# Etude des facteurs influençant l'amertume des vins blancs par l'analyse sensorielle

**Soline Caillé**<fnref n="1" />, **Catherine Chabalier**<fnref n="1" />, **Alain Samson**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />

## Introduction

L'amertume est un critère important dans l'acceptation des produits alimentaires et des boissons car elle serait associée, de manière innée, à des produits toxiques ou dangereux pour la santé de l'homme (Pandey et al., 2010).

Dans le vin, l'amertume est un des paramètres majoritaires pour définir le goût ; elle participe à l'équilibre général avec l'acidité et la sucrosité. Si l'amertume des vins rouges trouve son origine majeure dans leurs richesses en polyphénols dont on sait que certaines conformations de ces molécules peuvent l'exacerber (Noble, 1994), l'amertume des vins blancs est beaucoup plus controversée. Mieux comprendre son origine et agir éventuellement sur son niveau est un enjeu pour la filière afin de répondre aux attentes des consommateurs, de plus en plus sensibles à de faibles niveaux de défaut dans les vins (Leigh, 2010).

Certains cépages tels que le muscat à petits grains, le viognier ou le mauzac sont reconnus pour apporter plus fréquemment de l'amertume aux vins. En outre, ces cépages sont particulièrement sensibles à l'oxydation, qui renforcerait elle-même cette sensation (Nagel & Graber, 1988). D'autres facteurs engendreraient l'amertume : la concentration en certaines molécules, tel que l'alcool, les terpènes ou l'acroléine (Noble et al., 1988 ; Noble, 1994 ; Bauer et al., 2010), ou l'équilibre des perceptions gustatives. L'astringence peut par exemple perturber la perception de l'amertume (Brannan et al., 2001). A l'inverse, des paramètres peuvent diminuer cette perception comme l'acidité (Kallithraka et al., 1997), le taux de sucre ou de glycérol (Smith et al., 1996 ; Fontoin et al., 2008).

Pour diminuer l'amertume des vins blancs, des pratiques œnologiques sont bien connues. C'est le cas des collages comme avec la PVPP (poly vinyl poly pyrrolidone), qui se lie aux polyphénols (Caillet, 2006) ou l'édulcoration des vins au conditionnement. Cependant, ces solutions sont correctives et ne permettent pas de comprendre l'origine d'une amertume excessive afin de la prévenir.

Cette étude se propose d'identifier certains facteurs inhérents au raisin ou à la vinification impactant l'amertume des vins blancs pour mieux en comprendre son origine et mettre en place des actions préventives le plus en amont possible.

## Matériel et Méthodes

Les dispositifs expérimentaux mis en place lors de cette étude permettent d'étudier l'influence de deux facteurs marquant l'amertume des vins : le taux d'alcool et l'extraction de composés lors d'une macération pelliculaire (Tableau 1).

Les études ont été menées sur trois cépages : le muscat, le mauzac et le viognier, qui ont été identifiés comme des cépages qui communiquent fréquemment de l'amertume aux vins, lors d'une enquête faite en 2013, auprès de trente professionnels de la filière en Languedoc Roussillon.

<footnote n="1">¹ INRA – UMR 1083 Sciences pour l’œnologie, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="2">² INRA – UE 999 Pech Rouge, Gruissan, France</footnote>
# Etude des facteurs influençant l'amertume des vins blancs par l'analyse sensorielle

**Soline Caillé**<fnref n="1" />, **Catherine Chabalier**<fnref n="1" />, **Alain Samson**<fnref n="1" />,<fnref n="2" />

## Introduction

L'amertume est un critère important dans l'acceptation des produits alimentaires et des boissons car elle serait associée, de manière innée, à des produits toxiques ou dangereux pour la santé de l'homme (Pandey et al., 2010).

Dans le vin, l'amertume est un des paramètres majoritaires pour définir le goût ; elle participe à l'équilibre général avec l'acidité et la sucrosité. Si l'amertume des vins rouges trouve son origine majeure dans leurs richesses en polyphénols dont on sait que certaines conformations de ces molécules peuvent l'exacerber (Noble, 1994), l'amertume des vins blancs est beaucoup plus controversée. Mieux comprendre son origine et agir éventuellement sur son niveau est un enjeu pour la filière afin de répondre aux attentes des consommateurs, de plus en plus sensibles à de faibles niveaux de défaut dans les vins (Leigh, 2010).

Certains cépages tels que le muscat à petits grains, le viognier ou le mauzac sont reconnus pour apporter plus fréquemment de l'amertume aux vins. En outre, ces cépages sont particulièrement sensibles à l'oxydation, qui renforcerait elle-même cette sensation (Nagel & Graber, 1988). D'autres facteurs engendreraient l'amertume : la concentration en certaines molécules, tel que l'alcool, les terpènes ou l'acroléine (Noble et al., 1988 ; Noble, 1994 ; Bauer et al., 2010), ou l'équilibre des perceptions gustatives. L'astringence peut par exemple perturber la perception de l'amertume (Brannan et al., 2001). A l'inverse, des paramètres peuvent diminuer cette perception comme l'acidité (Kallithraka et al., 1997), le taux de sucre ou de glycérol (Smith et al., 1996 ; Fontoin et al., 2008).

Pour diminuer l'amertume des vins blancs, des pratiques œnologiques sont bien connues. C'est le cas des collages comme avec la PVPP (poly vinyl poly pyrrolidone), qui se lie aux polyphénols (Caillet, 2006) ou l'édulcoration des vins au conditionnement. Cependant, ces solutions sont correctives et ne permettent pas de comprendre l'origine d'une amertume excessive afin de la prévenir.

Cette étude se propose d'identifier certains facteurs inhérents au raisin ou à la vinification impactant l'amertume des vins blancs pour mieux en comprendre son origine et mettre en place des actions préventives le plus en amont possible.

## Matériel et Méthodes

Les dispositifs expérimentaux mis en place lors de cette étude permettent d'étudier l'influence de deux facteurs marquant l'amertume des vins : le taux d'alcool et l'extraction de composés lors d'une macération pelliculaire (Tableau 1).

Les études ont été menées sur trois cépages : le muscat, le mauzac et le viognier, qui ont été identifiés comme des cépages qui communiquent fréquemment de l'amertume aux vins, lors d'une enquête faite en 2013, auprès de trente professionnels de la filière en Languedoc Roussillon.

<footnote n="1">¹ INRA – UMR 1083 Sciences pour l’œnologie, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="2">² INRA – UE 999 Pech Rouge, Gruissan, France</footnote>
<table><caption>Tableau 1. Description des dispositifs expérimentaux</caption><thead><tr><th>Millésime</th><th>Cépage</th><th>Dispositif expérimental<br>Facteur taux d'alcool</th><th>Dispositif expérimental<br>Facteur Extraction de composés</th></tr></thead><tbody><tr><td>2013</td><td>Muscat</td><td>2 dates de récolte<br>Ajout de MCR</td><td>Pressurage direct<br>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2013</td><td>Viognier</td><td>2 dates de récolte<br>Ajout de MCR</td><td>Pressurage direct<br>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2014</td><td>Muscat</td><td>2 dates de récolte</td><td>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2014</td><td>Mauzac</td><td>2 dates de récolte<br>Effeuillage de la vigne</td><td></td></tr><tr><td>2015</td><td>Muscat</td><td>2 dates de récolte</td><td>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2015</td><td>Mauzac</td><td>2 dates de récolte<br>Effeuillage de la vigne</td><td></td></tr><tr><td>2016</td><td>Mauzac</td><td>2 dates de récolte<br>Ajout de MCR</td><td></td></tr></tbody></table>

L'analyse sensorielle des vins est réalisée par un jury expert (20 juges), sélectionné sur ses aptitudes sensorielles et entraîné (AFNOR ISO 8586). Les juges sont entraînés à identifier et évaluer l'intensité de l'amertume par l'utilisation de solutions standards (caféine, sulfate de quinine et L-phénylalanine). L'intensité de l'amertume est évaluée sur une échelle linéaire, continue et bornée. Les vins sont présentés en comparatif, selon un ordre basé sur un carré latin équilibré sur les effets arrières (Macfie et al., 1989) et dans des verres noirs standardisés INAO. Une répétition de l'analyse des vins est réalisée. Les données sont recueillies avec un système d'acquisition de données informatisé (FIZZ software, Biosystemes, Couternon France).

Le traitement statistique est réalisé avec le logiciel XLstat (Addinsoft, France), par des analyses de variances. Au préalable, les performances du jury (discrimination, répétabilité et consensus) sont vérifiées. Lorsque des différences significatives sont observées (p <0,05), les intensités moyennes sont comparées en utilisant le test de comparaison multiple Tukey (HSD). Des corrélations de Pearson sont calculées entre les données issues de l'analyse sensorielle et les données œnologiques des vins.

## Résultats et Discussion

La maturité correspond au ratio sucre/acide des baies de raisin avant récolte mais pendant la maturation, une modification plus complexe de la composition physico-chimique (arômes, polyphénols ...) des raisins se produit. C'est pour cela que l'ajout de moût concentré rectifié (MCR) en cours de fermentation a également été réalisé, afin de mesurer de façon plus indépendante l'augmentation de la perception de l'amertume avec le degré alcoolique.
<table><caption>Tableau 1. Description des dispositifs expérimentaux</caption><thead><tr><th>Millésime</th><th>Cépage</th><th>Dispositif expérimental<br>Facteur taux d'alcool</th><th>Dispositif expérimental<br>Facteur Extraction de composés</th></tr></thead><tbody><tr><td>2013</td><td>Muscat</td><td>2 dates de récolte<br>Ajout de MCR</td><td>Pressurage direct<br>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2013</td><td>Viognier</td><td>2 dates de récolte<br>Ajout de MCR</td><td>Pressurage direct<br>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2014</td><td>Muscat</td><td>2 dates de récolte</td><td>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2014</td><td>Mauzac</td><td>2 dates de récolte<br>Effeuillage de la vigne</td><td></td></tr><tr><td>2015</td><td>Muscat</td><td>2 dates de récolte</td><td>Décanteur centrifuge<br>Macération pelliculaire avant décanteur centrifuge</td></tr><tr><td>2015</td><td>Mauzac</td><td>2 dates de récolte<br>Effeuillage de la vigne</td><td></td></tr><tr><td>2016</td><td>Mauzac</td><td>2 dates de récolte<br>Ajout de MCR</td><td></td></tr></tbody></table>

L'analyse sensorielle des vins est réalisée par un jury expert (20 juges), sélectionné sur ses aptitudes sensorielles et entraîné (AFNOR ISO 8586). Les juges sont entraînés à identifier et évaluer l'intensité de l'amertume par l'utilisation de solutions standards (caféine, sulfate de quinine et L-phénylalanine). L'intensité de l'amertume est évaluée sur une échelle linéaire, continue et bornée. Les vins sont présentés en comparatif, selon un ordre basé sur un carré latin équilibré sur les effets arrières (Macfie et al., 1989) et dans des verres noirs standardisés INAO. Une répétition de l'analyse des vins est réalisée. Les données sont recueillies avec un système d'acquisition de données informatisé (FIZZ software, Biosystemes, Couternon France).

Le traitement statistique est réalisé avec le logiciel XLstat (Addinsoft, France), par des analyses de variances. Au préalable, les performances du jury (discrimination, répétabilité et consensus) sont vérifiées. Lorsque des différences significatives sont observées (p <0,05), les intensités moyennes sont comparées en utilisant le test de comparaison multiple Tukey (HSD). Des corrélations de Pearson sont calculées entre les données issues de l'analyse sensorielle et les données œnologiques des vins.

## Résultats et Discussion

La maturité correspond au ratio sucre/acide des baies de raisin avant récolte mais pendant la maturation, une modification plus complexe de la composition physico-chimique (arômes, polyphénols ...) des raisins se produit. C'est pour cela que l'ajout de moût concentré rectifié (MCR) en cours de fermentation a également été réalisé, afin de mesurer de façon plus indépendante l'augmentation de la perception de l'amertume avec le degré alcoolique.
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 1. Effet de la maturité et l'ajout de MCR sur l'amertume</figcaption></figure>

Pour l'ensemble des millésimes, excepté en 2014, pour lequel l'écart de maturité entre les deux dates de récoltes était plus faible que les autres millésimes, nous constatons des différences d'amertume significatives entre les deux maturités, avec une amertume plus prononcée pour la 2ème maturité.

En ce qui concerne l'ajout de MCR, pour le millésime 2013, une différence d'amertume est observée. En effet, les vins issus de la première maturité additionnés de MCR sont perçus aussi amers que les vins issus de la deuxième maturité. En 2016, l'effet est moins marqué.

<table><caption>Tableau 2. Corrélation de Pearson entre les données œnologiques et l'amertume</caption><thead><tr><th></th><th>Viognier<br>2013</th><th>Muscat<br>2013</th><th>Mauzac<br>2014</th><th>Muscat<br>2014</th><th>Mauzac<br>2015</th><th>Muscat<br>2015</th><th>Mauzac<br>2016</th></tr></thead><tbody><tr><th>Alcool</th><td>0,544</td><td>0,929</td><td>0,604</td><td>-0,099</td><td>0,72</td><td>0,99</td><td>0,961</td></tr><tr><th>Acidité totale</th><td>-0,287</td><td>-0,496</td><td>-0,592</td><td>-0,37</td><td>0,23</td><td>0,99</td><td>-0,954</td></tr><tr><th>pH</th><td>0,085</td><td>0,35</td><td>0,129</td><td>-0,393</td><td>0,42</td><td>0,95</td><td>0,853</td></tr></tbody></table>

Les corrélations effectuées avec les données œnologiques, nous permettent de confirmer les résultats de la recherche bibliographique sur le lien entre l'alcool et l'amertume (Noble, 1994). En effet, nous observons des corrélations globalement significatives entre ces deux critères. Plus le Titre Alcoométrique Volumique (TAV) est élevé et plus le vin est amer. Nous ne pouvons toutefois pas conclure que l'alcool est le seul responsable de l'augmentation d'amertume ; l'hypothèse qu'il doit agir en interaction avec d'autres composés du vin reste à explorer.

De plus, les corrélations entre la perception de l'amertume, l'acidité totale et le pH des vins ne sont pas significatives. Ce qui confirme également que le pH et l'acidité totale n'ont pas d'effet significatif sur la perception amère (Noble, 1994 ; Fontoin et al., 2008).

On peut donc conclure que le fait de récolter le raisin plus tardivement augmente l'amertume du vin avec une probabilité plus élevée. C'est certainement l'accroissement de la concentration en sucre dans les baies avec la maturité, et donc du taux d'alcool, dans les vins qui est le facteur principal d'augmentation de l'amertume.
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 1. Effet de la maturité et l'ajout de MCR sur l'amertume</figcaption></figure>

Pour l'ensemble des millésimes, excepté en 2014, pour lequel l'écart de maturité entre les deux dates de récoltes était plus faible que les autres millésimes, nous constatons des différences d'amertume significatives entre les deux maturités, avec une amertume plus prononcée pour la 2ème maturité.

En ce qui concerne l'ajout de MCR, pour le millésime 2013, une différence d'amertume est observée. En effet, les vins issus de la première maturité additionnés de MCR sont perçus aussi amers que les vins issus de la deuxième maturité. En 2016, l'effet est moins marqué.

<table><caption>Tableau 2. Corrélation de Pearson entre les données œnologiques et l'amertume</caption><thead><tr><th></th><th>Viognier<br>2013</th><th>Muscat<br>2013</th><th>Mauzac<br>2014</th><th>Muscat<br>2014</th><th>Mauzac<br>2015</th><th>Muscat<br>2015</th><th>Mauzac<br>2016</th></tr></thead><tbody><tr><th>Alcool</th><td>0,544</td><td>0,929</td><td>0,604</td><td>-0,099</td><td>0,72</td><td>0,99</td><td>0,961</td></tr><tr><th>Acidité totale</th><td>-0,287</td><td>-0,496</td><td>-0,592</td><td>-0,37</td><td>0,23</td><td>0,99</td><td>-0,954</td></tr><tr><th>pH</th><td>0,085</td><td>0,35</td><td>0,129</td><td>-0,393</td><td>0,42</td><td>0,95</td><td>0,853</td></tr></tbody></table>

Les corrélations effectuées avec les données œnologiques, nous permettent de confirmer les résultats de la recherche bibliographique sur le lien entre l'alcool et l'amertume (Noble, 1994). En effet, nous observons des corrélations globalement significatives entre ces deux critères. Plus le Titre Alcoométrique Volumique (TAV) est élevé et plus le vin est amer. Nous ne pouvons toutefois pas conclure que l'alcool est le seul responsable de l'augmentation d'amertume ; l'hypothèse qu'il doit agir en interaction avec d'autres composés du vin reste à explorer.

De plus, les corrélations entre la perception de l'amertume, l'acidité totale et le pH des vins ne sont pas significatives. Ce qui confirme également que le pH et l'acidité totale n'ont pas d'effet significatif sur la perception amère (Noble, 1994 ; Fontoin *et al.*, 2008).

On peut donc conclure que le fait de récolter le raisin plus tardivement augmente l'amertume du vin avec une probabilité plus élevée. C'est certainement l'accroissement de la concentration en sucre dans les baies avec la maturité, et donc du taux d'alcool, dans les vins qui est le facteur principal d'augmentation de l'amertume.
Un autre dispositif expérimental mis en place pour observer l'effet de la maturité est l'effeuillage. Celui-ci consiste à enlever une partie des feuilles pour exposer davantage les grappes au soleil et ainsi accélérer la maturation des baies tout en favorisant la synthèse de certains composés précurseurs d'arômes. Cette technique a été mise en œuvre suite à l'enquête de 2013 auprès des professionnelles de la filière, qui indiquait que les années plus ensoleillées produisaient plus fréquemment des vins plus amers. Cela a donc été réalisé par un effeuillage sur une vigne de cépage mauzac.

De plus, des études ont pu montrer que le fait d'effeuiller tôt permettait d'avoir des vins plus riches en composés phénoliques (ENTAV-ITV France, 2007). On peut donc supposer que le raisin est exposé à une sur-maturation au moment de la récolte, contrairement aux vignes non effeuillées. Cela va dans le même sens que les résultats de la thèse de Jérôme Pillet (2011), concernant la quantité de flavonols qui s'accumuleraient lors d'une surexposition au soleil.

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 2. Effet de l'effeuillage sur l'amertume</figcaption></figure>

Pour les deux millésimes, aucune différence significative d'amertume entre les vins issus de vignes effeuillées ou non effeuillées n'a été observée (Figure 2). Toutefois pour le millésime 2015, on observe une tendance : le vin effeuillé est perçu un peu plus amer. Nous ne pouvons donc pas confirmer le rôle de l'exposition au soleil sur la quantité de flavonols dans les raisins et son lien avec l'amertume des vins. Il faut noter qu'en 2014 l'effeuillage a été effectué trop tardivement dans le cycle végétatif de la vigne pour avoir un impact optimum.

Le deuxième facteur étudié : la macération pelliculaire, permet, quant à elle une extraction accrue de certains composés dans le moût en fonction de sa durée et de la température des baies. Il s'agit de voir si des composés extraits plus abondamment lors de cette macération seraient responsables de l'amertume des vins blancs. C'est le cas par exemple des acides phénols (Vérette et al., 1988; Peleg et Noble, 1995). Dans notre expérimentation, la macération est favorisée par un mélangeur/homogénéisateur horizontale réglable en température et un système centrifuge de foulage dont le principe consiste en un éclatement des baies sur une paroi.
Un autre dispositif expérimental mis en place pour observer l'effet de la maturité est l'effeuillage. Celui-ci consiste à enlever une partie des feuilles pour exposer davantage les grappes au soleil et ainsi accélérer la maturation des baies tout en favorisant la synthèse de certains composés précurseurs d'arômes. Cette technique a été mise en œuvre suite à l'enquête de 2013 auprès des professionnelles de la filière, qui indiquait que les années plus ensoleillées produisaient plus fréquemment des vins plus amers. Cela a donc été réalisé par un effeuillage sur une vigne de cépage mauzac.

