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# Perte des protéines MBNL dans les motoneurones : impact sur la fonction de l'unité motrice dans la Dystrophie myotonique

Charles Frison-Roche

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Charles Frison-Roche. Perte des protéines MBNL dans les motoneurones : impact sur la fonction de l'unité motrice dans la Dystrophie myotonique. Médecine humaine et pathologie. Sorbonne Université, 2022. Français. NNT : 2022SORUS305 . tel-04265649v2

HAL Id: tel-04265649

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Submitted on 31 Oct 2023

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ED515 : Complexité du vivant

UMRS974 / Equipe Repeat expansions & Myotonic Dystrophy

# Perte des protéines MBNL dans les motoneurones : Impact sur la fonction de l'unité motrice dans la Dystrophie myotonique

Par Charles Frison-Roche

Thèse de doctorat de Biologie

Dirigée par Denis Furling et co-encadrée par Frédérique Rau

Présentée et soutenue publiquement le 30 septembre 2022

Devant un jury composé de :

Dr. Nicolas Sergeant, directeur de recherche, rapporteur

Pr. Claire Legay, professeur émérite, rapporteur

Pr. Onnik Agbulut, professeur, examinateur

Dr. Perrine Castets, assistant professeur, examinateur

Dr. Denis Furling, directeur de recherche, directeur de thèse

Dr. Frédérique Rau, chargé de recherche, co-encadrant de thèse
Remerciements

Je tiens à remercier les membres du Jury qui ont accepté d'évaluer l'ensemble de mes
travaux de thèse. Je remercie le Pr. Claire Legay et le Dr. Nicolas Sergeant et qui ont endossé le
rôle de rapporteur. Je remercie également le Pr. Onnik Agbulut et le Dr. Perrine Castets,
examinateurs ayant également jugé la qualité de mon travail.

Je remercie la fondation pour la recherche médicale (FRM) pour avoir financé 3 ans de
recherche sur ce projet, sans quoi il n'aurait pas pu voir le jour.

Mille mercis au Dr. Denis Furling pour m'avoir accueilli dans cette équipe. Merci pour ta
guidance durant les périodes charnières de cette thèse et les longues discussions sur ce sujet qui
n'était pas toujours facile. Merci également pour ta bienveillance qui m'a permis de me sentir intégré
dans cette équipe.

Merci infiniment au Dr. Frédérique Rau. Je n'aurais pas pu espérer une meilleure encadrante de thèse. Tu m'as scientifiquement guidé tout au long de ce travail et je n'aurai pas pu en apprendre autant sans ta rigueur, ton savoir et ton intelligence. Merci également pour ton implication sans faille dans ce projet, et ce jusqu'à la dernière minute ! Je te remercie enfin d'avoir toujours essayé de me comprendre et de te mettre à ma place ce qui m'a permis de vivre cette thèse avec plus de calme et de sérénité que je ne l'aurais jamais espéré. Notre entente m'a fait donner le meilleur de moi-même et je suis immensément heureux d'avoir travaillé avec toi pendant ces 4 ans.

Je tiens également à remercier tous les membres de mon équipe pour leur conseil et leur
participation dans ce projet. Je tiens à remercier particulièrement Ludovic Arandel pour la
manipulation des animaux et Xavière Lornage pour ses magnifiques génotypages mais aussi nos
discussions qui m'ont énormément apporté. Merci encore à Steve Cottin qui n'aura été dans cette
équipe que quelques mois mais a permis au projet d'avancer à pas de géants.

Merci à Julien Messéant et Marius Halliez pour leur aide sur l'étude des JNM. C'était un
vrai plaisir d'en apprendre autant sur ce sujet avec des personnes aussi savantes et didactiques.
Merci également à Jeanne Lainè pour son étude par MET de la JNM. Je remercie aussi Stéphanie
Godard-Bauché pour son expertise de la JNM et de l'ACHE. Merci pour tes conseils ainsi que nos
séances improvisées de vocalise. Merci à Mégane Lemaitre pour la partie électrophysiologie des animaux mais également le CatWalk, mais aussi pour ta compréhension et ton implication.

Merci à tous mes collègues et amis de Babinski avec qui j'ai passé d'excellents moments au cours de ces 4 ans. Je remercie particulièrement Saline, Xavière, Eline, Alexandra et Alexandrine pour leur bonne humeur et leur soutien quotidien, je n'aurais pas pu y arriver sans vous !

Pour finir, merci à toute ma famille et à mes amis d'avoir été présents pour moi durant ces 4 ans. Merci d'avoir pris le temps de m'écouter radoter sur ma thèse. Cela m'a donné la force de continuer et m'a fait réaliser la chance que j'avais.
# Sommaire

<table><tr><td>Remerciements</td><td>1</td></tr><tr><td>Sommaire</td><td>3</td></tr><tr><td>Introduction</td><td>7</td></tr><tr><td>1 Dystrophia myotonica</td><td>7</td></tr><tr><td>1.1 Dystrophie myotonique de type 1</td><td>8</td></tr><tr><td>1.1.1 Anticipation dans la DM1</td><td>9</td></tr><tr><td>1.1.2 Mosaïcisme somatique dans la DM1</td><td>10</td></tr><tr><td>1.1.3 Interruptions inter-répétitions dans la DM1</td><td>11</td></tr><tr><td>1.2 Dystrophia myotonique de type 2</td><td>11</td></tr><tr><td>1.3 Phénotype clinique des formes adultes des DM</td><td>12</td></tr><tr><td>1.3.1 Symptômes musculaires dans la DM</td><td>13</td></tr><tr><td>1.3.1.1 Myotonie</td><td>14</td></tr><tr><td>1.3.1.2 Faiblesse musculaire et atrophie</td><td>14</td></tr><tr><td>1.3.1.3 Atteinte cardiaque dans la DM</td><td>17</td></tr><tr><td>1.3.2 L'atteinte du système nerveux central dans la DM</td><td>17</td></tr><tr><td>1.3.3 Symptômes génito-urinaires et gastro-intestinaux dans la DM</td><td>18</td></tr><tr><td>1.3.4 Autres symptômes des patients DM</td><td>19</td></tr><tr><td>1.4 Physiopathologie de la DM1</td><td>19</td></tr><tr><td>1.4.1 L'haploinsuffisance des gènes DMPK, SIX5 et DMWD</td><td>20</td></tr><tr><td>1.4.2 Le gain de fonction toxique de l'ARN muté</td><td>21</td></tr><tr><td>1.4.3 Mécanisme pathologique impliquant des protéines de liaison à l'ARN</td><td>23</td></tr><tr><td>1.4.3.1 Séquestration de MBNL</td><td>23</td></tr><tr><td>1.4.3.2 Hyperactivation de CELF</td><td>25</td></tr><tr><td>1.4.3.3 Autres protéines dérégulées</td><td>26</td></tr><tr><td>1.5 Mécanismes physiopathologiques dans la DM</td><td>27</td></tr><tr><td>1.5.1 Dérégulation de l'épissage alternatif dans la DM</td><td>28</td></tr><tr><td>1.5.2 Autres mécanismes physiopathologiques de la DM</td><td>30</td></tr><tr><td>1.5.2.1 Dérégulation des facteurs de transcription</td><td>30</td></tr><tr><td>1.5.2.2 Traduction, localisation et stabilité des ARNm</td><td>30</td></tr><tr><td>1.5.2.3 Dérégulation des miARN</td><td>31</td></tr><tr><td>1.5.2.4 ARN interférence</td><td>32</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>1.5.2.5</td>
      <td>L'expression d'un ARN antisens</td>
      <td>32</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.5.2.6</td>
      <td>Traduction sans ATG</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6</td>
      <td>Modèles de la DM</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.1</td>
      <td>Modèle DMSXL : expression d'un grand nombre de répétitions CTG dans le gène DMPK humain</td>
      <td>34</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2</td>
      <td>Modèles de souris invalidées pour Mbnl</td>
      <td>35</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2.1</td>
      <td>Perte de Mbnl1 de manière ubiquitaire</td>
      <td>35</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2.2</td>
      <td>dKO Mbnl1/Mbnl2 : déplétion homozygote de Mbnl1 et hétérozygote de Mbnl2</td>
      <td>35</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2.3</td>
      <td>KO Mbnl1/Myo-Mbnl2 : déplétion homozygote de Mbnl1 et muscle spécifique de Mbnl2</td>
      <td>36</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2.4</td>
      <td>KO Mbnl1/Myo-Mbnl2/Myo-Mbnl3 : déplétion homozygote de Mbnl1 et muscle spécifique de Mbnl2 et Mbnl3</td>
      <td>36</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2.5</td>
      <td>KO Mbnl1/Nestine-Mbnl2 : déplétion homozygote de Mbnl1 et neurone spécifique de Mbnl2</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.6.2.6</td>
      <td>KO Mbnl1/Myh6-Mbnl2 : déplétion homozygote de Mbnl1 et muscle cardiaque spécifique de Mbnl2</td>
      <td>37</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>1.7</td>
      <td>Stratégies thérapeutiques pour la DM1</td>
      <td>40</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2</td>
      <td>La famille de protéines MBNL</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1</td>
      <td>Trois paralogues : MBNL1, MBNL2 et MBNL3</td>
      <td>42</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.1</td>
      <td>L'implication de MBNL dans le muscle squelettique</td>
      <td>45</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.1.2</td>
      <td>L'implication de MBNL dans le système nerveux central</td>
      <td>46</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2</td>
      <td>Fonctions individuelles des différents domaines des protéines MBNL</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.1</td>
      <td>Propriétés de liaison à l'ARN de la partie N-terminale</td>
      <td>47</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2</td>
      <td>Modalités de liaison de MBNL à sa cible ARN</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2.1</td>
      <td>Séquence consensus</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2.2</td>
      <td>Structure de l'ARN cible</td>
      <td>48</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.2.3</td>
      <td>Nombre et positions des motifs consensus</td>
      <td>49</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.2.3</td>
      <td>Régulation de l'épissage alternatif par la partie C-terminale de la protéine</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3</td>
      <td>Régulateurs des protéines MBNL</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.1</td>
      <td>Autorégulation de MBNL</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.3.2</td>
      <td>Autres régulateurs de MBNL</td>
      <td>51</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4</td>
      <td>Fonction des protéines MBNL</td>
      <td>52</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.1</td>
      <td>Régulation de l'épissage alternatif</td>
      <td>52</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>2.4.2</td>
      <td>Régulation des processus 3'UTR-dépendants</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.2.1</td>
      <td>Polyadénylation alternative</td>
      <td>54</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.2.2</td>
      <td>Localisation des ARN</td>
      <td>55</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.2.3</td>
      <td>Stabilisation des ARN</td>
      <td>57</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.3</td>
      <td>Biosynthèse des miARN</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.4.4</td>
      <td>Inhibition des gènes d'induction à la pluripotence</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3</td>
      <td>L'unité motrice</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1</td>
      <td>Le motoneurone</td>
      <td>61</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1</td>
      <td>Développement des MNs</td>
      <td>62</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1.1</td>
      <td>Organisation des MNs en colonnes</td>
      <td>64</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1.2</td>
      <td>Organisation en groupes de MNs</td>
      <td>65</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1.3</td>
      <td>Types de MNs somatiques</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1.3.1</td>
      <td>MNs α</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.1.3.2</td>
      <td>MNs β et γ</td>
      <td>66</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.2</td>
      <td>La transmission synaptique dans les MNs</td>
      <td>67</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.2.1</td>
      <td>Cellules gliales, soutien des cellules neuronales</td>
      <td>68</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.2.2</td>
      <td>Guidage axonal des MNs</td>
      <td>69</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1.2.3</td>
      <td>Transport des ARNm et traduction locale</td>
      <td>70</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>La jonction neuromusculaire</td>
      <td>71</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1</td>
      <td>Structure tripartite de la JNM</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1.1</td>
      <td>La présynapse axonale</td>
      <td>73</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1.2</td>
      <td>La postsynapse</td>
      <td>73</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.1.3</td>
      <td>La cellule de Schwann</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2</td>
      <td>Développement de la JNM chez la souris</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.1</td>
      <td>Formation</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.1.1</td>
      <td>« Clustering » des RACH et voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.1.2</td>
      <td>Acteurs en aval de MuSK</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.1.3</td>
      <td>Voie de signalisation Wnt</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.1.4</td>
      <td>Voies de signalisation rétrogrades</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.1.5</td>
      <td>Elimination des RACH aneuraux</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.2.2</td>
      <td>Maturation de la JNM</td>
      <td>80</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.3</td>
      <td>Maintien, régénération et vieillissement de la JNM</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.3.1</td>
      <td>Maintien de la JNM</td>
      <td>81</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2.3.2</td>
      <td>Régénération de la JNM après une blessure nerveuse</td>
      <td>82</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table><tr><td>3.2.3.3</td><td>L'évolution de la JNM avec l'âge</td><td>82</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Muscle squelettique et couplage excitation-contraction</td><td>83</td></tr><tr><td>3.4</td><td>Altération du MN et de la JNM dans la DM1</td><td>85</td></tr><tr><td colspan="2">Problématique et objectifs</td><td>87</td></tr><tr><td colspan="2">Résultats</td><td>89</td></tr><tr><td colspan="2">Article en préparation</td><td>89</td></tr><tr><td colspan="2">Résultats complémentaires</td><td>122</td></tr><tr><td colspan="2">Discussion Générale</td><td>136</td></tr><tr><td colspan="2">Conclusion & perspectives</td><td>151</td></tr><tr><td colspan="2">Bibliographie</td><td>153</td></tr><tr><td colspan="2">Annexes à l'article en préparation</td><td>201</td></tr><tr><td colspan="2">Annexe – Vidéos de locomotion des souris</td><td>201</td></tr><tr><td colspan="2">Annexe – Tables supplémentaires</td><td>201</td></tr><tr><td colspan="2">Table des figures</td><td>202</td></tr><tr><td colspan="2">Table des tableaux</td><td>204</td></tr><tr><td colspan="2">Abréviations</td><td>205</td></tr></table>
# Introduction

## 1 Dystrophia myotonica

Le terme dystrophia myotonica (DM), ou dystrophie myotonique, a été introduit au début du siècle dernier, formulé à partir de patients présentant une atrophie musculaire accompagnée d'une difficulté de relaxation des muscles après une contraction, ou myotonie (Batten & Gibb, 1909; Steinert, 1909). A l'heure actuelle, la dystrophie myotonique regroupe deux maladies multisystémiques rares héréditaires à transmission autosomique dominante, la Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) et la Dystrophie Myotonique de type 2 (DM2), originellement appelée dystrophie myotonique proximale (PROMM).

La DM1 et la DM2 sont des maladies dites à expansion. La DM1 est due à une expansion de triplets CTG dans le gène *DMPK* (Brook et al., 1992; Buxton et al., 1992; Fu et al., 1992) et la DM2 a une expansion de quadruplets CCTG dans le gène *ZNF9*, aujourd'hui nommé *CNBP*, respectivement (Thornton et al., 1994; Day et al., 1999; Liquori et al., 2001; Ranum et al., 1998; Ricker et al., 1994). Si l'atteinte musculaire est le symptôme le plus proéminant et caractéristique de la DM, les patients peuvent développer des défauts dans de multiples tissus et selon des degrés très différents (Thornton, 1999; Day et al., 2003). La DM est la dystrophie la plus répandue chez l'adulte avec une prévalence mondiale estimée à 1/8500 (Harper, 2001), ce nombre étant sans doute sous-estimé à cause de la difficulté de diagnostic des patients asymptomatiques ou peu atteints (Suominen et al., 2011).

Ce premier chapitre aura pour but de décrire la pathologie et comprendra 7 parties. Je présenterai d'abord les spécificités de la DM1 (1), puis de la DM2 (2). Les deux pathologies partageant de nombreux aspects, je traiterai par la suite de la DM au sens général, avec mention des différences entre la DM1 et la DM2. J'aborderai ainsi le phénotype clinique (3), le mécanisme moléculaire à l'origine de la DM (4) ainsi que les mécanismes physiopathologiques qui en découlent (5). Je finirai ce chapitre en détaillant les nombreux modèles murins utilisés pour étudier la DM (6) ainsi que les stratégies thérapeutiques considérées jusqu'à présent (7).
## 1.1 Dystrophie myotonique de type 1

La DM1 a été décrite au début des années 1900 (Batten & Gibb, 1909; Steinert, 1909). Elle est désormais reconnue parmi les dystrophies les plus communes chez l'adulte. La DM1 semble être plus présente dans les continents européen et américain avec une prévalence de 1/2100 qui peut monter jusqu'à 1/529 dans certaines régions d'Amérique du Nord (Mathieu et al., 1990; Johnson et al., 2021). Elle est cependant peu représentée en Asie avec une incidence pouvait descendre jusqu'à 1/100 000 (Hsiao et al., 2003). La DM1 est due à une mutation dans le gène *DMPK*, pour *dystrophia myotinica protein kinase*, qui se trouve sur le chromosome 19 (19q13.32) (figure 1) (Johnson et al., 1990).

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>Figure 1 : Représentation schématique du gène *DMPK*.</figcaption></figure>

Le gène *DMPK* présente dans sa partie 3'UTR des répétitions de triplets nucléotidiques CTG. Chez les individus sains, ce nombre de répétitions varie entre 5 et 35 CTG alors que les patients DM1 en comptent entre 50 à plusieurs milliers (Brook et al., 1992; Mahadevan et al., 1992). Le nombre de répétitions CTG est généralement proportionnel à la sévérité des symptômes et inversement proportionnel à l'âge d'apparition des premiers signes de la maladie (Hunter et al., 1992). Actuellement, on distingue 5 catégories de patients et formes de DM1 qui se basent donc à la fois sur le pronostic et la taille des répétitions (figure 2). En partant des formes les plus graves et précoces (De Antonio et al., 2016), les patients peuvent développer la forme :

* Congénitale, apparaissant à la naissance

* Infantile, apparaissant entre 1 mois et 10 ans

* Juvénile, apparaissant entre 11 ans et 20 ans

* Adulte, apparaissant entre 21 ans et 40 ans

* Adulte tardive, apparaissant après 40 ans
<table><caption>Figure 2 : Catégories de patients DM1 et principaux symptômes associés</caption><thead><tr><th>CTG<sub>n</sub></th><th>Catégorie clinique</th><th>Âge d'apparition de la pathologie</th><th>Principaux symptômes possibles</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="5">&gt;1000</td><td>Congénitale</td><td>A la naissance</td><td rowspan="2">Muscle immature, hypotonie, retard mental et ceux mentionnés plus bas</td></tr><tr><td>Infantile</td><td>1 mois - 10 ans</td></tr><tr><td>400-800</td><td>Juvénile</td><td>11 an - 20 ans</td><td rowspan="2">Myotonie, cataractes, problèmes gastriques, faiblesse faciale, défauts de conduction cardiaque, faiblesse et fonte des muscles distaux, résistance à l'insuline, insuffisance respiratoire, QI faible</td></tr><tr><td>250-750</td><td>Adulte</td><td>21 - 40 ans</td></tr><tr><td>50-600</td><td>Adulte tardif</td><td>&gt; 40 ans</td><td>Légère myotonie, cataractes, problèmes gastriques</td></tr><tr><td>35-49</td><td>Prémutation</td><td></td><td>Aucun</td></tr><tr><td>5-34</td><td>Sain</td><td></td><td>Aucun</td></tr></tbody></table>

(adapté de Thomas, Oliveira, Sznajder, & Swanson, 2018).

### 1.1.1 Anticipation dans la DM1

La transmission de la pathologie suit le principe d'anticipation (Höweler et al., 1989), c'est-à-dire que la sévérité des symptômes, et le nombre de répétitions CTG, tendent à augmenter de génération en génération (Harley et al., 1993). Les répétitions CTG deviennent instables à plus de 35 répétitions, les individus présentant entre environ 35 et 49 répétitions sont donc considérés en pré-mutation car ce nombre peut augmenter et provoquer l'apparition de symptômes DM1 à la génération suivante (Kumar et al., 2014; Yamagata et al., 1994). Cette augmentation n'est pas systématique et n'est pas forcément uniforme d'une génération à l'autre, avec chez certains enfants une augmentation considérable du nombre de répétitions CTG par rapport à leur parent porteur de la mutation (figure 3) (Martorell et al., 1998, 2001; Monckton & Caskey, 1995).
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure 3 : Phénomène d'anticipation entre les générations mis en évidence par une famille atteinte de DM1.**</figcaption></figure>

Les contractions du nombre de répétitions sont également possibles entre les générations mais celles-ci ne concernent que 6,4% des transmissions de parents atteints de DM1 (Ashizawa et al., 1994).

### 1.1.2 Mosaïcisme somatique dans la DM1

Les cellules somatiques de l'organisme, ne comprenant donc pas les cellules germinales servant à la reproduction, présentent elles aussi un biais vers l'expansion du nombre de répétitions CTG au cours de la vie de l'individu (Lavedan et al., 1993). L'instabilité somatique dépend de multiples facteurs dont : la taille de l'allèle responsable de la pathologie (Wong et al., 1995), le tissu concerné et le type cellulaire affecté (Ashizawa et al., 1993).

L'instabilité somatique dans le sang a été reliée avec un âge d'apparition des symptômes plus précoce que celui prédit par la taille estimée de l'allèle d'origine (Morales et al., 2012, 2020). Le muscle (Anvret et al., 1993; Martorell et al., 1997) et le cerveau (Otero et al., 2021) figurent parmi les tissus avec le plus grand nombre de répétitions CTG, celui-ci pouvant dépasser 5000 au cours de la vie de l'individu. Ce nombre ne corrèle alors plus avec l'âge d'apparition des symptômes ou leur sévérité dans ces tissus (Zatz et al., 1995). Cette absence de corrélation pour les très longues répétitions montre que leur effet pathogénique est saturable, l'augmentation extensive du nombre de répétitions n'impliquant pas l'aggravation des symptômes (Day & Ranum, 2005b; Harper, 2001). Étant donné que l'instabilité somatique concerne à la fois les cellules somatiques mitotiques et post-mitotiques, les mécanismes physiologiques de réplication, de méthylation (Castel et al., 2011; Cleary et al., 2010) et de réparation (Franck et al., 2020) de l'ADN ont été explorés comme causes possibles de l'instabilité somatique.
### 1.1.3 Interruptions inter-répétitions dans la DM1

Entre 3 et 5% des patients DM1 ne présentent pas une répétition pure de triplets CTG au locus DMPK, celle-ci est en effet interrompue par des triplets variants tels que CCG, CAG ou CGG (Musova et al., 2009; Pešović et al., 2017; Santoro et al., 2013). Étant donné qu'aucun patient avec des interruptions n'a développé de forme congénitale, il en a été déduit que les interruptions atténuent indirectement le phénotype causé par la mutation. En effet, les patients DM1 avec des répétitions interrompues semblent présenter des altérations musculaires et neurologiques amoindries par rapport aux patients présentant des défauts similaires mais sans interruption (Cumming et al., 2019; Miller et al., 2020). Cette atténuation phénotypique peut être due à la répression de l'expansion somatique par stabilisation des répétitions CTG (Pešović et al., 2018), dont le mécanisme reste inconnu. Un profil de méthylation spécifique aux patients avec interruptions pourrait également participer à ce phénomène (de Pontual & Tomé, 2022).

## 1.2 Dystrophie myotonique de type 2

La DM2 représente 2% des patients DM avec une incidence d'un individu touché sur 20 000. Cette incidence est certainement sous-estimée (Suominen et al., 2011) de par la variabilité des symptômes qui caractérise la pathologie. La DM2 est due à une expansion de répétitions tétra-nucléotidiques CCTG (de 75 à 11 000) dans le premier intron du gène *CNBP*, pour *CCHC-type zinc finger nucleic acid binding*, qui se trouve sur le chromosome 3 (3q21) (figure 4) (Day et al., 1999; Liquori et al., 2001; Ranum et al., 1998; Ricker, 1999). Le premier porteur de la mutation à l'origine de la DM2 a été identifié au nord de l'Europe (Bachinski et al., 2003), région ayant la prévalence de la DM2 la plus élevée (Day et al., 2003).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 4 : Représentation schématique du gène *CNBP*.</figcaption></figure>
Le gène *CNBP* présente dans son 1er intron des répétitions de tétramères CCTG. Comme la DM1, la DM2 est une maladie à expansion de répétitions. L'allèle normal compte moins de 30 répétitions CCTG alors que les patients DM2 peuvent présenter jusqu'à 11 000 répétitions, avec une moyenne de 5 000 répétitions dans le sang (Liquori et al., 2001). Contrairement à la DM1, aucun cas de forme congénitale DM2 n'a été décrit et aucune corrélation évidente entre le nombre de répétitions CCTG et la sévérité ou l'âge d'apparition des premiers symptômes n'a été observée. De plus, la DM2 ne suit pas le phénomène d'anticipation mais, comme la DM1, la DM2 est soumise au mosaïcisisme somatique (Ashizawa & Sarkar, 2011; Day et al., 2003). Les mécanismes moléculaires pouvant expliquer la différence d'instabilités entre les répétitions CTG et CCTG sont encore peu clairs.

Enfin, chez les patients atteints de la DM2, l'apparition des symptômes est souvent plus tardive dans et ceux-ci sont souvent moins prononcés que chez les patients atteints de la DM1, malgré un nombre de répétitions bien supérieur (figure 5).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 5 : Principaux symptômes associés à la DM2</figcaption></figure>

(adapté de Thomas, Oliveira, Sznajder, & Swanson, 2018).

## 1.3 Phénotype clinique des formes adultes des DM

Les DM sont caractérisées par des atteintes multisystémiques (figure 6). De plus, ces défauts sont extrêmement variables entre les individus. D'une part à cause de la distinction entre la DM1 et la DM2 et d'autre part à cause des différentes catégories de patients DM1. Enfin, les symptômes varient même au sein des patients DM2 ou au sein des patients DM1 d'une même forme clinique. La DM affecte primairement les tissus musculaires, la myotonie ainsi que la faiblesse et l'atrophie musculaires étant les symptômes les plus représentatifs de la pathologie. Des atteintes cardiaques se manifestent dans 3 patients DM1 sur 4 et 1 patient DM2 sur 5. Avec l'insuffisance respiratoire causée par la faiblesse musculaire, elles constituent les causes majeures de décès chez les patients DM, ces derniers pouvant également développer des troubles neurologiques que l'on retrouve dans
les formes les plus graves de la DM1. En contraste, toutes les formes de la DM peuvent provoquer l'apparition de cataractes atypiques dites en « sapin de Noël ».

Enfin, la majorité des patients souffrent de problèmes gastrointestinaux. Les patients atteints de la forme congénitale de la DM1 ont l'espérance de vie la plus faible parmi les patients DM : 25% de mortalité dans la période postnatale et environ 50% avant 35 ans. Alors que, dans la grande majorité des cas, la DM2 n'impacte pas l'espérance de vie des patients, les patients DM1 avec une forme clinique adulte ont une espérance de vie réduite de 60% par rapport à la population saine à 65 ans. (Day et al., 2003; De Antonio et al., 2016; Mahadevan et al., 2021; Meola, 2020).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 6 : Symptômes plurisystémiques de la DM**</figcaption></figure>

Les patients DM développent des défauts dans de nombreux tissus, incluant les systèmes nerveux central, respiratoire, cardiaque, gastro-intestinal et musculaire.

### 1.3.1 Symptômes musculaires dans la DM

Les atteintes musculaires représentent le défaut le plus commun aux patients DM. Les patients se plaignent ainsi de fortes douleurs musculaires (myalgies) (Romeo, 2012).
### 1.3.1.1 Myotonie

La myotonie, définie comme la difficulté à relâcher les muscles une fois qu'ils ont été contractés, est un défaut musculaire qui affecte la quasi-totalité des patients DM1 avec un profil adulte (figure 7) (Myotonic Dystrophy Foundation, n.d.). La myotonie affecte le plus sévèrement la main, les pieds, la mâchoire et la langue (Wang & Huang, 2011). Elle peut être mesurée par EMG, l'hyperexcitabilité des fibres musculaires produisant des décharges continues de potentiels d'action après une stimulation (Hudson et al., 1995). Alors que la myotonie est un symptôme très commun parmi les patients DM1, les patients DM2 n'en développent que rarement, et encore plus rarement de manière sévère (Udd & Krahe, 2012; Young et al., 2010). La myotonie dans la DM a été associée à un défaut de l'épissage alternatif des transcrits du canal chlorure 1 voltage-dépendant (CLC-1) conduisant à la perte d'expression des canaux (Charlet-B. et al., 2002; Mankodi et al., 2002). La myotonie peut être réduite par traitement avec des bloqueurs des canaux sodiques ou chlorure ou encore des antidépresseurs tricycliques (Antonini et al., 1990; Grant et al., 1987; Leyburn & Walton, 1959).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 7 : La myotonie chez les patients DM**</figcaption></figure>

(adapté de Thomas, Oliveira, Sznajder, & Swanson, 2018). Myotonie de la main après avoir fermé le poing.

### 1.3.1.2 Faiblesse musculaire et atrophie

Les muscles squelettiques des patients DM sont également caractérisés par une faiblesse progressive, accompagnée d'une atrophie, qui touche plus de la moitié des patients (De Antonio et
al., 2016; Montagnese et al., 2017). La DM1 et DM2 se distinguent notamment en fonction des muscles atteints. En effet, la DM1 touche prioritairement les muscles distaux comme les muscles fléchisseurs des doigts et des poignets ainsi que les muscles extenseurs du pied, lesquels provoquent des défauts de locomotion chez les patients (Jiménez-Moreno et al., 2018). Cette faiblesse musculaire est progressive et peut toucher les muscles oropharyngés et respiratoires dont le dysfonctionnement mène à des dysphagies et insuffisances respiratoires, qui représentent la cause majeure de mortalité chez les patients (Mathieu et al., 1999).

La faiblesse et l'atrophie musculaire touchent également les muscles temporaux, sterno-cléido-mastoïdien du cou et orbiculari oculi des paupières qui peuvent engendrer un ptosis. Ces altérations mènent à un profil facial DM1 défini par une tête allongée avec les tempes creuses et souvent associé à une alopécie frontale. Ce faciès est peu représenté chez les patients DM2 et constitue une des distinctions entre les patients. De plus, chez les patients DM2, la faiblesse musculaire touche majoritairement les muscles proximaux et axiaux tels que les muscles fléchisseurs du cou, des cuisses et extenseurs des cuisses (Wenninger et al., 2018). Cette atteinte des muscles proximaux ont valu à la DM2 son nom initial de PROMM (Abbruzzese et al., 1996; Thornton et al., 1994; Meola & Sansone, 1996; Ricker et al., 1994).

Chez les patients DM, la faiblesse musculaire pourrait être due à une altération de l'épissage alternatif conduisant à des défauts du couplage excitation/contraction des membranes musculaires. En effet, l'épissage alternatif des ARNm de la protéine 1 d'interaction dépendante de la boîte myc (BIN1) (Fugier et al., 2011), et des récepteurs à la dihydropyridine (DHPR) par la sous-unité 1S des canaux calciques voltage-dépendant de type L (CACNA1S) (Tang et al., 2012) est altéré à la fois dans la DM1 et la DM2. A ces altérations se rajoutent des défauts de l'épissage alternatif des ARNm du récepteur à la ryanodine 1 (RYR1) et de la pompe ATPase calcique du réticulum sarcoplasmique (RS) (SERCA ou ATP2A1) uniquement dans la DM1 (Kimura et al., 2005).

Au niveau histologique (figure 8), les fibres musculaires des patients DM ont des diamètres particulièrement hétérogènes, sont parfois scindées, certaines pouvant même être orthogonales. Les fibres musculaires peuvent également contenir des agrégats de noyaux pycnotiques qui se manifestent dans les fibres fortement atrophiées. Quant à l'atrophie, elle est plus représentée dans les fibres oxydatives lentes de type I dans la DM1 et dans les fibres glycolytiques rapides de type II dans la DM2. Ce même tropisme a été remarqué pour la centronucléation (Vihola et al., 2003). D'ordinaire, les noyaux des cellules musculaires sont en périphérie de la fibre mais, de manière générale, dans les fibres de type I et II dans la DM1, et dans les fibres de type II dans la DM2, ils sont parfois observés au centre de la fibre (Bassez et al., 2008). Dans un contexte normal, les fibres
centronucléées sont présentes dans les muscles en régénération mais, à ce jour, seule une faible régénération musculaire a été décrite dans les muscles de la DM (Grimby et al., 1988).

Les fibres musculaires de patients DM peuvent également présenter des accumulations de lipides, des noyaux extraordinairement larges ou déformés, des chaînes de noyaux, des masses sarcoplasmiques et de la fibrose au stade tardif (Ikezoe et al., 2007; Meola & Cardani, 2015; Ozimski et al., 2021). Enfin, les muscles des patients peuvent présenter des fibres orthogonales (Schröder & Adams, 1968), associées au défaut d'épissage de la dystrophine (Rau et al., 2015). Pour finir, les muscles lisses, et notamment les muscles du pharynx, l'œsophage et le côlon sont également touchés et ceci peut-être plus fréquemment que les muscles striés squelettiques (Garrett et al., 1969; Schuman et al., 1965).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 8 : Défauts histologiques du muscle squelettique chez les patients DM1 et DM2**</figcaption></figure>

(adapté de Meola & Cardani, 2015). (A-B) Marquages à l'hématoxyline & à l'éosine révélant les noyaux centraux, fibres atrophiques et amas de noyaux. (C-D) Marquages des chaînes lourdes de myosines révélant l'atrophie préférentielle des fibres de type I dans la DM1 et de type II dans la DM2.
### 1.3.1.3 Atteinte cardiaque dans la DM

Après l'insuffisance respiratoire, la mort subite a priori d'origine cardiaque, est la deuxième cause de mortalité chez les patients DM (Groh et al., 2008). Les atteintes cardiaques concernent plus de 80% des patients DM, et peuvent être présentes dès l'adolescence avec des arythmies atriales et ventriculaires ainsi que des embolies (Bassez et al., 2004). Les manifestations cardiaques présentes chez les patients DM1 comprennent des anomalies de la conduction cardiaque, des arythmies, et plus rarement des atteintes cardiaques ischémiques sous forme d'angine stable, instable ou d'infarctus du myocarde. Pour cette raison, des analyses par ECG sont essentielles pour déceler les défauts cardiaques des patients DM, qui peuvent précéder les défauts des muscles squelettiques (McNally et al., 2020). Plus précisément, les ECG révèlent des blocs atrio-ventriculaires, des blocs de branche (Petri et al., 2014) ainsi que des fibrillations et « flutter » atriaux qui semblent être liés aux cas de mort subites des patients (Brembilla-Perrot et al., 2014).

Les patients DM portent des pacemakers ou des défibrillateurs cardiaques, qui augmentent le risque d'ischémie cérébrale (Yoshida et al., 2018). Au niveau histologique, le système de conduction cardiaque des patients DM1 présente majoritairement de la fibrose interstitielle accompagnée d'infiltrations graisseuses (Phillips & Harper, 1997). Les défauts de la conduction cardiaques ont été associées à une altération de l'épissage alternatif de la sous-unité alpha du canal sodique voltage dépendant V (SCN5A) (Freyermuth et al., 2016). La forme des myocytes est également altérée par une hypertrophie et un désalignement des uns par rapport aux autres (Rakocevic-Stojanovic et al., 1999). Chez les patients DM2, ces défauts cardiaques sont similaires mais généralement moins marqués (Kimura & Saito, 2011).

## 1.3.2 L'atteinte du système nerveux central dans la DM

Depuis quelques années, les études cliniques et neuropsychologiques ont prouvé l'implication du système nerveux central (CNS) dans la pathologie, notamment dans les formes les plus sévères de la maladie, renforçant l'idée que la DM1 renvoie aussi à une pathologie neurologique. Un des grands traits cliniques de la DM1 est l'hypersomnie. Les patients DM peuvent également souffrir de douleurs, fatigue, et d'une diminution de la qualité du sommeil (apnée du sommeil et insomnie) (Yu et al., 2011; Rubinsztein et al., 1998). D'autres atteintes neurologiques variées incluent : apathie, un syndrome dysexécutif, des défauts de repérage dans l'espace et une mémoire défaillante. Un tiers des patients présentant la forme adulte classique ont un QI réduit et la moitié présentent une dysfonction exécutive (Liu et al., 2021).
L'atteinte neurologique est encore plus importante chez les formes précoces de la maladie. Ainsi les formes congénitales sont caractérisées par un retard mental pouvant aller de modéré à sévère, alors que la forme infantile est caractérisée par un QI plus bas ainsi qu'un déficit de l'exécution (Angeard et al., 2007; Liu et al., 2021). Au niveau histologique, la DM1 et la DM2 causent une atrophie cérébrale diffuse (Antonini et al., 2004; Kornblum et al., 2004) et des lésions de la matière blanche, notamment des lésions hyperintenses (Romeo et al., 2010) avec une perte axonale associée à une démyélinisation dans la matière blanche profonde dans la DM1 (Itoh et al., 2010)(Minnerop et al., 2018; Weijs et al., 2021). Par ailleurs, des enchevêtrements fibrillaires, associés aux tauopathies, ont été décrits dans la DM (Kiuchi et al., 1991; Maurage et al., 2005). De plus, la physiopathologie de la DM comprend des altérations de l'épissage alternatif, du transport nucléocytoplasmique ainsi que de la traduction sans ATG qui sont des phénomènes réminiscents d'autres maladies neurodégénératives (Caillet-Boudin et al., 2014; Fernandez-Gomez et al., 2019). Dans la DM1, les enchevêtrements fibrillaires sont dus aux défauts de l'épissage alternatif des transcrits codant la protéine Tau associée aux microtubules (MAPT) (Dhaenens et al., 2008; Goodwin et al., 2015; Sergeant et al., 2001). Ces études désignent la DM, et particulièrement la DM1, comme une tauopathie mais cette dénomination reste débattue. Ainsi, une étude récente n'a pas détecté de signature de Tau *in vivo* dans une petite cohorte de patients DM1, soulignant la variabilité entre les patients (Laforce et al., 2022).

### 1.3.3 Symptômes génito-urinaires et gastro-intestinaux dans la DM

La DM altérant le muscle strié mais également le muscle lisse (Harvey et al., 1965), les systèmes génito-urinaires et gastro-intestinaux sont également affectés dans la DM (Fisette-Paulhus et al., 2022). Ainsi, les patients souffrent d'incontinence urinaire (Voháňka et al., 2014). Alors que les femmes sont plus touchées par ce problème, les hommes peuvent présenter une dysfonction érectile ainsi qu'un hypogonadisme (Antonini et al., 2009). Quant aux atteintes gastro-intestinales, les patients peuvent présenter une incontinence anal et des épisodes de diarrhée, de constipation et de douleurs abdominales (Rönnblom et al., 1996). Ces dysfonctionnements semblent plus toucher les femmes que les hommes (Hilbert et al., 2017).

Les symptômes DM sont parfois associés à des défauts du sphincter anal ainsi qu'à une faiblesse et une atrophie des muscles du plancher pelvien, du sphincter anal externe et du muscle pubo-rectal (Eckardt & Nix, 1991; Hamel-Roy et al., 1984). Le foie semble également touché, avec une augmentation des aspartate/alanine aminotransférase (Bellini et al., 2006). La DM est parfois décrite comme une maladie du vieillissement prématuré (Mateos-Aierdi et al., 2015), cela se
retrouve dans les systèmes génito-urinaires et gastro-intestinaux, les symptômes des patients DM ressemblant à ceux de la population gériatrique (Osman & Chapple, 2014; Selvin et al., 2007)

### 1.3.4 Autres symptômes des patients DM

La DM est associée à l'apparition de nombreux autres symptômes dans différents tissus. La survenue de cataractes caractéristiques de la DM dites en « sapin de Noël », est un des symptômes les plus décrits et observé chez plus de la moitié des patients (Day et al., 2003; Ekström et al., 2010; Montagnese et al., 2017). Cependant, le mécanisme physiopathologique associé n'a pas été décrit. Dans un autre registre, les patients DM sont vulnérables face à d'autres pathologies, étant plus susceptibles que la population générale de développer des cancers endométriaux, cervicaux, ovariens et du côlon (Gadalla et al., 2011) ainsi que des maladies thromboemboliques veineuses pour les patients DM1 (Sochala et al., 2018).

Certaines altérations présentes chez les patients DM n'ont pas encore été reliées aux symptômes de la pathologie. Ainsi, la majorité des patients DM1 développent une hypogammaglobulinémie des immunoglobulines G qui n'a pas été associée à des défauts cliniques (Kaminsky et al., 2011). Quant aux patients DM2, ils présentent une plus grande quantité d'auto-anticorps, qui pourrait causer des maladies auto-immunes (Tieleman et al., 2009). Les fonctions endocrines peuvent également être touchées chez les patients DM avec un risque accru de cancer thyroïdien (Alsaggaf et al., 2018), un hypogonadisme, un hyperinsulinisme probablement dû à une résistance à l'insuline, ainsi qu'une alopécie frontale (Winters, 2021).

## 1.4 Physiopathologie de la DM1

Les expansions de répétitions CTG et CCTG à l'origine de la DM1 et DM2 se trouvant toutes deux dans des régions non-codantes et étant donné le grand nombre de ressemblances entre les deux pathologies, il a été postulé qu'un unique mécanisme pathologique était à l'origine des symptômes des patients DM. Deux mécanismes principaux ont été étudiés. D'une part, pour la DM1, l'haploinsuffisance des gènes porteurs de la mutation et des gènes flanquant l'allèle *DMPK* muté contenant les répétitions : *SIX homeobox 5 (SIX5)* et *DM1 Locus, WD Repeat Containing (DMWD)*. D'autre part, un gain de fonction toxique des ARNs transcrits contenant de longues répétitions CUG ou CCUG ayant un impact sur des cibles en aval.
1.4.1 L'haploinsuffisance des gènes DMPK, SIX5 et DMWD

L'expansion de répétitions CTG est située dans la région 3'UTR du gène *DMPK*, située entre les gènes *SIX5* et *DMWD*. Une première hypothèse postulait d'un modèle d'haploinsuffisance par un effet en cis sur l'expression des gènes *DMPK*, *SIX5* et *DMWD* comme mécanisme pathologique possible pour expliquer les symptômes associés à la DM1. En effet, les ARN mutés contenant de longues répétitions CUG ne sont pas exportés et sont retenus dans les noyaux des cellules sous forme d'agrégats nucléaires (Davis et al., 1997; Sabouri et al., 1993), entraînant une diminution d'expression de 50% du gène *DMPK* dans des tissus et cellules dérivés de patients (Carango et al., 1993; Davis et al., 1997; Klein et al., 2011; Maeda et al., 1995; Ueda et al., 1999; Fu et al., 1992, 1993).

Les îlots CpG en amont et en aval des répétitions CTG ne sont pas méthylés chez les individus sains mais sont hyperméthylés chez les patients atteints de la forme congénitale de la DM1. Cette différence suggère que les longues répétitions sont plus susceptibles à certaines modifications épignétiques (Barbé et al., 2017; Steinbach et al., 1998). Cependant, même si la perte de fonction de la protéine DMPK avait d'abord été reliée à des anomalies cardiaques et une légère myopathie (Berul et al., 1999, 2000; Saba et al., 1999), une étude plus récente a montré que la perte de fonction de DMPK n'avait aucun impact sur la fonction des muscles squelettiques ou cardiaques (Carrell et al., 2016).

L'hypothèse d'haploinsuffisance s'est également portée sur les gènes proches des expansions de répétitions, étant donné que *SIX5* et *DMWD* ont également une expression diminuée dans la DM1 (Alwazzan et al., 1999)(Klesert et al., 1997). Pour *SIX5* particulièrement, le site *enhancer* hypersensible entre les répétitions CTG et le promoteur du gène *SIX5* a été considéré comme une cause possible de l'haploinsuffisance de *SIX5* (Thornton et al., 1997; Klesert et al., 1997; Otten & Tapscott, 1995). Les souris invalidées pour le gène *SIX5* développent des cataractes à l'état homozygote et des anomalies cardiaques légères chez les hétérozygotes. Cependant, les patients développent des cataractes alors que l'expression de *SIX5* n'est que diminuée, et pas abolie (Klesert et al., 2000; Sarkar et al., 2000).

Une étude récente a cependant combiné les approches précédentes en générant un modèle de souris invalidées pour les gènes *Dmpk*, *Six5*, *Dmwd* et *Mbnl1*. Ainsi, un modèle quadruple KO incluant ces trois premiers gènes, et Mbnl1 (dont nous verrons l'implication dans la pathologie dans la suite de ce chapitre), aggrave fortement le Triple KO qui n'inclut pas la déplétion de *Dmwd*. En effet, le quadruple KO reproduit de nombreux aspects de la forme congénitale de la DM1 : mortalité plus élevée, atrophie musculaire généralisée et taches dans les yeux qui pourraient être
associées à une cataracte (Yin et al., 2019). Cette étude a remis en perspective l'implication de l'haploinsuffisance de *DMPK*, *SIX5* et *DMWD* dans le développement de la pathologie mais reste toutefois relié à la perte de MBNL1.

Pour la DM2, le modèle murin invalidé pour le gène *Cnbp* reproduit une atteinte plurisystémique des patients avec notamment des cataractes, des défauts cardiaques et une fonte musculaire (Chen et al., 2007). Pour conclure, bien que l'haploinsuffisance des gènes liés aux locus DM1 et DM2 puissent être liée dans une certaine mesure aux différences entre la DM1 et la DM2 (Raheem et al., 2010), le fait que les mutations de la DM1 et de la DM2 ne soient pas sur le même locus exclut ce processus pour expliquer la plus grande partie du mécanisme pathologique responsable des grandes similitudes entre la DM1 et la DM2.

### 1.4.2 Le gain de fonction toxique de l'ARN muté

Le modèle d'haploinsuffisance des gènes *DMPK* et *SIX5* a été contesté dans une étude montrant que l'expression seule de 200 répétitions CTG en dehors du contexte de la région 3'UTR du gène *DMPK* était suffisante pour induire une inhibition de la myogenèse de cellules C2C12 (Amack et al., 1999).

De plus en plus d'études soutiennent l'hypothèse d'un gain de fonction toxique des ARNs mutés comme source du mécanisme pathologique de la DM. La transcription des expansions de répétitions C(C)TG produisent des ARNs toxiques contenant des expansions de répétitions (C(C)UGexp) qui s'agrègent dans le noyau des cellules et forment des structures imparfaites à deux brins, ou foci ARN, qui sont visibles dans les cellules dérivées et tissus de patients DM (Figure 9). Ces foci ont été observés dans les cellules des patients DM1 et DM2, confortant leur implication dans un mécanisme pathologique commun aux deux maladies.

Le rôle majeur de ces ARNs mutés dans la DM a d'abord été révélé par les modèles de souris transgéniques DM300 et HSA<sup>1R</sup>, qui expriment des transcrits avec des CUGexp (Gourdon et al., 1997; Mankodi et al., 2000). Les souris DM300, générées par insertion d'un fragment génomique humain d'environ 45kb avec 300 répétitions CTG, récapitulent les défauts plurisystémiques de la DM1. Tandis que les souris HSA<sup>1R</sup>, générées par expression d'un transgène avec l'actine squelettique humaine comprenant 250 répétitions CTG dans sa partie 3'UTR, récapitulent certaines altérations musculaires de la DM1, telles que la myotonie et la présence de noyaux centraux au niveau histologique, qui corrèlent positivement avec l'expression du transgène.
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 9 : Foci ARN dans la DM1 et la DM2</figcaption></figure>

(adapté de Liquori et al., 2001). Hybridation *in situ* de sondes CAG (DM1) et CAGG (DM2) dans le noyau (bleu) de cellules dérivées (a) ou de tissus musculaires (b) de patients.

Non seulement la DM1 et la DM2 ne sont pas causées par des mutations dans le même gène mais la localisation des répétitions dans le gène muté est essentielle au mécanisme pathologique de l'ARN. En effet, dans la DM1, les ARNm *DMPK* mutés, coiffés en 5', polyadénylés en 3', sont épissés et traduits, ce qui signifie que leur rétention intranucléaire n'est pas due à une dérégulation du métabolisme de l'ARN *DMPK* (Taneja et al., 1995). Alors que dans le cas de la DM2, les CCTGexp devraient être intégralement éliminées au cours de l'épissage alternatif. Les foci CCTG observés dans la DM2 seraient donc composés de séquences introniques dépourvues des régions adjacentes (Margolis et al., 2006). Il est cependant également possible qu'il y ait une rétention d'intron au cours de l'épissage alternatif du gène, comme cela a été décrit dans des lymphoblastes de patients avec la sclérose latérale amyotrophique présentant des répétitions GGGGCC (Niblock et al., 2016).

Par ailleurs, l'encombrement moléculaire des hélices électronégatives ARN de type A avec des renflements de mésappariements U-U ainsi que la localisation éparse des foci C(C)UGexp leur donnent de grandes zones disponibles pour interagir avec des protéines de liaison à l'ARN ou d'autres facteurs cellulaires, perturbant leur fonction (Mooers et al., 2005; Tian et al., 2000). Ces facteurs diminuent la mobilité de ces complexes ribonucléoprotéiques au sein du noyau et entraînent leur rétention dans le noyau (Querido et al., 2011).
Enfin des études ont été menées afin de comprendre le rôle des gènes *DMPK* et *CNBP* portant respectivement les répétitions CTG et CCTG. L'absence de DMPK dans les myotubes des souris *Dmpk*⁻/⁻ conduirait à des augmentations du calcium intracellulaire et à des défauts du couplage excitation/contraction, mettant en évidence le rôle de Dmpk dans l'homéostatsie calcique (Benders et al., 1997). Plus récemment, il a été montré que la protéine DMPK migre au niveau de l'enveloppe nucléaire au cours de la différenciation induite par le facteur LIF ainsi qu'au cours de la mitose de cellules C2C12 (Harmon et al., 2008). Enfin, la surexpression ou la déplétion de *Dmpk* dans des cellules C2C12 perturbe l'intégrité de la membrane nucléaire (Harmon et al., 2011). La protéine CNBP est exprimée de manière ubiquitaire et localisée au niveau des bandes Z du muscle squelettique et au niveau des axones neuronaux chez l'homme (Massa et al., 2010). A ce jour, ses fonctions restent méconnues.

### 1.4.3 Mécanisme pathologique impliquant des protéines de liaison à l'ARN

La fonction de deux familles de protéines de liaison à l'ARN, Muscleblind-like (MBNL) et CUGBP Elav-like Family member (CELF), a été décrite comme profondément altérée dans la DM et directement liée à l'établissement de la physiopathologie des patients DM. MBNL et CELF sont notamment des facteurs d'épissage qui contrôlent la transition des isoformes fœtales aux isoformes adultes de leurs cibles au cours du développement (Ho et al., 2004; Kuyumcu-Martinez et al., 2007; Philips et al., 1998; Lin et al., 2006). MBNL et CELF ont des actions antagonistes sur leurs cibles, qui sont dues aux régulations qui découlent de leur liaison à des sites en amont et en aval de l'exon régulé (Wang et al., 2015; Kalsotra et al., 2008). La perte de fonction des protéines MBNL combinée à l'hyperactivation de CELF promeut donc un profil d'expression fœtale pathologique des transcrits caractéristique de la DM. Ce mécanisme étant central dans cette pathologie, la DM est qualifiée de spliceopathy (Nakamori et al., 2013). L'activité d'autres protéines de liaison à l'ARN est également perturbée dans la DM1, notamment Staufen homolog 1 (STAUFEN1) (Bondy-Chorney et al., 2016) et la ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène H (hnRNP h) (Kim et al., 2005).

