<figure><img src="image_1.png" /></figure>

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

# Utilisation des propriétés de PCR en temps réel pour estimer la charge virale

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

## Introduction

La quantité de virus présent dans un tissu ou un fluide biologique, appelée charge virale, est devenue un paramètre biologique essentiel pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique des infections virales comme le COVID-19.

## Méthodologie et principe du PCR

La PCR ou Polymerase Chain Reaction (1) en temps réel a été utilisée pour évaluer l'impacte de traitement contre le virus de COVID-19 (SARS-CoV2), à l'aide d'un thermocyclette en temps réel (Fig-1). En effet, la réduction de la charge virale pharyngale et nasale est une des facteurs prises en comptes pour évaluer l'efficacité du traitement contre le COVID-19.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 1: Thermocyclette en temps réel (STRATAGENE Mx 3000P - FOFIFA-DRZVP)</figcaption></figure>

### ➤ Principe de PCR en temps réel ou qPCR

En plus des principes utilisés par la PCR conventionnel (Dénaturation de l'ADN double brin matrice, hybridation spécifique des couples d'amorce et polymérisation avec des polymérides thermotolérant), la technologie de PCR en temps réel est basée sur la détection et la quantification d'un reporter fluorescent (TaqMan ou SybrGreen - Fig-2) dont l'émission est directement proportionnelle à la quantité des amplicons générés pendant la réaction de PCR (2).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 2: Représentation schématique des chimies de marquage qPCR Sybr-Green et TaqMan. Les chimies sont présentées pendant la phase d'hybridation et en fin d'extension, quand le brin complémentaire est synthétisé par l'ADN polymérase (en noir). Les molécules reportrices sont colorées en vertes et les quenchers en rouges (2).</figcaption></figure>

### ➤ Approche quantitative de la PCR

Au cours de la phase d'amplification exponentiel, la quantité d'ADN ($Q_n$) obtenue à l'issue de n-cycles se détermine à partir de la quantité d'ADN obtenue ($Q_{n+1}$) à l'issue du cycle précédent (n+1 cycles):

$$Q_n = (1 + E)^n * Q_{n+1} \quad [1] \quad \text{Où } E \text{ est l'efficacité de la duplication de l'ADN}$$

- Si l'efficacité de duplication est de 100% ($E = 1$), on a un doublement de la quantité d'ADN (une copie d'ADN donne deux copies à chaque cycle):

$$\rightarrow Q_n = 2Q * (n+1)$$

- Si l'efficacité de duplication est plus faible, par exemple 90% ($E = 0,9$), la relation devient :

$$\rightarrow Q_n = 1,9Q * (n+1)$$

Par extension, on peut calculer la quantité d'ADN obtenue ($Q_n$) à l'issue de n-cycles d'amplification d'ADN, à partir de la quantité initiale d'ADN ($Q_0$) de la façon suivante :

$$Q_0 = (1 + E)^n * Q_n \quad [2] \quad \text{ou} \quad Q_n = \frac{1}{(1+E)^n} * Q_0 \quad [3]$$

### ➤ Notion de cycle seuil ou Cycle Threshold (Ct) et valeur seuil unique (Qs)

Par construction, les appareils de PCR quantitative utilisent une valeur seuil de fluorescence à partir de laquelle ils déterminent pour chaque échantillon le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour atteindre ce seuil (Fig-3). Le nombre de cycles d'amplification nécessaires pour atteindre la valeur seuil (Qs) est appelé cycle seuil (Ct ou Cycle Threshold). C'est grâce au suivi en temps réel de l'amplification d'ADN que le cycle seuil (Ct) peut être déterminé (Ctn à n-cycles: $Ct=19,1$ ou $Ct=31,8$ - Fig-3). Le fait qu'il y ait une valeur seuil unique (Qs) pour tous les échantillons traités dans une même expérience a pour conséquence que la quantité initiale d'ADN présente dans les différents échantillons analysés en parallèle est directement reliée à la valeur du Ct (Fig-3). Par construction, les appareils de PCR quantitative utilisent une valeur n a alors, pour les échantillons 1, 2, 3,..., n :

