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# Analyse des interactions molécules-membranes et conception de vecteurs lipidiques sélectifs

Ofelia Maniti

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Ofelia Maniti. Analyse des interactions molécules-membranes et conception de vecteurs lipidiques sélectifs. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Claude Bernard Lyon 1, 2022. tel-04428420

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Submitted on 6 Feb 2024

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Rapport d'activité en vue de l'obtention de
l'Habilitation à Diriger des Recherches

Analyse des interactions molécules-membranes et conception de vecteurs lipidiques sélectifs

Présenté par

Ofelia MANITI

Le 22 juin 2022
devant

l'Université Claude BERNARD Lyon 1

Jury:

Dr. Grégory DURAND, Avignon Université

Dr. Thierry DURAND, Université de Montpellier

Prof. Agnès GIRARD-EGROT, Université Claude Bernard Lyon 1

Prof. Catherine PICART, CEA, Grenoble

Dr. Christophe MARQUETTE, Université Claude Bernard Lyon 1 -CNRS

Prof. Patrick SAULNIER, Université d'Angers

Dr. André SCHRODER, INSA de Lyon-CNRS
Table des matières

<table><tr><td>Liste des abréviations</td><td>5</td></tr><tr><td>Introduction</td><td>7</td></tr><tr><td>1. Parcours de recherche</td><td>7</td></tr><tr><td>2. Activité pédagogique</td><td>10</td></tr><tr><td>3. Responsabilités pédagogiques</td><td>12</td></tr><tr><td>4. Encadrement doctoral et scientifique</td><td>13</td></tr><tr><td>Thèse de doctorat</td><td>17</td></tr><tr><td>La créatine kinase mitochondriale – organisatrice de la membrane mitochondriale ? Ségrégation de la cardiolipine sur des monocouches phospholipidiques. Perturbations induites par un agent issu de la peroxydation lipidique, le 4-hydroxynonénal</td><td>17</td></tr><tr><td>1. La Créatine kinase mitochondriale</td><td>18</td></tr><tr><td>2. La membrane interne de la mitochondrie</td><td>21</td></tr><tr><td>3. Modèle membranaire d'étude</td><td>22</td></tr><tr><td>4. Formation de complexes Cardiolipine-CKmt visualisés par microscopie à l'angle de Brewster</td><td>24</td></tr><tr><td>5. Influence de la composition en chaînes acyles de la CL sur la formation de complexes protéine-lipide</td><td>26</td></tr><tr><td>6. Action de l'agent oxydant 4-hydroxynonénal sur la formation de complexes protéine-lipide</td><td>29</td></tr><tr><td>7. La fixation de la CKmt à la monocouche analysée par mesures électrochimiques</td><td>30</td></tr><tr><td>7.1. Insertion de la CKmt dans la monocouche de CL</td><td>33</td></tr><tr><td>7.2 Stabilisation de la membrane par rapport aux variations de potentiel suite à la fixation de la CKmt</td><td>34</td></tr><tr><td>7.3 Deux étapes dans l'interaction CKmt-monocouche: adsorption suivie par l'insertion de segments protéiques</td><td>35</td></tr><tr><td>8. Réorientation des domaines protéiques par Spectroscopie Infrarouge de Réflexion – Absorption par Modulation de Polarisation (PM-IRRAS)</td><td>37</td></tr><tr><td>8.1 Orientation de la CKmt à l'interface air-tampon</td><td>38</td></tr><tr><td>8.2 Changements d'orientation des domaines protéiques suite à l'interaction avec la monocouche</td><td>39</td></tr><tr><td>9. Suite du projet – développements ultérieurs</td><td>42</td></tr><tr><td>Premier stage Postdoctoral (2008-2009)</td><td>45</td></tr><tr><td>Mécanisme d'interaction des peptides basiques de type vecteur avec des membranes modèles et biologiques</td><td>45</td></tr><tr><td>1. L'endocytose physique comme voie d'entrée des peptides vecteurs basiques à l'intérieur des cellules</td><td>47</td></tr><tr><td>2. Tubulations induites par la pénétratine sur les vésicules issues de la membrane plasmique</td><td>51</td></tr><tr><td>3. Est-ce que la capacité de former de tubulations au niveau de la membrane est spécifique à la pénétratine ?</td><td>53</td></tr><tr><td>Deuxième stage Postdoctoral (2009-2011)</td><td>59</td></tr><tr><td>Interactions des protéines recombinantes de la famille ERM (Ezrine/Radixine/Moésine) avec l'actine et des membranes phospholipidiques biomimétiques</td><td>59</td></tr><tr><td>Maître de conférences</td><td>71</td></tr><tr><td>Université Claude Bernard Lyon 1, UMR 5246</td><td>71</td></tr><tr><td>1. Présentation générale de thématiques de recherche</td><td>72</td></tr><tr><td>1.1. Liposomes sur mesure pour le ciblage des cellules tumorales</td><td>72</td></tr><tr><td>1.2. Fluidité des vésicules extracellulaires</td><td>73</td></tr></table>
<table><tr><td>1.3. Rôles des structures lipidiques dans les articulations synoviales</td><td>74</td></tr><tr><td>1.4. Analyse des mécanismes impliqués dans l'interaction liposomes - membranes en utilisant des bicouches lipidiques supportées biomimétique</td><td>74</td></tr><tr><td>2. La membrane lipidique au cœur du ciblage tumoral : vers de nouveaux vecteurs, thérapeutiques liposomaux</td><td>75</td></tr><tr><td>2.1 Le contexte du projet</td><td>75</td></tr><tr><td>2.2 Ciblages des cellules tumorales: avec ou sans anticorps ?</td><td>80</td></tr><tr><td>2.3 Premiers test d'interaction liposomes-cellules</td><td>83</td></tr><tr><td>2.4 Encapsulation d'un principe actif dans les liposomes de fluidité membranaire variable</td><td>89</td></tr><tr><td>2.5 Le mécanisme de ciblage basé sur la fluidité membranaire est-il un mécanisme plus général?</td><td>95</td></tr><tr><td>2.6 Vers des méthodes d'analyse moins invasives: corrélation fluidité liposomes / vésicules extracellulaires de type exosomes</td><td>95</td></tr><tr><td>3. Comment transformer les résultats prometteurs obtenus in cellulo en un nanovecteur de nouvelle génération efficace prêt à l'utilisation in vivo ?</td><td>97</td></tr><tr><td>4. Vers des modèles d'étude plus complexes: analyse de la biodistribution et du ciblage tumoral</td><td>103</td></tr><tr><td>5. Aspects mécanistiques de l'interaction liposomes - membrane</td><td>103</td></tr><tr><td>6. Mise au point d'une méthode de dosage de membranes à l'aide du fluorophore Dioll</td><td>109</td></tr><tr><td>7. Rôles de structures lipidiques dans les articulations synoviales</td><td>111</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>115</td></tr></table>
## Liste des abréviations

<table>
  <tr>
    <td>4-HNE</td>
    <td>4-hydroxynonenal</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ADN</td>
    <td>Acide DésoxyriboNucléique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>AFM</td>
    <td>Microscopie à Force Atomique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ANT</td>
    <td>Adenosine Nucleotide Translocator</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ARA</td>
    <td>Anti Reflecting and made of Absorbing material</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ATP</td>
    <td>Adénosine TriPhosphate</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>BAM</td>
    <td>Microscopie à l'Angle de Brewster</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>BALM</td>
    <td>Backside Absorbing Layer Microscopy</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CF</td>
    <td>Carboxyfluorescéine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CCD</td>
    <td>Dispositif à transfert de charges (pour Charge Coupled Device)</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CD</td>
    <td>Dichroïsme circulaire</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Chol</td>
    <td>Cholestérol</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CK</td>
    <td>Créatine kinase</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CKmt</td>
    <td>Créatine kinase mitochondriale</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CL</td>
    <td>Cardiolipine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>COX</td>
    <td>Cytochrome C Oxydase</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CPP</td>
    <td>Cell penetrating peptides</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CR</td>
    <td>Cytochrome C NADPH Réductase</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>cryo-TEM</td>
    <td>Cryo-Microscopie Electronique à Transmission</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CTCF</td>
    <td>Corrected Total Cell Fluorescence</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>CXCR4</td>
    <td>C-X-C chemokine receptor type 4</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DAPC</td>
    <td>1,2-DiArachidoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DiI</td>
    <td>1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DLPC</td>
    <td>1,2-DiLinoléoyl-sn-glycéro-3- PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DLS</td>
    <td>« Dynamic Light Scattering » ou diffusion dynamique de la lumière</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DMPC</td>
    <td>1,2-DiMyristoyl-sn-glycéro-3- PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DOGS-NTA</td>
    <td>« 1,2-DiOleoyl-sn-Glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxyentyl) iminodiacetic acid) Succinyl] »</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DOPC</td>
    <td>1,2-DiOléoyl-sn-glycéro-3- PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DOPE</td>
    <td>1,2-DiOléoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylEthanolamine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DPPC</td>
    <td>1,2-DiPalmitoyl-sn-glycéro-3- PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DPPT</td>
    <td>1,2-DiPalmitoyl-sn-glycéro-3-PhosphoThioéthanol</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DSPC</td>
    <td>1,2-DiStéaroyl-sn-glycéro-3- PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>DTX</td>
    <td>Docétaxel</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>EDTA</td>
    <td>ÉthylèneDiamineTétraAcétique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>EGFR</td>
    <td>« Epidermal Growth Factor Receptor » ou récepteur au facteur de croissance épidermique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>EPR</td>
    <td>Enhanced Permeability and Retention</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>ERM</td>
    <td>Ezrine/Radixine/Moésine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>FERM</td>
    <td>4.1 Protein/Ezrine/Radixine/Moésine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>FRAP</td>
    <td>« Fluorescence Recovery After Photobleaching » ou recouvrement de fluorescence après photoblanchiment</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>FTIR</td>
    <td>Fourier Transformed Infrared Spectroscopy</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>GFP</td>
    <td>Green Fluorescent Protein</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>GP</td>
    <td>« Generalized Polarization » ou polarisation généralisée</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>GPMV</td>
    <td>Vésicules Géantes de la Membrane Plasmique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>GUV</td>
    <td>Vésicule unilamellaire géante (« Giant Unilamellar Vesicle »)</td>
  </tr>
</table>
<table>
  <tr>
    <td>HER2</td>
    <td>Human Epithelial Receptor 2</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>HIV</td>
    <td>Human Immunodeficiency Virus</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>IR</td>
    <td>Infrarouge</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>LDH</td>
    <td>Lactate DésHydrogénase</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>LUT</td>
    <td>« LookUp Table » ou table de conversion</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>LUV</td>
    <td>« Large Unilamellar Vesicle » ou grande vésicule unilamellaire</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>MLV</td>
    <td>« MultiLamellar Vesicle » ou vésicule multilamellaire</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>MMAE</td>
    <td>MonoMéthyle Auristatine E</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>NBD-PE</td>
    <td>N-(7-Nitro-2,1,3-BenzoxaDiazol-4-yl)-1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylEthanolamine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>NDPK</td>
    <td>nucléotide diphosphate kinase</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>P19-4H</td>
    <td>Peptide pilotis</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PA</td>
    <td>Phosphatase Alcaline</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PAH</td>
    <td>Peptide fusogène</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PBS</td>
    <td>Phosphate Buffered Saline</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PC</td>
    <td>PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PE</td>
    <td>PhosphatidylEthanolamine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PEG</td>
    <td>PolyÉthylène Glycol</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>pep-tBLM</td>
    <td>peptide-tethered Bilayer Lipid Membrane</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PFA</td>
    <td>paraFormAldéhyde</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PI</td>
    <td>PhosphatidylInositol</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PIP<sub>2</sub></td>
    <td>phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PIP<sub>3</sub></td>
    <td>phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>pcn</td>
    <td>potentiel de charge nulle</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PM-IRRAS</td>
    <td>Spectroscopie Infrarouge de Réflexion – Absorption par Modulation de Polarisation</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>POPC</td>
    <td>1-Palmitoyl-2-Oléoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylCholine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>PS</td>
    <td>PhosphatidylSérine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>Rhod-PE</td>
    <td>N-(lissamine Rhodamine B sulfonyl)-1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-PhosphatidylEthanolamine</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>RPE</td>
    <td>Résonance Paramagnétique Electronique</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SL</td>
    <td>Sphingolipide</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SLB</td>
    <td>Supported Lipid Bilayer</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SM</td>
    <td>SphingoMyéline</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SPR</td>
    <td>« Surface Plasmon Resonance » - résonance plasmonique de surface</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SPRi</td>
    <td>Imagerie par SPR</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>SUV</td>
    <td>« Small Unilamellar Vesicle » ou petite vésicule unilamellaire</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>tBLM</td>
    <td>tethered Bilayer Lipid Membrane</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>TIRF</td>
    <td>« Total Internal Reflection Fluorescence » ou fluorescence par réflexion totale interne</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>T<sub>m</sub></td>
    <td>Température de transition de phase</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>VDAC</td>
    <td>Voltage Dependent Anion Channel</td>
  </tr>
</table>
# Introduction

Mon activité scientifique s'organise, depuis ma thèse, autour des membranes biologiques et des interactions molécules-membranes, en utilisant à la fois des membranes biomimétiques, des membranes de cellules en culture ou des vésicules d'origine naturelle. La nature des molécules analysées englobe plusieurs catégories : des protéines, comme la créatine kinase mitochondriale ou les protéines de la famille Ezrine/Radixine/Moésine (ERM), des peptides, comme la pénétratine, des molécules thérapeutiques ou toxiques, incluant des assemblages supramoléculaires de type liposomes.

## 1. Parcours de recherche

Pendant ma thèse, soutenue le 2 octobre 2008 devant l'Université Claude Bernard Lyon 1 et réalisée dans l'équipe des Drs. Thierry Granjon et Olivier Marcillat, j'ai analysé l'interaction de la créatine kinase mitochondriale (CKmt) avec la membrane interne de la mitochondrie. Dans cette étude, ce n'est pas le partenaire d'interaction qui était recherché, mais les conséquences de l'interaction sur l'organisation protéolipidique de la membrane, notamment la ségrégation de la cardiolipine, un phospholipide anionique présent dans la membrane interne de la mitochondrie, connu comme cible de fixation de la CKmt. L'important dans ces travaux est l'utilisation de trois techniques couplées aux monocouches de Langmuir en tant que modèle membranaire. Ces techniques (microscopie à l'angle de Brewster (BAM), spectroscopie infrarouge à l'interface air-tampon (PM-IRRAS) et mesures de capacité différentielle d'une électrode de mercure en contact avec la monocouche) sont peu connues, mais elles ont donné un nombre important d'informations par rapport aux mécanismes moléculaires de l'interaction. Je décrirai plus loin ces techniques et les résultats majeurs qui ont été obtenus. Mes travaux de thèse ont mené à la publication de 10 articles. J'ai annexé à cette rédaction les 4 articles qui me semblent les plus importants.

En ce qui concerne le premier stage postdoctoral réalisé à l'Université Pierre et Marie Curie, Paris, dans l'équipe du Dr. Jesus Ayala Sanmartín, je me suis intéressée à l'interaction de peptides vecteurs avec les membranes. Ces peptides ont une action de type "Cheval de Troie" : ils pénètrent dans la cellule en entrainant avec eux d'autres molécules. Le mécanisme d'action n'étant pas élucidé, l'hypothèse de travail du
laboratoire était une « endocytose physique » : en se fixant sur la membrane, la pénétratine forme des invaginations/tubulations qui sont ensuite internalisées avec leur contenu par les cellules. Ces phénomènes étant trop rapides *in cellulo*, l'équipe les avait mis en évidence sur des vésicules géantes de type GUV (*Giant unilamellar vesicles*). J'ai tout d'abord adapté au laboratoire un modèle membranaire très intéressant, de vésicules naturelles obtenues à partir de la membrane plasmique par bourgeonnement. L'effet des peptides sur ces vésicules est étonnant. Nous avons pu observer une richesse de structures qui inclue des tubulations vers l'intérieur ou vers extérieur de la vésicule, avec des dynamiques variables, des modifications de courbure membranaire, ainsi que la formation des domaines membranaires très rigides. Dans ce manuscrit, j'ai essayé d'illustrer ces propos avec des images de microscopie confocale. Au vue de ces effets, l'entrée des peptides dans les cellules impliquerait, non pas un seul, mais de multiples mécanismes. Ces travaux ont mené à la publication de 5 articles, dont 2 disponibles en annexes.

Le deuxième stage postdoctoral, réalisé au Laboratoire des Matériaux et du Génie Physique, dans l'équipe du Prof. Catherine Picart, à Grenoble, a porté sur l'étude des interactions des protéines de la famille des ERM (ezrine/radixine/moésine) avec la membrane plasmique et les filaments d'actine. Ces protéines participent à la fixation du cytosquelette d'actine à la membrane plasmique et sont impliquées dans les phénomènes liés à la motilité cellulaire. La fonction physiologique de ces protéines implique des mécanismes d'activation complexes, que nous avons réussis en partie à reproduire *in vitro*. Nous avons pu montrer que, lorsque l'ezrine ou la moésine se fixent à la membrane des liposomes, des changements de structure ont lieu, aboutissant à une structure tridimensionnelle de la protéine plus ouverte. Cependant, ces changements ne sont pas suffisants pour entrainer une fixation des filaments d'actine à la protéine et des phosphorylations supplémentaires pourraient se produire *in vivo* pour assurer le lien entre la membrane et le cytosquelette. J'ai également participé à une étude plus large de l'équipe du Prof. Steve Shaw concernant la fixation de la moésine à la membrane, menée à la fois *in vitro* et *in cellulo*. Cette étude est marquante car elle montre encore une fois la complexité de ces interactions. Ces travaux ont mené à 4 publications, dont 2 disponibles en annexe.

Depuis ma nomination comme Maître de conférences à l'Université Claude Bernard Lyon 1 en octobre 2011 à l'Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires,
dans l'Equipe Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et Assemblages Supramoléculaires (GEMBAS), mon projet de recherche s'organise autour de la conception sur mesure de vecteurs lipidiques pour la délivrance de composés actifs et le ciblage spécifique de cellules tumorales avec plusieurs directions d'étude. En premier lieu, nous avons pu montrer, lors d'une première thèse encadrée sur le sujet et soutenue en décembre 2020, que nous pouvons cibler des cellules cancéreuses en assurant une compatibilité entre les propriétés physicochimiques des membranes du vecteur et celles de la cellule cible. La sélectivité du ciblage n'est pas due à un ciblage actif, *i.e.* anticorps, mais à une spécificité basée sur la fluidité membranaire qui peut être mesurée à l'aide d'une sonde créée à l'Institut, le Dioll. Ainsi nous avons pu montrer une distribution sélective des molécules vectorisées entre les lignées cellulaires non tumorales et les lignées cellulaires tumorales de prostate, qu'il s'agisse de fluorophores (Bompard et al. 2020) ou de principes actifs (Abawi et al. 2021). Outre les deux bourses obtenues par Julien Bompard et Ariana Abawi lors du concours à l'Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences Santé (EDISS), plusieurs projets ont permis de financer ces études (BQR Université Lyon 1 (2013-2014), Projet Ligue contre le Cancer (2015-2016), Projet ANR via l'institut Carnot-LiSa (2016-2017). J'ai également participé au développement des applications de la sonde Dioll (1 brevet et 2 articles soumis pour publication), qui a été soutenu par plusieurs projets financés (projet pre-maturation CNRS (2018-2019), suivi d'un projet de maturation financé par la Société d'accélération du transfert de technologies (SATT) Pulsalys (2019-2020), portés par le Dr. Thierry Granjon) et d'un projet collaboratif ICBMS-Centre de Recherche contre le Cancer de Lyon (CRCL), dans le cadre de l'appel d'offre PlasCan (2020-2021) porté par le Dr. Arnaud Vigneron.

Un autre axe de mes recherches actuelles porte sur la purification et l'analyse des
propriétés physicochimiques des vésicules extracellulaires de type exosomes, ou small
extracellular vesicles sEV. L'étude des sEV connaît actuellement un vrai essor car on leur
attribue un rôle dans la formation des métastases. Le développement des nouvelles
techniques d'analyse et de séparation de ces vésicules constitue le cœur du projet Pack
Ambition Recherche FluiDiPlast, financé pour 5 ans par la région Auvergne Rhône-
Alpes, projet collaboratif porté par le Dr. Arnaud Vigneron (CRCL) et impliquant les
equipes LCO2-Glyco et GEMBAS de l'ICBMS, l'équipe GeParm du Laboratoire
d'Automatique, de Génie des Procédés et de Génie Pharmaceutique (LAGEPP) et
l'entreprise privée Covalab.
En parallèle, dans le cadre des projets portés par le Prof. Agnès Girard-Egrot, j'ai participé
au développement de nouvelles membranes biomimétiques, à base de bicouches
supportées sur des pilotis peptidiques (International Patent WO/2016/066947) (Girard-
Egrot, Maniti, and Rebaud 2016). Ces membranes, très flexibles en termes de
composition lipidiques, sont découplées du substrat et peuvent trouver de multiples
applications comme l'insertion des protéines transmembranaires (Chadli et al. 2018,
2017), ou l'analyse par des techniques microscopiques des phénomènes de fusion
membranaire (Bompard et al. 2021).

Enfin, je m'intéresse également aux vésicules synoviales, structures lipidiques multilamellaires secrétées par les synoviocytes au niveau de l'articulation. Les pathologies ostéoarticulaires, comme l'arthrose et l'arthrite rhumatoïde, induisent une déstructuration de ces assemblages vésiculaires. En collaboration avec l'équipe MecaLip du Laboratoire de Mécanique des Contacts et des Structures (LaMCoS), nous cherchons à comprendre le rôle de ces assemblages moléculaires sur les performances des articulations, dans le but de proposer des vésicules de substitution mimant les propriétés mécaniques et lubrifiantes des vésicules saines. Deux articles sont en préparation.

D'autres sujets/collaborations ont permis de diversifier mon activité de recherche dans
différents projets, qui ont abouti à la publication de 15 articles en dehors de ceux
mentionnés plus haut.

## 2. Activité pédagogique

Mon activité d'enseignement se concentre dans les unités d'enseignement (UE) de
Licence 2ème année (environ 90h) et 3ème année du parcours Biochimie de la licence
Sciences de la Vie et de la Terre (SVT) (environ 60h). J'interviens également dans la
Licence Professionnelle Analyse des Aliments et Substances Naturelles (15h) et dans les
UE du tronc commun de L1 SVT (10h).

Depuis 2017, je suis responsable de l'UE de L3 Techniques Spectroscopiques en
Biochimie. Dans le cadre de cette UE, j'encadre depuis mon recrutement les Travaux
Pratiques (TP) portant sur l'analyse de l'activité enzymatique de l'invertase par
polarimétrie et, plus récemment, les Travaux Dirigés (TD) portant sur les applications des
méthodes spectroscopiques optiques. Depuis 2020, je suis responsable de l'UE
Prélèvement Echantillonnage Analyse et Traitement (PEAT) de la LPro Analyse des Aliments et Substances Naturelles. J'ai contribué à mettre en place cette UE, qui se déroule sur le site de l'Université et sur celui du Lycée Jean-Baptiste de la Salle, à Lyon, avec une équipe pédagogique mixte université/lycée.

Lors de mon recrutement, j'ai pu mettre en place une série de travaux dirigés portant sur l'expression de résultats et l'analyse de données dans l'UE de L2 Biochimie Expérimentale 1. J'ai mis en place, sur la même thématique, une série de TD dans le cadre de l'UE PEAT de la LPro Analyse des Aliments et Substances Naturelles.

De mes compétences en recherche, j'ai cherché à intervenir dans les enseignements portant sur la biochimie des lipides. J'assure une séance de travaux pratiques dans l'UE Projets Tuteurés et Biomolécules (2ème année licence Biochimie) sur l'encapsulation de l'acide ascorbique dans les liposomes, j'interviens en cours magistraux sur la structure des lipides dans la même UE. En 3ème année de licence, j'assure les Cours Magistraux (CM) et les TD portant sur les membranes biologiques dans l'UE Biochimie Structurale et Fonctionnelle 1. J'interviens également dans l'UE optionnelle Biomolécules et Applications Industrielles sur la vectorisation de principes actifs. Une autre thématique que j'ai privilégiée concerne la purification de protéines. J'assure deux séries de TP, l'une sur la purification du lysozyme à partir de blanc d'œuf dans l'UE de L2 Biochimie Techniques Préparatives et Analytiques en Biochimie, et l'autre sur la purification de la lactate déshydrogénase à partir d'un homogénat de foie de rat dans l'UE de L2 Sciences de la vie, Enzymologie et métabolisme. Depuis 2011, j'interviens également dans l'UE enzymologie en assurant les enseignements d'un groupe de TD.

J'interviens ponctuellement dans les UE de première année de L1 en tant qu'intervenant en TP et TD.
## Présentation synthétique des enseignements :

<table><thead><tr><td>Enseignement</td><td>Niveau</td><td>Nature</td><td>Volume horaire*</td><td>Effectif de l'UE*</td></tr></thead><tbody><tr><td>Techniques Spectroscopiques en Biochimie</td><td>L3</td><td>TD et TP</td><td>43</td><td>120</td></tr><tr><td>Biochimie Structurale et Fonctionnelle</td><td>L3</td><td>CM et TD</td><td>31</td><td>120</td></tr><tr><td>Enzymologie et métabolisme</td><td>L2</td><td>TP</td><td>32</td><td>500</td></tr><tr><td>Techniques préparatives et analytiques en Biochimie</td><td>L2</td><td>TP</td><td>32</td><td>120</td></tr><tr><td>Biochimie expérimentale</td><td>L2</td><td>TD</td><td>12</td><td>120</td></tr><tr><td>Enzymologie</td><td>L2</td><td>TD</td><td>10</td><td>120</td></tr><tr><td>Projets tutorés et Biomolécules</td><td>L2</td><td>TP</td><td>28</td><td>120</td></tr><tr><td>Biomolécules et applications industrielles</td><td>L2</td><td>CM</td><td>4.5</td><td>40</td></tr><tr><td>Biomolécules A Prélèvement, échantillonnage, analyse et traitement</td><td>L1</td><td>TP</td><td>12</td><td>700</td></tr><tr><td></td><td>LPro</td><td>TD</td><td>18</td><td>12</td></tr></tbody></table>

## 3. Responsabilités pédagogiques

Je suis actuellement responsable de deux Unités d'Enseignement : Techniques Spectroscopiques en Biochimie de L3 Biochimie (6 crédits, UE obligatoire) et Prélèvement, Echantillonnage, Analyse et Traitement de la Licence professionnelle Analyse des aliments et des Substances Naturelles-Qualité.

Depuis 2013, je suis référent pédagogique, j'assure le suivi pédagogique de 60 étudiants de première et deuxième année de licence, portail SVT – Université Lyon 1.

Je suis aussi membre de la Commission Pédagogique en charge d'instruire les dossiers d'admission en Licence SVT.

Depuis 2014, je suis responsable de la planification des enseignements (gestion des emplois du temps) de 2ème et 3ème année de Licence SVT, parcours Biochimie.

<footnote>* en moyenne, peut varier légèrement selon le nombre d'inscrits</footnote>
4. **<u>Encadrement doctoral et scientifique</u>**

Encadrement de thèses :

* **Depuis octobre 2021 :** Co-encadrante de la thèse de Mlle Ariana Abawi (70 %), directrice de thèse Pr. Agnès Girard-Egrot (30%): *Interactions vecteurs-membranes de cellules tumorales pour la délivrance optimisée de médicaments*

o Monomethyl Auristatin E Grafted-Liposomes to Target Prostate Tumor Cell Lines. Abawi A, Wang X, Bompard J, Bérot A, Andretto V, Gudimard L, Devillard C, Petiot E, Joseph B, Lollo G, Granjon T, Girard-Egrot A, **Maniti O**. Int J Mol Sci. 2021 22(8):4103.

* **2017-2020:** Co-encadrante de la thèse de M Julien Bompard (70%), directrice de thèse Pr. Agnès Girard-Egrot (30%): *Liposomes sur mesure pour un ciblage optimisé des membranes cellulaires sur la base de leurs caractéristiques physicochimiques.*
Soutenue le 16/12/2020

o Membrane Fluidity as a New Means to Selectively Target Cancer Cells with Fusogenic Lipid Carriers. Bompard J, Rosso A, Brizuela L, Mebarek S, Blum LJ, Trunfio-Sfarghiu, Lollo AM, Granjon T, Girard-Egrot A, **Maniti O** Langmuir 2020 36 (19): 5134-5144

o BALM: Watching the Formation of Tethered Bilayer Lipid Membranes with Submicron Lateral Resolution. Bompard J, **Maniti O**, Aboukhachfe R, Ausserre D, Girard-Egrot A. Langmuir. 2021 37(31):9457-9471.

* **Depuis octobre 2019 :** Participation à l'encadrement de la Thèse de Layth Ben Trad (dirs de Thèse Dr Thierry Granjon, dr Ana-Maria Trunfio-Sfarghiu et prof Ahmed Landoulsi, cotutelle UCBL -Faculté de Bizerte, Tunisie) : *Bio-lubrification par vésicules biomimétiques : Application dans la détection et la thérapie précoce des maladies articulaires* ; taux d'encadrement 20 %

o 2 articles en préparation: Identification and role of extracellular vesicles and their phospholipid structure in the tribological performances of synovial fluids associated with human joint pathologies. Ben-Trad L, Matei CI, Sava MM, Duclos ME, Filali S, Berthier I, Guichardant M, Bernoud-Hubac N, **Maniti O**, Landoulsi A, Blanchin MG, Miossec P, Granjon T, Trunfio-Sfarghiu AM.

o Multi-scale analysis of phospholipid vesicles synthesized by human synoviocytes in joint pathologies. Role in lubrication and inflammatory process Filali S, Darragi-Raies N, Ben-Trad L, Piednoir A, Hong SS, Pirot F, Landoulsi A, Girard-Egrot A, Granjon T, Maniti O, Miossec P, Trunfio-Sfarghiu AM

* **Depuis octobre 2021:** Participation à l'encadrement de la Thèse de Mlle Anna Bérot (dir de Thèse Dr Thierry Granjon) *Développement d'anticorps et de nanovecteurs lipidiques pour la purification et la caractérisation des exosomes dans le cadre du cancer du sein*; taux d'encadrement 20 %

* **2015-2018 :** Participation à l'encadrement de la Thèse de Mme Meriem Chadli (directrice de thèse Pr Agnès Girard-Egrot) (20 %) : *Développement de la technologie*
« *TransMembraChip* » : biopuces à membranes pour la réinsertion et le criblage d'agonistes / antagonistes de protéines membranaires - thèse soutenue le 16 juillet 2018

o A new functional membrane protein microarray based on tethered phospholipid bilayers. Chadli M, Maniti O, Marquette C, Tillier B, Cortès S, Girard-Egrot A. Analyst. 2018 143(9):2165-73.

o New Tethered Phospholipid Bilayers Integrating Functional G-Protein-Coupled Receptor Membrane Proteins. Chadli M, Rebaud S, Maniti O, Tillier B, Cortès S, Girard-Egrot A. Langmuir. 2017. 3(39):10385-401.

* **2015-2018:** Participation à l'encadrement de la Thèse de Mme Jihen Zouaoui (directeurs de thèse dr Thierry Granjon et prof Ahmed Landoulsi) : *Caractérisation biomécanique et biophysique à différentes échelles des cellules du cancer de la prostate : Marqueurs biologiques pertinents pour évaluer le potentiel métastatique cellulaire* (20 %) : thèse soutenue le 18 septembre 2018

o Multi-scale mechanical characterization of prostate cancer cell lines: Relevant biological markers to evaluate the cell metastatic potential. Zouaoui J, Trunfio-Sfarghiu AM, Brizuela L, Piednoir A, Maniti O, Munteanu B, Mebarek S, Girard-Egrot A, Landoulsi A, Granjon T. Biochim Biophys Acta. 2017 1861(12):3109-19.

## Encadrement de M2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle (5 stages)

* **Janvier -juillet 2021:** Mlle Ariana Abawi (100 %) : *Interactions vecteurs-membranes de cellules tumorales pour la délivrance optimisée de médicaments*

* **Janvier -juillet 2020 :** Mlle Xiaoyi Wang (100 %) : *Délivrance de molécules thérapeutiques par liposomes: ciblage des cellules cancéreuses selon leur fluidité membranaire*

* **Janvier -juillet 2018 :** Mlle Samira Samba-Mossiamasson (100 %) : *Mise au point et validation d'une technique de dosage des membranes biologiques.*

* **Janvier -juillet 2017 :** M Julien Bompard (100 %) : *Liposomes sur mesure pour le ciblage des cellules selon leur fluidité membranaire*

* **Octobre 2013-juillet 2014:** Encadrement d'un étudiant de M2 Recherche Biochimie Structurale et Fonctionnelle, Mme Meriem Chadli (70 %) : *Développement de vecteurs lipidiques fonctionnalisés et d'une membrane modèle pour des études d'interactions membranaires visant à optimiser la délivrance ciblée de principes actifs*

## Encadrement d'étudiants de Licence et IUT (16 stages) :

### Stages de L3 Biochimie

Stage volontaire:
* **Décembre 2017-mars 2018** : Mlle Julie Roy: *Extraction et dosage de lipides membranaires à partir des cellules prostatiques tumorales et non-tumorales.*
Stages de 7 semaines intégrés à la formation (10 stages)

* **Mars-mai 2022:**

- Mlle Jade Délean

- M Benjamin Brigaud colab avec le Dr Ana-Maria Trunfio-Sfarghiu

* **Mars-mai 2020:** Mlle Nika Zarubina: *Caractérisation des liposomes encapsulant des molécules actives. Tests d'agrégation*

* **Mars-mai 2019:**

- Mlle Ariana Abawi: *Préparation et caractérisation des liposomes pour le ciblage de cellules tumorales*

- Mlle Paola Franco-Bareto colab. avec le Dr Ana-Maria Trunfio-Sfarghiu: *Caractérisation biochimique et rhéologique du liquide synovial*

* **Mars-avril 2017 :**

* Mlle Sarah Benyahya : *Mise en place d'une membrane biomimétique reconstituée sur l'or à partir de vésicules lipidiques fusionnées*

* Mlle Fabiana Izaguirre-Vega : *Interactions de vecteurs lipidiques avec des cellules tumorales de prostate pour la délivrance de médicaments*

* **Avril-mai 2015** : M Hoang Tong Kieu, colab. avec Dr Bastien Doumeche : *Stabilisation des liposomes sur des électrodes en papier et détection électrochimique des molécules encapsulées*

* **Avril-mai 2013:** Mlle Natacha Jugnot: *Mise en place d'un protocole expérimental pour la préparation d'immunoliposomes*

* **Avril-mai 2012:** Mlle Aurélie Michelet: *Etude de l'interaction de vecteurs lipidiques avec un système membranaire modèle*

## Stages volontaires de L2 Biochimie

* **Juin-juillet 2017** : Mlle Charlotte Sorieul : *Libération contrôlée et détection électrochimique des molécules encapsulées dans les liposomes*

* **Janvier-mars 2016 :)** Mlle Sarah Benyahya, colab. avec Dr Trunfio-Sfarghiu: *Mise au point d'un protocole de fixation sur verre et de visualisation par AFM et microscopie confocale des vésicules synoviales biomimétiques*
* **Janvier -mars 2013**: Mlle Domitile Chambre: Mise en place d'un protocole de préparation des billes de polyélectrolyte et encapsulation des liposomes

Stages IUT 2ème année (2 stages):

* **Mars-juillet 2017** : Mlle Elise Cuchet : Mise au point et validation d'une technique de dosage des lipides contenus dans les liposomes et protéoliposomes

* **Mars-juillet 2015** : M Dave Diamond, échange académique avec le Collège Shawinigan Québec, Canada: Encapsulation des liposomes dans des billes de polyélectrolyte

Stage de 4ème année de Biochimie et Biotechnologies, INSA de Lyon:

* **Avril-juillet 2019:** Mlle Anna Bérot: Délivrance de molécules thérapeutiques à l'aide de liposomes : ciblage sur la base de propriétés physicochimiques des membranes
La créatine kinase mitochondriale – organisatrice de la membrane mitochondriale ?
Ségrégation de la cardiolipine sur des monocouches phospholipidiques. Perturbations
induites par un agent issu de la peroxydation lipidique, le 4-hydroxynonénal.

Réalisé à l'ICBMS UMR-CNRS 5246, Laboratoire de Génie Enzymatique et Biomoléculaire
Université Claude Bernard Lyon 1 sous la direction des drs Olivier Marcillat
et Thierry Granjon

Soutenue publiquement le 2 octobre 2008
Les interactions protéines – membranes régissent une multitude de processus biologiques. Au niveau de la mitochondrie, des interactions spécifiques entre des protéines membranaires (intrinsèques ou extrinsèques) interviennent dans le fonctionnement de la chaîne respiratoire ou dans le déclenchement et le déroulement de l'apoptose. Parmi ces protéines, la créatine kinase mitochondriale (CKmt) et son interaction avec la membrane interne de la mitochondrie jouent un rôle dans le maintien de la structure et le bon fonctionnement de la mitochondrie. Pendant ma thèse, je me suis intéressée aux processus mis en jeu dans l'interaction de cette protéine avec la membrane. En début de ce chapitre, je voudrais introduire les deux acteurs principaux de mes travaux de thèse, la créatine kinase mitochondriale (CKmt) et la membrane interne de la mitochondrie, et plus particulièrement la cardiolipine (CL), lipide spécifique de cette structure membranaire.

# 1. La Créatine kinase mitochondriale

Les créatine kinases (CK) sont des enzymes exprimées dans les tissus aux besoins énergétiques importants et variables, comme les cellules musculaires squelettiques ou cardiaques, les cellules nerveuses, les spermatozoïdes ou les cellules rénales. Elles catalysent la phosphorylation réversible de la créatine par l'ATP suivant la réaction :

$$ \text{Créatine} + \text{ATPMg}^{2-} \rightleftharpoons \text{Phosphocréatine} + \text{ADPMg}^{-} + \text{H}^{+} $$

Cette réaction permet le stockage et le transport de l'énergie chimique contenue dans l'ATP sous forme de phosphocréatine (PCr) et sa libération rapide lors d'un besoin énergétique.

Les CK, enzymes de la famille des guanidino kinases, existent sous plusieurs isoformes spécifiques des tissus et des compartiments cellulaires. Chez les vertébrés, on connaît 5 isoenzymes, dont 3 isoformes cytosoliques et 2 isoformes mitochondriales.

Les isoformes cytosoliques sont dimériques et se différencient suivant le type de tissus. Les sous-unités constitutives des dimères, B et M, s'associent pour former trois types d'isoenzymes :

- MM présente dans les cellules musculaires;

- BB dans les cellules nerveuses;

- MB présente en petite quantité dans le cœur, les poumons et l'estomac.

Dans la mitochondrie, une isoforme sarcomérique est présente dans les cellules musculaires striées, et une isoforme ubiquitaire dans des organes ou tissus comme le cerveau, les reins, la
peau, les organes reproductifs, etc... (Schlegel et al. 1988; Wallimann et al. 1992; Haas and Strauss 1990). Les isoformes mitochondriales de la CK (CKmt) existent sous deux formes stables interconvertibles : un dimère et un octamère (Marcillat et al. 1987; Schlegel et al. 1988). Sous forme octamérique, et uniquement sous cette forme, elles sont localisées à la face externe de la membrane interne des mitochondries, en concentration importante au niveau des sites de contact entre les membranes externe et interne (Kottke et al. 1991; Kottke, Wallimann, and Brdiczka 1994). La forme octamérique est prédominante (Wyss et al. 1992). Les formes mitochondriales sont toujours co-exprimées avec les formes cytoplasmiques correspondant au type cellulaire. Le foie est le seul organe qui n'exprime aucune isoforme de la créatine kinase dans les conditions physiologiques.

L'existence de 2 isoformes à la localisation cellulaire différente, cytoplasmique et mitochondriale, joue un rôle important dans le transport d'énergie. L'ATP synthétisé dans la mitochondrie sert à phosphoryler la créatine, pour donner la phosphocréatine, une molécule plus petite qui peut quitter la mitochondrie par diffusion à travers une porine, le transporteur VDAC (Voltage Dependent Anion Channel). Au niveau cytosolique, elle est déphosphorylée par les isoenzymes cytosoliques de la CK, une réaction qui permet la régénération de l'ATP : c'est ce qu'on appelle la navette phosphocréatine. (Jacobus and Lehninger 1973)

Le rôle classiquement attribué aux créatines kinases mitochondriales concerne le transport de l'énergie à travers les membranes mitochondriales sous forme de phosphocréatine. Ce rôle ne peut pas être dissocié de ceux de deux autres protéines mitochondriales : la porine ou VDAC et l'ANT (Adenosine Nucleotide Translocator). Cependant, plusieurs études attribuent à cette enzyme un rôle structural. Ce rôle serait déterminé par sa fixation à la membrane, plus ou moins indépendant de l'activité catalytique. Par exemple, l'inactivation des gènes codant pour la CKmt dans les kératinocytes conduit à une morphologie aberrante des mitochondries, ainsi qu'à une diminution de la prolifération cellulaire et augmentation de la nécrose cellulaire (Lenz et al. 2007). Ce rôle structural pourrait être lié à la fixation de la protéine à la membrane et à son interaction avec la cardiolipine. En modulant la distribution de la CL au niveau de la membrane la CKmt pourrait diriger la fixation des molécules comme le cytochrome c, les protéines de la famille Bax et l'organisation des complexes transmembranaires au niveau de la membrane interne de la mitochondrie.

Des études avec des liposomes de compositions phospholipidiques variables ont établi que la fixation de l'enzyme à la membrane mettait en jeu des interactions électrostatiques, les
partenaires étant des phospholipides chargés négativement, en particulier la cardiolipine (CL),
(Müller et al. 1985; M Schlame and Augustin 1985; Vacheron et al. 1997).

La structure tridimensionnelle de la CKmt de poulet en présence d'ATP a été résolue en 1996
(Fritz-Wolf et al. 1996). Le monomère de la CKmt est constitué de 380 acides aminés dont 33
% sont conformés en hélices α et 14 % en feuillets β anti-parallèles. Ces monomères sont
arrangés en 2 domaines : un petit domaine du côté N-terminal, résidus 1 à 112, comprenant une
hélice α 310 et 5 hélices α (domaine I), et un grand domaine du côté C-terminal, résidus 113 à
380, contenant 8 feuillets β antiparallèles et 7 hélices α (domaine II).

L'octamère de la CKmt est un parallélépipède de 93 x 93 x 86,8 Å, une structure presque
cubique (Figure 1). Il est constitué de 4 dimères en forme de banane, organisés autour d'un axe
de symétrie central. Les 4 faces latérales sont identiques, mais différentes des faces supérieure
et inférieure.

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1 :** Structure de l'octamère de la CKmt sarcomérique de poulet: a. Vue latérale; b. Vue du haut. Les monomères sont représentés en couleurs différentes (Fritz-Wolf *et al.*, 1996).</figcaption></figure>

La structure obtenue par diffraction des rayons X montre deux domaines possibles d'interaction
avec la membrane, qui sont exposés sur deux surfaces opposées et qui présentent des charges
positives susceptibles d'interagir avec la CL. Il s'agit du domaine Asp357-Lys380 de
l'extrémité C-terminale et du domaine interne Ala107-Gln115 (Kabsch and Fritz-Wolf 1997).
La mutagenèse dirigée des résidus Lys de l'extrémité C-terminale, notamment 2 résidus Lys
consécutifs 379 et 380 et un 3ème résidu, Lys 369, supposés être impliqués dans l'interaction,
diminue la fixation de plus de 90 % (Schlattner et al. 2004). Ces résidus chargés positivement
sont exposées sur les faces supérieure et inférieure du cube octamérique. En conclusion, la
fixation à la membrane se fait par l'intermédiaire de ces deux faces. Ce domaine joue donc le
rôle principal dans l'interaction CKmt- membrane. La fixation résiduelle pourrait être due à une
interaction hydrophobe avec la membrane.
La fixation de la protéine aux liposomes contenant des phospholipides chargés négativement (CL ou phosphatidylglycérol) induit des changements de structure au niveau de la protéine et des changements d'état physique des lipides avec une tendance à rigidifier la membrane (Granjon et al. 2001).

Des mesures calorimétriques avec des vésicules contenant des mélanges CL-Dipalmitoyl phosphatidyléthanolamine (DPPE) ou CL-Palmitoyl-Oléoyl-phosphatidyléthanolamine (POPE) ont montré que la fixation de la CKmt induit l'apparition du pic spécifique des phosphatidyléthanolamines sur la transition de phase du mélange. Ces résultats ont été interprétés comme une séparation entre les deux composants du mélange, suite à la fixation de la protéine (Epand et al. 2007).

## 2. La membrane interne de la mitochondrie

Même si l'existence des radeaux lipidiques ou rafts, tels que décrits à l'origine, est encore sous débat, il est généralement reconnu que la membrane n'est pas homogène et que dans les membranes plasmiques, tout comme dans celles de la plupart des organelles, des domaines de différente fluidité modulent le fonctionnement des protéines membranaires. Cette organisation repose sur la propriété des (glyco)sphingolipides à adopter des phases plus organisées, modulées par l'association avec le cholestérol, créant ainsi des domaines de taille de 10 à 200 nm, plus rigides, plus épais, favorisant une interaction avec certaines protéines transmembranaires (van Meer 2005; Pike 2006).

De ce point de vue, les membranes mitochondriales constituent une exception (Figure 2). Probablement du fait de leur origine différente et de l'absence d'un transport vésiculaire, elles contiennent très peu de cholestérol et une fraction relativement faible de sphingolipides (SL) dans la membrane externe. Ces lipides sont absents dans la membrane interne (Ardail et al. 2003; Comte, Maïsterrena, and Gautheron 1976). En revanche, cette membrane contient un phospholipide spécifique, la cardiolipine (CL). Pourrait-il jouer un rôle dans la microcompartimentation ?

Des domaines de CL ont été mis en évidence au niveau des membranes bactériennes. En 2000, Mileykovskaya et Dowhan ont observé des accumulations de CL dans la membrane d'E. coli suite à un marquage de ce phospholipide avec une sonde fluorescente spécifique (Mileykovskaya and Dowhan 2000). Des domaines riches en CL ont aussi été observés dans les membranes de B. subtilis pendant la sporulation (Kawai et al. 2004). Ces structures contribueraient à maintenir co-localisés les composants de la chaîne respiratoire (Zhang,
Mileykovskaya, and Dowhan 2002). En même temps, la CL est l'une des cibles potentielles des molécules impliquées dans l'apoptose, comme tBid, qui présentent une affinité pour ce lipide. Les domaines enrichis en CL pourraient déterminer la transmission du signal apoptotique dans la mitochondrie, ainsi que la proportion de cytochrome c ancré au niveau de la membrane interne.

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

**Figure 2:** Organisation des lipides dans la cellule animale: rouge – membranes riches en cholestérol et SL (membrane plasmique, le réseau trans golgi, endosomes); gris-membranes riches en glycérophospholipides (appareil de Golgi, réticulum endoplasmique); bleu – les exceptions : membrane mitochondriale interne, riche en cardiolipine et membranes des endosomes tardifs et des lysosomes, riches en acide lysobisphosphatidique (Van Meer, 2005).

Aux températures physiologiques, du fait de son fort degré d'insaturation, la CL est, contrairement aux sphingolipides mentionnés plus haut, à l'état fluide. Donc, si des domaines riches en CL se forment au niveau des membranes, leur association repose sur un autre mécanisme que celui des microdomaines riches en sphingolipides. Un facteur pouvant contribuer à l'association des domaines enrichis en CL pourrait être la présence de certaines protéines, transmembranaires ou périphériques. Parmi ces protéines, la CKmt est l'une des plus abondantes au niveau de la membrane mitochondriale interne et interagit avec une forte affinité avec la CL. La proportion de cette protéine est estimée à 7 µg CKmt/mg de protéines mitochondriales de l'espace intermembranaire (Quemeneur, Eichenberger, and Vial 1990). Est-elle l'organisatrice de la membrane interne de la mitochondrie?

### 3. Modèle membranaire d'étude

La résolution des méthodes microscopiques à disposition au début de ma thèse ne permettant pas la visualisation des domaines CL-CKmt dans les mitochondries, nous avons fait le choix de
dissocier les deux partenaires de l'interaction du reste de la cellule et d'utiliser des membranes modèles, notamment les monocouches de Langmuir. Nous avons également fait le choix d'utiliser des mélanges de lipides naturels, aux chaines variées et généralement insaturées, situation qui se rapproche de celle de la membrane interne.

A l'interface air/eau, les molécules amphiphiles forment spontanément un film monomoléculaire (monocouche de Langmuir). La partie polaire des molécules s'immerge dans la phase aqueuse alors que les chaînes aliphatiques restent dans l'air de manière à minimiser leur contact avec l'eau, formant à l'interface air-tampon une structure similaire à un demi-feuillet membranaire dont l'organisation est contrôlée par compression. Les monocouches de Langmuir représentent par conséquent un système d'étude intéressant des interactions protéines périphériques - lipides membranaires.

La présence d'une protéine à l'interface lipide-tampon peut être mise en évidence par une modification de l'isotherme de compression – décompression (par exemple un décalage vers les grandes valeurs d'aire moléculaire), une modification de la transition de phase ou de la pression de collapse, ou par l'enregistrement de l'évolution de la pression de surface (à aire constante) ou de l'aire (à pression constante) après addition de protéine dans la sousphase. Toutes ces mesures donnent une indication sur les capacités d'interaction d'une protéine ou d'un peptide avec les lipides constituant la monocouche.

En effet, les protéines sont capables de s'adsorber à l'interface air - eau et par simple mesure de pression, il est difficile de distinguer une adsorption spécifique d'une adsorption non spécifique. D'ailleurs, l'absence d'une augmentation de pression n'indique pas forcement l'absence d'interaction. Une protéine peut s'adsorber sur les têtes polaires d'un lipide sans s'insérer dans la monocouche et donc sans modification de la pression de surface.

Nous avons fait le choix d'analyser l'interaction de la CKmt avec les monocouches mimant la membrane mitochondriale. Dans la plupart de nos expériences, une pression de surface constante relativement élevée, à 30 mN/m a été utilisée pour mimer la situation physiologique (Marsh 1996; Eibl and Blume 1979) et minimiser les interactions non-spécifiques. Nous avons visualisé la morphologie de la monocouche par microscopie à l'angle de Brewster (BAM), analysé les modification de structure et d'orientation de la protéine après fixation par une technique basé sur la spectroscopie infrarouge (PM-IRRAS) et analysé l'effet de la protéine sur la perméabilité de la monocouche par mesure de capacité différentielle d'une électrode de mercure en contact avec la monocouche.
4. Formation de complexes Cardiolipine-CKmt visualisés par microscopie à l'angle de Brewster

La microscopie à l'angle de Brewster, BAM, développée en 1991 en parallèle par Hénon et Meunier et Hönig et Möebius, permet la visualisation directe, à l'échelle du micron, des films de molécules amphiphiles à l'interface air - eau (Hénon and Meunier 1991; Hönig and Möbius 1992).

Le principe a été décrit par le physicien écossais Sir David Brewster au 19ème siècle : lorsqu'une interface parfaitement plane et infiniment mince (interface de Fresnel) séparant deux milieux transparents d'indices de réfraction n₁ et n₂ est éclairée par un faisceau de lumière polarisée parallèlement au plan d'incidence (onde polarisée P), on enregistre deux phénomènes :

- une réfraction du rayon incident, avec une déviation qui dépend de l'indice de réfraction du deuxième milieu, n₂;

- une réflexion du rayon incident à un angle égal à l'angle d'incidence.

A un angle particulier, dépendant de chaque type d'interface, la réflexion est annulée (Figure 3a). Cet angle est appelé l'angle de Brewster, défini par la relation tan α = n₁/n₂. Pour l'interface air - eau, il vaut 53°.

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

**Figure 3:** Trajet optique d'un faisceau polarisé incident à l'angle de Brewster sur une surface en absence (a) ou en présence (b) d'un film lipidique.

Ainsi, à l'interface air- eau, pour une incidence à l'angle de Brewster, le faisceau est entièrement réfracté (Figure 3a). En présence d'un film mince, les caractéristiques de l'interface changent, le faisceau est partiellement réfléchi et l'intensité de la lumière réfléchie est dépendante de l'épaisseur et de l'indice de réfraction du film (Figure 3b). En plaçant une caméra CCD dans la direction du rayon réfléchi, la visualisation d'une monocouche devient possible à l'échelle du micron. Ainsi, les régions plus épaisses (ou plus condensées) dans une monocouche vont
apparaître plus brillantes sur l'image (Gehlert, Siegel, and Vollhardt 1993).

L'ajout de la CKmt sous une monocouche constituée d'un mélange de phosphatidylcholine (PC), phosphatidyléthanolamine (PE) et cardiolipine (CL) en rapport molaire de 2:1:1, avec une proportion de chaînes insaturées se rapprochant de celle existante dans la membrane mitochondriale interne, induit la formation de régions plus lumineuses observables par BAM (Figure 4a), qui augmentent progressivement en taille au cours du temps. L'augmentation de la luminosité est due à un épaississement du film interfacial et/ou à un changement d'indice de réfraction par la formation d'une phase plus épaisse et plus organisée (avec un indice de réfraction plus important). Ces deux phénomènes ne peuvent pas être dissociés.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 4:** Monocouche PC:PE:CL (2:1:1) (a) et CL (b) à 30 mN/m avant et après injection de CKmt. Des domaines blancs de formes irrégulières apparaissent progressivement. Le temps d'incubation après injection de la protéine en minutes, le niveau de gris (NG) et la vitesse d'obturation (VO) sont indiqués sous chaque image.</figcaption></figure>

L'estimation de l'épaisseur locale des domaines indique que les molécules de protéine s'accumulent en une organisation assez dense. Dans ces régions de forte luminosité, l'épaisseur estimée à 10-12 nm, est compatible avec la hauteur théorique d'un complexe lipide - protéine.
En effet, l'épaisseur de la monocouche lipidique en absence de CKmt a été estimée entre 1,8 et 2 nm, et l'octamère de CKmt est un cube 8-10 nm de côté (Fritz-Wolf et al. 1996). Ceci indique que, dans ces régions, les molécules de protéines sont organisées sous le film lipidique en une monocouche compacte, avec peu d'espace libre. Cette organisation pourrait se rapprocher de l'arrangement très régulier de la protéine mis en évidence dans les essais de cristallisation de la CKmt sur des films de CL (Schnyder et al. 1994).

L'injection de la protéine sous une monocouche de PC, un phospholipide zwitterionique, n'induit pas de changement au niveau de l'aspect du film interfacial. La formation de domaines brillants requiert la présence de CL, phospholipide chargé négativement et connu comme étant le partenaire d'interaction de la CKmt au niveau de la membrane mitochondriale. L'aspect homogène de la monocouche avant injection de l'enzyme, ainsi que la croissance lente des domaines, indiquent que la CKmt recrute des phospholipides pour former des domaines à organisation spécifique. Ce phénomène est particulièrement prononcé dans le cas d'une monocouche constituée de CL (Figure 4b). La forme en arborescence des domaines CKmt - CL, pouvant être caractérisée comme fractale, indique une forte tension à la frontière des deux régions d'état de condensation différente. La protéine induit une organisation plus ordonnée des lipides, semblable à un état gel, dans un environnement fluide. Pour illustrer un exemple opposé, les domaines riches en sphingolipides et cholestérol, caractérisés par une phase liquide ordonné dans un environnement liquide désordonné, forment des régions circulaires (Bagatolli 2006). Ceci est en accord avec des expériences réalisées au laboratoire sur des liposomes contenant une sonde fluorescente sensible à la polarité du milieu, le Laurdan, qui ont montré que la fixation de la CKmt aux liposomes PC:PE:CL (2:1:1) entraîne l'apparition d'une phase gel (Granjon et al. 2001). L'ensemble de ces résultats ont fait l'objet d'un article publié en 2008 dans Biophysical Journal et disponible en annexe 1. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2008.12.3911

**5. Influence de la composition en chaînes acyles de la CL sur la formation de complexes protéine-lipide**

Le degré d'insaturation et la composition des chaînes acyles de la CL est variable selon les tissus ou les organismes. Dans les mitochondries des cellules musculaires, du myocarde en particulier, jusqu'à 90% des molécules de CL se retrouvent sous forme de tetralinoléoylcardioline (TLCL) (Michael Schlame and Otten 1991; Michael Schlame et al. 2005). Le maintien de cette forte proportion en chaînes linoléoyles (C18:2) semble essentiel pour le bon fonctionnement de la mitochondrie. Des situations pathologiques comme l'ischémie
(Sparagna et al. 2007) ou le syndrome de Barth (Vreken et al. 2000; Barth et al. 1983) sont caractérisées par une proportion faible de chaînes insaturées, en particulier linoléoyle.

Nous avons testé l'interaction de la CKmt avec des monocouches constituées de lipides à chaînes acyles de longueur et de degré différents d'insaturation. L'interaction de la protéine avec une monocouche constituée de dimyristoyl phosphatidyl glycérol (DMPG) et tétramyristoylcardiolipine (TMCL), phospholipides à chaînes relativement courtes (14 atomes de C) et saturées induit un épaississement homogène du film interfacial (Figure 5). Dans le cas d'un PG naturel (provenant du jaune d'œuf), constitué de molécules à chaînes saturées et insaturées, la fixation de la CKmt induit l'apparition de domaines brillants (Figure 5). Ces observations sont à rapprocher de celles effectuées avec les monocouches contenant de la CL. Cependant, les domaines formés sont sensiblement plus petits. Sur une monocouche de tétraoléoylcardiolipine (TOCL) (C18:1), les régions brillantes sont de formes irrégulières et de tailles variables (Figure 5). Cependant, cet effet semble moins fort que celui enregistré avec la CL extraite de cœur de bœuf, majoritairement constituée de chaînes linoléoyle (C18 :2).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 5: Monocouches lipidiques avant et après injection de la CKmt dans la sousphase. Les domaines CKmt-lipides apparaissent dans le cas de lipides unsaturés (PG (jaune d'œuf) et TOCL) mais pas dans le cas des lipides saturés (DMPG et TMCL). Dans ce cas, la protéine entraine une augmentation homogène du niveau de gris de l'image.</figcaption></figure>

Le degré d'insaturation des chaînes acyles et, donc de fluidité des monocouches, a, par conséquent, une influence déterminante sur la morphologie de la monocouche après fixation de la CKmt. Les mitochondries des cellules musculaires expriment la CKmt en quantité importante. Elles présentent également un fort pourcentage de chaînes acyles insaturées, notamment linoléoyle. Ces deux observations peuvent être associées. La formation des complexes CL – CKmt et la ségrégation de la CL seraient donc importantes dans les cellules avec un métabolisme énergétique intense. Ces résultats ont fait l'objet d'un article publié dans
## 6. Action de l'agent oxydant 4-hydroxynonénal sur la formation de complexes protéine-lipide

Afin d'analyser l'effet des modifications oxydatives de la CKmt sur son interaction avec les membranes, nous avons testé l'effet d'une molécule issue de la peroxydation lipidique, le 4-hydroxy-2-nonénal (4-HNE). Découvert en 1960 parmi les différents produits de l'auto-oxydation de l'ester méthylique du linoléate (Schauenstein, Esterbauer, and Zollner 1977), le 4-HNE résulte de la peroxydation des acides gras de la série n-6 et, en particulier, des acides arachidonique (20:4n-6) et linoléique (18:2n-6) (Esterbauer, Schaur, and Zollner 1991). Comparativement aux radicaux libres, les aldéhydes ont une durée de vie plus longue. Ils peuvent franchir les membranes et gagner d'autres compartiments cellulaires. Les aldéhydes agissent donc comme des «seconds messagers toxiques» de la peroxydation lipidique (Esterbauer, Schaur, and Zollner 1991). Le 4-HNE possède une double liaison conjuguée au groupement carbonyle, caractéristique des 4-hydroxyalkenals, qui lui confère une forte réactivité envers de nombreuses molécules biologiques.

Dans les conditions physiologiques, le 4-HNE réagit spontanément avec les groupements thiols pour former majoritairement des produits d'addition appelés adduits de Michael par l'attaque du groupement nucléophile –SH sur la double liaison C=C. Cet adduit peut se cycliser en hémiacétal. Dans des conditions pathologiques, le 4-HNE peut par le même mécanisme former des adduits avec les résidus cystéine des protéines. Dans certaines conditions, le 4-HNE réagit avec les groupements amine primaire des protéines, acides nucléiques et phospholipides. L'attaque nucléophile d'un groupement amine primaire au niveau de la double liaison du 4-HNE conduit à des adduits de Michael ou à la formation de bases de Schiff, si cette attaque concerne le groupement carbonyle du 4-HNE.

L'action du 4-HNE sur la CKmt entraîne une perte partielle de l'activité enzymatique à faibles concentrations ou quasi-totale (90 %) à fortes concentrations. Même à faibles concentrations, le 4-HNE entraine l'agrégation de la solution protéique. L'apparition des bandes à 1618-1690 cm⁻¹ sur le spectre infrarouge de la protéine, caractéristiques de la formation des feuillets β intermoléculaires de type β-amyloïde, confirme l'agrégation de la protéine sous l'action du 4-HNE. Les agrégats sont capables de se fixer aux monocouches contenant la CL par interaction électrostatique, mais la morphologie des domaines protéolipidiques est complétement modifiée.
De larges structures recouvrent la monocouche, leur morphologie rappellant celle obtenue par Ta *et al* en 2011 (Ta et al. 2011) suite à l'interaction de variants toxiques du peptide β-amyloïde avec des monocouches chargées négativement. Ces résultats font partie d'une publication disponible en annexe 3. https://doi.org/10.3109/09687688.2015.1023376

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 6: Monocouche de PC:PE:CL (2/2/1) après injection de CKmt pre-incubée avec le 4-HNE. Des réseaux dentelés recouvrent entièrement la surface.</figcaption></figure>

## 7. La fixation de la CKmt à la monocouche analysée par mesures électrochimiques

Pour cette partie de l'étude, nous avons utilisé une technique électrochimique qui repose sur des mesures de capacité différentielle à l'aide d'une électrode de mercure, en collaboration avec le Prof. Marie-France Lecompte de l'Université Paul Sabatier de Toulouse.

D'un point de vue électrochimique, le système de membrane modèle peut être assimilé à un condensateur (Figure 7A), situé entre la surface de l'électrode de mercure (électrode de travail) et un point situé à l'intérieur de la solution non perturbée par la présence de cette électrode, l'ensemble constituant l'interface d'épaisseur e.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 7:** Représentation schématique du système utilisé pour les mesures de capacité différentielle. A. L'électrode de mercure est placée en contact avec une monocouche lipidique, la contre-électrode et l'électrode de référence sont plongées dans la sous-phase; B. Evolution de la capacité différentielle de l'électrode de mercure au contact de l'électrolyte (a), d'une monocouche protéique (b) ou d'une monocouche condensée de lipides (c), en fonction du potentiel (Lecompte, Bouix, and Mann 1994).</figcaption></figure>

La capacité du condensateur, de dimension moléculaire, dépend de la composition de l'interface et du potentiel appliqué aux bornes de l'interface. Elle dépend de la constante diélectrique du milieu (ε), reliée à la polarité des molécules le constituant. La différence de potentiel est appliquée entre les électrodes de travail et de référence. **La capacité du condensateur, assimilé à un condensateur plan, où S est la surface de l'électrode de travail, s'écrit :**

$$C = \varepsilon S/e$$

où S est la surface de l'électrode de travail, ε, la constante diélectrique du milieu et e, la distance entre l'électrode de mercure et un point situé à l'intérieur de la solution non perturbée par la présence de cette électrode.

En pratique, pour réaliser la mesure, on superpose une tension sinusoïdale à la rampe de potentiel et on suit l'évolution de l'intensité du courant alternatif mesurée, ce qui permet de calculer une capacité, la capacité différentielle. Celle-ci est la dérivée seconde de la pression de surface par rapport au potentiel. Ce paramètre est donc particulièrement sensible aux moindres variations induites par la présence de molécules à l'interface.

En absence de monocouche, l'électrolyte a la valeur de capacité différentielle la plus forte
(Figure 7B, a). Les molécules adsorbées à l'électrode diminuent la capacité du système en fonction de leur polarité : les lipides, du fait de leurs parties hydrophobes, présentent la valeur la plus basse (Figure 7B, c); pour les protéines, cette valeur est intermédiaire (Figure 7B, b).

Ainsi, lorsque l'électrode de mercure est en contact avec une monocouche condensée de lipides, c'est-à-dire, lorsque ces molécules forment un film continu à la surface de l'électrolyte, ne permettant pas leur contact direct avec l'électrode, la capacité différentielle est basse et constante sur un intervalle de potentiel assez large. Cet intervalle de stabilité se distribue autour du potentiel de charge nulle (pcn) de l'électrode, -0,45 V dans le cas du mercure. A cette valeur, il n'y a pas de champ électrique surimposé appliqué à l'interface.

Si une protéine s'adsorbe aux têtes polaires de lipides, sa présence à l'interface ajoute un deuxième condensateur couplé en série (Figure 8a).

La capacité différentielle de l'ensemble s'écrit alors :

$$1/C = 1/C_{\text{lipides}} + 1/C_{\text{protéine}}$$

La valeur de C sera plus petite que celle de la monocouche de lipides. Une protéine adsorbée à la couche lipidique diminue donc la capacité différentielle du système.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 8:** Représentation schématique des modes d'interaction d'une protéine avec une monocouche de lipides en contact avec l'électrode de mercure et effet sur la capacité différentielle du système. Cas d'une adsorption à la monocouche (a); cas d'une insertion dans la monocouche (b).</figcaption></figure>

Si au contraire, une protéine s'insère dans la monocouche, le système pourra être assimilé à des condensateurs couplés en parallèle (Figure 8b). La capacité différentielle est alors la somme des capacités des condensateurs, relatifs aux lipides d'une part et aux protéines d'autre part, au contact de l'électrode, pris séparément :

$$C = C_{\text{lipides}} + \theta (C_{\text{protéine}} - C_{\text{lipides}})$$

Avec θ, la fraction de la monocouche de lipides qui a été pénétrée par les protéines.
L'insertion d'une protéine dans une monocouche lipidique peut impliquer, comme on peut l'observer sur la figure 8b, un certain degré d'adsorption. Sur un plan théorique, la diminution de la capacité enregistrée dans le cas d'une adsorption est beaucoup plus petite que l'augmentation obtenue dans le cas d'une insertion. Pour cette raison, l'effet dû à l'adsorption ne peut pas être pris en compte du fait de sa faible contribution. Ainsi, l'enregistrement de l'évolution de la capacité différentielle autour du pcn après addition de la molécule d'intérêt dans la sous-phase, permet de déterminer la situation qui l'emporte entre insertion de protéines dans une monocouche condensée ou adsorption aux têtes polaires des lipides (Lecompte 2005; Lecompte, Bouix, and Mann 1994; Lecompte et al. 1998).

## 7.1. Insertion de la CKmt dans la monocouche de CL

Pour toutes les monocouches que nous avons étudiées, autour du pcn, la capacité différentielle est restée stable et constante (Figure 9), indiquant la formation d'un film compact et continu en contact avec l'électrode, empêchant l'accès des molécules d'électrolyte à l'électrode. Dans le cas de ces monocouches, que nous avons appelées condensées (Lecompte 2005), l'adsorption hydrophobe à l'interface air (argon) – eau (ou mercure – eau) est exclue.

L'addition de CKmt sous des monocouches contenant de la CL, induit une augmentation nette de la capacité différentielle au pcn, ce qui traduit une insertion dans la monocouche (Figure 9). Etant donné que l'espace libre parmi les lipides au sein du film interfacial est extrêmement réduit et que la CKmt est une protéine de taille relativement importante, nous avons interprété ce phénomène comme une insertion limitée à un ou plusieurs domaines de la molécule dans le cœur hydrophobe du film lipidique. Cette information a permis de compléter notre compréhension des phénomènes mis en jeu lors de l'interaction de la protéine avec la membrane (Maniti et al. 2009).
<figure><img src="image_10.png" /></figure>

**Figure 9:** Capacité différentielle (C) d'une électrode de mercure au contact d'une monocouche de CL en absence (trait continu) ou en présence de CKmt 4 nM (pointillé), en fonction du potentiel (E).

## 7.2 Stabilisation de la membrane par rapport aux variations de potentiel suite à la fixation de la CKmt

Suite à la variation de potentiel appliquée à l'interface, hors de l'intervalle de stabilité, les monocouches subissent des réarrangements. Ces réarrangements se répercutent sur la courbe capacité différentielle vs. potentiel (C vs. E) sous la forme de pics caractéristiques du lipide. Des études sur des lipides de nature différente ont donné lieu à une interprétation du mécanisme de réarrangement (Nelson and Leermakers 1990). Ainsi, dans l'intervalle de potentiel entre -0,2 V et -0,7 V, les lipides sont organisés avec les chaînes acyles orientées vers l'électrode et la tête polaire vers la sous-phase. A des potentiels plus négatifs, les têtes polaires des lipides rentrent en compétition avec les chaînes acyles, au contact de l'électrode. Ce réarrangement correspond à un premier pic observé sur la courbe C vs. E. A des valeurs de potentiel encore plus négatives, la monocouche continue à subir des réorientations jusqu'à se désorber à -1,4 V. La présence ou l'absence d'un pic, correspondant à une étape dans le réarrangement de la monocouche, dépend de la structure du lipide, notamment de la charge du groupement polaire et du degré d'insaturation de la chaîne hydrophobe. Dans le cas de la CL et en absence de protéine, un premier pic est observé à une valeur de potentiel de -1 V, suivi d'un deuxième pic
à -1,3 V (Figure 9). Le premier peut être attribué à la déstabilisation de la monocouche et au passage des têtes polaires en contact avec l'électrode. Le deuxième, plus difficile à attribuer, pourrait correspondre à une formation de bicouches, suivie de la désorption des molécules de lipides de l'électrode, comme décrit précédemment pour la PC (Nelson and Leermakers 1990). Les pics observés sont très fins, indiquant que les réarrangements se produisant à l'électrode sont rapides (Lecompte 2005).

La présence de protéine induit une diminution de la hauteur des pics (Figure 9, trait pointillé), indiquant que des processus plus lents ont lieu à l'électrode. Ceci traduit une stabilisation de la monocouche par rapport à la variation de potentiel (Lecompte 2005). Des études réalisées sur des liposomes ont montré à la fois une stabilisation des lipides (avec un passage d'une phase cristal liquide à une phase gel) et une stabilisation de la protéine par rapport à la dénaturation thermique (Granjon et al. 2001). Ces deux aspects conduisent à l'idée d'une stabilisation du système protéine – membrane dans son ensemble par rapport aux stimuli extérieurs. Ceci peut être associé au rôle attribué à la CKmt dans la stabilisation de la structure des membranes mitochondriales et dans la formation des points de contact (Schlattner, Tokarska-Schlattner, and Wallimann 2006). En effet, les hépatocytes des souris transgéniques exprimant la CKmt ont un nombre plus important de points de contact entre la membrane externe et la membrane interne de la mitochondrie par rapport aux hépatocytes normaux, dépourvus de cette enzyme (Speer et al. 2005).

## 7.3 Deux étapes dans l'interaction CKmt-monocouche: adsorption suivie par l'insertion de segments protéiques

En diminuant la quantité de protéine ajoutée au système, nous avons pu déceler deux étapes dans le mécanisme d'interaction avec CL. Une première courbe C vs. E, enregistrée 30 minutes après injection de la CKmt est caractéristique d'une adsorption à la monocouche (Figure 10). La courbe C vs. E enregistrée après 1 heure indique, comme dans le cas précédent, une insertion dans la monocouche. Les deux étapes du mécanisme d'interaction sont donc fonction du temps. Dans une première étape, la CKmt est adsorbée, probablement par interaction électrostatique, à la monocouche de CL, puis ses domaines hydrophobes s'insèrent dans le film lipidique. Un changement de conformation de la protéine pourrait avoir lieu après fixation aux têtes polaires des lipides, suivie d'une insertion, aboutissant à la formation d'un complexe protéine – lipide.
<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**Figure 10:** Evolution de la capacité différentielle (C) d'une électrode de mercure au contact d'une monocouche de CL en absence (trait continu) ou en présence de 0,4 nM de CKmt, 30 minutes après injection (petits pointillés) ou 1h après injection (tirets) en fonction du potentiel (E).

L'insertion de la protéine (ou d'une partie de la protéine) pourrait être consécutive à l'adsorption aux têtes polaires de la membrane. A ce point, la méthode ne donne pas d'information sur la nature des segments protéiques qui s'insèrent dans la monocouche. Dû à son caractère amphiphile, un candidat potentiel pourrait être l'hélice C-terminale (Figure 11), α12, qui pourrait se positionner parallèlement à l'interface monocouche-électrolyte, dans un mécanisme similaire à celui de l'apolipoprotéine AI (Lecompte et al. 1998).

ELVQIVIDGVNYLVDCEKKLER

341

364

**Figure 11** : Séquence de l'hélice α12 de la CKmt sarcomérique de lapin – en rouge, les acides aminés hydrophobes.

Une autre possibilité serait l'implication d'un segment du domaine C-terminal, riche en résidus proline, situé entre les résidus lysine qui participent à l'interaction électrostatique (Schlattner, Tokarska-Schlattner, and Wallimann 2006). Ce fragment pourrait former une boucle qui, insérée dans la membrane, rapprocherait les résidus lysines et donc les molécules de CL avec lesquelles elles interagissent. Cela favoriserait une condensation des lipides dans le film
interfacial et la formation des régions à organisation plus ordonnée, comme celles observées sur les images de BAM. Cette étude a été publiée dans European Biophysical Journal en 2010, article disponible en annexe 4. https://doi.org/10.1007/s00249-010-0600-4

## 8. Réorientation des domaines protéiques par Spectroscopie Infrarouge de Réflexion – Absorption par Modulation de Polarisation (PM-IRRAS)

Comme son nom l'indique, cette méthode combine la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) avec d'une part, les particularités de réflectivité en lumière polarisée et sous incidence quasi-rasante (IRRAS) et d'autre part, la modulation rapide de la polarisation du faisceau incident entre les polarisations linéaires parallèle (S) et perpendiculaire (P). Elle permet notamment la caractérisation des films ultraminces à l'interface air – eau dans un environnement ouvert (D. Blaudez et al. 1994).

Ainsi, la polarisation du faisceau incident est modulée entre un état linéaire P perpendiculaire et un état linéaire S parallèle à la surface d'incidence :

* la lumière polarisée P interagit à la fois avec les espèces adsorbées à la surface et avec les molécules de solvant et de gaz qui entourent l'échantillon;

* la lumière polarisée S n'interagit pas avec les espèces adsorbées à la surface mais interagit avec les molécules du milieu environnant.

A l'interface air – eau, les vibrations ayant un moment de transition parallèle à la surface présentent des bandes positives par rapport à la ligne de base, alors que les vibrations ayant un moment de transition perpendiculaire à la surface présentent des bandes négatives. L'intensité de la bande est nulle pour un moment de transition orienté à 38° par rapport à la normale (Daniel Blaudez et al. 1996). Des études sur des peptides modèles et des simulations ont montré que l'orientation des hélices α par rapport à l'interface dépend des intensités relatives des bandes amides I et amide II (Cornut et al. 1996). Ainsi, une orientation de l'hélice parallèle à l'interface résulte en une bande amide I de forte intensité et une bande amide II de faible intensité (Figure 12). Une orientation perpendiculaire à l'interface est caractérisée par une bande amide I négative. L'absorption de la bande amide I est majoritairement due aux liaisons C=O, orientées parallèlement à l'axe de l'hélice. La bande amide II, due à la superposition de plusieurs absorptions, reste dans tous les cas positive.
<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 12:** Orientation de l'hélice α à l'interface air - eau. a) Simulation de spectres PM-IRRAS de l'hélice α à différentes orientations; b) Rapport des intensités des bandes amide I/amide II en fonction de l'inclinaison de l'hélice par rapport au plan de l'interface (Cornut et al., 1996); c) orientation du moment dipolaire (flèche) pour une hélice α.</figcaption></figure>

## 8.1 Orientation de la CKmt à l'interface air-tampon

La CKmt possédant un comportement interfacial, nous avons pu enregistrer le spectre PM-IRRAS de la protéine à l'interface air-tampon, en absence de lipides. Le spectre PM-IRRAS de la CKmt (Figure 13a) est caractérisé par une bande amide-I de forte intensité avec un maximum d'intensité vers 1659 cm⁻¹, caractéristique des hélices α, et une bande amide-II relativement faible, centrée à 1545 cm⁻¹. Ce spectre ne présente pas de bande d'absorption à 1616 cm⁻¹, qui serait caractéristique d'une structure agrégée et dénaturée irréversiblement (Granjon et al. 2001). Des études antérieures au laboratoire ont également montré que la protéine à l'interface est active (Vernoux et al. 2006). Nous avons conclu que la CKmt ne subit pas de changements majeurs de structure à l'interface.

En faisant l'approximation que l'intensité à 1659 cm⁻¹ est due essentiellement aux hélices α, majoritaires dans la structure secondaire de la CKmt, nous avons calculé un rapport amide-
I/amide-II de 3,2 pour la protéine à l'interface air-tampon. Ainsi, ce rapport de 3,2 correspondrait à une orientation de la résultante des moments dipolaires des hélices α d'approximativement 30° par rapport au plan de l'interface (Figure 12).

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**Figure 13: Orientation de la CKmt à l'interface air-tampon.** a) Spectre PM-IRRAS de la CKmt à l'interface air - tampon TrisHCl 20 mM, pH 7,4; b) Orientation proposée pour la CKmt à l'interface air-tampon: a. hélices α d'un monomère orienté de manière à obtenir une résultante des moments dipolaires inclinée de 30° par rapport au plan de l'interface; c) orientation correspondante de l'octamère - les faces supérieures et inférieures du cube sont parallèles à l'interface.

A l'aide du logiciel disponible sur le site « Protein Dipole Moment Server » (Felder et al. 2007), nous avons pu calculer un moment dipolaire résultant des hélices α par rapport à un repère interne. Nous avons ensuite disposé le monomère de manière à ce que ce vecteur soit orienté à 30° par rapport au plan de l'interface (Figure 13b). Dans ce cas, les hélices α12, comprise entre les résidus E341-E363, et α9, comprise entre les résidus M241-R262, et la plupart des hélices plus courtes sont inclinées à des angles relativement faibles par rapport au plan de l'interface, bien que certaines hélices, comme α7 et α6 soient disposées verticalement. L'orientation de l'octamère de la CKmt correspondant à une telle disposition des hélices α est celle présentant les faces supérieure et inférieure du cube parallèlement à l'interface (Figure 13c). Ces faces contiennent, au niveau du segment C-terminal, les résidus impliqués dans l'interaction avec les membranes, Lys 380, 379 et 368 (Schlattner et al. 2004).

## 8.2 Changements d'orientation des domaines protéiques suite à l'interaction avec la monocouche

En présence de monocouches contenant des phospholipides chargés négativement, une diminution du rapport amide-I/amide-II dans la région des hélices α est enregistrée sur les spectres PM-IRRAS de la CKmt (Figure 14). Les spectres infrarouges de la CKmt obtenus
précédemment en présence ou en absence de liposomes ont montré que la protéine ne subit pas de changements majeurs de structure suite à l'interaction avec la membrane (Granjon et al. 2001). Les modifications observées dans cette étude, notamment le déplacement de l'absorption caractéristique des feuillets β antiparallèles de 1636 à 1632 cm⁻¹, ont été attribuées à l'augmentation des liaisons hydrogène due à l'environnement hydrophobe des lipides et une possible réorientation de certains segments de la protéine qui rapprocherait deux feuillets β intramoléculaires (Granjon et al. 2001). La diminution de l'intensité de l'absorption des hélices α observée en PM-IRRAS correspondrait alors plutôt à un changement d'orientation des hélices α en présence de lipides, par rapport à la protéine à l'interface air – tampon. En effet, une disparition des hélices α entrainerait l'apparition de nouvelles structures (β ou apérodiques) or, bien qu'une analyse fine des changements de structure soit très difficile étant donné le faible rapport signal sur bruit, aucune bande liée à de telles structures ne semble apparaitre.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 14:** Spectre PM-IRRAS de la CKmt à l'interface air-tampon (courbe 1, bleu) et spectres de obtenus en présence d'une monocouche de CL (courbe 2, violet), DMPG (courbe 3, vert) ou PC:PE:CL (2:1:1) (courbe 4, rouge).</figcaption></figure>

Comme indiqué ci-dessus, nous ne pouvons pas exclure un changement de structure secondaire de la protéine, mais compte tenu des modifications de structure relativement faibles observées en solution, la forte diminution de l'absorption dans la région 1650-1660 cm⁻¹ et l'augmentation de la bande amide-II semblent indiquer une verticalisation d'une ou de plusieurs hélices dans la protéine, suite à l'interaction avec les lipides constituant la monocouche. Il est difficile d'identifier les hélices impliquées, cependant nous pouvons faire quelques hypothèses.

Une première hypothèse serait la réorientation de l'hélice C-terminale, α12, suite à l'interaction avec la monocouche (Figure 15).
<figure><img src="image_15.png" /></figure>

**Figure 15** : Reorientation hypothétique de l'hélice α 12 en présence des lipides à l'interface : exemple d'un des 4 monomères (rectangle noir) exposés à l'interface lipides-tampon.

Constituée de 22 résidus et relativement importante en taille par rapport aux autres hélices de la protéine, l'hélice amphipathique α12 est située au voisinage du site de fixation à la membrane. Elle est donc susceptible de subir une re-orientation suite à l'interaction avec les lipides. Ce changement d'orientation permettrait aux résidus chargés positivement situés à l'extrémité de l'hélice, Arg 364 (chez le lapin) ou Lys 364 (chez le poulet et la plupart des autres mammifères), de participer à la fixation. Cette verticalisation nous permet d'éliminer une des hypothèses faites d'après les mesures de capacité différentielle, selon laquelle cette hélice pourrait s'insérer dans la monocouche en s'orientant parallèlement à l'interface. En même temps, l'insertion de l'hélice orientée verticalement semble exclue du fait de la présence des acides aminés chargés à son extrémité. La deuxième explication serait plutôt liée à un déplacement global des monomères, selon le type d'interface à laquelle ils sont exposés. En absence de monocouche et d'après les modèles (Castano et al. 1999), la résultante des moments dipolaires des hélices α est inclinée par rapport à l'interface avec un angle de 30°. La meilleure orientation de l'octamère à l'interface air - eau est celle avec les faces supérieure et inférieure du cube de la CKmt parallèles au plan de l'interface. Dans ce cas, les monomères seraient distribués symétriquement par rapport à la normale et par rapport au plan de l'interface, dans une conformation proche de la structure cristallisée. En présence d'une monocouche chargée, les monomères en interaction directe avec les lipides pourraient subir une distorsion se traduisant par une modification dans l'orientation de la résultante des moments dipolaires de l'octamère par rapport à la membrane.
9. Suite du projet – développements ultérieurs

Après ma thèse, l'équipe a continué le travail sur l'interaction CKmt-membrane mitochondriale.
Mouhedine Cheniour (thèse soutenue en 2012, dir. thèse Olivier Marcillat et Thierry Granjon)
a pu mettre en évidence la présence des complexes protéolipidiques à la surface de vésicules
géantes (GUV) composées de PC:PE:CL 2/2/1 (Figure 16). Il a également pu montrer que i) la
protéine "ponte" les vésicules, ce qui confirme son rôle au niveau de points de contact entre les
membranes mitochondriales et que ii) la fixation de la protéine induit une diminution de la
fluidité membranaire et une homogénéisation globale de la fluidité membranaire (Cheniour et
al. 2017).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 16:** GUV PC:PE:CL (2:1:1) après incubation avec CKmt-AEDANS. Des domaines de protéine se forment à la surface de la vésicule (Cheniour et al. 2017).</figcaption></figure>

Afin de mettre en évidence l'existence de domaines de fluidité membranaire différente au sein
de la membrane, l'équipe a démarré un projet de synthèse d'analogues du Laurdan, sonde de
fluorescence sensible à la polarité de son environnement. Ce projet a abouti à une série
d'analogues aux propriétés diverses (Cheniour et al. 2016) et à la synthèse d'une molécule en
particulier, le Dioll, dont il sera question plus tard.

Nos expériences sur la CKmt montrent un rôle d'organisation de la protéine au niveau de la
membrane mitochondriale. Mais, les hépatocytes sont dépourvues de CKmt. Dans la littérature
(Schlattner et al. 2015, 2018), il a été suggéré qu'une autre protéine pourrait prendre la relève.
Celle-ci serait la forme mitochondriale de la nucléotide diphosphate kinase-D, la NDPK-D.
Pendant ma thèse, nous avons commencé à mettre en place un protocole de purification de la
NDPK-D, puis des isoformes cytosolique A et B, travaux continués avec la thèse de Liberty
François-Moutal (soutenue en 2013, dir thèse Olivier Marcillat et Thierry Granjon) (Francois-
Moutal et al. 2016; Francois-Moutal, Marcillat, and Granjon 2014; Francois-Moutal et al.
2013). Nous avons pu montrer, d'une part, que l'isoforme mitochondrial de la NDPK, l'isoforme
D, pouvait également former des complexes avec la CL, mais avec des tailles et des épaisseurs beaucoup plus faibles, et, d'autre part, que l'isoforme cytosolique NDPK-B se fixe à la phosphatidylsérine au niveau du feuillet interne de la membrane plasmique et que cette fixation entraine une rigidification de la membrane et la formation de complexes NDPK-B – PS. La fixation a lieu en deux étapes, adsorption suivie d'une insertion de la protéine dans la membrane.
Premier stage Postdoctoral (2008-2009)

*Mécanisme d'interaction des peptides basiques de type vecteur avec des membranes modèles et biologiques*

Equipe du Dr. Jesus Ayala Sanmartin, UMR 7613 CNRS-Université Pierre et Marie Curie, Paris.
Pendant mon stage post-doctoral à l'Université Pierre et Marie Curie dans l'équipe du dr. Jesus Ayala Sanmartin, je me suis intéressée à l'interaction de peptides vecteurs (pénétratine, polyarginine, RW9, ...) avec des modèles membranaires tels que les liposomes et les bourgeons de la membrane plasmique. Je me suis plus particulièrement focalisée sur l'études des modifications de courbure et fluidité membranaire, en utilisant la fluorescence d'une sonde sensible à la fluidité de son environnement, par microscopie optique, d'épifluorescence et confocale à l'aide d'un peptide à étiquette carboxyfluorescéine et de sondes membranaires.

Les peptides basiques pénétrants (CPP pour *cell penetrating peptides*) peuvent transporter à l'intérieur des cellules différentes molécules polaires ou apolaires. Parmi les premiers CPP décrits, nous pouvons citer le peptide Tatp47-57 (YGRKKRRQRRR), découvert en 1988, dérivé du facteur de transcription TAT du virus HIV (Green and Loewenstein 1988), ou encore le peptide principalement étudié lors de ce stage postdoctoral, la pénétratine (RQIKIWFQNRRMKWKK). La pénétratine est un peptide de 16 acides aminés issu d'Antennapaedia, un facteur de transcription chez la Drosophile, qui contrôle le placement des pattes sur l'axe de polarité antéro-postérieur, d'où l'abréviation parfois utilisée de pANT. Une mutation sur ce facteur entraîne la formation de pattes à la place des antennes (Figure 17).

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 17:** Drosophile normale (gauche) et drosophile possédant la mutation Antennapaedia avec des pattes formées à la place des antennes. Image obtenue en microscopie électronique à balayage (Green and Loewenstein 1988) Source Image Interactive Fly, *Drosophila* (sdbonline.org).</figcaption></figure>

Le fragment correspondant à la pénétratine correspond à la séquence responsable de l'internalisation cellulaire et de l'adressage nucléique de ce facteur (le *protein transduction domain*). Donc, ce peptide est capable de traverser les membranes et de transporter différents cargos à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau. Depuis sa découverte en 1991 (Joliot et al. 1991), la pénétratine est utilisée comme peptide de pénétration cellulaire.
Les CPP ont une action de type Cheval de Troie : ils pénètrent dans la cellule en entrainant
avec eux d'autres molécules. En règle générale, les CPP n'ont pas de récepteurs cellulaires connus. Différentes études ont montré que les peptides vecteurs peuvent à la fois être internalisés par des mécanismes de type endocytose (par exemple par voie indépendante de la clathrine (Drin et al. 2003), par la voie des cavéoles (Ferrari et al. 2003) ou par macropinocytose (Khalil et al. 2006)), mais aussi par des phénomènes de translocation (Derossi et al. 1996). Sur le même type cellulaire, la pénétratine peut être internalisée par endocytose à faibles concentrations (<5 µM) ou par des mécanismes non-énergétiques à fortes concentrations (Alves et al. 2010).

Plusieurs études montrent une fixation exclusive des CPP sur les lipides chargés négatifs (Derossi et al. 1996; Vives 2005); d'autres montrent également une interaction avec des lipides neutres (Bellet-Amalric et al. 2000; Magzoub, Eriksson, and Gräslund 2003). Par mesures de fluorescence (la pénétratine possède 2 résidus Trp dans sa séquence), il a été montré que le peptide peut interagir à la fois avec des membranes chargées et non chargées, mais que 10 % de lipide chargé négativement suffisent pour augmenter fortement l'affinité du peptide pour la membrane (Christiaens et al. 2002). Une internalisation spontanée du peptide a été montrée en utilisant de GUV (Thorén et al. 2000; Persson, Thorén, Esbjörner, et al. 2004). En revanche, l'internalisation n'est pas spontanée lorsque des vésicules unilamellaires de type LUV (Large unilamellar vesicles) sont utilisées, l'application d'un potentiel transmembranaire étant nécessaire pour aboutir à l'internalisation du peptide (Terrone et al. 2003). La courbure membranaire est donc importante dans la translocation du peptide.

# 1. L'endocytose physique comme voie d'entrée des peptides vecteurs basiques à l'intérieur des cellules

Les travaux précédents du laboratoire (thèse d'Antonin Lamazière, 2005-2008, dir. thèse Dr. Jesus Ayala-Sanmartin) ont montré que la pénétratine était capable de déformer profondément les bicouches lipidiques. A l'échelle microscopique, ces déstabilisations se traduisent par la formation d'invaginations tubulaires, très dynamiques, qui croissent à l'intérieur des vésicules géantes constituées de lipides en phase désordonnée (Figure 18).
<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 18:** Déformations membranaires induites par la pénétratine sur des GUVs PC:PG 9:1, observées par microscopie à contraste de phase. Barre d'échelle 20 µm (Lamazière et al. 2007)</figcaption></figure>

A l'échelle moléculaire, la pénétratine génère une nouvelle phase lipidique qui s'apparente à des structures à forte courbure, semblables à des micelles inverses. Dans la formation de cette phase, la phosphatidyléthanolamine semble jouer un rôle important. Ces deux phénomènes se produisent sans apport énergétique extérieur et sans altérer la perméabilité membranaire.

Antonin Lamazière a analysé les effets de cinq autres peptides basiques: la Substance P, un neuromodulateur impliqué dans la transmission de la douleur qui agit *via* des récepteurs dédiés (SP), le peptide cationique R9, constitué d'un enchaînement de 9 arginines et trois peptides amphipathiques RW9, RW16 et RL9 (Figure 19).

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 19:** Structures et caractéristiques des peptides analysés: séquence, nombre d'acides aminées, charge positive globale, caractère amphipatique de l'hélice (Lamazière et al. 2007).</figcaption></figure>

Les effets observés dépendent des caractéristiques du peptide (Figure 20). La pénétratine et le peptide R9 induisent la formation de microtubes à l'intérieur des vésicules qui envahissent progressivement le compartiment interne en moins de 20 min. L'intégrité de la vésicule est maintenue et on peut observer un processus d'attachement des vésicules
voisines.

Le peptide amphipatique RW16 induit également la formation de tubes, mais avec un diamètre systématiquement plus important, ainsi que des petits agrégats lipidiques à l'intérieur de la vésicule, ce qui cause une perturbation de la vésicule, une diminution de son diamètre et, occasionnellement, son éclatement. RW16 induit également l'adhésion de vésicules et la formation de petits agrégats, sans formation préalable de tubes.

Le peptide RW9 a un effet intermédiaire entre la pénétratine et le RW16, avec la formation concomitante de tubes fins et larges, la formation de petits agrégats lipidiques et la vésiculation à l'intérieur des GUV. L'intégrité des GUV n'est pas affectée.

Le peptide amphipathique RL16 induit la destruction complète des GUV en quelques secondes. La Substance-P ne perturbe pas la morphologie des vésicules.

<figure><img src="image_20.png" /></figure>

**Figure 20:** Déformations membranaires induites par les CPP sur des GUV PC:PG 9:1, observées par microscopie à contraste de phase. Barre d'échelle 20 µm (Lamazière et al. 2007)
Ces résultats ont permis de proposer un modèle pour expliquer les différents comportements des peptides et leur effet sur les membranes: l’existence d’une «endocytose physique» comme nouvelle voie d’entrée des peptides vecteurs basiques à l’intérieur des cellules.

Suite à ces publications, une partie de mon travail de postdoctorat a été de vérifier l'existence des invaginations/tubulations lorsque la pénétratine et les autres peptides basiques se fixent sur des membranes plus complexes. Au niveau de la cellule, la présence du cortex d'actine, ainsi que celle de protéines telles que la dynamine, qui coupent les protrusions membranaires, empêchent la mise en évidence de la formation de tubules ou protrusions suite à l'interaction avec les membranes. C'est pour cela que nous avons utilisé un autre système d'étude, les bourgeons de la membrane plasmique, aussi appelés GPMV pour *Giant Plasma Membrane Vesicles* ou PMS pour *Plasma Membrane Spheres*. Ces vésicules, qui ont une composition proche de celle de la membrane plasmique, ont été utilisées dans plusieurs études pour analyser la coexistence des phases lipidiques (gel/liquide ordonné/liquide désordonné) dans des membranes de compositions plus complexes que celles des GUVs (Baumgart et al. 2007). Elles sont dépourvues de cytosquelette, mais contiennent des protéines transmembranaires et périphériques caractéristiques de la membrane plasmique. Cependant, l'asymétrie membranaire est perdue, la présence de PS à l'extérieur de la vésicule étant mise en évidence.

Plusieurs protocoles de préparation des bourgeons sont disponibles dans la littérature (Baumgart, Hess, and Webb 2003; Baumgart et al. 2007; Lingwood et al. 2008). Ils se forment notamment après une courte incubation (1h à 2h) avec des solvants tels que l'acétone ou le formaldéhyde. Nous avons choisi une méthode plus douce, décrite dans Lingwood *et al.*, 2008, par incubation des cellules (ici des cellules épithéliales, MDCK) avec PBS 1,5 mM CaCl₂, 1,5 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, 1 mg ml⁻¹ glucose, sur la nuit (Lingwood et al. 2008). Une population très nombreuse de vésicules de type GPMV a été obtenue. De manière générale, les vésicules sont rondes, leur diamètre variant entre 1 et 5 µm. Elles apparaissent soit individualisées (Figure 21), soit attachées à un corps cellulaire nettement rétréci (Figure 21, flèche).
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 21:** GPMV obtenues à partir des cellules MDCK visualisées par microscopie à contraste de phase (gauche) ou microscopie de fluorescence (marquage membranaire réalisé avec di-4-ANEPPDHQ).</figcaption></figure>

Le marquage des membranes a été réalisé à l'aide de plusieurs sondes: le di-4-ANEPPDHQ, le DiI ou dans des cellules exprimant une protéine périphérique avec une étiquette GFP, l'annexine A2-GFP, qui est associé à la membrane plasmique. Pour toutes les expériences de microscopie nous avons utilisé une construction pénétratine-carboxyfluorescéine (CF), que j'ai synthétisée avec l'aide des Drs Fabienne Burlina et Gérard Chassaing, Laboratoire de Biomolécules, Université Pierre et Marie Curie.

## 2. Tubulations induites par la pénétratine sur les vésicules issues de la membrane plasmique

Observées par microscopie optique (contraste de phase), les vésicules apparaissent translucides en absence de pénétratine. Après ajout du peptide (10 µM), on observe une accumulation de structures plus sombres et dynamiques à l'intérieur (Figure 22).
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 22:** Structures formées par la pénétratine sur les GPMV. A gauche, GPMV avant l'ajout de pénétratine, à droite la même vésicule après ajout de pénétratine au cours du temps.</figcaption></figure>

Afin de caractériser ces structures, nous avons utilisé la pénétratine-CF (en vert) et différents marquages membranaire. Comme nous pouvons voir dans la figure 23, des structures riches en pénétratine partent de la membrane des vésicules et grandissent vers l'intérieur. La taille et l'intégrité de la vésicule sont maintenues. Les structures sont également marquées par une sonde membranaire (ici DiI, en rouge). Elles sont dynamiques et rappellent les tubulations observées sur les membranes des GUVs PC/PG 9/1. Le peptide R9 est également capable de produire des structures similaires.

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 23:** Les structures riches en pénétratine-CF contiennent également des membranes: colocalisation de la pénétratine avec le marqueur membranaire DiI.</figcaption></figure>

Ces résultats sont à notre connaissance la première description de tubulations induites par des CPP dans les membranes biologiques. Les invaginations membranaires pourraient être dues à la formation de régions de courbure négative dans la membrane. Dans le cas de la pénétratine, ces régions seraient formées suite à l'association des résidus arginine aux phospholipides chargés négativement de la membrane induisant une compaction des lipides dans le feuillet externe. Une fois les invaginations initiées, des changements dans la tension membranaire permettraient la croissance spontanée des tubes à l'intérieur de la vésicule. Dans une cellule, une telle croissance des tubules est difficilement observable, certainement
dû à la présence de filaments d'actine en contact avec la membrane. Dans le cas des bourgeons de la membrane plasmique, l'absence de cytosquelette permet une certaine flexibilité de la membrane et la poursuite de la tubulation vers l'intérieur de la vésicule. Dans le cas des cellules, les vésicules d'endocytose sont rapidement séparées de la membrane par la dynamine, élément absent dans les bourgeons membranaires. La capacité de produire des invaginations a été décrite pour la toxine Shiga (Römer et al. 2007), ainsi que pour les domaines I bar des protéines (Saarikangas et al. 2009). Les travaux sur la toxine Shiga ont montré une stabilisation des invaginations membranaires dans des cellules dépourvues de dynamine et dans lesquelles la polymérisation de l'actine a été bloquée (Römer et al. 2007).

### 3. Est-ce que la capacité de former de tubulations au niveau de la membrane est spécifique à la pénétratine ?

Nous avons utilisé le même modèle membranaire pour analyser l'interaction des peptides R9, RW9 et RW16.

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 24** : Accumulation de structures peptide/membrane à l'intérieur de GPMV produites par les peptides RW9 (haut) et R9 (bas).</figcaption></figure>
L'effet des peptides basiques sur les GPMV est différent selon la charge et la structure du peptide. Les peptides R9 et RW9 peuvent former de tubulations à l'intérieur des vésicules mais leur fréquence est plus faible et leur diamètre plus grand (Figure 24). R9 et RW9 sont des peptides relativement courts et très chargés. La pénétratine est un peptide long et versatile du point de vue structural (Caesar et al. 2006; Magzoub, Eriksson, and Gräslund 2002; Magzoub et al. 2001; Persson, Thorén, Lincoln, et al. 2004; Maniti et al. 2010). Ce peptide peut se fixer à la membrane en différents points de sa surface et s'adapter en adoptant des structures plus diversifiées qui favorisent le pontage des membranes et la formation de tubes longs.

En plus de la formation de tubes, plusieurs phénomènes sont observés sur la morphologie des vésicules. L'effet le plus impressionnant est la déformation de la vésicule avec la formation de bourgeons /protubérances à l'extérieur de la vésicule (Figure 25).

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 25:** Déformations de vésicules suite à l'intéraction avec les peptides RW9, R9 et RW16.</figcaption></figure>
Le nombre de protrusions formées après incubation avec le peptide RW16 est
sugnificativement plus faible, ce qui indique que la longueur du peptide est importante pour
l'induction des courbures positives dans la membrane.

L'organisation de la membrane au niveau de la protubérence se retrouve dans certains cas
modifiée comme le montre le marquage de la membrane avec la sonde di-4-ANEPPDHQ.
Cette sonde est sensible à l'organisation membranaire, via des intéractions avec le
choléstérol (Amaro et al. 2017) Nous avons enregistré des images en microscopie confocale
sur deux canaux 570-590 nm et 620-640 nm selon le protocole de (Jin et al. 2006). En
absence de peptides, les intensités des deux cannaux sont similaires. Nous avons attribué
une coloration verte au canal 570-590 nm et rouge au canal 620-640 nm. L'image fusionnée
de deux canaux montre une membrane homogène colorée en jaune. Le peptide R9 ne
modifie pas cette coloration, en revanche, après ajout du peptide RW9, nous avons observé
sur certains GPMV des régions distinctes colorées en vert. Ceci indique la présence de
regions plus ordonnées dans la membrane. Ce phénomène est observé dans la plupart des
cas au niveau des protubérances comme le montre la figure 26.

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 26:** Formation de protubérances sur les GPMV suite à l'action du peptide RW9. La membrane a été marquée avec la sonde sensible à l'organisation de la membrane di-4-ANEPPDHQ. Une coloration verte au niveau de la protusion (flèche) indique une plus grande rigidité.</figcaption></figure>

Un deuxième effet est la formation de tubes avec des diamètres entre 0,2 et 1 µm et de
longueurs variant entre 5 et plus de 100 µm (Figure 27). La plupart de tubes se forment à
partir de bourgeons encore attachés au corps cellulaire. Nous avons supposé que celui-ci
pourrait constituer un réservoir de lipides qui permetrait la croissance des tubes (comme
l'électrode dans le cas des GUV électroformés).
<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 27:** Formation de tubes à l'extérieur des bourgeons suite à l'interaction des peptides avec les vésicules.</figcaption></figure>

Un phénomène très intriguant observé de manière systématique est l'enroulement de tubes très fins sous l'effet du faisceau d'éclairage (Figure 28). Ces phénomènes, bien que nombreux, sont très rapides et sont difficiles à capturer en images.

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>**Figure 28:** Enroulement d'un tube sous l'effet du faisceau d'éclairage. Le tube est en mouvement à l'extérieur de la vésicule, puis s'enroule pour former une spirale à la surface.</figcaption></figure>

Ces résultats ont fait le sujet de deux articles publiés en International Journal of Biochemistry & Cell Biology, disponibles en annexe 5 et 6.

https://doi.org/10.1016/j.biocel.2014.02.017

https://doi.org/10.1016/j.biocel.2012.02.010

En parallèle, nous avons analysé l'effet et le rôle individuel des lipides dans la fixation et l'internalisation du peptide. Nous avons choisi d'effectuer cette analyse sur des modèles membranaires très simples (LUV de 100 nm de diamètre) et constitués d'un seul type de lipide. L'importance de la charge dans l'interaction pénétratine-membrane a déjà été largement analysée, nous nous sommes intéressés en plus à l'interaction de la pénétratine avec la PE. Nous avons pu montrer que l'affinité de la pénétratine pour les bicouches
supportées PC:PE (1/1) est d'un ordre de grandeur plus important que celle de pénétratine pour les bicouches PC et 4 fois plus important que les bicouches PG.

Nous avons pu mettre en évidence des phénomènes d'agrégation des vésicules constituées de PC et surtout de PE, mais pas des vésicules de PG : le mécanisme d'interaction est donc très différent – l'exposition de charges négatives ne permet pas le "pontage" de vésicules PG par la pénétratine, mais le permet pour celles de PC et PE.

Nous avons également mis en évidence des changements de fluidité de la membrane ou par des mesures de fluorescence en utilisant le Laurdan comme sonde sensible à la fluidité membranaire et par des mesures de spectroscopie infrarouge: la pénétratine produit une rigidification des vésicules de PE et de PG. Cette rigidification est due à l'expulsion des molécules d'eau au niveau des têtes polaires et de la chaîne glycérol, et non à un effet sur les chaînes acyles, dont les vibrations caractéristiques sont peu ou pas modifiées sur le spectre FTIR.

Les changements de conformation du peptide après fixation aux trois types de liposomes ont été analysés par dichroïsme circulaire (CD) et spectroscopie infrarouge (FTIR) et ont confirmé le statut de caméléon structural de la pénétratine. Les spectres en solution correspondent à un état avec peu de structures secondaires périodiques. La fixation aux vésicules de PG entraine la formation d'hélices α très marquées sur le spectre CD et feuillets β, plus visibles sur le spectre FTIR. En présence de PE, la pénétratine adopte majoritairement une structure en hélice α sur le spectre FTIR ; la forte agrégation induite par la pénétratine ne nous a cependant pas permis d'obtenir les spectres CD correspondants.
Nous avons pu proposer un modèle d'interaction pénétratine – membranes différent selon la charge de la membrane cible : le peptide, non-structuré en solution, adopte une structure secondaire bien définie en présence de lipides chargés comme le PG. Cette structuration ne permet pas l'exposition des charges positives à la surface et ne permet pas la fixation de plusieurs vésicules sur le même peptide, ni la formation de complexes multimoléculaires de peptide.

L'interaction avec les phospholipides zwitterioniques dépend de la taille de la tête polaire du lipide. La pénétratine semble capable d'établir à la fois des interactions électrostatiques et non-électrostatiques. L'interaction a lieu en deux étapes : dans la première, le peptide induit une répulsion au niveau des lipides et dans la deuxième, les phospholipides se redistribuent dans une bicouche plus compacte, incluant le peptide plus ou moins "structuré" par l'interaction. Cette nouvelle structure permet la formation de complexes vésiculaires. Il est très intéressant de remarquer, d'une part la forte affinité de la pénétratine pour la PE, et
d'autre les effets très importants que le peptide induit sur les vésicules de PE: très forte
agrégation, rigidification, changement de structure secondaire. Ces effets pourraient
intervenir dans la translocation des protéines à travers les membranes. Dans ce cas, la
structure membranaire en contact avec le peptide serait le feuillet interne de la membrane
plasmique, riche en PE.

La diminution de fluidité membranaire et l'hétérogénéité de régions membranaires créées
par le peptide pourrait également avoir une importance physiologique dans la translocation.
Le pontage entre les membranes favoriserait la formation de structures tubulaires avant
l'internalisation.

Ces résultats ont été publiés dans PLoSONE en 2010, article disponible en annexe 7.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0015819
Deuxième stage Postdoctoral (2009-2011)

Interactions des protéines recombinantes de la famille ERM (Ezrine/Radixine/Moésine) avec l'actine et des membranes phospholipidiques biomimétiques

Equipe du Prof. Catherine Picart,

Laboratoire de Matériaux et du Génie Physique, CNRS-UMR 5628, Grenoble.
Lors de ce second stage postdoctoral, j'ai analysé les interactions des protéines de la famille des ERM (Ezrine/Radixine/Moésine) avec la membrane plasmique et les filaments d'actine par une approche biomimétique, en utilisant des vésicules lipidiques et des protéines recombinantes, pour reproduire et analyser *in vitro* ces interactions.

Le cortex d'actine est un réseau dense de microfilaments et de protéines, associé à la membrane plasmique qui, grâce à la tension qu'il génère, contrôle la forme, la polarisation et la motilité de la cellule. Les protéines de la famille ERM, l'ezrine, la radixine, la moésine sont des protéines qui "lient" les filaments d'actine (l'actine-F) à la membrane plasmique. Elles organisent ainsi le cortex d'actine au voisinage de la membrane participant à la formation de bourgeons, microvillosités, lamellae, pseudopodes, jonctions, synapses, etc (Fehon, McClatchey, and Bretscher 2010; Niggli and Rossy 2008). Chez les vertébrés, les ERM présentent des localisations distinctes: l'ezrine est retrouvée surtout dans les cellules épithéliales, étant initialement isolées à partir des cellules pariétales gastriques (Bretscher, Reczek, and Berryman 1997), la moésine est présente dans les cellules endothéliales et la radixine dans les hépatocytes. Les souris dépourvues d'ezrine ont des cellules intestinales présentant des vili courts et mal orientés, et ne survivent pas plus de quelques jours (Saotome, Curto, and McClatchey 2004); celles dépourvues de radixine présentent des dommages au niveau du foie et survivent 8 semaines (Kikuchi et al. 2002) et celles dépourvues de moésine ne présentent pas de différences phénotypiques avec les souris sauvages (Doi et al. 1999). Les ERM ont donc à la fois des fonctions spécifiques et des fonctions qui peuvent être prises en charge par les autres membres de la famille.

De par leur rôle dans la régulation de la motilité cellulaire, l'ezrine et la moésine ont été souvent associées aux phénomènes de métastase (Estecha et al. 2009; Yu et al. 2004; Khanna et al. 2004; Elliott et al. 2005). L'ezrine et la moésine sont distribuées de manière différente lors de l'invasion des matrices de collagène par les cellules: la moésine est présente au niveau du dôme cortical d'actine et l'ezrine au niveau des protrusions membranaires (Estecha et al. 2009). Des distributions différente des deux protéines ont été également mises en évidence lors de l'activation des lymphocytes T (Shaffer et al. 2009; Ilani et al. 2007). Dans ce cas, l'ezrine est présente au niveau de la synapse immunologique et la moésine est présente au pôle distal. La moésine, et non l'ezrine, est également impliquée dans l'entrée des virus dans les cellules (Barrero-Villar et al. 2009). L'ezrine et la moésine ont donc à la fois des fonctions redondantes et des fonctions distinctes au niveau cellulaire.

Du point de vue structural, l'ezrine partage 73 % d'identité de séquence avec la moésine et 76 % avec la radixine (Niggli and Rossy 2008). Les trois ERM sont composées d'un domaine N-
terminal, impliqué dans la fixation à la membrane, le domaine FERM, d'un domaine C-terminal responsable de la fixation aux filaments d'actine et d'une région charnière (Figure 29). Cette région charnière, essentiellement structuré en hélice α, est repliée dans la forme inactive, mais est supposée s'ouvrir lors de l'activation des ERM.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>**Figure 29:** Structure des ERM. A. Domaines structuraux de l'ezrine et de la moesine: domaine FERM (gris), domaine C-terminal (rouge) et la région charnière hélicoidale (bleu). B. Structure tertiaire de l'ezrine: à gauche la forme fermée et à droite la forme ouverte, obtenue par modélisation à partir de la structure cristallographique de *S. frugipeda* (2I1JA). F1, F2, F3 sont les trois lobes du domaine FERM.</figcaption></figure>

Les mécanismes moléculaires de l'activation ne sont pas entièrement établis, mais il est décrit que dans l'état inactif, cytosolique, les domaines FERM et C-terminal interagissent, et les sites de fixation à l'actine sont masqués. Dans leur forme active, les ERM s'ouvrent et le site de fixation à l'actine est exposé (Figure 30). Un élément essentiel dans l'activation des ERM est la fixation à la membrane (Yonemura et al. 2002; Hao et al. 2009; Hirao et al. 1996; Fievet et al. 2004; Barret et al. 2000). Des processus de phosphorylation ont également été proposés (Fievet et al. 2004).

Au niveau membranaire, le partenaire d'interaction est le phosphatidylinositol (4,5)-
bisphosphate, le PIP₂, lipide impliqué dans les mécanismes de régulation de la formation du cytosquelette (Saarikangas, Zhao, and Lappalainen 2010).

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 30:** Mécanisme hypothétique d'activation des ERM : les ERM subissent un changement de conformation suite à la fixation à la membrane qui entraîne une ouverture de la structure protéique et l'exposition du site d'interaction avec l'actine.</figcaption></figure>

Un but majeur de mon activité pendant ce stage postdoctoral a été de reconstituer ces interactions *in vitro*. Pour cela, nous avons tout d'abord analysé l'interaction de l'ezrine et de la moésine avec des liposomes, des LUV contenant du PIP₂, et les modifications structurales de ces deux protéines suite à la fixation à la membrane (article annexe 8).

https://doi.org/10.1016/j.bbamem.2012.07.004

Si l'interaction de l'ezrine avec des membranes modèles avait déjà été étudiée, la fixation de la moésine avait été négligée. Nous avons mis en place un protocole de purification de cette protéine et nous avons estimé et comparé les constantes d'affinité des deux protéines par rapport au LUV contenant du PIP₂ ou PIP₃ (Figure 31).

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 31:** Fixation de la moésine aux liposomes. Les liposomes chargés en saccharose ont été séparés du surnageant par centrifugation. A. La quantité de protéine fixée a été estimée à partir du gel SDS-PAGE. B. Pourcentage de fixation en fonction de la concentration de phospholipide chargé négativement (○) PIP₂, (●)PIP₃ ; (□)PS, (∇) contrôle liposomes PC (concentration Moésine 0,4 µM) et valeurs de K_D (C).</figcaption></figure>
En termes de structure, nous avons pu obtenir un faisceau de preuves qui vont dans la direction d'un "relâchement" de la structure des deux protéines: les résidus tryptophane et la sonde Alexa546 greffée au domaine C-terminal sont plus exposés au solvant, les deux protéines sont plus sensibles à la protéolyse après fixation à la membrane. En termes de structure secondaire, les spectres FTIR des deux protéines montrent une diminution du % des hélices α, en faveur de structures apériodiques (Tableau 1).

<table><caption>**Tableau 1:** Position du maximum de la bande de vibration et pourcentage de la structure sur la totalité de la bande amide I obtenues par déconvolution des spectres FTIR de l'ezrine et de la moésine en solution ou après fixation à des LUV PC:PIP<sub>2</sub> 95:5.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th rowspan="2"></th><th colspan="2">ezrine</th><th colspan="2">moésine</th></tr><tr><th>PIP<sub>2</sub>-LUV -</th><th>PIP<sub>2</sub>-LUV +</th><th>PIP<sub>2</sub>-LUV -</th><th>PIP<sub>2</sub>-LUV +</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Hélices α</td><td>position du pic (cm<sup>-1</sup>)</td><td>1653</td><td>1652</td><td>1650</td><td>1650</td></tr><tr><td>%</td><td>39</td><td>32</td><td>50</td><td>37</td></tr><tr><td rowspan="2">Feuillets β<br>intramoleculaire</td><td>position du pic (cm<sup>-1</sup>)</td><td>1631</td><td>1635</td><td>1635</td><td>1635</td></tr><tr><td>%</td><td>37</td><td>32</td><td>32</td><td>30</td></tr><tr><td rowspan="2">Structures apériodiques</td><td>position du pic (cm<sup>-1</sup>)</td><td>1644</td><td>1641</td><td>1644</td><td>1640</td></tr><tr><td>%</td><td>17</td><td>31</td><td>10</td><td>32</td></tr><tr><td rowspan="2">Feuillets β<br>intermoleculaire</td><td>position du pic (cm<sup>-1</sup>)</td><td>1606</td><td>1606</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%</td><td>3.5</td><td>1</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Cependant, malgré de multiples tests, nous n'avons pas pu mettre en évidence, avec certitude, une fixation aux filaments d'actine des ERM fixées aux LUV. A titre d'exemple, la figure 32A montre une image des filaments d'actine observés par microscopie TIRF (total internal reflexion florescence microscopy), en présence de liposomes ayant fixé l'ezrine-Alexa488. Les filaments sont marqués à la phalloïdine Alexa546. On observe une distribution aléatoire des LUV et des filaments. La même distribution aléatoire est observée par cryo-microscopie (Figure 32B).
<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Figure 32: Filaments d'actine et LUV-PIP₂ Ezrine: A. Image en microscopie TIRF (Ezrine Alexa488 et Actine Phalloïdine Alexa546. B. Images en microscopie électronique à transmission: gauche : LUV-PIP₂/actine, droite : LUV-PIP₂ Ezrine/actine.

En revanche, lorsque l'ezrine est adsorbée sur des billes de polystyrène en présence de PIP₂, nous pouvons observer une croissance des filaments d'actine à partir de ces billes (Figure 33).

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

**Figure 33:** Organisation des filaments d'actine autour des billes sur lesquelles l'ezrine fluorescente est adsorbée. Haut: en présence de PIP₂; Bas: en absence de PIP₂. L'actine est marquée en rouge (Alexa546 Phalloïdine) et l'ezrine en vert (Alexa488).

Nous avons émis l'hypothèse que les changements de structure de l'ezrine en présence de LUV - PIP₂ ne sont pas suffisants pour induire l'activation de la protéine. D'autres phénomènes pourraient être mis en jeu comme la phosphorylation de l'ezrine. Nous avons donc purifié un double mutant phosphomimétique, Ezrine T235D T567D (Ezrine DD). L'interaction de ce mutant avec des bicouches lipidiques contenant du PIP₂ a été analysée après mon départ du
laboratoire pendant la thèse de Quentin Lubart (soutenue en 2016, dir Thèse Prof Catherine Picart). En effet, la forme mutée de l'ezrine se fixe effectivement à la membrane, et permet l'accumulation des microtubules à la surface d'une bicouche supportée contenant du PIP₂ (Lubart et al. 2018).

En parallèle, j'ai participé à une étude mené par l'équipe du Prof Steve Shaw du National Cancer Institute, Bethesda, Etats Unis, dans laquelle les rôles de chaque site de fixation de la moésine au PIP₂ ont été analysés dans un contexte cellulaire et confirmés par des expériences *in vitro* réalisées dans notre laboratoire. Cet article est disponible en annexe 9.

https://doi.org/10.1074/jbc.M111.304881

En termes de séquence/structure, deux sites de fixation ont été proposés dans la littérature. Le premier, le "PIP₂-binding POCKET" (POCKET) a été identifié sur la structure cristalline du domaine FERM de la radixine complexé à l'IP₃ (Hamada et al. 2000). Ce site est situé dans un sillon entre les lobes A et C du domaine FERM. Le deuxième, PATCH, est situé sur le lobe C et a été proposé comme site de fixation par V Niggli et ses collaborateurs grâce à une séquence de 2 paires de résidus lysine (K253/K254 et K262/K263) (Barret et al. 2000). La mutation de ces 4 résidus lysines en asparagines (le mutant 4N) abolit toute fixation à la membrane. Le rôle de chaque site dans la séquence d'activation des ERM est mal compris. Le domaine POCKET, par exemple, est complétement masqué dans la structure 3D de la protéine et une fixation au PIP₂ est difficilement envisageable (Li et al. 2007). Le domaine PATCH peut initier la fixation à la membrane, mais peut-il également induire l'ouverture de la protéine et son activation ?

Des mutants ont été générés par l'équipe de Steve Shaw et leur fonctionnalité testée. Premièrement, parmi les mutants des résidus impliqués dans l'interaction Radixin FERM-IP3 (POCKET) (K60 and K63 - lobe A and K278 - lobe C) (Figure 34A), les K63N et K278N diminuent la fixation de la protéine GFP à la membrane de 50 % et la double mutation de 80 %.
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 34:** Le domaine POCKET et la fixation de la Moésine à la membrane des cellules Jukat. A. Les 3 lobes du domaine FERM et les résidus K60, K63 et K278 impliqués dans l'interaction avec l'IP₃ dans la structure cristallisée. B. Distribution de la Moésine-GFP WT et mutants K60N, K63N, K278N, K60/278N, K63/278N dans la cellule. C. Enrichissement membranaire calculé comme le rapport entre la fluorescence mesurée à la membrane/fluorescence mesurée dans le cytosol.</figcaption></figure>

Afin de confirmer ce résultat, nous avons effectué des tests de cosédimentation avec des liposomes LUV-PIP₂ et déterminé les constantes de dissociation de la moésine WT et K63/K278N (Figure 35). La double mutation K63/278N induit une augmentation marquée du K_D (de 22 à 105 µM). La forme mutée ne se fixe pas aux protéines membranaires CD44 et NHERF1 en présence de PIP₂.
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 35:** La mutation de résidus K63 et K278 du POCKET réduit considérablement la fixation de la moésine au PIP₂ et annule l'interaction avec les domaines cytoplasmiques des protéines membranaires CD44 (B) et NHERF1 (C) en présence de PIP₂.</figcaption></figure>

En ce qui concerne la région PATCH, 4 résidus lysines ont déjà été analysés (K253/K254 et K262/K263) (Barret et al. 2000). En plus de ces 4 résidus, 3 autres résidus lysine sont susceptibles d'intervenir dans l'interaction (K211, K212 et K258) (Fig. 36A). Parmi les résidus mutés les K253, K254 et K263 sont critiques pour la fixation à la membrane (Fig. 36 B et C). Le quatrième mutant, K262N, présente également une diminution de la fixation à la membrane, mais moins importante. Ces résidus correspondent aux 2 paires initialement décrites (Barret et al. 2000).

Est-ce que la diminution de la localisation membranaire est due à une modification de l'affinité pour le PIP₂? Les tests de co-sédimentation montrent qu'au contraire, les mutations ponctuelles induisent peu ou pas de variation au niveau du K<sub>D</sub>, mais la mutation des 4 résidus, le mutant 4N, réduit drastiquement la fixation du mutant 4N (Figure 36 D).
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure 36:** Le domaine PATCH et la fixation de la Moésine à la membrane. A. Localisation des résidus d'intérêt et potentiel électrostatique de surface. B. Distribution de la Moésine-GFP WT et mutants dans les cellules Jurkat. C. Enrichissement membranaire calculé comme le rapport entre la fluorescence mesurée à la membrane/fluorescence mesurée dans le cytosol. D. Constantes de dissociation des mutants déterminées par cosédimentation avec des liposomes PC/PIP₂ (95/5)</figcaption></figure>

Les mutations ponctuelles affectent donc la localisation membranaire sans affecter la fixation au PIP₂, ce qui suggère que la localisation membranaire est plus complexe que la simple fixation
au PIP<sub>2</sub>. L'activation nécessiterait des phénomènes complémentaires à la fixation au lipide, comme par exemple l'interaction avec les protéines membranaires comme CD44 et NHERF-1. En effet, l'interaction avec ces protéines en présence de PIP<sub>2</sub> se retrouve grandement affectée à la fois par les mutations ponctuelles et par les double ou quadruple mutations. Les "simple" mutants peuvent se fixer au PIP<sub>2</sub>, mais ne sont pas activés suite à la fixation.

Deux sites de fixation au PIP<sub>2</sub> sont donc présents, avec des localisations et des accessibilités différentes : le domaine PATCH étant exposé à la surface, peut initier le contact avec le PIP<sub>2</sub>, pendant que le domaine POCKET est masqué par un segment chargé négativement (acidic region) d'approximativement 23 aminoacides (472-494) (Figure 37). Ce segment masque également la poche hydrophobe responsable de l'interaction avec le CD44. Cette région, dont l'importance a été décrite pour la première fois, a été dénommée FLAP. Une forme tronquée de la protéine dans laquelle le FLAP a été enlevé présente une fixation très importante au PIP<sub>2</sub> et peut se fixer aux protéines CD44 et NHERF1. En résumé, les domaines PATCH et POCKET participent à la fixation de la moésine à la membrane. PATCH, exposé à la surface et accessible, est le premier site d'interaction. Sa fixation à la membrane produit le déplacement du domaine FLAP qui, à son tour, rend accessible le domaine POCKET pour l'interaction avec la membrane.

En absence de PIP<sub>2</sub>, les sites de phosphorylation du domaine C-terminal ne sont pas accessibles (Hicks et al. 2008; Pearson et al. 2000; Fievet et al. 2004). La fixation du PIP<sub>2</sub> au domaine POCKET complèterait l'activation de la moésine et permettrait la phosphorylation des sites, et, par conséquent, la stabilisation de la forme ouverte, active, capable d'interagir avec les filaments d'actine.
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 37:** Position et rôle du domaine FLAP. Potentiel électrostatique de surface de la région POCKET recouverte par le domaine FLAP (A) et lorsque ce domaine est enlevé (B). On observe l'exposition d'une région avec un potentiel de surface positif, capable d'interagir avec les charges négatives de la membrane. Structure de la moésine en conformation fermée avec la région FLAP en rouge (C). Comparaison de séquence au niveau de ce domaine. On remarque une structure peu conservée, mais très riche en acides aminés chargés négativement (D).</figcaption></figure>
Maître de conférences
Université Claude Bernard Lyon 1, UMR 5246

Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires

Dans l'Equipe Génie Enzymatique, Membranes Biomimétiques et Assemblages Supramoléculaires (GEMBAS).

Depuis oct. 2011
# 1. Présentation générale de thématiques de recherche

Mon activité scientifique actuelle s'organise autour de 4 thématiques ayant toutes en commun les lipides et leurs rôles au niveau des membranes, et l'étude des interactions molécules-membranes.

## 1.1. Liposomes sur mesure pour le ciblage des cellules tumorales

Lors de mon recrutement dans l'équipe en 2011, j'ai souhaité mettre à profit mon expérience dans le domaine des membranes pour la conception de vecteurs de délivrance de médicaments de nature lipidique et l'analyse de leur interaction avec les membranes cellulaires et biomimétiques. Je me suis intéressée plus particulièrement aux liposomes, un des plus anciens mais des plus intéressants systèmes de délivrance de médicaments. Leur succès clinique est lié à leur structure en bicouche phospholipidique semblable à celle des membranes biologiques. Cependant, un taux d'encapsulation faible, un greffage d'anticorps coûteux avec de faibles rendements, ainsi qu'une charge de surface trop importante provoquant une élimination rapide des liposomes dans le sang pénalisent l'emploi de ces nanovecteurs en médecine. Afin d'augmenter la spécificité et l'efficacité des liposomes dans la vectorisation des chimiothérapies, le facteur utilisé pour cibler les cellules cancéreuses est la fluidité membranaire, chiffrée à l'aide d'une sonde de fluorescence développée à l'ICBMS et brevetée (collaboration avec l'équipe LCO2-Glyco). Ce projet de recherche a mené à la soutenance de thèse de Julien BOMPARD (co-encadrée avec le Prof. Agnès Girard-Egrot), le 16 décembre 2020. Pendant sa thèse, Julien Bompard a analysé l'interaction de liposomes de fluidité membranaire variable avec plusieurs lignées de cellules cancéreuses. Il a pu montrer que l'internalisation de ces vecteurs pouvait être modulée en fonction de la fluidité membranaire et que l'interaction entre la membrane du liposome et la membrane plasmique correspondait à un phénomène de fusion. Ces travaux ont été publiés dans Langmuir en 2020. Ils ont été présentés dans divers congrès sous forme de communications orales ou poster, et ils ont été accueillis avec beaucoup d'intérêt; Julien ayant remporté plusieurs fois le prix de la meilleure communication « Jeune chercheur » ou du meilleur poster.

Lors des stages de M2 recherche de Mme Xiaoyi Wang (2020) et de Mme Ariana Abawi (2021), nous avons poursuivi ce projet afin de délivrer un spécifiquement composé actif dans les lignées cancéreuses prostatiques. Nous avons choisi la délivrance des composés ancrés dans les membranes, afin d'augmenter l'efficacité de l'encapsulation, avec une
molécule phare, la Monométhyl Auristatine E, greffée sur un dérivé lipidique. Ces travaux ont été publiés en 2021 dans l'International Journal of Molecular Science.

Des tests avec d'autres molécules actives sont actuellement en cours.

La stabilité des liposomes *in vivo* est également analysée, en vue d'une utilisation thérapeutique de ces vecteurs. Cette étude est réalisée en collaboration avec le dr Giovanna Lollo de l'équipe GeParm du LAGEPP.

Nous poursuivons actuellement les tests sur d'autres lignées cellulaires afin de vérifier si la corrélation entre la fluidité membranaire des liposomes et celle des cellules cibles est un phénomène plus général et si ce paramètre peut être utilisé de manière systématique pour le ciblage des cellules tumorales. Ces mesures seront faites durant la thèse d'Ariana Abawi (2021-2024), que je co-dirige actuellement avec le Prof Agnès Girard-Egrot, en collaboration avec le dr Thierry Granjon, de l'équipe LCO2, ICBMS.

## 1.2. Fluidité des vésicules extracellulaires

Dans le cadre d'un projet régional financé sur la période 2021-2026, coordonné par le Dr. Arnaud Vigneron, CRCL, dans lequel je suis responsable scientifique pour l'équipe GEMBAS, nous allons analyser la fluidité membranaire des vésicules extracellulaires de type exosomes dans un contexte d'évolution tumorale. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires libérées par les cellules dans des situations physiologiques et pathologiques et sont envisagés comme biomarqueurs. Ils présentent des avantages majeurs par rapport à l'analyse de biopsies ou de tumeurs *in situ* car ils sont excrétés par la tumeur. Une corrélation de la fluidité membranaire des exosomes/vésicules extracellulaires (EV), issues de la tumeur et plus accessibles que les biopsies, avec celle des liposomes ciblant la tumeur présenterait une avancée thérapeutique importante.

L'analyse de la fluidité membranaire dans un contexte de développement tumoral fait partie d'un projet plus ample, concernant l'utilisation de la sonde Dioll dans des buts diagnostiques et pronostiques, financé d'abord par la Ligue contre le Cancer, Comité de Haute Savoie (2015-2016), puis par le CNRS dans le cadre d'un programme de pré-maturation (2016-2018) et par la SATT Pulsalys (maturation) (2019-2020), projets coordonnées par le Dr. Thierry Granjon, et par la région Rhône-Alpes-Auvergne via un financement Pack Ambition Recherche (2021-2026), projet coordonné par le Dr. Arnaud Vigneron. Dans ces projets je suis partenaire responsable de l'équipe GEMBAS.
### 1.3. Rôles des structures lipidiques dans les articulations synoviales

Les performances lubrifiantes des articulations synoviales humaines, qui surclassent de loin les formulations de synthèse, sont dues à l'interface cartilage-liquide synovial, capable d'accommoder le glissement avec un frottement minime. En particulier, la présence des vésicules lipidiques multilamellaires, les vésicules synoviales, secrétées par les synoviocytes, semble essentielle pour le bon fonctionnement de l'articulation. Les pathologies ostéoarticulaires comme l'arthrose et l'arthrite rhumatoïde induisent une déstructuration de ces assemblages vésiculaires. En collaboration avec l'équipe MecaLip du LaMCoS, nous cherchons à comprendre le rôle de ces assemblages moléculaires sur les performances des articulations, dans le but de proposer des vésicules de substitution mimant les propriétés mécaniques et lubrifiantes des vésicules saines. Ce projet fait l'objet de la thèse de Layth Ben Trad, que je co-encadre avec Dr. Thierry Granjon et le Dr Ana-Maria Trunfio-Sfarghiu.

### 1.4. Analyse des mécanismes impliqués dans l'interaction liposomes – membranes en utilisant des bicouches lipidiques supportées biomimétique

Dans une deuxième partie de sa thèse, M Bompard a cherché à caractériser l'interaction liposomes-membranes sur de modèles membranaires afin de mieux comprendre ses mécanismes. Pour cela, nous avons utilisé un système de membranes biomimétiques, des bicouches supportées découplées du support, mis au point dans notre équipe depuis 2014 et breveté. Ce projet, né sous l'impulsion du professeur Girard-Egrot, est un projet phare de notre groupe de recherche « membranes biomimétiques » dans lequel je suis fortement impliquée. Nous avons couplé ce système à une technique d'imagerie innovante, en collaboration avec le Dr. Dominique Ausséré (CNRS).
## 2. La membrane lipidique au cœur du ciblage tumoral : vers de nouveaux vecteurs thérapeutiques liposomaux

Situées à l'interface cellule/environnement, les membranes cellulaires subissent des transformations profondes lors de l'évolution d'une pathologie et sont susceptibles de servir de biomarqueurs, mais aussi de cibles thérapeutiques. Plusieurs études ont relié, par exemple, l'agressivité du cancer à des changements de la composition lipidique et donc, des propriétés physico-chimiques de la membrane plasmique qui devient alors de plus en plus fluide (Edmond et al., 2015; Hattori et al., 1987; Komizu et al., 2012; Sherbet, 1989; Zouaoui et al., 2017). Cependant, malgré les modifications profondes des membranes biologiques dans des conditions pathologiques, les aspects membranaires sont très peu exploités pour des approches thérapeutiques.

Parmi les différents systèmes de vectorisation développés, les systèmes liposomaux sont les plus répandus de par leur facilité de préparation, leur caractère amphiphile qui les rend compatibles à la vectorisation de composés hydrophiles ou hydrophobes, ou encore, leur innocuité en termes de biocompatibilité et biodégradabilité. Les liposomes sont des vésicules lipidiques, constituées d'une ou plusieurs bicouches, et sont généralement recouverts d'un revêtement hydrophile qui leur confère leur stabilité dans la circulation sanguine. Les stratégies de vectorisation ciblée à partir de liposomes reposent le plus souvent sur un couplage avec un fragment protéique, un anticorps ou un ligand, spécifique d'un des éléments surexprimés à la surface des cellules tumorales. En ce sens, les stratégies développées tirent parti des modifications de la composition protéique de la membrane plasmique pour un ciblage spécifique. Certaines stratégies tirent également partie des modifications de la composition glucidique, *via* un couplage des liposomes avec des fragments de lectines. En revanche, les modifications de la composition lipidique et des propriétés physicochimiques de la membrane plasmique sont encore à ce jour très largement sous-exploitées.

### 2.1 Le contexte du projet

En 2011, un article publié par Komizu et al dans ACS Medicinal Chemistry Letters montre que des liposomes hybrides (constitués de 90 % DMPC et 10 % éthers de polyoxyéthylene dodécyle) inhibent la croissance des cellules tumorales. Cet effet est corrélaté à la fluidité de la membrane plasmique des cellules, mesurée par dépolarisation de fluorescence en utilisant le 1,6-diphényl-1,3,5-hexatriène (DPH) (Komizu et al. 2011). L'activité antitumorale des
liposomes hybrides passe par l'induction de l'apoptose *via* l'activation de la Caspase 3 (Ueoka et al. 2011). Des études ultérieures ont confirmé ces résultats, apportant des données expérimentales qui montrent que les liposomes hybrides sont capables de discriminer entre les cellules de carcinome hépatiques, avec des membranes plus fluides, et les hépatocytes normaux (Komizu, Ueoka, and Ueoka 2012). Des effets thérapeutiques ont été obtenus également sur un modèle murin et chez les patients atteints de lymphomes (Ueoka et al. 2011). Ces résultats ouvrent la voie d'un ciblage cellulaire/tumoral basé sur les propriétés biophysiques des membranes.

D'autre part, le dr. Thierry Granjon, en collaboration avec le Dr. David Gueyrard et le prof. Peter Goekdjian, a mis au point dans l'institut une sonde (le Dioll) capable de mesurer de manière simple la fluidité membranaire à la fois sur des systèmes modèles (liposomes, nanoemulsions) et sur des membranes cellulaires (Cheniour et al. 2016).

Jusqu'à présent, le Laurdan (6-lauroyl-2-dimethylaminonaphtalene) est probablement la sonde la plus utilisée pour étudier la fluidité membranaire dans des assemblages biomimétiques, du fait de sa grande sensibilité à la polarité de son environnement. Cette molécule associe un noyau naphtalène, doté d'un rendement quantique de fluorescence élevé, à une chaîne alkyle lui permettant une bonne insertion dans la membrane (Figure 38). La tête polaire de la sonde se place à l'interface entre les chaînes acyles et les groupements phosphates des phospholipides au niveau de la chaîne glycérol (Jurkiewicz et al. 2012). Le Laurdan présente cependant plusieurs désavantages qui limitent son utilisation *in vivo*. Il est peu soluble dans un milieu aqueux, a une tendance à précipiter, sa fluorescence est relativement faible avec une forte tendance au photoblanchiment. Pour cette raison, la plupart des études *in cellulo* utilisent un système de microscopie biphotonique. De plus, le Laurdan marque, en plus des membranes, les gouttelettes lipidiques, ce qui entraine des artefacts dans l'évaluation de la fluidité des membranes cellulaires.

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 38:** Structures chimiques du Laurdan et Dioll.</figcaption></figure>
L'analogue du Laurdan, la sonde Dioll reprend la même structure globale, avec une différence majeure: un groupement méthyle de la tête "polaire" est remplacé par un isopropandiol, ce qui rend la molécule plus hydrophile sans ajout de charge supplémentaire (Figure 38). Ceci lui confère une meilleure solubilité dans des milieux aqueux et une intensité d'émission de fluorescence plus importante.

Comme son analogue plus connu, le Dioll s'insère dans les bicouches lipidiques, probablement au niveau de la chaîne glycérol (représentée schématiquement en Figure 39A) et sa fluorescence est très sensible à la polarité de l'environnement, qui influe sur la relaxation vibrationnelle de la molécule. Comme c'est le cas de toutes les molécules fluorescentes, après absorption d'un photon excitateur, le fluorophore subit des phénomènes de relaxation vibrationnelle, correspondant le plus souvent à une dissipation d'énergie dans le milieu par interaction avec les molécules de solvant. Par conséquent, le photon réémis sous forme de fluorescence a une énergie plus basse que celle du photon excitateur et, par conséquent, une longueur d'onde d'émission plus élevée. Lorsque le Dioll est inséré dans une membrane fluide, la longueur d'onde du maximum d'émission est de 490 nm (Figure 39B) pour une excitation à 390 nm. En revanche, quand la sonde est insérée dans une membrane rigide, le manque de mobilité des molécules dans la membrane réduit l'accessibilité de la sonde au solvant, ce qui atténue la relaxation vibrationnelle (Figure 39C). Le photon d'émission lorsque la sonde se situe dans une membrane rigide a donc une énergie plus élevée que celui émis dans le cas d'une membrane fluide, ce qui se traduit par une longueur d'onde d'émission de fluorescence plus faible (440 nm). Ainsi, en fonction de l'état physique de la membrane, on observe une inversion de l'intensité des pics d'émission (Figure 39D): le rapport I<sub>440nm</sub> / I<sub>490nm</sub> diminue. Dans le cas du Laurdan, on assiste à une perte de rendement assez importante lorsque cette sonde est insérée dans une membrane fluide, alors que cette perte est plus limitée dans le cas du Dioll. A partir des spectres d'émission obtenus, un paramètre qui permet de donner une estimation quantitative de la fluidité membranaire peut être calculé: il s'agit de la polarisation généralisée (GP) (Parasassi et al. 1991). Le paramètre GP est calculé à partir des intensités des pics d'émission de fluorescence obtenus pour chaque état de la membrane, selon la formule suivante :

$$GP = \frac{I_{gel} - I_{cl}}{I_{gel} + I_{cl}}$$

I<sub>gel</sub> et I<sub>cl</sub> correspondent respectivement aux intensités maximales de fluorescence en phase gel (I<sub>gel</sub>) et en phase cristal-liquide (I<sub>cl</sub>). Selon la formule présentée ci-dessus, plus la valeur du paramètre GP est élevée, plus les lipides qui constituent la membrane adoptent une
conformation ordonnée et plus la fluidité de la membrane diminue. A l'inverse, plus il est faible, plus les lipides adoptent une conformation désordonnée et plus la fluidité membranaire augmente (Parasassi et al. 1998). La figure 39E montre l'évolution du GP en fonction de la température. Le point d'inflexion permet de calculer une température de transition de phase.

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 39:** Fluorescence du Dioll dans les membranes lipidiques. A. Schéma représentant l'insertion du Dioll dans une membrane lipidique de DPPC. B. Phénomènes de relaxation dans une membrane fluide. C. Phénomènes de relaxation dans une membrane rigide. **1** : Excitation ; **2** : Relaxation vibrationnelle ; **3** : Retour à l'état fondamental et émission du photon de fluorescence. D. Spectres du Dioll inséré dans la membrane des liposomes DMPC à plusieurs températures. E. GP obtenu à partir des spectres de la figure D en fonction de la température.</figcaption></figure>

Parmi ses nombreux avantages, le Dioll a la capacité de marquer rapidement l'ensemble des membranes des cellules (Figure 40), ce qui permet de quantifier la fluidité membranaire des différents types membranaires (Figure 41), mais également la fluidité globale de la cellule.
<figure><img src="image_40.png" /></figure>

**Figure 40:** Le Dioll marque l'ensemble des membranes cellulaires. Tests de colocalisation avec des marqueurs membranaires (DiI), du réticulum endoplasmique (ER Tracker), de la mitochondrie (Mito Tracker) et du noyau (Hoechst).

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

**Figure 41:** Cellules mammaires épithéliales (HMEC), marquées par Dioll. A. La membrane plasmique, plus rigide présente une coloration différente de la membrane des organelles. B. Mesure du GP réalisée au niveau des différentes membranes par traitement d'image.
Nous avons donc décidé d'utiliser cette sonde afin de mesurer des variations de la fluidité des membranes des cellules tumorales et d'utiliser les modifications des propriétés membranaires comme facteur de ciblage par des liposomes de composition modulable. En effet, en adaptant la longueur de la chaîne lipidique et l'insaturation des phospholipides constituant les membranes liposomales, il est possible d'ajuster leur fluidité pour correspondre à celle de la membrane cible, et favoriser de façon spécifique la fusion du liposome avec la membrane plasmique de la cellule cancéreuse.

## 2.2 Ciblages des cellules tumorales: avec ou sans anticorps ?

Les premiers tests de fusion entre des liposomes de fluidité similaire, en absence de cellules, n'ont pas été concluants: quelle que soit la composition des liposomes, l'efficacité de la fusion, déclenchée à l'aide d'un peptide fusogène et évaluée par FRET, n'est pas significativement différente selon le type de liposomes testés.

Lors du stage de M2 de Meriem Chadli (sept-juin 2014), nous avons décidé d'ajouter un autre élément de reconnaissance. Sur la base d'une littérature assez abondante à l'époque, nous avons décidé de greffer un fragment d'anticorps anti-EGFR à la surface des liposomes par une réaction entre un groupement thiol présent sur le fragment d'anticorps obtenu par fragmentation par protéolyse ménagée, et un lipide possédant une tête maléimide intégré dans les liposomes (Figure 42). L'EGFR est un récepteur membranaire surexprimé à la surface des cellules cancéreuses dans de nombreux types de tumeurs solides et faisant l'objet d'un intérêt accru en recherche fondamentale et industrielle.

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 42:** Réaction de greffage du fragment Fab' de l'anticorps anti-EGFR au groupement maléimide présent sur la tête amine de la PE. Ce dérivé est intégré au sein des liposomes.</figcaption></figure>
Après préparation des immunoliposomes, nous avons analysé par deux méthodes différentes leur interaction avec la cible, le fragment extracellulaire de récepteur à l'EGF, soit par un test d'immunodétection de type ELISA, soit par un test en SPRi en utilisant une bicouche supportée découplée du support.

Le premier test consiste à mesurer l'interaction entre l'EGFR et les immunoliposomes sur une plaque de 96 puits (Figure 43). L'EGFR a été fixé par le biais de son étiquette « strep-tag » à la streptavidine adsorbée au fond des puits. L'immunoliposome a été rendu fluorescent par intégration du Dioll dans la bicouche lipidique. L'intensité de fluorescence à 490 nm a été mesurée pour une λexc de 390 nm. Un contrôle sans EGFR a été effectué pour s'assurer de la spécificité de reconnaissance des immunoliposomes.

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>**Figure 43** : Test d'immunodétection révélée par mesure de l'intensité de fluorescence du Dioll intégré dans les LUVs pour la détection de l'interaction entre immunoliposomes et EGFR - En rouge, présence d'EGFR dans les puits; en rose, absence d'EGFR dans les puits.</figcaption></figure>

Une différence significative entre l'intensité de fluorescence mesurée en présence ou en absence d'EGFR a été observée, avec une augmentation mesurée de 22 % de l'intensité de fluorescence en présence d'EGFR (Figure 43). Ce résultat est en faveur d'une reconnaissance spécifique de l'EGFR par les immunoliposomes dont il est la cible.

Un deuxième test mis au point implique la formation préalable d'une bicouche phospholipidique
supportée à la surface d'un prisme SPRi. Cette bicouche est formée sur une surface préalablement recouverte de streptavidine et contient un lipide biotinylé. Le fragment extracellulaire du récepteur à l'EGFR se fixe sur la bicouche, mimant la situation physiologique dans laquelle le récepteur traverse la membrane et expose son exodomaine à l'extérieur de la cellule. Les liposomes peuvent ensuite interagir avec ce récepteur (Figure 44).

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 44:** Formation de la bicouche modèle exposant le fragment de l'EGFR</figcaption></figure>

Cependant, le rendement de greffage, le coût des anticorps et les faibles différences d'interaction entre les liposomes greffés ou non et le récepteur nous ont fait abandonner cette voie.

Meriem Chadli a poursuivi la mise au point des systèmes biomimétiques d'analyse des interactions molécules membranes en thèse Cifre (Dir thèse Agnès Girard-Egrot) en collaboration avec l'entreprise Synthelis (2015-2018). Elle a notamment continué la mise au point d'un mode de formation de bicouches supportées innovant, initié par le prof Agnès Girard-Egrot (ref brevet), en y intégrant des récepteurs transmembranaires (Chadli et al. 2018, 2017). Ces travaux font partie d'un axe important d'étude du groupe "Membranes Biomimétiques" de l'équipe GEMBAS, auquel je participe activement et qui seront décrits plus loin.

Cette approche, le greffage des anticorps sur des liposomes, sera adoptée à nouveau en 2021, lors de la thèse Cifre d'Anna Bérot (Dir. thèse Thierry Granjon), en collaboration avec l'entreprise Covalab. Le greffage des fragments d'anticorps sur les liposomes sera réalisé en utilisant une technologie brevetée par Covalab, ce que, nous l'espérons, va améliorer le rendement de greffage. Cependant, le but de cette thèse n'est pas de favoriser la fusion avec les membranes, mais au contraire, de délivrer une molécule fluorescente au niveau des endosomes, afin d'obtenir des exosomes fluorescents. Dans le cadre de ce projet de thèse, je participe à la mise au point de conditions de marquage et de purification des exosomes.
## 2.3 Premiers test d'interaction liposomes-cellules

L'arrivée dans l'institut du Dr. Leyre Brizuela-Madrid nous a permis de donner une autre dimension au projet et d'analyser les capacités d'interaction des liposomes-vecteurs avec les membranes de cellules en culture. Le Dr Brizuela-Madrid nous a proposé un modèle de cancer de la prostate. Nous avons tout d'abord comparé deux types cellulaires : PC-3 (lignée cellulaire de cancer de prostate métastasique, obtenue à partir d'une métastase osseuse d'un adénocarcinome prostatique de grade IV) et WPMY-1 (lignée cellulaire obtenue à partir de (myo)fibroblastes et de cellules épithéliales issues du stroma de la prostate; elle sert de contrôle mimant le tissu prostatique sain) (stage M2 de Julien Bompard, janv-juin 2017). M Bompard a continué ces analyses lors de sa thèse (2017-2020). Nous avons élargi cette étude avec deux autres lignées tumorales les LNCaP et les C4-2B, la première correspondant à une métastase issue d'un cancer de la prostate localisée dans un ganglion lymphatique supraclaviculaire, la seconde créée par inoculation chez une souris de cellules LNCaP et de fibroblastes issus d'un ostéosarcome, suivie d'une castration des souris pour induire une indépendance aux hormones.
Les cellules ainsi créées forment des métastases osseuses.

Les 4 lignées tumorales présentent donc des degrés d'agressivité différents, schématisés dans la figure 45.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 45.** Lignées utilisées de cancer de la prostate.</figcaption></figure>

Des travaux portant sur deux des lignées prostatiques utilisées (WPMY-1 et PC-3) avaient été réalisés dans le cadre de la thèse de Jihen ZOUAOUI (Dir Thèse Thierry Granjon, 2015-2018) et avaient montré, par le biais de méthodes rhéologiques, que la membrane des cellules tumorales PC-3 était plus souple et plus déformable que celle des cellules contrôles WPMY-1 (Zouaoui et al. 2017). Ces résultats vont dans le sens d'une plus grande fluidité des membranes des cellules tumorales plus fluide que celles des cellules non-tumorales.

Nous avons préparé une gamme de six compositions liposomales, en faisant varier la taille et la saturation des chaînes acyles des molécules de PC. Nous avons rendu ces liposomes fusogéniques en ajoutant dans la composition un lipide, la dioléoyl-phosphatidyl-éthanolamine
(DOPE). Grâce à sa forme conique, ce phospholipide a la propensité de former des phase hexagonales inversées ($H_{II}$) (Israelachvili, Mitchell, and Ninham 1976) dans les membranes (Figure 46, haut). Ces structures contribuent à la stabilisation d'intermédiaires de fusion entre les membranes, ce qui facilite les processus de fusion (Figure 46, bas). Ce lipide représente 20 % de la composition des liposomes détaillés dans le tableau 2.

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

**Figure 45:** Rôle structural de la DOPE : formation de phases $H_{II}$ et rôle dans la fusion membranaire. Haut: ce lipide présente une géométrie conique qui lui permet de s'associer dans des structures de type héxagonale inversée. Bas: ces structures sont décrites comme des intermédiaires de fusion entre deux membranes.
<table><caption>**Tableau 2:** Composition des liposomes utilisés dans les tests de vectorisation. Selon les conditions expérimentales, les liposomes peuvent également contenir un lipide fluorescent, du Diol ou le principe actif.</caption><thead><tr><th>Noms de liposomes</th><th>Lipides</th><th>Chaînes acyles</th><th>Structure</th><th>Tm</th></tr></thead><tbody><tr><td>DL</td><td>1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine 80 %</td><td>18:2 (Cis) PC</td><td>[Structure de DL]</td><td>-57°C</td></tr><tr><td>DO</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>18:1 (Δ9-Cis) PC</td><td>[Structure de DO]</td><td>-17°C</td></tr><tr><td>PO</td><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine</td><td>16:0-18:1 PC</td><td>[Structure de PO]</td><td>-4°C</td></tr><tr><td>DM</td><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>14:0 PC</td><td>[Structure de DM]</td><td>24°C</td></tr><tr><td>DP</td><td>1,2-dipalmitoyl-glycero-3-phosphocholine</td><td>16:0 PC</td><td>[Structure de DP]</td><td>41°C</td></tr><tr><td>DS</td><td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>18:0 PC</td><td>[Structure de DS]</td><td>55°C</td></tr><tr><td>Toutes les préparations</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine 20 %</td><td>18:1 (Δ9-Cis) PE</td><td>[Structure de DS]</td><td>-16°C</td></tr></tbody></table>
Les liposomes préparés ont été caractérisés en termes de taille et de polydispersité par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Figure 47A) et par microscopie électronique à transmission cryogénique (cryo-TEM), en collaboration avec le Dr Giovanna Lollo de l'équipe GePharm du LAGEPP. Nous avons obtenu des préparations de taille homogène, située autour de 125 nm avec un indice de polydispersité (PdI) inférieur à 0,2, à l'exception de la préparation la plus rigide, DS, où une population de vésicules agrégées est présente, en plus de celle présentant une taille de 125 nm. Les liposomes sont stables sur plusieurs mois à 4°C.

La fluidité membranaire a été évaluée à l'aide de la sonde Dioll (Figure 47B et C).

Une gamme de fluidité membranaire assez large a été obtenue, allant de liposomes très rigides de type DS avec une valeur de GP de 0,5 jusqu'aux liposomes de type DL avec un GP de -0,33.

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>**Figure 47:** Caractérisation des liposomes utilisés comme vecteurs: A. Diamètre moyen et PDI sur 4 semaines. B. Spectres du Dioll inséré dans la membrane à 37°C (ex. 390 nm). C. GP calculé à partir des spectres à 37°C. Les barres d'erreurs représentent l'écart type de 3 mesures sur 3 préparations liposomales différentes.</figcaption></figure>

L'interaction liposome-membrane a été évaluée par microscopie de fluorescence, à l'aide d'un
marqueur fluorescent intégré dans la membrane des liposomes, la NBD-PE ou la Rhodamine-PE. Lorsque les liposomes sont internalisés, les cellules deviennent fluorescentes (Figure 48A). Cette fluorescence peut être quantifiée par un traitement d'image (Figure 48B). Nous avons obtenu un résultat très intéressant avec un ciblage spécifique des lignes tumorales par les liposomes PO, DO et, spécifiquement, par DL, dans le cas des PC-3, et par DM, dans le cas des LNCaP et C4-2B. Inversement, les liposomes de type DS rigides à 37°C interagissent uniquement avec la lignée non tumorale WPMY-1.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 48** : Interaction des liposomes de fluidité croissante avec les cellules de prostate non-tumorales (WPMY-1) et tumorales (LNCaP, C4-2B et PC-3). a. Profil de fluorescence après incubation des cellules avec des liposomes fluorescents marqués à la NBD-PE b. Quantification de l'intensité de fluorescence au niveau des cellules par traitement d'image.</figcaption></figure>

Les résultats indiquent une distribution du fluorophore au niveau de la membrane cellulaire. La présence de NBD-PE au niveau de la membrane plasmique indique soit l'adsorption des
liposomes fluorescents à la surface de la cellule, soit son intégration dans la membrane cellulaire après fusion des liposomes avec cette dernière. Pour discriminer entre ces deux types d'interaction, nous avons encapsulé un fluorophore hydrosoluble, la calcéine, dans les liposomes. Après incubation des liposomes avec les cellules, ce fluorophore est distribué diffuse dans la cellule de manière. Cette observation est en faveur du relargage du fluorophore dans le cytoplasme, donc d'un processus de fusion membranaire, plutôt que d'une adhésion des liposomes à la surface de la membrane plasmique (Figure 49).

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 49:** Distribution des flurophores dans la cellule. La distribution du fluorophore membranaire sur la membrane cellulaire (gauche) et du fluorophore soluble dans le cytosol (droite) indique un mécanisme de fusion entre la membrane du liposome et celle de la cellule. Expériences réalisées avec des cellules PC-3 et des liposomes PO.</figcaption></figure>

Nous pouvons conclure que la composition lipidique des liposomes a un impact direct sur leur interaction avec la membrane cellulaire. Le paramètre modifié par les variations de composition lipidique est la fluidité membranaire des liposomes, qui est donc responsable de cette différence d'interaction. En effet, seules la longueur et la saturation des chaînes varient dans la gamme de composition lipidique ; la nature de la partie polaire est identique de par tous les liposomes. Cette hypothèse est étayée par trois publications indépendantes, qui montrent toutes une influence de la composition lipidique sur l'interaction membrane-membrane (Abumanhal-Masarweh et al. 2019; Carradori et al. 2018; Takechi-Haraya et al. 2016). Une telle approche constitue une alternative aux stratégies habituelles de vectorisation ciblée, en proposant une solution à moindre coût et facilement modulable, basée sur la composition lipidique plutôt que sur un greffage protéique coûteux. De surcroit, cette approche permet une internalisation par
fusion membranaire plutôt que par endocytose, évitant ainsi la dégradation endosomale des composés actifs. L'ensemble de ces résultats a été publié dans Langmuir et disponible en annexe 10.

https://doi.org/10.1021/acs.langmuir.0c00262

## 2.4 Encapsulation d'un principe actif dans les liposomes de fluidité membranaire variable

Ces premiers résultats nous ont encouragés à poursuivre dans cette voie de ciblage basée sur la fluidité membranaire en encapsulant un principe actif dans les liposomes. Ceci a été le but de deux stages M2 recherche (Xiaoyi Wang, janv-juillet 2020 et Ariana Abawi janv-juillet 2021) et d'un stage ingénieur 4ème année de l'INSA (Anna Bérot, avril-juillet 2019) que j'ai encadré. Tout d'abord, nous nous sommes intéressés aux différents types de molécules anti-tumorales pouvant être encapsulées dans les liposomes. Lors de son stage de M2 (janv-juin 2020), réalisé pendant la période de confinement, Xiaoyi Wang a effectué une recherche bibliographique pour identifier des molécules anti-tumorales efficaces sur des lignées cancéreuses en culture utilisées au laboratoire. Différents candidats ont alors été envisagés (Tableau 3). Ils incluent à la fois des anti-tumoraux connus tels que le paclitaxel, le docétaxel ou la vincristine, des molécules dont des études plus récentes ont prouvé leur efficacité contre les cancers du sein et de la prostate, telles que la MonoMéthyl Auristatine E (MMAE) ou la salinomycine, et des molécules dont le potentiel est suggéré mais leur utilisation n'est pas encore validée, telles que les neuroprostanes ou les phytoprostanes (série de molécules mise à disposition par le Dr. Thierry Durand).
<table><caption>**Tableau 3** : Récapitulatif des caractéristiques des 6 candidats médicaments identifiés par recherches bibliographiques. Les valeurs d'IC50 proviennent de la base de données « Genomics of Drug Sensitivity in Cancer » (GDSC).</caption><thead><tr><th></th><th>Définition</th><th>Cancer ciblé</th><th>Mode d'action</th><th>IC50</th><th>Structure</th><th>Affinité pour l'eau</th></tr></thead><tbody><tr><td>Paclitaxel</td><td>Actif naturel extrait de l'écorce de Taxus brevifolia</td><td>-Carcinome ovarien<br>-cancer du sein, de la tête, du cou et du poumon</td><td>-Anti-microtubule : liaison aux 31 dérivés d'acides aminés N-ter de la sous unité bêta-tubuline des microtubules<br>-Microtubules associés à la molécule sont dysfonctionnels et provoquent donc la mort de la cellule</td><td>LNCaP : 0,025 µM<br>PC-3 : 1,573 µM<br>HT-29 : 0,016 µM</td><td></td><td>Hydrophobe</td></tr><tr><td>Docétaxel</td><td>Appartient à la classe des taxanes</td><td>-Carcinome ovarien<br>-Cancer du sein, du poumon, du cou, et de la prostate</td><td>-Même mode d'action que le Paclitaxel</td><td>LNCaP : 0,005 µM<br>PC-3 : 0,067µM<br>HT29 : 0,004 µM</td><td></td><td>Hydrophobe</td></tr><tr><td>Vincristine</td><td>-Un alcaloïde naturel extrait de la Catharanthus roseus et communément appelée pervenche de Madagascar.<br>-Initialement étudiée pour ses propriétés anti-diabétiques</td><td></td><td>-Se lie aux tubulines et inhibe la polymérisation des microtubules du fuseau mitotique entrainant la suppression de la mitose.</td><td>LNCaP : 0,046µM<br>PC-3 : 0,521 µM<br>HT29 : 0,032 µM</td><td></td><td>Hydrophile</td></tr><tr><td>MMAE</td><td>-Dérivé synthétique de la dolastatine 10<br>-un depsipeptide linéaire composé de 5 acides aminés dérivé avec des chaînes latérales méthyle et méthoxyde substituées</td><td>-Les lymphomes<br>-Cancer du sein, de prostate</td><td>-Inhibe la polymérisation de la tubuline.<br>-Induit le mécanisme de mort cellulaire « catastrophe mitotique »</td><td>LNCaP et PC-3 : 2nM<br>HT-29 : 5nM</td><td></td><td>Hydrophobe</td></tr><tr><td>Salinomycine</td><td>Antibiotique polyéther isolé de Streptomyces album.</td><td>-cancer du sein, de l'ovaire</td><td>-Inhibiteur des cellules souches cancéreuses (CSC)</td><td>LNCaP, PC-3 et HT-29 : 5 µM</td><td></td><td>Hydrophobe</td></tr><tr><td>Neuroprostane</td><td>Analogue de l'isoprostane (deux carbones de plus)</td><td>-cancer du sein</td><td>-Effet anti-prolifératif</td><td>Non déterminé (basé sur des études précédentes au laboratoire : 100 et 200 µM)</td><td></td><td>Hydrophobe</td></tr></tbody></table>
Lors du stage d'Ariana Abawi, nous avons évalué l'efficacité de ces 6 molécules sur 3 lignées cancéreuses : LNCap, PC-3 et HT-29 (lignée cellulaire modèle de cancer du côlon) (Figure 50).

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure 50** : Quantification de la viabilité cellulaire sur 3 lignées tumorales, PC-3 en orange, LNCaP en vert et HT29 en jaune, à l'aide d'un test à la résazurine, 3 jours après le traitement des cellules. Un contrôle sans médicament correspondant à 100% de viabilité a été réalisé.</figcaption></figure>

La sensibilité aux médicaments des différentes lignées cellulaires a été mesurée en utilisant un test de viabilité à la résazurine, 72h après traitement avec les molécules. Les tests ont été réalisés à la concentration correspondant à leur IC50 obtenu dans la littérature (disponibles dans la base de données GDSC), mais aussi à une concentration 2 fois supérieure ou 2 fois inférieure à cette valeur. Cette étude révèle une diminution significative des viabilités cellulaires pour les 3 lignées, avec un pourcentage de viabilité toujours inférieur à 30% pour tous les médicaments sauf pour le neuroprostane, pour lequel nous avons enregistré un pourcentage de viabilité d'environ 40%.

Nous avons donc sélectionné 2 molécules : la MMAE, qui est la molécule qui engendre le taux de viabilité le plus bas à la concentration la plus faible (1 nM) et la vincristine, une molécule hydrophile, agissant également à une faible concentration (environ 16 nM).

La MMAE est un des principaux composants cytotoxiques des assemblages nommés « conjugués anticorps-médicaments » ou « Antibody-Drug Conjugates » an anglais (ADC). Elle est notamment utilisée, en tant qu'ADC, pour traiter des cancers tels que le lymphome (Francisco et al., 2003) ou le cancer du sein (Yardley et al., 2015). Cependant, l'utilisation des ADC présente des limites liées à l'hydrophobicité, l'inhomogénéité et au faible rapport
médicament/anticorps (DAR « Drug to Antibody Ratio ») des conjugués. Plus le DAR est élevé, plus le nombre de cargaisons de médicaments fortement hydrophobes est grand, ce qui augmente en parallèle l'hydrophobicité globale du conjugué.

Pour résoudre ce problème, l'équipe du Prof. Benoit Joseph à l'ICBMS a associé la polysarcosine (PSAR) à l'ADC. Cette molécule rend l'ensemble plus hydrophile et plus efficace (Viricel et al., 2019). L'équipe SMITH et la start-up "Mablink" nous ont donc fourni une construction incluant le module PSAR, initialement destinée à être greffée sur un anticorps, que nous avons greffé sur la tête thioéthanol d'un lipide incorporé par la suite dans la bicouche du liposome. Cette construction a été réalisée par Anna Bérot et le Dr Waren Viricel (Mablink).

La construction globale, présentée en figure 51 et appelée par la suite DPPT-MMAE, inclut la MMAE comme puissante cytotoxine, une gâchette glucuronide (hydrolysable *in vivo* par des enzymes de l'environnement tumoral), un agent de liaison auto-immolatif, une tête de bioconjugaison auto-hydrolysable à base de maléimide et une unité PSAR décrite précédemment (Figure 51).

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure 51:** Structure de la DPPT-MMAE réalisée pour cette étude et intégrée dans des liposomes de fluidité variable (79,96% de PC (POPC, DSPC, DMPC ou DPPC), 20% de DOPE et 0,04% de DPPT-MMAE).</figcaption></figure>

La construction DPPT-MMAE a été intégrée dans la composition de 4 types de liposomes DS, DP, DM, PO, de fluidité membranaire variable, avec un rapport molaire lipide/médicament de
2500 :1 (Figure 51).

Nous avons mesuré la taille de ces liposomes, leur charge de surface (le potentiel Zeta) et leur fluidité membranaire. En comparaison avec les préparations sans MMAE, les liposomes-MMAE sont plus gros. Toutes les préparations de liposomes ont un potentiel Zeta négatif compris entre -15 mV et -25 mV, à l'exception de DP-MMAE (-45 mV). Le DPPC a les mêmes chaînes acyles que le dérivé DPPT-MMAE. Nous pouvons émettre l'hypothèse que l'orientation différente de la tête polaire en présence du dérivé induit un changement de la charge de surface. La distribution de la taille et du PdI des échantillons est stable sur une période de 12 semaines. Seul l'échantillon DS-MMAE est sujet à des phénomènes d'agrégation au cours du temps. Tous ces résultats sont encourageants car ils indiquent que les liposomes MMAE pourraient être utilisés comme vecteurs de médicaments.

Comme notre étude repose sur l'interaction des liposomes avec des lignées cancéreuses selon le paramètre de fluidité membranaire, nous avons mesuré l'effet du dérivé MMAE sur la fluidité des membranes liposomales pour les 4 échantillons préparés, en utilisant le Dioll. A 37°C, nous obtenons une échelle de fluidité variant entre -0,16 et -0,12 pour les membranes des PO-MMAE et DM-MMAE et -0,05 et 0,13 pour DP et DS-MMAE.

Les valeurs de GP sont inférieures à celles obtenues pour les liposomes dépourvus de MMAE. Cette différence peut s'expliquer par la présence de la tête volumineuse du dérivé DPPT-MMAE, qui gêne l'organisation de la bicouche et augmente ainsi la mobilité du solvant au voisinage du fluorophore. Ceci dit, ce résultat confirme que le dérivé MMAE a été intégré avec succès dans la membrane liposomale.

Nous avons effectué les tests de vectorisation sur des lignées cellulaires de cancer de la prostate, LNCaP et PC-3. En parallèle, une lignée de fibroblastes a été utilisée comme contrôle non tumoral.

Nous avons tout d'abord vérifié l'effet inhibiteur de la DPPT-MMAE libre (concentration finale à 100 nM) dans du DMSO vis-à-vis des 3 lignées NIH-3T3, PC-3 et LNCaP. Les résultats montrent que la viabilité a globalement diminué pour les 3 lignées cellulaires testées, mais une importante variabilité entre les dosages a été observée, ainsi qu'une action sur la lignée contrôle.

En revanche, les liposomes PO-MMAE ont montré une efficacité réduite sur les fibroblastes, mais un fort effet sur les lignées cellulaires tumorales, avec une diminution de plus de 60% de la viabilité cellulaire pour LNCaP et de plus de 50%, pour PC-3. Les liposomes DP et DS-MMAE ont peu ou pas d'effet sur les lignées tumorales, mais affectent la viabilité des
fibroblastes (Figure 52A). Les liposomes DM ont peu d'effet sur la viabilité des trois lignées. Ces résultats corroborent ceux de Julien Bompard : les liposomes aux membranes fluides fusionnent plus facilement avec celles des cellules cancéreuses.

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

**Figure 52:** Sélectivité des liposomes MMAE vis-à-vis des fibroblastes et des lignées cellulaires tumorales. (A) : les liposomes PO, DM, DP et DS-MMAE ont été incubés avec des lignées cellulaires NIH-3T3, LNCaP et PC-3, et la viabilité a été mesurée en utilisant le test à la résazurine. *** p < 0.001, ** p < 0.01 et * p < 0.05, test Student. (B) : diminution de la viabilité des cellules tumorales PC-3 et LNCaP mais pas de celle des cellules NIH-3T3 en présence de PO-MMAE.

En ciblant les cellules tumorales et en ayant peu d'effet sur les lignées fibroblastiques, les liposomes PO-MMAE sont donc des vecteurs intéressants (Figure 52B). Ces résultats ont été publiés récemment dans un numéro spécial du International Journal of Molecular Science, "Nanostructures Applied to Drug Delivery and Diagnosis", disponible en annexe 11.

https://doi.org/10.3390/ijms22084103

Cependant, la construction DPPT-MMAE, même si intéressante d'un point de vue théorique, est relativement compliquée à mettre en œuvre car la synthèse est complexe et la molécule n'est pas disponible commercialement. Nous nous sommes alors intéressés à un autre médicament, la vincristine, commercialement disponible, peu onéreuse et efficace à des concentrations de l'ordre du nM. La vincristine a été initialement étudiée pour ses propriétés antidiabétiques. Le mécanisme de son activité anti-tumorale réside dans l'inhibition de la polymérisation des microtubules du fuseau mitotique entraînant la suppression de la mitose. Cependant, certains points tels que son taux de clairance rapide et sa neurotoxicité dose-dépendante limitent son potentiel d'utilisation. Une des solutions est son encapsulation dans des liposomes conventionnels dont une préparation est déjà utilisée en clinique (Marqibo®).
Nous avons donc encapsulé la vincristine dans le cœur hydrophile des liposomes par une méthode de gradient de pH (Mayer et al. 1990), dans le but de rendre la membrane imperméable et emprisonner la vincristine. Ce projet de vectorisation de la vincristine fait partie de la thèse d'Ariana Abawi, commencée en octobre 2021.

