of the actin</td><td>A_33_P3331307</td><td>4.43</td><td>1.72E-04</td></tr></tbody></table>