Introduction

Myotonic Dystrophy type 1 (DM1) is a multisystemic disorder characterized by progressive
muscle weakness and wasting, myotonia, arrhythmia and cardiac conduction defects, endocrine
deficiencies, cataracts as well as cognitive impairments (Harper, 2001). DM1 disease is inherited in
an autosomal dominant manner and caused by an unstable expansion of CTG repeats located in
the 3'UTR of the *DMPK* gene (Brook et al., 1992). These pathogenic CTG expansions are
transcribed to mutant RNAs containing expanded CUG repeats (CUGexp-RNAs) that accumulate
in the nucleus and form ribonucleoprotein aggregates.

Among the multiple molecular consequences associated to expanded CTG repeats, expression of CUGexp-RNAs alters the function of RNA binding proteins of the MBNL family leading to global RNA metabolism alterations including alternative splicing, mRNA stability, alternative polyadenylation and miRNA processing (Batra et al., 2014; Klein et al., 2011; Rau et al., 2011; E. T. Wang et al., 2012).

Notably, MBNL protein functional loss, due to their sequestration by CUGexp-RNAs, reverts specific pre-mRNA processing events to a foetal regulatory pattern in DM1. Thus, several splicing mis-regulations have been associated with DM1 symptoms such as myotonia, muscle weakness, dystrophic process and cardiac conduction defects (Charlet-B. et al., 2002; Freyermuth et al., 2016; Fugier et al., 2011; Rau et al., 2015; Tang et al., 2012). Further considerable evidences for MBNL functional loss in DM1 pathology were supported by single or combined Mbnl knockout mice models that developed symptoms observed in DM1 patients (Charizanis et al., 2012; Goodwin et al., 2015; Kanadia et al., 2003; Lee-Hsin et al., 2020; K.-Y. Lee et al., 2022; K. Y. Lee et al., 2013; Poulos et al., 2013).

In mammals, besides their structural resemblance, MBNL proteins differ in their expression
pattern. MBNL1 and MBNL2 are ubiquitously expressed, however the highest MBNL1 expression
level has been reported in heart and skeletal muscles, while MBNL2 is predominantly present in
the central nervous system (CNS) (Konieczny et al., 2014). Remarkably, MBNL1 and MBNL2
could have compensatory roles as the deletion of either MBNL1 or MBNL2 results in a significant
increase of the other paralog, associated with partial functional compensation. Indeed, mice
invalidated for both Mbnl1 and Mbnl2 (dKO) are embryonic lethal and cardiac as well as skeletal
muscle-specific MBNL2-Knockout (KO) in MBNL1-KO background causes robust splicing
alterations, mimicking the spliceopathy observed in DM1 patients (K.-Y. Lee et al., 2022; K. Y. Lee
et al., 2013). Additionally, neuron-specific conditional Mbnl2-KO in the Mbnl1 KO background
leads to cortical neurons defects with significantly enhanced mis-splicing of alternative exons in
the CNS resembling the ones observed in DM1 when compared to single KO (Goodwin et al.,
2015; K. Y. Lee et al., 2019).

While MBNL1 and MBNL2 functions in skeletal muscles and CNS, particularly in the brain, are extensively reviewed, their involvement in the spinal cord and the connected peripheral nervous system remain poorly investigated. Peripheral nerves involvement in DM1 pathophysiology has been open to debate in the last century with the observations of several abnormalities including abnormal endplate size and arborization in DM1 muscle biopsies (Allen et al., 1969; Fardeau & Tomé, 1980; Macdermot, 1961). More recent observations of neuromuscular transmission abnormalities reconsidered their implication suggesting defective axonal transmission (Bombelli et al., 2016; Krishnan & Kiernan, 2006).

Interestingly, spinal cord biopsies obtained from DM1 patients have shown that CUGexp-
RNA colocalize with MBNL proteins in motor neurons (MN), possibly causing MBNL loss-of-
function in this cell type and subsequent peripheral nerves deficiency (Wheeler et al., 2007).
Furthermore, abnormalities of diaphragm neuromuscular junctions (NMJs), including changes in
motor endplate size and shape, have been documented in DMSXL mice (Panaite et al., 2008).
Similarly, defective NMJs structures were observed in tibialis anterior (TA) muscles of MBNL1-/-
; MBNL2+/- mice together with an increase in fragmented endplates (K. Y. Lee et al., 2013).

All these observations emphasize the importance of the motor unit communication in DM1
muscle dysfunction but also raise the question of the function of MBNL proteins in MN and their
role in the motor unit. To assess the role of MBNL1 and MBNL2 in MN and their importance for
muscle homeostasis via NMJs, we generated MN-specific Mbnl2-KO mice in which Mbnl2
expression is selectively ablated from MN with Mbnl1 being constitutively null (Hb9Cre-dKO,
dKO mice : Mbnl1Δ3/Δ3, Mbnl2<sup>cond/cond</sup>, Hb9Cre<sup>+/-</sup>). Adult dKO mice develop coordination deficiencies
when compared to Mbnl1-KO mice, associated with progressive NMJs structural and
ultrastructural defects indicating that MBNL proteins in MN play a role in NMJs maintenance. In
addition, identification of mis-splicing events in the spinal cord of dKO mice of genes involved in
neurotransmission suggests that MBNL proteins could regulate nerve-muscle communication.
Overall, our data propose that MBNL loss of function in MN may contribute to DM1
pathogenesis.
# Results

## MBNL depletion affects locomotion

To investigate the role of MBNL1 and MBNL2 in MN and their importance for muscle homeostasis via NMJs, we generated conditional MN-specific Mbnl2-KO mice in which Mbnl2 expression is selectively ablated from motor neurons (MN), using homeobox gene 9 (Hb9) promoter to drive the expression of the Cre recombinase in spinal motor neurons (Bolis et al., 2005; Cheever et al., 2011; Chipman et al., 2010; Hess et al., 2007; Li et al., 2008; Luria & Laufer, 2007; Mende et al., 2010). We analyzed the consequence of Mbnl2 specific depletion in MN with or without Mbnl1 being constitutively null (Hb9-dKO, dKO: Mbnl1<sup>-/-</sup>: Hb9Cre-Mbnl2<sup>-/-</sup> and Hb9Cre-MBNL2-KO: Mbnl1<sup>+/+</sup>; Hb9Cre-Mbnl2<sup>-/-</sup> mice, respectively) (Fig. 1a).

First, dKO mice are developmentally viable and do not display early post-natal overt phenotype. Also, adult dKO mice show comparable body weight to adult Mbnl1-KO and CTL mice (Mbnl1-KO: Mbnl1<sup>-/-</sup>) (Supp fig. 1a, b). We evaluated the Cre recombinase efficiency in MN by examining MBNL2 protein expression in mice spinal cord. As expected, MBNL1 protein was not observed in any cells of the spinal cord in Mbnl1-KO and dKO mice, while the presence of MBNL2 protein colocalizing with choline acetyltransferase (ChAT)-positive cells is heterogeneous with MBNL2-negative MN and some MBNL2-positive MN in dKO mice suggesting an incomplete Cre recombination (Supp fig. 1c). However, RNAseq analysis from dKO spinal cord confirmed splicing alterations of MBNL2 specific targets (St3gal3, Csnk1d, Dgl2, Tanc2, Cacna1d) identified initially in the brain of MBNL2-KO mice (Charizanis et al., 2012) suggesting an acceptable MBNL2 depletion in MN (Supp table S1).

Quantification of motor neuron viability in 4 months old Mbnl1-KO and dKO mice by Nissl staining in the ventral horn of spinal cord sections do not reveal a significant difference in the number of MN from Mbnl1-KO nor dKO mice compared to CTL mice, indicating that MBNL1 and MBNL2 are not required for MN viability *in vivo* (Supp fig. 1d, e).

While, adult Hb9Cre-Mbnl2-KO mice do not develop overt phenotype and are indistinguishable from CTL mice, Mbnl1-KO and dKO mice develop progressive abnormal motor behavior. As spinal motor neurons are known to handle the coordination of walking muscles, we further characterized motricity and coordination defects and observed impaired rotarod
performances in Mbnl1-KO and dKO mice at 2 and 4 months of age compared to CTL mice
(Supp fig. 1f, g, h, i).

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

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<figure><img src="image_38.png" /></figure>
**Supplementary figure 1: Characterization of Mbnl-KO mice**

(a,b) Body weight of 2 months old and 4 months old CTL, Mbnl1-KO and dKO mice, respectively.

(c) Immunostainings of spinal cord ventral horns from 4 months old CTL, Mbnl1-KO and dKO mice with anti-MBNL1 (red), anti-MBNL2 (green) antibodies and antibody for marker of MN (anti-ChaT, grey). Nuclei are labelled with Hoechst (blue), white squares indicate MN magnify on the upper right corner, Scale bars 100µm and 10µm. (d) Nissl staining of MN in the ventral horn of lumbar spinal cord cryosections from 4 months old CTL, Mbnl1-KO and dKO mice, scale bar 100µm. (e) Quantification of MN per cryosection. At least 200 MN per mouse: n<sub>CTL</sub> = 7; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 6; n<sub>dKO</sub> = 5. (f, h) Rotarod assay represented by latency to fall (second; sec) and (g, i) rotational velocity at the time of falling in 2 months and 4 months old CTL, Hb9Cre-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO and dKO mice respectively. Data are means ± SEM from 2 months old n<sub>CTL</sub> = 10; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 8; n<sub>Hb9Cre-Mbnl2-KO</sub> = 7; n<sub>dKO</sub> = 9 mice and from 4 months old n<sub>CTL</sub> = 8; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 7; n<sub>Hb9Cre-Mbnl2-KO</sub> = 6; n<sub>dKO</sub> = 4 mice. \*p<0.05, \*\*p<0.01, \*\*\*p<0.001, \*\*\*\*p<0.0001. One way ANOVA Tukey's test.

Additional gait analysis confirmed that 2 months and 4 months-old Mbnl1-KO and dKO mice exhibit a reduced mobility with a comparable average speed reduction for both genotypes compared to CTL mice (Fig. 1b, c and fig. 1h, i). Of interest, the coordination pattern of walking was different in 2 months-old dKO mice compared to Mbnl1-KO and CTL mice with a reduced percentage of classical diagonal limbs walking pattern and an increased percentage of other types of walking (three, four limbs and alternative walking patterns) (Fig. 1d and supp videos 1 to 3). Additionally, modifications of footprints are observed with a reduced stride length of the hind legs and front legs in Mbnl1-KO and dKO mice compared to CTL mice, as well as an increase of the distance between the position of the hind paw and the position of the previously placed front paw on the same side of the body (Fig. 1e, f, g). At 4 months of age, motor activity and coordination are aggravated in Mbnl1-KO and dKO mice with comparable deficiencies between the two genotypes compared to CTL mice (Fig. 1h, i, j, k, l, m and supp videos 4 to 6). Thus, MBNL1 loss lead to progressive motor coordination deficiencies with earlier manifestation with additional loss of MBNL2 in MN suggesting that MBNL1 and MBNL2 may regulate processes in spinal MN important for motor coordination.
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 1: Mbnl1 and Mbnl2 simultaneous depletion in MN affects mice locomotion.</figcaption></figure>

(a) Schematic representation of breeding strategy used to deplete specifically Mbnl2 in MN in transgenic mice. Mbnl1+/−; Mbnl2LoxP/LoxP mice were crossed with Mxn1Cre mice (also known as Hb9Cre mice) to generate: Mbnl1+/+; Hb9-Mbnl2+/+ control mice (CTL); Mbnl1−/−; Hb9-Mbnl2−/− dKO mice; Mbnl1−/−; Hb9-Mbnl2+/+ Mbnl1-KO mice and Mbnl1+/+; Hb9-Mbnl2−/− Hb9Cre-Mbnl2-KO mice.

(b-h) Representative trace of footprint analysis for testing gait abnormalities in CTL, Mbnl1-KO and dKO mice at 2 and 4 months of age. (c-g) Quantifications from the gait analyses for 2 months old CTL, Mbnl1-KO and dKO mice. (i-m) Quantifications from the gait analyses for 4 months old CTL, Mbnl1-KO and dKO mice. (c-i) Quantification of average speed in centimeter per
second (cm/sec) (d-j) Proportions of walking patterns, defined by the limbs mice are standing on at the same time during walking. "Others" refers to standing on 3 or 4 limbs, and alternative walking patterns. (e-k) Quantification of stride length of the hindlegs. (f-l) Quantification Stride length of the front legs. (g-m) Quantification of Hind/front paw distance of either ipsilateral combination of paws. Bars indicate Data are means± SEM from 2 months old n<sub>CTL</sub> = 14; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 11; n<sub>dKO</sub> = 8 mice and from 4 months old n<sub>CTL</sub> = 10; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 7; n<sub>dKO</sub> = 4 mice. \*p<0.05, \*\*p<0.01; \*\*\*p<0.001; \*\*\*\*p<0.0001. One-way ANOVA Tukey's test.

## MBNL proteins are involved in NMJs maintenance

To assess the role of MBNL1 and MBNL2 in MN and their importance for NMJs homeostasis, we analyzed the NMJs morphology of isolated TA muscle fibers from 2 and 4 months old Mbnl1-KO, Hb9Cre-Mbnl2-KO and dKO mice and compared with TA from CTL mice. At 2 months of age, NMJs from Hb9Cre-Mbnl2-KO and Mbnl1-KO are innervated and exhibit a typical mature "pretzel-like" shape (Fig. 2a and supp fig. 2a). Quantitative analyses show that acetylcholine receptor (AChR) clusters area, endplate perimeter and post-synaptic fragmentation of NMJs of Hb9Cre-Mbnl2-KO and Mbnl1-KO are similar to CTL mice (Fig. 2b-e, supp fig. 2b-e). Interestingly, NMJs of 2 months-old dKO mice adopt a characteristic "pretzel-like" shape with enlarged AChR clusters area, motor endplate perimeter compared to CTL and Mbnl1-KO mice (Fig. 2b, 2c).

In addition, NMJs post-synaptic structures in TA from dKO mice were discontinuous. Quantitative analysis shows an increase of AChR fragmentation in NMJs of dKO mice compared to CTL and Mbnl1-KO mice (Fig. 2d) with a decrease of 30% of NMJs containing 1 to 3 AChR clusters and an increase of NMJs containing 4 to 6 fragments (Fig. 2e). Despite this deficit, the overlap ratio between presynaptic and post-synaptic markers, connotative of NMJs innervation, remain unchanged in Hb9Cre-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO and dKO mice compared to CTL mice (Fig. 2f and supp fig. 2f). Indeed, the increased size of the postsynaptic compartment is accompanied by a nerve terminal area enlargement in dKO mice compared to CTL, Hb9Cre-Mbnl2-KO and Mbnl1-KO (supp fig. 2g). These observations suggest that loss of MBNL1 and loss of MBNL2 specifically in MN do not impair NMJs innervation nor development (formation and maturation) but additional loss of MBNL2 in MN alters NMJs morphological features.
<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 2: dKO mice exhibit NMJs structural alterations at 2 months of age.</figcaption></figure>

(a) Representative confocal images of isolated muscle fibers from 2 months aged CTL, Mbnl1-KO and dKO TA muscle stained with antibodies to Neurofilament (NF, magenta and Synaptophysin (Syn, magenta) together with α-bungarotoxin (α-BTX, AChR, green), with quantitative analysis (b-f). (b) AChR cluster area. (c) Endplate perimeter. (d) Index of AChR fragmentation. (e) Percentages of NMJs that contain indicated numbers of AChR fragments. (f) Overlap ratio of pre- and post-synaptic AChR clusters area staining. Scale bar, 10μm, data are means ± SEM from nCTL = 4, at least 10 NMJs per mouse; nMbnl1-KO = 3, at least 11 NMJs per mouse; ndKO = 4, at least 10 NMJs per mouse. \*p<0.05, \*\*p<0.01; \*\*\*p<0.001 by One-way ANOVA Dunn's test (b-d); one-way ANOVA Turkey's test (f) Two-way ANOVA Sidak's test (e).
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Supplementary figure 2: NMJS structure from 2 months old Mbn1 mice.</figcaption></figure>

(a) Representative confocal images of TA NMJS from 2 months old CTL and Hb9Cre-Mbn12-KO mice. Neurofilament (NF, magenta) and Synapsin (SYN, magenta) together with a-BTX (AChR, green), scale bar 10µm. (b-e) Quantification of NMJS structural characteristics of TA from 2 months old CTL and Hb9Cre-Mbn12-KO mice. (b) AChR area. (c) Endplate perimeter. (d) Index of AchR fragmentation. (e) Percentages of NMJs that contain indicated numbers of AchR fragments. (f) Overlap ratio of pre- and post-synaptic AchR clusters area staining (e) Overlap ratio of pre- and post-synaptic AchR area (%). (f) NMJS nerve terminal area from TA of 2 months old CTL, Hb9Cre-Mbn12-KO, Mbn1-KO and dKO mice. (g) NMJS nerve terminal area from TA of 2 months old CTL, Hb9Cre-Mbn12-KO, Mbn1-KO and dKO mice.

Data are means ± SEM from n CTL = 4, at least 10 NMJs per mouse; n Mbn1-KO = 3, at least 11 NMJs per mouse; n Hb9Cre-Mbn12-KO = 3, at least 8 NMJs per mouse; n dKO = 4, at least 10 NMJs per mouse.
*p<0.05, **p<0.01; ***p<0.001. One way ANOVA Dunn's test (b-d), one-way ANOVA Tukey's test (f,g), two-way ANOVA Sidak's test (e).

To test whether loss of MBNL proteins is critical for NMJs maintenance, we analyzed NMJs of TA from 4 months old CTL and Mbn1-KO mice. As observed at 2 months of age, NMJs of Hb9Cre-Mbn12-KO mice resemble NMJs of CTL mice (Supp fig. 3a-f).
<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Supplementary figure 3: NMJS structure from 4 months old Mbnl mice,</figcaption></figure>

(a) Representative confocal images of TA NMJS from 4 months old CTL and Hb9Cre-Mbnl2-KO mice. Neurofilament (NF, magenta) and Synapsin (SYN, magenta) together with α-BTX (AChR, green), scale bar 10µm. **b-e)** Quantification of NMJS structural characteristics of TA from 4 months old CTL and Hb9Cre-Mbnl2-KO mice. **b)** AChR area. **c)** Endplate perimeter. **(d)** Index of AchR fragmentation. **(e)** Percentages of NMJs that contain indicated numbers of AchR fragments. **(f)** Overlap ratio of pre- and post-synaptic AchR clusters area staining. **(g)** Overlap ratio of pre- and post-synaptic AchR area (%). **(h)** NMJS nerve terminal area from TA of 4 months old CTL, Hb9Cre-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO and dKO mice. **(i)** Transmission electron microscopy of
TA NMJS from 4 months old dKO mouse. The synaptic button is colored in purple and terminal schwann cells in yellow. Data are means ± SEM from n<sub>CTL</sub> = 4, at least 9 NMJs per mouse; n<sub>Hb9Cre-Mbnl2-KO</sub> = 7, at least 9 NMJs per mouse; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 7, at least 13 NMJs per mouse; n<sub>dKO</sub> = 6, at least 9 NMJs per mouse. \*p<0.05, \*\*p<0.01; \*\*\*p<0.001. One-way ANOVA Dunn's test (b-d,g) and two-way ANOVA Sidak's test (e).

However, AChR clusters of Mbnl1-KO and dKO mice are larger with increased AchR clusters area and endplate perimeter (Fig. 3a, b, c). In addition, TA muscle NMJs of Mbnl1-KO and dKO mice exhibit AchR fragmentations with a decrease of 40% of NMJs containing 1 to 3 fragments and appearance of more than 30% of NMJs containing 7 fragments and more compared to CTL mice (Fig. 3d, e). These deficits are associated with reduced pre- and post-synaptic overlap ratio in Mbnl1-KO and dKO mice without any modification of the nerve terminal area compared to CTL mice (Fig. 3f and supp fig. 3g). Of interest, solely NMJs of dKO mice exhibit abnormal nerve terminal sprouts without any colocalization with AChR clusters (Fig. 3a arrow, g) suggesting the occurrence of synaptic plasticity changes that might come from MN.

Transmission electron microscopy (TEM) of NMJs of 4 months old mice further support these hypotheses. Indeed, in Mbnl1-KO mice, ultra-structural abnormalities are restricted to the post-synaptic area of NMJs with enlarged synaptic gutters, irregularly shaped crests and presence of degenerative structures while NMJs of dKO mice do not only reproduce post-synaptic alterations seen in Mbnl1-KO mice but also develop presynaptic defects as the presence of degenerative structures inside the presynaptic button and partial denervation (Fig. 3h). The occurrence of synaptic remodeling is also suggested by the presence of non-myelinating terminal Schwann cells (tSC) at the synaptic cleft of dKO mice NMJs (Supp fig. 3h). Thus, the global aggravation of NMJs structure between 2 and 4 months of age in Mbnl1-KO and dKO mice indicates a role of MBNL1 and MBNL2 in NMJs maintenance.
<figure><img src="image_43.png" /></figure>

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Synaptic buttons are colored in purple, black squares focus on a synapse magnify on the right. Degenerative structures (arrows). Scale bars 2 and 1 µm.

data are means ± SEM from n<sub>CTL</sub> = 4, at least 9 NMJs per mouse; n<sub>Mbnl1-KO</sub> = 7, at least 13 NMJs per mouse; n<sub>dKO</sub> = 6, at least 9 NMJs per mouse. \*p<0.05, \*\*p<0.01; \*\*\*p<0.001. One way ANOVA Dunn's test (b, c, d); Two-way Anova, Sidak's test (e); one way ANOVA Tukey's test (f,g).

The specific presynaptic modifications of NMJs detected in dKO mice suggest that combined loss of MBNL1 and MBNL2 in MN may be deleterious to signals transmission from nerve to muscle. As 4 months-old Mbnl1-KO and dKO mice exhibit severe NMJs structure abnormalities, we next examined TA muscle function. *In situ* force measurements confirmed the presence of myotonia and reduced specific maximal tetanic muscle force in Mbnl1-KO mice compared to CTL as previously reported (Choi et al., 2015; Kanadia et al., 2003), but additional loss of MBNL2 in MN do not worsen specific maximal tetanic muscle strength neither modify myotonia (Supp fig. 4a, b). To study neuromuscular transmission, we performed repetitive nerve stimulation of the sciatic nerve and recorded the compound muscle action potential (CMAP) of TA muscle, representative of muscle electrical response to stimuli. CMAP amplitude from CTL and Mbnl1-KO mice do not decrement with stimuli, and dKO mice show a high variability of response but no statistically significant compared to Mbnl1-KO and CTL mice (Supp Fig. 4c). These data, suggest that additional loss of MBNL2 in MN and subsequent NMJ structures modifications, is not sufficient to worsen Mbnl1-KO muscle pathology. However, the presence of pre-synaptic structural and ultrastructural abnormalities solely in NMJs of dKO mice suggest that MBNL proteins in MN may regulate fine processes involved in nerve to muscle communication.

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Supplementary figure 4: Absence of nerve-evoked tetanic force and CMAP modifications in the TA muscle of Mbnl1-KO and dKO mice.</figcaption></figure>

(a) *in situ* measurement of myotonia (g.s). (b) Quantitative analysis of nerve-evoked absolute specific muscle forces (g/mg of muscle). (c) Quantification of amplitude of 10 CMAPs, expressed
as percentage of the first, at 5Hz. Data are means ± SEM from (a, b) $n_{CTL} = 14$; $n_{Mbnl1-KO} = 12$; $n_{dKO} = 8$. (b-c) $n_{CTL} = 14$; $n_{Mbnl1-KO} = 11$; $n_{dKO} = 8$. (c) $n_{CTL} = 8$; $n_{Mbnl1-KO} = 6$; $n_{dKO} = 3$ mice. \*p<0.05, \*\*p<0.01; \*\*\*p<0.001; \*\*\*\*p<0.0001. One-way ANOVA Tukey's test (a, b) and Two-way ANOVA Dunnett's test (c).

## MBNL proteins in MN regulate the alternative splicing of RNA involved in synaptic neurotransmission

To explore the molecular consequences of MBNL1 and MBNL2 loss in MN and the impact of MBNL deficiency on spinal cord pre-mRNA processing, we performed high-throughput RNA sequencing using total RNA isolated from lumbar spinal cord from Mbnl-KO and CTL 4 months old mice (n=4 per condition) (Supp table S2-4). Comparison of RNA from spinal cord of dKO and CTL mice revealed 1017 differential alternative splicing events (DSE), affecting 815 unique genes (FDR corrected p<0.05, ΔPSI > 10%), with a majority of skipped exons (SE) events (68,9%) (Fig. 4a). As expected for cell-type conditional KO model, a majority of DSE (65%) are comprised between 10 and 20% with a median 17% ΔPSI value.

Hierarchical clustering revealed that spinal cord of dKO mice have a distinct RNA splicing profile compared to CTL, Mbnl1-KO and HB9Cre-Mbnl2-KO mice (Supp fig. 5a). Unbiased gene ontology (GO) biological process analysis of these 1017 differentially alternative spliced RNA showed top categories involved in microtubule cytoskeleton organization, NMJs development and neurotransmitter exocytosis suggesting the role of MBNL proteins in these processes (Fig. 4b).

To determine the contribution of MBNL1 and MBNL2 loss to DSE observed in dKO mice, we compared them to DSE in Mbnl1-KO and Hb9Cre-MBNL2 KO (compared to CTL) mice followed by GO biological process analysis (Fig. 4c). Interestingly, GO top categories from DSE common to Mbnl1-KO and dKO mice refer to synaptic vesicle budding, and endocytosis while GO analysis from DSE common to Hb9Cre-Mbnl2-KO and dKO mice show enriched pathways in neurotransmitter transport and secretion, and protein localization to synapse. DSE and GO analysis outlined already documented MBNL1 RNA targets in the CNS, including Clasp1 exon 26, Clasp2 ex16, Dnm2 exon 10, Mapt exon 2/3, as well as MBNL2 RNA targets including Tanc2 ex23a, st3gal3 ex3, Csnk1d ex9 and Dlg2 ex17b (Fig. 4d). To support computational analysis, we performed RT-PCR assay on CTL and dKO lumbar spinal cord RNA and confirmed significant changes of Clasp1, Cacna1d and others (Supp fig. 5b).
Among splicing defects relative to MN synaptic neurotransmission and associated to NMJs, we noticed an aberrant inclusion of Dvl1 39 bp exon 14b only in spinal cord from dKO mice (Fig. 4e). We validated this observation by RT-PCR and confirmed a significant increased inclusion of this 39 bp exon only in dKO mice (Fig. 4f). To determine if alternative splicing of Dvl1 exon 14b is regulated by MBNL2, we verified its inclusion rate in publicly available RNAseq data from brains of WT and Mbnl2-KO mice (Charizanis et al., 2012).
<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>a</figcaption></figure>

FDR corrected p < 0.05
ΔΨ > 0.1

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>c</figcaption></figure>

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>d</figcaption></figure>

<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>e</figcaption></figure>

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>f</figcaption></figure>

<figure><img src="image_63.png" /></figure>
<caption>**Figure 4: Alternative splicing changes in spinal cord from 4 months old dKO mice**</caption>

(a) Pie chart represents the proportion of significant differential alternative splicing (DSE) (ΔΨ > 10% - FDR < 0,05) in 4 months old dKO mice compared to CTL mice and categorized as as skipped exons (SE), alternative 5' and 3' splice sites (A5SS and A3SS), mutually exclusive exons (MXE) and retained introns (RI).

