l'aide d'un papier filtre de l'échantillon déposé sur la grille est réalisé du côté opposé de ce dernier afin de favoriser la répartition des filaments d'actine dans les trous.

Finalement j'ai pu utiliser des grilles de cuivre C-Flat R1.2/1.3 ou 2/2 avec un paramètre de réseau de 300. Ces grilles ont la particularité de présenter une surface extrêmement plane en comparaison aux grilles Quantifoil. Ce paramètre peut influer sur la répartition de l'eau à la surface de la grille après contact avec un papier filtre.

## 6.3. Oxide de Graphène pour la cryo-microscopie électronique.

La présence de trous au sein des grilles de cryo-microscopie électronique a tendance à réduire la densité des protéines observées. En effet, c'est le support continu présent dans les grilles utilisées en coloration négative qui participe fortement à adsorber les protéines de l'échantillon. Pour pallier à cet effet, la réalisation de grilles de cryo-microscopie électronique recouvertes de feuilles d'oxide de graphène a pu être mise en place (Fig. 30). Les feuilles d'oxide de graphène ont l'avantage d'être en grande partie transparentes aux électrons tout en présentant une bonne stabilité mécanique. Les échantillons déposés sur grilles peuvent ainsi bénéficier de l'interaction procurée par le support additionnel d'oxide de graphène tout en conservant un bon contraste de travail.

Le protocole utilisé est adapté du protocole de Thomas G. Martin et al., du « *Laboratory of Molecular Biology* » de Cambridge²³⁹ et du protocole de Eugene Palovkac et al., du *Department of Biochemistry and Biophysics* de l'Université de Californie²⁴⁰.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 30** - Schéma de principe de la réalisation d'une grille de microscopie électronique recouverte de feuilles d'oxide de graphène. (Créé avec BioRende)</figcaption></figure>
En pratique, les grilles de microscopie électronique sont préalablement rincées dans du chloroforme afin de rétirer tout résidu plastique. Une fois sèches, les grilles sont soumises à une décharge ionisante de 20 mA pendant 1 minute. Un volume de 3 µL de solution de graphène-oxide est déposé du côté carboné de la grille à une concentration de 0.2 mg/ml pendant 1 minute. Le surplus de solution est ensuite aspiré à l'aide d'un papier filtre Whatman® n°4 et le côté carboné de la grille est rincé à travers une goutte d'eau déionisée. Le surplus d'eau est aussi tôt aspiré. Cette opération de rinçage est réalisée trois fois en prenant soin de rincer le côté métallique de la grille à la dernière itération. Les grilles ainsi traitées sont laissées à sécher le temps d'une nuit. Avant leur utilisation, les grilles sont exposées à une décharge ionisante. Des intensités de 1 à 7.5 mA pendant 15 secondes ont été testées afin d'optimiser la répartition des protéines et l'épaisseur d'eau retenue sur ces grilles après contact avec un papier filtre.

La préparation de la solution d'oxide de graphène est réalisée à partir d'une solution commerciale concentrée à 2 mg/ml. Deux protocoles homologues ont pu être utilisés pour préparer la solution d'oxide de graphène à 0.2 mg/ml. Le premier protocole consiste simplement à diluer dix fois la solution initiale d'oxide de graphène dans de l'eau. Ce mélange est ensuite centrifugé à environ 500 g pendant 1 minute afin d'en éliminer les plus gros agrégats. Le surnageant obtenu est finalement utilisé pour recouvrir les grilles de cryo-microscopie électronique.

Dans le second protocole, des étapes supplémentaires sont ajoutées. Dans un premier temps, la solution d'oxide de graphène stock de 2 mg/ml est diluée dix fois dans une solution de méthanol (H₂O:MeOH, 1:5). Le mélange obtenu est immergé pendant 10 minutes dans un bain à sonication dans le but de dissocier des potentiels feuillets d'oxide de graphène. La solution est centrifugée pendant 10 minutes à 4000 g afin de séparer les plus petites feuilles d'oxide de graphène des autres. Les feuilles d'oxide de graphène suffisamment grandes pour se retrouver dans le culot sont resuspendues dans de l'eau. La solution est à nouveau soniquée durant 1 minute puis centrifugée à 500 g pendant 1 minute afin d'éliminer de potentiels agrégats. La concentration du surnageant en oxide de graphène est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre et le mélange est dilué dans de l'eau à une concentration d'environ 0.2 mg/ml. Ce mélange fraichement obtenu est utilisé pour tapisser des grilles de cryo-microscopie électronique.
## 6.4. Acquisition d'images en cryo-microscopie électronique.

Afin de vérifier les conditions d'observation des échantillons d'actine-formine en cryo-microscopie électronique, des images ont été réalisées sur le microscope électronique à transmission Tecnai G2 de FEI. Les images ont été réalisées avec une tension d'accélération des électrons de 200 kV et un grossissement variant entre x2700 et x50 000. L'intensité du faisceau d'électron a été ajustée afin obtenir une dose de 15-20 e⁻/Å² après 800 – 900 ms de temps d'acquisition.

Une fois l'identification de conditions compatibles avec l'acquisition d'images pour une Analyse en Particule Isolée, des acquisitions automatiques ont été réalisées sur un microscope Glacios de FEI situé à l'Institut Pasteur. Ce microscope est équipé d'une source à émission de champs et d'une caméra à détection directe Falcon 2. Les images ont été réalisées en dose fractionnée avec une acquisition automatique via le logiciel d'acquisition EPU, en sélectionnant au préalable un total de 4233 positions. Les paramètres utilisés pour l'acquisition sont résumés dans le tableau suivant (Tableau 2).

<table><caption>Tableau 3 – Paramètres d'acquisition utilisés sur le microscope Glacios de l'Institut Pasteur</caption><tr><td>Spherical Aberration Coefficient</td><td>2.7 mm</td></tr><tr><td>Defocus Values</td><td>- 1.0 to -3.0 µm</td></tr><tr><td>Frames</td><td>60</td></tr><tr><td>Exposure Time</td><td>2,22 sec</td></tr><tr><td>Dose</td><td>60 e⁻/Å²</td></tr><tr><td>Pixel Size</td><td>2,5 Å</td></tr></table>

Ces images ont été réalisées sur une grille de cryo-microscopie électronique recouverte d'oxide de graphène (C-Flat R2/2, protocole n°1) réalisée à partir d'une expérience de sonication (Sonicator Vibracell 75041) de filaments d'actine (1 µM) mis en contact 20 secondes avec de la formine (125 nM).
# 7. Analyse Structurale en Particule Isolée.

## 7.1. Correction des images brutes.

En microscopie électronique par transmission conventionnelle, l'intensité des images $(I(r))$ n'est pas directement égale au potentiel des objets sondés $(\Phi(r))$ mais dépend des réglages du microscope (sous focalisation, longueur d'onde, astigmatisme) et de ses caracatéristiques techniques (aberrations sphériques, diaphragme de l'objectif)$^{219}$. On parle de fonction de transfert de contraste $(C(k)$ dans l'espace de Fourier). L'information est également altérée par les défauts de chromaticité et l'extension spatiale de la source qui limitent la résolution. On parle de fonction d'enveloppe $(E(k))$ dans l'espace de Fourier. La fonction d'enveloppe est de la forme $E(k)=\exp(-k^2 B/4)$. On a alors l'équation suivante dans l'espace de Fourier :

$$F[I(r)](k)=F[\Phi(r)](k)C(k)E(k) \text{ avec } F() \text{ la fonction transformée de Fourier}$$

La fonction de transfert de contraste (CTF) qui sous-tend le contraste de phase des images est de la forme suivante :

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 31 - Graphe représentatif de l'allure d'une fonction de transfert. (Grégory Effantin, 2005).</figcaption></figure>

Dans les conditions d'observation utilisées avec le microscope Tecnai G2, le premier zéro de la fonction de transfert correspond à une résolution supérieure à la résolution limite imposée par la coloration négative. En outre, une part non négligeable du contraste est assurée par le
colorant qui introduit un contraste d'amplitude supplémentaire. Dans ce contexte, la fonction
de transfert n'altère pas formellement l'analyse des images obtenues dans ces conditions.

Cette affirmation n'est plus vraie dans le cadre d'images acquises en cryo-microscopie électronique sur le microscope Glacios de l'Institut Pasteur. Dans cette configuration, la modulation du signal transmis à travers la fonction de transfert doit être prise en compte dans l'analyse des images acquises dans ces conditions. En pratique, la fonction de transfert de chaque image acquise est estimée via sa transformée de Fourier. Chaque image est ensuite corrigée à travers un filtre de Wiener consistant en la division de la transformée de Fourier par la fonction de transfert estimée²⁴¹, préalablement réhaussée d'une constante. Cette opération permet de rehausser les composantes du signal transmis dont les fréquences spatiales se situent à proximité des zéros de la fonction de transfert. En outre une telle opération permet de compenser, aux plus hautes fréquences spatiales, l'atténuation du signal transmis par la fonction d'enveloppe.

Pour réaliser ce traitement préliminaire des images, le programme dédié CTFFIND4 a été utilisé. Cette opération est réalisée après l'alignement préalable des images de cryo-microscopie acquises en dose fractionnée. Pour réaliser cet alignement, le programme MotionCor2 a été utilisé. Les images ont été visualisées à travers l'environnement d'analyse Scipion et les images inexploitables ont été mises de côté (graphène/protéines agrégées, membrane cassée, glace cristallisée). Au total, 3405 images ont été conservées pour en extraire des particules.

## 7.2. Extraction des particules pour une Analyse en Particule Isolée.

Les particules de chacune des micrographies ont été sélectionnées manuellement. Cette sélection consiste en l'extraction d'un ensemble de boites correspondant à des sous-images de taille définie, chacune centrée sur une particule d'intérêt de la micrographie considérée. Les logiciels Eman2 ou Xmipp ont été utilisés dans cette opération.

Dans le cadre d'expériences visant à étudier l'interaction des formines à l'extrémité barbée des filaments d'actine, des signaux ponctuels pouvant correspondre à des dimères de FH2 ont également pu être observés le long de ces filaments d'actine. Ainsi, en plus des extrémités de filaments d'actine (EF), des particules correspondant à ces signaux sus-cités, situés le long du corps des filaments (CF), identifiés à l'œil nu, ont également pu être extraites.
Dans le cadre de l'étude structurale du complexe ternaire Arp2/3-mDia1-Spin90, pour l'ensemble des mélanges réalisés, seules les particules de taille observée supérieure ou équivalente à celle du complexe Arp2/3 ont été sélectionnées.

<table><caption>Tableau 4 – Récapitulatif des particules extraites</caption><thead><tr><td>Type d'expérience</td><td>Nombre de particules extraites</td><td>Dimensions d'une boite</td></tr></thead><tbody><tr><td>Protéine seule, construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His).</td><td>12 869</td><td>99x99 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Protéine seule, construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His).</td><td>2 637</td><td>94x94 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Polymérisation d'actine à temps court (~10 secondes). Nucléation par des complexes spec-trine-actine en présence de formine.</td><td>1 904 (EF)</td><td>EF : 135x135 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td rowspan="2">Sonication de filaments d'actine en présence de Gc-globuline suivie d'ajout de formines 1X, 20 secondes. (Sonicator XL2020)</td><td>7553 (EF)</td><td>EF : 110x110 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>6 653 (EF)</td><td>EF : 180x180 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td rowspan="2">Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines 1X, 20 secondes. (Sonicator Vibracell 75041)</td><td>18 266 (EF)<br>2031 (CF)</td><td>EF : 180x180 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>(CF, 45% des images traitées)</td><td>CF : 170x170 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines 2X, 20 secondes. (Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 327 (EF)</td><td>EF : 180x180 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines 1X, 1 minute. (Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 329 (EF)</td><td>EF : 180x180 pixel<sup>2</sup> (2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine seuls.</td><td></td><td>EF : 180x180 pixel<sup>2</sup></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>(Sonicator Vibracell 75041)</td><td>1 033 (EF)</td><td>(2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Mise en contact Arp2/3, Formine.</td><td>7 572</td><td>140x140 pixel<sup>2</sup><br>(2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Mise en contact Arp2/3, Spin90.</td><td>6 568</td><td>140x140 pixel<sup>2</sup><br>(2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Mise en contact Arp2/3, Formine, Spin90.</td><td>10 044</td><td>140x140 pixel<sup>2</sup><br>(2.13 Å/pixel)</td></tr><tr><td>Sonication de filaments d'actine suivie d'ajout de formines (125 nM), 20 secondes.<br>(Sonicator Vibracell 75041)<br>Cryo-ME</td><td>12 112 (EF)</td><td>EF : 154x154 pixel<sup>2</sup><br>(2.5 Å/pixel)</td></tr></table>

Dans le cas particulier des analyses réalisées au *Structural Biology Research Center* de Nagoya à partir d'images réalisées en **METB**, des rectangles de 400 pixels de largeur (4.96 Å/pixel) et de longueurs variables ont été utilisés pour extraire des filaments d'actine en partant d'une de leur extrémité. Pour ce faire, le début du rectangle est positionné à une extrémité d'un filament d'actine visible sur la micrographie et la fin de ce rectangle est positionné à l'autre extrémité du filament d'actine (si celle-ci est également visible sur la micrographie) ou sur un point du corps du filament d'actine prolongeant l'extrémité.

Ces filaments ainsi extraits sont étirés computationnellement afin d'obtenir des filaments droits. La polarité des filaments est alors déterminée à travers l'environnement de calcul Eos (Extensible and object-oriented system) développé par l'équipe du *Structural Biology Research Center*<sup>242,231</sup>. Pour ce faire, chaque filament est alors comparé aux projections d'un modèle d'actine orienté dans un sens ou l'autre. Les scores de corrélation obtenus permettent ainsi d'identifier la polarité du filament extrait. Les polarités de 1600 filaments ont ainsi pu être obtenues. Les extrémités des rectangles associés aux filaments sont alors extraites en distinguant les extrémités correspondant au côté pointu, des extrémités correspondant au coté barbé. 900 particules associées à des extrémités pointues ont été extraites contre un total de 700 particules associées aux extrémités barbées.
## 7.3. Alignement et classification 2D de particules.

Les alignements et les classifications 2D des particules extraites ont été réalisées à l'aide
des logiciels SPIDER et/ou RELION.

SPIDER est un logiciel d'analyse d'images qui fonctionne par l'implémentation de scripts fais-
sant appel à des opérations paramétriques développées pour son propre environnement. SPI-
DER offre une grande liberté quant à la combinaison des opérations utilisées et permet ainsi de
créer une séquence d'analyse spécialement adaptée à l'échantillon observé. À l'inverse, RE-
LION est un logiciel qui fonctionne à travers une interface utilisateur plus conviviale mais qui
en contrepartie limite la flexibilité de l'analyse. Néanmoins, RELION offre une approche sta-
tistique robuste de l'analyse des données en opposition à SPIDER qui s'appuie sur une descrip-
tion déterministe susceptible de sur-représenter du bruit dans les classes générées. Une combi-
naison de ces deux logiciels d'analyse a donc pu être utilisée. Ainsi, l'ensemble des analyses a
été réalisé avec une première approche sous SPIDER suivi d'une analyse complémentaire sous
RELION.

L'alignement des particules globulaires comme les formines ou les complexes ternaires Arp2/3-
SPIN90-Formine ont été réalisées à travers une séquence computationnelle pré-établie.

La configuration particulière des extrémités de filaments d'actine ou des extraits de corps de
filaments d'actine ont fait le fruit d'une optimisation des séquences d'alignement et de classi-
fication 2D utilisées sous SPIDER et détaillées dans la section III.3.

Les principes généraux de l'analyse 2D à travers SPIDER sont évoqués dans les sections suivantes.

### A. Alignement 2D sous SPIDER : principes.

La première partie de l'analyse consiste en l'alignement 2D des particules afin qu'elles
puissent être comparées une à une pour une classification par critère structural. L'ensemble des
images est dit aligné lorsque toutes les paires possibles d'images de cet ensemble sont dans une
orientation relative qui maximise la fonction de corrélation croisée. Un critère équivalent pour
évaluer la qualité de l'alignement consiste à sommer un à un l'intensité des pixels de l'ensemble
des images orientées. L'intensité de chaque pixel résultant dans l'image ainsi moyennée est
alors élevée au carré. Finalement, l'ensemble de ces valeurs est sommé pour donner un score
qui définit la qualité de l'alignement (plus ce score est élevé, plus l'alignement est correct).
## Alignement sans référence

Un premier alignement des particules sans référence est réalisé. L'absence de référence évite de biaiser l'analyse dès le départ via une information externe trop contraignante. L'alignement sans référence est réalisé selon deux étapes.

Premièrement, une approximation aléatoire de la moyenne globale est réalisée. Deux particules sont sélectionnées aléatoirement, orientées et moyennées. La moyenne obtenue est utilisée pour orienter une nouvelle particule qui est à son tour incorporée dans la moyenne globale. Cette opération est poursuivie itérativement jusqu'à prendre en compte dans la moyenne globale la totalité des particules.

Ce processus est répété plusieurs fois en parallèle en utilisant d'autres séquences aléatoires d'inclusion d'image. Toutes les moyennes globales obtenues sont alors sommées pour donner une unique moyenne représentative de l'estimation.

Deuxièmement, un raffinement itératif de cette moyenne globale est réalisé. À chaque étape, une particule est retirée de la moyenne globale puis réalignée avec la sous-moyenne résultante. Cette opération est réalisée pour chacune des particules de manière séquentielle. Le processus est terminé lorsque plus aucune particule n'a besoin d'être réalignée.

Les fonctions SPIDER utilisées pour ce premier alignement permettent, tout en déterminant les orientations relatives des particules, de les rassembler selon leurs similarités dans un nombre de groupe N spécifié par l'utilisateur. On choisit généralement N tel que $N=0.01*(nombre de particules totales)$. Les groupes obtenus sont représentatifs du jeu de donné utilisé.

## Alignement multi-références

L'alignement sans référence est limité par l'importance du bruit présent dans les images brutes. Un nouvel alignement prenant comme référence les moyennes des groupes obtenus précédemment permet de limiter cet aspect. Ainsi, l'orientation et la position de chaque particule brute sont comparées à chacun de ces groupes moyennés qui présentent un rapport signal sur bruit élevé. En outre, un masque créé à partir de la moyenne globale obtenue précédemment (filtrée, seuillée, dilatée) est appliqué aux références. Cette opération permet de restreindre l'analyse aux pixels d'intérêt. Un nouvel alignement plus fin des particules (rotations et translations) est alors obtenu à partir de ce second traitement.
## B. Classification 2D sous SPIDER : principes.

Une fois les particules alignées, elles sont classifiées selon leurs caractéristiques structurales. Pour ce faire, une analyse multivariée (analyse en composantes principales) est réalisée. Dans cette analyse, chaque particule est associée à un point dans un espace de dimension correspondant au nombre de pixels d'une boite. Les coordonnées du point correspondent aux intensités de chacun des pixels de la particule. L'ensemble des particules constitue donc un nuage de points dans cet hyperespace. On comprend intuitivement que plus l'information contenue dans deux particules est similaire, plus les points correspondants seront « proches » dans l'hyperespace. Un nouveau système de coordonné est alors défini. Dans ce système, les axes (vecteurs propres, orthogonaux entre eux) sont associés à des variances inter-images. Les vecteurs propres sont rangés selon l'évaluation du « rapport signal sur bruit » par ordre décroissant. Ces vecteurs propres permettent de définir les caractéristiques structurales des particules. Des « images propres » leur sont associées. Le calcul et l'observation de ces « images propres » permet d'identifier les vecteurs propres qui relèvent de détails structuraux caractéristiques de la particule. Ces vecteurs propres sont alors sélectionnés.

Un dendrogramme est calculé en agrégeant séquentiellement les différents éléments du nuage de points par distance croissante. L'agrégation séquentielle et donc le dendrogramme résultant dépend de la métrique choisie. Cette métrique repose sur les vecteurs propres sélectionnés précédemment. Un seuil est appliqué au dendrogramme afin de regrouper les classes les plus proches.

Une première étape clef de cette analyse repose sur le choix du masque appliqué aux particules permettant de cibler les pixels utilisés dans l'analyse.

Une deuxième étape importante de l'analyse repose dans le choix des vecteurs propres. Plussieurs combinaisons de vecteurs propres ont pu être explorés afin de faire ressortir certaines caractéristiques structurales en 2D.

À l'issue de ces classifications 2D, les particules associées à des classes d'intérêts sont sélectionnées, soit afin d'affiner leur caractérisation structurale 2D à travers de nouvelles classification 2D, soit afin de poursuivre l'analyse sur une caractérisation structurale 3D.
## 7.4. Reconstruction 3D.

### A. Principe.

Chaque particule extraite correspond à une projection 2D de la structure 3D de l'objet imagé. Ainsi, il est possible de reconstruire la structure 3D de l'objet en assignant à chaque particule l'orientation de la projection correspondante. Pour obtenir les paramètres d'orientation de ces particules (angles d'Euler), les images sont comparées aux projections d'un modèle de référence. Une approche itérative est réalisée, à chaque étape, les projections 2D du modèle 3D obtenu sont comparées aux données expérimentales permettant d'obtenir un nouveau modèle 3D affiné. Ce procédé est réalisé jusqu'à l'obtention d'un modèle 3D stable.

Durant ce procédé, l'approche Bayesienne proposée par RELION permet de générer plusieurs classes 3D en parallèle à travers un tri des particules utilisées. Le nombre de classes générées est choisi a priori par l'utilisateur. Une sélection des particules d'intérêt peut ainsi être réalisée à l'issu d'une classification 3D, afin d'affiner l'analyse 3D.

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 32** – Schéma de principe de la reconstruction d'une structure 3D à partir d'un modèle de référence initial comparé aux images 2D d'un objet. (Peter B. Rosenthal, John Rubinstein, 2005)</figcaption></figure>

### B. Modèles de référence utilisés.

Les modèles de références utilisés pour réaliser les reconstructions 3D ont été générés à partir de SPIDER²⁴³ pour des formes géométriques basiques (sphère, cylindre) ou à partir de UCSF Chimera²⁴⁴ pour des modèles s'appuyant sur des structures atomiques filtrées en résolution de la Protein Data Bank (Annexe 1).
### C. Paramètres clefs.

Au-delà du modèle de référence initial utilisé pour générer une structure 3D, trois paramètres supplémentaires apparaissent essentiels dans la reconstruction 3D.

Le premier paramètre correspond au diamètre du masque circulaire utilisé a priori durant l'analyse. La dimension de ce masque est cruciale notamment pour l'analyse d'extrémités de filaments d'actine. Ce masque est centré au milieu de la boite, au niveau duquel les extrémités de filaments d'actine ont été préalablement alignées au cours de l'analyse 2D. Ainsi, plus le masque est grand, plus de bruit de fond sera intégré dans l'analyse mais également une plus grande part des sous-unités d'actine situées en amont de l'extrémité. Un équilibre doit donc être trouvé entre ces deux facteurs.

Le second paramètre essentiel est le nombre de classes choisies afin de réaliser une classification 3D des particules. Un nombre de classe trop faible pourrait mélanger des particules inhomogènes pour la génération d'une structure 3D non consistante tandis qu'un nombre de classe trop élevé pourrait conduire à diviser le nombre de particules utilisées pour la reconstruction d'une structure 3D donnée, réduisant de ce fait le rapport signal sur bruit associé.

Le troisième paramètre correspond au paramètre de régularisation $T^{226}$, inhérent à l'approche computationnelle par inférence Bayesienne de RELION. Ce paramètre attribue un coût à la fonction d'optimisation utilisée durant l'analyse, afin de limiter les phénomènes de sur-ajustement (intégration de signal associé au bruit dans la structure 3D générée). Un paramètre T faible aura tendance à générer une structure moins détaillée structuralement mais plus fiable. Une valeur de T élevée pourra générer des structures à plus haute résolution mais avec une potentielle sur-représentation du bruit des données dans la structure générée.

