# Détection d'un biofilm et mesure de son épaisseur par des techniques électrochimiques. Développement d'un capteur.

Delphine Herbert-Guillou

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Delphine Herbert-Guillou. Détection d'un biofilm et mesure de son épaisseur par des techniques électrochimiques. Développement d'un capteur. Autre. Université Pierre et Marie Curie (Paris 6), 2000. Français. NNT: 2000PA066211. tel-04132547

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## THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE PARIS VI

Spécialité :

ELECTROCHIMIE

Présentée par

Delphine HERBERT-GUILLOU

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS VI

Sujet de thèse :

DETECTION D'UN BIOFILM ET MESURE DE SON EPAISSEUR PAR
DES TECHNIQUES ELECTROCHIMIQUES.

DEVELOPPEMENT D'UN CAPTEUR.

Soutenue le 28 janvier 2000, devant le jury composé de :

<table><tr><td>M<sup>elle</sup> Nadine PEBERE</td><td>Chargée de recherche à l'ENSC de Toulouse</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. Adrien CAPRANI</td><td>Directeur de recherche au CNRS, Paris VII</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>M. Dominique FESTY</td><td>Ingénieur de recherche à IFREMER</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>M. Christian FIAUD</td><td>Professeur à l'Université Paris VI</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>M. Laurent KIENE</td><td>Ingénieur au CIRSEE, Le Pecq sur Seine</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>M. Bernard TRIBOLLET</td><td>Directeur de recherche au CNRS, Paris VI</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>M. Antoine POURBAIX</td><td>Ingénieur au CEBELCOR, Belgique</td><td>Membre Invité</td></tr><tr><td>M. Yves LEVI</td><td>Professeur à l'Université Paris XI</td><td>Membre Invité</td></tr></table>
A mes parents,

A Bernard,

A Justine,

A la mémoire de ma grand-mère.
Avant-propos

Ce travail a été réalisé, pour la plus grande partie, au Laboratoire Matériaux Marins de l'IFREMER à Plouzané, aujourd'hui Service Matériaux et Structures, en collaboration avec le Laboratoire Physique des Liquides et Electrochimie, UPR 15 du CNRS à l'Université Pierre et Marie Curie et avec le Centre International de Recherche Sur l'Eau et l'Environnement (CIRSEE) de la Lyonnaise des Eaux à Le Pecq sur Seine.

Je tiens tout d'abord à remercier Monsieur Lionel Lemoine, ancien Responsable du Laboratoire Matériaux Marins de m'avoir accueilli au sein de son laboratoire. Il a été suivi dans cette fonction par Jean Croquette puis actuellement par Pierre Chauchot, que je tiens également à remercier.

Monsieur Laurent Kiéné, Responsable du Service Réseaux du Centre International de Recherche Sur l'Eau et l'Environnement (CIRSEE) de la Lyonnaise des Eaux m'a permis, à plusieurs reprises, de travailler dans ses locaux. Je le remercie pour son accueil et l'intérêt qu'il m'a porté.

Toute ma reconnaissance va à Mademoiselle Nadine Pébère, Chargée de recherche à l'Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Toulouse, et à Monsieur Adrien Caprani, Directeur de recherche au Laboratoire Biorhéologie, Hydrodynamique Physico-chimique à l'Université Denis Diderot, qui m'ont fait l'honneur d'analyser ce travail et d'en être les rapporteurs.

Que Messieurs Christian FIAUD, Professeur à l'Université de Paris VI, Antoine POURBAIX, Ingénieur au CEBELCOR en Belgique et Yves LEVI, Professeur à l'Université Paris XI, qui ont accepté de participer au jury, trouvent ici l'expression de ma vive reconnaissance.

Je souhaite remercier Monsieur Bernard Tribollet, mon Directeur de thèse, pour tous ses précieux conseils qu'il m'a dispensés au cours de ce travail.
Monsieur Dominique Festy m'a accueilli lors mon arrivée à IFREMER en stage de DEA, et il a su me faire confiance durant ce travail de thèse. Ses conseils et son aide m'ont toujours été d'un grand secours, et je le remercie chaleureusement.

Merci à Karine L., Michel J., Samuel R. et Philippe P. et aux autres membres du Service pour leur disponibilité et leur gentillesse lors de mes venues aux CIRSEE. Encore merci à Touriya E. M. et aux membres de l'UPR 15 avec qui j'ai passé des moments très agréables.

Que tous les membres du Laboratoire Matériaux Marins et des services d'IFREMER que j'ai côtoyés, trouvent en ces quelques mots, ma profonde gratitude pour leur écoute et leur dévouement. Merci à Luc R. pour toute son aide en électronique, à Max C. pour ses dépannages en informatique, à Florence M. pour toutes ses explications techniques, à Chantal C. pour tous ses précieux conseils en électrochimie, à Peter D. pour toutes ses corrections d'anglais, à Dominique C. pour toutes les discussions hors travail, à Annie M. pour sa disponibilité en secrétariat, à Henri L. pour ses dépannages en résine, à Jean-Pierre L.R. pour ses conseils techniques, à Nicolas L. pour son aide, à Michel P. pour ses mots tendres, à Céline R. pour ses mesures en microbiologie et à Régis B. au nom de notre amitié.

Je souhaite remercier Régis B. et Bertrand F. pour leurs travaux sur MATLAB et qui, ainsi, ont pu me permettre de présenter une analyse de traitements d'images.

Merci également à Véronique L. V. et Véronique B. qui ont « débroussaillé » le logiciel et ont contribué à ce que je puisse réaliser des mesures d'épaisseurs de biofilm. Merci aussi à Eva pour ses nombreux et précieux conseils via le web.

Une pensée particulière va à mes amis thésards Nicolas et Céline, ainsi qu'à Nathalie qui a sué à grosses gouttes en même temps que moi. Merci à tous les stagiaires que j'ai croisés lors de quatre années à l'IFREMER, pour leurs bonnes humeurs et nos sorties.

Je souhaiterai remercier tous mes amis qui m'ont accueilli chaleureusement lors de mes différents séjours à Paris : Monique et Jacques M., Maryse et Jean-Pierre A., Magali D. et Eric B., Nathalie T., Danièle et Marcel A. et enfin Christelle B. et Jérémie H.
Pour finir, j'aimerais exprimer ma profonde gratitude à toute ma famille et belle-
famille. A mes parents, qui m'ont permis d'avoir la chance d'arriver jusque là et qui ont cru
en moi, merci.

A Bernard qui m'accompagne depuis neuf ans, qui m'encourage, qui m'aide et qui accepte mes choix, je voudrais dire merci, tout simplement merci.

Et enfin, à Justine, qui me procure encore et toujours de nombreuses joies, surtout quand elle chiffonne des chapitres de ma thèse, merci, merci, merci...
# Sommaire

LISTE DES SYMBOLES

8

LEXIQUE

9

INTRODUCTION

11

## PREMIÈRE PARTIE

DÉTERMINATION DE L'ÉPAISSEUR D'UN BIOFILM

13

INTRODUCTION DE LA PREMIÈRE PARTIE

14

## CHAPITRE I.

CONNAISSANCES GÉNÉRALES SUR LE BIOFILM

15

1 FORMATION DU BIOFILM

16

2 FACTEURS CONDITIONNANT LE DÉVELOPPEMENT DU BIOFILM

18

3 STRUCTURE DU BIOFILM

19
# CHAPITRE II.

## CONDITIONS EXPÉRIMENTALES ET MÉTHODES D'ÉTUDE

23

### 1 MÉTHODES ÉLECTROCHIMIQUES

23

1.1 Modèle physique : analyse du transport de matière au voisinage d'une électrode recouverte d'une couche poreuse

23

1.2 Voltampérométrie ou courbes courant – potentiel, i = f(E)

26

1.3 Courbes courant – vitesse de rotation, i = f(Ω)

27

### 2 DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL

27

2.1 Electrolyte

27

2.1.1 Eau de mer

27

2.1.2 Eau douce

29

2.1.3 Bouillon nutritif

30

2.1.4 Incubateurs

31

2.2 Appareillage électronique

33

2.3 Cellule de mesure

33

2.3.1 Electrode de travail

33

2.3.2 Electrode de référence (ER)

34

2.3.3 Contre électrode (CE)

35

2.4 Traceurs Electrochimiques

35

2.4.1 Traceur ferricyanure

35

2.4.2 Oxygène

36

### 3 TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES

37

3.1 Observation optique

37

3.2 Énumération par microscopie à épifluorescence

37

3.3 Détermination de paramètres caractéristiques des biofilms sur lame

37

3.3.1 Mesure de l'ATP

37

3.3.2 Mesure de l'activité exoprotéolytique

38

3.3.3 Dosage de protéines

38

3.4 Énumération bactérienne

38

3.5 Vérification de la pureté des souches bactériennes

38
# CHAPITRE III.

## RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

39

### 1 BIOFILM DÉVELOPPÉ EN EAU DE MER

39

1.1 Traceur ferricyanure

39

1.1.1 Courbes courant-potentiel, i=f(E)

39

1.1.2 Courbes courant-vitesse de rotation, i=f(Ω)

40

1.2 Traceur oxygène

44

1.2.1 Courbes courant-potentiel, i=f(E)

44

1.2.2 Courbes courant-vitesse de rotation, i=f(Ω)

45

1.3 Influence de l'hydrodynamique sur la formation du biofilm

47

1.4 Evolution temporelle de l'épaisseur du biofilm

51

1.5 Influence du chlore

52

### 2 BIOFILM DÉVELOPPÉ EN EAU DOUCE

54

2.1 Courbes courant-potentiel, i=f(E)

54

2.2 Détermination de l'épaisseur du biofilm

55

### 3 PSEUDOMONAS DÉVELOPPÉ DANS UN MILIEU NUTRITIF

57

3.1 Mesure de l'épaisseur du biofilm

57

3.2 Analyses bactériologiques

60

3.2.1 Observation au microscope et à la loupe binoculaire

60

3.2.2 Observations par microscopie à épifluorescence

61

3.2.3 Détermination de paramètres caractéristiques des biofilms sur lame

62

3.2.3.1 Mesure de l'ATP

62

3.2.3.2 Mesure de l'activité exoprotéolytique

62

3.2.3.3 Dosage de protéines

63

3.2.4 Énumération bactérienne

63

3.2.4.1 A partir du milieu des cellules

63

3.2.4.2 A partir du biofilm obtenu sur lames

64

3.2.5 Vérification de la pureté des souches bactériennes

65

3.3 Comparaison entre les deux types de mesures

66

## CONCLUSION DE LA PREMIÈRE PARTIE

68
# DEUXIÈME PARTIE

## DÉVELOPPEMENT D'UN CAPTEUR DE BIOFILM 69

## INTRODUCTION DE LA DEUXIÈME PARTIE 70

### CHAPITRE I.

#### DÉTECTION DU BIOFILM 71

1 DÉTECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS MÉCANIQUES 72

2 DÉTECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS OPTIQUES 73

3 DÉTECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS SPECTROSCOPIQUES 73

4 DÉTECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS THERMIQUES 74

5 DÉTECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS BIOLOGIQUES 75

6 DÉTECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS ÉLECTROCHIMIQUES 78

### CHAPITRE II.

#### PRINCIPE DE LA CELLULE À JET NOYÉ 83

1 CONTRÔLE DES CONDITIONS HYDRODYNAMIQUES 83

2 CARACTÉRISATION DU TRANSPORT DE MATIÈRE DANS LA CELLULE À JET NOYÉ 87

3 DESCRIPTION DE LA CELLULE À JET NOYÉ 89
## CHAPITRE III.

### CELLULE OPTO-ÉLECTROCHIMIQUE

91

#### 1 DISPOSITIF EXPÉRIMENTAL

91

1.1 La cellule à jet noyé

91

1.2 Conditions expérimentales

92

1.3 Electrode de travail

94

#### 2 RÉSULTATS EXPÉRIMENTAUX

95

2.1 Voltampérométrie ou i=f(E)

95

2.2 Détermination de l'épaisseur

95

2.3 Analyse optique

98

2.3.1 Méthode expérimentale

98

2.3.1.1 Procédure de traitement

98

2.3.1.2 Détermination du seuil

99

2.3.2 Au temps initial

100

2.3.3 A cinq jours d'immersion

101

2.3.4 A neuf jours d'immersion

102

2.3.5 A quatorze jours d'immersion

103

2.4 Synthèse

104

#### 3 CONCLUSION

108
## CHAPITRE IV.

### CAPTEUR DE BIOFILM 110

1. DESCRIPTION DU CAPTEUR BIOFILM 110

1.1 Principe 110

1.2 Automatisation 113

1.3 Processus de mesure automatique 113

2. DETECTION DU BIOFILM 115

2.1 Validation du capteur à l'aide d'une couche de gel 115

2.2 Application en eau de mer : mesure de l'épaisseur du biofilm 116

2.2.1 Première expérimentation 116

2.2.2 Deuxième expérimentation 119

3. CONCLUSION 121

CONCLUSION 122
ANNEXES

EFFET DE L'EXTRAIT DE LEVURE SUR LA DÉTERMINATION DE L'ÉPAISSEUR DU BIOFILM

125

1 VOLTAMPÉROMÉTRIE, i=f(E)

125

2 REPRÉSENTATION DE LEVICH, i = f(Ω¹/²)

126

CONTRÔLE DU BIOFILM

128

1 PREVENTION DE LA FORMATION DU BIOFILM

128

1.1 Prévention de l'adhésion des organismes

128

1.2 Interruption de la croissance du biofilm

128

2 ELIMINATION MÉCANIQUE DU BIOFILM

130

3 CONCLUSION

130

RÉALISATION DE L'ÉLECTRODE DE TRAVAIL : MÉTHODE DE PYROLYSE D'AÉROSOL

131

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES

133
# Liste des symboles

## GRECS et LATINS

ν : viscosité cinématique du milieu ($10^{-2} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$)

δ ou $\delta_n$ : épaisseur de la couche poreuse (biofilm ou gélatine)

$\delta_h$ : épaisseur de la couche hydrodynamique

$\delta_n$ : épaisseur de la couche de diffusion

$\Omega$ : vitesse de rotation de l'électrode tournante (tr.mn⁻¹)

$\Phi$ : diamètre de la zone d'uniforme accessibilité au transport de matière

$\theta$ : vitesse du flux

$c_{\text{eq}}$ : concentration de l'espèce électroactive dans la solution (dans le cas du ferricyanure $c=2.10^{-3} \text{ M}$ ou $10^{-2} \text{ M}$ en eau douce et dans le cas de l'oxygène $c=2.10^{-4} \text{ M}$)

$c_0$ : concentration de l'espèce électroactive à l'interface couche poreuse/électrode

$D$ : coefficient de diffusion de l'espèce électroactive (pour le ferricyanure $D=5,6 \cdot 10^{-6} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$, pour l'oxygène $D=1,6 \cdot 10^{-5} \text{ cm}^2 \cdot \text{s}^{-1}$)

$d$ : diamètre du tube ou de la buse

$D_f$ : coefficient de diffusion à travers la couche poreuse

$E$ : potentiel imposé à l'électrode

$E_{i=0}$ : potentiel d'abandon

$F$ : Faraday ($96484.56 \text{ C} \cdot \text{mol}^{-1}$)

$h$ : hauteur de la buse

$i$ : courant (en µA ou en µA.cm⁻²)

$i_L$ : courant de Levich

$i_o$ : courant non diffusionnel

$J$ : flux de matière

$K$ : coefficient de Levich.

$n$ : nombre d'électrons échangés ($n=1$ pour le ferricyanure et $n=4$ pour l'oxygène)

$Q$ : débit

$r$ : rayon de l'électrode à disque tournant

$Re$ : nombre de Reynolds

$S$ : surface de l'électrode tournante (cm²)

$Sc$ : nombre de Schmidt

$Sh$ : nombre de Sherwood

$t$ : temps

$V$ ou $v$ : vitesse ($V_x$ selon l'axe $x$, $V_r$ selon l'axe $r$)

## ABREVIATIONS

ATP : adénosine triphosphate

CE : contre-électrode

UFC : unité formant colonie

CODB : carbone organique dissous biodégradable

COT : carbone organique total

CV : coefficient de variation

ECS : électrode au calomel saturé

EDT : électrode à disque tournant

EHD : électrohydrodynamique

ENH : électrode normale à hydrogène

AEP : activité exoprotéolytique

EPS : exopolyssacharides

ER : électrode référence

PIA : *Pseudomonas* Isolation Agar

PMMA : polyméthyl méthacrylate

PVC : chlorure de polyvinyle

UV : ultraviolet
Lexique

<table><tr><td>Clusters</td><td>Amas.</td></tr><tr><td>Consortium</td><td>Groupement, association, ensemble.</td></tr><tr><td>Dapi</td><td>4,6 diaminido 2 phenylindole (C<sub>16</sub>H<sub>15</sub>N<sub>5</sub>), colorant s'insérant entre les paires de base de l'ADN et qui a la particularité de fluorescer sous une lumière UV.</td></tr><tr><td>Décon</td><td>Puissant biocide, agent tensioactif concentré, utilisé pour le nettoyage et la décontamination radioactive du matériel de laboratoire (d'après le catalogue Polylabo).</td></tr><tr><td>Décor</td><td>Dépôt métallique sur un matériau.</td></tr><tr><td>Dépolarisation</td><td>Phénomène inverse de la polarisation.</td></tr><tr><td>Ecosystème</td><td>Unité écologique de base, formée par le milieu et les organismes animaux et végétaux qui y vivent.</td></tr><tr><td>Elasticité</td><td>Aptitude d'un corps à reprendre, après sollicitations, la forme et les dimensions qu'il avait avant d'être soumis à ces sollicitations.</td></tr><tr><td>Equations de Navier-Stokes</td><td>Equations représentant le champ de vitesses instantané dans un fluide incompressible.</td></tr><tr><td>Exopeptidase</td><td>Enzyme excrétée hors de la cellule permettant l'hydrolyse d'une liaison peptidique. On distingue les exopeptidases qui hydrolysent la première liaison peptidique d'un polypeptide (aminopeptidase) ou la dernière (carboxypeptidase), et les endopeptidases dont le pouvoir catalytique peut s'exercer à toutes les positions.</td></tr><tr><td>Exoprotéolytique</td><td>Qui hydrolyse les protéines et les substances protidiques au cours de processus métaboliques sous l'effet d'enzymes (-Protéases).</td></tr><tr><td>Fractal</td><td>Dont la forme est très irrégulière et en général interrompue, fragmentée, cette fragmentation étant quantifiable dans son irrégularité et pouvant être représentée mathématiquement.</td></tr><tr><td>Génotype</td><td>Constitution héréditaire d'un organisme, formée par la totalité du stock chromosomique caractéristique de l'espèce.</td></tr><tr><td>Hétérotrophe</td><td>Qui se nourrit de substances organiques, ne peut effectuer lui-même la synthèse de ses éléments.</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Abri biologique permettant le développement de bactéries.</td></tr><tr><td>Isolat</td><td>Groupe ethnique isolé.</td></tr><tr><td>Luciférase</td><td>Enzyme.</td></tr><tr><td>Luciférine</td><td>Substance composée produisant une luminescence par oxydation, sous l'influence d'une enzyme, la luciférase. L'énergie produite par la réaction</td></tr></table>
chimique est libérée sous forme de lumière et non sous forme de chaleur.

**Lyse**
Destruction d'éléments organiques sous l'action d'agents physiques, chimiques ou biologiques.

**Mucoïdes**
Qui produit du mucus, substance peptique.

**Nombre de Reynolds**
Grandeur adimensionnelle qui représente l'importance des forces d'inertie associées à l'écoulement par rapport aux forces de viscosité $v$. Ce nombre sert à caractériser les régimes hydrodynamiques et est égal à : $Re = \frac{r^2 * \Omega}{v}$ pour l'électrode à disque tournant de rayon $r$ et de vitesse angulaire $\Omega$, $Re = \frac{4 * Q}{\pi * d * v}$ pour un écoulement dans un tube où $Q$ est le débit et $d$ le diamètre du tube.

**Nombre de Schmidt**
Le nombre de Schmidt exprime le rapport entre la diffusivité de la quantité de mouvement ($v$ : viscosité cinématique) et la diffusivité de la matière ($D$ : coefficient de diffusion) : $Sc = \frac{v}{D}$.

**Nombre de Sherwood**
Le nombre de Sherwood traduit le transfert de masse vers l'électrode de rayon $r$. C'est le rapport entre une dimension caractéristique et l'épaisseur de la couche de diffusion. Il chiffre l'importance du transfert par convection par rapport au transfert par diffusion. Si on considère une réaction électrochimique limitée par la diffusion des espèces actives en concentration $c_\infty$, où le courant limite est $i_1$, le nombre de Sherwood s'écrit : $Sh = \frac{i_1 * r}{n * F * d * c_\infty}$.

**Oligotrophe**
Se dit d'un milieu pauvre en substances nutritives.

**Phénon**
Regroupement d'isolats pour un seuil de similitude donné (ici, seuil de 0,9).

**Phénotype**
Expression visible des gènes.

**PIA**
Gélose favorisant la croissance des exopolymères des *Pseudomonas*.

**Planctonique**
Qui flottent passivement dans un milieu aquatique.

**R$_2$A**
Gélose permettant le développement de tous types de bactéries.

**Sessile**
Qui se fixe sur un support.

**Stress**
Agression de l'organisme dans sa totalité et pouvant menacer son existence par des agents de toute nature. Dans le cas d'un biofilm, les facteurs qui peuvent conduire à l'état de stress sont en partie : le manque de nutriment, les traitements biocides, l'écoulement, les changements dans l'écoulement, la température.

**Substrat**
Nutriment.

**Substratum**
Support.
# Introduction

En présence d'eau ou d'humidité relative, toute surface peut se recouvrir rapidement d'un voile biologique, appelé également « biofilm ». Ce biofilm se compose de microorganismes excrétant des polymères organiques extracellulaires pour former une matrice de fibres entrelacées et des particules inorganiques s'enlisent souvent dans les filaments d'exopolymères. La couche formant ainsi le biofilm permet alors aux organismes de plus en plus importants de se fixer et de se développer.

Les biotechnologies utilisent et optimisent le développement des biofilms, principalement pour sa fonction d'élimination des contaminants, comme dans le traitement de l'eau. Par contre, ils peuvent être considérés comme indésirables, voire nuisibles dans de nombreux secteurs d'activités comme la distribution d'eau potable, les industries agroalimentaires, pharmaceutiques, électroniques... En effet, les macro organismes peuvent pénétrer dans un circuit d'eau à l'état larvaire, et s'abriter au sein du biofilm pour s'y développer : les conséquences d'une contamination biologique peuvent être graves.

Dans le cas des échangeurs thermiques, l'augmentation de la résistance de transfert de chaleur induite par le biofilm entraîne une diminution du rendement. La conductivité thermique du biofilm est proche de celle de l'eau, étant donné sa part importante dans la constitution de celui-ci. Ainsi, les canalisations se comportent comme si elles étaient recouvertes d'une couche d'eau stagnante.

La détérioration des matériaux est une autre conséquence de la présence du biofilm. Dans l'industrie pétrolière, la corrosion influencée microbiologiquement ou « biocorrosion » a conduit au percement de conduites par des attaques localisées à des vitesses de pénétration supérieures à un centimètre par an, comme au Congo en 1990 [1]. Dans certains ports tel que celui de Boulogne sur Mer (Pas de Calais), la perforation des palplanches aux plus bas niveaux des marées est attribuée à la corrosion bactérienne [2].

Pour palier à tous ces inconvénients et lutter contre la formation de biofilms, les industriels et les exploitants de réseaux utilisent différentes techniques dont la principale est l'emploi de biocide (chlore par exemple). Ainsi, exception faite des domaines particuliers que sont la pharmacie et la microélectronique, où des efforts considérables sont alloués pour la prévention de toute formation de biofilm, on se limite dans la majorité des cas à un contrôle de son développement.
L'étude du biofilm est un thème de recherche interdisciplinaire nécessitant d'aborder les domaines de la biologie, de la chimie, de la physique et de l'écologie. Les spécialités indispensables à son étude sont donc nombreuses. Dans ce travail, l'électrochimie constituera la base de la méthode de caractérisation et quelques analyses microbiologiques seront réalisées en parallèle.

L'objectif de ce travail est de proposer et de valider une méthode électrochimique de détermination de l'épaisseur de biofilms développés en milieux naturels et artificiels, afin de la transposer à la réalisation d'un prototype de capteur industriel.

Dans la première partie, ce manuscrit permet au lecteur, à travers une rapide description du biofilm, de mieux appréhender la complexité de sa détection. L'étude bibliographique montre que le biofilm est décrit de par sa structure et sa teneur en eau comme une couche poreuse homogène d'un point de vue macroscopique. Pour son développement, différents milieux (eau de mer, eau douce et bouillon nutritif) sont utilisés. Les méthodes d'étude, basées sur l'analyse du transport de matière à travers une couche poreuse, sont des méthodes dites stationnaires comme la voltampérométrie et la mesure du courant limite de réduction d'un traceur électrochimique.

