# Étude par microscopie électronique des conformations structurales adoptées par la Formine durant la polymérisation des filaments d'actine.

Julien Maufront

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Julien Maufront. Étude par microscopie électronique des conformations structurales adoptées par la Formine durant la polymérisation des filaments d'actine.. Sciences du Vivant [q-bio]. PSL Université Paris Dauphine, 2021. Français. NNT: 2021UPSLS049. tel-04061804

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# Étude par microscopie électronique des conformations structurales adoptées par la Formine durant la polymérisation des filaments d'actine.

Soutenue par

**Julien MAUFRONT**

Le 21 juin 2021

Ecole doctorale n° 515

**Complexité Du Vivant**

Spécialité

**Biologie Cellulaire**

## Composition du jury :

**Anne, HOUDUSSE JUILLÉ**

Directrice de Recherche, Institut Curie – Biologie Cellulaire et
Cancer (UMR 144)
Présidente

**Denis, CHRÉTIEN**

Directeur de Recherche, Institut Génétique et Développement
de Rennes (UMR 6290)
Rapporteur

**Alphée, MICHELOT**

Chargé de Recherche, Institut de Biologie du Développement
de Marseille
Rapporteur

**Célia, PLISSON-CHASTANG**

Chargée de Recherche, Centre de Biologie Intégrative –
Laboratoire de Biologie Moléculaire Eucaryote
Examinatrice

**Rut, CARBALLIDO-LOPEZ**

Directrice de Recherche, INRAE
Examinatrice

**Aurélie, BERTIN**

Chargée de Recherche, Institut Curie – Laboratoire Physico-Chimie Curie (UMR 168)
Directrice de thèse

**Guillaume, ROMET-LEMONNE**

Directeur de Recherche, Institut Jacques Monod
Invité

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

institut
**Curie**
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>7.4.</td>
      <td>Reconstruction 3D.</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III.</td>
      <td>RESULTATS.</td>
      <td>109</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.</td>
      <td>CARACTERISATION STRUCTURALE DE CONSTRUCTIONS DE FORMINE MDIA1.</td>
      <td>110</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.1.</td>
      <td>Construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His).</td>
      <td>110</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.2.</td>
      <td>Construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His).</td>
      <td>113</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.3.</td>
      <td>Conclusion.</td>
      <td>116</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.</td>
      <td>PREPARATION DES ECHANTILLONS ACTINE-FORMINE POUR LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE.</td>
      <td>117</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.</td>
      <td>Nucléation stimulée.</td>
      <td>117</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.</td>
      <td>Élongation contrôlée.</td>
      <td>121</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.</td>
      <td>ANALYSES EN PARTICULE UNIQUE ADAPTEES POUR DES EXTREMITES DE FILAMENT D'ACTINE.</td>
      <td>128</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.</td>
      <td>Analyse en Particule Isolée : Nucléation, Spectrine • Actine • Formine.</td>
      <td>128</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.</td>
      <td>Analyse en Particule Isolée : Sonication, Gc-globuline - Actine • Formine.</td>
      <td>129</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3.</td>
      <td>Analyse en Particule Isolée : Sonication, Actine • Formine.</td>
      <td>137</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.</td>
      <td>STRUCTURES 3D DU COMPLEXE FORMINE - BOUT BARBE OBTENUES EN COLORATION NEGATIVE : MODELE DE « LA MARCHE ENJAMBEE ».</td>
      <td>142</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.</td>
      <td>VARIATION CONFORMATIONNELLE DE L'ETAT « OUVERT ».</td>
      <td>148</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1.</td>
      <td>« Battement » 2D du premier domaine FH2.</td>
      <td>148</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.</td>
      <td>« Battement » du domaine FH2 : élaboration d'un modèle structural 3D.</td>
      <td>151</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.</td>
      <td>DIMERE DE FORMINE ENCERCLANT LE CORPS D'UN FILAMENT D'ACTINE.</td>
      <td>155</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>7.</td>
      <td>ÉTUDE PAR CRYO-MICROSCOPIE ELECTRONIQUE DE LA COIFFE DES FORMINES.</td>
      <td>158</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>7.1.</td>
      <td>Mise au point des conditions de réalisation des grilles de cryo-microscopie électronique.</td>
      <td>158</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>7.2.</td>
      <td>Analyse en Particule Isolée de données de cryo-microscopie électronique.</td>
      <td>164</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>8.</td>
      <td>FORMATION D'UN COMPLEXE NUCLEATEUR FORMINE-ARP2/3-SPIN90.</td>
      <td>167</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>8.1.</td>
      <td>Analyse en Particule Isolée : alignements et classifications 2D.</td>
      <td>168</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>8.2.</td>
      <td>Analyse en Particule Isolée : classifications et reconstructions 3D.</td>
      <td>169</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.</td>
      <td>CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES.</td>
      <td>174</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.1.</td>
      <td>Modalités de génération d'une densité élevée de courts filaments d'actine adaptée à une Analyse en Particule Isolée.</td>
      <td>174</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.2.</td>
      <td>Détermination structurale en coloration négative de complexes de formine aux extrémités barbées de filaments d'actine en elongation.</td>
      <td>176</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.3.</td>
      <td>Modèle du battement de FH2 dans l'état « ouvert » et dimères de formine encerclant le corps des filaments d'actine.</td>
      <td>179</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.4.</td>
      <td>Étude du complexe extrémité barbée - formine par une approche en cryo-microscopie électronique.</td>
      <td>180</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.5.</td>
      <td>Formation d'un complexe ternaire Arp2/3-SPIN90-mDia1.</td>
      <td>181</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>9.6.</td>
      <td>Conclusion générale.</td>
      <td>182</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.</td>
      <td>ANNEXES.</td>
      <td>185</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V.</td>
      <td>BIBLIOGRAPHIE.</td>
      <td>187</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
Remerciements

Je tiens à remercier avant tout pour la réalisation de cette thèse ma bienveillante directrice Au-
rélie Bertin. C'est elle qui m'a accueilli à bras ouverts au Laboratoire de Physico Chimie Curie. Elle
m'a chaperonné, elle m'a formé, elle m'a guidé, elle m'a encouragé et soutenu tout au long de ces
quatres années de thèse. Je suis convaincu que c'est son optimisme à toute épreuve, fidèlement incarné
par son sourire joyeux, qui m'a permis de garder la lueur d'espoire nécessaire pour mener à bien mon
projet de recherche.

Je tiens à remercier dans un second temps Cyntia, car c'est bel et bien par son entremise que j'ai atterri
à l'Institut Curie. Mais que serait Cyntia sans son associée Su-Jin, le binôme le plus tornitruant de
l'équipe, notamment lorsqu'il est question de séances de karakoky.

Merci à Aurélie D de m'avoir montré ses trucs et astuces en microscopie électronique et d'avoir pris
soin des infernales loupes électromagnétiques cracheuses d'électrons qui se terrent au sous-sol du bati-
ment. Elles m'ont été bien utiles.

Merci à Manuela pour sa bonne humeur, son sens de l'humour et surtout de ne pas m'avoir éjecté du
bureau malgré mon impertinence.

Merci au grand chef Daniel Lévy qui m'a laissé ma place dans l'équipe MMM (&M's ?) et qui nous a
fait profiter chaque année de bons repas.

Merci à Eugénio d'avoir répondu à chaque fois à mes détresses Linuesques.

Merci au duo de légende Antoine et Guillaume sans qui le projet CONFORMIN n'aurait pas eu lieu.
Merci à toutes vos questions/conseils/suggestions pertinentes tout au long de ma thèse. Merci par exten-
sion aux membres de l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » avec notamment
Bérengère, Lu-Yan et Sandy qui ont participé activement à la production de formine et d'actine micro-
litre par microlitre que j'ai pu consommer litre après litre.

Merci à John de m'avoir mis sur les rails de la sonication, c'est peut-être un détail pour vous mais pour
moi ça veut dire beaucoup.

Merci à Narita et Maeda de m'avoir chaleureusement accueilli à Nagoya et d'avoir pris le temps de
s'intéresser à mon projet de recherche, tout ça le temps de deux typhons, ce fut un grand honneur.

Enfin, et non des moindres, un grand merci à ma petite famille Isidora a.k.a concubine, Lilo a.k.a le
chat, Mona a.k.a le chien. Merci Isidora de m'avoir supporté du début à la fin de ma thèse c'est une
belle preuve d'amour, heureusement pour toi la thèse a une fin. Merci à Mona et Lilo d'avoir été mes
co-bureaux durant ces longs mois de confinement. Merci à Mona de m'avoir rappelé régulièrement qu'il
fallait faire des pauses, merci à Lilo d'avoir systématiquement tenté de dévérouiller mon ordinateur pour
que je gagne du temps à chaque retour. Merci à Sylvie ma belle mère préférée. Et pour finir, merci la
famille de Bretagne et merci la famille de Lille.
# Préambule

Ma thèse a porté sur l'étude d'un des éléments phare du cytosquelette : l'actine. L'actine occupe un rôle fondamental dans les cellules vivantes en assurant de nombreux processus cellulaires tels que la division, la migration ou l'adhésion. Bien que l'actine possède la capacité intrinsèque de nucléer et polymériser spontanément des filaments dans des conditions biochimiques données, la régulation fine de ce comportement est indispensable dans la cellule. Les formines incarnent alors le rôle d'un régulateur clef de l'actine lui permettant de mener à bien ces activités fonctionnelles variées. Ainsi, les formines assemblent rapidement de longs filaments d'actine pour générer des ultra-structures essentielles telles que l'anneau cytokinétique et les fuseaux mitotiques¹,²,³ pour assurer la division cellulaire, les fibres de stress, les adhésions focales et les filopodes²,⁴,⁵,⁶,⁷ pour permettre l'adhésion et la migration cellulaire. Un dérèglement des formines peut ainsi entraîner de nombreuses pathologies connexes incluant le développement de cancers primaires et/ou de métastases comme dans le cas du cancer du larynx, du cancer du sein, du cancer colorectal ou de la leucémie⁸,⁹,¹⁰,¹¹,¹².

À l'échelle moléculaire, les formines constituent des homodimères capables de poursuivre les extrémités barbées de filaments d'actine en cours d'élongation par une interaction avec leurs domaines FH2¹³,¹⁴. Cette traque de l'extrémité barbée s'accompagne d'une augmentation considérable de la vitesse de polymérisation du filament à travers une stimulation de l'incorporation de nouvelles sous-unités d'actine à ce filament via leurs domaines FH1 (interaction avec la réserve d'actine-profiline en solution)¹⁴.

Bien que les conformations structurales impliquées dans l'activité de la formine n'ont jamais été observées directement, des études semblent suggérer que le dimère de FH2 se déplace pas à pas à l'extrémité barbée polymérisante, à travers un équilibre rapide entre deux états dits "fermé" et "ouvert"¹⁴,¹⁵. L'alternance entre ces deux états assurerait alors le maintien de la formine au bout barbé tout en permettant l'incorporation de nouvelles sous-unités d'actine.

Le domaine FH1, quant à lui, formerait une chaîne flexible qui, en fixant les unités d'actine-profiline en solution, augmenterait la concentration locale d'actine pour qu'elles soient finalement incorporées sur l'extrémité barbée où sont ancrés les domaines FH2¹⁴.

Cette description simple cependant, ne précise pas les mécanismes d'interactions de la formine à l'extrémité barbée, notamment concernant la nature des états dit « fermé » et « ouvert » et les modalités de transition entre les deux. Deux modèles de type « pas à pas » s'opposaient alors :
la « marche enjambée »¹⁶, ¹⁷ et le « saut enclenché »¹⁸, ¹⁹. Evaluer la pertinence de ces deux modèles constitue le point de départ de ma thèse.

Au-delà de cette interaction aux extrémités barbées, la capacité singulière de formines à encercler le corps même des filaments d'actine avait également pu être observée pour certains isoformes. La mise en évidence d'un tel mode d'interaction pour la formine mDial a ainsi été entreprise durant cette thèse.

En parallèle de ce projet principal, j'ai pu participer à l'étude d'un point de vue structural de l'action synergique de la Formine avec Arp2/3 permise par l'intermédiaire de la protéine Spin90. À cette occasion, j'ai mis en évidence la formation d'un complexe ternaire entre ces trois protéines régulatrices.

L'ensemble de ces travaux a été réalisé par une étude *in vitro* en microscopie électronique. Mon projet de recherche a été réalisé en collaboration étroite avec l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » de Guillaume Romet-Lemonne et Antoine Jégou à l'Institut Jacques Monod. Ils m'ont procuré les protéines essentielles pour mes expériences, de même qu'ils m'ont partagé leurs précieuses connaissances dans le domaine.
# I. Introduction.
# 1. Le cytosquelette et ses acteurs.

Le cytosquelette est un élément pilier de toutes les cellules vivantes. D'un point de vue général, le cytosquelette permet une structuration adaptative de la cellule à son environnement par l'élaboration d'un réseau dynamique interne (Fig. 1.A). Ce réseau dynamique est constitué de bio-polymères qui peuvent être divisés en quatre familles : les filaments intermédiaires, les microtubules, l'actine et les septines. Chaque type de filament présente des propriétés structurales, mécaniques, dynamiques et biochimiques qui lui sont propres.

Au travers de ces différents acteurs, le cytosquelette assure de multiples fonctions pour la cellule²⁰. Le cytosquelette régit la répartition d'organites dans le cytosol à l'exemple du noyau cellulaire, du réticulum endoplasmique ou de l'appareil de golgi. En outre, les filaments d'actine et les microtubules matérialisent un réseau de transport emprunté par des moteurs moléculaires comme la myosine²¹ pour les premiers ou la dynéine et la kinésine²² pour les seconds. Ces moteurs peuvent alors déplacer activement du matériel cellulaire, allant de granules d'insuline dans les cellules β-pancréatiques aux mitochondries dans les axones de neurones.

Le cytosquelette régule également la forme globale de la cellule via des ancrages à la membrane plasmique²³, pouvant être assurés par les moteurs moléculaires sus-cités ou d'autres encore tels que les formines. Finalement, le cytosquelette assure la sensibilité ainsi que la réponse mécanique de la cellule face à des stimuli, en permettant la transmission et la génération de forces²⁴,²⁵.

Cette médiation des forces est optimisée par l'assemblage des filaments du cytosquelette en des ultra-structures dédiées. On trouve ainsi dans la cellule des câbles linéaires et circulaires composés de multiples filaments liés entre eux et orientés ; des réseaux branchés ou réticulés composés de filaments non alignés connectés à travers leurs extrémités ou le corps de leur filament (Fig 2.B). Ce panel topologique offre au cytosquelette de multiples configurations mécaniques utiles pour autant de fonctions cellulaires.

De ce fait, l'action du cytosquelette se retrouve à l'origine de processus fondamentaux comme l'adhésion cellulaire²⁷, la migration cellulaire²⁶,²⁷,²⁸, la division cellulaire²⁹,³⁰,³¹, et l'endocytose³²,³³. À une plus grande échelle, le cytosquelette des cellules sous-tend l'organisation des tissus ou le développement embryonnaire³⁴.
Ces fonctionnalités pléthoriques attribuées au cytosquelette ne sont rendues possibles que par une régulation spatio-temporelle fine de la polymérisation de ses constituants ainsi que de leur assemblage en ultra-structures³⁵,³⁶,³⁷. Il existe ainsi une myriade de protéines qui interviennent directement auprès du cytosquelette pour orchestrer cette machinerie. Ces protéines permettent la modulation de la dynamique, de la localisation ou des interconnexions des quatre acteurs du cytosquelette. L'ensemble combiné des membres du cytosquelette et de leurs protéines régulatrices encode la capacité adaptative des cellules à leur environnement.

Dans un cas extrême comme chez *Physarum Polycephalum*, être vivant unicellulaire, le cytosquelette peut apparaitre comme le premier support à l'origine d'un comportement dit « intelligent » en permettant la transduction, la transmission et la structuration des flux d'informations³⁸. Dans un autre sens et malheureusement d'une façon plus tangible pour l'homme, la dérégulation du cytosquelette est à l'origine de nombreuses maladies chez les êtres vivants³⁹ comme certaines maladies neurodégénératives, cardiovasculaires, ou bien le développement de certains cancers.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 1** – A. Image colorisée d'un fibroblaste observé en microscopie de fluorescence. Phalloïdine anti F-actine (bleu), Anticorps anti-microtubule (vert), Filaments intermédiaires (rouge) (Pollard et Goldman, 2018). B. Représentation schématique d'une cellule exhibant différents types d'assemblage du cytosquelette (Blanchoin et al., 2014).</figcaption></figure>

Comprendre précisément le fonctionnement du cytosquelette, sa dynamique et sa régulation reste donc de nos jours d'un intérêt et d'un enjeu majeur. Ces caractéristiques sont codées en partie au sein même de la structure fine de chacun des composants du cytosquelette et de leurs partenaires. En effet, c'est de ces entités fondamentales et de leurs interactions qu'émergent les processus complexes indispensable au vivant. Dans ce contexte, décortiquer au mieux leurs
propriétés structurelles pour en saisir leurs comportements dynamiques et leurs qualités inter-
ractionnelles apparaît être une approche scientifique incontournable.

1.1. Les microfilaments d'actine.

Un acteur des plus dynamiques du cytosquelette est l'actine. L'actine est le composant
du cytosquelette phare de ma thèse. C'est sur lui que mes travaux de recherche ont été focalisés
durant ces années d'exploration.

Découvert en 1942 dans le laboratoire de Albert Szent-Györgyi⁴⁰, l'actine est une protéine ubi-
quitaire des cellules eucaryotes. Elle est présente en quantité importante dans les cellules de
telle sorte qu'elle peut atteindre jusqu'à 20% de la masse des cellules musculaires⁴¹.

L'actine en solution, nommée G-actine pour « actine globulaire », est capable dans certaines conditions biochimiques de polymériser sous la forme de filaments, une propriété connue depuis 1943⁴⁰. On parle alors de F-actine pour actine fibrillaire.

Ces filaments d'actine dans le cytoplasme et le noyau sont engagés dans des assemblages variés. On observe ainsi des réseaux branchés comme dans le cas des lamellipodes où les filaments d'actine sont connectés entre eux par les protéines Arp2/3, une extrémité pointue d'un filament étant connectée au corps d'un autre filament. Ces lamellipodes permettent le mouvement cellulaire qui s'opère via un assemblage du réseau contre la membrane plasmique accompagné d'un désassemblage du même réseau en amont⁴²,⁴³.

On observe de même des réseaux complexes comme dans le cas du cortex cellulaire sur la surface interne des cellules où des filaments d'actine sont parfois interconnectés par des protéines comme les fascines ou les myosines. Le cortex cellulaire contrôle la forme des cellules ainsi que la morphogenèse des tissus³⁰.

D'autre part on observe également dans la cellule des faisceaux linéaires de filaments d'actine
antiparallèles comme dans les fibres de stress. Les filaments y sont interconnectés par les pro-
téines moteurs de myosine qui leur confèrent une propriété contractile. Les fibres de stress par-
ticipent ainsi à l'adhésion et la migration des cellules⁴³.

On observe aussi des faisceaux linéaires parallèles de filaments d'actine comme dans les filo-
podes. Dans ces assemblages, les filaments d'actine sont interconnectés entre eux en faisceaux
par des protéines telle que la fascine. Les extrémités barbées quant à elles, sont ancrées à la
membrane plasmique par des protéines coiffantes comme la formine. Les faisceaux de filaments
pointent ainsi orthogonalement à la membrane plasmique. Cette configuration permet la génération de protrusions cytoplasmiques depuis le cortex cellulaire. Les filopodes permettent ainsi aux cellules de sonder leur environnement, avec un rôle notable dans les interactions intercellules, de même que dans la migration cellulaire⁴⁴.

On observe enfin des structures annulaires composées de filaments d'actine interconnectés entre eux par des myosines dans un contexte de cytocinèse. Cette composition permet la constriction d'un anneau contractile d'actine qui remodèle la membrane plasmique. Pour ce faire, l'anneau contractile doit être directement ancré à la membrane plasmique. L'une des protéines jouant un rôle important pour cette fonction est la septine, 4e acteur du cystosquelette⁴⁵.

À l'échelle moléculaire, l'actine est une protéine globulaire de 42 kDa dont la structure a pu être déterminée une première fois en 1990 par Kenneth C. Holmes en diffraction des rayons X⁴⁶. L'actine se divise en deux domaines principaux : le « petit domaine » et le « grand domaine » en référence à leur dimension respective et à l'existence de deux sillons opposés les délimitant. L'actine peut également être vue comme 4 sous-domaines où les sous-domaines 1 et 2 correspondent au petit domaine tandis que les sous-domaines 3 et 4 correspondent au grand domaine (Fig. 2.A). Le sillon situé entre les sous-domaines 2 et 4 accueille un nucléotide d'adénosine lié à un dication de calcium ou de magnésium. Sans nucléotide fixé, l'actine se dénature rapidement. De l'autre côté, le sillon situé entre les sous-domaines 1 et 3 est un site d'interaction pour de nombreuses protéines de liaison à l'actine⁴⁷,⁴⁸.

En solution, l'actine s'assemble sous la forme d'une hélice d'environ 7 nm de diamètre (Fig. 2.B-C). Cette structure a pu être élucidée par Holmes, Wolfgang et leurs collègues, en 1990, par diffraction des rayons X sur fibres alignées⁴⁹. Le filament est caractérisé par une hélice simple présentant 13 sous-unités d'actine qui se répètent quasi exactement après 6 tours gauches de 166,7º ⁴⁸ (Fig. 2.B). Il a cependant été montré qu'il existait un polymorphisme structural concernant cette structure du filament d'actine avec une torsion qui peut varier de plusieurs degrés⁵⁰ et des structures secondaires qui peuvent adopter différents états⁵¹,⁵². Le pas angulaire repère de 166,7º relativement proche de 180º permet également de voir le filament d'actine comme une double hélice droite dans laquelle deux brins s'enroulent lentement l'un sur l'autre avec un pas long de 36 nm. On parle alors d'interaction intra-brin pour qualifier des interactions entre des sous-unités d'un même brin ou bien d'interaction inter-brin pour qualifier des interactions entre sous-unités d'actine issues des deux brins. Les interactions intra-brin se caractérisent notamment par une boucle (D-loop) du sous-domaine 2 qui s'intercale dans le sillon hydrophobe situé entre les sous-domaines 3 et 1 de la sous-unité d'actine voisine (Fig. 2.D, gauche). Les
interactions inter-brins se caractérisent par une interaction à trois domaines localisés à l'inter-
section entre les sous-unités n, n+2 d'un brin et la sous unité n+1 du second brin (Fig. 2.D,
droite).

Le filament d'actine possède une longueur de persistance de l'ordre de 10 µm<sup>53,54</sup>, entre celles
des microtubules et des filaments intermédiaires. Ce filament est polarisé, avec les sous-dom-
maines 2 et 4 pointant vers l'extrémité négative ou bout pointu, et les sous-domaines 1 et 3
pointant vers l'extrémité positive ou bout barbé.

La dynamique des filaments d'actine est régie par une activité catalytique d'hydrolyse d'ATP
qui permet à terme de polariser l'élongation des filaments<sup>55</sup>. Ce processus se traduit par une

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

**Figure 2** - **A.** Représentation en ruban d'un mono-
mère d'actine obtenue à partir de sa structure cris-
tallographique, PDB : 1NWK (adapté de Graceffa et
Dominguez, 2003). **B.** Structure en double hélice
d'un filament d'actine obtenue à partir de données
de cryo-microscopie électronique (Dominguez et
Holmes, 2011). **C.** Cryo-Micrographie électronique
de filaments d'actine de 7 nm de diamètre observés
en "Volta Phase Plate" (Chou et Pollard, 2019). **D.**
Structures atomiques mettant en évidence les inte-
ractions intra-brins (gauche. D-loop, résidus : 38-
49) et inter-brins (droite) impliquées dans la forma-
tion du filament d'actine. (Oda et al. 2009).

<figure><img src="image_6.png" /></figure>
polymérisation aux extrémités barbées couplée avec une dépolymérisation aux extrémités pointues. On parle du phénomène dit de « tapis roulant »⁵⁶. Ce mécanisme clef de la dynamique de l'actine est au cœur de multiples processus cellulaires⁴³ et sera décrit plus en détail dans la section 2.1.

