L'autophagie dans les cellules
dendritiques promeut des
lymphocytes CD4+ protecteurs
contre l'athérosclérose

Marc Clément<fnref n="1" />, Juliette Raffort<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Fabien Lareyre<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Ziad Mallat<fnref n="1" />,<fnref n="3" />

> L'athérosclérose est une lésion des artères de gros et moyen calibres. Elle est responsable de la survenue d'évènements cardiovasculaires indésirables, tels que l'infarctus du myocarde ou l'accident vasculaire cérébral. Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité, et une meilleure compréhension des mécanismes contribuant au développement de l'athérosclérose permettra de développer de nouveaux moyens thérapeutiques [1]. L'implication d'une réponse inflammatoire en réponse à l'agression chronique des vaisseaux avait été suggérée et étudiée depuis plus de 30 ans, mais ce n'est que très récemment que les premiers résultats d'essais thérapeutiques impliquant directement l'inflammation dans la survenue d'évènements cardiovasculaires indésirables chez l'homme ont été obtenus [2]. En effet, les lipoprotéines oxydées qui s'accumulent dans la paroi artérielle sont reconnues comme un signal de « danger » par les récepteurs du système immunitaire inné, qui sont exprimés aussi bien sur les cellules vasculaires que sur les cellules immunitaires innées attirées dans la paroi vasculaire par activation de ce système [3]. Ces cellules inflamma-toires, particulièrement les macrophages, sont importantes pour « nettoyer » les produits toxiques accumulés, mais une fois engorgées, elles finissent par mou-rir dans la lésion vasculaire naissante. L'altération des capacités de nettoyage de ces cellules entraîne l'accumulation de débris cellulaires, contribuant ainsi à la formation du noyau nécrotique de la plaque d'athérome. Nous avons récem-

ment montré que la reconnaissance de ces débris nécrotiques par le système immunitaire inné perpétue l'inflam-mation chronique au sein de la plaque d'athérome *via* la stimulation de récep-teurs comme CLEC4E ou CLEC9A (*C*-type lectin-like receptors, CTLR), exprimés par les cellules myéloïdes et capables de reconnaître des motifs moléculaires exposés lors de la nécrose cellulaire [4,5]. Empêcher la formation du noyau nécrotique et la réponse inflammatoire associée constitue donc un enjeu primor-dial dans la prévention des évènements cardiovasculaires indésirables.

La présence de cellules présentatrices d'antigènes, comme les cellules den-dritiques (DC, *dendritic cells*), dans la paroi artérielle contribue à l'activa-tion de cellules de l'immunité adapta-tive, dont font partie les lymphocytes T CD4+, *via* la présentation d'antigènes dérivés des lipoprotéines oxydées et reconnus comme du « non-soi » [6]. La différenciation de ces lymphocytes en lymphocytes T auxiliaires 1 (Th1), pro-duisant l'interféron gamma (IFN-γ) et le *tumor necrosis factor alpha* (TNF-α), ou en lymphocytes T régulateurs (Treg), exprimant le facteur de transcription Foxp3, dépend de l'état d'activation de la cellule dendritique (qui exprime alors des molécules de co-stimulation) et de l'environnement cytokinique lors de la présentation d'antigène au lymphocyte T naïf. Dans le contexte de l'athé-rosclérose, les lymphocytes Th1 sont principalement considérés comme pro-athérogènes, alors que les lymphocytes Treg ont des propriétés athéro-protec-

trices, principalement en favorisant la
résolution de l'inflammation et la répa-
ration de la paroi vasculaire [6].

Il existe quatre types principaux de DC chez la souris : dans les organes lym-phoïdes, il s'agit de DC résidentes CD8α⁺CD11b⁻ et CD8α⁻CD11b⁺, alors que dans les autres tissus, ce sont des DC CD103⁺CD11b⁻ et CD103⁻CD11b⁺. Le déve-loppement de ces sous-types de DC est dépendant de facteurs de transcription, IRF8/BATF3 pour les cellules CD8α⁺CD11b⁻ et CD103⁺CD11b⁻, et RBPJ/IRF4 pour les cellules CD11b⁺. Nous avons récemment montré que l'activation pro-athérogène des lymphocytes Th1 était dépendante de l'expression d'IRF8 par les DC [7].

C'est dans ce contexte que nous nous sommes intéressés au rôle de l'auto-phagie dans les DC. Au cours de l'auto-phagie, des vésicules intracellulaires se spécialisent dans la dégradation de divers organelles et protéines afin de les recycler. La formation des vési-cules d'autophagie dépend d'un com-plexe protéique formé par ATG5, ATG12 et ATG16L1. Ces protéines permettent la lipidation de la protéine LC3, qui sera enchâssée dans la membrane de l'autophagosome pour contribuer à son élongation et à sa fermeture. Une fois scellé, l'autophagosome fusionne avec le lysosome pour former un autopha-golysosome, qui dégrade le matériel séquestré (cargo autophagique). Les DC possèdent des lysosomes particuliers qui leur permettent d'apprêter au mieux les peptides antigéniques (pH faiblement acide). La fusion des vésicules d'auto-phagie avec les lysosomes contribue à

