# Modélisation de la barrière de filtration glomérulaire

Mahamadou Dembele, Marion Delafosse, Nadhir Yousfi, Hanna Debiec, Kieu Ngo, Emmanuelle Plaisier, Pierre Ronco, Guillaume Perry

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Mahamadou Dembele, Marion Delafosse, Nadhir Yousfi, Hanna Debiec, Kieu Ngo, et al. Modélisation de la barrière de filtration glomérulaire. Médecine/Sciences, 2021, 37 (3), pp.242-248. 10.1051/med-sci/2021010. hal-03175326

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> Nous présentons, dans cette revue, les dernières avancées concernant la modélisation *in vitro* de la barrière de filtration glomérulaire. Ces systèmes, permettant de réduire l'utilisation des modèles animaux, connaissent un intérêt croissant et bénéficient du développement de nos connaissances des cellules souches et de la bioingénierie. Nous discuterons les limites des modèles cellulaires glomérulaires actuels et nous introduirons les méthodes permettant d'obtenir des cellules glomérulaires à partir des cellules souches. Enfin, nous discuterons de l'importance du microenvironnement dans le maintien du phénotype, quels que soient les systèmes utilisés tels que la co-culture, les bio-matériaux ou la microfluidique. <

Le rein est un organe essentiel au maintien de l'homéostasie de l'organisme par sa capacité à épurer le sang. Chez l'homme, chaque rein est composé d'environ un million d'unités fonctionnelles, appelées néphrons, eux-mêmes constitués de deux grandes parties : le glomérule et le système tubulaire. Le glomérule permet la production de l'urine primitive grâce à l'ultrafiltration du sang à travers une structure très spécifique, appelée barrière de filtration glomérulaire (BFG). Cette structure fonctionnelle constitue une barrière de taille et de charge, imperméable aux éléments figurés du sang, aux grosses molécules, telles que les lipides et les protéines plasmatiques dont la masse moléculaire est égale ou supérieure à celle de l'albumine (66 458 daltons).

La barrière de filtration glomérulaire est composée de trois couches avec, du compartiment sanguin au compartiment urinaire (Figure 1) :

**Les cellules endothéliales glomérulaires (CEnG).** Le cytoplasme de ces cellules délimitant les capillaires glomérulaires a la particularité de former des pores, également appelés fenestrations, par réorganisation de

# Modélisation de la barrière de filtration glomérulaire

## Nouvelles avancées

Mahamadou Dembele<fnref n="1" />*, Marion Delafosse<fnref n="1" />*, Nadhir Yousfi<fnref n="1" />, Hanna Debiec<fnref n="1" />, Kieu Ngo<fnref n="2" />, Emmanuelle Plaisier<fnref n="1" />, Pierre Ronco<fnref n="1" />, Guillaume Perry<fnref n="1" />,<fnref n="3" />

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l'actine. La présence de ces pores et celle du glycocalyx à la surface des CEnG jouent un rôle important dans la perméabilité à l'eau et aux solutions de faible masse moléculaire [1]. Ces cellules expriment des marqueurs spécifiques endothéliaux, tels que le vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) et CD31 [2].

**La membrane basale glomérulaire (MBG).** C'est une structure matricielle constituée de réseaux interconnectés de collagène de type IV et de laminines, auxquels s'associent des protéoglycanes. Des altérations génétiques de la MBG, comme le syndrome d'Alport, sont responsables de maladies glomérulaires avec un passage anormal des globules rouges dans les urines (hématurie) [3].

**Les cellules épithéliales viscérales.** Elles sont également appelées podocytes du fait de leurs ramifications, ou pédicelles. Ceux-là forment un maillage étroit, qui ne laisse libre que de petits espaces, formés par des diaphragmes de fente (DF). L'intégrité des DF est assurée grâce à un réseau complexe de protéines transmembranaires, comme la podocine ou la néphrine. L'atteinte des podocytes, comme dans la glomérulonéphrite extra-membraneuse, va se traduire par une fuite massive de protéines d'une masse moléculaire égale ou supérieure à l'albumine dans les urines (protéinurie glomérulaire) [4].

