may increase with the rise of water temperature, due to global warming (Travers et al., 2009, Vezzulli et al., 2015).

In the rearing tanks, the abundance of presumptive cultivable Vibrionaceae appeared to follow a seasonal pattern, with the highest values in August and the lowest in April. On the contrary, there was no clear seasonal pattern in the variation of *V. harveyi* abundance. This difference can be attributed to the divergence between monitoring methods. The real-time PCR method is based on a DNA target and provides an estimation of the quantity of cultivable bacteria, viable but not cultivable (VBNC) bacteria, and residual DNA released by dead bacteria. Quantification by plate count on selective media provides an estimation of the quantity of cultivable bacteria only, and does not allow recovery of VBNC bacteria. However, the quantification of VBNC bacteria in the rearing tanks is of significant importance. In particular, VBNC *V. harveyi* may conserve their pathogenic potential and infect a host when they break dormancy under favorable environmental conditions (Sun et al., 2008). Moreover, VBNC bacteria are more resistant to antibiotics than cultivable bacteria (Ayrapetyan et al., 2015). The major drawback of monitoring *V. harveyi* abundance using real-time PCR is the quantification of residual DNA of dead bacteria. A suitable solution, which could be used in a future study, is the use of propidium monoazide (PMA) real-time PCR (Nocker et al., 2006, Mougin et al., 2019). This method allows the estimation of both cultivable and VBNC bacteria, which may represent potential fish pathogens and zoonotic sources.

Overall, the trend in the abundance of *V. harveyi* in the water of rearing tanks may follow the trend recorded in the water inlets. The water inlets may thus represent a source of contamination for the rearing tanks. Moreover, our work highlighted the presence of Vibrionaceae and *V. harveyi* in biofilms on the concrete walls of the rearing tanks. In particular, biofilms may be a reservoir of potentially pathogenic bacteria in aquaculture facilities (Bourne et al., 2006). Their relative resistance to antibiotics and sanitizers make them more threatening to the aquaculture sector (Karunasagar et al., 1996). In our study, attached cultivable Vibrionaceae were detected from day 42 of the sampling campaign and attached *V. harveyi* was detected from day 56. This delay
in detection can be attributed to high water flow and fish movements in the rearing tanks. A better understanding of biofilm dynamics may help develop non-toxic anti-biofilm compounds or preventive anti-biofilm control measures. Quorum-sensing interfering agents hold promise for developing anti-biofilm therapies (Defoirdt, 2017, Arunkumar et al., 2020). Previous studies have reported that the *Piper betle* ethyl acetate extract (PBE) or citrus limonoids may have anti-biofilm properties against *V. harveyi* (Vikram et al., 2011, Srinivasan et al., 2017). Their quorum-sensing interfering properties can be tested on the pathogenic isolates identified and collected from biofilms in this study. This approach may be the key to designing new control measures that can then be integrated in a preventive holistic strategy including hosts, pathogens, and the environment to control vibriosis.

**5. Conclusion**

In conclusion, the abundance of cultivable Vibrionaceae increased in the rearing tanks during the warm summer months. These bacteria may come from the water inlets, but biofilms may also be a reservoir for potential pathogenic bacteria for seabass. Importantly, several pathogenic bacterial species were isolated from rearing water and biofilm samples: *P. damselae*, *V. alginolyticus*, *V. harveyi*, *V. owensii* and *V. rotiferianus*. Overall, *V. harveyi* is considered as the main pathogen on the fish farm and its constant presence represents a risk for vibriosis outbreaks. The correlation between its abundance and water temperature suggests that this risk may increase with the rise of water temperature, caused by global warming. Moreover, the probability of vibriosis outbreaks may be increased by the presence of *V. harveyi* in biofilms, which may facilitate resistance against antibiotics, water sanitizers, and environmental fluctuations.

Future studies must now assess the pathogenicity of virulence of the isolates collected in this study. The pathogenic strains isolated from biofilms can be then used to study biofilm dynamics and to design and develop anti-biofilm control measures. Because *V. harveyi* affects not only seabass, but also a wide range of crustaceans, mollusks, and fishes, these measures can be then adapted to other aquaculture facilities.
Acknowledgements

Julia Mougin would like to thank the Hauts-de-France Regional Council for its financial support of her PhD studies. This work was funded by the French government and the Hauts-de-France Regional Council as part of the CPER 2014-2020 MARCO project. The authors also thank Aquanord-Ichtus for contributing to the LUVIBAR project, especially Guillaume Tielie, Anabelle Duhamel and Céline Doyen. The authors are also grateful to the REALCAT platform funded by the French National Research Agency (ANR) as part of the ‘Investments for the Future’ expenditure scheme (ANR-11-EQPX-0037), as well as to Egon Heuson for helpful assistance.

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Supplemental data

Supplementary Figure 1. Photographs of the fragments of concrete collected on the fish farm from April to October 2018.

<figure><img src="image_58.png" /></figure>
<table><caption>Supplmentary Table 1. Identification of pathogenic bacteria isolated from the spleens of moribund seabass (Dicentrarchus labrax) on the fish farm in 2018. Two methods were used to identify the isolates: the mreB-targeted real-time PCR specific to Vibrio harveyi the MALDI-TOF MS technique using the Bruker BioTyper ver. 9.0.0.0 database supplemented with the Luvibase database.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Tested strains/Isolates</th><th rowspan="3">mreB-targeted real time PCR, specific to V. harveyi</th><th colspan="2">MALDI-TOF MS</th><th rowspan="3">Assigned species</th></tr><tr><th colspan="2">Bruker + Luvibase databases</th></tr><tr><th>Identification</th><th>log-score</th></tr></thead><tbody><tr><td>10187</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.48</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>10188</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.46</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>10189</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.65</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>10195</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.64</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>10196</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.45</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>11306</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.54</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>11307</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.43</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>3189.4</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.45</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>3193.5</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.50</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>3196.3</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.50</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>8708</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.44</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>9846</td><td>+</td><td>V. harveyi</td><td>● 2.57</td><td>V. harveyi</td></tr><tr><td>5422</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.50</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6515</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.49</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6576</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.48</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6578</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.48</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6632</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.48</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6658</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.41</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6575</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.45</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6656</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.51</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>6882</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.46</td><td>V. anguillarum</td></tr><tr><td>7077</td><td>-</td><td>V. anguillarum</td><td>● 2.42</td><td>V. anguillarum</td></tr></tbody></table>
## 3. Etude préliminaire des capacités d'adhésion et de formation de biofilms

D'après les données collectées lors de la campagne d'échantillonnage, des souches potentiellement pathogènes pour le bar commun, notamment *V. harveyi*, sont capables de former des biofilms sur la paroi des bassins en béton. Ces biofilms peuvent induire une persistance des souches dans les bassins, entraînant un risque de récurrence des épisodes de vibriose au sein de la ferme. Afin de prévenir et de trouver des moyens de lutte contre l'établissement de ces biofilms, il est primordial d'apporter des éléments de compréhension concernant leur dynamique d'adhésion et de formation. Ainsi, lors de ces travaux de thèse, des essais préliminaires ont été réalisés afin de mettre au point un protocole d'étude de la capacité à former des biofilms, dans l'objectif d'étudier les isolats collectés lors de la campagne d'échantillonnage.

### 3.1. Tentative d'étude *in vitro* de formation de biofilms sur béton

Dans un premier temps, nous voulions établir un protocole d'étude haut-débit permettant de traiter un grand nombre d'isolats, dans des conditions similaires à celles rencontrées dans les bassins d'Aquanord-Ichtus. Etant donné que la dynamique de formation de biofilms est étroitement liée aux propriétés de la surface d'adhésion, un protocole de tests *in vitro* de formation de biofilms sur les morceaux de béton, avait été envisagé. L'idée était d'utiliser et d'adapter le protocole mis au point au cours de mon stage de fin d'étude d'ingénieur et publié au cours de cette thèse (Mougin et al., 2019) (Annexe 1, Article 4, p.254). Brièvement, la cinétique de formation de biofilms de *Vibrio cholerae* et *Vibrio parahaemolyticus* sur acier inoxydable a été étudiée avec des points réguliers à 3 h, 24 h et 48 h. Les bactéries viables, VNC et mortes ont été quantifiées par qPCR, les bactéries viables et VNC ont été quantifiées par PMA-qPCR, et enfin les bactéries cultivables ont été quantifiées par méthodes culturales. Pour finir, l'analyse de la structure du biofilm a été réalisée par microscopie à épifluorescence (Imager.Z1, Zeiss) à l'aide du colorant LIVE/DEAD® BacLight™, permettant de distinguer les
bactéries mortes des bactéries viables et VNC. Ce protocole permettait de fournir des informations sur la viabilité des bactéries au cours du développement des biofilms.

Toutefois, lors de l'adaptation de ce protocole pour cette étude, deux problèmes de taille se sont présentés : la stérilisation préalable des morceaux de béton et l'observation au microscope. En effet, la stérilisation du béton par autoclave n'était pas une solution envisageable puisqu'un composant du béton, l'ettringite, se décompose à des températures supérieures à 100 °C, changeant la structure de celui-ci (Zhou et Glasser, 2001, Lv et al., 2015). Des tentatives de stérilisation avaient été réalisées comme décrit dans la publication de Lv et al. (2015). Brièvement, des bains d'éthanol (75 % ou 95 %) successifs ont été effectués (24 h, 48 h, ou 72 h) puis les morceaux de béton ont été placés à 60 °C afin d'éliminer les résidus d'éthanol. Malheureusement, aucune de ces tentatives n'a permis de stériliser ces derniers de manière répétable. De plus, la surface des morceaux de béton étant poreuse et pas totalement plane, il était très difficile d'obtenir une observation nette par microscopie. Nous nous étions alors tournés vers la Microscopie Electronique à Balayage (MEB), mais le temps de préparation des échantillons était finalement un frein à nos essais, d'autant plus que le nombre d'isolats à étudier était très important (1009 isolats).

