# Biodétérioration microbienne des déchets : définitions, principes et méthodes d'évaluation

Rémy Gourdon, Rémy Bayard, G. Valla

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Rémy Gourdon, Rémy Bayard, G. Valla. Biodétérioration microbienne des déchets: définitions, principes et méthodes d'évaluation. Environnement, Ingénierie & Développement, 1996, N°1 - 1er Trimestre 1996, pp.13-21. 10.4267/dechets-sciences-techniques.554. hal-01963024

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BIODÉTÉRIORATION MICROBIENNE DES
DÉCHETS : DÉFINITIONS, PRINCIPES ET
MÉTHODES D'ÉVALUATION

R. Gourdon et R. Bayard, G. Valla*

Laboratoire de chimie physique appliquée et environnement (LCPAE) - Insa de Lyon 1

Laboratoire de biosystématique et nuisances fongiques - Université Claude Bernard - Lyon

Lors de leur stockage ou de leur valorisation, les déchets peuvent être soumis à des agressions d'origine microbienne, même lorsque les conditions de stockage ou valorisation sont destinées à les réduire. Les mécanismes de biodétérioration peuvent être directs lorsque les micro-organismes transforment les constituants des déchets, ou indirects lorsque ce sont leurs métabolites qui sont agressifs. La biodétérioration peut s'avérer significative lorsque le déchet ou son environnement contient ou apporte des substances telles que matière organique, composés soufrés, composés azotés, fer. Elle peut être ralentie ou empêchée par des conditions physico-chimiques défavorables, notamment de faible teneur en eau, pH très alcalin et mauvaise oxygénation. Les méthodes d'évaluation reposent sur des essais accélérés qui tentent d'optimiser le contact déchet/micro-organismes, et des tests de simulation visant à reproduire le scénario de stockage ou utilisation envisagé.

During their re-utilization or after disposal, wastes
may undergo various agressions of microbial origins,
even when the scenario of disposal or utilization is
designed to reduce them. The mechanisms of bio-
deterioration may be direct (when micro-organisms
metabolize the constituents of the waste), or undirect
(when the metabolites are responsible for the dete-
rioration). Biodeterioration may have significant
effects when the waste or its environment contains
or provides such substances as organic matter, sulfur
- or nitrogen - containing substances, or iron. It may
be partly or totally inhibited under unfavorable phy-
sical-chemical conditions such as low water content,
high pH and poor oxygenation. The methods of eva-
luation are based on accelerated assays designed to
improve the contact between waste constituents
and micro-organisms, and simulation tests designed
to reproduce the conditions of disposal or utilization.

DÉFINITIONS

Au cours de son stockage ou de sa valorisation ou après
banalisation, tout déchet est soumis à des agressions méca-
niques, physico-chimiques, mais aussi biologiques lorsque
son environnement est suffisamment humide et non stéri-

le, ce qui est très généralement le cas. L'ensemble des agres-
sions auxquelles le déchet est soumis vont induire sa dété-
rioration.

Le verbe « détériorer » provient du latin deterior qui signi-
fie « plus mauvais ». Détériorer signifie donc « mettre en
mauvais état [...], rendre moins bon, compromettre », et
la forme pronominale « se détériorer » signifie « s'abîmer,
subir des dégradations, devenir plus mauvais » (définitions
extraites du Petit Larousse 1995). La détérioration, qui est
l'action de (se) détériorer ou son résultat, désigne donc
une réduction de qualité ou de valeur du système considé-
ré (le système pouvant être un objet, un matériau, un orga-
nisme ou une situation donnée). La biodétérioration sera ainsi
définie comme une réduction de la qualité ou de la valeur
du système considéré dont la cause peut être, au moins
partiellement, attribuée à des agents biologiques. Dans cet
article, les agents biologiques considérés sont des micro-orga-
nismes, mais des organismes supérieurs peuvent également
être des agents de biodétérioration.

On voit que les définitions retenues impliquent une appré-
ciation du système en termes de « valeur » ou de « quali-
té ». Les paramètres d'appréciation varient bien évidem-
ment en fonction du système considéré. Ils peuvent parfois
être difficiles à évaluer, voire à définir, comme c'est le cas
lorsque le système considéré est un ouvrage (au sens géné-
ral du terme) de valorisation, stockage ou banalisation de
déchets.

Ces considérations suggèrent au moins deux commentaires :
– d’une part, l’évaluation de la (bio) détérioration implique qu’il soit possible d’apprécier la « qualité » ou la « valeur » du système. Globalement, la « qualité » d’un système de valorisation, stockage ou banalisation de déchets pourra être appréciée par sa capacité à retenir les polluants qu’il contient (Ademe, travaux en cours) ;

– d'autre part, dans de nombreux cas, il sera difficile de dis-
tinguer la biodétérioration des autres détériorations abio-
tiques, car l'ensemble des agressions biologiques et abiotiques
auront lieu simultanément.

A ce stade, il convient de bien distinguer les termes « bio-
détérioration » et « biodégradation ». Dans notre esprit, le
terme de biodétérioration s'applique à des systèmes conçus
pour être relativement protégés des agressions micro-
biennes. La biodétérioration désigne donc une réduction
de la « qualité » ou de la « valeur » du système et non pas
leur perte, par opposition à la biodégradation. Cette définition
rejoint celle de nombreux auteurs (Griffin et al., 1991 ; Rose,
1981 ; Eggins et Oxley, 1980 ; Calleja, 1980). Ce distinguo
peut être fait dans le cas des déchets. Ainsi la mise en déchar-
ge d'ordures ménagères ou l'épandage de boues de stations
d'épuration ne se conçoivent pas comme des systèmes des-
tinés à protéger les déchets des agressions microbiennes. La
biodégradation des ordures ménagères ou des boues dans
ces scénarios ne sera donc pas considérée dans cet article.
En revanche, l'enfouissement de déchets « ultimes », la bana-
lisation de certains déchets ou leur utilisation comme maté-
riaux de substitution constituent des systèmes visant res-
pectivement à stocker ou à valoriser des déchets dans des
conditions de stabilité optimales, y compris au niveau bio-
logique. Les agressions microbiennes éventuelles entrent
alors dans la définition donnée à la biodétérioration.

