# Tips & Tricks pour analyser un Hydrogel en CRYO MEB

C. Blavignac<fnref n="1" />, A. Bonnotte<fnref n="2" />, A. Canette<fnref n="3" />, A. Carvalho<fnref n="4" />, D. Goux<fnref n="5" />, R. Mallet<fnref n="6" />, B. Payré<fnref n="7" />, C. Rose<fnref n="8" />, M. Schmutz<fnref n="4" />, I. Svahn<fnref n="9" />

## Objectifs & Contexte

### Caractériser par CRYO MEB un Hydrogel Fmoc FFpY (tripeptides) assemblé en fibres par action d'une alkalyne phosphatase

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Fmoc-FFpY</figcaption></figure>

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Fmoc-FFY
Criado-Gonzalez et al.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

## 3 Techniques de congélation testées

**Azote pâteux** : sur rivet ou navette double plaquette

**Congélation Ethane liquide** : sur rivet

**Congélation Haute Pression** : - Cupule 3mm

- Cupule « cryofracture » Leica

- Cupule « clip » Leica

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<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Quorum, ref 26658

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

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Leica, ref 16771874

## Sublimation & Métallisation
### Paramètres MEB

**Sublimation** : -90°C de 0 à 7min

**Sans métallisation** : « taille réelle » des fibres, ✖ d'artéfacts, temps de sublimation ajustable

**Métallisation après cryofracture** : **Ebeam** : Pt 4nm
**Sputtering** : Cr 2nm ou Pt 10'' à 2' à 10mA

**Avec métallisation** : **meilleur rapport S/B, stabilisation des fibres**
**Ebeam** : **pas d'entrée de gaz (HV) et taille de grains faible**
**Sputtering** : **facilité et rapidité, taille de grains + ↗, métal dépendant**

**Paramètres MEB** : T°: -150°C platine et -170°C anti contaminateur

**HT** : 0,79kV à 5kV **Courant de sonde** : 16 pA à 10µA

**Détecteurs** : en chambre (SE) ou en colonne (SE, BSE)

**Détecteurs en colonne SE** : **résolution ↗ à faible DT mais sensible aux charges**

**BSE** : - sensible aux charges

## Navettes & Cryofracture

**Cannes de transfert**

**Quorum**

**Leica**

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Navettes**

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

Quorum, ref 13054

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

Payré et al, 2018

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Leica, VCT 100 Shuttle

**Cryo Fracture** : Couteau parallèle ou Scalpel

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Congélation N2 pâteux - rivet - scalpel</figcaption></figure>

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Congélation HPF - carrier - scalpel</figcaption></figure>

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>CRYO MEB Fibres ≈ 10nm
Sans métallisation</figcaption></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>CRYO MEB Fibres ≈ 14nm
Sputtering Cr 2 nm</figcaption></figure>

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>CRYO MEB Fibres ≈ 13nm
Ebeam Pt 4 nm</figcaption></figure>

100 nm

EHT = 0.790 kV

Noise Reduction = Drift Comp. Frame Int. Busy

Mag = 100.00 K X

WD = 2.2 mm

Signal A = InLens

Width = 1.143 µm

Image Pixel Size = 1.117 nm

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

11 May 2023
INSTITUT DE
BIOLOGIE
D'INSERM

100 nm

EHT = 0.790 kV

Noise Reduction = Drift Comp. Frame Int. Busy

Mag = 100.00 K X

WD = 2.1 mm

Signal A = InLens

Width = 1.143 µm

100 nm

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

11 May 2023
INSTITUT DE
BIOLOGIE
D'INSERM

100 nm

EHT = 0.790 kV

Noise Reduction = Drift Comp. Frame Int. Busy Mag = 100.00 K X

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

11 May 2023
INSTITUT DE
BIOLOGIE
D'INSERM

WD = 2.1 mm

Signal A = InLens

Width = 1.143 µm

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

11 May 2023
INSTITUT DE
BIOLOGIE
D'INSERM

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

## Repérer les Artéfacts

**Mauvaise congélation** -> Glaces hexagonales

**Sublimation trop ↗** -> Fibres collapsées

**Métallisation trop ↗** -> Pt visible, épaississement des fibres

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

## Take Home Message

**CONGÉLATION HAUTE PRESSION OU ÉTHANE**

**MÉTALLISATION NON OBLIGATOIRE**

**FAIBLE HT ET COURANT DE SONDE**

**DÉTECTEURS EN COLONNE**

**ATTENTION AUX ARTÉFACTS !**

<footnote n="1">¹ Université Clermont Auvergne, Centre Imagerie Cellulaire Santé (CICS), Clermont-Ferrand, France</footnote>

<footnote n="2">² Université de Bourgogne, Plateforme DImaCell, UMR Agroécologie, INRAE, L'Institut Agro Dijon, Dijon, France</footnote>

<footnote n="3">³ Sorbonne Université, CNRS, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Service de Microscopie Électronique (IBPS-SME), Paris, France</footnote>

<footnote n="4">⁴ Institut Charles Sadron, Plateforme Microscopies - PLAMICS, Strasbourg, France</footnote>

<footnote n="5">⁵ Normandie Université, UNICAEN, CMAbio3 (Centre de Microscopie Appliquée à la Biologie), US EMerode, Caen, France</footnote>

<footnote n="6">⁶ Université d'Angers, Institut de Biologie en Santé, Service commun d'imageries et d'analyses microscopiques (SCIAM), Angers, France</footnote>

<footnote n="7">⁷ Faculté de Santé de Toulouse, Université Paul Sabatier, CMEAB Centre de Microscopie Électronique Appliquée à la Biologie, Toulouse, France</footnote>

<footnote n="8">⁸ Université de Lorraine, Plateforme SILVATECH, Pôle Imagerie et Mesures Multi-Modales (I3M), INRAE, Nancy, France</footnote>

<footnote n="9">⁹ Université de Bordeaux, Bordeaux Imaging Center, Imagerie Electronique, UAR 3420 CNRS/UB - US4 INSERM, Bordeaux, France</footnote>