Par la suite, nous nous sommes donc orientés vers un protocole d'étude, dans des conditions différentes de celles *in vivo*, mais largement détaillé et utilisé dans la littérature : l'étude de la capacité à former des biofilms en microplaques avec marquage au cristal violet.

## 3.2. Quantification relative de la formation de biofilm par coloration au cristal violet

La quantification relative de la formation de biofilm par coloration au cristal violet, dérivée du protocole de Christensen et al. (1985), est considérée comme la méthode de référence pour la caractérisation de la capacité des bactéries à former des biofilms. Le principe de cette méthode repose sur la coloration des bactéries adhérentes par cristal violet (colorant capable de pénétrer la membrane des bactéries et de colorer l'ADN), suivie de la quantification relative de la biomasse
adhérente par mesure d'absorbance du cristal violet. Le protocole développé ici a été mis au point à partir des protocoles de O'Toole (2011), Han et al. (2016) et Song et al. (2017).

Des cultures bactériennes ont été préparées dans un milieu liquide LBS (Luria-Bertani supplémenté avec 20 % NaCl) pendant 24 h à 37 °C. Un lavage a été réalisé par centrifugation (5000 × g, 10 min) et le culot a été repris dans du LBS stérile, afin d'apporter de nouveaux nutriments. Une suspension bactérienne a été préparée, par ajustement de la DO₅₀ à 0,5. Un volume de 200 µL de cette suspension a été déposé dans des puits d'une microplaque 96 puits en polystyrène (Falcon®, transparente, fond plat, non traitée pour la culture cellulaire, stérile). Un volume de 200 µL de milieu de culture liquide LBS stérile a également été déposé en tant que contrôle négatif. La microplaque a été incubée 24 h à 37 °C. La suspension bactérienne a été retirée et trois lavages successifs ont été réalisés avec 200 µL d'eau physiologique stérile, afin d'éliminer les bactéries non adhérées. Après séchage sous hotte aspirante (10 min), un volume de 200 µL de cristal violet à 0,1 % (Conda S.A., Madrid, Espagne) a été ajouté dans chaque puits et la plaque a été incubée 30 min, à température ambiante. Le cristal violet a ensuite été retiré et les puits ont d'abord été lavés par bain d'eau physiologique, puis par ajout de 200 µL d'eau physiologique, afin de retirer l'excédent de cristal violet. Après séchage (45 min), un volume de 200 µL d'éthanol 95 % a été ajouté dans chaque puits afin de solubiliser le cristal violet. Lorsque la solubilisation était totale, la DO₅₀ a été mesurée à l'aide d'un spectrofluorimètre Xenius XC (SAFAS, Monte Carlo, Monaco). La différence entre la DO₅₀ des puits contenant la suspension bactérienne et la DO₅₀ Contrôle du contrôle négatif contenant du LBS seul, a été utilisée afin de caractériser la capacité des souches à former des biofilms. Les critères ont été établis tel que décrit par Song et al. (2017) : pas de formation de biofilms (DO₅₀ < DO₅₀ Contrôle), faible capacité à former des biofilms (DO₅₀ Contrôle < DO₅₀ < 2 × DO₅₀ Contrôle), capacité modérée (2 × DO₅₀ Contrôle < DO₅₀ < 4 × DO₅₀ Contrôle), forte capacité (DO₅₀ > 4 × DO₅₀ Contrôle).

La capacité à former des biofilms a été étudiée pour (i) une souche de *V. harveyi* de collection, (ii) 12 isolats de *V. harveyi* collectés à partir de la rate de poissons moribonds en 2017 (détail des caractéristiques dans le *Chapitre I*) dont 2 souches utilisées pour mettre au point l'auto-
vaccin sur Aquanord-Ichtus en 2018 et (iii) 11 isolats collectés à partir des échantillons de biofilms formés sur les morceaux de béton, récupérés lors de la campagne d'échantillonnage précédemment décrite. Ces derniers ont été sélectionnés afin de couvrir les espèces et les types morphologiques les plus souvent isolés sur Aquanord-Ichtus. Enfin, les souches de *V. cholerae* et *V. parahaemolyticus* de collection, dont la capacité à former des biofilms sur acier inoxydable a été démontrée par Mougin *et al.* (2019), ont été utilisées comme témoins positifs. Les résultats sont présentés dans la Figure 29.

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Figure 29 : Pourcentage relatif de la DO$_{500}$ des puits contenant une suspension bactérienne par rapport à la DO$_{500}$ Contrôle du témoin négatif. Les valeurs indiquées représentent la moyenne de 18 mesures c'est-à-dire de 6 puits pour 3 différentes microplaques, les barres d'erreurs représentent les écarts types. Le signe « ++ » indique une capacité modérée à former des biofilms, « + » indique une faible capacité à former des biofilms, l'absence de marqueur indique que les souches ne sont pas capables de former des biofilms. Le nom des souches marqué par une « * » indique les souches utilisées pour mettre au point l'auto-vaccin sur Aquanord-Ichtus en 2018.</figcaption></figure>

D'après ces résultats, seuls 9 isolats sur 25 testés sont capables de former des biofilms. D'après les critères définis, la capacité à former des biofilms de la souche de collection *V. cholerae* est modérée, alors que celle des 8 autres isolats est faible. Au total, 3 isolats pathogènes pour les poissons et 3 isolats issus d'échantillons de biofilms de la campagne d'échantillonnage sont
capables de former des biofilms. Il est ainsi plausible que les souches pathogènes de poissons persistent dans les bassins d'Aquanord-Ichtus sous forme de biofilms.

Ce protocole est une première approche pour différencier les souches formatrices de biofilm des souches non ou faiblement formatrices. Néanmoins, celui-ci est chronophage et n'est aujourd'hui pas adapté à une étude haut-débit. Il ne pourra donc pas être utilisé afin d'étudier la formation de biofilm de l'ensemble des isolats collectés sur Aquanord-Ichtus. De plus, les critères permettant de caractériser la capacité à former des biofilms (faible, modérée et forte) ne sont pas standardisés et divergent d'une étude à l'autre. Afin de pallier ces différents inconvénients, nous nous sommes donc tournés vers un autre dispositif, le Biofilm Ring Test®, selon un protocole moins chronophage, moins toxique pour l'expérimentateur, standardisé et reproductible (Chavant et al., 2007).

### 3.3. Caractérisation du biofilm grâce au Biofilm Ring Test®

Un partenariat a été mis en place avec l'entreprise BioFilm Control, commercialisant des kits de Biofilm Ring Test®, dans le cadre du projet FEAMP LUVIBAR. Les résultats présentés ici sont issus des données obtenues par l'entreprise.

Le principe du Biofilm Ring Test® (BRT) repose sur la capacité des bactéries à immobiliser des microbilles, sous l'influence d'un champ magnétique. Une suspension bactérienne est préparée avec des microbilles magnétisables et déposée dans les puits d'une microplaque. Celle-ci est incubée puis des mesures d'adhésion sont directement effectuées sans étape de lavage ou de marquage. Pour cela, la microplaque est déposée sur un support aimanté, générant un champ magnétique. Sous l'influence de ce champ, les microbilles libres vont s'agglomérer au centre du puits, entraînant l'apparition d'un spot brun, visible macroscopiquement. À l'inverse, les microbilles immobilisées dans un biofilm ne pourront pas se déplacer, et aucun spot n'apparaîtra. L'analyse d'images par le logiciel BFC Elements® permet ensuite de caractériser l'adhésion des bactéries grâce à un indice de formation de biofilm (BFI). Le principe de ce test est schématisé par la Figure 30.
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Figure 30 : Schéma du principe du Biofilm Ring Test® commercialisé par l'entreprise BioFilm Control®.</figcaption></figure>

Lors de ces travaux, le BRT (BioFilm Control, Saint Beauzire, France) a été utilisé pour étudier la cinétique de formation du biofilm à différents temps : 4 h, 8 h, 24 h, 32 h, 48 h, 72 h, ainsi que la force d'adhésion de celui-ci à 24 h, selon deux protocoles différents.

### Cinétique de formation du biofilm

Des cultures bactériennes ont été préparées dans un milieu liquide LBS (Luria-Bertani supplémenté avec 20 % NaCl) pendant 24 h à 20 °C. Cette culture a été ajustée à une DO₆₀₀ de 1/250 (10⁶ UFC.mL⁻¹). La solution TON0004, contenant des microbilles, a été ajoutée à cette suspension afin d'obtenir une concentration finale de 1 % (v/v). Un volume de 200 µL de cette solution a été déposé dans des puits d'une microplaque 96 puits. Un volume de 200 µL de milieu de culture liquide LBS stérile a également été déposé en tant que contrôle négatif. La microplaque a été incubée à 20 °C pendant 4 h, 8 h, 24 h, 32 h, 48 h ou 72 h. Après incubation, la microplaque a été préparée pour l'étape de lecture. Les puits ont été recouverts de 120 µL de liquide de contraste. La plaque a ensuite été déposée sur le support aimanté pendant 1 min. Le BFI a alors été déterminé grâce au logiciel d'analyse d'images BFC Elements®.
**Caractérisation de la force d'adhésion du biofilm à 24 h** Ce protocole a été mis au point à partir du protocole de Di Domenico et al. (2016), dénommé le clinical Biofilm Ring Test. Des cultures bactériennes ont été préparées dans un milieu liquide LBS (Luria-Bertani supplémenté avec 20 % NaCl) pendant 24 h à 20 °C. Cette culture a été ajustée à une DO₆₀₀ de 0,19 (10⁸ UFC.mL⁻¹). Un volume de 220 µL de cette suspension a été ajoutée à la première ligne de la microplaque, puis des dilutions en séries au dixième (de 10⁻¹ à 10⁻⁶, c'est-à-dire de 10⁷ à 10² UFC.mL⁻¹) ont été réalisées dans du LBS stérile contenant une concentration de 10 µL.mL⁻¹ de la solution TON0004, incluant les microbilles, pour un volume final de 200 µL par puits. Après 24 h d'incubation à 20 °C, l'étape de lecture est réalisée telle que décrite précédemment. Les valeurs de BFI obtenues ont ensuite été utilisées pour déterminer le seuil *cut-off* (BFIc) et le Potentiel de formation du Biofilm (BP) tels que décrits par Di Domenico et al. (2016). Ces valeurs ont alors permis de caractériser la force d'adhésion du biofilm telle que : non productrice de biofilm (BP < 2 BFIc à 10⁻¹), faible (BP > 2 BFIc à 10⁻¹ et/ou 10⁻²), modérée (BP > 2 BFIc à 10⁻³ et/ou 10⁻⁴) et forte (BP > 2 BFIc à 10⁻⁵ et/ou 10⁻⁶).

