系IIコアアンチナクロロフィル蛋白質の平膜内分子配列構造

古賀淑哲 坂上作光・西本哲子・山下昭二

(九工研　九大異)

高等植物の光合成系は、光エネルギーを有効に利用するために、系Ⅰ、系Ⅱという異なる光反应系を持っている。それぞれの反应系は光反应を担うコア蛋白複合体と、その周辺にある光を捕集するためのアンチナ蛋白質(LHCP)より構成されている。さらに、より高効率化のため、コア蛋白複合体中にも活�中心蛋白質により強く結合したアンチナ蛋白質(系ⅡのCP47、CP43等)が存在する。これらのコアアンチナ蛋白質はLHC Pに比べクロロフィル組成が単純であり(Ch1.aのみ)、活性中心と強く結合していることから膜との親和性が高いと考えられる。人工膜中でもLHCPとは異なる分子配列構造をとること考えられる。

今回、CP47、CP43の平面二分子膜内配列構造について検討する。サンプルの調製は以下の通り行った。ホウレン草より単離したチラコイド膜を、クロロフィルとTriton X100の重量比が1:25となるように調製し可溶化を行った。可溶化したチラコイド膜より、遠心分離を数回繰り返し事により系Ⅱ粒子を単離した。取り出した系Ⅱ粒子にoctylglucopyranosideを1:30となるように加え、クロロフィル濃度を0.5mg/mlに調製し、20分間可溶化を行った。CP47、CP43を単離するために、可溶化した系Ⅱサンプルを電気泳動にかけた。Acrylamide 11%を含む厚さ1cmのゲルに20mlのサンプルをアプライし、60mAの定電流を6時間流して分離を行った。泳動後、分子量の大きい方より順にCPI、LHCP, CP47, CP43, LHCPⅡモノマー、フリーリの色素成分の6本のバドが観察された。このうちCP47、CP43のバドをそれぞれゲルに切り出し、Tris-buffer で抽出したものから、ゲル片を遠心で取り除いた。抽出したサンプルをCellofine GH-25-c カラムに通し、さらに Cephalop CL6B を用い精製した物を最終的な蛋白資料とした。

精製したCP47を用い、リン脂質との混合平面二分子膜を作成した。二分子膜は偏光顕微鏡の直交ニコルでの順側で視野が完全に暗視し、一軸対称性を有することが確認された。コアアンチナ蛋白質の膜内配列構造については当日詳細に報告する。

K. Koga, S. Sakagami, E. Nishimoto, S. Yamashita: Molecular orientation of core(Ⅰ) light harvesting protein in bilayer membrane.

## シウジョウバエ網膜Rab蛋白質のcDNAクローニングと発現

○尾崎浩一、河野明子、+徳永史生 (大阪大・理・生物、+大阪大・理・宇宙地球)

カロチノイド欠乏で飼育したシウジョウバエの視細胞では、オプブンの成熟・輸送が阻害される。GTP-ブロティングの結果、カロチノイド欠乏により低分子量G蛋白質が増加することが見出された。オプブンの細胞内輸送に、小胞輸送系に特異的な低分子量G蛋白質、RAB、が関与する可能性が高いと考えられたので、網膜cDNAからRab遺伝子断片をPCR増幅、クローニングし、その配列を決定した。その結果、Rab蛋白質をコードすると思われた13種のDNA断片を得た。これらのcDNA配列から推定されるアミノ酸配列を、既知のRABの配列と比較したところ、10種は哺乳類RABと80%以上の相同性を示した(DRAB)。残りの3種については、既知のRABとの相同性は低く、RABファミリーの新たなメンバーと考えられた(DRABR)。このうち、その発現量が比較的多いと考えられるDRAB1, DRAB2 (哺乳類RAB1, RAB2に相等)と、哺乳類RABとの相同性の低いDRABR4について、全長cDNAをクローニングし、その塩基配列を決定した。さらに、ノーザンハイブリダイゼーションにより、カロチノイド欠乏でmRNA量が変化するか否かを検討した。その結果、DRAB1, DRAB2では、カロチノイドの有無によるmRNA量の変化が検出されなかったのに対し、DRABR4では網膜および脳においてカロチノイド欠乏によるmRNA量の増加が、DRAB3, DRAB14では、逆に、その減少が観察された。

K. Ozaki, A. Kohno, F. Tokunaga: cDNA cloning and expression of *Drosophila* RAB.

## S-モジュリン蛋白ファミリーの機能とミリスチン酸飾修

○河村 悟、J.A. Cox*、P. Nef* (廣大・医・生理、

*Dept. Biochem., Univ. of Geneva, Switzerland)

視細胞内でロドブシンが光受容と cGMP 濃度が減少し、原形質膜の隔イオンネチラルが閉じて過分極性の視細胞電位が発生する。視細胞に定常的に光が当たると明順性が生じるが、これは、細胞内のCa²⁺ 濃度が減少することにその理由がある。S-モジュリンは暗順時 (高 Ca²⁺ 濃度下)に光活化されたロドブシンの寿命を延ばして視細胞の光感受性を高め、明順時(低 Ca²⁺ 濃度下)には逆にその寿命を短くすることにより視細胞の光感受性を落とす¹⁾。

最近脳に存在するS-モジュリン様蛋白質が相次いで報告されているが、これらの蛋白質は3つのサブファミリーに分類されることが明らかになった。これらのうちS-モジュリンを除くとフリクエンジンで生理作用が明らかにされているのみで、しかも、その作用機構は不明である。そこでこれら蛋白質の生理作用、作用機構を明らかにする目的で、これら蛋白がS-モジュリンと同様にロドブシンのリン酸化をCa²⁺存在下で阻害するか否かを検討した。検討にはそれぞれのサブファミリーから少なくとも1種の蛋白質を選んだ。その結果、何れの蛋白質も生理的なCa²⁺ 濃度でロドブシンのリン酸化を阻害した²⁾。このことから、S-モジュリン蛋白ファミリーは、それぞれの細胞で、受容体のリン酸化をCa²⁺依存的に調節し、刺激受容を調節する機能を有することが強く示された。

上記の実験で用いた蛋白質試料は何れも大腸菌で発現させたものである。天然のS-モジュリン蛋白質ファミリーのN末はミリスチン酸化されているが、大腸菌にはその酵素活性がないため、発現させた蛋白質はミリスチン酸による修飾を受けていない。にもかかわらずずらから蛋白質が天然のもと同様の作用を現わしたことから、これら蛋白質の生理作用に、ミリスチン酸化は関係しないことも同時に示された³⁾。

1) Kawamura, Nature, 362, 855 (1993). 2) Nef et al., submitted.

3) Kawamura et al., submitted.

S. Kawamura, J.A. Cox, P. Nef: S-modulin protein family; its function and myristoylation modification.

## シウジョウバエ視細胞特異的diacylglycerol kinase (rdgA蛋白)の細胞内局在

○铃木未木子(東京・医科研・微細形態)、政井一郎(東・遺伝子)、堀田樹恵(東大・理・物理)

我々はシウジョウバエ視細胞突然変異retinal degeneration Aの解析から、これまでに1)網膜で高い活性を示すdiacylglycerol kinase (DGK)の活性がrdgA遺伝子量に比例すること(文献1)、(2)rdgA遺伝子が既知のDGKの遺伝子(アタDGK、Drosophila DGK)の catalytic domain と高い相同性を示すdomainを含み、その発現は視細胞特異的であること(文献2)を見だし、rdgA遺伝子がシウジョウバエ視細胞固有のDGK(eye-DGK)をコードしていることを明らかにした。一方rdgA突然変異は、光受容膜の変性を始まる視細胞変性をおこすことが知られている。我々はその過程を詳細に調べる事により、光受容膜近傍に存在する滑面小胞体網工(subrhabdomeric cisternae, SRC)が光受容膜変異の初期に消失することを見だした(文献3)。これらの結果から、eye-DGKがSRC膜や光受容膜の構造維持に重要な役割をはたしている可能性が考えられた。そこで今回我々は、eye-DGKの機能とSRCとの関係を明らかにする目的で、その細胞内分布を検討した。rdgA遺伝子の構造から、蛋白分子の親水性部分と考えられるペプチド(15アミノ酸残基)を合成し、これに対するポリクローラル抗体を作製した。この抗体は、ウエスタンブロットでrdgA蛋白の分子量に相当する約110kDaのシングルバンドを検出し、組織染色では視細胞を特異的に染色するがrdgApcn突然変異は染色しないことから、rdgA蛋白を特異的に認識すると考えられた。この抗体を用いてrdgA蛋白の細胞内局在を免疫電顕法で調べたところ、SRCの膜とSRC周辺の細胞質にrdgA蛋白が高濃度に存在することがわかった。網膜DGK活性の90%が、膜結合性であること(文献4)を考えあわせると、今回の結果はeye-DGK活性がSRC膜上に局在することを強く示唆している。rdgA突然変異では、SRC膜上のeye-DGK活性が損し、このこと为何かの過程でSRC膜の崩壊につながると考えられる。

文献: 1.H.Inoue et al. J.Biol.Chem. 264:5996-6000(1989)

2.Masai et al. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:11115-111161(1993)

3.E.Matsumoto et al. Cell Tissue Res. 252:293-300(1988)

4.H.Inoue et al. Biochem.Biophys.Acta. 1122:219-224(1992)

E. Suzuki, I. Masai, Y.Hotta: Subcellular localization of Drosophila photoreceptor-specific diacylglycerol kinase (rdgA protein).
Phototransformation of Pea Phytochrome A
Induces an Increase in α-helical Folding of
the Apoprotein

Lily Deforce,°徳富 哲¹, Pill-Soon Song

(Univ. Nebraska·Dep.Chem,¹基生研)

The photoreversible conformational change
associated with the Pr - Pfr transformation of a dicot
phytochrome A (Pisum sativum, pea) has been probed
by circular dichroism (CD) studies. Three different
CD analysis methods have been used to determine
the secondary structure of pea phytochrome A in
both Pr and Pfr forms. We have shown that the
secondary structure of dicot pea phytochrome is very
similar to the structure of monocot oat phytochrome
A which was determined earlier [Sommer & Song
(1990)]. As with oat phytochrome A, an increase in
the α-helical folding of the apoprotein takes place
when phytochrome in the Pr form is
phototransformed to the Pfr form. This
conformational change might well be a general
characteristic of all phytochrome A's.

L Deforce, S.Tokutomi, P.-S. Song :  
Phototransformation of Pea Phytochrome A Induces  
an Increase in α-helical Folding of the Apoprotein.

Photoactive Yellow Proteinの光反応

°今元 泰、片岡幹雄、徳史生(大阪大・理・宇宙地球科学)

Photoactive Yellow Protein (PYP)は、好塩光合成細菌 *Ectothio-
rhodospira halophila* に見出された色素蛋白質である¹)。PYPは分子量
14KDaの水溶性蛋白質であり、450nm付近に吸収極大波長を持つ。そ
の発色団は決定されていないが、光反応サイクルを示すことから、高度好
塩菌のレチナール蛋白質との関連に関心がもたれている。そこで今回われ
われは、PYPをE. halophila から精製し、その光反応過程を低温分光法
で解析した。

E. halophila を超音波破砕し、水溶性画分を得た。50%酸和疏安下で不
溶性成分を除去し、上清を脱塩した後、DEAEセフロースカラムクロ
マトグラフィーを用いてPYPを単離した。PYPを-80℃で光照射す
ると、長波長シフトした中間体が生成したが、この中間体の吸収スペクト
ルは、液体窒素温度で見いだされた中間体²)よりも短波長側にあり、室温
でマイクロ秒領域で見られる中間体³)に対応するものと考えられる。室温
で見られたこの中間体は、熊反応によって340nmに吸収極大をもつ中間
体に変化した後、ミリ秒領域でもとのPYPに戻ることが報告されている
が、今回低温で生成した中間体からは、340nmの中間体は生成せず、
-40℃以上で直接PYPに変化した。以上のことから、PYPの光反応
サイクルは温度によって大きく影響を受けることが示されたが、これは、
PYPの分子量が小さく、発色団が蛋白質部分で保護されていないため
に、溶媒の状態変化等の影響を受けやすいことが原因であると考えられ
る。
[E. halophila 株を分けていただいた東京都立大・嶋田敬三助教授に感謝
します。]

[E. halophila 株を分けていただいた東京都立大・嶋田敬三助教授に感謝
します。]

1) T. E. Meyer, *Biochim. Biophys. Acta* **806**, 175 (1985)

2) W. D. Hoff et al., *Photochem. Photobiol.* **56**, 529 (1992)

3) T. E. Meyer et al., *Biochemistry* **26**, 418 (1987)

Y. Imamoto, M. Kataoka, F. Tokunaga : Photoreaction of photoactive yellow protein.

アラスカインドウのフィトクロムを経由した光信号伝達の分子機構

浜田敏、○蓮沼仰恵、田中紀史、野口貴文 (横浜市大、木原生研)

竜芽芬アラスカインドウ上転数の第3節間を甩冠して *in vitro* 光信号伝達の解析系を立てた。第3節間を赤色光で0, 10, 50, 100 µmole/m²/secで、40秒間照射した直後に磨砕し、原形質粒を精製し、また可溶性分画を得た。また赤色光(10µmole/m²/sec, 10秒間)照射後、近赤光 (0.4 µmole/m²/sec, 180秒間)照射し、同じ分画を得た。光強度を変えるように[a-³²P]ATP, [a-³²P]GTP, [a-³²P]UTPの結合活性が変動する少なくとも5種類のNTP結合蛋白質が見出した。そのうち92kDa蛋白質は赤色光により[a-³²P]ATPの結合活性の上昇が見られ、近赤外光照射によりその打ち消したが見られた。この反応は特にジフテリア毒素や百日核毒素の存在下で顕著に見られ、フィトクロムを経由する信号を受容すると考えられる。さらにこの系を用いて、リン酸化を原形質粒および可溶性分画において検討した。0℃ 7秒での4×10⁻⁶M (γ-³²P)ATPからの15kDa, 50kDa, 70kDa蛋白質のリン酸化の促進が原形質粒で見られ、可溶性分画では15kDa蛋白質の赤色光照射に依存してリン酸化の促進のみが見られた。両分画における15kDa蛋白質のリン酸化の促進は近赤外光照射により抑制され、フィトクロムから光信号が伝達されると考えられる。ATPを結合する92kDa蛋白質、リン酸化される15kDa蛋白質は粗製分画から可溶化された。これらの蛋白質は約200kDaの分子量を示し、融合体を形成する示唆を得ている。可溶性分画の15kDa蛋白質は約120kDaの分子量を示した。両分画の約15kDa蛋白質は非平衡pHや配電気泳動により、リン酸化の取の相異も含め3分子種が挙げられた。15kDa蛋白質は0.1~1pmole/生重量(第3節間)存在することが判明した。92kDa蛋白質ともに15kDa蛋白質の粗製が進行中である。

T. Hamada, K. Hasunuma, N. Tanaka, T. Noguchi, Analysis of
phytochrome mediated light signal transmission in the stem
section of etiolated pea seedlings.

