# Impact du profil cytokinique anti-inflammatoire intrafolliculaire sur les résultats en FIV

Sarah Abdul-Baki

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Sarah Abdul-Baki. Impact du profil cytokinique anti-inflammatoire intrafolliculaire sur les résultats en FIV. Médecine humaine et pathologie. 2023. dumas-04346869

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THÈSE

POUR LE DIPLÔME D'ÉTAT DE DOCTEUR EN MÉDECINE

Soutenue publiquement

Le mercredi 11 octobre 2023

Par Madame Abdul-Baki Sarah

Née le 18 septembre 1991 à Libertyville (99)

Impact du profil cytokinique anti-inflammatoire intrafolliculaire
sur les résultats en FIV

Président du Jury : Monsieur le Professeur Henri COPIN

Membres du Jury :
Madame le Professeur Rosalie CABRY-GOUBET
Monsieur le Professeur Saïd KAMEL

Madame le Professeur Hafida KHORSI-CAUET

Directeur de Thèse : Monsieur le Professeur Moncef BEN KHALIFA
REMERCIEMENTS

A Monsieur le Professeur Henri COPIN

Professeur des Universités – Praticien Hospitalier

Histologie-Embryologie-Cytogénétique

Chef du Service de Médecine et Biologie de la Reproduction et CECOS de
Picardie

Pôle « Femme-Couple-Enfant »

Responsable de l'UF de Cytogénétique du Laboratoire de Génétique
Constitutionnelle

Pôle « Biologie, Pharmacie et Santé des Populations »

Chevalier dans l'Ordre des Palmes Académiques

Monsieur le Professeur,

Je vous remercie de me faire l'honneur de présider mon jury de thèse et je vous suis très
reconnaissante de l'intérêt que vous portez à ce travail.

Veuillez croire à l'expression de ma profonde reconnaissance et de mon grand respect.
A Madame le Professeur Rosalie CABRY-GOUBET

Professeur des Universités – Praticien Hospitalier

Histologie et Embryologie

Médecine et Biologie de la Reproduction et CECOS de Picardie

CHU Amiens Picardie, Centre de Biologie Humaine

Madame le Professeur,

Je suis très honorée de vous compter parmi les membres de mon jury de thèse.

Malgré vos responsabilités au sein du service de Médecine et Biologie de la Reproduction et CECOS de Picardie et de la Faculté, vous avez toujours témoigné de votre soutien et intérêt dans mes projets durant mon parcours d'interne en Biologie de la Reproduction.

Je vous en suis profondément reconnaissante.
A Monsieur le Professeur Saïd KAMEL

Professeur des Universités

Pharmacie

Monsieur le Professeur,

Vous m'avez fait l'honneur d'accepter de faire partie de mon jury de thèse.

Je vous remercie de votre gentillesse et disponibilité, et de la qualité de votre enseignement en
biochimie.

Veuillez trouver ici, Professeur, l'expression de mes sincères remerciements.
Madame le Professeur Hafida KHORSI-CAUET

Professeur des Universités

Biologie cellulaire

Madame le Professeur,

Votre présence au sein de mon jury représente pour moi un grand honneur. Je vous remercie
de votre précieuse aide apportée à l'élaboration du protocole de recherche.

Je vous remercie pour vos conseils, vos encouragements, votre disponibilité et votre
gentillesse tout au long de ce travail.

Cher Professeur, veuillez trouver dans ce travail l'assurance de mon estime et mon profond
respect.
A Monsieur le Professeur Moncef BEN KHALIFA

Professeur des Universités – Praticien Hospitalier

Médecine et Biologie de la Reproduction et du Développement

Monsieur le Professeur,

Vous m'avez fait un grand honneur en acceptant d'être mon Directeur de thèse.

Vous m'avez entièrement accordé votre confiance en me confiant ce travail de recherche, qui m'a grandement intéressé. Je vous en suis profondément reconnaissante.

Je vous remercie de l'intérêt que vous avez apporté à ma formation, en m'inspirant toujours à l'excellence. Vous avez également su m'encourager à aller plus loin dans mes projets.

Soyez assuré de mon sincère respect.
**Au Dr Elodie Lefranc et au Dr Dorian Bosquet** merci pour votre gentillesse, votre simplicité et pour vos qualités de chef. Je vous suis reconnaissante d'avoir pris le temps de m'intégrer à l'équipe dès le premier jour et pour m'avoir formé et transmis vos connaissances (et merci à Dorian pour tes conseils mode et ton humour 😊).

**A l'équipe de BDR : Séverine, Audrey, Amandine, Elodie, David, Benoît, Sophie.** Après deux années passées avec vous, je vous considère comme ma famille de cœur. J'ai appris beaucoup auprès de vous, et je vous remercie d'avoir pris le temps de me former (il faut de la patience !). J'ai apprécié les moments partagés avec vous, et j'espère encore

**A l'équipe gynéco : Rosalie, Albane, Claire, Maryam, Emmanuelle, Alizée, Anaïs, Maité, Océane, Guillaume, Elsa...** : je suis heureuse d'avoir travaillé à vos côtés et je serai honorée de travailler de nouveau avec vous. Vous êtes une super équipe !

**A l'équipe du laboratoire d'immunologie Dr Gwladys Bourdenet, Dr Brigitte Gubler, à Lucie Moussot** je vous remercie d'avoir accepté de m'aider dans le protocole de recherche. Cela n'a pas toujours été facile mais vous étiez toujours disponible pour moi. Je vous remercie pour votre patience et votre gentillesse, et votre précieuse aide.

**A Molka Bouricha**, je te souhaite la meilleure réussite professionnelle. Je suis sûre que s'ouvre devant toi une grande carrière de Médecin biologiste de la Reproduction (je n'en doute pas une seule seconde !). Tu as été d'une grande aide dans ma thèse et dans la rédaction de l'article, et je t'en suis infiniment reconnaissante.

**A la promo PouetPouet : Tasnim, Kenza, Yann, Kais, Guillaume, Julie, Ophélie** je vous souhaite une belle carrière professionnelle, vous le méritez. J'ai passé de bons moments avec vous et j'espère vous revoir bientôt.

**A mes co-internes de BDR : Lucie et Khadija, Léa** je suis contente d'avoir passé mes semestres à vos côtés. J'en garderai de bons souvenirs toute ma vie. Vous avez été adorables et je vous souhaite le meilleur pour la suite.

**A Sara**, j'ai tellement hâte de voir le petit bout d'chou arriver dans ce monde (inshaalhah !!). Tu es une belle personne, avec des valeurs, ne doute jamais de toi !

**A Valentine**, je suis contente d'avoir partagé la sdi avec toi (#cagibi). J'ai beaucoup apprécié ton humour, reste comme tu es 😊.

**A Isabelle**, merci pour ta gentillesse et ton authenticité. Tu es super !
**Aux secrétaires : Audrey, Béné et Angél, en plus d'être professionnelles, j'ai adoré votre bonne humeur et les moments de rigolade avec vous !**

**A l'équipe de BDR d'Antoine-Béclère, je ne regrette pas d'avoir choisi votre centre pour mon inter CHU. J'ai apprécié votre gentillesse, votre simplicité et je suis fière d'avoir fait partie de votre équipe durant ces six mois.**

**A Leila (Dr Bouzlafa), à Zineb, Rihab (Dr Slim), merci de m'avoir soutenu dans les moments difficiles. Même si on ne se voit pas assez, sachez que je pense à vous souvent et je vous souhaite beaucoup de réussite et de bonheur dans votre vie.**

**A Nour, que je considère comme ma seconde maman. Je te considère comme un modèle par tes qualités humaines, par ton intelligence et ta beauté mais aussi par ta force et ton courage. Des milliers de km nous séparent mais tu es toujours présente dans mon cœur !**

**A Jude Becker et Sophia, I would have loved to see you grow up with me, but life has other plans for us. I love to be your auntie and your bestie. I love to laugh with you, to spoil you, to visit new cities with you. I enjoy so much spending quality time with you! I've seen you grow up so fast, now that you guys are taller than me. I wish you the best life 'cause you're the best.**

**A Momo, le frérot le plus sympa et le plus cool qu'on puisse imaginer !! Je suis certaine que tu seras parmi les meilleurs radiologues de France et de Navarre. Je te souhaite beaucoup de bonheur dans ta vie, tu le mérites tellement !**

**A Dania, maman de Runa, j'adore notre complicité, notre amour des animaux qu'on partage toutes les deux, et surtout nos disputes 😊. Depuis que tu es en Espagne, je sens qu'il y a un vide dans mon cœur et j'attends avec impatience tes visites en France. Je suis certaine que tu seras une excellente véto NAC.**

**A Houeyda, Hala, les meilleures tatas qu'on puisse imaginer. Votre douceur, gentillesse et bonté d'âme sont tellement rares de nos jours !**

**A mes parents, qui représentent tout pour moi. Vous resterez à jamais mes meilleurs soutiens. Vous êtes partis de rien et vous avez construit votre avenir à la sueur de votre front. J'admire votre force, votre courage et votre détermination. Vous m'avez transmis de belles valeurs, et vos qualités humaines exceptionnelles m'inspirent à être une meilleure personne chaque jour. J'espère vous rendre fière de moi tous les jours. Quoi qu'il arrive, je serai toujours à vos côtés car je vous suis toute ma vie redevable.**
TABLE DES MATIERES

<table><tr><td>REMERCIEMENTS</td><td>2</td></tr><tr><td>TABLE DES MATIERES</td><td>9</td></tr><tr><td>TABLES DES ILLUSTRATIONS</td><td>12</td></tr><tr><td>LISTE DES ABREVIATIONS</td><td>13</td></tr><tr><td>1. Introduction</td><td>14</td></tr><tr><td>1.1. Définitions de l'infertilité</td><td>14</td></tr><tr><td>1.2. Quelques données sur l'infertilité</td><td>14</td></tr><tr><td>1.2.1. Impact de l'infertilité sur la population en âge de procréer</td><td>14</td></tr><tr><td>1.2.2. Impact de l'infertilité en AMP</td><td>14</td></tr><tr><td>1.2.3. Echecs d'implantation répétés en AMP</td><td>14</td></tr><tr><td>1.3. Processus d'implantation embryonnaire</td><td>15</td></tr><tr><td>1.3.1. Connaissances générales sur le processus d'implantation</td><td>15</td></tr><tr><td>1.4. L'immunologie de l'implantation</td><td>16</td></tr><tr><td>1.4.1. Rôle des cellules immunitaires dans l'implantation</td><td>16</td></tr><tr><td>1.4.2. Rôle des cytokines dans l'implantation</td><td>17</td></tr><tr><td>1.4.3. « Paradigme Th1/ Th2/ Th17 » : Equilibre environnement pro et anti-inflammatoire</td><td>18</td></tr><tr><td>1.4.3.1. Environnement initiale pro-inflammatoire</td><td>19</td></tr><tr><td>1.4.3.2. Environnement anti-inflammatoire</td><td>19</td></tr><tr><td>1.5. Interleukine 10</td><td>20</td></tr><tr><td>1.5.1. Origine de l'IL-10</td><td>20</td></tr><tr><td>1.5.2. Voies de signalisation IL-10</td><td>21</td></tr><tr><td>1.5.3. Rôle IL-10 dans l'implantation embryonnaire</td><td>22</td></tr><tr><td>1.5.4. Mécanismes de régulation de l'IL-10</td><td>22</td></tr><tr><td>1.5.5. Impact clinique du déficit en IL-10</td><td>23</td></tr><tr><td>1.6. TGF-β</td><td>24</td></tr><tr><td>1.6.1. Origine du TGF-β</td><td>24</td></tr><tr><td>1.6.2. Voies de signalisation du TGF-B1</td><td>25</td></tr><tr><td>1.6.3. Rôle du TGF-β1 dans l'implantation embryonnaire</td><td>26</td></tr><tr><td>1.6.3.1. TGF-β1 et Tregs</td><td>26</td></tr><tr><td>1.6.3.2. TGF-β1 et cellules NK</td><td>26</td></tr><tr><td>1.6.3.3. TGF-β1 et macrophages</td><td>26</td></tr><tr><td>1.7. Utilisation du liquide folliculaire pour l'étude de nouveaux biomarqueurs</td><td>27</td></tr></table>
<table>
  <tr>
    <td>1.8.</td>
    <td>Objectif de l'étude</td>
    <td>29</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.</td>
    <td>Matériel et Méthodes</td>
    <td>30</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.1.</td>
    <td>Type d'étude et population étudiée</td>
    <td>30</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.2.</td>
    <td>Critères de jugement principal et secondaires</td>
    <td>30</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.3.</td>
    <td>Protocoles de stimulation ovarienne en vue d'une FIV</td>
    <td>31</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.4.</td>
    <td>Déroulement d'un protocole de FIV</td>
    <td>31</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.5.</td>
    <td>Formation des groupes de patientes</td>
    <td>32</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.6.</td>
    <td>Recueil et préparation des échantillons de liquide folliculaire</td>
    <td>32</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.</td>
    <td>Technique ELISA</td>
    <td>32</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.1.</td>
    <td>Principe de la technique ELISA</td>
    <td>32</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.2.</td>
    <td>Technique ELISA conventionnelle versus ELISA automatisé</td>
    <td>33</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.3.</td>
    <td>Détermination des concentrations intra-folliculaire de TGF-β1 et d'IL-10 par ELISA conventionnel</td>
    <td>33</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.4.</td>
    <td>Dosage intra-folliculaire du TGF-β1 et IL-10 en ELISA automatisé</td>
    <td>35</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.4.1.</td>
    <td>Principe du dosage en microfluidique</td>
    <td>35</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.4.2.</td>
    <td>Protocole de dosage en microfluidique</td>
    <td>37</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>2.7.5.</td>
    <td>Analyses statistiques</td>
    <td>39</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>3.</td>
    <td>Résultats</td>
    <td>40</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>3.1.</td>
    <td>Analyse descriptive de la population étudiée</td>
    <td>40</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>3.2.</td>
    <td>Etudes comparatives</td>
    <td>41</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>3.3.</td>
    <td>Etudes corrélatives</td>
    <td>42</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.</td>
    <td>Discussion</td>
    <td>44</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.</td>
    <td>Etudes comparatives</td>
    <td>44</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.1.</td>
    <td>Profil Th2 anti-inflammatoire</td>
    <td>44</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.2.</td>
    <td>IL-10</td>
    <td>44</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.2.1.</td>
    <td>IL-10 et endométriose</td>
    <td>44</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.2.2.</td>
    <td>IL-10 et SOPK</td>
    <td>45</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.2.3.</td>
    <td>Impact de l'âge et des EIR sur les taux d'IL-10</td>
    <td>45</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.3.</td>
    <td>TGF-β1</td>
    <td>46</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.3.1.</td>
    <td>TGF-β1 et bon pronostic</td>
    <td>46</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.3.2.</td>
    <td>TGF-β1 et SOPK</td>
    <td>47</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.1.3.3.</td>
    <td>TGF-β1 et endométriose</td>
    <td>47</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.2.</td>
    <td>Etudes corrélatives</td>
    <td>48</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.2.1.</td>
    <td>L-10 et E2 et Pg</td>
    <td>48</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.2.2.</td>
    <td>TGF-β1 et E2 et Pg</td>
    <td>49</td>
  </tr>
  <tr>
    <td>4.2.3.</td>
    <td>IL-10 et qualité ovocytaire</td>
    <td>50</td>
  </tr>
</table>
<table><tr><td>4.2.4.</td><td>IL-10 et taux de grossesse</td><td>51</td></tr><tr><td>4.2.5.</td><td>TGF-β1 et taux d'implantation</td><td>52</td></tr><tr><td>4.2.6.</td><td>Limites de l'étude</td><td>53</td></tr><tr><td>5.</td><td>Conclusion</td><td>54</td></tr><tr><td>6.</td><td>Perspectives</td><td>55</td></tr><tr><td colspan="2">BIBLIOGRAPHIE</td><td>56</td></tr><tr><td colspan="2">ANNEXES</td><td>62</td></tr><tr><td colspan="2">Impact du profil cytokinique anti-inflammatoire intrafolliculaire sur les résultats en FIV</td><td>66</td></tr><tr><td colspan="2">Impact of intrafollicular anti-inflammatory cytokine profiles on IVF results</td><td>67</td></tr></table>
# TABLES DES ILLUSTRATIONS

