<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Fig. 2** Period measured in weeks between LAA application and the following treatment when considering or not the technical advice provided</figcaption></figure>

by more than 6 weeks. This approach helps to predict when and which paddocks are likely to be infested by tick larvae. Thus, strategic LAA treatment can be applied when the largest number of paddocks is infested. The aim of this strategy is to adapt rotations after LAA application to collect and kill as many larvae as possible during the period of LAA efficacy. If a herd has not grazed in an infested paddock during the period of LAA efficacy, tick larvae will be present and cattle that come into the paddock soon after the end of the efficacy period will have to be retreated because they are parasitized rapidly.

**Effect of tick detection the day of LAA treatment on period between LAA application and the following tick treatment**

Of the 34 LAA treatments for which information on the presence or absence of *R. australis* on cattle the day of the application was recorded, no ticks were reported for 7 treatments and ticks were present for 27 treatments. The period between LAA treatment and the following tick treatment was 11.2±5.3 weeks if ticks were observed and 18.5±11.7 weeks if no ticks were observed (Fig. 3). The difference between the two periods was statistically significant (Mann-Whitney *U* test, *U* = 37.5, *z*-score = -2.4064, *P* = 0.0080).

The distribution of cases according to tick observation the day of the LAA treatment and compliance with the

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Fig. 3** Period measured in weeks between LAA application and the following treatment considering tick detection the day of LAA treatment</figcaption></figure>
recommended rotation schedule is presented in Table 2 when data were available in both cases. Among these 34 LAA treatments, recommendations concerning pasture rotations were followed for 21 cases (61.8%). For these 21 situations, the period between LAA treatment and the following treatment was 11.4 ± 5.9 weeks, whereas it reached 21.3 ± 14.9 weeks when ticks were not observed the day of the LAA treatment and advice was followed.

Based on the 34 LAA treatments for which information on the presence or absence of *R. australis* on cattle the day of the LAA was recorded.

This suggests that farmers who understand the principle of tick management through rotations and correctly anticipate the date of the LAA are also the most likely to follow the recommendations after LAA treatment.

## Stocking rate effect on length of stay required for cattle treated with LAA to be exposed to *R. australis* larvae in infested pasture

There was a tendency (Mann–Whitney *U* test, *U* = 16, z-score = 1.2374, *P* = 0.1075) for higher stocking rates to have a more efficacious outcome than lower stocking rates based on the 15 LAA treatments (Table 3). Rotations post-LAA treatments were planned to collect larvae in all paddocks considered infested during the period of acaricide efficacy. Rotations and lengths of stay per paddock were defined considering the number and the size of the paddocks. Higher weekly stocking rates resulted in more efficient collection of larvae. A stocking rate of 6 animals per hectare per week under our conditions enhanced the collection of

larvae. Efficiency (percentage of cattle with ticks) falls to 86% with 5 animals per hectare per week. A higher stocking rate requires herds to remain longer in paddocks. However, if several paddocks are infested, sufficiently long stays are not always possible given the expected 6 weeks of initial LAA efficacy. Since the usual stocking rate of around 2 ha per animal is relatively low in New Caledonia, sufficiently long stays in paddocks are problematic. Furthermore, among the 13 situations where the stocking rate was less than 6 animals/ha/week, the collection of larvae was nevertheless efficient to avoid a reinfestation of cattle in 7 cases (54%). This percentage decreased to 38% in the 8 cases when the stocking rate was less than 5 animals/ha/week. But, it increased to 50% in the 6 situations where the stocking rate was less than 4 animals/ha/weeks. The stocking rate of 5 cattle/ha/week appears to be a reasonable compromise between animal production considerations restricting stocking rate and length of stay considerations allowing sufficient collection of larval ticks by herds treated with LAA.

Efficacy represents the percentage of times animals did not need to be treated when re-grazing to a previously infested plot. Numbers in parentheses denote number of cases.

## Discussion

A major finding of this study is that the actual time between treatments when the two LAA were tested under field conditions was 6 to 8 weeks. When they were first used in the Caledonian tick control program, the FLZ-LAA and IVM-LAA commercial formulations were expected to help manage population of *R. australis* larvae for 6 weeks. This means that tick detection by producers and tick treatments should not occur before 9 weeks after the previous LAA treatment, considering the ~3-week period for larvae to reach the adult stage on infested cattle. Results reported here for the LAA evaluated also contrast with previous findings in that the period of efficacy was expected to be longer for FLZ-LAA than for IVM-LAA. Whereas the label claim for the IVM-LAA product tested mentioned a control period against species of *Rhipicephalus* (*Boophilus*) ticks affecting cattle of up to 75 days (i.e., 11 weeks), other studies reported a

<table><caption>**Table 2** Distribution of cases according to tick observation the day of the LAA treatment and compliance with the recommended rotation schedule</caption><thead><tr><th rowspan="2">Recommended rotation sched-<br>ule followed</th><th colspan="3">Ticks observed the day of the LAA<br>treatment</th></tr><tr><th>No</th><th>Yes</th><th>Total</th></tr></thead><tbody><tr><th>No</th><td>3</td><td>21</td><td>24</td></tr><tr><th>Yes</th><td>4</td><td>6</td><td>10</td></tr><tr><th>Total</th><td>7</td><td>27</td><td>34</td></tr></tbody></table>

<table><caption>**Table 3** Impact of weekly stocking rate on *R. australis* larvae collection after a LAA treatment in an infested pasture</caption><thead><tr><th>Stocking rate per week greater than</th><th>Efficient when the stocking rate was greater than</th><th>Stocking rate per week less than</th><th>Efficient although the stocking rate was less than</th></tr></thead><tbody><tr><td>3 (14)</td><td>57% (8)</td><td>3 (1)</td><td>100% (1)</td></tr><tr><td>4 (9)</td><td>67% (6)</td><td>4 (6)</td><td>50% (3)</td></tr><tr><td>5 (7)</td><td>86% (6)</td><td>5 (8)</td><td>38% (3)</td></tr><tr><td>6 (2)</td><td>100% (2)</td><td>6 (13)</td><td>54% (7)</td></tr></tbody></table>
shorter control period. Davey et al. (2010) reported con-
trol of *R. microplus* larvae during 14 days after an injec-
tion of this IVM-LAA, and larvae released on cattle for
artificial infestation at 28-d posttreatment produced con-
siderably larger engorged ticks than those released at 14-d
posttreatment. Gomes et al. (2015) reported 80% efficacy
after 4 weeks of treatment with the same IVM-LAA prod-
uct, which decreased to 62.0% at 5 weeks posttreatment. By
comparison, Bull et al. (1996) observed that practically no
adults were recorded up to 12 weeks after a treatment with
the FLZ-LAA pour-on applied at 1.5 mg/kg of bodyweight
(BW). Mendonça (2010) reported a residual acaricidal effect
superior to 90% during 13 weeks posttreatment with FLZ-
LAA 2.5 mg/kg BW, while Benavides et al. (2017) observed
semi-engorged females 8 weeks after treatment with FLZ-
LAA. A possible reason for the lower persistence effect of
LAA in some cases (on some farms) might be that the spread
of these chemicals within cattle is fat-dependent, so a shorter
time of efficacy could be related to poor body conditions in
the dry season. Another possible explanation might be that
the date of the following treatment depends on the rhythm of
cattle observations by the producer. Thus, the producer can
apply this following tick treatment as soon as he observes
the first ticks if he is every day in the herds or it could occur
some days later if he just observes herds once or twice a
week. However, due to the small number of observations,
it was not possible to rigorously explore the impact of the
season or rhythm of observation.

This study also identified areas to advance integrated
*R. australis* management practices in New Caledonia. Our
results confirmed that producers must practice biosurveil-
lance for infestations before the end of the expected initial
period of efficacy to enhance coordination with tick program
technicians to adapt the application of LAA (Wang et al.
2020). Technical advice to producers also needs to be rede-
fined taking these new data into account. The short period
we observed between LAA application and the following
tick treatment underscores the potential for the development
of acaricide resistance and other factors that could affect
overall efficacy. No resistance to IVM has been detected
thus far through the macrocyclic lactone bioassays con-
ducted routinely at the IAC laboratory (Hüe 2019). However,
it has been documented that the use of IVM-LAA to treat
gastrointestinal infections is a predisposing factor select-
ing for IVM resistance in tick populations infesting cattle
(Alegría-López et al. 2015). This also underlines the need
to adapt a bioassay to assess resistance to fluazuron in New
Caledonia because even though its use on cattle is limited to
a maximum of once per year and usually it is applied only
once every 2 years, cattle ticks can become resistant to this
chemical acaricide (Reck et al. 2014).

Our results highlight the importance of pasture monitor-
ing before and after a LAA treatment to know when and

which paddocks are infested by tick larvae. Because sub-
stantial numbers of engorged ticks are known to drop off
cattle early in the morning (Hitchcock 1955; Wharton 1970),
detecting infested cattle on the day of LAA application
indicates some ticks already fell into the paddock. In New
Caledonia, the period between dropping-off of engorged
ticks and the hatching of eggs varies from 6 weeks during
the hot season to 10 weeks during winter (Desquesnes and
Vignon 1987). As observed in this study under natural con-
ditions, the efficacy of LAA treatment is less than 6 weeks.
If engorged ticks have fallen into the paddock the day of
LAA treatment, the acaricide will not be effective when eggs
hatch and larvae become present in the paddock. Therefore,
animals will be reinfested as soon as they pasture in these
newly infested paddocks and will need to be treated once
more within a few weeks after LAA application. By contrast,
if no engorged ticks are observed the day of LAA treatment,
assuming the paddock where animals come from is free of
ticks and that posttreatment rotations have been correctly
planned, this increases the likelihood of efficient collec-
tion of larvae by grazing cattle from the other paddocks.
Knowing this and considering the population dynamics of R.
*australis* in New Caledonia, if tick detection is reported by
the producer, then program technicians can recommend to
treat first with a short-acting acaricidal product, for example,
an amitraz spray or macrocyclic lactone pour-on (Hüe and
Fontfreyde 2019). Doing this delays LAA treatment as long
as possible and avoids the application of these products to
cattle when ticks were not detected infesting them.

This study helped optimize the use of LAA for integrated
*R. australis* management by combining information on the
use of pastures under New Caledonia conditions (Hüe and
Fontfreyde 2019). Since our results were based on the obser-
vations of producers, we acknowledge the potential bias.
Nonetheless, our results confirmed that the period of efficacy
against larvae for the LAA tested in this study can be less
than 6 weeks. Importantly, collaborating with cattle produc-
ers, we demonstrated the importance of using LAA not only
retroactively to treat tick infestations, but also pro-actively
during strategic periods before infestation to reduce larval
populations in pasture. This decreased the overall number
of treatments required to manage *R. australis* populations.
Pro-active use of LAA is only possible if producers main-
tain a calendar noting their herd rotations and tick observa-
tions to know when and where larvae were present in pad-
docks to make informed decisions that anticipate future tick
infestations.

Information generated through this study can be used to
develop guidance concerning stocking rates to ensure effi-
cient larval collection in pasture after LAA treatment. The
stocking rate of 5 cattle/ha/week recommended in this study
is also consistent with Sutherst et al. (1977) who concluded
that a stocking rate of 5 cattle per hectare picked up between
50 and 85% of the tick larvae in a week compared with 30 to 70% with two animals per hectare.

All of these results are directly relevant to extending science-based evidence to producers for adaptive integrated tick management. This approach can now be consolidated with other livestock husbandry studies to advance cattle breeding under changing agroecological conditions.

**Acknowledgements** The authors would like to thank the technicians of the Groupement de Défense Sanitaire Animal for taking part in the data collection. Mention of trade names or commercial products in this publication is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the authors. USDA is an equal opportunity provider and employer.

**Author contribution** TH conceived and designed research, wrote original draft, and revised manuscript. TH and CF conducted experiments and collected data. HHW and WEG analyzed data and revised manuscript. PDT and APdL reviewed the manuscript. All authors read and approved the manuscript.

**Funding** The research of T. Hüe was funded by the 2017–2021 Development Contract with contributions from the French Government, the New Caledonian Government, and the South, North and Loyalty Islands Provinces. H.-H. Wang was partially supported by USDA-ARS and USDA-APHIS projects 58–3094–8–010 and 58–3094–9–016. The research of A.A. Pérez de León was funded through USDA-ARS appropriated project number 3094–32000–042–00-D.

**Data availability** Not applicable

**Code availability** Not applicable.

## Declarations

**Conflict of interest** The authors declare no competing interests.

**Ethics approval** Not applicable.

**Consent to participate** Not applicable.

**Consent for publication** Not applicable.

## References

Alegría-López, M.A., Rodríguez-Vivas, R.I., Torres-Acosta, J.F., Ojeda-Chi, M.M., Rosado-Aguilar, J.A., 2015. Use of Ivermectin as Endoparasiticide in Tropical Cattle Herds Generates Resistance in Gastrointestinal Nematodes and the Tick *Rhipicephalus microplus* (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology, Mar;52(2):214-21. https://doi.org/10.1093/jme/tju025.

Benavides, E., Jiménez, P., Betancur, O., Vélez, G., Polanco, N., & Morales, J., 2017. Efecto del uso de fluazurón para control de *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* en bovinos. Revista MVZ Córdoba, 6050-6061.

Beugnet F, Chardonnet L., 1995. Tick resistance to pyrethroids in New Caledonia. Veterinary Parasitology, 56:325-38. https://doi.org/10.1016/0304-4017(94)00686-7.

Bianchi, M.W., Barré, N., Messad, S., 2003. Factors related to cattle infestation level and resistance to acaricides in *Boophilus microplus* tick populations in New Caledonia. Veterinary Parasitology, Feb 28;112(1-2):75-89. https://doi.org/10.1016/s0304-4017(02)00415-6.

Bull, M.S., Overend, D., Hess, E.A., 1996. Suppression of *Boophilus microplus* populations with fluazuron - an acarine growth regulator. Australian Veterinary Journal, 74, 468-470.

Citroni, D., D'agostino, B. I., Martins, S., Schmid, H. R., Junqueira, P., 1999. Efficacy of fluazuron against infestations with Argentinean *Boophilus microplus*. In Profeeding of the 17th International Conference of the WAAVP, Copenhagen, 15-19.

Davey, R. B., Pound, J. M., Miller, J. A., & Klavons, J. A., 2010. Therapeutic and persistent efficacy of a long-acting (LA) formulation of ivermectin against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* (Acari: Ixodidae) and sera concentration through time in treated cattle. Veterinary parasitology, 169(1-2), 149-156.

Davey, R.B., Pound, J.M., Klavons, J.A., Lohmeyer, K.H., Freeman, J.M., Perez de Leon, A.A., Miller, R.J., 2011. Efficacy and blood sera analysis of a long-acting formulation of moxidectin against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* (Acari: Ixodidae) on treated cattle. Journal of Medical Entomology, Mar;48(2):314-21. https://doi.org/10.1603/me10154.

Desquesnes, M., Vignon, L., 1987. A preliminary study aimed at integrating pasture rotation with tick control in New Caledonia. Revue d'Elevage et de Médecine Vétérinaire de Nouvelle Calédonie, (10) 13-19.

Estrada-Peña, A., Venzal, J. M., Nava, S., Mangold, A., Guglielmone, A. A., Labruna, M. B., De La Fuente, J., 2012. Reinstate-ment of *Rhipicephalus (Boophilus) australis* (Acari: Ixodidae) with redistribution of the adult and larval stages. Journal of Medical Entomology, 49 (4), 794-802.

Ferlat, C., 2004. Utilisation d'une formulation longue action d'ivermectine contre *Boophilus microplus* et les principaux strongles digestifs du bétail en Nouvelle-Calédonie. Thèse de médecine vétérinaire. Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse. 138 pp.

Gomes, L. V. C., Lopes, W. D. Z., Cruz, B. C., Teixeira, W. F., Felip-pelli, G., Maciel, W. G., ... & Martinez, A. C., 2015. Acaricidal effects of fluazuron (2.5 mg/kg) and a combination of fluazuron (1.6 mg/kg) + ivermectin (0.63 mg/kg), administered at differ-ent routes, against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* parasitizing cattle. Experimental parasitology, 153, 22-28.

Hitchcock, L. F., 1955. Studies on the parasitic stages of the cattle tick, *Boophilus microplus* (Canestrini) (Acari: Ixodidae). Australian Journal of Zoology, 3(2): 145-155.

Hüe, T., 2019. Livestock ticks in New Caledonia: Review on 75 years of presence and 60 years of research. Local history for global learning. Revue d'Elevage et de Médecine Vétérinaire Pays Tropicaux, 72 (3): 123-132, https://doi.org/10.19182/ remvt.31781

Hüe, T., Fontfreyre, C., 2019. Development of a new approach of pasture management to control *Rhipicephalus microplus* infestation. Tropical Animal Health and Production, 51:1989-1995.

Hüe, T., Petermann, J., Bonnefond, R., Mermoud, I., Rantoen, D., Vuocolo, T., 2017. Experimental efficacy of a vaccine against *Rhipicephalus australis*. Experimental and Applied Acarology, 73:245-256. https://doi.org/10.1007/s10493-017-0184-0.

Mendonça, R.P., 2010. Atividade endectocida, segurança clínica e farmacocinética de resíduos de uma nova alternativa terapêutica (fluazuron + abamectina) em bovinos. Brasil: Ph. D. Thesis, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Unesp, Campus de Jaboticabal, 177pp.

Miraballes, C., Riet-Correa, F., Saporiti, T., Lara, S., Parodi, P., Sanchez, J., 2019. Probability of *Rhipicephalus microplus* introduction into farms by cattle movement using a Bayesian Belief Network. Ticks and Tick Borne Diseases, Jun;10(4):883-893. https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2019.04.009.

<figure><img src="image_58.png" /></figure>
Nava, S., Mangold, A.J., Canevari, J.T., Guglielmone, A.A., 2015 Strategic applications of long-acting acaricides against Rhipicephalus (Boophilus) microplus in northwestern Argentina, with an analysis of tick distribution among cattle. Veterinary Parasitology, Mar 15;208(3-4):225-30. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2015.01.015.

Pérez de León, A.A., Mitchell, R.D., Watson, D.W., 2020. Ectoparasites of cattle. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 36:173-185. https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2019.12.004.

Petermann, J., Cauquil, L., Hurlin, J.C., Gaia, H., Hüe, T., 2016. Survey of cattle tick, *Rhipicephalus (Boophilus) microplus*, resistance to amitraz and deltamethrin in New Caledonia. Veterinary Parasitology, 217&nbsp;; 64–70.

Reck, J., Klafke, G. M., Webster, A., Dall'Agnol, B., Scheffer, R., Souza, U. A., Corassini, V.B., Vargas, R., dos Santos, J.S., de Souza Martins, J. R., 2014. First report of fluazuron resistance in *Rhipicephalus microplus*: a field tick population resistant to six classes of acaricides. Veterinary Parasitology, 201(1-2), 128-136.

Rodríguez-Vivas, R.I., Pérez-Cogollo, L.C., Rosado-Aguilar, J.A., Ojeda-Chi, M.M., Trinidad-Martinez, I., Miller, R.J., Li, A.Y., Pérez de León, A.A., Guerrero, F., Klafke, G., 2014. *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* resistant to acaricides and ivermectin in cattle farms of Mexico. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, Apr-Jun;23(2):113-22. https://doi.org/10.1590/s1984-29612014044.

Rodríguez-Vivas, R.I., Jonsson N.N., Bhushan, C., 2018. Strategies for the control of *Rhipicephalus microplus* ticks in a world of conventional acaricide and macrocyclic lactone resistance. *Parasitology Research*. 117:3-29.

Sutherst, R. W., Dallwitz, M. J., Utech, K. B. W., & Kerr, J. D., 1977. Aspects of Host Finding by the Cattle Tick, *Boophilus microplus*. Australian Journal of Zoology, 26(1), 159-174.

Wang, H.H., Grant, W.E., Teel, P.D., Lohmeyer, K.H., Pérez de León, A.A., 2020. Enhanced biosurveillance of high-consequence invasive pests: southern cattle fever ticks, *Rhipicephalus (Boophilus) microplus*, on livestock and wildlife. Parasites and Vectors, 13:487. https://doi.org/10.1186/s13071-020-04366-x.

Wharton, R. H., 1970. The relation between engorgement and dropping of *Boophilus microplus* (Canestrini) (Ixodidae) to the assessment of tick numbers on cattle. Australian Entomology, 9(3), 171-182.

**Publisher's note** Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations.
# PARTIE IV – Développement d'un vaccin calédonien anti-Boophilus australis

Cette partie s'appuie sur les articles suivants, présentés pages 150 à 162, pages 163 à 174 et pages 175 à 181 :

Petermann, J., Bonnefond, R., Mermoud, I., Rantoen, D., Meynard, L., Munro, C., Lua L., Hüe, T. (2017). Evaluation of three adjuvants with respect to both adverse effects and the efficacy of antibody production to the Bm86 protein. *Experimental and Applied Acarology*, 72(3): 303-315

Hüe, T., Petermann, J., Bonnefond, R., Mermoud, I., Rantoen, D., Vuocolo, T. (2017) Experimental efficacy of a vaccine against *Rhipicephalus australis*. *Experimental and Applied Acarology*, 73(2):245-256.

Duval, H., Hüe, T. (2022). Field efficacy assessment of a vaccine against *Rhipicephalus (Boophilus) australis* in New-Caledonia. *Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports*. 100702.

## 1. Historique du projet

Afin de fournir aux éleveurs de nouvelles méthodes de lutte contre la tique du bétail, l'IAC a été sollicité en 2010 par les professionnels pour travailler sur la lutte immunologique et développer un vaccin (Hubert, 2015). En 2010, le vaccin australien TickGard® n'était plus commercialisé mais un autre vaccin similaire, le Gavac®, était toujours produit à Cuba et commercialisé en Amérique latine. Cependant, ce vaccin ne présentant pas les garanties sanitaires suffisantes pour être importé et utilisé sur le territoire, il n'a pas été autorisé localement. Il a alors été décidé de développer un vaccin à base de souches de tiques calédoniennes. Nous avons sollicité, dès 2010, le Pr. Peter Willadsen, initiateur de ce vaccin en Australie au sein du CSIRO. Ce dernier est venu en mission en octobre 2010 pour participer à la définition de la feuille de route. Il apporte depuis 2010, et jusqu'à ce jour, un soutien technique à ce projet.

### 1.1 Séquençage de la protéine vaccinale

Le séquençage de l'ADN codant pour la protéine Bm86 de 5 populations de tiques collectées en Nouvelle-Calédonie a été réalisé par le CSIRO (Hüe et al., 2017). Le gène codant la Bm86 est composée de 1839 paires de bases codant pour 629 acides aminés. L'alignement des séquences d'ADNc des cinq échantillons de tiques *R. australis* a été réalisé à l'aide du logiciel ClustalX® et est présenté par Hüe et al. (2017). Les séquences des 5 souches de tiques présentaient entre 97,6% et 98,4% d'homologie avec la séquence australienne présente dans GeneBank (NCBI accession M29321). La séquence de l'échantillon de tique n°4 (strain_4) ayant le plus grand nombre d'acides aminés en commun avec les
autres séquences, elle a été considérée comme étant la plus représentative des cinq échantillons séquencés. C'est cette séquence qui a été retenue pour la suite du développement de ce vaccin.

## 1.2 Production de la protéine et des doses vaccinales

### Production sur *Pichia pastoris*

La première production de la protéine Bm86 s'est faite au début 2013 par le laboratoire Protein Expression Facility (Université du Queensland, Australie). La synthèse de la protéine par la levure *Pichia pastoris* a été initialement choisie car c'était le milieu de production utilisé dans la production du vaccin TickGard®. Ce milieu de culture présente également l'avantage de produire une protéine directement fonctionnelle. La protéine Bm86 a en effet une structure 3D complexe avec de nombreux ponts disulfures et la production par cette levure produit une protéine avec sa structure définitive. Les rendements furent cependant faibles et seuls 2 mg de protéine ont été produits. Cette quantité étant trop faible pour réaliser un essai en conditions contrôlées, il a été décidé de changer de système.

