extrêmement diversifié a souvent été ignoré. Doit-on le prendre en compte dans les schémas de sélection ?

L'exposé présentera les différentes origines possibles de cette diversité mais également comment améliorer son utilisation et tentera de répondre à la question de l'importance du microbiome dans les schémas de sélection.

Quelle diversité pour la création variétale ?

La création variétale exploite donc la diversité de la vigne, mais quelle diversité ?

Un principe simple : pour être amélioré, un caractère doit être variable dans l'espèce considérée. Ainsi, les caractères de qualité de la vendange peuvent être sélectionnés chez Vitis vinifera, mais ce n'est pas vers cette espèce que l'on va se tourner pour sélectionner du matériel résistant à l'oïdium ou au mildiou par exemple.

La diversité peut être présente naturellement dans les zones de présence des différentes espèces du genre Vitis. Il faudra alors organiser des prospections pour récupérer cette diversité (Péros et al., 2021). Elle peut aussi être conservée dans les collections de ressources génétiques comme le domaine de Vassal qui héberge plus de 8000 accessions de cépages, hybrides producteurs directs, porte-greffe, lambrusques et espèces de Vitacées (Figure 1). Les 5788 accessions de Vitis vinifera représentent plus de 2500 cépages différents, originaires d'une cinquantaine de pays, soit près de la moitié des cépages existant.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 1. Le CRB-Vigne du Domaine de Vassal et le nombre d'accessions de vignes conservées.</figcaption></figure>

Mais la diversité peut également être créée. La vigne est très hétérozygote, c'est à dire que de nombreuses zones du génome sont différentes sur les deux chromosomes homologues d'une paire. Ainsi, n'importe quel croisement va créer de la diversité (Figure 2). Par ailleurs, n'importe lesquelles des 75 espèces de Vitis Eurasienne, Américaines ou Asiatiques sont inter-fertiles permettant ainsi de croiser toutes ces espèces entre elles.

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 2.** Illustration de la création de diversité par croisement : répartition de l'acidité totale dans une population issue d'un croisement Syrah par Grenache.</figcaption></figure>

Les cépages Grenache et Syrah ont été croisés et les 180 descendants de ce croisement ont été analysés pour la composition des baies, notamment l'acidité totale. On observe une distribution quasi normale de la diversité de ce caractère dans la population, l'acidité totale variant de 320 à 620 milliéquivalents alors que les deux parents présentaient une acidité totale de 370 mEq pour le Grenache et de 470 mEq pour la Syrah.
La variabilité peut également être créée de toute pièce, par l'utilisation des méthodes de génie génétique ou plus récemment de la méthode d'édition des génomes. Ce type de matériel peut cependant se heurter à des réticences du consommateur.

## Comment améliorer l'utilisation de la diversité dans les schémas de sélection ?

Différents développements méthodologiques permettent de mieux exploiter l'utilisation de la diversité génétique et d'accélérer les schémas de sélection.

La sélection assistée par marqueurs moléculaires extrêmement efficace pour aider la sélection de caractères simples a déjà grandement démontré son efficacité pour les facteurs de résistance à l'oïdium et au mildiou, notamment lorsque l'on combine résistances totales et partielles. Les marqueurs peuvent être utilisés aussi bien pour la sélection des parents les plus intéressants que pour une sélection rapide et efficace des descendants d'un croisement. Mais pour des caractères de qualité du raisin et du vin ou d'adaptation aux contraintes abiotiques, plus complexes à prendre en compte dans les schémas de sélection, la sélection assistée par marqueurs classique n'est plus adaptée.

On a alors recours à la sélection génomique, qui permet par exemple de prédire la performance moyenne d'un croisement à partir de la valeur de ses parents (Figure 3) ou de sélectionner les meilleurs descendants sur la base de caractères quantitatifs (Brault *et al.*, 2022).

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 3.** Capacité prédictive de la sélection génomique pour 10 croisements (issus d'un demi-diallèle Syrah, Grenache, Cabernet-Sauvignon, Pinot N, Terret) et 15 caractères différents. Trois scénarios du choix de la population d'entraînement ont été testés. Les capacités prédictives varient selon les caractères et les scénarios : lorsque la population d'entraînement est proche de la population sélectionnée (Scénarios 1a et 1b), la capacité prédictive est meilleure et proche de 1. D'après Brault *et al.* (2022).</figcaption></figure>

## Doit-on prendre en compte la diversité au niveau du microbiome dans les schémas de sélection ?

La vigne, comme tout organisme vivant est en contact avec une extrême diversité de microorganismes présents sur ses organes (on parle de phyllosphère), à l'intérieur de ses organes (ou endosphère) et dans la portion de sol qui touche ses racines (Rhizosphère). Ils forment le microbiome de la vigne, qui varie fortement au cours de la vie de la plante et de son histoire évolutive (Fournier, Pellan *et al.*, 2022).