De plus, des études ont pu montrer que le fait d'effeuiller tôt permettait d'avoir des vins plus riches en composés phénoliques (ENTAV-ITV France, 2007). On peut donc supposer que le raisin est exposé à une sur-maturation au moment de la récolte, contrairement aux vignes non effeuillées. Cela va dans le même sens que les résultats de la thèse de Jérôme Pillet (2011), concernant la quantité de flavonols qui s'accumuleraient lors d'une surexposition au soleil.

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 2. Effet de l'effeuillage sur l'amertume</figcaption></figure>

Pour les deux millésimes, aucune différence significative d'amertume entre les vins issus de vignes effeuillées ou non effeuillées n'a été observée (Figure 2). Toutefois pour le millésime 2015, on observe une tendance : le vin effeuillé est perçu un peu plus amer. Nous ne pouvons donc pas confirmer le rôle de l'exposition au soleil sur la quantité de flavonols dans les raisins et son lien avec l'amertume des vins. Il faut noter qu'en 2014 l'effeuillage a été effectué trop tardivement dans le cycle végétatif de la vigne pour avoir un impact optimum.

Le deuxième facteur étudié : la macération pelliculaire, permet, quant à elle une extraction accrue de certains composés dans le moût en fonction de sa durée et de la température des baies. Il s'agit de voir si des composés extraits plus abondamment lors de cette macération seraient responsables de l'amertume des vins blancs. C'est le cas par exemple des acides phénols (Vérette et al., 1988; Peleg et Noble, 1995). Dans notre expérimentation, la macération est favorisée par un mélangeur/homogénéisateur horizontale réglable en température et un système centrifuge de foulage dont le principe consiste en un éclatement des baies sur une paroi.
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 3. Effet de la macération pelliculaire sur l'amertume</figcaption></figure>

Aucune différence significative d'amertume n'a été perçue entre les vins issus du décanteur centrifuge et ceux issus de la macération pelliculaire préalable à l'extraction des jus avec un décanteur centrifuge. La seule différence significative d'amertume a été perçue, pour le cépage viognier en 2013, entre le vin avec un pressurage des baies dans un pressoir pneumatique et celui où les baies ont subi une macération suivie d'une extraction des jus avec un décanteur centrifuge.

Le fait de macérer le raisin avant l'extraction n'a pas eu un impact significatif sur l'amertume du vin. L'hypothèse que cette macération aurait permis une libération accrue de composés des éléments solides de la baie (pellicule, pépins) et que ces composés soient responsables d'une augmentation de l'amertume n'est donc pas vérifiée.

Le choix du cépage muscat a été déterminé par l'hypothèse que les composés terpéniques auraient une influence sur l'amertume. Ceci en se basant sur les travaux de Noble et al. (1988), qui stipule que l'amertume serait due aux terpènes aglycones ou à d'autres constituants. Des analyses de terpènes (linalol, nérol et géraniol) ont donc été réalisées sur les vins de muscat, millésime 2013. Les corrélations entre les concentrations de ces trois composés et la perception de l'amertume ne sont pas significatives et ne permettent de vérifier cette hypothèse.

## Conclusion

Lors de cette étude, nous avons étudié l'influence de deux facteurs sur l'amertume des vins : le taux d'alcool et la macération pelliculaire. Pour cela plusieurs expérimentations ont été mises en place pendant quatre millésimes.

Une maturité plus élevée du raisin ainsi que l'ajout de MCR en cours de fermentation communique aux vins plus d'amertume. Celle-ci peut être reliée notamment à la quantité d'alcool contenu dans le vin. Par contre, l'effeuillage qui permettrait une exposition plus importante au soleil, n'influence pas significativement l'amertume des vins, même si une tendance a été observée en 2015. Enfin, la macération pelliculaire avec une extraction plus poussée de composés du raisin n'a pas montré une perception accrue de l'amertume des vins.

Tout en étudiant des critères technologiques pouvant faire varier l'amertume des vins blancs, nous explorons une nouvelle piste d'identification de composés responsables d'amertume dans les vins : les peptides. Dans ce cadre, le lien peptide/amertume a été analysé sur les vins. Des premiers résultats sont encourageants mais le programme en cours ne nous permet pas aujourd'hui de présenter de résultats.
<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 3. Effet de la macération pelliculaire sur l'amertume</figcaption></figure>

Aucune différence significative d'amertume n'a été perçue entre les vins issus du décanteur centrifuge et ceux issus de la macération pelliculaire préalable à l'extraction des jus avec un décanteur centrifuge. La seule différence significative d'amertume a été perçue, pour le cépage viognier en 2013, entre le vin avec un pressurage des baies dans un pressoir pneumatique et celui où les baies ont subi une macération suivie d'une extraction des jus avec un décanteur centrifuge.

Le fait de macérer le raisin avant l'extraction n'a pas eu un impact significatif sur l'amertume du vin. L'hypothèse que cette macération aurait permis une libération accrue de composés des éléments solides de la baie (pellicule, pépins) et que ces composés soient responsables d'une augmentation de l'amertume n'est donc pas vérifiée.

Le choix du cépage muscat a été déterminé par l'hypothèse que les composés terpéniques auraient une influence sur l'amertume. Ceci en se basant sur les travaux de Noble et al. (1988), qui stipule que l'amertume serait due aux terpènes aglycones ou à d'autres constituants. Des analyses de terpènes (linalol, nérol et géraniol) ont donc été réalisées sur les vins de muscat, millésime 2013. Les corrélations entre les concentrations de ces trois composés et la perception de l'amertume ne sont pas significatives et ne permettent de vérifier cette hypothèse.

## Conclusion

Lors de cette étude, nous avons étudié l'influence de deux facteurs sur l'amertume des vins : le taux d'alcool et la macération pelliculaire. Pour cela plusieurs expérimentations ont été mises en place pendant quatre millésimes.

Une maturité plus élevée du raisin ainsi que l'ajout de MCR en cours de fermentation communique aux vins plus d'amertume. Celle-ci peut être reliée notamment à la quantité d'alcool contenu dans le vin. Par contre, l'effeuillage qui permettrait une exposition plus importante au soleil, n'influence pas significativement l'amertume des vins, même si une tendance a été observée en 2015. Enfin, la macération pelliculaire avec une extraction plus poussée de composés du raisin n'a pas montré une perception accrue de l'amertume des vins.

Tout en étudiant des critères technologiques pouvant faire varier l'amertume des vins blancs, nous explorons une nouvelle piste d'identification de composés responsables d'amertume dans les vins : les peptides. Dans ce cadre, le lien peptide/amertume a été analysé sur les vins. Des premiers résultats sont encourageants mais le programme en cours ne nous permet pas aujourd'hui de présenter de résultats.
Références

AFNOR ISO 8586. (1994), Analyse sensorielle – guide général pour la sélection, l’entraînement et le contrôle des sujets. AFNOR.

Bauer R., Cowan A., Crouch, A. (2010), Importance of 3-Hydroxypropionaldehyde and Derivatives in Production and Detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 3243–3250.

Brannan G.D., Setser C S., Kemp K.E. (2001), Interaction of astringency and taste characteristics. Journal of Sensory Studies, 2, 179–197.

Caillet M.A. (2006), Historique du collage, le collage des moûts et des vins : principe, résultats et perspectives. Revue française d'oenologie, 217.

Fontoin H., Saucier C., Teissedre P.L. et al. (2008), Effect of pH, ethanol and acidity on astringency and bitterness of grape seed tannin oligomers in model wine solution. Food Quality and Preference 19(3): 286-291.

Kallithraka S., Bakker J., Clifford M.N., (1997). Red wine and model wine astringency as affected by malic and lactic acid. Journal of Food Science, 62, 416-420

Leigh F. (2010), Linking wine flavour components, sensory properties and consumer quality perceptions. The Australian and New Zealand Wine Industry Journal, 25 (5), 18-23.

Mac Fie H., Bratchell M., Greenhoff K., et al. (1989), Designs to balance the effect of order of presentation and first order carry-over effects in hall tests. Journal of Sensory Studies, 4, 129-148.

Nagel C., Graber W. (1988), Effect of must oxygenation on quality of white wines. American Journal of Enology and Viticulture. 39, 1-4.

Noble A.C. (1994), Bitterness in wine. Physiology & Behavior, 56 (6), 1251-1255.

Noble A.C., Strauss C., Williams P. et al. (1988), Contribution of terpene glycosides to bitterness in Muscat wines. American Journal of Enology and Viticulture, 39, 129-131.

Pandey S., Kumar S., Prajapati S.K., et al. (2010), An overview on taste physiology and masking of bitter drugs. International Journal of Pharma and Bio sciences, 1 (3).

Peleg, H., & Noble, A. (1995). Perceptual properties of benzoic acid derivatives. Chemical Senses, 20, 393-440.

Pillet J. (2011). Impact du microclimat sur le métabolisme de la baie de raisin. Thèse : biologie végétale. Bordeaux : Université Victor Segalen Bordeaux. 198.

Smith A.K., June H., Noble A.C. (1996), Effects of viscosity on the bitterness and astringency of grape seed tannin. Food Quality and Preference, 3-4, 161-166.

Vérette, E., Noble, A., & Somers, T. (1988). Hydroxycinnamates of Vitis vinifera: sensory assessment in relation to bitterness in white wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 45, 267-272.
Références

AFNOR ISO 8586. (1994), Analyse sensorielle – guide général pour la sélection, l’entraînement et le contrôle des sujets. AFNOR.

Bauer R., Cowan A., Crouch, A. (2010), Importance of 3-Hydroxypropionaldehyde and Derivatives in Production and Detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 58, 3243–3250.

Brannan G.D., Setser C S., Kemp K.E. (2001), Interaction of astringency and taste characteristics. Journal of Sensory Studies, 2, 179–197.

Caillet M.A. (2006), Historique du collage, le collage des moûts et des vins : principe, résultats et perspectives. Revue française d'oenologie, 217.

Fontoin H., Saucier C., Teissedre P.L. et al. (2008), Effect of pH, ethanol and acidity on astringency and bitterness of grape seed tannin oligomers in model wine solution. Food Quality and Preference 19(3): 286-291.

Kallithraka S., Bakker J., Clifford M.N., (1997). Red wine and model wine astringency as affected by malic and lactic acid. Journal of Food Science, 62, 416-420

Leigh F. (2010), Linking wine flavour components, sensory properties and consumer quality perceptions. The Australian and New Zealand Wine Industry Journal, 25 (5), 18-23.

Mac Fie H., Bratchell M., Greenhoff K., et al. (1989), Designs to balance the effect of order of presentation and first order carry-over effects in hall tests. Journal of Sensory Studies, 4, 129-148.

Nagel C., Graber W. (1988), Effect of must oxygenation on quality of white wines. American Journal of Enology and Viticulture. 39, 1-4.

Noble A.C. (1994), Bitterness in wine. Physiology & Behavior, 56 (6), 1251-1255.

Noble A.C., Strauss C., Williams P. et al. (1988), Contribution of terpene glycosides to bitterness in Muscat wines. American Journal of Enology and Viticulture, 39, 129-131.

Pandey S., Kumar S., Prajapati S.K., et al. (2010), An overview on taste physiology and masking of bitter drugs. International Journal of Pharma and Bio sciences, 1 (3).

Peleg, H., & Noble, A. (1995). Perceptual properties of benzoic acid derivatives. Chemical Senses, 20, 393-440.

Pillet J. (2011). Impact du microclimat sur le métabolisme de la baie de raisin. Thèse : biologie végétale. Bordeaux : Université Victor Segalen Bordeaux. 198.

Smith A.K., June H., Noble A.C. (1996), Effects of viscosity on the bitterness and astringency of grape seed tannin. Food Quality and Preference, 3-4, 161-166.

Vérette, E., Noble, A., & Somers, T. (1988). Hydroxycinnamates of Vitis vinifera: sensory assessment in relation to bitterness in white wines. Journal of the Science of Food and Agriculture, 45, 267-272.
# Intérêt de l'utilisation des dérivés de levure en œnologie

**Julie Mekoue Nguela**<fnref n="1" />, **Nathalie Sieczkowski**<fnref n="1" />, **Céline Poncet-Legrand**<fnref n="2" />, **Stéphanie Roi**<fnref n="2" />, **Jean-Marc Brillouet**<fnref n="2" />, **Aude Vernhet**<fnref n="2" />

## Introduction

Les dérivés de levure constituent aujourd'hui une large famille d'auxiliaires de vinification communément employés à différents stades du processus de vinification. Ce sont les écorces de levures qui ont d'abord été utilisées pour la détoxification des moûts et des vins dans le but d'une meilleure maîtrise des fermentations alcooliques et malo-lactiques (1). Puis, en complément, les levures inactivées sont entrées dans la composition d'activateurs complexes de fermentation en diversifiant les sources azotées de nutriments sur une composante organique (source d'acides aminés...) (2). Puis dès le début des années 2000, les levures inactivées spécifiques (LIS) ont vu le jour. Leur développement s'est fortement inspiré de l'élevage traditionnel sur lies et des contributions des lies de levures à la qualité des vins liées notamment à leur pouvoir anti-oxydant et à la libération de composés d'intérêt (mannoprotéines...). Différents procédés de nature mécanique, physico-chimique ou enzymatique sont mis en oeuvre pour l'obtention de fractions de composition et de propriété différentes.

Révelant ainsi le potentiel immense de la levure en composés d'intérêt œnologique, les LIS ont rapidement trouvé leur utilité sur tout le processus de vinification pour différentes applications depuis le raisin jusqu'au vin fini :

* Protection des moûts et des vins contre l'oxydation (levures inactivées riches en glutathion),

* Protection et nutrition des levures et des bactéries au cours des fermentations alcooliques et malolactiques respectivement (autolysats de levure, levures inactivées, écorces de levure),

* Adsorption des composés toxiques/indésirables en fermentation ou en élevage (écorces de levure),

* Alternative à l'élevage sur lies (levures inactivées spécifiques),

* Collage pour les opérations de clarification, de stabilisation et d'affinage (extraits protéiques de levure),

* Stabilisation tartrique des vins (mannoprotéines).

Malgré un intérêt croissant pour l'utilisation des LIS en œnologie, les mécanismes exacts impliqués dans leur effet potentiel sur les vins (clarification, caractéristiques sensorielles et stabilité) restent mal connus. Ceci est lié : i) à la composition complexe des LIS, qui peuvent inclure du matériel intracellulaire de levure et des constituants pariétaux et ii) à la complexité de la matrice vin. Dans le contexte de la vinification en rouge, l'impact des LIS est principalement attribué aux interactions avec les composés phénoliques. Mais les modes d'action et les fractions impliquées aussi bien dans les LIS que dans les polyphénols restent peu identifiés. Ce travail présente les travaux de recherche réalisés à l'INRA de Montpellier (UMR SPO) dans le but de mieux comprendre les mécanismes d'interaction entre LIS et polyphénols dans le contexte de la vinification en rouge, et de progresser dans l'identification des fractions actives et des polyphénols impliqués. Nous présenterons ici les travaux de recherche portant sur : i) la sorption des polyphénols par les levures dans le contexte de l'élevage sur lies et ii) les interactions entre un extrait protéique de levure et les polyphénols dans le contexte du collage.

<footnote n="1">¹Lallemand SAS, 19 rue des Briquetiers, BP 59, 31 702 Blagnac, France</footnote>

<footnote n="2">²UMR Sciences Pour l'Œnologie-Montpellier-France</footnote>
# Intérêt de l'utilisation des dérivés de levure en œnologie

**Julie Mekoue Nguela**<fnref n="1" />, **Nathalie Sieczkowski**<fnref n="1" />, **Céline Poncet-Legrand**<fnref n="2" />, **Stéphanie Roi**<fnref n="2" />, **Jean-Marc Brillouet**<fnref n="2" />, **Aude Vernhet**<fnref n="2" />

## Introduction

Les dérivés de levure constituent aujourd'hui une large famille d'auxiliaires de vinification communément employés à différents stades du processus de vinification. Ce sont les écorces de levures qui ont d'abord été utilisées pour la détoxification des moûts et des vins dans le but d'une meilleure maîtrise des fermentations alcooliques et malo-lactiques (1). Puis, en complément, les levures inactivées sont entrées dans la composition d'activateurs complexes de fermentation en diversifiant les sources azotées de nutriments sur une composante organique (source d'acides aminés...) (2). Puis dès le début des années 2000, les levures inactivées spécifiques (LIS) ont vu le jour. Leur développement s'est fortement inspiré de l'élevage traditionnel sur lies et des contributions des lies de levures à la qualité des vins liées notamment à leur pouvoir anti-oxydant et à la libération de composés d'intérêt (mannoprotéines...). Différents procédés de nature mécanique, physico-chimique ou enzymatique sont mis en oeuvre pour l'obtention de fractions de composition et de propriété différentes.

Révelant ainsi le potentiel immense de la levure en composés d'intérêt œnologique, les LIS ont rapidement trouvé leur utilité sur tout le processus de vinification pour différentes applications depuis le raisin jusqu'au vin fini :

* Protection des moûts et des vins contre l'oxydation (levures inactivées riches en glutathion),

* Protection et nutrition des levures et des bactéries au cours des fermentations alcooliques et malolactiques respectivement (autolysats de levure, levures inactivées, écorces de levure),

* Adsorption des composés toxiques/indésirables en fermentation ou en élevage (écorces de levure),

* Alternative à l'élevage sur lies (levures inactivées spécifiques),

* Collage pour les opérations de clarification, de stabilisation et d'affinage (extraits protéiques de levure),

* Stabilisation tartrique des vins (mannoprotéines).

Malgré un intérêt croissant pour l'utilisation des LIS en œnologie, les mécanismes exacts impliqués dans leur effet potentiel sur les vins (clarification, caractéristiques sensorielles et stabilité) restent mal connus. Ceci est lié : i) à la composition complexe des LIS, qui peuvent inclure du matériel intracellulaire de levure et des constituants pariétaux et ii) à la complexité de la matrice vin. Dans le contexte de la vinification en rouge, l'impact des LIS est principalement attribué aux interactions avec les composés phénoliques. Mais les modes d'action et les fractions impliquées aussi bien dans les LIS que dans les polyphénols restent peu identifiés. Ce travail présente les travaux de recherche réalisés à l'INRA de Montpellier (UMR SPO) dans le but de mieux comprendre les mécanismes d'interaction entre LIS et polyphénols dans le contexte de la vinification en rouge, et de progresser dans l'identification des fractions actives et des polyphénols impliqués. Nous présenterons ici les travaux de recherche portant sur : i) la sorption des polyphénols par les levures dans le contexte de l'élevage sur lies et ii) les interactions entre un extrait protéique de levure et les polyphénols dans le contexte du collage.

<footnote n="1">¹Lallemand SAS, 19 rue des Briquetiers, BP 59, 31 702 Blagnac, France</footnote>

<footnote n="2">²UMR Sciences Pour l'Œnologie-Montpellier-France</footnote>
## Adsorption des polyphénols par les LIS dans le contexte de l'élevage

L'adsorption d'un pool de polyphénols purifié d'un vin rouge (Merlot) par la biomasse morte d'une souche de levure œnologique *Saccharomyces cerevisiae* a été étudiée et comparée à celle des parois cellulaires purifiées après broyage mécanique de la levure (3). Les expériences ont été réalisées en solution modèle vin, en présence de $10^8$ cellules/mL et des concentrations initiales en polyphénols variant de 0,01 à 5 g/L. Après 24 h de contact, les résultats ont mis en évidence une forte capacité des cellules entières à adsorber irréversiblement des quantités importantes de polyphénols, principalement les oligomères et les polymères de tanins et pigments dérivés (3). Les quantités fixées étaient de l'ordre de 200 mg de tanins et pigments dérivés par gramme de levures sèches (Figure 1). Seules des interactions très faibles ont été observées pour les parois cellulaires correspondantes, les quantités adsorbées étaient environ 10 fois moins importantes que celles observées avec les levures entières (Figure 1).