Pour chaque reconstruction 3D réalisée, les valeurs de ces trois paramètres ont été ajustées empiriquement à travers diverses combinaisons.

La visualisation des structures 3D générées ainsi que l'ajustement de structures atomiques dans ces enveloppes 3D ont été réalisées à travers le programme UCSF Chimera.
III. Résultats.
# 1. Caractérisation structurale de constructions de formine mDia1.

## 1.1. Construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His).

### A. Observations en microscopie électronique par coloration négative.

Les premières observations réalisées en microscopie électronique par coloration négative de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) montrent sur grille une population hétérogène de particules adsorbées (Fig. 33). En effet, des objets de tailles variables sont visibles. La population observée est constituée d'agrégats globulaires de plus de 15 nm de diamètre, de fragments protéiques de quelques nanomètres et de particules intermédiaires dont les dimensions peuvent correspondre à celles d'un dimère de formine (~9 nm). Ces observations suggèrent une oligomérisation variée de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) sur grille de microscopie électronique. À ce stade, il est difficile de savoir s'il existe une structuration dans l'architecture des oligomères observés.

À l'échelle de la grille, la répartition des protéines est elle-même hétérogène et on observe un dépôt inhomogène du colorant utilisé selon les carreaux considérés.

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

Figure 33 –
Micrographie de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His), traitée en coloration négative. (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV | x52 000).
## B. Classification 2D.

Des classifications 2D réalisées avec SPIDER sur des images de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD) confirment l'hétérogénéité oligomérique précédemment observée à travers des images brutes de microscopie électronique (Fig. 34).

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 34 – Résultat d'une classification 2D SPIDER de particules extraites d'une micrographie réalisée à partir de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) (dimensions des boîtes : 21 nm²).</figcaption></figure>

Les particules extraites des micrographies (12 869 particules) ont été sélectionnées manuellement en s'affranchissant de tout critère de taille défini a priori. Un nombre important de classes présente des dimensions nettement supérieures à celles escomptées pour un dimère de formine (Fig. 34, classes n° 64 -79). Aucune structuration n'est clairement identifiable au sein de ces plus gros assemblages. D'autres classes présentent, quant-à-elles, des dimensions pouvant correspondre à des protéines dimérisées (Fig. 34, exemples : classes n° 6, 17, 35, 39, 45, 54,...). Parmi les classes de dimensions attendues on observe, avec un fort signal, des objets en forme de « pinces » (Fig. 34, classes n° 26, 29, 30).
Pour affiner la caractérisation structurale de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His), une analyse 2D a été effectuée en parallèle avec RELION. Une identification automatisée des particules au sein des micrographies suivie d'une série de classifications/sélections 2D ont été réalisées afin de trier drastiquement les objets imagés pour recentrer l'analyse sur des particules associées à des classes moyennes sous forme de « pince ». Trois classes ont finalement été selectionnées (Fig. 35), représentant un sous-total réduit de 519 particules.

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

**Figure 35** – Classes moyennes obtenues sous RELION à partir de particules extraites d'une micrographie réalisée avec la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) (dimensions des boîtes : 21 nm²).

### C. Reconstruction 3D.

Pour aller plus loin, une reconstruction 3D a été réalisée sur le jeu de 519 particules sélectionnées computationnellement.

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

**Figure 36** - Structure 3D à 26 Å de résolution (gris) d'un dimère de mDia1 généré par RELION et dans lequel les structures atomiques des domaines FH2 de mDia1 (PDB : 1V9D) ont été ajustées (bleu, vert).
La reconstruction 3D générée à partir d'un modèle de référence constitué d'un dimère de FH2 filtré à 50 Å de résolution a permis de converger, malgré le peu de particules utilisées, vers une structure à 26 Å de résolution cohérente avec le modèle d'un dimère de FH2 (Fig. 36).

On note ici que seuls les domaines FH2 de la formine mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) sont mis en évidence par la reconstruction 3D obtenue. Cette observation est en accord avec la flexibilité et la taille des autres domaines dont le signal initialement faible est perdu durant le processus de moyennage des particules.

## 1.2. Construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His).

### A. Observations en microscopie électronique par coloration négative.

Les observations effectuées sur des grilles de microscopie électronique réalisées en coloration négative à partir d'aliquotes de construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His) montrent une population de particules dont la taille moyenne est inférieure à celle observée avec la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) (Fig. 37).

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

Figure 37 - Micrographie de la construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His), traitée en coloration négative. (Tampon-F, pH7.0 | 80 kV | x42 000).

Ces premières observations ont été effectuées à partir d'aliquotes d'une purification réalisée en 2011 par John Manzi et stockées depuis à -80°C. De nouvelles purifications ont été entreprises avec le plasmide correspondant de cette construction afin d'obtenir des protéines fraichement purifiées. On observe après deux étapes de purification par chromatographies d'affinité l'agréation d'une partie des protéines (Fig. 38, A). Les agrégats sont partiellement éliminés après
une étape d'ultracentrifugation de la protéine (Fig. 38, B). Néanmoins, on observe toujours des regroupements de protéines sur grille pouvant traduire l'existence d'agrégats instables partiellement dissociés. Ces agrégats pourraient avoir été induits par les étiquettes GST des constructions de formine, connus pour leur capacité à dimériser.

Ces observations nous ont poussé à utiliser les grilles réalisées directement à partir de la purification de 2011 afin d'effectuer une analyse 2D des particules.

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

**Figure 38** – Micrographies de la construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His), traitée en collaboration négative après deux étapes de purification par chromatographie d'affinité (A) suivies d'une ultra-centrifugation (B) (Tampon-F, pH 7.0 | 80 kV | x42 000). C. Image d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE associé à la purification de mDia1(GST-FH1FH2-His).
## B. Classification 2D.

Une analyse 2D réalisée sur RELION à partir de 2637 particules extraites manuellement de micrographies de la construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD) montre une majorité de classes dont la taille moyenne est inférieure à celle escomptée pour un dimère de formine (Fig. 39).

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 39 - Résultat d'une classification 2D RELION de particules extraites d'une micrographie réalisée à partir de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His). Encadrés rouges : classes moyennes associées aux particules utilisées pour une reconstruction 3D. (Dimensions des boîtes : 21 nm²).</figcaption></figure>

## C. Reconstruction 3D.

Une reconstruction 3D a été réalisée à partir des particules associées aux classes dont les dimensions peuvent correspondre à un dimère de FH2 (Fig. 39, encadrés rouges, 696 particules). Une reconstruction cohérente à 23 Å de résolution a pu être générée en prenant pour référence le modèle atomique filtré à 50 Å d'un dimère de FH2. Cette reconstruction 3D dessine une enveloppe pouvant accomoder des domaines FH2 selon des orientations relatives distinctes de celles observées avec les données de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) (Fig. 40). Une telle différence d'orientation des domaines FH2 est permise par l'interaction flexible qui existe au sein d'un dimère de formine (I.3.2.A). Cette différence d'orientations pourrait avoir été induite par la différence du pH utilisé dans le cas de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) et mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His). En effet, alors que dans le premier cas une valeur de pH 7.8 a été utilisée, dans le second cas une valeur de pH 7.0 a été utilisée. La valeur de pH 7.8 ou 7.0 ne semblait pas au premier abord changer radicalement l'aspect des grilles de microscopie électronique réalisées avec la construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His). Néanmoins, la grille de microscopie électronique présentant une répartition sensiblement meilleure des protéines et du colorant avait pu être réalisée à partir d'une solution de protéine à pH 7.0, et c'est pourquoi une telle condition avait été choisie pour l'analyse.
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

**Figure 40** - Structure 3D à 23 Å de résolution (gris) d'un dimère de mDia1 généré par RELION et dans lequel les structures atomiques des domaines FH2 de mDia1 (PDB : 1V9D) ont été ajustées (bleu, vert).

## 1.3. Conclusion.

L'oligomérisation élevée observée sur grille de microscopie électronique de la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) peut avoir été induite par le processus de coloration négative, mais peut également être représentative de propriétés biochimiques intrinsèques de cette construction.

En effet, dans le premier cas, l'agrégation peut être une conséquence de la déshydration inhérente à la coloration négative et/ou peut résulter d'une interaction artéfactuelle des protéines avec le colorant utilisé. Un tel phènomène a déjà pu être observé pour d'autres protéines traitées en coloration négative²²².

Deuxièmement, l'hétérogénéité observée sur grille pourrait être représentative d'un équilibre en solution entre différents états oligomériques. Comme évoqué en section **I.3.2**, une telle propension à l'oligomérisation au-delà d'un dimère a déjà pu être observée pour des constructions de formines INF2 ou Bni1p. En outre, la capacité des domaines FH2 de mDia1 à
cristalliser sous la forme de tétramères suggère qu'il existe des contacts d'interaction plus ou moins faibles entre dimères de FH2 pouvant médier cet état d'oligomérisation élevé.

D'autre part, dans le cadre des grilles de microscopie électronique obtenues à partir de la construction mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His), la présence d'objets dont la taille est inférieure à celle attendue pour un dimère de formine peut être interprétée aussi bien par une protéolyse des protéines que par une dissociation partielle des dimères de formine.

Malgré cette ambiguïté concernant la variabilité des états structuraux observés par microscopie électronique pour les deux constructions mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) et mDia1(GST-FH1FH2-DAD-His), on peut supposer qu'une partie non négligeable des formines se trouvent en solution sous leur forme dimérique active. En effet, et en particulier pour la construction mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His), des expériences réalisées parallèlement par l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » à l'IJM attestent de cette activité des protéines purifiées.

De ce fait, les constructions mDia1(SNAP-FH1FH2-DAD-His) purifiées à l'IJM ont été utilisées pour une analyse structurale de leur interaction avec les extrémités barbées d'actine.

# 2. Préparation des échantillons Actine-Formine pour la microscopie électronique.

Différentes stratégies ont été testées afin de générer une densité satisfaisante de courts filaments d'actine (quelques centaines de nanomètres de long) mis en contact avec des formines. Ces différentes approches, plus ou moins fructueuses, sont présentées ci-dessous.

## 2.1. Nucléation stimulée.

### A. Formines : une nucléation limitée.

Dans un premier temps, il a été entrepris de s'appuyer sur la capacité intrinsèque des formines, utilisées dans le système, à stimuler la nucléation de nouveaux filaments d'actine. L'ajout progressif de monomères d'actine dans une solution de formine en tampon-F génère de longs filaments d'actine en quantité relativement faible (Fig. 41). Cette observation indique que
la capacité nucléatrice des formines ne permet pas de compenser le déficit cinétique de la nu-
cléation lente de nouveaux filaments d'actine vis-à-vis de l'élongation rapide de filaments d'ac-
tine pré-existants.

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Figure 41** - Micrographie issue d'une expérience de nucléation d'actine (concentration finale : 1 µM) par de la formine (concentration finale 100 nM) traitée en coloration négative. (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV, A. x21 000, B. x42 000).</figcaption></figure>

Partant de cette observation, l'ajout de noyaux de nucléation spectrine-actine a été envisagé afin de stimuler la génération d'un plus grand nombre de courts filaments d'actine à des temps courts de polymérisation.

B. Complexes de spectrine-actine.

En présence de complexes spectrine-actine, une nucléation rapide de filaments d'actine s'opère en solution dans les premières secondes de mise en contact de ces noyaux de nucléation avec de l'actine en tampon-F (Fig. 42). La taille des filaments adsorbés est dépendante de la concentration d'actine utilisée (1 ou 2 µM) qui régit principalement ici la vitesse d'élongation des filaments d'actine. On observe sur grille de microscopie électronique une densité moyenne de l'ordre de cinq extrémités de filaments d'actine par image à un grandissement de travail de l'ordre de x50 000. Cette densité reste relativement très faible pour une Analyse en Particule Isolée.

En outre, on observe sur les micrographies réalisées un bruit de fond non négligeable introduit
par des complexes spectrine-actine libres reconnaissables par leur forme en « crochet flexible »
(Fig. 42.C, flêches et cercles). Le tapissage du fond des images par ces complexes-spectrine
actine peut introduire une ambiguïté quant à la liaison des extrémités de filaments d'actine ob-
servés avec ces complexes. Dans ce contexte, la polarité de filaments d'actine observés dans
leur totalité n'est pas toujours clairement identifiable (Fig. 42.C). De plus, les signaux de complexes spectrine-actine localisés à proximité d'extrémités de filaments d'actine peuvent altérer l'analyse computationnelle réalisée ultérieurement.

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

**Figure 42** – Micrographies issues d'expériences de polymérisation d'actine (concentrations finales, A : 1 µM et B-C : 2 µM) à temps court (~10 secondes) nuclée par 150 pM de complexe spectrine-actine en présence de 100 nM de formine et traitées en coloration négative. Cercle rouge : complexes spectrine-actine libres. Flèche bleue foncée : complexe-spectrine-actine lié à l'extrémité d'un filament d'actine. Flèches bleues claires : complexes spectrine-actine positionnés aux deux extrémités d'un même filament d'actine. (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV | A-B. x16 000, C. x52 000).

La quantité de complexes spectrine-actine utilisée ici reste faible avec une concentration affichée de 150 pM pour 1 µM d'actine. Cette concentration est estimée via des expériences de nucléation d'actine pratiquées par l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » à l'IJM. Ainsi cette concentration apparente n'inclue pas la potentielle présence de complexes spectrine-actine inactifs. En ce sens, une tentative de sélection des complexes actifs par ultra-centrifugation de filaments d'actine générés par des noyaux de nucléation spectrine-actine a été réalisée. Les résultats sont présentés en **Figure 43**.
<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 43** - Micrographies réalisées en coloration négative et issues d'une expérience de polymérisation d'actine (concentration finale < 1.5 µM) à temps court (~10 secondes) en présence de 135 nM de formine et nuclée par des complexes spectrine-actine préalablement ultra-centrifugés avec de l'actine-F. (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV | A. x16 000, B. x42 000).</figcaption></figure>

On remarque sur les grilles de microscopie électronique réalisées qu’un tapis important de complexes spectrine-actine libres persiste (Fig. 43.B). Par ailleurs, la densité des filaments d’actine observés n’est pas augmentée. Ces observations peuvent suggérer que l’ultra-centrifugation réalisée n’a pas permis de séparer, entre surnageant et culot, les complexes spectrine-actine libres présumés inactifs des complexes spectrine-actine liés présumés actifs. Il peut également être supposé ici que la liaison de ces complexes spectrine-actine soit régit par un équilibre dynamique, l’activité à l’échelle moléculaire de ces complexes restant peu détaillée dans la littérature.

Finalement, des acquisitions d'image automatisées ont été réalisées à partir d'une expérience de polymérisation à temps courts en présence de 1 µM d'actine, 150 pM de complexes spectrine-actine non-centrifugés et 125 nM de formine.
## 2.2. Élongation contrôlée.

### A. Approche électrostatique.

Sur des temps courts de polymérisation, aucune influence marquée de la force ionique sur la longueur des filaments d'actine générés par des complexes de spectrine-actine n'a pu être mise en évidence par microscopie électronique dans la gamme de concentration saline utilisée (25 mM – 100 mM). Une caractérisation par microfluidique plus aboutie de l'impact de la force ionique sur la processivité des formines et sur la vitesse d'élongation des filaments d'actine avait pu être réalisée par LuYan Cao en 2018 démontrant que ce paramètre ne pouvait en effet pas être utilisé pour controler efficacement la taille des filaments d'actine générés (Fig. 44). Une concentration intermédiaire de 50 mM de KCl a alors été choisie pour le reste des expériences réalisées.

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

**Figure 44** - Impact de la concentration saline sur les taux de dissociation de la formine ainsi que sur les taux d'élongation des extrémités barbées. (Luyan Cao et al., 2018)

En ce qui concerne l'utilisation de pH extrêmes dans le but de moduler la cinétique de polymérisation des filaments d'actine, des effets directs sur l'agrégation et l'intégrité structurale des assemblages de protéine en solution ont pu être mis en évidence. On observe ainsi une agrégation sévère des complexes actine-spectrine à bas pH (Fig. 45.A-B, pH 5.6). Cette agrégation s'accompagne d'une diminution de leur activité nucléatrice suggérée par un nombre réduit de filaments d'actine observés sur grille de microscopie électronique. Un pH réduit ne permet donc pas de stimuler suffisamment la nucléation des filaments d'actine pour compenser la perte d'activité des complexes spectrine-actine observée.
À pH élevé (Fig. 45.C-D, pH 8.5), les filaments d'actine apparaissent ondulés avec une tendance à l'agrégation plus élevée sur grille de microscopie électronique. Cette observation sug-gère une altération de la structure même des filaments d'actine, ce qui n'est pas compatible avec l'étude structurale de leur interaction avec les formines.

Dans ce contexte, une valeur de pH de 7.8 a été conservée pour l'ensemble des expériences réalisées.

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**Figure 45** - Micrographies issues d'expériences de polymérisation de 1 µM d'actine nuclée par 750 pM de complexes spectrine-actine en présence de 100 nM de formine et traitées en coloration négative. Flèches rouges (B) : complexes spectrine-actine fortement agrégés (Tampon-F, A-B. : pH 6.5, C-D. : pH 8.5 | 80 kV | A-C. x21 000, B-D. x42 000).</figcaption></figure>

## B. Sonication de filaments en état stationnaire.

Les filaments d'actine traités par bain à sonication n'apparraissent pas segmenter dans les conditions utilisées (Fig. 46.A-B). Cette observation peut traduire une énergie trop faible transférée de la chambre de sonication à l'échantillon immergé et maintenu dans un eppendorf. Pour pallier à cela une sonication par sonde introduite directement dans l'échantillon a été réalisée à l'aide d'un sonicateur XL2020 équipé d'une pointe de 2 mm de diamètre. On constate la génération de nano-filaments d'actine dont la longueur est inférieure à 200 nm (Fig. 46.D).
La densité en filaments d'actine observée reste cependant limitée avec la persistance de plus longs filaments.

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>**Figure 46** – Micrographies issues d'expériences de sonication d'actine-F (2 µM, A-B : bain à sonication Branson Ultrasonic Bath, C-D : sonicateur à sonde XL2020). (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV | A-C. x16 000, B. x52 000, D. x42 000).</figcaption></figure>

Dans le but de limiter la redistribution de la taille des filaments d'actine vers des valeurs plus élevées, pendant ou après sonication, l'usage de protéines régulatrices de l'actine a été explorée.

L'introduction combinée de 750 pM de complexe spectrine-actine (coiffe des extrémités barbées et nucléation de nouveaux filaments) et 300 nM de Gc-globuline (sequestration de l'actine-G en solution) durant la sonication de 2 µM d'actine-F permet de maintenir une bonne densité en nano-filaments d'actine jusqu'à l'adsorption sur grille de microscopie électronique (Fig. 47.A-B). La présence de complexes spectrine-actine en quantité élevée introduit néanmoins un signal parasite pouvant perturber l'analyse des extrémités de filament d'actine.

D'autre protéines régulatrices de l'actine ont alors été testées pour remplacer la coiffe des extrémités pointues précédemment assurée par les complexes spectrine-actine. Des complexes Arp2/3 sans activateur ou de la tropomoduline ont ainsi été utilisées.
Dans le cas des complexes Arp2/3, on observe un effet limité de ces derniers sur la taille des filaments d'actine adsorbés sur grille de microscopie électronique après sonication (Fig. 47.E). Peu de filaments d'actine apparaissent coiffés d'un complexe Arp2/3 dans les conditions utilisées. Il faut noter ici que seulement 20 nM d'Arp2/3 avait pu être utilisé pour une constante d'équilibre associée au bout pointu variant entre 40 nM et 1 µM selon l'état d'hydrolisation des nucléotides des sous-unités d'actine constitutives de l'extrémité pointue (Tableau 1).

Dans le cas de la tropomoduline, une quantité importante de cette dernière (1 µM) a dû être utilisée au regard de la constante d'équilibre élevée associée avec l'extrémité pointue (~0.1 µM). Cette concentration élevée en tropomoduline introduit un signal parasite important dans les images de microscopie électronique réalisées sans pour autant préserver une population élevée de courts filaments d'actine (Fig. 47.E-F).

L'introduction de formines au cours même de la sonication a également pu être testée. Un effet positif sur la densité des extrémités observées a pu être identifié (Fig. 47. G-H). Néanmoins, cette observation s'accompagne de la formation d'agrégats pouvant traduire une dénaturation des constructions de formine utilisées lors d'une telle sonication (Fig. 47. G-H).
<figure><img src="image_62.png" /></figure>

**Figure 47** – A,B,D,F,G,H. Micrographies issues d'expériences de sonication d'actine-F (2 µM, sonicateur à sonde XL2020) en présence de A-B : 750 pM de complexe spectrine-actine et 300 nM de Gc-globuline, D : 20 nM Arp2/3 (flèche rouge : Arp2/3 lié à une extrémité pointue) et 300 nM de Gc-globuline, F : 1 µM de tropomoduline et 300 nM de Gc-globuline, H : 100 nM de formine et 300 nM de Gc-globuline. C. Micrographie réalisée à partir de 50 nM de complexe Arp2/3. E. Micrographie réalisée à partir de 1 µM de tropomoduline (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV | A-G. x16 000; B,C,D,E,F,H : x42 000).
Finalement, une densité raisonnable d'extrémités d'actine a pu être obtenue en s'affranchissant de l'utilisation de protéines de coiffe des extrémités pointues, en ajustant la concentration d'actine initiale à 1 µM, en conservant l'utilisation de 300 nM de Gc-globuline durant la sonication et en introduisant rapidement après sonication 100 nM de formine (Fig. 48).

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>**Figure 48** - Micrographies issues d'une expérience de sonication d'actine-F (1 µM, sonicateur à sonde XL2020) en présence de 300 nM de Gc-globuline mises en contact 20 secondes avec 100 nM de formines. (Tampon-F, pH 7.8 | A-B: TEM 80 kV, C: TEM 200 kV – LaB₆, D: METB 30 kV | A. x16 000, B. x42 000, C. x50 000).</figcaption></figure>

Des acquisitions automatisées à l'aide du microscope électronique en transmission conventionnelle Tecnai G2 (Fig. 48.C) ainsi que des acquisitions manuelles à l'aide du microscope électronique en transmission à balayage SU9000 (Fig. 48.D) ont pu être réalisées sur ces grilles de microscopie électronique. On remarque ici la différence de contraste existant entre une image brute acquise par MET standard (-1.35 µm de défocalisation) et une image brute acquise par METB.

Afin d'améliorer les conditions de préparation des échantillons actine-formine, un sonicateur à sonde Vibracell 75041 équipé d'une pointe de 3 mm de diamètre a pu être testée. Après optimisation des paramètres de sonication, des résultats satisfaisant concernant la densité d'extrémités observées par microcrographe ont pu être obtenus en s'affranchissant de l'utilisation de
toute protéine tierce de régulation de l'actine afin de préserver l'interaction du binôme actine-formine. Une telle condition simplifiée permet de faciliter l'interprétation des analyses réalisées ultérieurement.

Dans ce contexte, plusieurs ajustements ont été explorés pour moduler le ratio de liaison observé des formines aux extrémités barbées des filaments d'actine.

La concentration d'actine-F soniquée ici est de 1 µM en présence de 100 nM de formines introduites 20 secondes (Fig. 49.A) ou 1 minute (Fig. 49.C) avant le dépôt des échantillons sur grille de microscopie électronique. Une concentration de 200 nM de formine a également pu être utilisée avec un temps d'attente de 20 secondes entre l'introduction des formines et le dépôt des échantillons sur grille de microscopie électronique (Fig. 49.B).

