# Application de la technique de double marquage à la mise en évidence du neuropeptide substance P dans l'innervation sensitive du tractus génital male chez le rat

S. Gougis

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S. Gougis. Application de la technique de double marquage à la mise en évidence du neuropeptide substance P dans l'innervation sensitive du tractus génital male chez le rat. Cahier des Techniques de l'INRA, 1998, 40, pp.25-44. hal-04690739

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APPLICATION DE LA TECHNIQUE DE DOUBLE MARQUAGE À LA MISE EN ÉVIDENCE DU NEUROPEPTIDE SUBSTANCE P DANS L'INNERVATION SENSITIVE DU TRACTUS GÉNITAL MÂLE CHEZ LE RAT.

S. Gougis

Laboratoire de Neurobiologie des Fonctions Végétatives, Bâtiment 325, I.N.R.A.,
78352 Jouy-en Josas Cedex, France.

**I. Introduction**

Le laboratoire de Neurobiologie des Fonctions Végétatives étudie la motricité génitale chez les mammifères et son contrôle par le système nerveux autonome et les hormones stéroïdes sexuelles. Nous utilisons couramment l'érection chez le rat mâle comme modèle de motricité génitale. Au cours de la copulation l'érection apparaît comme une réponse réflexe à la stimulation génitale. Le réflexe a pour point de départ une action exercée sur les organes génitaux. Cette action est transformée en influx nerveux conduit par le nerf dorsal du pénis (NDP), nerf sensitif, vers la moelle épinière. Dans la moelle cette information afférente est transmise aux neurones qui commandent la motricité des organes génitaux, leur vascularisation et les muscles striés qui leur sont associés. Nous avons montré l'existence d'un réflexe proérectile chez le rat anesthésié: la stimulation électrique appliquée au nerf dorsal du pénis provoque une augmentation de pression dans les corps caverneux, signe objectif de l'érection (Rampin et al., 1994). Les fibres
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<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1: Représentation schématique des réflexes qui commandent la motricité génitale chez le rat mâle.</figcaption></figure>

A: La voie afférente matérialisée par le NDP transmet des informations issues du gland vers la moelle épinière. Les fibres nerveuses du NDP empruntent le NHs. Les corps cellulaires de cette voie afférente sont présents dans le ganglion rachidien L6. Dans la moelle épinière, un interneurone transmet l'information afférente aux motoneurones innervant les muscles striés du plancher pelvien. Les axones de ces motoneurones cheminent dans le NHm. La stimulation du gland provoque la contraction des muscles striés pelviens (réflexe somato-somatique).

B: la même voie afférente active par l'intermédiaire d'un interneurone d'autres motoneurones, préganglionnaires autonomes. Les axones de ces motoneurones cheminent dans le NP et entrent en relation par des synapses avec les neurones du GPM. Ces neurones post ganglionnaires innervent les corps caverneux en empruntant le NC. La stimulation du gland provoque la relaxation des fibres musculaires lisses des corps caverneux, aboutissant à l'érection (réflexe somato-visceral).
nerveuses du nerf dorsal du pénis, dont les corps cellulaires sont présents dans le ganglion rachidien lombaire L6, constituent la branche afférente du réflexe. La branche efférente est constituée par le nerf pelvien (NP) et le nerf caverneux (NC). Les corps cellulaires du NP se trouvent dans les étages lombosacrés de la moelle épinière et ceux du NC se trouvent dans le ganglion pelvien majeur (GPM). Le NC participe à l'innervation des fibres musculaires lisses du tractus génital mâle, principalement des corps caverneux. La stimulation du NDP provoque également une réponse réflexe des muscles striés du plancher pelvien, lesquels sont innervés par les motoneurones du nerf honteux (Figure 1). Or il n'y a pas de relations directes entre les fibres afférentes du NDP (entrée dans la moelle) et les motoneurones du nerf pelvien ou du nerf honteux (sorties). Des populations de neurones intermédiaires, les interneurones, mettent en relation les entrées et les sorties. Nous avons démontré, par une technique morphofonctionnelle, la présence de tels interneurones dans les étages lombosacrés de la moelle épinière. Ces interneurones répondent à la stimulation du nerf dorsal du pénis (Rampin et al., 1997). Le but de notre étude a été de rechercher les substances chimiques (neuromédiateurs) libérés par les fibres sensitives du NDP et susceptibles d'exciter les interneurones. Parmi celles-ci, nous nous sommes intéressés à la substance P. La substance P est un neuropeptide de 11 acides aminés, extrait sous forme de poudre (d'où son nom) à partir du tube digestif et du cerveau par von Euler et Gaddum en 1931. La substance P est une tachykinine. Ce nom désigne une famille de peptides qui ont pour propriété d'accélérer les contractions de préparations isolées d'intestins et qui ont en commun une analogie structurale dans leur partie C-terminale. En tant que neuromédiateur, la substance P est synthétisée par des enzymes spécifiques dans les neurones et libérée à leur extrémité terminale dans la fente synaptique, afin d'agir sur une cellule cible (autre neurone, ou fibre musculaire lisse). La substance P agit en se fixant sur un récepteur porté par la membrane de la cellule cible.

