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# Le nucléosome centromérique et la fibre de chromatine

Natalia Conde E Silva

► To cite this version:

Natalia Conde E Silva. Le nucléosome centromérique et la fibre de chromatine. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Pierre et Marie Curie (Paris 6), 2007. Français. NNT: tel-04336802

HAL Id: tel-04336802

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Submitted on 13 Dec 2023

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THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PIERRE ET MARIE

CURIE

Spécialité

BIOLOGIE MOLECULAIRE

Présentée par

NATALIA CONDE E SILVA

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS VI

Sujet de la thèse :

LE NUCLEOSOME CENTROMERIQUE

ET LA FIBRE DE CHROMATINE

Soutenance prévue le 31 janvier 2007

Devant le jury composé de

<table><tr><td>Thierry FOULON</td><td>Président</td></tr><tr><td>Olivier HYRIEN</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Françoise LIVOLANT</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>François STRAUSS</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Térence STRICK</td><td>Examinateur</td></tr><tr><td>Ariel PRUNELL</td><td>Directeur de thèse</td></tr></table>
<figure><img src="image_2.png" /></figure>
THESE DE DOCTORAT DE L'UNIVERSITE PIERRE ET MARIE

CURIE

Spécialité

BIOLOGIE MOLECULAIRE

Présentée par

NATALIA CONDE E SILVA

Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITE PARIS VI

Sujet de la thèse :

LE NUCLEOSOME CENTROMERIQUE

ET LA FIBRE DE CHROMATINE

Soutenance prévue le 31 janvier 2007

Devant le jury composé de

Thierry FOULON Président

Olivier HYRIEN Rapporteur

Françoise LIVOLANT Rapporteur

François STRAUSS Examinateur

Térence STRICK Examinateur

Ariel PRUNELL Directeur de thèse
# SOMMAIRE

## CHAPITRE 1 : ORGANISATION DE LA CHROMATINE....7

I. LES PRINCIPAUX PARTENAIRES DE LA CHROMATINE..................9

I.1 L'ADN..................................................................................9

I.1.1 La structure ..................................................................................9

I.1.2 La courbure..................................................................................11

I.1.3 Rappels de topologie ........................................................................11

I.2 Les histones ..................................................................................14

II. L'UNITÉ ÉLÉMENTAIRE ET RÉPÉTITIVE DE LA CHROMATINE : LE

NUCLÉOSOME..................................................................................18

II.1 La structure du nucléosome..................................................18

II.2 Le positionnement........................................................................20

II.2.1 En rotation et en translation....................................................20

II.2.2 Les méthodes d'analyse................................................................21

II.2.3 Les séquences positionnantes ....................................................22

II.3 Le remodelage des nucléosomes ..................................................23

II.3.1 La méthylation de l'ADN ................................................................23

II.3.2 Les modifications des histones ....................................................23

II.3.3 Les facteurs de remodelage....................................................25

II.3.4 Les variants des histones ..........................................................26

II.4 Les grands processus nucléaires et le nucléosome....................29

II.4.1 La transcription ........................................................................29

II.4.2 La réplication ........................................................................31

III. DU NUCLÉOSOME AU CHROMOSOME MÉTAPHASIQUE ................33

III.1 Le chromatosome........................................................................33

III.1.1 La structure des histones de liaison........................................33

III.1.2 Le positionnement des histones de liaison sur le nucléosome................33

III.1.3 La variabilité des histones de liaison et leur modifications................35

III.1.4 Le rôle des histones de liaison ....................................................36

III.2 La fibre de 30 nm........................................................................36

III.2.1 Quelques modèles ........................................................................36

III.2.2 Les caractéristiques de la fibre de 30 nm ....................................37

III.3 Les structures secondaires ..........................................................38

III.3.1 L'oligomérisation........................................................................38

III.3.2 Autres protéines ou complexes impliqués dans des structures secondaires................38

III.4 Les boucles chromatiniennes et au-delà........................................39
<table><tr><td>III.5</td><td>La dynamique de la chromatine</td><td>40</td></tr><tr><td>IV.</td><td>UN DOMAINE CHROMATINIEN PARTICULIER : LE CENTROMÈRE</td><td>41</td></tr><tr><td>IV.1</td><td>Généralités</td><td>41</td></tr><tr><td>IV.2</td><td>La chromatine centromérique</td><td>41</td></tr><tr><td>IV.2.1</td><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>41</td></tr><tr><td>IV.2.2</td><td>Schizosaccharomyces pombe</td><td>42</td></tr><tr><td>IV.2.3</td><td>Les eucaryotes supérieurs</td><td>42</td></tr><tr><td>IV.2.4</td><td>Cas particuliers</td><td>45</td></tr><tr><td>IV.3</td><td>Le variant centromérique de l'histone H3</td><td>46</td></tr><tr><td>IV.3.1</td><td>Les caractéristiques de CENP-A</td><td>46</td></tr><tr><td>IV.3.2</td><td>L'adressage de CENP-A au centromère : une question vitale</td><td>47</td></tr></table>

# CHAPITRE 2 : LES TECHNIQUES UTILISEES ET LEURS APPORTS

## I. LA TECHNIQUE DES MINICERCLES

I.1 Le paradoxe du nombre d'enplacements de l'ADN dans la chromatine

I.2 Les bases théoriques pour l'approche dite "des minicercles"

I.2.1 Les minicercles nus

I.2.2 Les minicercles reconstitués

I.3 La dynamique du nucléosome

I.3.1 Les "instantanés" de microscopie électronique

I.3.2 Les trois conformations

I.3.3 Les queues des histones

I.3.4 L'énergie élastique de la boucle

I.3.5 Le polymorphisme de séquence

I.4 La dynamique du tétrasome

I.4.1 Les données expérimentales

I.4.2 La transition chirale

I.5 La dynamique du chromatosome

## II. MICROMANIPULATION DE FIBRES INDIVIDUELLES DE CHROMAMATINE

II.1 Les dispositifs

II.2 La réponse mécanique en traction...

II.2.1 ...d'une molécule d'ADN

II.2.2 ...d'une fibre la chromatine

II.3 La réponse mécanique en rotation...

II.3.1 ...d'une molécule d'ADN

II.3.2 ...d'une fibre de chromatine
# CHAPITRE 3 : RESULTATS ET DISCUSSION......................77

## ARTICLE I : DESASSEMBLAGE PREFERENTIEL DES NUCLEOSOMES
CENP-A. CONTRIBUTION POSSIBLE À SA LOCALISATION

EXCLUSIVE AU CENTROMERE ....................................................79

I.1 Résumé .................................................................................... 79

I.2 Introduction .................................................................................... 79

I.3 Article............................................................................................ 79

I.4 Résultats complémentaires ............................................................ 115

I.5 Résultats et discussion........................................................................ 118

## ARTICLE II : PLASTICITÉ STRUCTURALE D'UNE FIBRE UNIQUE DE

CHROMATINE REVELEE PAR MANIPULATION EN ROTATION ........121

II.1 Résumé .................................................................................... 121

II.2 Article............................................................................................ 121

II.3 Résultats et discussion........................................................................ 146

## ARTICLE III : FIBRES DE CHROMATINE SOUS CONTRAINTE

ROTATIONNELLE POSITIVE : UNE TRANSITION CHIRALE POSSIBLE

DU NUCLÉOSOME............................................................................149

III.1 Résumé .................................................................................... 149

III.2 Article............................................................................................ 149

III.3 Résultats et discussion........................................................................ 184

# CHAPITRE 4 : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES..................187

# ANNEXE.................................................................191

## ARTICLE IV : CARACTERISATION DES NUCLEOSOMES CONTENANT UN

VARIANT HUMAIN DE L'HISTONE H2B (hTSH2B) ....................193

# BIBLIGRAPHIE.................................................................203
# CHAPITRE 1 :

## ORGANISATION DE LA

## CHROMATINE
# I. LES PRINCIPAUX PARTENAIRES DE LA CHROMATINE

## I.1 L'ADN

### I.1.1 La structure

L'Acide DésoxyriboNucléique, ou ADN, est un polymère de nucléotides composés d'un groupement phosphate, d'un sucre (un désoxyribose) et d'une base azotée (figure 1A). La succession de ces nucléotides forme un brin dont l'orientation est définie, par convention, de 5' (pour l'extrémité phosphate libre) vers 3' (pour l'extrémité hydroxyle du sucre) (figure 1B). Deux brins orientés anti-parallèlement s'enroulent l'un autour de l'autre dans le sens direct de la trigonométrie pour former la double hélice d'ADN. Cette structure est stabilisée par des interactions d'empilement (stacking) et des liaisons hydrogènes entre les bases des deux brins : la guanine G s'associe à la cytosine C et l'adénine A avec la thymine T (figure 1C). Ces bases associées forment ce qu'on appelle couramment les paires de bases (pb). Plusieurs conformations de la double hélice ont été découvertes dont les plus connues sont les formes A, Z et B (figure 2, tableau 1).

L'ADN-A pourrait résider à des sites spécifiques, tels les promoteurs et les sites d'interaction des facteurs de transcription. Cette conformation est favorisée par un faible taux d'humidité (<75%). L'hélice de la forme A est large (2,6 nm de diamètre) avec des paires de bases bien inclinées tournant un peu au-delà de l'axe de l'hélice. Le sillon mineur est mince et profond, alors que le sillon majeur est peu profond.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1 : L'acide désoxyribonucléique</figcaption></figure>

(A) Un nucléotide ; (B) un brin d'ADN montrant les liaisons phosphodiesters ; (C) l'appariement des bases.
La *forme Z de l'ADN* est une hélice gauche qui se distingue aussi par le chemin en zigzag du squelette ribose-phosphate. Cette conformation est favorisée par des séquences purine-pyrimidine alternées, ainsi que par une concentration saline élevée.

L'**ADN-B** est la conformation canonique de la double hélice. Des études de diffraction aux rayons X indiquent que, dans les conditions physiologiques, l'ADN est une hélice régulière droite avec un diamètre de 2 nm, faisant un tour complet tous les 3,4 nm environ. Cette structure de l'ADN a approximativement 10,5 pb/tour d'hélice, avec une variation selon la séquence des bases de 9,9 à 11,1 pb/tour. Chaque paire de bases tourne approximativement de 34° (360°/10,5) autour de l'axe de l'hélice relativement à la paire de bases précédente. La double hélice résultante a un sillon mineur d'une largeur de 1,2 nm, et un grand sillon de 2,2 nm. La géométrie des sillons majeurs et mineurs est cruciale pour les interactions des protéines avec le squelette ribose-phosphate. Dans la suite de cet exposé, nous ne ferons plus référence qu'à l'ADN-B.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 2 : Les principales conformations de l'ADN</figcaption></figure>

Pour chaque conformation, à gauche : les structures en rubans, au centre : les hélices vues de dessus et à droite : les hélices en structure pleine.

<table><caption>Tableau 1 : Caractéristiques des 3 conformations majeures de la double hélice d'ADN</caption><thead><tr><th>conformation</th><th>A</th><th>Z</th><th>B</th></tr></thead><tbody><tr><td>hélicité</td><td>droite</td><td>gauche</td><td>Droite</td></tr><tr><td>pb/tour</td><td>11.0</td><td>12.0</td><td>10.5</td></tr><tr><td>diamètre</td><td>~ 26 Å</td><td>~ 18 Å</td><td>~20 Å</td></tr><tr><td>grand sillon</td><td>étroit, profond</td><td>plat</td><td>large, profond</td></tr><tr><td>petit sillon</td><td>large, peu profond</td><td>étroit, profond</td><td>étroit, profond</td></tr></tbody></table>
### I.1.2 La courbure

L'ADN peut être courbé ou se courber. Lorsque la courbure de la double hélice est due à une séquence particulière, la courbure est dite intrinsèque (la courbure est présente en solution sans qu'aucune force ne soit appliquée). Si cette déformation est due à des contraintes extérieures, la courbure est induite. La flexibilité (facilité avec laquelle une courbure de l'ADN est induite) peut être anisotrope, par exemple dirigée sur le grand sillon, ou isotrope, ceci en fonction de la séquence. Les protéines exploitent souvent une courbure intrinsèque ou une anisotropie de la flexibilité pour faciliter leur interaction avec l'ADN.

### I.1.3 Rappels de topologie

#### Nombre d'enlacements, torsion et vrillage

✓ Le nombre de fois qu'un brin de la double hélice croise l'autre brin, lorsque que la molécule est à plat, définit le nombre d'enlacements, noté Lk (Linking number). C'est un invariant topologique, fixé une fois que les extrémités de l'ADN sont immobilisées (et entier dans le cas des cercles). Par convention, Lk est positif pour une double hélice droite. Il est relié à deux paramètres géométriques, Tw et Wr qui dépendent de la forme de l'ADN dans l'espace, par l'équation (White, 1969 ; Fuller, 1971) :

$$Lk = Tw + Wr \quad (1)$$

Des molécules d'ADNs circulaires qui ne diffèrent que par leur nombre d'enplacements sont des topoisomères.

✓ Tw (Twisting number) représente la torsion de l'ADN, c'est-à-dire le nombre de tours qu'effectue l'un des deux brins autour de l'axe de la double hélice (figure 3). Par définition :

$$Tw = N / h \quad (2)$$

où N est le nombre de paires de base du fragment considéré et h le pas de la double hélice (en pb/tour). Une augmentation du pH ou de la température déroule l'ADN et donc augmente h et diminue la torsion. A l'inverse, une augmentation de la concentration en sel, qui écrante les charges négatives et diminue la répulsion entre les deux brins, diminue h et augmente Tw. Certaines drogues peuvent également modifier la torsion de l'ADN : la chloroquine et le bromure d'éthidium s'intercalent entre les plateaux des paires de bases (pb) et déroulent la double hélice ; la nétropsine, en se fixant sur le petit sillon des séquences riches en adénine, provoque un fléchissement de l'axe de l'ADN et augmente la torsion (figure 4). On utilise
<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 3 : Représentations de la torsion (à gauche) et du vrillage (à droite) (d'après Saenger, 1988)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 4 : Modification de la torsion de l'ADN</figcaption></figure>

(A) Déroulement de la double hélice par intercalation du BET (en rouge) ou de la chloroquine (en bleu) entre les paires de bases. (B) Augmentation de la torsion de la double hélice par interaction de la nétropsine (en vert) avec le petit sillon.

donc ces molécules pour la fabrication des plasmides ou des minicercles sous- ou sur-enroulés.

✓ Wr (Writhing number) représente le vrillage de l'ADN, c'est-à-dire le nombre de croisements qu'effectue l'axe de la double hélice sur lui-même (figure 3). En se fixant à l'ADN, certaines protéines modifient la trajectoire de la double hélice, créant ainsi du vrillage. Un exemple extrême est celui de l'ADN enroulé autour d'un octamère d'histones pour former le nucléosome. Nous y reviendrons par la suite.

Pour une molécule relâchée (sans contrainte), le vrillage est nul ($Wr = 0$) et la molécule est plane. Un nombre d'enplacements de référence $Lk_0$, dit “le plus probable”, est alors défini par l'équation :
$$L_{k0} = T_{w0} = N / h_{0} \quad (3)$$

$h_0$ étant le pas de l'ADN dans l'état relâché. Notons que si Lk est entier, Lk₀ ne l'est pas forcément.

## Contrainte de surenroulement et énergie

La contrainte de surenroulement est exprimée par :

$$\Delta L_k = L_k - L_{k0} = \Delta T_w + \Delta W_r \quad (4)$$

où $\Delta W_r = W_r - W_{r0}$. Avec $W_{r0} = 0$ pour l'état relâché, on obtient :

$$\Delta L_k = \Delta T_w + W_r \quad (5)$$

On définit la densité de surenroulement, $\sigma = \Delta L_k/L_{k0}$. Cette valeur, indépendante de la taille de l'ADN, représente l'excès ou le déficit relatif de tours de l'ADN par rapport à l'état relâché. *In vivo*, chez les eucaryotes comme chez les procaryotes, $\sigma = -0,05$ ce qui signifie qu'il manque 5 % des tours, soit environ un tour pour 200 pb. Pour les eucaryotes, la raison en est la présence des nucléosomes : on dit que tout le surenroulement est contraint. Chez les procaryotes, on estime que seulement la moitié est contraint. Le reste est libre et sert peut-être à déstabiliser la double hélice pour rendre les séquences accessibles aux protéines régulatrices.

L'équation (4) montre que lorsqu'on change $\Delta L_k$ (par coupure et nouvelle liaison ; voir plus loin), la contrainte générée se répartit entre torsion et vrillage (figure 5). Cette répartition est variable. Un ADN long préférera le vrillage alors qu'un court optera davantage pour la torsion. Des courbures de l'ADN peuvent favoriser le vrillage.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 5 : Répartition torsion (Tw)-vrillage (Wr)</figcaption></figure>

Lorsqu'on introduit une contrainte de $\Delta L_k = -3$ tours dans un ADN circulaire (par coupure suivie de refermeture), celle-ci se répartit entre torsion et vrillage.
Différentes enzymes (appelées topoisomérides) sont capables de modifier Lk. D'un côté, on trouve des topoisomérides passives qui relâchent l'ADN, comme la topoisomérase I (qui effectue une coupure sur un seul brin, ce qui modifie Lk par incrément d'une unité) ou la topoisomérase II (qui coupe les deux brins de l'ADN et modifie le nombre d'enplacements de deux unités). De l'autre côté, on a des topoisomérides actives qui sont capables, en utilisant l'ATP, de créer du surenroulement négatif (comme la gyrase procaryote ; Wang, 1996) ou positif (la gyrase inverse de certaines archébactéries ; Kikuchi et Asai, 1984).

Lorsqu'on relâche un ADN circulaire surenroulé ou lorsqu'on circularise un ADN linéaire, la population des topoisomères se répartit selon une distribution gaussienne. Ce résultat reflète les fluctuations de rotation d'un brin par rapport à l'autre au moment de la fermeture. $Lk_0$ correspond alors à la moyenne de la distribution. Un topoisomère de Lk différent de $Lk_0$ contient de l'énergie, appelée énergie libre de surenroulement. Cette énergie est proportionnelle au carré de la contrainte (Horowitz et Wang, 1984) et est donnée par :

$$ \Delta G_{SC} = (K_{SC} / N) * \Delta Lk^2 = (K_{SC} / N) * (Lk - Lk_0)^2 \quad (6) $$

Ainsi cette énergie dépend de la taille (N), de la rigidité dynamique ($K_{SC}$ est la constante de force de surenroulement) de l'ADN, et des conditions ioniques, à travers $Lk_0$ et $h_0$ (équation (3)).

## I.2 Les histones

Découvertes en 1884 (Kossel, 1884), les histones ont tout d'abord été considérées comme les éléments porteurs de l'information génétique. Ces protéines sont des composants indispensables des cellules eucaryotes et sont présentes en même quantité pondérale que l'ADN. Les histones sont les protéines les mieux conservées au cours de l'évolution, comme le montre la comparaison historique des séquences de l'histone H4 chez le petit pois et le veau (Delange et coll., 1969). Les gènes sont regroupés et présents en un grand nombre de copies, sans doute pour en assurer une biosynthèse rapide lors de la réplication de l'ADN.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 6 : Séquences des histones du cœur</figcaption></figure>

En haut la séquence des queues, en bas la séquence du domaine dit du “repliement des histones”. Les séquences soulignées sont organisées en hélices α et les résidus surmontés d’un chapeau correspondent aux arginines s’intercalant dans le petit sillon de l’ADN aux SHL indiqués (voir figure 11). Les séquences en gris ne sont pas résolues dans le cristal à 2,8Å de résolution (d’après Luger et coll., 1997).
Les histones H2A, H2B, H3 et H4 (tableau 2) sont des protéines basiques composées d'un domaine appelé "repliement des histones" (ou *histone fold*) et de deux queues N- et C-terminales (figure 6 ; Arents et coll., 1991). Le domaine "repliement des histones" est organisé en trois hélices α et deux boucles β (figure 7A). En fonction des histones, les queues sont en partie structurées en hélices dites accessoires : H3 possède une hélice αN (N pour N-terminale) et H2B une hélice αC. La cinquième histone, l'histone de liaison H1, possède un domaine de repliement spécifique que nous verrons ultérieurement.

Les histones du cœur (du nucléosome) interagissent ensuite deux à deux (H3 avec H4, et H2A avec H2B) pour former un motif en "poignée de mains" (*handshape* ; figure 7B). Les histones H2A et H2B, ainsi que H3 et H4, n'existent à l'état natif qu'ainsi appariées (figure 8A). Les dimères H3-H4 s'associent au niveau des histones H3 dans un motif particulier à quatre hélices (*four helix bundle*) pour former le tétramère (H3-H4)₂ (figure 8B). La dernière étape est la constitution de l'octamère : 2 dimères H2A-H2B prennent en sandwich un tétramère (H3-H4)₂ (figure 8C). Cet octamère d'histones n'est stable que quand ses charges positives sont écrantées, à haute force ionique (2M NaCl) ou en interaction avec l'ADN dans le nucléosome.

<table><caption>Tableau 2 : Caractéristiques physico-chimiques des histones du cœur</caption><thead><tr><th rowspan="2">Histone</th><th rowspan="2">Poids moléculaire (kDa)</th><th rowspan="2">Nombre d'acides aminés</th><th colspan="2">% de résidus basiques</th></tr><tr><th>Lysine</th><th>Arginine</th></tr></thead><tbody><tr><td>H2A</td><td>13,96</td><td>129</td><td>10,9</td><td>9,3</td></tr><tr><td>H2B</td><td>13,77</td><td>125</td><td>16,0</td><td>6,4</td></tr><tr><td>H3</td><td>15,27</td><td>135</td><td>9,6</td><td>13,3</td></tr><tr><td>H4</td><td>11,24</td><td>102</td><td>10,8</td><td>13,7</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 7 : Repliement des histones</figcaption></figure>

(A) Le “repliement des histones” et (B) le motif en “poignée de mains” (Harp et coll., 2004).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 8 : Les structures quaternaires des histones</figcaption></figure>

(A) Le dimère H2A-H2B ; (B) le tétramère H3-H4 ; (C) l'octamère (Harp et coll., 2000 ; code PDB : 1eqz).
## II. L'UNITÉ ÉLÉMENTAIRE ET RÉPÉTITIVE DE LA CHROMATINE : LE NUCLÉOSOME

### II.1 La structure du nucléosome

La première étape de la formation d'un nucléosome est l'enroulement de ~ 55 pb d'ADN autour du tétramère $(H3-H4)_2$ pour former le tétrasome (figure 9). Puis deux dimères H2A-H2B viennent prendre le tétrasome en sandwich en enroulant 45 pb supplémentaires chacun (figure 10). La fixation de l'ADN ne produit que très peu de changements dans les interactions entre histones ou à l'intérieur même du "repliement des histones" (Hansen, 2002). 1,65 tour d'ADN s'enroule ainsi en super-hélice gauche suivant un "chemin" de charges positives sur l'octamère (Arents et coll., 1991). L'ADN en interaction avec les histones est protégé contre l'action de différentes nucléases dont la nucléase de microcoque, qui génère des fragments de 146 ±2 pb, correspondant à "l'ADN nucléosomique".

Le cristal de 1997 (Luger et coll., 1997, figure 10) a donné la première structure à haute résolution (2,8 Å). Ce nucléosome a été construit sur un palindrome de 146 pb d'une séquence α-satellite humaine pour obtenir une symétrie binaire complète du nucléosome. Des histones recombinantes ont de plus été utilisées pour éviter les hétérogénéités des histones naturelles en termes de modifications post-traductionnelles. Une série de cristaux (notamment Harp et coll., 2000 ; Davey et coll., 2002 ; Tsunaka et coll., 2005) a suivi apportant une meilleure résolution ou concernant d'autres types d'histones (organismes, modifications ou variants)

Plusieurs éléments importants de la structure peuvent être soulignés :

* De face, le nucléosome est un complexe pseudo-symétrique dont l'axe dyadique passe par le "motif à quatre hélices". Vu de profil, il semble être structuré en soufflet.

* La majeure partie des histones est résolue, seuls quelques résidus terminaux de certaines histones ne sont pas visibles, signe d'une structure désordonnée (en gris dans la figure 6).

* Le chemin de charges positives qui guide l'interaction de l'ADN autour de l'octamère est essentiellement composé d'arginines régulièrement disposées : la chaîne latérale de ces résidus s'intercale dans le petit sillon de l'ADN tous les 10 pb environ (figure 11). Ces points de contact privilégiés sont numérotés du SHL (Super Helix Location) -6,5 au SHL +6,5. Il existe ainsi 14 arginines ancrant l'ADN sur les histones. On peut les considérer comme des sortes de bouton-pression qui peuvent être enclenchés ou détachés. Le cas des SHL ± 6,5 est
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 9 : Le tétrasome</figcaption></figure>

55 pb sont enroulés en 0,75 tour sur le tétramère d'histones (H3-H4)₂ (Harp et coll., 2000 ; code PDB : 1eqz).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 10 : La structure cristallographique du nucléosome</figcaption></figure>

A gauche : la structure complète vue de face ; à droite : vue de profil (remarquer la forme en “fer à cheval” sur la vue de face et en “soufflet” sur la vue de profil, ainsi que les queues N-terminales qui sortent du nucléosome) (d'après Luger et coll., 1997).
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 11 : Les Super-Helix Locations (SHL)</figcaption></figure>

Structure de la spire supérieure du nucléosome. Les chiffres de 0 à 7 indiquent les grands sillons de l'ADN qui font face aux histones (d'après Luger et coll., 1997).