<footnote n="1">¹Inserm, Sorbonne Université, Maladies rénales fréquentes et rares (CoRaKiD), UMRS 1155, Hôpital Tenon, Bâtiment recherche, 4 rue de la Chine, 75020 Paris, France.</footnote>

<footnote n="2">²Sorbonne Université, CNRS, Laboratoire interfaces et systèmes électrochimiques, LISÉ, Campus Pierre et Marie Curie, 4 place Jussieu 75252 Paris, France.</footnote>

<footnote n="3">³CNRS, Sorbonne université, Laboratoire de génie électrique et électronique de Paris, GeePs, Campus Pierre et Marie Curie, 4 Place Jussieu 75252 Paris, France.</footnote>

<footnote>*Ces auteurs ont contribué de façon égale à cet article et sont considérés comme premiers auteurs
guillaume.perry@sorbonne-universite.fr</footnote>
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 1. Barrière de filtra-tion glomérulaire.**</figcaption></figure>

A. Représentation schéma-tique. Photos de micro-scopie électronique (B) d'une barrière non altérée [40] (sous licence Creative commons CC BY4), (C) d'une barrière altérée par un syndrome d'Alport avec un épaississement typique de la membrane basale glomérulaire (flèches noires) et un effacement progres-sif des pédicelles, et (D) d'une glomérulonéphrite extra-membraneuse avec des dépôts immuns (flèches noires) au niveau de la membrane basale gloméru-laire du côté des podocytes (P).

A

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B

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D

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C

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De nombreuses maladies peuvent altérer l'architecture de la BFG, entraînant l'apparition d'une protéinurie et/ou d'une hématurie, voire d'une insuffisance rénale. La reproduction dans les modèles des pro-priétés structurales et fonctionnelles complexes de la BFG est essen-tielle pour comprendre les mécanismes physiopathologiques de ses altérations, pour proposer des thérapeutiques spécifiques, ou encore pour contribuer à la génération d'un rein bioartificiel. Les modèles in vivo et ex vivo (glomérule isolé et perfusé) présentent plusieurs limites : essentiellement fondés sur des modèles murins, les résul-tats obtenus posent le problème de leur pertinence pour l'étude des maladies rencontrées chez l'homme. Par ailleurs, la viabilité ex vivo des structures glomérulaires reste limitée, réservant ces expériences pour des équipes expérimentées réduisant leur champ d'exploitation [5]. Les organoïdes rénaux représentent une alternative intéressante [6]. Cependant, ces structures multicellulaires tridimensionnelles sont dépourvues de réseaux capillaires et de compartiments urinaires bien définis, ce qui les rend inaptes à reproduire l'activité de filtration glomérulaire [7]. Récemment, plusieurs modèles in vitro de BFG ont été développés, permettant notamment d'agir de manière spécifique sur chacun de ses composants. L'objectif de cette revue est de pré-

senter les deux grands axes du développement des modèles in vitro de BFG, 1) l'utilisation de nouveaux types cellulaires et 2) la possibilité de reproduire le microenvironnement. Nous soulignerons également les limites respectives de ces modèles et présenterons les défis à relever.

