# EuroDBA

## 2012 – European Diamond-Blackfan Anemia Consortium

## 2015 – Ontogeny as a critical determinant of DBA sensitivity in red blood cells

### Appel à projets générique | 2015

## DBA Multigène

### Identification et caractérisation de gènes candidats pour la découverte de nouveaux mécanismes physiopathologiques à l'origine de l'anémie de Blackfan-Diamond

### Rappel des objectifs

**L'anémie de Blackfan-Diamond : une érythroblastopénie congénitale**

L'anémie de Blackfan-Diamond (ABD) est une érythroblastopénie congénitale généralement révélée par une anémie dans les premiers mois après la naissance (~1 cas sur 150 000 naissances en Europe). Cet état est la conséquence d'un déficit drastique en précurseurs érythropblastiques dans la moelle osseuse, faisant de l'ABD un défaut intrinsèque et quasi-spécifique de l'érythropoïèse. La moitié des patients présentent par ailleurs des malformations congénitales variées, en particulier des fentes labio-palatines, des anomalies des pouces, de certains organes (coeur, rein), un retard de croissance... Le risque d'hémopathies malignes ou de tumeurs solides est accru, mais reste faible en comparaison d'autres insuffisances médullaires.

**Des possibilités de traitements limitées**

Au cours de la première année de vie, les nourrissons sont transfusés pour maintenir leur taux d'hémoglobine. Les corticoides, qui stimulent l'érythropoïèse chez plus de 60% des patients, sont ensuite introduits pour un traitement au long cours à condition que les patients soient bons répondeurs et que la dose soit <0.3 mg/kg/1. Les patients cortico-résistants continuent de recevoir des transfusions itératives, ce qui requiert une chélation du fer efficace. La greffe de moelle osseuse est, à l'heure actuelle, le seul traitement curatif. De nouvelles thérapies fondées sur des petites molécules ou sur la thérapie génique sont en cours d'étude sur la base de résultats de recherche fondamentale.

**Une « ribosomopathie » à la génétique complexe et encore incomplète**

De façon très inattendue, cette pathologie érythroide a été associée à des mutations hétérozygotes dans 24 gènes de protéines ribosomiques (RPS, RPL). La perte de fonction d'un allèle entraîne une haplo-insuffisance en une protéine ribosomique, ce qui affecte la formation des ribosomes et leur taux de production. Récemment, des mutations dans des gènes codant des chaperons des protéines ont été également identifiées. L'étude de l'ABD a ainsi conduit à définir une nouvelle classe de maladies génétiques, les ribosomopathies, des pathologies liées à un défaut de production et/ou de fonctionnement des ribosomes. Malgré des avancées considérables, le diagnostic génétique reste infructueux pour 20 à 30% des patients.

**La nécessité d'une approche multidisciplinaire et transnationale**

L'association de l'ABD à un dysfonctionnement de la synthèse des ribosomes a rapproché deux champs disciplinaires relativement éloignés. Biologistes moléculaires spécialistes du ribosome, hématopédiatres et hématobiologistes et généticiens travaillent ensemble pour identifier les gènes responsables de la maladie pour améliorer le diagnostic et comprendre les mécanismes physiopathologiques de l'ABD, en particulier son tropisme érythroide.

### Résultats majeurs

**Identification de mutations causales et amélioration du diagnostic**

De nouveaux gènes de protéines ribosomiques ont été associés à la maladie, souvent chez un nombre limité de patients. Le caractère causal de ces mutations a pu être établi en démontrant leur impact sur la biogenèse des ribosomes. Cette signature moléculaire a également permis de distinguer des porteurs de mutation asymptomatiques sur le plan hématopoïétique. Nous avons également identifié des mutations causales dans le gène HEATR3 qui code pour un chaperon de la protéine ribosomique RPLS, elle aussi associée à l'ABD. À l'inverse, nous avons pu reclassifier des patients initialement diagnostiqués comme ADB, mais portant des mutations n'impactant pas la synthèse des ribosomes, par exemple dans le gène CECR1. Ce travail a permis d'améliorer le diagnostic génétique des patients et de mettre en place un « pipe-line » pour caractériser de nouvelles mutations, in vitro ou in vivo chez le poisson-zèbre. Par ailleurs, l'ABD fait désormais partie d'une entité plus large ou syndrome ABD, lié à l'haplo-insuffisance en protéines ribosomiques, parfois même sans phénomène hématopoïétique. Une nouvelle définition de la maladie à l'échelle internationale a ainsi pu être établie.

**Mécanisme physiopathologique : quels liens entre dysfonctionnement des ribosomes et érythropoïèse ?**

L'énigme du tropisme quasi-exclusivement érythrocytaire de l'ABD a pu être en partie expliquée par les travaux effectués lors de ces programmes ANR qui ont montré que la synthèse et la stabilité de GATA1, le facteur de transcription majeur de l'érythropoïèse, étaient diminuées au cours de l'ABD du fait d'une dégradation de sa protéine chaperonne HSP70 par le protéasome. Des travaux indépendants ont montré que la synthèse de GATA1 était particulièrement sensible à une baisse de la quantité de ribosomes. Par ailleurs, le suppresseur de tumeur p53 est activé dans les précurseurs hématopoïétiques par le stress que constitue l'altération de la biogenèse des ribosomes (stress ribosomique), ce qui est de nature à empêcher la prolifération érythroide, voire de déclencher leur mort par apoptosis. D'autres signaux de réponse au stress ribosomique sont également susceptibles de rentrer en jeu et restent à identifier.

**Construction d'un réseau européen intégrant patients, médecins et scientifiques**

Les deux projets EuroDBA ont été des leviers puissants pour constituer un réseau européen autour de l'ABD. Sur le plan clinique et scientifique, un consortium européen s'est progressivement bâti autour du noyau initial réuni pour le projet EuroDBA. Des registres de patients ont été mis en place dans différents pays : Pologne, Turquie, Pays-Bas. Ce travail a ainsi pu s'étendre et continuer à travers un consortium dans le cadre d'EJP RD. Par ailleurs, EuroDBA a organisé en 2014 un congrès international visant à rassembler scientifiques, médecins et représentants des associations de patients d'Europe et au-delà.
## Production scientifique et valorisation

Ces travaux ont conduit à : une vingtaine d'articles scientifiques et cliniques ; une amélioration du diagnostic génétique de la maladie en France et en Europe ; et la mise en place de nouveaux registres.
Les projets EuroDBA ont également conduit à la mise en place d'une conférence internationale biannuelle sur la DBA fédérant scientifiques, médecins et patients, et à l'élaboration de nouvelles recommandations internationales pour le diagnostic et le soin des patients en collaboration avec des collègues de différents pays dans le monde (article de guidelines consensus actuellement soumis).

## Articles sélectionnés

O'Donohue M. F., et al. (2022) *HEATR3* variants impair nuclear import of uL18 (RPL5) and drive Diamond-Blackfan anemia, *Blood*, 139(21), pp. 3111-3126.
https://doi.org/10.1182/blood.2021011846

Lezzerini M., et al. (2020) Ribosomal protein gene RPL9 variants can differentially impair ribosome function and cellular metabolism, *Nucleic Acids Res.*, 48, pp. 770-787.
https://doi.org/10.1093/nar/gkz1042

Rio S., et al. (2019) Regulation of globin-heme balance in Diamond-Blackfan anemia by HSP70/GATA1, *Blood*, 133, pp. 1358-1370.
https://doi.org/10.1182/blood-2018-09-875674

Ulirsch J. C., et al. (2018) The Genetic Landscape of Diamond-Blackfan Anemia, *Am J Hum Genet*, 103, pp. 930-947.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2018.10.027

Wlodarski M. W., et al. (2018) Recurring mutations in RPL15 are linked to hydrops fetalis and treatment independence in Diamond-Blackfan anemia, *Haematologica*, 103, pp. 949-958.
https://doi.org/10.3324/haematol.2017.177980

Paolini N. A., et al. (2017) A Ribosomopathy Reveals Decoding Defective Ribosomes Driving Human Dysmorphism, *Am J Hum Genet.*, 100, pp. 506-522.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.01.034

Gastou M. et al. (2017) The severe phenotype of Diamond-Blackfan anemia is modulated by heat shock protein 70, Blood Adv., 1, pp. 1959-1976.
https://doi.org/10.1182/bloodadvances.2017008078

Da Costa L. et al. (2016) Molecular approaches to diagnose Diamond-Blackfan anemia: The EuroDBA experience, *Eur J Med Genet.*, 61, pp. 664-673.
https://doi.org/10.1016/j.ejmg.2017.10.017

Antunes A. T. et al. (2015) Ribosomal Protein Mutations Result in Constitutive p53 Protein Degradation through Impairment of the AKT Pathway, *PLoS Genet.*, 11.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005326

### EuroDBA

**Débuts des projets : janvier 2013 et juin 2016 | Durées : 48 et 51 mois | Financements ANR : 225 000 € et 437 094 €**

### Partenaires

**EuroDBA 2013 :** Amsterdam Medical Center (Pays-Bas) | University of Freiburg (Allemagne) | Sorbonne Université, Hôpital universitaire Robert Debré

**EuroDBA 2016 :** Amsterdam Medical Center (Pays-Bas) | University of Freiburg (Allemagne) | Sorbonne Université, Hôpital universitaire Robert Debré | Université de Toulouse |

**Schneider Children's Medical Center (Israël) | Université d'Hacettepe (Turquie) | Université médicale de Varsovie (Pologne) | Université du Piémont Oriental (Italie)**

### DBA Multigène

**Début du projet : octobre 2015 | Durée : 36 mois | Financement ANR : 494 312 €**

### Partenaires

**DBA Multigène :** Sorbonne Université, Hôpital universitaire Robert Debré | Université de Toulouse | Centre biologie intégrative, Toulouse

### Coordination

Lydie da Costa - Hematim, hématopoiése et immunologie, UR 4666, Sorbonne Université et Université de Picardie Jules Verne | lydie.dacosta@aphp.fr | Pierre-Emmanuel Gleizes - Centre de biologie intégrative, Université de Toulouse 3, CNRS - pierre-emmanuel.gleizes@univ-tlse3.fr | https://cbi-toulouse.fr/fr/ | https://www.u-picardie.fr/unites-de-recherche/hematim/hematim-524872.kjsp
### DevMiCar

## Altérations génétiques, développementales et du micro-environnement dans les atteintes surrénalienne et osseuse du complexe de Carney

### Rappel des objectifs

Le complexe de Carney (CNC) est une maladie génétique rare responsable de lésions endocrines touchant notamment la glande corticosurrénale, caractérisées par des nodules induisant un excès de cortisol sanguin (hormone glucocorticoïde) ou syndrome de Cushing, de prévalence majoritairement féminine. Le gène principalement muté est PRKAR1A, dont la fonction est de freiner l'activité de la signalisation de la protéine kinase A (PKA) qui, en conséquence, est trop élevée chez ces patients et explique l'excès de cortisol. La corticosurrénale est organisée en trois zones concentriques spécialisées, de la périphérie vers le centre, dans la production d'hormones minéralocorticoïde, glucocorticoïde et DHEA. En renouvellement constant, ces zones sont interdépendantes puisque les cellules formant la couche la plus externe sont les plus immatures et, se déplaçant vers le centre, se différencient en adoptant successivement les différentes capacités hormonales. Notre but est d'identifier les mécanismes reliant la signalisation PKA aux anomalies de zonation, de découvrir de nouvelles mutations causales et de rechercher les raisons de la prévalence féminine du syndrome de Cushing.

Nous avons développé des modèles de souris génétiquement modifiées comportant une inactivation du gène *Prkar1a* dans la corticosurrénale et dans certains organes dont la fonction est affectée dans le CNC. Par croisement avec différentes lignées de souris, nous avons combiné cette altération à d'autres ablations géniques connues pour moduler le renouvellement du cortex et suivi le devenir des cellules mutantes (Prkar1a inactif) différenciées au cours du développement post-natal grâce à un marquage fluorescent définitif des cellules immatures précurseurs. Les conséquences de ces combinaisons de modifications géniques ont été analysées en fonction du sexe ou de manipulations des contenus en hormones sexuelles. Enfin, nous avons séquencé l'ADN génomique d'une cohorte de patients CNC présentant une atteinte surrénalienne et un syndrome de Cushing sans mutation du gène PRKAR1A pour identifier des mécanismes inédits.

### Résultats majeurs

La zonation fonctionnelle de la corticosurrénale repose sur un antagonisme entre les signalisations PKA et b-caténine, la prépondérance de la première induisant un syndrome de Cushing, tandis que la seconde favorise la survenue de tumeurs. La découverte de nouvelles mutations touchant d'autres sous-unités de la PKA chez les patients CNC confirme son rôle central. La signalisation PKA est nécessaire à la différenciation des zones les plus internes et au renouvellement cellulaire de l'ensemble du cortex de manière sexe-dépendante. Les androgènes freinent le renouvellement cellulaire induit par la PKA en favorisant l'antagonisme sus-décrit et en réduisant le choix des cellules précurseurs. Ces mécanismes pourraient expliquer la prévalence féminine des maladies surrénaliennes, dont le syndrome de Cushing.

### Production scientifique et valorisation

15 articles (dont neuf originaux, cinq revues et un chapitre d'ouvrage).

14 communications internationales et trois nationales.

Organisation du deuxième colloque Recherche FIRENDO.

Vidal V., et al. (2016) The adrenal capsule is a signalling centre controlling cell renewal and zonation through Rspo3, *Genes & Dev.*, 30(12), pp. 1389-94.

https://doi.org/10.1101/gad.277756.116

Drelon C., et al. (2016) WNT signalling inhibition by PKA is involved in 1 adrenal zonation and restrains malignant tumour development, *Nat Commun.*, 7, art. 12751.

https://doi.org/10.1038/ncomms12751

Dumontet T., et al. (2018) PKA signalling drives reticularis differentiation and sexually dimorphic adrenal cortex renewal, *JCI Insight*, 3(2), p. 98394.

https://doi.org/10.1172/jci.insight.98394

Espiard S., et al. (2018) Activating PRKACB somatic mutation in cortisol-producing adenomas, *JCI Insight*, 3(8), p. 98296.

https://doi.org/10.1172/jci.insight.98296

Grabek A., et al. (2019) The adult adrenal cortex undergoes rapid tissue renewal in a sex-specific manner, *Cell Stem Cell*, 25(2) pp. 290-296.

https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.04.012

**Début du projet : mars 2015 | Durée : 57 mois | Financement ANR : 580 000 €**

**Partenaires**

Institut Cochin, Paris | Institut de biologie Valrose (iBV), Nice | National Institute of Health (NIH), Bethesda (États-Unis)

**Coordination**

Antoine Martinez – Institut GReD, UMR 6293 CNRS, U 1103 Inserm, Université Clermont-Auvergne – antoine.martinez@uca.fr
https://www.gred-clermont.fr/
# Dynamuscle

## Rôle de la dynamine 2 dans le muscle normal et pathologique

### Rappel des objectifs

Les myopathies congénitales sont des maladies génétiques sévères avec un fort impact sur les patients, leurs familles et notre système de santé. Il y a trois obstacles majeurs dans ce domaine : 1) la moitié des patients n'ont pas de diagnostic génétique, ce qui exclut la possibilité de conseil génétique ; 2) les mécanismes pathologiques sont peu connus ; et 3) il n'existe pas de thérapie spécifique.

Le projet Dynamuscle projette de mieux comprendre le rôle de la dynamine 2 (DNM2), une protéine mutée dans la myopathie centronucléaire dominante, dans le muscle squelettique normal ainsi que les conséquences de ses défauts chez les patients. Ce projet souhaite aussi apporter des premières preuves de principe d'approches thérapeutiques.

### Résultats majeurs

L'analyse du rôle cellulaire de la dynamine 2 dans des systèmes de culture de cellules musculaires et dans plusieurs modèles murins révèle son importance pour l'organisation intracellulaire des myofibres et pour la structure et la fonction mitochondriales. Le projet a aussi validé plusieurs stratégies thérapeutiques innovantes qui ont grandement amélioré les déficits moteurs de souris modèles pour plusieurs formes génétiques de myopathies centronucléaires et myotubulaires. Notamment, nous montrons que la diminution du niveau général de dynamine 2 par transgénèse, injection d'oligo-nucléotides antisens ou virus adeno-associés exprimant des ARN interférents (shRNA) prévient la progression de la myopathie myotubulaire liée à des mutations du gènes MTM1, et de la myopathie centronucléaire liée à des mutations de BIN1. De plus, nous avons développé et validé l'inhibition spécifique de l'allèle muté dans la myopathie centronucléaire liée à des mutations dominantes de DNM2 dans un modèle murin et des cellules de patients.

### Production scientifique et valorisation

Cowling B.S., et al. (2017) Amphiphysin (BIN1) negatively regulates dynamin 2 for normal muscle maturation, *J Clin Invest*, 127(12), pp. 4477-4487.

https://doi.org/10.1172/JCI90542

Tasfaout H., et al. (2018) Single Intramuscular Injection of AAV-shRNA Reduces DNM2 and Prevents Myotubular Myopathy in Mice, *Mol Ther*, 26(4), pp. 1082-1092.

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.02.008

Trochet D., et al. (2018) Allele-specific silencing therapy for Dynamin 2-related dominant centronuclear myopathy, *EMBO Mol Me*, 10(2), pp. 239-253.

https://doi.org/10.15252/emmm.201707988

Deux brevets : Dynamin 2 inhibition et Allele-specific dynamin 2 downregulation, tous deux concernant le traitement des myopathies centronucléaires.

Création de la start-up Dynacure (localisée à Illkirch ; www.dynacure.fr/) à la fin de l'année 2016.

Et un premier essai clinique lancé en 2020.

Début du projet : septembre 2014 | Durée : 36 mois |

Financement ANR : 510 000 €

### Partenaires

Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (IGBMC) | Inserm, Paris

### Coordination

Jocelyn Laporte - IGBMC, U 1258, UMR 7104, Université de Strasbourg - jocelyn@igbmc.fr
www.igbmc.fr/laporte
# DYSther

## Dystrophines Dans Le Système Nerveux : de la Neurophysiologie à la Thérapie Moléculaire

### Rappel des objectifs

La thérapie génique offre des perspectives sérieuses pour traiter la myopathie, mais peu de travaux ont évalué sa capacité à corriger les dysfonctionnements cérébraux responsables des troubles intellectuels et psychiatriques dans cette maladie. Deux défis majeurs ont été relevés : 1) mieux comprendre les causes de variabilité des symptômes, qui dépendent de la variété des mutations altérant différentes protéines dans les neurones et les cellules gliales et 2) concevoir des outils moléculaires capables de cibler ces cellules et identifier des mesures pour évaluer le bénéfice de ces traitements.

Pour atteindre ces objectifs, nous avons utilisé une analyse pluridisciplinaire combinant les expertises de quatre partenaires, afin d'identifier des mécanismes pathologiques, du gêne au comportement, chez des souris porteuses de différentes mutations. De nouvelles souris modèles ont été conçues pour faciliter l'imagerie cellulaire ou activer des réseaux neuronaux par optogénétique. Nos approches thérapeutiques ont consisté à administrer des molécules conçues pour pénétrer facilement le cerveau à la suite d'une administration dans la circulation générale et capables de corriger le gêne ou de réintroduire la protéine manquante.

Ce projet pluridisciplinaire était indispensable pour répondre aux questions émergentes de recherche fondamentale et aux défis technologiques nécessaires à l'amélioration des stratégies de thérapie génique pour les maladies génétiques affectant le système nerveux central.

### Résultats majeurs

L'identification des mécanismes responsables de troubles sensoriels et cognitifs associés au syndrome de myopathie de Duchenne a constitué une contribution importante à notre compréhension du fonctionnement normal de la rétine et du cerveau, et des bases neurales des maladies neurodéveloppementales. Nous avons caractérisé les relations géotype-phénotype à différents niveaux (du moléculaire au comportement) et le rôle de la dystrophine neuronale dans le système GABAergique et celui d'une forme gliale dans l'homéostasie hydrique et potassique, identifiant ainsi des biomarqueurs pertinents pour évaluer l'efficacité des approches de thérapie génique.

Pour l'approche préclinique du projet, nous avons couplé nos outils moléculaires à des chimies particulières ou les avons véhiculés à l'aide de vecteurs spécifiques, sélectionnés de manière à ce que leurs effets thérapeutiques puissent cibler des types de cellules spécifiques. Ces techniques innovantes ont permis aux molécules thérapeutiques circulantes de pénétrer les tissus et diffuser dans l'ensemble des régions affectées par cette maladie (muscle, système nerveux).

La réversibilité d'une partie des déficits et la démonstration qu'il est possible d'optimiser des outils de thérapie génique ciblant plusieurs organes ont ouvert des perspectives de soin stratégiques pour le développement de médicaments pour la myopathie et d'autres maladies génétiques affectant la rétine et le cerveau.

### Production scientifique et valorisation

Ce projet est associé à 18 publications dans des revues internationales à fort impact (Ann Neurol, Nucleic Acids Research, Glia, IOVS, Mol Ther, Hum Mol Genet...), dont six articles de synthèse sur les approches de thérapie moléculaire, sept articles de recherche partenaires, trois chapitres de livre, 24 communications orales dont 14 dans des congrès internationaux et trois de vulgarisation, et 21 communications sous forme de séminaires et affiches. Six autres publications sont encore en préparation (une en révision).

Les retombées du projet sont multiples, avec notamment une contribution à la mise en œuvre d'essais cliniques avec les molécules d'ADN tricycliques pour le saut d'exon thérapeutique, l'application de nos approches comportementales à d'autres souris modèles de déficience intellectuelle et d'autisme, l'organisation d'un symposium sur les altérations centrales dans la myopathie (Myology, 2019), le rattachement de deux partenaires (Vaillend, Goyenvalle) à un réseau européen qui ont ensuite pris en charge deux working packages d'un projet de recherche collaboratif européen (2019-2023 : Horizon 2020, Brain Involvement in Dystrophinopathies), le développement de nouvelles collaborations internationales et la mise en place d'un projet collaboratif préclinique Homme/Animal en collaboration avec des cliniciens français pour approfondir nos connaissances des altérations rétiniennes et cérébrales dans la myopathie.

Début du projet : octobre 2014 | Durée : 48 mois |

Financement ANR : 540 532 €

**Partenaires**

Institut des neurosciences Paris-Saclay, UMR 9197 CNRS | U 1179 UVSQ-Inserm, Montigny-le-Bretonneux | UMR_S 968 UPMC-Inserm, Paris

**Coordination**

Cyrille Vaillend - Institut des neurosciences Paris-Saclay, UMR 9197 CNRS - cyrille.vaillend@universite-paris-saclay.fr
https://neuropsi.cnrs.fr/departements/cnn/equipe-cyrille-vaillend/
# EBThera

## Repurposing biomolecules for the treatment of epidermolysis bullosa

### Rappel des objectifs

This proposal dealt with new therapeutic approaches for a rare, disabling genetic skin disease, dystrophic epidermolysis bullosa (DEB). The hallmark of DEB is skin blistering induced by minor friction, followed by chronic wounds and severe scarring that progresses into generalized soft tissue fibrosis. Among symptoms, joint contractures and mitten deformities of hands and feet cause severe disability, and the fibrosis of the dermis increases tissue stiffness and favours development of squamous cell carcinoma, a lethal complication of the disease. At the time of the proposal selection, little benefit in pilot clinical trials were shown. Therefore, alternative approaches to improve the health and quality of life of patients were needed. Here, we proposed to assess the potential of repurposing drugs and other biomolecules to prevent the progression of soft tissue fibrosis in DEB. The approach was based on findings that TGF-β and JAK/STAT-mediated signalling is causally involved in DEB fibrosis. We have elucidated the molecular and cellular mechanisms of these signalling pathways in DEB and used FDA/EMA-approved TGF-β and JAK/STAT-antagonists and other biomolecules, to interfere with signalling in murine and human DEB cells in vitro and to attenuate soft tissue fibrosis in DEB mouse models in vivo. Our data demonstrated that Ruxolitinib treatment of a RDEB mice model of skin blistering, reduced dermal skin fibrosis and inflammation, hallmarks of pre-cancerous lesions.