Grâce à ces 2 protocoles, la cinétique de formation du biofilm et la force d'adhésion à 24 h ont été déterminées pour (i) 3 isolats de *V. harveyi* collectés à partir de rates de poissons moribonds en 2017 (détail des caractéristiques dans le *Chapitre II, Article 1*) et utilisés pour mettre au point l'auto-vaccin sur Aquanord-Ichtus en 2018, (ii) 12 isolats de *V. harveyi* collectés en 2018 à partir de rates de poissons moribonds (détail des caractéristiques dans le *supplemental data* de l'**Article 3**) dont un isolat (10189) a été utilisé pour mettre au point l'auto-vaccin sur Aquanord-Ichtus en 2019 et (iii) 12 isolats de *V. harveyi* collectés à partir des échantillons de biofilms formés sur les morceaux de béton, lors de la campagne d'échantillonnage précédemment décrite.

Ces isolats ont été choisis en fonction de la période d'échantillonnage et de leurs caractéristiques phénotypiques différentes. Ces données sont détaillées dans le Tableau 8.
<table><caption>Tableau 8 : Détail des caractéristiques morphologiques d'isolats collectés à partir de biofilms lors de la campagne d'échantillonnage, menée d'avril à octobre 2018.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Isolat</th><th rowspan="3">Date de collecte</th><th rowspan="3">Origine</th><th rowspan="3">Echantillon</th><th rowspan="3">Identification par MALDI-TOF MS</th><th colspan="5">Morphologie des colonies sur TCBS</th></tr><tr><th>Base de données</th><th>Taille</th><th>Couleur</th><th>Forme</th><th>Halo</th></tr><tr><th>Bruker + Luvibase</th><th>*</th><th></th><th></th><th></th></tr><tr><th></th><th></th><th></th><th></th><th>Identification log-score</th><th></th><th></th><th></th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>361</td><td>16/05/2018</td><td>Bassin 1</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,61</td><td>M</td><td>Jaune clair</td><td>Ronde</td><td>-</td></tr><tr><td>856</td><td>30/05/2018</td><td>Bassin 3</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,52</td><td>G</td><td>Jaune</td><td>Ronde</td><td>-</td></tr><tr><td>422</td><td>13/06/2018</td><td>Bassin 3</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,40</td><td>M</td><td>Vert foncé</td><td>Ronde</td><td>-</td></tr><tr><td>91</td><td>27/06/2018</td><td>Bassin 1</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,37</td><td>G</td><td>Jaune/marron</td><td>Diforme</td><td>-</td></tr><tr><td>506</td><td>11/07/2018</td><td>Bassin 3</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,48</td><td>M</td><td>Vert foncé</td><td>Ronde</td><td>+</td></tr><tr><td>287</td><td>27/07/2018</td><td>Bassin 3</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,60</td><td>G</td><td>Jaune foncé</td><td>Ronde</td><td>-</td></tr><tr><td>765</td><td>08/08/2018</td><td>Bassin 2</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,47</td><td>G</td><td>Vert foncé</td><td>Ronde</td><td>+</td></tr><tr><td>659</td><td>22/08/2018</td><td>Bassin 1</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,53</td><td>M</td><td>Vert clair</td><td>Ronde</td><td>-</td></tr><tr><td>28</td><td>05/09/2018</td><td>Bassin 2</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,40</td><td>M</td><td>Jaune foncé</td><td>Ronde</td><td>+</td></tr><tr><td>961</td><td>19/09/2018</td><td>Bassin 2</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,62</td><td>G</td><td>Jaune</td><td>Ronde, bords irisés</td><td>-</td></tr><tr><td>171</td><td>17/10/2018</td><td>Bassin 1</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,52</td><td>G</td><td>Vert foncé</td><td>Ronde</td><td>+</td></tr><tr><td>601</td><td>31/10/2018</td><td>Bassin 2</td><td>Biofilm</td><td>V. harveyi</td><td>● 2,48</td><td>G</td><td>Jaune</td><td>Ronde</td><td>+</td></tr></tbody></table>

Enfin, les résultats obtenus par BioFilm Control à partir de ces différentes souches sont présentés dans la Figure 31.

<footnote>* M = taille moyenne, G = grande taille</footnote>

<footnote>** + = présence d'un halo, - = absence d'un halo</footnote>
1. Isolats de rates de poissons moribonds collectés en 2017, utilisés pour mettre au point le vaccin en 2018

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

2. Isolats de rates de poissons moribonds collectés en 2018

<figure><img src="image_62.png" /></figure>

3. Isolats de biofilms formés sur le béton, collectés en 2018

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

Figure 31 : Résultats obtenus avec le Biofilm Ring Test® par BioFilm Control pour des isolats de V. harveyi. A. Résultats de l'étude de la cinétique d'adhésion avec A.a. le détail de la cinétique au cours du temps et A.b. le temps nécessaire aux bactéries pour former un biofilm. Chaque point des courbes représente la moyenne de 24 valeurs (4 puits pour 6 plaques), les barres d'erreurs représentent l'écart type. Une valeur de BFI élevée indique une forte mobilité des microbilles sous l'action de l'aimant, correspondant à l'absence de biofilm. Un BFI proche de 0 indique une immobilisation des mirobilles suite à la formation d'un biofilm. B. Résultats de l'étude de la force d'adhésion du biofilm à 24 h. Les tests ont été réalisés en duplicatas.
D'après les résultats de l'étude de la cinétique d'adhésion (Figure 31 A.a. et A.b.), tous les isolats sont capables de former un biofilm en moins de 72 h exceptés 3 isolats collectés à partir des biofilms formés sur béton (isolats 506, 856, 91), (Figure 31 3.A.a et 3.A.b). Au total, 44 % des isolats étaient capables de former un biofilm en 24 h, 15 % en 32 h, 15 % en 48 h et 15 % en 72 h. Ainsi, la majorité des isolats formant des biofilms en 24 h, la force d'adhésion a été déterminée pour 24 h d'adhésion (Figure 31 B.). Les résultats ont montré que 27 % des isolats collectés à partir de rates de poissons moribonds sont non producteurs de biofilm à 24 h, 60 % témoignent d'une force d'adhésion modérée à 24 h et 13 % témoignent d'une force d'adhésion forte à 24 h. En revanche, 83 % des isolats collectés à partir des biofilms formés sur béton sont non producteurs de biofilm à 24 h et 17 % témoignent d'une force d'adhésion faible à 24 h. Néanmoins, il faut ici souligner que l'étude de la force d'adhésion a été réalisée à 24 h. Or, d'après la cinétique d'adhésion, ces isolats sont bien capables de former des biofilms pour des temps supérieurs à 24 h.

Ces résultats préliminaires nous ont permis de décrire différentes cinétiques au sein des isolats collectés sur Aquanord-Ichtus. En général, le temps d'adhésion des isolats collectés à partir de biofilms sur béton est plus long que celui des isolats collectés à partir de rates de poissons moribonds. Toutefois, ces études ont été réalisées sur un nombre restreint d'isolats, dans des conditions in vitro très différentes des conditions retrouvées dans les bassins d'Aquanord-Ichtus, c'est-à-dire en conditions statiques, dans un milieu de culture riche, avec une monoculture et une surface en polystyrène. Cette étude est donc une première étape qui nous permettra, par la suite, de mettre au point le protocole d'étude de formation de biofilms dans des conditions plus proches de celles retrouvées sur Aquanord-Ichtus.
Schéma de synthèse

**Objectif** : Evaluer le risque *Vibrio* au sein de la ferme aquacole Aquanord-Ichtus par l'étude de la distribution spatiale et temporelle des Vibrionaceae cultivables à 37 °C et plus particulièrement de *V. harveyi*, ainsi que l'étude de l'impact de différents facteurs environnementaux biotiques et abiotiques.

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Figure 32 : Schéma de synthèse du Chapitre IV, relatif à l'étude de la distribution spatiale et temporelle des Vibrionaceae et de l'espèce *Vibrio harveyi* dans un élevage de bars communs.</figcaption></figure>
Discussion et perspectives

Mes travaux de thèse s'inscrivent dans la problématique de la vibriose du bar commun d'élevage (*Dicentrarchus labrax*), thématique très récente au sein de l'unité Biochimie des Produits Aquatiques (BPA) de l'UMR transfrontalière INRAe n°1158 BioEcoAgro et initiée à travers cette thèse. Ces travaux ont été réalisés en partenariat avec la ferme aquacole Aquanord-Ichtus, faisant face à des épisodes de vibriose récurrents, principalement causés par l'espèce *Vibrio harveyi*, impactant fortement l'équilibre économique de l'entreprise.

L'objectif principal de la thèse était d'apporter des éléments de compréhension, à travers la combinaison d'approches microbiologiques et moléculaires, visant à optimiser la gestion du risque *Vibrio* pour le bar commun d'élevage. Cela implique une bonne connaissance de la dynamique spatio-temporelle des bactéries, capables d'engendrer la vibriose chez le bar commun, au sein de la ferme. En effet, leurs comportements ainsi que leurs capacités de persistance et de multiplication déterminent, en partie, leur impact sur l'environnement et plus particulièrement sur les poissons. Ces comportements bactériens sont eux-mêmes influencés par des facteurs environnementaux biotiques et/ou abiotiques.

Afin de répondre à ces objectifs, la stratégie adoptée lors de ces travaux de thèse a reposé dans un premier temps sur la mise au point d'outils et de méthodes de détection et d'identification, dans une perspective de suivi environnemental (Chapitre II et III, Article 1 et 2). Ce suivi a été réalisé dans un second temps *via* l'étude de la dynamique spatio-temporelle des Vibrionaceae potentiellement pathogènes pour le bar commun, et plus particulièrement de *V. harveyi*, au sein d'Aquanord-Ichtus (Chapitre IV, Article 3).
Ces travaux de recherche, nous ont ainsi conduits :

* à la mise au point et à la validation d'une PCR en temps réel spécifique à l'espèce *V. harveyi*, principal agent responsable de la vibriose sur Aquanord-Ichtus (**Chapitre II, Article 1**)

* à la conception d'une nouvelle base de données, dénommée Luvibase, permettant l'identification des espèces du clade Harveyi par MALDI-TOF MS (**Chapitre III, Article 2**)

* à l'élaboration d'une stratégie d'échantillonnage et d'isolement de souches bactériennes issues de l'eau d'élevage et des biofilms formés sur les parois en béton des bassins d'Aquanord-Ichtus (**Chapitre II et IV, Article 1 et 3**)

* à la caractérisation de la distribution spatio-temporelle des Vibrionaceae cultivables à 37 °C et plus particulièrement de *V. harveyi*, au sein d'Aquanord-Ichtus et à la l'étude des corrélations entre les paramètres environnementaux et l'abondance de ces bactéries (**Chapitre IV, Article 3**)

* à la conception d'une banque d'isolats bactériens d'origine aquacole, comprenant plus d'un millier de bactéries appartenant majoritairement au genre *Vibrio* (13 espèces) et *Photobacterium*, et plus particulièrement 223 isolats de *V. harveyi* (**Chapitre IV, Article 3**)

# 1. Les outils et méthodes d'identification

La 1ère étape de mes travaux a consisté à mettre au point des outils et méthodes de détection et d'identification spécifiques à l'espèce *V. harveyi* ou plus largement au clade Harveyi. Les méthodes développées au cours de ma thèse ont été adaptées afin de quantifier l'espèce *V. harveyi* directement dans des échantillons d'eau et de biofilms issus d'aquaculture, mais également pour établir un criblage rapide des bactéries isolées de ces échantillons. En ce sens, les méthodes d'identification phénotypiques, ainsi que les méthodes moléculaires, telles que la MLSA (MultiLocus Sequence Analysis), ont rapidement été écartées de par leur caractère chronophage
(Bonnin-Jusserand et al., 2017). Ainsi, notre choix s'est porté sur des techniques de PCR en temps réel et de MALDI-TOF MS.

## 1.1. Les méthodes moléculaires

Afin de mettre au point la méthode de PCR en temps réel, il a fallu identifier une cible génétique spécifique à l'espèce *V. harveyi*. Les cibles génétiques couramment utilisées chez les bactéries du genre *Vibrio* sont des gènes de ménage, codant pour des fonctions essentielles à la bactérie, tels que le gène codant pour l'ARNr 16S, ou les gènes *ftsZ*, *gapA*, *gyrB*, *mreB*, *pyrH*, *recA*, *rpoA* ou *topA* (Thompson et al., 2005, Thompson et al., 2007, Sawabe et al., 2013). Ces gènes présentent des pouvoirs de résolution divergeants en fonction du groupe d'espèces ciblé. Par exemple, les gènes *rpoA*, *recA*, et *pyrH* ne permettent pas de différencier les espèces *V. coralliilyticus*/*V. neptunius* et *V. anguillarum*/*V. ordalii* alors qu'ils permettent de différencier les espèces *V. campbellii*/*V. harveyi* (Thompson et al., 2005).

L'identification d'une seule cible génétique spécifique est d'autant plus complexe au sein du clade Harveyi que la similarité des génomes y est très forte (Gomez-Gil et al., 2004). Par exemple, le gène codant pour l'ARNr 16S ou le gène *rpoB* possèdent un faible pouvoir de résolution et ne sont pas adaptés à la différenciation de certaines espèces au sein du clade Harveyi (Gomez-Gil et al., 2004, Erler et al., 2015). En effet, comme démontré dans ces travaux, le séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S ne permet pas de différencier certaines souches de *V. alginolyticus*/*V. natriegens*/*V. parahaemolyticus* (**Chapitre III, Article 2**). De plus, la diversité génétique au sein même d'une espèce et la plasticité génétique liée en partie au transfert horizontal de gènes, rendent l'identification de cibles génétiques encore plus fastidieuse (Conejero et Hedreyda, 2003, Rowe-Magnus et al., 2006).

Au cours de ces travaux de thèse, 3 cibles génétiques ont été envisagées et testées afin d'identifier spécifiquement *V. harveyi* : le gène *toxR*, très régulièrement employé dans la littérature (Pang et al., 2006, Schikorski et al., 2013), et les gènes *topA* et *mreB* dont la concaténation des loci permet de différencier les espèces proches de *V. harveyi* (Cano-Gomez et al., 2011). Les amorces ciblant
les gènes *toxR* et *topA* étaient déjà disponibles dans la littérature (Pang *et al.*, 2006; Cano-Gomez *et al.*, 2015). En revanche, d'après nos connaissances, aucun oligonucléotide n'avait été élaboré sur le gène *mreB* et nous avons ainsi dû les mettre au point (Chapitre II, Article 1).

Afin d'évaluer la spécificité des amorces ciblant respectivement les gènes *toxR*, *topA* et *mreB*, nous nous sommes efforcés d'inclure une grande variété de souches dans notre étude. Ainsi, contrairement à la plupart des études, la quasi-totalité des espèces appartenant au clade Harveyi, c'est-à-dire *V. alginolyticus*, *V. azureus*, *V. campbellii*, *V. harveyi*, *V. jasicida*, *V. mytili*, *V. natriegens*, *V. owensii*, *V. parahaemolyticus*, et *V. rotiferianus*, ont été incorporées. De plus, afin de couvrir au maximum la diversité génétique de l'espèce, nous avons inclus une grande variété de souches de *V. harveyi* d'origines géographiques et épidémiologiques différentes. Ainsi, des souches isolées de mollusques (huitres, ormeaux), de crustacés (amphipodes, crevettes), de poissons (bars communs, daurades royales, maquereaux, requins) ou d'eau de mer, couvrant une large zone géographique (Bahamas, Espagne, France, Japon, Mexique, Thaïlande, USA) ont été intégrées. Les résultats ont démontré une bonne exclusivité pour les 3 paires d'amorces. En revanche, plusieurs résultats faux négatifs ont révélés une diversité génétique des gènes *toxR* et *topA* au sein de l'espèce *V. harveyi* et une bonne conservation des séquences du gène *mreB*. C'est ainsi que la cible génétique *mreB* nous est apparue la plus adaptée dans le cadre de notre étude. Cette cible semble prometteuse pour l'identification de souches de *V. harveyi* d'origines très variées et pourrait ainsi être utilisée dans différentes études, relatives à d'autres secteurs aquacoles ou au milieu naturel.

Cette cible génétique a notamment permis de mettre en lumière deux erreurs d'identification concernant les souches de collections LMG 10946 et LMG 10947 (Chapitre II, Article 1). Ces souches avaient été auparavant identifiées comme *V. harveyi* mais la PCR ciblant le gène *mreB* était négative. D'autres analyses telles que le séquençage des gènes *ftsZ*, *recA* et *gyrB* ainsi que le séquençage du génome entier, nous ont alors permis de reclasser la souche LMG 10946 comme *V. campbellii* et la souche LMG 10947 comme *V. owensii*. Ces erreurs sont régulièrement relevées dans la littérature. Ainsi, Hoffmann *et al.* (2012) ont démontré que les souches LMG 16862 et
LMG 16863, auparavant identifiées comme *V. harveyi*, appartiennent en réalité à l'espèce *V. campbellii* et la souche LMG 4043 identifiée comme *V. harveyi* appartient à l'espèce *V. owensii*. La découverte progressive de ces erreurs s'explique par le développement de nouvelles technologies disposant d'un pouvoir de résolution de plus en plus conséquent. Ces technologies ont permis de faire évoluer la taxonomie des *Vibrio* et il est fort probable que la démocratisation du séquençage du génome entier, de par une réduction progressive de coûts, puisse profondément transformer la taxonomie, telle qu'on la connaît aujourd'hui (Urbanczyk et al., 2013b, Bayliss et al., 2017). Ceci pourrait notamment améliorer le diagnostic au sein des fermes aquacoles (Bachand et al., 2020).

La quantification des espèces potentiellement pathogènes, directement dans des échantillons d'origine aquacole, est primordiale à l'établissement d'un diagnostic rapide et fiable lors de l'émergence d'une maladie, afin de rapidement mettre en œuvre des traitements thérapeutiques ciblés. De même, celle-ci est indispensable à la surveillance des agents pathogènes présents ou émergents au sein de la structure aquacole afin d'établir une stratégie prophylactique adaptée. La PCR en temps réel possède ainsi l'avantage d'être rapide, fiable, peu coûteuse et de quantifier les bactéries potentiellement pathogènes en état VNC, non détectables *via* les méthodes culturales. En revanche, cette méthode destructrice ne permet pas l'isolement et la conservation des différentes souches présentes au sein de la ferme. La collecte de ces souches trouve tout son intérêt dans l'étude phénotypique et génotypique ainsi que dans l'étude des mécanismes de virulence en relation avec l'environnement. Ces études peuvent ainsi permettre d'apporter une meilleure connaissance du fonctionnement des bactéries et d'élaborer des stratégies de contrôle.