## Vers de nouveaux modèles de cellules glomérulaires

### Types cellulaires actuellement utilisés

La culture de cellules glomérulaires humaines in vitro est une approche essentielle pour étudier ces cellules et émettre des hypothèses sur les interactions entre les différents constituants de la BFG. Idéalement, les cellules doivent présenter des caractéristiques mor-phologiques (pédicelles des podocytes et fenestrations des CEnG) et moléculaires (expression des marqueurs spécifiques) identiques à celles des cellules gloméru-laires in vivo. Actuellement, les principales sources de
<table><caption>**Tableau 1. Modèles cellulaires de la barrière de filtration glomérulaire in vitro.** CD2AP : cluster of differentiation 2-associated protein ; CPLA : cellules progénitrices rénales issues du liquide amniotique ; DF : diaphragme de fente ; ICAM 2 : intercellular adhesion molecule 2 ; P-CAD : P-cadhérine ; PODXL : podocalyxine ; SYN : synaptopodine, marqueur clé des podocytes différenciés in vivo ; Tie2 : tyrosine kinase with immunoglobulin and EGF homology domains 2 ; VE-CAD : vascular endothelial cadherin ; VEGFR2 : vascular endothelial growth factor receptor 2 ; vWF : von Willebrand factor ; WT1 : Wilms tumor 1.</caption><thead><tr><td>Types cellulaires</td><td>Marqueurs spécifiques</td><td>Avantages</td><td>Inconvénients</td><td>Références</td></tr></thead><tbody><tr><td>Culture primaire de podocytes</td><td>Podocine, néphrine, P-CAD, WT-1</td><td>Pédicelles et DF proches de ceux de podocytes in vivo</td><td>Accès difficile, coût élevé, potentiel prolifératif faible, perte des pédicelles et de SYN au cours des passages</td><td>[34]</td></tr><tr><td>Culture primaire de CEnG</td><td>CD31, ICAM2, VEGFR2,vWF, VE-CAD, Tie2</td><td>Maintien des fenestrations au cours des passages précoces</td><td>Accès difficile, coût élevé, potentiel prolifératif faible, perte progressive des fenestrations</td><td>[35]</td></tr><tr><td>Lignées de podocytes immortalisées</td><td>Podocine, néphrine, P-CAD, SYN</td><td>Potentiel prolifératif optimisé, source illimitée, accès facile Antigène SV40 thermosensible</td><td>Différences phénotypiques entre différentes lignées et avec les podocytes in vivo, absence de pédicelles, Instabilité génomique</td><td>[36]</td></tr><tr><td>Lignées de CEnG immortalisées</td><td>CD31, ICAM2, VEGFR2,vWF</td><td>Potentiel prolifératif optimisé, source illimitée, accès facile</td><td>Absence de glycocalyx, Instabilité génomique</td><td>[37]</td></tr><tr><td>Podocytes dérivés de cellules progénitrices rénales issues du liquide amniotique (CPLA)</td><td>Podocine, néphrine, WT-1, SYN</td><td>Potentiel prolifératif intéressant, présence de structures semblables aux pédicelles, pas d'instabilité génomique</td><td>Rôle physiologique des CPLA mal connu, coût du tri des CPLA élevé et rendement faible</td><td>[38]</td></tr><tr><td>Podocytes isolés des organoïdes rénaux dérivés des iPSC</td><td>SYN, CD2AP, WT-1, PODXL</td><td>Potentiel prolifératif intéressant, présence de structures semblables aux pédicelles, instabilité génomique faible ou inexistante, modèle personnalisable</td><td>Protocole de différenciation long, complexe et coûteux, pédicelles et DF peu définis, immaturité potentielle</td><td>[39]</td></tr></tbody></table>

cellules glomérulaires étudiées présentent des limites impactant leur pertinence physiologique (Tableau 1). On peut regrouper ces cellules en trois grandes catégories : 1) les cultures primaires de cellules glomérulaires, 2) les lignées de cellules glomérulaires immortalisées, et 3) les cellules glomérulaires dérivées de cellules progénitrices ou de cellules souches. Les cultures primaires de cellules présentent l'avantage d'un phénotype proche de celui observé in vivo, plus particulièrement durant les passages<sup>1</sup> précoces de leur culture in vitro. Si leur utilisation a permis des avancées dans la compréhension des bases moléculaires

de glomérulopathies humaines, leur très faible potentiel prolifératif et la difficulté à maintenir un phénotype différencié au-delà des premiers passages lors de la culture in vitro restent deux limites importantes à leur utilisation. Les lignées cellulaires de podocytes et de CEnG humaines immortalisées par transfection avec un transgène codant l'antigène T du virus simien 40 (SV40) ont constitué une avancée importante. Outre l'acquisition de propriétés prolifératives à 33 °C, l'utilisation d'un transgène thermosensible a permis l'acquisition, à 37 °C, de caractéristiques phénotypiques différenciées. Actuellement, ces lignées sont des modèles de cellules glomérulaires in vitro très largement utilisés. Toutef

<footnote n="1">¹ Le passage, ou sous-culture de cellules, est une procédure dans laquelle les cellules d'une culture donnée sont ensemblocées dans du milieu frais et distribuées dans de nouvelles boîtes de culture (flacons ou plaques) pour poursuivre leur culture in vitro (« repiquage »).</footnote>
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 2.** Les différents types de modèles de culture in vitro.</figcaption></figure>

## Vers un microenvironnement plus physiologique des cultures de cellules glomérulaires

Outre les propriétés intrinsèques des cellules utilisées, leur environnement local, ou microenvironnement, joue un rôle essentiel dans leur différenciation et leur capacité de prolifération. Pour étudier la BFG *in vitro*, il est donc indispensable de contrôler ce microenvironnement, en particulier les interactions intercellulaires, les propriétés de la matrice extracellulaire environnante, et les effets biomécaniques dus aux cisaillements générés par le flux sanguin et le flux urinaire. Les différents modèles existants sont illustrés dans la *Figure 2*.

