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インフルエンザウイルスの運動とその制御

堺 立也, 齊藤峰輝

川崎医科大学微生物学教室

1. はじめに

インフルエンザウイルスは、RNAを遺伝子とする直径100nmほどのエンベロープウイルスである。ウイルスは、エンドサイトーシスを利用して細胞内に侵入し、エンベロープとエンドソーム膜の融合によりウイルス粒子内部のRNAが細胞質に移行することで感染が成立する。ところで感染の場となる上気道では、組織表面の大部分は繊毛に覆われており、繊毛表面ではエンドサイトーシスは起きない。そこで、ウイルスは繊毛の基部やその付近の非繊毛細胞(分泌細胞や免疫系の細胞)といった比較的エンドサイトーシスをよく行う領域(標的部位)へ到達しなければならない。一般にウイルスは、細菌や真核生物が持つような運動能力は持たないとされているが、呼吸器に吸い込まれたインフルエンザウイルスは、どのようにして繊毛に隠された標的部位に到達しているのだろうか。我々は、インフルエンザウイルスがウイルス受容体を次々と交換することで細胞表面を運動する能力を持つことを見出した1), 2)。本稿ではこのインフルエンザウイルスの持つ独自の運動機構について紹介する。

2. 受容体交換を動作原理としたウイルス運動

インフルエンザウイルスに関する我々の報告1), 2) 以前にもウイルスの細胞表面での運動については報告されている。しかし、これらの運動は、ウイルスが結合した受容体分子の運動にともなら受動的な運動である。例えば、ネズミ白血病ウイルス(MLV)やウシ水疱性口内炎ウイルス(VSV)では、細胞の糸状仮足に吸着したウイルスが受容体を介し細胞のアクチンーミオシン系の運動機構により仮足の根元(ウイルスの細胞内侵入に有利な部位)に運ばれる3)。MLVやVSVはしっかりと受容体に結合していれば、受容体の運動により標的部位に到達できると考えられる。しかし、このような受容体の運動を利用するにはインフルエンザウイルスと受容体の結合は極めて弱い。

インフルエンザウイルスと受容体との弱い結合は別

のタイプの運動を引き起こす可能性がある1)。インフルエンザウイルスのスパイクタンパク質のひとつであるヘマグルチニン(HA)は、ウイルス受容体であるシアロ糖鎖と結合する。HAとシアロ糖鎖との結合は、解離定数(Kd)がmMオーダーと極めて弱い。ちなみに、同じエンベロープウイルスであるVSVやセムリキ森林ウイルスの受容体結合タンパク質のKdは10nMオーダーである。つまり、これらの結合タンパク質に比べHAの結合は10万(10⁵)倍ほど解離しやすい。ウイルスが標的部位まで移動するあいだ(おそらく数分間), HAが受容体に結合したままでいることは難しいだろう。実際,原子間力顕微鏡を使った測定では, HAとシアロ糖鎖の結合は1秒間ほどしか維持されなかった4)。見方を変えると, インフルエンザウイルスが細胞膜へ吸着し続けるには、複数のHA-受容体結合が必要であり、個々のHAと受容体分子は常に結合と解離を繰り返している。我々は, HAと受容体の結合と解離の繰り返しが、ウイルスの運動を生み出すと考えている。

複数のHAと受容体の結合・解離の繰り返しは、ウイルス粒子全体ではHAと受容体の結合の組み合わせを入れ替え(受容体交換を起こし), その結果ウイルスの運動を生じさせる(仮説1, 図1A)。

さらにインフルエンザウイルスのもうひとつのスパイクタンパク質であるノイラミニダーゼ(NA)は、運動方向を制御する。NAはシアロ糖鎖の分解酵素である。ウイルス粒子が過去にいた場所の受容体をNAが破壊していれば、ウイルスは後戻りしづらくなり、常に新しい場所へと移動する(方向性を持って運動する)のではないかだろうか(仮説2, 図1B)。インフルエンザウイルスが、わずか2種類のタンパク質を使い、原始的とはいえない運動や運動方向の制御という生物らしい振る舞いをしているとすれば大変面白い。我々は、この2つの仮説を検証するため、シアロ糖タンパク質を固定したガラス表面を作製し、この表面でのウイルス粒子の運動を観察した。
<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>図1 ウイルス運動の仮説。(A) 受容体交換によりウイルスはランダムに運動する。◀は次にHAと結合する受容体。(B) NAの受容体破壊により運動に方向性が生じる。</figcaption></figure>

