# Biominéralisation de la coquille d'oeufs d'oiseaux

Joël Gautron

► To cite this version:

Joël Gautron. Biominéralisation de la coquille d'oeufs d'oiseaux. UE Biominéralisation, 2015, pp.87. hal-02795700

HAL Id: hal-02795700

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# Bioinéralisation de la coquille d'œufs d'oiseaux

Joël Gautron

INRA, UR83 Recherches

Avicoles

37380 Nouzilly
# Bioinéralisation de la coquille d'œufs d'oiseaux

- Introduction

- Structure de la coquille

- Formation de la coquille

- Rôle de la matrice organique

- Identification des protéines de la matrice organique

- Hiérarchiser les Protéines de la matrice organique intervenant dans le processus de minéralisation

- Conclusion
INTRODUCTION
# L'œuf de poule

## L'Œuf, un produit de base pour l'alimentation humaine

### Au niveau mondial en 2012

- ☐ 66,4 millions de tonnes par an (>1200 milliards d'œufs)

- ☐ Accroissement du marché de 2.2 %

- ☐ Premier producteur est la Chine (24,5 MT – 37 % de la production mondiale)

- ☐ Union européenne second producteur mondial (6 MT- 9 % de la production mondiale)

### Filière française en 2013

- ☐ 15,2 milliards d'œufs

(47 millions de poules pondeuses)

- ☐ 1.37 milliards d'Euros

- ☐ 4 % de la valeur des productions animales

- ☐ 1.7 % de la valeur des productions agricoles

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### Consommation

- ☐ 145 œufs par an et par habitant dans le monde

- ☐ 216 œufs par an et par personne en France

- ☐ 60% sous forme d'œufs en coquille

- ☐ 40% sous forme d'ovoproduits

Source ITAVI
# Microbiologie de l'œuf et des ovoproduits

☐ Au moment de la ponte, le contenu des œufs est généralement stérile

☐ Le pourcentage d'œufs frais contaminés reste souvent inférieur à 1 %

☐ Contamination verticale est rare

☐ La contamination horizontale est beaucoup plus fréquente

☐ Se produit après la ponte par contact avec les microorganismes

* fientes

* environnement élevage

* centre de conditionnement

* circuit de commercialisation

* consommateur...

→ Les œufs et produits d'œufs sont consommés crus (mayonnaise...)

→ Impliqués dans 45% des salmonelloses (62 % pour salmonella enteritidis)

Le risque de contamination par les microorganismes et notamment *Salmonella* est donc une préoccupation pour la filière œufs et ovoproduits
# Le contexte européen

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Impact sur la qualité hygiénique de l'oeuf ?
L'Œuf, un pré-
Chambre is

Doit contenir la totalité des composants nécessaires au développement
embryonnaire

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Agressions
physiques

Microbes

► Éléments nutritionnels parfaitement équilibrés

► Nombreux composés avec un large spectre d'activités biologiques

► Systèmes de protection (défenses naturelles)

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Défense physique (coquille principalement)

Défense chimique (activité antimicrobienne des protéines de l'œuf)
# Structure de la coquille
La coquille (défense physique)

<figure><img src="image_8.png" /></figure>
# La coquille (défense physique)

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

## Composition :

* ✓ Carbonate de calcium (calcite)

* ✓ 3,5 % matrice organique (2% partie minéralisée)
La coquille (défense physique)

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

Gallus gallus x 72

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

Cygnus x 53
# Formation de la coquille
# La formation de l'œuf

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

**Foie**

Protéines du jaune
(maturité sexuelle)

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**Ovaire**

**infundibulum**

Membranes vitellines
(< 1 h)

**Magnum**

Protéines du blanc
(1h – 4h30)

**Isthme**

Membranes coquillières
(4h30-6h)

**Utérus**

Calcification de la coquille
(6h – 24 h)

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

- Membranes coquillières

- Couche calcifiée
# Eggshell Biomineralisation in uterus

## Supply of minerals for shell mineralization

*General model describing
uterine ion transporters
during eggshell
calcification*

Jonchère et al., 2012, BMC physiology

Brionne et al., 2014, BMC Genomics

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Jonchère, et al., BMC physiology, 2012; Brionne, et al., BMC Genomics, 2014

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

## Biomineralisation process

*3 main phases
in the uterine
fluid
(acellular milieu)*

<figure><img src="image_17.png" /></figure>
# La formation de la coquille des oiseaux, un processus de biominéralisation

Minéralisation de la coquille se produit dans l'utérus qui constitue un espace compartimenté

Les cellules de l'utérus sécrètent un fluide acellulaire (liquide utérin) dans lequel se produit la minéralisation

L'ensemble des constituants minéraux et organiques nécessaires à la formation de la coquille sont présents dans ce milieu

Le carbonate de calcium précipite à partir du calcium et des bicarbonates du fluide utérin

Le calcium et les carbonates se trouvent à des concentrations élevées

Le produit de solubilité est dépassé de 100 fois environ
# La formation de la coquille

## La phase initiale

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

Le carbonate de calcium se dépose en des sites organiques (noyaux mamillaires) en surface de la membrane de l'œuf
# La formation de la coquille

## La phase initiale

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

<figure><img src="image_21.png" /></figure>

Peu à peu les noyaux mamillaires sont recouverts de calcite
# La formation de la coquille

## La phase initiale

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

La couche calcifiée est étroitement liée aux
fibres de la membrane de la coquille
# La formation de la coquille

## La phase initiale

<figure><img src="image_24.png" /></figure>

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

Les noyaux mamillaires recouverts de carbonate de calcium (calcite) forment des cônes qui fusionnent au fur et à mesure que la
# La formation de la coquille