### Résultats majeurs

We have assessed the therapeutic benefit of Ruxolitinib treatment on RDEB mice model. In vitro, we show that RDEB-fibroblasts deficient in coll VII expression display a phenotype similar to that of the dermal fibroblasts of healthy controls. Such observation suggests that coll VII deficiency per se is not directly responsible for the formation of the fibrotic skin lesions observed in patients. However, SCC-RDEB fibroblasts were phenotypically undistinguishable from that of carcinoma-associated fibroblasts isolated from sporadic non-RDEB SCCs. Our data show that Ruxolitinib treatment abrogates the excessive ECM remodeling linked to fibrosis. We hypothesized that blister-induced inflammation is responsible for tissue fibrosis in RDEB disease.

RDEB-mice were treated with Ruxolitinib to assess the anti-fibrotic role of the drug by immunohistochemical analysis of skin biopsies obtained from treated and untreated animals. In the treated mice, the skin-induced blisters, at the level of the dermis, displayed a significant decrease of collagen deposition, STAT3 activity and an accelerated healing.

In conclusion, the results collected so far support the idea that in RDEB skin blisters trigger inflammatory-dependent fibroblast activation and fibrosis. In an in vitro and in vivo context, inhibition of the JAK1/STAT3 pro-inflammatory signalling pathway using Ruxolitinib is consistent with absent detection of markers characteristic of the fibrotic lesions at the skin blister site.

### Production scientifique et valorisation

Mittapalli V. R., et al. (2020) STAT3 targeting in dystrophic epidermolysis bullosa, *The British Journal of Dermatology*, 182(5), pp. 1279-1281.
https://doi.org/10.1111/bjd.18639

Grasset E. M., et al. (2018) Matrix Stiffening and EGFR Cooperate to Promote the Collective Invasion of Cancer Cells, *Cancer Research*, 78(18), pp. 5229-5242.
https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-0601

Bonan S., et al. (2017) Membrane-bound ICAM-1 contributes to the onset of proinvasive tumor stroma by controlling acto-myosin contractility in carcinoma-associated fibroblasts, *Oncotarget*, 8(1), pp. 1304-1320.
https://doi.org/10.18632/oncotarget.13610

Kuzet S. E., et al. (2016) Fibroblast activation in cancer: when seed fertilizes soil, *Cell and Tissue Research*, 365(3), pp. 607-619.
https://doi.org/10.1007/s00441-016-2467-x

Albrengues J., et al. (2015) Epigenetic switch drives the conversion of fibroblasts into proinvasive cancer-associated fibroblasts, *Nature Communications*, 6, art. 10204.
https://doi.org/10.1038/ncomms10204

**Début du projet : février 2015 | Durée : 36 mois |**

**Financement ANR : 196 964 €**

**Partenaires**

Department of Dermatology, Medical Center, University of Freiburg (Allemagne) | Istituto Dermopatico dell'Immacolata, Laboratory of Molecular and Cell Biology, Rome (Italie) | Laboratory of Tissue Repair and Regeneration, University of Toronto (Canada)

**Coordination**

Cédric Gaggioli - IRCAN, U 1081 Inserm, UMR 7284 CNRS - gaggioli@univ-cotedazur.fr
# EMIR

## Mécanismes épigénétiques dans l'inflammation et le remodelage vasculaire de l'hypertension pulmonaire

### Rappel des objectifs

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par une intolérance à l'effort qui évolue progressivement vers l'insuffisance cardiaque droite. L'HTAP est due à l'obstruction des petites artères qui apportent le sang désoxygéné vers les alvéoles des poumons pour y être oxygéné. Cette obstruction gêne l'écoulement du sang au travers des poumons. Le ventricule droit, la partie du cœur qui pousse le sang dans les poumons, se fatigue alors jusqu'à défaillir. Des traitements sont disponibles pour dilater en partie les artères bouchées, mais ne suffisent pas à enrayer l'évolution de la maladie qui reste fatale à moins d'une transplantation pulmonaire. En effet, il y a dans l'HTAP une multiplication anormale des cellules qui composent la paroi des artères qu'on appelle remodelage vasculaire, et qui est peu sensible à la vasodilatation. L'objectif général de ce projet était donc d'identifier des mécanismes responsables de ce remodelage afin de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, valorisables en traitements innovants et potentiellement curatifs de l'HTAP. Dans ce but, nous avons étudié des modifications apportées à l'ADN des cellules vasculaires pulmonaires et qui modulent l'expression de certains gènes sans altérer leur séquence ; c'est ce qu'on appelle des modifications épigénétiques. Déterminer les gènes qui sont la cible de ces modifications épigénétiques devait permettre d'identifier les gènes impliqués dans le remodelage artériel responsable de l'HTAP.

### Résultats majeurs

Nous nous attendions à identifier des gènes principalement impliqués dans la balance multiplication/mort cellulaire et dans l'inflammation. Parmi les gènes différentiellement méthylés dans les cellules endothéliales pulmonaires issues de patients HTAP, une grande partie étaient cependant impliqués dans les maladies métaboliques (30%). L'un de ces gènes, ABCA1, code pour une protéine (ABCA1) intervenant dans le transport du cholestérol et jouant un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité vasculaire. Nous avons confirmé la diminution d'expression d'ABCA1 que prédisait l'hyperméthylation d'ABCA1, au niveau des poumons et des artères pulmonaires des patients HTAP en comparaison avec les tissus témoins. Dans un modèle animal d'HTAP sévère, l'utilisation d'un activateur pharmacologique d'ABCA1 a réduit la sévérité de la maladie, apportant la preuve de concept que la modulation d'ABCA1 pourrait constituer une option thérapeutique chez l'humain. Suite à nos travaux, plusieurs équipe ont confirmé la perte d'ABCA1 dans l'HTAP et son rôle dans la prolifération vasculaire pulmonaire. Ils ont également mis en évidence un autre mode de régulation épigénétique médié par des microARN ; l'inhibition de ces microARN fournissant également un moyen de réduire l'HTAP dans des modèles animaux de la maladie. Nos travaux et ces études confirment le potentiel thérapeutique de cibler les troubles métaboliques, et ABCA1 en particulier, dans cette maladie rare et sévère.

### Production scientifique et valorisation

21 articles mentionnent le support de l'ANR-13-JSV1-0011-01, dont la publication ci-après qui décrit la méthodologie et les résultats d'EMIR : Hautefort A., et al. (2017) Pulmonary endothelial cell DNA methylation signature in pulmonary arterial hypertension, *Oncotarget*, 8(32), pp. 52995-53016.

https://doi.org/10.18632/oncotarget.18031

Début du projet : janvier 2014 | Durée : 48 mois |

Instrument : JCJC | Financement ANR : 260 000 €

#### Partenaires

Centre national de recherche en génomique humaine (CNRGH), CEA, Évry | Institut Max-Planck de recherche sur le cœur et les poumons, Bad Nauheim (Allemagne)

#### Coordination

Frédéric Perros – Hypertension pulmonaire : physiopathologie et nouvelles thérapies, UMR_S 999 Inserm – frederic.perros@inserm.fr
# EndoMechano

## Rôle des protéines de l'endocytose dans la mécano-transduction des cellules musculaires

### Rappel des objectifs

Les plaques de clathrine sont des structures de la membrane plastique dont la fonction demeure mal comprise. Ces plaques sont situées au niveau des sites d'adhésion de la cellule avec le substrat, suggérant qu'elles pourraient jouer un rôle dans la transduction des forces mécaniques. Des résultats de notre équipe ont montré que, dans les cellules musculaires, la dynamine 2 (DNM2), dont les mutations causent la myopathie centronucléaire (CNM), était impliquée dans la formation de l'appareil contractile d'actine. Notre projet visait à analyser le rôle des plaques de clathrine et de la DNM2 en tant qu'organisateurs du cytosquelette et à rechercher des défauts de cette voie dans la physiopathologie de la CNM.

De par leur nature, les plaques de clathrine sont difficiles à visualiser, même par des techniques de microscopie électronique de pointe. Grâce au financement ANR, nous avons d'une part développé, pour la première fois en France, une technique de microscopie électronique à haute résolution (platinum-replica electron microscopy, PREM) qui consiste à déposer une fine couche de platine à la surface des cellules musculaires en culture préalablement décapées par des ultrasons. Cette technique nous a permis de visualiser directement l'interaction entre les plaques de clathrine et le cytosquelette à très haute résolution.

### Résultats majeurs

Nous avons démontré que les plaques de clathrine et la DNM2 qui leur est associée sont capables d'organiser le cytosquelette d'actine et des filaments intermédiaires de desmine. Dans un second temps, nous avons montré que les filaments d'actine associés aux plaques de clathrine séquestrent deux facteurs de transcription clés, YAP et TAZ, à la surface des cellules musculaires et les libèrent suite à des contraintes mécaniques comme l'arrêtement. Nos résultats montrent que la déplétion de DNM2 induit un défaut majeur dans l'organisation du cytosquelette et la distribution de YAP et TAZ, induisant par conséquent une dérégulation de l'expression de leurs gènes cibles. L'association de DNM2 avec TAZ et la desmine nous a incités à analyser son implication dans la physiopathologie de la CNM. L'analyse des muscles de souris transgéniques et des cellules de patients a révélé des défauts majeurs dans l'organisation du cytosquelette ainsi que la voie de mécanotransduction YAP/TAZ.

De plus, nous avons montré que la clathrine peut former des structures tubulaires qui pincent les fibres de collagène et qui sont nécessaires pour l'adhésion cellulaire dans un environnement 3D (Elkhatib et al., 2017). Nous avons établi des collaborations sur le rôle des cavéoles dans la mécanotransduction (Lamaze et al., Curr Opin Cell Biol., 2017 ; Torino et al., J Cell Biol., 2018) et notre expertise a permis de découvrir un mécanisme clé pour la fusion des cellules musculaires (Randrianarison-Huetz et al., 2018).

### Production scientifique et valorisation

Vassilopoulos S., (2020) Unconventional roles for membrane traffic proteins in response to muscle membrane stress, *Curr Opin Cell Biol.*, 65, pp. 42-49.

https://doi.org/10.1016/j.ceb.2020.02.007

Vassilopoulos S., et al. (2019) Ultrastructure of the axonal periodic scaffold reveals a braid-like organization of actin rings, *Nat Commun.*, 10(1), p. 5803.

https://doi.org/10.1038/s41467-019-13835-6

Franck A., et al. (2019) Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle, *Mol Biol Cell.*, 30(5), pp. 579-590.

https://doi.org/10.1091/mbc.e18-11-0718

Trochet D., et al. (2018) Allele-specific silencing therapy for Dynamin 2-related dominant centronuclear myopathy, *EMBO Mol Med.*, 10(2), pp. 239-253.

https://doi.org/10.15252/emmm.201707988

Elkhatib N., et al. (2017) Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration, *Science*, 16, p. 356.

https://doi.org/10.1126/science.aal4713

Nous avons pu mettre la technique de PREM à la disposition de la communauté de biologie cellulaire en la proposant aux utilisateurs de la plateforme de microscopie (http://www.ibps.upmc.fr/fr/plate-formes/imagerie/microscopie-electronique).

Début du projet : janvier 2015 | Durée : 36 mois |

Instrument : JCJC | Financement ANR : 196 560 €

Partenaires

Association française contre les myopathies

Coordination

Stéphane Vassilopoulos - Centre de recherche en myologie, UMR_S 974, Sorbonne Université, Inserm, Association Institut de myologie - s.vassilopoulos@institut-myologie.org https://vassilopoulos.org/ https://recherche-myologie.fr/research/labs/bitoun-lab/?lang=en
# EPINE

## Rôle du CD74 Endothélial dans l'Hypertension Pulmonaire : au carrefour entre Dysfonction endothéliale et Inflammation

### Rappel des objectifs

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) se caractérise par une élévation progressive de la résistance vasculaire pulmonaire (RVP) à l'origine d'une symptomatologie invalidante à issue fatale. Cette augmentation de la RVP s'explique par un remodelage obstructif des artères pulmonaires de petit calibre associé à une infiltration périvasculaire de cellules inflammatoires. À ce jour, il n'existe pas de traitement curatif. Afin d'améliorer les stratégies existantes et de développer de nouvelles voies thérapeutiques, ce programme de recherche avait pour objectif de préciser le rôle de la surabondance du récepteur CD74 à la surface des cellules endothéliales (CE) pulmonaires dans l'HTAP humaine et expérimentale.

Le CD74 lie, avec une forte affinité, deux cytokines pro-inflammatoires : le facteur d'inhibition de migration des macrophages (MIF) et D-dopa-chrome tautom器ase (DDT). Situées en amont de la cascade immuno-inflammatoire, MIF et DDT, en se liant au CD74, peuvent réguler des gènes cruciaux pour la prolifération, la survie cellulaire et la synthèse de diverses cytokines, chimiokines et molécules d'adhésion. Nous avons donc testé l'hypothèse que les voies MIF/CD74 et DDT/CD74 étaient anormalement activées dans l'HTAP et qu'elles pourraient constituer des cibles moléculaires intéressantes pour le développement de nouvelles voies thérapeutiques.

### Résultats majeurs

Nos données EPINE ont révélé que les taux sériques de MIF étaient surabondants dans l'HTAP et que le CD74 était surexprimé par les CE pulmonaires HTAP. De plus, nous avons démontré, pour la première fois, que l'endothélium pulmonaire HTAP présentait un phénotype pro-inflammatoire marqué *in vivo* et *in vitro*, qui pouvait être corrigé par l'inhibition de l'axe MIF/CD74. Nous avons aussi pu démontrer que l'inhibition de la voie MIF/CD74 permettait de corriger le remodelage vasculaire et l'inflammation dans deux modèles précliniques d'étude de l'HTAP, ouvrant ainsi le champ à de nouvelles options thérapeutiques. En collaboration avec le Pr Anh-Tuan Dinh-Xuan du Laboratoire de physiologie respiratoire UPRES-EA 2511, les effets bénéfiques d'agents anti-MIF contre la progression du remodelage vasculaire pulmonaire ont également pu être validés dans un modèle murin de sclérodermie systémique.

Ce programme de recherche a donc permis non seulement une avancée majeure dans la compréhension de la pathologie de cette maladie, mais a aussi facilité le développement de stratégies innovantes anti-MIF. Avec la société française Mifcare, nous avons en effet utilisé les connaissances EPINE pour évaluer l'efficacité d'un candidat médicament « first-in-class » oralement biodisponible. Cette innovation de rupture est actuellement en route vers une preuve de concept chez l'humain grâce au soutien de la société biopharmaceutique wallonne Apaxen qui a acquis les droits mondiaux exclusifs sur la technologie anti-MIF de Mifcare.

### Production scientifique et valorisation

Le Hiress M., et al. (2015) Proinflammatory Signature of the Dysfunctional Endothelium in Pulmonary Hypertension. Role of the MIF/CD74 Complex, *Am J Respir Crit Care Med*, 192(8), pp. 983-97.
https://doi.org/10.1164/rccm.201402-0322oc

Le Hiress M., et al. (2018) Design, Synthesis, and Biological Activity of New N-(Phenylmethyl)-benzoxazol-2-thiones as MIF Antagonists: Efficacies in Experimental Pulmonary Hypertension, *J Med Chem*, 61(7), pp. 2725-2736.
https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.7b01312

Günther S., et al. (2018) MIF Inhibition in a Murine Model of Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis, *Int J Mol Sci*, 19(12), p. 4105.
https://doi.org/10.3390/ijms19124105

Günther S., et al. (2019) Role of MIF and DDT in immune-inflammatory, autoimmune, and chronic respiratory diseases: from pathogenic factors to therapeutic targets, *Drug Discov Today*, 24(2), pp. 428-439.
https://doi.org/10.1016/j drudis.2018.11.003

Halce G., et al. (2020) Multiple roles of macrophage migration inhibitory factor in pulmonary hypertension, *Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.*, 318(1), pp. L1-L9.
https://doi.org/10.1152/ajplung.00234.2019

### Brevets

Brevet européen EP 2 944 310 A1.
Brevet international WO 2015/173433 A1.

### Création de start-up

Aide à la création de la start-up Mifcare incubée à Paris Biotech Santé en 2013.
Démarrage d'un essai clinique de phase 2 (Apaxen).

Début du projet : janvier 2013 | Durée : 36 mois |
Instrument : JCJC | Financement ANR : 291 023 €

### Coordination

Christophe Guignabert – UMR_S 999 Inserm, Faculté de médecine Paris-Saclay – christophe.guignabert@inserm.fr
http://www.u999.universite-paris-saclay.fr/en/team-1/
/pah-physiology-topics.html
# EURO-CDG-2

## A European research network directed towards improving diagnosis and treatment of inborn glycosylation disorders

### Appel à projets générique | 2015

## SOLV_CDG

## Décryptage des patients CDG (Congenital Disorders of Glycosylation) déficients en TMEM165 – de la compréhension des mécanismes moléculaires à une thérapie

### Rappel des objectifs

Les CDG (Congenital Disorders of Glycosylation) sont un groupe de maladies génétiques rares affectant le métabolisme de la glycosylation, une modification post-traductionnelle consistant en la fixation covalente de structures glycanniques aux protéines et aux lipides. Cruciale pour de nombreux processus cellulaires, cette modification, lorsqu'elle est incomplète voire absente dans le cas des CDG, induit des phénotypes extrêmement variables et complexes avec notamment un retard de développement, une atteinte multiviscérale, des symptômes neurologiques et des traits dysmorphiques. À ce jour, les CDG représentent plus de 160 maladies génétiques rares du métabolisme, et leur liste ne cesse de croître. L'identification et la caractérisation des différents gènes associés aux CDG rendent la compréhension de la physiopathologie de ces maladies particulièrement difficile et limite les approches thérapeutiques. En effet, bien que les techniques de séquençage de nouvelle génération aient révélé un diagnostic des patients atteints de maladies métaboliques héréditaires, l'identification de variants génétiques dans des gènes de fonction inconnue apporte un niveau de complexité supplémentaire. Ces projets visaient à : 1) élucider la fonction de TMEM165, une protéine de fonction inconnue, déficiente chez des patients CDG présentant un phénotype très intriguant de dysplasie squelettique majeure (dysplasie spondylo-épimétaphysaire) avec courbure de la colonne vertébrale, laxité articulaire, ostéoporose et nanisme ; 2) explorer la pathogénicité de nouveaux défauts génétiques et des variants de signification inconnue dans les troubles de glycosylation ; et 3) explorer des pistes pour de nouveaux traitements.

### Résultats majeurs

Dans le cadre d'un projet initié en 2012 avec l'identification de patients CDG déficients en TMEM165, nous avons cherché à établir la fonction cellulaire et le rôle de la protéine dans la glycosylation. Nous avons ainsi démontré que des déficiences en TMEM165 et Gdt1p, son orthologue de levure, sont associées à de fortes anomalies de la glycosylation golgienne. Tous les types de glycosylation (N-, O-, glycolipides et GAG) sont affectés, ce qui contribue largement au phénotype clinique unique des patients. Afin de faire le lien entre la déficience en TMEM165 et les anomalies squelettiques observées, des souris knock-out TMEM165 dans le cartilage ont été générées par le Dr Mohamed Ouzzine (Université de Nancy). L'analyse de la plaque de croissance présente une organisation et une morphologie des chondrocytes désordonnées pouvant expliquer le phénotype clinique des patients. Au niveau cellulaire, nous avons montré que TMEM165 est localisée dans l'appareil de Golgi. La compréhension du mécanisme moléculaire liant le défaut de glycosylation à la perte de TMEM165 est venue du résultat absolument fascinant que la supplémentation des cellules de patients en manganèse (Mn²⁺) (seulement 1+ µM) suffit à supprimer tous les défauts de glycosylation observés. De manière tout aussi inattendue, nous avons démontré que la supplémentation en

galactose (Gal) permet également de supprimer certains défauts de glycosylation. La nocivité du Gal étant moindre que celle du Mn²⁺, nous avons entrepris, dans un premier temps et en collaboration avec nos collègues cliniciens, de traiter les patients TMEM165-CDG avec ce monosaccharide. Après quelques mois, des améliorations de leurs profils glycanniques sériques étaient visibles, démontrant ainsi que le Gal peut être proposé comme traitement ciblé pour les patients TMEM165-CDG. Néanmoins, nous venons récemment de démontrer que le Gal, contrairement au Mn²⁺, ne restaure qu'un type particulier de glycosylation, la N-glycosylation, et ne peut ainsi se substituer complètement au traitement par l'ion métallique. Ce travail montre l'importance de la compréhension des mécanismes déficients dans la mise en place d'une stratégie de traitement pour les patients CDG. En effet, aucune autre stratégie n'aurait pu identifier le Mn²⁺ et le Gal comme traitements potentiels.

Nos travaux ont ensuite permis de révéler TMEM165 comme le transporteur principal de Mn²⁺ au niveau de l'appareil de Golgi, permettant une régulation fine de l'homéostasie de ce métal dans l'organelle, et de préciser les régions de la protéine impliquées dans son transport. Par ailleurs, les mécanismes moléculaires de régulation de l'homéostasie cellulaire du Mn²⁺ étant très peu connus, nous avons engagé une collaboration avec le Pr Charles Rice (prix Nobel de médecine 2020) visant à les élucider. Nous avons ainsi pu démontrer un lien fonctionnel et totalement inattendu entre TMEM165 et SPCA1, la pompe ATPase Ca²⁺ de l'appareil de Golgi. Nos résultats démontrent que l'abondance de TMEM165 est régulée par la fonctionnalité de SPCA1. En absence de SPCA1, TMEM165 est complètement déstabilisée et détruite au niveau des lysosomes par un mécanisme entièrement inconnu. Ce lien entre les deux protéines est totalement inédit et ouvre de nouvelles perspectives de recherche, en particulier dans la maladie de Hailey-Hailey résultant de mutations dans le gène ATP2C, codant la protéine SPCA1, et caractérisée par des éruptions cutanées. La pathogénèse de cette maladie n'est pas connue, mais semble due à une dérégulation de la concentration calcique cytosolique des kératinocytes conduisant à une perturbation dans la formation des desmosomes et un défaut dans leur différenciation. En collaboration avec le Dr Alain Hovnanian (Institut Imagine), qui est spécialiste de cette maladie pour l'avoir identifiée, nous avons étudié le profil d'expression et de localisation de TMEM165 dans les kératinocytes des patients Hailey-Hailey. Nos travaux montrent que l'expression de TMEM165 est altérée dans les kératinocytes de ces patients, ce qui pourrait contribuer à l'étiologie de la pathologie.

Enfin, notre implication dans le réseau européen EURO-CDG nous a permis de contribuer à l'identification et la caractérisation de nouveaux CDG mettant en évidence de nouvelles voies métaboliques dans le processus de glycosylation.
## Production scientifique et valorisation

Les projets ont permis la publication de 17 articles dont les plus significatifs sont présentés ci-dessous. Les résultats ont été présentés dans de nombreux congrès nationaux et internationaux et ont fait l'objet de la soutenance de trois thèses de doctorat.