## 1.2. Le MALDI-TOF MS

La technologie MALDI-TOF MS permet l'identification rapide de l'ensemble des isolats présents dans un échantillon, suite à un isolement sur milieu gélosé, voire après conservation. L'avantage par rapport à l'étude d'une seule cible génétique repose sur l'analyse de la bactérie entière et non d'une unique partie du génome, permettant, dans certains cas, une meilleure résolution à l'espèce (Clark et al., 2013). L'identification repose sur la comparaison d'un spectre de masse avec des
spectres de masse de référence (MSPs) enregistrés dans une base de données. Les bases de données commerciales, telles que Bruker BioTyper, ont été initialement conçues pour une utilisation clinique, et manquent donc de spectres de référence de souches environnementales ou vétérinaires (Emami et al., 2012). En effet, comme démontré lors de ces travaux de thèse, cette base de données n'est pas adaptée au criblage de souches d'origine aquacole. Nous avons ainsi dû créer notre propre base de données, la Luvibase, afin d'identifier rapidement des souches isolées sur Aquanord-Ichtus (Chapitre III, Article 2).

La Luvibase a été élaborée avec 23 souches de collection appartenant aux espèces *V. alginolyticus*, *V. azureus*, *V. campbellii*, *V. harveyi*, *V. jasicida*, *V. natriegens*, *V. owensii*, *V. parahaemolyticus*, *V. rotiferianus* et *V. sinaloensis*. La plus-value de cette base de données a été évaluée et validée par l'identification de 62 souches de collection et isolats d'origines épidémiologiques et géographiques différentes. L'implémentation de la Luvibase dans la base de données Bruker BioTyper, a permis une identification fiable à l'espèce pour 100 % des bactéries, contre 75,3 % pour la Bruker BioTyper seule. Cette implémentation a notamment permis l'identification fiable au niveau de l'espèce, de souches appartenant au clade Harveyi. Nous avons envisagé différents moyens afin de rendre cette base de données la plus accessible. Nous avons, dans un premier temps, publié la Luvibase en Open Access (Mougin et al., 2020b). En parallèle et dans la même optique, nous avons envisagé la possibilité d'ajouter cette base de données aux bases de données largement utilisées. Ainsi, nous avons contacté l'entreprise Bruker afin d'envisager l'inclusion de la Luvibase dans la base de données Bruker BioTyper, ce qui permettrait un accès facile et standardisé pour tout utilisateur. Nous sommes actuellement en pourparlers avec les commerciaux de cette entreprise.

A l'avenir, il serait intéressant d'incrémenter la Luvibase avec de nouvelles souches de collection voire des souches environnementales bien caractérisées et isolées sur Aquanord-Ichtus. Par exemple, nous avons isolé dans les bassins aquacoles de nombreuses bactéries appartenant à l'espèce *Photobacterium damselae*, potentiellement pathogènes pour le bar commun (Essam et al., 2016), (Chapitre IV, Article 3). Nous n'avons pas pu identifier ces bactéries jusqu'à la
sous-espèce puisqu'à ce jour, la base de données Bruker BioTyper ne permet pas la différenciation de *P. damselae* subsp. *damselae* et *P. damselae* subsp. *piscicida* (Pérez-Sancho et al., 2016). Ces deux sous-espèces diffèrent par leur pathogénie et leur virulence. La sous-espèce *piscicida* est responsable de la pasteurellose, une infection aiguë entrainant des mortalités de masse chez les poissons, alors que la sous-espèce *damselae* est associée à des infections plus sporadiques. La différenciation de ces deux sous-espèces trouve donc tout son intérêt dans le diagnostic d'espèces potentiellement pathogènes pour le bar commun, afin de mettre en place des mesures de contrôle ciblées et appropriées. Une fois ces sous-espèces bien différenciées, par séquencage par exemple, nous pourrions donc enregistrer leur profil de spectres de masse dans la Luvibase.

La technologie MALDI-TOF MS a séduit de nombreux chercheurs de par sa rapidité, son faible coût, sa possibilité de haut débit et son caractère automatisable. Cette technologie est ainsi largement utilisée comme outil de diagnostic permettant l'identification de bactéries, obtenues à partir d'une culture bactérienne sur milieu solide. Ces dernières années, cette technologie a été optimisée afin d'analyser des cultures bactériennes en milieu liquide ou encore d'analyser directement l'échantillon (Hou et al., 2019). Ces analyses requièrent un traitement préalable de l'échantillon afin d'éliminer les composés pouvant interférer ou inhiber l'analyse. De bons résultats ont été obtenus pour des échantillons d'urine (Ferreira et al., 2010), de liquide céphalorachidien (Segawa et al., 2014) ou encore d'hémoculture (La Scola et Raoult, 2009). Généralement, ces échantillons doivent renfermer une concentration bactérienne relativement élevée et présenter une contamination mono-microbienne, afin d'obtenir des résultats fiables. Ces méthodes ont été optimisées pour le traitement d'échantillons cliniques mais il serait intéressant d'extrapoler celles-ci au traitement d'échantillons environnementaux ou dans un contexte vétérinaire. Bien que le traitement de ces échantillons soit plus complexe de par la présence d'un cocktail de bactéries, il est tout à fait plausible que, grâce à de futures avancées technologiques, l'analyse MALDI-TOF puisse être directement réalisée, sans étape préalable, sur des échantillons environnementaux et plus particulièrement d'origine aquacole.
## 1.3. Comparaison synthétique des différentes méthodes utilisées

Le Tableau 9 permet de comparer les différentes méthodes utilisées au cours de ces travaux de thèse, c'est-à-dire la PCR en temps réel, le MALDI-TOF MS et le séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S.

<table><caption>Tableau 9 : Comparaison des méthodes d'identification développées et/ou testées au cours de ces travaux de thèse.</caption><thead><tr><th>Méthodes</th><th>Etapes et temps de procédures</th><th>Avantages</th><th>Inconvénients</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">PCR en temps réel</td><td>Extraction d'ADN</td><td>&lt;1 h</td><td>Possibilité d'obtenir des données quantitatives</td><td>Nécessité d'un personnel qualifié</td></tr><tr><td>Préparation de la réaction et PCR en temps réel</td><td>&lt;1 h</td><td>Rapide, fiable, sensible</td><td>Coût important au quotidien</td></tr><tr><td>Total</td><td>&lt;2 h</td><td>Détection des bactéries VNC</td><td>Mise au point fastidieuse<br>Nécessité de mettre au point des amorces spécifiques pour chaque espèce</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5">MALDI-TOF MS</td><td>Culture bactérienne</td><td>24 h</td><td>Faible coût et facilement applicable au quotidien</td><td>Coût de l'appareil</td></tr><tr><td>Préparation de la cible</td><td>&lt;3 min</td><td>Simple et automatisée</td><td>Manque de profils de référence d'origine</td></tr><tr><td>Passage de la cible et comparaison avec les bases de données</td><td>&lt;5 min</td><td>Haut-débit</td><td>environnementale dans les bases de données</td></tr><tr><td>Total</td><td>~ 24 h</td><td>Possibilité de créer facilement sa propre base de données pour optimiser l'identification</td><td>commerciales</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Mise à jour régulière des bases de données</td><td>Difficulté de traiter certains microorganismes (bactéries Gram + et mycobactéries) en raison d'une résistance à la lyse</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Possibilité de typage épidémiologique des souches</td><td>Nécessité de standardisation au sein des laboratoires</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Incapacité de détecter des bactéries en état VNC sans enrichissement</td></tr><tr><td rowspan="7">Séquençage du gène codant pour l'ARNr 16S</td><td>Culture bactérienne</td><td>24 h</td><td>Méthode de référence pour l'identification bactérienne utilisée par de nombreux laboratoires</td><td>Coût important</td></tr><tr><td>Extraction d'ADN</td><td>&lt;1 h</td><td>Bases de données bien incrémentées</td><td>Faible pouvoir de résolution pour certaines espèces dont celles appartenant au clade Harveyi</td></tr><tr><td>Réaction de PCR</td><td>2-3 h</td><td></td><td>Nécessité d'un personnel qualifié</td></tr><tr><td>Révélation sur gel d'électrophorèse</td><td>1 h</td><td></td><td>Fastidieux et long</td></tr><tr><td>Séquençage</td><td>24-48 h</td><td></td><td>Difficulté d'application au quotidien</td></tr><tr><td>Traitement des séquences et comparaison avec les bases de données</td><td>1 h</td><td></td><td>Incapacité de détecter des bactéries en état VNC sans enrichissement</td></tr><tr><td>Total</td><td>&gt;48 h</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
## 2. Etude de la dynamique des *Vibrio* potentiellement pathogènes

La 2ème étape de mes travaux a consisté en l'étude de la distribution spatio-temporelle et de la structure des populations bactériennes potentiellement pathogènes pour le bar commun au sein de la ferme aquacole Aquanord-Ichtus (Chapitre IV, Article 3).

Le schéma fonctionnel et architectural d'Aquanord-Ichtus est atypique. La ferme est alimentée par deux entrées d'eau de mer, une entrée d'eau froide provenant de l'environnement naturel marin et une entrée d'eau chaude provenant du système de refroidissement de la CNPE. Une précédente étude a mis en avant une abondance plus importante de bactéries du genre *Vibrio* au point de rejet de la ferme et de la CNPE, que dans l'environnement naturel (Antajan et al., 2019). Ainsi plusieurs hypothèses ont émergé concernant l'origine de la contamination par *Vibrio* :

* les bactéries du genre *Vibrio* étant ubiquitaires du milieu marin, elles sont naturellement apportées par l'arrivée d'eau froide au sein de la ferme et les conditions d'élevage dans les bassins entraînent une prolifération des bactéries du genre *Vibrio*

* la hausse des températures générée par le passage de l'eau dans la CNPE entraine une multiplication des bactéries du genre *Vibrio*, directement libérées dans la ferme

* les bactéries du genre *Vibrio* peuvent former des biofilms sur la paroi des bassins d'élevage, entrainant une persistance des souches dans les bassins

Afin d'apporter des éléments de réponse, une campagne d'échantillonnage a été entreprise d'avril à octobre 2018. Un total de 609 échantillons, dont 465 échantillons d'eau et 164 échantillons de biofilms, ont été collectés dans 3 bassins d'Aquanord-Ichtus et des échantillons d'eau ont été collectés au niveau des arrivées d'eau chaude et d'eau froide alimentant la ferme. Les outils méthodologiques mis au point et détaillés dans les *Chapitre II*, *Article 1* et *Chapitre III*, *Article 2* ont été utilisés pour évaluer la distribution spatio-temporelle de l'espèce *V. harveyi* ainsi que l'évolution de la structure des populations de Vibrionaceae cultivables à 37 °C. Par ailleurs, en parallèle de ces travaux de thèse, cette campagne d'échantillonnage a également été
utilisée afin de suivre l'évolution de la population bactérienne totale, par séquençage haut débit (next-generation sequencing, NGS). Ce travail a été réalisé par la post-doctorante Roxane Roquigny et a été valorisé par un article, publié dans *Aquaculture* (Roquigny et al., 2021) et disponible en Annexe 2, p.275 (Article 5).