## La phase de croissance

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

Les noyaux mamillaires recouverts de carbonate de calcium (calcite) forment des cônes qui fusionnent au fur et à mesure que la calcification se poursuit
# La formation de la couille

## La phase de croissance

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Surface de la couche calcifiée avec
apparition d'un pore obtenu en absence de
fusion des pores
# La formation de la coquille

## La phase terminale

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

En surface de la couche calcifiée apparaît une couche monocristalline de calcite (Couche des cristaux verticaux)
# La formation de la coquille

## La phase terminale

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

La minéralisation s'arrête. Une fine couche de matière organique vient se déposer en surface (cuticule)

<figure><img src="image_33.png" /></figure>
# La formation de la coquille

## La phase terminale

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

La cuticule recouvre la totalité de l'œuf. En séchant, elle se fissure pour permettre les échanges gazeux via les pores
Similitude des coquilles d'œufs

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Gallus gallus</figcaption></figure>

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>coturnix japonica</figcaption></figure>

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Meleagris gallopavo</figcaption></figure>

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Anas platyrhynchos</figcaption></figure>

<figure><img src="image_40.png" /></figure>

<figure><img src="image_41.png" /></figure>
# Similitude des coquilles d'œufs

☐ PROCESSUS DE BIOMINERALISATION UNIVERSEL

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Gallus gallus</figcaption></figure>

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Numida meleagris</figcaption></figure>

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Struthio</figcaption></figure>

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Sankofa pyrenaica</figcaption></figure>

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

<figure><img src="image_49.png" /></figure>
# La formation de la coquille, un processus de biominéralisation

## Formation d'une orientation privilégiée des cristaux et de la microstructure

<figure><img src="image_50.png" /></figure>

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Gallus gallus</figcaption></figure>

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Meleagris gallopavo</figcaption></figure>

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Numida meleagris</figcaption></figure>

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>Sankofa pyrenaica</figcaption></figure>
# Propriétés biomécaniques des coquilles d'œufs

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

<figure><img src="image_57.png" /></figure>

<figure><img src="image_58.png" /></figure>

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Caille</figcaption></figure>

<caption>Pintade</caption>

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>Dinde</figcaption></figure>

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>Moineau</figcaption></figure>

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Merle noir</figcaption></figure>

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Canard</figcaption></figure>

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Poule</figcaption></figure>
# La formation de la coquille

* XRD 2D (X-Ray Diffraction) (détermination quantitative du polymorphe cristallin présent)

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

L'angle de diffraction est spécifique du type polymorphique du cristal (ici calcite)
# La formation de la coquille

* XRD 2D (X-Ray Diffraction) (détermination quantitative du polymorphe cristallin présent)

<figure><img src="image_68.png" /></figure>

5h p.o

<figure><img src="image_69.png" /></figure>

6h p.o

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

7h p.o

<figure><img src="image_71.png" /></figure>

14h p.o

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

5h p.o :
pas de
cristal

<figure><img src="image_73.png" /></figure>

6h p.o :
cristallisatio
n
très faible

<figure><img src="image_74.png" /></figure>

7h p.o :
cristal plus
organisé

<figure><img src="image_75.png" /></figure>

14h p.o :
cristal
totalement
organisé
# La formation de la coquille

* XRD 2D (X-Ray Diffraction) (détermination quantitative du polymorphe cristallin présent)

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

* ✓ Nanocristaux formés aux stades précoces (5-6 heures)

* ✓ Accroissement de la taille des cristaux à partir des nanocristaux

* ✓ Les plus gros cristaux forment un petit nombre d'unités cristallines orientées microstructure en colonne
# La formation de la coquille

## Contexte

2 hypothèses possibles pour la formation de la calcite sous influence de la matrice organique

Hypothèse n°1 : calcite formée directement $Ca + CO_3 \rightleftharpoons calcite$

Hypothèse n°2 : passage par du carbonate de calcium amorphe (ACC) dans une phase transitoire avant d'obtenir la calcite $Ca + CO_3 \rightleftharpoons ACC \rightleftharpoons calcite$
☐ Plus soluble, plus réactif, source temporaire de calcium

### Biomineralization

### Structural Control of Crystal Nuclei by an Eggshell Protein**

Colin L. Freeman, John H. Harding, David Quigley, and P. Mark Rodger*

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

<figure><img src="image_78.png" /></figure>

**Figure 1.** Ovocleidin-17 bound to an amorphous (a) and a crystallized (b) calcium carbonate nanoparticle containing 192 formula units. The

Angewandte
International Edition
Chemie

DOI: 10.1002/anie.201000679
# La formation de la coquille

quantification du ratio CaCO3 cristallin/CaCO3 total (FTIR)

Faisceau
IR
incident

<figure><img src="image_79.png" /></figure>

échantillon

Diffraction dans
certaines directions de l'espace

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

<figure><img src="image_81.png" /></figure>

Spectre IR

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

Diffraction des IR
en fonction
des liaisons
chimiques présentes

<figure><img src="image_83.png" /></figure>
# La formation de la coquille

## quantification du ratio CaCO3 cristallin/CaCO3 total (FTIR)

5h p.o

<figure><img src="image_84.png" /></figure>

6h p.o

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

7h p.o

<figure><img src="image_86.png" /></figure>

14h

<figure><img src="image_87.png" /></figure>

16h

<figure><img src="image_88.png" /></figure>

calcite pure

<figure><img src="image_89.png" /></figure>
# La formation de la coquille

quantification du ratio CaCO3 cristallin/CaCO3 total (FTIR)

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

* ✓CaCO3 amorphe (ACC) aux stades précoces, mais une certaine orientation (proto-calcite)

* ✓Augmentation du ratio aire pic C/aire pic T, qui traduit une transformation graduelle de l'ACC en calcite à tous les stades
# La formation de la coquille

## Role of amorphous calcium carbonate (ACC)

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

**Time 1 (5-6 h Post ovulation):**

ACC particles nucleate on the
whole eggshell membranes.