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 1A. Isothermes d'adsorption du pool de polyphénol purifié d'un vin rouge (Merlot) par des levures entières inactivées et par les parois purifiées correspondantes.</figcaption></figure>

Ces résultats ont soulevé la question du rôle réel joué par les parois cellulaires dans la capacité de la levure de fixer les tanins. Pour répondre à cette question, la microscopie électronique à transmission (Figure 1B et C) et la microscopie confocale (Figure 1D et E) ont été utilisées pour identifier les compartiments cellulaires impliqués dans les interactions avec les polyphénols (4). Les résultats ont montré que si les tanins interagissent avec les parois cellulaires, et en particulier avec les mannoprotéines (Figure 1C), la majeure partie des polyphénols passent à travers la paroi cellulaire et la membrane plasmique des cellules mortes pour interagir avec leurs composants intracellulaires (Figure 1E) (4). Ces résultats ont apporté de nouvelles informations concernant les tanins et leurs interactions avec la levure au cours de l'élevage des vins, démontrant ainsi que les interactions entre ces dernières et les polyphénols ne sont pas limitées à la paroi cellulaire, mais impliquent également et de façon plus importante les compartiments plus internes de la levure. Cette accumulation importante des tanins à l'intérieur des levures mortes présente la levure inactivée comme un vrai outil alternatif à l'élevage sur lies pour la réduction de l'astrangence des vins rouges.
Adsorption des polyphénols par les LIS dans le contexte de l'élevage

L'adsorption d'un pool de polyphénols purifié d'un vin rouge (Merlot) par la biomasse morte d'une souche de levure œnologique *Saccharomyces cerevisiae* a été étudiée et comparée à celle des parois cellulaires purifiées après broyage mécanique de la levure (3). Les expériences ont été réalisées en solution modèle vin, en présence de 10⁸ cellules/mL et des concentrations initiales en polyphénols variant de 0,01 à 5 g/L. Après 24 h de contact, les résultats ont mis en évidence une forte capacité des cellules entières à adsorber irréversiblement des quantités importantes de polyphénols, principalement les oligomères et les polymères de tanins et pigments dérivés (3). Les quantités fixées étaient de l'ordre de 200 mg de tanins et pigments dérivés par gramme de levures sèches (Figure 1). Seules des interactions très faibles ont été observées pour les parois cellulaires correspondantes, les quantités adsorbées étaient environ 10 fois moins importantes que celles observées avec les levures entières (Figure 1).

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>Figure 1A. Isothermes d'adsorption du pool de polyphénol purifié d'un vin rouge (Merlot) par des levures entières inactivées et par les parois purifiées correspondantes.</figcaption></figure>

Ces résultats ont soulevé la question du rôle réel joué par les parois cellulaires dans la capacité de la levure de fixer les tanins. Pour répondre à cette question, la microscopie électronique à transmission (Figure 1B et C) et la microscopie confocale (Figure 1D et E) ont été utilisées pour identifier les compartiments cellulaires impliqués dans les interactions avec les polyphénols (4). Les résultats ont montré que si les tanins interagissent avec les parois cellulaires, et en particulier avec les mannoprotéines (Figure 1C), la majeure partie des polyphénols passent à travers la paroi cellulaire et la membrane plasmique des cellules mortes pour interagir avec leurs composants intracellulaires (Figure 1E) (4). Ces résultats ont apporté de nouvelles informations concernant les tanins et leurs interactions avec la levure au cours de l'élevage des vins, démontrant ainsi que les interactions entre ces dernières et les polyphénols ne sont pas limitées à la paroi cellulaire, mais impliquent également et de façon plus importante les compartiments plus internes de la levure. Cette accumulation importante des tanins à l'intérieur des levures mortes présente la levure inactivée comme un vrai outil alternatif à l'élevage sur lies pour la réduction de l'astrangence des vins rouges.
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 1. Images de microscopie électronique à transmission de la levure sans polyphénol (B) et de la levure en présence de polyphénols de vin (C). Images de microscopie confocale de la levure sans polyphénol (D) et de la levure en présence de polyphénols de vin (E).</figcaption></figure>

## Interactions entre un extrait protéique de levure et les polyphénols dans le contexte du collage

Les mécanismes d'interaction entre un extrait protéique de levure issu de *Saccharomyces cerevisiae* et les polyphénols ont été étudiés en milieu modèle vin et avec une fraction de tanins natifs de pellicules de raisin d'un degré de polymérisation moyen (DPm) 27 (appelée **TP27**) à l'aide d'expériences d'adsorption/agrégation et d'analyses par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et calorimétrie de titration isotherme (ITC) (5). L'EPL utilisé ici est un mélange de composés intracellulaires et pariétaux, les macromolécules solubles étaient des protéines, mais aussi des mannoprotéines et des β-glucanes. Afin de mieux explorer les interactions EPL-tanins, ainsi que la part des mannoprotéines et des β-glucanes, des expériences d'ITC et de DLS ont été effectuées avec la fraction soluble de l'EPL, une solution commerciale de mannoprotéines de hauts poids moléculaires (> 10 kDa) purifiées de *Saccharomyces cerevisiae* et une chaine linéaire de β-glucane purifiée à partir d'algues (Laminarine). L'ITC, réalisée à 25°C, a permis de mesurer les changements d'enhalpie associés aux interactions entre les macromolécules (concentration 4 g/L) et les tanins (concentration 5 g/L). L'intensité de la chaleur dégagée et la pente des courbes de titration (**Figure 2 A, C et E**) montrent une plus forte interaction des tanins avec l'EPL par comparaison aux mannoprotéines et aux β-glucanes. La DLS permet de mettre en evidence les phénomènes d'agrégation et d'en suivre les cinétiques. Les expériences ont été réalisées à 25 °C pour des concentrations de tanins et de macromolécules fixées à 0,4 g/L. La **figure 2** (B, D et F) présente le diamètre hydrodynamique ($D_H$) des particules en suspension dans les échantillons avant interaction et dans le mélange après interaction. L'ajout de l'EPL dans la solution de tanins a conduit à la formation d'agrégats dont la taille augmente très rapidement et qui sédimentent spontanément au bout de 24 h (**Figure 2B**). Les résultats obtenus avec la laminarine ne montrent pas d'interactions avec les tanins conduisant à une agrégation (**Figure 2F**). Avec les mannoprotéines, les résultats montrent qu'il existe des interactions entre ces dernières et les tanins, conduisant à la formation d'agrégats.
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 1. Images de microscopie électronique à transmission de la levure sans polyphénol (B) et de la levure en présence de polyphénols de vin (C). Images de microscopie confocale de la levure sans polyphénol (D) et de la levure en présence de polyphénols de vin (E).</figcaption></figure>

## Interactions entre un extrait protéique de levure et les polyphénols dans le contexte du collage

Les mécanismes d'interaction entre un extrait protéique de levure issu de *Saccharomyces cerevisiae* et les polyphénols ont été étudiés en milieu modèle vin et avec une fraction de tanins natifs de pellicules de raisin d'un degré de polymérisation moyen (DPm) 27 (appelée **TP27**) à l'aide d'expériences d'adsorption/agrégation et d'analyses par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et calorimétrie de titration isotherme (ITC) (5). L'EPL utilisé ici est un mélange de composés intracellulaires et pariétaux, les macromolécules solubles étaient des protéines, mais aussi des mannoprotéines et des β-glucanes. Afin de mieux explorer les interactions EPL-tanins, ainsi que la part des mannoprotéines et des β-glucanes, des expériences d'ITC et de DLS ont été effectuées avec la fraction soluble de l'EPL, une solution commerciale de mannoprotéines de hauts poids moléculaires (> 10 kDa) purifiées de *Saccharomyces cerevisiae* et une chaine linéaire de β-glucane purifiée à partir d'algues (Laminarine). L'ITC, réalisée à 25°C, a permis de mesurer les changements d'enhalpie associés aux interactions entre les macromolécules (concentration 4 g/L) et les tanins (concentration 5 g/L). L'intensité de la chaleur dégagée et la pente des courbes de titration (**Figure 2 A, C et E**) montrent une plus forte interaction des tanins avec l'EPL par comparaison aux mannoprotéines et aux β-glucanes. La DLS permet de mettre en evidence les phénomènes d'agrégation et d'en suivre les cinétiques. Les expériences ont été réalisées à 25 °C pour des concentrations de tanins et de macromolécules fixées à 0,4 g/L. La **figure 2** (B, D et F) présente le diamètre hydrodynamique ($D_H$) des particules en suspension dans les échantillons avant interaction et dans le mélange après interaction. L'ajout de l'EPL dans la solution de tanins a conduit à la formation d'agrégats dont la taille augmente très rapidement et qui sédimentent spontanément au bout de 24 h (**Figure 2B**). Les résultats obtenus avec la laminarine ne montrent pas d'interactions avec les tanins conduisant à une agrégation (**Figure 2F**). Avec les mannoprotéines, les résultats montrent qu'il existe des interactions entre ces dernières et les tanins, conduisant à la formation d'agrégats.
Cependant, la taille de ces agrégats restent stable au cours du temps et aucune sédimentation n'a été observée (Figure 2D).

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 2. Résultats de l'ITC réalisé entre les tanins de pellicule de raisin (TP27) et (A) Extrait protéique de levure (EPL), (C) Laminarine (β-glucane) et (E) Mannoprotéines. Résultats de la DLS réalisée entre les tanins de pellicule de raisin (TP27) et (B) Extrait protéique de levure (EPL), (D) Laminarine (β-glucane) et (F) Mannoprotéines.</figcaption></figure>

Le rôle essentiel de la composition en protéines levuriennes de l'EPL vis-à-vis des polyphénols du raisin a ainsi été établi. De par son fort potentiel d'agrégation et de précipitation des tanins, l'EPL représente ainsi une alternative fiable et novatrice aux agents de collage jusqu'ici utilisés en oenologie, tout en respectant les nouvelles attentes des consommateurs en termes de sécurité alimentaire et d'intrants naturels. Ces travaux ont également conforté l'hypothèse selon laquelle les mannoprotéines libérées par les levures inactivées spécifiques peuvent contribuer à l'amélioration de la qualité gustative des vins rouges à travers la formation des complexes stables en solution avec les tanins. Il est par ailleurs attendu qu'une application en tout début de vinification des fractions enrichies en mannoprotéines
Cependant, la taille de ces agrégats restent stable au cours du temps et aucune sédimentation n'a été observée (Figure 2D).

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 2. Résultats de l'ITC réalisé entre les tanins de pellicule de raisin (TP27) et (A) Extrait protéique de levure (EPL), (C) Laminarine (β-glucane) et (E) Mannoprotéines. Résultats de la DLS réalisée entre les tanins de pellicule de raisin (TP27) et (B) Extrait protéique de levure (EPL), (D) Laminarine (β-glucane) et (F) Mannoprotéines.</figcaption></figure>

Le rôle essentiel de la composition en protéines levuriennes de l'EPL vis-à-vis des polyphénols du raisin a ainsi été établi. De par son fort potentiel d'agrégation et de précipitation des tanins, l'EPL représente ainsi une alternative fiable et novatrice aux agents de collage jusqu'ici utilisés en oenologie, tout en respectant les nouvelles attentes des consommateurs en termes de sécurité alimentaire et d'intrants naturels. Ces travaux ont également conforté l'hypothèse selon laquelle les mannoprotéines libérées par les levures inactivées spécifiques peuvent contribuer à l'amélioration de la qualité gustative des vins rouges à travers la formation des complexes stables en solution avec les tanins. Il est par ailleurs attendu qu'une application en tout début de vinification des fractions enrichies en mannoprotéines
pourrait conduire à limiter précocement l'agrégation des tanins et des anthocyanes, contribuant ainsi à la couleur et à la texture des vins rouges.

Conclusion

Ces travaux de recherche qui se poursuivent permettent de progresser dans la compréhension des mécanismes d'interaction entre dérivés de levure et polyphénols dans le contexte de la vinification en rouge, d'identifier les fractions potentiellement interessantes et d'expliquer les effets empiriquement observés. Les levures ont donc un potentiel infini, au cœur des fermentations alcooliques, elles sont aussi un réservoir immense de composés d'intérêt œnologique, pour l'amélioration de la qualité des vins.

Références

(1) A. Lonvaud-Funel, C. Desens, A. Joyeux. Stimulation de la fermentation malolactique par addition au vin d'enveloppes de levures et de différents adjuvvants de nature polysaccharidique et azotée. *Connaissance Vigne Vin*, 1985, 19, N° 4, 229-240.

(2) S. Lafon-Lafourcade, C. Geneix, P. Ribéreau-Gayon. Inhibition of alcoolic fermentation of grape must by fatty acids produced by yeasts and their elimination by yeast ghosts. *Appl. Environ. Microbiol*, 1984, 47, N° 6, 1246-1249.

(3) J. Mekoue Nguela, N. Sieczkowski, S. Roi. Vernhet, A. Sorption of Grape Proanthocyanidins and Wine Polyphenols by Yeasts, Inactivated Yeasts, and Yeast Cell Walls. *J. Agric. Food Chem.* 2015, **63**, 660–670.

(4) J. Mekoue Nguela, A. Vernhet, N. Sieczkowski, J. M. Brillouet. Interactions of Condensed Tannins with *Saccharomyces Cerevisiae* Yeast Cells and Cell Walls: Tannin Location by Microscopy. *J. Agric. Food Chem.* 2015, **63**, 7539–7545.

(5) J. Mekoue Nguela, C. Poncet-Legrand, N. Sieczkowski, A. Vernhet. Interactions of grape tannins and wine polyphenols with a yeast protein extract, mannoproteins and β-glucan. *Food Chemistry*, 2016, 210, 671–682.
pourrait conduire à limiter précocement l'agrégation des tanins et des anthocyanes, contribuant ainsi à la couleur et à la texture des vins rouges.

Conclusion

Ces travaux de recherche qui se poursuivent permettent de progresser dans la compréhension des mécanismes d'interaction entre dérivés de levure et polyphénols dans le contexte de la vinification en rouge, d'identifier les fractions potentiellement interessantes et d'expliquer les effets empiriquement observés. Les levures ont donc un potentiel infini, au cœur des fermentations alcooliques, elles sont aussi un réservoir immense de composés d'intérêt œnologique, pour l'amélioration de la qualité des vins.

Références

(1) A. Lonvaud-Funel, C. Desens, A. Joyeux. Stimulation de la fermentation malolactique par addition au vin d'enveloppes de levures et de différents adjuvvants de nature polysaccharidique et azotée. *Connaissance Vigne Vin*, 1985, 19, N° 4, 229-240.

(2) S. Lafon-Lafourcade, C. Geneix, P. Ribéreau-Gayon. Inhibition of alcoolic fermentation of grape must by fatty acids produced by yeasts and their elimination by yeast ghosts. *Appl. Environ. Microbiol*, 1984, 47, N° 6, 1246-1249.

(3) J. Mekoue Nguela, N. Sieczkowski, S. Roi. Vernhet, A. Sorption of Grape Proanthocyanidins and Wine Polyphenols by Yeasts, Inactivated Yeasts, and Yeast Cell Walls. *J. Agric. Food Chem.* 2015, **63**, 660–670.

(4) J. Mekoue Nguela, A. Vernhet, N. Sieczkowski, J. M. Brillouet. Interactions of Condensed Tannins with *Saccharomyces Cerevisiae* Yeast Cells and Cell Walls: Tannin Location by Microscopy. *J. Agric. Food Chem.* 2015, **63**, 7539–7545.

(5) J. Mekoue Nguela, C. Poncet-Legrand, N. Sieczkowski, A. Vernhet. Interactions of grape tannins and wine polyphenols with a yeast protein extract, mannoproteins and β-glucan. *Food Chemistry*, 2016, 210, 671–682.
# Les laccases de *Botrytis cinerea*: Structures, activités, effet souche et inhibitions par des extraits polyphénoliques

Cédric Saucier¹, Natalia Quijada Morín¹, François Garcia¹, François-Xavier Sauvage, Karen Lambert², Anne-Sophie Walker³, Muriel Viaud³, Laurent Tiers⁴, Christophe Hirtz⁴, Nerea Iturmendi⁵ & Virginie Moine⁵

(1) UMR SPO, Université Montpellier, INRA, Montpellier Supagro, France

(2) PHYMEDEXP, INSERM U1046, CNRS, UMR 9214 Université de Montpellier, France

(3) UMR 1290 BIOGER, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, France

(4) LBPC-IRMB, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Montpellier, France

(5) Biolaffort, 126 quai de la Souys, Bordeaux, France

## Introduction

*Botrytis cinerea* est responsable d'une des infections les plus importantes des raisins à maturité particulièrement dans les vignobles exposés aux conditions climatiques fraiches et pluvieuses. Il cause d'importantes baisses de qualité même à un tau de contamination estimée à 5% (Ky *et al.*, 2012). La couleur et les qualités organoleptiques des vins sont particulièrement affectées. La laccase provenant de *Botrytis cinerea* est étudiée depuis les années 1970 pour son activité dans le raisin et le vin mais aussi pour son activité oxydante vis à vis de différents substrats. On trouve dans la littérature scientifique plusieurs publications qui décrivent les principales caractéristiques de la laccase comme par exemple son poids moléculaire, son pourcentage de glycosylation, son point isoélectrique ou son activité en fonction du pH ou de la température. Néanmoins, il subsiste d'importantes variations de ces paramètres. Le récent séquençage du génome de Botrytis a mis en évidence la présence de plusieurs gènes pouvant coder des laccases (Amselem *et al.*, 2011).

L'objectif de nos travaux de recherches a été de caractériser les structures et les activités laccase de 3 souches de *Botrytis cinerea* (B0510, VA612 and RM344) par des techniques modernes: spectrométrie de masse, séquençage des gènes, % de glycosylation, mesure des activités enzymatiques et mesure de l'influence de paramètres environnementaux (température, pH).

## Résultats et Discussion

3 souches de Botrytis, une de référence (B0510) et deux souches isolées dans deux vignobles (VA612 et RM344) ont été cultivées au laboratoire dans des conditions identiques. Les analyses protéomiques sur gel SDS-PAGE des laccases isolées des cultures sont représentées **Figure 1**. Le poids moléculaire apparent des laccases est identique, de l'ordre de 94 kDa pour toutes les souches. De même le taux de glycosylation apparent après déglycosylation des laccases, est estimé à 68% pour toutes les souches. Toutefois, le taux d'activité des différentes souches et la gamme d'activité en fonction du pH sont différents pour les souches (**Figure 2**). Si toutes les souches sont actives au pH du moût de raisin et du vin (entre 3 et 4), on note une activité plus importante pour la souche VA 612 et une gamme d'activité plus large (entre 3 et 7) comparés aux autres souches. De même la stabilité des laccases vis à vis de la chaleur est très différente selon la souche (**Figure 3**): Les laccases produites par VA 612 sont nettement plus stables à la chaleur et ne sont inhibées qu'a partir de 60°C contrairement aux deux autres souches qui sont plus thermosensibles. Des analyses complètes au niveau moléculaire ont révélé que 2 protéines de types laccase sont produites par les 3 souches: les Laccase 3-BcLCC7 et Laccase 2-BcLcc2 ont été identifiées de manière formelle par spectrométrie de masse pour les 3 souches. Le séquençage des
# Les laccases de *Botrytis cinerea*: Structures, activités, effet souche et inhibitions par des extraits polyphénoliques

Cédric Saucier¹, Natalia Quijada Morín¹, François Garcia¹, François-Xavier Sauvage, Karen Lambert², Anne-Sophie Walker³, Muriel Viaud³, Laurent Tiers⁴, Christophe Hirtz⁴, Nerea Iturmendi⁵ & Virginie Moine⁵

(1) UMR SPO, Université Montpellier, INRA, Montpellier Supagro, France

(2) PHYMEDEXP, INSERM U1046, CNRS, UMR 9214 Université de Montpellier, France

(3) UMR 1290 BIOGER, INRA, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, France

(4) LBPC-IRMB, Centre Hospitalier Universitaire (CHU) de Montpellier, France

(5) Biolaffort, 126 quai de la Souys, Bordeaux, France

## Introduction

*Botrytis cinerea* est responsable d'une des infections les plus importantes des raisins à maturité particulièrement dans les vignobles exposés aux conditions climatiques fraiches et pluvieuses. Il cause d'importantes baisses de qualité même à un tau de contamination estimée à 5% (Ky *et al.*, 2012). La couleur et les qualités organoleptiques des vins sont particulièrement affectées. La laccase provenant de *Botrytis cinerea* est étudiée depuis les années 1970 pour son activité dans le raisin et le vin mais aussi pour son activité oxydante vis à vis de différents substrats. On trouve dans la littérature scientifique plusieurs publications qui décrivent les principales caractéristiques de la laccase comme par exemple son poids moléculaire, son pourcentage de glycosylation, son point isoélectrique ou son activité en fonction du pH ou de la température. Néanmoins, il subsiste d'importantes variations de ces paramètres. Le récent séquençage du génome de Botrytis a mis en évidence la présence de plusieurs gènes pouvant coder des laccases (Amselem *et al.*, 2011).