Cercles de couleur : localisation des arginines interagissant dans le petit sillon de l'ADN.

particulier : il correspond aux sites où les ADNs entrent et sortent du nucléosome. Nous reviendrons sur ces arginines particulières qui jouent un rôle important dans la dynamique des nucléosomes.

## II.2 Le positionnement

### II.2.1 En rotation et en translation

Pour chaque nucléosome, il faut considérer un positionnement à deux niveaux : en rotation et en translation, les deux étant liés. Pour faciliter la compréhension, on peut considérer l'ADN comme une vis et les histones comme un écrou. Si on tourne la vis, c'est-à-dire si la position de l'ADN est modifiée en rotation, la vis se déplace par rapport à l'écrou, la position de l'ADN change en translation.

Le positionnement en rotation conditionne l'exposition d'une séquence courte (moins de 10 pb) à la surface du nucléosome. Du positionnement en translation va dépendre l'inclusion ou l'exclusion de la séquence dans le nucléosome (figure 12). Evidemment le même positionnement en rotation se retrouve tous les 10 pb environ, c'est-à-dire avec la périodicité de l'ADN.
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 12 : Influence possible du positionnement sur le contrôle de l'expression génétique</figcaption></figure>

(A) Positionnement en translation et intégration dans le nucléosome. (B) Positionnement en rotation et accessibilité aux nucléases.

(d'après Lewin, 2004).

Une courbure intrinsèque ou une anisotropie de flexibilité provoquée par certains di- ou tri-nucléotides espacés selon la période de l'ADN facilite son enroulement autour de l'octamère d'histones (Trifonov et Sussman, 1980 ; Shrader et Crothers, 1989 et 1990). Des reconstitutions compétitives entre des séquences artificielles aléatoires et des séquences naturelles indiquent que toutes les séquences, avec cependant des affinités variables, sont susceptibles d'être incorporées dans les nucléosomes (Lowary et Widom, 1997). Nous verrons par la suite des exemples du rôle physiologique du positionnement des nucléosomes.

## II.2.2 Les méthodes d'analyse

Il existe plusieurs méthodes pour déterminer le positionnement d'un nucléosome sur une séquence. On peut visualiser ses frontières 3'OH par digestion avec l'exonucléase III (Prunell et Kornberg, 1978 ; Riley et Weintraub, 1978) : cette technique permet d'évaluer le positionnement en translation, mais elle n'est pas suffisamment précise pour atteindre le positionnement en rotation. On peut aussi réaliser des empreintes à la DNase I ou aux radicaux hydroxyles : à l'inverse, on a un positionnement précis en rotation (les maxima correspondent aux nucléotides exposés à la surface du nucléosome) mais pas en translation (les limites du nucléosome sont difficiles à déterminer). Plus récemment, Flaus et coll. (1996) ont mis au point une technique qui permet le positionnement précis (à la base près) en rotation et en translation, de la région centrale du nucléosome. Cependant, on n'a aucune information sur les bords du nucléosome. Une cartographie précise des positions occupées par les
nucléosomes sur un fragment d'ADN nécessite donc l'utilisation combinée de plusieurs de ces méthodes.

Les "gels chromatine" (des gels de nucléoprotéines adaptés aux nucléosomes) développés au laboratoire représentent un autre moyen de visualiser les différentes positions occupées par un nucléosome unique reconstitué sur un ADN linéaire d'environ 350-360 pb (figure 13 ; Duband-Goulet et coll., 1992). De manière similaire à la migration du complexe ADN-CAP (Wu et Crothers, 1984), la migration des nucléosomes dépend de leur position sur le fragment : les nucléosomes migrant le plus vite sont situés à l'une ou l'autre extrémité de l'ADN, les plus retardés sont positionnés au centre.

### II.2.3 Les séquences positionnantes

Une des séquences les plus utilisées pour obtenir des nucléosomes positionnés est le gène de l'ARN ribosomal 5S d'oursin (Simpson et Stafford, 1983) ou de grenouille (Rhodes, 1985). Quoique relativement peu positionnante (Hamiche et coll., 1996a ; figure 13), elle a l'avantage d'être une séquence naturelle. La dernière séquence "à la mode" est, elle, artificielle et est même ultrapositionnante : c'est le "601" (Lowary et Widom, 1998). Les

Figure 13 : Positionnement sur "gel chromatine"

Electrophorèse de mononucléosomes reconstitués sur les séquences pBR (356 pb) et 5S (357 pb). diNS : sous-produit de deux octamères sur le même fragment.

<figure><img src="image_15.png" /></figure>
travaux récents sur la structure de la fibre de 30 nm ont été réalisés en utilisant une répétition en tandem de cette séquence (par exemple : Huynh et coll., 2005 ; Schalch et coll., 2005 ; Robinson et coll., 2006).

## II.3 Le remodelage des nucléosomes

Le terme de “remodelage” est un terme générique englobant plusieurs phénomènes biologiques distincts. Il comprend les modifications de l’ADN et celles des queues des histones, l’action des facteurs de remodelage, proprement dits, qui agissent de manière mécanique sur les nucléosomes et le remplacement des histones canoniques par des variants.

### II.3.1 La méthylation de l'ADN

Cette modification a lieu sur la cytosine des di-nucléotides CpG dans les génomes de mammifères. Il existe une forte corrélation entre le degré de méthylation de l'ADN et l'hétérochromatine (Razin, 1998). Cette modification semble donc liée à la répression de la transcription. Elle est aussi impliquée dans l'inactivation du chromosome X et dans un marquage épigénétique du génome (genomic imprinting).

### II.3.2 Les modifications des histones

Les queues chargées, qui présentent des sites potentiels d'interaction avec l'ADN et différentes protéines nucléaires, subissent de nombreuses modifications post-traductionnelles pendant le cycle cellulaire, dont le rôle précis n'est pas toujours connu avec précision. La figure 14 montre les différents résidus et les modifications qu'ils peuvent subir.

**L'acétylation** est un processus associé à l'ouverture réversible de la chromatine lors de la transcription. Ce processus, régulé par les acétyltransférase et les déacétylases, est très dynamique. L'acétylation supprime les charges positives des lysines présentes sur les queues N-terminales des histones, surtout celles de H3 et H4, modifiant ainsi l'interaction de ces dernières avec l'ADN. Des travaux récents, où la distance entre les ADNs entrant-sortant de mononucléosomes a été mesurée par FRET (*Fluorescence Resonance Energy Transfert*), ont montré une augmentation de cette distance lorsque les queues des histones sont acétylées, surtout dans le cas de l'histone H3 (Tóth et coll., 2006).
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 14 : Modifications post-traductionnelles des histones du cœur (d'après Davie, 2004)</figcaption></figure>

**La méthylation** est une modification très stable des lysines des histones H3 et H4 qui peut se maintenir sur plusieurs divisions cellulaires. Le degré de méthylation (mono-, di- ou tri-méthylation) et la position du résidu modifié conduisent à un rôle dans la transcription (en étroite corrélation avec l'acétylation) ou bien dans la formation de l'hétérochromatine, par interaction avec la protéine HP1 (Heterochromatin Protein 1). On a récemment découvert la première déméthylase, remettant ainsi en cause l'irréversibilité de cette modification (Shi et coll., 2004).

**La phosphorylation** entraîne la formation de charges négatives sur les sérires et les thréonines des histones H3, H2A et H4 et donc la déstabilisation des interactions histones-ADN. La phosphorylation d'un des variants de H2A, qui va permettre de décondenser la chromatine, est par exemple un préalable à la réparation de lésions sur l'ADN.

**L'ubiquitination** lie de manière covalente une petite protéine de 76 résidus, l'ubiquitine, à une lysine située dans la partie C-terminale des histones H2A et H2B. La multi-ubiquitination des protéines, contrairement à la mono-ubiquitination, permet de marquer celles-ci pour une dégradation ultérieure par le protéasome, y compris pour les histones (Gunjan et coll., 2006). La mono-ubiquitination pourrait favoriser la transcription en empêchant la formation de structures d'ordre supérieure (hypothèse encore sujette à controverse).
La poly-ribosylation pourrait, elle aussi, jouer un rôle dans la transcription en liant de manière covalente plusieurs unités d'ADP-ribose (200 et plus) sur des sites spécifiques des histones et ainsi déstabiliser la structure de la chromatine. Le polyribose est en effet fortement chargé négativement et pourrait déplacer les histones.

## Le "code des histones"

Les possibilités combinatoires de toutes ces modifications sur les différents résidus ont suscité l'hypothèse d'un "code des histones" (Turner, 1993 ; Strahl et Allis, 2000), où une combinaison particulière de modifications sur une ou plusieurs queues pourrait mener à une réponse biologique spécifique. Pour vérifier cette hypothèse, l'équipe de O. J. Rando (Dion et coll., 2005) a muté, chez S. cerevisiae, les quatre lysines de l'histone H4 (séparément ou en combinaison) et a analysé la modification de l'expression des gènes par micro-réseaux d'ADN (DNA microarrays). Seule la Lys16 semble avoir un rôle spécifique, les trois autres ne semblent intervenir que quantitativement par leur apport en charges positives. En dehors de quelques cas particuliers, cette association d'une combinaison de modifications pour une réponse particulière ne semble donc pas être la règle. Certains chercheurs préfèrent alors parler de "code booléen" (Bradbury et van Holde, 2004) ou remettent en cause le terme même de "code" (Peterson et Laniel, 2004).

## II.3.3 Les facteurs de remodelage

Les facteurs de remodelage interviennent dans la plupart des processus nucléaires. Ils sont composés de 2 à 15 sous-unités dont une ATPase qui appartient, par sa séquence et sa structure tridimensionnelle, à la superfamille des translocases. Ces complexes, présents aussi bien chez la levure que chez les mammifères, sont classés selon le type de l'ATPase qu'ils renferment. Les trois principales sous-familles de moteurs ATPasiques sont (Travers et Owen-Hugues, 2004 ; figure 15) :

- Swi2/Snf2 : SWI/SNF et RSC en sont les complexes les plus étudiés,

- Iswi : par exemple ACF, NURF et CHRAC,

- NURD/Mi-2/CHD : les facteurs de remodelage, qui sont associés à une sous-unité déacétylase (HDAC, Histone DeAcetylase Complex), ont donné leur nom à cette famille d'ATPase.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 15 : Les principales sous-familles de facteurs de remodelage (d'après Lusser et Kadonaga, 2003)</figcaption></figure>

Les divers complexes de remodelage se différencient par leur activité : déstabilisation des contacts ADN-histones, glissement des nucléosomes, transfert des octamères sur des ADNs compétiteurs, formation de “dinucléosomes” (Peterson, 2000 ; Becker et Hörz, 2002). Deux modèles ont été proposés : celui de la “boucle” dans lequel une onde de courbure se propage à la surface des histones comme une vague (Guschin et Wolffe, 1999) ; et celui de la “torsion” où là, c'est une onde de sur-torsion imposée à l'entrée du nucléosome qui se propage à la surface de l'octamère jusqu'à la sortie (Havas et coll., 2000). Très récemment une équipe a conforté le modèle de la “boucle” pour deux facteurs de remodelage différents (ISWI2 et SWI/SNF) (Zofall et coll., 2006). Un mécanisme commun à la majorité des complexes de remodelage, basé sur la boucle de translocation, est donc envisageable. L'activité précise et les cibles de ces facteurs seraient alors modulées par les sous-unités (Saha et coll., 2006).

### II.3.4 Les variants des histones

Contrairement aux histones canoniques, ces variants sont issus de gènes uniques, susceptibles de renfermer des introns, et dont les transcrits sont polyadénylés. En outre, l'expression de ces variants est découplée de la réplication.

On ne connaît, à l'heure actuelle, aucun variant de l'histone H4. H2B possède quelques variants mineurs spécialisés dans la chromatine du sperme et des testicules de différents
organismes. Les variants d'histones concernent donc essentiellement les histones H2A et H3 (figure 16).

## Les variants de H2A

Macro-H2A est le premier variant découvert pour cette histone (Pehrson et Fried, 1992). Présent uniquement chez les vertébrés, il est composé d'un domaine N-terminal à 64 % identique à H2A et d'un domaine C-terminal complètement différent qui représente les deux tiers des résidus totaux. Ce variant est surtout associé à l'inactivation du chromosome X chez les femelles. Ailleurs dans le génome, il se retrouve avec des histones H3 hypoacétylées, l'impliquant dans la répression de la transcription (Chakravarthy et coll, 2005).

H2ABbd, trouvé tout d'abord chez l'homme, est spécifique des mammifères. H2ABbd est exclu de l'hétérochromatine et du chromosome X inactif chez les femelles, caractéristique qui lui a valu son nom (*Barr body deficient*), en opposition avec macroH2A. En outre, H2ABbd voisine avec l'histone H4 acétylé, indice d'un rôle dans la chromatine transcriptionnellement active (Chadwick et Willard, 2001).

H2A-Z est le plus important pour la quantité, puisqu'il représente 5 à 10% du total des H2A. Plus conservée dans l'évolution que l'histone canonique H2A, H2A-Z est essentielle à la viabilité des levures et au développement de la mouche du vinaigre et de la souris (Sarma et Reinberg, 2005). Son rôle n'est cependant pas encore clairement défini. On le trouve au niveau des promoteurs de gènes actifs ou au niveau de régions proches des télomères où il empêcherait la propagation de l'hétérochromatine (Meneghini et coll., 2003).

Dans les cellules de mammifères, H2A-X ne représente que 2 à 15 % du total des histones H2A, alors que c'est l'histone majeure chez *S. cerevisiae*. Le nucléosome contenant H2A-X est régulièrement distribué dans le génome et servirait de gardien contre les cassures double brin de l'ADN. De plus, il existerait une relation entre la proportion de H2A-X dans la chromatine et la capacité des organismes à faire de la recombinaison homologue (réparations de cassures double brin, recombinaisons méiotiques ou des gènes des immunoglobulines), mécanisme prédominant chez la levure. Au contraire, *C. elegans*, qui ne possède pas de système de recombinaison homologue, ne dispose pas non plus de H2A-X (Li et coll., 2005).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 16 : Localisation des différences entre les histones canoniques et les variants Représentation des histones en 3 dimensions, en bleu : H3 et en orange : H2A. Les différences sont soulignées en jaune (d'après Henikoff et Ahmad, 2005).</figcaption></figure>
## *Les variants de H3*

H3.1 est de loin le variant prépondérant, H3.2 et H3.3 en sont très proches. Un seul résidu différencie H3.1 de H3.2 et cinq sont modifiés entre H3.1 et H3.3. Seuls les mammifères possèdent ces trois types de H3. Chez les autres organismes, on trouve les variants H3.3 et H3.1 ou H3.2 (Hake et coll., 2006).

Ces trois variants se répartissent en deux catégories, fonction de leur biosynthèse couplée
ou non à la réplication de l'ADN. H3.1 et H3.2 sont exprimées et déposées sur l'ADN
pendant la phase S, alors que H3.3 est exprimée tout au long du cycle cellulaire. H3.3 semble
associée aux régions transcriptionnellement actives, où les échanges d'histones sont favorisés.
Au contraire, les histones H3.1 et H3.2, couplées à la réplication, sont exclusives de
l'hétérochromatine qui est "fermée" pendant la majorité du cycle cellulaire. Chaque type
d'histone H3 est associé à un chaperon spécifique : le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly
Factor 1) est associé à H3.1 et le complexe HIRA (H1stone Regulatory Homolog A) à H3.3.
Malgré de nombreux travaux, on ne comprend toujours pas les raisons profondes de
l'existence d'un variant dont l'expression est découplée de la réplication.

Le dernier variant de H3, CENP-A, le plus éloigné en séquence (son domaine du "repliement des histones" n'est qu'à 64% homologue à celui de H3), est spécifiquement localisé au centromère, dont il est le marqueur épigénétique. Nous aurons l'occasion de nous attarder sur ses attributs dans la section dédiée à ce territoire chromosomique.

## II.4 Les grands processus nucléaires et le nucléosome

### II.4.1 La transcription

Lors de la transcription, les nucléosomes peuvent interférer au niveau de l'*initiation*. La position du nucléosome est partie intégrante de la régulation de l'expression du gène : en déplaçant artificiellement le nucléosome situé sur la boîte TATA, Lomvardas et Thanos (2002) ont altéré le profil temporel de l'expression du gène inductible IFN-β. Les complexes de remodelage peuvent également agir à ce niveau. En induisant une accessibilité des facteurs de transcription au promoteur, le complexe SWI/SNF, recruté au promoteur MMTV après activation à la progestérone, déstabilise les dimères H2A-H2B du nucléosome et favorise
A

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 17 : La transcription</figcaption></figure>

(A) Surenroulement créé par le déplacement de l'ARN polymérase (en noir). (B) Modèle de la translocation de l'octamère ou spooling model (d'après Walter et Suditsky, 2001).

l'initiation de la transcription (Vicent et coll., 2004). Les modifications post-traductionnelles et/ou le remplacement des histones canoniques par des variants constituent un autre mécanisme de déstabilisation des nucléosomes (Morillon, 2006).

Au cours de l'_elongation_ la vitesse de progression des polymérides eucaryotes est identique sur l'ADN nu *in vitro* et sur la chromatine *in vivo* (Walter et Suditsky, 2001). Différents facteurs interviennent donc pour rendre “invisibles” les nucléosomes. Le surenroulement positif à l'avant et négatif à l'arrière de la polymérase (figure 17A ; Liu et Wang, 1987) permettrait respectivement de déstabiliser à distance les dimères H2A-H2B et de les réincorporer après le passage du complexe enzymatique (Jackson, 2004 ; voir plus loin ARTICLE III). Les modifications post-traductionnelles, telles l'acétylation, certaines protéines chaperonnes (Belotserkovskaya et coll., 2003) et les facteurs de remodelage (Carey et coll., 2006) sont également impliqués dans ces processus.

Deux mécanismes de transcription des nucléosomes ont été décrits, fonction de l'ARN polymérase : dans le premier, associé à l'ARN polymérase III et aux ARN polymérides bactériennes, l'octamère entier est déplacé en cis de l'avant vers l'arrière de la polymérase (figure 17B ; Studitsky et coll., 1994 et 1997) ou en trans sur un autre fragment d'ADN (O'Donohue et coll., 1994). Dans le second mécanisme, qui concerne l'ARN polymérase II,
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 18 : La réplication</figcaption></figure>

A gauche de la fourche de réplication la chromatine parente, à droite les deux ADNs nouvellement répliqués. Noter que l'assemblage des nucléosomes nouvellement synthétisés est séquentiel : d'abord tétramères (H3-H4)₂, puis dimères H2A-H2B (Gasser et coll., 1996).

celle-ci traverse le nucléosome en déplaçant seulement un dimère H2A-H2B (Kireeva et coll., 2002).

## II.4.2 La réplication

Les ADN polymérides copient l'ADN et, comme les ARN polymérides, doivent s'affranchir de la barrière des nucléosomes. La fourche de réplication définie deux domaines. En aval de la polymérase, on trouve la chromatine parentale pas encore répliqué, et en amont celui des ADN nouvellement synthétisés et la chromatine nouvellement assemblée.

La première interrogation concerne le devenir des nucléosomes parentaux. Des expériences menées sur des minichromosomes de SV40 (Randall et Kelly, 1992) ont conduit à la conclusion que ces nucléosomes restaient associés à l'ADN lors du passage du complexe de réplication, quoiqu'ils deviennent temporairement instables : un large excès d'ADN compétiteur peut les détruire (Gruss et coll., 1993). Des minichromosomes de SV40 photoactivés par le psoralène ont montré que les deux nucléosomes en aval de la fourche de réplication étaient dépourvus d'histone de liaison (voir plus bas) et que le plus proche d'entre eux avait perdu les dimères H2A-H2B (figure 18 ; Gasser et coll., 1996).

La question suivante concerne l'assemblage de la chromatine sur les ADNs néosynthétisés. Les tétramères (H3-H4)₂ sont transférés sur chacun des ADNs néosynthétisés, laissant des trous. Ceux-ci sont remplis par des histones nouvellement synthétisées apportées par le complexe CAF-1 (Smith et Stillman, 1991) sous forme d'hétérodimères H3-H4 (Tagami et coll., 2004 ; English et coll., 2005), formant des tétrasomes à environ 120 pb de l'extrémité des ADN naissants (Cusick et coll., 1981). Puis les tétrasomes incorporent
indistinctement les anciens ou les nouveaux dimères H2A-H2B pour reformer des nucléosomes (Smith et Stillman, 1991). La maturation de la chromatine se poursuit avec l'incorporation des histones de liaison, l'action des enzymes de modifications post-traductionnelles et l'homogénéisation de l'espacement des nucléosomes par les facteurs de remodelage (Verreault, 2000).
# III. DU NUCLÉOSOME AU CHROMOSOME
MÉTAPHASIQUE

## III.1 Le chromatosome

### III.1.1 La structure des histones de liaison

Les histones de liaison (le qualificatif “d’histone” ne leur a été attribué qu’à cause de leur stoechiométrie avec les histones du coeur ; van Holde, 1988) révèlent trois domaines : un domaine N-terminal non structuré, un domaine globulaire relativement conservé et une queue C-terminale très chargée positivement. Ainsi que le montre la structure cristalline (Ramakrishnan et coll., 1993 ; Gajiwala et coll., 2000) et celle par RMN (Résonnance Magnétique Nucléaire ; Cerf et coll., 1993), le domaine globulaire fait partie de la famille des protéines dites à “hélices en forme d’ailes” (*winged helix*). Il possède une homologie de structure avec des protéines spécifiques de certaines séquences comme les protéines de mammifère HNF3γ (*Hepatic Nuclear Factor 3γ*) ou encore RFX1 (*Regulator Factor X1*). On trouve deux sites d’interaction à l’ADN (figure 19A) : le premier est manifeste par l’homologie de séquence avec les protéines précédemment citées, alors que le second, diamétralement opposé sur la protéine, est moins bien défini (Goytisolo et coll., 1996 ; Duggan et Thomas, 2000).

La queue C-terminale possède une charge nette positive égale à 30-50% de la charge positive totale, selon les variants et les espèces (Lu et Hansen, 2003). En solution, ce domaine ne possède pas de structure secondaire identifiable et on a d’abord suggéré qu’il interagissait avec l’ADN par simples interactions électrostatiques (Subirana, 1990). Plus récemment, Vila et coll. (2001) ont montré par spectroscopie infra-rouge qu’un peptide issu de la queue C-terminale de l’histone H1 se structurait en hélice et en boucle au contact de l’ADN.

### III.1.2 Le positionnement des histones de liaison sur le nucléosome

Dans les chromatosomes, les histones de liaison interagissent avec les ADNs entrant-sortant du nucléosome et protègent 20 pb supplémentaires par rapport au coeur (Noll et Kornberg, 1977 ; Simpson, 1978). La partie globulaire est suffisante pour conférer cette protection de 166 pb (Allan et coll., 1980).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 19 : L'histone de liaison et son positionnement</figcaption></figure>

(A) Domaine globulaire des histones de liaison (Jerzmanowski, 2004). (B) Positionnement de l'histone H5 à l'entrée-sortie du nucléosome et formation du motif en tige (Hamiche et coll., 1996a). (C) Les deux modèles possibles pour le positionnement de la partie globulaire de l'histone de liaison (d'après Travers, 1999). lin : linéaire

Dans notre laboratoire, la reconstitution d'un mononucléosome contenant l'histone de liaison H5 (un variant de H1 ; voir plus loin) sur un fragment linéaire a permis de mettre en évidence la structure en "tige" (stem) de l'entrée-sortie du nucléosome formée par l'interaction avec la queue C-terminale (Hamiche et coll., 1996a; figure 19B). Cette structure a été retrouvée dans la chromatine native, aussi bien que reconstituée (Bednar et coll., 1998). Ces approches de microscopie et de cryomicroscopie électroniques, respectivement, n'ont cependant pas une résolution suffisante pour déterminer la position du domaine globulaire de l'histone de liaison. Les structures cristallographiques du nucléosome (Luger et coll., 1997) jointes à celles du domaine globulaire de l'histone de liaison (Ramakrishnan et coll., 1993 ; Gajiwala et coll., 2000) n'ont pas non plus permis de positionner ce dernier avec précision.

La partie globulaire a tout d'abord été placée symétriquement à l'entrée-sortie du nucléosome, protégeant ainsi dix pb de chaque côté : c'est le modèle symétrique (Allan et coll., 1980 ; figure 19C). En 1998, Zhou et coll. proposent un modèle asymétrique où les 20 pb protégées sont situées d'un seul côté du nucléosome. Dans ce modèle, l'hélice III (site 1) est au contact d'un des deux ADNs entrant-sortant et le site 2 est à proximité de l'axe de symétrie. Dans notre laboratoire, la "technique des minicercles" a permis de confirmer cette
hypothèse et de proposer un "glissement" du domaine globulaire le long du grand sillon avec
lequel il interagit lors de la fluctuation des ADNs entrant-sortant entre croisement négatif et
croisement positif (Sivolob et coll., 2003). Récemment des expériences de FRAP
(Fluorescence Recovery After Photobleaching ; Brown et coll., 2006) ont également vérifié
cette seconde hypothèse avec, cependant, une inversion des deux sites d'interaction avec le
nucléosome. Les auteurs émettent l'hypothèse qu'il existerait une hétérogénéité dans
l'interaction des histones de liaison avec les nucléosomes.