Form massive deposits
# La formation de la coquille

## Role of amorphous calcium carbonate (ACC)

<figure><img src="image_92.png" /></figure>

Calcite formation

<figure><img src="image_93.png" /></figure>

**Time 2 (6-7 h post ovulation):** Interface-coupled dissolution-precipitation process

Direct transformation of ACC into calcite aggregates on mammillary knobs
# La formation de la coquille

## Role of amorphous calcium carbonate (ACC)

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

Large calcite crystal units deposition

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

Time 3 (>7h post ovulation):
Additional cristallisation events
on calcite template
# Rôle de la matrice organique
# La matrice organique

## ✓ Organic matrix plays a key role

*determine the texture of the shell and its resulting mechanical properties*

<figure><img src="image_96.png" /></figure>

*Orientation and stabilisation of calcium carbonate polymorphs Drive the calcite morphology*

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

Calcium carbonate (calcite) ← → Organic matrix
# La matrice organique

## Détermine la microstructure du biomatériau

* ✓ The avian eggshell is a complex and highly structured calcitic bioceramic

* ✓ Competitive crystal growth

* ✓ Mineral-binding proteins guide crystal growth (organic matrix control)

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

Rodriguez-Navarro et al., 2000; Nys et al., (2004)

<figure><img src="image_100.png" /></figure>

Images: J.M. Garcia-Ruiz, Granada
# Protéines de la matrice et minéralisation de la coquille

<figure><img src="image_101.png" /></figure>

Initial

<figure><img src="image_102.png" /></figure>

Croissance

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

Fluide utérin

Terminal

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

Composition variable du fluide utérin au cours du processus de calcification

<figure><img src="image_105.png" /></figure>

Adaptation du contenu organique selon le stade de minéralisation
# Protéines de la matrice et minéralisation de la coquille

Augmente la cinétique de nucléation des cristaux
 temps nécessaire pour observer les premiers cristaux
Témoins 900 minutes
Fluide utérin < 10 secondes

Augmente le nombre de cristaux

<figure><img src="image_106.png" /></figure>

Témoins
40 cristaux

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

Initiale

<figure><img src="image_108.png" /></figure>

Croissance

<figure><img src="image_109.png" /></figure>

Terminale

Fluide utérin >10 000 cristaux

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

## Effet du fluide utérin sur la croissance de la calcite in vitro

(Poultry Sci., 2000, 79, 901-907 ; J. Crystal Growth, 2008, 310, 1754-1759 ; Cryst. Growth. Des., 2008, 8, 4330-4339)

<figure><img src="image_111.png" /></figure>

<figure><img src="image_112.png" /></figure>

Favorise la calcite comme type polymorphique

<figure><img src="image_113.png" /></figure>

<figure><img src="image_114.png" /></figure>

<figure><img src="image_115.png" /></figure>

Témoins (%) 55
Fluide utérin (%) 100

22.5
0

22.5
0

Modifie la morphologie des cristaux de calcite

<figure><img src="image_116.png" /></figure>

Témoin

<figure><img src="image_117.png" /></figure>

Initiale

<figure><img src="image_118.png" /></figure>

Croissance
Fluide utérin

<figure><img src="image_119.png" /></figure>

Terminale
# Identification des protéines de la matrice organique
# Identification des protéines de l'œuf

* Caractériser les protéines de la matrice

* Établir lesquelles jouent un rôle crucial lors du processus de minéralisation

## Les techniques classiques

* Biochimie (Fractionnement des composés de l'œuf par chromatographie, électrophorèses...) et biologie moléculaire (banque cDNA, EST ...)

□ 2006, environ 50 protéines de l'œuf (10 dans la coquille)
# Les protéines de la matrice organique

## Les protéines préalablement identifiées dans le blanc d'œuf

- Le lysozyme

- L'ovotransferrine

- L'ovalbumine

## Les protéines ubiquitaires

- La clusterine

- L'ostéopontine,
- NEFA

## Les protéines spécifiques

- L'ovocleidin-17

- L'ovocleidine-116

- L'ovocalyxine-32

- L'ovocalyxine-36

- L'ovocalyxine-25

- L'ovocalyxine-21
# Les protéines préalablement identifiées dans le blanc d'œuf

☐ **lysozyme** (Matrix Biol., 2000, 19, 443-453) **et ovotransferrine** (Connect. Tissue. Res., 2001, 42, 225-267)

<figure><img src="image_120.png" /></figure>

<figure><img src="image_121.png" /></figure>

<figure><img src="image_122.png" /></figure>

* Présentes dans la coquille

* sécrétées par les tissus où se forme la coquille
# Les protéines préalablement identifiées dans le blanc d'œuf

☐ **lysozyme** (Matrix Biol., 2000, 19, 443-453) **et ovotransferrine** (Connect. Tissue. Res., 2001, 42, 225-267)

* Jouent un rôle dans la protection physique de l'œuf et de l'embryon

## Interaction avec le carbonate de calcium

<figure><img src="image_123.png" /><figcaption>Témoi
n°</figcaption></figure>

<figure><img src="image_124.png" /><figcaption>Ovotransferrine</figcaption></figure>

<figure><img src="image_125.png" /><figcaption>Lysozyme</figcaption></figure>

* Jouent un rôle antimicrobien (protection chimique de l'œuf et de l'embryon)

* Ovotransferrine → Inhibe la croissance des bactéries à Gram négatif par privation de fer

