# Sans témoin positif, pas de preuve : révéler et intégrer la vraie réponse biologique des bioessais in vitro

Iris Barjhoux, Aurore Huré, Damien Rioult, B Marie, Emilie Lance

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## To cite this version:

Iris Barjhoux, Aurore Huré, Damien Rioult, B Marie, Emilie Lance. Sans témoin positif, pas de preuve : révéler et intégrer la vraie réponse biologique des bioessais in vitro. Assemblée générale de l'UMR-I-02 SEBIO, Jul 2025, Reims, France. hal-05184920

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Submitted on 24 Jul 2025

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# Sans témoin positif, pas de preuve : révéler et intégrer la
vraie réponse biologique des bioessais in vitro

I. Barjhoux¹, A. Huré¹, D. Rioult¹,², B. Marie³, E. Lance¹

¹ Université de Reims Champagne-Ardenne, Université Le Havre Normandie, INERIS, Normandie Univ, UMR-102 SEBIO, BP 1039, 51 687 Reims Cedex 2, France

² Université de Reims Champagne Ardenne, URCATech, MOBICYTE, BP 1039, 51 687 Reims Cedex 2, France

³ UMR 7245 MNHN/CNRS Molécules de Communication et Adaptation des Micro-organismes (MCAM), Cyanobactéries, Cyanotoxines et Environnement (CCE), MNHN, Paris, France

## Contexte

* Evaluation de la toxicité doit reposer sur une approche plurispécifique et multi-marqueurs[1]

* Compilation des informations par approches Weight-of-evidence (WoE) quantitatives recommandée[2, 3]

* Intérêt des bioessais *in vitro* comme NAMs (principe 3R)[4]

* Bioessais *in vitro* sur espèces autochtones pour augmenter la pertinence environnementale

* Témoins positifs (T+) recommandés dans les tests standardisés (ex.[5]) mais rarement appliqués hors contexte réglementaire

**Bibliographie** : [1] Lillicrap et al. 2016, doi: 10.1002/etc.3603. [2] Santos et al. 2021, doi: 10.1016/j.ecolind.2020.107030. [3] Burton et al. 2002, doi: 10.1080/20028091057547. [4] Lee et al. 2024, doi: 10.1016/j.envint.2024.109112. [5] OECD 2021, doi: 10.1787/c66d5190-en. [6] Piva et al. 2011, doi: 10.1016/j.chemosphere.2010.12.064. [7] Barjhoux et al. 2018, doi: 10.1007/s11356-016-6993-6.

**Hypothèse** : l'inclusion des T+ dans le process d'intégration de données affine le diagnostic en établissant un « 100% de réponse » pour chaque paramètre

* Modification de la méthode initiale par Piva et al.[6] modifiée par Barjhoux et al.[7] :

✓ Valeur d'effet E(i) = %Variation par rapport. Témoin négatif (T-) → Norm.0% (T-) – 100%(T+)

✓ Intensité de dépassement seuil T- donne classe toxicité → classes toxicité réparties entre seuil T et seuil T+

* Application dans une approche Effect Directed Analysis (EDA) sur 18 extraits de souches de cyanobactéries (ANR MC-Tox)

## Protocole expérimental

* Bioessais *in vitro* sur lignées cellulaires de poissons dulcicoles (RTL-W1, CLC)

* Expositions à **18 extraits** méthanoliques de souches de cyanobactéries pendant **24h** et **48h**

* Extraits (S1 à S18) répartis sur 3 séries de tests (6 extraits par test)

* 3 répétitions de tests (réplicats « expérimentaux » ; N = 3 ; Repl_Exp = moy(Repl_Tech))

* Mesure de la cytotoxicité et de la croissance cellulaire par cytométrie en flux

* Design expérimental :

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Doses-réponses 3,4-DCA
(RTL-W1, CLC à 24h et 48h)

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*3,4-DCA : 3,4-Dichloroaniline, témoin positif pour mortalité cellulaire recommandé par l'OCDE LD No. 249 Toxicité aiguë sur lignée cellulaire de poisson RTgill-W1

## Détermination des seuils

* Sens de variation d'intérêt : ➡ pour et ➡ pour

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* Pour chaque réponse, étude des distributions Repl_Tech pour chaque lignée et temps

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<table><thead><tr><th>Condition</th><th>Test</th><th>Moy.</th><th>SD</th><th>Méd.</th><th>P1th</th><th>P99th</th><th>Min</th><th>Max</th></tr></thead><tbody><tr><td>T-MeOH</td><td>CLC_24h</td><td>2.91%</td><td>1.43%</td><td>2.44%</td><td>1.79%</td><td>7.32%</td><td>1.77%</td><td>7.47%</td></tr><tr><td>T-MeOH</td><td>CLC_48h</td><td>1.84%</td><td>0.71%</td><td>1.68%</td><td>0.96%</td><td>3.89%</td><td>0.91%</td><td>4.11%</td></tr><tr><td>T-MeOH</td><td>RTL_24h</td><td>4.92%</td><td>2.11%</td><td>4.63%</td><td>2.84%</td><td>10.8%</td><td>2.80%</td><td>11.7%</td></tr><tr><td>T-MeOH</td><td>RTL_48h</td><td>6.23%</td><td>1.79%</td><td>6.07%</td><td>4.03%</td><td>11.0%</td><td>4.02%</td><td>11.6%</td></tr><tr><td>3,4-DCA</td><td>CLC_24h</td><td>79.0%</td><td>3.06%</td><td>79.5%</td><td>71.9%</td><td>84.3%</td><td>70.9%</td><td>84.5%</td></tr><tr><td>3,4-DCA</td><td>CLC_48h</td><td>63.2%</td><td>5.56%</td><td>63.2%</td><td>54.4%</td><td>75.1%</td><td>54.3%</td><td>75.5%</td></tr><tr><td>3,4-DCA</td><td>RTL_24h</td><td>89.2%</td><td>5.98%</td><td>88.8%</td><td>75.9%</td><td>97.1%</td><td>75.6%</td><td>97.2%</td></tr><tr><td>3,4-DCA</td><td>RTL_48h</td><td>89.5%</td><td>4.48%</td><td>89.6%</td><td>81.1%</td><td>96.6%</td><td>80.7%</td><td>96.9%</td></tr></tbody></table>

* Distributions **groupées** et **bornées**

* Mortalité basale RTL-W1 > CLC

* Réponse 3,4-DCA RTL-W1 > CLC

* Réponse 3,4-DCA plus faible CLC_48h

* RTL-W1 24h < 48h vs. CLC 48h < 24h

* Seuils $Th_{A-L}$ et $Th_{M-S}$ **cohérents**

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* Distributions étalées et bornées (min)

* Chevauchement des percentiles

* Besoin d'améliorer la mesure et le T+

* Travail sur les Repl_Exp au lieu Repl_Tech :

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**Témoins perfectibles !**

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## Principaux résultats

Méthodes calculs seuils (mortalité)

* Classes toxicité identiques (98/108)

* Analyse des disparités :

<table><thead><tr><th>Test</th><th>Cond.</th><th>Moy.</th><th>Exp</th><th>Val</th><th>T- Val</th><th>T+ E(i)</th><th>Méth.1</th><th>Méth. 2</th><th>Méth. 3</th></tr></thead><tbody><tr><td>CLC_48h</td><td>S14</td><td>6.3%</td><td>2.1%</td><td>62.0%</td><td>7.09%</td><td>Léger</td><td>Modéré</td><td>Léger</td><td>Léger</td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S16</td><td>8.7%</td><td>2.1%</td><td>62.0%</td><td>11.01%</td><td>Léger</td><td>Modéré</td><td>Léger</td><td>Léger</td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>S13</td><td>24.5%</td><td>2.3%</td><td>80.3%</td><td>28.43%</td><td>Modéré</td><td>Majeur</td><td>Modéré</td><td>Modéré</td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S13</td><td>24.5%</td><td>1.5%</td><td>66.4%</td><td>35.47%</td><td>Modéré</td><td>Majeur</td><td>Majeur</td><td>Majeur</td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S17</td><td>18.0%</td><td>1.5%</td><td>66.4%</td><td>9.38%</td><td>Léger</td><td>Modéré</td><td>Léger</td><td>Léger</td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S8</td><td>11.9%</td><td>1.9%</td><td>61.3%</td><td>16.77%</td><td>Léger</td><td>Majeur</td><td>Modéré</td><td>Modéré</td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S10</td><td>11.1%</td><td>1.9%</td><td>61.3%</td><td>15.46%</td><td>Léger</td><td>Majeur</td><td>Modéré</td><td>Modéré</td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S12</td><td>10.1%</td><td>1.9%</td><td>61.3%</td><td>9.82%</td><td>Léger</td><td>Modéré</td><td>Léger</td><td>Léger</td></tr><tr><td>RTL_24h</td><td>S13</td><td>21.9%</td><td>4.6%</td><td>88.1%</td><td>20.73%</td><td>Léger</td><td>Modéré</td><td>Léger</td><td>Modéré</td></tr><tr><td>RTL_48h</td><td>S13</td><td>41.3%</td><td>6.3%</td><td>89.2%</td><td>42.28%</td><td>Modéré</td><td>Majeur</td><td>Majeur</td><td>Majeur</td></tr></tbody></table>

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Repl_Exp puis Moy(E(i)) vs. Moy(Repl_Exp)

* Comparaison que sur données mortalité

* Analyse des disparités (11/108 ; que CLC) :

<table><thead><tr><th>Test</th><th>Cond.</th><th>Rep_Exp</th><th>E(i)</th><th>Class_Tox</th><th>Moy<br>E(i)</th><th>Class_Tox</th><th>VS</th><th>Moy<br>Rep_Exp</th><th>E(i)</th><th>Class_Tox</th></tr></thead><tbody><tr><td>CLC_24h</td><td>S7</td><td>13.0%</td><td>13.8%</td><td>Léger</td><td>8.36%</td><td>Léger</td><td></td><td>9.13%</td><td>2.11%</td><td>Absent</td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>S7</td><td>10.0%</td><td>9.66%</td><td>Léger</td><td></td><td>Absent</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>S7</td><td>4.35%</td><td>1.65%</td><td>Absent</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>S9</td><td>15.6%</td><td>17.1%</td><td>Léger</td><td></td><td>Absent</td><td>9.26%</td><td>Léger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>S9</td><td>7.07%</td><td>5.86%</td><td>Absent</td><td></td><td>Absent</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>S9</td><td>5.89%</td><td>4.79%</td><td>Absent</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S17</td><td>38.2%</td><td>50.4%</td><td>Majeur</td><td>23.9%</td><td>Modéré</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S17</td><td>5.11%</td><td>5.56%</td><td>Léger</td><td></td><td>Modéré</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>S17</td><td>10.7%</td><td>15.8%</td><td>Léger</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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Intégration Repl_Exp reflète mieux la variabilité inter-test (si pas de variabilité, résultats identiques)

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## Intégration seuils vs. Scoring

* Moy(Rep_Exp), mortalité et croissance

* Classes toxicité identiques pour 12/21

* Analyse des disparités (ex.) :

<table><thead><tr><th>Test</th><th>Endpoint</th><th>Cond.</th><th>Th</th><th>ToxHQ<sub>index</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>RTL_24h</td><td>Mortalité cell.</td><td>S1</td><td>Absent</td><td></td></tr><tr><td>RTL_48h</td><td>Mortalité cell.</td><td>S1</td><td>Absent</td><td></td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>Croissance cell.</td><td>S1</td><td>Modéré</td><td>4.43%</td></tr><tr><td>CLC_24h</td><td>Mortalité cell.</td><td>S1</td><td>Absent</td><td></td></tr><tr><td>CLC_48h</td><td>Mortalité cell.</td><td>S1</td><td>Léger</td><td></td></tr></tbody></table>

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Scoring donne classe tox > intégration seuils
Refère **différentes intensités** d'effets observés
Introduction **principe de précaution** possible

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Classes tox. de méthode modifiée plus **cohérente** par rapport au **range de réponse**

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## Conclusions & Perspectives

* Application efficace dans le cadre d'une démarche EDA

* Référentiels à consolider avec données supplémentaires → référentiel externe

* Double enjeu des contrôles T+ et T- : critères de validité et grille d'interprétation des réponses (seules ou intégrées)

* T+ améliore l'intégration en fixant 100% de réponse → grille d'interprétation spécifique à chaque réponse et son [Min-Max]

* Intérêt d'intégrer les réplicats expérimentaux → prise en compte variabilité inter-test

* Méthodologie à valider avec jeu de données plus contrasté

* Croissance à améliorer → importance d'un T+ spécifique à la réponse mesurée

* A développer sur d'autres réponses de bioessais → renforcement évaluation toxicité

* Application aux **biomarqueurs** ?