(b) Unbiased gene ontology (GO) top biological processes involved by the DSE identified in dKO mice when compared to CTL mice.

(c) Venn diagram of the number of unique genes affected in Hb9Cre-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO and dKO mice when compared to CTL mice (left). The top 10 unbiased GO biological processes of genes common between dKO and Mbnl1-KO mice or Hb9Cre-Mbnl2-KO mice are shown on the right with their corresponding p-values.

(d) Heatmap show selected DSE changed in dKO mice compared to CTL mice.

(e) Sashimi plot for Dvl1 ex14b in CTL and dKO mice.

(f) Representative RT-PCR splicing analysis of Dvl1 ex14b from CTL (n=3), Mbnl1-KO (n=3), Hb9Cre-Mbnl2-KO (n=2) and dKO mice (n=3) with PSI quantification.
<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Supplementary figure 5: Spinal cord DSE characterization from 4 months-old Mbnl mice</figcaption></figure>

(a) Heatmap representing Pearson's tau rank correlation from all differential splicing events (DSE) observed in 4 months-old dKO compared to CTL mice (ΔΨ >10%; FDR<0,05,) and compared to Mbnl1-KO and Hb9Cre-MBNL2 profile for the same DSE. (b) RT-PCR analysis validation of DSE found by RNAseq in spinal cord from Mbnl mice.
As observed in lumbar spinal cord from dKO mouse, Dvl1 exon 14b is aberrantly included in brain hippocampi from Mbnl2-KO mice indicating its possible regulation by MBNL2 in mouse CNS (Supp Fig. 6a). Of interest, the sequence corresponding to Dvl1 exon 14b in mouse is highly conserved among species: 92,4% of homology between mouse and human (where it is not annotated as an exon but present in intron 14) (Supp fig. 6b). As MBNL loss of function is a major contributor to DM1 pathology, we asked whether DVL1 mis-splicing occurs in DM1 CNS. For this purpose, we verified its inclusion rate in publicly available RNAseq data from brain cortex samples from Control and DM1 patients (Goodwin et al., 2015) and confirmed the aberrant inclusion of Dvl1 exon 14b (39bp) in DM1 CNS (Supp fig. 6c) suggesting that Dvl1 mis-splicing showed in spinal cord from dKO mice could also be involved in CNS from DM1 patients.

a

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_66.png" /></figure>

c

<figure><img src="image_67.png" /></figure>
**Supplementary figure 6: Computational analysis of Dvl1 ex 14b alternative splicing in brains from Mbnl2-KO and DM1 patients**

(a,c) Genome browser view of RNA-seq generated from brains from Mbnl2-KO mice and DM1 patients brain samples, publicly available from Charizanis et al., 2012, Goodwin et al., 2015 and from Dr. Nicolas Sergeant. (b) DVL1 exon 14b conservation across species.

Altogether, our data show that MBNL1 and MBNL2 regulate alternative RNA splicing in mouse spinal cord and may regulate different process in MN to fine-tune synaptic transmission through the NMJs to the skeletal muscle.

**Discussion**

Our data reveal the implication of MBNL1 and MBNL2 proteins in the maintenance of NMJs and suggest a role for these two proteins in regulating the synaptic transmission from MN to skeletal muscle. MBNL proteins function in the CNS has been extensively studied, with a major role of MBNL2 in neuronal cells (Charizanis et al., 2012; Goodwin et al., 2015). Our RNA splicing analysis performed on spinal cord from dKO mice have shown that MBNL1 and MBNL2 act as regulators in MN for neurotransmission by targeting transcripts involved in synaptic vesicle homeostasis (budding, recycling), neurotransmitter release and protein localization to synapse confirming the importance of MBNL proteins for NMJs function. Among DSE identified in spinal cord from dKO mice, we noticed a number of mis-splicing events already reported in the CNS of MBNL KO mice (Charizanis et al., 2012; Goodwin et al., 2015; Suenaga et al., 2012) suggesting that CNS pre-mRNA regulation of MBNL1 and MBNL2 demonstrated in the brain also occurs in the spinal cord and that similar neuronal regulating pathways could be transposed from brain neurons to MN.

We also reported new transcripts differentially spliced with the loss of MBNL proteins and identified Dvl1 39 bp ex14b mis-splicing in spinal cord from dKO mice. Dvl1 is coding for dishvelled segment polarity protein 1, key player in Wnt/PCP signaling participating to NMJs maintenance through MN (Shafer et al., 2011; Shen et al., 2018; W. Wang et al., 2015). The molecular and physiological consequences of Dvl1 ex14b aberrant inclusion in spinal cord remain to be determined. However, as its inclusion produces a premature stop codon, it might lead to the degradation of the transcript through nonsense-mediated mRNA decay (NMD) leading to a
decreased expression of DVL1 protein, as previously reported in DM1 pathology for C1cn1
(Charlet-B. et al., 2002).

While MBNL proteins in MN seem to regulate numbers of RNA splicings, we showed that combined loss of MBNL1 and MBNL2 do not impact MN cells survival and muscle innervation but alter NMJs maintenance rather than development. However, appearance of moderate NMJs fragmentation at 2 months of age in dKO mice may indicate premature impairment during early maintenance. Additionally, NMJs from Mbnl1-KO and dKO mice showed progressive and severe AChR clusters fragmentation in 4 months old Mbnl1-KO and dKO mice. Origins of these NMJs fragmentations remain unclear as MBNL1 is depleted from MN and muscle in Mbnl1-KO and dKO mice. NMJs fragmentation has been associated with massive skeletal muscle degeneration and regeneration as observed in dystrophin-deficient *mdx* mice (Pratt et al., 2013, 2014, 2015). However, despite the presence of a subset of muscle fibres with centronuclei, Mbnl1-KO mice do not exhibit overt muscle regeneration (Kanadia et al., 2003; K. Y. Lee et al., 2013).

MBNL1 is highly expressed in muscle tissues and colocalizes with CUGexp in the nuclei of DM1 muscle cells, including subsynaptic nuclei (Wheeler et al., 2007). Of interest, alternative splicing changes of transcripts coding for post-synaptic NMJs proteins such as CHRNG and MUSK have been reported in myoblastic primary culture from human embryonic muscle tissues carrying large CTG repeats (Klinck et al., 2014) indicating the possible contribution of CUGexp and MBNL1 loss in skeletal muscle to NMJ homeostasis defects. Observations of ultrastructural abnormalities in the post-synaptic compartment of 4 months old Mbnl1-KO and dKO mice further support MBNL1 muscle contribution to NMJs defects. However, the presence of nerve terminal sprouts and degenerative structures in the synaptic button has only been observed in dKO mice indicating that additional loss of MBNL2 in MN has an impact at the presynaptic level. This hypothesis is strengthened by mbl-1 deficient C. elegans (MBNL orthologue) which exhibit NMJs defects rescued by mbl-transgene expression in presynaptic neurons only and not in muscles (Spilker et al., 2012). Lastly, although NMJs fragmentation and terminal nerve sprouting could be interpreted as degeneration markers of the NMJs in rodent, it has been proposed to represent an outcome of active repair process helping to maintain the efficiency of neuromuscular transmission (Slater, 2020).

Titration of MBNL proteins by CUGexp-RNA plays a pivotal role in DM1 pathogenesis and most of DM1 splicing abnormalities are attributable to MBNL loss-of-function (Nakamori et al., 2013). CUGexp foci that colocalize with MBNL1 have been found in DM1 motor neurons
(Wheeler et al., 2007) and electron microscopy analysis showed modifications of motor endplates size, NMJs shape as well as neurotransmission defects in affected muscles of DM1 patients (Allen et al., 1969; Bombelli et al., 2016; Fardeau & Tomé, 1980; Kanning et al., 2010; Macdermot, 1961). Loss of MBNL proteins, and notably loss of MBNL2, in mice have recapitulated DM1 neurological features associated with similar splicing abnormalities (Charizanis et al., 2012; Goodwin et al., 2015). Of interest, some alternative splicing abnormalities found in spinal cord of dKO mice, such as MAPT, SORBS1 and TANC2 have been previously reported in brain from DM1 patients (Caillet-Boudin et al., 2014; Dhaenens et al., 2011; Jiang et al., 2004; Sergeant et al., 2001; Suenaga et al., 2012) as well as brain from DMSXL mice (Dinca et al., 2022; Hernández-Hernández et al., 2013), and associated with DM1 patients CNS defects suggesting that RNA modifications described in DM1 brain may also occur in DM1 spinal cord and contribute to DM1 pathogenesis.

In conclusion, our results demonstrate the contribution of MBNL1 and MBNL2 in motor unit homeostasis and provide new insights to a better understanding of motor unit involvement in DM1 disease. This work also opens new avenues for the care of DM1 patients and most importantly, for further clinical trials.

## Material and methods

### Antibodies

Rabbit monoclonal anti-synaptophysin (Syn) (Invitrogen, 1/200), polyclonal anti-neurofilament (NF) 68 kDa (Millipore Bioscience Research Reagents, 1/500), α-BTX Alexa Fluor 488 conjugate (1/500) were purchased from Invitrogen. Spinal cord immunofluorescences were performed with polyclonal anti-MBNL1 antibody (A2764, gift from C. A. Thornton, 1/1000), monoclonal anti-MBNL2 antibody (3B4, Santa Cruz, 1/300) and anti-ChAT antibody (AB144P, Millipore, 1/50).

### Generation of Hb9-Cre-dKO conditional knock mice

Mbnl1$^{+/-}$:Mbnl2$^{LoxP/LoxP}$ mice (obtained from Dr. Swanson, USA; K. Y. Lee et al., 2013) have been crossed with transgenic mice expressing a Cre Recombinase under a MN-specific Hb9 promoter (B6.129S1-Mnx1$^{tm4(cre)Tmj}$/J; Stock #006600, Jackson Labs, Bar Harbor, ME) to generate Hb9-Cre DKO mice (Mbnl1$\Delta$E3/ΔE3, Mbnl2c/c; Hb9-Cre$^{+/-}$), Hb9Cre-Mbnl2 KO mice (Mbnl1$^{+/+}$, Mbnl2c/c; Hb9Cre$^{+/-}$), Mbnl1-KO mice (Mbnl1$\Delta$E3/ΔE3, Mbnl2c/c; Hb9Cre$^{-/-}$) and CTL mice (Mbnl1$^{+/+}$; Mbnl2$^{+/-}$; Hb9-Cre$^{-/-}$).
## Animal procedures

All mouse procedures were done according to the protocols APAFIS#22706-2019110616459523 v5; APAFIS#22758_2019111316521357v8 and APAFIS#22871-2019112115405462v4 approved by the Ethical Committee on Animal Resources at the Centre Experimentation Fonctionnelle of Pitié-Salpétrière animal facility and under appropriate biological containment. Briefly, mice were maintained in a conventional specific-pathogen-free facility with a fixed light cycle (22°C, 12-hour dark-light cycle). Mice have been analyzed for motor function at 2 and 4 months of age by accelerating rotarod and gait analysis using Catwalt XT device.

## Accelerating rotarod

Rotarod testing was performed on 2- and 4-months old mice using LE8200 apparatus (Harvard Apparatus). An accelerating rotarod protocol 4 to 40 rpm over 5 min was used. Mice's latency to fall was recorded as the mean latency of the three consecutive trials and data are reported ± SEM.

## Gait analysis

Gait analysis was performed using The CatWalk™. For data collection, six runs per animal were performed with a minimum of three runs crossed at the same speed with 3-full step sequence patterns. Quantitative analysis of the data included the following parameters: Step sequence, average speed, walking pattern, stride length, Stand duration, hind-front paw distance.

## In situ isometric force analysis

*In situ* isometric contraction of the TA muscle was performed as described previously (Delacroix et al., 2018). Mice were anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (50 mg/kg body weight). A blind analysis was performed by the investigator. The knee and foot were fixed with clamps and the distal tendon of the TA muscle was attached using a silk ligature to a force sensor (305B, Dual-Mode Lever, Aurora Scientific). The sciatic nerve was proximally crushed and distally stimulated by a bipolar silver electrode using supramaximal square wave pulses of 0.1 ms duration. Muscle was also directly stimulated in order to initiate muscle contraction in the case of neurotransmission failure. Force that was developed during isometric muscle contractions in response to nerve or muscle tetanic stimulation (frequency of 100Hz, train of stimulation of 500 ms) was then measured. The maximal absolute force was determined at optimal length (ie., length at which supramaximal tension was obtained during the tetanus). Signals from the force sensor were amplified and digitized with a computer equipped with an analogue-to-digital interface board
(BioAmp, ADInstruments) using LabChart 8 software (ADInstruments). Myotonia was quantified
as the area beneath the curve of muscle force decaying over time after stimulation.

Repetitive sciatic nerve stimulation electromyography

Repetitive sciatic nerve stimulation electromyography of the muscle TA was performed as described previously (Boëx et al., 2022). Briefly, two monopolar reference and recording electrodes were inserted, one close to the patella tendon and the other in the middle of the TA muscle. A monopolar ground electrode was also inserted into the contralateral hindlimb muscle. The sciatic nerve was stimulated with series of 10 stimuli at 5Hz. CMAPs were amplified (BioAmp, ADInstruments), acquired with a sampling rate of 100 kHz, and filtered with a 5-kHz low-pass filter and a 1-Hz high-pass filter (PowerLab 4/25, ADInstruments), and peak-to-peak amplitudes were analyzed with LabChart 8 software (ADInstruments). During all experiments, mouse body temperature was maintained at 37°C with radiant heat. After recordings, the mice were euthanized by cervical dislocation and the muscles were collected.

RNA extraction & RNA seq

Total RNAs from 4 months old mice lumbar spinal cord were isolated using TRI-Reagent
according to the manufacturer's protocol and tissue were lysed using Fastprep system and Lysing
Matrix D tubes (MP biomedicals). For mouse samples, total stranded RNA-seq was performed at
the Platform of the Institut du Cerveau. RNA quality control of each sample was realised
with Tapestation 2200 (Agilent) and libraries were prepared with the KAPA
mRNA hyperprep ROCHE kit, from an input of 250ng. Sequencing was performed on an Illumina
NovaSeq 6000 as paired-end 150 bp reads using flowcells SP-300. RNA-seq reads were trimmed
using Cutadapt(v2.10) and aligned with STAR (v2.7.5a). The reference genomes used for the
alignment are mm10. Quantification of transcripts followed with HTSeq(v0.12.4). All the
steps where built in a Nextflow(v20.04.1). Differential alternative splicing was detected
by rMATS(v4.1.2), based on the STAR-aligned files (.bam). Detection of events was done with a
'prep' step of each pair of conditions (CTL-vs-dKO, CTL-vs-Mbnl1-KO, CTL vs Hb9Cre-
MBNL2-KO), a 'post' step of all conditions together and finally a 'stats' step of each pair of
conditions to define *pvalue*, *false discovery rate* (FDR) and *IncLevelDifference* for each comparison. GO
terms and biological pathways enrichment analysis was done using the EnrichR (GO Biological
process 2021) (Supp table S5-7).
## Reverse transcription PCR (RT-PCR)

200 ng RNA was reverse transcribed using SuperScriptIV™ first-strand synthesis system (Life Technologies) in a total of 20 µl. 0,5 microliter of complementary DNA preparation was subsequently used in a semi-quantitative PCR analysis according to standard protocol (ReddyMix, ThermoFisher). PCR amplification was carried out for 0-35 cycles for splicing of pre-mRNA within the linear range of amplification for each gene. PCR products were quantified using the QIAxcel Advanced system (Qiagen). Tanc2 ex 23a and Cacna1d ex 12a primers were as described by (Charizanis et al., 2012), Clasp1 ex26 was described by (Dinca et al., 2022). Dvl1 ex 14b primers: ex13FW (CTTACCAGGACCCTGGCTTC) and ex15REV (TGATTCACTGCCACTACCCC).

## NMJS staining from isolated muscle fiber

TA muscle fibers from adult 2- and 4-months old mice were dissected and fixed with 4% PFA in PBS for 30 min at 4°C and rinsed with PBS at room temperature. Isolated muscle fibers were then staining as described previously (Messéant et al., 2015). Briefly, isolated muscle fibers were washed three times for 15 min in PBS, incubated for 15 min with 100 µm glycine in PBS, permeabilized (0.5% Triton X-100 in PBS) for 1 h and blocked for 4 h in blocking buffer (3% BSA, 5% goat serum and 0.5% Triton X-100 in PBS). Isolated muscle fibers were incubated overnight at 4°C with rabbit polyclonal antibodies against NF and Syn in blocking solution. After three washes in PBS, muscles were incubated overnight at 4°C with Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488-conjugated α-BTX in blocking solution. After three washes in PBS, isolated muscle fibers were flat-mounted in Vectashield (Vector Laboratories) mounting medium. Images were collected with Zeiss LSM880 confocal microscope and processed through a semi-automatic ImageJ macro adapted from NMJS-morph (Jones et al., 2016).

## Spinal cord Nissl staining

Anesthetized mice were transcardially perfused with phosphate buffered saline (PBS), followed by 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffer for fixation. spinal cords were post-fixed in 4% PFA overnight, cryoprotected in 30% sucrose for over 24 hr and embedded in Tissue-Tek before storage at -80°C. 14µm transversal cryosections of lumbar spinal cords were mounted on slides, air dried for 30 minutes and stored at -80°C until staining. Slides were air dried for 30 minutes then rinsed in 70% ethanol for 1 minute, stained with cresyl violet (0,05% glacial acid acetic, 0,05% cresyl violet in distilled water) for 15 minutes then quickly rinsed in several ethanol baths: 70%, 70%, 90% and 100% before dehydration with xylene for 1 minute. Sections were covered in DPX mounting medium then coverslipped before drying overnight.
## Spinal cord immunostaining

MN immunostaining was adapted from (Besse et al., 2020). After air drying for 30 minutes, slides with transversal cryosections of lumbar spinal cords were permeabilized for 30 minutes (0.1% Triton X-100 in PBS). Then, we performed an unmasking procedure using 85°C heated citric acid monohydrate (10mM, pH6), incubating slides in it twice for 5 minutes. Sections were then cooled in cold PBS. Sections were then washed using the following procedure, repeated along the experiment: twice in PBS for 5 minutes then in 0.1% Triton X-100 in PBS for 2 minutes and once again in PBS for 5 minutes. Sections were isolated using Dako pen. Sections were blocked for 1 hour in blocking buffer (4% BSA, 10% donkey serum and 0.1% Triton X-100 in PBS) then incubated with anti-MBNL1, anti-MBNL2 and anti-ChAT antibodies overnight at 4°C in the blocking solution. Sections were washed, incubated 1 hour at room temperature with Alexa fluor Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG and Alexa Fluor 647 donkey anti-goat IgG in 0.1% Triton X-100 in PBS. Finally, sections were washed, incubated with Hoechst (1/2500 in PBS) for 10 minutes, washed twice with PBS and flat-mounted in Vectashield (Vector Laboratories) mounting medium. Images were taken using a Nikon Ti2 confocal microscope with a SCU-W1 spinning disk head (Yokogawa).

## MET

Mouse anterior tibialis were fixed for 2 with 2% paraformaldehyde, 2% glutaraldehyde in 0.1M phosphate buffer (pH 7.4). Samples were postfixed with 2% OsO4, in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) for 1 h, then dehydrated in a graded series of acetone including a 1% uranyl acetate staining step in 70% acetone, and finally embedded in epoxy resin (EMBed-812, Electron Microscopy Sciences, USA). Ultra-thin (70 nm) sections were stained with uranyl acetate and lead citrate. examined using a CM100 Philips transmission electron microscope and photographied with a digital SIS Morada camera.

## Statistical analysis

All statistical analyses were performed using the GraphPad Prism software (Version 8, GraphPad Software Inc.). Data distribution was assessed by the Shapiro-Wilk test prior to the use of one-way ANOVA analyses of variance as appropriate.

**Acknowledgments:** This work was supported by grants from ANR (Agence National de la Recherche, "motor-DM" project to F.R), AFM (Association Francaise contre les Myopathies) and Association Institut de Myologie. CFR was supported by the Fondation pour la Recherche
Médicale (FRM). We thank Pr. M. Swanson for Mbnl1$^{Δ3/Δ3}$; Mbnl2$^{c/c}$ mouse model. Holt and G. Morris (CIND, RJAH Orthopeadic Hospital, UK) as well as “The Muscular Dystrophy Association Monoclonal Antibody Resource” for the MBNL2 antibody, C. Thornton for the MBNL1 polyclonal antibody, the iGenSeq facility and Data analysis core of the Institut du Cerveau (Paris, France).

**Author contributions:** C.F.R., S.C., J.L. L.A. X.L. conducted most of the experiments. M.H. and J.M contributed to semi-automated NMJs analysis, M.L. conducted animal procedures, L.S. provided resources for NMJs analysis. M.S. provided Mbnl conditional mouse model. D.F. and F.R supervised the project and wrote the manuscript.

**Competing interests:** The authors declare no conflicts of interest.

## References

Allen, D. E., Johnson, A. G., & Woolf, A. L. (1969). The intramuscular nerve endings in dystrophia myotonica--a biopsy study by vital staining and electron microscopy. *Journal of Anatomy*, **105**(Pt 1), 1-26. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1232086/pdf/janat00396-0008.pdf

Batra, R., Charizanis, K., Manchanda, M., Mohan, A., Li, M., Finn, D. J., Goodwin, M., Zhang, C., Sobczak, K., Thornton, C. A., & Swanson, M. S. (2014). Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease. *Molecular Cell*, **56**(2), 311-322. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.08.027

Besse, A., Astord, S., Marais, T., Roda, M., Giroux, B., Lejeune, F. X., Relaix, F., Smeriglio, P., Barkats, M., & Biferi, M. G. (2020). AAV9-Mediated Expression of SMN Restricted to Neurons Does Not Rescue the Spinal Muscular Atrophy Phenotype in Mice. *Molecular Therapy*, **28**(8), 1887-1901. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2020.05.011

Boëx, M., Cottin, S., Halliez, M., Bauché, S., Buon, C., Sans, N., Montcouquiol, M., Molgó, J., Amar, M., Ferry, A., Lemaitre, M., Rouche, A., Langui, D., Baskaran, A., Fontaine, B., Messéant, J., & Strochlic, L. (2022). The cell polarity protein Vangl2 in the muscle shapes the neuromuscular synapse by binding to and regulating the tyrosine kinase MuSK. *Science Signaling*, **15**(734). https://doi.org/10.1126/scisignal.abg4982

Bolis, A., Coviello, S., Bussini, S., Dina, G., Pardini, C., Previtali, S. C., Malaguti, M., Morana, P., Del Carro, U., Feltri, M. L., Quattrini, A., Wrabetz, L., & Bolino, A. (2005). Loss of Mtmr2 phosphatase in Schwann cells but not in motor neurons causes Charcot-Marie-Tooth type 4B1 neuropathy with myelin outfoldings. *Journal of Neuroscience*, **25**(37), 8567-8577. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2493-05.2005

Bombelli, F., Lispi, L., Porrini, S. C., Giacanelli, M., Terracciano, C., Massa, R., & Petrucci, A. (2016). Neuromuscular transmission abnormalities in myotonic dystrophy type 1: A neurophysiological study. *Clinical Neurology and Neurosurgery*, **15**, 84-88. https://doi.org/10.1016/j.clineuro.2016.08.020
Brook, J. D., McCurrach, M. E., Harley, H. G., Buckler, A. J., Church, D., Aburatani, H., Hunter, K., Stanton, V. P., Thirion, J. P., Hudson, T., Sohn, R., Zemelman, B., Snell, R. G., Rundle, S. A., Crow, S., Davies, J., Shelbourne, P., Buxton, J., Jones, C., ... Housman, D. E. (1992). Molecular basis of myotonic dystrophy: Expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. *Cell*, **68**(4), 799-808.
https://doi.org/10.1016/0092-8674(92)90154-5

Caillet-Boudin, M. L., Fernandez-Gomez, F. J., Tran, H., Dhaenens, C. M., Buee, L., & Sergeant, N. (2014). Brain pathology in myotonic dystrophy: When tauopathy meets spliceopathy and RNAopathy. In *Frontiers in Molecular Neuroscience* (Vol. 6, Issue JAN, p. 57). Frontiers Media SA. https://doi.org/10.3389/fnmol.2013.00057

Charizanis, K., Lee, K. Y., Batra, R., Goodwin, M., Zhang, C., Yuan, Y., Shiue, L., Cline, M., Scotti, M. M., Xia, G., Kumar, A., Ashizawa, T., Clark, H. B., Kimura, T., Takahashi, M. P., Fujimura, H., Jinnai, K., Yoshikawa, H., Gomes-Pereira, M., ... Swanson, M. S. (2012). Muscleblind-like 2-Mediated Alternative Splicing in the Developing Brain and Dysregulation in Myotonic Dystrophy. *Neuron*, **75**(3), 437-450. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.05.029

Charlet-B., N., Savkur, R. S., Singh, G., Philips, A. V., Grice, E. A., & Cooper, T. A. (2002). Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. *Molecular Cell*, **10**(1), 45-53. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(02)00572-5

Cheever, T. R., Olson, E. A., & Ervasti, J. M. (2011). Axonal regeneration and neuronal function are preserved in motor neurons lacking β-actin. *In Vivo*. *PLoS ONE*, **6**(3), e17768.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0017768

Chipman, P. H., Franz, C. K., Nelson, A., Schachner, M., & Rafuse, V. F. (2010). Neural cell adhesion molecule is required for stability of reinnervated neuromuscular junctions. *European Journal of Neuroscience*, **31**(2), 238-249. https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.2009.07049.x

Choi, J., Personius, K. E., DiFranco, M., Dansithong, W., Yu, C., Srivastava, S., Dixon, D. M., Bhatt, D. B., Comai, L., Vergara, J. L., & Reddy, S. (2015). Muscleblind-Like 1 and Muscleblind-Like 3 Depletion Synergistically Enhances Myotonia by Altering Clc-1 RNA Translation. *EBioMedicine*, **2**(9), 1034-1047. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2015.07.028

Delacroix, C., Hyzewicz, J., Lemaitre, M., Friguet, B., Li, Z., Klein, A., Furling, D., Agbulut, O., & Ferry, A. (2018). Improvement of Dystrophic Muscle Fragility by Short-Term Voluntary Exercise through Activation of Calcineurin Pathway in mdx Mice. *American Journal of Pathology*, **188**(11), 2662-2673. https://doi.org/10.1016/j.ajpath.2018.07.015

Dhaenens, C. M., Tran, H., Frandemiche, M. L., Carpentier, C., Schraen-Maschke, S., Sistiaga, A., Goicoechea, M., Eddarkaoui, S., Van Brussels, E., Obriot, H., Labudeck, A., Gevaert, M. H., Fernandez-Gomez, F., Charlet-Berguerand, N., Deramecourt, V., Maurage, C. A., Buée, L., de Munain, A. L., Sablonnière, B., ... Sergeant, N. (2011). Mis-splicing of Tau exon 10 in myotonic dystrophy type 1 is reproduced by overexpression of CELF2 but not by MBNL1 silencing. *Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease*, **1812**(7), 732-742.
https://doi.org/10.1016/j.bbadis.2011.03.010

Dinca, D. M., Lallemant, L., González-Barriga, A., Cresto, N., Sicot, G., Pillet, L.-E., Polveche, H., Magneron, P., Huguet-Lachon, A., Benyamine, H., Azotla-Vilchis, C. N., Agonizantes-Juárez, L. E., Tahraoui-Bories, J., Martinat, C., Hernández-Hernández, O., Auboeuf, D., Rouach, N., Bourgeois, C. F., Gourdon, G., & Gomes-Pereira, M. (2022). Myotonic dystrophy RNA toxicity alters morphology, adhesion and migration of mouse and human astrocytes. *Research Square Preprints*, 10.21203/RS.3.RS-137333/V1. https://doi.org/10.1038/s41467-022-31594-9

Fardeau, M., & Tomé, F. (1980). Light and electron microscopic study of motor endplates in the
adult and neonatal forms of dystrophia myotonica. In Elsevier/North-Holland Biomedical Press (Ed.), *Ontogenesis and functional mechanisms of peripheral synapses* (pp. 287–298).