* Lysozyme → Hydrolyse la paroi des bactéries à Gram positif
# Les protéines spécifiques de la coquille

☐ Ovocleidin -116 (J. Biol. Chem., 1999, 274, 32915-32923)

☐ Ovocalyxines-25 et -21 (Bioactive egg compounds, 109-115. Springer-Verlag (Ger))

☐ Ovocalyxine -32 (J. Biol. Chem., 2001, 276, 39243-39252) (1/3)

► Nouvelles séquences protéiques non identifiées au préalable

## Utilisation des banques EST

### Le but

* Identifier les gènes fonctionnels

### Méthode

* Un catalogue compréhensible de l'ensemble des séquences d'un organisme ou d'un tissu spécifique ou d'une fonction biologique

<figure><img src="image_126.png" /></figure>
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation des banques EST

<figure><img src="image_127.png" /></figure>

Assembled into a genome-wide non-redundant catalog of expressed genes
(Unigenes)

### Main projects for poultry:

- University Delaware (http://www.chickest.udel.edu/)

- University of Manchester (http://www.chick.umist.ac.uk/index.html)

- Inra (http://www.sigenae.org)

<figure><img src="image_128.png" /></figure>

dbEST: database of "Expressed Sequence Tags"

dbEST release 130101

**600 434 séquences** (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html) **pour 260 460 contigs et**
**129 842 singlets** (http://public-contigbrowser.sigenae.org:9090/Gallus_gallus/index.html)
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation des banques EST

Séquençage des Protéines et traduction en nucléotides

### Protein sequencing of OCX-32

**N terminal sequence**

ERLPWPQVPGVMHPLNPKHREAV

**Internal peptide sequences**

CB3 GLAIVGSSH(I)

CB4 YLV

ERLPW

K1 X(Q)IRK

K2 (G)NF

K3 KSPXVVHAK

K4 DNAFAK

K5 X(Q)IRXDNAFAK

K6a (Q)IQEED(HR)FYE(YLQ)

K6b KQIQEED HR FYE(YLQ)

K7a KQSTEHTGYLLAQVSS(V)K

K7b QSTEHTGYLLAQVSS(V)K

K8 YLVWTLGHPIRVK

K9 FIVLLHEIPTQQLVNX(H)

K10 KPITANYIPDS(N)GNIA(HDH)

**Traduction en séquences nucléotidiques (code dégénéré)**

Leucine : 6 codons

(UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG)

Acide aspartique : 2 codons (GAU, GAC)

Méthionine : codon unique (AUG)

Milliers de combinaisons possibles

Utilisation d'outils bioinformatiques
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation des banques EST

Séquençage des Protéines et traduction en nucléotides

### Protein sequencing of OCX-32

**N terminal sequence**

ERLPWPQVPGVMHPLNPKHREAV

**Internal peptide sequences**

CB3 GLAIVGSSH(I)

CB4 YLV

ERLPW

K1 X(Q)IRK

K2 (G)NF

K3 KSPXVVHAK

K4 DNAFAK

K5 X(Q)IRXDNAFAK

K6a (Q)IQEED(HR)FYE(YLQ)

K6b KQIQEED HR FYE(YLQ)

K7a KQSTEHTGYLLAQVSS(V)K

K7b QSTEHTGYLLAQVSS(V)K

K8 YLVWTLGHPIRVK

K9 FIVLLHEIPTQQLVNX(H)

K10 KPITANYIPDS(N)GNIA(HDH)

Traduction en séquences nucléotidiques (code dégénéré)

Recherche dans les bases de données Banques d'EST (tblastN)

Identification des séquences EST correspondantes

<figure><img src="image_129.png" /></figure>
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation des banques EST

Séquençage des Protéines et traduction en nucléotides

* Full length cDNA sequence

<figure><img src="image_130.png" /></figure>

Amino acid translation

EFGTSAAERLPWPQVPGVMRPLNPSHREAVWAAWTALHYINSHEASPSRP
LALHKVVKAASKMIPRLGWKYYVHCTTEGYIHGENAGSCFATVLYLKKSP
PVVHGKCVHAQNKKQIQEEDHRFYEYLQHQKKPITANYIPDSNGNIAHDH
LQLWGLAIVGSSYIMWKQSTEHTGYLLAQVSSVKQQIRKDNAVAFKFIVL
LHEIPTQQLNVCHMYLVWTLGHPIRVKYSCAPDNHGLEDGSGQDSGSAAG
TSHETKGNF
# Les protéines spécifiques de la coquille

□ Ovocalyxine-32 (J. Biol. Chem., 2001, 276, 39243-39252)

(2/3)

►Uniquement exprimée dans les tissus où se forme la coquille

<figure><img src="image_131.png" /></figure>

RT-PCR de l'ovocalyxine-32

<figure><img src="image_132.png" /></figure>

Western blot de l'ovocalyxine-32
# Les protéines spécifiques de la coquille

□ Ovocalyxine -32 (J. Biol. Chem., 2001, 276, 39243-39252) (3/3)

► Impliquée dans le processus d'arrêt de la calcification

<figure><img src="image_133.png" /></figure>

<figure><img src="image_134.png" /></figure>

► Joue un rôle antimicrobien (protection chimique de l'œuf et de l'embryon)

* Inhibiteur de carboxypeptidase

* inhibe la croissance de *Bacillus subtilis*

(Comp. Biochem. Physiol. B, Biochem. Mol. Bio, 2007, 147, 172-177)
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 282, NO. 8, pp. 5273-5286, February 23, 2007
© 2007 by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Printed in the U.S.A.

