hectares de la cultures de plants pour la production de tubercules-semences sont infectés par ces pathogènes, ce qui équivaut à une perte estimée de 0,3 à 2 millions d'euros (Source FN3PT ; Fédération Nationale des Producteurs de Plants de Pomme de Terre). Par ailleurs, certains *Dickeya* et *Pectobacterium* sont aussi à l'origine de dégâts chez des cultures horticoles (œillets, violette africaine, ...) et maraîchères (carottes, endives, betteraves,...), confortant l'intérêt du développement de méthode de lutte.

Des travaux de recherche mis en place par le Laboratoire de Microbiologie Signaux et Microenvironnement (Normandie Université, Evreux) et l'Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (CNRS-CEA-Université Paris-Saclay, Gif-sur-Yvette) ont révélé l'existence d'un processus de communication intercellulaire qui synchronise l'expression des facteurs de virulence (enzymes lytiques et effecteurs) au sein de la population assaillante des pathogènes *Dickeya* et *Pectobacterium*. Ce processus de communication est basé sur l'échange de signaux chimiques entre les bactéries. Ces travaux ont permis de montrer que la perturbation de cette communication était suffisante pour empêcher totalement ou réduire fortement les dégâts observés sur tubercules (Crépin et al., 2012a,b,c). La découverte d'agents bactériens auxiliaires capables de perturber cette communication et la virulence chez les phytopathogènes *Pectobacterium* et *Dickeya* a permis de proposer un protocole opératoire de lutte, actuellement en essai dans des zones tests de culture de la pomme de terre (Cirou et al., 2007, 2012). Les premiers essais réalisés en serres et aux champs ont comparé différentes stratégies de lutte : soit par conservation, reposant sur la biostimulation des populations auxiliaires autochtones, soit par bioaugmentation, reposant sur l'épandage de l'auxiliaire, soit par couplage des deux principes.

Dans les paragraphes suivants, seront présentés avec plus de détails le processus de communication bactérienne qui peut être choisi pour cible de la lutte biologique puis les différentes stratégies de perturbation de cette communication bactérienne, enfin les travaux réalisés dans la lutte biologique ciblant la virulence des pathogènes de la pomme de terre *Dickeya* et *Pectobacterium*.

## 2. De l'intérêt d'être à l'écoute des communications microbiennes

On a longtemps cru que la majorité des bactéries (organismes unicellulaires) n'étaient pas capables de coordonner et synchroniser leur comportement au sein d'un groupe d'individus. Cette vision simpliste a été contestée par l'étude fine des structures de colonies et biofilms bactériens, montrant une collaboration étroite entre les bactéries à l'origine de changements dans la physiologie, la mobilité et la différenciation des cellules bactériennes. Plus récemment, plusieurs systèmes de communication intra- et interspécifiques ont été caractérisés, confirmant que colonies et populations bactériennes devaient être considérées comme des communautés sociales (Witzany, 2011).

L'évolution des techniques de microscopie ainsi que l'association des approches de biologie et de chimie sont à l'origine de ces découvertes. Ainsi, le pathogène opportuniste *Pseudomonas aeruginosa* produit et accumule des molécules de signalisation de la famille des quinolones dans des vésicules qui bourgeonnent au niveau de sa paroi puis circulent dans le milieu extérieur avant de
fusionner avec la paroi d'une cellule réceptrice de sa population (Mashburn & Whiteley, 2005). D'autres bactéries forment des connexions tubulaires fines, appelées aussi nanotubes ou nanofils, à travers lesquelles des électrons des chaînes respiratoires, des petites molécules, mais aussi des protéines ou des plasmides peuvent passer d'une cellule à une autre (Chun, 2014). Mais la présence de structures de transfert de molécules signalétiques n'est pas obligatoire pour permettre l'échange d'information entre les bactéries.

Un des mécanismes de communication les plus étudiés repose ainsi sur l'émission de petites molécules diffusant librement à travers les membranes des cellules. La concentration de ces molécules reflète directement le nombre des bactéries dans un environnement donné. Ainsi, la concentration environnementale de ces signaux informe les populations bactériennes à la fois de leur nombre mais aussi de leur localisation dans un environnement clos, seul capable d'empêcher la dilution des signaux. Cette particularité a valu à ce système de communication le nom de *quorum sensing* (ou QS), littéralement perception du *quorum* donc du nombre suffisant d'individus pour être efficace (Fuqua et al., 1994).

De nombreuses espèces bactériennes utilisent une communication QS pour réguler la transcription de leurs gènes et coordonner le comportement de leur population. C'est le cas des bactéries pectinolytiques *Dickeya* et *Pectobacterium* qui sont capables de synthétiser et de percevoir des molécules de communication de la famille des N-acyl homosérine lactones (Crépin et al., 2012b). La communication QS permet à ces populations pathogènes de mener une attaque de la plante hôte selon une chronologie bien particulière. Dans un premier temps, les bactéries se multiplient sur les sites d'infection (e.g., blessures) en utilisant les ressources en place, notamment les exsudats racinaires. Cette multiplication est associée à la synthèse par chaque bactérie de N-acyl homosérine lactones qui s'accumulent dans le milieu. Lorsque ces lactones atteignent la concentration critique reflétant le *quorum* cellulaire, ces lactones sont efficacement perçues comme signaux par l'ensemble des cellules de la population qui déclenche l'expression des facteurs de virulence. Cette phase de virulence se matérialise par la libération massive et synchrone d'un arsenal d'enzymes pectinolytiques, cellulases, protéases, ainsi que par l'injection dans la plante hôte d'effecteurs affaiblissant ses défenses *via* les systèmes de sécrétion de type III bactériens. Cette aptitude à coordonner son attaque grâce au QS apparaît comme un moyen pour le pathogène de demeurer masqué de la plante lors de la primo-invasion puis de surpasser les défenses de l'hôte dans un second temps, grâce à sa population accrue et la production massive concomitante de facteurs de virulence (Crépin et al., 2012a).

L'importance de la communication QS pour la virulence des bactéries macergènes *Pectobacterium* et *Dickeya* a été vérifiée grâce à la construction au laboratoire de souches mutées dans leur capacité à synthétiser les N-acyl homosérine lactones ou en faisant produire par les pathogènes des lactonases qui dégradent ces molécules signal avant leur libération dans l'environnement (Latour
et al., 2007 ; Crépin et al., 2012b). Des résultats prometteurs ont été obtenus lors d'essais de protection des tubercules en laboratoire par perturbation de la communication QS chez divers isolats de Pectobacterium et Dickeya déjà présents dans les collections, ainsi que d'autres plus contemporains et émergents. Ainsi, la communication QS via les N-acyl homosérine lactones a été validée comme une cible privilégiée de lutte contre les pathogènes Pectobacterium et Dickeya.

3. Comment perturber la communication des bactéries pathogènes ?

Une grande variété d'organismes (plantes, animaux, champignons, bactéries...) sont capables de produire des substances qui perturbent la communication bactérienne [pour une revue récente lire Grandclément et al. (2016)]. Par analogie, l'aptitude de ces organismes à masquer la communication QS a reçu le qualificatif de quorum quenching (QQ). Dans la majorité des cas analysés, ces substances sont soit des enzymes qui modifient l'intégrité des signaux QS soit des molécules chimiques qui perturbent le processus d'activation de la signalisation QS.

Les enzymes modifiant les signaux QS montrent des activités réductase, oxydase, lactonase et amidase. Tous domaines du vivant confondus, les enzymes les plus fréquemment identifiées sont les lactonases et les amidases. Ces enzymes ont été découvertes chez des bactéries qui produisent des signaux QS, comme les pathogènes Agrobacterium tumefaciens et Pseudomonas aeruginosa. Il a été suggéré que ces enzymes pouvaient jouer un rôle pour recycler les signaux QS, ou pour prévenir la saturation des récepteurs des signaux QS, ou encore pour réguler de manière fine le niveau de leur accumulation. Mais dans la majorité des cas, ces enzymes ont été découvertes chez des organismes qui ne produisent pas les signaux QS qu'elles inactivent (Grandclément et al., 2016). Citons, par exemple, des bactéries de l'espèce Bacillus thuringiensis, déjà connues pour produire des composés insecticides très utilisés en agriculture, qui produisent aussi une lactonase capable d'ouvrir le noyau lactone des signaux QS, donc de prévenir l'accumulation des signaux QS des bactéries pathogènes (Dong et al., 2004). D'autres microorganismes thermophiles comme les archées du genre Sulfolobus sont aussi capables de produire des lactonases qui sont très stables, donc utilisables pour certains développements technologiques de traitement des eaux et des surfaces (anti-biofilm), voire en médecine ou agriculture par application directe de spray d'enzymes (Ng et al., 2011 ; Hiblot et al., 2012). Des plantes, comme certaines légumineuses, et les mammifères (y compris l'Homme) sont aussi capables d'exprimer une activité lactonase inactivant les signaux QS (Grandclément et al., 2016).

Les composés naturels inhibiteurs du QS sont de nature chimique très différente : des composés phénoliques, des dérivés indole, des alcaloïdes, des furanones, des lactones, des composés organo-soufrés. Ces composés ont des modes d'action différents : ils peuvent bloquer la synthèse, la diffusion ou la perception des signaux QS. La sinefungine (un analogue structural de la S-adénosylméthionine, substrat universel des réactions de méthylation chez tous les organismes), qui est capable de bloquer la
synthèse des signaux QS, est produite par des bactéries du sol *Streptomyces* (Yadav *et al.*, 2014). La solenopsine-A, un alcaloïde découvert dans la fourmi de feu (*Solenopsis invicta*), est capable d'inhiber la signalisation QS chez le pathogène *P. aeruginosa* en perturbant l'interaction entre le signal QS et son récepteur protéique (Park *et al.*, 2008). D'autres inhibiteurs interagissant avec le récepteur des signaux QS sont ceux de la famille des furanones halogénées, identifiées chez une algue rouge (*Delisea pulchra*). Outre ces composés naturels, différents composés de synthèse montrent une activité d'inhibition du QS. Ils ont été identifiés par criblage de chimiothèques ou par analogie avec des inhibiteurs naturels ou avec les signaux QS eux-mêmes (Grandclément *et al.*, 2016).

Dans le cadre de la lutte contre les pathogènes *Pectobacterium* et *Dickeya*, très peu de composés naturels ou synthétiques se sont avérés efficaces pour contenir l'expression de leurs fonctions de virulence (Raoul des Essarts *et al.*, 2013). Une explication possible est la production massive de signaux N-acyl homosérine lactones par ces pathogènes. La seule approche de QQ actuellement efficace est l'utilisation d'enzymes ou de microorganismes produisant des enzymes de dégradation des signaux N-acyl homosérine lactones (Crépin *et al.*, 2012b).

## 4. Biostimulation de la dégradation des signaux de quorum sensing

Les premiers travaux ont été engagés afin de développer une stratégie de lutte reposant sur la biostimulation des populations auxiliaires autochtones. Nous avons recherché des composés biodégradables qui sont capables de stimuler la croissance des bactéries dégradant les signaux QS dans la rhizosphère. Des composés dont la structure est proche des signaux QS, mais qui ne sont pas reconnus comme signaux QS par les bactéries pathogènes, ont été choisis puis comparés pour leur capacité à augmenter l'activité de dégradation des signaux QS au sein de communautés bactériennes issues du sol. Les composés ayant la meilleure activité de biostimulation ont été la γ-caprolactone (GCL, CAS 695-06-7) et la γ-heptalactone (GHL, CAS 105-21-5) (Cirou *et al.*, 2007). Ces deux composés activent la croissance de la communauté bactérienne qui est capable de dégrader les signaux QS. Cette communauté activée par la GHL ou la GCL est capable de protéger des tubercules de pommes de terre contre le phytopathogène *P. atrosepticum* (Cirou *et al.*, 2011). Ce procédé a fait l'objet d'un dépôt de brevet avec des extensions internationales des revendications (Faure *et al.*, 2007).

L'activité de biostimulation de la GCL et GHL a été évaluée *in planta*. Des essais ont été réalisés en culture hydroponique sous serre, selon les pratiques de la filière plants de pommes de terre (Station de Bretteville-du-Grand-Caux, http://plantdepommedeterre.org/index/comite-nord). Dans les cultures hydroponiques de plants de pomme de terre sans traitement GCL ou GHL, les bactéries dégradant les signaux QS représentent moins de 5% des populations bactériennes cultivables. Ces bactéries appartiennent majoritairement au genre *Agrobacterium* (la moitié des isolats caractérisés) puis aux genres *Rhodococcus*,
*Pseudomonas* et *Bacillus* en proportion décroissante. Dans un système hydroponique de culture traitée à la GCL, les bactéries dégradant les signaux QS représentent de 50 à 70% des communautés cultivables et appartiennent majoritairement (96% des isolats caractérisés) au genre *Rhodococcus*, et plus particulièrement à l'espèce *R. erythropolis* (Cirou et al., 2011, 2012). Ces travaux montrent qu'en milieu hydroponique la biostimulation par la GCL conduit à l'enrichissement en bactéries *R. erythropolis* dégradant les signaux QS, bactéries naturellement présentes, mais en plus faible proportion, en absence de traitement. Par ailleurs, des isolats issus des plants de pomme de terre capables de dégrader les signaux QS et appartenant aux espèces *Rhodococcus* et *Agrobacterium* ont été comparés pour leur capacité de protection des tubercules contre *Pectobacterium*. Aucun des isolats du genre *Agrobacterium* ne montre d'effet protecteur, contrairement aux isolats du genre *Rhodococcus*. Ce résultat montre que la GCL et la GHL sélectionnent des populations de *Rhodococcus* qui dégradent les signaux QS avec une efficacité telle qu'elles deviennent capables de perturber l'expression des facteurs de virulence chez la pathogène *Pectobacterium* (Cirou et al., 2011, 2012).

**5. Un agent bactérien capable d'une dégradation efficiente des signaux de quorum sensing**

En parallèle à ces travaux sur la biostimulation, la recherche d'isolats bactériens efficaces pour une activité de QQ a été entreprise. Ces bactéries auxiliaires ont été recherchées dans la rhizosphère de la pomme de terre où la densité racinaire du microbiote végétal est usuellement estimée à $10^7-10^9$ microbes par gramme de sol rhizosphérique, et peut atteindre jusqu'à $10^{10}-10^{11}$ microbes par gramme de racine à la surface (rhizoplan) de racines matures produisant d'importantes quantités d'exsudats (Diallo et al., 2011). Un criblage des différents isolats capables de dégrader les N-acyl homosérine lactones a permis de sélectionner une souche particulièrement efficiente (*R. erythropolis* R138), chez laquelle les déterminants génétiques responsables de l'activité protectrice ont été recherchés au laboratoire (Cirou et al., 2011 ; Barbey et al., 2013).