L'objectif de nos travaux de recherches a été de caractériser les structures et les activités laccase de 3 souches de *Botrytis cinerea* (B0510, VA612 and RM344) par des techniques modernes: spectrométrie de masse, séquençage des gènes, % de glycosylation, mesure des activités enzymatiques et mesure de l'influence de paramètres environnementaux (température, pH).

## Résultats et Discussion

3 souches de Botrytis, une de référence (B0510) et deux souches isolées dans deux vignobles (VA612 et RM344) ont été cultivées au laboratoire dans des conditions identiques. Les analyses protéomiques sur gel SDS-PAGE des laccases isolées des cultures sont représentées **Figure 1**. Le poids moléculaire apparent des laccases est identique, de l'ordre de 94 kDa pour toutes les souches. De même le taux de glycosylation apparent après déglycosylation des laccases, est estimé à 68% pour toutes les souches. Toutefois, le taux d'activité des différentes souches et la gamme d'activité en fonction du pH sont différents pour les souches **(Figure 2)**. Si toutes les souches sont actives au pH du moût de raisin et du vin (entre 3 et 4), on note une activité plus importante pour la souche VA 612 et une gamme d'activité plus large (entre 3 et 7) comparés aux autres souches. De même la stabilité des laccases vis à vis de la chaleur est très différente selon la souche **(Figure 3)** : Les laccases produites par VA 612 sont nettement plus stables à la chaleur et ne sont inhibées qu'a partir de 60°C contrairement aux deux autres souches qui sont plus thermosensibles. Des analyses complètes au niveau moléculaire ont révélé que 2 protéines de types laccase sont produites par les 3 souches: les Laccase 3-BcLCC7 et Laccase 2-BcLcc2 ont été identifiées de manière formelle par spectrométrie de masse pour les 3 souches. Le séquençage des
gènes codant pour ces laccases pour les 3 souches n'a pas permis de mettre en évidence des différences significatives pouvant expliquer les différences d'activité (Quijada-Morin *et al.*, 2017). De même la caractérisation des sites actifs par électrochimie n'a pas permis de détecter de différences significatives de profils qui étaient tous semblables à ceux de la **figure 4**.

Afin d'inhiber ces laccases en œnologie, les stratégies classiques sont l'utilisation de SO₂ ou du traitement à la chaleur. Afin de limiter les doses de SO₂ et d'énergie, d'autres possibilités existent telles que l'utilisation d'extraits polyphénoliques au niveau du moût pour la vinification en rouge. Un exemple de l'inhibition des laccases par un extrait polyphénolique de noix de galle est présenté Figure 5 et montre des résultats intéressants. Des recherches sont en cours pour développer des extraits polyphénoliques spécifiques de cette inhibition.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 1. Analyse des laccases des 3 souches sans (A) ou avec (B) déglycosylation</figcaption></figure>

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 2. Activités des laccases des 3 souches en fonction du pH</figcaption></figure>
gènes codant pour ces laccases pour les 3 souches n'a pas permis de mettre en évidence des différences significatives pouvant expliquer les différences d'activité (Quijada-Morin *et al.*, 2017). De même la caractérisation des sites actifs par électrochimie n'a pas permis de détecter de différences significatives de profils qui étaient tous semblables à ceux de la **figure 4**.

Afin d'inhiber ces laccases en œnologie, les stratégies classiques sont l'utilisation de SO₂ ou du traitement à la chaleur. Afin de limiter les doses de SO₂ et d'énergie, d'autres possibilités existent telles que l'utilisation d'extraits polyphénoliques au niveau du moût pour la vinification en rouge. Un exemple de l'inhibition des laccases par un extrait polyphénolique de noix de galle est présenté Figure 5 et montre des résultats intéressants. Des recherches sont en cours pour développer des extraits polyphénoliques spécifiques de cette inhibition.

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure 1. Analyse des laccases des 3 souches sans (A) ou avec (B) déglycosylation</figcaption></figure>

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 2. Activités des laccases des 3 souches en fonction du pH</figcaption></figure>
<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Figure 3. Effet de la température sur les activités laccases des 3 souches</figcaption></figure>

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 4. Profil électrochimique des laccases (CV, Cyclic Voltammetry ; SWV, Square Wave Voltammetry)</figcaption></figure>
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 3. Effet de la température sur les activités laccases des 3 souches</figcaption></figure>

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 4. Profil électrochimique des laccases (CV, Cyclic Voltammetry ; SWV, Square Wave Voltammetry)</figcaption></figure>
<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 5. Inhibition des laccases par un extrait phénolique de noix de galle</figcaption></figure>

Conclusion

Les analyses par spectrométrie de masse ont révélé la présence de deux laccases à poids moléculaire et degré de glycosylation équivalents pour les 3 souches mais on note en revanche différentes propriétés catalytiques des enzymes produites. Les mesures d'activité montrent des différences importantes entre les souches. Leurs comportements en fonction du pH et de la température sont également différents. Des mesures de potentiel redox et des activités vis-à-vis de différents composés phénoliques sont en revanche très proches selon les souches. Dans un deuxième temps, les interactions polyphénols-laccase ont été mesurées et on note des différences au niveau de l'inhibition. Les résultats de ces recherches apportent un éclairage nouveau à un phénomène bien connu des vinificateurs mais qui n'est pas systématiquement maîtrisable.

Références

Amselem, J., et al. 2011 Genomic Analysis of the Necrotrophic Fungal Pathogens *Sclerotinia sclerotiorum* and *Botrytis cinerea*. *Plos Genetics* 7, e1002230.

Ky, I., Lorrain, B., Jourdes, M., Pasquier, G., Fermaud, M., Geny, L., Rey P., Donech B., Teissedre, P. L. 2012. Assessment of grey mould (Botrytis cinerea) impact on phenolic and sensory quality of Bordeaux grapes, musts and wines for two consecutive vintages. *Australian Journal of Grape and Wine Research*, *18*, 215-226.

Mayer, A.M., Staples, R.C. 2002. Laccase: new functions for an old enzyme. *Phytochemistry* 60, 551-565.

Quijada-morin, N., Garcia, F., Lambert, K., Walker, A. S., Tiers, L., Viaud, M., Sauvage, F.X., Hirtz, C., Saucier, C. 2017. Strain effect on extracellular laccase activities from botrytis cinerea. *Austr. J.Grape Wine Res*. DOI: 10.1111/ajgw.12322

Steel, C.C., Blackman, J.W., Schmidtke, L.M. 2013. Grapevine Bunch Rots: Impacts on Wine Composition, Quality, and Potential Procedures for the Removal of Wine Faults. *Journal of Agricultural and Food Chemistry* 61, 5189-5206.
<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 5. Inhibition des laccases par un extrait phénolique de noix de galle</figcaption></figure>

Conclusion

Les analyses par spectrométrie de masse ont révélé la présence de deux laccases à poids moléculaire et degré de glycosylation équivalents pour les 3 souches mais on note en revanche différentes propriétés catalytiques des enzymes produites. Les mesures d'activité montrent des différences importantes entre les souches. Leurs comportements en fonction du pH et de la température sont également différents. Des mesures de potentiel redox et des activités vis-à-vis de différents composés phénoliques sont en revanche très proches selon les souches. Dans un deuxième temps, les interactions polyphénols-laccase ont été mesurées et on note des différences au niveau de l'inhibition. Les résultats de ces recherches apportent un éclairage nouveau à un phénomène bien connu des vinificateurs mais qui n'est pas systématiquement maîtrisable.

Références

Amselem, J., et al. 2011 Genomic Analysis of the Necrotrophic Fungal Pathogens *Sclerotinia sclerotiorum* and *Botrytis cinerea*. *Plos Genetics* 7, e1002230.

Ky, I., Lorrain, B., Jourdes, M., Pasquier, G., Fermaud, M., Geny, L., Rey P., Donech B., Teissedre, P. L. 2012. Assessment of grey mould (Botrytis cinerea) impact on phenolic and sensory quality of Bordeaux grapes, musts and wines for two consecutive vintages. *Australian Journal of Grape and Wine Research*, *18*, 215-226.

Mayer, A.M., Staples, R.C. 2002. Laccase: new functions for an old enzyme. *Phytochemistry* 60, 551-565.

Quijada-morin, N., Garcia, F., Lambert, K., Walker, A. S., Tiers, L., Viaud, M., Sauvage, F.X., Hirtz, C., Saucier, C. 2017. Strain effect on extracellular laccase activities from botrytis cinerea. *Austr. J.Grape Wine Res*. DOI: 10.1111/ajgw.12322

Steel, C.C., Blackman, J.W., Schmidtke, L.M. 2013. Grapevine Bunch Rots: Impacts on Wine Composition, Quality, and Potential Procedures for the Removal of Wine Faults. *Journal of Agricultural and Food Chemistry* 61, 5189-5206.
# Risques associés à l'activité Polyphénol Oxydase (PPO)
et vinification bas intrants

Yannick Sire, Elodie Remise, Alain Samson, Michel Moutounet, **Jean-Michel Salmon**

INRA Unité expérimentale de Pech Rouge (UE 0999), domaine de Pech Rouge, 11430 Gruissan, France

## Introduction

Dans le contexte actuel de la réduction des sulfites et plus généralement des intrants en vinification, le comportement de l'activité polyphénol oxydase doit être pris en compte du raisin à la récolte, au cours des étapes d'élaboration des moûts jusqu'à la fin de fermentation. En effet, cette activité enzymatique oxydante peut apparaître sous deux formes, soit sous forme soluble, soit sous forme liée à des particules, qui ne vont pas réagir de façon identique au cours du process d'élaboration du vin. Dans certaines conditions, le remplacement partiel des sulfites par un refroidissement de la vendange ou des moûts n'empêche pas une forte rémanence de cette activité, notamment sous sa forme soluble, même après la fin de fermentation alcoolique. Il est donc important de tenir compte spécifiquement de l'activité PPO soluble résiduelle, seule activité susceptible d'impacter significativement la conduite d'un itinéraire technologique (mené en bio ou non). En absence d'un effet suffisant des doses de sulfites ajoutés, seul un traitement thermique des moûts peut permettre une dénaturation totale de cette activité oxydante.

## Mesure de l'activité Polyphénol oxydase (PPO)

L'activité PPO a été mesurée de façon normée après extraction standardisée du raisin dans un pressoir anoxique de laboratoire, sans étapes de trituration ni de rebêchage. Cette mesure doit être considérée comme le potentiel en activité PPO de l'échantillon analysé, ce qui peut permettre de déterminer l'influence de pratiques culturales ou d'itinéraires d'élaboration sur la variation de ce potentiel. La vitesse de consommation de l'oxygène dissout est mesurée à l'aide d'une pastille PreSens® PSt3 (Precision Sensing GmbH, Regensburg, Allemagne) dans un flacon bouché vis de 5 ml thermostaté et sous agitation. Ce flacon est rempli de 4 ml d'une solution tampon saturée à l'air (citrate/phosphate Na₂HPO₄-2H₂O 50 mM, pH 4,8) contenant 10 mM d'acide chlorogénique, substrat possédant une très forte affinité vis-à-vis de la PPO du raisin (Lee *et al.*, 1983). La réaction est déclenchée par addition de 400 µl d'échantillon (moût ou vin brut), et la mesure d'activité est effectuée en condition de vitesse initiale pendant 5 minutes, la PPO étant soumise à inactivation pendant son fonctionnement (Whitaker, 1995). L'activité PPO correspond à la quantité d'oxygène consommé à une température de 25°C en nanokatal (nKat = nmol O₂ L⁻¹ s⁻¹). La différentiation entre activités PPO solubles et particulaires est obtenue par la mesure de l'activité sur un même échantillon avant et après centrifugation (10 min, 12000 ×g) (Interesse *et al.*, 1984).

## Evolution de l'activité Polyphénol oxydase (PPO) au cours de la maturation du raisin

L'activité PPO est essentiellement localisée dans les chloroplastes, mais également dans la fraction soluble de la cellule (Dubernet, 1974). Dès la rupture cellulaire, elle est retrouvée à la périphérie des débris cellulaires de la pulpe (Christensen, 2000), avec une augmentation de ses formes solubles (Macheix *et al.*, 1991).
# Risques associés à l'activité Polyphénol Oxydase (PPO)
et vinification bas intrants

Yannick Sire, Elodie Remise, Alain Samson, Michel Moutounet, **Jean-Michel Salmon**

INRA Unité expérimentale de Pech Rouge (UE 0999), domaine de Pech Rouge, 11430 Gruissan, France

## Introduction

Dans le contexte actuel de la réduction des sulfites et plus généralement des intrants en vinification, le comportement de l'activité polyphénol oxydase doit être pris en compte du raisin à la récolte, au cours des étapes d'élaboration des moûts jusqu'à la fin de fermentation. En effet, cette activité enzymatique oxydante peut apparaître sous deux formes, soit sous forme soluble, soit sous forme liée à des particules, qui ne vont pas réagir de façon identique au cours du process d'élaboration du vin. Dans certaines conditions, le remplacement partiel des sulfites par un refroidissement de la vendange ou des moûts n'empêche pas une forte rémanence de cette activité, notamment sous sa forme soluble, même après la fin de fermentation alcoolique. Il est donc important de tenir compte spécifiquement de l'activité PPO soluble résiduelle, seule activité susceptible d'impacter significativement la conduite d'un itinéraire technologique (mené en bio ou non). En absence d'un effet suffisant des doses de sulfites ajoutés, seul un traitement thermique des moûts peut permettre une dénaturation totale de cette activité oxydante.

## Mesure de l'activité Polyphénol oxydase (PPO)

L'activité PPO a été mesurée de façon normée après extraction standardisée du raisin dans un pressoir anoxique de laboratoire, sans étapes de trituration ni de rebêchage. Cette mesure doit être considérée comme le potentiel en activité PPO de l'échantillon analysé, ce qui peut permettre de déterminer l'influence de pratiques culturales ou d'itinéraires d'élaboration sur la variation de ce potentiel. La vitesse de consommation de l'oxygène dissout est mesurée à l'aide d'une pastille PreSens® PSt3 (Precision Sensing GmbH, Regensburg, Allemagne) dans un flacon bouché vis de 5 ml thermostaté et sous agitation. Ce flacon est rempli de 4 ml d'une solution tampon saturée à l'air (citrate/phosphate Na₂HPO₄-2H₂O 50 mM, pH 4,8) contenant 10 mM d'acide chlorogénique, substrat possédant une très forte affinité vis-à-vis de la PPO du raisin (Lee *et al.*, 1983). La réaction est déclenchée par addition de 400 µl d'échantillon (moût ou vin brut), et la mesure d'activité est effectuée en condition de vitesse initiale pendant 5 minutes, la PPO étant soumise à inactivation pendant son fonctionnement (Whitaker, 1995). L'activité PPO correspond à la quantité d'oxygène consommé à une température de 25°C en nanokatal (nKat = nmol O₂ L⁻¹ s⁻¹). La différentiation entre activités PPO solubles et particulaires est obtenue par la mesure de l'activité sur un même échantillon avant et après centrifugation (10 min, 12000 xg) (Interesse *et al.*, 1984).

## Evolution de l'activité Polyphénol oxydase (PPO) au cours de la maturation du raisin

L'activité PPO est essentiellement localisée dans les chloroplastes, mais également dans la fraction soluble de la cellule (Dubernet, 1974). Dès la rupture cellulaire, elle est retrouvée à la périphérie des débris cellulaires de la pulpe (Christensen, 2000), avec une augmentation de ses formes solubles (Macheix *et al.*, 1991).
<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure 1.** Evolution des activités polyphénol oxydase (PPO) totale (■) et soluble (■) au cours de la maturation du raisin. Mesures effectuées sur des prélèvements de microvignes cultivées en serre à température constante (20°C).</figcaption></figure>

Concernant l'évolution de l'activité PPO au cours de la maturation du raisin, il a déjà été signalé un pic d'activité totale aux environs de la maturité technologique suivi d'une diminution ultérieure, sans toutefois différentier activités solubles et particulaires (Wissemann et Lee, 1980 ; Sapis et al., 1983a). Aucun travail antérieur n'ayant été publié sur l'évolution de cette activité avant la maturité technologique, nous avons suivi celle-ci sur des microvignes, matériel permettant aisément d'obtenir une même variété à divers niveaux de maturité sur un même plant (Chaib et al., 2010). On observe sur microvignes un net remodelage de la localisation de la PPO (Figure 1). Au cours de la maturation, alors que l'activité de la PPO soluble augmente, l'activité de la PPO particulaire décroit, sans que l'activité totale ne semble affectée (Figure 1). Nous pouvons donc émettre l'hypothèse qu'il se produit au cours de la maturation un transfert de l'enzyme des fractions particulaires (parties solides) vers la partie liquide soluble (Remise, 2016).

## Variabilité de l'activité Polyphénol oxydase (PPO) en fonction des cépages et de facteurs culturaux

La variabilité de l'activité PPO décelable au moment de la récolte (à maturité technologique) a été étudiée pour différentes variétés, sur différentes parcelles et pour divers modes de conduite pour deux millésimes (Tableau 1). Même si cette étude n'est pas exhaustive, pour les 35 lots de raisin étudiés, l'activité PPO totale moyenne s'établit autour de 750 nKat, avec un écart-type de seulement 72 nKat (soit moins de 10% de la valeur moyenne). Cette valeur très centrée de l'activité PPO montre à l'évidence que les différences d'oxydabilité connues entre cépages blancs ne peuvent être attribuées à des variations de l'activité PPO. L'étude la plus similaire réalisée sur diverses variétés de raisins récoltés à maturité (Sapis et al., 1983b) montrait après extraction totale de la PPO par précipitation à l'acétone une variabilité de l'activité PPO d'un facteur 1 à 3 suivant les cépages. On peut noter que la seule variété de raisin noir testée sur deux millésimes (Grenache noir) rentre aussi dans cette fourchette. La répartition entre activités solubles et particulaires (Tableau 1) montre par contre une dispersion beaucoup plus forte, avec une répartition moyenne d'environ 50%, assortie d'un fort écart type (24%).
<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure 1.** Evolution des activités polyphénol oxydase (PPO) totale (■) et soluble (■) au cours de la maturation du raisin. Mesures effectuées sur des prélèvements de microvignes cultivées en serre à température constante (20°C).</figcaption></figure>

Concernant l'évolution de l'activité PPO au cours de la maturation du raisin, il a déjà été signalé un pic d'activité totale aux environs de la maturité technologique suivi d'une diminution ultérieure, sans toutefois différentier activités solubles et particulaires (Wissemann et Lee, 1980 ; Sapis et al., 1983a). Aucun travail antérieur n'ayant été publié sur l'évolution de cette activité avant la maturité technologique, nous avons suivi celle-ci sur des microvignes, matériel permettant aisément d'obtenir une même variété à divers niveaux de maturité sur un même plant (Chaib et al., 2010). On observe sur microvignes un net remodelage de la localisation de la PPO (Figure 1). Au cours de la maturation, alors que l'activité de la PPO soluble augmente, l'activité de la PPO particulaire décroit, sans que l'activité totale ne semble affectée (Figure 1). Nous pouvons donc émettre l'hypothèse qu'il se produit au cours de la maturation un transfert de l'enzyme des fractions particulaires (parties solides) vers la partie liquide soluble (Remise, 2016).