## Cloning of Ovocalyxin-36, a Novel Chicken Eggshell Protein Related to Lipopolysaccharide-binding Proteins, Bactericidal Permeability-increasing Proteins, and Plunc Family Proteins*

Received for publication, November 3, 2006, and in revised form, December 14, 2006. Published, JBC Papers in Press, December 19, 2006, DOI 10.1074/jbc.M610294200

Joël Gautron<sup>†</sup>, Emi Murayama<sup>§</sup>, Alain Vignal<sup>¶</sup>, Mireille Morisson<sup>¶</sup>, Marc D. McKee<sup>||</sup>, Sophie Réhault<sup>‡</sup>, Valérie Labas<sup>**</sup>, Maya Belghazi<sup>**</sup>, Mary-Laure Vidal<sup>‡</sup>, Yves Nys<sup>‡</sup>, and Maxwell T. Hincke<sup>‡‡</sup>
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_135.png" /></figure>

<figure><img src="image_136.png" /></figure>

<figure><img src="image_137.png" /></figure>

<figure><img src="image_138.png" /></figure>

<figure><img src="image_139.png" /></figure>
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_140.png" /></figure>
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_141.png" /></figure>
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

## Analyse bioinformatique des séquences génomique, cDNA et protéique

### Séquence cDNA de OCX 36

Aucune homologie avec des séquences répertoriées

### Séquence en acides aminés

Identité et similarité limités avec "lipopolysaccharide binding proteins (LBP)", "bactericidal permeability increasing protein (BPI)" et "Plunc families proteins"

* 20-25 % résidus identiques

* 39-44 % substitutions conservatives

Expected value 10-4 to 10-28
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

5'

3'

Séquence DNA (1995 bp) de l'ARNm de l'ovocalyxin-36

<figure><img src="image_142.png" /></figure>

Identification et localisation génomique de l'ovocalyxin-36

Chromatographie et positionnement de l'ovocalyxin-36 en position 9 et 11 et 9842177
# Les protéines spécifiques de la coquille

## Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

Ovocalyxine-36, protéine apparentée à LBP/BPI et Plunc

Se lient au lipopolysaccharide (LPS) de la paroi des bactéries à Gram négatif
— Mort de la bactérie

Reconnaissance précoce des produits bactériens dans le système respiratoire supérieur chez les mammifères

Architecture du gène

<figure><img src="image_143.png" /></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_144.png" /><figcaption>Expression de l'OCX-36 à différentes conditions physiologiques</figcaption></figure>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

## Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

BIOLOGY OF REPRODUCTION 83, 893-900 (2010)
Published online before print 11 August 2010.
DOI 10.1095/biolreprod.110.085019

### Minireview

## What Makes an Egg Unique? Clues from Evolutionary Scenarios of Egg-Specific Genes¹

Xin Tian,³,⁴,⁵,⁶ Joel Gautron,⁷ Philippe Monget,³,⁴,⁵,⁶ and Géraldine Pascal²,³,⁴,⁵,⁶

UMR85,³ Physiologie de la Reproduction et des Comportements, INRA, Nouzilly, France

UMR6175,⁴ CNRS, Nouzilly, France

Université François Rabelais de Tours,⁵ Tours, France

Haras Nationaux,⁶ Nouzilly, France

UR83 Recherches Avicoles,⁷ INRA, Nouzilly, France

<figure><img src="image_145.png" /></figure>

Developmental and Comparative Immunology xxx (2010) xxx-xxx

Contents lists available at ScienceDirect

### Developmental and Comparative Immunology

journal homepage: www.elsevier.com/locate/dci

<figure><img src="image_146.png" /></figure>

ELSEVIER

<figure><img src="image_147.png" /></figure>

Human Chromosome 20

<figure><img src="image_148.png" /></figure>

## Identification and characterisation of the BPI/LBP/PLUNC-like gene repertoire in chickens reveals the absence of a LBP gene²

Shih-Chieh Chiangª,¹, Edwin J.A. Veldhuizenᵇ, Frances A. Barnesª, C. Jeremy Cravenᶜ, Henk P. Haagsmanᵇ, Colin D. Bingleª,⁺

<footnote>ªAcademic Unit of Respiratory Medicine, Department of Infection and Immunity, University of Sheffield, Sheffield S10 2ZF, UK</footnote>

<footnote>ᵇDepartment of Infectious Diseases and Immunology, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, P.O. Box 80.165, 3508 TD Utrecht, The Netherlands</footnote>

<footnote>ᶜKrebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Sheffield, Sheffield S10 2FN, UK</footnote>
# Utilisation combinée des banques cDNA, EST, génomique et des outils de bioinformatique

Ovocalyxin-36, une protéine spécifique de la matrice organique de la coquille

<figure><img src="image_149.png" /></figure>
# Identification des protéines de l'œuf

## Les techniques classiques

* Biochimie (Fractionnement des composés de l'œuf par chromatographie, électrophorèses...) et biologie moléculaire

☐ 2006, environ 50 protéines de l'œuf (10 dans la coquille)

## Les développements récents

✓ 2004, Publication de la séquence génomique de la poulpe

<figure><img src="image_150.png" /></figure>

✓ Genome-wide non redundant catalog of 33 838 different genes

<figure><img src="image_151.png" /></figure>

Mise à disposition des techniques « omics » et des outils de data mining pour identifier de nouvelles protéines de l'œuf

✓ cDNA and ESTs libraries (Identification of 600 434 functional genes in chickens)

<figure><img src="image_152.png" /></figure>
# « omics » to identify novel egg proteins

<figure><img src="image_153.png" /></figure>

* Transcriptomics (microarrays, RNA seq...)