Khan S., et al. (2021) TMEM165 a new player in proteoglycan synthesis: loss of TMEM165 impairs elongation of chondroitin- and heparan-sulfate glycosaminoglycan chains of proteoglycans and triggers early chondrocyte differentiation and hypertrophy, *Cell Death & Disease*, 13(1), p. 11.
https://doi.org/10.1038/s41419-021-04458-1

Foulquier F., et al. (2020) Biometals and glycosylation in humans: Congenital disorders of glycosylation shed lights into the crucial role of Golgi manganese homeostasis, *Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects*, 1864(10), p. 129674.
https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2020.129674

Roy A. S., et al. (2020) SPCA1 governs the stability of TMEM165 in Hailey-Hailey disease, *Biochimie*, 174, pp. 159-170.
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2020.04.017

Lebredonchel E., et al. (2019) Investigating the functional link between TMEM165 and SPCA1, *The Biochemical Journal*, 476(21), pp. 3281-3293.
https://doi.org/10.1042/BCJ20190488

Vicogne D., et al. (2020) Fetal bovine serum impacts the observed N-glycosylation defects in TMEM165 KO HEK cells, *Journal of Inherited Metabolic Disease*, 43(2), pp. 357-366.
https://doi.org/10.1002/jimd.12161

Lebredonchel E., et al. (2019) Dissection of TMEM165 function in Golgi glycosylation and its Mn2+ sensitivity, *Biochimie*, 165, pp. 123-130.
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.016

Houdou M., et al. (2019) Involvement of thapsigargin- and cyclopiazonic acid-sensitive pumps in the rescue of TMEM165-associated glycosylation defects by Mn2+, *FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology*, 33(2), pp. 2669-2679.
https://doi.org/10.1096/fj.201800387R

Potelle S., et al. (2017) Manganese-induced turnover of TMEM165, *The Biochemical Journal*, 474(9), pp. 1481-1493.
https://doi.org/10.1042/BCJ20160910

Potelle S., et al. (2016). Glycosylation abnormalities in Gdt1p/TMEM165 deficient cells result from a defect in Golgi manganese homeostasis, *Human Molecular Genetics*, 25(8), pp. 1489-1500.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddw026

**EURO-CDG-2**

Début du projet : janvier 2016 |

Durée : 44 mois |

Financement ANR : 352 600 €

**Partenaires**

CNRS-Université de Lille | Université de Louvain (Belgique) | Université catholique de Louvain (Belgique) | Hôpital Bichat-Claude Bernard, AP-HP | Université d'Heidelberg (Allemagne) | Université de médecine Charité, Berlin (Allemagne)

**SOLV_CDG**

Début du projet : septembre 2015 |

Durée : 48 mois |

Financement ANR : 542 568 €

**Partenaires**

CNRS-Université de Lille | CNRS-Institut des Saint-Pères | Université de Lorraine

**Coordination**

François Foulquier – UMR 8576 CNRS, Unité de glycobiologie structurale et fonctionnelle (UGSF), Université de Lille – francois.foulquier@univ-lille.fr
# FSHDecipher

## Mécanismes moléculaires de la dystrophie Facio-Scapulo-Humérale : de l'apport de la génomique à l'exploration mécanistique de nouvelles voies de régulation du locus 4q35

### Rappel des objectifs

La dystrophie facio-scapulo-humérale est une maladie complexe encore bien énigmatique. Cette myopathie génétique est caractérisée par une faiblesse musculaire progressive de muscles spécifiques. Elle est transmise de façon autosomique dominante. Il en existe deux formes. La FSHD1 (95% des cas) est caractérisée par une diminution du nombre de répétitions d'un élément répété en tandem de 3,3kb appelé D4Z4 au locus 4q35. Les individus non atteints portent 11 à 150 D4Z4, tandis que les patients FSHD1 en ont entre 1 et 10. La plupart des patients portent un haplotype de type qA en aval des répétitions D4Z4. La diminution du nombre de D4Z4 est associée à une hypométhylation de l'ADN. La seconde forme, appelée FSHD2 (5% des cas) n'implique pas de diminution du nombre de D4Z4. Ces patients présentent une hypométhylation des répétitions D4Z4. Une proportion de patients FSHD2 portent des mutations hétérozygotes du gène SMCHD1.

Nos objectifs étaient de développer des outils et approches à haut débit pour l'analyse du locus de la maladie et d'explorer les patients atypiques afin de décrypter les mécanismes moléculaires de la maladie. Un modèle impliquant la protéine DUX4 traduite à partir de la dernière répétition D4Z4 conduisant à la production d'une protéine toxique pour le muscle est proposé pour expliquer les mécanismes de la maladie. Toutefois, de nombreuses questions restent sans réponse, en particulier en raison de la forte variabilité clinique individuelle et intra-familiale, de la pénétrance incomplète de cette maladie. Afin d'approfondir ces aspects, nous avons choisi d'explorer de grandes cohortes de patients, présentant des formes atypiques de la maladie afin de rechercher d'autres variants génétiques, d'approfondir le rôle de la méthylation de l'ADN en particulier dans la régulation de DUX4 et d'étudier les mécanismes moléculaires de régulation de la chromatine de la région contenant les D4Z4.

### Résultats majeurs

Nous avons identifié de nouveaux gènes mutés chez certains patients et décrit des patients portant des réarrangements complexes du locus 4q35. Dans ces différentes catégories, nous avons montré que l'hypométhylation est plus marquée chez les individus atteints que chez les porteurs asymptomatiques. L'ensemble de ces travaux et l'exploration de larges cohortes de patients ont abouti à la mise en place de nouveaux tests génétiques de la maladie, à l'interface avec la clinique. De plus, nous avons dérivé une collection de cellules de patients atteints de FSHD et exploré les mécanismes de la maladie dans ces cellules. En particulier, nous avons produit une large collection de cellules souches pluripotentes induites, largement exploitées au-delà du projet FSHDecipher, en particulier grâce à l'établissement de collaborations nationales et internationales fructueuses.

Nos résultats soulignent la complexité de la maladie et le défi que représente l'interprétation des diverses caractéristiques moléculaires tels que les changements de méthylation, le nombre de répétitions D4Z4 ou les mutations de SMCHD1. L'ensemble de ces paramètres doit être évalué précisément pour une compréhension plus complète des défauts génomiques associés à la maladie. Dans la FSHD, il est donc essentiel de comprendre et d'évaluer les limites des tests moléculaires pour le diagnostic, mais aussi de comprendre la complexité des régions subtélomériques 4q et 10q et leur implication dans la pathogenèse de cette maladie génétique.

### Production scientifique et valorisation

Nous avons identifié de nouveaux gènes candidats pour la maladie et développé une approche à haut débit pour l'analyse systématique de la méthylation chez les patients et leurs apparentés.

Ce projet a donné lieu à la publication de plus de 10 articles scientifiques.

Les travaux ont été présentés lors de différents colloques scientifiques, dans le cadre de formations universitaires et lors de conférence auprès d'associations de patients.

Nous avons mis en place des outils de diagnostic moléculaire de la FSHD2, dans le cadre de travaux collaboratifs avec l'Assistance Publique - Hôpitaux de Marseille.

Début du projet : novembre 2013 | Durée : 42 mois |

Financement ANR : 439 998 €

#### Partenaires

Marseille Medical Genetics, UMR 1251 Inserm-Aix-Marseille
Université | University College London (UCL) (Royaume-Uni) |
IRCAN, Université Côte d'Azur, Hôpital de l'Archet, Nice

#### Coordination

Frédérique Magdinier - Marseille Medical Genetics,
UMR 1251 Inserm-Aix-Marseille Université -
frederique.magdinier@univ-amu.fr
https://www.marseille-medical-genetics.org/fr
# Gene_Transfer_Tolerance

## Bases moléculaires de la tolérance immunitaire après transfert de gène

### Rappel des objectifs

L'administration in vivo de vecteurs recombinants issus des virus adéno-associé (AAV) permettent d'exprimer très efficacement des transgènes d'intérêt thérapeutique dans des tissus cibles définis. La maturité de ce nouvel outil thérapeutique est telle qu'un nombre croissant d'essais cliniques sont menés et que la FDA et l'EMA ont récemment approuvé deux médicaments à base d'AAV, le Luxturna et le Zolgensma.

Ce type d'approche se fonde sur l'expression de novo d'une protéine fonctionnelle qui est soit absente, soit déficiente chez le patient. Ainsi n'existe-t-il souvent pas de tolérance immune préexistante contre le produit du transgène et une réponse immune délétère peut se mettre en place, limitant l'efficacité du traitement. Ce projet avait pour objectif de caractériser les paramètres conduisant au rejet ou à l'acceptation des cellules génétiquement modifiées. Alors que la présentation directe de l'antigène par les cellules dendritiques est plutôt immuno-gène, la présentation croisée est tolérogène.

Afin d'étudier cela pour les AAV, nous avons utilisé des souris invalidées pour des gènes impliqués dans la présentation antigénique directe ou croisée, des nouveaux transgènes chimériques contenant des épitopes connus afin de pouvoir mesurer finement la réponse cellulaire anti-transgène et des vecteurs contenant des séquences cibles du miR142-3p dans la cassette d'expression pour réduire la présentation directe du produit du transgène.

### Résultats majeurs

Ce projet a débuté par la validation des nouveaux outils que nous avions générés : 1) faisant la preuve de principe pour un vecteur AAV de l'efficacité de l'addition de séquences miR142-3pT pour réduire la réponse immune ; et 2) validant l'approche d'un transgène chimérique contenant divers épitopes CD4 et CD8. Cherchant ensuite à déterminer si la présentation croisée du transgène vectorisé via un vecteur AAV était capable d'induire un état de tolérance à l'encontre du transgène, nous avons caractérisé un certain nombre de paramètres liés au transgène et au site d'injection qui pouvaient moduler la décision entre réponse et tolérance immune. Ainsi, une tolérance « croisée » ne pouvait être obtenue après administration intramusculaire qu'à l'encontre de la forme cytosolique du transgène, les formes membranaire ou sécrétée étant immunogènes. Ni les cellules CD4+Foxp3+, ni la molécule inhibitrice PD-1 ne semblaient impliquées dans cette tolérance. Contrairement à ce qui était attendu, la présentation croisée n'était pas bloquée dans les souris IRAP KO. Néanmoins, nous avons observé une réponse T altérée dans ces souris, ce qui a donné lieu à un travail collaboratif spécifique. Enfin, la voie intradermique s'est avérée être bien plus immunogène que la voie intramusculaire et la présentation croisée induisait dans ce contexte des cellules résidentes mémoires dans la peau.

### Production scientifique et valorisation

Evnouchidou I., et al. (2020) IRAP-dependent endosomal T cell receptor signalling is essential for T cell responses, *Nature Communications*, 11(1), p. 2779.

https://doi.org/10.1038/s41467-020-16471-7

Gross D. A., et al. (2019) Cross-Presentation of Skin-Targeted Recombinant Adeno-associated Virus 2/1 Transgene Induces Potent Resident Memory CD8+ T Cell Responses, *Journal of Virology*, 93(5), e01334-18.

https://doi.org/10.1128/JVI.01334-18

Ghenassia A., et al. (2017) Intradermal Immunization with rAAV1 Vector Induces Robust Memory CD8+ T Cell Responses Independently of Transgene Expression in DCs, *Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy*, 25(10), pp. 2309-2322.

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.06.019

Carpentier M., et al. (2015) Intrinsic transgene immunogenicity gears CD8(+) T-cell priming after rAAV-mediated muscle gene transfer, *Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy*, 23(4), pp. 697-706.

https://doi.org/10.1038/mt.2014.235

Boisgerault F., et al. (2013) Prolonged gene expression in muscle is achieved without active immune tolerance using microrRNA 142.3p-regulated rAAV gene transfer, *Human Gene Therapy*, 24(4), pp. 393-405.

https://doi.org/10.1089/hum.2012.208

**Début du projet : décembre 2011 | Durée : 44 mois | Instrument : JCJC | Financement ANR : 280 000 €**

### Partenaires

UMR_S 974 Inserm | UMR 1149 Inserm | Association française contre les myopathies

### Coordination

David A Gross – UMR 951 Inserm, Généthon – david.gross@inserm.fr
https://www.genethon.com/our-science/our-research-teams/immunology-and-liver-diseases/
# GENOMIT

## Mitochondrial Disorders: from a genome-wide Registry to medical genomics, toward molecular mechanisms and new therapies

### Rappel des objectifs

Mitochondrial disorders are a genetically heterogeneous group of rare and severe diseases with no effective treatment. GENOMIT is a network of eight partners in Germany, Austria, Italy, France, and USA acting with the International Mitochondrial Patient organization to improve the diagnosis and care of mitochondrial disease patients. The objectives of GENOMIT were to: 1) create the largest mitochondrial patient database worldwide, integrating four existing national registries from Europe and USA, including more than 4500 patients; 2) boost genome-wide diagnostics and optimize interpretation of genomic data by aggregating >1200 exome datasets; 3) extend functional studies on novel genes and pathways involved in the pathophysiology of mitochondriopathies; 4) test new therapeutic options by protein replacement therapy and bypassing respiratory chain complex I deficiency.

GENOMIT partners are established national hubs for the diagnosis and care of patients with mitochondriopathies. They represent the existing national patient registries and have access to the largest collection of mitochondriopathy-related NGS data in Europe. Each of them has also developed a unique expertise that will be shared synergistically within the network. GENOMIT will thus create the critical mass to expand knowledge on the natural history, and genotype-phenotype correlation of mitochondrial disease, and gain insight into pathophysiologic mechanisms and feasibility of novel therapeutic approaches.

### Résultats majeurs

We have been involved in several WPs of the European GENOMIT project.

**WP1:** we have progressively established a database for French patients diagnosed in Necker-Enfants malades Hospital. This database has been integrated in 2016 in the Imagine Plateforme de bases de données and is continuously updated with the new patients.

**WP2:** we have performed next generation sequencing (NGS) in a total of 60 cases using in most cases DNA of the proband only. This has allowed us to identify the disease-causing gene in 30% of families. Some of these genes don't encode mitochondrial proteins suggesting a wrong clinical diagnosis of mitochondrial disease. In other cases, the identification of the disease gene allowed to expand the clinical phenotype associated with mutation of the corresponding gene. Finally, we also identified novel disease genes such as MIPEP or TAMM41.

**WP3:** a third part of our project focused on neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA) for which we ascribed iron overload to abnormal recycling of the transferrin receptor (TfR1) and a reduction of TfR1 palmitoylation. Moreover, we showed that palmitoylation represents a hitherto unreported level of TfR1 post-translational regulation, and that an antimalarial agent rescued abnormal TfR1 palmitoylation in cells from NBIA patients. These observations suggest new therapeutic possibilities aimed at targeting TfR1 recycling and palmitoylation in the devastating NBIA phenotype.

### Production scientifique et valorisation

Drecourt A., et al. (2018) Impaired Transferrin Receptor Palmitoylation and Recycling in Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation, *American Journal of Human Genetics*, 102(2), pp. 266-277.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2018.01.003

Gardeitchik T., et al. (2018). Bi-allelic Mutations in the Mitochondrial Ribosomal Protein MRPS2 Cause Sensorineural Hearing Loss, Hypoglycemia, and Multiple OXPHOS Complex Deficiencies, *American Journal of Human Genetics*, 102(4), pp. 685-695.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2018.02.012

Paul A., et al. (2017) FDXR Mutations Cause Sensorial Neuropathies and Expand the Spectrum of Mitochondrial Fe-S-Synthesis Diseases, *American Journal of Human Genetics*, 101(4), pp. 630-637.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.09.007

Metodiev M. D., et al. (2016) Recessive Mutations in TRMT10C Cause Defects in Mitochondrial RNA Processing and Multiple Respiratory Chain Deficiencies, *American Journal of Human Genetics*, 98(5), pp. 993-1000.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2016.03.010

Sánchez-Caballero L., et al. (2016) Mutations in Complex I Assembly Factor TMEM126B Result in Muscle Weakness and Isolated Complex I Deficiency, *American Journal of Human Genetics*, 99(1), pp. 208-216.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2016.05.022

**Début du projet : janvier 2016 | Durée : 36 mois |**

**Financement ANR : 213 680 €**

**Partenaires**

Klinikum rechts der Isar der Technische Universität München, Munich (Allemagne) | Department of Paediatrics, Salzburg (Autriche) | Istituto Neurologico Carlo Besta, Milan (Italie) | UMR 1141 Inserm, Paris

**Coordination**

Agnes Rötig – UMR 1163 Inserm, Institut Imagine – agnes.rotig@inserm.fr | Pierre Rustin – UMR 1141 Inserm – pierre.rustin@inserm.fr
# GenRED
### Étude des anomalies génétiques des érythrocytoses inexplicitées

## Rappel des objectifs

Le projet GenRED a pour objectif d'identifier les mutations germinales responsables des érythrocytoses héréditaires (EH) ou idiopathiques (EI), maladies hématologiques rares caractérisées par une production excessive d'hématies. Elles sont parfois associées à des complications thrombotiques des tumeurs. Au début du projet, huit gènes avaient été associés aux EH/EI mais, dans 80% des cas, aucune anomalie génétique n'était retrouvée, n'autorisant aucun diagnostic ni prise en charge précis pour les patients et leurs familles.

L'étude GenRED s'est proposée de créer une base de données française regroupant les données clinicobiologiques des patients atteints de EH/IE. L'objectif était de mettre en place le diagnostic moléculaire par séquençage haut débit en utilisant un panel de gènes candidats puis, en absence de mutation identifiée, en réalisant le séquençage de l'exome entier. L'objectif suivant était de valider fonctionnellement *in cellulo*, *in vitro* et *in vivo* la pertinence clinique des variants génétiques identifiés. Ces études devaient permettre de déterminer leur rôle causal dans la pathologie, mais également d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans la survenue des EH et de leurs éventuelles complications. De nouveaux outils diagnostiques (tests *in vitro*, utilisation de lignées cellulaires et de modèles de poissons-zèbres) devraient être développés en vue d'améliorer le diagnostic et le pronostic de ces maladies.

## Résultats majeurs

Nous avons recruté plus de 400 patients et avons ainsi constitué la plus grande collection d'Europe de patients avec érythrocytose. Nous avons réalisé un séquençage à l'aide d'un panel NGS (Next Generation Sequencing) et rendu un diagnostic pour ces patients. L'étude des variants génétiques identifiés ont permis d'en classer près de 70 dans la catégorie « mutation causale ». Pour ces patients, un suivi clinique approprié et une étude familiale ont été mis en place. Près de 300 variants de signification inconnue ont également été identifiés, notamment dans des régions non codantes des gènes. Nous avons ainsi découvert que de nombreux gènes impliqués dans les érythrocytoses avaient une structure et une régulation plus complexe que ce qui est décrit (notamment dans la maturation des ARNm (épissage)). Nous avons approfondi nos recherches sur trois gènes en particulier et avons notamment découvert la présence de séquences génétiques cachées qui jouent un rôle majeur dans les érythrocytoses.

Nous avons aussi découvert de nouveaux gènes impliqués dans cette pathologie.

Les voies biologiques identifiées jouent un rôle dans de nombreuses autres pathologies et les découvertes de ce projet auront un large impact.

## Production scientifique et valorisation

Nos travaux ont donné lieu à la publication de 10 articles, quatre revues, 19 communications invitées et 12 posters.

Girodon F., et al. (2017) Gene panel sequencing in idiopathic erythrocytosis, *Haematologica*, 102(1), e30.
https://doi.org/10.3324/haematol.2016.158337

Lenglet M., et al. (2018) Identification of a new VHL exon and complex splicing alterations in familial erythrocytosis or von Hippel-Lindau disease, *Blood*, 132(5), pp. 469-483.
https://doi.org/10.1182/blood-2018-03-838235

Burlet B., et al. (2019) High HFE mutation incidence in idiopathic erythrocytosis, *British Journal of Haematology*, 185(4), pp. 794-795.
https://doi.org/10.1111/bjh.15631

Filser M., et al. (2021) Low incidence of EPOR mutations in idiopathic erythrocytosis, *Haematologica*, 106(1), pp. 299-301.
https://doi.org/10.3324/haematol.2019.244160

Filser M., et al. (2021) Increased incidence of germline PIEZO1 mutations in individuals with idiopathic erythrocytosis, *Blood*, 137(13), pp. 1828-1832.
https://doi.org/10.1182/blood.2020008424

**Début du projet : janvier 2016 | Durée : 48 mois | Instrument : JCJC | Financement ANR : 583 000 €**

### Partenaires

Inserm Grand Est | Inserm Grand Ouest | CHU de Nantes | École pratique des hautes études | CHU de Dijon

### Coordination

François Girodon – CHU de Dijon –
francois.girodon@chu-dijon.fr | Betty Gardie – EPHE, Institut du thorax, Nantes – betty.gardie@inserm.fr
# GETH

## L'Édition Génomique comme outil Thérapeutique contre les β-Hémoglobinopathies

### Rappel des objectifs

β-hemoglobinopathies (Sickle cell disease and β-thalassemias) are genetic anemias caused by mutations affecting the adult hemoglobin expression and are currently treated by red blood cell (RBC) transfusion and iron chelation regimen. For patients affected by severe β-hemoglobinopathies, allogenic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation is the only definitive therapy. Transplantation of autologous, genetically corrected HSC represents an alternative therapy for patients lacking a suitable bone marrow donor. The clinical course of β-thalassemias and Sickle cell disease (SCD) is ameliorated in the presence of elevated expression of the fetal γ-globin genes. Naturally occurring large deletions encompassing β- and δ-globin genes in the globin gene cluster and point mutations in the γA- and γG-globin promoters, defined as Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin (HPFH) traits, result in increased fetal hemoglobin (HbF) expression ameliorating both thalassemic and SCD clinical phenotypes. The goal of the project is the development of novel therapeutic strategies based on nuclease-mediated genome-editing approaches finalized to re-activate fetal globin expression in the erythroid progeny of HSC. Mutational analyses of individuals carrying HPFH deletions and β-thalassemic patients revealed the presence of putative HbF silencers in the β-globin gene cluster. Sequence-specific nucleases were used to disrupt these cis-regulatory functional elements. Additionally, we introduced HPFH-like mutations in the γA- and γG-globin promoters to promote HbF expression. This approach will give insights into globin regulation and provide the molecular bases for the development of a novel therapeutic strategy for β-globin disorders.

### Résultats majeurs

#### Induction of fetal hemoglobin synthesis in human erythroblasts by CRISPR/Cas9-mediated editing of the β-globin locus

We designed a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and CRISPR-associated protein 9 (Cas9) (CRISPR/Cas9) strategy to disrupt a 13.6-kb genomic region encompassing the adult δ- and β-globin genes and a putative γ-δ intergenic fetal hemoglobin (HbF) silencer. Disruption of just the putative HbF silencer results in a mild increase in fetal γ-globin expression, whereas deletion or inversion of a 13.6-kb region causes a robust reactivation of HbF synthesis in adult erythroblasts. In primary SCD patient-derived hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs), targeting the 13.6-kb region results in a high proportion of γ-globin expression in erythroblasts, increased HbF synthesis, and amelioration of the sickling cell phenotype.

#### Editing a γ-globin repressor binding site restores fetal hemoglobin synthesis and corrects the SCD phenotype

HPFH mutations in the *HBG* γ-globin promoters disrupt binding sites for the repressors BCL11A and LRF. We used CRISPR-Cas9 to mimic HPFH mutations in the *HBG* promoters by generating insertions and deletions, leading to disruption of known and putative repressor binding sites. Editing of the LRF-binding site in patient-derived HSPCs resulted in γ-globin derepression and correction of the sickling phenotype. Xenotransplantation of edited HSPCs showed a high editing efficiency in repopulating HSPCs.

### Production scientifique et valorisation

Weber L., et al. (2020) Editing a γ-globin repressor binding site restores fetal hemoglobin synthesis and corrects the sickle cell disease phenotype, *Science Advances*, 6(7), p. 9392.

https://doi.org/10.1126/sciadv.aay9392

Lattanzi A., et al. (2019) Optimization of CRISPR/Cas9 Delivery to Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Therapeutic Genomic Rearrangements, *Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy*, 27(1), pp. 137-150.

