KURZE MITTEILUNGEN

Bis am 20. des Monats bei der Redaktion eingehende kurze Mitteilungen werden in der Regel am 15. des folgenden Monats veröffentlicht
Es werden auch Manuskripte aus dem Auslande angenommen

Hydratationsenergie des NaCl-Ionenpaares*

Wenn man die Bedeutung der Hydratationsenergie des Ionenpaares<fnref n="1" /> kennt, kann man sich nur wundern, wie wenig Anstrengungen bisher unternommen wurden, sie zu bestimmen. Es überrascht aber noch mehr, daß sie oft bedenkenlos gleich Null gesetzt wurde.

Die elektrostatische Berechnung kann, in Anlehnung an die Berechnung von BERNAL und FOWLER<fnref n="2" /> für die freien Ionen, in fünf Teile geteilt werden:

$$
H_s^{MX} = \sum H_{e\mu} + \sum H_{\mu\mu} + \sum H_{rep} + H'_{diss} + \sum H_{w}
$$

1. Anziehung der Ionen auf die umliegenden Wasserdipole, H<sub>eµ</sub>. Die vorliegende Rechnung beschränkt sich auf die erste Schale, weil das Ionenpaar ja ebenfalls einen Dipol darstellt und die Dipol-Dipol-Energie mit der dritten Potenz des Abstandes abfällt. Hingegen wurde die Abstoßung zwischen einem Ion und den Solvatmolekülen des Partnerions berücksichtigt. Ebenso berücksichtigt wurde der induzierte Dipol.

$$
H_{e\mu} = -Ne\mu/a_{ij}^2 - \alpha e/a_{ij}^3.
$$

Dabei bedeuten N die Loschmidtsche Zahl, e eine Elementarladung, μ der Dipol eines Wassermoleküles, a<sub>ij</sub> der Kernabstand zwischen den Teilchen i und j, und a die Polarisierbarkeit der Wassermoleküle.

2. Die gegenseitige Abstoßung der Wassermoleküle der Hydratschale wurde nach einer Gleichung von BUCKINGHAM<fnref n="3" /> berechnet:

$$
H_{\mu\mu} = N\mu_i\mu_j (2 \cos \theta_1 \cos \theta_2 + \sin \theta_1 \sin \theta_2 \cos \zeta)/a_{ij}^3.
$$

Die Winkel θ₁, θ₂ und ζ bestimmen die räumliche Anordnung der Dipole zueinander.

3. Das Abstoßungspotential wurde wie üblich 12. Ordnung angenommen:

$$
H_{rep} = NB / a_{ij}^{12}.
$$

B ist eine Konstante.

4. Der Kernabstand zwischen dem Anion und dem Kation ist in der Gasphase kleiner als im Kristall. Da die Sublimationsenergie nahezu gleich der Solvatationsenergie des Ionenpaares ist, greifen in beiden Fällen gleich große Kräfte an der NaCl-Bindung an. Beim Übergang von der Gasphase in die Lösung muß sie gestreckt

werden. Die dazu notwendige Energie wurde mit einer Coulombschen Gleichung berechnet:

$$
H'_{diss} = (1/a_g - 1/a_k).
$$

a<sub>g</sub> ist der Kernabstand in der Gasphase, a<sub>k</sub> derjenige im Kristall.

5. Die Wassermoleküle müssen von der Struktur des umgebenden Wassergitters losgelöst werden. Die Verdampfungswärme von Wasser ist bei 20° 10,5 kcal/Mol. Die Wassermoleküle der Hydratschale werden sich jedoch in der Struktur des umgebenden Wassers so einfügen, daß dadurch ein Maximum an Energie gewonnen wird. Nehmen wir an, daß jedes Molekül der Hydratschale eine Wasserstoffbrücke wiederherstellt, so wird H<sub>w</sub> etwa 8 kcal/Mol. Die Resultate sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

<table><caption>Tabelle 1. Elektrostatisch berechnete Hydratationsenthalpie des NaCl-Ionenpaares</caption>
  <thead>
    <tr>
      <th>Koordinationszahl</th>
      <th>Kernabstand Å</th>
      <th>H<sub>s</sub><sup>MX</sup> kcal/Mol</th>
    </tr>
  </thead>
  <tbody>
    <tr>
      <td>2</td>
      <td>2,48</td>
      <td>-23,3</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4</td>
      <td>2,54</td>
      <td>-52,0</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6</td>
      <td>2,65</td>
      <td>-61,4</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>8</td>
      <td>2,70</td>
      <td>-78,8</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>10</td>
      <td>2,76</td>
      <td>-98,2</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>11</td>
      <td>5,52</td>
      <td>-88,1</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>n<sub>M</sub> + n<sub>X</sub></td>
      <td>∞</td>
      <td>-54,6</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

Von besonderem Intersse ist der Übergang vom inni-
gen zum lösungsmittelgetrennten Ionenpaar. Das elfte
Hydratmolekül muß sich zwischen die Ionen drängen.
Das Wasser ist jedoch kein Kontinuum, es kann nicht
zwischen die Ionen fließen und den Zwischenraum aus-
füllen. Zwischen den Ionen entsteht also anfänglich ein
Vakuum. Da die Dielektrizitätskonstante anfänglich
gleich 1 ist, muß für diesen ersten Schritt eine enorm
große Coulombsche Energie überwunden werden. Um
die beiden Ionen so weit zu trennen, daß ein Wassermole-
kül zwischen ihnen Platz findet, sind etwa 30 kcal/Mol
notwendig. Dies würde bedeuten, daß in Lösung nur
Ionenpaare vorhanden sein könnten, weil die Aktivie-
rungsenergie des Zerfalls so groß ist, daß dieser un-
wahrscheinlich wird. Freie Ionen kämen allenfalls im
Meerwasser vor; dieses würde sich daher anders verhal-
ten als eine im Labor hergestellte Lösung gleichen Ge-
haltes. Zweifellos existiert ein energetisch günstigerer
Mechanismus, der eine Aktivierungsenergie in einem
vernünftigen Rahmen erlaubt,