Le génome de *R. erythropolis* R138 est constitué d'un chromosome circulaire de 6,2 Mb, d'un plasmide linéaire de 477 kb et d'un plasmide circulaire de 91 kb. La taille exacte du génome est de 6 806 506 paires de bases. La première version incomplète de ce génome a été obtenue en combinant des données issues des technologies Illumina et 454-Roche : 12 séquences continues (contigs) de 5,5 kb à 2,7 Mb ont été obtenues et assemblées en trois propositions de réplicons (Kwasiborski et al., 2014). La version complète du génome a été obtenue en utilisant la technologie Pacific Biosciences qui permet la lecture d'une traite de longues séquences allant jusqu'à 3000 bases (Kwasiborski et al., 2015b). En comparant les séquences de ces deux versions, seules quatre variations de nucléotides ont été observées, démontrant la qualité des séquences. Le génome de *R. erythropolis* R138 code 6 734 protéines, dont seule la lactonase QsdA présente sur le chromosome circulaire est identifiée comme impliquée dans la dégradation des signaux QS. La base de données NCBI contient trois autres génomes complets de l'espèce *R. erythropolis*
ayant des tailles de 6,3 à 6,7 Mb et une architecture similaire composée d'un chromosome circulaire et de plasmides linéaires ou
circulaires de nature et taille variables. Le gène *qsdA* codant la lactonase éponyme est identifié dans tous les génomes complets ou
incomplets présents dans la base de données NCBI.

Grâce à une approche de protéomique comparative (extraction protéique totale, séparation bidimensionnelle puis analyse par spectrométrie de masse en tandem MALDI-TOF/TOF), la plupart des enzymes responsables de l'assimilation des γ-lactones (dont font partie les molécules signalétiques N-acyl homosérine lactones ainsi que les biostimulants GCL et GHL) a été caractérisée chez la souche R138. Parmi elles, nous avons retrouvé la lactonase QsdA précédemment décrite et plusieurs autres enzymes, l'ensemble formant une nouvelle voie métabolique non encore décrite dans la littérature et que nous avons nommé voie catabolique des γ-lactones (Barbey et al., 2012).

Des études analytiques (dosage des signaux QS, suivi des populations bactériennes) et de transcriptomique ciblant l'expression de *qsdA* ou plus largement le transcriptome bactérien ont ensuite permis de démontrer *in planta* l'implication de cette voie dans la protection biologique couplée à la dégradation des signaux QS dans le tubercule. Ces travaux ont surtout montré que c'était la communication QS et la virulence associée de l'agent pathogène, plutôt que sa présence dans l'hôte au côté du *Rhodococcus* protecteur, qui étaient responsables de l'induction de l'activité de protection QQ, ainsi que de la modification afférente du métabolisme de l'agent protecteur (Barbey *et al.*, 2013 ; Kwasiborski *et al.*, 2015a).

# 6. Transfert d'échelle et application en sols

Si les essais réalisés en culture hydroponique ont permis de valider le paradigme de biostimulation des bactéries *R. erythropolis* par les agents GHL et GCL, des essais complémentaires ont été réalisés en macrocosmes de sol (espaces suffisamment grands pour étudier de grands volumes d'écosystème reconstitué durant plusieurs années) afin de tester ce paradigme dans la rhizosphère de plants de pomme de terre. Ces essais ont été réalisés dans les serres du CNRS (Gif-sur-Yvette, France). Trois traitements différents ont été comparés à une condition témoin non-traitée. Le premier traitement est une biostimulation par l'apport de l'agent biochimique GHL uniquement ; le second traitement est l'apport de l'agent biologique, la bactérie *R. erythropolis* R138 ; le troisième est le couplage des agents biochimique (GHL) et biologique (*R. erythropolis* R138).

Les résultats montrent une disparition rapide de l'agent biochimique introduit, laissant la GHL à un niveau 1000 fois inférieur à celui de l'introduction. Deux semaines après son application, la GHL atteint un niveau indétectable par les outils HPLC/MS-MS (couplage chromatographie liquide et spectrométrie de masse). L'agent GHL est donc rapidement dégradé par les populations de microorganismes présentes dans le sol. En revanche, aucune augmentation du niveau des populations dégradant les signaux QS
n'est observée quand la GHL est appliquée seule. Ce traitement montre donc peu d'effet en macrocosmes de sol, contrairement aux effets observés en cultures hydroponiques en hors sol (Cirou et al., 2012). Par ailleurs, une faible (ou non significative) augmentation des populations dégradant les signaux QS est observée lorsque l'agent biologique *R. erythropolis* R138 est introduit seul dans la rhizosphère de plants de pomme de terre. Ceci suggère que l'agent biologique seul n'est pas suffisant pour modifier la structure fonctionnelle des populations de la rhizosphère. Enfin, lors du couplage des agents biologique *R. erythropolis* R138 et biochimique GHL, une forte colonisation de la rhizosphère par la population *R. erythropolis* est observée puisque celle-ci atteint 40% de la communauté cultivable. Il est important de noter qu'en absence de nouveaux traitements la population introduite R138 décroît en quelques semaines. L'installation de cette population est donc transitoire. Ces expériences ont été répétées et validées plusieurs fois en utilisant des plants de pommes de terre et de tomate.

Afin d'évaluer l'impact de ces traitements sur la structure des communautés bactériennes de la rhizosphère, des analyses de diversité bactérienne par séquençage 454-Roche d'amplicons du gène ribosomique 16S ont été réalisées. La structure globale des communautés des échantillons traités avec l'approche de couplage associant GHL et *R. erythropolis* R138 est différente des échantillons témoins. D'une manière remarquable, le niveau de la population cible (les bactéries appartenant au genre *Rhodococcus*) est le plus augmenté dans le traitement de couplage. Ces données par approche séquençage 454-ARN16S consolident les acquis par les approches cultivables. Parmi les genres plus abondants, c'est-à-dire dont la représentation est supérieure à 1/1000 dans les communautés, les genres dominants comme *Pseudomonas* ou *Acidovorax* ne sont pas affectés par les traitements, contrairement aux populations cibles comme *Rhodococcus*. L'ensemble de ces données suggèrent que les traitements ont un impact mesurable, mais n'affectent pas les populations dominantes de la rhizosphère de plants de pommes de terre.

Dans ces essais, quatre parcelles randomisées de 200 plants sont préparées pour chacune des conditions comparées : plantes saines, plantes infectées par le pathogène *P. atrosepticum*, et plantes infectées par le pathogène et traitées par l'agent *R. erythropolis* R138 et l'agent de biostimulation GHL (Figure 14-2). Les tubercules sont inoculés avec le pathogène *P. atrosepticum* par trempage le jour de la plantation. Les relevés des symptômes de la première campagne montrent une baisse significative des symptômes avec le traitement contenant l'agent *R. erythropolis* R138 et l'agent de biostimulation GHL par rapport au témoin seulement contaminé par le pathogène. Dans cette campagne, nous avons également fait des prélèvements de sol afin de suivre les modifications des communautés bactériennes par l'approche de séquençage d'amplicons ribosomiques par séquençage 454-Roche. Les données de 454-ARN16S montrent que les genres dominants ne sont pas affectés par les traitements. De plus, l'analyse de la dynamique de la diversité des populations révèle que le seul facteur explicatif de variations est le stade de culture de
plants de pommes de terre. Autrement dit, l'effet du stade de la plante sur la structure des populations de la rhizosphère est plus marqué qu'un potentiel effet des traitements par l'agent *R. erythropolis* R138 et l'agent de biostimulation GHL.

## 7. Perspectives

Le biocontrôle des populations microbiennes phytopathogènes dans les sols constitue une des solutions agroécologiques actuellement promues par les chercheurs (Lemanceau et al., 2015 ; Dessaux et al., 2016 voir chapitres 10 et 13 de cet ouvrage). Celle-ci doit répondre aux besoins d'une agriculture raisonnée moins polluante et aux impasses technologiques laissées par le remplacement des intrants chimiques. La lutte microbiologique repose sur l'utilisation de microorganismes auxiliaires présents naturellement dans les sols ou apportés de manière exogène afin de compenser leur faible présence dans les sols. Les recherches visent à proposer de nouveaux candidats microbiens ainsi que de nouvelles propriétés, dont la bactérie *R. erythropolis* et l'antivirulence par QQ sont des exemples. Toutefois, l'efficacité de la protection demeure intimement liée à la persistance de l'agent protecteur et à l'exercice de son effet antagoniste sur ses cibles. Il est donc nécessaire de maîtriser la formulation des produits biologiques et le conditionnement physiologique des microorganismes étudiés.

Dans le cas de l'activité QQ, les travaux actuels ont pour but de caractériser le mécanisme de régulation des voies cataboliques impliquées dans la dégradation des signaux, en identifiant notamment les molécules inductrices de ces voies (Latour et al., 2013 ; El Sahili et al., 2015). L'étape suivante consiste à mettre sous formulation adéquate l'agent protecteur, afin de faciliter son installation à proximité de la plante et d'atténuer l'effet barrière dû à la microflore autochtone. L'utilisation d'un système d'ensachage composé d'un polymère biodégradable contenant des biostimulants de la famille des γ-lactones est clairement envisagée. En effet, ces biostimulants donneraient à la fois un avantage métabolique aux rhodococci (soutenant leur densité de population) et joueraient le rôle d'inducteur de l'activité de dégradation de ces molécules et donc de celle collatérale des signaux pathogènes similaires. Par ailleurs, la dégradation progressive du sachet formulant par la microflore indigène permettrait une libération prolongée des actifs sur tout ou partie de la période de culture du végétal (Latour et al., 2013).

Un autre moyen d'améliorer et amplifier l'effet protecteur recherché consisterait à diversifier les mécanismes de lutte microbiologique, voire à les coupler avec des procédés de lutte biotechnique (Raoul des Essarts et al., 2016). Il s'agirait ici de regrouper plusieurs agents protecteurs microbiens aux propriétés diverses (anti-virulence, antibiose, antagonisme de contact) et un cocktail de molécules élicitrices des défenses des plantes et biostimulantes. Dans l'idéal, l'ensemble devrait être regroupé dans une même formulation afin de limiter le travail mécanique d'épandage aux champs, mais il est évident que de nombreuses études préalables devront évaluer la compatibilité biochimique entre les molécules d'intérêt et leur contenant ainsi que la compatibilité biologique entre microorganismes.
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## Légendes des Figures

**Figure 14-1.** Symptôme de jambe noire sur plants de pomme de terre provoqué par la bactérie *Pectobacterium* [avec l'aimable autorisation d'Amélie Beury© - SIPRE (Semences Innovation Protection Recherche Environnement ; Comité Nord Plants de Pommes de Terre ; http://www.comitenordplant.fr/FR/PAGE_SIPRE.awp)].

**Figure 14-2.** Essai de protection de cultures de plants de pomme de terre contre les phytopathogènes *Pectobacterium* et *Dickeya*. Les essais initiaux de lutte biologique par anti-virulence ont été menés grâce à l'agent bactérien de biocontrôle *Rhodococcus erythropolis* stimulé ou non dans son métabolisme par des γ-lactones similaires aux signaux échangés par les pathogènes [avec l'aimable autorisation d'Amélie Beury© - SIPRE (Semences Innovation Protection Recherche Environnement ; Comité Nord Plants de Pommes de Terre ; http://www.comitenordplant.fr/FR/PAGE_SIPRE.awp)].
# Chapitre 15

## Défis et perspectives pour l'utilisation de la fixation biologique de l'azote en agriculture

Benoît Alunni, Peter Mergaert*

Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR 9198, CNRS/Université Paris-Sud/CEA – F-91198 Gif-sur-Yvette, France

* Auteur pour la correspondance - Peter Mergaert (peter.mergaert@i2bc.paris-saclay.fr)

### Résumé

Certaines bactéries et archées ont développé au cours de l'évolution un complexe enzymatique, appelé nitrogénase, capable de réduire le N₂ en ammoniac. En mettant en place des interactions symbiotiques avec ces bactéries diazotrophes des plantes, principalement de la famille des légumineuses, ont tiré bénéfice de cette fixation biologique de l'azote. Dans ce chapitre, nous décrivons les stratégies proposées afin de produire des plantes cultivées obtenant leur azote de la fixation biologique. Elles reposent sur l'utilisation d'endophytes diazotrophes colonisant la plante et fixant l'azote pour son hôte, la production du complexe nitrogénase dans des organites végétaux et l'ingénierie et le transfert de la capacité organogénétique à former des nodosités. Nous détaillons également les défis technologiques à relever en vue du transfert des capacités de nodulation à des plantes de grandes cultures n'appartenant pas à la famille des légumineuses.

### 1. L'addiction de l'agriculture à l'azote

L'azote est un élément chimique fondamental pour les organismes vivants. On le retrouve dans de nombreuses biomolécules telles que les acides aminés constituant les protéines, les acides nucléiques qui portent l'information génétique, et dans de nombreux autres composés organiques indispensables à la vie. En effet, la croissance des plantes dépend de la disponibilité dans le sol d'azote sous une forme utilisable, qu'il soit oxydé ou réduit, minéral ou organique. Cet élément est l'un des plus abondants sur Terre, constituant près de 80% de l'atmosphère, où il est présent sous forme de diazote gazeux (N₂), une forme chimiquement très stable et inutilisable par la plupart des organismes vivants. A contrario, les formes utilisables d'azote sont assez rares dans la
biosphère notamment dans les systèmes agricoles.

Depuis l'invention de l'agriculture, un élément majeur de la Révolution Néolithique (Demoule, 2010), l'histoire de l'Humanité a été significativement influencée par les limitations en azote du sol et par la découverte de pratiques agricoles permettant de contourner ces limitations et d'augmenter la production de biomasse. Durant la période Néolithique, les premiers agriculteurs ont utilisé le fumier des animaux domestiques, très riche en azote organique, pour amender le sol et en améliorer la fertilité. Dès l'antiquité romaine et même auparavant, dans la civilisation chinoise, des Légumineuses ont été utilisées comme engrais vert sur des terres en jachère pour en améliorer les performances agronomiques (Smil, 2001). Sur le continent américain, la coculture de Légumineuses (haricot) avec des céréales (maïs) et des courges, système de culture dit des « trois sœurs », a été adoptée par de nombreuses ethnies, cette association permettant des augmentations de rendement pour chacune des trois espèces. On trouve notamment trace de ces pratiques culturales dans des écrits Mayas ou dans la culture iroquoise (Landon, 2008). Toutefois, ça n'est qu'au XIXᵉ siècle que les scientifiques perçurent l'importance de l'azote comme nutriment pour les plantes et que les vertus des Légumineuses résidaient dans leur capacité à fixer l'azote par l'intermédiaire d'une symbiose (Smil, 2001). De nouvelles formes d'azote ont été mises à disposition des agriculteurs au XIXᵉ siècle, notamment sous forme de matières premières naturelles comme le guano (excréments d'oiseaux solidifiés) ou le nitrate de sodium (minéraux exploités notamment dans le désert de l'Atacama et connus sous le nom de Salpêtre du Chili), ou encore par l'introduction de nombreux procédés chimiques de fixation de l'azote. Néanmoins, aucune de ces approches ne permettait de garantir un approvisionnement en azote fiable et pérenne. Une avancée majeure surgit au tournant du XXᵉ siècle, avec la découverte du procédé Haber-Bosch. Cette invention majeure, une merveille d'ingénierie des procédés chimiques, permet la production massive d'ammoniac, et à partir de celui-ci, l'essor de tout un pan de la chimie industrielle, dont la production d'engrais azotés. Ce procédé requiert de l'azote (N₂) et de l'hydrogène (H₂), une température élevée (~450°C), une pression importante (~200-300 bars) et un catalyseur métallique pour pouvoir cliver la triple liaison du diazote, une des liaisons chimiques les plus fortes. Depuis sa découverte, le procédé a rapidement été déployé à une échelle mondiale, tirant dans son sillage les rendements agricoles à des niveaux jamais atteints auparavant, et éclipsant ainsi les autres sources d'azote fixé, dont les Légumineuses et la fixation biologique de l'azote. Le procédé Haber-Bosch est sans doute l'une des inventions qui a le plus contribué à la croissance démographique mondiale, permettant un quadruplement de la population mondiale en un siècle (Smil, 2001).