Par notre étude nous tentons de mettre en évidence la substance P dans les fibres nerveuses du NDP, et d'identifier les nerfs périphériques dans lesquels courrent ces fibres à substance P. Dans ce but des sections bilatérales de nerfs périphériques qui participent à l'innervation des organes génitaux, le nerf caverneux et la branche sensitive du nerf honteux, sont réalisées. La présence ou la disparition de fibres à substance P après les différentes sections nerveuses est alors recherchée dans les
différents tissus érectiles, les corps caverneux et le corps spongieux.

## II. Matériels et méthodes

Les neurones peuvent capter par leurs terminaisons axonales des composés exogènes, par exemple des macromolécules protéiques (composés fluorescents de synthèse comme le fast blue, le true blue, le fluorogold, ou enzymes exogènes d'origine végétale comme la péroxydase du raifort), des acides aminés ou des sucres radioactifs. Une fois internalisés, ces composés sont transportés par flux axonal vers le soma des neurones (flux axonal rétrograde). On utilise cette propriété pour mettre en évidence l'origine de l'innervation des tissus périphériques: muscles striés et viscères. Le dépôt de la substance exogène est réalisé dans le tissu cible, et l'endroit où cette substance est concentrée dans les somas des neurones correspond au site à l'origine de son innervation (Kuypers et Huisman, 1984). On peut également utiliser cette technique pour rechercher l'innervation sensitive des organes. Pour mettre en évidence la localisation des corps cellulaires des fibres sensitives innervant le pénis nous utilisons le fast blue comme traceur fluorescent. Son emploi est facile, car sa mise en évidence est directe par une lecture au microscope à fluorescence dans l'ultraviolet. Le fast blue permet également le couplage avec une réaction d'immunohistochimie dirigée contre la substance P.

Un anticorps dirigé contre la substance P est fabriqué chez le lapin en injectant le peptide couplé à une macromolécule comme l'albumine chez cet animal. Le lapin réagit contre ce complexe moléculaire exogène en produisant des anticorps. Les anticorps sont alors extraits et purifiés. Ces mêmes anticorps mis en présence de coupes de tissus de rats se lient à leur antigène, la substance P. Dans un deuxième temps, le complexe antigène-anticorps est mis en évidence par une réaction colorée, la méthode du complexe avidine-biotine péroxydase (Hsu et col., 1981) compatible avec l'observation au microscope optique.

Le succès de l'immunohistochimie dépend dans notre cas des seuils de détection visuelle du complexe coloré, directement lié à la quantité de substance P présente dans les tissus étudiés. Or d'une façon générale les neuropeptides ne sont pas assez abondants naturellement pour obtenir des révélations immunohistochimiques de qualité. C'est pourquoi on peut "concentrer" le neuropeptide, par exemple en ligaturant un nerf (on
interrompt alors le flux qui le transporte, et le peptide s'accumule du côté où il est synthétisé) ou encore en bloquant le système des flux intracellulaires par la colchicine (le neuropeptide n'est plus transporté le long des prolongements nerveux, il s'accumule alors au lieu de sa synthèse, dans le soma).

Les coupes de tissus sur lesquelles on recherche la présence de substance P sont sériées. Une série est utilisée pour identifier l'ensemble des tissus présents dans la coupe (fibres musculaires lisses, fibres nerveuses) et est donc traitée par une méthode cytoarchitectonique à l'aide de violet de crésyl (colorant basique qui réagit avec les acides nucléiques).

## 1 Préparation des animaux

Nous utilisons des rats mâles adultes de souche Sprague Dawley pesant de 180 à 250 grammes et fournis par Charles River, St-Aubin les Elbeuf, France. Les rats sont placés par groupe de deux dans les cages et s'alimentent et s'abreuvent à volonté. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale réalisée par l'injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (60 mg/Kg).

Groupe 1: deux rats témoins sont anesthésiés et perfusés immédiatement et leur pénis est prélevé.

Groupe 2 (n = 6):

Le fast blue est préparé en solution à 3% dans l'eau distillée stérile. La solution est agitée sur un appareil vortex puis placée dans une cuve à ultrasons pendant dix minutes. Chez le rat anesthésié, on expose la branche gauche du NDP à la face dorsale du pénis après ouverture du fourreau. Cette branche est sectionnée et sa partie proximale plongée pendant quarante cinq minutes dans une cupule contenant un microlitre de la solution de fast blue (FB). La région exposée est rinçée plusieurs fois avec du NaCl 0,9% pour éliminer tout risque de contamination d'autres tissus par le fast blue. Le fourreau est suturé par des ligatures.

-Temps de survie.

C'est le temps qui sépare l'administration des molécules du sacrifice de l'animal. Il dépend de l'espèce animale et de la longueur du trajet nerveux à parcourir. Pour notre
modèle, nous comptons huit jours de migration pour que le FB soit capté et concentré par les corps cellulaires dans le ganglion rachidien L6.

-Traitement à la colchicine.

Le septième jour le rat est à nouveau anesthésié, le ganglion rachidien L6 est dégagé au niveau lombaire vertèbre L6, un tampon de spongel imbibé de colchicine à 20% est mis au contact de ganglion pendant dix minutes. Ensuite il faut bien laver avec du sérum physiologique à 0,9% et refermer l'animal à l'aide de points de sutures. Les rats sont sacrifiés le lendemain.

Groupe 3 (n=4):

Même approche chirurgicale que pour les rats du groupe 2. Le NDP gauche du pénis est disséqué puis ligaturé avec un fil de soie est faite caverneux, la région pelvienne est refermée à l'aide de points de sutures. Les rats sont sacrifiés 48h après.

Groupe 4 (n=4):

Par l'insicion des plans cutanés et musculaires abdominaux, on expose la face ventrale de la prostate. Les ganglions pelviens majeurs, pairs et symétriques, accolés à la face latérale de la prostate dorsale, sont identifiés. Les nerfs caverneux qui en partent pour innerver le pénis sont isolés par dissection puis sectionnés. Pour éviter une régénérescence de ces nerfs, les parties distales et proximales sont éloignées en prélevant un segment d'environ deux millimètres entre ces deux parties.

Groupe 5 (n=4):

La région pelvienne est ouverte, la symphise pubienne est dégagée, les muscles striés sont réclinés de chaque côté, pour mettre en évidence les nerfs honteux sensibles. Ceux-ci sont alors isolés par dissection puis sectionnés, ensuite le protocole est suivi comme précédemment.

Groupe 6 (n=4):

Pour ces rats les deux techniques de chirurgie sont effectuées. Les nerfs caverneux et honteux sensibles sont sectionnées suivant le protocole effectué pour les groupes 4 et 5.
Les rats des groupes 4, 5 et 6 sont sacrifiés 8 jours après la chirurgie.

## 2 Sacrifice et perfusion de l'animal

Tous les rats reçoivent une dose léthale de pentobarbital sodique (90 mg/kg), leur cage thoracique est ouverte et une canule de perfusion est placée dans le ventricule gauche.
Les rats sont perfusés de la façon suivante (pour chaque rat):

-250 ml de sérum physiologique à 37°C auxquels on ajoute de l'héparine (25U/ml, anticoagulant). La solution est passée à l'aide d'une pompe à perfusion. Le débit est de 100ml/mn, pour préserver les vaisseaux.

1 litre de paraformaldéhyde à 4% dans une solution de tampon phosphate 0,1 M; pH= 7,4-7,6 : 200 ml sont passés à vitesse rapide (375 ml/mn), les 800 ml restant sont passés à vitesse lente (100ml/mn).

## 3 Prélèvement et conservation

Il faut prendre soin de bien identifier le ganglion rachidien L6 gauche, celui-ci se trouve en arrière de la vertèbre L6. Pour le nerf dorsal du pénis et les fibres nerveuses de celui-ci, il faut prélever l'ensemble du pénis: la base du pénis avec les corps caverneux et le gland. L'ensemble des tissus est post fixés 2h dans la solution de fixation, pour les ganglions cette opération se fait à l'abri de la lumière. Les tissus sont rincés 3 x10mn dans une solution de tampon phosphate 0,1m pH= 7,4-7,6, en prenant les mêmes précautions pour les ganglions rachidiens. Les tissus sont conservés pour leur cryoprotection membranaire, dans une solution tampon phosphate 0,1M, pH=7,4-7,6 contenant 30% de saccharose à + 4°C pour une durée variant de 24 heures à quinze jours.

## 4 Inclusion et coupe au cryostat

Les tissus sont inclus dans un milieu de montage Tissue-Tek avant d'être débités en coupes. La température de l'enceinte du cryostat doit être de -24° à -26°C. Les
ganglions rachidiens sont coupés à une épaisseur de 12 µm. Pour le nerf dorsal du pénis et les fibres nerveuses de celui-ci, il faut séparer avant de couper au cryostat le gland et les corps caverneux avec la base du pénis. La coupe des corps caverneux se réalise en abordant en premier la face dorsale du pénis, là où se trouve le nerf dorsal du pénis, la difficulté de couper les corps caverneux fait que l'épaisseur des coupes est de 14 ou 20 µm, le gland est coupé à 14 µm. La réalisation de la coupe de ces tissus demande un échantillonnage. Des séries de 4 lames sont obtenues de la façon suivante: la première coupe est collée sur la première lame, la deuxième est collée sur la deuxième lame ceci jusqu'à la quatrième coupe et lame, ensuite 5 coupes sont éliminées puis à nouveau même échantillonnage, suivant la grandeur des tissus deux où trois coupes sont montées sur la même lame. Toutefois pour les ganglions rachidiens et quand le nerf dorsal du pénis est en vu toutes les coupes sont gardées en respectant l'échantillonnage. Les lames utilisées sont des lames SuperFrost. Pour tous les tissus, les séries de lames des coupes obtenues sont conservées à -20°C.

## 5 Observation au microscope

La présence du traçeur fluorescent est observé sur les coupes de ganglion seulement. L'observation se réalisant au microscope à fluorescence, dans l'ultrat violet à la longueur d'onde d'exitation de 360 nm. L'observation est effectuée à l'objectif 10 (grossissement 100), sans recouvrir la lame par une lamelle. Les prises de vues sont réalisées sur film noir et blanc de 400 ASA. Les coordonnées des verniers en déplacement x et y de la platine du microscope sont soigneusement notées pour chaque vue. Chaque champ photographié doit recouvrir partiellement le précédent pour permettre une bonne reconstitution de l'ensemble de la coupe. Les lames sélectionnées ont été choisies de la façon suivante : la moyenne du nombres de lames obtenues par ganglion en réalisant l'échantillonnage décrit précédemment est de 16 lames, les lames 4, 8, 12 et 16 sont retenues pour l'analyse.

## 6 Traitement immunohistochimique

Nous utilisons une méthode immunologique indirecte mettant en jeu un anticorps
primaire, puis un anticorps secondaire biotinylé. L'utilisation du complexe ABC auquel
la péroxydase est fixée, augmente la sensibilité de la réponse. Le traitement
immunohistochimique sur des coupes montées sur lame et conservées à -20°C nécessite
plusieurs précautions: de sortir les coupes du congélateur et de les laisser sécher et
d'entourer les coupes avec DAKO PEN, crayon marqueur, avant de commencer le
traitement, afin de créer un puits pour mettre moins de réactifs. Réaliser un traitement
immunohistochimique sur des coupes montées sur lame demande tout au long du
traitement de rincer les coupes dans des cuves en verre verticales avec agitation sur une
plaque tridimensionnelle et d'utiliser des boites en polystyrene en atmosphère humide
pour les autres traitements pour éviter l'evaporation des réactifs.

a) Prétraitement des coupes

Les coupes sont rincées 3 x 10 minutes dans le tampon phosphate sodique (PBS): 0,1M à pH = 7,4-7,6 et 0,9% NaCl. Les coupes sont incubées pendant 90 minutes, dans le mélange PBS + sérum de chèvre normal (SNC) 3% + Triton X100 0,3% + Avidine 200µl/ml (blocking kit Avidine-Biotine Vector Laboratories). Il est déposé suivant l'importance de la coupe de 50µl (coupe de ganglion) à 150µl (coupe de gland ou de corps caverneux) du mélange précédemment préparé. Le sérum de chèvre, de la même espèce animale que celle qui produit l'anticorps secondaire, contient des immunoglobulines qui empêchent la fixation non spécifique de l'anticorps secondaire. L'avidine est utilisée pour neutraliser les groupements non spécifiques qui pourraient se faire, au moment de l'emploi en fin de traitement, avec le complexe ABC. Le triton X100 perméabilise les membranes lipidiques et facilite la pénétration des anticorps. Ensuite les coupes sont rincées 3 x 10 minutes dans du PBS.

b) Anticorps primaire

L'anticorps primaire anti-substance P est fourni gracieusement par le Docteur Tramu
(Laboratoire de Neurocytochimie Fonctionnelle). Après un test de dilution, il est utilisé
à une concentration de 1/5000 ou 1/10000e, respectivement pour les coupes de ganglion
ou de gland et de corps caverneux. Les coupes sont mises en présence de l'anticorps
<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 2: Microphotographie d'une coupe horizontale de ganglion rachidien lombaire L6 de rat (x 160). Les corps cellulaires des neurones identifiés par des flèches présentent à la fois une activité Fast blue (à gauche, indiquant qu'ils ont capturé ce fluorescent par leur fibre courant dans le nerf dorsal du pénis) et une immunoréactivité positive pour le neuropeptide substance P (à droite). Un petit nombre seulement de neurones sensitifs participant à l'innervation du pénis utilise la substance P comme neuromédiateur.</figcaption></figure>
contact de ces deux molécules doit être de 30 minutes précises à température ambiante et agitation douce pour permettre aux radicaux libres restants de l'avidine de s'accrocher aux biotines de l'anticorps secondaire. Le complexe ainsi formé à pour but d'amplifier la sensibilité de la réaction. Les coupes sont rincées 2 x 10 minutes dans PBS, puis incubées dans la solution du complexe ABC pendant 90 minutes à température ambiante dans les boites.

Ensuite les coupes sont rincées 3 x 10 minutes dans PBS.

Révélation de l'activité péroxydasique du complexe avec le kit peroxydase substrate DAB, Vector Laboratories.

La péroxydase est mise en présence d'eau oxygénée avec laquelle elle forme un complexe:

$$HRP + H_2O_2 \Leftrightarrow [HRP-H_2O_2]$$

Ce complexe est mis en présence du chromogène sous forme réduite:

$$[HRP-H_2O_2] + (CHR)H_2 \Leftrightarrow \underline{CHR} + 2H_2O + HRP$$

Le chromogène oxydé précipite sous forme d'un composé brun stable, de diaminobenzydine (DAB). C'est ce précipité brun qui observé au microscope optique.