Les agressions microbiennes d'un matériau quel qu'il soit reposent sur la biotransformation des constituants de ce matériau (agressions ou biodétérioration directes) ou l'effet agressif de certains métabolites produits par biotransformations de substances se trouvant dans le matériau lui-même ou dans son environnement immédiat (agressions ou biodétérioration indirectes). Dans le cas des déchets comme dans la plupart des cas, il est clair que biodétériorations directe et indirecte peuvent se produire simultanément.

PRINCIPES GÉNÉRAUX DE LA
BIODÉTÉRIORATION

Il est connu que les micro-organismes jouent un rôle impor-
tant dans la détérioration des roches, minéraux, ciments,
bétons et pierres d'ouvrage. De nombreux exemples de
biodétérioration sont rapportés dans la littérature (se repor-
ter par exemple à Janton, 1974 ; Berthelin, 1976 ; Krumbein,
1988 ; Caneva et al, 1989 ; Griffin et al, 1991). Les études réa-
lisées sur la biodétérioration mettent en évidence que les
micro-organismes accentuent l'action des autres agents
agressifs. On parle de synergie lorsqu'il y a couplage de plu-
sieurs agents agressifs (Krumbein et al, 1978). Cependant,
pour certains auteurs, la biodétérioration est typiquement
un processus secondaire de dégradation qui apparaît lorsque
le matériau a atteint un certain degré de détérioration
(Griffin et al, 1991).

Les micro-organismes susceptibles de détériorer un déchet
dans un système de stockage, de banalisation ou de valori-
sation, peuvent provenir de l'environnement direct du déchet
(sol, eau, air, autres déchets) ou du déchet lui-même. Leurs
caractéristiques métaboliques sont très variées.

Généralités sur les métabolismes microbien

Le métabolisme énergétique de tous les êtres vivants repose sur des réactions d'oxydo-réduction. Cela signifie que les organismes vivants retirent l'énergie nécessaire à leur vie en oxydant des substrats (qualifiés de donneurs d'électrons

et de protons) et en réduisant un ou des accepteurs.

Du fait des conditions d'environnement très variées des dif-
férents biotopes de la planète, le monde microbien est très
diversifié et ses capacités métaboliques très vastes. La vie
microbienne est ainsi possible dans des environnements
extrêmes. De nombreuses substances peuvent être utili-
sées par les micro-organismes comme substrats donneurs
d'électrons et comme accepteurs finals de ces électrons
(pour plus de détails, se reporter notamment à Pelmont,
1993).

Réactions d'oxydation - Substrats oxydables

Lorsque les réactions d'oxydo-réduction sont induites par
l'excitation lumineuse de certains pigments cellulaires, les
organismes compétents sont qualifiés de phototrophes. Les
procaryotes phototrophes appartiennent à deux groupes :
- Les cyanobactéries (« algues bleues ») qui pratiquent la pho-
tosynthèse sur le même mode que les plantes vertes (c'est-
à-dire avec production d'oxygène par lyse de l'eau);

- les rhodospirillales (bactéries pourpres et bactéries vertes) dont le métabolisme est anaérobie strict (à part quelques espèces) et non producteur d'oxygène. Ces bactéries photolithotrophes utilisent comme sources d'électrons des substances minérales telles que H₂, H₂S, S ou d'autres composés soufrés réduits. Certaines bactéries photo-organotrophes (bactéries non sulfureuses) peuvent oxyder des composés organiques.

Lorsque les réactions d'oxydo-réduction ont lieu en l'absence
de lumière, les organismes compétents sont qualifiés de chi-
miotrophes. Les micro-organismes chimiotrophes sont très
nombreux et très divers.

Les substrats organiques oxydables par les chimio-organo-
trophes sont extrêmement nombreux. Ces micro-orga-
nismes sont à l'origine des principales agressions micro-
biennes possibles sur un déchet, dès lors que sa fraction
organique est suffisante, biodisponible et biodégradable.

Les substrats minéraux oxydables par les micro-organismes chimio-lithotrophes sont également assez variés. On peut citer par exemple :

- le soufre et les composés réduits du soufre tels que H₂S (Thiobacilles notamment);

- l'ammoniac (Nitrosomonas);

- les ions nitrite (Nitrobacter);

- le fer (II) (Thiobacillus, Gallionella et Leptothrix) et le Mn(II) (Leptothrix).

Réactions de réduction - Substances pouvant jouer le
rôle d'accepteurs finals

Une substance quelconque (substrat ou donneur) ne peut
être oxydée que si une autre substance (accepteur) peut, en
se réduisant, accepter les électrons arrachés à la première.
Cela est thermodynamiquement possible si, dans les condi-
tions du milieu, le potentiel du couple donneur est inférieur
à celui du couple accepteur. Les micro-organismes sont
capables de catalyser, c'est-à-dire d'accélérer de manière
considérable, les réactions de transfert d'électrons entre
des donneurs, qui nous l'avons vu sont de nature très variée,
et des accepteurs qui sont eux-mêmes très divers. Ces accepteurs peuvent être minéraux ou organiques.