Nous nous sommes intéressés à la phyllosphère de la feuille et de la baie en considérant 3 paramètres potentiels de variation : l'identité du cépage, l'environnement et l'organe considéré. L'analyse a été réalisée par métagénomique : amplification de la région 16S ribosomique pour les bactéries et de la région ITS2 pour les champignons à partir d'ADN extrait de la surface des feuilles et des baies et séquençage des produits PCR. Nous avons ainsi comparé la phyllosphère de 15 cépages de *Vitis vinifera* (Singh *et al.*, 2018a), puis de diverses espèces de *Vitis* et de Vitacées (*Vitis riparia*, *Vitis pentagona*, *Muscadinia rotundifolia*, *Parthenocissus* ; Singh *et al.*, 2019). Pour étudier l'effet de l'environnement, nous avons étudié la phyllosphère deux années consécutives, à deux dates de récolte dans un même
lieu et pour 5 cultivars (Cabernet- Sauvignon, Chardonnay, Grenache, Syrah et Sauvignon Blanc) dans 3 régions différentes (océanique, continentale, méditerranéenne ; Singh *et al.*, 2018b).

Les compositions du microbiome de la feuille et de la baie sont très différentes quel que soit la saison (Figure 4).

<figure><img src="image_49.png" /></figure>

**Figure 4.** Etude du microbiome bactérien des feuilles (points verts) et des baies (points rouges) de 15 cultivars diversifiés. (A) indices Chao1 de diversité α pour les deux types d'organe et (B) ACP réalisée sur les données globales du microbiome bactérien sur la base des matrices de distance de Bray-Curtis (les taxons avec une variance < 1e-05 ont été éliminés). On observe une différenciation claire des échantillons issus de feuilles et de baies. D'après Singh *et al.*, 2018a.

Enfin, même si dans des conditions environnementales données, un faible effet du génotype de vigne sur la phyllosphère a été observé, le moteur de la composition de la phyllosphère le plus important est l'environnement comme l'illustre la **Figure 5**.

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

**Figure 5.** Abondance différentielle de la composition bactérienne (A) et fongique (B) de la phyllosphère de la feuille entre les 3 zones agroclimatiques pour 5 cépages. Chaque cépage a été analysé 3 fois dans chaque zone. Sur le plan des axes 1 et 2 des ACP, on peut observer un très net regroupement des échantillons en fonction de la zone agroclimatique démontrant un effet majeur de l'environnement sur la composition de la phyllosphère.
Conclusion

La diversité génétique naturelle intraspécifique et interspécifique constitue un réservoir très important pour la création variétale qui exploite cette diversité. Par ailleurs, tout croisement entre deux vignes de la même espèce ou de deux espèces différentes de *Vitis* produira de la diversité exploitable plus ou moins rapidement. Enfin, sans vouloir minimiser l'importance du microbiome, sachant que le moteur majeur agissant sur la composition de la phyllosphère de la feuille et de la baie de raisin est l'environnement, il ne sera pas nécessaire d'en prendre compte dans les schémas de sélection.

Références

Brault, C., Segura, V., This, P., Le Cunff, L., Flutre, T., Francois, P., Pons, T., Peros, J., Doligez, A., (2022). Across-population genomic prediction in grapevine opens up promising prospects for breeding. HORTICULTURE RESEARCH 9. https://doi.org/10.1093/hr/uhac041

Fournier, P. et al. (2022). Chapter Two - The functional microbiome of grapevine throughout plant evolutionary history and lifetime, in: Bohan, D.A., Dumbrell, A. (Eds.), Advances in Ecological Research. Academic Press, pp. 27–99. https://doi.org/10.1016/bs.aecr.2022.09.001

Péros, J.-P., Cousins, P., Launay, A., Cubry, P., Walker, A., Prado, E., Peressotti, E., Wiedemann-Merdinoglu, S., Laucou, V., Merdinoglu, D., This, P., Boursiquot, J.-M., Doligez, A., (2021). Genetic diversity and population structure in Vitis species illustrate phylogeographic patterns in eastern North America. Molecular Ecology 30, 2333–2348. https://doi.org/10.1111/mec.15881