On constate sur les images brutes que pour une concentration de formine plus élevée (200 nM), le tapis de protéine observé est plus dense (Fig. 49.B) tandis que pour une durée plus longue entre sonication des filaments d'actine et dépôt des échantillons sur grille, les filaments d'actine observés sont qualitativement plus long.

Des acquisitions d'image automatisées ont pu être réalisées sur ces différentes conditions avec le microscope Tecnai G2.

<figure><img src="image_64.png" /></figure>

Figure 49 - Micrographies issues d'une expérience de sonication d'actine-F (1 µM, sonicateur à sonde VibraCell) mise en contact A-B : 20 secondes, C : 1 minute avec A,B : 100 nM de formines ; C : 200 nM de formines. (Tampon-F, pH 7.8 | 80 kV | x42 000).
Finalement, un nombre conséquent d'approches pour la préparation des échantillons actine-
formine a été évalué. Cette phase de fenêtrage stratégique et de mise au point des procédés a
constitué une part importante du projet de thèse et a permis de rendre atteignable l'objectif
initialement fixé consistant à déterminer les conformations structurales adoptées par des for-
mines au cours même de la polymérisation des filaments d'actine.

3. Analyses en Particule unique adaptées pour des extrémités de filament d'actine.

3.1. Analyse en Particule Isolée : Nucléation, Spectrine • Actine • Formine.

Le premier jeu de données ayant pu être traité par une Analyse en Particule Isolée cor-
respond aux extrémités de filaments d'actine issus d'une expérience de polymérisation d'actine
à temps courts en présence de formine et dont la nucléation est assurée par des complexes spec-
trine-actine.

A. Alignement et classification 2D.

Un alignement 2D suivi d'une classification 2D classiques ont été utilisés pour traiter
ces données (Fig. 50).

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Figure 50 – Schéma de principe d'une analyse 2D classique.</figcaption></figure>
On constate dans l'ensemble des classes obtenues un signal fort des sous-unités d'actine constituant les filaments (Fig. 51). Quelques classes présentent des densités électroniques exotiques mais le rapport signal sur bruit affiché reste faible laissant ces moyennes difficilement interprétables dans le contexte d'une coiffe par un dimère de formine (Fig. 51, seconde ligne). En outre, la contribution de potentiels signaux associés à des complexes spectrine-actine dans ces données n'est pas clairement définie au sein des classes observées.

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>**Figure 51** - Résultat d'une classification 2D SPIDER de particules issues d'une expérience de polymérisation d'actine (1 µM) à temps court (~10 secondes) nuclée par 150 pM de complexes spectrine-actine en présence de 135 nM de formine et traitées en coloration négative (Dimensions des boîtes : 29 nm²).</figcaption></figure>

En conclusion, la densité d'extrémités de filaments d'actine (~5 extrémités de filament d'actine par image) obtenue à travers une approche de nucléation de filaments par des complexes spectrine-actine ne permet pas d'acquérir une quantité de particules suffisante pour réaliser une Analyse en Particule Isolée aboutie. Cette approche n'a donc pas été poursuivie.

## 3.2. Analyse en Particule Isolée : Sonication, Gc-globuline – Actine • Formine.

Le second jeu de données ayant pu être traité par une Analyse en Particule Isolée correspond aux extrémités de filaments d'actine issus d'une expérience de sonication d'actine-F en présence de Gc-globuline mis en contact succintement avec de la formine avant dépôt sur grille de microscopie électronique. La densité d'extrémité de filaments d'actine obtenue avec une telle approche est de 15 extrémités par image.
A. Alignement et classification 2D : MET.

De même que pour l'approche par nucléation stimulée en présence de complexes spec-
trine-actine, le jeu de données présenté ici a été traité dans un premier temps par un alignement
2D suivi d'une classification 2D classiques (Fig. 50). Le résultat d'une classification 2D réali-
sée sous SPIDER à partir de particules de dimensions 110x110 pixel² est représenté en **Figure
52**.

<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Figure 52 - Résultat d'une classification 2D SPIDER de particules issues d'une expérience de sonication d'actine-F en (1 µM) présence de Gc-globuline (300 nM) mis en contact succinctement avec de la formine (100 nM) et traitée en coloration négative. Encadrés rouges : classes moyennes présentant une densité globulaire à l'extrémité. (Dimensions des boîtes : 23 nm²).</figcaption></figure>

On constate parmi les classes obtenues des classes moyennes présentant, en plus des sous-unités
d'actine constituant le filament, une densité globulaire située à l'extrémité du filament d'actine
(Fig. 52, encadrés rouges). Les particules associées à ces classes représentent 22% des parti-
cules extraites (1698 particules).

B. Alignement et classification 2D : METB.

Des résultats analogues ont pu être obtenus à partir de la même grille de microscopie
électronique observée par **METB** au *Structural Biology Research Center* de Nagoya. Les par-
ticules ont été analysée via RELION après une détermination sous EOS de la nature pointue ou
barbée des extrémités considérées (Cf II.7.2).

On retrouve parmi les classes associées aux bouts barbés une classe qui présente une densité globulaire à son extrémité (Fig. 53.B, encadré rouge). La présence exclusive de ces densités globulaires aux extrémités barbées est en accord avec ce qui est attendu pour des formines interagissant avec des filaments d'actine. Les particules associées à cette classe représentent environ 40 % des extrémités barbées identifiées. Ce pourcentage est en adéquation avec la valeur obtenue dans l'analyse précédente (22 %) dans laquelle les extrémités barbées et les extrémités pointues sont confondues.
<figure><img src="image_68.png" /></figure>

**Figure 53** – Classes moyennes représentatives des classifications réalisées via RELION une fois avoir déterminé la nature pointue (A) ou barbée (B) des extrémités considérées. Encadré rouge : classe moyenne de bouts barbés présentant une densité globulaire à l'extrémité.

On remarque que pour cette classe, contrairement aux autres, le motif ondulé associé à l'hélicité du corps du filament d'actine n'est pas mis en évidence (Fig. 53.B). Cette observation peut être interprétée comme une différence du signal prépondérant dans l'alignement des filaments de ces deux cas. Dans le cas des filaments où une densité globulaire est présente à l'extrémitée, on peut supposer que les extrémités contrastées guident l'alignement des particules au détriment de l'alignement du corps des filaments d'actine qui ne sont pas nécessairement orientés dans la même direction. Le motif ondulé caractéristique d'une orientation est donc perdu.

En l'absence de densité contrastée à l'extrémité des filaments, ont peut supposer que les corps des filaments sont alignés de sorte à faire correspondre « crêtes » et « creux » de ce motif ondulé associé à l'hélicité du filament d'actine, cela au détriment de l'alignement des extrémités.

Le nombre d'images acquises pour cette analyse par METB a été limité par l'impossibilité de réaliser des acquisitions automatisées. En effet, le système alors utilisé nécessitait un réglage manuel du focus avant la réalisation de chaque image. Un total de 218 images a pu être obtenu. À partir de ces images environ 1600 extrémités ont pu être extraites après identification de la polarité des filaments leurs étant associés. Ainsi une densité d'environ 7.5 extrémités par image a pu être obtenue à travers cette analyse. La densité d'extrémité affichée ici, inférieure par rapport à celle obtenue dans l'analyse précédente, est une conséquence de l'étape supplémentaire visant à déterminer au préalable la polarité des filaments extraits. En effet, dans cette étape, les filaments trop petits, trop courbés ou dont le signal n'est pas suffisamment résolu pour en déterminer efficacement la polarité se retrouvent écartés de l'analyse, diminuant de ce fait le nombre d'extrémités considérées.
Au final, 280 bouts barbés présentant une densité globulaire à leur extrémité ont pu être identifiés. Ce nombre de particules reste insuffisant pour pouvoir réaliser une Analyse en Particule Isolée.

Ainsi, bien qu'une étude par **METB** présente un avantage concernant le contraste observé des images obtenues vis-à-vis d'une étude par **MET**, le nombre de données générées reste insuffisant pour tirer profit de cet avantage dans une Analyse en Particule Isolée.

### C. Optimisation 1D de l'alignement des extrémités.

Malgré le nombre de particules obtenues par une approche en **MET** (7551 particules), l'ensemble des reconstructions 3D réalisées à partir de ce jeu de données reste très bruité, laissant les sous-unités d'actine de l'extrémité difficilement identifiables au sein des reconstructions 3D obtenues. Cette observation reste vraie que ce soit en générant un modèle 3D à partir de particules associées à des classes avec ou sans densité globulaire à l'extrémité du filament d'actine. Cette observation pourrait être la conséquence d'un alignement imprécis des extrémités de filament d'actine. En effet, des classifications 2D réalisées avec RELION sur ce jeu de données semblent mettre en évidence un alignement imparfait de certaines extrémités (Fig. 54). On observe ici des tailles d'extrémités extraites différentes.

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>**Figure 54** – Groupe de classes moyennes issues d'une unique classification 2D RELION et présentant des extrémités alignées selon deux hauteurs différentes (gauche/droite).</figcaption></figure>

Pour remédier à cette observation, une étape supplémentaire d'ajustement de la position des extrémités sur l'axe du filament a été entreprise (Fig. 55). Pour ce faire une classification 2D des particules pré-alignées sous SPIDER a été réalisée en générant un nombre de classes conséquent, cela dans le but d'échantilloner au mieux les données tout en conservant un rapport signal sur bruit suffisant à travers le moyennage de quelques particules par classe (Fig. 55, gauche). Chaque classe moyenne est ensuite masquée pour ne conserver que le signal associé à la bande de l'image contenant le filament d'actine (Fig. 55, a.). Une projection en 1D des images 2D est réalisée selon un axe perdendiculaire à celui des filaments d'actine (Fig. 55, b.). Dans cette étape, les images de filaments d'actine sont préalablement débruitées à traver un filtre *Mean-Shift* opéré sous ImageJ. Ce filtre permet de lisser les fluctuations d'intensité soit le
long du filament, soit en aval du filament, tout en préservant le saut d'intensité associé à l'extrémité du filament (Fig. 55, c.).

En outre, les pixels de l'image dont l'intensité est négative sont systématiquement rehaussés à zéro. Cette précaution permet de limiter l'effet de l'enveloppe de colorant accumulé autour du filament d'actine. En effet, cette accumulation de colorant a pour conséquence de déplacer les valeurs d'intensité associées vers des valeurs négatives marquées. De telles valeurs d'intensité auraient pour effet lors de la projection 1D d'atténuer la contribution du signal des protéines associées quant à elles à des valeurs d'intensité positives.

Suite à ces opérations, la projection 1D est seuillée (Fig. 55, d.) et le bord délimitant l'extrémité du filament est déterminé à travers un calcul de dérivée (Fig. 55, e.). La position du maximum associé à ce gradient d'intensité est alors déterminée (Fig. 55, f.).

Une telle approche de détermination de la position de l'extrémité des filaments d'actine est réalisée pour chacune des classes moyennes précédemment générées. Les positions de chaque ensemble de particules associées à chacune de ces classes moyennes sont alors réajustées pour faire correspondre l'ensemble des positions d'extrémité déterminées.

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>**Figure 55** – **Gauche** : Exemple de classes visant à échantillonner les différentes positions des extrémités de filament d'actine existantes dans le jeu de donnée. **Droite** : Principe de détermination 1D de la position de l'extrémité du filament d'une classe moyenne. a. Masque du filament. b. Graphe de l'intensité le long de l'axe du filament après projection 1D. c. Graphe de l'intensité le long de l'axe du filament après projection 1D et débruitage par un filtre Mean-Shift. d. Image 2D représentative du seuillage de la projection 1D. e. Image du gradient d'intensité après seuillage. f. Détermination de la position du maximum associé au gradient de l'image seuillée.</figcaption></figure>

Après cette étape supplémentaire d'alignement des extrémités extraites on retrouve par classification 2D sous RELION des classes plus justement alignées selon l'axe du filament (Fig. 56).
<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>**Figure 56** – Groupe de classes issues d'une unique classification 2D RELION de particules dont la position de l'extrémité a été ajustée selon une approche 1D.</figcaption></figure>

Néanmoins, malgré cette étape d'alignement supplémentaire, l'aspect des reconstructions 3D réalisées à partir de particules ré-alignées selon une approche 1D restent bruitées.

Afin d'harmoniser la taille des extrémités de filaments observés dans le jeu de données, un recadrage de la bordure des boîtes utilisées a été réalisé selon le schéma présenté en **Figure 57**.

L'aspect bruité des reconstructions 3D réalisées à partir de telles particules recadrées avec une boite de dimension finale $86x86$ pixel² se retrouve largement amplifié. Cette observation suggère un effet drastique des dimensions de boite utilisées sur les opérations de reconstruction 3D.

Un nouveau jeu de données (6653 particules) a été ré-extrait des micrograhies avec une taille de boite de $180x180$ pixel². Un traitement similaire a été réalisé sur ces particules nouvellement extraites (alignement 2D SPIDER, alignement 1D, recadrage) pour arriver à une dimension finale de boite de $160x160$ pixel².

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>**Figure 57** – Schéma de principe du recadrage des particules extraites. a. Détermination 1D de la position de l'extrémité. b. Alignement des extrémités. c. Nouvelle délimitation de la boîte utilisée.</figcaption></figure>
Des reconstuctions 3D réalisées à partir de ce nouveau jeu de données ont permis d'obtenir une reconstruction fidèle d'une extrémité de filament d'actine nu à 28 Å de résolution. La structure obtenue permet d'ajuster fidèlement le modèle atomique d'une extrémité d'actine avec un meil-leur ajustement pour une extrémité barbée.

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>**Figure 58** - Structure 3D à 28 Å de résolution (gris) d'une extrémité d'actine générée par RELION et dans laquelle la structure atomique d'un filament barbé d'actine (PDB : 5OOE) a été ajustée (rose, or).</figcaption></figure>

Bien que l'on puisse générer à partir de ce nouveau jeu de données la structure d'une extrémité d'actine nue, aucune structure cohérente avec une extrémité d'actine coiffée d'une formine n'a pu être générée en considérant les classes moyennes associées à une densité globulaire marquée. En outre, les classes moyennes 2D associées à cette densité globulaire sont difficilement inter-prétables en tant que projections d'une extrémité barbée coiffée d'un dimère de FH2.

Une hypothèse a alors été soulevée : la Gc-globuline utilisée dans ces expériences pourrait perturber l'interaction des extrémitées barbées avec les formines qui ne sont introduites dans le mélange actine - Gc-globuline, que dans un second temps et pendant une durée limitée.

Une telle perturbation de l'interaction bout barbé – formine pourrait être la conséquence d'une interaction des Gc-globulines soit avec les formines, soit avec les bouts barbés. Dans le premier cas, aucune étude n'a été menée sur le sujet. Dans le second cas, il est mentionné dans la littérature que la Gc-globuline interagit exclusivement avec l'actine-G en solution¹¹³. Néanmoins, le mode d'interaction des Gc-globulines avec les monomères d'actine sur le sillon 1/3 de ces
derniers (Fig. 8.C) laisse, a priori, envisageable une interaction de la Gc-globuline avec la pre-
mière sous-unité d'actine d'un modèle d'extrémité barbée, sans contrainte stérique apparente
exercée par le reste des sous-unités d'actine du filament (Fig. 59). Des expériences visant à
étudier cette interaction avaient pu être réalisées en 2002¹¹³. Ces expériences reposent sur la
séparation en solution de l'actine-G et de l'actine-F par une ultra-centrifugation opérée à 10 000
g. On peut alors se demander si les filaments de plus petites tailles sont efficacement culottés
dans ces expériences, en effet, une accélération d'un ordre de grandeur supérieur est générale-
ment préconisée.

En outre, les classes moyennes présentant une densité globulaire marquée observées ici (Fig. 52, encadrés rouges) peuvent être mises en correspondance avec des projections d'un modèle structurale d'extrémité barbée coiffée d'une Gc-globuline (Fig. 59.B). Cependant, l'existence de ce complexe Gc-globuline – bout barbé n'a pas pu être confirmé par la génération d'une structure 3D correspondante.

<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>**Figure 59** – A. Modèle atomique d’une extrémité barbée (PDB : 5OOE, rose/or) coiffée d’une Gc-globuline (PDB : 1MA9, bleu). B. Comparaison entre deux projections du modèle atomique bout barbé – Gc-globuline préalablement traité à l’aide d’un filtre Gaussien (Gauche) et deux classes moyennes obtenues à partir du mélange actine – Gc-globuline – formine (droite).</figcaption></figure>

Au regard de ces résultats, des expériences de sonication de filaments d'actine, en s'affranchis-
sant de toute protéine de liaison avec l'actine, exceptée la formine, ont été réalisées. Une telle
configuration permet de lever toute ambiguïté sur la nature des potentiels complexes observés
aux extrémités des filaments d'actine.
### 3.3. Analyse en Particule Isolée : Sonication, Actine • Formine.

Finalement, les derniers jeux de données obtenus par une approche en coloration néga-
tive et ayant pu être traités par une Analyse en Particule Isolée correspondent aux extrémités de
filaments d'actine issus d'expériences de sonication de 1 µM d'actine-F seule avec un soni-
cateur Vibracell, mise en contact succintement avec de la formine avant dépôt sur grille de
microscopie électronique. Ces conditions ont permis d'obtenir les résutats les plus concluants
concernant l'étude de l'association des formines aux extrémitées barbées des filaments d'actine.

Pour l'ensemble des concentrations de formine utilisées (100/200 nM) ou des temps de contact entre actine-F soniquée et formine avant dépôt sur grille de microscopie électronique (20/60 secondes), une densité d'environ 12 extrémités de filament d'actine par image est observée.
Pour chacune de ces conditions, des structures particulières à l'extrémité de certains filaments d'actine sont observables dès l'acquisition des images brutes de microscopie électronique (Fig. 60).

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

Figure 60 – Image d'un filament d'actine présentant à son extrémité une structure asymétrique caractéristique de l'échantillon actine-formine observé (MET | 80 kV).

Lors de l'alignement des extrémités de filament extraites, une attention particulière a été portée
sur ces structures.

**A. Optimisation 2D de l'alignement des extrémités.**

La première étape de l'analyse de ces jeux de données a été d'améliorer le protocole
d'alignement et de classification 2D utilisé avec SPIDER pour l'analyse des extrémités de fil-
ment d'actine. En effet, SPIDER offre une très grande flexibilité quant aux diverses fonctions
paramétriques utilisées pour réaliser une analyse 2D. Cette flexibilité rend l'analyse 2D sous
SPIDER plus délicate mais en contrepartie permet d'adapter l'approche choisie, au jeu de don-
nées traité.
Les différentes étapes utilisées dans ce protocole d'analyse 2D sous SPIDER sont résumés dans
le schéma **Figure 61** et détaillées ci-dessous.

Dans la première étape, les filaments sont normalisés à travers un masque circulaire classique.
Cette étape consiste à ajuster pour chaque particule la distribution des intensités de tous les
pixels situés en dehors d'un disque centré (Fig. 61.1), avec la distribution des intensités d'une
image référence ne représentant que du bruit (sans aucune protéine). Cette étape permet d'har-
moniser l'intensité de toutes les particules du jeu de données.

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>Figure 61 – Schéma représentant les étapes de l'anayse 2D adaptée à des extrémités de filament (analyse réalisée sous SPIDER).</figcaption></figure>

Cependant, un tel traitement est correctement réalisé lorsque seul du bruit est présent en dehors
du disque centré, comme c'est le cas pour des particules globulaires. Ici, les extrémités extraites
interceptent le bord de la boite ce qui implique que les pixels constituant l'extérieur du disque
centré contiennent également du signal associé aux protéines. Une nouvelle étape de normali-
sation est donc réalisée après avoir aligné rotationnellement l'ensemble des extrémités selon un
axe donné, et en utilisant cette fois-ci un masque rectangulaire qui éclipse totalement le signal
du filament (Fig. 61.2).

Dans un troisième temps, une analyse en composantes principales est réalisée sur les extrémités
alignées rotationnellement (Fig. 61.3). Cette étape a pour but de générer des moyennes réfé-
rences représentatives de l'allure globale des extrémités extraites. Les moyennes références gé-
nérées sont alignées entre elles et utilisées pour un alignement multiréférences (Fig. 61.4).
L'objectif principal de cet alignment est d'ajuster au mieux l'orientation de chacune des particules. Dans cette opération, un filtre passe-bas est appliqué sur les particules et les moyennes références afin de faire ressortir l'orientation globale de chaque particule.

Une nouvelle analyse en composantes principales est alors réalisée à travers un masque focalisé sur le bout des filaments extraits (Fig. 61.5). Cette étape a pour but de générer des moyennes références représentatives de la variabilité structurale ainsi que des diverses positions de ces bouts. À nouveau, les moyennes références générées sont alignées entre elles et utilisées pour un alignement multiréférences (Fig. 61.6). L'objectif de cet alignement est d'ajuster avec précision la position des extrémités.

En outre, les particules « miroirs » du jeu de données sont également considérées. Ces particules « miroirs » correspondent aux particules générées après l'application d'une symmétrie 2 selon l'axe des filaments. Étant donné que l'image d'un objet 3D en microscopie électronique correspond à la projection de ses densités en 2D, l'information structurale contenue dans l'image d'un objet ou dans son image « miroir » est identique. En effet, cela revient à observer l'objet adsorbé par une face ou par sa face opposée. Pour chaque particule alignée, le score d'alignement obtenu est comparé au score d'alignement obtenu en considérant sa particule « miroir ». La particule présentant le score le plus élevé est conservée pour le reste de l'analyse. Cette étape permet dans le cas de particules asymétriques comme observées en **Figure 60**, d'aligner l'ensemble des motifs asymétriques dans un sens donné pour augmenter le rapport signal sur bruit obtenu après moyennage et permettre également l'utilisation d'un masque asymétrique plus adapté (Fig. 62).

<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>Figure 62 – Moyennage de particules asymétriques sans considérer l'alignement des particules « miroirs » (gauche) ou en considérant l'alignement des particules « miroirs » (droite).</figcaption></figure>

## B. Affinement itératif de l'analyse 2D.

Les premiers résultats des analyses 2D obtenus à partir de la sonication (sonicateur Vibracell) d'actine-F mise en contact avec de la formine sont présentés en **Figure 63.A-C**.

Dans l'ensemble de ces classifications 2D on retrouve des classes moyennes représentatives d'extrémités de filaments d'actine nues (Fig. 63.A-C, classes moyennes non encadrées) au côté
de classes moyennes atypiques, analogues à la densité caractéristique observée en **Figure 60** (**Fig. 63.A-C**, encadrés rouges) ainsi que des classes moyennes moins contrastées, génériques de ces premières classes moyennes atypiques (**Fig. 63.A-C**, encadrés bleus). Ces classes moyennes atypiques ne sont pas observables à l'issue d'une sonication d'actine-F réalisée sans ajout de formine (**Fig. 60.D**, 1033 particules) et semblent ainsi caractéristiques des formines. Les particules associées aux premières classes moyennes atypiques (**Fig. 63**, encadrés rouges) représentent environ 20 % de la totalité des extrémités considérées dans les expériences réalisées après sonication d'actine-F mise en contact 20 secondes avec 100 nM (**Fig. 63.A**, 2249 particules) ou 200 nM de formine (**Fig. 63.B**, 1327 particules). Ce pourcentage descend à 11 % dans le cas d'une expérience de sonication d'actine-F mise en contact 1 minute avec 100 nM de formine (**Fig. 63.C**, 1329 particules). Néanmoins, l'interprétation de cette baisse de ratio reste délicate étant donné que l'aliquote de formine utilisée ici provient du même lot d'aliquotes utilisé pour les deux autres conditions mais a enduré une nuit d'attente sur glace après sa décongélation. On ne peut donc pas exclure ici une dégradation partielle des formines utilisées pour cette expérience.