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2018.10.008

Antoniani C., et al. (2018) Induction of fetal hemoglobin synthesis by CRISPR/Cas9-mediated editing of the human β-globin locus, *Blood*, 131(17), pp. 1960-1973.

https://doi.org/10.1182/blood-2017-10-811505

Lagresle-Peyrou C., et al. (2018) Plerixafor enables safe, rapid, efficient mobilization of hematopoietic stem cells in sickle cell disease patients after exchange transfusion, *Haematologica*, 103(5), pp. 778-786.

https://doi.org/10.3324/haematol.2017.184788

#### Brevet

Miccio Annarita, Weber Leslie. Methods for increasing fetal hemoglobin content in eukaryotic cells and uses thereof for the treatment of hemoglobinopathies, WO/2020/053224/PCT/EP2019/074131. 19/03/2020

Début du projet : octobre 2016 | Durée : 36 mois |

Instrument : JCJC | Financement ANR : 343 616 €

Coordination

Annarita Miccio - Laboratory of Chromatin and gene regulation during development, UMR 1163 Inserm, Institut Imagine, Université Paris-Cité - annarita.miccio@institutimagine.org
https://www.institutimagine.org/en/annarita-miccio-189
# GOSAMPAC

## Genomics of cAMP signaling alterations in adrenal Cushing

### Appel à projets générique | 2015

# GP-PMAH

## Génétique et physiopathologie de l'hyperplasie macronodulaire des surrénales

## Rappel des objectifs

### Contexte

La voie de signalisation AMPc/PKA stimulée par l'ACTH hypophysaire contrôle la sécrétion de cortisol et la trophicité du cortex surrénalien. Les lésions surrénaליennes bénignes, responsables d'un syndrome de Cushing (SC) (excès chronique de cortisol), sont soit des adénomes bénins (ACA) uniques, soit des nodules multiples bilatéraux (ou hyperplasie nodulaire (micronodulaire (PPNAD) ou macronodulaire (PBMAH)). Il s'agit de lésions bien différenciées et autonomes sur le plan sécrétoire, malgré l'absence d'ACTH. La PPNAD s'observe le plus souvent chez l'enfant et l'adulte jeune dans le cadre du complexe de Carney (association de lentiginose, myxome cardiaque et hyperactivité endocrine), maladie autosomique dominante liée à des variations germinales inactivatrice du gène *PRKAR1A* (sous-régulatrice R1A de la PKA). Dans de rares ACA responsables d'un SC, des altérations somatiques inactivatrices de *PRKAR1A* et activatrices GNAS ont été observées. Le caractère bilatéral des nodules dans les PPNAD et PBMAH suggère une prédisposition génétique. Si cette dernière est démontrée dans le complexe de Carney, elle ne l'était pas lors du démarrage du projet dans les PPNAD isolées sans autre atteinte du complexe de Carney, sauf chez les rares patients présentant des variations germinales inactivatrices de la phosphodiesterase PDE11A, et dans la PBMAH qui est diagnostiquée chez l'adulte entre 40 et 60 ans.

### Hypothèse

L'hypothèse initiale était basée sur l'implication d'anomalies de la voie de signalisation AMPc/PKA dans les lésions surrénaליennes bénignes responsables d'un syndrome de Cushing.

### Objectif

L'objectif du projet était d'identifier des anomalies génétiques ou épi-génétiques altérant la voie de signalisation AMPc/PKA par différentes approches de génomique sur tissu surrénalien et ADN germinal de patients souffrant de SC surrénalien. Cette approche de génomique intégrée avait pour objectif d'établir une classification moléculaire de ces pathologies sans a priori clinique. Une fois cette classification établie, le retour aux corrélations phénotypique incluant les données hormonales et l'analyse histologique des tissus étudiés permettrait de valider cette approche pour identifier une hétérogénéité moléculaire. L'étude des sous-groupes moléculaires identifiés permettrait ensuite plus facilement d'identifier, dans ces maladies rares, les altérations causales. En parallèle, des études fonctionnelles sur des modèles cellulaires de lignées surrénaליennes établies ou sur culture primaire de lésions corticosurrénaליennes seraient développées pour étudier les conséquences des anomalies identifiées sur la voie de l'AMPc.

## Les collaborations et réseaux

Ce projet a bénéficié et permis d'amplifier des collaborations nationales (réseau COMETE, FSMR Firendo) et internationales (ENSAT, ENDO-ERN) indispensables pour réunir, d'un côté, les échantillons biologiques sur des maladie rares et, de l'autre côté, les expertises multiples en génomique et études de voie de signalisation.

## Résultats majeurs

### Classification moléculaire des lésions bénignes de la surrénales

La génomique (transcriptome, méthylome, miRNome, snp, exome) a permis de démontrer des caractéristiques communes aux lésions nodulaires (ACA, PPNAD, PBMAH) responsables d'un SC, partagés avec les hyperplasie surrénaליennes liées à un excès d'ACTH (SC d'origine hypophysaire) et les différenciant des ACA non sécrétants ou sécrétants de l'aldostérone.

### Identification de quatre nouveaux gènes du syndrome de Cushing surrénalien

La classification moléculaire identifiant un groupe spécifique d'ACA avec SC et le séquençage de l'exome somatique de ces lésions ont révélé des variations génétiques pathogènes récurrentes sur des « hot spots » limités du gène *PRKACA* (sous-unité catalytique de la PKA). L'étude d'une grande cohorte européenne démontre qu'il s'agit de l'anomalie moléculaire la plus fréquente, présente dans 40% des ACA avec SC. De façon intéressante, des duplications germinales du même gène *PRKACA* (mais pas d'anomalie ponctuelle) sont retrouvées chez des patients présentant une PPNAD. Par ailleurs, une mutation assez équivalente somatique du gène de la sous-unité Cb de la PKA (*PRKACB*) a été mise en évidence dans un ACA du même groupe. La classification moléculaire des PBMAH avec SC a révélé trois groupes aux caractéristiques cliniques et histologiques spécifiques. L'étude des snp de l'ADN somatique et germinal identifie, dans l'un des groupes, des pertes d'allèle récurrentes en 16p. Le séquençage complet du génome identifie dans ce groupe des variants pathogènes inactivant le gène ARMC5 localisé en 16p. Le deuxième groupe d'hyperplasies macronodulaires des surrénales présente des pertes d'allèle en 1p, et le RNAseq révèle que le gène le plus sureexprimé est le récepteur du GIP (stimulant l'APc) et le plus sous-exprimé KDM1A. L'exome démontre, dans ce groupe, que les patients présentent des variations pathogènes inactivatrices du gène KDM1A localisé en 1p.

### La compréhension des conséquences fonctionnelles des anomalies moléculaires des gènes identifiés

Les études fonctionnelles, par des approches multiples de biologie moléculaire et cellulaire et des techniques de BRET et FRET, ont permis de démontrer comment les variants de PRKAR1A, PRKACA et PRKACB, dérégulent les interactions entre les sous-unités régulatrices et catalytiques de la PKA, conduisant à une activation anormale de cette enzyme. L'identification de partenaires d'ARMC5 (CUL3, NRF1) ouvre des perspectives pour comprendre les mécanismes d'action de ce nouveau gène.
## Conclusion

Ces travaux ont permis d'identifier de nouveaux gènes du SC sur-rénalien et démontrent le caractère génétique d'une cause de SC de l'adulte, la PBMAH. L'application immédiate est la possibilité d'un dépistage familial pour un diagnostic précoce de cette maladie pour en limiter le retentissement important en cas de diagnostic tardif, qui est habituel. À plus long terme, la compréhension de ces anomalies permettra de développer des approches thérapeutiques médicales spécifiques.

## Production scientifique et valorisation

Calebiro D., et al. (2014) PKA catalytic subunit mutations in adrenocortical Cushing's adenoma impair association with the regulatory subunit, *Nature Communications*, 5, p. 5680.
https://doi.org/10.1038/ncomms6680

Cazabat L., et al. (2014) Inactivation of the Carney complex gene 1 (PRKAR1A) alters spatiotemporal regulation of cAMP and cAMP-dependent protein kinase: a study using genetically encoded FRET-based reporters, *Human Molecular Genetics*, 23(5), pp. 1163-1174.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddt510

Di Dalmazi C., et al. (2014) Novel somatic mutations in the catalytic subunit of the protein kinase A as a cause of adrenal Cushing's syndrome: a European multicentric study, *The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism*, 99(10), pp. E2093-E2100.
https://doi.org/10.1210/jc.2014-2152

Espiard S., et al. (2015) ARMC5 Mutations in a Large Cohort of Primary Macronodular Adrenal Hyperplasia: Clinical and Functional Sequences, *The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism*, 100(6), pp. E926-E935.
https://doi.org/10.1210/jc.2014-4204

Ronchi C. L., et al. (2016) Genetic Landscape of Sporadic Unilateral Adrenocortical Adenomas Without PRKACA p.Leu206Arg Mutation, *The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism*, 101(9), pp. 3526-3538.
https://doi.org/10.1210/jc.2016-1586

Weigand I., et al. (2017) Differential expression of the protein kinase A subunits in normal adrenal glands and adrenocortical adenomas, *Scientific Reports*, 7(1), p. 49.
https://doi.org/10.1038/s41598-017-00125-8

Espiard S., et al. (2018) Activating PRKACB somatic mutation in cortisol-producing adenomas, *JCI Insight*, 3(8), p e98296.
https://doi.org/10.1172/jci.insight.98296

Cavalcante I. P., et al. (2020) Cullin 3 targets the tumor suppressor gene ARMC5 for ubiquitination and degradation, *Endocrine-Related Cancer*, 27(4), pp. 221-230.
https://doi.org/10.1530/ERC-19-0502

Faillot S., et al. (2021) Genomic classification of benign adrenocortical lesions, *Endocrine-Related Cancer*, 28(1), pp. 79-95.
https://doi.org/10.1530/ERC-20-0128

Vaczlavik A., et al. (2022) KDM1A inactivation causes hereditary food-dependent Cushing syndrome, *Genetics in Medicine: Official Journal of the American College of Medical Genetics*, 24(2), pp. 374-383.
https://doi.org/10.1016/j.gim.2021.09.018

## GOSAMPAC

Début du projet : avril 2014 |

Durée : 45 mois |

Financement ANR : 172 000 €

## Partenaires

Inserm | Université clinique de Hôpital universitaire, Munich (Allemagne) | University Hospital, Würzburg (Allemagne) | Fondazione IRCCS (Italie)

## GP-PMAH

Début du projet : janvier 2016 |

Durée : 36 mois |

Financement ANR : 250 000 €

## Partenaires

Inserm | Université de Sao Paulo (Brésil)

## Coordination

Jérôme Bertherat - Institut Cochin, U 1016 Inserm, UMR 8104 CNRS, Université Paris-Cité - jerome.bertherat@aphp.fr
http://cochin.inserm.fr/la_recherche/departements/emc/equipe-bertherat
# HEART DM

## Understanding the causes of heart defects in myotonic dystrophies

# Cure-FXTAS

## Experimental approaches towards therapeutic intervention for Fragile X-associated Tremor Ataxia Syndrome

# Drug_FXSPreMut

## Preclinical approaches towards therapeutic intervention for Fragile X PreMutation carriers

### Rappel des objectifs

Twenty years of human genome sequencing has now revealed that most of our genome is composed of repetitive DNA elements and non-coding sequences. Among these repetitive sequences, microsatellites, also known as DNA Short Tandem Repeats (STR), are short sequences of 3 to 6 nucleotides repeated so multiple times that they occupy as much as 3 to 5% of the human genome. Microsatellite variation occurs naturally and has important roles in genomes evolution and functions. However, expansion of a subset of these microsatellites over a threshold size can also be the leading cause of devastating human genetic disorders.

In these ANR/E-rare funded projects, we investigated the pathogenic mechanisms underlying two of these microsatellite diseases: myotonic dystrophies (DM) and Fragile X tremor ataxia syndrome (FXTAS).

1) With a worldwide incidence of 1 out of 8000, myotonic dystrophies (DM) are the most common forms of adult-onset muscle dystrophy. DM patients are characterized by multiple symptoms including muscle hyper-excitability (myotonia), progressive muscle wasting and multiple cardiac dysfunctions. Myotonic dystrophies are caused by two non-coding microsatellites: either an expansion of CTG repeats in the 3'UTR of the DMPK gene (DM of type 1), or an expansion of CCTG repeats in the first intron of the CNBP gene (DM of type 2). At the molecular level, these CTG and CCTG repeat expansions are transcribed in mutant CUG or CCUG-repeated RNAs, which bind and capture the muscleblind-like proteins (MBNL) RNA-binding proteins. MBNL are splicing factors that regulate alternative splicing of various pre-mRNAs, and thus titration of the MBNL proteins by expanded CUG/CCUG RNA repeats leads to specific alternative splicing changes that are associated with and/or responsible of DM symptoms. However, the cause and mechanisms underlying heart dysfunctions in DM were unknown.

2) Fragile X tremor ataxia syndrome (FXTAS) is a rare neurodegenerative disorder that affects adult males who are carriers of 55 to 200 CGG repeats located in the 5'UTR of the FMR1 gene, which is located on the X chromosome. Individuals with FXTAS develop progressive ataxia, dementia and parkinsonism. At the histopathological level, FXTAS is characterized by neuronal cell loss and the intriguing presence of large ubiquitin-positive intranuclear inclusions, which were of unknown origin. Moreover, the pathogenic mechanisms underlying FXTAS, and notably how an expansion of CGG repeats located in a genomic region predicted as non-coding is toxic and drives neuronal cell death were unknown.

### Résultats majeurs

To explore how an expansion of tri-nucleotide repeats (CGG in FXTAS, CTG/CCTG in DM) are toxic, we collaborated with European groups experts in these diseases and found that:

1) Cardiac conduction delay and arrhythmias are the second cause of death in myotonic dystrophies (DM). These disorders are caused by expanded CTG and CCTG repeats that are transcribed in mutant RNAs, which bind and capture the MBNL RNA-binding proteins, thus causing specific alternative splicing changes responsible of DM symptoms. However, the molecular mechanisms underlying heart defects in DM were unclear. Through massive RNA sequencing, the HEART-DM network uncovered novel splicing alterations in DM heart samples, among which a splicing change within the cardiac sodium channel SCN5A. Interestingly, genetic mutations in SCN5A cause cardiac conduction diseases with symptoms strikingly similar to myotonic dystrophies. The HEART-DM network found that MBNL regulates alternative splicing of SCN5A and that depletion of MBNL activities reproduces the mis-regulation of SCN5A splicing observed in DM. Moreover, the HEART-DM consortium reproduced the specific DM splicing alteration of Scn5a in mice and found that it was sufficient to promote heart arrhythmia and cardiac conduction delay. Thus, mis-regulation of the SCN5A alternative splicing may explain the electrical cardiac dysfunctions characteristic of myotonic dystrophies.

2) Concerning FXTAS, the Cure-FXTAS network, followed by the Drug-FXSPreMut consortium helped to uncover that despite being embedded in a genomic region initially described as "non-coding", the expanded CGG repeats responsible of FXTAS are translated into a novel polyglycine-containing protein, named FMRpolyG. Importantly, translation of these CGG repeats occurs in absence of any ATG start codon, but instead, translation initiation takes place at an ACG near-cognate codon located upstream of the CGG repeats. Near-cognate initiation codons are codons differing from the cognate AUG start codon by one nucleotide, but that can nonetheless initiate translation through mispairing with the initiator methionine-tRNA. Of clinical interest, expression of FMRpolyG in neuronal cells is sufficient to form ubiquitin-positive aggregates, and antibodies developed against this protein stain the FXTAS-typical intranuclear inclusions in patient's cells and tissue sections. Finally, the Cure-FXTAS and the Drug-FXSPreMut networks helped to develop mouse models expressing FMRpolyG, as well as human FXTAS-iPS cells that we differentiated into neurons.
These novel cell and animal models indicate that expression of FMR-polyG is toxic, resulting in neuronal cell loss, locomotor alterations, ataxia and neuroinflammation. These results are important as they clarify the origin of the neurodegeneration and presence of intranuclear inclusions in FXTAS. Moreover, these novel iPS cell and animal models will be instrumental to develop innovative therapeutic approaches for this disease.

## Production scientifique et valorisation

Freermuth F., et al. (2016) Splicing mis-regulation of SCN5A contributes to cardiac conduction delay and heart arrhythmia in myotonic dystrophy, *Nature Communications*, 17, art. 11067.
https://doi.org/10.1038/ncomms11067

Buijsen R., et al. (2014) FMRpolyG-positive inclusions in CNS and non-CNS organs of a fragile X premutation carrier with FXTAS, *Acta Neuropathol Commun.*, 2(1), art. 162.
https://doi.org/10.1186/s40478-014-0162-2

Sellier C., et al. (2017) Translation of expanded CGG repeats is pathogenic in Fragile X Tremor Ataxia Syndrome, *Neuron*, 93(2), pp. 331-347.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.12.016

### HEART DM

**Début du projet :** janvier 2013 | **Durée :** 36 mois | **Financement ANR :** 237 120 €

### Partenaires

Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (IGBMC) | University Medical Center Hamburg-Eppendorf (Allemagne) | Fundación investigación clínico de Valencia (Espagne) | Institut de myologie

### Cure-FXTAS

**Début du projet :** mars 2013 | **Durée :** 36 mois | **Financement ANR :** 221 520 €

### Partenaires

Erasmus Medical Centre Rotterdam (Pays-Bas) | Institut de génétique et de

biologie moléculaire et cellulaire (IGBMC) | Université Otto-von-Guericke, Magdeburg (Allemagne)

### Drug_FXSPreMut

**Début du projet :** décembre 2014 | **Durée :** 48 mois | **Financement ANR :** 221 520 €

### Partenaires

Institut de génétique et de biologie moléculaire et cellulaire (IGBMC) | Erasmus University Medical Center, Rotterdam (Pays-Bas) | II-STEM, UMR 861 Inserm/UEVE, AFM Genopole | Université Otto-von-Guericke, Magdeburg (Allemagne) | Université Adam Mickiewicz, Poznan (Pologne) | TechnoPhage, SA

### Coordination

Nicolas Charlet-Berguerand – IGBMC, UMR 7104 CNRS, U 1258 Inserm – ncharlet@igbmc.fr
https://www.igbmc.fr/equipes/maladies-a-gain-de-fonction-darn
# Heart_asymmetry

## Asymétrie précoce requise pour l'alignement des chambres cardiaques : développement et pathologie

### Rappel des objectifs

1% des enfants naissent avec une malformation cardiaque, ce qui peut avoir des conséquences fonctionnelles graves. Le cœur fonctionne comme une double pompe : à droite, pour envoyer le sang pauvre en oxygène dans les poumons et, à gauche, pour distribuer le sang riche en oxygène aux autres organes. La structure du cœur, assurant la double circulation sanguine, dépend d'un processus asymétrique qui a lieu dans l'embryon à la quatrième semaine de grossesse. À ce moment-là, l'ébauche du cœur est un tube, qui s'enroule un peu comme une hélice de coquille d'escargot. Cette étape de courbure du tube cardiaque est fondamentale pour l'alignement des chambres cardiaques et le cloisonnement du cœur.

Alors que la cascade moléculaire qui initialise l'asymétrie droite/gauche a été bien caractérisée dans l'embryon précoce, on comprend encore mal comment elle est ressentie par les cellules du cœur. Le premier objectif du projet *Heart_asymmetry* était de comprendre comment la signalisation droite/gauche contrôle le mécanisme de courbure du cœur. Le second objectif était de mieux caractériser une malformation cardiaque rare, la transposition congénitalement corrigée des gros vaisseaux (CCTGA), qui se manifeste par une inversion droite/gauche des ventricules, et à ce titre considérée comme une anomalie de courbure du cœur.

### Résultats majeurs

Dans une publication parue dans *Developmental Cell*, le laboratoire de Sigolène Meilhac rapporte que l'action du gêne Nodal, déterminant gauche majeur, est transitoire et précoce dans les cellules cardiaques, avant que le cœur ne commence à battre. En l'absence de Nodal, le tube cardiaque embryonnaire est toujours courbé, mais l'hélice est de travers, ce qui conduit à des malformations cardiaques à la nais-sance, caractéristiques du syndrome d'hétérotaxie. Si l'initiation de l'asymétrie du cœur est indépendante de Nodal, celui-ci joue toutefois un rôle important : il oriente et sculpte la courbure pour que le tube cardiaque embryonnaire prenne une forme d'hélice spécifique. Ces travaux montrent ainsi le rôle de Nodal dans la mise en place de la double pompe cardiaque et mettent au jour des mécanismes du syndrome d'hétérotaxie. Ils ouvrent en outre de nouvelles perspectives de recherche, en montrant que Nodal n'est pas le seul acteur de la courbure du cœur.

En combinant cardiopédiatrie, génétique humaine et biologie du développement, le projet *Heart_asymmetry* a des répercussions, en recherche fondamentale, pour la compréhension des mécanismes d'asymétrie droite/gauche nécessaires à la formation d'autres organes viscéraux (l'organogenèse), ainsi que dans la pratique clinique pour la prise en charge des patients présentant des défauts d'alignement des chambres cardiaques, représentant près de 20% des malformations congénitales du cœur. En outre, cette collaboration interdisciplinaire a favorisé de nouveaux projets de recherche sur d'autres malformations cardiaques.

### Production scientifique et valorisation

Desgrange A., et al. (2019) Standardised imaging pipeline for phenotyping mouse laterality defects and associated heart malformations, at multiple scales and multiple stages, *Disease Models & Mechanisms*, 12(7), dmm038356.
https://doi.org/10.1242/dmm.038356

Desgrange A., et al. (2020) Transient Nodal Signaling in Left Precursors Coordinates Opposed Asymmetries Shaping the Heart Loop, *Developmental Cell*, 55(4), pp. 413-431.e6.
https://doi.org/10.1016/j.devcel.2020.10.008

Ainsi que deux articles de synthèse bibliographiques sur le thème de la courbure du cœur et des défauts de latéralité :
Desgrange A., et al. (2018) Left-right asymmetry in heart development and disease: forming the right loop, *Development (Cambridge, England)*, 145(22), dev162776.
https://doi.org/10.1242/dev.162776

Houyel L., et al. (2021) Heart Development and Congenital Structural Heart Defects, *Annual Review of Genomics and Human Genetics*, 22, pp. 257-284.
https://doi.org/10.1146/annurev-genom-083118-015012

Présentation dans 26 conférences scientifiques et 13 interventions grand public.

**Début du projet : novembre 2016 | Durée : 54 mois | Financement ANR : 567 240 €**

**Partenaires**

UMR 1163 Inserm, Institut Imagine | Institut Pasteur | Unité médico-chirurgicale de cardiologie pédiatrique et congénitale, Hôpital Necker-Enfants malades | Centre national de référence des malformations cardiaques congénitales complexes-M3C, Hôpital Necker-Enfants malades | UMR 1163 Inserm, Institut Imagine

**Coordination**

Sigolène Meihac – UMR 1163 Inserm, Institut Imagine – sigolene.meilhac@pasteur.fr – https://research.pasteur.fr/en/team/heart-morphogenesis/ – https://www.institut reimagine.org/en/sigolene-meilhac-64
# HEART-iPS

### Étude du rôle des facteurs de transcription Iroquois dans les arythmies
cardiaques à l'aide de cellules souches pluripotentes induites

#### Rappel des objectifs

Les arythmies cardiaques touchent plus de 3% de la population et sont liées à une forte morbidité et un sur-risque de mort subite cardiaque. Ainsi, la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent la génération et la propagation de l'influx électrique, et l'analyse de ses modifications dans les maladies cardiaques, sont d'intérêt majeur. Dans ce contexte, les facteurs de transcription, régulateurs du développement cardiaque et, bien que moins connu, impliqués dans le contrôle de l'activité électrique du cœur adulte, sont devenus une cible d'intérêt.

Les facteurs de transcription Iroquois homeobox (Irx) jouent des rôles importants dans le développement cardiaque foetal et la physiologie post-natale chez l'animal. Cependant, leurs rôles dans le cœur humain n'avaient pas été identifiés. De manière intéressante, nous avions auparavant montré que, comme chez la souris, IRX5 est présent dans le cœur humain, ce qui suggérait un rôle potentiellement important de ce facteur de transcription dans des conditions physiologiques et pathologiques chez l'humain.

Le problème abordé dans le projet HEART-iPS était de comprendre le rôle fonctionnel du facteur de transcription IRX5 dans la physiologie cardiaque humaine. En utilisant une combinaison de cellules souches pluripotentes induites générées à partir de patients, nous avons également déchiffré son rôle dans le phénotype cardiaque anormal des syndromes arythmiques d'Hamamy et de Brugada.

#### Résultats majeurs

Avec le projet Heart-iPS, nous avons montré que certaines arythmies sévères, qui se manifestent généralement avec l'âge, s'initient au cours du développement structural et électrophysiologique du cœur.

Pour cela, nous avons d'une part tiré parti d'une maladie congénitale récessive humaine rare, le syndrome d'Hamamy, pour lequel les patients sont porteurs d'une mutation dans le gène IRX5 et présentent à la fois des défauts structuraux et électrophysiologiques cardiaques. D'autre part, des études avaient également suggéré un rôle d'IRX5 dans une autre maladie arythmique héréditaire, le syndrome de Brugada (BrS).

Notre travail a permis de caractériser l'impact des mutations d'IRX5 sur le phénotype électrique des cardiomyocytes. Nous avons découvert que la régulation transcriptionnelle de plusieurs acteurs majeurs

de la conduction électrique cardiaque, tels que SCN5A et les connexines, est liée à IRX5. Ce travail a donc identifié un rôle clé d'IRX5 dans la régulation de la dépolarisation ventriculaire humaine et de la conduction électrique cardiaque, apportant ainsi de nouvelles perspectives dans notre compréhension des maladies cardiaques. Par ailleurs, dans une étude en cours de publication, de nouveaux mécanismes de régulation ont été identifiés et validés biologiquement entre IRX3, IRX5 et trois facteurs de transcription centraux du développement et de la fonction cardiaque, GATA4, TBX5 et NKX2-5.

#### Production scientifique et valorisation

Trois thèses de doctorat (Zeina R. Al Sayed, Bastien Cimarosti et Robin Canac) sur les projets financés par cette ANR, ont été réalisées et soutenues à l'École doctorale Biologie Santé en 2018 et 2022.

**Publications :**

Canac R., et al. (2022) Deciphering Transcriptional Networks during Human Cardiac Development, *Cells*, 11(23), p. 3915.

https://doi.org/10.3390/cells11233915

Al Sayed Z. R., et al. (2021) A consistent arrhythmogenic trait in Brugada syndrome cellular phenotype, *Clinical and Translational Medicine*, 11(6), e413.

https://doi.org/10.1002/ctm2.413

Al Sayed Z. R., et al. (2021) Human model of IRX5 mutations reveals key role for this transcription factor in ventricular conduction, *Cardiovascular Research*, 117(9), pp. 2092-2107.

https://doi.org/10.1093/cvr/cvaa259

Canac R., et al. (2022) Generation of three human induced pluripotent stem cell lines with IRX5 knockout and knockin genetic editions using CRISPR-Cas9 system, *Stem Cell Research*, 58, p. 102627.

https://doi.org/10.1016/j.scr.2021.102627

Belbachir N., et al. (2019) RRAD mutation causes electrical and cytoskeletal defects in cardiomyocytes derived from a familial case of Brugada syndrome, *European Heart Journal*, 40(37), pp. 3081-3094.

https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehz308

**Début du projet : octobre 2015 | Durée : 48 mois |**

**Instrument : JCJC | Financement ANR : 272 988 €**

**Coordination**

Nathalie Gaborit - Institut du thorax, U 1087 Inserm,
U 6291 CNRS, Nantes - nathalie.gaborit@univ-nantes.fr
https://umr1087.univ-nantes.fr/
# HGDIFD

## Déterminisme génétique des infections fongiques invasives chez l'humain

### Rappel des objectifs

Les infections fongiques invasives (IFI) sont des infections graves, souvent mortelles, qui surviennent habituellement chez des patients avec un déficit immunitaire (DI) acquis ou primaire (DIP). Elles représentent un problème majeur de santé publique. Comme elles frappent généralement des patients avec divers facteurs concomitants, leur pathogenèse reste mal comprise. Dans de rares cas, ces IFI surviennent chez des patients sans facteurs de risque connus. Ces IFI dites idiopathiques constituent une opportunité unique de comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Notre hypothèse est qu'un défaut héréditaire monogénique, qui touche spécifiquement la réponse immunitaire dirigée contre le champignon causal, est responsable de ces IFI ; défaut que nous chercherons à découvrir et à caractériser. Cette étude permettra de comprendre les mécanismes qui confèrent une immunité protectrice vis-à-vis des champignons responsables de l'infection et la pathogenèse sous-jacente. Ces résultats bénéficieront aux patients et à leurs familles en termes de diagnostic et de conseil génétique et devraient ouvrir la voie à de nouvelles interventions prophylactiques et thérapeutiques adaptées, basées sur une meilleure compréhension de la physiopathologie.

### Résultats majeurs

Au total, grâce aux collaborations nationales et internationales établies, nous avons recruté 407 patients avec une IFD idiopathique prouvée (par exemple : cryptococcose, aspergillose, dermatophytose, candidose) et 260 apparentés (au total 667 individus). Nous avons réalisé un séquençage à haut débit pour 428 individus. Pour 42 patients, enfants ou adultes, auparavant en bonne santé, avec une IFD sans aucun facteur de risque sous-jacent connu, nous avons identifié un défaut autosomique récessif en CARD9, une protéine impliquée dans la signalisation en aval de récepteurs capables de reconnaître des motifs exprimés à la surface de champignons. Ces patients présentaient essentiellement des infections du système nerveux central et/ou du tube digestif par Candida albicans, des dermatophytoses profondes, ou des phaeohyphomycoses invasives et le plus souvent fatales. Pour huit patients avec des cryptococcoses neuroméningées, nous avons identifié la présence de titres élevés d'autoanticorps neutralisants anti-GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor). Enfin, pour 23 patients, nous avons identifié 13 défauts génétiques, connus ou nouveaux, caractérisés au cours de ces dernières années ou encore en cours de caractérisation. Ces résultats ont démontré que des IFI peuvent avoir une origine génétique, même chez l'adulte, et ont permis une meilleure définition de la physiopathologie des infections fongiques.

### Production scientifique et valorisation

Ce projet a donné lieu à plus de 20 publications (publications originales et revues), notamment sur des défauts monogéniques de l'immunité associés à des IFI ou la présence d'autoanticorps anti-cytokines associés à des IFI.

Neehus A. L., et al. (2021). Impaired respiratory burst contributes to infections in PKCδ-deficient patients, *The Journal of Experimental Medicine*, 218(9), e20210501.
https://doi.org/10.1084/jem.20210501

Béziat V., et al. (2020) Dominant-negative mutations in human IL6ST underlie hyper-IgE syndrome, *The Journal of Experimental Medicine*, 217(6), e20191804.
https://doi.org/10.1084/jem.20191804

Li J., et al. (2019) Chronic mucocutaneous candidiasis and connective tissue disorder in humans with impaired JNK1-dependent responses to IL-17A/F and TGF-β, *Science Immunology*, 4(41), eaax7965.
https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aax7965

Béziat V., et al. (2018) A recessive form of hyper-IgE syndrome by disruption of ZNF341-dependent STAT3 transcription and activity, *Science Immunology*, 3(24), eaat4956.
https://doi.org/10.1126/sciimmunol.aat4956.

Toubiana J., et al. (2016) Heterozygous STAT1 gain-of-function mutations underlie an unexpectedly broad clinical phenotype, *Blood*, 127(25), pp. 3154-3164.
https://doi.org/10.1182/blood-2015-11-679902

Début du projet : janvier 2015 | Durée : 48 mois |

Financement ANR : 328 460 €

### Partenaires

Molecular Mycology Unit, Institut Pasteur | Service des Maladies infectieuses et tropicales adultes, hôpital Necker-Enfants malades

### Coordination

Anne Puel – Laboratoire de génétique humaine des maladies infectieuses, Institut Imagine –
anne.puel@inserm.fr
https://www.institutimagine.org/fr/jean-laurent-casanova-177
# ICM
## Institut de neurosciences translationnelles de Paris

### Rappel des objectifs

ICM's goal is to better understand how the brain functions, both in health and disease, and to pave the way for disruptive therapies for neurological and psychiatric disorders such as Parkinson's, Alzheimer's, Multiple Sclerosis, Epilepsy and Depression, as well as rare diseases such as ALS and Huntington's disease. Since its establishment in 2012, the funds raised allowed ICM to scale up and structure innovative research initiatives, expand scientific and medical community resources, implement new technologies and develop innovative care and education initiatives. IHU-funded initiatives have had a significant scientific, clinical and economic impact. Today ICM ranks second in the neurology field, recruits top team leaders through international calls and hosts scientists from over 40 different countries. ICM has leveraged the IHU investment, increasing the number of key industrial partnerships, and has incubated numerous innovative start-ups which delivered several new products to the market. ICM is now poised to become a global leader in making breakthrough discoveries of brain function in health and disease, translating them into innovative applications and effective therapies, and creating a world-class center for the training of the leading scientists of the future.

### Résultats majeurs

The ICM has a long-lasting interest in rare neurological diseases: today, 12 ICM research teams are investigating the causes of 13 rare diseases. Genetic studies led by ICM researchers have identified new genes in familial cases of ALS (TBK1 gene), frontotemporal dementia (SQSTM1 gene), spinocerebellar degeneration and epilepsy, as well as the functional impact of gene mutations in dystonia (ADCY5 and PRRT2 genes) and spastic paraplegia (SPG11). An important advance in the understanding of the progression of ALS is the identification of the role of immunity or metabolic dysfunctions. In Huntington's disease, our researchers have discovered the implication of neurodevelopmental components to the initiation of the disease. These scientific discoveries go hand in hand with strong clinical research, which is embedded in the clinical ecosystem of Pitié Salpêtrière and was reinforced in 2019 by the creation of ICM clinical research infrastructures (ICRINS) dedicated to neurological diseases (including ALS, and Neurogenetics). These teams benefit from the support of the Center for clinical Investigation, which includes every year, around 1500 new patients in research protocols and allows to implement clinical trials that will provide innovative therapeutic applications for these rare diseases (e.g. antisense oligonucleotides in Huntington's disease).
To foster creative ideas for new disease solutions between researchers, clinicians, and innovation, the ICM has developed interdisciplinary training and immersive programmes. The strong links with the Neuroscience department of the Hospital, as well as international partnerships have catalysed excellency in clinical research.

ICM researchers have obtained several prestigious grants (IMI, H2020, Horizon Europe, 18 ERC, JPND programs, RHU) and have been associated with the European network of excellence on neurodegenerative diseases.

### Production scientifique et valorisation

Since 2012: more than 5500 publications (5 in Cell, 6 in Nature, 10 in Science), 182 ongoing clinical trials, 61 active patents, 25 start-ups supported at the ICM start-up incubator (iPEPS).

Barbier M., et al. (2021) SLITRK2, an X-linked modifier of the age at onset in C9orf72 frontotemporal lobar degeneration, Brain: a Journal of Neurology, 144(9), pp. 2798-2811.
https://doi.org/10.1093/brain/awab171

Barnat M., et al. (2020) Huntington's disease alters human neurodevelopment, Science, 369(6505), pp. 787-793.
https://doi.org/10.1126/science.aax3338

Brande, J. P., et al. (2020) Variant Creutzfeldt-Jakob Disease Diagnosed 7.5 Years after Occupational Exposure, The New England Journal of Medicine, 383(1), pp. 83-85.
https://doi.org/10.1056/NEJMc2000687

Chiot A., et al. (2020) Modifying macrophages at the periphery has the capacity to change microglial reactivity and to extend ALS survival, Nature Neuroscience, 23(11), pp. 1339-1351.
https://doi.org/10.1038/s41593-020-00718-z

Coarelli G., et al. (2022) Safety and efficacy of riluzole in spinocerebellar ataxia type 2 in France (ATRIL): a multicentre, randomised, double-blind, placebo-controlled trial, The Lancet. Neurology, 21(3), pp. 225-233.
https://doi.org/10.1016/S1474-4422(21)00457-9

**Début du projet : 2011 | Durée : plus de 13 ans | Financement France 2030 : 72 M€**

**Partenaires**

Pasteur Institute | Neurospin-CEA | C-BRAINS | Cure-ND (UK-DRI, DZNE, Mission Lucidity) | Yale University (États-Unis) | Montreal Neurological Institute (Canada) | Columbia University (États-Unis) | Weizmann Institute (Israël) | Lukasiewicz PORT (Pologne)

**Coordination**

Alexis Brice - Institut du cerveau -
alexis.brice@icm-institute.org
https://institutducerveau-icm.org/fr/presentation-de-ihu/
# IEIHSEER

## L'encéphalite herpétique de l'enfant résulte de déficits héréditaires d'immunité contre l'HSV-1 : une exception ou une règle ?

### Rappel des objectifs

The objective of this project is to test the hypothesis that childhood Herpes simplex encephalitis (HSE) is not only a viral disease, but also the more general consequence of a diverse collection of central nervous system (CNS)-intrinsic inborn errors of immunity to HSV-1 infection. We have previously described 13 patients, each carrying homozygous or heterozygous mutations of a TLR3 pathway gene (UNC93B1, TLR3, TRIF, TRAF3 or TBK1). Children with HSE who do not carry mutations of those genes may carry inborn errors of other genes associated with a predisposition to HSE, due to the impairment of CNS-intrinsic immunity to HSV-1 infection, probably, but not necessarily, relating to the TLR3-IFN circuit.

### Résultats majeurs

Thanks to this support from ANR, we have made important progress in our studies of human genetic and immunological basis of HSE pathogenesis, during the past years. More specifically, we have demonstrated: 1) TLR3 pathway deficiencies underlie forebrain HSE in a high proportion of affected children; 2) autosomal recessive DBR1 deficiency underlies brainstem HSE through a new, TLR3-independent mechanism; 3) heterozygous mutations in SNORA31 impair anti-HSV-1 immunity in CNS neurons and underlie HSV1 encephalitis through a TLR3-independent mechanism; 4) other new genetic etiologies of HSE have been identified, the characterization of which is currently ongoing in our laboratory.

### Production scientifique et valorisation

Zhang S. Y., Casanova J. L., (2015) Inborn errors underlying herpes simplex encephalitis: From TLR3 to IRF3, *The Journal of Experimental Medicine*, 212(9), pp. 1342-1343.
https://doi.org/10.1084/jem.2129insight4

Zhang S. Y., et al. (2018) Inborn Errors of RNA Lariat Metabolism in Humans with Brainstem Viral Infection, *Cell*, 172(5), pp. 952-965.e18.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.02.019

Lafaille F. G., et al. (2019) Human SNORA31 variations impair cortical neuron-intrinsic immunity to HSV-1 and underlie herpes simplex encephalitis, *Nature Medicine*, 25(12), pp. 1873-1884.
https://doi.org/10.1038/s41591-019-0672-3

Gao D., et al. (2021) TLR3 controls constitutive IFN-β antiviral immunity in human fibroblasts and cortical neurons, *The Journal of Clinical Investigation*, 131(1), e134529.
https://doi.org/10.1172/JCI134529

Zhang P., et al. (2021) A computational approach for detecting physiological homogeneity in the midst of genetic heterogeneity, *American Journal of Human Genetics*, 108(6), pp. 1012-1025.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2021.04.023

**Début du projet : janvier 2015 | Durée : 57 mois |**
**Financement ANR : 468 000 €**

**Partenaires**
Human Evolutionary Genetics Laboratory (HEG),
CNRS URA 3012, Institut Pasteur

**Coordination**
Shen-Ying Zhang - UMR 1163 Inserm, Institut Imagine - shenying.zhang@inserm.fr
# Immune-Rep

## Conséquences des défauts de réparation de l'ADN et du maintien des télomères sur le fonctionnement du système immunitaire : application aux DICV et aux déficits immunitaires avec syndromes dysmorphiques

### Rappel des objectifs

Le système immunitaire est un organe privilégié pour l'étude de la réponse aux dommages de l'ADN (DDR), car il est le siège d'une plasticité génétique importante dans le cadre de son programme de développement et de maturation. De nombreuses modifications de l'ADN sont en effet introduites dans le génome des lymphocytes B et T. Cette dynamique du génome s'accompagne de mécanismes de réparation de l'ADN très efficaces. Des mutations dans certains des facteurs de réparation de l'ADN sont connues pour avoir des conséquences dramatiques pour le système immunitaire, ce qui entraîne une immunodéficience combinée sévère (SCID) chez l'humain. Dans le projet ImmuneRep, nous avons souhaité élargir nos études sur les conséquences des défauts de réparation de l'ADN à diverses populations de patients : déficit immunitaire commun variable (CVID) ou déficit immunitaire combiné tardif (LOCID) ; syndromes malformatifs ; patients présentant une toxicité élevée aux traitements anticancéreux.

### Résultats majeurs

On peut citer le développement du biomarqueur PROMIDISa qui, à partir de l'étude du répertoire des lymphocytes T périphériques, permet d'identifier des patients porteurs d'anomalies de développement du système immunitaire et/ou défaut de réparation de l'ADN. L'analyse, en immunofluorescence, des lymphocytes exprimant le TCR-Va7.2 est maintenant utilisée en routine au Centre d'étude des déficits immunitaires (CEDI, Hôpital Necker) et au Département d'immunologie clinique (hôpital Saint-Louis). Il s'est avéré que tous les patients avec niveau indétectable de Va7.2 sont porteurs de mutations dans les gènes *RAG1/RAG2/Artémis*. PROMIDISa est utilisé dans le cadre du diagnostic moléculaire de l'ataxie télangiectasie (AT, Institut Curie). Dans ce cas, l'existence d'une signature PROMIDISa particulière a permis de valider des variants de pathogénicité inconnue dans le gène *ATM*.

Le projet ImmuneRep a permis d'identifier des mutations dans des gènes connus (*CORO1A*, *RAG2*, *ERCC2*, *RAC2*, *DNA Ligase IV*, *SMARCAL1*, *STIM1*). Il a également permis l'identification d'un nouveau gène, *Hebo*, ainsi qu'une situation particulière de mutation *FANCG* dans l'anémie de Fanconi.

### Production scientifique et valorisation

Fournier B., et al. (2022) Inborn errors of immunity caused by defects in the DNA damage response pathways: Importance of minimizing treatment-related genotoxicity, *Pediatric Allergy and Immunology: Official Publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology*, 33(6), e13820.

https://doi.org/10.1111/pai.13820

Fusaro M., et al. (2021) Improving the diagnostic efficiency of primary immunodeficiencies with targeted next-generation sequencing, *Journal of Allergy and Clinical Immunology*, 147(2), pp. 734-737.

https://doi.org/10.1016/j.jaci.2020.05.046

Berland A., et al. (2019) PROMIDISα: A T-cell receptor α signature associated with immunodeficiencies caused by V(D)J recombination defects, *Journal of Allergy and Clinical Immunology*, 143(1), pp. 325-334.e2.

https://doi.org/10.1016/j.jaci.2018.05.028

Lesport E., et al. (2018) Reduced recruitment of S3BP1 during interstrand crosslink repair is associated with genetically inherited attenuation of mitomycin C sensitivity in a family with Fanconi anemia, *Oncotarget*, 9(3), pp. 3779-3793.

https://doi.org/10.18632/oncotarget.23375

Zhang S., et al. (2016) A nonsense mutation in the DNA repair factor Hebo causes mild bone marrow failure and microcephaly, *Journal of Experimental Medicine*, 213(6), pp. 1011-1028.

https://doi.org/10.1084/jem.20151183

Le dosage des lymphocytes T exprimant le TCR-Va7 et le test PROMIDISa sont maintenant utilisés en routine au Centre d'étude des déficits immunitaires (Necker) et au Département d'immunologie clinique (Saint-Louis) dans l'immunophénotypage des patients. Ce test permet d'orienter vers un séquençage direct de gènes candidats, plutôt que l'utilisation du séquençage de l'exome ou de panel ciblés.

**Début du projet : janvier 2014 | Durée : 46 mois |**

**Financement ANR : 257 629 €**

**Partenaires**

Laboratoire Dynamique du génome dans le système immunitaire, Institut Imagine | Service hématologie et rhumatologie pédiatrique, Hôpital Necker-Enfants malades | Département d'immunologie clinique, Hôpital Saint-Louis

**Coordination**

Jean Pierre de Villartay - UMR 1161 Inserm, Institut Imagine - Jean-Pierre.de-villartay@inserm.fr
https://www.institut reimagine.org/fr/DGSIMRH
# IRIS

## La thérapie génique des maladies héréditaires monogéniques du système immunitaire

### Rappel des objectifs

Ce projet vise à conforter la place de la thérapie génique (TG) dans l'arsenal thérapeutique des déficits immunitaires héréditaires (DIH) et à proposer un traitement curatif pour les patients qui ne peuvent pas avoir recours au traitement curatif de référence, la greffe allogénique de cellules souches hématopoétiques, capables de générer l'ensemble des cellules sanguines indispensable au bon fonctionnement du système immunitaire. Les DIH sont dues à une mutation dans un gène spécifique, indispensable au bon fonctionnement de ce système immunitaire. Pour corriger ce défaut, la greffe de moelle osseuse peut être envisagée, mais elle nécessite la présence d'un donneur compatible, ce qui limite son utilisation.

L'approche proposée dans le cadre du projet IRIS est de développer des produits de TG basés sur l'autogreffe de cellules génétiquement modifiées. L'autogreffe consiste à prélever les cellules sanguines du patient portant la mutation, les modifier en laboratoire afin d'y introduire une copie fonctionnelle du gène défectueux, pour ensuite réinjecter les cellules chez le patient. Les deux DIH ciblés par cette approche sont : la lymphohistiocytose hémophagocytaire familiale de type 3 (FHL3), et le syndrome d'immunodérégulation, polyendocrinopathie, entéropathie auto-immune liée au chromosome X (syndrome IPEX). Cette approche devrait permettre de pallier l'absence de donneur compatible et de répondre ainsi aux attentes des patients.

L'accessibilité de la TG est souvent remise en cause, du fait notamment du prix élevé des traitements pouvant atteindre plus de 1,5 million d'euros sur le marché. Un des enjeux du projet IRIS est aussi de réduire les coûts de la TG afin de faciliter une prise en charge par le système de santé. Les études médico-économiques qui seront menées dans ce projet permettront de définir un ratio coût/bénéfice/ efficacité par rapport à l'ensemble des coûts sociétaux et économiques des traitements prodigués en l'absence de donneur compatible.

### Résultats majeurs

FHL3 est un déficit immunitaire primaire causé par la mutation du gène UNC13D et caractérisé par un syndrome d'activation macrophagique débutant généralement dans les premiers mois de vie. Une TG basée sur l'autogreffe de cellules médullaires génétiquement corrigées est en cours de développement. Des lots de vecteurs lentiviraux compatibles avec une utilisation clinique ont été produits par notre partenaire industriel. Le groupe de recherche translationnelle du CIC-BT a débuté les études précliniques en validant tout d'abord ces lots in vitro afin de vérifier que leur utilisation n'était pas toxique pour les cellules. Ensuite, nous avons étudié leur efficacité en mettant en place des tests fonctionnels quantitatifs et qualitatifs. Le développement et l'optimisation du protocole de transduction s'est égalment achevé en 2022. Les études de biodistribution/génotoxicité in vivo sont en cours et les résultats attendus pour 2023. L'ensemble de ce travail nous permettra de compléter le dossier réglementaire et de lancer un essai clinique en 2024.

Le syndrome IPEX est causé par des mutations du gène FOXP3 qui entraînent la perte de fonction des cellules T régulatrices (Tregs) et le développement de manifestations auto-immunes au début de la vie. L'induction sélective d'un programme Treg dans les cellules T CD4+ autologues par transfert de gène FOXP3 est une approche prometteuse pour guérir les maladies auto-immunes. Nous avons mis en place un nouveau test in vivo de la fonctionnalité des Tregs, basé sur le transfert adoptif de ces cellules dans des souris scurfy (modèle animal de l'IPEX) et une combinaison de conditionnement au cyclophosphamide et de traitement à l'interleukine-2.

En utilisant ce modèle in vivo et un vecteur lentiviral optimisé exprimant Foxp3 humain et, comme rapporteur, une forme tronquée du récepteur de faible affinité du facteur de croissance des nerfs (DLNGFR), nous avons démontré que le transfert adoptif de cellules T CD4+ de souris scurfy transduites par FOXP3 permettait la rémission à long terme de la maladie auto-immune dans ce modèle. L'efficacité était similaire à celle observée avec des Tregs de type sauvage. Après expansion in vivo, les cellules CD4FOXP3 converties ont reproduit la signature transcriptomique fondamentale des Tregs. Ces résultats démontrent que l'expression de FOXP3 convertit les cellules T CD4+ en Tregs fonctionnels capables de contrôler la maladie et donc la faisabilité d'une approche de thérapie génique basée sur les cellules lymphoïdes T chez les patients IPEX actuellement en cours de développement préclinique.

Ce projet a également permis de développer des tests analytiques standardisés dans le cas des tests d'insertion génomique des vecteurs. Nous avons mis ainsi au point un matériel cellulaire de référence pour l'étalonnage ou la qualification des méthodes analytiques quantifiant le nombre de copies de vecteurs dans les cellules ou les sites d'intégration génomique des vecteurs lentiviraux.

### Production scientifique et valorisation

Delville M., et al. (2021) A combination of cyclophosphamide and interleukin-2 allows CD4+ T cells converted to Tregs to control scurfy syndrome, *Blood*, 137(17), pp. 2326-2336.
https://doi.org/10.1182/blood.2020009187

Corre G., et al. (2022) Lentiviral standards to determine the sensitivity of assays that quantify lentiviral vector copy numbers and genomic insertion sites in cells, *Gene Therapy*, 29(9), pp. 536-543.
https://doi.org/10.1038/s41434-022-00315-8

Début du projet : novembre 2019 | Durée : 72 mois | Financement France 2030 : 7 000 000 €

### Partenaires

Assistance Publique – Hôpitaux de Paris | Institut Imagine | Inserm | Flash Therapeutics | Institut clinique de la souris (ICS)

### Coordination

Marina CAVAZZANA – Département de biothérapie, Hôpital Necker-Enfants malades ; CIC Biothérapie, Inserm, AP-HP – m.cavazzana@aphp.fr
# LIFESENSES
Des sens pour la vie

RHU | 2015

## LIGHT4DEAF
ÉCLAIRER LA SURDITÉ : UNE APPROCHE HOLISTIQUE DU SYNDROME D'USHER

IHU | 2018

## FORESIGHT
PRÉVISION – Permettre la Restauration de la VISION

### Rappel des objectifs

Les déficits sensoriels en général, et la malvoyance en particulier, affectent plusieurs millions de personnes. Des progrès majeurs sont attendus dans les domaines du diagnostic, de la prévention, de la médecine régénérative et des prothèses. Atteindre ces objectifs implique la coopération de médecins, scientifiques, ingénieurs et industriels, pour définir et mettre en œuvre des stratégies innovantes, et promouvoir l'évaluation et la mise à disposition de tous des soins optimaux, au meilleur coût. Les projets LIFESENSES, LIGHT4DEAF et maintenant FORESIGHT s'inscrivent dans un continuum (2011-2028) ayant permis un changement d'échelle pour entrer dans un cercle vertueux auto-entretenu de croissance et d'accélération, porteur d'innovations validées publiques et privées, diagnostiques, thérapeutiques et palliatives.

Le projet LabEx LIFESENSES (2011-2019) prolonge et amplifie l'effort conjoint considérable d'institutions de premier plan qui ont créé un environnement translationnel intégré pour franchir les principaux obstacles dans la lutte contre le déficit sensoriel.

La création de ce LabEx a représenté une opportunité unique de le positionner comme un leader mondial grâce 1) à l'efficacité de la gouvernance et des équipes et en facilitant leur coopération ; 2) à la fertilisation croisée des recherches en audition et vision ; 3) au développement de systèmes d'imagerie à haute résolution de micro-électronique et de microfluidique ; 4) au développement de nouveaux marqueurs et de schémas innovants d'essais cliniques ; 5) à l'évaluation de l'impact de la médecine fondée sur les preuves en pratique ; 6) à l'attraction de chercheurs reconnus internationalement ; et 7) à l'intensification des collaborations internationales avec les meillemenaces.

LIGHT4DEAF (2015-2021), projet ambitieux, vise à lutter contre le syndrome d'Usher (USH), la forme la plus commune de surdi-cécité, soutient associée à un déficit vestibulaire. Cette initiative mobilise une équipe multidisciplinaire de scientifiques, cliniciens et experts en sciences humaines dans un effort commun visant à répondre aux besoins cliniques non satisfaits des patients USH.

Dans la suite logique du projet LIFESENSES, FORESIGHT (2019-2028) a pour but de transformer deux structures connexes, le Centre hospitalier national d'optalmologie et l'Institut de la vision, en un pôle intégré de soins dont la stratégie, centrée sur le patient et intégrant une dimension socio-économique, devrait accélérer le transfert clinique des progrès de recherches précliniques et technologiques. Il s'agira d'étudier les mécanismes de perception visuelle de la rétine au cortex, et notamment la plasticité cérébrale dans le cadre de la restauration visuelle, de caractériser le vieillissement et les processus

pathologiques du système visuel pour prévenir la perte de vision, et enfin de développer et valider de nouvelles approches thérapeutiques en médecine régénérative et prothétique.

### Résultats majeurs

#### LIFESENSES - FORESIGHT

Il faut aborder ces deux projets comme faisant partie d'un continuum. Grâce à eux, plus de 60 projets scientifiques et cliniques translationnels multidisciplinaires ont été financés. Ils ont aussi permis d'établir et de conduire des projets structurants à long terme sur des études physiopathologiques de la surdité, la structuration et l'étude de cohortes de patients souffrant de dystrophies rétiniennes héréditaires, et d'évaluer, entre autres, l'impact du handicap visuel sur la plasticité cérébrale. Ces projets ont permis d'attirer et de recruter de jeunes chefs d'équipes, ainsi que des chercheurs confirmés, dans des domaines non couverts encore dans la structure (photonique, mathématiques, psychophysique, etc.), permettant de renforcer la transdisciplinarité de la structure.

Il est à noter que les résultats obtenus dans le cadre de ces deux projets ont permis d'obtenir des premières mondiales et de lancer les premiers essais cliniques en thérapie génique (LUMEVOQ, pour la neuropathie optique de Leber), optogénétique (GS30, pour la rétinite pigmentaire) et cellulaire (conception d'un patch de cellules pigmentées de la rétine à partir de cellules souches pluripotentes pour le traitement de la rétinite pigmentaire).

#### LIGHT4DEAF

De nouveaux outils de diagnostic ont pu être développés : 1) un test moléculaire hautement résolutif et fiable ; 2) de nouveaux tests auditifs développés sur la souris et transposables chez l'humain ; et 3) un système d'imagerie multifonctionnel à haute résolution, contribuant à l'établissement d'un catalogue de phénotypes de la pathologie des photorécepteurs. Au travers de modèles cellulaires et chez l'animal, nous avons élucidé les mécanismes pathologiques à l'origine des atteintes sensorielles (audition, équilibre et vision) pour les trois formes du syndrome. Des approches thérapeutiques gènementépendantes et gène-indépendantes ont été initiées pour évaluer et valider leur potentiel de prévention/correction des atteintes sensorielles avec plusieurs résultats concluants (facteur antioxydant, optogénétique). Nous avons caractérisé les rôles de plusieurs protéines USH dans le cerveau, en montrant notamment leurs implications dans le développement de neurones inhibiteurs du cortex auditif. Ces résultats devraient permettre le développement de réhabilitations auditives plus innovantes.
L'enquête sociologique a porté sur les parcours de vie, les construc-
tions identitaires de personnes USH, leurs attentes en matière de
soins et d'informations médicales, et les difficultés et solutions pos-
sibles qu'elles ont identifiées pour garantir leur autonomie et leurs
droits. Des actions de communication ont été entreprises. L'objectif,
au travers de ces différentes actions de communication, étant de
permettre aux patients, aux professionnels et au grand public d'avoir
accès à des informations vérifiées et à jour sur la maladie, la
recherche, la vie au quotidien et la prise en charge médicale tout au
long du projet.

## Production scientifique et valorisation

Depuis 2011 et jusqu'à aujourd'hui, plus de 1 400 articles scientifiques et cliniques ont été publiés dans le périmètre des projets LIFESENSES, LIGHT4DEAF et FORESIGHT.

La collaboration avec Gensight Biologics a permis d'apporter l'opto-
génétique en clinique. L'essai clinique est en cours pour restaurer la
vision sur des patients atteints de rétinite pigmentaire. Un premier
article dans Nature Medicine, paru en 2021, rapporte cette première
mondiale en décrivant les performances visuelles d'un patient
aveugle.

Les innovations issues des équipes de recherche sont systémati-
quement protégées. Cette politique se traduit par une moyenne de
huit dépôts de brevets par an. Actuellement, 90 familles de brevets
sont actives.

Depuis le lancement du projet LIFESENSES, huit spin-offs ont été
créées :

Pixium Vision (2012 - Euronext, PIX, FR0011950641) est spécialisé dans
le développement d'implants rétiniens électroniques. Les produits
sont destinés aux personnes ayant perdu la vue suite à des troubles
dégénératifs de l'œil, tels que la rétinite pigmentaire.

Gensight Biologics (2012 - Euronext, SIGHT, FR0013183985) développe
des thérapies géniques pour des maladies de l'œil (neuropathie
optique de Leber et rétinite pigmentaire).

Prophesee (2015) développe et commercialise une caméra neuro-
morphique imitant l'œil et le cerveau humain.

Chronolife (2016) met à la disposition des professionnels de santé un
suivi continu et multiparamétrique des patients et personnes à risque,
afin de faciliter les interventions précoces et garantir un continuum
de soins entre l'hôpital et le domicile.

Tilak Healthcare (2016) crée des jeux mobiles médicaux ludiques des-
tinés au suivi des patients atteints de maladies chroniques.

GrAI Matter labs (2016) a créé le premier Edge processeur d'IA au monde qui exploite des architectures bio-inspirées pour atteindre des temps de latences ultra-faibles, tout en gardant une très faible consommation d'énergie pour des applications de vision industrielle et d'analyse de données venant de différents capteurs.

Sparing Vision (2016) exploite le potentiel de la thérapie génique et de la modification du génome pour apporter une innovation de pointe dans la découverte et le développement de médicaments contre les maladies oculaires.

Sharpeye (2020) développe un appareil d'imagerie optique de l'œil appelé Cell-OCT. L'objectif de cet instrument est d'offrir aux ophtalmo-logistes de multiples spécificités et fonctionnalités facilement acces-sible à partir d'un seul instrument : tomographie grand champ et basse résolution avec l'accès simultané à la haute résolution, tomo-graphie de la rétine et de la cornée, quantification des écoulements sanguins, vitesse, etc.

Gamut Therapeutics (2020) vise à développer des thérapies de méde-
cine régénérative (thérapie génique et/ou cellulaire) avec l'objectif de
redonner une sensibilité à la lumière aux rétines de patients atteints
de maladies cécitantes à des stades avancés.

## LIFESENSES

Début du projet : avril 2011 |

Durée : 8,5 ans | Financement France

2030 : 22 000 000 €

### Partenaires

Fondation Voir et Entendre | Centre
hospitalier national d'ophtalmologie
des Quinze-Vingts | Sorbonne Université |
Institut Pasteur

## LIGHT4DEAF

Début du projet : novembre 2015 |

Durée : 6 ans | Financement France

2030 : 9 500 000 €

### Partenaires

Fondation Voir et Entendre | Centre
hospitalier national d'ophtalmologie des
Quinze-Vingts | Sorbonne Université |
Institut Pasteur | GENSIGHT-BIOLOGICS |
AP-HP | Fondation Maison des sciences
de l'Homme | Fondation agir pour
l'audition | Université de Clermont-
Auvergne | Office National d'études et
de recherches aérospatiales (ONERA) |
Inserm | Université Paris-Cité

## FORESIGHT

Début du projet : janvier 2019 |

Durée : 9,5 ans | Financement France

2030 : 50 000 000 €

### Partenaires

Fondation Voir et Entendre | Centre
hospitalier national d'ophtalmologie
des Quinze-Vingts | Sorbonne Université |
AP-HP | Inserm | CEA Paris | Fondation
ophtalmologique Adolphe de Rothschild

### Coordination

José-Alain Sahel - Fondation Voir et
Entendre - j.sahel@gmail.com
https://www.ihu-france.org/fr/ihu-
foresight/
# MECANO
## Mécanismes des encéphalites auto-immunes

RHU | 2018

# BETPSY
## Biomarqueurs des encéphalites auto-immunes et des syndromes neurologiques paranéoplasiques

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### Rappel des objectifs

Les encéphalites autoimmunes (EA) et les syndromes neurologiques paranéoplasiques (SNP) sont des maladies neuro-immunes rares pour lesquelles il existe un large panel de présentations cliniques, rendant le diagnostic particulièrement difficile.

Bien que rare, le diagnostic de ces maladies est essentiel car les patients peuvent être guéris par une immunothérapie appropriée. Sans traitement, les décès sont fréquents.

Ces syndromes sont caractérisés par la présence dans le sérum et le liquide céphalorachidien d'auto-anticorps spécifiques et qui peuvent servir de biomarqueurs de la maladie. Cependant, dans plusieurs cas hautement suspects d'EA ou de SNP, aucun auto-anticorps spécifique n'a, pour l'instant, été identifié, menant souvent à une prise en charge inappropriée. De plus, les mécanismes exacts de ces maladies restant inconnus, les traitements actuels ne sont pas optimaux, voire dans certains cas inefficaces. Dans certains cas, des processus immunitaires délétères sont déclenchés par la présence d'une tumeur. On parle alors de SNP.

Le projet MECANO réunissait une équipe clinique lyonnaise de neurologie labellisée Centre maladies rares et spécialisée dans la prise en charge des EA, et trois équipes de neurobiologie spécialisées dans l'étude des mécanismes moléculaires de la fonction neuronale et disposant d'outils de pointe pour étudier l'effet des auto-anticorps sur le neurone (Lyon, Paris, Bordeaux). Notre premier objectif était de caractériser leurs rôles pathologiques spécifiques et décrypter les effets aigus et chroniques du NMDAR-Abs sur les propriétés biophysiques et structurelles du récepteur NMDA, la plasticité synaptique, la morphologie neuronale et les performances cognitives. Ce projet devait fournir des informations clés sur les effets des auto-anticorps des patients sur la dynamique cellulaire et la régulation des protéines ou des récepteurs synaptiques et sur les cascades moléculaires activées au cours du dysfonctionnement de la synapse. Nous devions étudier comment la liaison des auto-anticorps était susceptible de modifier l'activité des récepteurs, modifier la mobilité des récepteurs de surface et réguler de manière dynamique la maturation des synapses et des circuits neuronaux. À cette fin, nous souhaitions utiliser une combinaison unique d'imagerie à haute résolution (suivi d'une seule nanoparticule), d'ingénierie des récepteurs, d'électrophysiologie cellulaire, d'approches informatiques (modélisation structurelle) et de biologie cellulaire et moléculaire et, enfin, de tests de comportement.

Le projet BETPSY a pour objectif d'identifier de nouveaux biomarqueurs sériques et génétiques dans les EA et SNP afin de produire des outils de diagnostic et créer de nouvelles stratégies pour l'étude des mécanismes de ces maladies. BETPSY consiste également en la conception de modèles animaux, qui permettront d'identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques et de comprendre les mécanismes pathophysiologiques de ces maladies neuro-immunes.

### Résultats majeurs

Le projet MECANO a permis l'identification de trois nouveaux biomarqueurs des encéphalites auto-immunes et de préciser les caractères cliniques des patients. Un brevet est déjà accepté (TRIM 9, TRIM67) et est en cours de négociation avec un industriel et un autre brevet est en cours de rédaction. 18 articles scientifiques ont été publiés. Le projet nous a permis de mieux comprendre l'hétérogénéité des patients et le rôle différent que pouvaient avoir les auto-anticorps en fonction de la cible reconnue. Nous avons pu montrer l'effet des auto-anticorps anti-CASPR2 sur les interactions protéines/protéines.

Le projet BETPSY a permis de doubler le nombre total d'échantillons biologiques collectés par an au sein du centre de référence (185 en 2018 contre 358 en 2021) dont la base de données compte actuellement 4 050 patients.

Notre collaboration avec l'entreprise Euroimmun a permis d'améliorer la spécificité et la sensibilité de certains tests de diagnostic commerciaux en diminuant la proportion de faux positifs, permettant ainsi de meilleurs résultats diagnostiques (certains tests commerciaux avaient 93% de faux positifs). L'utilisation de nos cohortes a abouti à une meilleure caractérisation clinique de certains groupes de patients atteints d'EA ou de SNP associés à des auto-anticorps nouvellement décrits dont les résultats ont été publiés dans des journaux internationaux. Suite à nos travaux publiés sur la caractérisation des carcinomes ovariens associés à un SNP, nous avons étudié les altérations génétiques conduisant à la rupture de la tolérance immune des tumeurs du sein et du poumon à petites cellules associées à un SNP. Ces travaux ont démontré que les mécanismes de dégradation immunitaire varient en fonction de la tumeur et des auto-anticorps associés.

L'utilisation de modèles animaux pour décrypter le rôle des cellules B et T et identifier les antigènes capables de dégrader le système immunitaire progresse malgré l'impact de la Covid-19.

La qualité de ce travail conduit à la multiplication des invitations pour des communications orales à des congrès internationaux et au développement de nouvelles collaborations internationales (Mayo-Clinic, UCSF, Stanford, Oxford University, etc.), ainsi que l'obtention récente d'une bourse européenne pour le projet SAPIENCE.

### Production scientifique et valorisation

#### MECANO

Le projet MECANO a été un succès sur l'aspect clinique et translationnel avec la production de 18 articles scientifiques (la plupart dans des revues scientifiques d'**impact factor** supérieur à 10), quatre articles de revues et un commentaire d'article, un dépôt de brevet (PCT/EP2019/061280) et le démarrage des interactions avec des industriels qui ont conduit au succès à l'appel d'offre RHU4 pour le projet BETPSY.

L'impact est majeur car nous avons développé trois nouveaux biomarqueurs qui sont maintenant utilisés en clinique et un quatrième devrait voir le jour prochainement.
De plus, le projet MECANO nous a permis d'augmenter notre expertise et développer des modèles animaux et cellulaires qui sont maintenant parfaitement maîtrisés et qui nous ont permis d'obtenir le projet BETPSY.

## BETPSY

Les deux premières années du projet BETPSY ont été très productives avec une vingtaine d'articles scientifiques et une quinzaine de revues publiées dans des journaux internationaux de haut rang et un dépôt de brevet concernant la découverte d'un nouvel anticorps (PCT/EP2021/075239 : Anti-argonaute protein autoantibodies as biomarkers of autoimmune neurological diseases).

Nous avons élargi le réseau français de collecte d'échantillons biologiques et de données cliniques de patients atteints d'EA et de SNP, ce qui nous a permis de construire la plus grande collection mondiale d'échantillons dont la collection de blocs tumoraux (plus de 200 tumeurs fixées) et d'ADN.

Grâce au projet BETPSY, nous avons pu développer une première version de la nouvelle base de données en lien avec la base des Hospices civils de Lyon qui reprend les données des 4 050 patients. Nous avons décrit de nouveaux syndromes cliniques et nous comprenons mieux les facteurs génétiques associés à ces maladies.

## Publications

Muñiz-Castrillo S., et al. (2021) Distinctive clinical presentation and pathogenic specificities of anti-AK5 encephalitis, Brain: a Journal of Neurology, 144(9), pp. 2709-2721.
https://doi.org/10.1093/brain/awab153

Muñiz-Castrillo S., et al. (2020) Anti-CASPR2 clinical phenotypes correlate with HLA and immunological features, Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 91(10), pp. 1076-1084.
https://doi.org/10.1136/jnnp-2020-323226

Vogrig A., et al. (2020). Central nervous system complications associated with immune checkpoint inhibitors, *Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry*, 91(7), pp. 772-778.
https://doi.org/10.1136/jnnp-2020-323055

Saint-Martin M., et al. (2019) Impact of anti-CASPR2 autoantibodies from patients with autoimmune encephalitis on CASPR2/TAG-1 interaction and Kv1 expression, *Journal of Autoimmunity*, 103, p. 102284.
https://doi.org/10.1016/j.jaut.2019.05.012

Joubert B., et al. (2016) Characterization of a Subtype of Autoimmune Encephalitis With Anti-Contactin-Associated Protein-like 2 Antibodies in the Cerebrospinal Fluid, Prominent Limbic Symptoms, and Seizures, JAMA Neurology, 73(9), pp. 1115-1124.
https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2016.1585

### MECANO

Début du projet : décembre 2014 |

Durée : 60 mois |

Financement ANR : 561 138 €

### Partenaires

Hospices civils de Lyon | Institut de biologie de l'École normale supérieure (IBENS) | Institut interdisciplinaire des neurosciences de Bordeaux

### BETPSY

Début du projet : décembre 2019 |

Durée : 60 mois | Financement

France 2030 : 7 381 509 €

### Partenaires

Hospices civils de Lyon | Université Claude Bernard Lyon 1 | Euroimmun | Institut du cerveau et de la moelle épinière (ICM) | Inserm, Délégation régionale Occitanie-Pyrénées | Centre Léon Bérard, Lyon

### Coordination

Jérôme Honnorat - CHU de Lyon -
jerome.honorat@chu-lyon.fr
# MicroKin

## Deciphering the multifaceted pathways underlying MCPH pathogenesis in the mouse and human

### Rappel des objectifs

Les microcéphalies, associées à une diminution de la taille du cerveau d'au moins trois déviations standard, entraînent des retards mentaux plus ou moins sévères et affectent 2% de la population globale. Elles partagent diverses origines : syndromique ou non syndromique, génétique ou environnementale (exposition à des virus, drogues ou alcool). Quelle que soit leur origine, les microcéphalies résultent principalement d'un déficit de production de neuroprogéniteurs et, par conséquent, de neurones dans le néocortex. Les mécanismes sous-jacents à ces déficits étant partiellement identifiés, le projet MicroKin visait à en élargir le spectre et à mieux comprendre l'étiologie de ces maladies du développement cérébral. Bénéficiant d'expertises complémentaires, notre projet a tiré parti de MCPH (microcéphalies génétiques congénitales non syndromiques) pour mettre au jour de nouveaux mécanismes qui régulent l'homéostasie des progéniteurs au cours de la néocorticogenèse, et comprendre comment leur altération peut conduire à des microcéphalies. La caractérisation d'interactions fonctionnelles entre certaines protéines MCPH recrutées au centrosome et des kinases régulatrices du cycle cellulaire, et l'identification de nouveaux facteurs moléculaires impliqués dans les déficits de production de progéniteurs, y compris en rapport avec le métabolisme cellulaire, ont effectivement ouvert de nouvelles voies vers la compréhension des réseaux fonctionnels influençant la croissance néocorticale.

### Résultats majeurs

Nos analyses transcriptomiques et fonctionnelles ont identifié de nouveaux facteurs impliqués dans le contrôle de la prolifération des progéniteurs néocorticaux, en rapport avec la matrice extracellulaire, tel que Plekha7, ou bien exprimés spécifiquement chez l'humain, tels que NOTCH2-NL et ARHGAP-11B. De plus, nous avons montré que les protéines MCPH CDK5RAP2/CEP135 et les kinases du cycle cellulaire PLK1/AURORA A favorisent respectivement des divisions cellulaires symétriques et asymétriques en contrôlant le mode de duplication du centrosome et influencent ainsi différemment l'homéostasie des neuroprogéniteurs. De manière inattendue, nous avons révélé que des voies du métabolisme cellulaire, en particulier la glutaminolyse, favorisent la prolifération et la survie des progéniteurs néocorticaux. Notamment, les protéines ARHGAP11B et MCPH1 localisées à la mitochondrie activent l'activité mitochondriale en stimulant la glutaminolyse et en contrôlant l'homéostasie du calcium mitochondrial. Ces résultats ont ouvert de nouvelles perspectives d'études sur l'implication de déficits métaboliques ou de mutations de gènes du métabolisme sur l'incidence de microcéphalies. Dans ce sens, un nouveau projet ERA-NET Neuron, MEP1cephaly, a été financé à partir de 2022 pour étudier, dans des organoïdes humains orientés vers une différenciation néocorticale, comment le dysfonctionnement de voies métaboliques impacte la prolifération et les régulations épigénétiques au sein des neuroprogéniteurs.

### Production scientifique et valorisation

Suzuki I K., et al. (2018) Human-Specific NOTCH2NL Genes Expand Cortical Neurogenesis through Delta/Notch Regulation, *Cell*, 173(6), pp. 1370-1384.e16.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.03.067

Tavano S., et al. (2018) Insm1 Induces Neural Progenitor Delamination in Developing Neocortex via Downregulation of the Adherens Junction Belt-Specific Protein Plekha7, *Neuron*, 97(6), pp. 1299-1314.e8.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2018.01.052

Namba T., et al. (2020) Human-Specific ARHGAP11B Acts in Mitochondria to Expand Neocortical Progenitors by Glutaminolysis, *Neuron*, 105(5), pp. 867-881.e9.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.11.027

Journiac N., et al. (2020) Cell Metabolic Alterations due to Mcph1 Mutation in Microcephaly, *Cell Reports*, 31(2), p. 107506.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.03.070

González-Martínez J., et al. (2022) Genetic interaction between PLK1 and downstream MCPH proteins in the control of centrosome asymmetry and cell fate during neural progenitor division, *Cell Death & Differentiation*, 29(8), Art. 8.
https://doi.org/10.1038/s41418-022-00937-w

Début du projet : avril 2016 | Durée : 36 mois |

Financement ANR : 234 572 €

**Partenaires**

Inserm | Université Paris-Cité | Université libre de Bruxelles (Belgique) | Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid (Espagne) | Max-Planck-Institut (MPI), Dresde (Allemagne)

**Coordination**

Pierre Gressens - U 1141 Inserm, Hôpital Robert Debré, Paris - pierre.gressens@inserm.fr - https://www.neurodiderot.com
# MN Progress

## Dissection moléculaire des glomérulopathies extramembraneuses : vers un traitement et une surveillance personnalisés

### Rappel des objectifs

L'objectif de ce projet était l'identification de nouveaux mécanismes génétiques et immunologiques associés à la maladie et à sa récidive sur le greffon.

La glomérulopathie extramembraneuse (GEM) est la cause la plus fréquente de syndrome néphrotique (fuite massive d'albumine dans les urines) chez l'adulte. Elle résulte d'un conflit immunologique dans le glomérule rénal (le rein contient un à deux millions de ces structures filtrantes). Ce conflit induit l'activation d'une cascade de molécules qui forment le système du complément, principal effecteur de la protéinurie. Depuis l'identification récente de l'antigène PLA2R (récepteur de la phospholipase A2), cible du conflit immunologique présente sur le podocyte des glomérules, la GEM est considérée comme le prototype des maladies auto-immunes spécifiques d'organe. Bien qu'une rémission spontanée survienne dans environ 40% des cas, 30% des patients évolueront vers l'insuffisance rénale sévère malgré le traitement immunosuppresseur. Une récidive sur le greffon est observée dans 40% des cas. Le traitement qui utilise des médicaments potentiellement toxiques ou coûteux reste controversé.

La clé d'une prise en charge personnalisée est l'identification des mécanismes pathogéniques et de biomarqueurs robustes, en plus des anticorps anti-PLA2R. Notre objectif est d'approfondir les mécanismes génétiques et immunologiques de la maladie afin de déterminer quels patients traiter, pendant combien de temps, à quel moment les retraiter, et quel est le meilleur donneur en cas de transplantation.

### Résultats majeurs

La forme la plus fréquente étant liée à la production d'anticorps contre l'antigène PLA2R, nous avons séquencé le gène chez une centaine de patients. Nous n'avons pas trouvé de variants communs qui pourraient expliquer le développement d'une réponse auto-immune. Nos recherches génétiques se sont poursuivies dans une cohorte de malades ayant reçu un greffon rénal. Nous avons montré que la récidive sur le greffon était associée à des variants génétiques du locus HLA-D du donneur, ce qui pourrait avoir un impact sur l'éviction des donneurs à risque. En collaboration avec l'équipe italienne de Giuseppe Remuzzi, nous avons montré la valeur pronostique péjorative d'un taux élevé d'anticorps anti-PLA2R au diagnostic et plus encore de leur persistance sous traitement immunosuppresseur, tandis que leur réapparition annonce le plus souvent une rechute. Enfin, nous avons réalisé le premier essai clinique randomisé utilisant un anti-CD20 dirigé contre les lymphocytes B, montant l'efficacité de ce traitement comparé à un traitement symptomatique anti-protéïnique et confirmant que la rémission immunologique précède de plusieurs mois la rémission clinique. Ces résultats sont à l'origine d'un changement de paradigme dans la surveillance des patients et l'ajustement du traitement (revue dans *The Lancet*).

Nous avons également établi un nouvel algorithme pour le diagnostic des formes néonatales causées par une immunisation contre l'endo-peptidase neutre.

### Production scientifique et valorisation

Ces travaux ont été reconnus par des prix des Sociétés européenne et japonaise de néphrologie.

Dahan K., et al. (2017) Rituximab for Severe Membranous Nephropathy: A 6-Month Trial with Extended Follow-Up, *Journal of the American Society of Nephrology*, 28(1), pp. 348-358.
https://doi.org/10.1681/ASN.2016040449

Ruggenenti P., et al. (2015) Anti-Phospholipase A2 Receptor Antibody Titer Predicts Post-Rituximab Outcome of Membranous Nephropathy, *Journal of the American Society of Nephrology*, 26(10), pp. 2545-2558.
https://doi.org/10.1681/ASN.2014070640

Ronco P., et al. (2015) Pathophysiological advances in membranous nephropathy: Time for a shift in patient's care, *Lancet (London, England)*, 385(9981), pp. 1983-1992.
https://doi.org/10.1016/S0140-6736(15)60731-0

Debiec H., et al. (2014) Allo-immune membranous nephropathy and recombinant aryl sulfatase replacement therapy: A need for tolerance induction therapy, *Journal of the American Society of Nephrology*, 25(4), pp. 675-680.
https://doi.org/10.1681/ASN.2013030290

Coenen M. J. H., et al. (2013) Phospholipase A2 Receptor (PLA2R1) Sequence Variants in Idiopathic Membranous Nephropathy, *Journal of the American Society of Nephrology*, 24(4), pp. 677-683.
https://doi.org/10.1681/ASN.2012070730

Début du projet : octobre 2012 | Durée : 36 mois |

Financement ANR : 327 600 €

### Partenaires

Division of Nephrology and Dialysis, Children's Hospital
Bambino Gesù, Rome (Italie) | Mario Negri Institute,
Bergame (Italie) | Radboud UMC (Pays-Bas)

### Coordination

Pierre Ronco et Hanna Debiec – UMR_S 1155 Inserm,
Sorbonne Université – pierreronco@yahoo.fr
# NeurATRIS

## Infrastructure de Recherche Translationnelle pour les Biothérapies en Neurosciences

### Rappel des objectifs

Les maladies neurodégénératives (MND) représentent un enjeu médical et sociétal majeur. Faute de traitements curatifs et du fait du vieillissement de la population, la prévalence des troubles neurologiques ne cesse d'augmenter dans la population mondiale. C'est dans ce contexte que l'infrastructure de recherche nationale NeurATRIS a été créée en 2012, dans le but d'accélérer la transformation des découvertes issues de la recherche fondamentale en innovations médicales pour le traitement des maladies neurodégénératives et neurodéveloppementales.

Son objectif est de proposer un continuum d'expertises translationnelles allant des modèles cellulaires *in vitro* aux essais cliniques de phase 2 sur des patients atteints de pathologies cérébrales majeures, telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson, la sclérose en plaques, certaines maladies neurodéveloppementales ou encore des pathologies neurologiques dites « rares », telles que la maladie de Huntington (MH) ou la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Organisée en réseau à guichet unique, NeurATRIS coordonne les activités et le développement technologique au service des communautés scientifiques et industrielles, en simplifiant l'accès et l'utilisation d'installations de haut niveau. Elle favorise également la participation des acteurs français aux initiatives européennes grâce à son appartenance à l'infrastructure européenne de médecine translationnelle EATRIS-ERIC.

NeurATRIS est une infrastructure distribuée qui regroupe sept hôpitaux et instituts de recherche publics et dont l'expertise et les compétences en neuro-imagerie, pharmacologie et biothérapies sont complémentaires et reconnues au niveau international. Cette synergie, renforcée par une localisation essentiellement en Île-de-France à l'exception d'une composante nantaise, répond pleinement aux besoins de découverte, de caractérisation et de validation de nouvelles cibles thérapeutiques, ainsi qu'à celui de l'identification et de la validation de nouveaux biomarqueurs. Elle permet également d'établir des collaborations avec des partenaires universitaires et privés en mettant à disposition de ceux-ci des services de pointe reposant sur un ensemble d'expertises technologiques, scientifiques, méthodologiques et stratégiques indispensables dans la chaîne de valeur des activités de recherche translationnelle en neurosciences.

NeurATRIS œuvre ainsi à identifier les obstacles scientifiques et techniques rencontrés en recherche translationnelle et tente de développer les méthodes permettant de les surmonter. Un de ses principaux objectifs est de renforcer l'innovation en recherche translationnelle par la mise en œuvre de quatre axes de recherche ou *work packages* spécifiques décrits ci-dessous.

### Résultats majeurs

**Thérapie cellulaire.** L'essai clinique MIG-HD a permis de démontrer la faisabilité et l'efficacité thérapeutique potentielle, mais aussi les limitations d'une transplantation intracérébrale de neurones fœtaux chez des patients atteints de MH (Bachoud-Lévi et al., 2020). Afin de préparer le remplacement des neurones fœtaux humains par des cellules iPS humaines, une étude menée chez le singe modèle de la MH a, quant à elle, montré qu'une compatibilité immunologique parfaite (autogreffe ou allogreffe) ne permet pas de s'affranchir à long terme des traitements immunosuppresseurs permettant de garantir la survie des cellules greffées (Aron Badin et al., 2019). Nous avons également contribué au développement d'une méthode de conversion des fibroblastes humains en oligodendrocytes myélinisants, une perspective thérapeutique intéressante pour la SLA (Chanoumidou et al., 2021).

**Thérapie génique.** Grâce à un nouveau vecteur capable de cibler les oligodendrocytes, le nœud Bicêtre a fourni une preuve de concept robuste chez le primate permettant d'envisager des applications de thérapie génique contre l'adrénomyéloneuropathie (AMN), mais aussi d'autres maladies démyélinisantes (Ozgür-Gunes, 2022). Enfin, dans le cadre d'un essai clinique de phase 3 (Hoffmann-La Roche), les nœuds Mondor et ICM ont participé à l'évaluation chez des patients MH d'une thérapie génique de « silencing » utilisant un oligonucléotide anti-sens.

**Évaluation in vivo et efficacité thérapeutique.** Des travaux récents de NeurATRIS en neuro-imagerie ont montré que l'imagerie CEST du glutamate permet d'identifier à un stade précoce une atteinte des faisceaux de fibres myélinisées chez des animaux modèles de la MH (Pépin et al., 2020 ; Pérot et al., 2020). Cette observation préclinique originale a permis, depuis, de confirmer l'atteinte précoce du corps calleux chez les patients MH. Sur le plan clinique, des travaux du nœud Mondor ont également permis de valider de nouveaux tests cognitifs fondés sur l'identification de marqueurs vocaux et de nouvelles tâches cognitives. Ces tests, évalués chez les patients MH, ont démontré leur sensibilité pour un suivi quantitatif de l'évolution de la maladie. À l'insitar de l'IRM, différents radiotraceurs TEP développés pour la détection précoce de la neuro-inflammation ont été évalués au stade préclinique (Van Camp et al., 2020) et clinique.

**Thérapies médicamenteuses.** L'ICM a développé des inhibiteurs de la kallicréine 6 permettant de traiter les maladies à composantes démyélinisantes (Brevet et publication en collaboration avec Pr El Amri, IBPS). En utilisant une combinaison de deux modèles de (re)myélinisation chez la souris et chez le Xénope, le nœud ICM a également démontré qu'un inhibiteur de la Bruton's tyrosine kinase favorisait la remyélinisation. Le criblage d'une librairie de 274 molécules candidates a permis de sélectionner de nouveaux *leads* capables de promouvoir la différenciation des oligodendrocytes et la myélinisation.

### Production scientifique et valorisation

Aron Badin R., et al. (2019) MHC matching fails to prevent long-term rejection of iPSC-derived neurons in non-human primates, *Nat Commun*, 10(1), art. 4357.

https://doi.org/10.1038/s41467-019-12324-0

Bachoud-Lévi A.-C., on behalf the Multicentric Intracerebral Grafting in Huntington's Disease Group (2020) Human Fetal Cell Therapy in Huntington's Disease: A Randomized, Multicenter, Phase II Trial, *MoV Dis*, 35(8), pp. 1323-35.

https://doi.org/10.1002/mds.28201

Bougnères P., et al. (2021) Long-term follow-up of hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy, *Hum Gene Therapy*, 32(19-20), pp. 1260-1269.

https://doi.org/10.1089/hum.2021.053

Chanoumidou K., et al. (2021) One-step Reprogramming of Human Fibroblasts into Oligodendrocyte-like Cells by SOX10, OLIG2, and NKX6.2, *Stem Cell Reports*, 16(4), pp. 771-783.

https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2021.03.001

Mevel M., et al. (2020) Chemical Modification of the Adeno-Associated Virus Capsid to Improve Gene Delivery, *Chem Sci*, 11(4), pp. 1122-1131.

https://doi.org/10.1039/c9sc04189c
Özgür-Günes Y., et al. (2022) Long-Term Disease Prevention with a Gene Therapy Targeting Oligodendrocytes in a Mouse Model of Adrenomyeloneuropathy, *Human Gene Therapy*, 33(17 18), pp. 936-949.
https://doi.org/10.1089/hum.2021.293

Pépin J., et al. (2020) Complementarity of GluCEST and 1 H-MRS for the Study of Mouse Models of Huntington's Disease, *NMR Biom*, 33(7), e4301.
https://doi.org/10.1002/nbm.4301

Pérot J.-B., et al. (2022) Longitudinal multimodal MRI characterization of a knock-in mouse model of Huntington's disease reveals early gray and white matter alterations, *Hum Mol Genet*, 31(21), pp. 3581-3596.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddac036

Van Camp N., et al. (2020) Assessment of Simplified Methods for Quantification of [18F]-DPA-714 Using 3D Whole-Brain TSPO Immunohistochemistry in a Non-Human Primate, *J Cereb Blood Flow Metabol*, 40(5), pp. 1103-1116.
https://doi.org/10.1177/0271678X19859034

Début du projet : juillet 2012 | Durée : 12,5 ans |
Financement France 2030 : 31 300 000 €

Partenaires

CEA, Fontenay-aux-Roses | Institut du cerveau et de la moelle épinière (ICM) | Université Paris-Est-Créteil-Val-de-Marne | INRAE, Centre Pays-de-la-Loire | AP-HP | Inserm

Coordination

Philippe Hantraye - MIRCen, CEA Fontenay-aux-Roses -
philippe.hantraye@cea.fr
www.neuratris.com
# NS-EuroNet
## European network on Noonan syndrome and related disorders

### Rappel des objectifs

Les RASopathies sont parmi les plus fréquentes des maladies rares affectant le développement. Elles rassemblent le syndrome de Noonan (SN) et un nombre croissant de syndromes apparentés dont le mécanisme physiopathologique commun est l'activation anormale de la voie RAS suite à la mutation d'un composant ou d'un régulateur de cette voie majeure de signalisation. Outre des particularités faciales caractéristiques, les sujets atteints présentent, à des degrés variables, un retard de croissance, des cardiopathies, des défauts cognitifs, des désordres squelettiques et hématologiques, et une prédisposition à certains cancers et hémopathies malignes. Nos objectifs ont été d'explorer les bases moléculaires des RASopathies en identifiant de nouveaux gènes candidats, de comprendre la pathogenèse, de tester des drogues ciblées en utilisant des modèles complémentaires in silico, in vitro et in vivo, et de fournir des données d'épidémiologie moléculaire précises permettant de définir des corrélations géotype/phénotype afin d'aider les cliniciens à poser un diagnostic rapide.

### Résultats majeurs

Une approche combinée gène candidat et WES a permis d'identifier de nouveaux gènes de RASopathie (par exemple RRAS2, GTPase de la superfamille RAS), ainsi que de nouveaux gènes candidats.

Les études fonctionnelles ont permis de mieux comprendre la physiopathologie et ont fourni des informations sur la variabilité clinique associée aux mutations, leur spectre moléculaire et leur impact. Le partage des cohortes nationales de patients a été fondamental pour établir de nouvelles corrélations génotypes/phénotypes concernant des conditions extrêmement rares (par exemple SOS2/anomalies lymphatiques, MRAS/cardiomyopathies).

Des modèles in vitro et in vivo ont été élaborés pour analyser certaines manifestations cliniques et tester des composés thérapeutiques.

Une lignée de poissons-zèbres exprimant une mutation de Ptpn11 a permis de reproduire les symptômes du SN. Ces poissons présentaient des anomalies hématopoétiques rappelant la leucémie observée chez certains patients. L'analyse des cellules souches et progénitrices hématopoétiques mutées a révélé un profil inflammatoire similaire à celui des patients atteints de leucémie, ouvrant ainsi des pistes thérapeutiques nouvelles.

Un modèle de souris de SN a permis d'explorer les altérations métaboliques (par exemple : anomalies du tissus adipeux) et de montrer que les anomalies du métabolisme du glucose et la résistance à l'insuline associés au SN étaient la conséquence d'un état inflammatoire des tissus métaboliques lié à un dysfonctionnement des macrophages.

### Production scientifique et valorisation

Solman M., et al. (2022) Inflammatory response in hematopoietic stem and progenitor cells triggered by activating SHP2 mutations evokes blood defects, *ELife*, 11, e73040.

https://doi.org/10.7554/eLife.73040

Paccoud R., et al. (2021) SHP2 drives inflammation-triggered insulin resistance by reshaping tissue macrophage populations, *Science Translational Medicine*, 13(591), eabe2587.

https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abe2587

Motta M., et al. (2020) Activating MRAS mutations cause Noonan syndrome associated with hypertrophic cardiomyopathy, *Human Molecular Genetics*, 29(11), pp. 1772-1783.

https://doi.org/10.1093/hmg/ddz108

Capri Y., et al. (2019) Activating Mutations of RRAS2 Are a Rare Cause of Noonan Syndrome, *The American Journal of Human Genetics*, 104(6), pp. 1223-1232.

https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2019.04.013

Tajan M., et al. (2018) Noonan syndrome-causing SHP2 mutants impair ERK-dependent chondrocyte differentiation during endochondral bone growth, *Human Molecular Genetics*, 27(13), pp. 2276-2289.

https://doi.org/10.1093/hmg/ddy133

### Essais cliniques

Essai thérapeutique vs placebo de phase 3, randomisé, en double aveugle, visant à tester l'efficacité et la sécurité d'un traitement par simvastatine sur la croissance et les anomalies osseuses chez des enfants atteints du SN (PHRC N°15782601, NCT02713945).

RAS-HEMATO – Étude des anomalies hématologiques des enfants porteurs de RASopathie (EudraCT 2019-A00845-52).

Début du projet : janvier 2016 | Durée : 42 mois |

Financement ANR : 224 824 €

### Partenaires

Istituto Superiore di Sanità, Rome (Italie) | Institute of Human Genetics, Otto-von-Guericke University, Magdebourg (Allemagne) | Institute of Biochemistry & Molecular Biology II, Heinrich-Heine University, Düsseldorf (Allemagne) | Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen, Hubrecht Institute, Utrecht (Pays-Bas)

### Coordination

Hélène Cavé – U 1131 Inserm (Institut de recherche Saint-Louis), Université Paris-Cité, Hôpital Robert Debré (APHP) – helene.cave@aphp.fr |
Armelle Yart – U 1301 Inserm, Toulouse – Armelle.yart@inserm.fr
# OPTOREMODE

## Retinitis Pigmentosa diagnosis and therapy: retinal remodeling and optogenetic reactivation of degenerated retina

### Rappel des objectifs

La cécité peut résulter de la perte de photorécepteurs dans des maladies comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge ou des maladies rares comme la rétinite pigmentaire. Au début de ce projet, les prothèses rétiniennes avaient démontré la possibilité de restaurer la vision chez les patients aveugles atteints de rétinite pigmentaire par stimulation électrique de la rétine résiduelle. En parallèle, la thérapie optogénétique montrait qu'il était possible de restaurer certaines fonctions visuelles chez l'animal aveugle en exprimant soit la channelrhodopsine-2 dans les cellules ganglionnaires rétiniennes ou les cellules bipo-laires ON, soit l'halorhodopsine dans les cônes ayant perdu leur photosensibilité naturelle. La perte des photorécepteurs étant suivie d'une dégénérescence secondaire des neurones de la rétine interne, il était difficile de définir si ce remodelage tissulaire affecterait la restauration visuelle par optogénétique suivant son ciblage cellulaire.

Le projet OPTOREMODE visait à : 1) étudier la perte de vision dans deux modèles animaux classiques de dégénérescence rétinienne, la souris rd1 et le rat P23H ; 2) examiner comment l'activation optogénétique de la rétine dégénérée affecte le remodelage rétinien ; et 3) mesurer l'activité neuronale par électrorétinogramme au cours du processus dégénératif tardif.

Les perspectives étaient de définir le ciblage cellulaire optimal pour restaurer la vision par thérapie optogénétique afin de porter cette nouvelle stratégie en clinique.

### Résultats majeurs

Pour définir le ciblage cellulaire optimal en optogénétique, nous avons étudié l'évolution des performances visuelles de la souris rd1 au cours du processus neurodégénératif des photorécepteurs. La perte du comportement visuel a été mesuré progressivement du vingt-cinquième jusqu'au centième jour de vie, tant par le test optomoteur que par le test de la falaise. Dans ces deux tests, la réduction est progressive entre ces deux stades avec un niveau nul à la fin. Cette perte visuelle a été corrélée anatomiquement avec la perte des cellules photoréceptrices et de leurs contacts synaptiques en ruban. Les tests de comportement ont été adaptés pour la thérapie optogénétique car le niveau de luminance requis pour les opsines microbiennes est bien supérieur aux opsines de mammifères. Ils ont ainsi permis de démontrer une augmentation des performances visuelles à des âges supérieur à 100 jours sur des animaux traités en optogénétique pour la stimulation au niveau soit des photorécepteurs soit des cellules ganglionnaires. L'enregistrement de l'activation de la rétine en optogénétique peut être mise en évidence au niveau du cortex par la mesure d'un potentiel évoqué visuel de courte latence. Enfin, nous avons montré que l'électrorétinogramme mesuré sur les patients avec une dégénérescence des photorécepteurs peut être décomposé selon une transformée discrète en ondelettes pour détecter des signaux au-delà de ce que permettent les mesures et analyses classiques.

### Production scientifique et valorisation

Le projet a permis de développer les approches technologiques pour évaluer l'efficacité de traitements par thérapie optogénétique sur les rongeurs, ouvrant ensuite la voie pour l'évaluation du traitement sur le primate non humain. Les résultats sur l'expression de l'opsine CatCh dans les cellules ganglionnaires de la souris et le primate sont par exemple décrits dans l'article ci-dessous dans lequel le projet OPTOREMODE est remercié :

Chaffiol A., et al. (2017). A New Promoter Allows Optogenetic Vision Restoration with Enhanced Sensitivity in Macaque Retina, *Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy*, 25(11), pp. 2546-2560.

https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.07.011

Obtention d'un financement du projet SightAgain par la Banque publique d'investissement (18 M€).

Essai clinique en cours pour restaurer la vision par thérapie optogénétique sur des patients atteints de rétinopathie pigmentaire : Sahel J. A., et al. (2021) Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy, *Nature Medicine*, 27(7), pp. 1223-1229.

https://doi.org/10.1038/s41591-021-01351-4

Début du projet : mars 2014 | Durée : 48 mois |
Financement ANR : 255 840 €

### Partenaires

Institut de la vision | Max-Planck Institute for Brain Research (Allemagne) | Université d'Alicante (Espagne) | Mac Gill University (Canada)

### Coordination

Serge Picaud – Institut de la vision –
serge.picaud@inserm.fr
https://www.institut-vision.org/fr/
# PREV-DEMALS

## Prédire pour prévenir les démences frontotemporales (DFT) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)

### Rappel des objectifs

Les démences frontotemporales (DFT) sont des maladies rares se manifestant par des troubles cognitivo-comportementaux liés à la neurodégénérescence du cortex frontal et temporal. Elles sont parfois associées à une sclérose latérale amyotrophique (SLA) entraînant une paralysie progressive, rapidement fatale. La principale cause de DFT/SLA est une expansion (GGGGCC)n du gène C9orf72. Des thérapeutiques sont en cours de développement, et seront idéalement administrées aux personnes porteuses de mutation, à la phase présymptomatique (cliniquement silencieuse) de la maladie. Ce projet vise à identifier les premières modifications cérébrales structurelles (IRM), métaboliques (TEP-FDG), et les étapes initiales de la cascade biologique conduisant à la mort neuronale dans les DFT/SLA chez des individus asymptomatiques porteurs d'expansion suivant pendant 36 mois. Cette étude multimodale a combiné des approches classiques d'imagerie (VBM, FLAIR) et des méthodes originales développées récemment pour mesurer la densité de neurites (imagerie NODDI) et détecter des lésions microstructurelles précoces au niveau spinal (DTI médullaire). Le séquençage des microARNs et le dosage des neurofilaments (NfL) dans le plasma ont pu être réalisés grâce à des développements technologiques récents. Les marqueurs biologiques, de neuro-imagerie et cognitifs, issus de ce projet translationnel constitueront des outils indispensables pour initier les thérapeutiques et en mesurer l'efficacité dès la phase présymptomatique.