## FIGURES

<table><tr><td>Figure1. Les étapes de l'implantation embryonnaire</td><td>16</td></tr><tr><td>Figure 2. Cellules immunitaires au site implantatoire</td><td>17</td></tr><tr><td>Figure 3. Voies de signalisation de l'IL 10</td><td>21</td></tr><tr><td>Figure 4. Impact clinique du déficit en IL-10 sur la grossesse</td><td>24</td></tr><tr><td>Figure 5. Voies de signalisation du TGF-β1</td><td>25</td></tr><tr><td>Figure 6. ELISA en microfluidique</td><td>36</td></tr><tr><td>Figure 7. Schéma de la plaque utilisée pour dosages de cytokines et automate Ella</td><td>37</td></tr></table>

## TABLEAUX

<table><tr><td>Tableau 1. Analyse descriptive des deux groupes</td><td>40</td></tr><tr><td>Tableau 2. Analyse comparative des résultats de FIV des deux groupes</td><td>41</td></tr><tr><td>Tableau 3. Concentrations de TGF-B1 et d'IL-10 dans le liquide folliculaire</td><td>42</td></tr><tr><td>Tableau 4. Corrélations entre résultats de FIV et biomarqueurs du liquide folliculaire</td><td>43</td></tr></table>
LISTE DES ABREVIATIONS

AMH : Anti-müllerian hormone

AMP : Assistance Médicale à la Procréation

β-HCG: Human Chorionic Gonadotrophin hormone (fraction β)

CD : Cellules dendritiques

EIR : Echecs d'implantation répétées

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay

FCR : Fausses couches à répétitions

FIV: Fécondation In Vitro

FSH: Follicle Stimulating Hormone

GnRH: Gonadrotropin Releasing Hormone

ICSI: Intra Cytoplasmic Sperm Injection

IL-10: Interleukine 10

LH: Luteinizing Hormone

NK: Natural Killer

OMS : Organisation Mondiale de la Santé

SOPK : Syndrome des ovaires polykystiques

TGF-β1: Transforming Growth Factor β1

Th1: Lymphocytes T Helper 1

Th2: Lymphocytes T Helper 2

Treg: Lymphocytes T régulatrices
# 1. Introduction

## 1.1. Définitions de l'infertilité

L'infertilité se définit par une absence d'obtention d'une grossesse clinique après 12 mois de rapports sexuels réguliers non protégés chez des personnes en âge de procréer. L'infertilité a été catégorisée comme une pathologie du système reproductif depuis 2017 par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS). L'objectif de l'OMS était de considérer la lutte contre l'infertilité comme un enjeu de santé publique majeure et faciliter la prise en charge des personnes infertiles en Assistance Médicale à la Procréation (AMP) (1).

## 1.2. Quelques données sur l'infertilité

### 1.2.1. Impact de l'infertilité sur la population en âge de procréer

On estime que 8 à 12 % de la population mondiale en âge de procréer présente une infertilité (2). Cela concerne plus de 186 millions de personnes dans le monde, ce qui constitue un enjeu de santé publique majeure (3).

De même, en France la proportion des personnes infertiles est croissante. Basé sur un échantillon de 867 femmes de 18 à 44 ans, sans contraception, à rapports réguliers (interrogées entre 2007-2008), 46 % des couples n'ont pas obtenu de grossesse après 6 mois, 24% après 12 mois et 11% après 12 mois (4).

### 1.2.2. Impact de l'infertilité en AMP

Malgré les progrès des techniques en AMP, le pourcentage d'obtention de grossesses cliniques par transfert d'embryons reste limité à environ 35%. Les fausses couches précoces surviennent dans environ 15% des grossesses cliniques. Dans 40 à 50% des cas, il n'a pas été identifié de cause précise (5).

### 1.2.3. Echecs d'implantation répétés en AMP

L'échec d'implantation répété (EIR) est défini comme l'absence d'implantation après des transferts répétés d'embryons.
Bien que ce phénomène clinique soit courant et qu'il existe une vaste littérature sur le sujet, il n'existe pas de définition universellement acceptée.

La définition de l'EIR varie selon le nombre de transferts d'embryons sans grossesse, le stade et la qualité du ou des embryons transférés (stade de clivage, blastocyste et statut euploïde), ainsi que la définition de l'implantation (taux de β- HCG et présence d'un sac gestationnel) (6).

L'échec d'implantation répété est le plus souvent définie comme un échec de grossesse clinique après 4 transferts d'embryons frais ou congelés de bonne qualité chez des femmes âgées de moins de 40 ans, ayant eu au minimum 3 cycles de FIV (7).

## 1.3. Processus d'implantation embryonnaire

### 1.3.1. Connaissances générales sur le processus d'implantation

L'implantation est l'une des étapes les plus critiques de la reproduction (8). Une implantation réussie nécessite un embryon compétent, un endomètre réceptif et un dialogue synchronisé entre les tissus maternel et embryonnaire (9).

Le processus d'implantation implique l'apposition, l'adhésion et l'invasion du blastocyste au niveau de l'endomètre. Lors de l'apposition du blastocyste, les cellules trophoblastiques entrent en contact avec l'épithélium de l'endomètre. L'adhésion décrit le processus par lequel le blastocyste s'ancrera ensuite à la lame basale de l'endomètre et à la matrice extracellulaire stromale. Ceci est suivi d'une invasion, avec pénétration du blastocyste à travers l'épithélium luminal (Figure 1) (6,10)
<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>**Figure1.** Les étapes de l'implantation embryonnaire</figcaption></figure>

**1.4. L'immunologie de l'implantation**

**1.4.1. Rôle des cellules immunitaires dans l'implantation**

Le fœtus est considéré comme une semi-allogreffe. Le système immunitaire de la mère, tolère
le fœtus allogénique et permet ainsi de maintenir la grossesse.

Les aspects immunologiques de l'implantation sont de mieux en mieux documentés dans la recherche scientifique et la clinique fondamentale. Dernièrement, il existe un intérêt croissant pour l'étude des cellules immunitaires de l'endomètre afin de prédire les résultats de grossesses en FIV (6).

En plus des cellules déciduales et les cellules endothéliales, les cellules immunitaires infiltrantes représentent un composant cellulaire majeur de l'endomètre. Les premières études ont clairement montré que l'endomètre normal post-implantation est riche en infiltrats immunitaires. Les infiltrats observés comprennent à la fois des cellules immunitaires innées (natural killer, macrophages, cellules dendritiques etc.) et adaptatives (lymphocytes T et B). Environ 70 % des leucocytes déciduaux sont des cellules natural killer (NK), 20 à 25 % sont
des macrophages, 1,7 % sont des cellules dendritiques (CD) et environ 3 à 10 % sont des lymphocytes T (Figure 2).

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>**Figure 2.** Cellules immunitaires au site implantatoire</figcaption></figure>

La présence d'infiltrats immunitaires est nécessaire au bon déroulement de la grossesse, ce qui suggère la possibilité que les cellules immunitaires ne soient pas recrutées au niveau de l'endomètre en réaction à un fœtus "étranger" ou "non-soi", mais qu'elles soient au contraire activement recrutées pour faciliter une implantation correcte et favoriser le bon déroulement de la grossesse. Une greffe d'organe réussie nécessite une immunosuppression constante tandis qu'une grossesse réussie nécessite un système immunitaire robuste, dynamique et réactif. La modulation immunitaire et l'induction de la tolérance au début de la grossesse sont nécessaires pour permettre l'implantation, mais une grossesse réussie dépend également d'un système immunitaire réactif capable de protéger la mère et le fœtus contre les agressions environnementales (10).

### 1.4.2. Rôle des cytokines dans l'implantation

Les cytokines sont des glycopeptides régulateurs produits par la plupart des cellules nucléées. Ces peptides ont des effets pléiotropes, qu'ils exercent au niveau local de façon paracrine, ou autocrine sur un très grand nombre de types cellulaires (11).
L'endomètre produit de nombreuses cytokines pendant la phase proliférative et sécrétoire du cycle. Ces cytokines sont supposées crucales pour la préparation de l'utérus à l'implantation d'embryons et au développement placentaire pendant la grossesse (5).

La décidualisation de l'endomètre est essentielle à l'établissement de la grossesse (12). Le processus de décidualisation implique la reprogrammation des cellules stromales de l'endomètre, qui comprend la production de divers médiateurs tels que les cytokines et les chimiokines, et le recrutement sélectif de cellules immunitaires. De plus, les cellules trophoblastiques pourraient participer au recrutement des cellules immunitaires telles que les lymphocytes T (13). De manière générale, les lymphocytes T CD4 + naïfs sont les principaux producteurs de cytokines et peuvent être classés en divers sous-ensembles tels que les lymphocytes T helper Th1, Th2, Th17. Mais les cytokines sont également produites par d'autres cellules, notamment les cellules stromales, les cellules épithéliales et les macrophages (5).

Les cytokines ont un rôle dans la croissance du placenta, la production de cytotrophoblastes, la formation de vaisseaux sanguins, l'invasion des cellules trophoblastiques extra villeuses, le remodelage des artères spiralées, le développement cellulaire et l'apoptose ainsi que l'induction de la tolérance embryonnaire (14). Le succès de la grossesse dépend essentiellement de la signalisation réciproque entre la mère et le développement du blastocyste et de la réceptivité déciduale tout au long de la fenêtre implantatoire. Cette fenêtre implantatoire correspond à une période où la réceptivité endométriale à l'embryon est maximale. Elle est d'une courte durée d'environ 4 jours, et correspond au jour 20 à 24 d'un cycle menstruel (8,11).

Les cytokines agiraient comme médiateurs de communication entre les cellules trophoblastiques et déciduales. La communication entre les cellules à l'interface mère-embryon modifie l'expression de la variété et de la quantité des cytokines. La tolérance immunitaire ou stimulation immunitaire peut être donc liée aux variations du profil des cytokines des lymphocytes T (15).

### 1.4.3. « Paradigme Th1/ Th2/ Th17 » : Equilibre environnement pro et anti-inflammatoire

La grossesse débute dans un environnement pro-inflammatoire (de type Th1) permettant l'implantation et la placentation, puis passe à un environnement anti-inflammatoire (de type
Th2). Un environnement pro-inflammatoire est nécessaire à la fin d'une grossesse afin de
favoriser le travail et l'accouchement (16).

**1.4.3.1. Environnement initiale pro-inflammatoire**

L'attachement initial du blastocyste à la paroi épithéliale de l'utérus pendant l'implantation et la placentation impliquent la dégradation active et la restructuration de l'endomètre par le trophectoderme invasif. La phase d'implantation et de placentation précoce ressemble donc au processus de lésion tissulaire et à la réparation qui s'ensuit. Au site d'implantation, l'inflammation est caractérisée notamment par la présence d'interleukine-6 (IL-6), d'IL-8, d'IL-15, de facteur stimulant les colonies de granulocytes et de macrophages (GM-CSF), et facteur de nécrose tumorale (TNF) qui proviennent à la fois des cellules stromales de l'endomètre et des cellules immunitaires infiltrantes (16).

**1.4.3.2. Environnement anti-inflammatoire**

Après une implantation et une placentation réussie, il y a une phase de croissance et de développement rapide du fœtus. À ce stade, la mère, le placenta et le fœtus sont en symbiose et le milieu prédominant est de type TH2 ou anti-inflammatoire. Plusieurs types de cellules immunitaires dont les macrophages, les cellules NK déciduales et les cellules T régulatrices (Treg) contribuent à l'établissement d'un microenvironnement anti-inflammatoire à ce stade de la grossesse (17).

Les macrophages deciduaux ont un phénotype de type M2 associé au renouvellement des tissus et sécrètent principalement des cytokines anti-inflammatoires ces cellules sont importantes pour le renouvellement des tissus pendant l'invasion du trophoblaste et la croissance du placenta. Les cellules NK deciduales diffèrent des cellules NK du sang périphérique en termes de phénotype et de fonction (18).