パクテリオロドブシンの
フェムト秒励起状態ダイナミクスの温度依存性
ー吸収スペクトルのフーリエ変換による解析一
○秋山良、垣谷使昭(名大・理)、今元泰(阪大・理)、
七田芳則(京大・理)、秦野やする世(中京大・情報科学)

パクテリオロドブシンの発色団であるレチナールのcis-trans 光異性化反応は非常に高速で起り、特に励起状態のダイナミクスは、光受容後数百fs以内に完了する事が知られている。本研究においては、78、133、193、233、273Kの五つの温度でパクテリオロドブシンの光吸収スペクトルの測定を行ない、フーリエ変換し、その理論的な解析を行なう事で、フェムト秒領域のダイナミクスの詳細な描像を求めた。

フーリエ変換の結果得られた励起状態の振動の波束の自己相関数(tcf)の絶対値を図1に示す。(ここでは133、233Kは略す。)tcfの絶対値の減少は、温度が高くなるほど速くなっている。また、78Kでは、明確であった27fsのピークは、温度が高くなるにしたがい消えてゆき、193Kでは30fs に極小が見られる。また、78、133Kのtcf には約30fs周期の振動構造が見られるのに対し、233、273Kのものは60fsの振動周期になっている。これらの温度変化は、発色団レチナールのみでは得られないので、蛋白の効果と考えられる。すなわち、フェムト秒領域の非常に速い時間から光異性化反応に蛋白質が関与しているといえる。

これらのtcfの理論的な理解の為に、発色団を独立した調和振動子の集
合とし、それらと蛋白環境の相互作用をブラウン運動的な揺らぎとして

取り入れたモデルで解析し
た。Mathiesらの共鳴マン
散乱データを基に求めたtcfの
振動構造も、全体のdecayの
様子も再現出来なかった。励
起状態の振動構造は、基底状
態の場合と比べ、調和振動子
から大きく変化していると予
想される。

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>図1. 振動の波束の自己相関数の絶対値</figcaption></figure>

R.Akiyama,T.Kakitani,Y.Imamoto,Y.Shichida,Y.Hatano: Temperature Dependence of Femtosecond Excited State Dynamics of Bacteriorhodopsin Analyzed by the Fourier Transform of Optical Absorption Spectra.
ナノ秒時間分解赤外分光によるバクテリオロドブシンの光反応：
KからKLへの運移の観測

○佐々木純¹、湯沢哲朗²、神取秀樹¹、前田章夫¹、滨口宏夫²
(¹京大・理・生物物理、²神奈川科学技術アカデミー)

バクテリオロドブシン (BR) の光サイクルにおいて、発色団の光異性化産物であるK中間体とプロトン放出の前段階であるL中間体の間にKL中間体の存在が見出されている。可視吸収分光によると、KL中間体は数ナノ秒の時定数で生成し、約1マイクロ秒で滅衰するが、K中間体との間のスペクトル変化が小さいため、その存在は必ずしも確定していない。

我々はこれまで、赤外吸収分光によりBRの光サイクルの研究を行った。低温における測定では、77Kでの光反応により生成するK中間体以外に、135KではK中間体とよく似ているが水素面外変角振動が大きく異なる光産物が検出された1)。一方、室温での時間分解赤外分光によるとサマイクロ秒領域に現れる中間体は135Kの光産物によく似ている1)。従って、さらに短い時間領域の赤外吸収測定により、KからLに至る過程の分子構造変化が得られるものと期待された。

今回我々は、分散型赤外分光器による測定系1)に時間分解能の向上したMCT検出器 (装置間数の半値幅: 60 ns) を用い、1400-900 cm⁻¹の領域でのBRフィルムの測定を行った。得られたスペクトルの時間変化を、装置間数を考慮に入れた exponential curve fitting により成分分割したところ、1マイクロ秒の変化成分以外に、10ナノ秒程度の時定数成分が見 itself された。さらに、これらの変化成分は、それぞれ135Kおよび77Kで得られた差スペクトルによく一致した。以上の結果から、ピコ秒からマイクロ秒にかけて、BRの光サイクルはK→KL→Lという中間体の構造変化を伴うものと結論できる。

1) Sasaki et al. (1993) *Biochemistry*, 2867-871.

Jun Sasaki, Tetsuro Yuzawa, Hideki Kandori, Akio Maeda and Hiroo Hamaguchi: Nanosecond Time-Resolved Infrared Spectroscopy on the Photoreaction of Bacteriorhodopsin

## 高度好塩菌紫膜の蛍光分光

○神谷成敏 追田秀策 大谷弘之 石川満 渡口宏夫*

(東大・生命理工 沼松ホトニクス株) (神奈川科学技術アカデミー**)

バクテリオドブシン (bR) は、高度好塩菌の紫膜中に含まれるレチノイドタンパク質である。bRは光を吸収することにより、速い異性化速度 (サブピコ秒オーター)、高い反応量子収率 (0、6)、高い反応遺伝性 (all-trans→13-cis) で光異性化反応し、その後熱反応により一連の中間体を経て元のbRに戻る光化学サイクルを形成する。

紫膜の蛍光には、スペクトル、寿命量に励起光強度依存性やpH依存性があることが知られている。その理由は、紫膜中にはbR568以外にも蛍光種が存在することができである。本研究では、定常光照射の蛍光スペクトル測定と、時間分解蛍光測定を用いて紫膜中の蛍光種の経過を行うことを目的とする。

次に結果を示す。酸性条件では、bR568とO中間体の蛍光が観測された。蓄積したO中間体が光るため、bR568単転の蛍光スペクトルは得られなかった。アルカリ性では、主にbR568とQ中間体の蛍光が観測された。無蛍光性のN中間体はアルカリ性で蓄積するが、その一部が光子を吸うことにより反応し、Q中間体に異なる。Q中間体の蛍光放出は3光子過程であるため、弱い励起光を用いることによりQ中間体の影響のないbR568単転の蛍光スペクトルを測定することができた。中性条件では、bR568、O中間体、Q中間体の蛍光が観測された。詳細をTable 1に示す。

<table><caption>Table 1 紫膜中の蛍光種の特徴</caption><thead><tr><th>蛍光種</th><th>bR568</th><th>O中間体</th><th>Q中間体</th></tr></thead><tbody><tr><td>蛍光寿命</td><td>&lt;1 ps</td><td>17 ps</td><td>56 ps</td></tr><tr><td>極大波長</td><td>756 nm</td><td>755 nm</td><td>&lt;720 nm</td></tr><tr><td>半値幅</td><td>3522 cm<sup>-1</sup></td><td>3404 cm<sup>-1</sup></td><td>3000 cm<sup>-1</sup></td></tr></tbody></table>

N. Kamiya, Y. Sakoda, H. Ohtani, M. Ishikawa and H. Hamaguchi: Fluorescence spectroscopy of the purple membrane of *H. halobium*.

胃膜の紫外共鳴ラマンスペクトル

○橋本慎二、重藤理子、竹内英夫、原田一誠 (東北大・薬)

バクテリオロドブシン (bR) は酸性溶液中で脱イオン化により、プロトネンポール機能のない青膜に変わった。本研究では青膜の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定してそのタンパク部分の構造について調べた。

紫外共鳴ラマン(UVRR)分光法ではタンパク質のTyrやTrp側鎖のバンドを選択的に観測することができる。以前我々は、青膜と紫膜ではTrpのW7ダブプリトの相対強度が逆転して、青膜ではTrp側鎖の環境が顕性的になっていることを示した[1]。今回、bRを重水に應激して、Trp側鎖の重水素化速度を比較したところ、紫膜と比べ青膜ではその速度が速くなっていることがわかった。TrpはbR中に残基含まれ、大きく分類すると、タンパク質表面付近に存在して水分子と比較的接しやすい場所にあると考えられる側鎖と、レチナール結合部位を形成している側鎖がある。紫膜において重水素化速度の遅いTrp側鎖は硃水性のレチナール結合部位を形成しており、色転移にもともないタンパク構造がゆるみ、レチナール結合部位に水分子が侵入しやすくなると考えられる。水のOH伸縮バンドを强度標準として紫膜と脱イオン化により作製した青膜の差スペクトルを測定した結果、Tyr側鎖のY8aバンドの強度増大とY9aバンドの低酸素バンドが観測された。溶液のpHを下げてついた紫膜についても同様の結果が得られた。この差スペクトルは、Tyr側鎖のベンゼン環に対するフェノール性水酸基のコフェメーションが変化したことを示唆し、bR中の解離性アミノ酸側鎖のプロトン化によりTyr側鎖の構造が変化したことを示していると考えられる。Tyr側鎖に関する紫膜一紫膜の差スペクトルはM412とbR588について観測されている差スペクトル[2]と良く似ており、青膜とM412には同じ構造のTyr側鎖があることを示している。bR中にはTyrは11残基含まれているが、この差スペクトルを与えるTyrは同じ側鎖である可能性がある。

1) S. Hashimoto et al., Photochem. Photobiol., 56, 1097(1992)

2) J. B. Ames et al., Biochemistry, 31, 5328(1992)

S. Hashimoto, S. Shigefuji, H. Takeuchi, I. Harada: Ultraviolet resonance Raman spectra of blue membrane.

高温紫膜に存在する青色色素の光反応

○青谷淳司 大谷弘之 山本興孝 トーマス・エブソン

(東大・生命理工、NEC基礎研*)

高度好塩菌の紫膜を酸性にする、あるいは脱塩すると吸収構積大が長波長側にシフトし、反応性の低い青色の色素 (bR605、すなわち酸性型bR)が生成する。一方、中性懸濁液でも高温にすると長波長シフトが起こし、bR605に類似した青色色素 (bL) が生じる。これは、bR568、bR548 (bR555)以外の色素塩白の生成を示唆している。そこで、このbLの光反応を継ぐために、ピコ秒ならびにナノ秒のレーザーホリシスを行った。bLは630nmに強い吸収をもつので、YAGレーザーの第2高継波 (532nm)を、アセトンで満たされたラマンセルに通すことにより630nmの光を発生させ、励起光として用いた。

その結果、bLの光化学サイクルには>600nmに吸収があって短命のK-like種と500nm付近に吸収がある長寿命のL-like (N-like)種が生成するが、bR568のM中間体に相当するものは現れてなかった。この反応はO中間体の光化学サイクルによく似であり、bLとは高温によってbR568からの逆反応が起きた生じたO中間体であると考えられる。また、bR605の光反応における特徴もこれらと同様である。従って、bLやO中間体とbR605は異なる条件で生じる色素でありながら、同様な構造を持つと考えよう。

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

J. Aotani, H. Ohtani, N. Yamamoto and T. Ebbesen: Photoreaction of a blue pigment in purple membrane at high temperature.
bR568とは、高度好塩菌Halobacterium halobiumの紫膜(purple membrane)中に含まれる膜蛋白であります。この膜蛋白bR568は光エネルギーを吸収することによって、サイクル反応を行うことが知られています。この反応は10ms以内に複数の反応中間体を経由することが吸収分光により明かにされています。

吸収スペクトルと同様の情報を与える分光法に蛍光効率起スベクトル法があります。この方法の利点は多成分系でも、その各成分の光能量収率の速いにより測定するより成分のмыで選択的に測定することが可能となることにより明かにされます。

吸収スペクトルと同様の情報を与える分光法に蛍光効率起スベクトル法が吸収分光率が高いとされている○中間体の蛍光効率起スペクトルの測定を試みました。その結果をFIG. 1に示します。従来から○中間体と、紫膜を酸性にして得られる青膜とは同じ構造を持つであろうと言われています。過去の本研究室の測定では両者は全く同じ蛍光スペクトルを呈しました。また、高温では紫膜の吸収スペクトルが長波長シフトすることから、○中間体の生成あるいは紫膜/青膜転移が考えられます。そのため、青膜と高温における紫膜の定常光効率起スペクトルを測定し、それぞれもFIG. 1に合わせて示しました。

高温における紫膜の吸収極大波長は予想通り568nmから617nmにプロットしており、スペクトルは青膜のそれと一致しました。一方、○中間体の吸収極大波長は600-610nmにあることがわかれば青膜や高温時の紫膜のそれとは一致しませんでした。しかし、その極大波長は過去の時間分解吸収分光法の結果(640nm付近)より短波長にあることがわかりました。

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

S. Kanematsu and H. Ohtani : Time-resolved fluorescence excitation spectrum of purple membrane.

## パクテリオロドブシンのプロトン化レチナールシフト塩基近傍の誘電率の推定

○小山航也、和田光人、古木隆生、櫻井実、井上義夫 (東大工・生命理工・生体分子)

本研究では、パクテリオロドブシン(bR)中のレチナールシフト塩基のpKa値がタンパク質部位からの抵動により水溶液中に比べ異常に高い値を示す原因を、タンパク質の誘電応答の観点から検討し、bRのプロトン化レチナールシフト塩基近傍の誘電率を推定した。

プロトン化シフト塩基とその対アニオンに相当するモデル系のpKa値をタンパク質法を用いて最適化を行い、タンパク質部位の誘電効果の評価は、当研究室で発展させてきた境界要素法を用いた反作用場理論をAM1分子軌道法に組み込んで行った。

まず、タンパク環境とレチナールシフト塩基との相互作用を、その本質を失わずに扱うための極小構造モデルとして、レチナールと同一の長さの共役鎖を持つトランス型エチルアミンシフト塩基が適当であるという結果を得た。ついで、脱プロトン化とその逆過程の反応経路を評価するため、シフト塩基と対アニオンの窒素-酸素間距離及び窒素-プロトン間距離を固定し、プロトン移動の断熱ボテンシャルマップを求めた。その結果、真空中ではプロトン化状態に比べ脱プロトン化状態の方が著しく安定であった。しかし、周囲の環境の誘電効果を考慮した計算により、プロトン化状態の方法が安定であるという結果が得られた。ここで得られた両エネルギーの差ΔEをプロトン移動の自由エネルギー変化とみなしてpKa値を算出すると、誘電率5程度でbRの実測値13.3を再現することがわかった。

K. Koyama, M. Wada, T. Furuki, M. Sakurai, Y. Inoue :
Estimation of dielectric constant of the bacteriorhodopsin interior
using a self-consistent reaction field theory.

## 固体高分解能¹³C NMRによる常温、水和紫膜中における[³¹C]Ala標識バクテリオロドブシンの次高構造および運動性の解析

○辻 晃、内蔵 晶、斉 蓮 聖 (姫路工大・理・生命)

高度好塩菌(Halobacterium halobium)の紫膜に存在する光プロトンボンプ活性を持つ膜蛋白質、バクテリオロドブシンを試料として、常温、水和状態の生体膜中ににおける膜蛋白質の動的な次高構造を固体¹³C NMRを用いて解析し、低温と常温における構造の比較を行なった。試料として、高度好塩菌の培地中に[³¹C]アラニンを加行was。次に試料として、高度好塩菌の培地中に[³¹C]アラニン標識バクテリオロドブシンを含む紫膜を凍結乾燥後相対湿度100%のもとで水和したもの、および同試料に等重量の蒸留水を添加したものを使用した。

CPMASおよびDDMAS法による観測の結果、質膜構造α-ヘリックス構造の¹³C化学シフト値は70℃では15.8ppmであるが、23℃では16.3ppmに低磁場シフトし、α-ヘリックスの構造が低温下と常温で異なることを示した。α-ヘリックス構造の化学シフト値が温度に比例して変化し、-70℃以下の温度で39℃の温度範囲では二種類のα-ヘリックス構造の交換を含む動的な次高構造が存在し、高次構造中の各α-ヘリックス構造の存在比率は温度に依存して変化することが見い出された(図)。

一方、○末端の親水性部位は常温(21℃)においてランダムコイル構造をなる部位とα-ヘリックス構造をなる部位を持つと帰属され、10⁵ Hz以上の速度の揺らぎが観測されるが、21℃から-10℃の温度範囲で温度の低下とともにランダムコイル構造のピークに低磁場シフトが見られ、ランダムコイル構造とより制限された高次構造の間で温度に依存する構造の交換が存在していることが見い出された。

S. Tuzi, A. Naito, H. Saito: High-resolution solid-state ¹³C NMR study on conformation and dynamics of [3-¹³C]Ala labelled bacteriorhodopsin in hydrated purple membrane.