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>**Figure 63** – Résultat d'une classification 2D SPIDER, de particules issues d'expériences de sonication d'actine-F (1 µM) mis en contact 20 s (A,B) ou 60 s (C) avec 100 nM (A,C), 200 nM (B) ou 0 nM (D) de formine avant d'être traitées en coloration négative. Encadrés rouges : première série de classes moyennes présentant une densité atypique. Encadrés bleus : seconde série de classes moyennes présentant une densité atypique générique de la première. (Dimensions des boîtes : 38 nm²).</figcaption></figure>

En ce qui concerne les secondes classes moyennes atypiques (**Fig. 63**, encadrés bleus), elles représentent 3 à 7 % de la totalité des particules observées.
Suite à ces observations et afin de travailler à partir d'un jeu de données plus conséquent pour maximiser le rapport signal sur bruit à l'issu des moyennages, l'ensemble des données issues des expériences de sonication d'actine-F mise en contact 20/60 secondes avec 100/200 nM de formine a été regroupé.

En outre, de nouvelles images ont été acquises sur une grille de microscopie électronique issue d'une expérience de sonication (Vibracell) d'actine-F mise en contact 20 secondes avec 100 nM. Cette condition a été choisie pour l'acquisition de nouvelles images étant donné qu'aucune amélioration du ratio des particules attribuables à des complexes bout barbé – formine n'a pu être observée avec les autres conditions.

La classification 2D SPIDER résultante de ce jeu de données agrandi (20 922 particules) est présentée en **Figure 64**. Les particules associées à des classes moyennes d'extrémités de filament d'actine atypiques (**Fig. 64**, encadrés vert) ont été sélectionnées pour réaliser une nouvelle série d'alignement et de classification 2D sous SPIDER à partir d'un jeu de donnée plus homogène.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>**Figure 64** - Résultat d'une classification 2D SPIDER de particules issue d'un mélange d'expériences de sonication d'actine-F (1 µM) mis en contact 20/60 s avec 100/200 nM de formine avant d'être traitées en coloration négative. Encadrés verts : série de classes moyennes présentant une densité atypique caractéristiquées formines. (Dimensions des boîtes : 38 nm²).</figcaption></figure>

À cette occasion, un *script* a pu être généré dans le but de de ré-extraire les particules alignées en transposant aux coordonnées de chacune des boites d'extraction initiales, les paramètres de
translation déterminés lors de l’alignement (Fig. 65). Cette opération permet d’harmoniser la taille des extrémités utilisées lors de reconstructions 3D réalisées ultérieurement.

<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>**Figure 65** – Schéma de principe de la ré-extraction d’une extrémité d’actine après alignement. A. Position initiale de la boite d'extraction. B. Extrémité extraite et alignée. C. Ajustement de la postion de la boite d'extraction en prenant en compte les paramètres d'alignement précédemment. D. Extrémité ré-extraite et ré-alignée.</figcaption></figure>

## 4. Structures 3D du complexe formine – bout barbé obtenues en coloration négative : modèle de « la marche enjambée ».

Les expériences de sonication d'actine-F mise en contact avec de la formine ont finalement permis, après analyse 2D (III.3.4.B), de constituer deux jeux de particules distincts, avec une configuration majoritaire regroupant 3804 particules (Fig. 66.A) et une configuration minoritaire regroupant 800 particules (Fig. 66.C).

<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>**Figure 66** – A. Moyenne totale des particules (3804) associées à la configuration majoritaire des extrémités barbées coiffées de formine. B. Correspondance 2D de la configuration majoritaire avec un modèle atomique de l'état « ouvert » décrit par le modèle de la « marche enjambée ». C. Moyenne totale des particules (800) associées à la configuration minoritaire des extrémités barbées coiffées de formine. D. Correspondance 2D de la configuration minoritaire avec un modèle atomique de l'état « fermé » décrit par le modèle de la « marche enjambée ».</figcaption></figure>
La classe moyenne majoritaire (Fig. 66.A) peut être mise en correspondance avec une projection d'un modèle atomique d'une extrémité barbée coiffée d'une formine dans l'état « ouvert » décrit par le modèle de la « marche enjambée » (Fig. 66.B). La classe moyenne minoritaire (Fig. 66.C) peut, quant à elle, être mise en correspondance avec une projection du modèle atomique d'une extrémité barbée coiffée d'une formine dans l'état « fermé » décrit par le modèle de la « marche enjambée » (Fig. 66.D).

Cette correspondance entre les données expérimentales et les deux états du modèle de la « marche enjambée » est plus largement validée par la reconstruction de deux structures 3D. Ces structures 3D ont été obtenues en partant des deux jeux de données évoqués ci-dessus et affinés après une série de classification 3D/sélection de particules sous RELION.

D'une part, un modèle atomique de l'état « ouvert » décrit par le modèle de la « marche enjambée » a pu être ajusté dans la structure 3D regroupant le plus grand nombre de particules sélectionnées (Fig. 67, 2048 particules, 24 Å de résolution). D'autre part, un modèle atomique de l'état « fermé » décrit par le modèle de la « marche enjambée » a pu être ajusté dans la structure 3D regroupant un nombre restreint de particules sélectionnées (Fig. 68, 402 particules, 35 Å de résolution).

Les ajustements des modèles atomiques effectués ici ont été réalisés en deux temps à l'aide de la fonction « Fit in Map » de Chimera. Dans un premier temps, des modèles atomiques rigides d'une extrémité barbée coiffée d'une formine dans son état « ouvert » ou « fermé » (modèle de la « marche enjambée ») ont été ajustés dans les deux structures de microscopie électronique présentées ici. Ces deux modèles atomiques ont été obtenus à partir d'un dimère de formine lié à deux monomères d'actine (état « ouvert ») ou trois monomères d'actine (état « fermé ») selon l'agencement observé dans la structure 1Y64. Dans ce modèle atomique, le pseudo-filament d'actine présentant un pas angulaire de 180° est étendu du coté pointu par l'addition de deux sous-unités d'actine orientées selon la symétrie classique du filament d'actine observée dans la structure 5OOE. Une fois ce premier ajustement global réalisé, un ajustement local est effectué en permettant l'ajustement indépendant des deux domaines FH2 ainsi que des sous-unités d'actine. Les sous-domaines « linker » reliant les deux domaines FH2 ont été supprimés dans cette opération afin de permettre leur ajustement indépendemment l'un de l'autre. D'autre part les contacts « actine – $FH2_{knob}$» initiaux, de même que l'orientation relative des deux sous-unités d'actine ajoutées à l'extrémité pointue sont maintenus au cours de cet ajustement.

Les deux reconstructions 3D ainsi obtenues (Fig. 67-68) valident largement la description structurale des états « ouvert » et « fermé » proposée dans le modèle de la « marche enjambée » et
écartent le modèle du « saut enclenché » avec une structure 3D principale (Fig. 67) qui n’est
pas décrite dans le cadre de ce dernier modèle.

En outre, les proportions de complexes formine - bout barbé identifiés dans l'état « ouvert » ou
dans l'état « fermé » (modèle de la « marche enjambée »), après sélection 2D (respectivement
83% et 17%) ou sélection 3D (respectivement 84% et 16%) sont cohérents avec le facteur d'ou-
verture d'environ 0.9¹⁹⁹ proposé initialement pour la formine mDia1.
<figure><img src="image_82.png" /></figure>

**Figure 67** - Structure 3D à 24 Å de résolution de la configuration majoritaire des extrémités barbées coiffées de formines (gris) dans laquelle un modèle atomique de l'état « ouvert » décrit par le modèle de la « marche enjambée » est ajusté (structures 1Y64 et 5OOE juxtaposées). Vert/bleu : domaines FH2. Orange/rose : sous-unités d'acétine.
<figure><img src="image_83.png" /></figure>

**Figure 68** - Structure 3D à 35 Å de résolution de la configuration minoritaire des extrémités barbées coiffées de formines (gris) dans laquelle un modèle atomique de l'état « fermé » décrit par le modèle de la « marche enjambée » est ajusté (structures 1Y64 et 5OOE juxtaposées). Vert/bleu : domaines FH2. Orange/rose : sous-unités d'actine. Lignes discontinues noires : liaisons schématisées reliant les sous-domaines « lasso » et « post » d'un même domaine FH2.
Bien que les structures 3D obtenues ici confortent le modèle de la « marche enjambée », il est à noter que les basses résolutions qui leurs sont associées laissent une ambiguïté quant à l'hélocité adoptée par les filaments d'actine coiffés de formines et ne permettent donc pas d'exclure une variation du pas angulaire entre 167° et 180° comme proposé dans le modèle du « saut enclenché ».

Les résolutions limitées observées dans ces deux structures générées s'expliquent par le nombre restreint de particules utilisées dans les reconstructions 3D ainsi que par une distribution angulaire inhomogène des particules identifiées (Fig. 69.A-B). L'occurrence d'orientations privilégiées est cohérente avec les analyses 2D réalisées précédemment (Fig. 66) qui mettent en avant des projections particulières.

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>**Figure 69** – Représentation 3D RELION de la distribution des angles de projections assignés aux particules lors de la reconstruction 3D de la configuration majoritaire (A) ou minoritaire (B) des extrémitées barbées coiffées de formines. Les structures 3D sont observées selon l'axe du filament d'actine. La position de chaque cylindre correspond à un axe de projection ayant été associé à des particules. Les hauteur des cylindres sont proportionnelles aux nombres de particules assignées. De même, des cylindres associés à des couleurs chaudes indiquent un plus grand nombre de particules assignées.</figcaption></figure>

Il est peu probable que l'extrémité coiffée des filaments d'actine adsorbés sur grille influe significativement sur l'orientation de l'ensemble du filament. Ainsi, il est plus vraisemblable ici que l'observation d'orientations privilégiées soit une conséquence de l'analyse computationnelle. En effet, la forme allongée des domaines FH2 structurés ainsi que leur poids moléculaire (40 - 45 kDa) proche de celui de l'actine (42 kDa) rendent l'identification des complexes actine-formine plus ou moins favorable selon leur orientation. Une telle explication permet de réinterpréter le faible taux de particules associées à des extrémités barbées coiffées de formines
(III.3.4.B, ~20%) parmi l'ensemble des extrémités considérées. Ce faible taux ne représenterait qu'une partie des complexes formines – bout barbés existants.

Pour aller plus loin, une analyse 2D focalisée sur les complexes formine - actine identifiés dans leur état « ouvert » a été réalisée afin d'en évaluer l'hétérogénéité structurale.

# 5. Variation conformationnelle de l'état « ouvert ».

## 5.1. « Battement » 2D du premier domaine FH2.

Dès la première classification 2D réalisée à partir de 20 922 extrémités, on observe au sein des classes moyennes associées à l'état « ouvert » d'un complexe actine – formine une certaine variation de l'orientation du premier domaine FH2 relativement à l'axe du filament d'actine (Fig. 64, dernière ligne).

Un masque focalisé sur ce domaine FH2 (Fig. 70.A, bas), independant du masque utilisé lors de l'alignement (Fig. 70.A, milieu), a alors été employé pour réaliser une classification 2D des particules associées aux complexes actine – formine dans l'état « ouvert » (Fig. 70.A, haut, 3804 particules). Quatre classes moyennes ont pu être générées à partir de cette classification 2D SPIDER (Fig. 70.B).

Les trois premières classes moyennes présentent des orientations différentes de leur premier domaine FH2 qui, mis bout à bout, dessinent un « battement » à deux dimensions (Fig. 70.B, colonne de gauche). Ces trois premières classes moyennes constituent respectivement 25% (956 particules), 29% (1092 particules) et 17% (651 particules) des particules observées. La quatrième classe moyenne (29% des particules observées, 1104 particules) présente une configuration similaire à la classe moyenne n°2 mais avec un premier domaine FH2 moins bien délimité par l'enveloppe noire de colorant (Fig. 70.B, dernière ligne). Cette observation peut suggérer une plus grande disparité conformationnelle et/ou d'orientation parmi les particules associées à cette dernière classe moyenne. Cette classe moyenne a donc été écartée du reste de l'analyse afin de conserver un rapport signal sur bruit suffisant.
Bien que les domaines FH2 présentent des orientations manifestement différentes parmi les trois premières classes moyennes observées, les corps des filaments d'actine correspondant res-

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

**Figure 70** – A. *Haut* - moyenne totale des particules associées à l'état « ouvert » d'un complexe bout barbé – formine. *Milieu* - moyenne totale superposée au masque utilisé lors de l'alignement des particules. *Bas* – moyenne totale superposée au masque utilisé lors de la classification. *B. Gauche* – classes moyennes superposées au masque utilisé lors de la classification. *Droite* – Classes moyennes observées dans leur totalité. *C* – Image de la variance associée aux trois premières classes moyennes non masquées. (Dimensions des boîtes : 38 nm²).

tent quant à eux globalement alignés (Fig. 70.B, colonne de droite). La variance associée à ces trois classes moyennes pointe en effet une variation d'intensité concentrée au niveau du premier domaine FH2 (Fig. 70.C).

Cette dernière observation suggère que la variation de l'orientation en deux dimensions des premiers domaines FH2 observée parmi les trois premières classes moyennes repose principalement sur une variation conformationnelle limitée strictement au complexe formine - actine (deux premières sous-unités d'actine) et non pas à une variation de l'orientation globale des filaments extraits.
Pour appuyer cette observation, aucune corrélation évidente n'a pu être observée entre l'appar-
tenance d'une particule à l'une de ces classes (Fig. 70.B) et une gamme spécifique des angles
de projections qui lui sont assignés au cours de la reconstruction 3D présentée en **Figure 67**.

La structure à basse résolution obtenue à partir de cette reconstruction 3D (Fig. 67) ne permet
apparemment pas de révéler la légère variation d'orientation du premier domaine FH2 observée
à deux dimensions.

En outre, des reconstructions 3D réalisées à partir de sous-groupes de particules, chacun associé
aux différentes classes moyennes observées (Fig. 70.B) n'ont pas permis d'obtenir des struc-
tures 3D cohérentes de complexe formine – actine présentant chacune des orientations diffé-
rentes de leur premier domaine FH2. Les sous-groupes de particules obtenus en divisant le jeu
de données initial selon les classes moyennes observées ne sont vraisemblablement pas suffi-
samment grands pour générer des structures cohérentes (rapport signal sur bruit trop faible).

Afin d'estimer l'amplitude de la variation de l'orientation du premier domaine FH2, des me-
sures d'angle à deux dimensions ont été réalisées sous ImageJ à partir des trois premières
classes moyennes. Pour ce faire, les images des complexes FH2 – actine masqués (Fig. 71.A,
première ligne) ont été binarisées (Fig. 71.A, deuxième ligne). Des délimitations 1D de ces
complexes ont ensuites été générées à partir des images binaires (Fig. 71.A, troisième et qua-
trième lignes).

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

**Figure 71** – A. Différentes étapes réalisées lors de la mesure de l'angle formé par l'axe du filament d'actine et le premier domaine FH2 pour les trois configurations observées. **Ligne 1** – classes moyennes masquées. **Ligne 2** – images binari-sées. **Ligne 3** – Délimitation de la bordure. **Ligne 4** – Réduction 1D des bordures. **Ligne 5** – Valeurs d'angle obtenues. **B. Principe de la mesure d'un angle à partir de la bordure 1D générée.**
Pour finir, des mesures d'angle ont été réalisées selon le schéma présenté **Figure 71.B**. On trouve ainsi un angle entre l'axe du filament d'actine (horizontal) et l'orientation du domaine FH2 associé à la classe moyenne n°1 d'environ 108°, d'environ 121° pour la classe moyenne n°2 et d'environ 135° pour la classe moyenne n°3.

Ces mesures ne sont pas absolues dans le sens ou elles dépendent fortement du contraste des images, de la finesse du contour des protéines après moyennage et de la forme du domaine FH2 sur laquelle repose l'attribution de son orientation. De telles mesures permettent néanmoins d'obtenir un ordre de grandeur associé à l'amplitude de la variation des orientations observée en deux dimensions. Ces mesures ont ainsi pu être utilisées afin de concevoir un modèle structural 3D.

## 5.2. « Battement » du domaine FH2 : élaboration d'un modèle structural 3D.

### A. Modèles structuraux envisageables.

Deux modèles structuraux ont pu être proposés pour expliquer ces variations d'orientation observées en deux dimensions.

Dans un premier temps, on peut supposer que le premier domaine FH2 oscille autour de son axe principal indépendemment du reste de la structure (Fig. 72.A). Lorsque l'on associe l'amplitude des variations d'orientation mesurées en section III.5.1 à un tel mouvement, aucune contrainte stérique n'apparait dans le modèle atomique correspondant (Fig. 72.A). En outre, la flexibilité de la région « linker » autorise un tel mouvement au sein du dimère de formine. Néanmoins, ce mouvement suppose que l'interaction existante entre la région « knob » du domaine FH2 mobile et la sous-unité d'actine à laquelle ce dernier est rattaché soit suffisamment préservée lors de la rotation du domaine FH2 de sorte à le maintenir lié à l'extrémité barbée, et cela malgré un alignement des acides aminés en interaction qui varie. Cette dernière supposition reste incertaine.

Dans un second temps, il a pu être proposé que la variation des orientations observée en deux dimensions soit associée à un réarrangement dynamique de l'orientation de la première sous-unité du filament d'actine vis-à-vis de la sous-unité d'actine suivante. Cette première sous-unité d'actine emporterait dans son mouvement le domaine FH2 qui lui est rattaché par sa région « knob » de sorte à laisser intacte cette liaison. Ce réarrangement pourrait impliquer le passage
d'une orientation assimilable à celle observée dans la structure cristalline de Takanori Otomo (PDB : 1Y64) à une orientation assimilable à celle observée dans un filament d'actine classique (PDB : 5OOE). En effet, la transition entre ces deux arrangements implique non seulement une diminution du pas angulaire qui passe de 180° à 167°, mais également un pivotement de la sous-unité d'actine par rapport à l'axe principal du filament d'actine, cette dernière exposant ainsi plus largement son sous-domaine 2 au solvant (Fig. 19.B). Un tel réarrangement suffirait donc à expliquer la variation de l'orientation du premier domaine FH2 observée en deux dimensions (Fig. 72.B-C). Ce second modèle structural apparaît plus robuste que le premier dans le sens ou il s'appuie sur des modes de liaison (FH2« knob »/actine ou actine/actine) déjà mis en évidence par le passé au sein de structures atomiques (1Y64, 5OOE).
A

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_89.png" /></figure>

**Figure 72** – A. Modèle atomique d'une extrémité barbée coiffée d'une formine dans son état « ouvert » et présentée selon l'agencement déterminé précédemment (milieu, Fig. 67) ou après rotation indépendante du domaine FH2 dans le sens trigonométrique (gauche) ou anti-trigonométrique (droite). B. Modèle atomique d'une extrémité barbée coiffée d'une formine dans son état « ouvert » et présentée selon l'agencement déterminé précédemment (gauche, Fig. 67) ou après réorientation de la première sous-unité d'actine (droite). Haut – vue latérale. Bas – vue du dessus. Vert/bleu : domaines FH2. Orange/rose : sous-unités d'actine.
## B. Modèle structural du « battement » et au-delà.

La configuration structurale de l'état « ouvert » évoquée précédemment, impliquant la
ré-orientation de la première sous-unité d'actine vers un arrangement proche de celui classique-
ment observé dans un filament d'actine (Fig. 72.B, droite) autorise l'incorporation, sans aucune
contrainte stérique apparente, d'un monomère d'actine supplémentaire, toujours orienté selon
l'arrangement classique du filament d'actine. La nouvelle configuration ainsi obtenue corres-
pond exactement à l'état « ouvert » décrit par le modèle du « saut enclenché » (Fig. 21.B). Si
l'on considère l'ajout d'un second monomère d'actine à cette nouvelle configuration, on re-
trouve cette fois l'état transitoire décrit par le modèle du « saut enclenché » (Fig. 21.A). Alors
que dans le modèle du « saut enclenché », la nature hautement transitoire de cette configuration
est indispensable pour pouvoir expliquer le maintien efficace des formines aux extrémités bar-
bées, cette caractéristique n'est pas nécessaire dans le cadre du modèle de la « marche enjam-
bée » qui s'appuie sur un mécanisme autre (« cliquet Brownien ») pour décrire la processivité
des formines à l'extrémité barbée des filaments d'actine. On peut ainsi envisager que si une
extrémité barbée coiffée d'une formine atteint cette configuration particulière (Fig. 73) l'élon-
gation du filament à l'extrémité barbée pourrait se poursuivre en laissant le dimère de formine
encercler non plus l'étrémité barbée du filament d'actine mais le corps de ce filament.
La recherche d'une telle configuration a pu être réalisée et est décrite dans la section suivante.

<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>**Figure 73** – Modèle atomique d’une extrémité barbée coiffée d’une formine et correspondant à l’état « transitoire » décrit dans le modèle du « saut enclenché ».</figcaption></figure>
# 6. Dimère de formine encerclant le corps d'un filament d'actine.

Le motif caractéristique d'une projection 2D d'un dimère de formine encerclant le corps d'un filament d'actine (Fig. 73) a été recherché à l'œil le long de filaments d'actine issus d'experiences de sonication d'actine-F et mise en contact 20 secondes avec 100 nM de formine. Un total de 2013 particules a pu être extrait à l'issue de cette recherche et soumis à une analyse 2D telle que présentée en section III.3.4.A, Figure 61. Les résultats de l'analyse 2D sont présentés dans la Figure 74 ci-dessous.

<figure><img src="image_91.png" /><figcaption>Figure 74 – A. Résultats d'une classification 2D RELION de particules pouvant correspondre a priori à un dimère de formine encerclant le corps d'un filament d'actine. Classe moyenne correspondant fidèlement (encadré rouge) ou grossièrement (encadré bleu) à la projection d'une formine encerclant un filament d'actine. B. Superposition de la première classe moyenne avec le modèle atomique correspondant. (Dimensions des boites : 36 nm²).</figcaption></figure>

On retrouve une classe moyenne correspondant parfaitement à la projection d'un dimère de formine encerclant le corps d'un filament d'actine (Fig. 74.A-B, encadrés rouges). Une seconde classe moyenne (Fig. 74.A, encadré bleu) présente également un couple d'intensités globulaires pouvant correspondre à des domaines FH2 observés par leur tranche. Cependant, dans cette seconde classe moyenne, le filament d'actine observé apparaît moins bien défini. L'utilisation des particules associées à cette seconde classe moyenne n'a pas permis d'obtenir des résultats convainquants lors d'analyses 3D. Les autres classes moyennes (Fig. 74.A, classes moyennes non encadrées) semblent pointer des interactions artéfactuelles de protéines avec le filament d'actine. Finalement, l'ensemble des particules associées à la première classe moyenne (717 particules) a été utilisé lors d'une reconstruction 3D RELION dont le résultat final est présenté en Figure 75.
<figure><img src="image_92.png" /></figure>

**Figure 75** - Structure 3D à 33 Å de résolution d'une formine encerclant un filament d'actine (gris) dans laquelle un modèle atomique correspondant a été ajusté (structures 1Y64 et 5OOE juxtaposées). Vert/bleu : domaines FH2. Orange/rose : sous-unités d'actine.
Une structure 3D à 33 Å de résolution a pu être obtenue. La structure obtenue ici souffre d'une distorsion suivant les axes principaux des domaines FH2 (Fig. 75). Cette distorsion est la conséquence d'un sous-échantillonage des angles de projection correspondant à des points de vue orthogonaux aux axes principaux des deux domaines FH2 (Fig. 76). La sur-représentation des images présentant les domaines FH2 selon leur axe principal s'explique par le fait que c'est à travers ce point de vue que le motif formé par un dimère de formine encerclant un filament d'actine est le plus facilement identifiable. Ainsi, lors de la sélection des particules à l'œil le long des filaments d'actine, seules des projections proches de ce point de vue ont pu être identifiées. Par la suite, des sélections automatisées réalisées sous RELION via une approche par comparaison de modèle 2D ont pu être testées sans succès.