<footnote n="1">¹Division of cardiovascular medicine,
Université de Cambridge, Addenbrooke's
Hospital, CB20QQ Cambridge, Royaume Uni.</footnote>

<footnote n="2">²Université Côte d'Azur, Inserm, Centre méditerranéen de recherche moléculaire, Hôpital universitaire de Nice, 06003 Nice, France.</footnote>

<footnote n="3">³Inserm, Centre de recherche cardio-
vasculaire (PARCC) HEGP, 75015 Paris, France.
ziad.mallat@inserm.fr</footnote>
<figure><img src="image_1.png" /></figure>

<figure><img src="image_2.png" /><figcaption>**Figure 1.** Représentation schématique du rôle de l'autophagie des cellules dendritiques dans la modulation de la réponse immunitaire et le développement de l'athérosclérose. La suppression de la protéine ATG16L1, donc de l'autophagie, dans les cellules dendritiques CD11b⁺ (Atg16l1⁻/⁻, à droite) modifie profondément leur réponse au TGF-β, et favorise ainsi la production de lymphocytes T CD4⁺ régulateurs (Treg) aux dépens des lymphocytes T CD4⁺ producteurs d'IFN-γ (Th1), ce qui réduit le développement des plaques d'athérome.</figcaption></figure>

la production des banques d'antigènes présentés par les DC. Celles-ci étant présentes à la fois dans les organes lymphoïdes secondaires, comme la rate, et les artères athéromateuses, nous nous sommes demandés si l'autophagie dans les DC pouvait contribuer à l'activation et à la polarisation des lymphocytes CD4⁺ naïfs au cours de l'athérosclérose et modifier son évolution.

Afin d'étudier le flux autophagique dans les DC au cours de l'athérogenèse, nous avons utilisé un modèle de souris mutantes dépourvues du récepteur des lipoprotéines de faible densité (souris Ldlr⁻/⁻), transplantées avec une moelle osseuse provenant de souris transgéniques exprimant la protéine LC3 étiquetée avec la green fluorescent protein (LC3-GFP). L'analyse des DC de la rate et des artères de ces souris par cytométrie en flux a montré que ces cellules exprim-

maient plus fortement la GFP que les autres cellules immunitaires. Un régime alimentaire athérogène et l'administration à ces souris de chloroquine, un inhibiteur de la fusion des lysosomes avec les autophagosomes, ont augmenté l'expression de la LC3-GFP dans les DC CD11b⁺ de la rate et les DC CD103⁺CD11b⁻ des artères, montrant que le flux autophagique de ces CD était actif dans ces conditions expérimentales [8].

Pour savoir si l'activation de l'autophagie dans les DC jouait un rôle sur l'activation de la réponse immunitaire associée à l'athérosclérose, nous avons transplanté les souris Ldlr⁻/⁻ avec une moelle osseuse issue de souris Atg16l1 flox/flox exprimant ou non la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur du gène Itgax (exprimé spécifiquement dans les DC et une sous-population de macrophages). Après 8 semaines de régime athérogène,

les souris Ldlr⁻/⁻ transplantées dont les DC étaient dépourvues de la protéine ATG16L1 (souris Itgax cre+, Atg16l1 flox/ flox), donc déficientes pour l'autophagie, avaient un nombre de DC dans la rate équivalent à celui des souris transplantées témoins. En revanche, l'expression des protéines de classe II du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH II) par ces cellules était significativement diminuée. Cette diminution était associée à une réduction significative du nombre de lymphocytes T CD4⁺ et CD8⁺ dans la rate par rapport aux souris témoins, et à un changement qualitatif important : la proportion des lymphocytes Treg était augmentée. Dans la paroi des artères athéromateuses, l'accumulation des DC était équivalente dans les deux groupes de souris, mais la proportion de lymphocytes Treg était supérieure chez les souris dont les DC étaient déficientes pour l'autophagie, et cette augmentation s'accompagnait d'une réduction de la proportion de lymphocytes Th1, du développement de l'athérosclérose, et du noyau nécrotique de la plaque athéromateuse [8]. De plus, une déplétion en lymphocytes T a empêché la réduction de l'athérosclérose que nous avions observée chez ces souris, ce qui indiquait que la présence de lymphocytes T était nécessaire pour que l'absence d'autophagie dans les DC protège contre l'athérosclérose [8].

Afin d'affiner notre analyse, des souris exprimant la recombinase Cre sous le contrôle du promoteur du gène *Clec9a* (dont l'expression est plus spécifique des DC CD8α⁺ et CD103⁺) ont été croisées avec les souris Atg16l1 flox/flox. Après la transplantation de moelle et 8 semaines de régime athérogène, aucune différence en ce qui concerne l'athérosclérose ou les lymphocytes T n'a été observée entre les souris *Clec9a* cre+ Atg16l1 flox/flox, déficientes pour l'autophagie dans les DC CD8α⁺ et CD103⁺, et les souris témoins, suggérant que la protection contre l'athérosclérose implique l'absence d'autophagie dans les DC CD11b⁺. L'analyse par ARN-seq de DC triées par FACS (fluores-