# Participation à l'amélioration d'un fromage innovant de type pâte molle en vue d'un test sensorieL

Aubert Luc

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Aubert Luc. Participation à l'amélioration d'un fromage innovant de type pâte molle en vue d'un test sensorieL. Ingénierie des aliments. 2022. hal-03706922

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# Participation à l'amélioration d'un fromage innovant de type pâte molle en vue d'un test sensoriel

Luc Aubert, Marielle Harel-Oger

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Luc Aubert, Marielle Harel-Oger. Participation à l'amélioration d'un fromage innovant de type pâte molle en vue d'un test sensoriel. [Stage] IUT de Saint Brieuc. 2022, 39p. hal-03705505

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# Rapport de stage

## Participation à l'amélioration d'un fromage innovant de type pâte molle en vue d'un test sensoriel

Stage du 06/04/2022 au 17/06/2022

Etudiant : Luc Aubert

Tuteur en entreprise : Marielle Harel-Oger
Chercheuse de l'équipe plateforme

Tuteur IUT : Eric Château
Enseignant en Tech-Alim
## Remerciements

Tout d'abord, je tiens à remercier Hélène Lucas, Présidente du centre INRAE Bretagne-Normandie et Yves Le Loir, Directeur de l'UMR STLO de m'avoir permis de réaliser mon stage au sein de l'INRAE.

Je tiens également à remercier Gilles Garric de m'avoir accueilli au sein de l'équipe Plateforme Lait.

Je remercie ma maître de stage Marielle Harel-Oger de m'avoir guidé et enseigné pendant ces mois de stage mais tout particulièrement de m'avoir fait confiance au point de me laisser en autonomie sur les différentes missions du projet.

Je remercie également Françoise Boissel pour m'avoir formé aux analyses physico-chimiques et Gwénaël Jan pour m'avoir formé sur les techniques de microbiologie en laboratoire ainsi que Sandrine Parayre.

Je remercie les membres de l'extension pour leur bienveillance quotidienne : Guillaume Levesque-du-Rostu, Didier Morand, Anny Vivas, Gaëlle Tanguy et Luca Lanotte.

Et enfin, un immense merci à toutes les personnes que j'ai rencontrées au STLO qui ont pris le temps de parler avec moi et de m'accompagner pour contribuer à ce que mon stage se passe au mieux.
<table><tr><td>Remerciements</td><td>2</td></tr><tr><td>Sommaire</td><td>3</td></tr><tr><td>Liste des abréviations</td><td>4</td></tr><tr><td>Préambule</td><td>5</td></tr><tr><td>Introduction</td><td>6</td></tr><tr><td>1. La structure</td><td>7</td></tr><tr><td>1.1. L'INRAE et l'environnement de travail</td><td>7</td></tr><tr><td>1.2. L'UMR STLO</td><td>7</td></tr><tr><td>2. Le projet FroM'Innov-Syalsa</td><td>8</td></tr><tr><td>2.1. Le contexte de l'étude</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2. Le brevet FroM'Innov</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2.1. Le procédé</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2.2. La matrice de texture</td><td>9</td></tr><tr><td>2.2.3. La matrice aromatique</td><td>9</td></tr><tr><td>2.2.4. Mélange et texturation</td><td>9</td></tr><tr><td>2.3 Organisation des semaines du projet</td><td>11</td></tr><tr><td>2.3.1 Rappel chronologique du projet</td><td>11</td></tr><tr><td>2.3.2 Phase 1</td><td>11</td></tr><tr><td>2.3.3 Conclusion partielle de la partie 1</td><td>17</td></tr><tr><td>3. Matériels et Méthodes</td><td>17</td></tr><tr><td>3.1. Matériels et méthodes microbiologiques</td><td>17</td></tr><tr><td>3.1.1. Les micro-organismes</td><td>17</td></tr><tr><td>3.1.2 Les dénombrements</td><td>18</td></tr><tr><td>3.2 Matériels et méthodes physico-chimique</td><td>18</td></tr><tr><td>3.2.1. Mesure de la matière grasse</td><td>18</td></tr><tr><td>3.2.2. Mesure du pH</td><td>19</td></tr><tr><td>3.2.3. Mesure de l'extrait sec total</td><td>19</td></tr><tr><td>3.2.4. Mesure de la matière azotée totale</td><td>20</td></tr><tr><td>3.3 Matériels et méthodes de Technologie Alimentaire</td><td>20</td></tr><tr><td>3.3.1. Echelle paillasse</td><td>20</td></tr><tr><td>3.3.2. Echelle plateforme</td><td>21</td></tr><tr><td>4. Résultats et Interprétations</td><td>21</td></tr><tr><td>4.1. Comparaison essai1 sem15-22 et essai2 sem17-22</td><td>22</td></tr><tr><td>4.2. Comparaison essai2 sem17-22 et essai3 sem18-22</td><td>23</td></tr><tr><td>4.3. Comparaison essai3 sem18-22 et essai4 sem19-22</td><td>24</td></tr><tr><td>4.4. Comparaison essai4 sem19-22 et essai2 sem22-22</td><td>24</td></tr><tr><td>4.5 Comparaison globale de tous les essais</td><td>25</td></tr><tr><td>4.6 Conclusion partie résultats</td><td>27</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>28</td></tr><tr><td>Annexes</td><td>30</td></tr><tr><td>Références bibliographiques</td><td>37</td></tr><tr><td>Résumé</td><td>39</td></tr></table>
## Liste des abréviations :

UMR : Unité Mixte de Recherche

STLO : Science et Technologie du Lait et de l'Œuf

CSGA : Centre des Sciences du Gout et de l'Alimentation

PSAE : Paris Saclay Applied Economics

INRAE : Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement

PSM : Poste de Sécurité Microbiologique.

YEL : Yeast Extract Lactate

YELa : Yeast Extract Lactate agar

UF : Ultrafiltration

PUF : Perméat d'Ultrafiltration

GDL : Glucono-Delta-Lactone

FRV : Facteur de Réduction Volumique

EST : Extrait Sec Total

MMV : Maubois-Mocquot-Vassal

MO : Micro-organisme

Propioniques : Bactéries propioniques (Propionibacterium freudenreichii entre autres)

MG : Matière grasse

AG : Acides gras

LGA : Lithium Glycerol Agar

Ret : Rétentat

M : Masse

MAT : Matière Azotée Totale

Dem : Démoulage

Emb : Emballage

Sem : Semaine

CAP : Consentement à Payer

WTP : Willingness To Pay
## Préambule

Le fromage est un produit laitier issu de la coagulation de matières laitières (lait, rétentat, babeurre...). A la suite de cette coagulation peut s'en suivre une fermentation et/ou un affinage.

La coagulation des matières laitières est due à la coagulation des protéines du lait appelées caséines. Cette coagulation est réalisée soit par acidification du milieu laitier par des microorganismes et/ou par des enzymes coagulantes, soit l'ajout d'acide organique (acide lactique principalement), soit par les deux méthodessimultanément.

Lors de la coagulation, si elle est d'origine microbienne, elle est initiée par des ferments acidifiants qui vont métaboliser le lactose présent dans le lait en acide lactique. L'acide va alors faire chuter le pH du milieu ce qui va entrainer une coagulation des caséines. Les ferments acidifiants en question sont des bactéries lactiques. On retrouve parmi elles des espèces connues telles que : *Lactococcus lactis*, *Lactobacillus delbrueckii* subsp. *lactis*, *Streptococcus thermophilus* ou encore *Leuconostoc spp*

Après la coagulation et le moulage vient l'affinage du fromage. Pendant cette étape, d'autres micro-organismes peuvent être ajoutés afin de modifier l'arome final du fromage et/ou de modifier l'aspect du fromage. Il en a été répertorié plus de 70 genres et 200 espèces dont des bactéries lactiques (*Lactobacillus spp*, *Leuconostoc spp*, *Enterococcus spp*, ...), des levures (*Debaryomyces hansenii*, *Geotrichum candidum*, *Kluyveromyces lactis*, *Yarrowia lipolytica* ...), des moisissures (*Penicillium roqueforti*, *P. camemberti*, ...), des Actinobacteria (*Glutamicibacter arilaitensis*, *Brevibacterium linens*, *Propionibacterium freudenreichii*, ...) ou des Proteobacteria (*Hafnia alvei*, ...). Chaque espèce de micro-organismes nécessite des conditions différentes pour se développer. De plus, elles peuvent interagir métaboliquement entre-elles (coopération, compétition ou inhibition), impactent positivement ou négativement une ou les deux flores ce qui permet des combinaisons aromatiques et texturales d'autant plus variées. Afin d'innover dans la transformation fromagère, le brevet From'Innov a été déposé par l'UMR STLO, Rennes, INRAE. Il réside dans la réduction du temps d'affinage du fromage. C'est ce vecteur, moyen qui va être utilisé **dans le projet FroM'Innov**. Son programme sera détaillé plus loin dans le rapport.
## Introduction

Mon stage s'est déroulé du 6 avril au 17 juin 2022. Celui-ci avait pour objectif de faire un premier pas dans le monde professionnel. Il devait me permettre de me faire une idée sur le monde des entreprises ainsi que de me faire découvrir le travail en équipe. Les principales tâches que j'ai réalisées s'inscrivaient dans une démarche d'amélioration d'un fromage fait avec un procédé innovant (détaillé plus loin). J'ai donc travaillé à part entière sur le projet FroM'Innov. Il s'inscrit dans un appel à projet appelé le méta programme SYALSA dont le programme est basé sur l'amélioration des questions de santé autour de l'alimentation et de l'environnement. Ce projet est en adéquation avec les axes de SYALSA, c'est-à-dire i) la construction des qualités des aliments et de l'alimentation ii) les relations entre pratiques de production et de transformation et iii) la santé. Et ce, pour une durée de deux ans. Le projet est principalement porté par Marielle Harel-Oger, UMR STLO, INRAE Rennes, Gilles Garric, UMR STLO, INRAE Rennes, Christophe Martin, CSGA, INRAE Dijon et Stéphan Marette, UMR PSAE, INRAE Paris Saclay.

Ses objectifs sont simples mais très intéressants : fabriquer un fromage innovant à partir du brevet From'Innov et étudier l'impact de l'innovation et de ses effets sur l'environnement et la santé. Pour ce faire, on teste l'acceptabilité du consommateur vis-à-vis de l'innovation en comparaison d'un produit fabriqué de manière classique lors d'un test auprès de 160 consommateurs, de tout âge, de tout sexe, de toutes catégories socio-professionnelles. La méthode utilisée est le consentement à payer (CAP) ou le willingness to pay (WTP).

Dans le but de répondre à cette problématique, nous allons :

- Dans un premier temps rappeler ce qu'est un fromage et en quoi le brevet From'Innov diffère d'une fabrication de fromage classique.

- Dans un second temps, nous retracerons l'histoire du projet ainsi que la raison qui nous pousse toujours à améliorer le produit.

- Dans un troisième temps, nous définirons les méthodes d'analyses qui nous ont permis d'améliorer les fromages et nous discuterons sur les résultats de ces analyses.

- Et enfin, nous conclurons par une réponse à notre problématique et le ressenti globale du stage.
# 1. La structure

## 1.1. L'INRAE et l'environnement de travail

L'INRAE est l'Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement. Il est le premier institut de recherche à regrouper 3 secteurs de recherches dans un seul organisme. Il est né le 1er janvier 2020 suite à la fusion entre l'INRA, l'Institut National de la Recherche Agronomique et l'IRSTEA, l'Institut National de Recherche en sciences et technologies pour l'Environnement et l'Agriculture. Comme indiqué dans son nom, l'INRAE est l'Institut National de Recherche sur l'Agriculture, l'Alimentation et l'Environnement. C'est donc un institut publique soutenu par l'état français. Il est composé de 18 centres répartis partout en France, avec 14 départements de recherche différents basés sur les sciences de l'environnement et de l'agronomie tels que la microbiologie, l'alimentation, l'environnement, la biologie, les mathématiques et statistiques, la physiologie animale et végétale, etc.). Ces 14 départements sont divisés en 268 unités de recherches, de services et expérimentales. L'INARE a une portée internationale. Il emploie plus de 8000 agents titulaires et plus de 3000 agents contractuels. Il publie dans plus de 150 pays, tous types de publications scientifiques et 50% des publications sont en collaboration avec un pays étranger.