<figure><img src="image_154.png" /></figure>

0 h

**Liver:**

Egg yolk proteins (several weeks)

<figure><img src="image_155.png" /></figure>

24 h

**Ovary and infundibulum:**

Vitelline membranes (less 1 h)

**Magnum:**

egg white proteins (1 to 4 h 30)

**Isthmus:**

eggshell membranes (4h30 to 6 h)

**Uterus:**

eggshell calcification (6 to 24 h)

## Egg formation
### Spatial and temporal regulation

Different tissues or organs

Egg components are deposited at different times

Different physiological stages

<figure><img src="image_156.png" /></figure>

Comparison of gene expression in the
various segment of the reproductive tract

<figure><img src="image_157.png" /></figure>

Quantification of genes specifically related to the egg yolk, the vitelline membranes, the egg white, the eggshell membranes and the eggshell calcification process
# « omics » to identify novel egg proteins

<figure><img src="image_158.png" /></figure>

## ✓ Transcriptomics (microarrays, RNA-Seq)

Bourin et al. BMC Genomics 2012, 13:457
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/13/457

BMC
Genomics

<figure><img src="image_159.png" /></figure>

**Liver:** **582** ←
Egg yolk proteins (several weeks)

<figure><img src="image_160.png" /></figure>

**Ovary and infundibulum:**
Vitelline membranes (less 1 h)

**Magnum:** **828** ←
egg white proteins (1 to 4 h 30)

**Isthmus:** **135** ←
eggshell membranes (4h30 to 6 h)

**Uterus:** **605** ←
eggshell calcification (6 to 24 h)

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Transcriptomic profiling of proteases and
antiproteases in the liver of sexually mature hens
in relation to vitellogenesis

Marie Bourin, Joël Gautron, Magali Berges, Christelle Hennequet-Antier, Cédric Cabau, Yves Nys and Sophie Réhault-Godbert*

New insights in egg white proteins using cDNA microarrays and extensive proteomic data mining

**EggMeat symposia 2011 - Leipzig**

Joël Gautron¹, Aurélien Brionne¹, Christelle Hennequet-Antier¹, Cédric Cabau¹, Nicolas

Guyot¹, Larry Cogburn², Sophie Réhault-Godbert¹, Yves Nys¹

Identifying specific proteins involved in eggshell membrane
formation using gene expression analysis and bioinformatics.

Jingwen Duª, Maxwell Hinckeª, d, Aurélien Brionneb, Christelle Hennequet-Antierb, Larry A.

Cogburnc, Yves Nysb, Joel Gautronb **Submitted**

Brionne et al. BMC Genomics 2014, 15:220
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/15/220

BMC
Genomics

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Hen uterine gene expression profiling during
eggshell formation reveals putative proteins
involved in the supply of minerals or in the shell
mineralization process

Aurélien Brionne, Yves Nys, Christelle Hennequet-Antier and Joël Gautron*

Jonchère et al. BMC Genomics 2010, 11:57
http://www.biomedcentral.com/1471-2164/11/57

BMC
Genomics

## RESEARCH ARTICLE

Open Access

Gene expression profiling to identify eggshell
proteins involved in physical defense of the
chicken egg

Vincent Jonchère¹, Sophie Réhault-Godbert¹, Christelle Hennequet-Antier¹, Cédric Cabau¹, Vonick Sibut¹, ³

Larry A Cogburn², Yves Nys¹, Joel Gautron¹*
ser les outils à haut débit pour identifier les gènes et protéines impliqués dans la formation de l'œuf

✓ **Proteomics**

<figure><img src="image_161.png" /></figure>

Proteomic analysis provides new insight into the chicken eggshell cuticle

Megan Rose-Martel, Jingwen Du, Maxwell T. Hincke*

Proteomics 2013, 13, 3523-3536

DOI 10.1002/pmic.201300296

3523

RESEARCH ARTICLE

Differential label-free quantitative proteomic analysis of avian eggshell matrix and uterine fluid proteins associated with eggshell mechanical property

Congjiao Sun, Guiyun Xu and Ning Yang

JOURNAL OF PROTEOMICS 113 (2015) 178-193

<figure><img src="image_162.png" /></figure>

ELSEVIER

Available online at www.sciencedirect.com

ScienceDirect

www.elsevier.com/locate/jprot

<figure><img src="image_163.png" /></figure>

Quantitative proteomics and bioinformatic analysis provide new insight into protein function during avian eggshell biomineralization

<figure><img src="image_164.png" /></figure>

CrossMark

Pauline Marieª, Valérie Labasᵇ, Aurélien Brionneª, Grégoire Harichauxᵇ, Christelle Hennequet-Antierª, Yves Nysª, Joël Gautronª,\*

JOURNAL OF PROTEOMICS 116 (2015) 81-96

<figure><img src="image_165.png" /></figure>

ELSEVIER

Available online at www.sciencedirect.com

ScienceDirect

www.elsevier.com/locate/jprot

<figure><img src="image_166.png" /></figure>

Novel identification of matrix proteins involved in calcitic biomineralization

<figure><img src="image_167.png" /></figure>

CrossMark

Megan Rose-Martel, Sandy Smiley, Maxwell T. Hincke*

shell

Proteomics 2006, 6, 3801-3810

DOI 10.1002/pmic.200600120

3801

RESEARCH ARTICLE

Proteomic analysis of the acid-soluble organic matrix of the chicken calcified eggshell layer

Karlheinz Mann, Boris Maček and Jesper V. Olsen

106

DOI 10.1002/pmic.200600635

Proteomics 2007, 7, 106-115

RESEARCH ARTICLE

Phosphoproteins of the chicken eggshell calcified layer

Karlheinz Mann, Jesper V. Olsen, Boris Maček, Florian Gnad and Matthias Mann

Max-Planck-Institute for Biochemistry, Department of Proteomics and Signal Transduction, Martinsried, Germany