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>図2 フェツイン固定化表面でのA型インフルエンザウイルスの運動。(A) 蛍光標識したウイルス(白い粒子)の運動. 左上の数字は時間(秒). 右下のスケールバーは1µm. 線縁はウイルスの軌跡。(B) ウイルス3粒子の軌跡. 観測開始時点のウイルスの位置を原点とし、1秒毎のウイルスの位置をプロットした。Inset は NA 阻害剤存在下でのウイルス (3粒子)の軌跡。(C) ウイルスの軌跡から計算したMSD (赤のプロット). 青線は、並進拡散の理論式($<r^2>=4Dt$, $<r^2>:MSD$; D:拡散係数; t:時間). 文献1の図(Licensed under CC BY 4.0) を改変して掲載した。</figcaption></figure>

### 3. 受容体交換によるA型ウイルスの運動

A型インフルエンザウイルスは、受容体交換により運動する1)。受容体となるフェツインを固定したガラス表面で、A型インフルエンザウイルスが運動するのが観察された(図2A, B)。受容体分子は物理的吸着によりガラス表面に固定されて動かないので、観察されたウイルス運動は受容体の運動にともなう受動的なものではなく、受容体交換によるものと考えられる。またこの運動は、NA阻害剤によって完全に抑制された(図2B inset)。NAによる受容体破壊がない状況(NA阻害剤存在下)では、同じHAと受容体分子どうしが結合と解離を繰り返すのみで、ウイルス粒子全体では結合の組み合わせがあまり変わらない(受容体交換が起きない)ためウイルス運動が生じない。一方、NA活性が正常であれば、一時的にHAから解離した受容体をNAが破壊することで強制的な受容体交換が起き、ウイルス運動が発生するのであろう。とこ

ろで、多数のウイルス粒子に対し、測定開始地点からの変位を測定し、その2乗平均(mean square displacement; MSD)を取ると、MSDは時間($t$)に比例した。これはウイルス運動が2次元のランダムな運動(並進拡散)であることを意味する(図2C)。つまり、HAの受容体交換によるウイルス運動(仮説1)は立証され、さらにNAの強制的受容体交換による運動発生機構も明らかになったが、NAの受容体破壊による運動方向の制御(仮説2)は、A型インフルエンザウイルスにおいて否定されたことになる。

### 4. 受容体破壊によるC型ウイルスの運動制御

C型インフルエンザウイルスは、受容体破壊により運動方向を制御する2)。C型ウイルスには、NAが存在しないが、NA同様の受容体分解活性を持つエステラーゼ (ES) が存在する。また受容体となるシロ糖鎖の種類(構造)もA型やB型ウイルスの受容体とは異なる。さらにC型ウイルスの形態的特徴として細長い繊維状の形態を取る。C型ウイルスの受容体となるムチンを固定したガラス表面で、C型ウイルスが運動することが観察された。特に繊維状C型ウイルスは、長軸に垂直な方向を維持して運動し、その速度も一定であった(図3A)。次に、MSDによる運動解析を行った。ウイルスの運動が一直線の場合MSDは時間の2乗($t^2$)に比例し、ランダムウォークであれ

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>図3 ムチン固定化表面でのC型インフルエンザウイルスの運動。(A) 繊維状ウイルス(黒い棒状の物体)の直進性の高い運動。(左) 同一のウイルスの30秒毎の画像を重ね合わせて表示した。赤の→は運動方向。ウイルスの像が等間隔なのは一定速度で運動していることを示す。(右) 同一のウイルスの15秒毎の画像を重ね合わせて表示した。青の→は運動方向。◀はウイルスが方向転換した位置。スケールバーは1µm。(B) 繊維状および球状ウイルスのMSD (両対数プロット)。MSDは赤のプロット、長軸の長さが0.5 µm 以上のウイルスを繊維状、直径0.3 µm以下のものを球状ウイルスとした。文献2の図(Licensed under CC BY 4.0)を改変して掲載した。</figcaption></figure>
ば1乗($t^1$)に比例する. 繊維状C型ウイルスのMSDは、時間の$t^{1.7}$に比例し、運動の直進性が高いことが定量的にも示された(図3B). これらの結果は、繊維状C型ウイルスが、ESによる受容体破壊により運動方向を制御していることを示している。