<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>**Figure 76** - Représentation 3D RELION de la distribution des angles de projections assignés aux particules lors de la reconstruction 3D d'une formine encerclant un filament d'actine.</figcaption></figure>

Malgré tout, la structure 3D obtenue ici permet d'ajuster fidèlement le modèle atomique d'un dimère de formine encerclant le corps d'un filament d'actine (Fig.74) et valide de ce fait ce mode d'interaction inattendu de la formine mDia1.

Le déroulé mécanique par lequel un dimère de formine se retrouve en position d'encercler le corps d'un filament d'actine reste cependant à déterminer. Un premier scénario a pu être évoqué en section III.5.2.B. Dans ce scénario un dimère de formine initialement lié à une extrémité barbée se retrouve à encercler un filament d'actine suite à l'élongation de ce filament indépendemment de la procession des domaines FH2. On peut également imaginer ici que la dissociation partielle des dimères de FH2 pourrait permettre l'encerclement direct du corps des filaments d'actine sans passer par leur extrémité barbée.
L'ensemble des résultats obtenus ici l'ont été via une approche par coloration négative. Afin de confirmer ces observations et d'obtenir de meilleures résolutions, une étude par cryo-microscopie électronique a été entreprise en se focalisant sur la coiffe des extrémités barbées par des formines.

# 7. Étude par cryo-microscopie électronique de la coiffe des formines.

Comme évoqué dans les sections II.6.1-3, les deux grandes difficultés accompagnant le passage d'une approche par coloration négative à une approche par cryo-microscopie électronique sont la baisse du contraste des images de par l'absence d'agent contrastant ainsi que la diminution de la densité des protéines observées de par la nature différente de l'interaction des protéines avec les grilles utilisées. Pour ce dernier aspect, différentes grilles de cryo-microscopie électronique ont été testées afin de conserver une densité d'extrémités de filaments d'actine convenable pour une Analyse en Particule Isolée.

## 7.1. Mise au point des conditions de réalisation des grilles de cryo-microscopie électronique.

Les premières observations réalisées à l'aide de grilles Quantifoil classiquement utilisées en cryo-microscopie électronique montrent une très faible densité de filaments d'actine retenus sur grille. Les filaments d'actine observables sont localisés en périphérie des trous de la grille de microscopie (Fig. 77). Le reste des filaments d'actine est réparti sur la membrane amorphe de carbone.

Une telle répartition des filaments d'actine est courante en cryo-microscopie électronique. Dans ce contexte, il est en général d'usage de concentrer la quantité d'actine polymérisée à déposer sur grille afin de maximiser le nombre de filaments d'actine retenus dans les trous des grilles de cryo-microscopie électronique. Pour exemple, Steven Z. Chou et Thomas D. Pollard ont dû
déposer une solution de 9 µM d'actine polymérisée sur des grilles Quantifoil pour en étudier le corps des filaments d'actine²²⁹.

<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>Figure 77 - Cryo-micrographie issue d'une expérience de sonication d'actine mise en contact avec de la formine. Flèches rouges : filaments d'actine incorporés dans un trou de la grille. (Grille Quantifoil R2/1 | TEM 200 kV – LaB₆ | x50 000).</figcaption></figure>

Avec l'approche utilisée ici pour étudier l'extrémité des filaments d'actine et qui s'appuie sur la sonication de longs filaments d'actine en état stationnaire, une telle concentration d'actine n'est pas envisageable. En effet, une concentration d'actine trop élevée entrainerait dans ce cas, au-delà d'une repolymérisation rapide des filaments après sonication, l'agrégation de ces filaments au cours de leur sonication.

L'utilisation de grilles Lacey à la place des grilles Quantifoil avait alors pu être testée. Les grilles Lacey ont l'avantage de présenter des trous de tailles variables avec un ratio membrane/trou faible ce qui facilite généralement l'incorporation, dans ces trous, des protéines déposées sur grille.
Des densités locales plus importantes de filaments d'actine avaient pu être observées avec l'utilisation de grilles Lacey (Fig. 78.A). Cependant, ces zones peuplées de filaments d'actine sont peu représentatives de l'ensemble de la grille utilisée et la majorité des trous restent vides (Fig. 78.B). Une telle observation n'est pas compatible avec la nécessité d'acquérir un nombre conséquent d'images pour une Analyse en Particule Isolée.

<figure><img src="image_95.png" /><figcaption>Figure 78 - Cryo-micrographies réalisées à deux grossissements différents (A : x50 000, B : x3500) et obtenue à partir d'expériences de sonication d'actine mise en contact avec de la formine le tout déposé sur une grille Lacey. A. Flèches rouges : filaments d'actine observables. B. Flèches rouge : zone contenant des filaments d'actine. Flèche bleue : zone vide de protéine.</figcaption></figure>

Rapidement, l'utilisation de grilles recouvertes de feuilles d'oxide de graphène a été envisagée. Les premières observations ont mis en évidence l'intérêt de l'utilisation des feuilles d'oxide de graphène qui participent à maintenir une densité importante de filaments d'actine sur grille (Fig. 79).

On peut ainsi observer, à l'extrémité de certains filaments d'actine, des motifs caractéristiques d'extrémité barbées coiffées de formines (Fig. 79, encadrés et cercles rouges). La présence de feuilles d'oxide de graphène est confirmée par la densité plus importante de protéines observées ainsi que par la présence de lignes droites sans motif associé à l'hélice d'un filament d'actine (Fig. 79, flèches bleues) interprétées comme des plis ou des bordures de ces feuilles.

Aucune influence notable n'a pu être mise en évidence entre les deux variantes du protocol de préparation des grilles couvertes de feuilles d'oxide de graphène (Cf section II.6.3). Le contrôle de la concentration effective d'oxide de graphène en solution apparaît cependant utile avec des variations significatives ayant pu être mesurées après prélèvement du surnageant issu d'une centrifugation de la solution stock diluée. Ces variations de la concentration mesurées traduisent
vraisemblablement un état d'agrégation évolutif de la solution stock d'oxide de graphène uti-
lisée.

<figure><img src="image_96.png" /></figure>

**Figure 79** – **Haut** : Cryo-micrographie is-sue d'une expérience de sonication d'ac-tine mise en contact avec de la formine le tout déposé sur une grille Quantifoil R2/1 préalablement tapissée de feuilles d'oxide de graphène. Flèches bleues : bordures ou plis de feuilles d'oxide de graphène. Enca-drés rouges : filaments d'actine présen-tant des structures caractéristiques des formines à leurs extrémités. **Bas** : Images agrandies des deux filaments encadrés. Cercles rouges : structures caractéris-tiques de formines coiffant les extrémités de filaments d'actine. (TEM 200 kV – LaB<sub>6</sub> | x50 000).
Malgré ces premières observations encourageantes concernant l'utilisation de feuilles d'oxide de graphène, les grilles réalisées dans un premier temps apparaissaient globalement très hétérogènes (Fig. 80.A) avec des trous aléatoirement fournis en filaments d'actine. Les paramètres de réalisation des grilles ont pu être ajustés afin d'obtenir des grilles plus homogènes, condition nécessaire pour la réalisation d'acquisitions automatisées d'images. Dans ce but les paramètres associés à la décharge ionisante appliquée sur les grilles avant dépôt des échantillons ont été révisés passant d'une intensité de 1 mA à 2.5 mA pour retenir au mieux les échantillons déposés sur grille. De même, le temps de dépôt des échantillons sur grille a été modifié passant de quelques secondes à 30 secondes afin de laisser le temps nécessaire à l'échantillon de se répartir de manière homogène à la surface de la grille. Enfin le temps du contact entre le papier filtre et la grille juste avant de plonger l'échantillon dans l'éthane a été rallongé de 1 seconde à 3 secondes afin d'obtenir une répartition de la glace plus reproductible. Finalement, des grilles C-Flat R2/2 ont été utilisées. L'ensemble de ces modifications ont permis d'obtenir des grilles plus homogènes avec néanmoins une perte sur l'épaisseur de la glace dans les zones exploitables (Fig. 80.B-C).
<figure><img src="image_97.png" /></figure>

**Figure 80 – A-B.** Cryo-micrographies réalisées à deux grossissements différents (A, B : trous de 2 µm de diamètre) et obtenue à partir d'expériences de sonication d'actine mise en contact avec de la formine le tout déposé sur une grille Quantifoil R2/1 (A) ou une grille C-Flat R2/2 (B) toutes deux préalablement tapisée de feuillets d'oxide de graphène. C. Cryo-micrographie réalisée à partir de la grille observée en B (TEM 200 kV – LaB₆ | x50 000).

Des acquisitions automatisées d'images ont pu être réalisées à partir d'une grille réalisée selon les dernières conditions évoquées ci-dessus, sur un microscope Glacios 200 kV de FEI équipé d'une caméra à détection directe et situé à la plateforme de microscopie électronique de l'Institut Pasteur.
## 7.2. Analyse en Particule Isolée de données de cryo-microscopie électronique.

Un total de 4233 images a été collecté sur une grille de cryo-microscopie obtenue à partir d'une expérience de sonication d'actine mise en contact avec de la formine. Un sous-total de 3405 images a pu être conservé après avoir écarté les micrographes présentant une membrane partiellement cassée associée à une dérive importante de l'échantillon ou bien des zones présentant exclusivement des agrégats de feuillets d'oxide de graphène et/ou de protéines.

De ces images, une quantité limitée d'extrémités de filaments d'actine ont pu être identifiées disctinctement et extraites manuellement (12 112 particules). Le faible nombre d'extrémités de filaments d'actine extraits s'explique par une densité variable des filaments observés sur grille (Fig. 81.A-B) et par des extrémités pas toujours exploitables à causes notamment de la présence

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

Figure 81 – A, B, C. Cryo-micrographies obtenues à partir d'une expérience de sonication d'actine mise en contact avec de la formine le tout déposé sur une grille C-Flat R2/2. (TEM 200 kV – FEG | x60 000).
d'agrégats de protéines, de contaminations ou de feuillets de graphène mal dissociés (Fig. 81.C).

Un tel jeu de données reste très limité dans le cadre d'une analyse en cryo-microscopie ou le ratio signal sur bruit initialement faible nécessite le moyennage d'un nombre important de particules. Néanmoins, des classifications 2D ont tout de même pu être réalisées et ont mis en évidence des classes moyennes caractéristiques d'un dimère de formine coiffant l'extrémité d'un filament d'actine (Fig. 82, encadrés rouges).

<figure><img src="image_99.png" /><figcaption>**Figure 82** – Résultat d'une classification 2D RELION obtenue à partir d'une expérience de sonication d'actine mise en contcat avec de la formine et observée par cryo-microscopie électronique. (Dimensions des boites : 38,5 nm²).</figcaption></figure>

Ces classes moyennes représentent 13 % du jeu de données (1548 particules). Une structure 3D à basse résolution (30 Å) a alors pu être générée (Fig. 83) à travers une classification 3D intégrant l'ensemble des extrémités et utilisant deux modèles références initiaux : l'extrémité d'un filament d'actine nu ou bien coiffé d'une formine (état « ouvert ») tous deux filtrés à 40 Å de résolution.

Bien que cette structure 3D obtenue par cryo-microscopie électronique reste peu résolue et ainsi n'apporte pas plus d'informations structurales que celles déjà obtenues par une approche en coloration négative, cette structure confirme tout au moins l'origine non artéfactuelle des structures identifiées précédemment.

Afin d'obtenir une meilleure résolution, la collecte de données supplémentaire serait nécessaire. Néanmoins, les contraintes liées au système étudié limites fortement la quantité de particules facilement atteignable et compromet ainsi l'obtention d'une structure à haute résolution.
<figure><img src="image_100.png" /></figure>

**Figure 83** - Structure 3D RELION à 30 Å de résolution de l'état « ouvert » de l'extrémité barbée coiffée d'une formine (gris) obtenue par cryo-microscopie électronique et dans laquelle le modèle atomique correspondant est ajusté (structures 1Y64 et 5OOE juxtaposées). Vert/bleu : domaines FH2. Orange/rose : sous-unités d'actine.
En parallèle de cette étude structurale visant à élucider les modalités de l'association pérenne des formines aux extrémités barbées des filaments d'actine en elongation, une étude structurale de l'activité nucléatrice des formines exercée en synergie avec Arp2/3 et SPIN90 a également pu être réalisée et est présentée dans la section suivante.

## 8. Formation d'un complexe nucléateur Formine-Arp2/3-SPIN90.

En parallèle de mon projet de thèse, nos collaborateurs de l'équipe « Régulation de la dynamique d'assemblage de l'actine » à l'Institut Jacques Monod ont pu étudier la polymérisation formine-dépendante de filaments d'actine nucléés par des complexes Arp2/3 préalablement activés par SPIN90.

Au cours de ces expériences réalisées par microfluidique, ils ont pu observer que lorsque des protéines SPIN90 sont ancrées à la surface d'une chambre de microfluidique et que l'on expose cette chambre séquentiellement et de manière transitoire à une solution de Arp2/3 puis de formine mDial et enfin d'actine, une fraction non négligeable des filaments polymérisés à partir des complexes de la chambre de microfluidique polymérise à une vitesse accélérée caractérisque de l'activité des formines. Lorsque les formines sont introduites avant Arp2/3, la fraction caractéristique d'une elongation formine-dépendante n'est plus observée.

Ces observations suggèrent qu'un complexe a pu se former entre SPIN90-Arp2/3 d'une part et la formine mDial d'autre part lors de l'ajout séquentiel des protéines, retenant cette dernière au sein de la chambre de microfluidique.

Afin de mettre en évidence l'existence d'un tel complexe ternaire, j'ai réalisé une étude par microscopie électronique en coloration négative à l'Institut Curie. Cette étude a été intégrée dans un article collaboratif publié en 2020 dans Nature Cell Biology²⁴⁵.
## 8.1. Analyse en Particule Isolée : alignements et classifications 2D.

Les micrographies réalisées à partir de Arp2/3 ou SPIN90 montrent des protéines globalement homogènes sur grille de microscopie électronique (Fig. 84.A-B). Les micrographies issues d'un mélange de ces deux protéines sans ou avec la formine mDia1 sont présentées en **Figure 84.C** et **Figure 84.D** respectivement. On observe une plus grande hétérogénéité dans le mélange avec l'introduction de la formine mDia1 (Fig. 84.D).

<figure><img src="image_101.png" /><figcaption>Figure 84 - A. Micrographie de complexes Arp2/3 observés en coloration négatve. B. Micrographie de SPIN90 observé en coloration négatve. C. Micrographie issue d'un mélange de Arp2/3 et SPIN90 observé en coloration négatve. D. Micrographie issue d'un mélange de Arp2/3, SPIN90 et mDia1 observé en coloration négatve. (Tampon-F, pH7.8 | 80 kV LaB6, x42 000).</figcaption></figure>

Pour chacune de ces expériences, les particules observées dont la taille correspondrait à celle d'un complexe potentiel, incluant Arp2/3, ont été sélectionnées. Arp2/3 présente la masse mo-léculaire la plus élevée parmi les protéines introduites sur grille et de ce fait les particules dont la taille est inférieure à celle de Arp2/3 ne peuvent correspondre à un complexe et sont pour cette raison directement écartées de l'analyse.

Les classifications 2D réalisées pour chacun de ces jeux de données (6 568 particules dans le cas de Arp2/3-SPIN90 et 9970 dans le cas de Arp2/3-SPIN90-mDia1) montrent des résultats à première vue très similaires et dominés par le signal du complexe Arp2/3 (Fig. 85).
<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>**Figure 85** - A. Classification 2D RELION obtenue à partir d'un mélange Arp2/3-SPIN90. B. Classification 2D RELION obtenue à partir d'un mélange Arp2/3-SPIN90-mDia1. C. Moyenne totale des particules alignées issues d'un mélange Arp2/3-SPIN90. D. Modèle atomique du complexe Arp2/3-SPIN90 (PDB : 6DEC). Bleu : Arp2, Rouge : Arp3, Vert : SPIN90.</figcaption></figure>

Un moyennage globale des particules associées au mélange Arp2/3 et SPIN90 montre une correspondance avec une orientation particulière de la structure atomique du complexe Arp2/3-SPIN90 (Fig. 85.C-D). Cette orientation qui apparaît ainsi majoritaire ne permet pas de distinguer aisément la densité associée à SPIN90 (Fig. 85.C, sous-unité verte), celle-ci se retrouvant projetée sur le reste du complexe.

La distinction des différents complexes potentiels (Arp2/3, Arp2/3-SPIN90, Arp2/3-SPIN90-mDia1) apparaît avec ces premiers résultats difficilement réalisable à travers une simple observation des classes moyennes 2D générées.

De ce fait, un tri des particules à travers une classification 3D a été envisagé.

## 8.2. Analyse en Particule Isolée : classifications et reconstructions 3D.

Pour chacun des jeux de données obtenus à partir des différents mélanges sus-cités, une première classification 3D RELION a été réalisée en permettant la génération de trois classes distinctes, cela afin de trier les particules. Dans chaque cas, une structure atomique filtrée spatialement à 40 Å de résolution a été utilisée comme modèle de référence. Seules les particules ayant permis la génération d'une structure cohérente avec le modèle de référence initial sont alors conservées.

La structure atomique du complexe Arp2/3-SPIN90 (PDB : 6DEC) a été utilisée pour l'analyse des données Arp2/3-SPIN90. Différents modèles générés à partir du complexe Arp2/3-SPIN90
(PDB : 6DEC) et des domaines FH2 provenant du complexe FH2-actine (PDB : 1Y64) ont été
utilisés pour l'analyse des données Arp2/3-SPIN90-mDia1. Dans ces modèles, une interaction
des domaines FH2 avec les sous-unités Arp2 et/ou Arp3 (structures homologues à l'actine) est
imposée en prenant pour référence l'interaction existant dans la structure 1Y64 entre ces même
domaines FH2 et les sous-unités d'actine.

Additionnellement, une analyse similaire a été réalisée à partir d'un jeu de données issu d'un
mélange entre Arp2/3 et mDia1 uniquement (7 572 particules). À cette occasion un modèle
généré à partir de la structure atomique de Arp2/3 (PDB : 4XF2) avec ou sans domaines FH2
ajoutés (PDB : 1Y64) a été utilisé.

À travers ces tris par classification 3D, un total de 4 690 particules a pu être sélectionné dans le
cadre du mélange Arp2/3-SPIN90 (70% des particules). Un total de 2006 particules a pu être
sélectionné dans le cadre du mélange Arp2/3-SPIN90-FH2 (20% des particules). En revanche,
dans le cadre du mélange Arp2/3-mDia1 aucune structure cohérente avec le modèle initial de
référence incluant des domaines FH2 n'a pu être obtenu. Cette observation suggère qu'aucun
complexe stable impliquant Arp2/3 et mDia1 n'a été généré. Lorsqu'un modèle atomique de
Arp2/3 sans domaine FH2 additionnel est utilisé comme référence pour ce dernier jeu de don-
nées, 5456 particules peuvent être sélectionnées (72 % des particules).

À la suite de ces sélections, les sous-jeux de particules obtenus sont soumis à des reconstruc-
tions 3D en utilisant des modèles de référence initiaux plus fortement filtrés (50 – 60 Å) afin
de limiter les biais introduits par ces derniers.

Des structures 3D à 27 Å de résolution ont pu être obtenues pour ces différents jeux de données
et sont présentées en **Figures 86, 87**.

Un modèle atomique du complexe Arp2/3-SPIN90 (PDB : 6DEC) peut être ajusté sans ambi-
guïté dans la structure issue du mélange Arp2/3-SPIN90 (**Fig. 86.B**) de même qu'un modèle
atomique de Arp2/3 (PDB : 4XF2) peu être ajusté dans la structure issue du mélange Arp2/3-
mDia1 (**Fig. 86.A**).
<figure><img src="image_103.png" /><figcaption>**Figure 86 - A.** Structures 3D RELION à 27 Å de résolution obtenues à partir des mélanges Arp2/3-mDia1 (A, rose) ou Arp2/3-SPIN90 (B, bleu) et dans lesquelles les modèles atomiques correspondant ont été ajustés (A : Arp2/3, PDB :4XF2 | B : Arp2/3-SPIN90, PDB : 6DEC). Bleu : Arp2, Rouge : Arp3, Vert : SPIN90.</figcaption></figure>

En ce qui concerne la structure issue du mélange Arp2/3-SPIN90-mDia1, lorsque le complexe atomique de Arp2/3-SPIN90 est ajusté dans la structure, une densité supplémentaire est observée à proximité des sous-unités Arp2 et Arp3 (Fig. 87). Cette densité n'étant pas observée dans les autres structures, elle est identifiée ici comme la contribution des domaines FH2 de mDia1. Dans la **Figure 87**, l'enveloppe électronique accueille un modèle généré à partir de la structure atomique du complexe Arp2/3-SPIN90 activée (PDB : 6W17) et dont les sous-unités Arp2 et Arp3 sont mises en contact avec les domaines FH2 selon la configuration observée dans la structure 1Y64 (contact actine-FH2). Des incompatibilités stériques locales sont observées dans ce modèle entre les domaines FH2 et le restant du complexe Arp2/3, cependant, une légère réorientation de ces domaines FH2 permetterait d'éviter ces incompatibilités stériques localisées sans modifier l'allure globale du modèle.
<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>**Figure 87** - Structures 3D RELION à 27 Å de résolution obtenue à partir du mé-lange Arp2/3-SPIN90-mDia1 et dans laquelle un modèle atomique impliquant Arp2/3-SPIN90 (PDB : 6W17) et un dimère de FH2 (PDB : 1Y64) a été ajusté. Bleu : Arp2, Rouge : Arp3, Vert : SPIN90, Violet/orange : domaines FH2. Flèche rouge : densité s'étendant au-delà du complexe Arp2/3-SPIN90 et indiquant l'interaction de ce dernier avec une protéine tierce.</figcaption></figure>
Cette dernière structure soutient directement l'hypothèse de la formation d'un complexe ternaire impliquant Arp2/3-SPIN90-mDia1 avec une interaction identifiée du côté Arp2/Arp3. Néanmoins, une ambiguïté persiste sur le positionnement des domaines FH2 dans ce complexe avec différentes orientations ajustables au sein de la structure obtenue, ne permettant pas d'avoir une définition claire du complexe formé. Il serait alors nécessaire d'inclure un plus grand nombre de particules en coloration négative avant de passer ensuite à une approche par cryomicroscopie électronique pour mieux caractériser le complexe ternaire formé.

Ces résultats ont pu être intégrés au sein d'un article publié en 2020 dans le journal *Nature Cell Biology* : « SPIN90 associates with mDia1 and the Arp2/3 complex to regulate cortical actin organization »²⁴⁵.
# 9. Conclusions et Perspectives.

## 9.1. Modalités de génération d'une densité élevée de courts filaments d'actine adaptée à une Analyse en Particule Isolée.

L'étude structurale des extrémités d'actine hautement dynamiques et notamment de leur extrémité barbée reste un enjeu majeur pour la compréhension fine d'un ensemble de procédés biologiques impliquant la polymérisation de ces filaments d'actine. En effet, une part importante de la régulation dynamique et/ou fonctionnelle des filaments d'actine s'opère à travers ces extrémités. On peut ainsi penser à l'activité des protéines de coiffe CapZ ou des formines dans le fonctionnement des lamellipodes ou des filopodes.

