# Approches microbiologiques et moléculaires pour lutter contre la vibriose du bar (Dicentrarchus labrax)

Julia Mougin

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Julia Mougin. Approches microbiologiques et moléculaires pour lutter contre la vibriose du bar (Dicentrarchus labrax). Sciences du Vivant [q-bio]. Université du Littoral Côte d'Opale - ULCO, 2020. Français. NNT: . tel-04557395

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Université du Littoral Côte d'Opale

École Doctorale des Sciences de la Matière, du Rayonnement et de l'Environnement

## Thèse de doctorat

*Pour obtenir le grade de*

## Docteur

*Discipline : Biologie, Médecine, Santé*

Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

*Présentée par*

## Julia MOUGIN

# Approches microbiologiques et moléculaires pour lutter contre la vibriose du bar

## (*Dicentrarchus labrax*)

Soutenue le 11 Décembre 2020

*Devant le jury composé de :*

<table><tr><td>Dr. Christine PAILLARD</td><td>Directrice de Recherche, CNRS, Brest</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Dr. Alexis BAZIRE</td><td>Maître de Conférences, Université de Bretagne Sud</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Dr. Dominique HERVIO-HEATH</td><td>Cadre de Recherche, IFREMER, Brest</td><td>Examinatrice</td></tr><tr><td>Dr. Jean-Michel BOLLA</td><td>Directeur de Recherche, INSERM, Marseille</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Pr. Sébastien MONCHY</td><td>Professeur des universités, Université du Littoral Côte d'Opale</td><td>Président du jury</td></tr><tr><td>Dr. Cédric LE BRIS</td><td>Maître de Conférences, Université du Littoral Côte d'Opale</td><td>Encadrant</td></tr><tr><td>Pr. Thierry GRARD</td><td>Professeur des universités, Université du Littoral Côte d'Opale</td><td>Directeur de thèse</td></tr></table>
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# Remerciements

J'ai quitté la Catalogne, il y a de cela bien longtemps. À l'aube où je pensais y retourner, je me suis finalement engagée pour 3 belles années à vos côtés. J'ai fui la chaleur de mon Sud pour la grisaille du Nord. Pourtant, cette chaleur, je l'ai retrouvée auprès des personnes que j'ai côtoyées. Ce préambule est dédié à toutes les personnes que j'ai croisées au cours de cette odyssée.

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J'adresse tout d'abord ma gratitude aux financeurs de cette thèse, la région Hauts-de-France et l'ULCO. Ces travaux ont également été financés par le gouvernement français, l'IFREMER et la région Hauts-de-France, faisant partie intégrante du projet CPER MARCO 2014-2020. Enfin cette thèse a aussi été financièrement épaulée par le biais d'un projet FEAMP (PFEA470017FA1000006), dénommé LUVIBAR. Je tiens à remercier particulièrement Dr. Christine PAILLARD et Dr. Alexis BAZIRE d'être rapporteurs de ces travaux. Je remercie également les membres du jury, Dr. Dominique HERVIO-HEATH, Dr. Jean-Michel BOLLA et Pr. Sébastien MONCHY pour avoir accepté d'évaluer mes travaux de thèse.

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Ce travail de thèse a été réalisé au sein de l'unité Biochimie des Produits Aquatiques (BPA), composante de l'UMR transfrontalière BioEcoAgro intégrant l'institut Charles VIOLLETTE et conventionnée à l'Anses via une unité sous contrat avec le Laboratoire de Sécurité des Aliments (LSA) localisé à Boulogne sur mer. J'ai également eu la chance de travailler à Gravelines au sein de la ferme Aquanord-Ichtus, ainsi qu'à l'Université de Lille sur la plate-forme REALCAT.

Je tiens à adresser mes remerciements :

À Maryse BONNIN-JUSSERAND, sans qui tout cela n'aurait pas pu commencer. Je te remercie de m'avoir accordée ta confiance dès mon stage de fin d'études Ingénieur, ainsi que d'avoir partagé tes connaissances avec moi. Je tiens également à t'adresser un grand merci pour tes nombreux encouragements.

À Cédric LE BRIS, pour ta disponibilité, ton écoute ainsi que ton exigence. Ce fut un réel plaisir de travailler à tes côtés. Nos discussions, aussi bien au laboratoire qu'autour d'une bière, ont toujours été fort appréciées. Grâce à toi, j'ai le sentiment d'avoir mené ces travaux avec beaucoup d'autonomie tout en étant solidement épaulée, surtout lors de mes périodes de doutes. J'ajouterais que selon moi, ce sont les personnes les plus exigeantes qui nous font le plus progresser et mûrir, alors je te remercie sincèrement de l'avoir été avec moi.

À Thierry GRARD, pour ton soutien, ta bonne humeur ainsi que ta franchise. Je te remercie d'avoir partagé avec moi les arcanes du métier de chercheur, parsemées d'anecdotes cinématographiques et
musicales. Je tiens à t'adresser un grand merci pour les opportunités que j'ai eu la chance d'avoir, en particulier pour ma participation à 2 conférences internationales, aux Îles Féroé et au Canada.

Enfin, merci à vous 3 pour la qualité de l'encadrement que j'ai pu recevoir au cours de ces 3 années. J'ai beaucoup appris à vos côtés, autant sur le plan professionnel que personnel, et je vous en suis très reconnaissante.

À Roxane ROQUIGNY alias Roro, pour ta bonne humeur, ta patience ainsi que nos fous rires. Travailler avec toi fut fort agréable, les feux toujours au vert, Chante-France à fond, un cookie à portée de main et un bon de colère à froisser violemment et à jeter rageusement dans un coin, en cas de crise. Plus sérieusement, merci pour tous les moments que nous avons partagés.

À Christophe FLAHAUT, pour ta disponibilité, ta patience ainsi que ton soutien sur Lille. Je te remercie particulièrement pour tout le temps que tu m'as accordé et pour avoir partagé tes connaissances et tes compétences avec moi.

À tout le personnel d'Aquanord-Ichtus. Je souhaite en particulier remercier Annabelle DUHAMEL, Céline DOYEN, Guillaume TIELIE et Yann LEGUIL pour votre disponibilité, votre soutien et votre bienveillance. Un grand merci à tous les éleveurs qui ont pris le temps de m'aider et de converser avec moi lors de la campagne d'échantillonnage, ainsi qu'aux ouvriers qui ont fait preuve d'ingéniosité pour fabriquer les 300 morceaux de béton.

Aux membres de mon comité de suivi de thèse pour votre temps et vos précieux conseils, Graziella BOURDIN, Dominique HERVIO-HEATH, Jean-Michel BOLLA, Christophe FLAHAUT et Sami SOUISSI.

Je tiens à adresser toute ma gratitude aux personnes qui m'ont aidée pendant l'élaboration de ma thèse : Thomas BRAUGE pour ton soutien, ton écoute et ta bonne humeur, merci d'avoir toujours répondu présent à l'appel d'un jogging ou plus régulièrement à l'appel d'une bière ; Alexandre DEHAUT pour ton soutien et tes précieux conseils qui ont toujours été d'une grande richesse ; Stéphanie COPIN pour tes précieux conseils ; Egon HEUSON pour ton accueil chaleureux et ton aide sur REALCAT, ainsi que Roxane RAULO ; Mahammed ZIDOUR pour tes conseils concernant le MALDI-TOF MS ; Méline SORET pour ta disponibilité et pour m'avoir suppléée les semaines d'échantillonnage quand je n'étais pas disponible ; Périne DOYEN pour tes conseils ; Dennis WATIER pour tes talents de bricoleur, merci d'avoir confectionné les gabarits en acier inoxydable ; Philippe LENCEL pour ton appui lors des TP d'IUT ; Marie-France Louchet pour ta disponibilité et ton aide précieuse ; Guillaume DUFLOS pour m'avoir chaleureusement accueillie au sein du laboratoire ; Marie-Agnès TRAVERS pour tes précieux conseils ; Lucie COURCOT pour m'avoir accueillie au LOG à Wimereux et pour avoir partagé tes connaissances sur le MEB ; Cindy DUCROCQ pour tes conseils relatifs à la préparation des milieux ; et enfin *last but not least*, Marie-Ange HUCHIN pour m'avoir naturellement épaulée.
Aux stagiaires. Un grand merci à Juliette GAUDILLAT pour avoir mené à bien tes travaux, toujours dans la bonne humeur. Jonathan SABLIER, bien que la situation sanitaire fut compliquée, tu as su t'adapter et rebondir. Je remercie également Juliette FONTENILLE, pour ses travaux de stage à BioFilm Control.

Je tiens à adresser mes remerciements à tous les membres des équipes que j'ai côtoyés au cours de ces 3 années, aussi bien à l'ULCO qu'à l'Anses et que sur REALCAT, pour l'accueil que j'ai reçu ainsi que pour les conditions dans lesquelles j'ai pu travailler. Merci également aux équipes de LABOCEA, de BioFilm Control et du laboratoire MCT de la faculté de pharmacie de l'Université Aix-Marseille.

J'adresse une mention spéciale à Nina alias face de poulpe pour son brin de folie, à Charlotte alias Cafard furieux/Grand sage Rafiki et à Mathilde alias la Terreur des petits Crapauds pour avoir mis des paillettes dans ma vie.

À mes confrères, les doctorants ; Ludovic et Arnaud, pour nos discussions, nos délires et nos embûches, j'espère avoir été un bon Padawan et que vous m'accorderez le rang de Maître ; Jérôme, pour ton humour décalé #Poutinesurunours ; Maureen, la petite grumpy, pour tes encouragements et nos dressages de goélands. Enfin, je souhaite bonne continuation aux nouveaux arrivants Fleurine, Tiffanie, Erwan et Sylvain.

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Je tiens à adresser mes remerciements à toutes les rencontres aussi inopinées qu'enrichissantes. À mes tiot biloutes, Aurélie, Carole, Duduss, Fabouchet, Frankepic, La Dipe, Martin, Matthew, Ricou, Solène, ptit'B, et bien d'autres. Je n'ai malheureusement pas la possibilité de tous vous citer mais sachez que ces 3 années n'auraient pas été les mêmes sans vous. J'adresse un merci particulier à Alaia alias ma vielle morue, pour nos sessions de surf et nos soirées stat/cookies ; à Maria pour nos sessions sportives et nos discussions toujours aussi enrichissantes ; à Kelly alias Po, Charles alias La-La et Baptiste alias Dipsy pour nos fous rires, notre entraide et nos sessions de travail entrecoupées de jeux de société au Kawa.

À mes amis de longue date et en particulier à mes Knakies, Charline, Claire, Justine, Laura, Maureen et Suzy, pour votre soutien inconditionnel depuis nos débuts en prépa au Lycée du Parc. Un merci particulier à Maureen, toujours à l'écoute et prête à faire des kilomètres, ainsi que Suzy, alias mon Gandalf/Coquillage des Îles, pour nos fous rires et nos escapades à Lille, Bruxelles et Amsterdam. Un grand merci également à mes amis en terre catalane, particulièrement à Eugénie alias mon suricate des îles et enfin à Alexandre.

À ma famille, et en particulier à mes parents. L'achèvement de ce travail est le fruit de votre soutien total. Je vous remercie pour m'avoir laissée faire mes propres choix comme je l'entendais et pour avoir relu ce manuscrit à la recherche de la moindre faute d'orthographe. Je crains un Bescherelle pour Noël.

À Sébastien.
# Sommaire

Liste des abréviations..................................................................................................................1

Liste des Tableaux ....................................................................................................................3

Liste des Figures ........................................................................................................................4

Introduction ........................................................................................................................................7

Chapitre I. Contexte scientifique et économique ........................................................................11

1. L'aquaculture du bar commun : *Dicentrarchus labrax*................................................................13

1.1. Systématique et caractéristiques biologiques................................................................13

1.2. Marché et réglementation ....................................................................................................15

1.3. L'élevage du bar commun....................................................................................................17

1.4. Les challenges d'aujourd'hui ..................................................................................................21

2. Les bactéries du genre *Vibrio* ....................................................................................................24

2.1. Systématique et caractéristiques des *Vibrio* ................................................................24

2.2. La stratégie d'adaptation des *Vibrio*................................................................................30

2.3. Les interactions hôte - *Vibrio* ........................................................................................35

3. L'espèce *Vibrio harveyi* ................................................................................................................38

3.1. Historique et taxonomie........................................................................................................38

3.2. Maladies associées à l'espèce *Vibrio harveyi*................................................................39

3.3. Pathogénie et virulence........................................................................................................42

4. Méthodes de détection et d'identification de *Vibrio harveyi*................................................................51

4.1. Méthodes culturales de croissance et identification phénotypique................................52

4.2. Techniques de biologie moléculaire ................................................................................54

4.3. Analyse protéomique par MALDI-TOF MS........................................................................60

5. Les moyens de lutte contre la vibriose en aquaculture ................................................................63

5.1. Principes de gestion des maladies en milieu aquacole................................................................63

5.2. Les mesures de contrôle appliquées à ce jour ................................................................65

5.3. Les mesures de contrôle alternatives................................................................................69

Chapitre II. Développement d'une PCR en temps réel pour la détection et la quantification de *Vibrio harveyi* en milieu aquacole........................................................................75

1. Contexte ..................................................................................................................................................76

2. Mise au point de la PCR en temps réel..................................................................................77

2.1. Conception des amorces........................................................................................................77
<table><tr><td>2.2. Sélection des couples d'amorces</td><td>78</td></tr><tr><td>2.3. Optimisation</td><td>80</td></tr><tr><td>3. Adaptation au traitement d'échantillons environnementaux</td><td>82</td></tr><tr><td>3.1. Echantillons d'eau</td><td>82</td></tr><tr><td>3.2. Echantillons de biofilms</td><td>84</td></tr><tr><td>4. Validation et application de la PCR en temps réel : Article 1</td><td>86</td></tr><tr><td>Article 1</td><td>87</td></tr><tr><td>Schéma de synthèse</td><td>115</td></tr></table>

## Chapitre III. Développement de la Luvibase, une base de données permettant

### l'identification par MALDI-TOF MS des espèces du clade Harveyi..................................117

<table><tr><td>1. Contexte</td><td>118</td></tr><tr><td>2. Utilisation de la base de données Bruker et de la VibrioBase</td><td>119</td></tr><tr><td>3. Développement et validation de la Luvibase : Article 2</td><td>122</td></tr><tr><td>Article 2</td><td>123</td></tr><tr><td>Schéma de synthèse</td><td>146</td></tr></table>

## Chapitre IV. Distribution spatiale et temporelle des Vibrionaceae et de l'espèce

### Vibrio harveyi dans un élevage aquacole de bars communs ........................................147

<table><tr><td>1. Contexte</td><td>148</td></tr><tr><td>1.1. Aquanord-Ichtus en quelques chiffres</td><td>148</td></tr><tr><td>1.2. Le site d'élevage</td><td>148</td></tr><tr><td>1.3. La problématique de la vibriose sur Aquanord-Ichtus</td><td>149</td></tr><tr><td>2. Distribution spatiale et temporelle des Vibrio en milieu aquacole : Article 3</td><td>151</td></tr><tr><td>Article 3</td><td>153</td></tr><tr><td>3. Etude préliminaire des capacités d'adhésion et de formation de biofilms</td><td>180</td></tr><tr><td>3.1. Tentative d'étude in vitro de formation de biofilms sur béton</td><td>180</td></tr><tr><td>3.2. Quantification relative de la formation de biofilm par coloration au cristal violet</td><td>181</td></tr><tr><td>3.3. Caractérisation du biofilm grâce au Biofilm Ring Test®</td><td>184</td></tr><tr><td>Schéma de synthèse</td><td>190</td></tr></table>

### Discussion et perspectives..................................................................................................191

<table><tr><td>1. Les outils et méthodes d'identification</td><td>192</td></tr><tr><td>1.1. Les méthodes moléculaires</td><td>193</td></tr><tr><td>1.2. Le MALDI-TOF MS</td><td>195</td></tr><tr><td>1.3. Comparaison synthétique des différentes méthodes utilisées</td><td>198</td></tr></table>
<table><tr><td>2. Etude de la dynamique des Vibrio potentiellement pathogènes</td><td>199</td></tr><tr><td>3. Perspectives</td><td>202</td></tr><tr><td>3.1. Caractérisation des différentes souches</td><td>203</td></tr><tr><td>3.2. Etude de la capacité de formation de biofilms</td><td>206</td></tr><tr><td>4. Schéma de synthèse</td><td>210</td></tr><tr><td>Valorisation des travaux de thèse</td><td>211</td></tr><tr><td>Références</td><td>215</td></tr><tr><td>Annexes</td><td>253</td></tr></table>
Liste des abréviations

<table><tr><td>AB</td><td>Agriculture Biologique</td></tr><tr><td>Abi</td><td>Avortement de l'infection</td></tr><tr><td>ADN</td><td>Acide désoxyribonucléique</td></tr><tr><td>AFLP</td><td>Amplified Fragment-Length Polymorphism</td></tr><tr><td>AgNP</td><td>Nanoparticule d'argent</td></tr><tr><td>AI</td><td>Auto-Inducteur</td></tr><tr><td>ANR</td><td>Agence Nationale de la Recherche</td></tr><tr><td>ANSES</td><td>Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail</td></tr><tr><td>ARN</td><td>Acide ribonucléique</td></tr><tr><td>ARNr</td><td>ARN ribosomique</td></tr><tr><td>BCCM</td><td>Belgian Coordinated Collections of Microorganisms</td></tr><tr><td>BFI</td><td>Indice de Formation du Biofilm</td></tr><tr><td>BFIc</td><td>BFI cut-off</td></tr><tr><td>BLAST</td><td>Basic Local Alignment Search Tool</td></tr><tr><td>BLIS</td><td>Bacteriocin-Like Substance</td></tr><tr><td>BP</td><td>Potentiel de formation du Biofilm</td></tr><tr><td>BPA</td><td>Biochimie des Produits Aquatiques</td></tr><tr><td>BRT</td><td>Biofilm Ring Test®</td></tr><tr><td>CECT</td><td>Spanish Type Culture Collection</td></tr><tr><td>CIP</td><td>Collection de l'Institut Pasteur</td></tr><tr><td>CMIb</td><td>Concentration Minimale Inhibitrice du biofilm</td></tr><tr><td>CNPE</td><td>Centrale Nucléaire de Production d'Electricité</td></tr><tr><td>CPER MARCO</td><td>Contrat de plan État-Région de Recherches marines et littorales en Côte d'Opale</td></tr><tr><td>C<sub>T</sub></td><td>Cycle threshold</td></tr><tr><td>CV</td><td>Cristal Violet</td></tr><tr><td>DBHB</td><td>Dibromohemibastadin-1</td></tr><tr><td>DDH</td><td>Hybridation ADN-ADN</td></tr><tr><td>DGAL</td><td>Direction générale de l'alimentation</td></tr><tr><td>DO</td><td>Densité optique</td></tr><tr><td>DSMZ</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures</td></tr><tr><td>EEA</td><td>Agence Européenne de l'Environnement</td></tr><tr><td>EFSA</td><td>Autorité Européenne de Sécurité des Aliments</td></tr><tr><td>ELISA</td><td>Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay</td></tr><tr><td>EPS</td><td>Substances Polymériques Extracellulaires</td></tr><tr><td>ESI</td><td>Electron Spray Ionization</td></tr><tr><td>EUMOFA</td><td>Observatoire Européen des Marchés des Produits de la Pêche et de l'Aquaculture</td></tr><tr><td>FAFLP</td><td>Fluorescent Amplified Fragment Length Polymorphism</td></tr><tr><td>FAO</td><td>Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture</td></tr><tr><td>FEAMP</td><td>Fonds européen pour les affaires maritimes et la pêche</td></tr><tr><td>GE</td><td>Genome Equivalent</td></tr><tr><td>IFREMER</td><td>Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer</td></tr><tr><td>ISO</td><td>Organisation internationale de normalisation</td></tr><tr><td>IUCN</td><td>Union Internationale pour la Conservation de la Nature</td></tr></table>
<table>
   <tr>
    <td>LBS</td>
    <td>Luria-Bertani Salé</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>LOD</td>
    <td>Limit of detection</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>LOQ</td>
    <td>Limit of quantification</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>LPSN</td>
    <td>List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>LSA</td>
    <td>Laboratoire de Sécurité des Aliments</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>LUVIBAR</td>
    <td>Lutte contre la vibriose du bar</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MA</td>
    <td>Marine agar</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MALDI-TOF MS</td>
    <td>Matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MCT</td>
    <td>Membranes et Cibles Thérapeutiques</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MEB</td>
    <td>Microscopie Electronique à Balayage</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MedAID</td>
    <td>Mediterranean Aquaculture Integrated Development</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MLSA</td>
    <td>MuliLocus Sequence Analysis</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MLST</td>
    <td>MultiLocus Sequence Typing</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>MSP</td>
    <td>Mass Spectra Profile</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NCBI</td>
    <td>National Center for Biotechnology Information</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>ND</td>
    <td>Not detected</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NGS</td>
    <td>Next Generation Sequencing</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NRL</td>
    <td>National Reference Laboratory</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>NTC</td>
    <td>No template control</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>OIE</td>
    <td>Organisation Mondiale de la Santé Animale</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>OMS</td>
    <td>Organisation Mondiale de la Santé</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>pb</td>
    <td>Paires de bases</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>PBE</td>
    <td>Piper betle ethyl acetate extract</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>PCR</td>
    <td>Polymerase Chain Reaction</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>PFGE</td>
    <td>Pulsed-Field Gel Electrophoresis</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>q-PCR</td>
    <td>PCR quantitative</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Qrr</td>
    <td>Quorum regulatory RNA</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>QS</td>
    <td>Quorum sensing</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>RAPD</td>
    <td>Random Amplified Polymorphic DNA</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>rep-PCR</td>
    <td>repetitive extragenic palindromic PCR</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>RT-PCR</td>
    <td>Reverse-Transcriptase PCR</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Ta</td>
    <td>Température d'hybridation</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>TCBS</td>
    <td>Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>TLH</td>
    <td>Hémolysine Thermolabile</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>Tm</td>
    <td>Température de fusion</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>UE</td>
    <td>Union Européenne</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>UFC</td>
    <td>Unité formant colonie</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>ULCO</td>
    <td>Université du Littoral Côte d'Opale</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>UPGMA</td>
    <td>Unweighted pair group method with arithmetic mean</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>UV</td>
    <td>Ultra-violet</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>VHA</td>
    <td>Vibrio harveyi agar</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>VHH</td>
    <td>Vibrio harveyi hémolysine</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>VHML</td>
    <td>Vibrio harveyi myovirus-like</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>VHS1</td>
    <td>Vibrio harveyi siphophage 1</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>VNC</td>
    <td>Viable Non Cultivable</td>
   </tr>
   <tr>
    <td>WoRMS</td>
    <td>Word Register of Marine Species</td>
   </tr>
  </table>
# Liste des Tableaux

## Chapitre I

Tableau 1 : Exemples d'organismes affectant le bar commun en milieu aquacole, adapté de Jobling et al., (2010). 5

Tableau 2 : Liste d'espèces de Vibrio pouvant causer des maladies en milieu aquacole. 37

Tableau 3 : Liste non exhaustive des espèces répertoriées sensibles à Vibrio harveyi en milieu aquacole. 40

Tableau 4 : Liste non exhaustive des différentes amorces, rencontrées dans la littérature, mises au point pour l'identification spécifique de Vibrio harveyi. 58

## Chapitre II (hors-publication)

Tableau 5 : Caractéristiques et analyse de spécificité in silico des séquences sens (forward, notées F) et antisens (reverse, notées R) mises au point. pb : paires de bases. 77

Tableau 6 : Résultats d'amplification et analyse de la courbe de fusion des essais réalisés sur les 5 couples d'amorces. Les moyennes et les écarts types ont été obtenus à partir de triplicatas. pb : paires de bases. 79

## Chapitre III (hors-publication)

Tableau 7 : Comparaison entre les résultats d'identification obtenus par MALDI-TOF MS en utilisant la base de données Bruker BioTyper ver. 9.0.0.0. et les résultats obtenus en utilisant la base de données Bruker BioTyper, implémentée avec la VibrioBase. Les 85 isolats utilisés ont été précédemment identifiés dans le Chapitre II, Article 1. Remplissage vert = identification identique à l'espèce attribuée, remplissage rouge = identification différente de l'espèce attribuée. 119

## Chapitre IV (hors-publication)

Tableau 8 : Détail des caractéristiques morphologiques d'isolats collectés à partir de biofilms lors de la campagne d'échantillonnage, menée d'avril à octobre 2018. 187

## Discussion et perspectives

Tableau 9 : Comparaison des méthodes d'identification développées et/ou testées au cours de ces travaux de thèse. 198
# Liste des Figures

## Introduction

Figure 1: Productions halieutique et aquacole mondiale (FAO, 2018). 8

## Chapitre I

Figure 2: Photographie d'un bar commun (*Dicentrarchus labrax*) face latérale, 27 cm. 13