Au début du XXIᵉ siècle, la consommation mondiale d'engrais azotés s'élève à près de 130 mégatonnes/an (Smil, 2001). La contribution des activités humaines au cycle géochimique de l'azote représente actuellement un apport équivalent à celui des processus naturels, dont la composante majeure est la fixation biologique de l'azote. Une utilisation aussi massive des engrais
azotés a des conséquences dramatiques pour l'environnement. Les problèmes engendrés comprennent la pollution des nappes phréatiques et des eaux de surface par suraccumulation de nitrates, qui conduisent à l'eutrophisation des cours d'eau et à des marées vertes sur les côtes, ainsi qu'à l'émission de gaz à effet de serre. Ce dernier effet pervers provient notamment de la consommation massive d'énergie fossile (1-2% de la consommation annuelle mondiale) nécessaire à la production, au transport et à l'épandage des engrais azotés, au relargage d'oxyde nitreux (N₂O) par les sols engraissés et à l'émission de méthane lors de la décomposition des algues suite aux marées vertes. Les conséquences néfastes de cet apport anthropique d'azote dans la biosphère sont alarmantes. De plus, les engrais azotés coûtent cher et ne sont pas toujours accessibles pour les petits producteurs des pays en développement dont les rendements, de fait, restent faibles. Bien que la dépendance planétaire vis-à-vis du procédé Haber-Bosch soit loin de s'estomper à court-terme, il devient de plus en plus urgent de développer d'autres pratiques agricoles plus respectueuses de l'environnement et plus durables en gérant différemment le cycle de l'azote, et qui puissent garantir une sécurité alimentaire pour les populations humaines toujours en expansion. Une partie de la solution à ces problèmes se trouve sans doute dans un regain d'intérêt pour la fixation biologique de l'azote au sein du monde agricole, en l'utilisant toutefois de façon innovante.

## 2. La fixation symbiotique de l'azote, pierre angulaire d'une future agriculture durable

### 2.1. La symbiose Légumineuses-rhizobium

Pour les mêmes raisons qu'en chimie industrielle, la fixation biologique de l'azote est également très difficile à réaliser et très consommatrice d'énergie. Les plantes comme les animaux n'ont jamais acquis la capacité à cliver la triple liaison du N₂. Toutefois, certaines bactéries et archées ont développé au cours de l'évolution un complexe enzymatique, appelé nitrogénase, capable de réduire le N₂ en ammoniac. Certaines plantes ont tiré bénéfice de la fixation biologique de l'azote en mettant en place des interactions symbiotiques avec ces bactéries diazotrophes. Les familles de plantes concernées sont relativement rares et comprennent en particulier la majorité des plantes appartenant à la famille des Légumineuses, qui forment une symbiose avec un groupe de bactéries diazotrophes appartenant aux α- et β-protéobactéries, collectivement appelées rhizobia. L'interaction entre les partenaires végétaux et bactériens mène à la formation d'un nouvel organe végétal : la nodosité (Sprent et al., 2007). Cet organe héberge les rhizobia, qui vont y fixer l'azote atmosphérique et transférer l'ammonium à la plante qui l'utilisera pour sa croissance. L'azote fourni par les rhizobia au sein des nodosités satisfait totalement les besoins en azote de la plante.

### 2.2. Les autres interactions plantes-bactéries fixatrices d'azote

Un autre groupe de plantes, collectivement appelées plantes actinorhiziennes, établit une symbiose fixatrice d'azote avec des bactéries du genre *Frankia*, appartenant aux actinobactéries, un groupe non-apparenté aux rhizobia. Les plantes actinorhiziennes
représentent un petit nombre d'espèces appartenant à trois ordres des Angiospermes : les Fagales, les Cucurbitales et les Rosales (Santi et al., 2013). Ces ordres sont apparentés à l'ordre des Fabales ou *Leguminosae*. Tout comme les Légumineuses, les plantes actinorhiziennes forment des nodosités pour abriter les symbiotes bactériens. Par ailleurs, de nombreuses associations symbiotiques se sont mises en place entre des cyanobactéries fixatrices d'azote des genres *Nostoc* et *Anabeana* et des plantes appartenant à divers clades de la lignée verte. On trouve notamment des associations avec des Anthocérotes, des hépatiques, des bryophytes, des ptéridophytes (comme la fougère aquatique *Azolla*) et même une Angiosperme (du genre *Gunnera*) (Santi et al., 2013). Enfin, un grand nombre d'espèces bactériennes, dont certains rhizobia et des bactéries appartenant aux genres *Azoarcus*, *Azospirillum*, *Herbaspirillum* ou *Gluconacetobacter*, sont connues pour fixer l'azote atmosphérique en plus ou moins étroite relation avec les plantes, comme colonisateur épi- ou endophytique (Santi et al., 2013). Ces associations contribuent de manière très inégale à la nutrition azotée des plantes hôtes (de 0 à 60% des apports en N), cette contribution étant bien plus faible que celle des symbioses des Légumineuses et des plantes actinorhiziennes.

## 2.3. Ingénierie de la fixation d'azote : les trois stratégies en cours d'exploration

L'extension de la capacité à fixer l'azote à des plantes cultivées non-Légumineuses est un objectif ambitieux affiché par la communauté scientifique travaillant sur des symbioses fixatrices d'azote. Cela permettrait, après la révolution verte des années 1930-1960, de déclencher une nouvelle révolution agricole et d'entrevoir une agriculture réellement durable d'un point de vue environnemental. Cet objectif, déjà énoncé depuis 1917 par Burrill et Hansen, devient de plus en plus réaliste au vu de l'avancement des connaissances relatives à la génétique et à la biochimie de la nitrogénase et de son activité, des nouvelles découvertes au sujet des évènements d'organogenèse et d'infection des nodosités, ainsi que l'idée selon laquelle les rhizobactéries fixatrices d'azote (des bactéries colonisant la rhizosphère) et les bactéries endophytes (colonisant les tissus végétaux) sont largement répandues. A partir de ces connaissances, et grâce aux avancées techniques dans le domaine de la génomique et de la biologie synthétique, trois stratégies ont été proposées afin de produire des plantes cultivées obtenant leur azote de la fixation biologique. Ces trois approches concurrentes reposent sur : i) l'utilisation d'endophytes diazotrophes colonisant la plante et fixant l'azote pour son hôte, ii) la production du complexe nitrogénase dans des organites végétaux, iii) l'ingénierie et le transfert de la capacité organogénétique à former des nodosités (Figure 15-1). Dans ce chapitre, les deux premières approches sont brièvement décrites et nous détaillons surtout les défis technologiques à relever en vue du transfert des capacités de nodulation.

# 3. Utilisation d'endophytes diazotrophes comme bioinoculant
Parmi les voies explorées actuellement, l'utilisation des bactéries endophytes fixatrices d'azote (Geddes et al., 2015) semble a priori la solution la plus simple. En effet, des souches d'endophytes fixateurs d'azote ont été isolées à partir de nombreuses plantes cultivées, et le criblage de souches présentant une efficacité de fixation élevée devrait mener à l'isolation de nouvelles souches d'intérêt. Toutefois, cette approche a ses limites car la quantité d'azote transféré à la plante est généralement très basse, même si dans quelques cas, chez la canne à sucre, le blé ou le maïs par exemple, des études ont montré qu'une quantité significative de l'azote de la plante provenait des endophytes diazotrophes (Santi et al., 2013). L'amélioration des capacités de fixation d'azote des endophytes et de transfert vers la plante est donc requise pour envisager une utilisation rentable.

Le faible nombre de bactéries endophytes colonisant les tissus végétaux pourrait être à l'origine du niveau marginal de fixation d'azote observé. Ainsi améliorer les capacités de colonisation de la plante chez des souches d'intérêt par ingénierie biotechnologique représente un axe de progrès possible. Une voie particulièrement intéressante repose sur l'ingénierie de plantes produisant un métabolite rare et spécifiquement utilisable par l'endophyte comme source de carbone, créant une rhizosphère modifiée. Ainsi, la génération de plantes transgéniques produisant des opines, des composés spécifiquement produits par les tumeurs induites par Agrobacterium sur ses hôtes végétaux et qui servent de substrats carbonés pour la croissance des agrobactéries possédant la voie métabolique nécessaire à l'assimilation de ces opines, favorise leur colonisation par les bactéries utilisatrices d'opines (Oger et al., 2007 ; Savka & Farrand, 2007 ; voir chapitre 13 de cet ouvrage). L'autre option est d'utiliser une bactérie qui colonise très efficacement les plantes, chez laquelle on exprime les gènes de fixation de l'azote provenant d'une bactérie diazotrophe, comme testé lors de l'introduction d'un large ilôt génomique de fixation d'azote provenant de la bactérie diazotrophe Pseudomonas stutzeri dans la souche rhizosphérique Pseudomonas protegens Pf-5. La souche transgénique présentait une activité nitrogénase forte et dérégulée, relarguant des quantités significatives d'ammonium et promouvant la croissance des plantes hôtes cultivées en limitation azotée, ainsi qu'une augmentation de la teneur en azote dans la plante, liée à la fixation biologique (Fox et al., 2016).

Une stratégie plus complexe afin d'augmenter le niveau de colonisation des plantes par les endophytes serait de sélectionner ou de mettre au point des plantes dans lesquelles une niche spécifiquement favorable aux endophytes serait surdéveloppée (e.g., le système racinaire, la base des racines latérales...) ou dans lesquelles des structures hypertrophiées ou néoplasiques, comme les structures « tumorales » induites par des phytohormones ou par certains pathogènes bactériens, viraux ou fongiques, seraient produites (Doonan & Sablowski, 2010). Ces néoplasies constituent des puits de nutriments pouvant potentiellement former une niche pour les endophytes d'intérêt. Enfin, il est possible d'optimiser la réponse de la plante aux endophytes fixateurs d'azote par amélioration variétale. Une approche de génétique d'association pangénomique étudiant la variabilité génétique naturelle
d'Arabidopsis pour sa réponse à la bactérie PGPR (pour plant growth-promoting rhizobacteria, des bactéries rhizosphériques promouvant la croissance végétale) Pseudomonas simiae (dont la fonction PGPR n'est pas liée à la fixation d'azote) a permis de montrer que la réponse de la plante à la bactérie dépend largement d'une composante génétique (Wintermans et al., 2016). On peut donc légitimement penser que la réponse des plantes cultivées aux endophytes fixateurs d'azote est également contrôlée génétiquement et que cela peut constituer un axe privilégié pour des programmes d'amélioration variétale.

## 4. La production de la nitrogénase dans des organites végétaux : les « nitroplastes »

Une seconde stratégie consiste à introduire directement dans la plante les gènes permettant de produire la nitrogénase (Curatti & Rubio, 2014). Ce complexe enzymatique est constitué de deux parties majeures : la partie catalytique, composée d'un hétérotétramère de NifDK, et de la dinitrogénase réductase, composée d'un homodimère de NifH. Ce complexe contient aussi trois types de clusters fer-soufre. La protéine NifH contient un cluster [4Fe-4S] que l'on retrouve de manière ubiquiste dans la nature, tandis que chaque complexe NifDK contient deux clusters métalliques très particuliers, dont un de type [8Fe-7S] appelé P-cluster, et un cofacteur à fer et molybdène nommé FeMo-co ([Mo-7Fe-9S-C-homocitrate], l'un des clusters fer-soufre les plus complexes connus) (Rubio & Ludden, 2008). La nitrogénase reçoit des électrons provenant de ferrédoxines ou de flavodoxines, passant par NifH et les métalloclusters constituent une chaîne de transfert d'électrons jusqu'au FeMo-co, qui est enfoui dans le site catalytique du complexe enzymatique où a lieu la réduction du N₂ en NH₃. Ce transfert d'électrons est énergisé par l'hydrolyse d'ATP effectuée par NifH (Rubio & Ludden, 2008).

Du fait de sa structure complexe, l'assemblage et le fonctionnement de la nitrogénase nécessitent la participation de nombreux gènes (e.g., 18 chez Klebsiella oxytoca), dont ceux codant les sous-unités structurales de la nitrogénase, mais aussi les enzymes impliquées dans la biogenèse du P-cluster et du FeMo-co et dans leur insertion dans l'apoprotéine NifDK. De plus, l'enzyme requiert des conditions physiologiques stringentes comme un faible niveau d'oxygène (car il endommage irréversiblement les cofacteurs métalliques de l'enzyme) et un haut niveau énergétique sous la forme d'ATP et de pouvoir réducteur, requis pour briser la triple liaison du N₂. Enfin, du fait de la toxicité de l'ammoniac produit par la nitrogénase, il doit être rapidement assimilé sur le lieu de sa synthèse. Ces trois facteurs constituent autant de verrous technologiques à lever pour pouvoir envisager ce type d'application biotechnologique.

Le grand nombre de gènes requis pour la biosynthèse et le fonctionnement de la nitrogénase représente un challenge dantesque d'ingénierie métabolique. Par exemple, l'assemblage et le fonctionnement de la nitrogénase sont largement impactés par les niveaux d'expression relatifs de ses différents composants structuraux et biosynthétiques. Toutefois, la biologie synthétique actuelle
permet d'entrevoir des solutions pour assembler efficacement des constructions polygéniques par juxtaposition de modules individuels comprenant des promoteurs, des gènes et des terminateurs. Ces méthodes ont permis l'expression d'une nitrogénase fonctionnelle dans *Escherichia coli* (Temme *et al.*, 2012), une avancée majeure qui laisse entrevoir la possibilité d'obtenir un jour la production d'une nitrogénase et de réaliser la fixation d'azote dans des cellules végétales. De plus, il a été montré qu'un nombre plus faible de gènes (9 à 10 gènes) est requis pour exprimer dans *E. coli* une nitrogénase fonctionnelle provenant de *Paenibacillus* sp. WLY78 ou d'Azotobacter vinelandii, permettant d'envisager des stratégies d'ingénierie métabolique basées sur des systèmes plus simples à transférer (Wang *et al.*, 2013 ; Yang *et al.*, 2014).

Les chloroplastes et les mitochondries sont considérés comme les compartiments subcellulaires les plus aptes à héberger une activité nitrogénase. Ces deux sites peuvent fournir de grandes quantités d'ATP et de pouvoir réducteur requis pour le fonctionnement de la nitrogénase. Les chloroplastes présentent l'avantage de pouvoir être transformés génétiquement, d'obtenir de hauts niveaux d'accumulation de protéines et d'utiliser des machineries de transcription et de traduction de type procaryote, ce qui permet de recourir à des constructions géniques basées sur des promoteurs bactériens et des regroupements de gènes en opérons. Toutefois, les chloroplastes produisent de grandes quantités d'oxygène lors de la photosynthèse, ce qui est incompatible avec le fonctionnement de la nitrogénase. Une solution pourrait consister à exprimer la nitrogénase la nuit dans les chloroplastes en utilisant des promoteurs contrôlés par le rythme circadien. Par ailleurs, les mitochondries portent des systèmes de production et d'assemblage de métalloclusters similaires à ceux requis pour la nitrogénase, suggérant que l'activité respiratoire de la mitochondrie maintient un niveau d'oxygène suffisamment bas pour permettre la production et le fonctionnement d'enzymes sensibles à l'oxygène. L'absence de procédure de transformation génétique est un problème quant à l'utilisation des mitochondries comme organite fixateur d'azote. Cela nécessiterait de produire à partir de gènes nucléaires les composants structuraux et biosynthétiques de la nitrogénase en fusion avec des signaux d'adressage mitochondriaux. Entre chloroplastes et mitochondries, la communauté scientifique manque encore de recul à l'heure actuelle pour pouvoir déterminer quelle option est la meilleure.

Une limite potentielle au fonctionnement optimal d'une voie métabolique reconstruite dans un hôte transgénique est son intégration dans le contexte des réseaux métaboliques préexistants chez l'hôte. Ainsi, la nécessité d'utiliser des ferrédoxines ou des flavodoxines réduites pour effectuer le transfert d'électrons au sein de la nitrogénase *via NifH* est une contrainte pour son bon fonctionnement. La présence de donneurs d'électrons compatibles dans les plastes et/ou les mitochondries n'a pas été démontrée et il sera peut-être nécessaire de reconstituer une chaîne de transfert d'électrons adaptée. Un second point critique pour une bonne intégration de la nitrogénase dans le métabolisme de l'hôte correspond à l'assimilation de l'ammonium, effectuée par le cycle glutamine synthétase/glutamine oxoglutarate aminotransférase (GS/GOGAT) qui implique des fonctions chloroplastiques et
mitochondriales (Curatti & Rubio, 2014). Il est impossible de prédire comment le flux d'électrons vers la nitrogénase et l'assimilation de l'ammonium vont perturber les autres voies métaboliques de la plante, mais on peut s'attendre à ce que l'intégration métabolique d'une nitrogénase nécessitera de profondes adaptations d'autres voies métaboliques.

## 5. L'organogenèse de nodosités chez des plantes de grande culture

Le troisième scenario consiste à transférer la capacité de nodulation vers des plantes d'intérêt agronomique (Rogers & Oldroyd, 2014). Il a été montré que l'interaction Légumineuse-rhizobium est initiée par un dialogue moléculaire complexe au sein duquel les signaux moléculaires appelés facteurs Nod (NF), produits par les rhizobia, jouent un rôle clé. Ce signal NF permet la détection de l'endosymbionte par la plante et déclenche les processus d'organogenèse et d'infection. Les analyses génétiques menées sur les plantes ont permis l'identification de nombreux éléments de la voie de signalisation NF (Oldroyd, 2013). La mise en évidence de cette voie de signalisation a été ensuite à la base de découvertes spectaculaires qui ont suscité un regain d'optimisme auprès des partisans du transfert de la nodulation aux non-Légumineuses, qui poursuivent actuellement cet ambitieux objectif à long terme. Ces avancées incluent la découverte de l'implication d'éléments génétiques de la voie de signalisation NF dans d'autres processus d'endosymbiose comme la symbiose actinorhizienne ou la mycorhization arbusculaire (Markmann & Parniske, 2009 ; Oldroyd, 2013). Comme la mycorhization concerne une très large majorité des plantes terrestres, dont les céréales, cela signifie que certains éléments de la voie NF sont déjà présents et fonctionnels chez des non-Légumineuses et que la stratégie d'ingénierie génétique de la nodulation dans les plantes cultivées pourrait être simplifiée en tirant parti des voies de signalisations préexistantes.

La signalisation NF est de loin la composante la mieux connue de l'interaction Légumineuses-Rhizobium, mais il en faut plus pour former une nodosité fonctionnelle. Au-delà des évènements de signalisation précoce permettant la reconnaissance des partenaires, de l'initiation de l'infection et de l'organogenèse nodulaire, l'établissement d'une nodosité fonctionnelle requiert également l'accommodation intracellulaire des bactéries sous la forme d'organites temporaires appelés symbiosomes et enfin l'intégration métabolique de l'endosymbionte au sein de l'hôte. Notre compréhension de la manière dont s'articulent et s'intègrent ces différents processus est encore très incomplète et nécessite davantage d'investigation. Cet état de l'art est un facteur supplémentaire indiquant que l'ingénierie de la nodulation chez les plantes cultivées est un projet pour le moins complexe. Toutefois, il semble que tout ou partie de la voie de signalisation NF soit impliquée dans les processus de l'organogenèse nodulaire, l'infection et la formation des symbiosomes (voir plus loin).

Au sein des Légumineuses, la diversité des formes, des processus organogénétiques et des modes d'infection des nodosités est importante, allant d'organes primitifs assez simples à des organes très complexes. Cette diversité structurale reflète probablement
l'histoire évolutive de ce processus symbiotique, au cours de laquelle, dans certains clades, sa complexification pourrait s'accompagner d'une augmentation de l'efficacité de fixation de l'azote atmosphérique. Mais dans tous les cas, l'azote fixé bénéficie à la plante. On peut donc penser qu'une certaine quantité d'azote pourra être fixée dès lors qu'une interaction entre un rhizobium et un hôte d'intérêt aura pu être établie par ingénierie génétique. De manière similaire aux processus évolutifs, il sera alors possible d'apporter des améliorations au système pour augmenter l'efficacité symbiotique.

**5.1. La voie de signalisation dépendant des facteurs Nod (NF)**

Certainement, la première étape à franchir pour induire la formation de nodosités chez une plante cultivée est de lui transférer une voie de signalisation NF fonctionnelle. Les composants de cette voie de signalisation (pour des revues récentes, voir Oldroyd et al., 2011 ; Oldroyd, 2013) comprennent premièrement des récepteurs de type LysM-RLK (récepteur kinase à domaine LysM) situés au niveau de la membrane plasmique. Ces récepteurs sont impliqués dans la perception des NF et fonctionnent en complexe avec un récepteur LRR-kinase (SYMRK ; Antolin-Llovera et al., 2014). En aval des récepteurs, la signalisation intracellulaire repose sur l'activation d'oscillations calciques nucléaires mettant en jeu des nucléoporines (NUP85, NUP133, NENA), des canaux potassiques (CASTOR, POLLUX/DMI1) fonctionnant en tandem avec une pompe calcique (MCA8) et un canal perméable au Ca²⁺ de type CNG (Charpentier et al., 2016), tous situés au niveau de l'enveloppe nucléaire. L'enzyme HMGR (hydroxyméthylglutaryl-CoA réductase, enzyme clé de la voie de biosynthèse du mévalonate) forme un complexe avec SYMRK et produit du mévalonate qui active les canaux potassiques (Kevei et al., 2007 ; Venkateshwaran et al., 2015). Un module de décodage des oscillations calciques, composé d'une kinase dépendante du Ca²⁺/calmoduline (CCaMK), phosphoryle le complexe d'initiation de la transcription comprenant CYCLOPS/IPD3, qui à son tour recrute et active le facteur de transcription NIN (Singh et al., 2014). Ensuite, NIN active la transcription d'autres facteurs de transcription de type NF-Y. De plus, des facteurs de transcription de type GRAS sont également activés par les oscillations calciques et CCaMK. L'activation de ces facteurs de transcription en aval, en conjonction avec des cytokinines (phytohormones végétales indispensables au développement des plantes) qui sont perçues par le récepteur LHK1/CRE1, est requise pour l'initiation de l'organogenèse. Au démarrage de l'interaction, la reconnaissance des NF et l'activation de la voie de signalisation ont lieu au niveau des cellules épidermiques, où est initié le processus d'infection, tandis que les processus organogénétiques démarrent parallèlement dans la partie corticale de la racine par une réactivation des divisions cellulaires. Ce second processus nécessite également la signalisation NF-dépendante et la transmission d'un signal encore inconnu de l'épiderme vers le cortex (Oldroyd et al., 2011).

Hormis les récepteurs de type LysM-RLK, une partie des facteurs de transcription en aval de la voie et le processus
organogénétique, un très grand nombre d'éléments de la voie de signalisation des NF est également impliqué dans l'établissement de la mycorhization, et ainsi cette portion de la voie de signalisation est appelée voie commune SYM. La voie SYM est conservée hors de la famille des Légumineuses chez des plantes mycorhiziennes, et de manière remarquable, de nombreux éléments de la voie SYM peuvent être remplacés fonctionnellement par leurs homologues d'autres espèces non-Légumineuses (Markmann & Parniske, 2009 ; Oldroyd, 2013). Cela indique que les non-Légumineuses possèdent une voie SYM fonctionnelle, et qu'il suffirait peut-être d'introduire des éléments en amont (récepteurs LysM-RLK) et aval (facteurs de transcription) spécifiques de la voie NF pour induire une réponse aux rhizobia. Il est difficile de prédire l'ampleur de cette réponse, mais comme la voie NF contrôle l'organogenèse, l'infection et la formation de symbiosomes (voir plus bas), il est possible qu'un certain niveau de colonisation puisse être atteint par cette première étape d'ingénierie génétique.

## 5.2. L'infection des nodosités

Dans le cas le plus général, l'infection d'une nodosité naissante se fait par l'intermédiaire de structures tubulaires appelées cordons d'infection, qui sont mises en place à partir du point de contact initial entre la bactérie et son hôte. Ces cordons, qui s'allongent entre ou à travers les cellules végétales, transportent les rhizobia qui se multiplient dans ces structures et les acheminent vers les cellules symbiotiques dans lesquelles les bactéries sont relarguées. Les cordons d'infection sont des structures subcellulaires dérivées du système endomembranaire, délimitées par une membrane dérivée de la membrane plasmique, et remplies de composés pariétaux d'origine végétale, de polysaccharides bactériens et de rhizobia en cours de multiplication. Ainsi, on peut considérer que la localisation des rhizobia au sein de ces structures est similaire à une localisation extracellulaire. Les cordons d'infection subissent une croissance apicale ou polaire, de manière similaire à d'autres structures végétales comme les tubes polliniques ou les poils racinaires. En effet, dans de nombreux cas, les cordons d'infection sont initiés à partir de la réorientation de croissance de poils racinaires, qui passent d'une croissance apicale allongeant le foil à une croissance vers l'intérieur menant à une invagination de la membrane plasmique et à la formation du cordon d'infection. L'initiation et la croissance des cordons d'infection mettent en jeu un certain nombre de mécanismes moléculaires communs à la croissance des tubes polliniques et des poils absorbants. Cela se caractérise par la mise en place d'un influx calcique à l'apex de la structure considérée, créant ainsi un gradient de Ca²⁺ qui, en combinaison avec une production localisée d'espèces réactives de l'oxygène, dirige la croissance apicale en coordonnant l'organisation du cytosquelette d'actine et le trafic vésiculaire vers l'apex (pour revue, voir Oldroyd et al., 2011). Ces réponses sont activées par la liaison des NF à leurs récepteurs, eux-mêmes complexés à des canaux ioniques, des ROP-GTPases et probablement une NADPH oxydase, mais cela ne nécessite pas les autres composants de la voie de signalisation NF. D'autre part, l'initiation des cordons d'infection dans les poils racinaires n'est pas cantonnée à une redirection de la croissance du foil par
les NF, mais cela implique également une restructuration localisée de la paroi végétale *via* l'activation transcriptionnelle de gènes codant des enzymes de modification de la paroi végétale (Xie *et al.*, 2012 ; Fournier *et al.*, 2015). Cette dernière réponse nécessite la voie NF complète et notamment le facteur de transcription NIN.

De prime abord, la voie de signalisation NF et les mécanismes cellulaires mis en place lors de la formation des cordons d'infection peuvent sembler complexes et spécifiques au processus étudié. Dans les faits, tout ceci est très apparenté aux mécanismes mis en jeu lors de la mise en place d'une interaction endomycorhizienne (Oldroyd, 2013 ; Fournier *et al.*, 2015). Il n'est donc pas déraisonnable de penser que l'activation de la voie NF dans des plantes transgéniques pourrait mener à un certain niveau d'infection.

### 5.3. L'hébergement de grandes populations bactériennes

L'efficacité de la symbiose Légumineuse-Rhizobium, qui, contrairement aux endophytes diazotrophes, peut entièrement satisfaire les besoins en azote de la plante, repose sur un contact intime et prolongé entre la plante hôte et la bactérie symbiotique dans les nombreuses nodosités présentes au niveau du système racinaire de la plante, au sein desquelles des milliards de bactéries sont hébergées de façon intracellulaire dans les cellules symbiotiques de l'hôte. Ainsi, une seconde étape vers l'obtention de nodosités fixant efficacement l'azote chez des plantes cultivées, après y avoir introduit une voie de signalisation NF fonctionnelle, passera par l'amélioration quantitative de la colonisation de ces nodosités par les bactéries fixatrices d'azote. Ces dernières années, des progrès majeurs ont été faits dans la compréhension des mécanismes régulant l'accommodation intracellulaire de grandes populations de rhizobia au sein des cellules hôtes. Ces mécanismes seront donc la cible de cette seconde étape d'ingénierie génétique.

L'organogenèse des nodosités nécessite une forte activité de division cellulaire, qui permet de fournir toutes les cellules qui constituent cet organe. De plus, une voie de différenciation cellulaire est spécifiquement mise en place dans les cellules des nodosités, caractérisée par un accroissement spectaculaire de leur taille qui s'accompagne de nombreux cycles d'endoréplication. L'endoréplication correspond à un état particulier du cycle cellulaire au cours duquel les phases S s'enchaînent sans qu'il n'y ait de phase de mitose entre chacune, induisant une augmentation du contenu cellulaire en ADN. Cela mène à la formation de cellules symbiotiques géantes (> 50 µm de diamètre et jusqu'à 80 fois leur taille initiale) portant jusqu'à 64C (1C correspond à un génome haploïde). La polyploïdie des cellules symbiotiques est essentielle à leur fonctionnement, puisque l'extinction de CCS52A, un régulateur de l'endoréplication, mène à la formation de nodosités non-fonctionnelles (Vinardell *et al.*, 2003).

Dans la nodosité mature, les cellules végétales endorépliquées infectées par les rhizobia constituent la majorité de l'organe et
représentent le cœur de l'interaction symbiotique. Wildermuth (2010) avait remarqué, en comparant de nombreuses interactions biotrophes impliquant des plantes, que la polyploïdie des cellules hôtes était une caractéristique commune des symbioses avec les rhizobia et les champignons endomycorhiziens, mais aussi des interactions avec les champignons pathogènes et les nématodes parasites. Ainsi, la polyploïdisation des cellules hôtes semble être une adaptation favorable à l'échange de nutriments entre plantes hôtes et microorganismes.

La façon dont la différenciation cellulaire médiée par l'endoréplication est régulée reste mal comprise. Toutefois, la signalisation de la voie NF semble être impliquée dans ce processus. En effet, les mutants de *Medicago truncatula* dans le gène *IPD3* (CYCLOPS) forment différents types de nodosités dont certaines de grande taille, traversées par un dense réseau de cordons d'infection. Toutefois, les cellules symbiotiques ne se différencient pas, il n'y a pas d'endoréplication, et cela est associé à un défaut de relargage intracellulaire des bactéries. Cela suggère qu'IPD3 est requis pour l'activation de l'endoréplication et que cette étape est nécessaire au relargage des bactéries depuis les cordons d'infection ou *vice versa* (Maunoury et al., 2010 ; Ovchinnikova et al., 2011).

Au cours de la formation des nodosités, les rhizobia vont être relargués de façon intracellulaire depuis les cordons d'infection par un processus endocytotique pour former des symbiosomes au sein desquels les bactéries se différencient en leur forme fixatrice d'azote appelée bactéroïde. Au-delà d'IPD3, ces mécanismes font intervenir des composants de la voie de signalisation NF comme CCaMK, les récepteurs des NF et SYMRK (Capoen et al., 2005 ; Limpens et al., 2005 ; Godroy et al., 2006 ; Capoen et al., 2009 ; Moling et al., 2014). Deux flotillines et une rémorine, des protéines membranaires associées aux radeaux lipidiques (microdomaines de la membrane plasmique constituant des zones privilégiées pour l'activité de certaines protéines qui y sont intégrées), sont requises respectivement pour la croissance des cordons d'infection et la formation des symbiosomes (Lefebvre et al., 2010 ; Haney & Long, 2010).

## 5.4. Différenciation des bactéroïdes au sein des symbiosomes

Suite à leur relargage au sein des symbiosomes, les bactéries vont également subir une différenciation cellulaire dont les caractéristiques rappellent celle des cellules végétales (pour revue, voir Alunni & Gourion, 2016). Ainsi, chez *Medicago*, les rhizobia vont s'allonger pour atteindre jusqu'à 10 fois leur taille initiale. En parallèle, leur génome va s'endorépliquer pour atteindre des niveaux de ploïdie allant jusqu'à 24C (Mergaert et al., 2006). Cette différenciation cellulaire dite terminale (car les bactéries ne peuvent plus revenir en arrière et reprendre leur multiplication) se met en place sous l'effet d'un intense trafic vésiculaire qui achemine des facteurs végétaux aux bactéries par l'intermédiaire de la voie de sécrétion, nécessitant l'action d'une signal-
peptidase spécifique des nodosités (Van de Velde et al., 2010 ; Wang et al., 2010). Suite à leur maturation par la signal-peptidase, les protéines sécrétées vont poursuivre leur export vers les symbiosomes via le trafic vésiculaire, qui fait intervenir des protéines SNARE (enzymes catalysant les réactions de fusion membranaire au cours du transport vésiculaire) lors des événements de fusion des vésicules aux membranes cibles (Ivanov et al., 2012 ; Pan et al., 2016). Ce trafic vésiculaire et la mise en place des symbiosomes mettent en jeu un réseau dense de filaments d'actine autour des organites (Gavrin et al., 2015). En parallèle, la mise en place et le maintien des symbiosomes dans les cellules symbiotiques nécessitent la répression des régulateurs du trafic vésiculaire à destination de la vacuole (Gavrin et al., 2014). Par contre, lorsque les nodosités entrent en sénescence, les symbiosomes acquièrent des SNARES vacuolaires et par conséquent une identité vacuolaire préliminaire à leur lyse (Limpens et al., 2009).

Parmi les facteurs végétaux induisant la différenciation des bactéroïdes, une famille de peptides antimicrobiens appelés NCR (pour *Nodule-specific Cysteine-Rich*) a été identifiée (Van de Velde et al., 2010). Ces peptides sont adressés aux bactéroïdes et sont des acteurs majeurs de la différenciation terminale des bactéroïdes. Chez *M. truncatula*, la famille NCR compte plusieurs centaines de gènes exclusivement exprimés dans les nodosités selon plusieurs vagues successives (Maunoury et al., 2010 ; Guefrachi et al., 2014). Les NCR ont une activité antimicrobienne *in vitro* et permettent, à des doses sublétales, d'induire une différenciation partielle des bactéries en culture (Van de Velde et al., 2010). Le mode d'action des NCR reste encore assez mystérieux, leur cibles d'action semblant être localisées autant au niveau de l'enveloppe bactérienne qu'au niveau intracellulaire. Par exemple, il a été montré que le peptide NCR247 pouvait interagir avec de nombreuses protéines bactériennes dont certains acteurs de la division cellulaire induisant le passage vers l'endoréplication (Farkas et al., 2014 ; Penterman et al., 2014). D'autres résultats récents viennent compliquer la vision que nous pouvons avoir du rôle des NCR dans la différenciation cellulaire des bactéroïdes. En effet, deux mutants de *Medicago* dans des gènes NCR (*NCR169* et *NCR211*) présentent un défaut symbiotique, l'un bloquant avant la différenciation bactérienne, l'autre après (Horvath et al., 2015 ; Kim et al., 2015).

Toutefois, la différenciation terminale des bactéroïdes n'est pas la règle générale. On trouve de nombreuses Légumineuses chez lesquelles ce processus n'est pas mis en place. L'analyse d'un large échantillon de Légumineuses a montré que l'état ancestral des bactéroïdes est l'état indifférencié, et que la différentiation terminale est apparue plusieurs fois indépendamment au cours de l'évolution des Légumineuses (Oono et al., 2010 ; Czernic et al., 2015). On peut donc s'interroger sur l'intérêt pour la plante d'investir autant d'énergie dans la production de centaines de NCR. Une première piste a été avancée en comparant l'efficacité symbiotique de bactéroïdes différenciés et non différenciés, montrant que la différenciation terminale induit un gain d'efficacité symbiotique (Oono & Denison, 2010). Ainsi les Légumineuses imposant une différenciation terminale aux bactéries obtiendraient un
meilleur retour sur investissement. Il est donc possible à moyen terme de généraliser cette différenciation terminale à d'autres Légumineuses d'intérêt agronomique ne mettant pas en place ce processus comme le soja, afin d'en améliorer les performances symbiotiques et donc possiblement les performances agronomiques. A plus long terme, le transfert de la capacité de nodulation à des plantes cultivées pourrait également bénéficier de ce type d'optimisation.

### 5.5. Répression de l'immunité au sein des nodosités

Comme énoncé précédemment, les cellules symbiotiques sont intégralement remplies de symbiosomes, ce qui peut sembler paradoxal, puisque les plantes sont dotées d'un système immunitaire qui lutte activement contre les attaques microbiennes. Ainsi, les plantes peuvent détecter la présence de microorganismes et déclencher des réponses de défense impliquant la synthèse de composés antimicrobiens et d'espèces réactives de l'oxygène, ainsi qu'un renforcement pariétal. On peut donc supposer que les nodosités constituent des organes particuliers vis-à-vis de leur statut immunitaire, et que les Légumineuses ont mis en place une stratégie d'évitement de ces défenses dans les cellules symbiotiques (Gourion et al., 2015). La découverte récente de plusieurs mutants végétaux présentant des réactions de défense dans le cadre d'une symbiose non fonctionnelle renforce cette idée. Les gènes impliqués dans le contrôle de l'immunité des nodosités comprennent le facteur de transcription RSD (Sinharoy et al., 2013), le récepteur de type RLK SymCRK (Berrabah et al., 2014), la phospholipase DNF2 (Bourcy et al., 2013) et le peptide à domaine transmembranaire NAD1 (Wang et al., 2016). Le réseau de gènes impliqués et la manière dont le contrôle de l'immunité s'effectue dans les nodosités sont encore mal connus, mais cela laisse d'ores et déjà entrevoir que l'ingénierie génétique de la fixation d'azote chez des plantes cultivées risque de se heurter à des problèmes d'ordre immunitaire liés à l'hébergement intracellulaire de grandes populations bactériennes.

### 5.6. L'intégration métabolique des endosymbiontes dans les cellules symbiotiques des nodosités

Finalement, quand bien même les verrous technologiques relatifs au transfert des capacités de nodulation à des plantes cultivées auraient pu être levés, les symbiosomes contenus au sein de nodosités devront être métaboliquement intégrés au sein de leur hôte (Udvardi & Poole, 2013). Cette tache semble également très complexe, notamment au vu des profonds changements transcriptomiques observés dans les cellules symbiotiques, dont une bonne part sert à créer un environnement favorable aux échanges métaboliques entre partenaires (Maunoury et al., 2010). L'une des conditions clé pour cette intégration métabolique est la mise en place d'un environnement microaérobie, requis pour la fixation d'azote dans les bactéroïdes. Cela est essentiellement effectué par la production massive d'une hémoprotéine végétale captant l'oxygène : la leghémoglobine. Une autre étape importante dans cette adaptation métabolique concerne l'apport massif de carbone comme source d'énergie aux bactéroïdes, qui consomment
notamment des dicarboxylates comme le malate. Ainsi les systèmes permettant l'import de saccharose dans la nodosité et sa conversion en malate sont fortement activés dans l'organe symbiotique. Enfin, de manière similaire aux deux premières stratégies décrites, l'assimilation de l'ammonium produit par les bactéroïdes par la voie GS/GOGAT sera un point critique pour l'adaptation de l'hôte à cette ingénierie métabolique.

# 6. Conclusion

Parmi les trois stratégies actuellement explorées pour étendre la fixation biologique de l'azote au-delà des Légumineuses, celle reposant sur la manipulation des endophytes semble être la plus à même de produire des résultats à court terme. En effet, certaines souches sont déjà disponibles pour des essais sur des plantes de grande culture. De plus, les technologies actuelles de séquençage à haut débit permettent une exploration rapide et quasiment exhaustive de la biodiversité, ce qui laisse penser que de nombreuses nouvelles souches d'endophytes d'intérêt pourront être identifiées sous peu. Toutefois, on peut douter de l'impact réel de cette approche sur la nutrition azotée des plantes et de son adaptabilité à toutes les cultures. Les deux autres voies visant à implémenter la fixation biologique de l'azote chez des plantes de grande culture semblent plus prometteuses, au moins de manière théorique. Plusieurs laboratoires à l'échelle internationale sont engagés dans cet effort de recherche. Compte tenu de la complexité de ces projets d'ingénierie génétique, on peut s'attendre à ce que ces stratégies ne portent leurs fruits qu'à long terme, peut-être dans une vingtaine d'années, voire plus. De plus, de nombreuses questions relatives aux mécanismes contrôlant l'interaction Légumineuses-Rhizobium restent ouvertes, nécessitant davantage d'efforts de recherche pour pouvoir envisager un transfert des capacités de nodulation vers des plantes de grande culture. Néanmoins, la signalisation NF semble être impliquée dans le contrôle de nombreuses étapes du processus symbiotique. Elle intervient au niveau de la reconnaissance des partenaires, au niveau de l'organogenèse avec l'activation de l'endoréplication, au niveau de l'infection avec la croissance des cordons d'infection et le relargage intracellulaire des rhizobia. On peut donc légitimement penser que la reconstitution d'une voie de signalisation NF fonctionnelle sera une première étape cruciale vers l'obtention de plantes produisant des nodosités et fixant l'azote. Quelles que soient les difficultés techniques à surmonter pour chacune des stratégies évoquées, la nécessité de nourrir une population humaine toujours grandissante est si impérieuse qu'il ne faudra sans doute pas limiter les efforts de recherche à la question de l'azote.

Finalement, les solutions envisagées reposent quasi toutes sur l'utilisation d'organismes génétiquement modifiées (OGMs), végétaux et/ou bactériens, tandis que dans l'état actuel, l'opinion publique reste largement opposée à toute forme d'application d'OGMs au champ. Donc un dernier verrou pour étendre la fixation biologique de l'azote vers les grandes cultures sera d'obtenir l'acceptation de ces nouvelles cultures par le grand public.
Remerciements

Notre laboratoire est soutenu par l'Agence National de la Recherche (ANR), convention n° ANR-13-BSV7-0013-01 et du LabEx Saclay Plant Sciences-SPS (ANR-10-LABX-0040-SPS).

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## Légende de la Figure

**Figure 15-1.** Les trois stratégies actuellement explorées visant à implémenter la fixation biologique de l'azote chez des plantes de grande culture. 1) Les souches endophytes diazotrophes colonisant les racines des plantes pourront être testées pour leur contribution à la nutrition azotée de l'hôte. A défaut de résultats probants, les souches endophytes capables de coloniser efficacement les tissus de l'hôte pourraient être utilisées comme châssis pour l'introduction de gènes de fixation d'azote. Jusqu'à présent les endophytes caractérisés sont exclusivement extracellulaires (apoplastiques), mais il est possible qu'il existe certaines bactéries capables de coloniser les cellules végétales de façon intracellulaire. 2) La reconstitution de la voie métabolique de la fixation biologique de l'azote par introduction dans les plastes et/ou les mitochondries des gènes codant la nitrogénase permettrait de générer des « nitroplastes » fixateurs d'azote. 3) L'introduction des gènes contrôlant la formation et le fonctionnement de nodosités pourrait permettre la mise en place de nodosités fixatrices d'azote sur les systèmes racinaires de plantes de grande culture.
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# Chapitre 16

## Communication entre les partenaires dans la symbiose mycorhizienne à arbuscules

Guillaume Bécard*, Virginie Puech-Pagès

Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales, Université de Toulouse, CNRS, UPS - 24, chemin de Borde Rouge, Auzeville, BP42617 - F-31326 Castanet Tolosan, France

*Auteur pour la correspondance - Guillaume Bécard (becard@lrsv.ups-tlse.fr)

### Résumé

La symbiose entre plantes et champignons mycorhiziens à arbuscules contribue à améliorer la nutrition minérale et hydrique des plantes, mais aussi leur résistance à divers stress biotiques et abiotiques. Certains éléments de la communication entre les deux partenaires ont été découverts ces dernières années, notamment les plus précoces d'entre eux, c'est-à-dire ceux qui interviennent dans le sol pour la reconnaissance mutuelle des deux partenaires, avant même leur contact physique. Ainsi, des molécules appelées strigolactones sont sécrétées par les racines des plantes et sont spécifiquement reconnues par les champignons mycorhiziens. Par ailleurs, le champignon produit d'autres molécules, appelées Myc-LCOs (lipo-chitooligosaccharides) et Myc-COs (chitooligosaccharides), qui déclenchent les premières réponses symbiotiques de la plante hôte. Dans ce chapitre nous décrivons l'état actuel des connaissances sur les rôles des strigolactones, des Myc-LCOs et des Myc-COs dans la symbiose après un bref résumé de l'histoire de leur découverte.

### 1. Introduction

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (MA) sont une composante vivante très abondante de tous les sols naturels. Ces champignons, très anciens, sont classés dans un groupe à part, les Gloméromycètes. Ils vivent en association symbiotique étroite avec les racines des plantes (Figure 16-1) dans lesquelles ils pénètrent pour s'approvisionner en sucres issus de l'activité photosynthétique de leurs plantes-hôtes (voir chapitre 12 de cet ouvrage). En échange, grâce à leur mycélium extraracinaire, ils fournissent à la plante de l'eau et des minéraux qu'ils prélèvent dans le sol, en particulier du phosphate et de l'azote. Cette
symbiose contribue donc à améliorer la nutrition minérale et hydrique des plantes, mais aussi leur résistance à divers stress biotiques et abiotiques. Elle existe depuis 450 millions d'années et concerne aujourd'hui la plupart des plantes terrestres dans tous les écosystèmes (Smith & Read, 2008).

Issue d'une très longue co-évolution plante-champignon, la symbiose MA est une interaction très intime et extrêmement coordonnée. Dans les cellules du cortex racinaire, le champignon forme des extrémités cellulaires hyper ramifiées, appelées arbuscules (Figure 16-1B). C'est là que s'effectue l'essentiel des échanges trophiques entre les deux partenaires. Du côté de la plante une importante réorganisation cellulaire et moléculaire doit se mettre en place (Genre et al., 2005; Parniske, 2008; Harrison, 2012; Gutjahr & Parniske, 2013; Bucher et al., 2014). Ces processus très intégrés reposent sur une communication étroite et complexe entre les partenaires.

Certains éléments de cette communication ont été découverts ces dernières années, notamment les plus précoces d'entre eux, c'est-à-dire ceux qui interviennent dans le sol pour la reconnaissance mutuelle des deux partenaires, avant même leur contact physique. Ainsi, des molécules appelées strigolactones sont sécrétées par les racines des plantes et sont spécifiquement reconnues par les champignons MA. Elles stimulent leur métabolisme et déclenchent une ramification plus intense de leurs hyphes (Akiyama et al., 2005; Besserer et al., 2006). De leur côté les champignons MA produisent des molécules, appelées Myc-LCOs (lipochito-oligosaccharides) et Myc-Cos (chito-oligosaccharides), qui déclenchent les premières réponses symbiotiques de la plante hôte (Maillet et al., 2011; Genre et al., 2013). Une importante voie de signalisation est alors activée. Cette voie, appelée CSSP (Common Symbiotic Signalling Pathway), est essentielle pour l'établissement de la symbiose mycorhizienne mais aussi pour la symbiose Rhizobium-Légumineuses (Parniske, 2008). Les objectifs de ce chapitre sont de décrire notre connaissance actuelle des rôles des strigolactones, des Myc-LCOs et des Myc-COs dans la symbiose MA après un bref résumé de l'histoire de leur découverte.

## 2. Les strigolactones : des molécules de signalisation aux multiples fonctions

### 2.1. Découverte

Les champignons MA sont périodiquement confrontés à des situations pendant lesquelles ils ne sont plus alimentés. Cela se produit à la fin de chaque saison de croissance, lorsque leurs plantes hôtes meurent ou hivèrent. Au cours de cette période de privation, les spores et les vésicules sont les principales formes vivantes restantes (Figure 16-1). Ces structures d'attente, riches en réserves lipidiques, sont produites au cours de la saison de croissance, respectivement par le mycélium extra- et intraradical. Elles servent à initier de nouveaux cycles symbiotiques lors de la saison suivante.

Cette étape particulière d'association symbiotique horizontale, à renouveler sans cesse, est un passage critique pour des
biotrophes obligatoires. Les champignons MA ont développé une intéressante stratégie conservatoire visant à maximiser leur survie. La germination de leurs spores se fait en deux étapes : la première, qui ne nécessite pas la présence d'une plante hôte, produit une croissance d'hyphes très limitée. La deuxième se déclenche ensuite quand une racine de plante vivante croît à proximité (Bécard et al., 2004). Lors de la première étape, si aucune plante n'est présente, le champignon finira par rétracter son cytoplasme dans ses spores ou produira des spores (plus petites) secondaires. Cette pseudo germination peut se répéter des dizaines de fois sans consommer beaucoup de carbone et d'énergie (Lumini et al., 2007). Lors de la deuxième étape, c'est la germination véritable. L'allongement des hyphes et leur ramification sont alors beaucoup plus importants, le métabolisme catabolique du champignon est entièrement activé (Bécard et al., 2004 ; Buecking et al., 2008).

Cette réponse fongique à la présence d'un hôte végétal constitue un premier mécanisme par lequel les plantes contrôlent la croissance de leurs partenaires fongiques, et il a été étudié activement depuis des années (Smith & Read, 2008). Le mécanisme implique l'action conjuguée d'une concentration élevée de CO2 et de certaines molécules présentes dans les exsudats des racines. En réponse à ces facteurs racinaires, la physiologie cellulaire globale du champignon est modifiée de façon significative. Ses activités respiratoires, cataboliques et membranaires augmentent soudainement, ainsi que son pH cytosolique (Smith & Read, 2008). De nouveaux gènes s'activent (Malbreil et al., non publié). En conséquence, la croissance fongique est fortement stimulée. Le niveau de ramification des hyphes augmente à mesure que le champignon se rapproche des racines de la plante, ce qui augmente la probabilité de contact entre les deux partenaires (Bécard et al., 2004).

Certains flavonoïdes exsudés par les racines ont été initialement proposés comme responsables de certains de ces effets (Steinkellner et al., 2007). La stimulation de la croissance fongique par les flavonoïdes peut en effet être parfois spectaculaire. Mais en tant que métabolites secondaires, ce ne sont pas nécessairement les mêmes flavonoïdes qui sont produits par toutes les espèces végétales, et comme ils ne sont pas actifs sur toutes les espèces de champignons MA (certains d'entre eux peuvent même être inhibiteurs), on ne peut les considérer comme des signaux racinaires mycorhiziens universels. La colonisation par les champignons MA (Bécard et al., 1995) de plantes mutées de maïs, incapables de produire des flavonoïdes, confirme cela. Une hypothèse séduisante serait que les flavonoïdes jouent un rôle dans la mise en place de la préférence d'hôte, en favorisant certaines associations plantes-champignons MA (Ellouze et al., 2012).

La ramification intense des hyphes produite par le champignon à proximité d'une racine a été utilisée pour développer un biotest très sensible (Nagahashi & Douds, 1999) et isoler le facteur de ramification responsable produit par les racines (Buée et al., 2000). Dans les fractions organiques des exsudats racinaires de lotier et de sorgho contenant le facteur de ramification, Akiyama et al. (2005) et Besserer et al. (2006) ont constaté la présence de strigolactones (SLs). Ces molécules étaient déjà connues comme des
stimulants très actifs de la germination des graines des plantes parasites orobanche et striga (Cook et al., 1966 ; Xie & Yoneyama, 2010). Lors d'un essai des composés synthétiques purs, les SLs étaient aussi actives sur les champignons MA que les facteurs de ramification initialement isolés par Buée et al. (2000). Suite à cette découverte, les SLs ont également été identifiées comme une nouvelle classe d'hormones végétales, impliquées dans le contrôle de la ramification des tiges (Gomez-Roldan et al., 2008 ; Umehara et al., 2008 ; Delaux et al., 2012) et dans plusieurs autres aspects du développement des plantes (Brewer et al., 2013 ; Ruyter-Spira et al., 2013 ; Bennett & Leyser, 2014 ; Waldie et al., 2014). Cette triple bioactivité des SLs comme stimulateurs rhizosphériques de la germination des plantes parasites, de la croissance pré-symbiotique des champignons MA, et comme phytohormones contrôlant le développement des plantes, est un cas unique. Pour cette raison les SLs ont fait l'objet d'études très nombreuses ces dernières années.

## 2.2. Structures et synthèse des strigolactones

Les SLs sont des lactones tricycliques (cycles A, B, C) reliés à un méthylbuténolide (cycle D) via une liaison énol-éther. Diverses substitutions peuvent être trouvées sur les cycles A et B (Figures 16-2A,B). Dix-huit SLs naturelles ont été identifiées dans les plantes jusqu'à présent, et d'autres devraient être isolées et identifiées dans les années à venir (Yoneyama et al., 2009 ; Tokunaga et al., 2015). Les SLs ont été divisées en deux familles : le type strigol (Figure 16-2A) et le type orobanchol (Figure 16-2B), sur la base de la stéréochimie de leur partie B, C, D (Zwanenburg & Mwakaboko, 2011 ; Xie et al., 2013 ; Zwanenburg & Pospisil, 2013). Des études de structure-activité ont montré que, si les cycles C et D sont essentiels pour l'activité des SLs sur la ramification des hyphes, la présence des cycles A et B est également importante pour une efficacité optimale (Besserer et al., 2006 ; Akiyama et al., 2010).

Les SLs dérivent du métabolisme des caroténoïdes. Trois enzymes, une caroténoïde isomérase (DWARF27) et deux dioxygénases de clivage des caroténoïdes (CCD7 et CCD8), convertissent le bêta-carotène en carlactone (Figure 16-2C), le précurseur des SLs (Ruyter-Spira et al., 2013 ; Seto & Yamaguchi, 2014 ; Waldie et al., 2014). Ensuite, une enzyme spécifique du cytochrome P450 agit comme une carlactone oxydase pour synthétiser soit un type strigol soit un type orobanchol (Zhang et al., 2014). Fait intéressant, la biosynthèse des SLs chez *Medicago truncatula* nécessite les facteurs de transcription NSP1 et NSP2 de la famille GRAS [GIBBERELLIN-ACID INSENSITIVE (GAI), REPRESSOR OF GA1 (RGA), et SCARECROW (SCR)] (Liu et al., 2011). Or ces deux facteurs de transcription sont également impliqués dans la voie de signalisation activée par les champignons MA lors de la mycorhization et par les rhizobia lors de la nodulation (voir ci-dessous).

La stabilité des SLs dans le sol est très faible. La liaison énol-éther qui relie les cycles C et D peut être facilement hydrolysée, en particulier dans les sols alcalins, ce qui conduit à la perte du cycle D et à l'inactivation de la molécule. Cette instabilité empêche les
formes actives de persister trop longtemps dans le sol, et conduit à ce que les plus fortes concentrations de molécules actives ne se trouvent qu'à proximité de racines vivantes.

Akiyama et al. (2010) ont établi que l'activité des différentes SLs naturelles sur la ramification des hyphes du champignon MA *Gigaspora margarita* peut être très variable. Si on prend en compte le fait que les espèces végétales produisent des SLs différentes et que les espèces de champignons MA peuvent ne pas répondre avec la même intensité à ces différentes SLs, on peut prédire que les SLs jouent un rôle dans le choix de l'hôte par le partenaire fongique.

## 2.3. Les activités biologiques des strigolactones sur la germination des champignons MA

Les SLs sont synthétisées principalement dans les racines et dans les parties inférieures de la tige. De là, elles sont transportées vers les parties supérieures de la plante (Kohlen et al., 2011). Elles sont également excrétées par les racines dans la rhizosphère, mais à des concentrations extrêmement faibles. Cela rend généralement difficile leur détection dans les exsudats racinaires car les analyses par spectrométrie de masse ont une limite de détection aux environ de $10^{-9}$ M. Or elles peuvent être perçues par les champignons MA à des concentrations bien plus basses, jusqu'à $10^{-13}$ M. Quelques minutes après cette détection, l'activité respiratoire et la synthèse d'ATP par le champignon augmentent de façon très sensible. Moins d'une heure plus tard une forte biogenèse mitochondriale est déclenchée (Besserer et al., 2008). Des approches pharmacologiques ont permis de proposer l'hypothèse selon laquelle l'augmentation de la concentration d'ATP proviendrait tout d'abord de la □-oxydation des lipides et / ou de la dégradation du glycogène. Cette augmentation initiale de l'état énergétique du champignon permettrait alors d'activer la phosphorylation oxydative, puis la machinerie cellulaire du champignon, dont la biogenèse mitochondriale, la division nucléaire et, finalement, le cycle cellulaire conduisant à la ramification des hyphes (Besserer et al., 2008 ; Besserer et al., 2009).

## 2.4. Les champignons MA signalent leur présence avec des dérivés de la chitine

### 2.4.1. Découverte des lipo-chitooligosaccharides

Dans la symbiose fixatrice d'azote avec les légumineuses, les bactéries rhizobia perçoivent des signaux racinaires spécifiques tels que certains flavonoïdes. En réponse à ces signaux la bactérie produit alors des lipo-chitooligosaccharides (LCOs) appelés facteurs Nod (Lerouge et al., 1990 ; Roche et al., 1991). Les facteurs Nod sont essentiels à l'établissement de la symbiose. Ils activent l'expression de nombreux gènes nécessaires à l'entrée des bactéries dans la racine et au processus de différenciation des nodules dans lesquels les bactéries fixeront l'azote atmosphérique pour le transformer en ammoniac (D'Haeze & Holsters, 2002 ; Oldroyd et al., 2011 ; voir chapitre 15 de cet ouvrage). De très nombreuses études génétiques et cellulaires ont décrit la voie de signalisation Nod qui conduit à cette reprogrammation génétique de la plante et qui est activée par les facteurs Nod (Downie, 2014 ; Suzaki & Kawaguchi, 2014). Plusieurs arguments biochimiques, physiologiques, génétiques et moléculaires ont progressivement conduit à
l'hypothèse selon laquelle les champignons MA produisent également des molécules signal impliquées dans la mise en place de la symbiose MA, peut-être avec une structure chimique similaire à celle des facteurs Nod.

Tout d'abord, le squelette oligochitinique des facteurs Nod, dont la synthèse par des bactéries avait été une surprise, est, en revanche, un métabolite très fréquent chez les champignons en tant que principale composante de leur paroi cellulaire. Un autre résultat inattendu était que la mycorhization des plantes légumineuses (*Glycine max*, *Lablab purpureus*, *Medicago truncatula*) pouvait être stimulée par des traitements avec des facteurs Nod bactériens (Olah *et al.*, 2005 ; Xie *et al.*, 1998 ; Xie *et al.*, 1995). Plus tard, plusieurs gènes initialement identifiés comme étant impliqués dans la nodulation ont également été trouvés induits dans les racines en réponse à des exsudats de champignons MA et / ou lors de la mycorhization (vanRhijn *et al.*, 1997 ; Albrecht *et al.*, 1998 ; Journet *et al.*, 2001 ; Chabaud *et al.*, 2002 ; Kosuta *et al.*, 2003 ; Weidmann *et al.*, 2004). Ces mêmes exsudats fongiques, tout comme les facteurs Nod, avaient également été reconnus capables de stimuler la formation de racines latérales chez *M. truncatula* (Olah *et al.*, 2005). Mais le principal argument en faveur de l'existence des « facteurs Myc » était génétique. Certains mutants de plantes légumineuses, à savoir les mutants *dmi1*, *dmi2* et *dmi3* de la voie de signalisation Nod, ayant perdu la capacité à être nodulés, se sont montrés également très sévèrement affectés dans leur capacité à être mycorhizés (Sagan *et al.*, 1995 ; Catoira *et al.*, 2000). L'hypothèse selon laquelle le processus de mycorhization passe par l'activation d'une voie de signalisation mycorhizienne (Myc) dont certaines composantes moléculaires sont retrouvées dans la voie de signalisation Nod, a donc émergé à partir de toutes ces données expérimentales (Riely *et al.*, 2004 ; Oldroyd & Downie, 2006 ; Kosuta *et al.*, 2008 ; Parniske, 2008 ; Oldroyd *et al.*, 2009 ; Streng *et al.*, 2011). Elle a motivé la recherche des facteurs Myc responsables de l'activation de la voie de signalisation Myc, le présupposé étant qu'ils devaient avoir une structure chimique proche de celle des facteurs Nod, c'est-à-dire de type lipo-chitooligosaccharidique. Par conséquent, les essais biologiques utilisés pour détecter leur présence dans les exsudats de champignons MA, ont été les mêmes que ceux qui avaient permis la découverte des facteurs Nod : le test de déformation des poils absorbants de racines de vesce et l'induction du gène *ENOD11* chez *M. truncatula*, deux biotests connus pour répondre aux LCOs (Lerouge *et al.*, 1990 ; Journet *et al.*, 2001). A partir de 300 litres d'exsudats mycorhiziens issus de cultures de *Glomus intraradices* (maintenant appelés *Rhizophagus irregularis*), en association avec des racines de carotte transformées, et de 40 millions de spores produites dans les mêmes conditions, il a pu être montré qu'un champignon MA produisait des LCOs (Maillet *et al.*, 2011).

Comme les LCOs sont produits sous forme de traces, leur détection et leur caractérisation chimique ont posé beaucoup de difficultés et n'ont été possibles qu'à l'aide des techniques les plus avancées de la spectrométrie de masse. Globalement, les analyses ont montré la présence de LCOs constitués de quatre à cinq N-acétyl-glucosamines, sulfaté ou non à l'extrémité réductrice de l'oligomère de chitine, et généralement acylé avec un acide palmitique ou un acide oléique à l'extrémité non réductrice
de l'oligomère de chitine (Figure 16-3). Cependant, nous ne pouvons pas exclure que d'autres structures plus complexes soient également produites par les champignons MA. De nouveaux spectromètres de masse avec des performances encore plus élevées, des protocoles pour stimuler la production de LCOs par le champignon et l'étude d'un spectre plus large de champignons MA seront nécessaires pour obtenir une vue complète des LCOs produits par les champignons MA.

### 2.4.2. Les activités biologiques des Myc-LCOs

Les champignons, parce que symbiotes obligatoires, sont incultivables en culture pure. De plus ils développent un mycélium unicellulaire, multinucléé, ce qui les rend intransformables génétiquement. Ces caractéristiques rendent très difficiles la manipulation expérimentale des champignons MA et impossibles, pour le moment, des études fonctionnelles des LCOs par génétique inverse. Par conséquent, l'importance réelle des LCOs dans l'établissement de la symbiose AM, qui ne pourrait être prouvée qu'en utilisant des champignons MA déficients en LCOs, n'est pas encore connue. Pour cette raison, depuis leur découverte, les LCOs produits par les champignons MA ont été appelés Myc-LCOs plutôt que facteurs Myc.

Nos connaissances sur l'importance des Myc-LCO reposent essentiellement sur des études physiologiques, génétiques et transcriptomiques de plantes traitées avec des LCOs exogènes. A des concentrations de 10 nM, ces molécules peuvent stimuler la mycorhization des légumineuses (*M. truncatula*) mais aussi de plantes non-légumineuses comme *Tagetes patula* et *Daucus carota* (Maillet et al., 2011). Les Myc-LCOs peuvent aussi stimuler le développement racinaire de *M. truncatula* (Maillet et al., 2011) et de céréales telles que le maïs, le riz et *Setaria* (Sun et al., 2015 ; Tanaka et al., 2015). Ces activités des Myc-LCOs sur des légumineuses et des non-légumineuses sont compatibles avec la large gamme d'hôtes des champignons MA.

Des études génétiques et transcriptomiques ont montré que la réponse racinaire de *M. truncatula* aux Myc-LCOs dépendait de la présence de NFP, DMI1, DMI2, DMI3, NSP2 et NSP1 (Parniske et al., 2008 ; Maillet et al., 2011 ; Czaja et al., 2012 ; Delaux et al., 2013 ; Camps et al., 2015). Or toutes ces protéines font partie de la voie de signalisation Nod et, à part NFP, contrôlent également la symbiose MA. Toutes ces données ont conduit progressivement à une découverte majeure de la biologie des symbioses végétales : les processus symbiotiques Nod et Myc, qui semblaient en première analyse n'avoir rien en commun, partagent en fait une voie symbiotique commune de signalisation (CSSP, Figure 16-4 ; Gough & Cullimore, 2011 ; Oldroyd, 2013 ; chapitre 15 de cet ouvrage).

### 2.4.3. Les champignons MA produisent également des oligomères de chitine à chaînes courtes

Suite à la découverte des Myc-LCOs, il a été constaté que les champignons MA produisaient également de courtes chaînes de chitine non acylées (Myc-COs, Figure 16-3 ; Genre et al., 2013). Deux arguments appuient l'hypothèse que ces molécules ont un rôle symbiotique. Leur production est stimulée en présence d'un analogue de strigolactone (GR24, Figure 16-2D) et surtout, ces
molécules induisent des oscillations de concentration calcique nucléaire dans les noyaux des cellules épidermiques de l'hôte, similaires à celles induites par les champignons MA (Kosuta et al., 2008; Chabaud et al., 2011; Genre et al., 2013). Chez *M. truncatula*, cette réponse calcique provoquée par les Myc-COs est absente chez le mutant *dmi3* (Genre et al., 2013) qui code une protéine clé de la CSSP.

### 3. Emission de strigolactones et de Myc-LCOs : monologues ou dialogue ?

Nous avons vu ci-dessus que la synthèse des Myc-COs qui, par définition, sont également des précurseurs de Myc-LCOs, était stimulée lorsque le champignon MA était traité par le GR24, un analogue synthétique de SLs (Figure 16-2D). En effet des spores en germination de *R. irregularis* et de *G. rosea* traitées avec $10^{-6}$ M de GR24 produisent, après sept jours de traitement, de trois à soixante-dix fois plus de Myc-COs que les spores témoins (Genre et al., 2013). Ce fut la première indication indirecte que la synthèse de LCO pouvait être activée dans les champignons MA en réponse aux SLs. À l'appui de cette hypothèse les synthèses de Myc-COs les plus stimulées étaient celle du chitotéraose et du chitopentaose, les COs les plus actifs dans l'induction de la réponse calcique. Des preuves plus directes que les SLs pourraient spécifiquement stimuler la synthèse de LCOs fongiques ont été obtenues récemment avec *R. irregularis*. Sa production de LCOs a augmenté de 50 fois après seulement une heure de traitement avec $10^{-6}$ M de GR24 (résultats non publiés). Si l'activation transcriptionnelle était responsable de cette réponse fongique rapide, cela permettrait peut-être d'identifier, en utilisant une approche transcriptomique, les gènes Myc candidats codant pour des enzymes de synthèse des Myc-LCOs.

Plusieurs arguments suggèrent que les Myc-LCOs pourraient à leur tour jouer un rôle dans la régulation de la synthèse des SLs. Partant du fait qu'une forte réduction des niveaux de SLs a été observée dans des racines de tomate fortement mycorhizées, comparativement à ceux mesurés dans des racines non mycorhizées (Lopez-Raez et al., 2011), on peut supposer que cette réduction est provoquée par un signal fongique. À l'appui de cette hypothèse, le traitement des racines de *M. truncatula* avec des Myc-LCOs à $10^{-8}$ M active l'expression d'un microARN le miR171h (Lauressergues et al., 2012). Une cible de miR171h est le gène *NSP2*. Ce facteur de transcription régule les gènes en aval de la CSSP impliqués dans la mycorhization (Maillet et al., 2011) (Figure 16-4). NSP2 régule également la biosynthèse des SLs, peut-être en interaction avec la protéine DWARF27, une enzyme clé de la voie de biosynthèse des SLs (Liu et al., 2011). Au cours de la mycorhization, l'expression de miR171h est observée dans les régions apicales des racines, qui ne sont généralement pas colonisées par les champignons MA. C'est également dans cette région que l'expression de miR171h est observée dans des racines non mycorhizées, mais traitées avec des Myc-LCOs. Fait intéressant, dans les plantes exprimant un ARN messager de *NSP2* résistant au clivage par miR171h, c'est-à-dire où la régulation négative de NSP2 par miR171h et donc celle de NSP2 par les Myc-LCOs sont abolies, les racines sont davantage colonisées et la
colonisation s'étend jusqu'aux apex racinaires. Au total, ces observations suggèrent que les Myc-LCOs pourraient jouer un rôle inattendu dans la symbiose AM, en régulant négativement la colonisation fongique *via* une régulation négative de la synthèse des SLs. Cette régulation empêcherait une colonisation excessive des racines par le champignon et ferait partie des mécanismes qui assurent l'homéostasie mutualiste de l'interaction.

Mais cette hypothèse est contestée par l'observation que le traitement des racines de *M. truncatula* par les Myc-LCOs peut activer l'expression de *NSP1*, codant un autre facteur de transcription impliqué dans la symbiose MA (Delaux *et al.*, 2013). Cette activation transcriptionnelle de *NSP1* est également observée dans les racines mycorhizées de *M. truncatula*. Or *NSP1*, comme *NSP2*, est un facteur de régulation positif de *DWARF27* et donc de la biosynthèse des SLs (Liu *et al.*, 2011). En outre, l'infection mycorhizienne est réduite chez les mutants *nsp1* et *nsp1nsp2* de *M. truncatula* (Liu *et al.*, 2011 ; Delaux *et al.*, 2013). Contrairement à la régulation négative, *via* *NSP2*, de l'infection mycorhizienne décrite ci-dessus, nous décrivons ici une régulation positive de la mycorhization par les Myc-LCOs. La coexistence des deux régulations négative et positive semble illogique, à moins qu'elles ne se produisent à des moments différents et / ou dans différents tissus des racines.

Au total, ces données sont compatibles avec le fait que les SLs et les Myc-LCOs/COs font partie du dialogue moléculaire qui s'instaure entre les plantes et les champignons MA au cours des étapes pré-symbiotiques et, vraisemblablement aussi, au cours des étapes ultérieures de l'interaction mycorhizienne.

## 4. Conclusions et perspectives

Cette revue apporte un certain nombre d'arguments génétiques, moléculaires et physiologiques en faveur de l'importance des SLs et des Myc-LCOs/COs comme signaux moléculaires dans la symbiose MA. Cependant, nos connaissances sur ces signaux sont extrêmement fragmentaires. Concernant les SLs, leurs rôles dans la symbiose mycorhizienne sont encore loin d'être pleinement compris. Par exemple, comment sont-elles perçus par les champignons MA et quelles voies de signalisation activent-elles ? Quels rôles les SLs pourraient-elles jouer, plus indirects, dans la symbiose MA, en tant qu'hormones végétales impliquées dans la biologie de la plante hôte ? Est-ce que les différentes structures chimiques des SLs ont des rôles différents ?

Concernant les Myc-LCOs les questions sont encore plus ouvertes. En effet, nos connaissances actuelles suggèrent que les Myc-LCOs induisent des réponses qui sont directement liées à la symbiose, tandis que d'autres réponses (stimulation de la mycorhization / inhibition de la colonisation des racines) apparaissent contradictoires, et d'autres encore affectent la biologie du développement des racines. Un défi pour l'avenir sera de mieux comprendre le(s) rôle(s) des différentes structures chimiques des Myc-LCO, au cours des différentes étapes de la symbiose MA.

Cette revue a également fait le choix délibéré de ne considérer que les SLs et les Myc-LCOs comme signaux moléculaires
impliqués dans la symbiose AM. Des synthèses plus complètes couvrant d'autres aspects de la communication MA ont été publiées récemment (Bonfante & Genre, 2010 ; Harrison, 2012 ; Gutjahr & Parniske, 2013 ; Nadal & Paszkowski, 2013 ; Schmitz & Harrison, 2014 ; Bonfante & Genre, 2015). En effet les champignons MA communiquent également avec leurs plantes hôtes via des protéines fongiques effectrices (Kloppholz et al., 2011) et d'autres molécules non identifiées (Mukherjee & Ane, 2011 ; Bonfante & Genre, 2015), dont certaines sont proposées par des comparaisons de transcriptomes obtenus après stimulation avec des Myc-LCOs ou avec des exsudats fongiques plus complexes (Malbreil et al., résultats non publiés). En plus des flavonoïdes, les plantes produisent également d'autres composés phénoliques, des monomères de cutine, des acides gras hydroxylés, des acyl-carnitines susceptibles d'être perçus par les champignons MA (Douds et al., 1996 ; Steinkellner et al., 2007 ; Mandal et al., 2010 ; Nagahashi & Douds, 2011 ; Wang et al., 2012 ; Murray et al., 2013 ; Laparre et al., 2014 ; Bonfante & Genre, 2015). D'autres métabolites végétaux impliqués dans la symbiose MA ont été proposés à partir de comparaisons de métabolomes de racines mycorhizées et non mycorhizées (Schliemann et al. 2008 ; Laparre et al., 2014).

Etant donnée la très longue période de temps pendant laquelle les champignons MA et les plantes ont co-évolué ensemble, on pouvait s'attendre à ce que les mécanismes par lesquels ces partenaires symbiotiques se reconnaissent et communiquent entre eux soient complexes. Même si nous avons encore un long chemin à parcourir pour comprendre ces mécanismes complètement, les découvertes récentes des SLs et des Myc-LCO/COs comme signaux symbiotiques ont été des apports décisifs.

Les connaissances acquises rapportées ici ont une portée plus grande qu'initialement prévue. Du côté de la plante hôte, elles ont conduit à la découverte que les SLs n'étaient pas seulement des signaux excrétés dans le sol par les racines des plantes, mais représentaient une nouvelle classe d'hormones végétales qui fait aujourd'hui l'objet de recherches intenses et dont on commence tout juste à comprendre l'importance dans la biologie des plantes.

Du côté des symbioses végétales, elles ont conduit à la découverte que la voie de signalisation CSSP déclencheuse de la nodulation chez les légumineuses, dérive en fait d'une voie plus ancienne impliquée dans la mycorhization. La symbiose entre les rhizobia et les légumineuses apparue il y a 65 millions d'années a donc évolué à partir de la symbiose mycorhizienne vieille, elle, de 450 millions d'années. Ce que cette découverte nous dit c'est que les plantes aptes à être mycorhizées (la plupart des plantes terrestres), comme par exemple le blé, le riz ou le maïs, possèdent presque au complet la boîte à outils moléculaires nécessaire à la nodulation. Elles sont donc naturellement prédisposées à être nodulées ! Des travaux actuels menés par un consortium international comprenant plusieurs équipes françaises visent, grâce aux énormes progrès réalisés ces dernières années en biologie synthétique, à faire acquérir à des non légumineuses (des céréales) la capacité à noduler (voir chapitre 15 de cet ouvrage). A terme, ces travaux pourraient conduire à réduire ou même à supprimer les besoins en engrais azoté pour certaines grandes
cultures.

Remerciement

Nous remercions Adeline Bascaules pour avoir réalisé la Figure C16-2.

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Zwanenburg B., Pospisil T., 2013. Structure and activity of strigolactones: New plant hormones with a rich future. *Molecular Plant*, 6(1), 38-62.

## Légendes des Figures

**Figure 16-1.** Racines de *Medicago truncatula* mycorhizées avec le champignon *Rhizophagus irregularis*. A. Vue générale des racines, et du mycélium extraracinaire produit par le champignon. Barre d'échelle = 2 mm. B. Arbuscule marqué au WGA-FITC et observé au microscope confocal. Barre d'échelle = 20 µm.
**Figure 16-2.** Structure chimique générale de la plupart des strigolactones. A, Strigolactones de type strigol. B, Strigolactones de type orobanchol. C, Voie de biosynthèse simplifiée des strigolactones. D, Analogue de synthèse GR24.

**Figure 16-3.** Structure des Myc-LCOs et des Myc-COs. R₁= acide gras ; R₂= H ou SO₃H ; n= 1 ou 2.

**Figure 16-4.** Modèle simplifié de la voie commune de signalisation symbiotique (CSSP) conduisant respectivement à la mycorhization et à la nodulation en réponse aux Myc-LCO/COs et aux facteurs Nod.
# Liste des contributeurs

**Reinhard Agerer**

Mycology, Ludwig-Maximilians-Universität München, Germany

**Benoît Alunni**

Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR 9198, CNRS/Université Paris-Sud/CEA – F-91198 Gif-sur-Yvette, France

**Laure Avoscan**

Agroécologie, AgroSup Dijon, INRA, Université Bourgogne Franche-Comté – F-21000 Dijon, France

**Guillaume Bécard**

Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales, Université de Toulouse, CNRS, UPS - 24, chemin de Borde Rouge, Auzeville, BP42617 – F-31326 Castanet Tolosan, France

**Jacques Berthelin**

Académie d'Agriculture de France – F-75007, Paris, France

**Isabelle Bertrand**

INRA, UMR1222 Ecologie Fonctionnelle et Biogéochimie des Sols et Agrosystèmes (Eco&Sols) - 2, place Pierre Viala – F-34000, Montpellier, France

**Antonio Bispo**

ADEME - Service Agriculture et Forêt, 20 - Avenue du Grésillé, BP 90406 – F-49004 Angers Cedex 01, France

**Eric Blanchart**

IRD, UMR 210 Eco&Sols (Ecologie fonctionnelle et biogéochimie des sols et des agro-écosystèmes) - 2, place Pierre Viala – F-34060 Montpellier cedex 2, France

**Manuel Blouin**

AgroSup Dijon, UMR Agroécologie, CNRS/INRA/Université de Bourgogne Franche-Comté - 17, rue Sully, BP 8651 – F-21000 Dijon, France

**Sophie Boulanger-Joimel**

INRA, AgroParisTech, UMR 1402 Ecosys (Ecologie fonctionnelle et écotoxicologie des agroécosystèmes) - Route de Saint-Cyr,
RD 10 – F-78026 Versailles cedex, France

**Alain Brauman**

IRD, UMR1222 Ecologie Fonctionnelle et Biogéochimie des Sols et Agrosystèmes (Eco&Sols) - 2, place Pierre Viala – F-34060 Montpellier, France

**Jean-François Briat**

Unité de Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes (B&PMP), Université de Montpellier – CNRS – INRA - Montpellier SupAgro, IBIP - Bât. 7 - 2 place Pierre Viala – F-34060 Montpellier cedex 2, France ; Académie d'agriculture de France – F-75007 Paris, France

**Ary Bruand**

Institut des Sciences de la Terre d'Orléans (UMR 7327), CNRS/Université d'Orléans/BRGM - 1A, rue de la Férollerie – F-45071 Orléans Cedex 2, France

**Yvan Capowiez**

INRA, UR 1115 PSH (Plantes et Systèmes de Culture Horticoles) - INRA Domaine Saint-Paul - Site Agroparc - 228, route de l'Aérodrome CS40509 – F-84914 Avignon cedex 9, France

**Claire Chenu**

AgroParisTech, UMR Ecosys (Ecologie Fonctionnelle et Ecotoxicologie des Agroécosystèmes) INRA-AgroParisTech, Campus AgroParisTech Grignon - Bât. EGER - Avenue Lucien Brétignières – F-78850 Thiverval Grignon, France

**Daniel Cluzeau**

UMR ECOBIO (Ecosystèmes, Biodiversité, Evolution), CNRS, Université Rennes 1, Station Biologique – F-35580 Paimpont, France

**Pierre-Emmanuel Courty**

University of Fribourg, Department of Biology - 3, rue Albert Gockel – 1700 Fribourg, Suisse

**Thibaud Decaëns**

UMR 5175 CEFE (Centre d'Ecologie Fonctionnelle et Evolutive), CNRS/Université de Montpellier/Université Paul-Valéry Montpellier/EPHE - 1919, route de Mende – F-34293 Montpellier cedex 5, France

**Yves Dessaux**

Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC), CEA – CNRS - Université Paris-sud - Université Paris-Saclay, Département de Microbiologie, Bâtiment 34, Avenue de la Terrasse – F-91198 Gif-sur-Yvette CEDEX, France
**Alice Drain**

Agroécologie, AgroSup Dijon, CNRS, INRA, Université de Bourgogne Franche-Comté – F-21000 Dijon, France

**Xiahong Duan**

Institute of Agricultural Science in the Tropics, University of Hohenheim, 70593 Stuttgart, Germany

**Robin Duponnois**

IRD-CIRAD, Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes - UMR 113, Campus CIRAD de Baillarguet, TA-A 82/J
– F-34398 Montpellier cedex 5, France

**Denis Faure**

Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC), Bâtiment 21, Avenue de la Terrasse – F-91190, Gif-sur-Yvette, France

**Patricia Garnier**

AgroParisTech, UMR Ecosys (Ecologie Fonctionnelle et Ecotoxicologie des Agroécosystèmes) INRA-AgroParisTech, Campus AgroParisTech Grignon - Bât. EGER - Avenue Lucien Brétignières – F-78850 Thiverval Grignon, France

**Mohamed Hafidi**

Laboratoire Ecologie & Environnement (Unité associée au CNRST, URAC 32), Faculté des Sciences Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc

**Mickael Hedde**

INRA, AgroParisTech, UMR 1402 Ecosys (Ecologie fonctionnelle et écotoxicologie des agroécosystèmes) - Route de Saint-Cyr, RD 10 – F-78026 Versailles cedex, France

**Usman Irshad**

Department of Environmental Sciences, COMSATS, Institute of Information Technology Abbottabad, Pakistan

**Dominique Job**

Laboratoire mixte CNRS - Université Claude Bernard Lyon 1 – INSA - Bayer CropScience (UMR5240) – F-69009, Lyon, France ; Académie d'agriculture de France – F-75007 Paris, France

**Claudy Jolivet**

INRA, Unité de Service 1106 InfoSol – F-45075 Orléans, France

**Pascal Jouquet**

IRD, UMR iEES Paris (Institut d'écologie et des sciences de l'environnement de Paris) - Centre IRD France-Nord - 32, avenue Henri Varagnat – F-93143 Bondy CEDEX, France ; IISc, Civil Engineering Department, Indo-French Cell for Water Science
(LMI CEFIRSE/IFCWS), Indian Institute of Science, 560012 Bangalore, India

**Gwenaëlle Lashermes**

UMR FARE (Fractionnement des AgroRessources et Environnement) -Reims, Centre de recherches en environnement et agronomie - 2, Esplanade Roland Garros - F-51100 Reims, France

**Xavier Latour**

Laboratoire de Microbiologie Signaux et Microenvironnement (MMSM), Normandie Université, Université de Rouen EA 4312, IUT, Evreux - F-27000 Evreux, France

**Nathalie Leborgne-Castel**

Agroécologie, AgroSup Dijon, CNRS, INRA, Université de Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France

**Philippe Lemanceau**

Agroécologie, AgroSup Dijon, INRA, Université Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France ; Académie d'agriculture de France - F-75007 Paris, France

**Rainer Matyssek**

Ecophysiology of Plants, Technische Universität München, Freising-Weihenstephan, Germany ; Académie d'agriculture de France - F-75007 Paris, France

**Sylvie Mazurier**

Agroécologie, AgroSup Dijon, INRA, Université Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France

**Peter Mergaert**

Institute for Integrative Biology of the Cell, UMR 9198, CNRS/Université Paris-Sud/CEA - F-91198 Gif-sur-Yvette, France

**Jean-Charles Munch**

Soil Microbiology, Technische Universität München, D-85354 Freising-Weihenstephan, Germany ; Académie d'agriculture de France - F-75007 Paris, France

**Naoise Nunan**

Institut d'écologie et des sciences de l'environnement de Paris (iEES Paris), Equipe Biogéographie et diversité des interactions du sol (BioDIS), Campus AgroParisTech - Bât. EGER - Avenue Lucien Brétignières - F-78850 Thiverval Grignon, France

**Lahcen Ouahmane**

Laboratoire Ecologie & Environnement (Unité associée au CNRST, URAC 32). Faculté des Sciences Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc
**Guénola Pérès**

INRA, UMR1069 SAS (Sol Agro et hydrosystème Spatialisation) - INRA-Agrocampus Rennes - 65, rue de Saint-Brieuc - F-35042 Rennes CEDEX, France

**Carole Pfister**

Agroécologie, AgroSup Dijon, CNRS, INRA, Université de Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France

**Barbara Pivato**

Agroécologie, AgroSup Dijon, INRA, Université Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France

**Claude Plassard**

INRA, UMR1222 Ecologie Fonctionnelle et Biogéochimie des Sols et Agrosystèmes (Eco&Sols) - 2, place Pierre Viala - F-34060 Montpellier, France

**Valérie Pot**

AgroParisTech, UMR Ecosys (Ecologie Fonctionnelle et Ecotoxicologie des Agroécosystèmes) INRA-AgroParisTech, Campus AgroParisTech Grignon - Bât. EGER - Avenue Lucien Brétignières - F-78850 Thiverval Grignon, France

**Eckart Priesack**

Institute of Biochemical Plant Pathology, Helmholtz Zentrum München, German Research Center for Environmental Health - 85764 Neuherberg, Germany

**Yves Prin**

IRD-CIRAD, Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes - UMR 113, Campus CIRAD de Baillarguet, TA-A 82/J - F-34398 Montpellier cedex 5, France

**Karin Pritsch**

Biochemical Plant Pathology, Helmholtz-Zentrum München, Neuherberg, Germany

**Virginie Puech-Pagès**

Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales, Université de Toulouse, CNRS, UPS - 24, chemin de Borde Rouge, Auzeville, BP42617 - F-31326 Castanet Tolosan, France

**Lionel Ranjard**

UMR1347 Agroécologie, INRA, AgroSup Dijon, Université de Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France

**Patricia Ranoarisoa**

IRD, UMR1222 Ecologie Fonctionnelle et Biogéochimie des Sols et Agrosystèmes (Eco&Sols) - 2, place Pierre Viala - F-34060
Montpellier, France

**Sylvie Recous**

UMR FARE (Fractionnement des AgroRessources et Environnement) -Reims, Centre de recherches en environnement et agronomie - 2, esplanade Roland Garros - F-51100 Reims, France

**Sébastien Roy**

Agronutrition, Laboratoire de biotechnologies - 436, rue Pierre et Marie Curie - F-31670 Labège, France

**Hervé Sanguin**

IRD-CIRAD, Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes - UMR 113, Campus CIRAD de Baillarguet, TA-A 82/J
- F-34398 Montpellier cedex 5, France

**Gérard Tendon**

Académie d'agriculture de France - F-75007 Paris, France

**Daniel Tessier**

Académie d'Agriculture de France - 18, rue de Bellechasse - F-75007 Paris, France

**Jean Trap**

IRD, UMR1222 Ecologie Fonctionnelle et Biogéochimie des Sols et Agrosystèmes (Eco&Sols) - 2, place Pierre Viala - F-34060 Montpellier, France

**Laure Vieublé**

AgroParisTech, UMR Ecosys (Ecologie Fonctionnelle et Ecotoxicologie des Agroécosystèmes) INRA-AgroParisTech, Campus AgroParisTech Grignon - Bât. EGER - Avenue Lucien Brétignières - F-78850 Thiverval Grignon, France

**Cécile Villenave**

ELISOL ENVIRONNEMENT - 10, avenue du Midi - F-30111 Congénies, France

**Sanâa Wahbi**

IRD-CIRAD, Laboratoire des Symbioses Tropicales et Méditerranéennes - UMR 113, Campus CIRAD de Baillarguet, TA-A 82/J
- F-34398 Montpellier cedex 5, France ; Laboratoire Ecologie & Environnement (Unité associée au CNRST, URAC 32), Faculté des Sciences Semlalia, Université Cadi Ayyad, Marrakech, Maroc

**Daniel Wipf**

Agroécologie, AgroSup Dijon, CNRS, INRA, Université de Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France

**Jérémie Zerbib**
Agroécologie, AgroSup Dijon, CNRS, INRA, Université de Bourgogne Franche-Comté - F-21000 Dijon, France ; Oriskany - 22, rue GM Lunsford Oliver - L-2225 Luxembourg, Luxembourg

**Marine Zwicke**

INRA, AgroParisTech, UMR 1402 Ecosys (Ecologie fonctionnelle et écotoxicologie des agroécosystèmes) - Route de Saint-Cyr, RD 10 - F-78026 Versailles cedex, France ; AgroParisTech, UMR Agronomie - Avenue Lucien Brétignières - F-78850 Thiverval Grignon, France
## Résumé (présentation de l'ouvrage)

Cet ouvrage regroupe 16 chapitres qui présentent et discutent les avancées récentes dans les connaissances des sols et des interactions entre plantes et organismes telluriques s'y établissant. Les travaux de caractérisation physico-chimique des sols, permettent de comprendre comment certaines parties du sol servent d'habitat privilégié pour la vie souterraine et, en corollaire, comment cette vie souterraine crée de nouveaux espaces qui seront colonisés par les organismes telluriques. Les rôles de la faune du sol sont essentiels à cette structuration, influençant la colonisation microbienne. La caractérisation globale des microorganismes des sols à l'échelle de la France par des approches de métagénomique permet la mise en évidence des populations microbiennes en fonction des conditions environnementales ou des types de cultures. Enfin, des travaux de génétique moléculaire montrent que des exsudats de racines de plantes sont capables de sculpter le microbiote racinaire, inhibant ou activant la croissance de populations microbiennes spécifiques. De telles avancées scientifiques ouvrent de nouvelles voies pour orienter les interactions plantes-microorganismes afin de promouvoir les effets bénéfiques du microbiote de la rhizosphère sur la plante dans des systèmes de culture plus durables et plus économes en intrants de synthèse, mettant en évidence le potentiel de ces recherches pour le développement de l'agroécologie.

**Mots-clés (Tags)** : Structure du sol ; Interactions sols-êtres vivants ; agroécologie ; génomique ; ingeniérie écologique

## Coordinateurs

Jean-François Briat est directeur de recherche honoraire au CNRS. Ingénieur des techniques agricoles de l'ENITA de Bordeaux et docteur d'État en biologie cellulaire et moléculaire (UJF Grenoble). Chercheur en biologie végétale, ses travaux concernent l'étude des mécanismes adaptatifs des plantes aux contraintes environnementales, et plus particulièrement ceux régissant l'adaptation à la carence où à l'excès des métaux, dont le fer. Élu membre correspondant de l'Académie d'Agriculture de France en 2015, il a dirigé le département de Biologie Végétale de l'INRA de 1999 à 2002 et l'UMR Biochimie et physiologie moléculaire des plantes à Montpellier de 2007 à 2012.

Dominique Job est directeur de recherche émérite au CNRS. Chercheur en physiologie végétale, ses travaux portent sur le développement et l'évolution des plantes, mettant en particulier en évidence la dynamique du protéome des graines. Il est membre de l'Académie d'agriculture de France.

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