Malgré cet intérêt notoire, les études en microscopie électronique portant sur les extrémités de ces filaments d'actine restent peu nombreuses. On peut néanmoins noter l'occurrence de deux travaux de recherche récents, paru en 2020 pour le premier et à paraître pour le second (disponible sur BioRxiv), et élucidant, dans l'ordre, la structure à haute résolution de l'extrémité pointue coiffée d'un complexe Arp2/3-Dip1<sup>232</sup> (3,9 angström) et la structure de l'extrémité barbée en complexe avec la protéine de coiffe CapZ (3,8 angström). Ces deux résultats marquent une avancée remarquable dans l'étude des extrémités de filaments d'actine par microscopie électronique. Dans ces deux cas les auteurs ont utilisé avec succès la capacité neutralisante de la dynamique des extrémités barbée qu'offre la protéine de coiffe CapZ. Ils ont ainsi pu adsorber sur grille de microscopie électronique une densité importante de courts filaments d'actine nécessaire pour une Analyse en Particule Isolée.

Malheureusement une telle approche n'est plus envisageable lorsque l'on s'intéresse à la structure libre de l'extrémité barbée ou bien à son interaction intacte avec une autre protéine de coiffe telles que les formines étudiées au cours de ma thèse.

De ce fait, plusieurs stratégies alternatives ont dû être envisagées pour mener à bien mon projet de thèse qui visait principalement à élucider les modalités de l'association pérenne des formines aux extrémités barbées des filaments d'actine en élongation. Ces stratégies ayant pour but de générer une densité importante de courts filaments d'actine ont été évaluées dans un premier temps à travers une approche par coloration négative.
## A. Approche infructueuse du rééquilibrage nucléation/elongation des filaments d'actine.

La première approche ayant été testée a consisté à stimuler la nucléation des filaments d'actine par le biais de complexes spectrine-actine pour rendre le mécanisme de nucléation de nouveaux filaments d'actine prépondérant vis-à-vis de leur elongation. Cette approche n'a pas permis d'obtenir des résultats satisfaisants concernant la densité d'extrémités de filaments d'actine observées sur grille de microscopie électronique. Il n'est cependant pas exclu ici que d'autres noyaux de nucléation puissent donner de meilleurs résultats.

Toujours dans l'idée de favoriser la nucléation des filaments d'actine par rapport à leur elongation, une approche par modulation des interactions électrostatiques en solution à travers la modulation de la force ionique ou du pH a été envisagée. De nouveau, cette approche n'a pas permis d'obtenir les résultats escomptés. Dans le cas de la force ionique aucun effet majeur n'a pu être mis en évidence alors que ce paramètre pourrait altérer l'association pérenne des formines aux extrémités barbées (défavorable dans le contexte de l'étude).

En outre, l'utilisation de pH extrèmes (6.5 – 8.5) a mis en évidence une neutralisation du potentiel nucléateur des complexes spectrine-actine à bas pH et une altération de l'intégrité structurale des filaments d'actine observés à haut pH. Dans le cas des bas pH, l'effet inhibiteur sur l'activité des complexes spectrine-actine empêche la génération d'une densité importante de filaments d'actine. Dans le cas des pH élevés, la perturbation de la structure des filaments d'actine n'apparaît pas compatible avec une étude structurale de ces derniers avec les formines.

## B. Approche fructueuse du contrôle de la taille des filaments d'actine par sonication.

Une tout autre approche a alors été envisagée. Dans cette approche, des filaments d'actine amenés à leur état stationnaire ont été segmentés par sonication avant d'être mis succintement en contact avec de la formine. Cette approche a permis d'obtenir des résultats satisfaisant concernant la densité des extrémités de filaments d'actine observées sur grille de microscopie électronique.

Dans cette approche, l'utilisation de sonicateurs à sonde est apparue primordiale avec un ajustement crucial des paramètres de sonication (pulsations, diamètre de la pointe). Si la sonication des filaments d'actine pouvait, a priori, laisser envisager une potentielle altération structurale des filaments d'actine générés (ce qui aurait été néfaste pour l'interaction des formines), la
capacité observée des filaments à repolymériser après sonication a pu montrer que l’intégrité
structurale de ces derniers reste largement préservée.

Dans le cadre de cette approche par sonication, des protéines régulatrices de la polymérisation
des filaments d'actine ont également pu être testées (complexes spectrine-actine, Arp2/3, tro-
pomoduline, Gc-globuline) afin de limiter la repolymérisation des filaments d'actine pendant
ou après la sonication. À cette occasion, seule la Gc-globuline avait été retenue afin de neutra-
liser la réserve d'actine-G non polymérisée en solution. Une Analyse en Particule Isolée réalisée
à partir d'une expérience de sonication d'actine-F en présence de Gc-globuline et mise en con-
tact succintement avec des formines avant dépôt sur grille n'avait cependant pas permis d'iden-
tifier la coiffe d'extrémités barbées par des formines. Des densités électroniques supplémen-
taires avaient cependant pu être identifiées aux extrémités barbées. Les classes moyennes 2D
correspondantes avaient alors pu être associées à des projections 2D d'un hypothétique com-
plexe formé à partir d'une Gc-globuline coiffant une extrémité barbée. Néanmoins, aucune re-
construction 3D n'a permis de confirmer la formation d'un tel complexe.

Des conditions simplifiées avaient finalement été retenues en s'affranchissant, tout au long de
la préparation des échantillons, de l'utilisation de protéines régulatrices autres que celle des
formines. Une densité d'environ 12 extrémités de filament d'actine par image avait alors pu
être observée en coloration négative. Cette densité d'extrémité reste relativement faible mais a
néanmoins permis de réaliser une Analyse en Particule Isolée fructueuse en coloration négative.
Une Analyse en Particule Isolée a également pu être envisagée en cryo-microscopie électro-
nique grâce à une acquisition massive d'images permise par les nouveaux systèmes d'acquisi-
tions des microscopes électroniques.

9.2. Détermination structurale en coloration négative de
complexes de formine aux extrémités barbées de fil-
ments d'actine en elongation.

A. Validation du modèle de la « marche enjambée ».

Les analyses 2D réalisées en coloration négative à partir d'expériences de sonication
d'actine-F mise en contact succintement avec de la formine ont permis de mettre en évidence
des classes moyennes caractéristiques de la coiffe des extrémités barbées par des formines. Un
protocole d'analyse 2D dédié a été mis en place à cette occasion afin d'aligner et de classifier
au mieux les extrémités de filaments d'actine dont la forme est atypique dans le cadre d'une
Analyse en Particule Isolée. Ce protocole a permis de mettre en évidence, en plus de la conformation structurale majoritaire associé à une formine coiffant l'extrémité d'un filament d'actine (environ 20% des extrémités), une seconde conformation structurale minoritaire (environ 2% des extrémités). Ces deux conformations structurales identifiées lors d'analyses 2D ont alors permis de générer des structures 3D à respectivement 24 angström et 35 angström de résolution, directement interprétables comme l'état « ouvert » (majoritaire) et l'état « fermé » (minoritaire), décrits par le modèle de la « marche enjambée ». Ces résultats permettent ainsi de soutenir largement le modèle de la « marche enjambée » initialement proposé par Takanori Otomo et ses collègues.

## B. Distribution angulaire inhomogène des complexes bout barbé -formine.

Lors des reconstructions 3D de complexes bout barbé – formine on observe une distribution des angles de projection associés aux particules durant la reconstruction qui surreprésente certaines orientations du modèle atomique. Cette observation est en accord avec les classes moyennes 2D identifiées, dominées par des angles de projections particuliers. Une telle configuration est néanmoins difficillement imputable à l'adsorption selon une orientation particulière des extrémités coiffées de formine sur grille de microscopie électronique. En effet, cela impliquerait que l'orientation des filaments d'actine adsorbé sur grille soit dominée par l'interaction d'une de leur extrémité ce qui semble peu probable. Il a alors été proposé ici que cette distribution inhomogène des orientations identifiées lors des analyses est le fruit d'un biais computationnel avec des orientations données moins facilement identifiables que les autres parmi l'ensemble des extrémités de filaments d'actine extraites, mais pas moins présentes dans le jeu de données. Des reconstructions 3D réalisées avec l'ensemble des particules extraites (sans tri préalable des particules après analyses 2D) pour tenter d'assigner des orientations difficilement identifiables en 2D dans le cadre d'un complexe bout barbé - formine n'avaient néanmoins pas permis ici d'améliorer les résultats. Une solution envisageable dans ce contexte pour remédier à ce potentiel effet d'orientations sous-identifiées serait d'introduire lors des acquisitions d'images, une seconde image réalisée avec un angle non orthogonal entre le faisceau d'électron incident et le plan de la grille de microscopie électronique. Un tel mode d'acquisition permetterait de générer des paires d'image à deux angles de vue différents pour chaque extrémité extraite. Ces deux angles de vue pourraient ainsi favoriser la probabilité d'identifier un complexe bout barbé – formine en favorisant l'observation de chaque extrémité selon une orientation favorable à une telle identification.
### C. Facteur d'ouverture.

Les proportions de complexes formine - bout barbé identifiés d'un point de vue structurale ici dans l'état « ouvert » ou dans l'état « fermé » (modèle de la « marche enjambée »), après des analyses 2D (83% et 17%) ou 3D (84% et 16%) sont cohérentes avec le facteur d'ouverture de la formine mDia1 proposé en 2006 dans l'article « Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. » et estimé à 0.9¹⁹⁹. Dans cet article, l'estimation du facteur d'ouverture s'appuie sur la différence des vitesses d'élongation des filaments d'actine mesurées soit en présence soit en absence d'une coiffe de formine. La réduction de la vitesse d'élongation mesurée en présence de formines (sans profiline) est attribuée ici à une occupation de l'état « fermé ». Cette interprétation suppose que la coiffe des extrémités barbées par des formines n'altère pas significativement les taux d'additions ou de soustraction des sous-unités d'actine à l'extrémité barbée dans son état ouvert. Une telle hypothèse reste largement discutable.

Concernant les structures déterminées ici, les natures « ouverte » (élongation autorisée des filaments d'actine) ou « fermée » (élongation impossible du filament d'actine) sont attribuées essentiellement à travers une analogie avec la description structurale initialement proposée par le modèle de la « marche enjambée ». En effet, les faibles résolutions obtenues ici ne permettent pas de certifier la possibilité ou l'impossibilité stérique de l'ajout d'un nouveau monomère d'actine dans une configuration donnée. En particulier, dans le cas de l'état dit « fermé » un changement conformationnel du complexe bout barbée – formine, analogue à celui proposé dans le modèle du « saut enclenché » et qui expliquerait « l'ouverture » de l'extrémité n'est pas excluable.

Il serait intéressant ici d'obtenir des données supplémentaires pour caractériser plus finement cet état minoritaire dit « fermé » du complexe bout barbé - formine. Dans le même article cité ci-dessus, il avait été proposé que l'hydrolysation des nucléotides fixés aux sous-unités d'actine des extrémités barbée pouvait influencer le rapport entre état « ouvert » et état « fermé » en faveur de ce dernier. Pour la formine mDia1, le passage d'un facteur d'ouverture de 0.9 en présence d'ATP-actine à 0.5 en présence d'ADP-actine avait pu être estimé. Un tel phénomène, s'il est vérifié, pourrait être utile dans le but de caractériser l'état « fermé » initialement minoritaire. Toujous à travers cet article, des facteurs d'ouverture variés avaient pu être estimés pour d'autres isoformes de formine. Des facteurs d'ouvertures de 0.75 – 0.5 pour Bni1p, 0.25 pour mDia2 et 0 pour Cdc12 ont ainsi pu être estimés¹⁹⁹. Il serait profitable ici de réaliser avec ces différents isoformes la même expérience que celle effectuée avec la formine mDia1, cela afin
de comparer les rapports observés entre état « ouvert » et état « fermé » avec les facteurs d'ouverture initialement estimés.

Étant donné que l'approche par microscopie électronique proposée ici s'appuie sur une observation directe des états structuraux adoptés par les formines aux extrémités barbées, l'estimation du facteur d'ouverture qui en résulte est décorrélée de potentielles variation des taux échanges des monomères d'actine dans l'état « ouvert ». Une telle approche pourrait ainsi valider ou invalider l'effet de l'hydrolysation de l'ATP sur la proportion des ces deux états par une comparaison de résultats issus d'expériences réalisée en présence d'ATP-actine ou en présence d'ADP-actine.

## 9.3. Modèle du battement de FH2 dans l'état « ouvert » et dimères de formine encerclant le corps des filaments d'actine.

Des analyses 2D focalisées sur l'état « ouvert » des complexes bout barbé - formine ont pu mettre en évidence une variation conformationnelle localisée au niveau du premier domaine FH2 qui semble réaliser un battement à deux dimensions.

Une telle observation avait permis de proposer un modèle 3D reliant notamment cette variation conformationnelle observée en 2D avec une réorientation de la première sous unité d'actine vis-à-vis du reste du filament, passant d'une configuration proche de celle observée dans le cristal de Takanori Otomo à une configuration proche de celle observée dans un filament d'actine classique. Cette reconfiguration est analogue à la variation structurale proposée dans le modèle du « saut enclenché ». Cette variation conformationnelle observée dans l'état « ouvert » pourrait enrichir le modèle à deux états proposé (ouvert/fermé) en introduisant l'occurrence de sous-états conformationnels qui pourraient eux-même moduler l'échange des monomères d'actine aux extrémités barbées.

Partant de ce modèle du battement de l'état « ouvert », une configuration plus avancée de l'état d'élongation du filament a pu être envisagée avec pour conséquence l'encerclement de corps du filament d'actine par le dimère FH2, à distance de l'extrémité barbée.
Une telle configuration a pu être confirmée via des analyses 2D réalisées à partir des images de microscopie électronique précédemment obtenues en coloration négative par sonication d'actine-F mise en contact avec de la formine. Le scénario proposé ici pour atteindre cette configuration reste néanmoins à prouver avec une potentielle dissociation partielle des dimères de formine pouvant permettre l'encerclement du corps des filaments d'actine sans passer par leurs extrémités barbées. Des mutants de formine non-dissociables pourrait être envisagés pour vérifier ce dernier scénario.

La structure 3D de cette configuration obtenue à 33 angström de résolution indique sans surprise une surreprésentation de l'orientation présentant les domaines FH2 du dimère de formine selon leurs deux axes principaux. En effet, seule cette orientation avait pu être reconnue lors de l'extraction des particules. Comme proposé dans le cadre de la coiffe des extrémités barbées, il serait bénéfique ici de réaliser des acquisitions d'images couplées en introduisant un angle dans l'orientation de la grille de microscopie électronique. Cette approche pourrait être d'autant plus bénéfique si les axes des filaments d'actine observés étaient orientés selon l'axe de rotation de la grille. Dans ce contexte, l'alignement des filaments d'actine lors de leur dépôt sur grille de microscopie électronique pourrait être envisagé en s'appuyant sur l'utilisation d'un champs magnétique faible comme décrit dans l'article « Low-intensity magnetic fields assisted alignment of actin filaments »²⁴⁶.

## 9.4. Étude du complexe extrémité barbée – formine par une approche en cryo-microscopie électronique.

Les résultats encourageants concernant l'étude de la coiffe des extrémités barbées par des formines obtenus par une approche en coloration négative ont permis d'envisager une approche par cryo-microscopie électronique afin de confirmer ces résultats dans un premier temps mais également d'améliorer la résolution des structures générées. La difficulté de ce transfert des résultats d'une approche par coloration négative à la cryo-microscopie électronique réside dans la baisse de densité en protéine généralement observée avec les grilles classiquement utilisées dans cette seconde approche. Ce point est critique dans le cadre de l'étude des formines aux extrémités barbées étant donné que c'est le facteur limitant majeur de l'étude d'un tel complexe par une Analyse en Particule Isolée.
Les travaux ayant visé à maintenir la densité des extrémités de filaments d'actine sur grille de
cryo-microscopie électronique ont rapidement convergés vers l'utilisation de grilles C-Flat re-
couvertes de feuilles d'oxide de graphène. Il est intéressant de voir que l'équipe de Stefan Raun-
ser a également convergé vers l'utilisation de feuilles d'oxide de graphène pour maintenir une
densité importante de courts filaments d'actine dans le cadre de leur étude à paraitre de la coiffe
des extrémités barbées par les protéines CapZ.

Dans le cas de l'étude des complexes bout barbé – formine une densité moyenne très limitée
avait finalement pu être obtenue : de l'odre de 4 - 5 extrémités par image ce qui équivaut à une
densité divisée par trois par rapport à ce qui avait pu être observé en coloration négative (12 -
15).

Malgré tout, des classes moyennes 2D similaires à celles observées en coloration négative pour
l'état « ouvert » ont pu être mises en évidence par cette approche en cryo-microscopie électro-
nique, confirmant ainsi le caractère non artéfactuel de ces premières observations.

Le peu de particules alors identifiées (1548) n'a pas permis de générer une structure 3D à une résolution plus importante que celle déja obtenue en coloration négative (30 angström de résolution contre 24 angström de résolution).

Une amélioration pourrait être obtenue à travers l'optimisation du tapissage des grilles de cryo-
microscopie par des feuilles d'oxide de graphène. En effet, une tendance non négligeable à
l'agrégation de ces feuilles ou l'occurrence de trous dépourvus de feuille indique une marge
d'amélioration.

Néanmoins, les résultats obtenus restent très éloignés des dizaines de milliers de bouts barbés
coiffés de formine nécessaires pour générer une structure à haute résolution. Le travail d'opti-
misation reste donc encore très important.

9.5. Formation d'un complexe ternaire Arp2/3-SPIN90-mDia1.

Des Analyses en Particule Unique réalisées parallèlement avec des mélanges de Arp2/3-
SPIN90 ou Arp2/3-SPIN90-mDia1 ont permis de mettre en évidence la génération d'un com-
plexe ternaire Arp2/3-SPIN90-mDia. En effet, l'occurrence d'une densité supplémentaire avait
pu être observée au niveau de Arp2/Arp3 dans la structure 3D générée par un mélange Arp2/3-
SPIN90-mDial1 en comparaison avec celle obtenue à partir du mélange Arp2/3-SPIN90. Le nombre de particules correspondant au complexe Arp2/3-SPIN90-mDial1 reste cependant limité avec 2006 particules identifiées (20% des particules) ce qui n'a pas permis de générer une structure suffisamment résolue (27 angström) pour décrire sans ambigüité les modalités d'interactions des domaines FH2 dans ce complexe. Plus de données pourraient être obtenues pour améliorer ces résultats. Néanmoins, il se peut que la résolution atteignable soit également limitée par une variabilité conformationnelle du complexe formé entre mDial1 et Arp2/3-SPIN90.

## 9.6. Conclusion générale.

L'un des résultats majeurs de ma thèse a été la caractérisation structurale des conformations adoptées par les formines au cours même de la coiffe dynamique des extrémités barbées de filaments d'actine en elongation. Cette caractérisation structurale obtenue par une approche en microscopie électronique a été permise suite à la résolution de verrous techniques empêchant initialement toute réalisation d'une Analyse en Particule Isolée à partir de ce système hautement dynamique et hétérogène. Les informations structurales qui ont été obtenues ici ont permis de valider dans un premier temps des hypothèses relatives au mode de fonctionnement des formines liées aux extrémités barbées des filaments d'actine, puis dans un second temps, d'enrichir le modèle à deux états initialement proposé pour décrire la procession des formines aux extrémités barbées. À la lumière de ce modèle affiné, un second mode d'interaction de la formine mDial1 avec le corps des filaments d'actine a pu être envisagé, puis déterminé en microscopie électronique. L'ensemble de ces résultats inédits apportant une contribution substantielle au domaine d'étude fait actuellement l'objet de la préparation d'un article scientifique.
# IV. Annexes.

<figure><img src="image_105.png" /><figcaption>**Annexe 1** – Modèles filtrés spatialement utilisées comme références pour la reconstruction de structures 3D sous RELION. A. Dimère de FH2. B. Extrémité barbée coiffée d'une formine dans l'état « ouvert ». C. Extrémitée barbée coiffée d'une formine dans l'état « fermé ». D. Arp2/3 E. Arp2/3-SPIN90. F. Arp2/3-SPIN90-mDia1.</figcaption></figure>
V. Bibliographie

1. Tominaga, T. et al. Diaphanous-Related Formins Bridge Rho GTPase and Src Tyrosine Kinase Signaling. *Molecular Cell* **5**, 13–25 (2000).

2. Kato, T. mDia1 localization to mitotic spindle. 10.

3. Tolliday, N., VerPlank, L. & Li, R. Rho1 Directs Formin-Mediated Actin Ring Assembly during Bud-ding Yeast Cytokinesis. *Current Biology* **12**, 1864–1870 (2002).

4. Yamana, N. et al. The Rho-mDia1 Pathway Regulates Cell Polarity and Focal Adhesion Turnover in Migrating Cells through Mobilizing Apc and c-Src. *Mol Cell Biol* **26**, 6844–6858 (2006).

5. Hotulainen, P. & Lappalainen, P. Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells. *Journal of Cell Biology* **173**, 383–394 (2006).

6. Carramusa, L., Ballestrem, C., Zilberman, Y. & Bershadsky, A. D. Mammalian diaphanous-related formin Dia1 controls the organization of E-cadherin-mediated cell-cell junctions. *Journal of Cell Science* **120**, 3870–3882 (2007).

7. Mellor, H. The role of formins in filopodia formation. *Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research* **1803**, 191–200 (2010).

8. DeWard, A. D., Eisenmann, K. M., Matheson, S. F. & Alberts, A. S. The role of formins in human disease. *Biochim. Biophys. Acta* **1803**, 226–233 (2010).

9. Lin, Y.-N. et al. Expression of DIAPH1 is up-regulated in colorectal cancer and its down-regulation strongly reduces the metastatic capacity of colon carcinoma cells. *Int. J. Cancer* **134**, 1571–1582 (2014).

10. Kim, D. et al. mDia1 regulates breast cancer invasion by controlling membrane type 1-matrix metalloproteinase localization. *Oncotarget* **7**, (2016).

11. Thompson, S. B. et al. The Formin mDia1 Regulates Acute Lymphoblastic Leukemia Engraft-ment, Migration, and Progression in vivo. *Front Oncol* **8**, 389 (2018).
12. Yang, J. et al. DIAPH1 Is Upregulated and Inhibits Cell Apoptosis through ATR/p53/Caspase-3 Signaling Pathway in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. *Dis. Markers* **2019**, 6716472 (2019).

13. Pruyne, D. et al. Role of Formins in Actin Assembly: Nucleation and Barbed-End Association. *Science* **297**, 612–615 (2002).

14. Romero, S. et al. Formin is a processive motor that requires profilin to accelerate actin assembly and associated ATP hydrolysis. *Cell* **119**, 419–429 (2004).

15. Otomo, T. et al. Structural basis of actin filament nucleation and processive capping by a formin homology 2 domain. *Nature* **433**, 488–494 (2005).

16. Jégou, A., Carlier, M.-F. & Romet-Lemonne, G. Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments. *Nature Communications* **4**, 1–7 (2013).

17. Kubota, H. et al. Biphasic Effect of Profilin Impacts the Formin mDia1 Force-Sensing Mechanism in Actin Polymerization. *Biophys. J.* **113**, 461–471 (2017).

18. Paul, A. & Pollard, T. The Role of the FH1 Domain and Profilin in Formin-Mediated Actin-Filament Elongation and Nucleation. *Curr Biol* **18**, 9–19 (2008).

19. Paul, A. S. & Pollard, T. D. Energetic Requirements for Processive Elongation of Actin Filaments by FH1FH2-formins. *J Biol Chem* **284**, 12533–12540 (2009).

20. Pollard, T. D. & Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. *Cold Spring Harb Perspect Biol* **10**, (2018).

21. Ali, M. Y., Vilfan, A., Trybus, K. M. & Warshaw, D. M. Cargo Transport by Two Coupled Myosin Va Motors on Actin Filaments and Bundles. *Biophys. J.* **111**, 2228–2240 (2016).