### Production sur *Escherichia coli*

La seconde production de la protéine a été réalisée sur *E. coli*. Ce support garantit des rendements de production plus élevés mais cette approche requiert une étape supplémentaire. En effet, contrairement à la production sur levure (système eucaryote), ce milieu de culture produit la protéine sous forme linéaire et il faut une étape de repliage pour s'approcher de la structure définitive de la protéine. Tous les détails de la synthèse protéique sont présentés dans l'article de Petermann et al. (2017). Lors de ce second essai, 45,7 mg de protéine ont été produits.

## 1.3 Production des doses vaccinales

Les doses de vaccin ont été préparées au laboratoire de l'IAC. Un mg de protéine recombinante solubilisé dans 8 mL d'eau pour solution injectable a été mis en suspension dans 12 mL d'adjuvant, soit un flacon de 20 mL. Le vaccin ainsi préparé était directement conditionné dans des seringues de 2 mL prêtes à l'usage, correspondant à 100 µg de protéine adjuvée par animal.

## 2. Évaluation de différents adjuvants

Avant de réaliser un essai en stabulation, une étude a été menée en 2015 pour comparer l'impact de différents adjuvants sur la réponse immunitaire des animaux et évaluer les effets secondaires locaux et généraux qu'ils pourraient provoquer.
## 2.1 Matériels et Méthodes

### 2.1.1 Adjuvants testés

Trois adjuvants, utilisés dans des vaccins destinés aux bovins, ont été fournis par la société SEPPIC : Montanide™ Gel 01, Montanide™ ISA 201 VG et Montanide™ ISA 61 VG.

- L'adjuvant Montanide™ Gel 01 est un adjuvant polymère aqueux conçu pour les vaccins de type aqueux.

- L'adjuvant Montanide™ ISA 201VG est un adjuvant à base d'huile minérale qui a été mis au point pour la fabrication d'émulsions eau dans huile dans l'eau (E/H/E).

- L'adjuvant Montanide™ ISA 61 VG est un adjuvant à base d'huile minérale développé pour la fabrication d'émulsions eau dans l'huile (E/H).

Les adjuvants à base d'huile minérale ont été testés car ce sont les adjuvants les plus communément utilisés dans les vaccins pour les bovins en vue de stimuler la réponse immunitaire, cependant ils sont connus pour engendrer des réactions inflammatoires. L'adjuvant aqueux a été testé car il présentait en théorie l'avantage de provoquer moins de de réactions inflammatoires mais il fallait évaluer ses capacités à stimuler la réponse immunitaire.

Comme indiqué précédemment, chaque dose vaccinale de 2,0 mL contenait 100 µg de protéine Bm86.

### 2.1.2 Description de l'essai

#### Animaux

Quarante génisses charolaises ont été réparties en quatre lots homogènes de 10 animaux, composés de 3 génisses d'un an et de 7 génisses de 2 ans. Trois lots ont été vaccinés en utilisant un adjuvant différent et les animaux du groupe témoin ont reçu une injection de 100 µg de protéine diluée dans 2,0 mL d'eau pour solution injectable. Chaque animal a reçu 2 injections à un mois d'intervalle par voie sous-cutanée, du côté droit de l'encolure lors de la 1ère injection (J0) et du côté gauche à la seconde (J28). Les animaux ont été maintenus en parc pendant quatre jours après les deux injections et ont ensuite été mis au pâturage le reste du temps. Après le 71e jour, trois génisses de 2 ans par groupe ont quitté l'étude pour être vendues. Les animaux restants ont reçu une troisième injection le jour 248 afin de suivre la cinétique des anticorps.

#### Suivi des effets secondaires et de la cinétique des anticorps

Le suivi des effets secondaires a consisté à relever les paramètres d'une inflammation locale au point d'injection et ceux d'une inflammation générale. Le pli de peau a été retenu pour évaluer l'inflammation locale. L'inflammation générale a été suivie par le relevé de la température rectale et la mesure de différents paramètres sanguins : Fibrinogène, Sérum Amyloid A (SAA) et Haptoglobine
(Alsemgeest et al., 1994; Humblet et Godeau, 2005). Les lots d'animaux ont été systématiquement passés dans le même ordre pour que les différences de température ambiante entre le début et la fin des mesures journalières n'interfèrent pas avec le relevé de la température rectale pour un même lot.
Des prises de sang ont été régulièrement réalisées pour suivre l'évolution des titres en anticorps (Ac).
Les dates des vaccination, mesures et prises de sang sont présentées dans le tableau 6.

<table><caption>Tableau 6 : Dates de vaccination, mesures et prises de sang après la première injection (J0)</caption><thead><tr><th>Jour</th><th>0</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>7</th><th>20</th><th>28</th><th>29</th><th>30</th><th>31</th><th>37</th><th>42</th><th>55</th><th>70</th><th>104</th><th>142</th><th>164</th><th>201</th><th>248</th><th>280</th><th>399</th></tr></thead><tbody><tr><td>Vaccination</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titrage Ac</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Température</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epaisseur du pli de peau</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAA</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haptoglobine</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogène</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

## Méthode de titrage des anticorps

Le titrage des anticorps a été réalisé au Laboratoire de Nouvelle-Calédonie (LNC) et s'est fait par la technique ELISA. La technique est décrite dans l'article de Petermann et al. (2017) présenté à la fin de ce chapitre. La densité optique (DO) a été mesurée à l'aide d'un lecteur Thermo Multiskan EX ELISA équipé d'un filtre de 450nm. Pour le développement de la technique, cinq animaux ont été vaccinés et ont été considérés comme témoin positif. Des prises de sang ont été réalisées sur cinq bovins non vaccinés, considérés comme témoin négatif du test ELISA. Les titres d'anticorps des animaux prélevés dans le cadre de ces différents essais ont été calculés par la formule : $100*(DO Sérum/DO témoin Positif)$ et les résultats sont exprimés en pourcentage (%S/P).

## Méthodes biochimiques

Les prises de sang sur tube sec ont été réalisées et les différentes analyses ont été effectuées au LNC.
Le fibrinogène a été analysé par la méthode de précipitation sur plasma chauffé. L'haptoglobline et le sérum amyloid A ont été analysés respectivement par des techniques de colorimétrie et d'ELISA sandwich en utilisant les kits Tridelta TP801-Phase et Tridelta TP802-Phase.

## Analyses statistiques

Les valeurs moyennes par groupe des titres d'anticorps, de l'haptoglobine, du SAA, du fibrinogène, de la température et de l'épaisseur de la peau ont été comparées par des ANOVA à un facteur. Le lien entre l'épaisseur de la peau et le titre d'anticorps a été analysé par un test de corrélation de Pearson.
## 2.2. Résultats de l'évaluation des trois adjuvants

### 2.2.1 Impact sur la réponse immunitaire

Suite à la première injection, les titres des anticorps ont augmenté dans les trois groupes vaccinés pour atteindre à J20 une moyenne de 118 %S/P pour le groupe ayant reçu l'adjuvant 61VG, 85 %S/P avec le 201VG et 40 %S/P avec le Gel 01. Ces titres ont ensuite diminué légèrement jusqu'au rappel vaccinal à J28, sans que cette réduction soit significative (p>0,1). Les titres ont atteint un pic à J42 pour les adjuvants 201VG et Gel01 respectivement à 122 et 96 avant de diminuer jusqu'au rappel suivant à J248. Pour les animaux ayant reçu l'adjuvant 61VG, les titres ont augmenté entre J28 et J55 pour atteindre une moyenne de 137 avant de commencer à diminuer. Une ANOVA à 2 facteurs (adjuvant et temps) permet d'indiquer que la variation des titres d'anticorps est significativement et uniquement corrélée à l'adjuvant, avec un effet plus important pour le 61VG.

La moyenne des titres en anticorps dans le groupe témoin est restée autour de 3, en deçà du seuil de positivité estimé à 40 % S/P. La différence des titres entre les trois groupes ayant reçu des adjuvants et le groupe témoin est significative pour l'ensemble des dates (p<0,001). Les titres obtenus avec le 61VG sont significativement supérieurs aux titres obtenus avec le 201VG et le Gel01 (p<0,05) aux dates suivantes : J20, J28, J42, J55, J70, J164, J201 et J248. Les titres obtenus avec le 201VG sont significativement supérieurs à ceux obtenus avec le Gel01 (p<0,05) aux dates suivantes : J20, J28, J42, J55, J70, J104, J164, J201 et J248. Après le rappel à J248, les titres ne sont pas significativement différents pour les adjuvants 61VG et 201VG à J280 et J399 mais ils sont significativement plus élevés que les titres obtenus avec l'adjuvant aqueux (p<0,01). L'ensemble des résultats sont présentés dans la figure 16.
<figure><img src="image_59.png" /></figure>

Figure 16 : Cinétique des anticorps dans les différents groupes d'adjuvants. Les flèches rouges marquent les dates de vaccination, les barres indiquent les écart-types (10 réplicas par adjuvant entre J0 et J70 puis 7 réplicas après J70).

### 2.2.2 Évaluation des effets secondaires

#### Épaisseur du pli de peau au point d'injection

L'ensemble des animaux ayant reçu un adjuvant ont présenté une augmentation de l'épaisseur de la peau suite à la première injection. Cependant, par rapport au groupe témoin, cette augmentation n'a été significative que pour le groupe 61VG à J7 (p<0,01) et à J20 (p<0,05).

Cette réaction locale s'est accentuée suite lors du rappel vaccinal à J28 et les plis de peau mesurés à partir de cette date dans les différents lots étaient significativement plus épais que dans le groupe témoin. L'augmentation de l'épaisseur du pli de peau a été plus rapide pour les groupes 201VG et Gel01 mais le groupe 61VG a présenté une réaction plus marquée (figure 17).
<figure><img src="image_60.png" /></figure>

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Figure 17 (a et b) : Moyenne de l'épaisseur du pli de peau dans les différents groupes. Les flèches marquent les dates de vaccination. Les barres indiquent les écart-types (N=10).</figcaption></figure>
## Température rectale

Il n'y a pas eu d'augmentation significative de la température rectale dans les jours suivants la vaccination (figure 18). Etant donné qu'aucune augmentation de la température rectale n'a été observée dans les 3 jours après les injections, le suivi de ce paramètre ne s'est pas poursuivi au-delà.

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

Figure 18 : Température rectale moyenne des animaux dans les différents groupes. Les flèches rouges marquent les dates de vaccination. Les barres indiquent les écart-types (N=10).

## Sérum Amyloïd A (SAA)

Les valeurs usuelles de la concentration sanguine de SAA avec ce test sont comprises entre 9,5 et 150 µg/mL. Les moyennes des différents groupes sont restées dans les valeurs usuelles pour ce paramètre (figure 19), bien que si 6 animaux aient présenté des valeurs au-delà des valeurs usuelles et jusqu'à 168 g/mL dans le groupe 61VG à J31, trois jours après la seconde injection.
<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Figure 19 : Moyenne des taux de sérum amyloïd A dans les différents groupes. Les flèches rouges marquent les dates de vaccination. Les barres indiquent les écart-types (N=10).</figcaption></figure>

### Haptoglobine

Les valeurs usuelles de la concentration sanguine pour l'haptoglobine avec ce test se situent entre 0,05 et 0,2 mg/mL. La moyenne du groupe 61 VG a été supérieure à ce seuil à J0, en raison de valeurs élevées (0,49 et 0,53 mg/mL) chez deux individus, avant de revenir dans les valeurs usuelles dans les jours suivants (figure 20). Ce lot a vu également sa moyenne repasser au-dessus de 0,2 mg/mL trois jours après le rappel vaccinal (J31), en raison également de valeurs élevées chez deux autres individus (1,50 et 0,86 mg/mL). Pour les autres lots, 201 VG et Gel 01 et témoins, la moyenne de la concentration sanguine de ce paramètre est toujours restée entre les valeurs usuelles.

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Figure 20 : Moyenne des taux d'haptoglobine dans les différents groupes. Les flèches rouges marquent les dates de vaccination. Les barres indiquent les écart-types (N=10).</figcaption></figure>
## Fibrinogène

Les valeurs usuelles de concentration sanguine du fibrinogène se situent en dessous de 5,5 g/L. Les valeurs de ce paramètre dans les différents groupes sont restées dans les valeurs usuelles durant tout le suivi (figure 21).

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

Figure 21 : Moyenne des taux de fibrinogène dans les différents groupes. Les flèches rouges marquent les dates de vaccination. Les barres indiquent les écart-types (N=10).

## Corrélation entre les titres en anticorps et les paramètres relevés

Une corrélation positive a pu être établie entre l'épaisseur individuelle maximale du pli de peau et le titre le plus élevé en anticorps pour le groupe 61 VG (test de Pearson, r= 0,07, p= 0,02). Cette corrélation est intéressante à souligner car elle indique que plus la réaction est importante au point d'injection, plus l'animal produit des anticorps. Aucune corrélation n'a pu être établie pour les autres paramètres.

## Conclusion

L'évaluation des 3 adjuvants testés n'a pas mis en évidence une augmentation significative de la température rectale ni des paramètres sanguins de l'inflammation par rapport au groupe témoin, hormis de façon ponctuelle pour l'haptoglobine avec le lot ISA 61 VG. En revanche, le pli de peau était significativement plus marqué – signe d'une réaction inflammatoire locale – dans les trois groupes vaccinés avec un adjuvant, et cette augmentation était significativement plus importante pour l'adjuvant ISA 61 VG, notamment lors du rappel vaccinal à un mois. Cet adjuvant a entraîné une
augmentation significativement plus importante de la production d'anticorps qui s'est maintenu également plus longtemps. L'adjuvant ISA 61 VG a donc été retenu pour la suite des études.

## 3. Essai en conditions contrôlées

### 3.1 Matériels et Méthodes

#### 3.1.1 Conditions de l'étude

Cet essai a eu lieu mi-2015 dans les conditions de stabulation de la station zootechnique de la province Sud. Au préalable, des tiques gorgées avaient été collectées sur des animaux de cette même station et un élevage de tiques avait été mis en place à l'IAC pour produire des larves âgées de 15 jours en vue des infestations artificielles.

#### Animaux

Seize bovins charolais mâles de 12 mois ont été retenus pour cette étude. Une première infestation a été réalisée en déposant 1000 larves de tiques sur le dos de chaque animal deux fois à 48h d'intervalle pour évaluer le niveau de résistance de chaque individu. Les tiques gorgées ont été collectées sur les 2 côtés de l'animal et comptées trois semaines plus tard pendant une période de 6 jours pour établir le degré de réceptivité à l'infestation par les tiques de chaque animal. Deux animaux trop nerveux ont été écartés à l'issue de cette première phase. Les animaux restants ont été répartis selon leur réceptivité individuelle pour obtenir deux groupes homogènes. Les deux groupes ont été maintenus en stabulation dans deux stalles distinctes pendant toute la période de l'étude.

#### Vaccination et infestations

Les animaux du groupe « vacciné » ont reçu leur première dose vaccinale le 05 juillet 2015 (J0) et le rappel a eu lieu quatre semaines plus tard (J28). Les animaux du lot « témoin » recevaient parallèlement une injection placebo ne contenant que la solution adjuvée sans la protéine vaccinale. Les animaux ont ensuite été soumis à deux séries de trois infestations artificielles à 48h d'intervalle, à J39, J41, J43 puis à J53, J55 et J57. Mille larves de tiques étaient déposées lors de chaque infestation.

#### 3.1.2 Paramètres étudiés

##### Impact du vaccin sur les tiques

Les femelles gorgées ont été collectées de J58 à J67 puis de J72 à J83 sur l'ensemble des animaux. Elles ont été ramenées au laboratoire où elles ont été lavées, comptées et pesées pour chaque animal. Les tiques gorgées ont été examinées pour déterminer le nombre de tiques présentant des lésions
hémorragiques. Les tiques ont ensuite été placées dans une enceinte à température contrôlée (27°C ; 85% RH) pour récolter les pontes. Une fois la ponte terminée, les œufs ont été pesés et mis par tube de 5 mg pour évaluer l'éclosion.

## Suivi sérologique

Des prises de sang ont été réalisées sur l'ensemble des animaux à J0, J14, J28, J42, J56, J70, J82 et J113 pour suivre la cinétique des anticorps.

## Analyses statistiques

Les effets de la vaccination sur la biologie des tiques ont été déterminés tels que décrit par de la Fuente et al. (1999). L'impact du vaccin sur les tiques a été évalué en calculant, entre les 2 groupes d'animaux, la réduction du nombre tiques femelles adultes (% DT), de la capacité de ponte (% DOv) et de la fertilité (% DF). La capacité de ponte est le rapport entre le poids des pontes et le poids des tiques avant la ponte. La fertilité est le pourcentage d'œufs viables.

L'efficacité du vaccin a été calculée comme étant 100 × [1 - (CRT × CRO × CRF)], où CRT, CRO et CRF sont respectivement la réduction du nombre de tiques femelles adultes, de la capacité de ponte et de la fertilité, soit CRT=1-DT, CRO=1-DOv et CRF=1-DF.

Pour l'analyse des résultats, des comparaisons par paire (test t de Student, p=0,05) ont été effectuées pour comparer les résultats entre le groupe vacciné et le groupe témoin. Les niveaux moyens d'anticorps ont été comparés à l'aide d'un test ANOVA à un facteur.

## 3.2 Résultats

### 3.2.1 Cinétique des anticorps

Les titres en anticorps, dans le lot d'animaux vaccinés, ont atteint leur maximum deux semaines après la seconde injection, soit à J14 et J42, avant de diminuer progressivement jusqu'à la fin de l'étude, sans que la différence ne soit significative entre J42 et J113 (p=0,09) (figure 22).
<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Figure 22 : Moyenne des titres en anticorps Bm86 pour le groupe témoin (en bleu) et le lot vacciné. Les flèches rouges marquent les dates de vaccination. Les barres indiquent les écart-types (N=7).</figcaption></figure>

### 3.2.2 Impact sur les tiques

Le nombre total de tiques gorgées récoltées sur les animaux vaccinés était inférieur de 40,3% par rapport au groupe témoin. Le poids moyen des tiques collectées sur les animaux vaccinés était significativement inférieur de 35,0% chez les animaux vaccinés, leur capacité de ponte était significativement réduite de 51,2% et leur fertilité était diminuée de 18,8% par rapport aux tiques récoltées sur les animaux du lot témoin (tableau 7). En reprenant la formule présentée au point précédent, l'efficacité de ce vaccin expérimental a été de 74,2%.

<table><caption>Tableau 7 : Résultats des infestations artificielles lors de l'essai.</caption><thead><tr><th>Lot</th><th>Nombre de tiques par lot</th><th>Nombre de tiques par animal</th><th>Poids des tiques (mg)</th><th>Poids des pontes par tiques (mg)</th><th>Fertilité (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Vacciné (N=7)</td><td>234</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moyenne</td><td></td><td>33,4</td><td>135,0</td><td>54,1</td><td>0,70</td></tr><tr><td>Ecart-type</td><td></td><td>24,0</td><td>9,0</td><td>15,1</td><td>0,20</td></tr><tr><td>Témoin (N=7)</td><td>392</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moyenne</td><td></td><td>56,0</td><td>207,8</td><td>117,3</td><td>0,79</td></tr><tr><td>Ecart-type</td><td></td><td>23,7</td><td>17,4</td><td>13,9</td><td>0,07</td></tr><tr><td>p-value</td><td></td><td>0,10</td><td>&lt; 0,0001</td><td>&lt; 0,0001</td><td>0,32</td></tr><tr><td></td><td>%DT : 40,3%</td><td></td><td>%DR : 35,0%</td><td>%DOv : 51,2%</td><td>%DF : 18,8%</td></tr></tbody></table>
Parmi les tiques collectées sur les animaux vaccinés, 41,9% présentaient des lésions hémorragiques (figure 23) contre 0,3% des tiques prélevées sur les animaux du groupe témoin.

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Figure 23 : Tiques gorgées prélevées sur un animal vacciné (à gauche) et sur un animal témoin (à droite)</figcaption></figure>

## 4. Évaluation de l'efficacité vaccinale lors d'un essai de terrain

Les résultats de l'essai en conditions contrôlées ayant été satisfaisants, il a été décidé de tester ce vaccin en conditions d'élevage. Cet essai s'est déroulé entre 2017 et 2020.

### 4.1 Matériels et Méthodes

#### 4.1.1 Élevages

Les élevages inclus ont été sélectionnés sur les critères suivants :

* Un cheptel supérieur à 25 vaches mères et génisses de renouvellement ;

* La présence d'un ou plusieurs troupeaux de vaches mères de races dites « sensibles » à la tique, à savoir de race Limousine, Charolaise ou Blonde d'Aquitaine ;

* La volonté de l'éleveur de maintenir ces races pendant les 3 ans de l'essai ;

* En présence d'autres troupeaux de races résistantes à la tique dans l'élevage, le(s) troupeau(x) suivi(s) pour l'essai est(sont) mené(s) séparément sur des parcelles dédiées.

* La présence d'une barrière à cerf intégrale ou moins de 20 cerfs constatés sur la propriété.

Neuf élevages bovins ont été inclus dans cet essai, soit environ 1400 bovins, répartis sur l'ensemble du territoire (figure 24).
<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Figure 24 : Répartition des 9 élevages suivis au cours de l'essai.</figcaption></figure>

### 4.1.2 Vaccin

La protéine vaccinale a été produite sur système *E. coli* par le même laboratoire du PEF (Université du Queensland) que pour l'étude expérimentale. L'adjuvant Montanide™ ISA 61 VG a été conservé. Le conditionnement a été réalisé en flacons de 50 doses (100 mL) par un prestataire australien.

### 4.1.3 Protocole

Le protocole prévoyait le suivi des élevages pendant un an avant la vaccination puis pendant deux ans après sa mise en place. Il n'a pas été envisagé de comparer des élevages vaccinés à des élevages témoins pour éviter une démotivation des éleveurs témoins en cours d'essai comme cela avait été le cas lors de l'essai mené en 1999-2000 (voir chapitre 1).

Le protocole retenu est présenté sur la figure 25. La première année (phase 1) a été consacrée à l'évaluation de la pression parasitaire dans les élevages suivis en enregistrant le nombre de traitements acaricides et en réalisant des comptages de tiques lors de ces traitements. Cette première année fut également l'occasion de mettre en place les mesures de lutte agronomique pour les éleveurs qui ne les avaient pas encore appliquées. Cette première phase a débuté en juillet 2017.
<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Figure 25 : Protocole de l'essai terrain.</figcaption></figure>

Les premières vaccinations ont eu lieu la seconde année (phase 2) entre septembre et novembre 2018. Le protocole vaccinal consistait en deux injections à un mois d'intervalle puis un rappel tous les 6 mois. Initialement tous les animaux de plus d'un mois du/des lots suivis ont été vaccinés. Au final, cinq campagnes de vaccination ont été réalisées, pour un total de 6079 injections.

#### 4.1.4 Paramètres d'évaluation

Le nombre de traitements acaricides et le score d'infestation, calculé à partir des comptages de tique, ont été les deux principaux indicateurs retenus pour évaluer la pression parasitaire tout au long de l'étude. Pour évaluer l'impact du programme, nous avons comparé ces deux indicateurs pour les périodes concernant les 12 premiers mois (mi-2017 à mi-2018) et les 12 derniers mois de l'essai (mi-2019 à mi-2020). L'impact du vaccin sur les tiques a également été évalué en collectant des tiques sur les animaux au cours de l'essai. La pluviométrie a été enregistrée pour surveiller son évolution. Les effets secondaires du vaccin et le ressenti des éleveurs ont également été notés.

##### Traitements acaricides

Les traitements acaricides ont été enregistrés de juillet 2017 à juin 2020 pour chaque troupeau. Afin de mettre en commun les données des traitements avec différents acaricides, les traitements rémanents (Ivomec Gold® ou Acatak®) ont été comptabilisés comme équivalents à trois traitements à
l'amitraze tel que décrit au chapitre 3. Pour chaque élevage, le nombre de traitements contre les tiques a été enregistré par bovin et par an.