Figure 3: Schéma représentant les différentes caractéristiques morphologiques du bar commun (*Dicentrarchus labrax*) et du bar tacheté (*Dicentrarchus puntatus*), adapté de Fischer *et al.*, (1981). 14

Figure 4: Répartition géographique du bar commun *Dicentrarchus labrax* (Jobling *et al.*, 2010). 15

Figure 5: Productions halieutique et aquacole du bar commun de 1950 à 2016 (selon les données de FAO FishStat, (2019)). 17

Figure 6: Cycle de production du bar commun, inspiré de Jobling *et al.*, (2010) et Lucas *et al.*, (2019). 18

Figure 7: Photographies d'élevages de bars communs. A. Elevage en cage de bars communs et de daurades royales en mer Egée, Grèce. Source: Jean Housen [CC BY-SA 3.0], via Wikimedia Commons. B. Elevage en bassin de bars communs sur les côtes du Nord de la France. 20

Figure 8: Arbre phylogénétique basé sur la concaténation des séquences des gènes *ftsZ*, *gapA*, *gyrB*, *mreB*, *pyrH*, *recA*, et *topA*. Les différents clades de *Vibrio* sont représentés par des encadrés (Sawabe *et al.*, 2013). Les clades indiqués par une ligne rouge continue sont les nouveaux clades proposés lors de l'étude; les clades indiqués par une ligne pointillée rouge ou noire sont les clades modifiés ou inchangés respectivement lors de l'étude. 26

Figure 9: Mécanismes de transfert horizontal de gènes adapté de McInnes *et al.*, (2020). 28

Figure 10: Etapes de la formation d'un biofilm, adapté de Koo *et al.*, (2017). 33

Figure 11: Schéma représentant les principaux mécanismes de tolérance et résistance aux antibactériens au sein d'un biofilm. Les bactéries (rectangle orange) sont incorporées dans la matrice (vert), fixées à un support (gris). Les mécanismes de résistance sont liés aux facteurs suivants: 1. Gradient de nutriments, avec moins de nutriments disponibles au centre du biofilm, générant une réduction du métabolisme bactérien et donc une diminution de la sensibilité aux antibactériens; 2. Matrice d'exopolysaccharides, limitant la diffusion de substances antibactériennes; 3. ADN extracellulaire, altérant l'environnement extracellulaire et impliqué dans le transfert horizontal de gènes; 4. Réponses au stress (stress oxydatif, réponse stringente); 5. Expression de gènes spécifiques au biofilm, dont les produits de gènes sont impliqués dans la réduction de la sensibilité aux antibactériens; 6. Pompe d'efflux, éliminant les antibactériens vers le milieu extracellulaire; 7. Interactions intercellulaires: quorum sensing, transfert horizontal de gènes... favorisant l'adaptation des bactéries; 8. Cellules en état VNC, moins sensibles aux antibactériens. Adapté de Hall et Mah, (2017). 34
Figure 12 : Photographies indiquant la morphologie des souches de Vibrio harveyi. A. Croissance de la souche VIB 391 sur marine agar 2216E ; B. Luminescence de la souche VIB 391 ; C. Croissance de la souche VIB 645 sur TCBS ; D. Microscopie électronique en transmission de la souche VIB 645 cultivée en marine broth, échelle = 1 µm (Zhang et al., 2020). 38

Figure 13 : Lésions anatomopathologiques chez le bar commun (Dicentrarchus labrax) résultant d'une infection volontaire à V. harveyi par immersion. A. Individus atteints de mélanose (flèche) comparés à des individus non atteints (tête de flèche). B. Ulcères cutanés et érosion de la nageoire caudale (flèche) avec exophtalmie (tête de flèche). C. Dilatation de l'intestin, entérite. Selon Pretto, (2018). 42

Figure 14 : Quorum sensing de Vibrio harveyi et les mécanismes de virulence associés, adapté de Montánchez et Kaberdin, (2019). 49

Figure 15 : Photographies de colonies sur milieu gélosé TCBS après incubation 24 h à 37 °C. A. Isolement d'eau de mer. B. Isolement de la souche Vibrio harveyi de référence LMG 4044. C. Isolement de la souche Vibrio harveyi de référence LMG 18298. 52

Figure 16 : Schéma permettant de comparer le mécanisme de la technologie en sonde TaqMan® et SYBR® Green (adapté de Applied Biosystems, (2020)). 56

Figure 17 : Schéma général représentant la préparation d'un échantillon bactérien dans le but d'une identification par la technique MALDI-TOF MS (Clark et al., 2013). 61

Figure 18 : Schéma général représentant la technique d'analyse d'un échantillon ionisé, par MALDI-TOF MS (Clark et al., 2013). 62

Figure 19 : Diagramme de Venn permettant de conceptualiser le déclenchement d'une maladie infectieuse selon une approche intégrative incluant l'hôte, l'agent pathogène et l'environnement. Issu de Snieszko, (1974). 64

Figure 20 : Schéma conceptualisant le déclenchement d'une maladie infectieuse en aquaculture, ainsi que les stratégies de contrôle préconisées. Adapté de Pérez-Sánchez et al., (2018) et Defoirdt et al., (2011). 65

## Chapitre II (hors-publication)

Figure 21 : Courbes d'amplification et courbes de fusion obtenues à partir de 3 kits de pré-mix différents. 81

Figure 22 : Gel d'électrophorèse obtenu suite à la réalisation d'une gamme de températures d'hybridation allant de 55 °C à 65 °C. 82

Figure 23 : Concentration de V. harveyi LMG 4044 récupérée en fonction des différents temps de sonication et de vortex testés. Deux concentrations initiales ont été testées 10⁴ UFC.mL⁻¹ et 10² UFC.mL⁻¹. Les histogrammes représentent la moyenne de 3 répliquats et les barres d'erreurs représentent l'écart type. 84

Figure 24 : Photographies des morceaux de béton et du dispositif permettant de les maintenir immergés 20 cm sous la surface de l'eau dans les bassins aquacoles contenant des bars communs d'élevage. 85

Figure 25 : Photographies du gabarit, permettant d'écouvillonner une surface définie, et d'un morceau de béton avant et après écouvillonnage de la surface. 85
Figure 26 : Schéma de synthèse du Chapitre II, relatif au développement d'une PCR en temps réel pour la détection et la quantification de Vibrio harveyi en milieu aquacole. .................................................................................. 115

## Chapitre III (hors-publication)

Figure 27 : Schéma de synthèse du Chapitre III, relatif au développement de la Luvibase, une base de données permettant l'identification par MALDI-TOF MS des espèces du clade Harveyi. .................................................. 146

## Chapitre IV (hors-publication)

Figure 28 : Implantation et fonctionnement de la ferme aquacole Aquanord-Ichtus sur le site de Gravelines. A. Photographie aérienne de la ferme Aquanord-Ichtus (CNPE : Centrale Nucléaire de Production d'Electricité). B. Photographie des 3 bassins d'élevage utilisés lors de l'étude. C. Schéma du fonctionnement d'un module d'élevage sur Aquanord-Ichtus. Le canal d'alimentation est un mélange contrôlé d'eau chaude, provenant du canal de rejet de la CNPE (A.b.) et d'eau froide, provenant du canal d'amenée (A.a.), l'eau du canal d'évacuation est rejetée dans la mer du Nord. .................................................. 149

Figure 29 : Pourcentage relatif de la DO$_{590}$ des puits contenant une suspension bactérienne par rapport à la DO$_{590}$ Contrôle du témoin négatif. Les valeurs indiquées représentent la moyenne de 18 mesures c'est-à-dire de 6 puits pour 3 différentes microplaques, les barres d'erreurs représentent les écarts types. Le signe « ++ » indique une capacité modérée à former des biofilms, « + » indique une faible capacité à former des biofilms, l'absence de marqueur indique que les souches ne sont pas capables de former des biofilms. Le nom des souches marqué par une « * » indique les souches utilisées pour mettre au point l'auto-vaccin sur Aquanord-Ichtus en 2018. .................................................................................................................. 183

Figure 30 : Schéma du principe du Biofilm Ring Test® commercialisé par l'entreprise BioFilm Control®. .................... 185

Figure 31 : Résultats obtenus avec le Biofilm Ring Test® par BioFilm Control pour des isolats de V. harveyi. A. Résultats de l'étude de la cinétique d'adhésion avec A.a. le détail de la cinétique au cours du temps et A.b. le temps nécessaire aux bactéries pour former un biofilm. Chaque point des courbes représente la moyenne de 24 valeurs (4 puits pour 6 plaques), les barres d'erreurs représentent l'écart type. Une valeur de BFI élevée indique une forte mobilité des microbilles sous l'action de l'aimant, correspondant à l'absence de biofilm. Un BFI proche de 0 indique une immobilisation des mirobilles suite à la formation d'un biofilm. B. Résultats de l'étude de la force d'adhésion du biofilm à 24 h. Les tests ont été réalisés en duplicatas. .................................................................................................................................................................................. 188

Figure 32 : Schéma de synthèse du Chapitre IV, relatif à l'étude de la distribution spatiale et temporelle des Vibrionaceae et de l'espèce Vibrio harveyi dans un élevage de bars communs. .................................................. 190

## Discussion et perspectives

Figure 33 : Contribution du travail de thèse à une meilleure compréhension du risque Vibrio en environnement aquacole. .................................................................................................................................................. 210
Introduction

*Give a person a fish and you feed them for a day;*
*Teach a person how to fish and you feed them for their life-time;*
*Teach a person how to grow fish and you feed them and their neighbours for their life-times.*

Aquaculture: farming aquatic animals and plants, 3rd edition.

John S. Lucas, Paul C. Southgate et Craig S. Tucker.

2019, John Wiley & Sons Ltd

Selon les prévisions de l'Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture (FAO), d'ici 2030, la part de l'aquaculture dans la production aquacole et halieutique mondiale, destinée ou non à l'alimentation, s'élèverait à plus de 54 % (FAO, 2018). Depuis une vingtaine d'années, la production halieutique stagne en raison d'une raréfaction des stocks naturels et de l'application de quotas dans certains pays (Fig. 1). Afin de garantir la sécurité alimentaire auprès d'une population croissante et de répondre à un récent engouement pour les denrées aquatiques, l'aquaculture s'est fortement développée. Avec l'émergence de nouvelles technologies et un meilleur contrôle dans le procédé de production, l'aquaculture moderne s'est répandue au détriment de l'aquaculture traditionnelle (Edwards, 2015). Ceci a entrainé une intensification et une diversification de la production aquacole à fort potentiel de rendement. Il en résulte une augmentation significative de la production aquacole depuis les années 50 (Fig. 1) (FAO, 2018).
<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Note: Les mammifères aquatiques, les crocodiles, alligators et caïmans, les algues marines et les autres plantes aquatiques ne sont pas pris en compte

<caption>Figure 1 : Productions halieutique et aquacole mondiale (FAO, 2018).</caption>

C'est ainsi que le terme de « révolution bleue » a émergé dans les années 90, en référence à la « révolution verte » survenue dans le secteur agricole après la seconde guerre mondiale (Coull, 1993). A cette époque, l'intensification et la croissance rapide du secteur aquacole ont rapidement soulevé des inquiétudes relatives à la dégradation de l'environnement, à l'impact négatif sur la biodiversité et sur la santé publique. Plus particulièrement, la propagation du phénomène d'antibiorésistance, survenue suite à l'utilisation d'antibiotiques de manière excessive et inappropriée, est devenue une préoccupation majeure. Chaque année au niveau mondial, 700 000 décès sont attribués à des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques. D'ici 2050, ce chiffre pourrait atteindre les 10 millions, soit plus que le cancer (O'Neill, 2016).

Aujourd'hui, de nouvelles inquiétudes relatives à l'impact du réchauffement climatique émergent. En effet, ce dernier pourrait jouer un rôle catalyseur dans la répartition, la propagation et l'émergence de certaines maladies infectieuses, notamment en Europe (EEA, 2017). L'augmentation de la température des océans a entraîné une explosion de cas de vibriose, causée par les bactéries du genre Vibrio (Vezzulli et al., 2015, Baker-Austin et al., 2017, Froelich et Daines, 2020). Ces bactéries, ubiquitaires dans l'environnement aquatique, sont d'autant plus dangereuses qu'elles peuvent affecter une grande variété d'hôtes tels que les crustacés, les mollusques, les poissons ou encore l'Homme (Austin, 2010).
Dans ce contexte, l'EFSA encourage fortement la recherche sur les bactéries du genre Vibrio (EFSA, 2016). En effet, une meilleure compréhension des conséquences liées à l'émergence et la dynamique de nouvelles maladies est cruciale pour le développement de politiques de prévention et de contrôle responsables. Cette stratégie s'intègre dans le concept One Health, apparu dans les années 2000, visant à promouvoir une expertise collective pour lutter contre les problèmes sanitaires émergents. Celle-ci repose sur une approche holistique et intégrative incluant la santé animale, la santé humaine et l'environnement (Destoumieux-Garzón et al., 2018). Le concept One Health a notamment été reconnu comme un élément majeur dans le contrôle et la prévention des maladies par les agences internationales OIE - FAO - OMS (Organisation Mondiale de la Santé Animale - Organisation des Nations Unies pour l'Alimentation et l'Agriculture - Organisation Mondiale de la santé) (Nuttall et al., 2014).

L'impact socio-économique de la vibriose est encore mal connu. Ces dernières années, des mortalités massives, responsables de pertes économiques considérables, ont été constatées dans des élevages de crustacés, mollusques et poissons (Zhang et al., 2014, Dong et al., 2017, Rameshkumar et al., 2017, Zhu et al., 2018, King et al., 2019). Plus particulièrement, en Europe, la vibriose est aujourd'hui la principale cause de mortalité chez le bar commun d'élevage (Dicentrarchus labrax), espèce à fort intérêt économique (Bostock et al., 2016, Muniesa et al., 2020). Pendant longtemps, l'agent pathogène, majoritairement recensé au sein des élevages, était l'espèce Vibrio anguillarum. Afin de lutter contre cet agent, des méthodes prophylactiques ont été développées et sont aujourd'hui appliquées. Récemment, l'espèce Vibrio harveyi est devenue un agent étiologique émergent, pour lequel aucun moyen de contrôle prophylactique, tels que les vaccins, n'est à ce jour commercialisé (Vendramin et al., 2016, Dadar et al., 2017).

Ainsi, cette thèse s'inscrit dans la problématique de la vibriose du bar commun d'élevage. Ces travaux ont été réalisés en partenariat avec la ferme aquacole Aquanord-Ichtus (Gravelines, France), subissant des épisodes de vibriose récurrents, majoritairement causés par V. harveyi. L'objectif consiste à apporter des éléments de compréhension, à travers la combinaison d'approches microbiologiques et moléculaires, visant à optimiser la gestion du risque Vibrio pour
le bar commun d'élevage, sur Aquanord-Ichtus. Cela implique une bonne connaissance de la dynamique spatio-temporelle des bactéries, potentiellement pathogènes, au sein de cette ferme.
En effet, leur comportement ainsi que leur capacité de persistance et de multiplication déterminent, en partie, leur impact sur l'environnement et plus particulièrement sur les poissons.
Ces comportements bactériens sont eux-mêmes influencés par des facteurs environnementaux biotiques et/ou abiotiques.

Afin de répondre à ces objectifs, mes travaux de thèse reposent, dans un premier temps, sur la conception d'outils et de méthodes de détection et d'identification, dans une perspective de surveillance et de suivi environnemental. Ce suivi a ensuite été réalisé, dans un second temps, *via* l'étude de la dynamique spatio-temporelle des Vibrionaceae et plus particulièrement de *V. harveyi* au sein d'Aquanord-Ichtus. Ce manuscrit de thèse s'articule autour de 4 chapitres :

* *Chapitre I :* ce chapitre fait état des connaissances actuelles sur l'élevage du bar commun, les problèmes de vibriose, particulièrement liés à l'espèce *V. harveyi*, ainsi que les méthodes de diagnostic et de lutte couramment utilisées et émergentes.

* *Chapitre II et III :* ces deux chapitres ont pour objectif la mise au point d'outils et de méthodes de détection et d'identification. Le *Chapitre II* présente une méthode de PCR en temps réel, permettant de quantifier l'espèce *V. harveyi* dans l'eau d'élevage et les biofilms formés dans les bassins d'Aquanord-Ichtus. Le *Chapitre III* décrit la conception de la Luvibase, une base de données de profils de spectres de masse, permettant d'identifier les espèces du clade Harveyi par MALDI-TOF MS.

* *Chapitre IV :* ce chapitre est consacré à l'étude de la distribution spatio-temporelle des Vibrionaceae cultivables à 37 °C, et plus particulièrement de *V. harveyi*, sous forme planctonique et de biofilm, *via* une campagne d'échantillonnage réalisée d'avril à octobre 2018 au sein d'Aquanord-Ichtus. Les outils et méthodes présentés dans les *Chapitre II* et *III* sont ici mis en application et les résultats ont été considérés en tenant compte des facteurs environnementaux.

Ces chapitres sont suivis d'une discussion générale concernant l'ensemble des résultats et faisant état des perspectives qui en découlent.
# Chapitre I.

# Contexte scientifique et économique

## Sommaire

1. L'aquaculture du bar commun : *Dicentrarchus labrax*..................................................13

1.1. Systématique et caractéristiques biologiques..................................................13

1.2. Marché et réglementation ..................................................................................15

1.3. L'élevage du bar commun..................................................................................17

1.3.1. Prérequis ........................................................................................................17

1.3.2. La production d'écloserie..................................................................................18

1.3.3. Les unités de grossissement ........................................................................19

1.4. Les challenges d'aujourd'hui ..................................................................................21

2. Les bactéries du genre *Vibrio* ..................................................................................24

2.1. Systématique et caractéristiques des *Vibrio* ....................................................24

2.1.1. Historique et taxonomie ..................................................................................24

2.1.2. Caractéristiques génétiques........................................................................27

2.1.3. Caractéristiques biologiques, habitat et dynamique..................................28

2.2. La stratégie d'adaptation des *Vibrio*....................................................................30

2.2.1. L'état viable non cultivable (VNC) .................................................................30

2.2.2. Les biofilms bactériens..................................................................................31

2.3. Les interactions hôte - *Vibrio* ............................................................................35

2.3.1. Les relations symbiotiques................................................................................35

2.3.2. Les principales espèces pathogènes pour l'Homme........................................35

2.3.3. Les espèces pathogènes recensées en milieu aquacole..................................36

3. L'espèce *Vibrio harveyi* .................................................................................................38

3.1. Historique et taxonomie....................................................................................38

3.2. Maladies associées à l'espèce *Vibrio harveyi*....................................................39

3.2.1. Les espèces sensibles....................................................................................39

3.2.2. Les signes cliniques chez le bar commun....................................................42

3.3. Pathogénie et virulence..........................................................................................42

3.3.1. Infection et colonisation d'un hôte..................................................................43
<table><tr><td>3.3.2.</td><td>Multiplication et dommages tissulaires</td><td>45</td></tr><tr><td>3.3.3.</td><td>Régulation de l'expression et transfert des facteurs de virulence</td><td>47</td></tr><tr><td>4.</td><td>Méthodes de détection et d'identification de Vibrio harveyi</td><td>51</td></tr><tr><td>4.1.</td><td>Méthodes culturales de croissance et identification phénotypique</td><td>52</td></tr><tr><td>4.2.</td><td>Techniques de biologie moléculaire</td><td>54</td></tr><tr><td>4.3.</td><td>Analyse protéomique par MALDI-TOF MS</td><td>60</td></tr><tr><td>5.</td><td>Les moyens de lutte contre la vibriose en aquaculture</td><td>63</td></tr><tr><td>5.1.</td><td>Principes de gestion des maladies en milieu aquacole</td><td>63</td></tr><tr><td>5.1.1.</td><td>Déclenchement des maladies</td><td>63</td></tr><tr><td>5.1.2.</td><td>Une stratégie de contrôle holistique</td><td>64</td></tr><tr><td>5.2.</td><td>Les mesures de contrôle appliquées à ce jour</td><td>65</td></tr><tr><td>5.2.1.</td><td>Les pratiques de préventions généralisées</td><td>65</td></tr><tr><td>5.2.2.</td><td>Les antibiotiques</td><td>66</td></tr><tr><td>5.2.3.</td><td>Les vaccins et immunostimulants</td><td>67</td></tr><tr><td>5.3.</td><td>Les mesures de contrôle alternatives</td><td>69</td></tr><tr><td>5.3.1.</td><td>Les probiotiques</td><td>69</td></tr><tr><td>5.3.2.</td><td>Les bactériophages</td><td>70</td></tr><tr><td>5.3.3.</td><td>Les composés anti-biofilms</td><td>71</td></tr><tr><td>5.3.4.</td><td>Les revêtements antifouling</td><td>72</td></tr></table>
# 1. L'aquaculture du bar commun : *Dicentrarchus labrax*

## 1.1. Systématique et caractéristiques biologiques

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 2 : Photographie d'un bar commun (*Dicentrarchus labrax*) face latérale, 27 cm.</figcaption></figure>

À ce jour, d'après le site WoRMS (Word Register of Marine Species) (WoRMS, 2019), la classification du bar commun (*Dicentrarchus labrax*) est la suivante :

* Règne : Animalia

* Embranchement : Chordata

* Sous-embranchement : Vertebrata

* Super-classe : Gnathostomata

* Classe : Actinopterygii

* Ordre : Perciformes

* Sous-ordre : Percoidei

* Famille : Moronidae

* Genre : *Dicentrarchus* (Gill, 1860)

* Espèce : *Dicentrarchus labrax* (Linnaeus, 1758)

Le bar commun (Fig. 2), également appelé bar ou loup sur les côtes méditerranéennes, appartient au genre *Dicentrarchus*. Les espèces de ce genre sont caractérisées, par un corps allongé de couleur majoritairement argentée, avec une bouche modérément protractile. L'opercule est formé de deux épines et le préopercule est dentelé. Elles possèdent deux nageoires dorsales distinctes ; la première, comptant huit à dix épines, la deuxième, comptant une épine et onze à quatorze rayons
mous (Fischer et al., 1981). Le genre *Dicentrarchus* regroupe seulement deux espèces : le bar commun *Dicentrarchus labrax* (Linnaeus, 1758) et le bar tacheté *Dicentrarchus punctatus* (Bloch, 1792). Ces deux espèces sont régulièrement confondues. Il existe toutefois des caractéristiques morphologiques permettant de les distinguer (Fig. 3). L'espèce *D. labrax* adulte ne présente pas de taches noires sur le corps contrairement aux individus *D. punctatus* juvéniles et adultes. De même, l'espèce *D. labrax* présente des dents seulement sur la partie antérieure du vomer, alors que l'espèce *D. punctatus* présente des dents sur tout le vomer (Quéro et Vayne, 1997).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 3 : Schéma représentant les différentes caractéristiques morphologiques du bar commun (*Dicentrarchus labrax*) et du bar tacheté (*Dicentrarchus punctatus*), adapté de Fischer et al. (1981).</figcaption></figure>

Le bar commun est une espèce généralement côtière. Il est à la fois benthique et pélagique. Cette espèce est eurytherme, c'est-à-dire capable de s'adapter à de grandes variations de températures : de 2 °C à 32 °C. Elle est également euryhaline, c'est-à-dire capable de s'adapter à de grandes variations de salinité : de 0,5 à 40 (Pérez-Ruzafa et Marcos, 2014). Ces caractéristiques permettent d'expliquer sa vaste répartition géographique en Europe. Le bar est présent sur les
coates Nord-Est de l'Atlantique, du Maroc jusqu'à la Norvège. Il est présent en mer du Nord, en mer d'Irlande et en mer Baltique. Il est également retrouvé en Méditerranée ainsi qu'en mer Noire (Fig. 4). Au niveau génétique, les populations naturelles peuvent être divisées en trois groupes distincts : Atlantique, Est-méditerranéen, et Ouest-méditerranéen (Naciri et al., 1999, Bahri-Sfar et al., 2000).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 4 : Répartition géographique du bar commun *Dicentrarchus labrax* (Jobling et al., 2010).</figcaption></figure>

Le bar commun est un prédateur vorace, adaptable et opportuniste. Les juvéniles se nourrissent principalement de zooplancton et d'invertébrés alors que les adultes peuvent se nourrir de vers, crevettes, mollusques et petits poissons.

Le bar commun est une espèce gonochoristique. En général, les mâles et les femelles atteignent respectivement la maturité sexuelle à partir de 2 et 3 ans. La période de fraie est saisonnière et n'a lieu qu'une fois par an. Les œufs sont pélagiques et la fécondation est externe. Un individu adulte peut atteindre 9-10 kg voire 15 kg et posséder une longévité de plus de 20 ans (Pérez-Ruzafa et Marcos, 2014).