Le composé (CHR)H2 donneur d'hydrogène est la 3,3'-diaminobenzidine tétrahydrochloride (DAB, kit Vector Laboratories). La solution de révélation se fait suivant les indications données par le kit: 2 gouttes de solution tampon concentrée + 4 gouttes de solution de chromogène DAB + 2 gouttes de solution de péroxyde d'hydrogène sont mélangées à 5ml d'eau distillée, il faut bien mélanger après chaque solution ajoutée ensuite filter la solution obtenue sur un flitre à seringue millipore de 0,22 µm, la solution obtenue est conservée à l'abri de la lumière. Il est déposé 1 ou 2 gouttes de cette solution sur les coupes, un temps de 30 secondes à 1 minute est suffisant pour observer la présence de la subtance P dans les neurones du ganglion et dans les fibres de l'ensemble du pénis. Les coupes sont ensuite rincées dans de l'eau distillée, après un temps de 15 minutes les coupes toujours humides sont mise en contact d'une solution d'aquatex (Merck) et recouvrir d'une lamelle.

L'utilisation du kit peroxydase substrate DAB, Vector Laboratories est d'utilisation facile et moins dangereuse car la 3,3'diaminobenzidine tétrahydrochloride a des
primaire pendant 72 heures à +4°C. L'anticorps anti-SP est dilué dans du PBS + SNC
0,3% + Triton X100 0,3% + Biotine 200µl/ml (kit Avidine-Biotine). La biotine est
utilisée pour saturer l'avidine mise dans le prétraitement des coupes. Le dépôt de
l'anticorps sur les coupes se fait de la même façon que précédemment. Il est
indispensable de s'assurer de la spécificité de l'anticorps primaire. Pour cela, quelques
coupes de ganglion et de coupes de pénis sont traitées en l'absence d'anticorps primaire.

c) Traitement à l'eau oxygénée (H2O2) pour éliminer les péroxydases endogènes

Les coupes sont rincées 3 x 10 minutes dans le PBS. Elles sont ensuite plongées 30 minutes dans une solution de méthanol pur contenant 3% d'eau oxygénée concentrée. L'eau oxygénée neutralise les péroxydases endogènes non éliminées au moment de la perfusion. Les coupes sont à nouveau rincées 3 x 10 minutes PBS.

d) Anticorps secondaire

L'anticorps secondaire est produit chez la chèvre et dirigé contre les immunoglobulines
de lapin. Cet anticorps est biotinylé. Il possède de nombreuses molécules libres de
biotine qui permettent la fixation du complexe avidine-biotine. On utilise le coffret
Vectastain Elite ABC Kit (rabbit IgG, Vector Laboratories), le sérum de chèvre est
utilisé à 0,3%, l'anticorps secondaire est utilisé à raison d'une goutte pour 5ml de PBS
auquel est ajouté le Triton X100 à 0,3%. Le contact des coupes avec l'anticorps
secondaire est de 24 heures à +4°C.

e) Complexe ABC et mise en évidence de l'activité péroxydasique du complexe:  
méthode de Hsu et col. (1981)

Après rinçage des coupes 1 fois pendant 10 minutes dans le tampon PBS, le complexe ABC est préparé comme suit: 2 gouttes d'avidine (flacon A du kit ABC) sont mélangées à 2 gouttes de biotine (flacon B du kit ABC) dans 5ml de PBS. L'avidine est une glycoprotéine et la biotine est une vitamine sur laquelle sont fixées plusieurs molécules de péroxydase, ces deux molécules ont une grande affinité l'une pour l'autre, aussi le
propriétés cancérigènes.

## 7 Observation au microscope

Le précipité brun de DAB met en évidence la présence du neuropeptide la substance P dans les corps cellulaires du ganglion rachidien L6 et dans les fibres nerveuses de l'ensemble du pénis.