## Score d'infestation

Des comptages de tiques ont été effectués lorsque l'infestation nécessitait un traitement acaricide des animaux selon l'appréciation de l'éleveur. Vingt-cinq bovins femelles ont été choisis aléatoirement à chaque comptage de tiques en évitant les bovins âgés de moins de 24 mois et de plus de 8 ans, car l'âge influe sur la réceptivité des animaux et ces tranches d'âge peuvent être plus réceptifs à l'infestation par les tiques. Le score d'infestation est calculé selon la méthode décrit par Naves et al. (2016). Il représente la somme du nombre de tiques de plus de 4 mm sur un côté du corps et du score de tiques immatures. Le score de tiques immatures (larves et nymphes) est obtenu par l'exploration de trois zones du corps : le cou, la queue et le périnée. La quantité de tiques immatures est évaluée semi-quantitativement par une note de 0 à 4. La moyenne de ces trois notes est multipliée par 10 pour obtenir le score de tiques immatures. Pour chaque exploitation, le score moyen d'infestation a été calculé par année.

## Indice d'infestation par les tiques

Pour estimer la charge annuelle de tiques, un indice d'infestation a été calculé. Cet indice est le niveau d'infestation mesuré par le score d'infestation, multiplié par le nombre de traitements acaricides.

$$ \text{Indice d'infestation annuel} = \text{score d'infestation annuel} \times \text{nombre de traitements acaricides annuels} $$

## Collecte de femelles gorgées

Des tiques gorgées ont été collectées dans les élevages suivis pour mesurer l'impact du vaccin sur leurs capacités de gorgement et de reproduction. Elles ont été collectées aléatoirement sur plusieurs bovins vaccinés en même temps que les comptages de tiques entre octobre 2018 et août 2020. Les tiques collectées ont été dénombrées et pesées individuellement. La présence de lésions hémorragiques a été relevée (photo 23 au point 3.2. de ce chapitre). Un maximum de vingt tiques, dont la moitié de tiques présentant des lésions hémorragiques quand elles étaient observées, étaient ensuite mises en élevage dans une enceinte climatique (27°C et 85% RH). Chaque tique a été placée dans un tube individuel et trois semaines plus tard, les pontes ont été individuellement pesées. L'objectif de ce suivi était d'évaluer la relation entre la présence de lésions hémorragiques et les capacités de développement et de reproduction des tiques.
### Pluviométrie

La pluviométrie pouvant influencer les populations parasitaires (voir chapitre 1), elle a été enregistrée mensuellement dans les différentes exploitations pour les périodes de mi-2017 à mi-2018 et de mi-2019 à mi-2020. Pour les élevages n'enregistrant pas cette donnée, l'information a été collectée dans la station météorologique la plus proche.

### Effets secondaires

Les réactions au point d'injection (nodule, dépilation ou abcès) ont été enregistrées lors d'une enquête menée à la fin de l'essai. Les éleveurs ont alors indiqué le pourcentage d'animaux au sein du troupeau ayant eu ces réactions cutanées par classe : 0%, 0-5%, 5-25%, 25-50%, 50-75% ou 75-100%.

Ces réactions locales ont également pu rendre la viande impropre à la consommation humaine et certaines parties de la carcasse ont pu être saisies à l'abattoir. Les quantités saisies, en lien avec la vaccination, ont également été relevées.

### Enquête de satisfaction

Une enquête de satisfaction a été menée à la fin des trois années de l'essai pour évaluer le ressenti des éleveurs. Le questionnaire portait sur le niveau de satisfaction globale du programme, leur ressenti sur l'efficacité des mesures agronomiques et du vaccin, et sur leur ressorti concernant les effets secondaires.

### 4.1.5 Analyses statistiques

La comparaison des moyennes du nombre de traitements acaricides des neuf élevages entre la première et la dernière année de l'essai a été réalisée en utilisant un test ANOVA. Les scores d'infestation ont été comparés entre les 2 périodes par un test de Wilcoxon en utilisant le logiciel R® (R Core Team, 2020). Les indices d'infestation de tiques de l'année mi 2017-mi 2018 et de l'année mi 2019-mi 2020 et les capacités de développement et de reproduction des tiques selon qu'elles présentent ou non des lésions hémorragiques ont été comparés par des tests de Fisher et de Student.

## 4.2 Résultats

### 4.2.1 Impact sur la pression parasitaire

#### Réduction du nombre de traitements acaricides

Entre la phase 1 (2017-2018) et la fin de la phase 2 (2019-2020), le nombre moyen de traitements acaricides annuel est passé de 7,4 ± 2,2 à 4,5 ± 1,8 par bovin, ce qui représente une réduction significative du nombre de traitements de 40,2% (p= 0,026) (figure 26).
<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>Figure 26 : Nombre de traitements acaricides par bovin et par an enregistrés au cours de la première et la dernière année de l'essai.</figcaption></figure>

### Augmentation des scores d'infestation

Vingt-deux comptages de tiques ont été réalisés sur la première année de suivi et 20 sur la dernière année. La moyenne des scores d'infestation sur la première année N1 était de 17,9 ± 1,7 et de 23,4 ± 3,3 durant la dernière année. Cette augmentation de 30,7% est significative (p= 0,037).

### Stabilisation de l'indice d'infestation

La moyenne de cet indicateur a peu fluctué entre les 2 années, passant de 126 ± 122,9 à 135 ± 122,8. Cette différence n'étant pas significative (p= 0,93). Ce résultat indique que la pression parasitaire reste constante malgré une réduction de 40,2% du nombre de traitements acaricides.

### Impacts sur les paramètres biologiques des tiques

Pendant la durée de l'essai, 1732 tiques gorgées ont été collectées sur les animaux et ramenées au laboratoire. Parmi celles-ci, 198 tiques, soit 11,4%, présentaient des lésions hémorragiques. Une fois pesées, 358 tiques ont été mises en incubation. Le tableau 8 compare le poids des femelles gorgées,
des pontes et du ratio [poids des pontes / poids des femelles gorgées] selon que les tiques présentent ou non des lésions hémorragiques. La présence de lésions hémorragiques entraine une réduction significative du poids des femelles gorgées, du poids des pontes et du ratio [poids des pontes / poids des femelles gorgées].

<table><caption>Tableau 8 : Comparaison du poids des tiques et du poids des pontes en fonction de la présence ou non de lésions hémorragiques.</caption><thead><tr><th>Présence de<br>lesions<br>hémorragiques</th><th>Nombre de<br>tiques pesées</th><th>Poids moyen des<br>femelles gorgées<br>(mg)</th><th>Poids moyen<br>des pontes (mg)</th><th>Ratio (poids des pontes /<br>poids des femelles<br>gorgées)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Oui</td><td>128</td><td>131,4 ± 37,1</td><td>38,1 ± 30,8</td><td>27,2 ± 19,9</td></tr><tr><td>Non</td><td>230</td><td>145,1 ± 46,0</td><td>70,8 ± 30,9</td><td>48,0 ± 12,4</td></tr><tr><td>p-value</td><td></td><td>0,004</td><td>&lt;2,2<sup>e</sup>-16</td><td>&lt;2,2<sup>e</sup>-16</td></tr></tbody></table>

## Analyses de la pluviométrie

La pluviométrie moyenne sur les 9 exploitations diminue de 811 ± 267 mm à 675 ± 302 mm entre la première et la dernière année du suivi mais cette baisse n'est pas significative (p= 0,33).

### 4.2.2 Effets secondaires

#### Réactions locales

Les réactions observées suite aux injections ont été de trois ordres :

- Des épaississements nodulaires de la peau de 5 cm de diamètre en moyenne mais pouvant atteindre les 15 cm de diamètre. Ils apparaissent dans les jours suivant l'injection et leur taille se réduit au fur et à mesure du temps jusqu'à disparaître au bout de quelques semaines. Cependant, les nodules après les premières injections étaient encore présents sur certains animaux à la fin de l'essai. En moyenne, 46,6% des injections ont donné lieu à des nodules ;

- Des pertes de poils de quelques centimètres à 20 centimètres de diamètre. La peau était rosée à orange, suintante et desquamée (figure 27). Ces lésions ont disparu en une semaine. Ces dépilations ont été observées dans moins de 1% des injections ;

- Des abcès, dont certains ont dû être traités chirurgicalement, se sont développés pour 0,1% des injections.
<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>Figure 27 : Réaction inflammatoire locale ayant entrainé une perte de poils.</figcaption></figure>

### Saisies à l'abattoir

Des saisies ont été relevées au niveau du point d'injection du vaccin mais sont restées ponctuelles. Au total, des saisies partielles (entre 1 et 5 kg) ont été réalisées sur 44 bovins. Rapporté au nombre de bovins abattus pendant la période de l'essai, cela représente 6,5 % des bovins envoyés à l'abattoir. Aucune saisie de l'ensemble de la carcasse en lien avec la vaccination n'a été enregistrée pendant l'étude.

### 4.2.3 Retour des éleveurs sur l'essai

L'enquête de satisfaction menée auprès des éleveurs a donné les résultats présentés dans la figure 28.

**Notes obtenues lors du questionnaire de satisfaction concernant le programme de lutte intégrée (2017-2020)**

<figure><img src="image_72.png" /></figure>
Figure 28 : Résultats de l'enquête de satisfaction réalisée en juillet 2020 auprès des 9 éleveurs de l'essai (1 : pas satisfait / 5 : très satisfait). Dans ce « boxplot », la croix représente la moyenne, la barre horizontale dans la boite représente la médiane, les limites inférieures et supérieures de la boite représentent le 1er et le 3ème quartile (Q1 et Q3) et les barres extérieures représentent 1,5 fois la valeur interquartile (Q3-Q1). Les points représentent les valeurs extrêmes, ne rentrant pas dans les barres extérieures.

Les différentes méthodes de lutte, qu'elles soient vaccinale, agronomique ou combinée ont été considérées comme très satisfaisantes avec des moyennes supérieures à 4/5. Le rythme de vaccination, avec une injection tous les 6 mois, a également été jugé satisfaisant. L'impression de moins traiter a été plus diversement ressentie par les éleveurs avec des notes allant de 2 à 5. Cependant, même sans observer une réduction importante du nombre de traitements acaricides, les éleveurs concernés se sont sentis rassurés de savoir leurs animaux vaccinés pour faire face à une infestation de tiques. Un tiers des éleveurs (3/9) ont répondu que les effets secondaires n'étaient « pas du tout gênant », 4/9 ont dit que c'était « un peu gênant », 1/9 « gênant » et 1 éleveur a considéré ces effets comme « très gênants ».

Tous les éleveurs ont souhaité, à l'issue de cet essai, continuer la vaccination de leurs troupeaux.
## Ce qu'il faut retenir :

L'évaluation de la réponse immunitaire induite par 3 adjuvants et des effets secondaires engendrés a permis d'identifier l'adjuvant Montanide ISA 61 VG comme le candidat à privilégier pour la production des doses vaccinales.

Les résultats obtenus en conditions contrôlées indiquent que le vaccin entraine une réduction de :

- 40,3% du nombre de tiques arrivant à se gorger sur les animaux,

- 35,0% du poids des tiques,

- 51,2% de leur capacité de ponte,

- 18,8% de la fertilité des œufs.

En prenant en compte ces résultats, l'efficacité du vaccin est estimée à 74,2%.

En conditions d'élevage, la vaccination diminue de 40,2% le nombre de traitements acaricides à l'issue de 2 années de vaccination, sans qu'il y ait de changement de la pression parasitaire dans les exploitations.

Des lésions hémorragiques ont été observées sur 41,9% des tiques collectées lors de l'essai en stabulation et sur 11,4% des tiques récoltées lors de l'essai en conditions d'élevage. La présence de lésions hémorragiques diminue significativement les capacités de développement et de reproduction des tiques.

Des effets secondaires, globalement mineurs, au point d'injection ont été relevés. La moitié des injections ont entraîné l'apparition de nodules persistants plus ou moins longtemps. Des dépilations voire des abcès ont été ponctuellement observés.

Malgré ces effets secondaires, l'ensemble des éleveurs impliqués dans l'essai ont trouvé les résultats très satisfaisants et souhaitent la prolongation de ce programme combinant la vaccination et les mesures de lutte agronomique.
## 5. Discussion

Les études menées dans le cadre de cet axe de recherche ont permis d'identifier l'adjuvant présentant le meilleur ratio bénéfices/risques et d'évaluer l'impact du vaccin développé en conditions contrôlées et en conditions d'élevage. Cependant nos travaux présentent certaines limites. La première porte sur la taille des effectifs étudiés lors des essais en stabulation puisqu'ils n'ont porté que sur 2 lots de 7 animaux. L'effectif restreint de chaque lot était un compromis entre la disponibilité d'animaux, et les considérations budgétaires et techniques. Une seconde limite est le faible nombre de larves déposées sur les animaux lors des infestations artificielles. Nous avons choisi d'appliquer six séries de 1 000 larves de tiques lors de ces essais alors que des publications portant sur des études similaires font état d'infestations artificielles plus massives avec 15 000 à 20 000 larves de tiques (Andreotti et al., 2002; Cunha et al., 2012). Cependant une infestation modérée est plus en accord avec les conditions naturelles du terrain. Enfin il peut nous être reproché l'absence d'élevages témoins lors de l'évaluation en conditions d'élevage. Le choix de ce protocole a été fait en concertation avec les éleveurs pour éviter leur démotivation. Il est néanmoins tout à fait classique de ne pas avoir de groupe témoin / contrôle négatif lors d'essais de terrain en médecine.

### 5.1 Choix de l'adjuvant

#### Réponse immunitaire induite

Parmi les trois adjuvants testés, la réponse induite par l'adjuvant à base de gel fut faible et non persistante. L'adjuvant Montanide 61 VG, de type eau-dans-huile (E/H) a entrainé l'augmentation la plus importante des titres d'anticorps ainsi qu'un maintien de ces titres pendant 6 mois après la 2ème et la 3ème injection. Ces résultats sont cohérents avec ceux de Spickler et Roth (2003) et Aucouturier et al. (2001) qui indiquent que les adjuvants à base d'huile stimulent principalement les réponses en anticorps et que les émulsions E/H libèrent lentement les antigènes du vaccin. Ces adjuvants peuvent ainsi entrainer une bonne immunité à long terme.

#### Effets secondaires

En conditions expérimentales, la vaccination avec les différents adjuvants n'a eu aucun effet secondaire conséquent sur les indicateurs d'une inflammation générale (température rectale, sérum amyloïde A et fibrinogène). Seule une légère augmentation du taux d'haptoglobine au-dessus des valeurs usuelles a été observée à J31 avec l'adjuvant Montanide 61 VG. Ces résultats concordent avec ceux de Stokka et al. (1993) qui, en utilisant un adjuvant similaire, ont observé une concentration sérique des protéines plasmatiques et du fibrinogène dans les limites des valeurs usuelles et une augmentation de la concentration sérique d'haptoglobine. En revanche, une réaction locale,
caractérisée par une augmentation de l'épaisseur du pli de peau, fut le principal effet secondaire relevé. Cette réaction a été plus marquée sur les bovins vaccinés avec les adjuvants Montanide 201 VG et surtout 61 VG. Les réactions locales plus importantes observées avec ce dernier adjuvant peuvent être liées au fait que les émulsions E/H sont plus visqueuses que les émulsions huile-dans-eau-dans-huile (H/E/H) telle que l'adjuvant Montanide 201 VG (Spickler et Roth, 2003).

## 5.2 Impact du vaccin sur les paramètres de développement et de reproduction des tiques

La vaccination des bovins lors de l'essai en conditions contrôlées a entraîné une réduction de 40,3% du nombre de tiques femelles adultes (%DT), une diminution de 51,2% de la capacité de ponte (%DOv) et une réduction de 18,8% de la fertilité (%DF) par rapport au groupe témoin. L'efficacité globale de ce vaccin dans ces conditions est ainsi évaluée à 74,2%. De nombreuses études ont été publiées sur des essais en stabulation avec différents vaccins contre les tiques mais il est délicat de comparer directement les résultats car les protocoles utilisés sont souvent différents en termes de protocole vaccinal, d'adjuvant, de voie d'administration ou de quantité de protéine vaccinale injectée. Selon les études, l'efficacité des vaccins varient ainsi de 31% (Cunha, 2012) à 91% (Penichet, 1994 ; Canales, 1997). Plus récemment, Pattaroyo (2020) a évalué l'efficacité de peptides dérivés de la protéine Bm86 à 72,4%, ce qui est un résultat très similaire au notre.

Les résultats concernant les différents paramètres étudiés sont également dans la moyenne de ceux obtenus par les études précédentes. Dans une revue, de la Fuente et al. (1999) ont noté que l'effet de la vaccination avec Gavac®, selon les études, se traduisait par une réduction de 9% à 74% du nombre de tiques femelles adultes, une diminution de 8% à 61% de la capacité de ponte et une diminution de 0% à 30% de la fertilité.

Les variations observées semblent s'expliquer essentiellement par des différences dans les protocoles appliqués mais d'autres hypothèses peuvent également être envisagées. Des proximités génétiques plus ou moins fortes entre les séquences de la protéine Bm86 du tube digestif des souches de tiques employées lors de ces essais et la séquence de la protéine vaccinale pourraient expliquer des différences dans les résultats obtenus. Une autre hypothèse porte sur la qualité de la protéine vaccinale utilisée. En effet, la protéine Bm86 possède un grand nombre de liaisons disulfures qui rendent le repliement de la protéine difficile. Cette phase de repliement est naturellement réalisée quand la protéine est produite par la levure *Pichia pastoris* mais ce n'est pas le cas lorsqu'elle est produite sur *E. coli* et le repliement nécessite alors une phase supplémentaire dans le processus de production. Cette dernière phase peut être à l'origine de variations dans la qualité du repliement obtenu et donc dans l'efficacité du vaccin produit.
### 5.3 Inflammation locale, réponse immunitaire et protection des animaux

La question d'une corrélation entre l'importance de la réaction inflammatoire au point d'injection, la production d'anticorps et l'impact sur les tiques est intéressante à étudier. En effet, une réaction inflammatoire attire principalement des macrophages, des granulocytes et des neutrophiles impliqués dans la production d'anticorps. Ce mécanisme soutient la corrélation positive entre l'épaisseur maximale individuelle du pli de peau et la production maximale d'anticorps que nous avons observé dans l'évaluation des différents adjuvants, pour les animaux ayant reçu l'adjuvant Montanide 61 VG. Willadsen et al. (1995) avaient également relevé une corrélation positive entre la taille de la réaction au site d'injection et le titre des anticorps. Cependant, la réaction inflammatoire au point d'injection peut être en partie liée à la présence d'endotoxines produites lors de la synthèse de la protéine vaccinale et une attention particulière doit donc être portée à la purification de la protéine lors de sa production pour limiter cette réaction inflammatoire.

Les animaux vaccinés dans les deux essais décrits ici ont présenté une élévation des titres en anticorps. Mais un niveau élevé de ces titres ne traduit pas nécessairement une bonne activité du vaccin sur les tiques (Willadsen et al., 1995), car la production d'anticorps n'a d'intérêt que si ces anticorps réagissent avec la protéine ciblée au niveau du tube digestif de ce parasite et entrainent les lésions escomptées chez les tiques. Willadsen et al. (1995) avaient évalué la corrélation entre le titre en anticorps et la capacité de ponte à -0,62. De la Fuente et al. (1998) ont observé, dans une étude à grande échelle utilisant le vaccin Gavac®, qu'un titre d'anticorps élevé était négativement corrélé au poids des tiques et au poids d'œufs par tique. Dans notre essai en stabulation, les animaux vaccinés ont démontré une réponse immunitaire avec une élévation des titres en anticorps. Sans que nous ne soyons en mesure de corréler les titres avec un impact sur les paramètres de développement des tiques, les résultats confirment une efficacité de l'immunisation avec une réduction du nombre total de tiques, du poids total des femelles engorgées et du poids total des œufs, par rapport au groupe témoin.

### 5.4 Vaccination en conditions d'élevage

L'essai terrain de ce vaccin a permis d'observer une réduction moyenne de 40,2 % du nombre de traitements acaricides au sein de 9 exploitations. Les scores d'infestation ont augmenté en moyenne de 30,7 %, ce qui est significatif, mais ils sont restés à un faible niveau. Cette augmentation du score d'infestation au cours du temps peut s'expliquer par le protocole retenu pour l'évaluer. En effet, dans des études de suivis d'infestations parasitaires, les comptages de tiques sont effectués à intervalles réguliers, de chaque semaine à chaque mois (Rodríguez et al., 1995; Willadsen et al., 1995; García-García et al., 2000; Jonsson et al., 2000). Ces comptages réguliers de tiques permettent un meilleur
suivi de la pression des tiques sur le bétail mais peuvent avoir lieu un jour où les animaux n'ont pas beaucoup de tiques puisque la date est fixée à l'avance. Cette approche n'a pas été retenue dans notre essai car ces comptages fréquents sont plus contraignants pour les éleveurs, notamment pour les études sur 3 ans. Dans notre étude, les comptages de tiques ont été effectués le jour du traitement contre les tiques, donc quand les animaux ont un nombre de tiques justifiant d'être traités. Le résultat suggère que les éleveurs ont toléré plus de tiques avant de traiter, sachant leurs animaux vaccinés.

La proportion de tiques présentant des lésions hémorragiques représente 11,4% des tiques collectées lors de cet essai alors qu'elle représentait 41,9% dans l'essai en conditions contrôlées. Cette proportion semble être très variable entre les études puisque Kemp et al. (1989) ont observé 20% de tiques avec des lésions hémorragiques, Rodriguez et al. (1994) 88% et Wong et Opdebeeck (1989) entre 40% et 55% au cours de son essai. Cependant toutes ces études étaient menées en conditions contrôlées sur des lots d'animaux homogènes et il serait à présent intéressant d'étudier quels facteurs pourraient expliquer une réduction de cette proportion dans notre essai en conditions d'élevage.

Plusieurs études sur l'utilisation des vaccins anti-tiques Gavac® ou Tickgard® à grande échelle en élevages ont démontré l'intérêt de ces vaccins (de la Fuente et al., 1999; Rodriguez Valle et al., 2004; de la Fuente et al., 2007; Domínguez García et al., 2016; Suarez et al., 2016). Une comparaison des études évaluant les vaccins contre les tiques du bétail est résumée dans le tableau 9. La réduction du nombre de traitements acaricides observée lors de notre essai est inférieure à celles décrites dans d'autres études mais plusieurs paramètres varient entre les essais. L'un d'eux est le protocole de vaccination. Le protocole recommandé pour l'utilisation du vaccin Gavac® indique trois injections initiales (à la 1ère, 4ème et 7ème semaine) puis un rappel tous les 6 mois, mais Vargas et al. (2010) ont souligné qu'une primo-vaccination avec Gavac® avec 2 ou 3 injections avait un impact similaire sur le poids des tiques et le poids des œufs de tiques. Le protocole du vaccin TickGard® recommandait deux injections de primovaccination à un mois d'intervalle et un rappel tous les trois mois. En tenant compte des facteurs logistiques et économiques, le choix de deux primo-vaccinations à un mois d'intervalle avec des rappels semestriels a été retenu pour notre étude de terrain.

La durée de l'étude est également un paramètre qui peut influencer la réduction du nombre de traitements. En effet, l'effet de la vaccination s'inscrit dans le temps. Elle n'empêche pas les tiques de se fixer mais réduit les capacités de reproduction. A chaque génération, la population de tiques va décliner et plus la vaccination sera prolongée, plus il est probable de constater une accentuation de la réduction des infestations parasitaires et donc du nombre de traitements acaricides.

Le changement de stratégie de traitements au cours d'un essai de vaccination est important à noter puisqu'il entre dans une politique globale de changement de pratiques et de réduction de l'usage des
acaricides. Cependant, cela surestime l'efficacité même de la vaccination puisqu'une partie de la réduction des traitements est liée à ces changements de pratiques. Dans l'étude de Rodriguez Valle et al. (2004) par exemple, les éleveurs passent de traitements systématiques réguliers à des traitements au-delà d'un certain seuil d'infestation. Dans notre étude, il est intéressant de relever que, bien que les éleveurs n'aient reçu aucune consigne en termes de traitements, certains ont modifié leurs pratiques. Ayant pris confiance dans le vaccin, certains éleveurs ont élevé d'eux-mêmes leur seuil de déclenchement de traitements voire n'ont pas traité les animaux face à une faible infestation comme ils auraient pu le faire auparavant.

Les effets secondaires restent un point important à prendre en compte. Les résultats que nous avons observés sont du même ordre que ceux connus dans la littérature. En effet, Willadsen et al. (1995) signalent des réactions importantes et suintantes dans 1% des injections, ce qui correspond à nos observations.

Malgré cela, tous les éleveurs inclus dans cet essai souhaitent poursuivre le programme de vaccination, ce qui démontre qu'ils ont perçu le rapport bénéfice/risque positif du vaccin.
<table><caption>Tableau 9 : Comparaison des différents essais vaccinaux en conditions d'élevage.</caption><thead><tr><th>Etude</th><th>Vaccin</th><th>Protocole de vaccination (A,B,C)*<sup>1</sup></th><th>Race</th><th>Pays</th><th>Nombre de bovins vaccinés</th><th>Durée de l'essai</th><th>Présence d'un groupe témoin</th><th>Changement de la stratégie de traitement en cours d'essai</th><th>Réduction du nombre de traitements acaricides (D, E)*<sup>4</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>Essai de l'étude (2017-2020)</td><td>Bm86 (souches locales)</td><td>A</td><td>Limousine, Charolaise, Blonde d'Aquitaine</td><td>Nouvelle-Calédonie</td><td>1 400</td><td>2 ans</td><td>Non</td><td>Non</td><td>40,2% (D)</td></tr><tr><td>(Rodriguez Valle et al., 2004)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Holstein</td><td>Cuba</td><td>588 573</td><td>8 ans</td><td>Oui*<sup>2</sup></td><td>Oui*<sup>3</sup></td><td>87% (D)</td></tr><tr><td>(Suarez et al., 2016)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Non précisé</td><td>Venezuela</td><td>28 727</td><td>2 ans</td><td>Oui</td><td>Non</td><td>83,7% (E)</td></tr><tr><td>(de la Fuente et al., 2007)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Croisé</td><td>Mexique</td><td>2 600</td><td>10 ans</td><td>Non</td><td>Non</td><td>67% (D)</td></tr><tr><td>(Redondo et al., 1999)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Croisé</td><td>Mexico</td><td>800</td><td>8 mois</td><td>Oui (20 bovins)</td><td>Non</td><td>70% (E)</td></tr><tr><td>(García-García et al., 2000)</td><td>Gavac et Bm95</td><td>C</td><td>Non précisé</td><td>Cuba</td><td>192 (Gavac) et 849 (Bm95)</td><td>6 mois</td><td>Oui (193 bovins)</td><td>Non précisé</td><td>41,5% (Gavac) et 54,2% (Bm95) (E)</td></tr><tr><td>(de la Fuente et al., 1998)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Croisé Holstein</td><td>Cuba</td><td>105 000</td><td>18 mois</td><td>Non</td><td>Non précisé</td><td>60% (D)</td></tr><tr><td>(Dominguez García et al., 2016)</td><td>Gavac</td><td>C</td><td>Non précisé</td><td>Mexique</td><td>587</td><td>Non précisé</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>80% (D)</td></tr></tbody></table>
*¹ Protocole de vaccination : A : Primo-vaccination à la 1ère et 5ème semaine puis rappel tous les 6 mois ; B : Primo-vaccination à la 1ère, 4ème et 7ème semaine puis rappel tous les 6 mois ; C : Primo-vaccination à la 1ère et 4ème semaine ;

*² Le groupe témoin est composé d'animaux non vaccinés mais d'une race différente (Bos indicus vs Holstein) ;

*³ avant la vaccination, les éleveurs traitaient systématiquement à un rythme régulier. Après la mise en place de la vaccination, ils traitaient au delà d'un certain seuil d'infestation ;

*⁴ Calcul de l'efficacité : D : Comparaison avant et après la mise en place de la vaccination au sein des troupeaux vaccinés ; E : Comparaison entre le lot vacciné et le lot témoin.
# Evaluation of three adjuvants with respect to both adverse effects and the efficacy of antibody production to the Bm86 protein

Julie Petermann<fnref n="1" /> · Romain Bonnefond<fnref n="2" /> · Isabelle Mermoud<fnref n="3" /> · Dewi Rantoen<fnref n="3" /> · Laure Meynard<fnref n="3" /> · Christopher Munro<fnref n="4" /> · Linda H. L. Lua<fnref n="4" /> · Thomas Hüe<fnref n="1" />

Received: 17 April 2017 / Accepted: 17 July 2017

© Springer International Publishing AG 2017

**Abstract** Cattle tick infestations remain an important burden for farmers in tropical area like in New Caledonia. With the development of acaricide resistance, tick vaccines should be an attractive alternative to control ticks but their efficacy needs to be improved. In this study three adjuvants were studied in an experimental tick vaccine with a Bm86 protein to assess their performance in terms of antibody productions and adverse reactions following vaccinations. The water-in-oil adjuvant ISA 61 VG led to higher antibody titers compared to a water-in-oil-in-water adjuvant ISA 201 VG and an aqueous polymeric adjuvant Montanide Gel 01. Vaccinations with these three adjuvants did not produce severe general reaction but an increase in skin thickness was observed especially with both oil-based emulsions. These results indicated that the water-in-oil adjuvant is the most interesting to use for this vaccine but local adverse reactions remain an issue.

**Keywords** Rhipicephalus australis · Vaccine · Adjuvant · Side reaction · Integrated management

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

<footnote>Thomas Hüe
hue@iac.nc</footnote>

<footnote n="1">¹ Équipe ARBOREAL: AgricultuRe BiOdiveRsité Et vALorisation, Laboratoire de Parasitologie, Institut Agronomique néo-Calédonien, BP 73, 98890 Païta, New Caledonia</footnote>

<footnote n="2">² Station zootechnique de port Laguerre, Direction Provinciale du Développement Rural, Païta, New Caledonia</footnote>

<footnote n="3">³ Service des Laboratoires Officiels Vétérinaires Agroalimentaires et Phytosanitaires de Nouvelle-Calédonie, Direction des Affaires Vétérinaires Alimentaires et Rurales de Nouvelle-Calédonie, Station zootechnique de Port-Laguerre, BP 42, 98890 Païta, New Caledonia</footnote>

<footnote n="4">⁴ The University of Queensland, Protein Expression Facility, Brisbane, QLD 4072, Australia</footnote>
Introduction

*Rhipicephalus (Boophilus) australis* has been a major problem for cattle in New Caledonia since its introduction in 1942. Until recently, breeders were used to treating herds monthly with short acting acaricides. However, as resistance against acaricides is developing faster than the development of new acaricidal treatments, alternative, novel tools for tick control are needed. Previous studies have shown that Bm86 vaccine can be use in an integrated pest management (Willadsen et al. 1995; Jonsson et al. 2000) with positive economic impact and a reduction of the use of chemicals (De La Fuente et al. 1999; Suarez et al. 2016; Valle et al. 2004).

As the efficiency of this vaccine depends of the sequence used to produce the protein (Freeman et al. 2010), the choice was made to develop a local vaccine with a Bm86 sequence extracted from New Caledonian tick strains. Adjuvants play an important role in enhancing antibody production and the efficacy of vaccines but there is no universal adjuvant. The choice among adjuvants has to be done with the best balance between efficacy and safety.

Mineral oil adjuvants are commonly better than non mineral oils with synthetic and purified proteins (Aucouturier et al. 2001) and they have been shown to induce high titer antibodies that persisted for long time periods (Iyer et al. 2001). But adjuvants can be responsible of local and systemic reactions, from local inflammation to ulcers and from fever to anaphylaxis, which can limit the acceptance of vaccines by farmers. In New Caledonia a previous field trial to assess TickGARD efficacy has to be stopped before the end partially due to side reactions.

In the present study, three 'ready to formulate' oil adjuvants were tested to identify the one most able to improve the antibody production with mild side effects.

**Materials and methods**

Extraction and production of Bm86 protein on Escherichia coli

Plasmid construction

A consensus sequence of Bm86 gene was constructed from five strains of tick (R. (B.)
australis) native to New Caledonia. The sequence was codon optimized for gene expres-
sion in E. coli, synthesized by GeneArt™ (ThermoFisher Scientific), and cloned into
plasmid pOPINE (Berrow et al. 2007). The Bm86 gene inserts amplified with primers
Bm86F (5'-CCATCACCACCATCACAGCAGCGGTGAAAGCAGCATTTGTAGCGA
TTTTGGC-3') and Bm86R (5'-GTTTAAACTGGTCTAGAAAGCTTCAGCTGCTTT
TACCCGGATCAGGA-3') were cloned into KpnI and HindIII linearized vector via
homologous recombination. The construct, designated pOPINE-Bm86, was sequenced
verified by Australian Genome Research Facility.

Expression of Bm86

Construct pOPINE-Bm86 was transformed into Shuffle® T7 Express competent E. coli
(New England BioLabs). Cultures of 500 mL MagicMedia™ (ThermoFisher Scientific)
auto-induction media containing 50 µg/mL ampicillin and 34 µg/mL chloramphenicol in

<figure><img src="image_75.png" /></figure>
2.5 L TunairTM full-baffle shake flasks (IBI Scientific) were inoculated and grown at 30 °C overnight before harvesting by centrifugation at 8000 g for 20 min.

## Bm86 purification

Cell pellet from 1 L expression culture was resuspended in 250 mL lysis buffer [PBS, 1% Triton X-100, complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche Diagnostics)] and lysed using a Branson Sonifier on ice with 4 pulses of 30 s each. The lysate was centrifuged at 17,000 g for 30 min at 4 °C to isolate the insoluble inclusion bodies. The pellet was resuspended in 200 mL inclusion body wash buffer 1 (PBS, 1% Triton X-100), sonicated and centrifuged as described previously. This wash step was repeated using inclusion body wash buffer 2 (PBS) and inclusion body wash buffer 3 (PBS, 2 M guanidine-HCl) to remove impurities. The washed pellet was resuspended in 200 mL solubilization buffer (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 8 M urea, 20 mM B-mercaptoethanol, pH 8.0) and incubated overnight on a rotating wheel at room temperature, followed by 30 min incubation at 37 °C. Resolubilized protein was centrifuged as above to isolate the soluble fraction.

The supernatant was filtered through a 0.45 µm filter and applied to a 5 mL HisTrap FF Crude column (GE Healthcare Life Sciences) pre-equilibrated with solubilisation buffer. Unbound protein was removed with 10 column volumes (CV) of IMAC wash buffer 1 (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 8 M urea, pH 8.0). Endotoxin removal was performed by washing the column with 50 CV IMAC wash buffer 2 (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 8 M urea, 0.1% Triton X-114, pH 8.0). Bound protein was removed using a gradient from 0 to 60% IMAC elution buffer (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 500 mM imidazole, pH 8.0) over 9 CV, a gradient from 60 to 100% IMAC elution buffer over 3 CV and holding at 100% IMAC elution buffer for a further 10 CV. Fractions corresponding to purified Bm86 were pooled. All steps were performed on an AKTAexpress chromatofigry system (GE Healthcare Life Sciences) at a flow rate of 5 mL/min at 4 °C.

Purified Bm86 was refolded by stepwise dialysis against buffers with decreasing concentrations of urea using a 10 kDa molecular weight cut-off SnakeSkin pleated dialysis tubing (ThermoFisher Scientific). The sample was initially dialyzed against 50× volume of buffer containing 4 M urea at room temperature for 4 h, followed by 50× volume of buffer containing 1.5 M urea at 4 °C overnight, and finally 50× volume of buffer without urea at 4 °C for 4 h. Final buffer for storage was 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, pH 8.0.

## Protein and endotoxin analysis

Samples from the purification process were analysed on a 4–12% bis–tris SDS-PAGE Gel (ThermoFisher Scientific) under denaturing and reducing conditions as per manufacturer's instructions. Gels were visualized by SimplyBlue SafeStain (ThermoFisher Scientific) and imaged using a ChemiDoc XRS+ System (Bio-Rad). Target protein concentration was estimated by absorbance at 280 nm using a NanoDrop 1000 Spectrophometer (Thermo Scientific). Endotoxin measurement was performed using an Endosafe-PTS Limulus Amebocyte Lysate test kit (Charles River Laboratories).
## Adjuvant tested

The adjuvants used for this trial were Montanide™ Gel 01, Montanide™ ISA 201 VG and Montanide™ ISA 61 VG furnished by Seppic. All three adjuvants are intended to be used in cattle vaccines. Montanide™ Gel 01 is an aqueous polymeric adjuvant designed for aqueous type vaccines. Montanide™ ISA 201VG is a mineral oil based adjuvant that has been developed for the manufacture of Water-in-Oil-in-Water (W/O/W) emulsions. Montanide™ ISA 61 VG is a mineral oil based adjuvant developed for the manufacture of water-in-oil (W/O) emulsions.

## Preparation of doses

The volume of each dose was 2.0 mL and contains 100 µg of Bm86 protein. The different adjuvants were prepared with the protein according to manufacturer's recommendations. For oil based adjuvant, the emulsion quality was controlled through the drop test. Each animal of the control group was injected with 100 µg of protein in 2.0 mL of water.

## Pen trial

### Location

The pen trial was conducted in a public farm, Païta, New-Caledonia (22°7′56″S, 166°21′29″E). New-Caledonia is a French island in the South Pacific Ocean with a dry tropical climate, 1200 km to the east of Australia and 2000 km to the north of New Zealand. The trial began on 3rd February 2015, which is the summer period in New-Caledonia. During the trial period, temperatures were constantly above 22 °C and reached 36 °C.

### Animals

Forty Charolaise heifers were allocated in four groups of ten animals, each composed of seven 2-years-old heifers and three 1-year-old heifers. They were injected subcutaneously in the right side of the neck at day 0 and in the left side of the neck at day 28. They stayed in a cowshed during four days following both injections and they were in pasture the rest of the time. After day 71, three 2-years-old heifers per group were removed for commercial sale. The remaining animals received a third injection on day 248, only to follow antibody kinetics.

### Animal examination of adverse effects and antibody production

On the day of first injections and during the three following days, animals' rectal temperatures and local skin reactions (skin thickness increasing) were recorded. Skin thickness was also measured at day 7, 20, 37, 42, 55 with a caliper at the injection point.

Six animals randomly selected among the ten in each group were blood sampled to analyze parameters of general inflammation: Fibrinogen, serum amyloid A (SAA) and Haptoglobin according to Alsemgeest et al. (1994) and Humblet and Godeau (2005). Blood samples were regularly done to follow the evolution of antibodies titers. Dates of all injections, blood samples and measures are summarized in Table 1.
<table><caption>**Table 1** Dates of vaccinations, blood samples and measures after the first vaccination</caption><thead><tr><th>Day</th><th>0</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>7</th><th>20</th><th>28</th><th>29</th><th>30</th><th>31</th><th>37</th><th>42</th><th>55</th><th>70</th><th>104</th><th>142</th><th>164</th><th>201</th><th>248</th><th>280</th><th>399</th></tr></thead><tbody><tr><td>Vaccination</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titre Ac</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skin thickness</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SAA</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Haptoglobin</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

## ELISA procedures

### Positive and negative controls serum of the ELISA

Another group of five animals was immunized by intramuscular route on weeks 0, 4 and 7 with TickGARD and was used as positive control. Sera from 5 unvaccinated cattle were collected and pooled to prepare the negative control serum of the ELISA.

### ELISA to detect anti-Bm86 antibodies in sera

Greiner F polystyrene 96-well microtiter plates were coated with 100 µl per well of Bm86 at a concentration of 0.5 µg/ml in 0.1 M carbonate buffer, pH 9.6 (TCO3) then covered with acetate plate seal and stored overnight at 5 °C. Plates were blocked for 1 h at room temperature (RT) with 200 µl per well of blocking buffer (2% casein in carbonate buffer). Plates were washed three times with DPBS-T (PBS at pH 7.2 containing 0.1% Tween-20) with a Thermo Wellwash ELISA plate washer. 100 µl serum and controls diluted 1:100 in 2% SMP/DPBS-T (SMP, skim milk powder) were added within a duplicate well. Plates were incubated 30 min at RT while shaking on a Heidolph Titramax 1000 plate shaker at low speed, and then washed five times with DPBS-T. 100 µl of conjugate solution diluted at 1:20,000 in 2% SMP/DPBS-T (rabbit anti-bovine IgG conjugated to horseradish peroxidase; Sigma) were added to each well. Plates were incubated 30 min at RT while shaking on a Titramax 1000 ELISA plate shaker at low speed. Plates were washed five times with DPBS-T. The substrate solution consisted of Tetramethylbenzidine (TMB peroxidase substrate + peroxidase solution B; KPL) was added. Color was allowed to develop for exactly 5 min. Adding 50 µl per well of 2 M H₂SO₄ (APS) terminated the reaction. The optical density (OD) was measured using a Thermo Multiskan EX ELISA reader equipped with a 450 nm filter. Incubation time and concentrations of the conjugate were defined and optimized using positive and negative control to work with OD between 1.000 and 3.000. Antibody titers in vaccinated and control cattle were expressed as OD 450 nm and also as S/P% (100 × (OD sera/OD positive control)).

## Statistical analyses

Statistical analyses were conducted with R software. Mean group values of antibody titers, haptoglobin, SAA, fibrinogen, temperature and skin thickness were compared by ANOVA.
The link between skin thickness and antibodies titer was analyzed with a Pearson correlation test.

## Results

### Bm86 expression and purification

Bm86 was overexpressed in *E. coli* as inclusion bodies and purified by IMAC under denaturing conditions. A Triton X-114 wash step was incorporated during chromatography to remove endotoxin from Bm86 while the target protein remained bound to the column. The endotoxin level of the final purified sample was 645 endotoxin units (EU) per mg purified Bm86. Approximately 45 mg of Bm86 was purified from 1 L expression culture (Fig. 1).

### Evolution of Bm86 antibody titer

After the first injection, antibody titer increased with the three adjuvants at d20 to reach a mean of 118 for the 61VG group, 85 for 201VG group and 40 for Gel group. It decreased slightly between d20 and d28 when the booster was done. Antibody titers increased between d28 and d42 for the 201 VG and the Gel groups to reach means of 122 and 96, respectively. Then antibody titers decreased until d248 when the third injection was done. For the 61VG group, antibody titer increased between d28 and d55 to reach a mean of 137, then decreased until d164 to reach a mean of 90.4 before increasing slightly until d248 to reach a mean of 96.4.

Means of antibody titer in the control group remained around 3. The difference of antibody titer obtained with the three adjuvants versus the control is significant (*p* < 0.001) for all days. Antibody titers obtained with 61 VG are significantly above antibody titers obtained with 201 VG and Gel (*p* < 0.05) on days 20, 28, 42, 55, 70, 164, 201 and 248 (Fig. 2).

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>**Fig. 1** Bm86 inclusion body purification analyzed by SDS-PAGE. Lane 1—protein ladder; Lane 2—total cell lysate; Lane 3—washed inclusion bodies; Lane 4—final purified sample. Black arrow indicates band corresponding to Bm86 (expected size 69 kDa)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_77.png" /></figure>
<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Fig. 2 Kinetic of mean (± SD) antibody titres for the various groups. Arrows correspond to vaccinations</figcaption></figure>

Evaluation of adverse effects

Rectal temperature

The order in which group rectal temperatures were measured was the same every day in order that body temperature variations for a group were linked to the vaccination and not to the variation of temperature which occurred between early and later in the morning. The control batch was evaluated the first in the morning, the Gel group second, the 201 VG group in third place and 61 VG group was the last in the morning. The only exception was on d28 as animals were brought back from pasture and were not yet reallocated into their respective groups. They were herded in the sun at an outside temperature of 34 °C. After this process, animals were placed in the cowshed for the next four days.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Fig. 3 Mean (± SD) rectal temperature in the various groups</figcaption></figure>
<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>**Fig. 4** Mean (± SD) skin thickness in the various groups</figcaption></figure>

Even if rectal temperatures were different between the groups, there was no increase of
temperature the days following the vaccination (Fig. 3).

Skin thickness

After the first injection, except for the control group, animals of all other groups showed a local reaction to the vaccine with an increase of the skin thickness. This reaction was only significant for the 61 VG group at d7 (p < 0.01) and at d20 (p < 0.05) versus control group (Fig. 4).
The vaccine booster at d28 caused a greater local reaction with an increasing of skin thickness. The reaction appears more rapidly for the groups 201 VG and Gel. The skin was significantly thicker for groups 61 VG, 201 VG and Gel versus control group at d 7, 29, 30, 31, 37, 42 and 55 (p < 0.05).

The adjuvant 61VG induced a significantly thicker skin five times during the trial (d7, 20, 37, 42 and 45) whereas the adjuvant 201VG caused a significantly thicker skin twice during the same period (d29 and d30) (Table 2).

## Serum amyloid A (SAA) and haptoglobin

Normal values of SAA blood concentration with this test are between 9.5 and 150 µg/mL. Mean values of each group remained in the normal range even if some individual values were above the limit in the group 61VG at d31, three days after the second injection (Fig. 5).

Normal values of haptoglobin blood concentration with this test are between 0.02 and 0.2 mg/mL. Mean of haptoglobin of group 61VG is above 0.2 mg/mL on d0 and decreased on d3, d7 and d28. Mean of this group increases on d31 to go above the limit with a value of 0.31 mg/mL.

For groups 201 VG, Gel and Control, mean of blood concentration of haptoglobin remained below the limit for all the five dates (Fig. 6).

## Fibrinogen

The average values per group of fibrinogen still remain below the normally observed values of 5.5 g/L (Fig. 7).

<table><caption>**Table 2** Difference (p < 0.05) of the skin thickness between the adjuvants at different days of the study</caption><thead><tr><th></th><th>0</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>7</th><th>20</th><th>28</th><th>29</th><th>30</th><th>31</th><th>37</th><th>42</th><th>55</th></tr></thead><tbody><tr><th>61VG</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td>b</td><td>b</td><td></td><td>a,b</td><td>a</td><td></td><td>b</td><td>b</td><td>b</td></tr><tr><th>201VG</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td>c</td><td></td><td></td><td>a</td><td>a</td><td></td><td>c</td><td>c</td><td>c</td></tr><tr><th>Gel</th><td></td><td></td><td></td><td></td><td>b,c</td><td>b</td><td></td><td>b</td><td></td><td></td><td>b,c</td><td>b,c</td><td>b,c</td></tr></tbody></table>

In grey is the group with the thicker skin

<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>**Fig. 5** Mean (± SD) serum amyloid A in the various groups</figcaption></figure>
<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>Fig. 6 Mean (± SD) haptoglobin in the various groups</figcaption></figure>

<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>Fig. 7 Mean (± SD) fibrinogen in the various groups</figcaption></figure>

Link between antibodies titer and skin thickness

A link between individual maximal skin thickness and maximal antibodies production for group 61VG, with a positive correlation of Pearson (r = 0.7, p = 0.02). No correlation was found for the other adjuvants.

Discussion

Antibody titer

As expected, antibody titers in the three adjuvant groups were higher than in the control group. Despite an increasing antibody titer after the two boosters, the Gel based adjuvant did not lead to a persistent antibody response over time. During this trial, antibody titers were significantly higher with the vaccine using 61 VG compared with the other adjuvants on most dates. Good persistence of antibody production was observed in this group during
6 months after the second injection and after the third injection. Oil-based adjuvants are known to stimulate mainly antibody responses (Spickler and Roth 2003) and Aucouturier et al. (2001) also observed that water-in-oil emulsions release the vaccine antigens slowly and can give good long-term immunity.

Titers observed after injections of the Bm86 protein associated with the water-in-oil adjuvant need to be correlated with its efficacy against ticks as observed by Willadsen et al. (1995). Antibody production seems indeed to be a good criterion as long as the antibodies react with the native protein (Kemp et al. 1989; Cunha et al. 2012).

## Side effects

Vaccination with the different adjuvants has no influence on bovine temperature, serum amyloid A and fibrinogen blood concentration. Haptoglobin level was just above the normal values at day 31 with the Montanide 61VG. This is consistent with Stokka et al. (1994) using a W/O adjuvant who observed a slight increase of plasma protein and fibrinogen levels which remained well within normal limits and an increase of blood haptoglobin levels after injection.

In this study, local reactions with an increase of skin thickness was the main adverse effect with rapid and persisting observations especially for groups vaccinated with vaccine containing Montanide 61VG and 201VG. The adjuvant W/O 61VG seems to cause higher local inflammatory reaction with a skin significantly thicker for five times during the trial versus two times for the W/O/W adjuvant 201VG. The less marked local reactions may be due to the fact that water-in-oil-in-water emulsions are less viscous than water-in-oil emulsions (Spickler and Roth 2003).

During large field trials using the TickGard™ in subcutaneous route, Willadsen et al. (1995) mentioned that one issue was the site reaction resulting from the use of the oil adjuvant. Inflamed or weeping injection site reactions were observed in fewer than 1% of vaccinated cattle but no serious reactions were observed in the thousands vaccinated. However, these reactions were transitory and did not affect the growth of the animal or the value of the carcass. During its commercialization, the Technical Guide of TickGard pointed out that a swelling may occur at the site of injection, from marble-sized up to the size of half an orange which gradually reduced in size over a period of some weeks. More recently, during a pen trial with intramuscular injection of Gavac™, Miller et al. (2012) reported no overt general or local adverse reactions.

Even if no ulcers or abscesses are observed, these reactions may generate mistrust or refusal to use these vaccines by farmers, despite these adverse effects are not commensurate with the benefit of vaccination. However, local reactions induce inflammatory responses, which attract mainly antigen presenting macrophages, granulocytes and neutrophils. That contributes to the adjuvant activity by producing cytokines (Mohan et al. 2013). This postulate is confirmed with the Montanide 61VG, where the skin thickness was correlated with the antibody titer. There was a significant positive correlation between the size of the injection site reaction and the resulting antibody titer (Willadsen et al. 1995) and this link may be a way of gaining acceptance by the breeders as visible local reactions mean that animals are more protected.
Conclusion

Considering side effects and antibody titer, we can conclude that the water-in-oil adjuvant 61 VG is the most appropriate amongst the three tested for this vaccine.

At this stage, antibody titers are a good way to discriminate between adjuvants but efficacy on ticks after vaccination with this protein and this adjuvant needs to be assessed through experimental or natural infestations.

Further improvements during the antigen processing are needed, with a special attention on a more stringent removal of endotoxin, to decrease site reactions. Indeed, regardless of the efficacy of the vaccine, a marked site reaction might be a reason for vaccine rejection among breeders.

**Acknowledgements** We wish to thank François Bertrand, Manager, Seppic, Shanghaï, for providing us the three Montanide adjuvants, the Direction of the Rural Development of the New Caledonia as well as technicians of the station of Port-Laguerre to provide us animals, stalls and all we needed to conduct this trial and Peter Willadsen for his technical support.

Compliance with ethical standards

**Conflict of interest** The authors declare that they have no conflict of interest.

References

Alsemgeest SPM, Kalsbeek HC, Wensing T et al (1994) Concentrations of serum Amyloid-a (SAA) and haptoglobin (HP) as parameters of inflammatory diseases in cattle. Vet Q 16(1):21-23

Aucouturier J, Dupuis L, Ganne V (2001) Adjuvants designed for veterinary and human vaccines. Vaccine 19(17):2666-2672

Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S et al (2007) A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res 35(6):e45

Cunha RC, Pérez de León AA, Leite FPL et al (2012) Bovine immunoprotection against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* with recombinant Bm86-Campo Grande antigen. Rev Bras Parasitol Vet 21(3):254-262

De La Fuente J, Rodríguez M, Montero C et al (1999) Vaccination against ticks (*Boophilus spp.): the experience with the Bm86-based vaccine Gavac™. Genet Anal Biomol Eng 15(3):143-148

Freeman JM, Davey RB, Kappmeyer LS et al (2010) Bm86 midgut protein sequence variation in South Texas cattle fever ticks. Parasites Vectors 3(1):1

Humblet MF, Godeau JM (2005) L'haptoglobine, marqueur protéique de l'inflammation aiguë, dans l'espèce bovine. Ann Med Vet 149(1):20-33

Iyer AV, Ghosh S, Singh SN, Deshmukh RA (2001) Evaluation of three 'ready to formulate' oil adjuvants for foot-and-mouth disease vaccine production. Vaccine 19(9):1097-1105

Jonsson NN, Matschoss AL, Pepper P et al (2000) Evaluation of TickGARD PLUS, a novel vaccine against Boophilus microplus, in lactating Holstein-Friesian cows. Vet Parasitol 88(3):275-285

Kemp DH, Pearson RD, Gough JM, Willadsen P (1989) Vaccination against *Boophilus microplus*: localization of antigens on tick gut cells and their interaction with the host immune system. Exp Appl Acarol 7(1):43-58

Miller R, Estrada-Peña A, Almazán C et al (2012) Exploring the use of an anti-tick vaccine as a tool for the integrated eradication of the cattle fever tick, *Rhipicephalus (Boophilus) annulatus*. Vaccine 30(38):5682-5687

Mohan T, Verma P, Rao DN (2013) Novel adjuvants & delivery vehicles for vaccines development: a road ahead. Indian J Med Res 138(5):779

Spickler AR, Roth JA (2003) Adjuvants in veterinary vaccines: modes of action and adverse effects. J Vet Intern Med 17(3):273-281

Stokka GL, Edwards AJ, Spire MF et al (1994) Inflammatory response to clostridial vaccines in feedlot cattle. J Am Vet Med Assoc 204(3):415-419

Suarez M, Rubi J, Pérez D et al (2016) High impact and effectiveness of Gavac™ vaccine in the national program for control of bovine ticks *Rhipicephalus microplus* in Venezuela. Livest Sci 187:48-52

<figure><img src="image_84.png" /></figure>
Valle MR, Mèndez L, Valdez M et al (2004) Integrated control of *Boophilus microplus* ticks in Cuba based on vaccination with the anti-tick vaccine Gavac TM. Exp Appl Acarol 34(3-4):375-382

Willadsen P, Bird P, Cobon GS, Hungerford J (1995) Commercialisation of a recombinant vaccine against *Boophilus microplus*. *Parasitology* 110(S1):S43-S50
<figure><img src="image_85.png" /></figure>

Experimental efficacy of a vaccine against *Rhipicephalus australis*

Thomas Hüe<fnref n="1" /> • Julie Petermann<fnref n="1" /> • Romain Bonnefond<fnref n="2" /> • Isabelle Mermoud<fnref n="3" /> • Dewi Rantoen<fnref n="3" /> • Tony Vuocolo<fnref n="4" />

Received: 7 August 2017/Accepted: 1 November 2017/Published online: 6 November 2017
© Springer International Publishing AG, part of Springer Nature 2017

**Abstract** Despite several decades of chemical use the cattle tick, *Rhipicephalus australis*, still represents an important threat for breeders of tick susceptible cattle under tropical conditions. The intense use of acaricides has lead to the development of multi-resistant strains of ticks and alternative means of control need to be developed to maintain control. A vaccine against ticks, based on the *Boophilus microplus* Bm86 protein, is one of the promising alternative means of tick control. In this investigation, an experimental vaccine was developed based on the orthologous *R. australis* Bm86 sequence identified from local *R. australis* strains and a recombinant protein expressed in *Escherichia coli*. The efficacy of this vaccine against a local strain of *R. australis* was assessed under controlled conditions. Vaccinated cattle presented 40.3% fewer ticks than unvaccinated cattle and tick reproductive performance was also affected by the vaccine. Ticks that engorged on vaccinated animals laid 51.2% less egg mass and tick fertility decreased by 18.8% compared to the control group. The use of the vaccine reduced the tick population by 74.2% at each generation. The tick vaccine can be used in an integrated tick control program.

**Keywords** Tick vaccine · Recombinant protein · *Rhipicephalus australis* · Pen trial

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

<footnote>Thomas Hüe
hue@iac.nc</footnote>

<footnote n="1">1 Équipe ARBOREAL : AgricultuRe BiOdiveRsité Et vALorisation, Laboratoire de Parasitologie, Institut Agronomique néo-Calédonien (IAC), BP 73, 98890 Païta, New Caledonia</footnote>

<footnote n="2">2 Station zootechnique de port Laguerre, Direction Provinciale du Développement Rural, BP L1, 98849 Noumea Cedex, New Caledonia</footnote>

<footnote n="3">3 Service des Laboratoires Officiels Vétérinaires Agroalimentaires et Phytosanitaires, Direction des Affaires Vétérinaires Alimentaires et Rurales, BP 42, 98890 Païta, New Caledonia</footnote>

<footnote n="4">4 CSIRO Agriculture and Food, Queensland Biosciences Precinct, 306 Carmody Road, St Lucia, QLD 4067, Australia</footnote>
## Introduction

In New Caledonia, the cattle tick, previously named *Rhipicephalus microplus* until its morphological and genetic distinction to *Rhipicephalus australis* (Estrada-Peña et al. 2012), is the major health problem on cattle farms. Even if no major tick borne diseases are present in this territory, regular high tick infestations lead to economic losses through impact on cattle body conditions and can cause mortality. Since its introduction in 1942, the *R. australis* ectoparasite was controlled by several successive acaricides. As observed in many parts of the world, tick resistance to these chemical control agents is increasing and presently the situation is becoming critical in New Caledonia, with tick resistant strains to amitraz now present in one quarter of farms (Petermann et al. 2016). As a French territory, New Caledonian cattle breeders have a long history of using tick susceptible European cattle breeds and they now have to change their strategy to manage tick infestations.

A vaccine that protects cattle from ticks is one of the promising alternative ways to control ticks. Now that acaricides are no longer sufficiently effective to solely manage ticks on farms, a vaccine may provide a complementary treatment in an integrated pest management program. Furthermore, a tick vaccine has additional benefits compared to chemical control agents. The vaccine is more selective for the target parasite, presents less environmental impacts and cattle retain no vaccine related chemical residues as compared to use of acaricides (Willadsen 1997). Since the first vaccine trials in the 1980’s, multiple field testing using the tick vaccine showed good results in terms of reduced use of chemicals and a reduction on tick burden and impact of ticks on cattle (De La Fuente et al. 1999, 2007; Valle et al. 2004; Suarez et al. 2016). Over these last decades, several antigens have been described showing promise for inclusion in a tick vaccine and recent studies highlight the synergist effect in the use of Bm86 and tick Subolesin (De la Fuente and Contreras 2015). However, the Bm86 protein continues to prove its efficacy in many field trials and together with the fact that commercial tick vaccines including this protein are in use make its local acceptance by farmers and Official Veterinary Services easier.

Two vaccines based on the Bm86 protein have been commercialized including Tick-Gard™ (Intervet) (Willadsen et al. 1995) which is no longer commercially available and Gavac™ (Heber Biotec) (Canales et al. 1997) which is the only one still available. However, due to New Caledonian biosecurity restrictions this vaccine cannot be imported into the Territory.

Additionally the Gavac™ vaccine was engineered using the *R. microplus* strain of Bm86, whereas the cattle tick present in New Caledonia is *R. australis* (Estrada-Peña et al. 2012). As García-García et al. (1999) observed, there was a negative correlation between the efficacy of the vaccination with Bm86 and the amino acid sequence variations in the Bm86 protein in challenges with *R. microplus*. Thus it is important to optimize the efficacy of the vaccine by using a Bm86 recombinant protein derived from New Caledonian tick species.

## Materials and methods

### Area description

New Caledonia is a French island in the South Pacific Ocean with an oceanic tropical climate where a cattle population of around 80,000 head is raised under extensive

<figure><img src="image_88.png" /></figure>
conditions by approximately 600 farmers. The experiment took place from April to July 2016, in Station Zootechnique de Port Laguerre, Païta, New Caledonia (22°06'S; 166°19'E), a province-owned livestock farm, whose aim is to maintain a genetic pool of improved breed livestock, cattle and sheep, for dissemination to livestock farmers.

## Biological samples and RNA isolation from *Rhipicephalus australis*

Five field strains of adult *R. australis* were collected from different farms in New Caledonia: CM (1), AI (2), WC (3), SZPLG (4) and ST (5). The ticks were brought back to the laboratory where they were washed and placed in a temperature controlled chamber at 27 °C and 85% relative humidity for egg laying. When egg laying was completed, eggs were collected and stored at -80 °C until further processing.

Total RNA was extracted from 50 mg of frozen eggs for each tick strain by homogenisation with Trizol™ (Invitrogen) reagent and then further purified by isolation on PureLink™ (Invitrogen) RNA purification columns including on column DNaseI digestion. RNA was spectrophotometrically quantified and analysed for integrity on a non-denaturing agarose gel.

## cDNA synthesis, Bm86 cloning and sequencing

Five µg of total RNA isolated from each *R. australis* strain was individually reverse transcribed into first strand cDNA using MMLV Superscript III™ reverse transcriptase (Invitrogen) with random hexamer and anchored oligo dT priming. The mature coding sequence of Bm86 was amplified using a high fidelity Taq polymerase, Platinum Taq HiFi (Invitrogen) with the oligonucleotide primers Bm86 forward (5'-gaattcagaatcatc-catttgctctgac-3') and Bm86 reverse (5'-gcggccgcacttgactttccaggatc-3') designed on NCBI Bm86 reference sequence (assession M29321) from *R. microplus*. The amplification reaction for Bm86 cDNA for each tick strain was run on an agarose gel and the 1839 bp DNA band encoding Bm86 protein was excised and purified using a PCR clean-up column (Qiagen) (Fig. 1). The purified fragment was ligated and cloned using the pGEMT-easy vector (Promega). A representative clone encoding Bm86 for each of the five *R. australis* strains was sequenced using cloning vector and Bm86 internal primers. Contig DNA sequences were constructed for each clone and the translated Bm86 amino acid sequences determined.

## Recombinant Bm86 production

The software ClustalX® was used to align the cDNA sequences from the five *R. australis* tick strains (Fig. 2). Tick strain SZPLG (4) sequence was used as the template to engineer an *E. coli* codon optimized DNA sequence that was synthetically synthesized by GeneArt™ (ThermoFischer Scientific). The sequence was cloned into the expression vector pOPINE, transformed and cultured in *E. coli* whereby the bacterial culture was harvested and the Bm86 recombinant protein purified from inclusion bodies as described in Petermann et al. (2017).

<figure><img src="image_89.png" /></figure>
<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>**Fig. 1** PCR amplicons for each individual New Caledonian tick strain (1–5). S denotes DNA size standards. The white arrow indicates the band (1839 bp) encoding Bm86 for the five tick strains that was excised, purified, cloned and sequenced. Strain (1) amplification was faint and the amplification yielded two bands (*) with one slightly smaller in size than for the other samples</figcaption></figure>

## Formulation of vaccine doses

For the production of the vaccine, 12 mL of a water-in-oil emulsion adjuvant (Mon-tanide™ ISA 61 VG, Seppic) was placed in a beaker and mixed at 3000 rpm with an Ultra Turrax (Lab IKA). One mg of recombinant protein in 8 mL of water for injection was added slowly and the suspension mixed at a speed of 10,000 rpm for 1 min then slowed to 3000 rpm. The preparation was placed at + 4 °C for 24 h before its use and the stability of the emulsion was controlled by the drop test.

For the control group, 12 mL of adjuvant was mixed with 8 mL of water for injection.

## Individual tick susceptibility and group constitution

Sixteen one-year-Charolais male cattle were used for the vaccination trial. As these animals have a history of field tick exposure, a first infestation was done in order to constitute two groups with equivalent naturally-acquired immunity (Willadsen et al. 1995). This preliminary infestation was performed by infesting each animal with 1000 tick larvae three times at 2 day intervals. Larvae for infestation were about 15 days old and were placed on the neck of each animal. Engorged ticks were then counted on both sides of the animals every morning 3 weeks after infestation over a period of 6 days. Fourteen animals were assigned to two groups considering individual susceptibility in order to obtain two comparable groups. Two animals were too nervous to allow safe tick inspections and were eliminated from the trial.

<figure><img src="image_91.png" /></figure>
Bm86 refn
Strain 1 ESSICSDFGNEFCRNAECEVVGAEDDFVCKFRCDNMYFNAEAKQCEYKDTCKTRECSYG
Strain 1 iso ESSICSDFGNEFCRNAECEVVGAEDDFVCKFRCDNMYFNAEAKQCEYKDTCKTRECSYG
Strain 2 ESSICSDFGNEFCRNAECEVVGAEDDFVCKFRCDNMYFNAEAKQCEYKDTCKTRECSYG
Strain 3 ESSICSDFGNEFCRNAECEVVGAEDDFVCKFRCDNMYFNAEAKQCEYKDTCKTRECSYG
Strain 4 ESSICSDFGNEFCRNAECEVVGAEDDFVCKFRCDNMYFNAEAKQCEYKDTCKTRECSYG
Strain 5 ESSICSDFGNEFCRNAECEVVGAEDDFVCKFRCDNMYFNAEAKQCEYKDTCKTRECSYG
************************* *************************

Bm86 refn
Strain 1 RCVESNPSKASCVCEASDDLT/LQCKIKNYATDCRNRGGTAKLRTDGFIGATCDCGEWGA
Strain 1 iso RCVESNPSKASCVCEASDDLT/LQCKIKNYATDRRNRGGTAKLRTDGFIGATCDCGEWGA
Strain 2 RCVESNPSKASCVCEASDDLT/LQCKIKNYATDCRNRGGTAKLRTDGFIGATCDCGEWGA
Strain 3 RCVESNPSKASCVCEASDDLT/LQCKIKNYATDCRNRGGTAKLRTDGFIGATCDCGEWGA
Strain 4 RCVESNPSKASCVCEASDDLT/LQCKIKNYATDCRNRGGTAKLRTDGFIGATCDCGEWGA
Strain 5 RCVESNPSKASCVCEASDDLT/LQCKIKNYATDCRNRGGTAKLRTDGFIGATCDCGEWGA
************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 MMMTTRNCVPTTCLRPLDTCKDLCEKNLLQRDSRCCQGWNTANCSAAPPADSYCSPGSPK
Strain 1 iso MMMTTRNCVPTTCLRPLDTCKDLCEKNLLQRDSRCCQGWNTANCSAAPPADSYCSPGSPK
Strain 2 MMMTTRNCVPTTCLRPLDSCKDLCEKNLLQRDSRCCQGWNTANCSAAPPADSYCSPGSPK
Strain 3 MMMTTRNCVPTTCLRPLDSCKDLCEKNLLQRDSRCCQGWNTANCSAAPPADSYCSPGSPK
Strain 4 MMMTTRNCVPTTCLRPLDSCKGLCEKNLLQRDSRCCQGWNTANCSAAPPADSYCSPGSPK
Strain 5 MMMTTRNCVPTTCLRPLDTCKDLCEKNLLQRDSRCCQGWNRSNCSAAPPADSYCSPGSPK
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 GPDQGCINACKTKEAGFVCKHGRSTGKAYECTCPSGSTVAEDGITCKSISHTVSTAQE
Strain 1 iso GPDQGCINACKTKEAGFVCKHGRSTGKAYECTCPSGSTVAEDGITCKSISHTVSTAQE
Strain 2 GPDQGCINACKMKEAGFVCKHGRSTAKAYECTCPRAFTVAEDGITCKSISHTVSTAQE
Strain 3 GPDQGCINACKMKEAGFVCKHGRSTAKAYECTCPRAFTVAEDGITCKSISHTVSTAQE
Strain 4 GPDQGCINACKMKEAGFVCKHGRSTAKAYECTCPRAFTVAEDGITCKSISHTVSTAQE
Strain 5 GPDQGCINACKTKEAGFVCKHGRSTGKAYECTCPSGSTVAEDGITCKSISHTVSTAQE
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain 1 KQTCRPTECDRVHGKTVLCEPWNQHLVGDTCI SDCVDKCHEEFMDCGVIMNNRQSCYCP
Strain 1 iso KQTCRPTECDRVHGKTVLYCEPWNQHLVGDTCI SDCVDKCHEEFMDCGVIMNNRQSCYCP
Strain 2 KQTCRPTECDRVHGKTVLCEPWNQHLVGDTCI SDCVDKCHEEFMDCGVIMNNRQSCYCP
Strain 3 KQTCRPTECDRVHGKTVLCEPWNQHLVGDTRI SDCVDKCHEEFMDCGVIMNNRQSCYCP
Strain 4 KQTCRPTECDRVHGKTVLCEPWNQHLVGDTCI SDCVDKCHEEFMDCGVIMNNRQSCYCP
Strain 5 KQTCRPTECDRVHGKTVLCEPWNQHLVGDTCI SDCVDKCHEEFMDCGVIMNNRQSCYCP
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 WKRSPKGPVNINELLNEIYYTTSFPNISFSDHCKWYEDRVLEAIRTSIGKEVFKVE
Strain 1 iso WKRSPKGPVNINELLNEIYYTTSFPNISFSDHCKWYEDRVLEAIRTSIGKEVFKVE
Strain 2 WKRSPKGPVNINELLNEIYYTTSFPNISFSDHCKWYEDRVLEAIRTSIGKEVFKVE
Strain 3 WKRSPKGPVNINELLNEIYYTTSFPNISFSDHCKWYEDRVLEAIRTSIGKEVFKVE
Strain 4 WKRSPKGPVNINELLNEIYYTTSFPNISFSDHCKWYEDRVLEAIRTSIGKEVFKVE
Strain 5 WKRSPKGPVNINELLNEIYYTTSFPNISFSDHCKWYEDRVLEAIRTSIGKEVFKVE
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 ILNCTQDIKARLIAEKPLSKHVLRLKQACEHPIGEWCMWMPKLLIKKNSATEIEEENLCD
Strain 1 iso ILNCTQDIKARLIAEKPLSKHVLRLKQACEHPIGEWCMWMPKLLIKKNSATEIEEENLCD
Strain 2 ILNCTQDIKARLIAEKPLSKHVLRLKQACEHPIGEWCMWMPKLLIKKNSATEIEEENLCD
Strain 3 ILNCTQDIKARLIAEKPLSKHVLRLKQACEHPIGEWCMWMPKLLIKKNSATEIEEENLCD
Strain 4 ILNCTQDIKARLIAEKPLSKHVLRLKQACEHPIGEWCMWMPKLLIKKNSATEIEEENLCD
Strain 5 ILNCTQDIKARLIAEKPLSKHVLRLKQACEHPIGEWCMWMPKLLIKKNSATEIEEENLCD
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 SLLKDQEAAAYKGONKCVKVDNLFWFQCADGTTTYTEMTRGRLRRSSVCKAGVSCNEQSE
Strain 1 iso SLLKDQEAAAYKGONKCVKVDNLFWFQCADGTTTYTEMTRGRLRRSSVCKAGVSCNEQSE
Strain 2 SLLKDQEAAAYKGONKCVKVDNLFWFQCADGTTTYTEMTRGRLRRSSVCKAGVSCNEQSE
Strain 3 SLLKDQEAAAYKGONKCVKVDNLFWFQCADGTTTYTEMTRGRLRRSSVCKAGVSCNEQSE
Strain 4 SLLKDQEAAAYKGONKCVKVDNLFWFQCADGTTTYTEMTRGRLRRSSVCKAGVSCNEQSE
Strain 5 SLLKDQEAAAYKGONKCVKVDNLFWFQCADGTTTYTEMTRGRLRRSSVCKAGVSCNEQSE
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 CADKGQIFVYIENGKANCQCCPPDTKPGEIGCIERTTCNPKEIQECQD KKLECYVKNHKAEC
Strain 1 iso CADKGQICVYIENGKANCQCCPPDTKPGEIGCIERTTCNPKEIQECQD KKLECYVKNHKAEC
Strain 2 CADKGQICVYIENGKANCQCCPPDTKPGEIGCIERTTCNPKEIQECQD KKLECYVKNHKAEC
Strain 3 CADKGQICVYIENGKANCQCCPPDTKPGEIGCIERTTCNPKEIQECQD KKLECYVKNHKAEC
Strain 4 CADKGQICVYIENGKANCQCCPPDTKPGEIGCIERTTCNPKEIQECQD KKLECYVKNHKAEC
Strain 5 CADKGQICVYIENGKANCQCCPPDTKPGEIGCIERTTCNPKEIQECQD KKLECYVKNHKAEC
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 ECPDHECYREPAKDSSEEDNGKCQSSGQRCVIENGKAVCKESEATTAATTTTKAKDK
Strain 1 iso ECPDHECYREPAKDSSEEDNGKCQSSGQRCVIENGKAVCKESEATTAATTTTKAKDK
Strain 2 ECPDHECYREPAKDSSEEDNGKCQSSGQRCVIENGKAVCKESEATTAATTTTKAKDK
Strain 3 ECPDHECYREPAKDSSEEDNGKCQSSGQRCVIENGKAVCKESEATTAATTTTKAKDK
Strain 4 ECPDHECYREPAKDSSEEDNGKCQSSGQRCVIENGKAVCKESEATTAATTTTKAKDK
Strain 5 ECPDHECYREPAKDSSEEDNGKCQSSGQRCVIENGKAVCKESEATTAATTTTKAKDK
************************* ************************* *************************

Bm86 refn
Strain1 DPDPGKSSAA
Strain 1 iso DPDPGKSSAA
Strain 2 DPDPGKLSAA
Strain 3 DPDPGKLSAA
Strain 4 DPDPGKSSAA
Strain 5 DPDPGKSSAA
************************* ************************* *************************

<figure><img src="image_92.png" /></figure>
► **Fig. 2** Amino acid sequence alignment of Bm86 amplified from tick strains 1–5 aligned to the reference Bm86 sequence (M29321). Differences in sequence are highlighted by grey shading. Asterisks denote identity in all sequences while colons denote amino acid similarity. A spliced variant from Strain 1 is denoted as Strain_1_iso

Vaccination and infestation

Cattle of the first group were vaccinated with the Bm86 recombinant protein; animals in the control group were injected with the adjuvant alone. The trial animals received two injections 1 month apart at d0 (05/07/2015) and at d28.

All the animals were infested with 1000 tick larvae at d39, d41, d43 and d53, d55, d57. The tick larvae were obtained from the tick strain from the zootechnic farm at Port Laguerre. Engorged ticks were originally collected on cattle from this farm 4 months earlier and the colony was maintained on 6-month-old calves during this time and the period of the trial. The larvae were approximately 15 days old at each infestation time. The two groups were kept in separated stalls and treated in the same way during the whole trial period.

Tick collection and analyses

From d58 to d67 and d72 to d83, engorged female ticks were carefully collected by hand from both sides of each animal. Ticks were brought back to the lab where they were washed, counted and weighed for each animal. The ticks were then placed in a temperature controlled chamber at 27 °C and 85% relative humidity for egg laying. When egg laying was completed, eggs were collected, weighed and tubes with 5 mg of eggs prepared at four different dates to assess the hatchability. The engorged ticks on the animals were examined daily to determine the number of ticks with hemorrhagic lesions and ticks that were dead before egg laying was also noted.

Serum collection and analyses

Blood samples were taken from each animal at d0, d14, d28, d42, d56, d70, d82 and d113. Sera were analyzed with an ELISA technique using the Bm86 protein produced with *E. coli*. Anti-Bm86 antibodies were detected according to the method described in Petermann et al. (2017).

Statistical analyses

Vaccination effects on tick biology and efficacy were determined as described by De La Fuente et al. (1999). Reduction rates of infestation associated with Bm86 immunization relative to the unvaccinated group were determined for adult female ticks (%DT), egg-laying capacity (%DO), and fertility (%DF). Vaccine efficacy was calculated as 100 × [1 – (CRT × CRO × CRF)], where CRT, CRO, and CRF are respectively, the reduction in the number of adult female ticks, egg-laying capacity, and fertility. Fertility is the percent of viable eggs.

For the analysis of results, pair wise comparisons (Student *t* test, *α* = 0.05) were conducted to compare results between vaccinated and control groups. Mean antibody levels were compared using an ANOVA test.

<figure><img src="image_93.png" /></figure>
# Results

## Bm86 sequence

Sequence analysis of a representative clone from each tick strain revealed a 1839 bp sequence for strains 1–5, CM (1), AI (2), WC (3), SZPLG (4) and ST (5) respectively, encoding a 629 amino acid protein sequence. These strains had a very high degree of amino acid identity (> 97.6%) to the reference Bm86 sequence (NCBI accession M29321). Tick Strain_1 yielded two faint bands in the amplification of Bm86 (Fig. 1) and sequencing of these bands revealed a full length sequence of 1839 bp and a sequence of 1698 bp with a 141 bp fragment encoding 47 amino acids spliced out of the coding sequence from the smaller band of the two. This putatively alternatively spliced sequence was confirmed by sequence analysis of an additional and independent Strain_1 clone. This spliced variant is novel and was not apparent in the other four tick strains. A Clustal alignment of Bm86 amino acid sequences representing the five New Caledonia tick strains and the reference sequence (M29321) is shown in Fig. 2. The Genbank accession for the Bm86 sequences derived from the five New Caledonia tick strains are; Strain_1, MG002399; Strain_1_iso, MG002400; Strain_2, MG002401; Strain_3, MG002402; Strain_4, MG002403 and Strain_5, MG002404.

## Bm86 recombinant protein

*Rhipicephalus australis* Bm86 recombinant protein was produced as an inclusion body in *E. coli*, solubilized using 8 M urea and purified using the hexaHis affinity tag incorporated into the recombinant protein as described in detail in Petermann et al. (2017). The purity of the antigen was estimated at greater than 85% based by visualisation of the purified recombinant protein on silver stained SDS-PAGE gels. The DNA and amino acid sequence of the recombinant Bm86 protein produced for this vaccination study is shown in Fig. 3.

## Bm86 vaccination antibody titer

Vaccinated cattle developed a strong antibody titer to recombinant Bm86 compared to the control group (Fig. 4). The antibody titer reached a peak 2 weeks after the second injection and decreased slowly until the end of the trial.

## Impacts on ticks

Tick development was negatively impacted by the Bm86 vaccination. Amongst ticks collected on vaccinated cattle, 41.9% showed apparent damage from hemorrhagic lesions (Fig. 5). Furthermore, immunization of cattle with this vaccine reduced the total number of ticks engorged on the animal by 40.3%. The ticks collected from the vaccinated animals were lighter in weight by 35.0% compared to the control group. The egg-laying capacity was reduced 51.2% and the fertility reduced 18.8%. The overall efficacy of this vaccine on Caledonian ticks was estimated at 74.2% based on these data (Table 1).
<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>**Fig. 3** *Escherichia coli* codon optimized DNA sequence and the translated amino acid sequence of recombinant *Rhipicephalus australis* Bm86 protein used in the vaccine. Bm86 protein sequence is italicized and the hexaHis affinity tag is underlined</figcaption></figure>

<figure><img src="image_95.png" /></figure>
<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>**Fig. 5** Damaged tick engorged on vaccinated cattle (right side) versus tick collected on non vaccinated cattle (on the left)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

Discussion

Five different tick strains of *R. australis* endemic to New Caledonia contained mRNAs encoding five slightly different variants of Bm86 as determined by comparison of sequence information encoding the full length mature protein. The percentage identity with the reference Bm86 amino acid sequence (NCBI accession M29321) ranged from 97.62 to 98.74% for the full length Bm86 strain sequences. One strain of *R. australis* additionally contained mRNA encoding a shorter version of Bm86, which was likely due to alternative splicing although there was only partial agreement with the consensus sequences for mRNA splicing. It is not clear why this variant was only detected in one tick strain.

Vaccination of cattle in this trial with a recombinant Bm86 antigen derived from *R. australis* Bm86 cDNA demonstrated an efficacy of 74.2%, including a reduction of 40.3% of adult female ticks (%DT), a decrease of 51.2% of egg laying capacity (%DO) and an impact of 18.8% on fertility (%DF) as compared to the control group. These effects were deemed significant (*p* < 0.05) except for the impact on fertility. Many studies have been published about pen trials with different tick vaccines on different tick strains but it's not easy to compare the results as authors often use different protocols (i.e. number of doses, adjuvant, route or dose used). However these results are in the range reported in other studies. Cunha et al. (2012) obtained an efficacy of 31% with a Bm86 based vaccine on *R. microplus* when Penichet et al. (1994) or Canales et al. (1997) observed an efficacy of 91%.
<table><caption>**Table 1** Results of challenge with tick larvae in the pen trial</caption><thead><tr><th>Group</th><th>Animal</th><th>Number of ticks</th><th>Damaged ticks (%)</th><th>Tick weight (mg)</th><th>Egg weight per tick (mg)</th><th>Fertility (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="7">Vaccine</td><td>1</td><td>30</td><td>26 (86.7)</td><td>115.75</td><td>29.90</td><td>0.39</td></tr><tr><td>2</td><td>84</td><td>28 (33.3)</td><td>141.39</td><td>55.10</td><td>0.58</td></tr><tr><td>3</td><td>26</td><td>10 (38.5)</td><td>132.23</td><td>45.18</td><td>0.40</td></tr><tr><td>4</td><td>6</td><td>3 (50.0)</td><td>133.00</td><td>74.67</td><td>0.82</td></tr><tr><td>5</td><td>28</td><td>10 (35.7)</td><td>132.16</td><td>54.68</td><td>0.78</td></tr><tr><td>6</td><td>26</td><td>9 (34.6)</td><td>143.89</td><td>68.46</td><td>0.77</td></tr><tr><td>7</td><td>34</td><td>12 (35.3)</td><td>134.08</td><td>64.35</td><td>0.84</td></tr><tr><td>Total</td><td></td><td>234</td><td>98 (41.9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mean</td><td></td><td>33.43</td><td>14.0</td><td>134.97</td><td>54.05</td><td>0.70</td></tr><tr><td>SD</td><td></td><td>24.02</td><td>9.33</td><td>9.02</td><td>15.13</td><td>0.20</td></tr><tr><td rowspan="7">Control</td><td>1</td><td>91</td><td>0 (0.0)</td><td>222.07</td><td>126.87</td><td>0.69</td></tr><tr><td>2</td><td>48</td><td>0 (0.0)</td><td>223.31</td><td>126.08</td><td>0.77</td></tr><tr><td>3</td><td>57</td><td>0 (0.0)</td><td>184.10</td><td>111.33</td><td>0.84</td></tr><tr><td>4</td><td>64</td><td>0 (0.0)</td><td>205.21</td><td>123.31</td><td>0.80</td></tr><tr><td>5</td><td>37</td><td>0 (0.0)</td><td>216.34</td><td>120.19</td><td>0.87</td></tr><tr><td>6</td><td>75</td><td>1 (1.3)</td><td>203.76</td><td>107.77</td><td>0.74</td></tr><tr><td>7</td><td>20</td><td>0 (0.0)</td><td>180.23</td><td>88.05</td><td>0.90</td></tr><tr><td>Total</td><td></td><td>392</td><td>1 (0.3)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mean</td><td></td><td>56</td><td>0.14</td><td>207.78</td><td>117.28</td><td>0.79</td></tr><tr><td>SD</td><td></td><td>23.71</td><td>0.38</td><td>17.36</td><td>13.85</td><td>0.07</td></tr><tr><td>p value</td><td></td><td></td><td>%DT: 40.3%</td><td>%DR: 35.0%</td><td>%DO: 51.2%</td><td>%DF: 18.8%</td></tr></tbody></table>

The different parameters studied are also in the mean range of those obtained by previous studies. In a review, De La Fuente et al. (1999) noted that the effect of vaccination with Gavac™, according to studies and *R. microplus* strains, results in a reduction of 9–74% of the number of adult female ticks, a decrease of 8–61% of the egg laying capacity and a diminution of 0–30% of fertility. In addition to minor sequence variations in the Bm86 antigen, the variance in vaccine efficacy is likely to be dominated by different vaccination protocols and particularly different extends of correct folding of the recombinant protein. The Bm86 protein has an extensive array of disulphide bonds which make protein folding difficult and likely to be highly variable.

Compared to other studies, only very few engorged female ticks were collected during this trial (Andreotti 2006; Cunha et al. 2012; Wong and Opdebeeck 1989). The ticks were counted and collected at 7:00 a.m., although it is possible that some engorged ticks had dropped off before counting on the animals had commenced. Cattle were also infested with a relatively low number of tick larvae as compared to other studies to avoid detrimental consequences on these high genetic potential animals. Each animal was infested 6 times with 1000 larvae, whereas usual tick infestations are made with 15,000–20,000 larvae (Andreotti 2006; Cunha et al. 2012; Wong and Opdebeeck 1989). The rate of damaged ticks is interesting with 41.9% of ticks in the vaccinated group displaying hemorrhagic
lesions as compared to only 0.3% of the control group. This rate seems to be highly variable between independent studies as Kemp et al. (1989) observed 20% of red ticks, Rodríguez et al. (1994) recorded 88% of damaged ticks whilst Wong and Opdebeeck (1989) obtained a range from 40 to 55% of damaged ticks during his trial.

The vaccinated animals demonstrated an immune response to the Bm86 antigen based on the antibody titers measured. Antibody response in the vaccinated group reached a peak 2 weeks after the second injection and the antibody kinetic was similar to those described by Andreotti (2006) or Cunha et al. (2012). A high level of antibody titer does not necessarily translate into a good activity of the vaccine against ticks (Willadsen et al. 1995), but De La Fuente et al. (1998) observed, in a large scale study using Gavac™ that a high antibody titer was negatively correlated to tick weight and egg weight per tick. In this trial, the results confirm an immunization efficacy with a reduction in total tick number, total engorged female weight, and total egg weight, as compared with the control group.

There was no statistical correlation of antibody titres and impact on tick parameters observed in this trial but this may be due to the low number of cattle used in the trial or low numbers of tick collected.

Several studies on the use of the tick vaccines Gavac™ or Tickgard™ on a large scale demonstrated a technical and economic interest of these vaccines (De La Fuente et al. 1999; Valle et al. 2004; De la Fuente et al. 2007; Suarez et al. 2016; Domínguez et al. 2016). As we have obtained similar results to those observed with commercial vaccines in a pen trial, we can be optimistic to pursue further field trials under farm conditions with our vaccine. A home-made vaccine however raises several questions and one of the most significant is the regulatory issue. Even if the concept of this vaccine is the same as for Tickgard™ or Gavac™ vaccines which were or are registered for commercial use, a home-made vaccine will require a local exemption from governmental services and, if obtained, can only be used for the local market. Another issue is the cost to produce this type of recombinant vaccine. Initial quotes to produce 7000 doses for a field trial indicate that the price per individual dose will be around 4.50 USD each. This price includes the production of the protein by an academic lab and packaging in vials of 50 doses each but does not consider all the cost to commercialize or use this vaccine. Even if we extend the use of this vaccine to the whole Caledonian herd, the local market is too small to go to a large scale production with a view to decrease costs of production. In comparison, Canales et al. (2010) obtained a vaccine production costs from US$0.56 to US$0.92 per dose depending on process, but these costs were calculated for a demand of 4 million doses per year. The final price however, will be a key point for the acceptance by breeders and it has to be considered in a global strategic approach involving farmers as well as technical and financial partners of cattle production.

Beyond the cost issue for the vaccine production, it is important to explain to farmers the importance of having alternative means for tick control when resistances to acaricides begins to increase to a critical level whereby they are no longer effective to maintain control on cattle farms.

Finally, the question of acceptance of a vaccine by farmers is an important point to regard. Seeing engorged ticks on vaccinated cattle can be difficult for farmers to accept and this method of control has to be accompanied by a technical explanation from an animal health professional working alongside farmers. This process is possible in New Caledonia which has a dense framework of veterinary structures and technical services but it must be taken into account to ensure the success of this tick vaccine approach.
**Acknowledgements** We wish to thank François Bertrand, Manager, Seppic, Shanghaï, for providing us the Montanide adjuvants and the Direction of the Rural Development of the New Caledonia as well as technicians of the station of Port-Laguerre to provide us animals, stalls and all we needed to conduct this trial. We would like to thank especially Peter Willadsen for his technical support since the beginning of this project.

**Compliance with ethical standards**

**Conflict of interest** The authors declare that they have no conflict of interest.

**References**

Andreotti R (2006) Performance of two Bm86 antigen vaccine formulation against tick using crossbreed bovines in stall test. Rev Bras Parasitol Vet 15(3):97–100

Canales M, Enriquez A, Ramos E et al (1997) Large-scale production in *Pichia pastoris* of the recombinant vaccine Gavac™ against cattle tick. Vaccine 15(4):414–422

Canales M, Moreno-Cid JA, Almazán C et al (2010) Bioprocess design and economics of recombinant BM86/BM95 antigen production for anti-tick vaccines. Biochem Eng J 52(1):79–90

Cunha RC, Pérez de León AA, Leite FPL et al (2012) Bovine immunoprotection against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* with recombinant Bm86-Campo Grande antigen. Rev Bras Parasitol Vet 21(3):254–262

De la Fuente J, Contreras M (2015) Tick vaccines: current status and future directions. Expert Rev Vaccines 14(10):1367–1376

De La Fuente J, Rodríguez M, Redondo M et al (1998) Field studies and cost-effectiveness analysis of vaccination with Gavac™ against the cattle tick *Boophilus microplus*. Vaccine 16(4):366–373

De La Fuente J, Rodríguez M, Montero C et al (1999) Vaccination against ticks (*Boophilus* spp.): the experience with the Bm86-based vaccine Gavac™. Genet Anal Biomol E 15(3):143–148

De la Fuente J, Almazán C, Canales M et al (2007) A ten-year review of commercial vaccine performance for control of tick infestations on cattle. Anim Health Res Rev 8(01):23–28

Domínguez D, Agatón FT, Cruz RR (2016) Evaluación económica del control de garrapatas *Rhipicephalus microplus* en México. CIBA 5(9):43–52

Estrada-Peña A, Venzal JM, Nava S et al (2012) Reinstatement of *Rhipicephalus (Boophilus) australis* (Acari: Ixodidae) with redescription of the adult and larval stages. J Med Entomol 49(4):794–802

García-García JC, Gonzalez IL, González DM et al (1999) Sequence variations in the *Boophilus microplus* Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp Appl Acarol 23(11):883–895

Kemp DH, Pearson RD, Gough JM, Willadsen P (1989) Vaccination against *Boophilus microplus*: localization of antigens on tick gut cells and their interaction with the host immune system. Exp Appl Acarol 7(1):43–58

Penichet M, Rodriguez M, Castellano O et al (1994) Detection of Bm86 antigen in different strains of *Boophilus microplus* and effectiveness of immunization with recombinant Bm86. Parasite Immunol 16(9):493–500

Petermann J, Cauquil L, Hurlin JC et al (2016) Survey of cattle tick, *Rhipicephalus (Boophilus) microplus*, resistance to amitraz and deltamethrin in New Caledonia. Vet Parasitol 217:64–70

Petermann J, Bonnefond R, Mermoud I et al (2017) Evaluation of three adjuvants with respect to both adverse effects on the efficacy of antibody production to the Bm86 protein. Exp Appl Acarol. https://doi.org/10.1007/s10493-017-0156-4 (in press)

Rodríguez M, Rubiera R, Penichet M et al (1994) High level expression of the *B. microplus* Bm86 antigen in the yeast *Pichia pastoris* forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol 33(2):135–146

Suarez M, Rubi J, Pérez D et al (2016) High impact and effectiveness of Gavac™ vaccine in the national program for control of bovine ticks *Rhipicephalus microplus* in Venezuela. Livest Sci 187:48–52

Valle MR, Mèndez L, Valdez M et al (2004) Integrated control of *Boophilus microplus* ticks in Cuba based on vaccination with the anti-tick vaccine Gavac TM. Exp Appl Acarol 34(3):375–382

Willadsen P (1997) Novel vaccines for ectoparasites. Vet Parasitol 71(2):209–222

Willadsen P, Bird P, Cobon GS, Hungerford J (1995) Commercialisation of a recombinant vaccine against *Boophilus microplus*. Parasitology 110(S1):S43–S50

Wong JY, Opdebeeck JP (1989) Protective efficacy of antigens solubilized from gut membranes of the cattle tick, *Boophilus microplus*. Immunology 66(1):149

<figure><img src="image_98.png" /></figure>
<figure><img src="image_99.png" /></figure>

ELSEVIER

Contents lists available at ScienceDirect

Veterinary Parasitology: Regional Studies and Reports

journal homepage: www.elsevier.com/locate/vprsr

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

Original Article

# Field efficacy assessment of a vaccine against *Rhipicephalus (Boophilus)* *australis* in New-Caledonia

Héloïse Duval, Thomas Hüe*

Laboratoire de Parasitologie Animale, Equipe ARBOREAL, Institut Agronomique néo-Caledonien (IAC), BP73, 98890 Païta, New Caledonia

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

## ARTICLE INFO

**Keywords:**

*Rhipicephalus australis*

Tick vaccine

Pasture and cattle management

Side effects

## ABSTRACT

Pure European bovine breeding is compromised in South Pacific (i.e. Australia, New Caledonia) due to the impact of acaricide-resistant *Rhipicephalus (Boophilus) australis* ticks. Farmers need new solutions to sustainably maintain their activity. An integrated tick control program has been applied for 2 years in herds of European breeds (i.e. Charolais and Limousine cattle breeds) in New Caledonia. A field trial including the use of a vaccine based on a local Bm86 antigen, agropastoral measures and a chemical control of the tick was conducted to assess the possibility to reduce the number of acaricidal treatments. Nine farms including 1400 animals were monitored from July 2017 to June 2020. The year mid2017-mid2018 was the year of initial monitoring in order to get control data related to tick infestation during the seasons and to the number of treatments per herd. Vaccinations began between September and December 2018. Results obtained from mid2019 to mid2020 were then compared to the initial period (mid2017-mid2018) to assess the benefits of the vaccine. The average annual number of acaricide treatments decreased significantly from 7.44 before vaccination to 4.45 during mid2019-mid2020 (p = 0.026). Infestation scores, assessed by tick counts when farmers grouped the cattle to apply acaricides, showed a constant and low infestation level. Nevertheless, farmers were willing to tolerate slightly higher tick loads on vaccinated cattle with less acaricidal treatments compared to unvaccinated and frequently treated cattle. Local cutaneous reactions were recorded at the injection site with 46.6% of all injections evolving into nodules and 1% of injections giving depilation or abscesses. At the end of the trial, all the breeders wish to continue the vaccination and consider that it is now possible to serenely maintain their breed.

## 1. Introduction

New-Caledonia is a French island in the Pacific Ocean, 1500 km east from Australia. Until early 2000's, European bovine breeds such as the Limousine, Charolaise and Blonde d'Aquitaine were preferred by most New Caledonia farms. However, these breeds are highly susceptible to the cattle tick *Rhipicephalus australis* and high infestations can be fatal (Barré and Delathière, 2010), while the main tick borne diseases (babesiosis, anaplasmosis) are not present on the territory - with the exception of one very limited area (Hüe et al., 2013). In New Caledonia, *R. australis* was previously known as *Rhipicephalus microplus* until its physiological, genetic and morphological distinction to *R. australis* (Labruna et al., 2009; Estrada-Pena et al., 2012). Until 2000's, tick control relied mostly on regular treatments (i.e. dip, pour-on) with chemical acaricides. Several classes of chemicals have been used, though acaricide resistance has developed. Organophosphates (e.g. diazinon, chlorpyriphos) lost their efficacy in the 90's and were replaced by

pyretroids (e.g. deltamethrin, flumethrin) until the 2000's when resistance impaired their use in the field. Amitraz has then been used and, by 2014, 23.3% of tick strains tested were resistant to this acaricide (Petermann et al., 2016). Amitraz is applied by dipping, and the frequency of treatment may be up to every 2 months. Macrocyclic lactones with short residual activity are used intermittently on farms (e.g. Cydectin®, Virbac, Australia). Long acting ivermectin formulation (Ivomec Gold®, Boehringer Ingelheim Animal Health, South Africa), with residual activity around 6 weeks (Benavides et al., 2017; Davey et al., 2010; Gomes et al., 2015) is also used, as well as a specific Tick Growth Regulator (Fluazuron, Acatak®, Elanco, Australia). The use of the two latest is restricted and treatments are done by dedicated technicians one to two times maximum per year.

During the last two decades, other control methods have been tested to maintain the viability of cattle farming in New Caledonia. Genetically tick resistant cattle breeds have been imported (e.g. Brahman, Santa Gertrudis). However, pure European breeds remain of interest because

<footnote>* Corresponding author.
E-mail address: huc@iac.nc (T. Hüe).</footnote>
of the quality of their meat. Nowadays, these animals are frequently
crossed with tick resistant cattle.

Agropastoral control is another component of the tick integrated control program. A common method is plot rotation and pasture spelling when ticks are observed. With this approach, infested plots need to be rested for 4 to 5 months to allow the natural death of tick larvae which is a limiting factor considering the degradation of forages (Salas et al., 1994). A new method of pastures and cattle management (PCM) has been proposed by the Agronomic Institute of New Caledonia (Hüe and Fontfreyde, 2019) to combine forage production and tick control. This method requires an initial investigation of the farm to identify the main risk factors for tick infestation. Once it is completed, corrective measures are proposed to the farmers. This approach was applied in 2015 on two farms for two years and led to a decrease by 70.9% to 82.9% of acaricide treatments.

An additional component of an integrated strategy is the develop-
ment of a local tick vaccine, which began in 2010. Two vaccines based
on the Bm86 protein have been commercialized including TickGard™
(formerly Intervet, Australia) (Willadsen et al., 1995) which is no longer
commercially available and Gavac™ (Heber Biotec, Havana, Cuba)
(Canales et al., 1997). However, due to sanitary constraints, the Gavac®
vaccine (Heber Biotec S.A., Cuba) could not be introduced in New
Caledonia. Thus, a vaccine based on local Bm86 protein strains was
produced and tested in an experimental trial in 2015 (Hüe et al., 2017).
During this pen trial, vaccine efficacy was 74.2%. The aim of this study
was to assess the efficacy of the local vaccine under field conditions, in
association with the existing control measures.

## 2. Materials and methods

2.1. Area and climatic description

New-Caledonia has an oceanic tropical climate. A hot and wet sea-
son, with means of temperature between 27 °C and 28 °C, is usual from
mid-December to late May. A cold season is observed from June to mid-
September, with means of temperature between 20 °C and 22 °C. A dry
season occurs usually from mid September to mid-December. Annual
rainfall in the study area was usually between 800 mm and 1200 mm,
but since 2013, annual rainfalls have been below the average measured
from 1981 to 2010. The years of 2017 and 2019 are in the top 10 of
driest years since 1961 (Météo France, 2020).

2.2. Participant farms

Nine Caledonian farms with pure European herds, representing 1400
bovines, were selected. Farms had at least one herd of Limousin,
Charolais or Blonde d'Aquitaine breeds with more than 25 cows.
Depending on the farm, the size of the monitored herd varied from 50 to
350 animals. At the beginning of the trial, five of them had a positive
diagnosis of resistance to amitraz. In three large farms, producers had
several herds but, due to dose availability, only the herd of highest ge-
netic value was vaccinated. In these cases, the vaccinated herd grazed on
dedicated plots.

2.3. Anti-tick acaricidal treatments

Most of the time, cattle were treated with amitraz-based products
during tick infestations. Individual producers had different criteria for
applying an acaricide treatment. One treated as soon as a tick was
observed. Four producers tolerated low tick infestations before treating.
The last four producers were more or less tolerant of ticks depending on
the herd concerned and season. During this trial, no threshold was
defined for treatment and producers were free to treat when they
considered it necessary.

2.4. Agropastoral measures

A pasture and cattle management (PCM) method was used as
described by Hüe (Hüe and Fontfreyde, 2019). Four farms already
applied this approach before the beginning of this trial and this method
was initiated on the other five farms in mid-2017.

2.5. Vaccination

A vaccine based on Bm86 from Caledonian strains was produced in an Australian laboratory (Protein Expression Facility Lab, University of Queensland) (Hüe et al., 2017). Each animal over one month old received two injections one month apart. Booster was given every 6 months. Two milliliters, corresponding to 100 µg of protein, were injected subcutaneously into the neck.

2.6. Protocol

This trial began in July 2017 and ended in June 2020. The year mid2017-mid2018 was the year of monitoring in order to get control data related to tick infestation during the seasons and to the number of treatments per herd. Vaccinations began between September and December 2018. The comparison of the studied variables obtained from mid2019 to mid2020 were then compared to the initial period from mid2017 to mid2018 to assess the potential benefits of the vaccine.

2.7. Study variables

Number of acaricidal treatments, tick counts, and rainfalls were recorded during the study period (2017–2020). Side effects of the vaccine were recorded too. Level of farmer satisfaction was assessed by a survey.

2.7.1. Acaricidal treatments

The number of treatments was considered as the primary variable in this field study. The treatments were noted from July 2017 to June 2020 for each herd. To consider the different acaricides, long acting treatments (with Ivomec Gold® or Acatak®) were counted as equivalent to three short acting treatments (with amitraz or short residual avermectin) as described by Hüe (Hüe and Fontfreyde, 2019). For each farm, the number of tick treatments was recorded per bovine per year.

2.7.2. Infestation score

Tick counts were carried out at the time of acaricidal treatments. Infestation score was calculated according to the method previously described by Naves et al. (2016). Twenty to twenty-five bovines were randomly chosen at each tick count avoiding cattle over 8 years old. The infestation score is the sum of the number of ticks over 4 mm from one side of the body and an immature tick score. The immature tick score was obtained by exploration of three areas of the body: neck, tail and perineum. It indicates quantity of immature ticks by a grade from 0 to 4. The average of these three scores was multiplied by 10 to obtain the immature tick score. For each farm, the average infestation score was calculated per year.

2.7.3. Tick infestation index

To estimate the annual tick load, a tick infestation index was
calculated. This index is the level of tick infestation as measured by the
infestation score, multiplied by the number of times each year the herd
reaches that score.

2.7.4. Rainfall

Rainfall was recorded for the periods mid2017-mid2018 and
mid2019-mid2020 in farms. For farms that did not record rainfall, this
information was extracted from the nearest weather station.
<table><caption>**Table 1**
infestation score, number of acaricidal treatments, tick infestation score during the first and last year of the trial and percentage of abscesses post injection per producer (NO: not observed).</caption><thead><tr><th>Farm n°</th><th>Number of treatments mid2017-mid2018</th><th>Number of treatments mid2019-mid2020</th><th>Average infestation score mid2017-mid2018</th><th>Average infestation score mid2019-mid2020</th><th>Tick infestation index mid2017-mid2018</th><th>Tick infestation index mid2019-mid2020</th><th>Average percentage of abscesses on cattle after the vaccine</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>7.0</td><td>5.4</td><td>59.0</td><td>74.7</td><td>413</td><td>403</td><td>5-25%</td></tr><tr><td>2</td><td>9.3</td><td>4.5</td><td>3.6</td><td>9.7</td><td>33</td><td>44</td><td>1-5%</td></tr><tr><td>3</td><td>10.4</td><td>5.7</td><td>6.5</td><td>9.0</td><td>68</td><td>118</td><td>0</td></tr><tr><td>4</td><td>5.0</td><td>6.0</td><td>13.4</td><td>18.4</td><td>67</td><td>220</td><td>1-5%</td></tr><tr><td>5</td><td>6.3</td><td>4.5</td><td>16.7</td><td>16.2</td><td>105</td><td>73</td><td>0</td></tr><tr><td>6</td><td>8.0</td><td>5.0</td><td>20.3</td><td>22.0</td><td>162</td><td>110</td><td>0</td></tr><tr><td>7</td><td>7.0</td><td>1.0</td><td>20.1</td><td>NO</td><td>141</td><td>NO</td><td>1-5%</td></tr><tr><td>8</td><td>10.0</td><td>6.0</td><td>11.5</td><td>7.7</td><td>115</td><td>70</td><td>1-5%</td></tr><tr><td>9</td><td>4.0</td><td>2.0</td><td>11.9</td><td>19.7</td><td>48</td><td>39</td><td>0</td></tr><tr><td>Mean</td><td>7.44</td><td>4.45</td><td>17.9</td><td>23.4</td><td>126</td><td>135</td><td></td></tr><tr><td>P value (compares means of the 2 periods)</td><td>0.026</td><td></td><td></td><td>0.0365</td><td></td><td>0.934</td><td></td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>**Fig. 1.** Number of acaricide treatments during the periods mid2017-mid2018 and mid2019-mid2020. Lines are medians. **: the difference between the two periods is significant (p = 0.026).</figcaption></figure>

### 2.7.5. Side-effects

Local side effects due to the injection of the vaccine were recorded during a survey at the end of the trial in July 2020. Producers indicated the percentage of animals in their herds with local skin reactions according to a class scale: 0%, 0-5%, 5-25%, 25-50%, 50-75 or 75-100%. Averages of each local reaction were calculated.

### 2.7.6. Satisfaction survey

A satisfaction survey was conducted at the end of the three years to collect the feedback of farmers. Questions were designed to estimate the level of satisfaction concerning the global program, the efficacy of agropastoral measures, the efficacy concerning the vaccine and their feelings of side effects.

### 2.8. Analysis

Averages of the number of acaricide treatments for the nine farms were compared between the first and last year of the trial. It was carried out by ANOVA using the R© software (R Core, 2020). The parameter of the infestation score was compared between the two periods with Wilcoxon test using the R© software.

Tick infestation indexes from year mid 2017-mid2018 and year mid 2019-mid 2020 were compared using Fisher and Student tests. Confidence intervals of rainfall were calculated on Excel (Microsoft Corporation, Redmont, United States).

## 3. Results

All the results concerning acaricide treatments, infestation scores, tick infestation index and abscess are presented in Table 1.

### 3.1. Acaricide treatments

The average annual number of acaricide treatments decreased from 7.44 before vaccination to 4.45 during mid2019-mid2020 (Fig. 1). This represents a significant decrease of 40.2% between these two periods (p-value = 0.026).

### 3.2. Infestation score

A total of 22 tick counts occurred in mid2017-mid2018 and 20 in mid2019-mid2020. Average of infestation score in mid2017-mid2018 was 17.9 ± 1.7, whereas it was 23.4 ± 3.3 during the period mid2019-mid2020 (Table 1). Score infestation has significantly increased by 30.7% (p value = 0.0365). Individual tick counts achieved during these period are presented in additional file.

### 3.3. Tick infestation index

The mean of this index increased from 126 to 135, which is not significant (p value = 0.934). This was calculated without taking into account the herd n°7. Only one acaricide treatment occurred in this farm during the last year compared to the initial seven treatments, and a tick count was not performed during this treatment.

### 3.4. Rainfall

Average rainfall of the nine farms was recorded in the year mid2017-mid2018 and mid2019-mid2020. The two averages, respectively 811 mm and 675 mm, were not significantly different (p = 0.33).
<figure><img src="image_103.png" /><figcaption>Fig. 2. Level of farmer satisfaction (score from 0 to 5) during the trial.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>Fig. 3. Correlation matrix between answers to the satisfaction survey (Global: global satisfaction); Treatment: perception of less treating; PCM: perception that pasture and cattle management measures are efficient; Vaccine: perception that vaccination is efficient; Rhythm: satisfaction in the rhythm of vaccination.</figcaption></figure>

### 3.5. Side effects

A total of 6079 injections were performed during this trial. Local reactions at injection sites were reported in 46.6% of the herds. These were mostly skin nodules, thickening of the skin in the shape of a sphere. The diameter sphere varies from 5 cm up to a maximum of 15 cm. They appeared in the days following vaccine injection. Their size decreased over time and some of them completely disappeared. A second cutaneous reaction was depilation, which occurred in 0.9% of injections. Its diameter went from few centimeters to 20 cm. Skin was pinkish to orange, oozing and scaly. This type of lesion disappeared after 7 days. At last, 0.1% injections evolved into abscesses.

### 3.6. Satisfaction survey

Means of satisfaction were all between 4 and 4.5 out of 5, despite one farmer considered this program as moderately effective, vaccine as not very effective and side effects annoying. However, all farmers wanted to continue the vaccination (Fig. 2). A correlation matrix highlights that

the global satisfaction is much more correlated with the reduction in the number of acaricide treatments and vaccination than with the perception that agropastoral measures are efficient (Fig. 3).

## 4. Discussion

The major objective of this trial was to test the benefit of the vaccine in reducing the number of acaricidal treatments in European pure breeds. The combination of this tick vaccine and the agro-pastoral method led to a reduction of 40.2% of acaricide treatments. Infestation scores increased on average by 30.7%, which was significant, but they remained at a low level, except for a farm breeding Charolaise cattle which commonly faced high tick infestations. In our study, high infestation score can be explained by the method of tick counts. Indeed, they were done the day of tick treatment and this protocol is different from other trials when tick counts are at scheduled intervals from every week to every month (Garcia-Garcia et al., 2000; Jonsson et al., 2000; Rodríguez et al., 1995a, 1995b; Willadsen et al., 1995). These regular tick counts allow a better monitoring of tick pressure on cattle and allow to highlight a potential decrease of tick population. This approach was not selected in our trial as these frequent counts are more constraining for farmers, especially for 3 year-studies. Moreover, farmers felt more confident when their animals were vaccinated, they were less stressed when they observed ticks and can wait to consider if a treatment is needed. This may explain why they tolerate more ticks before treatment and the increase of infestation score. Tick infestation index remained constant during the trial which means that tick load did not change despite the reduction of acaricide treatments.

Amongst external factors that can interfere with impact tick infestations, rainfall can influence tick pressure in two ways. Survival of eggs and larvae is reduced with dry weather (Davey et al., 1991). But on the other hand cattle can suffer from a lack of food because of drought and cattle are up to 5 times less resistant to ticks with nutritional stress (Sutherst et al., 1983). In this trial, rainfall was not significantly different between the two years of comparison. Nevertheless, one can conclude that the reduction of tick treatments observed during this field trial was due to the addition of the vaccine program. Decreasing acaricidal treatments provide an economical gain for the farmers, and also allow a decrease in selection pressure for resistance.

Various methods to control ticks on cattle have been reviewed (Ghosh et al., 2007; Jonsson, 2004; Pérez de León et al., 2014; Peter et al., 2005; Rodríguez-Vivas et al., 2018) and mathematical models exist to estimate the impact of the different approaches (Beugnet et al., 1998; Floyd et al., 1995; Wang et al., 2019). Some studies present the effect of one of these methods associated with chemical treatments, like the interest of pasture spelling (Nicaretta et al., 2020; Wharton et al., 1969; Wilkinson, 1964) or the impact of tick vaccine (Cunha and
<table><caption>**Table 2**
: Comparison with different vaccine field trials and the studied trial (Dominguez-Garcia et al., 2016; de la Fuente et al., 1998, 2007; Garcia-Garcia et al., 2000; Redondo et al., 1999; Rodriguez Valle et al., 2004; Suarez et al., 2016).</caption><thead><tr><th>References</th><th>Vaccine</th><th>Vaccination protocol (A,B, C)<sup>a</sup></th><th>Breed</th><th>Area</th><th>Number of vaccinated bovine</th><th>Time of trial</th><th>Control group</th><th>Change in treatment strategy</th><th>Reduction in number of treatments (D, E)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Presented trial</td><td>Bm86 (Caledonian strains)</td><td>A</td><td>Limousine, Charolaise, Blonde d'Aquitaine</td><td>New-Caledonia</td><td>1400</td><td>18 months</td><td>No</td><td>No</td><td>40.2% (D)</td></tr><tr><td>(Rodriguez Valle et al., 2004)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Holstein</td><td>Cuba</td><td>588,573</td><td>8 years</td><td>Yes<sup>b</sup></td><td>Yes<sup>c</sup></td><td>87% (D)</td></tr><tr><td>(Suarez et al., 2016)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Unknown</td><td>Venezuela (18 states)</td><td>28,727</td><td>2 years</td><td>Yes</td><td>No</td><td>83.7% (E)</td></tr><tr><td>(de la Fuente et al., 2007)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Cross-bred</td><td>Mexico (Taumaulipas)</td><td>2600</td><td>10 years</td><td>No</td><td>No</td><td>67% (D)</td></tr><tr><td>(Redondo et al., 1999)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Cross-bred (beef)</td><td>Mexico (Taumaulipas)</td><td>800</td><td>8 months</td><td>Yes (20 bovines)</td><td>No</td><td>70% (E)</td></tr><tr><td>(Garcia-Garcia et al., 2000)</td><td>Gavac and Bm95 vaccine</td><td>C</td><td>Unknown</td><td>Cuba (Pinard et Rio)</td><td>192 (Gavac) and 849 (Bm95)</td><td>6 months</td><td>Yes (193 bovines)</td><td>Unknown</td><td>41.5% (Gavac/ control) et 54.2% (Bm95/ control) (E)</td></tr><tr><td>(de la Fuente et al., 1998)</td><td>Gavac</td><td>B</td><td>Cross-bred Holstein</td><td>Cuba</td><td>105,000</td><td>18 months</td><td>No</td><td>Unknown</td><td>60% (D)</td></tr><tr><td>(Dominguez Garcia et al., 2016)</td><td>Gavac</td><td>C</td><td>Unknown</td><td>Mexico (Coyuca de Benítez)</td><td>587</td><td>Unknown</td><td>No</td><td>Unknown</td><td>80% (D)</td></tr></tbody></table>

Andreotti, 2013; de la Fuente et al., 2007; Suarez et al., 2016) but, to our knowledge, no evaluation of the association with a vaccine is described in the literature.

A comparison of studies assessing cattle tick vaccines is summarized in Table 2. The reduction of number of acaricide treatments observed during our field trial is lower than those described in other studies but several parameters vary between trials. One is the protocol of vaccination. The one selected in this trial is the result of previous local experimentation on antibody persistence up to six months (unpublished data) and Gavac® and TickGard® protocols. Label instructions for Gavac® require three priming injections at 0, 4 and 7th week with a booster every 6 months, but Vargas et al. (2010) highlighted that priming vaccination with Gavac® at 0 and 4 weeks or at 0, 4 and 7th weeks has a similar impact on tick weight and tick eggs weight. Label claim for the TickGard® indicated a protocol of two priming injections one month apart and a booster every three months. Considering also logistic and economical factors, choice of two priming vaccinations one month apart with boosters every six months was selected in the present field study. Contrary to some studies in the Table 2, we did not include a control group in this trial. Including control farmers raises the question of maintaining their motivation over a three-year trial and this risk was not initially taken.

Our results confirm the interest of vaccination with the Bm86 protein, but a lot of research is currently focused on new candidates antigens. However, these new antigens are mainly tested in controlled pen trials and they did not lead to commercial development (de la Fuente and Contreras, 2015; Pereira et al., 2022). In New-Caledonia, the agropastoral PCM method provided a decrease of chemical treatments from 70.9% to 82.9% at a small scale (Hüe and Fontfreude, 2019) and this decrease drop to 33% when more farms are monitored (Hüe et al., 2021). The vaccination program added here an additional 40% decrease in the number of acaricidal treatments, highlighting the interest to

combine both measures agropastoral and vaccine methods are complementary approaches with the same goal. The effect of the vaccine plays its full role in reducing the number of eggs laid by engorged ticks, thus impacting the tick population, but the effect is not immediate on tick infestation and the farmers need to understand that the action will be progressive.

It's interesting to consider that all farmers included in this trial wanted to continue the vaccination program despite the rate of side effects, which is a demonstration that they saw the positive benefit/risk ratio of the vaccine. Vaccination will continue for two more years in these 9 farms to assess the medium-term effects and discussions are underway to be able to offer vaccination to a larger scale of Caledonian farmers.

## 5. Conclusion

Breeding European breeds in New Caledonia is a challenge because of the level of tick infestation and the development of acaricide resistance. The development of a tick vaccine and agropastoral control measures together allow producers to raise susceptible cattle in this environment with a minimum of chemical treatments which is a guarantee of sustainability for their activity. These results can be of interest for farmers of other countries faced to Rhipicephalus spp. infestations but PCM developed under Caledonian farming conditions should then be adapted.

## Ethic approval

Not applicable

<footnote>a Vaccination protocol: A: Priming vaccination on 0 and 5th week, then booster every 6 months; B: Priming vaccination on 0, 4 and 7th week, then booster every 6 months; C: Priming vaccination on 0 and 4th weeks.</footnote>

<footnote>b There is another group of vaccinated bovine. This is not a "control" group because there were chosen after the trial and had not the same protocol, only number of treatment were recorded after the trial.</footnote>

<footnote>c Before vaccination, producers used to treat systemically against ticks at the same time interval. After, they treated according to a tolerance threshold for tick infestation.</footnote>

<footnote>d Method of comparison: D: Comparison between before and after implemation on vaccination on the same group; E: Comparison between vaccinated and control group; F: Comparison between a systematic treatment mode and after vaccination.</footnote>
# Declaration of Competing Interest

The authors declare that they have no conflict of interest.

# Acknowledgements

The authors would like to thank the producers involved in this trial, the technicians of the Groupement de Défense Sanitaire Animal for taking part in the data collection, the Caledonian Government (DAVAR-LNC) for their support, UQ PEF's provisions of services for the protein production, SEPPIC for providing the adjuvant and Peter Willadsen for his indefectible technical support for ten years.

# Funding

This research did not receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not-for-profit sectors.

# Ethical statement

Animals used in this field experiment were followed by vet if any problems occurred. They were healthy and stress caused by manipulations was reduced to his minimal.

# References

Barré, N., Delatière, J.M., 2010. Stratégies de Lutte Contre la Tique du Bétail en Nouvelle-Calédonie - Synthèse des Connaissances. IAC Editions. Etudes & Synthèses, Paita, Nouvelle-Calédonie.

Benavides, E., Jimenez Castro, P., Betancur, O.C., 2017. Efecto del uso de flanzaronó para control de *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* en bovinos. Revista MVZ Córdoba 22, 6050.

Beugnet, J., Chalvet-Monfray, K., Sabatier, P., 1998. Use of mathematical model to study the control measures of the cattle tick *Boophilus microplus* in New Caledonia. Vet Parasitol. 77, 277-288.

Canales, M., Enriquez, A., Ramos, E., Cabrera, D., Dandie, H., Soto, A., Falcon, V., Rodríguez, M., de la Fuente, J., 1997. Large-scale production in *Pichia pastoris* of the recombinant vaccine Gavac™ against cattle tick. Vaccine 15 (4), 414-422.

Canha, R.C., Andreotti, R., 2013. Calculation of the efficacy of vaccines against tick infestations on cattle. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 22, 571-578.

Davey, R.B., Cooksey, L.M., Despins, J.L., 1991. Survival of larvae of *Boophilus annulatus*, *Boophilus microplus*, and *Boophilus hybrids* (Acani: *boodidae*) in different temperature and humidity regimes in the laboratory. Vet. Parasitol. 40, 305-313.