Dans la deuxième partie, le prolongement de cette étude est le développement d'un capteur permettant la détermination *in situ* de l'épaisseur de biofilm. Les méthodes existantes de détection et de suivi du biofilm sont nombreuses et ont souvent recours à la biologie. Le capteur, basé sur l'application d'une méthode électrochimique, permet d'évaluer la capacité d'un milieu à développer un biofilm sur une paroi.
# Introduction de la première partie

La première partie de ce manuscrit décrit les résultats d'études effectuées en laboratoire, dans le prolongement de ceux obtenus durant la thèse de E. L'Hostis [3]. Lors de cette étude, elle a montré qu'à partir de la mesure du courant limite de diffusion d'un traceur électrochimique, il est possible de déduire l'épaisseur du biofilm formé jusqu'à deux semaines d'immersion.

Après validation des résultats obtenus par E. L'Hostis [3], la méthode électrochimique est évaluée en vue du développement d'un capteur industriel pour permettre une détermination d'une épaisseur de biofilm pour des temps d'immersion allant jusqu'à quelques mois.

Le premier chapitre expose les connaissances de base sur le biofilm, qui a l'échelle microscopique présente une structure hétérogène, où des amas de bactéries et d'exopolymères sont juxtaposés à des zones qui en sont exemptes. Dans le second chapitre, les méthodes expérimentales d'études sont développées pour deux traceurs, l'oxygène et le ferricyanure. Enfin dans un dernier chapitre, les résultats de cette étude sont présentés en eau de mer naturelle, en eau douce et dans un bouillon nutritif pour différentes conditions expérimentales.
# Chapitre I.

## Connaissances générales sur le biofilm.

Ce chapitre a simplement pour but, à travers une rapide description du biofilm, de permettre au lecteur de mieux appréhender sa complexité et les enjeux de sa détection. Une large description du biofilm a été faite par E. L'Hostis lors de son travail de thèse [3]. Nous ne reprendrons donc ici que les informations déterminantes et les nouvelles données apparues depuis.

Des cellules bactériennes adhérent et colonisent à plus ou moins long terme toutes les surfaces présentes dans un environnement médical, industriel ou aquatique. En milieu aqueux, il est apparu que les microorganismes résidaient préférentiellement à la surface des matériaux, l'adhésion et la communauté en biofilm favorisant leur survie. Selon les microbiologistes, deux types de microorganismes peuvent être différenciés : les organismes planctoniques qui sont flottants et libres dans l'eau, et les organismes sessiles qui sont fixes et colonisent les surfaces. Les cellules adhérentes croissent, se divisent et excrètent des polymères organiques extracellulaires pour former une matrice de « fibres » fortement entrelacées, donnant alors naissance à un biofilm. Dans le cas le plus simple, ce biofilm est composé de cellules bactériennes et de leurs produits (ex : polymères extracellulaires). Un tel biofilm a généralement une structure très poreuse (> 80 % d'eau) [4-7], et il se compose également d'une part importante de particules inorganiques enlisées dans les exopolymères en raison de sa structure en réseau maillé. Au sein d'un biofilm, les organismes plus évolués cohabitent comme des algues, des protozoaires... Dans la plupart des écosystèmes, les biofilms sont généralement hétérogènes dans le temps et l'espace, mais aussi dans le génotype [8, 9].
# 1 FORMATION DU BIOFILM

La formation d'un biofilm sur les surfaces exposées en eau de mer a fait l'objet de nombreuses études tant en milieu naturel qu'en laboratoire. De nombreux auteurs [10-17] qui traitent de la formation du biofilm sont d'accord pour dire qu'elle s'effectue en trois grandes étapes : initiation, croissance et stabilisation (Figure 1.1).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1.1 : Formation du biofilm [18].</figcaption></figure>

La première étape, dans les minutes qui suivent l'immersion, correspond à l'adsorption de macromolécules organiques (exopolymères, glycoprotéines, acides humiques) et/ou inorganiques présentes dans le milieu ou secrétées par les micro-organismes vivants dans ce milieu. Ces macromolécules adsorbées constituent ainsi le film primaire. Celui-ci est essentiel car en modifiant certaines propriétés de surface du matériau (tension de surface, énergie libre de surface, polarité, mouillabilité), il conditionne l'attachement ultérieur des bactéries [11]. L'état de surface du matériau (rugosité) est un facteur déterminant non négligeable dans la formation de la couche primaire [15]. En effet, la rugosité augmente le nombre de sites d'adsorption et d'adhésion puisque à une grande rugosité correspond une surface plus importante. De plus, l'énergie libre et la tension de surface sont différentes sur une surface parfaitement lisse ou très rugueuse. Aussi, les macromolécules formant le film
primaire vont se fixer préférentiellement sur une surface où l'énergie déployée pour l'adhésion est moindre.

C'est la phase d'amorçage ou d'initiation qui conditionne les suivantes par la formation d'une monocouche discontinue de bactéries. L'adhésion irréversible est la conséquence de l'activité métabolique des bactéries, qui se traduit notamment par la sécrétion d'exopolymères.

La phase de croissance met en scène une colonisation en multicouches discontinues et/ou continues selon E. S. Beardwood [18]. Le taux de croissance est alors élevé et exponentiel par la multiplication de nombreuses espèces. Une étape de ralentissement apparaît : les bactéries s'accumulent sous forme de couches multiples, créant ainsi une zone anaérobie à la base du film. La croissance du biofilm est contrôlée par les processus cinétiques et de transport de masse [19].

Durant la phase plateau, ou de stabilisation, il y a une forte population avec prédominance de certaines espèces. Le biofilm a alors atteint son épaisseur et sa masse maximales. Lors de cette même phase de stabilisation apparaît une étape d'érosion avec décrochage partiel du voile biologique et possibilité d'évolution vers une minéralisation du dépôt (entartrage). L'arrachement du biofilm peut être provoqué par une modification brutale des conditions hydrodynamiques et les contraintes de cisaillement imposent l'épaisseur du biofilm.

La phase plateau marque la fin de la croissance du biofilm, qui se caractérise par la lyse cellulaire dans les couches profondes, et le détachement des cellules responsables de la fixation du biofilm au support. Pour R. C. Hoehn et A. D. Ray [20], ce détachement est le plus souvent dû à l'épaississement du biofilm qui conduit à l'épuisement en oxygène et en nutriments dans les couches profondes. Cependant, des auteurs ont montré que certaines bactéries aérobies peuvent développer une capacité anaérobie lorsqu'elles se trouvent privées d'oxygène [18, 21]. Par ailleurs, le biofilm va libérer des bactéries, ou « corps flottants », tandis que des « éclaireurs » planctoniques mobiles sont envoyés pour coloniser de nouvelles surfaces [5, 6, 18, 22].
## 2 FACTEURS CONDITIONNANT LE DEVELOPPEMENT DU BIOFILM

Le flux en nutriments organiques assimilables qui diffusent à travers le biofilm est le principal facteur favorable à son développement. Le Carbone Organique Dissous Biodégradable (CODB) est le nutriment des bactéries hétérotrophes. Par exemple, dans le cas des réseaux d'eau potable, aucun traitement ne parvient à éliminer totalement le CODB. Par conséquent, les bactéries sessiles du biofilm auront toujours les nutriments nécessaires à leur développement et à leur reproduction, quels que soient les traitements de l'eau employés.

Un « état de stress » permet également le développement du biofilm par une production importante de polymères extracellulaires. La fixation des bactéries, grâce au réseau polymérique, leur assure une meilleure capacité à survivre et se développer dans un milieu oligotrophe. Un stress par carence nutritive conduit à la sécrétion d'exopolymères qui absorbe le substrat, qui s'est raréfié.

La température de l'eau est un autre facteur favorisant la croissance du biofilm. Plus celle-ci est élevée, plus la prolifération des bactéries est importante. Une faible vitesse d'écoulement favorise également la formation du biofilm, et inversement un débit d'eau trop important empêche ou retarde bien souvent son apparition. Mais une fois formé, le voile biologique est très dense et adhérent fortement à la surface du support.

Le revêtement ainsi que l'état des surfaces peuvent induire ou inhiber partiellement l'ancrage bactérien. Le polyéthylène, par exemple est reconnu comme donnant des biofilms moins importants en concentration bactérienne, et de même les canalisations en polychlorure de vinyle (PVC) entraînent des biofilms plus faibles que les canalisations en ciment. Une surface oxydée ou présentant des aspérités favorise également l'accrochage des bactéries.

H. C. Flemming en décrivant les domaines d'existence du biofilm sous forme de liste non limitative rapporte que des bactéries peuvent se développer et donc un biofilm croître dans des environnements divers et extrêmes (Tableau 1.1) [14].
<table><caption>Tableau 1.1 : Domaines d'existence du biofilm [14].</caption><tr><td>Température</td><td>De -12°C à +115°C</td></tr><tr><td>pH</td><td>De 0 à 13</td></tr><tr><td>Salinité</td><td>De 0 à presque toutes les solutions saturées en sel</td></tr><tr><td>Potentiel redox</td><td>Tous les potentiels en eaux naturelles</td></tr><tr><td>Pression hydrostatique</td><td>De 0,01 bar à plus de 1400 bar</td></tr><tr><td>Concentration en nutriment</td><td>A partir de 10 µg.L<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Matériaux</td><td>Tous les types de surface</td></tr><tr><td>Concentration en biocide</td><td>Croissance jusqu'à 2 mg.L<sup>-1</sup> de chlore</td></tr><tr><td>Radiation</td><td>Croissance sur les écrans de quartz des lampes UV<br>Croissance sur de sources radioactives (&gt; 400 krad)</td></tr></table>

La formation plus ou moins rapide du biofilm lui confère une structure complexe. Sa morphologie et sa structure varient avec l'âge et dépendent des conditions externes comme l'apport de nutriment ou la vitesse d'écoulement. Comme cela a été dit précédemment, la structure du biofilm est aussi déterminée par le rapport entre les forces de détachement et le taux de production de la biomasse dans le biofilm [15]. En présence de forces faibles et d'une production importante d'exopolymères, le biofilm est peu dense, par contre sous l'action de contraintes importantes, sa densité augmente afin d'être plus résistant [23, 24].

## 3 STRUCTURE DU BIOFILM

L'image d'un biofilm homogène, qui a longtemps dominé tous les modèles jusque dans les années 1980, a volé en éclats avec l'application du microscope laser à balayage confocal à son étude [6].

Dans les années 80, le biofilm était représenté comme une structure plane avec une distribution homogène des cellules. Le transfert de masse était diffusionnel et perpendiculaire au substratum [25, 26].

La nouvelle description du biofilm le montre comme une structure hautement complexe contenant des cavités, communiquant par des canaux (Figure 1.2). La biomasse (« clusters » de cellules et partie fixée sur le support) et la solution liquide dans les espaces
constituent le biofilm. Des « clusters », amas microbiens, où les métabolites cellulaires et leurs produits sont plus concentrés, ont pu être mis en évidence, ils sont séparés par des interstices. Ces espaces facilitent le transport de masse convectif, favorisant une forte concentration de nutriments. Ce type de structure permet l'échange de nutriments avec le biofilm et met en défaut la notion de gradient de substrat. Ceci est la conséquence du transfert diffusif à travers un milieu poreux. Cette structure complexe a été trouvée dans des biofilms différents comme ceux des réacteurs, ceux des usines de traitements des eaux et ceux des cultures de *Pseudomonas aeruginosa* (bactéries présentes dans les réseaux de distribution d'eau potable) [6, 8, 9, 24, 27-29]. Cependant une telle structure n'est valable que pour une épaisseur de quelques dizaines de micromètres.

Cette structure, dite en « champignon » [4-7, 19, 30-32] ou en « tulipe », est caractérisée par des formes fractales [33]. Le biofilm n'est plus homogène mais hétérogène, aussi bien en profondeur qu'en distribution spatiale [34]. Il est hautement stratifié, caractérisé par une augmentation de la densité et par une diminution de la porosité en fonction de la distance à la paroi, ainsi que par une diminution de l'activité métabolique [28]. Un modèle à trois dimensions est nécessaire pour calculer complètement le transport de matière [30].

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1.2 : Structure du biofilm décrite comme tortueuse, fortement hydratée, poreuse, stratifiée et contenant de nombreux canaux [6].</figcaption></figure>
Le biofilm est en majorité composé d'eau (80 à 95 %), d'exopolymères (comprenant des EPS, des protéines, des acides aminés...), qui constituent 85-98 % de la matière organique, de micro-organismes et de particules organiques et inorganiques [4-7, 14, 15, 30-32, 35]. Les bactéries ne représentent qu'un faible pourcentage du biofilm. Au sein de celui-ci, plus la densité augmente et plus la porosité diminue. Ces deux grandeurs physiques ne sont pas homogènes d'un point de vue microscopique [19]. La densité est une grandeur macroscopique à la différence de la porosité qui, est une grandeur microscopique. Avec le temps d'immersion, le biofilm va se densifier avec notamment une minéralisation du dépôt. Notons également que la densité locale peut varier fortement avec l'épaisseur où pour un biofilm de plusieurs centaines de micromètres d'épaisseur, la densité varie au sein même de la couche en fonction de la distance à la paroi [20].

Des mesures réalisées avec une microélectrode montre que la concentration en oxygène dissous peut être nulle sous un biofilm d'épaisseur 180 µm [36], confirmant ainsi que des zones aérobies et anaérobies peuvent coexister au sein même du biofilm. Le suivi de la concentration en oxygène pour caractériser un biofilm ne peut donc se faire que dans le cas de biofilms de faibles épaisseurs (une centaine de micromètres maximum). Cette distribution de l'oxygène est fortement corrélée à la structure du biofilm lui-même et le profil de concentration en oxygène (par microscope laser à balayage confocal et microélectrode) varie en fonction du temps. Tout d'abord, l'oxygène pénètre de façon importante dans le cluster puis peu à peu, il est ralenti. La concentration sur le substratum est plus importante qu'au milieu du cluster. Les trous étant souvent interconnectés avec des canaux parallèles au support, la diffusion va se faire surtout dans une direction normale à l'interface. Les modèles de structure du biofilm ont pu être affinés par des mesures de densité [27] et par l'utilisation de microélectrodes pour le transport des espèces dissoutes [19].

En conséquence, le biofilm doit pouvoir se développer dans de nombreux milieux comme ceux que nous allons utiliser par la suite (eau de mer, eau potable et bouillon nutritif). La structure très complexe d'un point de vue microbiologique l'est beaucoup moins d'un point de vue macroscopique. A l'échelle microscopique, le biofilm est hétérogène. A l'échelle macroscopique, celui-ci peut alors être considéré comme une couche d'eau stagnante sur la surface des matériaux de part sa structure et une épaisseur moyenne doit pouvoir être déterminée. Lors de cette détermination, le biofilm est alors considéré comme homogène.

Les méthodes classiques de microbiologie, très employées pour étudier et détecter le biofilm, présentent de nombreuses contraintes comme la nécessité de prélever des
échantillons et d'effectuer des manipulations longues... (Chapitre I de la deuxième partie). Pour palier à ces inconvénients, une technique électrochimique a été proposée pour détecter le biofilm [3]. A partir d'une mesure instantanée du courant limite de diffusion, l'épaisseur du biofilm développé sur l'électrode peut être calculée.
# Chapitre II.

## Conditions expérimentales et méthodes d'étude.

Le biofilm doit pouvoir être détecté dans des milieux variés, essentiellement eau de mer et eau douce (potable ou non), et dans des conditions hydrodynamiques différentes (écoulement tubulaire laminaire ou turbulent, écoulement engendré par un disque tournant). Les méthodes électrochimiques développées dans ce travail prennent en compte ces différentes possibilités.

# 1 METHODES ELECTROCHIMIQUES

## 1.1 MODELE PHYSIQUE : ANALYSE DU TRANSPORT DE MATIERE AU VOISINAGE D'UNE ELECTRODE RECOUVERTE D'UNE COUCHE POREUSE

Une couche poreuse d'épaisseur $\delta_f$ recouvrant la surface d'une électrode métallique agit comme une barrière de diffusion (Figure 1.3) [37]. L'interface métal/couche est supposée uniformément réactive. Le gradient de concentration de l'espèce électroactive est distribué entre :

- la solution, où le transport de matière est contrôlé par un processus de diffusion convective. Le flux suit alors l'équation de Nernst-Plank :

$$ J = -D\nabla c + c\theta \qquad \text{Eq. 1.1} $$

- la couche poreuse, où le transport de matière est contrôlé par un processus de diffusion moléculaire. L'expression du flux revient à :

$$ J = -D\nabla c \qquad \text{Eq. 1.2} $$

Dans cette étude, l'électrolyte support est supposé en excès et ainsi le flux de migration pourra être systématiquement négligé.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 1.3 : Profil de concentration des espèces électroactives consommées à la surface d'une électrode recouverte d'une couche poreuse en fonction de la coordonnée axiale x, où $\delta_f$ est l'épaisseur de la couche poreuse, $\delta_n$ l'épaisseur de la couche de diffusion, $c_\infty$ la concentration de l'espèce électroactive dans la solution électrolytique et $c_o$ la concentration de l'espèce électroactive à l'interface couche poreuse/électrode [38].</figcaption></figure>

Pour une électrode à disque tournant, la surface est uniformément accessible, c'est-à-dire que $V_x$ n'est fonction de x ($V_x$ = -$ax^2$ et $V_r$ = $ax$) [39, 40]. Une représentation de l'écoulement est donnée sur la Figure 1.4.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 1.4 : Mouvement d'un fluide créé par une EDT.</figcaption></figure>
En absence de couche poreuse, V. G. Levich [41] a calculé le courant limite de diffusion sur une électrode tournante. Ce courant s'écrit :

$$i_L = 0.620*n*F*S*D^{2/3}*v^{-1/6}*\sqrt{\frac{2\pi}{60}}*\Omega^{1/2}*c_{\infty} \quad \text{Eq. 1.3}$$

$$\text{ou} \quad i_L = K*\Omega^{1/2} \quad \text{Eq. 1.4}$$

En présence d'une couche poreuse, le système, décrit par les équations 1.1 et 1.2, s'intègre analytiquement [38] et l'expression du courant s'écrit :

$$i = \frac{1}{i_f^{-1} + i_L^{-1}} \quad \text{Eq. 1.5}$$

où

- $i_L$ est le courant de Levich (Eq. 1.3)

- et $i_f^{-1} = \frac{\delta_f}{n F S D_f c_\infty}$ \quad Eq. 1.6

avec $c_\infty$: concentration du traceur électrochimique dans la solution,

$\delta_f$: épaisseur de la couche poreuse,

$D_f$: coefficient de diffusion à travers la couche poreuse.

Généralement, et ainsi que cela a été démontré par E. L'Hostis [3], si la couche poreuse est considérée comme une couche solide d'épaisseur indépendante de la vitesse de rotation de l'électrode, alors l'analyse de l'équation 1.5 s'effectue d'après la représentation de Koutecky-Levich (Figure 1.5).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 1.5 : Représentation de Koutecky-Levich.</figcaption></figure>

$i_f^{-1}$ est déduit à partir de l'ordonnée à l'origine de la droite représentant la variation de $i^{-1}$ en fonction de $\Omega^{-1/2}$. Cette droite est parallèle à celle qui représente la variation de $i_L^{-1}$.

Cette méthode permet donc de déterminer $i_f$ et par la même $\frac{D_f}{\delta_f}$ d'après l'équation 1.6.

Dans le cas particulier d'un biofilm, les diagrammes d'impédances électro-hydro-dynamiques (EHD) d'E. L'Hostis [3, 42] ont montré que d'une part, ils correspondent au comportement d'une électrode recouverte d'une couche poreuse sans effet de blocage sur la surface [43], en accord avec les diagrammes stationnaires, et que d'autre part, le coefficient de diffusion de l'espèce electroactive dans la solution D et le coefficient de diffusion de cette même espèce dans la couche poreuse $D_f$ sont quasiment identiques :

$$D \approx D_f \qquad \text{Eq. 1.7}$$

La mesure de $i_f$ permet alors de remonter à $\delta_f$, l'épaisseur du biofilm.

Dans le travail présenté, et quelle que soit l'épaisseur du biofilm mesurée (quelques dizaines de micromètres), la relation 1.7 est toujours considérée comme vérifiée. L. F. Melo a aussi suggéré que la densité et la conductivité thermique du biofilm sont considérées comme égale à celle de l'eau [15].

## 1.2 VOLTAMPEROMETRIE OU COURBES COURANT – POTENTIEL, i = f(E)

La voltampérométrie consiste à imposer à l'électrode de travail, un potentiel variant linéairement avec le temps à partir d'une valeur initiale (généralement $E_{i=0}$) et à enregistrer
la réponse en courant. Les courbes de polarisation ainsi obtenues renseignent sur les processus électrochimiques mis en jeu entre l'électrolyte et le matériau. Cela permet de connaître l'influence du biofilm sur les processus cinétique et diffusionnel à l'interface de l'électrode.

Les vitesses de balayage en potentiel utilisées au cours de ce travail sont 1, 2 et 5 mV.s⁻¹. Lorsque les courbes obtenues à 1 et 2 mV.s⁻¹ sont confondues, la vitesse de balayage de 2 mV.s⁻¹ sera choisie, et de même lorsque les courbes obtenues à 2 et 5 mV.s⁻¹ sont confondues, c'est la vitesse de 5 mV.s⁻¹ qui sera choisie. Dans tous les cas, les courbes tracées pourront être considérées comme quasi stationnaires.

Les courbes ainsi obtenues permettent de déterminer la plage de potentiel correspondant au courant limite de diffusion.

## 1.3 COURBES COURANT – VITESSE DE ROTATION, i = f(Ω)

L'électrode étant polarisée à un potentiel correspondant au courant limite de diffusion, ce courant est enregistré en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode.

# 2 DISPOSITIF EXPERIMENTAL

## 2.1 ÉLECTROLYTE

Pour ce travail, les différents milieux utilisés pour suivre le développement du biofilm sont l'eau de mer, l'eau douce et un bouillon nutritif.

### 2.1.1 Eau de mer

L'eau de mer de la rade de Brest (Finistère, France) est pompée par dix mètres de profondeur puis recueillie dans un château d'eau. Elle est alors utilisée par les différents laboratoires du centre de Brest de l'IFREMER. Les principaux paramètres physico-chimiques sont répertoriés dans le Tableau 1.2. La concentration en oxygène dissous est déterminée par la méthode polarographique de Winkler [45]. Notons que ces paramètres peuvent varier légèrement au cours des saisons. Les principaux composés chimiques de l'eau de mer sont représentés dans le Tableau 1.3. Les différents éléments composants la matière organique sont répertoriés dans le Tableau 1.4. Le Tableau 1.5 montre les différentes souches de bactéries pionnières adhérentes cultivables hétérotrophes en eau de mer (9 phénons et 16 isolats). Néanmoins, d'après Ph. Féra [44], il n'y a pas d'évolution importante du nombre de bactéries en fonction des saisons.
<table><caption>Tableau 1.2 : Paramètres caractéristiques de l'eau de mer prélevée à Sainte-Anne du Portzic, en rade de Brest.</caption><tr><td>pH</td><td>De 8 à 8,3</td></tr><tr><td>Concentration en oxygène dissous (O<sub>2</sub>)</td><td>De 8 à 10 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Salinité [45]</td><td>De 32 à 36 g.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Conductivité à 23 °C</td><td>De 40 à 54 mS.cm<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Turbidité [45]</td><td>De 0,5 à 5 NTU</td></tr><tr><td>Densité bactérienne (Marine Agar 2216 DIFCO)</td><td>De 10<sup>2</sup> à 10<sup>3</sup> bact.ml<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Température, thermostatée</td><td>23 ± 2°C</td></tr></table>

<table><caption>Tableau 1.3 : Principaux paramètres chimiques de l'eau de mer [45].</caption><tr><td>Chlorure (Cl<sup>-</sup>)</td><td>19,4 g.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Sodium (Na<sup>+</sup>)</td><td>10,8 g.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Sulfate (SO<sub>4</sub><sup>-2</sup>)</td><td>2,7 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Magnésium (Mg<sup>2+</sup>)</td><td>1,3 g.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Calcium (Ca<sup>2+</sup>)</td><td>410 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Potassium (K<sup>+</sup>)</td><td>400 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Bicarbonate (HCO<sub>3</sub><sup>-</sup>)</td><td>142 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Bromure (Br<sup>-</sup>)</td><td>67 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Acide borique (B(OH)<sub>3</sub>)</td><td>26 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Strontium (Sr<sup>2+</sup>)</td><td>8 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Fluorure (F<sup>-</sup>)</td><td>1,3 mg.kg<sup>-1</sup></td></tr></table>

<table><caption>Tableau 1.4 : Composition de la matière organique dans l'eau de mer [46].</caption><tr><td>Acides organiques</td><td>De 5 à 50 µg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Acides aromatiques</td><td>&lt; 1 µg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Acides aminés</td><td>De 50 à 200 µg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Acides gras</td><td>De 1 à 20 µg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Oses</td><td>De 0,25 à 0,75 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Polysaccharides</td><td>De 2,5 à 25 mg.l<sup>-1</sup></td></tr></table>
<table><caption>Tableau 1.5: Bactéries pionnières adhérentes cultivables hétérotrophes en novembre 1998 en eau de mer naturelle à Brest [47].</caption><thead><tr><td>Phénon</td><td>Isolats</td><td>Identification</td></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>01</td><td>Vibrio vulnificus</td></tr><tr><td>D</td><td>04</td><td>Pseudomonas</td></tr><tr><td></td><td>06</td><td>Non déterminé</td></tr><tr><td>D</td><td>12</td><td>Pseudomonas</td></tr><tr><td>E</td><td>16</td><td>Flavobacterium / Cytophaga</td></tr><tr><td>E</td><td>22</td><td>Pseudomonas sp.</td></tr><tr><td>E</td><td>23</td><td>Pseudomonas sp.</td></tr><tr><td>C</td><td>34</td><td>Pseudomonas sp.</td></tr><tr><td>H</td><td>41</td><td>Pseudomonas sp.</td></tr><tr><td>E</td><td>42</td><td>Acinetobacter</td></tr><tr><td>E</td><td>43</td><td>Acinetobacter</td></tr><tr><td>B</td><td>53</td><td>Pseudomonas sp.</td></tr><tr><td>A</td><td>61</td><td>Vibrio vulnificus</td></tr><tr><td>A</td><td>66</td><td>Vibrio</td></tr><tr><td>E</td><td>73</td><td>Pseudomonas sp.</td></tr><tr><td>I</td><td>74</td><td>Pseudomonas stutzeri</td></tr></tbody></table>

### 2.1.2 Eau douce

L'eau douce utilisée lors des manipulations est issue du réseau d'eau potable du centre de Brest de l'IFREMER, distribuée par la Communauté Urbaine de Brest (juin 1998 à août 1998). Les principaux paramètres de cette eau potable sont répertoriés dans le Tableau 1.6. Les principaux micro-organismes<fnref n="1" /> des réseaux de distribution sont :

- Des bactéries : Actinomycètes, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Citrobacter, E. coli, Enterobacter, Flavobacterium, Klebsiella, Micrococcus, Pseudomonas, Staphylococcus, Nitrobacter, Thiobacillus, Gallionella, Leptothrix;

<footnote n="1">¹ Données fournies par le CIRSEE.</footnote>
- Des moisissures : *Pénicillium*, *Aspergillus*, *Rhizopus* ;

- Des levures : *Candida* ;

- Des protozoaires flagellés : Colpidium, amibes.