Connective Tissue Research, 48:1-8, 2007

Copyright © Informa Healthcare

ISSN: 0300-8207 print / 1521-0456 online

DOI: 10.1080/03008200601003116

ORIGINAL RESEARCH

Proteins of Insoluble Matrix of Avian (Gallus Gallus) Eggshell

Ivan Mikšík and Adam Eckhardt

Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, and Cardiovascular Research Centre, Prague, Czech Republic

Pavla Sedláková and Katerina Mikulikova

Institute of Physiology, Academy of Sciences of the Czech Republic, Prague, Czech Republic

Anal Bioanal Chem (2010) 397:205-214

DOI 10.1007/s00216-009-3326-3

ORIGINAL PAPER

Determination of insoluble avian eggshell matrix proteins

Ivan Mikšík • Pavla Sedláková • Katerina Lacinová

Statis Pataridis • Adam Eckhardt
# « omics » to identify novel egg proteins

<figure><img src="image_168.png" /></figure>

* ✓ **Proteomics** (Mass spectrometry-based methods for protein identification)

>3600 protein identifiers in the different eggshell proteomes from 3 different databases
IPI (closed), GeneBank and UniProt

<figure><img src="image_169.png" /></figure>

Lot of redundancies

Majority of them were not annotated

<figure><img src="image_170.png" /></figure>

<figure><img src="image_171.png" /></figure>

<figure><img src="image_172.png" /></figure>

Data mining and bioinformatics tools

<figure><img src="image_173.png" /></figure>

Loading of the sequences, multi alignment to eliminate redundancies

<figure><img src="image_174.png" /></figure>

725 non redundant eggshell proteins

<figure><img src="image_175.png" /></figure>

Update of functional annotations
# Eggshell proteins and physical defence

## calcification process

* ✓ Proteins involved in the **biomineralization** of shell

* OC-17

* OC-116

* Ovotransferrin

* OCX-32

* Osteopontin

* Lysozyme

Ovotransferrin is a Matrix Protein of the Hen Eggshell Membranes and Basal Calcified Layer

J. GAUTRONª, M.T. HINCKEᵇ, M. PANHELEUXª, J.M. GARCIA-RUIZᶜ, T. BOLDICKEᵈ and Y. NYSª,⁺

<figure><img src="image_176.png" /></figure>

Proteins interact with minerals to influence the morphology of crystals
# Eggshell proteins and physical defence

## calcification process

* ✓ Proteins involved in the **biomineralization** of shell

* OC-17

* OC-116

* Ovotransferrin

* OCX-32

* Osteopontin

* Lysozyme

Angewandte
International Edition Chemie

DOI: 10.1002/anie.201000679

**Biomineralization**

**Structural Control of Crystal Nuclei by an Eggshell Protein**

Colin L. Freeman, John H. Harding, David Quigley, and P. Mark Rodger*

<figure><img src="image_177.png" /></figure>

**Figure 1.** Ovocleidin-17 bound to an amorphous (a) and a crystallized (b) calcium carbonate nanoparticle containing 192 formula units. The
# Eggshell proteins and physical defence

## calcification process

* ✓ Proteins involved in the **biomineralization** of shell

* OC-17

* OC-116

* Ovotransferrin

* OCX-32

* Osteopontin

* Lysozyme

* ✓ **Calcium binding proteins (CaBPs) to interact with calcium to favour crystal nucleation or drive the morphology of crystals**

Identification of numerous novel CaBPs

* A total of 23 proteins with EF-hand and EGF-like calcium binding domains are present in the shell

<figure><img src="image_178.png" /></figure>
# Eggshell proteins and physical defence

## calcification process

* Proteins involved in the **proper folding of the eggshell matrix**

An appropriate conformation of proteins is required to ensure calcium and mineral interactions and to ensure template to the mineralized structure

- Molecular chaperone

- Protein assisting folding

- Proteins with interactive properties related to proteoglycans

* **Regulation of the activity of proteins** related to the shell deposit

Shell mineralisation occurs in a non cellular milieu

In situ by direct action of proteins to inhibit or activate the molecular actors present in the milieu.

- Molecular chaperone which can interact with proteins might be involved in this regulation process.

- Proteases and proteases inhibitors (specific and controlled role during calcification process, either by degrading proteins or regulating processing of proteins into their mature forms)
Hiérarchiser les Protéines de la matrice
organique intervenant dans le processus de
minéralisation
# Etude de la bioméralisation de la coquille des oiseaux

<figure><img src="image_179.png" /></figure>

### Métaboliser les acteurs moléculaires prépondérants lors du processus de minéralisation

## Etudes à différents stades de la minéralisation (poule et pintade)

<figure><img src="image_180.png" /></figure>

AGENCE NATIONALE DE LA RECHERCHE
ANR

IMPACT (2013-2017)
# Etude de la biominéralisation de la coquille des oiseaux

(Propriétés mécaniques exceptionnelles)

## ☐ Importance de l'initiation de la minéralisation

* Etape cruciale pour la suite de la biominéralisation

* Détermine les propriétés mécaniques de la coquille

<figure><img src="image_181.png" /></figure>

Rodriguez-Navarro
and Garcia-Ruiz,
2000
# Etude de la biominéralisation de la coquille des oiseaux

(Propriétés mécaniques exceptionnelles)

## ☐ Importance de l'initiation de la minéralisation

* Etape cruciale pour la suite de la biominéralisation

* Détermine les propriétés mécaniques de la Coquille en information collectée à différents points de l'initiation de la minéralisation

<figure><img src="image_182.png" /></figure>

<figure><img src="image_183.png" /></figure>

<figure><img src="image_184.png" /></figure>
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