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

## パクテリオロドブシンのシフト塩基-カウンターイオン相互作用と構造変化の相関

○上久保裕生¹・片岡転雄¹・三原康一¹・R. Needleman²・
J.K.Lanyi³・徳永史生¹ (阪大・理・I. Wayne State Univ.²・
Univ.of California,Irvine³)

我々はパクテリオロドブシン(bR)の光駆動プロトンボンプの分子構造を理解するために、特に構造変化に注目して研究を行っている。既に、M中間体においてヘリックスの傾きといったような構造の変化が生じていることを明らかにした。今回我々は、シフト塩基のプロトン化状態と構造の相関を調べるために D85N変異bRを用いてX繰回折実験を行った。

bRでは、D85はシフト塩基に対するH⁺のアクセプターであり、同時にシフト塩基のH⁺と強い相互作用を持っている(カウンターイオン)と言われている。これらの相互作用が消失した変異体(D85N)では、その光反応過程にM中間体は生成しないにも關わらず、アルカリ条件でスペクトル的にM中間体様の産物が生じ、シフト塩基が脱プロトン化する。本報告では、中性でのD85N(Blue form)とアルカリ性でのD85N(Yellow form)の構造の比較を行ったところ、両者で異なるX繰回折像が得られた。この回折像の変化をD96Nやアルギニン処理bRによるTrasbRとMBRの回折像変化と比較したところ同一である(相関係数~0.7)ことが明かとなった。また、D85N/D96N変異体でも類似の変化があらわれたが、その変化の相対量はD85N変異体に比べ小さなものであった。しかし、2つの変異体のYellow formの回折バターンはM中間体の回折バターンと同一であった。即ち、シフト塩基の脱プロトン化とM中間体構造は密接に関連していると考えられる。

又、D85N/D96N変異体ではBlue formの状態までにM中間体構造を獲得していると考えられる。実際、そのBlue formからの中回折像はM中間体からの回折像の特徴を有している。このことから、カウンターイオンとシフト塩基の相互作用の消失により、trans-bRとN-bRの構造の平衡が生じるようになると考えられ、逆にこの相互作用の存在下ではtrans-bRの構造しか取れないような制限を受けていると予測される。

H. Kamikubo, M. Kataoka, K. Mihara, R. Needleman, J. K. Lanyi, F. Tokunaga
bR structure is correlated with Schiff Base-counterion interaction.
マイクロマシン技術による微小孔アレーに
配向紫膜を固定化した光電応答セル
○福澤健二、柳沢圭一、桑野博喜
(NTT境界領域研究所)

高度好塩菌(Halobacterium salinarium)の細胞膜の一部である紫
膜に含まれる蛋白バクテリオドブシンは、水素イオンポンプ機能
があることはよく知られている。紫膜の光電応答は水素イオンポンプ
の機構を解明する点および光電変換材料としての応用面からも重要で
ある。生体内では細胞膜内外で環境が異なるが、これをin vitroで再現
するには水溶液との接触を十分確保した隔膜状の配向紫膜薄膜が必要
である。結果ではこの条件を満たすセルは提案されている。

今回、我々はマイクロマシン技術を用い、微小孔を多数有する薄膜
に紫膜薄膜を固定化し隔膜状の紫膜光電応答セルを作製した(図1)。
厚さ約600nmの薄膜に約3×10⁶個の微小孔(径~2 µm)を作製し
た。その微小孔アレーに電着法により配向紫膜を固定化した。固定
化された紫膜の厚さは、100nm以下である。この微小孔アレーに電
着した紫膜は、通常の平坦な電極に電着した場合に比べ、膜厚が薄い
場合でも一樣な薄膜が得られた。連続的な水素イオン輸送に起因する
dc光電流の発生 (数十nm/cm²)を確認できた。図2に、紫膜態濁
液の吸収スペクトルとdc光電流のactionスペクトルを示した。dc光電
流の吸収は水素イオン輸送に起因することを示しており、水溶液との
接触が十分確保された配向紫膜の薄膜状セルが構成できた。

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Fig. 1 Photoelectric Cell</figcaption></figure>

<caption>Fig. 2 dc-photocurrent and
absorbance spectrum</caption>

K. Fukuzawa, K. Yanagisawa, and H. Kuwano:
Purple membrane-based photoelectric cell
fabricated by micromachining techniques

ハイブリッドアーキロドブシン類の構造形成と光プロトンボン
プ
杉山康雄, 山田直久, 梅村徹, 向畑恭男 (名大・理・生物)

【はじめに】光駆動プロトンボンプ,アーキロドブシー1と2
(aR-1とaR-2)およびバクテリオドブシン(bR)間には、吸収極
大波長,紫膜→青膜転移のpK値、光反応中間体の寿命等の物性に相
違がある。そこで、これらの物性に相違をもたらす領域やアミノ酸
残基を同定するため、aR-1のヘリックス領域をaR-2の対応する領域
と置き換えたハイブリッドプロトンプを作成して光サイクルを
解析した。さらに、ヘリックス置換とルーブ領域の変更がハイブ
リッドドンパクの構造形成に及ぼす影響を調べた。

【結果】

1. クロモフォア形成過程の解析 一大腸管で発現させた“a0-1 および“ca0-2 (コントロール) is in vitroでDMPC/CHAPS 混合ミズ Cell中で全トランス型レチナールを加えると、中間体 (λmax=435/460 nm) を経て、紫の色素 (λmax,それぞれ560nmと550nm) へ、それぞれ、8分と3分の half timeで変換する (20℃)。ハイブリッドa0-1/2E, a0-1/2F, および、a0-1/2Eはいずれの場合も中間体を経てクロモフォアを形成した。従って、少なくとも、aR-1とaR-2 の間でヘリックスを交換しても構造形成には影響しない。しかしながら、ヘリックスEとPをつなぐルーブ領域に5アミノ酸残基の挿入あるいは欠失を起こした変異a0-1タノパク(a0-1△)はクロモフォア形成に多量のリン脂質を必要とし、また、その収量が低くなった。

2.ハイブリッド色素の光反応“caR-1の中間体の崩壊速度は
“caR-2より速い。caR1/2Eは“caR-2様の、また,caR1/2Fは“caR-1
とcaR-2の中間的な光サイクルを示した。一方,caR1/2Fでは、N中
間体の崩壊速度が遅くなり、0中間体も観測された。変異色素aR-1
△では、N中間体と思われる寿命1秒の成分が観測できた。そして、
0中間体のシグナルが増大した。また、光に対して不安定となった。
これらの結果とアミノ酸置換の関係を考察する。

Y.Sugiyama, N. Yamada, T. Uemura and Y. Mukohata
:Chromophore generation of hybrid archaerhodopsins
and light-driven proton pump.

新穀ハロロドブシンの遺伝子配列決定及び大量発現
大友 純 (1, 2)、村松高道 (2)
(1) 新技術・さがきがد研究21、 (2) 日立・基礎研)

高度好塩菌shark及びport株1)からハロロドブシン(HR)様蛋白質をコードすると思われる遺伝子のクローニング及びその配列を決定した。これまで知られている3種類のHRのC-リックス及びGヘリックスの相同性の高い部分の塩基配列を基に、ミックスプライマーを合成し、新種の高度好塩菌shark及びport株の全グノDNAからPCRによりHRのC-G部分の遺伝子を増幅した。このC-G部分の遺伝子を基に、PCR及びカセットDNAを利用した方法でshark及びport株の全HR遺伝子をクローニングした。遺伝子配列の解析の結果halobium HRとport株のHRでは約62%、shark株のHRでも約62%の相同性があった。port株とshark株では、5つのアミノ酸が異なるているだけで、ヘリックスを構成していると予想される部分はすべて保存されていた2)。ヘリックスを構成している部分で113番目のアラニンがスレオニンになっている以外、レチナールポケット、およびイオンポンプに重要だと予想されたアミノ酸は、すべて保存されている。また、A-B及びB-ブリッド遺伝子を構築し、その遺伝子をBR及びHR欠損株に導入した。その形質転換体は青色を呈しており、shark HRが大量に発現していた。このshark HRの機能に関しても報告する。

(参考文献)

1) Otomo et al. (1992) J. Gen. Microbiol., 138, 1027-1037.

2) Otomo et al. (1992) BBA, 1112, 7-13.

J. Otomo, T. Muramatu: Gene cloning and sequencing of new Halorhodopsins and its
overexpression.

ファラオニスファローブドブシン (ppR)
と弱酸アニオンとの相互作用
大北栗 ○高尾浩一郎、加茂直樹

ファラオニスファローブドブシン (pharaonis photorhodopsin, ppRと略す)は Natron-bacterium pharaonisに存在するphotorhodopsin (H. halobiumにおける負の走光性受容体)に類似したリナノキルである。我々はppRの光化学反応の評価が次の通りであることを明らかにした。

$$
\begin{align*}
\text{ppR(498nm)} &\rightarrow \text{ppRx} (\sim 540\text{nm}) \rightarrow \text{ppRx} (512\text{nm}) \rightarrow \text{ppRx} (488\text{nm}) \rightarrow \\
\text{ppRn} (390\text{nm}) &\rightarrow \text{ppRn} (560\text{nm}) \rightarrow \text{ppR}
\end{align*}
$$

M中間体(ppRn)の崩壊は遅く、その速度定数はpHにも依存するが、293 Kにおいて 0.25 s⁻¹ (pH9)から 10 s⁻¹ (pH4)である。Tittor (EHBO J. 8, 3 477(1989)) によれば、パリシド“アスブ(bD)の変異体D96NはN中間体の崩壊は遅くH⁺輸送能はないが、N₃⁻のような弱酸のアニオンを添加すると、速度が増加しプロトン輸送能も回復する。そこで、今回、遅いH₃中間体の崩壊を示すppRの反応サイクルに及ぼす弱酸アニオンの影響を調べた。

【結果】 azide, nitrite, acetate, cyanate, thiocyanate等の弱酸アニオンの添加でppRnの崩壊は遅くなった(pH 7, 293 K, 200 mM azide存在下で速度定数は250 s⁻¹。アニオンはこの順に効果的であった。酸性のmediumでは、アニオンはより低温度でppRnの崩壊を遅くした。bR的D96NとppRnでの結果を比較すると、どの弱酸でも、N₃⁻の崩壊の加速に対するKₐm値は、1 ないし 24-25値ppRnの方が大きかった。例えば、Na⁺について、ppRでは703 mM、D96Nでは3~4 mMであった。温度依存性から、N中間体の崩壊の活性化エネルギー Ea と活性化エントロピー dS°を求めた。結果を次表に示す。

<table>
  <thead>
    <tr>
      <th></th>
      <th>Ea (kJ/mol)</th>
      <th>dS°<sup>‡</sup> (J/mol/K)</th>
    </tr>
  </thead>
  <tbody>
    <tr>
      <td>bR wild</td>
      <td>71 - 79</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>D96N</td>
      <td>27</td>
      <td>-140</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>D96N + 100 mM Na<sup>+</sup></td>
      <td>48</td>
      <td>-26</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>ppR</td>
      <td>75</td>
      <td>-10</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>+ 500 mM Na<sup>+</sup></td>
      <td>41</td>
      <td>-82</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

【説論】以上の事より、ppRにおいてもdeprotonated Schiff baseと弱酸アニオンが直接相互作用できること、しかし加速化に必要なアニオン濃度はD96Nに比べて高いこと、また、活性化エントロピーが小さい事等が明らかになった。この1の解釈として、Schiff base近傍が混み合ってい
asideとSchiff baseとの反応の頻度が低下する事が考えられる。リナノキル
の再生速度実験(Hirayama et al.)はこの考えと矛盾しない。

K. Takao and N. Kamo: Interaction of pharaonis photorhodopsin with
basic anions.
レチールアナログで再構成したフォロドブシンによる
高度好塩菌の光鷲動性

○田渕済一郎、辻本和雄、高橋哲郎
(北陸先端科学技術大学院大学・材料科学)

### 識言 フォロドブシン (pR)は、高度好塩菌 *Halobacterium salinarium*の光鷲動性を媒介する。青光色急に照らされた好塩菌の遊泳方向を反転させ、消灯の際には逆に反転頻度を低下させる。

今回、発色団アナログ 13-demethylretinal で再構成したpRは、本来現
在一転青光色灯直後の反転頻度の上昇 (ステップゲン応答) を引き起
こすことを見だした。すなわち光運動性の符号が逆転した。

実験 ロドブシン様タンパクとしてpRアポタンパクのみを持つ好塩菌変異株 Flx3b₁に、発色団として 13-demethylretinal または all-trans retinal を加えて培養した。近赤外光でモニターした顕微鏡画像から、遊泳方向を反転する固体数の割合 (反転頻度) を測定した。刺激光としては青光色 (490nm) を主に用いた。

吸収スペクトルの測定には Flx3b₁の細胞膜の懸濁液を用いた。

結果 約1分間隔の繰り返し刺激では、本来の発色団 all-trans retinal では青色光点光灯後の反転頻度の上昇 (ステップアップ応答) のみが現れるのに対し、13-demethylretinal で再構成した場合にはステップダウン応答のみが現れた。

他方、暗所に置いたアナログ再構成細胞は第1回目の刺激に対してのみステップアップとステップダウン応答の両方が現れることがわかった。ステップアップ応答の回復に要する時間は少なくとも90秒以上であると見もられた。

考察 13-demethylretinalの結果は、ステップアップ応答のシグナルを媒介する光化学中間体が長寿命のために蓄積することで説明できる。すなわち第2の光子吸収による反応サイクルを仮定すれば説明されている。フロボドブシンとセンサリーロドブシンでは受容体の信号発生の機構が異なることが推察される。

別の光鷲動性受容体センサリーロドブシンでは、13位のメチル基は光異性化的支点として働き、光鷲動性発現に重要であるとされている。フロボドブシンとセンサリーロドブシンでは受容体の信号発生の機構が異なることが推察される。

K.Tabuchi, K.Tsujimoto, T.Takahashi: Photophobic response of halobacteria caused by phoborhodopsin reconstituted with retinal analogs

### 緑色光合成細菌のクロロゾームとそのモデル系のバクテリオクロロフィルと高次構造形成における合会速度の影響

・廣田雅光、堀田敬三、十三室守、★Mette Miller、★Raymond P. Cox、松浦克美 (都立大理生物、+基生研、*Odense大)

緑色光合成細菌はクロロゾームと呼ばれる光捕集器官を持っており、その脂質一重膜に囲まれた内部には主な光捕集色素としてバクテリオクロロフィル (BChl) が存在する。これらのBChl は、それら自身の相互作用によって会合体をつくり高次構造を形成していることが示されてきた。またこれらの構造をはすにはBChl と脂質が必要だということを示してきた。このような構造体がクロロゾーム中、または水相中でどのように会合していくか調べることは、クロロゾーム内のBChl の構造の詳細を知る上で重要である。今回我々は、BChl を in vitro で人工的に会合させるとときに、ゆくくりと会合せるとクロロゾームにより類似した構造を形成することをなすことを見いたので報告する。

ヘキサノール処理したクロロゾームはその750nmの吸収が、単分子型の吸収 670nm に単長波シフトするが、ヘキサノールを除去するとまた元のクロロゾームの吸収に戻る。このときの吸収スクリプトルの変化をストップトフローで測定したところ、急速に希釈したものはクロロゾーム比べ短波長の738nmの吸収を安定的に示した。一方ゆくくりと希釈したときはクロロゾームと同様な長波長タイプの749nmの吸収がみられた。またクロロゾーム抽出物を水相中に再構成させるモデル系の形成において、抽出物を透析膜を使いゆくくりと再構成させたときは、その吸収はクロロゾームと同様の吸収を示したが、シリンジ等を使い、水相中に急速に注入したときは、クロロゾームにはない短波長成分が作られることが多かった。このことからクロロゾーム内のBChlの高次構造は、BChl分子がゆくくりと会合していくことによって初めで形成されることがわかった。一方、急速に会合が進むとクロロゾーム内のより少ない会合数のBChl からなる構造が形成され短波長に吸収を持つ成分ができると考えられる

M. Hirota, K. Shimada, M. Mimuro, M. Miller, R.P. Cox, and K. Matsuura: The higher structure of bacteriochlorophylls c depended on their aggregation rates in the chlorosomes of the green photosynthetic bacteria and their model-systems.

### 緑色光合成細菌 Chloroflexus のクロロゾームにおけるカロテノイド分子種の組成と機能

辻公博、*高市真一、広田雅光、松浦克美、* 嶶田敬三 (都立大・理・生物、*日医大・生物)

緑色光合成細菌 *Chloroflexus aurantiacus* の光捕集装置であるクロロゾームは、バクテリオクロロフィル (BChl) c、BChl a、カロテノイドを含む脂質とタンパクから成ると考えられる表層菌を持つ状態の構造である。これらの色素のうち BChl c はクロロゾーム内部に自己集合体として、また BChl a は細胞膜との接触部である baseplate にタンパクとの集合体として存在していると考えられていが、カロテノイドについては相当量の存在が知られていないもの、組成、分布、機能について不明の点が多い。まではこのクロロゾームにおけるカロテノイドの構造的・機能的役割に興味を持ち、カロテノイド分子種の組成、分布さらに光捕集色素としての機能について調べた。

Chloroflexus のカロテノイドはβ-およびγ-カロテンを主成分とOH-γ-カロテンおよびその配転体を含むとされているが、今回OH-γ-カロテンクロシドの脂肪酸エステルが相当量含まれていることを見出した。しかしこのカロテノイド配転体エステルはクロロゾームをうすい(0.08%) SDSで処理することにより baseplate の BChl a と共に除去されることから baseplate および表層菌に局在し、内部のBChl c 集合体には含まれていないことが示された。これに対し、β-およびγ-カロテンは約0%がSDS処理したクロロゾームに残っており、さらに光質の励起スペクトルから BChl aへのエネルギー転移も未処理のクロロゾームと同程度に起こっていることが認められた。すなわちこれらのカロテノイドのみがBChl c 集合体と相互作用を持つことが示された。このSDS処理クロロゾームにおける BChl/Carotenoid 比は約4であった。一方、未処理クロロゾームにおけるカロテノイド励起の光質スペクトル及び BChl a および BChl c の光質の励起スペクトルから baseplate の BChl a へ直接エネルギー転移をしているカロテノイドが存在する可能性が示された。

K.Tsuji, S. Takaichi, M. Hirota, M. Matsuura, K. Shimada: Composition, localization and function of carotenoids in chlorosomes of *Chloroflexus aurantiacus*.

### 緑色光合成細菌 Chlorobium limicola のホモダイマー反応中心標品

○伊藤 菅、岩城 崇代、*大同宏造、*角谷佐紀、*井元正一郎、*松原 太(基生研、*大坂大 理生)

高等植物でNADPの還元に働く光化学系I反応中心の原型と考えられるの緑色硫黄光合成細菌 *Chlorobium limicola*の反応中心複合体(CRC)の構造と機能を検討した。

異なるポリペブチド組成を持つ反応中心複合体標品を調製し、機能を比較した(表)。[1] CRC-1標品は、電子供与体P840、Cyt-cの光酸化と FeSの還元を示し、活性な反応中心標品といえる。

[2] RC-coreとCyt-cポリペブチのみからCRC-2標品は、P840の化学酸化及び光による吸収変化を示した。Cyt-cの光酸化活性はなかった。アミン酸配列からRC-coreは一種で、これとCyt-cと併せて2種、各2個つづるペペブチからなると推定されるCRC-2はホモダイマー複合体と考えられる。

[3] Cyt-cを欠くCRC(-c)標品は、光酸化によるP840の光酸化と、P840+の数十ミリ秒での暗還元を示し、硫銘黄センターも持つと思われる。これはCyt-cが反応中心活性に必須の成分ではないことを示す。

これらの結果は、RC-coreペペブチ2本のみが反応中心を形成し(図)、光エネルギー変換活性をもたらすことを示している。CRC中では電子伝達成分はC2対称に配置されていると思われ、何が電子移動の方向性を決めているかは興味深い。CRC中でのエネルギーと電子移動機構を検討した。

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

S. Itoh, M. Iwaki, *H. Ohoka, *S. Kutani, *S. Kamei and *H. Matsubara: Homodimer reaction center complex of photosynthetic green sulfur bacterium *Chlorobium limicola*.
熟処理による光合成光化学系Ⅰ反応中心複合体の
構造変化とクロロフィルの変性
○岩城 雅代、§小林 正美、伊藤 繁 (基生研、§東大工)

光合成光化学系Ⅰ反応中心複合体は約80kDaの2種のポリペブチド、
PSI-AとPSI-Bのヘテロダイマから成り、中核部分に電子供与体クロロ
フィル P700 (Ch1 a dimer=Ch1-696N)、受容体 A0 (Ch1 a monomer=C
h1-686nm)、アセカサリークロロフィル、キノン、及び鉄銘硫黎クラスター
が結合する(図)。その周辺には約百分子のアンテナクロロフィルが結
合する。限定的な加熱処理で生じる反応中心の変性過程を調備、反応中
心複合体の構造を考察した。 【実験】ホウレンソウ葉総体から単離
した光化学系Ⅰ粒子を凍結乾燥し、エーテルでアンテナクロロフィル、
アロチロイド、キノンを抽出し、反応中心あたりクロロフィルが12~
13分子含まれる標品を調製した。これを加熱処理(30~50℃、10min)
し、吸収/CD分光測定、及び、HPLCによる色素定量を行った。

【結果・考察】
30~40℃では加熱温度上昇にともない、主に P700 (Ch1-696nm)、A0 (Ch1-686nm)の吸収ビクが短波長シフトし、40~50℃ではこれに加えCh1-682nm、Ch1-676nmが短波長シフトした。P700の短波

長シフトにともない光活性(酸化還元活性)が失活し、Ch1-696nmとCh1-682nmのCD活性も消失した。一方、660~670nmにピークをもつ短波長アンテナクロロフィルはこの温度では変性しなかった。HPLC実験から、加熱によりCh1の酸化が促進され、反応中心あたり約3分子のCh1が特異的に変性することがわかった。

以上の現象は、加熱によりPSI-Aと
-Bのヘテロダイマーの結合態が変化し、
これらの中核部分に存在するクロロフィル
が特異的に変性したものとして説明され、
未だ分光特性が同定されていない
アセカサリークロロフィルはCh1-682nmで
ある可能性が高い。

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Masayo IWAKI, Masami KOBAYASHI, Shigeru ITOH : Heat-induced structural changes in the Photosystem I reaction center complex.

リン脂質平面膜法による大腸菌タンパク質輸送系の解析

○平田 鑑、金森 睦 (施工大・理)、徳田 元 (東大・分子細胞研)、水島昭二 (東京薬大)

大腸菌細胞膜におけるタンパク質膜透過に関与するSecA、Y、Eなどの因子がどのような機構で膜透過反応を進行させるか、それが単純な孔(チャンネル)を構成しているのかイオンポンプであるのか、また、新たに精製された因子SecGがどのような役割を果たしているか、などを明らかにすることを目的に行われた。

まずasoelectinによって作製したリン脂質平面膜のcis側に400mMClを添
加することによって浸透圧差をつけ、SecY/E大量発現珠の細胞膜をオクチ
ルグルコシドで可溶化した標物を直接挿入法でcis側から再構成する。単
一チャンネルが組み込まれたことを確認した後、灌流により浸透圧差を解
消LTrans側の電位を変化させてチャンネルの挙動を調べた。この状態では
チャンネルは常時間口しているが、流れる電流は+電位の方が一電位より
大きくゆるい整流性が見られる。また、cis側に種々の塩を填えることに
よって電流/電圧特性を調べたところ、このチャンネルはNa⁺あるいは
K⁺などの腸イオンは透過させるが、Choline⁺やTris⁺などの有機隔イオン
は透過させないことが示された。また、新しい因子SecGはこのSecY/Eチ
ャンネルのコンダクタンを約1.5倍上昇させることからSecGはSecY/Eの
孔径を大きくすることが考えられる。このようなSecY/厄チャネルにcis
側からSecAおよびSecB+前駆体タンパク質proOMPを加えると閉口する
頻度が上昇し、さらにATPの添加によりチャンネルは完全に閉口した。こ
れらからSecY/E/Gはチャンネル様の挙動を示し、SecAがその閉口を制御
し、基質前駆体タンパク質はSecAによるATP水解に伴ってチャンネル内部
に挿入されていくことが考えられる。

H.Hirata, M.Kanamori, H.Tokuda, S.Mizushima : Protein Translocation Assembly in Planar Phospholipid Bilayers.

好熱菌PS3アラニンキャリアタンパク質 (ACP) 遺
伝子の発現と大腸菌アラニン輸送体 (E. DagA)
*金森 睦、村井法之、永島祐司、鎌田英明、
平田 鑑 (鉱工大・理)

【目的】

これまでに我々は好熱菌アラニンキャリアタンパク質 (ACP) の精製と遺伝子クローニングにより、その一次構造を決定してきた。今回はACPの遺伝子 (acp) の発現と新たにクローニングした大腸菌アラニン輸送体遺伝子の発現産物についての諸性質の比較を行った。

【方法と結果】

大腸菌RM1株(E. coli dagA*)にゲノムライブラリーを導入し、アラニンをC源とする培地中での生育を指標にE. DagA 遺伝子のクローニングに成功した。ACPIは445アミノ酸より成り、8~10回の膜貫通領域を有するのに対して、E. DagAは470アミノ酸より構成される12回膜貫通領域を有することが推定された。さらに、RM1株を用いた機能発現系によりACPとE. DagAの结构性質の比較を行った。アラニン輸送のKI値は、ACPもE. DagAもほぼ同じレベル (約10µM)であったが、E. DagAの至適温度は40℃であったのに対してACPは45℃であり、ヤや好熱性を示した。また[14C]アラニンの細胞内取り込みに対する各種アミノ酸の阻害から、E. DagAはグリシン、グリシン等小型中性アミノ酸のみを基質にすると考えられた。これに対してACPはこれらのアミノ酸の他にアスパラジン、グルタミン等も基質とすると推定された。ホモジジン検索の結果、E. DagAは大腸菌の芳香族アミノ酸輸送体や、リジンパーミアーゼ等に高い相同性が認められた。一方、ACPIは8~10回膜貫通領域を持つと推定される、海洋細菌 Alteromonas haloplanktisのアラニン輸送体 (A. DagA) と中央部の120残基のアミノ酸領域を除いて非常に高い相同性を有するが、E. DagAとACP間には頑若な相同性は認められず、E. DagAとACPは異なるアミノリーに属するアミノ酸輸送体であると考えられた。

新生膜蛋白のER膜における透過路：

Transloconポアの電気生理学的特性

○老木成徳、山本隆、Sabirov Z. Ravshan、
富永知子、岡田泰伸 (生理学研究所、機能協関部門)

新生膜蛋白のER膜での透過経路は脂質二重層ではなく
transloconという膜蛋白のポアであることが明らかになって
きる。新生れつつある膜蛋白の将来の膜質通領域は
transloconを透過する際にER膜脂質二重層に組み込まれる。
Translocon は新生膜蛋白の殊水性配列を認識し、ポアが脂質
層に開いた大きな構造変化を起こす必要がある。Transloconは
新生膜蛋白をどのような機構で透過させ、トポロジーを決定し、
膜に組み込み、折りたたむのか? 本研究の目的は、新生蛋白
の膜透過機構を明らかにするために透過蛋白とtransloconとの
相互作用の場であるポアの特性を明らかにすることである。翻
訳されつつある蛋白をビューロマイシンによって未成熟終結さ
せると、未成熟新生蛋白はポアから放出され、ベプトドを透過
させるだけの大きなポアが開存する。イオン強度が低いときポ
アは開き続けイオンが透過しめる。TransloconのポアをBobel
らの方法で単一チャネルとして捉え、transloconにおける蛋白
透過路の静的、動的構造を解明したい。私達はツメガル卵母
細胞とイソ脉臓の粗面小胞体分画を得、膜蛋白透過活性を確認
した。このベシクルを脂質平面膜に再構成し、細胞質側から
ビューロマイシンを添加すると数十秒後にイオンチャネル活性
が観察された。細胞質側のイオン強度を上昇させることによ
ってチャネル活性は消失した。単一チャネルコンダクタンスから
アニオンとカチオンの選択性は弱いことが明らかになった。こ
のチャネルは通常のイオンチャネルと同様、チャネルの開閉を
示す。チャネルのゲーティングは特異な電位依存性を示した。

S. Oiki, T. Yamamoto, R. Z. Sabirov, T. Tominaga & Y. Okada: A pathway for nascent membrane proteins in ER membrane: Electrophysiological properties of the translocon pore.
ポリエーテル系抗生物質サリノマイシンの起電性
イオン輸送について

北大・薬　○秦　正樹、宮内 正二、加茂 直樹

【目的】 サリノマイシン、モネンシン、ナイジェリシンなどのポリエーテル系抗生物質は末端でポリポキシル基を持つ。これらの抗生物質は金属カチオンとのプロトンのantiporterであるといわれてきた[1]。輸送の機構は、①膜表面でカルボキシル基のプロトン解離とそれに続く分子内水素結合の形成によって環状構造をとる。抗生物質はこの環の内部に金属カチオンを取り込み電気的に中性な複合体となる。②電気的に中性な複合体は膜中を散乱反対側へ移動する。③金属カチオンを解離しプロトンと結合し再に中性となりの元の側へ戻る、の過程からなると考えられている。この機構に従えてpElectronneutralであるはずである。しかしながら、我々は以前モネンシンのNa⁺輸送において、electrogenicな輸送が存在することを示した[2]。そのelectrogenicな輸送はモネンシン二分子とNa⁺分子から形成される複合体によってなされていると推定されている。今回、我々はサリノマイシンのK⁺輸送について研究を行った。

【実験】 平面脂質二分子膜をフロレチンを用いてモンタール・高木法に従い作成した。実験には膜電気容量が0.5-0.9μF/cm²、抵抗が1000Ω以下の膜を用いた。二分子膜の両側にK⁺あるいはNa⁺(0-500mM)を存在させ、サリノマイシン(0-50μM)による膜コンダクタンスの上昇をバッチクリーンプ用のアンプ(日本光電、CB22200)を用いて測定した。