Singh, P., Gobbi, A., Santoni, S., Hansen, L., This, P., Peros, J., (2018a). Assessing the impact of plant genetic diversity in shaping the microbial community structure of *Vitis vinifera* phyllosphere in the Mediterranean. Frontiers In Life Science 11, 35–46. https://doi.org/10.1080/21553769.2018.1552628

Singh, P., Santoni, S., This, P., Peros, J., (2018b). Genotype-Environment Interaction Shapes the Microbial Assemblage in Grapevine's Phyllosphere and Carposphere: An NGS Approach. Microorganisms 6. https://doi.org/10.3390/microorganisms6040096

Singh, P., Santoni, S., Weber, A., This, P., Peros, J., (2019). Understanding the phyllosphere microbiome assemblage in grape species (Vitaceae) with amplicon sequence data structures. Scientific Reports 9. https://doi.org/10.1038/s41598-019-50839-0
# La diversité disponible au niveau clonal et son analyse :
le cas du Merlot

**Victoria SICHEL**<fnref n="1" />, **Gautier SARAH**<fnref n="1" />, **Loic LE CUNFF**<fnref n="2" />,<fnref n="3" />, **Valérie LAUCOU**<fnref n="1" />,⁴, **Catherine ROUX**<fnref n="1" />,⁴, **Patrice THIS**<fnref n="1" />,<fnref n="3" />, **Thierry LACOMBE**<fnref n="1" />,<fnref n="3" />, **Charles ROMIEU**<fnref n="1" />,<fnref n="3" />

**Contact** : charles.romieu@inrae.fr

## Introduction

Second cépage le plus planté au monde et emblématique du vignoble Bordelais, le Merlot s'illustre par ses caractéristiques reconnues pour la production de vin rouge de qualité. Toutefois, son époque de maturité précoce le rend particulièrement sensible au changement climatique. En effet, la concentration en sucre au moment de la récolte détermine le taux d'alcool dans les vins et pour le Merlot ce taux est en augmentation depuis 20 ans. Si ce phénomène a d'abord été bénéfique pour la qualité du vin, il pourrait prochainement atteindre ses limites et finalement affecter le potentiel œnologique. Parmi les nombreux leviers pour s'adapter au changement climatique cette étude s'intéresse plus particulièrement à la diversité au niveau intra-variétal du matériel végétal. Le Merlot provient d'un croisement entre le Cabernet franc (père) et la Magdeleine noire des Charentes (mère). La date d'apparition de ce cépage n'est pas connue mais semble relativement récente comparée à d'autres cépages traditionnels comme le Pinot. Depuis sa création, le Merlot a été largement multiplié végétativement par bouturage et greffage. A partir des années 1970, l'ENTAV (aujourd'hui IFV) et ses partenaires ont sélectionné 12 clones distincts de Merlot agréés sous la marque ENTAV-INRA®. Aujourd'hui, ces sélections sont les plus diffusées mais certains domaines viticoles privés ont également choisi de maintenir une diversité génétique dans leurs propres collections de Merlot. Ces collections privées ne sont pas destinées à la commercialisation car leurs caractéristiques agronomiques n'ont pas été validées par le processus de la sélection clonale et leur origine n'est pas attestée ; ces individus sont ainsi désignés comme « accessions » plutôt que « clones ».

## Matériels et méthodes

Trois années de phénotypage d'une collection privée de 55 accessions et 3 clones commerciaux de Merlot ont permis d'identifier deux accessions extrêmes sur le caractère de la concentration en sucres dans les baies au moment de la vendange. Les extrêmes ont été suivis lors d'une quatrième année de mesures sur un dispositif incluant plusieurs générations de multiplications végétatives (bouturage et greffage) afin de confirmer la stabilité génétique du caractère d'intérêt identifié. Durant cette dernière année de suivi, quatre prélèvements successifs de baies ont alors été effectués au cours du cycle de maturation. Des dosages de sucres (glucose, fructose) et d'acides organiques ont été réalisés sur un fragment de chaque baie individuelle. Ces données ont permis de trier et de sélectionner des baies étant au même stade physiologique de par leur composition. Les baies sélectionnées ont été broyées, leurs ARN extraits et quantifiés par RNAseq. L'analyse bio-informatique des résultats a permis de mettre en évidence les gènes différentiellement exprimés entre les deux accessions extrêmes.