## Variabilité de l'activité Polyphénol oxydase (PPO) en fonction des cépages et de facteurs culturaux

La variabilité de l'activité PPO décelable au moment de la récolte (à maturité technologique) a été étudiée pour différentes variétés, sur différentes parcelles et pour divers modes de conduite pour deux millésimes (Tableau 1). Même si cette étude n'est pas exhaustive, pour les 35 lots de raisin étudiés, l'activité PPO totale moyenne s'établit autour de 750 nKat, avec un écart-type de seulement 72 nKat (soit moins de 10% de la valeur moyenne). Cette valeur très centrée de l'activité PPO montre à l'évidence que les différences d'oxydabilité connues entre cépages blancs ne peuvent être attribuées à des variations de l'activité PPO. L'étude la plus similaire réalisée sur diverses variétés de raisins récoltés à maturité (Sapis et al., 1983b) montrait après extraction totale de la PPO par précipitation à l'acétone une variabilité de l'activité PPO d'un facteur 1 à 3 suivant les cépages. On peut noter que la seule variété de raisin noir testée sur deux millésimes (Grenache noir) rentre aussi dans cette fourchette. La répartition entre activités solubles et particulaires (Tableau 1) montre par contre une dispersion beaucoup plus forte, avec une répartition moyenne d'environ 50%, assortie d'un fort écart type (24%).
<table><caption>**Tableau 1.** Activités PPO de différentes variétés de raisin (vendanges 2013 et 2014) pressurées en conditions anoxiques. En dehors des conditions dénotées par un astérisque, les vignes sont conduites en espalier, non irriguées et les raisins récoltés à maturité technologique. * : FI: fertirrigué, I: irrigué, NI: non irrigué, E: partiellement effeuillé, NE: non effeuillé, Mx: niveau de maturité à la récolte, TM: taille minimale, ESP: espalier, TRP: taille rase de précision.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Variétés (date, origine)</th><th rowspan="2">Activité totale<br>PPO<br>(nkat)</th><th colspan="2">Répartition</th></tr><tr><th>Soluble<br>(%)</th><th>Particulaire<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Bourboulenc (08/10/2013, UEPR parcelle 68)</td><td>842</td><td>74,5%</td><td>25,5%</td></tr><tr><td>Bourboulenc (22/09/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>739</td><td>79,2%</td><td>20,8%</td></tr><tr><td>Chardonnay (30/08/2013, UEPR parcelle 81)</td><td>821</td><td>84,2%</td><td>15,8%</td></tr><tr><td>Chardonnay (26/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>726</td><td>43,8%</td><td>56,2%</td></tr><tr><td>Chardonnay-FI* (25/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>759</td><td>65,7%</td><td>34,3%</td></tr><tr><td>Chardonnay-I* (25/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>701</td><td>87,0%</td><td>13,0%</td></tr><tr><td>Chardonnay-NI* (25/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>746</td><td>59,1%</td><td>40,9%</td></tr><tr><td>Grenache blanc (17/09/2013, UEPR parcelle 75)</td><td>834</td><td>10,7%</td><td>89,3%</td></tr><tr><td>Grenache gris (17/09/2013, UEPR parcelle 71)</td><td>693</td><td>10,8%</td><td>89,2%</td></tr><tr><td>Grenache noir (18/09/2013, UEPR parcelle 64)</td><td>799</td><td>26,3%</td><td>73,7%</td></tr><tr><td>Grenache noir (19/08/2014, UEPR parcelle 64)</td><td>574</td><td>20,9%</td><td>79,1%</td></tr><tr><td>Maccabeu (17/09/2013, UEPR parcelle 66)</td><td>803</td><td>80,3%</td><td>19,7%</td></tr><tr><td>Mauzac-E-M1* (23/09/2014, Limoux parcelle A)</td><td>761</td><td>45,2%</td><td>54,8%</td></tr><tr><td>Mauzac-E-M2* (02/10/2014, Limoux parcelle A)</td><td>732</td><td>28,8%</td><td>71,2%</td></tr><tr><td>Mauzac-NE-M1* (23/09/2014, Limoux parcelle A)</td><td>657</td><td>37,6%</td><td>62,4%</td></tr><tr><td>Mauzac-NE-M2* (02/10/2014, Limoux parcelle A)</td><td>740</td><td>69,5%</td><td>30,5%</td></tr><tr><td>Muscat (25/09/2013, UEPR parcelle 98)</td><td>773</td><td>25,4%</td><td>74,6%</td></tr><tr><td>Muscat (25/09/2013, UEPR parcelle 91)</td><td>786</td><td>96,7%</td><td>3,3%</td></tr><tr><td>Muscat-M1* (01/09/2014, UEPR parcelle 51)</td><td>797</td><td>64,9%</td><td>35,1%</td></tr><tr><td>Muscat-M2* (10/09/2014, UEPR parcelle 51)</td><td>682</td><td>52,1%</td><td>47,9%</td></tr><tr><td>Piquepoul (12/09/2014, UEPR parcelle 8)</td><td>720</td><td>44,9%</td><td>55,1%</td></tr><tr><td>Roussanne (17/09/2013, UEPR parcelle 68)</td><td>866</td><td>64,5%</td><td>35,5%</td></tr><tr><td>Sauvignon (09/09/2013, UEPR parcelle 10)</td><td>795</td><td>31,6%</td><td>68,4%</td></tr><tr><td>Syrah (19/09/2013, UEPR parcelle 22)</td><td>802</td><td>74,3%</td><td>25,7%</td></tr><tr><td>Vermentino (25/09/2013, UEPR parcelle 67)</td><td>807</td><td>45,0%</td><td>55,0%</td></tr><tr><td>Vermentino (25/09/2013, UEPR parcelle 68)</td><td>793</td><td>30,5%</td><td>69,5%</td></tr><tr><td>Vermentino-M1* (14/08/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>752</td><td>49,6%</td><td>50,4%</td></tr><tr><td>Vermentino-M2* (20/08/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>646</td><td>33,0%</td><td>67,0%</td></tr><tr><td>Vermentino-M3* (28/08/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>711</td><td>28,7%</td><td>71,3%</td></tr><tr><td>Vermentino-M4* (04/09/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>777</td><td>52,3%</td><td>47,7%</td></tr><tr><td>Vermentino-M5* (15/09/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>532</td><td>0,0%</td><td>100,0%</td></tr><tr><td>Viognier-TM (24/09/2013, UEPR parcelle 55)</td><td>820</td><td>73,0%</td><td>27,0%</td></tr><tr><td>Viognier-TM (08/09/2014, UEPR parcelle 55)</td><td>754</td><td>76,1%</td><td>23,9%</td></tr><tr><td>Viognier-ESP (20/08/2014, UEPR parcelle 55)</td><td>658</td><td>44,5%</td><td>55,5%</td></tr><tr><td>Viognier-TRP (28/08/2014, UEPR parcelle 55)</td><td>756</td><td>67,6%</td><td>32,4%</td></tr></tbody><tfoot><tr><td colspan="2">Moyenne</td><td>747</td><td>50,8%</td><td>49,2%</td></tr><tr><td colspan="2">(écart-type)</td><td>(72)</td><td>(24,3%)</td><td>(24,3%)</td></tr></tfoot></table>

Le degré de maturité à la récolte impacte aussi fortement la proportion d'activité PPO soluble résiduelle. Ces nouveaux résultats posent la question de l'efficacité du débourbage pour la réduction de l'activité PPO particulaire suivant la récolte, paramètre non pris en compte jusqu'à maintenant dans la réflexion du traitement de la vendange à la récolte, à réception et pour son traitement pré-fermentaire.

## Influence de la température sur l'activité Polyphénol oxydase (PPO) du raisin

Des travaux menés sur le refroidissement de la vendange ont permis de montrer que l'effet positif du refroidissement de la vendange était dominant sur l'effet négatif d'une plus forte solubilité de l'oxygène dans le moût (Frissant et al., 2012). En effet, un abaissement de la température moyenne de la vendange de 20°C à 5-7°C réduit la vitesse de la réaction enzymatique et amenuise donc l'intensité des phénomènes oxydatifs, en réduisant d'environ 50% (de 7 à 3 mg/L) la quantité totale d'oxygène consommé estimée depuis la récolte jusqu'à l'obtention du moût. Ce résultat (mesuré sur des moûts obtenus en situation industrielle) est ici confirmé puisque une réduction de température similaire entraîne une diminution de 50% de l'activité PPO (Figure 2). Il est à noter que, même à 0°C, environ 30%
<table><caption>**Tableau 1.** Activités PPO de différentes variétés de raisin (vendanges 2013 et 2014) pressurées en conditions anoxiques. En dehors des conditions dénotées par un astérisque, les vignes sont conduites en espalier, non irriguées et les raisins récoltés à maturité technologique. * : FI: fertirrigué, I: irrigué, NI: non irrigué, E: partiellement effeuillé, NE: non effeuillé, Mx: niveau de maturité à la récolte, TM: taille minimale, ESP: espalier, TRP: taille rase de précision.</caption><thead><tr><th rowspan="2">Variétés (date, origine)</th><th rowspan="2">Activité totale<br>PPO<br>(nkat)</th><th colspan="2">Répartition</th></tr><tr><th>Soluble<br>(%)</th><th>Particulaire<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Bourboulenc (08/10/2013, UEPR parcelle 68)</td><td>842</td><td>74,5%</td><td>25,5%</td></tr><tr><td>Bourboulenc (22/09/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>739</td><td>79,2%</td><td>20,8%</td></tr><tr><td>Chardonnay (30/08/2013, UEPR parcelle 81)</td><td>821</td><td>84,2%</td><td>15,8%</td></tr><tr><td>Chardonnay (26/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>726</td><td>43,8%</td><td>56,2%</td></tr><tr><td>Chardonnay-FI* (25/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>759</td><td>65,7%</td><td>34,3%</td></tr><tr><td>Chardonnay-I* (25/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>701</td><td>87,0%</td><td>13,0%</td></tr><tr><td>Chardonnay-NI* (25/08/2014, UEPR parcelle 81)</td><td>746</td><td>59,1%</td><td>40,9%</td></tr><tr><td>Grenache blanc (17/09/2013, UEPR parcelle 75)</td><td>834</td><td>10,7%</td><td>89,3%</td></tr><tr><td>Grenache gris (17/09/2013, UEPR parcelle 71)</td><td>693</td><td>10,8%</td><td>89,2%</td></tr><tr><td>Grenache noir (18/09/2013, UEPR parcelle 64)</td><td>799</td><td>26,3%</td><td>73,7%</td></tr><tr><td>Grenache noir (19/08/2014, UEPR parcelle 64)</td><td>574</td><td>20,9%</td><td>79,1%</td></tr><tr><td>Maccabeu (17/09/2013, UEPR parcelle 66)</td><td>803</td><td>80,3%</td><td>19,7%</td></tr><tr><td>Mauzac-E-M1* (23/09/2014, Limoux parcelle A)</td><td>761</td><td>45,2%</td><td>54,8%</td></tr><tr><td>Mauzac-E-M2* (02/10/2014, Limoux parcelle A)</td><td>732</td><td>28,8%</td><td>71,2%</td></tr><tr><td>Mauzac-NE-M1* (23/09/2014, Limoux parcelle A)</td><td>657</td><td>37,6%</td><td>62,4%</td></tr><tr><td>Mauzac-NE-M2* (02/10/2014, Limoux parcelle A)</td><td>740</td><td>69,5%</td><td>30,5%</td></tr><tr><td>Muscat (25/09/2013, UEPR parcelle 98)</td><td>773</td><td>25,4%</td><td>74,6%</td></tr><tr><td>Muscat (25/09/2013, UEPR parcelle 91)</td><td>786</td><td>96,7%</td><td>3,3%</td></tr><tr><td>Muscat-M1* (01/09/2014, UEPR parcelle 51)</td><td>797</td><td>64,9%</td><td>35,1%</td></tr><tr><td>Muscat-M2* (10/09/2014, UEPR parcelle 51)</td><td>682</td><td>52,1%</td><td>47,9%</td></tr><tr><td>Piquepoul (12/09/2014, UEPR parcelle 8)</td><td>720</td><td>44,9%</td><td>55,1%</td></tr><tr><td>Roussanne (17/09/2013, UEPR parcelle 68)</td><td>866</td><td>64,5%</td><td>35,5%</td></tr><tr><td>Sauvignon (09/09/2013, UEPR parcelle 10)</td><td>795</td><td>31,6%</td><td>68,4%</td></tr><tr><td>Syrah (19/09/2013, UEPR parcelle 22)</td><td>802</td><td>74,3%</td><td>25,7%</td></tr><tr><td>Vermentino (25/09/2013, UEPR parcelle 67)</td><td>807</td><td>45,0%</td><td>55,0%</td></tr><tr><td>Vermentino (25/09/2013, UEPR parcelle 68)</td><td>793</td><td>30,5%</td><td>69,5%</td></tr><tr><td>Vermentino-M1* (14/08/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>752</td><td>49,6%</td><td>50,4%</td></tr><tr><td>Vermentino-M2* (20/08/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>646</td><td>33,0%</td><td>67,0%</td></tr><tr><td>Vermentino-M3* (28/08/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>711</td><td>28,7%</td><td>71,3%</td></tr><tr><td>Vermentino-M4* (04/09/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>777</td><td>52,3%</td><td>47,7%</td></tr><tr><td>Vermentino-M5* (15/09/2014, UEPR parcelle 68)</td><td>532</td><td>0,0%</td><td>100,0%</td></tr><tr><td>Viognier-TM (24/09/2013, UEPR parcelle 55)</td><td>820</td><td>73,0%</td><td>27,0%</td></tr><tr><td>Viognier-TM (08/09/2014, UEPR parcelle 55)</td><td>754</td><td>76,1%</td><td>23,9%</td></tr><tr><td>Viognier-ESP (20/08/2014, UEPR parcelle 55)</td><td>658</td><td>44,5%</td><td>55,5%</td></tr><tr><td>Viognier-TRP (28/08/2014, UEPR parcelle 55)</td><td>756</td><td>67,6%</td><td>32,4%</td></tr></tbody><tfoot><tr><td colspan="2">Moyenne</td><td>747</td><td>50,8%</td><td>49,2%</td></tr><tr><td colspan="2">(écart-type)</td><td>(72)</td><td>(24,3%)</td><td>(24,3%)</td></tr></tfoot></table>

Le degré de maturité à la récolte impacte aussi fortement la proportion d'activité PPO soluble résiduelle. Ces nouveaux résultats posent la question de l'efficacité du débourbage pour la réduction de l'activité PPO particulaire suivant la récolte, paramètre non pris en compte jusqu'à maintenant dans la réflexion du traitement de la vendange à la récolte, à réception et pour son traitement pré-fermentaire.

## Influence de la température sur l'activité Polyphénol oxydase (PPO) du raisin

Des travaux menés sur le refroidissement de la vendange ont permis de montrer que l'effet positif du refroidissement de la vendange était dominant sur l'effet négatif d'une plus forte solubilité de l'oxygène dans le moût (Frissant et al., 2012). En effet, un abaissement de la température moyenne de la vendange de 20°C à 5-7°C réduit la vitesse de la réaction enzymatique et amenuise donc l'intensité des phénomènes oxydatifs, en réduisant d'environ 50% (de 7 à 3 mg/L) la quantité totale d'oxygène consommé estimée depuis la récolte jusqu'à l'obtention du moût. Ce résultat (mesuré sur des moûts obtenus en situation industrielle) est ici confirmé puisque une réduction de température similaire entraîne une diminution de 50% de l'activité PPO (Figure 2). Il est à noter que, même à 0°C, environ 30%
de l'activité PPO initiale reste détectable, donc active. L'inactivation de l'activité PPO n'est obtenue que pour des températures aux alentours de 80-85°C (Figure 3), régimes de température susceptibles de participer à la dégradation des anthocyanes du raisin (Iyengar et Mc Evily, 1992). L'inactivation thermique à 70°C (valeur maximale autorisée en l'état actuel de la réglementation sur la vinification biologique) a été également testée: dans ces conditions, dès 2 minutes de traitement, l'activité PPO baisse d'un facteur 8, mais seul un traitement de 8 minutes à 70°C permet de ne plus déceler d'activité PPO (Sire et al., 2016).

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 2. Variation de l'activité polyphénol-oxydase du raisin (Cépage Colombard, vendange 2014) en fonction de la température de mesure de cette activité.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>Figure 3. Effet de la température de mesure sur l'activité PPO du raisin (Cépage Chardonnay, vendange 2012).</figcaption></figure>

## Influence du SO₂ sur l'activité Polyphénol oxydase (PPO) du raisin

L'étude de l'influence de la teneur en sulfites ajoutés sur l'activité PPO montre que le maximum d'inhibition n'est pas obtenu instantanément, mais qu'il faut un temps de contact d'au moins 30 min pour constater un effet. On remarque également que l'inhibition totale par les sulfites n'est obtenue que pour des teneurs supérieures à 40 mg L⁻¹, un ajout de 20 mg L⁻¹ de sulfites n'inhibant que 50% de l'activité PPO initiale (Sire et al., 2016).
de l'activité PPO initiale reste détectable, donc active. L'inactivation de l'activité PPO n'est obtenue que pour des températures aux alentours de 80-85°C (Figure 3), régimes de température susceptibles de participer à la dégradation des anthocyanes du raisin (Iyengar et Mc Evily, 1992). L'inactivation thermique à 70°C (valeur maximale autorisée en l'état actuel de la réglementation sur la vinification biologique) a été également testée: dans ces conditions, dès 2 minutes de traitement, l'activité PPO baisse d'un facteur 8, mais seul un traitement de 8 minutes à 70°C permet de ne plus déceler d'activité PPO (Sire et al., 2016).

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Figure 2. Variation de l'activité polyphénol-oxydase du raisin (Cépage Colombard, vendange 2014) en fonction de la température de mesure de cette activité.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 3. Effet de la température de mesure sur l'activité PPO du raisin (Cépage Chardonnay, vendange 2012).</figcaption></figure>

## Influence du SO₂ sur l'activité Polyphénol oxydase (PPO) du raisin

L'étude de l'influence de la teneur en sulfites ajoutés sur l'activité PPO montre que le maximum d'inhibition n'est pas obtenu instantanément, mais qu'il faut un temps de contact d'au moins 30 min pour constater un effet. On remarque également que l'inhibition totale par les sulfites n'est obtenue que pour des teneurs supérieures à 40 mg L⁻¹, un ajout de 20 mg L⁻¹ de sulfites n'inhibant que 50% de l'activité PPO initiale (Sire et al., 2016).
Influence des itinéraires technologiques sur l'activité Polyphénol oxydase (PPO) du raisin

L'effet du refroidissement de la vendange à la machine à vendanger ou au cours du pressurage et celui d'ajouts de sulfites à différentes étapes entre la récolte et le jus extrait, sur l'évolution de l'activité PPO a été testé (Tableau 2). Il est remarquable de constater qu'un refroidissement de la vendange dès la récolte et son maintien à basse température (2-3°C) pendant le pressurage, opération préconisée pour limiter les phénomènes d'oxydation en absence de sulfites ajoutés, maintient l'activité PPO à un niveau très élevé, y compris après la fin de la fermentation alcoolique (Modalité A : 185 nKat, soit environ 30% de l'activité initiale). Dans ces conditions, un débourbage statique à 10°C ne permet pas de réduire l'activité PPO particulière du moût. L'addition de sulfites à la machine à vendanger permet d'inhiber fortement l'activité PPO dans le jus d'égouttage, sans toutefois protéger les jus de presse qui doivent être alors protégés spécifiquement à chaque séquence de pressurage. Même si le jus d'assemblage ne présente plus d'activité PPO mesurable, les bourbes issues du débourbage montrent une activité PPO résiduelle. Il est intéressant de noter que seules les modalités B et C avec addition préalable de sulfites présentent une activité PPO nulle au stade vin, ce qui n'est pas le cas pour la modalité A n'ayant pas reçu de sulfites. Ceci pose le problème de l'élaboration de vins sans sulfites pour lesquels il est indispensable de trouver une solution de substitution au risque de favoriser une oxydation dépréciant la qualité des vins.