Pour les corps cellulaires des ganglions rachidiens, l'observation au microscope optique objectif 10 ( grossissement 100) est suivie des prises de vues en recherchant les coordonnées mesurées pour le FB. A partir des documents photographiques correspondant à l'identification de la présence du FB nous avons reconstitué l'ensemble des coupes, et à l'aide de papier transparent pour rétroprojection, nous avons reporté l'ensemble en identifiant les neurones ayant capté le FB. Nous avons suivi la même technique pour les neurones exprimant la présence de la substance P. Les neurones qui sont à la fois FB positifs et immunoréactifs pour la substance P (neurones doublement marqués : Figure 2) sont repérés à partir de la superposition des calques. Des repères extérieurs tels que bords des coupes ou des structures naturelles telles que les vaisseaux sanguins ont été utilisés comme référence géographique. Le dénombrement des doubles marquages pour tous les ganglions a ainsi été réalisé. Pour les fibres nerveuses du pénis, nous avons traité en immunologie qu'une lame sur quatre, la lame précédente ayant servie à une coloration classique au crésyl violet. Nous avons procédé de cette façon pour mieux identifier la présence du nerf dorsal du pénis. Nous avons appliqué ce procédé pour l'ensemble du pénis. L'observation au microscope optique, objectif 10 ( grossissement 100) et objectif 16 ( grossissement 160 ) est suivie de prise de vues, le film ayant les mêmes caractéristiques que précédemment. Nous avons simplement mis en évidence la présence de la substance P dans les fibres nerveuses.

# III. Résultats

## 1. Localisation des corps cellulaires des neurones dont les fibres courrent dans le nerf dorsal du pénis.
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 3: Microphotographie d'une coupe horizontale de gland chez le rat (x 160). Des fibres nerveuses immunoréactives pour la substance P sont identifiées par des flèches. Ces fibres parcourent les plans superficiels et profonds du tissu (en haut à gauche: bord extérieur).</figcaption></figure>
Groupe 2) Rats dont la branche gauche proximale du NDP est plongée dans le traceur neuronal: le fast blue (FB) est capturé par 47% des corps cellulaires du NDP localisés dans le ganglion rachidien L6.

## 2. Double marquage: certaines fibres afférentes du nerf dorsal du pénis sont immunoréactives pour la substance P

Groupe 2) Rats traités à la colchicine et ayant eu le traceur fluorescent FB. Dans les corps cellulaires du ganglion rachidien L6 : 43% des neurones expriment la présence de la substance P et 7% d'entres eux sont doublement marqués (FB et Substance P).

## 3. Distribution des fibres immunoréactives pour la substance P dans le gland, les corps caverneux et le nerf dorsal du pénis.

Pour l'ensemble de ces tissus, un résultat qualitatif de la présence de la substance P dans les fibres nerveuses est suffisant. Groupe 1 et Groupe 4) Rats témoins et dont les deux nerfs caverneux sectionnés: la substance P est présente dans le NDP, les corps caverneux, les muscles bulbo-spongieux du gland (Figure 3), dans l'urètre et autour des vaisseaux. Groupe 3) Rats dont le NDP a été ligaturé, l'accumulation de la substance P dans les fibres du NDP du côté proximal à la ligature montre que le transport du peptide s'effectue de la moelle épinière vers les organes génitaux, éliminant l'hypothèse de la présence de corps cellulaires synthétisant la substance P à la périphérie (Figure 4). Groupe 5 et 6) Rats dont les nerfs honteux et ceux dont les nerfs caverneux et honteux sont sectionnés: il n'y a plus de fibres nerveuses exprimant la substance-P dans l'ensemble du pénis ainsi que dans le NDP.

<table><caption>Tableau 1: distribution des fibres immunoréactives pour le neuropeptide substance P</caption><thead><tr><th>rats</th><th>NDP</th><th>CC</th><th>CS</th></tr></thead><tbody><tr><td>témoins</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>NCx</td><td>+</td><td>+</td><td>+</td></tr><tr><td>NHSx</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>NCxNHSx</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

Figure 4: Microphotographie d'une coupe transversale du pénis, partie dorsale (x 160). En bas à gauche, une ligature du nerf dorsal du pénis a été réalisée 48 heures avant le sacrifice du rat. L'accumulation de substance P dans les fibres nerveuses du côté proximal à la ligature (centre de l'image) révèle la synthèse du neuropeptide et son transport à partir du ganglion rachidien.
dans le nerf dorsal du pénis (NDP), les corps caverneux (CC) et le corps spongieux (CS) chez des rats témoins et des rats ayant subi i) une section bilatérale des nerfs caverneux (NCx), ii) une section bilatérale de la branche sensitive du nerf honteux (NHSx) et iii) une section bilatérale de ces deux nerfs (NCxNHSx). +: présence de fibres: 0: absence de fibres.