### Les interactions cellule-cellule

De nombreuses molécules sont impliquées dans la différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules glomérulaires, puis dans leur viabilité et dans le maintien de leur phénotype mature. Dans un système *in vitro*, ces molécules peuvent être apportées de manière exogène, en supplémentant le milieu de culture, ou de manière plus physiologique, grâce à la co-culture de plusieurs types cellulaires. La co-culture de cellules endothéliales glomérulaires (CEnG) avec des podocytes induit l'organisation des CEnG, en tubes ressemblant aux capillaires glomérulaires, grâce à un effet paracrine du VEGF (vascular endothelial growth factor) podocytaire sur les CEnG [13, 14]. De même, l'endothéline 1 (ET-1), produite par les CEnG, stimule la prolifération des cellules mésangiales [15]. De nombreuses interactions entre cellules résidentes du glomérule ont été décrites [21], ainsi qu'avec d'autres types cellulaires extraglomérulaires, tels que

les cellules tubulaires ou les cellules immunitaires [17]. En outre, les podocytes et les CEnG ont un rôle synergique dans la synthèse des constituants de la membrane basale glomérulaire mature. L'analyse par spectrométrie de masse de la composition de la matrice extracellulaire (MEC) obtenue avec des co-cultures de podocytes et de CEnG montre que celle-là se rapproche en effet plus de la composition de la membrane basale glomérulaire *in vivo* que celle de la MEC qui est obtenue avec des monocultures de cellules [18].

### Matrice extracellulaire et propriétés locales

Contrairement aux organoïdes rénaux au sein desquels les différents types cellulaires s'organisent spontanément en trois dimensions pour reproduire l'architecture du glomérule observée *in vivo*, les autres systèmes de culture *in vitro* nécessitent un support artificiel pour reproduire l'interface que constitue la membrane basale glomérulaire au sein de la BFG qui est composée des deux compartiments distincts que sont le compartiment sanguin et le compartiment urinaire. Cela est particulièrement important pour l'étude des capacités de filtration de la BFG. De nombreux procédés ont été mis au point pour reproduire les propriétés biochimiques et biophysiques des membranes basales [19]. Li et al. ont montré que des podocytes cultivés sur un support recouvert de collagène de type IV (le collagène
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majoritaire de la MBG) exprimaient plus fortement les marqueurs de différenciation néphrine/synaptopodine que des podocytes cultivés sur un support recouvert de collagène de type I (en quantité faible dans la MBG) [20]. Flegeau et al. ont récemment généré une micro-fibre mimant la BFG par extrusion d'une solution à base de collagène de type I contenant des CEnG en suspension [21] sur lesquels les podocytes sont ensuite déposés. Dans ce modèle, une néosynthèse de MEC ainsi que la présence de podocytes fonctionnels en périphérie de la microfibre et de CEnG au centre, ont été observées. Néanmoins, ce modèle ne présente pas de lumière au niveau des CEnG.

Outre la composition moléculaire, le contrôle des propriétés biophysiques des supports de culture est essentiel. En effet, la rigidité d'un hydrogel (exprimée par le module de Young<fnref n="2" />) servant de support de culture permet d'optimiser la morphologie et l'expression de marqueurs de différenciation de podocytes humains immortalisés, les meilleurs résultats étant observés avec une rigidité comprise entre 2 et 5 kPa [22]. La forme du support de culture influence également le phénotype cellulaire. La méthode d'électrofilage, qui génère un réseau de microfibres grâce à un champ électrique, permet ainsi de créer des supports propices au maintien de la viabilité et du phénotype des cellules glomérulaires [23]. Pour prendre en compte l'influence de la courbure du support sur la morphologie spécifique des podocytes, Korolj et al. ont produit un support de culture en 3 dimensions constitué de micro-hémisphères s'approchant du diamètre des glomérules [24]. La culture de podocytes dans ces conditions induit un réarrangement des fibres d'actine et une meilleure capacité de filtration que la culture développée sur un support en deux dimensions classique.