#### 1.4.3.1 Séquestration de MBNL

Les protéines MBNL se lient spécifiquement aux ARN contenant des répétitions CUG (Miller et al., 2000) grâce aux bases GC interrompues par des bases pyrimidiques désappariées, telles que les mésappariements U-U (tels que dans les CUGexp de la DM1) et C-U/U-C (tels que dans les CCUGexp de la DM2) (Yuan et al., 2007). La quantité de MBNL séquestré est
proportionnelle à la longueur des répétitions (Miller et al., 2000). MBNL colocalise avec les foci CUG et CCUG (figure 10) (Cardani et al., 2006; Fardaei et al., 2001; Holt et al., 2009; Mankodi et al., 2001; Perdoni et al., 2009). Elle est par ailleurs essentielle à la stabilisation des foci caractéristiques de la DM. Ainsi, la déplétion de MBNL entraîne une diminution du nombre de foci (Dansithong et al., 2005), et sa surexpression conduit à leur augmentation (Osborne & Thornton, 2008).

Au-delà de son implication dans la formation des foci, la perte de fonction de MBNL est un phénomène central dans la mise en place du mécanisme pathologique de la DM. En effet, les souris modèles déplétées pour *Mbnl1* de manière ubiquitaire reproduisent les altérations plurisystémiques de la DM, incluant la myotonie, des cataractes et les défauts d'épissage alternatif rencontrés dans cette *spliceopathy* (Kanadia, Johnstone, et al., 2003). A contrario, la surexpression de MBNL1 annule les altérations dues aux CUGexp dans le modèle HSA<sup>1,R</sup> (Kanadia et al., 2006). Quant à la perte globale de MBNL2, elle induit l'apparition de troubles exclusivement neurologiques tels que des troubles du sommeil paradoxal et un déficit de la mémoire spatiale (Charizanis et al., 2012). La perte simultanée des protéines MBNL1 et MBNL2, cette dernière à l'état hétérozygote (le double KO homozygote étant létal à l'état embryonnaire) aggrave les défauts décrits suite à la perte de MBNL1 uniquement. Ces souris développent une atrophie musculaire associée à des altérations supplémentaires de l'épissage alternatif par rapport aux souris déplétées pour MBNL1 uniquement (Goodwin et al., 2015; Lee et al., 2013).

Ces défauts de l'épissage alternatif sont encore aggravés par une perte simultanée des 3 protéines MBNL1, MBNL2 et MBNL3 dans le muscle squelettique. Ces souris MBNL triple KO développent ainsi une myopathie comparable aux patients atteints de la forme congénitale de la DM1 (Thomas et al., 2017). Ainsi, les modèles murins de déplétion des protéines MBNL récapitulent les altérations principales de la DM, démontrant l'importance de la perte de fonction de ces protéines dans le mécanisme pathologique de la DM (Du et al., 2010).
<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 10 : MBNL est séquestré par les foci ARN dans le noyau des cellules DM**</figcaption></figure>

FISH révélant les CUGexp (rouge) combiné à un immunomarquage de MBNL (vert) dans le noyau (bleu) de cellules dérivées de patients DM1.

Dans la DM2 spécifiquement, il a été montré *in vitro* que RBFOX, un autre facteur d'épissage, est en compétition avec MBNL pour la liaison aux répétitions CCUG à l'origine de la pathologie (Sellier et al., 2018). De cette compétition résulte une séquestration amoindrie de MBNL dans les foci qui pourrait expliquer les symptômes moins prononcés des patients atteints de la DM2 par rapport à ceux atteints de la DM1 (Sellier et al., 2018).

#### 1.4.3.2 Hyperactivation de CELF

Le potentiel de liaison de CELF1 aux C(C)UGexp a été identifié *in vitro* (Timchenko et al., 1996; Timchenko et al., 2001). Cependant, CELF1 ne colocalise pas avec les foci CUG dans des fibroblastes dérivés de patients DM (Fardaei et al., 2002; Faustino & Cooper, 2005; Timchenko, 1999; Teplova et al., 2010). A l'inverse, CELF1 est surexprimé dans les muscles squelettiques et cardiaques DM1 (Kalsotra et al., 2008; Philips et al., 1998) ainsi que dans certains modèles cellulaires et murins exprimant des CUGexp (Kuyumcu-Martinez et al., 2007; Timchenko et al., 2001; Roberts et al., 1997; Savkur et al., 2001). De plus, la surexpression de CELF1 dans des souris modèles suffit à reproduire en partie la myopathie (fonte musculaire, défauts de conduction cardiaque), spliceopathy de la DM ainsi qu'une mortalité précoce (Ho, Bundman, et al., 2005; Koshelev et al., 2010; Timchenko et al., 2004; Ward et al., 2010).

La surexpression de CELF1 est due à une hyperphosphorylation et stabilisation de la protéine par la voie de la protéine kinase C (PKC) (Kuyumcu-Martinez et al., 2007). Ainsi, une inhibition de la voie PKC a réduit la quantité de protéines CELF1 et amélioré le phénotype de souris modèles présentant 960 CUGexp dans un transgène DMPK humain (Wang et al., 2009; Kuyumcu-Martinez et al., 2007; Morriss et al., 2018). Cependant, le mécanisme par lequel les expansions de triplets CTG activent la voie PKC est inconnu à ce jour. D'autres régulateurs de
CELF1 incluent la glycogène kinase synthase 3 beta (GSK3β), la kinase cycline-dépendante 4 (CDK4)/Cycline D3 et la calcineurine (Jones et al., 2012; Ravel-Chapuis et al., 2018). Quant à la DM2, les études sont contradictoires, certaines décrivant une surexpression de CELF1 comme dans la DM1 (Salisbury et al., 2009) tandis que d'autres ne relèvent aucun changement dans des cellules dérivées de patients DM2 (Pelletier et al., 2009; Lin et al., 2006).

### 1.4.3.3 Autres protéines dérégulées

MBNL et CELF1 ne sont pas les seules protéines liées au métabolisme des ARNs impactées par les C(C)UGexp dans la DM. En effet, hnRNP h fait partie d'un complexe protéique régulant l'épissage alternatif. Son expression est augmentée dans des cellules musculaires DM1 et pourrait jouer un rôle dans la spliceopathy de la DM1 (Kim et al., 2005; Paul et al., 2011). Pareillement, STAUFEN1 est surexprimée dans le muscle DM1 et de modèles DM1. STAUFEN1 régule le transport des ARNm et semble être impliquée dans l'épissage alternatif de certains transcrits dérégulés de la DM (Bondy-Chorney et al., 2016) ainsi que l'export des ARN DMPK mutés non associés aux foci en dehors du noyau. Tout comme hnRNPh, on ne sait pas si STAUFEN1 est séquestrée par les foci (Ravel-Chapuis et al., 2012).

DEAD box protein 5 (DDX5) et DEAD box protein 6 (DDX6) sont des hélicases ARN capables de séparer les structures en épingles à cheveux des C(C)UGexp, les rendant plus susceptibles à la dégradation. Leur expression est réduite dans la DM1 mais leur surexpression dans des cellules DM1 a donné des résultats prometteurs, réduisant le nombre de foci et corrigeant quelques épissages altérés dans la pathologie (Jones et al., 2015; Pettersson et al., 2014). En revanche, l'action de DDX5 sur les répétitions CUG exacerbe leur liaison à MBNL1 in vitro (Laurent et al., 2012). Ainsi, à la fois la diminution et l'augmentation de l'activité de DDX5 dans le cadre de la DM pourrait participer à la mise en place du mécanisme pathologique de la DM.

Enfin, dans la DM2, les protéines de liaison à l'ARN rbFOX, régulant l'épissage alternatif, se lient directement aux CCUGexp mais ne sont pas séquestrées dans les foci. rbFOX1 et rbFOX2 rivalisent avec MBNL pour la liaison aux CCUGexp et la surexpression de rbFOX1 libère une partie des protéines MBNL, conduisant à une amélioration des défauts d'épissage. rbFOX pourrait ainsi participer aux mécanismes responsables de la pathogénicité réduite de la DM2 par rapport à la DM1 (Sellier et al., 2018).
## 1.5 Mécanismes physiopathologiques dans la DM

L'expansion du nombre de répétitions C(C)TG altère le fonctionnement d'autres voies métaboliques qui sont à l'origine du développement de la DM (figure 11). Le mécanisme principal décrit est la séquestration des protéines MBNL et l'hyperactivation de CELF1 qui causent des défauts de l'épissage alternatif dans les multiples tissus affectés par la pathologie. Par ailleurs, les C(C)UG induisent un dérèglement de certains facteurs de transcription, de la traduction, de la stabilité des ARNm et du fonctionnement des miARN. Les ARNm mutés DMPK et CNBP sont également concernés par la transcription antisens et la traduction sans ATG dont les conséquences restent à déterminer précisément.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 11 : Mécanisme pathologique principale de la DM**</figcaption></figure>

(adapté de André, Ausems, Wansink, & Wieringa, 2018). Locus DM1 et DM2 avec les gènes DMPK et CNBP présentant des répétitions CTG ou CCTG dans leur région 3'UTR ou intronique respectivement. Les transcrits mutés *DMPK* et *CNBP* s'accumulent dans le noyau des cellules et ne sont pas exportés vers le cytoplasme. Ces foci ARN séquestrent les protéines MBNL, nuisant à leur fonction. CELF1, ayant un rôle antagoniste de MBNL, est hyperphosphorylé et exacerbé notamment les défauts d'épissage dus à la perte de MBNL. Les protéines des loci DM1 et DM2 ne sont traduites correctement que par l'allèle sauvage. Les C(C)TGexp sont partiellement traduites en polypeptides qui s'accumulent dans le noyau.
1.5.1 Dérégulation de l’épissage alternatif dans la DM

La DM est considérée comme une spliceopathy, c'est-à-dire qu'une majeure partie de son mécanisme pathologique est dû à des altérations de l'épissage alternatif, lequel est un processus cellulaire essentiel par lequel les introns d'un pre-ARNm sont excisés et les exons joints les uns aux autres, formant un ARNm mature pour la traduction en protéine. Par rapport à l'épissage constitutif, l'épissage alternatif ajoute à ces étapes l'excision de certains exons, démultipliant le nombre de protéines pouvant être traduites à partir d'un seul gène (pour revue : Wilkinson, Charenton, & Nagai, 2020).

Dans le cas de la DM, la dérégulation de l'épissage alternatif est due à un effet trans dominant des expansions CUGexp et CCUGexp situé sur un seul allèle des gènes *DMPK* et *ZNF9* respectivement, sur des facteurs d'épissage alternatif (MBNL et CELF notamment). Plus précisément, les facteurs d'épissage MBNL et CELF, dérégulés par les C(C)UGexp contrôlent le basculement entre les isoformes fœtales et adultes au cours du développement. La perte de fonction de MBNL et/ou l'hyperphosphorylation de CELF1 induit une expression d'isoforme fœtale de nombreux transcrits dans un tissu adulte. Plus d'une centaine d'événements d'épissage alternatif altéré ont été décrits dans la DM et certains ont été directement reliés à certains symptômes caractéristiques de la DM (Tableau 1).
<table><caption>Tableau 1 : Événements d'épissage alternatif altérés et associés aux symptômes de la DM1</caption><thead><tr><th>Organe</th><th>Symptôme</th><th>Gène</th><th>Exon(s)</th><th>Evènement</th><th>Fonction de la protéine</th><th>Conséquence moléculaire</th><th>Référence(s)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="10"></td><td rowspan="4">Faiblesse musculaire</td><td>BIN1</td><td>11</td><td>Exclusion</td><td>Régulation de la biogenèse des tubules transverses</td><td>Tubules transverses anormaux</td><td>Fugier et al., 2011</td></tr><tr><td>CACNA1S</td><td>29</td><td>Exclusion</td><td>Canal calcique voltage-dépendant CaV1.1 impliqué dans le couplage excitation/contraction</td><td>Augmente la conductance de CaV1.1 et la sensitivité au voltage. Dans les fibres matures, augmente la libération de Ca<sup>2+</sup></td><td>Tang et al., 2012</td></tr><tr><td>SERCA1</td><td>22</td><td>Exclusion</td><td>Pompe sarcoplasmique permettant le repompage du Ca<sup>2+</sup></td><td>Dérégulation de l'homéostasie du Ca<sup>2+</sup> dans le réticulum sarcoplasmique. Couplage excitation/contraction perturbé</td><td>Kimura et al., 2005</td></tr><tr><td>RYR1</td><td>70</td><td>Exclusion</td><td>Canal calcique essentiel pour la libération du Ca<sup>2+</sup> dans le réticulum sarcoplasmique</td><td>Activité anormale de la dystrophine par régression de la partie C-terminale adulte en feuillets β en une forme embryonnaire en hélice α ampiphatique</td><td>Rau et al., 2015</td></tr><tr><td>Processus dystrophique</td><td>DMD</td><td>78</td><td>Exclusion</td><td>Protéine structurale et de signalisation qui lie le cytosquelette d'actine à la matrice extracellulaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myotonie</td><td>CLCN1</td><td>7a</td><td>Inclusion</td><td>Canal calcique reponsable de la conductance transmembranaire au chlore</td><td>Dégradation des ARN non-sens qui induit la perte de fonction de la protéine</td><td>Mankodi et al., 2002<br>Charlet et al., 2002<br>Wheeler et al., 2009</td></tr><tr><td>Atrophie musculaire</td><td>PKM2</td><td>10</td><td>Inclusion</td><td>Kinase essentielle pour la glycolyse aérobie</td><td>Défauts du métabolisme glycolitique énergétique</td><td>Gao et al., 2013</td></tr><tr><td>Résistance à l'insuline</td><td>INSR</td><td>11</td><td>Exclusion</td><td>Récepteur à l'insuline impliqué dans le stockage et la métabolisme du glucose</td><td>Augmente l'affinité pour l'insuline et accélère son recyclage et son internalisation</td><td>Savkur et al., 2001</td></tr><tr><td>Symptômes progressifs de la pathologie</td><td>MBNL1, MBNL2</td><td>5<br>7<br>8</td><td>Inclusion</td><td>Protéines de liaison à l'ARN régulatrices du métabolisme des ARN</td><td>Translocation nucléaire des protéines. Altération de l'activité régulatrice de MBNL dont l'épissage alternatif, la localisation et le choix du site de polyadénylation</td><td>Sznajder et al., 2016<br>Kino et al., 2015<br>Tran et al., 2010<br>Yuna et al., 2007</td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2">Arythmie et délai de conduction</td><td>SCN5A</td><td>6a<br>6b</td><td>Inclusion<br>Exclusion</td><td>Canal sodique responsable de l'excitabilité des cardiomyocytes et de la contraction cardiaque</td><td>Excitabilité réduite</td><td>Freyermuth et al., 2016</td></tr><tr><td>RBFOX2</td><td>43 nt</td><td>Exclusion</td><td>Protéine de liaison à l'ARN régulatrice de l'épissage alternatif</td><td>Epissage alternatif de canaux sodiques et potassiques voltage-dépendants altéré</td><td>Misra et al., 2020</td></tr><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2">Déficit cognitif</td><td>MAPT</td><td>2<br>3<br>6c<br>6d<br>10</td><td>Exclusion<br>Exclusion<br>Exclusion<br>Inclusion<br>Exclusion</td><td>La protéine tau associée aux microtubules stabilise les microtubules, majoritairement dans les neurones</td><td>Apparition progressive d'enchevètrements fibrillaires formés d'agrégats de MAPT hyperphosphorylée</td><td>Sergeant et al., 2001<br>Leroy et al., 2006<br>Jiang 2004<br>Goodwin et al., 2015</td></tr><tr><td>Mémoire défaillante</td><td>NMDAR1</td><td>5</td><td>Inclusion</td><td>Récepteur ionotropique à la synapse neuronale impliqué dans la plasticité synaptique</td><td>Délocalisation des dendrites vers le soma</td><td>Jiang et al., 2004</td></tr></tbody></table>
1.5.2 Autres mécanismes physiopathologiques de la DM

Aux défauts d'épissage alternatifs s'ajoutent d'autres mécanismes moléculaires qui témoignent de la complexité et de la variété des atteintes de la DM.

1.5.2.1 Dérégulation des facteurs de transcription

Au-delà de la spliceopathy caractérisant la DM, l'expression de nombreux gènes dans différents tissus a été décrite comme altérée dans des biopsies de patients et des modèles de la pathologie (Botta et al., 2007; Du et al., 2010; Wang et al., 2012; Otero et al., 2021). De plus, des facteurs de transcription sont dérégulés dans la DM, que ce soit dans leur distribution et accessibilité comme la specificity protein 1 (SP1), le récepteur gamma à l'acide rétinoïque (RARγ) (Ebralidze et al., 2004) et la protéine de répression associée à SMRT/HDAC1 (SHARP) dans des cellules musculaires DM1 ou dans leur expression comme NK2 homeobox 5 (NKX2-5), diminuée dans le muscle DM1 et impliquée dans la conduction cardiaque et la régénération musculaire (Yadava et al., 2008).

1.5.2.2 Traduction, localisation et stabilité des ARNm

La traduction, la localisation et la stabilité des ARN sont également dérégulées dans la DM. En effet, non seulement les protéines MBNL et CELF se lient dans les régions introniques et exoniques des ARNm régulant l'épissage alternatif, mais des expériences de cross-linking immunoprecipitation (CLIP) ont révélé des sites de liaison de ces protéines dans la partie 3'UTR de certains ARN, suggérant un rôle supplémentaire dans leur régulation (Wang et al., 2012). Ainsi, dans les neurones, MBNL1 et MBNL2 contrôlent l'épissage alternatif d'exons terminaux alternatifs (ALE) influençant la localisation de transcrits vers le soma ou les neurites (Taliaferro et al., 2016). Le 3'UTR est souvent le lieu contrôlant la localisation de l'ARN (Andreassi & Riccio, 2009), MBNL pourrait donc être impliqué dans la localisation d'un grand nombre de transcrits.

De plus, MBNL pourrait également affecter la stabilité des ARNm, suggérant ainsi que l'altération de l'expression de certains gènes ne serait pas liées à leur transcription mais à une modification de la stabilité de leur ARNm (Wang et al., 2012, 2015; Masuda et al., 2012).

De la même manière que pour l'épissage alternatif, le choix du site de polyadénylation est perturbé dans la DM, conduisant à l'expression d'isoformes fœtales (Wang et al., 2012). Ces défauts
ont été reliés à la séquestration de MBNL, dont l'interaction dans le 3'UTR est essentielle au choix
du site de polyadénylation de certains transcrits (Batra et al., 2014).

Chez les patients DM, la stabilité augmentée de CELF1 conduit à des anomalies de la
traduction (Timchenko, 1999, 2002; Timchenko et al., 2004). Il interagit avec le facteur eucaryote
d'initiation 2 (eIF2), lui-même impliqué dans le recrutement du complexe d'initiation à la traduction
pour l'ARNm cible (Dasgupta & Ladd, 2012). Cette interaction dépend de l'état de phosphorylation
de CELF1, qui est altéré dans la DM1 et la DM2, provoquant l'agrégation de complexes CELF1-
eIF2 dans des granules de stress (Vlasova-St. Louis et al., 2013). Ce faisant, l'hyperphosphorylation
de CELF1 perturbe la traduction de ces ARNm cibles, impliqués dans la différentiation des cellules
musculaires (Barreau et al., 2006). D'autre part, CELF1, en se liant aux ARN contenant une
séquence riche en G-U dans leur 3'UTR, peut modifier leur expression en réduisant leur demi-vie
(Wang et al., 2015; Vlasova et al., 2008). Parmi ces ARN, on retrouve des transcrits codant pour
des protéines impliquées dans l'homéostasie musculaire (Timchenko, 2013; Rattenbacher et al.,
2010).

1.5.2.3 Dérégulation des miARN

Les miARNs sont de petits ARNs non codants qui régulent de manière post-
transcriptionnelle l'expression de transcrits cibles. Tel que cela a été décrit dans différentes
myopathies (Eisenberg et al., 2009), l'expression de miARNs tels que miR-1, miR-7, miR-10 et
miR-29 dans la DM1 et miR221-3p, miR34c-5p et miR125b-5p dans la DM2, semble altérée dans
des cellules musculaires dérivées de patients DM (Fernandez-Costa et al., 2013; Greco et al., 2012;
Perbellini et al., 2011). Plus particulièrement, dans le cœur de patients DM1, plus d'une vingtaine
de miARNs ont une expression diminuée, associée à des arythmies et de la fibrose, tel que cela est
décrit dans la DM (Kalsotra et al., 2014). Parmi ces miARNs, miR-1 a été relié à des défauts de
conduction cardiaque, sa diminution induisant une augmentation de l'expression de la sous-unité
alpha 1 du canal calcique voltage-dépendant (CACNA1C) et de la protéine alpha-1 des jonctions
communicantes (GJA1) (Rau 2011). Deux mécanismes ont été proposés pour expliquer le défaut
de maturation de miR-1 dans un contexte DM. Le premier l'impute à la déplétion de MBNL1, qui,
dans un contexte sain, peut se lier au pre-miR-1, le rendant disponible pour son activation par le
complexe dicer, une ribonucléase responsable de la biogenèse des miARNs et siARNs.

Des sites de liaison ont également été identifiés dans d'autres pre-miARNs, suggérant un
rôle similaire de MBNL1 pour d'autres cibles (Rau et al., 2011). Le second mécanisme impute la
dérégulation de miR-1, et de nombreux autres miARNs, à la diminution de la protéine myocyte enhancer factor-2 (MEF2) (Kalsotra et al., 2014).

Dans des cellules musculaires dérivées de patients DM1, il a été montré que la diminution de miR-7 induit des défauts de fusion des myoblastes en myotubes en promouvant le processus d'autophagie, un processus de recyclage des composants cellulaires, permettant un apport énergétique nécessaire à l'homéostasie tissulaire. Ce défaut ayant pu être corrigé par une surexpression de miR-7, il est intéressant de noter que cette régulation ne semble pas dépendante de MBNL (Sabater-Arcis et al., 2020). En effet, l'autophagie a été montrée comme hyperactivée dans des cellules musculaires dérivées de patients DM1 (Loro et al., 2010).

### 1.5.2.4 ARN interférence

Il a été suggéré que les CUGexp, structurés en épingle à cheveux, puissent être clivés, de la même manière que les ARNs double-brin à l'origine des shARN, par Dicer en petits ARN CUG se comportant comme de petits ARNs interférant et régulant négativement l'expression de divers transcrits (Krol et al., 2007). Cependant, les ARNs mutés *DMPK* étant séquestrés dans le noyau et l'activité de maturation des pre-miARNs et pre-siARNs de Dicer étant exclusivement cytoplasmique, ce processus est peu probable (White et al., 2014). Ce processus d'ARN interférence n'a été démontré que dans un modèle DM1 invertébré avec *C.elegans* (Qawasmi et al., 2019), aucune corrélation n'ayant été décrite dans d'autres modèles et chez des patients.

### 1.5.2.5 L'expression d'un ARN antisens

La transcription étant bidirectionnelle, des ARNs sont aussi produits à partir du brin complémentaire de celui à partir duquel est produit tel ou tel gène d'intérêt. Leur régulation peut être dépendante ou indépendante du gène auquel ils sont associés. Souvent, ces ARNs ont un effet régulateur sur le gène, que ce soit au niveau transcriptionnel, traductionnel ou encore de la dégradation de l'ARNm (Pelechano & Steinmetz, 2013). Ce phénomène a été confirmé également pour les séquences présentant des CTGexp (Batra et al., 2010; Cho et al., 2005).

A l'image des ARNs *DMPK* mutés, l'ARN antisens *DMPK* original s'étend sur plus de 6kb et comprend plusieurs sites d'initiation de la transcription. Il est également soumis à l'épissage alternatif, produisant différents ARNm avec ou sans répétitions CAG (Cho et al., 2005). Non seulement la variété de transcrits est augmentée dans la DM1 à cause des CTGexp, mais la quantité d'ARNs antisens produite semble plus élevée que dans la population générale, bien qu'elle demeure
négligeable dans de nombreux tissus (Gudde, van Heeringen, et al., 2017). Peu de choses sont connues sur l'effet de ces transcrits antisens. Il a été supposé qu'ils pourraient intervenir dans la formation d'agrégats toxiques de ribonucléoprotéines ou dans la traduction sans ATG (Gudde, van Kessel, et al., 2017). *In vitro*, il semble que ces transcrits antisens soient impliqués dans l'instabilité des CTGexp, augmentant le taux d'expansions ou contractions entre générations par rapport aux cellules sans expansions (Nakamori, Pearson, et al., 2011).

### 1.5.2.6 Traduction sans ATG

Il a été montré qu'en plus de toutes les anomalies que suscitent les expansions de répétitions CTG, ils sont également sujet à une forme particulière de traduction qui ne nécessite pas de codon initiateur ATG. La DM1 (Zu et al., 2011) et la DM2 (Zu et al., 2017) sont toutes deux concernées par ce phénomène, produisant des tripeptides de polyglutamines dans des cellules musculaires et du tissu musculaire DM1 et des térapeptides à motifs répétés Leu-Pro-Ala-Cys à partir du brin sens et Gln-Ala-Gly-Arg à partir du brin antisens dans le cerveau de patients DM2. Quant à la DM1, des tripeptides de polyglutamines ont été détectés dans des cellules musculaires et du tissu musculaire de patients (Zu et al., 2011) mais une étude plus récente n'a pas reproduit ce résultat dans des cellules dérivées de 10 patients DM1 (Koehorst et al., 2021). Il est possible que les outils utilisés ne soient pas assez sensibles pour détecter ces peptides en faible quantité.

Ces produits anormaux de traduction ayant été caractérisés dans des tissus altérés dans la DM, il est possible qu'ils jouent un rôle dans le mécanisme de la pathologie. Leur présence a en effet été reliée au phénomène d'apoptose mais le mécanisme sous-jacent reste inconnu. Enfin, en se basant sur les séquences des brins sens et antisens des gènes *DMPK* et *CNBP*, il est possible que d'autres polypeptides soient produits dans la DM mais ceux-ci n'ont pas encore été découverts.

## 1.6 Modèles de la DM

Durant les vingt dernières années, de nombreux modèles *in vitro* et *in vivo* ont été générés pour décrire le mécanisme pathologique de la DM. La DM faisant partie des maladies les plus hétérogènes et complexes, aucun modèle ne récapitule de manière idéale le mécanisme pathologique moléculaire et ses implications. Cependant, indépendamment et de manière groupée, les modèles DM ont permis d'identifier et de caractériser différentes voies moléculaires impliquées
dans le développement de la pathologie. Ils sont également régulièrement utilisés pour le test de stratégies thérapeutiques.

Caenorhabditis elegans et le poisson zèbre (Danio rerio) par exemple, bien que phylogénétiquement éloignés de l'homme, ont permis d'étoffer certains aspects de la DM (Machuca-Tzili et al., 2011; Spilker et al., 2012). L'expression de transgènes codant pour des CUGexp a permis l'apparition de foci associée à une myopathie chez ces espèces, confirmant l'importance de ce mécanisme pathologique fondateur de la DM (deLorimier et al., 2014; K. Y. Chen et al., 2007; Wang et al., 2011; Todd et al., 2014). En plus de ces défauts, Drosophila melanogaster récapitule également la séquestration des protéines Muscleblind (Mbl) , associée à une altération de l'épissage alternatif (Garcia-Lopez et al., 2008; Picchio et al., 2013; Yu & Bonini, 2011).

Afin d'étudier le mécanisme pathologique de la DM chez les vertébrés et dans un contexte plus proche de l'homme, de nombreux modèles murins ont été générés. Ils miment les mécanismes centraux de la pathologie : l'expansion de répétitions CTG (tableau 2) ainsi que la perte de fonction de MBNL ou la surexpression de CELF1 (tableau 3). Parmi ces modèles, je développerai plus précisément le modèle de souris DMSXL ainsi que les souris déficientes pour Mbnl.

1.6.1 Modèle DMSXL : expression d'un grand nombre de répétitions CTG dans le gène DMPK humain

La souris DMSKL est porteuse de répétitions CTG élargies dans leur contexte naturel. Elle est originelle d'une insertion de 45kb de séquence génomique humaine comprenant le gène DMK, ne comprenant que 300 répétitions (Seznec et al., 2001). En raison de l'instabilité intergénérationnelle, ce nombre a augmenté au cours du temps et atteint aujourd'hui plus de 1500 répétitions (Gomes-Pereira et al., 2001, 2007).

Le transgène, sous contrôle du promoteur *DMPK* humain a une expression presque ubiquitaire, quoiqu'un peu faible par rapport à l'homme. Celle-ci est notamment assez faible dans le muscle squelettique mais elle est élevée dans le cerveau (Vignaud et al., 2010). Les souris DMSXL présentent un phénotype sévère avec un retard de croissance, des déficiences neurologiques, une atrophie musculaire bien que les défauts d'épissage restent légers (Hernández-Hernández et al., 2013; Huguet et al., 2012; Vignaud et al., 2010). En raison de l'expression ubiquitaire du transgène muté, les souris DMSXL constituent un bon modèle pour étudier les défauts plurisystémiques de la DM1 et de sa forme congénitale.
## 1.6.2 Modèles de souris invalidées pour Mbnl

### 1.6.2.1 Perte de Mbnl1 de manière ubiquitaire

La première souris déplétée pour Mbnl1 de manière ubiquitaire a été réalisée par délétion de l'exon 3 du gène *Mbnl1* chez la souris (Kanadia, Johnstone, et al., 2003). Il a en effet été supposé que la perte de cet exon éliminerait toute isoforme capable de se lier aux répétitions CUG, reproduisant la perte de fonction induite par la séquestration de MBNL1 dans la DM (Miller et al., 2000).

Ces souris présentent de nombreuses altérations similaires aux patients DM : myotonie, anormalités de l'épissage alternatif, myopathie musculaire et cardiaque ainsi que des cataractes (Kanadia, Johnstone, et al., 2003). Ainsi, cette étude a démontré le rôle central qu'occupe MBNL1 dans le mécanisme pathologique de la DM. Elle a notamment permis d'identifier MBNL1 comme le régulateur de l'épissage alternatif de *CLCN1*, dérégulé dans la DM et causant la myotonie (Charlet-B. et al., 2002; Mankodi et al., 2002).

Plus récemment, un autre modèle a été généré, également en délétant l'exon 3 du gène Mbnl1 qui contient le codon ATG d'initiation de la traduction (Dixon et al., 2015). Ces souris présentent des anomalies cardiaques progressives, démontrant le rôle de MBNL1 pour la pathologie cardiaque des patients DM. Enfin le modèle murin invalidé pour Mbnl1 via la délétion de l'exon 3 a été dérivé dans un autre fond génétique et induit une atteinte plus sévère (Sznajder et al., 2020).

### 1.6.2.2 dKO Mbnl1/Mbnl2 : déplétion homozygote de Mbnl1 et hétérozygote de Mbnl2

La souris dKO Mbnl1/Mbnl2 combine la déplétion de Mbnl1 par excision de l'exon 3 (Kanadia, Johnstone, et al., 2003) à celle de l'exon 2 comprenant l'ATG de *Mbnl2* (Charizanis et al., 2012). La perte conjointe de Mbnl1 et Mbnl2 exacerbe les défauts musculaires présents dans la souris KO-Mbnl1 (Lee et al., 2013). En effet, ces souris développent un phénotype plus sévère avec une mortalité précoce, une atrophie et une faiblesse musculaire et des altérations plus vastes de l'épissage alternatif. Mbnl2 étant très peu exprimé dans le muscle squelettique, cette souris démontre pour la première fois la compensation de la perte de Mbnl1 par la surexpression de Mbnl2. Cette étude, ainsi que celle démontrant l'importance de MBNL2 dans le cerveau (Charizanis et al., 2012), remettent donc en cause le rôle unique de MBNL1 dans le développement du mécanisme pathologique de la DM. Ce principe de compensation entre Mbnl1 et Mbnl2 a donné
lieu à de nombreux modèles avec une approche tissu-spécifique, la perte de ces deux protéines étant létale au stade embryonnaire.

### 1.6.2.3 KO Mbnl1/Myo-Mbnl2 : déplétion homozygote de Mbnl1 et muscle spécifique de Mbnl2

Dans la même étude, le double KO Mbnl1 et Mbnl2 spécifique du muscle squelettique présente une myopathie encore plus altérée que celle des souris avec une déplétion globale mais hétérozygote de Mbnl2 (Lee et al., 2013). Ce modèle a été généré en croisant des souris avec une expression de la Cre recombinase spécifique dans le muscle squelettique sous contrôle du promoteur de la myogénine (Li et al., 2005) avec des souris dont l'exon 2 de *Mbnl2* contenant l'ATG d'initiation de la traduction est entouré de sites lox (Charizanis et al., 2012).

Ces souris développent ainsi une faiblesse musculaire décuplée associée à des anomalies musculaires histologiques sévères et un dérèglement encore plus marqué de l'épissage alternatif de transcrits tels que *BIN1* et *CACNA1S*, le rapprochant d'un profil d'une forme congénitale de la DM1 (Fugier et al., 2011; Lee et al., 2013; Tang et al., 2012).

### 1.6.2.4 KO Mbnl1/Myog-Mbnl2/Myog-Mbnl3 : déplétion homozygote de Mbnl1 et muscle spécifique de Mbnl2 et Mbnl3

Dans la même démarche que le modèle précédent, le modèle triple KO Mbnl1, Mbnl2 et Mbnl3 spécifique au muscle squelettique (Thomas et al., 2017) a été généré par expression de la Cre recombinase sous contrôle du promoteur de la myogénine chez des souris loxées autour de l'exon 2 de *Mbnl2* (Charizanis et al., 2012) et l'exon 2 de *Mbnl3* qui contient un ATG d'initiation de la traduction (Poulos et al., 2013). Les souris triple KO présentent des défauts similaires à ceux décrits dans les souris double KO avec cependant des altérations de l'épissage alternatif plus étendues, les rapprochant des altérations des patients avec une forme congénitale de la DM1 (Thomas et al., 2017). Les différences entre ces deux modèles restent cependant discrètes, montrant les rôles prépondérants de MBNL1 et MBNL2 par rapport à MBNL3 dans le muscle squelettique.
### 1.6.2.5 KO Mbn11/Nestine-Mbn12 : déplétion homozygote de Mbn11 et neurone spécifique de Mbn12

Les souris déplétées de manière ubiquitaire pour Mbn11 (Suenaga et al., 2012) ou Mbn12 (Charizanis et al., 2012) développent des défauts de l'épissage alternatif dans le cerveau, montrant l'importance de ces deux protéines, particulièrement Mbn12, pour le développement du système nerveux central. Afin de tester si, de la même manière que dans le muscle squelettique (Lee et al., 2013), la perte simultanée de Mbn11 et Mbn12 dans le cerveau aggrave les modèles simple KO, les souris KO Mbn11 et loxées dans *Mbn12* ont été croisées avec des souris exprimant la Cre recombinase sous contrôle du promoteur neurone spécifique de la nestine (Goodwin et al., 2015).

La perte simultanée de Mbn11 et Mbn12 dans le cerveau provoque des défauts musculaires et moteurs chez les souris, suggérant que la perte de MBNL dans le SNC pourrait participer au phénotype musculaire de la DM. De plus, les souris KO Mbn11/Nestine-Mbn12 développent des altérations de l'épissage alternatif aggravées ou supplémentaires par rapport aux souris KO Mbn12 dans le cerveau, les rapprochant d'un profil DM (Goodwin et al., 2015). Ainsi, l'épissage de *MAPT*, altéré dans la DM (Sergeant et al., 2001) et partiellement dans les souris KO Mbn12 (Charizanis et al., 2012), est fortement dérégulé dans la souris KO Mbn11/Nestine-Mbn12 (Goodwin et al., 2015). Dans le cerveau, MBNL1 et MBNL2, de manière prépondérante, sont donc impliqués dans le mécanisme pathologique de la DM.

### 1.6.2.6 KO Mbn11/Myh6-Mbn12 : déplétion homozygote de Mbn11 et muscle cardiaque spécifique de Mbn12

Le dernier modèle de codéplétion des protéines Mbn11 et Mbn12 utilise une expression de la Cre recombinase spécifiquement dans le cœur par le promoteur de la chaîne lourde de la myosine 6 (*MYH6*) pour déléter Mbn12 (Lee et al., 2022). Ces souris développent un délai de conduction cardiaque et des tachyarrhytmies ventriculaires par rapport aux souris KO Mbn11. Ces défauts sont associés à des morts subites cardiaques et à une réduction de l'espérance de vie. Enfin, la perte conjointe de Mbn11 et Mbn12 dans le cœur provoque des aggravations d'altérations de l'épissage alternatif révélées dans les souris KO Mbn11 tels que *Ryr2* et la protéine 4 interagissant avec la kinase c-jun-amino-terminale (*Spag9*) (Lee et al., 2022). La perte de MBNL1 et MBNL2 dans le cœur pourrait donc participer au phénomène de mort subite cardiaque des patients DM, la deuxième cause de mortalité chez ces individus (Mathieu et al., 1999).
<table><caption>Tableau 2 : Modèles murins avec répétitions CTG.</caption><caption>Modèles de souris avec répétitions pathogéniques</caption><thead><tr><th>Modèle transgénique</th><th>Principe</th><th>Altérations</th><th>Limites</th><th>Contribution</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>Dmt</td><td>Premier modèle transgénique de la DM1. Transgène avec environ 162-750 pdb de répétitions CTG à côté de la partie 3'UTR de Dmpk.</td><td>Contractions et expansions des répétitions (-7 à +7), influence du parent porteur de la mutation, instabilité somatique au cours du temps (-20 à +540 dans le rein)</td><td>Pas de séquence promotrice donc pas d'expression des répétitions. Application exclusivement à l'instabilité</td><td>A démontrer l'instabilité somatique et intergénérationnelle</td><td>Monckton et al., 1997<br>Fortune et al., 2000</td></tr><tr><td>HSA<sup>LR</sup></td><td>Transgène avec 250 répétitions CTG dans le 3'UTR de l'actine squelettique humaine (HSA)</td><td>Foci ARN qui séquestrent Mbnl, épissage altéré, myotonie, myopathie, noyaux centraux</td><td>Expression cantonnée au muscle squelettique au stade post-développemental et très élevée par rapport au gène Dmpk. Pas de faiblesse ou d'atrophie musculaire. Pas d'effet sur CELF.</td><td>A démontrer le gain de fonction toxique de l'ARN de la DM1. Très utilisé pour le test de molécules thérapeutiques.</td><td>Mankodi et al., 2000</td></tr><tr><td>DM300</td><td>Transgène du locus DMPK avec environ 300 répétitions CTG dans le 3'UTR</td><td>Instabilité somatique et intergénérationnelle. Myotonie, myopathie, défauts d'épissage de la protéine Tau</td><td>Phénotype léger, expression variable du transgène</td><td>Etude du gain de fonction toxique des répétitions CTG dans le contexte génétique humain</td><td>Seznec et al., 2000<br>Seznec et al., 2001</td></tr><tr><td>DMSXL</td><td>Lignée transgénique dérivée du modèle DM300. Exprime plus de 1000 répétitions</td><td>Epissage altéré dans le cerveau et le muscle squelettique des sours homozygotes, myotonie, myopathy, faiblesse et atrophie musculaire, agrégation de la protéine Tau dans le cerveau, jonction neuromusculaire atteinte</td><td>Dérivée d'un unique individu, faible expression du transgène, les hétérozygotes ne présentent pas de phénotype grave, l'épissage est moins altéré que dans d'autres modèles</td><td>Etude du gain de fonction toxique des répétitions CTG dans le contexte génétique humain</td><td>Gomes-Pereira et al., 2007<br>Huguet et al., 2012</td></tr><tr><td>EpA960</td><td>Surexpression tissu-spécifique de d'un transgène avec 960 répétitions CTG dans l'exon 15 de DMPK</td><td>Myotonie, myopathie, fonte musculaire, défauts de conduction cardiaque, séquestration de Mbnll et hyperactivation de Celf1, épissage altéré</td><td>Répétitions interrompues, modèle spécifique au cœur avec une mortalité précoce</td><td>960 répétitions CTG mènent aux symptômes majeurs de la DM. Suggère que l'hyperactivation de CELF1 est dépendante du contexte génomique</td><td>Wang et al., 2007<br>Orengo et al., 2008</td></tr><tr><td>TRE-EGFP-CTG5 et CTG200</td><td>Lignée transgénique avec une expression inductible d'un transcrit portant 5-200 répétitions CTG</td><td>Myotonie, myopathie, défauts de conduction cardiaque, épissage altéré</td><td>Pas de faiblesse musculaire ni de foci. La souris avec 5 répétitions a une haute mortalité précoce avec des phénotypes DM</td><td>L'induction à la doxycycline cause l'apparition de la myotonie et des défauts cardiaques, qui sont réversibles</td><td>Mahadevan et al., 2006</td></tr><tr><td>EpA960/CaMK II-Cre</td><td>Surexpression dans le cerveau post-développemental d'un transgène avec 960 répétitions CTG</td><td>Foci, épissage altéré, atrophie cervicale, difficulté d'apprentissage, neurodégénération, défauts axonaux et dendritiques après perte de Mbnll</td><td>Répétitions interrompues</td><td>Modèle DM1 spécifique au cerveau</td><td>Wang et al., 2017</td></tr></tbody></table>
<table><caption>Tableau 3 : Modèles murins d'expression de MBNL et CELF1.</caption><thead><tr><th colspan="7">Modèles de souris Knock-Out (KO) ou avec surexpression</th></tr><tr><th>Modèle transgénique</th><th>Principe</th><th>Altérations</th><th>Limites</th><th>Contribution</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>KO Dmpk</td><td>Haploinsuffisance de DMPK dans la DM1</td><td>Problème d'homéostasie du calcium chez les souris âgées</td><td>Peu de défauts, contradictions entre les études</td><td>La perte de fonction de DMPK n'explique pas la pathophysiologie de la DM1</td><td>Reddy et al., 1996<br>Carrell et al., 2016</td></tr><tr><td>KO Six5</td><td>Haploinsuffisance de Six5 dans la DM1</td><td>Catanactes, fertilité réduite chez les mâles, défauts cardiaques</td><td>Cataracte différente de celle caractéristique de la DM1, dosage différent avec les patients</td><td>La perte de fonction de SIX5 n'explique pas l'apparition des cataractes chez les patients DM1</td><td>Klesert et al., 2000<br>Sarkar et al., 2000<br>Wakimoto et al., 2002<br>Sarkar et al., 2004</td></tr><tr><td>KO Cnbp</td><td>Haploinsuffisance de Cnbp dans la DM2</td><td>Myotonie, épissage altéré, cataracte comparable aux patients, myopathie, noyaux centraux</td><td>CNBP n'est pas indistinctivement réduit chez tous les patients, ne récapitule pas certains défauts majeurs d'épissage alternatifs</td><td>La perte de fonction de CNBP peut contribuer aux symptômes de la DM2</td><td>Chen et al., 2003<br>Margolis et al., 2006<br>Chen et al., 2007<br>Raheem et al., 2010</td></tr><tr><td>tKO<br>hétérozygote<br>Dmpk/Six5/M<br>bn11</td><td rowspan="2">Haploinsuffisance de Dmpk, Six5 et Dmwd et réduction de Mbn11 dans la DM1</td><td>Mortalité précoce, atrophie et faiblesse musculaire, myotonie, défauts histologiques</td><td rowspan="2">On ne connaît pas la part de la perte de Mbn11 dans le développement du phénotype</td><td rowspan="2">L'haploinsuffisance de DMPK, SIX5 et DMWD peut jouer un rôle dans le développement de la DM1</td><td rowspan="2">Yin et al., 2019</td></tr><tr><td>qKO<br>hétérozygote<br>Dmpk/Six5/M<br>bn11/Dmwd</td><td>Mortalité précoce plus élevée, déformation cardiaque, myopathie du diaphragme, quelques noyaux centraux, tâches oculaires, jonctions neuromusculaires immatures</td></tr><tr><td>KO Mbn11</td><td>Perte de fonction de Mbn11</td><td>Myotonie, épissage altéré, cataracte comparable aux patients, myopathie musculaire et cardiaque, noyaux centraux</td><td>Pas de faiblesse musculaire, CELF1 pas altéré</td><td>La perte de fonction de MBNL1 est un processus central dans le développement de la DM</td><td>Kanadia et al., 2003<br>Lee et al., 2013</td></tr><tr><td rowspan="2">Altération de MBNL2</td><td>Mutation dans l'intron 2 par piégeage de gène</td><td>Myotonie, lardose, diminution de l'aire des fibres musculaires, noyaux centraux, fibrose</td><td>Pas d'étude du SNC, résultats incohérents avec d'autres modèles</td><td>Rôle indépendant de MBNL2 dans la DM1</td><td>Hao et al., 2008</td></tr><tr><td>Mutation dans l'intron 4 par piégeage de gène</td><td>Aucune altération du muscle squelettique</td><td>Résultats incohérents avec d'autres modèles</td><td>Pas de rôle indépendant de MBNL2 dans le muscle squelettique</td><td>Lin et al., 2006</td></tr><tr><td>KO Mbn12</td><td>Perte de fonction de Mbn12</td><td>Epissage d'ARN altérés dans le cerveau, défauts de mémoire et de sommeil</td><td>Pas d'altération musculaire</td><td>La perte de fonction de MBNL2 est un processus central dans le développement des altérations du CNS dans la DM</td><td>Charizanis et al., 2012</td></tr><tr><td>KO Mbn13</td><td>Perte de fonction de Mbn13</td><td>Régénération musculaire altérée chez les souris âgées</td><td>Peu de défauts, MBNL3 est très peu exprimé chez l'adulte</td><td>La perte de fonction de MBNL3 pourrait participer au phénotype musculaire de la DM1</td><td>Reddy et al., 1996<br>Carrell et al., 2016</td></tr><tr><td>dKO<br>Mbn11/Mbn12<br>hétérozygote</td><td>Perte de fonction constitutive de Mbn11 et réduction de Mbn12</td><td>Retard de croissance, Myotonie, faiblesse et atrophie musculaires, épissage fortement altéré, noyaux centraux, bloc cardiaque, Jonction neuromusculaire affectée</td><td>Haute mortalité, Perte de fonction de Mbn12 n'est pas totale car léthale au stade embryonnaire</td><td>La perte de fonction de MBNL1 et MBNL2 aggrave celle limitée à MBNL1, reprisant des défauts plus proches de la forme congénitale de la DM1</td><td>Lee et al., 2013.</td></tr><tr><td>dKO<br>Mbn11/Mbn12<br>Myo-Cre</td><td>Perte de fonction constitutive de Mbn11 et spécifique au muscle de Mbn12</td><td>Cyphose, Myotonie, forte faiblesse et atrophie musculaires, épissage fortement altéré, noyaux exclusivement centraux</td><td>Haute mortalité, phénotypes limités au nucle squelettique</td><td>MBNL2 peut compenser la perte de fonction de MBNL1 dans le muscle squelettique et le cerveau</td><td>Lee et al., 2013.<br>Chou et al., 2017</td></tr><tr><td>dKO<br>Mbn11/Mbn12<br>hétérozygote</td><td>Perte de fonction constitutive de Mbn11 et réduction de Mbn12</td><td>Non décrit, le modèle a été utilisé uniquement au niveau transcriptomique</td><td>Perte de fonction de Mbn12 n'est pas totale car léthale au stade embryonnaire</td><td>Les altérations d'épissage dues à la perte de MBNL1 et MBNL2 expliquent la majorité des défauts d'épissage des souris avec CUGexp</td><td>Tanner et al., 2021</td></tr><tr><td>dKO<br>Mbn11/Mbn12<br>Nestine-Cre</td><td>Perte de fonction constitutive de Mbn11 et spécifique au SNC de Mbn12</td><td>Mortalité précoce, épissage fortement altéré dans le cerveau, défauts moteurs sèvères par "grip test"</td><td>Haute mortalité précoce, phénotypes limités au cerveau</td><td>La perte de fonction de MBNL1 et MBNL2 aggrave celle limitée à MBNL2 quant à l'épissage alternatif dans le cerveau</td><td>Goodwin et al., 2015</td></tr><tr><td>dKO<br>Mbn11/Mbn12<br>Myh6-Cre</td><td>Perte de fonction constitutive de Mbn11 et spécifique au cœur de Mbn12</td><td>Mortalité précoce, hypertrophie cardiaque, fibrose, tachyarythmies, défauts cardiaques, défauts de conduction cardiaque</td><td>Peu de défauts par rapport aux souris KO Mbn11, phénotypes limités au cœur</td><td>La perte de fonction de MBNL1 et MBNL2 dans le cœur aggrave celle limitée à MBNL1 MBNL2 peut compenser la perte de fonction de MBNL1 dans le cœur</td><td>Lee et al., 2022</td></tr><tr><td>tKO<br>Mbn11/Mbn12/<br>Mbn13 Myog-Cre</td><td>Perte de fonction constitutive de Mbn11 et spécifique au muscle de Mbn12 et Mbn13</td><td>Retard de croissance post-natal, faiblesse et atrophie musculaire, défauts histologiques, problèmes respiratoires, épissage altéré</td><td>Haute mortalité, phénotypes limités au nucle squelettique</td><td>Modèle plus complet pour mimer la forme congénitale de la DM1</td><td>Thomas et al., 2017</td></tr><tr><td>Surexpression de CELF1</td><td>Surexpression de CELF1 dans le muscle squelettique ou le cœur</td><td>Myopathie musculaire et cardiaque, défauts de conduction cardiaque, épissage altéré pour les cibles de CELF1</td><td>Mortalité précoce, reproduit une minorité de symptômes, applications thérapeutiques limitées</td><td>L'hyperactivation de CELF1 est un processus important dans le développement de la DM1</td><td>Timchenko et al., 2004<br>Ward et al., 2010<br>Koshelev et al., 2010</td></tr></tbody></table>
## 1.7 Stratégies thérapeutiques pour la DM1

A l'heure actuelle, il n'existe aucun traitement curatif pour la DM et seules existent des stratégies visant à réduire la douleur et la myotonie ressenties par les patients. Ces traitements mettent en œuvre les connaissances accumulées sur les différents mécanismes pathologiques de la DM et agissent ainsi à différents niveaux. Jusqu'à présent, le développement de thérapies se concentre principalement sur la DM1, l'absence de modèles spécifiques pour la DM2 limitant leur évaluation au stade préclinique (Day & Ranum, 2005a; Margolis et al., 2006). Seulement quelques études ont fait état de petites molécules spécifiques aux répétitions CCUG ou ont examiné l'extinction post-transcriptionnelle de l'allèle mutant *CNBP* (Cheng et al., 2014; Wong et al., 2011; Childs-Disney et al., 2014; Nguyen et al., 2014; Lee et al., 2009).

Pour les raisons décrites ci-dessus, seules les stratégies thérapeutiques liées à la DM1 ont été résumées dans le tableau suivant (Tableau 4). Globalement, la mise au point des thérapies pour la DM1 cible 4 niveaux du mécanisme de la pathologie. Premièrement, éliminer à la source l'effet toxique des expansions de répétition CTG par génie génétique (Dastidar et al., 2022) ou inhibition de la transcription (Reddy et al., 2019), bien que ce dernier ne corrigerait pas le phénomène d'haploinsuffisance de la DM1.

Au niveau du transcrit *DMPK* muté, des stratégies visent à inactiver les expansions de répétitions CUG, en les dégradant (Yadava et al., 2020) ou en les saturant (Klein et al., 2019). CELF et MBNL ayant des rôles prépondérants dans le développement de la DM1, des stratégies ont également pour but de restaurer l'activité de ces protéines (Arandel et al., 2022; Horrigan et al., 2020). Enfin, certaines études se sont focalisées sur des gènes dérégulés en aval de MBNL (Wheeler, Lueck, et al., 2007) ou sur d'autres mécanismes impactés par les répétitions (Sabater-Arcis et al., 2021).
<table><caption>Tableau 4 : Stratégies thérapeutiques pour la DM1.</caption><thead><tr><th colspan="4">Stratégies thérapeutiques pour la DM1</th></tr><tr><th>Stratégie</th><th>Molécule ou traitement</th><th>Limites</th><th>Références</th></tr></thead><tbody><tr><td>Induction de contractions des répétitions</td><td>Lumière UV, agents anticancéreux (cisplatine, rayons X, agents alkylants) par modulation des mécanismes de réparation et de réplication de l'ADN, oligonucléotides antisens (ASO)</td><td>Manque de spécificité, doses trop élevées</td><td>Gomes-Pereira et al., 2004<br>Hashem et al., 2002<br>Nakamori et al., 2011</td></tr><tr><td>Inhibition de la transcription du gène DMPK muté</td><td>Extinction de SUPT4H1 (stimulateur transcriptionnel), pentamidine et dérivés (ligand des répétitions), actinomycine D (intercalant de l'ADN), colchicine (inhibiteur de polymérisation des microtubules)</td><td>Toxicité, manque de spécificité</td><td>Cheng et al., 2015.<br>Coonrod et al., 2013<br>Siboni et al., 2015.<br>Reddy et al., 2019</td></tr><tr><td>Compétition avec MBNL pour la liaison aux répétitions CUG</td><td>ASO : réduction du nombre de foci, redistribution de Mbnl1, correction d'épissages alternatifs, morpholino oligonucléotides phosphorodiamidate (PMO) avec une sonde CAG conjugués avec des peptides pénétrants, MiniPEG-γ</td><td>Faible pénétrance des ASO, dose dépendant du nombre de répétitions donc différente selon le patient</td><td>Wheeler et al., 2009<br>Mulders et al., 2009<br>Klein et al., 2019<br>Hsieh et al., 2018</td></tr><tr><td>Dégradatation des ARNs DMPK mutés</td><td>ASO modifiés avec de courtes séquences nucléotidiques (gapmers) (Reconnaissance des transcrits mutés par la voie de dégradation à la Rnase H) : dégradation des trancrits mutés, réduction du nombre de foci, correction d'épissages alternatifs, amélioration de la fatigue, des défauts cardiaques, de la myotonie et de la faiblesse musculaire</td><td></td><td>Khvorova et al., 2017<br>Yadava et al., 2020<br>Jauvin et al., 2017<br>Wheeler et al., 2012</td></tr><tr><td>Augmentaton du niveau disponible de MBNL</td><td>Drogues anti-inflammatoires (phenylbutazone, ketoprofen), drogues antiautophagiques (chloroquine), éponges miARN, antagomiRs, histone déacétylase, erythromycine, forme tronquée de MBNL</td><td>Ne vise que l'augmentation de MBNL, pas les autres pathomécanismes de la DM1</td><td>Bargiela et al., 2019.<br>Chen et al., 2016<br>Cerro-Herreros et al., 2020<br>Zhang et al., 2017<br>Nakamori et al., 2016<br>Arrandel et al., 2022</td></tr><tr><td>Diminution de l'activité de CELF1</td><td>Inhibiteurs de la voie PKC, inhibiteur de GSK3β (amélioration de la faiblesse musculaire et de la myotonie) dont le Tideglusib (améliore la survie, la croissance et la fonction musculaire, améliore les symptômes neuromusculaires chez les patients), activateur de la voie AMPK (amélioration de la structure du muscle, de l'épissage, les foci, la myotonie)</td><td>Ne vise que la diminution de CELF1, pas les pathomécanismes majeurs de la DM1</td><td>Wang et al., 2009<br>Jones et al., 2012<br>Horrigan et al., 2020<br>Ravel-Chapuis et al., 2018</td></tr><tr><td>Génie génétique</td><td>TALEN, Cas9 désactivée (blacage transcription DMPK), Cas9 visant l'ARN (dégradation des transcrits mutés DMPK), CRISPR-Cas9 (insertion d'une séquence de polyadénylation en amont des répétitions ou excision des répétitions) : dégradation du transcrit muté, amélioration de l'épissage et diminution du nombre de foci</td><td>Nécessite une expression constante, pas d'effet au niveau génomique sauf pou l'excision des répétitions</td><td>Pinto et al., 2017<br>Batra et al., 2017<br>Wang et al., 2018<br>Dastidar et al., 2022<br>André et al., 2019</td></tr></tbody></table>
## 2 La famille de protéines MBNL

La protéine Muscleblind a d'abord été décrite chez la drosophile comme jouant un rôle central dans la différentiation des photorécepteurs et des cellules musculaires (Begemann et al., 1997). Les protéines Muscleblind ont été hautement conservées au cours de l'évolution depuis leur apparition il y environ 800 millions d'années et sont spécifiques aux métazoaires. De manière générale les invertébrés ne présentent qu'un gène muscleblind alors que les vertébrés possèdent 3 gènes homologues Muscleblind-Like (MBNL). De plus, la forte similarité des paralogues MBNL suggère une duplication récente du gène ancestral (Begemann et al., 1997; Pascual et al., 2006). Les protéines MBNL1, MBNL2 et MBNL3 ont depuis conservé de nombreuses similarités mais aussi acquis des fonctions et caractéristiques uniques.

Ce deuxième chapitre décrira les protéines MBNL, centrales pour la pathologie de la DM. Ce chapitre comprendra 4 parties. Je présenterai d'abord les trois paralogues MBNL : MBNL1, MBNL2 et MBNL3 (1). Je décrirai ensuite les fonctions individuelles des différents domaines des protéines MBNL (2) puis les régulateurs de ces protéines (3). Enfin, je détaillerai les différentes fonctions associées aux protéines MBNL (4).

### 2.1 Trois paralogues : MBNL1, MBNL2 et MBNL3

Chez les mammifères, MBNL1, MBNL2 et MBNL3 sont situés sur les chromosomes 3, 13 et X respectivement. Les 3 gènes ont un haut degré de similarité vis à vis de leur composition exonique, autant en termes de nombre que de taille (Fardaei et al., 2002). Ainsi MBNL1, MBNL2 et MBNL3 sont constitués de 10, 8 et 11 exons respectivement (Pascual et al., 2006). La composition nucléotidique est également proche entre les 3 paralogues (entre 65 et 73%), MBNL1 et MBNL2 étant les plus proches. Les 3 gènes sont soumis à l'épissage alternatif, produisant différentes isoformes qui diffèrent par leur localisation cellulaire, leur capacité de multimérisation, leur capacité de liaison aux ARNs ainsi que leur activité (Edge et al., 2013; Terenzi & Ladd, 2010; Tran et al., 2011) (Figure 12).
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 12 : Gènes MBNL1, MBNL2 et MBNL3 et transcrits associés chez les vertébrés.</figcaption></figure>

Représentation schématique des gènes MBNL1, MBNL2 et MBNL3 aux locus 3q25, 13q31 et Xq26 respectivement. Plusieurs exons sont soumis à l'épissage alternatif, donnant différentes isoformes pour chaque gène (isoformes principales représentées) (basé sur Pascual et al., 2006).

MBNL1, MBNL2 et MBNL3 diffèrent cependant grandement dans leurs modalités d'expression, autant en termes de tissu que de temporalité (Figure 13).
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 13 : Niveaux relatifs d'expression des ARNm des gènes MBNL1, MBNL2 et MBNL3 dans différents tissus.**</figcaption></figure>

Les couleurs représentent la proportion de chaque gène dans le tissu concerné (à partir de *Human protein atlas*).

Ainsi, *MBNL1* et *MBNL2* sont exprimés de manière ubiquitaire mais *MBNL1* est globalement plus exprimé que *MBNL2* et joue un rôle prépondérant par rapport aux autres paralogues, surtout dans le muscle squelettique et cardiaque. *MBNL2* est cependant prédominant dans le cerveau et la moelle épinière (Fardaei et al., 2002; Kanadia, Urbinati, et al., 2003). Là où l'expression de *MBNL1* et *MBNL2* augmente sensiblement au cours du développement dans la plupart des tissus, celle de *MBNL3* est davantage confinée au stade fœtal, mais elle est cependant détectée à l'âge adulte dans les poumons, la rate et le placenta (Konieczny et al., 2014). Cette dynamique est également retrouvée *in vitro* dans les myoblastes, cellules musculaires précurseurs, murins.

Chez l'homme, seuls *MBNL1* et *MBNL2* sont exprimés dans les cellules musculaires (Holt et al., 2009). L'expression majoritairement développementale de *MBNL3* est à considérer en regard de son rôle dans la régénération et la différentiation. En effet, c'est un régulateur négatif de la protéine myoblast determination protein 1 (MyoD) et donc un inhibiteur de la différentiation des cellules musculaires. Les souris Mbnl3-KO présentent par ailleurs des défauts du processus de régénération à un âge tardif (Poulos et al., 2013).

Enfin, différents modèles murins montrent que la déplétion de Mbnl1 ou Mbnl2 entraîne l'augmentation de Mbnl2 ou Mbnl1 respectivement dans le muscle squelettique et cardiaque ainsi
que le cerveau (Lee et al., 2013, 2022; Sta Maria et al., 2021). Les deux protéines ayant des fonctions
similaires, et la perte conjointe de ces deux protéines étant létale à l'état embryonnaire, il a été
postulé que MBNL1 et MBNL2 peuvent se compenser. Le poids de cette hypothèse a été renforcé
par l'aggravation du phénotype musculaire et neurologique ainsi que par l'extension des altérations
de l'épissage alternatif, induite dans de nombreux modèles de souris par la perte conjointe de ces
deux protéines par rapport à la perte de l'une ou l'autre (Goodwin et al., 2015; Lee et al., 2013,
2022; Tanner et al., 2021; Thomas et al., 2017).

Des résultats préliminaires de Nitschke et al. suggèrent que cette compensation se met en
place par l'inclusion anormale de l'exon 8 (95 pb) de *MBNL2*. L'épissage alternatif de cet exon
serait régulé par MBNL1 et la perte de MBNL1 conduirait donc à une augmentation de l'inclusion
de celui-ci (Nitschke et al., IDMC13). L'inclusion de l'exon 8 de *MBNL2* conduit à un décalage de
phase du cadre de lecture et à un C-terminal alternatif de la protéine qui la stabiliserait. On peut
noter que l'inclusion aberrante de l'exon 8 de *MBNL2* avait déjà été observée dans le muscle
squelettique et le thymus des souris Mbnl1-KO mais jamais associé au phénomène de
compensation (Lee 2013, Sznajder 2020).

2.1.1 L'implication de MBNL dans le muscle squelettique

Le modèle de déplétion de Mbnl1 a montré l'importance de cette protéine dans le muscle
squelettique (Kanadia, Johnstone, et al., 2003). En effet, parmi les défauts d'épissage alternatif à la
source des symptômes DM1 dans ce tissu (présentés tableau 1), la grande majorité est due à la perte
de fonction de MBNL1 (Du et al., 2010). Comme mentionné précédemment, MBNL1 régule
l'épissage alternatif de *CLCN1* dont le mauvais épissage conduit à l'apparition de la myotonie dans
la DM (Charlet-B. et al., 2002). La perte de MBNL1 induit l'inclusion de l'exon 7a contenant un
exon stop prématuré et la dégradation des ARN *CLCN1* (Charlet-B. et al., 2002; Mankodi et al.,
2002). La restauration de cet épissage par libération ou surexpression de MBNL1 suffit à corriger
la myotonie dans le modèle HSA<sup>LR</sup> (Kanadia et al., 2006; Wheeler et al., 2009).

L'épissage alternatif altéré de nombreux ARN a été associé à la faiblesse musculaire, un
symptôme central de la DM. MBNL1 régule ainsi l'expression de *SERCA1* et *RYR1* (Hino et al.,
2007; Lee et al., 2013; Kimura et al., 2005), *CACNA1S* (Tang et al., 2012) et *BIN1* (Fugier et al.,
2011) qui sont impliqués dans les voies de la signalisation calcique du couplage
excitation/contraction. Leur dérégulation pourrait donc contribuer à l'apparition de la faiblesse
musculaire chez les patients DM, laquelle est une maladie dégénérative dont le processus
dystrophique musculaire a été associé à l'exclusion pathogénique de l'exon 78 de la dystrophine causé par la perte de MBNL1 (Rau et al., 2015).

Enfin, MBNL1 régule l'inclusion de l'exon 11 du récepteur à l'insuline (INSR), tandis que son exclusion dans la DM provoque une insulino-résistance chez les patients (Savkur et al., 2001). Ce ne sont pas les seuls transcrits altérés par la perte de MBNL1 dans le muscle squelettique. En effet, il régule également l'épissage alternatif de plusieurs centaines de transcrits dans le muscle squelettique dont l'altération pourrait participer au mécanisme pathologique de la DM (Wang et al., 2012). Ce nombre est encore augmenté si l'on considère également MBNL2, capable de compenser pour la perte de MBNL1 (Lee et al., 2013). MBNL3 semble, quant à lui, impliqué dans le mécanisme de régénération chez les souris âgées, la faible expression de ce paralogue dans le muscle squelettique reflète donc son rôle mineur dans ce tissu (Poulos et al., 2013).

## 2.1.2 L'implication de MBNL dans le système nerveux central

Contrairement au muscle squelettique, MBNL2 est plus exprimé que MBNL1 dans le cerveau (Konieczny et al., 2014). Les défauts d'épissage de la souris délétée pour Mbnl1 (Suenaga et al., 2012) sont d'ailleurs bien moins importants que ceux observés chez le modèle délété pour Mbnl2 (Charizanis et al., 2012). L'épissage de MAPT est ainsi altéré dans le cerveau des patients DM1 (Sergeant et al., 2001), MBNL2 étant responsable de l'épissage des exons 2, 3 et 10 (Charizanis et al., 2012; Goodwin et al., 2015). Ces défauts s'accompagnent d'enchevêtrements fibrillaires formés de protéines Tau hyperphosphorylées dans les cerveaux des patients DM (Kiuchi et al., 1991), permettant d'assimiler la DM au groupe des tauopathies (Fernandez-Gomez et al., 2019).

D'autres transcrits avec un épissage anormal dans la DM1 tels que l'exon 5 de NMDAR1 (Jiang et al., 2004) et l'exon 5 de GRIN1 (Jiang et al., 2004; Shimizu et al., 2000) ont été retrouvés dans les souris avec une perte de Mbnl2, imputant la régulation de leur épissage à ce paralogue dans le cerveau (Charizanis et al., 2012). L'étude de ce modèle a par ailleurs permis d'identifier plusieurs centaines d'exons différentiellement épissés par la perte de Mbnl2 dont l'exon 23a de Tanc2 (S. Han et al., 2010), l'exon 12a de Cacna1d (McKinney et al., 2009) et les exons 23a et b de Clasp2 (Beffert et al., 2012), tous trois similairement dérégulés chez les patients DM1 (Charizanis et al., 2012). Globalement, les gènes dérégulés par la perte de Mbnl2 sont impliqués dans la fonction synaptique, le développement neuronal et le guidage axonal. Ces souris présentant des troubles du sommeil et de la mémoire réminiscents des défauts des patients DM1, MBNL2 apparaît comme un acteur majeur du mécanisme pathologique neurologique dans la pathologie (Charizanis et al., 2012).
De la même manière que dans le muscle squelettique, ces défauts sont décuplés par la perte simultanée des deux paralogues spécifiquement dans les neurones avec des altérations plus fortes de l'épissage alternatif associées à des défauts locomoteurs (Goodwin et al., 2015). MBNL1 et MBNL2 semblent cependant au moins aussi importants dans les cellules gliales. En effet, un modèle murin DM1 présente des astrocytes avec des anormalités structurales associées à des altérations de l'épissage alternatif encore plus sévères que dans les neurones (Dinca et al., 2022). Ces défauts sont récapitulés *in vitro* par la déplétion de Mbnl1 et Mbnl2, suggérant que c'est la séquestration de MBNL par les foci qui est à l'origine de ces défauts (Dinca et al., 2022). N'étant que peu exprimé dans le système nerveux central, le rôle de MBNL3 n'a jamais été étudié dans ce tissu.

## 2.2 Fonctions individuelles des différents domaines des protéines MBNL

MBNL1 étant la protéine la mieux étudiée parmi les paralogues MBNL, nous allons décrire les différents domaines de cette protéine, sachant que les exons de MBNL2 et MBNL3 sont très similaires à ceux de MBNL1 (Tran et al., 2011).

### 2.2.1 Propriétés de liaison à l'ARN de la partie N-terminale

Les protéines MBNL présentent dans leur partie N-terminale des domaines de doigt-de-zinc (ZnF) qui sont essentiels pour la reconnaissance des cibles ARN de MBNL. Le nombre de ces domaines passe de 2 à 4 des invertébrés aux vertébrés, sans indice sur le caractère ancestral. Chez les vertébrés, ces ZnF sont codés par les exons 1, 2 et 4. Plus précisément, les 4 domaines ZnF sont arrangés en 2 paires en tandem, la première paire étant codée par les exons 1 et 2 tandis que la seconde paire est codée par l'exon 4. Chaque motif ZnF comprend 3 cystéines suivies d'une histidine (CCCH) (Fardaei 2002) (Pascual et al., 2006). Les paires de ZnF ont des structures très proches, avec un espacement identique entre les résidus cystéine et histidine des ZnF 1 et 3 (Edge et al., 2013). Malgré leurs ressemblances, les deux paires de ZnF ont des propriétés de liaison différentes, chaque paire de ZnF étant indépendamment essentielle pour la liaison à différents ARNs cibles. Néanmoins, la première paire de ZnF reste prépondérante pour la liaison et l'activité de MBNL1 quant à la majorité des cibles de MBNL1 (Hale et al., 2018; Purcell et al., 2012).

Les paires de ZnF sont par ailleurs reliées par un domaine de liaison, codé par l'exon 3 de la protéine. Sa déplétion réduit considérablement la capacité de liaison de la protéine (Kino 2004). Il a été supposé que ce domaine assure la flexibilité conformationelle de MBNL1, lui permettant d'interagir avec une variété d'ARNs (Cass et al., 2011; Kino et al., 2004). Ce domaine de liaison
n'est cependant pas essentiel à la liaison aux CUGexp de la DM1. De plus, sa séquence n'est qu'à
moitié conservée entre les paralogues MBNL (Grammatikakis et al., 2011), contrairement aux ZnF
qui sont quasi-identiques entre les vertébrés (Fardaei et al., 2002; Pascual et al., 2006). Ce
polypeptide pourrait donc avoir un rôle légèrement différent suivant la protéine.

2.2.2 Modalités de liaison de MBNL à sa cible ARN

2.2.2.1 Séquence consensus

La séquence ARN consensus de liaison par MBNL1 a été identifiée comme un
enchaînement de 4 nucléotides YGCY (un dinucléotide GpC flanqué de chaque côté par une
pyrimidine, notée Y) (Ho et al., 2004). Plus particulièrement, la séquence majoritairement présente
parmi les cibles de MBNL1 est un motif UGCU répété sur une courte région nucléotidique (Goers
et al., 2010). Ce motif a été confirmé par des expériences de *cross-linking and immunoprecipitation*
(CLIP-Seq), non seulement pour MBNL1 mais également pour MBNL2 et MBNL3 (Charizanis et
al., 2012; Wang et al., 2012; Poulos et al., 2013). En effet, le ZnF3 de MBNL1 reconnaît
préférentiellement les séquences GC alors que le ZnF4 se lie aux GCU (Teplova & Patel, 2008).

La liaison des ZnF à l'ARNm provoque le repliement antiparallèle de l'ARNm entre les
deux séquences reconnues, les ZnF se retrouvant entre les deux chaînes de l'ARNm. Les séquences
reconnues GC s'engouffrent alors dans des poches de résidus aromatiques avec les cystéines
interagissant avec le zinc. De plus, au sein d'une paire, les ZnF semblent avoir des rôles séquentiels,
ZnF2 et ZnF4 s'apparrant d'abord avec la région CGCU d'une séquence GUCUCGUUUUCCCC
de l'ARN de la troponine cardiaque humaine (hcTnT). Cette liaison nécessite en outre la présence
d'environ 10 nucléotides autour de la séquence consensus (Park et al., 2017).

Que les protéines MBNL se lient aux régions introniques, exoniques, 5'UTR ou 3'UTR, la séquence consensus reste YGCY, ce qui suggère que le processus de liaison des protéines MBNL reste le même, quelle que soit la région liée (Wang et al., 2012).

2.2.2.2 Structure de l'ARN cible

MBNL1 semble préférer le motif YGCY avec les bases pyrimidiques simple-brin mais la
liaison du dinucléotide central n'est pas discriminante comme c'est le cas pour CELF1 et RbFOX2
(un homologue de RbFOX1, impliqué dans la DM2) (Lambert et al., 2014). Cette conformation
simple brin/double brin est notamment retrouvée dans les expansions de répétitions de la DM, les
répétitions formant des structures en épingles à cheveux avec des mésappariements périodiques U-
U et A-A ne formant qu'une liaison hydrogène (Childs-Disney et al., 2014; Kiliszek et al., 2009).
Ces mésappariements sont essentiels à la liaison de MBNL à sa cible. En effet, la liaison de MBNL1
avec les répétitions CUG est abolie lorsque les mésappariements sont remplacés par des liaisons
fortes de Watson-Crick, tel qu'elles sont formées dans les répétitions CGG avec lesquelles MBNL1
ne peut interagir (Kiliszek et al., 2011; Warf & Berglund, 2007). Plusieurs études indiquent que
MBNL favorise ensuite la séparation des deux brins par déstabilisation de la structure de l'ARN,
permettant la liaison des ZnF avec les séquences GC dénaturées (Gates et al., 2011; Teplova &
Patel, 2008; Fu et al., 2012).

2.2.2.3 Nombre et positions des motifs consensus

La liaison des protéines de liaison à l'ARN dépend de leur propre structure mais également
de la variété de structures, motifs et position de ces motifs des ARNs cibles (Lewis et al., 2017;
Lunde et al., 2007). Spécifiquement pour MBNL, dans un contexte structural constant, le nombre
de répétitions de motifs consensus est proportionnel à la force de liaison de la protéine à l'ARN,
corrélée avec la profondeur de la régulation de l'épissage alternatif par MBNL1. Même si deux
motifs consensus répétés sont suffisants sur un ARNm simple brin pour une liaison avec MBNL1,
l'affinité de la protéine est décuplée lorsque ce nombre est doublé (Taylor et al., 2018). D'ailleurs,
les cibles confirmées de MBNL ont un grand nombre de motifs répétés : 15 pour l'exon 10 de la
protéine à domaine de liaison LIM 3 (LDB3) (Cywoniuk et al., 2017), 9 pour l'exon 11 de INSR
(Sen et al., 2010) et 12 pour l'exon 1 de MBNL1 (Konieczny et al., 2017).

De plus, les positions relatives des motifs consensus sont également essentielles pour
définir la capacité de liaison et d'activité de MBNL. En effet, l'activité de MBNL est la plus forte
lorsque les motifs consensus se suivent de manière contiguë (5'...UGCUUGCU...3'), baisse
lorsque les deux motifs sont superposés (5'...UGCUUGCU...3'). Alors que cette différence
n'influence pas l'affinité de la protéine pour l'ARN, à la fois la capacité de liaison et l'activité de
MBNL1 chutent considérablement lorsque la structure secondaire proche de ces motifs est trop
stabilisée (Taylor et al., 2018).

Comme dit précédemment, les trois paralogues MBNL1, MBNL2 et MBNL3 et leurs
isoformes ont des parties N-terminales quasi-identiques mais peuvent réguler l'épissage de cibles
différentes, même lorsqu'exprimés dans le même tissu (Charizanis et al., 2012; Suenaga et al., 2012).
Il est possible que ce choix soit influencé par les paramètres structuraux de l'ARN cible en regard
des parties C-terminales alternatives de ces paralogues et de leurs isoformes (Sznajder et al., 2016;
Taylor et al., 2018).

2.2.3 Régulation de l'épissage alternatif par la partie C-terminale de la protéine

Les exons suivant l'exon 4 font partie de la partie dite C-terminale de MBNL. Bien qu'elle
ne soit pas impliquée dans la liaison à l'ARN, cette partie de la protéine est essentielle pour son
activité de régulation de l'épissage alternatif. L'exon 5 modifie la localisation cellulaire de MBNL,
sa présence induisant une localisation majoritairement nucléaire de la protéine (Kino et al., 2004,
2015; Terenzi & Ladd, 2010). De manière notable, cette séquence exonique n'est pas présente dans
le gène *MBNL3*, son expression en est cytoplasmique de manière prédominante (Gates et al., 2011).

Un motif KRPALE, également présent dans d'autres protéines, a été identifié dans l'exon 6 et est également impliqué dans la localisation cellulaire de la protéine. (Fernandez-Costa & Artero, 2010; Kino et al., 2015; Tran et al., 2011) Contrairement à l'exon 5, cette séquence est présente dans tous les paralogues, mais son rôle n'est applicable qu'en regard de l'exon 5. Le motif KRPALE et l'exon 5 forment donc un signal de localisation nucléaire en deux parties (Kino et al., 2015). De plus, l'exon 6 est décrit comme jouant un rôle dans l'activité de MBNL, sa déplétion diminuant la régulation qu'exerce la protéine sur l'épissage alternatif (Tran et al., 2011).

Dans la DM, l'inclusion de l'exon 5 est favorisée, entraînant une plus grande localisation nucléaire des protéines MBNL et donc une plus forte séquestration par les répétitions C(C)UG (Lin et al., 2006). L'exon 7 de la protéine influence la multimérisation de la protéine (Tran et al., 2011) et semble impliqué dans l'épissage de certains ARNm cibles (Sznajder et al., 2016). Tout comme l'exon 5, l'exon 7 est préférentiellement inclus dans la DM, mais sa contribution au développement de la pathologie n'a pas encore été élucidé (Tran et al., 2011).

2.3 Régulateurs des protéines MBNL

2.3.1 Autorégulation de MBNL

Les protéines MBNL étant centrales dans le mécanisme pathologique de la DM, des études récentes se sont focalisées sur la caractérisation des acteurs impliqués dans leur régulation. Il a été notamment montré que les protéines MBNL se lient à leur propre ARNm, régulant leur expression. En effet, MBNL1, MBNL2 et MBNL3 peuvent se lier à la partie 5' de l'exon 1 de *MBNL1* qui comprend des séquences consensus YCGY formant des structures lâches en épingles à cheveux.
MBNL induit ainsi l'exclusion de l'exon 1 et le début de la traduction dans l'exon 2. La perte de la première paire de ZnF induit une perte d'affinité de la protéine pour ses cibles ARNs ainsi qu'une diminution considérable de sa stabilité et de son activité régulatrice de l'épissage alternatif. Cet événement est majoritairement détecté dans les tissus avec un niveau d'expression élevé de MBNL1 et constitue une boucle autorégulatrice négative (Konieczny et al., 2017). Cet exon a également été étudié car il est utilisé comme matrice pour la formation d'un transcrit circularisé très abondant chez la drosophile, et également présent chez l'homme (Ashwal-Fluss et al., 2014; Houseley et al., 2006).

Chez la drosophile, la protéine Muscleblind est directement impliquée dans la circularisation de l'exon 2 (exon 1 chez les vertébrés), par liaison aux régions introniques adjacentes et excision de l'exon grâce au spliceosome. Cet ARN circulaire présente des sites de liaison de MBNL et induit la diminution de Muscleblind chez la drosophile, servant d'éponge en cas de surexpression de la protéine (Ashwal-Fluss et al., 2014). Par ailleurs, la déplétion de cet ARN circulaire chez la drosophile induit des défauts musculaires et du SNC, suggérant qu'il est impliqué dans l'homéostasie de ces tissus (Pamudurti et al., 2018). Cette boucle de régulation négative ne semble pourtant pas participer à la perte de fonction de MBNL dans la DM, la quantité de cet ARN circulaire étant identique chez les patients sains et DM (Konieczny et al., 2017). De manière intéressante, il semble qu'un ARN circulaire soit également produit à partir de l'exon 2 de MBNL2 chez la souris (Salzman et al., 2013).

### 2.3.2 Autres régulateurs de MBNL

Au cours du développement, dans le cerveau et le muscle squelettique, la localisation cytoplasmique ou nucléaire de MBNL1 n'est pas entièrement expliquée par l'exclusion ou l'inclusion de l'exon 5. En effet, MBNL1 est également polyubiquitiné via la lysine 63. Cette modification induit la localisation cytoplasmique de la protéine, importante notamment pour la croissance des neurites. Dans un modèle de souris DM1, MBNL1 est déubiquitiné, menant à sa translocation dans le noyau, où il est séquestré par les CUGexp. Ce processus pourrait donc contribuer à la perte de fonction de MBNL dans le mécanisme pathologique de la DM (Wang et al., 2018).

Une étude a démontré *in vitro* que dans des conditions neurodégénératives, retrouvées dans un modèle DM1 (Sicot et al., 2017), la translocation de la Calpain-2 (CAPN2) corrèle avec une diminution de MBNL2. Bien qu'il n'y ait pas de preuve de l'interaction directe entre les deux
protéines, une perte de fonction de la CAPN2 est suffisante pour préserver la quantité cellulaire de MBNL2, suggérant que la CAPN2 est capable de réguler MBNL2 (Wang et al., 2022).

## 2.4 Fonction des protéines MBNL

### 2.4.1 Régulation de l'épissage alternatif

La fonction la plus décrite des protéines MBNL est celle de la régulation de l'épissage alternatif, dont le mécanisme simplifié est présenté figure 14.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 14 : Représentation schématique du mécanisme d'épissage alternatif.</figcaption></figure>

Le spliceosome, formé des petites particules nucléaires ribonucléoprotéiques (snRNPs) (U1, U2, U4, U5 et U6), permet l'excision d'un exon alternatif (Exon B) et les introns adjacents. Complexe A : U1 se lie au site d'épissage 5' (5'SS) et U2, associé à U2AF65/35, au point de branchement, proche du site de polypirimidines (PPT). Complexe C : Le tricomplexe U4-U5-U6 s'associe au spliceosome en formation, dissociant U1 et U4 et formant un lasso avec l'exon B et les introns adjacents. L'excision de ce lasso et la ligation des exons A et C forme un ARN prémessager épissé (adapté de La Cognata et al., 2014).
MBNL peut promouvoir l'inclusion ou l'exclusion d'un exon, cette modalité étant souvent déterminée par la position relative de liaison par rapport à cet exon (Figure 15). MBNL régule de cette manière la transition développementale de centaines de transcrits dans différents tissus (Charizanis et al., 2012; Wang et al., 2012; Goers et al., 2010; Kalsotra et al., 2008).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 15 : Représentation schématique de l'effet de la liaison de MBNL sur l'épissage alternatif de ses cibles.**</figcaption></figure>

Généralement, la liaison de MBNL à un motif YGCY sur la flèche rouge induit l'exclusion de l'exon alternatif tandis que la liaison de MBNL à un motif YGCY sur la flèche verte induit l'exclusion de l'exon alternatif.

Cette modalité de régulation n'est pas spécifique à MBNL, d'autres protéines de liaison à l'ARN ayant un mode de fonctionnement identique (Witten & Ule, 2011). L'exclusion d'exon a été imputée à un blocage des facteurs promouvant l'exclusion, des sites d'épissage en 3', de séquences riches en polyprimidines ou de la jonction entre l'intron et l'exon par MBNL. MBNL pourrait induire l'inclusion de l'exon en améliorant la reconnaissance du site d'épissage en 5' par le spliceosome ou en étant en compétition avec les inactivateurs de l'épissage et les activateurs de l'épissage à partir de séquences introniques (Wang et al., 2012).

MBNL semble impliqué dans davantage d'exclusions que d'inclusions d'exons (Sznajder et al., 2016). C'est le cas notamment pour l'exon 7A de *CLCN1*, que MBNL exclut en stabilisant la structure en tige boucle dans l'intron 6, occultant une séquence polypyrimidique, le site d'épissage 3' et les activateurs exoniques de l'épissage (Kino et al., 2009). *cTNT* est également concerné par ce mode d'action, MBNL stabilisant les tiges boucles adjacentes au site d'épissage 3' de l'exon F
(Kanadia, Johnstone, et al., 2003) et celle dans l'intron 5' de l'exon 5, empêchant la liaison avec le facteur d'épissage U2AF65, facilitant l'exclusion de l'exon (Warf et al., 2009).

MBNL semble également pouvoir désorganiser la structure de son ARN cible, tel que cela a été décrit pour ses propres exons alternatifs. En effet, MBNL se lie dans l'intron 4 de son ARNm et empêche la reconnaissance, ou la liaison de manière indirecte, du site d'épissage 3', induisant l'exclusion de l'exon 5 (Gates et al., 2011).

MBNL peut également promouvoir l'inclusion d'exons alternatifs, comme pour l'exon 16 du récepteur aux lipoprotéines à très basse densité (VLDLR) (Du et al., 2010), l'exon 22 de l'ATPase 1 transporteuse de Ca²⁺ du réticulum sarcoplasmique/endoplasmique (ATP2A1) (Kimura et al., 2005) et l'exon 11 de INSR (Sen et al., 2010). L'inclusion de ce dernier est due au phénomène inverse de l'exclusion de l'exon 5 de cTNT, MBNL induit l'activation de U2AF65 et l'assemblage du spliceosome (Echeverria & Cooper, 2014).

Parmi les paralogues, sur les transcrits majeurs régulés par MBNL, MBNL1 montre l'activité d'épissage la plus élevée et MBNL3 la plus faible. Cette différence peut provenir de l'exon 3, des parties C-terminales ou encore des profils d'expression de chaque paralogue, différents entre MBNL1, MBNL2 et MBNL3 (Sznajder et al., 2016).

## 2.4.2 Régulation des processus 3'UTR-dépendants

Au-delà des régions introniques et exoniques, les sites de liaison de MBNL sont également présents en quantité équivalente ou supérieure dans la partie 3'UTR de ses cibles, en fonction du paralogue et du tissu étudié (Charizanis et al., 2012; Wang et al., 2012). MBNL régule ainsi le choix du site de polyadénylation, la localisation du transcrit ainsi que sa stabilité et sa demi-vie.

### 2.4.2.1 Polyadénylation alternative

Les protéines MBNL contrôlent en effet le choix du site de polyadénylation (pA) de nombreux transcrits et surtout la transition du site caractéristique d'un 3'UTR fœtal à une forme adulte, de la même manière que pour l'épissage alternatif (Batra et al., 2014). Plus précisément, en se liant à une séquence consensus proximale, MBNL peut masquer un site de pA des facteurs 3' de pA, induisant le choix d'un site distal. Inversement, la liaison de MBNL en amont du site de pA corrèle avec le choix préférentiel de ce site (figure 16).

MBNL pourrait donc influer à deux niveaux, soit la reconnaissance du site de pA par la machinerie de pA 3', soit la stabilité de structures propices au recrutement de ces facteurs. Par
exemple, l'ARNm de la protéine régulatrice associée au complexe mTORC1 (RPTOR) subit dans la DM un changement de son site de pA, au profit d'un site distal, associé à une diminution de la quantité de cet ARNm (Batra et al., 2014). La voie de la cible mammifère de la rapamycine (mTOR) est un processus clé impliqué dans la régulation de la croissance et les processus hypertrophiques et atrophiques musculaires (Laplante & Sabatini, 2012), dérégulés dans la DM.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 16 : Représentation schématique de l'effet de la liaison de MBNL sur le choix du site de polyadénylation de ses cibles.**</figcaption></figure>

La liaison de MBNL à un motif YGCY (flèche) masque (rouge) ou promeut (vert) le choix du site de pA proximal au profit (rouge) ou au détriment (vert) respectivement du site de pA distal.

### 2.4.2.2 Localisation des ARN

La localisation des ARNm étant majoritairement régulée par des interactions impliquant leur partie 3'UTR (Andreassi & Riccio, 2009), des études récentes se sont focalisées sur cet aspect de la régulation de MBNL. Ainsi, MBNL2 se lie à l'ARNm de l'intégrine $α_3$ dans sa partie 3'UTR et est responsable de sa localisation à la membrane plasmique (Adereth et al., 2005). La localisation des ARNm et la traduction locale qui en découlent sont d'une importance de premier ordre dans le SNC, les neurones élongeant leurs projections cytoplasmiques sur de grandes distances (Broix et al., 2021). En effet, une stratégie d'interférence ARN dans des cellules neuronales a révélé que les protéines Mbnl1 et Mbnl2 sont essentielles pour la localisation de certaines d'ARNm aux neurites. MBNL régule la localisation de ces transcrits en influençant l'épissage alternatif de leur dernier exon, modifiant leur 3'UTR (figure 17) (Taliaferro et al., 2016). Ce phénomène pourrait être à l'origine de défauts de la complexité et de la maturité des dendrites dans un modèle spécifique aux neurones de déplétion conjointe de Mbnl1 et Mbnl2 (Lee et al., 2019).
Par ailleurs, la localisation cytoplasmique de MBNL1 dans des myoblastes n'est pas uniforme mais majoritairement accolée à la membrane plasmique. *In vivo*, MBNL1 est localisé aux disques Z du sarcomère qui concentrent les membranes endoplasmiques et du réticulum sarcoplasmique (Denes et al., 2021). Cela corrèle avec le fait que les transcrits liés par MBNL1 dans leur 3'UTR sont particulièrement enrichis dans la catégorie de la *Gene Ontology* des composants cellulaires (Wang et al., 2012). L'ancrage de MBNL à la membrane a en effet été démontré dans des myoblastes via la partie non structurée C-terminale de MBNL1 (Hildebrandt et al., 2022).

Les protéines de liaison à l'ARN transportent les ARNm en formant des granules de ribonucléoprotéines (RNP) avec leur cible ARN (Ries et al., 2019). Dans les neurones, leur transport le long des neurites fait intervenir les protéines de la famille des kinésines et dynéines conjointement avec les microtubules (Czaplinski, 2014). Or, une analyse transcriptomique d'échantillons de cortex frontal de patients DM1 a révélé que MBNL régule l'épissage alternatif du domaine de liaison aux kinésines (KBD) de la protéine 1 interagissant avec le récepteur la protéine *glutamate Receptor Interacting Protein 1* (GRIP1). La séquestration de MBNL induit la diminution de l'affinité de GRIP1 avec la kinésine KIF5A, ce qui participe aux altérations synaptiques décrites dans cette étude (Otero et al., 2021).

Le transport de MBNL lui-même a été démontré très récemment, en 2022, *in vitro*. Cette prépublication identifie Kif1bα et Kif5c comme partenaires directs des ZnFs de Mbnl1 avec qui ils se déplacent dans des cellules neuronales (Hildebrandt et al., 2022). Le rôle de MBNL dans la localisation des ARNm peut donc être direct, par liaison au 3'UTR et aux moteurs moléculaires, ou indirect via une régulation de l'épissage alternatif ou des protéines impliquées dans ce transport.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 17 : Représentation schématique du rôle de MBNL sur la localisation des ARNm**</figcaption></figure>

Dans les neurones, MBNL régule directement la localisation d'ARNm en favorisant l'exclusion du dernier exon proximal (rouge) au profit du dernier exon distal (vert). Ces exons sont ensuite transportés vers les neurites (flèches vertes). MBNL intervient également dans le transport des ARNm par liaison et régulation de la machinerie de transport vésiculaire.

### 2.4.2.3 Stabilisation des ARN

La liaison au 3'UTR par MBNL peut, comme CELF1, induire une déstabilisation de l'ARNm et faciliter sa dégradation (Du et al., 2010; Masuda et al., 2012; Osborne & Thornton, 2008). En effet, *in vitro*, la liaison de MBNL1 à des cibles artificielles et endogènes provoque la diminution de la demi-vie de ces cibles. L'analyse transcriptomique a révélé que ces ARNm sont impliqués majoritairement dans la liaison à l'ARN, aux protéines du cytosquelette et à des facteurs de transcription. Parmi les cibles affectées par MBNL1, paired like homeodomain 2 (*PTIX2*), un facteur de transcription impliqué majoritairement dans la formation de l'œil et du cœur (Masuda et al., 2012). A noter, la perte de fonction de Mbnl n'a que modestement augmenté le taux de transcription générale des ARNm dans une autre étude, postulant que ce phénomène reste marginal (Wang et al., 2012).
### 2.4.3 Biosynthèse des miARN

MBNL1 est directement impliqué dans la maturation d'un microARN miR-1, par liaison à un motif UGC dans une région double brin en boucle terminale dans le miARN précurseur. Cette liaison empêche l'uridylation du précurseur et favorise sa maturation par Dicer (Rau et al., 2011). miR-1 est la seule cible connue de MBNL ne présentant qu'un seul exemplaire de sa séquence consensus.

### 2.4.4 Inhibition des gènes d'induction à la pluripotence

Les paralogues MBNL1 et MBNL2 ont été identifiés comme des régulateurs négatifs de la pluripotence cellulaire. Ensemble, ils contrôlent l'épissage alternatif d'un large panel de gènes différemment épissés entre des cellules souches embryonnaires (CSEs) et les autres types cellulaires. Parmi ces gènes, la famille de facteurs de transcriptions à tête de fourche (FOXP1) joue un rôle clé dans le contrôle de la pluripotence. De plus, la perte de fonction de MBNL1 et MBNL2 augmente significativement l'expression des gènes d'induction à la pluripotence ainsi que la formation de cellules souches pluripotentes induites durant la reprogrammation somatique (Han et al., 2013; Venables et al., 2013).
### 3 L'unité motrice

L'unité motrice est un élément clé de la contraction musculaire ; elle est décrite par Sherrington comme le pont entre le SNC, le SNP et le muscle squelettique (Liddell & Sherrington, 1925). L'information permettant tout mouvement volontaire, née dans le cortex prémoteur, doit ainsi être transmise jusqu'aux muscles depuis le cortex moteur à travers le faisceau pyramidal. Les prolongements cytoplasmiques, ou axones, des MNs supérieurs du cortex moteur du prosencéphale se rassemblent et parcourent la capsule interne, les pédoncules cérébraux du mésencéphale puis le pont en position ventrale, formant les pyramides dans la médulla.

La vaste majorité des axones décussent, c'est-à-dire qu'ils traversent la ligne médiane et cheminent le long du cordon latéral de la moelle épinière (faisceau corticospinal latéral) tandis que l'autre partie reste du côté ventral (faisceau corticospinal ventral) (figure 18). Les deux faisceaux innervent ensuite les différents MN inférieurs dont les axones forment les fibres nerveuses motrices qui innervent les fibres musculaires par l'intermédiaire de la JNM (Armand, 1982).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 18 : Représentation schématique du faisceau corticospinal.**</figcaption></figure>

Les axones des MNs supérieurs du cortex moteur passent à travers la capsule interne du cortex puis à travers différentes parties du tronc cérébral, les pédoncules cérébraux et le pons, relais avec le cervelet, puis forment les pyramides. A l'intersection avec la moelle épinière, la majorité des axones décussent et suivent une position latérale (Armand, 1982).

Ce dernier chapitre comprendra 4 parties. Les 3 premières se concentreront sur les différentes parties de l'unité motrice, à savoir le motoneurone (1), la jonction neuromusculaire (2) et enfin le muscle squelettique et le couplage excitation-contraction (3). Je terminerai cette introduction par une description des altérations de l'unité motrice dans la DM1 (4).
## 3.1 Le motoneurone

Comme mentionné précédemment, les MNs supérieurs se trouvent dans le cortex cérébral. Ils innervent les MNs inférieurs, ou spinaux, du tronc cérébral et de la moelle épinière. En plus des MNs supérieurs, les MNs spinaux reçoivent des informations des neurones sensitifs, des fibres musculaires ainsi que des interneurones de la moelle épinière. Les MNs spinaux sont responsables de la transmission du signal des MN supérieurs aux muscles effecteurs afin de réaliser un mouvement. Ils innervent par la suite différents organes, qui permettent de définir 3 types de MN spinaux (Vaiserman & Lushchak, 2019).

On distingue ainsi les MNs branchiaux, viscéraux et somatiques (revu par Stifani, 2014). Les MNs brachiaux sont situés dans le tronc cérébral et innervent les muscles du cou et de la face (Chandrasekhar, 2004). Les MNs viscéraux innervent le système nerveux autonome (SNA), lui-même séparé en système sympathique et parasympathique. Le système sympathique assure l'activation du métabolisme global de l'organisme, il gère le muscle cardiaque, les poumons, les reins, les intestins et le côlon. Le système parasympathique contrôle notamment la sécrétion des glandes, la digestion, la croissance etc. (Vaiserman & Lushchak, 2019). Enfin, les MNs somatiques sont situés à la fois dans le tronc cérébral et la moelle épinière. Ils s'organisent en colonnes et innervent les muscles squelettiques, permettant leur contraction et le mouvement du corps (Rexed, 1954).

Les MNs sont, comme les autres neurones, composés d'un corps cellulaire, ou soma, duquel s'étendent les prolongements cytoplasmiques ramifiés, ou neurites, qui permettent la transmission synaptique. Les neurites comprennent l'axone et les dendrites. Pour les MNs somatiques, la terminaison axonale forme le bouton synaptique qui relaie le message synaptique du MN à la fibre musculaire. Les dendrites forment des synapses entre les neurones. Les MNs intègrent ainsi l'information nerveuse d'autres neurones, modulant la décharge efférente du MN vers sa cible musculaire. En effet, les MNs somatiques reçoivent des signaux du cortex moteur et des muscles, par les MNs supérieurs et les neurones sensitifs via les interneurones respectivement (Vaiserman & Lushchak, 2019) (figure 19).
<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 19 : Connexions synaptiques d'un MN somatique**</figcaption></figure>

Représentation schématique d'un MN recevant un signal afférant d'un neurone sensitif via un interneurone, ainsi que d'un MN supérieur. Le MN émet un signal nerveux efférent vers sa cible musculaire. Ces connexions sont représentées par des flèches. L'axone du neurone sensitif et du motoneurone sont entourés de myéline qui l'isole et améliore la conduction du signal.

### 3.1.1 Développement des MNs

Lors du développement du tube neural formant *in fine* le cerveau et la moelle épinière, les protéines sonic hedgehog morphogen (SHH) (Ericson et al., 1996; Roelink et al., 1994) et wingless-type MMTV integration site family (Wnt) (Alvarez-Medina et al., 2008)/bone morphogenetic protein family (BMP) (Mehler et al., 1997) sont exprimées selon un gradient dorso-ventral dans le
tube neural. Ce gradient est transduit en gradient d'activité des protéines GLI-Kruppel family (GLI). En effet, SHH se lie aux protéines patched homolog 1 receptor (PITCH1) (Stone et al., 1996) qui empêche la dégradation des protéines GLI (Niewiadomski et al., 2014) par smoothened homolog (SMO) (Quirk et al., 1997).

Inversement, l'absence de SHH induit une répression des protéines GLI (Wang et al., 2000). L'activité des protéines GLI induit ou réprime ensuite l'expression de protéines dites de Classe 1 ou 2, toujours selon un gradient dorso-ventral (Shirasaki & Pfaff, 2002). Les protéines de classe 1 et 2 ayant par ailleurs des interactions inter-répressives, 5 domaines progéniteurs se créent dans la partie ventro-médiane de la moelle épinière, dont le domaine progéniteur des MNs dont proviennent tous les MNs. Des 4 autres domaines (p0, p1, p2 et p3) naissent les différents interneurones (Briscoe et al., 2000) (figure 20).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 20 : Génération des domaines progéniteurs du tube neural</figcaption></figure>

Le gradient SHH (rouge) s'oppose au gradient Wnt/BMP (bleu) le long de l'axe dorso-ventral. Ce gradient guide l'activité des protéines GLI (vert), qui influe sur l'expression des protéines de classes 1 (orange) et 2 (violet). Les profils d'expression de ces protéines guident la formation des 5 domaines progéniteurs (p0, p1, p2, pMN et p3). Tous les MNs viennent du domaine pMN (adapté de Ulloa & Martí, 2009).

Les progéniteurs MNs doivent ensuite sortir du cycle cellulaire et se différencier. D'une part, l'acide rétinoïque (RA) induit l'expression d'autres protéines nécessaires au programme de différenciation des MNs (Novitch et al., 2003). D'autre part, les protéines 1 et 2 facteurs de transcription des oligodendrocytes (OLIG1&2) favorisent l'expression de la neurogénine 2 (NEUROG2) (Lu et al., 2002; Novitch et al., 2001; Sommer et al., 1996) qui induit l'expression en aval d'autres gènes des MNs dont Homeobox 9 (Hb9) (Mizuguchi et al., 2001; Lee et al., 2009).
Hb9 étant par la suite capable de stimuler sa propre expression, il est très utilisé pour le marquage des MNs spinaux post-mitotiques (Tanabe et al., 1998).

Par la suite, la diminution de l'expression de NEUROG2 jumelée à la stabilité d'expression d'OLIG1&2 permet la différenciation d'autres cellules du domaine progéniteur MN en oligodendrocytes, des cellules avec un rôle de soutien pour les autres neurones de la moelle épinière (Lu et al., 2002; Zhou & Anderson, 2002). En sortant du cycle cellulaire, les MNs spinaux se détachent de l'épithélium neuronal et migrent latéralement (Rousso et al., 2012). Les MNs spinaux nouvellement formés doivent ensuite se spécialiser davantage, ils forment alors des colonnes le long de la moelle épinière.

### 3.1.1.1 Organisation des MNs en colonnes

L'expression de facteurs de croissance et de différenciation en gradient le long de l'axe rostro-caudal induit l'expression localisée des différents représentants de la famille homeobox (HOX) (Ensini et al., 1998; Liu et al., 2001). Le profil d'expression des protéines HOX est davantage raffiné par des interactions inter-répressives entre ces protéines (Dasen et al., 2003) ainsi que des modifications de la chromatine (Golden & Dasen, 2012). Ainsi, l'expression des protéines HOX dans les différents segments de la moelle épinière définit plusieurs colonnes motrices le long de l'axe rostro-caudal (Dasen et al., 2003). Chaque colonne motrice est définie par un profil d'expression génique unique et est impliquée dans l'innervation d'un système particulier (Francius & Clotman, 2014). Les différentes colonnes sont représentées dans la figure 21.

La moelle épinière est divisée en 4 parties : la moelle cervicale, thoracique, lombaire et sacrée. La colonne médiane motrice (MMC) innerve les muscles axiaux essentiels pour la posture du corps et s'étend donc sur toute la longueur de la moelle (Fetcho, 1987).

La colonne spinale accessoire (SAC), composée des MNs branchiaux qui innervent les muscles mastoïdiens et du cou, se trouve dans les 5 premiers segments de la moelle cervicale (Jacobson & Marcus, 2008).

La colonne phrénique motrice (PMC) se trouve entre les segments 3 et 5 de la moelle cervicale, elle innerve le diaphragme (Allan & Greer, 1997; Webber & Pleschka, 1976).

La colonne préganglionique motrice (PGC) s'étend sur toute la moelle thoracique ainsi que les 2 premiers segments de la moelle lombaire et les segments 2 à 4 de la moelle sacrée, les MNs viscéraux sont impliqués dans la stimulation des muscles lisses et la sécrétion des glandes. On
distingue les MNs viscéraux thoraciques qui innervent le SNA sympathique des MNs viscéraux sacrés qui innervent le SNA parasympathique.

La colonne hypaxiale motrice (HMC) s'étend sur toute la moelle thoracique et innerve les muscles intercostaux et abdominaux du thorax.

Enfin, la colonne latérale motrice (LMC) se trouve entre le 5ème segment de la moelle cervicale et le 1er segment thoracique ainsi que sur toute la partie lombaire, elle innerve les muscles des membres, ce qui explique sa séparation en deux au niveau des bras et des jambes (Furness, 2006; Gutman et al., 1993; Landmesser, 2001).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 21 :** Segmentation en colonnes des domaines motoneuronaux de la moelle épinière</figcaption></figure>

La moelle épinière est divisée en 4 parties : la moelle cervicale, thoracique, lombaire et sacrée. MMC = c1-s5 ; SAC = c1-c5 ; PMC = c3-c5 ; PGC = t1-t2 et s2-s4 ; HMC = t1-t12 ; LMC = c5-t1 et l1-l5 (adapté de Dasen & Jessell, 2009).

Au sein de chaque colonne, les MNs somatiques sont organisés en groupes, chaque groupe étant responsable de l'innervation d'un muscle spécifique. Cette spécification supplémentaire précise permet l'exécution de mouvements complexes (Romanes, 1941; Sullivan, 1962).

### 3.1.1.2 Organisation en groupes de MNs

Les groupes de MNs suivent une organisation topographique : plus un groupe est rostral, plus le muscle innervé est antérieur et proximal (Kania, 2014). L'appartenance d'un MN à un groupe particulier est guidée par des facteurs intrinsèques et extrinsèques (Dasen & Jessell, 2009). Les protéines Hox jouent là encore un rôle prépondérant. Associés à l'expression de facteurs de transcription spécifiques à chaque groupe, l'expression combinatoire des protéines Hox assure la spécification pour chaque groupe de MNs (Dasen et al., 2005; Philippidou & Dasen, 2013).
De plus, le facteur extrinsèque neurotrophique des cellules gliales (GDNF) est également impliqué dans ce processus (Haase et al., 2002). GDNF est un facteur physiologique trophique nécessaire à la survie des MNs (Henderson et al., 1994). Par un transport rétrograde depuis le muscle squelettique jusqu'aux MNs, GDNF assure le maintien et la spécialisation des MNs (Haase et al., 2002; Ito & Enomoto, 2016). Au sein de chaque groupe, les MNs acquièrent des spécificités propres à chacun qui découlent d'un code de facteurs de transcription influant sur la morphologie dendritique et axonale (Enriquez et al., 2015). Enfin, les MNs somatiques sont séparés en trois types aux propriétés morphologiques et fonctionnelles distinctes.

### 3.1.1.3 Types de MNs somatiques

#### 3.1.1.3.1 MNs α

Les MNs α innervent exclusivement les fibres musculaires productrices de force, ou extrafusales. Le message efférent des MNs α, impliqués dans différentes unités motrices, est la principale source de la contraction musculaire et du mouvement corporel (Eccles et al., 1960). Il existe plusieurs types de fibres extrafusales : les fibres de type I, dites lentes et résistantes à la fatigue ; les fibres de type IIa, dites rapides et résistantes à la fatigue ; les fibres de type IIb, dites rapides et fatigables ; les fibres de type IIx, dites rapides et avec une résistance à la fatigue moyenne entre les deux autres types de fibres II (Schiaffino & Reggiani, 2011).

Au sein des MNs α, les MNs ont des morphologies variées adaptées à l'innervation et au recrutement des différents types de fibres selon le mouvement musculaire requis, chaque MN n'innervant qu'un unique type de fibres (Burke et al., 1973). Les MNs α sont par ailleurs innervés par les neurones sensitifs des fibres musculaires. Le message afférent des neurones sensitifs vers les MNs α permet la vitesse de contraction caractéristique du réflexe musculaire (Eccles et al., 1960).

#### 3.1.1.3.2 MNs β et γ

Les MNs β innervent les fibres extrafusales et intrafusales, qui composent le fuseau musculaire portant les neurones sensitifs. Les MNs β sont cependant bien moins nombreux que les MNs α et sont donc assez peu décrits (Bessou et al., 1965). Les MNs γ innervent exclusivement les fibres intrafusales, ils n'ont donc aucun rôle direct dans la fonction motrice. En revanche,
comme les MNs β, ils augmentent la tension des fibres intrafusales et les rendent plus sensibles à la contraction des fibres extrafusales. Ainsi, les MNs β et γ confèrent au fuseau musculaire son rôle sensitif nécessaire à la proprioception (Eccles et al., 1960).

### 3.1.2 La transmission synaptique dans les MNs

La synapse est le contact fonctionnel entre deux neurones : l'axone du neurone émetteur, représentant la partie présynaptique, et la dendrite du neurone recevant l'information, représentant la partie postsynaptique.

De manière globale, il existe des synapses électriques et chimiques, différenciées par la nature des molécules transmises entre la partie présynaptique et postsynaptique. Dans les synapses électriques, le transfert d'ions entre les deux parties de la synapse est assuré par des jonctions serrées. Dans les synapses chimiques, des vésicules synaptiques produites par la partie présynaptique fusionnent avec la membrane présynaptique, relâchant dans la commissure entre les deux parties de la synapse les neurotransmetteurs qu'elles contenaient. Ces neurotransmetteurs se lient à des récepteurs spécifiques sur la membrane postsynaptique, induisant l'ouverture, ou la fermeture, de canaux ioniques à la membrane postsynaptique.

Pour les deux types de synapses, le flux ionique modifie la conductance et souvent le potentiel de membrane du neurone postsynaptique, favorisant ou enrayant la décharge d'un potentiel d'action par le neurone postsynaptique (Vaiserman & Lushchak, 2019). Les MNs supérieurs sont glutamatergiques, ce qui signifie que l'information qu'ils partagent avec les MNs spinaux passe par la libération de glutamate, un neurotransmetteur (Ivanhoe & Reistetter, 2004). Les récepteurs postsynaptiques au glutamate des MNs spinaux sont ionotropiques, c'est-à-dire qu'ils sont directement liés à des canaux ioniques, ou métabotropiques couplés à la protéine G, c'est-à-dire non couplés à des canaux ioniques mais qui provoquent leur ouverture par l'intermédiaire d'autres protéines.

Les MNs spinaux portent 3 récepteurs ionotropiques au glutamate : AMPA (acide propionique α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole), NMDA (N-methyl-D-aspartate) et KA (kainate) (Seeburg, 1993). Les récepteurs AMPA sont les plus importants et relaient une information rapide et excitatrice au MN spinal, tandis que les récepteurs NMDA relaient l'aspect tardif de la transmission excitative (Collingridge & Lester, 1989) (figure 22).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 22 :** Représentation schématique de la transmission synaptique entre un MN supérieur et un MN spinal</figcaption></figure>

La synapse entre un MN supérieur et un MN spinal est chimique et glutamatergique. Les vésicules présynaptiques fusionnent avec la membrane présynaptique, relâchant le glutamate dans la commissure synaptique Celui-ci provoque notamment l'ouverture des récepteurs NMDA et AMPA, induisant l'entrée d'ions Ca²⁺ et Na⁺ respectivement dans la synapse postsynaptique. L'influx d'ions participe à la génération d'un potentiel d'action par le MN spinal (adapté de Van Den Bosch, Van Damme, Bogaert, & Robberecht, 2006).

### 3.1.2.1 Cellules gliales, soutien des cellules neuronales

De la même manière que les neurones, les cellules gliales représentent environ la moitié des cellules du SNC (von Bartheld et al., 2016). Cela comprend notamment les astrocytes, les progéniteurs d'oligodendrocytes (OPCs), les oligodendrocytes et les microglies (Allen & Lyons, 2018). Les cellules gliales interviennent dans le développement du SNC, les microglies régulent ainsi la survie des cellules neuronales et phagocytent les neurones en excès produits au début du développement (Kierdorf & Prinz, 2017).

L'axone des MNs est recouvert de myéline (figure 19), la myélinisation dans le SNC par les oligodendrocytes augmente la vitesse de conduction du potentiel d'action et favorise la rapidité
d'exécution de la contraction musculaire (Almeida & Lyons, 2017). La synapse est le lieu de transit de l'information neuronale, sa formation est donc strictement régulée. Les astrocytes rendent d'abord les neurones immatures aptes à la synaptogenèse puis guident la formation de synapses immatures (Allen & Eroglu, 2017). Leur maturation passe par la réception de signaux gliaux, les microglies ayant également été associées à ce processus. (Reemst et al., 2016). Les synapses immatures ou en excès sont ensuite élaguées par les astrocytes et microglies, donnant aux neurones leur connectivité adulte (Filipello et al., 2018; Vainchtein et al., 2018).

Chaque astrocyte est également impliqué dans la communication et la plasticité de milliers de synapses, contrôlant la quantité de neurotransmetteurs disponible (Allen, 2014) ou empêchant les fuites vers d'autres synapses (Khakh & McCarthy, 2015).

Des modèles transgéniques altérant les microglies et les OPCs ont révélé qu'ils étaient également nécessaires pour la mise en place de la transmission synaptique (Almeida & Lyons, 2017; Salter & Stevens, 2017). Les cellules gliales interviennent aussi dans la transmission synaptique directement, les astrocytes par exemple éliminant les ions potassium de l'espace extracellulaire, accélérant la repolarisation des larges MNs spinaux α après un potentiel d'action, ce qui confère aux MNs le débit élevé de décharges nécessaire pour atteindre le pic de force musculaire (Kelley et al., 2018).

Les astrocytes assurent également la maintenance de la connexion synaptique motoneuronale en approvisionnant les MNs en facteurs de survie (Ekestern, 2004) mais aussi en éliminant l'excès de glutamate de la fente synaptique (figure 22) (Novelli et al., 1988). Enfin, les microglies, astrocytes et OPCs sont également impliqués dans le guidage axonal, étape clé de la mise en place de la transmission synaptique (Ginhoux & Prinz, 2015; Minocha et al., 2015). Dans le SNP, les cellules de Schwann (SC) font office de supports aux axones motoneuronaux, assurant leur survie et leur fonction en sécrétant des facteurs de survie et en les entourant de myéline (revu dans Sherman & Brophy, 2005).

### 3.1.2.2 Guidage axonal des MNs

Le guidage axonal est essentiel au le développement des MNs somatiques car il permet la mise en place de la connexion synaptique entre le SNC et le muscle squelettique. Les axones des MNs émergent de la moelle épinière, transitent à travers différents tissus et se connectent à leur cible. Les différentes étapes du développement mettent en place une organisation hiérarchique des MNs qui influence directement leur innervation (Stifani, 2014). En effet, les colonnes motrices
destinent les MNs qui les composent vers une première catégorie de cibles possibles (cf. 3.1.1.1). Les cibles des MNs se précisent encore davantage avec leur appartenance à un groupe de MNs, puis avec leur type et enfin avec leurs caractéristiques morphologiques individuelles et des facteurs extrinsèques (cf. 3.1.1.2).

Le guidage axonal repose sur les capacités sensitives du cône de croissance, au bout de l'axone. Ce cône de croissance peut détecter des protéines de guidance axonale, exprimées selon des trajectoires et des temporalités prédéfinies afin de guider l'axone jusqu'à sa cible. Ces protéines se lient aux différents récepteurs protéiques sur le cône de croissance, influant sur sa trajectoire au travers du cytosquelette (Kolodkin & Tessier-Lavigne, 2011). Pour les MNs somatiques, 4 familles de protéines de guidance axonale ont été identifiées : les Nétrines, les Slits, les Sémaphorines et les Ephrines (Kolodkin & Pasterkamp, 2013).

Une fois qu'elles ont été captées sur un récepteur membranaire, elles doivent être intégrées par la cellule par endocytose. Une fois endocytées, les protéines de guidance axonale peuvent être recyclées, dégradées. Alternativement, elles peuvent être exocytées, ou sécrétées dans des exosomes, dérivées des corps multivésiculaires de la voie des endosomes tardifs. La traduction locale dépendant du transport des ARNm est un mécanisme centrale pour assurer la fonction du cône de croissance (Bashaw & Klein, 2010; Pasterkamp & Burk, 2021).

### 3.1.2.3 Transport des ARNm et traduction locale

Les MNs projettent leur axone sur de très longues distances, ce qui représente une difficulté pour maintenir l'homéostasie dans toute la cellule. Pour y pallier, la cellule possède des mécanismes de transport à direction antérograde et rétrograde des ARNm, permettant une traduction locale des protéines à leur lieu d'intérêt. Ce transport s'appuie sur la répartition globale du cytosquelette, composé majoritairement par les filaments d'actine et les microtubules (MT), formant une toile sur laquelle naviguent les structures portant les ARNm (Hirokawa et al., 2010). Les ARNm, dans des granules avec des protéines de liaison à l'ARN (RBP), majoritairement les ribonucléoprotéines hétérogènes nucléaires (hnRNP) et les hélicases DEAD-box (Kanai et al., 2004), sont ainsi transportés par les kinésines (Vale et al., 1985) et les dynéines (Lye et al., 1987), des moteurs moléculaires assurant le transport le long des MT à direction antérograde et rétrograde respectivement (Hirokawa et al., 1990). Le transport de ces granules repose également sur l'activité des myosines, qui se déplacent, elles, sur les filaments d'actine (Hammer & Sellers, 2012).

De plus, il a été montré que les granules peuvent profiter de la mobilité d'autres organelles en s'y liant pour se déplacer dans la cellule (Liao et al., 2019). Le transport associé aux MT des
ARNm, relié à la traduction locale, est un mécanisme central lorsque les maladies neurodégénératives sont souvent dues à des mutations dans les protéines associées aux MT (Deniston et al., 2020; Dubey et al., 2015), aux protéines motrices (Hirokawa et al., 2010), aux RBP (Ramaswami et al., 2013) et aux régulateurs de la traduction (Banerjee et al., 2018). De même, cette importance semble partagée au niveau musculaire, les MT étant essentiels pour le transport des ARN *in vivo* (Denes et al., 2021).

## 3.2 La jonction neuromusculaire

Les MNs somatiques interviennent dans des synapses chimiques particulières puisqu'elles relient le MN somatique, partie présynaptique, avec le muscle strié, partie postsynaptique. Cette synapse hautement spécialisée porte le nom de jonction neuromusculaire (JNM), ou plaque motrice (figure 23). Le MN somatique produit de l'acétylcholine (ACh) par l'activité de la choline acétyltransférase (ChAT) (Nachmansohn & Machado, 1943). L'ACh est ensuite empaquetée dans des vésicules présynaptiques qui s'accumulent près de la membrane, dans des zones actives (Südhof, 2012).

L'arrivée d'un potentiel d'action entraîne l'ouverture de canaux calciques voltage-dépendants dans la synapse présynaptique, qui induisent l'entrée de calcium dans la cellule. Ce flux entrant calcique entraîne la fusion, ou exocytose, des vésicules présynaptiques avec la membrane présynaptique par le complexe protéique Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptor (SNARE) des vésicules présynaptiques, relâchant l'ACh dans la commissure synaptique (Baker & Hughson, 2016).

L'ACh se fixe ensuite aux sous-unités α et δ ou ε des récepteurs à l'ACh (RACh) sur la partie postsynaptique musculaire, ce qui entraîne un changement de conformation des RACH et leur ouverture (Miyazawa et al., 2003). L'ouverture des RACH entraîne l'entrée de cations dans la partie postsynaptique, et l'ouverture de canaux sodiques voltage-dépendants à la membrane. L'effet groupé de ces canaux dépolarise la membrane et produit un potentiel de plaque. Lorsque le potentiel de plaque dépasse un certain seuil, il se propage à la fibre musculaire de manière bidirectionnelle, donnant naissance à un potentiel d'action de fibre musculaire.

Dans un contexte normal, le potentiel de plaque dépasse largement la valeur nécessaire pour produire un potentiel de fibre. Ce ratio est appelé facteur de sécurité et protège la transmission neuromusculaire des faibles altérations (Wood & R. Slater, 2001). Cette dépolarisation globale de la fibre entraîne la libération de calcium par le réticulum sarcoplasmique, première étape de la contraction musculaire. L'ACh est ensuite recyclée par l' acétylcholinestérase dans la commissure
synaptique afin d'éviter une dépolarisation trop longue et pour repolariser la membrane (Engel et al., 2015).

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 23 : Représentation schématique de la génération du potentiel de plaque à la JNM**</figcaption></figure>

Un potentiel d'action parcourt le MN somatique et atteint la terminaison axonale (1). Le potentiel d'action provoque l'ouverture de canaux calciques voltage-dépendants (2) qui induisent l'exocytose des vésicules synaptiques à la membrane, relâchant l'acétylcholine (ACh) dans la commissure synaptique (3). L'ACh se lie aux récepteurs aux RACH au niveau postsynaptique, provoquant leur ouverture. Les RACH ouverts permettent l'entrée dans la postsynapse d'ions $NA^+$ qui produisent un potentiel de plaque (4). Le potentiel de plaque entraîne l'ouverture de canaux sodiques voltage-dépendants qui dépolarisent encore plus la membrane par entrée d'ions $Na^+$. Le potentiel d'action résultant se propage à toute la fibre musculaire, créant un potentiel de fibre musculaire (5). Après une courte latence, l'ACh rémanente est recyclée par l'acétylcholinestérase (6). Les potentiels électriques sont représentés par des flèches violettes.

### 3.2.1 Structure tripartite de la JNM

Par rapport à la taille des fibres musculaires, les JNMs sont de petites structures (environ 30µm de diamètre), chaque fibre de chaque muscle n'en portant qu'une seule. Classiquement, la JNM est divisée en trois parties majoritaires : l'axone terminal constituant la partie présynaptique, la partie postsynaptique au niveau de la fibre musculaire et la cellule de Schwann terminale (tSC) (Figure 24) (Omar & Bollu, 2019). Entre les parties présynaptique et postsynaptique, la commissure
synaptique est remplie d'une matrice extracellulaire spécialisée, nommée lamina synaptique basale,
cruciale pour l'intégrité de la JNM. Elle représente en effet un soutien mécanique pour la synapse
mais présente également des protéines impliquées dans des voies de signalisation impliquées dans
le développement et le maintien de la JNM (Sanes, 2003). Par exemple, l'AChE s'attache à cette
matrice grâce au Collagène Q (ColQ), spécifique de la lamina synaptique basale (Ohno et al., 1998).

3.2.1.1 La présynapse axonale

Les axones des MNs sont projetés depuis la moelle épinière vers chaque muscle
squelettique cible. Chaque axone se ramifie dans sa partie terminale, innervant ainsi plusieurs fibres
musculaires. A chaque synapse, l'extrémité de l'axone est dépourvue de gaine de myéline et forme
le bouton synaptique, une petites protubérance qui constitue la partie présynaptique de la JNM
(Desaki & Uehara, 1981). Le bouton synaptique est rempli de vésicules synaptiques qui contiennent
l'ACh, produite dans le cytoplasme du bouton terminal à partir d'acétyl-COA et de choline par
l'action de la ChAT (Nachmansohn & Machado, 1943).

3.2.1.2 La postsynapse

La partie postsynaptique de la JNM est formée par une portion épaissie de la membrane
plasmique musculaire, le sarcolemme, qui se replie de façon à augmenter la surface de contact
synaptique, formant les gouttières synaptiques. A leur crête, les gouttières synaptiques portent les
RACh qui permettent la 1ère dépolarisation de la membrane. Les canaux sodiques voltage-
dépendants nichent au fond des gouttières synaptiques, l'influx sodique causé par leur ouverture
induit la propagation du potentiel de plaque au reste de la fibre musculaire. séparée du bouton
synaptique par la commissure synaptique (Ratliff et al., 2018).

Un RACH est formé de 5 sous-unités polypeptidiques : 2 sous-unités α (α2), β, δ et ε chez l'adulte ou γ au cours du développement. Lors d'une dénervation de la JNM, on peut observer une réversion de la composition en sous-unités des RACH vers un profil fœtal (Gu & Hall, 1988). 2 molécules d'ACH se fixent sur le RACH, une entre les sous-unités α et ε/γ et l'autre entre les sous-unités α et δ, ce qui provoque un changement conformationnel du récepteur et l'ouverture du canal cationique (Popot & Changeux, 1984).
### 3.2.1.3 La cellule de Schwann

Différents types de cellules de Schwann (SC) enveloppent l'axone et, en tant que cellules gliales, elles sont impliquées dans le développement, le maintien et le fonctionnement de la JNM. Toutes les SC dérivent des cellules souches de la crête neurale, les SC myélinisantes et non myélinisantes se trouvent le long de l'axone et l'enveloppent avec et sans myéline respectivement. Les SC terminales (tSC) enveloppent le bouton synaptique, à proximité de la synapse (Darabid et al., 2014). Les tSC ne sont pas excitables électriquement mais peuvent détecter et intégrer des informations sous forme de neurotransmetteurs, l'ACh via des RACH muscariniques métabotropiques, ou de gliotransmetteurs, l'adénosine triphosphate (ATP) et le glutamate par exemple. La liaison de ces molécules induit l'augmentation de la concentration en calcium de la tSC qui transmet en réponse un signal rétrograde vers le MN (Darabid et al., 2014).
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 24 : Marquages de la JNM de la souris</figcaption></figure>

La JNM est classiquement observée en microscopie optique par des marquages fluorescents (A) et par microscopie électronique à transmission (MET) (B). (A) Visualisation d'une JNM mature en « bretzel » par immunomarquage des RACH (vert) par la toxine botulique (α-bungarotoxine / α-BTX) et du neurofilament (NF) axonal ainsi que des vésicules synaptiques (Synapsine) (magenta). Les RACH forment des « clusters » sans zone de contact. L'axone innervant la JNM a un marquage d'intensité très prononcée par rapport à la synapsine. Les parties présynaptique et postsynaptique se superposent. (B) Visualisation d'une JNM mature par MET. La tSC est coloriée en violet, le bouton synaptique et les gouttières synaptiques sont détourés en rouge et en vert respectivement. Entre ces deux zones se trouve la commissure synaptique. Les RACH sont repérables au sommet des crêtes synaptiques par une zone dense en électrons.
### 3.2.2 Développement de la JNM chez la souris

La grande majorité des études sur le développement de la JNM ont été effectuées chez la souris et la drosophile. Même si elles présentent de fortes similitudes avec les JNM humaines, les JNM murines sont plus grandes que les JNM humaines qui sont par ailleurs naturellement plus fragmentées (Jones et al., 2017). En outre, les gouttières synaptiques des JNM humaines sont caractérisées par le plus haut degré de repliement parmi les espèces étudiées jusqu'à présent (Slater, 2017).

#### 3.2.2.1 Formation

La formation de la JNM commence au niveau musculaire au 11ème jour du développement, avant l'innervation des muscles par les MNs. En effet, les fibres musculaires forment des versions primitives de « clusters » de RACH, majoritairement au milieu de la fibre musculaire (Kummer et al., 2006). Ce « prepatterning » musculaire implique les protéines musculaires de la kinase spécifique au muscle (MuSK) et la rapsyne, de manière indépendante au MN (Lin et al., 2001). Dans les jours suivants, les axones des MNs atteignent les fibres musculaires par guidage axonal, innervant les « clusters » de RACH précédemment formés et permettant leur développement. Les tSC co-migrent avec les cônes de croissance des MNs et sont impliqués dans le guidage axonal (Thompson & Buettner, 2006).

L'innervation axonale provoque également l'apparition de nouveaux « clusters », tandis que ceux non innervés disparaissent, entraînant une répartition médiane des JNM sur chaque fibre (McMahan, 1990). Cette répartition est permise par la sécrétion d'agrine neurale et d'ACH par le bouton synaptique qui stimulent et répriment respectivement le « clustering » des RACH (Lin et al., 2005). L'expression des gènes codant pour les composants de la JNM augmente dans les noyaux sous-synaptiques par rapport aux autres noyaux de la fibre musculaire (Schaeffer et al., 2001). La voie majeure impliquée dans la formation de la JNM et de « clustering » des RACH est la voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK.

##### 3.2.2.1.1 « Clustering » des RACH et voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK

L'agrine est une protéine de plus de 200 kDa produite selon différentes isoformes associées à sa localisation. L'agrine neurale est exclusivement exprimée par les MNs et sécrétée dans la commissure synaptique où elle interagit notamment avec la protéine low-density lipoprotein
receptor-related protein 4 (Lrp4). Le domaine globulaire laminin-like 3 que porte l'agrine neurale est suffisant pour activer MuSK. Ce domaine n'est pas présent sur l'agrine musculaire et l'agrine neurale est 5000 fois plus efficace que sa version musculaire pour induire le « clustering » des RACH (Ruegg & Bixby, 1998). Ainsi, par la suite, l'agrine neurale sera simplement dénommée « agrine ».

L'agrine se lie au récepteur transmembranaire Lrp4, formant un complexe tétramérique qui promeut l'activation et la transphosphorylation de MuSK, (Zhang et al., 2008; Zong et al., 2012). L'activation par ce complexe nécessite par ailleurs l'intervention de la kinase-7 en aval (Dok7), une protéine ligand adaptor-like. En effet, Dok7 se lie, par l'intermédiaire de son domaine de liaison aux phosphotyrosines (PTB), à la Tyrosine 553 phosphorylée de MuSK (Okada et al., 2006). Le domaine d'homologie aux pleckstrines (PH) de Dok7 induit sa dimérisation et celle de MuSK, facilitant sa transautophosphorylation (l'autophosphorylation d'autres résidus tyrosine de MuSK) (Bergamin et al., 2010).

Le mécanisme de phosphorylation de la tyrosine 553 n'est cependant pas connu. Les acteurs principaux de la voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK sont schématisés dans la figure 25.

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 25 :** Représentation schématique du déclenchement de la voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK</figcaption></figure>

L'agrine sécrétée par la terminaison axonale se lie à Lrp4 et, avec Dok7 phosphorylé, permet l'activation de MuSK. MuSK phosphorylé active une multitude de protéines en aval, comme la rapsyne, qui induisent le « clustering » des RACH (Adapté de Ohkawara et al., 2020).
### 3.2.2.1.2 Acteurs en aval de MuSK

L'activation de MuSK induit ensuite le « clustering » des RCh et la formation de la jonction par des voies de signalisation en aval. Comme MuSK, Dok7 est lui aussi phosphorylé, ce qui lui permet de recruter les protéines adaptatrices Crk et Crk-L (Hallock et al., 2010). De plus, les protéines Sorbs1 et Sorbs2 interagissent avec cette dernière, leur activité étant nécessaire au « clustering » des RCh (Hallock et al., 2016).

La rapsyne est une protéine clé du « clustering » des RCh en tant que lien entre les RCh et le cytosquelette par l'intermédiaire du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine (DGC) (Apel et al., 1995; Moransard et al., 2003). La rapsyne possède une activité de ligase E3, essentielle pour le « clustering » des RCh. Ce domaine peut lui conférer des activités de neddylation ainsi que d'ubiquitination et de sumoylation par la lysine 63, mais l'activité précise *in vivo* de ce domaine n'est pas encore claire (Li et al., 2016). Une autre protéine, *Dishevelled-1* (Dvl1), interagit avec MuSK et régule le « clustering » des RCh. Dvl1 étant impliqué dans la voie Wnt, son rôle dans le développement de la JNM a été étudié (Luo et al., 2002).

### 3.2.2.1.3 Voie de signalisation Wnt

Comme mentionné plus haut, la voie Wnt est impliquée dans une quantité phénoménale de processus biologiques. La régulation par les protéines Wnt commence par une liaison aux protéines Frizzled, recrutant la protéine Dvl1. Plusieurs Wnt semblent impliqués dans le « pre patterning » musculaire et le « clustering » des RCh (notamment Wnt3, Wnt4 et Wnt11) (Zhang et al., 2012; Henriquez et al., 2008; Strochlic et al., 2012). Cette régulation semble nécessiter le domaine riche en cystéine (CRD) de MuSK, homologue au domaine des protéines Frizzled (Messéant et al., 2015).

Au niveau présynaptique, Wnt7A et Wnt7B, exprimés dans les MNs, sont essentiels au développement de la partie présynaptique de la JNM (Shen et al., 2018). La voie canonique inclut l'augmentation de l'expression de la β-Caténine, un activateur transcriptionnel (Komiya & Habas, 2008). Pour le développement de la JNM, elle semble posséder, comme d'autres acteurs de la JNM, un mode d'action rétrograde (M. Li et al., 2008).
### 3.2.2.1.4 Voies de signalisation rétrogrades

Le développement des parties pré- et postsynaptiques de la JNM est strictement coordonné, ce qui indique une réciprocité des signaux entre ces deux compartiments. La β-Caténine est un activateur transcriptionnel clé de la voie canonique Wnt (Cadigan & Nusse, 1997). Sa déplétion muscle-spécifique induit des défauts morphologiques dans le bouton synaptique (Li et al., 2008), possiblement par la dérégulation de Slit2, une protéine du guidage axonal (Jaworski & Tessier-Lavigne, 2012).

Au-delà de son rôle dans la voie Agrine-Lrp4-MuSK, Lrp4 est également nécessaire en tant que signal rétrograde pour la différenciation du bouton synaptique (Yumoto et al., 2012). La lamine β2, une protéine de la lamina synaptique basale, intervient dans la maturation des canaux calciques voltage-dépendants présynaptiques (Chand et al., 2015) et sa déplétion induit des défauts présynaptiques (Noakes et al., 1995). Enfin, GDNF, mentionné précédemment (cf. 3.1.1.2), est un facteur neurotrophique impliqué également dans le développement de la JNM (Keller-Peck et al., 2001) et dont la sécrétion rétrograde semble dépendre des protéines précurseurs de l'amyloïde (APP) exprimées dans le muscle (Stanga et al., 2016).

### 3.2.2.1.5 Elimination des RACH aneuraux

L'innervation axonale des fibres musculaires induit non seulement la formation des JNM mais également la dispersion des « clusters » primitifs de RACH qui ne sont pas innervés. Cette inhibition est médiée par l'activité musculaire et plus précisément par la sécrétion d'ACH (An et al., 2010). L'ACH se lie aux RACH, induisant une entrée de calcium dans le compartiment postsynaptique, activant la protéine Calpain. Celle-ci clive p35, le ligand de la Cycline 5 dépendante d'une kinase (Cdk5) en p25, stimulant son activité (Chen et al., 2007; Patrick et al., 1999). Ce mécanisme induit le remodelage du cytosquelette et induit la dispersion des RACH aneuraux (Xie et al., 2006). L'influx calcique provoqué par la liaison de l'ACH aux RACH semble également réprimer le « clustering » des RACH par activation de la voie de la protéine kinase C (PKC) et de la kinase II dépendant de Ca²⁺/calmoduline (CAMKII) (Li et al., 1992; Macpherson et al., 2002). Enfin, l'activité musculaire peut également induire le clivage de Dvl1 mentionné précédemment, ce qui pourrait contribuer à l'élimination des RACH aneuraux (Wang et al., 2014).
### 3.2.2.2 Maturation de la JNM

Une fois formée, la synapse musculaire doit maturer afin d'adopter sa structure définitive. Au cours de cette période, la plaque motrice s'élargit et le sarcolemme s'invagine, augmentant la surface de contact avec la lame basale synaptique, formant les gouttières synaptiques (Lichtman & Colman, 2000). Au cours de son développement, lorsqu'observée par des immunomarquages, la JNM passe d'un aspect rond et plein à une forme perforée en bretzel (figure 26) (Slater, 1982).

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 26 : Evolution morphologique de la JNM au cours du développement**</figcaption></figure>

La JNM se développe et s'étend au cours du développement. Les RACh adoptent, au cours de leur maturation, une forme perforée en bretzel (Adapté de Shi, Fu, & Ip, 2012).

Au stade développemental, à la suite de l'innervation axonale des fibres musculaires, plusieurs axones peuvent innerver la même plaque motrice. Ces innervations surnuméraires sont graduellement perdues au cours de la maturation de la JNM, ne laissant au final qu'un axone par plaque motrice (Brown et al., 1976). Le choix de la synapse semble basé sur l'activité synaptique, l'axone du MN le plus actif étant conservé. Les activités asynchrones des différents MNs à la même plaque stimulent le déroulement de l'élagage synaptique. Ce processus semble prendre forme au niveau postsynaptique, le blocage des RACh de manière localisée entraînant la résorption de l'axone à ce niveau (Balice-Gordon & Lichtman, 1994; Favero et al., 2012).

Les tSC jouent un rôle important dans ce mécanisme, engloutissant les débris laissés par l'axone retiré (Bishop et al., 2004). Puis, le bouton synaptique restant s'étend, occupant toute la plaque motrice (Turney & Lichtman, 2012). Au niveau moléculaire, la neuréguline 1 (Nrg1) axonale promeut l'action des tSC pour l'élagage synaptique (Lee et al., 2016). Le cytosquelette et le transport par les MTs semble impliqué dans l'élagage synaptique, des acteurs moléculaires impliqués dans ces processus ayant été identifiés (Brill et al., 2016; Roche et al., 2014).
Au cours de la première semaine après la naissance, les RACH nicotiniques composés jusqu'alors des sous-unités α2, β, δ et γ acquièrent leur forme adulte, composée des sous-unités α2, β, δ et ε. Cette transition depuis la forme fœtale augmente la conductance au calcium des RACH (Missias et al., 1996).

### 3.2.3 Maintien, régénération et vieillissement de la JNM

#### 3.2.3.1 Maintien de la JNM

Le fonctionnement de la JNM est assuré par la coordination des trois parties qui la composent. Le dysfonctionnement d'un composant de la synapse peut donc en altérer le maintien (Couesnon et al., 2013). La concentration importante des RACH est assuré par leur « clustering » et le recyclage continuel des RACH (Bruneau et al., 2005). De nombreuses protéines sont impliquées dans le maintien de cet état. L'α-syntrophine, via l'action de l'α-dystrobrévine 1 phosphorylée et des protéines du DGC sont essentielles pour ce processus (Martinez-Pena y Valenzuela et al., 2011; Schmidt et al., 2011).

La protéine αkap, encodée dans le gène CaMKII, semble protéger les RACH face à une dégradation par le système ubiquitine/protéasome (Mouslim et al., 2012). Les voies des protéines kinases A et C ont des effets antagonistes sur la concentration des RACH à la JNM. La première assure une forte densité de RACH aux crêtes synaptiques tandis que la seconde stimule leur dispersion (Martinez-Pena & Valenzuela et al., 2013).

La perte de fonction des RACH muscariniques induit des altérations de la maintenance de la JNM (Wright et al., 2009).

Les MNs viscéraux, impliqués dans l'innervation du SNA sympathique, établissent des contacts avec la JNM et semblent participer à son maintien par activation des β2-adrénorécepteurs musculaires (Khan et al., 2016).

La voie de signalisation Agrine-Lrp4-MuSK n'est pas impliquée que dans la formation de la JNM. En effet, des modèles ou expériences de déplétion de l'agrine (Samuel et al., 2012), de Lrp4 (Barik et al., 2014), de Dok7 (Eguchi et al., 2016) et de MuSK, directement (Kong et al., 2004) ou par l'intermédiaire de la protéine ligand biglycan (Amenta et al., 2012), ont montré que l'action de ces protéines était essentiel au maintien de la JNM. Enfin, une étude a montré que l'ablation, après maturation de la JNM, des tSC chez des souris induit des défauts globaux de la plaque motrice (Barik et al., 2016).
### 3.2.3.2 Régénération de la JNM après une blessure nerveuse

Les tSC ont également un rôle pivot dans le processus de régénération de la JNM. Des expériences d'écrasement de nerfs ont révélé que les axones des MNs se régénérèrent selon leur trajectoire d'origine le long des tubes des tSC (Kang et al., 2014; Nguyen et al., 2002). Lorsqu'un nerf est sectionné, les tSC s'activent et s'étendent au sein de la commissure synaptique, encerclant le reliquat du bouton synaptique.

Par ailleurs, les tSC des JNMs déténvées mettent en place des ponts synaptiques avec d'autres JNMs. De l'axone intact émergent des excroissances synaptiques qui sont guidées par le pont synaptique vers la plaque motrice déténvée pour rétablir la transmission synaptique, démontrant la plasticité axonale (Son & Thompson, 1995). Le processus de déténration provoque la production par les tSC de facteurs de survie motoneuronale et de régénération axonale comme GDNF, le facteur neurotrophique issu du cerveau (BDNF) et le facteur de croissance nerveux (NGF) (Heumann et al., 1987; Meyer et al., 1992; Naveilhan et al., 1997).

### 3.2.3.3 L'évolution de la JNM avec l'âge

Le vieillissement s'accompagne d'une diminution progressive de la masse et de la force musculaires, selon un processus appelé sarcopénie. L'altération de nombreux mécanismes interdépendants ont été associés à la sarcopénie : l'activité physique, la résistance aux processus anaboliques, l'inflammation ou encore la transmission neuromusculaire (Tournadre et al., 2019). Chez la souris, le vieillissement s'accompagne d'une déficience globale des JNM avec de la déténration totale ou partielle selon les fibres (Chai et al., 2011), une fragmentation des *clusters* de RACH accompagnée d'une diminution de la densité de ces récepteurs, de l'apparition d'excroissances synaptiques et de gonflements axonaux (Valdez et al., 2010).

Les causes de ces altérations ne sont pas bien identifiées. Chez la souris, la perte de MN avec l'âge est controversée et n'a pas été impliquée de manière univoque. L'autophagie décline au cours du vieillissement et son inhibition a été reliée à des défauts structurels et fonctionnels de la JNM (Carnio et al., 2014). Il est donc difficile de déterminer si la dégradation de la JNM au cours du vieillissement est causée par la sarcopénie ou si elle joue un rôle dans l'établissement de cette pathologie. De plus, les JNMs humaines sont très stables au cours du vieillissement, contrairement aux JNMs murines (Jones et al., 2017), montrant que les conclusions faites chez la souris, concernant la sarcopénie, doivent être considérées avec précaution.
3.3 Muscle squelettique et couplage excitation-contraction

La génération du potentiel d'action musculaire provoque la contraction musculaire via un
processus nommé couplage excitation-contraction (Kahn & Sandow, 1950; Sandow, 1952). Celui-
ci repose sur des variations rapides dans la cellule musculaire de la concentration en calcium
(Niedergerke, 1955). En effet, le potentiel d'action induit une libération rapide de calcium par le
réticulum sarcoplasmique (RS) dans le sarcoplasme, qui provoque la contraction musculaire
(Caputo & Gimenez, 1967; Ebashi et al., 1969). Ensuite, le calcium est réintégré dans le RS
(Winegrad, 1968). Pour décrire plus précisément les étapes conduisant à la production de la force
musculaire au niveau d'une fibre, le potentiel d'action se propage de manière longitudinale dans la
fibre et de manière radiale le long des tubules transverses (tubules T) (Huxley, 1964). Le potentiel
d'action atteint ainsi l'intérieure de la fibre où le tubule T est entouré par le RS, ou citernes
terminales qui forment la triade (Peachey, 1965).

La dépolarisation de la membrane sarcoplasmique provoque un changement conformationnel des récepteurs à la dihydropyridine (DHPR) et l'ouverture des récepteurs à la ryanodine (RyR) avec lesquels ils forment des tétrades (Protasi, 2002). L'ouverture des RyR entraîne la libération de calcium par le RS (Smith et al., 1988). Le Ca²⁺ interagit ensuite avec la troponine C, éliminant l'inhibition de la troponine I et de la tropomyosine sur l'interaction entre les filaments d'actine et de myosine. Les filaments d'actine glissent alors sur les filaments de myosine, produisant la tension musculaire (Huxley, 1969). Le Ca²⁺ est ensuite réintégré dans le RS par la protéine pompe ATPase calcique du RS (SERCA) avec l'aide notamment de la parvalbumine (Baylor & Hollingworth, 2011). Le mécanisme du couplage d'excitation-contraction est schématisé par la figure 27.
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 27 : Représentation schématique du couplage excitation-contraction</figcaption></figure>

Le potentiel d'action généré par la JNM parcourt la fibre de manière longitudinale et radiale au travers des tubules T (1). Le potentiel d'action induit la libération de Ca²⁺ par le RS (2). Le Ca²⁺ libère les filaments d'actine de l'inhibition de la troponine et de la tropomyosine, induisant le glissement des filaments d'actine sur les têtes de myosine (3). Le Ca²⁺ est réintégré dans le RS (4), rétablissant l'inhibition sur les filaments d'actine (5) (adapté de Campbell, Mitchell, & Reece, 2000).
## 3.4 Altération du MN et de la JNM dans la DM1

La DM1 étant une pathologie neuromusculaire, les atteintes du muscle, et plus récemment du cerveau, ont été étudiées de manière extensive, comme décrit précédemment. Cependant, les défauts des autres composants de l'unité motrice, à savoir le MN et la JNM, restent assez peu caractérisés dans le cadre de cette maladie. Pourtant, les études faites chez les patients DM1, mais aussi sur des modèles *in vivo* et *in vitro* de la maladie, suggèrent des défauts de communication au sein de l'unité motrice, lesquels pourraient participer au mécanisme physiopathologie de la DM1 (Bombelli et al., 2016).

De très rares études ont été menées au niveau de la moelle épinière et du système nerveux périphérique chez les patients DM1. Une étude menée sur 5 patients DM1 a montré qu'il n'existait pas de perte de motoneurones spinaux suggérant ainsi que la pathologie musculaire de la DM1 n'est pas le résultat d'une perte massive de ces neurones comme observé dans d'autres pathologies comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) (Walton et al., 1977). Cependant, la présence de foci CUG a été identifiée post-mortem dans les MNs spinaux de patients DM1. Ces foci CUG colocalisent avec les protéines MBNL1, suggérant la séquestration et la perte de fonction de MBNL dans ce type cellulaire (Wheeler, Krym, et al., 2007).

Des altérations fonctionnelles et morphologiques des axones des MNs chez les patients ont également été observées (Cros et al., 1988; Krishnan & Kiernan, 2006). *In vitro*, des défauts de formation des axones ont été décrits dans des cellules souches pluripotentes reprogrammées en MN, associés avec des défauts de formation de la JNM (Marteyn et al., 2011). Enfin, une étude cellule-spécifique a récemment révélé des altérations de l'épissage alternatif dans des MNs spinaux de patients DM1, lesquelles sont associées à des défauts morphologiques des neurites (Nakamori et al., 2022).

Au niveau de la JNM, les études morphologiques de ces structures chez les patients DM1 datent d'il y a plus de 40 ans. Elles ont mis en évidence des anomalies d'arborisation, une réduction de la densité des vésicules présynaptiques et un élargissement des plaques motrices (Coers et al., 1973; Allen et al., 1969; Fardeau & Tomé, 1980; Macdermot, 1961). Ces défauts semblent être reliés à la présence de longues répétitions CTG. En effet, des défauts de la JNM ont été montrés dans le diaphragme du modèle murin DMSXL, exprimant le gène *DMPK* humain avec plus de 1000 répétitions CTG (Panaite et al., 2013).
De telles observations ont également été décrites au niveau du muscle tibial antérieur (TA) dans un modèle de souris invalidées de manière ubiquitaire pour *Mbnl1* et *Mbnl2* (MBNL1<sup>-/-</sup> ; MBNL2<sup>+/-</sup>) (Lee et al., 2013), suggérant que les défauts de la JNM dans la DM1 sont attribuables à la perte de fonction de MBNL1 et MBNL2. Enfin, la déplétion de *mbl-1*, homologue de MBNL1, dans un modèle *C.elegans* perturbe la formation des JNMs et celle-ci n'est restaurée qu'avec une surexpression de la protéine au niveau présynaptique, alors que la surexpression dans le muscle n'a aucun effet (Spilker et al., 2012).

En revanche, des défauts de l'épissage alternatif de l'exon 6 de MuSK et de la sous-unité gamma du RACH ont été décrits dans des cellules musculaires dérivées de fœtus avec plus de 1000 répétitions CTG et de patients DM1 respectivement (Klinck et al., 2014). Ces altérations suggèrent que les répétitions dans le muscle squelettique peuvent contribuer aux défauts de la JNM dans la DM1. L'ensemble de ces études suggère donc que la perte des protéines MBNL pourrait participer aux défauts de communication neuromusculaire décrits chez les patients. Incidemment, le MN et la JNM pourraient être impliqués dans la mise en place du mécanisme pathologique de la DM1.
# Problématique et objectifs

La DM1 est due à des expansions de répétitions CTG dans le 3'UTR du gène *DMPK* (Brook et al., 1992). Ce anormalité a été reproduite chez la souris, donnant lieu à des modèles qui récapitulent une grande partie des défauts caractéristiques de la pathologie (Wang et al., 2007; Gomes-Pereira et al., 2007; Mankodi et al., 2000; Orengo et al., 2008). Parmi les mécanismes dérégulés par les foci générés par l'agrégation des ARN DMPK mutés, la séquestration et perte de fonction des protéines de liaison à l'ARN MBNL provoque des défauts globaux du métabolisme des ARNs, comme ont pu le démontrer de nombreux modèle de déplétion de ces protéines (Charizanis et al., 2012; Goodwin et al., 2015; Lee et al., 2013; Kanadia, Johnstone, et al., 2003). Ces études ont ainsi pu identifier des cibles ARN de la régulation des protéines MBNL dont l'altération conduit à l'émergence de défauts similaires aux symptômes développés par les patients DM1.

En effet, la DM1 est une maladie neuromusculaire dégénérative dont les composantes musculaires, et plus récemment cognitives, ont été étudiées de manière extensive (Harper, 2001). En revanche, le mécanisme pathologique à l'origine des défauts dans la DM1(cf. partie 3.3) du lien entre le SNC et le muscle squelettique que représente l'unité motrice, formée du MN et de la JNM, n'a pas été clairement défini. L'identification de foci colocalisant avec MBNL dans des MNs issus de biopsies post-mortem de moelle épinière de patients DM1 et au niveau des noyaux sous-synaptiques de la JNM chez des patients DM1 (Wheeler, Krym, et al., 2007) suggère que MBNL pourrait être séquestré dans les MNs, provoquant sa perte de fonction et conduisant à des défauts de communication neuromusculaire décrits dans la pathologie. Cette hypothèse soulève la question suivante : quel est le rôle de MBNL dans les MNs sur l'homéostasie et la fonction musculaire ?

Afin d'y répondre nous avons appliqué une démarche similaire aux études mentionnées précédemment en générant un modèle murin de déplétion des protéines MBNL1 de manière ubiquitaire et MBNL2 spécifiquement dans le MN (MBNL3 n'étant que très peu exprimé dans le SNC) (Goodwin et al., 2015; Lee et al., 2013; Lee et al., 2022). Pour cela, nous avons délété l'exon 2 de MBNL2 contenant l'ATG de traduction par expression de la Cre recombinase sous contrôle du promoteur Hb9 MN-spécifique dans des souris. La caractérisation de ces souris avait 2 objectifs principaux : 1) déterminer les conséquences physiologiques de la perte de fonction de Mbnl1 et Mbnl2 dans les MNs sur les différents composants de l'unité motrice, c'est-à-dire le MN, la JNM et le muscle squelettique ; et 2) identifier les cibles ARN régulées par les protéines MBNL dans les MNs. Notre démarche vise à montrer l'importance de MBNL dans les MNs et son rôle potentiel
dans la physiopathologie de la DM1 mais aussi donner des pistes sur l'origine moléculaire des altérations de l'unité motrice dans la DM1. Les résultats obtenus au cours de cette étude fait l'objet d'un article en cours de préparation (cf. p89)
# Résultats

## Article en préparation

### MBNL deficiency in spinal motor neurons compromises neuromuscular junction maintenance and walking coordination: involvement for Myotonic Dystrophy

Charles Frison-Roche<fnref n="1" />, Steve Cottin<fnref n="1" />, Jeanne Lainè<fnref n="1" />, Ludovic Arandel<fnref n="1" />, Marius Halliez<fnref n="1" />, Mégane Lemaitre<fnref n="2" />, Xavière Lornage<fnref n="1" />, Laure Strochlic<fnref n="1" />, Maurice S. Swanson<fnref n="3" />, Julien Messéant<fnref n="1" />, Denis Furling<fnref n="1" />*, Frédérique Rau<fnref n="1" />*

Keywords: DM1, Myotonic Dystrophy, MBNL, Neuromuscular junction, motor neurons, RNA splicing

## Abstract

Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a neuromuscular disease caused by the expression of CTG repeat expansions in the 3'UTR of the *DMPK* gene. Subsequent mutant transcripts, containing expanded CUG repeats, aggregate as ribonuclear inclusions that sequester Muscleblind-like (MBNL) RNA-binding proteins, impairing their functions in various tissues. RNA metabolism abnormalities observed in affected DM1 tissues are mainly attributable to MBNL family loss-of-function, however, MBNL proteins involvement in the spinal cord and the connected peripheral nervous system is poorly investigated. To address this question, we generated a conditional mouse model invalidated for *Mbnl1* and *Mbnl2* in MN (dKO). dKO mice develop progressive motor abnormalities and exhibit neuromuscular junction (NMJ) maintenance deficiencies. Transcriptome analysis reveals numerous RNA splicing alterations in the spinal cord, indicative of MBNL1 and MBNL2 involvement in synaptic transmission at the NMJ. Our findings highlight the contribution of the motor unit to DM1 pathogenesis.

<footnote n="1">¹Sorbonne Université, Inserm, Institut de Myologie, Centre de Recherche en Myologie, Paris, France;</footnote>

<footnote n="2">²Sorbonne Université, UMS28, Phénotypage du Petit Animal, Paris, France</footnote>

<footnote n="3">³Department of Molecular Genetics and Microbiology, Center for NeuroGenetics and the Genetics Institute, University of Florida, College of Medicine, Gainesville, FL 32610, USA</footnote>

<footnote>*Correspondence should be addressed to D.F. (denis.furling@sorbonne-universite.fr) or F.R. (frederique.rau@sorbonne-universite.fr)</footnote>