<footnote>* Vorläufige Mitteilung. Vorgetragen an der Sommerversammlung der Schweizerischen Chemischen Gesellschaft am 3. Oktober 1964 in Zürich.</footnote>

<footnote n="1">1 R. HÜMBELIN, *Electrochim. Acta* **9** (1964) 685.</footnote>

<footnote n="2">² J. D. BERNAL und R. H. FOWLER, *J. Chem. Physics* **1** (1933) 515.</footnote>

<footnote n="3">³ A. D. BUCKINGHAM, Quart. Rev. **13** (1959) 183.</footnote>
<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Abb. 1. Energiediagramm der Dissoziation in Lösung</figcaption></figure>

— elektrostatisch berechnet, — aus thermodynamischen Daten ab-
geschätzt. Die Werte beziehen sich auf das Ionenpaar in der Gas-
phase, so daß die Minima die Hydratationsenergien der Ionenpaare
darstellen. Beim Übergang vom innigen zum lösungsmittelgetrennten
Ionenpaar entsteht anfänglich zwischen den Ionen ein Vakuum (im
mittleren Modell schraffiert gezeichnet). Dadurch muß für diesen
Schritt eine große Coulombsche Energie, E<sub>a</sub>, aufgewendet werden

Bisher wurde das Lösungsmittel meistens als Konti-
nuum betrachtet und in der Folge angenommen, das
Ionenpaar könne gar nicht genau definiert werden, weil
der Übergang vom Ionenpaar zum freien Ion ein konti-
nuierlicher sei. Die Lösungsmittelmoleküle sind jedoch
meistens größer als die Ionen, so daß, wie immer auch
der Mechanismus sei, bei der Dissoziation eine größere
oder kleinere Energiebarriere überwunden werden muß.
Diese molekulartheoretische Betrachtungsweise zeigt,
daß das innige Ionenpaar ein relativ beständiger und
gut definierbarer Körper ist. Erst dadurch wird eine
thermodynamische Bestimmung der Hydratationsener-
gie des Ionenpaares sinnvoll.

In einer gesättigten Lösung muß die Aktivität auf
beiden Seiten der Kristalloberfläche gleich sein:

$(MX_s) = (MX_{krist}).$

Der absolute Aktivitätskoeffizient¹ des Ionenpaares muß entsprechend der Definition von G. N. LEWIS<fnref n="4" /> eine Funk-

tion der freien (oder Gibbs-) Energie der Solvatation
des Ionenpaares, G<sub>s</sub><sup>MX</sup>, sein:

$$
\ln f_{MX_s} = - G_s^{MX} / RT.
$$

Analog ist der absolute Aktivitätskoeffizient der Salz-
moleküle im Kristall eine Funktion der freien Sublima-
tionsenergie des Monomeren, G<sub>subl</sub><sup>MX</sup>:

$$
\ln f_{krist} = - G_{subl}^{MX} / RT.
$$

Aus diesen drei Gleichungen ergibt sich sofort eine expli-
zite Gleichung für die freie Solvatomationsenergie:

$$
G_s^{MX} = G_{subl}^{MX} + RT \ln [MX_s] / [MX_{krist}],
$$

welche in einer handlicheren Form lautet:

$$
G_s^{MX} = G_{subl}^{MX} + RT \ln c_s Md_s / d_k (c_s M + 1000),
$$

wobei c₈ die Sättigungskonzentration des Salzes in Mol
pro 1000 g Lösungsmittel, M sein Molekulargewicht,
d₈ die Dichte der gesättigten Lösung und dₖ die Dichte
des Kristalls ist. Die letzten Gleichungen gelten natür-
lich nur, wenn die gesättigte Lösung vollständig gepaart
ist. Allerdings bewirkt ein Dissoziationsgrad von 90%
nur eine Änderung von 1,3 kcal/Mol.

Wenn die Temperaturabhängigkeit der Löslichkeit be-
kannt ist, kann auch die Enthalpie der Solvatation des
Ionenpaares berechnet werden:

$$
\begin{align*}
H_s^{MX} &= G_s^{MX} - \partial G_s^{MX} / \partial T \\
&= H_{subl}^{MX} - RT^2 \partial (\ln[MX_s]) / \partial T.
\end{align*}
$$

Zum Vergleich kann die Solvatomationsenthalpie aus der
Lösungswärme *L* unter Annahme vollständiger Assozia-
tion berechnet werden:

$$
H_s^{MX} = H_{subl}^{MX} - L.
$$

<table><caption>Tabelle 2. Hydratationsenergie des NaCl-Ionenpaares</caption>
  <tr>
    <td>G<sub>s</sub><sup>NaCl</sup></td>
    <td>-45,7 kcal/Mol</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>H<sub>s</sub><sup>NaCl</sup> aus Löslichkeit</td>
    <td>-54,0 kcal/Mol</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>H<sub>s</sub><sup>NaCl</sup> aus Lösungswärme</td>
    <td>-55,2 kcal/Mol</td>
  </tr>
</table>

Diese beiden Methoden zur Berechnung der Enthalpie
hängen in ganz verschiedener Weise von vereinfachen-
den Annahmen ab. Die gute Übereinstimmung in Ta-
belle 2 darf wohl als Rechtfertigung dieser Annahmen
gelten. Die thermodynamisch ermittelten Werte liegen
etwa 43 kcal/Mol höher als der elektrostatische. Es läßt
sich aber leicht zeigen, daß der wahre Wert nicht viel
niedriger sein kann als der thermodynamische. Wählt
man für die Hydratmoleküle die Verdampfungsentropie
von Eis und für das sogenannte freie Wasser die be-
kannte Entropie von Wasser, so wird die freie Energie
nach der elektrostatischen Berechnung noch größer als