### III.1.3 La variabilité des histones de liaison et leur modifications

#### *Les variants de H1*

Il existe chez les mammifères sept variants, ou sous-types, de l'histone H1. Cinq sont des variants somatiques : H1.2, H1.3, H1.4 et H1.5 sont ubiquitaires, alors que H1.1 est spécifique de certains tissus ou organes (thymus, testicule, rate et cellules lymphoïdes et neuronales). Les deux autres sous-types sont plus spécialisés : on trouve H1t dans les testicules et H1.0 n'est exprimée qu'à certains stades du développement. Les membres du premier groupe ont un domaine globulaire quasiment identique et ne se différencient que par les queues N- et C-terminales. H1t et H1.0 sont plus divergents au niveau des queues mais aussi dans la partie centrale (Parseghian et Hamkalo, 2001).

Deux autres variants sont connus.H5, un sous-type rencontré dans les érythrocytes nucléés des amphibiens et des oiseaux, est très utilisé dans les expériences *in vitro* car il possède une forte affinité pour les nucléosomes. B4, dont les interactions avec l'ADN sont les plus faibles, est spécifique des amphibiens.

#### *Les modifications post-traductionnelles*

La modification post-traductionnelle principale est la phosphorylation, dépendante du cycle cellulaire. Curieusement un pic de phosphorylation se produit au moment de la mitose alors que la chromatine est sous sa forme la plus compacte. Très récemment, Wisniewski et coll. (2006) ont recensé, par spectrométrie de masse, de nombreuses autres modifications sur des résidus des queues et du domaine globulaire. Ils ont, entre autres, mis en évidence certaines lysines acétylées du domaine central qui pourraient ainsi déstabiliser le chromatosome.
<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 20 : Modèles de la fibre de 30 nm</figcaption></figure>

(A) Modèle “à un départ” : le solénoïde.

(B) Modèle “à deux départs” où les ADNs de liaison se croisent à l'intérieur de la fibre (d'après Dorigo et coll., 2004).

### III.1.4 Le rôle des histones de liaison

Le rôle principal des histones de liaison est de stabiliser la fibre de 30nm. Cette activité est bien sûr modulée par les modifications post-traductionnelles et les variants, dont l'affinité pour les nucléosomes varie (Parseghian et Hamkalo, 2001). La présence des histones de liaison a des conséquences sur les grands mécanismes nucléaires, notamment sur l'initiation de la réplication (Lu et coll., 1999). Il apparaît de plus que les histones de liaison peuvent réprimer, mais aussi activer, l'expression de certains gènes (Takami et Nakayama, 1997).

## III.2 La fibre de 30 nm

### III.2.1 Quelques modèles

En 1976, les premières images de fibres de nucléosomes ont conduit au modèle du solénoïde, ou modèle à “un seul départ” (single-start), dans lequel les nucléosomes s’enroulent en spirale (figure 20A ; Finch et Klug, 1976 ; Thoma et coll., 1979). A l’heure actuelle, à part quelques résistants de la dernière heure, ce modèle est abandonné. Il impose en effet une forte courbure des ADNs de liaison et ne peut tenir compte de l’irrégularité des fibres (Leuba et coll., 1994 ; Woodcock et coll., 1993).

Le modèle est vigueur est actuellement celui du zigzag, ou modèle à “deux départs” (double-start ; Woodcock et coll., 1993 ; Leuba et coll., 1994) où les ADNs de liaison se croisent à l'intérieur de la structure (figure 20B). Les ADNs à l'entrée/sortie des nucléosomes forment la “structure en tige”, stabilisée par les histones de liaison (Hamiche et coll., 1996a).
Le tout s'enroule pour former une fibre de nucléosomes dont le diamètre, plus ou moins régulier, est en moyenne de 30 nm (van Holde, 1988).

### III.2.2 Les caractéristiques de la fibre de 30 nm

Le repliement dans ces fibres a été étudié par de nombreuses techniques, en particulier par centrifugation et microscopie. La centrifugation analytique (essentiellement utilisée par l'équipe de J.C. Hansen) permet d'accéder au coefficient de sédimentation (où interviennent la masse molaire et le rayon hydrodynamique des fibres), mais ne donne pas d'informations structurales précises. Les techniques de microscopie et cryomicroscopie électroniques, ou à force atomique (AFM) rendent possible la visualisation des fibres à l'échelle du nanomètre.

A faible force ionique, la fibre de nucléosomes dépourvue d'histones de liaison est étendue et a donc le diamètre du nucléosome, environ 10 nm (figure 21, à gauche). Les sels monovalents permettent d'obtenir une structure de condensation intermédiaire (Schwarz et Hansen, 1994). La compaction maximale (30 nm ; figure 21, à droite) est atteinte seulement avec des métaux (par exemple entre 0,5 à 2 mM de $MgCl_2$) ou en présence des histones de liaison (Hansen, 2002). Dans les deux cas, on diminue les répulsions électrostatiques des ADNs entrant-sortant des nucléosomes, induisant leur rapprochement. La présence des histones de liaison entraîne ainsi une structure irrégulière en zigzag de 30 nm de diamètre environ (Bednar et coll., 1998). Celles-ci ne définissent cependant pas la géométrie de la fibre de 30 nm, qui est intrinsèque aux nucléosomes, mais la stabilisent (Schwarz et Hansen, 1994).

Les queues des histones du cœur se sont révélées primordiales pour la formation d'une fibre compacte, même en présence d'histones de liaison (Allan et coll., 1982). Les modifications post-traductionnelles régulent cette compaction. En particulier l'acétylation de la lysine 16 de l'histone H4 inhibe la formation des fibres compactes mais également celle des oligomères (Shogren-Knaak et coll., 2006 ; voir ci-dessous), l'état de modification de ce même résidu possédant aussi un rôle particulier dans le contrôle de l'expression des gènes (voir page 25). De plus, il faut au moins six nucléosomes consécutifs pour former la super-structure, car les interactions entre nucléosomes sont essentielles, un "trou" sans nucléosome suffit en effet à déstabiliser tout l'édifice (Hansen, 2002).
<figure><img src="image_24.png" /></figure>

Figure 21 : Les fibres de 10 et 30 nm
Clichés par microscopie à force atomique de fibres natives avec et sans histones de liaison (à droite et à gauche ; Leuba et coll., 1998).

### III.3 Les structures secondaires

#### III.3.1 L'oligomérisation

De fortes concentrations en magnésium (6-60 mM) permettent la formation de structures massives, résultats de l'oligomérisation, c'est-à-dire de l'assemblage latéral des fibres de nucléosomes (Schwarz et Hansen, 1994 ; Schwarz et coll., 1996). Ce phénomène est indépendant de la compaction des nucléosomes en fibre de 30 nm et se produit avec des fibres de tétrasomes ou des fibres comportant des "trous" (Schwarz et coll., 1996). Les interactions des queues des histones avec des nucléosomes inter-fibres semblent être la clef de voûte de cette nouvelle structure (Gordon et coll., 2005).

#### III.3.2 Autres protéines ou complexes impliqués dans des structures secondaires

Plusieurs protéines de structures participent à la condensation de la chromatine et sont généralement associées à la répression de la transcription (Adkins et coll., 2004 ; Luger et Hansen, 2005 ; figure 22).

MENT (Myeloid and Erythroid Nuclear Terminator stage-specific protein), protéine de la famille des Serpines, est impliquée dans les transitions conformationnelles à longue distance et peut former des super-structures qui "ressemblent" aux fermetures Eclair à leucines.

MeCP2 (Methyl-CpG-binding Protein 2) possède un domaine de liaison à l'ADN méthylé. Cette protéine, qui induit une fibre de 30 nm atypique, peut déplacer les histones de
<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Figure 22 : Quelques structures secondaires de la chromatine
Structures induites par MENT (A), MeCP2 (B) et le complexe PPC (C) [(A) et (B) : Adkins et coll. (2004) ; (C) : Luger et Hansen (2005)].

liaison et former une structure équivalente à l'oligomérisation. Elle est surtout localisée dans
les régions péricentromériques.

Le complexe PPC (*Polycomb group Protein Complex*) peut se lier à trois nucléosomes et
former des structures supérieures potentiellement indépendantes des modifications post-
traductionnelles des queues des histones.

<u>HP1</u> (Heterochromatin Protein 1), qui se lie aux fibres déjà repliées et induit des réarrangements locaux de la structure secondaire, ne favorise pas les structures supérieures.

III.4 Les boucles chromatiniennes et au-delà

Un troisième niveau d'organisation de l'ADN dans les noyaux peut être défini par
l'attachement de la chromatine aux composants de la matrice nucléaire. Celle-ci est présentée
comme la structure protéique résiduelle restant après extraction des histones et enlèvement
des membranes nucléaires par traitement avec un détergent non-ionique (Berezney et Coffey,
1974 ; Verheijen et coll., 1988).
<figure><img src="image_26.png" /></figure>

Figure 23 : Le chromosome métaphasique
Cliché de microscopie électronique d'un
chromosome humain pendant la mitose.

Attachée à la matrice (formant ainsi des domaines topologiques), la chromatine est
plusieurs fois repliée, et structurée sous forme de boucles, de rosettes... A l'heure actuelle,
ces structures sont encore mal caractérisées. Le chromosome atteint son maximum de
compaction pendant la métaphase de la mitose, le facteur de compaction longitudinal de
l'ADN étant alors de 10 000 (contre 7 pour le nucléosome). C'est sous cette forme que les
chromosomes sont généralement représentés (figure 23).

### III.5 La dynamique de la chromatine

La chromatine est constamment soumise à des réarrangements : à grande échelle au cours
du cycle cellulaire, et locaux lors des processus nucléaires, transcription, réplication (comme
nous l'avons vu), mais aussi réparation ou recombinaison. Des études relativement récentes
montrent l'importance de la dynamique de la chromatine *in vivo*. Des expériences de FRAP
ont révélé que les protéines nucléaires interagissaient avec la chromatine de manière
transitoire et étaient en compétition pour les différents sites de liaison (Phair et coll., 2004).
C'est le cas par exemple de l'histone H1 et la protéine HMGN pour le site formé par les
ADNs entrant-sortant du nucléosome (Catez et coll., 2004). Les temps de résidence de ces
différentes protéines peuvent être très courts, de l'ordre de deux à trois secondes pour certains
facteurs de transcription, ou plus longs, jusqu'à plusieurs heures, pour l'histone du cœur H2A
(Phair et coll., 2004). De manière remarquable, cette dynamique existe également pendant la
mitose, au moment où la chromatine est la plus compacte (Chen et coll., 2005). Différents
mécanismes se mettent ainsi en place pendant la transition anaphase-télophase (remplacement
des histones, modifications post-traductionnelles, assemblage de certaines sous-unités de
l'ARN polymérase II) pour préparer, entre autres processus, le redémarrage de la transcription
dans le cycle cellulaire suivant (Chen et coll., 2005).
# IV. UN DOMAINE CHROMATINIEN PARTICULIER : LE CENTROMÈRE

## IV.1 Généralités

### La mítose

La mitose peut être décomposée en plusieurs étapes distinctes. Pendant la *prophase*, les chromosomes se condensent, le centrosome, centre organisateur de la cellule, est dupliqué et la membrane nucléaire est progressivement détruite. A la *métaphase*, les chromosomes condensés à leur maximum se placent sur le plan équatorial de la cellule grâce au fuseau de microtubules dirigé par les centromères. Les chromatides sœurs se scindent et se déplacent le long de ces microtubules pendant l'*anaphase*. Cette étape clef est contrôlée dans l'espace et dans le temps pour éviter toute erreur qui pourrait mener à l'aneuploïdie (les cellules-filles ne possèdent alors plus le même nombre de chromosomes que la cellule-mère) et à terme au cancer (Draviam et coll., 2004 ; Rajagopalan et Lengauer, 2004). Enfin la *téléphase* clôt la division de la cellule.

### Le centromère et le kinétochore

Le centromère est la constriction où sont réunies les chromatides sœurs jusqu'à l'anaphase. Le kinétochore, énorme complexe protéique, relie la chromatine centromérique au fuseau mitotique et renferme les protéines de régulation de l'anaphase.

## IV.2 La chromatine centromérique

### IV.2.1 Saccharomyces cerevisiae

Chacun des seize chromosomes contient une séquence centromérique similaire d'environ 125 pb. Cette séquence est constituée de trois domaines (CDE I, CDE II, CDE III) avec lesquels interagissent des protéines spécifiques telles CBF1, Cse4p ou CBF3 (figure 24A). Des mutations sur les séquences CDE I ou CDE III peuvent entraîner des erreurs de ségrégation des chromosomes (Hegemann et Fleig, 1993). Dans cet organisme, un seul nucléosome, contenant le variant centromérique de l'histone H3 (Cse4p), forme le centromère proprement dit, mais plus de cinquante protéines constituent le kinétochore (Crotti et Basrai, 2004).
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 24 : Organisation linéaire des centromères de levures
(Amor et coll., 2004)</figcaption></figure>

## IV.2.2 Schizosaccharomyces pombe

Le centromère, sur chacun des trois chromosomes, s'étend sur 35 à 110 kb. La partie centrale (cnt) est composée de séquences uniques entourées de séquences répétées, spécifiques de chacun des centromères (imr). Ce large domaine est lui-même bordé de séquences répétées inversées (otr) de 20 à 100 kb, communes à tous les centromères (figure 24B). Les séquences cnt et imr sont le support de l'assemblage du kinétochore, alors que les séquences otr sont impliquées dans la cohésion des chromatides sœurs (Carroll et Straight, 2006).

## IV.2.3 Les eucaryotes supérieurs

### Le modèle linéaire du centromère

Chez les eucaryotes supérieurs, les séquences du centromère peuvent s'étendre sur plusieurs mégabases et sont souvent constituées de séquences répétées dont la taille correspond à un ou deux nucléosomes. Nous allons ici nous intéresser plus particulièrement aux centromères des cellules humaines (figure 25).

Les séquences centromériques, riches en AT, sont appelées séquences “α-satellite”. Elles sont de deux types : les séquences “α-satellite” de type I possèdent un motif particulier de 17
<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 25 : Organisation linéaire des centromères humains
(Amor et coll., 2004)</figcaption></figure>

pb sur lequel peut se fixer la protéine CENP-B (CENP-B box sequence). C'est sur une sous-
fraction (50 à 66%) de ces séquences que se forment les nucléosomes centromériques et le
kinétochore (Blower et coll., 2002). Le type II des séquences “α-satellite” en est dépourvu et
n'est impliqué dans la formation des centromères que sur le chromosome Y et dans les
néocentromères (voir plus loin, Masumoto et coll., 2004). La taille de ces séquences répétées
est de 171 pb et correspond à un nucléosome.

On trouve sur ces séquences α-satellite des blocs de nucléosomes canoniques (que nous
appellerons nucléosomes H3) et des blocs de nucléosomes contenant le variant centromérique
de l'histone H3 : CENP-A (CENtromeric Protein-A ; figure 25). Ces blocs peuvent s'étendre
sur 10 à 50 kb (Blower et coll., 2002), soit entre 50 et 250 nucléosomes. Les modifications
post-traductionnelles des blocs de nucléosomes H3 ne correspondent ni à celles de
l'hétérochromatine ni à celles de l'euchromatine et définissent ainsi un domaine particulier
(Sullivan et Karpen, 2004). De chaque côté, l'hétérochromatine, essentielle, participe à la
cohésion des chromatides sœurs jusqu'au début de l'anaphase et crée les frontières entre le
centromère et les bras des chromatides (Bernard et Allshire, 2002).
<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 26 : Modèle tridimensionnel du centromère humain
(Amor et coll., 2004)</figcaption></figure>

Sur cette chromatine centromérique s'assemble ensuite le kinétochore, supra-complexe protéique trilaminaire (Brinkley et Stubblefield, 1966). Le kinétochore interne est composé de six protéines constitutives du centromère (le nombre réel de ces protéines peut encore augmenter) dont CENP-A, CENP-C ou CENP-B (seule protéine non essentielle à la viabilité des cellules). Le kinétochore externe interagit avec les microtubules sur lesquels les chromatides se déplacent. Enfin le kinétochore intermédiaire forme la jonction entre les deux premières strates (figure 25). Le recrutement des protéines des couches intermédiaires et externes est coordonné au cycle cellulaire.

## Le modèle tridimensionnel du centromère

La chromatine linéaire s'enroule pour former une spirale (figure 26) où les blocs de nucléosomes H3 se retrouvent juxtaposés d'un côté et les blocs CENP-A sur l'autre (Zinkowski et coll., 1991 ; Blower et coll., 2002). Entre les deux chromatides, les complexes de la cohésine enferment la chromatine H3, attachant ainsi les deux chromatides sœurs. A l'extérieur de la spirale, les nucléosomes CENP-A interagissent avec les microtubules par
l'intermédiaire du kinétochore. On a supposé que les blocs de nucléosomes CENP-A
correspondaient à des sous-unités élémentaires ayant pour modèle de base le kinétochore de S.
cerevisiae (Zinkowski et coll., 1991).

IV.2.4 Cas particuliers

Les holocentromères

Des nombreux vers, insectes et plantes possèdent des centromères holocentriques : le
centromère s'étend sur l'ensemble des chromosomes. Un exemple connu de cette catégorie est
le vers C. elegans. On peut noter là quelques détails intéressants. La taille de ses
chromosomes (entre 14 et 21 Mb) correspond à la taille des centromères des mammifères.
D'autre part HCP-3 (l'homologue de CENP-A) n'est pas répartie sur l'ensemble des
chromosomes, mais est concentrée en loci distincts, ce qui rappelle fortement les blocks
alternés de nucléosomes H3 et CENP-A (Dernburg, 2001).

Les néocentromères

Ils se forment sur des séquences uniques et non sur les séquences répétées “α-satellite”. Il
en existe 50 à 60 recensés sur le génome humain (Choo, 2001). Ces néocentromères
fonctionnels ne se distinguent des centromères classiques que par l’absence de la protéine
CENP-B (Masumoto et coll., 1989). Lo et coll. (2001) ont analysé les caractéristiques de
l’ADN de deux néocentromères (10q25.3 et 20p12) : ces séquences uniques sont, par rapport
à l’ensemble du génome, riches en nucléotides A et T et tendent à exclure les séquences SINE
(Short Interspersed Nuclear Elements).

La localisation du centromère n'est donc pas imposée par la séquence d'ADN (sauf pour *S. cerevisiae*) et est transmise épigénétiquement. CENP-A qui, comme on l'a vu, remplace l'histone H3 dans les nucléosomes du centromère, semble être le meilleur candidat pour ce marquage épigénétique.
# IV.3 Le variant centromérique de l'histone H3

## IV.3.1 Les caractéristiques de CENP-A

### Historique

Dans le sérum de patients atteints du syndrome de CREST ("Calcinosis, Raymond's phenomenon, Esophageal hypomobility, Sclerodactyly, Telangiectasia"), maladie auto-immune, des anticorps sont dirigés contre des protéines du centromère : CENP-A, CENP-B et CENP-C (Moroi et coll., 1980 ; Earnshaw et coll., 1985). Palmer et coll. (1987) ont montré que CENP-A était toujours copurifiée avec les histones du cœur, indépendamment de la méthode d'extraction. Le séquençage du gène correspondant a révélé que CENP-A est un variant de l'histone H3 (Palmer et coll., 1991 ; Sullivan et coll., 1994). La confirmation que CENP-A pouvait effectivement remplacer H3 a été apportée par Yoda et coll. (2000), qui ont reconstitué *in vitro* des nucléosomes porteurs de CENP-A.

### Les caractéristiques de CENP-A

CENP-A et ses homologues dans d'autres organismes sont composés de deux domaines :

* ✓ Le domaine N-terminal est spécifique à chaque espèce et varie en longueur et en séquence (Malik et Henikoff, 2003). Chez l'homme, ce domaine a la même taille que la queue N-terminale de l'histone H3 et le même nombre de charges positives (Sullivan et coll., 1994). Cependant, alors que sur H3 ces charges se répartissent entre arginines (7) et lysines (8), les charges positives de la queue de CENP-A sont portées quasi exclusivement par les arginines (12 arginines pour 1 lysine), laissant supposer très peu de modifications post-traductionnelles sur ces résidus et donc un nombre de charges positives constant (Sullivan et coll., 1994).

* ✓ Le domaine de "repliement des histones" montre environ 60% d'homologie avec celui de H3 (Malik et Henikoff, 2003). La longueur de la boucle L1 est la principale différence entre les deux variants : CENP-A possède deux à trois résidus supplémentaires suivant les organismes (figure 27). Des différences ponctuelles existent aussi en des points stratégiques. Dans le nucléosome, trois arginines du domaine de "repliement des histones" de H3 interagissent avec le petit sillon de l'ADN (Luger et coll., 1997) aux SHL ± 1,5, ± 2,5 et ± 6,5. Dans beaucoup d'homologues de CENP-A, les arginines en SHL ± 2,5 et ± 6,5 sont remplacées par d'autres résidus (figure 27). Chez l'homme, on y trouve, respectivement, une asparagine et une lysine. Ces deux SHL sont particulièrement intéressants parce qu'ils
<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 27 : Alignement des séquences CENP-A de différents organismes et comparaison avec H3</figcaption></figure>

h : humain, m : souris, d : mouche du vinaigre, y : levure *S. cerevisiae*. Les séquences des queues N-terminales de CENP-A de la mouche du vinaigre et de la levure, très différences, ne sont pas reportées. Sur l'histone H3, trois arginines (en gras) interagissent avec l'ADN aux SHL indiqués. Sur les différents homologues de CENP-A, une à deux arginines sont mutées (en rouge et en gras), affaiblissant localement les interactions protéines-ADN (d'après Pehrson, 2004).

définissent l'entrée-sortie du tétrasome (± 2,5) et du nucléosome (± 6,5), laissant prévoir des
altérations des dynamiques de ces deux particules (voir le chapitre 3, ARTICLE I).

Jusqu'à récemment, le nucléosome porteur de CENP-A n'avait donné lieu aucune étude
structurale. Black et coll. (2004) sont les premiers à s'être intéressés la question : ils ont
démontré, grâce à la chromatographie d'exclusion, que le tétramère (CENP-A-H4)$_2$ était plus
compact que le tétramère (H3-H4)$_2$. La technique d'échange hydrogène/deutérium, couplée à
la spectrométrie de masse, leur a permis ainsi de mettre en évidence, toujours dans le
tétramère (CENP-A-H4)$_2$, une moindre accessibilité au solvant des hélices α2 des histones
CENP-A et H4 (Black et coll., 2004).

IV.3.2 L'adressage de CENP-A au centromère : une question vitale

Les éléments en cís

Contrairement à ce qu'on aurait pu attendre, vu sa spécificité, le domaine spécifique N-
terminal de CENP-A n'est pas responsable de l'adressage du variant au centromère (Sullivan
et coll., 1994 ; Lermontova, 2006). Toutefois il est nécessaire, chez *S. cerevisiae*, au
recrutement d'autres protéines du kinétochore (Chen et coll., 2000). L'étude de chimères
construites à partir de H3 et de CENP-A humaines a conduit à la détermination d'un certain
nombre d'éléments du domaine du "repliement des histones" impliqués dans l'adressage de la
protéine (Shelby et coll., 1997). Ainsi la boucle L1 et l'hélice α2 apparaissent non seulement
nécessaires, mais suffisantes pour cet adressage. Curieusement, ces deux éléments, regroupés
sous le terme de CATD (*CENP-A Targeting Domain*), sont aussi responsables de la
diminution de la surface accessible au solvant dans le tétramère (CENP-A/H4)₂ (voir plus
haut).

Les éléments en trans

Au sein du centromère, les protéines dépendent plus ou moins les unes des autres (figure
28). Une protéine CENP-A mutée peut conduire à la mauvaise localisation de très nombreuses
protéines du centromère (par exemple : Okada et coll., 2006 ; Hayashi et coll., 2004 ; Chen et
coll., 2003).

Pour isoler le centromère de l'incorporation de l'histone H3, on a émis l'idée que l'ADN
centromérique était répliqué indépendamment du reste du génome dans le temps et/ou
l'espace (Csink et Henikoff, 1998). L'hypothèse s'est révélée inexacte au moins dans les
cellules de la mouche du vinaigre et de mammifères : la réplication de l'ensemble des
centromères n'est pas synchronisée et se fait en même temps que celle de nombreuses autres
régions du génome (Shelby et coll., 2000 ; Sullivan et Karpen, 2001 ; Ouspenski et coll.,
2003). En revanche l'expression de la plupart des variants des histones, et en particulier de
CENP-A, est découplée de la réplication. Pour CENP-A, sa quantité est maximale pendant la
phase G2 du cycle cellulaire (Shelby et coll., 2000). La production de CENP-A lors de la
phase S (sous le promoteur de H3 : Shelby et coll., 1997, ou sous promoteur inductible :
Shelby et coll., 2000) conduit à une répartition homogène de CENP-A sur le génome. Un des
éléments importants de la localisation spécifique de CENP-A au centromère est donc le
découplage de son expression de la réplication de l'ADN.

La découverte d'un chaperon de CENP-A est très récente (Furuyama et coll., 2006).
RbAp46/48 est un chaperon commun à l'ensemble des variants de l'histone H3 (en fait les
chaperons prennent en charge le dimère H3-H4). Il interagit cependant avec le dimère au sein
de différents complexes : le complexe CAF-1 pour l'histone canonique H3.1, le complexe
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 28 : Exemples de cartes d'interactions des protéines du centromère</figcaption></figure>

(A) Carte des interactions physiques de 15 protéines et des sous-domaines formés (Foltz et coll., 2006). (B) Cascade de recrutement d'environ 20 protéines en fonction du cycle cellulaire (Liu et coll., 2006).

HIRA pour H3.3. Dans le cas de CENP-A, RbAp46/48 interagit au contraire seul avec CENP-A-H4 (Furuyama et coll., 2006).

Chez *S. cerevisiae* et la mouche du vinaigre, un processus négatif semble aider à la localisation exclusive de CENP-A au centromère. Celle-ci est marquée à l'ubiquitine et dégradée par le protéasome quand elle est située sur les bras des chromosomes, mais elle est protégée dans le centromère (Collins et coll., 2004 ; Moreno-Moreno et coll., 2006).
# CHAPITRE 2 :

## LES TECHNIQUES UTILISEES
ET LEURS APPORTS
# I. LA TECHNIQUE DES MINICERCLES

## I.1 Le paradoxe du nombre d'enplacements de l'ADN dans la chromatine

Ce paradoxe vient d'un conflit entre les données topologiques et les données structurales du nucléosome. Le nombre de supertours négatifs de l'ADN dans le minichromosome natif du virus SV40 correspond au nombre de nucléosomes (Germond et coll, 1975 ; Shure et Vinograd, 1976 ; Saragosti et coll, 1980). Ceci implique que chaque nucléosome réduit le nombre d'enplacements (Lk ; équation (1), page 11) d'une unité. D'un autre côté, les premiers cristaux de la particule cœur du nucléosome (Finch et coll., 1977 ; 1981) montraient un ADN enroulé en 1,75 tour d'une superhélice gauche sur les histones. Le simple prolongement des ADNs entrant-sortant dans le nucléosome complet conduisait à un croisement négatif. Joint au croisement négatif interne, ce croisement devrait réduire le nombre d'enplacements de deux unités par nucléosome et non pas d'une. Klug et Lutter (1981) ont émis l'hypothèse que l'ADN subissait une surtorsion au cours de son enroulement sur l'octamère, et ils ont proposé une périodicité locale de l'ADN de 10 pb par tour au lieu de 10,5 pour l'ADN libre en solution.

Pour résoudre cette contradiction, il est rapidement apparu que le système le plus simple est un nucléosome unique reconstitué sur un minicercle. Le premier avantage est de supprimer les effets des ADNs de liaison et les éventuelles interactions nucléosome/nucléosome des minichromosomes. Le second est de pouvoir visualiser directement le chemin suivi par l'ADN sur l'octamère et dans la boucle au moyen de la microscopie électronique. Dans un premier temps, la mise en évidence du nucléosome "ouvert", où les ADNs entrant-sortant ne croisaient pas (Goulet et coll., 1988 ; Zivanovic et coll., 1988), a permis de réconcilier topologie et structure en montrant qu'il n'y a pas de surtorsion de l'ADN à la surface des histones. Le paradoxe était alors résolu par une absence de croisement des ADNs entrant-sortant dans la chromatine. Il est apparu ensuite que le nucléosome pouvait adopter trois conformations différentes (ouverte, fermées négative et positive). Le paradoxe était donc définitivement résolu par l'équilibre dynamique des nucléosomes entre ces trois états, en l'absence de surtorsion (Sivolob et coll., 1999 ; De Lucia et coll., 1999). Ainsi, le mélange des croisements négatif et positif équivalait à pas de croisement du tout.
# I.2 Les bases théoriques pour l'approche dite “des minicercles”

## I.2.1 Les minicercles nus

Dans la mise en œuvre de la “technique”, la première étape est la fabrication de topoisomères sous-enroulés par circularisation de fragments d’ADN en présence de bromure d’éthidium (BET). Pour chaque molécule de BET intercalée entre deux pb, l’angle de torsion des plateaux (environ 34°) diminue d’environ 23° (Sivolob et coll., 1999). ΔLk est alors la détorsion totale pour toutes les molécules de BET intercalées. On enlève le BET après circularisation, et la contrainte ΔLk se répartit en torsion, ΔTw, et vrillage, Wr (équation (5), page 13). La migration des topoisomères sur un gel de polyacrylamide est fonction de ce vrillage. On peut alors les fractionner, les identifier et les purifier après extraction (figure 29).

La figure 30 montre les produits du relâchement avec la topoisomérase I d'une série de minicercles. Ceux-ci ont la même séquence mais des tailles (N en pb) qui varient par incrément de une à deux pb. On observe le plus souvent un topoisomère majoritaire (voire unique), mais pas toujours. En réalité, la distribution des topoisomères à l'équilibre obéit à la loi de Boltzman, où la probabilité p(Lk) du topoisomère de nombre d'enplacements Lk est

$$p(Lk) = \frac{e^{-\Delta G_{sc}(Lk)}}{\sum_{Lk} e^{-\Delta G_{sc}(Lk)}} \quad (7)$$

où ΔGsc est l'énergie libre de surenroulement (équation (6), page 14). Le nombre d'enplacements moyen pour la distribution est défini par :

$$\langle Lk \rangle = \sum_{Lk} p(Lk) * Lk \quad (8)$$

La courbe $\langle Lk \rangle = f(N)$ adopte une allure en pallier (figure 31). Un tel comportement traduit la rigidité des fragments courts. Lorsque N est un multiple exact du pas h (pb/tour) de la double hélice, les brins sont en phase angulaire et l'ADN est relâché en un seul topoisomère. Pour un accroissement de N de h/2, les deux brins sont en opposition de phase et deux topoisomères sont alors obtenus en quantité égale (du fait de l'équiprobabilité de la sur- et sous-torsion). Dans les cas intermédiaires, la circularisation tend à former le topoisomère qui correspond au plus petit angle de torsion, positif ou négatif. La tendance au pallier décroît quand N augmente, c'est-à-dire quand la rigidité diminue (Shore et Baldwin, 1983a ; 1983b).

La courbe $\langle Lk \rangle = f(N)$ (figure 31) présente deux points d'inflexion (A et B) qui correspondent à deux topoisomères obtenus en quantité égale pour les tailles $N = nh + h/2$ (n
<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 30 : Relâchement des minicercles nus
Electrophorèse des topoïsomères obtenus après relâchement avec la topoïsomérase I des topoïsomères Lk = 32 de la série pBR. (De Lucia et coll., 1999).</figcaption></figure>

Figure 29 : Préparation des topoïsomères en présence de BET
Le fragment de 354pb de la série pBR marqué au ³²P avec la kinase est circularisé en présence d'une ADN ligase et de quantité croissante de bromure d'éthidium (BET). Les produits sont soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide. On montre une autoradiographie du gel. CO : circulaire ouvert.

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

Figure 31 : Evolution du nombre moyen d'enlacements <Lk> de la série pBR en fonction de la taille (N)
<Lk> est calculé à partir de la quantification des produits de relâchement des topoïsomères nus, sur le gel de la figure 30. Points A et B : points d'inflexion correspondant à 2 topoïsomères obtenus en quantités égales (voir le texte).

<table><caption>Tableau 3 : Paramètres de l'ADN des séries "pBR" et "5S"</caption><thead><tr><th>Série</th><th>h<sub>0</sub> (pb/tour)<br>(±0,003)</th><th>Ksc (kT.pb)<br>(±300)</th><th>τ (°d'angle/°C/pb)<br>(±0,001)</th></tr></thead><tbody><tr><td>pBR</td><td>10,494</td><td>4000</td><td>0,015</td></tr><tr><td>5S</td><td>10,538</td><td>4200</td><td>0,012</td></tr></tbody></table>
entier). Ces deux points sont alignés sur la droite $<Lk> = Lk_0 = N/h_0$ (en pointillé sur la figure31). $h_0$ peut être estimé par la mesure de $N_A$- $N_B$ : on trouve environ 10,5 pb (cette mesure est peu précise). L'écart de la courbe à la droite $<Lk> = N/h_0$ reflète la rigidité du minicercle.

$<Lk>$ est fonction de $h_0$, mais aussi de Ksc, la constante de force du surenroulement, une mesure de l'élasticité dynamique du minicercle. En ajustant (par la méthode des moindres carrés non linéaire) l'équation (8) aux résultats expérimentaux de la figure 31, on obtient Ksc et $h_0$. Il existe une méthode beaucoup plus précise, mais reposant sur le même principe, pour mesurer les paramètres de l'ADN. On relâche deux minicercles de même séquence à différentes températures, leurs tailles ayant été choisies de manière à donner deux topoisomères à l'équilibre. On obtient alors le pas, $h_0$, rapporté à la température de référence (37°C), Ksc, et le coefficient de déroulement thermique de la double hélice, $\tau$. Le tableau 3 présente les paramètres ainsi obtenus pour les ADNs des séries pBR et 5S.

### I.1.2 Les minicercles reconstitués

✓ Pour chaque conformation d'une particule (tétrasome, nucléosome ou chromatosome) sur un minicercle, on peut écrire :

$$ \Delta Lk = \Delta Lk_p(i) + \Delta Lk_b(i) \quad (9) $$

où $\Delta Lk$, $\Delta Lk_p(i)$ et $\Delta Lk_b(i)$ sont les contraintes de surenroulement associées, respectivement, au minicercle nu, à la conformation i de la particule et à la boucle d'ADN. L'équation (5) (page 13) peut s'écrire :

$$ \Delta Lk = \Delta Tw_p(i) + \Delta Tw_b(i) + Wr(i) \quad (10) $$

avec $\Delta Tw_p$ et $\Delta Tw_b$ les différences de torsion à la surface de la particule et dans la boucle et $Wr$ le vrillage total dans la conformation i. Quand la boucle est relâchée ($\Delta Lk_b(i) = 0$ et $\Delta Tw_b(i) = 0$), $Wr(i) = Wr_0(i)$, et en combinant les équations (9) et (10), on obtient :

$$ \Delta Lk_p(i) = \Delta Tw_p(i) + Wr_0(i) \quad (11) $$

avec

$$ \Delta Tw_p(i) = N_p(i) * (1/h - 1/h_0) \quad (12) $$

où $N_p(i)$ est le nombre de pb enroulées autour de la particule avec la périodicité h. Cette périodicité est en fait la périodicité “intrinsèque” $h_{int}$, mesurée dans un référentiel fixe, par exemple du laboratoire. Elle est reliée à la périodicité locale $h_{loc}$ (périodicité des contacts de
l'ADN avec les histones, accessible en principe par digestion avec la DNaseI ou avec les radicaux hydroxyles) par (Le Bret, 1988 ; Prunell, 1998) :

$$1/h_{\text{loc}} = 1/h_{\text{int}} - 0,34 * p/(2\pi r)^2 * p^2 \quad (13)$$

où r (nm) et p (nm) sont le rayon et le pas de la superhélice de l'ADN à la surface des histones, si cette surface peut être considérée comme parfaitement cylindrique. Avec r = 4,3 nm et p = 2,7 nm (Richmond et coll., 1984), on obtient :

$$h_{\text{loc}} = h_{\text{int}} - 0,15 \quad (14)$$

✓ L'énergie libre d'une particule dans l'état i sur le topoisomère Lk de taille N peut se décomposer en deux termes :

$$G(i, N, Lk) = G_{\text{sc}}(i) + G_{\text{p}}(i) \quad (15)$$

Gsc(i) est l'énergie libre de surenroulement de la boucle (pour l'état i du nucléosome) :

$$\begin{align}
G_{\text{sc}}(i) &= [K_{\text{sc}}(i) / N_b] * \Delta L k_b^2 \nonumber \\
&= [K_{\text{sc}}(i) / (N - N_p)] * (L_k - L k_0 - \Delta L k_p(i))^2 \tag{16}
\end{align}$$

où N<sub>b</sub> = N - N<sub>p</sub> est la taille de la boucle et K<sub>sc</sub> est la constante de force du surenroulement.

G<sub>p</sub>(i) comprend toutes les autres contributions à l'énergie libre du nucléosome : en particulier l'énergie de courbure de la boucle non contrainte en torsion, et l'énergie de liaison de l'ADN avec les histones. G<sub>p</sub>(i) est mesuré par référence à un des états de la particule.

✓ La probabilité de trouver dans l'équilibre de relâchement une particule dans l'état i sur le topoisomère Lk est

$$p(i, N, Lk) = e^{-G(i, N, Lk)} \quad (17)$$

La probabilité d'une particule sur le topoisomère Lk, quel que soit son état, est donc :

$$P(N, Lk) = \frac{\sum_{i} p(i, N, Lk)}{\sum_{Lk} \sum_{i} p(i, N, Lk)} \quad (18)$$

On remplace N par <N> et Lk par ΔLk, et on obtient :

$$P(\Delta Lk) = \frac{\sum_{i} p(i, \Delta Lk)}{[(... + \sum_{i} p(i, \Delta Lk - 1) + \sum_{i} p(i, \Delta Lk) + \sum_{i} p(i, \Delta Lk + 1) + ...]} \quad (19)$$

Ksc(i) dans l'équation (16) est calculé pour chaque état par les solutions explicites des systèmes d'équations décrivant la boucle dans la théorie de la tige élastique pour l'ADN (nommée par la suite : théorie des "solutions explicites" ; Swigon et coll., 1998). Dans cette approche, la boucle est considérée comme un domaine dont les extrémités, au contact des histones, sont bien définies en position et direction. On peut alors déterminer le Wr₀ de chaque conformation. Puis en ajustant l'équation (19) aux résultats expérimentaux, on obtient
pour chaque état i, $\Delta L_{k_p}(i)$ et $\Delta G_p(i)$. Ces paramètres sont alors utilisés en sens inverse pour
tracer les courbes théoriques, c'est-à-dire les enveloppes des points expérimentaux (voir ci-
dessous).

## I.3 La dynamique du nucléosome

### I.1.1 Les “instantanés” de microscopie électronique

La reconstitution sur des minicercles produit, en plus de mononucléosomes dotés d'ADNs entrant-sortant croisés ou non, des dinucléosomes dont les ADNs de liaison croisent ou non (figure 32). Ces différentes conformations fluctuent en principe dans le temps : on dit que les nucléosomes sont “dynamiques”. Différents facteurs peuvent influencer cette dynamique : le sel, par exemple, favorise les états croisés en diminuant la répulsion des ADNs entrant-sortant par écrantage de leurs charges négatives (tableau 4).

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Figure 32 : Visualisation des nucléosomes par microscopie électronique
Produits de la reconstitution sur les topoisomères -1 (à gauche) et -2 (à droite) d'un fragment de 359 pb issu du plasmide pBR322. On distingue : (a) des topoisomères nus, (b) des mononucléosomes ouverts, ou (c) fermés, et (d) des dinucléosomes ouverts ou (e) fermés. Ces conformations peuvent fluctuer en solution (Goulet et coll., 1988 ; Zivanovic et coll., 1988).
<table><caption>Tableau 4 : Effet du sel sur la fréquence des conformations croisées des nucléosomes selon le topoisomère</caption><thead><tr><td>ΔLk</td><td>TE</td><td>100mM NaCl</td><td>croisement</td></tr></thead><tbody><tr><td>-2</td><td>0,45</td><td>0,87</td><td>-</td></tr><tr><td>-1</td><td>0,01</td><td>0,15</td><td>~ 0</td></tr><tr><td>0</td><td>0</td><td>0,40</td><td>+</td></tr></tbody></table>

La fréquence des conformations croisées est comptabilisée à partir de clichés de microscopie de nucléosomes reconstitués sur les topoisomères indiqués (Goulet et coll., 1988 ; Zivanovic et coll., 1988)

## I.1.2 Les trois conformations

### Le principe des expériences de relâchement

Les étapes successives de l'expérience sont schématisées sur la figure 33A. Les particules sont reconstituées sur des topoisomères sous-enroulés (figure 33B, 1er puits) et relâchées à l'aide de la topoisomérase I (3ème puits). On utilise $ΔLk ≤ -3$ pour les nucléosomes et les chromatosomes et $ΔLk ≤ -2$ pour les tétrasomes, la règle étant que le topoisomère de départ n'appartienne pas à l'équilibre final. Une partie de la contrainte initiale du topoisomère ($ΔLk$) reste emprisonnée sur les histones et le reste de la contrainte, dans la boucle, est relâchée par la topoisomérase. Après fractionnement sur "gel chromatine", on découpe la bande du gel correspondant aux nucléosomes relâchés. On extrait alors l'ADN et on identifie et quantifie les topoisomères sur "gel ADN" (figure 33C et D).

Pour obtenir la contrainte emprisonnée dans une conformation particulière de la particule, on recherche le topoisomère qui donnera une boucle parfaitement relâchée. Cependant, pour une taille donnée, les topoisomères ne diffèrent les uns des autres que par valeur entière du $ΔLk$. Un spectre plus continu de $ΔLk$ sera obtenu avec une série de minicercles. Deux séries d'ADN sont actuellement disponibles : la série "pBR" est issue du plasmide pBR322 (De Lucia et coll., 1999) et la série "5S" dérive du gène 5S d'oursin de mer (Sivolob et coll., 2003).
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 33 : Relâchement des minicercles reconstitués</figcaption></figure>

(A) Principe de l'expérience. (B) Des nucléosomes sont reconstitués sur le topoisomère -2,7 (355 pb de la série 5S ; puits -2,7), et incubés avec (+) ou sans (-) la topoisomérase I. On dépose sur le même gel, comme témoins, les nucléosomes reconstitués sur les topos -1,7 et -0,7 (Control). La tranche de gel correspondant aux nucléosomes relâchés (crochet) est découpée, l'ADN est élué et extrait, et les topoisomères sont déposés sur un "gel ADN" (en C ; puits +) avec des topoisomères marqueurs (marker). Pour une meilleure résolution des topoisomères, ce gel contient de la chloroquine. (D) Profil du puits + du "gel ADN" en (C).

## Les détails des conformations

Les résultats du relâchement des nucléosomes sont représentés sous la forme de graphes reliant la quantité relative de chaque topoisomère à son ΔLk, ceci pour tous les équilibres obtenus avec les différents minicercles de la série (figure 34). Alors qu'un seul pic large est obtenu dans le cas des nucléosomes 5S, pour la série pBR, un pic et deux épalements se dessinent. Les nucléosomes ont accès à trois conformations différentes (correspondant à chacun des pics ou épalements) avec des ΔLkNS de -1,69, -1,04 et -0,56 (tableau 5). La théorie des "solutions explicites" permet de prévoir le chemin suivi par l'ADN pour chacune des conformations (figure 34B).
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

croisé -

<figure><img src="image_42.png" /></figure>

ouvert

<figure><img src="image_43.png" /></figure>

croisé +

Figure 34 : Equilibre dynamique des nucléosomes entre les trois conformations

(A) Les quantités relatives des topoisomères obtenus par relâchement des nucléosomes des séries pBR et 5S sont tracées en fonction de la contrainte des topoisomères. Les résultats obtenus dans (D) de la figure 33 sont représentés par les points noirs. Noter les épaulements correspondant aux conformations. (B) Représentations de l'ADN dans les conformations fermée négative, ouverte et fermée positive. Celles-ci sont calculées par la théorie des "solutions explicites", avec les paramètres du tableau 5, pour un minicercle de 359 pb et avec un enroulement de 1,7 tour pour les états fermés et 1,4 tour pour l'état ouvert (Sivolob et Prunell, 2004).

✓ $\Delta L_{k_{NS}} = -1,69$ correspond au nucléosome “canonique” où l’ADN s’enroule autour de l’octamère d’histones en 1,75 tour. C’est la conformation fermée négative qu’on voit figure 32 (insert c) : le nucléosome étant reconstitué sur un topoisomère $\Delta L_k = -2$, la boucle est presque relâchée. Il s’agit de la conformation la plus favorable ($\Delta G_{NS \min} < 0$ ; tableau 5).

✓ $\Delta L_{k_{NS}} = -1,04$ correspond à la conformation ouverte : 120 pb seulement sont enroulées sur les histones en 1,45 tour. Les sites d’interactions aux SHL $\pm 6,5$ (voir le § II.1 du CHAPITRE 1) sont rompus, et les ADNs entrant-sortant ne croisent pas (figure 32 à gauche et insert b à droite).

✓ $\Delta L_k = -0,56$ correspond à la conformation la plus énergétique et donc la moins favorable. Les ADNs entrant-sortant croisent positivement.
<table><caption>Tableau 5 : Paramètres des états des nucléosomes (indice NS) selon la série des minicercles et l'état de modifications des histones</caption><thead><tr><th>Série</th><th>Etat</th><th>ΔLk<sub>NS</sub></th><th>Wr<sub>0</sub></th><th>ΔG<sub>NS</sub></th><th>Probabilité de chaque état</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">pBR-histones normales</td><td>fermé -</td><td>- 1,69</td><td>- 1,64</td><td>- 0,8</td><td>0,63</td></tr><tr><td>ouvert</td><td>- 1,04</td><td>- 1,00</td><td>0</td><td>0,28</td></tr><tr><td>fermé +</td><td>- 0,56</td><td>- 0,31</td><td>1,2</td><td>0,09</td></tr><tr><td rowspan="3">pBR-histones acétylées</td><td>fermé -</td><td>- 1,73</td><td>- 1,64</td><td>0,8</td><td>0,30</td></tr><tr><td>ouvert</td><td>- 1,02</td><td>- 1,00</td><td>0</td><td>0,68</td></tr><tr><td>fermé +</td><td>- 0,61</td><td>- 0,31</td><td>3,6</td><td>0,02</td></tr><tr><td rowspan="3">5S-histones normales</td><td>fermé -</td><td>- 1,40</td><td>- 1,64</td><td>- 1,7</td><td>0,83</td></tr><tr><td>ouvert</td><td>- 0,72</td><td>- 1,00</td><td>0</td><td>0,15</td></tr><tr><td>fermé +</td><td>- 0,41</td><td>- 0,31</td><td>2,2</td><td>0,02</td></tr></tbody></table>

ΔLkNS et ΔGNS sont obtenus par ajustement des points expérimentaux, alors que Wr0 est issu de la théorie des “solutions explicites”. La probabilité de chaque état est égale à :

$$p(i) = \frac{\exp[-\Delta G_{NS}(i)]}{\sum_{i} \exp[-\Delta G_{NS}(i)]}$$

### I.1.3 Les queues des histones

Les queues N-terminales de H3 (et de H4 dans une moindre mesure), en interagissant avec les ADNs entrant-sortant du nucléosome, réduisent leur répulsion électrostatique. Ceci peut être constaté en reconstituant des octamères d'histones acétylées ou demi-acétylées (correspondant à un mélange de tétramères (H3-H4)$_2$ acétylés et de dimères H2A-H2B non acétylés ; De Lucia et coll., 1999). L'acétylation, en supprimant les charges positives des queues, affaiblit leur interaction avec les ADNs entrant-sortant et donc augmente leur répulsion mutuelle, défavorisant du même coup les états croisés (tableau 5).

Le remplacement du tampon Tris par un tampon Phosphate a le même effet que l'acétylation. Les ions phosphates se comportent en effet comme des compétiteurs des phosphates du squelette de l'ADN vis-à-vis des résidus basiques des histones, affaiblissant leurs interactions avec l'ADN (De Lucia et coll., 1999). On peut également supprimer le magnésium du tampon Tris (la topoisomérase I peut fonctionner sans magnésium, quoique avec une moindre activité). Là encore, on a un effet similaire à l'acétylation des queues : l'absence de ce cation doit diminuer l'interaction des queues avec l'ADN. Le rôle exact du magnésium est complexe, car il a aussi une capacité de pontage.
### I.1.4 L'énergie élastique de la boucle

La figure 35 montre l'énergie élastique Gsc de la boucle d'ADN, en fonction de la contrainte du topoisomère $\Delta L_k$ calculée pour une conformation ouverte (1,45 tour d'ADN enroulé sur les histones) ou fermée (1,7 tour), au moyen de la théorie des "solutions explicites" (Sivolob et coll., 2003).

Dans le premier cas, le minimum d'énergie correspond bien au $\Delta L_{k_{NS}}$ de la conformation ouverte. Le calcul avec un enroulement de 1,7 tour fait apparaître deux minima (autour de -1,7 et -0,3). La théorie permet également de déterminer les $\Delta L_k$ où se produisent les contacts physiques entre les ADNs entrant et sortant (autour de -2,3 et -0,5). La première valeur est bien au-delà du $\Delta L_{k_{NS}}$ (-1,7) de la conformation croisée négative et n'interfère pas avec cet état. Pour la conformation fermée positive, en revanche, les ADNs entrent en contact avant d'avoir atteint le minimum d'énergie. Expérimentalement on ne peut donc obtenir que -0,5, et non la valeur prédite de -0,3.

