Influence du rouge neutre sur le développement de certains Myxomycètes.

Par
F. X. SKUPIEŃSKI.

Au cours de mes recherches cytologiques sur les Myxomycètes j'ai pu me rendre compte que le rouge neutre, auquel j'ai déjà consacré une publication (1929), peut, dans certaines conditions, devenir nuisible pour ces organismes. Ce colorant vital, dont l'emploi est très pratique et peut bien aider à résoudre certaines questions obscures d'ordre morphogénétique, quand il est soumis à 100° C (température de stérilisation habituelle) il devient toxique et empêche le développement normal des organismes en question.

*Didymium nigripes*, myxomycète endosporé, *Dictyostelium mucoroides*, *Polysphondylium pallidum* et *Polysphondylium violaceum* <fnref n="1" />), du groupe des Acrasiées, constituèrent l'objet de mes recherches. Ces organismes furent cultivés sur la gélose au bouillon de carotte et de pomme de terre (25 gr de carotte et 25 gr de pomme de terre épluchée pour un litre d'eau). Le $P_h$ du milieu ainsi préparé et réparti dans des tubes à essai est, après la stérilisation, de 7-7·4. Le cycle évolutif complet, sur un tel substratum, dure pour *Didymium nigripes* de 12 à 14 jours et pour les trois Acrasiées de 4 à 6 jours, à la température de la chambre (14-16° C).

Après l'ensemencement, les cultures de chaque espèce furent divisées en deux groupes. Chaque culture d'un groupe a reçu, à l'aide d'une pipette stérile, un peu de solution de rouge neutre à 1:1000. La quantité du colorant introduit est telle que l'eau de condensation, accumulée dans le fond du tube (à la base du bloc de gélose) prit une coloration nettement rose. Un autre groupe de cultures ne reçoit pas de colorant et constitut le groupe-témoin. Les deux catégories

<footnote n="1">¹) Les souches de ces deux derniers m'ont été gracieusement offerts par Monsieur le Professeur S. Krzemieniewski de Lwów.</footnote>
de cultures furent gardées dans un endroit obscur à la température de la chambre (14—16⁰ C).

## Didymium nigripes.

Dans les deux groupes de cultures, l'un avec colorant l'autre sans, les spores germent au bout de quelques heures avec la même intensité, à la suite de quoi apparaissent, dans l'eau de condensation, de nombreuses myxamibes et zoospores. A coté de cela les bactéries, associées à l'organisme en question, prennent un développement pareil dans les deux catégories de cultures. A mesure que celui-ci avance, la couleur rose de l'eau de condensation disparaît pour ainsi dire complétement. Ce fait peut être facilement expliqué: sous l'influence des bactéries en évolution le milieu nutritif devient alcalin; cette alcalinité croissante fait virer le rouge neutre en jaune pâle. Quelques jours plus tard, dans toutes les cultures, avec et sans colorant vital, à la surface de la gélose, apparaissent de petits plasmodes dont le nombre est différent pour chaque culture. Dans les cultures additionnées de rouge neutre, ces petits plasmodes prennent la coloration rose pâle. L'analyse microscopique permet de constater que cette couleur rose des plasmodes est due à la coloration de leurs vacuoles (celles-ci ayant la réaction acide) ainsi qu'à la coloration très intense des corpuscules métachromatiques.