## 1.2. Marché et réglementation

**La consommation de bar commun en Europe** Le bar commun est aujourd'hui considéré comme un mets délicat. C'est une espèce prisée par les consommateurs et les restaurateurs. De par son caractère combatif, il suscite également de l'intérêt chez les pêcheurs
de loisir. En 2016, en moyenne, en Europe, la consommation par an par habitant était de 200 g. Le bar sauvage est considéré comme un produit haut de gamme, dont le prix peut atteindre les 25 €/kg, alors que le prix du bar d'élevage est en moyenne autour des 10 €/kg. Le bar sauvage sera donc principalement apprécié des poissonniers et restaurateurs. Le bar d'élevage sera majoritairement présent en grande distribution pour une consommation individuelle des ménages (EUMOFA, 2019).

## La production halieutique

Au cours de ces dix dernières années, les captures mondiales de bar commun ont fortement diminué (-46 %). Ceci s'explique par une diminution des stocks naturels, notamment dans l'Atlantique Nord, suite à une importante pression de pêche et une diminution de la reproduction (EUMOFA, 2019). Celle-ci est fortement perturbée en raison de la pollution et de la destruction de l'habitat naturel. D'après les données de l'Union Internationale pour la Conservation de la Nature (IUCN), le bar commun est aujourd'hui classé sur liste rouge dans la catégorie « quasi-menacée », en Méditerranée (Yokes, 2011). Ce contexte a entraîné la mise en place de mesures de contrôle. Ainsi en 2015, l'Union Européenne (UE) a instauré une nouvelle réglementation visant à protéger les stocks naturels de bar commun. Cette mesure regroupe la limitation de la pêche au chalut, l'instauration de quotas, de zones de pêche, d'une période d'autorisation de capture, d'une taille minimale de capture.

## La production aquacole

Historiquement, l'élevage de bars communs a débuté en Europe dans les années 70. Cet élevage était principalement lagunaire avec des juvéniles issus du milieu naturel. La production s'est particulièrement améliorée grâce aux progrès zootechniques et au développement de nouvelles technologies. Ainsi, cette production est en constante augmentation depuis les années 90 (Fig. 5). Ces dernières années, la production aquacole a atteint les 190 000 tonnes par an alors que la production halieutique se situait autour de 6 000 tonnes seulement (Fig. 5). Le bar commun est devenu l'espèce piscicole la plus produite en Méditerranée. L'UE est aujourd'hui leader du marché avec plus de 50 % de la production provenant de Grèce, suivie de l'Espagne (28 %), l'Italie (8 %), la Croatie (6 %), la France (3 %) et Chypre (2 %). Ces dernières années, une concurrence émerge de la Turquie avec des prix défiants toute concurrence (FAO,
2018, EUMOFA, 2019, 2020). En France, en 2018 la production aquacole correspondait à plus de 63 % de la production totale française, soit une augmentation de 11 % par rapport à 2010 (FranceAgriMer, 2010, FranceAgriMer, 2018).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 5 : Productions halieutique et aquacole du bar commun de 1950 à 2016 (selon les données de FAO FishStat (2019)).</figcaption></figure>

## 1.3. L'élevage du bar commun

### 1.3.1. Prérequis

Par définition, l'aquaculture signifie l'élevage d'organismes aquatiques tels que les crustacés, les mollusques, les poissons et les plantes. Le terme « aquaculture » implique l'intervention de l'Homme dans le processus de production et la propriété du stock d'élevage (Lucas et al., 2019).

Un système aquacole se caractérise selon trois paramètres :

* La structure, c'est-à-dire l'architecture dans laquelle les organismes sont élevés. Il peut s'agir de piscines, bassins, cages, filets, parcs...

* Le renouvellement d'eau. Il peut être statique, pas de renouvellement d'eau ; ouvert, les cages sont placées dans une grande quantité d'eau (lac, océan) de sorte que le renouvellement s'effectue exclusivement grâce aux flux naturels ; semi-fermé, un flux d'eau provenant d'une source externe est apporté à la ferme pour maintenir la qualité de
l'eau ; ou fermé, système de recirculation d'eau dont la connexion avec l'environnement est minime.

* **L'intensité.** Une activité intensive est caractérisée par un contrôle de la nutrition et de l'environnement, ainsi qu'un rendement par unité d'aire élevé. Par opposition, un système extensif est intégré dans un écosystème naturel. Il en résulte un faible contrôle de la nutrition et de l'environnement, ainsi qu'un rendement par unité d'aire limité. Le système semi-intensif est un système intermédiaire dépendant majoritairement de l'écosystème naturel, auquel des fertilisants, de l'oxygène ou des nutriments sont apportés en complément.

Les systèmes d’élevage du bar commun sont généralement intensifs. Ainsi, seul ce système sera détaillé ici.

### 1.3.2. La production d’écloserie

Il existe deux phases majeures lors de l'élevage : la phase de production de juvéniles en écloserie et la phase de grossissement de juvéniles (Fig. 6).

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 6 : Cycle de production du bar commun, inspiré de Jobling *et al.* (2010) et Lucas *et al.* (2019).</figcaption></figure>

**Géniteurs et ponte** Les géniteurs sont des individus adultes ayant atteint la maturité sexuelle (2-4 ans pour les mâles, 5-8 ans pour les femelles), issus de captures sauvages ou de
l'élevage (Jobling et al., 2010). Depuis les années 80, des programmes de reproduction sélective sont en cours en France, Espagne, Italie et Israël afin d'améliorer la croissance, la morphologie, la résistance aux maladies et le rendement. Chez le bar commun, la période de fraie est de novembre à mars. Toutefois, les écloseries sont en mesure de provoquer cette période grâce au contrôle des paramètres environnementaux (température, photopériode) ou l'usage d'hormones. La fertilisation des œufs a lieu de façon naturelle dans des bassins de fraie en maintenant un ratio de deux mâles pour une femelle. Les œufs fertilisés sont ensuite incubés pendant 3-4 jours jusqu'à l'éclosion (Lucas et al., 2019).

### La culture larvaire
Les larves viables sont ensuite sélectionnées et transférées au système de culture larvaire. La culture larvaire repose sur un contrôle strict de la lumière, de la température et de la salinité. Pendant les 3-4 premiers jours, les larves se nourrissent des restes de sac vitellin. Elles sont ensuite nourries avec une quantité croissante de proies vivantes telles que les rotifères (Brachionus plicatilis) et les nauplius de crevettes saumâtres (Artemia salina) (Jobling et al., 2010, Lucas et al., 2019).

### La nurserie
Les juvéniles, c'est-à-dire les individus d'environ 43 à 45 jours et pesant environ 80 mg, sont ensuite sélectionnés et transférés vers le système de nurserie. Les organismes sont sevrés progressivement par incorporation de nourriture inerte dans leur régime. Les juvéniles sont maintenus en nurserie pendant 3 à 6 mois pour atteindre un poids de 1,5 à 10 g. A la fin de ce stade, les juvéniles sont entièrement nourris par des aliments desséchés et sont aptes à rejoindre la phase de grossissement (Lucas et al., 2019).

### 1.3.3. Les unités de grossissement

Les juvéniles, qui arrivent en unités de grossissement, sont classés en fonction de leur taille. Au cours de cette phase, les individus sont régulièrement triés afin d'éviter une variation de taille ainsi que le cannibalisme. Les individus sont nourris une à deux fois par jour avec des aliments sous forme de granules contenant des protéines (35-50 %) et des lipides (10-26 %). Les systèmes
d'élevage du bar commun sont majoritairement offshore. Toutefois, le nombre de fermes aquacoles onshore augmente (Lucas et al., 2019).

### L'élevage offshore
L'élevage offshore (Fig. 7.A) est un système ouvert dans lequel les bars sont maintenus dans des cages ou des filets placés en pleine mer. Ces compartiments peuvent atteindre 25 m de diamètre et 10 m de profondeur. La densité de poisson est d'environ $20 \text{ kg.m}^{-3}$. L'avantage de ce système repose sur la réduction des coûts de production. Le renouvellement d'eau se fait grâce aux courants naturels de sorte qu'aucun coût n'est engagé pour le maintien de la qualité de l'eau. Néanmoins, le contrôle des paramètres environnementaux est limité. La qualité de l'eau dépend uniquement des facteurs externes et peut difficilement être contrôlée. Les systèmes ouverts sont également plus sujets à la prédation.

### L'élevage onshore
L'élevage onshore (Fig. 7.B) est un système fermé ou semi-fermé dans lequel les bars sont élevés dans des bassins ou raceway. La densité de poissons est d'environ $50 \text{ kg.m}^{-3}$. Ce type d'élevage fournit aujourd'hui plus de la moitié de la production de bars communs. Les avantages de ce système sont un rendement accru ainsi qu'un contrôle total des paramètres environnementaux. Les fermes peuvent ainsi s'implanter dans des zones diverses, indépendamment des facteurs environnementaux. Toutefois, il en résulte un coût de construction et de production plus élevé.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 7 : Photographies d'élevages de bars communs. A. Elevage en cage de bars communs et de daurades royales en mer Egée, Grèce. Source: Jean Housen [CC BY-SA 3.0], via Wikimedia Commons. B. Elevage en bassin de bars communs sur les côtes du Nord de la France.</figcaption></figure>
## 1.4. Les challenges d'aujourd'hui

Aujourd'hui l'aquaculture du bar commun fait face à plusieurs enjeux dont le primordial consiste à réduire les coûts tout en maintenant une qualité et une vitesse de production pouvant répondre aux besoins du marché.

**Amélioration par contrôle du sexe et de la maturation**

L'un des problèmes majeurs que rencontre l'élevage de bars communs est la prédominance des individus mâles par rapport aux individus femelles (> 75 %). Les mâles grossissent moins vite que les femelles et atteignent la maturité plus rapidement. Certains pourraient même devenir matures avant d'atteindre la taille de vente requise. D'un point de vue industriel, cela se traduit par une diminution de rendement. Ce déterminisme sexuel est dû à des facteurs génétiques ainsi qu'à des facteurs environnementaux (température) appliqués lors des stades précoces du développement (Piferrer et al., 2005). A ce jour, bien que des manipulations permettent d'améliorer le ratio femelles/mâles aucun procédé n'a été développé pour obtenir des populations « mono-sexe » propres à la consommation (Vandeputte et Piferrer, 2019).

**La sélection génétique**

Ces dernières années de nombreux progrès ont été réalisés dans le domaine de la sélection génétique. Aujourd'hui, la part d'entreprises aquacoles européennes, toutes espèces confondues, ayant recours à ce procédé atteint les 80 à 83 % (Janssen et al., 2017). Celle-ci repose sur la sélection de caractères héréditaires jugés bénéfiques dans le cas de la production aquacole. Par exemple, le poids des bars communs à taille commerciale peut être augmenté de 25 à 30 % par génération en sélectionnant les individus les plus lourds, le poids étant, dans une certaine mesure, un caractère héréditaire (Dupont-Nivet et al., 2008). Ce procédé est toutefois long dans la mesure où des résultats satisfaisants ne sont visibles qu'au bout de plusieurs générations (Janssen et al., 2017). Des études de création d'un hybride entre les deux espèces, *D. labrax* et *D. punctatus* ont également été mises en place. L'objectif était d'induire une hétérosis bénéfique à la production aquacole. Cet hybride a ainsi démontré des avantages, tels qu'une amélioration de la survie au cours des stades précoces du développement, par rapport aux
lignées parentales (Ky et al., 2012). Néanmoins, d'un point de vue commercial, les hybrides sont
de moindre valeur.

**L'alimentation** Le système de nutrition est également un facteur important ayant un impact sur le rendement. De nombreuses études ont été réalisées afin de mesurer l'impact du régime alimentaire et de ses conditions d'administration. Ces derniers ont une influence sur la vitesse de grossissement, la qualité des filets et le système immunitaire (Kousoulaki et al., 2015). Les aliments retrouvés dans le commerce sont principalement formulés à base de protéines animales (farine de poissons) et/ou végétales. Aujourd'hui, des alternatives émergent avec l'apparition de protéines d'insectes. L'utilisation de ces protéines a montré des résultats prometteurs pour l'élevage du bar commun (Basto et al., 2020). Cependant, ces protéines ne sont pas encore autorisées en France.

**Les maladies** Plusieurs organismes peuvent affecter les bars communs : les bactéries, les virus, les parasites protistes et les parasites métazoaires (Jobling et al., 2010). En milieu aquacole, ces organismes peuvent altérer la qualité ou engendrer des mortalités massives. Ceux-ci engendrent des pertes économiques considérables. Un recensement de quelques espèces rencontrées chez le bar commun d'élevage est fourni dans le Tableau 1.
<table><caption>Tableau 1 : Exemples d'organismes affectant le bar commun en milieu aquacole, adapté de Jobling *et al.* (2010).</caption><thead><tr><th>Organismes</th><th>Espèces</th><th>Maladie</th><th>Signes cliniques</th><th>Méthode prophylactique</th><th>Méthode curative</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">Bactéries</td><td>Vibrio alginolyticus,<br/>V. anguillarum,<br/>V. harveyi, V. ordalii,<br/>V. parahaemolyticus<br/>V. vulnificus</td><td>Vibriose</td><td>Léthargie, exophtalmie, ulcères et lésions cutanées, hémorragies internes, ascite, pâleur du rein et du foie. Mortalité</td><td>Vaccination</td><td>Antibiotiques</td><td>(Le Breton, 1999, Ghittino et al., 2003, Kahla-Nakbi et al., 2006, Korun et Timur, 2008, Khouadja et al., 2013)</td></tr><tr><td>Photobacterium damselae subsp. piscicida</td><td>Pasteurellose</td><td>Septicémie hémorragique, nécrose des branchies, des reins, du foie, et de la rate. Mortalité</td><td>Vaccination</td><td>Antibiotiques</td><td>(Magariños et al., 1996)</td></tr><tr><td>Photobacterium damselae subsp. damselae</td><td>Photobactériose</td><td>Septicémie, ulcères cutanés, hémorragies</td><td>-</td><td>-</td><td>(Khouadja et al., 2014)</td></tr><tr><td>Tenacibaculum maritimum</td><td>Tenacibaculose</td><td>Ulcères et lésions cutanées, nécrose des branchies, exophtalmie, hémorragies internes</td><td>-</td><td>-</td><td>(Yardimci et Timur, 2015)</td></tr><tr><td>Mycobacterium marinum</td><td>Mycobactériose</td><td>Inflammation granulomateuse au niveau des organes internes tels que la rate et les reins. Mortalité</td><td>-</td><td>Pas de traitement efficace</td><td>(Knibb et al., 1993, Colorni et al., 1998)</td></tr><tr><td>Virus</td><td>Nodavirus</td><td>Encéphalite virale</td><td>Mouvements désordonnés, perte d'équilibre. Mortalité massive</td><td>-</td><td>Pas de traitement efficace</td><td>(Frerichs et al., 1996)</td></tr><tr><td rowspan="4">Parasites protistes</td><td>Amyloodinium ocellatum</td><td>Amyloodiniose (maladie du velours)</td><td>Aspect poudré ou de velours de la peau, perte d'appétit, détresse respiratoire. Mortalité</td><td>-</td><td>Parasiticide (formaline, sulfate de cuivre...) ou immersion en eau douce durant quelques minutes</td><td>(Francis-Floyd et Floyd, 2011)</td></tr><tr><td>Cryptocaryon irritans</td><td>Cryptocaryonose (maladie des points blanc)</td><td>Hyperproduction de mucus, décoloration de la peau, présence de nodules blanchâtres sur la peau, perte d'appétit, détresse respiratoire. Mortalité</td><td>-</td><td>Parasiticide (formaline, sulfate de cuivre...) ou immersion en eau douce durant quelques minutes</td><td>(Colorni et Burgess, 1997, Fioravanti et al., 2006)</td></tr><tr><td>Sphaerospora dicentrarchi, S. testicularis</td><td>Myxosporidiose</td><td>Infestation de l'intestin, des reins, de la vésicule biliaire. Faible mortalité résultant de maladies opportunistes</td><td>-</td><td>Pas de traitement efficace</td><td>(Fioravanti et al., 2004)</td></tr><tr><td>Copépodes et isopodes</td><td>Maladie des pous de mer</td><td>Infestation des branchies, de la peau et de la cavité buccale, lésions. Mortalité</td><td>-</td><td>Parasiticide</td><td>(Vagianou et al., 2006)</td></tr><tr><td>Parasites métazoaires</td><td>Diplectanum aequans, D. laubieri</td><td>Diplectanose</td><td>Infestation des branchies, nécroses. Mortalité</td><td>-</td><td>Parasiticide</td><td>(González-Lanza et al., 1991)</td></tr></tbody></table>
Les données épidémiologiques relatives aux maladies affectant le bar commun d'élevage sont rares. En effet, à ce jour celui-ci ne fait pas partie des espèces sensibles aux maladies à déclaration obligatoire énumérées dans la directive du conseil européen 2006/88/EC (EU, 2006). Toutefois, afin de pallier ce manque et d'améliorer les performances du secteur aquacole méditerranéen, un projet européen nommé MedAID (Mediterranean Aquaculture Integrated Development) a vu le jour dans le cadre d'Horizon 2020. Il en découle une récente étude regroupant des fermes aquacoles de Croatie, Chypre, France, Grèce, Espagne, Tunisie et Turquie. Les résultats ont permis de dresser un tableau des maladies à fortes répercussions sur le secteur aquacole du bar commun grâce à des données collectées de 2015 à 2017. Le taux de survie lors de la phase de grossissement était de 85 %. Au total, 10 % des individus sont morts suite à la contraction de maladies. Il a été démontré que 75 % des pathologies étaient d'origine bactérienne. La vibriose était la pathologie la plus commune suivie de la tenacibaculose et de la photobacteriose. La vibriose a été observée sur tout le processus d'élevage, de l'écloserie jusqu'à la phase de grossissement, alors que la tenacibaculose et la photobacteriose étaient plus particulièrement observées lors de la phase de grossissement. Ainsi la vibriose, qui est une pathologie causée par les bactéries du genre Vibrio, est la pathologie la plus fréquemment rencontrée chez le bar commun d'élevage (Muniesa et al., 2020).

## 2. Les bactéries du genre Vibrio

### 2.1. Systématique et caractéristiques des Vibrio

#### 2.1.1. Historique et taxonomie

En 1854, la première espèce du genre Vibrio : Vibrio cholerae (Pacini, 1854), a été découverte par l'Italien Filippo Pacini. Celle-ci a été détectée par analyse microscopique des muqueuses intestinales de patients victimes du choléra. Ce n'est qu'en 1883 que l'espèce V. cholerae a été isolée sur milieu gélosé par l'Allemand Robert Koch. Cette bactérie a alors été identifiée comme l'agent responsable du choléra (Thompson et al., 2004a).
A cette époque et jusqu'à la moitié du XXe siècle, la taxonomie des *Vibrio* était établie selon des critères phénotypiques (Alsina et Blanch, 1994). Ces critères se sont avérés insuffisants quant à la discrimination d'une souche à l'espèce. En effet, certaines souches de *Vibrio*, appartenant à différentes espèces, possèdent un phénotype similaire. C'est notamment le cas pour les espèces *Vibrio campbellii*, *Vibrio rotiferianus* et *Vibrio harveyi* (Thompson et Swings, 2006). Le développement d'outils moléculaires a alors été nécessaire pour édifier une taxonomie polyphasique fiable, établie selon des critères génétiques et phylogéniques, en complément des données phénotypiques (Vandamme et al., 1996). Ainsi, le séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S a permis de clarifier la taxonomie des *Vibrio* (Dorsch et al., 1992). Néanmoins, les séquences de gènes de l'ARNr 16S étant très conservées au sein des *Vibrio*, cette technique permet uniquement une identification fiable à la famille et au genre. Par exemple, les espèces, *Vibrio harveyi*, *Vibrio campbellii*, *Vibrio rotiferianus*, *Vibrio parahaemolyticus*, *Vibrio alginolyticus* et *Vibrio natriegens* partagent 97,6 % de similarité au niveau de cette séquence, les rendant difficilement distinguables (Dorsch et al., 1992). L'identification à l'espèce a été possible par combinaison des méthodes d'hybridation ADN-ADN, rep-PCR et d'amplification sélective des fragments d'ADN de restriction ou AFLP (Amplified Fragment-Length Polymorphism) (Thompson et al., 2004a). La classification a ensuite été affinée grâce au développement de méthodes d'analyse de séquences de gènes de ménage ou MLSA (MuliLocus Sequence Analysis) (Thompson et al., 2005). Par exemple, ces méthodes ont permis de reclasser certaines souches identifiées en tant que *V. harveyi*, comme étant des souches appartenant aux espèces *Vibrio campbellii* et *Vibrio owensii*. Il s'est également avéré que les espèces *Vibrio owensii* et *Vibrio communis* étaient en réalité la même espèce (Hoffmann et al., 2012).

Il semble ainsi délicat d'établir une taxonomie précise des bactéries du genre *Vibrio*, celle-ci étant, jusqu'à présent, en constante évolution. Néanmoins, d'après la dernière mise à jour du Bergey's Manuel of Systematics of Archea and Bacteria (Farmer et al., 2015), la classification des bactéries du genre *Vibrio* est la suivante :
Règne : Bacteria

Embranchement : Proteobacteria

Classe : Gamma proteobacteria

Ordre : Vibrionales

Famille : Vibrionaceae

Genre : Vibrio

La famille Vibrionaceae est divisée en 7 genres : *Aliivibrio*, *Echinimonas*, *Enterovibrio*, *Grimontia*, *Photobacterium*, *Salinivibrio* et *Vibrio* (Sawabe *et al.*, 2013). Le genre *Vibrio* compte 129 espèces recensées par le site LPSN (List of prokaryotic names with standing in nomenclature) (LPSN, 2020). Ces espèces s'organisent en différents clades dont la plupart sont représentés dans la Figure 8.

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Figure 8 : Arbre phylogénétique basé sur la concaténation des séquences des gènes *ftsZ*, *gapA*, *gyrB*, *mreB*, *pyrH*, *recA*, et *topA*. Les différents clades de *Vibrio* sont représentés par des encadrés (Sawabe *et al.*, 2013). Les clades indiqués par une ligne rouge continue sont les nouveaux clades proposés lors de l'étude; les clades indiqués par une ligne pointillée rouge ou noire sont les clades modifiés ou inchangés respectivement lors de l'étude.
### 2.1.2. Caractéristiques génétiques

Contrairement à la majorité des bactéries, la plupart des souches de *Vibrio* décrites à ce jour possèdent deux chromosomes circulaires de tailles différentes (Trucksis et al., 1998, Yamaichi et al., 1999, Chen et al., 2003, Makino et al., 2003, Okada et al., 2005). Le chromosome I ou grand chromosome (3 à 4 Mégabases, Mb), semble être relativement bien conservé parmi les différentes espèces de *Vibrio* alors que le chromosome II ou petit chromosome (0,8 à 2,4 Mb), est plus variable (Okada et al., 2005). Le chromosome I renferme la plupart des gènes essentiels à la croissance, la réplication et la virulence (Heidelberg et al., 2000). Le chromosome II renferme en partie des gènes impliqués dans la survie et l'adaptation aux conditions environnementales (Xu et al., 2003). Ainsi, ces deux chromosomes remplissent des fonctions distinctes. Plusieurs théories tentent d'expliquer l'origine du chromosome II. Selon la première, ce serait le résultat de l'acquisition ancestrale d'un mégaplasmide par transfert horizontal (Heidelberg et al., 2000). Selon la deuxième, ce serait le résultat d'une excision ancestrale du génome (Waldor et RayChaudhuri, 2000). Toutefois il existe des exceptions : des études récentes ont mis en évidence la présence de souches environnementales de *V. cholerae* possédant un seul chromosome apparenté à la fusion des chromosomes I et II (Xie et al., 2017).