### Résultats majeurs

Des altérations microstructurelles et cognitives ont été détectées environ 20 ans avant les premiers symptômes. Des modifications du métabolisme cérébral sont encore plus précoces, constituant l'un des marqueurs les plus fiables du début du processus pathologique. Les analyses biologiques dans le plasma ont permis d'élaborer des outils de prédiction de la progression de la pathologie, basés sur le taux annualisé d'augmentation des NfL et une signature transcriptomique de quatre microARNs progressivement dérégulés au cours de la maladie. Ces résultats constituent une avancée importante permettant de modéliser la chronopathologie, et apportent des connaissances fondamentales et cliniques indispensables à l'initiation des essais thérapeutiques dans cette forme génétique. Ils s'intègrent dans un effort international considérable pour définir des marqueurs fiables de la maladie, et positionnent les partenaires de PREV-DEMALS comme leaders internationaux sur cette thématique de recherche, et la France comme l'un des partenaires mondiaux incontournables dans le développement des essais thérapeutiques dans cette forme génétique. Le rôle des partenaires, appelés à participer en tant qu'experts dans des groupes de travail et consortiums internationaux sur la phase présymptomatique, et dans les comités de mise en place des essais thérapeutiques, illustre le positionnement de la France au niveau international dans le développement de ces essais thérapeutiques.

### Production scientifique et valorisation

Bertrand A., et al. (2018) Early Cognitive, Structural, and Microstructural Changes in Presymptomatic C9orf72 Carriers Younger Than 40 Years, *JAMA Neurology*, 75(2), pp. 236-245.
https://doi.org/10.1001/jamaneurol.2017.4266

Querin G., et al. (2019) Presymptomatic spinal cord pathology in c9orf72 mutation carriers: A longitudinal neuroimaging study, *Annals of Neurology*, 86(2), pp. 158-167.
https://doi.org/10.1002/ana.25520

Montembeault M., et al. (2020) Cognitive inhibition impairments in presymptomatic C9orf72 carriers, *Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry*, 91(4), pp. 366-372.
https://doi.org/10.1136/jnnp-2019-322242

Kmetzsch V., et al. (2021) Plasma microRNA signature in presymptomatic and symptomatic subjects with C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis, *Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry*, 92(5), pp. 485-493.
https://doi.org/10.1136/jnnp-2020-324647

Saracino D., et al. (2021) Plasma NfL levels and longitudinal change rates in C9orf72 and GRN-associated diseases: From tailored references to clinical applications, *Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry*, 92(12), pp. 1278-1288.
https://doi.org/10.1136/jnnp-2021-326914

**Début du projet : octobre 2015 | Durée : 48 mois |**

**Financement ANR : 461 573 €**

**Partenaires**

Institut du cerveau et de la moelle épinière (ICM) |
Laboratoire d'imagerie biomédicale (LIB), Sorbonne
Université | CHU Lille | CHU Rouen | CHU Limoges | CIC
Neurosciences et santé mentale | Unité de recherche
clinique du Groupement hospitalier Pitié Salpêtrière

**Coordination**

Isabelle Le Ber - ICM, Groupement hospitalier Pitié
Salpêtrière - isabelle.leber@upmc.fr
# RARE-G

## The Epidermal Growth Factor System in Rare Glomerular Disease: From Molecular Mechanisms to Therapeutics

### Rappel des objectifs

Rare diseases may affect the renal glomerulus, the filter units of the kidney. There are two major forms: crescentic glomerulonephritis (CGN) and primary focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS). Both diseases often lead to chronic loss of renal function and, ultimately, to a life-long need for renal replacement therapy. Such a condition is associated with a significantly increased risk for cardiovascular morbidity and mortality.

In recent years, members of this consortium have contributed to our understanding of these rare glomerular diseases.

We could show that two major cell types, podocytes and parietal epithelial cells (PECs), are crucially involved in the pathogenesis of these diseases. Furthermore, we observed that the epidermal growth factor (EGF) system is probably involved in mediating signals in both types of diseases.

Our goal was then to investigate the functional significance of these cells, their cellular activation, and the role of EGF signaling in these rare severe diseases of the kidney.

### Résultats majeurs

We demonstrated a critical link between podocyte metabolism and inflammation. This enabled us to file a patent and propose a clinical trial to treat CGN patients with a repurposed drug (PHRC-N 2021). The trial will start in January 2023.

Our consortium could also show that a so far unrecognized cell type (parietal cells, PECs) is indeed involved in all forms of FSGS and CGN. Furthermore, we observed that no regeneration of podocytes from these cells (PECs) may occur to replenish essential cells lost in the disease. We proved that *de novo* CD9 expression is crucial in PEC activation and glomerular diseases. We revealed the common pathogenic expression of CD9 implicated in the change of phenotype of PEC and directly drives glomerular injury in both CGN and FSGS. CD9 regulates HB-EGF/EGFR and PDGFR signaling in PECs and ITGB1-mediated PEC migration.

Additionally, these results suggest a novel concept of severe kidney diseases caused by pathogenic PEC recruitment to the glomerular tuft with destructive-oriented migration of these cells to the glomerular capillary.

We showed that these insights may improve diagnostic sensitivity and uncovered novel pathophysiological mechanisms, some being targetable.

At last, the RARE-G project was helpful in generating preliminary data that helped us obtain an ERC-Consolidator grant the following year, an ERC-Proof of Concept grant in 2018, and a national PHRC grant to fund a multicenter trial in 2021.

### Production scientifique et valorisation

Lazareth H., et al. (2019) The tetraspanin CD9 controls migration and proliferation of parietal epithelial cells and glomerular disease progression, *Nature Communications*, 10(1), p. 3303.
https://doi.org/10.1038/s41467-019-11013-2

Henique C., et al. (2016) Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2 Drives Podocyte-Specific Expression of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ Essential for Resistance to Crescentic GN, *Journal of the American Society of Nephrology*, 27(1), pp. 172-188.
https://doi.org/10.1681/ASN.2014111080

Lenoir O., et al. (2014) Direct action of endothelin-1 on podocytes promotes diabetic glomerulosclerosis, *Journal of the American Society of Nephrology*, 25(5), pp. 1050-1062.
https://doi.org/10.1681/ASN.2013020195

### Brevets

Tharaux P.-L., et al. Use of cd9 as a biomarker and as a biotarget in glomerulonephritis or glomerulosclerosis. World Intellectual Property Organization Patent No WO2020245208A1. 2020.

Tharaux P.-L., et al. Methods for the prevention and the treatment of rapidly progressive glomerulonephritis. World Intellectual Property Organization Patent No WO2016071727A. 2016.

Tharaux P.-L., et al. Methods for the Prevention and the Treatment of Extracapillary Glomerulonephritis. Patent No 20160340673. 2016.

Multicenter randomised trial to evaluate the efficacy of pioglitazone to promote RENAI Tolerance in ANCA-associated vasculitis-2022-2025.

Début du projet : mai 2012 | Durée : 36 mois |

Financement ANR : 157 560 €

### Partenaires

Uniklinik, University Hospital of the Aachen Technical University (Allemagne) | Ernst Moritz Arndt University (Allemagne) | Clinical Institute of Pathology of the Medical, University of Vienna, Vienna General Hospital (Autriche)

### Coordination

Pierre-Louis Tharaux - Paris Cardiovascular Research Centre (PARCC), UMR 970 Inserm - pierre-louis.tharaux@inserm.fr
http://parcc.inserm.fr/research-teams/team/tharaux-camerer/
# SightREPAIR

### Validation pré-clinique d'un épithélium pigmentaire rétinien dérivé de cellules souches embryonnaires humaines pour le traitement des rétinopathies

#### Rappel des objectifs

Les maladies qui affectent l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR), parmi lesquelles la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et les rétinopathies pigmentaires (RP), entraînent des pertes sévères et rapides de la vision conduisant jusqu'à la cécité. Alors que la DMLA, qui représente la forme la plus commune de cécité dans les pays occidentaux, semble déclenchée par des causes environnementales et génétiques, les RP sont d'origine monogénique et affectent des populations plus jeunes. Aucun traitement curatif n'est disponible pour ces pathologies. La thérapie génique, qui peut rétablir certaines fonctions des cellules de l'EPR, est rendue difficile par l'hétérogénéité des mutations causales. Le but de notre programme est de développer un produit d'ingénierie tissulaire (PIT) constitué de cellules de l'EPR, dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), polarisées en monocouche sur un substrat biocompatible. Ce médicament de thérapie innovante (MTI) devrait permettre de restaurer la fonction des cellules EPR et prévenir la mort des photorécepteurs.

#### Résultats majeurs

Nous avons, d'une part, optimisé le procédé de fabrication du PIT afin de faciliter son industrialisation selon les Bonnes pratiques de fabrication (BPF). Le deuxième aspect était de valider la fonctionnalité et la tolérance de notre PIT dans des modèles animaux (rongeurs et primates non humains). Nos études préliminaires ayant déjà montré que la transplantation du PIT dans un modèle de RP affectant l'EPR chez le rat (rats RCS) permettait de restaurer la vision en protégeant les photorécepteurs de la mort. Le but était d'estimer les risques de formation de tumeurs associées à une contamination de notre PIT par des CSEh résiduelles, ainsi que la biodistribution et la toxicité de notre produit dans des rongeurs immunodéprimés. Cette étape représentait un prérequis réglementaire avant la première administration à l'humain de notre produit. Nous souhaitions également valider le geste chirurgical ainsi que l'absence d'effets secondaires chez le primate non-humain. Pour finir, le dernier objectif était de transférer l'ensemble des procédures de fabrication et de contrôle vers un établissement pharmaceutique pour la réalisation des banques de cellules de l'EPR et du PIT à usage clinique. L'ensemble des résultats obtenus a permis la rédaction du dossier permettant la soumission du programme devant l'Agence européenne du médicament (AEM) qui a été déposé en juillet 2018. L'essai clinique a été approuvé le 23 janvier 2019 et a démarré le 5 septembre 2019 avec la transplantation de sept patients à ce jour (MTIAECNAT-2018-07-00005, N°EudraCT 2018600457-53).

#### Production scientifique et valorisation

Nos études préliminaires ont montré que la transplantation du PIT dans un modèle de RP affectant l'EPR chez le rat (rats RCS), permettait de restaurer la vision en protégeant les photorécepteurs de la mort (Ben M'Barek K., et al. (2017) Human ESC-derived retinal epithelial cell sheets potentiate rescue of photoreceptor cell loss in rats with retinal degeneration, *Science Translational Medicine*, 9(421), eaai7471, https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aai7471).

Une étude réalisée chez des primates non humains a permis de valider les conditions de préparation du PIT dans un établissement pharmaceutique, son transport et son implantation dans des conditions cliniques. Les résultats ont montré que le PIT est positionné correctement dans l'espace sous-rétinien et n'altère pas la structure et la fonction de la rétine (Ben M'Barek K., et al. (2020) Clinical-grade production and safe delivery of human ESC derived RPE sheets in primates and rodents, *Biomaterials*, 230, p. 119603, https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2019.119603).

I-STEM (Partner 1), en collaboration avec la société MDE (Medical Device Engineering) a mis au point un système permettant l'enrobage du produit en gélatine, son transport et le découpage du patch par le chirurgien dans le bloc juste avant son administration (Brevet national N°18/52114 (12/03/2018)).

L'IDV (Partner 2) a mis au point un système d'injection compatible avec le PIT (en cours de brevetabilité).

Début du projet : juin 2017 | Durée : 54 mois |

Financement ANR : 690 205 €

**Partenaires**

Institut de la vision (IDV) | Banque de tissus humain, AP-HP

**Coordination**

Christelle Montville - I-STEM, UMR 861 Inserm/UEVE - cmonville@istem.fr
www.istem.eu
# SMART-HaemoCare

## Small Antibody Fragment as Alternative Tools in Haemophilia Care

### Rappel des objectifs

The coagulation cascade is a strictly regulated process that ultimately results in the generation of thrombin, an enzyme that is responsible for the formation of a fibrin network at sites of injury. The absence of certain factors that contribute to this process is associated with a strongly reduced thrombin generation, and consequently severe bleeding complications. Among the different bleeding disorders, haemophilia A (caused by a deficiency of coagulation factor VIII) is probably known the most.

Haemophilia patients have commonly be treated by replacement-therapy, in which the missing coagulation factor was infused intravenously. Although effective, this approach is characterized by the need of frequent infusions (up to 3 per week) and the development of neutralizing antibodies. It is not surprising therefore that alternative treatment options have been developed over the last decade. As part of this search for alternative treatment options, the SMART-HaemoCare consortium set out to generate single-domain antibodies against antithrombin, an inhibitor of thrombin and some other coagulation factors.

The underlying hypothesis is that by blocking antithrombin, more thrombin can be generated, and bleeding can be reduced or even prevented. In addition, the use of single-domain antibodies (also known as nanobodies) can be produced relatively cheaply in micro-organisms (in contrast to complex proteins as classic IgG-antibodies) and are expressed efficiently in a gene-therapeutic setting.

### Résultats majeurs

In a consortium consisting of experts in coagulation (Drs Lenting (Inserm, coordinator) and Lillicrap (Queen's University, Canada)) and gene therapy (Drs Mingozzi (Généthon, France) and Grimm (University of Heidelberg, Germany)), we indeed were able to generate a series of single-domain antibodies (sdAbs) targeting antithrombin. In *in vitro* experiments, these sdAbs markedly improved thrombin generation in the absence of factor VIII. *In vivo*, treatment of mice with a factor VIII-deficiency strongly reduced blood loss, underscoring the efficiency of these sdAbs. Also in a gene-therapeutic approach by using Adenovirus-associated virus (AAV)-mediated transgene expression, we observed that unusually high levels of sdAb production could be achieved (up to 2.5 mM). Moreover, the transgene sdAbs targeting antithrombin reduced blood loss, while no neutralizing antibody response against these sdAbs was observed.

As such, our study has provided evidence that anti-antithrombin antibodies can be used as a tool to reduce or prevent bleeding in haemophilia A, either *via* a protein-based approach or *via* gene therapy.

### Production scientifique et valorisation

Barbon E., et al. (2020) Single-domain antibodies targeting antithrombin reduce bleeding in hemophilic mice with or without inhibitors, *EMBO Mol Med*, 12, e11298.

https://doi.org/10.15252/emmm.201911298

A patent related to the anti-antithrombin nanobodies has been filed: Anti-antithrombin single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof WO2017158176 (priority 2016-03-18).

**Début du projet : février 2016 | Durée : 36 mois | Financement ANR : 317 326 €**

**Partenaires**

Dept. of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, Kingston (Canada) | Généthon, UMR_S 951
Inserm | Dept. of Infectious Diseases, Heidelberg University Hospital, Heidelberg (Allemagne)

**Coordination**

Peter Lenting - U 1176 Inserm, Université Paris-Saclay - peter.lenting@inserm.fr
# SPATAX-QUEST

## Identification of new causative genes in spinocerebellar degenerations by combination of whole genome scan, next-generation sequencing and biological validation in vitro and in vivo

### Rappel des objectifs

Les quatre partenaires du projet SPATAX-QUEST, associés aux membres du réseau international SPATAX, avaient pour but d'améliorer la prise en charge diagnostique des patients atteints d'ataxie cérébelleuse ou de paraplégie spastique, des pathologies rares du système nerveux souvent très invalidantes ou fatales. L'objectif principal était donc d'identifier de nouveaux gènes permettant de diminuer l'errance diagnostique chez près de 50 % des patients et de proposer des solutions diagnostiques plus efficaces. Le second objectif était d'identifier des pistes d'intérêt thérapeutiques.

### Résultats majeurs

Les partenaires ont identifié des mutations dans des centaines de gènes connus chez plusieurs milliers de patients grâce à l'utilisation de la nouvelle génération de séquençage, ce qui a permis d'améliorer nos connaissances de leurs fréquences relatives et des spectres mutationnels et cliniques associés. En particulier, plusieurs gènes connus ont vu leur implication étendue à de nouveaux modes de transmission ou à de nouvelles indications cliniques, compliquant encore la nosologie de ces maladies. Un kit de détection de mutations dans les 70 gènes impliqués dans les paraplégies spastiques est désormais utilisé en pratique clinique courante. De plus, grâce à une stratégie d'analyse de l'exome, des mutations dans sept nouveaux gènes ont pu être trouvées et validées fonctionnellement grâce à l'utilisation de modèles cellulaires ou animaux. Enfin, les données fonctionnelles obtenues pour un de ces gènes, SPG11, et l'analyse de cerveaux de patients et de souris modèles ont permis d'identifier un stigmate neuropathologique ouvrant sur une étude préclinique ciblée chez l'animal en collaboration avec une start-up.

### Production scientifique et valorisation

La collaboration entre les quatre partenaires a donné lieu à un brevet déposé et accepté à l'international concernant un ciblage thérapeutique potentiel dans la paraplégie spastique de type SPG11, au développement d'un panel diagnostic de 70 gènes proposé en diagnostic génétique des paraplégies spastiques par les centres de référence de neurogénétique, l'identification de sept nouveaux gènes causaux, plus de 50 communications et 23 publications originales dans des revues internationales à comité de lecture, dont trois en multipartenaires incluant :

Coutelier M., et al. (2015) A Recurrent Mutation in CACNA1G Alters Cav3.1 T-Type Calcium-Channel Conduction and Causes Autosomal-Dominant Cerebellar Ataxia, *American Journal of Human Genetics*, 97(5), pp. 726-737.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2015.09.007

Coutelier M., et al. (2015) Alteration of ornithine metabolism leads to dominant and recessive hereditary spastic paraplegia, *Brain: A Journal of Neurology*, 138(8), pp. 2191-2205.
https://doi.org/10.1093/brain/awv143

Morais S., et al. (2017) Massive sequencing of 70 genes reveals a myriad of missing genes or mechanisms to be uncovered in hereditary spastic paraplegias, *European Journal of Human Genetics: EJHG*, 25(11), pp. 1217-1228.
https://doi.org/10.1038/ejhg.2017.124

Boutry M., et al. (2018) Inhibition of Lysosome Membrane Recycling Causes Accumulation of Gangliosides that Contribute to Neurodegeneration, *Cell Reports*, 23(13), pp. 3813-3826.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.05.098

Coutelier M., et al. (2022) NPTX1 mutations trigger endoplasmic reticulum stress and cause autosomal dominant cerebellar ataxia, *Brain: A Journal of Neurology*, 145(4), pp. 1519-1534.
https://doi.org/10.1093/brain/awab407

Début du projet : mars 2014 | Durée : 40 mois |

Financement ANR : 315 000 €

### Partenaires

Département génomique et physiopathologie des maladies cardiovasculaires, UMR_S 1166 Inserm | Institut ICAN pour le cardiométabolisme et la nutrition, Campus Pitié Salpêtrière

Collaboration avec les laboratoires de David Tregouet et de Jamilé Hazan en France, celui d'Isabel Alonzo au Portugal, ainsi que les membres du réseau SPATAX

### Coordination

Giovanni Stevanin – Institut des neurosciences cognitives et intégratives d'Aquitaine (INCIA), CHU de Bordeaux – giovanni-b.stevanin@inserm.fr
https://spatax.wordpress.com/
# SUMO-ID

## Conséquences fonctionnelles de la SUMOylation de la protéine FMRP
(Fragile X Mental Retardation Protein)

### Rappel des objectifs

Le syndrome de l'X fragile est la forme la plus fréquente de déficience intellectuelle héréditaire. Cette maladie résulte de mutations du gène *FMR1* (*Fragile X Messenger RibonucleoProtein 1*), localisé sur le chromosome X, et se caractérise par une augmentation du nombre de triplets CGG dans la région 5' non codante du gène, ce qui inhibe sa transcription. La protéine correspondante, FMRP, est absente chez les patients X fragile. Le modèle murin mimant la pathologie humaine n'exprime pas FMRP, ce qui induit des anomalies architecturales de la synapse qui sont à l'origine de défauts de connectivité et de troubles cognitifs. FMRP peut lier de nombreux ARNm, et les transporter en inhibant leur traduction jusqu'à la synapse où ils seront libérés en fonction des besoins, en réponse aux variations de l'activité neuronale. Les ARNs liés par FMRP codent pour des protéines impliquées dans la régulation de la morphologie synaptique et les fonctions cognitives. Pour accomplir son rôle, FMRP interagit avec de nombreux partenaires et ses interactions sont régulées par des modifications post-traductionnelles. Le projet SUMO-ID a fait appel à un panel d'approches de pointe allant de la biologie moléculaire à la biochimie synaptique, la pharmacologie ou la microscopie confocale en temps réel, avec pour finalité de comprendre les conséquences fonctionnelles de la modification de la FMRP par la petite protéine SUMO (*Small Ubiquitin like MOdifier*).

### Résultats majeurs

Nous avons tout d'abord montré que la protéine FMRP est un substrat d'une nouvelle modification post-traductionnelle appelée SUMOylation. Cette modification consiste en l'ajout covalent de la petite protéine SUMO sur des résidus lysines spécifiques que nous avons identifiés sur FMRP. Nous avons ensuite démontré que la protéine FMRP est SUMOylée *in vivo* de manière dépendante de l'activité neuronale et en particulier suite à l'activation des récepteurs métaboliques du glutamate de type mGluR5. Nous montrons également que la diffusion synapto-dendritique de l'unique enzyme de conjugaison de la SUMOylation, Ubc9, est directement régulée par l'activation de ces récepteurs mGluR5 via l'activation de la PKC. Cette cascade d'événements se traduit par une augmentation rapide de la SUMOylation des protéines synaptiques et de FMRP. La SUMOylation de FMRP entraîne sa dissociation des granules de transport des ARNm à la base des épines dendritiques, ce qui permet la libération des ARNm liés à FMRP-SUMO directement à la synapse. Ces ARNs sont alors traduits localement en protéines essentielles au processus d'élimination et de maturation des épines dendritiques. Le projet SUMO-ID a non seulement permis d'ajouter un degré supplémentaire de compréhension de la régulation fonctionnelle de la protéine FMRP, mais met également en lumière un rôle important de la SUMOylation dans le contrôle de la maturation neuronale, un processus central du neurodéveloppement.

### Production scientifique et valorisation

Loriol C., et al. (2013) Activity-dependent regulation of the sumoylation machinery in rat hippocampal neurons, *Biology of the Cell*, 105(1), pp. 30-45.

https://doi.org/10.1111/boc.201200016

Gwizdek C., et al. (2013) Protein Sumoylation in Brain Development, Neuronal Morphology and Spinogenesis, *NeuroMolecular Medicine*, 15(4), pp. 677-691.

https://doi.org/10.1007/s12017-013-8252-z

Loriol C., et al. (2014) MGlυ5 receptors regulate synaptic sumoylation via a transient PKC-dependent diffusional trapping of Ubc9 into spines, *Nature Communications*, 5(1), p. 5113.

https://doi.org/10.1038/ncomms6113

Cassé F., et al. (2015) Tracking the activity-dependent diffusion of synaptic proteins using restricted photoconversion of Dendra2, *Frontiers in Cellular Neuroscience*, 9.

https://doi.org/10.3389/fncel.2015.00367

Khayachi A., et al. (2018) Sumoylation regulates FMRP-mediated dendritic spine elimination and maturation, *Nature Communications*, 9(1), p. 757.

https://doi.org/10.1038/s41467-018-03222-y

Effet levier pour l'obtention d'un projet ANR Collaboratif en tant que coordinateur, avec l'UMR 5397 CNRS comme partenaire.

Début du projet : janvier 2012 | Durée : 48 mois |
Instrument : JCJC | Financement France 2030 : 338 578 €

Coordination
Stéphane Martin – Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (IPMC), UMR 7275 CNRS – martin@ipmc.cnrs.fr – https://www.ipmc.cnrs.fr?page=martin