## 1.2. Les microtubules.

Les microtubules sont des filaments tubulaires du cytosquelette et, comme l'actine, elles sont dynamiques. Grâce à la microscopie électronique, ces structures filamenteuses atypiques ont pu être observées au sein des cellules dès les années 50, notamment chez les plantes par Irene Manton et Brian Clarke en 1952 et chez les animaux par Don Fawcett et Keith Porter en 1954⁵⁷.

D'un point de vue de l'organisation intracellulaire, le réseau de microtubules dans le cytoplasme des cellules non-différenciées est centralisé par le centrosome : centre cellulaire organisateur des microtubules (MOTC). C'est de cette structure située généralement à proximité du noyau que de nombreuses microtubules sont nucléées. Lors de la différenciation cellulaire, cette centralisation par le MOTC est remplacée par d'autres modes d'organisation spécifiques à chaque type de cellule. On trouve ainsi des réseaux apico-basaux dans les cellules épithéliales simples, des réseaux corticaux dans les cellules épithéliales stratifiées ou des réseaux longitudinaux dans les myoblastes fusionnés⁵⁸.

Les assemblages de microtubules dans la cellule peuvent donner naissance à des structures très actives comme les fuseaux mitotiques lors de la division cellulaire ou les axonèmes des flagelles et des cils pour la motilité cellulaire⁵⁹.

À l'échelle moléculaire, les microtubules sont constituées d'une protéine globulaire : la tubuline. La tubuline a été purifiée pour la première fois en 1967 par le groupe de Taylor via une contribution significative de Bosley⁶⁰. La tubuline forme alors en solution un hétérodimère composé de deux protéines globulaires : la tubuline α et la tubuline β d'approximativement 50 kDa chacune (Fig. 3.A). En 1998, la première structure d'un dimère de tubuline était obtenue par cristallographie électronique⁶¹. Ces hétérodimères de 8 nm de long s'associent longitudinalement sous la forme de protofilaments qui interagissent latéralement pour constituer un tube protéique d'un diamètre externe de 25 nm et d'un diamètre interne de 15 nm (Fig. 3.B-C). Une
microtubule se compose généralement de 13 protofilaments. Des données structurales concer-
nant cet arrangement avait déjà pu être obtenues dès les années 70 par des observations en
microscopie électronique<sup>57</sup>. Le filament généré est polarisé avec des tubulines α qui pointent à
l'extrémité dite négative et les tubulines β qui recouvrent l'extrémité dite positive. Il existe
d'autres familles de tubulines (γ, δ, ε, ζ) jouant un rôle dans la nucléation ou l'organisation des
centrioles.

La géométrie remarquable des microtubules implique que chaque hétérodimère au cœur d'un
filament est en étroite interaction au minimum avec quatre partenaires (2 interactions longitu-
dinales, 2 interactions latérales), ce qui participe vraisemblablement à la rigidité des microtu-
bules, supplantant celles des autres filaments du cytosquelette. La longueur de persistance peut
ainsi atteindre 1 à 8 mm pour les microtubules les plus longues<sup>53</sup>.

Les microtubules sont également des filaments dynamiques, principalement à leur extrémité positive où sont exposées les tubulines β<sup>59</sup>. Comme les tubulines α, les tubulines β ont la capacité de fixer un GTP (guanosine triphosphate), mais contrairement aux premières, elles peuvent également catalyser son hydrolyse. Néanmoins, la capacité d'un hétérodimère libre d'hydrolyser son GTP reste limitée. Cette activité enzymatique est stimulée une fois l'hétérodimère polymérisé. En outre, les tubulines en solution liées à des GTP ont une plus grande affinité avec l'extrémité du filament. Ces caractéristiques impliquent la formation d'une coiffe de GTP-tubulines à l'extrémité positive des microtubules où des GTP-tubulines sont fraichement ajoutées, suivie de tubulines globalement fixées par des GDP (guanosines diphosphates) dans le reste de la structure. L'existence et la taille de la coiffe de GTP-tubuline dépend de la vitesse d'élongation du filament. Si celle-ci est trop faible, les GTP-tubulines nouvellement incorporées sont hydrolysées avant que d'autres tubulines fraiches ne soient ajoutées. Or, l'hydrolyse du nucléotide d'une tubuline s'accompagne de changements conformationnels qui influent sur la stabilité du filament. Ce processus serait à l'origine des évènements dits « catastrophes » au cours desquels les microtubules dépolymérisent rapidement depuis leur extrémité positive. Certains sugèrent que ce phénomène brusque s'appuie sur une forte interdépendance de l'état (nucléotidique/structural) entre hétérodimères voisins. Ce couplage entre voisins serait alors à l'origine de réactions en chaînes dont découlent les « évènements catastrophes ». Dans la cellule, cette dynamique chaotique est fermement contrôlée par les « protéines d'association aux microtubules » (MAP) qui peuvent la promouvoir ou l'inhiber<sup>59,62</sup>.
A

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 3 – A.** Représentation en ruban d'un hétérodimère de tubuline de 8 nm de long (Pollard et Goldman, 2018). **B.** Modèle d'une microtubule en elongation (Brouhard et Rice, 2018). **C.** Cryo-Micrographie électronique de microtubules de 25 nm de diamètre (adapté de Jánosi, Chrétien et Flyvbjerg, 2002).</figcaption></figure>

## 1.3. Les filaments intermédiaires.

Les filaments intermédiaires sont des structures filamentaires observables dans les cellules métazoaires⁶³. La kératine, constituant les cheveux en est un exemple emblématique. Cette protéine a été l'objet de nombreuses recherches depuis plus d'un siècle. Les premières informations structurales fines la concernant ont été obtenues grâce à des données de diffraction de rayons X par William T Astbury en 1932. L'avènement de la microscopie électronique a ensuite permis l'observation directe de filaments intermédiaires dans les cellules. C'est en 1968 que Holtzer et ses collègues identifient distinctement ces filaments dont le diamètre est intermédiaire entre celui de l'actine et celui des microtubules. D'autres recherches de biochimie et de biologie structurale ont permis par la suite d'étayer nos connaissances concernant cette famille importante du cystosquelette⁶⁴.
D'un point de vue général, les filaments intermédiaires forment dans la cellule un réseau
qui s'étend de la membrane plasmique jusqu'au noyau. Certains filaments intermédiaires,
comme la lamine, sont localisés dans le noyau même des cellules, participant à un maillage qui
recouvre la membrane nucléaire interne : la lamina. Les filaments intermédiaires fournissent
ainsi un support mécanique à la cellule tout en ancrant le noyau de celle-ci. Capables de s'as-
socier aux microfilaments d'actine et aux microtubules, les filaments intermédiaires constitue-
raient un échafaudage permettant de moduler la transmission des signaux mécaniques au sein
de la cellule.<sup>63,65,66</sup>

On distingue 6 types de polypeptide à l'origine des filaments intermédiaires. Ces polypeptides sont regroupés selon leurs similarités de séquence et de structure. La nature des filaments intermédiaires varie beaucoup d'un type de cellule à l'autre avec par exemple une présence de vi- mentine dans les fibroblastes, de cytokératine dans les cellules épithéliales ou bien de desmine dans les cellules musculaires. La lamine située dans le noyau cellulaire, elle, est ubiquitaire. La composition structurale globale de ces polypeptides ainsi que leur principe d'assemblage en filament restent conservés. À l'origine d'un filament intermédiaire se trouve une protéine fi- breuse d'environ 50 kDa et capable de dimériser (Fig. 4.A). Le dimère formé est constitué d'une succession d'hélices alpha assemblées en superhélices (domaines « coiled coil ») et séparées par des connecteurs flexibles. Ce dimère arbore à ses deux extrémités des domaines globale- ment non structurés appelés « queue » et « tête », très variables d'un polypeptide à l'autre. Deux dimères peuvent ensuite s'associer en quinconce dans un mode semi-étagé pour générer un complexe tétramérique dont le cœur structuré mesure environ 48 nm de long (Fig. 4.A). Le tétramère constitue la brique fondamentale des filaments intermédiaires. Ces tétramères s'as- semblent latéralement puis longitudinalement pour former des filaments intermédiaires matures dont le diamètre final varie autour de 10 nm (Fig. 4.B-C).<sup>65,66</sup>

La structure caractéristique du polypeptide ainsi que le principe d'assemblage confèrent aux filaments intermédiaires des propriétés mécaniques singulières. Les filaments intermédiaires sont apolaires, moins dynamiques que les autres membres du cytosquelette, très extensibles, et flexibles avec une longueur de persistance de l'ordre de 0.2 µm à 1 µm.<sup>67</sup>
A

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

**Figure 4** – A. Gauche, Structure atomique d'un homodimère de kératine. Droite, Structure moléculaire d'un tétramère de vimentine (adapté de Hermann et Aebi, 2016) B. Représentation schématique de la constitution d'un filament intermédiaire mature (adapté de Steinhert, Marekov et David, 1993). C. Micrographie électronique d'un neurofilament de 10 nm de diamètre traité par ombrage (adapté de Herrmann, Kreplak et Aebi, 2004).

## 1.4. Les filaments de septine.

Les septines, souvent oubliées, constituent le dernier composant du cytosquelette à avoir été observé. Cette observation a été réalisée par microscopie électronique, en 1976, par Byers et Goetsch sur le cou bourgeonnant d'une cellule en division⁶⁸. Les filaments de septine forment alors un anneau épousant ce cou bourgeonneant. Les septines interagissent directement avec les phospholipides ce qui leur permet de polymériser dans le plan de la membrane plasmique. La membrane plasmique apparaît alors comme un support facilitant la polymérisation des septines en des assemblages ordonnés. Inversement, les septines polymérisées sur la membrane, influen- cent sa géométrie et ses propriétés mécaniques⁶⁹,⁷⁰.

Ainsi, les filaments de septine en tant que composant du cytosquelette capable de s'as- socier directement avec la membrane plasmique sont impliqués dans de multiples fonctions cellulaires. Les septines participent à l'établissement d'une rigidité membranaire tout en remo- delant la forme de la cellule. Elles interviennent dans l'endocytose et la fusion de vésicules.
Leur organisation dans la membrane est exploitée par des protéines tierces comme échafaudage régulant leur localisation. Elles jouent alors le rôle de barrière de diffusion contribuant à la compartimentalisation cellulaire. Les septines interviennent également dans la motilité cellulaire avec une participation active dans les fibres de stress en association avec les microfilaments d'actine. Enfin les septines, toujours via une interaction étroite avec les microfilaments d'actine participent activement à la cytokinèse⁴⁵,⁶⁹,⁷¹. Cependant, les microfilaments d'actine ne constituent pas l'unique partenaire du cytosquelette pour les septines. Des études montrent également une co-localisation importante des septines avec les microtubules dans la cellule. Les septines et les microtubules apparaissent co-localisées par exemple dans les fuseaux mitotiques lors de la mitose cellulaire, ou bien dans les axones de neurones au cours de leur croissance⁷²,⁷¹.

À l'échelle de la protéine, une septine se décompose en plusieurs domaines dont l'ensemble fait 30 à 65 kDa (Fig. 5.A). On distingue un domaine de liaison de GTP, un N-terminal riche en proline, un domaine de liaison aux lipides polybasiques et, chez les Opisthocontes, un C-terminal arrangé en superhélice (coiled coil)⁷¹. Chez l'humain, il existe 13 septines différentes divisées en quatre groupes homologues. Des septines de différents groupes peuvent s'assembler en des séquences linéaires palindromiques qui forment des oligomères de quatre, six ou huit septines (Fig. 5.B). Ces oligomères constituent l'unité canonique de structures plus complexes. La présence d'un nucléotide de guanine dans le domaine de liaison influe sur la stabilité des oligomères. La plupart des septines assemblées, sont en outre capables d'hydrolyser leur nucléotide lié. Cependant, lorsque c'est le cas, l'activité enzymatique mesurée est lente. Contrairement à l'actine ou la tubuline, l'intérêt biologique d'une telle activité enzymatique demeure peu comprise à ce jour⁷³. Le plan d'assemblage particulier des septines confère aux oligomères leur caractère apolaire.

Ces oligomères peuvent s'agencer sous la forme d'assemblages élaborés tels que des filaments simples, des paires de filaments (Fig. 5.C), des feuillets ou des anneaux pour finalement s'intégrer dans des ultra-structures fonctionnelles.⁷⁴
A

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

**Figure 5** - A. Représentation structurale d'un homodimère de septine 2 humaine (adapté de Andrew D. Weems et al., 2014). B. Représentation surfacique d'un hexamère de septine. (adapté de Sirajuddin et al., 2007) C. Gauche, schéma d'une paire de filaments de septine de levure. Droite, Micrograpphe d'une paire de filaments de septine de levure observé en coloration négative (adapté de Bertin et al. 2008)

## 1.5. Le cytosquelette, une machinerie à décortiquer.

De ce tableau dépeignant les quatre acteurs du cytosquelette, on perçoit la diversité structurale qui est à l'origine de propriétés individuelles singulières, que ce soit d'un point de vue mécanique ou dynamique.

Chacun des acteurs du cytosquelette s'inscrit néanmoins dans un concert coordonné à l'origine des multiples processus fonctionnels pour la cellule. Cette dynamique collective est rendue possible par des propriétés intrinsèques complémentaires pouvant se conjuguer directement ou, indirectement via l'intermédiaire de diverses protéines régulatrices. On peut ainsi citer l'interaction directe existant entre la « queue » des vimentines et l'actine<sup>66</sup> ou bien l'affinité intrinsèque des filaments d'actine avec les septines<sup>75</sup>. On peut également noter l'existence de protéines régulatrices capables de cibler simultanément plusieurs membres du cytosquelette. On retrouve par exemple l'anniline qui participe à l'interconnexion des septines, de l'actine et des microtubules dans l'anneau contractile de la division cellulaire<sup>76</sup>. On peut également citer la myosine X et la dynéine corticale qui interconnectent activement les microtubules et les filaments.
ments d'actine des fuseaux mitotiques<sup>76</sup>. On notera enfin les nesprines qui associent durable-
ment les filaments d'actine à la lamine nucléaire<sup>77</sup>. Le cytosquelette au sein de la cellule se
trouve donc largement unifié.

Avoir une connaissance pointue sur le comportement d'un acteur du cytosquelette ou d'une protéine régulatrice permet de mettre la lumière sur un rouage de cette machinerie complexe.
Au cours de ma thèse je me suis intéressé en particulier à l'actine et sa régulation par la formine d'un point de vue structurale. La connaissance déjà accumulée sur ces deux protéines complémentaires est vaste. Dans les deux chapitres suivant je tâcherai d'en exposer les informations les plus pertinentes dans le cadre de mes travaux.

2. L'actine, une protéine pivot.

2.1. La dynamique intrinsèque de l'actine.

L'actine est un polymère, ainsi elle existe sous une forme désassemblée ou assemblée. Cette polymérisation des filaments d'actine à partir de monomères dépend des conditions biochimiques en solution et notamment de la force ionique. En effet, les monomères d'actine à pH physiologique ont une charge nette négative<sup>78</sup>. Ainsi, à basse force ionique, ils exercent les uns sur les autres une force électrostatique répulsive qui prévient l'amorçage de toute polymérisation. Lorsque la force ionique en solution augmente comme avec l'ajout de sel, la charge des monomères se retrouve écrantée. La force attractive exercée entre les structures des monomères supplante ainsi la force répulsive permettant la formation d'oligomères à l'origine de la polymérisation.

La cinétique de polymérisation des filaments d'actine a été étudiée depuis des décennies à tra-
vers différentes expériences incluant des mesures de viscosité<sup>79</sup>, des mesures de fluorescence<sup>80</sup>
ou des observations en microscopie électronique<sup>81</sup>. Dans le premier cas, la viscosité d'une so-
lution d'actine est fonction de la proportion de polymères contenue en solution ce qui permet
de suivre l'évolution de la polymérisation à travers la mesure de cette viscosité. Dans le second
cas, les monomères d'actine sont fusionnés avec des fluorophores de pyrène dont la fluores-
cence augmente significativement lorsque ces derniers sont intégrés dans l'environnement bio-
chimique des filaments. Une mesure de la fluorescence au cours du temps permet alors d'éva-
luer la progression de l'assemblage des filaments. Dans le dernier cas, la résolution de la mi-
croscopie électronique permet une mesure directe de la taille des filaments. La fixation et la
caractérisation de fractions prélevées à différents temps d'un échantillon d'actine en polymérisation permet d'identifier les constantes cinétiques de la polymérisation des filaments d'actine.
Trois phases ont ainsi été mises en évidence pour décrire la polymérisation de l'actine : une phase de **nucléation**, une phase d'**élongation** et une **phase stationnaire**.

## A. Nucléation.

La phase de nucléation correspond à la formation d'un oligomère d'actine, point de départ pour l'élongation d'un filament. En solution, les monomères d'actine diffusent et entrent aléatoirement en contact engendrant la formation ponctuelle de dimères instables. Les dimères dont les sous-unités sont correctement orientées peuvent poursuivre l'oligomérisation avec l'intégration de nouveaux monomères jusqu'à la formation d'un tétramère. Le tétramère constitue alors l'oligomère intermédiaire le moins stable avec une existence transitoire dans le processus de polymérisation. On parle de noyau de nucléation<sup>82</sup>. L'ajout d'un cinquième monomère stabilise l'assemblage et amorce l'élongation du filament nouvellement nucléé. Cette étape de nucléation est énergétiquement défavorable car elle nécessite la mise en contact de plusieurs monomères s'additionnant à travers des intermédiaires instables. La réussite du processus de nucléation dépend donc de la probabilité qu'un intermédiaire instable incorpore un nouveau monomère avant sa propre dissociation et ceci jusqu'à l'initiation de l'élongation à partir d'un tétramère. Cette probabilité augmente avec la concentration de monomère en solution en démultipliant la fréquence des interactions<sup>82</sup>.

## B. Élongation.

La phase de nucléation lente est suivie d'une phase d'élongation rapide des filaments d'actine. Le filament d'actine étant polarisé, il présente à ses extrémités pointue et barbée des caractéristiques biochimiques et structurales différentes<sup>83</sup>. Cette différence se traduit par un échange plus dynamique de monomères entre le filament et la solution à l'extrémité barbée qu'à l'extrémité pointue<sup>84</sup>.

La dynamique à une extrémité est caractérisée par sa constante cinétique de dissociation $k_{off}$ et sa constante cinétique d'assemblage $k_{on}$. Le rapport entre ces deux constantes donne une concentration critique d'assemblage. Si la concentration d'actine en solution est supérieure à cette concentration critique, l'extrémité polymérise. Si la concentration d'actine en solution est inférieure à cette concentration critique, l'extrémité dépolymérise. On relève d'après « Fujiwara et al., 2007 »<sup>84</sup> les valeurs suivantes :
À l'extrémité barbée en présence d'ATP :

$$k_{on}^{B,ATP} = 11.6 \ \mu\text{M}^{-1}\text{s}^{-1} \text{ et } k_{off}^{B,ATP} = 1.4 \ \text{s}^{-1} \text{ d'où } C_{critique}^{B,ATP} = 0.12 \ \mu\text{M}$$

À l'extrémité pointue en présence d'ATP :

$$k_{on}^{P,ATP} = 1.3 \ \mu\text{M}^{-1}\text{s}^{-1} \text{ et } k_{off}^{P,ATP} = 0.8 \text{ d'où } C_{critique}^{P,ATP} = 0.6 \ \mu\text{M}$$

Malgré une dynamique différenciée au bout barbé et au bout pointu, avec un taux d'assemblage d'un ordre de grandeur supérieur pour le bout barbé, les concentrations critiques d'assemblage observées restent similaires. Cette quasi-symétrie est remplacée au profit d'une asymétrie marquée grâce à l'hydrolyse de l'ATP qui s'opère au cours de la polymérisation.

### C. Phase stationnaire et processus du « tapis roulant ».

Lors de la polymérisation, la structure d'un monomère d'actine nouvellement incorporé dans un filament subit des changements conformationnels. Ils se traduisent notamment par une rotation de 20° du petit domaine du monomère d'actine par rapport au grand domaine rendant la protéine plus plate⁸⁵,⁸⁶. Ces changements de conformation stimulent l'hydrolyse d'un potentiel ATP lié dans la poche d'interaction de l'actine⁸⁷. Le taux d'hydrolyse monte alors à 1/3.3 s⁻¹ alors que pour la G-actine en solution il est limité à 1/4510 s⁻¹⁵⁵. Ainsi, chaque monomère d'ATP-actine incorporé dans un filament subit un cycle d'hydrolyse (Fig. 6). Le passage de l'ATP-actine à l'ADP-actine se fait par un état intermédiaire ADP-Pi-actine pour lequel le phosphate hydrolysé reste piégé dans la poche d'interaction de l'actine. Le taux de relargage du phosphate piégé sous la forme ADP-Pi-actine est 100 fois inférieur au taux d'hydrolyse d'une sous-unité ATP-F-actine⁵⁵. Ainsi, les filaments fraichement polymérisés (quelques secondes) à partir d'ATP-actine restent principalement constitués d'ATP actine. Au-delà de ce temps, les filaments sont principalement constitués d'ADP-Pi actine. Enfin, les filaments vieux de plusieurs minutes sont principalement constitués d'ADP-actine. L'état nucléotidique du filament joue ainsi le rôle d'une horloge interne.

La différence structurale entre les bouts pointus et les bouts barbés engendre une dynamique différenciée de ces extrémités, avec un échange de monomères plus important aux extrémités barbées (Cf k<sub>on</sub>, k<sub>off</sub>)<sup>83</sup>. Cette caractéristique entraine, après quelques minutes de polymérisation, la formation d'une coiffe d'ATP-actine aux bouts barbés des filaments tandis que les bouts pointus sont composés principalement d'ADP-actine. Or, la transition de l'ATP-actine vers de
l'ADP-actine entraine des changements conformationnels qui affaiblissent les interactions intra-filaments. En ce sens, Stephan Raunser et ses collègues proposent que cette déstabilisation découle de la propension réduite de la D-loop d'une sous-unité d'ADP-actine à former une poche hydrophobe (état ouvert) capable de piéger la queue C-terminale de sa sous-unité voisine (Fig. 6)⁸⁶,⁸⁸.

Il en résulte une nette différence entre la concentration critique d'assemblage des monomères au bout barbé composé d'ATP-actine et au bout pointu composé d'ADP-actine, la dernière devenant bien supérieure à la première⁸⁹,⁸⁴.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 6** – Représentation schématique de la catalyse de l'hydrolyse lors de l'incorporation d'un monomère ATP-actine dans un filament et du changement structural qui l'accompagne entrainant la déstabilisation de ce même filament. (Merino et al., 2019)</figcaption></figure>

Ainsi, lors de la polymérisation d'actine en solution, partant d'une concentration initiale d'ATP-actine libre supérieure aux deux concentrations critiques, un phénomène singulier se met en place. Au fur et à mesure que de l'ATP-actine libre en solution est consommée pour nucléer puis allonger des filaments et que le cycle d'hydrolyse s'opère, la concentration d'actine monomérique disponible diminue jusqu'à être inférieure à la concentration critique d'assemblage des bouts pointus d'ADP-actine. On a ainsi une dépolymérisation des filaments d'actine aux extrémités pointues. Comme cette concentration critique d'assemblage aux bouts pointus est supérieure à la concentration critique d'assemblage aux bouts barbés, toujours composés d'ATP-actine, la concentration d'actine libre disponible en solution reste supérieure à la concentration critique d'assemblage des extrémités barbées. Ainsi, en parallèle de la dépolymérisation des filaments aux bouts pointus, ces mêmes filaments continuent de polymériser à leurs extrémités barbées. On a donc un équilibre qui se forme entre les extrémités pointues dépolymérisantes et les extrémités barbées polymérisantes. Cet état correspond à un état stationnaire
du système pour lequel la taille globale des filaments ne change pas et la concentration mono-
mérique d’actine est maintenue aux alentours de 0.15 µM⁸⁹. On parle alors du phénomène de
« tapis roulant »⁵⁶. Il a été mis en évidence que le principe du tapis roulant, mis en action par
des protéines régulatrices, est à l’origine de la motilité induite par les réseaux branchés des
lamellipodes⁴³,⁹⁰.