22. Pilling, A. D., Horiuchi, D., Lively, C. M. & Saxton, W. M. Kinesin-1 and Dynein are the primary motors for fast transport of mitochondria in Drosophila motor axons. *Mol. Biol. Cell* **17**, 2057–2068 (2006).

23. Liu, Z., Persson, S. & Zhang, Y. The connection of cytoskeletal network with plasma membrane and the cell wall. *J Integr Plant Biol* **57**, 330–340 (2015).
24. Fletcher, D. A. & Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. *Nature* **463**, 485–492 (2010).

25. Pegoraro, A. F., Janmey, P. & Weitz, D. A. Mechanical Properties of the Cytoskeleton and Cells. *Cold Spring Harb Perspect Biol* **9**, (2017).

26. Le Clainche, C. & Carlier, M.-F. Regulation of actin assembly associated with protrusion and adhesion in cell migration. *Physiol. Rev.* **88**, 489–513 (2008).

27. Bugyi, B., Didry, D. & Carlier, M.-F. How tropomyosin regulates lamellipodial actin-based motility: a combined biochemical and reconstituted motility approach. *EMBO J.* **29**, 14–26 (2010).

28. Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C. & Plastino, J. Actin dynamics, architecture, and mechanics in cell motility. *Physiol. Rev.* **94**, 235–263 (2014).

29. Short, B. *Formin*’ the cytokinetic ring. *J Cell Biol* **203**, 3 (2013).

30. Chugh, P. & Paluch, E. K. The actin cortex at a glance. *J Cell Sci* **131**, (2018).

31. Wang, S. & O'Shaughnessy, B. Anchoring of actin to the plasma membrane enables tension production in the fission yeast cytokinetic ring. *Mol Biol Cell* **30**, 2053–2064 (2019).

32. Goode, B. L., Eskin, J. A. & Wendland, B. Actin and Endocytosis in Budding Yeast. *Genetics* **199**, 315–358 (2015).

33. Pedersen, R. T. A. & Drubin, D. G. Type I myosins anchor actin assembly to the plasma membrane during clathrin-mediated endocytosis. *J. Cell Biol.* **218**, 1138–1147 (2019).

34. Huber, F. *et al*. Emergent complexity of the cytoskeleton: from single filaments to tissue. *Adv Phys* **62**, 1–112 (2013).

35. dos Remedios, C. G. *et al*. Actin binding proteins: regulation of cytoskeletal microfilaments. *Physiol. Rev.* **83**, 433–473 (2003).

36. Paavilainen, V. O., Bertling, E., Falck, S. & Lappalainen, P. Regulation of cytoskeletal dynamics by actin-monomer-binding proteins. *Trends Cell Biol.* **14**, 386–394 (2004).

37. Pollard, T. D. Actin and Actin-Binding Proteins. *Cold Spring Harb Perspect Biol* **8**, (2016).
38. Mayne, R., Adamatzky, A. & Jones, J. On the role of the plasmodial cytoskeleton in facilitating intelligent behavior in slime mold Physarum polycephalum. *Communicative & Integrative Biology* **8**, (2015).

39. Ramaekers, F. C. & Bosman, F. T. The cytoskeleton and disease. *The Journal of Pathology* **204**, 351–354 (2004).

40. Bugyi, B. & Kellermayer, M. The discovery of actin: "to see what everyone else has seen, and to think what nobody has thought"*. *J Muscle Res Cell Motil* **41**, 3–9 (2020).

41. Cooper, G. M. Structure and Organization of Actin Filaments. *The Cell: A Molecular Approach*. 2nd edition (2000).

42. Pantaloni, D., Le Clainche, C. & Carlier, M. F. Mechanism of actin-based motility. *Science* **292**, 1502–1506 (2001).

43. Carlier, M.-F. & Shekhar, S. Global treadmilling coordinates actin turnover and controls the size of actin networks. *Nat. Rev. Mol. Cell Biol.* **18**, 389–401 (2017).

44. Mattila, P. K. & Lappalainen, P. Filopodia: molecular architecture and cellular functions. *Nature Reviews Molecular Cell Biology* **9**, 446–454 (2008).

45. Schwayer, C., Sikora, M., Slováková, J., Kardos, R. & Heisenberg, C.-P. Actin Rings of Power. *Dev. Cell* **37**, 493–506 (2016).

46. Kabsch, W., Mannherz, H. G., Suck, D., Pai, E. F. & Holmes, K. C. Atomic structure of the actin: DNase I complex. *Nature* **347**, 37–44 (1990).

47. Dominguez, R. *A Common Binding Site for Actin-Binding Proteins on the Actin Surface*. (Landes Bioscience, 2013).

48. Dominguez, R. & Holmes, K. C. Actin Structure and Function. *Annual Review of Biophysics* **40**, 169–186 (2011).

49. Holmes, K. C., Popp, D., Gebhard, W. & Kabsch, W. Atomic model of the actin filament. *Nature* **347**, 44–49 (1990).
50. Egelman, E. H., Francis, N. & DeRosier, D. J. F-actin is a helix with a random variable twist. *Nature* **298**, 131–135 (1982).

51. Galkin, V. E., Orlova, A., Solodukhin, A., Schröder, G. F. & Egelman, E. H. Structural Polymorphism of F-Actin is Coupled with its Mechanical Properties. *Biophysical Journal* **104**, 644a–645a (2013).

52. Fujii, T., Iwane, A. H., Yanagida, T. & Namba, K. Direct visualization of secondary structures of F-actin by electron cryomicroscopy. *Nature* **467**, 724–728 (2010).

53. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. *J Cell Biol* **120**, 923–934 (1993).

54. Wisanpitayakorn, P., Mickolajczyk, K. J., Hancock, W. O. & Tuzel, E. Measurement of the Per-sistence Length of Cytoskeletal Filaments using Curvature Distributions. 16.

55. Murakami, K. et al. Structural basis for actin assembly, activation of ATP hydrolysis, and de-layed phosphate release. *Cell* **143**, 275–287 (2010).

56. Wegner, A. Head to tail polymerization of actin. *Journal of Molecular Biology* **108**, 139–150 (1976).

57. Wells, W. A. Microtubules get a name. *J Cell Biol* **168**, 852–853 (2005).

58. Muroyama, A. & Lechler, T. Microtubule organization, dynamics and functions in differenti-ated cells. *Development* **144**, 3012–3021 (2017).

59. Brouhard, G. J. & Rice, L. M. Microtubule dynamics: an interplay of biochemistry and me chanics. *Nat. Rev. Mol. Cell Biol.* **19**, 451–463 (2018).

60. Wells, W. A. The discovery of tubulin. *J Cell Biol* **169**, 552 (2005).

61. Nogales, E., Wolf, S. G. & Downing, K. H. Structure of the alpha beta tubulin dimer by elec-tron crystallography. *Nature* **391**, 199–203 (1998).

62. Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C. & Janke, C. Microtubule-Associated Proteins: Structuring the Cytoskeleton. *Trends Cell Biol.* **29**, 804–819 (2019).
63. Herrmann, H., Bär, H., Kreplak, L., Strelkov, S. V. & Aebi, U. Intermediate filaments: from cell architecture to nanomechanics. *Nat. Rev. Mol. Cell Biol.* **8**, 562–573 (2007).

64. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. *Exp. Cell Res.* **313**, 1981–1994 (2007).

65. Herrmann, H. & Aebi, U. Intermediate Filaments: Structure and Assembly. *Cold Spring Harb Perspect Biol* **8**, (2016).

66. Sanghvi-Shah, R. & Weber, G. F. Intermediate Filaments at the Junction of Mechanotransduction, Migration, and Development. *Front Cell Dev Biol* **5**, 81 (2017).

67. Wen, Q. & Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. *Curr Opin Solid State Mater Sci* **15**, 177–182 (2011).

68. Mostowy, S. & Cossart, P. Septins: the fourth component of the cytoskeleton. *Nature Reviews Molecular Cell Biology* **13**, 183–194 (2012).

69. Bridges, A. A. & Gladfelter, A. S. Septin Form and Function at the Cell Cortex. *J. Biol. Chem.* **290**, 17173–17180 (2015).

70. Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. *Nature Communications* **10**, 1–12 (2019).

71. Gönczi, M. et al. Septins, a cytoskeletal protein family, with emerging role in striated muscle. *J. Muscle Res. Cell. Motil.* (2020) doi:10.1007/s10974-020-09573-8.

72. Spiliotis, E. T. Spatial effects - site-specific regulation of actin and microtubule organization by septin GTPases. *J. Cell. Sci.* **131**, (2018).

73. Valadares, N. F., d' Muniz Pereira, H., Ulian Araujo, A. P. & Garratt, R. C. Septin structure and filament assembly. *Biophys Rev* **9**, 481–500 (2017).

74. Bertin, A. et al. Saccharomyces cerevisiae septins: Supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly. *PNAS* **105**, 8274–8279 (2008).

75. Mavrakis, M. et al. Septins promote F-actin ring formation by crosslinking actin filaments into curved bundles. *Nature Cell Biology* **16**, 322–334 (2014).
76. Dogterom, M. & Koenderink, G. H. Actin-microtubule crosstalk in cell biology. *Nature Reviews Molecular Cell Biology* **20**, 38-54 (2019).

77. Pfisterer, K., Jayo, A. & Parsons, M. Control of nuclear organization by F-actin binding proteins. *Nucleus* **8**, 126-133 (2017).

78. Crevenna, A. H. et al. Electrostatics Control Actin Filament Nucleation and Elongation Kinetics. *J Biol Chem* **288**, 12102-12113 (2013).

79. Grazi, E., Ferri, A. & Cino, S. The polymerization of actin. A study of the nucleation reaction. *Biochem. J.* **213**, 727-732 (1983).

80. Cooper, J. A., Walker, S. B. & Pollard, T. D. Pyrene actin: documentation of the validity of a sensitive assay for actin polymerization. *J Muscle Res Cell Motil* **4**, 253-262 (1983).

81. Pollard, T. D. & Mooseker, M. S. Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores. *J. Cell Biol.* **88**, 654-659 (1981).

82. Oda, T., Aihara, T. & Wakabayashi, K. Early nucleation events in the polymerization of actin, probed by time-resolved small-angle x-ray scattering. *Scientific Reports* **6**, 1-13 (2016).

83. Narita, A., Oda, T. & Maéda, Y. Structural basis for the slow dynamics of the actin filament pointed end. *EMBO J* **30**, 1230-1237 (2011).

84. Fujiwara, I., Vavylonis, D. & Pollard, T. D. Polymerization kinetics of ADP- and ADP-Pi-actin determined by fluorescence microscopy. *PNAS* **104**, 8827-8832 (2007).

85. Oda, T., Iwasa, M., Aihara, T., Maéda, Y. & Narita, A. The nature of the globular- to fibrous-actin transition. *Nature* **457**, 441-445 (2009).

86. von der Ecken, J. et al. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. *Nature* **519**, 114-117 (2015).

87. Merino, F. et al. Structural transitions of F-actin upon ATP hydrolysis at near-atomic resolution revealed by cryo-EM. *Nat Struct Mol Biol* **25**, 528-537 (2018).
88. Merino, F., Pospich, S. & Raunser, S. Towards a structural understanding of the remodeling of the actin cytoskeleton. *Seminars in Cell & Developmental Biology* (2019) doi:10.1016/j.semcdb.2019.11.018.

89. Fujiwara, I., Takahashi, S., Tadakuma, H., Funatsu, T. & Ishiwata, S. Microscopic analysis of polymerization dynamics with individual actin filaments. *Nature Cell Biology* **4**, 666–673 (2002).

90. Loisel, T. P., Boujemaa, R., Pantaloni, D. & Carlier, M. F. Reconstitution of actin-based motility of Listeria and Shigella using pure proteins. *Nature* **401**, 613–616 (1999).

91. Pospich, S. et al. Near-atomic structure of jasplakinolide-stabilized malaria parasite F-actin reveals the structural basis of filament instability. *Proc Natl Acad Sci U S A* **114**, 10636–10641 (2017).

92. Kumpula, E.-P., Lopez, A. J., Tajedin, L., Han, H. & Kursula, I. Atomic view into Plasmodium actin polymerization, ATP hydrolysis, and fragmentation. *PLOS Biology* **17**, e3000315 (2019).

93. Wetzel, D. M., Håkansson, S., Hu, K., Roos, D. & Sibley, L. D. Actin Filament Polymerization Regulates Gliding Motility by Apicomplexan Parasites. *Mol Biol Cell* **14**, 396–406 (2003).

94. Perrin, B. J. & Ervasti, J. M. The Actin Gene Family: Function Follows Isoform. *Cytoskeleton* (Hoboken) **67**, 630–634 (2010).

95. Belyantseva, I. A. et al. Gamma-actin is required for cytoskeletal maintenance but not development. *Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.* **106**, 9703–9708 (2009).

96. Bunnell, T. M., Burbach, B. J., Shimizu, Y. & Ervasti, J. M. β-Actin specifically controls cell growth, migration, and the G-actin pool. *Mol. Biol. Cell* **22**, 4047–4058 (2011).

97. Gimona, M. et al. β-actin specific monoclonal antibody. *Cell Motility* **27**, 108–116 (1994).

98. Hill, M. A. & Gunning, P. Beta and gamma actin mRNAs are differentially located within myoblasts. *J. Cell Biol.* **122**, 825–832 (1993).

99. Kang, H. et al. Identification of cation-binding sites on actin that drive polymerization and modulate bending stiffness. *PNAS* **109**, 16923–16927 (2012).
100. Karakozova, M. et al. Arginylation of beta-actin regulates actin cytoskeleton and cell motility. *Science* **313**, 192–196 (2006).

101. Zhang, F., Saha, S., Shabalina, S. A. & Kashina, A. Differential arginylation of actin isoforms is regulated by coding sequence-dependent degradation. *Science* **329**, 1534–1537 (2010).

102. Skruber, K., Read, T.-A. & Vitriol, E. A. Reconsidering an active role for G-actin in cytoskeletal regulation. *J. Cell. Sci.* **131**, (2018).

103. Carlier, M. F. Actin: protein structure and filament dynamics. *J. Biol. Chem.* **266**, 1–4 (1991).

104. Weber, A., Herz, R. & Reiss, I. Role of magnesium in the relaxation of myofibrils. *Biochemistry* **8**, 2266–2271 (1969).

105. Pantaloni, D. & Carlier, M. F. How profilin promotes actin filament assembly in the presence of thymosin beta 4. *Cell* **75**, 1007–1014 (1993).

106. Hertzog, M. et al. The beta-thymosin/WH2 domain; structural basis for the switch from inhibition to promotion of actin assembly. *Cell* **117**, 611–623 (2004).

107. Porta, J. C. & Borgstahl, G. E. O. Structural basis for profilin-mediated actin nucleotide exchange. *J Mol Biol* **418**, 103–116 (2012).

108. Courtemanche, N. & Pollard, T. D. Interaction of profilin with the barbed end of actin filaments. *Biochemistry* **52**, (2013).

109. Ferron, F., Rebowski, G., Lee, S. H. & Dominguez, R. Structural basis for the recruitment of profilin–actin complexes during filament elongation by Ena/VASP. *EMBO J* **26**, 4597–4606 (2007).

110. Xue, B., Leyrat, C., Grimes, J. M. & Robinson, R. C. Structural basis of thymosin-β4/profilin exchange leading to actin filament polymerization. *Proc Natl Acad Sci U S A* **111**, E4596–E4605 (2014).

111. Otterbein, L. R., Cosio, C., Graceffa, P. & Dominguez, R. Crystal structures of the vitamin D-binding protein and its complex with actin: structural basis of the actin-scavenger system. *Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.* **99**, 8003–8008 (2002).
112. Chun, R. F. New perspectives on the vitamin D binding protein. *Cell Biochemistry and Function* **30**, 445-456 (2012).

113. Verboven, C. et al. Actin-DBP: the perfect structural fit? *Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr.* **59**, 263-273 (2003).

114. Van Baelen, H., Bouillon, R. & De Moor, P. Vitamin D-binding protein (Gc-globulin) binds actin. *J. Biol. Chem.* **255**, 2270-2272 (1980).

115. Mohapatra, L., Lagny, T. J., Harbage, D., Jelenkovic, P. R. & Kondev, J. The Limiting-Pool Mechanism Fails to Control the Size of Multiple Organelles. *Cell Systems* **4**, 559-567.e14 (2017).

116. Suarez, C. & Kovar, D. R. Internetwork competition for monomers governs actin cytoskeleton organization. *Nature Reviews Molecular Cell Biology* **17**, 799-810 (2016).

117. Rotty, J. D. et al. Profilin-1 serves as a gatekeeper for actin assembly by Arp2/3-dependent and -independent pathways. *Dev Cell* **32**, 54-67 (2015).

118. Suarez, C. et al. Profilin regulates F-actin network homeostasis by favoring formin over Arp2/3 complex. *Dev. Cell* **32**, 43-53 (2015).

119. Wioland, H. et al. ADF/Cofilin Accelerates Actin Dynamics by Severing Filaments and Promoting Their Depolymerization at Both Ends. *Curr. Biol.* **27**, 1956-1967.e7 (2017).

120. Tanaka, K. et al. Structural basis for cofilin binding and actin filament disassembly. *Nat Commun* **9**, 1860 (2018).

121. Fan, J. et al. Structural Basis for pH-mediated Regulation of F-actin Severing by Gelsolin Domain 1. *Scientific Reports* **7**, 1-10 (2017).

122. Huehn, A. et al. The actin filament twist changes abruptly at boundaries between bare and cofilin-decorated segments. *J. Biol. Chem.* **293**, 5377-5383 (2018).

123. Gurel, P. S. et al. INF2-mediated severing through actin filament encirclement and disruption. *Curr Biol* **24**, 156-164 (2014).
124. Harris, E. S., Li, F. & Higgs, H. N. The mouse formin, FRLalpha, slows actin filament barbed end elongation, competes with capping protein, accelerates polymerization from monomers, and severs filaments. *J. Biol. Chem.* **279**, 20076–20087 (2004).

125. Pospich, S., Merino, F. & Raunser, S. Structural Effects and Functional Implications of Phalloidin and Jasplakinolide Binding to Actin Filaments. *Structure* **28**, 437-449.e5 (2020).

126. Melak, M., Plessner, M. & Grosse, R. Actin visualization at a glance. *J Cell Sci* **130**, 525–530 (2017).

127. Gunning, P. W., Hardeman, E. C., Lappalainen, P. & Mulvihill, D. P. Tropomyosin – master regulator of actin filament function in the cytoskeleton. *J Cell Sci* **128**, 2965–2974 (2015).

128. Ostrowska-Podhorodecka, Z., Śliwinska, M., Reisler, E. & Moraczewska, J. Tropomyosin isoforms regulate cofilin 1 activity by modulating actin filament conformation. *Archives of Biochemistry and Biophysics* **682**, 108280 (2020).

129. Behrmann, E. et al. Structure of the Rigor Actin-Tropomyosin-Myosin Complex. *Cell* **150**, 327–338 (2012).

130. Svitkina, T. The Actin Cytoskeleton and Actin-Based Motility. *Cold Spring Harb Perspect Biol* **10**, (2018).

131. Bryan, J., Edwards, R., Matsudaira, P., Otto, J. & Wulfkuhle, J. Fascin, an echinoid actin-bundling protein, is a homolog of the Drosophila singed gene product. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America* **90**, 9115–9 (1993).

132. Jansen, S. et al. Mechanism of Actin Filament Bundling by Fascin. *J Biol Chem* **286**, 30087–30096 (2011).

133. Yang, S. et al. Molecular Mechanism of Fascin Function in Filopodial Formation. *J Biol Chem* **288**, 274–284 (2013).

134. Louvet-Vallée, S. ERM proteins: from cellular architecture to cell signaling. *Biol. Cell* **92**, 305–316 (2000).
135. Ribeiro, E. de A. et al. The Structure and Regulation of Human Muscle α-Actinin. *Cell* **159**, 1447–1460 (2014).

136. Hosseini, K., Sbosny, L., Poser, I. & Fischer-Friedrich, E. Binding dynamics of alpha-actinin-4 in dependence of actin cortex tension. *bioRxiv* 2020.03.11.986935 (2020)
doi:10.1101/2020.03.11.986935.

137. Jin, Y. et al. Complete Characterization of Cardiac Myosin Heavy Chain (223 kDa) Enabled by Size-Exclusion Chromatography and Middle-down Mass Spectrometry. *Anal Chem* **89**, 4922–4930 (2017).

138. Wear, M. A., Yamashita, A., Kim, K., Maéda, Y. & Cooper, J. A. How capping protein binds the barbed end of the actin filament. *Curr. Biol.* **13**, 1531–1537 (2003).

139. Narita, A., Takeda, S., Yamashita, A. & Maéda, Y. Structural basis of actin filament capping at the barbed-end: a cryo-electron microscopy study. *EMBO J* **25**, 5626–5633 (2006).

140. Pappas, C. T., Bhattacharya, N., Cooper, J. A. & Gregorio, C. C. Nebulin Interacts with CapZ and Regulates Thin Filament Architecture within the Z-Disc. *Mol Biol Cell* **19**, 1837–1847 (2008).

141. Fowler, V. M., Greenfield, N. J. & Moyer, J. Tropomodulin contains two actin filament pointed end-capping domains. *J. Biol. Chem.* **278**, 40000–40009 (2003).

142. Yamashiro, S., Gokhin, D. S., Kimura, S., Nowak, R. B. & Fowler, V. M. Tropomodulins: pointed-end capping proteins that regulate actin filament architecture in diverse cell types. *Cyto-skeleton (Hoboken)* **69**, 337–370 (2012).

143. Dmitrieff, S. & Nédélec, F. Amplification of actin polymerization forces. *J. Cell Biol.* **212**, 763–766 (2016).

144. Harker, A. J. et al. Ena/VASP processive elongation is modulated by avidity on actin filaments bundled by the filopodia cross-linker fascin. *Mol Biol Cell* **30**, 851–862 (2019).

145. Higgs, H. N. Formin proteins: a domain-based approach. *Trends Biochem. Sci.* **30**, 342–353 (2005).
146. Bear, J. E. et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. *Cell* **109**, 509–521 (2002).

147. Shekhar, S., Pernier, J. & Carlier, M.-F. Regulators of actin filament barbed ends at a glance. *J Cell Sci* **129**, 1085–1091 (2016).

148. Shekhar, S. et al. Formin and capping protein together embrace the actin filament in a mé-nage à trois. *Nature Communications* **6**, 8730 (2015).

149. Umeki, N., Hirose, K. & Uyeda, T. Q. P. Cofilin-induced cooperative conformational changes of actin subunits revealed using cofilin-actin fusion protein. *Scientific Reports* **6**, 1–13 (2016).

150. Ngo, K. X., Kodera, N., Katayama, E., Ando, T. & Uyeda, T. Q. Cofilin-induced unidirectional cooperative conformational changes in actin filaments revealed by high-speed atomic force mi-croscopy. *eLife* **4**.

151. Sharma, S., Grintsevich, E. E., Hsueh, C., Reisler, E. & Gimzewski, J. K. Molecular Cooperativity of Drebrin1-300 Binding and Structural Remodeling of F-Actin. *Biophysical Journal* **103**, 275–283 (2012).

152. Ngo, K. X. et al. Allosteric regulation by cooperative conformational changes of actin filaments drives mutually exclusive binding with cofilin and myosin. *Sci Rep* **6**, 35449 (2016).

153. Galkin, V. E., Orlova, A. & Egelman, E. H. Actin filaments as tension sensors. *Curr. Biol.* **22**, R96-101 (2012).

154. Uyeda, T. Q. P., Iwadate, Y., Umeki, N., Nagasaki, A. & Yumura, S. Stretching Actin Filaments within Cells Enhances their Affinity for the Myosin II Motor Domain. *PLOS ONE* **6**, e26200 (2011).