$$\rightarrow Q_s = (1 + E)^{Ct_1} * Q_1$$

$$\rightarrow Q_s = (1 + E)^{Ct_2} * Q_2$$

$$\rightarrow Q_s = (1 + E)^{Ct_3} * Q_3$$

$$\rightarrow Q_s = (1 + E)^{Ct_n} * Q_n$$

Le rapport entre les quantités initiales d'ADN de deux échantillons dont les Ct sont respectivement $Ct_1$ et $Ct_2$. Ce rapport est directement dépendant de la différence entre les valeurs des cycles seuils:

$$\frac{Q_1}{Q_2} = \frac{(1+E)^{Ct_2}}{(1+E)^{Ct_1}} \quad [4]$$

La quantité d'ADN ($Q_n$) après un nombre de cycle donné ($Ct_n$) dépend de la quantité d'ADN au départ ($Q_0$), où $Q_0=0$. Le réarrangement de l'équation [4] donne la relation mathématique sur laquelle repose la PCR quantitative.

$$\frac{Q_0}{Q_n} = \frac{1}{(1+E)^{-Ct_n}} \quad [5] \quad Q_0 = \frac{Q_n}{(1+E)^{-Ct_n}} \quad [6]$$

## Courbe standard et calcul de charge virale

### ➤ La base mathématique de la courbe standard

La base mathématique de la courbe standard est obtenue en utilisant le logarithme de l'équation [6] :

$$\rightarrow \log_{10}(Q_0) = \log_{10}\left[\frac{Q_n}{(1+E)^{-Ct_n}}\right] \rightarrow \log_{10}(Q_0) = \log_{10}(Q_n) + \log_{10}[(1+E)^{Ct_n}]$$

$$\rightarrow \log_{10}(Q_0) - \log_{10}[(1+E)^{Ct_n}] = \log_{10}(Q_n) \rightarrow -Ct_n \log_{10}(1+E) = \log_{10}(Q_n) - \log_{10}(Q_0)$$

$$\rightarrow Ct_n = \frac{-\log_{10}(1+E)}{\log_{10}(Q_n) - \log_{10}(Q_0)}$$

$$\rightarrow Ct_n = \left[ \frac{-\log_{10}(1+E)}{\log_{10}(1+E)} \right] * \log_{10}(Q_n) + \frac{\log_{10}(Q_0)}{\log_{10}(1+E)} \quad [7]$$

Si l'on assume que $E, Q_0$ et $Q_n$ sont constants, l'équation [7] a la structure générale d'une équation du premier degré :

$$Y = AX + B \quad \text{où} \quad \left\{ \begin{array}{l} X = \log_{10}(Q_n) \\ A = \text{pente} = \frac{-1}{\log_{10}(1+E)} \\ B = \frac{\log_{10}(Q_0)}{\log_{10}(1+E)} \end{array} \right.$$

→ Si l'on reporte les $X = \log_{10}(Q_n)$ en abscisse et les $Ct_n$ en ordonnée sur un graphique, on obtient une droite dont la pente est égale à A.

### ➤ Préparation de courbe standard (Y=AX+B) d'un témoin homologue externe

<table><thead><tr><th>Dilution</th><th>N</th><th>Q<sub>n</sub>/N</th><th>Log(Q<sub>n</sub>)</th><th>Valeur Ct</th><th>Moyenne Ct</th></tr></thead><tbody><tr><td>Q1</td><td>1</td><td>3 000 000</td><td>6,48</td><td>25,63</td><td>25,56</td><td>25,27</td><td>25,49</td></tr><tr><td>Q2</td><td>10</td><td>300 000</td><td>5,48</td><td>27,83</td><td>27,80</td><td>27,67</td><td>27,77</td></tr><tr><td>Q3</td><td>100</td><td>30 000</td><td>4,48</td><td>29,20</td><td>28,13</td><td>29,10</td><td>28,81</td></tr><tr><td>Q4</td><td>1000</td><td>3 000</td><td>3,48</td><td>31,29</td><td>31,20</td><td>32,04</td><td>31,51</td></tr><tr><td>Q5</td><td>10000</td><td>300</td><td>2,48</td><td>33,14</td><td>33,11</td><td>33,17</td><td>33,14</td></tr><tr><td>Q6</td><td>100000</td><td>30</td><td>1,48</td><td>35,35</td><td>35,34</td><td>35,63</td><td>35,44</td></tr><tr><td>Q7</td><td>1000000</td><td>3</td><td>0,48</td><td>39,55</td><td>39,33</td><td>38,37</td><td>39,08</td></tr></tbody></table>