Dans la cellule, ce mécanisme élégant par lequel l'hydrolyse de l'ATP polarise la polymérisa-
tion des filaments, se complexifie avec l'interaction de nombreuses protéines de liaison à l'ac-
tine.

2.2. Diversité biochimique de l'actine.

A. Génétique et modifications post-traductionnelles.

La disparité génétique de l'actine entre eukaryotes est très modérée avec une divergence
qui reste inférieure à 10% entre la levure et l'homme⁸⁸. Néanmoins, de légères modifications
de la composition peptidique de l'actine en des endroits clefs peuvent entrainer des phénotypes
foncièrement distincts. Ainsi, chez les Apicomplexa, parasites des métazoaires, les microfila-
ments d'actine générés présentent au niveau de l'interface inter-brin, des acides aminés diffé-
rents de ceux des filaments d'actine de mammifère, les rendant instables⁸⁸,⁹¹,⁹². Cette instabilité
des microfilaments chez les Apicomplexa favorise alors l'émergence d'une population de
courts filaments, nécessaire pour leur motilité et leur infectivité⁹³.

Au sein même d'une classe d'animal, il existe également une certaine variabilité structurale de
l'actine avec par exemple l'existence de six isoformes distincts chez les mammifères et les oi-
seaux : α_squelettique, α.cardiac, α.lisse, γ.lisse, β.cyto, et γ.cyto. Parmi ces isoformes, la β.cyto-actine et la γ.cyto-
actine sont présentes dans la plupart des cellules⁹⁴. Bien que leurs différences structurales se
limitent à quelques acides aminés, des expériences in vivo montrent des phénotypes différenciés
après modulation de leur expression respective⁹⁵,⁹⁶. En outre, la distribution en isoformes d'ac-
tine semble pouvoir varier selon l'ultra-structure de la cellule considérée. Des observations sug-
gèrent par exemple que la β-actine se localise préférentiellement au front des lamellipodes⁹⁷
tandis que la γ-actine se trouverait préférentiellement au cœur du cytoplasme⁹⁸.

Cette diversité structurale encodée dans l'ADN est enrichie par des modifications post-traduc-
tionnelles⁹⁹ avec notamment l'arginylation qui, lorsque qu'elle est réalisée sur la β-actine d'une
cellule, favorise la formation des lamelilopodes¹⁰⁰, mais lorsqu'elle est réalisée sur la γ-actine,
entraîne la dégradation de celle-ci par le protéasome¹⁰¹.
## B. pH.⁷⁸

L'activité des ions hydrogènes en solution a également un impact sur la composition de l'actine en déterminant l'état de protonation/déprotonation de ses acides aminés. Cet état influe alors directement sur la nucléation et l'élongation des filaments d'actine. Il a ainsi été montré qu'une diminution du pH à une valeur proche de 6 entraine une stimulation de la nucléation avec une réduction du temps de latence précédent la phase d'élongation⁷⁸. Cette stimulation s'appuie non pas sur des changements structuraux au sein des monomères d'actine mais sur une réduction de la charge nette en valeur absolue qui se rapproche du point isoélectrique théorique du monomère d'actine alors inférieur à 6. Cette diminution du pH permet donc de neutraliser les forces électrostatiques répulsives des monomères d'actine qui entravent la nucléation.

De la même manière, le pH à un effet sur la vitesse d'élongation des filaments nucléés en monodifiant les cinétiques d'assemblage et de désassemblage aux extrémités des filaments⁷⁸.

Ce contrôle électrostatique de la polymérisation par l'intermédiaire du pH ne se limite pas à l'éprouvette mais peut avoir des implications biologiques réelles. C'est le cas pour la bactérie Listeria qui fonde sa motilité sur la formation d'une comète d'actine branchée à sa surface et dont la polymérisation entraine sa propulsion⁹⁰. Il a été montré que lorsque le pH cytoplasmique de la cellule hôte est diminué de 7.4 à 7.1, la motilité de la bactérie augmente en accord avec la stimulation de la polymérisation des filaments d'actine mesurée *in vitro*⁷⁸.

## C. Cations et nucléotides.

Comme évoqué en section 1.1, le monomère d'actine possède une poche de liaison pour un dication de magnésium ou calcium lié à un nucléotide d'adénine. L'affinité de cette interaction est très forte avec un $K_d$ de l'ordre du nanomolaire¹⁰². En outre, les monomères d'actine présentent une affinité bien plus importante pour l'ATP que pour l'ADP. Lorsque qu'un ATP est lié au monomère d'actine, la liaison d'un dication entraine des changements conformationnels. La liaison d'un magnésium ou d'un calcium influence différemment la dynamique des filaments d'actine avec une nucléation et une elongation plus importante en présence de Mg-ATP¹⁰³. Le magnésium entraine également une hydrolyse plus rapide de l'ATP en comparaison au calcium avec des changements structuraux après hydrolyse plus marqués. Ainsi, le magnésium favorise la polarisation des filaments d'actine à travers l'hydrolyse de l'ATP (phénomène du « tapis roulant »). Dans la cellule la concentration en magnésium est supérieure à la concentration de calcium de telle sorte qu'il est communément admis que le sillon 4/2 du monomère d'actine est naturellement occupé par un dication de magnésium lié à un nucléotide d'adénine,
cela bien que l'affinité des monomères d'actine pour le calcium soit supérieure à leur affinité pour le magnésium¹⁰³,¹⁰⁴.

Il existe également sur le monomère d'actine environ cinq autres sites de liaisons de cations à faible affinité ($K_d$ de l'ordre du micro ou mili-molaire). Lorsque le filament se forme, deux sites de liaison de cation supplémentaires apparaissent à travers l'agencement des sous-unités d'actine. Ces deux sites de liaison ont pu être prédits par bio-informatique et ont été étudiés *in vitro*⁹⁹. Un premier site de liaison se situe à l'interface entre les sous-domaines 3 et 4 de deux sous-unités d'actine d'un même brin. L'occupation de ce site de liaison favorise la polymérisation du filament d'actine. Un second site de liaison se situe à l'interface entre les sous-domaines 3 et 2 (D-loop) de deux sous-unités d'actine d'un même brin. L'occupation de ce site renforce quant à lui la rigidité du filament d'actine (Fig. 7).

<figure><img src="image_17.png" /></figure>

**Figure 7** - Modèle structural d'une interaction intra-brin d'un filament d'actine mettant en évidence différents sites de liaison pour des cautions (adapté de Kang et al., 2013).

Les nucléotides, les cations et le pH ne sont pas les seuls facteurs influençant la dynamique et la mécanique de l'actine. De nombreuses protéines tierces interagissent également avec l'actine pour en moduler son activité. Ces différents intervenants peuvent alors s'influencer mutellement via une compétition ou une coopération sur l'actine et ses sites de liaison.

## 2.3. Le monomère et ses protéines régulatrices.

Une dernière source importante de variabilité dans la population d'actine monomérique des cellules vient de sa fonctionnalisation par diverses protéines de liaison. Je m'applique dans cette section à décrire de manière non exhaustive de telles actrices me paressant représentatives de la fonctionnalisation de l'actine.
La concentration locale d'actine monomérique mesurée dans les cellules peut avoisiner 1500 fois la concentration critique de l'actine<sup>102</sup>. Cet état est rendu possible par les protéines de séquestration de l'actine comme la **thymosine β4** (5 kDa<sup>47</sup>) ou la **profiline** (14 kDa<sup>37</sup>). L'action de ces protéines entraine la constitution d'une réserve massive d'actine non polymérisée qui est, au besoin, intégrée dans des ultra-structures fonctionnelles de la cellule. Ces protéines permettent donc une réactivité de la cellule capitale pour un haut niveau d'adaptabilité à son environnement.

La **thymosine β4** peut neutraliser la G-actine en se fixant simultanément aux sillons 3/1 et 4/2 de l'actine par l'intermédiaire de deux helices alpha reliées par une chaine peptidique étendue (Fig. 8.A). La **thymosine β4** inhibe ainsi la polymérisation de l'actine que ce soit pour la nucléation ou son incorporation dans un filament. La **thymosine β4** présente une affinité 50 fois supérieur pour de l'ATP-actine que pour de l'ADP-actine<sup>105,106</sup>. En outre son mode de fixation à l'actine empêche l'échange d'un nucléotide piégé dans le sillon 4/2. Ces deux caractéristiques mises bout à bout permettent à la **thymosine β4** de maintenir en réserve un ensemble de monomères ATP-actine prêt à être polymérisé et capable d'opérer le cycle d'hydrolyse associé<sup>37</sup>.

En parallèle, la **profiline** permet également de fixer l'actine monomérique en se concentrant sur le sillon 3/1 de celle-ci (Fig. 8.B)<sup>37</sup>. La **profiline** ainsi liée empêche la nucléation de l'actine. En outre, sa fixation entraine un éloignement allostérique des sous-domaines 4 et 2 favorisant l'échange de nucléotide dans la poche alors ouverte. Étant donné une affinité plus importante de la structure engendrée pour la Mg-ATP, la **profiline** stimule ainsi la régénération des ADP-actine en ATP-actine<sup>107</sup>.

La fixation de la **profiline** du côté « positif » de l'actine n'inhibe pas l'association de cette dernière à une extrémité barbée<sup>108</sup>. Cette incorporation dans un filament d'actine peut être contrôlée à travers une affinité des **profilines** pour des protéines promotrices de l'élongation des filaments d'actine comme la **formine**<sup>14</sup> ou **Ena/VASP**<sup>109</sup>. Une **profiline** liée à un monomère d'actine fait alors le lien entre le monomère et la protéine promotrice de l'élongation qui accompagne à son tour le monomère d'actine à l'extrémité barbée d'un filament. La transition structurale de la G-actine vers la F-actine lors de la polymérisation favorise une dissociation de la **profiline** du bout barbé nouvellement allongé permettant ainsi la poursuite de l'élongation.

Enfin, des études structurales suggèrent que la **profiline** et la **thymosine β4** peuvent former un complexe ternaire transitoire avec l'actine monomérique<sup>110</sup>. Cette propriété permettrait d'assurer un relais continu entre les deux protéines, limitant toute nucléation spontanée de l'actine jusqu'à l'élongation contrôlée d'un filament via les partenaires de la **profiline** sus-cités.
Il existe également des protéines de séquestration d'actine en dehors des cellules avec notamment la **gc-globuline** (52 kDa<sup>111</sup>) circulant dans les vaisseaux sanguins<sup>112</sup>. Son rôle crucial est de prévenir toute polymérisation accidentelle d'actine dans ces vaisseaux pouvant être délétère pour l'organisme. La **gc-globuline** interagit avec l'actine via le sillon 3/1 avec une surface d'interaction importante (Fig. 8.C)<sup>111,113</sup>. Ce mode d'interaction confère à la **gc-globuline** une constante de dissociation (K<sub>d</sub>) avec l'ATP-actine de l'ordre de 1 nM<sup>114</sup> alors qu'elle est de 0.1 – 3.9 µM pour la **thymosine β<sub>4</sub>** et de 0.1 µM pour la **profiline<sup>110</sup>**.

Le sillon 3/1 apparaît comme un domaine d'interaction clef de l'ensemble de ces protéines de liaison au monomère d'actine (Fig. 8). Il en résulte une conservation frappante de ses acides aminés, de la levure à l'homme<sup>47</sup>. Cette conservation résulte certainement d'une pression évolutive colossale s'exerçant sur l'actine à travers son rôle de protéine pivot dans la cellule<sup>88</sup>.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 8 –</figcaption></figure>

Structures cristallographiques de monomères d'actine (bleus) en interaction avec A. une thymosine β₄ (rouge) - PDB : 4PI7, B. une profiline (violet) – PDB : 2PBD, C. une gc-globuline (rose) – PDB : 1MA9. (barre d'échelle : 50 Å)

Dans la cellule, des assemblages fonctionnels très différenciés se forment à partir de l'actine monomérique, parfois séquentiellement, parfois simultanément. Ces différentes ultra-structures puisent leurs briques d'assemblages dans la réserve d'actine disponible pour créer ou maintenir leur structure tout en respectant des contraintes d'échelles strictes.

Une simple compétition sur l'utilisation de la réserve d'actine commune ne suffit pas à expliquer le renouvellement spatio-temporelle de ces ultra-structures variées<sup>102,115,116</sup>. Afin d'assurer la formation contrôlée de ces ultra-structures définies par des propriétés géométriques précises, un aiguillage s'opère par la fonctionnalisation même de la réserve d'actine monomérique disponible. Cette fonctionnalisation peut en effet permettre l'assignation efficace des monomères d'actine dans les différentes ultra-structures<sup>102</sup>.

C'est ainsi par exemple, qu'un monomère d'actine lié à une **profiline** serait plus facilement incorporé dans un faisceau d'actine linéaire que dans un réseaux branchés. En effet, les réseaux branchés sont initiés par la protéine de régulation **Arp2/3** tandis que les longs filaments des
faisceaux linéaires sont favorisés par les **formines**. Or, si la **profiline** soutient l'activité élongatrice des **formines**, à l'inverse, elle contrarie l'activité nucléatrice d'Arp2/3<sup>102,117,118</sup>.

Les protéines de liaison des monomères d'actine représentent donc la première couche de régulation de la dynamique de l'actine. La seconde couche de régulation, elle, s'opère à l'échelle des filaments déjà formés via une seconde catégorie de protéines agissant directement sur la structure hélicoïdale des microfilaments d'actine.

## 2.4. Le filament d'actine comme plateforme d'interaction.

Il existe dans la cellule une profusion de protéines régulatrices des microfilaments d'actine. C'est de cette diversité qu'émerge la quantité variée des modes d'organisation de l'actine et des fonctions cellulaires actine-dépendantes (Fig. 9)<sup>88</sup>.

On distingue différentes protéines régulatrices selon leur modalité d'interaction principale avec les filaments d'actine. Certaines protéines décorent latéralement les filaments pour les dépolyrémeriser, les stabiliser ou les fonctionnaliser. D'autres protéines coiffent leurs extrémités et influencent ainsi la nucléation, l'élongation ou l'ancrage des filaments.
<figure><img src="image_19.png" /></figure>

**Figure 9** – A. Réplique de platine du front d'une cellule de mélanome de souris observée en microscopie électronique (Bleu : fagots d'actine constitutifs des filopodes, Marron : réseau dense de filaments d'actine constitutifs du lamellipode, Violet : réseau plus clairsemé de la lamelle cellulaire – barre d'échelle 1 µm). B. Région agrandie de l'encadré A (Rose : complexe de protéines régulatrices à l'extrémité d'un filopode). C. Extrait d'un fibroblaste de rat présentant un fragment d'une fibre de stresse (gauche) accompagné d'un réseau d'autres composants du cytosquelette (droite) (Jaune : filaments d'actine, Bleu : filaments intermédiaires, Rouge : microtubules – barre d'échelle 500 nm). D. Mise en évidence d'un empilement de myosines II alignées après dissolution d'actine (Rouge : myosine II, Bleu : filaments intermédiaires – barre d'échelle 500 nm). E. Organisation des filaments d'actine dans un lamellipode de kératocyte de poisson. L'encadré jaune est agrandi, montrant la présence de filaments d'actine branchés en bleu – barre d'échelle 500 nm. (Svitkina, 2018)

## A. Décorations déstabilisantes le long du corps des filaments d'actine.

Comme dans le cas des cations évoqué en section 2.2, il se forme le long de l'agence-ment hélicoïdal des filaments d'actine des sites de liaisons spécifiques pour des protéines régulatrices. Parmi ces protéines, une première catégorie permet, par leur fixation, d'influencer directement la structure et la dynamique du filament entrainant sa déstabilisation. On peut alors citer les **ADF/cofilines**¹¹⁹,¹²⁰ et les **gelsolines**¹²¹, qui à travers leur interaction découpent les filaments d'actine en de plus courts fragments. Les mécanismes d'action de ces deux familles de protéine sont distincts.

Les **ADF/cofilines** sont des petites protéines de 13 – 19 kDa qui se lient, avec un ratio 1:1 et de manière coopérative aux sillons formés par les sous-domaines 2 et 1 d'une interface intra-brin
(Fig. 10.A)¹²⁰. Cette interaction coopérative entraine la formation de sections de filaments décorées laissant d'autres sections nues. Les sections du filament décorées présentent une torsion modifiée avec un pas angulaire qui tombe à 162°. Cette différence structurale entre sections décorées et sections nues entraine une instabilité à leur frontière qui à terme déclenche la rupture du filament¹²². La rupture a lieu préférentiellement à la frontière d'un patch décoré situé du côté pointu. Les **ADF/cofilines** peuvent également stimuler la dépolymérisation des filaments aux extrémités et elles présentent une affinité supérieure pour les ADP-actines. En fin de compte, ces propriétés permettent aux **ADF/cofilines** d'assister le recyclage actif de l'actine dans des ultra-structures établies en désassemblant les filaments à proximité des extrémités pointues principalement constituées d'ADP-actine. L'actine ainsi désassemblée pourra ensuite être réutilisée pour allonger les extrémités barbées des filaments d'actine, c'est le processus du tapis roulant régulé. Comme déjà évoqué dans la section 2.1. C'est sur ce processus que se fonde la motilité des cellules à travers les lamellipodes (Fig. 9.A,E) dans lesquels les bouts barbés pointent vers la membrane plasmique tandis que les bouts pointus pointent vers le cytoplasme.

Les **gelsolines**, pour leur part, forment une famille de grandes protéines multi-domaines de l'ordre de 90 kDa. Une série de domaines se lient comme les **ADF/cofilines** aux sillons formés par les sous-domaines 2 et 1 d'une interface intra-brin (Fig. 1.D). Ces domaines conduisent à l'encerclement du filament¹²¹. D'autres sous-domaines interagissent plus en profondeur sur l'interface positive des protomères d'actine, entrainant le découpage du filament. La nouvelle extrémité barbée exposée par ce découpage reste alors coiffée de la **gelsoline**.³⁷ À l'instar des **gelsolines**, on peut d'ores et déjà évoquer au moins deux **formines** présentant cette même particularité fonctionnelle de découpage des filaments d'actine : INF2¹²³ et FRL-α¹²⁴.

## B. Décorations stabilisantes du corps des filaments d'actine.

De manière antagoniste, certaines protéines régulatrices renforcent quant à elles la stabilité des filaments d'actine. On peut alors citer la **phalloïdine**, la **jasplakinolide** et la **tropomyosine**. Les deux premières protéines sont des toxines, respectivement de champignon et d'éponge de mer, capables de se lier à l'interface inter-brin d'un filament d'actine (Fig. 10.B). Elles renforcent de ce fait les interactions inter-brins mais également intra-brins du filament. En outre, la fixation de ces protéines inhibe l'hydrolyse de l'ATP par les protomères d'actine.
De par cette activité, ces deux toxines perturbent la dynamique cellulaire des filaments d'actine⁹¹,¹²⁵. Fonctionnalisées avec des fluorophores, ces protéines ont souvent été utilisées pour visualiser les filaments d'actine *in cellulo*¹²⁶.

Pour sa part, la **tropomyosine**, protéine non exogène, apparait indispensable pour certaines fonctions physiologiques avec notamment une participation dans l'édification des sarcomères musculaires¹²⁷. De plus grande dimension que la **phalloïdine** ou la **jasplakinolide**, la **tropomyosine** forme en solution un dimère tête bêche de 70 kDa via un assemblage en superhélice de 420 Å de long. Ces dimères peuvent polymériser en interaction avec les filaments d'actine. Ils suivent ainsi sensiblement le pas long du filament à travers deux rubans de **tropomyosines** parallèles et disjoints (**Fig. 10.C**). Cette décoration du filament permet, tout en stabilisant la structure, de l'habiller pour contrôler l'activité de protéines régulatrices tierces comme les **ADF/cofilines**¹²⁸ ou les **myosines**¹²⁹,⁸⁶.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 10** – Structures atomiques, déterminées par cryo-microscopie électronique, de filaments d'actine (bleus) en complexe avec A. des cofilines (verts) – PDB : 5YU8. B. des phalloïdines (jaunes) – PDB : 6T1Y, encadré : environnement d'une phalloïdine (S. Pospich, F. Merino, S. Raunser. 2020). C. des tropomyosines (violet) – PDB : 3J8A. (barre d'échelle : 50 Å)</figcaption></figure>

### C. Décorations fonctionnalisantes du corps des filaments d'actine.

Une autre catégorie de protéine est capable de fonctionnaliser les filaments d'actine pour organiser leur agencement au sein d'ultra-structures. Un premier exemple est la **fascine**, protéine essentielle pour la formation des filopodes (**Fig. 9.A-B**) ou des fibres de stress (**Fig. 9.C**)¹³⁰. Cette protéine d'environ 55 kDa¹³¹ permet de connecter deux filaments d'actine linéairement orientés. Pour se faire, cette protéine rigide expose deux sites principaux d'interaction avec l'actine distant de 5 nm et reliés par une quasi-symétrie 2. Il en résulte, après l'association des **fascines** avec des filaments d'actine, la formation de faisceaux compacts (**Fig. 11.A**)¹³²,¹³³.
Les fagots d'actine générés peuvent ensuite être ancrés latéralement à la membrane plasmique par l'intermédiaire des protéines ERM (**ezrine**, **radixine**, **moesine**). La membrane plasmique est remodelée par la forme du fagot d'actine<sup>134</sup>.

Une deuxième protéine capable d'interconnecter les filaments d'actine est l'**α-actinine**. L'**α-actinine** forme en solution un homodimère symétrique allongé de 200 kDa et 360 Å de long (Fig. 11.B). Ce dimère arbore à ses extrémités des domaines globulaires liés de manière flexible au corps de la protéine. Ce sont ces domaines qui assurent l'interaction avec les filaments d'actine. La flexibilité de leur liaison permet alors l'incorporation d'**α-actinine** dans des réseaux contractiles, réticulés ou linéaires, comme dans le cas du cortex cellulaire ou des fibres de stress (Fig. 9.C)<sup>135,136</sup>.

Une troisième protéine interagissant directement avec le corps des filaments d'actine et à l'origine du caractère contractile des réseaux suscités se trouve être la **myosine** et notamment la **myosine II**. La particularité de cette protéine linéaire dont l'unité canonique mesure ~250 kDa, réside dans son rôle de moteur moléculaire et sa capacité d'assemblage sous la forme de myofilaments<sup>137</sup>. Ces myofilaments exhibent des « têtes » mobiles, capables, à travers l'hydrolyse d'ATP, de pivoter en entrainant avec elles le corps d'un filament d'actine en contact. On retrouve alors ces filaments de **myosine** dans les sarcomères des myofibrilles, responsables de la contraction musculaire (Fig. 9.D, 12.C).
<figure><img src="image_21.png" /></figure>

**Figure 11** – A. Gauche, structure atomique d'une fascine obtenue par cristallographie – PDB : 3LLP (barre d'échelle : 50 Å). Droite, micrographie d'un faisceau de filaments d'actine interconnectés par des fascines et observé en coloration négative (adapté de Jansen et al. 2011). B. Gauche, structure atomique d'une actinine obtenue par cristallographie – PDB : 1SJJ (barre d'échelle : 100 Å). Droite, micrographie d'un faisceau de filaments d'actine interconnectés par des actinines et observés par microscopie électronique en coloration négative (barre d'échelle : 100 nm – adapté de P.K. Luther. 2009). C. Gauche, haut - structure d'une portion d'un filament de myosines II obtenue par cryo-microscopie électronique. Gauche, bas - mise en évidence de l'agencement de plusieurs myosine II (bleu : myosines II segmentées – barres d'échelle 100 Å – adapté de Hu et al. 2016). Droite – micrographie d'un filament bipolaire de myosine II observé par microscopie électronique en coloration négative et accompagné de sa représentation schématique (adapté de Molecular Biology of the Cell. 4th edition). D. Structure atomique d'un filament d'actine (jaune) en interaction avec la « tête » d'une myosine II (bleu) – PDB : 1M8Q (barre d'échelle : 50 Å).

Le corps des filaments d'actine ne représente cependant pas l'unique surface d'interaction pour des protéines régulatrices. Au contraire la dynamique intrinsèque des filaments étant localisée à ses extrémités, ces dernières apparaissent comme des sites de prédilection pour réguler la cinématique des échanges.
D. Coiffes inhibitrices de l'elongation.