**Occurrence et abondance d'espèces potentiellement pathogènes**

Cette campagne d'échantillonnage a permis de mettre en évidence que plusieurs espèces de *Vibrio*, potentiellement pathogènes pour le bar commun, sont présentes dans les arrivées d'eau et dans les bassins d'élevage, pendant une grande partie de l'année. Ces agents pathogènes peuvent subsister, non seulement sous forme planctonique mais également sous forme de biofilms. Quelques études similaires avaient déjà été entreprises dans des élevages de bars communs mais celles-ci se focalisaient surtout sur la contamination de l'eau d'élevage et non sur la persistance sous forme de biofilms (Martins et al., 2018, Duarte et al., 2019). Les espèces potentiellement pathogènes pour le bar commun que nous avons identifiées sont *P. damselae*, ou encore *V. alginolyticus*, *V. harveyi*, *V. owensii* et *V. rotiferianus*, appartenant au clade Harveyi (Ghittino et al., 2003, Kahla-Nakbi et al., 2006, Korun et Timur, 2008, Essam et al., 2016). Les espèces *V. harveyi*, *V. owensii* et *V. rotiferianus* avaient déjà été isolées et identifiées chez des poissons moribonds en 2017, néanmoins, *V. harveyi* restait l'espèce la plus fréquemment isolée. Il existe également un autre agent pathogène au sein d'Aquanord-Ichtus, *V. anguillarum*, qui n'a pas été isolé lors de notre étude. En effet, le risque associé à *V. anguillarum* étant aujourd'hui bien contrôlé grâce à l'administration d'un vaccin commercialisé, nos travaux ont principalement porté sur les espèces appartenant au clade Harveyi et plus particulièrement *V. harveyi*. Ainsi les conditions de cultures ont été adaptées afin de favoriser la croissance de ces espèces, impliquant une température de croissance de 37 °C, alors que la température optimale de croissance de *V. anguillarum* est de 25 °C.

Il est fort probable que l'abondance de ces agents potentiellement pathogènes dans l'environnement soit corrélée à leur prévalence chez le bar commun, bien que, pour des raisons éthiques, nous n'avons pas pu réaliser un échantillonnage sur les poissons. En effet, selon l'étude
de Kim et Lee (2017) l'augmentation de l'abondance de bactéries du genre *Vibrio* dans les bassins aquacoles est corrélée à une augmentation de la prévalence chez les poissons. De même, selon Albert et Ransangan (2013) l'abondance dans les biofilms peut être corrélée à la mortalité de poissons. Ainsi, l'occurrence de ces agents potentiellement pathogènes dans l'eau d'élevage et les biofilms peut donc augmenter le risque de déclenchement d'un épisode de vibriose. Cela dit, les abondances sont, par ailleurs influencées par des fluctuations environnementales.

**Impact des facteurs environnementaux**

L'analyse des corrélations a permis de déceler une corrélation entre la température et l'abondance de *V. harveyi* et plus généralement des Vibrionaceae cultivables à 37 °C, non seulement dans l'eau d'élevage mais également dans les biofilms. Cette corrélation positive est largement décrite dans la littérature pour différentes espèces du genre *Vibrio* (Pereira *et al.*, 2011, Johnson *et al.*, 2012, Takemura *et al.*, 2014, Siboni *et al.*, 2016, Davis *et al.*, 2017). Dans les années à venir, une augmentation de l'occurrence et de l'abondance de ces bactéries est envisagée en lien avec l'augmentation de la température de l'eau, due au réchauffement climatique (Travers *et al.*, 2009, Baker-Austin *et al.*, 2013, Vezzulli *et al.*, 2015, Baker-Austin *et al.*, 2017). Ceci est d'autant plus préoccupant qu'une récente étude a démontré que cette augmentation de température pouvait également induire une augmentation de l'expression des facteurs de virulence chez l'espèce *V. harveyi* (Montánchez *et al.*, 2019). De plus, les changements environnementaux causés par le réchauffement climatique pourraient également affecter le système immunitaire et l'état physiologique de l'hôte, le rendant plus sensible à une infection (Cheng *et al.*, 2004, Cheng *et al.*, 2005, Dittmar *et al.*, 2014, Zha *et al.*, 2017, Reverter *et al.*, 2020). Néanmoins, à ce jour, selon nos connaissances, cela n'a pas encore été démontré chez le bar commun.

A l'échelle d'Aquanord-Ichtus, ceci est d'autant plus préoccupant que lors des mois estivaux, la ferme est uniquement alimentée par le canal d'eau froide, provenant de l'environnement naturel. Ceci signifie que toute la ferme est dépendante de la température de l'eau environnante, et qu'il n'y a, à ce jour, aucun moyen de la refroidir. L'ensemble de la ferme est donc directement
vulnérable face au réchauffement climatique, particulièrement l'été, lorsque le risque de vibriose est maximal.

**Les biofilms, réservoirs d'espèces potentiellement pathogènes**

La présence de *V. harveyi* sous forme de biofilms est d'autant plus préoccupante que ces derniers peuvent conférer une résistance aux flux environnementaux, aux antibiotiques et aux désinfectants (Karunasagar et al., 1996, Bourne et al., 2006), augmentant le risque d'échec thérapeutique. La présence de ces biofilms peut donc induire une persistance de *V. harveyi* dans les bassins aquacoles et augmenter le risque de déclenchement d'épisodes de vibriose récurrents. Ce risque est également renforcé par le mécanisme de quorum sensing (QS), pouvant réguler l'expression de facteurs de virulence au sein de la communauté bactérienne composant le biofilm. Par exemple, De Decker et al. (2013) ont démontré que l'espèce *V. splendidus* était capable de produire un auto-inducteur (AI) pouvant activer l'expression de métalloprotéases chez d'autres espèces de Vibrio.

Toutefois, d'autres facteurs doivent être pris en compte pour considérer le risque de vibriose (Defoirdt et al., 2011). En effet, comme nous l'avons démontré lors de notre étude, bien que des espèces potentiellement pathogènes aient été détectées toute l'année, aucun épisode de vibriose ne s'est déclenché au cours de la campagne d'échantillonnage. Plusieurs éléments peuvent expliquer ceci, tels que l'efficacité du nouvel auto-vaccin prodigué par Aquanord-Ichtus, une meilleure résistance des poissons liée à la génétique ou aux conditions environnementales ou la pathogénie et la virulence des souches présentes (Vazzana et al., 2002, Defoirdt et al., 2011).

## 3. Perspectives

Ces travaux de thèse ont permis de répondre à plusieurs objectifs fixés. Ils ont notamment abouti à la conception d'une banque d'isolats bactériens, comprenant à ce jour plus d'un millier d'isolats d'origine aquacole, provenant d'échantillons d'eau et de biofilms, identifiés par MALDI-TOF MS. Néanmoins, ce travail a également permis de soulever de nouvelles interrogations vis-à-vis, par
exemple, de la pathogénie et de la virulence des souches collectées. Par conséquent, dans la continuité de ces travaux, l'objectif à court terme serait de caractériser ces différents isolats.

## 3.1. Caractérisation des différentes souches

### 3.1.1. Typage bactérien par MALDI-TOF MS

Dans un premier temps, un typage de l'ensemble des souches récoltées pourrait être réalisé. Cela nous permettrait de déterminer le nombre de souches différentes parmi notre banque d'isolats, ainsi que d'évaluer l'évolution spatiale et temporelle de l'occurrence de chaque souche collectée. Pour cela, plusieurs méthodes moléculaires sont généralement employées afin d'étudier la variabilité des souches telles que la PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis), la MLST (MultiLocus Sequence Typing) ou la rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR). Néanmoins, ces méthodes sont longues, coûteuses et fastidieuses. Une alternative émergente à ces différentes techniques repose sur la technologie MALDI-TOF, déjà utilisée au cours de ces travaux de thèse (Sandrin et al., 2013). L'absence/présence ou la variation de certains signaux de masse peuvent permettre d'identifier des biomarqueurs spécifiques permettant la différenciation des souches au sein d'une même espèce. En effet, bien que les séquences des gènes codant pour des protéines ribosomales soient bien conservées, quelques variations nucléotidiques peuvent générer une variation de poids moléculaire chez ces protéines. Ces variations génèrent des signaux de masse différents, pouvant être utilisés afin de comparer des souches d'une même espèce, sans toutefois impacter l'identification de celle-ci (Sauget et al., 2017). Grâce à cette méthode, il est ainsi possible de distinguer deux sérotypes différents. Par exemple, les différents sérotypes de l'espèce *Flavobacterium psychrophilum*, espèce pathogène affectant les salmonidés, ont pu être différenciés grâce à la caractérisation de biomarqueurs distincts (Fernández-Álvarez et al., 2018).

La technique de MALDI-TOF MS est également prometteuse pour la caractérisation de la pathogénie, voire de la résistance aux antibiotiques des différentes souches (Hrabák et al., 2013). Par exemple, des différences dans le signal de masse généré par la protéine OmpU ont permis de
distinguer les souches de *Vibrio cholerae* O1/O139 responsables d'épidémies, des souches moins virulentes (Paauw *et al.*, 2014). Une récente étude portant sur *Vibrio tapetis*, un agent affectant les palourdes japonaises (*Ruditapes philippinarum*), a également montré que cette technique pouvait permettre de discriminer les souches de *V. tapetis* pathogènes des souches non pathogènes (Rahmani *et al.*, 2020). La mise en place de telles méthodes s'avère toutefois longue et fastidieuse.