Davey, R.B., Pound, J.M., Müller, J.A., Klavons, J.A., 2010. Therapeutic and persistent efficacy of a long-acting (LA) formulation of ivermectin against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* (Acani: *boodidae*) and sera concentration through time in treated cattle. Vet. Parasitol. 169, 149-156.

de la Fuente, J., Contreras, M., 2015. Tick vaccines: current status and future directions. Expert. Rev. Vaccines 14 (10), 1367-1376.

de la Fuente, J., Rodriguez, M., Redondo, M., Montero, C., García-García, J.C., Mendez, L., Serrana, E., Valdez, M., Enriquez, A., Canales, M., Ramos, E., Boué, O., Machado, H., Leonart, R., de Armas, C.A., Rey, S., Rodríguez, J.L., Artiles, M., Garcia, L., 1998. Field Studies and Cost Effectiveness Analysis of Vaccination with Gavac™ against the Cattle Tick *Boophilus microplus*. Vaccine, 16, pp. 366-373.

de la Fuente, J., Almazán, C., Canales, M., de la Lastra, J.M.P., Kocan, K.M., Willadsen, P., 2007. A ten-year review of commercial vaccine performance for control of tick infestations on cattle. Anim. Health Res. Rev. 8, 23-28. https://doi.org/10.1017/S1466252307001193.

Dominiguez-García, D.I., Agaton, F.T., Rosario-Cruz, R., 2016. Evaluación económica del control de garrapatas *Rhipicephalus microplus* en México / Económica evaluation of tick (*Rhipicephalus microplus*) control in Mexico. In: CIBA Rev. Iberoamericana Gine. Biológicas Agropecuarias, 5, pp. 43-52.

Extrada-Péria, A., Venzal, J.M., Hava, S., Mangold, A.J., Guglielmone, A.A., Labruna, M. B., de la Fuente, J., 2012. Reinstatement of *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* (Acani: *boodidae*) with redescription of the adult and larval stages. J. Med. Entomol. 49 (4), 794-802.

Lloyd, R.B., Sutherst, R.W., Hungerford, J., 1995. Modelling the field efficacy of a genetically engineered vaccine against the cattle tick, *Boophilus microplus*. Int. J. Parasitol. 25, 285-291.

García-García, J.C., Montero, C., Redondo, M., Vargas, M., Canales, M., Boué, O., Rodríguez, M., Joglar, M., Machado, H., Gonzales, I., Valdez, M., de la Fuente, J., 2000. Control of ticks resistant to immunization with Bm86 in cattle vaccinated with the recombinant antigen Bm95 isolated from the cattle tick, *Boophilus microplus*. Vaccine 18 (21), 2275-2287.

Ghosh, S., Azhahanianambi, P., Yadav, M.P., 2007. Upcoming and future strategies of tick control: a review. J. Vector Dis. 44 (2), 79.

Gomes, L.V.C., Lopes, W.D.Z., Góz, B.C., Teixeira, W.F., Felippelli, G., Maciel, W.G., Bichette, M.A., Ruivo, M.A., Alcantara Colli, M.H., Carvalho, R.S., Martínez, A.C.,

Soares, V.E., da Costa, A.J., 2015. Acaricidal effects of flazuron (2.5mg/kg) and a combination of flazaron (1.6mg/kg) + ivermectin (0.63mg/kg), administered at different routes, against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* parasitizing cattle. Exp. Parasitol. 153, 22-28.

Hül, T., Fontireyde, C., 2019. Development of a new approach of pasture management to control *Rhipicephalus microplus* infestation. Trop. Anim. Health Prod. 51, 1989-1995.

Hül, T., Graille, M., Mortelécque, A., Desoutter, D., Delatière, J.M., Marchal, C., Teulai, M., Barré, N., 2013. Diagnostic methods used to monitor an outbreak of babesiosis (*Babesia bovis*) in a herd of feral cattle in New Caledonia. Aust. Vet. J. 91, 254-258.

Hül, T., Petermann, J., Bonnefond, R., Mermod, L., Rantoen, D., Vuocolo, T., 2017. Experimental efficacy of a vaccine against *Rhipicephalus microplus*. Exp. Appl. Acarol. 73, 245-256.

Hül, T., Berger, A., Wang, H.H., Grant, W.E., Ted, P.D., de León, A.A.P., 2021. Integrated control of the cattle tick, *Rhipicephalus microplus* (Acani: *boodidae*), in New Caledonia through the pasture and cattle management method. Parasitol. Res. 120 (8), 2749-2758. https://doi.org/10.1007/s00436-021-07235-3.

Jonsson, N.N., 2004. Integrated Control Programs for Ticks on Cattle: An Examination of some Possible Components. FAO animal Production and Health Paper. School of Veterinary Science, University of Queensland, Australia, pp. 51-58.

Jonsson, N.N., Matschoss, A.L., Pepper, P., Green, P.E., Albrecht, M.S., Hungerford, J., Ansell, J., 2000. Evaluation of tickGARD(PLUS), a new vaccine against *Boophilus microplus*, in lactating Holstein-Friesian cows. Vet. Parasitol. 88, 275-285.

Labcuna, M.B., Haranjo, V., Mangold, A.J., Thompson, C., Estrada-Péria, A., Guglielmone, A.A., Jongejan, F., de la Fuente, J., 2009. Allopatricia speciation in ticks: genetic and reproductive divergence between geographic strains of *Rhipicephalus (Boophilus) microplus*. BMC Evol. Biol. 9 (1), 1-12. https://doi.org/10.1186/1471-2148-9-46.

Météo France, 2020. Météo Nouvelle-Calédonie - Bulletins Climatiques [WWW Document]. http://www.meteo.nc/nouvelle-calédonie/dimat/bulletins-climatiques (accessed 6.16.20).

Naves, M., Hül, T., Camoin, M., 2016. Evaluation of infestation level of cattle by the tick *Rhipicephalus microplus* in New Caledonia. In: Annual Meeting of the Caribbean Food Crops Society (CFC5), Caribbean Food Crops Society, Caribbean FoodCrops Society Proceedings.

Nicarreta, J.E., dos Santos, J.B., Couto, L.F.M., Heller, L.M., Cravinel, L.B., de Mélo Junior, R.D., Assis de Cavalcante, A.S., Zapa, D.M.B., Pereira, L.L., Oliveira de Monteiro, C.M., Soares, V.E., Lopes, W.D.Z., 2020. Evaluation of rotational grazing as a control strategy for *Rhipicephalus microplus* in a tropical region. Res. Vet. Sci. 131, 92-97.

Pereira, D.F.S., Ribeiro, H.S., Gonçalves, A.A.M., da Silva, A.V., Lait, D.F. de Oliveira, D. S., Giunchetti, R.C., 2022. Rhipicephalus microplus: an overview of vaccine antigens against the cattle tick. Ticks Tick-borne Dis. 13 (1), 101828.

Pérez de León, A.A., Ted, P.D., Li, A., Ponnasamy, L., Roe, R.M., 2014. Advancing integrated tick management to mitigate burden of tick-borne diseases. Outlooks Pest Manage 25, 382-389.

Pete, R.J., Van den Bosseke, P., Penzhor, B.I., Sharp, B., 2005. Tick, fly, and mosquito control - lessons from the past, solutions for the future. Vet. Parasitol. 132 (3-4), 205-215. https://doi.org/10.1016/j.vetpar.2005.07.004.

Petermann, J., Caquil, L., Hurlin, J.C., Gaia, H., Hül, T., 2016. Survey of cattle tick, *Rhipicephalus (Boophilus) microplus*, resistance to amitraz and detamethrin in New Caledonia. Vet. Parasitol. 217, 64-70.

R Core, 2020. A Language and Environment for Statistical Computing.

Redondo, M., Fragoso, H., Otiz, M., Montero, C., Lona, J., Medelín, J.A., Fria, R., Hernandez, V., Franco, R., Machado, H., Rodríguez, M., de la Fuente, J., 1999. Integrated control of acaricide-resistant *Boophilus microplus* populations on grazing cattle in Mexico using vaccination with Gavac™ and amidine treatments. Exp. Appl. Acarol. 23, 841-849.

Rodríguez Valle, M., Mendez-Perez, I., Valdez, M., Redondo, M., Montero, C., Vargas, M., Leonart, R., Burrios, H., Seoane, G., Ramírez, E., Boué, O., Vigil, J., Machado, H., Borrego, C., Píneiro, M., 2004. Integrated control of *Boophilus microplus* ticks in Cuba based on vaccination with the anti-tick vaccine Gavac™. Exp. Appl. Acarol. 34 (3-4), 375-382.

Rodríguez, M., Massard, C.L., da Fonseca, A.H., Ramos, N.F., Machado, H., Labarta, V., de la Fuente, J., 1995a. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of *Boophilus microplus* in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine 13, 1804-1808.

Rodríguez, M., Penichet, M.L., Morris, A.E., Labarta, V., Lorenzo Luanes, I., Rubiera, R., Cordoves, C., Sánchez, P.A., Ramos, E., Soto, A., Canales, M., Palenzada, D., Triguero, A., Leonart, R., Herrera, I., de la Fuente, J., 1995b. Control of *Boophilus microplus* populations in grazing cattle vaccinated with a recombinant Bm86 antigen preparation. Vet. Parasitol. 57, 339-349.

Rodríguez-Vivas, R.I., Jonsson, N.N., Bhushan, C., 2018. Strategies for the control of *Rhipicephalus microplus* ticks in a world of conventional acaricide and macrocytic lactone resistance. Parasitol. Res. 117, 3-29.

Salas, M., Corniaux, C., Desvals, L., Dulieu, D., Grimaud, P., Houchot, A., Toutain, B., 1994. Caractéristiques et Valeurs Alimentaires des Fourages de Nouvelle-Calédonie. CIRAD-EMVT, Montpellier.

Suarez, M., Rubi, J., Perez, D., Cordova, V., Salazar, Y.D.P., 2016. High impact and effectiveness of Gavac™ vaccine in the national program for control of bovine ticks *Rhipicephalus microplus* in Venezuela. Livest. Sci. 187, 48-52.

Sutherst, R.W., Kerr, J.D., Maywald, G.F., Stegeman, D.A., 1983. The effect of season and nutrition on the resistance of cattle to the tick *Boophilus microplus*. Aust. J. Agric. Res. 34, 329-339.

Vargas, M., Montero, C., Sánchez, D., Pérez, D., Valdés, M., Alfonso, A., Joglar, M., Machado, H., Rodríguez, E., Méndez, L., Leonart, R., Suárez, M., Fernández, E.,
Extrada, M.P., Rodríguez-Mallón, A., Farnós, O., 2010. Two initial vaccinations with the Bm86-based Gavaclus vaccine against *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* induce similar reproductive suppression to three initial vaccinations under production conditions. BMC Vet. Res. 6, 43.

Wang, H.H., Ted, P.D., Grant, W.E., Soltero, F., Urdaz, J., Perez-Ramirez, A.E., Miller, R. J., Perez de Leon, A.A., 2019. Simulation tools for assessment of tick suppression treatments of *Rhipicephalus (Boophilus) microplus* on non-lactating dairy cattle in Puerto Rico. Parasite Vector. 12, 1-9.

Wharton, R.H., Harley, K.L.S., Wilkinson, P.R., Utech, K.B.W., Kedley, B.M., 1969.
Comparison of cattle tick control by pasture spreading, planned dipping, and tick-
resistant cattle. Aust. J. Agric. Res. 20, 783-797. https://doi.org/10.1071/
ar9690783

Wilkinson, P.R., 1964. Pasture spelling as a control measure for cattle ticks in southern Queensland. Aust. J. Agric. Res. 15, 822-840. https://doi.org/10.1071/ar9640822.

Willadsen, P., Bird, P., Cobon, G.S., Hungerford, J., 1995. Commercialisation of a recombinant vaccine against *Boophilus microplus*. Parasitology 110, 543-550.
# CHAPITRE V – CONCLUSION - Apports de nos travaux dans le contrôle de la tique R. australis

Les questions de recherche qui sous-tendaient ce travail portaient sur :

- le développement des résistances aux acaricides et la situation actuelle en Nouvelle-Calédonie,

- l'impact d'une nouvelle méthode de gestion des pâturages et des troupeaux sur le nombre de traitements acaricides,

- l'impact d'un vaccin sur les capacités de reproduction de la tique en conditions contrôlées puis sur la réduction du nombre de traitements acaricides dans les élevages.

## 1. Développement des résistances aux acaricides

Les travaux menés au cours de nos recherches ont montré l'apparition et l'extension de la résistance à l'amitraze au fur et à mesure de son utilisation. Les tests de résistance vis-à-vis de la deltaméthrine indiquent qu'une réversion de la résistance est envisageable après l'arrêt de l'utilisation de cet acaricide mais les observations en élevage suggèrent que cette résistance revient très rapidement dès qu'on utilise à nouveau cette molécule. L'usage exclusif d'acaricides ne semble ainsi pas être une approche durable pour la gestion de la tique du bétail et il est nécessaire de mettre en place une lutte intégrée pour son contrôle.

## 2. Gestion des pâturages et des troupeaux

Un apport majeur de nos travaux porte sur le développement d'une nouvelle méthode de gestion des pâturages et des troupeaux permettant de réduire le nombre de traitements acaricides, tout en optimisant la gestion de la ressource fourragère.

Les outils développés dans le cadre de ce travail permettent de savoir comment gérer une parcelle en fonction de la présence ou non de larves de tiques. L'analyse des pratiques de l'éleveur permet d'identifier quels sont les points critiques à l'origine de possibles infestations parasitaires des animaux et donc de définir un plan de lutte adapté à chaque exploitation. Les résultats obtenus permettent également d'améliorer les connaissances sur l'utilisation des traitements acaricides, qui restent nécessaires. En utilisant les acaricides rémanents au moment opportun, combinés à des rotations appropriées, leurs effets se trouvent optimisés et les délais entre l'application d'un traitement rémanent et le traitement acaricide suivant augmentent de façon significative.
Un bénéfice important de cette méthode est le changement de regard des éleveurs sur les infestations parasitaires. À partir du moment où ils comprennent comment les populations de tiques évoluent dans et entre les parcelles, d'où viennent les tiques qu'ils observent sur leurs animaux, et quelles seront les conséquences de la présence de ces tiques sur la gestion des parcelles, les éleveurs passent d'un statut d'observateur à un statut d'acteur dans la gestion des infestations parasitaires sur leurs exploitations.
Jusqu'à présent, ils traitaient – le plus souvent dans l'urgence – lorsqu'ils observaient des tiques et par conséquent les animaux étaient déjà infestés et les pâturages contaminés.

Cette méthode est innovante. Elle a été développée dans les conditions de conduite d'élevage propres à la Nouvelle-Calédonie. Elle n'est sans doute pas transposable en l'état à d'autres contextes d'élevage, y compris en contexte tropical. Cependant, son principe repose sur la connaissance de la biologie et de l'écologie de la tique pour définir des préconisations et ces recommandations peuvent très bien évoluer pour s'adapter à de nouvelles pratiques d'élevage. La méthode développée vise à réduire la population de tiques à un niveau suffisamment faible pour ne pas entrainer de pertes zootechniques mais elle ne vise pas l'éradication des tiques. Une surveillance constante des animaux est toujours requise pour éviter une augmentation des infestations, à la faveur par exemple de conditions climatiques favorables ou d'une erreur de management. C'est pourquoi il était intéressant de développer un vaccin pour réduire les populations de tiques dans les pâturages.

### 3. Vaccin

Les résultats obtenus lors du développement du vaccin à partir de souches de tiques locales ont permis :

- d'identifier un mode de production de la protéine vaccinale permettant d'avoir des rendements intéressants pour un usage en Nouvelle-Calédonie,

- d'identifier un adjuvant favorisant la réponse immunitaire et limitant les effets secondaires,

- d'évaluer l'impact de ce vaccin sur différents paramètres de développement et de reproduction de cette tique, et de calculer l'efficacité globale de ce vaccin en conditions contrôlées,

- d'évaluer la réduction du nombre de traitements acaricides lorsque la vaccination est utilisée dans les élevages.

Les résultats de l'essai en conditions l'élevage nous permettent avant tout d'indiquer que ce vaccin peut s'intégrer aux autres méthodes de lutte contre la tique et qu'il est à présent possible de continuer à élever des races sensibles à la tique en ayant recours à un nombre restreint de traitements acaricides annuels. En effet, autant Pereira et al. (2022) recensent une trentaine d'essais de candidats vaccins
réalisés sur des animaux en conditions contrôlées, autant, à notre connaissance, peu d'essais en conditions d'élevage ont été effectués pour valider l'efficacité de ces vaccins (de la Fuente et al., 1998; Redondo et al., 1999; García-García et al., 2000; Rodriguez Valle et al., 2004; de la Fuente et al., 2007; Domínguez García et al., 2016; Suarez et al., 2016). Malgré des variations en termes de nombre et de race d'animaux, de durée ou de protocole vaccinal, toutes ces études montrent l'intérêt d'utiliser la vaccination pour lutter contre cette tique.

Ce vaccin agissant sur les capacités de reproduction des tiques, il est réaliste d'espérer que l'effet observé à la fin de cet essai continue à s'accentuer au fur et à mesure des rappels vaccinaux. Rodriguez Valle et al. (2004) ont ainsi relevé une réduction de 87% des traitements acaricides au bout de 8 années de vaccination.

## 4. Intérêt de la lutte intégrée

À l'issue de l'essai en conditions d'élevage, c'est un programme de lutte intégrée associant l'usage de la vaccination avec des mesures de lutte agronomique et un usage raisonné des traitements acaricides qui a été développé. Les résultats obtenus permettent d'indiquer qu'il est aujourd'hui possible d'élever des bovins de races sensibles à la tique du bétail en Nouvelle-Calédonie en ayant recours à un nombre restreint de traitements acaricides. Ce résultat est d'autant plus intéressant qu'à notre connaissance, la mise en place d'un tel programme de lutte est novatrice. En effet, différentes revues ont été publiées portant sur les méthodes de lutte, utilisées seules ou combinées entre elles, contre les tiques (Jonsson, 2004; Peter et al., 2005; Ghosh et al., 2007; Pérez de León et al., 2014; Rodriguez-Vivas et al., 2018) et des modèles mathématiques existent pour estimer l'impact des différentes approches (Floyd et al., 1995; Beugnet et al., 1998; Wang et al., 2019). Des études présentent l'effet des rotations et des mises en défens des parcelles associées aux traitements chimiques (Wilkinson, 1964; Wharton et al., 1969; Nicaretta et al., 2020). D'autres publications mesurent l'impact du vaccin contre les tiques combiné aux traitements acaricides (de la Fuente et al., 2007; Cunha et al., 2013; Suarez et al., 2016). Toutes ces études mettent en avant l'importance de diversifier les méthodes de lutte pour ne plus faire reposer le contrôle des infestations parasitaires sur les seuls acaricides dans un contexte de développement de résistance à ces produits. Cependant, à notre connaissance, l'association du vaccin avec des mesures agropastorales n'avait jamais été évaluée et publiée.

Les méthodes de lutte agronomique, acaricide, et vaccinale sont complémentaires. La lutte agronomique vise à limiter le contact entre les tiques et les bovins pour réduire les infestations parasitaires. Le vaccin réduit les capacités de reproduction des tiques ce qui va diminuer la
contamination des pâturages. Ceci permet de réduire le nombre de traitements acaricides comme
nous l'avons démontré.

5. Conclusions et perspectives

5.1 Bilan de nos travaux

Le développement d'une nouvelle méthode de lutte intégrée a apporté une solution efficace aux éleveurs pour lutter contre les tiques. Le volet agronomique permet par ailleurs une amélioration de la gestion fourragère de leur exploitation. La méthode a été transférée aux services techniques mais elle n'est pas encore aujourd'hui pleinement déployée dans les élevages. En effet, cette méthode nécessite une bonne compréhension de la biologie et de l'écologie de la tique et demande ainsi un accompagnement technique important, le temps que les éleveurs s'approprient le concept et mettent en place les mesures.

Les recherches réalisées sur la vaccination ont apporté des avancées scientifiques importantes dans le cadre de la lutte contre la tique. Le développement du vaccin a apporté une solution concrète pour les éleveurs et même si des publications sont été faites sur cet outil depuis plus de trente ans, les études que nous avons menées apportent des éléments nouveaux sur l'utilisation d'une protéine vaccinale directement issue des populations locales de tiques, sur l'évaluation de différents adjuvants et sur son usage en conditions d'élevage.

Nous sommes aujourd'hui à la croisée des chemins entre la fin de la phase de recherche et la possibilité
de proposer un vaccin « commercial » aux éleveurs. Comme de nombreuses recherches menées sur
l'identification de candidats vaccins, les résultats en conditions contrôlées ou en conditions d'élevage
montrent une efficacité intéressante mais il n'existe pas (encore) d'appropriation par l'industrie
pharmaceutique et seuls quelques pays, comme Cuba ou le Mexique, commercialisent un vaccin.
Plusieurs hypothèses peuvent expliquer cette situation. D'un point de vue économique, le marché des
acaricides est considérable et il est commercialement plus attractif que celui des vaccins (de la Fuente
et Estrada-Peña, 2019). D'un point de vue industriel, la formulation et la production d'un vaccin
nécessite un lourd investissement, des contrôles continus des lots, et un enregistrement spécifique.
Un vaccin adapté à chaque souche régionale de tique serait comme un nouveau produit, nécessitant
chaque fois des essais expérimentaux, de terrain, et un enregistrement spécifique. Seul un vaccin a
efficacité « globale » pourrait être viable industriellement. Le vaccin n'empêche pas les tiques de se
fixer, des tiques sont toujours visibles sur les animaux vaccinés et il faut attendre plusieurs mois pour
commencer à voir un effet. Dans tous les cas, l'éleveur devra continuer à utiliser des acaricides. Si
l'éleveur ne dispose pas d'un bon encadrement technique, il vaccinera une, deux voire trois fois mais
voyant toujours des tiques sur ces animaux, il pourrait se décourager et arrêter.

Le développement commercial de ce vaccin est à ce stade confronté à plusieurs difficultés. La protéine est jusqu'à présente produite dans un laboratoire de recherche de l'université du Queensland. De ce fait, la production de la protéine dans le cadre de notre projet de recherche se fait à petite échelle, sans que tous les frais inhérents au développement soient répercutés sur le tarif facturé. Le changement d'échelle, ou industrialisation, représente une difficulté majeure comme indiquée dans le paragraphe précédent, incluant les volets juridiques (patentes), développement, essais à grande échelle suivant les « guidelines » d'enregistrement, processus d'enregistrement auprès d'une agence du médicament (par exemple Australienne), production et contrôle de lots.... En concertation avec les partenaires locaux, nous avons décidé dans un premier temps de prolonger la phase de recherche mais de l'étendre aux éleveurs qui seraient demandeurs de cette méthode de lutte. En contrepartie, les éleveurs utilisant ce vaccin collecteront des informations, telles que le nombre de traitements acaricides annuels pour que nous puissions continuer à suivre l'évolution des traitements antiparasitaires au cours du temps. La réglementation calédonienne autorise l'usage d'un médicament n'ayant pas d'AMM dans des conditions bien précises, ce qui nous permettra de poursuivre la vaccination le temps d'identifier une solution plus pérenne.

A ce jour, le coût de revient d'une dose vaccinale pour les éleveurs serait de 1000 cfp (8,38 euros). Ce coût peut sembler raisonnable mais il est à mettre en perspective avec la gratuité des acaricides utilisés sur le territoire. Les prochaines recherches devraient porter sur la réduction des coûts de production en essayant de revenir sur une production utilisant la levure *Pichia pastoris* comme milieu de culture.
En espérant obtenir de meilleurs rendements que précédemment grâce à l'amélioration des techniques, ce mode de production s'avèrerait moins coûteux que la production sur *E. coli* car il nécessite moins d'étapes. Des résultats sont attendus en 2022 pour évaluer le coût de revient de ce vaccin produit sur ce milieu de culture. En attendant de résoudre ces différents points, des financements ont été obtenus pour continuer la vaccination dans les 9 élevages initialement impliqués dans l'essai afin d'évaluer l'impact de cet outil jusqu'à la fin de l'année 2022.

Des discussions sont également actuellement en cours avec l'ensemble des départements et territoires d'outre-mer confrontés à ce parasite. Un essai vaccinal devrait démarrer en 2022 en Polynésie française. La mise en commun des demandes des différents territoires ultra-marins permettra peut-être de susciter l'intérêt d'instituts de recherche, tels que le CIRAD et l'INRAE, et des producteurs de vaccins vétérinaires.