【結果】 サリノマイシンとK⁺が共存する場合、膜コンダクタンスの上昇がみられた。上記のようなポリエーテル系抗生物質のイオン輸送機構では膜コンダクタンスの上昇はふらふらではないはずである。一方、サリノマイシンとNa⁺が共存する場合、膜コンダクタンスの上昇はK⁺の場合に比べて小さかった。これらの結果はサリノマイシンによるelectrogenicな輸送が存在すること、その遷移性はK⁺>Na⁺であることを示している。次にサリノマイシン濃度を50μM一定にしてK⁺濃度と0(0)の関係を調べた。G(0)は外部電圧0mVにおける膜コンダクタンスの濃度である。その結果K⁺の濃度は0.2(0)が比例していた。これはサリノマイシンによるelectrogenicな輸送がK⁺二分子を含む複合体によってなされていることを示唆している。現在、より詳細な解析を行っている。

【参考文献】

[1] B.C. Pressman (1976) Ann. Rev. Biochem., 45 501-530

[2] 植林 実ら (1993) 日本薬学会114年会

M. Hata, S. Miyachi and N. Kam: Salinomycin, polyether antibiotics mediates electrogenic transport.

人工平膜面に再構成したバクテリオロドプシンの起電性

○宗行 英哉、*池松 立男、吉田 賀右

(東大・大資源研、*三洋電機・筑波研)

生体膜に存在する起電性のイオンポンプ蛋白質は化学反応や光反応と共に役
してイオンを輸送することにより、膜の両側でのイオンの濃度差と電位差
を発生する。イオンの濃度差と電位差は電気化学ポテンシャルの成分とし
てエネルギー的に等価であり、Peter Mitchell は proton well の概念を用
いてこれらが輸送速度に対しても等価になるモデルを提出した ( Theor.
Exp. Biophys. 2, 159-216 (1969))。プロトンポンプについては実験的にも
ΔpH とΔΨが等価になるような結果が報告されたこともあるが (Maloney,
J. Membr. Biol. 67, 1-12(1982), Al-Awqati et al. Am. J. Physiol. 233, F502-508
(1977)),多くの結果は膜小胞系や生体细胞で得られたので、イオンポンプ
の性質として ΔpH とΔΨが速度論的に等価になるのかについては疑問
が残る。これらの問題に答えるには精製したイオンポンプを人工平膜系
に再構成して ΔpH とΔΨを外部から制御した上で輸送速度を実測すること
が望ましいが、従来のイオンポンプの人工平膜面への再構成ではイオン
ポンプ蛋白質が人工膜を貫通しておらず、外部電圧とイオン濃度差がイオ
ンポンプにどのようにかかっているかが不明であった。我々は第 29、30
回年会に於て可溶化したバクテリオロドプシンの人工平膜面への再構成
法を報告した(Muneyuki et al. Biophys. Biochem. Acta 1183, 171-179 (1993))。
脱共役剤の効果から、この方法はバクテリオロドプシンが人工平膜を
貫通した形で再構成されることが示唆されたので、本法で再構成した状態
での ΔpH とΔΨの光流にたいする効果を検討した。電位差は外部の電
気回路で制御した。pH 差は膜の片側のpHを1固定し、もう片側に少
量の酸を加えて調整した。現在の所得られている結果では ΔpH とΔΨは
光流に対して必ずしも同様の効果を示さない。膜蛋白の置かれているミ
クロな環境の効果も考慮して、結果の意味について議論したい。

E. Muneyuki, M. Ikematsu, M. Yoshida : Photoelectric current generated by bacteriorhodopsin reconstituted into planar bilayer membrane.

合成イオノフォアー、カリックスアレンエステル誘
導体のリン脂質二分子膜におけるイオン輸送機構

○神 隆 (北大電子研)

カリックスアレンはフェノールとアルデヒドからなる円筒形の環状
縮合体で、そのエステル誘導体はアルカリ金属イオンに対し選択的な
鎖形成能を有する脂環性の化合物である。我々は、encyにカリックス
アレンエステル誘導体がリン脂質二分子膜中で、イオノフォアーとし
て機能することを見だいている。今回は平面二分子膜を介した輸送
実験ならびに23NaMRによるナトリウムイオンの輸送速度の測定から、
イオン輸送機構について検討したこれらの報告である。

使用したカリックスアレンは、四置換及び2置換のエステル誘導体
(p-tert-butylacil[4]arene tetraethylcarbonylmethyl ester 及び
diethylcarbonylmethy l ester)である。図1は、四置換エステル誘導体
を、大豆レシチンからついたLUVにドープさせた時の膜を介した
ナトリウムイオンの交換速度を
示している。Na⁺イオンの交
換速度は、加えたカリックスア
レン濃度に対し一次に増加した。
また、その速度は、モネンシン
に比べて約1/4であった。

図2には2置換のエステル誘導体を平面二分子膜に組み込んだ時に観測されたNa⁺イオン透過に基づく電流変化を示した。四置換エステル誘導体ではこのようなチャネル電流は見られなかった。2置換のエステル誘導体では、2分子でチャネルを形成することが示唆される。

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>図1、LUV における Na⁺ 交換速度</figcaption></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

T. Jin: Ion transport mechanism of Calixarene ester
derivatives across phospholipid bilayer membranes

Regulation of a Ca²⁺ activated non selective cation
channel in β agonist treated fetal distal lung epithelium
Yoshinori MARUNAKA and Hideoki TOHDA
Division of Respiratory Research, Research Institute,
Hospital for Sick Children, University of Toronto,
Toronto, Ontario, Canada M5G 1X8

Epithelia that actively transport Na⁺ require an apical membrane Na⁺ entry pathway. Non selective cation channels (NSCC) have been identified in the apical membrane of several different types of Na⁺ transporting cells, including mature fetal distal lung epithelium (FDLE). However, despite the amiloride sensitivity and of these FDLE NSCC, their physiologic role in Na⁺ transport is uncertain. Since terbutaline, a β₂ agonist, increases Na⁺ transport by FDLE in monolayer culture we studied its effect and selected signal transduction mechanisms on the NSCC activity. Our previous report (Biochem. Biophys. Res. Commun. 187:648-656, 1992) indicated that under basal conditions the NSC channel in FDLE had a low open probability (P₀) and became active in the excised inside out patch clamp configuration at a high [Ca²⁺], and that terbutaline activated the NSCC and increased cytosolic [Ca²⁺] (Ca²⁺) at [Ca²⁺]. However, it remained questionable whether the terbutaline-induced elevation of [Ca²⁺]ᵢ was sufficient, by itself, to activate the NSCC. Using single channel recording and single cell imaging techniques, we found that terbutaline activated the NSCC by: 1) increasing its sensitivity to cytosolic [Ca²⁺]ᵢ by ~1000 fold; 2) increasing [Ca²⁺]ᵢ from 35±3.5nM to 3.3±0.5μM; 3) producing a dependency of the NSC channel activity on the cytosolic [Ca²⁺]ᵢ ([Ca²⁺]ᵢ) at a physiological [Ca²⁺]ᵢ; 4) reducing the [Ca²⁺]ᵢ from 45 to 25mM which directly activate the β₂ treated NSCC. Taken together, these observations indicate that a β₂ agonist physiologically activates an amiloride-blockable NSCC in fetal distal lung (alveolar) epithelium through an increase in its sensitivity to [Ca²⁺]ᵢ resulting in the development of a [Ca²⁺]ᵢ-dependency at a physiological [Ca²⁺]ᵢ associated with both an increase in [Ca²⁺]ᵢ and a reduction in [Ca²⁺]. A development of the [Ca²⁺]ᵢ-dependency and a reduction in [Ca²⁺]ᵢ act as a second messenger of the β agonist signal transduction pathway in this Na⁺ transporting epithelium.

Supported by Grants-in-Aid from the Medical Research Council of Canada, The Kidney Foundation of Canada, The National Sanatorium Association of Canada, The Lung Association of Canada and The Ontario Thoracic Society to Y. Marunaka.
エンドサイトーシスはNon-canonical PI-turnoverによって制御される。佐藤智。(新科技团さきがけ研究
2.1、京大・理)、山科正平(北里大・医)、田口隆久(大工研、有機部)、宮山朝二(京大・ウイルス研)

我々は、昨年度本会年会でエンドサイトーシスが、培地のCa²⁺濃度を上げることによって上昇することを報告した。この効果は、Ca²⁺の流入を阻害する以外に、Li⁺によって阻害された。Ca²⁺は、protein kinase C (PKC)を活性化し、Li⁺は、PI-turnoverを間接的に阻害する。本研究で用いたヒトfibrosarcoma HT-1080のエンドサイトーシスは、PMAによっても活性化されたが、Ca²⁺効果はPKC阻害剤によって抑制されない。2) オカダ酸(100nM)はCa²⁺効果を阻害するが、PMA効果を増加させることが見だされ、2つのエンドサイトーシスの上昇機制は別物であった。

非常に興味深ことに、PMA効果もまた、Li⁺によって抑制された。このことは、エンドサイトーシス活動の根幹に未同定の制御機構があることを示唆した。そこで、通常の4'OHリン酸化は異なり、イノシトールの3'OHをリン酸化するnon-canonicalなPI-turnoverの根幹をなすPI-3キナーゼの阻害剤である、wortmanninを投与したところ、細胞は、Li⁺処理と同様エンドサイトーシスを停止させた。wortmanninの作用は①非常に速い(t<sub>25</sub>=10分)、②非常に遅くしか回復しない(t<sub>25</sub>>4時間)、③非常に強力である(c<sub>25</sub>=5nM)などの特徴があった。Li⁺あるいはwortmannin処理した細胞は、surface internalizationが起こらず、また、細胞内の管状エンドソームが小胞化し、ランダムに運動するようになった。従来、PI3-kの細胞機能における役割は不明であったが、本研究の結果は、non-canonicalなPI-turnoverそのものがエンドサイトーシスにおける細胞内膜動に必須であることを強く示唆している。

S. B. Sato, S. Yamashina, T. Taguchi, Toyama
S. : Control of Endocytosis by Non-canonical
PI-turnover

細胞内カルシウム濃度変化によるデスモソーム形成の制御
佐甲靖志¹、川崎一則²、宮本宏²、○補見明弘¹
(¹東大・教養、²工技院・生工研)

マウス皮膚由来のケラチノサイトF7p細胞の細胞間存在着構造は、50μMの細胞外(培養液中の)Ca²⁺濃度では見られないが、細胞外Ca²⁺濃度を1.8mMに上昇させると形成されている。この現象をカルシウムスイッチと呼ぶ。細胞外Ca²⁺濃度を変化させることによって、デスモソーム形成を起こす細胞外Ca²⁺濃度の閾値は0.3mM程度であることがわかった。一方、細胞膜のカルシウムチャネルを阻害するCoCl₂(0.1mM)や、膜を透過して細胞内のCa²⁺をキレートするBAPTA-AM (0.5μM)によって、カルシウムスイッチによるデスモソームの形成が阻害された。CoCl₂による阻害は、カルシウムイオノフォアA23187 (0.1μM)によって回復する。

そこで、細胞外Ca²⁺濃度上昇時の細胞内Ca²⁺濃度の経時変化を、Fura 2をプローブとして蛍光顕微鏡下で測定した。細胞外Ca²⁺濃度を0.5mM以上にすると、細胞内Ca²⁺濃度は一過性に上昇して50-100秒後にピークに達した後、徐々に下降したが15分後にはCaCl₂添加前よりも高い濃度で安定した。細胞外Ca²⁺濃度を0.3mMにすると、一過性の上昇は見られたが15分で元の濃度に戻り、長期的な上昇は観察されなかった。細胞外Ca²⁺濃度0.1mMでは一過性応答も見られなかった。デスモソーム形成と細胞内Ca²⁺濃度変化の両者の、細胞外Ca²⁺濃度依存性はよく対応している。

以上の結果は、細胞外からのCa²⁺の流入による細胞内Ca²⁺濃度の上昇がデスモソーム形成のシグナルとなる可能性を強く示唆している。

Y. Sako, K. Kawasaki, H. Miyamoto, A. Kusumi : Regulation of the
Desmosome formation by intracellular calcium concentration.

光ピンセット法と一粒子追跡法によるFcγ受容体の運動の
制御機構の研究

○藤原敬宏、Ira Mellman*、佐甲靖志、補見明弘
(東大・教養・基質研究、*Department of Cell Biology and
Pathology, Yale University School of Medicine)

我々は、細胞膜上の受容体を1分粒子で観察・操作することにより、細胞膜上の受容体分子の運動は膜骨格のフェンバー効果や膜骨格/細胞骨格への結合などによって制限を受けること、多くの膜タンパク質が可動性の高い膜裏打ちネットワークに結合している可能性があること、などを示してきた。本研究では、マクロスFcγ受容体のFcγRII B1またはB2をCHO細胞に発現させ、リガンド結合依存的な運動の変化、膜裏打ち構造との相互作用の変化を調べた。なお、B1はリガンド関係後アクチル縦維と相互作用するが、膜内に取り込まれないこと、B2はピットに捕捉され取り込まれることが報告されている。①受容体の標識には抗FcγRII抗体 (2.4G2) Fab断片を結合した直径40nmの金コロイド、または免疫複合体(リガンド)を結合した直径210nmのラックス粒子を用い、次の結果を得た。

(1) 2.4G2による標識の場合、B1とB2の微視的拡散係数は10¹²~3x10¹⁰ cm²/secの分布を示し、固い膜裏打ち/細胞骨格に結合しているものから自由拡散しているものまで多様な運動状態にあることが示された。平均値はB1、B2ともに3x10¹⁰ cm²/secと比較的大きかった。また、約20%が一方向へのドリフトが重量された運動を示した。0.25 pNの捕捉力の光ピンセットで牽引すると、中央値で1μm程度牽引であった。

(2) 免疫複合体による標識の場合、B1、B2ともに一方向へのドリフト速度をもつ拡散運動の割合が20から40%に増加した。微視的拡散係数は10⁻¹²~3x10¹¹ cm²/secの成分が増加し、平均値はB1で0.9x10¹⁰ cm²/secに、B2では1.5x10¹⁰ cm²/secとなり、2.4G2の場合に僅かに1/2~1/3に減少した。0.2 pNの捕捉力の光ピンセットで牽引すると、牽引可能距離は中央値で400nm以下と2.4G2標識の場合に比べて1/2以下になった。捕捉力を0.8 pNに増大させるとB2の方向が約2倍(B1: 410 nm、B2: 870 nm)長く牽引できた。またほとんど牽引できない成分が2.4G2標識とくらべて数値増加している。

以上の結果から、Fcγ受容体はリガンドが結合すると大きめの運動状態が行われ、これは膜骨格/細胞骨格への結合成分が増加していること、さらに膜骨格/細胞骨格の構造も変化する可能性を示唆している。

1) Miettinen et al. J. Cell Biol. 116, 875-888 (1992)

T. Fujiwara, I. Mellman, Y. Sako, A. Kusumi : Regulation mechanisms of the movement of Fcγ receptor as studied by optical trapping and single particle tracking.

海馬シナプスにおける神経伝達物質の素量解析

○鳥居鈴太郎、+松沢照男、國藤進(北陸先端科学技术大学院大学・情報科学研究科、+情報科学センター)

素量解析の手法として、D. M. Kullmann は最尤推定法に基づいた MEND(Maximum Entropy Noise Deconvolution)を提案した。最尤推定法は、そのままでノイズの影響を敏感に受けてしまい、元の信号を再現しにくいという欠点がある。これに対して、MEND は最大エントロピーレーの考えを最尤推定法に付加することにより、細かなノイズの振幅を平坦にし、より良好な結果を得るとすものである。しかし、MEND は連続したデータを離散値にまとめて計算する部分があり、限られた量の生体データを無駄にしてしまう側面がある。そこで本研究は、連続値のまま合理的な計算ができるように MEND の改良を行ない、シミュレーション実験で改良案の有効性を確認した。さらに、ノイズの影響を受けてならだかな曲線となりLYがら下的な解析結果(図1)から、座標上における各振幅値の傾斜を求め、元の信号のピークを明確に推定する(図2)手法を考察した。

さらに、本研究ではこれから改良案を実験データに適用し、その有効性を確認した。実験データは海馬のモノシナプスで測定した、長期増強の前段階である基礎実験データを使用した。なおモノシナプスは、ある細胞からある細胞へ、シナプスが1つだけ対応しているものである。今後、本改良案を用いてモノシナプスによる長期増強の実験データを解析すれば、シナプス前膜、後膜の動きの解明に、大きな役割を果たすことが期待できる。

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>図1 解析結果</figcaption></figure>

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>図2 各振幅における傾斜</figcaption></figure>
細胞内情報伝達に関与する蛋白質成分のうち、ライアノジン受容体(以下RyaR)とイソトールを捕酸受容体(以下IP₃R)とは、それ本身がCa²⁺チャネルを形成することで知られ、様々な方向からの研究がなされている。これらの受容体は、既に両者ともそのアミノ酸配列が決定されており部分的にかなり類似していることが指摘されている。また両者とも4量子を形成而成アミノ末端胞の主要部分は細胞質側に突出していることも共通している。組織学的には、RyaRは脊格筋のT管と小胞体の接合部にあるfootと呼ばれる構造に相当し、またIP₃Rはその特異抗体による染色パターンから小脇プルキンエ細胞内に豊富に分布することが判明している。更にRyaRに関しては、積製した分子のネガティブ染色像あるいはクライオ電子顕微鏡像から3次元再構成像が得られているのに対し、IP₃Rではよりやくネガティブ染色像が得られてはいるもののまだ像質は貧弱であり微細構造の解析には程遠い現状である。我々はこの受容体のin situにおける高分解能の構造を追求するために、受容体を豊富に含むウニ小脇プルキンエ細胞の急速凍凍 freeze-fracture deep-etching 像を電子顕微鏡にて観察した。この結果、分子層において、豊富に存在する樹脂突起内部の膜構造内に4角格子状の2次元晶元として配列する膜分子の集団を見いだした。個々の分子はほぼ正方形に配列する4個のセプトニットから形成されその1辺は約16nmであった。しか正方形分子のそれぞれの辺は結晶格子の軸と30°ほど傾いて並んでいた。これらの点はそのサイズを除く、脊格筋におけるRya-Rの構造およびその配列と酷似しており過去のデータから予想されているIP₃Rの構造とも良く符合している。ただ、ここで観察された分子のサイズは従来ネガティブ染色で観察されたIP₃Rのサイズ (25 x 25 nm)よりずっと小さいことが特徴的である。しかしながら、最近IP₃Rを強制発現させたCOS-細胞の超薄切像でやりは膜構造に含まれる4角格子状の分子配列が見いだされており、我々の結果はむしろそのサイズと良く合致している。現在、この構造物の物質の基盤を確立すべく研究を続けているが、もしくはIP₃R対応すると仮定されるならば、この分子はflexibleでありネガティブ染色色は変形を受けているものと想像される。この点、RyaR では精製後も比較的良く形態が保たれていることと対照的である。

【目的】副腎皮質は副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、アンギオテンシンII (ATII)、ATP等の刺激により、コスステロールからステロイドホルムを合成而成爲した。我々は、この時程皮質内カルシウム濃度が高くなることを観察してきたが、顕微鏡による単一細胞レベルでの観察の結果、カルシウム応答を起こす細胞と起こさない細胞が存在することが明らかとなった。本研究では、これらの細胞の違いを理解することを目的として、単一の細胞に対してカルシウム応答、コレスコロールプル、ステロイドホルモン中間体合成酵素活性の3つをイメージングし、カルシウム応答する細胞の特徴を明らかにした。

【方法】実験にはカーゲラス上で培養した牛副腎皮質東部状の初代培養細胞を用いた。試料をカルシウム感受性蛍光色Calcium Green-1で染色しカルシウム応答を観察した後、位相差顕微鏡で細胞の形態を観察した。さらにNitro-BTでステロイドホルム合成中間体酵素であるB-β-水酸化ステロイド脱水素酵素活性を染色し、次いでOil Red Oにより細胞内コレスコロールプルと考えられている脂肪顆粒を染色してその分布を可視化し、透過光および蛍光を用いて顕微鏡観察した。

【結果・考察】ACTH、ATII、ATP等のどの刺激物質に対しても、カルシウム応答をもつ細胞は以下の特徴において共通していた。位相差顕微鏡でその細胞の形態観察の結果、カルシウム応答した細胞は培養しているカーゲラスにより貼り付いた薄、伸いた細胞であり、内部の構造がほかと異別できないものばかりであった。さらに組織化学的染色の結果、カルシウム応答を起こした細胞はNitro-BTで染色してもほとんど染色されず、またOil Red Oにより染色される細胞内脂肪顆粒がほとんど、あるいは全く存在しないものであった。一方カルシウム応答しない細胞にはや或く厚い形で、Nitro-BTで多く染色され、かつOil Red O染色される脂肪顆粒が多重に存在するものが多くかった。Hoechst33258線を染色するとカルシウム応答した細胞の線も明確に染色され、これらも実際は内縁構造が存在するが細胞が薄いために識別しにくいことがわかっていた。Nitro-BTはカルシウム応答する細胞が染色されないものも細胞が薄ったことがよく取り挙げられていないことが明らかとなった。またカルシウム応答する細胞に脂肪顆粒が少なかったのは、活発にステロイドホルモンを産生しているため細胞内コレスコロールプルとされる脂肪顆粒が継続して多重に消費されていることによるものと推察された。

副腎皮質東部状細胞では、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)が細胞膜上の受容体に結合することにより、ステロイドホルモンを合成している。ステロイドホルモン合成にカルシウムが必要なもの、ACTHの結合後に細胞内でカルシウムイオン濃度が速やかに上昇するという現象は今まで測定されていないかった。それ故、ACTH結合後にどの様な細胞応答が起こるかにつないだった。我々は副腎皮質東部状細胞にACTH投與後にカルシウムイオン濃度が速やかに上昇する事を初めて発見したのでこれを報告する。

カルシウムイオン濃度の変化は、カルシウム感受性色素 Calcium Green-1の蛍光強度変化として捉えた。顕微鏡のステージ上を37℃に保ち、細胞応答を起こし易くした。蛍光像を超高感度SITカメラで捉えビデオテープに緑画し、画像処理を行うことによって初めてカルシウム応答を画像として得ることができた。

蛍光色素で染色される細胞の割合は全体の2割程度と小さかった。ACTHによっておこる細胞内カルシウム濃度変化はATPによる場合と比べると、変化を変化させる細胞の割合、及び変化の大半とも小さかった。しかし、高濃度の(数 uM)ではьんろん、生理濃度(約100pM)でもしっかりとカルシウム応答をおこしていた。また、投与後応答をおこすまでの時間もわずかに長く10秒程度かかった。高濃度のACTHを加えた場合、カルシウム応答は一過性であったが、低濃度のACTHを加えたときは細胞のいくつかでアレルギーユーンが観察された。これは、ATPやアンギオテンシンIIなど、カルシウム応答をおこすことが知られている刺激物質で刺激した場合と同様の現象であった。当日は、ACTHによる刺激の原、カルシウムイオンがステロイドホルモン合成にどのように関わるのかについても観察したい。

Y. Ohta, T. Kimoto, S. Kawato: *Changes in Intracellular Ca²⁺ Concentration Induced by ACTH in Adrenal Zona Fasciculata Cells measured with Fluorescence Imaging*

【目的】B細胞による特異的抗原、及び非特異的抗原の提示機構を、画像処理を利用したT-B細胞相互作用の解析法により追究し、両機構における細胞内蛋白質のチロシンリン酸化の役割について検討した。

【実験】B細胞として、TNP基特異的B細胞ハイブリド-マTP67.21を使用した。T細胞としては、KLH蛋白に特異的なペルバーT細胞クローニン28-4を使用した。細胞内カルシウムイオン濃度変化は、共焦点レーザ顕微鏡により測定し画像解析を行った。

【結果】B細胞TP67.21に特異抗原 TNP-KLH1μg/mlを与えて時間培養しておいたもので、カルシウム蛍光指示薬 fluo3-AMで標識したT細胞28-4に添加すると、個々の細胞においてその蛍光強度が上昇するが観察された。これに対し、TP67.21に非特異抗原 KLH1μg/mlを与えたものでは、28-4の蛍光強度にほとんど変化はみられなかった。しかし、高濃度で処理したものでは、28-4の蛍光強度の上昇がみられていた。さまざまな抗原濃度に対するT細胞の応答率を解析した結果、どちらの抗原に対してもT細胞の応答率は抗原濃度に依存して上昇するが、非特異抗原の場合にはT細胞を活性化するのに特異抗原の100倍の濃度が必要であった。ところで、抗原によりB細胞膜上レセプターが架橋されると、速やかに細胞内蛋白質のチロシンリン酸化が起こることが知られている。そこで、チロシンキナaze阻害剤であるherbimycin Aで、TP67.21を前処理し、これに特異抗原 TNP-KLH、または非特異抗原 KLH を与えてT細胞に添加したときの、T細胞の応答率を解析した。その結果、herbimycin Aは、B細胞の特異的な抗原処理を著しく阻害したが、非特異的な抗原処理は抑制しなかった。

以上の結果から、細胞内蛋白質のチロシンリン酸化反応が特異抗原の処理機構に直接関与していること、ピノサイト-シスによる非特異抗原の処理機構には関与していないことが明らかになった。

<footnote>T. Kimoto, Y. Ohta, S. Kawato: *Multiple Imaging of Adrenal Zona Fasciculata Cells which show Calcium Signaling*</footnote>

<footnote>Y. Nagao, M. Nakanishi: Antigen processing by antigen-specific and antigen-nonspecific B cells: Influence on the calcium signals in T cells.</footnote>
## B細胞抗原レセプター会合と細胞内シグナル

### ・鳥越智香子、中西守

### 名市大・薬

**目的・方法** 細胞内シグナル伝達においては、まずレセプターの会合が必要であると考えられが、レセプターの会合状態とシグナルの定量的関係は不明である。我々は、ハプテン特異的B細胞ハイブリドマーについて、抗レセプター抗体、蛋白質およびペプチドを担体とした種々の多価抗原を用いて抗原レセプターの会合状態を変化させ、初期の細胞内シグナルとして細胞内カルシウムイオン動態を、細胞の活性化性の指標として細胞増殖および抗体産生量を調べ、両者の相関関係を定量的に検討した。また、レセプターの会合状態がどの程度の時間領域でシグナル伝達に必要なかを明らかにするため、多価抗原の結合にももた細胞内カルシウムイオン濃度上昇をハプターが急速に阻害する現象について、光光標識抗原および共焦点レーザー顕微鏡を用いることにより、レセプターの動態を観察した。

**結果・考察** モノクローナル抗レセプター抗体を細胞に結合させた実験から、このB細胞ハイブリドマーにおいては、レセプターのdimer形成ではシグナル伝達は行われず、trimer以上の形成が必要であることが示された。ところが dimer形成ではシグナルが誘導されなかったにもかかわらず、dimer形成後さらにレセプターを会合させたところ、そのシグナル伝達に影響を示した。細胞表面のレセプター会合は、単に静的会合状態のみではなく、動的な側面も重要であることが示された。分子量の異なる蛋白質、ペプチドを多価抗原の担体とすることによりハプターの局所的密度を変化させた結果、抗原刺激にもとなな細胞内カルシウムシウムシグナル誘導のバターンが、ハプターの局所的密度により異なっていた。また、ハプテンによる多価抗原のシグナル伝達阻害は、カルシウムイオンの細胞外からの流入および細胞内ストアからの遊離のいずれについてもみられ、このとき同時にレセプター会合状態の変化がおこっていると考えられた。

Torigoe, C., Nakanishi, M.: Quantitative correlation between receptor aggregation and intracellular signal transduction.

## 脂質細胞の細胞内Ca²⁺動態と脱顆粒の関係 (2)

○〇梅元恵任(九州大・薬), 桐野 豊(東京大・薬)

**【目的】**昨年の年会で、我々は、2種の螢光色で染色した肥満細胞を対象とした2波長励起螢光イメージグリ法により、単一細胞内Ca²⁺温度変化と脱顆粒現象を同時に測定する方法を確立し、予備的な結果を報告した。

**【方法】**ラット腹腔肥満細胞を単離し、傾測用チャンバー中で、Fluo-3/AMとquinalcrine (Q)を用いて染色した。塩基性のQは酸性のオレガネラである分泌顆粒内と特異的に取り込む、脱顆粒には細胞外に放出されるので、脱顆粒をQの螢光(励起波長420 nm)の減少として検出することができる。Ca²⁺指示薬Fluo-3は励起スペクルがQに大きく異なる、480 nmの励起波長を用いたが、脱顆粒と独立にCa²⁺温度変化を測定することができる。
compound 48/80 (Compd)で刺激した後の単一細胞の螢光強度変化をARGUS-50システム (深谷ホトニクス)又はMCID-M4システム (Imaging Research, 富士真徳フィルム)で測定した。

**【結果】**二重染色した肥満細胞を1mLの細胞外Ca²⁺温度([Ca²⁺])の下に、0.1~1 µg/mlのCompdで刺激した。高温度Compdで刺激した場合には多くの細胞で一過性の細胞内Ca²⁺温度の上昇が観測され、低温度Compdで刺激した場合には細胞内Ca²⁺温度の振動が高頻度で観測された。一過性のCa²⁺温度が下降する時期と一致した。Ca²⁺振動した細胞の場合、脱顆粒が始まった時には振動が停止した。いずれの場合にも、脱顆粒後に再びCa²⁺温度が上昇することはなかった。[Ca²⁺]=0の条件下に刺激すると、低温度のCompdで刺激したときにもCa²⁺振動は観測されず、細胞内Ca²⁺応答としては、一過性のCa²⁺上昇のみが観測され、この場合、脱顆粒する細胞も観められた。細胞内Ca²⁺ストアーのCa²⁺取り込みを抑制するthapsigarginで前処理を行った後に刺激すると、Ca²⁺温度変化も脱顆粒も観められなかった。全ての場合において細胞内Ca²⁺の上昇しない細胞では脱顆粒は起こらなかった。

## 内分泌顆粒からのCa²⁺放出機構

○〇野永實之、宮本茂昭 (九工大・情報工・生化システム)

内分泌顆粒におけるエキソサイトーシャルによるホルモンの分離は、顆球内Ca²⁺温度の上昇が引き金となる起こることはよく知られている。顆球内Ca²⁺温度が上昇するには、①細胞外から顆球内へのCa²⁺の流入、②小胞体などの顆球内オルガネラからのCa²⁺放出の二つが考えられる。今回我々は後者の点着目し、副腎質クロマフィン顆粒のCa²⁺放出機構について、顆粒レベルでの実験を行い検討してみた。

牛の副腎質又は discharge、精製したクロマフィン顆粒に、さまざまな刺激物質をIn vitroで作用させ、分生光螢光光度計によりCa²⁺intensityの経時変化を測定した。また今回はカルシウムインジケーターとして、高い酸性和性持つCalcium Green-5Nを使用した。

上記の実験により、クロマフィン顆粒膜にはIP3レセプター、もしくはRyanodineレセプターのどちらか、又は両方が存在することが分かった。つまりクロマフィン顆粒はCa²⁺-ATPaseによりCa²⁺を取り込む能力を持つと同時に、耐えられたCa²⁺をIP3レセプターやRyanodineレセプターにより放出する機構をも備えている。

今後の課題として、NAD⁺基質として合成されるCaDPRが、内分泌细胞や神経細胞においてどのような役割を果たしているのか検討する予定である。

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>図1 IP3又はRyanodineによるCa²⁺放出</figcaption></figure>

H. Suzuki and S. Miyamoto: Ca²⁺ release from endocrine granule.

## 画像解析法による脱顆粒過程でのCD63抗原の動態

○古野忠秀、*手島玲子、堀越由美子、中西 守

(名市大・薬、*国立衛試)

**【目的】**CD63抗原はリソソーム膜や顆粒球膜に存在する238残基のアミノ酸からなる膜蛋白質である。即時型アルギー反応では、肥満細胞や好塩基球からのヒステミン遊離の際に、顆粒球膜が細胞膜と融合し、CD63抗原が細胞球上に発現すると推察される。そこで、抗CD63抗体を用いて、共焦点レーザー顕微鏡により、好塩基球や肥満細胞の脱顆粒過程でのCD63抗原の動態を究究した。

**【方法】**抗原は、ラット好塩基球細胞のRBL-2H3 とラット腹腔性肥満細胞を用いた。CD63抗原の動態の観測には抗CD63モノクローナー抗体(AD1)とFITC標識した二次抗体を用いた。刺激は、抗原、thapsigargin、A23187、compound48/80で行った。測定には共焦点レーザー顕微鏡(LSM410)を用いた。

**【結果及び結論】** RBL-2H3細胞のCD63抗原の動態を共焦点レーザー顕微鏡で観察した。その結果、刺激前にも細胞膜上に微量に存在するCD63抗原により、細胞膜上に沿って弱い螢光が観測された。抗原及びA23187を添加すると細胞膜に沿った螢光強度が増大した。これは、抗原及びA23187の添加により、CD63抗原が細胞膜上に発現したためであると考えられた。また、微分干像では、そのような状態の細胞は著しくつぶれたようになっていた。抗原及びA23187の添加により、脱顆粒の指標となるβ-hexosaminidaseの遊離が起こり、その時間はCD63抗原の細胞膜上への発現時間とほぼ対応していた。また、thapsigarginの添加では、細胞内カルシウムイオン温度は上昇したが、CD63抗原の細胞膜上への発現とβ-hexosaminidaseの遊離は起こらなかった。このことより、CD63抗原の細胞膜上への発現は脱顆粒反応と密接に関係していると考えられた。また、肥満細胞をcompound48/80で刺激したところ、RBL-2H3細胞の場合よりも細胞膜の内側深くまでCD63抗原が螢光標識された。このことは、肥満細胞の顆粒球の方が好塩基球よりも大きいといわれている結果と対応しているものと考えられた。このように、画像処理法によるCD63抗原の動態の観測は、脱顆粒過程を新たな立場から追究する有用な手法であると考えられた。

<footnote>A. Kusumoto, Y. Kirino: The relationship between intracellular calcium change and degranulation in rat peritoneal mast cells</footnote>

<footnote>T. Furuno, R. Teshima, Y. Horikoshi, M. Nakanishi: Study for the CD63 antigen mobilization in degranulation by imaging analysis.</footnote>
開口放出を可视化するための蛍光色素の選択

○河崎行、森彦多佳、辻 倒、田中省二
三変化成生命科学研究所

目的: 開口放出によるホルム分泌や神経伝達物質の機構を調べるために適した蛍光色素を選択する。

試料: ラットの腹水由来マツト細胞をcompound 48/80で刺激した。
開口のマーカーとして隣イオン性色素、陰イオン性色素、膜融合のマーカーとして疏水性色素を用いた。

測定法: マット細胞を蛍光染色体、共焦点顕微鏡法で蛍光、微分干渉、反射散乱の各像を、通常顕微鏡で蛍光像を冷却CCDカメラ、高感度撮像管にて微分干渉像、蛍光像を撮影した。

結果: 開口の状態を知るためには隣イオン性色素としてキナクリン、アクリジンオレンジ等によって分離顆粒内部からの色素の流失をモニターできるが、時間経過をみると、色素の流失はとスタミンの放出より10秒近く遅れておこった。隣イオン性色素を用いるとこの遅れは数秒であった。隣イオン性色素の中でLucifer Yellowや6-carboxy fluoresceinが最もよく用いられるが、これらの色素は光反応を起こしやすく、細胞毒性を示すことがある。これに対してpyreneの誘導体であるHPTSは細胞毒性発現の程度が低く、蛍光も強いという点でより優れた。

開口放出にともなう膜の融合を調べるには疏水性蛍光色素が用いられるが、膜特異性が高く、応答が速く、かつ懸濁状態も調定可能という点ではTMADPHが優れている。しかし、この色素は光退色しやすく、かつ、光反応による細胞毒性を強く示す。さらに、この色素は励起が紫外であるため共焦点顕微鏡での調定には不都合なことが多い。一方、膜電位プローブとして知られているStyryl系の色素は可視光で励起できると、光退色の度合や細胞毒性が低い点でTMADPHより有利といえる。ただし、これらの色素は細胞外液中でも若干蛍光を発するため懸濁状態での調定に関しては不利である。Styryl系の色素の中で、FM1-43という色素はマット細胞において緑の蛍光で観察すると膜部分に、赤の蛍光で見ても顆粒内部の離集物に吸着していることが示された。このように、単一の色素でも長さを短くすることによって、異なる部位から情報が得られるという点で、FM1-43という色素は特徴的である。

ここで示したように、開口放出の可视化に際しては、適当な蛍光色素を選ぶことによって、それぞれ異なった情報を与えてくれることが解った。

グルタチオン化学受容とグルタチオン結合蛋白

花井一光、+久保田信(賀医大・分子神経化学、+京大瀬戸臨海実験)

グルタチオンで誘起されるヒドラの触手球形成応答はヒドラをトリプシンで処理してやると著しく増強される。そこでグルタチオン結合蛋白がトリプシン処理によってどのように変わるかを調べた。グルタチオンを固定化した樹脂(エポキシコトバルันを利用)を利用してグルタチオン結合蛋白を分離した。この結合した蛋白は7M尿素で樹脂から溶出した。この樹脂にはグルタチオン特異的に蛋白が吸着することが観察された。またトリプシン処理に伴って吸着する蛋白の量は著しく増加した。一方今後さらに詳しくこの蛋白を調べるためには、大量の蛋白が必要であるがヒドラから調整するのは非常に困難であることも明らかであった。数万匹のヒドラをモチフェンでも、高々数百ngの蛋白しか調製できない。いろいろなロスを考えるときわめて不十分と言わざるを得ない。

大量に利用できそうな動物として、ミズクラグ、Aurelia aurita を検討してみた。ミズクラグは和歌山県白浜町にある京大瀬戸臨海実験所で採集した。まずミズクラグがグルタチオンに反応するかどうかを調べた。口腔(oral arm)の内側に寄生している口触手(oral tentacle)は、ピペットに吸い込むと容易と垂直する。垂直した口触手は自発的な収縮運動をしている。この収縮運動はグルタチオンを加えてやるとその頻度は1.4から1.5倍にまで増加した。これはWilcoxon's paired sign testで有意に(p<0.05)増加した。従って口触手はグルタチオンに反応すると考えられる。一方傘の周囲にある縁触手は全く反応しなかった。そこでヒドラのグルタチオン結合蛋白を調製するのと同じ方法でミズクラグの口腔からこれを調製してみた。するとSDS-PAGE で類似したものか得られた。従って、この蛋白はグルタチオン化学受容と対応関係していると考えられる。ミズクラグの採集にあたりましては、田名瀬博士に協力していただきました。ここに記して感謝いたします。

共焦点顕微鏡によるウニ卵の受精時における表層変化の観察

○細井真理子、明石意一郎、田中百合子、箱崎博之、
中村 竜*、木下一彦
(愛大 理工、(株)ニコン顕微鏡開発部*)

ウニ卵が受精すると、卵内の細胞膜付近にある表層粒が崩壊し、細胞膜と融合する現象(エキササイトーシス)が起こる。その後、細胞膜表面に微小な突起物(マクロピライ)が伸長することが電子顕微鏡観察によりわかっている。そこで我々は、共焦点顕微鏡を用いて表層付近の微細構造を生きた卵で観察することによって、この2つの現象の関係を探ることを目的とした。蛍光色素(di-4-ANEPPS)で細胞膜を染色したウニ卵を受精直後から共焦点顕微鏡で蛍光観察した結果は下図である。~10sに表層が乱れ始め、30s頃までに表層粒の融合とおもわれる現象(丸い輪)をとらえることができた。50s頃から受精膜の上昇が始まり、その後、表層の乱れの様子がより細かくなったように見ることができるのだが、マイクロピライは長いものを除いて1本1本を見分けることが難しかった。特に長く受精膜に到達するようなマイクロピライははっきりと見え、あたかも上昇する受精膜に引っ張られて伸びていくように見えた。また、この蛍光の偏光を通常の光学顕微鏡で測定することにより、偏光が受精後2段階にわたって変化することが確認されているので、共焦点顕微鏡による観察結果との対応をつけることを試みている。

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>上下方向に偏光した光で励起しているので、左右方向を向いた膜が強く
光っている</figcaption></figure>

M.Hosoi, K.Akashi, Y.Tanaka, H.Hakozaki, R.Nakamura, K.Kinosita Jr.: Confocal
Microscopy of the Reorganization of Egg-cortex at Fertilization

極低温電子顕微鏡によるreceptor-Gprotein complexの観察

○有本育代、宮済淳夫、*士耕長*、*藤吉好則(蛋白工学研究所, *松下電器・中央研究所)*

リセプターとGタンパク質との相互作用を通して、細胞外の様々な情報が細胞内に伝達される。この相互作用は種々のGタンパク質が存在する細胞内に於ける大変選択性の高いものである。リセプター、Gタンパク質相互の認識様式をより深く理解するために、in vitroでこれらの単分子間複合体を形成させ、極低温電子顕微鏡を用いて直接観察する事を試した。

実験材料としてウシ網膜のドロプシン(Rho)とトランスデューション(Td)を用いた。Rhoはウシ視細胞体様外節(ROS)の円板膜中に高溫度に存在しており、このROS膜をそのまま顕微鏡観察に利用できる。またTdは他のGタンパク質よりも容易に大量精製できる。

実験はまず、凍結ウシ網膜から分離・精製したTdのα及びβγサブユニットを金粒子(1.4nm)で標識し、これを電子顕微鏡観察したところ、それぞれのサブユニットは容易に同定できた。次に、αβγ3量体としての

Tdを、GTP非存在下に於いて円板膜内の活性型Rhoと結合した状態で観察した。その結果、Tdはαとβγサブユニットそれぞれの一端ずつが結合したU字型としている事が分かった(右図)。このとき観察されたTdの大きさは、その分子量から推定される大きさに対応した。更に、ROS膜のみの場合、及びRho-Td混合溶液中にGTPγSを加えた場合は、それらのROS膜上には何も見られなかった。これらは顕微鏡観察と平行して行った電気動実験によっても確認できた。今後、構造解析プログラムを用いて単分子像から立体構造の再構成ができないか検討していく予定である。

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

<footnote>K.Hanai, S. Kubota: Glutathione chemoreception and glutathione-binding protein</footnote>

<footnote n="1">1. Arimoto, A. Miyazawa, T. Doi, Y. Fujiyoshi: Observation of receptor
-Gprotein complex by electron cryo-microscope.</footnote>
SH 基特異的アフニティクロマトグラフィーを用いた
大腸菌セリンセレブター Tsr の精製

○岩间智德(岐阜大・教養)、川岸郁朗、今栄康雄、
本間道夫(名大・理・分子生物)

大腸菌化学感觉レセプター Tsr は、誘引物質の一つセリンの感覚受容に関与する。これは、分子量約 60 kDa の膜質通型タンパク質で Cys 残基を全く持たない。156番目の Thr 残基を Cys に置換しても、セリンの感覚能はあまりおきないが、この変異レセプター Tsr-T156C のみを持つ間に NEM などの SH 試薬を与えるとセリン感受能のみが特異的に阻害される(1)。["H]-NEM がたしかに Tsr-T156C に共有結合すること、また、セリンによる保護効果が見られることから、Cys-156 残基(野生型では Thr-156)がセリン結合部位にあることが明らかになっている。本研究では、Tsr-T156C の SH 試薬との反応性を基礎にして、このレセプターインパク質を簡便に精製することができたので報告する。先ず、レセプターを大量発現させた菌を超音波破砕した後、膜画分を調製し、Foster ら(2)の方法に従って、膜タンパク質を可溶化した。可溶性画分をthiopropyl sepharose 6B (Pharmacia) カラムにかけ、1.2 % octylglucoside を含む開始緩衝液で充分洗い流した後、10 mM DTT を加えて溶出させた。溶出液を SDS-PAGE で解析したところ Tsr の分子量に当たる約 60 kDa のパンドが確認された。したがって、Tsr-T156C がこの条件で樹脂に結合することが分かった。現在、セリンの保護効力を利用した夾雑タンパク質の除去、および ["H]-NEM 標準による各分画のセリン結合活性の測定について検討中である。

(1)岩间智德、五味絵子、川岸郁朗、今栄康雄 生物物理 32: S135 (1992)

(2) Foster, D. L., S. L. Mowbray, B. K. Jap., and D. E. Koshland, Jr. J. Biol. Chem. 260: 11706-10 (1985)

T. Iwama, I. Kawagishi, Y. Imae and M. Homma:
Purification of the *Escherichia coli* serine receptor Tsr
using sulfhydryl-specific affinity chromatography.

### 大腸菌温度感觉レセプター Tar:

### 欠失変異レセプターの温度受容能の解析

○西山宗一郎、川岸郁朗、奈良敏文、今栄康雄、本間道夫
(名大・理・現・北大・彫)

大腸菌Tarは、温度変化のセンサーとして備く分子量約60 kDaの膜質通型タンパク質であり、化学物質pH変化も検知できる多機能性をもつ。このレセプターが温度変化を検知するカマニズムを知る手がかりとして、本研究では温度センサーとしての認識部位についての解析を行った。

まず、Tarのみで温度センサーとしての機能をもつのか、他のタンパク質との相互作用が温度受容に関与するのかについて検討した。大腸菌をベニシル処理してベニラズムのタンパク質を除去したところ、マルトース応答能(ベリプリズムの特異的結合タンパク質を必要とする)は失われたが、温度応答は見られた。したがって、温度刺激の受容はTar自身の何らかの構造変化によっても考えられると考えられる。

次に、欠失変異Tarの温度受容能を解析した。当研究室ではTarの温度センサー機能が、その細胞質内ドメインの特定の残基に依存して大きく変化することを見出している(1, 2)。このことからTarの細胞質内ドメインが温度センサー機能に特に重要であると考えられる。実際、大沢ら(3)は、Tarの細胞質側フラグメントがpHセンサー機能を有することを示している。そこで、このフラグメントをレセプター欠損株中で発現させたが、温度応答は示さなかった。このフラグメントは偏ったグシルを產生する傾向があり、そのため見かけ上応答が現れない可能性が考えられたので、細胞内pHが突然変異によってこの偏りを変えてみたが、はやり温度応答は見られなかった。したがって、細胞質内フラグメントのみでは温度受容能はなく、膜質通領域やベリプリズム側のリガンド結合ドメインも温度受容に関係していることが示された。現在この領域を含む別種の欠失変異Tarを作成し温度受容能を解析している。

(1) 奈良敏文、今栄康雄 生物物理 1992. 32:S135.

(2) 西山宗一郎、奈良敏文、川岸郁朗、今栄康雄 生物物理 1993. 33:S117.

(3) K. Oosawa, N. Motoh and M. I. Simon. 888. J. Bacteriol. 170:2521.

S. Nishiyama, I. Kawagishi, T. Nara, Y. Imae and M. Homma. The *Escherichia coli* thermoreceptor Tar: Thermosensing abilities of deletion mutants.

大腸菌化学感觉レセプターによる膜を介したシグナル伝達機械：
ホモダイマーにおける二つの細胞質側シグナル產生ドメインの役割
○立野一郎¹、川岸郁朗¹、大澤研二、本間道夫¹

(名大・理・分子生物、帝京大・理工・バイオサイエンス)

大腸菌化学感觉レセプター Tar は二回膜貫通型タンパク質で、ペリブラズム側でアスパラギン酸などのリガンドを認識し、細胞質側で走化性タンパク質 CheA と相互作用してその自己リン酸化活性を調節する。Tar はホモダイマーを形成し、アスパラギン酸一分子を二つのサーボニットで挟みこむ形で認識する。また、シグナル伝達にはモノマーの会合・解離が必要ないことが示唆されており、Tar ダイマー内に生じる何らかの構造変化が重要と考えられる。しかし、シグナル産生機構の実態については、細胞質側でのサーボニット間相互作用が関与するのか、それとも本質的には細胞質側ドメインのサーボニット内構造変化によるのか、議論が分かれている。

この点を明らかにするために、アスパラギン酸結合能はあるが、細胞質側ドメインはゲイマーあたり一つもたないハロゲイマー Tarの、レセプターとしての機能を調べた。具体的には、単独では機能しない二種の変異 Tarをレセプター欠損株中で同時発現させ、走化性応答を解析する。すでに、われわれは、一方のサーボニットの A198E変異は他方のサーボニットのA19K変異を抑压することを見出している(1)。そこで、Tar-A198E から、細胞質側ドメインを欠失させた変異 Tar を二種類作成した。それらの一方面是細胞質側ドメインの中央部分、他方は C 末端部分のシグナル產生に必要な領域を欠失している。これらを Tar-A19K と同時に発現させて解析した。いずれの菌も軟灰天培地でスフォーム・コロニーを形成し、誘引物質であるアスパラギン酸と忌避物質であるグリセロールに対して走化性応答を示した。野生型 Tar をもつ菌と比べると、スフォーム能は低下していたが、アスパラギン酸とグリセロールに対する親和性はほとんど違達なかった。以上の結果から、Tar ダイマーあたり一つの細胞質側ドメインがあれば、膜の外から内へのシグナル伝達が起こることが明らかになった。

1. 川岸郁朗、柴嶽学、大澤研二、今栄康雄 1993. 生物物理 33: s118.

I. Tatsuno, I. Kawagishi, K. Oosawa and M. Homma: Transmembrane signaling by the *Escherichia coli* chemosensory receptor -- Roles of the two identical cytoplasmic signaling domains in the homodimer.

アカパンカビにおいて青色光によりリン酸化されるタンパク群 ps15の解析---in vitroでのリン酸化活性と屈光性との関係
○小田和司、市村和也、蓮沼仰陽(横浜市大、木原生研)

我々は in vitro において青色光照射によりリン酸化が促進される約15kDaのタンパク群(ps15)を既に見出している。さらに青色光に全く呟苦ない突然変異株wc-1及びwc-2から抽出した膜画分を用いて in vitro においてps15のリン酸化が相補できた(文献1)。このこと为例「ps15 の活性がwc-1産物とwc-2産物によって制御されている」か、「wc-1産物がwc-2産物のどちらがps15そのものである」と考えられる。そこで野生株およびwc-1の8株、wc-2の4株から膜画分を抽出して非平衡pH配分電気泳動(NEPHGE)を行い各株のps15の特性を制御した。

その結果、ps15はNEPHGEによって4本のパンドに分解された。また、この4本のパンドのうちの3本はNEPHGEの泳動性において野生株とwc-1の7株が差がなかったがもつも強くリン酸化されるパンドが野生株とwc-1の7株で異なっていた。残りの1本のパンドは野生株に特有でwc-1の7株に見られなかった。さらに、wc-1のうち残り1株ではps15の4本のパンドの活性はまったく認められなかった。以上の結果からwc-1産物はps15そのものではないが、ps15の活性を制御していると結論された。なお、現在、ps15について同様な解析を行ったが、

一方、ps15の活性が全くなかったnull type mutantについて戻し交換を行ったところ、外見的には野生型を示したがps15の活性が全くない株が分解された。したがってps15のnull type mutation (Δps16)はwc-1遺伝子とは別の遺伝子変異であるか、またはwc-1に対する何らかの抑制遺伝子を含むことが示唆された。

そこでps15の活性の生物学的意味を明らかにするため、子殻類から發する突起(peak)の屈光性を説明した。その結果、Δps15は野生株に比べ若干屈光性の感度が高かった。また、野生株は子殻類の極性方向(peakの出る位置)が現在の条件で一方向(軸画上方に近い)であるのに対し、Δps15は全くランダムであった。現在、子殻類の極性の光生物学的意味について解析中である。

【文献1】Oda, K. and Hasunuma, K. FEBS Lett. 345 (1994) 162-166
K. Oda, K. Ichimura, K. Hasunuma; Analysis of blue light-
induced phosphorylation of ps15 in Neurospora --Relation
between *in vitro* phosphorylation activity of ps15 and
*phototropism*
## カイロ劲虫の触角における感覚受容とその多機能性

吉岡 和晃、〇本間 知夫、松岡 英明 (東農工大・工・物質生物工)

**【目的】** カイロ劲虫はクワ生業を好んで食べるが、まず触角にあると言われた感覚器でクワ生業の発する勾ivalentを受容し、近づくことが知られる。触角は機械的刺激と受容する機能以外にも、この触に他の刺激を受容する器官であり、工学的見地からも、その多機能性は興味深い。本研究では、触角における多機能性を明らかにすることを目的として、様々な刺激(物理的、化学的刺激)に対する応答特性を電化學的に解析することとすること。

**【方法】** 麻静したカイロ劲虫を実験ステージに固定し、マイクロマニビューターを用いて、Ag-AgCl電極を触角表面に密着させ、表面電位を測定した。刺激として、はじめに機械的刺激について検討した。触角先端の長毛を刺激ブロード体に対して内側(±方向)、外側(一方向)に移動してときの触角の表面電位を測定した。また、熱・冷刺激に対する応答も測定した。

**【結果】** ±/−方向の連続機械的刺激に対する応答の測定結果をFig.1(A)に示した。特に−10μm刺激すると、表面電位は±側~5mVシフトした。繞って+10μm刺激すると、逆に一側~10mV変化した後、静止電位に戻った。これらの刺激を繰り返し行ったところ、同様の応答が繰り返し得られた。また、温・冷刺激に対する応答を検討した結果、温刺激と冷刺激によって異なる電位変化を示した(Fig.1(B))。以上の結果より、カイロ劲虫の触角に機械的刺激、温度刺激を受容する機能があることが分かった。更に、刺激強度依存性、応答發生率の同定及び他の刺激に対する応答を調べることによって、カイロ劲虫の触角の多機能性を検討していく。

### (A) 機械的刺激

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

### (B) 温・冷刺激

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Fig.1 機械的刺激(A)及び温・冷刺激(B)に対する触角の表面電位変化</figcaption></figure>

K. Yoshioka, T. Homma, H. Matsuoka: Multi-functionality in sensory reception of antenna of silkworm, Bombyx mori.

## 高度好熱菌グルタミルRNA合成酵素のモジュール構造と機能相関

* ◎総野 賢<fnref n="1" />, 濂木 理<fnref n="2" />, 水谷 正輝<fnref n="3" />, 由良 敬<fnref n="3" />,

森川 而石<fnref n="1" />, 横山 茂之<fnref n="1" />, 郷 通子<fnref n="2" />

¹(東大・理・生化<fnref n="2" />, 理研<fnref n="3" />, 名大・理・生物<fnref n="4" />, 蛋工研⁵)

RNAと特異的なアミノ酸との結合は、アミノアシルRNA合成酵素 (ARS) が両者が厳密に認識することによってのみ保証されている。このきわめで正確な分子認識機構を明らかにするために、濡木らはX線結晶構造解析により、高度好熱菌グルタミルRNA合成酵素 (GhRS) の立体構造を解明した。それによれば、GhRSのN端側ドメインは、大腸菌グルタミルRNA合成酵素 (GlnRS) の同端ドメインと立体構造における高い類似性をもつが、同時にRNAのアイデンティティ決定因子の違いに対応した立体構造における相違 (2箇所) が明らかになった。我々は、GlnRSのモジュール構造を明らかにし、GlnRSでの同定結果 (本大会・郷通子ら) などをあわせて解析することによって、GlnRSの立体構造と機能および分子進化との相関を明らかすることを試みた。その結果、GlnRSは各個のモジュールから構成され、N端側ドメインの22個のうち18個がGlnRSとの共通モジュールであった。一方、GlnRSおよびGlnRSの立体構造における上記の2箇所の異なる部位は、両者の非共通モジュールに対応していることが明らかになった。これはすき wie、RNAのアイデンティティ決定因子の位置およびそのヌクレオシドの相違を厳密に識別するために、少数のモジュール単位での挿入、組み換がGlnRS (N端側ドメイン) の分子進化の過程で行われたものと考えることができる。さらに、GlnRSのC端側ドメインでは、モジュール31がヘリックス・ターン・ヘリックスを形成している。そこで、DNA結合タンパク質である434Coにおける同モチーフ(単一モジュールよりなる)との重合合わせを行った(いずれも15残基)。その結果、両者のRMSD(±43.43)であり、これらの立体構造は酷似していることが明らかにした。また、このモジュール31に含まれるジンがグルタミンに変換した変異体では、アミノアシル化活性の低下が見られる。したがって、GlnRS・rRNA (複合体モデルをさえて考慮すると、GlnRS (複端側ドメイン) およびrRNAの両者にコフィメーション変化が生じ、その結果、モジュール31とアイデンティティとが互いに接近することによって、特異的な相互作用が行われるものと予測される。そこで今後、両者の複合体モデルにおいて分子動力学計算を行い、この仮説を検討したいと考えている。

M.Tateno, O. Nureki, M. Mizutani, K. Yura, K. Morikawa, S. Yokoyama, M. G6: Correlation between the Function and the Module Structure of Thermus thermophilus Glutamyl-tRNA Synthetase

## タイプⅠ型アミノアシルRNA合成酵素のモジュール構成と機能の比較

* 水谷正輝, +館野 賢, ○郷 通子

（名大・理, +東大・理）

アミノアシルtRNA合成酵素 (ARS) はATPに依存して、アミノ酸とtRNAとの結合を触媒する酵素で、RNAワールドから蛋白質世界への移行のカギを握る分子として、重要な研究対象であるモジュールは蛋白質の球状ドメイン内のコバライドなサブ構造で、連続した10-40残基からできている。遺伝子上のイントロンがモジュールの境界に対応して存在していることから、エキソンの混成はモジュールの混成であり、蛋白質はモジュールを組み合わせて進化してきた可能性が大きい。tRNAとアミノ酸を同時に認識するARSは数百残基からなり、サイズかなり大きいことから、モジュール単位での分子解剖を行うことは、機能と構造の関係を知るために、さらに20種のARS間の進化的関係を明らかにするためにも重要である。ARSは触媒ドメインの構造から2つのタイプ(IとⅡ)に分けられる。タイプⅠに属するチロシルtRNA合成酵素 (TyrRS)とグルタミニルtRNA合成酵素 (GlnRS) の立体構造から、それぞれのモジュールを同定した。同じタイプⅠに属するTyrRSとGlnRSに、モジュール構成の違いが存在し、異なるアミノ酸の認識に寄与していることが分かった。両者に共通なモジュールと共通でないモジュールが担う機能的な役割を調べた結果、AMP/ATP結合には共通のモジュールが、アミノ酸結合には共通でないモジュールが使われていることがわかった。2つのARSについて、モジュール境界とイントロンとの対応についても考察する。

M. Mizutani, M. Tateno, M. G6: Module organization and function of type I aminoacyl-tRNA synthetases.

新しいDNA結合モチーフの提案: 練習菌遺伝子節割蛋白質 A1gR3 およびヘルペスウイルス US11 蛋白質繰り返しアミノ酸配列のコイルドコイル構造

松嶋範男(札幌医大保健医療)、中山享、毎田徳夫(長崎大医学部生化学)、Robert H. Kretsinger (パージニア大生物)

練習菌に存在するアルギン酸生合成に関与する遺伝子のプロモーターを活性化する遺伝子節割蛋白質 A1gR3, A1gP およびヘルペスウイルス US11 蛋白質繰り返しアミノ酸配列(分子全体の3/4を占める)を持っている。また、ヘルペスウイルスの持つ遺伝子US11のコードする蛋白質は、DNA結合蛋白質と考えられており、C末端にPro-Arg-Kaaのトリペブドが連続して24回繰り返しアミノ酸配列(分子全体の1/2を占める)が存在する。これらの繰り返し単位には塩基性アミノ酸である Lys, Arg が存在するため、DNAと直接相互作用することが考えられる。これらの組成ペブドを用いたDNAとの結合実験から、確かにDNAと相互作用することが示唆されている。<fnref n="1" />,<fnref n="2" />

本研究では、コンピュータグラフィックスを徹底的に用いた分子モデルリング法により、DNAと相互作用するこれらの繰り返しアミノ酸配列の立体構造により予測することを試みた。分子モデルリングは、ワークステーション Indigo<fnref n="3" /> 上で作動する Tripos社製の SYBYL と MMS の両ソフトプログラムを併用した。

すでに、我々は(AAKP)の立体構造がDNA二重ランクの溝にフィットすることを示した。<fnref n="3" /> 今回は、実際の繰り返しアミノ酸配列により近い配列(AAKP)・AAKTA の立体構造を予測することを試みた。<fnref n="4" /> また、PRXの繰り返しアミノ酸配列の立体構造も、同様な方法を用いて予測することを試めた。予測立体構造は、両者ともある種のコイルドコイル構造として特徴づけられ、合理的にDNAの溝(major groove)にフィットした。これらのコイルドコイル構造は、ヘリックス・ターン-ヘリックス、ロインジバーナ、弐鉄フィンガー等とは異なる新しいDNA結合モチーフであると考えられる。

<footnote n="1">1) Medvedkin, V. N., et al., submitted for publication.</footnote>

<footnote n="2">2) 中山享他 日本生化学会(1994).</footnote>

<footnote n="3">3) 松嶋範男他 日本生物物理学会 (1991).</footnote>

<footnote n="4">4) Matsushima, N., et al., submitted for publication.</footnote>