Freyermuth, F., Rau, F., Kokunai, Y., Linke, T., Sellier, C., Nakamori, M., Kino, Y., Arandel, L., Jollet, A., Thibault, C., Philipps, M., Vicaire, S., Jost, B., Udd, B., Day, J. W., Duboc, D., Wahbi, K., Matsumura, T., Fujimura, H., ... Charlet-Berguerand, N. (2016). Splicing misregulation of SCN5A contributes to cardiac-conduction delay and heart arrhythmia in myotonic dystrophy. *Nature Communications*, 7, 11067.
https://doi.org/10.1038/ncomms11067

Fugier, C., Klein, A. F., Hammer, C., Vassilopoulos, S., Ivarsson, Y., Toussaint, A., Tosch, V., Vignaud, A., Ferry, A., Messaddeq, N., Kokunai, Y., Tsuburaya, R., De La Grange, P., Dembele, D., Francois, V., Precigout, G., Boulade-Ladame, C., Hummel, M. C., De Munain, A. L., ... Charlet-Berguerand, N. (2011). Misregulated alternative splicing of BIN1 is associated with T tubule alterations and muscle weakness in myotonic dystrophy. *Nature Medicine*, 17(6), 720–725. https://doi.org/10.1038/nm.2374

Goodwin, M., Mohan, A., Batra, R., Lee, K. Y., Charizanis, K., Fernández Gómez, F. J., Eddarkaoui, S., Sergeant, N., Buée, L., Kimura, T., Clark, H. B., Dalton, J., Takamura, K., Weyn-Vanhentenryck, S. M., Zhang, C., Reid, T., Ranum, L. P. W., Day, J. W., & Swanson, M. S. (2015). MBNL Sequestration by Toxic RNAs and RNA Misprocessing in the Myotonic Dystrophy Brain. *Cell Reports*, 12(7), 1159–1168.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.07.029

Harper. (2001). Myotonic dystrophy, 3rd edition. In *Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry*. https://doi.org/10.1136/jnnp.72.3.422-a

Hernández-Hernández, O., Guiraud-Dogan, C., Sicot, G., Huguet, A., Luilier, S., Steidl, E., Saenger, S., Marciniak, E., Obriot, H., Chevarin, C., Nicole, A., Revillod, L., Charizanis, K., Lee, K. Y., Suzuki, Y., Kimura, T., Matsuura, T., Cisneros, B., Swanson, M. S., ... Gomes-Pereira, M. (2013). Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse behaviour. *Brain*, 136(3), 957–970.
https://doi.org/10.1093/brain/aws367

Hess, D. M., Scott, M. O., Potluri, S., Pitts, E. V., Cisterni, C., & Balice-Gordon, R. J. (2007). Localization of TrkC to Schwann cells and effects of neurotrophin-3 signaling at neuromuscular synapses. *Journal of Comparative Neurology*, 501(4), 465–482.
https://doi.org/10.1002/cne.21163

Jiang, H., Mankodi, A., Swanson, M. S., Moxley, R. T., & Thornton, C. A. (2004). Myotonic dystrophy type 1 is associated with nuclear foci of mutant RNA, sequestration of muscleblind proteins and deregulated alternative splicing in neurons. *Human Molecular Genetics*, 13(24), 3079–3088. https://doi.org/10.1093/hmg/ddh327

Jones, R. A., Reich, C. D., Dissanayake, K. N., Kristmundsdottir, F., Findlater, G. S., Ribchester, R. R., Simmen, M. W., & Gillingwater, T. H. (2016). NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure–function relationships at the neuromuscular junction. *Open Biology*, 6(12), 160240. https://doi.org/10.1098/rsob.160240

Kanadia, R. N., Johnstone, K. A., Mankodi, A., Lungu, C., Thornton, C. A., Esson, D., Timmers, A. M., Hauswirth, W. W., & Swanson, M. S. (2003). A Muscleblind Knockout Model for Myotonic Dystrophy. *Science*, 302(5652), 1978–1980.
https://doi.org/10.1126/science.1088583

Kanning, K. C., Kaplan, A., & Henderson, C. E. (2010). Motor neuron diversity in development and disease. In *Annual Review of Neuroscience* (Vol. 33, Issue 1, pp. 409–440). Annual Reviews.
https://doi.org/10.1146/annurev.neuro.051508.135722
Klein, A. F., Gasnier, E., & Furling, D. (2011). Gain of RNA function in pathological cases: Focus on myotonic dystrophy. In *Biochimie* (Vol. 93, Issue 11, pp. 2006–2012). Elsevier.
https://doi.org/10.1016/j.biochi.2011.06.028

Klinck, R., Fourrier, A., Thibault, P., Toutant, J., Durand, M., Lapointe, E., Caillet-Boudin, M. L., Sergeant, N., Gourdon, G., Meola, G., Furling, D., Puymirat, J., & Chabot, B. (2014). RBFOX1 cooperates with MBNL1 to control splicing in muscle, including events altered in myotonic dystrophy type 1. *PLoS ONE*, *9*(9), 18–21.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107324

Konieczny, P., Stepniak-Konieczna, E., & Sobczak, K. (2014). MBNL proteins and their target RNAs, interaction and splicing regulation. *Nucleic Acids Research*, *42*(17), 10873–10887.
https://doi.org/10.1093/nar/gku767

Krishnan, A. V., & Kiernan, M. C. (2006). Axonal function and activity-dependent excitability changes in myotonic dystrophy. *Muscle and Nerve*, *33*(5), 627–636.
https://doi.org/10.1002/mus.20516

Lee-Hsin, W., Yu-Mei, L., Chien-Yu, L., Yijuang, C., & Guey-Shin, W. (2020). Neurodegeneration induces a developmental RNA processing program by calpain- mediated MBNL2 degradation. *886*, 1–35.

Lee, K.-Y., Seah, C., Li, C., Chen, Y.-F., Chen, C.-Y., Wu, C.-I., Liao, P.-C., Shyu, Y.-C., Olafson, H. R., McKee, K. K., Wang, E. T., Yeh, C.-H., & Wang, C.-H. (2022). Mice lacking MBNL1 and MBNL2 exhibit sudden cardiac death and molecular signatures recapitulating myotonic dystrophy. *Human Molecular Genetics*, *5*–6. https://doi.org/10.1093/hmg/ddac108

Lee, K. Y., Chang, H. C., Seah, C., & Lee, L. J. (2019). Deprivation of Muscleblind-Like Proteins Causes Deficits in Cortical Neuron Distribution and Morphological Changes in Dendritic Spines and Postsynaptic Densities. *Frontiers in Neuroanatomy*, *13*, 75.
https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00075

Lee, K. Y., Li, M., Manchanda, M., Batra, R., Charizanis, K., Mohan, A., Warren, S. A., Chamberlain, C. M., Finn, D., Hong, H., Ashraf, H., Kasahara, H., Ranum, L. P. W., & Swanson, M. S. (2013). Compound loss of muscleblind-like function in myotonic dystrophy. *EMBO Molecular Medicine*, *5*(12), 1887–1900. https://doi.org/10.1002/emmm.201303275

Li, X. M., Dong, X. P., Luo, S. W., Zhang, B., Lee, D. H., Ting, A. K. L., Neiswender, H., Kim, C. H., Carpenter-Hyland, E., Gao, T. M., Xiong, W. C., & Mei, L. (2008). Retrograde regulation of motoneuron differentiation by muscle β-catenin. *Nature Neuroscience*, *11*(3), 262–268.
https://doi.org/10.1038/nn2053

Luria, V., & Laufer, E. (2007). Lateral motor column axons execute a ternary trajectory choice between limb and body tissues. *Neural Development*, *2*(1), 13. https://doi.org/10.1186/1749-8104-2-13

Macdermot, V. (1961). The histology of the neuromuscular junction in dystrophia myotonica. *Brain*, *84*(1), 75–84. https://doi.org/10.1093/brain/84.1.75

Mende, Y., Jakubik, M., Riessland, M., Schoenen, F., Roßbach, K., Kleinridders, A., Köhler, C., Buch, T., & Wirth, B. (2010). Deficiency of the splicing factor Sfrs10 results in early embryonic lethality in mice and has no impact on full-length SMN /Smn splicing. *Human Molecular Genetics*, *19*(11), 2154–2167. https://doi.org/10.1093/hmg/ddq094

Messéant, J., Dobbertin, A., Girard, E., Delers, P., Manuel, M., Mangione, F., Schmitt, A., Le Denmat, D., Molgó, J., Zytnicki, D., Schaeffer, L., Legay, C., & Strochlic, L. (2015). Musk frizzled-like domain is critical for mammalian neuromuscular junction formation and maintenance. *Journal of Neuroscience*, *35*(12), 4926–4941.
https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3381-14.2015

Nakamori, M., Sobczak, K., Puwanant, A., Welle, S., Eichinger, K., Pandya, S., Dekdebrun, J.,
Heatwole, C. R., McDermott, M. P., Chen, T., Cline, M., Tawil, R., Osborne, R. J., Wheeler, T. M., Swanson, M. S., Moxley, R. T., & Thornton, C. A. (2013). Splicing biomarkers of disease severity in myotonic dystrophy. *Annals of Neurology, 74*(6), 862-872.
https://doi.org/10.1002/ana.23992

Panaite, P. A., Gantelet, E., Kraftsik, R., Gourdon, G., Kuntzer, T., & Barakat-Walter, I. (2008). Myotonic dystrophy transgenic mice exhibit pathologic abnormalities in diaphragm neuromuscular junctions and phrenic nerves. *Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, 67*(8), 763-772. https://doi.org/10.1097/NEN.0b013e318180ec64

Poulos, M. G., Batra, R., Li, M., Yuan, Y., Zhang, C., Darnell, R. B., & Swanson, M. S. (2013). Progressive impairment of muscle regeneration in muscleblind-like 3 isoform knockout mice. *Human Molecular Genetics, 22*(17), 3547-3558. https://doi.org/10.1093/hmg/ddt209

Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., & Lovering, R. M. (2013). Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. *Journal of Physiology, 591*(2), 559-570. https://doi.org/10.1113/jphysiol.2012.241679

Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Kerr, J. P., Stains, J. P., & Lovering, R. M. (2014). Recovery of altered neuromuscular junction morphology and muscle function in mdx mice after injury. *Cellular and Molecular Life Sciences, 72*(1), 153-164. https://doi.org/10.1007/s00018-014-1663-7

Pratt, S. J. P., Valencia, A. P., Le, G. K., Shah, S. B., & Lovering, R. M. (2015). Pre- and postsynaptic changes in the neuromuscular junction in dystrophic mice. *Frontiers in Physiology, 6*(SEP), 252.
https://doi.org/10.3389/fphys.2015.00252

Rau, F., Freyermuth, F., Fugier, C., Villemin, J. P., Fischer, M. C., Jost, B., Dembele, D., Gourdon, G., Nicole, A., Duboc, D., Wahbi, K., Day, J. W., Fujimura, H., Takahashi, M. P., Auboeuf, D., Dreumont, N., Furling, D., & Charlet-Berguerand, N. (2011). Misregulation of miR-1 processing is associated with heart defects in myotonic dystrophy. *Nature Structural and Molecular Biology, 18*(7), 840-845. https://doi.org/10.1038/nsmb.2067

Rau, F., Lainé, J., Ramanoudjame, L., Ferry, A., Arandel, L., Delalande, O., Jollet, A., Dingli, F., Lee, K. Y., Peccate, C., Lorain, S., Kabashi, E., Athanasopoulos, T., Koo, T., Loew, D., Swanson, M. S., Le Rumeur, E., Dickson, G., Allamand, V., ... Furling, D. (2015). Abnormal splicing switch of DMD's penultimate exon compromises muscle fibre maintenance in myotonic dystrophy. *Nature Communications, 6*(1), 7205.
https://doi.org/10.1038/ncomms8205

Sergeant, N., Sablonnière, B., Schraen-Maschke, S., Ghestem, A., Maurage, C. A., Wattez, A., Vermersch, P., & Delacourte, A. (2001). Dysregulation of human brain microtubule-associated tau mRNA maturation in myotonic dystrophy type 1. *Human Molecular Genetics, 10*(19), 2143-2155. https://doi.org/10.1093/hmg/10.19.2143

Shafer, B., Onishi, K., Lo, C., Colakoglu, G., & Zou, Y. (2011). Vangl2 Promotes Wnt/Planar Cell Polarity-like Signaling by Antagonizing Dvl1-Mediated Feedback Inhibition in Growth Cone Guidance. *Developmental Cell, 20*(2), 177-191. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2011.01.002

Shen, C., Li, L., Zhao, K., Bai, L., Wang, A., Shu, X., Xiao, Y., Zhang, J., Zhang, K., Hui, T., Chen, W., Zhang, B., Hsu, W., Xiong, W. C., & Mei, L. (2018). Motoneuron Wnts regulate neuromuscular junction development. *ELife, 7*. https://doi.org/10.7554/eLife.34625

Slater, C. R. (2020). 'Fragmentation' of NMJs: a sign of degeneration or regeneration? A long journey with many junctions. *Neuroscience, 439*, 28-40.
https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2019.05.017

Spilker, K. A., Wang, G. J., Tugizova, M. S., & Shen, K. (2012). Caenorhabditis elegans Muscleblind homolog mbl-1 functions in neurons to regulate synapse formation. *Neural Development, 7*(1),
1-14. https://doi.org/10.1186/1749-8104-7-7

Suenaga, K., Lee, K. Y., Nakamori, M., Tatsumi, Y., Takahashi, M. P., Fujimura, H., Jinnai, K., Yoshikawa, H., Du, H., Ares, M., Swanson, M. S., & Kimura, T. (2012). Muscleblind-like 1 knockout mice reveal novel splicing defects in the myotonic dystrophy brain. *PLoS ONE*, 7(3), e33218. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033218

Tang, Z. Z., Yarotskyy, V., Wei, L., Sobczak, K., Nakamori, M., Eichinger, K., Moxley, R. T., Dirksen, R. T., & Thornton, C. A. (2012). Muscle weakness in myotonic dystrophy associated with misregulated splicing and altered gating of Ca v1.1 calcium channel. *Human Molecular Genetics*, 21(6), 1312-1324. https://doi.org/10.1093/hmg/ddr568

Wang, E. T., Cody, N. A. L., Jog, S., Biancolella, M., Wang, T. T., Treacy, D. J., Luo, S., Schroth, G. P., Housman, D. E., Reddy, S., Lécuyer, E., & Burge, C. B. (2012). Transcriptome-wide regulation of pre-mRNA splicing and mRNA localization by muscleblind proteins. *Cell*, 150(4), 710-724. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.06.041

Wang, W., Li, X., Lee, M., Jun, S., Aziz, K. E., Feng, L., Tran, M. K., Li, N., McCrea, P. D., Park, J. Il, & Chen, J. (2015). FOXKs promote Wnt/β-catenin signaling by translocating DVL into the nucleus. *Developmental Cell*, 32(6), 707-718. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2015.01.031

Wheeler, T. M., Krym, M. C., & Thornton, C. A. (2007). Ribonuclear foci at the neuromuscular junction in myotonic dystrophy type 1. *Neuromuscul Disorders*, 17(3), 242-247. https://doi.org/S0960-8966(07)00004-1 [pii]\r10.1016/j.nmd.2006.12.015
# Résultats complémentaires

## La perte de MBNL2 dans les MN n'induit pas d'anomalies tardives de la JNM

La nette aggravation de la structure des JNM entre 2 et 4 mois des souris dKO a montré que la maintenance de la JNM est altérée par la perte des protéines MBNL. En revanche, les plaques motrices des souris Hb9Cre-Mbnl2-KO ne se détériorent pas, 4 mois après la naissance des souris. En supposant que cette déficience puisse apparaître plus tardivement chez les souris Hb9Cre-Mbnl2-KO, nous avons caractérisé les JNM des souris CTL et Hb9Cre-Mbnl2-KO âgées de 1 an, en comparaison avec les souris âgées de 4 mois (Figure 28).

<figure><img src="image_68.png" /></figure>
**Figure 28 : JNM des souris Hb9Cre-Mbn12-KO de 1 an**

(a) Images confocales représentatives des JNM de TA de souris CTL et Hb9Cre-Mbn12-KO âgées de 4 mois ou 1 an. Neurofilament (NF, magenta) et Synapsine (SYN, magenta) avec α-BTX (RACh, vert). (b-f) Quantifications des caractéristiques structurales des JNM de TA de souris CTL et Hb9Cre-Mbn12-KO âgées de 4 mois ou 1 an. (b) Aire des RACH. (c) Périmètre de la plaque motrice. (d) Index de fragmentation des RACH. (e) Pourcentages de JNMs qui contiennent le nombre de fragments de RACH indiqués. (f) Ratio de la superposition des marquages pré- et postsynaptiques. (g) Aire terminal nerveuse.

$n_{CTL4m}$= 4, au moins 9 JNM par souris ; $n_{CTL1y}$ = 3, au moins 16 JNM par souris ; $n_{Hb9Cre-Mbn12-KO4m}$ = 7, au moins 9 JNM par souris ; $n_{Hb9Cre-Mbn12-KO1y}$ = 5, au moins 11 JNM par souris. Les barres d'erreur indiquent la s.e.m ; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. One way Anova : (b, c, f, g) test de Tukey ; (d) test de Dunn. (e) Two way Anova : test de Sidak.

Les JNM des TA des souris Hb9Cre-Mbn12-KO âgées de 1 an ont un aspect similaire à celles des souris CTL de même âge. Comme les JNM des souris âgées de 4 mois, elles ont un aspect bien délimité et perforé et ne présentent pas de défaut d'innervation (Figure 28 a). L'aire occupée par les RACH (Figure 28 b) ainsi que le périmètre de la plaque motrice terminale (Figure 28 c) des JNM des souris Hb9Cre-Mbn12-KO mais aussi CTL augmente entre 4 mois et 1 an. Ainsi, la déplétion de Mbn12 spécifiquement dans les MN ne conduit pas à une augmentation anormale tardive de la taille des JNM comparées aux souris CTL.

En outre, les JNM des souris CTL âgées de 1 an présente des structures post-synaptiques discontinues avec un taux de fragmentation supérieur à celui observées chez des souris plus jeunes (4 mois) (Figure 28 d). La proportion de « cluster » de RACH CTL présentant de 1 à 3 fragments diminue de 40% et le nombre de RACH présentant entre 4 et 6 fragments est significativement augmentée, confirmant les résultats précédemment publiés sur la tendance des plaques motrices à se fragmenter au cours du vieillissement (Figure 28 e)(Valdez et al., 2010). En revanche, tout comme nous l'avions observé à 4 mois, et contrairement aux souris CTL, les JNM des TA des souris Hb9Cre-Mbn12-KO âgées de 1 an ne présentent pas de fragmentation des RACH. Ces résultats surprenants suggèrentraient que la perte de Mbn12 seul dans le MN pourrait avoir un effet protecteur quant à la fragmentation des « clusters » de RACH au cours du vieillissement.

Quant au côté présynaptique, l'aire terminale nerveuse, de la même manière que l'aire des RACH, augmente significativement chez les souris CTL entre 4 mois et 1 an mais pas chez les souris Hb9Cre-MBNL2. Toutefois, la colocalisation des marquages pré- et postsynaptiques ne varie pour
aucune condition montrant l'absence d'anomalie de l'innervation des JNM chez ses souris (Figure 28 f). Enfin, l'aire terminale nerveuse de la même manière que l'aire des RACh, augmente significativement chez les souris CTL entre 4 mois et 1 an mais pas chez les souris Hb9Cre-MBNL2 (Figure 28 g). Il n'y a donc pas d'anomalie de l'innervation des JNM des souris Hb9Cre-Mbnl2-KO, 1 an après la naissance. Ainsi, la perte d'expression de Mbnl2 dans les MN ne conduit pas à l'apparition tardive d'anomalies de la structure des JNM.

## MBNL dans le muscle squelettique participe au maintien de la JNM

Notre étude du modèle dKO en comparaison du modèle Mbnl1-KO nous a permis de démontrer l'importance des protéines MBNL dans le MN pour le maintien des JNM et suggère leur implication au niveau de la communication neuromusculaire. Les atteintes structurales de la JNM des souris Mbnl1-KO étant cependant sévères au niveau post-synaptique, elles soulèvent la question suivante : quel est le rôle de MBNL dans le muscle squelettique sur le maintien de la JNM ? Dans ce but, nous avons déplété à la fois Mbnl1 et Mbnl2 spécifiquement dans le muscle squelettique (TA) de souris adultes sauvages (âgées de 2 mois) par injection intramusculaire de virus adéno-associés (AAV). En effet, la protéine MBNL1 est exprimée de manière prédominante dans le muscle squelettique mais sa déplétion induit une compensation par surexpression de son paralogue MBNL2 (K. Y. Lee et al., 2013).

Pour cela, nous avons injecté des AAV contenant un shmiR dirigé contre Mbnl1 et Mbnl2 (shMBNL), sous contrôle du promoteur synthétique sPC5.12 spécifique au muscle squelettique. Contrairement aux shARN qui sont transcrits par l'ARN polymérase III, les shmiR sont transcrits par l'ARN polymérase II, ce qui permet de placer leur expression sous l'influence d'un promoteur tissu-spécifique (K. H. Chung et al., 2006). Des AAV exprimant un shmiR contrôle dirigé contre l'ARNm bactérien LacZ ont été injectés dans le TA contralatéral (shCt). Nous avons ensuite prélevé les TA injectés 2 ou 4 mois post-injection (PI) et avons confirmé par qRT-PCR une diminution de l'expression de l'ARNm de MBNL1 de 80% et de MBNL2 de 50% dans les TA exprimant le shMBNL par rapport aux shCt, 2 mois PI comme 4 mois PI (Figure 29 a, b).

De plus, nous n'avons pas relevé de diminution évidente de la quantité relative de l'ARNm de MBNL1 et de MBNL2 dans le nerf sciatique ou la moelle épinière correspondants aux TA injectés avec les AAV-shMBNL 4m PI, confirmant la spécificité de notre approche pour le muscle squelettique (Figure 29 c, d). La perte de MBNL1 et MBNL2 dans le muscle squelettique adulte entraîne l'apparition de la myotonie (Figure 29 e), ainsi qu'une diminution de la force maximale spécifique (Figure 29 f) précédemment décrits dans les modèles DM1 (Mankodi et al., 2000;
Vignaud et al., 2010) et de déplétion de MBNL (Choi et al., 2015; K. Y. Lee et al., 2013; Kanadia, Johnstone, et al., 2003).

Notre approche par ARN interférence est donc efficace pour étudier l'impact de la perte de MBNL1 et MBNL2 dans le muscle squelettique adulte.

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>b</figcaption></figure>

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>c</figcaption></figure>

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>d</figcaption></figure>

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>e</figcaption></figure>

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>f</figcaption></figure>

<figure><img src="image_74.png" /></figure>
Figure 29 : L'injection d'AAV-shMBNL provoque la diminution importante de Mbnl1 et Mbnl2 spécifiquement dans le muscle squelettique

(a-d) Quantifications des quantités relatives des ARNm Mbnl1 (a) et Mbnl2 (b) par RT-PCR quantitative par rapport à la quantité d'ARNm de RLP0 : (a, b) dans les TA exprimant le shCtrl ou le shMBNL, 2 et 4 mois PI ; (c, d) dans les TA, nerfs sciatiques (SCIA) et moelle épinière (SC) des souris injectées avec les AAV exprimant le shCtrl et le shMBNL, 4 mois PI. (e) Mesure *in situ* de la myotonie (g.s) dans les TA exprimant le shCtrl ou le shMBNL, 2 et 4 mois PI. (f) Analyse quantitative dans les TA exprimant le shCtrl ou le shMBNL, 2 et 4 mois PI, des forces maximales spécifiques absolues (g/mg de muscle) par stimulation nerveuse.

(a, b) $n_{shCtrl2mPI} = 5$ ; $n_{shMBNL2mPI} = 5$ ; $n_{shCtrl4mPI} = 3$ ; $n_{shMBNL4mPI} = 3$. One way Anova : test de Tukey.

(c, d) $n_{TAshCtrl4mPI} = 4$ ; $n_{TAshMBNL4mPI} = 3$ ; $n_{SCIAshCtrl4mPI} = 4$ ; $n_{SCIAshMBNL4mPI} = 4$ ; $n_{SC4mPI} = 4$. Test de Student apparié. (e, f) $n_{shCtrl2mPI} = 8$ ; $n_{shMBNL2mPI} = 8$ ; $n_{shCtrl4mPI} = 9$ ; $n_{shMBNL4mPI} = 9$. One way Anova :

(e) test de Dunn ; (f) test de Tukey. Les barres d'erreur indiquent la s.e.m ; \*p\<0.05, \*\*p\<0.01, \*\*\*p\<0.001, \*\*\*\*p\<0.0001.

L'analyse des JNM et de la communication neuromusculaire de ces souris, 2 et 4 mois PI, est présentée figure 30.
<figure><img src="image_75.png" /></figure>

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**Figure 30 : La depletion simultanée de Mbnl1 et Mbnl2 dans le muscle squelettique adulte induit des défauts structuraux progressifs de la JNM**

(a) Images confocales représentatives des JNM de souris WT injectées avec des AAV-Ctl (shCtrl) ou des AAV-shMbnl (shMBNL), 2 ou 4 mois PI (Post-injection). Neurofilament (NF, magenta) et Synapsine (SYN, magenta) avec α-BTX (RACh, vert).

(b-h) Quantifications des caractéristiques structurales des JNM de TA de souris WT injectées avec les shCtrl ou les shMBNL, 2 ou 4 mois PI. (b) Aire des RACH. (c) Périmètre de la plaque motrice.