SDS-PAGE 4-20

<figure><img src="image_185.png" /></figure>

Analyse protéomique
sur LTQ-VelosOrbitrap
des bandes

Identification des protéines

Etablissement d'une liste
non redondante de 216
protéines
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

- 216 protéines quantifiées

- Détermination de l'abondance relative dans chacun des 4 stades

- Analyses statistiques

- ANOVA
    175 Protéines ont des variations d'abondance significatives selon les stades

- Cluster hiérarchique profils d'abondance protéique
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

## Classement des protéines selon leur profil d'abondance

### Réalisation d'un cluster hiérarchique pour les 175 protéines

- Valeur moyenne réduite pour limiter l'effet de la variance

- Calculs de distance entre individus : corrélation de Pearson

- Calculs de distance entre classe : moyenne des distances entre chaque individu de chaque classe (aver)

<figure><img src="image_186.png" /></figure>
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

<figure><img src="image_187.png" /><figcaption>## 70 proteins overabundant during rapid growth phase</figcaption></figure>

<figure><img src="image_188.png" /><figcaption>## 13 proteins overabundant during ACC transformation into calcite aggregates</figcaption></figure>

<figure><img src="image_189.png" /><figcaption>## 47 proteins overabundant when large calcite crystal units are formed</figcaption></figure>

<figure><img src="image_190.png" /><figcaption>## 18 proteins overabundant at stages associated with the presence of calcite</figcaption></figure>

<figure><img src="image_191.png" /></figure>
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

<figure><img src="image_192.png" /></figure>

ACC

Calcite

ACC deposition
(5-6 h p.o.)

<figure><img src="image_193.png" /></figure>

27
overabundant
proteins

ACC transformation into
calcite (6-7 h p.o.)

<figure><img src="image_194.png" /></figure>

13
overabundant
proteins

Crystal units formation
(7h p.o.)

<figure><img src="image_195.png" /></figure>

47overabundant
proteins

Rapid growth phase
(16 h)

<figure><img src="image_196.png" /></figure>

70
overabundant
proteins

## Functions and biological activities of the identified matrix proteins ?

<figure><img src="image_197.png" /></figure>

Literature, data mining and bioinformatics tools

<figure><img src="image_198.png" /></figure>

Classification in different groups according to their potential functions

<figure><img src="image_199.png" /></figure>

Associated to Mineralization
process

<figure><img src="image_200.png" /></figure>

Involved in the regulation of
activity of proteins

<figure><img src="image_201.png" /></figure>

Antimicrobial
proteins
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

## Proteins associated to shell mineralization process

* ✓ Proteins involved in the **biomineralization** of shell or other biominerals (bones, molluscan...)

* ✓ **Calcium binding proteins (CaBPs)** interact with calcium to favour crystal nucleation or drive the morphology of crystals

* · Identification of numerous novel CaBPs

* Numerous proteins with EF-hand and EGF-like calcium binding domains are present in the shell

* ✓ **Proteoglycans** et proteoglycan binding proteins

* · proteoglycans have a negative charge to attract Ca2+ ions

* ✓ **Eggshell membranes** proteins
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

## Proteins involved in the regulation of activity of proteins driving mineralisation

* ✓ Proteins involved in the proper folding of the eggshell matrix

* An appropriate conformation of proteins is required to ensure calcium and mineral interactions and to ensure template to the mineralized structure

* Molecular chaperone

* Protein assisting folding

* Proteins with interactive properties related to proteoglycans

* ✓ **Regulation of the activity of proteins** related to the shell deposit

* Shell mineralisation occurs in a non cellular milieu

* Direct action of proteins to inhibit or activate the molecular actors present in the milieu.

* Molecular chaperone interact with proteins driving mineralisation

* Proteases and protease inhibitors (specific and controlled role during calcification process either by degrading proteins or regulating processing of proteins into their mature forms)

* ✓ Mineralisation depends on the degree of protein phosphorylation

* Kinases

* Phosphatases
# Etude de la coquille à différents temps de la minéralisation

ACC
Calcite

<figure><img src="image_202.png" /></figure>

ACC deposition
(5-6 h p.o.)

EDIL3

ALB
OVM
CST3
**HAPLN3**
CLU
**OCX-25**

LYZ
OVOT
**OC-17**
OVAL

<figure><img src="image_203.png" /></figure>

ACC transformation into
calcite (6-7 h p.o.)

EDIL3

ALB
**CLU**
OC-116
CST3
**LOC 428451**
**NUCB2**
**MFGE8**
**OCX-32**
**OCX-25**

OVAL
LYZ
OVOT
OC-17

<figure><img src="image_204.png" /></figure>

Crystal units formation
(7h p.o.)

ALB

OVAL
**CST3**
CLU
**NUCB2**
**OCX21**
**PPIB**
**GPC4**
**OCX25**

LYZ
**OC-116**
OC-17
**EDIL3**
OVOT

<figure><img src="image_205.png" /></figure>

Rapid growth phase
(16 h)
# Biominéralisation de la coquille d'œuf d'oiseaux

- Microstructure, ultrastructure parfaitement définie

- Rôle du carbonate de calcium amorphe (ACC) est démontré et important

- Interaction matrice organique minéraux est prépondérante

- Stabilisation de l'ACC, morphologie des cristaux

- Caractérisation de la matrice organique récente (10 protéines en 2006, > 700 aujourd'hui)

- Hiérarchisation des acteurs moléculaires prépondérants lors du processus de minéralisation

- Etablissement d'une liste restreinte de candidats pivots

## Validation expérimentale

(purification, interaction minéral, invalidation des gènes codant les protéines clefs, recherche de polymorphismes associés à la solidité du biomatériau, marqueurs biologiques de la solidité, relation structure-fonction....)