<footnote n="1">¹ AGAP Institut, Univ. Montpellier, CIRAD, INRAE, Institut Agro Montpellier, Montpellier</footnote>

<footnote n="2">² Institut Français de la Vigne et du Vin, Montpellier</footnote>

<footnote n="3">³ UMT Geno-Vigne®, IFV, INRAE, Institut Agro Montpellier</footnote>
# Résultats

## 1- Phénotypage

L'effet « accession » impacte significativement la teneur en sucre des baies au moment de la vendange. La différence moyenne entre les deux extrêmes est de 17g/l de sucres, c'est-à-dire l'équivalent d'un degré alcoolique sur vin fini. En outre, ces premiers résultats montrent des différences significatives sur d'autres caractères liés à l'équilibre physiologique global de la plante. Sont ainsi détectés des corrélations entre la faible concentration en sucre et i) le poids plus élevé d'un sarment, ii) des grappes plus grosses, et iii) un delta C13 plus faible.

## 2- Dosage des sucres et acides sur baies individuelles

L'évolution respective des sucres et de l'aide malique lors de la maturation du raisin a pu être reconstruite en exploitant l'asynchronie des baies individuelles (Figure1). Ces deux accessions sont d'abord proches et la phase d'accumulation de sucre ne semble pas être discriminante. Toutefois, après l'arrêt du chargement du phloème, les deux extrêmes s'éloignent et montrent un comportement différent durant la phase de flétrissement (Figure 1).

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 1. Dégradation du malate en fonction de l'accumulation et de la concentration des sucres au cours de la maturation des baies individuelles de deux accessions extrêmes de Merlot.</figcaption></figure>

## 3- Détection de gènes différentiellement exprimés dans les deux accessions extrêmes

Toutes les baies de raisin d'une même grappe sont asynchrones et ont leur propre rythme de maturation. La sélection de baies individuelles de composition identique permet de comparer les deux accessions à des stades physiologiques équivalents et de s'affranchir des décalages phénologiques qui impactent l'expression de milliers de gènes. Les analyses transcriptomiques ont conduit à la détection de 28 gènes différentiellement exprimés (DEG) entre les deux extrêmes. Les fonctions des DEG identifiés dans cette expérience ne sont pas encore complètement élucidées et semblent être liées à différents aspects de la biologie développementale de la plante. Néanmoins, ces gènes impactent directement ou indirectement le flétrissement des baies de raisin et donc la concentration en sucres au moment de la récolte. La plupart de ces gènes montrent une expression différentielle entre les extrêmes durant toute la période de maturation, depuis la fin du plateau herbacé jusqu'à la phase terminale de flétrissement (Figure 2).
<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>**Figure 2.** Expression du gène *Vitvi15g01710* - *LOC100258557* - *anaphase-promoting complex subunit 11* en fonction de la concentration en sucres pour deux accessions extrêmes de Merlot.</figcaption></figure>

Finalement, l'analyse en composante principale explique 84% des variations d'expression génique entre les échantillons suivant deux axes majoritaires, le premier (68% de variance expliquée) correspondant à *posteriori* à la concentration des sucres, et le second (16% de la variance) à l'expansion ou au flétrissement des baies (figure 3). C'est lors de cette dernière phase que les deux accessions se différencient le plus. L'expression génique vient donc confirmer l'interprétation phénotypique précédente.

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 3.** Analyse en composante principale de l'expression génique globale pour deux accessions extrêmes de Merlot. Chaque point représente une baie unique.</figcaption></figure>

## Conclusion et perspectives

La différence entre les deux accessions de Merlot est significative et équivaut environ à un degré alcoolique dans les vins finis. La phase terminale de flétrissement du raisin qui succède à l'accumulation proprement dite a un impact déterminant sur la concentration finale en sucres dans la vendange et il existe des différences significatives de comportement au niveau clonal à ce stade. Finalement, ce n'est pas une différence d'accumulation en sucres dans les raisins mais plutôt un mécanisme d'adaptation hydrique et photosynthétique global de la plante qui expliquerait cette différence de phénotype. Par la suite, il serait intéressant de mieux comprendre la fonction des gènes différentiellement exprimés qui ont été identifiés dans cette étude et d'utiliser des données de séquençage ADN pour tenter d'identifier des mutations causales responsables de ces différences phénotypiques.
<figure><img src="image_54.png" /></figure>
Responsable Édition

Agnès AGEORGES
UMR SPO
INRAE Montpellier

Contact : ihev-jsvv-contact@supagro.fr

Institut Agro Montpellier - IHEV
Campus de la Gaillarde
2, place Pierre Viala
34060 Montpellier Cedex 2