(d) Index de fragmentation des RACH. (e, f) Pourcentages de JNMs des TA exprimant les shCtrl ou shMBNL, 2 mois PI (e) ou 4 mois PI (f), qui contiennent le nombres de fragments de RACH indiqués. (g) Ratio de la superposition des marquages pré- et postsynaptiques. (h) Proportion de JNM avec des « sprouts ».

$n_{shCtrl2mPI} = 5$, au moins 12 JNM par TA ; $n_{shMBNL,2mPI} = 5$, au moins 15 JNM par TA ; $n_{shCtrl4mPI} = 3$, au moins 14 JNM par TA ; $n_{shMBNL,4mPI} = 3$, au moins 14 JNM par TA.

(i) Images de microscopie électronique à transmission de JNM de TA de souris WT injectées avec les shCtrl 4 mois PI ou les shMBNL, 2 ou 4 mois PI. Les boutons synaptiques sont coloriés en violet.

Les barres d'erreur indiquent la s.e.m ; \*p<0.05, \*\*p<0.01, \*\*\*p<0.001, \*\*\*\*p<0.0001. One way Anova : (b, c, d, g, h) test de Dunn. (e, f) Two way anova : test de Sidak.

Chez la souris, la JNM adopte sa conformation adulte au bout de 20 jours après la naissance et à 2 mois, elle est considérée comme mature (Slater, 1982). 2 mois et 4 mois PI, les clusters de RACH des TA exprimant le shCtrl ont une forme perforée en bretzel qui dénote de cette maturité (Figure 30 a). L'aire occupée par les RACH est augmentée pour les JNM des TA exprimant le shMBNL par rapport au shCtrl, passant à une aire moyenne de 435 à 575µm² et de 452 à 777 µm² entre 2 et 4 mois PI respectivement (Figure 30 b). De même le périmètre des plaques motrices shMBNL s'agrandit par rapport à celui des shCtrl, passant de 128 à 161µm et de 129 à 195µm entre 2 et 4 mois PI respectivement (Figure 30 c). Ainsi, la taille des plaques motrices des TA injectés avec le shMBNL est bien plus grande qu'avec le shCtrl, 2 mois PI et de manière encore plus importante 4 mois PI.

En plus d'une modification de la taille des JNM, les RACH des TA injectés avec le shMBNL présentent un aspect fragmenté avec un marquage discontinu des RACH, confirmé par l'augmentation de l'index de fragmentation 2 mois et 4 mois PI (Figure 30 d). 2 mois PI, les JNM avec plus de 7 fragments représentent environ 10% des synapses dans les TA exprimant le shCtrl
(Figure 30 d). Cette proportion est portée à 37% dans les TA shMBNL 2 mois PI et à 87% 4 mois PI avec plus de 30% des JNM présentant plus de 15 fragments. Ainsi, les « clusters » de RACH des TA exprimant le shMBNL sont plus fragmentés que dans les TA exprimant le shCtrl avec une sévérité accrue 4 mois PI (Figure 30 e, f).

Quant au côté présynaptique, nous avons décelé une diminution de 10% de la surface colocalisant entre les marquages pré- et postsynaptiques parmi les JNM des TA exprimant le shMBNL par rapport au shCtrl 4 mois PI (Figure 30 g). Étonnamment, le ratio associé au shCtrl 4 mois PI est plus élevé que 2 mois auparavant de 10%. Le muscle squelettique et la JNM continuent de croître après la naissance jusqu'aux alentours de 2 mois après la naissance (Cano et al., 2013; Gokhin et al., 2008), ce qui pourrait expliquer cette augmentation de la colocalisation entre les parties pré- et postsynaptiques entre 2 et 4 mois chez les souris transgéniques CTL. Cependant, les souris soumises à notre injection d'AAV ont 2 mois au moment de l'injection et 4 mois 2 mois PI ; elles ont donc un profil entièrement adulte dès 2 mois PI. Un processus régénératif pourrait être à l'origine de cette différence.

Le déficit d'innervation détecté 4 mois PI est associé avec l'apparition de « sprouts » terminaux de neurofilament dans 44% des JNM analysées des TA shMBNL (Figure 30 h). 2 mois PI, 21% des JNM sont déjà concernées par ce phénomène tandis que les TA shCtrl ne développent pas ces structures 2 ou 4 mois PI. De la même manière que pour les défauts postsynaptiques, les altérations présynaptiques des souris AAV-shMbnl1/2 sont bien plus importantes 4 mois PI que 2 mois PI. Cette aggravation est encore plus marquée que pour les anomalies postsynaptiques puisque le défaut d'innervation n'est pas présent 2 mois PI.

Ces observations sont corroborées par l'analyse ultrastructurale de ces JNM. En effet, les JNM des TA exprimant le shMBNL présentent, 2 mois PI, des défauts strictement postsynaptiques avec des zones de dégénérescence dans des gouttières synaptiques anormalement formées. Ces défauts sont retrouvés 4 mois PI mais sont associés à des dégénérescences des boutons terminaux (Figure 30 i). Ces analyses montrent donc une aggravation globale au cours du temps des JNM des TA suite à une perte de Mbnl1 et Mbnl2 à l'âge adulte. Ainsi, nos résultats montrent que la perte des protéines MBNL dans le muscle squelettique adulte altère le maintien de la JNM et suggèrent que les protéines MBNL (et notamment MBNL1) exprimées dans le muscle squelettique peuvent réguler le métabolisme d'ARN impliqués dans le maintien de la JNM.

De plus, de la même manière que pour les JNM des souris transgéniques Mbnl1-KO, les altérations des TA exprimant le shMBNL 2 mois PI semblent postsynaptiques. Cette ressemblance
suggère un rôle pour MBNL1 dans le maintien de la postsynapse, MBNL2 étant surtout exprimé par compensation dans le muscle squelettique (K. Y. Lee et al., 2013). Par ailleurs, les altérations relevées 2 mois PI des JNM des TA shMBNL s'étendent au compartiment pré-synaptique à 4 mois PI. Il est en effet possible que des dérégulations au niveau postsynaptique dues à la perte de MBNL1 puissent causer une détérioration de la présynapse, par un mécanisme rétrograde restant à déterminer tel que cela a été montré pour Lrp4 (Barik et al., 2014).

Alors que la structure et l'ultrastructure des JNM sont altérées dans les TA de souris déplétées pour MBNL, l'analyse par électromyogramme (EMG) n'a pas permis de mettre en évidence des défauts de la communication nerf-muscle avec une absence de décrément du CMAP des TA exprimant le shMBNL par rapport aux TA exprimant le shCtrl, 2 ou 4 mois PI (Figure 31 a). Ce résultat suggère que les défauts de la JNM ne sont pas suffisants pour provoquer un déficit de la communication neuromusculaire. En effet, malgré une baisse de la force maximale spécifique directe des TA shMBNL par rapport aux TA shCtrl 2 et 4 mois PI (Figure 31 b), les TA déplétés de Mbnl1 et Mbnl2 ne manifestent pas de diminution du ratio de la force directe sur la force indirecte (Figure 31 c), une mesure de l'implication nerveuse dans la génération de la force tétanique. Les altérations fonctionnelles causées par la perte de Mbnl1 et Mbnl2 dans le muscle squelettique seraient donc soit purement musculaires, soit les anomalies pré-synaptiques observées par MET ne sont pas suffisantes pour observer une modification fonctionnelle avec les techniques utilisées.

<figure><img src="image_85.png" /><figcaption>Figure 31 : La perte de MBNL dans le muscle squelettique n'induit pas de défauts manifestes de la communication neuromusculaire</figcaption></figure>

(a) Quantification de l'amplitude des 10 premiers Potentiels d'action musculaire composés (CMAP), exprimées en pourcentage du premier pic, à 5Hz. (b) Analyse quantitative dans les TA exprimant le shCtrl ou le shMBNL, 2 et 4 mois PI, des forces maximales spécifiques directes (g/mg de muscle) par stimulation musculaire. (c) Calcul du ratio des forces maximales spécifiques directes et absolues. n<sub>shCtrl2mPI</sub> = 8 ; n<sub>shMBNL2mPI</sub> = 8 ; n<sub>shCtrl4mPI</sub> = 9 ; n<sub>shMBNL4mPI</sub> = 9. (a) Two way Anova : test de Tukey. (a, b) One way Anova : test de Tukey.
Contribution du muscle squelettique aux défauts de la JNM dans un contexte DM1

Les modèles transgéniques Mbnl-KO et de déplétion par ARN interférence nous ont permis de caractériser l'impact d'une perte des protéines MBNL dans le MN et le muscle squelettique sur le maintien de la JNM. Afin de rapporter ces observations à un modèle DM1, nous avons caractérisé les JNM de souris HSA<sup>LR</sup> (Figure 32). Ces souris expriment spécifiquement dans le muscle squelettique un transgène de l'actine squelettique humaine contenant 300 répétitions CTG dans son 3'UTR (Mankodi et al., 2000). Nous avons mené cette étude sur des souris adultes de 4 mois (« young ») et des souris âgées de plus de 1 an (« old »), suspectant que les défauts pourraient s'aggraver avec le temps de la même manière que pour nos modèles basés sur la perte de MBNL.

<figure><img src="image_86.png" /></figure>
**Figure 32 : Les JNM des souris HSA<sup>LR</sup> reproduisent certains défauts postsynaptiques des souris déplétées de MBNL dans le muscle squelettique**

(a) Images confocales représentatives des JNM de TA de souris WT et HSA<sup>LR</sup> jeunes et âgées. Neurofilament (NF, magenta) et Synapsine (SYN, magenta) avec α-BTX (RACh, vert).

(b-e) Quantifications des caractéristiques structurales des JNM de TA de souris WT et HSA<sup>LR</sup> jeunes et âgées. (b) Aire des RACH. (c) Périmètre de la plaque motrice. (d) Index de fragmentation des RACH. (e) Pourcentages de JNMs qui contiennent le nombre de fragments de RACH indiqués (f) Ratio de la superposition des marquages pré- et postsynaptiques.

$n_{WT_j} = 4$, 15 JNM par souris ; $n_{WT_a} = 4$, au moins 7 JNM par souris ; $n_{HSA_j} = 4$, au moins 12 JNM par souris ; $n_{HSA_a} = 4$, au moins 13 JNM par souris. Les barres d'erreur indiquent la s.e.m ; \*p<0.05, \*\*p<0.01, \*\*\*p<0.001, \*\*\*\*p<0.0001. One way Anova : (b, c, d, f) test de Dunn. (d) Two way Anova : test de Tukey.

De la même manière que pour les souris transgéniques CTL, Mbnl1-KO et dKO, les JNM des jeunes souris WT et HSA<sup>LR</sup> ne manifestent pas de défaut de maturité (Figure 32 a). Ainsi, comme la déplétion de MBNL dans le muscle squelettique adulte, la présence de répétitions CTG dans le muscle squelettique sous la dépendance du promoteur HSA ne provoque pas d'altérations développementales de la JNM ni de dénervation. De plus, les aires des RACH des JNMs des souris HSA<sup>LR</sup> sont comparables à celles des souris WT, peu importe l'âge (Figure 32 b). Les plaques motrices des jeunes souris HSA<sup>LR</sup> ont toutefois un périmètre plus élevé de 30µm par rapport à celui des plaques motrices des jeunes souris WT (Figure 32 c). La différence de taille entre les JNM des souris WT et HSA<sup>LR</sup> est donc visible uniquement à un jeune âge et dans une mesure bien moindre que celle observée pour les modèles de déplétion de MBNL.

Au niveau postsynaptique, les TA des souris HSA<sup>LR</sup> âgées de 4 mois montrent un taux de fragmentation supérieur à celui des souris WT (Figure 32 d) avec une diminution de 25% du nombre de « clusters » de RACH présentent 1 à 3 fragments (Figure 32 e). Cette différence de fragmentation des « clusters » de RACH entre les souris WT et HSA<sup>LR</sup> n'est plus retrouvée chez les souris âgées (Figure 32 d). Toutefois, on peut noter que la fragmentation augmente avec l'âge, aussi bien chez les souris WT que HSA<sup>LR</sup> avec une tendance à une proportion plus élevée de JNM présentant plus de 7 fragments et de façon plus marquée pour les JNMs des TA des souris HSA<sup>LR</sup>. (Figure 32 e). Ainsi, l'expression de longues répétitions CTG dans le muscle squelettique provoque une fragmentation anormale des « clusters » de RACH qui s'aggrave avec le temps.
L'effet est très similaire à celui observé chez les souris Mbnl1-KO, dKO et déplétées de Mbnl1 et Mbnl2 par ARN interférence, ce qui suggère que la séquestration de MBNL1 dans le muscle squelettique pourrait être la principale cause de cette fragmentation dans un contexte DM1. Les présynapses des souris HSA<sup>LR</sup> ne présentent pas de défauts apparents, ne manifestant pas de diminution de la colocalisation des marquages pré- et postsynaptiques (Figure 32 f) ou de « sprouts » neuronaux terminaux. L'expression de répétitions pathologiques CTG dans le muscle squelettique ne provoque donc pas de défauts présynaptiques, même chez des souris âgées, contrairement à ce qui a été observé avec la déplétion de MBNL1 et MBNL2 spécifiquement dans le muscle squelettique par ARN interférence. Cette différence pourrait être due à un plus faible niveau de perte de fonction de MBNL dans les souris HSA<sup>LR</sup>, les foci ne provoquant la séquestration permanente que d'environ 30% de la quantité totale de MBNL1 *in vitro* dans un autre modèle DM1 (Ho, Savkur, et al., 2005). Ainsi, il est possible que la perte de MBNL puisse être le facteur déterminant à la source des défauts de la JNM dans un contexte DM1. La perte de fonction de MBNL dans les souris HSA<sup>LR</sup> ne serait donc pas suffisante dans les souris HSA<sup>LR</sup> pour récapituler les défauts de nos modèles transgéniques et d'ARN interférence.

Par ailleurs, le ratio de colocalisation des parties pré- et postsynaptiques augmente de 50 à 60% entre les jeunes souris WT et HSA<sup>LR</sup>, alors qu'il est identique entre les deux génotypes à un âge avancé (Figure 32 f). Les JNM des jeunes souris HSA<sup>LR</sup> semblent donc adopter un profil âgé avant les JNM des souris WT. La même dynamique est visible pour la fragmentation des « clusters » de RACH : l'augmentation de la proportion de JNM avec plus de 7 fragments est de 30% entre les souris jeunes et âgées WT et HSA<sup>LR</sup> mais ces dernières sont fragmentées plus précocement (Figure 32 e). De ces deux observations l'on peut supposer que les JNM des souris HSA<sup>LR</sup> sont altérées par un phénomène de vieillissement accéléré. En effet, des marqueurs de sénescence ont été identifiés dans la DM (revu dans Hasuike, Mochizuki, & Nakamori, 2022).
## Matériel & méthodes des résultats complémentaires

Les anticorps utilisés, les procédures animales, l'analyse de la force isométrique *in situ*, l'extraction ARN, la transcription réverse PCR (RT-PCR), le marquage des JNMs, la microscopie électronique à transmission ainsi que la méthode d'analyse statistique ont été précisés dans la partie « Material and methods » de l'article en préparation (cf. p111).

## Injections d'AAV

Les TA de souris C57BL/6 WT de 2 mois ont été injectés avec 15µL de vecteurs AAV9-SpC5.12-shLacZ (shCtl) ou de vecteurs AAV9-SpC5.12-shMbn1&Mbn12 (shMBNL) contenant 1.10<sup>11</sup> génomes viraux. Pour chaque souris, le TA gauche a été injecté avec les AAV-shMBNL et le muscle contralatéral avec les AAV-shCtl. Les animaux ont été sacrifiés 2 ou 4 mois après l'injection.

## Souris HSA<sup>LR</sup>

Les souris HSA<sup>LR</sup> homozygotes (à longues répétitions, lignée 20b, généreusement fournies par C. A. Thornton) ont été comparées à des souris WT du même fond (FVB/N).

## Caractérisation de l'AChE (cf. p149)

L'activité de l'AChE a été déterminée par la méthode de Koëlle-Friedenwald (Koelle & Friedenwald, 1949). Brièvement, les muscles congelés ont été coupés avec une épaisseur de 12µm au cryostat et mis sur lame. Après réhydratation des sections, elles ont été incubées avec la solution de Koëlle puis la réaction a été interrompue avec du sulfate d'ammonium (20% dans de l'eau). Les coupes ont ensuite été lavées au PBS puis fixées au paraformaldéhyde (4% dans du PBS) avant un dernier lavage et montage entre lame et lamelle. La présence de l'AChE a été investiguée par immunofluorescence tel que précédemment décrit (Krejci et al., 2006). Les coupes ont été fixées au paraformaldéhyde (4% dans du PBS), lavées au PBS, bloquées (BSA 3%, sérum de chèvre 5% dans du PBS) et incubées avec la fasciculine-2 conjuguée avec l'anticorps Alexa fluor 594 (1/500) dans la solution de blocage sur la nuit à 4°C. Après 3 lavages au PBS, les coupes ont été montées entre lame et lamelle avec du vectashield (Vector Laboratories). Les images ont été prises à l'Apotome de Zeis et traitées avec le logiciel ImageJ.
Conclusion des résultats complémentaires

Les altérations progressives de la structure et de l'ultrastructure de la JNM des TA injectés avec les AAV exprimant le shMBNL démontrent l'implication de MBNL, cette fois dans le muscle squelettique, sur la maintenance de la JNM. MBNL1 et MBNL2 interviennent donc dans le maintien de la JNM dans toute l'unité motrice. De plus, la perte de MBNL dans le muscle squelettique semble être à l'origine de la majorité des défauts post-synaptiques relevés dans nos modèles.

Le modèle HSA<sup>LR</sup> reproduit ces résultats, montrant que l'expression de répétitions CTG dans le muscle squelettique induit des défauts exclusivement post-synaptiques de maintenance de la JNM. Cette déficience semble donc majoritairement due à la perte de fonction de MBNL dans un cadre DM1. Par ailleurs, le modèle HSA<sup>LR</sup> n'exprimant que peu de répétitions exclusivement dans le muscle squelettique, il est possible que les altérations de la JNM chez les patients DM1 soient plus sévères que dans ce modèle, comme le suggère notre modèle de déplétion spécifique aux MNs de MBNL1 et MBNL2. Nos résultats suggèrent que les altérations de toute l'unité motrice participent à la myopathie de la DM1.
## Discussion Générale

L'ensemble de mon travail de thèse a visé à identifier le rôle de MBNL dans la communication neuromusculaire. En effet, la littérature sur la contribution du SNC à la pathologie musculaire de la DM1 reste succincte. A cette fin, nous avons généré un modèle murin délété de Mbnl1 de façon ubiquitaire et Mbnl2 spécifiquement dans les MNs (dKO). Nous avons ensuite caractérisé les altérations de l'unité motrice causées par cette perte. Ainsi, les souris Mbnl1-KO et dKO développent des troubles moteurs aux alentours de l'âge de 2 mois, qui s'intensifient avec le temps. Ceux-ci comprennent une diminution de leur vitesse de déplacement accompagnée d'une diminution des foulées que font les animaux. L'aspect ubiquitaire de la perte de Mbnl1 dans notre modèle ne nous permet pas d'identifier précisément la source de cette déficience. Bien que la perte de MBNL1 n'induise pas de réduction de la force musculaire générée par le tibialis antérieur (TA), elle provoque l'apparition de la myotonie dans ce muscle qui pourrait participer aux défauts mesurés par notre expérience de démarche. De plus, la locomotion est un mécanisme volontaire qui sollicite tout le corps de la souris, des altérations dans d'autres muscles et organes causées par le KO Mbnl1 pourraient donc participer au déficit moteur que nous observons. En revanche les souris dKO manifestent des défauts additionnels de coordination par rapport aux souris CTL et Mbnl1-KO à l'âge de 2 mois. En effet, à cet âge, les souris dKO se reposent sur plus de pattes lors de leur déplacement. La déplétion de MBNL2 dans les MNs montre donc de manière spécifique que MBNL1 et MBNL2 dans les MNs sont directement impliqués dans la coordination motrice.

Les MNs induisant la contraction musculaire au travers de la jonction neuromusculaire (JNM), nous avons réalisé une étude morphologique et fonctionnelle de cette synapse dans le TA chez les souris Mbnl-KO âgées de 2 et 4 mois. Seules les souris dKO montrent des défauts morphologiques de la JNM à 2 mois, suggérant que MBNL1 et MBNL2 dans le MN sont tous deux nécessaires pour la structure de la plaque motrice. Les JNM des souris dKO mais aussi Mbnl1-KO de 4 mois développent des altérations bien plus sévères que celles des souris de 2 mois. Les anomalies morphologiques des JNM des souris Mbnl1-KO semblent majoritairement post-synaptiques tandis que les JNM des souris dKO reproduisent ces défauts mais développent également des déficiences pré-synaptiques structurales et ultrastructurales. Cette aggravation globale entre les âges de 2 et 4 mois des JNM des souris dKO dénote d'un rôle de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs pour la maintenance de la JNM. Nous avons complété cette analyse par l'étude de modèles spécifiques au muscle squelettique. Les défauts post-synaptiques des JNM des souris injectées avec les AAV-shMbnl1&2 et des souris HSA<sup>LR</sup> suggèrent que ces altérations sont majoritairement dues à la perte
de MBNL1 dans le muscle squelettique. Nous n'avons pas décelé de défauts de conduction neuromusculaire chez nos souris. Cependant, les défauts progressifs structuraux de la JNM mais également de coordination des souris dKO suggèrent que MBNL1 et MBNL2 pourraient réguler des processus synaptiques fins dans les MNs.

Afin d'identifier les conséquences moléculaires de la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs, nous avons réalisé un séquençage haut-débit des ARNs extraits de moelles épinières des souris Mbnl-KO âgées de 4 mois. L'analyse qui en découle a identifié plus de 1000 événements différentiels d'épissage alternatif affectant 815 gènes uniques entre les souris contrôles et dKO. L'analyse des processus biologiques dans lesquels sont impliqués les transcrits altérés par la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs montre que les protéines MBNL sont des acteurs de la communication neuromusculaire en régulant l'homéostasie des vésicules, la libération de neurotransmetteurs et la localisation des protéines à la synapse. Nous avons retrouvé certains événements d'épissage déjà décrits dans le cerveau de souris déplétées de MBNL1 ou MBNL2 dans la moelle épinière de nos souris Mbnl-KO (Charizanis et al., 2012; Suenaga et al., 2012), suggérant une régulation similaire entre le cerveau et la moelle épinière des ARN prémessagers par MBNL1 et MBNL2. Nous avons également identifié de nouveaux transcrits altérés par la perte de MBNL1 et MBNL2. Dvl1 est un acteur central de la voie Wnt qui participe au maintien des JNM par l'intermédiaire du MN (Shafer et al., 2011; Shen et al., 2018; Wang et al., 2015). L'exon 14b de Dvl1 est anormalement inclus dans les cellules de la moelle épinière des souris dKO uniquement. Les conséquences de cette inclusion ne sont pas connues mais pourraient mener à une dégradation du transcrit par la dégradation des ARNm non sens (NMD), l'exon 14b introduisant un codon stop prématuré. Nos résultats montrent que MBNL1 et MBNL2 régulent l'épissage alternatif de nombreux transcrits dans la moelle épinière et pourraient intervenir dans la transmission synaptique au sein de l'unité motrice.

J'ai ainsi démontré que MBNL est impliqué dans le maintien de l'unité motrice. Mes résultats suggèrent, pour la première fois, que le MN pourrait contribuer à la physiopathologie musculaire de la DM1.
# 1. Atouts et limites des modèles murins

## a. Atouts et limites des modèles transgéniques Mbnl-KO

Afin de déterminer le rôle de MBNL dans les MNs sur l'homéostasie et la fonction musculaire, nous avons délété Mbnl2 spécifiquement dans les MNs. Pour cela nous avons croisé des souris loxées autour de l'exon 2 de Mbnl2 avec des souris exprimant la Cre recombinase sous l'influence du promoteur Homeobox9 (Hb9), un gène exprimé spécifiquement dans les MNs (Ross et al., 1998). L' expression du gène Hb9 augmente dès 9,5 jours de développement chez la souris (Arber et al., 1999). Or, de la même manière que chez l'homme, le pic d'expression de MBNL chez la souris dans le cerveau est plus tardif que 9,5 jours (Kanadia, Urbinati, et al., 2003; Konieczny et al., 2014). Donc la déplétion de Mbnl2 est suffisamment précoce pour la considérer comme une déplétion constitutive dans les MNs. De plus, les axones des MNs innervent la JNM aux alentours de 12,5 jours de développement (W. Lin et al., 2001). Ainsi, notre modèle permet de voir les effets de la perte de MBNL2 dans les MNs sur tout le processus de formation, maturation et maintenance de la JNM.

Plutôt qu'un knock-out, notre modèle se rapproche d'un knock-down, ayant montré que Mbnl2 n'est déplété que dans une partie des MNs de la moelle épinière. Cet effet a également été observé dans un autre modèle de délétion de Mbnl2 par expression de la Cre recombinase dans les cardiomyocytes (K.-Y. Lee et al., 2022). Cependant, ce degré d'efficacité de la Cre recombinase est suffisant pour d'une part induire des défauts locomoteurs et de la JNM supplémentaires chez les souris dKO par rapport aux souris Mbnl1-KO ; d'autre part conduire à des défauts de l'épissage alternatif dans les MNs des souris Hb9Cre-Mbnl2-KO et des altérations de l'épissage alternatif supplémentaires dans la moelle des souris dKO par rapport aux souris Mbnl1-KO. En conclusion, la diminution de MBNL2 dans les MNs des souris Hb9Cre-Mbnl2-KO et dKO est suffisante pour déduire le rôle de Mbnl2 dans l'homéostasie de l'unité motrice.

Il s'agit donc du premier modèle de délétion de Mbnl1MN spécifique visant à étudier l'implication du MN dans la DM1.

Afin de déterminer les conséquences moléculaires de la perte d'expression de Mbnl1 et/ou Mbnl2 dans les MNs de souris transgéniques, des expériences de séquençage ARN à haut débit ont été effectuées à partir d'extraits ARN issus de la moelle épinière lombaire des souris Mbnl-KO. La perte de Mbnl2 étant MN spécifique, nous avons pu attribuer les événements d'épissage alternatifs différents entre les souris WT et Hb9Cre-Mbnl2-KO / Mbnl1-KO et dKO à la perte de Mbnl2
dans les MNs. Cela dit, Mbnl1 est délété de manière ubiquitaire dans la moelle épinière des souris Mbnl1-KO et dKO, où les MNs ne représentent qu'une partie infime des cellules (K. Chung et al., 1984). Ainsi, cette analyse nous informe uniquement sur les processus dans lesquels Mbnl1 est impliqué dans les neurones, cellules gliales et autres cellules de la moelle épinière. De plus, une étude récente a montré la présence d'anomalies de l'épissage alternatif cellule-spécifique dans le CNS des patients DM1 et notamment une différence entre des ARN issus de la substance blanche et des motoneurones spinaux (Nakamori et al., 2022).

Afin de pallier à ce manque de spécificité, nous avons envisagé de faire notre séquençage ARN sur des MNs isolés par microdissection laser (Bandyopadhyay et al., 2014). Cependant, la quantité de MNs et de souris nécessaires afin d'obtenir une quantité suffisante d'ARN pour le séquençage à haut débit ne nous a pas permis de réaliser cette expérience durant ma thèse. Une solution alternative serait d'utiliser un modèle de délétion de Mbnl1 et Mbnl2 spécifique aux MNs, par l'insertion de sites LoxP autour de l'exon 3 de Mbnl1 en plus des sites LoxP déjà présents autour de l'exon 2 de Mbnl2 et de croiser ces souris avec des souris Hb9Cre, comme nous l'avons réalisé au cours de ma thèse.

Les modèles MBNL décrits jusqu'à présent récapitulent une grande partie des défauts DM (Charizanis et al., 2012; K. Y. Lee et al., 2013; K.-Y. Lee et al., 2022). Cependant dans la DM1, la perte de fonction de MBNL n'est pas totale (Ho, Savkur, et al., 2005). Dès lors, la perte de MBNL peut provoquer des altérations plus sévères que celles observées dans le cadre pathologique. C'est le cas pour un modèle de double déplétion ubiquitaire de MBNL1 et MBNL2 létal à l'état embryonnaire, alors que les souris DMSXL exprimant de longues répétitions CTG, malgré des défauts développementaux, sont viables à la naissance (Huguet et al., 2012; K. Y. Lee et al., 2013 et cf. Introduction 1.6.1).

D'autre part, d'un point de vue purement musculaire, le phénotype observé chez les souris délétées de Mbnl1 et Mbnl2 spécifiquement dans le muscle squelettique est nettement plus sévère que celui observé chez les souris HSA<sup>1.R</sup> (K. Y. Lee et al., 2013; Mankodi et al., 2000). En revanche, certaines altérations de l'épissage alternatif de la DM1, notamment de la forme congénitale, ne sont reproduites que dans les modèles de double déplétion de MBNL1 et MBNL2 (Goodwin et al., 2015; K. Y. Lee et al., 2013). Enfin, la perte de fonction de MBNL serait à l'origine de plus de 80% des défauts du métabolisme des ARN observés chez les patients DM1 (Nakamori et al., 2013).
Ainsi, la génération de modèles murins modélisant la perte des protéines MBNL dans différents tissus est un bon moyen d'identifier les conséquences possibles de la séquestration de ces protéines dans la pathologie. Ces altérations doivent ensuite être confirmées dans un modèle en contexte DM1, avec expansion de répétitions et si possible dans des échantillons de tissus issus de patients DM1.

b. Atouts et limites de l'approche AAV et ARN interférence

A la vue des anomalies postsynaptiques que nous avons identifiés dans le TA des souris Mbnl1-KO, nous avons supposé qu'en plus de son rôle dans les MN sur le maintien de la JNM, MBNL1 (Mbnl2 n'étant exprimé que très faiblement dans le muscle squelettique de souris sauvages) pourrait également réguler le maintien de la JNM via les composants exprimés dans le muscle squelettique. Afin d'évaluer le rôle des protéines MBNL dans le muscle squelettique sur le maintien de la JNM, nous avons généré au cours de ma thèse un modèle murin basé sur l'injection d'un AAV exprimant un shmiR dirigé contre Mbnl1 et Mbnl2 sous le contrôle du promoteur muscle spécifique SpC5.12. L'injection intramusculaire d'AAV9, avec un fort taux de transduction dans les cellules musculaires (Muraine et al., 2020), exprimant le shmiR dirigé contre Mbnl1 et Mbnl2 (shMBNL) sous le contrôle du promoteur spécifique au muscle squelettique SpC5.12 (X. Li et al., 1999), a permis une déplétion de MBNL1 et MBNL2 spécifiquement dans ce tissu (cf. Résultats complémentaires figure 29). Les JNM des TA exprimant le shMBNL développent des défauts d'abord postsynaptiques qui s'étendent à la partie présynaptique. Ainsi, l'expression des protéines MBNL dans le muscle squelettique est impliqué dans le maintien de la JNM. De la même manière que dans le MN, MBNL pourrait réguler le métabolisme des ARN participant à ce processus. Cette approche a pour avantage de se mettre en place rapidement, contrairement aux souris transgéniques mais surtout de permettre la déplétion de Mbnl chez la souris adulte, et dans notre cas regarder l'effet sur des JNM déjà matures.

Toutefois, si le promoteur SpC5.12 permet l'expression du shmiR-MBNL spécifiquement dans les noyaux des fibres musculaires (X. Li et al., 1999), nous n'avons pas la certitude qu'il l'induise également dans les noyaux sous-synaptiques. Ces noyaux, placés à proximité de chaque plaque motrice, se spécialisent afin de permettre l'expression des gènes codant pour les éléments de la JNM et sont donc essentiels au développement et au maintien de la synapse musculaire (revu par Belotti & Schaeffer, 2020). Les altérations des JNM des souris Mbnl1-KO ou des souris exprimant le shMBNL pourraient donc être causées par une dérégulation du métabolisme des ARN dans ces
noyaux suite à la perte de MBNL1. Pour déterminer si le promoteur SpC5.12 permet l'expression de nos constructions dans les noyaux sous-synaptiques, nous prévoyons d'injecter en intramusculaire des AAV9 exprimant le gène LacZ sous contrôle du promoteur SpC5.12 afin de regarder l'expression de la β-galactosidase dans les noyaux sous-synaptiques.

En parallèle, afin de confirmer le rôle des protéines MBNL dans les MNs sur le maintien des JNM, nous souhaiterions développer un modèle AAV. Pour dépléter Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs, nous utiliserions la même approche précédemment décrite mais via des injections intrathécales. Cette approche nécessite la validation de promoteurs motoneurones spécifiques, qui ne soient pas trop grands, afin de pouvoir répondre à la limite de la taille d'encapsidation du virus, mais aussi une concentration importante de virus à la vue du faible volume pouvant être injecté dans la moelle épinière des souris.

### c. Intérêt du modèle transgénique HSA<sup>LR</sup> pour l'étude de la JNM

Pour rapporter nos résultats à un modèle DM1, nous avons caractérisé la morphologie des JNM issues de TA de souris HSA<sup>LR</sup>, exprimant un transgène de l'actine squelettique humaine avec 300 répétitions CTG dans sa partie 3'UTR (Mankodi et al., 2000). L'expression du transgène est donc confinée au muscle squelettique, ce qui nous a permis de comparer les effets des répétitions CTG et de la perte totale de MBNL1 et MBNL2 spécifiquement dans ce tissu.

A ce jour, il n'existe pas de modèle murin exprimant des répétitions CTG spécifiquement dans les MNs mais le modèle EpA960/CaMKII<sup>Cre</sup> pourrait constituer une solution alternative. Ce modèle murin induit l'expression de 960 répétitions CTG dans l'exon 15 de DMPK, sous contrôle du promoteur de la kinase Ca<sup>2+</sup>/calmoduline dépendante (CaMKII) (P. Y. Wang et al., 2017). La protéine CaMKII est en effet exprimée spécifiquement dans le SNC, dont les MNs spinaux (Y. L. Lin et al., 2022). Toutefois, contrairement aux patients DM1, les longues répétitions 960CTG de ce modèle sont interrompues.

Une alternative serait l'expression d'un transgène contenant les répétitions CTG sous contrôle d'un promoteur spécifique aux MNs, ChAT par exemple. L'équivalent d'un modèle DMSXL confiné aux MNs.
## 2. Rôle des protéines MBNL dans l'unité motrice sur la communication neuromusculaire

### a. Rôle des protéines MBNL dans les MNs sur la communication neuromusculaire

Afin de déterminer les effets sur le métabolisme des ARN de la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs, nous avons réalisé un séquençage ARN à haut débit sur des extraits de moelles épinières lombaires des souris Mbnl-KO. Notre séquençage ARN associé à une analyse d'épissage alternatif a permis d'identifier MBNL1 et MBNL2 comme des régulateurs de la communication neuromusculaire dans la moelle épinière et les MNs. Plus précisément, les termes associés de la « Gene ontology » (termes GO) les plus représentés des gènes dont l'épissage est dérégulé par l'absence de MBNL1 et MBNL2 concernent globalement le transport de l'information synaptique. Les gènes régulés par MBNL1 et MBNL2 sont ainsi impliqués dans le bourgeonnement, l'endocytose et l'amarrage des vésicules synaptiques.

Cependant, notre séquençage ARN n'étant pas cellule spécifique, les proportions des modifications identifiées de l'épissage alternatif des gènes chez les souris Hb9Cre-Mbnl2-KO et dKO par rapport aux souris Mbnl1-KO peuvent être sous-estimées dans les MNs. En effet, il est possible que d'autres cellules que les MNs, donc non déplétées de Mbnl2, puissent également exprimer ces gènes. En effet, des défauts de l'épissage alternatif, associés à un phénotype anormal, ont été décrits dans les astrocytes (cf. Introduction partie 3.1.2.1) du modèle DMSXL (cf. Introduction partie 1.6.1) mais également dans des astrocytes prélevés post-mortem dans le cortex frontal et l'hippocampe de patients DM1 (Dinca et al., 2022). De plus, ces dérégulations semblent attribuées à la perte de fonction de MBNL1 et MBNL2 dans ce type cellulaire (Dinca et al., 2022).

### i. Nouvelles voies possibles de régulation de la JNM dans les MNs pour la DM1

Parmi les ARN dérégulés, vérifiés par RT-PCR (cf. Article figure 4e, f), dans notre modèle transgénique, on retrouve la protéine *dishevelled* 1 (Dvl1) dont l'épissage est altéré spécifiquement chez les souris dKO. En effet, la perte de MBNL1 et MBNL2 spécifique dans les MNs induit une augmentation de l'inclusion de l'exon 14b qui contient un codon stop et dont l'apparition pourrait altérer l'activité de la protéine. Dvl1 est une protéine centrale dans l'activation de la voie Wnt, impliquée dans une grande variété de processus biologiques, dont l'homéostasie de la JNM (cf. Introduction partie 3.2.2.1.3). La voie Wnt est également active dans les MNs et participe à la
formation et la maintenance de la JNM (Shen et al., 2018). Plus précisément, la délétion du gène médiateur de sécrétion du ligand Wnt (Wls) spécifiquement dans les MNs induit l'apparition de déficits axonaux à l'âge adulte (Shen et al., 2018). Le transport axonal vésiculaire pourrait participer à la manifestation de ces défauts, ayant été décrit comme altéré dans un mutant C.elegans de la voie Wnt non canonique JNK (Byrd et al., 2001). Cette voie de signalisation est sous contrôle de Wnt7a (Heasley & Winn, 2008), exprimé dans les MNs (Shen et al., 2018). L'inclusion de l'exon 14b de Dvl1 a également été identifiée dans le cerveau des souris Mbnl2-KO (Charizanis et al., 2012). De plus, une expérience de CLIP a identifié des sites de liaison de MBNL dans le 3'UTR du gène Dvl1, dans le cortex frontal humain (Goodwin et al., 2015).

Nous avons également identifié une inclusion anormale de la forme +ex34/+ex35 de l'agrine uniquement dans la moelle épinière de souris dKO. Ainsi, la perte conjointe de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs de la moelle épinière induirait l'inclusion de l'exon 35 de l'agrine, l'épissage alternatif de l'exon 34 ne paraissant pas être altéré. L'agrine neurale sécrétée par le MN permet le

<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>Figure 33 : La perte de Mbnl1 et Mbnl2 spécifiquement dans les MNs induit l'inclusion de l'exon 35 de l'agrine</figcaption></figure>

Vue par « Genome browser » des sites de liaison de MBNL2 sur les ARN prémessagers de l'agrine obtenus par séquençage CLIP dont les libraries ont été générées à partir d'échantillons humains de cerveau de patients contrôles et DM1 par Goodwin et al., 2015.

Des sites de liaison de MBNL sont retrouvés dans l'intron 34 de l'ARN de l'agrine murine dans le cortex frontal humain (Goodwin et al., 2015) (Figure 33). MBNL induisant généralement l'exclusion d'un exon dont il se lie en amont (Figure 15), la protéine pourrait favoriser l'exclusion de l'exon 35. L'exon 35 fait partie des exons alternatifs de l'agrine qui forment les sites d'épissage
alternatifs Z (Hoch et al., 1993). Cet exon est inclus dans les formes Z11 et Z19 alors qu'il est exclu des formes Z8 et Z0. La forme Z0 est incapable d'induire le « clustering » des RACH tandis que l'efficacité des autres formes Z sont plus ou moins efficaces quant à ce processus (Ferns et al., 1993; Gesemann et al., 1995). Les protéines Nova1 et Nova2 ont été identifiées comme des régulateurs de l'épissage alternatif de l'exon 34 (Ruggiu et al., 2009), cependant, les protéines de liaison à l'ARN régulatrices de l'épissage alternatif des autres exons alternatifs de l'agrine ne sont pas connues.

Ainsi, les voies Wnt et Agrine-Lrp4-MuSK, centrales dans la communication synaptique et l'homéostasie de la JNM, pourraient être modifiées dans les MNs des souris dKO. L'altération de l'épissage alternatif de Dvl1 et de l'agrine pourraient participer aux défauts de communication neuromusculaire chez les souris dKO, et par extension, les patients DM1. Toutefois, les conséquences des dérégulations de l'épissage alternatif sur la fonction des protéines résultantes restent à être déterminées.

Nous avons concentré notre étude de la JNM sur le muscle tibial antérieur (TA). Cependant, la locomotion utilise le système musculaire dans son intégralité. Ainsi, même si le TA ne présente pas de décrément par EMG, il est possible que d'autres muscles soient plus impactés par la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs. D'ailleurs, les défauts de locomotion des souris Mbnl-KO se manifestent également dans les pattes avant (cf. Article figure 1), suggérant que la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs affectent également les muscles antérieurs, conduisant à des défauts globaux de la motricité. Le soleus par exemple, un autre muscle postérieur mais lent par opposition au TA (Gollnick et al., 1974), pourrait révéler un profil d'innervation avec les MNs différent du TA.

ii. La perte de Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs récapitule les défauts d'épissage DM1 identifiés dans le cerveau

Notre analyse de séquençage ARN a également révélé des altérations de l'épissage alternatif dans la moelle épinière des souris Mbnl-KO, précédemment décrites dans d'autres tissus de modèles murins et des patients DM1 (cf. Article figure 4 d).

En effet, La perte concomitante de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs induit l'inclusion de l'exon 23a du gène *Tetratricopepetide repeat, ankyrin and coiled-coil containing 2* (Tanc2) et l'inclusion de l'exon 12a du gène de la sous-unité α du canal calcique voltage-dépendant (CACNA1D) (cf. Article
Figure supplémentaire 5 b), tel que cela a été décrit dans l'hippocampe de souris délétées de Mbnl2 et le cortex temporal des patients DM1 (Charizanis et al., 2012). Par ailleurs, la perte de Mbnl1 dans les cellules de la moelle épinière induit l'inclusion de l'exon 26 du gène de la protéine 1 associée au ligand cytoplasmique (CLASP1) (cf. Article Figure supplémentaire 5 b), comme décrit dans le cortex frontral des patients DM1 (Dinca et al., 2022).

Un autre gène dont l'épissage est dérégulé dans l'hippocampe des souris DMSXL est CamkIIβ, dont l'exon 13 est anormalement exclus (Potier et al., 2022). CamkII est une protéine impliquée dans les voies du métabolisme énergétique AMPK et mTORC1 (Raney & Turcotte, 2008). A la synapse, CamkII semble intervenir dans le maintien des RACH par protection face au système ubiquitine/protéasome (Mouslim et al., 2012). De plus, il a été démontré dans un modèle murin que l'inactivation de CamkIIβ spécifiquement dans les MNs provoque des perturbations dans la voie de signalisation Agrin-Lrp4-MuSK, conduisant à des défauts de formation et de maintenance de la JNM (Y. L. Lin et al., 2022). Le défaut d'épissage de CamkIIβ dans les MNs pourrait donc également jouer un rôle sur la maintenance de la JNM dans notre modèle.

Nous avons donc révélé de nombreux évènements d'épissage alternatif altérés par la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs, dont certains précédemment décrits dans le cerveau de modèles murins ou patients DM1. Ces résultats suggèrent que le MN est un type cellulaire affecté par la séquestration des protéines MBNL causée par les répétitions CTG caractéristiques de la pathologie. Le MN pourrait donc participer au mécanisme physiopathologique de la DM1.

### iii. Impact de la perte de MBNL dans les cellules de Schwann terminales

La JNM est une structure tripartite (cf. Introduction 3.2.1). Bien que nous nous soyons concentrés sur les parties pré- et postsynaptiques de la JNM, nous avons relevé un engouffrement anormal du bouton synaptique par des cellules de Schwann terminales (tSC) exclusivement dans les TA des souris dKO (cf. Article figure supplémentaire 3). Les tSC sont notamment impliquées dans la régénération de la JNM (cf. Introduction 3.2.3.2), nous ne savons donc pas si ce comportement hors du commun est dû au fonctionnement normal de la tSC dans un cadre régénératif causé par la perte de MBNL dans les MNs ou à une altération des tSC en elles-mêmes. Dans ce dernier cas, la perte de MBNL dans les MNs et les tSC leur serait détrimentaire. L'expression des transcrits mutés DMPK n'a jamais été investiguée dans les tSC, elles sont cependant altérées dans la Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), une autre dystrophie musculaire. (Revu par Santosa, Keane, Jablonka-Shariff, Vannucci, & Snyder-Warwick, 2018).
Notre travail suggérant une implication de la JNM au mécanisme pathologique de la DM1, il est
possible que les tSC y participent.

b. Rôle des protéines MBNL dans le muscle squelettique sur la communication neuromusculaire

La ressemblance des altérations postsynaptiques entre les JNM des TA des souris Mbnl1-KO, dKO (cf. Article figure 3) et ceux exprimant le shMBNL (cf. Résultats complémentaires figure 30) suggère qu'elles sont, au moins partiellement, dues à la perte de MBNL1 dans le muscle squelettique. Il a été montré précédemment que l'épissage alternatif de l'exon 6 de MUSK et l'exon 4 de CHRNG est altéré dans des cellules musculaires dérivées de fœtus DM1 avec plus de 1000 répétitions CTG en comparaison à celles dérivées de fœtus sains, et dans du tissu de patients DM1 pour CHRNG (Klinck et al., 2014). L'exon 6 de Musk code, avec l'exon 7 constitutif, le 3ème domaine immunoglobuline G (Ig3) de la protéine. Bien que ce domaine ne soit pas essentiel au « clustering » des RACH par la voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK (H. Zhou et al., 1999), il est nécessaire pour la co-liaison de Musk avec les protéines de la morphogenèse osseuse (BMP) (Yilmaz et al., 2016). Les BMP interviennent dans le développement de nombreux tissus, dont le muscle squelettique (revue par Katagiri & Watabe, 2016).

Cette activité de MuSK est nécessaire pour l'expression de la protéine *regulator of G protein signaling 4* (RGS4) dont l'altération inhibe l'activité des RACH muscariniques dans des myoblastes (Yilmaz et al., 2016). Par ailleurs, la régulation dépendant des BMP de MuSK semble affecter le profil d'expression de gènes spécifiques aux muscles lents (Yilmaz et al., 2016). Si ce domaine est affecté dans notre modèle, il serait d'autant plus intéressant d'étudier les JNM du soleus, un muscle lent.

La sous-unité gamma des RACH n'est produite qu'au stade fœtal, suite à quoi elle est remplacée par la sous-unité ε des RACH (CHRNE) (Gu & Hall, 1988). La délétion de CHRNG chez la souris compromet le processus de « prepatterning » des RACH (Y. Liu et al., 2008) tandis que des mutations chez l'homme conduisent à des myasthénies (Morgan et al., 2006). Les effets de l'altération de l'épissage alternatif de MuSK et CHRNG n'ont pas été étudiés dans la DM1 mais pourraient contribuer à des défauts neuromusculaires chez les patients.

CamkIIβ est un autre gène exprimé dans le muscle squelettique et dont l'épissage est dérégulé dans le muscle squelettique des souris Mbnl1-KO et HSA<sup>LR</sup> (X. Lin et al., 2006) ainsi que chez les
patients DM1 (Nakamori et al., 2013). CamkII est un activateur de la kinase activée par l'AMP (AMPK) (Hart et al., 2015). AMPK, quant à elle, est impliquée dans la voie de signalisation AMPK/mTORC1 de régulation du métabolisme. Ainsi, AMPK promeut l'initiation du mécanisme autophagique tandis mTORC1 l'inhibe (J. Kim et al., 2011).

Les répétitions CTG caractéristiques de la DM1 semblent déréguler ces adaptations de la cellule musculaire à l'environnement. En effet, le processus autophagique ne semble pas s'activer dans des muscles de souris HSA<sup>LR</sup> et de patients DM1, malgré des conditions de privation, propices à l'autophagie (Brockhoff et al., 2017). La dérégulation de l'autophagie dans la DM1 pourrait participer à la dégradation des JNM, tels que le montrent des altérations de la plaque motrice chez des modèles murins avec des défaillance de la voie de signalisation mTOR (Baraldo et al., 2020; revue par Castets, Ham, & Rüegg, 2020).

### c. MBNL et le transport des ARN dans l'unité motrice

Les protéines MBNL sont impliquées dans différents mécanismes moléculaires du métabolisme de l'ARN (cf. Introduction 2.4). Outre leur rôle de régulateur de l'épissage alternatif, les protéines MBNL peuvent également se lier au 3'UTR de leurs cibles ARN et diriger le choix du site de polyadénylation et influencer la localisation ou la stabilité des ARN cibles (Batra et al., 2014; Masuda et al., 2012, cf. Introduction 2.4.2.1 et 2.4.2.3). Au sein des cellules neuronales, les transcrits sont fréquemment localisés entre le corps cellulaire et les projections neuronales (Cajigas et al., 2012). L'enrichissement différentiel des transcrits dans différents compartiments des cellules neuronales s'accompagne de leur traduction locale et contribue au maintien de la polarité neuronale mais aussi à la neurotransmission (Mattioli et al., 2019; revue par Rajgor, Welle, & Smith, 2021).

Pour certains gènes, les isoformes de clivage et de polyadénylation alternatifs (APA) sont localisées différemment entre ces compartiments, ainsi le choix du site APA influence directement la localisation du transcrit (revue par Waldron, 2016). Ainsi il a été montré que les régions 3'UTR des transcrits issus de l'utilisation des derniers exons alternatifs distaux (ALE) contiennent plus de motifs de liaisons à des protéines liant l'ARN comme les protéines MBNL (Taliaferro et al., 2016). Ainsi la déplétion de MBNL diminue l'association des isoformes à APA distaux des fractions membranaires (E. T. Wang et al., 2012). De plus, la dérégulation induite par la perte de MBNL suit un principe similaire à l'épissage alternatif : les transitions des isoformes APA fœtales à celles adultes sont dérégulées dans le muscle squelettique du modèle HSA<sup>LR</sup> et chez les patients DM (Batra et al., 2014).
Nous pourrions ainsi compléter notre analyse de l'épissage alternatif par la technique de séquençage poly(A)-seq afin d'identifier des cibles potentielles soumises au transport et à la traduction locale dépendant de MBNL. L'isolation des MNs serait, là encore, utile pour distinguer le rôle de MBNL1 spécifiquement dans les MNs, étant directement impliqué dans le transport des ARN dans les cellules neuronales (Hildebrandt et al., 2022). Ces mécanismes étant également mis en place dans le muscle squelettique (Denes et al., 2021), une approche similaire sur des ARN extraits de JNM isolées pourrait révéler des altérations dans cette structure à l'interface du SNP et du muscle squelettique.

### 3. Les atteintes de la communication neuromusculaire dans la DM1

#### a. Les anomalies structurales et fonctionnelles du SNP chez les patients DM1

Les altérations de la communication neuromusculaire des patients DM1 prêtent à débat. En effet, peu d'études se sont penchées spécifiquement sur l'implication de la JNM et du MN sur la force musculaire, la DM1 étant principalement connue comme une « myopathie ». Ainsi, une étude a relevé des troubles de la communication axonale chez des patients DM1 (Krishnan & Kiernan, 2006), tandis qu'une autre suggère des défauts fonctionnels de la JNM (Bombelli et al., 2016). En revanche, d'autres identifient la faiblesse musculaire comme strictement myopathique (Caughey & Myrianthopoulos, 1963). Ces études s'accordent cependant sur la grande hétérogénéité de l'atteinte périphérique chez les patients DM1. Il est en effet possible que celle-ci dépende de la forme clinique. Des mesures électrophysiologiques sur une cohorte plus grande, celles précédemment citées n'ayant pu recruter au maximum qu'une dizaine de patients souvent avec une forme adulte ou tardive, pourraient renseigner sur les défauts de communication neuromusculaire des patients DM1. Les anomalies structurales des JNM des patients DM1 montrent elles aussi la variété des altérations des plaques motrices parmi les patients (cf. Introduction 3.4). Ces études se basent également sur des petites cohortes et datent d'il y a plus de 40 ans. Une caractérisation ultrastructurale mais aussi structurale des JNM de plus de patients permettrait de déterminer les leurs défauts en fonction du phénotype clinique.

En plus des déficits de la structure des JNM que développent les patients DM1 et certains modèles DM1 ou de perte de MBNL (K. Y. Lee et al., 2013; Panaite et al., 2013), une autre étude a décrit un déficit de la forme 16S de l'AChE chez des patients DM1 congénitaux (Fardeau & Tomé, 1980). La forme 16S de l'AChE est produite dans le muscle squelettique et, au moins en
partie, sécrétée par le MN (Fernandez, 1981; Koenig & Vigny, 1978). L'AChE assure l'élimination rapide de l'ACh rémanente après une un potentiel de plaque (Rosenberry, 1979). Dans le but de vérifier une possible altération de l'expression et/ou de l'activité AchE dans nos modèles murins, nous avons effectué des marquages de l'AChE par immunofluorescence et regardé son activité par la méthode de Koëlle (Figure 34).

<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>Figure 34 : La perte de MBNL dans l'unité motrice n'altère pas l'homéostasie de l'AChE</figcaption></figure>

(a) Images confocales représentatives de coupes transversales de TA de souris CTL, Hb9Cre-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO et dKO. AChE (Fasciculine).

(b) Images représentatives de coupes transversales de TA de souris CTL, Hb9Cre-Mbnl2-KO, Mbnl1-KO et dKO. Activité de l'AChE (réaction de Koëlle).

L'AChE est présente chez les souris CTL, Mbnl1-KO, Hb9Cre-Mbnl2-KO et dKO âgées de 4 mois (Figure 34 a). De plus, il n'y a pas de différence d'activité de l'AChE entre les différents génotypes étudiés (Figure 34 b). Ainsi, la perte ubiquitaire de Mbnl1, associée ou non à une perte spécifique au MN de Mbnl2, n'a pas d'impact sur la présence de l'AChE ou son activité dans le TA. Soit la dérégulation de l'AChE dans la DM1 est due à un autre mécanisme que la perte de
fonction de MBNL, soit l'AChE n'est pas affectée dans la DM1, la publication à la source de cette
information n'ayant étudié que 3 patients congénitaux dont 2 présentaient un déficit de la forme
16S de l'AChE (Fardeau & Tomé, 1980). Il est également possible que la perte de cette forme de
l'AChE ne soit pas suffisante pour observer une diminution globale des AChE, ou qu'elle soit
compensée par d'autre isoformes.

b. Contribution nerveuse au déficit locomoteur des patients DM1

Nous avons décrit pour la première fois des défauts locomoteurs dus à la perte de MBNL1
de manière ubiquitaire, avec ou sans une perte de MBNL2 spécifiquement dans les MNs (cf. Article
figure 1). Quelques études ont identifié des défauts de la motricité chez des patients DM1 (Galli et
al., 2012; R. B. Wright et al., 1995) qui corrèlent avec la myopathie chez ces patients (Bachasson et
al., 2016). Les altérations neuronales des patients DM1 pourraient cependant participer au déficit
locomoteur que rencontrent les patients, tel que cela a été décrit dans la DMD (Goudriaan et al.,
2018). Dans ce sens, la faiblesse musculaire ne semble pas corrélée aux défauts de coordination
chez les patients DM1 (Naro et al., 2019). L'aggravation du profil de marche entre les souris Mbnl1-
KO et dKO (cf. Article figure 1d) illustre cette possibilité et suggère que les défauts de coordination
dans la DM1 pourraient être dus, au moins en partie, à la perte de MBNL dans le SNC et plus
précisément dans les MNs.
Conclusion & perspectives

Mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence l'importance des protéines MBNL pour la communication neuromusculaire. Les anomalies structurales sévères de la JNM associées aux défauts de locomotion dus à la perte des protéines MBNL montrent que celles-ci sont impliquées dans le maintien de la JNM et sa fonction. Les causes moléculaires de ces altérations restent à définir. En effet, nous avons révélé de possibles voies métaboliques et de signalisation dérégulées par la perte de MBNL1 et MBNL2 dans les MNs mais la nature tissu-, et non cellule, - spécifique de notre analyse ne permet pas d'en mesurer la portée sur la fonction du MN. Il est donc désormais nécessaire de confirmer ces altérations de l'épissage alternatif et d'en caractériser les conséquences fonctionnelles. L'inclusion de l'exon 14b de Dvl1 dans les MNs constitue un bon candidat pour cette approche. Des cellules souches pluripotentes de patients DM1 reprogrammées en MNs, en coculture avec des cellules musculaires, permettraient de confirmer l'implication de ce défaut d'épissage dans la communication neuromusculaire dans la DM1. De manière plus globale, notre analyse a révélé des défauts du métabolisme des vésicules synaptiques. Celles-ci ne sont pas importantes que pour la communication neuromusculaire mais également dans les synapses purement neuronales du SNC. La perte de MBNL1 et MBNL2 pourrait, de cette manière, participer aux altérations neurologiques et neuromusculaires de la DM1.

Par ailleurs, MBNL étant majoritairement décrit comme un régulateur de l'épissage alternatif, nous avons axé notre analyse sur cet aspect. Cependant, la diversité des modes de régulation du métabolisme des ARN par MBNL gagne de plus en plus l'intérêt de la communauté des chercheurs de la DM1. Afin de caractériser les différents échelons de la régulation des ARN dans les MNs, des expériences complémentaires sont nécessaires. La localisation et le transport associés aux sites de polyadénylation des ARN constituent de bons candidats pour approfondir notre savoir sur MBNL dans les MNs, surtout en considérant l'importance de ces processus dans des cellules polarisées comme les neurones. La grande proportion de gènes dérégulés dans les MNs en lien avec les microtubules, plateformes pour le transport vésiculaire, appuie encore davantage cette perspective.

La transposition aux patients DM1 de nos conclusions requiert de caractériser les mécanismes dérégulés dans notre modèle chez un ou plusieurs modèles DM1 et dans des tissus de patients DM1. Malgré tout, nos résultats suggèrent, pour la première fois, que le MN est impliqué dans la physiopathologie de la DM1. Ce travail remet au goût du jour la notion de contribution du
système nerveux périphérique, mais également du SNC, dans les atteintes musculaires de la DM1.
La contribution nerveuse aux troubles myopathiques de la DM1 n'a pas été étudiée dans des
proportions suffisantes. La DM1 pose en effet problème quant à l'extrême variabilité des
symptômes parmi les patients, tant pour la nature de l'organe touché que son degré de défaillance.
La caractérisation de la DM1 nécessite donc des études extrêmement complètes avec un grand
nombre de patients, de différentes formes cliniques, ce qui est souvent incompatible avec sa faible
prévalence.

En ayant soulevé les questions de l'implication des MNs et de la communication
neuromusculaire dans la DM1, nous espérons que davantage d'attention sera portée sur ces aspects
dans la DM1. La complexité de la régulation des protéines MBNL dans autant de tissus est à l'image
des altérations que causent leur perte. Il est donc nécessaire d'en définir le rôle et les cibles dans les
tissus affectés pour parvenir à clarifier l'intrication du mécanisme pathologique de la DM1.
Bibliographie

Abbruzzese, C., Krahe, R., Liguori, M., Tessarolo, D., Siciliano, M. J., Ashizawa, T., & Giacanelli, M. (1996). Myotonic dystrophy phenotype without expansion of (CTG)n repeat: An entity distinct from proximal myotonic myopathy (PROMM)? *Journal of Neurology*, **243**(10), 715-721. https://doi.org/10.1007/BF00873977

Adereth, Y., Dammai, V., Kose, N., Li, R., & Hsu, T. (2005). RNA-dependent integrin α3 protein localization regulated by the Muscleblind-like protein MLP1. *Nature Cell Biology*, **7**(12), 1140–1147. https://doi.org/10.1038/ncb1335

Allan, D. W., & Greer, J. J. (1997). Development of phrenic motoneuron morphology in the fetal rat. *Journal of Comparative Neurology*, **382**(4), 469–479. https://doi.org/10.1002/(SICI)1096-9861(19970616)382:4<469::AID-CNE4>3.0.CO;2-0

Allen, D. E., Johnson, A. G., & Woolf, A. L. (1969). The intramuscular nerve endings in dystrophia myotonica--a biopsy study by vital staining and electron microscopy. *Journal of Anatomy*, **105**(Pt 1), 1-26.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1232086/pdf/janat00396-0008.pdf

Allen, N. J. (2014). Astrocyte regulation of synaptic behavior. *Annual Review of Cell and Developmental Biology*, **30**(1), 439–463. https://doi.org/10.1146/annurev-cellbio-100913-013053

Allen, N. J., & Eroglu, C. (2017). Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. In *Neuron* (Vol. 96, Issue 3, pp. 697–708). https://doi.org/10.1016/j.neuron.2017.09.056

Allen, N. J., & Lyons, D. A. (2018). Glia as architects of central nervous system formation and function. In *Science* (Vol. 362, Issue 6411, pp. 181–185).
https://doi.org/10.1126/science.aat0473

Almeida, R. G., & Lyons, D. A. (2017). On myelinated axon plasticity and neuronal circuit formation and function. *Journal of Neuroscience*, **37**(42), 10023-10034.
https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3185-16.2017

Alsaggaf, R., St. George, D. M. M., Zhan, M., Pfeiffer, R. M., Wang, Y., Wagner, K. R., Greene, M. H., Amr, S., & Gadalla, S. M. (2018). Cancer Risk in Myotonic Dystrophy Type I: Evidence of a Role for Disease Severity. *JNCI Cancer Spectrum*, **2**(4).
https://doi.org/10.1093/jncics/PKY052

Alvarez-Medina, R., Cayuso, J., Okubo, T., Takada, S., & Martí, E. (2008). Wnt canonical pathway restricts graded Shh/Gli patterning activity through the regulation of Gli3 expression. *Development*, **135**(2), 237-247. https://doi.org/10.1242/dev.012054

Alwazzan, M., Newman, E., Hamshere, M. G., & Brook, J. D. (1999). Myotonic dystrophy is associated with a reduced level of RNA from the DMWD allele adjacent to the expanded repeat. *Human Molecular Genetics*, **8**(8), 1491-1497. https://doi.org/10.1093/hmg/8.8.1491

Amack, J. D., Paguio, A. P., & Mahadevan, M. S. (1999). Cis and trans effects of the myotonic dystrophy (DM) mutation in a cell culture model. *Human Molecular Genetics*, **8**(11), 1975-1984. https://doi.org/10.1093/hmg/8.11.1975

Amenta, A. R., Creely, H. E., Mercado, M. L. T., Hagiwara, H., McKechnie, B. A., Lechner, B. E., Rossi, S. G., Wang, Q., Owens, R. T., Marrero, E., Mei, L., Hoch, W., Young, M. F., McQuillan, D. J., Rotundo, R. L., & Fallon, J. R. (2012). Biglycan Is an Extracellular MuSK Binding Protein Important for Synapse Stability. *Journal of Neuroscience*, **32**(7), 2324-2334.
https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4610-11.2012

An, M. C., Lin, W., Yang, J., Dominguez, B., Padgett, D., Sugiura, Y., Aryal, P., Gould, T. W., Oppenheim, R. W., Hester, M. E., Kaspar, B. K., Ko, C. P., & Lee, K. F. (2010).
Acetylcholine negatively regulates development of the neuromuscular junction through distinct cellular mechanisms. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*, **107**(23), 10702–10707. https://doi.org/10.1073/pnas.1004956107

André, L. M., Ausems, C. R. M., Wansink, D. G., & Wieringa, B. (2018). Abnormalities in skeletal muscle myogenesis, growth, and regeneration in myotonic dystrophy. In *Frontiers in Neurology* (Vol. 9, Issue MAY, p. 368). Frontiers. https://doi.org/10.3389/fneur.2018.00368

André, L. M., van Cruchten, R. T. P., Willemse, M., Bezstarosti, K., Demmers, J. A. A., van Agtmaal, E. L., Wansink, D. G., & Wieringa, B. (2019). Recovery in the myogenic program of congenital myotonic dystrophy myoblasts after excision of the expanded (CTG)n repeat. *International Journal of Molecular Sciences*, **20**(22), 5685. https://doi.org/10.3390/ijms20225685

Andreassi, C., & Riccio, A. (2009). To localize or not to localize: mRNA fate is in 3'UTR ends. In *Trends in Cell Biology* (Vol. 19, Issue 9, pp. 465–474). Trends Cell Biol. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2009.06.001

Angeard, N., Gargiulo, M., Jacquette, A., Radvanyi, H., Eymard, B., & Héron, D. (2007). Cognitive profile in childhood myotonic dystrophy type 1: Is there a global impairment? *Neuromuscular Disorders*, **17**(6), 451–458. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2007.02.012

Antonini, G., Clemenzi, A., Bucci, E., Morino, S., Garibaldi, M., Sepe-Monti, M., Giubilei, F., & Novelli, G. (2009). Erectile dysfunction in myotonic dystrophy type 1 (DM1). In *Journal of Neurology* (Vol. 256, Issue 4, pp. 657–659). Springer. https://doi.org/10.1007/s00415-009-0912-4

Antonini, G., Mainero, C., Romano, A., Giubilei, F., Ceschin, V., Gragnani, F., Marino, S., Fiorelli, M., Soscia, F., Di Pasquale, A., Caramia, F., Morino, S., Fiorelli, M., Soscia, F., & Pasquale, A. Di. (2004). Cerebral atrophy in myotonic dystrophy: A voxel based morphometric study. *J Neurol Neurosurg Psychiatry*, **75**(11), 1611–1613. https://doi.org/10.1136/jnnp.2003.032417

Antonini, G., Vichi, R., Leardi, M. G., Pennisi, E., Monza, G. C., & Millefiorini, M. (1990). Effect of clomipramine on myotonia: A placebo-controlled, double-blind, crossover trial. *Neurology*, **40**(9), 1473. https://doi.org/10.1212/WNL.40.9.1473

Anvret, M., Ahlberg, G., Grandell, U., Hedberg, B., Johnson, K., & Edstrom, L. (1993). Larger expansions of the CTG repeat in muscle compared to lymphocytes from patients with myotonic dystrophy. *Human Molecular Genetics*, **2**(9), 1397–1400. https://doi.org/10.1093/hmg/2.9.1397

Apel, E. D., Roberds, S. L., Campbell, K. P., & Merlie, J. P. (1995). Rapsyn may function as a link between the acetylcholine receptor and the agrin-binding dystrophin-associated glycoprotein complex. In *Neuron* (Vol. 15, Issue 1). https://doi.org/10.1016/0896-6273(95)90069-1

Arandel, L., Matloka, M., Klein, A. F., Rau, F., Sureau, A., Ney, M., Cordier, A., Kondili, M., Polay-Espinoza, M., Naouar, N., Ferry, A., Lemaitre, M., Begard, S., Colin, M., Lamarre, C., Tran, H., Buée, L., Marie, J., Sergeant, N., & Furling, D. (2022). Reversal of RNA toxicity in myotonic dystrophy via a decoy RNA-binding protein with high affinity for expanded CUG repeats. *Nature Biomedical Engineering*, **6**(2), 207–220. https://doi.org/10.1038/s41551-021-00838-2

Arber, S., Han, B., Mendelsohn, M., Smith, M., Jessell, T. M., & Sockanathan, S. (1999). Requirement for the homeobox gene Hb9 in the consolidation of motor neuron identity. *Neuron*, **23**(4), 659–674. https://doi.org/10.1016/S0896-6273(01)80026-X

Armand, J. (1982). The Origin, Course and Terminations of Corticospinal Fibers in Various Mammals. *Progress in Brain Research*, **57**(C), 329–360. https://doi.org/10.1016/S0079-6123(08)64136-9

Ashizawa, T., Anvret, M., Baiget, M., Barceló, J. M., Brunner, H., Cobo, A. M., Dallapiccola, B.,
Fenwick, R. G., Grandell, U., Harley, H., Junien, C., Koch, M. C., Korneluk, R. G., Lavedan, C., Miki, T., Mulley, J. C., De López Munain, A., Novelli, G., Roses, A. D., ... Harper, P. S. (1994). Characteristics of intergenerational contractions of the CTG repeat in myotonic dystrophy. *American Journal of Human Genetics*, 54(3), 414–423.

Ashizawa, T., Dubel, J. R., & Harati, Y. (1993). Somatic instability of ctg repeat in myotonic dystrophy. *Neurology*, 43(12), 2674–2678. https://doi.org/10.1212/wnl.43.12.2674

Ashizawa, T., & Sarkar, P. S. (2011). Myotonic dystrophy types 1 and 2. In *Handbook of Clinical Neurology* (Vol. 101). Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-08-045031-5.00015-3

Ashwal-Fluss, R., Meyer, M., Pamudurti, N. R., Ivanov, A., Bartok, O., Hanan, M., Evantal, N., Memczak, S., Rajewsky, N., & Kadener, S. (2014). CircRNA Biogenesis competes with Pre-mRNA splicing. *Molecular Cell*, 56(1), 55–66. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.08.019

Bachasson, D., Moraux, A., Ollivier, G., Decostre, V., Ledoux, I., Gidaro, T., Servais, L., Behin, A., Stojkovic, T., Hébert, L. J., Puymirat, J., Eymard, B., Bassez, G., & Hogrel, J. Y. (2016). Relationship between muscle impairments, postural stability, and gait parameters assessed with lower-trunk accelerometry in myotonic dystrophy type 1. *Neuromuscular Disorders*, 26(7), 428–435. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2016.05.009

Bachinski, L. L., Udd, B., Meola, G., Sansone, V., Bassez, G., Eymard, B., Thornton, C. A., Moxley, R. T., Harper, P. S., Rogers, M. T., Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F., Wieser, T., Gamez, J., Navarro, C., Bottani, A., Kohler, A., Shriver, M. D., Sallinen, R., ... Krahe, R. (2003). Confirmation of the Type 2 Myotonic Dystrophy (CCTG)n Expansion Mutation in Patients with Proximal Myotonic Myopathy/Proximal Myotonic Dystrophy of Different European Origins: A Single Shared Haplotype Indicates an Ancestral Founder Effect. *American Journal of Human Genetics*, 73(4), 835–848. https://doi.org/10.1086/378566

Baker, R. W., & Hughson, F. M. (2016). Chaperoning SNARE assembly and disassembly. *Nature Reviews Molecular Cell Biology*, 17(8), 465–479. https://doi.org/10.1038/nrm.2016.65

Balice-Gordon, R. J., & Lichtman, J. W. (1994). Long-term synapse loss induced by focal blockade of postsynaptlc receptors. *Nature*, 372(6506), 519–524.
https://doi.org/10.1038/372519a0

Bandyopadhyay, U., Fenton, W. A., Horwich, A. L., & Nagy, M. (2014). Production of RNA for Transcriptomic Analysis from Mouse Spinal Cord Motor Neuron Cell Bodies by Laser Capture Microdissection. *Journal of Visualized Experiments*, 83, e51168–e51168.
https://doi.org/10.3791/51168

Banerjee, A., Ifrim, M. F., Valdez, A. N., Raj, N., & Bassell, G. J. (2018). *Aberrant RNA translation in fragile X syndrome: From FMRP mechanisms to emerging therapeutic strategies*. https://doi.org/10.1016/j.brainres.2018.04.008

Baraldo, M., Geremia, A., Pirazzini, M., Nogara, L., Solagna, F., Türk, C., Nolte, H., Romanello, V., Megighian, A., Boncompagni, S., Kruger, M., Sandri, M., & Blaauw, B. (2020). Skeletal muscle mTORC1 regulates neuromuscular junction stability. *Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle*, 11(1), 208–225. https://doi.org/10.1002/jcsm.12496

Barbé, L., Lanni, S., López-Castel, A., Franck, S., Spits, C., Keymolen, K., Seneca, S., Tomé, S., Miron, I., Letourneau, J., Liang, M., Choufani, S., Weksberg, R., Wilson, M. D., Sedlacek, Z., Gagnon, C., Musova, Z., Chitayat, D., Shannon, P., ... Pearson, C. E. (2017). CpG Methylation, a Parent-of-Origin Effect for Maternal-Biased Transmission of Congenital Myotonic Dystrophy. *American Journal of Human Genetics*, 100(3), 488–505.
https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2017.01.033

Bargiela, A., Sabater-Arcis, M., Espinosa-Espinosa, J., Zulaica, M., De Munain, A. L., & Artero, R. (2019). Increased Muscleblind levels by chloroquine treatment improve myotonic dystrophy type 1 phenotypes in in vitro and in vivo models. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*, 116(50), 25203–25213.
https://doi.org/10.1073/pnas.1820297116

Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., & Mei, L. (2016). Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. *Journal of Neuroscience*, **36**(38), 9770–9781. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.0174-16.2016

Barik, A., Lu, Y., Sathyamurthy, A., Bowman, A., Shen, C., Li, L., Xiong, W. C., & Mei, L. (2014). LRP4 is critical for neuromuscular junction maintenance. *Journal of Neuroscience*, **34**(42), 13892–13905. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.1733-14.2014

Barreau, C., Paillard, L., Méreau, A., & Osborne, H. B. (2006). Mammalian CELF/Bruno-like RNA-binding proteins: molecular characteristics and biological functions. In *Biochimie* (Vol. 88, Issue 5, pp. 515–525). https://doi.org/10.1016/j.biochi.2005.10.011

Bashaw, G. J., & Klein, R. (2010). Signaling from axon guidance receptors. *Cold Spring Harbor Perspectives in Biology*, **2**(5), a001941. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a001941

Bassez, G., Chapoy, E., Bastuji-Garin, S., Radvanyi-Hoffman, H., Authier, F. J., Pellissier, J. F., Eymard, B., & Gherardi, R. K. (2008). Type 2 myotonic dystrophy can be predicted by the combination of type 2 muscle fiber central nucleation and scattered atrophy. *Journal of Neuropathology and Experimental Neurology*, **67**(4), 319–325.
https://doi.org/10.1097/NEN.0b013e31816b4acc

Bassez, G., Lazarus, A., Desguerre, I., Varin, J., Laforêt, P., Bécane, H. M., Meune, C., Arne-Bes, M. C., Ounnoughene, Z., Radvanyi, H., Eymard, B., & Duboc, D. (2004). Severe cardiac arrhythmias in young patients with myotonic dystrophy type 1. *Neurology*, **63**(10), 1939–1941.
https://doi.org/10.1212/01.WNL.0000144343.91136.CF

Batra, R., Charizanis, K., Manchanda, M., Mohan, A., Li, M., Finn, D. J., Goodwin, M., Zhang, C., Sobczak, K., Thornton, C. A., & Swanson, M. S. (2014). Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease. *Molecular Cell*, **56**(2), 311–322. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.08.027

Batra, R., Charizanis, K., & Swanson, M. S. (2010). Partners in crime: Bidirectional transcription in unstable microsatellite disease. *Human Molecular Genetics*, **19**(R1), R77–R82.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddq132

Batra, R., Nelles, D. A., Pirie, E., Blue, S. M., Marina, R. J., Wang, H., Chaim, I. A., Thomas, J. D., Zhang, N., Nguyen, V., Aigner, S., Markmiller, S., Xia, G., Corbett, K. D., Swanson, M. S., & Yeo, G. W. (2017). Elimination of Toxic Microsatellite Repeat Expansion RNA by RNA-Targeting Cas9. *Cell*, **170**(5), 899–912.e10. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.07.010

Batten, F. E., & Gibb, H. P. (1909). Myotonia atrophica. *Brain*, **32**(2), 187–205.
https://doi.org/10.1093/brain/32.2.187

Baylor, S. M., & Hollingworth, S. (2011). Calcium indicators and calcium signalling in skeletal muscle fibres during excitation-contraction coupling. In *Progress in Biophysics and Molecular Biology* (Vol. 105, Issue 3, pp. 162–179). https://doi.org/10.1016/j.pbiomolbio.2010.06.001

Beffert, U., Dillon, G. M., Sullivan, J. M., Stuart, C. E., Gilbert, J. P., Kambouris, J. A., & Ho, A. (2012). Microtubule plus-end tracking protein CLASP2 regulates neuronal polarity and synaptic function. *Journal of Neuroscience*, **32**(40), 13906–13916.
https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.2108-12.2012

Begemann, G., Paricio, N., Artero, R., Kiss, I., Pérez-Alonso, M., & Mlodzik, M. (1997). muscleblind, a gene required for photoreceptor differentiation in Drosophila, encodes novel nuclear Cys3His-type zinc-finger-containing proteins. *Development (Cambridge, England)*, **124**(21), 4321–4331. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0034248

Bellini, M., Biagi, S., Stasi, C., Costa, F., Mumolo, M. G., Ricchiuti, A., & Marchi, S. (2006). Gastrointestinal manifestations in myotonic muscular dystrophy. In *World Journal of Gastroenterology* (Vol. 12, Issue 12, pp. 1821–1828). Baishideng Publishing Group Inc.
https://doi.org/10.3748/wjg.v12.i12.1821

Belotti, E., & Schaeffer, L. (2020). Regulation of Gene expression at the neuromuscular Junction. Neuroscience Letters, 735(June). https://doi.org/10.1016/j.neulet.2020.135163

Benders, A. A. G. M., Groenen, P. J. T. A., Oerlemans, F. T. J. J., Veerkamp, J. H., & Wieringa, B. (1997). Myotonic dystrophy protein kinase is involved in the modulation of the Ca2+ homeostasis in skeletal muscle cells. *Journal of Clinical Investigation*, *100*(6), 1440–1447.
https://doi.org/10.1172/JCI119664

Bergamin, E., Hallock, P. T., Burden, S. J., & Hubbard, S. R. (2010). The Cytoplasmic Adaptor Protein Dok7 Activates the Receptor Tyrosine Kinase MuSK via Dimerization. *Molecular Cell*, *39*(1), 100–109. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2010.06.007

Berul, C. I., Maguire, C. T., Aronovitz, M. J., Greenwood, J., Miller, C., Gehrmann, J., Housman, D., Mendelsohn, M. E., & Reddy, S. (1999). DMPK dosage alterations result in atrioventricular conduction abnormalities in a mouse myotonic dystrophy model. *Journal of Clinical Investigation*, *103*(4), R1-7. https://doi.org/10.1172/JCI5346

Berul, C. I., Maguire, C. T., Gehrmann, J., & Reddy, S. (2000). Progressive atrioventricular conduction block in a mouse myotonic dystrophy model. *Journal of Interventional Cardiac Electrophysiology*, *4*(2), 351–358. https://doi.org/10.1023/A:1009842114968

Bessou, P., Emonet-Dénand, F., & Laporte, Y. (1965). Motor fibres innervating extrafusal and intrafusal muscle fibres in the cat. *The Journal of Physiology*, *180*(3), 649–672.
https://doi.org/10.1113/jphysiol.1965.sp007722

Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., & Lichtman, J. W. (2004). Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. *Neuron*, *44*(4), 651–661.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2004.10.026

Bombelli, F., Lispi, L., Porrini, S. C., Giacanelli, M., Terracciano, C., Massa, R., & Petrucci, A. (2016). Neuromuscular transmission abnormalities in myotonic dystrophy type 1: A neurophysiological study. *Clinical Neurology and Neurosurgery*, *150*, 84–88.
https://doi.org/10.1016/j.clineuro.2016.08.020

Bondy-Chorney, E., Crawford Parks, T. E., Ravel-Chapuis, A., Jasmin, B. J., & Côté, J. (2016). Staufen1s role as a splicing factor and a disease modifier in Myotonic Dystrophy Type I. *Rare Diseases*, *4*(1), e1225644. https://doi.org/10.1080/21675511.2016.1225644

Botta, A., Vallo, L., Rinaldi, F., Bonifazi, E., Amati, F., Biancolella, M., Gambardella, S., Mancinelli, E., Angelini, C., Meola, G., & Novelli, G. (2007). Gene expression analysis in myotonic dystrophy: Indications for a common molecular pathogenic pathway in DM1 and DM2. *Gene Expression*, *13*(6), 339–351. https://doi.org/10.3727/000000006781510705

Brembilla-Perrot, B., Schwartz, J., Huttin, O., Frikha, Z., Sellal, J. M., Sadoul, N., Blangy, H., Olivier, A., Louis, S., & Kaminsky, P. (2014). Atrial flutter or fibrillation is the most frequent and life-threatening arrhythmia in myotonic dystrophy. *PACE - Pacing and Clinical Electrophysiology*, *37*(3), 329–335. https://doi.org/10.1111/pace.12260

Brill, M. S., Kleele, T., Ruschkies, L., Wang, M., Marahori, N. A., Reuter, M. S., Hausrat, T. J., Weigand, E., Fisher, M., Ahles, A., Engelhardt, S., Bishop, D. L., Kneussel, M., & Misgeld, T. (2016). Branch-Specific Microtubule Destabilization Mediates Axon Branch Loss during Neuromuscular Synapse Elimination. *Neuron*, *92*(4), 845–856.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2016.09.049

Briscoe, J., Pierani, A., Jessell, T. M., & Ericson, J. (2000). A homeodomain protein code specifies progenitor cell identity and neuronal fate in the ventral neural tube. *Cell*, *101*(4), 435–445.
https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)80853-3

Brockhoff, M., Rion, N., Chojnowska, K., Wiktorowicz, T., Eickhorst, C., Erne, B., Frank, S., Angelini, C., Furling, D., Rüegg, M. A., Sinnreich, M., & Castets, P. (2017). Targeting
deregulated AMPK/mTORC1 pathways improves muscle function in myotonic dystrophy type i. *Journal of Clinical Investigation*, **127**(2), 549–563. https://doi.org/10.1172/JCI89616

Broix, L., Turchetto, S., & Nguyen, L. (2021). Coordination between Transport and Local Translation in Neurons. In *Trends in Cell Biology* (Vol. 31, Issue 5, pp. 372–386). Elsevier. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2021.01.001

Brook, J. D., McCurrach, M. E., Harley, H. G., Buckler, A. J., Church, D., Aburatani, H., Hunter, K., Stanton, V. P., Thirion, J. P., Hudson, T., Sohn, R., Zemelman, B., Snell, R. G., Rundle, S. A., Crow, S., Davies, J., Shelbourne, P., Buxton, J., Jones, C., ... Housman, D. E. (1992). Molecular basis of myotonic dystrophy: Expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. *Cell*, **68**(4), 799–808. https://doi.org/10.1016/0092-8674(92)90154-5

Brown, M. C., Jansen, J. K., & Van Essen, D. (1976). Polyneuronal innervation of skeletal muscle in new-born rats and its elimination during maturation. *The Journal of Physiology*, **261**(2), 387–422. https://doi.org/10.1113/jphysiol.1976.sp011565

Bruneau, E., Sutter, D., Hume, R. I., & Akaaboune, M. (2005). Identification of nicotinic acetylcholine receptor recycling and its role in maintaining receptor density at the neuromuscular junction in vivo. *Journal of Neuroscience*, **25**(43), 9949–9959. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3169-05.2005

Burke, R. E., Levine, D. N., Tsairis, P., & Zajac, F. E. (1973). Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius. *The Journal of Physiology*, **234**(3), 723–748. https://doi.org/10.1113/jphysiol.1973.sp010369

Buxton, J., Shelbourne, P., Davies, J., Jones, C., Van Tongeren, T., Aslanidis, C., De Jong, P. J., Jansen, G., Anvret, M., Riley, B., Williamson, R., & Johnson, K. (1992). Detection of an unstable fragment of DNA specific to individuals with myotonic dystrophy. *Nature*, **359**, 710–713. file:///C:/Users/ASUS/Desktop/Rujukan PhD/p21/xiong1993.pdf

Byrd, D. T., Kawasaki, M., Walcoff, M., Hisamoto, N., Matsumoto, K., & Jin, Y. (2001). UNC-16, a JNK-signaling scaffold protein, regulates vesicle transport in C. elegans. *Neuron*, **32**(5), 787–800. https://doi.org/10.1016/S0896-6273(01)00532-3

Cadigan, K. M., & Nusse, R. (1997). Wnt signaling: A common theme in animal development. *Genes and Development*, **11**(24), 3286–3305. https://doi.org/10.1101/gad.11.24.3286

Caillet-Boudin, M. L., Fernandez-Gomez, F. J., Tran, H., Dhaenens, C. M., Buee, L., & Sergeant, N. (2014). Brain pathology in myotonic dystrophy: When tauopathy meets spliceopathy and RNAopathy. In *Frontiers in Molecular Neuroscience* (Vol. 6, Issue JAN, p. 57). Frontiers Media SA. https://doi.org/10.3389/fnmol.2013.00057

Cajigas, I. J., Tushev, G., Will, T. J., Tom Dieck, S., Fuerst, N., & Schuman, E. M. (2012). The Local Transcriptome in the Synaptic Neuropil Revealed by Deep Sequencing and High-Resolution Imaging. *Neuron*, **74**(3), 453–466. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.02.036

Campbell, N. A., Mitchell, L. G., & Reece, J. B. (2000). *Biology: concepts & connections*. Benjamin/Cummings. https://openlibrary.org/works/OL1983083W/Biology

Cano, R., Torres-Benito, L., Tejero, R., Biea, A. I., Ruiz, R., Betz, W. J., & Tabares, L. (2013). Structural and functional maturation of active zones in large synapses. *Molecular Neurobiology*, **47**(1), 209–219. https://doi.org/10.1007/s12035-012-8347-9

Caputo, C., & Gimenez, M. (1967). Effects of external calcium deprivation on single muscle fibers. *The Journal of General Physiology*, **50**(9), 2177–2195. https://doi.org/10.1085/jgp.50.9.2177

Carango, P., Noble, E., Marks, H. G., & Funanage, V. L. (1993). Absence of DMPK mRNA as a result of a triplet repeat expansion in myotonic dystrophy. *Genomics*.

Cardani, R., Mancinelli, E., Rotondo, G., Sansone, V., & Meola, G. (2006). Muscleblind-like
protein 1 nuclear sequestration is a molecular pathology marker of DM1 and DM2. *European Journal of Histochemistry*, 50(3), 177-182. https://air.unimi.it/retrieve/dfa8b990-7df3-748be053-3a05fe0a3a96/EUR J HIST 2006-Cardani R.pdf

Carnio, S., LoVerso, F., Baraibar, M. A., Longa, E., Khan, M. M., Maffei, M., Reischl, M., Canepari, M., Loefler, S., Kern, H., Blaauw, B., Friguet, B., Bottinelli, R., Rudolf, R., & Sandri, M. (2014). Autophagy Impairment in Muscle Induces Neuromuscular Junction Degeneration and Precocious Aging. *Cell Reports*, 8(5), 1509-1521.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2014.07.061

Carrell, S. T., Carrell, E. M., Auerbach, D., Pandey, S. K., Bennett, C. F., Dirksen, R. T., & Thornton, C. A. (2016). Dmpk gene deletion or antisense knockdown does not compromise cardiac or skeletal muscle function in mice. *Human Molecular Genetics*, 25(19), 4328-4338.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddw266

Cass, D., Hotchko, R., Barber, P., Jones, K., Gates, D. P., & Berglund, J. A. (2011). The four Zn fingers of MBNL1 provide a flexible platform for recognition of its RNA binding elements. *BMC Molecular Biology*, 12, 20. https://doi.org/10.1186/1471-2199-12-20

Castel, A. L., Nakamori, M., Tomé, S., Chitayat, D., Gourdon, G., Thornton, C. A., & Pearson, C. E. (2011). Expanded CTG repeat demarcates a boundary for abnormal CpG methylation in myotonic dystrophy patient tissues. *Human Molecular Genetics*, 20(1), 1-15.
https://doi.org/10.1093/hmg/ddq427

Castets, P., Ham, D. J., & Rüegg, M. A. (2020). The TOR Pathway at the Neuromuscular Junction: More Than a Metabolic Player? *Frontiers in Molecular Neuroscience*, 13(August), 1-19.
https://doi.org/10.3389/fnmol.2020.00162

Caughey, J., & Myrianthopoulos, N. (1963). *Dystrophia Myotonica and related disorders* (III). Charles C Thomas, Springfield.

Cerro-Herreros, E., González-Martínez, I., Moreno-Cervera, N., Overby, S., Pérez-Alonso, M., Llamusí, B., & Artero, R. (2020). Therapeutic Potential of AntagomiR-23b for Treating Myotonic Dystrophy. *Molecular Therapy - Nucleic Acids*, 21(September), 837-849.
https://doi.org/10.1016/j.omtn.2020.07.021

Chai, R. J., Vukovic, J., Dunlop, S., Grounds, M. D., & Shavlakadze, T. (2011). Striking denervation of neuromuscular junctions without lumbar motoneuron loss in geriatric mouse muscle. *PLoS ONE*, 6(12), e28090. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0028090

Chand, K. K., Lee, K. M., Schenning, M. P., Lavidis, N. A., & Noakes, P. G. (2015). Loss of β2-laminin alters calcium sensitivity and voltage-gated calcium channel maturation of neurotransmission at the neuromuscular junction. *Journal of Physiology*, 593(1), 245-265.
https://doi.org/10.1113/jphysiol.2014.284133

Chandrasekhar, A. (2004). Turning Heads: Development of Vertebrate Branchiomotor Neurons. In *Developmental Dynamics* (Vol. 229, Issue 1, pp. 143-161).
https://doi.org/10.1002/dvdy.10444

Charizanis, K., Lee, K. Y., Batra, R., Goodwin, M., Zhang, C., Yuan, Y., Shiue, L., Cline, M., Scotti, M. M., Xia, G., Kumar, A., Ashizawa, T., Clark, H. B., Kimura, T., Takahashi, M. P., Fujimura, H., Jinnai, K., Yoshikawa, H., Gomes-Pereira, M., ... Swanson, M. S. (2012). Muscleblind-like 2-Mediated Alternative Splicing in the Developing Brain and Dysregulation in Myotonic Dystrophy. *Neuron*, 75(3), 437-450.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2012.05.029

Charlet-B., N., Savkur, R. S., Singh, G., Philips, A. V., Grice, E. A., & Cooper, T. A. (2002). Loss of the muscle-specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. *Molecular Cell*, 10(1), 45-53. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(02)00572-5
Chen, F., Qian, L., Yang, Z. H., Huang, Y., Ngo, S. T., Ruan, N. J., Wang, J., Schneider, C., Noakes, P. G., Ding, Y. Q., Mei, L., & Luo, Z. G. (2007). Rapsyn Interaction with Calpain Stabilizes AChR Clusters at the Neuromuscular Junction. *Neuron*, **55**(2), 247–260.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2007.06.031

Chen, G., Masuda, A., Konishi, H., Ohkawara, B., Ito, M., Kinoshita, M., Kiyama, H., Matsuura, T., & Ohno, K. (2016). Phenylbutazone induces expression of MBNL1 and suppresses formation of MBNL1-CUG RNA foci in a mouse model of myotonic dystrophy. *Scientific Reports*, **6**, 25317. https://doi.org/10.1038/srep25317

Chen, K. Y., Pan, H., Lin, M. J., Li, Y. Y., Wang, L. C., Wu, Y. C., & Hsiao, K. M. (2007). Length-dependent toxicity of untranslated CUG repeats on Caenorhabditis elegans. *Biochemical and Biophysical Research Communications*, **352**(3), 774–779.
https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.11.102

Chen, W., Liang, Y., Deng, W., Shimizu, K., Ashique, A. M., Li, E., & Li, Y. P. (2003). The zinc-finger protein CNBP is required for forebrain formation in the mouse. *Development*, **130**(7), 1367–1379. https://doi.org/10.1242/dev.00349

Chen, W., Wang, Y., Abe, Y., Cheney, L., Udd, B., & Li, Y. P. (2007). Haploinsufficiency for Znf9 in Znf9+/- Mice Is Associated with Multiorgan Abnormalities Resembling Myotonic Dystrophy. *Journal of Molecular Biology*, **368**(1), 8–17.
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.01.088

Cheng, A. W., Shi, J., Wong, P., Luo, K. L., Trepman, P., Wang, E. T., Choi, H., Burge, C. B., & Lodish, H. F. (2014). Muscleblind-like 1 (Mbnl1) regulates pre-mRNA alternative splicing during terminal erythropoiesis. *Blood*, **124**(4), 598–610. https://doi.org/10.1182/blood-2013-12-542209

Cheng, H. M., Chern, Y., Chen, I. H., Liu, C. R., Li, S. H., Chun, S. J., Rigo, F., Bennett, C. F., Deng, N., Feng, Y., Lin, C. S., Yan, Y. T., Cohen, S. N., & Cheng, T. H. (2015). Effects on Murine Behavior and Lifespan of Selectively Decreasing Expression of Mutant Huntingtin Allele by Supt4h Knockdown. *PLoS Genetics*, **11**(3), e1005043.
https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005043

Childs-Disney, J. L., Yildirim, I., Park, H., Lohman, J. R., Guan, L., Tran, T., Sarkar, P., Schatz, G. C., & Disney, M. D. (2014). Structure of the myotonic dystrophy type 2 RNA and designed small molecules that reduce toxicity. *ACS Chemical Biology*, **9**(2), 538–550.
https://doi.org/10.1021/cb4007387

Cho, D. H., Thienes, C. P., Mahoney, S. E., Analau, E., Filippova, G. N., & Tapscott, S. J. (2005). Antisense transcription and heterochromatin at the DM1 CTG repeats are constrained by CTCF. *Molecular Cell*, **20**(3), 483–489. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.09.002

Choi, J., Personius, K. E., DiFranco, M., Dansithong, W., Yu, C., Srivastava, S., Dixon, D. M., Bhatt, D. B., Comai, L., Vergara, J. L., & Reddy, S. (2015). Muscleblind-Like 1 and Muscleblind-Like 3 Depletion Synergistically Enhances Myotonia by Altering Clc-1 RNA Translation. *EBioMedicine*, **2**(9), 1034–1047. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2015.07.028

Chung, K. H., Hart, C. C., Al-Bassam, S., Avery, A., Taylor, J., Patel, P. D., Vojtek, A. B., & Turner, D. L. (2006). Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155. *Nucleic Acids Research*, **34**(7).
https://doi.org/10.1093/nar/gkl143

Chung, K., Kevetter, G. A., Willis, W. D., & Coggeshall, R. E. (1984). An estimate of the ratio of propriospinal to long tract neurons in the sacral spinal cord of the rat. *Neuroscience Letters*, **44**(2), 173–177. https://doi.org/10.1016/0304-3940(84)90077-6

Cleary, J. D., Tomé, S., Castel, A. L., Panigrahi, G. B., Foiry, L., Hagerman, K. A., Sroka, H., Chitayat, D., Gourdon, G., & Pearson, C. E. (2010). Tissue-and age-specific DNA replication patterns at the CTG/CAG-expanded human myotonic dystrophy type 1 locus.
*Nature Structural and Molecular Biology*, **17**(9), 1079–1087. https://doi.org/10.1038/nsmb.1876

Coers, C., Telerman-Toppet, N., & Gerard, J. M. (1973). Terminal innervation ratio in neuromuscular disease. II. Disorders of lower motor neuron, peripheral nerve, and muscle. *Arch Neurol*, **29**(4), 215–222. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/4353847

Collingridge, G. L., & Lester, R. A. J. (1989). Excitatory amino acid receptors in the vertebrate central nervous system. *Pharmacological Reviews*, **41**(2), 143–210.

Coonrod, L. A., Nakamori, M., Wang, W., Carrell, S., Hilton, C. L., Bodner, M. J., Siboni, R. B., Docter, A. G., Haley, M. M., Thornton, C. A., & Berglund, J. A. (2013). Reducing levels of toxic RNA with small molecules. *ACS Chemical Biology*, **8**(11), 2528–2537. https://doi.org/10.1021/cb400431f

Couesnon, A., Offner, N., Bernard, V., Chaverot, N., Backer, S., Dimitrov, A., Perez, F., Molgó, J., & Bloch-Gallego, E. (2013). CLIPR-59: A protein essential for neuromuscular junction stability during mouse late embryonic development. *Development (Cambridge)*, **140**(7), 1583–1593. https://doi.org/10.1242/dev.087106

Cros, D., Harnden, P., Pouget, J., Pellissier, J. F., Gastaut, J. L., & Serratrice, G. (1988). Peripheral neuropathy in myotonic dystrophy: A nerve biopsy study. *Annals of Neurology*, **23**(5), 470–476. https://doi.org/10.1002/ana.410230508

Cumming, S. A., Jimenez-Moreno, C., Okkersen, K., Wenninger, S., Daidj, F., Hogarth, F., Littleford, R., Gorman, G., Bassez, G., Schoser, B., Lochmüller, H., Van Engelen, B. G. M., & Monckton, D. G. (2019). Genetic determinants of disease severity in the myotonic dystrophy type 1 OPTIMISTIC cohort. *Neurology*, **93**(10), E995–E1009. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000008056

Cywoniuk, P., Taylor, K., Sznajder, L. J., & Sobczak, K. (2017). Hybrid splicing minigene and antisense oligonucleotides as efficient tools to determine functional protein/RNA interactions. *Scientific Reports*, **7**(1), 17587. https://doi.org/10.1038/s41598-017-17816-x

Czaplinski, K. (2014). Understanding mRNA trafficking: Are we there yet? *Seminars in Cell and Developmental Biology*, **32**, 63–70. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2014.04.025

Dansithong, W., Paul, S., Comai, L., & Reddy, S. (2005). MBNL1 is the primary determinant of focus formation and aberrant insulin receptor splicing in DM1. *Journal of Biological Chemistry*, **280**(7), 5773–5780. https://doi.org/10.1074/jbc.M410781200

Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., & Robitaille, R. (2014). Neuromuscular synaptogenesis: Coordinating partners with multiple functions. *Nature Reviews Neuroscience*, **15**(11), 703–718. https://doi.org/10.1038/nrn3821

Dasen, J. S., & Jessell, T. M. (2009). Chapter Six Hox Networks and the Origins of Motor Neuron Diversity. In *Current Topics in Developmental Biology* (Vol. 88, pp. 169–200). Curr Top Dev Biol. https://doi.org/10.1016/S0070-2153(09)88006-X

Dasen, J. S., Liu, J. P., & Jessell, T. M. (2003). Motor neuron columnar fate imposed by sequential phases of Hox-c activity. *Nature*, **425**(6961), 926–933. https://doi.org/10.1038/nature02051

Dasen, J. S., Tice, B. C., Brenner-Morton, S., & Jessell, T. M. (2005). A Hox regulatory network establishes motor neuron pool identity and target-muscle connectivity. *Cell*, **123**(3), 477–491. https://doi.org/10.1016/j.cell.2005.09.009

Dasgupta, T., & Ladd, A. N. (2012). The importance of CELF control: Molecular and biological roles of the CUG-BP, Elav-like family of RNA-binding proteins. In *Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA* (Vol. 3, Issue 1, pp. 104–121). Wiley Interdiscip Rev RNA. https://doi.org/10.1002/wrna.107

Dastidar, S., Majumdar, D., Tipanee, J., Singh, K., Klein, A. F., Furling, D., Chuah, M. K., & VandenDriessche, T. (2022). Comprehensive transcriptome-wide analysis of spliceopathy correction of myotonic dystrophy using CRISPR-Cas9 in iPSCs-derived cardiomyocytes.
*Molecular Therapy*, **30**(1), 75-91. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.08.004

Davis, B. M., Mccurrach, M. E., Taneja, K. L., Singer, R. H., & Housman, D. E. (1997). Expansion of a CUG trinucleotide repeat in the 3' untranslated region of myotonic dystrophy protein kinase transcripts results in nuclear retention of transcripts. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*, **94**(14), 7388-7393.
https://doi.org/10.1073/pnas.94.14.7388

Day, J. W., & Ranum, L. P. W. (2005a). Genetics and molecular pathogenesis of the myotonic dystrophies. *Current Neurology and Neuroscience Reports*, **5**(1), 55-60.
https://doi.org/10.1007/s11910-005-0024-1

Day, J. W., & Ranum, L. P. W. (2005b). RNA pathogenesis of the myotonic dystrophies. *Neuromuscular Disorders*, **15**(1), 5-16. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2004.09.012

Day, J. W., Ricker, K., Jacobsen, J. F., Rasmussen, L. J., Dick, K. A., Kress, W., Schneider, C., Koch, M. C., Beilman, G. J., Harrison, A. R., Dalton, J. C., & Ranum, L. P. W. (2003). Myotonic dystrophy type 2: Molecular, diagnostic and clinical spectrum. *Neurology*, **60**(4), 657-664. https://doi.org/10.1212/01.WNL.0000054481.84978.F9

Day, J. W., Roelofs, R., Leroy, B., Pech, I., Benzow, K., & Ranum, L. P. W. (1999). Clinical and genetic characteristics of a five-generation family with a novel form of myotonic dystrophy (DM2). *Neuromuscular Disorders*, **9**(1), 19-27. https://doi.org/10.1016/S0960-8966(98)00094-7

De Antonio, M., Dogan, C., Hamroun, D., Mati, M., Zerrouki, S., Eymard, B., Katsahian, S., & Bassez, G. (2016). Unravelling the myotonic dystrophy type 1 clinical spectrum: A systematic registry-based study with implications for disease classification. In *Revue Neurologique* (Vol. 172, Issue 10, pp. 572-580). Elsevier Masson.
https://doi.org/10.1016/j.neurol.2016.08.003

de Pontual, L., & Tomé, S. (2022). Overview of the Complex Relationship between Epigenetics Markers, CTG Repeat Instability and Symptoms in Myotonic Dystrophy Type 1. In *International Journal of Molecular Sciences* (Vol. 23, Issue 7, p. 3477).
https://doi.org/10.3390/ijms23073477

deLorimier, E., Coonrod, L. A., Copperman, J., Taber, A., Reister, E. E., Sharma, K., Todd, P. K., Guenza, M. G., & Berglund, J. A. (2014). Modifications to toxic CUG RNAs induce structural stability, rescue mis-splicing in a myotonic dystrophy cell model and reduce toxicity in a myotonic dystrophy zebrafish model. *Nucleic Acids Research*, **42**(20), 12768-12778. https://doi.org/10.1093/nar/gku941

Denes, L. T., Kelley, C. P., & Wang, E. T. (2021). Microtubule-based transport is essential to distribute RNA and nascent protein in skeletal muscle. *Nature Communications*, **12**(1), 6079.
https://doi.org/10.1038/s41467-021-26383-9

Deniston, C. K., Salogiannis, J., Mathea, S., Snead, D. M., Lahiri, I., Matyszewski, M., Donosa, O., Watanabe, R., Böhning, J., Shiau, A. K., Knapp, S., Villa, E., Reck-Peterson, S. L., & Leschziner, A. E. (2020). Structure of LRRK2 in Parkinson's disease and model for microtubule interaction. *Nature*, **588**(7837), 344-349. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2673-2

Desaki, J., & Uehara, Y. (1981). The overall morphology of neuromuscular junctions as revealed by scanning electron microscopy. *Journal of Neurocytology*, **10**(1), 101-110.
https://doi.org/10.1007/BF01181747

Dhaenens, C. M., Schraen-Maschke, S., Tran, H., Vingtdeux, V., Ghanem, D., Leroy, O., Delplanque, J., Vanbrussel, E., Delacourte, A., Vermersch, P., Maurage, C. A., Gruffat, H., Sergeant, A., Mahadevan, M. S., Ishiura, S., Buée, L., Cooper, T. A., Caillet-Boudin, M. L., Charlet-Berguerand, N., ... Sergeant, N. (2008). Overexpression of MBNL1 fetal isoforms and modified splicing of Tau in the DM1 brain: Two individual consequences of CUG
trinucleotide repeats. *Experimental Neurology*, **210**(2), 467-478.
https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2007.11.020

Dinca, D. M., Lallemant, L., González-Barriga, A., Cresto, N., Sicot, G., Pillet, L.-E., Polveche, H., Magneron, P., Huguet-Lachon, A., Benyamine, H., Azotla-Vilchis, C. N., Agonizantes-Juárez, L. E., Tahraoui-Bories, J., Martinat, C., Hernández-Hernández, O., Auboeuf, D., Rouach, N., Bourgeois, C. F., Gourdon, G., & Gomes-Pereira, M. (2022). Myotonic dystrophy RNA toxicity alters morphology, adhesion and migration of mouse and human astrocytes. *Research Square Preprints*, 10.21203/RS.3.RS-137333/V1.
https://doi.org/10.1038/s41467-022-31594-9

Dixon, D. M., Choi, J., El-Ghazali, A., Park, S. Y., Roos, K. P., Jordan, M. C., Fishbein, M. C., Comai, L., & Reddy, S. (2015). Loss of muscleblind-like 1 results in cardiac pathology and persistence of embryonic splice isoforms. *Scientific Reports*, **5**, 1-13.
https://doi.org/10.1038/srep09042

Du, H., Cline, M. S., Osborne, R. J., Tuttle, D. L., Clark, T. A., Donohue, J. P., Hall, M. P., Shiue, L., Swanson, M. S., Thornton, C. A., & Ares, M. (2010). Aberrant alternative splicing and extracellular matrix gene expression in mouse models of myotonic dystrophy. *Nature Structural and Molecular Biology*, **17**(2), 187-193. https://doi.org/10.1038/nsmb.1720

Dubey, J., Ratnakaran, N., & Koushika, S. P. (2015). Neurodegeneration and microtubule dynamics: Death by a thousand cuts. *Frontiers in Cellular Neuroscience*, **9***(September), 343.
https://doi.org/10.3389/fncel.2015.00343

Ebashi, S., Endo, M., & Ohtsuki, I. (1969). Control of muscle contraction. *Quarterly Reviews of Biophysics*, **2**(4), 351-384. https://doi.org/10.1017/S0033583500001190

Ebralidze, A., Wang, Y., Petkova, V., Ebralidse, K., & Junghans, R. P. (2004). RNA Leaching of Transcription Factors Disrupts Transcription in Myotonic Dystrophy. *Science*, **303**(5656), 383-387. https://doi.org/10.1126/science.1088679

Eccles, J. C., Eccles, R. M., Iggo, A., & Lundberg, A. (1960). Electrophysiological Studies on Gamma Motoneurones. *Acta Physiologica Scandinavica*, **50**(1), 32-40.
https://doi.org/10.1111/j.1748-1716.1960.tb02070.x

Echeverria, G. V., & Cooper, T. A. (2014). Muscleblind-like 1 activates insulin receptor exon 11 inclusion by enhancing U2AF65 binding and splicing of the upstream intron. *Nucleic Acids Research*, **42**(3), 1893-1903. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1020

Eckardt, V. F., & Nix, W. (1991). The anal sphincter in patients with myotonic muscular dystrophy. *Gastroenterology*, **100**(2), 424-430. https://doi.org/10.1016/0016-5085(91)90212-4

Edge, C., Gooding, C., & Smith, C. W. J. (2013). Dissecting domains necessary for activation and repression of splicing by muscleblind-like protein 1. *BMC Molecular Biology*, **14**, 29.
https://doi.org/10.1186/1471-2199-14-29

Eguchi, T., Tezuka, T., Miyoshi, S., & Yamanashi, Y. (2016). Postnatal knockdown of dok-7 gene expression in mice causes structural defects in neuromuscular synapses and myasthenic pathology. *Genes to Cells*, **21**(6), 670-676. https://doi.org/10.1111/gtc.12370

Eisenberg, I., Alexander, M. S., & Kunkel, L. M. (2009). miRNAs in normal and diseased skeletal muscle. In *Journal of Cellular and Molecular Medicine* (Vol. 13, Issue 1, pp. 2-11). J Cell Mol Med. https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2008.00524.x

Ekestern, E. (2004). Neurotrophic factors and amyotrophic lateral sclerosis. *Neurodegenerative Diseases*, **1**(2-3), 88-100. https://doi.org/10.1159/000080049

Ekström, A. B., Tulinius, M., Sjöström, A., & Aring, E. (2010). Visual Function in Congenital and Childhood Myotonic Dystrophy Type 1. *Ophthalmology*, **117**(5), 976-982.
https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2010.01.055

Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., & Sine, S. M. (2015). Congenital myasthenic syndromes:
Pathogenesis, diagnosis, and treatment. In *The Lancet Neurology* (Vol. 14, Issue 4, pp. 420–434). Elsevier. https://doi.org/10.1016/S1474-4422(14)70201-7

Enriquez, J., Venkatasubramanian, L., Baek, M., Peterson, M., Aghayeva, U., & Mann, R. S. (2015). Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes. *Neuron*, *86*(4), 955–970.
https://doi.org/10.1016/j.neuron.2015.04.011

Ensini, M., Tsuchida, T. N., Belting, H. G., & Jessell, T. M. (1998). The control of rostrocaudal pattern in the developing spinal cord: Specification of motor neuron subtype identity is initiated by signals from paraxial mesoderm. *Development*, *125*(6), 969–982.
https://doi.org/10.1242/dev.125.6.969

Ericson, J., Morton, S., Kawakami, A., Roelink, H., & Jessell, T. M. (1996). Two critical periods of Sonic Hedgehog signaling required for the specification of motor neuron identity. *Cell*, *87*(4), 661–673. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(00)81386-0

Fardaei, M., Larkin, K., Brook, J. D., & Hamshere, M. G. (2001). In vivo co-localisation of MBNL protein with DMPK expanded-repeat transcripts. *Nucleic Acids Research*, *29*(13), 2766–2771. https://doi.org/10.1093/nar/29.13.2766

Fardaei, M., Rogers, M. T., Thorpe, H. M., Larkin, K., Hamshere, M. G., Harper, P. S., & Brook, J. D. (2002). Three proteins, MBNL, MBLL and MBXL, co-localize in vivo with nuclear foci of expanded-repeat transcripts in DM1 and DM2 cells. *Human Molecular Genetics*, *11*(7), 805–814. https://doi.org/10.1093/hmg/11.7.805

Fardeau, M., & Tomé, F. (1980). Light and electron microscopic study of motor endplates in the adult and neonatal forms of dystrophia myotonica. In Elsevier/North-Holland Biomedical Press (Ed.), *Ontogenesis and functional mechanisms of peripheral synapses* (pp. 287–298).