Les bactéries du genre *Vibrio* sont capables d'acquérir du matériel génétique exogène *via* transfert horizontal de gènes. Celui-ci se définit par une assimilation d'ADN, de source exogène, dans le génome d'un organisme. Il est en opposition avec le transfert vertical de gènes, c'est-à-dire l'acquisition de caractères génétiques *via* une cellule parentale (Boucher et Stokes, 2006). Il existe plusieurs modes de transfert horizontal de gènes ; la conjugaison, c'est-à-dire le transfert par contact cellules-cellules ; la transformation, c'est-à-dire l'intégration d'ADN libre exogène dans le génome d'une cellule dite compétente ; la transduction, c'est-à-dire le transfert de gènes par l'intermédiaire d'un phage ; ou encore l'intégration d'ADN par fusion membranaire de vésicules lipidiques (Fig. 9).
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 9 : Mécanismes de transfert horizontal de gènes adapté de McInnes et al. (2020).</figcaption></figure>

Le transfert horizontal de gènes contribue à la grande diversité de plasmides retrouvée chez les Vibrio (Boucher et Stokes, 2006), à la présence de prophages intégrés dans le génome bactérien ou de bactériophages impliqués dans la virulence (Waldor et Mekalanos, 1996), ainsi qu'à la présence d'îlots de pathogénicité (Karaolis et al., 1998, Hacker et Kaper, 1999). L'intégration de gènes exogènes via transfert horizontal est favorisée par la présence d'intégrons (Boucher et Stokes, 2006). En effet, les intégrons sont des structures génétiques capables d'incorporer et d'exprimer des séquences de gènes mobiles, dépourvues de séquences promotrices, appelées cassettes. Ils confèrent au génome une certaine plasticité génétique inculquant aux bactéries une capacité d'adaptation (Escudero et al., 2018). Ils sont ainsi souvent impliqués dans le phénomène de résistance aux antibiotiques (Rowe-Magnus et al., 2002). Une particularité du génome de Vibrio est la présence de super-intégrons (Mazel et al., 1998). Ces derniers correspondent à des intégrons chromosomiques sédentaires pouvant contenir un grand nombre de cassettes, à différencier des intégrons mobiles (Escudero et al., 2018). Ces super-intégrons peuvent être assimilés à des réservoirs génétiques jouant un rôle dans l'adaptation des bactéries aux conditions environnementales (Rowe-Magnus et al., 2002).

### 2.1.3. Caractéristiques biologiques, habitat et dynamique

Les bactéries du genre Vibrio sont des bacilles Gram-négatif de forme droite ou incurvée (en virgule). Leur taille varie de 0,5 à 0,8 µm de diamètre sur 1,4 à 2,6 µm de longueur. Les Vibrio
sont majoritairement capables de synthétiser deux types de flagelles en fonction de l'environnement dans lequel ces bactéries évoluent. En milieu liquide, un flagelle polaire peut être synthétisé, conférant aux bactéries une motilité de type « swimming ». En milieu solide, plusieurs flagelles latéraux peuvent être synthétisés, conférant aux bactéries une motilité de type « swarming ». Les Vibrio sont des bactéries anaérobies facultatives disposant de métabolismes oxydatif et fermentatif. Elles sont généralement halophiles, mésophiles et chimio-organotrophes. La plupart sont oxydase, catalase et nitrate réductase positives (Farmer et al., 2005).

Les bactéries du genre Vibrio sont des organismes ubiquitaires du milieu aquatique. Elles sont présentes dans les milieux marins, estuariens, d'eau douce ainsi que dans les infrastructures aquacoles. Plusieurs paramètres environnementaux peuvent avoir une influence sur leur diversité et leur abondance (Thompson et al., 2004a). Ces paramètres peuvent être d'ordre biotique tels que la composition en éléments organiques, la présence de pigments (chlorophylle a), la prédation par des protozoaires et l'infection par des virus, ou l'abondance d'algues et d'animaux aquatiques. Ils peuvent également être d'ordre abiotique tels que la composition en éléments inorganiques, la température, la salinité, le pH, l'oxygène dissous... (Takemura et al., 2014; Siboni et al., 2016; Davis et al., 2017; Kopprio et al., 2017; Kauffman et al., 2018). Parmi ceux-ci, la température et la salinité se distinguent comme étant les plus corrélées à l'abondance de Vibrio. Toutefois, les nombreuses interactions entre ces facteurs génèrent une complexité dans l'étude de l'écologie et de la dynamique spatiale et temporelle des Vibrio (Takemura et al., 2014).

Ainsi, les variations des conditions environnementales rencontrées sur le globe permettent d'expliquer la répartition et la diversité des Vibrio. Ces derniers, sont rarement isolés en Antarctique alors qu'ils prolifèrent dans les zones tropicales (Bowman et al., 1997; Asplund et al., 2011). Dans les zones tempérées, une tendance liée à la saisonnalité se distingue. Lors de mois chauds estivaux, la quantité de Vibrio sera plus importante que lors des mois froids hivernaux (Heidelberg et al., 2002; Oberbeckmann et al., 2012). De plus, étant donné la forte corrélation entre l'abondance des Vibrio et la température environnementale, il a été suggéré que ces bactéries peuvent être considérées comme un baromètre du réchauffement climatique (Baker-
Austin *et al.*, 2017). L'abondance et la diversité des espèces du genre *Vibrio* sont également dépendantes de la colonne d'eau. De plus, la population retrouvée en haute mer ne sera pas la même que celle retrouvée en eau douce, dans les estuaires, ou près des côtes (Thompson et Polz, 2006). Dans la majorité des cas, cette dernière sera plus importante que la quantité retrouvée en haute mer (Yooseph *et al.*, 2010).

Les fluctuations environnementales peuvent entraîner la création d'un environnement hostile incompatible avec la prolifération bactérienne. Afin de survivre face à des conditions défavorables, les *Vibrio* sont capables d'accroître leur tolérance et d'adopter des stratégies d'adaptation telles que l'état viable non cultivable (VNC) ou la formation de biofilms (Orruño *et al.*, 2017).

## 2.2. La stratégie d'adaptation des *Vibrio*

### 2.2.1. L'état viable non cultivable (VNC)

L'état viable non cultivable (VNC) est un état physiologique bactérien, caractérisé par un métabolisme réduit et une perte temporaire du caractère cultivable. Il est généralement observé chez les bactéries soumises à un stress, résultant de conditions environnementales défavorables. Les facteurs ainsi que les temps d'exposition, pouvant induire l'état VNC chez les *Vibrio* sont nombreux et variables d'une espèce à l'autre. Les facteurs, les plus fréquemment décrits, sont une diminution de la température, une augmentation de la salinité, un pH extrême ou une exposition aux radiations solaires (Orruño *et al.*, 2017). Cet état est toutefois réversible. Un retour à des conditions environnementales plus favorables, telles qu'un apport de nutriments ou une augmentation de la température, permet aux bactéries de redevenir cultivables. Cette aptitude à « ressusciter » a longtemps été controversée. La question était de savoir si la reprise de la croissance était due à une reprise de l'activité métabolique des bactéries en état VNC ou simplement à une multiplication de quelques individus cultivables et non détectés au sein de la population VNC (Oliver, 2010). Aujourd'hui, plusieurs études confirment l'existence d'un mécanisme permettant aux *Vibrio* de « ressusciter » (Wong *et al.*, 2004, Du *et al.*, 2007, Li *et al.*, 2017). Cependant celui-ci est encore mal compris (Zhang *et al.*, 2018).
Le problème majeur que représentent les Vibrio en état VNC repose sur leur capacité à être plus résistants aux antibiotiques et à conserver leur caractère pathogène (Baffone et al., 2003, Ayrapetyan et al., 2015). Ainsi, les bactéries en état VNC sont plus résistantes aux antibiotiques que les bactéries cultivables. Suite au retour des conditions environnementales favorables, ces bactéries peuvent à nouveau se multiplier et, dans le cas des souches pathogènes, infecter un hôte (Nowakowska et Oliver, 2013). En effet, bien que les bactéries en état VNC ne soient pas pathogènes, celles-ci peuvent retrouver leur capacité à induire une maladie suite au retour à l'état cultivable (Sun et al., 2008). Ce problème est d'autant plus préoccupant que les bactéries en état VNC ne sont pas détectables par les méthodes culturales généralement utilisées en industries agroalimentaires ou aquacoles. La présence de pathogènes en état VNC peut ainsi induire un risque pour le consommateur. Ces bactéries peuvent également être rencontrées au sein de biofilms (Koo et al., 2017, Mougin et al., 2019).

### 2.2.2. Les biofilms bactériens

Un biofilm bactérien est une communauté bactérienne complexe, hétérogène et dynamique, rendue unique par la diversité des espèces qui la compose. C'est un agrégat bactérien, s'accumulant généralement au niveau d'une interface solide-liquide, incorporé dans une matrice de substances polymériques extracellulaires (EPS). Cette matrice est un conglomérat de biopolymères composé de polysaccharides, protéines, acides nucléiques et lipides, produits par les bactéries elles-mêmes. Elle représente plus de 90 % du biofilm et assure un rôle d'adhésion, de cohésion et de protection (Flemming et Wingender, 2010). La survie en biofilm est le mode de vie bactérien le plus répandu dans l'environnement. Il apporte un avantage écologique par rapport aux bactéries planctoniques notamment en facilitant les interactions dynamiques et synergiques telles que la communication intercellulaire ou le transfert horizontal de gènes. Ces interactions garantissent la restructuration et le renouvellement constant du biofilm en réponse aux fluctuations environnementales. La formation en biofilm est donc considérée comme une stratégie adaptative ainsi qu'une stratégie de colonisation (Flemming et al., 2016).
La formation d'un biofilm en milieu liquide s'initie sur une surface biotique ou abiotique
préalablement conditionnée. Lors de l'immersion d'une surface, ses propriétés physico-chimiques
sont modifiées par adsorption de molécules organiques et inorganiques présentes dans le milieu.
Il en résulte la création d'un film conditionnant, riche en nutriments. Les bactéries planctoniques
sont alors attirées par chimiotactisme, et se déplacent vers cette surface grâce à leur flagelle. Ces
bactéries, ainsi que celles physiquement transportées sur le support, peuvent alors initier la
formation d'un biofilm (Stoodley et al., 2002, Garrett et al., 2008). Celle-ci se décompose en 4
étapes, l'adhésion, la prolifération, la maturation et la dispersion (Fig. 10) (Koo et al., 2017) :

* La phase d'adhésion débute par un attachement réversible des bactéries au support par le biais d'interactions physico-chimiques telles que les forces de Van der Waals, les interactions électrostatiques, hydrophobes/hydrophiles, osmotiques etc. Il s'ensuit une phase d'attachement irréversible, au cours de laquelle les bactéries sont immobilisées suite à l'interaction des appendices protéiques (flagelle, pili, fimbriae) avec le support.

* La phase de prolifération se caractérise par le début d'une multiplication bactérienne et la formation de micro-colonies. La production d'appendices protéiques est réprimée et l'excrétion d'EPS est initiée.

* La phase de maturation du biofilm se caractérise par le développement tridimensionnel de la matrice d'EPS. Celle-ci devient une architecture complexe et hétérogène, incluant des structures en canaux et pores, facilitant la distribution en nutriments et la communication intercellulaire.

* La phase de dispersion se caractérise par la déstructuration du biofilm et par une libération des bactéries dans l'environnement. Lors de cette étape, la production d'EPS est réduite et la matrice est détruite grâce à la production d'enzymes. Les bactéries disséminées peuvent alors coloniser d'autres surfaces.
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 10 : Etapes de la formation d'un biofilm, adapté de Koo et al. (2017).</figcaption></figure>

La formation d'un biofilm est étroitement liée au phénomène de quorum sensing (QS). Le QS est un mécanisme de communication intercellulaire qui permet de réguler l'expression de gènes en réponse à la fluctuation de la densité de la population. Ce mécanisme s'appuie sur la production et la perception de molécules solubles appelées auto-inducteurs (AIs). La concentration des AIs dans le milieu extracellulaire augmente avec la densité bactérienne. Lorsque cette concentration atteint un seuil « quorum », la liaison des AIs avec leurs récepteurs membranaires spécifiques entraîne une cascade de mécanismes aboutissant à la régulation de l'expression des gènes (Wang et al., 2020). Par exemple, chez V. cholerae, il a été démontré que les gènes régulés par les mécanismes de QS sont, entre autres, impliqués dans la synthèse des EPS (Hammer et Bassler, 2003). Chez V. harveyi, un lien a été mis en évidence entre la motilité flagellaire et le QS (Yang et Defoirdt, 2015). Certains mécanismes de QS sont intra-spécifiques alors que d'autres sont à la fois intra- et inter-spécifiques. Bien que les bactéries du genre Vibrio partagent des AIs communs
et un système de signalisation similaire, les mécanismes de régulation et de formation de biofilms sont propres à chaque espèce (Yildiz et Visick, 2009). Dans la littérature, les mécanismes de QS les plus décrits sont ceux des principales espèces pathogènes pour l'homme *V. cholerae*, *V. parahaemolyticus* et *V. vulnificus*. Les souches de *Vibrio fischeri* et *V. harveyi* bioluminescentes sont aussi particulièrement étudiées, en raison de l'implication du QS dans le phénomène de bioluminescence.

En milieu aquacole, le problème majeur que représente la formation de biofilms repose sur le fait que les bactéries incluses dans un biofilm sont plus résistantes aux antibiotiques et aux désinfectants que les bactéries planctoniques (Fig. 11) (Hall et Mah, 2017).

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

Figure 11 : Schéma représentant les principaux mécanismes de tolérance et résistance aux antibactériens au sein d'un biofilm. Les bactéries (rectangle orange) sont incorporées dans la matrice (vert), fixées à un support (gris). Les mécanismes de résistance sont liés aux facteurs suivants : 1. Gradient de nutriments, avec moins de nutriments disponibles au centre du biofilm, générant une réduction du métabolisme bactérien et donc une diminution de la sensibilité aux antibactériens; 2. Matrice d'exopolysaccharides, limitant la diffusion de substances antibactériennes; 3. ADN extracellulaire, altérant l'environnement extracellulaire et impliqué dans le transfert horizontal de gènes; 4. Réponses au stress (stress oxydatif, réponse stringente); 5. Expression de gènes spécifiques au biofilm, dont les produits de gènes sont impliqués dans la réduction de la sensibilité aux antibactériens; 6. Pompe d'efflux, éliminant les antibactériens vers le milieu extracellulaire; 7. Interactions intercellulaires: quorum sensing, transfert horizontal de gènes... favorisant l'adaptation des bactéries; 8. Cellules en état VNC, moins sensibles aux antibactériens. Adapté de Hall et Mah (2017).

Ainsi, les biofilms peuvent devenir une source de contamination récurrente et constituent des réservoirs pour des souches potentiellement pathogènes (Karunasagar et al., 1996, Bourne et al., 2006).
## 2.3. Les interactions hôte – Vibrio

### 2.3.1. Les relations symbiotiques

Certaines espèces de *Vibrio* peuvent entretenir des relations symbiotiques avec un hôte. Par exemple, l'espèce bioluminescente *Vibrio fisheri* entretient une relation symbiotique avec le calamar géant d'Hawaï (Euprymna scolopes). Les bactéries sont stockées dans l'organe lumineux du calamar, engendrant une luminescence visible de cet organe. Cette association représente pour le calamar, entre autres, une stratégie d'antiprédation. En effet, lors d'une chasse nocturne, le calamar régule l'intensité lumineuse émise, afin de correspondre à l'intensité lumineuse du clair de lune. Ceci permet d'empêcher la formation d'une tache noire sur le fond marin, pouvant signaler la position du calamar à ses prédateurs (Visick et McFall-Ngai, 2000). D'autre part, certaines espèces peuvent faire partie de la flore entérique de certains hôtes. C'est le cas pour *Vibrio halioticoli*, qui représente 40 à 65 % de la flore bactérienne intestinale des ormeaux. Cette association permet la transformation d'alginate, composé majeur des algues brunes consommées par les ormeaux, en acide acétique, importante source d'énergie. En contrepartie, la bactérie dispose d'un habitat propice à sa croissance (Sawabe et al., 2003).

### 2.3.2. Les principales espèces pathogènes pour l'Homme

Les espèces majoritairement pathogènes pour l'Homme, sont constituées de *Vibrio cholériques* :
*Vibrio cholerae*, plus communément sérotypes O1 et O139 responsables du choléra et de *Vibrio*
non cholériques : *Vibrio cholerae* non-O1 et non-O139, *Vibrio parahaemolyticus* et
*Vibrio vulnificus*.

**Les Vibrio cholériques** Le choléra est une infection bactérienne causée par certaines
souches appartenant à l'espèce *V. cholerae*. L'infection chez l'Homme résulte de l'ingestion
d'aliments ou d'eau contaminés, renfermant une forte concentration de l'agent pathogène. Cette
maladie est caractérisée par une diarrhée aiguë, entraînant une déshydratation intense qui peut
provoquer le décès en seulement quelques heures (Prouty et Klose, 2006). Depuis 1817,
*V. cholerae* a été mis en cause dans 7 pandémies à travers le monde, et il semble aujourd'hui à
l'origine d'une 8ème pandémie, toujours en cours en Inde et en Asie. Les 6 premières pandémies ont été associées au sérotype O1, biotype dit « Classique », alors que la 7ème a été associée au sérotype O1, biotype dit « El Tor » (Barua, 1992). La 8ème pandémie, datant de 1992, est quant à elle, associée au sérotype O139 (Bhattacharya et al., 1993, Ramamurthy, 1993).

### Les Vibrio non cholériques
Des souches de V. cholerae non-O1 et non-O139 ont également été reportées dans des cas sporadiques de diarrhée aiguë chez l'Homme mais n'ont pas été mises en cause dans l'émergence de pandémies (Haley et al., 2014).

L'infection par *V. parahaemolyticus*, chez l'Homme est caractérisée par une gastroentérite, associée à la consommation de produits de la mer principalement crus ou séchés. La première épidémie confirmée est apparue au Japon en 1950, suite à une consommation de sardines juvéniles séchées. Au cours de celle-ci, 272 malades dont 20 morts ont été recensés (Fujino et al., 1953). Elle a ensuite été détectée dans divers pays du globe, en particulier la France (Nair et al., 2007). Depuis, cette espèce est fortement surveillée et contrôlée dans les produits de la mer.

*Vibrio vulnificus* est considérée comme l'espèce pathogène la plus virulente pour l'Homme avec un taux de mortalité de plus de 50 %, suite à la consommation de produits de la mer contaminés, plus spécifiquement des huîtres. Cette espèce est également responsable d'infections de plaies exposées à l'eau de mer, pouvant engendrer des septicémies importantes (Oliver, 2005).

Ces espèces représentent une menace pour la santé publique et sont donc très largement étudiées dans la littérature. D'autres espèces du genre *Vibrio* représentent un risque pour la santé animale.

### 2.3.3. Les espèces pathogènes recensées en milieu aquacole

De nombreuses espèces de *Vibrio* peuvent être pathogènes pour les crustacés, mollusques et poissons. Le Tableau 2 permet de recenser les différentes espèces pathogènes.
<table><caption>Tableau 2 : Liste d'espèces de *Vibrio* pouvant causer des maladies en milieu aquacole.</caption><thead><tr><th>Principales espèces pathogènes</th><th>Hôtes sensibles</th><th>Symptômes</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>Crustacés</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrio alginolyticus</td><td>Penaeus vannamei</td><td>Mortalité, anorexie</td><td>(Liu et al., 2004a)</td></tr><tr><td>Vibrio harveyi</td><td>Jasus verreauxi<br>Penaeus monodon</td><td>Luminous vibriosis</td><td>(Diggles et al., 2000)<br>(Ruangpan, 1998)</td></tr><tr><td>Vibrio nigripulchritudo</td><td>Litopenaeus stylirostris</td><td>Summer syndrome</td><td>(Goarant et al., 2006)</td></tr><tr><td>Vibrio owensii</td><td>Penaeus monodon<br>Panulirus ornatus</td><td>-</td><td>(Cano-Gomez et al., 2010)</td></tr><tr><td>Vibrio parahaemolyticus</td><td>Penaeus monodon</td><td>Bright-red syndrome</td><td>(Alapide-Tendencia et Dureza, 1997)</td></tr><tr><td>Vibrio penaeicida</td><td>Litopenaeus stylirostris</td><td>Syndrome 93</td><td>(Goarant et al., 1998)</td></tr><tr><td><strong>Mollusques</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrio alginolyticus</td><td>Haliotis rufescens</td><td>Mortalité</td><td>(Anguiano-Beltran et al., 1998)</td></tr><tr><td>Vibrio harveyi</td><td>Haliotis tuberculata<br>Haliotis [=Sulculus]<br>diversicolor supratexta</td><td>Taches blanches sur le pied, perte d'adhérence</td><td>(Nicolas et al., 2002)<br>(Travers et al., 2010)<br>(Nishimori et al., 1998)</td></tr><tr><td>Vibrio splendidus</td><td>Crassostrea gigas</td><td>Nécroses</td><td>(Sugumar et al., 1998)</td></tr><tr><td>Vibrio tapetis</td><td>Ruditapes philippinarum</td><td>Maladie de l'anneau brun, mortalité</td><td>(Allam et al., 2002)<br>(Paillard et al., 2008)</td></tr><tr><td>Vibrio tubiashii</td><td>Crassostrea gigas<br>Crassostrea sikamea<br>Panope abrupta</td><td>Mortalité</td><td>(Elston et al., 2008)</td></tr><tr><td><strong>Poissons</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrio anguillarum</td><td>Salmo salar<br>Oncorhynchus mykiss<br>Psetta maxima<br>Dicentrarchus labrax<br>Sparus aurata<br>Plecoglossus altivelis</td><td>Septicémie hémorragique, exophtalmie, ulcères, léthargie, perte de poids</td><td>(Frans et al., 2011)<br>(Korun et Timur, 2008)</td></tr><tr><td>Vibrio harveyi</td><td>Dicentrarchus labrax</td><td>Septicémie hémorragique</td><td>(Korun et Timur, 2008)</td></tr><tr><td>Vibrio ordalii</td><td>Salmo salar<br>Oncorhynchus keta<br>Dicentrarchus labrax</td><td>Septicémie hémorragique</td><td>(Colquhoun et al., 2004)<br>(Ransom et al., 1984)<br>(Korun et Timur, 2008)</td></tr><tr><td>Vibrio salmonicida</td><td>Gadus morhua<br>Salmo salar</td><td>Cold-water vibriosis</td><td>(Sørum et al., 1990)</td></tr></tbody></table>

D'après ce tableau, l'espèce *V. harveyi* a été reconnue pathogène, à la fois chez les crustacés, les mollusques et les poissons. Cette espèce constitue ainsi une préoccupation majeure pour différents secteurs aquacoles. De plus selon Vendramin *et al.* (2016), l'espèce *V. harveyi* est devenue un problème émergent pour l'aquaculture du bar commun
## 3. L'espèce Vibrio harveyi

### 3.1. Historique et taxonomie

L'espèce *Vibrio harveyi* (Fig. 12) a été décrite pour la première fois chez un amphipode mort du genre *Talorchestia* au Massachusetts en 1935. Originellement, elle a été nommée *Achromobacter harveyi* en l'honneur de E. N. Harvey pionnier dans le phénomène de bioluminescence (Johnson et Shunk, 1936). En effet, cette bactérie possède la particularité d'être bioluminescente. Elle est d'ailleurs associée au phénomène de marée bioluminescente ou *milky sea* correspondant à une diffusion de bioluminescence, visible à la surface de l'océan, associée à la prolifération de micro-algues (Miller et al., 2005).

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 12 : Photographies indiquant la morphologie des souches de *Vibrio harveyi*. A. Croissance de la souche VIB 391 sur marine agar 2216E ; B. Luminescence de la souche VIB 391 ; C. Croissance de la souche VIB 645 sur TCBS ; D. Microscopie électronique en transmission de la souche VIB 645 cultivée en marine broth, échelle = 1 µm (Zhang et al., 2020).</figcaption></figure>
Par la suite, elle a été identifiée en tant que *Lucibacterium harveyi* puis *Beneckea harveyi* pour finalement être assignée au genre *Vibrio* et nommée *Vibrio harveyi* (Baumann *et al.*, 1980). Plus tard, grâce au développement des méthodes d'identification, en particulier AFLP, ribotypage et hybridation ADN-ADN, *Vibrio carchariae* et *Vibrio trachuri* ont été reconnues comme synonymes de *V. harveyi* (Pedersen *et al.*, 1998, Thompson *et al.*, 2002).

L'espèce *V. harveyi* fait partie du clade Harveyi (Fig. 8, section 2.1.1, p.24). Bien qu'il n'existe pas de consensus établi concernant les critères d'appartenance d'une espèce au clade Harveyi, il est admis que ce dernier comprend 11 espèces : *V. alginolyticus*, *Vibrio azureus*, *V. campbellii*, *V. harveyi*, *V. jasicida*, *Vibrio mytili*, *V. natriegens*, *V. owensii* (synonyme de *V. communis*) *V. parahaemolyticus*, *V. rotiferianus* et *Vibrio sagamiensis* (Sawabe *et al.*, 2013, Urbanczyk *et al.*, 2013a).