Quand les différentes souches seront identifiées et discriminées, les éventuels duplicatas présents dans notre collection, pourraient être écartés et les expérimentations suivantes pourraient être menées sur un nombre plus restreint de souches. Nous pourrions alors évaluer leur résistance aux antibiotiques, ainsi que leur pathogénie et leur virulence, entre autre, grâce à des méthodes moléculaires applicables en haut débit, dans le but de déterminer le risque pour l'animal et l'Homme.

### 3.1.2. Résistance aux antibiotiques, pathogénie et virulence

Les fermes aquacoles sont des réservoirs de gènes de résistance aux antibiotiques, représentant une menace pour la santé animale et la santé publique (Igbinosa, 2016). Afin d'évaluer le risque de propagation de ces gènes, nous pourrions déterminer la présence de ceux-ci chez les différentes souches collectées. Par exemple, sachant que l'antibiotique utilisé à ce jour au sein d'Aquanord-Ichtus est l'oxytetracycline, il serait particulièrement intéressant d'évaluer la susceptibilité de ces souches à cet antibiotique. Des résistances à l'oxytetracycline, ainsi que le gène associé *tet*(34), ont déjà été mis en évidence chez des bactéries du genre *Vibrio*, dans des élevages de crevettes (Kim *et al.*, 2003; Rebouças *et al.*, 2011; Yano *et al.*, 2011).

En parallèle, la présence de gènes impliqués dans la pathogénie et la virulence pourrait également être évaluée. Bien que le mécanisme de pathogénie de *V. harveyi* ne soit, à l'heure actuelle, pas complétement connu (Zhang *et al.*, 2020), certains gènes codant pour des facteurs de virulence, tels que *chiA*, *flaB*, *luxR*, *toxR*<sub>Vh</sub>, *ser*, *vhh*, *vhpA*... sont supposés impliqués (Ruwandeepika *et al.*, 2010; Xu *et al.*, 2017; Peeralil *et al.*, 2020). De plus, selon Travers (2008), la pathogénie de *V. harveyi* pour l'ormeau (*Haliotis tuberculata*) est liée à la présence du plasmide pVCR1. Il
serait ainsi intéressant de rechercher la présence de celui-ci et de potentiellement identifier un marqueur de pathogénie commun à plusieurs espèces. D'autre part, en raison d'un transfert horizontal de gènes important chez les bactéries du genre *Vibrio*, des gènes plus fréquemment rencontrés chez des espèces pathogènes pour l'Homme pourraient être ciblés, comme cela a été effectué dans les travaux de Ruwandeepika *et al.* (2010). Cette étude a notamment permis de mettre en évidence chez *V. harveyi*, la présence des gènes *hlyA* et *toxR*, généralement identifiés chez *V. cholerae*. Cela permettrait d'apporter de nouveaux éléments au regard du risque pour l'animal, ainsi que pour l'Homme.

A première vue, en raison du grand nombre d'isolats et de gènes à tester, nous pourrions réaliser ces expérimentations en collaboration avec l'Anses *via* la plateforme IdentyPath, disposant d'appareils de pointe, en biologie moléculaire, utilisables en haut débit. Notamment, les systèmes BioMark HD™ et LightCycler® 1536 permettent la détection simultanée de plusieurs centaines de gènes et pourraient ainsi être utilisés dans le cadre de notre étude, afin d'identifier simultanément la présence de gènes impliqués dans la résistance aux antibiotiques et la pathogénie.

Toutefois, la seule présence de ces gènes ne suffit pas à caractériser la pathogénie de *V. harveyi* (Ruwandeepika *et al.*, 2010, Peeralil *et al.*, 2020). Ainsi, il serait, dans un deuxième temps, nécessaire de caractériser la pathogénie des souches grâce à des tests *in vivo*. Pour cela, un partenariat pourrait être mis en place avec le département aquaculture de la plate-forme d'innovation Nouvelles Vagues située à Wimereux. Cette plate-forme dispose d'une infrastructure spécialisée, permettant entre autres, de réaliser des challenges bactériens. Ces challenges pourraient être réalisés par balnéation, de plusieurs concentrations bactériennes. Lors de la campagne d'échantillonnage, la concentration de Vibrionaceae cultivables à 37 °C dans les bassins oscillait entre $2.28×10^3$ et $1.74×10^5$ UFC.mL$^{-1}$ et la concentration de *V. harveyi* détectée, oscillait entre $3.72×10^1$ et $9.51×10^1$ GE.mL$^{-1}$. Nous pourrions alors tester 3 concentrations de *V. harveyi* : $10^2$, $10^4$ et $10^6$ UFC.mL$^{-1}$ et suivre l'éventuel développement de la vibriose chez le bar commun. Enfin, afin d'apporter des éléments de compréhension sur le mécanisme de pathogénie de
V. harveyi pour le bar commun, il serait intéressant de suivre l'évolution de l'expression de différents gènes impliqués dans la virulence par RT-PCR, comme cela a été réalisé sur des larves de crevettes par Peeralil et al. (2020) ou Ruwandeepika et al. (2011). Selon nos connaissances, ce genre d'expérimentation n'a encore jamais été réalisé sur le bar commun.

La virulence et la persistance des bactéries étant également associées à la formation de biofilm, nous pourrions évaluer la capacité des souches, caractérisées comme pathogènes pour le bar commun, à former des biofilms, dans l'objectif de mettre en place des moyens de lutte contre la formation de ces biofilms.

## 3.2. Etude de la capacité de formation de biofilms

La mise en place d'un protocole d'étude de la capacité des souches à former un biofilm a été initiée lors de ces travaux de thèse. Suite au nombre important d'isolats que nous avions récoltés sur Aquanord-Ichtus, il était nécessaire d'utiliser des méthodes rapides, applicables en haut débit, standardisées et reproductibles. Après des essais chronophages et difficilement reproductibles, en employant la technique de coloration au cristal violet (CV), le Biofilm Ring Test® (BRT), développé par BioFilm Control, partenaire du projet FEAMP LUVIBAR, s'est imposé comme la méthode de prédilection. Bien qu'à l'heure actuelle l'étude soit toujours en cours, des essais préliminaires, réalisés sur quelques isolats, ont été présentés dans ces travaux de thèse. A terme, cette première partie de l'étude permettrait de caractériser la formation de biofilms des différentes souches et de les classer en fonction de la vitesse d'initiation de la formation du biofilm, ainsi qu'en fonction de la force d'adhésion.

Par la suite, la deuxième partie de l'étude porterait sur l'impact de composés anti-biofilms sur l'initiation précoce de l'adhésion bactérienne. Cette étude sera réalisée en partenariat avec le laboratoire Membranes et Cibles Thérapeutiques (MCT) au sein de la faculté de pharmacie de l'Université Aix-Marseille, également partenaire du projet FEAMP LUVIBAR. Nous pourrions, pour cela utiliser l'Antibiofilmogram® reposant sur une technologie adaptée du BRT et permettant de déterminer la cinétique de formation de biofilms d'une culture bactérienne soumise
à différentes concentrations de molécules inhibitrices. Plus particulièrement, ce dispositif est reconnu pour sa capacité à déterminer, de façon standardisée, la Concentration Minimale Inhibitrice du biofilm (CMIb) (Tasse et al., 2016). Cette étude permettrait de faire un premier criblage de composés à activité anti-biofilm.

Dans un souci d'écodéveloppement, ces composés seraient préférentiellement d'origine naturelle, non toxiques et dans notre cas, isolés du milieu marin. Par exemple, des substances produites par les bactéries marines elles-mêmes pourraient être testées (Desriac et al., 2018). Des études ont démontré que les produits extracellulaires sécrétés par la souche *Pseudoalteromonas* sp. 3J6, dépourvus d'activité anti-bactérienne, avaient une activité anti-biofilm pour l'espèce *V. tapetis*, également problématique dans le secteur aquacole (Dheilly et al., 2010, Rodrigues et al., 2015). Depuis, l'altérocine, présente dans ces produits extracellulaires, a été identifiée comme responsable de cette activité (Jouault et al., 2020). Ainsi, l'activité anti-biofilm de cette protéine pourrait éventuellement être testée pour des souches de *V. harveyi*. Différentes substances isolées de spongiaires, d'algues ou de plantes halophytes ont également démontré des propriétés anti-biofilms (Stowe et al., 2011, Kong et al., 2014, Le Norcy et al., 2017b, Vishwakarma et Sirisha, 2020). Par exemple, il a récemment été démontré que le dibromohemibastadin-1 (DBHB), isolé chez l'éponge *Ianthella basta*, présente une activité anti-biofilm et anti-quorum sensing (QS), tout en étant dépourvu d'activité anti-bactérienne (Le Norcy et al., 2017b).

Bien que l'Antibiofilmogram® soit une technologie *in vitro* rapide et standardisée, les conditions de formation du biofilm sont très différentes de celles retrouvées *in vivo*, et plus particulièrement dans les bassins d'Aquanord-Ichtus. Par exemple, les tests précédemment présentés sont réalisés en conditions statiques or les bassins aquacoles sont soumis à des flux, principalement générés par le renouvellement d'eau. Une fois le criblage des composés anti-biofilm réalisé, nous pourrions donc compléter cette étude en déterminant leur action en conditions dynamiques, par exemple en chambre à flux, et en réalisant potentiellement des cultures mixtes, afin de se rapprocher des conditions environnementales (Tolker-Nielsen et Sternberg, 2014, Azeredo et al., 2017).
Néanmoins, à l'échelle d'Aquanord-Ichtus, ces composés anti-biofilms devraient être ajoutés directement dans l'eau. Or la ferme étant un système semi-ouvert, les flux au sein des bassins d'élevage sont conséquents. Afin de garantir une quantité suffisante de substances anti-biofilms, celles-ci devraient être constamment renouvelées, générant des coûts importants. Il serait donc intéressant d'incorporer ces composés anti-biofilms dans des revêtements, recouvrant la paroi des bassins aquacoles. Des études pourraient alors être réalisées directement dans les bassins. Pour cela, ce revêtement pourrait être incorporé à la surface des morceaux de béton et immergés directement dans les bassins aquacoles à l'aide du dispositif mis au point dans le *Chapitre II*.