Faustino, N. A., & Cooper, T. A. (2005). Identification of putative new splicing targets for ETR-3 using sequences identified by systematic evolution of ligands by exponential enrichment. *Molecular and Cellular Biology*, *25*(3), 879–887. https://doi.org/10.1128/MCB.25.3.879-887.2005

Favero, M., Busetto, G., & Cangiano, A. (2012). Spike timing plays a key role in synapse elimination at the neuromuscular junction. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*, *109*(25). https://doi.org/10.1073/pnas.1201147109

Fernandez-Costa, J. M., & Artero, R. (2010). A conserved motif controls nuclear localization of Drosophila Muscleblind. *Molecules and Cells*, *30*(1), 65–70. https://doi.org/10.1007/s10059-010-0089-9

Fernandez-Costa, J. M., Garcia-Lopez, A., Zuñiga, S., Fernandez-Pedrosa, V., Felipo-Benavent, A., Mata, M., Jaka, O., Aiastui, A., Hernandez-Torres, F., Aguado, B., Perez-Alonso, M., Vilchez, J. J., Lopez de Munain, A., & Artero, R. D. (2013). Expanded CTG repeats trigger miRNA alterations in Drosophila that are conserved in myotonic dystrophy type 1 patients. *Human Molecular Genetics*, *22*(4), 704–716. https://doi.org/10.1093/hmg/dds478

Fernandez-Gomez, F., Tran, H., Dhaenens, C. M., Caillet-Boudin, M. L., Schraen-Maschke, S., Blum, D., Sablonnière, B., Buée-Scherrer, V., Buee, L., & Sergeant, N. (2019). Myotonic Dystrophy: an RNA Toxic Gain of Function Tauopathy? In *Advances in Experimental Medicine and Biology* (Vol. 1184, pp. 207–216). Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-32-9358-8_17

Fernandez, H. L. (1981). Properties of 16S acetylcholinesterase from rat motor nerve and skeletal muscle. *Neurochemical Research*, *6*(9), 1005–1017. https://doi.org/10.1007/BF00965031

Ferns, M. J., Campanelli, J. T., Hoch, W., Scheller, R. H., & Hall, Z. (1993). The ability of agrin to cluster AChRs depends on alternative splicing and on cell surface proteoglycans. *Neuron*, *11*(3), 491–502. https://doi.org/10.1016/0896-6273(93)90153-I
Fetcho, J. R. (1987). A review of the organization and evolution of motoneurons innervating the axial musculature of vertebrates. *Brain Research Reviews, 12*(3), 243-280.
https://doi.org/10.1016/0165-0173(87)90001-4

Filipello, F., Morini, R., Corradini, I., Zerbi, V., Canzi, A., Michalski, B., Erreni, M., Markicevic, M., Starvaggi-Cucuzza, C., Otero, K., Piccio, L., Cignarella, F., Perrucci, F., Tamborini, M., Genua, M., Rajendran, L., Menna, E., Vetrano, S., Fahnestock, M., ... Matteoli, M. (2018). The Microglial Innate Immune Receptor TREM2 Is Required for Synapse Elimination and Normal Brain Connectivity. *Immunity, 48*(5), 979-991.e8.
https://doi.org/10.1016/j.immuni.2018.04.016

Fisette-Paulhus, I., Gagnon, C., Girard-Côté, L., & Morin, M. (2022). Genitourinary and lower gastrointestinal conditions in patients with myotonic dystrophy type 1: A systematic review of evidence and implications for clinical practice. In *Neuromuscular Disorders* (Vol. 32, Issue 5, pp. 361–376). Elsevier. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2022.01.008

Fortune, M. T., Vassilopoulos, C., Coolbaugh, M. I., Siciliano, M. J., & Monckton, D. G. (2000). Dramatic, expansion-biased, age-dependent, tissue-specific somatic mosaicism in a transgenic mouse model of triplet repeat instability. *Human Molecular Genetics, 9*(3), 439–445.
https://doi.org/10.1093/hmg/9.3.439

Francius, C., & Clotman, F. (2014). Generating spinal motor neuron diversity: A long quest for neuronal identity. *Cellular and Molecular Life Sciences, 71*(5), 813–829.
https://doi.org/10.1007/s00018-013-1398-x

Franck, S., Barbé, L., Ardui, S., De Vlaeminck, Y., Allemeersch, J., Dziedzicka, D., Spits, C., Vanroye, F., Hilven, P., Duqué, G., Vermeesch, J. R., Gheldof, A., & Sermon, K. (2020). MSH2 knock-down shows CTG repeat stability and concomitant upstream demethylation at the DMPK locus in myotonic dystrophy type 1 human embryonic stem cells. *Human Molecular Genetics, 29*(21), 3566–3577. https://doi.org/10.1093/hmg/ddaa250

Freyermuth, F., Rau, F., Kokunai, Y., Linke, T., Sellier, C., Nakamori, M., Kino, Y., Arandel, L., Jollet, A., Thibault, C., Philipps, M., Vicaire, S., Jost, B., Udd, B., Day, J. W., Duboc, D., Wahbi, K., Matsumura, T., Fujimura, H., ... Charlet-Berguerand, N. (2016). Splicing misregulation of SCN5A contributes to cardiac-conduction delay and heart arrhythmia in myotonic dystrophy. *Nature Communications, 7*, 11067.
https://doi.org/10.1038/ncomms11067

Fu, Y. H., Friedman, D. L., Richards, S., Pearlman, J. A., Gibbs, R. A., Pizzuti, A., Ashizawa, T., Perryman, M. B., Scarlato, G., Fenwick, R. G., & Caskey, C. T. (1993). Decreased expression of myotonin-protein kinase messenger RNA and protein in adult form of myotonic dystrophy. *Science, 260*(5105), 235-238. https://doi.org/10.1126/science.8469976

Fu, Y. H., Pizzuti, A., Fenwick, R. G., King, J., Rajnarayan, S., Dunne, P. W., Dubel, J., Nasser, G. A., Ashizawa, T., De Jong, P., Wieringa, B., Korneluk, R., Perryman, M. B., Epstein, H. F., & Caskey, C. T. (1992). An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy. *Science, 255*(5049), 1256-1258. https://doi.org/10.1126/science.1546326

Fu, Y., Ramisetty, S. R., Hussain, N., & Baranger, A. M. (2012). MBNL1-RNA Recognition: Contributions of MBNL1 Sequence and RNA Conformation. *ChemBioChem, 13*(1), 112–119.
https://doi.org/10.1002/cbic.201100487

Fugier, C., Klein, A. F., Hammer, C., Vassilopoulos, S., Ivarsson, Y., Toussaint, A., Tosch, V., Vignaud, A., Ferry, A., Messaddeq, N., Kokunai, Y., Tsuburaya, R., De La Grange, P., Dembele, D., Francois, V., Precigout, G., Boulade-Ladame, C., Hummel, M. C., De Munain, A. L., ... Charlet-Berguerand, N. (2011). Misregulated alternative splicing of BIN1 is associated with T tubule alterations and muscle weakness in myotonic dystrophy. *Nature Medicine, 17*(6), 720–725. https://doi.org/10.1038/nm.2374

Furness, J. B. (2006). The organisation of the autonomic nervous system: Peripheral connections.
*Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical, 130*(1-2), 1-5.

https://doi.org/10.1016/j.autneu.2006.05.003

Gadalla, S. M., Lund, M., Pfeiffer, R. M., Gørtz, S., Mueller, C. M., Moxley, R. T., Kristinsson, S. Y., Björkholm, M., Shebl, F. M., Hilbert, J. E., Landgren, O., Wohlfahrt, J., Melbye, M., & Greene, M. H. (2011). Cancer risk among patients with myotonic muscular dystrophy.

*JAMA - Journal of the American Medical Association, 306*(22), 2480-2486.

https://doi.org/10.1001/jama.2011.1796

Galli, M., Cimolin, V., Crugnola, V., Priano, L., Menegoni, F., Trotti, C., Milano, E., & Mauro, A. (2012). Gait pattern in myotonic dystrophy (Steinert disease): A kinematic, kinetic and EMG evaluation using 3D gait analysis. *Journal of the Neurological Sciences, 314*(1-2), 83-87.

https://doi.org/10.1016/j.jns.2011.10.026

Gao, Z., & Cooper, T. A. (2013). Reexpression of pyruvate kinase M2 in type 1 myofibers correlates with altered glucose metabolism in myotonic dystrophy. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 110*(33), 13570-13575.

https://doi.org/10.1073/pnas.1308806110

Garcia-Lopez, A., Monferrer, L., Garcia-Alcover, I., Vicente-Crespo, M., Alvarez-Abril, M. C., & Artero, R. D. (2008). Genetic and chemical modifiers of a CUG toxicity model in Drosophila. *PLoS ONE, 3*(2), e1595. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001595

Garrett, J. M., Dubose, T. D., Jackson, J. E., & Norman, J. R. (1969). Esophageal and Pulmonary Disturbances in Myotonia Dystrophica. *Archives of Internal Medicine, 123*(1), 26-32.

https://doi.org/10.1001/archinte.1969.00300110028005

Gates, D. P., Coonrod, L. A., & Berglund, J. A. (2011). Autoregulated splicing of muscleblind-like 1 (MBNL1) Pre-mRNA. *Journal of Biological Chemistry, 286*(39), 34224-34233.

https://doi.org/10.1074/jbc.M111.236547

Gesemann, M., Denzer, A. J., & Ruegg, M. A. (1995). Acetylcholine receptor-aggregating activity of agrin isoforms and mapping of the active site. *Journal of Cell Biology, 128*(4), 625-636.

https://doi.org/10.1083/jcb.128.4.625

Ginhoux, F., & Prinz, M. (2015). Origin of microglia: Current concepts and past controversies.

*Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7*(8). https://doi.org/10.1101/cshperspect.a020537

Goers, E. S., Purcell, J., Voelker, R. B., Gates, D. P., & Berglund, J. A. (2010). MBNL1 binds GC

motifs embedded in pyrimidines to regulate alternative splicing. *Nucleic Acids Research, 38*(7), 2467-2484. https://doi.org/10.1093/nar/gkp1209

Gokhin, D. S. Q. analysis of neonatal skeletal muscle functional improvement in the mouse, Ward, S. R., Bremner, S. N., & Lieber, R. L. (2008). Quantitative analysis of neonatal skeletal

muscle functional improvement in the mouse. *Journal of Experimental Biology, 211*(6), 837-843.

Golden, M. G., & Dasen, J. S. (2012). Polycomb repressive complex 1 activities determine the columnar organization of motor neurons. *Genes and Development, 26*(19), 2236-2250.

https://doi.org/10.1101/gad.199133.112

Gollnick, P. D., Sjödin, B., Karlsson, J., Jansson, E., & Saltin, B. (1974). Human soleus muscle: A comparison of fiber composition and enzyme activities with other leg muscles. *Pflügers Archiv European Journal of Physiology, 348*(3), 247-255. https://doi.org/10.1007/BF00587415

Gomes-Pereira, M., Fairy, L., Nicole, A., Huguet, A., Junien, C., Munnich, A., & Gourdon, G. (2007). CTG trinucleotide repeat "big jumps": Large expansions, small mice. *PLoS Genetics, 3*(4), 0488-0491. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.0030052

Gomes-Pereira, M., Fortune, M. T., & Monckton, D. G. (2001). Mouse tissue culture models of unstable triplet repeats: In vitro selection for larger alleles, mutational expansion bias and tissue specificity, but no association with cell division rates. *Human Molecular Genetics, 10*(8), 2499-2509.
845–854. https://doi.org/10.1093/hmg/10.8.845

Gomes-Pereira, M., & Monckton, D. G. (2004). Chemically induced increases and decreases in the rate of expansion of a CAG·CTG triplet repeat. *Nucleic Acids Research*, *32*(9), 2865–2872.
https://doi.org/10.1093/nar/gkh612

Goodwin, M., Mohan, A., Batra, R., Lee, K. Y., Charizanis, K., Fernández Gómez, F. J., Eddarkaoui, S., Sergeant, N., Buée, L., Kimura, T., Clark, H. B., Dalton, J., Takamura, K., Weyn-Vanhentenryck, S. M., Zhang, C., Reid, T., Ranum, L. P. W., Day, J. W., & Swanson, M. S. (2015). MBNL Sequestration by Toxic RNAs and RNA Misprocessing in the Myotonic Dystrophy Brain. *Cell Reports*, *12*(7), 1159–1168.
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.07.029

Goudriaan, M., Shuman, B. R., Steele, K. M., Van Den Hauwe, M., Goemans, N., Molenaers, G., & Desloovere, K. (2018). Non-neural muscle weakness has limited influence on complexity of motor control during gait. *Frontiers in Human Neuroscience*, *12*, 5.
https://doi.org/10.3389/fnhum.2018.00005

Gourdon, G., Radvanyi, F., Lia, A. S., Duros, C., Blanche, M., Abitbol, M., Junien, C., & Hofmann-Radvanyi, H. (1997). Moderate intergenerational and somatic instability of a 55-CTG repeat in transgenic mice. *Nature Genetics*, *15*(2), 190–192.
https://doi.org/10.1038/ng0297-190

Grammatikakis, I., Goo, Y. H., Echeverria, G. V., & Cooper, T. A. (2011). Identification of MBNL1 and MBNL3 domains required for splicing activation and repression. *Nucleic Acids Research*, *39*(7), 2769–2780. https://doi.org/10.1093/nar/gkq1155

Grant, R., Sutton, D. L., Behan, P. O., & Ballantyne, J. P. (1987). Nifedipine in the treatment of myotonia in myotonic dystrophy. *Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry*, *50*(2), 199–206. https://doi.org/10.1136/jnnp.50.2.199

Greco, S., Perfetti, A., Fasanaro, P., Cardani, R., Capogrossi, M. C., Meola, G., & Martelli, F. (2012). Deregulated microRNAs in myotonic dystrophy type 2. *PLoS ONE*, *7*(6), e39732.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0039732

GRIMBY, G., HEDBERG, M., HENRIKSSON, K. -G, JOHANSSON, G., WIGERSTAD-LOSSING, I., SELLDÉN, U., & ÖRNDahl, G. (1988). Muscle Function and Morphology in Myotonic Dystrophy. *Acta Medica Scandinavica*, *224*(4), 349–356.
https://doi.org/10.1111/j.0954-6820.1988.tb19594.x

Groh, W. J., Groh, M. R., Saha, C., Kincaid, J. C., Simmons, Z., Ciafaloni, E., Pourmand, R., Otten, R. F., Bhakta, D., Nair, G. V., Marashdeh, M. M., Zipes, D. P., & Pascuzzi, R. M. (2008). Electrocardiographic Abnormalities and Sudden Death in Myotonic Dystrophy Type 1. *New England Journal of Medicine*, *358*(25), 2688–2697.
https://doi.org/10.1056/nejmoa062800

Gu, Y., & Hall, Z. W. (1988). Immunological evidence for a change in subunits of the acetylcholine receptor in developing and denervated rat muscle. *Neuron*, *1*(2), 117–125.
https://doi.org/10.1016/0896-6273(88)90195-X

Gudde, A. E. E. G., van Heeringen, S. J., de Oude, A. I., van Kessel, I. D. G., Estabrook, J., Wang, E. T., Wieringa, B., & Wansink, D. G. (2017). Antisense transcription of the myotonic dystrophy locus yields low-abundant RNAs with and without (CAG)n repeat. *RNA Biology*, *14*(10), 1374–1388. https://doi.org/10.1080/15476286.2017.1279787

Gudde, A. E. E. G., van Kessel, I. D. G., André, L. M., Wieringa, B., & Wansink, D. G. (2017). Trinucleotide-repeat expanded and normal DMPK transcripts contain unusually long poly(A) tails despite differential nuclear residence. *Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms*, *1860*(6), 740–749. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2017.04.002

Gutman, C. R., Ajmera, M. K., & Hollyday, M. (1993). Organization of motor pools supplying
axial muscles in the chicken. *Brain Research*, 609(1-2), 129-136.
https://doi.org/10.1016/0006-8993(93)90865-K

Haase, G., Dessaud, E., Garcès, A., De Bovis, B., Birling, M. C., Filippi, P., Schmalbruch, H., Arber, S., & DeLapeyrière, O. (2002). GDNF acts through PEA3 to regulate cell body positioning and muscle innervation of specific motor neuron pools. *Neuron*, 35(5), 893-905.
https://doi.org/10.1016/S0896-6273(02)00864-4

Hale, M. A., Richardson, J. I., Day, R. C., McConnell, O. L., Arboleda, J., Wang, E. T., & Andrew Berglund, J. (2018). An engineered RNA binding protein with improved splicing regulation. *Nucleic Acids Research*, 46(6), 3152–3168. https://doi.org/10.1093/nar/gkx1304

Hallock, P. T., Chin, S., Blais, S., Neubert, T. A., & Glass, D. J. (2016). Sorbs1 and -2 Interact with CrkL and Are Required for Acetylcholine Receptor Cluster Formation. *Molecular and Cellular Biology*, 36(2), 262-270. https://doi.org/10.1128/mcb.00775-15

Hallock, P. T., Xu, C. F., Park, T. J., Neubert, T. A., & Burden, T. C. S. J. (2010). Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L. *Genes and Development*, 24(21), 2451–2461. https://doi.org/10.1101/gad.1977710

Hamel-Roy, J., Devroede, G., Arhan, P., Tétreault, J. P., Lemieux, B., & Scott, H. (1984). Functional Abnormalities of the Anal Sphincters in Patients With Myotonic Dystrophy. *Gastroenterology*, 86(6), 1469-1474. https://doi.org/10.1016/S0016-5085(84)80160-2

Hammer, J. A., & Sellers, J. R. (2012). Walking to work: Roles for class v myosins as cargo transporters. In *Nature Reviews Molecular Cell Biology* (Vol. 13, Issue 1, pp. 13–26). Nature Publishing Group. https://doi.org/10.1038/nrm3248

Han, H., Irimia, M., Ross, P. J., Sung, H. K., Alipanahi, B., David, L., Golipour, A., Gabut, M., Michael, I. P., Nachman, E. N., Wang, E., Trcka, D., Thompson, T., O'Hanlon, D., Slobodeniuc, V., Barbosa-Morais, N. L., Burge, C. B., Moffat, J., Frey, B. J., ... Blencowe, B. J. (2013). MBNL proteins repress ES-cell-specific alternative splicing and reprogramming. *Nature*, 498(7453), 241–245. https://doi.org/10.1038/nature12270

Han, S., Nam, J., Li, Y., Kim, S., Cho, S. H., Cho, Y. S., Choi, S. Y., Choi, J., Han, K., Kim, Y., Na, M., Kim, H., Bae, Y. C., Choi, S. Y., & Kim, E. (2010). Regulation of dendritic spines, spatial memory, and embryonic development by the TANC family of PSD-95-interacting proteins. *Journal of Neuroscience*, 30(45), 15102–15112.
https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3128-10.2010

Hao, M., Akrami, K., Wei, K., De Diego, C., Che, N., Ku, J.-H. H., Tidball, J., Graves, M. C., Shieh, P. B., & Chen, F. (2008). Muscleblind-like 2 (Mbnl2) -deficient mice as a model for myotonic dystrophy. *Developmental Dynamics*, 237(2), 403–410.
https://doi.org/10.1002/dvdy.21428

Harley, H. G., Rundle, S. A., MacMillan, J. C., Myring, J., Brook, J. D., Crow, S., Reardon, W., Fenton, I., Shaw, D. J., & Harper, P. S. (1993). Size of the unstable CTG repeat sequence in relation to phenotype and parental transmission in myotonic dystrophy. *American Journal of Human Genetics*, 52(6), 1164–1174.

Harmon, E. B., Harmon, M. L., Larsen, T. D., Paulson, A. F., & Perryman, M. B. (2008). Myotonic dystrophy protein kinase is expressed in embryonic myocytes and is required for myotube formation. *Developmental Dynamics*, 237(9), 2353–2366.
https://doi.org/10.1002/dvdy.21653

Harmon, E. B., Harmon, M. L., Larsen, T. D., Yang, J., Glasford, J. W., & Perryman, M. B. (2011). Myotonic dystrophy protein kinase is critical for nuclear envelope integrity. *Journal of Biological Chemistry*, 286(46), 40296–40306. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.241455

Harper. (2001). Myotonic dystrophy, 3rd edition. In *Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry*.
https://doi.org/10.1136/jnnp.72.3.422-a
Hart, P. C., Mao, M., De Abreu, A. L. P., Ansenberger-Fricano, K., Ekoue, D. N., Ganini, D., Kajdacsy-Balla, A., Diamond, A. M., Minshall, R. D., Consolaro, M. E. L., Santos, J. H., & Bonini, M. G. (2015). MnSOD upregulation sustains the Warburg effect via mitochondrial ROS and AMPK-dependent signalling in cancer. *Nature Communications*, **6**, 6053.
https://doi.org/10.1038/ncomms7053

Harvey, J. C., Sherbourne, D. H., & Siegel, C. I. (1965). Smooth muscle involvement in myotonic dystrophy. *The American Journal of Medicine*, **39**(1), 81–90. https://doi.org/10.1016/0002-9343(65)90247-0

Hashem, V. I., & Sinden, R. R. (2002). Chemotherapeutically induced deletion of expanded triplet repeats. *Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis*, **508**(1-2), 107-119. https://doi.org/10.1016/S0027-5107(02)00190-2

Hasuike, Y., Mochizuki, H., & Nakamori, M. (2022). Cellular Senescence and Aging in Myotonic Dystrophy. In *International Journal of Molecular Sciences* (Vol. 23, Issue 4, p. 2339).
https://doi.org/10.3390/ijms23042339

Heasley, L. E., & Winn, R. A. (2008). Analysis of Wnt7a-stimulated JNK activity and cJun phosphorylation in non-small cell lung cancer cells. *Methods in Molecular Biology*, **468**, 187–196. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-249-6_14

Henderson, C. E., Phillips, H. S., Pollock, R. A., Davies, A. M., Lemeulle, C., Armanini, M., Simpson, L. C., Moffet, B., Vandlen, R. A., Koliatsos, V. E., & Rosenthal, A. (1994). GDNF: A potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. *Science*, **266**(5187), 1062–1064. https://doi.org/10.1126/science.7973664

Henriquez, J. P., Webb, A., Bence, M., Bildsoe, H., Sahores, M., Hughes, S. M., & Salinas, P. C. (2008). Wnt signaling promotes AChR aggregation at the neuromuscular synapse in collaboration with agrin. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*, **105**(48), 18812–18817. https://doi.org/10.1073/pnas.0806300105

Hernández-Hernández, O., Guiraud-Dogan, C., Sicot, G., Huguet, A., Luilier, S., Steidl, E., Saenger, S., Marciniak, E., Obriot, H., Chevarin, C., Nicole, A., Revillod, L., Charizanis, K., Lee, K. Y., Suzuki, Y., Kimura, T., Matsuura, T., Cisneros, B., Swanson, M. S., ... Gomes-Pereira, M. (2013). Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse behaviour. *Brain*, **136**(3), 957–970.
https://doi.org/10.1093/brain/aws367

Heumann, R., Korschning, S., Bandtlow, C., & Thoenen, H. (1987). Changes of nerve growth factor synthesis in nonneuronal cells in response to sciatic nerve transection. *Journal of Cell Biology*, **104**(6), 1623-1631. https://doi.org/10.1083/jcb.104.6.1623

Hilbert, J. E., Barohn, R. J., Clemens, P. R., Luebbe, E. A., Martens, W. B., McDermott, M. P., Parkhill, A. L., Tawil, R., Thornton, C. A., & Moxley, R. T. (2017). High frequency of gastrointestinal manifestations in myotonic dystrophy type 1 and type 2. *Neurology*, **89**(13), 1348-1354. https://doi.org/10.1212/WNL.0000000000004420

Hildebrandt, R. P., Moss, K. R., Janusz-kaminska, A., Knudson, L. A., Denes, L. T., Saxena, T., Boggupalli, D. P., Li, Z., Lin, K., Bassell, G. J., & Wang, E. T. (2022). Muscleblind-like proteins use modular domains to localize RNAs by riding kinesins and docking to membranes.

Hino, S. I., Kondo, S., Sekiya, H., Saito, A., Kanemoto, S., Murakami, T., Chihara, K., Aoki, Y., Nakamori, M., Takahashi, M. P., & Imaizumi, K. (2007). Molecular mechanisms responsible for aberrant splicing of SERCA1 in myotonic dystrophy type 1. *Human Molecular Genetics*, **16**(23), 2834–2843. https://doi.org/10.1093/hmg/ddm239

Hirokawa, N., Niwa, S., & Tanaka, Y. (2010). Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. In *Neuron* (Vol. 68, Issue 4, pp. 610–638). Elsevier. https://doi.org/10.1016/j.neuron.2010.09.039