Un accepteur très courant chez les organismes chimiotrophes est l'oxygène moléculaire O₂. Le potentiel normal du couple O₂/2 H₂O est de + 810 mv, ce qui rend possible l'oxydation de très nombreux substrats. Les organismes compétents sont qualifiés d'aérobies. Les aérobies stricts ne peuvent se passer d'oxygène, alors que les aérobies facultatifs peuvent utiliser, en l'absence d'oxygène, d'autres accepteurs de remplacement.

Des substances minérales autres que l'oxygène ou des substances organiques peuvent être utilisées comme accepteurs finals d'électrons. Les micro-organismes compétents sont qualifiés d'anaérobies stricts s'ils sont incapables d'utiliser l'oxygène ou anaérobies facultatifs s'ils peuvent utiliser l'oxygène lorsqu'il est présent. Notons que pour ces derniers, l'utilisation de l'oxygène est préférée (lorsqu'il est présent) car l'énergie récupérée est plus grande qu'avec la plupart des autres accepteurs à cause du potentiel élevé du couple O₂/2H₂O. Les principaux composés ou éléments pouvant jouer le rôle d'accepteurs d'électrons et de protons sont les suivants :

- Substances organiques diverses qui peuvent être initialement présentes dans le milieu ou être issues du métabolisme des micro-organismes.

- Formes minérales oxydées de l'azote : Nitrate (très grand nombre d'espèces), nitrite et oxydes d'azote (certaines espèces d'Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, Rhodobacter, Thiobacillus...).

- Soufre (Bactéries sulfo-réductrices telles que des Desulforomonas et bactéries méthanogènes telles que Methanosarcina barkeri) et sulfate (bactéries sulfato-réductrices telles que des Desulfovibrio, Desulfolobus, etc.).

- Formes minérales du carbone (CO₂, hydrogénocarbonates) pour les bactéries méthanogènes (Methanobacterium, Methanococcus...).

- Le Fer (III) et le Mn (IV) pour de nombreuses espèces bactériennes anaérobies strictes ou facultatives, en tant que contribution secondaire à leur métabolisme énergétique (Vibrio, Bacillus, Clostridium), et par un nombre restreint d'espèces encore mal caractérisées en tant que contribution principale ou unique (Pelmont, 1993). Le couple Fe³⁺/Fe²⁺ a un potentiel élevé de + 770 mV en conditions normales, ce qui en fait un bon oxydant. Le potentiel normal du couple MnO₂/Mn²⁺ est de + 380 mV.

- D'autres éléments à l'état oxydé, tels que As (V) (Benjamin et Honeyman, 1994), U (VI), et Se (VI) pour des bactéries telles que Geobacter metallireductens ou Thiobacillus denitrificans pour U (VI), Clostridium propionicum et C. Sticklandii pour As (V) et Se (VI) (Jones et al., 1988).

Il faut souligner que pour les métaux, certaines réactions d'oxydo-réduction sont effectuées par des micro-organismes comme mécanismes de défense vis-à-vis de la toxicité du métal, et non pas pour leur métabolisme énergétique. C'est le cas notamment du mercure, qui, en anaérobiose, peut être méthylé et réduit en Hg° volatil par des bactéries diverses (Thiobacillus, Pseudomonas, etc.).

<table><caption>Tableau I : Facteurs et paramètres principaux pour l'étude de la biodétérioration des déchets</caption><thead><tr><th>Facteurs prépondérants</th><th>Paramètres prépondérants</th></tr></thead><tbody><tr><td>Conditions d'alimentation en eau et composition de la solution apportée</td><td>Teneur en eau ou activité en eau, et capacité de rétention de l'eau</td></tr><tr><td>Température</td><td>Granulométrie</td></tr><tr><td>pH, Eh et force ionique (salinité)</td><td>Porosité</td></tr><tr><td>Exposition à la lumière</td><td>pH, Eh et force ionique</td></tr><tr><td>Aération et/ou teneur en oxygène dissous dans l'eau</td><td>Biomasse microbienne</td></tr><tr><td>Apports' extérieurs de substances susceptibles de stimuler l'activité microbienne, et notamment :<br/>- composés organiques biodégradables<br/>- soufre S, composés réduits du soufre<br/>- sulfates SO₄²⁻<br/>- azote ammoniacal NH₃<br/>- nitrates NO₃⁻<br/>- phosphates HPO₄²⁻ ou autres formes biodisponibles du phosphore</td><td>Présence¹ et biodisponibilité² de substances sources d'énergie pour les organismes chimiotrophes, notamment :<br/>- carbone organique (CO)<br/>- soufre S, composés réduits du soufre<br/>- azote ammoniacal NH₃<br/>- Fer II<br/>Biodégradabilité intrinsèque de la fraction organique du déchet</td></tr><tr><td>Exposition à l'air (banalisation, valorisation comme tuiles ou briques,...)</td><td>Présence¹ et biodisponibilité² de composés accepteurs d'électrons (dans le cas de milieux non aérés), et notamment :<br/>- nitrates NO₃⁻<br/>- sulfates SO₄²⁻<br/>- CO₂ dissous ou hydrogénocarbonates HCO₃⁻<br/>- Fer (III), Mn (IV)</td></tr><tr><td>Exposition à un autre milieu naturel microbiologiquement actif. Ce milieu peut être notamment un sol (enfouissement, soubassements...), un milieu marin (digues...), des eaux de surface (berges...)</td><td>Présence¹ et biodisponibilité² de nutriments divers même à faibles teneurs, et notamment de sources d'azote et dephosphore</td></tr><tr><td>Exposition à un milieu non naturel microbiologiquement actif. Notamment, présence d'autres déchets dans l'environnement immédiat</td><td>Présence de substances biocides ou biostatiques à ces concentrations toxiques</td></tr></tbody></table>

1. Si ces substances ne sont initialement ni présentes dans le déchet, ni apportées par l'extérieur, il faut penser qu'elles peuvent être produites au cours du temps par biotransformations de substances contenues dans le déchet ou dans le milieu extérieur.

2. La biodisponibilité est liée notamment à la solubilité des différentes espèces chimiques considérées, ainsi qu'à leur accessibilité aux micro-organismes (elle-même liée à la granulométrie et la porosité du déchet).

diverses (Thiobacillus, Pseudomonas, etc.). De même, il a été montré que plusieurs espèces appartenant aux genres Pseudomonas ou Bacillus sont capables de réduire le Cr (VI) en Cr (III) moins toxique (Romaneko et al., 1977; Horitsu et al., 1987).

## Facteurs et paramètres importants de la biodétérioration

Un certain nombre de facteurs (grandeurs externes au déchet) et de paramètres (grandeurs caractéristiques intrinsèques du déchet) doivent être considérés pour évaluer la possibilité qu'un déchet donné puisse subir certaines agressions microbiennes dans des conditions d'environnement données. Ces facteurs et paramètres sont cités dans le tableau I.

Parmi ceux-ci, la teneur en eau et le mode d'alimentation en eau sont prépondérants. Un développement microbien n'est possible que dans des milieux ayant des activités en eau comprises entre 0,60 et 0,99 environ. La granulométrie et la porosité influent sur la surface de contact et donc sur la réactivité du déchet. Les pH alcalins peuvent inhiber la croissance microbienne bien que des adaptations soient possibles en milieu non immergé. Enfin, les autres facteurs et
paramètres déterminants sont principalement ceux qui régis-
sent le métabolisme énergétique des micro-organismes :
exposition à la lumière, conditions d'oxygénation, tempé-
rature, présence ou apport de composés ou éléments don-
neurs et accepteurs d'électrons.

Mécanismes de la biodétérioration directe

Les mécanismes directs d'interaction se caractérisent par
une métabolisation de la matière organique ou minérale
du déchet qui est de ce fait altéré directement. Ces phé-
nomènes sont possibles notamment pour les déchets conte-
nant une fraction organique biodégradable par divers micro-
organismes chimio-organotrophes si l'humidité est suffi-
sante. Les déchets riches en soufre ou en composés soufrés,
en fer ou en manganèse, sont également a priori susceptibles
de subir une biodétérioration directe en aérobiose.

Biodégradation de composés organiques

Les composés organiques peuvent être utilisés comme
source de carbone et/ou d'énergie par les micro-orga-
nismes s'ils leur sont accessibles et s'ils sont biodégradables.
Dans le cas de déchets massifs ou granulaires, l'agression a
lieu dans un premier temps à la surface solide par des
enzymes exocellulaires et/ou fixation des micro-organismes
sur la surface (d'où l'importance de la porosité). Les moi-
sissures peuvent accéder à des substances moins superfi-
cielles grâce à la pénétration de leur mycélium. Ce sont
surtout les micro-organismes à forte activité hydrolytique
qui se développent si le déchet contient des polymères
organiques biodégradables. L'hydrolyse des polymères par
les enzymes exocellulaires excrétés par ces micro-orga-
nismes libère des oligomères ou des monomères qui peu-
vent servir de sources de carbone à ces mêmes micro-
organismes ou à d'autres espèces non hydrolytiques. Les
métabolites ainsi libérés sont généralement beaucoup plus
hydrosolubles que la fraction organique initiale du déchet.
D'autre part, ils peuvent avoir un comportement agressif vis
à vis du déchet lui-même ou d'autres déchets, entraînant leur
biodétérioration indirecte. Enfin, la production de méta-
bolites gazeux (CO₂, CH₄ en anaérobiose) peut avoir des
effets néfastes importants interdisant certains types d'uti-
lisation ou de stockage, ou nécessitant des mesures parti-
culières (collecte des gaz).

Consommation et transformation de composés minéraux

Nous avons vu que le soufre et ses dérivés réduits, des composés réduits de l'azote, le Fer (II) et le Mn (II) peuvent servir de substrats donnees d'électrons à de nombreux micro-organismes. Un déchet contenant ces substances minérales pourra donc être le siège de biotransformations en aérobiose. La production d'acides sulfurique ou nitrique par oxydation aérobie du soufre ou de l'ammoniac peut engendrer des agressions indirectes. Quant à l'oxydation du fer (II) ou du Mn (II), elle tend généralement à réduire la solubilité de ces éléments (formation possible de Fe (OH)₃ et MnO₂ très peu solubles).

A l'inverse, les formes oxydées de ces éléments peuvent,
en anaérobiose, jouer le rôle d'accepteurs finals d'élec-
trons. Ainsi, la réduction des ions sulfate en sulfures peut
diminuer considérablement la solubilité des métaux éven-
tuellement présents. En revanche, la réduction de nitrates
en ammonium peut induire la solubilisation de métaux par
formation de complexes.

Altérations mécaniques

La croissance des micro-organismes sur le déchet, ainsi qu'à l'intérieur des pores, modifie les propriétés de surface. Dans le cas des déchets massifs, la porosité de surface (rugosité) peut ainsi être augmentée significativement par éclatement des pores résultant, entre autres phénomènes, de la croissance et de la pénétration des mycéliums de diverses moisissures. Ces phénomènes peuvent être amplifiés par des cycles éventuels de gel-dégel dans les conditions d'utilisation ou de stockage des déchets. D'autre part, si le déchet est exposé à la lumière, la croissance d'algues en surface apporte une source de matière organique utilisable par d'autres micro-organismes hétérotrophes. Cette association est bien connue dans les lichens et les altérations des pierres des monuments historiques.

Mécanismes de biodétérioration indirecte

Les mécanismes indirects concernent l'altération du déchet
par les métabolites libérés par les micro-organismes. Ces
phénomènes sont souvent prépondérants dans la biodé-
térioration des matériaux minéraux, et peuvent être cou-
plés à des mécanismes directs comme nous l'avons vu pré-
cédemment. Ils sont relativement bien connus dans les
processus d'altération de la pierre et du béton. On peut
distinguer les processus principaux suivants :

- production d'acides minéraux ou organiques,

- production d'agents complexants,

- production d'agents oxydants.

La production d'acides peut être liée à l'oxydation du soufre ou de produits soufrés par des bactéries (principalement du genre *Thiobacillus*), à la formation d'acide nitrique par les bactéries nitrifiantes, ou à la fermentation de matières organiques par des bactéries acidogènes. Les acides produits peuvent altérer les déchets en accélérant la solubilisation de la matrice (cas des déchets solidifiés) ou en solubilisant des substances insolubles à des pH neutres ou basiques. De même, les agents complexants (acide citrique, ions ammonium, polyphosphates, etc.) et les agents oxydants (Fe³⁺, ...) peuvent accélérer la solubilisation de divers composés.

Les agressions microbiennes indirectes ne doivent pas être
considérées comme des interactions purement chimiques.
En effet, si le mécanisme d'altération est bien chimique, la
production de l'agent d'altération est microbienne. Le pro-
cессu ne pourrait donc pas avoir lieu (ou alors beaucoup
plus lentement) sans intervention microbienne. D'autre
part, la production microbienne de l'agent agressif peut
avoir lieu à l'intérieur des pores du déchet solide, ou être
localisée dans des zones particulières du déchet. L'altération
qui en résulte peut être très différente de celle qu'on
observerait avec le même agent présent en solution dans
la phase aqueuse en contact avec le déchet.

Les mécanismes de biodétérioration indirecte sont parti-
culièrement importants lors du mélange de plusieurs
déchets (par exemple en sites d'enfouissement). Ainsi, la
biodégradation anaérobie d'un déchet organique peut
conduire à la libération d'acides organiques et d'ions ammo-
nium capables de solubiliser des métaux présents dans un
autre déchet exclusivement minéral.

CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES DES PROCÉDURES D'ÉVALUATION DE LA BIODÉTÉRIORATION DES MATÉRIAUX

Généralités et définitions

Il n'existe pas à notre connaissance, en France comme à l'étranger, de procédures normalisées spécifiques à l'évaluation de la biodétérioration des déchets solides massifs, granulaires ou pulvérulents. Les tests proposés au Canada par le Wastewater Technology Center (WTC) pour l'évaluation des déchets stabilisés et solidifiés sont des tests américains de l'ASTM (American Society for Testing and Materials) destinés en fait à l'évaluation des plastiques. Aux États-Unis, il n'y a pas non plus de procédures spécifiques et on se réfère également, en cas de nécessité, aux normes ASTM (voir Méhu et al., 1993 et Landreth, 1980). Les articles scientifiques publiés sur le sujet rapportent généralement des recherches portant sur la biodégradation ou sur les mécanismes de biodétérioration davantage que sur les méthodes d'évaluation.

Il existe en revanche, en France et à l'étranger, de nom-
breuses procédures normalisées destinées à évaluer la
résistance de divers types de matériaux aux agents biolo-
giques. Ces procédures peuvent, moyennant un certain
nombre de modifications, être adaptées à l'étude de l'al-
tération microbienne des déchets.

On peut distinguer trois grandes catégories de tests :

- Tests en milieu de culture artificiel solide

- Tests en milieu de culture artificiel liquide

- Tests de simulation (plus ou moins complexes, mettant en œuvre un milieu réel ou simulant la réalité).

Le tableau 2 donne les caractéristiques des principales
normes d'évaluation de la biodétérioration des matériaux.
Des méthodes dérivées de certaines de ces normes ont été
utilisées dans le cadre de procédures d'évaluation du com-
portement à long terme de déchets stabilisés (WTC, 1990 ;
Ministère de l'Environnement, 1991).

L'approche classique consiste à mettre en contact le maté-
riau pendant quelques semaines avec un agent microbien
(généralement une souche pure ou un mélange de souches
pures de micro-organismes) dans des conditions favorables
au développement microbien. Puis, après la période d'in-
cubation, les paramètres de description du matériau sont
mesurés et comparés aux paramètres initiaux. La biodé-
térioration est donc mesurée par la diminution (altéra-

tion) des caractéristiques essentielles du matériau (réduc-
tion de sa « qualité » ou de sa « valeur »).

On cherche souvent à conduire les tests dans des condi-
tions qui favorisent la croissance des micro-organismes afin
de réduire la durée des tests, et on travaille pour cela en
présence d'un milieu de culture artificiel. On parle alors de
« tests accélérés ». En fonction du degré d'optimisation
des conditions expérimentales, on pourra parler, comme
on le fait déjà pour caractériser la biodégradation des sub-
stances chimiques, de « biodétérioration facile » ou de
« biodétérioration intrinsèque » (Nyholm, 1991 ; OCDE,
1992 ; Cabridenc 1993).

Cependant, ces tests ne fournissent qu'une information partielle souvent difficilement utilisable pour prévoir correctement l'évolution dans les conditions réelles. En effet, l'influence du milieu extérieur peut être considérable dans l'évolution biologique d'un déchet, du fait notamment des mécanismes de biodétérioration indirecte qui peuvent s'avérer prépondérants. Il est donc souvent nécessaire de chercher à reproduire ou à simuler les conditions réelles d'environnement qui seront celles du matériau ou du déchet lors de son utilisation ou de son stockage. On s'oriente alors vers des « tests de simulation », qui sont généralement plus longs et plus complexes que les tests accélérés.

La transposition des procédures mises au point pour un type de matériau (généralement les plastiques ou les peintures dans les procédures normalisées) à un autre type de matériau (les déchets considérés ici) n'est envisageable qu'après adaptation des conditions expérimentales. Les principaux facteurs qui doivent être reconsidérés sont la nature de l'inoculum, le mode d'inoculation, les conditions d'incubation, et la composition du milieu d'incubation.

Nature de l'inoculum

Il existe trois types d'inoculum :

- utilisation d'une souche pure,

- utilisation d'un mélange de souches pures,

- utilisation d'une microflore complexe.

On peut également envisager un quatrième cas où aucun
inoculum exogène n'est apporté. Cette approche peut être
 intéressante dans le cas des déchets puisqu'elle permet
d'évaluer l'activité potentielle des micro-organismes endo-
gènes. Elle présente cependant l'inconvénient de rendre
nécessaires des durées d'incubation parfois très longues.

Souche pure

Il s'agit de micro-organismes bien étudiés et qui ont la pro-
priété d'être assez ubiquistes comme par exemple
Pseudomonas aeruginosa (utilisé dans le test ASTM G22-76).

Dans le cas des déchets qui sont susceptibles de contenir
un mélange de différentes substances organiques et miné-
rales, l'utilisation d'une souche pure peut s'avérer trop res-
trictive. En effet, la souche inoculée risque de ne pas être
capable de dégrader l'ensemble des polluants organiques
considérés, et certains polluants organiques peuvent n'être
biodégradables que par une association de micro-organismes
différents. Ainsi il nous apparaît plus judicieux de travailler
<table><caption>Tableau 2 : Caractéristiques des principales normes d'évaluation de la biodétérioration des matériaux</caption><thead><tr><th rowspan="2">Norme</th><th rowspan="2">Titre</th><th rowspan="2">Matériaux testés</th><th rowspan="2">Tests proposés</th><th rowspan="2">Inoculum</th><th rowspan="2">Ensemencement</th><th colspan="3">Conditions d'incubation</th><th colspan="2">Témoins</th><th colspan="3">Évaluation de la biodétérioration</th></tr><tr><th>Température (C°)</th><th>Humidité (%)</th><th>Durée</th><th>Témoin stérile</th><th>Contrôle de la viabilité de l'inoculum</th><th>Analyse visuelle</th><th>Variation de masse</th><th>Autres paramètres physiques suivant matériau testé</th></tr></thead><tbody><tr><td>ASTM G21-90</td><td>Standard practice for determining resistance of synthetic polymeric materials to Fungi</td><td>Polymères de plastiques</td><td>Test en boîte de Petri sur milieu gélosé synthétique sans carbone exogène</td><td>Suspension de spores de champignons : 5 souches pures</td><td>Pulvérisation de la suspension</td><td>28 - 30</td><td>85</td><td>21 jours</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui</td></tr><tr><td>ASTM G22-76</td><td>Standard practice for determining resistance of plastic to bacteria</td><td>Matériaux plastiques</td><td>Test en boîte de Petri sur milieu gélosé synthétique sans carbone exogène</td><td>Suspension bactérienne de Pseudomonas aeruginosa (souches pures)</td><td>Inoculum incorporé à une gélose fondue et refroidie à 45°C</td><td>37</td><td>85 minimum</td><td>21 jours</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui</td></tr><tr><td>ASTM D3273</td><td>Resistance to growth of mould on the surface of interior coating in an environnemental chamber</td><td>Peinture</td><td>Test en chambre avec atmosphère contrôlée</td><td>Non</td><td>Non</td><td>?</td><td>95</td><td>?</td><td>Non</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>?</td><td>?</td></tr><tr><td rowspan="2">DIN 53739 (1967)</td><td rowspan="2">Résistance des matières plastiques aux agents de dégradation biologiques</td><td rowspan="2">Matériaux plastiques</td><td>Test en boîte de Petri sur milieu gélosé synthétique : Méthode A : sans carbone</td><td>Inoculum mixte composé d'une suspension de spores de champignons : 5 espèces dont 2 différentes des tests précédents</td><td>Pulvérisation ou également</td><td>28</td><td>85</td><td>28 jours</td><td>Oui pour test A</td><td>Oui : essai sur milieu synthétique + carbone organique</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Non</td></tr><tr><td>Méthode B : avec carbone</td><td>Non</td><td>Non</td><td>Ambiante</td><td>Étuve avec 90</td><td>De 6 à 24 mois</td><td>Non</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui : résistance à la traction</td></tr><tr><td>NF X41-513</td><td>Protection des matières plastiques - Partie 1 - Méthode d'essai de résistance des constituants aux micro-organismes (évaluation du degré de comestibilité et effet fongistatique)</td><td>Matières plastiques</td><td>Tests en boîte de Petri avec ou sans source de carbone organique</td><td>Inoculum mixte composé d'une suspension de spores de champignons : 12 souches pures</td><td>Inoculum mélangé à la gélose à 45°C</td><td>30</td><td>95</td><td>De 14 à 28 jours</td><td>Oui</td><td>Oui : essai sur tissu de coton</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui : résistance à la traction</td></tr><tr><td>NF X41-514</td><td>Protection des matières plastiques - Partie 2 - Détermination du comportement sous l'action des champignons et des bactéries - Évaluation par estimation visuelle ou par mesurage des variations de masse ou de caractéristiques physiques</td><td>Matières plastiques</td><td>Tests en boîte de Petri avec ou sans source de carbone organique exogène pour essai champignon et sans carbone exogène pour essai bactérie</td><td>Inoculum mixte composé d'une suspension de spores champignons (même inoculum que DIN 53739), ou inoculum bactérien (pseudomonas aeruginosa)</td><td>Suspension de spores déposée avec une pipette sur échantillons. Suspension bactérienne mélangée à la gélose</td><td>30</td><td>&gt; 90%</td><td>28 jour ou plus</td><td>Oui</td><td>Oui : sur milieu nutritif complet</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Oui : dépend du matériau testé</td></tr><tr><td>NF X41-515</td><td>Méthode d'essai de résistance des matériels et appareillages aux micro-organismes</td><td>Cf. NF X41-513</td><td></td><td>Non</td><td>Non</td><td>30</td><td>Terre &lt; 30%</td><td>14 à 28 jours</td><td>Oui : autoclave 120°C 30 min 3 fois</td><td>Oui</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>Oui : dépend du matériau testé</td></tr><tr><td>NF 41-520</td><td>Protection - Méthode d'essai de résistance des peintures et de leur pouvoir de protection</td><td>Peintures</td><td>Tests en boîte de Petri avec (action fongistatique) ou sans source de carbone organique exogène (comestibilité)</td><td>Inoculum mixte composé d'une suspension de spores de champignons : 10 souches pures - Soit dans l'eau distillée soit dans milieu nutritif sans carbone</td><td>Pulvérisation ou avec une pipette de préférence</td><td>30</td><td>Incubation dans une étuve à 95 % d'humidité</td><td>14 jours</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>Oui</td><td>Non</td><td>Oui : résistance à l'éclatement de la peinture</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Essai d'enfouissement dans le sol</td><td>Terre constituée d'un mélange tamisé à l'avance, de terre de jardin, de terreau, de fumier d'herbivore et de sable de rivière, pH de 5 à 7,5 et C/N entre 8 et 15</td><td>Non</td><td>30</td><td>Humidité du sol de 30 % environ, et incubation dans une étuve à 95 % d'humidité</td><td>14 jours</td><td>Non</td><td>Oui : contrôle de l'activité biodégradative du sol</td><td>Non</td><td>Non</td><td>Oui : résistance à l'éclatement de la peinture</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Exposition en chambre tropicale</td><td>Au fond de la chambre, terreau et feuilles en décomposition + suspension de spore de 10 champignons</td><td>Pulvérisation de la suspension de spores, au moment de la première mise en service de la chambre</td><td>30</td><td>95</td><td>De 1 à 6 mois</td><td>Non</td><td>Non</td><td>Oui</td><td>Non</td><td>Oui : résistance à l'éclatement de la peinture</td></tr></tbody></table>

avec des micro-organismes seuls, plutôt qu'avec une souche recommandée a priori. On peut également envisager une pré-sélection de souches capables de métaboliser les constituants du déchet. Cette démarche a été suivie pour étudier par exemple la détérioration de la matrice cimentaire de déchets radioactifs solidifiés (Rogers et McConnell, 1988; Perfettini, 1989).

## Mélange de souches pures

C'est le cas des tests américains de biodétérioration des plastiques ASTM D 5247-92 et G21-90 et du test français de résistance aux champignons NF X 41-514, dont l'objectif est d'évaluer l'action des champignons sur les matériaux polymériques synthétiques. Dans les 2 dernières procédures,

l'inoculum recommandé est une suspension de « spores » de différents champignons. La procédure D 5247-92 laisse quant à elle le choix entre un mélange de 3 espèces de Streptomyces (bactéries), une moisissure (Phanenochaete chrysosporium), ou tout(s) autre(s) micro-organisme(s) jugé(s) adéquat(s).

Ces tests sont nettement moins restrictifs que les tests de résistance aux bactéries qui n'employent qu'une seule souche. En revanche, les espèces fongiques sélectionnées pour évaluer la biodétérioration des matières plastiques risquent de ne pas convenir à l'évaluation de la biodétérioration des déchets. Il nous semble, d'une manière générale, plus judicieux d'utiliser une microflore complexe.

## Microflore complexe

C'est l'approche choisie par exemple pour le test normalisé français de Demande Biochimique en Oxygène (DBO), NFT 90.103, ainsi que pour de nombreuses autres procédures normalisées étrangères mises au point pour les rejets liquides, les agents de surface ou les substances chimiques solubles (Essai de Sturm modifié, Essai MITI modifié, essai de screening de l'OCDE, etc.). Les tests consistent à travailler avec la microflore déjà présente dans le milieu récepteur ou l'effluent, ou provenant d'autres milieux naturels ayant déjà été en présence de la substance étudiée, ou plus généralement apportée par une boue de station d'épuration urbaine. Citons également les tests de l'ASTM développés pour la détermination de la biodégradation aérobie ou anaérobie des plastiques en présence de boues de stations d'épuration urbaines aérobie (D 5209-92 et D 5271-93) ou anaérobie (D 5210-92), ou dans des conditions de compostage (D 5338-92).

## Mode d'inoculation

Il dépend de la nature du test. On peut envisager d'apporter l'inoculum sous forme d'une suspension de micro-organismes ou de spores fongiques qui sera soit diluée dans le milieu d'incubation (tests en milieu liquide noyé), mélangée à la gélose en surfusion (tests en boîtes de pétri) ou « aspergée » à la surface du déchet solide (tests en chambre d'incubation ou sur boîtes de pétri).

## Conditions d'incubation

Les conditions d'incubation dépendent de la nature du test et du type d'inoculum utilisé. Elles sont choisies pour favoriser la croissance des micro-organismes et optimiser la biodétérioration (tests accélérés) ou pour simuler les conditions réelles de stockage ou d'utilisation du matériau. On distingue plusieurs critères :

- Durée de l'incubation : 28 jours dans la plupart des cas. Pour les déchets, cette durée peut être notablement accrue (jusqu'à plusieurs mois).

- Température : 25-30°C si on utilise des micro-organismes mésophiles (cas général).

- Aération : Nécessaire pour les essais aérobie, elle est obtenue par agitation ou insufflation d'air dans les essais en milieu liquide, ou par contact avec l'air dans les autres cas. Les essais de biodégradation anaérobie doivent, eux, être conduits en l'absence totale d'oxygène, ce qui fait préférer les tests en milieu noyé d'où l'oxygène dissous est purgé initialement à l'azote (ECETOC, 1989).

- Lumière : elle est nécessaire si on travaille avec des microorganismes phototrophes. Au contraire, l'obscurité est préférée si l'inoculum est constitué de micro-organismes chirotrophes (cas général) afin d'éviter les phénomènes éventuels de photodégradation. Pour les tests anaérobie, l'obscurité est indispensable car le développement d'algues est à proscrire pour éviter la libération d'oxygène par photosynthèse.

- Humidité : au moins 85 %.

- pH du milieu : entre 6 et 8 en général. Notons que le déchet testé peut influencer le pH du milieu de culture, ce qui conduit à utiliser des milieux tamponnés ou à contrôler le pH en cours de test.

- Contact déchet/micro-organismes/milieu de culture : Il doit être le meilleur possible si l'on cherche à accélérer les phénomènes pour réduire la durée des tests. Pour les déchets solides, on est conduit souvent à réduire la granulométrie pour augmenter la surface de contact. Cependant, les dimensions des échantillons testés dépendent des essais que l'on veut effectuer sur le déchet après la période d'incubation, et on peut vouloir également, le cas échéant, respecter la structure massive du déchet pour simuler l'évolution dans des conditions plus proches de la réalité.
<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1 :** synthèse des principaux facteurs et paramètres susceptibles d'influencer la biodétérioriation d'un déchet</figcaption></figure>

## Composition du milieu de culture

La vitesse de biodétérioriation des déchets dépend, entre autres facteurs, de la disponibilité des nutriments minéraux et de la source de carbone pour les micro-organismes.

- Nutriments minéraux : Dans les tests en milieu liquide ou sur boîte de pétri, le milieu nutritif apporte généralement les nutriments nécessaires aux micro-organismes afin d'accélérer la biodétérioriation éventuelle du déchet.

- Source de carbone : Dans la plupart des tests, aucun substrat carboné exogène n'est ajouté au milieu. Les micro-organismes hétérotrophes ne peuvent alors satisfaire leur besoin en carbone organique qu'à partir des matériaux testés. Toutefois, l'altération de certains composés requiert la présence d'une source de carbone supplémentaire qui permet d'induire une activité microbienne et rend possible soit une biodétérioriation indirecte, soit un métabolisme fortuit des polluants du déchet (phénomène de cométabolisme). Signalons les normes européenne ISO 846-1978 et française NF X 41-514 qui proposent l'exposition des plastiques aux micro-organismes avec ou sans source de carbone supplémentaire dans le milieu.

## CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES DE RECHERCHE

Les points abordés dans cet article peuvent être synthétisés par la figure 1. Comme toute synthèse, cette figure doit être utilisée avec prudence. La figure ne prétend pas en effet rendre compte de toutes les situations possibles. En outre, elle ne considère pas les paramètres et facteurs physico-chimiques importants que sont la température, le pH,

la teneur en eau et le mode de contact avec l'eau, la capacité d'absorption en eau, la granulométrie et la porosité.

On peut distinguer trois axes principaux dans lesquels des travaux de recherche apparaissent encore nécessaires malgré le nombre important d'articles publiés sur la biodétérioriation des roches, des minéraux et des matériaux. Ces trois axes de recherche sont les suivants :

- étude des différents types possibles de biotransformations et de leurs mécanismes,

- étude des effets des développements microbiens (c'est-à-dire des résultats de la biodétérioriation),

- prévision de ces effets par le biais de modélisations.

Dans le domaine de la biodétérioriation des déchets, ce sont surtout les deux derniers axes qui semblent prioritaires, mais cependant il paraît difficile d'étudier de manière relativement exhaustive les effets des biotransformations et de modéliser ces phénomènes sans une connaissance suffisante

des différents types de biotransformations.

L'axe de recherche à privilégier pour l'heure dans le domaine de la biodétérioriation des déchets est sans doute celui portant sur l'étude des effets de la biodétérioriation. En effet, si les méthodes d'évaluation de la biodétérioriation permettent bien de déterminer si un développement microbien est possible, elles ne renseignent que très imparfaitement sur les effets du développement microbien sur les « qualités » du déchet.

La prévision des phénomènes par le biais de leur modélisation est l'objectif ultime, mais il apparaît nécessaire dans un premier temps d'acquérir les données expérimentales permettant de bâtir puis de valider les modèles.

### * R. Gourdon, R. Bayard

Laboratoire de chimie physique appliquée et environnement (LCPAE) - Insa - Bât. 404, 20 avenue A. Einstein - 69621 Villeurbanne cedex

### * G. Valla

Laboratoire de Biosystématique et Nuisances Fongiques - Université Claude Bernard - Bât. 405 - 69622 Villeurbanne cedex

Cet article a été rédigé sur la base d'études bibliographiques et de reflexions conduites notamment dans le cadre d'un programme portant sur l'écocompatibilité des déchets financé par l'Ademe. Les auteurs souhaitent remercier l'Ademe pour son soutien, ainsi que les équipes collaborant au programme pour les nombreuses discussions fructueuses sur le sujet, et notamment Y. Perrodin (Polden Insavalor), coordonnateur scientifique du programme.