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 35 : Calcul de l'énergie de surenroulement, Gsc, de la boucle d'ADN en fonction de la contrainte de surenroulement, $\Delta L_k$, du topoisomère</figcaption></figure>

(A) A gauche pour la conformation ouverte avec 1,45 tour d'ADN enroulé autour des histones et à droite pour les conformations fermées avec 1,7 tour d'ADN enroulé. (B) Influence de la courbure de l'axe de la superhélice de l'ADN sur l'énergie, Gsc, des deux conformations croisées. (C) Représentation de la courbure de l'axe de la superhélice de l'ADN nucléosomique (Sivolob et coll., 2003). Remarquons que cette courbure de l'axe est seulement un moyen commode d'effectuer les calculs avec la théorie des "solutions explicites". En réalité, les ADNs entrant-sortant semblent faire appel à un tout autre mécanisme pour diminuer leur divergence (détorsion au niveau des queues H2B ; voir plus bas).
### I.1.5 Le polymorphisme de séquence

#### Courbure de l'axe de la superhélice de l'ADN sur le nucléosome

Revenons à la série 5S. La différence principale des courbes de relâchement est la disparition de l'épaulement correspondant à la conformation croisée positive que l'on distingue bien pour la série pBR (figure 34). Le calcul de l'énergie confirme que cet état est devenu coûteux à atteindre ($\Delta G \ge 2,2$ kT ; tableau 5). La conformation fermée négative est, au contraire, plus accessible pour les nucléosome de la série 5S que pour ceux de la série pBR. De plus, les $\Delta L_{k_{NS}}$ expérimentaux de chacun des états sont différents dans les deux séries.

On observe que la différence d'énergie théorique entre les états positif et négatif (6 kT ; figure 35B) est proche de celle obtenue expérimentalement pour la série 5S (2,2 + 1,7 = 3,9 kT). Cette différence d'énergie est en revanche beaucoup plus faible pour la série pBR (1,2 + 0,8 = 2 kT ; tableau 5). Une hypothèse susceptible d'expliquer cette facilité à croiser "positif" des nucléosomes pBR consiste à supposer que l'axe de la superhélice de l'ADN sur le nucléosome est courbé, ce qui a pour effet de rendre les ADNs entrant-sortant moins divergents (figure 35C ; Sivolob et coll., 2003). Le rayon de courbure adéquat peut être calculé : il est de 15 nm (figure 35B). Remarquons que l'énergie de l'état négatif est alors peu modifiée.

#### Torsion de l'ADN sur le nucléosome

L'équation (11) relie $\Delta L_{k_{NS}}$, $W_r$ du tableau 5 et $\Delta T_{w_{NS}}$, la torsion de l'ADN à la surface des histones. On constate que $\Delta T_{w_{NS}}$ est proche de zéro pour la série pBR et d'environ + 0,3 pour la série 5S, et ceci pour les deux états ouvert et fermé négatif (l'état fermé positif est ici moins significatif). On en déduit que l'ADN s'enroule sans modification de la torsion sur les nucléosomes de la série pBR, et avec une surtorsion d'environ 0,3 tour sur ceux de la série 5S.

Pour mettre directement en évidence cette surtorsion, on reconstitue les nucléosomes sur les topoisomères -1 de chaque série. Ces nucléosomes sont digérés par la nucléase de microcoque pour obtenir les particules-cœurs, puis par la DNase I pour accéder à la périodicité locale de l'ADN sur les histones. L'ADN extrait du "gel chromatine" (figure 36A, crochet) est marqué au $^{32}$P à l'aide de la kinase et analysé sur un gel de séquence (figure 36B ; Sivolob et coll., 2003). On retrouve la périodicité moyenne attendue d'environ 10,5 pb/tour, mais on observe un décalage des bandes supérieures entre pBR et 5S. Le décalage, 1,2
<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 36 : Mesure et comparaison des périodicités locales de l'ADN dans les nucléosomes pBR et 5S</figcaption></figure>

(A) On reconstitue des nucléosomes (NS) sur le topoisomère -0,9 (puits 2). Les nucléosomes sont ensuite digérés avec la nucléase de microcoque (puits 3) pour obtenir des particules-cœurs des nucléosomes (NCP) puis avec la DNase I (puits 4). CO : circulaire ouvert. On montre seulement le nucléosome pBR à titre d'exemple. (B) Analyse, sur gel de séquence, des nucléosomes digérés du puits 4 du gel (A) et de leur équivalent pour les nucléosomes 5S. Puits 1 : marqueur de taille (fragment dépuriné 5S de 249 pb). A droite du gel complet, zoom de la région supérieure permettant une meilleure visualisation du décalage de 1,2 base entre les deux séries. (C) Fréquence de clivage à la DNase I en fonction de la taille des fragments, calculée à partir du gel (B). Noter le décalage des pics 5 et 6 entre pBR et 5S (Sivolob et coll., 2003).
nucléotide au SHL +5, se répercute au SHL +6 et à l'extrémité. La particule cœur étant
symétrique, on en déduit que le nucléosome pBR subit effectivement une détorsion de 2,4
nucléotides, soit de 2,4 / 10,5 = 0,23 tour par rapport au nucléosome 5S. Cette détorsion est
localisée aux SHL ±5, et est évidemment transmise aux ADNs entrant-sortant du nucléosome,
expliquant qu'on ait pu la détecter dans la boucle par relâchement.

Que se passe-t-il aux SHL ±5, siège de la détorsion ? C'est précisément là que la queue N-terminale de H2B passe entre les deux spires (figure 11, page 20). La queue de H2B apparaît ainsi s'insérer sans sous-torsion aux SHL ±5 pour les nucléosomes de la série 5S, et avec sous-torsion pour les nucléosomes de la série pBR. 20 pb plus loin (aux SHL ±6,5) s'insère la queue de H3. On peut supposer l'existence d'une interférence entre les deux queues : la différence d'insertion de la queue H2B aux SHL ±5 entraîne une différence dans l'insertion de la queue H3 aux SHL ±6,5, qui pourrait alors influencer directement l'orientation des ADNs entrant-sortant. C'est ce qu'on a appelé le polymorphisme de séquence des nucléosomes (Sivolob et coll., 2003).

**I.2 La dynamique du tétrasome**

**I.2.1 Les données expérimentales**

L'observation de base

La capacité des tétramères (H3-H4)₂ à former des tétrasomes sur des minicercles augmente rapidement avec le surenroulement, que ce surenroulement soit négatif ou positif. (figure 37). En fait il y a un petit décalage : la reconstitution est légèrement plus efficace avec la contrainte négative que positive. Cette différence montre qu'il faut un peu plus d'énergie pour former un tétrasome sur la branche positive que sur la branche négative.

La capacité des octamères à former des nucléosomes augmente aussi avec le
surenroulement négatif. Pour la contrainte positive, la situation est plus compliquée : on forme
plutôt des tétrasomes, les dimères H2A-H2B semblant généralement être laissés de côté.

La visualisation par microscopie électronique

Hamiche et coll. (1996b) ont reconstitué des tétrasomes sur des minicercles d'environ 350 pb de ΔLk = -1 et +1. La microscopie électronique révèle leurs ressemblances (figure 38) : i)
Figure 37 : Reconstitution des tétrasomes en fonction de la contrainte des topoisomères

(A) Les reconstitutions sont effectuées au même rapport histones /ADN pour tous les topoisomères.

(B) Les pourcentages de reconstitutions, obtenus par quantification du gel (A) et d'autres gels similaires (expériences indépendantes), sont tracés en fonction des contraintes des topoisomères (Hamiche et coll., 1996b).

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Figure 38 : Visualisation des tétrasomes par microscopie électronique

Les tétrasomes sont reconstitués sur les topoisomères -1 et +1 (359 pb de pBR). MT : tétrasome, II : particule possédant 2 tétramères empilés l'un sur l'autre (Hamiche et coll., 1996b).

Figure 39 : Equilibre dynamique des tétrasomes
(A) Les résultats des relâchement des tétrasomes sont représentés comme pour les nucléosomes dans la figure 34. (B) Représentations de l'ADN (359 pb) dans les conformations gauche et droite calculées à l'aide de la "théorie des solutions explicites" avec les paramètres du tableau 6 (Sivolob et coll., 2000 ; Sivolob et Prunell, 2004).

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>B</figcaption></figure>

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>gauche</figcaption></figure>

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>droit</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 6 : Paramètres des états chiraux des tétrasomes (indice TS)</caption><thead><tr><th>Série</th><th>Etat</th><th>ΔLk<sub>TS</sub></th><th>Wr<sub>0</sub></th><th>ΔG<sub>TS</sub></th><th>Probabilité de chaque état</th><th>r (nm)</th><th>ouverture latérale</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">pBR</td><td>gauche</td><td>-0,74</td><td>-0,82</td><td>0</td><td>0,67</td><td>4,3</td><td>-</td></tr><tr><td>droit</td><td>0,51</td><td>0,31</td><td>1,9</td><td>0,33</td><td>5,1</td><td>19%</td></tr><tr><td rowspan="2">5S</td><td>gauche</td><td>-0,68</td><td>-0,86</td><td>0</td><td>0,95</td><td>3,8</td><td>-</td></tr><tr><td>droit</td><td>0,60</td><td>-0,30</td><td>2,9</td><td>0,05</td><td>5,1</td><td>34%</td></tr></tbody></table>

ΔLkNS et ΔGNS sont obtenus par ajustement des points expérimentaux, alors que Wr0 et r (le rayon de la superhélice) sont issus de la théorie des “solutions explicites”. La probabilité de chaque état est égale à : $p(i) = \exp[-\Delta G_{TS}(i)] / \sum_{i} \exp[-\Delta G_{TS}(i)]$

dans les deux cas 55 pb sont enroulées en ~0,7 tour sur le tétramère (H3-H4)₂ ; ii) les ADNs entrant-sortant croisent et les boucles d'ADN nu semblent être relâchées. Les ΔLkTS devraient donc être proches de ±1.

## Le relâchement

La figure 39A présente les “courbes de relâchement” des tétrasomes reconstitués sur les minicercles des séries pBR et 5S (Sivolob et coll., 2000 ; Sivolob et Prunell, 2004). Deux pics sont observés, qui représentent les deux conformations du tétrasome (figure 39B), dotés de ΔLkTS presque opposés, -0,7 et +0,6 (tableau 6).

## I.2.2 La transition chirale

Ces résultats montrent que la boucle d'ADN peut fluctuer entre deux conformations croisées négative et positive. Rien, à ce niveau, ne permet d'affirmer que les protéines participent à ces oscillations. Il est utile de rappeler ici que le tétramère en tant que protéine forme un arc (3/4 tour) d'une superhélice gauche (c'est sur lui que s'enroule l'ADN). Sur cet arc, les dimères H3-H4 ressemblent à des sortes de croissants en contact à une de leurs pointes (l'interface H3/H3). Il est alors tentant de supposer que les fluctuations de la boucle d'ADN sont celles de la protéine : par rotation mutuelle autour de l'interface H3/H3, les dimères H3-H4 pourraient en effet passer d'une conformation gauche à une conformation droite (figure 40). Ce modèle a été validé par l'introduction d'une gêne stérique à l'interface H3/H3 au moyen de l'oxydation des cystéines 110 des H3. Il a été ainsi possible d'inhiber les fluctuations de l'ADN en bloquant le tétramère en forme gauche ou droite, selon le réactif des
<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 40 : La transition chirale du tétrasome</figcaption></figure>

La conformation gauche du tétrasome (l'ADN n'est pas représenté) permet l'incorporation des dimères H2A-H2B pour former le nucléosome. Les dimères ne peuvent pas interagir aussi facilement avec la conformation droite (Hamiche et coll., 1996b). Ce dernier point est l'objet de l'ARTICLE III. S·S indique les groupements thiols des cystéines 110 des H3 sur l'axe dyadique.

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Figure 41 : Le modèle du coin</figcaption></figure>

L'intercalation de la queue de H3 aux SHL ± 1 (Luger et coll., 1997) agit comme un coin s'opposant à l'ouverture latérale du tétrasome nécessaire dans la transition chirale. L'affaiblissement des interactions ADN/H3 (par acétylation, par exemple) va ainsi favoriser la transition (d'après Sivolob et coll., 2000).

thiols utilisés : le N-ethylmaleimide et le monobromobimane bloquent le tétramère en conformation gauche, alors que le DTNB (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoicacid)) le bloque en droit (Alilat et coll., 1999).

## Les queues et la transition chirale

Pour étudier l'effet des queues sur l'équilibre des tétrasomes, des tétramères ont été construits à partir de H3 et/ou H4 dépourvues des queues par dégradation (elles ont été coupées au moyen de la trypsine ; Sivolob et coll., 2000). Dans ces conditions, la transition chirale est favorisée et la conformation droite devient relativement plus favorable. Dans le modèle de la figure 41, la partie proximale de la queue N-terminale de H3 s'intercale dans le
petit sillon de l'ADN aux SHL ±1 (Sivolob et Prunell, 2000 ; Luger et coll., 1997). Cette intercalation agit comme un coin s'opposant à l'ouverture latérale du tétrasome, préalable à la transition chirale. Une telle ouverture latérale est en effet nécessaire pour permettre le passage des bras de l'ADN lors du changement de polarité du croisement. Ainsi, l'enlèvement des queues, ou l'affaiblissement de leurs interactions (par exemple par l'acétylation : Morales et Richard-Foy, 2000), favorise la transition.

## I.3 La dynamique du chromatosome

La figure 42 présente les "courbes de relâchement" des chromatosomes sur les séries 5S et pBR et le tableau 7 donne les paramètres topologiques et énergétiques des conformations. On constate, par rapport au nucléosome, la disparition de la conformation ouverte et une plus grande accessibilité à l'état fermé positif. Dans la série 5S, celui-ci reste cependant moins favorable que dans la série pBR. Mais la caractéristique la plus remarquable est sans doute la très grande flexibilité de la boucle dans les deux conformations : on passe d'un Ksc d'environ 2600 pour le nucléosome à 580-1200 pour le chromatosome (Sivolob et Prunell, 2003). L'origine de cette flexibilité est l'existence de la tige créée par H5 à l'entrée-sortie du nucléosome (voir le § III.1.2 du CHAPITRE 1). Cela signifie, en clair, qu'une contrainte imposée sur l'ADN entrant, par exemple, change le vrillage de la boucle, mais peu la torsion de l'ADN.

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 42 : Equilibre dynamique des chromatosomes
Même représentation que celles des nucléosomes et tétrasomes des figures 34 et 39 (Sivolob et Prunell, 2003).</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 7 : Paramètres des états du chromatosomes (indice CS)</caption><thead><tr><th>Série</th><th>Etat</th><th>ΔLk<sub>CS</sub></th><th>ΔG<sub>CS</sub></th><th>Probabilité de chaque état</th><th>K<sub>sc</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">pBR</td><td>négatif</td><td>- 1,89</td><td>0</td><td>0,75</td><td>580</td></tr><tr><td>positif</td><td>- 0,34</td><td>1,1</td><td>0,25</td><td>1200</td></tr><tr><td rowspan="2">5S</td><td>négatif</td><td>- 1,76</td><td>0</td><td>0,83</td><td>770</td></tr><tr><td>positif</td><td>- 0,16</td><td>1,6</td><td>0,17</td><td>1200</td></tr></tbody></table>

ΔLkNS et ΔGNS sont obtenus par ajustement des points expérimentaux, alors que Wr₀ Ksc sont issus de la théorie des “solutions explicites”. La probabilité de chaque état est égale à :

$$p(i) = \frac{\exp[-\Delta G_{CS}(i)]}{\sum_{i} \exp[-\Delta G_{CS}(i)]}$$
## II. MICROMANIPULATION DE FIBRES INDIVIDUELLES DE CHROMATINE

### II.1 Les dispositifs

Ces dispositifs se répartissent en deux grandes catégories (Zlatanova et Leuba, 2003) :

* ✓ La première permet, en même temps, une visualisation de l'objet étudié. Alors que la microscopie et la cryomicroscopie électroniques permettent seulement la visualisation, la microscopie à force atomique allie la visualisation et la micromanipulation (figure 43A). Une pointe montée sur un levier flexible interagit avec l'échantillon déposé sur une surface. Si on déplace cette surface, l'objet étudié va subir une force qui va fléchir le levier. Cette déflexion est repérée à l'aide d'un faisceau laser.

* ✓ La seconde catégorie permet seulement la micromanipulation et regroupe les systèmes de pinces optiques et de pinces magnétiques.

#### Le principe des pinces optiques.

Une bille diélectrique est attachée à une extrémité de la molécule. Sur cette bille est focalisé un faisceau laser qui sert de piège (figure 43B). L'autre extrémité de la molécule est fixée sur une surface ou à une autre bille maintenue par succion au moyen d'une micropipette. Si on exerce une force sur la molécule, la bille va être déviée du faisceau laser et subir une force de rappel proportionnelle à son déplacement par rapport au centre du piège, ce qui permet de mesurer cette force.

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 43 : Les dispositifs de micromanipulation de molécules uniques
(A) Microscopie à force atomique ; (B) pinces optiques ; et (C) pinces magnétiques (Zlatanova et Leuba, 2003).</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 8 : Caractéristiques des différents dispositifs</caption><thead><tr><td>Dispositif</td><td>Gamme de force (pN)</td><td>Résolution spatiale (nm)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Microscopie à force atomique</td><td>10&gt;10<sup>4</sup></td><td>&lt;1</td></tr><tr><td>Pinces optiques</td><td>10<sup>-1</sup>&gt;10<sup>2</sup></td><td>10</td></tr><tr><td>Pinces magnétiques</td><td>10<sup>-2</sup>&gt;10<sup>2</sup></td><td>10</td></tr></tbody></table>

### Le principe des pinces magnétiques.

Dans ce dispositif, une extrémité est attachée à une bille paramagnétique et l'autre est en général fixée au plancher d'une cellule. Des aimants permanents permettent d'exercer une force de traction sur la molécule, proportionnelle au gradient du champ magnétique (figure 43C). Plus on rapproche les aimants de la bille, plus la force augmente. Ce système permet aussi de faire tourner la bille autour de l'axe de la molécule par simple rotation des aimants.

### L'échelle des forces

Les moteurs moléculaires créent des forces comprises entre quelques pico-Newton (pN) et quelques dizaines de pN. Par exemple l'ARN polymérase de E. coli génère des forces d'environ 30 pN. Pour rompre les liaisons non-covalentes les plus fortes, il faut exercer des forces de plusieurs centaines de pN et pour les liaisons covalentes quelques nano-Newton. Pour rompre les liaisons phosphodiesters du squelette ribose-phosphate de l'ADN, par exemple, il faut exercer environ 1 nano-Newton (Zlatanova et Leuba, 2003). Le tableau 8 présente les ordres de grandeur des forces générées par les trois dispositifs précédents.

## II.2 La réponse mécanique en traction...

### II.2.1 ...d'une molécule d'ADN

La figure 44 montre la variation de la longueur relative d'une molécule d'ADN en fonction de la force de traction exercée (Allemand, 1997). La courbe obtenue peut être divisée en quatre domaines. Jusqu'à 10 pN, on déroule la "pelote statistique" de la molécule d'ADN,
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

Figure 44 : Allure de la réponse mécanique en traction de l'ADN

(1) On étire la pelote statistique de l'ADN : la force augmente peu (2) On tire sur les liaisons covalentes : la force augmente beaucoup sans grand changement de longueur. (3) La longueur de la molécule augmente de 60% environ à force constante : c'est la transition entre les conformations B et S de l'ADN. (4) ADN sous forme S. Cette forme reste mal définie (d'après Allemand, 1997).

c'est le régime entropique. Entre 10 et 70 pN (domaine n° 2), l'allongement de la molécule correspond sensiblement à la longueur cristallographique : on tire sur les liaisons chimiques (c'est le régime enthalpique). Une importante transition (domaine n°3) apparaît ensuite où la longueur de l'ADN augmente presque de moitié à force constante, ce qui mène enfin à une conformation mal définie (domaine n° 4).

Plusieurs paramètres sont utilisés pour décrire les caractéristiques physiques de l'ADN. La longueur de persistance est la longueur au bout de laquelle les corrélations directionnelles de l'axe de la molécule sont perdues à cause de l'agitation thermique. Elle traduit la rigidité de flexion de la molécule. Cette longueur de persistance est de 50 nm ou 150 pb pour l'ADN. On parle également de la longueur de persistance en torsion, qui est d'environ 80 nm, où là il s'agit des corrélations torsionnelles.

## II.2.2 ...d'une fibre la chromatine

Cui et Bustamante (2000) ont analysé la réponse de fibres de chromatine native contenant des histones de liaison, en réalisant plusieurs cycles de traction/relâchement dans différentes conditions salines. En 5 mM NaCl, les cycles successifs sont reproductibles. Les courbes aller et retour sont superposées tant qu'on n'exerce pas une force supérieure à 7 pN. Au-dessus apparaît une hystérésis qui révèle un résidu d'étirement (figure 45B). Entre 40 et 150mM NaCl, pour obtenir la même longueur de la fibre qu'en 5 mM, il faut tirer plus fort, comportement cohérent avec une augmentation des interactions attractives entre les nucléosomes. Ces interactions sont rompues par une force de 5 pN (figure 45C et D).
Figure 45 : Cycles de traction-relâchement d'une fibre de chromatine native
(Cui et Bustamante, 2000).

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

Figure 46 : Déroulement des nucléosomes par traction

(A) Visualisation des sauts de 25 nm quand la fibre de nucléosomes est soumise à une force de traction de 20 pN. (B) Schéma du déroulement de l'ADN. (d'après Brower-Toland et coll., 2002).

Dans d'autres travaux, les fibres de chromatine sont tirées à force constante et on regarde le changement de longueur en temps réel. L'équipe de M. Wang (Brower-Toland et coll., 2002) a reconstitué une fibre de nucléosomes sur un ADN formé de 17 répétitions de séquence 5S. En-dessous de 15 pN, l'extension de la fibre correspond à un déroulement réversible de 76 pb par nucléosome. Entre 15 et 50 pN, des sauts réversibles de 25 nm (ou 82 pb) apparaissent (figure 46A). Les auteurs ont proposé la séquence suivante : à faible force, on déroule d'abord le tour d'ADN enroulé sur les dimères H2A-H2B, puis on déroule le deuxième tour d'ADN en interaction avec le tétramère (H3-H4)₂. Au-delà de 50 pN, les sauts de longueur ne sont plus réversibles, traduisant une perte des histones, vraisemblablement des tétramères (H3-H4)₂, par rupture des SHL ± 0,5 au centre du nucléosome (figure 46B).
## II.3 La réponse mécanique en rotation...

### II.3.1 ...d'une molécule d'ADN

La figure 47A présente la réponse en rotation d'une molécule d'ADN à différentes forces (Strick et coll., 1996). En dessous de 0,3 pN, le comportement de la molécule sous contrainte rotationnelle positive ou négative est identique. La longueur de l'ADN diminue avec la formation de plectonèmes (figure 47B). Entre 1 et 3 pN, la réponse de l'ADN devient asymétrique. Sous contrainte positive, le comportement est le même qu'à faible force (à part l'augmentation de longueur). Sous contrainte rotationnelle négative, par contre, la diminution de longueur est beaucoup moins importante, voire nulle : le déroulement des deux brins de la double hélice devient plus favorable que la formation de plectonèmes (figure 47B). Au-delà de 3 pN, les plectonèmes sont défavorisés même sous contrainte positive. L'ADN bascule sous une conformation P (pour Pauling) dans laquelle les pb sont à l'extérieur de la double hélice.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 47 : Réponse en rotation d'une molécule d'ADN nu et conformations
(A) Réponse à différentes forces (Strick et coll., 1996). (B) Représentation schématique de la molécule d'ADN dans les conditions 1, 2, 3 du graphe A.</figcaption></figure>

### II.3.2 ...d'une fibre de chromatine

Aucun groupe n'avait réussi jusqu'à présent à obtenir la réponse en rotation d'une fibre de chromatine. Nous décrirons dans le CHAPITRE 3, nos résultats dans ce domaine, fruit de la collaboration de notre laboratoire avec une équipe de physique et une autre de modélisation.
## CHAPITRE 3 :
## RESULTATS ET
## DISCUSSION
**ARTICLE I : Désassemblage préférentiel des nucléosomes contenant CENP-A. Contribution possible à sa localisation exclusive au centromère.**

**I.1 Résumé**

Sachant qu'un variant de l'histone H3, CENP-A, remplace celle-ci au centromère, nous avons reconstitué des mononucléosomes contenant ces deux histones sur deux séries de minicercles. Après relâchement avec la topoisomérase I, nous avons mis en évidence une réduction de 6 à 8 pb de l'enroulement de l'ADN sur le nucléosome CENP-A par rapport au nucléosome H3. Ce déroulement, à l'entrée-sortie du nucléosome CENP-A, empêche l'interaction des histones de liaison, augmente l'accessibilité à l'exonucléase III et facilite le largage des dimères H2A-H2B par la protéine chaperon NAP-1. Le tétramère $(CENP-A-H4)_2$ est aussi plus facilement déstabilisé par l'héparine. Ces résultats suggèrent un désassemblage privilégié des nucléosomes CENP-A par rapport aux nucléosomes canoniques, qui permettrait de les enlever, après coup, des régions non-centromériques, contribuant ainsi à leur localisation exclusive au centromère.

**I.2 Introduction**

Le centromère assure la cohésion des chromatides sœurs jusqu'à leur séparation lors de l'anaphase. Sa position sur le chromosome est dictée non pas par la séquence de l'ADN mais par des informations épigénétique dont le messager semble être un variant de l'histone H3 : CENP-A. Comment CENP-A est-elle adressée au centromère ? reste une question centrale.

Pour notre part, nous avons étudié la structure et la dynamique du nucléosome CENP-A, faisant le pari que ce variant de H3 lui conférait des caractères particuliers. Les résultats, inattendus, apportent une partie de la réponse à la question de l'adressage.

**I.3 Article**
Easier Disassembly of CENP-A-containing Nucleosomes:
a Potential Contribution to their Exclusive Centromeric Localization

Natalia Conde e Silva¹, Ben E. Black²,³, Andrei Sivolob⁴, Jan Filipski¹,⁵, Don W. Cleveland²*, and Ariel Prunell¹*

¹ Institut Jacques Monod (UMR CNRS 7592), 2 place Jussieu, 75251 Paris Cédex 05, France

² Ludwig Institute for Cancer Research, Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, CA 92093, USA

³ Department of Biochemistry and Biophysics, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, PA 19014, USA

⁴ Department of General and Molecular Genetics, Taras Shevchenko National University, 64 Vladimirskaya street, 01033 Kiev, Ukraine

⁵ Institute of Biology, N. Copernicus University, 11 Gagarina street, 87-100 Torun, Poland

Classification : Biological Sciences-Biochemistry

Corresponding authors : prunell@ccr.jussieu.fr or dcleveland@ucsd.edu
CENP-A is a histone variant that replaces conventional H3 in
nucleosomes of functional centromeres. We report here reconstitution of
CENP-A- or H3-containing mononucleosomes on a series of DNA
minicircles. After relaxation with topoisomerase I, CENP-A nucleosomes
showed that relative to H3 nucleosomes an additional 6-8 base pairs of
DNA are unwound on a steady-state basis at their entry and exit sites in
both random sequence DNA and the human α-satellite DNA onto which
CENP-A is normally loaded. This leads to hindered binding of a linker
histone, increased access of exonuclease III and facilitated release of a
H2A-H2B dimer by nucleosome assembly protein 1 (NAP-1). The (CENP-A-
H4)₂ tetramer is also more readily destabilized with heparin, suggesting
easier disassembly of CENP-A nucleosomes as compared to canonical
nucleosomes. This feature is proposed to facilitate CENP-A removal from
non-centromeric regions, contributing to its exclusive localization at
centromeres.

Centromeres represent a specific chromosome region in eukaryotic cells which defines the site of kinetochore formation, thereby directing spindle attachment and chromosome segregation during mitosis (1). Maintenance of centromere identity through chromosome replication and cell division does not appear to be defined by the highly repetitive centromeric DNA sequence (α-satellite in human), but rather at an epigenetic level. The main candidate for the centromeric epigenetic mark is CENP-A, a histone H3 variant which replaces conventional H3 in centromeric nucleosomes (2,3). The C-terminal two-thirds of CENP-A (the histone fold) is relatively homologous (62% identical) to histone H3, but its N-terminal one-third is unique.

An early question raised by CENP-A is how it targets to the centromere. This
question is particularly intriguing because CENP-A, like the main H3 variant enriched
in transcriptionally-active chromatin, H3.3, is produced throughout the cell cycle, in
contrast to the major H3 (H3.1) that is synthesized exclusively during DNA replication
(4-8). The information for centromere targeting is present within the histone fold
domain of CENP-A (the CATD, for CENP-A targeting domain). Replacement of the L1
loop and α2 helix of H3 with the corresponding features from CENP-A (to produce a
H3<sup>CATD</sup> chimera; Fig. 1) is sufficient for centromere targeting (10), while replacing CENP-A residues within either the L1 loop or the α2 helix with the corresponding H3 residues results in chimeric histones that fail to target to centromeres (11,12). Size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation, and hydrogen/deuterium exchange showed that the CATD confers compaction and conformational rigidity to (CENP-A/H3<sup>CATD</sup>-H4)<sub>2</sub> tetramers (10), distinguishing them from tetramers made with H3.1 and H3.3.

Using a “DNA minicircle approach” (see 13 & 14 for reviews), three conformational states have been identified between which conventional nucleosomes can thermally fluctuate. The first state, we previously referred to as the “closed negative” state, introduces a topological deformation in linking number relative to naked DNA between -1.4 and -1.7 (ΔLk<sub>n</sub>(i) in Eq. 3 in Methods), and has DNAs entering and exiting the nucleosome negatively crossed. This form corresponds to the canonical conformation with ~147 bp of wrapped DNA, and is usually energetically favored. The second state, where the nucleosomal entry/exit DNAs are uncrossed (we have previously termed this the "open" state [ΔLk<sub>n</sub> = -0.7 to -1]), concomitantly involves the unwrapping of ~ 21 bp through breakage of the most distal H3 αN/DNA binding sites at superhelix locations (SHL) ±6.5 (15) (Fig. 1). The third, “closed positive” state has ΔLk<sub>n</sub> = -0.4 to -0.6 with positively crossed entry/exit DNAs, and is energetically least favored, as expected from the DNA left-handed wrapping around the histones (13,14). Modelling has defined the energetical and topological (see above) parameters of these conformational states and their dependence on potential effectors of nucleosome dynamics, such as the DNA sequence (16). Nucleosomes in chromatin fibers showed very similar values of these parameters, as observed in single-molecule experiments with magnetic tweezers (17).

Using nucleosomes assembled *in vitro* from purified histones and DNA minicircles made from a generic DNA template (18) or a typical human centromeric DNA target, we now ask how replacement of histone H3 by CENP-A affects nucleosome dynamics. CENP-A potential influence on nucleosome disassembly was also investigated using the histone chaperone NAP-1 (19) or heparin. DNA in CENP-A
nucleosomes is underwrapped relative to canonical nucleosomes, which in turn compromises the binding of a linker histone and facilitates NAP-1-mediated release of a H2A-H2B dimer. Relative to $(H3-H4)_2$, heparin more readily releases the (CENP-A-H4)$_2$ tetramer. These features are proposed to facilitate CENP-A removal from non-centromeric regions as one mechanism to ensure exclusive localization at centromeres.

# Results

## CENP-A nucleosomes are unwrapped at their entry/exit

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

**Figure 1.** Sequence alignment of H3, CENP-A and their derivatives. H3 is the chicken sequence (9). CENP-A is the human version (2). H3(RK) is identical to H3, except for an arginine 49-lysine substitution in αN. H3<sup>CATD</sup> is a chimera of H3 (black) and CENP-A (blue). Gaps in the alignment are indicated by dashes. Residue numbers are those of H3. Arrow heads indicate arginines whose lateral chain enters the small groove at SHL±6.5, ±1.5 and ±2.5 of the double helix in H3, or other residues at equivalent positions (bold red symbols).

The minicircle approach (scheme in Fig. 2a) was used with the canonical octamer, and three composite octamers in which conventional H3 was replaced with either CENP-A, $H3^{CATD}$ (see introduction), or H3(RK) (see histone stoichiometries in Fig. 5, which is published as supporting information on the PNAS web site). H3(RK) has the arginine 49 substituted for a lysine [a lysine is found at the corresponding position in CENP-A; Fig. 1]. The R49K substitution in H3 is expected to weaken the αN/DNA binding sites at nucleosome entry/exit (SHL±6.5; see introduction) since this arginine in histone H3 intercalates into the small groove and stabilizes
histone/DNA binding (15), which a lysine cannot do. Examples of assembly on an α-satellite DNA 356 bp- topoisomer of ΔLk ~ -3 (see Eq. 1 in Methods) are shown in Fig. 2b. Nucleosomes were electrophoresed before (lanes 1, 4, 7 and 10) or after incubation in the absence (-topo I, lanes 2, 5, 8 and 11) or presence of the enzyme (+ topo I : circled lane numbers). Relaxed nucleosomes were excised as gel slices (brackets) and the DNAs recovered and electrophoresed along with marker topoisomers (Fig. 2c). Three adjacent topoisomers were obtained, whose relative

<figure><img src="image_60.png" /></figure>

**Figure 2.** Diagram of the minicircle approach (a) and its application to nucleosomes on α-satellite 356 bp ΔLk~-3 topoisomer. (b) Mononucleosomes (NUC) were reconstituted on that topoisomer (lane C) with the indicated octamers (see Fig. 5) (lanes 1, 4, 7 and 10), incubated in buffer R without (lanes 2, 5, 8 and 11) or with topoisomerase I for 30 min. at 37 °C (lanes 3, 6, 9 and 12), and electrophoresed as nucleoproteins at room temperature. (c) Gel slices corresponding to relaxed nucleosomes (brackets in (b)) were cut, the DNAs products eluted and electrophoresed in a chloroquine-containing polyacrylamide gel, along with marker topoisomers (C1 and C2). Autoradiograms are shown. (d) Radioactivity profiles of the corresponding lanes in (c).
amounts vary depending upon whether H3 or CENP-A (or a variant of either) was
used. Canonical nucleosomes assembled with wild type histone H3 showed two
major peaks, with topo -1 slightly higher than topo -2 (Fig. 2d). Upon replacement
with CENP-A, topo -1 is greatly increased at the expense of topo -2, indicating a
higher proportion of nucleosomes in the "open" ~21-bp-unwrapped conformation
relative to nucleosomes in the "closed negative" conformation (see introduction). The
R49K mutation in H3 increases topo -1 to an intermediate extent (Fig. 2d),
suggesting substitution at this position is partly responsible for the shifted
topoisomer equilibrium distribution observed with CENP-A. In contrast, the CATD
substitution into H3 has no influence on the topoisomer distribution (Fig. 2d), and
therefore on nucleosome wrapping.

Results for the entire series of α-satellite 346-358 bp DNA minicircles are
shown in plots of the topoisomer relative amounts in the equilibria versus their ΔLk
(Fig. 3a ; similar data for another series of 351-363 bp DNA minicircles (the pBR
series) shown in Fig. 6 which is published as supporting information on the PNAS
web site). Smooth curves represent the 3-state model-fitted theoretical profile
calculated as previously described (16) on joined H3 and H3<sup>CATD</sup> data, taking into
account their nearly identical behavior in this assay. CENP-A-nucleosomes strongly
deviate from the behavior of canonical nucleosomes. A similar, although smaller,
deviation is observed with H3(RK)-containing nucleosomes (Fig. 3a). The 3-state-
fitted theoretical profiles obtained with H3- and H3<sup>CATD</sup>-containing (or CENP-A-,
H3(RK)-containing) nucleosomes on both α-satellite and pBR DNAs (Fig. 3b) yielded
topological (ΔLk<sub>n</sub>) and energetical parameters (ΔG<sub>n</sub>) for each (Table 1 ; see Eqs 3
and 4 in Methods for the definitions of ΔLk<sub>n</sub> and ΔG<sub>n</sub>). As observed previously with
the 5S values (see legend to the table), ΔLk<sub>n</sub> of α-satellite nucleosomes are less
negative than their pBR counterparts. Thus, both of the sequences thought to
provide bona fide nucleosome assembly sites *in vivo* (α-satellite DNA and 5S DNA),
but not the prokaryotic pBR DNA, show a net overtwisting relative to naked DNA
upon wrapping around the histone surface (16,18).

Relative to the uncrossed state, the free energies of the two crossed-
entry/exit states (negative and positive) increase equally from H3 to H3(RK)
nucleosomes and from H3 to CENP-A nucleosomes: 0.7 kT and ~1.7 kT on pBR DNA,
and 0.8 kT and ~1.6 kT on α-satellite DNA (Table 1). The arginine-lysine substitution
in H3(RK) therefore leads to a 40-50 (0.7/1.7 to 0.8/1.6) % destabilization of
the SHL±6.5 αN/DNA binding sites compared to CENP-A. The probability of
occupancy of each state can subsequently be calculated from these energies for a

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>**Figure 3.** Relaxation data of nucleosomes on α-satellite and pBR DNAs. (a) Topoisomer relative amounts in Fig. 2d (red in (a)) and in similar relaxations of the same nucleosomes on all DNA minicircles of the α-satellite series were plotted as functions of their ΔLk. Data points were often the mean of 2-3 independent measurements. (b) Smooth curves calculated from fitting the 3-state model to the data points in (a), as described in Methods. Smooth curves for H3<sup>CATD</sup> and H3 nucleosomes are identical. Smooth curves in (a) are the H3 curve shown in (b) (α-satellite panel). Smooth curves calculated from the counterpart data of the pBR series of DNA minicircles displayed in Fig. 6 are also shown for comparison. The nucleosome conformational states corresponding to the three peaks visible in the smooth H3 profile are diagrammed.</figcaption></figure>
nucleosome with a nicked loop free to rotate under thermal fluctuations, and from the probabilities the extra steady-state unwrappings in CENP-A and H3(RK) nucleosomes relative to H3 nucleosomes, respectively 6-8 bp and 3 bp (Table 2, which is published as supporting information on the PNAS web site). This unwrapping is confirmed by, and at the same time explains, the virtual failure of a linker histone to bind, and the facilitated invasion by exonuclease III (Figs 7 and 8, which are published as supporting information on the PNAS web site) and micrococcal nuclease (3).

<table><caption>**Table 1**

Fitted parameters for nucleosomes on pBR and α-satellite DNAs</caption><thead><tr><th rowspan="2">State</th><th colspan="4">pBR</th><th colspan="4">α-sat</th></tr><tr><th>ΔLk<sub>n</sub></th><th colspan="3">ΔG<sub>n</sub>(kT)</th><th>ΔLk<sub>n</sub></th><th colspan="3">ΔG<sub>n</sub>(kT)</th></tr><tr><th></th><th></th><th>H3</th><th>H3(RK)</th><th>CENP-A</th><th></th><th>H3</th><th>H3(RK)</th><th>CENP-A</th></tr></thead><tbody><tr><td>Negative</td><td>-1.67</td><td>-0.9</td><td>-0.2</td><td>0.9</td><td>-1.55</td><td>-1.5</td><td>-0.7</td><td>-0.1</td></tr><tr><td>Open</td><td>-0.95</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>-0.79</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>Positive</td><td>-0.53</td><td>1.2</td><td>1.9</td><td>2.8</td><td>-0.47</td><td>0.8</td><td>1.6</td><td>2.7</td></tr></tbody></table>

Fitting (see Materials and Methods) was simultaneously made for the three relative-amounts-vs.-ΔLk curves in Fig. 3b using 9 parameters: 3 ΔLk, which were assumed to be the same for all three nucleosomes, respectively, and 6 ΔG energies. Independent fitting of each curve with 5 parameters (3 ΔLk and 2 ΔG) led to similar values (not shown).

Errors bars are between ±0.02 and ±0.04 for ΔLk<sub>n</sub>, and ±0.1 and ±0.3 for ΔG<sub>n</sub>.

Former ΔLk<sub>n</sub> values for negative, open and positive states were -1.69, -1.04 and -0.56 for pBR and -1.40, -0.72 and -0.41 for 5S (16).

## CENP-A nucleosomes are easier to disassemble

Disassembly was first assayed with NAP-1 on chicken ~147 bp core DNA fragments and topos -1 and -2 reconstituted with H3 and CENP-A octamers (Figs 9 and 10, which are published as supporting information on the PNAS web site). When observed, removal concerned essentially a single H2A-H2B dimer, while the other dimer and the tetramer could not be removed at the highest NAP-1 concentration.
<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>**Figure 4.** Nucleosome depletions by heparin and model. (a) H3 and CENP-A nucleosomes (NUC), as reconstituted on α-satellite 356 bp ΔLk ~-1 and -2 topoisomers, were supplemented with a 9-fold excess (DNA/DNA; w/w) of naked form I pUC18 plasmid DNA, incubated for 10 min at 37 °C in TE buffer plus 50 mM NaCl with various concentrations of heparin, and electrophoresed. Results were virtually independent on the histone contents of the probes when reconstitution levels were in the ~20-40 % range (see (b) below). Higher reconstitution levels were not tested, while reconstitutions <20 % led to decreases in the heparin concentrations required (not shown). Fractions 0 : blank incubation. Starting from fraction 1 in 1.35 ng/ml heparin, the concentration is multiplied by 2 or 4 between each successive fraction, depending on its number, fractional or integer, respectively. Heparin concentration, C, for any fraction of number n is given by: $C = 1.35 \times 10^{-3} \times 4^{n-1}$ µg/ml. HEX: hexasomes (one tetramer and one dimer); TET: tetrasomes (one tetramer). Autoradiograms are shown. (b) Histograms of $C_{NUC}^{50}$ and $C_{DNA}^{50}$ heparin concentration values measured as shown in Fig. 11b, as derived from the gels in (a) and Fig. 11a and other gels (not shown). Error bars correspond to the standard deviation in two to four independent experiments for which nucleosome reconstitution was in the 20-40 % range. (c) Schemes of nucleosomes on topos -1</figcaption></figure>
Interestingly, almost twice as many dimers were removed with CENP-A compared to H3 in core particles (Fig. 9a), but the same amount in topo -1 nucleosomes, while none was removed from topo -2 nucleosomes (Fig. 10). These results are consistent with the extra unwrapping conferred by CENP-A, which is effective in core particles (see above), but not in nucleosomes on topos -1 or -2 where it is masked because the first nucleosomes are maximally unwrapped, while the second are forced to wrap.

Heparin, as a strongly-negatively-charged polymer, could be expected to be more efficient at removing histones than NAP-1. Like NAP-1, heparin removes mostly a single dimer, converting CENP-A and H3 nucleosomes on both topos -1 and -2 into hexasomes. This is evident from band mobilities for topo -1 (Fig. 4a), and was checked for topo -2 by sedimentations in sucrose gradients similar to those performed with core particles in Fig. 9b. Once the first dimer is released, the second dimer is usually stabilized up to the level of the tetramer, unless the first 26 and 25 residues, respectively, of the N-terminal tails of H3 and CENP-A were removed (Fig. 5), in which case the second dimer is released earlier and a hexasome-tetrasome transition is observed (see topo -1 data with H3tl and CENP-Atl in Fig. 11a, which is published as supporting information on the PNAS web site). Heparin concentrations were determined which destroy half of the nucleosomes, $C_{NUC}^{50}$, or generate half of the total increase in the amount of naked DNA, $C_{DNA}^{50}$ (Fig. 11b). $C_{NUC}^{50}$ therefore is a measure of the stability of the first dimer, and $C_{DNA}^{50}$ of the stability of the hexamer/tetramer.

<footnote>and -2 (NUC-1 and NUC-2) with the two αN binding sites "off" or "on" extended by heparin-bound H3 N-terminal tails. Single-turn tetrasomes on topos -1 and -2 (TET-1 and TET-2) are similarly shown with their L1 binding sites "on" at their entry/exit. TET-2 is assumed to make an additional crossing in its loop to take into account its larger electrophoretic mobility. Hexasomes are assumed to also be single-turn particles, consistent with their electrophoretic mobility equal to, or smaller than that of tetrasomes. Heparin is proposed to use the tails as a lever for destabilization through the breaking of αN helix or L1 loop binding sites in nucleosomes or hexasomes/tetrasomes, respectively.</footnote>
Histograms of $C_{\text{NUC}}^{50}$ in Fig. 4b, left panel, show a similar stability of the first dimer in CENP-A and H3 nucleosomes on topo -1 (CENP-A/H3 $C_{\text{NUC}}^{50}$ ratio ~ 1), as observed with NAP-1 (see above and Fig. 10), which persists upon removal of the tails (CENP-Atl/H3tl $C_{\text{NUC}}^{50}$ ratio ~ 1/1.5). In contrast, a destabilization is observed with CENP-A relative to H3 on topo -2 (CENP-A/H3 $C_{\text{NUC}}^{50}$ ratio ~ 1/3), which increases upon tail removal ($C_{\text{NUC}}^{50}$ ratios ~ 1/8). When compared between the two topoisomers, the dimer is found to stabilize from topo -1 to topo -2, as expected from the correlative stabilization of entry/exit $\alpha$N/DNA binding sites (see introduction). This stabilization is lower in CENP-A nucleosomes (topo-2/topo-1 $C_{\text{NUC}}^{50}$ ratio ~ 3, against ~12 with H3), consistent with weaker $\alpha$N binding in those nucleosomes compared to H3 nucleosomes.

$C_{\text{DNA}}^{50}$ values (Fig. 4b, right histogram) indicate a lower stability of the hexamer/tetramer with CENP-A compared to H3 on both topo -1 ($C_{\text{DNA}}^{50}$ ratio ~1/2.7) and topo -2 ($C_{\text{DNA}}^{50}$ ratio ~1/2). This difference increases substantially after tail removal ($C_{\text{DNA}}^{50}$ ratio ~1/7 on topo -1 and ~1/34 on topo -2). In contrast to the first dimer, the hexamer/tetramer does not stabilize between topo -1 and topo -2, but instead tends to destabilize (see in particular H3 and CENP-Atl).

We conclude that the first dimer is destabilized in CENP-A nucleosomes relative to H3 nucleosomes, whether on 147 bp DNA or topo -2. The failure to observe a similar difference on topo -1 is easily explained by the large DNA unwrapping in the open state which masks the CENP-A-induced smaller unwrapping. The hexamer/tetramer is also destabilized in CENP-A nucleosomes. As a rule, the difference in stability between the two nucleosomes with respect to both first dimer and hexamer/tetramer increases after tail removal. If dimer lower stability with CENP-A is in part due to the arginine 49-lysine substitution, hexamer/tetramer lower stability may similarly result from the arginine 83-asparagine substitution, since the arginine at the equivalent position of H3 interacts at SHL±2.5 (Fig. 1) and stabilizes tetrasome entry/exit sites. Interestingly, $H3^{\text{CATD}}$ nucleosomes resemble H3 nucleosomes with respect to release of the first dimer, but respond like CENP-A nucleosomes when the hexamer/tetramer is concerned (Fig. 11a, and Fig. 4b). This
switched behavior is consistent with H3<sup>CATD</sup> hybrid nature, i. e. with its arginine substitution at position 83 but not at position 49.

# Discussion

## Easier disassembly of CENP-A nucleosomes

### i) First dimer release

Easier access to the first dimer to be removed in nucleosome disassembly is a direct consequence of CENP-A-induced 6-8 bp steady-state unwrapping at nucleosome entry/exit (Table 2). Identification of the hexasome as a NAP-1 or heparin disassembly intermediate (Fig. 4a and Figs 9-11) implies that removal of one dimer stabilizes the second. This behavior has also been observed by others using NAP-1 or RNA (20), and during transcription elongation by RNA polymerase II (21). Hexasomes are also the main intermediate in NAP-1-induced nucleosome assembly (22). Intriguingly however, the opposite is observed upon octamer assembly from the tetramer and the dimers in high salt: binding of the first dimer enhances binding of the second (23).

The increase in dimer apparent stability after removal of the tails (Fig. 4b, left histogram) suggests they are used as “levers” in its release. Tails are likely to be heparin primary targets, consistent with their high positive charge and relative availability on the nucleosome surface. Interestingly, this “lever effect” of the tails may be mediated by their proximal αN/DNA binding sites at the particle entry/exit (symbolized by blue dots in the schemes of Fig. 4c). This is suggested by the observation that the lever effect increases from topo -1 to topo -2, and from CENP-A to H3 (see Results and Fig. 4b), in direct proportion to the strength of these binding sites.

### ii) Second dimer release

The second dimer and the tetramer are usually released together as a hexamer, except on topo -1 where tail removal accelerates release of the second dimer (see H3tl and CENP-Atl in Fig. 11a). This is at variance with the behavior of the first dimer which instead tends to stabilize upon tail removal. This discrepancy suggests that the tails have a dual role: an intrinsic role in particle stabilization, as could first be anticipated, and an instrumental role in destabilization by heparin mostly mediated
by the αN DNA/binding sites at SHL±6.5. The net result of the heparin assay
depends on the balance between tails conflicting roles, which strongly differs
between first and second dimer. The second dimer raises another question: does its
presence influence tetramer apparent stability ? The answer is no, at least for H3 on
topo -1. This was tested by heparin destabilization assays on H3 tetrasomes
reconstituted on that topoisomer. Their C<sub>TET</sub><sup>50</sup> value was the same, within the error
bar, as the above C<sub>DNA</sub><sup>50</sup> value of the corresponding nucleosomes (not shown).

iii) <u>Hexamer/tetramer release</u>

The hexamer/tetramer is more easily released in CENP-A-containing versus H3-
containing nucleosomes (see Results), and the tails again facilitate that release in the
latter but not the former nucleosomes (Fig. 4b, right histogram). Thus, except for the
destabilization on topo -1 relative to topo -2 which is not observed with the
hexamer/tetramer, the first dimer and the remaining hexamer/tetramer behave very
similar with respect to their differential susceptibility to heparin between the different
nucleosomes, and upon tail removal. This suggests that a lever effect of the tails is
still at work in that release. A lever effect can no longer occur through the αN/DNA
binding sites at SHL±6.5, which do not exist in single-turn tetrasomes (24,25) or
hexasomes (Fig. 4c, and legend). But it can be transmitted through the SHL±1.5 and
the α1 helix down to the L1 loop/DNA binding sites at tetrasome entry/exit
(SHL±2.5; Fig. 1). The fact that L1 binding sites are "on" with both topos -1 and -2
(blue stars in the schemes of Fig. 4c) explains hexamer/tetramer similar stabilities on
these two topoisomers. As does the R49K substitution at nucleosome entry/exit, the
R83N substitution weakens tetrasome entry/exit binding sites at SHL±2.5, thus
explaining the disappearance of the lever effect with CENP-A. Altogether these
results raise the interesting possibility that histone chaperones, some of which
possess an acidic tail necessary for disassembly but dispensable for assembly (e. g.
26), use a similar two-step "lever" mechanism to trigger sequential disruption of
dimer and tetramer in vivo.

**The centromeric nucleosome**

Weakening of αN DNA binding sites, leading to hindered linker histone binding
to, and facilitated *dimer* release in nucleosomes containing CENP-A or one of its
relatives, may be a general eukaryotic feature. This is suggested by the prevalence
of the arginine 49 substitution in CENP-A orthologs from mammals to yeast
(Drosophila CID is an exception where the arginine is preserved). Another general
feature pertaining to facilitating removal of the *hexamer/tetramer* is the prevalence
of the arginine 83 substitution (again CID is an exception, as well as budding yeast
Cse4p, with a preserved arginine but a presumably-compensating arginine 63
substitution at SHL±1.5; see Fig. 1).

Incorporation of CENP-A into noncentromeric regions when overexpressed by
>50 fold (e. g. 27) may simply be a result of mass action favoring its competition
against conventional H3. Our data argues that such *improper* CENP-A nucleosomes
assembled at non-centromeric loci could be easily removed and replaced with their
canonical counterparts. At normal expression levels, CENP-A localization exclusively
at the centromere may be enhanced by a local chromatin environment at the
centromere that precludes its removal. Others have suggested that generic assembly
factors, such as RbAp46/48, are involved in CENP-A deposition at centromeres (28),
and recently it was shown that the *Drosophila* CENP-A orthologue, CID, when
overexpressed is capable of binding, together with H4, to such a factor (29).
Interestingly, this binding does not require the presence of intervening proteins,
pointing to a passive rather than active assembly mechanism coupled with replication
or transcription as observed with H3 or H3.3 (see introduction). While an unknown
assembly factor specific to CATD-mediated targeting of CENP-A may still exist, a
generic assembly factor may be all that is required for faithful targeting, if the
physical properties of CENP-A insure rapid disassembly from non-centromeric sites.
Such a replacement mechanism, based on proteolysis, may exist in yeast (30).

**Materials and Methods**

**DNAs.** DNA fragments of the pBR series, 351, 353, 354, 356, 358, 360 and 363-bp long originate from plasmid pBR322 (18). α-satellite DNA fragments, 346, 348, 350, 352, 354, 356 and 358 bp long were obtained from human DNA by PCR and cloning in plasmid pUC18, to give recombinant plasmids pNCS-α(346-358) (see Fig. 12a and b, which is published as supporting information on the PNAS web site, for DNA sequences).
**Histones.** Histone H3-containing octamers were reconstituted from "native" H2A-H2B dimers purified from native chicken erythrocyte octamers (31) by chromatography in a CM52 (Whatman) column, and $(H3-H4)_2$ tetramers made from the individual chicken erythrocyte histones purified from native octamers by reverse phase HPLC (32). Dimers and tetramers in 2 M NaCl were mixed together in stoichiometric proportions to reform the octamers, which were stored frozen until use. Reconstituted H3 octamers were found to behave identical to native octamers in relaxation experiments (not shown). Tailless H3 (H3tl; first 26 residues deleted) and H3(RK) octamers were similarly made after replacement of H3 by recombinant Xenopus H3tl (expressed from vector H3glob_nf; a gift of K. Luger) and chicken H3(RK). H3(RK) was derived from H3 (expressed from vector H3plk; a gift of V. Ramakrishnan) by replacement of arginine 49 by a lysine (see Fig. 1) through site-directed mutagenesis (see Fig. 12c for primer sequences, and Supporting text, which is published as supporting information on the PNAS web site, for preparation protocols of recombinant histones). CENP-A, tailless CENP-A (CENP-Atl; first 25 residues deleted) and $H3^{CATD}$ octamers were made by mixing H2A-H2B dimers with $(CENP-A-H4)_2$, $(CENP-Atl-H4)_2$ and $(H3^{CATD}-H4)_2$ tetramers. Human CENP-A, CENP-Atl and $H3^{CATD}$ were coexpressed with human H4 in BL21 (DE3) as described (2). All histone concentrations were measured spectrometrically using $\epsilon_{230\max}^2$ for 1 mg/ml solutions, and final histone stoichiometries were checked by electrophoresis in a SDS-containing polyacrylamide gel stained with Coomassie blue (Fig. 5).

**Nucleosome reconstitution and relaxation.** Nucleosomes were reconstituted with octamers on the above $ ^{32}P $-end-labeled DNAs previously circularized into topoisomers, using the "salt-jump" method (31) with plasmid DNA as a carrier. This method involves a rapid dilution of the histone-DNA mixtures from 2 M to 0.5 M NaCl - at which step H5 was added when appropriate (Fig. 7) - followed by dialysis against TE buffer. Circular mononucleosomes were relaxed with wheat germ topoisomerase I (Promega Biotech) in buffer R (50 mM Tris-HCl [pH 7.5], 0.1 mM EDTA, 50 mM KCl, 5 mM $MgCl_2$, 0.5 mM dithiothreitol) for 30 min. at 37°C.
## Topology

Topoisomers were characterized by their linking number difference, $\Delta Lk$ (33), as given by

$$ \Delta Lk = Lk - Lk_0 \quad (1) $$

in which

$$ Lk_0 = Tw_0 = N / h_0 \quad (2) $$

$Tw_0$ is the DNA most probable twist (34), and $h_0$ is the helical periodicity in buffer R at 37°C, $10.49_3 (\pm0.003)$ bp/turn for the α-satellite DNA (Fig. 13, which is published as supporting information on the PNAS web site), as compared to $h_0 = 10.49_4 (\pm0.003)$ bp/turn for pBR DNA (16). $Tw_0$ and $\Delta Lk$ need not be integers. The α-satellite 356 bp DNA minicircle mostly used in this work has topoisomers of $\Delta Lk = -2.9, -1.9, -0.9$ and $+0.1$.

For a nucleosome in state i ($i = 1-3$) on topoisomer $\Delta Lk$, one has

$$ \Delta Lk = \Delta Lk_n(i) + \Delta Lk_l(i) \quad (3) $$

where $\Delta Lk_n(i)$ and $\Delta Lk_l(i)$ are the linking number differences respectively associated with the nucleosome and the loop. Eq. 3 gives $\Delta Lk_n(i) = \Delta Lk$ when $\Delta Lk_l(i) = 0$, which means that $\Delta Lk_n(i)$ is the total $\Delta Lk$ of the topoisomer when the nucleosome in state i has a relaxed loop.

Topological and energetical parameters for each state (Table 1) were calculated from the topoisomer relative amounts-vs.-$\Delta Lk$ curves in Figs 3 and 6, by fitting a thermodynamical three-state model (13,14).

Briefly, nucleosome free energy (DNA plus protein) in state i on topoisomer Lk is

$$ G(i, N, Lk) = G_{sc}(i) + G_n(i) \quad (4) $$

with

$$ G_{sc}(i) = \{K_{sc}(i) / N_i\}\{\Delta Lk_l(i)\}^2 \quad (5) $$

$G_{sc}(i)$ is the loop free energy of supercoiling, $N_i$ its size, and $K_{sc}(i)/N_i = 12$ its reduced supercoiling force constant previously calculated using the "explicit solutions" theory derived from the elastic rod model for DNA (32,35). $G_n(i)$ represents the bending energy of the torsionally relaxed loop plus all the other contributions to the free energy (originating in particular from the protein).
Experimentally, $G_n(i)$ was measured by reference to the open state, and noted $\Delta G_n(i)$ in Table 1. Fitted parameters were used in reverse to draw the smooth theoretical curves in Fig. 3.

## ACKNOWLEDGMENTS

NCeS thanks the French ministry of research, the Foundation for medical research and the Association for cancer research for three successive fellowships. AP thanks V Ramakrishnan (University of Cambridge, UK) and K Luger (Colorado State University, USA) for gifts of histone expression vectors, and S Leuba (University of Pittsburg, USA) for the gift of NAP-1. This work was supported by CNRS (AP lab), a postdoctoral fellowship from the American Cancer Society and a Career Award in the Biomedical Sciences from the Burroughs Wellcome Fund to BEB, and grants from the NIH (DWC lab).

## References

1. Cleveland DW, Mao Y, Sullivan KF (2003) *Cell* 112:407-421.

2. Palmer DK, O'Day K, Wener MH, Andrews BS, Margolis RL (1987) *J Cell Biol* 104:805-815.

3. Yoda K, Ando S, Morishita S, Houmura K, Hashimoto K, Takeyasu K, Okazaki T (2000) *Proc Natl Acad Sci USA* 97:7266-7271.

4. Shelby RD, Monier K, Sullivan KF (2000) *J Cell Biol* 151:1113-1118.

5. Ahmad K, Henikoff S (2002) *Proc Natl Acad Sci USA* 99:16477-16484.

6. Tagami H, Ray-Gallet D, Almouzni G, Nakatani Y (2004) *Cell* 116:51-61.

7. Schwartz BE, Ahmad K (2005) *Genes Dev* 19:804-814.

8. Daury L, Chailleux C, Bonvallet J, Trouche D (2006) *EMBO Rep* 7:66-71.

9. Wang SW, Robins AJ, d'Andrea R, Wells JR (1985) *Nucl Acids Res* 13:1369-1387.

10. Black BE, Foltz DR, Chakravarthy S, Luger K, Woods VL Jr, Cleveland DW (2004) *Nature* 430:578-582.

11. Sullivan KF, Hechenberger, M, Masri K. (1994) *J Cell Biol* 127:581-592.

12. Shelby RD, Vafa O, Sullivan KF (1997) *J Cell Biol* 136:501-513.
13. Prunell A, Sivolob A (2004) *New Comprehensive Biochemistry* 39:45-73.

14. Sivolob A, Prunell A (2004) *Phil Trans Roy Soc A* 362:1519-1547.

15. Luger K, Mäder AW, Richmond RK, Sargent DF, Richmond TJ (1997) *Nature* 389:251-260.

16. Sivolob A, Lavelle C, Prunell A (2003) *J Mol Biol* 326:49-63.

17. Bancaud A, Conde e Silva N, Barbi M, Wagner G, Allemand JF, Mozziconacci J, Lavelle C, Croquette V, Victor JM, Prunell A, Viovy JL (2006) *Nat Struct Mol Biol* 13:444-450.

18. De Lucia F, Alilat M, Sivolob A, Prunell A (1999) *J Mol Biol* 285:1101-1119.

19. Ishimi Y, Kikuchi A (1991) *J Biol Chem* 266:7025-7029.

20. Kepert JF, Mazurkiewicz J, Heuvelman GL, Toth KF, Rippe K (2005) *J Biol Chem* 280:34063-34072.

21. Kireeva ML, Walter W, Tchernajenko V, Bondarenko V, Kashlev M, Studitsky VM (2002) *Mol Cell* 9:541-552.

22. Mazurkiewicz J, Kepert JF, Rippe K (2006) *J Biol Chem* 281:16462-16472.

23. Benedict RC, Moudrianakis EN, Ackers GK (1984) *Biochemistry* 23:1214-1218.

24. Hamiche A, Carot V, Alilat M, De Lucia F, O'Donohue MF, Révet B, Prunell A (1996) *Proc Natl Acad Sci USA* 93:7588-7593.

25. Alilat M, Sivolob A, Révet B, Prunell A (1999) *J Mol Biol* 291:815-841.

26. Fujii-Nakata T, Ishimi Y, Okuda A, Kikuchi A (1992) *J Biol Chem* 267:20980-20986.

27. Heun P, Erhardt S, Blower MD, Weiss S, Skora AD, Karpen GH (2006) *Dev Cell* 10:303-315.

28. Hayashi T, Fujita Y, Iwasaki O, Adachi Y, Takahashi K, Yanagida M (2004) *Cell* 118:715-729.

29. Furuyama T, Dalal Y, Henikoff S (2006) *Proc Natl Acad Sci USA* 103:6172-6177.

30. Collins KA, Furuyama S, Biggins S (2004) *Curr Biol* 14:1968-1972.

31. Zivanovic Y Duband-Goulet I, Schultz P, Stofer E, Oudet P, Prunell A. (1990) *J Mol Biol* 214:479-495.

32. Sivolob A, De Lucia F, Alilat M, Prunell A (2000) *J Mol Biol* 295:55-69.

33. Wang JC, Peck LJ, Becherer K (1982) *Cold Spring Harbor Symp Quant Biol* 47:85-91.

34. Horowitz DS, Wang JC (1984) *J Mol Biol* 173:75-91.

35. Swigon D, Coleman BD, Tobias I (1998) *Biophys J* 74:2515-2530.
Conde e Silva et al. : Easier disassembly of CENP-A-containing nucleosomes: a potential
contribution to their exclusive centromeric localization

Correspondance to [prunell@ccr.jussieu.fr](mailto:prunell@ccr.jussieu.fr) or [dcleveland@ucsd.edu](mailto:dcleveland@ucsd.edu)

**SUPPORTING INFORMATION**

Files in this data supplement:

Supporting Figures 5-13

Supporting Table 2

Supporting text

SUPPORTING INFORMATION

<figure><img src="image_63.png" /></figure>

**Supporting Fig. 5.** Histone octamers characterization. Electrophoretic patterns of reconstituted octamers used in main work, compared to the native octamer from chicken erythrocyte chromatin, in a SDS-containing 18 % (acrylamide to bisacrylamide = 29 : 1, w/w) polyacrylamide gel, stained with Coomassie blue (see Fig. 1 and Materials and Methods in main text for further details). Note that tailless H3 (H3tl) comigrates with H4, and that H3 CATD migrates in between CENP-A and H3. CENP-Atl: tailless CENP-A.
<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>**Supporting Fig. 6.** Nucleosome relaxation data for pBR DNA. Same as Fig. 3a, main text, for nucleosomes on the pBR series of 351-363 bp DNA minicircles. The smooth curve is that previously obtained with that DNA using the *native* octamer shown in Supporting Fig. 5 (1). Histone H3-containing nucleosomes fit that curve, demonstrating that histone denaturation at the HPLC step of the octamer preparation protocol (see Materials and Methods; main text) does not alter nucleosome dynamics.</figcaption></figure>

<table><caption>**Supporting Table 2.** Probability of state occupancy and mean wrapping</caption><thead><tr><th rowspan="2">State</th><th rowspan="2">Wrapping</th><th colspan="3">pBR</th><th colspan="3">α-sat</th></tr><tr><th>H3</th><th>H3(RK)</th><th>CENP-A</th><th>H3</th><th>H3(RK)</th><th>CENP-A</th></tr></thead><tbody><tr><td>Negative</td><td>147 bp</td><td>0.65</td><td>0.52</td><td>0.28</td><td>0.75</td><td>0.63</td><td>0.51</td></tr><tr><td>Open</td><td>126 bp</td><td>0.27</td><td>0.42</td><td>0.68</td><td>0.17</td><td>0.31</td><td>0.46</td></tr><tr><td>Positive</td><td>147 bp</td><td>0.08</td><td>0.06</td><td>0.04</td><td>0.08</td><td>0.06</td><td>0.03</td></tr><tr><td>&lt;Wrapping&gt;</td><td></td><td>141 bp</td><td>138 bp</td><td>133 bp</td><td>143 bp</td><td>140 bp</td><td>137 bp</td></tr></tbody></table>

Probability of state i (i = 1-3), f(i), was calculated from its free energy, $\Delta G_n(i)$, in Table 1 in main text using the equation $f(i) = \exp[-\Delta G_n(i)] / \sum_i \exp[-\Delta G_n(i)]$ (2), and mean wrapping by weighing the wrapping in each state by its probability in the equilibria.
# 1- Hindered linker histone binding onto CENP-A nucleosomes

Linker histones may have difficulty to bind unwrapped nucleosomes, a prediction that stems from the view that they seal the 2-turn nucleosome (6-8). The binding of H5 (a H1 variant found in bulk chromatin from nucleated erythrocytes) to α-satellite CENP-A nucleosomes was inhibited almost completely on 356 bp topos ~1 and -2, under conditions where binding to H3 nucleosomes was robust (Supporting Fig. 7). Residual H5 binding to CENP-A nucleosomes does occur to some extent on topo-3 (Supporting Fig. 7c), but this is likely to result from the large net negative topological constraint in the loop (ΔLkᵢ ~-1.3; see Eq. 3 in Methods of main text) which stabilizes the negative state, i.e. the 2-turn nucleosome. CENP-A-containing nucleosomes are therefore virtually unable of binding linker histone, unless an unrealistically large unconstrained topological stress is applied.

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

**Supporting Fig. 7.** Compared H5 binding potential onto H3 and CENP-A nucleosomes (see Supporting text, section 1). Mononucleosomes (NUC) were reconstituted on α-satellite 356 bp topos -1, -2 and -3 with H3 and CENP-A octamers, and with H5 at the H5:octamer number ratios indicated (see Methods in main text), and electrophoresed. NUC<sub>H5</sub> : nucleosome with a single H5 bound. Autoradiograms are shown.
## 2- Exonuclease III as a probe for unwrapping of CENP-A nucleosomes

Exonuclease (exo) III is known to pause every ~10 nucleotides when invading the nucleosome from the 3' ends. These pauses reflect the DNA periodical binding to the histone surface, and are expected to be modulated by the strength of the corresponding binding sites (9-11). To test this prediction, CENP-A- and H3-containing core particles were reconstituted on the ~147 bp DNA, mixed with a nine-fold excess of H3 core particles on the same DNA, digested with exo III and electrophoresed (see schematics in Supporting Fig. 8a). Reconstitutions (lanes C in Supporting Fig. 8b) show an intense band of unreacted naked DNA, whose digestion with exo III initially leads to a trailing above the band (lanes 1 and 4), later replaced by a lower smear (lanes 3 and 6). In contrast, the nucleosome band remains essentially unaltered, although its intensity decreases due to disruption of the most trimmed particles (11). Aliquots of the DNAs extracted from the gel slices (brackets) were electrophoresed in a "denaturing" gel. At maximal digestion, histone H3-containing nucleosomes show 147- and 137-nucleotide bands of similar intensities (lane 3 in Supporting Fig. 8c), whereas the 137-nucleotide band strongly predominates for CENP-A nucleosomes (lane 6). Such differential digestions of the two nucleosomes, together with the equal digestions of their common carrier (lanes 3 and 6 in Supporting Fig. 8d), confirms that the extra steady-state unwrapping at the entry/exit of CENP-A nucleosomes provides shorter pauses to exo III at those locations.
<figure><img src="image_66.png" /></figure>

**Supporting Fig. 8.** Exonuclease III as a probe of unwrapping at the entry/exit of CENP-A nucleosomes (see Supporting text, section 2). (a) Schematics of the experiment. (b) Core particles (NUC) were reconstituted on ³²P-end-labelled ~147 bp DNA fragments extracted from native core particles prepared from a micrococcal nuclease digest of chromatin in chicken erythrocyte nuclei, and mixed with a 9-fold excess of unlabelled core particles on the same DNA. Mixtures were electrophoresed before (lanes C) or after digestion at 37 °C with 1000 U exonuclease III per ml (Fermentas) for 4 min (lanes 1 and 4), 9 min (lanes 2 and 5) and 20 min (lanes 3 and 6) in 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoethanol and 4 mM MgCl₂. (c) Gel slices (brackets) were cut out of the gel in (b), and aliquots of the eluted DNA products electrophoresed in a 7 M-urea-containing 10 % (acrylamide:bisacrylamide ; 29:1) polyacrylamide gel in 90 mM TBE. Lanes were numbered according to their origin in (b). C : Starting ~147-bp DNA. M : ³²P-end-labelled pUC 18 *HpaII*-digest. (d) Same as (c), but after DNA end-labelling with ³²P. Autoradiograms are shown.
### 3- NAP-1 depletion assays

Core particles were reconstituted with H3 and CENP-A octamers on the ~147 bp DNA. An excess of chromatin reconstituted on plasmid DNA with H3 octamers was added in order to serve as a histone acceptor and a buffer against potential variations in probe histone contents. Depletion patterns (Supporting Fig. 9a) show the appearance of particles below the core particles, which were previously identified as hexasomes (one tetramer ($H3-H4)_2$ plus one dimer $H2A-H2B$; ref. 12). This identification was confirmed here by their sedimentation in sucrose gradients half-way between control tetrasomes (one tetramer ; $C_{TET}$ in lane 5) and core particles ($C_{NUC}$ in lane 1) (Supporting Fig. 9b). Quantification of the gel bands showed almost 2-fold more hexasomes released from CENP-A nucleosomes than from $H3$ nucleosomes at both NAP-1 concentrations (Supporting Fig. 9a, and legend). Such a facilitated removal of the first dimer from CENP-A core particles is a consequence of the CENP-A-induced steady-state unwrapping (Supporting Table 2). Consistently, dimer stability depends on nucleosome conformational state, itself a function of the topoisomer $\Delta Lk$: open on topo -1, and closed negative on topo -2 (see introduction in main text). Half of both H3 and CENP-A nucleosomes on topo -1 were depleted of their first dimer at the highest NAP-1/octamer ratio, but none on topo -2 (Supporting Fig. 10). Therefore, open nucleosomes on topo -1 are much more susceptible to first dimer depletion than H3 core particles, but hardly more than CENP-A core particles (50 % against 20 % and 36 %, respectively; see legend to Supporting Fig. 9a).
<figure><img src="image_67.png" /></figure>

**Supporting Fig. 9.** NAP-1 depletions of core particles (see Supporting text, section 3). (a) Core particles (NUC) were reconstituted with H3- and CENP-A-containing octamers on the ³²P-labelled ~147 bp DNA, and a 9-fold excess (DNA/DNA; w/w) of a carrier chromatin made of pUC18 plasmid DNA reconstituted with H3-containing nucleosomes was subsequently added. Mixtures were incubated with 0, 7 and 20 NAP-1 per octamer (w:w) (lanes 2-4) in TE buffer supplemented with 100 mM NaCl and 100 µg/ml BSA for 1h at 37 °C, and electrophoresed (naked ~147 bp DNA not shown). 12 and 20 % of the H3 nucleosomes, and 21 and 36 % of the CENP-A nucleosomes, respectively, were converted into hexasomes (HEX) by NAP-1 treatment in lanes 3 and 4 (after subtraction of hexasome initial amounts in lanes 2). CNUC: Starting nucleosomes in TE. CTET: Control tetrasomes (TET) reconstituted with the tetramers. No CENP-A tetrasomes could be reconstituted, but only nucleosome-like particles presumably made of two tetramers stacked on top of each other (3,4) (lane 5). (b) Sedimentation profiles in linear sucrose gradients (5) of H3 control core particles (CNUC), H3 tetrasomes (CTET) and H3 cores particles incubated for 4h with 20 NAP-1 per octamer (CNAP) (upper-left gel). Fractions were collected from the bottom. Aliquots of selected fractions from the gradients were electrophoresed (lower gels). Hexasomes (HEX) sediment in between the nucleosome (NUC) and the DNA peaks, and tetrasomes (TET) on the faster side of the DNA peak. Note that control nucleosomes contain minor amounts of hexasomes well visible in some fractions of the gradient.
<figure><img src="image_68.png" /></figure>

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

**Supporting Fig. 10.** NAP-1 depletions of nucleosomes on topos -1 and -2 (see Supporting text, section 3). (a) H3 nucleosomes on α-satellite 356 bp ΔLk= -1 and -2 topoisomers were supplemented with pUC18 chromatin and incubated with NAP-1 as indicated in Supporting Fig. 9a at ratios of 0, 2.5, 7 and 20 NAP-1/octamer (lanes 2-5). 6, 32 and 50 % of H3 nucleosomes on topo -1 were converted into hexasomes by NAP-1 treatment in lanes 3-5, but none on topo -2, taking into account their initial amounts in lanes 2. Note that these figures are directly comparable to those obtained with core particles in Supporting Fig. 9a at the same NAP-1/octamer ratios. (b) Same as (a) with CENP-A nucleosomes. Figures were here 10, 37 and 48 % of CENP-A nucleosomes on topo -1 converted into hexasomes/tetrasomes in lanes 3-5, but still none on topo -2. Autoradiograms are shown.
4- Heparin depletion assays

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

**Supporting Fig. 11.** Heparin depletions of nucleosomes on topos -1 and -2. (a) Same as Fig. 4a in main text for H3tl-, CENP-Atl- and H3<sup>CATD</sup>-containing nucleosomes (see Supporting Fig. 5). (b) Decreases or increases in intensity of nucleosome or naked topoisomer bands, respectively, were measured in the gels in Fig. 4a in main text, normalized to 100 % reconstitutions, and plotted in % as functions of lane numbers and heparin concentrations. Horizontal “50%” lines were used for the measurements of C<sub>NUC</sub><sup>50</sup> and C<sub>DNA</sub><sup>50</sup> (see Results in main text).
**5- Construction of the α-satellite series of DNA minicircles**

The primers used in the PCR reaction have been designed on the basis of the sequence obtained from the GenBank (submitted by Puechberty J., Laurent A.M., Brun M.E., Vermeesch J. and Roizes G., accession # : AJ 295044), in order to produce ~355 bp fragments. EcoRI sites were introduced at the primers ends to facilitate cloning and subsequent excision from the vector. The PCR reaction was performed on a total human DNA template extracted from 20 µl blood donated by a healthy male volunteer. It appeared that most of the molecules present in the product mixture, which were synthesized on different α-satellite repeats present in the genome, contained an internal EcoRI site, that is, EcoR I digestion led, upon electrophoresis in a polyacrylamide gel, to two bands corresponding to fragment lengths of ~110 and ~250 bp, and only a trace of DNA of the whole length. EcoRI-resistant material was extracted from the gel and used for another PCR reaction using the same primers. The cycle of digestion and PCR reaction was repeated twice. The resulting products were cloned into the EcoR I site of plasmid pUC18.

Two clones were sequenced and one of them chosen for further experiments. As shown in Supporting Fig. 12a, the sequence of that clone (pNCS-α358) differed in a few details from the published sequence. Plasmids pNCS-α(346-356), which carry EcoRI 346-356 bp inserts of α-satellite DNA, were constructed from pNCS-α358 using the PCR reaction with the same lower primer as above, and the series of upper primers shown in Supporting Fig. 12b.

**6-R49K substitution in H3**

Arginine 49 in H3 was substituted for a lysine, to give H3(RK), through site-directed mutagenesis (Stratagene QuikChange) of the appropriate codon in plasmid H3plk (a gift of V. Ramakrishnan, University of Cambridge, UK), as shown in Supporting Fig. 12c. The resulting plasmid, pH3(RK), was propagated in DH5α and corresponding histone H3(RK) was expressed in BL21(DE3) and purified according to standard protocols. Briefly, inclusion bodies were dissolved in DMSO and guanidine, and proteins precipitated with acetone. The pellets were dissolved in 7 M urea and applied to HiTrap™ SP HP columns (Amersham Biosciences) eluted by a NaCl
gradient in dissolving buffer. Urea was removed by precipitation with acetone, the water-dissolved pellets were loaded in a reverse phase HPLC Vydac C4 column, and the eluted fractions of interest further processed as described (13).

a

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↓
TTCTGCAAG TGGATATACA GACCTCCTTG AG-CCTTCGT
ATGA ATTCTGCAAG TGGATATACA GACCC.T... ..G[......]

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TGGAAACGGG ATTTCTTCAT ATTCTGCTAG ACAGAATAAT TCTCAGTAAC
........... ...A...... ........... ...........

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TTCCTTGTGT TGTGTGTATT CAACTCACAG AGTTGAACGA TCCTTTACAC
........... ........... ...T...... ........... ........... G

Published
Cloned
AGAGCAGACT TGAAACACTC TTTTTATGGA ATTTGCAAGT GGAGATTTCA
........... ........... .....G.... ........... ...........

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GCCGCTTTGA GGTCAATGGT AGAATAGGAA ATATCTTCCT ATAGAAACTA
........... .T........ ........... ........... ........... ...........

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GACAGAATGA TTCTCAGAAA CTCCTTTGTG ATGTGTGCGT TCAACTCACA
........... ........... ........... ........... ........... G

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GAGTTTAACC GTTCTGTTCA TAGAGCAGTT AGGAAACACT CTGTTTGAA
......C.... T....T.... ........... G........... ........... GTAA

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AGTCTGCAAG TGGATA
AGTCTGCAAG TGGATAGAAT TCGAT
↑

↑↓ EcoRI

b

upper primers

(356) ATGAATTC CAAGTGGATATACAGACC

(354) ATGAATTC AGTGGATATACAGACCC

(352) ATGAATTC TGGATATACAGACCCC

(350) ATGAATTC GATATACAGACCCC

(348) ATGAATTC TATACAGACCCCTTTG

(346) ATGAATTC TACAGACCCCTTTGAG

c

H3(RK)-up: GGCACGGTGGCGCTGAAGGAGATCCGGCGCTACC

- G T V A L K₄₉ E I R R Y -

H3(RK)-low: GGTAGCGCCGGATCTCCTTCAGCGCCACCGTGCC

**Supporting Fig. 12.** DNA sequences. (a) Actual and published sequence of α-satellite DNA (see Supporting text, section 4). The upper primer and the sequence complementary to the lower primer used in the PCR reaction are underlined, and the sequence recognized by CENP-B protein is boxed. Arrows delimit the 358-bp long fragment excised with EcoRI from plasmid pNCS-α358. (b) Upper primers used in the PCR reaction to prepare plasmids pNCS-α(356-346) from pNCS-α358. The part of the primer sequences complementary to the satellite sequence is indicated in bold. (c) Primers used for site-directed mutagenesis of plasmid H3plk into plasmid pH3(RK) (see Supporting text, section 5). Mutated codons within the wild type sequence are shown in bold red.
## 7- Measurement of α-satellite DNA parameters

$Lk$ = 31 topoisomers of $N$ = 350 and 352 bp α-satellite DNA minicircles were relaxed with topoisomerase I at four temperatures, and electrophoresed in the chloroquin-containing polyacrylamide gel shown in Supporting Fig. 13a. The temperature-dependent relative amounts of the two topoisomers in the relaxation equilibria were used to calculate the DNA helical periodicity at 37°C in relaxation buffer, $h_0$, its supercoiling force constant, $K_{SC}$, and its thermal unwinding coefficient, $\tau$.

Topoisomer free energy of supercoiling (in kT units) is

$$G_{SC} = (K_{SC} / N)(\Delta Lk)^2 \quad [1]$$

where $\Delta Lk = Lk - Lk_T$, with $Lk_T = Tw_T = N/h_T$ being the most probable twist at temperature T. One has

$$Lk_T = Lk_0 - N \tau \Delta T / 360 \quad [2]$$

where $Lk_0 = Tw_0 = N/h_0$ is the most probable twist at 37°C, and $\Delta T = T - 37$. The probability of obtaining the $Lk$ topoisomer in the relaxation equilibrium at temperature T, $f_{Lk}^T$, is proportional to $\exp(-G_{SC})$. From this, one obtains an equation similar to that used previously to derive $K_{SC}$ and $h$ from topoisomer ratios in the circularization of short DNA fragments (14), except that the temperature was not an explicit parameter in the former equation:

$$\log (f_{Lk+1}^T / f_{Lk}^T) = 2 K_{SC} / h_0 - K_{SC} (1 + 2Lk) / N - 2 K_{SC} (\tau / 360) \Delta T \quad [3]$$

The log ($f_{Lk+1}^T / f_{Lk}^T$)-versus-$\Delta T$ plots give two parallel straight lines for the two minicircles in Supporting Fig. 13b. Their slope and intercepts led to $h_0$ = 10.493 (±0.003) bp/turn, $K_{SC}$ = 4200 (±100), and $\tau$ = 0.012 (±0.002) °angle/°C/bp (parameters for pBR DNA were 10.494 (±0.003) bp/turn, 4000 (±300) and 0.015 (±0.001) °angle/°C/bp, respectively; ref. 1).
<figure><img src="image_71.png" /></figure>

**Supporting Fig. 13.** Measurement of α-satellite DNA parameters (see Supporting text, section 6). (a) Lk = 31 topoisomers of 350 and 352 bp α-satellite DNA minicircles were relaxed with topoisomerase I in buffer R (see Methods in main text) for 30 min. at the temperatures indicated (T) into a mixture of Lk = 33 and 34 topoisomers, and electrophoresed in a chloroquin-containing 4 % polyacrylamide gel. An autoradiogram is shown. (b) The natural logarithms of the topoisomer ratios in the equilibria, as calculated from the radioactivity profiles of the gel in (a) (not shown), were plotted as functions of the temperature increments ΔT = T - 37.
REFERENCES

1. Sivolob A, Lavelle C, Prunell A (2003) Sequence-dependent nucleosome structural and dynamic polymorphism. Potential involvement of histone H2B N-terminal tail proximal domain. *J Mol Biol* 326:49-63.

2. Prunell A, Sivolob A (2004) Paradox lost : Nucleosome structure and dynamics by the DNA minicircle approach. *New Comprehensive Biochemistry* 39:45-73.

3. Hamiche A, Carot V, Alilat M, De Lucia F, O'Donohue MF, Révet B, Prunell A (1996) Interaction of the histone (H3-H4)₂ tetramer of the nucleosome with positively supercoiled DNA minicircles. Potential flipping of the protein from a left- to a right-handed superhelical form. *Proc Natl Acad Sci USA* 93:7588-7593.

4. Flaus A, Luger K, Tan S, Richmond TJ (1996) Mapping nucleosome position at single base-pair resolution by using site-directed hydroxyl radicals. *Proc Natl Acad Sci USA* 93:1370-1375.

5. Duband-Goulet I, Carot V, Ulyanov AV, Douc-Rasy S, Prunell A (1992) Chromatin reconstitution on small DNA rings. IV. DNA supercoiling and nucleosome sequence preference. *J Mol Biol* 224:981-1001.

6. Hamiche A, Schultz P, Ramakrishnan V, Oudet P, Prunell A (1996) Linker histone-dependent DNA structure in linear mononucleosomes. *J Mol Biol* 257:30-42.

7. Zhou YB, Gerchman SE, Ramakrishnan V, Travers A, Muyldermans S (1998) Position and orientation of the globular domain of linker histone H5 on the nucleosome. *Nature* 395:402-405.

8. Sivolob A, Prunell A (2003) Linker histone-dependent organization and dynamics of nucleosome entry/exit DNAs. *J Mol Biol* 331:1025-1040.

9. Prunell A, Kornberg RD (1977) Relation of nucleosomes to DNA sequences. *Cold Spring Harb Symp Quant Biol* 42:103-108.

10. Riley D, Weintraub H (1978) Nucleosomal DNA is digested to repeats of 10 bases by exonuclease III. *Cell* 13:281-293.

11. Prunell A (1983) Periodicity of exonuclease III digestion of chromatin and the pitch of DNA on the nucleosome. *Biochemistry* 22:4887-4894.

12. Kepert JF, Mazurkiewicz J, Heuvelman GL, Toth KF, Rippe K (2005) NAP1 modulates binding of linker histone H1 to chromatin and induces an extended chromatin fiber conformation. *J Biol Chem* 280:34063-34072.

13. Sivolob A, De Lucia F, Alilat M, Prunell A (2000) Nucleosome dynamics. VI. Histone tail regulation of tetrasome chiral transition. A relaxation study of tetrasomes on DNA minicircles. *J Mol Biol* 295:55-69.

14. Horowitz DS, Wang JC (1984) Torsional rigidity of DNA and length dependence of the free energy of DNA supercoiling. *J Mol Biol* 173:75-91.
I.4 Résultats complémentaires (non inclus dans l'article I)

La question, ici, était de savoir dans quelle mesure les nucléosomes CENP-A pouvaient avoir une préférence pour se former sur l'ADN α-satellite homologue plutôt que sur des ADNs hétérologues.

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>Figure 14 : Reconstitutions compétitives des nucléosomes H3 et CENP-A sur les ADNs α-satellite et pBR</figcaption></figure>

Pour répondre à la question, nous avons reconstitué les nucléosomes H3 et CENP-A sur un mélange de topoisomères –1 (marqué au $ ^{32}P $) des séquences α-satellite et pBR, à deux rapports histone/ADN (1 et 2). Ces nucléosomes sont alors soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide (le “gel chromatine” ; en haut). Les tranches du gel correspondant aux nucléosomes et aux topoisomères nus résiduels (crochets) sont découpées et les ADNs élués et extraits. Une double digestion par Fnu4H et HaeIII permet de différencier les deux ADNs qui sont séparés sur d'autres gels de polyacrylamide (les “gels ADN”, en bas ; les fragments porteurs de la radioactivité sont seuls visibles dans les autoradiographies). Le mélange initial de topoisomères (total) est composé de 51-52 % d'ADN α-satellite. Les nucléosomes CENP-
A apparaissent très légèrement enrichis en séquences α-satellite par rapport aux nucléosomes H3.

La seconde question était de savoir si CENP-A pourrait, par rapport à H3, induire une certaine spécificité de séquence dans le positionnement des nucléosomes. ✓

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>Figure 15 : Positionnement des nucléosomes sur les ADNs 5S et α-satellite</figcaption></figure>

Pour répondre à la question, nous avons exploité la propriété des mononucléosomes reconstitués sur des fragments linéaires, de migrer différemment selon leur position par rapport aux extrémités (Duband-Goulet et coll., 1992). La figure 15 montre d'abord que les nucléosomes CENP-A migrent légèrement moins vite que les nucléosomes H3, et ceci sur les deux ADNs α-satellite et 5S. Cette particularité existe aussi pour les nucléosomes H3(RK) (voir plus loin pour la définition de ce mutant), mais dans une moindre mesure. Ce retard de migration confirme le déroulement des nucléosomes CENP-A au niveau de leur entrée-sortie (SHL ± 6,5).

Sur le fragment 5S, la position N3 est fréquemment occupée par le nucléosome H3 mais peu ou pas par le nucléosome CENP-A. Mais regardons plutôt les positions sur l'ADN α-satellite, qui, moins nombreuses, sont plus simples à analyser. Nous remarquons que la position N2 des nucléosomes H3 et H3(RK) s'efface au profit de deux nouvelles bandes
(étoiles) avec CENP-A. Le domaine CATD de CENP-A n'en est pas responsable : les nucléosomes CATD ne montrent pas les nouvelles positions. On s'était également demandé si la queue de CENP-A, très différente de celle de H3, pouvait être à l'origine des nouvelles positions observées. Comme on peut le voir avec H3tl et CENP-Atl (tl : *tail-less*), il n'en est rien
## I.5 Résultats et discussion

Nous avons d'abord souhaité vérifier si l'adressage spécifique de CENP-A au centromère ne pouvait pas être la conséquence d'une affinité plus importante pour sa séquence "naturelle" (α-satellite). Les résultats de la figure 14 (Résultats complémentaires) montrent clairement que la réponse est non.

Nous avons ensuite réalisé des expériences de relâchement sur les minicercles de la série pBR, ainsi que sur une nouvelle série créée pour l'occasion : la "série α-satellite", issue d'une séquence de centromère humain. Les résultats montrent que le nucléosome CENP-A préfère la conformation ouverte, contrairement au nucléosome canonique qui, lui, préfère la conformation fermée négative. A partir des résultats quantitatifs, on a pu déterminer que le nucléosome CENP-A est déroulé de 6 à 8 pb par rapport au nucléosome H3, au niveau des ADNs entrant et sortant. La comparaison des séquences des deux protéines révèle que l'arginine 49 de H3 (SHL ± 6,5) est remplacée par une lysine dans CENP-A. Pour connaître la contribution de ce remplacement, nous avons fabriqué une nouvelle H3 (H3(RK)), où l'arginine 49 est remplacée par une lysine. Le déroulement de ce nucléosome H3(RK) est de 3 pb. On en conclut que le remplacement R49K de CENP-A est responsable de la moitié de l'effet observé. Nous avons également étudié une histone chimérique CATD : la boucle L1 et l'hélice α2 sont remplacées dans H3 par la région correspondante de CENP-A. En accord avec le fait que les SHL ± 6,5 sont ceux du nucléosome H3, ce nouveau nucléosome ne montre aucun déroulement.

L'exonucléase III voit ce déroulement en envahissant plus facilement un nucléosome CENP-A qu'un nucléosome H3. Cette ouverture du nucléosome CENP-A est aussi visible par sa moindre mobilité électrophorétique par rapport au nucléosome H3 (figure 15).

Le déroulement du nucléosome CENP-A est-il compatible avec la fixation de l'histone de liaison ? Celles-ci scellent en effet les conformations fermées, stabilisant le croisement des ADNs entrant-sortant. Les résultats montrent que l'histone H5 se lie peu ou pas au nucléosome CENP-A. Ceci permet de supposer qu'il en est de même pour l'histone de liaison H1, la seule présente *in vivo* car H1 est moins chargée positivement que H5.

Le premier dimère H2A-H2B est déstabilisé par le déroulement du nucléosome CENP-A. Il est en effet plus facilement arraché par la protéine chaperon NAP-1, mais aussi par l'héparine, un polysaccharide anionique. En forçant l'état ouvert sur le topoisomère -1, on
diminue aussi fortement la stabilité du premier dimère, confirmant le lien entre l'enroulement de l'ADN et la stabilité du dimère. Une fois le premier dimère enlevé, apparaît un hexasome (le tétramère + le second dimère) qui est ensuite arraché en un seul bloc. Cet arrachement est lui aussi facilité dans le nucléosome CENP-A, révélant une déstabilisation d'ensemble de celui-ci par rapport au nucléosome H3.

L'utilisation des histones sans queue, H3tl et CENP-Atl, a permis de mettre directement en évidence le rôle du remplacement de l'arginine 49 en lysine, mais également de l'arginine 83 en asparagine dans CENP-A. L'arginine 49 stabilise l'entrée-sortie aux SHL ± 6,5 du nucléosome canonique, et l'arginine 83 l'entrée-sortie du tétrasome H3, aux SHL ± 2,5. L'enlèvement des queues entraîne une forte stabilisation des nucléosomes et des tétrasomes canoniques alors que leurs homologues CENP-A sont toujours aussi instables. On peut en conclure que les queues servent en quelque sorte de levier à l'héparine pour déstabiliser d'abord le premier dimère, au travers des SHL ± 6,5, et ensuite l'hexamère, au travers des SHL ± 2,5. En l'absence des arginines, l'effet levier disparaît. Le fait que ces substitutions en 49 et 83 se retrouvent sur les variants centromériques des histones H3 de la plupart des mammifères, donnent à nos observations toute leur signification. De plus, plusieurs chaperons des histones possèdent une queue acide superflue à l'activité d'assemblage des nucléosomes mais vraisemblablement indispensable pour leur activité de désassemblage. Ceci nous laisse supposer que ces chaperons pourraient désassembler *in vivo* par l'intermédiaire des queues de H3 un peu comme le fait l'héparine.

L'équipe de Henikoff (Furuyama et coll., 2006) a montré qu'une protéine chaperonne, RbAp46/48, prend seule en charge le variant CENP-A chez la mouche du vinaigre. Ce résultat est d'autant plus remarquable que RbAp46/48 intervient également pour l'histone H3 principale, H3.1, et un autre variant, H3.3. Mais RbAp46/48 est alors une sous-unité de complexes impliqués dans l'assemblage des nucléosomes au cours de la réplication (CAF-1 pour H3.1) et la transcription (HIRA pour H3.3). On peut ainsi imaginer que CENP-A puisse diffuser partout dans le génome. C'est en tout cas ce qui se passe effectivement lorsqu'elle est surexprimée *in vivo*, en accord avec l'absence de spécificité de séquence des nucléosomes CENP-A.

Une mauvaise localisation du variant centromérique dans les bras des chromosomes peut conduire à la formation de plusieurs centromères sur un chromosome, et donc à des cassures et éventuellement à l'aneuploïdie. Il doit donc exister un mécanisme qui supprime CENP-A
des bras des chromosomes. Nous proposons que les nucléosomes CENP-A, du fait de leur instabilité, sont préférentiellement désassemblés et remplacés par des nucléosomes H3. Cela impose en contrepartie une protection des nucléosomes CENP-A du centromère. C'est bien ce qui a été observé chez la levure (Collins et coll., 2004), où le variant centromérique (Cse4p), surexprimé est dégradé par le protéasome partout sauf dans les centromères. Les CENP-As provenant du désassemblage des nucléosomes pourraient ainsi être vouées à la protéolyse plutôt qu'à un recyclage, une observation valable également chez la mouche du vinaigre (Moreno-Moreno, et coll., 2006).
**ARTICLE II : Plasticité structurale d'une fibre unique de chromatine révélée par manipulation en rotation.**

**I.1 Résumé**

La réponse mécanique en torsion d'une fibre de nucléosomes, obtenue grâce à un système de pinces magnétiques, montre que cette dernière est très élastique et peut emmagasiner une large contrainte rotationnelle, positive ou négative, sans changement important de sa longueur. Nous avons décrit quantitativement ce comportement par un modèle moléculaire de l'architecture tridimensionnelle de la chromatine, nous appuyant sur l'équilibre dynamique entre les trois conformations du nucléosome (croisement négatif, nul et positif des ADNs à l'entrée-sortie) mis en évidence avec les minicercles. La contrainte rotationnelle déplace cet équilibre, conduisant à une réorganisation de l'architecture de la fibre. Le modèle peut permettre une meilleure compréhension de la dynamique des protéines interagissant avec la chromatine.

**I.2 Article**
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# Structural plasticity of single chromatin fibers revealed by torsional manipulation

Aurélien Bancaud<fnref n="1" />, Natalia Conde e Silva², Maria Barbi³, Gaudeline Wagner<fnref n="1" />, Jean-François Allemand⁴, Julien Mozziconacci³, Christophe Lavelle²,³, Vincent Croquette⁴, Jean-Marc Victor³, Ariel Prunell² & Jean-Louis Viovy<fnref n="1" />

Magnetic tweezers were used to study the mechanical response under torsion of single nucleosome arrays reconstituted on tandem repeats of 5S positioning sequences. Regular arrays are extremely resilient and can reversibly accommodate a large amount of supercoiling without much change in length. This behavior is quantitatively described by a molecular model of the chromatin three-dimensional architecture. In this model, we assume the existence of a dynamic equilibrium between three conformations of the nucleosome, corresponding to different crossing statuses of the entry/exit DNAs (positive, null or negative, respectively). Torsional strain displaces that equilibrium, leading to an extensive reorganization of the fiber's architecture. The model explains a number of long-standing topological questions regarding DNA in chromatin and may provide the basis to better understand the dynamic binding of chromatin-associated proteins.

The genetic material of eukaryotic cells is organized into chromatin, a nucleoproteic structure whose repetitive unit is the nucleosome<fnref n="1" />. The core particle of the nucleosome consists of 147 bp of DNA wrapped 1.65 times around an octamer containing two copies each of the four core histones, H2A, H2B, H3 and H4 (ref. 2). This leads to both compaction and topological deformation of the DNA by one negative turn per nucleosome (ΔLk ~ -1, Lk being the linking number³). *In vivo*, regularly distributed nucleosome arrays with a repeat length of ~200 base pairs<fnref n="1" /> fold into 30-nm fibers, whose modulated compaction is thought to be associated with a differential accessibility of DNA⁴ to interactions with various factors, as required for DNA activity. A better knowledge of chromatin organization is thus expected to improve our understanding of the regulation of DNA transactions *in vivo*.

Bona fide nucleosome arrays can be reconstituted *in vitro*, and single-molecule techniques now offer a direct approach to study their molecular dynamics in real time. Force micromanipulation has revealed the existence of an internucleosomal attraction that maintains the higher-order chromatin structure under physiological conditions⁵ and shown a reversible peeling of ~80 bp of nucleosomal DNA below 15 pN (ref. 6), presumably associated with the destabilization of H2A-H2B dimers. Above this force, discrete disruption events of 25 nm each, attributed to the dissociation of tetrasomes ((H3-H4)₂-DNA complexes)⁶,⁷, have been observed.

In this study, we performed the first torsional nanMANipulation of single chromatin fibers using magnetic tweezers⁸. We observed that nucleosome arrays reconstituted on 5S tandemly repeated positioning

sequences⁹ with core histones purified from chicken erythrocytes can accommodate large amounts of negative or positive supercoiling without much change in their length. We propose a quantitative model based on a dynamic equilibrium between the three conformations of the nucleosome previously identified through the minicircle approach (a single nucleosome reconstituted on a DNA minicircle)¹⁰. In these states, the nucleosome entry/exit DNAs can cross negatively (as in the canonical structure²) or positively, or not cross at all. The model fits the chromatin length-versus-torsion response at various levels of compaction and under stretching forces ranging from 0.09 to 5 pN. It also shows how the torsional constraint can force nucleosomes to switch conformation and can induce a large and reversible reorganization of the fiber architecture. These findings provide simple answers to long-standing topological puzzles about DNA in chromatin. Moreover, the ability of chromatin to undergo fast and reversible structural reorganizations, revealed by this study, may underlie the dynamic nature of the binding of numerous chromatin-associated proteins¹¹,¹².

## RESULTS

### Torsion

Nucleosome arrays were reconstituted by stepwise dilution using a linear DNA containing 36 tandemly repeated 208-bp 5S positioning sequences⁹ and purified core histones. These fibers were then flanked by two naked DNA spacers, to avoid histone-mediated hydrophobic interaction with the surfaces, and by two 'stickers' that link the fiber to

<footnote n="1">¹Institut Curie, UMR 168, 75231 Paris, France. ²Institut Jacques Monod (UMR 7592), 2 Place Jussieu, 75251 Paris, cedex 05, France. ³Laboratoire de Physique Théorique de la Matière Condensée (UMR 7600), 4 Place Jussieu, 75252 Paris, cedex 05, France. ⁴Laboratoire de Physique Statistique (UMR 8549), 24 Rue Lhomond, 75231 Paris, cedex 05, France. Correspondence should be addressed to J.-L.V. (jean-louis.viovy@curie.fr) or A.P. (prunell@ccr.jussieu.fr).</footnote>