## 3.2. Maladies associées à l'espèce *Vibrio harveyi*

### 3.2.1. Les espèces sensibles

L'espèce *V. harveyi* s'est avérée pathogène pour de nombreux organismes marins vertébrés et invertébrés en milieu sauvage et aquacole (Austin et Zhang, 2006). Cette espèce est principalement reconnue pathogène pour les crustacés, mollusques et poissons. Néanmoins, de rares cas d'infection à *V. harveyi* chez l'Homme, ont été recensés suite au contact d'une plaie avec de l'eau contaminée ou suite à une morsure de requin (Pavia *et al.*, 1989, Del Gigia-Aguirre *et al.*, 2017, Brehm *et al.*, 2020). Les symptômes dépendent fortement de l'espèce atteinte, l'âge et la sensibilité. Le Tableau 3, non exhaustif, donne une vue d'ensemble des espèces sensibles à *Vibrio harveyi* en milieu aquacole.
<table><caption>Tableau 3 : Liste non exhaustive des espèces répertoriées sensibles à Vibrio harveyi en milieu aquacole.</caption><thead><tr><th>Nom scientifique</th><th>Nom vernaculaire</th><th>Classe d'âge</th><th>Signes cliniques</th><th>Mortalité</th><th>Localisation</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="7"><strong>Crustacés</strong></td></tr><tr><td>Fenneropenaeus chinensis</td><td>Crevette charnue</td><td>Larve, juvénile</td><td>Inactivité, anorexie, perte des setae, opacité des larves</td><td>Oui</td><td>Chine</td><td>(Vandenberghe et al., 1998)</td></tr><tr><td>Jasus verreauxi</td><td>Homard</td><td>Larve</td><td>Luminous vibriosis</td><td>Oui</td><td>Nouvelle Zélande</td><td>(Diggles et al., 2000)</td></tr><tr><td>Marsupenaeus japonicus</td><td>Crevette kuruma</td><td>-</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Liu et al., 1996a)</td></tr><tr><td>Penaeus monodon</td><td>Crevette géante tigrée</td><td>Larve, juvénile</td><td>Luminous vibriosis ou Tea Brown Gill Syndrome</td><td>Oui</td><td>Australie, Thaïlande</td><td>(Pizzutto et Hirst, 1995, Ruangpan, 1998)</td></tr><tr><td>Penaeus vannamei</td><td>Crevette à pattes blanches</td><td>Larve, juvénile</td><td>Bright-red syndrome</td><td>Oui</td><td>Mexique</td><td>(Soto-Rodriguez et al., 2010)</td></tr><tr><td>Portunus trituberculatus</td><td>Crabe bleu japonais</td><td>Larve, juvénile</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Chine</td><td>(Zhang et al., 2014)</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Mollusques</strong></td></tr><tr><td>Haliotis [=Sulculus]<br>diversicolor supratexta</td><td>Ormeau du Nord du Japon</td><td>-</td><td>Taches blanches sur le pied, perte d'adhérence</td><td>Oui</td><td>-</td><td>(Nishimori et al., 1998)</td></tr><tr><td>Haliotis rubra, H. laevigata<br>et leurs hybrides</td><td>Haliotope à ventre noir, Ormeau australien lisse</td><td>Juvénile</td><td>-</td><td>-</td><td>Australie</td><td>(Handlinger et al., 2005)</td></tr><tr><td>Haliotis tuberculata</td><td>Ormeau européen</td><td>Adulte</td><td>-</td><td>Oui</td><td>France</td><td>(Nicolas et al., 2002)<br>(Travers et al., 2010)</td></tr><tr><td>Pinctada maxima</td><td>Huitre perlière</td><td>-</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Australie</td><td>(Pass et al., 1987)</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Echinoderme</strong></td></tr><tr><td>Holothuria scabra</td><td>Concombre de mer</td><td>Juvénile</td><td>Ulcères cutanés</td><td>Oui</td><td>Madagascar</td><td>(Becker et al., 2004)</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>Poissons</strong></td></tr><tr><td>Acanthopagrus latus</td><td>Pagre à nageoires jaunes</td><td>-</td><td>Gastroentérite</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Lee et al., 2002)</td></tr><tr><td>Acanthopagrus schlegeli</td><td>Pagre tête noire</td><td>-</td><td>Gastroentérite</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Lee et al., 2002)</td></tr><tr><td>Acanthurus sohal</td><td>Brochet de mer</td><td>Adulte</td><td>Maladie oculaire : opacité de la cornée</td><td>-</td><td>Etats-Unis</td><td>(Kraxberger-Beatty et al., 1990)</td></tr><tr><td>Centropomus undecimalis</td><td>Denté commun</td><td>Juvénile</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Espagne</td><td>(Company et al., 1999)</td></tr><tr><td>Dentex dentex</td><td>Denté commun</td><td>Juvénile</td><td>Léthargie, exophtalmie, ulcères et lésions cutanés, hémorragies des organes internes, ascite, pâleur du rein et du foie</td><td>Oui</td><td>Turquie</td><td>(Korun et Timur, 2008)</td></tr><tr><td>Dicentrarchus labrax</td><td>Bar commun</td><td>Juvénile</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Turquie</td><td>(Korun et Timur, 2008)</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th>Nom scientifique</th><th>Nom vernaculaire</th><th>Classe d'âge</th><th>Signes cliniques</th><th>Mortalité</th><th>Localisation</th><th>Référence</th></tr></thead><tbody><tr><td>Dicologlossa cuneata</td><td>Céteau</td><td>Alevin, juvénile, adulte</td><td>Ulcères</td><td>Oui</td><td>Espagne</td><td>(López et al., 2009)</td></tr><tr><td>Epinephelus awoara</td><td>Mérou jaune</td><td>-</td><td>Ulcères</td><td>Oui</td><td>Chine</td><td>(Austin et Zhang, 2006)</td></tr><tr><td>Epinephelus coioides</td><td>Mérou à tâches oranges</td><td>-</td><td>Ulcères cutanés<br>Gastroentérite</td><td>Oui</td><td>Chine<br>Taiwan</td><td>(Yii et al., 1997, Chen et al., 2004)</td></tr><tr><td>Epinephelus fuscoguttatus<br>(♀) × E. lanceolatus (♂)</td><td>Hybride mérou marbré × mérou géant</td><td>Juvénile</td><td>Ulcères cutanés</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Shen et al., 2017)</td></tr><tr><td>Epinephelus tauvina</td><td>Mérou loutre</td><td>-</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Koweït</td><td>(Saeed, 1995)</td></tr><tr><td>Lateolabrax japonicus</td><td>Bar du Japon</td><td>-</td><td>Gastroentérite</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Lee et al., 2002)</td></tr><tr><td>Lates calcarifer</td><td>Barramundi</td><td>Adulte</td><td>Maladie oculaire : hémorragie, opacité de la cornée, exophtalmie</td><td>Oui</td><td></td><td>(Tendencia, 2002)</td></tr><tr><td>Mola mola</td><td>Poisson-lune</td><td></td><td>Infection oculaire opportuniste</td><td>-</td><td>Espagne</td><td>(Hispano et al., 1997)</td></tr><tr><td>Pagrus auratus</td><td>Daurade argentée</td><td>Juvénile, adulte</td><td>Gonflement de la vessie natatoire et des intestins (co-infection avec Photobacterium damselae)</td><td>Oui</td><td>Australie</td><td>(Stephens et al., 2006)</td></tr><tr><td>Paralichthys dentatus</td><td>Plie</td><td>Juvénile</td><td>Entérite nécrotique</td><td>Oui</td><td>Etats-Unis</td><td>(Soffientino et al., 1999)</td></tr><tr><td>Paralichthys olivaceus</td><td>Cardeau hirame</td><td>Adulte</td><td>Ascite</td><td>Oui</td><td>Corée</td><td>(Oh et al., 2006)</td></tr><tr><td>Rachycentron canadum</td><td>Cobia</td><td>Juvénile</td><td>Gastroentérite et ascite</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Liu et al., 2004b)</td></tr><tr><td>Sciaenops ocellatus</td><td>Tambour rouge</td><td>-</td><td>Gastroentérite</td><td>Oui</td><td>Taiwan</td><td>(Liu et al., 2003)</td></tr><tr><td>Scophthalmus maximus</td><td>Turbot</td><td>-</td><td>Ulcères, hémorragie, mélanose</td><td>Oui</td><td>Chine</td><td>(Fan et al., 2005, Sun et al., 2007)</td></tr><tr><td>Seriola dumerili</td><td>Sériole</td><td>-</td><td>Ascite, maladie oculaire</td><td>Oui</td><td>Japon</td><td>(Minami et al., 2016)</td></tr><tr><td>Solea senegalensis</td><td>Sole du Sénégal</td><td>-</td><td>Ulcères cutanés et hémorragie près de la bouche et des nageoires</td><td>Oui</td><td>Espagne</td><td>(Zorrilla et al., 2003)</td></tr><tr><td>Sparidentex hasta<br>(Acanthopagrus cuvieri)</td><td>Spare sobaity</td><td>-</td><td>Ulcères cutanés, gastroentérite</td><td>Oui</td><td>Koweït</td><td>(Saeed, 1995)</td></tr><tr><td>Sparus aurata</td><td>Daurade royale</td><td>Larve, juvénile</td><td>Maladie oculaire, érosion de la queue, sécrétion de mucus</td><td>Oui</td><td>Malte</td><td>(Haldar et al., 2010b)</td></tr><tr><td>Squalus acanthias</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Takifugu rubripes</td><td>-</td><td>Juvénile</td><td>-</td><td>Oui</td><td>Japon</td><td>(Mohi et al., 2010)</td></tr><tr><td>Trachinotus blochii</td><td>Pompaneau lune</td><td>-</td><td>Exophtalmie, infection opportuniste</td><td>-</td><td>Philippine</td><td>(Pakingking Jr et al., 2018)</td></tr><tr><td>Trachurus japonicus</td><td>Chinchard du Japon</td><td>-</td><td>Hémorragie interne, exophtalmie</td><td>Oui</td><td>Japon</td><td>(Iwamoto et al., 1995)</td></tr></tbody></table>
### 3.2.2. Les signes cliniques chez le bar commun

Concernant le bar commun, des épisodes de vibriose causés par *V. harveyi* ont été principalement recensés dans les pays méditerranéens, tels que l'Espagne (Pujalte et al., 2003), la Turquie (Korun et Timur, 2008, Uzun et Ogut, 2015) et la France (Le Breton, 1999). Le Breton (1999) a signalé la présence d'infections à *V. harveyi* chez des individus juvéniles et adultes, dont les principaux symptômes étaient des ulcères. Korun et Timur (2008) ont signalé un épisode touchant des individus juvéniles et engendrant une mortalité journalière entre 9 et 12 %. Les principaux symptômes décrits étaient une léthargie, une exophtalmie, des ulcères et lésions cutanés, des hémorragies des organes internes, une ascite ou une pâleur du rein et du foie. Selon Uzun et Ogut (2015), certains individus pourraient également être atteints de mélanose. Quelques-uns de ces symptômes sont représentés dans la Figure 13.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 13 : Lésions anatomopathologiques chez le bar commun (Dicentrarchus labrax) résultant d'une infection volontaire à *V. harveyi* par immersion. A. Individus atteints de mélanose (flèche) comparés à des individus non atteints (tête de flèche). B. Ulcères cutanés et érosion de la nageoire caudale (flèche) avec exophtalmie (tête de flèche). C. Dilatation de l'intestin, entérite. Selon Pretto (2018).</figcaption></figure>

### 3.3. Pathogénie et virulence

Initialement, un agent pathogène était défini comme un agent microbien pouvant causer une maladie. Cette approche suggérait qu'il existait des agents pathogènes et des agents non pathogènes. Toutefois, cette définition s'est révélée trop restrictive puisque certains agents microbiens, apparemment non pathogènes ou commensaux, étaient capables d'induire une maladie chez un hôte immunodéprimé. C'est ainsi qu'est apparu le terme d'agent pathogène dit « classique » ou « obligatoire » et d'agent pathogène dit « opportuniste » (Casadevall et Pirofski,
1999). La définition d'un agent pathogène doit donc prendre en compte ces différentes terminologies. C'est ainsi que Casadevall et Pirofski (2009) et Casadevall et Pirofski (1999) définirent l'agent pathogène comme un agent microbien capable de causer des dommages chez un hôte sensible. Sa pathogénie représente sa capacité à causer des dommages chez un hôte sensible, alors que sa virulence représente sa capacité relative (en terme d'intensité) à causer des dommages chez un hôte sensible. Enfin, un facteur de virulence est un élément microbien capable de causer des dommages chez un hôte sensible.

De manière générale, le cycle infectieux d'un agent pathogène peut démarrer avec l'entrée en contact d'un hôte et son internalisation. L'eau étant le mode de transmission majeur des Vibrio, l'invasion peut survenir principalement *via* le tube digestif, les branchies ou la peau. La bactérie va ensuite s'installer et se multiplier en causant des dommages modérés ou sévères pour les tissus de l'hôte. Enfin, la bactérie sera libérée dans l'environnement et pourra de nouveau infecter un autre hôte. Chaque étape de l'infection est associée avec divers facteurs de virulence, détaillés dans cette partie (Austin et Zhang, 2006, Defoirdt, 2014, Vanmaele et al., 2015).

Chez V. harveyi, ces facteurs sont généralement acquis *via* des éléments génétiques mobiles tels que les plasmides, phages et transposons (Pizzutto et Hirst, 1995, Austin et Zhang, 2006). Ainsi, il est important de noter que V. harveyi est une espèce très diversifiée dont le mécanisme de pathogénie est encore mal connu. Celui-ci divergerait en fonction de l'hôte infecté, notamment entre les poissons et les invertébrés (Zhang et al., 2020).

### 3.3.1. Infection et colonisation d'un hôte

L'activité **flagellaire** couplée au mécanisme de **chimiotactisme** confère aux bactéries une motilité essentielle à l'association et la colonisation d'un hôte. Le chimiotactisme s'inscrit dans un mécanisme de signalisation complexe qui génère un mouvement bactérien en modulant la vitesse et la rotation des flagelles en réponse à des stimuli environnementaux (Wadhams et Armitage, 2004). Grâce à ce mécanisme, les flagelles permettent aux bactéries de se déplacer vers un tissu cible d'un hôte. Par exemple, les bactéries sont particulièrement attirées par le mucus
présent à la surface de la peau et des branchies ou sur la paroi intestinale, en raison de sa forte
teneur en nutriments (Bordas et al., 1998). Ainsi, le flagelle polaire permettra à la bactérie de se
déplacer dans l'environnement vers l'hôte et les flagelles latéraux permettront un déplacement
au sein des tissus de l'hôte. Une fois l'hôte atteint, les flagelles jouent un rôle dans l'adhésion
initiale des bactéries en annihilant la répulsion générée par les forces électrostatiques négatives
(McCarter, 2001). Par exemple, il a été démontré que la perte de motilité chez V. harveyi réduit
fortement son potentiel pathogène (Yang et Defoirdt, 2015).

Les **pili** confèrent également aux bactéries une capacité d'adhésion essentielle à la colonisation (Yildiz et Visick, 2009). Les pili ou fimbriae sont des appendices protéiques membranaires filamenteux qui possèdent à leur extrémité des molécules de type adhésines capables de se lier à différents tissus (Proft et Baker, 2009). Par exemple, chez V. harveyi, certaines protéines sont capables de se lier spécifiquement à la chitine (Montgomery et Kirchman, 1994). Bien que leur rôle n'ait pas encore été bien identifié, elles sont présumées impliquées dans l'adhésion et la dégradation des surfaces chitineuses telles que l'exosquelette des organismes marins, impliquant également les chitinases (Yildiz et Visick, 2009).

La production de **substances polymériques extracellulaires (EPS)** et la formation de **biofilm** sont également impliquées dans la colonisation (Karunasagar et al., 1996, Yildiz et Visick, 2009). Parmi ces EPS, la sécrétion d'exopolysaccharides génère la production d'une couche visqueuse particulièrement impliquée dans la formation de la matrice des biofilms. Cette matrice confère adhésion, cohésion et protection aux bactéries (Ruwandeepika et al., 2010). En aquaculture, la présence de biofilms de *V. harveyi* est considérée comme un réservoir de souches potentiellement pathogènes (Karunasagar et al., 1996). Il a été démontré que les biofilms de *V. harveyi* étaient particulièrement résistants aux désinfectants et aux antibiotiques, induisant une persistance en milieu aquacole (Karunasagar et al., 1994).
### 3.3.2. Multiplication et dommages tissulaires

La virulence des bactéries est notamment associée à la sécrétion d'**enzymes lytiques**. Ces dernières provoquent des dommages chez l'hôte, et permettent aux bactéries de se propager au sein des tissus et d'obtenir des nutriments essentiels à la croissance et la multiplication. Plusieurs types d'enzymes lytiques ont été identifiés chez V. harveyi : des hémolysines, des protéases, des lipases et des chitinases.

Les **hémolysines** sont des exotoxines capables de provoquer la lyse des cellules sanguines, comme les érythrocytes, en s'attaquant à la membrane cellulaire. Le rôle des hémolysines dans la virulence des souches de V. harveyi a été décelé à la fois chez les crevettes et chez les poissons (Liu et al., 1996b, Sun et al., 2007). Plus particulièrement, une hémolysine thermolabile (TLH) nommée Vibrio harveyi hémolysine (VHH) et codée par le gène vhh, a été mise en évidence chez V. harveyi (Zhang et al., 2001). Notamment, Zhang et al. (2001) ont démontré la présence de 2 copies du gène vhh chez une souche de V. harveyi (VIB 645) hautement pathogène pour les salmonidés. La lyse des érythrocytes provoque la libération de leur contenu en particulier l'hémoglobine, la transferrine et la lactoferrine. Ainsi, le fer lié à ces protéines est rendu accessible aux bactéries et sera ensuite capté par les **sidérophores** (Zhang et Austin, 2005).

Le fer est un élément essentiel, impliqué dans le métabolisme des bactéries. Lors de l'infection d'un hôte, la biodisponibilité du fer est limitée puisqu'en majorité elle est intracellulaire et liée à des protéines. Afin de pallier une déplétion du fer dans leur environnement, les bactéries produisent et sécrêtent des sidérophores. Ces derniers sont des chélateurs de faible poids moléculaire ayant une forte affinité pour le fer. Ils permettent ainsi aux bactéries d'acquérir le fer séquestré par les protéines de l'hôte (Skaar, 2010). Les sidérophores sont considérés comme un facteur de virulence chez V. harveyi (Owens et al., 1996, Soto-Rodriguez et al., 2003). Won et Park (2008) ont mis en évidence une corrélation entre la production de sidérophores par V. harveyi et la mortalité de poissons, tels que le cardeau hirame (Paralichthys olivaceus) et le sébaste coréen (Sebastes schlegeli).
Les **protéases** jouent également un rôle prépondérant dans la virulence de *V. harveyi*. Ce sont des enzymes lytiques capables de digérer une variété de protéines chez l'hôte. Chez *V. harveyi*, 3 types de protéases impliquées dans la virulence ont été isolées et identifiées : une protéase à sérine, une métalloprotéase et une protéase à cystéine (Liu *et al.*, 1997; Teo *et al.*, 2003; Zhang *et al.*, 2008). Il a été démontré que la protéase à cystéine peut avoir un effet létal chez les crevettes, *Penaeus monodon*, en interférant avec l'hémostasie, grâce à la réduction du coagulogène, présent dans le plasma (Lee *et al.*, 1999). Les métalloprotéases peuvent engendrer des dommages tissulaires en dégradant certains composants de la matrice extracellulaire tels que le collagène, la gélatine ou la fibronectine (Teo *et al.*, 2003). Ces protéases sont principalement produites lors de l'infection d'un hôte. En effet, *Ruwandeepika et al.* (2011) ont mis en évidence la présence d'un pic d'expression des gènes *srp* et *vhp* codant pour la protéase à sérine et la métalloprotéase respectivement chez des espèces du clade Harveyi, lors de l'infection d'un hôte.

Les **lipases** sont des enzymes qui transforment les chaînes longues de triglycérides en acides gras et molécules de glycérol. Ces protéines peuvent potentiellement causer des dommages au niveau des tissus de l'hôte. Bien qu'elles aient été isolées chez *V. harveyi*, leur implication dans la virulence n'a pas encore été mise en évidence (Teo *et al.*, 2003, Montánchez et Kaberdin, 2019). Toutefois, une corrélation entre la production par *V. harveyi* de phospholipases, ainsi que de protéases ou de sidérophores, et le taux de mortalité des nauplii (*Artemia franciscana*) infectés a été décelée (Soto-Rodriguez *et al.*, 2003).

Les **chitinases** sont des enzymes hydrolytiques capables de transformer les polymères de chitine en chitine-oligosaccharides, ensuite métabolisés en source d'azote et de carbone. L'excrétion de chitinases, permet une dégradation des surfaces protectrices chitineuses et entraîne une exposition des tissus aux agents pathogènes. Ces protéines jouent donc un rôle essentiel dans la colonisation des hôtes possédant un exosquelette chitineux (Aguirre-Guzmán *et al.*, 2004). *V. harveyi* est capable de sécréter plus de 10 chitinases différentes. Certaines sont constamment produites alors que d'autres sont excrétées en présence de certaines formes de chitines (Svitil *et al.*, 1997).
Les **endotoxines**, c'est-à-dire des toxines situées sur la paroi des bactéries et libérées lors de la lyse bactérienne peuvent également jouer un rôle dans la virulence. Chez *V. harveyi*, la présence de lipopolysaccharides pouvant induire une pathogénie pour la langoustine commune (*Nephrops norvegicus*) a été mise en évidence. Selon Montero et Austin (1999), des extraits de produits extracellulaires de *V. harveyi*, traités et non traités à la protéinase K ou chauffés (100 °C, 10 min) entraînent une pathogénie. Ces résultats suggèrent l'existence d'une toxine non protéique et thermostable au sein des produits extracellulaires. Ces lipopolysaccharides mis en évidence ont été ainsi considérés comme une toxine létale de *V. harveyi*.

Les **bactériocines** sont des toxines protéiques produites par des bactéries, démontrant une toxicité pour les bactéries proches de la bactérie productrice. Leur spectre d'action est donc généralement étroit. La production de bactériocines représente un avantage compétitif pour la bactérie productrice en facilitant sa prolifération au sein d'une communauté bactérienne (Riley et Wertz, 2002). Une bactériocine nommée *bacteriocin-like substance* (BLIS) a été isolée chez une souche virulente de *V. harveyi*. Celle-ci pourrait ainsi induire une dominance de la souche virulente productrice par rapport aux souches sensibles. Ceci faciliterait l'accès aux ressources lors de la colonisation d'un hôte et assurerait la survie de la bactérie productrice (Prasad *et al.*, 2005).

### Systèmes de sécrétion de type III

La plupart des facteurs de virulence sont soit localisés sur la membrane bactérienne, soit sécrétés. Les bactéries disposent donc de systèmes de sécrétion permettant le transport de facteurs de virulence jusqu'à la membrane ou leur libération dans le milieu extracellulaire. Ces systèmes jouent donc un rôle important dans la pathogénie des bactéries. Chez *V. harveyi*, un système de sécrétion de type III a été identifié et régulé par le système de quorum sensing (Henke et Bassler, 2004a).

### 3.3.3. Régulation de l'expression et transfert des facteurs de virulence

L'expression de gènes de virulence s'inscrit dans un mécanisme métaboliquement coûteux. Les facteurs de virulence ne sont pas toujours nécessaires à la survie des bactéries. Par exemple,
certains facteurs seront particulièrement requis lors de l'infection d'un hôte mais pas indispensables lors de leur survie en phase planctonique. Leur production est donc sous le contrôle de divers systèmes de régulation tels que le quorum sensing (QS) ou le gène *toxR*. L'environnement et les caractéristiques de l'hôte jouent également un rôle prépondérant dans l'expression des facteurs de virulence (Ruwandeepika et al., 2010).

**Quorum sensing**

Comme défini dans la section 2.2.2. (p.31), le QS permet de réguler l'expression de gènes en réponse à la fluctuation de la densité de la population *via* la production et la perception d'auto-inducteurs (AIs). Le QS de *V. harveyi* s'appuie sur 3 systèmes de signalisation impliquant différents AIs, fonctionnant en synergie (Fig. 14) (Papenfort et Bassler, 2016):

* Le système LuxM/N impliquant un acyl-homosérine lactone HAI-1 (harveyi auto-inducteurs) produit par la synthase LuxM et détecté par le récepteur LuxN. Ce système a été mis en évidence uniquement chez *V. harveyi*.

* Le système LuxS/PQ impliquant un furanosyl borate diester AI-2 (auto-inducteur 2) produit par la synthase LuxS et détecté par le récepteur LuxPQ (complexe à 2 domaines). LuxP est le domaine de liaison et LuxQ est un domaine périplasmique permettant l'activation du QS. Ce système a été mis en évidence chez de nombreuses bactéries et constitue ainsi un système de communication inter-espèces.

* Le système CqsA/S impliquant une (Z)-3-aminoundec-2-en-4-one CAI-1 (choléra autoinducteur 1) produite par la synthase CqsA et détectée par le récepteur CqsS. Ce système a été mis en évidence uniquement chez plusieurs espèces de *Vibrio*.
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 14 : Quorum sensing de Vibrio harveyi et les mécanismes de virulence associés, adapté de Montánchez et Kaberdin (2019).</figcaption></figure>

À faible densité cellulaire, la concentration d'AIs dans le milieu extracellulaire est faible. Ainsi, les récepteurs LuxN, LuxQ et CqsS, fonctionnent alors comme des kinases. Ils s'auto-phosphorylent et initient une cascade de phosphorylations aboutissant à la phosphorylation de la protéine LuxO. Cette dernière active alors la production de 5 ARNs régulateurs nommés Qrr (quorum regulatory RNA), qui à leur tour vont activer la production du facteur de transcription AphA et réprimer la production du facteur de transcription LuxR (Lilley et Bassler, 2000, Tu et Bassler, 2007). Ce schéma est renforcé par la répression de la production de LuxR par AphA. Ainsi, à faible densité bactérienne, LuxR est peu produit alors que AphA est à son maximum (Fig. 14).

À forte densité bactérienne, la concentration d'AIs dans le milieu est forte. Les récepteurs LuxN, LuxQ et CqsS fonctionnent alors comme des phosphatases et entraînent la déphosphorylation de LuxO. Celle-ci est ainsi inactive et par conséquent, les ARNs Qrr régulateurs ne sont pas produits. LuxR est alors produit à son maximum tandis que la production de AphA est fortement réduite. (Ball et al., 2017). Les facteurs AphA et LuxR sont des régulateurs du QS pouvant à la fois
activer ou réprimer l'expression des gènes. AphA est capable de réguler l'expression de 167 gènes, LuxR de 625 gènes et ensemble les deux facteurs co-régulent 77 gènes. AphA est produit uniquement à faible densité cellulaire alors que LuxR est présent à la fois à faible et forte densités cellulaires. LuxR est ainsi le facteur majeur impliqué dans la régulation du QS (Van Kessel et al., 2013). Chez V. harveyi, le QS joue un rôle important dans la régulation des gènes impliqués dans la bioluminescence (Bassler et al., 1994, Manefield et al., 2000), la formation de biofilm, la motilité flagellaire (Yang et Defoirdt, 2015), la production de sidérophores (Lilley et Bassler, 2000, McRose et al., 2018), la production de protéases extracellulaires (Mok et al., 2003, Natrah et al., 2011) et le système de sécrétion de type III (Henke et Bassler, 2004b). De manière générale, à faible densité cellulaire, les facteurs de virulence exprimés permettent aux bactéries d'adhérer aux tissus de l'hôte et favorisent la multiplication bactérienne. En revanche, à forte densité cellulaire, ces facteurs favorisent la dégradation des biofilms et la dispersion des bactéries dans l'environnement (Fig. 14) (Rutherford et Bassler, 2012).

**Le gène toxR**
Le gène *toxR* code pour un facteur de transcription transmembranaire identifié chez la plupart des bactéries du genre *Vibrio*. Il a été particulièrement étudié chez *V. cholerae* et *V. parahaemolyticus* (Lin et al., 1993). Chez ces espèces, il a été mis en évidence que le facteur de transcription ToxR avait un rôle dans la régulation des gènes de virulence. Par exemple chez *V. cholerae*, celui-ci est capable de réguler les gènes impliqués dans la production de la toxine cholérique (*ctx*), la synthèse de pili (*tcp*) ou la motilité flagellaire et le chimiotactisme (Bina et al., 2003). Chez *V. harveyi*, ce gène a également été identifié. Il est supposé jouer un rôle dans la régulation de l'expression des gènes de virulence mais ceci n'a pas été démontré (Franco et Hedreyda, 2006).

**Les bactériophages**
Les bactériophages peuvent également moduler la virulence chez *V. harveyi*. Un bactériophage est un virus capable d'infecter les bactéries. Son génome, sous forme d'ARN ou d'ADN, est protégé par une capsule protéique. Lors de l'infection, son matériel génétique est transféré dans le cytoplasme bactérien de façon horizontale. Celui-ci peut alors, soit initier un cycle lytique et entraîner la lyse de la bactérie, soit initier un cycle lysogénique et
intégrer son propre génome au sein du génome bactérien. Le bactériophage devient alors un
prophage intégré dans le chromosome de l'hôte ou sous forme de plasmide. Son ADN sera alors
simultanément répliqué avec l'ADN bactérien lors de la division cellulaire. Ce cycle peut durer
indéfiniment. L'initiation d'un cycle lysogénique par un bactériophage entraîne ainsi un transfert
de gènes à la bactérie, pouvant ainsi conférer de la virulence (Fortier et Sekulovic, 2013). Chez
V. harveyi, au moins deux bactériophages impliqués dans la virulence et infectant
préférentiellement cette espèce, ont été identifiés. Oakey et Owens (2000) ont mis en évidence la
présence d'un bactériophage de la famille Myoviridae, le Vibrio harveyi myovirus-like (VHML),
chez une souche de V. harveyi, pathogène pour P. monodon. Il a été démontré que le transfert
du bactériophage VHML dans le génome bactérien de souches de V. harveyi non virulentes peut
les convertir en souches virulentes. Chez la plupart des souches infectées, le bactériophage
induisait une augmentation de l'activité hémolytique, de la sécrétion de protéines et de la
mortalité chez les larves de P. monodon (Munro et al., 2003). Plus récemment, Khemayan et al.
(2012) ont mis en évidence la présence du bactériophage Vibrio harveyi siphophage 1 (VHS1)
chez V. harveyi. Il a été démontré que le transfert de VHS1 dans le génome bactérien de
V. harveyi induisait une virulence ainsi qu'une mortalité accrue pour P. monodon mais pas pour
Penaeus [Litopenaeus] vannamei. Ce bactériophage serait impliqué dans la production de toxines
extracellulaires associées à l'agglutination d'hémocytes.

L'ensemble de ces facteurs de virulence, éventuellement présents chez *V. harveyi*, explique sa
dangerosité potentielle et la nécessité, dans les élevages aquacoles, d'être capable d'identifier et
de détecter cet agent potentiellement pathogène, rapidement et de façon fiable

4. Méthodes de détection et d'identification de Vibrio harveyi

La détection précoce d'agents pathogènes, est primordiale pour assurer une gestion efficace de la vibriose au sein d'une structure aquacole. Dans un premier temps, la surveillance revêt une importance fondamentale afin de prévenir la diffusion des maladies et d'améliorer les connaissances des facteurs épidémiologiques impliqués dans leur apparition et leur propagation.
Dans un second temps, lors d'un épisode de vibriose, l'établissement d'un diagnostic rapide est crucial pour mettre en place des mesures de contrôle ciblées et efficaces. Il est ainsi indispensable d'utiliser des méthodes fiables, permettant une identification rapide de l'agent pathogène, en particulier *V. harveyi*.

## 4.1. Méthodes culturales de croissance et identification phénotypique

Milieux sélectifs
Le TCBS (Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose) est un milieu sélectif utilisé pour l'isolement et la purification des bactéries du genre *Vibrio*. Il fait partie des milieux sélectifs de référence de la norme ISO (2017) pour l'isolement de *Vibrio* pathogènes. Sur ce milieu de couleur verte, les souches capables de fermenter le saccharose forment des colonies jaunes alors que les autres forment des colonies vertes. Les colonies de *Vibrio harveyi* peuvent ainsi apparaître jaunes ou vertes en raison de variations intraspécifiques (Fig. 15). Toutefois, leur aspect peut différer entre des cultures de 24 h et des cultures plus âgées de 48 h ou réfrigérées. La lecture des boîtes est ainsi préconisée sur des cultures récentes.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 15 : Photographies de colonies sur milieu gélosé TCBS après incubation 24 h à 37 °C. A. Isolement d'eau de mer. B. Isolement de la souche *Vibrio harveyi* de référence LMG 4044. C. Isolement de la souche *Vibrio harveyi* de référence LMG 18298.</figcaption></figure>

Bien qu'à l'origine ce milieu ait été mis au point pour l'isolement des espèces *Vibrio cholerae* et *V. parahaemolyticus*, celui-ci est adapté à la croissance de la plupart des *Vibrio* (Kobayashi *et al.*, 1963). Néanmoins, certaines espèces telles que *Vibrio penaeicida* et *Vibrio gazogenes* n'ont pas la capacité de croître sur ce milieu. D'autres espèces telles que *Vibrio cincinnatiensis*,
*Vibrio metschnikovii* et *Vibrio hollisae* ont une croissance très faible (Farmer *et al.*, 1988, Gomez-Gil et Roque, 2006). La sélectivité du TCBS repose sur la présence de bile empêchant la croissance des bactéries Gram-positif et coliformes. Il a toutefois été rapporté que certaines souches d'Aeromonas, Flavobacterium, Pseudoalteromonas, Shewanella, Staphylococcus et Streptococcus ont une croissance légère sur TCBS (Nicholls *et al.*, 1976).

Pour faire face à ces divers inconvénients, un autre milieu sélectif a été mis au point dans le but d'isoler et de distinguer spécifiquement *V. harveyi*: *Vibrio harveyi* agar (VHA) (Harris *et al.*, 1996). La distinction de *V. harveyi* parmi les *Vibrio*, capables de croître sur le VHA, repose sur la capacité de cette espèce à utiliser le cellobiose et l'ornithine. Les colonies formées par *V. harveyi* apparaîtront ainsi petites, vert clair avec un centre plus foncé et un halo jaune. Néanmoins, il a été démontré que la présence d'ornithine décarboxylase n'est pas un critère caractéristique suffisant pour différencier *V. harveyi* de *V. campbellii*. D'autres études sont donc nécessaires pour valider la spécificité de l'identification réalisée grâce à ce milieu (Gomez-Gil et Roque, 2006).

**Tests biochimiques**

L'identification à l'aide de tests biochimiques est longue et fastidieuse (Bonnin-Jusserand *et al.*, 2017). D'une part, il existe d'importantes variations phénotypiques intraspécifiques, et d'autre part certaines espèces de *Vibrio* telles que *V. harveyi* et *V. alginolyticus* ont des profils phénotypiques très similaires (Buller, 2014). Il est ainsi difficile d'identifier de façon fiable les espèces de *Vibrio* issues de l'environnement telles que *V. harveyi* à l'aide du système de Galerie API 20E (BioMerieux), en partie du fait du manque de données existantes dans les différentes bases de données (Bauer *et al.*, 2018).

**Tests sérologiques**

Une alternative aux tests biochimiques a émergé grâce au développement des tests sérologiques. La plupart des tests, sont disponibles à un prix relativement coûteux et ont été mis au point pour l'identification des espèces du genre *Vibrio* représentant un risque pour la santé humaine tel que *Vibrio cholerae*, avec notamment le Cholera Smart O1 (Hasan *et al.*, 1994). Afin de détecter *V. harveyi* dans des crevettes et l'eau d'élevage, Robertson *et al*. (1998) ont développé un test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),
basé sur des anticorps polyclonaux. Toutefois ce test manquait de spécificité puisque l'espèce
*V. campbellii* était également détectée.

Les limites de ces différentes méthodes ont conduit au développement de méthodes
d'identification moléculaire.

## 4.2. Techniques de biologie moléculaire

Différentes techniques de biologie moléculaire ont été élaborées pour l'identification de l'espèce *V. harveyi*. Celles-ci reposent sur l'hybridation moléculaire, la réaction de polymérisation en chaîne ou le séquençage des acides nucléiques. Certaines de ces techniques, telles que l'hybridation ADN-ADN (DDH), AFLP (Amplified Fragment-Length Polymorphism), rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR), et RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) sont basées sur l'étude du génome entier alors que d'autres telles que la MLSA (MultiLocus sequence analysis), la PCR (Polymerase Chain Reaction) et la PCR en temps réel ciblent préférentiellement un ou plusieurs gènes. Les techniques basées sur l'analyse d'un seul gène ont l'avantage d'être facilement applicables au quotidien, en offrant un résultat rapide et moins couteux. Plus particulièrement, la PCR en temps réel ou PCR quantitative (q-PCR) procure non seulement une identification fiable et rapide mais également une quantification de l'agent pathogène directement dans l'échantillon environnemental. Cette méthode peut ainsi être utilisée d'une part, par les entreprises aquacoles pour surveiller la présence et l'abondance d'un agent pathogène à des endroits clés de la structure et d'autre part, dans le domaine de la recherche pour étudier la dynamique spatiale et temporelle d'un agent pathogène et déterminer ainsi les facteurs épidémiologiques impliqués dans le déclenchement et la propagation de la vibriose. De ce fait, seule cette technique sera détaillée dans cette partie (pour plus de détails : Cano-Gomez et al. (2009)).

La technique de PCR est apparue pour la première fois dans les travaux de Mullis *et al.* (1986).
Celle-ci repose sur une réaction enzymatique *in vitro* permettant l'amplification d'un ADN cible.
Elle nécessite la mise au point en amont d'amorces d'ADN, capables de s'hybrider spécifiquement
aux extrémités de la région à amplifier. Au cours de la réaction, des variations cycliques de température, générées grâce à un thermocycleur, vont engendrer de manière successive, la dénaturation de l'ADN double brin en ADN simple brin, l'hybridation des amorces et l'amplification de l'ADN cible par l'ADN polymérase. La succession des cycles va ainsi permettre une amplification exponentielle de l'ADN cible. Cette technique a suscité un engouement particulier pour le diagnostic en raison de sa haute sensibilité et spécificité, aboutissant à l'apparition de nouvelles technologies permettant le perfectionnement de cette méthode et l'apparition de la q-PCR (Millar et al., 2007).

La technique de q-PCR est apparue pour la première fois dans les travaux de Higuchi et al. (1993). Cette technique est très similaire à la technique de PCR conventionnelle. La différence repose sur le fait que, au cours de la réaction de q-PCR, la quantité de produits amplifiés, ou amplicons, est mesurée en temps réel par un système de marqueur fluorescent. Le signal de fluorescence émis est directement proportionnel à la concentration d'ADN. Ainsi la corrélation linéaire entre la quantité d'ADN et l'intensité du signal de fluorescence permet de déterminer la quantité d'ADN initialement présente dans l'échantillon. Deux technologies de marqueurs fluorescents sont couramment utilisées : la technologie en sonde TaqMan® et la technologie SYBR® Green I (Arya et al., 2005). Le mécanisme de ces deux technologies est détaillé dans la Figure 16 (p.56).

La différence entre ces deux systèmes repose sur la spécificité de la réaction de fluorescence. En effet, la fluorescence émise par une sonde TaqMan® témoigne d'une amplification plus spécifique que celle générée par le SYBR® Green I. La sonde TaqMan® correspond à un brin d'oligonucléotide sur lequel est fixé un reporter à l'extrémité 3' dont la fluorescence est initialement inhibée par le quencher fixé à l'extrémité 3'. Ce brin a été mis au point pour s'hybrider de manière spécifique sur une séquence d'ADN cible. Lors de la polymérisation, l'ADN polymérase va hydrolyser la sonde, grâce à son activité 5'-exonucléasique, et va libérer le reporter du quencher, générant une fluorescence. Ainsi, la spécificité de la sonde permet de garantir que le signal de fluorescence est le témoin d'une amplification spécifique. En revanche, le SYBR®
Green I est un agent intercalant capable de s'intercaler entre n'importe quel ADN double brin. La spécificité de la réaction repose donc entièrement sur la spécificité des amorces. Néanmoins, l'avantage de cette technique s'appuie sur le fait qu'elle ne nécessite pas d'expertise pour l'élaboration d'une sonde : elle est ainsi plus simple à mettre en place et moins couteuse (Fig. 16) (Arya et al., 2005).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 16 : Schéma permettant de comparer le mécanisme de la technologie en sonde TaqMan® et SYBR® Green (adapté de Applied Biosystems (2020)).</figcaption></figure>

Les méthodes d'identification par PCR ou q-PCR reposent sur l'identification de marqueurs ou gènes cibles spécifiques au genre ou à l'espèce bactérienne. Ces marqueurs doivent d'une part être bien conservés au sein de l'espèce ciblée et d'autre part posséder un pouvoir discriminant
important, autrement dit une similarité inter-espèces faible. Ces deux critères permettent de
garantir l'inclusivité et la spécificité de la méthode. En raison de l'importante similarité des
séquences génétiques des espèces de *Vibrio* et plus spécifiquement du clade Harveyi,
l'identification à l'espèce de *V. harveyi* est rendue complexe. Il en résulte des erreurs
d'identification entre les espèces les plus proches de *V. harveyi* : *V. campbellii* et *V. rotiferianus*.
En effet, ces trois espèces partagent 99 % de similarité au niveau de la séquence codant pour
l'ARNr 16S (Gomez-Gil et al., 2003, Gomez-Gil et al., 2004). Cette séquence possède ainsi un
pouvoir discriminant faible et semble ici peu appropriée pour différencier les espèces au sein du
clade Harveyi. Différentes séquences d'amorces ont ainsi été dessinées sur différents gènes cibles
potentiels, afin d'identifier spécifiquement *V. harveyi* par techniques de PCR ou q-PCR. Le
Tableau 4 répertorie les différentes amorces retrouvées dans la littérature.
<table><caption>Tableau 4 : Liste non exhaustive des différentes amorces, rencontrées dans la littérature, mises au point pour l'identification spécifique de *Vibrio harveyi*.</caption><thead><tr><th>Gène cible</th><th>Produit de gène</th><th>Nom de l'amorce</th><th>Séquence nucléotidique (5'-3')</th><th>Taille du produit amplifié (pb)</th><th>Remarques</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">rrn</td><td rowspan="2">ARN ribosomal 16S</td><td>VH-1</td><td>AACGAGTTATCTGAACCTTC</td><td rowspan="2">1300</td><td rowspan="2">Amplification des deux espèces V. harveyi et V. alginolyticus. Ces espèces peuvent ensuite être distinguées par un test biochimique simple.</td><td rowspan="2">Oakey et al. (2003)</td></tr><tr><td>VH-2</td><td>GCAGCTATTAACTACACTACC</td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td>VHARF</td><td>CCGCATAATACCTACGGGTC</td><td rowspan="2">967</td><td rowspan="2">Sous-estimation de la quantité de V. harveyi en présence de V. campbellii ou V. rotiferianus. En effet, bien que la sonde TaqMan dessinée soit spécifique à V. harveyi, les amorces s'hybrident également sur les séquences de V. campbellii et V. rotiferianus.</td><td rowspan="2">(Fukui et Sawabe, 2008)</td></tr><tr><td>VHARR</td><td>ACCCGAAGTGCTGGCAAACA</td></tr><tr><td>gyrB</td><td>Sous-unité B de l'ADN gyrase</td><td>A2<br>B3</td><td>TCTAACTATCCACCGCGG<br>AGCAATGCCATCTTCACGTTC</td><td>363</td><td>gyrB manque de pouvoir discriminant. D'autres études sont nécessaires afin de valider la spécificité de ces amorces. Par exemple l'espèce V. rotiferianus n'a pas été testée.</td><td>Thaithongnum et al. (2006)</td></tr><tr><td rowspan="4">toxR</td><td rowspan="4">Protéine transmembranaire régulatrice de transcription</td><td>Vh_toxR-F</td><td>TTCTGAAGCAGCACTCAC</td><td rowspan="2">390</td><td rowspan="2">Résultats faux négatifs pour les souches VIB 391 et STD 3-101 identifiées comme V. harveyi.</td><td rowspan="2">Conejero et Hedreyda (2003)</td></tr><tr><td>Vh_toxR-R</td><td>TCGACTGGTGAAGACTCA</td></tr><tr><td>toxRF1</td><td>GAAGCAGCACTCACCGAT</td><td rowspan="2">382</td><td rowspan="2">Les espèces du clade Harveyi telles que V. rotiferianus, V. owensii, V. azureus... n'ont pas été testées. Seule une souche de V. campbellii de référence a été testée.</td><td rowspan="2">Pang et al. (2006)</td></tr><tr><td>toxRR1</td><td>GGTGAAGACTCATCAGCA</td></tr><tr><td rowspan="3">rpoB</td><td rowspan="3">Sous-unité β de l'ARN polymérase</td><td>toxR F1</td><td>CCACTGCTGAGACAAAAGCA</td><td rowspan="3">162</td><td rowspan="3">Cette étude a été réalisée en technologie TaqMan®. Plusieurs espèces du clade Harveyi telles que V. owensii, V. azureus, V. natriegens ou V. jasicida n'ont pas été testées.</td><td rowspan="3">Schikorski et al. (2013)</td></tr><tr><td>toxR R1</td><td>GTGATTCTGCAGGGTTGGTT</td></tr><tr><td>torR P1</td><td>CAGCCGTCGAACAAGCACCG</td></tr><tr><td></td><td></td><td>VH-4F</td><td>GTGATGAAGAAGCTTATCGCGATT</td><td rowspan="2">601</td><td rowspan="2">Les espèces du clade Harveyi telles que V. rotiferianus, V. owensii, V. azureus... n'ont pas été testées. Seule une souche de V. campbellii de référence a été testée.</td><td rowspan="2">Kim et al. (2014b)</td></tr><tr><td></td><td></td><td>VH-7F</td><td>CGCCTTCTTCAGTTAACGCAGGA</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th>Gène cible</th><th>Produit de gène</th><th>Nom de l'amorce</th><th>Séquence nucléotidique (5'-3')</th><th>Taille du produit amplifié (pb)</th><th>Remarques</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>vvh</td><td>Hémolysine</td><td>VHF1<br>VHR1<br>VhhemoR</td><td>ATCATGAATAAAACTATTACGTTACT<br>GAAAGGATGGTTTGACAAT<br>GCTTGATAACACTTTGCGGT</td><td>1257<br>308 avec<br>VHF1</td><td>vvh est impliqué dans la virulence. Certains auteurs ont démontré que ce gène n'est pas présent chez toutes les souches de V. harveyi (Zhang et al., 2001). De plus il peut être sujet au phénomène de transfert horizontal de gènes (Waldor et Mekalanos, 1996, Cano-Gomez et al., 2009, Izumiya et al., 2011).</td><td>Zhang et al. (2001)<br>Conejero et Hedreyda (2004)</td></tr><tr><td>luxN</td><td>Récepteur de LuxM/N du quorum sensing</td><td>fluxN<br>rluxN</td><td>CTGTGTACTCACTGTTTATC<br>GTCTAATTCGCGTTCTCCA</td><td>2048</td><td>Deux souches de V. campbellii sont ressorties positives suite à l'utilisation de ces amorces, démontrant leur manque de spécificité (Cano-Gomez et al., 2009).</td><td>Bassler et al. (1993)</td></tr><tr><td>topA</td><td>Topoisomérase I</td><td>Vh.topA-F<br>Vh.topA-R</td><td>TGGCGCAGCGTCTATACG<br>TATTTGTCACCGAACTCAGAACC</td><td>121</td><td>Plusieurs espèces du clade Harveyi telles que V. owensii, V. azureus, ou V. jasicida n'ont pas été testées.</td><td>Cano-Gomez et al. (2015)</td></tr><tr><td>hly</td><td>Hémolysine</td><td>Vh-hly1F<br>Vh-hly1R</td><td>GAGTTCGGTTTCTTTCAAG<br>TGTAGTTTTTCGCTAATTTC</td><td>454</td><td>Les espèces du clade Harveyi telles que V. rotiferianus, V. owensii, V. azureus ou V. jasicida n'ont pas été testées. De plus le gène hly est impliqué dans la virulence. Il peut donc être sujet au transfert horizontal de gènes et entrainer l'obtention de faux positifs ou faux négatifs (Izumiya et al., 2011).</td><td>Haldar et al. (2010a)</td></tr><tr><td>vhhP2</td><td>Protéine membranaire</td><td>F6<br>R4</td><td>TGGATGTAAATGAGTTTGG<br>CGTTACGATTATTTGATAG</td><td>159</td><td>Une souche de V. campbellii est ressortie positive suite à l'utilisation de ces amorces, démontrant leur manque de spécificité.</td><td>Sun et al. (2009)</td></tr></tbody></table>
Les méthodes de PCR et q-PCR se sont néanmoins avérées coûteuses pour une application au quotidien. De nombreux laboratoires vétérinaires se sont donc tournés vers des techniques d'identification par spectrométrie de masse moins onéreuses.

## 4.3. Analyse protéomique par MALDI-TOF MS

La spectrométrie de masse est une technique analytique, apparue au début du XXème siècle, utilisée pour déterminer la masse moléculaire d'un composé, permettant ainsi la détection et l'identification de molécules (De Hoffmann, 2000). Elle repose sur la mesure du rapport de la masse sur la charge (m/z) d'une molécule préalablement ionisée. Son utilisation était, dans un premier temps, restreinte aux petits composés thermostables. En effet, les techniques d'ionisation de l'époque engendraient une fragmentation excessive de l'échantillon entraînant une perte d'intégrité des molécules (Domon et Aebersold, 2006). Avec l'apparition, dans les années 80, de nouvelles techniques reposant sur une ionisation douce : Electron Spray Ionization (ESI) et Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), son utilisation a pu s'étendre aux composés organiques complexes tels que les protéines. Ceci a ainsi permis de rendre cette technique applicable à l'identification de bactéries, de virus et de champignons (Singhal et al., 2015).

La technique d'ionisation MALDI s'est avérée plus avantageuse que la technique ESI. En effet, la technique MALDI permet principalement de générer des ions mono-chargés, contrairement à la technique ESI, pouvant générer des ions multichargés. Ainsi, l'interprétation des données issues de la technique MALDI est plus simple. Cette technique repose sur le mélange d'un échantillon avec une solution organique, donneuse de protons, appelée matrice, le tout déposé sur une plaque de métal appelée cible. Généralement, en microbiologie, l'échantillon correspond à une colonie bactérienne. Le solvant organique présent dans la matrice pénètre la paroi bactérienne et en extrait les protéines intracellulaires. Sous l'effet du séchage, l'échantillon et la matrice co-cristallisent (Fig. 17) (Singhal et al., 2015).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 17 : Schéma général représentant la préparation d'un échantillon bactérien dans le but d'une identification par la technique MALDI-TOF MS (Clark et al., 2013).</figcaption></figure>

Ce dépôt solide est ensuite irradié par un faisceau laser. Ceci entraine la formation et la désorption (passage en phase gazeuse) d'ions issus du complexe matrice-échantillon. Les ions chargés sont ensuite transférés vers un analyseur permettant une séparation des ions en fonction de leur rapport *m/z*. L'analyseur le plus communément utilisé en microbiologie est issu de la technologie *Time Of Flight* (TOF) en mode linéaire. Les ions subissent une accélération grâce à l'application d'une différence de potentiel. Ils sont ensuite envoyés dans un tube de vol et séparés en fonction de leur vécuïté et donc de leur masse. Les ions atteignent ensuite le détecteur et les signaux reçus sont traités informatiquement. Le rapport *m/z* est alors déterminé en fonction du temps de vol des ions, c'est-à-dire le temps mis par les ions pour traverser le tube et atteindre le détecteur. Celui-ci est proportionnel à leur masse. Ainsi, plus la masse des ions est faible plus ils atteindront le détecteur rapidement et inversement. Un spectre caractéristique de l'échantillon est alors généré. Ce spectre est ensuite comparé aux spectres existants dans une base de données référente, nommés mass spectra profiles (MSPs) afin d'identifier l'échantillon inconnu. Un score est déterminé afin d'évaluer la qualité d'identification (Fig. 18) (Clark et al., 2013).
<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 18 : Schéma général représentant la technique d'analyse d'un échantillon ionisé, par MALDI-TOF MS (Clark *et al.*, 2013).</figcaption></figure>

La technologie MALDI-TOF MS est donc devenue une méthode rapide, fiable et à moindre coût pour l'identification de bactéries. Elle est ainsi couramment utilisée dans les établissements de santé afin de dresser un diagnostic rapide. Elle s'est notamment avérée efficace pour l'identification de pathogènes du genre *Vibrio* isolés chez l'Homme (Hazen *et al.*, 2009), mais également chez des organismes élevés en aquaculture ou dans l'environnement (Dieckmann *et al.*, 2010). Toutefois, cette méthode présente des inconvénients. En effet, l'identification dépend fortement des spectres enregistrés dans la base de données utilisée. Par exemple, l'une des bases de données la plus couramment utilisée : Bruker BioTyper (dernière version 9.0.0.0), a été principalement développée pour l'identification de souches cliniques et manque de souches isolées de l'environnement ou de souches pathogènes animales. Par exemple, elle ne comprend pas les spectres correspondant aux espèces *Vibrio jasicida*, *Vibrio owensii* et *Vibrio sagamiensis* appartenant au clade Harveyi ou même une des espèces de *Vibrio*, pathogène pour l'Homme, la plus connue : *Vibrio cholerae*. Leur identification à l'aide de cette base de données n'est donc aujourd'hui pas possible. Toutefois, afin de pallier ces inconvénients, il est possible de développer de nouvelles bases de données spécifiques. Par exemple, Erler *et al.* (2015) ont mis en place une base de données accessible, VibrioBase, comportant de nombreux spectres caractéristiques d'espèces du genre *Vibrio* isolées de l'environnement. L'utilisation de cette base de données permet donc d'améliorer la spécificité de l'identification obtenue. Enfin, pour être efficace et
reproductible, la méthode doit reposer sur une standardisation robuste. En effet, pour certaines espèces bactériennes, les conditions de culture (milieu, temps d'incubation...) peuvent profondément influencer le profil du spectre obtenu. Malgré ces différences, l'identification reste toutefois possible et le diagnostic peut être, malgré tout, dressé afin de mettre en place et d'appliquer des mesures de contrôle pour lutter contre la vibriose (Valentine et al., 2005).

# 5. Les moyens de lutte contre la vibriose en aquaculture

Compte tenu de l'impact économique et sanitaire croissant de la vibriose sur l'élevage, de nombreuses recherches sont allouées aux moyens de lutte. La plupart se focalisent sur des méthodes durables visant à limiter l'impact sur l'environnement, la santé animale et la santé humaine, intégrées dans le concept *One Health*. Le consommateur joue un rôle actif dans le développement de ces méthodes, en exigeant des denrées alimentaires plus saines, ainsi que des garanties sur le bien-être animal et le respect de l'environnement. Néanmoins, très peu de ces méthodes sont aujourd'hui autorisées en élevage et la législation en vigueur varie entre les pays.

## 5.1. Principes de gestion des maladies en milieu aquacole

### 5.1.1. Déclenchement des maladies

En milieu aquacole, une maladie peut être définie comme tout processus qui limite la productivité (Lucas et al., 2019). Celle-ci peut être d'origine non-infectieuse ou infectieuse. Les maladies non-infectieuses sont généralement associées à l'environnement, la nutrition ou la génétique et se limitent souvent à une ferme. Les maladies infectieuses peuvent se propager d'une ferme à l'autre et sont définies selon une approche intégrative incluant l'hôte, l'agent pathogène et l'environnement. Ainsi, selon Snieszko (1974), « une maladie infectieuse peut se déclencher chez un hôte sensible, suite à l'exposition à un agent pathogène virulent, dans des conditions environnementales favorables ». Un diagramme de Venn (Fig. 19) défini par Snieszko (1974) est communément utilisé pour conceptualiser l'infection et le déclenchement.
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 19 : Diagramme de Venn permettant de conceptualiser le déclenchement d'une maladie infectieuse selon une approche intégrative incluant l'hôte, l'agent pathogène et l'environnement. Issu de Snieszko (1974).</figcaption></figure>

### 5.1.2. Une stratégie de contrôle holistique

Au tout début de l'aquaculture, certaines stratégies de contrôle se limitaient à la conjecture selon laquelle, l'état optimal correspond à l'absence de pathogène. Seulement, réduire le contrôle d'une maladie à l'éradication du pathogène n'est pas une stratégie durable et rentable. D'une part, les coûts engagés pour une méthode curative sont souvent plus importants que pour une méthode préventive. D'autre part, les systèmes aquacoles étant, pour la plupart, en contact avec l'environnement extérieur, la probabilité de réinfection est importante (Lucas et al., 2019). Ainsi, une stratégie de contrôle holistique incluant l'hôte, l'agent pathogène et l'environnement s'est imposée comme une stratégie intégrative d'une aquaculture durable, dynamique et compétitive. Cette stratégie intègre en particulier des mesures préventives basées sur une amélioration de la qualité de l'environnement, une amélioration du système de défense immunitaire de l'hôte et une réduction de l'abondance ou de la virulence de l'agent pathogène. Cette stratégie intègre également des mesures curatives basées sur l'élimination de l'agent pathogène en cas de déclenchement de maladie (Defoirdt et al., 2011, Pérez-Sánchez et al., 2018). La Figure 20 permet de conceptualiser cette stratégie en résumant les différents points de contrôle.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 20 : Schéma conceptualisant le déclenchement d'une maladie infectieuse en aquaculture, ainsi que les stratégies de contrôle préconisées. Adapté de Pérez-Sánchez et al. (2018) et Defoirdt et al. (2011).</figcaption></figure>

## 5.2. Les mesures de contrôle appliquées à ce jour

### 5.2.1. Les pratiques de prévention généralisées

La gestion des maladies en milieu aquacole est intimement liée au mode d'élevage (ouvert, semi-fermé ou fermé) et à la biologie de l'espèce élevée. Toutefois quelques principes généraux sont communément appliqués.

Tout d'abord, une bonne qualité de l'eau, mode de transmission majeur des bactéries, permet de diminuer le risque d'infection bactérienne. Ainsi, il est souvent préconisé de maintenir un débit important, afin d'éviter une multiplication et une accumulation des bactéries. Certains préconisent également de stériliser l'eau *via* des traitements chimiques (chlorine, idophores, ozone) et physiques (UV). Néanmoins ces méthodes sont plus onéreuses (Lucas et al., 2019).
D'autre part, la propagation d'une maladie est un processus étroitement lié à la densité d'individus (Ina-Salwany et al., 2019). Plus la densité de poisson est élevée, plus la distance entre les individus est réduite, entraînant une augmentation de la probabilité de contact et donc de transmission de la maladie. Réduire la densité des poissons permet donc de réduire la probabilité de propagation d'une maladie. Toutefois, pour qu'une ferme reste compétitive, elle doit trouver un équilibre entre la réduction de la densité et la quantité de production.

La réduction de la densité permet également de réduire le stress ressenti par les individus en diminuant la compétition pour l'espace et la nourriture. En effet le stress peut avoir de lourdes conséquences sur le système immunitaire des poissons et donc augmenter la probabilité d'infection (Vazzana et al., 2002). Afin de réduire le stress, il est aussi conseillé de réduire au maximum toute manipulation et d'augmenter le niveau d'oxygène dissous (Lucas et al., 2019).

### 5.2.2. Les antibiotiques

Les antibiotiques sont des composés d'origine naturelle ou synthétique capables d'éradiquer ou d'inhiber la croissance d'une bactérie (Serrano, 2005). Ils ont longtemps été utilisés de manière excessive comme agents prophylactiques et thérapeutiques, résultant en l'émergence et la propagation du phénomène d'antibiorésistance. Celui-ci se caractérise chez les bactéries par l'acquisition d'une résistance aux antibiotiques, entraînant une diminution de la sensibilité aux traitements disponibles et donc une persistance des bactéries dans l'élevage. Par exemple, des souches de Vibrio harveyi résistantes ont entraîné des mortalités massives dans un élevage de crevettes (P. monodon) (Karunasagar et al., 1994). Par ailleurs, le développement de souches multi-résistantes est d'autant plus préoccupant que la gamme d'antibiotiques efficaces est drastiquement réduite, augmentant le risque d'échec thérapeutique. Pour illustration, une souche multi-résistante de Vibrio parahaemolyticus, espèce potentiellement pathogène à la fois pour l'Homme et l'animal, a été isolée d'une crevette importée du Vietnam jusqu'en France (Briet et al., 2018).
L'émergence de ce phénomène est non seulement un problème pour la santé animale mais également pour la santé humaine. En effet, les fermes aquacoles sont aujourd'hui considérées comme des réservoirs de gènes de résistance. Ces gènes peuvent non seulement se répandre et se transmettre dans l'environnement *via* transfert horizontal chez les bactéries pathogènes pour l'animal mais également chez les bactéries pathogènes pour l'Homme (Guglielmetti et al., 2009).

Aujourd'hui, malgré la propagation de ce phénomène et sachant que les antibiotiques sont de moindre efficacité contre les biofilms (Arunkumar et al., 2020), ceux-ci sont toujours utilisés en milieu aquacole, en raison d'un manque de méthodes thérapeutiques disponibles sur le marché. Sous la pression des consommateurs mais aussi pour limiter le risque sanitaire, des tentatives de régulation et de limitation ont vu le jour. Celles-ci avaient pour objectif de garantir une utilisation plus rationnelle et responsable des antibiotiques afin de réduire la quantité retrouvée dans les filets de poisson. Ainsi en France, seuls quatre antibiotiques sont aujourd'hui autorisés pour l'élevage de poissons : l'acide oxolinique, la fluméquine, l'oxytetracycline et l'association triméthoprime-sulfadiazine (ANSES, 2010). Toutefois ces régulations divergent d'un pays à l'autre, notamment en Chine et au Vietnam où les régulations sont moins strictes (Lulijwa et al., 2020).

### 5.2.3. Les vaccins et immunostimulants

Dans l'objectif de diminuer l'utilisation d'antibiotiques, des vaccins ont été élaborés. La vaccination repose sur l'administration d'un agent pathogène mort ou atténué ou uniquement d'un antigène afin d'engendrer une réponse immunitaire spécifique. Le but est de générer une protection durable contre l'agent pathogène grâce au développement d'une mémoire immunologique. L'utilisation de cette méthode requiert donc une bonne compréhension du système immunitaire de l'individu et le développement d'un mécanisme de défense immunitaire spécifique (Wali et Balkhi, 2006).

L'immunité des invertébrés reposant principalement sur des mécanismes innés, la vaccination n'est pas tout à fait adaptée à ces organismes. Pour ces derniers, seuls les immunostimulants,
capables de générer une réaction immunitaire non spécifique, sont généralement préconisés (Smith *et al.*, 2003). L'immunité des poissons reposant à la fois sur des mécanismes innés et acquis, la vaccination est régulièrement employée. En revanche, leur mémoire immunitaire étant relativement courte, plusieurs campagnes de vaccination sont souvent nécessaires. De plus, la vaccination est souvent inefficace dans les stades précoces de développement des poissons, c'est-à-dire chez les larves, puisque ces individus n'ont pas encore l'habilité de développer une réponse immunitaire spécifique (Vadstein, 1997).

De nos jours, la plupart des vaccins contre les bactéries du genre *Vibrio*, disponibles sur le marché pour l'élevage de poissons, sont des vaccins inactivés administrés par injection intrapéritonéale (Ji *et al.*, 2020). Ces derniers sont obtenus à partir de bactéries tuées par des méthodes physiques ou chimiques, après une culture et une amplification bactérienne. Les bactéries perdent leur pathogénie mais pas leurs propriétés antigéniques, ce qui permet d'induire une réponse immunitaire spécifique chez l'individu. Sur le marché, les vaccins disponibles procurent une protection contre une gamme réduite d'espèces de *Vibrio*. En effet, seules les espèces, *Vibrio salmonicida*, *Vibrio anguillarum* et *Vibrio ordalii* sont concernées par ces vaccins. Pourtant, des essais d'élaboration de vaccins contre *Vibrio harveyi* se sont avérés prometteurs pour conférer une protection chez la sole (*Solea senegalensis*), mais ne sont toujours pas commercialisés (Arijo *et al.*, 2005). Ceci est en partie dû au processus d'autorisation de mise sur le marché et de commercialisation, complexe et long.

Afin de pallier le manque de vaccin, les fermes aquacoles ont souvent recours à des auto-vaccins (Dadar *et al.*, 2017). Ces derniers sont en majorité des vaccins inactivés élaborés avec des souches isolées des précédentes épidémies au sein même de la ferme. Toutefois, les auto-vaccins doivent être régulièrement élaborés avec de nouvelles souches pathogènes, d'une part puisque les agents pathogènes présents dans la ferme peuvent évoluer et d'autre part puisque l'élaboration d'un seul vaccin spécifique à une espèce est rendue difficile à cause de l'existence de différents sérotypes (Hastefnl *et al.*, 2005).
## 5.3. Les mesures de contrôle alternatives

Ainsi, suite à l'émergence du phénomène d'antibiorésistance, à la complexité d'élaboration des vaccins et à leur inefficacité chez les larves, crustacés et mollusques, de nouvelles stratégies de contrôle ont émergé. Les mesures détaillées dans cette partie ont suscité un engouement dans le domaine de la recherche mais ne sont toujours pas appliquées au quotidien dans les fermes aquacoles. Certaines techniques, telles que l'utilisation de composés interférant avec le quorum sensing, sont toujours au stade de développement et n'ont pas encore été testées sur le terrain alors que d'autres, telles que les probiotiques, ont déjà fait leurs preuves (Pérez-Sánchez et al., 2018).

### 5.3.1. Les probiotiques

Les probiotiques sont définis comme des microorganismes vivants, pouvant avoir un effet bénéfique pour la santé. Ajoutés au régime alimentaire en quantité suffisante, ils peuvent coloniser le microbiote intestinal de l'hôte et permettre, d'améliorer la croissance et de conférer une protection contre les agents pathogènes. Ainsi, il existe différents modes d'action tels que l'amélioration de la digestion et de l'absorption de nutriments, la production de composés inhibiteurs, la compétition pour les nutriments et les sites d'adhésion, ou l'amélioration de la réponse immunitaire. Les probiotiques peuvent également être utilisés pour améliorer la qualité de l'eau environnante. Par exemple, une souche isolée du système digestif de bars communs, Vibrio lentus, s'est avérée efficace pour conférer une protection contre la vibriose causée par Vibrio harveyi chez les larves de bars communs (Schaeck et al., 2016). Ces derniers peuvent être administrés en tant qu'additif alimentaire avec des prébiotiques, des composés non-digestibles capables de promouvoir la colonisation et la prolifération bactérienne et/ou d'activer le métabolisme des bactéries intestinales résidentes afin d'optimiser l'alimentation, l'absorption de nutriments et l'efficacité des probiotiques. Le mélange de probiotiques et de prébiotiques, communément défini comme des symbiotiques, offre ainsi un effet synergique (Amenyogbe et al., 2020).
En milieu aquacole, divers probiotiques sont aujourd'hui reconnus tels que la levure *Saccharomyces cerevisiae*, ou des bactéries lactiques appartenant au genre *Enterococcus*, *Lactobacillus* ou *Bacillus*. Toutefois, d'après nos connaissances, à ce jour en Europe, très peu de probiotiques sont commercialisés (Dittmann et al., 2017). En effet, bien que les recherches soient fortement encouragées, la détermination du rapport coût-efficacité et l'élaboration de mesures standardisées pour l'évaluation de la réponse et de la toxicité chez un hôte sont requises avant toute utilisation à grande échelle (Lucas et al., 2019).

Il existe également diverses inquiétudes et limitations concernant l'utilisation de probiotiques en aquaculture. Tout d'abord, le microbiote intestinal est un environnement dynamique, ce qui suggère que les probiotiques doivent être administrés régulièrement, engendrant des coûts importants. D'autre part, l'administration sur le long terme d'une quantité importante de bactéries pourrait avoir un impact sur l'environnement. En effet, ces bactéries pourraient acquérir des gènes d'antibiorésistances et les transmettre *via* transfert horizontal de gènes (Newaj-Fyzul et al., 2014). Cependant, une alternative intéressante pourrait être l'utilisation de postbiotiques, c'est-à-dire une préparation d'éléments solubles sécrétés par des bactéries ou libérés lors de la lyse bactérienne, communément définis comme des probiotiques inactivés, mais ceux-ci sont toujours à l'état de recherche (Ang et al., 2020).

### 5.3.2. Les bactériophages

Les bactériophages (ou phages) sont des virus naturellement présents et abondants dans l'environnement, capables d'infecter les bactéries. L'infection d'une bactérie par un bactériophage lytique entraîne rapidement la lyse de la bactérie ainsi que la prolifération et la libération de nouveaux phages. Ces derniers sont généralement hautement spécifiques à l'espèce voire à certaines souches, ce qui permet d'éliminer spécifiquement le pathogène en minimisant les effets sur les bactéries commensales. Toutefois, cette spécificité peut également être un inconvénient pour le traitement de différentes souches, nécessitant l'élaboration de cocktails de phages et un renouvellement suite à l'évolution des pathogènes dans l'environnement (Oliveira et al., 2012). Récemment, un cocktail de phages lytiques, prometteur pour le traitement de la vibriose en
aquaculture, a été isolé d'une ferme d'élevage de crevettes (*P. monodon*) capable d'infecter diverses souches appartenant à l'espèce *V. harveyi*, *V. alginolyticus* et *V. parahemolyticus* (Stalin et Srinivasan, 2017). De plus, un bactériophage a révélé des propriétés inhibitrices, non seulement sur les bactéries planctoniques, mais également sur les biofilms de *V. alginolyticus* (Kim et al., 2019). Ceci suggère que les phages pourraient également être utilisés comme agents anti-biofilms potentiels.

Aujourd'hui, suite aux besoins grandissants de nouvelles stratégies de contrôle, les recherches sur le développement et l'utilisation des bactériophages en aquaculture ainsi que l'impact d'une utilisation industrielle à grande échelle sont fortement encouragées dans l'UE (Culot et al., 2019). Des inquiétudes émergent quant à la possibilité de développement d'une résistance chez les bactéries. Des résistances pourraient survenir *via* divers mécanismes tels que (i) l'inhibition de l'adsorption du phage, (ii) l'inhibition de l'injection du génome, (iii) les systèmes de restriction-modification qui comprennent des enzymes de restriction digérant l'ADN du phage et des enzymes de méthylation protégeant l'ADN bactérien et (iv) des systèmes d'avortement de l'infection (Abi) entraînant la mort simultanée du phage et de la bactérie (Labrie et al., 2010). De plus, les phages lysogéniques peuvent transférer des facteurs de virulence et des gènes de résistance aux antibiotiques dans le génome bactérien, pouvant ainsi être transmis aux futures générations (Munro et al., 2003, Flegel et al., 2005).

### 5.3.3. Les composés anti-biofilms

Comme décrit dans la section 2.2.2 (p.31), les biofilms confèrent aux bactéries une résistance aux antibiotiques et représentent un réservoir de souches potentiellement pathogènes en milieu aquacole. De nombreuses recherches se sont donc tournées vers l'identification et l'élaboration de composés anti-biofilms, représentant une perspective intéressante pour le contrôle de la vibriose en milieu aquacole. Ainsi, plusieurs composés d'origine naturelle extraits de végétaux ou issus de l'environnement marin se sont avérés prometteurs en tant que composés anti-biofilms (Adnan et al., 2018, Lu et al., 2019). Ces derniers peuvent affecter la formation de biofilms en inhibant l'adhésion et l'attachement des bactéries au support, la formation de la matrice extracellulaire,
l'agrégation bactérienne et en perturbant les voies de signalisation du quorum sensing. Par exemple, l'acide isolimonique, extrait de graines d'orange amère (*Citrus aurantium*), possède la capacité d'interférer avec les voies de signalisation du quorum sensing de *Vibrio harveyi*, en modulant l'expression du gène *luxO*, engendrant ainsi l'inhibition de la formation de biofilm (Vikram *et al.*, 2011). D'autres composés tels que les nanoparticules ont également suscité beaucoup d'intérêts (Velusamy *et al.*, 2016). Notamment, l'utilisation de nanoparticules d'argent (AgNPs) extraites d'algues rouges (*Gelidiella acerosa*) permet de diminuer la colonisation des bactéries du genre *Vibrio* et d'augmenter la survie des larves d'Artemia franciscana à hauteur de 100 %, sans effet toxique notable (Satish *et al.*, 2017).

L'avantage de tels composés repose sur le fait qu'ils n'interagissent pas directement avec la croissance des bactéries, suggérant qu'ils exercent une faible pression sélective et que les risques de développer une résistance sont moindres. Ceci n'a toutefois, toujours pas été prouvé (Defoirdt *et al.*, 2010).

### 5.3.4. Les revêtements antifouling

Généralement, un biofilm peut initier le développement de biofouling, culminant avec la colonisation des surfaces sous forme de macrofouling. Des revêtements antifouling, voire anti-biofilms, c'est-à-dire des revêtements de surface capables de réduire la cinétique de développement du biofouling ont ainsi été mis au point. Il en existe deux types : des revêtements dont les caractéristiques de surface vont impacter l'adhésion des organismes, et des revêtements agissant par libération de molécules actives, généralement des biocides (Fitridge *et al.*, 2012).

Ceux-ci ont été particulièrement utilisés en milieu aquacole. Des revêtements composés de cuivre sont régulièrement appliqués sur les filets des cages en mer, permettant de prévenir le biofouling. Toutefois, des inquiétudes émergent quant à l'impact du cuivre sur l'environnement. Celui-ci pourrait s'accumuler dans les sédiments et aurait des effets néfastes sur les organismes présents aux alentours des fermes aquacoles, comme les palourdes (*Tapes philippinarum*) (Munari et Mistri, 2007). Il a également été démontré qu'une exposition au cuivre peut affecter le système
immunitaire du bar commun, le rendant plus sensible aux infections (Cotou et al., 2012). Des restrictions quant à l'utilisation de cuivre commencent à émerger, et par conséquent la recherche d'alternatives est fortement encouragée (Floerl et al., 2016).

Ainsi, aujourd'hui, des recherches visant à réduire la dissémination du cuivre dans l'environnement (Liu et al., 2017) ou visant à développer des revêtements à effet de surface dépourvus de biocides (Nir et Reches, 2016) ont été entreprises. D'autres recherches se focalisent sur le développement de revêtements antifouling incorporant des composés d'origine naturelle (Almeida et Vasconcelos, 2015). Toutefois, à ce jour l'utilisation de tels revêtements n'est pas autorisée en milieu aquacole (Bannister et al., 2019).

Pour conclure, de nos jours, en Europe très peu de méthodes prophylactiques et curatives, permettant de lutter contre la vibriose causée par V. harveyi, sont disponibles pour l'élevage du bar commun. Compte tenu de son impact économique et sanitaire, et des inquiétudes relatives à sa propagation liée au réchauffement climatique, il est crucial d'identifier des méthodes de prévention efficaces. Aujourd'hui, ces dernières résident dans la compréhension de la dynamique bactérienne et dans la connaissance des mécanismes de déclenchement des maladies, au sein des fermes aquacoles.
<figure><img src="image_26.png" /></figure>
# 1. Contexte

Afin de suivre l'évolution, au cours du temps, de l'abondance de l'espèce *Vibrio harveyi* au sein d'Aquanord-Ichtus, la méthode de PCR en temps réel a été choisie pour quantifier les bactéries dans l'eau d'élevage et les biofilms formés sur les parois des bassins. Selon nos connaissances, seulement deux études, décrivant des méthodes de PCR en temps réel pour la quantification de *V. harveyi*, ont été publiées : la méthode développée par Fukui et Sawabe (2008) permet de cibler le gène *gyrB* et celle de Schikorski *et al.* (2013) permet de cibler le gène *toxR* et le plasmide pVCR1, impliqués dans la pathogénie des ormeaux (*Haliotis tuberculata*). Ces méthodes ont été mises au point pour des échantillons d'eau de mer provenant d'élevages d'ormeaux et/ou des échantillons d'hémolymphe d'ormeaux et n'ont pas été adaptées pour traiter des échantillons de biofilms. Celles-ci ont été développées avec une technologie TaqMan®. Par ailleurs, Fukui et Sawabe (2008) ont mis en évidence un manque de spécificité de leurs oligonucléotides, entraînant un manque de fiabilité dans l'estimation de la quantité de *V. harveyi* présente dans les échantillons.

L'objectif de ce chapitre consiste à relater la mise au point d'une PCR en temps réel, permettant de quantifier spécifiquement *V. harveyi*, à la fois, dans des échantillons d'eau de mer et de biofilms. Nous avons tout d'abord choisi de mettre au point la PCR en temps réel avec la technologie SYBR Green I plutôt que la technologie TaqMan®, en raison d'un faible coût, d'une facilité de mise au point et d'optimisation. Ainsi, 3 paires d'amorces ont été choisies : (i) des amorces ciblant le gène *toxR*, codant pour un régulateur transcriptionnel, largement utilisé dans la littérature (Pang *et al.*, 2006, Schikorski *et al.*, 2013), ainsi que des amorces ciblant les gènes (ii) *topA*, codant pour la topoisomérase I, et (iii) *mreB*, codant pour une protéine du cytosquelette, dont la concaténation des loci permet de différencier les espèces proches de *V. harveyi* (Cano-Gomez *et al.*, 2011). Un protocole d'échantillonnage a également été mis au point afin de collecter et d'extraire l'ADN des bactéries présentes dans l'eau des bassins et les biofilms sur les parois des bassins. Ce travail a fait l'objet d'une valorisation par une publication dans le journal *Aquaculture* (Mougin *et al.*, 2020a).
## 2. Mise au point de la PCR en temps réel

Les amorces ciblant les gènes *toxR* et *topA* étaient déjà présentes dans la littérature (Pang *et al.*, 2006, Cano-Gomez *et al.*, 2015). Néanmoins, selon nos connaissances, aucune paire d'amorces ciblant le gène *mreB* n'avait été mise au point. Nous avons donc, dans un premier temps, conçu ces amorces.

### 2.1. Conception des amorces

Deux alignements ont été réalisés à partir des séquences de gènes *mreB* référencées dans la base de données GenBank (National Center for Biotechnology Information, NCBI). Un premier alignement a permis d'identifier des zones hautement conservées au sein de l'espèce *V. harveyi*. Un deuxième alignement a permis d'identifier des zones de variabilité interspécifique au sein des espèces proches de *V. harveyi*: *V. alginolyticus*, *V. campbellii*, *V. mimicus*, *V. natriegens*, *V. owensii*, *V. parahaemolyticus* et *V. rotiferianus*. Au total, 7 amorces ont été sélectionnées. Leurs caractéristiques ont été déterminées à l'aide de Oligo Calculator ver. 3.27 (Kibbe, 2007) et Primer3Plus (Rozen et Skaletsky, 2000) et l'analyse de spécificité *in silico* a été réalisée à l'aide d'un BLAST (Basic Local Alighment Search Tool) nucléotidique (Tab. 5).

<table><caption>Tableau 5 : Caractéristiques et analyse de spécificité *in silico* des séquences sens (forward, notées F) et antisens (reverse, notées R) mises au point. pb : paires de bases.</caption><thead><tr><th>Nom</th><th>Séquences 5'-3'</th><th>Taille (pb)</th><th>Ta (°C)</th><th>%GC</th><th>Résultat du Blastn (100 % ID)</th></tr></thead><tbody><tr><td>mreB4R</td><td>CACCTGTTAACACCATACCG</td><td>20</td><td>61,3</td><td>50,0</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>mreB9F</td><td>ATTACAAGAGCCACTGTCAGG</td><td>21</td><td>61,4</td><td>47,6</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>mreB9bisR</td><td>CCTGACAGTGGCTCTTGTAA</td><td>20</td><td>60,8</td><td>50,0</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>mreB11F</td><td>TGAAGCTGTGATCAACTACG</td><td>20</td><td>59,0</td><td>45,0</td><td>V. harveyi, V. alginolyticus, V. rotiferianus, V. owensii</td></tr><tr><td>mreBbis11R</td><td>GTACGTAGTTGATCACAGCTTCA</td><td>23</td><td>59,9</td><td>43,5</td><td>V. harveyi, V. alginolyticus, V. owensii</td></tr><tr><td>mreB12F</td><td>GGTCTGCGTGTCTCTGA</td><td>17</td><td>57,7</td><td>58,8</td><td>V. harveyi</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><td>Nom</td><td>Séquences 5'-3'</td><td>Taille (pb)</td><td>Ta (°C)</td><td>%GC</td><td>Résultat du Blastn (100 % ID)</td></tr></thead><tbody><tr><td>mreB7F</td><td>TTCGTGAATCTGCACTAGG</td><td>19</td><td>59,6</td><td>47,4</td><td>V. harveyi, V. owensii, V. campbellii</td></tr></tbody></table>

## 2.2. Sélection des couples d'amorces

À partir de ces 7 amorces, 5 couples d'amorces, permettant d'amplifier des fragments d'ADN entre 100 et 300 paires de bases (pb), ont pu être élaborés. La synthèse des amorces a été effectuée par la société TIB MOLBIOL (TIB MOLBIOL Syntheselabor GmbH, Berlin, Allemagne).

Dans un premier temps, l'analyse de spécificité expérimentale des couples d'amorces a été réalisée à l'aide de 4 souches de collection : 2 souches de *V. harveyi* LMG 4044 et LMG 7890, 1 souche de *V. campbellii* CIP 70.67 et 1 souche de *V. owensii* LMG 4043. L'objectif était d'avoir un aperçu de la spécificité des 5 couples d'amorces et de vérifier la non-amplification de composés non spécifiques. À terme, cet essai a permis de sélectionner le couple d'amorces le plus prometteur pour réaliser la suite des expérimentations.

Lors de cet essai, les quatre souches ont été cultivées sur milieu gélosé LBS (Luria-Bertani supplémenté avec 20 % NaCl) pendant 24 h à 37 °C. Leur ADN a été extrait à l'aide de l'appareil QIAcube Connect (Qiagen, Hilden, Allemagne) en utilisant le kit DNeasy Blood&Tissue kit (Qiagen). La pureté et la quantité des ADNs ont été vérifiées à l'aide d'un spectrophotomètre DeNovix DS-11 (Clinisciences, Nanterre, France). Une PCR en temps réel a alors été réalisée sur un appareil LightCycler® 480 (Roche Diagnostics, France) à l'aide du Master Mix LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics) selon les préconisations des fabricants. Les essais ont été réalisés avec une température d'hybridation de 60 °C, en triplicatas pour chaque échantillon. Le détail des résultats d'amplification et l'analyse de la courbe de fusion sont disponibles dans le Tableau 6.
<table><caption>Tableau 6 : Résultats d'amplification et analyse de la courbe de fusion des essais réalisés sur les 5 couples d'amorces. Les moyennes et les écarts types ont été obtenus à partir de triplicatas. pb : paires de bases.</caption><thead><tr><th rowspan="3">No.</th><th rowspan="3">Couple</th><th rowspan="3">Amplicon<br>(pb)</th><th colspan="4">Moyenne des C<sub>T</sub> ± écart type</th><th colspan="4">Analyse de la courbe de fusion</th></tr><tr><th colspan="2">Témoins<br>positifs</th><th colspan="2">Témoins<br>négatifs</th><th colspan="2">Témoins<br>positifs</th><th colspan="2">Témoins<br>négatifs</th></tr><tr><th>V. harveyi<br>LMG<br>4044</th><th>V. harveyi<br>LMG<br>7890</th><th>V. campbellii<br>CIP<br>70.67</th><th>V. owensii<br>LMG<br>4043</th><th>Mélange réactionnel</th><th>V. harveyi<br>LMG<br>4044</th><th>V. harveyi<br>LMG<br>7890</th><th>V. campbellii<br>CIP<br>70.67</th><th>V. owensii<br>LMG<br>4043</th><th>Mélange réactionnel</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>mreB9F/<br>mreB4R</td><td>110</td><td>10,33<br>± 0,08</td><td>10,21<br>± 0,07</td><td>33,39<br>± 0,43</td><td>37,10<br>± 1,16</td><td>37,3<br>± 0,99</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>~</td><td>~</td></tr><tr><td>2</td><td>mreB11F/<br>mreB9bisR</td><td>215</td><td>14,46<br>± 0,62</td><td>11,24<br>± 0,36</td><td>ND</td><td>ND</td><td>ND</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>3</td><td>mreB11F/<br>mreB4R</td><td>302</td><td>18,38<br>± 0,45</td><td>12,56<br>± 0,25</td><td>22,54<br>± 0,23</td><td>ND</td><td>ND</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>4</td><td>mreB12F/<br>mreBbis11R</td><td>154</td><td>11,2<br>± 0,06</td><td>10,34<br>± 0,12</td><td>33,63<br>± 1,62</td><td>34,64<br>± 0,54</td><td>35,6<br>± 1,46</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>~</td><td>~</td></tr><tr><td>5</td><td>mreB7F/<br>mreBbis11R</td><td>231</td><td>14,37<br>± 0,99</td><td>10,34<br>± 0,29</td><td>16,99<br>± 0,54</td><td>15,67<br>± 0,13</td><td>ND</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td><td>-</td></tr></tbody></table>

+ Présence d'un seul pic de fusion

~ Présence de pics de fusion à des Tm (« melting temperature » ou température de fusion) différentes de celle des pics détectés chez les témoins positifs

- Absence de pic de fusion

ND, non détecté

Dans un premier temps, l'apparition de pics de fusion dans le mélange réactionnel contenant uniquement les couples d'amorces 1 et 4, démontre la présence d'amplification d'ADNs non spécifiques, potentiellement des dimères d'amorces. Les couples 1 et 4 ont donc été éliminés. Dans un second temps, des pics de fusion ont été détectés chez les témoins négatifs, à des Tm identiques aux pics détectés chez les témoins positifs, pour les couples 3 et 5. De plus, les valeurs de C<sub>T</sub> étaient inférieures à 23. Ceci témoigne d'une amplification non spécifique à l'espèce V. harveyi pour les couples 3 et 5. Ces derniers ont donc également été éliminés. Enfin, le couple 2 (mreB11F/mreB9bisR) présentant un seul pic de fusion uniquement pour les témoins positifs, a été sélectionné pour poursuivre les expérimentations.
## 2.3. Optimisation

Les travaux d'optimisation de la PCR en temps réel avec le couple 2 (mreB11F/mreB9bisR) ont d'abord porté sur le kit de pré-mix utilisé puis sur la température d'hybridation.

### 2.3.1. Sélection du kit de pré-mix

Après échanges avec différents fournisseurs, trois pré-mix ont été sélectionnés : (i) le Master Mix LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics), (ii) le QuantiNova SYBR Green PCR Kit (Qiagen) et (iii) le TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus) (Ozyme). Pour chaque kit, une PCR en temps réel a été réalisée selon les préconisations des fournisseurs. Chaque essai comprenait un témoin positif (V. harveyi LMG 4044), un témoin négatif (V. campbellii CIP 70.67) et un contrôle composé du mélange réactionnel seul. Les essais ont été réalisés avec une température d'hybridation de 60 °C, en triplicatas pour chaque échantillon. Les résultats sont présentés dans la Figure 21.

Le pré-mix Ozyme a d'abord été éliminé puisque deux des triplicatas correspondant au témoin positif n'ont pas été détectés par l'appareil. Bien qu'une courbe d'amplification soit affichée et qu'un pic de fusion soit détecté, l'appareil considère ces deux échantillons comme négatifs et ne renvoie pas de $C_T$. Ces résultats, répétables d'un essai à l'autre, n'ont pas pu être expliqués malgré plusieurs échanges avec les fournisseurs et les fabricants de l'appareil. Enfin, le choix entre le kit pré-mix Roche Diagnostics et Qiagen a été fait selon l'allure des courbes d'amplification obtenues. L'allure de la courbe d'amplification obtenue à partir du kit Qiagen témoigne d'une saturation de la fluorescence détectée par l'appareil. Celui-ci a donc été éliminé et le kit Roche diagnostics a ainsi été sélectionné pour les optimisations suivantes.
**Roche Diagnostics :** Master Mix LightCycler® 480 SYBR Green I Master

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

**Qiagen :** QuantiNova SYBR Green PCR Kit

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

**Ozyme :** TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 21 : Courbes d'amplification et courbes de fusion obtenues à partir de 3 kits de pré-mix différents.</figcaption></figure>

### 2.3.2. Sélection de la température d'hybridation

Dans un premier temps, une gamme de températures d'hybridation de 55 °C à 65 °C a été réalisée par PCR conventionnelle à l'aide d'un iCycler™ Thermal Cycler (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) en utilisant le kit Platinum™ Green Hot Start PCR Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon les recommandations des fabricants. Chaque essai a été réalisé en triplicatas et comprenait un témoin positif (*V. harveyi* LMG 4044), un témoin négatif (*V. campbellii* CIP 70.67) et un contrôle composé du mélange réactionnel seul. Le gel d'électrophorèse obtenu est présenté dans la Figure 22.
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 22 : Gel d'électrophorèse obtenu suite à la réalisation d'une gamme de températures d'hybridation allant de 55 °C à 65 °C.</figcaption></figure>

A l'issue de cette PCR conventionnelle, 4 bandes d'amplification spécifiques (215 pb) sont observées sur le gel d'électrophorèse pour des températures comprises entre 55 °C et 58.9 °C. Deux PCR en temps réel ont ensuite été réalisées selon les précédents paramètres optimisés avec deux températures d'hybridation différentes 55 °C et 57 °C. Pour une même concentration d'ADN, les valeurs de $C_T$ obtenues à 55 °C étaient inférieures (en moyenne -0,79 $C_T$) aux valeurs obtenues à 57 °C. Ainsi, pour la suite des expérimentations, la température d'hybridation retenue a été de 55 °C.

## 3. Adaptation au traitement d'échantillons environnementaux

L'objectif était de pouvoir adapter la PCR en temps réel, mise au point pour l'étude de la dynamique de *V. harveyi* en milieu aquacole, à la fois dans l'eau et les biofilms. Il a ainsi fallu sélectionner la méthode d'échantillonnage pour ces deux types d'échantillons, ainsi que la méthode de collecte des bactéries. Plusieurs tests préliminaires ont ainsi été réalisés.

### 3.1. Echantillons d'eau

Il existe plusieurs méthodes pour traiter des échantillons d'eau. Certains auteurs optent pour le prélèvement d'un petit volume (1 mL), directement suivi d'une analyse (Zhou et al., 2007). D'autres préconisent une étape de centrifugation ou de filtration, permettant de concentrer les bactéries (Staley et al., 2015). La filtration a l'avantage de permettre la concentration et le
traitement d'un plus grand volume d'eau et donc de fournir une meilleure représentativité de la
communauté bactérienne. Ainsi, dans cette étude, des volumes de 1 L d'eau ont été prélevés. Les
bactéries ont été collectées par filtration sur filtres de pores de 0,45 µm de diamètre. Les filtres
de pores 0,22 µm n'ont pas été retenus puisque l'abondance de matière organique dans les bassins
entraînait une saturation rapide de ces filtres.

Deux méthodes communément utilisées pour décrocher et récupérer les bactéries : le vortex (Staley et al., 2015) et la sonication (Wolffs et al., 2006), ont été testées. Brièvement, la souche de collection V. harveyi LMG 4044 a été inoculée dans du milieu LBS liquide et incubée 24 h à 37 °C. Deux lavages successifs ont été réalisés par centrifugation (5000 × g, 10 min) et le culot a été repris dans de l'eau physiologique stérile, afin d'éliminer toute trace du milieu de culture. Des volumes de 250 mL de suspension bactérienne ont ensuite été préparés dans de l'eau de mer stérile, par ajustement de la DO₄₀₀. Deux concentrations ont été testées : 10⁴ UFC.mL⁻¹ et 10² UFC.mL⁻¹. Ces suspensions ont ensuite été filtrées sur filtre de pore 0,45 µm (Sartorius, Göttingen, Germany). Les filtres ont ensuite été déposés dans un volume de 25 mL d'eau physiologique et les bactéries ont été décrochées selon différents protocoles : la sonication (45 kHz) pendant 1 min, 5 min ou 10 min ou le vortex pendant 1 min, 3 min ou 5 min. Les filtres ont ensuite été retirés et les solutions bactériennes ont été centrifugées. Le surnageant a été éliminé et le culot a été repris dans 2 mL d'eau physiologique. Des ensemencements ont été réalisés sur milieu LBS agar à l'aide d'un ensemenseur spirral (easySpiral®, Interscience, St-Nom-la-Bretèche, France) et les colonies ont été dénombrées à l'aide d'un Scan 500 (Interscience). Enfin, la concentration bactérienne récupérée suite à ces différents traitements a été déterminée. Les résultats sont présentés dans la Figure 23.
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 23 : Concentration de V. harveyi LMG 4044 récupérée en fonction des différents temps de sonication et de vortex testés. Deux concentrations initiales ont été testées 10⁴ UFC.mL⁻¹ et 10² UFC.mL⁻¹. Les histogrammes représentent la moyenne de 3 répliquats et les barres d'erreurs représentent l'écart type.</figcaption></figure>

D'après ces résultats, le maximum de bactéries a été récupéré grâce au vortex. Les quantités de bactéries récupérées au temps de vortex 3 min et 5 min étant très proches, pour des raisons pratiques, le temps de vortex de 3 min a été sélectionné pour la suite des expérimentations.

## 3.2. Echantillons de biofilms

En milieu aquacole, la présence de poissons dans les bassins tout au long de l'année rend le prélèvement de biofilms complexe. Les bassins ne pouvant pas être régulièrement vidés, les biofilms formés sur les parois sont difficilement accessibles. Il a fallu trouver une solution adaptée à la situation. Ainsi, dans cette étude, des morceaux de béton en forme de palets, ont été confectionnés par les employés d'Aquanord-Ichtus, avec les mêmes matériaux que ceux utilisés pour la confection de la paroi des bassins. Un dispositif a ensuite été mis au point pour maintenir les morceaux de béton à 20 cm en dessous de la surface de l'eau, les rendant facilement accessibles.
Une fois immergés dans les bassins, les biofilms formés sur ces morceaux sont considérés comme similaires à ceux formés sur la paroi des bassins. Ce dispositif permet non seulement de faciliter l'échantillonnage, mais également de suivre l'évolution du biofilm dès le début de la colonisation (Fig. 24).
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 24 : Photographies des morceaux de béton et du dispositif permettant de les maintenir immergés 20 cm sous la surface de l'eau dans les bassins aquacoles contenant des bars communs d'élevage.</figcaption></figure>

La méthode retenue pour décrocher et collecter les bactéries formant des biofilms sur les morceaux de béton consiste en l'écouvillonnage d'une surface donnée (De Muynck et al., 2010). Bien que tous les morceaux de béton avaient un diamètre de 5 cm, il n'était pas envisageable d'écouvillonner toute leur surface. En effet, il existait un risque que les morceaux de béton se dégradent au cours du temps, réduisant leur diamètre et donc la surface d'écouvillonnage, ce qui aurait pu entraîner un biais dans les mesures. Ainsi, des gabarits en acier inoxydable ont été confectionnés avec une perforation de 2,34 cm². Seule cette surface était ainsi écouvillonnée à l'aide de deux écouvillons comme décrit par Mougin et al. (2019). Les bactéries sont ensuite décrochées des écouvillons par vortex pendant 3 min (Fig. 25).

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 25 : Photographies du gabarit, permettant d'écouvillonner une surface définie, et d'un morceau de béton avant et après écouvillonnage de la surface.</figcaption></figure>
# 4. Validation et application de la PCR en temps réel : Article 1

**Statut de l'article** Publié dans *Aquaculture* (IF : 3,224) : Mougin *et al.* (2020a)

**Objectif de l'étude** L'objectif était de développer une PCR en temps réel, permettant de quantifier spécifiquement l'espèce *V. harveyi* dans des échantillons d'eau de mer et de biofilms.

**Résultats principaux** La spécificité des 3 paires d'amorces ciblant les gènes *toxR*, *topA* et *mreB*, a été déterminée grâce à un panel de 85 souches de collection et d'isolats d'origines variées, dont certaines isolées à partir de rates de poissons moribonds provenant d'Aquanord-Ichtus. Les 3 paires d'amorces ont démontré une bonne exclusivité. En revanche, plusieurs résultats faux négatifs ont révélé une diversité génétique des gènes *toxR* et *topA* au sein de l'espèce *V. harveyi* et une bonne conservation des séquences du gène *mreB*. La PCR en temps réel a donc été développée en utilisant les amorces ciblant le gène *mreB*, avec une limite de quantification et de détection de 5 copies de génome par réaction. Afin d'adapter cette PCR au traitement des échantillons environnementaux, 5 kits d'extraction d'ADN ont été testés. Parmi ceux-ci, le kit DNeasy PowerBiofilm (Qiagen) a permis d'obtenir l'ADN le plus pur ainsi qu'un meilleur rendement à la fois pour les échantillons d'eau et de biofilms. Enfin, la présence d'inhibiteurs de PCR a été vérifiée.

**Conclusion** La PCR en temps réel ciblant le gène *mreB* présentée dans cet article, permet de quantifier l'espèce *V. harveyi* directement dans des échantillons d'eau et de biofilms.
## Article 1

# Development of a *mreB*-targeted real-time PCR method for the quantitative detection of *Vibrio harveyi* in seawater and biofilm from aquaculture systems

Received 3 March 2020; Received in revised form 21 March 2020; Accepted 6 April 2020
Available online 8 April 2020

Julia Mougin<fnref n="1" />, Roxane Roquigny<fnref n="1" />, Marie-Agnès Travers<fnref n="2" />,<fnref n="3" />, Thierry Grard<fnref n="1" />, Maryse Bonnin-Jusserand<fnref n="1" /> and Cédric Le Bris<fnref n="1" />

**Keywords:** *Vibrio harveyi*, quantitative detection, *mreB* gene, seawater, biofilm, aquaculture

## Abstract

*Vibrio harveyi* is a particularly problematic Gram-negative bacterium because it can form biofilms on aquaculture facility surfaces, leading to resistance of bacteria against antibiotics and water sanitizers. A SYBR Green I quantitative real-time PCR method was developed to detect *V. harveyi* directly from environmental samples, including seawater and biofilm. Specific primers targeting the *mreB* gene were designed. The exclusivity and inclusivity of the newly designed primers were evaluated using a panel of 85 bacteria: 58 *V. harveyi* from multiple origins and 27

<footnote n="1">¹ Univ. Littoral Côte d'Opale, UMR 1158 BioEcoAgro, TERRA Viollette, USC Anses, INRAe, Univ. Lille, Univ. Artois, Univ. Picardie Jules Verne, Univ. Liège, Yncréa, F-62200 Boulogne-sur-Mer, France</footnote>

<footnote n="2">² Laboratoire de Génétique et Pathologie des Mollusques Marins, SG2M-LGPMM, Ifremer, F-17390 La Tremblade, France</footnote>

<footnote n="3">³ IHPE, Université de Montpellier, CNRS, Ifremer, Université de Perpignan Via Domitia. F-34090 Montpellier, France</footnote>