<table><caption>Tableau 1.6 : Paramètres caractéristiques de l'eau potable du réseau alimentant le technopôle Brest Iroise en juin 1998.</caption><tr><td>pH</td><td>8,0</td></tr><tr><td>Concentration en oxygène dissous (O<sub>2</sub>)</td><td>9 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Concentration en chlore libre<sup>2</sup> (Cl<sub>2</sub>)</td><td>0,05 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Conductivité<sup>2</sup> à 20 °C</td><td>383 µS.cm<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Turbidité<sup>2</sup></td><td>0,6 NTU</td></tr><tr><td>Densité bactérienne<sup>2</sup></td><td>1 UFC.ml<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Matière organique<sup>2</sup> (oxydabilité au permanganate &lt; 5)</td><td>0,2</td></tr><tr><td>Température</td><td>18 °C</td></tr><tr><td>Magnésium (Mg<sup>2+</sup>)</td><td>8 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Calcium (Ca<sup>2+</sup>)</td><td>35 mg.l<sup>-1</sup></td></tr></table>

### 2.1.3 Bouillon nutritif

Le milieu de culture est un bouillon nutritif à 1‰ de chez Diagnostic Pasteur (code 64065), autoclavé à 120°C pendant 20 minutes. Les principaux paramètres physico-chimiques de ce bouillon sont énumérés dans le Tableau 1.7.

<table><caption>Tableau 1.7 : Paramètres caractéristiques du bouillon nutritif.</caption><tr><td>Concentration en oxygène dissous (O<sub>2</sub>)</td><td>8 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Salinité</td><td>10 g.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>COT (carbone organique total)</td><td>De 35 à 40 mg.l<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Énumération bactérienne sur gélose R<sub>2</sub>A</td><td>De 10<sup>7</sup> à 10<sup>8</sup> UFC.ml<sup>-1</sup></td></tr><tr><td>Température</td><td>20 °C</td></tr></table>

<footnote n="2">² Données fournies par la DDASS.</footnote>
Deux souches différentes de *Pseudomonas aeruginosa* sont ensemencées dans le bouillon nutritif de quatre réacteurs électrochimiques. La première souche est constituée de *Pseudomonas aeruginosa* SG41, sélectionnée pour son caractère naturellement « mucoïde ». Elle est issue d'installations de traitement d'eau potable. La seconde est une mutante de la première, constituée de *Pseudomonas aeruginosa* SG41 R1, elle a perdu ses propriétés à produire des exopolymères. Ce caractère peut être mis en évidence sur un milieu de gélose spécifique des *Pseudomonas*, comme par exemple le milieu *Pseudomonas Isolation Agar (PIA)*. L'expression du caractère mucoïde (c'est à dire le phénotype mucoïde) est sous une double dépendance : génétique et condition de culture (nature du milieu).

## 2.1.4 Incubateurs

Selon les milieux de développement du biofilm et les conditions hydrodynamiques souhaitées, différents incubateurs ont été utilisés (Tableau 1.8).

### Incubateur tubulaire (Type I) :

Les électrodes sont disposées le long d'un tube dans lequel circule le milieu. Avec ce type d'incubateur, les électrodes doivent être déplacées pour faire les mesures dans une cellule électrochimique.

### Réacteurs permettant la rotation de l'électrode (Type II) :

Les électrodes ne sont pas manipulées entre les périodes de développement du biofilm et les séquences de mesures. L'électrolyte est renouvelé en permanence à raison de 6 l·h⁻¹. La vitesse de rotation des électrodes pendant la formation du biofilm est de 300 tours par minute (tr.min⁻¹).

### Réacteurs stériles (Type II) :

Ce réacteur étanche autorise la rotation de l'électrode en maintenant le milieu de culture à l'abri des contaminations. Le principe de la cellule réside dans la mise en place d'un joint tournant liquide. Pour cela, le couvercle de la cellule est équipé d'une gorge remplie d'alcool, dans lequel une cloche solidaire de l'électrode est insérée (voir Schéma, Tableau 1.8). L'étanchéité entre le corps et le couvercle de la cellule ainsi que celle des différents accès (électrode de référence, contre électrode, tuyaux d'alimentation, prélèvements) sont assurées par des joints SOVIREL.

Avant la mise en service du système, les réacteurs électrochimiques sont lavés au Décon. Les réacteurs ainsi que les circuits d'alimentation en milieu nutritif sont ensuite
javellisés à 15 g.l⁻¹ pendant 24 heures et ils sont rincés avec le milieu d'incubation stérile pendant 48 heures au minimum.

<table><caption>Tableau 1.8 : Les différents incubateurs lors du vieillissement des électrodes.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Type d'incubateurs</th><th rowspan="2">Incubateur tubulaire</th><th colspan="2">Réacteur électrochimique permettant la rotation de l'électrode</th></tr><tr><th colspan="2">Type II</th></tr><tr><th></th><th>Type I</th><th>non stérile</th><th>stérile</th></tr></thead><tbody><tr><th>Nature du flux</th><td>Turbulent</td><td>Laminaire</td><td>Laminaire</td></tr><tr><th>Nombre de Reynolds</th><td>Re = 15000</td><td>Re = 785</td><td>Re = 785</td></tr><tr><th>Electrolyte utilisé</th><td>Eau potable</td><td>Eau de mer</td><td>Bouillon nutritif contenant des Pseudomonas</td></tr><tr><th>Détermination de l'épaisseur</th><td>Dans un autre réacteur</td><td>Directement dans le réacteur</td><td>Directement dans le réacteur</td></tr><tr><th>Schéma de principe</th><td>Electrode<br>Electrolyte<br>Tube</td><td>Contre Electrode<br>Electrolyte<br>Thermostat</td><td>Contre Electrode<br>Electrolyte<br>Thermostat</td></tr><tr><th>Photo</th><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

<figure><img src="image_12.png" /></figure>
## 2.2 APPAREILLAGE ELECTRONIQUE

Un seul et même dispositif, schématisé sur la Figure 1.6, a été utilisé pour la voltampérométrie et les mesures de courants stationnaires qui permettent la détermination de l'épaisseur du biofilm. Il se compose :

- d'une cellule électrochimique à trois électrodes,

- d'un potentiostat SOLARTRON 1286 ou 1280, EGG ou VINCI suivant le cas,

- d'un ordinateur qui réalise l'acquisition des données (logiciel XTALK, CORR ou CORRWARE suivant le montage expérimental).

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 1.6 : Représentation schématique du montage expérimental.</figcaption></figure>

## 2.3 CELLULE DE MESURE

### 2.3.1 Electrode de travail

L'électrode de travail est une électrode à disque tournant, constituée d'un disque d'or de diamètre 10 mm (soit 0,785 cm²), montée sur un embout en acier inoxydable, et visée sur une tige métallique. Le tout est enrobé dans un matériau isolant (Figure 1.7). L'électrode peut être séparée de son support afin de permettre des observations de sa surface par microscopie à épifluorescence.
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 1.7 : Electrode de travail à disque tournant (EDT).</figcaption></figure>

Les vitesses de rotation de l'électrode vont de 100 à 1100 tr.mn⁻¹. Cette vitesse maximale a été choisie car elle correspond à des conditions où aucun décrochement du biofilm n'a été observé.

### Choix de l'EDT :

Dans la pratique, les structures sur lesquelles se déposent le biofilm sont plus souvent en acier qu'en or ! Le but de ce travail étant la mesure d'épaisseur d'un biofilm sur une surface métallique, l'or a été choisi en raison son immunité afin de se prémunir de l'influence d'une couche supplémentaire de produits de corrosion, [48]. L'influence du biofilm sur les aciers inoxydables est, quant à elle, étudiée dans les travaux de N. Le Bozec [49].

### Préparation de l'EDT :

L'électrode est polie au papier abrasif de carbure de silicium de grains 1000. Après rinçage à l'eau distillée, elle est nettoyée aux ultrasons dans de l'alcool, et polie sur papier abrasif de carbure de silicium de grains 4000. L'électrode est finalement nettoyée aux ultrasons dans de l'alcool et rincée à l'eau distillée.

### 2.3.2 Electrode de référence (ER)

L'électrode de référence est une électrode au calomel à solution saturée en KCl (ECS) RADIOMETER-TACUSSEL. La différence de potentiel de l'électrode par rapport à l'électrode normale à hydrogène (ENH) est 245 mV/ENH, à 25°C et à pression atmosphérique.

Par la suite, tous les potentiels seront exprimés par rapport à l'électrode au calomel saturé et leur unité est alors notée mV/ECS.
### 2.3.3 Contre-électrode (CE)

Une contre-électrode de grande dimension est constituée d'un fil de titane platiné d'un diamètre de 2 mm enroulé en forme en serpentin.

## 2.4 TRACEURS ELECTROCHIMIQUES

Selon l'électrolyte, un ou deux traceurs électrochimiques sont utilisés : l'ion ferricyanure $Fe(CN)_6^{3-}$ et l'oxygène [50].

### 2.4.1 Traceur ferricyanure

La réaction mise en jeu par le couple rédox $Fe(CN)_6^{4-}/Fe(CN)_6^{3-}$ est généralement employée pour l'étude du transport de matière car elle est extrêmement rapide.

Les propriétés essentielles de la courbe courant-potentiel de ce système sont rappelées sur la Figure 1.8.

Il est important de remarquer qu'une étude précédente [3] a permis de vérifier le caractère non bactéricide du traceur électrochimique $Fe(CN)_6^{4-}/Fe(CN)_6^{3-}$.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 1.8 : Courbe de polarisation dans une solution aqueuse neutre ou alcaline contenant le couple $Fe(CN)_6^{4-}/Fe(CN)_6^{3-}$ en concentration équimoléculaire.</figcaption></figure>
### 2.4.2 Oxygène

L'oxygène présente l'avantage d'être naturellement présent dans les eaux naturelles, sa concentration est donc imposée par le milieu.

La réduction de l'oxygène est généralement considérée comme s'effectuant en deux étapes :

$$ \begin{cases} O_2 + 2H_2O + 2e^- \rightarrow H_2O_2 + 2OH^- \\ H_2O_2 + 2e^- \rightarrow 2OH^- \end{cases} $$

$$ \text{Soit} \quad O_2 + 2H_2O + 4e^- \rightarrow 4OH^- $$

Les deux étapes sont des processus rapides et la réaction totale apparaît comme un transfert relativement rapide à quatre électrons, d'où l'apparition d'un palier limité par le transport de matière (Figure 1.9).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 1.9 : Courbe de polarisation dans une solution aqueuse neutre ou alcaline en présence d'oxygène.</figcaption></figure>
# 3 TECHNIQUES MICROBIOLOGIQUES

Dans le cadre de l'étude avec un milieu de culture artificiel, différentes techniques microbiologiques ont été mises en œuvre afin de connaître l'évolution bactériologique du milieu.

## 3.1 OBSERVATION OPTIQUE

Les observations au microscope et à la loupe binoculaire se font directement sur des lames de verre placées préalablement dans le milieu. Cette technique donne, en première approximation, la quantité de biofilm présent sur les lames. Cependant il faut une épaisseur de biofilm relativement importante et cette méthode reste toutefois subjective.

## 3.2 ENUMERATION PAR MICROSCOPIE A EPIFLUORESCENCE

L'observation par microscopie à épifluorescence nécessite une préparation spécifique des électrodes ou des lames de verre [3]. Cette technique permet l'observation des bactéries vivantes et mortes par leur coloration en bleue (due au Dapi). Grâce à une grille au niveau de la visée, il est possible de réaliser un comptage de bactéries. Cependant, l'expérimentateur peut être confronter à l'impossibilité de compter les bactéries disposées sur plusieurs couches. En effet, la faible profondeur du champ du microscope ne permet la visualisation que de la couche supérieure. De plus, le nombre de bactéries trouvées ne peut pas être directement relier à la quantité de biofilm.

## 3.3 DETERMINATION DE PARAMETRES CARACTERISTIQUES DES BIOFILMS SUR LAME

Des mesures d'ATP, d'activité exoprotéolytique, de dosage de protéines, et des énumérations sur milieu $R_2A$ et sur milieu spécifique des *Pseudomonas* (*Pseudomonas* Isolation Agar ou PIA) ont été effectués à partir des biofilms se trouvant sur les lames de verre. Pour cela, le biofilm est décroché de la lame de verre par ultrasons, puis la solution obtenue est homogénéisée au vortex.

### 3.3.1 Mesure de l'ATP

La mesure de la concentration en Adénosine TriPhosphate (ATP) traduit l'activité de la flore bactérienne. L'ATP est la forme de stockage de l'énergie au niveau d'une cellule. Cette énergie sera utilisée par la cellule pour faire différentes synthèses nécessaires à son maintien et/ou à sa croissance. L'ATP est dosé par une réaction de bioluminescence faisant
intervenir le substrat luciférine et l'enzyme luciférase. L'émission lumineuse est mesurée et intégrée pendant dix secondes par le Biocounter® M2500. L'ATP est exprimé en pictogramme par centimètre carré (pg.cm⁻²). En général, trois mesures successives sont effectuées pour chaque échantillon.

### 3.3.2 Mesure de l'activité exoprotéolytique

L'activité exoprotéolytique de la flore bactérienne est liée à la mesure de l'activité enzymatique (exopeptidase). La mesure est réalisée directement sur l'échantillon fixé sur le support et non après une étape de décrochage comme pour l'ATP.

### 3.3.3 Dosage de protéines

Le dosage des protéines des biofilms obtenus sur lame met en évidence la quantité de biomasse totale car les protéines sont un constituant cellulaire et sont présentes également au niveau des exopolymères. C'est une mesure globale traduisant la quantité de « matériau » biologique présent.

## 3.4 ÉNUMERATION BACTERIENNE

Les bactéries présentent dans le milieu de culture et dans les biofilms sont dénombrées sur deux types de milieux de culture (R₂A et PIA).

Après ensemencement et 7 jours d'incubation à 22 ± 2°C, le milieu R₂A permet de dénombrer le nombre maximal de microorganismes en comptabilisant les germes aérobies revivifiables mais aussi ceux qui ont pu être « stressés ».

Le milieu PIA est un milieu sélectif pour les *Pseudomonas*. Avant l'énumération, les boîtes de pétri sont placées 48 heures à 37°C.

## 3.5 VERIFICATION DE LA PURETE DES SOUCHES BACTERIENNES

La vérification de la pureté des souches est effectuée sur la gélose PIA. Ce milieu permet notamment de différencier les souches mucoïdes de celles qui ne le sont pas grâce au sel d'Irgasan (25 mg.l⁻¹) qui favorise la production de polysaccharides.

Notons que cette vérification se fait visuellement sur un milieu qui n'est pas le milieu de culture et de mesures électrochimiques.
# Chapitre III.

## Résultats expérimentaux.

Après validation de la méthode de mesure de l'épaisseur d'un biofilm en eau de mer, une généralisation de son application a été envisagée en eau potable et en eau synthétique. L'incidence de l'hydrodynamique sur la structure du biofilm a été également examinée en utilisant des incubateurs ayant des écoulements différents (turbulent et laminaire).

### 1 BIOFILM DEVELOPPE EN EAU DE MER

L'utilisation de deux traceurs (le ferricyanure et l'oxygène) pour déterminer l'épaisseur d'un même biofilm permet de valider la méthode décrite au chapitre précédent.

#### 1.1 TRACEUR FERRICYANURE [51]

##### 1.1.1 Courbes courant-potentiel, i=f(E)

La voltampérométrie montre que la cinétique du traceur ferricyanure n'est pas modifiée lors du développement du biofilm (Figure 1.10). La valeur du potentiel d'équilibre ne change pas en fonction du temps d'immersion et les courbes sont affines avec un rapport d'affinité correspondant au rapport des courants limites. Le courant limite de diffusion diminue avec le temps d'immersion et donc avec la croissance du biofilm. En effet, à -100 mV/ECS, à 300 tr.mn⁻¹ et à six semaines d'immersion, le courant passe de 375 µA à 253 µA (soit une réduction de 1/3 de sa valeur initiale).

Un potentiel de -100 mV/ECS correspondant au début du plateau (Figure 1.8) est choisi comme potentiel de polarisation de l'électrode pour les mesures de courant en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode. Dans ce cas, la mesure n'est pas perturbée par la réduction de l'oxygène (Figure 1.9).
<figure><img src="image_17.png" /></figure>

Figure 1.10 : Courbes de polarisation à 5 mV.s⁻¹ lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle à 300 tr.mn⁻¹ avec le traceur Fe(CN)₆³⁻. Mesures réalisées au temps initial —, à 2 semaines ■, 4 semaines ▲ et 6 semaines ●.

## 1.1.2 Courbes courant-vitesse de rotation, i=f(Ω)

Les courbes courant-vitesse de rotation (Figure 1.11) sont dans un premier temps tracées selon la représentation de Levich (voir Chapitre II). Au temps initial, la droite passe par 0, vérifiant ainsi la loi de Levich. Pour des temps d'immersion de deux, quatre et six semaines, une légère courbure apparaît, ce ne sont donc plus des droites. La loi de Levich n'est plus vérifiée et la représentation de Koutecky-Levich doit alors être utilisée pour déterminer l'épaisseur du biofilm.

La Figure 1.12 représente i⁻¹ en fonction de Ω⁻⁰.⁵. Au temps initial, la droite passe par 0, confirmant de nouveau la loi de Levich est vérifiée. Après deux semaines d'immersion, la courbe est sensiblement une droite et l'ordonnée à l'origine permet de déterminer une épaisseur du biofilm de 1,5 µm, ce qui est en accord avec les travaux d'E. L'Hostis [3].

Pour des temps d'immersion plus importants (4 et 6 semaines), ce ne sont plus des droites mais des courbes. En conséquence, l'analyse théorique exposée précédemment permettant la détermination de l'épaisseur du biofilm ne s'applique pas. L'hypothèse d'un blocage partiel de la surface [43] peut expliquer la courbure. Or d'après E. L'Hostis [3], les diagrammes d'impédances EHD ont montré qu'il n'y a pas de blocages sur la surface mais une couche poreuse.
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 1.11 : Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$. Mesures réalisées au temps initial —, à 2 semaines ■, 4 semaines ● et 6 semaines ▲.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 1.12 : Représentation de Koutecky-Levich lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$. Mesures réalisées au temps initial ♦, à 2 semaines ■, 4 semaines ● et 6 semaines ▲.</figcaption></figure>
L'exploitation des données obtenues jusqu'à présent [3] prenait comme hypothèse que l'épaisseur du biofilm $\delta_f$ est indépendante de la vitesse $\Omega$ de rotation de l'électrode. Maintenant, supposons que l'épaisseur du biofilm est dépendante de la vitesse de rotation de l'électrode, comme dans l'exemple de l'électrodissolution du cuivre en milieu acide où la dépendance de l'épaisseur d'une couche poreuse en fonction de la vitesse de rotation a été mise en évidence selon une variation $\delta=f(\Omega^{-0,5})$ [52]. L'équation $i = \frac{1}{i_f^{-1} + i_L^{-1}}$ est valide mais $i_f$ et $i_L$ dépendent de la vitesse de rotation de l'électrode. A t=0, $i_f^{-1}=0$ car il n'y a pas de biofilm sur l'électrode et $i(0)=i_L$.

Pour des temps t plus longs et à chaque vitesse de rotation, $i_f$ est facilement déduit à partir de la mesure du courant global $(i_f^{-1} = i(t)^{-1} - i_L^{-1})$. D'après la relation qui lie $\delta_f$ à $i_f$, l'épaisseur $\delta_f$ peut être obtenue :

$$ \delta_f = nFDc_\infty S(i(t)^{-1} - i(0)^{-1}) \quad \text{Eq. 1.8} $$

Cette équation originale, dans le cadre d'une application au biofilm prend en compte le fait que le coefficient de diffusion dans la solution et le coefficient de diffusion dans le biofilm sont identiques.

L'épaisseur à différents temps d'immersion est donnée sur la Figure 1.13. A partir de l'équation 1.8, à deux semaines d'immersion en eau de mer, entre 100 et 1100 tr.mn⁻¹, l'épaisseur varie entre de 2 à 1 µm. Ceci est en accord avec l'épaisseur déterminée à partir de la représentation de Koutecky-Levich. Notons que cette épaisseur correspond au seuil de détection de la méthode.

A quatre semaines d'immersion, l'épaisseur du biofilm varie entre 6 µm à 1100 tr.mn⁻¹ et 10 µm à 100 tr.mn⁻¹. Une variation similaire est constatée après six semaines mais avec une plus forte amplitude : entre 7 µm à 1100 tr.mn⁻¹ et 13 µm à 100 tr.mn⁻¹.

A partir de quatre semaines d'immersion, un comportement élastique du biofilm est mis en évidence comme l'illustre la Figure 1.13. Contrairement à l'hypothèse d'E. L'Hostis [3], le biofilm n'est plus considéré comme une couche poreuse solide, indépendante de la vitesse de rotation de l'électrode mais comme une couche dont l'épaisseur dépend de la vitesse de rotation au moment de la mesure. Les mesures de courant en vitesse croissante et décroissante montrent une absence d'hystérésis, décrivant ainsi la variation réversible de l'épaisseur et la propriété élastique du biofilm. Cette élasticité s'explique en partie par le
caractère poreux du biofilm. En effet, d'après la structure évoquée par J. W. Costerton [6, 7], les amas cellulaires vont se tasser sur le support sous la contrainte, entraînant une diminution de l'épaisseur globale du biofilm, cette épaisseur semble atteindre une valeur limite pour les vitesses élevées de rotation de l'électrode.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 1.13 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau de mer naturelle avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$ en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode. Mesures réalisées à 2 semaines ■, 4 semaines ● et 6 semaines ▲.</figcaption></figure>

**Note** : Les données obtenues au-delà de deux semaines, non exploitées par E. L'Hostis lors de son travail de thèse, ont été traitées en appliquant cette nouvelle méthodologie. Les résultats (Figure 1.14) avec le traceur ferricyanure montrent que le biofilm développé sur EDT en eau de mer additionnée d'extrait de levure (Annexe I), âgé de plus de deux semaines présente un caractère élastique identique à ceux développés dans le cadre de ce travail.

A cinq, dix et quatorze jours, le biofilm est peu élastique, et l'épaisseur est indépendante de la vitesse de rotation de l'électrode. L'hypothèse d'E. L'Hostis est donc valable. Par contre, après dix neuf jours d'immersion, le biofilm a un comportement élastique, décrivant la dépendance de l'épaisseur avec la vitesse de rotation de l'électrode.
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 1.14 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau de mer additionnée d'extrait de levure avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$ en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode. Mesures réalisées à 5 jours ■, 10 jours ▲, 14 jours ● et 19 jours ♦.</figcaption></figure>

## 1.2 TRACEUR OXYGENE [51]

### 1.2.1 Courbes courant-potentiel, i=f(E)

La voltampérométrie est beaucoup plus compliquée pour le traceur oxygène que pour le traceur ferricyanure. La Figure 1.15 montre une modification de la cinétique de l'oxygène par la présence du biofilm. L'étape à 2+2 électrons n'est plus clairement définie. Initialement, les deux vagues (à 2 et 4 électrons) respectivement à -600 mV/ECS et à -900 mV/ECS sont bien distinctes. Après deux, quatre ou six semaines d'immersion, seul le processus à 4 électrons (entre -1000 mV/ECS et -800 mV/ECS) apparaît. Cette modification de la cinétique de l'oxygène a également été observée sur l'acier inoxydable [53].

Le courant dépend seulement du transport de masse sur le plateau de réduction de l'oxygène. Il décroît avec le temps d'immersion en raison de la présence d'un biofilm. Même si le plateau de diffusion n'est pas aussi bien défini que dans le cas du ferri/ferrocyanure de potassium, un potentiel de -900 mV/ECS correpond au courant limite de diffusion. Cette absence de plateau est en partie due à la présence d'un courant de réduction de l'eau.
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 1.15 : Courbes de polarisation à 5 mV.s⁻¹ lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle à 300 tr.mn⁻¹ avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial —, à 2 semaines ■, 4 semaines ▲ et 6 semaines ●.</figcaption></figure>

### 1.2.2 Courbes courant-vitesse de rotation, i=f(Ω)

La représentation de Levich des courants mesurés est décrite sur la Figure 1.16. Au temps initial, le droite ne passe pas par l'origine et son ordonnée correspond au courant non diffusionnel $i_o$ de réduction de l'eau en hydrogène. La valeur de $i_o$, ajustée par les moindres carrés, vaut 13 µA. Cette valeur de $i_o$ déterminée à t=0 est supposée constante, ce qui correspond bien à une surface active constante.

Le courant global mesuré est la somme du courant d'hydrogène $i_o$ et du courant de réduction de l'oxygène. Ce courant s'écrit donc :

$$i(t) = i_o + \frac{1}{i_f^{-1} + i_L^{-1}} \qquad \text{Eq. 1.9}$$

A t=0, $i(0)=i_o+i_L$ car l'épaisseur du biofilm est nulle.

Pour des temps t plus longs, $i_f^{-1} \neq 0$, comme dans le cas du traceur ferricyanure, on considère que $\delta_f=f(\Omega)$. L'expression de l'épaisseur est alors :

$$\delta_f = nFDc_\infty S((i(t) - i_o)^{-1} - (i(0) - i_o)^{-1}) \qquad \text{Eq. 1.10}$$
<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 1.16 : Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm obtenu en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial ♦, à 2 semaines ■, 4 semaines ● et 6 semaines ▲.</figcaption></figure>

Après deux semaines d'immersion, l'épaisseur du biofilm déduit de la mesure du courant à partir de l'équation 1.10 est de 1 µm (Figure 1.17). Cette épaisseur est identique quelle que soit la vitesse de rotation de l'électrode. A quatre semaines, l'épaisseur est de 10 µm à 100 tr.mn⁻¹ et 4,5 µm à 1100 tr.mn⁻¹. A six semaines, le biofilm a une épaisseur qui varie entre 13 et 6 µm pour des vitesses de rotation de 100 et 1100 tr.mn⁻¹.

Sur cette même Figure 1.17, les résultats obtenus avec le ferricyanure ont été rappelés à titre de comparaison. Les épaisseurs des biofilms, obtenues à différents temps et à diverses vitesses de rotation d'électrode, sont comparables avec le traceur ferricyanure et avec le traceur oxygène. La différence systématique (de l'ordre du micromètre) peut être due à l'incertitude de la valeur de chaque paramètre impliqué dans les équations 1.8 et 1.10. La mesure étant indépendante du traceur utilisé, la méthode est validée pour le calcul de l'épaisseur du biofilm.

L'influence de la vitesse de rotation de l'électrode sur la détermination de l'épaisseur du biofilm met en évidence un caractère élastique de celui-ci qui peut être plus ou moins prononcé selon les conditions hydrodynamiques comme cela est décrit dans le paragraphe suivant.
<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Figure 1.17 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau de mer naturelle avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$ (en pointillé) et le traceur oxygène (symboles noirs) en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode. Mesures réalisées à 2 semaines ■, 4 semaines ● et 6 semaines ▲.

## 1.3 INFLUENCE DE L'HYDRODYNAMIQUE SUR LA FORMATION DU BIOFILM

L'objectif est de mettre en évidence, par l'utilisation de cette méthodologie, l'influence des conditions hydrodynamiques lors du développement du biofilm. Pour cela, une électrode est mise en rotation à la vitesse de 300 tr.mn⁻¹ dans un incubateur de manière à obtenir un régime laminaire, et une seconde électrode est insérée dans un tube où la vitesse d'écoulement est telle qu'un régime turbulent s'établit dans le tube. La même eau de mer s'écoule dans les deux systèmes de vieillissement.

Au temps initial, le traceur électrochimique étant l'oxygène, la loi de Levich est vérifiée et un courant non diffusionnel $i_o$ de 15 µA est déterminé et ceci quelle que soit l'électrode (Figure 1.18). A deux semaines d'immersion, dans le cas de l'incubateur à EDT, une légère modification du courant est observée, permettant la détermination de l'épaisseur du biofilm à partir de l'équation 1.10 (Figure 1.19) ; dans le tube, le courant a diminué de manière plus significative et une épaisseur de 3 µm est obtenue sur l'électrode (Figure 1.20). Dans ces deux cas, le biofilm est peu élastique et l'influence de l'hydrodynamique n'est pas très prononcée.
A quatre semaines, le courant est beaucoup plus faible sur l'électrode en immersion dans le tube que sur l'électrode en rotation (Figure 1.18). Cela se traduit par un biofilm d'épaisseur variant entre 8 µm à 100 tr.mn⁻¹ et 3 µm à 1100 tr.mn⁻¹ sur l'électrode en rotation tandis que l'épaisseur varie entre 80 µm et 53 µm, pour des vitesses de rotation de 100 et 1100 tr.mn⁻¹ (Figure 1.19, Figure 1.20). Dans le premier cas, l'épaisseur, peu importante, a diminué de plus de la moitié, décrivant les caractéristiques d'un biofilm souple, alors que dans l'autre cas, la diminution de l'épaisseur avec la vitesse de rotation est faible, traduisant les caractéristiques d'un biofilm moins souple.

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 1.18 :** Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène, dans un réacteur permettant la rotation de l'électrode (symboles noirs) et dans un tube (symboles blancs). Mesures réalisées au temps initial —, à 2 semaines ■ □ et à 4 semaines ▲ △.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 1.19 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau de mer naturelle dans un incubateur permettant la rotation de l'électrode avec le traceur oxygène en fonction de la vitesse de rotation. Mesures réalisées à 2 semaines ■ et 4 semaines ▲.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 1.20 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau de mer naturelle dans un incubateur tubulaire avec le traceur oxygène en fonction de la vitesse de rotation. Mesures réalisées à 2 semaines ■ et 4 semaines ▲.</figcaption></figure>
Afin de voir l'influence de la rigidité sur la formation du biofilm, la déformation est représentée en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode (Figure 1.21). La déformation est obtenue par différence entre les épaisseurs à une vitesse de rotation donnée et à une vitesse de rotation de 100 tr.mn⁻¹. Pour le biofilm obtenu avec un mode d'exposition laminaire, on constate que la déformation varie en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode de manière non constante : le biofilm est élastique non linéaire. Pour le biofilm obtenu avec un écoulement turbulent et tubulaire, la déformation varie de façon constante avec la vitesse de rotation : le biofilm est élastique linéaire. De plus, on remarque que pour les fortes vitesses de rotation, le biofilm est deux fois plus souple dans le cas « laminaire » que dans le cas « turbulent ».

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 1.21 : Déformation du biofilm obtenu en eau de mer naturelle en fonction du mode d'exposition : laminaire et rotation de l'électrode (symboles noirs), turbulent dans un tube (symboles blancs). Mesures réalisées 2 semaines ■ et à 4 semaines ▲ Δ.</figcaption></figure>

En conclusion, un régime laminaire favorise la formation d'un biofilm souple et sa croissance est lente ; tandis qu'un régime turbulent entraînera la formation d'un biofilm moins souple avec une croissance rapide. Aussi, les caractéristiques physico-chimiques du biofilm comme l'élasticité peuvent être plus ou moins prononcées en fonction des conditions hydrodynamiques. Ceci est en accord avec ce qui a été exposé dans le Chapitre I.
## 1.4 EVOLUTION TEMPORELLE DE L'EPAISSEUR DU BIOFILM

Du fait de l'utilisation de ce nouveau modèle de calcul de l'épaisseur du biofilm, son évolution temporelle peut être obtenue à partir de l'enregistrement ponctuel et régulier de la valeur du courant de réduction à une seule vitesse de rotation (300 tr.mn⁻¹ dans notre cas).

Cette épaisseur obtenue à un jour (Figure 1.22) est faible (moins de 1 µm). Cette épaisseur correspond à la valeur du seuil de détection de la méthode et à la phase d'initiation du biofilm décrit au Chapitre I. L'augmentation de l'épaisseur est ensuite rapide en passant de 2 µm à une trentaine de micromètres en sept jours, correspondant à la phase de croissance exponentielle (Chapitre I). Seules les deux premières phases de croissance du biofilm sont observées, le plateau de stabilisation n'a pas pu être atteint suite à un défaut d'alimentation des incubateurs.

Ces résultats sont en accord avec ceux rapportés E. S. Beardwood [18] où la colonisation se fait en deux jours, la formation de la couche primaire du biofilm en cinq jours et le maximum de la croissance du biofilm en quatorze jours.

Cette méthode simple de mesure de l'épaisseur du biofilm permet de suivre sa formation. Cela doit pouvoir être la principe de base d'un capteur de détection du biofilm.

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

**Figure 1.22 :** Epaisseur du biofilm obtenu en eau de mer naturelle sur une électrode en rotation (300 tr.mn⁻¹) pendant 14 jours avec le traceur oxygène.
## 1.5 INFLUENCE DU CHLORE

On se propose maintenant de valider l'utilisation de cette méthode dans le cas du traitement d'un biofilm de plusieurs jours par le chlore. Pour cela, l'électrode est placée dans un incubateur de type II pendant trente six jours. Puis après la détermination de l'épaisseur du biofilm sur cette électrode, 150 ppm de chlore sont ajoutés pendant une demi-heure.

La représentation de Levich (Figure 1.23) indique qu'au temps initial la loi de Levich est vérifiée et le courant non diffusionnel $i_0$ est égal à 20 µA. A trente six jours, la loi de Levich ne s'applique plus car il y a une courbure. L'ajout de chlore a un effet immédiat sur l'évolution du courant, mais même avec une concentration importante en chlore, le courant mesuré ne correspond pas au courant de Levich.

L'épaisseur du biofilm varie de façon importante en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode, comme indiquée sur la Figure 1.24. A 100 tr.mn⁻¹, l'épaisseur est de 36 µm tandis qu'à 1000 tr.mn⁻¹, l'épaisseur est de 6 µm. Cette évolution confirme bien le caractère élastique du biofilm.

L'ajout de chlore entraîne une diminution significative de l'épaisseur du biofilm qui se réduit à quelques micromètres (Figure 1.24), épaisseur quasiment constante quelle que soit la vitesse de rotation de l'électrode. Ce biofilm « chloré » est beaucoup moins élastique qu'à trente six jours. Notons que l'ajout de chlore n'entraîne pas une réduction totale du biofilm et une partie reste fixée sur la surface de l'électrode (la couche primaire, Figure 1.2, Figure 1.25). Or d'après la structure du biofilm évoquée au chapitre I, le chlore permet de tuer les bactéries contenues dans le cluster mais pas celles de la couche primaire. C'est l'épaisseur de cette couche de biofilm qui est mesurée après addition de biocide (Figure 1.25). En conclusion, la méthode permet de suivre l'évolution de l'épaisseur du biofilm lors d'un traitement de biocide.
<figure><img src="image_30.png" /></figure>

Figure 1.23 : Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial —, à 36 jours d'immersion ■, après injection de chlore ▲.

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Figure 1.24 : Epaisseur du biofilm obtenu en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène. Mesures réalisées à 36 jours d'immersion ■ et après injection de chlore ▲.
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 1.25 : Modèle de biofilm sur la surface d'une électrode avec indication de l'épaisseur équivalente calculée en fonction de Ω (a), après traitement de chlore (b).</figcaption></figure>

## 2 BIOFILM DEVELOPPE EN EAU DOUCE

Le but de cette manipulation est de montrer la faisabilité de la méthode électrochimique concernant la mesure de l'épaisseur d'un biofilm en eau potable. Cependant, certaines précautions doivent être prises. Il faut notamment s'affranchir de l'entartrage des électrodes avec l'utilisation d'un traceur différent de l'oxygène, comme par exemple le ferricyanure. La polarisation sur le palier de diffusion de l'oxygène (-900 mV/ECS) entraîne une augmentation du pH interfacial, provoquant l'entartrage, autrement dit la précipitation des ions calciums en calcaire [54]. Dans le cas de l'eau de mer, la présence du magnésium et la faible concentration en calcium réduisent le pouvoir entartrant et il est donc possible d'utiliser l'oxygène comme traceur. En eau douce, une solution serait d'utiliser les résultats en cinétique mixte (et non sur le palier de diffusion) mais comme cela est montré dans le paragraphe suivant, les modifications de la cinétique sont telles que le découplage paraît délicat. Il faut donc utiliser un traceur pour lequel le pH interfacial reste celui de la solution lorsqu'un potentiel est imposé : le ferricyanure.

Durant cette étude, le biofilm se développe sur les électrodes dans un incubateur de type I (voir Chapitre II, §2.1.4) et rappelons que les électrodes sont prélevées pour la mesure.

### 2.1 COURBES COURANT-POTENTIEL, i=f(E)

Au temps initial (Figure 1.26), les deux plateaux, correspondant à la réduction de l'oxygène en deux étapes successives, sont bien distincts sur la courbe de polarisation (Chapitre II, §2.4.2). A huit et onze semaines d'immersion, des modifications de la courbe
courant-potentiel en cinétique mixte par la présence de biofilms sont mises en évidence et le premier plateau n'est plus détecté. Par contre, le plateau limite de diffusion de l'oxygène (à -1000 mV/ECS) est bien visible, comme précédemment en eau de mer. Sur ce palier, le courant diminue légèrement avec le temps d'immersion, signalant la présence d'un biofilm.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 1.26 : Courbes de polarisation à 2 mV.s⁻¹ lors de la formation d'un biofilm en eau potable à 300 tr.mn⁻¹ avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial —, 8 semaines ■ et 11 semaines ▲ après correction de la chute ohmique Rₑ=1155 Ω.</figcaption></figure>

## 2.2 DETERMINATION DE L'EPAISSEUR DU BIOFILM

Pour déterminer l'épaisseur du biofilm, le courant est enregistré en fonction de la vitesse de rotation à différents temps d'immersion avec le traceur ferricyanure. Au temps initial (Figure 1.27), le courant obtenu est bien le courant de Levich et la droite passe par l'origine. A 1000 tr.mn⁻¹, au temps initial, il est de 3200 µA puis atteint 1200 µA à huit semaines, et finalement 700 µA environ à onze semaines d'immersion. Cette décroissance indique la présence d'un biofilm sur la surface de l'électrode.
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 1.27 : Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm en eau potable avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial —, à 8 semaines ■ et 11 semaines ▲.</figcaption></figure>

Sur la Figure 1.28, l'épaisseur du biofilm, obtenue d'après l'équation 1.8, est d'environ 20 µm à huit semaines quelle que soit la vitesse de rotation de l'électrode, permettant de dire que le biofilm est très rigide, ne se déformant pas sous l'action d'une contrainte. Après onze semaines de vieillissement, l'épaisseur est de 45 µm aussi bien à 100 tr.mn⁻¹ qu'à 1000 tr.mn⁻¹. Ceci est en accord avec le §1.3 de ce chapitre, décrivant qu'un biofilm développé en régime turbulent est plus rigide qu'un biofilm se développant sous des conditions laminaires. Rappelons que d'après J. W. Costerton [4-7], les contraintes de cisaillement peuvent limiter la formation du biofilm et conduire à une structure plus compacte, comme pour cette étude.

Le vieillissement en eau potable nécessite des temps de séjour beaucoup plus longs qu'en eau de mer pour obtenir une épaisseur de quelques dizaines de micromètres. Ceci est en accord avec le fait que l'eau est saine. Un comptage bactérien par microscopie à épifluorescence (voir §3.2 de ce chapitre) a été effectué, signalant la présence de 10⁷ bact.cm⁻². Cette valeur est cohérente compte tenu de l'épaisseur du biofilm d'une quarantaine de micromètres.

En conclusion, la mesure de l'épaisseur du biofilm en eau douce est plus complexe qu'en eau de mer car elle nécessite l'utilisation d'un traceur électrochimique qui n'est pas naturellement présent dans le milieu (ici le ferricyanure). Cette mesure est toute fois possible.
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 1.28 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau potable avec le traceur $Fe(CN)_6^{3-}$ en fonction du temps d'immersion (■ 8 semaines, ▲ 11 semaines).</figcaption></figure>

## 3 PSEUDOMONAS DEVELOPPE DANS UN MILIEU NUTRITIF

L'objet de ces travaux est d'utiliser le caractère mucoïde de deux souches pour évaluer la capacité d'une méthode à différencier un biofilm, composé en majorité d'EPS ou de bactéries. Pour cela, les souches SG41 (dans les réacteurs 1A et 1B) et sa mutante SG41R (dans les réacteurs 2A et 2B) ont été mises en culture dans un réacteur alimenté en continu par une solution de bouillon nutritif (Type II stérile).

Des essais préliminaires (énumération par mesure de la turbidité et sur gélose $R_2A$) ont permis de s'assurer que le taux de croissance des deux souches est identique dans les quatre cellules. Un contrôle en continu de l'énumération durant les mesures électrochimiques montre un maintien de la quantité de bactéries dans les réacteurs.

### 3.1 MESURE DE L'EPAISSEUR DU BIOFILM

L'épaisseur est déterminée grâce à l'équation de Koutecky-Levich (voir Eq. 1.10), par mesure du courant sur le palier de réduction de l'oxygène. Les résultats obtenus à différents temps d'immersion montrent que (Tableau 1.9) :

- Dans le réacteur 1A, l'épaisseur est faible (< 10 µm) quel que soit le temps d'immersion, sauf à quatre semaines où une épaisseur de 32 µm est mesurée,
- Dans le réacteur 1B, le biofilm est plus épais (> 10 µm), surtout après cinq semaines où il atteint 180 µm à 300 tr.min⁻¹,

- Dans le réacteur 2A, la croissance du biofilm est régulière en fonction du temps d'immersion pour atteindre 133 µm après cinq semaines,

- Dans le réacteur 2B, l'épaisseur est faible (< 10 µm).

La détermination de l'épaisseur en fonction du temps d'immersion ne montre pas de différence entre les deux types de biofilms.

<table><caption>Tableau 1.9 : Epaisseurs obtenues sur 4 électrodes dans 2 types de réacteurs (1 et 2) en fonction du temps d'immersion (2, 3, 4 et 5 semaines) pour une vitesse de rotation de 300 tr.mn⁻¹.</caption><thead><tr><th>Epaisseurs dans le réacteur</th><th>1A</th><th>1B</th><th>2A</th><th>2B</th></tr></thead><tbody><tr><td>2 semaines d'immersion</td><td>3</td><td>12</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>3 semaines d'immersion</td><td>1</td><td>10</td><td>7</td><td>10</td></tr><tr><td>4 semaines d'immersion</td><td>32</td><td>15</td><td>55</td><td>3</td></tr><tr><td>5 semaines d'immersion</td><td>8</td><td>180</td><td>133</td><td>6</td></tr></tbody></table>

L'épaisseur du biofilm est déterminée sur toute la gamme de vitesse de rotation de l'électrode à cinq semaines d'immersion. A l'instant initial, le courant total mesuré et représenté selon la loi de Levich (Figure 1.29), sur les quatre types d'électrodes, montre que la loi est vérifiée et que la droite ne passe pas par l'origine. L'ordonnée correspond à un courant d'hydrogène $i_0$ de 25 µA. Notons que les pentes ne sont pas tout à fait identiques pour les quatre électrodes, cela étant dû à des surfaces d'électrodes légèrement différentes. Néanmoins, la détermination de l'épaisseur se faisant toujours par une différence avec les valeurs au temps initial, les écarts aux valeurs idéales de la surface sont compensés. A cinq semaines d'immersion, les courants sont semblables pour les électrodes 1A et 2B (250 µA à 300 tr.mn⁻¹) et pour les électrodes 2A et 1B (50 µA à 300 tr.mn⁻¹) tandis qu'un courant de 325 µA est observé sur chaque électrode au début de l'expérience.
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 1.29 : Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm en milieu de culture avec le traceur oxygène. Mesures réalisées à 5 semaines d'immersion (■ électrode 1A, ◆ électrode 1B, Δ électrode 2A et O électrode 2B).</figcaption></figure>

La Figure 1.30 montre l'évolution de l'épaisseur du biofilm à cinq semaines d'immersion, en fonction de la vitesse de rotation sur les quatre électrodes issues de chaque réacteur. Le biofilm obtenu sur les électrodes 1A et 2B est très fin : une dizaine de micromètres d'épaisseur seulement et la variation avec la vitesse de rotation est quasiment nulle. Par contre, l'épaisseur du biofilm obtenu sur les électrodes issues des milieux 1B et 2A est différente de celle obtenue précédemment : le biofilm est beaucoup plus épais. En fonction de la vitesse de rotation (200 à 1000 tr.min⁻¹), l'épaisseur varie entre 230 µm et 70 µm, traduisant également un comportement très élastique de ce biofilm, pouvant être caractérisé par une mesure électrochimique.
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 1.30 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en milieu de culture avec le traceur oxygène à 5 semaines d'immersion (■ électrode 1A, ◆ électrode 1B, Δ électrode 2A et O électrode 2B).</figcaption></figure>

## 3.2 ANALYSES BACTERIOLOGIQUES

Les analyses bactériologiques vont permettre de quantifier le biofilm par l'observation au microscope et à la loupe binoculaire, l'énumération par la microscopie à épifluorescence, par les mesures d'ATP et d'AEP, par le dosage des protéines et par des énumérations bactériennes sur gélose.

### 3.2.1 Observation au microscope et à la loupe binoculaire

L'examen à la loupe binoculaire montre un biofilm plus épais sur la lame contenue dans la cellule 2A que sur celles contenues dans les cellules 1A et 1B. Normalement la cellule 2A contient des bactéries qui produisent moins d'exopolymères. L'examen microscopique montre que les bactéries sont toutes ovoïdes sur les lames des trois cellules (1A, 1B et 2A). La disposition des *Pseudomonas* sur les lames semble identique.

Aucune différenciation entre les lames contenues dans les trois cellules n'est visible par ce type d'examen.
### 3.2.2 Observations par microscopie à épifluorescence

Une observation et un comptage ont été effectués à cinq semaines sur la surface des électrodes des quatre réacteurs. Le nombre de bactéries déterminé par des mesures de microscopie à épifluorescence lors du comptage est de $2.10^6$ bact.cm$^{-2}$ sur l'électrode 1A et de $1.10^7$ bact.cm$^{-2}$ sur l'électrode 1B, l'électrode 2A et l'électrode 2B.

Les différentes photos de la Figure 1.31 mettent en évidence des bactéries de forme ovoïde. Sur les photos où la densité est importante, elles se trouvent sous la forme de filaments ou de bâtonnets, montrant l'association de plusieurs bactéries entre elles afin de former des chaînes. Les bactéries forment des petits amas avec des zones d'absence. Ainsi, leur répartition n'est pas homogène à l'échelle microscopique mais l'est à l'échelle macroscopique.

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

**Figure 1.31** : Observation par microscopie à épifluorescence des surfaces des électrodes issues des réacteurs 1A, 1B, 2A et 2B, l'échelle représentée par un trait blanc correspond à une dimension de 10 µm.
### 3.2.3 Détermination de paramètres caractéristiques des biofilms sur lame

#### 3.2.3.1 Mesure de l'ATP

Les mesures d'ATP effectuées sur les biofilms obtenus sur lames (Tableau 1.10) montrent que les valeurs pour les réacteurs 1A et 1B sont similaires et deux fois plus importantes que celle pour le réacteur 2A. L'activité globale du biofilm est donc plus importante au niveau des réacteurs 1A et 1B qu'au niveau du réacteur 2A.

<table><caption>Tableau 1.10 : Mesure de l'ATP (pg.cm⁻²) sur les biofilms générés sur lame.</caption><thead><tr><td>Réacteur</td><td>Moyenne</td><td>Ecart-type</td><td>CV (%)</td></tr></thead><tbody><tr><td>1A</td><td>776</td><td>48</td><td>6</td></tr><tr><td>1B</td><td>831</td><td>8</td><td>1</td></tr><tr><td>2A</td><td>433</td><td>8</td><td>2</td></tr></tbody></table>

#### 3.2.3.2 Mesure de l'activité exoprotéolytique

Les mesures de l'activité exoprotéolytique effectuées sur les biofilms obtenus sur lames (Tableau 1.11) montrent comme dans le cas de la mesure de l'ATP que les valeurs obtenues pour les réacteurs 1A et 1B sont similaires alors qu'elle est deux fois plus faible pour celle obtenue dans le réacteur 2A.

<table><caption>Tableau 1.11 : Mesure de l'activité exoprotéolytique des biofilms.</caption><thead><tr><td>Réacteur</td><td>Constante (min⁻¹)</td><td>Coefficient de corrélation</td></tr></thead><tbody><tr><td>1A</td><td>2,2</td><td>0,99</td></tr><tr><td>1B</td><td>1,9</td><td>0,99</td></tr><tr><td>2A</td><td>0,9</td><td>0,99</td></tr></tbody></table>
### 3.2.3.3 Dosage de protéines

Le dosage des protéines (Tableau 1.12) met en évidence que le biofilm obtenu sur lames dans le réacteur 2A a une faible valeur de protéines, comparée à la valeur pour les biofilms des réacteurs 1A et 1B, ceci étant en accord avec les résultats précédents. Cependant il n'y a plus le rapport 2 qui apparaissait pour les mesures de l'ATP et de l'activité exoprotéolytique.

Le dosage des protéines seul ne semble pas aussi déterminant que les mesures de l'ATP et de l'activité exoprotéolytique pour la caractérisation d'un biofilm actif.

<table><caption>Tableau 1.12 : Dosage des protéines des biofilms.</caption><thead><tr><td>Réacteur</td><td>Protéine (µg.cm<sup>-2</sup>)</td></tr></thead><tbody><tr><td>1A</td><td>40</td></tr><tr><td>1B</td><td>45</td></tr><tr><td>2A</td><td>33</td></tr></tbody></table>

### 3.2.4 Énumération bactérienne

Une énumération bactérienne a été effectuée sur le milieu de la cellule et sur le biofilm obtenu sur les lames dans les cellules 1A, 1B et 2A. Pour ces deux types de milieux étudiés, deux milieux de culture ont été utilisés : R₂A et PIA.

#### 3.2.4.1 A partir du milieu des cellules

Pour les quatre cellules, l'énumération bactérienne (Tableau 1.13) donne une valeur similaire sur le milieu R₂A de $10^8$ UFC.ml⁻¹. La valeur est plus faible d'un facteur 10 pour le réacteur 1A n'est cependant pas suffisamment significative pour indiquer une réelle différence entre les réacteurs. En général, selon les microbiologistes, un facteur 100 est représentatif d'un réel écart entre deux surfaces colonisées par les bactéries.
<table><caption>Tableau 1.13 : Énumération bactérienne (UFC.ml⁻¹), comparaison des bactéries en solution sur les milieux de culture R₂A et PIA.</caption><thead><tr><td>Réacteur</td><td>R<sub>2</sub>A</td><td>PIA</td><td>Ecart</td></tr></thead><tbody><tr><td>1A</td><td>10<sup>7</sup></td><td>10<sup>5</sup></td><td>100</td></tr><tr><td>1B</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>8</sup></td><td>=</td></tr><tr><td>2A</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>6</sup></td><td>100</td></tr><tr><td>2B</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>5</sup></td><td>1000</td></tr></tbody></table>

Sur le milieu PIA, des différences notables apparaissent entre les cellules. La similitude des *Pseudomonas* dans les cellules 1A et 1B, et 2A et 2B n'est pas confirmée par ces résultats. Finalement, aucune conclusion ne semble pouvoir être tirée de façon déterminante aussi bien en fonction du milieu de culture qu'en fonction du réacteur.

### 3.2.4.2 A partir du biofilm obtenu sur lames

Seule une énumération bactérienne sur les réacteurs 1A, 1B et 2A a été effectuée (Tableau 1.14). Sur la gélose R₂A, une concentration moyenne de 10⁸ UFC.ml⁻¹ environ de bactéries est dénombrée. Cette valeur semble indépendante du réacteur. Cela est toutefois légèrement plus faible d'un facteur 10 pour le réacteur 1A.

Sur le milieu PIA, une disparité existe d'une cellule à l'autre. L'utilisation de ces seuls résultats ne permet pas de conclure.

En comparant les deux milieux de culture R₂A et PIA, un écart d'un facteur 10 apparaît pour les réacteurs 1A et 2A. Cet écart est considéré comme très faible vu le nombre de bactéries observées.

<table><caption>Tableau 1.14 : Énumération bactérienne (UFC.ml⁻¹), comparaison des bactéries provenant des biofilms sur les milieux de culture R₂A et PIA.</caption><thead><tr><td>Réacteur</td><td>R<sub>2</sub>A</td><td>PIA</td><td>Ecart</td></tr></thead><tbody><tr><td>1A</td><td>10<sup>7</sup></td><td>10<sup>6</sup></td><td>10</td></tr><tr><td>1B</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>8</sup></td><td>=</td></tr><tr><td>2A</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>7</sup></td><td>10</td></tr></tbody></table>
## 3.2.5 Vérification de la pureté des souches bactériennes

A l'observation visuelle, les boîtes de pétri sur gélose PIA ne contiennent que des souches pures que ce soit des SG 41 ou SG 41R1 (Figure 1.32). Il n'apparaît pas de colonie extérieure. De plus, il n'a pas été observé de mélange entre les deux souches, ni de mutation spontanée. Les colonies observées sur les boîtes de pétri issues des réacteurs 1A et 1B apparaissent plus « grasses » que celles issues des réacteurs 2A et 2B. Les *Pseudomonas aeruginosa* SG41 produisent donc plus d'exopolymères sur le milieu spécifique PIA que les *Pseudomonas aeruginosa* SG41R1 sur PIA également. Notons que très peu de colonies sont observées sur la boîte 2B.

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 1.32 : Photos représentant les boîtes de pétri avec le milieu PIA pour les quatre milieux de culture (1A, 1B, 2A et 2B).</figcaption></figure>
### 3.3 COMPARAISON ENTRE LES DEUX TYPES DE MESURES

Les différentes mesures bactériologiques et électrochimiques ne peuvent être comparées qu'en fin de manipulation, c'est-à-dire à cinq semaines d'immersion car des mesures biologiques intermédiaires n'ont pu être faites. Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 1.15.

Les résultats concernant les mesures bactériologiques sur le biofilm indiquent une plus grande activité que ce soit ATP et AEP ainsi qu'une quantité plus importante des protéines pour les cellules 1A et 1B que pour la cellule 2A. Aucune mesure n'ayant été faite sur le biofilm de la cellule 2B, il est très difficile de se prononcer sur l'expression du caractère mucoïde.

<table><caption>Tableau 1.15 : Bilan des résultats concernant le développement de Pseudomonas.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Cellule</th><th colspan="8">Bactériologie</th><th>Epifluorescence</th><th>Electrochimie</th></tr><tr><th colspan="3">Biofilm</th><th colspan="4">Énumération Bactérienne</th><th rowspan="2">Electrodes</th><th rowspan="2">Electrodes</th></tr><tr><th>ATP</th><th>AEP</th><th>Protéine</th><th colspan="2">Solution</th><th colspan="2">Biofilm</th><th>Bactéries.cm<sup>-2</sup></th><th>1000 tr.min<sup>-1</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>1A</td><td>776±48</td><td>2</td><td>40</td><td>10<sup>7</sup></td><td>&lt;10<sup>6</sup></td><td>10<sup>7</sup></td><td>10<sup>6</sup></td><td>2.10<sup>6</sup></td><td>10</td><td></td></tr><tr><td>1B</td><td>831±8</td><td>2</td><td>45</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>7</sup></td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>2A</td><td>433±8</td><td>1</td><td>33</td><td>5.10<sup>7</sup></td><td>5.10<sup>6</sup></td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>7</sup></td><td>10<sup>7</sup></td><td>100</td><td></td></tr><tr><td>2B</td><td>/</td><td>/</td><td>/</td><td>10<sup>8</sup></td><td>10<sup>5</sup></td><td>/</td><td>/</td><td>10<sup>7</sup></td><td>10</td><td></td></tr></tbody></table>

**Note** : Une deuxième série d'essais a été réalisé par la suite ne permettant pas de différencier le caractère mucoïde des deux types de bactéries par les méthodes bactériologiques. De plus, une énumération a été effectuée sur une gélose de constitution très proche du bouillon nutritif avec pour résultat que le caractère non mucoïde ne s'exprime pas dans le bouillon nutritif. D'après S. Grobe *et al.* [55], il semble exister un milieu de culture plus favorable où les caractères mucoïdes et non mucoïdes puissent s'exprimer pleinement.

Les analyses bactériologiques permettent ainsi de conclure que le caractère mucoïde ne s'exprime pas dans le bouillon nutritif. Cependant, ces analyses décrivent le biofilm
comme contenant beaucoup de bactéries. Cela est confirmé par les analyses réalisées sur les électrodes par la microscopie à épifluorescence.

Les résultats concernant les mesures électrochimiques, c'est à dire la mesure d'épaisseur, sont donnés pour des vitesses de rotation de 1000 tr.min⁻¹. Ces résultats ne permettent pas de conclure sur l'observation de la différence d'expression du caractère mucoïde entre les électrodes. Néanmoins, la méthode basée sur l'analyse du transport de matière en présence d'une couche poreuse est utilisable pour la détermination de l'épaisseur de biofilms obtenus en milieu artificiel.
Conclusion de la première partie

La technique expérimentale permettant la mesure de l'épaisseur du biofilm sur les surfaces, basée sur l'analyse du transport de matière d'un traceur électrochimique à travers une couche poreuse, est utilisable quels que soient les milieux considérés (eau de mer naturelle, eau potable et milieu de culture). Cependant le traceur électrochimique doit être choisi en fonction des propriétés physico-chimiques du milieu (eaux entartrantes, milieu faiblement conducteur ...).

La méthode a conduit à mesurer la même épaisseur et la même élasticité pour un même biofilm lors de l'utilisation de deux traceurs distincts (l'oxygène et le ferricyanure). Par cette méthode, une seconde étude a permis de mettre en évidence l'influence des conditions hydrodynamiques (dans un tube et sur une EDT en rotation) sur le caractère élastique du biofilm lors de son développement. Le comportement de deux électrodes, l'une soumise à un flux laminaire et l'autre à un flux turbulent, pour des temps identiques d'immersion avec la même eau de mer a été étudié et nous avons pu ainsi montrer que le biofilm est plus épais et plus rigide pour l'électrode soumise à un régime turbulent alors que l'épaisseur du biofilm est plus faible et son élasticité plus importante pour l'électrode sous régime laminaire.

La méthodologie utilisée dans cette première partie est utilisable pour le suivi de la croissance du biofilm à tous les stades de son développement, y compris très précocement. De plus, la technique est compatible avec l'utilisation de biocide oxydant comme le chlore.

La nature des résultats obtenus dans cette première partie permet d'entreprendre la réalisation d'un capteur de biofilm dont les principales caractéristiques sont :

- l'utilisation de l'oxygène ou du ferricyanure lors de son fonctionnement selon les milieux étudiés,

- l'hydrodynamique parfaitement contrôlée, base de l'analyse du transport de matière à travers une couche poreuse,

- le fonctionnement à débit variable afin de mettre en évidence l'élasticité du biofilm.

L'objet de la deuxième partie de ce manuscrit est donc le développement d'un capteur de biofilm de ce type.
# Introduction de la deuxième partie

La demande pour des capteurs permettant la détection de biofilms (Chapitre I) est forte car les enjeux économiques et écologiques sont énormes. Mais ces capteurs n'ont pas des performances répondant aux enjeux de manière satisfaisante. Certains d'entre eux sont spécifiques du contrôle du biofilm (Annexe II).

L'application directe de l'EDT au développement d'un capteur, comme dans la première partie de ce travail, est difficilement réalisable pour des raisons technologiques. Un autre dispositif est donc proposé : il s'agit d'une cellule à jet immergé, développé pour différentes utilisations à l'UPR 15 du CNRS. La présentation de ce système est décrite dans le Chapitre II.

Le Chapitre III présente les résultats des essais en laboratoire avec cette cellule à jet noyé équipée d'une électrode transparente et conductrice, afin de coupler la mesure de l'épaisseur du biofilm par la méthode électrochimique, à une analyse par voie optique de l'interface. La suite de l'étude conduit au développement d'un prototype de capteur reposant sur le principe de la cellule à jet noyé (Chapitre IV).
## Chapitre I.

### Détection du biofilm

Selon G. J. Licina et al., certaines règles doivent être respectées lors de la conception d'un capteur de biofilm [56]. Ce capteur doit être :

- Simple à utiliser : l'installation de la sonde et la maintenance ne doivent pas avoir de répercussion sur le fonctionnement de l'usine ;

- Simple à interpréter : les résultats doivent être facilement interprétables par le personnel ;

- Solide : les sondes et équipements doivent être suffisamment solides pour supporter des maintenances ;

- Sensible : des effets doivent être détectés dès l'apparition du biofilm ;

- Précis : le moyen de suivi doit fournir une détection fiable de la présence du biofilm avec un minimum d'erreurs ;

- Economique : les coûts de l'installation et de la maintenance doivent être fonction des résultats escomptés par le système de suivi.

Ces différents critères doivent donc permettre d'optimiser le capteur afin de le rendre le plus compétitif possible.

Les principaux types de méthodes de détection sont mécaniques, optiques, spectroscopiques, thermiques, biologiques et électrochimiques (Tableau 2.1).
<table><caption>Tableau 2.1 : Différents systèmes de suivi du biofilm.</caption><thead><tr><td>Principes de détection</td><td>Méthodes de détection</td></tr></thead><tbody><tr><td>Mécanique</td><td>Suivi de la résistance de friction : pression [57], torsiomètre [57]<br>Suivi par ultrasons vitesse du son [58], écho pulsé [58], microbalance à cristal de quartz [59, 60], ondes acoustiques de surface [61]</td></tr><tr><td>Optique</td><td>Analyse d'images [62]<br>Capteur à fibre optique [63-66]</td></tr><tr><td>Spectroscopique</td><td>Infrarouge à transformée de Fourier [65, 67]<br>Fluorescence de biomolécules [59, 68]<br>Spectrométrie photoacoustique [69]</td></tr><tr><td>Thermique</td><td>Suivi du transfert de chaleur : échangeur de chaleur [18, 22, 57], microcalorimétrie [65]</td></tr><tr><td>Biologique</td><td>Détermination de paramètres microbiologiques, biochimiques</td></tr><tr><td>Electrochimique</td><td>Spectroscopie d'impédance [65]<br>Spectrométrie diélectrique [70]<br>Mesure de capacité</td></tr></tbody></table>

# 1 DETECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS MECANIQUES

Les microbalances à cristal de quartz sont utilisées pour suivre de manière non destructive la formation de biofilms [59, 60]. Un changement de la fréquence de résonance d'un cristal piézo-électrique traduit une augmentation de la masse correspondant à la présence d'un biofilm à la surface exposée dans le milieu. Il semble qu'un calibrage du système permet de déterminer le nombre de bactéries présentes dans le biofilm. Cependant, d'après le Chapitre I de la première partie, il n'existe pas de relation univoque reliant le nombre de bactéries à la quantité de biofilm. Ce détecteur semble avoir de nombreux inconvénients comme une utilisation complexe et des difficultés lors de l'interprétation. De plus il s'agit surtout d'une méthode de laboratoire.

Pour analyser les phénomènes de biosalissures, un appareil constitué d'un tube en acier au carbone est associé à un transmetteur de pression, à un système qui mesure la vitesse de corrosion et à un système de circulation d'eau, en suivant la perte de charge [71]. En
mesurant la pression et en utilisant la relation de corrélation entre le facteur de friction et la rugosité de la surface, H.J. Lee *et al.* ont montré qu'il existe une relation entre la quantité de matière solide en suspension, la température et la vitesse de l'eau sur la croissance du biofilm à la surface du métal. Cependant, ce type d'appareils de détection ne semble pas adaptable à tous les cas de corrosion microbienne.

## 2 DETECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS OPTIQUES

La possibilité d'utiliser des fibres optiques a été démontrée par M. A. Siebel *et al.*, R. G. Ravetti *et al.* et H.C. Flemming [63-66]. Le principe d'utilisation de ces fibres est de suivre la formation du biofilm grâce à la mesure de la lumière transmise et absorbée [63].

Des variations de pH, de concentration en ions ou en molécules organiques dont le biofilm est constitué, sont observées à l'aide d'un câble optique [64]. La détection repose sur l'observation des changements de couleurs et/ou d'absorbance en fonction des changements du milieu au moyen d'un câble, constitué de fibres optiques, avec à l'extrémité une membrane polymérique sensible.

H.C. Flemming a également utilisé la technique des fibres optiques pour suivre la croissance du biofilm, la lumière étant dans ce cas transmise sur un photo-détecteur [65]. Ensuite, l'intensité lumineuse mesurée est fonction de la quantité de particules qui permettent la réflexion de la lumière. Ce type de détecteur semble répondre aux nombreux critères de Licina *et al*. (simple à interpréter, solide, précis). Cependant, son utilisation ne semble pas facile dans les canalisations.

## 3 DETECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS SPECTROSCOPIQUES

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier peut aussi être utilisée pour la détection du biofilm. M. A. Siebel *et al.* ont développé un capteur basé sur ce principe permettant de déterminer de manière non destructive et en ligne des changements dans la nature chimique du biofilm [65, 67]. Néanmoins, l'analyse des spectres nécessite des compétences particulières et la technicité est complexe sur site industriel.

Selon D.E. Nivens *et al.*, des mesures électrochimiques (voir §6) peuvent être couplées à la microbalance à quartz (voir §1) et à la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier avec réflexion totale atténuée (ATR-FT/IR) [72, 73]. La microbalance à quartz fournit une estimation de la biomasse tandis que la spectroscopie permet de suivre l'état
d'attachement des bactéries sur les matériaux ainsi que l'accumulation des exopolymères. Ces deux techniques, permettant un suivi in situ de la corrosion et du biofilm sont non-destructives, mais, les résultats obtenus ne sont pas immédiats. Ils nécessitent une interprétation très rigoureuse des graphes et donc un personnel qualifié et ils semblent difficilement utilisables sur sites industriels.

## 4 DETECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS THERMIQUES

E.S. Beardwood utilise pour ses travaux un moyen de détection en ligne (NACE Standard RPO189-89) basé sur la détermination d'un coefficient d'échange thermique appelé également « facteur d'encrassement » [18, 22]. Il s'agit d'un échangeur de chaleur où différents coupons sont insérés. Cela permet de détecter la formation du biofilm en suivant la valeur du coefficient d'échange lors de l'encrassement de l'échangeur de chaleur. Ce principe de détection est proche de celui utilisé dans ce travail qui est, rappelons-le, l'analyse du transport de matière à travers une couche poreuse. L'évolution de la résistance de friction [57], méthode similaire au suivi du facteur d'encrassement permet également de détecter la formation du biofilm.

G. Salvago et al. ont étudié le comportement d'aciers inoxydables et de laitons d'aluminium exposés en eau de mer [74]. La résistance de transfert de chaleur et des mesures électrochimiques sous polarisation cathodique (voir §6) permettent de suivre la présence et la croissance du biofilm sur la face interne de tube. Les tests ont été réalisés dans une centrale thermique de la ENEL en Italie. L'appareil est constitué de deux branches parallèles identiques contenant les échantillons de tubes. Une ligne est traitée avec des antisalissures (NaClO, ClO₂, HCl) tandis que l'autre ne l'est pas. Chaque branche est soumise à des observations optiques par endoscopie, à l'évaluation de la résistance de transfert de chaleur, à un suivi électrochimique du biofilm par suivi de l'intensité du courant lors de l'application d'un potentiel et à l'examen de la protection cathodique.

P. S. N. Stokes et al. ont développé un instrument où est combiné le suivi de la corrosion et des salissures sous forme d'échangeur de chaleur miniaturisé [75]. Le suivi de la corrosion est réalisé à l'aide de quatre techniques électrochimiques (mesure par ampèremètre à résistance nulle, mesure du bruit électrochimique à partir du courant et à partir du potentiel et mesure de la résistance linéaire de polarisation). Les salissures sont détectées par mesure du transfert de chaleur. Ce système a montré son efficacité lors du contrôle du biofilm (voir
ANNEXE II). L'utilisation des quatre techniques électrochimiques rend le dispositif complexe et peu adaptable sur site.

## 5 DETECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS BIOLOGIQUES

Un brevet américain, basé sur la capacité des microorganismes à générer la fermentation, présente une certaine originalité [76]. Le principe est le suivant : l'appareil de test semi-perméable est placé à l'envers, à la verticale dans un milieu de culture de microorganismes. Lors de la formation d'un biofilm, des bactéries libérent du gaz qui est piégé dans l'appareil, qui se met alors à flotter. Le temps de mise à flot donne une indication sur la quantité de biofilm formé ainsi que sur sa taille. Cependant, aucun exemple n'est donné en suivant la formation du biofilm par la mesure du temps de mise à flot et le capteur semble peut adaptable sur site.

Un autre système a été développé pour suivre la croissance de la biomasse par mesure de la pression dans un bio-réacteur aéré [77]. Des billes servent de support au biofilm. La corrélation entre les mesures de pression et les nombres de Reynolds permet de déterminer la quantité de biomasse. L'activité biologique de la biomasse fixée est estimée à partir de la consommation en oxygène et de la quantité de carbone organique total. Néanmoins, un tel capteur ne répond pas aux critères de précision, de sensibilité et de simplicité.

P. Howsam et S. Tyrrel [78] ont un petit réacteur dans lequel des prélèvements de biofilm sont réalisés et analysés par des méthodes de microbiologie. Cette méthode de suivi est en général destructive [65]. Cependant, elle permet la détermination de paramètres microbiologiques comme la morphologie et le nombre de bactéries, de paramètres chimiques comme la composition de l'eau, la quantité de carbone organique total, la quantité d'azote et de phosphore, de paramètres biochimiques comme les protéines, les carbohydrates, l'acide urique, les lipides, l'ATP, l'activité respiratoire et des paramètres physiques comme la masse, l'épaisseur, le volume et les propriétés spectroscopiques.

Un système de mesure de l'adénosine triphosphate ou ATP, appelé Bioscan™ permet d'identifier les biofilms et de contrôler l'utilisation de bio-dispersants (Figure 2.1) [36]. Le détecteur repose sur la méthode classique de mesure de l'ATP. Il est peu destructif car seulement une petite partie du milieu est prélevée pour analyse. Le dispositif de la forme d'un stylo, utilisé dans le cadre du contrôle du biofilm (Annexe II), permet le prélèvement d'un échantillon de faible volume. Il se compose de quatre parties : tout d'abord, la lyse des cellules est réalisée sur le volume échantillonné pour libérer l'ATP, puis, il réagit dans une
chambre de mélange, un photomètre mesure l'intensité lumineuse par chromatographie, ensuite l'appui sur le bouton entraîne un agent désinfectant. Cet appareil présente deux inconvénients : d'une part, la mesure est fonction des cellules bactériennes et non du biofilm lui-même et d'autre part, il est sophistiqué et cher.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 2.1 : Bioscan™ [36].</figcaption></figure>

Pour P. Chumkhunthod et al., les microscopies à épifluorescence et électronique à balayage sont des méthodes rapides pour connaître l'efficacité de désinfectants contre les *Pseudomonas* contenus dans le biofilm [79]. L'observation des surfaces permet de mettre en évidence directement la présence ou non de bactéries. Cependant, ces techniques ne sont pas liées au biofilm mais aux bactéries, elles ne sont pas immédiates et nécessitent une préparation des échantillons.

L'analyse de coupons pour détecter et suivre la formation du biofilm est une technique classique et souvent décrite dans la littérature [16, 36, 80-84]. Des coupons d'aciers, en général, mais aussi de cupronickel, de titane ou d'aluminium sont placés dans le milieu étudié. Ils sont fabriqués la plupart du temps avec les mêmes matériaux que ceux du système étudié et peuvent avoir la forme de clous ou de plaques. Les échantillons sont ensuite placés soit directement dans le système, soit dans un circuit mis en dérivation sur une canalisation par exemple.
Comme le décrit H.A. Videla [36], le premier système de suivi avec des échantillons en dérivation ou en série est le Robbins Device où les coupons ont la forme de clous (Figure 2.2). Ses principaux inconvénients sont des temps de détection assez longs et une réalisation complexe. De plus, les petits échantillons entraînent une perte d'informations sur toute la surface. Cependant l'utilisation des systèmes en dérivation est plus flexible et interfère moins sur les installations. D'autre part, ce type de capteur peut aussi être utilisé dans le cadre du contrôle sous l'action de biocide.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 2.2 :** Système Robbins (Robbins device) [36].</figcaption></figure>

Un système développé plus récemment (RENAProbe™ soit REusable, Non-conventional Appliance) [36] est utilisé pour suivre les effets des biosalissures et de la corrosion dans les circuits de refroidissements ou dans les lignes d'injection d'eau des gisements pétroliers.

Un autre système, le Petrolite Bioprobe™ est basé sur les mêmes principes que ceux exposés précédemment (Figure 2.3) [36]. Les échantillons, en forme de clou, sont placés dans un circuit en parallèle.

H.A. Videla *et al.* ont également décrit une approche pratique du suivi des effets du biofilm sur la corrosion des surfaces métalliques utilisées dans les échangeurs de chaleurs et dans les pipelines [16]. Le principe de détection des coupons est d'immerger les échantillons pendant plusieurs semaines puis de pratiquer des diverses analyses de la surface : pertes de poids (la dégradation du matériau est dans ce cas non négligeable), résistance de polarisation, énumérations de souches bactériennes, identifications et mesures de l'activité biologique.
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 2.3 : Système d’échantillons Petrolite Bioprobe™ avec un montage haute pression [36].</figcaption></figure>

Signalons l'existence d'un brevet américain concernant la détection du biofilm à partir de coupons [85]. Contrairement à la plupart des méthodes de coupons, il ne s'agit pas ici de métaux mais de verre pouvant ainsi être stérilisé avant toute utilisation. Le biofilm est analysé par les méthodes de microbiologie de façon à déterminer la quantité, le type et le taux de croissance des microorganismes ainsi que les nutriments requis.

Les principaux inconvénients de ces méthodes de détection par coupons sont : des temps de réponse très longs, des analyses *ex situ*, un personnel qualifié pour la mise en œuvre et l'interprétation des résultats. Cependant ces capteurs sont largement utilisés car ils sont simples à mettre en place.

## 6 DETECTION DU BIOFILM PAR DES MOYENS ELECTROCHIMIQUES

G. Schmitt a réalisé une liste des différentes méthodes électrochimiques pour suivre la formation du biofilm et de la corrosion microbienne [86, 87]. Les conclusions obtenues sur chacune des principales techniques sont décrites dans le Tableau 2.2.
<table><caption>Tableau 2.2: Méthodes de détection du biofilm et de la corrosion influencée microbiologiquement [87].</caption><thead><tr><td>Méthodes d'études</td><td>Résultats obtenus</td></tr></thead><tbody><tr><td>Potentiel de corrosion</td><td>Mesure facile mais difficilement interprétable dans le cas d'une corrosion microbienne</td></tr><tr><td>Potentiel redox</td><td>Très limité pour suivre les changements de la solution engendrés par l'activité microbienne</td></tr><tr><td>Résistance de polarisation</td><td>Obtention d'informations sur la corrosion uniforme et non sur les piqûres occasionnées par le biofilm</td></tr><tr><td>Technique de la cellule double</td><td>Deux cellules identiques sont isolées par une membrane. La mesure du courant galvanique permet de mettre en évidence l'influence de l'activité microbiologique</td></tr><tr><td>Impédance électrochimique</td><td>Etude d'une corrosion uniforme par l'activité bactérienne. Il faut une électrode dans un état stationnaire d'un point de vue de la corrosion et du biofilm</td></tr><tr><td>Analyse du bruit électrochimique</td><td>Bons résultats. Pas de perturbation du système de corrosion et de l'activité microbienne</td></tr><tr><td>Technique de relaxation électrochimique</td><td>Une petite perturbation est suffisante pour mesurer une vitesse de corrosion. Cela peut être associé à un système électronique. Pas de relation avec l'activité biologique</td></tr><tr><td>Technique de l'électrode vibrante</td><td>Etat de la situation électrochimique du métal sous un biofilm. C'est une méthode non-destructive qui n'affecte pas l'activité microbienne du biofilm. Mais elle doit être associée à d'autres méthodes (XPS, FT-IR)</td></tr></tbody></table>

Certaines de ces techniques sont largement utilisées pour suivre la formation du biofilm. Selon G. Salvago *et al.*, une simple mesure électrochimique du courant et du potentiel lors de la réduction de l'oxygène permet de suivre la croissance du biofilm [74, 88]. En eau de mer, la surface de l'acier inoxydable est recouverte d'un film passif. Il existe donc une interface film passif/biofilm. En considérant le biofilm dans un état stationnaire, tout l'oxygène qui arrive à la surface du biofilm doit être réduit à l'interface film passif/biofilm selon un processus cathodique. Le biofilm peut alors influencer la valeur du courant obtenu par son épaisseur et sa capacité à permettre la diffusion de l'oxygène. L'augmentation de la résistance de la couche de diffusion et la diminution de la résistance de polarisation à la surface du film passif traduisent la formation d'un biofilm. Les effets du biofilm sur le film passif de l'acier inoxydable sont similaires à ceux obtenus lors d'une diminution du pH. Cependant, les travaux de N. Le Bozec ont montré que le film passif et le potentiel sont modifiés au cours du temps par la présence du biofilm [49].
J. Hubrecht et al. ont suivi la corrosion microbienne par mesure du bruit électrochimique [89]. La technique consiste enregistrer le courant entre deux électrodes de travail avec un ampèremètre à résistance nulle, lui-même connecté à un multimètre permettant des mesures de courant d'une précision de 1 nA. Un second multimètre à haute impédance et à haute résolution est utilisé pour les mesures de potentiels. Les spectres sont analysés par transformée de Fourier. Des mesures d'impédances ont permis de valider les résultats obtenus. A.M. Brennenstuhl a également utilisé la technique du bruit électrochimique pour suivre la corrosion influencée par les microorganismes [90]. Différentes techniques sont utilisées en complément comme le suivi de potentiel et l'ampérométrie à résistance nulle. Le but est d'optimiser la caractérisation du système pour fournir des informations en vue de pratiquer des tests accélérés. Cette technique de suivi semble bien fonctionnée. Cependant l'interprétation des spectres n'est pas toujours évidente et elle demande un personnel qualifié.

La formation du biofilm cause une forte dépolarisation au regard de la réduction de l'oxygène sur le métal lors d'un couplage galvanique entre un conduit en acier inoxydable par exemple, et une anode en cuivre, en titane ou en fer. Cela engendre l'augmentation du potentiel libre de corrosion du matériau dans l'état passif, l'augmentation du risque d'initiation de corrosion localisée et l'augmentation des courants galvaniques dans le couplage des matériaux actifs-passifs [91-94]. Le biofilm provoque également ces augmentations en fournissant un signal électrochimique (variation de potentiel ou de courant galvanique) avant même l'apparition d'une diminution du transfert de chaleur ou de l'augmentation du facteur de friction. Il est alors possible d'utiliser ce type de signaux pour détecter précocement la croissance du biofilm (moins de 50 µm). La mesure de courant galvanique, directement liée à la présence de bactéries ($10^6$ à $10^7$ bactéries.cm$^{-2}$) est un indice de la présence d'un biofilm. Les principaux capteurs sur ce principe de couplage galvanique sont présentés dans les lignes suivantes.

B. M. Rosales a décrit un détecteur dénommé « $H_2O-X-MP$», fournissant des informations rapides et faciles sur la présence des éléments dans l'eau et sur l'ampleur de la prolifération microbiologique dans les cuves des pétroliers [95]. Ce détecteur permet de connaître l'agressivité de la phase aqueuse envers les alliages d'aluminium, donnant des informations non seulement sur la croissance microbiologique mais aussi le contenu en sel de l'eau. Le détecteur est constitué d'une sonde avec une bi-électrode et d'une commande électronique. La sonde est formée de deux électrodes concentriques métalliques, séparées par
un matériau isolant, entre lesquelles circule un courant quand un potentiel est appliqué. Les caractéristiques de construction indiquent que le courant est proportionnel à la prolifération microbienne et à la quantité d'eau. Les avantages de ce système sont que tout d'abord il n'y a pas besoin de temps d'incubation pour connaître des risques de corrosion microbienne comme lors de l'utilisation de kits commerciaux, de plus il n'est pas nécessaire de vider le pétrolier comme pour réaliser une observation visuelle et, les équipements sont faciles à installer et à utiliser.

La sonde BIoGEORGE™, capteur de suivi du biofilm élaborée par G. Licina et al. (Figure 2.4) est constituée de deux électrodes identiques montées sur un corps en acier inoxydable et un système de contrôle et d'acquisitions de données. Les électrodes sont polarisées quotidiennement et les courants et potentiels sont suivis. Les biofilms peuvent être détectés par le suivi du courant qui évolue pendant le cycle de polarisation : le courant appliqué augmente de 1 à 17 µA. Le courant « généré » c'est a dire, le courant qui persiste une fois que les électrodes aient été séparées l'une de l'autre a un comportement similaire et augmente de 0 à près de 4 µA. Cependant, peu à peu, ce courant diminue pour ne plus exister après 6 mois d'expérimentation. Le courant « généré » fournit une mesure de l'activité du biofilm sur le métal [56, 96, 97].

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 2.4 : Principe de la sonde de suivi électrochimique sur ligne BIoGEORGE™ [56, 96, 97, 100].</figcaption></figure>
De plus, G. Nekoksa et G. Licina suppose que la polarisation cathodique peut faciliter la formation du biofilm et induire une détection plus précocement sur les surfaces polarisées que sur les surfaces non polarisées. V. Scotto et al. ont également montré que l'accumulation des exopolymères est facilitée par la polarisation cathodique du métal dû à un enrichissement en ions bivalents [98]. Par contre, pour N. J. E. Dowling et al., les fluctuations de potentiels peuvent interrompre ou perturber la formation du biofilm [99]. Il semble donc difficile de maîtriser les conséquences d'une polarisation sur le développement du biofilm. Cette polarisation doit entraîner dans tous les cas une différence de comportement entre les surfaces du capteur BIOGEORGE et les surfaces des canalisations étudiées. De plus, le seul milieu possible d'étude est l'eau de mer.

De même, A. Mollica et G. Ventura ont enregistré la mesure de l'évolution du courant galvanique [91-94]. Cette mesure est utilisée pour suivre la première phase de croissance du biofilm. Le courant galvanique entre un acier inoxydable et un alliage de cuivre augmente rapidement durant la première semaine d'exposition, résultat de la croissance initiale du biofilm sur les surfaces d'acier inoxydable. Une décroissance partielle du courant galvanique peut ensuite être observée, conséquence de l'épaississement du biofilm qui engendre une diminution du courant limite de réduction de l'oxygène. Les travaux de A. Mollica ont donné lieu à la réalisation d'un capteur : le BIOX, breveté par le Service Recherche de la ENEL en Italie. Cependant selon la STELAR S. N. C., société fabriquant et distribuant le BIOX, la détection du biofilm ne serait pas dépendante de la mesure du courant.

En conclusion, même si les capteurs basés sur une mesure du couplage galvanique répondent à certains critères comme la simplicité d'utilisation, d'interprétation et la solidité, ils semblent relativement discutables d'un point de vue sensibilité, précision et fiabilité dans l'interprétation des résultats.

La plupart des méthodes de détection et de suivi sont complexes dans leur mise en œuvre. Beaucoup d'entre elles ne sont utilisées qu'en laboratoire ou sur site pilote [65].

L'analyse du tranport de matière à travers une couche est une méthode qui vient compléter les techniques de détection du biofilm. Le développement d'un capteur basé sur ce principe nécessite d'utiliser un système permettant le contrôle de l'hydrodynamique à la surface d'une électrode disque fixe. Cette condition est réalisée par la cellule à jet noyé dont nous allons décrire le principe dans le chapitre suivant.
# Chapitre II.

## *Principe de la cellule*

### *à jet noyé.*

Les résultats obtenus dans la première partie de ce manuscrit ont montré que le contrôle de l'hydrodynamique est nécessaire pour permettre la détermination de l'épaisseur d'un biofilm par analyse du transport de matière d'un traceur électrochimique à travers une couche poreuse. Les problèmes créés par la rotation de l'électrode pour une application dans un milieu industriel nous conduisent à nous intéresser à un système à électrode fixe. Un dispositif expérimental où l'électrolyte circule devant l'électrode de travail dans des conditions hydrodynamiques parfaitement définies et maîtrisées est nécessaire.

## 1 CONTROLE DES CONDITIONS HYDRODYNAMIQUES

En électrochimie, plusieurs dispositifs à circulation d'électrolyte ont déjà été utilisés pour étudier des problèmes de transport de matière [101]. Le système le plus courant est l'électrode à disque tournant où la théorie est bien connue depuis les travaux de Levich ([41] et voir Première Partie). La propriété essentielle de ce dispositif est l'uniforme accessibilité de l'interface. Celle-ci repose sur le fait que la vitesse normale au voisinage immédiat de l'électrode est indépendante de la coordonnée radiale et sur l'hypothèse d'une électrode uniformément réactive ($c_o$=constante). Cette dernière hypothèse est vérifiée avec une bonne précision, au potentiel correspondant au courant limite de diffusion pour lequel $c_o$=0. L'expression théorique, définie par le nombre de Sherwood Sh, peut alors s'exprimer sous forme de nombre sans dimension pour des valeurs élevées du nombre de Schmidt Sc :

$$ Sh=0,62*Re^{1/2}*Sc^{1/3} \qquad \text{Eq. 2.1} $$

où Re est le nombre de Reynolds.
Le dispositif à jet immergé correspond à une électrode fixe dont la surface est uniformément accessible, il semble donc répondre aux critères recherchés. Ce dispositif est utilisé depuis une vingtaine d'années, pour diverses applications industrielles en électrochimie comme le polissage électrochimique, la corrosion-érosion ou l'électrodéposition de micro-dépôts localisés.

L'écoulement sur une surface plane fixe recevant normalement un jet de liquide peut se décomposer en trois zones dont leur taille et leur position dépendent de la géométrie du système et des caractéristiques de l'écoulement : la zone de stagnation, la zone de transition et la zone de paroi (Figure 2.5).

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 2.5 : Caractéristiques de l'écoulement du dispositif du jet immergé où d est le diamètre de la buse, h la distance entre l'électrode et la buse et V la vitesse (en coordonnées cylindriques Vr et Vz) [102].</figcaption></figure>

Dans la zone de stagnation, au voisinage de l'électrode, le jet est dévié de sa direction normale en un flux radial dont la vitesse augmente linéairement en fonction de la position radiale. L'écoulement est de type axisymétrique. L'épaisseur de la couche limite hydrodynamique ne dépend pas ici de la distance radiale.

Loin de l'axe du jet, se trouve la zone de paroi (wall-jet) qui a été l'objet des premiers travaux sur le jet [103, 104]. Dans cette zone, la vitesse radiale diminue et
l'épaisseur de la couche hydrodynamique totale augmente avec l'éloignement de l'axe de symétrie.

Dans la zone de transition qui sépare la zone de stagnation de la zone de paroi, l'hydrodynamique est complexe et mal définie ; de fortes perturbations peuvent prendre place comme des rouleaux de convection.

Pour être en mesure de décrire le transport de matière, il faut dans un premier temps déterminer en tout point la distribution de la vitesse d'écoulement. Ce problème a été résolu en plusieurs étapes en considérant des écoulements bidimensionnels et tridimensionnels puis des jets uniformes et non uniformes [102]. Les résultats concernant les écoulements bidimensionnels ne seront pas repris ici.

N. Frössling a résolu les équations de Navier-Stokes en coordonnées cylindriques $r$, $\theta$, $z$ pour un écoulement tridimensionnel uniforme intercepté par un plan immobile, infini, normal à l'axe de l'écoulement (Figure 2.6) [105].

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 2.6 : Décomposition de l'écoulement de part et d'autre de la couche hydrodynamique [102].</figcaption></figure>

Loin de la paroi, à proximité du point de stagnation, les équations de vitesse d'un flux non visqueux sont :

$$U(r) = a^*r$$

et

$$W(r) = -2a^*z$$

où $a$ est une constante.
Dans la zone de stagnation, la couche hydrodynamique a une épaisseur $\delta_h$ constante et égale à $2,4\sqrt{\frac{v}{a}}$, et au voisinage immédiat de la paroi, les vitesses sont égales à

$$v_r(r, z) = A^*r^2z$$

et à
$$v_z(r, z) = -Az^2$$
où A est une constante dépendante de h et d.

Lors d'un écoulement à l'intérieur d'un tube de section circulaire (la buse), le profil des vitesses n'est pas uniforme (Figure 2.7) [106]. Lorsque le régime laminaire est établi, un régime de Poiseuille apparaît, caractérisé par un profil parabolique : la vitesse est nulle le long de la paroi de la buse et est égale à $2*v$ au centre de la buse (v étant la vitesse moyenne de l'écoulement). A la sortie de la buse, le profil parabolique du jet tend à s'aplatir. Ainsi, au voisinage de l'axe et à quelques millimètres de la buse, le jet peut être considéré comme uniforme.

Pour un jet non uniforme (la plupart des jets), la vitesse radiale du flux n'est plus une fonction linéaire de r [102, 107] :

$$U(r) = a^*r + b^*r^3 + \dots \text{ où a et b sont des constantes.}$$

Mais dans le voisinage immédiat du point de stagnation, on peut limiter le développement au premier terme ($U(r) = a^*r$) et donc considérer que la couche limite est constante dans ce domaine restreint. Ainsi cette solution est valable pour les jets uniformes et non uniformes, que le régime dynamique en sortie de buse soit laminaire ou turbulent, la différence ne résidant que dans la valeur de la constante hydrodynamique a.

La distribution de la vitesse d'écoulement est donc connue en tout point. Une description du transport de matière dans la cellule à jet noyé peut alors être envisagée.
<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 2.7 : Jet incident non uniforme.</figcaption></figure>

## 2 CARACTERISATION DU TRANSPORT DE MATIERE DANS LA CELLULE A JET NOYE

Le problème du transfert de masse convecto-diffusif sur une électrode à disque placée dans la zone de stagnation d'un jet incident a été traité en détail par D. T. Chin et C. H. Tsang [108]. Ils ont établi un modèle semi-empirique basé sur la résolution de l'équation de Fick dans le cas de l'écoulement décrit dans le paragraphe précédent (voir §1 de ce chapitre). Ce modèle se limite au domaine où la couche limite hydrodynamique est d'épaisseur constante et les effets de migration négligeables. En absence de variation de concentration de l'espèce diffusante en fonction de r sur l'électrode ($c_o$= constante), l'équation du transport de matière en régime stationnaire se réduit à :

$$v_z \frac{\partial c}{\partial z} = D \frac{\partial^2 c}{\partial z^2} \qquad \text{Eq. 2.2}$$

où c est la concentration de l'espèce diffusante et D son coefficient de diffusion.

Le profil de concentration, obtenu lors de la résolution de l'équation différentielle par D. T. Chin et C. H. Tsang, est représenté par une série asymptotique, et le flux de matière J est relié au gradient de concentration pariétal par :

$$J = -D \left( \frac{\partial c}{\partial z} \right)_{z=0} = k (c_o - c_\infty) \qquad \text{Eq. 2.3}$$
où k est le coefficient local du transfert de masse.

De plus, $v_z$ dépend non seulement de la vitesse moyenne du jet $v$ mais aussi de la hauteur de la buse $h$ par rapport au plan. Pour diverses gammes de $h/d$, pour des jets circulaires ou rectangulaires, uniformes ou non uniformes et pour des nombres de $Sc$ allant de 2,45 à 16800, D. T. Chin et C. H. Tsang ont alors obtenu une série d'équations du transfert de masse de la forme :

$$ Sh = \alpha * Re^{1/2} * Sc^{1/3} * g(Sc) * f(h/d) \quad \text{Eq. 2.4} $$

où $\alpha$ est un coefficient numérique dépendant de la géométrie de la buse, de la nature de l'écoulement et de la valeur du nombre de Schmidt. Notons qu'à une constante près, la dépendance du nombre de Schmidt est identique à celle de l'électrode à disque tournant (Eq. 2.1). Cependant cette équation n'est valide que pour un espace limité autour du point de stagnation.

Pour caractériser le transport de matière, V. Bouet a étudié l'influence de la grandeur adimensionnelle de la buse $h/d$ sur le courant limite mais aussi l'influence de la longueur de la buse [102]. Elle a alors montré que la hauteur de la buse par rapport à l'électrode de travail pour laquelle $h/d$ est compris entre 0,5 et 3 n'a pas d'effet. En pratique, l'intervalle sera limité entre 1,5 et 2,5. De plus une buse trop courte ne permettra pas d'éliminer toutes les microturbulences et le domaine du régime laminaire sera réduit. En conséquence, la longueur de la buse doit être supérieure à cinquante fois son diamètre (50*d) afin d'obtenir le domaine du régime laminaire maximal. V. Bouet a également montré que le rayon de la zone de stagnation où l'électrode est uniformément accessible exprimé par rapport au diamètre de la buse est inférieure à $\frac{r}{d} = 0,65$.

F. Baleras a utilisé une microélectrode tri-segmentée pour déterminer les caractéristiques directionnelles fournissant le gradient de vitesse pariétale et la direction de l'écoulement [109, 110]. Il a ainsi démontré l'uniforme accessibilité de la surface, dans la zone de stagnation. F. Baleras a également montré qu'en régime laminaire, le diamètre $\Phi$ de la zone d'uniforme accessibilité au transport de matière, exprimé par rapport au diamètre de la buse est égal à $\Phi/d = 1,3$.

En résumé, V. Bouet et F. Baleras ont vérifié la validité de l'équation de D. T. Chin et C. H. Tsang. Il en ressort qu'une cellule à jet immergé, utilisée dans sa zone de stagnation, présente une hydrodynamique similaire à celle de l'électrode à disque tournant en tenant
compte de différents paramètres comme le diamètre de la buse, celui de l'électrode de travail et la hauteur entre la buse et l'électrode.

## 3 DESCRIPTION DE LA CELLULE A JET NOYE

Les deux cellules à jet noyé, employées dans le cadre de ce travail utilisent le principe développé par V. Bouet [102]. La première cellule à jet est réalisée en PMMA (pour la cellule opto-électrochimique) et la seconde en PVC (pour le capteur biofilm) (Figure 2.8).

L'électrode de travail est placée sur le fond plat, perpendiculairement à la buse, qui est caractérisée par sa longueur et son diamètre. La contre-électrode est disposée sur la paroi perpendiculairement à la buse. Une électrode de référence est ajoutée à la cellule électrochimique.

La cellule à jet immergé utilisée dans sa zone de stagnation a été rarement envisagée comme moyen d'étude en électrochimie [102, 110]. La raison est probablement la difficulté d'obtenir un jet parfaitement stable et constant dans une gamme de débit, en comparaison et la simplicité du contrôle de la vitesse de rotation de l'électrode à disque tournant. Ce problème a été résolu par l'utilisation d'une micro pompe à engrenages, entraînée par un moteur asservi équipé d'un tachymètre. Les débits obtenus varient entre 2,66 et 16 cm³.s⁻¹, permettant ainsi de conserver un régime laminaire.

Pour la cellule opto-électrochimique (Chapitre III), pour un diamètre de buse de 13 mm, le diamètre de la zone de stagnation est de 15,6 mm, compte tenu des travaux de F. Baleras. Ainsi, l'électrode, ayant un diamètre de 13 mm, est uniformément accessible au transport de matière. La même remarque peut être faite concernant les électrodes du capteur (Chapitre IV), leur diamètre étant de 10 mm, de même que celui de la buse. En positionnant la buse à une distance h = 20 mm de l'électrode, la grandeur adimensionnelle h/d est bien comprise dans l'intervalle [1,5 ; 2,5].
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Figure 2.8 : Principe de la cellule à jet noyé.</figcaption></figure>

En conclusion, en se basant sur les travaux réalisés par V. Bouet et F. Baleras, une cellule à jet immergé dont l'hydrodynamique est contrôlée peut être utilisée pour la détection du biofilm. Dans ces conditions, la variation du courant limite de réduction de l'oxygène en fonction du débit de l'électrolyte peut être mesurée et ainsi l'épaisseur du biofilm obtenue.
## Chapitre III.

### Cellule opto-électrochimique.

Le but de ce chapitre est de valider en laboratoire l'utilisation de la cellule à jet noyé en vue de la réalisation d'un capteur. La détermination de l'épaisseur du biofilm est obtenue à partir de la mesure du courant limite global. L'information obtenue correspond alors à une valeur moyenne de l'épaisseur du biofilm sur la surface de l'électrode, masquant ainsi des hétérogénéités éventuelles. Afin de connaître l'importance de ces hétérogénéités, nous avons équipé une cellule à jet immergé d'une électrode transparente et conductrice, qui autorise le couplage de la mesure de l'épaisseur du biofilm par méthode électrochimique à une observation du biofilm par voie optique directement à la surface de l'électrode. L'épaisseur du biofilm ainsi mesuré peut être comparer aux informations extraites par le traitement des images comme le taux de recouvrement et le nombre d'objets.

# 1 DISPOSITIF EXPERIMENTAL

## 1.1 LA CELLULE A JET NOYE

La cellule décrite dans le Chapitre II est fixée sur un banc permettant un déplacement horizontal ou vertical. L'électrode de travail est constituée d'une pastille de verre recouverte d'un dépôt d'oxyde d'étain modifié (SnO₂). Trois ampoules halogènes, placées autour de la buse à 120° l'une de l'autre, permettent un éclairage homogène pour la prise photographique de la surface (Figure 2.9 et Figure 2.10).

Un appareil photographique numérique (MINOLTA RD-175) couplé à un télé-microscope (QUESTAR QM 100, modèle 30003) permet de réaliser des photos de la surface de l'électrode. Les différents éléments schématisés sur la Figure 2.9 sont représentés sur la photographie du montage (Figure 2.10).
<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 2.9 : Schéma de principe du banc optique de la cellule à jet noyé.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 2.10 : Photographie de la cellule à jet immergé.</figcaption></figure>

## 1.2 CONDITIONS EXPERIMENTALES

Les électrodes sont immergées dans un bac à circulation continue, à l'air libre, en présence des ultraviolets du soleil qui accélèrent la formation du biofilm. Ce bac est situé sur
la plate forme où l'eau de mer est prélevée à Sainte-Anne du Portzic, en rade de Brest. Les électrodes sont placées pour les mesures dans une cellule électrochimique à jet noyé.

L'électrolyte est de l'eau de mer identique à celle décrite dans le §2.1.1 du Chapitre II de la première partie, et le traceur électrochimique est l'oxygène (voir §2.4.2, de ce même chapitre).

Les analyses électrochimiques et d'images ont été réalisées sur deux électrodes sur une durée de quatorze jours. Seuls les résultats concernant une électrode sont représentés, ces résultats étant très similaires.

Quatre zones différentes, repérées par une marque, sont sélectionnées pour avoir une représentation de la surface de l'électrode. D'après la Figure 2.11, la surface totale prise en photographie est d'environ 0,5 mm² soit 0,4 % de la surface totale. Ces quatre zones représentent 1,6 % de la surface totale de l'électrode. Notons que l'objectif n'est donc pas de se représenter la surface totale en images mais de savoir si quatre points pris aléatoirement sont représentatifs de l'ensemble de la surface. La position respective de chacune des zones d'étude est indiquée sur la Figure 2.12.

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>Figure 2.11 : Photographie d'une mire.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 2.12 : Position des repères sur la surface de l'électrode.</figcaption></figure>

## 1.3 ELECTRODE DE TRAVAIL

L'électrode de travail est une électrode de $SnO_2$ transparente et conductrice. Le dépôt d'oxyde d'étain ($SnO_2$), dopé au fluor (F) ou à l'antimoine (Sb) pour le rendre conducteur, est modifié spécialement pour notre étude afin d'obtenir des courants suffisamment importants lors de la réduction de l'oxygène [111, 112] (Annexe III). Des sites catalytiques vis-à-vis de la réduction de l'oxygène sont créés par dépôts d'éléments métalliques en surface, à l'état de traces pour conserver une bonne transparence optique (voir §2).

Le comportement électrochimique de l'électrode est alors très analogue à celui de l'or (Figure 2.13). La voltampérométrie met en évidence le palier de réduction de l'oxygène (entre -800 mV/ECS et -1000 mV/ECS) [113]. L'allure des courbes $i=f(E)$ sur une électrode d'oxyde d'étain modifiée est très proche de celle obtenue sur une électrode d'or, mise à part si l'on prend en compte un décalage de 200 mV sur l'ensemble de la courbe. Le dégagement d'hydrogène (destructeur du dépôt) est ainsi décalé vers les potentiels cathodiques.

La courbe courant tension peut facilement être obtenue pour le ferri/ferrocyanure de potassium, comme en eau douce.
<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Figure 2.13 : Courbes de polarisation avec le traceur oxygène en EDT à 1000 tr.mn⁻¹ sur électrode d'or massif (Au) O et sur électrode transparente et conductrice (SnO₂ modifié) ■ dans une solution de NaCl 0,5 M, pH 8 [113].</figcaption></figure>

## 2 RESULTATS EXPERIMENTAUX

### 2.1 VOLTAMPEROMETRIE OU i=F(E)

Des modifications de la courbe courant-potentiel sont observées en fonction du temps d'immersion sur la Figure 2.14. Cela se traduit au cours du temps, par une diminution du plateau de diffusion de l'oxygène, due à la présence du biofilm. D'une valeur de 530 µA sur la palier de diffusion au temps initial, le courant diminue à 460 µA à cinq jours, puis à 330 µA à neuf jours pour ensuite atteindre 280 µA après quatorze jours d'immersion.

La cinétique, quant à elle, semble peu modifiée en comparaison avec les courbes obtenues sur les électrodes d'or (Première Partie). Au temps initial, le premier palier de réduction de l'oxygène correspondant à une étape à deux électrons (Chapitre II, §2.4.2 de la première partie) n'est pas clairement défini. Le processus cinétique masque cette étape de réduction de l'oxygène en péroxyde d'hydrogène. Mais avec le temps d'immersion (surtout à 9 et 14 jours) et donc avec la formation du biofilm, une cassure dans l'allure de la courbe de polarisation à -600 mV/ECS est de plus en plus marquée.
Finalement, le palier de réduction de l'oxygène étant bien marqué, le potentiel de -1000 mV/ECS est le potentiel choisi dans la suite pour analyser la transport de matière et ainsi déterminer l'épaisseur du biofilm.

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 2.14 : Courbes de polarisation à 5 mV.s⁻¹ lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle à 10,66 cm³.s⁻¹ avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial —, à 5 jours ■, 9 jours ▲ et 14 jours ● sur une électrode de SnO₂ modifié.</figcaption></figure>

## 2.2 DETERMINATION DE L'EPAISSEUR

Etant donnée l'uniforme accessibilité de la surface de l'électrode au transport de matière, les équations 1.9 et 1.10 sont valides. A partir de la mesure du courant limite de réduction de l'oxygène, l'épaisseur du biofilm est déterminée pour chaque valeur de débit :

$$ \delta_f = nFD_f c_\infty S((i(t)-i_o)^{-1} - (i(0)-i_o)^{-1}). $$

Le courant global, obtenu sur le palier de réduction de l'oxygène (-1000 mV/ECS), sur l'électrode de SnO₂ modifié en fonction du temps et du débit permet d'atteindre la valeur de l'épaisseur du biofilm lors de son évolution (Figure 2.15). Au temps initial, la loi de Levich se vérifie par l'obtention d'une droite ne passant pas par l'origine et la valeur de $i_o$ est de 120 µA.
A cinq jours d'immersion (Figure 2.16), l'épaisseur du biofilm obtenue varie de 17 µm à 7 µm pour un débit variant de 5,33 cm³.s⁻¹ à 16 cm³.s⁻¹. A neuf et quatorze jours d'immersion, l'épaisseur du biofilm est de plus en plus importante. Pour un débit de 5,33 cm³.s⁻¹, l'épaisseur est de 47 µm à neuf jours et elle atteint 70 µm à quatorze jours. Pour un débit plus important comme 16 cm³.s⁻¹, l'épaisseur évolue de 21 µm à 31 µm entre neuf et quatorze jours.

L'épaisseur mesurée n'est pas constante en fonction du débit quel que soit le temps d'immersion (5, 9 ou 14 jours) et le caractère élastique s'observe également sur une électrode d'oxyde d'étain modifiée sous un jet noyé comme sur une électrode d'or à disque tournant.

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

**Figure 2.15** : Représentation de Levich lors de la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène. Mesures réalisées au temps initial ♦, à 5 jours■, 9 jours ▲ et 14 jours ● sur une électrode de SnO₂ modifié.
<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>Figure 2.16 : Epaisseur d'un biofilm obtenu en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène en fonction du débit. Mesures réalisées au temps initial ♦, à 5 jours ■, 9 jours ▲ et 14 jours ● sur une électrode de SnO₂ modifié.</figcaption></figure>

## 2.3 ANALYSE OPTIQUE

Au cours des mesures électrochimiques, des photographies de la surface de la l'électrode (Figure 2.17 a) sont réalisées et ensuite analysées par traitement d'images à l'aide du logiciel MATLAB.

### 2.3.1 Méthode expérimentale

#### 2.3.1.1 Procédure de traitement

Le traitement de l'image est assuré par un programme développé sur MATLAB associé à la « toolbox » Images Processing. La procédure est la suivante :

1. Chargement de la photographie,

2. Transformation de la photographie en image en niveau de gris,

3. Tracé de l'histogramme des pixels de l'image en fonction du niveau de gris, soit entre [0 ; 256] où à un niveau 0 correspond une image noire et à 256, une image blanche,

4. Détermination du seuil par un calcul d'écart de surfaces,
5. Binarisation de l'image,

6. Contournement de chaque objet,

7. Comptage des objets,

8. Calcul du taux de recouvrement des objets.

## 2.3.1.2 Détermination du seuil

Afin de binariser l'image obtenue en niveau de gris, il est nécessaire de fixer une valeur de seuil, ce qui se fait à partir d'un calcul d'écart minimal entre la surface couverte calculée avec des polygones et la surface couverte calculée avec les pixels. Le programme incrémente la valeur de seuil jusqu'à ce que l'écart entre les deux calculs de surfaces soit de 0,4. Précisons que cet écart est un critère artificiel qui permet d'obtenir un seuil de manière automatique pour la binarisation. Notons que ce critère d'écart pour déterminer le seuil n'est pas suffisant quand il y a peu de contraste sur l'image (au temps initial et à cinq jours notamment). Pour des raisons de temps, l'ajout d'un second ou d'un troisième critère n'a pu être réalisé.

Une hypothèse est formulée pour réaliser le traitement d'images : quand la fréquence cumulée en pixels, obtenue à partir de l'histogramme comme par exemple sur la Figure 2.17 b, est inférieure à 6 %, la valeur des pixels est considérée comme du noir optique. Cela peut être également décrit plus simplement comme suit : quand la valeur cumulée des pixels en gris ne représentent pas plus de 6 % du niveau de gris total, alors on considère qu'il s'agit de la surface de l'électrode et qu'elle est noire.

Pour chaque temps d'immersion et pour chaque position sur l'électrode de travail, une analyse d'images est réalisée en suivant cette procédure.
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Figure 2.17 : Photographie originale (a) et répartition des pixels en niveau de gris (b).</figcaption></figure>

## 2.3.2 Au temps initial

Au temps initial, pour chaque position sur la surface de l'électrode, le nombre d'objets et le taux de recouvrement sont représentés sur le Tableau 2.3. Pour les positions 1, 3 et 4, très peu de taches sont repérables sur les photographies de la Figure 2.20 alors qu'un nombre non négligeable de petits objets sont déterminés à partir du seuil (Figure 2.21).
Comme cela a été dit précédemment, c'est une conséquence du faible contraste sur l'image et la moindre variation de gris fait apparaître des objets. Cependant la surface couverte est très faible (<0.3%) et l'image binarisée est considérée comme satisfaisante.

Pour la position 2, la photographie (Figure 2.20) révèle des objets de dimensions non négligeables alors que la surface est normalement propre. L'électrode n'étant pas polie, elle n'a pas été passée aux ultrasons. Ainsi différentes particules peuvent être présentes sur la surface. Cependant, le taux de recouvrement n'excédant pas 1 %, la surface peut être considérée comme nue.

<table><caption>Tableau 2.3 : Caractéristiques de la photographie obtenue au temps initial sur les quatre positions de l'électrode de SnO₂ modifié.</caption><thead><tr><th>Position 1</th><th>Position 2</th><th>Position 3</th><th>Position 4</th></tr></thead><tbody><tr><td>40 objets</td><td>54 objets</td><td>41 objets</td><td>75 objets</td></tr><tr><td>Taux de recouvrement<br>0,1 %</td><td>Taux de recouvrement<br>1 %</td><td>Taux de recouvrement<br>0,3 %</td><td>Taux de recouvrement<br>0,3 %</td></tr></tbody></table>

### 2.3.3 A cinq jours d'immersion

Le Tableau 2.4 présente le nombre d'objets et le taux de recouvrement pour les quatre positions sur la surface de l'électrode après cinq jours d'immersion.

Le nombre d'objets est similaire d'une position à l'autre, aux alentours de 240, tandis qu'il est plus faible sur la position 1, où seulement 106 objets sont comptabilisés. Par contre, il existe des différences plus importantes concernant le taux de recouvrement entre les différentes positions : 0,5 % sur la position 3 à 5 % sur la position 4. A seulement cinq jours d'immersion des disparités apparaissent donc entre les positions (Figure 2.20, Figure 2.21).
<table><caption>Tableau 2.4 : Caractéristiques de la photographie obtenue après 5 jours d'immersion sur les quatre positions de l'électrode de SnO₂ modifié.</caption><thead><tr><th>Position 1</th><th>Position 2</th><th>Position 3</th><th>Position 4</th></tr></thead><tbody><tr><td>106 objets</td><td>234 objets</td><td>244 objets</td><td>238 objets</td></tr><tr><td>Taux de recouvrement<br>2 %</td><td>Taux de recouvrement<br>2 %</td><td>Taux de recouvrement<br>0,5 %</td><td>Taux de recouvrement<br>5 %</td></tr></tbody></table>

### 2.3.4 A neuf jours d'immersion

Sur le Tableau 2.5, à neuf jours d'immersion, les photographies (Figure 2.20) permettent d'observer une surface couverte beaucoup plus importante qu'à cinq jours d'immersion. Pour les positions 1, 2 et 3, la surface recouverte est de quelques pour cents, entre 7 et 12 (Figure 2.21) et elle atteint plus de 30 % en position 4. Par contre le nombre d'objets n'est pas proportionnel au taux de recouvrement. En position 4, la surface est très importante alors que le nombre d'objets n'a que très légèrement augmenté par rapport à cinq jours. Les objets sont de grandes tailles, tandis qu'en position 2, il y a beaucoup d'objets de petites tailles.

<table><caption>Tableau 2.5 : Caractéristiques de la photographie obtenue après 9 jours d'immersion sur les quatre positions de l'électrode de SnO₂ modifié.</caption><thead><tr><th>Position 1</th><th>Position 2</th><th>Position 3</th><th>Position 4</th></tr></thead><tbody><tr><td>520 objets</td><td>657 objets</td><td>178 objets</td><td>272 objets</td></tr><tr><td>Taux de recouvrement<br>10 %</td><td>Taux de recouvrement<br>12 %</td><td>Taux de recouvrement<br>7 %</td><td>Taux de recouvrement<br>32 %</td></tr></tbody></table>

A neuf jours d'immersion, les nombreux contrastes entre les quatre positions sur la surface de l'électrode signalent que les disparités observées à cinq jours se sont accrues. Des zones floues apparaissent autour des objets permettant de distinguer ainsi la partie du biofilm présente dans la solution de celle se trouvant sur la surface de l'électrode.
### 2.3.5 A quatorze jours d'immersion

Les hétérogénéités concernant le nombre d'objets et le taux de recouvrement, mises en évidence à cinq et neuf jours d'immersion sont toujours présentes après quatorze jours (Tableau 2.6). Le biofilm suffisamment dense pour interférer avec la lumière (Figure 2.20) n'est pas homogène sur toute la surface de l'électrode, en accord avec ce qui a été montré dans le chapitre I de la première partie. Des zones très denses sont voisines de zones « vides » comme le montrent les images binarisées (Figure 2.21). Sur la Figure 2.20 en position 4, apparaissent des endroits plus flous qui peuvent tout à fait correspondre à des exopolymères constituant des pièges d'eau, relativement bien transparents à la lumière.

<table><caption>Tableau 2.6 : Caractéristiques de la photographie obtenue après 14 jours d'immersion sur les quatre positions de l'électrode de SnO₂ modifié.</caption><thead><tr><th>Position 1</th><th>Position 2</th><th>Position 3</th><th>Position 4</th></tr></thead><tbody><tr><td>237 objets</td><td>602 objets</td><td>376 objets</td><td>307 objets</td></tr><tr><td>Taux de recouvrement<br>9 %</td><td>Taux de recouvrement<br>24 %</td><td>Taux de recouvrement<br>15 %</td><td>Taux de recouvrement<br>24 %</td></tr></tbody></table>
## 2.4 SYNTHESE

Les résultats ont montré que pour un temps donné, les quatre positions ne sont pas homogènes. La Figure 2.18, présentant l'évolution de la surface couverte par le biofilm en fonction du temps d'immersion, montre que l'augmentation est lente jusqu'à cinq jours. Comme cela a été décrit dans la Première Partie et par W.G. Characklis [114], la croissance commence par une phase d'induction, phase de croissance où la quantité de biofilm est faible, et entre zéro et cinq jours, le biofilm est toujours dans cette phase de développement. Le taux de recouvrement augmente rapidement à neuf et quatorze jours d'immersion. Cela correspond à la phase de croissance exponentielle du biofilm. A quatorze jours d'immersion, le biofilm semble avoir atteint la phase de stabilisation dans son développement.

La variation de l'occupation de la surface a la même allure quelles que soient les positions, même si le taux est plus ou moins grand entre deux positions différentes. Néanmoins une diminution est visible sur la position 2 à quatorze jours.

L'allure de la courbe décrivant l'évolution du nombre d'objets en fonction de la position et du temps d'immersion (Figure 2.19) est similaire à celle obtenue sur la Figure 2.18. Cependant, le nombre d'objets pour chaque position a une variation non homogène. Sur la position 1, il diminue à quatorze jours alors que la surface couverte augmente, permettant d'en déduire que les objets sont plus gros qu'à neuf jours.

La représentation pour chaque position et chaque temps d'immersion des photographies et des images binarisées (Figure 2.20 et Figure 2.21) permettent de voir l'évolution globale de la surface de l'électrode. Une modification de cette surface est beaucoup plus marquée après neuf et quatorze jours d'immersion qu'à cinq jours.
<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>Figure 2.18 : Evolution du taux de recouvrement de la surface en fonction du temps d'immersion et de la position (1 ◆, 2 ■, 3 ▲ et 4 ●).</figcaption></figure>

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 2.19 : Evolution du nombre d'objets sur la surface en fonction du temps d'immersion et de la position (1 ◆, 2 ■, 3 ▲ et 4 ●).</figcaption></figure>
<table><caption>Figure 2.20 : Photographies des 4 positions au temps initial, après 5, 9 et 14 jours d'immersion.</caption><thead><tr><th></th><th>Temps initial</th><th>5 jours</th><th>9 jours</th><th>14 jours</th></tr></thead><tbody><tr><td>Position 1</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Position 2</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Position 3</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Position 4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
<table><caption>Figure 2.21 : Images binarisées des 4 positions au temps initial, après 5, 9 et 14 jours d'immersion.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Position 1</th><th rowspan="2">Position 2</th><th rowspan="2">Position 3</th><th rowspan="2">Position 4</th><th>Temps initial</th><th>5 jours</th><th>9 jours</th><th>14 jours</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
## 3 CONCLUSION

Comparons la variation de l'épaisseur (pour un débit de $8 \text{ cm}^3 \cdot \text{s}^{-1}$) à l'évolution du nombre moyen d'objets (sur les quatre positions) et au taux moyen de recouvrement (également sur les quatre positions), en fonction du temps d'immersion (0, 5, 9 et 14 jours). Ces quatre positions représentent 1,6 % de la surface totale et ne permettent pas de réaliser une réelle étude statistique. Les courbes (Figure 2.22) ont une allure très similaire en fonction du temps. La variation est peu importante entre zéro et cinq jours. Les pentes des courbes augmentent brusquement à neuf jours pour ensuite se réduire à quatorze jours.

Comme cela a été montré dans le Chapitre III de la Première Partie, la formation d'un biofilm se fait en trois phases comme sur la Figure 2.22 : l'amorçage (entre 0 et 5 jours), la croissance (entre 5 et 9 jours) et la phase plateau (entre 9 et 14 jours).

Ces résultats permettent de mettre en évidence la corrélation entre la mesure de l'épaisseur et le traitement d'images. La mesure d'épaisseur est une valeur moyenne de part la méthode utilisée et ne permet pas de mettre en évidence les hétérogénéités de surface contrairement au traitement d'images. Ainsi, la mesure de l'épaisseur du biofilm permet de le caractériser à l'échelle macroscopique, alors que l'analyse d'images permet de la décrire à l'échelle microscopique.

Les évolutions temporelles des paramètres atteints (épaisseur, taux moyen de recouvrement, nombre moyen d'objets) sont très semblables et présentent l'allure type du développement des biofilms décrits dans la littérature.

Les résultats des mesures d'épaisseur de biofilms par analyse du transport de matière d'un traceur électrochimique à travers une couche poreuse à l'aide d'une cellule à jet noyé sont cohérents avec ceux obtenus par la technique de l'EDT. Cette technique est donc applicable à la réalisation d'un capteur industriel.
<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Figure 2.22 : Comparaison de l'évolution de l'épaisseur ■, du nombre d'objets ▲ et du taux de recouvrement ● au temps initial, à 5, 9 et 14 jours d'immersion.</figcaption></figure>
## Chapitre IV.

*Capteur de biofilm.*

Suite au développement de la méthode électrochimique permettant la mesure de l'épaisseur d'un biofilm (Première Partie) puis à la validation de la cellule à jet noyé pour cette étude, l'objectif de ce chapitre est la réalisation d'un capteur répondant notamment aux critères développés par G.J. Licina *et al.* [97]. Rappelons que ce système doit être :

- Simple à utiliser,

- Simple à interpréter,

- Solide,

- Sensible,

- Précis,

- Economique.

Après la description du capteur et des éléments associés, seront présentés les essais de détection et de mesures d'épaisseur de biofilm, réalisés avec le prototype.

# 1 DESCRIPTION DU CAPTEUR BIOFILM

## 1.1 PRINCIPE

La cellule de mesure, dont le principe est décrit dans le chapitre II, est en PVC. Cette cellule permet de réaliser la mesure dans le milieu même de formation du biofilm. Pour éliminer les disparités éventuelles entre les électrodes dues au biofilm (Chapitre III, Deuxième Partie), les électrodes de travail sont au nombre de six et les mesures d'épaisseur sont moyennées.

La longueur de la buse (10 cm) est assez courte pour limiter l'encombrement du capteur. La gamme de débit correspondant à un régime laminaire est peu étendue (3,73 cm³.s⁻¹ à 10,66 cm³.s⁻¹) [102]. Néanmoins, elle est suffisante pour une application industrielle.
Les électrodes de travail, en or et de surface 0,785 cm² sont placées dans la cellule électrochimique avec l'électrode de référence (électrode INGOLD Ag/AgCl à solution saturée en KCl) et l'électrode auxiliaire (plaque de titane platinée). Une buse est placée dans l'axe de chaque électrode à une distance h = 20 mm. La pompe à engrenages permet de maîtriser le débit du jet immergé lors de la mesure, sa vitesse de rotation étant asservie électroniquement à l'aide d'une dynamo tachymétrique, solidaire du moteur à courant continu qui entraîne la pompe. Chaque buse est reliée à la pompe à engrenage par une électrovanne.

Deux traceurs électrochimiques peuvent être utilisés pour effectuer les mesures (voir §2.4, Chapitre II, Première Partie) : l'oxygène et le ferricyanure de potassium. Les potentiels de travail utilisés sont respectivement de -900 mV/ECS et 0 mV/ECS. L'injection du traceur ferricyanure de potassium est assurée par une pompe doseuse. L'électrolyte est de l'eau de mer identique à celle décrite dans le paragraphe 2.1.1 du Chapitre II de la Première Partie.

La photographie de la Figure 2.23 présente la partie hydraulique du capteur. Les principaux éléments constituants le capteur sont présents. La Figure 2.24 représente un schéma de principe général et la Figure 2.25, un schéma de principe de la cellule électrochimique.

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Figure 2.23 : Photographie de la partie hydraulique du capteur.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Figure 2.24 : Schéma de principe du capteur de biofilm.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>Figure 2.25 : Schéma de principe de la cellule électrochimique.</figcaption></figure>
## 1.2 AUTOMATISATION

L'automatisation est assurée par un ordinateur qui intègre deux cartes de commande numérique/analogique ainsi que le logiciel utilisé pour gérer les mesures (Visual Basic pour Windows). Ces deux cartes se connectent sur le bus ISA. La carte d'entrées/sorties KEITHLEY DAS-1802-HR traite la partie analogique où elle contrôle en sortie la commande du moteur (pompe à engrenages) et la commande du potentiostat. En entrée, la vitesse de la pompe et la mesure du courant sont mesurées. La carte KEITHLEY PIO 24 présente vingt quatre entrées/sorties numériques, chaque élément du capteur pouvant ainsi être commander séparément : ouvrir ou fermer une électrovanne, commander la pompe à injection.

Le capteur se compose également d'un coffret interface de puissance. Il s'agit d'un coffret étanche à l'eau contenant les relais statiques de commandes des électrovannes, le potentiostat, l'asservissement de vitesse du moteur, les cartes de connexion du bus des cartes DAS et PIO.