155. Harris, A. R., Jreij, P., Belardi, B., Bausch, A. & Fletcher, D. A. Biased localization of actin binding proteins by actin filament conformation. *bioRxiv* 2020.02.21.959791 (2020)
doi:10.1101/2020.02.21.959791.

156. Kim, D. J. et al. Interaction of SPIN90 with the Arp2/3 complex mediates lamellipodia and ac-tin comet tail formation. *J. Biol. Chem.* **281**, 617–625 (2006).
157. Luan, Q., Liu, S.-L., Helgeson, L. A. & Nolen, B. J. Structure of the nucleation-promoting factor SPIN90 bound to the actin filament nucleator Arp2/3 complex. *EMBO J.* **37**, (2018).

158. Jégou, A. et al. Individual Actin Filaments in a Microfluidic Flow Reveal the Mechanism of ATP Hydrolysis and Give Insight Into the Properties of Profilin. *PLOS Biology* **9**, e1001161 (2011).

159. Pernier, J., Shekhar, S., Jegou, A., Guichard, B. & Carlier, M.-F. Profilin Interaction with Actin Filament Barbed End Controls Dynamic Instability, Capping, Branching, and Motility. *Dev. Cell* **36**, 201–214 (2016).

160. Mc Leod, J. F., Kowalski, M. A. & Haddad, J. G. Interactions among serum vitamin D binding protein, monomeric actin, profilin, and profilactin. *J. Biol. Chem.* **264**, 1260–1267 (1989).

161. Andrianantoandro, E. & Pollard, T. D. Mechanism of Actin Filament Turnover by Severing and Nucleation at Different Concentrations of ADF/Cofilin. *Molecular Cell* **24**, 13–23 (2006).

162. Cruz, E. M. D. L. & Pollard, T. D. Kinetics and thermodynamics of phalloidin binding to actin filaments from three divergent species. *Biochemistry* (1996) doi:10.1021/bi961047t.

163. De La Cruz, E. M. & Pollard, T. D. Transient kinetic analysis of rhodamine phalloidin binding to actin filaments. *Biochemistry* **33**, 14387–14392 (1994).

164. Winkelman, J. D. et al. Fascin- and α-Actinin-Bundled Networks Contain Intrinsic Structural Features that Drive Protein Sorting. *Current Biology* **26**, 2697–2706 (2016).

165. Blanchoin, L., Pollard, T. D. & Mullins, R. D. Interactions of ADF/cofilin, Arp2/3 complex, capping protein and profilin in remodeling of branched actin filament networks. *Curr. Biol.* **10**, 1273–1282 (2000).

166. Zwolak, A., Fujiwara, I., Hammer, J. A. & Tjandra, N. Structural Basis for Capping Protein Sequestration by Myotrophin (V-1). *J Biol Chem* **285**, 25767–25781 (2010).

167. Hansen, S. D. & Mullins, R. D. VASP is a processive actin polymerase that requires monomeric actin for barbed end association. *J Cell Biol* **191**, 571–584 (2010).

168. Maiti, S. et al. Structure and activity of full-length formin mDia1. *Cytoskeleton (Hoboken)* **69**, 393–405 (2012).
169. Goode, B. & Eck, M. Mechanism and Function of Formins in Control of Actin Assembly. *Annual review of biochemistry* **76**, 593–627 (2007).

170. Pring, M., Evangelista, M., Boone, C., Yang, C. & Zigmond, S. H. Mechanism of Formin-Induced Nucleation of Actin Filaments. *Biochemistry* **42**, 486–496 (2003).

171. Castrillon, D. H. & Wasserman, S. A. diaphanous is required for cytokinesis in Drosophila and shares domains of similarity with the products of the limb deformity gene. **11**.

172. Chalkia, D., Nikolaidis, N., Makalowski, W., Klein, J. & Nei, M. Origins and Evolution of the Formin Multigene Family That Is Involved in the Formation of Actin Filaments. *Mol Biol Evol* **25**, 2717–2733 (2008).

173. Goh, W. I. & Ahmed, S. mDia1-3 in mammalian filopodia. *Commun Integr Biol* **5**, 340–344 (2012).

174. Block, J. et al. Filopodia formation induced by active mDia2/Drf3. *Journal of Microscopy* **231**, 506–517 (2008).

175. Matusek, T. et al. Formin Proteins of the DAAM Subfamily Play a Role during Axon Growth. *J. Neurosci.* **28**, 13310–13319 (2008).

176. Jaiswal, R. et al. The Formin Daam1 and Fascin Directly Collaborate to Promote Filopodia Formation. *Current Biology* **23**, 1373–1379 (2013).

177. Pfisterer, K. et al. FMNL2 regulates dynamics of fascin in filopodia. *Journal of Cell Biology* **219**, (2020).

178. Harris, E. S., Gauvin, T. J., Heimsath, E. G. & Higgs, H. N. Assembly of filopodia by the formin FRL2 (FMNL3). *Cytoskeleton* **67**, 755–772 (2010).

179. Tojkander, S., Gateva, G. & Lappalainen, P. Actin stress fibers – assembly, dynamics and biological roles. *J Cell Sci* **125**, 1855–1864 (2012).

180. Lammel, U. et al. The Drosophila FHOD1-like formin Knittrig acts through Rok to promote stress fiber formation and directed macrophage migration during the cellular immune response. *Development* **141**, 1366–1380 (2014).
181. Innocenti, M. New insights into the formation and the function of lamellipodia and ruffles in mesenchymal cell migration. *Cell Adhesion & Migration* **12**, 401–416 (2018).

182. Kage, F. et al. FMNL formins boost lamellipodial force generation. *Nature Communications* **8**, 14832 (2017).

183. Breitsprecher, D. & Goode, B. L. Formins at a glance. *J Cell Sci* **126**, 1–7 (2013).

184. Thompson, S. B. et al. Formin-like 1 mediates effector T cell trafficking to inflammatory sites to enable T cell-mediated autoimmunity. *eLife* **9**, e58046 (2020).

185. Lai, S.-L. et al. Diaphanous-Related Formin 2 and Profilin 1 Are Required for Gastrulation Cell Movements. *PLOS ONE* **3**, e3439 (2008).

186. Li, D. et al. Dishevelled-associated activator of morphogenesis 1 (Daam1) is required for heart morphogenesis. *Development* **138**, 303–315 (2011).

187. Zigmond, S. H. et al. Formin leaky cap allows elongation in the presence of tight capping proteins. *Curr Biol* **13**, 1820–1823 (2003).

188. Sharma, S. et al. Nanostructured self-assembly of inverted formin 2 (INF2) and F-actin-INF2 complexes revealed by atomic force microscopy. *Langmuir* **30**, 7533–7539 (2014).

189. Rivero, F. et al. A comparative sequence analysis reveals a common GBD/FH3-FH1-FH2-DAD architecture in formins from Dictyostelium, fungi and metazoa. *BMC Genomics* **6**, 28 (2005).

190. Shimada, A. et al. The Core FH2 Domain of Diaphanous-Related Formins Is an Elongated Actin Binding Protein that Inhibits Polymerization. *Molecular Cell* **13**, 511–522 (2004).

191. Xu, Y. et al. Crystal structures of a Formin Homology-2 domain reveal a tethered dimer architecture. *Cell* **116**, 711–723 (2004).

192. Thompson, M. E., Heimsath, E. G., Gauvin, T. J., Higgs, H. N. & Kull, F. J. FMNL3 FH2-actin structure gives insight into formin-mediated actin nucleation and elongation. *Nat Struct Mol Biol* **20**, 111–118 (2013).

193. Lu, J. et al. Structure of the FH2 domain of Daam1: implications for formin regulation of actin assembly. *J Mol Biol* **369**, 1258–1269 (2007).
194. Yamashita, M. *et al.* Crystal structure of human DAAM1 formin homology 2 domain. *Genes to Cells* **12**, 1255–1265 (2007).

195. Cintio, O., Adami, R., Choquet, D. & Grazi, E. On the elastic properties of tetramethylrhodamine F-actin. *Biophys Chem* **92**, 201–207 (2001).

196. Kudryashov, D. S., Phillips, M. & Reisler, E. Formation and Destabilization of Actin Filaments with Tetramethylrhodamine-Modified Actin. *Biophysical Journal* **87**, 1136–1145 (2004).

197. Paul, A. S. & Pollard, T. D. Review of the mechanism of processive actin filament elongation by formins. *Cell Motil Cytoskeleton* **66**, 606–617 (2009).

198. Cao, L. *et al.* Modulation of formin processivity by profilin and mechanical tension. *eLife* **7**.

199. Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N. & Pollard, T. D. Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin. *Cell* **124**, 423–435 (2006).

200. Courtemanche, N. & Pollard, T. D. Determinants of Formin Homology 1 (FH1) Domain Function in Actin Filament Elongation by Formins *. *Journal of Biological Chemistry* **287**, 7812–7820 (2012).

201. Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D. & Greene, E. C. Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin. *Proceedings of the National Academy of Sciences* **110**, 9752–9757 (2013).

202. Vavylonis, D., Kovar, D. R., O'Shaughnessy, B. & Pollard, T. D. Model of Formin-Associated Actin Filament Elongation. *Mol Cell* **21**, 455–466 (2006).

203. Courtemanche, N. Mechanisms of formin-mediated actin assembly and dynamics. *Biophys Rev* **10**, 1553–1569 (2018).

204. Horan, B. G., Zerze, G. H., Kim, Y. C., Vavylonis, D. & Mittal, J. Computational modeling highlights the role of the disordered Formin Homology 1 domain in profilin-actin transfer. *FEBS Lett* **592**, 1804–1816 (2018).
205. Nezami, A., Poy, F., Toms, A., Zheng, W. & Eck, M. J. Crystal structure of a complex between amino and carboxy terminal fragments of mDia1: insights into autoinhibition of diaphanous-related formins. *PLoS One* 5, (2010).

206. Otomo, T., Tomchick, D. R., Otomo, C., Machius, M. & Rosen, M. K. Crystal Structure of the Formin mDia1 in Autoinhibited Conformation. *PLOS ONE* 5, e12896 (2010).

207. Ramalingam, N. et al. Phospholipids regulate localization and activity of mDia1 formin. *Eur J Cell Biol* 89, 723-732 (2010).

208. Gorelik, R., Yang, C., Kameswaran, V., Dominguez, R. & Svitkina, T. Mechanisms of plasma membrane targeting of formin mDia2 through its amino terminal domains. *Mol Biol Cell* 22, 189-201 (2011).

209. Gould, C. J. et al. The Formin DAD Domain Plays Dual Roles in Autoinhibition and Actin Nucleation. *Current Biology* 21, 384-390 (2011).

210. Vizcarra, C. L., Bor, B. & Quinlan, M. E. The Role of Formin Tails in Actin Nucleation, Processive Elongation, and Filament Bundling. *J Biol Chem* 289, 30602-30613 (2014).

211. Harris, E. S., Rouiller, I., Hanein, D. & Higgs, H. N. Mechanistic Differences in Actin Bundling Activity of Two Mammalian Formins, FRL1 and mDia2 *. *Journal of Biological Chemistry* 281, 14383-14392 (2006).

212. Michelot, A. et al. A novel mechanism for the formation of actin-filament bundles by a nonprocessive formin. *Curr Biol* 16, 1924-1930 (2006).

213. Mizuno, H. et al. Rotational movement of the formin mDia1 along the double helical strand of an actin filament. *Science* 331, 80-83 (2011).

214. Shemesh, T., Otomo, T., Rosen, M. K., Bershadsky, A. D. & Kozlov, M. M. A novel mechanism of actin filament processive capping by formin : solution of the rotation paradox. *Journal of Cell Biology* 170, 889-893 (2005).

215. Aydin, F., Courtemanche, N., Pollard, T. D. & Voth, G. A. Gating mechanisms during actin filament elongation by formins. *eLife* 7, e37342 (2018).
216. Kovar, D. R. & Pollard, T. D. Insertional assembly of actin filament barbed ends in association with formins produces piconewton forces. *PNAS* **101**, 14725–14730 (2004).

217. Yu, M. *et al*. mDia1 senses both force and torque during F-actin filament polymerization. *Nature Communications* **8**, 1650 (2017).

218. Popp, D. *et al*. Advances in Structural Biology and the Application to Biological Filament Systems. *Bioessays* **40**, e1700213 (2018).

219. Effantin, G. Etudes par cryo-microscopie électronique de la structure de virus: application aux bactériophages Gifsy-2 de Salmonella Typhimirium et T5 d'Escherichia Coli. 191 (2005).

220. Ruska, E. The early development of electron lenses and electron microscopy. *Microsc Acta Suppl* 1–140 (1980).

221. Boekema, E. J., Folea, M. & Kouřil, R. Single particle electron microscopy. *Photosynth Res* **102**, 189–196 (2009).

222. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F. & Iadaza, M. G. Variations on Negative Stain Electron Microscopy Methods: Tools for Tackling Challenging Systems. *Journal of Visualized Experiments : JoVE* (2018) doi:10.3791/57199.

223. Adrian, M., Dubochet, J., Lepault, J. & McDowall, A. W. Cryo-electron microscopy of viruses. *Nature* **308**, 32–36 (1984).

224. Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J. & Welter, L. M. Electron Gun Using a Field Emission Source. *Review of Scientific Instruments* **39**, 576–583 (1968).

225. Grigorieff, N. Direct detection pays off for electron cryo-microscopy. *eLife* **2**, e00573 (2013).

226. Scheres, S. H. W. A Bayesian View on Cryo-EM Structure Determination. *J Mol Biol* **415**, 406–418 (2012).

227. Milligan, R. A., Whittaker, M. & Safer, D. Molecular structure of F-actin and location of surface binding sites. *Nature* **348**, 217–221 (1990).

228. Holmes, K. C., Angert, I., Jon Kull, F., Jahn, W. & Schröder, R. R. Electron cryo-microscopy shows how strong binding of myosin to actin releases nucleotide. *Nature* **425**, 423–427 (2003).
229. Chou, S. Z. & Pollard, T. D. *Mechanism of actin polymerization revealed by cryo-EM structures of actin filaments with three different bound nucleotides*. http://bio-rxiv.org/lookup/doi/10.1101/309534 (2018) doi:10.1101/309534.

230. Chou, S. Z. & Pollard, T. D. Cryo-electron microscopy structures of pyrene-labeled ADP-P i - and ADP-actin filaments. *Nature Communications* **11**, 5897 (2020).

231. Narita, A. & Maéda, Y. Molecular Determination by Electron Microscopy of the Actin Filament End Structure. *Journal of Molecular Biology* **365**, 480–501 (2007).

232. Shaaban, M., Chowdhury, S. & Nolen, B. J. Cryo-EM reveals the transition of Arp2/3 complex from inactive to nucleation-competent state. *Nature Structural & Molecular Biology* **27**, 1009–1016 (2020).

233. Volkmann, N., Page, C., Li, R. & Hanein, D. Three-dimensional reconstructions of actin filaments capped by Arp2/3 complex. *Eur J Cell Biol* **93**, 179–183 (2014).

234. Pinder, J. C., Bray, D. & Gratzer, W. B. Actin polymerisation induced by spectrin. *Nature* **258**, 765–766 (1975).

235. Sept, D., Xu, J., Pollard, T. D. & Andrew McCammon, J. Annealing Accounts for the Length of Actin Filaments Formed by Spontaneous Polymerization. *Biophysical Journal* **77**, 2911–2919 (1999).

236. Carlier, M. F., Pantaloni, D. & Korn, E. D. Steady state length distribution of F-actin under controlled fragmentation and mechanism of length redistribution following fragmentation. *Journal of Biological Chemistry* **259**, 9987–9991 (1984).

237. Preparation of Uranyl Formate Stain | The Grigorieff Lab. https://grigoriefflab.umass-med.edu/preparation.uranyl_formate_stain.

238. Cryo-electron Microscope Developed for Simultaneous STEM, SEM Imaging and Its Application to Biological Samples | SI NEWS : Hitachi High-Tech GLOBAL. https://www.hitachi-hightech.com/global/sinews/si_report/100201/.
239. Graphene Oxide Grid Preparation. figshare /articles/media/Graphene_Oxide_Grid_Prepar-
tion/3178669/1 (2016) doi:10.6084/m9 figshare.3178669.v1.

240. Palovcak, E. et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. *J Struct Biol* **204**, 80–84 (2018).

241. Penczek, P. A. Image Restoration in Cryo-electron Microscopy. *Methods Enzymol* **482**, 35–72 (2010).

242. Yasunaga, T. & Wakabayashi, T. Extensible and object-oriented system Eos supplies a new environment for image analysis of electron micrographs of macromolecules. *J Struct Biol* **116**, 155–160 (1996).

243. Frank, J. et al. SPIDER and WEB: Processing and Visualization of Images in 3D Electron Microscopy and Related Fields. *Journal of Structural Biology* **116**, 190–199 (1996).

244. Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. *J Comput Chem* **25**, 1605–1612 (2004).

245. Cao, L., Yonis, A., Vaghela, M. et al. SPIN90 associates with mDia1 and the Arp2/3 complex to regulate cortical actin organization. *Nat Cell Biol* **22**, 803–814 (2020).

246. Harsimran, K. et al. Low-intensity magnetic fields assisted alignment of actin filaments. *Int. J. Biol. Macromol.* **47**, 371-374, (2010).

247. Nans, A. et al. Native Ultrastructure of the Red Cell Cytoskeleton by Cryo-Electron Tomogra-
phy. Biophys J. **101** (10), 2341–2350 (2011).

248. Rouiller, I. et al. The structural basis of actin filament branching by the Arp2/3 complex. J Cell Biol **180** (5), 887–895 (2008).

249. Mizuno, H. et al. Helical rotation of the diaphanous-related formin mDia1 generates actin filaments resistant to cofilin. PNAS **115** (22), 5000-5007 (2018).
# RÉSUMÉ

Les Formines sont des protéines régulatrices clés pour l'assemblage des filaments d'actine dans les cellules. Les formines y stimulent la nucléation et l'élongation rapide de filaments d'actine. L'activité des formines participe ainsi à la génération de structures fonctionnelles et se retrouvent impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux comme la migration ou la division cellulaire. À l'échelle moléculaire, les formines constituent des homodimères capables d'interagir avec les extrémités barbées des filaments d'actine en elongation via leurs domaines FH2. Bien que les changements conformationnels impliqués dans cette traque des bouts barbés n'aient jamais été observés directement, des études de biochimie, biophysique et biologie structurale suggèrent que le dimère de FH2 se déplace pas à pas à l'extrémité barbée polymérisante, à travers un équilibre entre deux états dits « fermé » et « ouvert ». Dans l'état « fermé », aucune nouvelle sous-unité d'actine ne peut être ajoutée à l'extrémité barbée tandis que cet évènement est permis dans l'état « ouvert ». Plusieurs modèles coexistent et sont en discussion pour décrire la conformation structurale de ces deux états ainsi que la transition de l'un vers l'autre. On peut alors évoquer le modèle de la « marche enjambée » et le modèle du « saut enclenché ». Mon projet de recherche a eu pour objet de lever les interrogations qui persistent quant à la nature des états conformationnels adoptés par la formine au bout barbé, plus particulièrement pour la formine de mammifère mDia1. Pour cela j'ai utilisé essentiellement des méthodes de biologie structurale par microscopie électronique. Aucune structure en microscopie électronique n'avait été obtenue jusqu'à présent. En effet, rapidement, en présence de formines, de longs filaments d'actine sont générés et ne permettent pas l'obtention d'une densité élevée de courts filaments coiffés de formines, nécessaire à une analyse en particules isolées. Un goulot d'étranglement a donc dû être surmonté afin d'optimiser les échantillons pour une telle analyse. Une approche par sonication a ainsi été choisie. Une première enveloppe 3D du complexe formé par l'extrémité barbée et le dimère de FH2 a pu être déterminée en coloration négative. Cette enveloppe correspond à l'état « ouvert » du modèle de la « marche enjambée ». Après une optimisation du protocole de traitement d'images, une seconde conformation 3D du complexe a pu être déterminée correspondant cette fois à l'état « fermé » du modèle de la « marche enjambée » minoritaire. Une étude à deux dimensions plus poussée a également permis de mettre en évidence des variations conformationnelles au sein même de l'état « ouvert ». Ces observations ont permis de proposer l'hypothèse que, pour des conformations extrêmes, le dimère de FH2 peut se retrouver non plus à encercler l'extrémité barbée mais le corps même des filaments d'actine. La recherche d'une telle configuration a pu être validée par des analyses 2D ainsi qu'une densité 3D préliminaire d'un complexe d'un dimère de FH2 encerclant le corps d'un filament. L'adaptation de mes échantillons vers la cryo-microscopie a été débutée. En particulier, des feuilles d'oxide de graphène ont été déposés sur les grilles de microscopie pour conserver une densité d'extrémités de filaments d'actine suffisante. Une quantité limitée d'extrémités a pu être analysée par classification 2D et 3D confirmant tout au moins la nature non artéfactuelle de l'état ouvert précédemment observé.

Enfin, j'ai également pu contribuer à travers cette thèse à l'étude de l'action synergique de la Formine avec Arp2/3 en présence de Spin90 via la mise en évidence d'un complexe tétramérique.

# MOTS CLÉS

Biologie Structurale – Microscopie électronique – Cytosquelette – Formine – Actine

# ABSTRACT

Formins are key regulators of the assembly of actin filaments in cells. Formins induce the nucleation and rapid elongation of actin filaments. The activity of formins thus participates in the generation of functional structures such as filopodia, stress fibers or the cytokinetic ring. Hence, formins are involved in fundamental cellular processes such as migration or cell division. At the molecular level, formins are homodimers capable of interacting with the barbed ends of elongating actin filaments via their FH2 domains. The conformational changes involved in tracking the barbed ends have never been directly observed. However, a set of biochemical, biophysical and structural biology studies evidence that the FH2 dimer moves stepwise at the barbed end, following an equilibrium between two states : "closed" and "opened". In the closed state, no new actin subunit can be added to the barbed end, while it is allowed in the opened state. Several models, under discussion, describe the structural nature of these two states and how they alternate. One can then evoke the « stair-stepping » model and the « stepping second » model.

My thesis aims at elucidating the debate about the conformational states adopted by formin at the barbed end, focusing on the mammalian formin mDia1. Our goal was undertaken using electron microscopy. So far, formins bound to the barbed ends of actin has not been described using electron microscopy. Indeed, to pursue single particle analysis by EM, a sufficient density of objects of interest randomly oriented have to be displayed within an image. Formins bound to actin rapidly generate long filaments, preventing the obtention of enough short filaments exhibiting formins at their barbed ends. Thus, a bottleneck had to be overcome to make the samples suitable for single particle structural analysis. A sonication approach was chosen to produce short actin filaments. A first 3D reconstruction of the FH2 dimer-actin complex was obtained from negative stain electron microscopy samples. This envelope corresponds to the open state of the « stair stepping » model. After optimizing the image analysis protocol, a second 3D conformation of the complex could be determined, corresponding to the closed state of the so-called « stair stepping » model, which was minoritary. A further 2D study also revealed conformational variations within the open state. These observations led to the hypothesis that, for extreme conformations, the FH2 dimer can be found not only at the barbed end but also on the body of the actin filaments. The search for such a configuration could be validated by 2D analyses and a preliminary 3D density of an FH2 dimer complex encircling the body of an actin filament. We have adapted our samples to cryo-electron microscopy. Graphene-Oxide was added to the surface of the EM grids to preserve a sufficient actin filament ends density. A limited quantity of filament ends could be analyzed through 2D and 3D classifications. It thus confirms the non-artefactual nature of the previously observed open state.

In addition, through a collaborative project, I also showed the synergistic action of Formin with Arp2/3 in the presence of Spin90 by highlighting the formation of a tetramer.

# KEYWORDS