Dans les ultra-structures des cellules, la taille des filaments d'actine est finement régulée. En effet, les propriétés mécaniques de ces assemblages complexes en dépendent. Les extrémités barbées dont la dynamique est élevée sont des cibles majeures pour maitriser la cinétique d'allongement globale des filaments d'actine.

En ce sens, des protéines régulatrices se lient spécifiquement aux extrémités barbées pour bloquer tout nouvel échange de monomère d'actine. Une protéine notoire assurant cette fonction est la protéine de coiffe CapZ (Fig. 12). Cette protéine est un hétérodimère composé de deux sous-unités α et β d'environ 30 kDa chacune. La structure atomique de la protéine CapZ seule, déterminée par diffraction des rayons X¹³⁸, ainsi que l'enveloppe 3D du complexe CapZ-extrémité barbée, déterminé par cryo-microscopie électronique, ont permis d'établir un modèle d'interaction de cette protéine¹³⁹. La liaison de CapZ au bout barbé serait assurée dans un premier temps par l'interaction des acides aminés basiques de la queue C-terminale du domaine α avec les acides aminés des deux premières sous-unités d'actine du bout barbé. Dans un second temps, la queue C-terminale du domaine β établirait une interaction hydrophobe avec la première sous-unité d'actine de l'extrémité barbée. Cumulées, ces deux interactions confèrent à la protéine de coiffe CapZ une très forte affinité pour le bout barbé des filaments d'actine (K<sub>d</sub>~1 nM). En outre, cette configuration retient la première sous-unité du filament d'actine tout en prohibant stériquement l'addition de nouveaux monomères d'actine au bout barbé. On retrouve alors la protéine de coiffe CapZ dans les lignes Z des sarcomères, structures dans lesquelles les filaments d'actine doivent être les plus stables possibles pour maintenir l'activité musculaire¹⁴⁰.

À l'autre extrémité du filament d'actine, le bout pointu présente une dynamique naturellement lente, ce qui ne laisse qu'une ouverture réduite pour l'échange de monomères d'actine. Néanmoins, dans des assemblages comme les sarcomères cette dynamique doit-être limitée à son minimum pour garantir des structures pérennes. Pour assurer cette fonction, on peut citer la **tropomoduline**, protéine régulatrice de 40 – 50 kDa venant coiffer les bouts pointus des filaments d'actine en s'enroulant autour de leurs trois premiers protomères (Fig. 12)¹⁴¹. La **tropomoduline** limite alors l'ajout et la dissociation de sous-unités d'actine à l'extrémité pointue. Son affinité avec le bout pointu reste cependant modérée avec une constante de dissociation d'environ 0.1 - 0.2 µM. Tout l'intérêt des **tropomodulines** se dévoile avec l'interaction de protéines régulatrices tierces comme la **tropomyosine** (Fig. 12). En effet, la **tropomoduline** en présence de **tropomyosine** voit sa constante de dissociation diminuer d'un ordre de grandeur¹⁴². La tropomoduline permet alors, en coopération avec les protéines de coiffe **CapZ**, de réduire
radicalement la dynamique des filaments d'actine. Elle assure en outre le bon alignement des **tropomyosines** sur les filaments<sup>88</sup>.

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

**Figure 12** – Modèle structural d'un filament d'actine (jaune) décoré de tropomyosines (orange) le long de son corps et coiffé à ses extrémités d'une tropomoduline (violet) au bout pointu et d'une protéine de coiffe CapZ (bleu) au bout barbé (Thomas D. Pollard, 2016).

La **tropomoduline** se manifeste également dans le cas particulier du cytosquelette spécialisé des érythrocytes<sup>247</sup>. Ce cytosquelette spécialisé est constitué d'un maillage tridimensionnel dont l'ossature est assurée non pas par des filaments d'actine mais par des filaments de **spectrine**. Les **spectrines** sont des protéines filiformes d'environ 250 kDa capables d'interagir avec les filaments d'actine. Deux isoformes de spectrine, α et β, sont capables de former des filaments bipolaires qui se décomposent en deux d'hétérodimères antiparallèles, associés tête bèche en un tétramère. Dans le contexte du cytosquelette des érythrocytes, les filaments d'actine constituent les nœuds du réseau via des fragments stabilisés de 30 nm de long. La stabilisation stricte
de ces fragments aux bouts pointus est assurée comme dans les sarcomères par la **tropomoduline** en interaction avec la **tropomyosine**. D'autres protéines comme les protéines ERM décorrent les fragments d'actine pour ancrer le réseau à la membrane plasmique et ainsi conférer leurs propriétés mécaniques aux hématies.

Dans ces deux types d'assemblage, sarcomères des myofibrilles ou cytosquelette spécialisé des érythrocytes, les filaments d'actine stabilisés par des protéines de coiffe jouent essentiellement le rôle de plateformes d'interactions statiques. Néanmoins, certaines protéines de coiffe interviennent également dans des assemblages d'actine très dynamiques tels que les lamellipodes.

### E. Stimulation de la nucléation et coiffes promotrices de l'élongation.

Dans le cas des réseaux branchés anisotropes tels que les lamellipodes, la nucléation des filaments repose principalement sur le complexe Arp2/3<sup>248,232,233</sup>. Ce complexe présente une activité à la croisée des chemins entre fonctionnalisation latérale d'un filament d'actine préexistant et coiffe de l'extrémité pointue d'un filament nouvellement nucléé ou préexistant. En effet, Arp2/3 peut décorer durablement le corps d'un filament d'actine tout en nucléant à partir de celui-ci un nouveau filament qui s'allonge depuis son extrémité barbée (Fig. 13.A). L'assemblage créé par Arp2/3 dessine un embranchement qui forme un angle d'environ 70° entre le filament d'actine initial « père » et le filament d'actine créé « fils » (Fig. 9.E, encadré). À l'échelle moléculaire, Arp2/3 est un complexe de 224 kDa constitué de sept protéines (Fig. 13.A). Deux de ces protéines, Arp2 et Arp3, présentent un repliement homologue à celui de l'actine. Pour assurer son activité de branchement et de nucléation le complexe Arp2/3 nécessite l'intervention de facteurs promoteurs de la nucléation (NPFs). Ces protéines, en se liant à Arp2/3 et en coopération avec l'interaction du filament père, entrainent des changements conformationnels dans le complexe qui à terme rapprochent les protéines Arp2 et Arp3. Ces deux domaines s'agencent alors sous la forme d'un pseudo filament d'actine dont les faces positives restent exposées ce qui permet d'outrepasser l'étape de nucléation spontanée pour entamer une elongation rapide d'un nouveau filament. En outre et dans une moindre mesure, le complexe Arp2/3 présente également la capacité de coiffer le bout pointu d'un filament d'actine préexistant sans que l'intervention de protéines tierces ne soit nécessaire<sup>233</sup>.

La géométrie particulière en « y » des assemblages d'actine générés par des Arp2/3 activés permet de convertir efficacement l'énergie de la polymérisation des filaments en force de poussee contre la membrane plasmique<sup>130,143</sup>. En effet, dans un premier temps, la coiffe des bouts
pointus par Arp2/3 et donc l'ancrage des filaments fils aux filaments pères permet de limiter le glissement de ces premiers vers le cytoplasme lors de la rencontre des extrémités barbées avec la membrane plasmique. En outre, l'angle introduit par le branchement contribue à la formation d'une intersection non-orthogonale entre l'extrémité barbée d'un filament fils et la membrane plasmique. Cette particularité topologique est favorable pour générer une force soutenue<sup>143</sup> et, faciliterait via les fluctuations thermiques, l'incorporation de nouveaux monomères d'actine aux extrémités barbées alors plus exposées.

D'autres protéines régulatrices, comme **Ena/VASP** ou les **formines**, stimulent la nucléation de nouveaux filaments en stabilisant la formation d'oligomères d'actine. Ces protéines ont en outre la capacité de traquer l'extrémité barbée polymérisante d'un filament tout en amplifiant active-ment sa vitesse d'élongation. Les modalités d'interaction de ces deux protéines diffèrent sensi-blement.

**Ena/VASP** est une protéine multi-domaine dénombrant trois régions principales<sup>109,144</sup>. Une première région N-terminale, qui assigne la protéine dans différentes ultra-structures cellulaires comme les lamellipodes ou les filopodes. Une seconde région riche en proline et donc semi-flexible qui permet l'interaction avec la profiline-actine. Une dernière région C-terminale qui assure la tétramérisation des **Ena/VASP** et l'interaction avec la face positive des monomères de même que le côté des filaments d'actine. La tétramérisation est réalisée via un domaine structuré en hélice α présent dans chaque protéine. Ces domaines sont capables de s'associer latéralement en une super hélice linéaire. La tétramérisation des **Ena/VASP**, regroupe ainsi physiquement plusieurs domaines d'interaction avec l'actine filamenteuse ou monomérique qui étaient initialement indépendants. La liaison stochastique de ces domaines au filament suffit pour maintenir quelques secondes l'attachement d**Ena/VASP** à proximité des extrémités barbées des filaments tout en y favorisant l'incorporation de nouveaux protomères (**Fig. 13.B**). L'efficacité processive d**Ena/VASP** est renforcée lorsque plus d'une extrémité barbée est présente localement, augmentant le nombre de partenaires d'ancrage<sup>144</sup>. C'est le cas à l'extrémité des filopodes ou la proximité des filaments d'actine est assurée par les fascines (**Fig. 9.B**).

L'activité des formines à travers leurs domaines est exposée plus en détail au chapitre suivant. On peut néanmoins d'ores et déjà évoquer l'architecture particulière des **formines** qui les distingue d**Ena/VASP**. Comme **Ena/VASP**, la séquence peptidique des **formines** telles que **mDial1** peut être divisée selon trois régions distinctes<sup>145</sup>. Une première région N-terminale, capable de dimériser, assure la régulation et l'ancrage des **formines** à la membrane plasmique. Une seconde région riche en proline et semi-flexible (domaine FH1) permet la fixation d'actine-
profiline. Une dernière région C-terminale permet l'interaction avec les filaments d'actine et participe à sa dimérisation (domaine FH2) et sa régulation (domaine DAD). Les domaines FH2 sont structurés à travers des helices α qui s'associent en une structure allongée et courbe. Deux domaines FH2 peuvent ensuite s'assembler via leurs deux extrémités dans une configuration tête bêche. À terme, le dimère de FH2 constitue un anneau d'un diamètre de l'ordre de 9 nm. Cet anneau est capable d'encercler les protomères constitutifs du bout barbé via une interaction médiée par ses acides aminés internes (Fig. 13.C)¹⁵. En outre, des liens flexibles connectant les extrémités des FH2 entre eux, permettent une liberté de mouvement telle qu'un dimère de FH2 peut en théorie se déplacer pas à pas, de protomère à protomère sur le filament d'actine, en suivant sa structure hélicoïdale. Cette modalité d'association, favorise une interaction robuste et continue d'une formine avec le filament et permet ainsi une processivité pérenne en intégrant au fur et à mesure de nouvelles sous-unités d'actine au bout barbé.

Les formines comme les Ena/VASP favorisent la génération de structures linéaires via la for-
mation rapide de longs filaments. On retrouve ainsi les formines à l'extrémité des filopodes ou
elles peuvent participer à l'ancrage dans la durée de cette ultra-structure à la membrane plas-
mique (Fig. 9.B). L'intersection orthogonale du fagot d'extrémités barbées avec la membrane
plasmique permet une protrusion localisée, rapide et allongée, utile pour sonder efficacement
l'environnement de la cellule.

Différentes architectures entrent ainsi en compétition à travers les protéines régulatrices des filaments d'actine telles que Arp2/3 et Ena/VASP ou les formines. Au sein des ultra-structures, cette compétition lorsqu'elle est équilibrée peut assurer un régime stationnaire et fonctionnel. Au contraire, lorsque l'activité d'un groupe de protéines régulatrices brise l'équilibre, une transformation locale ou globale de l'ultra-structure peut s'opérer pour évoluer vers une nouvelle architecture.
A

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

B

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C

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

**Figure 13** – **A.** Gauche, structure atomique d'un complexe Arp2/3 – PDB : 4JD2. Droite, ajustement de la structure atomique d'un complexe Arp2/3 (rouge) ainsi que des structures atomiques de filaments d'actine (jaune – PDB : 5JLF) dans l'enveloppe d'un branchement d'actine reconstruit par une moyenne de cryo-tomogrames (EMDB : 4790). **B.** Schéma d'interaction d'un tétramère d'Ena/VASP avec deux extrémités barbées d'actine voisines (Harker et al. 2019). **C.** Modèle d'interaction d'une formine (bleu) à l'extrémité barbée d'un filament d'actine (jaune). (A. C. tirés de F. Merino, S. Popisch. S. Raunser. 2019).
F. Activité compétitive/coopérative des protéines régulatrices à travers le réseau d'actine.

Le fonctionnement des lamellipodes est un exemple représentatif d'ultra-structure dans laquelle un régime compétitif de protéines régulatrices des filaments d'actine se met en place. Le mode de fonctionnement des lamellipodes peut être en partie défini selon deux critères géométriques essentiels : la densité de branchement et la taille des filaments impliqués. Une densité de branchement importante de courts filaments permet une protrusion lente mais persistante des lamellipodes. À l'inverse, une densité de branchement plus faible de longs filaments permet une protrusion rapide mais saccadée des lamellipodes, caractérisée par des phases de rétraction dues à une plus grande probabilité de flambage des filaments au contact de la membrane plasmique¹³⁰,¹⁴⁶. Cette densité de branchement dépend directement de l'activité de nucléation des complexes Arp2/3 mais aussi de la taille des filaments d'actine mis en jeu qui est quant à elle fonction de la vitesse d'élongation aux extrémités barbés. Ce dernier paramètre est ajusté négativement par les protéines de coiffe inhibitrices de l'élongation comme CapZ et peut être contrebalancée positivement par les protéines de coiffe promotrices de l'élongation comme les formines. Pris individuellement et in vitro, la constante de dissociation des formines (~10⁻⁴ s⁻¹) ou le temps de demi-vie des CapZ (~25 min) aux extrémités barbées apparaissent incompatibles avec la dynamique des lamellipodes observée in cellulo¹⁴⁷. La compétition aux bouts barbés entre ces deux types de protéines régulatrices, s'excluant l'une l'autre, pourrait expliquer en partie l'établissement d'un régime dynamique en adéquation avec celui observé dans les cellules¹⁴⁸.

La compétition des protéines régulatrices à travers le filament d'actine n'existe pas uniquement sous la forme d'une exclusion mutuelle localisée aux bouts pointus ou barbés. En effet, cette compétition peut être médiée allostériquement à travers la structure même du filament d'actine. Si le filament d'actine possède un polymorphisme structural intrinsèque avéré⁵¹, certaines protéines régulatrices favorisent par leur fixation aux filaments un état conformationnel donné, qui, en se propageant le long du filament, stimule la fixation d'autres protéines régulatrices. On parle alors d'interaction coopérative. La cofiline¹⁴⁹,¹⁵⁰ et la drébrine¹⁵¹ en sont deux exemples. À l'inverse, les états conformationnels sélectionnés par deux protéines régulatrices distinctes peuvent ne pas se recouper. Dans ce cas de figure, une ségrégation entre filaments d'actine peut se mettre en place via une exclusion mutuelle des protéines régulatrices. Cette exclusion mutuelle est médiée par la conformation qui est imposée à la F-actine. Ce phénomène a pu être observé in vitro entre la myosine et la cofiline¹⁵².
La sélection conformationnelle des filaments d'actine peut être induite par l'interaction de protéines régulatrices mais également par des contraintes mécaniques¹⁵³. En retour et, selon la conformation structurelle mécaniquement induite, le filament devient plus ou moins propice à l'interaction des dites protéines régulatrices. Ainsi, les **myosines II** présentent une affinité plus importante dans les cellules pour les filaments d'actine sous-tension¹⁵⁴. De même, la torsion d'un filament d'actine piégé aux extrémités et induite *in vitro* par la rotation d'une **formine** à son extrémité barbée réduit l'affinité de ce filament pour la **cofiline** et le protège de la dépolyrérisation²⁴⁹.

La sensibilité de certaines protéines régulatrices à la conformation structurale des filaments d'actine et, inversement, la favorisation de certaines conformations structurales des filaments d'actine par des protéines régulatrices pourraient ainsi participer à l'assignation spatiale de ces dernières dans les ultra-structures via un mécanisme rétroactif¹⁵⁵.

Dans une approche différente, la compétition entre les divers types d'architecture des ultra-structures peut être arbitrée en amont des protéines régulatrices par l'intermédiaire de protéines tierces sélectionnant leur mode d'activité. Ce phénomène a été mis en évidence dans le cas du facteur promoteur de la nucléation des **Arp2/3**, **Spin90**, qui permet en interagissant avec le complexe **Arp2/3** de nucléer non plus des filaments branchés mais des filaments linéaires¹⁵⁶,¹⁵⁷. Cette observation a d'abord été interprétée comme un moyen de générer les premiers filaments pères nécessaires à l'activité de branchement des complexes **Arp2/3**. Une récente étude impliquant nos collaborateurs de l'IJM a pu mettre en évidence *in vitro* et *in cellulo* une action synergie de **Spin90** avec les **formines**, notamment **mDia1**, à travers le complexe **Arp2/3**. J'ai alors pu dans ce cadre, via des observations et analyses en microscopie électronique, conforter la thèse de l'existence d'un complexe ternaire transitoire impliquant **Arp2/3**, **Spin90**, **mDia1**. Cette expérience est détaillée dans la partie III.8 du présent manuscrit. Ces nouveaux résultats indiquent que **Spin90** diminue la densité de branchement en favorisant la nucléation de filaments non branchés via **Arp2/3** et augmente la taille des filaments d'actine en favorisant le recrutement des formines **mDia1** aux bouts barbés qui allongent ces derniers plus rapidement.
<table><caption>Tableau 1 - Récapitulatif des caractéristiques de quelques protéines d'interaction avec l'actine.</caption><thead><tr><th>Protéines</th><th>Masses</th><th>Cible(s) d'interaction</th><th>Affinité (K<sub>d</sub>)</th><th>Effets principaux</th></tr></thead><tbody><tr><td>Profiline</td><td>~ 14 kDa<sup>37</sup></td><td>- monomère d'actine (G)<br/>- extrémité barbée (BE)</td><td>MgADP-Pi-actine (BE) : 5.96 ± 2.4 µM<sup>158</sup><br/>MgADP-actine (BE) : 28.1 ± 5.1 µM<sup>158</sup><br/>MgATP-actine (BE) : 29.25 µM<sup>159</sup><br/>MgATP-actine (G) : ~ 0.1 µM<sup>110</sup><br/>MgADP-actine (G) : ~ 0.17 µM<sup>110</sup></td><td>Séquestration des G-actines cytoplasiques favorisant la formation d'une réserve d'ATP-G-actine. Fonctionnalisation de la G-actine assurant ainsi le relais avec d'autres protéines régulatrices arborant des domaines poly-prolines.</td></tr><tr><td>Thymosine β<sub>4</sub></td><td>~ 5 kDa<sup>47</sup></td><td>- monomère d'actine (G)</td><td>MgATP-actine (G) : 1.1 - 3.9 µM<sup>110</sup><br/>MgADP-actine (G) : 80 - 100 µM<sup>110</sup></td><td>Séquestration des G-actines cytoplasiques favorisant la formation d'une réserve d'actine prête à polymériser.</td></tr><tr><td>Gc-globuline</td><td>~ 52 kDa<sup>111</sup></td><td>- monomère d'actine (G)</td><td>MgATP-actine (G) : ~ 1 nM<sup>114</sup><br/>MgADP-actine (G) : ~ 2 nM<sup>160</sup></td><td>Séquestration des G-actines extracelulaires prévenant la polymérisation accidentelle d'actine notamment dans les vaisseaux sanguins.</td></tr><tr><td>Cofiline</td><td>~ 13-19 kDa<sup>120</sup></td><td>- filament d'actine, corps (F)</td><td>actine (F) : ~ 0.1 µM<sup>161</sup></td><td>Décoration déstabilisante des filaments d'actine entraînant à terme leur dépolymérisation. Participe au recyclage de l'actine disponible dans la cellule.</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Phalloïdine</td><td>~ 4 kDa</td><td>- filament d'actine, corps (F)</td><td>actine (F) ~20 nM<sup>162,163</sup></td><td>Toxine stabilisante des filaments d'actine perturbant sévèrement leur dynamique.</td></tr><tr><td>Tropomyosine</td><td>~ 68-72 kDa<sup>127</sup> (dimère)</td><td>- filament d'actine, corps (F)</td><td>actine (F) ~ 1 µM<sup>127</sup></td><td>Décoration stabilisante et continue des filaments d'actine modulant l'interaction avec d'autres protéines régulatrices. Indispensable dans l'édification des sarcomères.</td></tr><tr><td>Fascine</td><td>~ 55 kDa<sup>131</sup></td><td>- filament d'actine, corps (F)</td><td>actine (F) ~ 0.3 µM<sup>164</sup></td><td>Interaction avec le corps des filaments d'actine permettant la formation de points de jonction solides entre deux filaments. Participe à la formation de réseaux d'actine réticulés ou linéaires.</td></tr><tr><td>Actinine</td><td>~ 200 kDa<sup>135</sup> (dimère)</td><td>- filament d'actine, corps (F)</td><td>actine (F) ~ 0.3 µM<sup>164</sup></td><td>Interaction avec le corps des filaments d'actine permettant la formation de points de jonction flexibles entre deux filaments. Participe à la struc-turation de réseaux contractiles.</td></tr><tr><td>Myosine II</td><td>~ 500 kDa<sup>137</sup> (hexamère)</td><td>- filament d'actine, corps (F)</td><td>ND</td><td>S'assemblent en myofilaments arborant des « têtes » mobiles qui entraînent dans leur mouvement les filaments d'actine en contact.</td></tr></table>
<table><tr><td>Tropomoduline</td><td>~ 50 kDa <sup>142</sup></td><td>- extrémité pointue (PE)<br/>- monomère d'actine (G) (Tmod3)</td><td>actine (PE)<br/>~ 0.1 – 0.2 µM <sup>142</sup><br/>MgATP-actine (G)<br/>~ 0.13 µM <sup>142</sup><br/>MgADP-actine (G)<br/>~ 0.6 µM <sup>142</sup></td><td>Moteur moléculaire à l'origine de la génération de forces dans les réseaux d'actine.<br/>Protéine coiffante du bout pointu empêchant stériquement l'association ou la dissociation de sous-unités d'actine à cette extrémité. Interaction stabilisée par la présence de tropomyosine.</td></tr><tr><td>Arp2/3</td><td>~ 220 kDa</td><td>- extrémité pointue (PE)<br/>- filament d'actine corps (F) : nécessite des protéines tierces</td><td>MgATP-actine (PE)<br/>~ 40 nM <sup>165</sup><br/>MgADP-actine (PE)<br/>~ 1 µM <sup>165</sup><br/>Actine (F)<br/>ND</td><td>Protéine coiffante des extrémités pointues. Activée par des protéines tierces, Arp2/3 peut décorer un filament préexistant et nucléer à partir de celui-ci un nouveau filament. Génère des réseaux branchés, orientés comme dans le cadre des lamellipodes.</td></tr><tr><td>CapZ</td><td>~ 62 kDa <sup>166</sup> (hétérodimère)</td><td>- extrémité barbée (BE)</td><td>actine (BE)<br/>~ 0.02 – 1 nM <sup>148,138</sup></td><td>Protéine coiffante du bout barbée empêchant stériquement l'association ou la dissociation de sous-unités d'actine à cette extrémité.</td></tr><tr><td>ENA/Vasp</td><td>~ 200 kDa <sup>167</sup> (tétramère)</td><td>- extrémité barbée (BE)</td><td>actine (BE)<br/>~ 9.2 ± 1.4 nM <sup>167</sup></td><td>Décore latéralement les filaments d'actine à proximité directe de leur extrémité barbée.</td></tr></table>
<table><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td>Favorise l'élongation des filaments d'actine. Activité stimulée par le regroupement de multiples extrémitées barbées comme dans le cadre des filopodes.</td></tr><tr><td>Formine (mDia1)</td><td>~ 260 kDa <sup>168</sup></td><td>- extrémité barbée (BE)</td><td>actine (BE) ~ 0.003 nM <sup>148</sup></td><td>Protéine coiffante du bout barbé capable de traquer l'extrémité polymérisante et d'y stimuler l'incorporation d'actine-profiline. Stimule la nucléation et l'élongation des filaments d'actine. Assure l'ancrage du bout barbé à la membrane plasmique.</td></tr></table>
# 3. Les Formines.