C型ウイルスの繊維状形態は、直進運動の維持に寄与する。一般にインフルエンザウイルスは、多形態性を持つと言われており、直径0.1~0.2 µmの球状や0.2~数µmの繊維状の形態を取る。C型ウイルスも多形態であり、比較的多くのウイルス粒子が繊維状であるが、球状の粒子も存在する。球状C型ウイルスのMSDを調べたところ、ウイルスの追跡開始直後のMSDは時間的$t^{1.7}$に比例するが、約50秒以降は$t^{1.0}$に比例するようになる(図3B)。これは、球状C型ウイルスが50秒前後で運動パターンを切り替えるのではなく、はじめは直進に近い運動を行うウイルスが、方向転換を繰り返すことで運動方向が徐々にランダム化され最終的にランダム運動になるものと考えられる。逆に、繊維状C型ウイルスでは直進運動が50秒以降も続くことから、繊維状の形態は直進運動の維持に寄与すると考えられる。一方、直進運動の発生は、C型ウイルスのES活性に基づくと思われる。ただし、A型ウイルスではNA活性が存在しても直進運動にはならないことから、受容体破壊活性と直進運動の発生の関係の詳細は不明である。しかし少なくとも運動方向の制御にウイルス形態や受容体破壊活性など複数の要因が寄与していることは明らかになった。

## 5. ウイルス運動におけるエネルギー変換

インフルエンザウイルスの運動のエネルギーはどこから供給されるのだろうか。受容体交換によるウイルス運動の直接の動力は、ブラウン運動と同じ水分子の衝突であろう。しかし、水分子の衝突は全方向から受けるので、繊維状C型ウイルスが方向性を持った運動をするためには別のエネルギー源や何らかのメカニズムが必要になる。我々は、ESによる分解で開放されるシアロ糖鎖の化学結合のエネルギーが最終的に方向性を持ったウイルス運動へと変換されると考えている。ESによるシアロ糖鎖(受容体)の破壊は、繊維状ウイルスの前後での受容体の表面密度の差を生じる。ウイルスの進行方向前方では、まだESによる破壊を受けておらず受容体密度が高いため、ウイルスは多くのHA-受容体結合を形成でき安定に存在できる。逆に後方ではESによる破壊で受容体密度が低下しているため、形成できるHA-受容体結合の数が少なく不安定である。つまりウイルスにとって自身の前後に

ポテンシャルエネルギーの勾配が存在していることになり、ウイルスはエネルギー勾配を下って運動する結果、直進運動となる。このインフルエンザウイルス独自のメカノメキカルカップリング機構において、ESは化学結合エネルギーからポテンシャルエネルギー勾配の形成への、HAはポテンシャルエネルギー勾配からウイルスの直進運動へのエネルギー変換装置と言えよう。一方、ランダムな運動を行うA型ウイルスでは、NAとHAのエネルギー変換がうまくリンクしていないと考えられるが、その原因については明らかでない。

## 6. おわりに

本稿では、インフルエンザウイルスの運動のメカニズムについて動作原理や制御方法あるいはエネルギー変換の観点から解説した。受容体との結合や受容体の分解といった単純な機能しか持たないわずか2種類のタンパク質を、ウイルスという微小なシステムに組み込むだけで、運動やその制御といった高次の機能を獲得するというインフルエンザウイルスの巧妙さや、後戻りしないことで効率的に目的地に達するという少し生物らしい特徴をお伝えできたのであれば幸いである。

最後に、本稿の内容は我々の論文<sup>1), 2)</sup> (2報ともオープンアクセス) から抜粋したものである。詳しい内容をお知りになりたい方は、ぜひ論文をご覧いただきたい(ウイルスが動く様子も動画で閲覧可能)。

## 文献

1) Sakai, T. et al. (2017) Sci. Rep. 7, 45043. DOI: 10.1038/srep45043.

2) Sakai, T. et al. (2018) J. Virol. 92, e01522-17. DOI: 10.1128/JVI.01522-17.

3) Lehmann, M. J. et al. (2005) J. Cell Biol. 170, 317-325. DOI: 10.1083/jcb.200503059.

4) Sieben, C. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 13626-13631. DOI: 10.1073/pnas.1120265109.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>堺 立也 (さかい たつや)</figcaption></figure>

川崎医科大学微生物学教室講師

1991年京都大学大学院理学研究科博士課程修了、博士(理学)。科学技術庁科学技術特別研究員などを経て、1998年川崎医科大学助手、2014年より現職。

研究内容:ウイルス行動科学

連絡先:〒701-0192 岡山県倉敷市松島577
E-mail: sakai@med.kawasaki-m.ac.jp

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>齊藤峰輝 (さいとう みねき)</figcaption></figure>

川崎医科大学微生物学教室教授

1991年鹿児島大学医学部医学科卒業、1995年同大学院医学研究科博士課程修了、博士(医学)。Imperial College London ポスドク、琉球大学大学院医学研究科准教授などを経て、2012年より現職。

研究内容:神経ウイルス学, 神経免疫学

連絡先:同上
E-mail: mineki@med.kawasaki-m.ac.jp