## Effets biomécaniques des contraintes de cisaillement

In vivo, les cellules sont soumises à différentes forces sous forme de contraintes mécaniques qui vont moduler leur phénotype. L'étirement des podocytes entraîne ainsi une elongation de leurs pédicelles et une réorganisation du cytosquelette d'actine [25]. Deux principales forces s'exercent au niveau de la paroi capillaire glomérulaire : (1) la contrainte de cisaillement induite par le flux sanguin rénal sur le versant endothélial, et (2) celle induite par le phénomène d'ultrafiltration sur le versant podocytaire. Au niveau des CEnG, les forces de cisaillement induisent un alignement des filaments d'actine et modulent la perméabilité du capillaire glomérulaire [26]. Au niveau podocytaire, le cisaillement diminue la quantité de fibres d'actine et peut entraîner le détachement des cellules [27]. L'intensité et la durée des contraintes imposées peuvent considérablement moduler ces effets cellulaires. Arora et al. ont cultivé des cellules endothéliales dérivées d'iPSC, à l'aide d'un montage en canaux parallèles permettant de faire varier les niveaux de cisaillement de 0,4 à 15 dyn/cm<fnref n="2" />. Dans ces conditions, les cellules n'exprimaient les marqueurs endothéliaux Notch 1 et Ephrin-B2 que dans le cas des cisaillements supérieurs à 4 dyn/cm<fnref n="2" />, leur expression n'étant stable que pour des durées d'exposition dépassant 24 heures [28].

## Conclusion

Depuis ces dernières années, des progrès importants ont été effectués dans la modélisation *in vitro* de la barrière de filtration glomérulaire (BFG), notamment grâce au développement de deux techniques d'importance : la maîtrise de l'utilisation de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et la miniaturisation. Même si iPSC représentent une approche très prometteuse, de nombreux obstacles existent encore avant l'obtention d'un phénotype physiologique stable de cellules glomérulaires. Le développement des techniques à haut-débit et les progrès en biologie du développement devraient permettre des avancées significatives, notamment grâce à l'identification des voies de signalisation importantes pour la différenciation des différentes cellules. En parallèle, les innovations de la bioingénierie ont permis la mise au point de plateformes microfluidiques, aussi appelées organes sur puce, intégrant des paramètres essentiels du microenvironnement cellulaire, tels que la compartimentalisation et l'application de contraintes de cisaillement. Différents points techniques restent néanmoins encore à approfondir, comme l'intégration de biomatériaux mimant la MBG. Les plateformes microfluidiques ont déjà été utilisées, notamment pour étudier la BFG. Les modèles actuels ont surtout servi à reproduire certaines situations pathologiques, comme les néphropathies hypertensive [29] et diabétique [30], ou certaines pathologies autoimmunes [31]. D'autres organes sur puce intégrant également la barrière intestinale ont été utilisés pour des études de néphrotoxicité [32]. Au-delà, la production de ce type de puces à grande échelle pourrait être une alternative intéressante, dans un avoir beaucoup plus lointain, aux techniques actuelles de suppléance rénale [33]. ◊

## SUMMARY

### Models of glomerular filtration barrier :
### New developments

In this article, we present the latest innovations to generate *in vitro* models of the glomerular filtration barrier. There is currently a growing interest for such model systems that allow to reduce the use of animal models. Methodologies to improve their physiological relevance have taken advantage of the development of induced pluripotent stem cells and of bioengineering, particularly tissue engineering. Here, we first introduce the methods to overcome the limitations of the currently used glomerular cells based on the use of stem cells. The different approaches to obtain podocytes, the most important cells in the glomerulus, are presented. Finally,

<footnote n="2">² Le module de Young ou module d'élasticité (exprimé en kPa) donne des informations sur le comportement du matériau soumis à des contraintes et caractérise sa rigidité. Il détermine à partir de quelle contrainte le matériau est déformé.</footnote>
we emphasize the importance of the glomerular microenvironment in maintaining the glomerular cell phenotype, which can be achieved by co-culturing different glomerular cells, integration of biomaterials mimicking the extracellular matrix and introduction of flows with microfluidics. ◊

## REMERCIEMENTS

Nous remercions l'UFR d'ingénierie de Sorbonne Université et la société francophone de Néphrologie, Dialyse et Transplantation pour le financement des stages de Mahamadou Dembele et de Marion Delafosse.

## LIENS D'INTÉRÊT

Les auteurs déclarent n'avoir aucun lien d'intérêt concernant les données publiées dans cet article.

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TIRÉS À PART
G. Perry

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