## 1.3 PROCESSUS DE MESURE AUTOMATIQUE [115]

La procédure automatique permet la réalisation d'une succession de mesures sur plusieurs jours ou de manière ponctuelle en entrant différents paramètres (intervalle de mesures, traceur, débits maximal et minimal). Les données sont alors stockées et une exploitation graphique peut être lancée, donnant l'intensité en fonction du débit et l'évolution de l'épaisseur du biofilm au fil du temps. Un mode avec une utilisation manuelle<qw> a également été développé pour vérifier le bon fonctionnement de chaque élément du capteur (potentiostat, électrovanne, moteur).

La procédure de mesure (Figure 2.26) entraîne l'isolation de la cellule de mesure, l'injection d'un traceur est ensuite demandée. Si la réponse est OUI, le traceur est injecté ; si la réponse est NON, on passe directement à la mesure. La mesure du courant est réalisée pour différents débits et pour chaque électrode. Le capteur est rincé en fin de mesure. Puis entre deux mesures, le biofilm se développe pendant un intervalle choisi par l'utilisateur.
<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Figure 2.26 : Procédure de mesure de l'épaisseur du biofilm.</figcaption></figure>
## 2 DETECTION DU BIOFILM

La validation du capteur est faite en utilisant des électrodes recouvertes de gélatine, modèle de couche poreuse [116]. Ensuite, le capteur est utilisé pour suivre le développement d'un biofilm en eau de mer naturelle.

### 2.1 VALIDATION DU CAPTEUR A L'AIDE D'UNE COUCHE DE GEL [115]

La calibration du capteur a été réalisée sur des électrodes recouvertes de gélatine<fnref n="3" /> avec le traceur ferricyanure de potassium (2.10⁻<fnref n="3" /> M) en eau de mer [115]. E. L'Hostis et al. ont montré que l'analyse du transport de matière à travers une couche poreuse est possible sur une couche de gélatine [116]. Le principe de la validation est de mesurer l'épaisseur d'une couche de gélatine déposée sur une électrode<fnref n="4" /> placée dans la cellule à jet immergé du capteur puis sur un montage d'EDT. Les mesures sont réalisées avec la même solution électrolytique.

La porosité étant différente de 1 [116], l'épaisseur ne peut pas être obtenue avec la seule mesure du courant limite $i_f$ de diffusion à travers la couche de gélatine. Mais la détermination de $\frac{\delta_f}{D_f}$, d'après l'équation 1.8, permet de comparer les résultats obtenus avec l'EDT et le capteur à jet immergé (Figure 2.27). A la constante $D_f$ près, les courbes obtenues traduisent l'évolution de l'épaisseur en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode, déduite du débit et du nombre de Reynolds dans le cas du capteur à jet immergé. La similitude entre les deux courbes (Figure 2.27) montre ainsi la bonne correspondance entre les deux méthodes de détermination de l'épaisseur et l'uniforme accessibilité de l'électrode soumise au jet noyé obtenu dans la cellule du capteur.

<footnote n="3">³ Gélatine pour la microbiologie, qualité alimentaire, art. 4070, Merck.</footnote>

<footnote n="4">⁴ Une couche de gélatine homogène en épaisseur est obtenue par immersion de l'électrode en rotation (2000 tr.mn⁻¹) dans un bain de gel liquéfié.</footnote>
<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Figure 2.27 : $\frac{\delta_f}{D_f}$ de la couche de gélatine en fonction de la vitesse de rotation (■ EDT) et de la vitesse de rotation équivalente après calculs à partir du débit et du nombre de Reynolds (O jet noyé).</figcaption></figure>

## 2.2 APPLICATION EN EAU DE MER : MESURE DE L'EPAISSEUR DU BIOFILM

Le capteur a ensuite été utilisé pour suivre le développement d'un biofilm en eau de mer naturelle avec le traceur oxygène. Les mesures sont réalisées à intervalle régulier. La mesure du courant sur chaque électrode à un instant donné permet de suivre l'évolution de l'épaisseur du biofilm en fonction du débit à partir de l'équation 1.10 où :

$$ \delta_f = nFD_f c_\infty S((i(t) - i_o)^{-1} - (i(0) - i_o)^{-1}). $$

Seule l'épaisseur moyenne sur les électrodes est représentée et les écart-types ne sont indiqués que pour deux temps d'immersion pour des raisons de lisibilité.

### 2.2.1 Première expérimentation

L'évolution de l'épaisseur moyenne du biofilm en fonction du débit et du temps d'immersion est représentée sur la Figure 2.28. Cette épaisseur augmente de manière régulière en fonction du temps. Pour un débit de $7 \text{ cm}^3 \cdot \text{s}^{-1}$, à douze jours l'épaisseur est d'environ 2 µm, elle atteint 7 µm à dix neuf jours, puis 23 µm à vingt six jours, ensuite à trente quatre jours environ 29 µm et enfin 36 µm après cinquante jours d'immersion.
Une épaisseur d'une quarantaine de micromètres après une durée de cinquante jours, à l'abri de la lumière, est en accord avec notre connaissance du biofilm (Première partie). Notons que les écart-types sont plus faibles à douze jours qu'à trente quatre jours d'immersion, ce qui montre une hétérogénéité de croissance du biofilm entre les électrodes. Le fait que les écart-types soient larges justifie le choix de multiplier les électrodes pour s'affranchir des disparités existant entre elles.

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Figure 2.28 : Epaisseur moyenne du biofilm en fonction du débit et du temps d'immersion (♦ 12 jours, ■ 19 jours, ▲ 26 jours, ● 34 jours et - 50 jours), (juillet-août 1999).</figcaption></figure>

De plus, ce biofilm est nettement plus élastique à douze et dix neuf jours d'immersion qu'à cinquante jours. En effet, l'épaisseur moyenne diminue lors de l'augmentation du débit de manière plus importante en début d'immersion qu'en fin. L'écoulement rapide de l'eau de mer a donc tendance à rigidifier le biofilm une fois les premiers amas fixés.

A la fin de la manipulation le capteur est démonté pour observer le développement du biofilm sur toute la surface de la cellule électrochimique. Il s'avère alors que le biofilm est plus épais sur la zone centrale du capteur faisant face au jet que sur les bords (Figure 2.29). Il semble que les buses placées devant les électrodes gênent la circulation de l'électrolyte. Un biofilm plus épais s'est développé dans le tout capteur sauf près des électrodes (Figure 2.30).
<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Figure 2.29 : Photographie de la cellule électrochimique, coté électrode.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Figure 2.30 : Photographie de l'intérieur de la cellule électrochimique, après développement du biofilm.</figcaption></figure>

Suite à ces constatations, la cellule du capteur est modifiée afin de favoriser le développement du biofilm et de l'uniformiser. Pour cela :

- La buse d'arrivée centrale de l'eau de mer est rallongée de façon à ce que l'écoulement soit plus proche de la paroi pendant le développement du biofilm.

- Une grille en PVC permet de limiter en partie le volume d'échange dans la cellule.

- Des déflecteurs favorisent l'écoulement de l'eau vers les électrodes.
<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Figure 2.31 : Photographie de l'intérieur de la cellule après modification de l'écoulement lors du développement du biofilm.</figcaption></figure>

## 2.2.2 Deuxième expérimentation

La cellule est remise en circulation et des mesures de courant sont réalisées régulièrement pour déterminer l'épaisseur du biofilm.

Comme le montre la Figure 2.32, un biofilm relativement fin (quelques micromètres) et peu élastique est détecté après huit jours d'immersion. A vingt cinq jours, le biofilm est beaucoup plus épais et élastique. En effet, son épaisseur évolue entre 14 µm et 36 µm et pour un débit variant entre 10,66 cm³.s⁻¹ et 3,73 cm³.s⁻¹. Ensuite, à trente six jours, l'épaisseur est comprise entre 20 µm et 42 µm toujours sur la même gamme de débit. Finalement, à quarante trois jours d'immersion, l'épaisseur du biofilm évolue entre 50 µm et 30 µm et son élasticité semble moins importante qu'à trente six jours. Cependant, en comparant les résultats obtenus lors de la première et deuxième expérimentation, le biofilm semble faire preuve d'une plus grande élasticité dans ce cas. Néanmoins, l'épaisseur moyenne est du même ordre de grandeur : plusieurs dizaines de micromètres.

Notons que comme précédemment, les écart-types sont plus petits à huit jours d'immersion qu'à quarante trois jours, ce qui confirme l'augmentation des disparités sur les électrodes en fonction du temps d'immersion. Cependant ces écart-types sont beaucoup plus faibles que lors de la première expérimentation. Cela suppose un meilleur écoulement dans la cellule du capteur ainsi que d'une faible hétérogénéité entre les six électrodes.
Par la suite, on peut supposer qu'un capteur constitué d'une seule électrode permettrait de suivre l'évolution de l'épaisseur du biofilm, avec l'avantage d'une taille plus petite et donc un coût plus faible.

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Figure 2.32 : Epaisseur moyenne du biofilm en fonction du débit et du temps d'immersion (♦ 8 jours, ■ 25 jours, ▲ 36 jours et ● 43 jours), (mi septembre-octobre 1999).</figcaption></figure>

Comme pour la première étude, la cellule est démontée pour évaluer l'influence des modifications sur le développement du biofilm. Sur la Figure 2.33, on constate que le biofilm s'est développé de manière beaucoup plus homogène que dans le cas précédent, ce qui montre que les modifications apportées à la cellule ont rendu l'écoulement beaucoup plus homogène au sein de celle-ci.
<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>Figure 2.33 : Photographie de la cellule électrochimique, coté électrode, après modification de l'écoulement lors du développement du biofilm.</figcaption></figure>

## 3 CONCLUSION

Après avoir valider le capteur en le calibrant avec une couche de gélatine, modèle de couche poreuse, le capteur est utilisé pour suivre la formation d'un biofilm en eau de mer naturelle. Le biofilm développé dans la cellule de mesure est d'épaisseur analogue au biofilm obtenu sur EDT, mais avec un caractère élastique moins prononcé. L'observation directe de l'ensemble du capteur a montré un développement hétérogène du biofilm, dû aux variations des régimes hydrodynamiques au sein du capteur pendant la phase de croissance du biofilm.

Après modification du capteur, un nouvel essai a été entrepris et les résultats obtenus sont beaucoup plus proches de ceux décrits dans la Première Partie. L'observation visuelle a montré cette fois, un développement homogène du biofilm sur la surface du capteur. Cette mise au point confirme le rôle essentiel joué par l'hydrodynamique sur le développement du biofilm.

En conclusion, le capteur développé au sein de l'IFREMER répond en grande partie aux nombreux critères mentionnés par G.J. Licina et al. [56]. En effet, le logiciel est simple à utiliser et les résultats sont facilement interprétables (suivi de l'épaisseur pouvant être directement visualisée sur l'écran d'un ordinateur). De plus, le capteur est solide et il peut supporter une pression de dix bars. Il est également sensible et précis car un biofilm de quelques micromètres seulement peut être détecter, ce qui correspond aux premiers stades de sa formation. L'utilisation de ce capteur en eau douce nécessite toutefois l'injection du ferricyanure, qui a été intégré dans la procédure de mesure et est opérationnelle.
Conclusion

La méthode électrochimique développée dans ce travail, basée sur l'analyse du courant limite de réduction d'un traceur électrochimique (oxygène ou ferricyanure) a permis la mesure *in situ* de l'épaisseur d'un biofilm dans une gamme de 1 à 100 µm pour des temps d'immersion de quelques jours à plusieurs mois, décrivant ainsi les trois phases de formation : initiation, croissance et stabilisation.

L'épaisseur obtenue, dépendante de la vitesse de rotation (ou du débit) correspond à une valeur moyenne sur toute la surface de l'électrode (Figure C.1). Cette épaisseur étant directement reliée à la quantité de biofilm, elle ne dépend pas directement du nombre de bactéries présentes.

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>Figure C.1 : Modèle de biofilm sur la surface d'une électrode, avec indication de l'épaisseur équivalente en fonction de Ω.</figcaption></figure>

La mesure de l'épaisseur en fonction de la vitesse de rotation de l'électrode a mis en évidence un caractère élastique du biofilm, c'est à dire, que celui-ci peut se déformer sous l'action de la vitesse de rotation et reprendre ensuite son épaisseur initiale quand la contrainte cesse. De plus, il s'est avéré que pour un même milieu, le développement du biofilm et en particulier son caractère élastique et sa souplesse dépendent des conditions hydrodynamiques sous lesquelles il est formé. Les résultats d'essais réalisés en eau de mer, eau douce, milieu de culture avec des souches bactériennes plus ou moins mucoïdes et en eau traitée avec un biocide (chlore) ont permis de préciser l'étendu du domaine d'application de la méthode. Ceci a conduit au développement d'un capteur industriel, basé sur le principe de la cellule à jet noyé. Cette cellule a été validée à l'aide d'une électrode en oxyde d'étain modifié, permettant la mesure de l'épaisseur et l'observation directe de l'interface par un télé-microscope.
Finalement, ce capteur industriel de biofilm (demande de brevet déposé à l'INPI le 10 janvier 2000, sous le n° FR 00 00228,) est équipé de six électrodes identiques afin d'augmenter la précision de la mesure d'épaisseur. Cette mesure est affectée par l'hétérogénéité spatiale du biofilm, qui est limitée par ailleurs par le contrôle de l'hydrodynamique. Ce capteur peut aussi bien fonctionner en eau de mer avec le traceur oxygène qu'en eau douce avec le traceur ferricyanure.

Enfin, les performances du capteur permettent de caractériser l'évolution du caractère élastique des biofilms développés dans les milieux d'exposition. L'avancement de cette étude permet d'envisager la réalisation d'un capteur industriel opérationnel. Une application préliminaire sur sites industriels doit permettre de l'optimiser en vue d'une commercialisation.
# Effet de l'extrait de levure
sur la détermination
de l'épaisseur du biofilm.

Selon la période de l'année, de l'extrait de levure est ajouté à la solution d'étude afin d'accroître le développement du biofilm. Une étude par voltampérométrie et mesures du courant de Levich a été entreprise pour connaître l'impact de l'extrait de levure sur le courant mesuré.

La solution étudiée est de l'eau de mer naturelle, stérilisée par filtration à 0,2 µm à laquelle est ajoutée 2 g.l⁻¹ d'extrait de levure. Cette quantité est élevée dans le but d'accentuer l'effet de l'extrait de levure sur l'électrode. Les électrodes sont immergées avec une légère agitation pendant 24 heures dans un incubateur préalablement autoclavé. Les électrodes sont ensuite testées dans une cellule électrochimique contenant de l'eau de mer stérile sans extrait de levure.

## 1 VOLTAMPEROMETRIE, i=f(E)

Les courbes de polarisation sont enregistrées à la vitesse de 1 mV.s⁻¹ de 0 à -1100 mV/ECS sur électrode nue et sur électrode après 24 heures en contact avec l'extrait de levure. Les résultats obtenus sont présentés sur la Figure A.I.1.

L'allure des courbes est différente pour une électrode nue et une électrode après immersion dans l'extrait de levure. Un décalage très important entre -300 et -900 mV/ECS apparaît entre les deux types d'électrodes. Le courant est beaucoup plus petit dans le cas de l'électrode en contact avec l'extrait de levure. Le premier plateau de réduction de l'oxygène (à environ -550 mV/ECS) correspondant à la formation de péroxyde n'est plus visible. La partie cinétique de la réduction de l'oxygène semble donc fortement modifiée par la présence d'extrait de levure.
A-1000 mV/ECS, potentiel correspondant au plateau, les courants sont très proches, ce qui correspond bien à une limitation par le transport de matière.

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>Figure A.I.1 : Courbe de polarisation à 1 mV.s⁻¹ avec le traceur oxygène sur électrode nue ■ et sur électrode après immersion O dans de l'eau de mer contenant de l'extrait de levure.</figcaption></figure>

## 2 REPRESENTATION DE LEVICH, i = f(Ω¹/²)

La représentation du courant de Levich en fonction de Ω⁰,⁵ (Figure A.I.2) permet de savoir si la loi de Levich (voir Chapitre II, Première partie) est vérifiée. La droite théorique obtenue sur une électrode nue ne passe pas par O. L'ordonnée à l'origine est de 15 µA et correspond à la valeur du courant non diffusionnel i₀, courant de réduction de l'eau.

Les valeurs expérimentales décrivant une droite pour l'électrode nue et pour l'électrode après immersion dans l'extrait de levure sont très proches de la valeur théorique. La loi de Levich est donc vérifiée et l'extrait de levure ne modifie pas le courant limite de réduction de l'oxygène

En conclusion, le transport de matière et donc le courant limite de la réduction de l'oxygène ne sont pas modifiés par la présence d'extrait de levure dans le milieu. L'extrait de
levure peut être utilisé pour accélérer le développement du biofilm sans entraîner une modification lors de la mesure de son épaisseur.

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>Figure A.I.2 : Représentation de Levich d'une électrode avant et après contact avec de l'extrait de levure avec le traceur oxygène (— valeur théorique, ■ valeur expérimentale pour électrode nue, O valeur expérimentale pour électrode en contact avec de l'extrait de levure), à –1000 mV/ECS.</figcaption></figure>
# Contrôle du biofilm.

La plupart des méthodes de détection décrites dans le Chapitre I de la deuxième partie peuvent être associées aux techniques de prévention et/ou de contrôle du développement des biofilms de façon à optimiser leurs performances [14, 36, 56, 58, 65, 66, 71-75, 77, 84, 88, 91-94, 96, 97, 100, 118-122].

Actuellement, les industriels utilisent trois stratégies pour limiter la formation du biofilm :

- la prévention de l'adhésion des organismes,

- l'interruption de la croissance du biofilm,

- le détachement périodique du biofilm arrivé à maturité.

# 1 PREVENTION DE LA FORMATION DU BIOFILM

## 1.1 PREVENTION DE L'ADHESION DES ORGANISMES

La prévention de l'adhésion des organismes est la stratégie utilisée dans le cas de l'application de peintures anti-salissures ou de l'injection de biocides. Cependant, il existe également des méthodes mécaniques comme l'utilisation de forts gradients de cisaillement à la surface, connus pour limiter les colonisations. Mais, cette méthode n'est plus efficace sur un biofilm établi [12].

## 1.2 INTERRUPTION DE LA CROISSANCE DU BIOFILM

La seconde stratégie repose sur l'interruption de la croissance du biofilm. D'après G. Nekoksa et G. J. Licina [84, 100], une augmentation des doses de chloration est habituellement efficace seulement lorsque ces doses sont injectées avant que la structure du biofilm soit complexe et protectrice. L'utilisation de biocides pour en contrôler la formation nécessite de tuer les bactéries dans le consortium structuré à l'intérieur même du biofilm [16]. Cependant, il ne semble pas exister de biocides utilisables dans tous les cas industriels. Cela se traduit par un nombre important de brevets et d'articles décrivant le contrôle par biocides. Certains brevets décrivent une utilisation de plusieurs biocides simultanés [123-127]. Selon les applications industrielles, leurs associations spécifiques permettent d'optimiser l'efficacité
de la prévention de la formation du biofilm. De plus, le contrôle peut aussi être réalisé de manière beaucoup plus complexe, comme par exemple, lors d'une combinaison d'enzymes produites par des bactéries et d'un agent surfactant anionique [121]. Une autre méthode de contrôle du biofilm consiste en l'injection *in situ* d'un biocide lors de l'application d'un champ électrique. Le courant appliqué sur les électrodes est de 1 à 200 mA [128]. Cette méthode utilisée en médecine a pour but de tuer les microorganismes sur les surfaces médicales.

Les principaux types de biocides utilisés sont décrit dans le tableau suivant.

<table><caption>Tableau A.II.1 : Principaux biocides.</caption><thead><tr><td>Nom</td><td>Propriétés</td></tr></thead><tbody><tr><td>Isothiazolones</td><td>Altèrent la structure des protéines et des enzymes [129].<br/>N'est bactéricide qu'à très fortes doses [129].<br/>Affectent la structure de la membrane (200 ppm pendant 20h) [36].</td></tr><tr><td>Métaux lourds</td><td>Altèrent la structure des protéines et des enzymes [129].</td></tr><tr><td>Aldéhydes</td><td>Glutaraldéhyde (solution à 2% pendant 15 mn, à 20°C) [129].<br/>Formaldéhyde (pH 3-10) [129], (166 ppm pendant 3h) [36].<br/>Réagit sur les groupements aminés mais aussi sur les amines, amides et sulfures.</td></tr><tr><td>Chlore,<br/>Dioxyde de chlore,<br/>Hypochlorite</td><td>0,1 ppm en résiduel [94].<br/>pH de 6,5 à 9,5, 1,5 mg.l<sup>-1</sup> de chlore résiduel ne permet pas une pénétration dans le biofilm [129].</td></tr><tr><td>Ozone</td><td>Efficace mais instable dans l'eau, [130]<br/>(0,25 ppm pendant 1h) [36]</td></tr><tr><td>Rayons UV</td><td>Tuent les bactéries pour une longueur d'onde de 253,7 nm [129].</td></tr><tr><td>Ammonium<br/>quaternaire</td><td>Entraînent une fuite de l'eau et la lyse des cellules bactériennes [129].</td></tr><tr><td>Dérivé phénolique</td><td>Action sur les membranes des bactéries [129].</td></tr><tr><td>Peroxyde<br/>d'hydrogène</td><td>Cause la lyse des cellules bactériennes [129].<br/>Forte concentration nécessaire (&gt;3%)[36].</td></tr></tbody></table>

P. S. Stewart *et al.* ont modélisé l'action d'agents antimicrobiens contre les biofilms [131]. Ce modèle pourrait être utile dans le cas d'étude de stratégies alternatives à l'utilisation
de biocides. En particulier, les simulations suggèrent un intervalle entre deux injections de biocides pour avoir une épaisseur minimale et donc des coûts minima.

## 2 ELIMINATION MECANIQUE DU BIOFILM

La dernière stratégie est le détachement périodique du biofilm arrivé à maturité par des moyens mécaniques. J. F. Echols décrit une technique de contrôle du biofilm basé sur un nettoyage en ligne des tubes d'échangeurs de chaleur [132]. Un tube « nettoyeur » est introduit dans les tubes entraînant un décrochage du biofilm sur les parois. Cela permet une élimination quasi complète du biofilm. Cette méthode est efficace mais nécessite de lourds moyens. Des balles de mousse peuvent également être introduites dans les canalisations pour les nettoyer. En général, ces méthodes entraînent un arrêt de la production industrielle.

## 3 CONCLUSION

Des moyens financiers considérables sont investis dans le contrôle du biofilm. L'impact est à la fois économique et écologiques. Des économies peuvent être réalisées en utilisant les seules quantités nécessaires de biocides et aux moments opportuns. Cela entraînerait une minimisation des dégradations environnementales causées par l'utilisation excessive de biocides. Selon T. E. Cloete, la règle d'or pour prévenir et contrôler les biosalissures et la biocorrosion dans les systèmes industriels est de « garder le système propre » [129]. Néanmoins, toutes ces méthodes nécessitent une détection du biofilm.
# Réalisation de l'électrode de travail : méthode de pyrolyse d'aérosol.

Il existe différentes méthodes de préparation des couches minces : par évaporation, par sputtering, par dépôt chimique en phase vapeur, par immersion, par croissance en solution ou par décomposition thermique d'un aérosol (méthode de spray).

C'est cette dernière méthode qui est utilisée pour la réalisation de nos électrodes transparentes et conductrices [133]. Son principe, représenté sur la Figure A.III.1, est d'envoyer une solution finement atomisée sur un substrat (disque de verre ou quartz) porté à température de 500°C. La solution de « spray » contient le composé tétrachlorure d'étain $SnCl_4$ mis en solution dans du méthanol comme solvant [134].

L'appareil de dépôt est composé d'un système de pulvérisation constitué d'une buse d'où sort le jet liquide conique envoyé par une pompe péristaltique. Ce jet est dispersé sous forme de gouttelettes grâce à un gaz pulvérisateur dont le débit est fixé par un débitmètre à bille. Cet ensemble est monté sur un système en balayage en X et Y muni d'une rotule et commandé par un moteur d'entraînement. Le système de chauffage est constitué d'une plaque circulaire en acier inoxydable. Des résistances chauffantes sont encastrées à l'intérieur de la plaque insérée dans un bloc réfractaire. La température est contrôlée par un thermocouple. Pour éviter l'ébullition de la solution à pulvériser avant qu'elle n'arrive à la buse, un système de refroidissement (circuit fermé) permet de faire circuler de l'eau grâce à une pompe dans le support de la buse.

Les solutions de « spray » standard utilisées dans notre travail sont de 0,02 ou 0,2 M de $SnCl_4$ dans le méthanol. Pour le dopage des films $SnO_2$ par des éléments fluor ou antimoine, des sels $NH_4F$ ou $SbCl_3$ sont ajoutés dans la solution. Les débits d'air et de solution dans la buse sont choisis selon la nature des échantillons et l'épaisseur souhaitée des films $SnO_2$ à déposer.