De plus, l'INRAE possède un financement s'élevant à 1 milliard d'euros dont environ 806 millions de subventions publiques. Actuellement, l'INRAE fait 30,9 millions d'euros de recettes dont 9,1 millions d'euros de redevance.

## 1.2. L'UMR STLO

L'UMR STLO (Science Technologique du Lait et de l'œuf) est le laboratoire dans lequel j'ai effectué mon stage. Il est rattaché à l'Institut Agro Ouest, pour la recherche et pour l'enseignement. C'est un laboratoire spécialisé dans la recherche sur le lait et les œufs. Le STLO possède 5 équipes de recherche chacune dirigée par un directeur de recherche expert dans le domaine. Il possède plusieurs pôles de recherche : microbiologie, nutrition, physique et procédés (séchage, évaporation, concentration). Il est équipé de deux plateformes : la plateforme lait et le CIRM BIA, et de nombreux plateaux analytiques.
Il a la particularité d'avoir sur son site des entreprises privées comme Eurial, Sodial, etc...
Elles possèdent des quartiers réservés dans le laboratoire.

Commenté [MH1]: À compléter
## 2. Le projet FroM'Innov -Syalsa

### 2.1. Contexte de l'étude

Les partenaires du projet ont utilisé le brevet From'Innov. C'est un nouveau procédé de technologie fromagère (cf. Fig 2) mis au point et breveté par INRAE permettant de découpler les éléments constitutifs de la construction de la qualité du produit, en substituant aux grandes étapes de la fromagerie (cf. Fig 1) des étapes de matrices de texture et d'aromatisation. Plusieurs avantages à cela : réduction des coûts de production, bénéfices nutritionnels et environnementaux, réduction du temps de fabrication.

Les étapes de la démarche envisagée sont les suivantes :

- Développement d'un nouveau fromage issu de la technologie FroM'Innov avec des améliorations nutritionnelles (par rapport aux autres produits sur le marché)

- Réalisations d'expérimentation auprès de consommateurs, incluant des dimensions sensorielles et économiques, pour mesurer leurs préférences vis-à-vis de ces produits

- Des entretiens auprès d'acteurs des filières pour évaluer les conditions d'adoption de ce type de procédés par les entreprises

- Des évaluation coûts – bénéfices visant à préciser les conditions d'entrée (prix et part de marché) de ces produits sur le marché

Les axes du programme Syalsa impliqués dans le projet sont ceux-ci :

- Construction des qualités des aliments et de l'alimentation.

- La santé, comme possible moteur de la dynamique des systèmes alimentaires : comportements des acteurs, politiques publiques et accompagnement des transitions

En adéquation avec le méta-programme Syalsa, le brevet FroM'Innov a alors pour but de créer des Fromages au Modèle Innovant.

### 2.2. Le brevet From'Innov

#### 2.2.1. Le procédé

FroM'Innov est un procédé breveté qui revisite les pratiques de fabrication fromagère en y installant une maitrise accrue du procédé.

En effet, le but de ce procédé est de raccourcir le temps de production du fromage à pâte molle tout en gardant une qualité nutritionnelle et une qualité pour la santé élevée.

FroM'Innov se caractérise par la préparation d'une matrice de texture et une ou plusieurs matrices aromatiques. Ces matrices sont ensuite assemblées pour obtenir le fromage avec les caractéristiques qui étaient souhaitées au départ.
La matrice de texture est fabriquée à partir d'un rétentat d'ultrafiltration 0,02µm (FRV 5,6). On travaille donc sur du lait concentré selon le procédé MMV. Dans la fabrication conventionnelle du fromage, celui-ci passe par une phase d'affinage qui peut aller de 1 à 2 mois. Ce temps va servir aux microorganismes afin qu'ils produisent les aromes caractéristiques attendus (en fonction du MO associé à la fabrication). Afin de raccourcir le process et d'éviter la phase d'affinage du fromage, la matrice aromatique est préparée séparément par fermentation de milieux laitiers par des MO traditionnels de l'affinage du fromage (...). La matrice aromatique est ensuite ajoutée à la matrice de texture avant coagulation. Comme l'arôme du fromage a déjà été fabriqué, on réduit ou même supprime le temps d'affinage, ce qui permet d'obtenir un fromage terminé en 2 à 3 jours au lieu de 1 à 2 mois.

Comme on vient de le voir, la technologie FroM'Innov offre des possibilités pour améliorer l'efficacité de la fabrication du fromage. Ce process réduit le temps d'affinage et augmente le rendement en fromage grâce à un taux de récupération de protéine plus élevé. De plus, la consommation d'eau et d'énergie de la production est réduite par rapport à une fabrication classique. (Chamberland et al.)

### 2.2.2. La matrice de texture

Elle est soit du lait pasteurisé soit un rétentat récupéré à partir d'ultrafiltration d'un lait pasteurisé. Le Facteur de Réduction Volumique auquel est soumis le lait dépend du type de fromage à fabriquer. Ainsi un fromage à pâte molle aura un FRV plus faible qu'un fromage à pâte pressée (5,5-5,6 vs 6,5).

### 2.2.3. La matrice aromatique

C'est la partie qui va apporter la flaveur désirée au fromage. Elle résulte de fermentation d'un milieu laitier par des micro-organismes sélectionnés dans la liste de ceux normalement utilisé pour l'affinage des fromages lors de la fabrication d'un fromage conventionnel. (Garric et al).

### 2.2.4. Mélange et texturation

Après fabrication parallèle des 2 matrices, de texture et aromatique, celles-ci sont assemblées et l'étape de texturation commence. On a, dans l'ordre, un salage de la pâte, l'ajustement du pH par ajout de GDL et enfin la coagulation du mélange qui se fait grâce à de la présure. La texture finale dépend des conditions physico-chimiques telles que la température, le pH, la dose de coagulant, la concentration en sel, la nature et la concentration des éventuels agents gélifiants ou épaississant ajoutés.

**Les micro-organismes utilisés pour la matrice aromatique :**

Selon le brevet du projet FroM'Innov, divers MO peuvent être cultivés afin d'obtenir les composés d'arômes souhaités. Les MO retenus sont des MO utilisés dans l'affinage des fromages conventionnels. Toujours selon le brevet, quatre espèces de MO ont été utilisées pour la fabrication de la matrice aromatique : *Lactococcus lactis* (LI), *Propionobacterium freudenreichii* (Pf), *Hafnia alvei* (Ha), et *Yarrowia lipolytica* (YI) qui est une levure.
<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Fig 1 : Diagramme de fabrication classique d'un fromage à pâte molle.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>
Fig 2 : Diagramme de fabrication d'une pâte molle par le procédé FroM'Innov.

## 2.3. Organisation des semaines du projet

### 2.3.1. Rappel chronologique du projet

Comme dit précédemment, le projet FroM'Innov a été proposé suite à un appel à projet s'inscrivant dans le métaprogramme Syalsa. Il a ensuite été retenu par son comité de pilotage. Le projet a été lancé le 1er juillet 2021 pour une période de 24 mois. Afin de simplifier la planification, 2 phases ont été programmées, chacune composée de 2 semestres. La figure 3 représente le planning du projet.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Fig 3 : Frise chronologique du déroulement du projet Fro'Innov : Juillet 2021 – Juin 2023</figcaption></figure>

Je vais m'intéresser à la 1ère phase du projet (du 1er au 12ème mois). La deuxième phase ira du 1er juillet 2022 à juin 2023. Elle débutera par l'interprétation des résultats du 2ème test hédonique et permettra une réflexion sur un 3ème test sensoriel et également sur la suite à donner à ce projet (date line de AAP de l'AMI 2 : 05/09/2022). Je ne m'étendrai pas sur cette 2ème phase car je ne serai plus présent à l'UMR STLO.

### 2.3.2. Phase 1

- Semestre 1 : Mise en place du 1er test hédonique (avant la période de mon stage)

Le travail accompli est résumé dans le tableau suivant :

<table><thead><tr><td>Quand</td><td>Quoi</td><td>Objectifs</td><td>Résultats</td></tr></thead><tbody><tr><td>S1 (juillet 2021)</td><td>pré-test : réalisation de 3 combinaisons de pâtes molles (PM) From'Innov (F'I)</td><td>-rencontre entre les différents partenaires<br/>-choisir 2 combinaisons de PM F'I</td><td>-C1 : PM avec ferment NIZO aromatique (2%)</td></tr></tbody></table>

Commenté [MH3]: Mettre un titre à la figure

Commenté [MH4]: (Voir produit laitier 2ème édition)
<table><tr><td></td><td></td><td>-choisir un témoin du commerce<br/>-réalisation du plan de maîtrise sanitaire</td><td>-C2 : PM avec ferments Ha (4%), NIZO (2%) et YI (0,5%)<br/>-choix de l'Ortolan<br/>-envoi à la DDPP en sept.2021</td></tr><tr><td>S1 (nov. 2021)</td><td>réalisation des 2 combinaisons</td><td>-réalisation d'un test hédonique auprès de 160 consommateurs*</td><td></td></tr><tr><td>S1 (déc. 2021)</td><td>test hédonique</td><td>- détermination de l'acceptabilité de l'innovation par le consommateur sur un produit de qualités</td><td>-142 consommateurs sur les 160 prévus initialement<br/>-cf. fig : spider</td></tr></table>

* volontaires et disponible, de tout âge, hommes et femmes, et de toutes catégories sociaux professionnelles.

<caption>Tableau 1 : Tableau récapitulatif du Semestre 1 de FroM'Innov</caption>

La méthodologie pour le test hédonique est celle du consentement à payer (CAP) c'est-à-dire :

* 1ère phase : dégustation hédonique des 3 produits à l'aveugle

* 2ème phase : le consommateur donne son CAP en fonction de l'appréciation hédonique

* 3ème phase : dégustation hédonique des 3 produits à l'aveugle avec une grille d'indicateurs à remplir (croûte, couleur, odeur, arôme, etc. : cf. fig : spider)

* 2ème phase : révélation d'informations concernant les procédés de fabrication fromagère (classique et innovant) → : 2ème CAP (étude de l'influence du process innovant / classique)

* 3ème phase : révélation d'informations concernant l'environnement (moins d'eau, moins d'énergie consommées) : 3ème CAP (étude de l'influence du procédé sur l'environnement) *

* 4ème phase : révélation d'informations concernant la santé (moins salé) : 4ème CAP (étude de l'influence du procédé sur la santé) *

* 2 sous-groupes (santé ou environnement) : randomisation de l'information santé ou environnement

* Questionnaire final (33 questions)

- Semestre 2 : Analyses des résultats et réflexion à la mise en place d'un second test hédonique

Commenté [MH5]: Bien définir les qualités

Commenté [MH6]: Mettre un titre au tableau
Le deuxième semestre de cette phase consiste à analyser les résultats du 1er test sensoriel réalisé et aux vues de ceux-ci, de proposer des améliorations pour la réalisation d'un 2nd test. C'est dans cette période et avec ces objectifs d'amélioration de produits que j'ai effectué mon stage, du 6 avril au 17 juin 2022. Plusieurs essais « paillasse » puis deux grandes expérimentations à l'échelle « pilote » dont une avec une évaluation sensorielle des produits auprès de 160 consommateurs ont été réalisés.

- Résultats clés pour mon stage

Après le test hédonique de décembre 2021, les résultats du test ont été analysés en janvier. Les 9 descripteurs organoleptiques de la seconde dégustation à l'aveugle ont été des résultats clés pour définir mon stage car ils ont permis d'améliorer les produits du 1er test sensoriel. Les tendances des 160 consommateurs, en autres, ont été retranscrites sous forme de diagramme en toile d'araignée (radar ou spider).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Fig 4 : Diagramme Spider : résultats combinés du test hédonique de décembre 2021</figcaption></figure>

Avec en bleu : témoin classique du commerce (Ortolan), en gris, un FroM'Innov doux (C1) et en orange : un FroM'Innov typé (C2)

Ces résultats seront détaillés et mis en relation avec les autres résultats dans la partie « Résultats »

- Améliorations des PM FroM'Innov : le cœur des objectifs de mon stage

En février et mars 2022, les grandes lignes d'un deuxième test sensoriel à Dijon auprès de 160 consommateurs avaient été définies. De plus, de nouveaux essais C1 et C2 sont en réflexion.

Commenté [MH7]: Mettre un titre
Le 6 avril commence mon stage dont l'objectif principal était d'améliorer les 2 combinaisons C1 et C2 de fromages FroM'Innov. Afin d'améliorer les fromages, nous avançons à tâtons en fonction des résultats des analyses microbiologique et chimique. En effet, pendant le mois d'avril, j'ai effectué ma première fabrication de pâtes molles. Le protocole à suivre pour la fabrication du fromage est noté dans la « fiche projet » (cf. annexe 1). C'est le document de référence quand il y a une fabrication de fromage à faire et à analyser. Celle-ci est écrite par Marielle et elle regroupe le diagramme de fabrication du fromage ainsi que les analyses à réaliser : Quelles analyses ? Qui doit les faire ? Quand ?

La première fabrication a été faite le 13 avril 2022. Elle avait pour objectif principal de déterminer à partir de quel pourcentage d'ensemencement en bactéries Propioniques dans les fromages, on décèle le goût « propionique » (goût noisette) et/ou un effet probiotique (cf. annexe 2). Cet effet est réel à partir de 10e9 bactéries/g de fromage. Le 2ème objectif était de familiariser avec les analyses microbiologiques (dénombrement des Propioniques) et physico-chimiques (Matières azotées totales (MAT), matières grasses (MG), et d'extrait sec total (EST) Et cela pour les deux types de fabrication : C1 (Propio ?, NIZO 2%) et C2 (Propio ?, NIZO 2%, Hafnia 4%, Yarrovia 0,5%). Toutes les fabrications C1 et C2 antérieures auront les mêmes matrices aromatiques que cette fabrication. Les fromages sont suivis de leur fabrication jusqu'à leur emballage, c'est-à-dire du jour j à j+9. Des prises de pH et T° sont réalisées à J+1, J+3, J+6 et J+9. Des analyses de Matières grasses (méthode Gerber), des mesures d'Azote Total (Kjeldhal) et d'Extrait Sec Total (étuve à 105°C) sont réalisées au démoulage (soit à J+1) et à l'emballage (à J+9). Pour les conserver, ils sont stockés dans un hâloir régulé en température à 15°C pendant 2 jours pour que les levures poussent, puis 12°C pendant 7 jours jusqu'à emballage à J+9. L'humidité relative est de 95%.

Suite à la fabrication du 13 avril, une réunion en Viso conférence a eu lieu avec les différents partenaires du projet. Afin d'améliorer les fromages, plusieurs axes ont été creusés. Tout d'abord, il a été redit que nous souhaitions obtenir 2 fromages de goûts distincts : C1 avec un goût Propionique (goût noisette / emmental) et C2 avec un goût typé, plus Hafnia (chou) qui se rapproche plus des goûts classiques des pâtes molles. Le second axe est l'effet probiotique associé aux 2 fromages. Pour obtenir cet effet il faut garder une quantité de bactéries Propioniques supérieure à 10^8 ufc / gramme de fromage et ce, dans les 2 types de fromage. Le dénombrement de bactéries Propioniques se fait sur milieu LGA car il est spécifique. L'effet probiotique est encore assez méconnu du grand public, cependant il est très intéressant (cf. annexe 2).

Afin de consolider l'axe « santé » amorcé par la présence de probiotiques dans le fromage, un autre point a été soulevé lors de la réunion : le Nutri-score (cf. annexe 3). En effet, la très grande majorité des fromages, familles toutes confondues, n'a pas une assez bonne composition nutritionnelle pour dépasser le Nutri-score D. Les fromages possèdent en général des protéines (15 -20 %), pas de fibres, ni de glucides, du sel, et beaucoup de matières grasses (environ 20%) et surtout un ratio [MG saturée] / (MG] élevé (environ 2/3 d'AG saturés) ce qui est en défaveur pour obtenir un Nutri-score faible (qui tend vers A). Pour obtenir un Nutri-score plus faible, il faut donc absolument modifier la composition

Commenté [MH8]: Ne pas oublier de la mettre

Commenté [MH9]: A mettre en noir
nutritionnelle de nos essais C1 et C2. Pour cela, on peut d'abord jouer sur le taux de matière grasse en le faisant diminuer jusqu'à un taux de gras sur sec (G/S) de 45% ce qui fait environ 18g de MG pour 100g de fromage fini. Ensuite, le pourcentage d'AG saturés est le facteur le plus pénalisant dans le calcul du Nutri-score. Cependant, ce taux n'est pas modifiable artificiellement, au mieux, il pourrait descendre à 50% d'AG saturés si de la matière grasse d'un lait d'été était utilisé. Ceci donnerait 18% de MG avec 9% d'AG saturés. Enfin, le pourcentage de sel dans le fromage est réduit par rapport à un fromage à pâte molle classique : on passe de 1,3 % à 0,9 % soit une réduction de 30% du taux de sel ce qui permet de faire encore baisser le Nutri-score. Si on applique toutes les modifications de valeurs nutritionnelles ci-dessus dans le tableau calculateur du Nutri-score du site « santepubliquefrance » (cf. annexe 3), alors on obtient un fromage avec un score plus faible que dans un fromage classique. Le produit passe donc de D à C. Cependant, il est impossible de faire passer les fromages en Nutri-score B du fait de la teneur trop élevée en AG saturés qui ne peut être diminuée.

**Comment [MH10]:** Mettre le calculateur en annexe et peut-être avec un exemple

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Fig 4 : Comparaison des valeurs nutritionnelles et du Nutri-Score entre un camembert classique et un fromage FroM'Innov</figcaption></figure>

Les 2 axes santé des fromages FroM'Innov, probiotique et sain, doivent permettre d'attirer le consommateur. Celui-ci aura plutôt tendance à se diriger vers un fromage avec un Nutri-score plus faible.

Suite à cette réunion, une seconde fabrication a été faite avec cette fois-ci pour objectif d'obtenir un pH plus élevé à terme de la maturation du fromage. En fait, à cause des ferments NIZO aromatiques, une post-acidification avait lieu ce qui fait que le pH en fin de maturation était trop faible. De ce fait, le fromage obtenait une texture sèche, compacte et un goût acide. Cela masquait globalement le goût des ferments. La solution qui a été adoptée pour remonter le pH est de détruire les ferments NIZO avec différents traitements thermiques plus ou moins violent afin de réduire la concentration en NIZO et donc ne pas avoir de post-acidification. Les traitements thermiques étaient : 1 = Sans TT ; 2 = 72°C/20s ; 3 = 95°C/12s. Les fabrications C1 et C2 résultantes de cet essai nous ont permis de suivre l'évolution du pH sur 9 jours et donc vérifier s'il y avait post-acidification. D'après les pH mesurés, on remarque une acidification des fromages pour lesquelles le ferment NIZO n'a pas subi de traitement thermique. Cela se confirme à la dégustation car ceux-ci sont encore trop acide au goût et leur texture est sèche
et cassante. De plus, les fromages fabriqués avec du NIZO ayant subi un traitement thermique n'ont eu quasi aucun changement de pH. Leur texture est celle attendue pour un camembert mais leur goût était très peu prononcé voire inexistant. Ce qui permet de conclure que d'un : sans traitement thermique, la post-acidification est trop intense ce qui gâche le goût et la texture du fromage. Et de deux : que la présence des ferments NIZO vivants dans le fromage renforce le goût « beurré » et les aromes des autres flores aromatiques. Suite à cette fabrication, il a été décidé de ne plus faire de traitement thermique sur les ferments NIZO car cela ne fonctionnait pas.

La fabrication de la semaine suivante (03/05/2022) avait pour but de diminuer le % de sel à 0.9% afin de voir l'incidence sur le goût du fromage une fois maturé. Après démoulage, maturation, et emballage, il y a eu dégustation des fromages. Et sans surprise, il avait encore un goût acide, avec une texture cassante et sèche. On pouvait s'y attendre au vu du pH à l'emballage presque identique à ceux des fromages à l'emballage de la semaine précédente. Pour ne plus avoir cette post-acidification, la prochaine fabrication sera modifiée de telle sorte que le pH des ferments NIZO ajoutés lors de l'étape de texturation aura été préalablement baissé à 3,8. Le but de l'acidification des NIZO est de bloquer la post-acidification tout en gardant leur arôme. Également, on mettra moins de GDL afin d'obtenir un pH à l'emprésurage plus élevé et par conséquent un pH au démoulage des fromages plus élevé. En plus d'abaisser le pH des NIZO, nous diminuerons également le pourcentage de sel dans la fabrication : il passe de 0.9% pour la fabrication précédente à 0.8% pour celle-ci. Lors de la fabrication, nous avons baissé le pH des NIZO de 4,8 à 3,8, et nous avons ajouté seulement 1,5% de GDL. Après maturation des fromages, on remarque qu'il y a peu de post acidification et que le pH ne descend pas trop bas. Ce qui fait que lors de la dégustation, les fromages sont beaucoup moins acides, ils sont plus gouteux et ont une meilleure texture. On peut donc dire que le fait de baisser le pH des ferments NIZO a eu une bonne influence sur le pH final des produits. Il est acté que nous réutiliserons cette méthode pour les fabrications suivantes.

Le mardi 31 mai, les fabrications pour le grand test hédonique de juin ont été réalisées avec le rétentat fabriqué lors de l'ultrafiltration du lundi 30 mai. Pour ces fabrications, une grosse quantité de fromage a été produite. Elles ont été faites dans un cutter Stephan puis démoulées le lendemain (J+1). Comme pour les autres fabrications, des mesures physico-chimiques ont été réalisées (MAT, MG et EST) et microbiologique ont été réalisées au démoulage (J+1) et à l'emballage (J+9).

A partir du lundi 13 juin à Dijon commenceront les tests hédoniques sur les fabrications de la semaine antérieure. Comme pour le premier, 160 consommateurs de tout âge, sexe et catégorie socio-professionnelle sont attendus. Après finalisation des tests, les résultats seront regroupés et analysés pour former, en autres, un nouveau diagramme en toile d'araignée grâce aux appréciations des consommateurs. Les résultats seront valorisés au travers de publications dans un journal économique et dans une revue Food Processing. Egalement, la réflexion sera poursuivie pour mener à bien la seconde phase de ce projet et penser à la suite à donner.
### 2.3.3. Conclusion partielle de la partie 1

Pour conclure, L'INRAE est un institut public qui reçoit d'importantes ressources financières. Des comités de pilotage rédigent des appels à projet interne à l'institut. C'est le cas du métaprogramme Syalsa. Il a permis de lancer le projet le FroM'Innov. Depuis le début du projet, en juillet 2021 et ce jusqu'à un an après (Juin 2022), les fromages se sont grandement améliorés. Grâce au procédé FroM'Innov, le temps d'affinage se voit grandement réduit. Ce qui permet un gain de temps et d'argent. Lors des recherches pour l'amélioration des fromages, de nouveaux axes d'innovation ont été découverts et mit en pratique tels que : le Nutri-score, l'effet probiotique, les différents gouts pour les deux fromages. L'amélioration des pâtes molles a été continue et lors de mon stage, j'ai pu voir cette amélioration au fil des semaines notamment par l'évolution des différents pH au fil des fabrications.

Il a également permis d'élaborer un beau partenariat entre différentes unités INRAE.

## 3. Matériel et méthodes

### 3.1. Matériels et méthodes microbiologiques

#### 3.1.1. Les micro-organismes

Les ferments utilisés sont les espèces définies dans le brevet From'Innov : ferment « NIZO » (Lactococcus lactis var. diacetylactis), *Yarrovia lipolytica* (YI), *Hafnia alvei* (Ha) et *Propionibacterium freudenreichii* (Pf)

Les souches utilisées (*Hafnia alvéi* 1823 et *Yarrovia lipolytica* 183T) sont celles définies lors du stage de Vincent Chassagnard (action 19-037) et les milieux de pré-culture et de culture sont ceux qui ont été optimisés lors du stage de Gloria Arias-Fraga (cf. Cahier de laboratoire n° 2019-46 - FI2). La seule souche *de Propionibactérium freudenreichii* du CIRM-BIA reconnue posséder des propriétés probiotiques est la souche CIRM-BIA 129. Les ferments NIZO ont été fournis frais par une société partenaire.

Les micro-organismes utilisés pour les essais paillasse sont stockés dans un congélateur à -18°C. Ils sont conservés dans des pots TPS stériles notamment *H. alvei* et *Y. lipolytica*. Au début du projet, les micro-organismes ont été fournis par le CIRM et ont été conservés dans un stockage à -80°C. Ils ont été ensuite revivifiés avec du YEL (Yeast Extract Lactate) à 30°C pour *P. freudenreichii* (Pf) et *H. alvei* (Ha), à 27°C pour *Y. lipolytica* (YI).

Les pré-cultures de Pf utilisées pour la fabrication des fromages ont été réalisées dans un milieu PUF (Perméat d'Ultra Filtration) supplémenté en peptone de caséine (0,5%), en extrait de levure (0,2%). Notamment pour *P. freudenreichii*, 2 repiquages ont été effectués pour ensemencer du milieu rétentat et ainsi fabriquer la matrice aromatique de bactéries Propioniques.

Le repiquage consiste à prendre un petit volume d'une culture de bactéries (ici 1mL) pour la transplanter sur un milieu neuf (9mL donc dilution au 10ᵉme) afin qu'elle continue sa croissance. S'en suit en général un ensemencement dans un milieu de culture. Dans notre cas,
les bactéries propioniques tirées des repiquages sont ensemencées dans un flacon contenant
du rétentat 3 d'UF, pour qu'elles s'y développent et finissent par donner un flacon de bactéries
propioniques utilisable en fabrication fromagère dans le procédé FroM'Innov.

On a d'abord eu un repiquage R1, puis R2 dans 3 tubes différents, ce qui a permis
d'ensemencer 3 flacons de rétentats différents : Ret 1, Ret 2 et Ret 3. A partir de ces 3
rétentats et donc de ces matrices aromatiques de bactéries propioniques, ont été fabriquées
les essais C1 et C2 du 26/04/2022, puis les essais de la semaine suivante soient le 03/05/2022.
Enfin, à partir de R2, un repiquage R3 a été fait. Il s'est suivi de l'ensemencement d'un nouveau
flacon de rétentat qui lui a servi pour les essais réalisés le 10/05.

3.1.2. Les dénombrements

Après fabrication des pâtes molles, il fallait dénombrer le nombre de bactéries propioniques afin de vérifier que la concentration reste à un taux d'ensemencement à 10^9 ufc/g de fromage, et cela pour conserver l'effet probiotique de *P. freudenreichii*. Les dénombrements se font évidemment en milieu stérile, la totalité de la manipulation se fait donc sous le PSM nettoyé à l'éthanol 70%. Pour les dénombrer, nous avons d'abord broyé les pâtes molles au Stomacher : 10g de fromage + 90g d'eau citratée thermostatée à 48°C au bain marie (pour dissoudre les graisses du fromage) à mettre dans un sac Stomacher pour obtenir une dilution à 10^-1 du fromage. Pour le dénombrement, on fera d'abord des dilutions décimales du contenu du sac stomacher dans des tubes à essais d'eau tryptonée (9mL) : jusqu'à 10^-8. Puis on fera une inclusion des bactéries en versant 1mL de dilution dans les boîtes et en recouvrant et en homogénéisant avec du milieu LGA (environ 20mL). Enfin, on place les boîtes coulées et solidifiées dans un bocal hermétique avec un générateur d'anaérobie (biocult) et un indicateur d'anaérobie. Le bocal est mis à l'étuve à 30°C pendant 7 jours. Pour les premiers dénombrements, nous utilisions du milieu YELA. Etant donné que c'est un milieu non sélectif, d'autres sortes de bactéries poussaient ce qui faussait le dénombrement. De ce fait, il a été décidé d'utiliser le milieu LGA qui est un milieu spécifique des bactéries propioniques et donc de *P. freudenreichii*. C'est un milieu qui a été développé par le l'UMR STLO de Rennes car c'est un laboratoire spécialisé dans l'étude des bactéries propioniques. Le changement de milieu a permis de n'avoir que des bactéries propioniques dans les boîtes ce qui est bien plus pratique pour les dénombrer.

3.2. Matériels et méthodes physico-chimiques

Sur chaque fabrication de PM, il fallait mesurer plusieurs données physico-chimiques : la matière grasse (MG), la matière azotée totale (MAT), le pH et l'extrait sec total (EST). Mesurer ces valeurs permet de comparer les fabrications entre elles et ainsi voir leur évolution au fil des semaines.

3.2.1. Mesure de la matière grasse

La mesure de la matière grasse a été faite par méthode acido-butyrométrique Gerber. C'est une méthode rapide de dosage de la matière grasse par séparation de phase. En fait, on ajoute
3g de fromage dans un godet à trous que l'on met ensuite dans le butyromètre. Puis on ajoute 10mL d'acide sulfurique 96%. Plongé dans un bain marie à 68°C, l'acide va dissoudre les matières organiques du fromage et libérer les matières grasses. Lorsque l'on travaille avec du fromage, il faut agiter le butyromètre toutes les 30 minutes pour une dissolution plus rapide, et cela tout en portant des EPI adaptés : blouse, gants antiacide, lunettes, car l'acide sulfurique dans le butyromètre est très dangereux. Une fois le produit dissous, on ajoute 1mL d'alcool iso-amylique. Celui-ci va faciliter la séparation de la matière grasse dans le butyromètre avec ce qui n'est pas MG. Enfin, on centrifuge le butyromètre à 1200 tr/min pendant 10min (en prenant soin d'équilibrer la centrifugeuse) afin d'avoir une démarcation nette entre la matière grasse et le reste. Une fois la centrifugation terminée, on peut lire le pourcentage de matière grasse sur la graduation du butyromètre.

### 3.2.2. Mesure du pH

Le pH des fromages est mesuré plusieurs fois : à J+1 suivant la fabrication (démoulage), à J+3, à J+6 et à J+9 (emballage). Pour pouvoir mesurer le pH, on utilise la sonde combinée (mesure du pH et de la température simultanément) du pH-mètre WTW 3300. La sonde de pénétration du pH-mètre doit être conservée dans un capuchon contenant une solution de KCl 3M. Celle-ci maintient la sonde chargée en électrons ce qui participe à son bon fonctionnement. Après avoir enlever le capuchon, on rince la sonde à l'eau ultra-pure puis on la sèche en prenant soin de ne pas frotter la sonde car cela pourrait la décharger. Enfin, on plante la sonde vers le milieu de la pâte molle et on lit la valeur de pH indiquée après qu'elle se soit stabilisée. La mesure au pH-mètre donne un couple de valeur pH/T°C qui constitue la valeur de pH mesurée à l'instant t. En effet, la mesure du pH change en fonction de la température due à l'agitation des atomes et molécules constituant le fromage, donc avec une température significativement plus élevée (au moins 10°C) le pH augmenterait. Pour ranger la sonde pH, il faut faire les étapes de à l'envers c'est-à-dire nettoyer la sonde à l'eau ultra pure et la ranger dans le capuchon avec le KCl 3M.

### 3.2.3. Mesure de l'extrait sec total

La mesure de l'extrait sec total (EST) pour toutes les fabrications et autres produits à mesurer (rétentat, lait standardisé, perméat, témoin du commerce) a été faite avec la méthode de référence : **Détermination de l'extrait sec total par gravimétrie**. Le but de cette méthode est d'obtenir le pourcentage de différence entre la masse initiale pesée et la masse après passage à l'étuve à 105°C, ce qui correspond au pourcentage d'eau dans le produit à mesurer. Sur une balance analytique précise à 0,1mg, on pèse un creuset en inox avec du sable à l'intérieur, avec un pilon en verre et le couvercle du creuset. Cela correspond à Mo. Avant de tarer la balance, on ouvre le creuset, puis on ajoute le produit dont on veut le pourcentage d'extrait sec. Pour les liquides on ajoute 5g et pour les solides 3g. Cette masse correspond à la masse M1. On réalise 3 mesures par produit pour avoir une meilleure précision. On mélange ensuite le produit au sable à l'aide du pilon en verre, en faisant attention de ne pas éjecter de sable car cela fausserait la mesure. Les creusets sont entrouverts et mis à l'étuve de dessiccation à
105°C pendant 7 heures. C'est le temps minimum pour que la totalité de l'eau soit évaporée. 7 heures plus tard, on reprend nos creusets en inox et on les place dans un dessiccateur en verre pendant 1 heure pour qu'ils refroidissent. Pour finir, on pèse les creusets secs pour obtenir notre masse M2. La formule pour obtenir l'EST est la suivante :

$$ EST = \frac{M2-M0}{M1} \times 100 (\%) $$

<caption>Fig 5 : Calcul de l'extrait sec total</caption>

### 3.2.4. Mesure de la matière azotée totale

La mesure de l'azote total (MAT) par méthode de Kjeldahl a pour principe la minéralisation de l'échantillon en milieu acide sulfurique en présence de cuivre Cu2+ et d'un catalyseur (oxyde de titane). Après minéralisation, l'azote organique de l'échantillon est retrouvé sous forme d'ammonium.

Les ions ammonium sont ensuite transformé en ammoniac (NH₃) lors de leur passage en milieu alcalin. On entraine alors l'ammoniac (NH₃) à la vapeur d'eau et on dose la solution condensée par dosage volumétrique avec de l'acide chloridrique.

## 3.3. Matériels et méthodes de Technologie alimentaire :

Pour la fabrication de la matrice de texture fromagère, le lait entier cru subit un traitement thermique de pasteurisation à 92°C pendant 2 minutes. Il est ensuite ultrafiltré jusqu'à un FRV de 5,5-5,6 (niveau de concentration du lait). Le rétentat obtenu est congelé à -18°C (essais « paillasse ») ou peut être conservé à +4°C (essais « pilotes »).

**Rappel** : Lors de la fabrication des fromages FroM'Innov, deux échelles de process ont été utilisées.

La première est l'échelle salle alimentaire ou paillasse correspondant à la petite échelle de fabrication. La seconde a une dimension beaucoup plus grande car il s'agit de fabrication à l'échelle d'une halle de technologie avec des machines industrielles de grand volume.

### 3.3.1. Echelle paillasse

Le rétentat est décongelé en chambre froide à 4°C pendant 24h. Pour la production de fromage, on utilise un Thermomix TM6 Vorwerk (vitesse 3 et 37°C). Le rétentat, soit la matrice de texture, est mélangé pendant 18min et atteint une température de 35°C. Toujours sous agitation, il est refroidi à 30°C par dissipation de la chaleur. La matrice aromatique est alors ajoutée et le rétentat devient alors du pré-fromage. Après entre 3 et 5min d'agitation (vitesse 2) sont progressivement ajoutés le sel et la GDL qui a besoin de 30 min pour diminuer le pH
au pH cible et bien se mélanger à la pâte. Après 30min d'attente, le pré-fromage est plongé dans un bain d'eau froide pour y être refroidi à 25°C. L'emprésurage (25ml / 100kg de rétentat) se fait sous agitation manuelle et les fromages sont moulés dans des moules Flexipan de 11cm de diamètre. Ils sont mis à l'étuve à 25°C pendant 2h puis placés en chambre froide en attendant d'être démoulés le lendemain.

Les fabrications faîtes en salle alimentaire se basent sur des volumes plus petits car le Thermomix a un volume de 2,2 L.

### 3.3.2. Echelle plateforme

Le process à l'échelle de la plateforme est le même que celui à l'échelle de la salle alimentaire mais avec des volumes beaucoup plus grands. De plus, des machines industrielles avec un fonctionnement précis sont utilisées pour la pasteurisation du lait (Actini effet joule), l'ultra filtration (0,02µm) et la production de fromages.

A partir du lait entier pasteurisé (92°C / 2 minutes), on obtient le rétentat (FRV 5,5-5,6) et le perméat par ultrafiltration sur la plateforme lait du STLO via un pilote d'UF (0,02µm) avec 3 membranes en céramique de 19 canaux de 6mm de diamètre interne. La surface membranaire est de 1,08m² et le seuil de coupure est de 15 kDa.

Commenté [MH11]: Peut-être ajouter un tableau avec les différents objectifs des essais

## 4. Résultats et interprétations

Dans cette partie, nous traiterons les résultats des analyses microbiologiques et physico-chimiques faîtes sur les fromages C1 et C2 de chaque fabrication, C1 étant le fromage avec un goût propionique (emmental, noisette), et C2 étant le fromage avec un goût plus prononcé du à l'Hafnia (chou). Tous les essais des semaines 15, 17, 18 et 19 ont eu pour but de préparer l'essai de la semaine 22 où les fromages seront utilisés pour le test hédonique avec 160 consommateurs. On est dans une logique d'amélioration continue de l'essai 1 sem47-21, qui lui avait un C1 avec seulement des NIZO aromatiques (2%) et un C2 avec NIZO (2%), Hafnia (4%), Yarrovia (0,5%). Il n'y avait pas de bactéries propioniques dans cette première fabrication. Nous comparerons d'abord les différentes fabrications entre elles, puis nous ferons une comparaison globale de toutes les fabrications.

* Dem = Démoulage

* Emb = Emballage
Les différents objectifs des essais sont rappelés ci-dessous

<table><caption>Tableau 2 : Objectif des essais FroM'Innov</caption><thead><tr><th>N°Essai</th><th>Essai 1 sem15</th><th>Essai 2 sem17</th><th>Essai 3 sem18</th><th>Essai 4 sem19</th><th>Essai 2 sem22</th></tr></thead><tbody><tr><th>Objectifs</th><td>Voir à partir de quel % de Propio on décelait le goût propio dans C1, et on ne le décèle plus dans C2</td><td>Voir l'incidence d'un traitement thermique sur les ferments NIZO sur le pH des fromages</td><td>Tester l'incidence du % de sel sur le goût des 2 fromages, baisse de 1% à 0,8%</td><td>Régler le problème de post acidification en baissant le pH des ferments NIZO à 3,8, Préparer l'essai sem22</td><td>Fabriquer à une échelle pilote les mêmes fromages que l'essai 4 sem 19</td></tr></tbody></table>

## 4.1. Comparaison essai 1 sem15 – 22 et essai 2 sem17 – 22

<table><caption>Fig 6 : tableau comparatif entre l'essai 1 sem15-22 et l'essai 2 sem17-22</caption><thead><tr><th></th><th></th><th>fab</th><th>pHe</th><th>pHdem (j+1)</th><th>pH j+3</th><th>pH j+6</th><th>pHemb (j+9)</th><th>ESTdem</th><th>ESTemb</th><th>MGdem</th><th>MGemb</th><th>dénomb dem</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">essai 1 sem15-22</td><td>C1</td><td></td><td>5,5</td><td>5,36</td><td></td><td></td><td></td><td>44,62</td><td></td><td>22</td><td></td><td>8,32 10e8</td></tr><tr><td>C2</td><td></td><td>5,52</td><td>5,31</td><td></td><td></td><td></td><td>45,72</td><td></td><td>21,62</td><td></td><td>7,45 10e8</td></tr><tr><td rowspan="2">essai 2 sem17-22</td><td>C1</td><td></td><td>5,74</td><td>5,59</td><td>5,35</td><td>5,48</td><td>4,96</td><td>42,32</td><td>43,31</td><td>18</td><td>18,75</td><td>1,63 10e10</td></tr><tr><td>C2</td><td></td><td>5,84</td><td>5,62</td><td>5,14</td><td>4,85</td><td>4,66</td><td>41,93</td><td>42,42</td><td>18</td><td>19</td><td>5,53 10e9</td></tr></tbody></table>

L'essai 1 sem15-22 et l'essai 2 sem17-22 ont respectivement été faits pendant la semaine n°15 et la semaine n°17 de 2022 soit le 13/04 et le 27/04 2022. Entre la fabrication de l'essai semaine 15 et l'essai semaine 17 a eu lieu la première réunion du projet FroM'Innov concernant les nouveaux essais avec seulement 2 recettes différentes (C1 et C2). Lors de cette réunion, il a été évoqué de faire rentrer le Nutri-score du fromage en considération. Pour le réduire, le lait ultrafiltré a reçu moins de crème que le lait qui a servi pour l'essai semaine 15, ce qui fait alors baisser le taux de matière grasse. Réduction du gras-sur-sec à 40% plutôt que 47% pour l'essai 1 semaine 47-22. Les C1 et C2 semaine 15 sont les premiers fromages à bénéficier d'une recette avec des bactéries propioniques afin d'avoir un goût propionique (noisette) sur C1 mais pas sur C2 (uniquement l'effet probiotique recherché). La quantité de Propiniques dans la recette de C1 est de 8% et, de 3,5% pour C2. L'essai semaine 17 correspond aux fromages n'ayant pas subi de traitement thermique sur les ferments NIZO aromatiques. Il se distingue par rapport aux résultats de l'essai semaine 15 par
un pH plus élevé à l'emprésurage (pHe) ce qui se traduit par une diminution du pH moins importante et donc un gout moins acide. De plus, le taux matière grasse de l'essai semaine 17 est plus faible ce qui se répercute sur le pourcentage d'extrait sec, 2 à 3% plus faible que celui de l'essai semaine 15. Le gras-sur-sec passe alors à 40%. Concernant le dénombrement de bactéries propioniques sur les deux fabrications, nous avons entre 10^8 et 10^9 ufc/g de fromage pour les deux fabrications. Cela garantit un effet probiotique au fromage. On remarque qu'il y a beaucoup plus de bactéries dans l'essai semaine 17 car pour cet essai, j'ai réalisé une culture « fraîche » de bactéries propioniques afin d'apprendre la méthode de repiquage et ensemencement du milieu de culture.

## 4.2. Comparaison essai 2 sem17 - 22 et essai 3 sem18 - 22

<table><caption>Fig 7: tableau comparatif entre l'essai 2 sem17-22 et l'essai 3 sem18-22</caption><thead><tr><th></th><th>fab</th><th>pHe</th><th>pHdem (j+1)</th><th>pH j+3</th><th>pH j+6</th><th>pHemb (j+9)</th><th>ESTdem</th><th>ESTemb</th><th>MGdem</th><th>MGemb</th><th>dénomb dem</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">essai-2-sem17-22</td><td>C1</td><td>5,74</td><td>5,59</td><td>5,35</td><td>5,48</td><td>4,96</td><td>42,32</td><td>43,31</td><td>18</td><td>18,75</td><td>1,63 10e10</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,84</td><td>5,62</td><td>5,14</td><td>4,85</td><td>4,66</td><td>41,93</td><td>42,42</td><td>18</td><td>19</td><td>5,53 10e9</td></tr><tr><td rowspan="2">essai-3-sem18-22</td><td>C1</td><td>5,54</td><td>5,5</td><td>5,42</td><td>5,11</td><td>5,03</td><td>42,66</td><td>47,04</td><td>17,5</td><td>19,5</td><td>1,85 10e9</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,47</td><td>5,47</td><td>5,38</td><td>5</td><td>4,95</td><td>42,85</td><td>46,28</td><td>18</td><td>19,25</td><td>1,3 10e9</td></tr></tbody></table>

L'essai 2 sem17-22 et l'essai 3 sem18-22 ont été fabriqués avec le même rétentat, EST % = 42,32%. Celui-ci provient de l'ultrafiltration réalisée le 26/04/2022. Ils ont donc des caractéristiques physico-chimiques proches au démoulage: EST, MG. Cependant, c'est différent à l'emballage car on voit que l'essai semaine 18 a des valeurs plus hautes que l'essai semaine 17. Ces différences sont dues au pourcentage de sel (1% pour semaine 17 et 0.9% pour semaine 18). Le pourcentage de GDL est lui aussi globalement plus élevé (semaine 17: 1.9%, contre 1.8% pour semaine 18). Les dénombrements de l'essai semaine 18 nous prouvent que l'on reste à environ 10^9 ufc/b pour C1 et C2: l'effet probiotique est donc toujours présent. Pour C1, on a une valeur légèrement plus élevée. Cette différence avec C2 suffit à faire ressortir le goût propionique au-dessus des autres flores aromatiques. En terme de pH, il est encore trop faible pour les deux essais et pour les deux fabrications, cela donne un gout acide aux fromages et modifie négativement leur texture.
### 4.3. Comparaison essai 3 sem 18 -22 et essai 4 sem 19 - 22

<table><caption>Fig 8 : tableau comparatif entre l'essai 3 sem18-22 et l'essai 4 sem19-22</caption><thead><tr><th></th><th>fab</th><th>pHe</th><th>pHdem (j+1)</th><th>pH j+3</th><th>pH j+6</th><th>pHemb (j+9)</th><th>ESTdem</th><th>ESTemb</th><th>MGdem</th><th>MGemb</th><th>dénomb dem</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">essai-3-sem18-22</td><td>C1</td><td>5,54</td><td>5,5</td><td>5,42</td><td>5,11</td><td>5,03</td><td>42,66</td><td>47,04</td><td>17,5</td><td>19,5</td><td>1,85 10e9</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,47</td><td>5,47</td><td>5,38</td><td>5</td><td>4,95</td><td>42,85</td><td>46,28</td><td>18</td><td>19,25</td><td>1,3 10e9</td></tr><tr><td rowspan="2">essai-4-sem19-22</td><td>C1</td><td>5,74</td><td>5,65</td><td>5,62</td><td>5,62</td><td>5,25</td><td>41,52</td><td>46,48</td><td>17,75</td><td>19,5</td><td>3,4 10e7</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,74</td><td>5,65</td><td>5,57</td><td>5,54</td><td>5,33</td><td>41,69</td><td>46,02</td><td>18,12</td><td>19,5</td><td>3,8 10e7</td></tr></tbody></table>

L'essai 4 sem19-22 a lui aussi été préparé avec le rétentat de l'UF du 26/04/2022 ce qui veut dire que les essais des semaines 17, 18 et 19 ont des caractéristiques physico-chimiques similaires. En effet, les EST et matières grasses au démoulage et à l'emballage sont quasi identiques pour les deux essais. La plus grande différence entre les deux essais est le pH. En fait, comme pour l'essai semaine 19, le pH des ferments NIZO a été diminué à 3,8, le pourcentage de GDL ajouté a été réduite à 1,5% (contre 1,8% pour essai semaine 18). De ce fait, la post-acidification due aux ferments NIZO a été grandement réduite. Au final, on a alors un fromage avec un pH au démoulage supérieur à 5,2. C'est une grande avancée si on le compare à celui de l'essai semaine 17 - 22. Il était beaucoup plus faible. La texture et le goût sont donc bien moins acide et le fromage est meilleur. Cette « pré-acidification » des ferments NIZO sera réutilisée pour la préparation de l'essai semaine 22.

Commenté [MH12]: Mettre la valeur

### 4.4. Comparaison essai 4 sem19 - 22 et essai 2 sem22 - 22

<table><caption>Fig 9 : tableau comparatif entre l'essai 4 sem19-22 et l'essai 2 sem22-22</caption><thead><tr><th></th><th>fab</th><th>pHe</th><th>pHdem (j+1)</th><th>pH j+3</th><th>pH j+6</th><th>pHemb (j+9)</th><th>ESTdem</th><th>ESTemb</th><th>MGdem</th><th>MGemb</th><th>dénomb dem</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">essai-4-sem19-22</td><td>C1</td><td>5,74</td><td>5,65</td><td>5,62</td><td>5,62</td><td>5,25</td><td>41,52</td><td>46,48</td><td>17,75</td><td>19,5</td><td>3,4 10e7</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,74</td><td>5,65</td><td>5,57</td><td>5,54</td><td>5,33</td><td>41,69</td><td>46,02</td><td>18,12</td><td>19,5</td><td>3,8 10e7</td></tr><tr><td rowspan="2">essai-2-sem22-22</td><td>C1</td><td>5,72</td><td>5,56</td><td>5,36</td><td>5,2</td><td>5</td><td>44,31</td><td>44,83</td><td>20,5</td><td>21,25</td><td>1,81 10e9</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,65</td><td>5,61</td><td>5,27</td><td>5,15</td><td>4,91</td><td>44,69</td><td>45,45</td><td>20,5</td><td>21,75</td><td>1,13 10e9</td></tr></tbody></table>

L'essai 2 sem22 - 22 permettra de fabriquer les fromages utilisés pour le test sensoriel à Dijon. Ils ont été fabriqués avec du rétentat frais venant de l'ultra filtration réalisée le 31/05 au matin.

Les fromages de l'essai 2 sem22-22 ont été fabriqués selon le même process que ceux de l'essai 4 sem19-22 mais à une échelle différente. L'essai sem19 a été produit à petite échelle (Thermomix) et en petite quantité (2 fromages pour chaque fabrication). L'essai sem22 a lui été produit au cutter Stephan (détaillé dans matériel et méthodes) afin de fabriquer 48 fromages de chacune des 2 combinaisons réalisées, C1 et C2. Par rapport à l'essai
semaine 19, l'essai semaine 22 a un pH plus faible, environ 0,3 unité pH en moins pour les deux fabrications. Cependant à la dégustation, les essais semaine 22 ont un fort arôme. C1 a l'arôme propionique et C2, celui d'Hafnia, ce qui masque l'acidité du fromage. De plus, d'après les dénombrements de bactéries propioniques, on reste bien dans l'intervalle 10^8 à 10^9 ufc/g de fromage. Les fromages produits ont bien l'effet probiotique recherché (souche de Propionibacterium freudenreichii CIRM-BIA 129 avec des effets probiotiques démontrés). La différence de 0.78x10^9 entre C1 et C2 semaine 22 suffit à avoir un goût propionique sur le C1 et pas sur le C2 tout en gardant l'effet Probiotique.

### 4.5. Comparaison globale de tous les essais

<table><thead><tr><th></th><th>fab</th><th>pHe</th><th>pHdem (j+1)</th><th>pH j+3</th><th>pH j+6</th><th>pHemb (j+9)</th><th>ESTdem</th><th>ESTemb</th><th>MGdem</th><th>MGemb</th><th>dénomb dem</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">essai 1 sem15-22</td><td>C1</td><td>5,5</td><td>5,36</td><td></td><td></td><td></td><td>44,62</td><td></td><td>22</td><td></td><td>8,32 10e8</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,52</td><td>5,31</td><td></td><td></td><td></td><td>45,72</td><td></td><td>21,62</td><td></td><td>7,45 10e8</td></tr><tr><td rowspan="2">essai 2 sem17-22</td><td>C1</td><td>5,74</td><td>5,59</td><td>5,35</td><td>5,48</td><td>4,96</td><td>42,32</td><td>43,31</td><td>18</td><td>18,75</td><td>1,63 10e10</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,84</td><td>5,62</td><td>5,14</td><td>4,85</td><td>4,66</td><td>41,93</td><td>42,42</td><td>18</td><td>19</td><td>5,53 10e9</td></tr><tr><td rowspan="2">essai-3 sem18-22</td><td>C1</td><td>5,54</td><td>5,5</td><td>5,42</td><td>5,11</td><td>5,03</td><td>42,66</td><td>47,04</td><td>17,5</td><td>19,5</td><td>1,85 10e9</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,47</td><td>5,47</td><td>5,38</td><td>5</td><td>4,95</td><td>42,85</td><td>46,28</td><td>18</td><td>19,25</td><td>1,3 10e9</td></tr><tr><td rowspan="2">essai-4 sem19-22</td><td>C1</td><td>5,74</td><td>5,65</td><td>5,62</td><td>5,62</td><td>5,25</td><td>41,52</td><td>46,48</td><td>17,75</td><td>19,5</td><td>3,4 10e7</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,74</td><td>5,65</td><td>5,57</td><td>5,54</td><td>5,33</td><td>41,69</td><td>46,02</td><td>18,12</td><td>19,5</td><td>3,8 10e7</td></tr><tr><td rowspan="2">essai-2 sem22-22</td><td>C1</td><td>5,72</td><td>5,56</td><td>5,36</td><td>5,2</td><td>5</td><td>44,31</td><td>44,83</td><td>20,5</td><td>21,25</td><td>1,81 10e9</td></tr><tr><td>C2</td><td>5,65</td><td>5,61</td><td>5,27</td><td>5,15</td><td>4,91</td><td>44,69</td><td>45,45</td><td>20,5</td><td>21,75</td><td>1,13 10e9</td></tr></tbody></table>

Fig 10 : tableau comparatif entre l'essai 1 sem15-22, l'essai 2 sem17-22, l'essai 3 sem18-22, l'essai 4 sem19-22, et l'essai 2 sem22-22

D'après ce tableau, on peut voir une amélioration des essais entre la semaine 17 et la semaine 22 par exemple. D'abord, au niveau du pH, ceux de la semaine 22 sont plus élevés que ceux de la semaine 17, de 0.04 pour C1 et de 0.25 pour C2. Cependant, l'essai avec les meilleurs pH est celui de la semaine 19, avec des pH de C1=5.25 et C2=5.33. les fromages ont une très bonne texture et peu de goût acide. Mais, c'est aussi sur l'essai de la semaine 19 qu'il y a le moins de bactéries propionique par rapport aux autres essais : 10 à 100 fois moins !
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Fig 11 : Courbe comparative de l'évolution des pH de C1 de chaque essais en fonction du temps</figcaption></figure>

Selon la courbe de l'évolution de pH des PM C1 en fonction du temps on voit que tous les fromages excepté l'essai 4 sem 19-22 se place entre 4,9 et 5,0 unité pH à J+9. Et le meilleur pH se situant à environ 5,3, c'est l'essai sem 19 qui est le plus avantageux avec un pH à 5,25.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Fig 12 : Courbe comparative de l'évolution des pH de C2 de chaque essais en fonction du temps</figcaption></figure>

De même pour les PM C2, le meilleur pH reste celui de l'essai 4 semaine 19-22 avec un pH de 5,33.
4.6. Conclusion partie résultats

Pour conclure cette partie résultats, on peut déjà reprendre l'essai 1 sem15-22 qui avait pour but de démontrer l'impact du pourcentage de bactéries propioniques sur les fromages. On remarque que le changement principal se fait dans le dénombrement de ces bactéries qui dans le fromage avec un pourcentage plus faible (C2) sont moins nombreuse que dans C1. Cette différence donne 2 pâtes molles avec un effet probiotique car on reste sur 10^9 ufc/g, mais C1 a un gout propionique et C2 ne l'a pas. Ensuite concernant l'évolution du pH, le fait d'avoir baisser le pH des ferments NIZO avec de l'acide lactique sur l'essai 4 sem19-22 était une bonne chose car cela a permis de régler en partie le problème de la post-acidification des fromages. On a alors un fromage moins acide avec un arome plus prononcé et une texture moins cassante plus proche d'un fromage du commerce. Cela s'est poursuivi sur l'essai 1 sem22-22 qui a servi pour le test sensoriel. Concernant l'évolution du taux de matière grasse à l'emballage (j+9), on garde une cohérence sur la semaine 17, 18 et 19 avec une teneur d'environ 19%. Ce qui est logique car ces trois essais ont été fabriqués avec le même rétentat (EST=42.32%).

En définitive, nous avons une amélioration notable des pâtes molles sur le pH, sur le goût, ce qui est lié au pH car l'acidité masquait les arômes. Sur le nombre d'ufc/g, resté globalement constant (10^9) sur les essais ce qui est cohérent avec le goût des fabrications. A terme de ces améliorations, le but est de faire le test sensoriel avec les fromages de l'essai 2 sem22 - 22 et d'en exploiter les résultats afin de déterminer l'acceptabilité de l'innovation vis-à-vis du consommateur.
## Conclusion

Mon stage avait pour but de s'inscrire dans une démarche d'amélioration d'un fromage en exploitant une partie des résultats d'un test sensoriel sur un essai préalable. Il devait répondre à la problématique suivante : Quelle est l'acceptabilité du consommateur vis-à-vis de l'innovation à partir d'un fromage réalisé à partir d'une technologie de rupture.

Pour répondre à cette question, plusieurs axes de recherches ont été abordés, notamment l'aspect santé du produit avec le Nutri-score et l'effet probiotique mais aussi la qualité organoleptique avec le goût, la texture et l'aspect visuel. Pour modifier l'aspect santé des fromages, la stratégie a été de se baser sur le nutri-score. Car en obtenant un nutri-score plus faible que les fromages à pâtes molle du commerce, le consommateur est attiré. Des mesures de changement du taux de matière grasse et de sel se sont faîtes et cela a permis de faire passer les fromages en Nutri-score C. L'aspect probiotique du fromage a été plus facile à mettre en place car en ajoutant un pourcentage de souche propionique aux effets probiotiques démontrés, on obtenait facilement 10^9 ufc/g de fromage. Cette concentration permet une action probiotique. Pour le goût et la texture, Il a été décidé suite au test hédonique et aux recherches faîtes par Vincent Chassagnard pendant son stage, d'introduire des bactéries propioniques dans les fabrications C1 et C2, pour ajouter un véritable arôme à C1 et donner un effet probiotique à C2 mais sans le goût propionique. De surcroît, les recherches ont mené vers un traitement acide sur les ferments NIZO afin de limiter la post-acidification qui était responsable du masquage du goût aromatique par l'acidité et à la texture trop ferme et cassante. Une fois cela fait (essai 4 sem19-22), les pH des deux fabrications ont augmenté à l'emballage, et à la dégustation les fromages avaient une meilleure texture (plus fondante) et un fort arôme. Toutes ses recherches étaient dans l'optique de préparer le deuxième test sensoriel du projet qui s'est déroulé en juin 2022, avec des fromages fabriqués cette fois à une échelle plus grande : l'échelle Pilote de la plateforme du STLO. Afin que les consommateurs puissent apprécier au maximum de l'innovation que FroM'Innov apporte au monde de la production du fromage.

Au terme de mon stage au STLO, j'ai beaucoup appris sur le fonctionnement du travail en entreprise et dans les domaines scientifiques sur lesquels j'ai travaillé. Particulièrement en microbiologie, où être rapide tout en étant concentré est difficile. J'ai alors appris à m'organiser autour d'une « heure limite » pour dénombrer le plus rapidement et méticuleusement possible. En plus de la méthode, j'ai acquis des connaissances sur les ferments aromatiques des fromages avec leurs effets macroscopiques sur le produit. De surcroît, j'ai énormément appris sur la réalisation d'analyses physico-chimiques où j'ai été formé par Françoise Boissel. J'ai donc pu être autonome sur les différentes missions qui m'ont été confiées. Enfin, j'ai pu échanger avec diverses personnes aux parcours différents, telles que des stagiaires comme moi ou même des chercheurs travaillant à l'INRAE.
# Annexes

## Annexe 1 : Fiche projet semaine 22, fp-essai-2-sem22-22

N° Projet : 22-009

N° Essai : essai-2-sem12-22

Nom du projet : From'Innov-Syalsa

Responsable du projet : MHO et GG

Date de rédaction : 17/05/22

Rédacteur : MHO

Diffusion : GG, GL, LA, FB, AL et MHO

Confidentialité : oui

### Partie 1 : Description générale du projet.

#### 1.1. Contexte du projet (enjeux socio-économique, problématique)

Fromages Modèles Innovants pour construire la qualité d'un aliment (FroM'Innov) est un nouveau procédé de technologie fromagère mis au point et breveté par INRAE qui permet de découpler les éléments constitutifs de la construction de la qualité du produit, en substituant aux grandes étapes de la fromagerie (maturation des laits, caillage, égouttage/acidification, salage, affinage) des étapes plus simples d'assemblage de matrices de texture et d'aromatisation. D'un côté, les bénéfices nutritionnels et environnementaux, ou encore la réduction des coûts de production par rapport aux procédés et produits standards, peuvent favoriser son adoption par les consommateurs et les filières. D'un autre côté, les possibles modifications sur le plan sensoriel, ainsi que la rupture technologique qui peut être perçue comme une perte de « naturalité » par les consommateurs, peuvent limiter sa diffusion sur les marchés. L'objectif du projet est d'analyser ces tensions, et d'évaluer sous quelles conditions une innovation de cette nature peut contribuer au développement de produits générant des bénéfices de santé et environnementaux, de façon compatible avec les préférences des consommateurs et les attentes des filières. La démarche envisagée combine différentes étapes : le développement d'un nouveau fromage issu de cette technologie avec des améliorations nutritionnelles par rapport aux produits équivalents standards du marché ; la réalisation d'expérimentations auprès de consommateurs, incluant des dimensions sensorielles et économiques, pour mesurer leurs préférences vis-à-vis de ces produits ; des entretiens auprès d'acteurs des filières pour évaluer les conditions d'adoption de ce type de procédés par les entreprises ; des évaluations coûts-bénéfices visant à préciser les conditions d'entrée (prix et parts de marché) de ces produits sur le marché. L'analyse fournira ainsi des éléments d'aide à la décision pour les entreprises et précisera les conditions d'adoption de ce type d'innovations par les consommateurs. De façon plus générale, le projet contribuera à l'élaboration d'une méthodologie pour la conception et l'évaluation multicritère d'une innovation de procédés alimentaires intégrant les préférences des consommateurs et des acteurs des filières.

Dans cet essai, seront réalisées deux combinaisons de pâtes molles à croûte fleurie : une pâte molle avec un goût fortement propionique et une autre avec un goût typé (celle définie dans l'essai-1-sem47-21). Cette seconde PM comportera également des bactéries propioniques mais son goût caractéristique (arôme propionique, noisette) ne devra pas être perçu. Dans ces 2 PM, l'effet probiotique des bactéries propioniques sera recherché. Le stage de Luc Aubert (action 22-009) a permis d'obtenir ces caractéristiques dans nos deux pâtes molles mais également d'apporter des améliorations aux fromages produits lors de l'essai-1-sem47-21 : obtenir une texture plus souple dans le produit innovant ne comportant que du ferment NIZO, abaisser le taux de sel (de 1 à 0,8%) et réduire l'aspect gras/collant du produit typé (obtenir un G/S = 45% =.

La matrice de texture utilisée sera le rétentat fabriqué le mardi 31 mai de la semaine 22-22.
Les ferments utilisés seront les espèces définies dans le brevet From'Innov : ferment « NIZO » (Lactococcus lactis var. diacetylactis), Yarrovia lipolytica (YI), Hafnia alvei (Ha) et Propionibacterium freudenreichii (Pf).

Les souches utilisées (Hafnia alvéi 1823 et Yarrovia lipolytica 183T) seront celles définies lors du stage de Vincent Chassagnard (action 19-037) et les milieux de pré-culture et de culture seront ceux qui ont été optimisés lors du stage de Gloria Arias-Fraga (cf. Cahier de laboratoire n° 2019-46 - FI2).

La seule souche de Propionibactérium freudenreichii du CIRM-BIA reconnue posséder des propriétés probiotiques est la souche CIRM-BIA 129. Quelques améliorations ont été apportées aux milieux de pré-culture et de culture (rétentat 3) afin d'obtenir un taux de 10⁹ ufc/g de fromage, concentration qui nous permet de d'affirmer que nos produits ont un effet probiotique.

Pour le ferment NIZO aromatique, c'est différent. Il proviendra d'une société partenaire.

**1.2. Objectifs/Résultats attendus/valorisation prévue (scientifiques, brevet, publi socio-économique ...)**

Oui : publications socio-économiques.

**1.3. Planification générale du projet (début, étapes scientifiques, délivrables, fin, dates d'essais si connues.**

L'essai est planifié semaine 22, du 30/05 au 3/06/2022.

**1.4. Personnel concerné**

GL, GG, LA, FB, AL et MHO

**Partie 2 : Description détaillée du projet.**

**2.1. Protocole expérimental**

**2.1.1. A jour J-1**

o Préparation des matériels

- Nettoyage des matériels (Actini, écrèmeuse et ligne réception)

- Nettoyage du pilote de 2m²

- Nettoyage des moules Flexiplan et plateaux inox lyoph

- Nettoyage salle AP5

- Pesée des ingrédients

- Préparation de la salle AP5

o Préparation de la matière première

- Pasteurisation du lait à 92°C/2 minutes
- Ecrémage du lait

- Standardisation du lait à un G/S de 45%

### 2.1.2. A jour J

- Réchauffage du lait à 50°C

- Ultrafiltration à FRV 5,7

- Récupération du rétentat

- Fabrication des 2 types de PM dans le Stéphan

- Mettre dans salle AP5 à 25°C

- Mettre le hâloir AP7-b à 15°C / 95% d'HR

#### ○ Préparation des fromages

- Refroidir le rétentat à 30°C

- Ajouter les ferments et flore de surface (1/3 PC et 2/3 GC)

- Ajouter le sel et la GDL

- Ajouter du rocou si besoin (pâte légèrement jaune)

- Refroidir à 25°C

- Emprésurer 20ml/100 : pHe = 5,6 ; Te = 25°C

- Conditionner en moule Flexipan

- Incuber à 25°C/2h

- Stocker à 4°C (AP10) toute la nuit

### 2.1.3. A jour J+1

- Démouler les fromages

- Mettre en affinage dans hâloir d'affinage 2j/15°C/95% HR puis 6-7 j/12°C/95% HR

### 2.1.5 A jour J+6 ou J+7

- Refroidir les produits à 4°C

- Emballer des fromages dans papier camembert paraffiné

- Les sur-emballer dans une boîte à camembert

## 2.2. Protocole expérimental détaillé

### 2.2.1. Combinaisons en ferments des différents produits :
<table><thead><tr><th>Ferments<br>Identification des<br>essais</th><th>Nizo<br>aromatique</th><th>Hafnia<br>alvéi</th><th>Yarrovia<br>lipolytica</th><th>Poropionibacterium<br>freudenreichii</th><th>Geotrichum<br>candidum<br>(Geo 13)</th><th>Penicillium<br>candidum<br>(PC neige)</th></tr></thead><tbody><tr><td>C1</td><td>x</td><td>-</td><td>-</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>C2</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr></tbody></table>

L'objectif de l'EST au démoulage est de 44%.

### 2.2.2. Diagramme de fabrication

<table><thead><tr><th>Identification des essais</th><th>Référence</th><th>C1</th><th>C2</th></tr></thead><tbody><tr><td>Récupération du rétentat</td><td></td><td colspan="2">en bassine et transfert dans la salle Stéphan</td></tr><tr><td>Quantité totale (%)</td><td></td><td colspan="2">100</td></tr><tr><td>Quantité rétentat +/- perméat(%)</td><td></td><td colspan="2">de 87,7 à 97,7</td></tr><tr><td>Refroidissement rétentat (°C)</td><td></td><td colspan="2">30°</td></tr><tr><td>Ajout ferments</td><td></td><td colspan="2">10% au total</td></tr><tr><td>Ajout flore de surface</td><td></td><td colspan="2">2 doses / 100kg de rétentat (2/3 de GC et 1/3 de PC)</td></tr><tr><td>NaCl (%) + GDL (%) +</td><td></td><td colspan="2">0,8 1,5</td></tr><tr><td>Durée incubation (min) / T (°C)</td><td></td><td colspan="2">30 / 27°</td></tr><tr><td>Emprésurage Te / pHe</td><td></td><td colspan="2">25°C +/-0,1°C / 5,6 +/- 0,1</td></tr><tr><td>Dose EP (ml/100L)</td><td></td><td colspan="2">20 ml extrait de pré pressure Carlin (520mg de chymosine/litre) /100 kg de rétentat</td></tr><tr><td>T°incubat° (°C) / durée (minutes)</td><td></td><td colspan="2">25°C / 2 h</td></tr><tr><td>T refroid (°C) / 15 h</td><td></td><td colspan="2">4°C / 15 h</td></tr><tr><td>Démoulage pH /T (°C)</td><td></td><td colspan="2">de 5,3 +/- 0,1 / 6°C</td></tr><tr><td>Affinage durée / T°</td><td></td><td colspan="2">2 jours / 15°C / 95% HR puis 6-7 jours / 12°C / 95% HR</td></tr><tr><td>Emballage</td><td></td><td colspan="2">quand flore de surface satisfaisante</td></tr></tbody></table>
Stockage