## IV. Conclusion

Nous avons utilisé une technique de double marquage: une technique de traçage des voies nerveuses et une technique d'immunohistochimie. L'utilisation du fast blue comme traceur neuronal permet de mettre en évidence les corps cellulaires des fibres nerveuses courant dans le nerf dorsal du pénis dans le ganglion rachidien L6. Sur ces mêmes neurones nous avons montré la présence de la substance P après avoir concentré celle-ci par application de colchicine sur le ganglion L6. A l'avenir pour mettre en évidence de la substance P ou un autre neuropeptide, nous pouvons utiliser comme révélateur de la réaction antigène-anticorps, d'autres fluorochromes, par exemple la rhodamine ou l'isothiocyanate de fluoresceïne. La longueur d'onde d'excitation est différente pour chacun de ces fluorochromes. L'utilisation d'un fluorescent comme traceur neuronal et d'un autre fluorescent comme révélateur de la présence d'un neurotransmetteur est très utilisé actuellement en neuroanatomie: un simple échange de filtres fluorescents permet d'observer les deux caractéristiques sans bouger la préparation sur la platine du microscope.

L'anticorps anti-substance P existe dans le commerce, chez Bio-Rad par exemple, mais reste cher à l'achat. Nous entretenons des relations avec des laboratoires publics de recherche qui produisent des anticorps. L'acquisition d'anticorps auprès de ces laboratoires est souvent gracieuse, et nous bénéficions des conseils d'utilisation directement auprès des personnes qui l'ont produit et utilisé.

La substance P est présente dans une population des fibres nerveuses du nerf dorsal du pénis. Les corps cellulaires des neurones à substance P sont présents dans le ganglion rachidien L6. Depuis son lieu de synthèse dans le corps cellulaire, la substance P est transportée vers la périphérie, et également vers la moelle épinière où elle participe au transfert d'informations vers les neurones qui y sont présents. On sait que 70% environ
des quantités synthétisées des neuropeptides présents dans les corps cellulaires des ganglions rachidiens sont transportés vers la périphérie. Leur rôle dans les tissus préraphériques demeure peu connu. La substance P participe aux réponses inflammatoires des tissus après lésion.

La substance P est toujours présente dans ces mêmes territoires après la section bilatérale des nerfs caverneux, les fibres à substance P ne passent pas par là. La substance P est présente autour des vaisseaux sanguins et disparaît dans les autres structures après la section bilatérale des nerfs honteux sensibles. Les fibres nerveuses du nerf honteux sensible contiennent des fibres nerveuses du NDP. Les résultats montrent également que l'innervation substance P des vaisseaux a une autre origine suggérant une commande nerveuse différente.

## V. Référence des produits

-Fast blue (F5756) SIGMA-ALDRICH, 38297 St Quentin Fallavier cedex.

- L'anticorps, anti- Substance P fourni gracieusement par le Professeur Tramu, Laboratoire de Neurocytochimie Fonctionnelle, Unité associée U.R.A. CNRS 339, Avenue des Facultés, 33405 TALENCE cedex.

-Avidin/Biotin, Blocking Kit SP-2001

-Complexe ABC et anticorps secondaire: Vectastain Elite ABC Kit (Rabbit IgG) PK-6101

-DAB Peroxidase Substrate Kit SK-4100

Ces trois kits sont distribués par Vector BIOSYS, 21, quai du clos des roses 60200 Compiègne, France.

-Crayon, Dako Pen: (réf. 65401), Poly Labo, 39, avenue d'Iena, Paris 75783 cedex 16.

-Tissue-tek: (réf. OCT 4583), Labonord, 59656 Villeneuve d'Ascq cedex.
VII. Références bibliographiques

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