<table><caption>Tableau 2. Activité PPO (mesurée à 25°C) de moûts de Chardonnay (vendanges 2014) au cours du pressurage sur pressoir pneumatique suivant diverses modalités. (A) refroidissement préalable de la vendange à la machine à vendanger (2-3 °C), pressurage avec refroidissement de chaque pressée (2-3°C) sans ajout de sulfites, (B) ajout de métabisulfite à la machine à vendanger (30 g pour 700 Kg, 19-20°C), pressurage avec ajout de sulfites à chaque pressée (3 g par hL de jus écoulé), (C) ajout de métabisulfite à la machine à vendanger, vendange refroidie au quai de réception (13°C), et pressurage avec refroidissement de chaque pressée (13°C) sans ajout de sulfites.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Echantillons</th><th colspan="3">Modalités</th></tr><tr><th>A</th><th>B</th><th>C</th></tr><tr><th colspan="3">Activité totale PPO (nKat)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Raisin pressé en conditions anoxiques (activité soluble, activité particulière)</td><td colspan="3">726 (320, 406)</td></tr><tr><td>Jus d'égouttage</td><td>575</td><td>nd</td><td>128</td></tr><tr><td>Premières presses</td><td>679</td><td>567</td><td>378</td></tr><tr><td>Dernières presses</td><td>712</td><td>661</td><td>418</td></tr><tr><td>Moût moyen (assemblage jus d'égouttage et presses)</td><td>674</td><td>0</td><td>315</td></tr><tr><td>Moût après débourbage (Bourbes)</td><td>427 (739)</td><td>0 (317)</td><td>127 (913)</td></tr><tr><td>Vin en fin de fermentation</td><td>185</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>

Dans le cas où la proportion de PPO soluble est élevée dans le moût après pressurage (cépage présentant à maturité une forte proportion d'activité PPO soluble, itinéraire de pressurage protégé par le refroidissement, pas ou peu de sulfites ajoutés), donc non éliminée par le débourbage, une étape de pasteurisation du moût apparaît alors efficace pour supprimer toute activité PPO du moût lors de sa mise en fermentation (Sire et al., 2016).
Influence des itinéraires technologiques sur l'activité Polyphénol oxydase (PPO) du raisin

L'effet du refroidissement de la vendange à la machine à vendanger ou au cours du pressurage et celui d'ajouts de sulfites à différentes étapes entre la récolte et le jus extrait, sur l'évolution de l'activité PPO a été testé (Tableau 2). Il est remarquable de constater qu'un refroidissement de la vendange dès la récolte et son maintien à basse température (2-3°C) pendant le pressurage, opération préconisée pour limiter les phénomènes d'oxydation en absence de sulfites ajoutés, maintient l'activité PPO à un niveau très élevé, y compris après la fin de la fermentation alcoolique (Modalité A : 185 nKat, soit environ 30% de l'activité initiale). Dans ces conditions, un débourbage statique à 10°C ne permet pas de réduire l'activité PPO particulière du moût. L'addition de sulfites à la machine à vendanger permet d'inhiber fortement l'activité PPO dans le jus d'égouttage, sans toutefois protéger les jus de presse qui doivent être alors protégés spécifiquement à chaque séquence de pressurage. Même si le jus d'assemblage ne présente plus d'activité PPO mesurable, les bourbes issues du débourbage montrent une activité PPO résiduelle. Il est intéressant de noter que seules les modalités B et C avec addition préalable de sulfites présentent une activité PPO nulle au stade vin, ce qui n'est pas le cas pour la modalité A n'ayant pas reçu de sulfites. Ceci pose le problème de l'élaboration de vins sans sulfites pour lesquels il est indispensable de trouver une solution de substitution au risque de favoriser une oxydation dépréciant la qualité des vins.

<table><caption>Tableau 2. Activité PPO (mesurée à 25°C) de moûts de Chardonnay (vendanges 2014) au cours du pressurage sur pressoir pneumatique suivant diverses modalités. (A) refroidissement préalable de la vendange à la machine à vendanger (2-3 °C), pressurage avec refroidissement de chaque pressée (2-3°C) sans ajout de sulfites, (B) ajout de métabisulfite à la machine à vendanger (30 g pour 700 Kg, 19-20°C), pressurage avec ajout de sulfites à chaque pressée (3 g par hL de jus écoulé), (C) ajout de métabisulfite à la machine à vendanger, vendange refroidie au quai de réception (13°C), et pressurage avec refroidissement de chaque pressée (13°C) sans ajout de sulfites.</caption><thead><tr><th rowspan="3">Echantillons</th><th colspan="3">Modalités</th></tr><tr><th>A</th><th>B</th><th>C</th></tr><tr><th colspan="3">Activité totale PPO (nKat)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Raisin pressé en conditions anoxiques (activité soluble, activité particulière)</td><td colspan="3">726 (320, 406)</td></tr><tr><td>Jus d'égouttage</td><td>575</td><td>nd</td><td>128</td></tr><tr><td>Premières presses</td><td>679</td><td>567</td><td>378</td></tr><tr><td>Dernières presses</td><td>712</td><td>661</td><td>418</td></tr><tr><td>Moût moyen (assemblage jus d'égouttage et presses)</td><td>674</td><td>0</td><td>315</td></tr><tr><td>Moût après débourbage (Bourbes)</td><td>427 (739)</td><td>0 (317)</td><td>127 (913)</td></tr><tr><td>Vin en fin de fermentation</td><td>185</td><td>0</td><td>0</td></tr></tbody></table>

Dans le cas où la proportion de PPO soluble est élevée dans le moût après pressurage (cépage présentant à maturité une forte proportion d'activité PPO soluble, itinéraire de pressurage protégé par le refroidissement, pas ou peu de sulfites ajoutés), donc non éliminée par le débourbage, une étape de pasteurisation du moût apparaît alors efficace pour supprimer toute activité PPO du moût lors de sa mise en fermentation (Sire et al., 2016).
Conclusion

La réduction de l’usage des sulfites en vinification demande un réexamen approfondi de l’occurrence de l’activité PPO lors de l’élaboration des vins afin de définir les meilleures stratégies pour s’en prémunir. Il est tout d’abord important de connaître la répartition relative entre activités PPO soluble et particulaire du raisin lors de sa récolte, puisque les opérations de débourbage n’ont qu’une action préférentielle sur l’activité particulière. Des raisins riches en forme soluble de l’activité PPO peuvent conduire à un moût présentant une forte activité PPO en début de fermentation, activité qui peut se maintenir même après la fermentation alcoolique. Cette situation n’avait jamais été décrite auparavant dans la littérature et était même généralement admise comme impossible dans la communauté œnologique. Il apparaît toutefois que la diminution de l’usage des sulfites dans les étapes précédant la fermentation alcoolique, et leur remplacement par un abaissement de la température lors des opérations de récolte et de pressurage peuvent conduire à une telle situation. De telles pratiques sont pourtant de plus en plus fréquentes dans le cadre de vinifications à basses quantités d’intrants.

Dans de telles conditions, seule l'inactivation thermique de l'activité PPO par une pasteurisation du moût reste le moyen le plus efficace pour annihiler toute activité PPO résiduelle avant mise en fermentation, de façon à obtenir un réel gain qualitatif sur le vin final.

Références

Chaïb J., Torregrosa L., Mackenzie D., Corena P., Bouquet A., Thomas M. R. 2010 – The grape microvine – a model system for rapid forward and reverse genetics of grapevines. The Plant Journal, 62, 1083-1092.

Christensen L.P., 2000 – Raisin production manual. Publication 3393. Agricultural & Natural Resources, communication services.
Ed. University of California, Oakland, USA (45 p.).

Dubernet M. 1974 – Recherches sur la tyrosinase de Vitis vinifera et la laccase de Botrytis cinerea. Applications technologiques. Thèse de doctorat. Université de Bordeaux II.

Frissant S., Delmas C., Souquet J.M., Samson A., Salmon J.M. 2012 – Management de la température de la vendange depuis la vigne jusqu'à la mise en fermentation: étude quantitative de la protection obtenue contre l'oxydation. Revue des Œnologues, 145 spécial, 21-25.

Interesse F.S., Alloggio V., Lamparelli F., D'Avella, G. 1984 – Characterization of the oxidative enzymatic system of the phenolic compounds from Muscat grapes. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 17, 5-10.

Iyengar R., Mc Evily A. J. 1992 – Anti-browning alternatives to the use of sulfites in foods. Trends in Food Science and Technology, 3, 60-64.

Lee C.Y., Smith N.L., Pennesi A.P. 1983 – Polyphenoloxidase from DeChaunac grapes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 34, 987-991.

Macheix J.J., Sapis J.C., Fleuriet A. 1991 – Phenolic compounds and polyphenoloxidases in relation to browning in grapes and wines. Critical Review in Food Science and Nutrition, 30, 441-486.

Remise E. 2016 – Suivi de l'activité enzymatique polyphénol oxydase et des quantités de substrat correspondant en fonction des stades phénologiques du raisin. Rapport de stage de Licence 3 Chimie Prépa DNO, Université de Montpellier.

Sapis J.C., Macheix J.J., Cordonnier R.E. 1983a – The browning capacity of grapes. I. Changes in polyphenoloxidase activities during development and maturation of the fruit. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 31, 342-345.

Sapis J.C., Macheix J.J., Cordonnier R.E. 1983b – The browning capacity of grapes. II. Browning potential and polyphenoloxidase activities in different mature grape varieties. American Journal of Enology and Viticulture, 34, 157-162.

Sire Y., Douçot S., Pull M-J., Samson A., Moutounet M., Salmon J-M. 2016 – Activité polyphénol-oxydase du raisin : influence de la température et de différentes opérations. Revue des Œnologues, 160, Juillet 2016, 38-40.

Whitaker, J.R. 1995 – Polyphenol oxidase. In Food Enzymes Structure and Mechanism, (D.W.S. Wong, ed.) pp. 271-307, Chapman and Hall, New York.

Wissemann K.W., Lee C.Y. 1981 – Characterization of polyphenoloxidase from Ravat 51 and Niagara Grapes. Journal of Food Science, 46, 506-508.
Conclusion

La réduction de l’usage des sulfites en vinification demande un réexamen approfondi de l’occurrence de l’activité PPO lors de l’élaboration des vins afin de définir les meilleures stratégies pour s’en prémunir. Il est tout d’abord important de connaître la répartition relative entre activités PPO soluble et particulaire du raisin lors de sa récolte, puisque les opérations de débourbage n’ont qu’une action préférentielle sur l’activité particulière. Des raisins riches en forme soluble de l’activité PPO peuvent conduire à un moût présentant une forte activité PPO en début de fermentation, activité qui peut se maintenir même après la fermentation alcoolique. Cette situation n’avait jamais été décrite auparavant dans la littérature et était même généralement admise comme impossible dans la communauté œnologique. Il apparaît toutefois que la diminution de l’usage des sulfites dans les étapes précédant la fermentation alcoolique, et leur remplacement par un abaissement de la température lors des opérations de récolte et de pressurage peuvent conduire à une telle situation. De telles pratiques sont pourtant de plus en plus fréquentes dans le cadre de vinifications à basses quantités d’intrants.

Dans de telles conditions, seule l'inactivation thermique de l'activité PPO par une pasteurisation du moût reste le moyen le plus efficace pour annihiler toute activité PPO résiduelle avant mise en fermentation, de façon à obtenir un réel gain qualitatif sur le vin final.

Références

Chaïb J., Torregrosa L., Mackenzie D., Corena P., Bouquet A., Thomas M. R. 2010 –The grape microvine – a model system for rapid forward and reverse genetics of grapevines. The Plant Journal, 62, 1083-1092.

Christensen L.P., 2000 – Raisin production manual. Publication 3393. Agricultural & Natural Resources, communication services.
Ed. University of California, Oakland, USA (45 p.).

Dubernet M. 1974 – Recherches sur la tyrosinase de Vitis vinifera et la laccase de Botrytis cinerea. Applications technologiques. Thèse de doctorat. Université de Bordeaux II.

Frissant S., Delmas C., Souquet J.M., Samson A., Salmon J.M. 2012 – Management de la température de la vendange depuis la vigne jusqu'à la mise en fermentation: étude quantitative de la protection obtenue contre l'oxydation. Revue des Œnologues, 145 spécial, 21-25.

Interesse F.S., Alloggio V., Lamparelli F., D'Avella, G. 1984 – Characterization of the oxidative enzymatic system of the phenolic compounds from Muscat grapes. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 17, 5-10.

Iyengar R., Mc Evily A. J. 1992 – Anti-browning alternatives to the use of sulfites in foods. Trends in Food Science and Technology, 3, 60-64.

Lee C.Y., Smith N.L., Pennesi A.P. 1983 – Polyphenoloxidase from DeChaunac grapes. Journal of the Science of Food and Agriculture, 34, 987-991.

Macheix J.J., Sapis J.C., Fleuriet A. 1991 – Phenolic compounds and polyphenoloxidases in relation to browning in grapes and wines. Critical Review in Food Science and Nutrition, 30, 441-486.

Remise E. 2016 – Suivi de l'activité enzymatique polyphénol oxydase et des quantités de substrat correspondant en fonction des stades phénologiques du raisin. Rapport de stage de Licence 3 Chimie Prépa DNO, Université de Montpellier.

Sapis J.C., Macheix J.J., Cordonnier R.E. 1983a – The browning capacity of grapes. I. Changes in polyphenoloxidase activities during development and maturation of the fruit. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 31, 342-345.

Sapis J.C., Macheix J.J., Cordonnier R.E. 1983b – The browning capacity of grapes. II. Browning potential and polyphenoloxidase activities in different mature grape varieties. American Journal of Enology and Viticulture, 34, 157-162.

Sire Y., Douçot S., Pull M-J., Samson A., Moutounet M., Salmon J-M. 2016 – Activité polyphénol-oxydase du raisin : influence de la température et de différentes opérations. Revue des Œnologues, 160, Juillet 2016, 38-40.

Whitaker, J.R. 1995 – Polyphenol oxidase. In Food Enzymes Structure and Mechanism, (D.W.S. Wong, ed.) pp. 271-307, Chapman and Hall, New York.

Wissemann K.W., Lee C.Y. 1981 – Characterization of polyphenoloxidase from Ravat 51 and Niagara Grapes. Journal of Food Science, 46, 506-508.
# L'UMT Minicave : outil de multi-vinifications en petit volume

Marie-Agnès Ducasse¹, Evelyne Aguera²

1-Institut Français de la Vigne et du Vin, Pôle Rhône-Méditerranée, Domaine de Pech Rouge - 11430 Gruissan

2-INRA, Unité expérimentale de Pech Rouge - 11430 Gruissan

## 1. Contexte

La vinification est une étape clef dans de nombreuses expérimentations viticoles et œnologiques et sa mise en œuvre maîtrisée apparaît incontournable pour évaluer la qualité et les caractéristiques des vins. Actuellement, l'évaluation de l'impact des différents facteurs viti-vinicoles est réalisée lors de vinifications en volumes autour de 100 L, conduites pour être représentatives de vinifications à l'échelle industrielle. Toutefois, cette échelle expérimentale nécessite une disponibilité suffisante de la matière première et une main d'œuvre importante. Si des dispositifs de vinification à l'échelle laboratoire et en 100 L en phase liquide sont déjà disponibles à l'UMR SPO et à l'UE Pech Rouge (Casalta et al., 2010), il s'avère pertinent de concevoir un dispositif permettant la conduite de vinifications de petits lots de vendange (<1 Kg) en phase hétérogène depuis les phases pré-fermentaires (foulage, macération, thermo-traitement) jusqu'à la fermentation et au pressurage. L'objectif principal de l'UMT Minicave est de concevoir un tel dispositif automatisé, dimensionné de manière adéquate, devant permettre :

* d'apporter de la robustesse aux expérimentations impliquant des vinifications, par la mise en œuvre systématique de triplicats.

* d'intégrer en amont les potentialités œnologiques dans la création variétale

* d'évaluer l'impact sur le vin d'un grand nombre de génotypes (panel de diversité ou descendants) soumis à différents stress (thermiques ou hydriques) et de tester des réponses œnologiques.

* de multiplier aisément les vinifications dans les essais de différents produits œnologiques en phase hétérogène, en conditions répétables et transposables à grande échelle (criblage de levures, d'enzymes et autres intrants).

* de mener également des études plus fondamentales sur des phénomènes encore mal connus en vinification en phase hétérogène comme les interactions entre levures et polyphénols ou l'extraction des composés d'intérêt.

En parallèle de la conception de l'outil automatisé, afin d'aborder les limites et les avantages de la micro-vinification en 1 kg et la mise en place de protocole d'échantillonnage approprié, une méthode de vinification a été testée en cafetière à piston (Dambergs et al., 2010).

## 2. Matériels & Méthodes

La méthode de micro-vinifications en cafetière à piston adaptée de la méthode AWRI (Dambergs et al., 2010) est récapitulée par le protocole de la **figure 1**. La robustesse d'une méthode se définit comme une mesure de sa capacité à ne pas être affectée par de petites variations des conditions opératoires (Feinberg, 2001). Pour l'évaluer, deux tests de robustesse (plans d'expérience de type criblage) ont été réalisés sur Merlot et sur Cabernet Sauvignon.

Plusieurs facteurs ont été testés :

- Plan sur Merlot : opérateur à l'encuvage, poids en raisin (700 g / 900 g), jour de décuvage fin fermentation alcoolique (+2 jours).

- Plan sur Cabernet Sauvignon : hauteur du piston (+1cm), perte de jus au foulage (-30mL), opérateur au pressurage.
# L'UMT Minicave : outil de multi-vinifications en petit volume

Marie-Agnès Ducasse¹, Evelyne Aguera²

1-Institut Français de la Vigne et du Vin, Pôle Rhône-Méditerranée, Domaine de Pech Rouge - 11430 Gruissan

2-INRA, Unité expérimentale de Pech Rouge - 11430 Gruissan

## 1. Contexte

La vinification est une étape clef dans de nombreuses expérimentations viticoles et œnologiques et sa mise en œuvre maîtrisée apparaît incontournable pour évaluer la qualité et les caractéristiques des vins. Actuellement, l'évaluation de l'impact des différents facteurs viti-vinicoles est réalisée lors de vinifications en volumes autour de 100 L, conduites pour être représentatives de vinifications à l'échelle industrielle. Toutefois, cette échelle expérimentale nécessite une disponibilité suffisante de la matière première et une main d'œuvre importante. Si des dispositifs de vinification à l'échelle laboratoire et en 100 L en phase liquide sont déjà disponibles à l'UMR SPO et à l'UE Pech Rouge (Casalta et al., 2010), il s'avère pertinent de concevoir un dispositif permettant la conduite de vinifications de petits lots de vendange (<1 Kg) en phase hétérogène depuis les phases pré-fermentaires (foulage, macération, thermo-traitement) jusqu'à la fermentation et au pressurage. L'objectif principal de l'UMT Minicave est de concevoir un tel dispositif automatisé, dimensionné de manière adéquate, devant permettre :

* d'apporter de la robustesse aux expérimentations impliquant des vinifications, par la mise en œuvre systématique de triplicats.

* d'intégrer en amont les potentialités œnologiques dans la création variétale

* d'évaluer l'impact sur le vin d'un grand nombre de génotypes (panel de diversité ou descendants) soumis à différents stress (thermiques ou hydriques) et de tester des réponses œnologiques.

* de multiplier aisément les vinifications dans les essais de différents produits œnologiques en phase hétérogène, en conditions répétables et transposables à grande échelle (criblage de levures, d'enzymes et autres intrants).

* de mener également des études plus fondamentales sur des phénomènes encore mal connus en vinification en phase hétérogène comme les interactions entre levures et polyphénols ou l'extraction des composés d'intérêt.

En parallèle de la conception de l'outil automatisé, afin d'aborder les limites et les avantages de la micro-vinification en 1 kg et la mise en place de protocole d'échantillonnage approprié, une méthode de vinification a été testée en cafetière à piston (Dambergs et al., 2010).

## 2. Matériels & Méthodes

La méthode de micro-vinifications en cafetière à piston adaptée de la méthode AWRI (Dambergs et al., 2010) est récapitulée par le protocole de la **figure 1**. La robustesse d'une méthode se définit comme une mesure de sa capacité à ne pas être affectée par de petites variations des conditions opératoires (Feinberg, 2001). Pour l'évaluer, deux tests de robustesse (plans d'expérience de type criblage) ont été réalisés sur Merlot et sur Cabernet Sauvignon.

Plusieurs facteurs ont été testés :

- Plan sur Merlot : opérateur à l'encuvage, poids en raisin (700 g / 900 g), jour de décuvage fin fermentation alcoolique (+2 jours).

- Plan sur Cabernet Sauvignon : hauteur du piston (+1cm), perte de jus au foulage (-30mL), opérateur au pressurage.
La robustesse du protocole a été évaluée sur les paramètres œnologiques classiques (pH, acidité totale, alcool, acide malique) mais également sur les paramètres qualitatifs tels que les polyphénols (indice des polyphénols totaux, anthocyanes), la couleur (intensité colorante, les absorbances à 420, 520, 620 nm, les coordonnées tristimulaires L*a*b*), et les principaux arômes du fruité (thiol : 3-mercaptohexan-1-ol, esters éthyliques : 2-phénylethanol, acétate d'isoamyle, acétate de 2-phénylethyle, décanoate d'éthyle, hexanoate d'éthyle, octanoate d'éthyle, butanoate d'éthyle, 2-hydroxypropanoate d'éthyle, 2-méthylbutanoate d'éthyle, 2-méthylpropanoate d'éthyle, C13-norisoprénoïdes : β-damascénone, β-ionone, terpénols : linalol, nérol, géraniol, citronellol, α-terpineol, diméthylsulfure).

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 1. Protocole de micro-vinifications en cafetières à piston</figcaption></figure>

### 3. Résultats et discussion

Les résultats du plan d'expérience sur Merlot sont présentés dans **Tableaux 1 et 2**. De façon à estimer quantitativement la fidélité (écart-type) de la méthode, une expérimentation du plan de criblage est répétée 6 fois. L'équation est d'ordre 1 : $Y = a_0 + a_1X_1 + a_2X_2 + a_3X_3$ et la comparaison des valeurs des coefficients a1, a2 et a3 avec l'écart type de fidélité (s) pour chaque grandeur mesurée (paramètres œnologiques, polyphénols totaux, anthocyanes et principaux arômes) a permis de déterminer si le facteur Xn est influent (si $|a^n| > 2s$). Sur ce premier plan d'expérience, les coefficients $|a1|$, $|a2|$, $|a3|$ sont inférieurs à 2s sur les paramètres œnologiques et les indices d'extraction que sont l'indice des polyphénols totaux et les anthocyanes (tableau 1). Par conséquent, aucun des facteurs (jour du décuvage, poids de raisin, opérateur à l'encuvage) n'est influent sur les paramètres œnologiques et sur ces indices d'extraction. Sur les principaux arômes du fruité (tableau 2), les coefficients sont également inférieurs à 2s, excepté pour la facteur a1 dans le cas de l'acétate de 2-phénylethyle et de la β-damascénone. Ceci montre que les facteurs : poids de raisin, opérateur à l'encuvage, ne sont pas influents sur les principaux arômes du fruité mais que le facteur: jour de décuvage (+2j) peut légèrement influer sur certains arômes. Ce facteur est à fixer dans le protocole.
La robustesse du protocole a été évaluée sur les paramètres œnologiques classiques (pH, acidité totale, alcool, acide malique) mais également sur les paramètres qualitatifs tels que les polyphénols (indice des polyphénols totaux, anthocyanes), la couleur (intensité colorante, les absorbances à 420, 520, 620 nm, les coordonnées tristimulaires L*a*b*), et les principaux arômes du fruité (thiol : 3-mercaptohexan-1-ol, esters éthyliques : 2-phénylethanol, acétate d'isoamyle, acétate de 2-phénylethyle, décanoate d'éthyle, hexanoate d'éthyle, octanoate d'éthyle, butanoate d'éthyle, 2-hydroxypropanoate d'éthyle, 2-méthylbutanoate d'éthyle, 2-méthylpropanoate d'éthyle, C13-norisoprénoïdes : β-damascénone, β-ionone, terpénols : linalol, nérol, géraniol, citronellol, α-terpineol, diméthylsulfure).

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 1. Protocole de micro-vinifications en cafetières à piston</figcaption></figure>

### 3. Résultats et discussion

Les résultats du plan d'expérience sur Merlot sont présentés dans **Tableaux 1 et 2**. De façon à estimer quantitativement la fidélité (écart-type) de la méthode, une expérimentation du plan de criblage est répétée 6 fois. L'équation est d'ordre 1 : $Y = a_0 + a_1X_1 + a_2X_2 + a_3X_3$ et la comparaison des valeurs des coefficients a1, a2 et a3 avec l'écart type de fidélité (s) pour chaque grandeur mesurée (paramètres œnologiques, polyphénols totaux, anthocyanes et principaux arômes) a permis de déterminer si le facteur Xn est influent (si $|a^n| > 2s$). Sur ce premier plan d'expérience, les coefficients $|a1|$, $|a2|$, $|a3|$ sont inférieurs à 2s sur les paramètres œnologiques et les indices d'extraction que sont l'indice des polyphénols totaux et les anthocyanes (tableau 1). Par conséquent, aucun des facteurs (jour du décuvage, poids de raisin, opérateur à l'encuvage) n'est influent sur les paramètres œnologiques et sur ces indices d'extraction. Sur les principaux arômes du fruité (tableau 2), les coefficients sont également inférieurs à 2s, excepté pour la facteur a1 dans le cas de l'acétate de 2-phénylethyle et de la β-damascénone. Ceci montre que les facteurs : poids de raisin, opérateur à l'encuvage, ne sont pas influents sur les principaux arômes du fruité mais que le facteur: jour de décuvage (+2j) peut légèrement influer sur certains arômes. Ce facteur est à fixer dans le protocole.
<table><caption>Tableau 1. Résultats du plan d'expérience sur Merlot sur les paramètres œnologiques (pH, acidité totale, alcool, acide malique) et les indices d'extraction (indice des polyphénols totaux, anthocyanes).</caption><thead><tr><th>paramètres</th><th>a0</th><th>s</th><th>2 s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>pH</td><td>3,14</td><td>0,02</td><td>0,04</td><td>0,00</td><td>0,02</td><td>0,00</td><td>0,6%</td></tr><tr><td>Acidité totale (g/L H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)</td><td>5,89</td><td>0,09</td><td>0,18</td><td>0,15</td><td>0,07</td><td>0,05</td><td>1,5%</td></tr><tr><td>Alcool (% vol)</td><td>14,03</td><td>0,05</td><td>0,11</td><td>0,07</td><td>0,02</td><td>0,07</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>Acide malique (g/L)</td><td>1,15</td><td>0,03</td><td>0,07</td><td>0,02</td><td>0,03</td><td>0,00</td><td>3,0%</td></tr><tr><td>Indice Polyphénols Totaux</td><td>52,25</td><td>1,38</td><td>2,76</td><td>0,75</td><td>0,75</td><td>0,25</td><td>2,6%</td></tr><tr><td>Anthocyanes (mg/L)</td><td>720,75</td><td>26,56</td><td>53,12</td><td>9,25</td><td>6,25</td><td>0,25</td><td>3,7%</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 2. Résultats du plan d'expérience sur Merlot sur les principaux arômes du fruité.</caption><thead><tr><th>Arômes* (µg/L)</th><th>Description organoleptiques*</th><th>Seuil de perception*</th><th>LOQ*</th><th>a0</th><th>s</th><th>2 s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>2-phényléthanol</td><td>rose litchi</td><td>10000</td><td>5,56</td><td>76771</td><td>4270</td><td>8540</td><td>1027</td><td>2559</td><td>1641</td><td>6%</td></tr><tr><td>acétate d'isoamyle</td><td>banane</td><td>30</td><td>52,14</td><td>766</td><td>90</td><td>180</td><td>146</td><td>38</td><td>59</td><td>12%</td></tr><tr><td>acétate de 2-phényléthyle</td><td>rose fanée</td><td>250</td><td>1,28</td><td>85</td><td>6</td><td>12</td><td>26</td><td>7</td><td>3</td><td>7%</td></tr><tr><td>décanoate d'éthyle</td><td>fruit, poire, eau de vie</td><td>510</td><td>0,00</td><td>78</td><td>7</td><td>13</td><td>0</td><td>1</td><td>4</td><td>8%</td></tr><tr><td>hexanoate déthyle</td><td>pomme, ananas, fruit mur</td><td>200</td><td>17,16</td><td>411</td><td>49</td><td>98</td><td>60</td><td>4</td><td>6</td><td>12%</td></tr><tr><td>octanoate d'éthyle</td><td>pêche, ananas, bonbon</td><td>200</td><td>5,33</td><td>331</td><td>28</td><td>55</td><td>25</td><td>24</td><td>2</td><td>8%</td></tr><tr><td>butanoate d'éthyle</td><td>ananas, fraise, fromage, beurre</td><td>20</td><td>25,67</td><td>204</td><td>20</td><td>40</td><td>11</td><td>3</td><td>8</td><td>10%</td></tr><tr><td>2-hydroxypropanoate d'éthyle</td><td>fruité lacté, arôme très léger</td><td>154000</td><td>151</td><td>2208</td><td>85</td><td>169</td><td>82</td><td>167</td><td>14</td><td>4%</td></tr><tr><td>2-méthylbutanoate d'éthyle</td><td>kiwi, fraise chimique, aigre</td><td>18</td><td>2,20</td><td>7,13</td><td>0,64</td><td>1,27</td><td>0,05</td><td>0,02</td><td>0,24</td><td>9%</td></tr><tr><td>2-méthylpropanoate d'éthyle</td><td>fraise, kiwi, mûre</td><td>15</td><td>3,08</td><td>41,78</td><td>4,20</td><td>8,40</td><td>0,26</td><td>0,46</td><td>0,48</td><td>10%</td></tr><tr><td>β-damascénone</td><td>floral, coing, compote de pomme</td><td>0,05</td><td>0,00</td><td>3,65</td><td>0,11</td><td>0,22</td><td>0,60</td><td>0,01</td><td>0,09</td><td>3%</td></tr><tr><td>Linalol</td><td>floral, litchi, légèrement citronné</td><td>15</td><td>0,01</td><td>5,98</td><td>0,43</td><td>0,85</td><td>0,39</td><td>0,02</td><td>0,06</td><td>7%</td></tr><tr><td>Nérol</td><td>tilleul, rose</td><td>400</td><td>0,02</td><td>1,62</td><td>0,08</td><td>0,16</td><td>0,07</td><td>0,04</td><td>0,04</td><td>5%</td></tr><tr><td>Géraniol</td><td>géranium, rose, bonbon</td><td>20</td><td>0,45</td><td>3,46</td><td>0,39</td><td>0,78</td><td>0,31</td><td>0,19</td><td>0,13</td><td>11%</td></tr><tr><td>Citronellol</td><td>citronelle</td><td>100</td><td>1,50</td><td>8,14</td><td>1,00</td><td>1,99</td><td>0,17</td><td>0,01</td><td>0,44</td><td>12%</td></tr><tr><td>α terpineol</td><td>muguet</td><td>400</td><td>0,03</td><td>2,28</td><td>0,10</td><td>0,20</td><td>0,12</td><td>0,01</td><td>0,14</td><td>4%</td></tr><tr><td>Diméthylsulfure</td><td>truffe, choux, asperge</td><td>10</td><td>0,09</td><td>2,41</td><td>0,31</td><td>0,62</td><td>0,37</td><td>0,26</td><td>0,44</td><td>13%</td></tr></tbody></table>

Les résultats du plan d'expérience sur Cabernet Sauvignon sont présentés dans les **tableaux 3 et 4**. Sur ce second plan d'expérience, les coefficients $|a1|, |a2|, |a3|$ sont inférieurs à 2s sur les paramètres œnologiques, les indices d'extraction (indice des polyphénols totaux, anthocyanes), la couleur (tableau 3) et également sur les principaux arômes (tableau 4). Par conséquent, aucun des facteurs (hauteur du piston, perte de jus, opérateur au pressurage) n'est influent sur les paramètres oenologiques mais aussi sur des paramètres qualitatifs tels que la couleur et les principaux arômes du fruité.

<footnote>*données arômes laboratoire Nyseos, LOQ = limite de quantification, CV = coefficient de variation.</footnote>
<table><caption>Tableau 1. Résultats du plan d'expérience sur Merlot sur les paramètres œnologiques (pH, acidité totale, alcool, acide malique) et les indices d'extraction (indice des polyphénols totaux, anthocyanes).</caption><thead><tr><th>paramètres</th><th>a0</th><th>s</th><th>2 s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>pH</td><td>3,14</td><td>0,02</td><td>0,04</td><td>0,00</td><td>0,02</td><td>0,00</td><td>0,6%</td></tr><tr><td>Acidité totale (g/L H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)</td><td>5,89</td><td>0,09</td><td>0,18</td><td>0,15</td><td>0,07</td><td>0,05</td><td>1,5%</td></tr><tr><td>Alcool (% vol)</td><td>14,03</td><td>0,05</td><td>0,11</td><td>0,07</td><td>0,02</td><td>0,07</td><td>0,4%</td></tr><tr><td>Acide malique (g/L)</td><td>1,15</td><td>0,03</td><td>0,07</td><td>0,02</td><td>0,03</td><td>0,00</td><td>3,0%</td></tr><tr><td>Indice Polyphénols Totaux</td><td>52,25</td><td>1,38</td><td>2,76</td><td>0,75</td><td>0,75</td><td>0,25</td><td>2,6%</td></tr><tr><td>Anthocyanes (mg/L)</td><td>720,75</td><td>26,56</td><td>53,12</td><td>9,25</td><td>6,25</td><td>0,25</td><td>3,7%</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 2. Résultats du plan d'expérience sur Merlot sur les principaux arômes du fruité.</caption><thead><tr><th>Arômes* (µg/L)</th><th>Descripteurs organoleptiques*</th><th>Seuil de perception*</th><th>LOQ*</th><th>a0</th><th>s</th><th>2 s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>2-phényléthanol</td><td>rose litchi</td><td>10000</td><td>5,56</td><td>76771</td><td>4270</td><td>8540</td><td>1027</td><td>2559</td><td>1641</td><td>6%</td></tr><tr><td>acétate d'isoamyle</td><td>banane</td><td>30</td><td>52,14</td><td>766</td><td>90</td><td>180</td><td>146</td><td>38</td><td>59</td><td>12%</td></tr><tr><td>acétate de 2-phényléthyle</td><td>rose fanée</td><td>250</td><td>1,28</td><td>85</td><td>6</td><td>12</td><td>26</td><td>7</td><td>3</td><td>7%</td></tr><tr><td>décanoate d'éthyle</td><td>fruit, poire, eau de vie</td><td>510</td><td>0,00</td><td>78</td><td>7</td><td>13</td><td>0</td><td>1</td><td>4</td><td>8%</td></tr><tr><td>hexanoate déthyle</td><td>pomme, ananas, fruit mur</td><td>200</td><td>17,16</td><td>411</td><td>49</td><td>98</td><td>60</td><td>4</td><td>6</td><td>12%</td></tr><tr><td>octanoate d'éthyle</td><td>pêche, ananas, bonbon</td><td>200</td><td>5,33</td><td>331</td><td>28</td><td>55</td><td>25</td><td>24</td><td>2</td><td>8%</td></tr><tr><td>butanoate d'éthyle</td><td>ananas, fraise, fromage, beurre</td><td>20</td><td>25,67</td><td>204</td><td>20</td><td>40</td><td>11</td><td>3</td><td>8</td><td>10%</td></tr><tr><td>2-hydroxypropanoate d'éthyle</td><td>fruité lacté, arôme très léger</td><td>154000</td><td>151</td><td>2208</td><td>85</td><td>169</td><td>82</td><td>167</td><td>14</td><td>4%</td></tr><tr><td>2-méthylbutanoate d'éthyle</td><td>kiwi, fraise chimique, aigre</td><td>18</td><td>2,20</td><td>7,13</td><td>0,64</td><td>1,27</td><td>0,05</td><td>0,02</td><td>0,24</td><td>9%</td></tr><tr><td>2-méthylpropanoate d'éthyle</td><td>fraise, kiwi, mûre</td><td>15</td><td>3,08</td><td>41,78</td><td>4,20</td><td>8,40</td><td>0,26</td><td>0,46</td><td>0,48</td><td>10%</td></tr><tr><td>β-damascénone</td><td>floral, coing, compote de pomme</td><td>0,05</td><td>0,00</td><td>3,65</td><td>0,11</td><td>0,22</td><td>0,60</td><td>0,01</td><td>0,09</td><td>3%</td></tr><tr><td>Linalol</td><td>floral, litchi, légèrement citronné</td><td>15</td><td>0,01</td><td>5,98</td><td>0,43</td><td>0,85</td><td>0,39</td><td>0,02</td><td>0,06</td><td>7%</td></tr><tr><td>Nérol</td><td>tilleul, rose</td><td>400</td><td>0,02</td><td>1,62</td><td>0,08</td><td>0,16</td><td>0,07</td><td>0,04</td><td>0,04</td><td>5%</td></tr><tr><td>Géraniol</td><td>géranium, rose, bonbon</td><td>20</td><td>0,45</td><td>3,46</td><td>0,39</td><td>0,78</td><td>0,31</td><td>0,19</td><td>0,13</td><td>11%</td></tr><tr><td>Citronellol</td><td>citronelle</td><td>100</td><td>1,50</td><td>8,14</td><td>1,00</td><td>1,99</td><td>0,17</td><td>0,01</td><td>0,44</td><td>12%</td></tr><tr><td>α terpineol</td><td>muguet</td><td>400</td><td>0,03</td><td>2,28</td><td>0,10</td><td>0,20</td><td>0,12</td><td>0,01</td><td>0,14</td><td>4%</td></tr><tr><td>Diméthylsulfure</td><td>truffe, choux, asperge</td><td>10</td><td>0,09</td><td>2,41</td><td>0,31</td><td>0,62</td><td>0,37</td><td>0,26</td><td>0,44</td><td>13%</td></tr></tbody></table>

Les résultats du plan d'expérience sur Cabernet Sauvignon sont présentés dans les **tableaux 3 et 4**. Sur ce second plan d'expérience, les coefficients $|a1|, |a2|, |a3|$ sont inférieurs à 2s sur les paramètres œnologiques, les indices d'extraction (indice des polyphénols totaux, anthocyanes), la couleur (tableau 3) et également sur les principaux arômes (tableau 4). Par conséquent, aucun des facteurs (hauteur du piston, perte de jus, opérateur au pressurage) n'est influent sur les paramètres oenologiques mais aussi sur des paramètres qualitatifs tels que la couleur et les principaux arômes du fruité.

<footnote>*données arômes laboratoire Nyseos, LOQ = limite de quantification, CV = coefficient de variation.</footnote>
<table><caption>Tableau 3. Résultats du plan d'expérience sur Cabernet Sauvignon sur les paramètres œnologiques (pH, acidité totale, alcool, acide malique), les indices d'extraction (indice des polyphénols totaux, anthocyanes) et la couleur (intensité colorante, absorbances à 420, 520, 620nm, coordonnées L*,a*,b*).</caption><thead><tr><th>paramètres</th><th>a0</th><th>s</th><th>2s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>pH</td><td>3,63</td><td>0,01</td><td>0,02</td><td>0,00</td><td>0,00</td><td>0,01</td><td>0,3</td></tr><tr><td>Acidité totale (g/L H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)</td><td>5,60</td><td>0,11</td><td>0,21</td><td>0,01</td><td>0,11</td><td>0,05</td><td>1,9</td></tr><tr><td>Alcool (% vol)</td><td>13,24</td><td>0,14</td><td>0,29</td><td>0,03</td><td>0,07</td><td>0,10</td><td>1,1</td></tr><tr><td>Acide malique (g/L)</td><td>3,59</td><td>0,04</td><td>0,09</td><td>0,05</td><td>0,08</td><td>0,06</td><td>1,2</td></tr><tr><td>Indice Polyphénols Totaux</td><td>57,06</td><td>1,83</td><td>3,66</td><td>1,31</td><td>0,98</td><td>2,39</td><td>3,2</td></tr><tr><td>Anthocyanes (mg/L)</td><td>800,36</td><td>23,71</td><td>47,42</td><td>29,06</td><td>6,64</td><td>6,82</td><td>3,0</td></tr><tr><td>Intensité Colorante</td><td>16,72</td><td>0,71</td><td>1,43</td><td>0,29</td><td>0,20</td><td>0,11</td><td>4,3</td></tr><tr><td>DO420</td><td>5,10</td><td>0,15</td><td>0,30</td><td>0,03</td><td>0,08</td><td>0,05</td><td>2,9</td></tr><tr><td>DO520</td><td>10,02</td><td>0,55</td><td>1,11</td><td>0,30</td><td>0,09</td><td>0,03</td><td>5,5</td></tr><tr><td>DO620</td><td>1,60</td><td>0,04</td><td>0,08</td><td>0,02</td><td>0,03</td><td>0,03</td><td>2,6</td></tr><tr><td>L*</td><td>10,33</td><td>0,48</td><td>0,96</td><td>0,08</td><td>0,38</td><td>0,38</td><td>4,7</td></tr><tr><td>a*</td><td>38,92</td><td>0,61</td><td>1,22</td><td>0,02</td><td>0,47</td><td>0,51</td><td>1,6</td></tr><tr><td>b*</td><td>17,77</td><td>0,80</td><td>1,59</td><td>0,14</td><td>0,61</td><td>0,67</td><td>4,5</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 4. Résultats du plan d'expérience sur Cabernet Sauvignon sur les principaux arômes du fruité.</caption><thead><tr><th>Arômes* (µg/L)</th><th>Descripteurs organoleptiques*</th><th>seuil de perception*</th><th>LOQ*</th><th>a0</th><th>s</th><th>2s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>3-mercaptohexan-1-ol</td><td>pamplemousse</td><td>0,06</td><td>0,002</td><td>0,175</td><td>0,009</td><td>0,018</td><td>0,016</td><td>0,007</td><td>0,009</td><td>5</td></tr><tr><td>2-phényléthanol</td><td>rose litchi</td><td>10000</td><td>18,50</td><td>83085</td><td>5699</td><td>11398</td><td>4292</td><td>944</td><td>4389</td><td>7</td></tr><tr><td>acétate d'isoamyle</td><td>banane</td><td>30</td><td>174</td><td>695</td><td>92</td><td>184</td><td>6</td><td>43</td><td>128</td><td>13</td></tr><tr><td>acétate de 2-phényléthyle</td><td>rose fanée</td><td>250</td><td>4,28</td><td>105</td><td>9</td><td>18</td><td>14</td><td>13</td><td>15</td><td>9</td></tr><tr><td>décanoate d'éthyle</td><td>fruit, poire, eau de vie</td><td>510</td><td>0,00</td><td>84</td><td>5</td><td>10</td><td>3</td><td>2</td><td>7</td><td>6</td></tr><tr><td>hexanoate d'éthyle</td><td>pomme, ananas, fruit mur</td><td>200</td><td>57,20</td><td>591</td><td>62</td><td>124</td><td>14</td><td>27</td><td>38</td><td>10</td></tr><tr><td>octanoate d'éthyle</td><td>pêche, ananas, bonbon</td><td>200</td><td>19,68</td><td>412</td><td>25</td><td>51</td><td>7</td><td>6</td><td>10</td><td>6</td></tr><tr><td>butanoate d'éthyle</td><td>ananas, fraise, fromage, beurre</td><td>20</td><td>85,57</td><td>258</td><td>39</td><td>79</td><td>5</td><td>2</td><td>24</td><td>15</td></tr><tr><td>2-hydroxypropanoate d'éthyle</td><td>fruité lacté, arôme très léger</td><td>154000</td><td>502</td><td>598</td><td>32</td><td>64</td><td>6</td><td>5</td><td>26</td><td>5</td></tr><tr><td>3-hydroxybutanoate d'éthyle</td><td>fraise</td><td>1800</td><td>0,00</td><td>601</td><td>25</td><td>49</td><td>26</td><td>25</td><td>9</td><td>4</td></tr><tr><td>2-méthylpropanoate d'éthyle</td><td>fraise, kiwi, mure</td><td>15</td><td>10,27</td><td>17,47</td><td>2,88</td><td>5,76</td><td>0,37</td><td>1,28</td><td>2,10</td><td>16</td></tr><tr><td>β-damascénone</td><td>floral, coing, compote de pomme</td><td>0,05</td><td>0,00</td><td>1,24</td><td>0,04</td><td>0,08</td><td>0,03</td><td>0,00</td><td>0,05</td><td>3</td></tr><tr><td>β-ionone</td><td>violette, framboise</td><td>0,09</td><td>0,02</td><td>0,14</td><td>0,01</td><td>0,02</td><td>0,004</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>6</td></tr><tr><td>Linalol</td><td>floral, litchi, légerement citronné</td><td>15</td><td>0,06</td><td>3,02</td><td>0,14</td><td>0,29</td><td>0,17</td><td>0,04</td><td>0,06</td><td>5</td></tr><tr><td>Nérol</td><td>tilleul, rose</td><td>400</td><td>0,06</td><td>1,25</td><td>0,05</td><td>0,10</td><td>0,03</td><td>0,06</td><td>0,04</td><td>4</td></tr><tr><td>Géraniol</td><td>géranium, rose, bonbon</td><td>20</td><td>1,49</td><td>3,27</td><td>0,10</td><td>0,20</td><td>0,19</td><td>0,10</td><td>0,06</td><td>3</td></tr><tr><td>Citronellol</td><td>citronelle</td><td>100</td><td>5,02</td><td>12,07</td><td>0,29</td><td>0,58</td><td>0,00</td><td>0,42</td><td>0,42</td><td>2</td></tr><tr><td>α terpineol</td><td>muguet</td><td>400</td><td>0,09</td><td>1,00</td><td>0,03</td><td>0,07</td><td>0,06</td><td>0,00</td><td>0,00</td><td>3</td></tr></tbody></table>

<footnote>*données arômes laboratoire Nyseos, LOQ = limite de quantification, CV = coefficient de variation.</footnote>
<table><caption>Tableau 3. Résultats du plan d'expérience sur Cabernet Sauvignon sur les paramètres œnologiques (pH, acidité totale, alcool, acide malique), les indices d'extraction (indice des polyphénols totaux, anthocyanes) et la couleur (intensité colorante, absorbances à 420, 520, 620nm, coordonnées L*,a*,b*).</caption><thead><tr><th>paramètres</th><th>a0</th><th>s</th><th>2s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>pH</td><td>3,63</td><td>0,01</td><td>0,02</td><td>0,00</td><td>0,00</td><td>0,01</td><td>0,3</td></tr><tr><td>Acidité totale (g/L H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)</td><td>5,60</td><td>0,11</td><td>0,21</td><td>0,01</td><td>0,11</td><td>0,05</td><td>1,9</td></tr><tr><td>Alcool (% vol)</td><td>13,24</td><td>0,14</td><td>0,29</td><td>0,03</td><td>0,07</td><td>0,10</td><td>1,1</td></tr><tr><td>Acide malique (g/L)</td><td>3,59</td><td>0,04</td><td>0,09</td><td>0,05</td><td>0,08</td><td>0,06</td><td>1,2</td></tr><tr><td>Indice Polyphénols Totaux</td><td>57,06</td><td>1,83</td><td>3,66</td><td>1,31</td><td>0,98</td><td>2,39</td><td>3,2</td></tr><tr><td>Anthocyanes (mg/L)</td><td>800,36</td><td>23,71</td><td>47,42</td><td>29,06</td><td>6,64</td><td>6,82</td><td>3,0</td></tr><tr><td>Intensité Colorante</td><td>16,72</td><td>0,71</td><td>1,43</td><td>0,29</td><td>0,20</td><td>0,11</td><td>4,3</td></tr><tr><td>DO420</td><td>5,10</td><td>0,15</td><td>0,30</td><td>0,03</td><td>0,08</td><td>0,05</td><td>2,9</td></tr><tr><td>DO520</td><td>10,02</td><td>0,55</td><td>1,11</td><td>0,30</td><td>0,09</td><td>0,03</td><td>5,5</td></tr><tr><td>DO620</td><td>1,60</td><td>0,04</td><td>0,08</td><td>0,02</td><td>0,03</td><td>0,03</td><td>2,6</td></tr><tr><td>L*</td><td>10,33</td><td>0,48</td><td>0,96</td><td>0,08</td><td>0,38</td><td>0,38</td><td>4,7</td></tr><tr><td>a*</td><td>38,92</td><td>0,61</td><td>1,22</td><td>0,02</td><td>0,47</td><td>0,51</td><td>1,6</td></tr><tr><td>b*</td><td>17,77</td><td>0,80</td><td>1,59</td><td>0,14</td><td>0,61</td><td>0,67</td><td>4,5</td></tr></tbody></table>

<table><caption>Tableau 4. Résultats du plan d'expérience sur Cabernet Sauvignon sur les principaux arômes du fruité.</caption><thead><tr><th>Arômes* (µg/L)</th><th>Descripteurs organoleptiques*</th><th>seuil de perception*</th><th>LOQ*</th><th>a0</th><th>s</th><th>2s</th><th>a1</th><th>a2</th><th>a3</th><th>cv (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>3-mercaptohexan-1-ol</td><td>pamplemousse</td><td>0,06</td><td>0,002</td><td>0,175</td><td>0,009</td><td>0,018</td><td>0,016</td><td>0,007</td><td>0,009</td><td>5</td></tr><tr><td>2-phényléthanol</td><td>rose litchi</td><td>10000</td><td>18,50</td><td>83085</td><td>5699</td><td>11398</td><td>4292</td><td>944</td><td>4389</td><td>7</td></tr><tr><td>acétate d'isoamyle</td><td>banane</td><td>30</td><td>174</td><td>695</td><td>92</td><td>184</td><td>6</td><td>43</td><td>128</td><td>13</td></tr><tr><td>acétate de 2-phényléthyle</td><td>rose fanée</td><td>250</td><td>4,28</td><td>105</td><td>9</td><td>18</td><td>14</td><td>13</td><td>15</td><td>9</td></tr><tr><td>décanoate d'éthyle</td><td>fruit, poire, eau de vie</td><td>510</td><td>0,00</td><td>84</td><td>5</td><td>10</td><td>3</td><td>2</td><td>7</td><td>6</td></tr><tr><td>hexanoate d'éthyle</td><td>pomme, ananas, fruit mur</td><td>200</td><td>57,20</td><td>591</td><td>62</td><td>124</td><td>14</td><td>27</td><td>38</td><td>10</td></tr><tr><td>octanoate d'éthyle</td><td>pêche, ananas, bonbon</td><td>200</td><td>19,68</td><td>412</td><td>25</td><td>51</td><td>7</td><td>6</td><td>10</td><td>6</td></tr><tr><td>butanoate d'éthyle</td><td>ananas, fraise, fromage, beurre</td><td>20</td><td>85,57</td><td>258</td><td>39</td><td>79</td><td>5</td><td>2</td><td>24</td><td>15</td></tr><tr><td>2-hydroxypropanoate d'éthyle</td><td>fruité lacté, arôme très léger</td><td>154000</td><td>502</td><td>598</td><td>32</td><td>64</td><td>6</td><td>5</td><td>26</td><td>5</td></tr><tr><td>3-hydroxybutanoate d'éthyle</td><td>fraise</td><td>1800</td><td>0,00</td><td>601</td><td>25</td><td>49</td><td>26</td><td>25</td><td>9</td><td>4</td></tr><tr><td>2-méthylpropanoate d'éthyle</td><td>fraise, kiwi, mure</td><td>15</td><td>10,27</td><td>17,47</td><td>2,88</td><td>5,76</td><td>0,37</td><td>1,28</td><td>2,10</td><td>16</td></tr><tr><td>β-damascénone</td><td>floral, coing, compote de pomme</td><td>0,05</td><td>0,00</td><td>1,24</td><td>0,04</td><td>0,08</td><td>0,03</td><td>0,00</td><td>0,05</td><td>3</td></tr><tr><td>β-ionone</td><td>violette, framboise</td><td>0,09</td><td>0,02</td><td>0,14</td><td>0,01</td><td>0,02</td><td>0,004</td><td>0,01</td><td>0,01</td><td>6</td></tr><tr><td>Linalol</td><td>floral, litchi, légerement citronné</td><td>15</td><td>0,06</td><td>3,02</td><td>0,14</td><td>0,29</td><td>0,17</td><td>0,04</td><td>0,06</td><td>5</td></tr><tr><td>Nérol</td><td>tilleul, rose</td><td>400</td><td>0,06</td><td>1,25</td><td>0,05</td><td>0,10</td><td>0,03</td><td>0,06</td><td>0,04</td><td>4</td></tr><tr><td>Géraniol</td><td>géranium, rose, bonbon</td><td>20</td><td>1,49</td><td>3,27</td><td>0,10</td><td>0,20</td><td>0,19</td><td>0,10</td><td>0,06</td><td>3</td></tr><tr><td>Citronellol</td><td>citronelle</td><td>100</td><td>5,02</td><td>12,07</td><td>0,29</td><td>0,58</td><td>0,00</td><td>0,42</td><td>0,42</td><td>2</td></tr><tr><td>α terpineol</td><td>muguet</td><td>400</td><td>0,09</td><td>1,00</td><td>0,03</td><td>0,07</td><td>0,06</td><td>0,00</td><td>0,00</td><td>3</td></tr></tbody></table>

<footnote>*données arômes laboratoire Nyseos, LOQ = limite de quantification, CV = coefficient de variation.</footnote>
Les coefficients de variation (CV%) des paramètres oenologiques et de la couleur sont faibles comme déjà démontrés dans la littérature (Dambergs et al. 2010, *Sparrow et al.*, 2015). Il est remarquable de noter que les coefficients de variation sont également inférieurs à 10% sur la plupart des arômes dosés. Cette étude apporte des données supplémentaires sur la robustesse de la méthode de vinification en cafetières à piston sur les principaux marqueurs du fruité.

## Conclusion

La méthode est robuste sur les paramètres oenologiques mais également sur les paramètres qualitatifs : couleur et principaux arômes du fruité. Des coefficients de variation bas sur la plupart des paramètres montrent la performance des micro-vinifications en cafetières à piston. Ceci est primordial pour l'expérimentation. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les limites et les avantages des micro-vinifications en petit volume.

## Perspectives

Les attentes et les perspectives de l'utilisation de l'outil de micro-vinifications en rouge (<1kg) sont nombreuses. L'échantillonnage de ces 1kg de raisins est primordial pour pouvoir répondre à des essais viticoles (agronomiques) ou à des essais oenologiques (criblage de produits oenologiques). Des protocoles d'échantillonnage sont actuellement en cours d'évaluation. La comparaison d'échelle 1kg/100kg est également en cours pour justifier que l'échelle 1 kg peut être utilisée pour intégrer en amont des critères oenologiques à la sélection variétale. Le prototypage (analyse fonctionnelle et caractérisation des fonctions) de l'outil final automatisé pour des micro-vinifications en rouge mobilise à l'heure actuelle les équipes de Supagro, de l'INRA (UMR SPO, UE Pech Rouge) et de l'IFV.

## Remerciements

L'UMT Minicave est financée par l'ACTIA. Nous remercions tous les acteurs de cette première année de lancement, en particulier l'équipe de l'IFV Pech Rouge (D. Caboulet, A.Roy, E.Romero, N. Imbern) ainsi que les stagiaires A. Garnier, B. de Faria Baricelli et A.Marty.

## Références

* Casalta, E., Aguera, E., Picou C., Rodriguez-Bencomo, JJ., Salmon, JM., Sablayrolles, JM. A comparison of laboratory and pilot-scale fermentations in winemaking condition. Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:1665-1673.

* Dambergs, R. G.; Sparrow, A. The "Bodum French Press": a simple, reliable, small-lot fermentation method. (2010) Poster, 14th AWITC.

* Feinberg M., Validation Interne des méthodes d'analyse. 224p.

* Sparrow, A. M., Smart, R. E., Fermentation Volume Studies for Red Wine Experimentation. S. Afr. J. Enol. Vitic. (2015) 36: 343-346
Les coefficients de variation (CV%) des paramètres oenologiques et de la couleur sont faibles comme déjà démontrés dans la littérature (Dambergs et al. 2010, *Sparrow et al.*, 2015). Il est remarquable de noter que les coefficients de variation sont également inférieurs à 10% sur la plupart des arômes dosés. Cette étude apporte des données supplémentaires sur la robustesse de la méthode de vinification en cafetières à piston sur les principaux marqueurs du fruité.

## Conclusion

La méthode est robuste sur les paramètres oenologiques mais également sur les paramètres qualitatifs : couleur et principaux arômes du fruité. Des coefficients de variation bas sur la plupart des paramètres montrent la performance des micro-vinifications en cafetières à piston. Ceci est primordial pour l'expérimentation. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les limites et les avantages des micro-vinifications en petit volume.

## Perspectives

Les attentes et les perspectives de l'utilisation de l'outil de micro-vinifications en rouge (<1kg) sont nombreuses. L'échantillonnage de ces 1kg de raisins est primordial pour pouvoir répondre à des essais viticoles (agronomiques) ou à des essais oenologiques (criblage de produits oenologiques). Des protocoles d'échantillonnage sont actuellement en cours d'évaluation. La comparaison d'échelle 1kg/100kg est également en cours pour justifier que l'échelle 1 kg peut être utilisée pour intégrer en amont des critères oenologiques à la sélection variétale. Le prototypage (analyse fonctionnelle et caractérisation des fonctions) de l'outil final automatisé pour des micro-vinifications en rouge mobilise à l'heure actuelle les équipes de Supagro, de l'INRA (UMR SPO, UE Pech Rouge) et de l'IFV.

## Remerciements

L'UMT Minicave est financée par l'ACTIA. Nous remercions tous les acteurs de cette première année de lancement, en particulier l'équipe de l'IFV Pech Rouge (D. Caboulet, A.Roy, E.Romero, N. Imbern) ainsi que les stagiaires A. Garnier, B. de Faria Baricelli et A.Marty.

## Références

* Casalta, E., Aguera, E., Picou C., Rodriguez-Bencomo, JJ., Salmon, JM., Sablayrolles, JM. A comparison of laboratory and pilot-scale fermentations in winemaking condition. Appl Microbiol Biotechnol (2010) 87:1665-1673.

* Dambergs, R. G.; Sparrow, A. The "Bodum French Press": a simple, reliable, small-lot fermentation method. (2010) Poster, 14th AWITC.

* Feinberg M., Validation Interne des méthodes d'analyse. 224p.

* Sparrow, A. M., Smart, R. E., Fermentation Volume Studies for Red Wine Experimentation. S. Afr. J. Enol. Vitic. (2015) 36: 343-346
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