Les cellules NK deciduales sont identifiées par leur phénotype unique qui leur permettent de présenter une faible cytotoxicité et il a été démontré qu'elles interagissent avec les macrophages deciduales et induisent la génération de cellules Treg (19).

Les cellules Treg sont des acteurs clés dans le processus de réparation des tissus grâce à leurs capacités anti-inflammatoires et anti-apoptotiques. Pendant la grossesse, les cellules Treg jouent un rôle central dans le maintien d'un environnement anti-inflammatoire (20). De même,
il a été démontré que la fausse couche spontanée est corrélée à un nombre de cellules Treg
systémiques inférieur à celui que l'on trouve dans les grossesses évolutives (21).

Une population de cellules Th17 est également présente dans l'utérus et cette population
s'accroît pendant la grossesse, mais pas dans la même mesure que les cellules Treg. Comme
elles sont généralement de nature pro-inflammatoire, ces cellules Th17 peuvent contribuer à
protéger l'interface materno-fœtale des infections microbiennes, tandis que les cellules Treg
peuvent servir à réguler la fonction des cellules Th17 (10).

L'inflammation a été principalement associée à des issues défavorables de la grossesse. Elle est considérée comme une cause de fausses couches, d'accouchement prématuré et même de pré-éclampsie. Ainsi, une grossesse évolutive nécessite un environnement anti-inflammatoire ou de type Th2 (10).

Deux cytokines anti-inflammatoires nous ont intéressé au cours de cette étude : l'interleukine 10 (IL-10) et le Transforming Growth Factor β1 (TGF-β1).

**1.5. Interleukine 10**

**1.5.1. Origine de l'IL-10**

L'interleukine 10 est une protéine homodimérique avec un poids moléculaire monomère de 18,5 kDa qui est codée sur le chromosome 1 chez l'homme (22).

L'IL-10 a été initialement identifiée dans les clones de cellules Th2, et a la capacité d'inhiber l'activité des cellules inflammatoires de type Th1 (23).

Cette cytokine a un rôle vital dans le maintien de la tolérance immunitaire. De nombreuses cellules, y compris des cellules immunitaires et non immunitaires, sécrète l'IL-10 de manière autocrine et paracrine(22).

L'IL-10 est exprimée par plusieurs cellules issues du système immunitaire adaptatif, y compris Th2, Tregs, les lymphocytes T CD8+ et les lymphocytes B, ainsi que dans le système immunitaire inné (les monocytes, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK, granulocytes, neutrophiles, éosinophiles et mastocytes). De plus, l'IL-10 est produite par des cellules non immunitaires, telles que les kératinocytes et les cellules tumorales. De nombreuses études ont indiqué que l'expression de l'IL-10 est régulée par ces types de cellules à différents stades d'une réponse immunitaire (22).
L'IL-10 a également été détectée dans les milieux de culture d'embryons pré-implantatoires humains, suggérant que les embryons pré-implantatoires sécrètent cette cytokine (24).

### 1.5.2. Voies de signalisation IL-10

La liaison de l'IL-10 à son complexe récepteur spécifique (IL-10R1 et IL-10R2) conduit à l'activation de plusieurs voies de signalisation, y compris la voie Jak/STAT (Janus kinase 1/ Signal transducer and activator of transcription) bien établie, les voies médiées par PI3K/Akt et P38/MAPK. Par sa transduction du signal, l'IL-10 joue un rôle dans l'anti-inflammation, la protection vasculaire et l'inhibition du stress du réticulum endoplasmique. Des études antérieures ont suggéré l'existence de voies de signalisation indépendantes de JAK / STAT qui interviennent dans les effets anti-inflammatoires de l'IL-10. L'IL-10 induit l'expression de l'hème oxygénase-1 (HO-1), une protéine inductible par le stress ayant des effets anti-inflammatoires potentiels. Associé au monoxyde de carbone (CO), l' HO-1 joue un rôle essentiel dans la médiation de l'effet anti-inflammatoire de l'IL-10 à la fois in vitro et in vivo (Figure3) (22).

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>**Figure 3.** Voies de signalisation de l'IL 10</figcaption></figure>
### 1.5.3. Rôle IL-10 dans l'implantation embryonnaire

L'IL-10 exerce ses effets anti-inflammatoires principalement en diminuant les cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-1, l'IL-6, l'IL-12 et le TNF-α, et en inhibant la présentation de l'antigène via le blocage de l'expression du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe II (22).

L'IL-10 fonctionne comme un puissant protecteur contre le dysfonctionnement vasculaire (25). Il a en effet été démontré que l'IL-10 fonctionne comme un médiateur clé de la protection vasculaire dans le dysfonctionnement endothélial et dans de nombreuses maladies telles que l'hypertension, le diabète et l'athérosclérose, et exerce un rôle dans l'angiogenèse placentaire. (26,27).

C'est donc une puissante cytokine anti-inflammatoire qui joue un rôle crucial, et souvent essentiel, dans la prévention des pathologies inflammatoires et auto-immunes (28). Ainsi, une expression ou une signalisation altérée de l'IL-10 peut améliorer la clairance des agents pathogènes lors d'une infection aiguë, mais également exagérer la réponse inflammatoire, entraînant des lésions tissulaires (29).

### 1.5.4. Mécanismes de régulation de l'IL-10

De plus, l'IL-10 régule la différenciation et la prolifération de plusieurs cellules immunitaires, notamment les lymphocytes T, les lymphocytes B, les uNK, les cellules présentatrices d'antigène, les mastocytes et les granulocytes (25). Il est important de noter que de nouveaux rôles ont été identifiés pour l'IL-10 en tant que puissant protecteur contre le dysfonctionnement vasculaire associé à l'hypertension et à l'inflammation pendant la grossesse (26).

Les cellules uNK sont les principaux lymphocytes présents au niveau de l'endomètre pendant la grossesse et ont la capacité de produire et d'être régulées par l'IL-10 (30). Il est important de noter que, contrairement aux fonctions immunitaires primordiales des cellules NK, les cellules uNK spécialisées, sous l'influence du milieu de la grossesse, soutiennent la grossesse
grâce à leur capacité unique à aider à réguler l'invasion trophoblastique et le remodelage vasculaire (31).

Fu et al ont récemment rapporté que les cellules déciduales NK (dNK) possèdent une capacité unique à maintenir la tolérance immunitaire et une grossesse réussie en supprimant les cellules Th17 inflammatoires (32).

Les cellules Th17 sont de puissants inducteurs d'inflammation tissulaire et représentent une lignée de cellules T auxiliaires pro-inflammatoires qui sont impliquées dans les maladies auto-immunes et empêchent l'induction de la tolérance lors de la grossesse (33), provoquant la perte du fœtus tout en participant à l'infiltration inflammatoire de l'endomètre chez les femmes souffrant de fausses couches à répétition (FCR). Il a été rapporté que l'IL-10 est la cytokine clé responsable de la suppression des cellules Th17 (22).

### 1.5.5. Impact clinique du déficit en IL-10

Les observations cliniques ont mis en évidence l'IL-10 comme un acteur central dans les processus pathologiques des FCR inexplicuées et de la naissance prématurée, car de nombreuses études ont montré des niveaux réduits de production d'IL-10, de cellules productrices d'IL-10 et de ratios Th1cytokine/IL-10 dans les tissus endométrial et placentaire et sérum de femmes atteintes de FCR (34–36). Toutes ces données soutiennent l'idée que la perturbation de l'équilibre de l'expression des cytokines pro et anti-inflammatoires ainsi que la dérégulation des cytokines associées à l'angiogenèse sont associées aux FCR et à la prématurité (22).

Il a été démontré que la dérégulation de l'IL-10 perturbe l'équilibre entre l'anti-inflammation et la pro-inflammation à l'interface materno-fœtale entraînant par conséquent un stress, une inflammation et une apoptose du réticulum endoplasmique placentaire, avec libération de facteurs anti-angiogéniques. En conséquence, la tolérance immunitaire maternelle et le remodelage vasculaire sont perturbés, entraînant de nombreuses issues défavorables de la grossesse (Figure 4) (22).
<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>**Figure 4.** Impact clinique du déficit en IL-10 sur la grossesse</figcaption></figure>

## 1.6. TGF-β

### 1.6.1. Origine du TGF-β

La superfamille TGF-β est un groupe de protéines structurellement conservé mais fonctionnellement diversifié. Ces protéines fonctionnent comme des ligands extracellulaires impliqués dans de nombreux processus physiologiques au cours de la vie prénatale et postnatale. Le locus du gène du TGF-β est situé sur le bras long du chromosome 19. Sur la base de caractéristiques structurelles, les membres de la superfamille ont été classés en plusieurs sous-familles. Il s'agit notamment de la sous-famille prototypique TGF-β comprenant trois isoformes (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), d'une sous-famille étendue de protéines morphogénétiques osseuses (BMP= Bone morphogenetic protein ), de la sous-famille des facteurs de croissance et de différenciation (GDF= Growth Differentiation Factor), et notamment l'hormone anti-müllérienne (AMH) (37).
### 1.6.2. Voies de signalisation du TGF-B1

Le TGF-β1 est sécrété sous forme latente lié à la protéine LTBP, qui permet de stocker TGF-β dans la matrice cellulaire. Le petit complexe latent est composé d'une protéine homodimérique LAP (Latency Associated Peptide). Le TGF-β1 est inactif car le LAP empêche le TGF-β1 mature de se lier aux récepteurs. Le processus de libération du TGF-β1 mature du TGF-β1 latent est appelé activation du TGF-β1 (37). Les mécanismes d'activation du TGF-β1 est un processus complexe comprennent la déformation du LAP médiée par l'intégrine et la libération de TGF-β1 mature et d'autres mécanismes tel que la protéolyse. Une fois activé, le TGF-β1 mature se lie aux récepteurs spécifiques de surface cellulaire de haute affinité et active les voies de signalisation en aval pour exécuter les fonctions biologiques correspondantes. Le TGF-β1 extracellulaire activé se lie au récepteur transmembranaire de la kinase TGF-β de type I (TβR-I) et au récepteur de TGF-β de type II (TβR-II) à la surface cellulaire pour former un complexe tétramère, conduisant à la phosphorylation et à l'activation des récepteurs (38). Par la suite, les récepteurs kinases phosphorylent et activent les signaux en cascade intracellulaires, impliquant les voies dépendantes et indépendantes de la SMAD (Figure 5), pour médier divers effets biologiques (39).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>**Figure 5.** Voies de signalisation du TGF-β1</figcaption></figure>
### 1.6.3. Rôle du TGF-β1 dans l'implantation embryonnaire

#### 1.6.3.1. TGF-β1 et Tregs

le TGF-β1 est un inducteur important des Tregs périphériques (40). Les Tregs à l'interface mère-fœtus empêchent le rejet fœtal en créant un microenvironnement de tolérance immunitaire caractérisé notamment par l'expression de l'IL-10, du TGF-β1. Les Tregs peuvent réguler la réponse immunitaire et maintenir la tolérance immunitaire grâce à un mécanisme dépendant du contact cellulaire et un mécanisme indépendant du contact cellulaire. Le mécanisme indépendant du contact cellulaire des Tregs est obtenu par la sécrétion de cytokines inhibitrices, et le TGF-β1 est essentiel à la prolifération et à l'activité inhibitrice des Tregs. L'activation du TGF-β1 est nécessaire pour induire la production de Tregs, et les Tregs peuvent alors sécréter du TGF-β1 et participer à la régulation immunitaire (41).

#### 1.6.3.2. TGF-β1 et cellules NK

Les cellules NK sont des composants importants du système immunitaire inné de l'endomètre et jouent un rôle important dans le maintien de la grossesse. Dans la phase initiale de la grossesse, les cellules NK sont préférentiellement recrutées au niveau de l'endomètre pour jouer un rôle immunomodulateur sous l'effet de chimiokines dérivées des cellules stromales et trophoblastiques de l'endomètre. Le TGF-β1 produit par les cellules stromales déciduales peut compléter la différenciation terminale des cellules utérines NK. Les cellules dNK faiblement cytotoxiques peuvent réguler le remodelage vasculaire à l'interface mère-fœtus en produisant un facteur de croissance endothélial vasculaire, et en produisant du TGF-β1 (42,43).

#### 1.6.3.3. TGF-β1 et macrophages

Près de 20 à 30 % des leucocytes de l'endomètre au cours du premier trimestre sont des macrophages. Les macrophages jouent un rôle important dans l'invasion des cellules trophoblastiques, le remodelage vasculaire et la tolérance immunitaire. Les macrophages sont classés en deux sous-populations : les macrophages M1 classiques et M2 alternatifs. Les macrophages M1 expriment des facteurs pro-inflammatoires tels que l'IL-6, l'IL-12 et le
TNF-α. Inversement, les macrophages M2 régulent à la hausse l'expression de cytokines anti-inflammatoires telles que TGF-β1 et IL-10. L'équilibre élaboré entre les macrophages M1 et les macrophages M2 est d'une importance primordiale pour établir et maintenir une grossesse. Les macrophages M2 favorisent l'homéostasie cellulaire en sécrétant du TGF-β1 et de l'IL-10, ce qui a un impact profond sur le maintien de l'environnement de tolérance immunitaire. Les macrophages régulent non seulement la fonction immunitaire locale, mais favorisent également directement la migration et l'invasion des cellules trophoblastiques extra villeuses et soutiennent le remodelage de l'artère spirale et l'angiogenèse. Le TGF-β1 joue un rôle important dans la régulation de la fonction des macrophages à l'interface mère-fœtus (44-46).

En conclusion, le TGF-β1 joue un rôle important dans l'invasion des cellules trophoblastiques, le maintien de la tolérance immunitaire fœto-maternelle et le remodelage de l'artère spirale utérine (47,48). De plus, en tant que cytokine multifonctionnelle, le TGF-β1 est largement impliqué dans la régulation de la fonction des cellules immunitaires et joue un rôle indispensable dans la tolérance immunitaire fœto-maternelle (49).