$T \le 4^{\circ}\mathrm{C}$

<table><thead><tr><th>Identification des essais C1</th><th>Réf (%)</th><th>Qtés à peser (kg)</th><th>C1(%)</th><th>Qtés à peser (kg)</th><th>C2 (%)</th><th>Qtés à peser (kg)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Quantité totale (%) / combinaison</td><td>100</td><td>1</td><td>100</td><td>15</td><td>100</td><td>15</td></tr><tr><td>Quantité rétentat (%) / combinaison</td><td>97,7</td><td></td><td>87,7</td><td></td><td>87,7</td><td></td></tr><tr><td>Refroidissement (°C)</td><td>30</td><td>-</td><td>30</td><td>-</td><td>30</td><td></td></tr><tr><td>Ferments (%)</td><td></td><td></td><td>2% N<br>8% Pf</td><td>0,3<br>1,2</td><td>2% N<br>4% Ha<br>0,5% YI<br>3,5% Pf</td><td>0,3<br>0,6<br>75g<br>0,525</td></tr><tr><td>Ajout flore de surface</td><td>2d/100kg mix</td><td>3d/100ml (0,67ml)</td><td>2d/100kg mix</td><td>3d/100 ml (10ml)</td><td>2d/100kg mix</td><td>3d/100 ml (10ml)</td></tr><tr><td>NaCl (%) + GDL (%) +</td><td>0,8<br>1,5</td><td>8g<br>15g</td><td>0,8<br>1,5</td><td>120g<br>225g</td><td>0,8<br>1,5</td><td>120g<br>225g</td></tr><tr><td>Temps d'attente (min)</td><td>30</td><td>-</td><td>30</td><td>-</td><td>30</td><td>-</td></tr><tr><td>Durée mélange (min) / T (°C)</td><td>30 / 26-27°</td><td>-</td><td>30 / 26-27°</td><td>-</td><td>30 / 26-27°</td><td>-</td></tr><tr><td>pHe / Te</td><td>5,6-5,7 / 25°</td><td>-</td><td>5,6-5,7 / 25°</td><td>-</td><td>5,6-5,7 / 25°</td><td>-</td></tr><tr><td>EP (mL/100L)</td><td>20ml / 100kg</td><td>0,2 ml</td><td>20ml / 100kg</td><td>3 ml</td><td>20ml / 100kg</td><td>3 ml</td></tr><tr><td>T incubat° (°C) / durée (minutes)</td><td>25° / 2h</td><td>-</td><td>25° / 2h</td><td>-</td><td>25° / 2h</td><td>-</td></tr><tr><td>T refroid (°C) / 1 nuit</td><td>&lt;6° / 15h</td><td>-</td><td>&lt;6° / 15h</td><td>-</td><td>&lt;6° / 15h</td><td>-</td></tr><tr><td>Démoulage à J+1 pH / T (°C)</td><td>5,4-5,5 / &lt;6°</td><td>-</td><td>5,4-5,5 / &lt;6°</td><td>-</td><td>5,4-5,5 / &gt;6°</td><td>-</td></tr><tr><td>Affinage</td><td>15°C/2j/95% HR<br>12°C/xjours/ 95% HR</td><td>-</td><td>15°C/2j/95% HR<br>12°C/xjours/ 95% HR</td><td>-</td><td>15°C/2j/95% HR<br>12°C/xjours/ 95% HR</td><td>-</td></tr></tbody></table>

### 3. Répartition du travail

<table><thead><tr><th>QUI</th><th>fait QUOI</th><th>QUAND</th></tr></thead><tbody><tr><td>GL</td><td>Nettoyage de la ligne prépa laits</td><td>25/05 aprem</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>GL</td><td>Nettoyage du hâloir AP7-b</td><td>25/05</td></tr><tr><td>GL</td><td>Appro lait (320kg de lait entier)</td><td>30/05 matin</td></tr><tr><td>GL, GG</td><td>Pasto, écrémage</td><td>30/05 matin</td></tr><tr><td>GL</td><td>Nettoyage ligne pasto/écrémage</td><td>30/05 aprem</td></tr><tr><td>GL</td><td>Nettoyage de la salle Stéphan et Stéphan</td><td>30/05 aprem</td></tr><tr><td>MHO</td><td>Nettoyage UF</td><td>30/05 matin</td></tr><tr><td>FB</td><td>Analyse MG lait et crème</td><td>30/05 fin de matinée</td></tr><tr><td>MHO</td><td>Standardisation MG</td><td>30/05 début aprem</td></tr><tr><td>LA</td><td>Lecture des boîtes dénombrement Pf</td><td>30/05 matin</td></tr><tr><td>LA</td><td>Prépa salle AP5, plateaux inox + moules Flexipan</td><td>30/05 matin</td></tr><tr><td>LA</td><td>Pesée des ingrédients, ferments</td><td>30/05 aprem</td></tr><tr><td>GL, MHO et LA</td><td>Réchauffage + Ultrafiltration</td><td>31/05 matin</td></tr><tr><td>GL, GG, LA et MHO</td><td>Réalisation fabrication</td><td>31/05 aprem</td></tr><tr><td>GL, MHO et LA</td><td>Démoulage des PM + mise en hâloir AP7-b</td><td>1/06 matin</td></tr><tr><td>MHO</td><td>Prélèvement et des échantillons</td><td>1/06 matin</td></tr><tr><td>LA</td><td>Dénombrement Pf</td><td>1/06 matin et 9/06 matin</td></tr><tr><td>MHO, GL et LA</td><td>Emballage PM</td><td>8/05 matin ou 9/05 matin</td></tr><tr><td>MHO, GL et LA</td><td>Suremballage</td><td>8/05 aprem ou 9/05 aprem</td></tr><tr><td>FB, AL, LA</td><td>Analyses physico-chimiques</td><td>sem 24 (lundi 30/05, mardi 31/05 et mercredi 1/06) et sem 23</td></tr></table>

4. Echantillonnage (tableau qui peut être utilisé pour l'étiqueteuse)

Date de réception : sem 22 et 23

Additif : oui/non Produit utilisé : -

<table><thead><tr><th>Nom échantillon</th><th>N° échantillon</th><th>Microbio Labocea</th><th>Microbio Pf</th><th>pH</th><th>T°C</th><th>EST</th><th>MG</th><th>MAT</th><th>Ca</th><th>Cl-</th></tr></thead><tbody><tr><td>lait écrémé</td><td>1</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crème</td><td>2</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lait standardisé</td><td>3</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>rétentat</td><td>4</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>perméat</td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>réf</td><td>6</td><td>x</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1-dem</td><td>7</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>C2-dem</td><td>8</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td>x</td></tr><tr><td>C1-emb</td><td>9</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>C2-emb</td><td>10</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>Témoin</td><td>11</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td></tr><tr><td>ferment Pf</td><td>12</td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ferment Nizo</td><td>13</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ferment Hafnia</td><td>14</td><td></td><td></td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td>x</td><td></td><td></td></tr></table>

## 5. Conservation des échantillons.

Responsable du stockage : FB et AL

## 6. Analyse des risques (facultative)

Les descriptions ci-dessous sont des exemples et peuvent être supprimées, remplacées ou complétées

<table><thead><tr><td>Description du risque</td><td>Niveau de l'impact</td><td>Actions immédiates</td><td>Actions préventives</td></tr></thead><tbody><tr><td>Absence Budget</td><td>Faible- Fort</td><td>Report/abandon/ Autre financeur<br>Autre :</td><td>Description :</td></tr><tr><td>Absence personnel</td><td>Faible - Fort</td><td>Abandon/ Report /Remplacement<br>Autre :</td><td>Description :</td></tr><tr><td>Matière première défectueuse</td><td>Faible-Fort</td><td>Report/Abandon/Autre fournisseur<br>Autre :</td><td>Description :</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Matériel défectueux</td><td>Faible- Fort</td><td>Report /Abandon/Réparation immédiate<br/>Autre :</td><td>Description :</td></tr><tr><td>Autres risques...</td><td>Faible- Fort</td><td></td><td>Description :</td></tr></table>

Annexe 2 : Les probiotiques

Les probiotiques sont des micro-organismes utiles qui constituent la flore buccale, intestinale et vaginale. Leur présence permet notamment de contrer la prolifération des micro-organismes nuisibles qui peuvent, par exemple, provoquer des diarrhées infectieuses ou des vaginites. Les probiotiques contribuent également à la digestion des aliments. Plus particulièrement, il est établi que les produits laitiers fermentés, comme le yogourt, facilitent la digestion du lactose¹, notamment chez les personnes qui y sont intolérantes. Les suppléments de certains probiotiques, les lactobacilles notamment, ont aussi cet effet, mais à un degré moindre. Les bactéries lactiques comptent parmi les principaux probiotiques. Leur nom générique vient du fait qu'elles produisent de l'acide lactique. Elles comprennent, notamment, les lactobacilles (bactéries du genre *Lactobacillus*), les bifidobactéries (bactéries du genre *Bifidobacterium*) et certains streptocoques (bactéries du genre *Streptococcus*) et les bactéries Propionoques dont certaines souches sont probiotiques (*Propionibacterium freudenreichii*). Ce sont des bactéries de ce type qui servent généralement à la production du yogourt (*Lactobacillus bulgaricus*, *Streptococcus thermophilus*), de la choucroute, des légumes lactofermentés et du salami (*Lactobacillus plantarum*).

Commenté [MH13]: Mettre en annexe 2
Références bibliographiques :

G. Arias Fraga, (2020), Optimisation de la base aromatique dans le cadre du projet FroM'Innov, Mémoire de fin d'étude,

INRAE, (2021), MP SYALSA, Appel à manifestation d'intérêt SYALSA 2021 – consortia interdisciplinaires et projet exploratoires –

V.Chassagnard, (2019), Optimisation d'arôme à partir de micro-organisme en milieux laitiers, Mémoire de stage, Université de Rennes 1.

INRAE, (2021), Proposition de projet exploitatoire, FroM'Innov : Fromages Modèles Innovants pour construire la qualité d'un aliment

INRA-Agrocampus, STLO,(2008), Lait et produits laitiers, Préparation des échantillons et des dilutions en vue d'une analyse microbiologique

INRA-Agrocampus, STLO,(2008), Lait et produits laitiers, Dénombrement de la flore propionique revivifiable

INRA-Agrocampus, STLO,(2009), Fromages : Détermination de la teneur en matière grasse Méthode acido-butyrométrique de Van Gulik

INRA-Agrocampus, STLO,(2009), Fromages : Détermination de la teneur en azote soluble à pH 4.4 et détermination de la teneur en azote non protéique

INRA-Agrocampus, STLO,(2009), Fromages et fromages fondus : Détermination de l'extrait sec, méthode par étuvage

INRA, (1994), A. Thierry, MN. Madec, R. Richoux, Croissance des bactéries propioniques dans le fromage : comparaison de 2 milieux de dénombrement
Analyschim, (2011), Dosage de l'azote total par méthode de Kjeldahl

Norme NF ISO 11261, (1995), Dosage de l'azote total du sol

M. Harel-Oger, G. Garric, (2020), IAA Filière lait et produits laitiers : La technologie fromagère : de la tradition aux technologies de rupture

Santé publique France, (2022), Nutri-Score,
https://www.santepubliquefrance.fr/determinants-de-sante/nutrition-et-activite-
physique/articles/nutri-score

Ph.D.S. Bastianetto, L'équipe Passeport Santé, (2014), Les Probiotiques,
https://www.passeportsante.net/fr/Solutions/PlantesSupplements/Fiche.aspx?doc=probioti-
gues_ps

INARE, Nous connaître, (2020), https://www.inrae.fr/nous-connaitre

AERES, Critères d'identification des chercheurs et enseignants-chercheurs"publiants",
(2010), http://www.aedres.fr/pdf/AERES_CriteresIdentificationPubliants.pdf

UMR STLO, Organisation, (2022), https://www6.rennes.inrae.fr/stlo/UMR-
STLO/Organisation

Méthode OIV-MA-BS-09, (2009), Détermination de l'extrait sec total par gravimétrie
https://www.oiv.int/public/medias/2636/oiv-ma-bs-09.pdf
Résumé

Le procédé FroM'Innov est un procédé innovant breveté en décembre 2015. Celui-ci permet
de fabriquer des fromages selon un procédé qui ne nécessite ni égouttage ni affinage.
Cette technologie repose sur l'assemblage d'une matrice de texture et d'une matrice
aromatique. Cette dernière est constituée de plusieurs cultures de micro-organismes
producteurs d'arômes notamment Yarrovia lipolytica (YI), Hafnia alvei (Ha) et
Propionibacterium freudenreichii (Pf) et des ferments NIZO. L'objectif de cette étude était
d'améliorer un essai déjà existant, créé en amont avec le procédé FroM'Innov. Au fil des
semaines, de nouvelles formulations de fromages sont faîtes avec à chaque fois une
amélioration par rapport à la précédente. Et ce afin d'obtenir deux types de fromages : C1 et
C2, pouvant concurrencer les fromages à pâte molle déjà implanté dans le commerce de par
leur goût, leur texture, mais aussi par leurs effets sur la santé. Ce projet s'inscrit dans le méta-
programme Syalsa qui a pour but de fabriquer des aliments de qualité en tout point.

Mots clés : Fromage, micro-organismes, production, rétentat, arôme, innovation