<footnote n="4">⁴ G. N. LEWIS, Z. Physik. Chem. 61 (1907/08) 129.</footnote>
die Enthalpie. Berechnet man mit diesem Wert die freie Energie der Dissoziation in Lösung:

$$G_{\text{diss}}^{\text{s}} = G_{\text{diss}}^{\text{g}} - G_{\text{s}}^{\text{M}} - G_{\text{s}}^{\text{X}} + G_{\text{s}}^{\text{MX}},$$

die freie Energie der Dissoziation in der Gasphase, $G_{\text{diss}}^{\text{g}}$, und die freien Energien der Hydratation der beiden Ionen, $G_{\text{s}}^{\text{M}}$ und $G_{\text{s}}^{\text{X}}$, sind bekannt<fnref n="5" />,<fnref n="6" />, und daraus die Gleichgewichtskonstante:

$$\ln K = G_{\text{diss}}^{\text{s}} / RT,$$

so findet man, daß Kochsalz in Lösung vollständig assoziiert sein müßte. In diesem Fall gelten aber die für die thermodynamische Rechnung verwendeten Gleichungen. Dieser Widerspruch tritt nur dann nicht auf, wenn der wahre Wert nicht viel unter dem thermodynamischen liegt. Anderseits zeigt die elektrostatische Berechnung, so ungenau sie auch sein mag, daß der wahre Wert auch nicht höher sein kann als der thermodynamische, so daß dieser, mit einer Fehlergrenze von ± 2 kcal/Mol, als verbindlich betrachtet werden darf.

R. HÜMBELIN

Sandoz AG, Basel

# Recherches préliminaires sur la structure de la partie glucidique des caséino-glycopeptides*

## Résumé

Quelques expériences préliminaires concernant le groupe ment prosthétique glucidique des caséino-glycopeptides sont décrites: l'acide sialique et le galactose occupent une position «externe» par rapport à la galactosamine sans doute liée à la partie peptidique.

La caséine entière de vache privée de sa fraction $\chi$ est pratiquement dépourvue de sucres<fnref n="1" />. Ce fait suggère que probablement tous les sucres se trouvent localisés dans la caséine $\chi$ qui est la seule fraction glycoprotéique importante de la caséine. Sous l'effet de la pré pressure, à pH 6,8, même en absence d'ions Ca, la caséine $\chi$ donne naissance à deux fractions: l'une, insoluble, appelée paracaséine $\chi$; l'autre, très soluble, appelée «caséino-glycopeptide $\chi$».<fnref n="2" /> Rappelons que la pré pressure agit sur la seule fraction $\chi$ de la caséine entière, qui est ainsi le véritable substrat de l'enzyme<fnref n="3" />. Le caséino-glycopeptide $\chi$ contient la majeure partie des sucres de la caséine, à savoir, du galactose, de la galactosamine et de l'acide neuraminique; le caséino-glycopeptide est donc la fraction glucidique la plus importante de la caséine<fnref n="4" />. L'étude de son groupement prosthétique glucidique peut être abordée en travaillant soit avec la caséine soit avec le caséino-glycopeptide: quelques expériences préliminaires ont été effectuées en faisant appel à des méthodes chimiques (action de H₂SO₄ 0,1 N; action de l'acide périodique) ou à une méthode enzymatique (action de la neuraminidase).

## Composition en sucres des CGP

Le tableau 1 indique la composition en sucres des caséino-glycopeptides (CGP) de vache (provenant de la

caséine $\chi$), de brebis (provenant de la caséine entière) et de chèvre (provenant de la caséine entière): les rapports moléculaires ont été calculés en admettant que les poids moléculaires des CGP sont de l'ordre de 8000. Les CGP de brebis et de chèvre contiennent un mélange des acides N-acétyl- et N-glycolyl-neuraminiques.

<table><caption>Tableau 1. Composition en sucres de trois caséino-glycopeptides en % de substance sèche; $r$ = rapport moléculaire calculé en fixant le poids moléculaire des CGP égal à 8000</caption><thead><tr><th rowspan="2">Caséino-glycopeptide</th><th colspan="2">Galactosamine*</th><th colspan="2">Galactose**</th><th colspan="2">Acide sialique***</th></tr><tr><th>%</th><th>r</th><th>%</th><th>r</th><th>%</th><th>r</th></tr></thead><tbody><tr><td>CGP $\chi$ de vache</td><td>6,5</td><td>2,9</td><td>6,0</td><td>2,7</td><td>10,2</td><td>2,8</td></tr><tr><td>CGP de brebis</td><td>2,4</td><td>1,0</td><td>2,1</td><td>0,9</td><td>1,0</td><td>0,3</td></tr><tr><td>CGP de chèvre</td><td>3,4</td><td>1,5</td><td>3,6</td><td>1,6</td><td>2,8</td><td>0,7</td></tr></tbody></table>

## Action de la neuraminidase sur la caséine $\chi$ et les CGP

Lorsque l'on fait agir la neuraminidase de V. cholerae, à pH 6 (solution tampon de phosphates 0,03 M) pendant 3 heures à 37°, sur une solution à 1% de caséine $\chi$ de vache ou de l'un des trois CGP mentionnés dans le tableau 1, la totalité des acides neuraminiques est libérée: l'acide neuraminique occupe donc une position terminale.