Des études ont confirmé l'expression du TGF-β1 dans le tissu décidual des patientes atteintes de FCR est significativement diminuée par rapport aux témoins sains (39).

## 1.7. Utilisation du liquide folliculaire pour l'étude de nouveaux biomarqueurs

Le liquide folliculaire est produit par le transfert de composants du plasma sanguin qui traversent la barrière folliculaire sanguine et par l'activité sécrétoire des cellules de la granulosa et de la thèque (50).

Il contient plusieurs composants biochimiques, notamment des cytokines, des facteurs de croissance et des hormones stéroïdiennes qui sont impliqués dans le processus de folliculogenèse. Cette composition du liquide folliculaire est variable dans les conditions physiologiques (51).

Le liquide folliculaire est considéré comme un liquide biologique traduisant les changements hormonaux se produisant dans le microenvironnement d'un ovocyte entouré de ses cellules de la granulosa, le développement des ovocytes étant largement influencé par le microenvironnement du liquide folliculaire (50).
Ce liquide folliculaire contient plusieurs composants biochimiques, notamment des cytokines, des facteurs de croissance, des cellules immunitaires et hormones stéroïdiennes qui sont impliqués dans le processus de folliculogenèse, et cette composition du liquide folliculaire est variable dans les conditions physiologiques.

Par conséquent, il est logique de penser que liquide folliculaire peut agir comme prédicteur des paramètres de résultat en FIV directement ou indirectement, en analysant la maturité des ovocytes, le taux de fécondation, la qualité de l'embryon, le taux de grossesse et le taux d'implantation (51).

Il représente un donc un milieu optimal pour l'étude de nouveaux biomarqueurs pouvant être utilisés dans l'évaluation de la compétence ovocytaire et la capacité implantatoire embryonnaire (50).
## 1.8. Objectif de l'étude

Dans une étude récente menée au CHU Amiens Picardie (2021), il avait été démontré que la décidualisation est associée non seulement à des niveaux plus élevés d'interleukines inflammatoires mais aussi à des niveaux plus élevés de facteurs de croissance dans le liquide folliculaire le jour de la ponction ovocytaire (52).

L'objectif de cette nouvelle étude était d'établir le profil cytokinique anti-inflammatoire intra-folliculaire afin de déterminer le rôle de ces cytokines dans la prédiction du potentiel de développement embryonnaire et de la grossesse.

Les taux d'IL-10 et de TGF-β1 ont été mesuré dans le liquide folliculaire et les taux de cytokines ont été comparé entre les patientes de bon et de mauvais pronostic qui ont recours à une FIV.
## 2. Matériel et Méthodes

### 2.1. Type d'étude et population étudiée

Une étude prospective et longitudinale a été mené dans le centre de Médecine et Biologie de la Reproduction du CHU Amiens Picardie (Amiens, France) de janvier 2022 à juillet 2022, en collaboration avec le laboratoire de Recherche et le laboratoire d'Immunologie.

Toutes les patientes participant à un programme de FIV ou d'ICSI ont été inclus : Les femmes âgées de 19 à 42 ans ayant un transfert d'un seul ou de deux pré-embryons au jour 3 ou 5 lors de leur première ou deuxième tentative ou même avec un échec d'implantation répété (EIR), défini comme l'absence d'obtention d'une grossesse après 4 transferts d'embryons supérieurs avec un minimum de trois cycles de FIV

Les patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) défini par les critères de Rotterdam ou souffrant d'endométriose ont été inclus.

Les critères d'exclusion étaient les receveuses d'ovocytes, les ponctions blanches (aucun ovocyte retrouvé) et les altérations sévères des spermatozoïdes en termes de concentration inférieur à 10 millions /ml ou de mobilité progressive inférieure à 20 % le jour de la fécondation.

Les taux d'IL-10 et de TGF-β1 ont été étudiés dans le liquide folliculaire le jour de la ponction ovocytaire (après recueil des ovocytes pour utilisation en FIV). Le liquide folliculaire est considéré à ce moment-là comme un déchet biologique. Cette étude a été approuvée par la Direction de la Recherche Clinique et de l'Innovation (DRCI) dans le cadre d'un projet de recherche n'impliquant pas la personne humaine.

### 2.2. Critères de jugement principal et secondaires

Le critère de jugement principal était le taux de grossesse, définie par un taux de β-HCG > 100 UI/L 14 jours post transfert d'embryon(s).

Les critères de jugement secondaires étaient le taux de maturation ovocytaire, le taux de fécondation, le taux de blastulation, le taux de tops embryons et le taux d'œstradiol (E2) et de progestérone (Pg) au jour de la ponction ovocytaire.
## 2.3. Protocoles de stimulation ovarienne en vue d'une FIV

La stimulation ovarienne a été réalisée par deux protocoles : un protocole agoniste long de la gonadotrophine (GnRH) et un protocole antagoniste de la GnRH.

Le protocole agoniste long avec un agoniste de la GnRH (acétate de triptoréline : Décapeptyl®, Ipsen Pharma, France ; 0,1 mg par jour pendant 14 jours, à partir de la phase mi-lutéale), suivi de l'administration de l'hormone folliculo-stimulante humaine recombinante (rFSH : Puregon®, Organon, France, ou Gonal-F®, Merck Serono SAS, France) ou de la gonadotrophine ménopausique humaine (HMG, Menopur®, Ferring, France), en association avec le Décapeptyl® (0,05 mg par jour).

Dans le protocole antagoniste, la rFSH a été administrée par voie sous-cutanée chaque jour à partir du jour 2 du cycle jusqu'à ce qu'un follicule dominant de 14 mm soit détecté. L'acétate de cétrorelix (Cetrotide®, Merck Serono, France ; 0,25 mg par jour) a ensuite été administré quotidiennement jusqu'au jour de la gonadotrophine chorionique humaine recombinante (rhCG) (Ovitrelle®, Merck Serono SAS).

## 2.4. Déroulement d'un protocole de FIV

Le déclenchement de l'ovulation a été effectué par de de la r-HCG lorsqu'au moins trois follicules avaient atteint un diamètre supérieur à 16 mm. La ponction transvaginale d'ovocytes a été effectuée 36 h après l'administration de HCG, par aspiration folliculaire. La décoronisation a été effectuée 38 heures après le déclenchement de l'HCG. Tous les ovocytes ont été utilisés pour la FIV ou l'ICSI selon les protocoles standards. La fécondation a été évaluée 16 à 18 heures après l'injection de sperme. La morphologie a été évaluée selon les critères du consensus d'Istanbul (pour les pré-embryons du jour 2/3) ou les critères de Gardner (pour les blastocystes).

Aucun immunomodulateur n'a été administré en dehors d'un progestatif (Utrogestan® 400 mg, Besins International, France) pour le soutien lutéal.

La grossesse a été définie par un taux sérique de β-hCG≥100 IU/L 14 jours après le transfert d'embryons.
## 2.5. Formation des groupes de patientes

La population étudiée était un échantillon représentatif de 134 patients, qui a été divisé en trois groupes :

Groupe 1 (n=59) : patientes de bon pronostic définie par des femmes d'âge ≤ 35 ans et en première ou deuxième tentative sans SOPK ou endométriose.

Groupe 2 (n=75) : patientes âgées de plus de 35 ans ou tentative avec échec de fécondation ou antécédent d'EIR ou SOPK (n=19) ou endométriose (n=6).

Groupe 3 (n=50) : Groupe 2 sans SOPK et/ou sans endométriose.

## 2.6. Recueil et préparation des échantillons de liquide folliculaire

Des échantillons de liquide folliculaire ont été prélevés sur 134 femmes. Après la ponction ovocytaire, les échantillons de liquide folliculaire restants de chaque patiente ont été regroupés à partir de la seringue contenant le plus grand nombre d'ovocytes. Bien que quelques études se soient également concentrées sur les follicules monodominants (liquide obtenu à partir d'un seul follicule), ces estimations peuvent ne pas refléter fidèlement la production de cellules de la granulosa ou de cellules thécales.

Les échantillons de liquide folliculaire ont été centrifugés afin d'obtenir un liquide clair, et dans le but d'éviter la contamination par le sang de l'échantillon qui sera analysé. Après élimination des cellules par centrifugation à 600 g pendant 10 minutes, le surnageant a été récupéré, conservé à -80°C en plusieurs nuncs pour chaque patiente, et décongelés immédiatement avant l'analyse.

## 2.7. Technique ELISA

### 2.7.1. Principe de la technique ELISA

La technique ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) est une technique immunoenzymatique de détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps
grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

### 2.7.2. Technique ELISA conventionnelle versus ELISA automatisé

Il existe une technique d'ELISA « conventionnelle ». C'est une technique manuelle qui comprend plusieurs étapes et périodes d'incubation. L'ELISA conventionnelle est donc très opérateur-dépendant. De plus, Les résultats sont d'abord donnés sous une forme brute : à l'aide de concentrations connues fournies, on peut établir une courbe d'étalonnage et déterminer une équation de cette droite. Cette équation va permettre de calculer les concentrations de chaque puits à partir des densités optiques (DO) mesurées.

La technique d'ELISA automatisée permet de raccourcir considérablement le temps d'analyse, en simplifiant le processus. Les échantillons sont placés dans les puits, puis l'analyse se fait en moins de 90 minutes. A l'issue de l'analyse, les résultats finaux sont disponibles sous forme de tableau. Cette technique-là est donc plus avantageuse car plus rapide, et le risque de biais est moindre. Les kits d'ELISA automatisés ont l'avantage d'offrir une excellente sensibilité, en proposant une gamme de mesure importante. Cela permet d'analyser des échantillons contenant une concentration élevée ou faible de l'analyte mesuré. L'avantage est d'utiliser le même facteur de dilution pour tous les échantillons analysés. On évite ainsi la nécessité de réaliser une analyse supplémentaire car le facteur de dilution n'est pas adapté.

### 2.7.3. Détermination des concentrations intra-folliculaire de TGF-β1 et d'IL-10 par ELISA conventionnel

Les concentrations d'IL-10 et de TGF-β1 sont peu connues dans le liquide folliculaire. De plus, les kits ELISA n'ont pas été testés pour analyser le liquide folliculaire. En effet, les kits sont essentiellement testés pour une analyse d'échantillons issus de surnageant de culture cellulaire, sérum et plasma humain. Il fallait donc tester le kit pour du dosage de liquide folliculaire.

Dans un premier temps, un travail d'analyse de la littérature a été fait afin retrouver les concentrations moyennes d'IL-10 et de TGF-β1 intra-folliculaire.
Des kits d'ELISA conventionnels étaient également disponibles afin d'analyser quelques échantillons de liquide folliculaire de patientes inclues dans l'étude.

Cela a permis de tester plusieurs dilutions sur ces échantillons afin de déterminer quelle dilution optimale choisir au moment de la réalisation de la technique en ELISA automatisé.

Le kit Quantikine™ ELISA Human IL-10 Immunoassay (Biotechne) proposait une gamme de mesure allant de 7,8 pg/mL à 500 pg/mL.

Dans la littérature, nous avons pu retrouver une concentration moyenne d'IL-10 de 0,7 et 10,8 pg/mL dans le liquide folliculaire en phase pré-ovulatoire (53). Il a donc été décidé d'évaluer les concentrations d'IL-10 dans le liquide folliculaire non dilué, dilué au 1/2 et au 1/10.

Le dosage des différentes dilutions des échantillons d'IL-10 avant correction par le facteur de dilution, montrent en moyenne pour les dosages d'échantillons non dilués, une concentration d'IL-10 entre 4,41 et 18,11 pg/mL. Les dosages avec dilution au 1/2 montrent une concentration d'IL-10 entre 0,50 et 8,91 pg/mL. Enfin les dosages avec dilution au 1/5 montrent une concentration d'IL-10 allant jusque 7,81 pg/mL. De manière générale, les CV calculés sur chaque duplicat étaient globalement meilleurs pour les échantillons non dilués et dilués au 1/2 que pour les échantillons dilués au 1/5 (Annexe 1).

Les concentrations des échantillons non dilués allant de 4,41 et 18,11 pg/mL, les valeurs sont bien incluses. Par ailleurs les CV étaient acceptables, et les valeurs se trouvent dans un intervalle compatible avec des résultats reproductibles.

Le kit Quantikine™ ELISA Human TGF-β1 Immunoassay (Biotechne) propose une gamme de mesure qui s'étend de 31,33 pg/mL à 2000 pg/mL. Ainsi, les concentrations des échantillons testés doivent être comprises entre ces valeurs.

Il existe une étape supplémentaire d'activation du TGF-β1 latent, à réaliser en amont de la technique.

Les échantillons ont été activés à l'aide de la solution d'activation : 40µL d'échantillon ont été mélangés à 20µL de 1 N HCl. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les échantillons ont été neutralisés par ajout de 20 µL de 1,5 NaOH/0,5 M HEPES. Le pH devait être compris entre 7,2 et 7,6, et a été vérifié sur quelques échantillons.

Dans le liquide folliculaire en phase pré-ovulatoire et une concentration moyenne de TGF-β1 de 3631,4 +/- 1426,3 pg/mL a été retrouvée dans le liquide folliculaire (54).
Une première analyse des échantillons non dilués, au ½, 1/, 1/10 et 1/20 avaient retrouvée des résultats incohérents, avec des CV élevées. De plus, les concentrations des échantillons non dilués, au ½ et au 1/5 se retrouvaient souvent en dehors de la gamme de mesure. Une deuxième analyse a donc été réalisée avec un choix de dilution au 1/10, 1/20 et 1/50.

Avant correction par le facteur de dilution, les concentrations de TGF-b retrouvées avec dilution au 1/10 étaient comprises entre 74,58 et 278,34 pg/mL. Les dosages dilués au 1/20 montrent une concentration de TGF-b entre 73,28 et 147,29 pg/ml. Enfin les dosages dilués au 1/50 montrent une concentration de TGF-b entre 47,17 et 76,53 pg/mL. (Tableau 3). Quel que soit la dilution, les CV calculés sur chaque triplicat étaient inférieurs à 10% (excepté l'échantillon 1 avec un CV jusque 21,06%) (Annexe 2).

Concernant le dosage du TGF-β1, avant correction par le facteur de dilution, nous retrouvons des concentrations comprises dans la gamme de mesure pour les échantillons dilués au 1/10.
La gamme de concentration proposée par le kit allant de 31,33 à 2000 pg/mL. La concentration des échantillons dilués au 1/10 allant de 74,58 et 278,34 pg/m sont bien inclus dans la gamme de mesure. De la même manière les CV étaient satisfaisants.

Les conditions de dosage sont donc satisfaisantes en utilisant les échantillons non dilués pour la détermination de l'IL-10 et les échantillons dilués au 1/10 pour déterminer le TGF-b.

### 2.7.4. Dosage intra-folliculaire du TGF-β1 et IL-10 en ELISA automatisé

#### 2.7.4.1. Principe du dosage en microfluidique

Récemment, ont été mis au point des tests ELISA en microfluidique, dans lesquels un système de cassette est conçu de manière qu'un échantillon déposé dans un puit unique soit réparti dans des microcapillaires.

Les réactifs sont ensuite distribués selon un protocole (volumes, temps d'incubation, ...)

Établi grâce à un automate (Ella®). Selon les besoins, plusieurs dosages peuvent être effectués en même temps (Figure 6). Pour chaque dosage, la réaction antigène-anticorps se déroule de la même manière qu'un ELISA conventionnel, au sein de 3 réacteurs appelés glass nano reactor (GNR), produisant alors automatiquement des triplicats. A la fin de la réaction, il est détecté une intensité de fluorescence (vs une densité optique en ELISA conventionnel) qui,
rapportée à une courbe d'étalonnage, permet de déterminer la concentration de l'analyte dosé.
Le test ELISA en microfluidique présente donc l'avantage d'être en grande parti automatisé.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 6.** ELISA en microfluidique</figcaption></figure>

Les concentrations de cytokines anti-inflammatoires ont été déterminées dans le liquide folliculaire à l'aide du kit ELISA IL-10 et TGF-β1 humain (ELLA, BIOTECHNE, États-Unis) (Figure 7).

La gamme de quantification du TGF-β1 était de 20,8 à 12 684 pg/mL et de l'IL-10 de 0.58 à 2212 pg/mL.
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 7.** Schéma de la plaque utilisée pour dosages de cytokines et automate Ella</figcaption></figure>

### 2.7.4.2. Protocole de dosage en microfluidique

Chaque kit de dosage contenait une plaque de 72 puits. Il a fallu utiliser deux kits d'IL-10 et deux kits de TGF-β1 pour analyser les 134 échantillons des patientes.
Le protocole de dosage du TGF-β1 et de l'IL-10 était le suivant :

## IL-10

- Préparer le plan de plaque.

- Décongeler à température ambiante les échantillons placés à -80°C puis les centrifuger à 8000 g pendant 4 minutes.

- Pipeter 1mL de solution tampon et les placer dans les puits correspondants.

- Pipeter 50 µL d'un échantillon non dilué par puit

- Placer 50µL de contrôle haut (reconstitué) dans un puit. Placer 50 µL de contrôle bas (reconstitué) dans un autre puit.

- Scanner le code barre de la plaque, et la placer dans l'automate pour analyse

## TGF-β1

- Préparer le plan de plaque

- Décongeler à température ambiante les échantillons placés à -80°C puis les centrifuger à 8000 g pendant 4 minutes

- Etape d'activation du TGF-β latent de chaque échantillon : 40µL d'échantillon ont été mélangés à 20µL de 1 N HCl. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les échantillons ont été neutralisés par ajout de 20 µL de 1,5 NaOH/0,5 M HEPES.

- Pipeter 1mL de solution tampon et les placer dans les puits correspondants.

- Réaliser une dilution au 1/10 avec le diluant fourni par le kit

- Placer 50 µL d'un échantillon dilué par puit

- Placer 50µL de contrôle haut (reconstitué) dans un puit. Placer 50 µL de contrôle bas (reconstitué) dans un autre puit.

- Scanner le code barre de la plaque, et la placer dans l'automate pour analyse

- Préciser le facteur de dilution utilisé
Les résultats sont obtenus sous forme de tableau en moins de 90 minutes (Annexe3). Il montre
pour chaque échantillon, les résultats des triplicats (si l'automate a pu faire qu'une seule
mesure sur les trois, le résultat est indiqué comme ininterprétable). Une moyenne des
concentrations est faite pour chaque échantillon, et les CV sont reportés automatiquement
dans le tableau.

2.7.5. Analyses statistiques

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec Spss 25. Les données continues ont été présentées sous forme de moyenne et d'écart-type (ET) par des statistiques descriptives, et les données catégorielles sous forme de pourcentages (%). Les différences entre les groupes ont été évaluées à l'aide d'un test de Mann-Whitney (pour les variables quantitatives) ou d'un test de Chi², d'un test exact de Fisher ou d'un test t de Student (pour les variables qualitatives). Le seuil de signification statistique a été fixé à p ≤0,05.

L'expression de ces molécules a été soumise à une analyse multivariée pour l'identification de
marqueurs prédictifs majeurs de la qualité ovocytaire et embryonnaire. L'étude corrélative
entre les composants du liquide folliculaire et les résultats de la FIV a été évaluée à l'aide du
coefficient de Pearson. La courbe ROC (Receiver operating characteristic) a été appliquée
pour déterminer le meilleur point de coupure pour la discrimination entre l'IL-10 et la qualité
ovocytaire chez ces patientes. Les coefficients de variation intra- et inter-essais étaient
inférieurs à 10 %.
# 3. Résultats

## 3.1. Analyse descriptive de la population étudiée

Les patientes du groupe 2 étaient significativement plus âgées (35,9 ans, p < 0,05)

Concernant les autres paramètres descriptifs : AMH, répartition des protocoles agonistes et antagonistes, taux de progestérone et d'œstrogènes au jour du déclenchement et durée de la stimulation ovarienne, les deux groupes étaient comparables (Tableau 1)

<table><caption>Tableau 1. Analyse descriptive des deux groupes</caption><thead><tr><th>Parameters</th><th>Patient age</th><th>AMH (ng/ml)</th><th>Agonist /Antag rate</th><th>Progesterone Trigger day (ng/ml)</th><th>E2 trigger day (pg/ml)</th><th>Duration of stimulation</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="7"><strong>GROUP1(n=59)</strong></td></tr><tr><td>Mean±SD</td><td>30.22±3.05</td><td>3.46±2.5</td><td>44.06/55.9%</td><td>1.28±1.36</td><td>2492.7±1386</td><td>9.47±1.6</td></tr><tr><td>Min-max</td><td>19-34</td><td>0.2-13.1</td><td></td><td>0.3-9</td><td>106-8725</td><td>5-16</td></tr><tr><td colspan="7"><strong>GROUP2(n=75)</strong></td></tr><tr><td>Mean±SD</td><td>35.92±4.3*</td><td>3.35±3.34</td><td>18.6/81.33%</td><td>0.94±1</td><td>2234.53±1045</td><td>10.43±2.3</td></tr><tr><td>Min-max</td><td>19-42</td><td>0.7-9</td><td></td><td>0.1-8.77</td><td>659-4690</td><td>7-13</td></tr></tbody></table>

<footnote>*p<0.05 ; AMH : anti-müllerian hormone</footnote>
## 3.2. Etudes comparatives

Les taux de maturation, de fécondation, de blastulation et de congélation étaient comparables. Le taux de top embryons qui était significativement plus élevé dans le groupe 1 (65,21 % contre 35,48 % ; p=0,03).

Toutes les patientes ont bénéficié d'un transfert d'embryon simple ou double (frais ou congelé) pour tous les cycles, et la probabilité de succès était significativement plus élevée dans le groupe de bon pronostic (33,9 % contre 13,3 ; p = 0,004) (Tableau 2).

Les 134 patientes ont toutes eu au moins deux ovocytes prélevés. Seules 25 patientes ont eu recours à une stratégie de « freeze all » en raison d'une hyperstimulation, d'un endomètre fin ou d'un taux de progestérone élevé, et 22 patientes ont déjà bénéficié d'un transfert d'embryons congelés. En ce qui concerne les tentatives cumulées, seules 4 patientes en ont subi deux au cours de cette période d'inclusion des patientes.

<table><caption>**Tableau 2.** Analyse comparative des résultats de FIV des deux groupes</caption><thead><tr><th>Parameters</th><th>Maturation rate</th><th>Fertilisation rate</th><th>Top embryo rate</th><th>Blastulation rate</th><th>Freezing rate</th><th>Ongoing PR</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>GROUP1</strong></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><strong>Rate%</strong></td><td>70.4</td><td>73.5</td><td>65.21</td><td>40.83</td><td>22.03</td><td>33.9</td></tr><tr><td><strong>GROUP2</strong></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><strong>Rate%</strong></td><td>69.18</td><td>76.3</td><td>35.48</td><td>46.6</td><td>20.96</td><td>13.33</td></tr><tr><td><strong>p</strong></td><td>-</td><td>-</td><td>0.03</td><td>-</td><td>-</td><td>0.004</td></tr></tbody></table>

Il n'y avait pas de différence significative entre le groupe 1 et le groupe 2 pour le TGF-β1, mais ce facteur de croissance était significativement plus élevé dans le groupe 1 que dans le
groupe 2 sans SOPK et sans endométriose (4537 pg/ml contre 3856 pg/ml ; p=0,04)
respectivement. Quant à l'IL-10, il était significativement plus faible dans le groupe 1 que
dans le groupe 2 (6,26 pg/ml contre 12,5 pg/ml ; p=0,007) (Tableau 3).

<table><caption>Tableau 3. Concentrations de TGF-β1 et d'IL-10 dans le liquide folliculaire</caption><thead><tr><th>Parameters</th><th>GROUP1<br>(n=59)</th><th>GROUP2<br>(n=75)</th><th>GROUP3: GROUP2<br>without PCOS and<br>endometriosis(n=50)</th></tr></thead><tbody><tr><td><strong>TGF-β1(pg/ml)</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mean±SD</td><td>4537±1910</td><td>4208.9±1667.9</td><td>3856.07±1190.4</td></tr><tr><td>Min-max</td><td>2184-12314</td><td>1893-11685</td><td>1893-6106</td></tr><tr><td>p</td><td></td><td>(p=0.29)</td><td>(p=0.04)</td></tr><tr><td><strong>IL-10(pg/ml)</strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mean±SD</td><td>6.26±3.3</td><td>12.5±16.6</td><td>6.52±3.69</td></tr><tr><td>Min-max</td><td>3.1-60.3</td><td>3.4-101</td><td>3.4-62.3</td></tr><tr><td>p</td><td></td><td>(p=0.007)</td><td>(p=0.3)</td></tr></tbody></table>

### 3.3. Etudes corrélatives

Les corrélations de Pearson ont révélé que l'IL-10 était significativement et positivement corrélé à l'E2 et à la progestérone au jour du déclenchement (p=0,047 et p=0,006) respectivement, mais qu'il était significativement et négativement corrélé aux taux de fécondation, de blastulation et de grossesse continue. En ce qui concerne le TGF-β1, il n'était corrélé qu'à l'E2 et à la Pg au jour du déclenchement (Tableau 4).
<table><caption>**Tableau 4.** Corrélation entre résultats de FIV et biomarqueurs du liquide folliculaire</caption><thead><tr><th>Parameters</th><th>TGF-1 (pg/ml)</th><th>IL10 (pg/ml)</th></tr></thead><tbody><tr><td>E2 trigger day(pg/ml)</td><td>r=0.25(p=0.004)</td><td>r=0.27(p=0.047)</td></tr><tr><td>OR and 95% CI</td><td>1.5; 0.9-1.9</td><td>1.1;1-1.4</td></tr><tr><td>Pg trigger day (ng/ml)</td><td>r=0.24(p=0.006)</td><td>r=0.25(p=0.006)</td></tr><tr><td>OR and 95% CI</td><td>1.6; 0.85-2.02</td><td>1.2; 1-3.5</td></tr><tr><td>Fertilization rate</td><td>-</td><td>r= -0.2(p=0.027)</td></tr><tr><td>OR and 95% CI</td><td>-</td><td>3.5; 1.7-5.5</td></tr><tr><td>Blastulation rate</td><td>-</td><td>r= -0.25(p=0.042)</td></tr><tr><td>OR and 95% CI</td><td>-</td><td>1.1; 1.14-1.65</td></tr><tr><td>Ongoing PR</td><td>-</td><td>r= -0.17(p=0.049)</td></tr><tr><td>OR and 95% CI</td><td>-</td><td>1.35; 1.2-1.71</td></tr></tbody></table>

Une analyse ROC a été réalisée entre l'IL-10 et le taux de grossesse en cours afin d'évaluer le potentiel de l'IL-10 à prédire la grossesse. Une valeur seuil de 6,65 pg/ml d'IL-10 a été identifiée avec une AUC=0,6 et p=0,049.
# 4. Discussion

## 4.1. Etudes comparatives

### 4.1.1. Profil Th2 anti-inflammatoire

Dans cette étude, le groupe de patientes à bon pronostic avait des taux significativement plus bas d'IL-10 et des taux plus élevés de TGF-β1 dans le liquide folliculaire, le jour de la ponction ovocytaire.

Plusieurs études récentes ont démontré que les cytokines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires coexistent pendant la période de grossesse, mais qu'elles passent d'un profil Th1 à un profil Th2 au cours de la période d'implantation (10).

Cela signifie qu'au début de la FIV, la diminution des taux de cytokines Th2 était attendu chez les femmes de bon pronostic. Cependant, le TGF-β1 était plus élevé dans le groupe bon pronostic et ne semblait pas agir comme une cytokine anti-inflammatoire pendant la période de pré-implantation.

### 4.1.2. IL-10

#### 4.1.2.1. IL-10 et endométriose

L'IL-10 était significativement plus élevé dans le groupe 3, groupe de mauvais pronostic incluant les patientes SOPK en endométriose (p=0,007).

L'endométriose est une pathologie gynécologique courante chez les femmes en âge de procréer caractérisée par l'implantation et la croissance de tissu endométrial en dehors de la cavité utérine, se manifestant notamment par des douleurs pelviennes et étant à l'origine d'une infertilité. Des études ont montré que la pathogenèse de la maladie est très complexe et qu'elle est liée à des facteurs mécaniques, hormonaux, immunitaires, environnementaux et génétiques

Les réponses immunitaires et inflammatoires médiées par les cytokines ont été considérées comme jouant un rôle important dans la pathogenèse de l'endométriose. Il a été rapporté que les taux de cytokines anti-inflammatoires Th2 (notamment l'IL-10) étaient significativement
plus élevés dans le liquide péritonéal des patientes atteintes d'endométriose et qu'il y avait un changement significatif vers la réponse immunitaire Th2 chez les patientes atteintes d'endométriose (55)

Une méta-analyse a été réalisée pour prouver le rôle de l'IL-10 dans le développement des lésions d'endométriose, qui pourrait être en lien polymorphisme du promoteur du gène de l'IL-10 (56).

#### 4.1.2.2. IL-10 et SOPK

Le diagnostic de SOPK a été établi sur la base des recommandations de la conférence de consensus de Rotterdam en fonction d'au moins deux des trois caractéristiques suivantes : oligo- ou anovulation, signes cliniques et/ou biochimiques d'hyperandrogénie, et ovaires polykystiques (57).

Le SOPK semble influencer les taux d'IL-10 en les augmentant dans le liquide folliculaire, et les mêmes résultats ont été trouvés par Zhang et al. Dans l'ovaire, les facteurs immunologiques jouent un rôle important dans la folliculogenèse et le développement du corps jaune. La mauvaise qualité des ovocytes observée chez les patientes atteintes de SOPK est due à l'expression anormale de facteurs immunologiques dans le liquide folliculaire (58)

Les taux d'IL-10 ont été positivement associés aux niveaux d'IL-1 α, un régulateur apical de l'inflammation, et son augmentation dans le SOPK pourrait compenser le processus inflammatoire chronique (57).

#### 4.1.2.3. Impact de l'âge et des EIR sur les taux d'IL-10

Lorsque l'on compare le groupe 1 (bon pronostic) au groupe 3, la différence n'est pas significative (p=0,3). En effet, l'âge diminue l'expression de l'IL-10 et altère l'expression de l'IL-10 par l'activation des macrophages vers un phénotype pro-inflammatoire à dominante M1, avec une diminution de l'activation des macrophages M2 (59).

La non-significativité du taux d'IL-10 entre ces deux groupes pourrait également être expliquée par les EIR. En effet, on sait que les EIR sont associés à des taux plus faibles d'IL-
10 dans le sérum des patientes, démontré par un niveau d'expression de l'ARNm de l'IL-10 plus faible dans la population des lymphocytes B des patientes atteintes d'EIR. (60)

Ainsi, d'une part, il y a une diminution de l'IL-10 le jour de la ponction ovocytaire qui est bénéfique pour l'équilibre immunitaire dans le groupe bon pronostic et d'autre part, nous avons la diminution de l'IL-10 dans le groupe 3 par l'âge et les EIR. Ceci pourrait expliquer la non-significativité du résultat entre ces deux groupes. En conséquence, de nombreux facteurs interfèrent avec les taux d'IL-10 et il pourrait être moins fiable pour prédire le pronostic d'une patiente lors d'une tentative de FIV, mais des niveaux plus élevés sont associés à un mauvais pronostic.

### 4.1.3. TGF-β1

#### 4.1.3.1. TGF-β1 et bon pronostic

Le TGF-β1 était plus élevé dans le groupe de bon pronostic et la différence était presque significative par rapport au groupe 3 (p=0,054).

La signalisation du TGF-β1 sur les cellules de la granulosa est une voie bien étudiée impliquée dans le développement folliculaire et l'ovulation. Le TGF-β1 est sécrété par les exosomes des cellules de la granulosa et des cellules de la thèque présents dans le liquide folliculaire : il régule le recrutement, la dominance, la croissance et l'ovulation des follicules ovariens de mammifères en stimulant la synthèse de l'ADN dans les cellules de la granulosa. De plus, le TGF-β1 a un effet inhibiteur sur la production d'androgènes par les cellules de la thèque. Il est donc raisonnable de supposer que le TGF-β peut être impliqué dans la croissance folliculaire et la régulation de la synthèse d'œstradiol (61).

Le TGF-β1 augmente le taux d'IL-6 dans les cellules de la granulosa du follicule ovarien (61). L'IL-6 a été liée dans de nombreuses études à la qualité ovocytaire et au taux d'implantation (52). Ainsi, le taux augmenté de TGF-β1 dans le groupe bon pronostic pourrait être expliqué par ce mécanisme, expliquant la différence significative du taux de grossesse entre les deux groupes. Cependant, la dérégulation potentielle de cette voie par l'âge est responsable du déclin de la qualité ovocytaire et va de pair avec la dérégulation du Vascular Endothélial Growth Factor (VEGF) (61), ce qui pourrait expliquer son niveau plus faible dans le groupe 3.
#### 4.1.3.2. TGF-β1 et SOPK

En incluant le SOPK et l'endométriose dans le groupe mauvais pronostic (groupe 2), la différence avec le groupe (bon pronostic) n'est plus significative car les femmes atteintes de SOPK ont des taux circulants élevés de TGF-β1, ce qui contribue à la pathogenèse du syndrome (62).

La signalisation dérégulée du TGFβ a été liée à la physiopathologie du SOPK, et en particulier au développement de la fibrose ovarienne et des anomalies de la reproduction

De nombreux membres de la superfamille TGF-β sont exprimés dans l'ovaire et ont été impliqués dans la pathogenèse du développement anormal des follicules et de l'hyperandrogénie dans le SOPK, notamment les activines, les inhibines, l'AMH et les BMP.

L'ovaire SOPK est caractérisé par un épaississement de la capsule ovarienne et du stroma en raison d'un dépôt accru de collagène et de tissu fibreux. Or le TGF-β1 est connu pour réguler la synthèse de collagène et ont été impliqués dans la fibrose. Un stroma ovarien épaissi peut être un signe d'un dérèglement local du TGF-β, qui favorisent des changements fonctionnels au niveau folliculaire. Les follicules n'auront pas la capacité de se développer en un follicule dominant en raison du stroma ovarien fibrosé et de la turgescence excessive de l'ovaire, entraînant le phénotype SOPK d'anovulation hyperandrogénique (63).

Une biodisponibilité locale plus importante dans les tissus et une séquestration du TGF-β1 dans la matrice extracellulaire induisant une dérégulation de la fonction TGF-β1 en stimulant la sécrétion de l'hormone antimüllérienne (63).

#### 4.1.3.3. TGF-β1 et endométriose

Dans une étude de Young VJ. (2017), les patientes atteintes d'endométriose avaient des taux de TGF-β1 augmentés, ce qui suggère qu'il joue un rôle dans cette pathologie. Mais la nature des cellules sécrétrices contribuant à cette augmentation n'est pas claire.

Les taux TGF-β1 sont significativement plus élevés dans les fibres nerveuses des lésions péritonéales d'endométriose que dans les fibres nerveuses péritonéales. Le TGF-β1 peut également contribuer à la survie du tissu ectopique.
Le TGF-β1 serait capable d'augmenter l'invasion des cellules épithéliales endométriales et pourrait induire une transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) dans ces cellules, ce qui expliquerait l'augmentation de la capacité migratoire et d'invasion des lésions endométriosiques (64).

Le TGF-β1 est un régulateur établi de l'expression du VEGF. Les concentrations de VEGF dans le liquide péritonéal de femmes atteintes ou non d'endométriose sont en corrélation avec les concentrations de TGF-β1, ce qui suggère un rôle régulateur du TGF-β1 dans l'expression péritonéale du VEGF-A. La néoangiogenèse est une étape critique dans la physiopathologie de l'endométriose et des études ont démontré que le blocage de l'angiogenèse peut bloquer l'établissement ou la croissance des lésions d'endométriose dans un modèle murin d'endométriose. Donc la surexpression du TGF-β1 dans le microenvironnement de l'endométriose peut contribuer à la physiopathologie en induisant des changements dans le métabolisme cellulaire, en augmentant l'invasion cellulaire et en initiant la néoangiogenèse. Ainsi, le TGF-β1 est impliqué dans la pathogenèse de l'endométriose et ses propriétés inflammatoires prennent le pas ses propriétés anti-inflammatoires (64).

De plus, certaines études ont montré que les niveaux de TGF-β1 étaient plus élevés dans les stades III et IV de l'endométriose (65).

## 4.2. Etudes corrélatives

### 4.2.1. L-10 et E2 et Pg

Les taux sériques d'œstradiol et de progestérone le jour du déclenchement de l'ovulation étaient positivement corrélés aux taux d'IL-10 intra-folliculaire le jour de la ponction ovocytaire.

L'œstradiol et la progestérone sont connues pour avoir un effet immunomodulateur pendant la grossesse. Elles favorisent une réponse immunitaire de type Th2 anti-inflammatoire après l'implantation embryonnaire (66).

Ainsi, des taux plus élevés d'œstradiol pendant la stimulation ovarienne pourraient altérer l'implantation embryonnaire par des taux plus élevés d'IL-10. En fait, le groupe 2 comprenant les patientes SOPK avait les niveaux d'IL-10 les plus élevés, ce qui pourrait être un facteur de
diminution du taux de grossesse chez les patientes SOPK en plus de la qualité ovocytaire
altérée.

En ce qui concerne les interactions entre la progestérone et l'IL-10, les résultats sont
controversés dans la littérature. Certaines études montrent une corrélation négative car la
progestérone inhibe la sécrétion d'IL-10 par l'intermédiaire des lymphocytes B (67).

Cependant, les résultats de cette étude sont concordants avec une étude récente montrant que
des concentrations élevées de progestérone peuvent stimuler la production de cytokines anti-
inflammatoires, en particulier l'IL-4 et l'IL-10 (68).

4.2.2. TGF-β1 et E2 et Pg

Les taux sériques d'œstradiol et de progestérone au jour du déclenchement de l'ovulation étaient positivement corrélés aux taux de TGF- β1 dans le liquide folliculaire issu d'une ponction ovocytaire.

En ce qui concerne le TGF- β1, nos résultats concordent avec la littérature, et il est corrélé aux
taux sériques d'œstradiol le jour de la ponction ovocytaire. Certains auteurs suggèrent donc
que le TGF- β1 est le lien entre la FSH et l'E2 dans le développement des follicules (69).

Dans une ancienne étude, une hypothèse avait été émis que les taux de TGF-β 1 dans le
follicule pouvaient être corrélés avec le type d'hyperstimulation ovarienne utilisé et que la
production d'E2 par le follicule pourrait être liée aux taux de TGF-β1 dans le liquide
folliculaire.

L'expression folliculaire de TGF-β1 était régulée différemment par une FSH hautement
purifiée par rapport à une préparation contenant de la FSH et de la LH chez les patients ayant
recours à une FIV.

Les résultats de cette étude suggéraient que le TGF-β1 pouvait être régulé en réponse à la
stimulation de l'ovaire par les gonadotrophines et qu'il peut participer à la régulation de la
production d'œstradiol folliculaire (70).

De plus, certaines études ont montré que les micro-ARN responsables de la régulation de la
signalisation du TGF-β1 étaient significativement plus élevés dans les follicules de grande
taille, ce qui prouve l'impact de l'œstradiol sur la sécrétion de TGF-β1 (69).
Une étude récente a même proposé que le TGF-β1 régule l'activité de la kisspeptine. La kisspeptine est exprimée dans l'hypothalamus et affecte l'axe hypothalamo-hypophysogonadique et la fonction de reproduction en régulant la sécrétion de l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), et donc l'activité de l'E2 et de la Pg à travers la régulation de la GnRH (71).

Il semble que le TGF-β1 soit également un médiateur de l'action de la progestérone sur les cellules du stroma ovarien. La progestérone induit indirectement la décidualisation stromale en augmentant l'expression et la sécrétion du TGF-bêta1 par les cellules épithéliales (68).

En effet, dans l'étude de Fedotcheva TA (2022), l'expression des récepteurs TGF-β1 était plus élevée dans les cellules stromales que dans les cellules épithéliales pendant la phase sécrétoire alors qu'aucune variation de ce type n'a été observée pendant la phase proliférative. En coculture d'épithélium endométrial humain avec des cellules stromales, l'administration de Pg a stimulé la décidualisation ainsi que l'activation de la signalisation TGF-β dans les cellules stromales. La Pg a également augmenté de manière significative la concentration de TGF-β1 dans le milieu de coculture. Ces résultats appuient l'idée que la Pg induit la décidualisation stromale indirectement, c'est-à-dire en améliorant l'expression et la sécrétion de TGF-β1 à partir des cellules épithéliales.

L'effet « antimigratoire » du TGF-β1 sur l'invasion du trophoblaste, pourrait résulter d'une sécrétion dérivée de l'épithélium induite par la progestérone, pourrait être l'un des rôles attribués aux cellules épithéliales endométriales dans la régulation de l'invasion du trophoblaste, en particulier dans l'attachement trophectoderme-épithélium.

Les résultats obtenus confortent donc l'idée que la décidualisation stromale induite par la Pg pourrait être principalement médiée par le TGF-β1 sécrété par les cellules épithéliales endométriales en activant la signalisation Smad dans les cellules stromales (68).

### 4.2.3. IL-10 et qualité ovocytaire

La diminution des taux d'IL-10 est responsable de l'augmentation des niveaux d'IL-6, car l'IL-10 est un régulateur important de l'IL-6 (72). Il existe donc une interaction entre les cytokines inflammatoires et anti-inflammatoires. Dans une étude récente, l'augmentation des taux d'IL-6
est connue pour être en corrélation avec la qualité ovocytaire (52), ce qui pourrait expliquer la corrélation négative trouvée entre l'IL-10 et le taux de fécondation et le taux de blastulation.
En outre, l'IL-10 exerce une régulation négative sur le cycle cellulaire mitotique (73).

En revanche, une étude récente d'Artini et al a montré que des taux plus élevés d'IL-10 jouaient un rôle prédictif positif pour la fécondation et la qualité embryonnaire. Cependant ils ont analysé cette interleukine sur le liquide folliculaire après la détermination du statut de fécondation des ovocytes, ce qui pourrait être une limitation de l'étude car un liquide folliculaire peut être un mélange d'ovocytes fécondables et non fécondables (50).

### 4.2.4. IL-10 et taux de grossesse

La régression linéaire a montré une corrélation négative significative entre l'IL-10 et le taux de grossesse cumulé (p=0,049), ce qui a été prouvé dans d'autres études (74) avec une nouvelle valeur seuil de 6,65 pg/ml. En effet, elle a non seulement un rôle anti-inflammatoire mais aussi une fonction vasoprotectrice en initiant une placentation saine et sa dérégulation peut conduire à la prééclampsie (13). Son rôle anti-inflammatoire est induit par l'altération de la voie inflammatoire de signalisation CD-28, bien que l'IL-10 soit sécrétée par les cellules CD28-T (75), de sorte que des niveaux réduits d'IL-10 pendant la période pré-implantatoire permettront des niveaux plus élevés de cytokines pro-inflammatoires qui permettront l'invasion endométriale et l'implantation (52).

La diminution des taux d'IL-10 s'accompagne également d'une augmentation de la synthèse des lipides et du stockage des protéines (76). En ce qui concerne la synthèse des lipides, une étude très récente a démontré qu'il y a de plus en plus de preuves à l'appui du rôle des lipides dans la période péri-implantatoire et des changements lipidiques dans le microenvironnement maternel et embryonnaire (77), de sorte que la diminution des taux d'IL-10 permettra la synthèse des lipides, ce qui pourrait favoriser l'implantation de l'embryon. En outre, l'IL-10 a été corrélé négativement à l'IL-6 dans une autre étude (78), et est donc indirectement et négativement corrélé au taux de grossesse en cours (52).
4.2.5. TGF-β1 et taux d'implantation

Dans notre étude, nous n'avons pas trouvé de corrélation directe entre cette cytokine et le taux d'implantation, ce qui concorde avec certaines études.

Néanmoins, le TGF-β1 peut induire la différenciation des cellules cytotrophoblastes humaines en syncytiotrophoblastes non invasifs, un mécanisme qui pourrait restreindre l'implantation.

Une régulation étroite de l'invasion des cellules extra villositaires du cytotrophoblaste (EVT) est essentielle pour la placentation et l'établissement d'une grossesse réussie. Une invasion insuffisante de cellules EVT conduit au développement de la prééclampsie (PE) qui est une cause majeure de mortalité et de morbidité maternelles et périnatales. Le TGF-β1 et la kisspeptine sont exprimés dans le placenta humain et il a été démontré qu'ils inhibent l'invasion des cellules EVT

Une étude de Lanlan et al a démontré que les niveaux d'ARNm et de protéines de la kisspeptine dans l'EVT sont augmentés par le TGF-β1, ce qui peut inhiber l'invasion des cellules EVT (71). Bien que la kisspeptine soit connue pour son rôle crucial dans l'implantation (79), son activation par le TGF-β1 de la voie de signalisation ERK1/2 a conduit à un effet inhibiteur sur l'invasion du trophoblaste (71).

De plus, le TGF-β1 diminue la régulation des métalloprotéinases matricielles qui médient l'invasion des cellules EVT en inhibant l'expression du gène de la métalloprotéinase 9 (MMP9) (80). En effet, la MMP9 est fortement exprimée par le trophoblaste au site d'implantation, et elle est impliquée dans la propriété invasive du trophoblaste la régulation à la baisse de la MMP9 par le TGF-β1 pourrait donc limiter l'implantation (81).
4.2.6. Limites de l'étude

Il serait préférable d'inclure un plus grand nombre de patientes, et de réaliser une étude multicentrique pour augmenter la puissance de cette étude.

Les kits Ella pour dosage des cytokines en ELISA automatisé sont encore limités au domaine
de la recherche. Il faudrait donc établir un protocole standardisé afin que cette analyse
biologique soit applicable en clinique.

Nous avons trouvé des résultats intéressants concernant les patientes SOPK et
endométriosiques. Le profil cytokinique des patientes pourraient être à l'origine de nouveaux
mécanismes physiopathologiques de ces pathologies. Cette étude incluait peu de patientes
SOPK ou avec endométriose. Il faudrait donc réaliser des études de profil cytokinique
spécifiquement pour ces patientes.
**5. Conclusion**

Le dosage ces cytokines dans le liquide folliculaire a permis d'obtenir des résultats interprétables, sans l'interférence avec des cytokines présentes dans le sperme au moment de la réalisation d'une fécondation en ICSI ou en FIV.

Certaines études n'ont pas pu conclure si l'échec de l'implantation est dû à l'incapacité de l'embryon à initier un environnement inflammatoire pendant l'implantation ou à l'incapacité de la mère à déclencher ces interleukines à l'arrivée de l'embryon.

Mais notre étude, qui complète une étude précédente sur le dosage de cytokines pro-inflammatoires, a confirmé que cet équilibre immunitaire existe dès le début de la tentative de FIV et que le rôle de la mère dans cette homéostasie immunitaire peut être plus décisif que les sécrétions de cytokines par le trophoblaste.

Il semble que le profil de l'IL-10 avant le transfert d'embryon (précisément au jour de la ponction ovocytaire), pourrait être informatif sur les chances d'obtenir une grossesse évolutive car cette étude révèle des altérations dans les profils de cytokines intra-folliculaire des patientes de mauvais pronostic.

Cependant il existe des facteurs confondants comme l'âge et les EIR. Le TGF-β1 semble agir comme un facteur de croissance à cette période plutôt que comme une cytokine anti-inflammatoire si nous nous limitons à l'étude comparative, il était plus élevé dans le groupe de bon pronostic. Mais le TGF-β1 n'était pas associée aux résultats cliniques en FIV.

En ce qui concerne les patientes atteintes de SOPK ou d'endométriose, elles présentaient des taux plus élevés d'IL-10 et de TGF-β1, mais cela résultait d'un mécanisme lié à ces pathologies.

Par conséquent, en comparant les résultats avec ceux de la dernière étude (52), l'analyse des cytokines inflammatoires en période pré-implantatoire semble plus fiable pour prédire une grossesse saine que les cytokines anti-inflammatoires.
# 6. Perspectives

Comme il existe une orchestration entre les différentes interleukines et qu'elles constituent un vaste réseau de cytokines au site d'implantation, il serait intéressant d'analyser d'autres interleukines inflammatoires et anti-inflammatoires au cours de la période préimplantatoire.

En conséquence, nous pourrions développer un kit avec les interleukines les plus fiables comme test non invasif prédictif d'une grossesse clinique. Ainsi, il pourrait permettre aux patientes une prise en charge plus personnalisée en FIV

De nouvelles stratégies thérapeutiques pourraient être proposée chez les patientes en EIR comme une immunomodulation de l'endomètre par insémination intra utérine de PBMC autologue (Peripheral Blood Mononuclear cell) avant un transfert embryonnaire.

De plus, l'analyse de ces interleukines sur une large cohorte de patientes atteintes de SOPK ou d'endométriose pourrait permettre de découvrir de nouveaux mécanismes physiopathologiques et permettre le développement de nouvelles possibilités thérapeutiques pour ces patientes.
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# ANNEXES

## ANNEXE 1 : Concentrations en IL-10 intra-folliculaire obtenues par ELISA conventionnel (sur quelques échantillons de patientes inclues dans l'étude)

<table><thead><tr><th>Échantillon</th><th>Dilution</th><th>Concentration (pg.mL<sup>-1</sup>)</th><th>Coefficient de variation</th><th>Concentration corrigée au facteur de dilution (pg.mL<sup>-1</sup>)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">1</td><td>non dilué</td><td>11,48</td><td>24%</td><td>11,48</td></tr><tr><td>1/2</td><td>3,18</td><td>16%</td><td>6,37</td></tr><tr><td>1/5</td><td>-1,25</td><td>-33%</td><td>-6,26</td></tr><tr><td rowspan="3">2</td><td>non dilué</td><td>4,41</td><td>3%</td><td>4,41</td></tr><tr><td>1/2</td><td>0,50</td><td>5%</td><td>1,00</td></tr><tr><td>1/5</td><td>-0,21</td><td>-235%</td><td>-1,06</td></tr><tr><td rowspan="3">3</td><td>non dilué</td><td>7,66</td><td>2%</td><td>7,66</td></tr><tr><td>1/2</td><td>7,65</td><td>7%</td><td>15,31</td></tr><tr><td>1/5</td><td>1,92</td><td>10%</td><td>9,60</td></tr><tr><td rowspan="3">4</td><td>non dilué</td><td>8,00</td><td>7%</td><td>8,00</td></tr><tr><td>1/2</td><td>2,66</td><td>9%</td><td>5,33</td></tr><tr><td>1/5</td><td>0,02</td><td>2768%</td><td>0,05</td></tr><tr><td rowspan="3">5</td><td>non dilué</td><td>11,57</td><td>15%</td><td>11,57</td></tr><tr><td>1/2</td><td>8,78</td><td>8%</td><td>17,56</td></tr><tr><td>1/5</td><td>7,81</td><td>2%</td><td>39,05</td></tr><tr><td rowspan="3">6</td><td>non dilué</td><td>18,11</td><td>20%</td><td>18,11</td></tr><tr><td>1/2</td><td>4,88</td><td>13%</td><td>9,77</td></tr><tr><td>1/5</td><td>2,81</td><td>18%</td><td>14,06</td></tr><tr><td rowspan="3">7</td><td>non dilué</td><td>8,16</td><td>17%</td><td>8,16</td></tr><tr><td>1/2</td><td>1,51</td><td>76%</td><td>3,02</td></tr><tr><td>1/5</td><td>-0,23</td><td>-178%</td><td>-1,16</td></tr><tr><td rowspan="3">8</td><td>non dilué</td><td>14,52</td><td>3%</td><td>14,52</td></tr><tr><td>1/2</td><td>8,91</td><td>23%</td><td>17,82</td></tr><tr><td>1/5</td><td>2,78</td><td>115%</td><td>13,94</td></tr><tr><td rowspan="3">9</td><td>non dilué</td><td>8,57</td><td>5%</td><td>8,57</td></tr><tr><td>1/2</td><td>5,40</td><td>6%</td><td>10,81</td></tr><tr><td>1/5</td><td>1,63</td><td>11%</td><td>8,15</td></tr><tr><td rowspan="3">10</td><td>non dilué</td><td>12,40</td><td>5%</td><td>12,40</td></tr><tr><td>1/2</td><td>5,92</td><td>15%</td><td>11,85</td></tr><tr><td>1/5</td><td colspan="3">* Pas de lecture pour le duplicat</td></tr></tbody></table>
ANNEXE 2. Détermination des concentrations en TGF-B par ELISA conventionnel (sur quelques échantillons de patientes inclues dans l'étude)

<table><thead><tr><th>Echantillon</th><th>Dilution</th><th>Concentration (pg.mL<sup>-1</sup>)</th><th>Coefficient de variation</th><th>Concentration corrigée au facteur de dilution (pg.mL<sup>-1</sup>)</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">1</td><td>1/10</td><td>74,58</td><td>18,47%</td><td>1491,60</td></tr><tr><td>1/20</td><td>73,28</td><td>21,06%</td><td>2931,53</td></tr><tr><td>1/50</td><td>41,60</td><td>12,44%</td><td>4160,29</td></tr><tr><td rowspan="3">2</td><td>1/10</td><td>129,09</td><td>2,18%</td><td>2581,84</td></tr><tr><td>1/20</td><td>74,01</td><td>5,56%</td><td>2960,46</td></tr><tr><td>1/50</td><td>41,88</td><td>3,76%</td><td>4188,73</td></tr><tr><td rowspan="3">3</td><td>1/10</td><td>197,25</td><td>9,50%</td><td>3945,12</td></tr><tr><td>1/20</td><td>97,19</td><td>5,31%</td><td>3887,65</td></tr><tr><td>1/50</td><td>45,82</td><td>3,33%</td><td>4582,83</td></tr><tr><td rowspan="3">4</td><td>1/10</td><td>209,39</td><td>3,01%</td><td>4187,85</td></tr><tr><td>1/20</td><td>104,98</td><td>3,22%</td><td>4199,44</td></tr><tr><td>1/50</td><td>54,93</td><td>7,17%</td><td>5493,571</td></tr><tr><td rowspan="3">5</td><td>1/10</td><td>169,72</td><td>0,74%</td><td>3394,51</td></tr><tr><td>1/20</td><td>84,84</td><td>4,57%</td><td>3393,60</td></tr><tr><td>1/50</td><td>44,35</td><td>6,28%</td><td>4435,21</td></tr><tr><td rowspan="3">6</td><td>1/10</td><td>165,27</td><td>2,18%</td><td>3305,58</td></tr><tr><td>1/20</td><td>89,23</td><td>3,05%</td><td>3569,29</td></tr><tr><td>1/50</td><td>47,17</td><td>5,94%</td><td>4717,04</td></tr><tr><td rowspan="3">7</td><td>1/10</td><td>278,34</td><td>1,29%</td><td>5566,96</td></tr><tr><td>1/20</td><td>147,29</td><td>2,12%</td><td>5891,62</td></tr><tr><td>1/50</td><td>76,53</td><td>2,03%</td><td>7653,93</td></tr></tbody></table>
ANNEXE 3. Exemple d'un tableau de résultats du dosage de l'IL-10 par ELISA
automatisé (70 échantillons)

<table><thead><tr><th rowspan="2">Inlet</th><th>IL-10</th><th>IL-10</th><th>IL-10</th><th>IL-10</th><th>IL-10</th></tr><tr><th>GNRs</th><th>Mean RFU</th><th>RFU %CV</th><th>Mean Conc.</th><th>Conc. %CV</th></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>3</td><td>18,02</td><td>2,04</td><td>101</td><td>2,05</td></tr><tr><td>2</td><td>3</td><td>1,54</td><td>3,34</td><td>8,22</td><td>3,54</td></tr><tr><td>3</td><td>3</td><td>1,9</td><td>3,54</td><td>10,3</td><td>3,7</td></tr><tr><td>4</td><td>3</td><td>1,5</td><td>4,33</td><td>8</td><td>4,59</td></tr><tr><td>5</td><td>3</td><td>0,87</td><td>2,58</td><td>4,44</td><td>2,89</td></tr><tr><td>6</td><td>3</td><td>0,87</td><td>3,18</td><td>4,44</td><td>3,57</td></tr><tr><td>7</td><td>3</td><td>1,63</td><td>2,17</td><td>8,73</td><td>2,29</td></tr><tr><td>8</td><td>3</td><td>0,6</td><td>1,46</td><td>2,9</td><td>1,75</td></tr><tr><td>9</td><td>3</td><td>0,95</td><td>3,91</td><td>4,87</td><td>4,34</td></tr><tr><td>10</td><td>3</td><td>1,13</td><td>3,58</td><td>5,89</td><td>3,89</td></tr><tr><td>11</td><td>3</td><td>1,17</td><td>2,75</td><td>6,13</td><td>2,98</td></tr><tr><td>12</td><td>3</td><td>1,01</td><td>4,1</td><td>5,23</td><td>4,51</td></tr><tr><td>13</td><td>3</td><td>5,22</td><td>2,99</td><td>29</td><td>3,03</td></tr><tr><td>14</td><td>3</td><td>1,4</td><td>2,3</td><td>7,44</td><td>2,45</td></tr><tr><td>15</td><td>3</td><td>1,03</td><td>4,43</td><td>5,32</td><td>4,86</td></tr><tr><td>16</td><td>3</td><td>1,45</td><td>5,02</td><td>7,75</td><td>5,34</td></tr><tr><td>17</td><td>3</td><td>1</td><td>4,35</td><td>5,17</td><td>4,8</td></tr><tr><td>18</td><td>3</td><td>1,34</td><td>3,88</td><td>7,12</td><td>4,15</td></tr><tr><td>19</td><td>3</td><td>1,16</td><td>1,72</td><td>6,06</td><td>1,87</td></tr><tr><td>20</td><td>3</td><td>1,75</td><td>3,04</td><td>9,43</td><td>3,2</td></tr><tr><td>21</td><td>3</td><td>1,09</td><td>1,96</td><td>5,67</td><td>2,14</td></tr><tr><td>22</td><td>2</td><td>1,74</td><td>0,29</td><td>9,36</td><td>0,31</td></tr><tr><td>23</td><td>3</td><td>1,11</td><td>3,09</td><td>5,78</td><td>3,37</td></tr><tr><td>24</td><td>3</td><td>1,61</td><td>3,1</td><td>8,63</td><td>3,27</td></tr><tr><td>25</td><td>3</td><td>0,69</td><td>0,54</td><td>3,38</td><td>0,63</td></tr><tr><td>26</td><td>3</td><td>1,35</td><td>1,6</td><td>7,16</td><td>1,72</td></tr><tr><td>27</td><td>3</td><td>1,66</td><td>2,39</td><td>8,93</td><td>2,52</td></tr><tr><td>28</td><td>3</td><td>0,94</td><td>1,87</td><td>4,85</td><td>2,08</td></tr><tr><td>29</td><td>3</td><td>1,27</td><td>4,98</td><td>6,7</td><td>5,35</td></tr><tr><td>30</td><td>3</td><td>3,71</td><td>1,72</td><td>20,5</td><td>1,75</td></tr><tr><td>31</td><td>3</td><td>1,33</td><td>2,76</td><td>7,06</td><td>2,96</td></tr><tr><td>32</td><td>3</td><td>1,15</td><td>2,24</td><td>6,02</td><td>2,43</td></tr><tr><td>33</td><td>3</td><td>1,46</td><td>2,61</td><td>7,8</td><td>2,77</td></tr><tr><td>34</td><td>3</td><td>1,07</td><td>4,23</td><td>5,58</td><td>4,63</td></tr><tr><td>35</td><td>3</td><td>1,81</td><td>1,63</td><td>9,8</td><td>1,71</td></tr><tr><td>36</td><td>3</td><td>1,42</td><td>3,68</td><td>7,55</td><td>3,92</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><th></th><th></th><th>GNRs</th><th>Mean RFU</th><th>RFU % CV</th><th>Mean Conc.</th><th>Conc. % CV</th></tr></thead><tbody><tr><td></td><td>37</td><td>3</td><td>1,23</td><td>2,14</td><td>6,49</td><td>2,31</td></tr><tr><td></td><td>38</td><td>3</td><td>1,89</td><td>4,54</td><td>10,2</td><td>4,75</td></tr><tr><td></td><td>39</td><td>3</td><td>0,91</td><td>5,48</td><td>4,64</td><td>6,11</td></tr><tr><td></td><td>40</td><td>3</td><td>1,17</td><td>3,63</td><td>6,14</td><td>3,94</td></tr><tr><td></td><td>41</td><td>3</td><td>1,91</td><td>3,78</td><td>10,3</td><td>3,95</td></tr><tr><td></td><td>42</td><td>3</td><td>1,54</td><td>6,88</td><td>8,25</td><td>7,29</td></tr><tr><td></td><td>43</td><td>3</td><td>0,95</td><td>2,62</td><td>4,91</td><td>2,9</td></tr><tr><td></td><td>44</td><td>3</td><td>4,1</td><td>1,73</td><td>22,7</td><td>1,75</td></tr><tr><td></td><td>45</td><td>3</td><td>1,83</td><td>0,66</td><td>9,91</td><td>0,69</td></tr><tr><td></td><td>46</td><td>3</td><td>1,22</td><td>2,74</td><td>6,44</td><td>2,95</td></tr><tr><td></td><td>47</td><td>3</td><td>0,79</td><td>4,07</td><td>3,96</td><td>4,63</td></tr><tr><td></td><td>48</td><td>3</td><td>2</td><td>2,07</td><td>10,8</td><td>2,15</td></tr><tr><td></td><td>49</td><td>3</td><td>1,13</td><td>3,52</td><td>5,93</td><td>3,83</td></tr><tr><td></td><td>50</td><td>3</td><td>0,78</td><td>7,58</td><td>3,9</td><td>8,64</td></tr><tr><td></td><td>51</td><td>3</td><td>1,34</td><td>7,02</td><td>7,11</td><td>7,52</td></tr><tr><td></td><td>52</td><td>3</td><td>2,5</td><td>4,53</td><td>13,7</td><td>4,67</td></tr><tr><td></td><td>53</td><td>3</td><td>1,65</td><td>5,46</td><td>8,88</td><td>5,75</td></tr><tr><td></td><td>54</td><td>3</td><td>1,33</td><td>4,76</td><td>7,08</td><td>5,1</td></tr><tr><td></td><td>55</td><td>3</td><td>1,31</td><td>1,79</td><td>6,97</td><td>1,92</td></tr><tr><td></td><td>56</td><td>3</td><td>0,81</td><td>4,46</td><td>4,07</td><td>5,05</td></tr><tr><td></td><td>Contrôle haut</td><td>3</td><td>249,74</td><td>1,45</td><td>1711</td><td>1,84</td></tr><tr><td></td><td>58</td><td>3</td><td>0,82</td><td>2,29</td><td>4,18</td><td>2,59</td></tr><tr><td></td><td>59</td><td>3</td><td>1,15</td><td>2,26</td><td>6,01</td><td>2,46</td></tr><tr><td></td><td>60</td><td>3</td><td>1,26</td><td>0,32</td><td>6,66</td><td>0,35</td></tr><tr><td></td><td>61</td><td>3</td><td>0,97</td><td>1,23</td><td>5,02</td><td>1,36</td></tr><tr><td></td><td>62</td><td>3</td><td>0,61</td><td>4,88</td><td>2,95</td><td>5,81</td></tr><tr><td></td><td>63</td><td>3</td><td>0,91</td><td>1,7</td><td>4,65</td><td>1,89</td></tr><tr><td></td><td>64</td><td>3</td><td>0,84</td><td>2,88</td><td>4,25</td><td>3,25</td></tr><tr><td></td><td>Contrôle bas</td><td>3</td><td>6,36</td><td>1,18</td><td>35,4</td><td>1,19</td></tr><tr><td></td><td>66</td><td>3</td><td>1,75</td><td>0,6</td><td>9,41</td><td>0,63</td></tr><tr><td></td><td>67</td><td>3</td><td>0,83</td><td>4,67</td><td>4,22</td><td>5,27</td></tr><tr><td></td><td>68</td><td>3</td><td>1,47</td><td>6,36</td><td>7,86</td><td>6,76</td></tr><tr><td></td><td>69</td><td>3</td><td>1,01</td><td>3,89</td><td>5,22</td><td>4,28</td></tr><tr><td></td><td>70</td><td>3</td><td>1,22</td><td>3,57</td><td>6,43</td><td>3,86</td></tr><tr><td></td><td>71</td><td>3</td><td>1,36</td><td>0,94</td><td>7,24</td><td>1</td></tr><tr><td></td><td>72</td><td>3</td><td>0,98</td><td>2,92</td><td>5,07</td><td>3,22</td></tr></tbody><tfoot><tr><td colspan="7">* indicates that the concentration is out of range (on left = low, on right = high)</td></tr></tfoot></table>
# Impact du profil cytokinique anti-inflammatoire intrafolliculaire sur les résultats en FIV

## Résumé

La grossesse est considérée comme un état de semi-allogreffe. Il est reconnu qu'une grossesse réussie nécessite un équilibre entre cytokines pro-inflammatoires (Th1) et anti-inflammatoires (Th2) afin de réguler le dialogue à l'interface mère-embryon.

Cette étude se concentre sur deux cytokines anti-inflammatoires, l'IL-10 et le TGF-β1 dont le profil d'expression dans le liquide folliculaire est cohérent avec un rôle potentiel dans l'implantation.

Une étude prospective et longitudinale a été menée au sein du centre d'AMP du CHU Amiens-Picardie entre janvier et juillet 2022, en collaboration avec le laboratoire d'immunologie. Les taux de cytokines ont été mesurés dans le liquide folliculaire de 134 patientes prises en charge en FIV, et comparé les résultats entre les patientes de bon (groupe 1, n=59) et de mauvais pronostic (groupe 2, n= 75).

Le groupe bon pronostic était représenté par les femmes âgées ≤ 35 ans et en cours de première ou seconde tentative de FIV. Le groupe mauvais pronostic comprenait les femmes > 35 ans ou ayant eu plusieurs échecs d'implantation auparavant, ou avec des antécédents de SOPK ou d'endométriose Au sein du groupe mauvais pronostic, un sous-groupe a été ajouté permettant d'exclure les patientes ayant un SOPK ou de l'endométriose (groupe 3, n= 50).

L'IL-10 était significativement diminuée dans le groupe 1 comparé au groupe 2 (6,26 pg/ml vs 12, (pg/ml ; p = 0,007) et négativement corrélée au taux de fécondation, au taux de blastulation et au taux de grossesse (avec un cut-off à 6,65 pg/ml pour le taux de grossesse).

Concernant le TGF-β1, il était seulement corrélé au taux d'œstradiol et de progestérone au jour du déclenchement de l'ovulation. Il n'a pas été trouvé de corrélation entre le taux de grossesse et le TGF-β1.

D'après les résultats obtenus, il semblerait que le dosage de l'IL-10 avant un transfert d'embryon, et au jour de la ponction ovocytaire pourrait être informatif sur la chance d'obtenir une grossesse évolutive.

Il faudrait inclure d'autres cytokines pro et anti-inflammatoires dans le panel de dosages, pour comprendre au mieux l'interaction de ces cytokines au moment de l'implantation.

**Mots-clés:** Fécondation In Vitro ; Interleukine-10, Transforming Growth Factor β ; liquide folliculaire ; échecs d'implantation répétés
# Impact of intrafollicular anti-inflammatory cytokine profiles on IVF results

## Abstract

Pregnancy is considered a state of semi-allografting. It is recognized that a successful pregnancy requires a balance between pro-inflammatory (Th1) and anti-inflammatory (Th2) cytokines to regulate the dialogue at the mother-embryo interface. This study focuses on two anti-inflammatory cytokines, IL-10 and TGF-β1, whose expression profile in follicular fluid is consistent with a potential role in implantation.

A prospective, longitudinal study was carried out at Amiens Picardie University Hospital (Amiens, France) between January and July 2022, in collaboration with the immunology laboratory. Two cytokines levels were analysed in the follicular fluid of 134 patients undergoing IVF treatment and compared results between patients with good (group 1, n=59) and poor prognosis (group 2, n=75).

The good prognosis group was represented by women aged ≤ 35 years and in the process of a first or second IVF attempt. The poor prognosis group included women > 35 years of age, or with a history of PCOS or endometriosis, or with multiple previous implantation failures. Within the poor prognosis group, a subgroup was added to exclude patients with PCOS or endometriosis (group 3, n= 50).

IL-10 was significantly reduced in group 1 compared with group 2 (6.26 pg/ml vs. 12, (pg/ml; p = 0.007) and negatively correlated with fertilization rate, blastulation rate and pregnancy rate (with a cut-off at 6.65 pg/ml for pregnancy rate). TGF-β1 was only correlated with oestradiol and progesterone levels on the day of ovulation induction. No correlation was found between pregnancy rate and TGF-β1.

From the results obtained, it showed that IL-10 dosage before embryo transfer, and on the day of oocyte puncture, could be informative about the chance of achieving a progressive pregnancy.

Other pro- and anti-inflammatory cytokines should be included in the assay panel, to better understand the interaction of these cytokines at the time of implantation.

**Key words:** In Vitro Fertilization; Interleukine-10, Transforming Growth Factor β; follicular fluid; Recurrent implantation failure.