Parmi l'ensemble des rouages qui constituent la machinerie actine - protéines régulatrices, mon projet de thèse a eu pour vocation de mettre la lumière sur le couple actine/formine. Ce tandem est à l'origine d'une grande partie des filaments d'actine non branchés présents dans les cellules¹⁶⁹. En effet les formines y stimulent à la fois la nucléation de nouveaux filaments d'actine¹³,¹⁷⁰ ainsi que leur elongation par une traque des extrémités barbées polymérisantes¹³,¹⁴.

## 3.1. Les formines à l'échelle de la cellule.

Découvertes dans les années 90 à travers des études en biologie du développement¹⁷¹, les formines constituent une innovation évolutive des eucaryotes enrichissant l'appareil régulateur de l'actine cellulaire. La séquence codante de la formine a pu se diversifier au cours du temps donnant naissance à de multiples isoformes (Fig. 14) dont les activités s'ajustent aux processus fonctionnels dans lesquels ils sont impliqués¹⁷².

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 14** – Analyse phylogénétique des formines humaines. Des séquences complètes de l'isoforme le plus important de chaque orthologue de formine ont été utilisées pour déterminer les degrés de divergence. (tiré de D. Breitsprecher, B.L. Goode. 2013)</figcaption></figure>
Au vu de l'activité centrale des formines qui consiste globalement à générer rapidement des filaments d'actine non branchés, on retrouve un nombre très varié de structures et fonctions spécifiques liées à l'actine pour lesquelles la contribution des formines est nécessaire. On peut ainsi évoquer, les activités des formines mDia1-3<sup>173,174</sup>, DAAM<sup>175,176</sup>, FMNL2/3<sup>177,178</sup> dans la génération des filopodes. De même les implications des formines mDia1/2<sup>179,5</sup>, Knittrig<sup>180</sup> ont pu être mises en évidence pour la génération des fibres de stress. Enfin les contributions des formines mDia1<sup>181</sup>, FMNL<sup>182</sup> ont pu être établies dans le fonctionnement des lamellipodes<sup>183</sup>. Les formines se retrouvent ainsi engagées dans diverses régions, fonctions et architectures du cytosquelette cellulaire (Fig. 15).

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 15 – Localisation intracellulaire de formines de mammifère. (Reproduction de D. Breischper et B.L. Goode, 2013. Réalisée avec BioRender).</figcaption></figure>

Cette participation des formines dans des ultra-structures fonctionnelles centrales de la cellule place inéluctablement ces dernières comme des actrices clefs de nombreux processus physiologiques, comme cela a pu être évoqué dans la revue « Formins at a glance. »<sup>183</sup> de D. Breitsprecher et B.L. Goode. On relève, par exemple, l'importance des formines FMNL1 dans
la motilité des lymphocytes T¹⁸⁴, de zDia2 dans la gastrulation¹⁸⁵ ou bien de DAAM1 dans la
morphogénèse du cœur¹⁸⁶.

Le rôle essentiel des formines à l'échelle cellulaire, mis en évidence dès les années 90, a con-
tribué à l'émergence d'études structurales des formines à l'échelle moléculaire dans le début
des années 2000.

3.2. Les formines à l'échelle moléculaire.

Au regard des premières études réalisées, l'état d'oligomérisation de l'unité fonction-
nelle de la formine n'était pas clairement identifié initialement. En effet, une tendance notable
de la formine Bnilp à former des tétramères avait pu être observée dans un premier temps¹⁸⁷,
et par la suite, des trimères, tétramères et autres oligomères ont pu être observés avec la formine
INF2¹⁸⁸. Néanmoins, les études biochimiques et structurales s'accordent aujourd'hui sur le fait
que l'unité fonctionnelle canonique de la formine se compose d'un homodimère.

La séquence d'une formine comporte ainsi plusieurs domaines protéiques dont deux régions de
dimérisation (Fig. 16.A). Parmi l'ensemble des domaines fonctionnels, on note deux domaines
omniprésents, fédérant la super-famille des formines : les domaines **FH2** et **FH1** (*Formin Homology Domain 1/2*). Si le domaine **FH2** est présent dans la totalité des formines, il existe une exception en ce qui concerne le domaine **FH1**, absent de la formine ForC¹⁸⁹ du Dictyostelium
Discoideum (mycétozoaire).

Les domaines **FH1** et **FH2**, lorsqu'ils sont tous deux présents, se retrouvent accolés dans la séquence peptidique et encadrés par d'autres domaines variables qui modulent l'activité et la localisation de l'isoforme considéré (**Fig. 16.A**). On dénombre des dizaines de combinaisons de ces domaines avec notamment quinzes séquences de la famille des formines identifiées chez l'Homme ou chez la souris (**Fig. 14**) et deux chez Saccharomyces Cerevisiae. La plus grande famille des formines regroupe les formines DRFs (Diaphanous Related Formins) telle que mDia1, la formine de souris étudiée dans ce projet de thèse. On y retrouve également la formine Bnilp de Saccharomyces Cerevisiae, formine largement étudiée dans la littérature.
Cette famille de formine se distingue par la composition de sa région N-terminale qui regroupe dans l'ordre le domaine **GBD** (*rhoGTPase Binding Domain*), le domaine **DID** (*Diaphanous Inhibitory Domain*), le domaine **DD** (*Dimerization Domain*) et un domaine en superhélice **CC** (*Coil-coiled Domain*). De l'autre côté, la région C-terminale accueille le domaine **DAD** (*Dipahnous Autoregulatory Domain*) (**Fig 17.A**).
Dans les paragraphes suivant je m'efforcerai de décrire l'ensemble des domaines protéiques énumérés ci-dessus du point de vue de leur structure, de leur interaction et de leur fonction.

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>A</figcaption></figure>

**Figure 16 - A.** Représentation multi-domaines de diverses formines de mammifères B. Schéma représentatif de la formine mDia1 dans ses états autoinhibé (gauche) et activé (droite) (Adapté de K.G. Campellone, M. D.) Welch, 2010)

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>B</figcaption></figure>

### A. Domaine FH2.

Le domaine FH2 est le domaine protéique principal des formines dans le sens où il as- sure l'interaction directe de ces dernières avec l'actine globulaire ou fibrillaire. Ce domaine protéique se compose essentiellement d'hélices α. Malgré d'importantes variations dans les sé- quences des domaines FH2 existants, le repliement caractéristique de ces domaines sous la forme de bâtonnets courbés d'environ 40 kDa¹⁹⁰ s'avère être largement conservé. Ce repliement offre une géométrie toute particulière à un assemblage anti-parallèle d'un dimère de FH2 sous la forme d'un anneau d'environ 9 nm de diamètre (Fig. 17.A). Une telle configuration permet au dimère de FH2 de retenir des sous-unités d'actine en son sein. Cette modalité d'interaction apparait primordiale pour la fonction des formines. Ainsi, l'ensemble des acides aminés assu- rant la dimérisation et l'interaction des domaines FH2 avec l'actine est plus significativement conservé en comparaison au reste de la séquence peptidique des formines¹⁷². Ces acides aminés clefs se répartissent selon quatre motifs du domaine FH2 : le sous-domaine « knob », le sous- domaine « linker », le sous-domaine « lasso » et le sous-domaine « post ». Diverses structures
de domaines FH2 cristallisés seuls ou en présence de tétraméthylrhodamine-actine mettent en évidence l'importance de ces sous-domaines¹⁹⁰,¹⁵,¹⁹¹,¹⁹²,¹⁹³,¹⁹⁴ (**Fig. 17**). La tétraméthylrhodamine-actine utilisée pour ces expériences altère la capacité de l'actine à polymériser sous la forme d'un filament dont la symétrie n'est pas compatible avec le processus de cristallisation¹⁹⁵,¹⁹⁶.

Dans ces structures, les corps des domaines FH2 en « bâtonnets courbés » constitués de superhélices (coil-coiled) exhibent les sous-domaine « knob » et « post » à leurs extrémités N-terminal et C terminale. Le sous-domaine « knob » est prolongé par le sous-domaine « linker ». À la suite de ce sous-domaine « linker » on trouve le sous-domaine « lasso » qui s'enroule sur un motif du sous-domaine « post » d'un second hémi-dimère. Cette liaison est assurée par des résidus aromatiques du sous-domaine « lasso » venant s'insérer dans une poche hydrophobe du sous-domaine « post ». (**Fig. 17.A**)

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 17** – A. Modèle atomique du dimère FH2 de Bni1p (PDB: 1Y64, Otomo et al., 2005, Dynamique moléculaire : Baker et al., 2015, Représentation : Naomi Courtemanche, 2018). B. Représentation de l'empilement cristallin obtenu par co-cristallisation de FH2 de Bni1p et de TMR-actine. C. Structure atomique sous différents angles d'un trimère d'actine encerclé par deux domaines FH2 dans le contexte cristallin. (B, C : Otomo et al., 2005)</figcaption></figure>

Les trois sous-domaines « linker », « lasso » et « post » participent ainsi à la dimérisation des domaines FH2 dans un mode antiparallèle. Le sous-domaine « linker » situé en position central
dans cette interaction dimérisante, offre, de par sa flexibilité, une liberté de mouvement relative entre les deux hémi-dimères qui composent la formine. En effet, dans des structures ou les deux domaines FH2 apparaissent rapprochés, le sous-domaine « linker » peut présenter une structuration partielle sous la forme d'une hélice α chez Bnl1p ou d'un feuillet β chez Daam1¹⁹³,¹⁹⁴ tandis que dans des structures ou les domaines FH2 sont plus éloignés, ce sous-domaine apparaît étendu ou désordonné¹⁵,¹⁹². Le sous-domaine « linker » rend ainsi envisageable une mobilité « pas à pas » de deux domaines FH2 à l'extrémité barbée d'un filament d'actine en élongation. Des études biochimiques montrent que la structuration et la longueur de ce domaine « linker » sont directement corrélées à cette capacité processive du dimère de formine. Des constructions chimériques remplaçant les sous-domaines « linker » de Bnl1p par des séquences de tailles différentes montrent que le taux de dissociation de la formine est directement proportionnel à la taille de son sous-domaine « linker »¹⁹,¹⁹⁷. En outre, des mutations neutralisant la formation du feuillet β chez Daam1 favorisent l'élongation des filaments d'actine par la formine¹⁹³,¹⁹⁷.

En parallèle, l'interaction de l'actine avec l'anneau formé par les domaines FH2 est assurée par les sous-domaines « post » et « knob ». Ces sous-domaines lient directement les monomères d'actine alors maintenus au centre de l'anneau¹⁹². Le dimère de FH2 pourrait ainsi stabiliser durablement des assemblages d'actine sous la forme de dimères ou de trimères autrement éphémères en solution. Ce mécanisme pourrait expliquer la nucléation active de nouveaux filaments d'actine opérée par les dimères de FH2. Le sous-domaine « knob », en particulier, présente des résidus basiques à l'origine d'interactions électrostatiques nécessaires dans ce mécanisme de nucléation mais dispensable dans le cadre d'un dimère de FH2 à l'extrémité barbée d'un filament d'actine¹⁸⁹. La nucléation d'un nouveau filament et la coiffe de l'extrémité barbée d'un filament préexistant semblent ainsi impliquer des interactions différentes bien que ces deux processus nécessitent tous deux le sous-domaine « knob ».

En 2005, Takanori Otomo et ses collègues sont parvenus à co-cristalliser des domaines FH2 de Bnl1p en présence de TMR-actine. De manière inattendue l'empilement cristallin alors obtenu induit une configuration toute particulière avec des TMR-actines ordonnées selon des pseudo-filaments double brins (Fig 17.B). Dans ces pseudo-filaments, les monomères sont associés à travers une rotation de 180° et une translation de 28 Å (Fig. 17.C) alors que ces paramètres sont respectivement de 166.7° et 27.5 Å dans le filament d'actine classiquement observé. En outre
chaque pseudo-filament de cet empilement cristallin est encerclé par un ruban unique de domaines FH2 qui s'enroule continument selon le pas court du pseudo-filament d'actine (Fig. 17.B)¹⁵.

Un assemblage similaire de FH2 en interaction avec un filament d'actine a pu être observée *in vitro* par microscopie électronique avec la formine INF2¹²³. De même, des observations par microscope à force atomique ont également pu mettre en évidence une telle organisation chez INF2 en présence et en absence d'un filament d'actine au sein des domaines FH2¹⁸⁸. Néanmoins, dans ces observations, la distinction entre un ruban unique de FH2 ou un empilement de dimères de FH2 n'est pas évidente.

La structure cristalline obtenue par Takanori Otomo et ses collègues a offert des informations cruciales dans la caractérisation des interactions existantes entre un dimère de FH2 et un filament d'actine (Fig 17.C). On sait ainsi que le sous-domaine globulaire « knob » peut s'associer à proximité de l'interface intra-brin du filament, au sillon hydrophobe formé par le sillon 1/3 d'une sous-unité d'actine. Simultanément, le sous-domaine allongé « post » enroulé par le sous-domaine « lasso » s'associe via une interaction principalement électrostatique au niveau du sous-domaine 1 de l'actine, à proximité de l'interface inter-brin du filament d'actine¹⁵,¹⁹¹. La force ionique en solution a alors une très forte influence sur le taux de dissociation des formines à l'extrémité barbée d'un filament d'actine en élongation avec une corrélation positive reliant ces deux paramètres¹⁹⁸.

Les domaines FH2 participent ainsi à la nucléation de nouveaux filaments d'actine et assurent la processivité des formines à l'extrémité barbée d'un filament en élongation. En parallèle, un second domaine phare des formines participe également à la nucléation et la stimulation de l'élongation des filaments d'actine : le domaine FH1.

## B. Domaine FH1.

Le domaine FH1 est présent dans la quasi-totalité des formines mises en évidence jusqu'à présent. Ce domaine se compose de multiples segments riches en proline. Ces motifs riches en proline sont capables de fixer de la profiline compléxée ou non avec de l'actine. Ces domaines FH1 permettent ainsi de stimuler la nucléation de nouveaux filaments d'actine en présence de profiline, ce qui n'est plus le cas lorsque seuls les domaines FH2 sont présents¹⁸,¹⁹⁷.
La fixation de complexes actine-profiline aux motifs riches en proline permettrait d'augmenter localement la concentration d'actine à proximité des domaines FH2. Lorsque les domaines FH2 se maintiennent à l'extrémité barbée d'un filament d'actine, leurs domaines FH1 chargés en actine-profiline pourraient ainsi favoriser l'ajout de nouvelles sous-unités d'actine à l'extrémité du filament, outrepassant la limite de diffusion de l'actine en solution¹⁹⁹,¹⁴. De multiples expériences de microscopie de fluorescence montrent ainsi une vitesse d'élongation des filaments d'actine décuplée en présence de profiline et de formine¹⁴,¹⁹⁹,¹⁸,¹⁹,²⁰⁰,²⁰¹,¹⁶. La dépendance de cette vitesse d'élongation à la concentration en profiline est biphasique. La vitesse d'élongation augmente dans un premier temps au fur et à mesure que l'actine en solution est liée par de la profiline. Puis cette vitesse d'élongation diminue lorsque qu'un surplus de profiline entre en compétition avec les complexes actine-profiline pour la liaison des motifs riches en proline des domaines FH1²⁰².

Ces domaines FH1 observés parmi les formines ont des tailles très variables avec une séquence peptidique allant de 15 à 229 acides aminés et une proportion de segments riches en proline représentant entre 35% et 100% du domaine FH1²⁰³. On note alors une corrélation entre la quantité de segments riches en proline présents sur les domaines FH1 d'une formine et sa capacité à augmenter la vitesse d'élongation des filaments en présence d'actine-profiline¹⁸.

La propension des prolines présents dans les domaines FH1 à empêcher le repliement de la chaine polypetidique en des structures ordonnées laisse suggérer que ces domaines sont flexibles par parties²⁰⁴. Cette flexibilité rend permise l'existence d'un « anneau complexe » à l'extrémité barbée d'un filament d'actine coiffé d'une formine (Fig. 18)²⁰². Dans cette structure transitoire, le bras FH1 serait replié de sorte à amener un segment riche en proline à proximité du bout barbé du filament d'actine. Ce segment riche en proline serait fixé par une profiline, elle-même complexée avec une sous-unité d'actine. Cette dernière serait finalement incorporée sur l'extrémité barbée du filament d'actine. Une boucle fermée est alors formée par l'ensemble FH1-Profiline-Actine-FH2-(FH1).

Une étude mesurant le taux de dissociation de la formine au cours de l'élongation de filaments d'actine suggère que l'occurrence de cet état transitoire participe à maintenir le dimère de formine à l'extrémité barbée¹⁹⁸.
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 18** – Représentation graphique de l'extrémité barbée d'un filament d'actine coiffé d'une formine. Cinétique de formation d'un « anneau complexe » par l'un des domaines FH1. (Naomi Courtemanche, 2018)</figcaption></figure>

D'autres domaines variés s'ajoutent aux domaines FH2 et FH1 enrichissant les modalités de régulation des formines, la palette de leurs protéines cibles et la nature de leurs activités.

### C. Régions N/C-terminales.

La région N-terminale des formines de la famille des DRF s'articule autour d'un domaine de dimérisation DD. Ce domaine est prolongé par un domaine en super-hélice CC (*coil-coiled*) de son côté C-terminal et le domaine DID puis GBD de son côté N-terminal. La région C-terminale quant à elle abrite le domaine DAD. (Fig. 16.B)

Le domaine FH1 flexible situé en aval de la région N-terminale offre une large amplitude de mouvement entre cette première région et la région C-terminale. Ces deux régions peuvent ainsi se retrouver physiquement éloignées ou en interaction direct selon le contexte biochimique. Or, il se trouve que le couple DID/DAD de la chaine polypeptidique incarne le système d'autorégulation de la formine. En effet, le domaine DAD situé à proximité directe de l'anneau de FH2 est capable de lier le domaine DID de la région N-terminale ramenant cette dernière vers l'anneau de FH2 (Fig 16.B). Une telle disposition du complexe N-terminal entraine l'obstruction stérique de l'interaction des domaines FH2 avec de l'actine<sup>205,168,206</sup>. Cette configuration adoptée naturellement par les formines DRF assure l'auto-inhibition de la protéine. Pour lever cette autoinhibition la neutralisation de l'interaction DID/DAD est nécessaire. On peut citer les protéines de la famille Rho qui en se liant au domaine GBD voisin de DID participent à briser cette interaction DID/DAD entrainant une levée de l'auto-inhibition, bien que celle-ci reste partielle. Cette interaction participe à l'ancrage des formines à la membrane. Il a également pu être mis en évidence une interaction
des phospholipides avec la région N-terminale des formines mDia1/2 participant également
à leur ancrage à la membrane<sup>207,208</sup>.

Le domaine DAD, au-delà de participer à l'auto-régulation des formines, est capable de se
lier à l'actine et ainsi d'assister les domaines FH2 à la fois dans la nucléation de nouveaux
filaments<sup>209</sup>, et dans leur stabilisation à l'extrémité barbée polymérisante d'un filament
d'actine<sup>210</sup>. En outre chez certaines formines comme Cappucino le domaine DAD de la ré-
gion C-terminale est remplacé par une queue capable de lier latéralement les filaments, loin
des extrémités, via des interactions principalement électrostatiques<sup>210</sup>. Ce mode d'interac-
tion latéral avec le corps des filaments d'actine est également médié par les domaines FH2
de certaines formines comme chez FRL1, mDia2 ou AFH1<sup>211,212</sup>. Un tel mode d'interaction
permet à des isoformes de formine comme Bnr1 d'associer des filaments voisins sous la
forme d'un fagot.

En outre, certaines queues C-terminales de formines comme celle de INF2 permettent de
couper les filaments d'actine via une potentielle interaction déstabilisante du domaine C-
terminal avec le sillon 1/3 des sous-unités d'actine du filament<sup>123</sup>.

Enfin, il a pu être montrer que pour des formines comme mDia2 le domaine C-terminal
supporte également une interaction directe avec les microtubules<sup>76</sup>.

Cette description structurale fine de l'interaction des formines avec l'actine, associée à des études biochimiques et biophysiques, ont permis l'échafaudage de modèles structuraux et cinétiques pour décrire l'activité processive des formines à l'extrémité barbée de filaments d'actine en elongation.

3.3. Modèles moléculaires de la processivité.

Dès l'année 2003, des études en microscopie de fluorescence ont permis de mettre en
évidence la capacité d'une protéine recombinante, constituée des domaines FH1 et FH2, de
coiffer durablement l'extrémité barbée des filaments d'actine tout en permettant l'ajout de sous-
unités d'actine à cette même extrémité, bien que la vitesse d'élongation y soit réduite<sup>170</sup>. Une
seconde étude a démontré la capacité de cette coiffe processive des formines à protéger l'extré-
mité barbée de la liaison d'autres protéines de coiffe comme CapZ<sup>187</sup>. L'expression « bouchon
fuyant » avait alors été introduite en opposition avec les protéines de coiffes qui par leur fixation
inhibent totalement l'élongation. En conséquence de ces observations, une marche « pas à pas »
des formines à l'extrémité barbée des filaments d'actine en élongation avait pu être évoquée pour expliquer la coiffe processive des formines¹⁴. L'année suivante, la structure de domaines FH2 de Bnilp sous la forme d'un dimère tête bêche connecté par des liens flexibles avait pu conforter le concept de marche « pas à pas ». Dans ce modèle, un domaine FH2 reste lié pendant que le second domaine FH2 se déplace plus loin sur l'extrémité barbée et ainsi de suite¹⁹¹.

### A. Modèle à deux états : « marche enjambée »¹⁵.

La question des conformations adoptées par ce dimère de FH2 à l'extrémité barbée restait cependant très ouverte jusqu'en 2005 et la parution de l'article de Takanori Otomo et ses collègues¹⁵. La co-cristallisation des domaines FH2 de Bnilp avec de la TMR-actine avait en effet permis de proposer un modèle plus détaillé de cette marche processive. Bien que la structure atomique alors obtenue à travers l'empilement cristallin ne présentait ni dimère de formine, ni véritable filament d'actine, ni extrémité barbée à proprement parler, Takanori Otomo et ses collègues ont su élaborer un modèle astucieux décrivant la processivité des fomines à l'extrémité barbée selon deux états caractérisés structuralement. Dans cette structure cristallographique chaque domaine FH2 est lié à deux monomères d'actine voisins (Fig. 17). Lorsque l'on considère deux domaines FH2 consécutifs, ce duo engage une interaction avec trois sous-unités d'actine, la sous-unité d'actine centrale étant partagée entre les deux domaines FH2 (Fig. 19.A). Les auteurs ont alors envisagé une réorientation de la région « linker » pointant vers l'extérieur du couple de FH2 pour que celle-ci viennent enrouler son domaine « lasso » autour de la région « post » libre du second domaine FH2 (Fig. 19.A). Alors que le domaine « linker » parcourt 40 Å dans sa position initiale, il devrait s'étendre sur une distance de 34 Å après une telle réorganisation, rendant cette dernière parfaitement envisageable. Un dimère de FH2 tête bêche serait alors créé à travers cette réorganisation, ramenant la structure observée à l'unité fonctionnelle de la formine en interaction avec trois sous-unités d'actine agencées selon la symétrie d'un pseudo-filament. Dans ce complexe, quatre domaines d'interaction actine/formine ont pu être identifiés. Deux domaines d'interaction pour les deux régions « post/lasso » du dimère de FH2 ainsi que deux domaines d'interaction pour les deux régions « knob ». L'importance de chacun de ces domaines de liaison dans la fonction de nucléation et la capacité processive du dimère de FH2 a alors pu être validée à travers la conception de mutants¹⁵.

Lorsque le complexe formé par le dimère de FH2 et les trois sous-unités d'actine est ramené au contexte de l'extrémité barbée d'un filament d'actine coiffée par un dimère de formine, plusieurs états peuvent être envisagés.
<figure><img src="image_32.png" /></figure>

**Figure 19** – A. Structure de trois sous-unités d'actine (jaune/rose) liées par deux domaines FH2 consécutifs (bleu/vert) agencés selon le modèle cristallin de Takanori Otomo : 1Y64. Le sous-domaine « linker » du domaine FH2 bleu peut être réorienté selon la flèche rouge pour reconstituer la topologie en anneau d'un dimère de FH2. B. Orientation relative des sous-unités d'actine selon celle observée dans le cristal 1Y64 (jaune/rose) et celle observée dans un filament d'actine classique décrit par Holmes (jaune/bleu). C. Positionnement d'un monomère d'actine au bout pointu d'un dimère d'actine du cristal 1Y64, complexé par un domaine FH2. Le monomère est orienté selon le pas long (blanc) ou court (bleu) du filament d'actine classique décrit par Holmes. D. Mise en évidence d'exclusions stériques lors du positionnement d'un monomère d'actine orienté selon le filament d'actine classique et ajouté au bout barbé d'un dimère d'actine du cristal, complexé par un domaine FH2. (Otomo et al., 2005)
## État fermé

Dans le premier état envisagé par les auteurs, l'ensemble des quatres domaines de liaison du dimère de FH2 est occupé par les trois premières sous-unités d'actine du filament (Fig. 19.A). Dans cette conformation, l'ensemble des trois sous-unités d'actine en interaction directe avec les domaines FH2 est supposé être définit par un angulaire de 180°, observé au sein de la structure cristalline (Fig. 19.B). Cette configuration maximiserait ainsi les interactions avec les domaines FH2. Cependant, une telle configuration offre une très faible surface d'interaction entre les sous-unités d'actine qui est ici de 450 Å² alors qu'elle est de 1700 Å² dans les filaments d'actine classiquement observés. Cette configuration est donc supposée défavorable pour maintenir des oligomères d'actine en interaction.

L'interaction des sous-unités d'actine de l'extrémité barbée avec les domaines FH2 apparaît ici nécessaire pour stabiliser l'assemblage. Les sous-unités d'actine situées en amont du complexe formine - extrémité barbée et ne bénéficiant pas d'interaction supplémentaire avec les domaines FH2 sont donc supposément dans une configuration proche de celle de l'actine classiquement observée. Une telle orientation des sous-unités d'actine situées du coté pointu du complexe est permise que ce soit en se référant au pas court ou au pas long de la structure classique du filament d'actine (Fig. 19.C).

À l'inverse, une telle orientation des sous-unités d'actine du coté barbé du complexe n'est pas stériquement permise (Fig. 19.D). En effet, l'ajout d'un monomère d'actine selon l'orientation du pas court du filament serait prohibée stériquement par l'extrémité N-terminale du premier domaine FH2. De même, l'ajout d'un monomère d'actine selon l'orientation du pas long du filament serait prohibée stériquement par le sous-domaine « post » du premier domaine FH2. Cet état correspondant aux trois premières sous-unités d'actine du filament liées par le dimère de FH2 est ainsi considéré comme « fermé ». De fait, aucun monomère d'actine supplémentaire ne devrait pouvoir se maintenir à l'extrémité barbée ainsi présentée.

## État ouvert

Un deuxième état dit « ouvert » a alors été envisagé. Dans cet état la première sous-unité d'actine de l'extrémité barbée précédemment observée est absente, laissant libre le domaine de liaison « post/lasso » du premier domaine FH2. Ainsi, lorsque l'extrémité barbée coiffée d'une formine se trouverait dans cet état, elle pourrait incorporer un monomère d'actine supplémentaire passant de l'état « ouvert » à l'état « fermé » précédemment décrit (Fig. 20.A). Il a alors
été proposé que l'extrémité barbée d'un filament d'actine coiffé par une formine peut alterner
spontanément entre ces deux états « fermé » et « ouvert ».

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 20** – A. Modèle de l'élongation d'un filament d'actine coiffé d'un dimère de formine, selon le mécanisme de la « marche enjambée » (actine : jaune ; FH2 : rouge/bleu, Thomas D. Pollard, 2016). B. Modèle cinétique de la « marche enjambée » (Otomo et al., 2005).</figcaption></figure>

## Modèle cinétique

L'alternance entre l'état « fermé » et « ouvert » s'opèrerait dans un premier temps à travers le
repositionnement dynamique d'un des deux domaines FH2. Pendant que le premier domaine
FH2 reste lié aux deux premières sous-unités d'actine de l'extrémité barbée, le second domaine
FH2 lierait alternativement la troisième sous-unité d'actine en plus de la deuxième sous-unité
d'actine de l'extrémité barbée, ou bien, uniquement la première sous-unité d'actine en exposant
au solvant sa région « post/lasso » (Fig. 20.B). Il existerait ainsi un équilibre dynamique entre « état fermé » et « état ouvert » à travers ce repositionnement continu du second domaine FH2. À l'incorporation d'un nouveau monomère d'actine dans l'état « ouvert », un nouvel équilibre dynamique s'établirait en intervertissant les rôles, fixe ou mobile, des deux domaines FH2. Ce modèle à deux états pourrait ainsi décrire la processivité des formines à l'extrémité des filaments d'actine²⁰². On parle ici du modèle de la « marche enjambée ».

Dans ce modèle aucun facteur externe ne déclenche le mouvement des domaines FH2. Le dimère de formine agit ici comme un cliquet brownien à l'extrémité barbée du filament d'actine¹⁵. En effet, la liaison alternée des domaines FH2 avec des monomères d'actine nouvellement incorporés permet l'avancée pas à pas du dimère à l'extrémité barbée en élongation. À l'inverse, un mouvement des domaines FH2 en direction de l'extrémité pointue est supposée thermodynamiquement défavorable car ce mouvement impliquerait une réorientation des sous-unités d'actine du filament nouvellement liées vers un pas angulaire de 180°. Cette reconfiguration est énergétiquement moins favorable que celle existante dans les filaments d'actine classiquement observés. Or, cette reconfiguration ne serait pas compensée par une énergie de liaison supplémentaire d'un domaine FH2 initialement dissocié, comme c'est le cas lors de l'incorporation de nouveaux monomères à l'extrémité barbée.

Plusieurs hypothèses sont faites à travers ce modèle de la « marche enjambée ». Premièrement, il est supposé que le domaine FH2 partiellement dissocié ne perturbe pas stériquement la liaison d'un nouveau monomère d'actine. Deuxièmement, le pas angulaire de 180° adopté par les trois premières sous-unités d'actine de l'extrémité barbée ne prohiberait pas l'association d'un nouveau monomère d'actine. L'alignement imparfait des acides aminés entre le nouveau monomère et les sous-unités du filament d'actine dans cette configuration serait ici compensé par la nouvelle liaison générée avec la région du domaine FH2 initialement dissociée. Finalement, l'état « fermé » serait matérialisé par une exclusion stérique excercée par le domaine FH2 recouvrant l'extrémité barbée dans cet état.

Pour soutenir ce modèle de procession « pas à pas » des formines aux extrémités barbées en croissance, des expériences réalisées en microscopie polarisée ont permis d'observer un pas de rotation des domaines FH2 en adéquation avec la structure hélicoïdale des filaments d'actine²¹³.
Facteur d'ouverture

Le ralentissement de l'incorporation de nouveaux monomères d'actine aux extrémités coiffées de formines s'expliquerait par l'occurence de l'état « fermé » évoqué précédemment. La fraction de temps qu'une formine coiffant l'extrémité barbée d'un filament d'actine passerait dans l'état « ouvert » dépendrait de son interaction avec cette extrémité barbée et donc de sa composition structurale¹⁵. L'importante différence observée entre chaque formine concernant le ralentissement de l'élongation des filaments d'actine coiffés a ainsi été interprétée comme une différence de la fraction de temps passé dans l'état « ouvert » pour chacune de ces formines¹⁹⁹. On parle de « facteur d'ouverture » auquel on associe la constante d'équilibre K<sub>O/C</sub> qui définit l'équilibre entre les états « ouvert » et « fermé ». Ce facteur d'ouverture a pu être évalué à une valeur de ~0.0 pour la formine Cdc12p, ~0.7 pour Bni1p et ~0.9 pour mDia1<sup>199</sup>.

**B. Modèle à deux états : « Saut enclenché » .**

Bien que le modèle de la « marche enjambée » puisse décrire la cinétique d'élongation des filaments d'actine coiffés de formines observés *in vitro*²⁰², d'autres modèles s'appuyant également sur la structure de Takanori Otomo et ses collègues ont pu être proposés par la suite²¹⁴,¹⁸.

Dans ces autres modèles, la nature des états « fermé » et « ouvert » diffèrent de ceux de la « marche enjambée », de même que le facteur déclenchant la transition de l'un à l'autre.

En 2008, Aditya Paul et Thomas Pollard proposent un nouveau modèle à deux états en partant du principe que le repositionnement des domaines FH2 s'accompagne d'une probabilité accrue de dissociation des formines¹⁸. Après avoir observé que le taux de dissociation des formines aux extrémitées barbées de filaments d'actine en élongation augmente avec la fréquence d'incorporation de nouveaux monomères, ils proposent que le repositionnement des domaines FH2 est directement corrélaté avec l'incorporation d'un nouveau monomère d'actine. Ainsi, dans leur nouveau modèle, c'est l'incorporation d'un nouveau monomère d'actine qui déclenche ce repositionnement, ce dernier ne correspondant plus à un équilibre intrinsèque du complexe comme dans le cas de la « marche enjambée ».

Dans ce nouveau modèle dit du « saut enclenché » la nature des états « fermé » et « ouvert »
différe du modèle de la « marche enjambée ». Entre chaque incorporation de nouveaux mono-
mères d'actine, le dimère de FH2 est supposé être constamment en interaction avec les trois
premières sous-unités de l'extrémité barbée. Les auteurs proposent alors qu'il existe une oscil-
lation de l'orientation de ces trois premières sous-unités d'actine qui varie entre une configura-
tion « fermée » correspondant à un pas angulaire de 180° et une configuration « ouverte » cor-

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 21** – A. Modèle cinétique du « saut enclenché ». B. Modèles structuraux des états « fermé » et « ouvert » associés au modèle du « saut enclenché » (actine : bleu/gris ; FH2 : vert/violet ; Aditaya S. Paul et Thomas D. Pollard, 2008)</figcaption></figure>

respondant au pas angulaire de 167° classiquement observé dans les filaments d'actine (Fig.
**21.B**).

Dans cet état « ouvert » l'interaction entre les domaines FH2 et les sous-unités d'actine sont plus laches tandis que l'un des domaines « linker » du dimère de FH2 se retrouve étiré (**Fig. 21.A-B**). Les auteurs associent alors une énergie de liaison du dimère de FH2 avec l'actine moins favorable dans cette configuration tandis que l'énergie d'interaction entre sous-unités d'actine est supposée plus favorable avec un pas angulaire de 167°. En outre, les auteurs supposent que l'agencement des sous-unités d'actine selon un pas angulaire de 180°, l'orientation qui permet une relaxation énergétique du complexe actine-formine, n'est adoptable que par les sous-unités d'actine situées juste à l'extrémité du filament, celle-ci étant moins contraintes.

Il a alors été proposé que lors de la liaison d'un nouveau monomère d'actine à l'extrémité coif-
fée du filament d'actine ayant adopté la configuration « ouverte », seul le repositionnement
rapide du dernier domaine FH2 vers les premières sous-unités d'actine de l'extrémité peut per-
mettre la relaxation énergétique du complexe actine-formine grâce à une ré-orientation vers un
pas angulaire de 180° de ces sous-unités nouvellement liées. On comprend ainsi le mécanisme
par lequel la liaison d'une nouvelle sous-unité d'actine pourrait déclencher le repositionnement d'un domaine FH2 selon le modèle du « saut enclenché ».

Pour résumer, dans le modèle de la « marche enjambée », les états « fermé » et « ouvert » se distinguent par un repositionnement dynamique d'un des deux hémidimères FH2 au bout barbé. L'état ouvert correspond alors à une dissociation partielle du premier domaine FH2 (Fig. 22.A). Dans le modèle dit du « saut enclenché », les deux états « fermé » et « ouvert » correspondent à deux torsions différentes de l'extrémité barbée en interaction avec le dimère de FH2. L'état ouvert correspond alors à une torsion proche de celle observée classiquement dans le filament d'actine (Fig. 22.B).

Ainsi, les deux états « ouverts » proposés par ces deux modèles présentent des conformations structurales radicalement différentes tandis que les deux états « fermés » restent similaires.

A

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 22 - A. Modèle de la « marche enjambée » (adapté de Yu et al., 2017). B. Modèle du « saut enclenché » (adapté de Aydin et al., 2018).</figcaption></figure>

B

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

### C. Modèles à deux états et au-delà.

D'autres études, notamment en dynamique moléculaire²¹⁵, ont pu proposer des versions ajustées des modèles à deux états. L'ouverture de l'état « fermé » pourrait correspondre à des fluctuations restreintes du domaine FH2 lié aux deux premières sous-unités de l'extrémité barbée, accompagné ou non de variations de la symétrie de l'extrémité barbée.

L'hypothèse d'un troisième état transitoire instable a également pu être proposé pour enrichir le modèle de la « marche enjambée » et ainsi prendre en compte l'augmentation du taux de dissociation des formines avec la fréquence d'incorporation des sous-unités d'actine¹⁹⁸,¹⁹².
Pour aller plus loin, plusieurs études ont pu montrer que l'application de forces sur des formines
coiffant les extrémités barbées de filaments en elongation influence directement la vitesse de
cette élongation<sup>216,16,201,17,217</sup>. Ainsi, Guillaume Romet-Lemonne, Antoine Jégou (collabora-
teurs directs de cette thèse) et Marie-France Carlier ont pu montrer en 2013 que l'application
d'une force de traction de l'ordre du picoNewton sur les domaines FH2 de la formine mDial1
augmente significativement la vitesse d'élongation des filaments d'actine que ce soit en pré-
sence ou en absence de profiline<sup>16</sup>. Ces observations ont pu être interprétées dans le cadre du
modèle de la « marche enjambée » avec une force de traction qui favoriserait la dissociation
partielle du domaine FH2 tiré et donc l'état « ouvert ». Néanmoins, d'autres isoformes semblent
suivre des comportements différents. Ainsi, bien que la formine Bnilp présente un comporte-
ment similaire à celui de mDial1 en présence de profiline, ce comportement s'inverse en l'ab-
sence de profiline avec un ralentissement observé de l'élongation en présence de force<sup>201</sup>.

3.4. Projet de thèse.

Au regard de l'ensemble des informations obtenues ces vingts dernières années sur l'ac-
tivité des formines à l'échelle moléculaire, de grandes avancées ont été réalisées sur la compré-
hension mécanistique et cinétique du fonctionnement de ces dernières. Néanmoins, depuis l'in-
troduction des modèles de la « marche enjambée » et du « saut enclenché » il y a une quinzaine
d'année, aucune expérience à ce jour n'a permis de trancher en faveur d'un modèle plus que
l'autre<sup>203</sup>.

Si une grande partie des informations structurales à l'échelle moléculaires ont été apportées via
des expériences de cristallographie, cette méthode présente des limites pour l'étude de l'extré-
mité barbée des filaments d'actine coiffés de formines. En effet, dans un premier temps, la
périodicité intrinsèque des cristaux ne permet pas d'étudier des discontinuités tels que des ex-
trémités de filaments. En outre, les contraintes de symétrie imposées par le processus de cris-
tallisation ne permettent pas d'incorporer des filaments d'actines intacts au sein de cristaux
3D<sup>218</sup>.

Une autre méthode de biologie structurale pourrait alors prendre la relève sur la cristallogra-
phie : la microscopie électronique<sup>88</sup>. C'est ainsi que j'ai pu entreprendre durant ma thèse une
étude par microscopie électronique des états conformationnels des formines adoptées durant
l'élongation de filaments d'actine.
La formine mDial a été choisie pour cette étude. Cette formine affiche un facteur d'ouverture de l'ordre de 0.9¹⁹⁹ ce qui suggère pour cet isoforme une surreprésentation de l'état « ouvert » vis-à-vis de l'état « fermé » lors de son interaction avec les extrémités barbées de filaments d'actine.

Une telle configuration facilitera alors la distinction structurale entre le modèle dit de « la
marche enjambée » et le modèle dit du « saut enclenché » évoqués précédemment.
II. Matériels et Méthodes.
# 1. La Microscopie électronique en principe.²¹⁹

## 1.1. Des électrons plutôt que des photons.

Mis au point en 1931 par le physicien Ernst Ruska et l'ingénieur électrique Max Knoll²²⁰, le microscope électronique a la particularité de créer une image agrandie d'un objet à partir d'une source d'électrons, à la différence du microscope optique qui utilise une source de photons. Ainsi, si le principe général de la formation d'une image reste le même pour ces deux types de microscope, la nature des lentilles utilisées pour manipuler les faisceaux de photons ou d'électrons diffèrent, avec des lentilles en verre utilisées en microscopie optique contre des lentilles électro-magnétiques utilisées en microscopie électronique (Fig. 23.A). L'intérêt d'utiliser un faisceau d'électrons en tant que sonde de la matière réside dans le fait que les lentilles magnétiques développées permettent de travailler avec des électrons accélérés dont les longueurs d'onde sont de plusieurs ordres de grandeurs inférieures à celles associées aux photons du spectre visible. Or, s'il existe des sources d'émission de photons dont les longueurs d'onde sont largement inférieures à celles associées au spectre visible à l'exemple des rayons X, il n'existe pas de lentilles optiques capables de manipuler de tels faisceaux. Sachant que la résolution théorique d'une image obtenue à partir d'un faiceau de particules est du même ordre de grandeur que celui de la longueur d'onde associée aux particules du faisceau incident, on comprend l'avantage que présente l'utilisation d'électrons accélérés. Les microscopes électroniques accélérent classiquement les électrons à travers des différences de potentiels de 100, 200, 300 kiloVolts ce qui équivaut à des électrons dont la longueur d'onde est de l'ordre du picomètre. Néanmoins, la résolution effectivement atteignable à travers un microscope électronique reste inférieure en raison des propriétés optiques limitées des lentilles magnétiques utilisées. On observe alors une limite de résolution inférieure à l'angström sur les microscopes électroniques en transmission.

## 1.2. Microscope électronique en transmission classique (MET) ou à balayage (METB).

Il existe deux modes d'imagerie en microscopie électronique en transmission : le microscope électronique en transmission classique (MET) et le microscope électronique en transmission à balayage (METB).
Dans le cas du **MET**, un faisceau parallèle d'électrons est transmis à travers l'échantillon à l'aide d'un système de lentilles condenseur. L'image de l'échantillon est alors reconstituée à partir des électrons transmis grâce à un système de lentilles objectif situé en aval de l'échantillon. L'image formée est finalement agrandie par un système de lentilles projecteur pour être enregistrée par un détecteur situé à la fin du trajet optique (**Fig. 23.A**). Le contraste de l'image résultante repose sur l'interaction locale des électrons avec les éléments constitutifs de l'échantillon. Dans le cas d'éléments lourds (ex : U), cette interaction peut entrainer l'absorption des électrons incidents ou la diffusion des électrons transmis à des angles élevés qui seront alors interceptés par le diaphragme objectif situé juste en aval du système de lentilles objectifs (**Fig. 23.A**). Dans ce contexte l'amplitude de l'onde électronique transmise au détecteur se retrouve localement réduite, on parle de contraste d'amplitude. Dans le cas d'éléments légers (ex : C,H,O,N), l'onde électronique transmise subit principalement un déphasage local qui entraine lors de la formation de l'image finale des interférences à l'origine d'un contraste de phase.

Dans le cas du **METB**, le faisceau d'électron est focalisé en un point de l'échantillon par un système de lentilles situé en amont de celui-ci (**Fig. 23.B**). Le faisceau d'électron transmis est redirigé vers un détecteur qui mesure l'intensité du signal transmis puis amplifié. Le point de focalisation du faisceau d'électrons sur l'échantillon est séquentiellement déplacé grâce à des bobines de déflexion jusqu'à balayer l'ensemble de l'échantillon. Ainsi, chaque point de l'échantillon est associé à un signal transmis permettant à terme de reconstruire une image point par point de l'échantillon à travers un contraste d'amplitude. (**Fig. 23.B**).

Le **MET** a été le mode d'imagerie de routine tout au long de ma thèse. Néanmoins, une expérience réalisée avec un **METB** a également pu être menée en collaboration avec l'équipe de Yuichiro Maeda et Akihiro Narita du « Structural Biology Research Center » de l'université de Nagoya.
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 23 - A. Schéma de principe de la formation d'une image en TEM. B. Schéma de principe de la formation d'une image en METB. (tiré de https://en.wikipedia.org/)</figcaption></figure>

## 1.3. Résolution spatiale et rapport signal sur bruit.

Bien que l'image formée par un microscope électronique en transmission contienne des informations structurales pouvant aller jusqu'à l'angström, la détermination de la structure d'une protéine par ces images avec une telle précision dépend en grande partie d'un autre facteur : le rapport signal sur bruit. En effet, lorsque les hautes fréquences spatiales associées à l'objet observé sont noyées dans le bruit, les structures fines de cet objet ne peuvent pas être déterminées. En biologie, la matière est principalement constituée d'atomes légers : carbone (Z=6), hydrogène (Z=1), azote (Z=7), oxygène (Z=8). Ces constituants introduisent un contraste limité vis-à-vis de leur environnement classiquement constitué d'eau. Ainsi, des astuces doivent être mises en œuvre pour améliorer le rapport signal sur bruit des protéines observées par microscopie électronique.

La première méthode permettant d'améliorer le rapport signal sur bruit est computationnelle. Dans cette approche, l'orientation de chaque protéine imagée est déterminée, puis, toutes les
protéines affichant la même orientation sont additionnées²²¹. On parle d'Analyse en Particule Isolée (Single Particle Analysis). Cette approche est décrite plus en détail dans les sectios 7.3 et 7.4 où les deux programmes d'analyse d'image SPIDER et RELION qui ont été utlisés durant ma thèse sont décrits.

Dans ce contexte, la résolution qui pourra être obtenue dépend de multiples paramètres. Dans un premier temps on peut évoquer la densité massique de la protéine, qui peut varier selon les domaines de sa structure. Ce paramètre influe directement sur le rapport signal sur bruit des images brutes. Dans un second temps on peut évoquer la précision computationnelle du tri des particules orientées identiquement ainsi que de leur alignement les unes avec les autres. Dans un troisième temps, le nombre de particules orientées identiquement et moyennées influe directement sur l'augmentation du rapport signal sur bruit. Enfin, le dernier critère correspond à la variabilité structurale qui existe entre les protéines alignées et moyennées. Cette variabilité peut être due à des variations conformationnelles natives des protéines observées ou bien à une dégradation structurale d'une partie des protéines alignées.

La seconde méthode permettant d'améliorer le rapport signal sur bruit consiste à introduire des atomes lourds dans l'environnement direct des protéines observées. Dans cette approche un important contraste est créé entre les protéines qui intéragissent faiblement avec le faisceau d'électrons incident et leur environnement comprenant des atomes lourds. On parle de coloration négative. Cette approche est décrite plus en détail dans la section II.5.1. Dans une approche par coloration négative, la résolution structurale est limitée la finesse de l'enveloppe d'atomes lourds épousant la silouhette des protéines. Ainsi l'approche par coloration négative est à double tranchant : si elle permet une amélioration significative du rapport signal sur bruit, cette méthode introduit également une limite sur la résolution des structures pouvant être obtenues avec une valeure limite de l'ordre de 20 Å²²².

## 1.4. Innovations techniques et technologiques en microscopie électronique.

Depuis l'invention du premier microscope électronique en 1931, le domaine de la microscopie électronique a connu de multiples avancées techniques et technologiques facilitant la détermination de structures protéiques complexes et repoussant la limite des résolutions structurales pouvant être obtenues.
Une avancée majeure dans le domaine de la microscopie électronique pour la biologie a été la mise au point dans les années quatre-vingt de la cryo-microscopie électronique²²³. Les électrons étant très sensibles aux molécules d'air, un vide poussé est nécessaire dans l'enceinte d'un microscope électronique en transmission. Cette contrainte limite l'introduction dans le microscope d'eau liquide constitutive de la majeure partie des échantillons biologiques. Ainsi, les échantillons biologiques avant l'avènement de la cryo-microscopie étaient systématiquement déshydratés et traités par coloration négative. Comme évoqué dans le paragraphe précédent, l'inconvénient d'un tel traitement est l'introduction d'une limite sur la résolution des structures pouvant être déterminées. L'astuce qui a alors été proposée est celle de vitrifier l'échantillon biologique avant son observation. Cette technique est décrite plus en détail dans la section II.6.1.

Le faible rapport signal sur bruit des images de microscopie électronique, et notamment de cryo-microscopie, s'est révélé être un défi central du domaine. Une avancée notable dans ce sens a été l'utilisation de nouveaux types de sources d'électrons plus brillantes que les sources initialement utilisées. Alors que les premières sources d'électrons reposent sur une émission purement thermoïonique, ces nouvelles sources d'électrons reposent sur une émission à effet de champs²²⁴. Dans le cas de l'émission thermoïonique, un cristal comme l'hexaborure de lanthane (LaB₆) est chauffé par un courant électrique pour en extraire des électrons qui seront accélérés par un champ électrique. Dans le cas de l'émission à effet de champs (FEG) utilisée par les dernières générations de microscope, les électrons sont extraits dans un vide poussé par l'intermédiaire d'un champ électrique. L'avantage de ce dernier type d'émission sur le premier, au-delà de sa brillance, est que la dispersion en énergie des électrons extraits ainsi que la dimension de leur zone d'émission sont bien plus limitées. Ces deux critères participent à réduire les aberrations chromatiques et spatiales qui nuisent à l'imagerie des microscopes électroniques.

Dans un second temps, une amélioration au niveau des détecteurs utilisés en microscopie électronique a pu être réalisée avec l'apparition de caméras à détection directe²²⁵. Les anciennes générations de détecteurs couplent des scintillateurs qui convertissent les électrons incidents en photons eux mêmes guidés par des lentilles ou des fibres optiques vers des capteurs CCD (« dispositiveif à transfert de charges ») ou CMOS (« métal-oxyde-semiconducteur complémentaire »). La nouvelle génération de détecteur s'affranchit de cette étape de conversion d'électrons en photons pour directement convertir les électrons transmis en un signal électrique exploitable. Ces détecteurs ont dû être modifiés pour supporter l'irradiation directe du faisceau d'électrons incident. De tels capteurs offrent une sensibilité et une vitesse d'acquisition qui permet lors de
l'acquisition de réaliser un film constitué d'une série d'images. La traversée du faisceau inci-
dent d'électrons chargés induit à son passage dans l'échantillon une dérive des protéines obser-
vées. Ce mouvement des protéines entraine un floutage pour des images dont le temps d'acqui-
sition est de plusieurs secondes. Un tel floutage masque le signal correspondant aux hautes
fréquences spatiales des structures protéïques. Dans le mode d'acquisition par dose fractionnée
permis par les caméras à détection directe, chaque image constitutive du film correspond à un
temps d'acquisition de quelques dizaines de millisecondes. Ces images peuvent alors être ali-
gnées entre elles avant qu'une moyenne soit calculée. Ce procédé permet de prendre en compte
le phénomène de dérive tout au long de l'acquisition et ainsi préserve le signal à haute résolu-
tion.

L'une des dernières avancées ayant facilité la détermination de structures protéïques par mi-
croscopie électronique a été réalisée du coté de l'analyse computationnelle. Une nouvelle mé-
thode d'analyse des images de microscopie électronique a ainsi été implémentée introduisant
une approche par inférence Bayésienne²²⁶. L'inférence Bayésienne est une méthode d'inférence
statistique utilisée pour actualiser la probabilité d'une hypothèse à mesure que des informations
supplémentaires sont disponibles. Ce cadre Bayésien offre une meilleure appréhension du bruit
inhérent aux images de microscopie électronique avec une caractérisation plus robuste des va-
riables cachées telles que l'orientation aléatoire des protéines imagées ou leur hétérogénéité
structurale. En effet, alors que les approches computationnelles classiques comme SPIDER
s'appuient sur une description déterministe de ces variables cachées, l'approche par inférence
Bayésienne propose une description probabiliste de ces variables cachées. On obtient ainsi une
caractérisation plus fiable du signal associé aux protéines imagées. Une telle approche est in-
carnée par le programme d'analyse d'image RELION (REgularised LIkelihood OptimisatioN)
détaillé plus loin.
## 2. Le filament d'actine à la lumière de la microscopie électronique.

### 2.1. Le corps du filament d'actine.

L'historique des structures de corps de filaments d'actine obtenues par microscopie électronique ces dernières décennies témoignent fidèlement des avancées qui ont été réalisées dans le domaine²¹⁸. La première enveloppe obtenue par cryo-microscopie électronique en 1990 par Milligan et ses collègues affichait une résolution de 25-30 Å²²⁷ (Fig. 24.A). Treize ans plus tard, une reconstruction d'un filament d'actine en complexe avec des myosines a pu être obtenue à une résolution de 13,8 Å²²⁸. Les avancées technologiques qui ont suivi en microscopie électronique ont permis de diviser cette résolution par deux en 2010 avec la détermination d'un filament d'actine seul à 6,6 Å de résolution⁵² (Fig. 24.B). L'avènement des caméras à détection directe a permis d'atteindre des résolutions de 3,7 Å en 2015 pour un filament d'actine en complexe avec de la tropomyosine, puis des structures de filaments d'actine à 3,1 et 3,0 Å de résolution respectivement en 2019²²⁹ et 2020²³⁰.

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

**Figure 24** – A. Structure du filament d'actine à 25 – 30 Å de résolution, obtenue par cryo-microscopie électronique en 1990 (Milligan et al., 1990). B. Structure du filament d'actine à 6.6 Å de résolution obtenue en 2010 (Fujii et al., 2010).

L'amélioration de la résolution des structures de corps de filaments d'actine obtenues par cryo-microscopie électronique a permis d'obtenir de meilleures connaissances sur les interactions moléculaires qui se jouent au sein du filament d'actine. Ces avancées remarquables s'appuient non seulement sur une amélioration des instruments associés à la microscopie électronique
mais également sur l'optimisation des méthodes d'analyse computationnelle propres aux filaments hélicoïdaux. Ces méthodes tirent notamment profit de l'agencement répétitif de la double hélice du filament d'actine. Ainsi, chaque sous-unité d'actine d'un filament est considéré comme une particule à aligner et une moyenne peut être obtenue avec les autres sous-unités de son filament ou les sous-unités d'autres filaments. Cette moyenne intra- et inter-filament est guidée par la symétrie préalablement déterminée de l'agencement hélicoïdal du filament d'actine et permet de compenser le signal sur bruit faible inhérent aux images de microscopie électronique.

## 2.2. Les extrémités du filament d'actine.

L'approche computationnelle développée pour l'analyse du corps des filaments d'actine n'est plus exploitable pour l'étude des extrémités au niveau desquelles la symétrie hélicoïdale est interrompue. En outre, la cinétique de polymérisation des filaments d'actine observée n'est pas favorable à la génération d'une quantité importante d'extrémités pouvant être moyennées par la suite. En effet, comme évoqué dans la section I.2.1, la polymérisation des filaments d'actine en solution s'opère selon deux étapes : une nucléation lente suivie d'une elongation rapide. Ce contexte favorise la génération d'un nombre limité de longs filaments d'actine et par conséquent d'une densité faible d'extrémités.

Ainsi, bien que les extrémités des filaments d'actine, et notamment leurs extrémités barbées, représentent les régions clefs pour la compréhension de la dynamique des filaments, il n'existe à ce jour qu'une poignée de structures obtenues par microscopie électronique ayant pu apporter des informations structurales sur ces régions.

La première structure qui a pu être obtenue à ce sujet est l'extrémité barbée coiffée de la protéine CapZ. Cette structure a été déterminée par cryo-microscopie électronique en 2006 par l'équipe d'Akihiro Narita et Yuichiro Maeda à une résolution de 23 Å (Fig. 25.A)¹³⁹. Dans ce système, la protéine de coiffe CapZ offre l'avantage de neutraliser la dynamique des filaments d'actine aux bouts barbés ce qui favorise la génération d'une densité suffisante d'extrémités (Fig. 25.C). Pour déterminer cette structure les auteurs ont développé leur propre méthode d'analyse²³¹. Ils ont mis en place pour l'occasion un protocole permettant de déterminer la polarité des filaments afin de distinguer les extrémités barbées des extrémités pointues. Akihiro
Narita et Yuichiro Maeda ont pu par la suite réutiliser le système actine/CapZ pour déterminer
la structure des extrémités pointues à une résolution de l'ordre de 20 Å (Fig. 25.B)⁸³.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 25** – A. Structure d'une extrémité barbée d'un filament d'actine coiffée d'une protéine CapZ, obtenue par cryo-microscopie électronique à 23 Å de résolution et acceuillant le modèle atomique du complexe correspondant (Narita et al., 2006). B. Structure d'une extrémité pointue de filament d'actine, obtenue par cryo-microscopie électronique à 20 Å de résolution et acceuillant le modèle atomique d'un bout pointu (Narita et al., 2011). C. Cryo-micrographie de filaments d'actine coiffés par la protéine CapZ à leur extrémité barbée (Narita et al., 2006).</figcaption></figure>

En 2020, la protéine de coiffe a de nouveau été utilisée, cette fois pour neutraliser la dynamique
de filaments d'actine générés par des complexes Arp2/3 préalablement activés par Dip1 (pro-
téine de S. Pombe, appartenant à la famille des WHISH/DIP/SPIN)²³². Cette combinaison de
protéines régulatrices neutralise efficacement la dynamique des filaments d'actine. Dans un
premier temps les complexes Arp2/3-Dip1 stimulent la nucléation de nouveaux filaments avant
de coiffer durablement leurs extrémités pointues nouvellement générées. Dans un second temps
l'elongation des filaments nouvellement générés est rapidement arrêtée par la présence de pro-
téines de coiffe qui viennent inhiber l'échange d'actine aux extrémités barbées. Ce cocktail de
protéines permet de générer une densité importante de courts filaments d'actine. La densité
d'extrémités observée par image est alors équivalente à la densité recherchée pour une « Ana-
lyse en Particule Isolée » classique (Fig. 26.B). En outre le poids moléculaire du complexe
compact formé par Arp2/3 et Dip1 étant supèrieur à 300 kDa, il introduit un rapport signal sur bruit conséquent aux extrémités pointues des filaments. Ces conditions ont permis à l'équipe de Brad Nolen de déterminer la structure du complexe Arp2/3-Spin90-bout pointu à une résolution de 3.9 Å (Fig. 26.A).

On constate, au regard de ces différentes structures qu'un des critères ayant permis leur détermination est la neutralisation de la dynamique rapide des filaments d'actine, notamment à leurs extrémités barbées.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 26 - A.** Structure d'une extrémité pointue d'un filament d'actine (gris) coiffée du complexe Arp2/3 (bleu, rouge, orange, cyan, jaune, vert) - Dip1 (rose), obtenue par cryo-microscopie électronique à 3.9 Å de résolution. C. Cryo-micrographie de filaments d'actine liées par la protéine de coiffe à leur extrémité barbée et par le complexe Arp2/3-Dip1 à leur extrémité pointue. (Shaaban et al., 2020)</figcaption></figure>

L'objectif de ma thèse étant de caractériser les conformations structurales adoptées par la forme durant l'élongation des filaments d'actine, une telle inhibition de la dynamique des extrémités barbées n'est pas envisageable.

En 2014, la structure d'une extrémité pontue coiffée de la protéine Arp2/3 avait pu être obtenue en coloration négative en s'affranchissant de la coiffe des extrémités barbées²³³. Dans cette expérience, les auteurs avaient utilisé des filaments d'actine stabilisés par de la phalloïdine. Ces filaments ainsi stabilisés sont mélangés en présence de complexes Arp2/3. Le mélange est ensuite soumis à des bains de sonication pour finalement être incubés une minute à température
ambiante avant leur dépôt sur grille de microscopie (Fig. 27.D). Une structure à une résolution de 35 Å avait pu être obtenue par la moyenne de sous-tomogrammes (Fig. 27.A-C).

Cette dernière expérience conforte la faisabilité de l'étude conformationnelle des formines aux extrémités barbées.

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

**Figure 27 – A-C** Structure d'une extrémité pointue d'un filament d'actine coiffée du complexe Arp2/3 et obtenue en coloration négative par moyennage de sous-tomogramme (résolution : 35 Å). Un modèle atomique du complexe Arp2/3 lié à l'extrémité pointue d'un filament d'actine est ajusté dans la structure. **B. Micrographie de filaments d'actine coiffés de complexes Arp2/3 observés en coloration négative.** (Volkmann et al., 2014)

Néanmoins, trois paramètres apparaissent plus défavorables dans mon projet de recherche. Premièrement, les régions structurées des deux domaines FH2 devant être identifiées sur l'extrémité barbée des filaments d'actine présentent chacune un poids moléculaire relativement faible de 40-45 kDa, équivalent au poids moléculaire des sous-unités d'actine (42 kDa). Cette première observation rend l'identification de ces domaines aux extrémités barbées délicate. Deuxièmement, la phalloïdine utilisée pour stabiliser les filaments d'actine dans l'expérience présentée ci-dessus altère la structure hélicoïdale des filaments ce qui a priori interférerait avec l'activité des formines aux extrémités barbées. Troisièmement, la variabilité structurale des domaines FH2 positionnés à l'extrémité barbée des filaments d'actine limite le gain en rapport signal sur bruit obtenu par la moyenne d'un nombre donné de particules.
### 3. Protéines utilisées durant la thèse.

Les purifications d'actine et de formine mDial utilisées tout au long de ma thèse ont été assurées par l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » de l'Institut Jacques Monod (IJM), co-dirigée par nos collaborateurs directs Antoine Jegou et Guillaume Romet-Lemonne. On notera en particulier les contributions marquées de Bérengère Guichard, LuYan Cao et Sandy Jouet.

L'actine a été purifiée à partir de muscles de lapin. Les aliquotes obtenues ont été stockées en chambre froide, dans de la glace, en tampon-G non polymérisant : 5 mM TRIS pH 7.8, 0.2 mM ATP, 0.1 mM CaCl₂, 1mM DTT et 0.01% NaN₃. Dans ces conditions, l'actine se trouve solutée sous forme monomérique (actine-G globulaire).

La protéine recombinante mDial(SNAP-FH1FH2-DAD-His) issue de souris a été exprimée en système E.Coli. Cette protéine a été purifiée à travers une chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés à travers l'étiquette Histidine (HisTrap) suivie d'une chromatographie d'exclusion stérique (HiLoad 16/60 Superdex 200). Après purification les protéines ont été stockées à -80°C en tampon 50 mM Hepes pH 7.8, 200 mM KCl, 10% glycerol et 1 mM DTT. Cette protéine recombinante de formine est dépourvue de sa région N-terminale qui assure en temps normale son autoinhibition.

La construction mDial(SNAP-FH1FH2-DAD-His) est ainsi nativement active. Le domaine SNAP de 20 kDa présent à l'extrémité N-terminale de cette protéine recombinante est utilisé par l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » pour sont ancrage lors d'expériences réalisées en microfluidique. Les domaines FH1, FH2 et DAD représentent respectivement 18.5 kDa, 46 kDa, et 12 kDa.

La protéine recombinante nativement active mDial(GST-FH1FH2-DAD-His) a également pu être purifiée à l'Institut Curie par mes soins ou ceux d'Aurélie Bertin et de John Manzi. Cette purification a été entreprise suite à l'observation par microscopie électronique d'anciennes aliquotes (purification réalisée en 2011 par John Manzi) présentant a priori une bonne structuration sur grille de microscopie électronique. Le plasmide alors utilisé avait été donné à Julie Plastino par l'équipe de Laurent Blanchoin. La protéine a été exprimée en système E. coli. Cette protéine a été purifiée via deux chromatographies d'affinités réalisées à travers le domaine GST (26 kDa) et l'étiquette Histidine suivie d'une chromatographie d'exclusion stérique et/ou une ultra-centrifugation. Une étape supplémentaire de purification par chromatographie à
d'ions (MonoQ) avait pu être introduite sans succès. De même, l'insertion d'un
domaine TEV dans la construction avait pu être réalisée par la plateforme BMBC afin de cliver
les domaines GST qui pourraient favoriser l'agrégation des protéines en solution.
Malheureusement, cette précaution avait été infructueuse avec un clivage apparemment
inopérant.

D'autres protéines de liaison avec l'actine ont également pu être utilisées dans le but de
contrôler la dynamique de la polymérisation des filaments d'actine.

Des complexes spectrine-actine ont ainsi été utilisés comme noyaux de nucléation pour la polymérisation des filaments d'actine. Ces complexes spectrine-actine ont été purifiés à partir d'erythrocyte humains puis stockés à -20°C en tampon 0.3 mM NaPO4 pH 7.6, 0.1 mM PMSF, 2 mM DTT et 50% glycérol.

De la gc-globuline issue de plasma humain (Sigma-Aldrich) a été utilisée afin de neutraliser rapidement la réserve d'actine-G lors d'expériences en condition polymérisante d'actine. De même, de la tropomoduline de souris mTmod3 purifiée à l'IJM à partir d'un plasmide de chez Addgene a été utilisée. Cette protéine avait pour objectif d'occuper les extrémités pointues des filaments d'actine afin de limiter de potentiels raboutages de filaments. Dans le même but, des complexes Arp2/3 issus de cerveaux porcins (Tebu-bio) ont également pu être utilisés.

Enfin, dans le cadre de la caractérisation structurale du complexe ternaire formé par les
protéines Spin90, Arp2/3 et mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His), la protéine Spin90 avait été
obtenue par nos collaborateurs en partant d'une séquence nucléotidique de souris issue de la
librairie I.M.A.G.E..

4. Préparation des échantillons pour des Analyses en Particule Unique.

L'objectif de ma thèse étant de déterminer les conformations structurales adoptées par
la formine lors de l'élongation de filaments d'actine, l'ensemble des échantillons a été réalisé
en condition polymérisante pour l'actine. Le tampon correspondant à cette condition est le tam-
pon-F. Ce tampon contient 5 mM de TRIS à pH 7.8, 0.2 mM de mg-ATP, 1 mM de MgCl2, 0.2
mM d'EGTA, 1 mM de DTT et une concentration en KCl de 20 mM, 50 mM ou 100 mM. Dans
ces conditions, l'agent chélateur que représente l'EGTA favorise la substitution des dications
calcium initialement en interaction avec les monomères d'actine globulaire, au profit des dications magnésium. En effet, l'EGTA possède une affinité d'un ordre de grandeur supérieur pour les dications calcium en comparaison à son affinité pour les dications magnésium. En outre, l'ajout d'ions KCl augmente la force ionique en solution entrainant la polymérisation de l'actine. Dans ces conditions, les formines se fixent efficacement aux bouts barbés des filaments d'actine et traquent ces extrémités en elongation.

## 4.1. Formine, Arp2/3, Spin90.

La première étape de mon projet de recherche a été de caractériser structuralement par microscopie électronique les différentes constructions de formine utilisées durant ma thèse. Pour ce faire, les constructions mDial1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) et mDial1(GST-FH1FH2-DAD-His) ont été déposées sur grille de microscopie électronique rapidement après décongélation et dilution en tampon-F pH 7.0 - 7.8 (Tris, Tris-HCl), et à des concentrations de 100 - 400 nM. Les grilles réalisées présentant un bon contraste et une bonne répartition de protéines ont été sélectionnées pour étudier à travers des Analyses en Particule Unique les constructions correspondantes.

Dans le cadre de la caractérisation structurale d'un complexe ternaire formé entre Arp2/3 et mDial1, par l'intermédiare de Spin90, des mélanges d'Arp2/3 incubé avec mDial1(SNAP-FH1FH2-DAD-His), Spin90 ou les deux ont été réalisés en tampon-F, pH 7.8. Des concentrations élevées de protéines ont été incubées pour favoriser la formation de complexes (Arp2/3 : 220 nM ; DIP : 1000 nM ; mDial1 : 500 nM). Ces mélanges Arp2/3-Spin90, Arp2/3-mDial1 et Arp2/3-Spin90-mDial1 ont été dilués dix foix avant d'être déposés sur grille pour atteindre une concentration en protéines compatible avec une observation par microscopie électronique.

L'analyse structurale du mélange Arp2/3-Spin90 vise à confirmer la possibilité d'identifier dans les conditions d'imagerie la formation de complexes Arp2/3-Spin90. L'analyse structurale du mélange Arp2/3, Spin90, mDial1 vise quant à elle à mettre en évidence la formation du complexe ternaire Arp2/3-Spin90-mDial1. Enfin, l'analyse structurale du mélange Arp2/3, mDial1 vise à mettre en évidence l'absence de formation de complexes Arp2/3-mDial1 sans l'intervention de Spin90.
## 4.2. Densité élevée d'extrémités barbées : contrôle positif de la nucléation.

Comme évoqué dans la partie **II.2**, la difficulté de l'analyse structurale par microscopie électronique d'un complexe formé à l'extrémité barbée de filaments réside dans l'obtention d'un nombre conséquent d'images de ces d'extrémités d'actine (de l'ordre d'une dizaine de milliers en coloration négative et plus encore en cryo-microscopie électronique). L'enjeu ici est de trouver les conditions de réalisation des grilles de microscopie électronique telles que la densité de filaments d'actine adsorbés sur la grille soit élevée tandis que la taille de ces filaments reste limitée afin de ne pas encombrer le champ d'observation. À titre d'indication, une image à un grossissement de x50 000 correspond à un champ d'observation de l'ordre de $1 \mu m^2$ tandis que la constante d'association de l'actine est de l'ordre de $10 \mu M^{-1} s^{-1}$ pour des sous-unités d'actine de dimension ~ 6 x 4 x 4 nm³. La mise au point de conditions optimales pour l'obtention d'une densité satisfaisante de bouts barbés a mené à un travail exploratoire où plusieurs stratégies, évoquées ci-dessous, ont été testées. Les observations résultantes sont présentées dans la partie **Résultats**, section 2.

Afin d'éliminer de potentiels agrégats d'actine-G formés dans les solutions stocks, les aliquotes sont systématiquement centrifugées à 250 000 g pendant 45 minutes avant chaque expérience de polymérisation d'actine ou seul le surnageant est utilisé.

### A. Nucléation reposant sur la formine.

La première approche mise en œuvre pour stimuler la nucléation d'un nombre important de filaments d'actine a été de s'appuyer sur la capacité nucléatrice des formines. Pour favoriser l'interaction des formines avec l'actine, une concentration élevée de formines (500 nM) placées dans du tampon-F ont été mises en contact avec une quantité faible d'actine dont la concentration est augmentée progressivement. En pratique, la concentration d'actine en solution a été augmentée de 0.5 µM toutes les 2 minutes jusqu'à atteindre une concentration finale de 5 µM. Cette concentration supplémentaire se situe juste au-dessus de la concentration critique mesurée pour un bout barbé coiffé de la formine mDial qui est de ~0.4 µM¹⁹⁰. Le ratio final actine:formine utilisé ici est de 10:1. Le mélange est ensuite dilué dix fois pour être déposé sur grille de microscopie électronique.
## B. Complexes de spectrine comme grains de nucléation.

Des complexes spectrine-actine ont été utilisés pour stimuler la nucléation des filaments d'actine. Ces complexes sont supposés être composés de courts oligomères d'actine réticulés par des tétramères de spectrine. Ces assemblages peuvent jouer le rôle de noyaux de nucléation d'actine<sup>234</sup>. L'avantage de l'utilisation de tels noyaux de nucléation est la coiffe de l'extrémité pointue des filaments d'actine par des complexes dont la structure est a priori reconnaissable. Cette configuration permet a priori d'écarter dès la première étape de l'analyse des extrémités pointues superflues pour l'étude des formines aux extrémités barbées.