### Action du périodate de K sur la caséine $\chi$

A une solution à 1% de caséine $\chi$ de vache dans une solution tampon de phosphates 0,05 M; pH 7; contenant

<footnote n="5">⁵ R. HÜMBELIN, in Vorbereitung.</footnote>

<footnote n="6">⁶ L. BENJAMIN und V. GOLD, *Trans. Faraday Soc.* 50 (1954) 797.</footnote>

<footnote>* Selon RONDLE et MORGAN⁵.</footnote>

<footnote>** Selon SCHULTZE et coll.⁶</footnote>

<footnote>*** Exprimé en acide N-acétylneuraminique (PM 309), dosage selon WARREN après hydrolyse acide⁷.</footnote>

<footnote>* Reçu le 10 octobre 1964.</footnote>

<footnote n="1">¹ C. ALAIS, Thèse Sci., Paris 1962; C. ALAIS et P. JOLLÈS, *Lait* 44 (1964) 138.</footnote>

<footnote n="2">² P. JOLLÈS, C. ALAIS et J. JOLLÈS, *Biochim. Biophys. Acta* 51 (1961) 309.</footnote>

<footnote n="3">³ D. F. WAUGH et P. H. VON HIPPEL, *J. Amer. Chem. Soc.* 78 (1956) 4576.</footnote>

<footnote n="4">⁴ C. ALAIS et P. JOLLÈS, *Biochim. Biophys. Acta* 51 (1961) 315.</footnote>

<footnote n="5">⁵ C. J. RONDLE et W. T. J. MORGAN, *Biochem. J.* 61 (1955) 586.</footnote>

<footnote n="6">⁶ H. E. SCHULTZE, R. SCHMIEDTBERGER et R. HAUPT, *Biochem. Z.* 329 (1958) 490.</footnote>

<footnote n="7">⁷ L. WARREN, *J. Biol. Chem.* 234 (1959) 1971.</footnote>
du KCl (0,15 M), on ajoute du périodate de K (35 mg KIO₄ pour 100 mg de caséine x); 80% de l'acide sialique sont détruits en 30 minutes à température ordinaire; par contre, les teneurs en galactose et en galactosamine demeurent constantes.

### Action de la neuraminidase suivie de celle du périodate de K sur la caséine x

On fait agir cette fois le périodate de K sur une solution de caséine x préalablement incubée avec de la neuraminidase, donc privée de l'acide sialique terminal. Après 30 minutes à température ordinaire, 40% de galactose ont disparu: par contre, la teneur en galactosamine demeure constante. Il semble donc que ce soit le galactose qui après le départ de l'acide sialique occupe une position «externe».

### Action de l'acide sulfurique 0,1 N sur les CGP

Les CGP de vache (x), de brebis et de chèvre sont hydrolysés pendant 6 heures à 100° avec H₂SO₄ 0,1 N<fnref n="8" />,<fnref n="9" />. L'hydrolysat est dessalifié puis chromatographié sur papier Whatman n° 1 dans le solvant n-butanol-acide acétique-eau (4 : 1 : 5, v/v). Deux substances ont pu être identifiées avec le réactif à l'oxalate d'aniline: le galactose libre (très abondant) et une substance peu abondante de R<sub>GleNH₂</sub> = 0,82. Il n'a pas été possible de caractériser de la galactosamine libre.

D'autre part, la substance de R<sub>f</sub> = 0 a été éluée du papier puis analysée. Elle contient de nombreux acides aminés et de la galactosamine (liée aux acides aminés); par contre, il n'a pas été possible de déceler la présence de galactose. Ces expériences montrent que c'est le galactose qui, après la destruction de l'acide sialique, occupe une position «externe»; par contre, c'est la

galactosamine qui semble être directement liée à la partie peptidique.

### Conclusion

La labilité particulière des acides sialiques et du galactose permet de placer ces composés en position «externe» par rapport à la galactosamine plus «interne». Ces trois glucides se trouvent en proportions équimoléculaires dans le CGP de vache. Dans les deux autres CGP, la galactosamine et le galactose se trouvent en proportions équimoléculaires, par contre, les résultats du dosage des acides sialiques indiquent qu'il y a 2 à 3 fois moins de résidus de ces composants; mais il s'agit de substances particulièrement labiles: le dosage, dans des matières qui en contiennent très peu, manque de précision.

Des recherches ultérieures devront déterminer si le groupement prosthétique du CGP de vache est formé par trois enchaînements identiques:

Acides aminés → Gal<sub>NH₂</sub> → Gal
→ Acide N-acétylneuraminique

ou par une seule chaîne contenant les 9 résidus glucidiques groupés 3 par 3. La nature de la liaison entre la partie peptidique et la galactosamine qui, d'après nos expériences, ne semble pas être du type ester, est également en cours d'étude.

En ce qui concerne les CGP de brebis et de chèvre, de nouvelles déterminations des composants glucidiques seront faites afin de préciser les rapports moléculaires.

Ce travail a bénéficié en partie d'une subvention du U.S. Department of Agriculture (grant FG-Fr-112).

PIERRE JOLLÈS, CHARLES ALAIS, ARLETTE ADAM, ANTOINE DELFOUR et JACQUELINE JOLLÈS

Laboratoire de Chimie biologique de la Faculté des Sciences, 96, Boulevard Raspail, Paris VIe et Institut de Biochimie, Faculté des Sciences, Orsay (Seine et Oise)

## Enol- und Inoläther-Additionen an 2-Acetyl-1,4-benzochinon*

Chinone, die mit elektronenziehenden Gruppen substituiert sind, addieren unter mildesten Bedingungen anionoide Moleküle. Besonders wertvoll sind die Reaktionen dann, wenn sie zu einer neuen C-C-Verknüpfung führen. Von solchen Reaktionen beschrieben wir bisher Umsetzungen mit Furanen sowie mit 3,4-Dimethoxythiophen und Acetessigester<fnref n="1" />. In der vorliegenden, vorläufigen Mitteilung seien erste Resultate aus Untersuchungen über die Additionsfähigkeit von Enoläthern an Acetylbenzochinon mitgeteilt (siehe Formelschema).

Löst man Acetylbenzochinon (I) in überschüssigem, reinem Äthylvinyläther, so tritt eine exotherme Reaktion ein. Das entstandene Acetal (II), (C₁₂H₁₄O₄), kann aus der Reaktionslösung durch Vakuumdestillation isoliert werden, doch ist es einfacher, die Reinigung mit der Spaltung zum Halbacetal (III), (C₁₀H₁₀O₄), durch Chromatographie an Kieselgel zu kombinieren. Letzteres ist gelb, kristallisiert (F = 135°), es reduziert Tollens-Reagens in der Kälte momentan und färbt die Epidermis stark gelb.

In gleicher Weise setzt sich Äthoxyacetylen mit (I) um. Das entstandene kristallisierte, gelbe Acetal (IV),

<footnote n="8">⁸ J. MONTREUIL et A. CHOSSON, C. R. Acad. Sci. 255 (1962) 3071.</footnote>

<footnote n="9">⁹ J. MONTREUIL, G. SPIK et A. CHOSSON, C. R. Acad. Sci. 255 (1962) 3493.</footnote>

<footnote>* Eingegangen am 14. Oktober 1964.</footnote>

<footnote n="1">¹ C. H. EUGSTER und P. BOSSHARD, *Chimia* 15 (1961) 528, 16 (1962) 45; *Angew. Chem.* 1963, 102; *Helv. Chim. Acta* 46 (1963) 815; C. H. EUGSTER und R. GOOD, *Chimia* 16 (1962) 343; P. BOSSHARD, S. FUMAGALLI, R. GOOD, W. TRUEB, W. V. PHILIPSBORN und C. H. EUGSTER, *Helv. Chim. Acta* 47 (1964) 769.</footnote>
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

(C₁₂H₁₂O₄), (F = 120 bis 121°), ist wesentlich hydrolysebeständiger als das Acetal (II), obwohl es formal ein Ketenacetal darstellt. Chromatographie an Kieselgel oder Behandlung mit verdünnter Salzsäure oder Schwefelsäure führen zu keiner Ätherspaltung, hingegen erfolgt diese leicht durch Kochen mit Essigsäure-Acetat-Puffer in Äthanol-Wasser<fnref n="2" />. Die Hydrolyse dürfte über eine säurekatalysierte, nucleophile Additionsreaktion, eventuell mit intermediärer Ringöffnung, ablaufen. Das gelbe 4-Acetyl-5-hydroxy-cumaranon-(2) (V), (C₁₀H₈O₄,

F = 186 bis 186,5°), liegt nach IR-, UV- sowie NMR-Spektren (siehe Tabellen 1, 2, 3) in der Form des Lactons vor. Besonders charakteristisch ist seine hohe Carbonyl-frequenz (1808 cm⁻¹ in Chloroform), wie sie auch bei andern γ-Enollactonen gefunden worden ist.

Die Kondensation von Acetylbenzochinon mit reinem, frisch destilliertem 4-Methoxy-buten(3)-in-(1) erfolgt gleichfalls unter erheblicher Wärmeentwicklung. Aus dem Reaktionsgemisch haben wir bisher zwei kristallisierte, isomere Produkte (C₁₃H₁₂O₄, A, F = 125°, B, F = 128°) isoliert, von denen A die Struktur (VI) besitzt. Demnach hat sich der aktivierende Einfluß der Methoxygruppe über die Acetylenbindung hinaus erstreckt. Die Zuordnung der cis-Konfiguration an der Doppelbindung in der Seitenkette stützt sich auf das

<footnote n="2">² S. M. McELVAIN und E. L. ENGELHARDT, J. Amer. Chem. Soc. 66 (1944) 1077, haben ähnliche Resistenz an 2-Äthoxy-5-hydroxybenzofuran (Kondensationsprodukt aus Benzo-1,4-chinon und Ketenacetal) festgestellt.</footnote>
NMR-Spektrum (siehe Tabelle 3). Überraschend leicht addieren auch zyklische Enoläther an (I). Bisher wurden 2,3-Dihydropyran und 2,3-Dihydrofuran eingesetzt. In ersterem Fall entsteht durch einfaches Stehenlassen der Komponenten die Verbindung (VII), (C₁₃H₁₄O₄, gelbe Prismen, F = 76 bis 77°), im zweiten Fall analog die Verbindung (IX), (C₁₂H₁₂O₄, goldgelbe Prismen, F = 125 bis 126°). Beim Arbeiten mit Benzol als Lösungsmittel konnte ein Zwischenprodukt (VIII) isoliert werden. Es

ist dunkler gelb, schwerlöslich in Benzol, Äther, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff. (Die Produkte VII und IX sind darin viel leichter löslich.) VIII besitzt die Summenformel C₁₂H₁₄O₅ (F = 156 bis 157°), reduziert Tollens-Reagens momentan und läßt sich durch Stehenlassen in Eisessig in nahezu quantitativer Ausbeute in IX überführen, womit seine Struktur gesichert ist. In der Folge haben wir solche Kondensationen meist in Eisessig als Lösungsmittel durchgeführt.

<caption>Tabelle 1. UV-Spektren</caption>

Lösungsmittel: Äthanol 95%

<table><caption>Tabelle 2. IR-Spektren</caption><thead><tr><th>Verbindung</th><th>λ<sub>max</sub> (log ε<sub>max</sub>)</th><th></th><th></th><th>λ<sub>min</sub> (log ε<sub>min</sub>)</th><th></th><th></th></tr></thead><tbody><tr><td>III</td><td>232 (4,12)</td><td>256 (3,85)</td><td>369 (3,55)</td><td></td><td>251 (3,83)</td><td>284 (2,33)</td></tr><tr><td>IV</td><td>230 (4,15)</td><td>302 (4,02)</td><td>368 (3,82)</td><td></td><td>258 (&lt; 2,0)</td><td>332 (3,46)</td></tr><tr><td>V</td><td>234 (4,12)</td><td>~250 (3,9)</td><td>351 (3,54)</td><td></td><td>278 (&lt; 2,0)</td><td></td></tr><tr><td>VI</td><td>254 (4,14)</td><td>317 (4,18)</td><td>379 (4,13)</td><td>225 (3,84)</td><td>265 (3,88)</td><td>344 (3,76)</td></tr><tr><td>VII</td><td>234 (4,10)</td><td>257 (3,81)</td><td>374 (3,52)</td><td>253 (3,79)</td><td>282 (2,02)</td><td></td></tr><tr><td>IX</td><td>232 (3,96)</td><td>~255 (3,6)</td><td>358 (3,46)</td><td>284 (&lt; 2,0)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

(Auswahl wichtiger Banden)

<table><caption>Tabelle 3. NMR-Spektren</caption><thead><tr><th>Verbindung</th><th>Banden (cm<sup>-1</sup>)</th><th>Lösungsmittel</th></tr></thead><tbody><tr><td>III</td><td>3623, 3333 (Halbacetal-OH), 1639 (CO geb.), 1370 (COCH<sub>3</sub>)</td><td>CHCl<sub>3</sub></td></tr><tr><td>IV</td><td>1637 (CO geb.), 1592, 1481 (Benzofuran), 1379 (COCH<sub>3</sub>)</td><td>CCl<sub>4</sub></td></tr><tr><td>V</td><td>1808 (Cumaranon), 1645 (CO geb.), 1366 (COCH<sub>3</sub>)</td><td>CHCl<sub>3</sub></td></tr><tr><td>VI</td><td>1661 (Doppelbindung), 1639 (CO geb.), 1592, 1563, 1488 (Benzofuran), ~1372 (COCH<sub>3</sub>)</td><td>CCl<sub>4</sub></td></tr><tr><td>VII</td><td>1645 (CO geb.), 1368 (COCH<sub>3</sub>)</td><td>CCl<sub>4</sub></td></tr><tr><td>VIII</td><td>3610, 3289 (OH), 1653 (CO geb.)</td><td>KBr</td></tr><tr><td>IX</td><td>1639 (CO geb.), 1366 (COCH<sub>3</sub>)</td><td>CCl<sub>4</sub></td></tr></tbody></table>

(Auswahl von Signalen)

Angaben in Hz (gemessen am Varian-A-60-MHz-Spektrometer), Koppelungskonstanten sind in Klammern angegeben

<table><thead><tr><th>Verbindung</th><th>COCH<sub>3</sub><br>s</th><th>OH<br>s</th><th>Ar-H</th><th>Weitere wichtige Signale</th><th>Lösungsmittel</th></tr></thead><tbody><tr><td>III</td><td>158</td><td></td><td>402 (9), d, H-6<br>418 (9), d, H-7</td><td>365, m, H-2</td><td>CD<sub>3</sub>COCO<sub>3</sub></td></tr><tr><td>IV</td><td>158</td><td>767</td><td>397 (9), d, H-6<br>440 (9), d, H-7</td><td>338, s, H-3</td><td>CDCl<sub>3</sub></td></tr><tr><td>V</td><td>169</td><td></td><td>431 (9), d, H-6<br>450 (9), d, H-7</td><td>260, s, H<sub>2</sub>-3</td><td>CF<sub>3</sub>COOH</td></tr><tr><td>VI</td><td>163</td><td>778</td><td>406 (9), d, H-6<br>448 (9), d, H-7</td><td>233, s, H<sub>3</sub>-(OCH<sub>3</sub>)<br>420, s, H-3; 324 (6), d, H-a; 382 (6), d, H-b</td><td>CDCl<sub>3</sub></td></tr><tr><td>VII</td><td>154</td><td>700</td><td>397 (9), d, H-7<br>412 (9), d, H-8</td><td>192, m, H-4a<br>338 (5), d, H-9a</td><td>CCl<sub>4</sub></td></tr><tr><td>IX</td><td>163</td><td></td><td>408 (9), d, H-6<br>421 (9), d, H-7</td><td>383 (6), d, H-8a</td><td>CDCl<sub>3</sub></td></tr></tbody></table>
Einzelne Signale im NMR und deren Werte sind der Tabelle 3 zu entnehmen. Ihre eingehende Besprechung erfolgt später in der ausführlichen Arbeit. Hervorzuheben sind hier vor allem die Koppelung von H-3 und H-7 in der Verbindung IV und V sowie die abnormal tiefe Lage des Acetalprotons an C-9a bzw. C-8a der Verbindungen VII bzw. IX, worauf bereits BARTON *et al.*<fnref n="3" /> hingewiesen haben.

Bemerkungen: Vorstehende Beispiele belegen erneut die Leichtigkeit, mit der Acylchinone mit den verschiedenen Substraten in Reaktion treten können. Hervorzuheben sind die zum Teil recht guten Ausbeuten (z. B. bei IX 60 bis 65% der Theorie an chromatographiertem und umkristallisiertem Produkt), die den präparativen Aspekt dieser Reaktionen betonen. Der neue Weg eröffnet einen unmittelbaren Zugang zu funktionell substituierten und auf andere Art und Weise wohl nur schwer zugänglichen Benzofuranderivaten. Die beiden zyklischen Verbindungen VII (5-Acetyl-6-hydroxy-tetrahydro-benzofuro [2,3-b]-pyran) und IX (4-Acetyl-5-

hydroxy-tetra-hydro-furo [2,3-b]-benzofuran) scheinen unseres Wissens die ersten synthetisch zugänglichen Verreter dieser interessanten Ringsysteme zu sein. In dehydrierter Form ist das Furo [2,3-b]-furan-System seit kurzem in Naturprodukten (z. B. in Clerodin<fnref n="3" />, Sterigmatocystin<fnref n="4" /> sowie in den Aflatoxinen<fnref n="5" />) festgestellt und zum Teil durch Hydrierung in das vorliegende System übergeführt worden. Wir selbst haben es in einem Umwandlungsprodukt von Coleon A festgestellt<fnref n="6" />.

Weitere Arbeiten über Additionsreaktionen an Acylchinonen sind bei uns im Gange. Die ausführliche Mitteilung wird in *Helv. Chim. Acta* publiziert werden.

Wir danken dem Schweizerischen Nationalfonds (Gesuch Nr. 2378) für die finanzielle Unterstützung der Arbeiten an Acylchinonen.

C. H. EUGSTER und P. KUSER

Organisch-Chemisches Institut der Universität Zürich

# Dünnschichtchromatographische Untersuchung von Imipramin

## Summary

Thin layer chromatography applied to commercial imipramine (Tofranil®) demonstrates the presence of less than 0.2% impurity.

These impurities consist of eight compounds. The concentration of no single entity exceeds 0.05%.

Highly fluorescent N-substituted acridines are present in amounts of less than 0.1%.

On the basis of pharmacologic studies, these impurities could not lead to unfavorable side effects at the level in which they are present in commercial Tofranil®.

Die in den letzten Jahren entwickelten hochempfindlichen analytischen Methoden haben die Nachweisgrenze für viele Substanzen beträchtlich gesenkt. Insbesondere sind mittels der chromatographischen Untersuchungsmethoden Bereiche erschlossen worden, die der klassischen Analytik im allgemeinen nicht zugänglich waren. Diese veränderte Situation hat unter anderem dazu geführt, daß organische Begleitsubstanzen, die naturgemäß auch in «reinen» Verbindungen nicht fehlen, verhältnismäßig leicht und in günstigen Fällen bis in den p. p. m.-Bereich herab nachweisbar geworden sind, woraus sich neue Möglichkeiten und Impulse für die Untersuchung derartiger Spuren ergeben.

<table><caption>Tabelle 1. Dünnschichtchromatographischer Nachweis der Begleitsubstanzen in Imipramin</caption><thead><tr><th></th><th colspan="2">Rf-Werte in</th><th colspan="2">Identifikation</th><th>Erfassungs-grenze in γ</th></tr><tr><th></th><th>A</th><th>B</th><th>1</th><th>2</th><th>3</th></tr></thead><tbody><tr><td>I</td><td>0,27</td><td>0,63</td><td>-</td><td>blau</td><td>dunkel*</td><td>10<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>II</td><td>0,35</td><td>0,32</td><td>-</td><td>blau</td><td>dunkel*</td><td>10<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>III</td><td>0,04</td><td>0,23</td><td>-</td><td>blau</td><td>dunkel*</td><td>10<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>IV</td><td>0,82</td><td>0,80</td><td>-</td><td>blau</td><td>dunkel*</td><td>10<sup>-2</sup></td></tr><tr><td>V</td><td>0,49</td><td>0,37</td><td>-</td><td>blau**</td><td>gelb</td><td>10<sup>-3</sup></td></tr><tr><td>VI</td><td>0,13</td><td>0,60</td><td>-</td><td>-</td><td>grüngelb</td><td>10<sup>-3</sup></td></tr><tr><td>IX</td><td>0,03</td><td>0,68</td><td>grüngelb</td><td>-</td><td>grüngelb</td><td>10<sup>-3</sup></td></tr><tr><td>X</td><td>0,09</td><td>0,41</td><td>blau</td><td>-</td><td>blau</td><td>10<sup>-3</sup></td></tr><tr><td>XI</td><td>0,49</td><td>0,68</td><td>-</td><td>-</td><td>grüngelb</td><td>10<sup>-3</sup></td></tr></tbody></table>

Schicht: Kieselgel G neutral (Merck)

Laufstrecke: 10 cm

Fließmittel A: Eisessig/Essigester/Wasser/konz. HCl (35/55/5/5)

Fließmittel B: Benzol/Essigester/Äthanol/konz. Ammoniak (50/50/10/5), leichte Phase. (Ein ähnliches Fließmittel haben W. PAULUS *et al.*, *Arzneimittel-Forsch. 13* [1963] 609 beschrieben)

Auftragsmenge: 25-200 γ (in frisch bereiteter äthanolischer Lösung)

Identifikation: 1 Im UV-Licht (366 mμ)
2 Nach Ansprühen mit Bichromat-Schwefelsäure (0,5% K₂Cr₂O₄ in 20 prozentiger H₂SO₄) im sichtbaren Licht

3 Nach Ansprühen, im UV-Licht (366 mμ)

* Später gelb (Imipramin zeigt in größerer Konzentration zunächst einen blau fluoreszierenden Fleck mit dunklem Rand).

** Nur nach Chromatographie im Fließmittel B.

<footnote n="3">³ G. A. SIM, T. A. HAMOR, I. C. PAUL und J. MONTEATH ROBERTSON, *Proc. Chem. Soc. 1961*, 75; D. H. R. BARTON, H. T. CHEUNG, A. D. CROSS, L. M. JACKMAN und M. MARTIN SMITH, *ibid. 1961*, 76; J. *Chem. Soc. 1961*, 5061.</footnote>

<footnote n="4">⁴ E. BULLOCK, J. C. ROBERTS und J. G. UNDERWOOD, *J. Chem. Soc. 1962*, 4179.</footnote>

<footnote n="5">⁵ K. K. CHEUNG und G. A. SIM, *Nature 201*, 1185 (1964); T. ASAO, G. BÜCHI, M. M. ABDEL-KADER, S. B. CHANG, E. L. WICK und G. N. WOGAN, *J. Amer. Chem. Soc. 85* (1963) 1706 und hierin zitierte frühere Arbeiten.</footnote>

<footnote n="6">⁶ C. H. EUGSTER und D. KARANATSIOS, erscheint in *Helv. Chim. Acta*; vorgetragen am 25. September 1964 an der Universität Göttingen.</footnote>
Bei der dünnschichtchromatographischen Untersuchung von Imipramin (I)<fnref n="1" /> lassen sich nach dem Besprühen der Platten mit einem Oxydationsmittel außer dem Hauptfleck verschiedene blau angefärbte bzw. im UV-Licht stark fluoreszierende Nebenflecken feststellen

(Tabelle 1). Es war für uns von Wichtigkeit, Art und Menge dieser Neben- und Folgeprodukte zu bestimmen.

Versuche, die Wirksubstanz durch wiederholte Kristallisation oder die freie Base durch Destillation weiter zu reinigen, führten nicht zu einem chromatographisch einheitlichen Produkt. Auch die Herstellung von I aus extrem gereinigten Zwischenprodukten brachte nur eine geringfügige Verbesserung. Erst durch vorsichtige

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

<footnote n="1">¹ Imipramin ist N-(γ-Dimethylaminopropyl)-iminodibenzyl, sein Hydrochlorid die Wirksubstanz von Tofranil® (registrierte Marke der J.R. Geigy AG).</footnote>
Säulenchromatographie an Alox gelang es, ein Produkt zu erhalten, das im Dünnschichtchromatogramm keine Nebenflecken mehr zeigte. Dies beweist zugleich, daß die Nebenflecken keine chromatographischen Artefakte von Imipramin darstellen. Wird andererseits nach obigem Verfahren gereinigtes, einheitliches Imipramin-Hydrochlorid in Gegenwart von Luft feucht und warm aufbewahrt, so treten bei der Dünnschichtchromatographie erneut die fluoreszierenden Nebenflecken in Erscheinung. Bei diesen muß es sich also um genuine Folgeprodukte handeln. Der Vergleich (Spektren, Dünnschichtchromatogramm) der mittels Säulenchromatographie angereicherten Neben- und Folgeprodukte (total etwa 0,2%) mit teils bekannten, teils eigens zu diesem Zweck hergestellten Verbindungen ermöglichte die Identifizierung der einzelnen Komponenten als II, III, IV, V, VI, IX, X und XI.

Die Entstehung der beiden Nebenprodukte II und III findet ihre Erklärung in der Tatsache, daß das zur Synthese verwendete γ-Dimethylaminopropylchlorid geringe Mengen γ-Methylaminopropylchlorid enthält. Bei der Kondensation dieser Beimengung mit Iminodibenzyl (IV) entsteht II, das zu III weiterreagieren kann. Anderseits ist das in sehr geringer Menge auftretende Iminodibenzyl (IV) auf eine auch in anderem Zusammenhang bereits beobachtete Abspaltung der Seitenkette<fnref n="2" /> des Imipramins zurückzuführen. Nach Belastung von Imipramin tritt der Nebenfleck IV tatsächlich vermehrt in Erscheinung.

Bei den weiteren identifizierten Nebenflecken V, VI, IX, X und XI handelt es sich um Oxydations- und/oder Umlagerungsprodukte von Imipramin, deren Entstehung besonders in Lösung oder bei feuchtwarmem Lagern von Imipramin-Hydrochlorid zu erkennen ist. Für ihre Bildung kann angenommen werden, daß aus Imipramin I durch Hydroxylierung in Benzylstellung 10-Hydroxy-imipramin (V) entsteht. Eine Wasserabspaltung aus V oder eine direkte Dehydrierung von I könnte für das Entstehen des Iminostilbenderivates VI verantwortlich sein. Sowohl V als auch VI erleiden in saurem Milieu eine Ringverengung zu IX, wobei allenfalls intermediär VII und VIII entstehen könnte. Beide Verbindungen konnten allerdings – vermutlich wegen ihrer hohen Instabilität – als Folgeprodukte nicht nachgewiesen werden. Bei Anwesenheit von Luft wird IX in neutraler oder alkalischer Umgebung (über VIII) zum

Acridonderivat X oxydiert, während bei Luftausschluß das 9-Methylacridanderivat XI entsteht.

Diese Umwandlungen ließen sich durch eine Reihe chemischer Reaktionen weitgehend sichern. In saurem Milieu konnte V in VI übergeführt werden, das seinerseits beim Erwärmen in starker Säure IX lieferte. Beim Belüften einer salzsauren alkoholischen Lösung von XI entstanden hauptsächlich IX und X, während IX und XI in alkalischem Milieu X lieferten. Die Oxydation von XI zu IX, die bei der Chromatographie im Fließmittel A nahezu quantitativ stattfindet, kann durch Zusatz eines Antioxydans verhindert werden. Dementsprechend ist in Imipramin-Hydrochlorid-Lösungen, die zur Stabilisierung Ascorbinsäure enthalten, Fleck IX im Fließmittel A (vgl. Tabelle 2) stark abgeschwächt, während gleichzeitig ein Doppelfleck V/XI verstärkt aufritt. Demnach dürfte IX weitgehend ein chromatographisches Artefakt von XI im sauren Fließmittel darstellen.

<table><caption>Tabelle 2. Gehalt an Begleitsubstanzen in Tofranil®-Wirksubstanz (Durchschnittswert in %)</caption><tr><td>II</td><td>0,04</td></tr><tr><td>III</td><td>0,04</td></tr><tr><td>IV</td><td>0,01</td></tr><tr><td>V</td><td>0,01</td></tr><tr><td>VI</td><td>0,03</td></tr><tr><td>IX/XI*</td><td>0,06</td></tr><tr><td>X**</td><td>0,01</td></tr></table>

Mit Hilfe der synthetisierten Verbindungen konnten die in Imipramin enthaltenen Verunreinigungen semiquantitativ bestimmt werden. In Tabelle 2 ist der Gehalt an Neben- und Folgeprodukten als Durchschnittswert einer größeren Zahl von Tofranil®-Wirksubstanz-Mustern angegeben. Durchaus vergleichbare Verhältnisse liegen in Tofranil®-Ampullen und -Dragées vor.

Die pharmakologische Prüfung ergab keine Anhaltspunkte, daß die im DC in Spuren nachgewiesenen Substanzen ungünstige Nebenwirkungen auslösen könnten.

K. ADANK und W. HAMMERSCHMIDT

Wissenschaftliche Laboratorien
der J. R. Geigy AG, Basel

<footnote n="2">² W. SCHINDLER und F. HÄFLIGER, Helv. Chim. Acta 37 (1954) 472.</footnote>

<footnote>* IX und XI wurden gemeinsam abgeschätzt (nach Luftoxydation von XI zu IX auf der Platte).</footnote>

<footnote>** Nur in Tofranil®-Dragées.</footnote>