Ce dispositif pourrait être optimisé afin de couvrir l'ensemble de la hauteur de la paroi des bassins, en immergeant des morceaux de béton à différentes profondeurs. Nous pourrions par exemple tester le DBHB, précédemment cité, qui s'est avéré efficace contre la formation de biofilms en milieu marin, une fois incorporé sous forme de vernis, confectionné avec des polymères biodégradables, sur un support de polycarbonate. (Le Norcy et al., 2017a, Le Norcy et al., 2017b). L'utilisation de tels revêtements a déjà été envisagée en milieu aquacole. Par exemple, Vijayakumar et al. (2017) ont mis au point un revêtement (Fu-AuNPs) composé de nanoparticules d'or et de fucoïdane à activité anti-bactérienne, isolée d'une algue brune, *Fucus vesiculosus*. Ce revêtement a la capacité de réduire fortement la formation de biofilms d'Aeromonas hydrophila, une espèce pathogène pour le Tilapia du Mozambique (*Oreochromis mossambicus*) en milieu aquacole.

Enfin, l'impact et l'accumulation du composé anti-biofilm sélectionné, dans l'environnement devraient être déterminés. La cytotoxicité pour des cellules de poissons et l'accumulation dans les filets devraient également être étudiées. Des tests de cytotoxicité sur des cellules humaines pourraient éventuellement être réalisés. Ces études permettraient d'évaluer le risque pour l'animal, l'Homme et l'environnement, selon une approche intégrée dans le concept *One Health*.

Ainsi, sur le long terme cette étude pourrait aboutir à la mise au point d'un revêtement ou peinture antifouling et anti-biofilm, comprenant des composés à activité anti-biofilm d'origine naturelle, non toxique pour l'animal, l'Homme et l'environnement. Celui-ci devrait être utilisable
en milieu aquacole à un coût raisonnable, sans altérer la qualité des produits. Une fois intégré à
la surface des bassins d'élevage, ce revêtement pourrait fortement réduire la formation de biofilms
d'espèces potentiellement pathogènes pour le bar commun, permettant de réduire la mortalité
sur Aquanord-Ichtus.
4. Schéma de synthèse

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Figure 33 : Contribution du travail de thèse à une meilleure compréhension du risque *Vibrio* en environnement aquacole.</figcaption></figure>
# Valorisation des travaux de thèse

## Articles scientifiques publiés dans des journaux à comité de lecture

Mougin, J., Flahaut, C., Roquigny, R., Bonnin-Jusserand, M., Grard, T. et Le Bris, C. (2020) Rapid identification of *Vibrio* species of the the Harveyi clade using MALDI-TOF MS profiling with main spectral profile database implemented with an in-house database: Luvibase. *Frontiers in Microbiology*. doi: 10.3389/fmicb.2020.586536 (**Article 2**)

Mougin, J., Roquigny, R., Travers, M.-A., Grard, T., Bonnin-Jusserand, M. et Le Bris, C. (2020) Development of a *mreB*-targeted real-time PCR method for the quantitative detection of *Vibrio harveyi* in seawater and biofilm from aquaculture systems. *Aquaculture*. doi: 10.1016/j.aquaculture.2020.735337 (**Article 1**)

Mougin, J., Copin, S., Bojolly, D., Raguenet, V., Robert-Pillot, A., Quilici, M.-L., Midelet-Bourdin, G., Grard, T. et Bonnin-Jusserand, M. (2019) Adhesion to stainless steel surfaces and detection of viable but non cultivable cells of *Vibrio parahaemolyticus* and *Vibrio cholerae* isolated from shrimps in seafood processing environments: Stayin'alive? *Food Control*. doi: 10.1016/j.foodcont.2019.03.024 (**Article 4**)

Roquigny, R., Mougin, J., Le Bris, C., Bonnin-Jusserand, M., Doyen, P. et Grard, T. (2021) Characterization of the marine aquaculture microbiome: a seasonal survey in a seabass farm. *Aquaculture*. doi: 10.1016/j.aquaculture.2020.735987 (**Article 5**)

Copin, S., Mougin, J., Raguenet, V., Robert-Pillot, A., Quilici, M.-L., Midelet-Bourdin, G., Grard, T., Bonnin-Jusserand, M. (2020) Comparison of ethidium monoazide and propidium
monoazide treatment for the differentiation of viable *Vibrio* cells by qPCR. *Letters in Applied Microbiology*. doi: 10.1111/lam.13412

## Articles scientifiques soumis dans des journaux à comité de lecture

Mougin, J., Roquigny, R., Flahaut, C., Bonnin-Jusserand, M., Grard, T. et Le Bris, C. Abundance and spatial patterns over time of Vibrionaceae and *Vibrio harveyi* in water and biofilm from a seabass aquaculture facility. Soumis à *Aquaculture*. (Article 3)

## Communications orales

Mougin, J., Roquigny, R., Doyen, P., Grard, T., Bonnin-Jusserand, M., Le Bris, C. “I will survive”: When *Vibrio harveyi* in fish farming systems thinks he is Gloria Gaynor! WEFTA conference. 15-17 octobre 2019. Tórshavn, Îles Féroé.

Mougin J., Roquigny, R., Bonnin-Jusserand, M., Le Bris, C., Doyen, P., Grard, T. Développement d'approches moléculaires pour l'étude des populations bactériennes en environnement aquacole. Plateau analytique. Journée MARCO, 10 octobre 2019, Nausicaá, Boulogne sur mer, France.

Mougin J., Bonnin-Jusserand, M., Le Bris, C., Grard, T. Approches microbiologiques et moléculaires pour lutter contre la vibriose du bar (*Dicentrarchus labrax*). Journée des doctorants de l'Institut Charles VIOLLETTE. Juillet 2019, Lille, France.

Mougin J., Bonnin-Jusserand, M., Le Bris, C., Grard, T. Approches microbiologiques et moléculaires pour lutter contre la vibriose du bar (*Dicentrarchus labrax*). Avenir Littoral 2019, Dunkerque, France.
Communications affichées

**Mougin, J.**, Roquigny, R., Travers, M.-A., Grard, T., Bonnin-Jusserand, M. et Le Bris, C. Finding *Vibrio harveyi*: Dynamic of bacterial proliferation in fish farming systems. Vibrio 2019 The Biology of Vibrios. 17-20 Novembre 2019. Montreal, Canada.

Ce poster s'est vu décerner le prix du **People's Choice Award in the Canadian Society of Microbiologists.**

**Mougin, J.**, Bonnin-Jusserand, M., Le Bris, C., Grard, T. Microbiological and molecular approach to control vibriosis in seabass (*Dicentrarchus labrax*). WEFTA 2018, Lisbonne, Portugal.

**Mougin, J.**, Bojolly, D., Copin, S., Raguenet, V., Robert-Pillot, A., Grard, T., Midelet-Bourdin, G., Bonnin-Jusserand, M. Development of PMA q-PCR method for the detection and quantification of *Vibrio cholerae* within a biofilm. WEFTA 2017, Dublin, Irlande.

**Mougin, J.**, Bojolly, D., Copin, S., Raguenet, V., Robert-Pillot, A., Grard, T., Midelet-Bourdin, G., Bonnin-Jusserand, M. Etude de la survie de *Vibrio cholerae* en biofilm. SFM 2017, Paris, France.

Copin, S., **Mougin, J.**, Raguenet, V., Robert-Pillot, A., Quilici, M.-L., Midelet-Bourdin, G., Grard, T., Bonnin-Jusserand, M. Comparaison de la toxicité du traitement par l'éthidium monoazide (EMA) et par le propidium monoazide (PMA) pour différencier les *Vibrio* viables par PCR en temps réel. SFM 2019, Paris, France.
<figure><img src="image_66.png" /></figure>
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# Annexe 1

## Adhesion to stainless steel surfaces and detection of viable but non cultivable cells of *Vibrio parahaemolyticus* and *Vibrio cholerae* isolated from shrimps in seafood processing environments: *Stayin' alive?*

Julia Mougin<sup>a,b,c,d,e,f</sup>, Stéphanie Copin<sup>f,g</sup>, Daline Bojolly<sup>a</sup>, Virginie Raguenet<sup>f</sup>, Annick Robert-Pillot<sup>g</sup>, Marie-Laure Quilici<sup>g</sup>, Graziella Midelet-Bourdin<sup>f</sup>, Thierry Grard<sup>a</sup>, Maryse Bonnin-Jusserand<sup>a</sup>

**Keywords:** *Vibrio parahaemolyticus*, *Vibrio cholerae*, Biofilm, Shrimps, VBNC, PMA-qPCR, Seafood industries

<footnote><sup>a</sup> Univ. Littoral Côte d'Opale, Convention ANSES, EA 7394 – ICV – Institut Charles Viollette, F-62321, Boulogne-sur-Mer, France</footnote>

<footnote><sup>b</sup> INRA, France</footnote>

<footnote><sup>c</sup> Univ. Lille, F - 59000, Lille, France</footnote>

<footnote><sup>d</sup> ISA, F - 59000, Lille, France</footnote>

<footnote><sup>e</sup> Univ. Artois, F - 62000, Arras, France</footnote>

<footnote><sup>f</sup> French Agency for Food, Environmental and Occupational Health & Safety (ANSES), Laboratory for Food Safety, Boulevard du Bassin Napoléon, 62200, Boulogne-sur-Mer, France</footnote>

<footnote><sup>g</sup> Institut Pasteur, Paris, Unité des Bactéries Pathogènes Entériques, Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra, France</footnote>

<footnote n="1"><sup>1</sup> J. Mougin and S. Copin share co-authorship of this article.</footnote>