Au bout d'un certain temps les petits plasmodes se fusionnent en un seul plasmode qui s'étale sur toute la surface du substratum. La couleur rose d'un pareil plasmode augmente progressivement d'intensité, surtout, quand s'approche la période de fructification. Le plasmode de *Didymium nigripes* peut fructifier sur n'importe quelle partie du substratum: tantôt sur la partie supérieure de celui-ci c-à-d. sur la partie la plus sèche), tantôt au centre, tantôt dans sa partie inférieure, au contact même de l'eau de condensation. C'est le dernier stade de la formation des fructifications qui est les plus instructif; les pieds de celles-ci sont dépourvus de colorant vital, tandis que les sporanges prennent une coloration rouge intense. L'examen microscopique permet de constater que dans ce stade le protoplasme est très condensé (par la perte considérable d'eau) et il contient un grand nombre de corpuscules sphériques, colorés en rouge très foncé. Ces derniers, comme je l'ai déjà annoncé dans ma publication précédente, seraient probablement des corpuscules métachromatiques; transportés dans l'eau distillée, ils gonflent et se transforment en vacuoles, colorées en rose. A coté de ces éléments il y a également un certain pourcentage de noyaux en voie de dégéné-
rescence qui prennent la coloration rouge. C'est donc à ces éléments que le sporange doit sa coloration rouge, au dernier stade de sa formation. Quand les sporanges atteignent le stade de la formation des spores, on peut constater que chacune d'elle renferme une ou deux grandes vacuoles colorées en rose. Ces vacuoles renferment, chacune, un corp cristallin, de nature incertaine, coloré en rouge intense. Grâce à ce fait l'intensité de la coloration du sporange va en augmentant. Il faut ajouter, que souvent, dans ces sporanges en formation, on peut trouver des cristaux de rouge neutre sous forme de paillette, réunies en faisseaux.

Le grand inconvénient que présente cette méthode d'ajouter du colorant vital après la stérilisation et le refroidissement du milieu de culture est que sa solution contient toujours des bactéries ou des spores d'une moisissure quelconque qui, en se développant plus tard, empêchent ou gênent tout au moins le développement normal du myxomycète. Pour éviter cette cause d'erreur il a fallu apliquer une autre méthode d'opération; celle d'ajouter du rouge neutre au milieu de culture <fnref n="1" />) avant sa stérilisation m'a parue la plus sûre. Après la triple stérilisation à la température de 100º C, la gélose ainsi préparée est uniformement colorée en rouge par le colorant en question. Le $P_h$ d'un tel milieu ne fut pas changé par la stérilisation. Les spores semées dans le milieu ainsi préparé germent comme dans un milieu dépourvu de colorant vital ou dans un milieu additionné de ce colorant non stérilisé. Si jusqu'à présent tout se passe normalement, comme dans les cultures dépourvues de colorant vital, les stades suivant du développement présentent des anomalies frappantes.

Sur environ cent cultures que j'ai monté, quinze seulement m'ont donné des plasmodes; sur ces quinze plasmodes trois seulement ont abouti à la fructification, les autres ayant complètement disparu de la surface du substratum, après quelques jours d'existence. Ces plasmodes de taille et de forme très différents de ceux que l'on obtient dans le milieu normal (sans colorant vital), sont intensément colorés en rouge, beaucoup plus intensément que les plasmodes formés dans le milieu nutritif identique, additionné de solution du rouge neutre non stérilisée. De ces trois cultures qui ont donné les fructifications, dans deux, celles-ci n'ont pas abouti au terme final de leur formation; elles ont été toutes arrêtées pour ainsi

<footnote n="1">¹) Je fais une solution de rouge neutre à la concentration 1 : 15.000, dans l'eau du robinet. A cette solution j'ajoute de la gélose (20 gr pour 1 litre) que je fais bouillir à 100º C. Le milieu ainsi préparé est réparti dans des tubes à essai et stérilisé ensuite trois fois à la température de 100º C.</footnote>
dire subitement dans leur procès de mûrissement. Ces fructifications ne différent pas extérieurement des fructifications normales en voie de formation. Chacune d'elle est constituée d'un sporange coloré en rouge et d'un stipe coloré en rose. Analysés au microscope, ces sporanges, datant de plusieurs jours, sont constitués, chacun, d'une masse d'aglomérations granuleuses de forme et de taille différentes. Il n'y a pas de columelle, d'aucune trace de spores ni de capillitium. Les cristaux de carbonate de caltium ne s'y forment pas non plus. Mais en échange, la paroi externe de tels sporanges est très forte et c'est elle qui occupe la presque totalité de la masse du sporange. La coloration rouge intense du sporange est due à la coloration de sa paroi, des granules plasmodiques et à la formation, en grand nombre, de dépôts cristallins du rouge neutre. Certains de ces sporanges présentent cette particularité que parmi ses éléments morts subsistent un ou plusieurs petits plasmodes vivants qui, transportés sur un nouveau milieu, additionné de rouge neutre stérilisé, continuent leur vie normale et finissent par fructifier.

Dans une des trois cultures, dont je viens de parler plus haut, il y a eu deux sortes de fructifications: sur un nombre total de 24, 16 furent anormales et 8 complètement normales. Ce qui est surprenant c'est que ces fructifications se sont formées en une seule rangée, une fructification anormale étant suivie d'une fructification normale et ainsi de suite. Un fait curieux: les spores de ces fructifications normales, ensemencées dans un milieu pareil au précédent (additionné de rouge neutre sterilisé) germent bien et il s'y forment des plasmodes qui aboutissent régulièrement à des fructifications normales. Celles-ci transplantées de nouveau sur un substratum pareil, fournissent également des fructifications normales.

Toutes ces observations prouvent que le rouge neutre soumis à des hautes températures (stérilisation à 100° C) même quand il est à une concentration relativement faible, devient toxique pour *Didymium nigripes*. Mais de l'autre coté cet organisme est capable de s'adapter très vite à ce changement de milieu, causé par la décomposition du rouge neutre.

## Acrasiées.

Ces organismes, pareillement à *Didymium nigripes*, se développent très bien en présence du rouge neutre, contenu en assez forte concentration (1 : 5000) dans le milieu nutritif, à l'exception de *Dictyostelium mucoroides* qui supporte mal en général la présence de ce colorant vital. Pour étudier l'influence de ce dernier sur le développement des organismes en question, j'ai préparé les mêmes milieux
de cultures que pour *Didymum nigripes*, c.-à-d. a) milieu sans le colorant vital, b) avec le colorant vital à la concentration 1 : 15.000 et stérilisé en même temps que le milieu nutritif, c) avec le colorant vital, ajouté après la stérilisation et le refroidissement du milieu nutritif, à la concentration à peu près 1 : 5.000. Les cultures de ces trois espèces furent gardées toujours dans l'obscurité et à la température de la chambre (14-16º C).

**Dictyostelium mucoroides.** Sur le substratum, dépourvu complètement de rouge neutre cet organisme se développe toujours le mieux de toutes les Acrasiées, en fournissant d'abondantes récoltes. Dans le milieu, additionné de rouge neutre à la concentration 1 : 5.000 et non stérilisé, il n'y a eu aucune trace de fructifications. Les bactéries, au contraire, se sont très bien développées. Dans le milieu, additionné de rouge neutre à la concentration 1 : 15.000 et sterilisé il n'y a eu non plus aucune trace de fructifications. Mais le milieu additionné de rouge neutre à la même concentration et non stérilisé, est favorable au développement de l'organisme en question. A un moment donné la surface du substratum ainsi préparé se couvre de nombreuses globules brillants et colorés en rose; ce sont des pseudoplasmodes, provenant de l'accumulation de myxamibes et leur couleur rose est due à la coloration des vacuoles et des corpuscules métachromatiques de ces myxamibes. A mesure qu'un pseudoplasmode se transforme en une fructification, l'intensité de la coloration augmente et finalement le rouge neutre se concentre uniquement dans le sporange et fait complètement absence dans le stipe.

**Polysphondylium pallidum.** J'ai fait, comme pour *Dictyostelium mucoroides* trois groupes de cultures. Dans le groupe, contenant du rouge neutre à la concentration 1 : 15.000 et stérilisé, sur trente cultures, une seulement contenait une seule fructification médiocre, dont les sporanges furent colorés en rose; dans les autres cultures se sont formés seulement les pseudoplasmodes, colorés en rose et de formes sphériques ou coniques. Dans l'autre groupe, contenant du rouge neutre à la concentration 1 : 5.000 et non stérilisé, se sont formées d'abondantes fructifications. On peut suivre progressivement le développement de chaque fructification, depuis la formation du pseudoplasmode jusqu'à l'apparition des sporanges. La présence du rouge neutre dans le milieu nutritif facilite beaucoup cette observation. On voit tout d'abord, sur le fond incolore du substratum, des pseudoplasmodes ramifiés et colorés en rose. L'analyse microscopique permet de constater que cette coloration provient de la coloration des vacuoles et des granulations métachromatiques des
myxamibes qui prennent part à la formation de ces pseudoplasmodes. Cette coloration augmente d'intensité quand le pseudoplasmode prend une forme sphérique. La sphère pseudoplasmodique s'allonge verticalement en une forme conique. C'est alors que la coloration rose passe progressivement à la partie terminale du cône. A mesure que celui-ci évolue en fructification composée, le stipe et ses ramifications perdent progressivement leur couleur rose et celle-ci se concentre uniquement dans les sporanges. Elle y persiste pendant longtemps, jusqu'à leurs complète dessication. L'analyse microscopique des fructifications permet de constater que leurs sporanges sont costitués par un liquide mucilagineux dans lequel baignent de nombreuses spores de forme ovale. Mais, à coté de celles-ci, il y a d'autres cellules, dépourvues de membrane solide, toutes de forme sphérique, un peu plus grandes que les spores et très vacuolisées. Je laisse de côté pour le moment la provenance et le rôle de ces cellules; cette question sera discutée par moi dans une prochaine publication. C'est grâce à ces cellules, riches en nombreuses vacuoles, que la couleur rose des pseudoplasmodes augmente d'intensité dans les sporanges et passe au rouge. Les spores, bien que possédant une fine membrane incolore — ce qui facilite l'observation de leur contenu, — sont complètement dépourvues de colotant vital. Il est donc évident que le rouge neutre à la concentration 1 : 5.000 n'est pas toxique pour l'organisme en question et il devient toxique, même à une concentration plus faible (1 : 15.000) quand ce colorant, mélangé au substratum gélosé, subit une triple stérilisation à 100° C, comme cela a été demontré par les cultures de *Didymtum nigripes*.

Le résultat est tout autre si on ensemence, sur un tel milieu, les spores provenant des sporanges évolués en présence du rouge neutre même non sterilisé. On est alors frappé par un curieux phénomène: dans toutes les cultures le développement de *Polysphondylium pallidum* se passe régulièrement et aboutit à une masse très abondante de fructifications. Celles-ci forment dans certaines cultures des touffes très serrées, composées d'individus vigoureux et dont les sporanges sont colorés en rouge. Il est évident que l'organisme en question s'adapte très vite à cette nouvelle combinaison de substratum et en plus de cela le rouge neutre modifié paraît jouer, par rapport au myxomycète, le rôle d'un stimulant.

**Polysphondylium violaceum.** Cet organisme, pareillement aux précédents, se laisse facilement cultiver sur les différents substratums synthétiques. Pour étudier l'influence du rouge neutre sur le développement de cet organisme, j'ai monté également trois groupes de
cultures: a) sans colorant vital, b) contenant du rouge neutre à 1:5.000 et c) contenant du rouge neutre à 1:15.000, stérilisé en même temps que le substratum.

Les cultures, contenant chacune du rouge neutre à la concentration 1:5.000 et non stérilisé, présentent un développement normal de *P. violaceum*. Au bout de trois jours, à partir de l'ensemencement des spores, apparaissent, à la surface du substratum incolore, des pseudoplasmodes colorés en rose. A mesure que le développement suit sa course normale et les pseudoplasmodes, d'abord ramifiés, ensuite sphériques, se transforment en fructifications composées, la couleur rose s'intensifie et passe progressivement vers la partie supérieure de celles-ci. Finalement, quand les fructifications sont complètement formées, leurs stipes sont incolorés, tandis que les sporanges, colorés normalement en violet clair, prennent, en présence du rouge neutre, une coloration violette foncée. Cette coloration persiste indéfiniment, même après la dessication complète des sporanges; ceux-ci paraissent alors sous forme de masses presque noires et mates.

J'ai pu également constater que cette espèce peut se développer en présence d'une plus forte concentration de rouge neutre, allant jusqu'à 1:2.000. Bien qu'en présence d'une telle concentration les fructifications arrivent à se former complètement, elles sont néanmoins peu nombreuses et d'une taille médiocre.

Sur le substratum, mélangé d'avance avec le rouge neutre à la concentration 1:15.000 et stérilisé, *Polysphondylium violaceum*, contrairement aux autres myxomycètes cités plus haut, est capable de passer par le cycle évolutif complet. Mais dans ces nouvelles conditions toutes les fructifications changent de formes et de taille; leurs stipes sont plus courts et plus épais que ceux des fructifications normales et sont dépourvus de ramifications caractéristiques pour cette espèce. Leurs sporanges sont néanmoins de volume et de forme ordinaire et fortement colorés en violet très foncé.

Quand on transplante, sur un tel substratum, les spores provenant des sporanges, évolués en présence du rouge neutre stérilisé ou non, on obtient alors un développement normal de cet organisme, comme si dans ce substratum il n'y avait pas du tout de colorant vital. L'abondance de fructifications m'a parue même plus forte que dans les cultures dépourvue de colorant vital.

En résumé, les myxomycètes dont il s'agit dans cette note, ne se comportent pas tous de la même manière en présence du rouge neutre, contenu dans le milieu de cultures. A l'exception de *Dictyostelium mucoroides*, tous ces organismes supportent bien de fortes
concentrations de ce colorant vital (1 : 5.000) et *Polysphondylium violaceum* peut fructifier même en présence d'une concentration à 1 : 2.000.

Mais en présence de la solution de rouge neutre qui a subi préalablement une triple stérilisation à 100º C, les mêmes organismes se comportent d'une façon différente, malgré que la concentration du colorant vital soit diminuée jusqu'à 1 : 15.000. Dans ces conditions *Didymium nigripes* se développe très difficilement et dans les cultures, où apparaissent les fructifications, une partie de celles-ci subit des modifications tératologiques. *Dictyostelium mucoroides*, dans les mêmes conditions, ne donne aucun signe de vie; les bactéries qui l'accom-pagnent ne se développent même pas et la surface du substratum réste toujours intacte. *Polysphondylium pallidum* prend un dévelop-pement médiocre, tandis que *Polysphondylium violaceum* se développe le mieux, en fournissant, dans toutes les cultures, d'assez abondantes fructifications. Celles-ci subissent néanmoins de fortes modifications morphologiques.

L'influence toxique du rouge neutre, ayant subi une triple stéri-lisation, ne fait aucun doute. Mais de l'autre côté tous ces orga-nismes s'adaptent très vite à ce milieu toxique.

Le rouge neutre, bien qu'il soit considéré comme un colorant par excellence vital, peut, dans certaines conditions ou en certaines concentrations, troubler l'évolution normale des organismes étudiés. De nombreuses preuves ont été fournies à ce sujet auparavant par plusieurs auteurs et dernièrement par W. A. Becker dans son ex-cellent travail sur l'influence des colorants vitaux sur le caractère de la cinèse somatique.

Institut de Botanique Générale de l'Université de Varsovie.

Index bibliographique.

1. Becker, W. A. Wpływ barwików, stosowanych za życia na charakter kinezy somatycznej. (Influence des colorants vitaux sur le caractère de la cinèse somatique). — Acta Soc. Bot. Pol. Vol. VI, Nr. 3. 1929.

2. Harper, R. A. Morphogenesis in *Polysphondylium*. — Bull. of the Torrey Botanical Club, Vol. 56. 1929/30.

3. Skupieński, F. X. Sur la coloration vitale de *Didymium nigripes* (Fr.). Note préliminaire. — Acta Soc. Bot. Pol. Vol. VI, Nr. 3. 1929.