L'approche envisagée ici afin d'obtenir une population dense de courts filaments d'actine sur les grilles de microscopie électronique est l'adsorption rapide de filaments créés, peu de temps après l'initiation stimulée de leur nucléation par les complexes spectrine-actine. En pratique, de l'actine-G est diluée à une concentration finale de 1 ou 2 µM dans une solution de tampon-F contenant 135 nM de formines et 150 pM de complexes spectrine-actine. Une série d'aspiration-expulsion vigoureuse est effectuée pendant 10 secondes à l'aide d'une micropipette P10. La solution de polymérisation est alors déposée sur grille de microscopie électronique.

### Expérience de sélection des complexes spectrine-actine actifs

Au cours de ces expériences de nucléation stimulée, de nombreux complexes spectrine-actine apparaissent non branchés à des filaments d'actine sur grille de microscopie électronique. Une expérience visant à sélectionner les complexes spectrine-actine actifs a alors été réalisée.

Dans cette expérience, une aliquote de complexes spectrine-actine est dialysée pour retirer le glycérol en solution qui peut être néfaste pour la coloration négative (2h à 4°C avec 16 µL d'échantillon contre 2L d'une solution de tampon stock sans glycérol).

Une polymérisation de 1.5 µM d'actine est réalisée à température ambiante dans 20 µL de tampon-F en présence de 18.75 nM de complexes spectrine-actine (rapport 80:1).

Les filaments polymérisés sont dilués 10 fois afin d'atteindre un volume final adapté pour une ultracentrifugation. Une quantité de 0.17 µM d'actine (concentration critique de l'actine) est ajoutée en solution afin de limiter la dépolymérisation des filaments d'actine après dilution. Les filaments d'actine sont ultra-centrifugés durant 1h30 à 150 000 g afin de faire tomber ces derniers dans le culot. L'objectif ici est de faire tomber uniquement les complexes spectrine-actine qui se seraient accrochés aux filaments d'actine.

Après ultra-centrifugation, le surnageant est retiré et le culot est resuspendu dans du tampon-G afin de dépolymériser les filaments d'actine.
Une expérience de polymérisation d'actine à température ambiante est réalisée avec l'ajout en une fois de 0.2 mM d'EGTA, 1 mM de MgCl₂ et de 50 mM de KCl. Les filaments nouvellement polymérisés (~10 secondes) sont déposés sur grille de microscopie électronique pour être observés.

## 4.3. Densité élevée d'extrémités barbées : contrôle néga-tif de la longueur des filaments.

### A. Maitrise électrostatique de l'elongation.

Au regard de l'article « Electrostatics Control Actin Filament Nucleation and Elongation Kinetics »<sup>78</sup> paru en 2013, une modulation de la cinétique de polymérisation des filaments d'actine a été entreprise à travers la variation de la force ionique ou du pH du tampon-F utilisé. Le premier paramètre permet de moduler l'écrantage des charges électrostatiques portées par les proteines en solution tandis que le second paramètre influence directement la valeur de ces charges électrostatiques en régissant l'état de protonation des acides aminés de ces protéines.

Dans un premier temps trois concentrations en KCl (20 mM, 50 mM, 100 mM) ont pu être testées à pH 7.8 (Tris-HCl).

Dans un second temps, trois valeurs de pH : 5.6 (MES), 5.9 (MOPS), 8.5 (Tris), ont pu être utilisées pour moduler la dynamique des filaments d'actine. Ces expériences de polymérisation ont été réalisées à une concentration de 50 mM de KCl et 2 µM d'actine en présence de 750 pM de complexes spectrine-actine ou 3 µM d'actine en l'absence de complexes spectrine-actine.

### B. Découpage de filaments d'actine par sonication.

Une seconde approche a été envisagée pour réguler la densité et la taille des filaments d'actine déposés sur grille de microscopie électronique. Dans cette approche, des filaments d'actine amenés à leur état stationnaire sont générés à partir de 5-10 µM d'actine polymérisée pendant 30-60 minutes en tampon-F (50 mM KCl, pH 7.8). Ces filaments sont ensuite dilués 5 fois en tampon-F juste avant leur sonication. La dilution permet de réduire momentanément la réserve d'actine G en solution pour limiter temporairement la repolymérisation des filaments. La sonication réalisée à pour but de segmenter les longs filaments d'actine initiaux en de multiples morceaux pour créer une population importante de courts filaments.
### C. Appareils de sonication.

Plusieurs appareils de sonication ont pu être testés au cours de ma thèse. Dans un premier temps, les filaments d'actine polymérisés ont été soumis à un bain de sonication pendant 30 à 180 secondes avec le sonicateur Branson Ultrasonic Bath (80W, 40 kHz).

Dans un second temps, les filaments d'actine polymérisés ont été soniqués à l'aide d'un sonicateur à sonde (Sonicator XL2020) équipé d'une pointe de 2 mm de diamètre et présentant une fréquence de 20 kHz avec une puissance de 600 Watts alors utilisée à 20% avec un paramètre d'amplitude de 3 (valeur indicative caractérisant l'amplitude des vibrations ultrasoniques à l'extrémité de la pointe). Pour limiter l'agrégation des protéines par échauffement de la solution, la sonication a été réalisée à travers 5 pulsations de 0.5 s de temps de sonication suivie de 3.5 s de temps de repos.

Dans un troisième temps, les filaments d'actine polymérisés ont été soniqués grâce à un sonicateur à sonde (Sonicator Vibracell 75041) équipé d'une pointe de 3 mm de diamètre et présentant une fréquence de 20 kHz avec une puissance de 750 Watts utilisée à 20%. La sonication a été réalisée à travers 10 pulsations de 0.1 s de temps de sonication suivies de 3.9 s de temps de repos. La surface de pointe plus large permet d'agrandir le volume traité et ainsi de réduire l'intensité de l'énergie transmise dans l'échantillon. Ce facteur permet théoriquement de mieux traiter l'ensemble de l'échantillon tout en limitant de potentielles agrégations des filaments dues à des piques de température localisés.

Après la dernière pulsation, de la formine est introduite en solution à une concentration finale de 100 - 200 nM. Un échantillon est prélevé après 20 secondes ou 1 minute d'interaction pour être déposé sur grille de microscopie électronique. Différentes concentrations en formine et différents temps d'interaction ont été utilisés ici afin de moduler le ratio d'extrémités barbées liées par des formines. Les formines sont ajoutées après sonication afin de présever leur intérgrité structurale. Des expériences de sonication en présence de formine avaient pu montrer sur grille de microscopie électronique la formation d'agrégats.

L'ajout de formines en solution et le prélèvement d'une fraction de l'échantillon sont réalisés grâce à un Hamilton de diamètre interne d'aiguille de 0.13 mm. Des échantillons de 500 µL ont été utilisés pour les expériences de sonication. Une attention particulière a été portée sur l'immersion de la pointe du sonicateur (environ 1 cm) et sur l'absence de contact avec la paroie de l'eppendorf contenant l'échantillon afin d'optimiser le transfert d'énergie vers l'échantillon.
Tout au long de la sonication, l'échantillon est immergé dans de la glace pour réduire l'échauffement.

## D. Inhiber la reprise de l'élongation.

Après arrêt de la sonication, une redistribution de la taille des filaments d'actine vers de plus longs assemblages a pu être observée par microscopie électronique.

Cette redistribution de la taille des filaments pourrait avoir lieu au cours même de la sonication, notamment durant les temps de relaxation qui séparent chaque pulse. Un tel phénomène pourrait limiter la taille des plus petits filaments d'actine créés par sonication. Deux mécanismes pourraient être impliqués dans ce phénomène. Premièrement, les courts filaments créés pourraient se rabouter les uns aux autres pour s'assembler rapidement en de plus longs filaments<sup>235</sup>. Ce mécanisme entrainerait une diminution nette de la densité d'extrémités. Un tel mécanisme serait prépondérant pour des filaments courts diffusant rapidement en solution. Le second mécanisme qui expliquerait la redistribution en taille des filaments d'actine implique une dépolymérisation partielle ou complète de filaments d'actine soumis aux pulses de sonication<sup>236</sup>. Cette dépolymérisation qui augmenterait fortement la réserve d'actine monomérique disponible en solution participerait à une repolymérisation rapide des filaments d'actine restant en solution.

Pour tenter de prévenir cette redistribution rapide de la taille des filaments d'actines, plusieurs protéines régulatrices de l'actine ont été utilisées.

Ainsi j'ai pu évaluer la capacité de coiffe des extrémités pointues par les complexes spectrine-actine (750 pM), les complexes Arp2/3 (20 nM) ou la tropomoduline Tmod3 (1 µM) dans le but de limiter le réallongement par raboutage des filaments d'actine au cours de la sonication.

D'autre part de la gc-globuline (300 nM) a été utilisée dans le but de neutraliser la réserve d'actine monomérique générée en solution durant les expériences de sonication.
# 5. Microscopie électronique en coloration négative.

Au vu des difficultés que peut présenter l'étude conformationnelle des formines aux extrémités barbées de filaments d'actine par microscopie électronique, un criblage par coloration négative a été réalisé dans un premier temps afin de déterminer les conditions adéquates de préparation des échantillons. Dans un second temps, une Analyse en Particule Isolée a été réalisée en coloration négative sur les échantillons d'intérêt identifiés.

En amont, les constructions de formine mDial(SNAP-FH1FH2-DAD-His) et mDial(GST-FH1FH2-DAD-His) ont également pu être observées et analysées.

La coloration négative présente l'avantage d'être simple de réalisation, avec l'introduction d'un contraste important permettant d'identifier des densités de protéine autrement difficiles à observer par cryo-microscopie électronique.

## 5.1. Préparation des grilles de microscopie en coloration négative.

En pratique, les protéines solutées dans leur tampon sont adsorbées sur des grilles de microscopie électronique pour être traitées en coloration négative (Fig. 28). Les grilles utilisées sont des grilles commerciales. Ces grilles sont constituées d'un réseau de cuivre de 3 mm de diamètre recouvert d'une membrane de carbone. Le réseau de cuivre assure la stabilité mécanique de la membrane tandis que cette dernière laisse traverser le faisceau d'électron incident pour une observation par microscopie électronique en transmission.

La membrane de carbone est préalablement traitée par décharge ionisante via une exposition de 30 secondes et 1 mA d'intensité avec un plasma cleaner. Cette ionisation permet de rendre la membrane de carbone hydrophile et donc d'améliorer l'adsorption de l'échantillon humide. Ce traitement est systématiquement réalisé dans la demie-heure qui précéde le dépôt des échantillons afin de préserver le potentiel hydrophile recherché.

Un volume de 4 µl d'échantillon est ensuite déposé sur grille pendant 30 secondes, pour permettre l'interaction des protéines en solution avec la membrane carbonée. Une fois ce temps écoulé, le surplus de solution présent sur la grille est aspiré à l'aide d'un papier filtre Whatman® n°1 mis en contact avec la bordure de la grille. Cette aspiration permet de définitivement
adsorber les protéines sur la membrane carbonée. Un volume de 4 µl de colorant est aussi tôt déposé sur grille puis aspiré à l'aide d'un papier filtre. Un dernier volume de 4 µl de colorant est déposé pour une durée de 30 – 60 secondes avant que la grille ne soit définitivement déshydratée au contact du papier filtre. Etant donné la présence de sels d'atomes lourds dans la solution de colorant utilisée, ces dernières étapes permettent d'introduire des molécules très diffusante aux électrons tout autour des protéines préalablement adsorbées. On introduit ainsi un contraste d'amplitude par diffusion des électrons, entre les protéines et leur environnement local. En outre l'enveloppe de colorant déposée sur les protéines leur assure une meilleure résistance à l'irradiation par le faisceau d'électron du microscope ainsi qu'une stabilité structurale dans le vide poussé de l'enceinte du microscope. Néanmoins, l'un des risques d'un tel traitement (déshydration en présence de sels d'atomes lourds) est la formation d'artéfact structuraux de part une trop forte interaction des molécules du colorant avec les protéines. Ce phénomène doit systématiquement être considéré lors d'une approche par coloration négative.

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>**Figure 28** – Schéma du processus de coloration négative pour la microscopie électronique en transmission. (Créé avec BioRender)</figcaption></figure>
Le colorant qui a été utilisé dans le cadre de ma thèse est le formiate d'uranyle à 1%. Ce composé présente un atome d'uranium (Z=92). Le formiate d'uranyle de formule $UO_2(HCOOH)_2$ est l'homologue de l'acétate d'uranyle de formule $UO_2(CH_3COO)_2$ couramment utilisé en microscopie électronique pour la coloration négative. Le formiate d'uranyle en comparaison à l'acétate d'uranyle forme sur grille une enveloppe de coloration présentant un grain plus fin que l'acétate d'uranyle ce qui repousse la limite de résolution atteignable via ce composé. L'inconvénient du formiate d'uranyle est qu'il est beaucoup moins stable en solution que son homologue avec une tendance importante à précipiter sous la forme de cristaux. Cette tendance impose la préparation de formiate d'uranyle frais quelques dizaines de minutes avant son utilisation en coloration négative.

Pour ce faire, une quantité de 10 mg de formiate d'uranyle en poudre est introduite dans 1 ml d'eau déionisée et préalablement portée à ébullition. L'ébullition de l'eau permet de désacidifier la solution. Le mélange est ensuite soumis à un agitateur vortex pendant 5 minutes. Après quoi 10 – 15 ul d'une solution de 1 M de NaOH est introduit afin de faciliter la dilution du formiate d'uranyle. Le pH ne doit pas dépasser une valeur de 4.5 auquel cas le formiate d'uranyle précipiterait²³⁷. La solution de formiate d'uranyle est de nouveau soumise à un agitateur vortex durant 5 minutes avant d'être centrifugée pendant 5 minutes à 12 000 g afin d'éliminer le formiate d'uranyle qui aurait précipité. Le surnageant est alors prélevé et filtré à travers un filtre de pores de 0.22 µm de diamètre pour en éliminer les derniers cristaux présents. Durant l'ensemble de ces étapes, la solution est maintenue à l'obscurité à l'aide de feuilles d'aluminium, la lumière pouvant stimuler la cristallisation du formiate d'uranyle.

## 5.2. Acquisition d'images pour la microscopie électronique en transmission conventionnelle par coloration négative.

Afin de mettre au point les conditions d'observation en coloration négative, des images ont été réalisées en routine sur un microscope à transmission Tecnai 120 Spirit de FEI. La caméra utilisée est une caméra Eloïse CCD. Les images ont été réalisées avec une tension d'accélération des électrons de 80 kV et un grossissement variant entre x21 000 (6.28 Å/pixel) et x52 000 (2.54 Å/pixel).
Une fois l'identification de conditions compatibles avec l'acquisition d'images pour une Analyse en Particule Isolée, des acquisitions automatiques ont été réalisées sur un microscope Tecnai G2 de FEI. Ce microscope est équipé d'une caméra TVIPS F416 CMOS. Les images ont été réalisées via les logiciels d'acquisition EM Tools et EM Menu de TVIPS avec une tension d'accélération des électrons de 200 kV et un grossissement de x50 000. La taille du pixel correspondant à ces paramètres est de 2.13 Å. Une défocalisation variant de -1000 nm à -2500 nm par incrément de 500 nm entre chaque image a été utilisée. Lors des acquisitions automatiques, l'intensité du faisceau est ajustée afin obtenir une dose faible limitant les dégâts d'irradiation (~15-20 e-/Å² après 800 – 900 ms de temps d'acquisition).

Les deux microscopes de travail utilisent un faisceau d'électron créé par émission thermoïo-nique à partir d'un filament d'hexaborure de lanthane (LaB₆).

Différentes expériences ont pu faire l'objet d'acquisiton automatique d'images. Toutes ces ex-périences ont été réalisées en tampon-F (50 mM KCl, pH 7.8) excepté pour l'observation de mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His) réalisée à pH 7.

<table><caption>Tableau 2 – Récapitulatif des acquisitions automatiques d'images réalisées en coloration négative.</caption><thead><tr><td>Type d'expérience</td><td>Concentrations de protéines</td><td>Nombre d'images</td></tr></thead><tbody><tr><td>Protéine seule, construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His).</td><td>400 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>141</td></tr><tr><td>Protéine seule, construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His).</td><td>150 nM mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His),</td><td>180</td></tr><tr><td>Polymérisation d'actine à temps court (~10 secondes). Nucléation par des complexes spectrine-actine en présence de formine.</td><td>1 µM actine || 150 pM complexe spectrine-actine || 135 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>362</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine en présence de Gc-globuline suite d'ajout de formines 1X, 20 secondes. (Sonicator XL2020)</td><td>1 µM actine || 300 nM Gc-globuline || 100 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>444</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines 1X, 20 secondes.<br/>(Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 µM actine || 100 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>1404</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines 2X, 20 secondes.<br/>(Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 µM actine || 200 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>120</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines 1X, 2 minutes.<br/>(Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 µM actine || 100 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>108</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine seuls.<br/>(Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 µM actine</td><td>271</td></tr><tr><td>Mise en contact Arp2/3, Formine</td><td>22 nM Arp2/3 || 50 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His)</td><td>125</td></tr><tr><td>Mise en contact Arp2/3, Spin90</td><td>22 nM Arp2/3 || 100 nM Spin90</td><td>58</td></tr><tr><td>Mise en contact Arp2/3, Formine, Spin90</td><td>22 nM Arp2/3 || 50 nM mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) || 100 nM Spin90</td><td>86</td></tr></table>

### 5.3. Acquisition d'images pour la microscopie électronique en transmission à balayage par coloration négative.

J'ai pu au cours de ma thèse réaliser l'acquisition d'images sur un microscope électronique en transmission à balayage au *Structural Biology Research Center* de Nagoya au sein de l'équipe d'Akihiro Narita et Yuichiro Maeda. L'avantage d'un tel microscope utilisé en coloration négative réside dans la possibilité d'obtenir des images avec un contraste supérieur à celui obtenu par un **MET** pour une résolution équivalente (la limite de résolution est imposée
ici par la coloration négative). Une telle propriété permet d'identifier plus facilement des structures de faible densité comme les domaines FH2 à l'extrémité des filamenst d'actine. Ainsi, ces

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 29** – A. Image d'un filament d'actine observé en coloration négative par **METB**. B. Structure d'un filament d'actine obtenue à partir de 4 filaments d'actine (508 sous-unités d'actine) observés par **METB** à 30 kV. C. Structure d'un filament d'actine obtenu à partir de 20 filaments d'actine (3547 sous-unités d'actine) observés par **MET** à 100 kV. (Usukura et al., 2018)</figcaption></figure>

images plus contrastées offrent un meilleur rendement résolutif. Autrement dit, à nombres de particules égaux, une meilleure résolution est obtenue par des images issues d'un **METB** plutôt qu'un **MET** (Fig. 29.B-C)²³⁸.

Le microscope qui a été utilisé est le modèle SU9000. Ce microscope est équipé d'une source à émission de champ. à une tension d'accélération de 30 kV et une intensité de 2 µA pour un grossissement de x70 000. La taille du pixel correspondant à ces paramètres est de 4.96 Å.

Un total de 218 images ont été acquises manuellement sur une grille de microscopie électronique réalisée par coloration négative suite à la sonication (sonicator XL2020) de filaments d'actine (1 µM) en présence de gc-globuline (300 nM) mis en contact 20 secondes avec de la formine (100 nM).

# 6. Cryo-microscopie électronique.

La cryo-microscopie électronique consiste à vitrifier des protéines dans leur tampon de solubilisation pour pouvoir les observer au microscope électronique. Cette technique permet de s'affranchir des limitations évoquées lors de la coloration négative des échantillons. Au-delà de lever la limitation sur la résolution introduite par la coloration négative, la cryo-microscopie électronique permet également de se prémunir de la potentielle formation d'artefacts structuraux.
## 6.1. Préparation de grilles en cryo-microscopie électronique.

Les échantillons sont déposés sur des grilles métalliques recouvertes d'une membrane de carbone. Contrairement à une approche par coloration négative, la membrane de carbone est percée de trous qui peuvent retenir par capillarité la solution de protéine déposée. Cette configuration permet d'imager des protéines solutées en l'absence de membrane de carbone dans l'axe du faisceau d'électrons. Une telle interaction du faisceau d'électrons avec la membrane de carbone occulterait ici l'interaction existante avec les protéines par l'introduction d'un bruit de fond trop élevé. En effet, le contraste qui existe entre les protéines et leur environnement local aqueux est drastiquement réduit en l'absence de colorant.

En pratique, un volume de 4 µL est déposé sur grille pendant une durée allant de quelques secondes à 1 minute afin de permettre une répartition homogène des protéines à la surface de la grille. Au préalable, les grilles sont soumises à une décharge ionisante d'une intensité de quelques milli-ampères pendant 15 - 30 secondes. Cette ionisation permet à la fois de rendre les grilles hydrophiles et de « nettoyer » leur surface. L'intensité utilisée ici est supérieure en comparaison à l'approche par coloration négative de sorte à contraindre l'introduction de solvant dans les trous présents sur la grille. Le surplus de solution est ensuite aspiré grâce à un papier filtre Whatman® n°1 mis en contact avec la face de la grille ayant reçu l'échantillon. Le contact est maintenu pour une durée de 1 - 3 secondes afin d'obtenir la formation d'un film fin de solution dans les trous de la membrane. Une attention particulière a été portée sur la force du contact afin d'obtenir une épaisseur correcte des films de solution sur la grille. Un film d'eau trop fin exclurait les particules des trous tandis qu'un film trop épais limiterait le contraste des images.

La grille retenue par une pince elle-même fixée dans un système de guillotine est rapidement plongée dans de l'éthane liquide refroidit par de l'azote à -186 °C. L'éthane ayant une capacité calorifique élevée, les molécules d'eau sont figées avant la formation de cristaux de glace. La glace ainsi obtenue est dite amorphe ou vitreuse. Cette condition est essentielle pour prévenir la détérioration des protéines par le réarrangement des molécules d'eau voisines.

L'ensemble de ces étapes est réalisé par l'intermédiaire d'un plongeur Leica EM-GP. Une humidité supérieure à 80 % est maintenue dans l'enceinte du plongeur afin de prémunir l'évaporation de l'échantillon déposé sur grille.
Les échantillons ainsi vitrifiés sont maintenus à basse température afin de prémunir tout échauffement de l'eau vitreuse pouvant amorcer sa cristallisation. Les grilles ainsi réalisées sont soit stockées dans de l'azote lique et/ou des vapeurs d'azote soit directement transférées dans le microscope électronique pour leur observation.

La cryo-microscopie électronique est techniquement plus contraignante à mettre en œuvre avec
à la clef l'obtention d'un contraste limité en comparaison à une approche par coloration
négative. Ainsi, cette technique est utilisée essentiellement après avoir préalablement identifié
par coloration négative des conditions d'observation adaptées. Néanmoins, la nature de
l'interaction des protéines avec les grilles utilisées en coloration négative ou les grilles utilisées
en cryo-microscopie diffère. Ainsi un criblage supplémentaire est parfois nécessaire en cryo-
microscopie électronique afin de pouvoir transposer des résultats préalablement observés par
une approche en coloration négative. C'est notamment le cas pour des objets allongés tels que
les filaments d'actine généralement difficilement retenus dans les trous des grilles de cryo-
microscopie électronique. Dans ce sens, différentes grilles destinées à la cryo-microscopie
électronique ont pu être testées pour l'imagerie de filaments d'actine en présence de formine.

6.2. Modèles de grille utilisés en cryo-microscopie élec-
tronique.

Les premières grilles de cryo-microscopie électronique qui ont été testées sont les grilles
de cuivre Quantifoil R 1.2/1.3, avec un paramètre de réseau de 200. Ces grilles présentent des
trous circulaires de 1.2 µm de diamètre espacés de 1.3 µm. Ces deux paramètres contrôlent la
ratio membrane/trous de la surface de la grille. Ce ratio peut influer sur la répartition des protéines
à la surface de la grille ainsi que sur la stabilité mécanique de la membrane. Le second paramètre
influant sur la stabilité mécanique de la membrane est le paramètre de réseau qui indique le
nombre de barreaux composant le réseau métallique de la grille.

J'ai également pu tester des grilles de cuivre « Lacey » avec un paramètre de réseau de 300.
Dans ces grilles la membrane forme un fin réseau amorphe. Les grilles « Lacey » ont ainsi la
particularité de présenter des trous de tailles et de formes variées, allant de moins de un micron
à plus de dix microns. Ces grilles présentant un ratio membrane/trous très faible, l'aspiration à