## 2.5 Le mécanisme de ciblage basé sur la fluidité membranaire est-il un mécanisme plus général?

D'autres lignées cellulaires que celles déjà utilisées i.e. du cancer du côlon, du poumon, de la prostate et du sein (disponibles dans l'équipe ou dans l'équipe du Dr. Arnaud Vigneron, CRCL), seront testées, afin de vérifier s'il existe une corrélation entre la fluidité membranaire des liposomes et celle des cellules cibles. Ce paramètre sera systématiquement quantifié à l'aide du Dioll. Cette mesure permettra d'obtenir une valeur chiffrée de la fluidité qui permettra en retour un ajustement fin des propriétés des membranes liposomales à celles des cellules ciblées. Ces mesures seront faites durant la thèse d'Ariana Abawi, en collaboration avec le Dr. Thierry Granjon, équipe LCO2, ICBMS.

## 2.6 Vers des méthodes d'analyse moins invasives: corrélation fluidité liposomes / vésicules extracellulaires de type exosomes

Les exosomes sont des vésicules extracellulaires (EV) libérées par les cellules dans des situations physiologiques et/ou pathologiques. Ils sont constitués d'une membrane phospholipidique, de protéines et d'acides ribonucléiques. L'étude des exosomes connaît actuellement un vrai essor car les tumeurs secrètent des quantités importantes de vésicules extracellulaires et on leur attribue un rôle dans la formation des métastases. De par leur taille et leur composition, ils s'apparentent aux liposomes, ce qui explique mon intérêt pour ces particules.

Cet axe de recherche fait partie d'un projet plus ample, concernant l'utilisation du Dioll à buts diagnostique et pronostique, financé d'abord par le CNRS dans le cadre d'un programme de pré-maturation, par la SATT Pulsalys (maturation), et actuellement par la région Rhône-Alpes-Auvergne *via* un financement PAR. Le projet dans sa globalité s'articule autour de 3 objectifs successifs : 1) établir une relation entre la perte d'identité cellulaire et l'agressivité des tumeurs, puis 2) entre l'agressivité et la fluidité membranaire, et 3) utiliser les vésicules extracellulaires (EV) comme marqueur de cette agressivité dans un but pronostique. Les EV présentent des
avantages majeurs par rapport à l'analyse de biopsies ou de tumeurs *in situ* puisqu'elles sont facilement accessibles dans les fluides corporels, qu'elles sont exemptes des contraintes mécaniques et environnementales et qu'elles représentent mieux la diversité phénotypique totale d'une tumeur (Théry 2015). Nous avons déjà montré sur des lignées cellulaires (brevet déposé n° 19306175.1) que les EV ont un signal de fluidité qui dépend de l'état physiopathologique de la cellule.

Par conséquent, une corrélation entre la fluidité membranaire des exosomes/EV, issues de la tumeur et plus accessibles que les biopsies, et celle des liposomes ciblant la tumeur représenterait une avancée thérapeutique importante.

De façon générale, les méthodes de purifications des EV ne font pas consensus et il n'existe pas à ce jour de moyens simples pour discriminer les EV issues de la tumeur de celles issues du reste de l'organisme. Mon rôle dans le cadre de ce projet est de participer à la mise en place de méthodes de purification et de caractérisation des EV, impliquant un ciblage des cellules tumorale et le marquage des exosomes tumoraux. Ce projet fait partie du projet de thèse Cifre d'Anna Bérot, en collaboration avec l'entreprise Covalab et l'équipe LCO2, avec comme premier but de valider et de développer un outil capable d'extraire les EV de petite taille, les exosomes, basé sur l'utilisation d'anticorps préparés par la société Covalab et des techniques d'immunoprécipitation séquentielle, afin d'obtenir des échantillons de grande qualité permettant par la suite une meilleure caractérisation de ces EV, et d'analyser leur fluidité membranaire.

En parallèle, nous avons commencé à définir les modalités permettant d'analyser de façon optimale la fluidité des vésicules extracellulaires excrétées par les cellules. De par la petitesse des vésicules analysées, les marquages basés sur l'expression de protéines de surface ne peuvent suffire à l'obtention d'un signal de fluorescence capable de détecter ces vésicules extracellulaires. Nous avons pu montrer qu'à l'inverse, le Dioll s'insérant en grande quantité dans les membranes et possédant un rendement quantique de fluorescence élevé, permet de détecter les vésicules extracellulaires.
### 3. Comment transformer les résultats prometteurs obtenus in cellulo en un nanovecteur de nouvelle génération efficace prêt à l'utilisation in vivo ?

Malgré leurs avantages et le nombre de formulations actuellement approuvées, les liposomes présentent des contraintes qui limitent leur efficacité. En particulier, les liposomes sont rapidement éliminés du système circulatoire par les macrophages, des cellules du système immunitaire. Leur élimination est due à leur reconnaissance par des opsonines, des protéines qui marquent les éléments extérieurs à l'organisme en s'y adsorbant, favorisant ainsi leur phagocytose par les macrophages (Yan, Scherphof, and Kamps 2005). Pour limiter l'adsorption des opsonines et prolonger la durée de vie des liposomes, la stratégie la plus couramment adoptée est celle de la pégylation, qui consiste en l'enrobage des liposomes par des chaînes de polyéthylèneglycol (PEG) (Suk et al. 2016). On parle alors de liposomes furtifs de par leur capacité à échapper à la reconnaissance du système immunitaire; ce sont les liposomes dits de « deuxième génération » (Figure 53). La pégylation représente également une plateforme pour la fonctionnalisation, en permettant une bonne exposition des ligands spécifiques au bout des chaînes de PEG, pour faciliter les interactions avec les cellules cibles ou permettre le greffage du principe actif. On parle alors de liposomes de troisième ou quatrième génération (Figure 53).

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 53: Représentation schématique de liposomes dits de 1ère, 2ème, 3ème et 4ème génération.</figcaption></figure>

Cependant, plusieurs études récentes ont mis en exergue les limites des stratégies actuelles de vectorisation basées sur des liposomes (Verhoef and Anchordoquy 2013). En particulier, la pégylation peut, dans certains cas, réduire leur durée de vie dans le système circulatoire,
modifier leur mode d'interaction avec leur cible, voire même déclencher une réponse immunogène spécifique du à la pégylation des liposomes (Thi et al. 2020).

En particulier, l'enrobage des liposomes d'un revêtement hydrophile pourrait limiter les phénomènes de fusion des liposomes avec la membrane de la cellule cible que nous cherchons à mettre en place. Nous avons ainsi cherché des stratégies alternatives à la pégylation. Parmi celles décrites dans la littérature, nous pouvons citer la protection des liposomes eux-mêmes dans des films biodégradables, des échafaudages ou des hydrogels (Mufamadi et al. 2011).

Une stratégie adoptée lors d'une collaboration avec le laboratoire chinois Key Lab of Colloid & Surface Science, CAS Institute of Chemistry de Pekin, et le Prof. Jumbai Li a visé à prendre en charge les liposomes eux-mêmes par des transporteurs, tels que des capsules de polyélectrolytes, afin de pallier à leur manque de stabilité dans le sang et de prolonger l'action thérapeutique du principe actif encapsulé. Nous avons ainsi pu encapsuler au cœur de capsules de polyélectrolytes des liposomes incorporant des fluorophores hydrophiles ou membranaires. Tout d'abord, nous avons préparé des matrices poreuses de CaCO₃ que nous avons mis en présence de liposomes. Ces matrices ont ensuite été enrobées de plusieurs couches consécutives de polyelectrolytes, alternant charges positives et charges négatives (Figure 54).

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>**Figure 54:** Représentation schématique de la formation de capsules polyélectrolyte encapsulant des liposomes.</figcaption></figure>

Les liposomes peuvent pénétrer à l'intérieur des pores de la matrice CaCO₃ et la quantité de fluorophore retenue dans les matrices a été estimée à l'aide d'une gamme étalon après dissolution de la matrice par traitement à l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). Nous avons observé l'intégration d'environ 10 % de la quantité de totale de fluorophore dans les matrices et une augmentation de la quantité de fluorophore dans les matrices proportionnelle à la quantité de fluorescéine ajoutée (Figure 55).
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

**Figure 55:** Matrices de CaCO₃ après incubation avec les liposomes contenant de la fluorescéine (A-D) ou de la NBD-PE (E et F). G. Quantification de la fluorescéine chargée dans les matrices sous forme de liposomes. Carrés: % de fluorescéine intégrée dans les matrices, losanges: quantité en ng de fluorescéine intégrée pour 3,8 mg matrice.

Les liposomes intégrés dans les matrices sont intacts, comme le montre la bonne colocalisation de la fluorescéine avec le marqueur membranaire rhodamine-PE (Figure 56) et l'expérience de relargage de la calcéine (Figure 57). Dans ce cas, la calcéine a été encapsulée à une concentration qui induit des phénomènes de quentching de fluorescence à l'intérieur des liposomes. L'ajout de détergent entraîne une libération de la calcéine et une augmentation de l'intensité de fluorescence (Figure 57) lorsque les liposomes sont inclus dans la matrice et lorsque 1 à 2 couches de polyélectolytes enrobent la matrice. Au-delà de 2 couches, le détergent ne peut plus pénétrer dans la capsule.

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

**Figure 56.** La fluorescéine (A) et la Rhodamine-PE (B) intégrées dans les liposomes colocalisent (C) au niveau des matrices CaCO₃. D. Image en lumière transmise de la même matrice.
<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure 57:** Les liposomes intégrés dans les matrices recouvertes par une couche de polyélectrolyte sont intacts. Haut: fluorescence de la calcéine avant (pointillés) et après (trait plein) ajout de triton-X100 (2 %) A. Caléine (20 mM) intégrée dans les liposomes, B. Calcéine en solution, C. Calcéine intégrée dans les liposomes, intégrés à leur tour dans les matrices. La matrice a été préalablement dissoute par l'EDTA. Bas: A. Les matrices intégrant les liposomes chargés de calcéine ont été recouvertes d'un film de polyelectrolyte chargé positivement ou négativement. B. Spectres de la calcéine obtenues avant (pointillés) et après (trait plein) ajout de Triton-X100.</figcaption></figure>

Nous avons donc réussi à encapsuler des liposomes contenant un fluorophore dans des matrices de carbonate et, par la suite, dans des microbilles de polyelectrolyte. Ces liposomes sont bien intacts à l'intérieur de ces particules. Ils pouvent donc être libérés après une dégradation des billes de polyélectrolytes. Cependant, la taille et les phénomènes d'agrégation de ces capsules limiteraient leur utilisation. Pendant le stage IUT de Dave Diamond (échange académique avec le Collège Shawinigan Québec, Canada, mars-juillet 2015), nous avons amélioré le protocole de préparation par traitement aux ultrasons afin de réduire l'agrégation et d'obtenir des particules
de 1 à 3 µm isolées, dont l'utilisation *in vivo* pourrait être envisagée. Ces résultats ont fait le sujet d'une publication disponible en annexe 12.

https://doi.org/10.3109/08982104.2014.950275

Plusieurs études ont montré qu'en fonction de la composition et des caractéristiques des liposomes, certaines préparations liposomales non-pegylées sont stables et présentent des temps de circulation assez longs.

Par exemple, en 2001, les liposomes Myocet (PC et Cholestérol en rapport molaire 55:45), encapsulant de la doxorubicine, ont été mis sur le marché, en association avec du cyclophosphamide, pour le traitement du cancer du sein métastatique de la femme adulte. Cependant, cette préparation a été retirée du marché en 2018 car elle ne présentait pas assez d'avantages par rapport aux hormonothérapies ou aux thérapies ciblées anti-HER2, ou à l'administration conventionnelle des anthracyclines (doxorubicine et épirubicine) dont la toxicité cardiaque est moins limitante du fait de l'évolution des protocoles de chimiothérapie.

En 2012, les liposomes Marquibo, constitués de SM et de cholestérol (6:4), encapsulant de la vincristine (Acrotech Biopharma, LLC) ont reçu l'approbation de la FDA pour dans le traitement de certaines leucémies et est actuellement disponible pour une utilisation clinique.

La fluidité de la membrane liposomale semble influencer non seulement la capacité d'interaction avec les cellules cibles mais aussi le comportement des liposomes dans la circulation sanguine. Une étude récente montre qu'en fonction de la température de transition de phase gel-LC du lipide composant les liposomes, donc de sa fluidité à la température de travail, les liposomes injectés chez les poissons zèbre ont des profils de distribution différents (Sieber et al. 2017). Les liposomes fluides à 28°C, température physiologique du poisson, constitués de DOPC et DMPC rentrent dans la circulation du poisson (Figure 58, bas, marquage en rouge des liposomes) et les liposomes rigides restent accrochés aux parois. Les liposomes fluides sont plutôt sphériques (Figure 58 Haut) et les liposomes rigides présentent des formes irrégulières. Les auteurs mettent en relation cette forme irrégulière avec la capacité des protéines/opsonines à s'accrocher au niveau de la bicouche lipidique et à promouvoir l'élimination des liposomes.
<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 58:** Etude de la distribution vasculaire des liposomes de fluidité décroissante injectés dans la veine centrale du poisson zèbre. Haut: images en cryo-microscopie électronique des liposomes et diamètre hydrodynamique moyen. Bas: Distribution des liposomes marqués à la rhodamine dans le poisson. Les cellules du système vasculaire du poisson zèbre exprime une protéine -GFP. (Sieber et al. 2017)</figcaption></figure>

Cette étude est extrêmement intéressante dans la perspective de mon projet de recherche car les liposomes fusogèniques de type PO et DO ont des formes sphériques et pourraient, de la même façon, montrer une circulation sanguine prolongée. Un autre moyen de réduire l'adsorption de protéines à leur surface et d'augmenter le temps de circulation plasmatique des liposomes est de modifier la charge des liposomes. Le but est d'obtenir une particule hydrophile, mais peu chargée, qui pourra échapper aux mécanismes d'élimination rapide dans le sang, tout en gardant ses capacités de fusion sélective avec les membranes tumorales.

Pour envisager l'étude de la stabilité des liposomes dans des liquides biologiques et dans l'organisme, une collaboration forte a été mise en place avec le dr Giovanna Lollo de l'équipe Génie Pharmacotechnique du Laboratoire d'Automatique, de Génie des Procédés et de Génie Pharmaceutique (LAGEPP – UMR 5007). En vue d'une utilisation *in vivo*, la stabilité des liposomes sera étudiée dans des milieux de culture et des fluides biologiques avant d'envisager d'explorer des modèles d'études plus complexes ou l'injection chez le petit animal.
4. Vers des modèles d'étude plus complexes: analyse de la biodistribution et du ciblage
tumoral

Nos collaborateurs du Centre de Recherches en Cancérologie de Lyon, Dr. Samia Ruby et Dr. Arnaud Vigneron, ont mis au point un modèle de tumeur mammaire *in vivo* par développement spontané sous l'influence du gène *c-myc* inductible à la doxycycline. Sous l'influence de cette molécule, les souris développent, dans un premier temps, des tumeurs, puis lors de l'arrêt du traitement à la doxycycline, les tumeurs régressent. Par des mécanismes de remodelage épigénétique entraînant une de perte d'identité cellulaire, des nouvelles tumeurs apparaissent à la suite de cette phase de régression.

Dans le cadre du projet FluiDiPlast, financé par la Région AURA, l'équipe du Dr. Vigneron procèdera à une mesure de la fluidité membranaire des différentes sous-populations des cellules cancéreuses au sein de ces tumeurs et estimera leur capacité à induire de nouvelles tumeurs. En parallèle du projet FluiDiPlast, nous allons vérifier la biodistribution après injection des liposomes marqués (fluorescence ou radioactivité) chez ces souris, estimer leur capacité à atteindre la tumeur et à la marquer. L'efficacité du ciblage sera estimée en fonction des données de fluidité en évaluant la capacité des vecteurs chargés en médicament à diminuer la masse tumorale.

5. Aspects mécanistiques de l'interaction liposomes - membrane

Afin de caractériser l'interaction liposome-membrane et d'évaluer l'impact des changements
de la composition lipidique et des propriétés membranaires sur cette interaction, nous avons
cherché à recréer un modèle d'interaction membranaire biomimétique. L'enjeu de ce projet est
de dissocier les mécanismes cellulaires "actifs", impliqués dans la fusion des liposomes avec la
membrane, des mécanismes "passifs" impliquant les propriétés physicochimiques des deux
membranes en contact, ce qui permettrait de comprendre pourquoi un appariement de chaines
pourrait moduler l'interaction liposome/membrane. Nous souhaitons donc recréer une
membrane à partir des lipides extraits de membranes plasmiques, ce qui mimera, ne serait-ce
que partiellement, la membrane de la cellule cible et analyser la possibilité de la fusion des
liposomes avec ce modèle.

Les bicouches biomimétiques utilisées ont été formées selon une technique développée par le
Prof. Agnès Girard-Egrot, brevetée et caractérisée au cours des thèses de Samuel REBAUD
(Girard-Egrot, Maniti, and Rebaud 2016) et Meriem CHADLI (Chadli et al. 2018, 2017). Cette
méthode, qui permet la formation de bicouches lipidiques attachées et découplées du support,
se distingue par une grande mobilité des lipides au sein de la bicouche grâce à son espacement
vis-à-vis de son support et par une grande flexibilité de composition lipidique. Le protocole
expérimental de formation des bicouches biomimétiques est schématisé **Figure 59**.

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>**Figure 59.** Formation de bicouches biomimétiques supportées sur de pilotis de peptide.</figcaption></figure>

A la surface d'un substrat d'or est ajouté un peptide pilotis dérivé de la lamine (P19-4H), qui s'ancre à la surface. Puis, l'ajout de liposomes enrichis en un lipide à tête chelatrice, le DOGS-NTA(Ni), liant un atome de Nickel, va conduire à l'attachement des liposomes au peptide pilotis. Enfin, l'ajout d'un peptide fusogène conduit à l'ouverture des liposomes et à la formation d'une bicouche lipidique plane reposant au-dessus des pilotis qui assurent son attachement, mais également son découplage au support. La formation de ces bicouches a déjà été caractérisée par imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), par recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) et par microscopie à force atomique (AFM). L'utilisation de protéoliposomes a permis de montrer que ce modèle est adapté à la réinsertion de protéines membranaires complexes, en réalisant une bicouche biomimétique réincorporant la protéine CXCR4 fonctionnelle, un récepteur couplé aux protéines G qui possède sept passages transmembranaires (Chadli et al. 2017).

Dans le cadre de la thèse de Julien Bompard (2017-2020), nous avons mis au point un protocole
de fractionnement cellulaire dans le but d'isoler des fragments de membranes plasmiques. Nous
avons extrait ces lipides et nous avons formé des liposomes "naturels" à partir de ces extraits
(Figure 60) afin de reconstituer, selon le protocole décrit ci-dessus, des bicouches
biomimétiques à partir de membranes naturelles.
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>**Figure 60:** Projet de reconstitution de bicouches supportées biomimétiques à partir de membranes naturelles et d'analyse de l'interaction liposomes/membrane.</figcaption></figure>

Après le fractionnement cellulaire des cellules WPMY-1 et PC-3, sur la base d'un protocole adapté de la littérature (van Blitterswijk et al. 1982) et en collaboration avec le Dr. Saïda MEBAREK (ICBMS - UMR CNRS 5246 - Equipe MEM²) (Figure 61), nous avons cherché des marqueurs spécifiques pouvant faire l'objet des dosages colorimétriques (Figure 62), de chaque fraction récupérée.

<figure><img src="image_61.png" /><figcaption>**Figure 61:** Fractionnement cellulaire: Plusieurs fractions sont obtenues suite à la lyse cellulaire et à des centrifugations différentielles. Le culot 3 correspond aux vésicules issues du réticulum endoplasmique et des membranes plasmiques, qui sont ensuite séparés par centrifugation à haute vitesse (100 000 x g) sur gradient de saccarose.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>**Figure 62:** Marqueurs présents dans les fractions obtenues après fractionnement de cellules WPMY-1 et PC-3). Pour chaque test sont indiqués le ou les organite(s) concerné(s).</figcaption></figure>

Ces tests ont permis de confirmer la présence d'une activité de la phosphatase alcaline dans les fractions issues des microsomes, ce qui montre la présence de membranes plasmiques. Parmi les fractions microsomales, les fractions S1 et S3 contiennent la plus grande quantité de membrane plasmique, mais les fractions S3 contiennent également de l'ADN ainsi qu'une forte activité de la Cytochrome C NADPH Réductase (CR), qui est le marqueur du réticulum endoplasmique. En comparaison, les fractions S1 ne contiennent pas ces éléments et ont donc été collectées (Figure 62, rectangle). Les phospholipides ont été extraits par le protocole de Bligh et Dyer (Bligh and Dyer 1959) et reconstitués dans des liposomes, afin d'être utilisés pour former les bicouches supportées sur les pilotis peptidiques. La formation des bicouches
supportées a été suivie par SPRi et par BALM, une méthode de microscopie optique en temps réel à ultra-haute résolution, développée par le Dr Dominique AUSSERRÉ (IMMM - UMR CNRS 6283). Elle est basée sur l'utilisation de couches anti-réfléchissantes faites de matériaux absorbants, appelées ARA (pour « *Anti Reflecting and made of Absorbing material* »). L'intérêt de ces couches anti réfléchissantes est de générer des interférences destructrices qui permettent d'obtenir l'extinction du signal de fond et, par conséquent, une meilleure résolution des objets observés. Cette technique a été utilisée pendant la thèse de Julien Bompard pour visualiser la formation des bicouches supportées de POPC et le mélange mimant la membrane plasmique (Bompard et al. 2021). A l'échelle globale, par SPRi et par BALM, nous n'avons pas pu obtenir des données montrant la fusion des liposomes et la formation de la bicouche supportée, mais à l'échelle locale, des phénomènes de fusion des liposomes ont pu être observée (Figure 63). Après fixation (cercle pointillé), le liposome semble progressivement s'estomper, sa couleur passant du rouge intense à des tons pâles plus proches du rose. En parallèle, les zones bleues autour du liposome passent elles aussi progressivement à des tons plus proches du rose.

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>**Figure 63:** Cinétique imagée par la BALM de la phase de fixation de liposomes obtenus à partir des lipides naturels sur des peptides pilotis. Les images ont été colorées par la table de conversion ou LUT (pour « *LookUp Table* ») « phase », qui colorie les intensités basses en bleu, les intensités moyennes en blanc et les intensités élevées en rouge.</figcaption></figure>

Ce phénomène s'explique par l'étalement du liposome et est particulièrement fréquent, comme le montre la Figure 64, où de nombreuses tâches rouges s'élargissent et s'éclaircissent en quelques minutes (cercles pointillés noirs). Ces phénomènes sont schématisés en figure 65.
<figure><img src="image_64.png" /></figure>

**Figure 64:** Cinétique imagée par la BALM de la phase de fixation de liposomes constitués de lipides naturels sur des peptides pilotis. Les images ont été colorées par la LUT « phase », qui colorie les intensités basses en bleu, les intensités moyennes en blanc et les intensités élevées en rouge.

<figure><img src="image_65.png" /></figure>

**Figure 65:** Représentation schématique du mécanisme de dépôt de matière lors de la phase d'accrochage des liposomes sur des peptides pilotis.

a. Surface initiale recouverte de peptide pilotis.

b. Adsorption du liposome.

c. Aplatissement progressif du liposome.

d. Formation d'une bicouche.

Ces résultats, bien que préliminaires, montrent que nous pouvons obtenir des extraits lipidiques enrichis en lipides issus de la membrane plasmique et préparer des liposomes, puis des bicouches supportées, à partir de ces extraits. La composition de ces extraits sera analysée par la suite. La formation de bicouches supportées sera suivie et caractérisée par les techniques déjà mises en place pour les bicouches "synthétiques" : SPRi, microscopie de fluorescence