Pour chaque concentration, le nombre de Ct est déterminé lors de la réaction de PCR en temps réel. La droite d'étalonnage exprime alors les variations de Ct en fonction de la quantité connue de copies d'acide nucléique (en log10) de chaque dilution (Fig-4).

### ➤ Calcul des charges virales des échantillons

On a déduit la charge virale ($Q_n$) d'un échantillon inconnu à partir de la droite $Y=AX+B$ où :

Y=Ct (obtenu par l'analyse qPCR)

$$A=2,1595 \quad (Fig-4)$$

$$B=39,1140 \quad (Fig-4)$$

$$X=\log_{10}(Q_n) = \frac{B-Y}{A} = \frac{B-Ct}{A} \rightarrow Q_n=10^x$$

Exemple de calcul ($C_{t1}=24,1$; $C_{t2}=26,5$, $C_{t3}=32,2$ et $C_{t4}=38,3$) sur une fichier Excel avec formule préétablie- Tab-2)

<table><caption>Tableau-1: Exemple de calcul sur Excel contenant des formules</caption><thead><tr><th>N'Échantillon</th><th>Ct</th><th>Charge virale (Log Q<sub>n</sub>)</th><th>Q<sub>n</sub> (ng/µl)</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>24,1</td><td>6,95</td><td>8 964 690,68</td></tr><tr><td>2</td><td>26,5</td><td>5,84</td><td>693 692,40</td></tr><tr><td>3</td><td>32,2</td><td>3,20</td><td>1 590,99</td></tr><tr><td>4</td><td>37,3</td><td>0,84</td><td>6,92</td></tr></tbody></table>

### Références bibliographiques

* (1) Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol.

* (2) Buston, S.A. and Mueller, R., 2005. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Research 109: 365-379.

* (3) Higuchi R, Facker C, Dollinger G, Watson R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 1993, 11(9):1026-1030.

Afin de quantifier la charge virale, il est nécessaire d'établir une courbe d'étalonnage à l'aide d'un témoin homologue externe (ici avec une concentration égale à 3.10⁶ng/µl (voir Tab-1. La courbe standard est obtenue en diluant de 10 en 10 le témoin homologue externe, pour donner une concentration initiale de 3.10⁶ng/µl (avec N=1; 10⁰)) à 3ng/µl (N=10⁶).

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure-4: Courbe standard</figcaption></figure>

## Discussion et Conclusion

Il existe une relation linéaire entre la charge virale (quantité de molécule cible) initialement présente dans l'échantillon et le Ct obtenu (3). Ainsi, plus un échantillon est concentré en matériel génétique viral, plus le nombre de cycles nécessaire pour détecter le signal est faible. Pour le traitement des maladies virales comme le COVID-19, l'objectif de l'utilisation des antiviraux ou des immunomodulateurs est de supprimer ou de limiter la réplication virale. Il s'agit d'un des marqueurs biologiques pour mesurer le succès de ces traitements. La charge virale avant le traitement et la vitesse à laquelle elle baisse, donnent une indication sur la probabilité de progression de la maladie.

MAMINAINA Oliver Frialdo¹,²,⁴

(1) Cimeté National de Recherche - Institut Maladies des Vacaux Vétérinaires (IMMAREV) - Muséum de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

(2) Cimeté National de Recherche - FONDRA - Département de Recherches Zootechniques, Vétérinaires et Polycliniques (FONDRA-ZOOTH) - Muséum de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

(3) Département d'Enseignement des Sciences Médicales et Vétérinaires - Faculté de Médecine - Muséum de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique