# Actes scientifiques de la 10ème Journée Scientifique Vigne et Vin (JSVV)

Agnès Ageorges, Bruno Blondin, Jean-Marie Sablayrolles

► To cite this version:

Agnès Ageorges, Bruno Blondin, Jean-Marie Sablayrolles. Actes scientifiques de la 10ème Journée Scientifique Vigne et Vin (JSVV). Quelles avancées récentes pour l'œnologie?, 2018, 10.17180/csxk-cc27. hal-04540594

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https://hal.inrae.fr/hal-04540594

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archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

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Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
# Actes scientifiques de la 10ème Journée Scientifique Vigne et Vin (JSVV)

Agnès Ageorges, Bruno Blondin, Jean-Marie Sablayrolles

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Agnès Ageorges, Bruno Blondin, Jean-Marie Sablayrolles. Actes scientifiques de la 10ème Journée Scientifique Vigne et Vin (JSVV). Quelles avancées récentes pour l’œnologie?, Mar 2018, Montpeller, France. 2018, 10.17180/csxk-cc27. hal-04540594

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abroad, or from public or private research centers.

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JOURNÉE SCIENTIFIQUE
VIGNE - VIN

Mercredi 21 mars 2018
Montpellier

Quelles avancées récentes
pour l'œnologie ?

organisée par

• l'unité mixte de recherches Sciences Pour l'Œnologie

• l'Institut des Hautes Études de la Vigne et du Vin (IHEV)

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<figure><img src="image_4.png" /></figure>

MONTPELLIER UNIVERSITÉ D'EXCELLENCE

MUSE

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Montpellier
SupAgro

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

INRA
SCIENCE & IMPACT

Contact : jsvv10@inra.fr

INRA UMR SPO
Campus de la Gaillarde - Bât 28
2 place Pierre Viala
34060 Montpellier cedex2
10

JOURNÉE SCIENTIFIQUE
VIGNE - VIN

Mercredi 21 mars 2018
Montpellier

Quelles avancées récentes
pour l'œnologie ?

organisée par

• l'unité mixte de recherches Sciences Pour l'Œnologie

• l'Institut des Hautes Études de la Vigne et du Vin (IHEV)

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MUSE
MONTPELLIER UNIVERSITÉ D'EXCELLENCE

M

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SupAgro
Montpellier

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INRA
SCIENCE & IMPACT

Contact : jsvv10@inra.fr

INRA UMR SPO
Campus de la Gaillarde - Bât 28
2 place Pierre Viala
34060 Montpellier cedex2
L'Unité Mixte de Recherches Sciences Pour l'Œnologie (UMR SPO) et l'Institut des Hautes Etudes de la Vigne et du Vin (IHEV) vous proposent de découvrir des avancées récentes de la recherche dans le secteur viti-vinicole sur le campus Montpellier SupAgro.

Pour cette 10ème édition, l'œnologie sera au cœur des sujets abordés. Le programme se décline autour de 3 sessions : une 1ère session traitant de la diversité et l'aspect nutritionnel des levures œnologiques ; une 2ème session sur l'amertume des vins ; et une 3ème session dans laquelle seront présentés les avancées et nouveaux outils pour une meilleure maîtrise de la qualité des vins.
Nous avons privilégié des interventions courtes et synthétiques afin d'offrir aux participants une vision la plus large possible des sujets de recherche actuels.
Cette formule laisse une place importante pour la discussion, et pour les remarques et suggestions des professionnels de la filière.

En espérant que cette journée du 21 Mars 2018 soit riche d'échanges et d'enseignements.

Bruno Blondin

Jean-Marie Sablayrolles

Directeur de l'IHEV

Directeur de l'UMR SPO

**Coordinatrice scientifique** : Agnès Ageorges, INRA, UMR SPO

**Comité d'Organisation**

Agnès Ageorges, INRA, UMR SPO

Bruno Blondin, Montpellier SupAgro, IHEV

Catherine Chabalier, INRA, UMR SPO

Véronique Cheynier, INRA, UMR SPO

Agnès Masquin, INRA, UMR SPO

Didier Ollé, Montpellier SupAgro, IHEV

Philippe Polizzi, INRA, UMR SPO

Sabine Ragusi, Montpellier SupAgro, IHEV

Jean-Marie Sablayrolles, INRA, UMR SPO

Jean-Michel Salmon, INRA, UE Pech-Rouge

Cédric Saucier, UM, UMR SPO

Aude Vernhet, Montpellier SupAgro, UMR SPO

**Avec l'appui de :**

Lisbeth Michel (Infographie, site web)
L'Unité Mixte de Recherches Sciences Pour l'Œnologie (UMR SPO) et l'Institut des Hautes Etudes de la Vigne et du Vin (IHEV) vous proposent de découvrir des avancées récentes de la recherche dans le secteur viti-vinicole sur le campus Montpellier SupAgro.

Pour cette 10ème édition, l'œnologie sera au cœur des sujets abordés. Le programme se décline autour de 3 sessions : une 1ère session traitant de la diversité et l'aspect nutritionnel des levures œnologiques ; une 2ème session sur l'amertume des vins ; et une 3ème session dans laquelle seront présentés les avancées et nouveaux outils pour une meilleure maîtrise de la qualité des vins.
Nous avons privilégié des interventions courtes et synthétiques afin d'offrir aux participants une vision la plus large possible des sujets de recherche actuels.
Cette formule laisse une place importante pour la discussion, et pour les remarques et suggestions des professionnels de la filière.

En espérant que cette journée du 21 Mars 2018 soit riche d'échanges et d'enseignements.

Bruno Blondin

Jean-Marie Sablayrolles

Directeur de l'IHEV

Directeur de l'UMR SPO

**Coordinatrice scientifique** : Agnès Ageorges, INRA, UMR SPO

**Comité d'Organisation**

Agnès Ageorges, INRA, UMR SPO

Bruno Blondin, Montpellier SupAgro, IHEV

Catherine Chabalier, INRA, UMR SPO

Véronique Cheynier, INRA, UMR SPO

Agnès Masquin, INRA, UMR SPO

Didier Ollé, Montpellier SupAgro, IHEV

Philippe Polizzi, INRA, UMR SPO

Sabine Ragusi, Montpellier SupAgro, IHEV

Jean-Marie Sablayrolles, INRA, UMR SPO

Jean-Michel Salmon, INRA, UE Pech-Rouge

Cédric Saucier, UM, UMR SPO

Aude Vernhet, Montpellier SupAgro, UMR SPO

**Avec l'appui de :**

Lisbeth Michel (Infographie, site web)
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<figure><img src="image_6.png" /></figure>
<figure><img src="image_11.png" /></figure>

# Sommaire

**Les levures non-Saccharomyces : un potentiel à exploiter en œnologie** p. 1

Seguinot P.¹, Rollero S.², Englezos V.³, Ortiz-Julien A.⁴, Guillamon J-M⁵, Divol B.², Bloem A.¹, Camarasa C.¹
¹UMR SPO, INRA; ²IWBT, Stellenbosch University; ³DISAFA, Turin University; ⁴Lallemand; ⁵Valencia University

**Que savons-nous de plus sur la diversité des levures Saccharomyces cerevisiae en œnologie ?** p. 7

Legras J-L
UMR SPO, INRA Montpellier

**La mortalité des levures en fermentation alcoolique : le rôle clé des limitations en micronutriments et de l'azote** p. 13

Blondin B.¹, Duc C.¹,², Pradal M.¹, Noble J.², Tesnière C.¹
¹UMR SPO, INRA, Montpellier SupAgro; ²Lallemand

**Effet des lipides des bourbes sur la conduite des fermentations et la viabilité des levures** p. 17

Tesnière C.¹, Casalta E.¹, Girardi-Piva G.¹, Pradal M.¹, Vernhet A.¹, Sablayrolles J-M¹, Salmon J-M²
¹INRA-UMR SPO; ²INRA UE Pech Rouge

**De la perception de l'amertume à l'amertume des vins** p.21

Samson A.¹, Leriche C.¹, Bégué C.¹, Fabre C.¹, Caillé S.²
¹UE Pech Rouge, INRA; ²UMR SPO, INRA

**Acquisitions récentes sur l'amertume des vins rouges : contribution des composés libérés par le bois de chêne** p. 27

Marchal A., Cretin B., Sindt L., Gammacurta M., Waffo-Téguo P., Dubourdieu D.
Univ. Bordeaux, ISVV; INRA, ISVV

**Etude des facteurs influençant l'amertume des vins blancs par l'analyse sensorielle** p. 35

Caillé S.¹, Chabalier C.¹, Samson A.¹,²
¹UMR SPO, INRA; ²UE Pech-Rouge, INRA

**Intérêt de l'utilisation des dérivés de levure en œnologie** p. 41

Mekoue Nguela J.¹, Sieczkowski N.¹, Poncet-Legrand C.², Roi S.², Brillouet J-M², Vernhet A.²
¹Lallemand; ²UMR SPO, INRA

**Les laccases de Botrytis cinerea : Structures, activités, effet souche et inhibitions par des extraits polyphénoliques** p. 47

Saucier C.¹, Quijada Morín N.¹, Garcia F.¹, Sauvage F-X, Lambert K.², Walker A-S³, Viaud M.³, Tiers L.⁴, Hirtz C.⁴, Iturmendi N.⁵, Moine V.⁵
¹UMR SPO, Université Montpellier; ²PHYMEDEXP, Univ Montpellier; ³UMR BIOGER, AgroParisTech; ⁴LBPC-IRMB, CHU Montpellier; ⁵Biolaffort

**Risques associés à l'activité Polyphénol Oxydase (PPO) et vinification bas intrants** p. 51

Sire Y., Remise E., Samson A., Moutounet M., Salmon J-M
UE Pech Rouge, INRA

**L'UMT Minicave : outil de multi-vinifications en petit volume** p. 57

Ducasse M-A¹, Aguera E.²
¹Institut Français de la Vigne et du Vin; ²UE Pech Rouge, INRA
<figure><img src="image_7.png" /></figure>

# Sommaire

**Les levures non-Saccharomyces : un potentiel à exploiter en œnologie** p. 1

Seguinot P.¹, Rollero S.², Englezos V.³, Ortiz-Julien A.⁴, Guillamon J-M⁵, Divol B.², Bloem A.¹, Camarasa C.¹
¹UMR SPO, INRA; ²IWBT, Stellenbosch University; ³DISAFA, Turin University; ⁴Lallemand; ⁵Valencia University

**Que savons-nous de plus sur la diversité des levures Saccharomyces cerevisiae en œnologie ?** p. 7

Legras J-L
UMR SPO, INRA Montpellier

**La mortalité des levures en fermentation alcoolique : le rôle clé des limitations en micronutriments et de l'azote** p. 13

Blondin B.¹, Duc C.¹,², Pradal M.¹, Noble J.², Tesnière C.¹
¹UMR SPO, INRA, Montpellier SupAgro; ²Lallemand

**Effet des lipides des bourbes sur la conduite des fermentations et la viabilité des levures** p. 17

Tesnière C.¹, Casalta E.¹, Girardi-Piva G.¹, Pradal M.¹, Vernhet A.¹, Sablayrolles J-M¹, Salmon J-M²
¹INRA-UMR SPO; ²INRA UE Pech Rouge

**De la perception de l'amertume à l'amertume des vins** p.21

Samson A.¹, Leriche C.¹, Bégué C.¹, Fabre C.¹, Caillé S.²
¹UE Pech Rouge, INRA; ²UMR SPO, INRA

**Acquisitions récentes sur l'amertume des vins rouges : contribution des composés libérés par le bois de chêne** p. 27

Marchal A., Cretin B., Sindt L., Gammacurta M., Waffo-Téguo P., Dubourdieu D.
Univ. Bordeaux, ISVV; INRA, ISVV

**Etude des facteurs influençant l'amertume des vins blancs par l'analyse sensorielle** p. 35

Caillé S.¹, Chabalier C.¹, Samson A.¹,²
¹UMR SPO, INRA; ²UE Pech-Rouge, INRA

**Intérêt de l'utilisation des dérivés de levure en œnologie** p. 41

Mekoue Nguela J.¹, Sieczkowski N.¹, Poncet-Legrand C.², Roi S.², Brillouet J-M², Vernhet A.²
¹Lallemand; ²UMR SPO, INRA

**Les laccases de Botrytis cinerea : Structures, activités, effet souche et inhibitions par des extraits polyphénoliques** p. 47

Saucier C.¹, Quijada Morín N.¹, Garcia F.¹, Sauvage F-X, Lambert K.², Walker A-S³, Viaud M.³, Tiers L.⁴, Hirtz C.⁴, Iturmendi N.⁵, Moine V.⁵
¹UMR SPO, Université Montpellier; ²PHYMEDEXP, Univ Montpellier; ³UMR BIOGER, AgroParisTech; ⁴LBPC-IRMB, CHU Montpellier; ⁵Biolaffort

**Risques associés à l'activité Polyphénol Oxydase (PPO) et vinification bas intrants** p. 51

Sire Y., Remise E., Samson A., Moutounet M., Salmon J-M
UE Pech Rouge, INRA

**L'UMT Minicave : outil de multi-vinifications en petit volume** p. 57

Ducasse M-A¹, Aguera E.²
¹Institut Français de la Vigne et du Vin; ²UE Pech Rouge, INRA
<figure><img src="image_12.png" /></figure>
<figure><img src="image_8.png" /></figure>
Les levures non-Saccharomyces : un
potentiel à exploiter en œnologie

Pauline Seguinot<fnref n="1" />, Stéphanie Rollero<fnref n="2" />, Vasileios Englezos<fnref n="3" />, Anne Ortiz-Julien<fnref n="4" />, José-Manuel Guillamon<fnref n="5" />, Benoit Divol<fnref n="2" />, Audrey Bloem<fnref n="1" />, Carole Camarasa<fnref n="1" />

Introduction

Ces 50 dernières années, la pratique du levurage, c'est-à-dire l'ensemencement des moûts de raisin par des souches de *Saccharomyces cerevisiae*, sélectionnées sur la base de traits d'intérêt technologique, s'est largement répandue dans la filière œnologique pour contrôler l'étape de fermentation alcoolique. C'est en effet le procédé le plus approprié pour s'assurer du bon déroulement de la fermentation et éviter la formation de défauts d'arôme. Dans ces conditions, les souches de *S. cerevisiae* ensemencées supplantent rapidement les espèces non-*Saccharomyces* de la flore indigène des jus de raisin. Ce phénomène est principalement lié au manque d'adaptation aux limitations en oxygène et aux concentrations croissantes en éthanol du milieu des levures non conventionnelles. De ce fait, elles sont incapables de mener la fermentation œnologique jusqu'à épuisement des sucres et ont longtemps été considérées comme des microorganismes d'altération.

Il existe actuellement un regain d'intérêt vis-à-vis de ces espèces, dont le potentiel pour améliorer la qualité aromatique des vins est maintenant reconnu (1). Ces souches se caractérisent par des spécificités métaboliques, notamment au niveau de la formation d'arômes, et par une capacité importante de production d'enzymes hydrolytiques qui sont impliquées dans la révélation d'arômes variétaux. Ainsi, même si elle est limitée au début de la fermentation, leur croissance peut contribuer de façon significative à la complexité et la typicité des vins. Ainsi, le développement de levains mixtes associant souches non-*Saccharomyces* et *S. cerevisiae*, doit permettre de répondre aux attentes des producteurs de la filière qui, pour s'imposer dans un marché mondial de plus en plus concurrentiel, cherchent à proposer des vins présentant une complexité organoleptique accrue.

Toutefois, en pratique, l'apport des levures non-Saccharomyces à la qualité des vins n'est pas observé de façon systématique et varie notamment en fonction des caractéristiques du moût. D'autre part, le développement de levures non-Saccharomyces en début de procédé conduit obligatoiremnet à une diminution des ressources nutritionnelles. Cela peut par la suite être préjudiciable à la croissance des souches de S. cerevisiae (2), dont l'implantation est requise pour assurer l'achèvement de la fermentation alcoolique. Il apparaît donc qu'une meilleure connaissance de la physiologie de ces espèces (métabolisme, consommation de nutriments,...) est nécessaire pour mieux exploiter leur potentiel en œnologie. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet étaient de déterminer les traits phénotypiques d'intêret technologique d'espèces de levures issues du consortium oenologique et d'étudier leurs besoins nutritifs pour proposer des stratégies de fermentation séquentielle avec S. cerevisiae.

<footnote n="1">¹INRA, UMR-SPO</footnote>

<footnote n="2">²IWBT, Stellenbosch University</footnote>

<footnote n="3">³DISAFA, Turin University</footnote>

<footnote n="4">⁴Lallemand</footnote>

<footnote n="5">⁵IATA, Valencia University</footnote>
Les levures non-*Saccharomyces* : un
potentiel à exploiter en œnologie

Pauline Seguinot<fnref n="1" />, Stéphanie Rollero<fnref n="2" />, Vasileios Englezos<fnref n="3" />, Anne Ortiz-Julien<fnref n="4" />, José-Manuel Guillamon<fnref n="5" />, Benoit Divol<fnref n="2" />, Audrey Bloem<fnref n="1" />, Carole Camarasa<fnref n="1" />

Introduction

Ces 50 dernières années, la pratique du levurage, c'est-à-dire l'ensemencement des moûts de raisin par des souches de *Saccharomyces cerevisiae*, sélectionnées sur la base de traits d'intérêt technologique, s'est largement répandue dans la filière œnologique pour contrôler l'étape de fermentation alcoolique. C'est en effet le procédé le plus approprié pour s'assurer du bon déroulement de la fermentation et éviter la formation de défauts d'arôme. Dans ces conditions, les souches de *S. cerevisiae* ensemencées supplantent rapidement les espèces non-*Saccharomyces* de la flore indigène des jus de raisin. Ce phénomène est principalement lié au manque d'adaptation aux limitations en oxygène et aux concentrations croissantes en éthanol du milieu des levures non conventionnelles. De ce fait, elles sont incapables de mener la fermentation œnologique jusqu'à épuisement des sucres et ont longtemps été considérées comme des microorganismes d'altération.

Il existe actuellement un regain d'intérêt vis-à-vis de ces espèces, dont le potentiel pour améliorer la qualité aromatique des vins est maintenant reconnu (1). Ces souches se caractérisent par des spécificités métaboliques, notamment au niveau de la formation d'arômes, et par une capacité importante de production d'enzymes hydrolytiques qui sont impliquées dans la révélation d'arômes variétaux. Ainsi, même si elle est limitée au début de la fermentation, leur croissance peut contribuer de façon significative à la complexité et la typicité des vins. Ainsi, le développement de levains mixtes associant souches non-*Saccharomyces* et *S. cerevisiae*, doit permettre de répondre aux attentes des producteurs de la filière qui, pour s'imposer dans un marché mondial de plus en plus concurrentiel, cherchent à proposer des vins présentant une complexité organoleptique accrue.

Toutefois, en pratique, l'apport des levures non-*Saccharomyces* à la qualité des vins n'est pas observé de façon systématique et varie notamment en fonction des caractéristiques du moût. D'autre part, le développement de levures non-*Saccharomyces* en début de procédé conduit obligatoirement à une diminution des ressources nutritionnelles. Cela peut par la suite être préjudiciable à la croissance des souches de *S. cerevisiae* (2), dont l'implantation est requise pour assurer l'achèvement de la fermentation alcoolique. Il apparaît donc qu'une meilleure connaissance de la physiologie de ces espèces (métabolisme, consommation de nutriments,...) est nécessaire pour mieux exploiter leur potentiel en œnologie. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet étaient de déterminer les traits phénotypiques d'intérêt technologique d'espèces de levures issues du consortium oenologique et d'étudier leurs besoins nutritifs pour proposer des stratégies de fermentation séquentielle avec *S. cerevisiae*.

<footnote n="1">¹INRA, UMR-SPO</footnote>

<footnote n="2">²IWBT, Stellenbosch University</footnote>

<footnote n="3">³DISAFA, Turin University</footnote>

<footnote n="4">⁴Lallemand</footnote>

<footnote n="5">⁵IATA, Valencia University</footnote>
Techniques expérimentales et matériels utilisés

Ce travail a été focalisé sur trois espèces de levures fréquemment rencontrées dans la flore indigène des moûts de raisin : *Metschnikowia pulcherrima*, *Klyveromyces marxianus* et *Starmerella bacillaris*.

Des fermentations en souche pure ou en inoculation séquentielle avec S. cerevisiae (ajoutée après 48 h) sont réalisées à l'échelle laboratoire (250 mL ou 1L) sur un milieu synthétique mimant la composition d'un moût de raisin. Ce milieu contient notamment de fortes concentrations en sucres et de faibles teneurs en azote (200 mg N/L sous forme d'un mélange d'ammonium et d'acides aminés) et en lipides (5 mg/L de phytostérols représentatifs des bourbes œnologiques : β-sitostérol majoritairement, campestérol et stigmastérol).

Le dégagement de CO₂ (correspondant à la cinétique fermentaire) est mesuré par suivi de la perte de poids. Les teneurs en sucres résiduels et en composés issus du métabolisme carboné central (glycérol, éthanol, acides organiques) sont dosées par HPLC et les concentrations en acides aminés sont mesurées par chromatographie liquide ionique couplée à une détection colorimétrique après dérivatisation post-colonne à la ninhydrine. Les profils aromatiques ont été déterminés par analyse GC-MS (chromatographie en phase gazeuse-détection par spectrophotométrie de masse). Les activités enzymatiques hydrolytiques sont mesurées par dosages colorimétriques, en utilisant des substrats synthétiques dont l'hydrolyse libère un groupement chromophore.

Résultats

Par rapport aux conditions de référence en culture pure de S. cerevisiae, des modifications importantes du profil de formation d'arômes sont observées lors de fermentations menées en inoculation séquentielle M. pulcherrima et S. cerevisiae, ajoutée après 48 h de fermentation (Figure 1A). En particulier, la croissance des levures M. pulcherrima en début de procédé conduit à une augmentation significative de la formation d'isobutanol et d'isoamyl alcool et de l'ensemble des esters d'acétate (amyl acétate, isoamyl acétate, isobutyl acétate et phenyléthanol). A l'inverse, la production d'acides gras à moyenne chaîne est diminuée.

De plus, l'espèce M. pulcherrima se caractérise par une capacité élevée de production d'enzymes hydrolytiques, qui sont impliquées dans la libération d'arômes variétaux à partir de leurs précurseurs apportés dans les moûts de raisin (Figure 1B). Ainsi, un niveau substantiel d'activité β-lyase, enzyme impliquée dans la libération de thiols, est mesuré tout le long de fermentations en présence de M. pulcherrima, alors qu'aucune activité n'est détectée au cours de fermentation de S. cerevisiae. L'ensemble de ces données souligne le potentiel de souches de M. pulcherrima, de par leurs caractéristiques enzymatiques et de production d'arômes fermentaires, pour améliorer la qualité organoleptique des vins lorsqu'elles sont utilisées en inoculation séquentielle avec S. cerevisiae.

Toutefois, la comparaison des populations cellulaires et des profils de production de CO₂ entre cultures de S. cerevisiae en souche pure et en inoculation séquentielle avec M. pulcherrima (Figure 1C, encart) montre une mauvaise implantation des levures S. cerevisiae au cours de la modalité inoculation séquentielle. Cela se traduit par un ralentissement marqué de la cinétique fermentaire. L'analyse du niveau de consommation des sources d'azote après 48 h de fermentation, qui correspond au moment de l'ajout de la souche de S. cerevisiae dans le mode d'inoculation séquentielle, montre une consommation partielle de la ressource azotée disponible (49 %). Toutefois, certains acides aminés, comme le glutamate et la glutamine, et les acides aminés branchés (leucine, isoleucine, valine), sont totalement consommés par M. pulcherrima. L'épuisement de ces sources d'azote pourrait être à l'origine de la limitation de croissance de S. cerevisiae en inoculation séquentielle avec M. pulcherrima. Ce phénomène peut aussi être expliqué par une limitation en un autre nutriment ou la production par l'espèce non-Saccharomyces d'un métabolite inhibiteur pour S. cerevisiae.
Techniques expérimentales et matériels utilisés

Ce travail a été focalisé sur trois espèces de levures fréquemment rencontrées dans la flore indigène des moûts de raisin : *Metschnikowia pulcherrima*, *Klyveromyces marxianus* et *Starmerella bacillaris*.

Des fermentations en souche pure ou en inoculation séquentielle avec S. cerevisiae (ajoutée après 48 h) sont réalisées à l'échelle laboratoire (250 mL ou 1L) sur un milieu synthétique mimant la composition d'un moût de raisin. Ce milieu contient notamment de fortes concentrations en sucres et de faibles teneurs en azote (200 mg N/L sous forme d'un mélange d'ammonium et d'acides aminés) et en lipides (5 mg/L de phytostérols représentatifs des bourbes œnologiques : β-sitostérol majoritairement, campestérol et stigmastérol).

Le dégagement de CO₂ (correspondant à la cinétique fermentaire) est mesuré par suivi de la perte de poids. Les teneurs en sucres résiduels et en composés issus du métabolisme carboné central (glycérol, éthanol, acides organiques) sont dosées par HPLC et les concentrations en acides aminés sont mesurées par chromatographie liquide ionique couplée à une détection colorimétrique après dérivatisation post-colonne à la ninhydrine. Les profils aromatiques ont été déterminés par analyse GC-MS (chromatographie en phase gazeuse-détection par spectrophotométrie de masse). Les activités enzymatiques hydrolytiques sont mesurées par dosages colorimétriques, en utilisant des substrats synthétiques dont l'hydrolyse libère un groupement chromophore.

Résultats

Par rapport aux conditions de référence en culture pure de S. cerevisiae, des modifications importantes du profil de formation d'arômes sont observées lors de fermentations menées en inoculation séquentielle M. pulcherrima et S. cerevisiae, ajoutée après 48 h de fermentation (Figure 1A). En particulier, la croissance des levures M. pulcherrima en début de procédé conduit à une augmentation significative de la formation d'isobutanol et d'isoamyl alcool et de l'ensemble des esters d'acétate (amyl acétate, isoamyl acétate, isobutyl acétate et phenyléthanol). A l'inverse, la production d'acides gras à moyenne chaîne est diminuée.

De plus, l'espèce M. pulcherrima se caractérise par une capacité élevée de production d'enzymes
hydrolytiques, qui sont impliquées dans la libération d'arômes variétaux à partir de leurs précurseurs
apportés dans les moûts de raisin (Figure 1B). Ainsi, un niveau substantiel d'activité β-lyase, enzyme
impliquée dans la libération de thiols, est mesuré tout le long de fermentations en présence de M.
pulcherrima, alors qu'aucune activité n'est détectée au cours de fermentation de S. cerevisiae.
L'ensemble de ces données souligne le potentiel de souches de M. pulcherrima, de par leurs
caractéristiques enzymatiques et de production d'arômes fermentaires, pour améliorer la qualité
organoleptique des vins lorsqu'elles sont utilisées en inoculation séquentielle avec S. cerevisiae.

Toutefois, la comparaison des populations cellulaires et des profils de production de CO2 entre cultures de S. cerevisiae en souche pure et en inoculation séquentielle avec M. pulcherrima (Figure 1C, encart) montre une mauvaise implantation des levures S. cerevisiae au cours de la modalité inoculation séquentielle. Cela se traduit par un ralentissement marqué de la cinétique fermentaire. L'analyse du niveau de consommation des sources d'azote après 48 h de fermentation, qui correspond au moment de l'ajout de la souche de S. cerevisiae dans le mode d'inoculation séquentielle, montre une consommation partielle de la ressource azotée disponible (49 %). Toutefois, certains acides aminés, comme le glutamate et la glutamine, et les acides aminés branchés (leucine, isoleucine, valine), sont totalement consommés par M. pulcherrima. L'épuisement de ces sources d'azote pourrait être à l'origine de la limitation de croissance de S. cerevisiae en inoculation séquentielle avec M. pulcherrima. Ce phénomène peut aussi être expliqué par une limitation en un autre nutriment ou la production par l'espèce non-Saccharomyces d'un métabolite inhibiteur pour S. cerevisiae.
Metschikowia pulcherrima

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

**Figure 1.** Fermentation séquentielle *Metschnikowia pulcherrima* / *Saccharomyces cerevisiae*.
(A) Production d'arômes fermentaires (concentrations mesurées en fin de fermentation) et (B) activités hydrolytiques au cours de fermentation de *S. cerevisiae* et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* / *S. cerevisiae*. (C) Population cellulaire, production de CO2 (encart ; la flèche indique le moment d'inoculation par *S. cerevisiae*) et consommation des sources d'azote au cours de cultures en souche pure et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* et *S. cerevisiae*.

Au cours de fermentations séquentielles S. bacillaris / S. cerevisiae, l'espèce S. bacillaris présente des
particularités phénotypiques liées à l'activité du métabolisme carboné central qui peuvent présenter un
intérêt technologique pour l'œnologie (3). Tout d'abord, cette espèce se caractérise par son caractère
fructophile, qui se traduit par une consommation exclusive de fructose en début de fermentation
séquentielle, avant l'ajout de S. cerevisiae (Figure 2A). Cette consommation précoce de fructose peut
être avantageuse dans le cas de fermentations difficiles, pour lesquelles une partie des sucres,
essentiellement du fructose, n'est pas consommé par S. cerevisiae. Cette espèce se différencie
également de S. cerevisiae par sa forte capacité de production de glycérol, et à l'inverse son faible
niveau de formation d'acétate (Figure 2B). Cela conduit à une augmentation de la teneur en glycérol et
une diminution de celle en acétate, ces deux propriétés métaboliques étant recherchées au cours de
l'élaboration des vins, pour l'obtention de produits moins acides et avec de la rondeur.
Metschikowia pulcherrima

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

**Figure 1.** Fermentation séquentielle *Metschnikowia pulcherrima* / *Saccharomyces cerevisiae*.
(A) Production d'arômes fermentaires (concentrations mesurées en fin de fermentation) et (B) activités hydrolytiques au cours de fermentation de *S. cerevisiae* et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* / *S. cerevisiae*. (C) Population cellulaire, production de CO2 (encart ; la flèche indique le moment d'inoculation par *S. cerevisiae*) et consommation des sources d'azote au cours de cultures en souche pure et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* et *S. cerevisiae*.

Au cours de fermentations séquentielles S. bacillaris / S. cerevisiae, l'espèce S. bacillaris présente des
particularités phénotypiques liées à l'activité du métabolisme carboné central qui peuvent présenter un
intérêt technologique pour l'œnologie (3). Tout d'abord, cette espèce se caractérise par son caractère
fructophile, qui se traduit par une consommation exclusive de fructose en début de fermentation
séquentielle, avant l'ajout de S. cerevisiae (Figure 2A). Cette consommation précoce de fructose peut
être avantageuse dans le cas de fermentations difficiles, pour lesquelles une partie des sucres,
essentiellement du fructose, n'est pas consommé par S. cerevisiae. Cette espèce se différencie
également de S. cerevisiae par sa forte capacité de production de glycérol, et à l'inverse son faible
niveau de formation d'acétate (Figure 2B). Cela conduit à une augmentation de la teneur en glycérol et
une diminution de celle en acétate, ces deux propriétés métaboliques étant recherchées au cours de
l'élaboration des vins, pour l'obtention de produits moins acides et avec de la rondeur.
Starmerella bacillaris

A

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

**Figure 2.** Fermentation séquentielle *Starmerella bacillaris* / *Saccharomyces cerevisiae*. (A) Production d'éthanol (orange), consommation de glucose (bleu) et de fructose (rouge) au cours de fermentation de *S. cerevisiae* (en clair) et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* / *S. cerevisiae* (en foncé). Croissance de *S. cerevisiae* en culture pure (bleu clair) et en culture séquentielle (bleu foncé) avec *S. bacillaris* (orange). La flèche indique le moment d'inoculation par *S. cerevisiae*. (B) Production de métabolites en fin de culture pure de *S. cerevisiae* et de culture séquentielle *M. pulcherrima* / *S. cerevisiae* et rendements de production des métabolites de *S. cerevisiae* et *S. bacillaris*. (C) Consommation/production de sources d'azote au cours de cultures en souche pure de *S. cerevisiae* et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* et *S. cerevisiae*.

Enfin, nous avons observé des différences majeures dans le profil d'assimilation des sources d'azote entre *S. cerevisiae*, qui mobilise en 48 h l'ensemble de la ressource azotée du milieu pour sa croissance et *S. bacillaris* (Figure 2C). Cette espèce n'utilise que partiellement la ressource azotée (30 %) en consommant préférentiellement certaines sources d'azote comme l'ammonium et l'arginine. D'autres composés ne sont pas assimilés ou sont même produits (alanine, glycine, leucine), ce qui peut être avantageux en fermentation séquentielle pour moduler la formation de composés volatils par *S. cerevisiae*. Par contre, le fort niveau de consommation de certaines sources d'azote par *S. bacillaris* peut être une des causes de l'implantation limitée de *S. cerevisiae* (Figure 2A) et doit être pris en compte pour le développement de fermentations séquentielles.
Starmerella bacillaris

A

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

C

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

**Figure 2. Fermentation séquentielle Starmerella bacillaris / Saccharomyces cerevisiae.**

**(A)** Production d'éthanol (orange), consommation de glucose (bleu) et de fructose (rouge) au cours de fermentation de *S. cerevisiae* (en clair) et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* / *S. cerevisiae* (en foncé). Croissance de *S. cerevisiae* en culture pure (bleu clair) et en culture séquentielle (bleu foncé) avec *S. bacillaris* (orange). La flèche indique le moment d'inoculation par *S. cerevisiae*. **(B)** Production de métabolites en fin de culture pure de *S. cerevisiae* et de culture séquentielle *M. pulcherrima* / *S. cerevisiae* et rendements de production des métabolites de *S. cerevisiae* et *S. bacillaris*. **(C)** Consommation/production de sources d'azote au cours de cultures en souche pure de *S. cerevisiae* et de fermentation séquentielle *M. pulcherrima* et *S. cerevisiae*.

Enfin, nous avons observé des différences majeures dans le profil d'assimilation des sources d'azote entre *S. cerevisiae*, qui mobilise en 48 h l'ensemble de la ressource azotée du milieu pour sa croissance et *S. bacillaris* (Figure 2C). Cette espèce n'utilise que partiellement la ressource azotée (30 %) en consommant préférentiellement certaines sources d'azote comme l'ammonium et l'arginine. D'autres composés ne sont pas assimilés ou sont même produits (alanine, glycine, leucine), ce qui peut être avantageux en fermentation séquentielle pour moduler la formation de composés volatils par *S. cerevisiae*. Par contre, le fort niveau de consommation de certaines sources d'azote par *S. bacillaris* peut être une des causes de l'implantation limitée de *S. cerevisiae* (Figure 2A) et doit être pris en compte pour le développement de fermentations séquentielles.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 3.** Fermentation séquentielle *Kluyveromyces marxianus* / *Saccharomyces cerevisiae*. (A) Production d'arômes fermentaires au cours de fermentation de *S. cerevisiae* et de fermentation séquentielle *K. marxianus* / *S. cerevisiae*. (B) Population cellulaire, production de CO₂ (la flèche indique le moment d'inoculation par *S. cerevisiae*). (C) Consommation de sources d'azote par *S. cerevisiae* et *K. marxianus*. Encart : Restauration de la cinétique de *S. cerevisiae* (bleu) par addition d'azote au cours de fermentation séquentielle *K. marxianus* / *S. cerevisiae* (gris) ; la flèche indique le moment d'ajout de *S. cerevisiae* et d'azote.</figcaption></figure>

La réalisation de fermentations séquentielles *K. marxianus* / *S. cerevisiae* conduit à des modifications des profils de formation d'arômes particulièrement intéressantes dans un contexte œnologique (4). En effet, on observe, dès le début de la fermentation, une forte augmentation de la teneur en phénylethyl acétate, et plus généralement en esters d'acétate, composés volatils impliqués dans le caractère fruité des vins (Figure 3A). Cette modification s'accompagne d'une augmentation de la formation de certains alcools supérieurs et d'une diminution de la formation d'acides gras à moyenne chaîne, dont la formation n'est pas souhaitable lors de l'élaboration des vins (odeur de rance et de chèvre).
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 3.** Fermentation séquentielle *Kluyveromyces marxianus* / *Saccharomyces cerevisiae*. (A) Production d'arômes fermentaires au cours de fermentation de *S. cerevisiae* et de fermentation séquentielle *K. marxianus* / *S. cerevisiae*. (B) Population cellulaire, production de CO₂ (la flèche indique le moment d'inoculation par *S. cerevisiae*). (C) Consommation de sources d'azote par *S. cerevisiae* et *K. marxianus*. Encart : Restauration de la cinétique de *S. cerevisiae* (bleu) par addition d'azote au cours de fermentation séquentielle *K. marxianus* / *S. cerevisiae* (gris) ; la flèche indique le moment d'ajout de *S. cerevisiae* et d'azote.</figcaption></figure>

La réalisation de fermentations séquentielles *K. marxianus* / *S. cerevisiae* conduit à des modifications des profils de formation d'arômes particulièrement intéressantes dans un contexte œnologique (4). En effet, on observe, dès le début de la fermentation, une forte augmentation de la teneur en phénylethyl acétate, et plus généralement en esters d'acétate, composés volatils impliqués dans le caractère fruité des vins (Figure 3A). Cette modification s'accompagne d'une augmentation de la formation de certains alcools supérieurs et d'une diminution de la formation d'acides gras à moyenne chaîne, dont la formation n'est pas souhaitable lors de l'élaboration des vins (odeur de rance et de chèvre).
La croissance de *K. marxianus* en début de fermentation conduit à un ralentissement de la cinétique fermentaire tout le long du procédé, qui s'explique par une implantation très réduite de *S. cerevisiae* (**Figure 3B**). La comparaison des profils d'assimilation des sources d'azote entre les deux espèces montre des niveaux de consommations similaires après 48 h de culture, et un épuisement de la ressource azotée au moment de l'inoculation de *S. cerevisiae* est probablement à l'origine de sa mauvaise implantation. Pour valider cette hypothèse, des ajouts d'azote (sous forme organique ou minérale) ont été effectués au moment de l'inoculation de *S. cerevisiae*, et ont permis de restaurer la cinétique fermentaire de référence (**Figure 3C**, encart).

**Conclusion**

L'ensemble de ces données montrent la grande diversité phénotypique des levures non-*Saccharomyces* du consortium œnologique, qui, par des traits d'intérêt technologique absents chez *S. cerevisiae*, peuvent contribuer de façon positive au procédé de vinification. Ces caractéristiques sont spécifiques d'une espèce ou d'un petit groupe d'espèces. Ainsi, l'apport de levures *K. marxianus*, et dans une moindre mesure de *M. pulcherrima*, module la teneur finale en arômes fermentaires des vins, notamment en esters d'acétate : ces deux espèces pourront être utilisées pour apporter des notes fruitées au produit fini. L'espèce *M. pulcherrima* présente également une forte capacité de production d'enzymes hydrolytiques, en particulier de β-lyases, et son utilisation est adaptée pour faciliter la libération de thiols variétaux (cépage Colombard, Sauvignon blanc). A l'inverse, *S. bacillaris* ne permet pas de moduler la formation d'arômes fermentaires, mais montre une forte capacité d'utilisation du fructose, et son utilisation en fermentation séquentielle peut permettre de limiter les problèmes d'achèvement de la fermentation par *S. cerevisiae*. Cette espèce se caractérise également par une réorientation métabolique vers la production de glycérol au détriment de l'éthanol, et peut donc être utilisée lorsqu'on recherche à abaisser légèrement le degré alcoolique des vins (de l'ordre de 0,5°C).

Il apparaît également que les trois espèces étudiées présentent des besoins nutritifs différents (en ce qui concerne la nutrition azotée), et que leur développement en début du procédé de fermentation peut entraîner des difficultés d'implantation de *S. cerevisiae*.

Ainsi, la mise en œuvre de fermentations séquentielles non-*Saccharomyces* / *S. cerevisiae* pour améliorer la qualité des vins nécessite :

- d'une part d'adapter le choix de l'espèce à l'objectif visé (formation d'arômes fermentaires, libération d'arômes variétaux, gestion de la fin de fermentation...)

- d'autre part de mettre en place, en prenant en compte les besoins nutritionnels de l'espèce non-*Saccharomyces* utilisée en début de procédé, des stratégies de nutrition de *S. cerevisiae* pour permettre sa bonne implantation.

**Références**

(1) Padilla B., Gil J.V., Manzanares P. Past and Future of Non-Saccharomyces Yeasts: From Spoilage Microorganisms to Biotechnological Tools for Improving Wine Aroma Complexity. Frontiers in Microbiology. 2016. 7:411. doi:10.3389/fmicb.2016.00411.

(2) Blateyron L., Sablayrolles J.M. Stuck and slow fermentations in enology: statistical study of causes and effectiveness of combined additions of oxygen and diammonium phosphate. J. Biosci. Bioeng. 2001. 91:184. doi:10.1016/S1389-1723(01)80063-3.

(3) Englezos V., Giacosa S., Rantsiou K., Rolle L., Cocolin L. Starmerella bacillaris in winemaking: opportunities and risks. Current Opinion in Food Science. 2017. 17:30-35. doi.org/10.1016/j.cofs.2017.08.007.

(4) Rollero S., Bloem A., Ortiz-Julien A., Camarasa C., Divol B. Altered Fermentation Performances, Growth, and Metabolic Footprints Reveal Competition for Nutrients between Yeast Species Inoculated in Synthetic Grape Juice-Like Medium. Frontiers in Microbiology. 2018. 9:196. doi: 10.3389/fmicb.2018.00196
La croissance de *K. marxianus* en début de fermentation conduit à un ralentissement de la cinétique fermentaire tout le long du procédé, qui s'explique par une implantation très réduite de *S. cerevisiae* (**Figure 3B**). La comparaison des profils d'assimilation des sources d'azote entre les deux espèces montre des niveaux de consommations similaires après 48 h de culture, et un épuisement de la ressource azotée au moment de l'inoculation de *S. cerevisiae* est probablement à l'origine de sa mauvaise implantation. Pour valider cette hypothèse, des ajouts d'azote (sous forme organique ou minérale) ont été effectués au moment de l'inoculation de *S. cerevisiae*, et ont permis de restaurer la cinétique fermentaire de référence (**Figure 3C**, encart).

**Conclusion**

L'ensemble de ces données montrent la grande diversité phénotypique des levures non-*Saccharomyces* du consortium œnologique, qui, par des traits d'intérêt technologique absents chez *S. cerevisiae*, peuvent contribuer de façon positive au procédé de vinification. Ces caractéristiques sont spécifiques d'une espèce ou d'un petit groupe d'espèces. Ainsi, l'apport de levures *K. marxianus*, et dans une moindre mesure de *M. pulcherrima*, module la teneur finale en arômes fermentaires des vins, notamment en esters d'acétate : ces deux espèces pourront être utilisées pour apporter des notes fruitées au produit fini. L'espèce *M. pulcherrima* présente également une forte capacité de production d'enzymes hydrolytiques, en particulier de β-lyases, et son utilisation est adaptée pour faciliter la libération de thiols variétaux (cépage Colombard, Sauvignon blanc). A l'inverse, *S. bacillaris* ne permet pas de moduler la formation d'arômes fermentaires, mais montre une forte capacité d'utilisation du fructose, et son utilisation en fermentation séquentielle peut permettre de limiter les problèmes d'achèvement de la fermentation par *S. cerevisiae*. Cette espèce se caractérise également par une réorientation métabolique vers la production de glycérol au détriment de l'éthanol, et peut donc être utilisée lorsqu'on recherche à abaisser légèrement le degré alcoolique des vins (de l'ordre de 0,5°C).

Il apparaît également que les trois espèces étudiées présentent des besoins nutritifs différents (en ce qui concerne la nutrition azotée), et que leur développement en début du procédé de fermentation peut entraîner des difficultés d'implantation de *S. cerevisiae*.

Ainsi, la mise en œuvre de fermentations séquentielles non-*Saccharomyces* / *S. cerevisiae* pour améliorer la qualité des vins nécessite :

- d'une part d'adapter le choix de l'espèce à l'objectif visé (formation d'arômes fermentaires, libération d'arômes variétaux, gestion de la fin de fermentation...)

- d'autre part de mettre en place, en prenant en compte les besoins nutritionnels de l'espèce non-*Saccharomyces* utilisée en début de procédé, des stratégies de nutrition de *S. cerevisiae* pour permettre sa bonne implantation.

**Références**

(1) Padilla B., Gil J.V., Manzanares P. Past and Future of Non-Saccharomyces Yeasts: From Spoilage Microorganisms to Biotechnological Tools for Improving Wine Aroma Complexity. Frontiers in Microbiology. 2016. 7:411. doi:10.3389/fmicb.2016.00411.

(2) Blateyron L., Sablayrolles J.M. Stuck and slow fermentations in enology: statistical study of causes and effectiveness of combined additions of oxygen and diammonium phosphate. J. Biosci. Bioeng. 2001. 91:184. doi:10.1016/S1389-1723(01)80063-3.

(3) Englezos V., Giacosa S., Rantsiou K., Rolle L., Cocolin L. Starmerella bacillaris in winemaking: opportunities and risks. Current Opinion in Food Science. 2017. 17:30-35. doi.org/10.1016/j.cofs.2017.08.007.

(4) Rollero S., Bloem A., Ortiz-Julien A., Camarasa C., Divol B. Altered Fermentation Performances, Growth, and Metabolic Footprints Reveal Competition for Nutrients between Yeast Species Inoculated in Synthetic Grape Juice-Like Medium. Frontiers in Microbiology. 2018. 9:196. doi: 10.3389/fmicb.2018.00196
# Que savons-nous de plus aujourd'hui sur la diversité des levures *Saccharomyces cerevisiae* en œnologie ?

Jean-Luc Legras

UMR SPO, INRA Montpellier

## Introduction

La fermentation alcoolique est une étape décisive de la transformation du moût de raisin en vin. Depuis la découverte du rôle des levures par Pasteur à la fin du 19ème siècle, la nature de ce microorganisme, sa spécificité en fonction des régions, des crus et des vins, l'ampleur de sa contribution à l'arôme des vins ont été le sujet de débats récurrents pour les viticulteurs. Chaque vigneron pense souvent posséder une flore unique dans ses parcelles, adaptée au terroir local et à la transformation du raisin. De plus, l'image d'une flore régionale de levure est de plus en plus véhiculée par les médias, avec une connotation de respect de la nature. En parallèle, la technique du levurage qui s'est largement développée dans les années 1980-90 pour remédier en premier lieu aux problèmes d'arrêts des fermentations puis pour l'amélioration de la qualité organoleptique, est aussi critiquée par certains vinificateurs au nom de la perte d'authenticité.

De 1990 à aujourd'hui, grâce au développement de différentes générations d'outils moléculaires, la connaissance de l'écologie et de la diversité des levures *S. cerevisiae* présentes dans les vignobles a considérablement évolué, puisqu'on est passé de l'idée de levures quasi exclusivement présentes dans les chais à une vision plus globale de l'écosystème vigne-vin.

## 1- Evolution des techniques moléculaires de caractérisation de S. cerevisiae

Les années 1990 ont été marquées par la mise au point de l'électrophorèse en champ pulsé (ECP) permettant la séparation des chromosomes et par le développement du profil de restriction de l'ADN mitochondrial (mDNA-RFLP) pour différencier les levures *S. cerevisiae* œnologiques (Vezinhet et al., 1990) (Figure1). Ces deux techniques et leurs variantes ont permis de suivre l'implantation de levures sélectionnées dans un chai (Frezier and Dubourdieu, 1992), d'évaluer la diversité régionale des levures (Versavaud et al., 1995), ou enfin d'estimer la dissémination des levures commerciales au vignoble (Valero et al., 2005). La découverte de l'amplification d'ADN par PCR a permis ensuite le développement d'une seconde génération de méthodes de typage des levures. La méthode la plus populaire aujourd'hui inventée en 1993, est basée sur l'amplification de régions situées entre des éléments répétés (delta) répartis aléatoirement dans le génome (Ness et al., 1993; Legras and Karst, 2003). Cette «PCR interdelta» permet d'atteindre le même niveau de différenciation que les méthodes précédentes (Schuller et al., 2004). Ces trois méthodes présentaient cependant des faiblesses: l'impossibilité de détecter de petites variations (ECP), la focalisation sur l'ADN mitochondrial seulement (mDNA-RFLP), l'origine multiple de bandes de même taille (PCR interdelta), et enfin l'impossibilité d'augmenter l'information disponible pour accroître la résolution. Les dernières méthodes développées ont cherché à corriger ces défauts et à offrir une meilleure résolution.

L'analyse de régions contenant des motifs microsatellites, motifs simples de deux ou trois bases nucléiques répétées en nombre variable d'une souche à l'autre, a permis à la fois d'améliorer la spécificité des allèles et d'augmenter la puissance d'analyse en combinant une dizaine de marqueurs. La comparaison de séquences est apparue en 2005-06 (Fay and Benavides, 2005a; Ayoub et al., 2006) mais les performances atteintes avec quelques gènes étaient moins bonnes que celles obtenues avec des marqueurs microsatellites. Enfin, l'évolution du coût de séquençage permet aujourd'hui de réaliser le séquençage direct d'un génome.
# Que savons-nous de plus aujourd'hui sur la diversité des levures *Saccharomyces cerevisiae* en œnologie ?

Jean-Luc Legras

UMR SPO, INRA Montpellier

## Introduction

La fermentation alcoolique est une étape décisive de la transformation du moût de raisin en vin. Depuis la découverte du rôle des levures par Pasteur à la fin du 19ème siècle, la nature de ce microorganisme, sa spécificité en fonction des régions, des crus et des vins, l'ampleur de sa contribution à l'arôme des vins ont été le sujet de débats récurrents pour les viticulteurs. Chaque vigneron pense souvent posséder une flore unique dans ses parcelles, adaptée au terroir local et à la transformation du raisin. De plus, l'image d'une flore régionale de levure est de plus en plus véhiculée par les médias, avec une connotation de respect de la nature. En parallèle, la technique du levurage qui s'est largement développée dans les années 1980-90 pour remédier en premier lieu aux problèmes d'arrêts des fermentations puis pour l'amélioration de la qualité organoleptique, est aussi critiquée par certains vinificateurs au nom de la perte d'authenticité.

De 1990 à aujourd'hui, grâce au développement de différentes générations d'outils moléculaires, la connaissance de l'écologie et de la diversité des levures *S. cerevisiae* présentes dans les vignobles a considérablement évolué, puisqu'on est passé de l'idée de levures quasi exclusivement présentes dans les chais à une vision plus globale de l'écosystème vigne-vin.

## 1- Evolution des techniques moléculaires de caractérisation de S. cerevisiae

Les années 1990 ont été marquées par la mise au point de l'électrophorèse en champ pulsé (ECP) permettant la séparation des chromosomes et par le développement du profil de restriction de l'ADN mitochondrial (mDNA-RFLP) pour différencier les levures *S. cerevisiae* œnologiques (Vezinhet et al., 1990) (Figure1). Ces deux techniques et leurs variantes ont permis de suivre l'implantation de levures sélectionnées dans un chai (Frezier and Dubourdieu, 1992), d'évaluer la diversité régionale des levures (Versavaud et al., 1995), ou enfin d'estimer la dissémination des levures commerciales au vignoble (Valero et al., 2005). La découverte de l'amplification d'ADN par PCR a permis ensuite le développement d'une seconde génération de méthodes de typage des levures. La méthode la plus populaire aujourd'hui inventée en 1993, est basée sur l'amplification de régions situées entre des éléments répétés (delta) répartis aléatoirement dans le génome (Ness et al., 1993; Legras and Karst, 2003). Cette «PCR interdelta» permet d'atteindre le même niveau de différenciation que les méthodes précédentes (Schuller et al., 2004). Ces trois méthodes présentaient cependant des faiblesses: l'impossibilité de détecter de petites variations (ECP), la focalisation sur l'ADN mitochondrial seulement (mDNA-RFLP), l'origine multiple de bandes de même taille (PCR interdelta), et enfin l'impossibilité d'augmenter l'information disponible pour accroître la résolution. Les dernières méthodes développées ont cherché à corriger ces défauts et à offrir une meilleure résolution.

L'analyse de régions contenant des motifs microsatellites, motifs simples de deux ou trois bases nucléiques répétées en nombre variable d'une souche à l'autre, a permis à la fois d'améliorer la spécificité des allèles et d'augmenter la puissance d'analyse en combinant une dizaine de marqueurs. La comparaison de séquences est apparue en 2005-06 (Fay and Benavides, 2005a; Ayoub et al., 2006) mais les performances atteintes avec quelques gènes étaient moins bonnes que celles obtenues avec des marqueurs microsatellites. Enfin, l'évolution du coût de séquençage permet aujourd'hui de réaliser le séquençage direct d'un génome.
<figure><img src="image_18.png" /></figure>

**Figure1. Profils obtenus avec les différentes méthodes de caractérisation moléculaire.** De gauche à droite: gels d'électrophorèse des trois premières méthodes mDNA-RFLP, ECP, PCR interdelta, et signal de fluorescence mesuré lors d'une électrophorèse de typage d'un locus microsatellite (à droite). Un pic est équivalent à une bande sur un des gels présentés à gauche.

**2- Les levures de vin et histoire de la vinification**

Bien que la séquence du génome de la levure *S. cerevisiae* ait été la première à être déchiffrée chez un organisme eucaryote, il existait peu d'information sur la diversité de cette espèce de champignon. Ce n'est qu'en 2005 et en 2007 qu'ont été publiées les premières études dévoilant sa diversité (Fay and Benavides, 2005b; Legras et al., 2007). On peut aujourd'hui distinguer les levures de vin, de pain, de bière, de fromage, de rhum, de vin de palme, de saké ou même de chêne sur la base des différences de leur ADN (Figure 2).

Parmi les différents groupes de levures, une famille est tout à fait remarquable par son extension géographique, celle des levures de vin. Les souches de vin se retrouvent dans tous les vignobles du monde: Europe, Amérique, Afrique du Sud, Japon et Australie. A l'exception de plusieurs souches sélectionnées (EC1118, 522Davis), multipliées industriellement et distribuées dans le monde entier, on trouve un très grand nombre de souches différentes qui semblent uniques à leur vignoble d'isolement. Une famille de levures isolées à partir de voiles (Vin jaune, Sherry, Vernaccia di Oristano...) est proche des levures de vin classiques, et ce groupe contient le groupe des levures isolées en Champagne (EC1118, DV10, CHP...) qui sont issues d'un croisement entre les levures de vin et de voile.

Les levures isolées dans la nature (écorce de chêne, litière au pied des arbres) en Europe, se trouvent dans un autre groupe dans l'arbre phylogénétique (Figure 1). Les levures de chêne ne sont d'ailleurs pas capables d'achever la fermentation d'un moût de raisin d'une teneur en sucre moyenne (Camarasa et al., 2011). En revanche, les levures de vin sont issues d'une population de levures de chêne trouvées autour de la Méditerranée (Almeida et al., 2015).
<figure><img src="image_14.png" /></figure>

**Figure1. Profils obtenus avec les différentes méthodes de caractérisation moléculaire.** De gauche à droite: gels d'électrophorèse des trois premières méthodes mDNA-RFLP, ECP, PCR interdelta, et signal de fluorescence mesuré lors d'une électrophorèse de typage d'un locus microsatellite (à droite). Un pic est équivalent à une bande sur un des gels présentés à gauche.

## 2- Les levures de vin et histoire de la vinification

Bien que la séquence du génome de la levure *S. cerevisiae* ait été la première à être déchiffrée chez un organisme eucaryote, il existait peu d'information sur la diversité de cette espèce de champignon. Ce n'est qu'en 2005 et en 2007 qu'ont été publiées les premières études dévoilant sa diversité (Fay and Benavides, 2005b; Legras et al., 2007). On peut aujourd'hui distinguer les levures de vin, de pain, de bière, de fromage, de rhum, de vin de palme, de saké ou même de chêne sur la base des différences de leur ADN (Figure 2).

Parmi les différents groupes de levures, une famille est tout à fait remarquable par son extension géographique, celle des levures de vin. Les souches de vin se retrouvent dans tous les vignobles du monde: Europe, Amérique, Afrique du Sud, Japon et Australie. A l'exception de plusieurs souches sélectionnées (EC1118, 522Davis), multipliées industriellement et distribuées dans le monde entier, on trouve un très grand nombre de souches différentes qui semblent uniques à leur vignoble d'isolement. Une famille de levures isolées à partir de voiles (Vin jaune, Sherry, Vernaccia di Oristano...) est proche des levures de vin classiques, et ce groupe contient le groupe des levures isolées en Champagne (EC1118, DV10, CHP...) qui sont issues d'un croisement entre les levures de vin et de voile.

Les levures isolées dans la nature (écorce de chêne, litière au pied des arbres) en Europe, se trouvent dans un autre groupe dans l'arbre phylogénétique (Figure 1). Les levures de chêne ne sont d'ailleurs pas capables d'achever la fermentation d'un moût de raisin d'une teneur en sucre moyenne (Camarasa et al., 2011). En revanche, les levures de vin sont issues d'une population de levures de chêne trouvées autour de la Méditerranée (Almeida et al., 2015).
<figure><img src="image_19.png" /></figure>

**Figure 2.** Arbre phylogénétique présentant la diversité de 1000 souches de levures S. cerevisiae isolées de différentes origines (d'après Legras *et al.*, 2007). Le niveau de parenté entre les souches est indiqué par la longueur des branches qui relient un individu à un autre. L'arbre a été obtenu à partir de la caractérisation de 12 loci microsatellites et construit à partir de la distance de Bruvo.

### 3- Diversité régionale de S. cerevisiae

L'utilisation de marqueurs microsatellites a permis également de mener des analyses par population (Figure 3). La première analyse de cet arbre indique une origine unique des levures de vin de vignobles du monde entier. La position particulière de la population de souches du Liban est en accord avec la possibilité d'une origine située en Mésopotamie d'où ces levures ont pu se répandre avec l'essor de la viticulture (Fay and Benavides, 2005; Legras et al., 2007).

La comparaison de groupes de levures de vignobles proches laisse aussi envisager une migration associée aux voies de communication fluviale (vallée du Rhône/Saône, Danube, Méditerranée) et aux cépages (échange du cépage Melon entre la Bourgogne et la Vallée de la Loire, ou de l'Ugni blanc entre l'Italie et la région de Cognac). Les différentes branches de cet arbre suggèrent enfin une spécificité géographique des populations de levures. Aussi plusieurs auteurs ont recherché les facteurs qui expliquent les différences entre les populations de levure S. cerevisiae de vignobles au Portugal, en
<figure><img src="image_15.png" /></figure>

**Figure 2.** Arbre phylogénétique présentant la diversité de 1000 souches de levures S. cerevisiae isolées de différentes origines (d'après Legras *et al.*, 2007). Le niveau de parenté entre les souches est indiqué par la longueur des branches qui relient un individu à un autre. L'arbre a été obtenu à partir de la caractérisation de 12 loci microsatellites et construit à partir de la distance de Bruvo.

### 3- Diversité régionale de S. cerevisiae

L'utilisation de marqueurs microsatellites a permis également de mener des analyses par population (Figure 3). La première analyse de cet arbre indique une origine unique des levures de vin de vignobles du monde entier. La position particulière de la population de souches du Liban est en accord avec la possibilité d'une origine située en Mésopotamie d'où ces levures ont pu se répandre avec l'essor de la viticulture (Fay and Benavides, 2005; Legras et al., 2007).

La comparaison de groupes de levures de vignobles proches laisse aussi envisager une migration associée aux voies de communication fluviale (vallée du Rhône/Saône, Danube, Méditerranée) et aux cépages (échange du cépage Melon entre la Bourgogne et la Vallée de la Loire, ou de l'Ugni blanc entre l'Italie et la région de Cognac). Les différentes branches de cet arbre suggèrent enfin une spécificité géographique des populations de levures. Aussi plusieurs auteurs ont recherché les facteurs qui expliquent les différences entre les populations de levure S. cerevisiae de vignobles au Portugal, en
Nouvelle Zélande, en Italie et en France. Ces travaux, montrent la présence de structure de population, et globalement des différenciations régionales plus ou moins marquées, avec de fortes variations entre sites (Gayevskiy and Goddard, 2012; Schuller et al., 2012; Viel et al., 2017). Les différences liées au cépages semblent également faibles (Schuller et al., 2012) mais d'une manière générale les facteurs expliquant ces structures de population semblent complexes.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 3.** Arbre présentant les liens entre les populations de levures *S. cerevisiae* isolées de différents vignobles, ou d'autres origines (Modifié d'après Legras *et al.*, 2007). Etabli à partir de la matrice de distance Fst entre populations.</figcaption></figure>

## 4- Caves, starters et levures de raisin

L'origine des levures présentes dans les fermentations des cuves non ensemencées est toujours un sujet de débat. Les différents travaux publiés semblent indiquer un lien entre les flores retrouvées dans les chais et les flores des parcelles sans qu'on puisse conclure à une identité de ces 2 flores (Goddard et al., 2010; Börlin et al., 2016).

En ce qui concerne les flux de levures du chai à la parcelle, les premières analyses réalisées en 2005 indiquaient qu'ils étaient très faibles (Valero et al., 2005). Récemment, l'analyse des populations de levures isolées à partir de raisin, dans plusieurs régions viticoles (Italie, Canada, Bordeaux) a laissé
Nouvelle Zélande, en Italie et en France. Ces travaux, montrent la présence de structure de population, et globalement des différenciations régionales plus ou moins marquées, avec de fortes variations entre sites (Gayevskiy and Goddard, 2012; Schuller et al., 2012; Viel et al., 2017). Les différences liées au cépages semblent également faibles (Schuller et al., 2012) mais d'une manière générale les facteurs expliquant ces structures de population semblent complexes.

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 3.** Arbre présentant les liens entre les populations de levures *S. cerevisiae* isolées de différents vignobles, ou d'autres origines (Modifié d'après Legras *et al.*, 2007). Etabli à partir de la matrice de distance Fst entre populations.</figcaption></figure>

## 4- Caves, starters et levures de raisin

L'origine des levures présentes dans les fermentations des cuves non ensemencées est toujours un sujet de débat. Les différents travaux publiés semblent indiquer un lien entre les flores retrouvées dans les chais et les flores des parcelles sans qu'on puisse conclure à une identité de ces 2 flores (Goddard et al., 2010; Börlin et al., 2016).

En ce qui concerne les flux de levures du chai à la parcelle, les premières analyses réalisées en 2005 indiquaient qu'ils étaient très faibles (Valero et al., 2005). Récemment, l'analyse des populations de levures isolées à partir de raisin, dans plusieurs régions viticoles (Italie, Canada, Bordeaux) a laissé
apparaître la présence de 10 à 25% de souches apparentées à des starters (Martiniuk et al., 2016; Viel et al., 2017). Cependant, les résultats de ces études doivent être nuancés: dans le cas de l'étude canadienne, les prélèvements ont été faits à moins d'un km du chai, et dans celui de l'étude italienne, nous n'avons pas ce type de données. De tels résultats n'étaient pas attendus car le maintien des levures au vignoble d'une année sur l'autre n'avait pas été observé dans des essais de pulvérisations de LSA sur les pieds de vigne (Cordero-Bueso et al., 2011). En conclusion, il semble logique de considérer que les flores de vigne et de chai sont en équilibre.

## 5- Cryophilie et levures hybrides

S. cerevisiae n'est pas capable de mener des fermentations à basse température. L'analyse de populations de levures de moûts fermentant à basse température a permis d'isoler des levures appartenant à l'espère voisine *Saccharomyces uvarum* qui est cryophile (Demuyter et al., 2004). Mais certaines levures cryophiles, dont plusieurs levures commerciales, sont en fait des hybrides interspécifiques entre S. cerevisiae, et S. uvarum (S6U) ou encore entre S. cerevisiae, et *Saccharomyces kudriazevii*, une autre levure cryophile, (ALS, Vin7, UvafermCS2, Lalvin W27, Uvaferm CEG). Ces levures hybrides présentent en général les aptitudes des deux espèces. Cette situation est similaire à celle connue pour les levures de bière dites « lager » issues également d'un croisement entre une espèce cryophile (*Saccharomyces eubayanus*) et S. cerevisiae.

## 6- Levures S. cerevisiae et leurs vecteurs

En 1878, Pasteur a été le premier à montrer, qu'une fois protégée, les baies de raisin restaient stériles jusqu'à la récolte. La population de levures S. cerevisiae sur raisins sains est extrêmement faible. En revanche, une baie altérée peut contenir facilement $10^6$ cellules. Par quels mécanismes les baies sont-elles inoculées par les levures ? Le lien avec l'altération des baies suggère l'intervention des insectes. Les guêpes peuvent blesser les baies avec leurs pièces buccales et sont de bonnes candidates capables de fournir un premier foyer de développement aux levures. Alors que la composition de la microflore levurienne de ces insectes varie, S. cerevisiae est présent étonnamment tout au long de l'année (Stefanini et al., 2012). De plus, leurs larves conservent les cellules de S. cerevisiae dans leur tube digestif durant l'hivernage. L'année suivante, ces guêpes adultes peuvent ainsi « inoculer » leurs levures aux nouveaux fruits. Les mouches de vinaigre *Drosophila melanogaster* sont quant à elles, fortement attirées par les jus en fermentation dont elles s'alimentent, et emmènent ainsi sur elles des cellules de levure (Les esters ou acétates semblent être les molécules impliquées dans l'attraction des drosophiles). Les abeilles, contiennent également des levures S. cerevisiae dans leur microflore.

Les oiseaux semblent également aussi pouvoir véhiculer des levures, en particulier sur de grandes distances, cependant le maintien des cellules de levure dans le tube digestif est court (Francesca et al., 2012).

A coté de la vection due à la faune, une équipe italienne a mis en évidence la présence de S. cerevisiae dans l'air à une fréquence de 0,1 cellule par m³, mais seulement dans une région viticole sur trois. Il est donc probable que les courants d'air puissent participer à la vection des levures, mais sans doute de manière plus limitée (Vigentini et al., 2014).
apparaître la présence de 10 à 25% de souches apparentées à des starters (Martiniuk et al., 2016; Viel et al., 2017). Cependant, les résultats de ces études doivent être nuancés: dans le cas de l'étude canadienne, les prélèvements ont été faits à moins d'un km du chai, et dans celui de l'étude italienne, nous n'avons pas ce type de données. De tels résultats n'étaient pas attendus car le maintien des levures au vignoble d'une année sur l'autre n'avait pas été observé dans des essais de pulvérisations de LSA sur les pieds de vigne (Cordero-Bueso et al., 2011). En conclusion, il semble logique de considérer que les flores de vigne et de chai sont en équilibre.

## 5- Cryophilie et levures hybrides

S. cerevisiae n'est pas capable de mener des fermentations à basse température. L'analyse de populations de levures de moûts fermentant à basse température a permis d'isoler des levures appartenant à l'espère voisine *Saccharomyces uvarum* qui est cryophile (Demuyter et al., 2004). Mais certaines levures cryophiles, dont plusieurs levures commerciales, sont en fait des hybrides interspécifiques entre S. cerevisiae, et S. uvarum (S6U) ou encore entre S. cerevisiae, et *Saccharomyces kudriazevii*, une autre levure cryophile, (ALS, Vin7, UvafermCS2, Lalvin W27, Uvaferm CEG). Ces levures hybrides présentent en général les aptitudes des deux espèces. Cette situation est similaire à celle connue pour les levures de bière dites « lager » issues également d'un croisement entre une espèce cryophile (*Saccharomyces eubayanus*) et S. cerevisiae.

## 6- Levures S. cerevisiae et leurs vecteurs

En 1878, Pasteur a été le premier à montrer, qu'une fois protégée, les baies de raisin restaient stériles jusqu'à la récolte. La population de levures S. cerevisiae sur raisins sains est extrêmement faible. En revanche, une baie altérée peut contenir facilement $10^6$ cellules. Par quels mécanismes les baies sont-elles inoculées par les levures ? Le lien avec l'altération des baies suggère l'intervention des insectes. Les guêpes peuvent blesser les baies avec leurs pièces buccales et sont de bonnes candidates capables de fournir un premier foyer de développement aux levures. Alors que la composition de la microflore levurienne de ces insectes varie, S. cerevisiae est présent étonnamment tout au long de l'année (Stefanini et al., 2012). De plus, leurs larves conservent les cellules de S. cerevisiae dans leur tube digestif durant l'hivernage. L'année suivante, ces guêpes adultes peuvent ainsi « inoculer » leurs levures aux nouveaux fruits. Les mouches de vinaigre *Drosophila melanogaster* sont quant à elles, fortement attirées par les jus en fermentation dont elles s'alimentent, et emmènent ainsi sur elles des cellules de levure (Les esters ou acétates semblent être les molécules impliquées dans l'attraction des drosophiles). Les abeilles, contiennent également des levures S. cerevisiae dans leur microflore.

Les oiseaux semblent également aussi pouvoir véhiculer des levures, en particulier sur de grandes distances, cependant le maintien des cellules de levure dans le tube digestif est court (Francesca et al., 2012).

A coté de la vection due à la faune, une équipe italienne a mis en évidence la présence de S. cerevisiae dans l'air à une fréquence de 0,1 cellule par m³, mais seulement dans une région viticole sur trois. Il est donc probable que les courants d'air puissent participer à la vection des levures, mais sans doute de manière plus limitée (Vigentini et al., 2014).
Conclusion

Les levures S. *cerevisiae* de vin ont été dispersées de part le monde au fil de l'extension de la viticulture.
Il est nécessaire d'abandonner le concept de « levure de terroir » au profit de « population de levures
régionale ». La flore levurienne des raisins est en équilibre avec les populations d'insectes présentes
dans la parcelle, et est liée à la population de levure retrouvée dans le chai. Toutefois, la spécificité
régionale des populations de levures ne veut pas dire nécessairement que ces populations présentent
une meilleure aptitude technologique à valoriser les cépages régionaux.

Références

Almeida P, Barbosa R, Zalar P, Imanishi Y, Shimizu K, Turchetti B, Legras J-L, Serra M, Dequin S, Couloux A, et al. 2015. A population genomics insight into the Mediterranean origins of wine yeast domestication. Mol. Ecol. 24:5412-5427.

Ayoub M-J, Legras J-L, Saliba R, Gaillardin C. 2006. Application of Multi Locus Sequence Typing to the analysis of the biodiversity of indigenous *Saccharomyces cerevisiae* wine yeasts from Lebanon. J. Appl. Microbiol. 100:699-711.

Börlin M, Venet P, Claisse O, Salin F, Legras J-L, Masneuf-Pomarède I. 2016. Cellar-associated *Saccharomyces cerevisiae* population structure revealed high diversity and perennial persistence in Sauternes wine estates. Appl. Environ. Microbiol. AEM.03627-15.

Camarasa C, Sanchez I, Brial P, Bigey F, Dequin S. 2011. Phenotypic Landscape of *Saccharomyces cerevisiae* during Wine Fermentation: Evidence for Origin-Dependent Metabolic Traits. Harris S, editor. PLoS One 6:e25147.

Cordero-Bueso G, Arroyo T, Serrano A, Valero E. 2011. Remanence and survival of commercial yeast in different ecological niches of the vineyard. FEMS Microbiol. Ecol.

Demuyter C, Lollier M, Legras J-L, Le Jeune C, LeJeune C. 2004. Predominance of *Saccharomyces uvarum* during spontaneous alcoholic fermentation, for three consecutive years, in an Alsatian winery. J. Appl. Microbiol. 97:1140-1148.

Fay JC, Benavides JA. 2005a. Evidence for domesticated and wild populations of *Saccharomyces cerevisiae*. PLoS Genet. 1:66.

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Francesca N, Canale DE, Settanni L, Moschetti G. 2012. Dissemination of wine-related yeasts by migratory birds. Environ. Microbiol. Rep. 4:105-112.

Frezier V, Dubourdieu D. 1992. Ecology of Yeast Strain *Saccharomyces cerevisiae* During Spontaneous Fermentation in a Bordeaux Winery. Am. J. Enol. Vitic. 43:375-380.

Gayevskiy V, Goddard MR. 2012. Geographic delineations of yeast communities and populations associated with vines and wines in New Zealand. ISME J. 6:1281-1290.

Goddard MR, Anfang N, Tang R, Gardner RC, Jun C. 2010. A distinct population of *Saccharomyces cerevisiae* in New Zealand: evidence for local dispersal by insects and human-aided global dispersal in oak barrels. Environ. Microbiol. 12:63-73.

Legras J-L, Karst F. 2003. Optimisation of interdelta analysis for *Saccharomyces cerevisiae* strain characterisation. FEMS Microbiol. Lett. 221:249-255.

Legras J-L, Merdinoglu D, Cornuet J-M, Karst F. 2007. Bread, beer and wine: *Saccharomyces cerevisiae* diversity reflects human history. Mol. Ecol. 16:2091-2102.

Martiniuk JT, Pacheco B, Russell G, Tong S, Backstrom I, Measday V. 2016. Impact of Commercial Strain Use on *Saccharomyces cerevisiae* Population Structure and Dynamics in Pinot Noir Vineyards and Spontaneous Fermentations of a Canadian Winery. Schacherer J, editor. PLoS One 11:e0160259.

Ness F, Lavallée F, Dubourdieu D, Aigle M, Dulau L. 1993. Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62:89-94.

Schuller D, Cardoso F, Sousa S, Gomes P, Gomes AC, Santos M a S, Casal M. 2012. Genetic diversity and population structure of *Saccharomyces cerevisiae* strains isolated from different grape varieties and winemaking regions. PLoS One 7:e32507.

Iero E, Dequin S, Casal M. 2004. Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231:19-26.

Stefanini I, Dapporto L, Legras J-L, Calabretta A, Di Paola M, De Filippo C, Viola R, Capretti P, Polsinelli M, Turillazzi S, et al. 2012. Role of social wasps in *Saccharomyces cerevisiae* ecology and evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:13398-13403.

Valero E, Schuller D, Cambon B, Casal M, Dequin S. 2005. Dissemination and survival of commercial wine yeast in the vineyard: a large-scale, three-years study. FEMS Yeast Res. 5:959-969.

Versavaud A, Courcoux P, Roulland C, Dulau L, Hallet JN. 1995. Genetic diversity and geographical distribution of wild *Saccharomyces cerevisiae* strains from the wine-producing area of Charentes, France. Appl. Environ. Microbiol. 61:3521-3529.

Viel A, Legras J-L, Nadai C, Carlot M, Lombardi A, Crespan M, Migliaro D, Giacomini A, Corich V. 2017. The Geographic Distribution of *Saccharomyces cerevisiae* Isolates within three Italian Neighboring Winemaking Regions Reveals Strong Differences in Yeast Abundance, Genetic Diversity and Industrial Strain Dissemination. Front. Microbiol. 8:1595.

Vigentini I, De Lorenzis G, Fabrizio V, Valdetara F, Faccincani M, Panont C a., Picozzi C, Imazio S, Failla O, Foschino R. 2014. The vintage effect overcomes the terroir effect: a three year survey on the wine yeast biodiversity in Franciacorta and Oltrepo Pavese, two northern Italian vine-growing areas. Microbiology 161:362-373.
Conclusion

Les levures S. *cerevisiae* de vin ont été dispersées de part le monde au fil de l'extension de la viticulture.
Il est nécessaire d'abandonner le concept de « levure de terroir » au profit de « population de levures
régionale ». La flore levurienne des raisins est en équilibre avec les populations d'insectes présentes
dans la parcelle, et est liée à la population de levure retrouvée dans le chai. Toutefois, la spécificité
régionale des populations de levures ne veut pas dire nécessairement que ces populations présentent
une meilleure aptitude technologique à valoriser les cépages régionaux.

Références

Almeida P, Barbosa R, Zalar P, Imanishi Y, Shimizu K, Turchetti B, Legras J-L, Serra M, Dequin S, Couloux A, et al. 2015. A population genomics insight into the Mediterranean origins of wine yeast domestication. Mol. Ecol. 24:5412-5427.

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Börlin M, Venet P, Claisse O, Salin F, Legras J-L, Masneuf-Pomarède I. 2016. Cellar-associated *Saccharomyces cerevisiae* population structure revealed high diversity and perennial persistence in Sauternes wine estates. Appl. Environ. Microbiol. AEM.03627-15.

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Cordero-Bueso G, Arroyo T, Serrano A, Valero E. 2011. Remanence and survival of commercial yeast in different ecological niches of the vineyard. FEMS Microbiol. Ecol.

Demuyter C, Lollier M, Legras J-L, Le Jeune C, LeJeune C. 2004. Predominance of *Saccharomyces uvarum* during spontaneous alcoholic fermentation, for three consecutive years, in an Alsatian winery. J. Appl. Microbiol. 97:1140-1148.

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Francesca N, Canale DE, Settanni L, Moschetti G. 2012. Dissemination of wine-related yeasts by migratory birds. Environ. Microbiol. Rep. 4:105-112.

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Goddard MR, Anfang N, Tang R, Gardner RC, Jun C. 2010. A distinct population of *Saccharomyces cerevisiae* in New Zealand: evidence for local dispersal by insects and human-aided global dispersal in oak barrels. Environ. Microbiol. 12:63-73.

Legras J-L, Karst F. 2003. Optimisation of interdelta analysis for *Saccharomyces cerevisiae* strain characterisation. FEMS Microbiol. Lett. 221:249-255.

Legras J-L, Merdinoglu D, Cornuet J-M, Karst F. 2007. Bread, beer and wine: *Saccharomyces cerevisiae* diversity reflects human history. Mol. Ecol. 16:2091-2102.

Martiniuk JT, Pacheco B, Russell G, Tong S, Backstrom I, Measday V. 2016. Impact of Commercial Strain Use on *Saccharomyces cerevisiae* Population Structure and Dynamics in Pinot Noir Vineyards and Spontaneous Fermentations of a Canadian Winery. Schacherer J, editor. PLoS One 11:e0160259.

Ness F, Lavallée F, Dubourdieu D, Aigle M, Dulau L. 1993. Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62:89-94.

Schuller D, Cardoso F, Sousa S, Gomes P, Gomes AC, Santos M a S, Casal M. 2012. Genetic diversity and population structure of *Saccharomyces cerevisiae* strains isolated from different grape varieties and winemaking regions. PLoS One 7:e32507.

Iero E, Dequin S, Casal M. 2004. Survey of molecular methods for the typing of wine yeast strains. FEMS Microbiol. Lett. 231:19-26.

Stefanini I, Dapporto L, Legras J-L, Calabretta A, Di Paola M, De Filippo C, Viola R, Capretti P, Polsinelli M, Turillazzi S, et al. 2012. Role of social wasps in *Saccharomyces cerevisiae* ecology and evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109:13398-13403.

Valero E, Schuller D, Cambon B, Casal M, Dequin S. 2005. Dissemination and survival of commercial wine yeast in the vineyard: a large-scale, three-years study. FEMS Yeast Res. 5:959-969.

Versavaud A, Courcoux P, Roulland C, Dulau L, Hallet JN. 1995. Genetic diversity and geographical distribution of wild *Saccharomyces cerevisiae* strains from the wine-producing area of Charentes, France. Appl. Environ. Microbiol. 61:3521-3529.

Viel A, Legras J-L, Nadai C, Carlot M, Lombardi A, Crespan M, Migliaro D, Giacomini A, Corich V. 2017. The Geographic Distribution of *Saccharomyces cerevisiae* Isolates within three Italian Neighboring Winemaking Regions Reveals Strong Differences in Yeast Abundance, Genetic Diversity and Industrial Strain Dissemination. Front. Microbiol. 8:1595.

Vigentini I, De Lorenzis G, Fabrizio V, Valdetara F, Faccincani M, Panont C a., Picozzi C, Imazio S, Failla O, Foschino R. 2014. The vintage effect overcomes the terroir effect: a three year survey on the wine yeast biodiversity in Franciacorta and Oltrepo Pavese, two northern Italian vine-growing areas. Microbiology 161:362-373.
# La mortalité des levures en fermentation alcoolique : le rôle clé des limitations en micronutriments et de l'azote

Bruno Blondin<fnref n="1" />, Camille Duc<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Martine Pradal<fnref n="1" />, Jessica Noble<fnref n="2" />, Catherine Tesnière<fnref n="1" />

## Introduction

Les fermentations languissantes ainsi que les arrêts de fermentations restent un souci d'actualité en vinification. La mortalité des levures est un phénomène souvent associé aux arrêts de fermentations mais les mécanismes responsable ne sont que partiellement connus. La perte de viabilité des levures au cours des fermentations œnologiques a jusqu'ici été surtout expliquée par des quantités insuffisantes de lipides des moût et leurs conséquences en terme de composition des membranes des levures. L'impact de la composition en lipides a été également largement abordé en lien avec les effets de l'éthanol qui est le premier facteur de stress rencontré par la levure en fermentation alcoolique. Toutefois ces approches ne rendent pas compte de manière satisfaisante de l'apparition de la mortalité des levures et des arrêts dans de nombreuses situations œnologiques.

Dans ce travail, nous avons abordé la question de la mortalité en fermentation en nous appuyant sur les données récentes qui ont mis en évidence l'importance du premier nutriment limitant provoquant l'arrêt de la croissance sur la survie des levures au cours de la phase stationnaire (Boer et al., 2008). Ces travaux ont, de plus, souligné la différence de réponse des levures selon la nature du premier nutriment limitant et ils ont apporté un nouveau cadre conceptuel pour appréhender la question de la mortalité des levures en relation avec les limitations en nutriments. C'est sur la base de ces connaissances que l'impact d'une limitation en lipides en fermentation alcoolique a été abordé dans un premier temps puis étendue à d'autres micronutriments (Tesnière et al., 2013 ; Duc et al., 2017). Pour cela, nous avons évalué puis analysé plus en détail, certaines conditions nutritionnelles entraînant une perte de viabilité des levures de façon dépendante de l'azote, et nous avons cherché à apporter des informations nécessaires à la compréhension des mécanismes régulant cette viabilité, par des approches physiologiques et génétiques.

## Résultats

L'impact de la nature du nutriment limitant la croissance a été étudié en mettant en œuvre la souche EC1118 dans un moût synthétique MS contenant des niveaux de micronutriments et d'azote variables. L'effet d'une limitation en ergostérol a été évalué de sorte à considérer deux situations : - une où l'arrêt de croissance de la levure est provoqué par un faible niveau d'ergostérol alors qu'il reste de l'azote dans le milieu, - l'autre où l'arrêt a lieu par une limitation simultanée en ergostérol et en azote. Les niveaux de nutriments milieux ont été fixés de sorte à ce que la population soit équivalente dans chaque situation et afin que la quantité d'ergostérol disponible pour les levures soit similaire (Figure 1). On observe que quand l'ergostérol limite seul la croissance (niveau d'azote élevé), la perte de viabilité en phase stationnaire est importante. Elle augmente au cours du temps mais aussi en fonction de la teneur en alcool du milieu ce qui nous conduit à représenter la mortalité en fonction du niveau de CO2 dégagé (directement lié au niveau d'alcool du milieu). Par contre quand la croissance de la levure est limitée à la fois par l'ergostérol et l'azote la viabilité est préservée à un niveau élevé. La présence d'un niveau élevé d'azote est donc impliquée dans la mortalité associée au faible niveau d'ergostérol. Cette mortalité a

<footnote n="1">¹ UMR SPO, INRA, Montpellier SupAgro, Université de Montpellier, 34060, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="2">² Lallemand SAS, 31702, Blagnac, France</footnote>
# La mortalité des levures en fermentation alcoolique : le rôle clé des limitations en micronutriments et de l'azote

Bruno Blondin<fnref n="1" />, Camille Duc<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Martine Pradal<fnref n="1" />, Jessica Noble<fnref n="2" />, Catherine Tesnière<fnref n="1" />

## Introduction

Les fermentations languissantes ainsi que les arrêts de fermentations restent un souci d'actualité en vinification. La mortalité des levures est un phénomène souvent associé aux arrêts de fermentations mais les mécanismes responsable ne sont que partiellement connus. La perte de viabilité des levures au cours des fermentations œnologiques a jusqu'ici été surtout expliquée par des quantités insuffisantes de lipides des moût et leurs conséquences en terme de composition des membranes des levures. L'impact de la composition en lipides a été également largement abordé en lien avec les effets de l'éthanol qui est le premier facteur de stress rencontré par la levure en fermentation alcoolique. Toutefois ces approches ne rendent pas compte de manière satisfaisante de l'apparition de la mortalité des levures et des arrêts dans de nombreuses situations œnologiques.

Dans ce travail, nous avons abordé la question de la mortalité en fermentation en nous appuyant sur les données récentes qui ont mis en évidence l'importance du premier nutriment limitant provoquant l'arrêt de la croissance sur la survie des levures au cours de la phase stationnaire (Boer et al., 2008). Ces travaux ont, de plus, souligné la différence de réponse des levures selon la nature du premier nutriment limitant et ils ont apporté un nouveau cadre conceptuel pour appréhender la question de la mortalité des levures en relation avec les limitations en nutriments. C'est sur la base de ces connaissances que l'impact d'une limitation en lipides en fermentation alcoolique a été abordé dans un premier temps puis étendue à d'autres micronutriments (Tesnière et al., 2013 ; Duc et al., 2017). Pour cela, nous avons évalué puis analysé plus en détail, certaines conditions nutritionnelles entraînant une perte de viabilité des levures de façon dépendante de l'azote, et nous avons cherché à apporter des informations nécessaires à la compréhension des mécanismes régulant cette viabilité, par des approches physiologiques et génétiques.

## Résultats

L'impact de la nature du nutriment limitant la croissance a été étudié en mettant en œuvre la souche EC1118 dans un moût synthétique MS contenant des niveaux de micronutriments et d'azote variables. L'effet d'une limitation en ergostérol a été évalué de sorte à considérer deux situations : - une où l'arrêt de croissance de la levure est provoqué par un faible niveau d'ergostérol alors qu'il reste de l'azote dans le milieu, - l'autre où l'arrêt a lieu par une limitation simultanée en ergostérol et en azote. Les niveaux de nutriments milieux ont été fixés de sorte à ce que la population soit équivalente dans chaque situation et afin que la quantité d'ergostérol disponible pour les levures soit similaire (Figure 1). On observe que quand l'ergostérol limite seul la croissance (niveau d'azote élevé), la perte de viabilité en phase stationnaire est importante. Elle augmente au cours du temps mais aussi en fonction de la teneur en alcool du milieu ce qui nous conduit à représenter la mortalité en fonction du niveau de CO2 dégagé (directement lié au niveau d'alcool du milieu). Par contre quand la croissance de la levure est limitée à la fois par l'ergostérol et l'azote la viabilité est préservée à un niveau élevé. La présence d'un niveau élevé d'azote est donc impliquée dans la mortalité associée au faible niveau d'ergostérol. Cette mortalité a

<footnote n="1">¹ UMR SPO, INRA, Montpellier SupAgro, Université de Montpellier, 34060, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="2">² Lallemand SAS, 31702, Blagnac, France</footnote>
des conséquences du point de vue de la consommation des sucres par la levure et on constate que le niveau élevé d'azote conduit à un arrêt de fermentation avec des sucres résiduels élevés alors que le faible niveau d'azote permet une consommation totale des sucres.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 1. Impact du niveau d'azote sur la mortalité lors de limitations en ergostérol.</figcaption></figure>

Une même démarche a été conduite pour d'autres micronutriments et une même réponse à leur limitation et à l'azote a été observée pour l'acide oléique, l'acide pantothénique et l'acide nicotinique. Dans les trois cas une mortalité dépendante de l'azote a été mise en évidence (Figure 2). Il y a donc un mécanisme général qui entraine la mortalité liée à la limitation de la croissance par certains micronutriments. Par contre nous avons observé que certains micronutriments n'entrainent pas de mortalité des levures dans les mêmes conditions. C'est le cas de la thiamine, de la biotine et de l'inositol dont les faibles niveaux perturbent le déroulement des fermentations sans entrainer de mortalité des levures. La levure a donc développé une capacité à s'adapter à la limitation en certains nutriments mais pas à d'autres.

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 2. Impact du niveau d'azote sur la mortalité lors de limitations en acide oléique et en acide pantothénique.</figcaption></figure>
des conséquences du point de vue de la consommation des sucres par la levure et on constate que le niveau élevé d'azote conduit à un arrêt de fermentation avec des sucres résiduels élevés alors que le faible niveau d'azote permet une consommation totale des sucres.

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 1. Impact du niveau d'azote sur la mortalité lors de limitations en ergostérol.</figcaption></figure>

Une même démarche a été conduite pour d'autres micronutriments et une même réponse à leur limitation et à l'azote a été observée pour l'acide oléique, l'acide pantothénique et l'acide nicotinique. Dans les trois cas une mortalité dépendante de l'azote a été mise en évidence (Figure 2). Il y a donc un mécanisme général qui entraine la mortalité liée à la limitation de la croissance par certains micronutriments. Par contre nous avons observé que certains micronutriments n'entrainent pas de mortalité des levures dans les mêmes conditions. C'est le cas de la thiamine, de la biotine et de l'inositol dont les faibles niveaux perturbent le déroulement des fermentations sans entrainer de mortalité des levures. La levure a donc développé une capacité à s'adapter à la limitation en certains nutriments mais pas à d'autres.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 2. Impact du niveau d'azote sur la mortalité lors de limitations en acide oléique et en acide pantothénique.</figcaption></figure>
La mortalité des levures provoquée par les limitations en micronutriments est liée au statut azoté du milieu. Divers travaux ont montré que l'azote pouvait moduler la réponse des levures à des stress environnementaux. En particulier, il a été montré que la perception de l'azote par la levure, en particulier par la voie TOR (Target Of Rapamycin) pouvait induire un signal qui contrôle la réponse au stress. Nous avons pu confirmer que cette voie de signalisation était bien impliquée dans la mortalité par l'étude de la réponse de mutants de cette voie. Ces mutants ne sont pas sensibles aux limitations en micronutriments en fermentation.

Nous avons par ailleurs évalué la capacité des levures à acquérir une résistance aux stress lors de fermentations correspondant à différentes limitations nutritionnelles. En accord avec les schémas connus de contrôle de la réponse au stress, nous avons observé que lors de fermentations limitées par l'azote, les levures développaient une résistance au stress lors de l'arrêt de la croissance. Cette réponse leur permet de résister à des stress tels qu'un traitement à la chaleur mais aussi à l'éthanol. Par contre, les limitations en micronutriments donnant lieu à de la mortalité (ergostérol, oléate, acide pantothénique, acide nicotinique) ne conduisent pas à la mise en place d'une réponse stress lors de l'arrêt de croissance. Ce défaut de réponse stress est bien sûr un élément clé qui explique l'apparition de la mortalité dans ces situations nutritionnelles.

Nous avons enfin évalué la capacité de différentes sources d'azote à entrainer une mortalité lors de fermentations carencées en micronutriments. Ces informations peuvent être utiles car la nature des sources d'azote résiduelles lors de carences en micronutriments peut varier suivant les situations œnologiques. Par ailleurs, ces informations peuvent être utiles pour gérer la complémentation des moûts carencés en azote. Nous avons observé que la plupart des acides aminés n'ont qu'une faible capacité à entrainer la mortalité quand ils sont apportés seuls. Néanmoins certains d'entre eux, en particulier les acides aminés aromatiques et la lysine ont une forte capacité à induire la mortalité. Plus curieusement, nous avons observé que la proline peut entrainer une forte mortalité quand elle est présente à des niveaux élevés (354 mg N/L). Cet effet de la proline est inattendu vu que la proline est souvent présente à des niveaux élevés dans les moûts et n'est pas une source d'azote assimilable. Ces données amènent à reconsidérer les effets du niveau de proline dans les moûts dans ces situations de carence. On s'est par ailleurs attaché à évaluer l'impact de l'ammonium vu son intérêt dans la supplémentation des moûts carencés en azote. Nous avons examiné l'effet de l'apport de l'ammonium suivant deux modalités, dans le moût avant fermentation et au cours de la fermentation à 1/3 de la consommation des sucres. L'apport d'ammonium (354 mg N /L) à un moût carencé en ergostérol avant fermentation induit une forte mortalité des levures et entraine un arrêt de fermentation avec un niveau élevé de sucres résiduels (Figure 3).

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure3. Impact de l'addition de NH4⁺ sur la mortalité.</figcaption></figure>
La mortalité des levures provoquée par les limitations en micronutriments est liée au statut azoté du milieu. Divers travaux ont montré que l'azote pouvait moduler la réponse des levures à des stress environnementaux. En particulier, il a été montré que la perception de l'azote par la levure, en particulier par la voie TOR (Target Of Rapamycin) pouvait induire un signal qui contrôle la réponse au stress. Nous avons pu confirmer que cette voie de signalisation était bien impliquée dans la mortalité par l'étude de la réponse de mutants de cette voie. Ces mutants ne sont pas sensibles aux limitations en micronutriments en fermentation.

Nous avons par ailleurs évalué la capacité des levures à acquérir une résistance aux stress lors de fermentations correspondant à différentes limitations nutritionnelles. En accord avec les schémas connus de contrôle de la réponse au stress, nous avons observé que lors de fermentations limitées par l'azote, les levures développaient une résistance au stress lors de l'arrêt de la croissance. Cette réponse leur permet de résister à des stress tels qu'un traitement à la chaleur mais aussi à l'éthanol. Par contre, les limitations en micronutriments donnant lieu à de la mortalité (ergostérol, oléate, acide pantothénique, acide nicotinique) ne conduisent pas à la mise en place d'une réponse stress lors de l'arrêt de croissance. Ce défaut de réponse stress est bien sûr un élément clé qui explique l'apparition de la mortalité dans ces situations nutritionnelles.

Nous avons enfin évalué la capacité de différentes sources d'azote à entrainer une mortalité lors de fermentations carencées en micronutriments. Ces informations peuvent être utiles car la nature des sources d'azote résiduelles lors de carences en micronutriments peut varier suivant les situations œnologiques. Par ailleurs, ces informations peuvent être utiles pour gérer la complémentation des moûts carencés en azote. Nous avons observé que la plupart des acides aminés n'ont qu'une faible capacité à entrainer la mortalité quand ils sont apportés seuls. Néanmoins certains d'entre eux, en particulier les acides aminés aromatiques et la lysine ont une forte capacité à induire la mortalité. Plus curieusement, nous avons observé que la proline peut entrainer une forte mortalité quand elle est présente à des niveaux élevés (354 mg N/L). Cet effet de la proline est inattendu vu que la proline est souvent présente à des niveaux élevés dans les moûts et n'est pas une source d'azote assimilable. Ces données amènent à reconsidérer les effets du niveau de proline dans les moûts dans ces situations de carence. On s'est par ailleurs attaché à évaluer l'impact de l'ammonium vu son intérêt dans la supplémentation des moûts carencés en azote. Nous avons examiné l'effet de l'apport de l'ammonium suivant deux modalités, dans le moût avant fermentation et au cours de la fermentation à 1/3 de la consommation des sucres. L'apport d'ammonium (354 mg N /L) à un moût carencé en ergostérol avant fermentation induit une forte mortalité des levures et entraine un arrêt de fermentation avec un niveau élevé de sucres résiduels (Figure 3).

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure3. Impact de l'addition de NH4⁺ sur la mortalité.</figcaption></figure>
Dans le cas d'une addition de l'ammonium au 1/3 de la fermentation, le niveau de viabilité des levures n'est que peu affecté et la consommation des sucres est accélérée et complète. Les différences de réponse entre les deux stades d'apport de l'ammonium peuvent s'expliquer par leur impact sur les conditions d'entrée en phase stationnaire. Quand l'ammonium est ajouté dans le moût, c'est l'ergostérol qui limite la croissance et ne permet pas un développement de réponse stress provoquant la mortalité des levures. Par contre, quand l'addition est réalisée en phase stationnaire, le faible niveau d'azote est responsable de l'arrêt de croissance qui induit une réponse stress protégeant la levure et que l'addition tardive d'azote n'affecte pas. Les mécanismes identifiés ici donnent une explication à l'efficacité constatée des ajouts tardifs d'ammonium comparés à leur apport dans les moûts.

## Conclusion

Dans ce travail, nous avons abordé la question de la mortalité en fermentation en nous appuyant sur les données récentes qui ont mis en évidence l'importance du premier nutriment limitant provoquant l'arrêt de la croissance sur la survie des levures. Nous montrons que la mortalité en fermentation entrainée par les limitations en micronutriments est liée à leur incapacité à mettre en place des mécanismes de survie lors de l'arrêt de croissance. Nous avons observé ce phénomène avec des micronutriments qui peuvent correspondre à des carences dans les milieux œnologiques, en particulier pour l'ergostérol et l'acide oléique mais éventuellement aussi pour les acides pantothéniques et nicotiniques. Les situations de forte clarification des moûts sont vraisemblablement celles qui par l'épuisement en lipides se rapprochent des situations examinées ici et où les mécanismes décrits sont opérants. Dans ces cas là nous montrons que la mortalité est étroitement contrôlée par le niveau d'azote des moûts via une modulation de la réponse stress des levures. La prise en compte de l'azote dans la mortalité des levures est une donnée majeure de ce travail pour la gestion des situations carencées en micronutriments. Ces résultats permettent de mieux cerner les mécanismes impliqués dans l'apparition de la mortalité des levures en fermentation. Ils doivent aussi permettre de mieux raisonner les apports d'azote, en particulier d'ammonium, dans ces situations de carences.

## Références

* Boer V.M., Amini S., Botstein D. (2008). Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 6930-6935.

* Duc C., Pradal M., Sanchez I., Noble J., Tesnière C., Blondin B. (2017) A set of nutrient limitations trigger yeast cell death in a nitrogen-dependent manner during wine alcoholic fermentation. PLoS ONE 12(9): e0184838

* Tesnière C., Delobel P., Pradal M. & Blondin B. (2013). Impact of nutrient imbalance on wine alcoholic fermentations: nitrogen excess enhances yeast cell death in lipid-limited must. Plos One, 8. e61645
Dans le cas d'une addition de l'ammonium au 1/3 de la fermentation, le niveau de viabilité des levures n'est que peu affecté et la consommation des sucres est accélérée et complète. Les différences de réponse entre les deux stades d'apport de l'ammonium peuvent s'expliquer par leur impact sur les conditions d'entrée en phase stationnaire. Quand l'ammonium est ajouté dans le moût, c'est l'ergostérol qui limite la croissance et ne permet pas un développement de réponse stress provoquant la mortalité des levures. Par contre, quand l'addition est réalisée en phase stationnaire, le faible niveau d'azote est responsable de l'arrêt de croissance qui induit une réponse stress protégeant la levure et que l'addition tardive d'azote n'affecte pas. Les mécanismes identifiés ici donnent une explication à l'efficacité constatée des ajouts tardifs d'ammonium comparés à leur apport dans les moûts.

## Conclusion

Dans ce travail, nous avons abordé la question de la mortalité en fermentation en nous appuyant sur les données récentes qui ont mis en évidence l'importance du premier nutriment limitant provoquant l'arrêt de la croissance sur la survie des levures. Nous montrons que la mortalité en fermentation entrainée par les limitations en micronutriments est liée à leur incapacité à mettre en place des mécanismes de survie lors de l'arrêt de croissance. Nous avons observé ce phénomène avec des micronutriments qui peuvent correspondre à des carences dans les milieux œnologiques, en particulier pour l'ergostérol et l'acide oléique mais éventuellement aussi pour les acides pantothéniques et nicotiniques. Les situations de forte clarification des moûts sont vraisemblablement celles qui par l'épuisement en lipides se rapprochent des situations examinées ici et où les mécanismes décrits sont opérants. Dans ces cas là nous montrons que la mortalité est étroitement contrôlée par le niveau d'azote des moûts via une modulation de la réponse stress des levures. La prise en compte de l'azote dans la mortalité des levures est une donnée majeure de ce travail pour la gestion des situations carencées en micronutriments. Ces résultats permettent de mieux cerner les mécanismes impliqués dans l'apparition de la mortalité des levures en fermentation. Ils doivent aussi permettre de mieux raisonner les apports d'azote, en particulier d'ammonium, dans ces situations de carences.

## Références

* Boer V.M., Amini S., Botstein D. (2008). Influence of genotype and nutrition on survival and metabolism of starving yeast. Proc Natl Acad Sci U S A, 105, 6930-6935.

* Duc C., Pradal M., Sanchez I., Noble J., Tesnière C., Blondin B. (2017) A set of nutrient limitations trigger yeast cell death in a nitrogen-dependent manner during wine alcoholic fermentation. PLoS ONE 12(9): e0184838

* Tesnière C., Delobel P., Pradal M. & Blondin B. (2013). Impact of nutrient imbalance on wine alcoholic fermentations: nitrogen excess enhances yeast cell death in lipid-limited must. Plos One, 8. e61645
# Effet des lipides des bourbes sur la conduite des fermentations et la viabilité des levures

**Catherine Tesnière**<fnref n="1" />, **Erick Casalta**<fnref n="1" />, **Giovana Girardi-Piva**<fnref n="1" />, **Martine Pradal**<fnref n="1" />, **Aude Vernhet**<fnref n="1" />, **Jean-Marie Sablayrolles**<fnref n="1" />, **Jean-Michel Salmon**<fnref n="2" />

## Introduction

Le taux de particules solides présentes après clarification des moûts a un impact sur le déroulement de la fermentation et sur la qualité finale du vin. Cet impact sur la fermentation est lié à leur teneur en lipides, en particulier les stérols. Ces derniers permettent aux levures de résister aux stress de l'éthanol et de la température. Les levures ne pouvant synthétiser leurs propres stérols en absence d'oxygène, les lipides apportés par les bourbes compensent au moins partiellement les déficiences en oxygène. Une clarification excessive des moûts peut donc aboutir à des effets négatifs, comme par exemple des arrêts de fermentation ou des fermentations languissantes. D'un autre côté, un taux de particules solides résiduelles trop élevé peut conduire à la formation d'arômes négatifs (odeurs de réduit) et de saveurs herbacées.

Ces phénomènes et mécanismes sont, pour la plupart, identifiés depuis de nombreuses années mais ils demeurent parfaitement décrits et maitrisés. Cet exposé vise précisément à faire un point de nos connaissances actuelles sur ces lipides des bourbes : caractérisation, assimilation, conséquences sur la viabilité des levures et le déroulement des fermentations.

## Origine et caractérisation des bourbes

Les bourbes proviennent de fragments de cellules végétales déstructurées au cours des opérations d'extraction, et de l'agrégation de composés insolubles du moût. Leur nature et quantité varient de manière importante selon la matière première et le processus d'extraction. On observe en effet une différence de composition des bourbes selon l'itinéraire technologique choisi.

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 1. Bourbes obtenues par différents itinéraires technologiques.**</figcaption></figure>

PP: pressoir pneumatique, DC: décanteur centrifuge, E: enzymage, F: traitement 2h au froid, D: décantation 14h au froid

<footnote n="1">¹INRA-UMR Sciences pour l’œnologie-Montpellier-France</footnote>

<footnote n="2">²INRA Unité expérimentale de Pech Rouge-Gruissan- France</footnote>
# Effet des lipides des bourbes sur la conduite des fermentations et la viabilité des levures

Catherine Tesnière<fnref n="1" />, Erick Casalta<fnref n="1" />, Giovana Girardi-Piva<fnref n="1" />, Martine Pradal<fnref n="1" />, Aude Vernhet<fnref n="1" />, Jean-Marie Sablayrolles<fnref n="1" />, Jean-Michel Salmon<fnref n="2" />

## Introduction

Le taux de particules solides présentes après clarification des moûts a un impact sur le déroulement de la fermentation et sur la qualité finale du vin. Cet impact sur la fermentation est lié à leur teneur en lipides, en particulier les stérols. Ces derniers permettent aux levures de résister aux stress de l'éthanol et de la température. Les levures ne pouvant synthétiser leurs propres stérols en absence d'oxygène, les lipides apportés par les bourbes compensent au moins partiellement les déficiences en oxygène. Une clarification excessive des moûts peut donc aboutir à des effets négatifs, comme par exemple des arrêts de fermentation ou des fermentations languissantes. D'un autre côté, un taux de particules solides résiduelles trop élevé peut conduire à la formation d'arômes négatifs (odeurs de réduit) et de saveurs herbacées.

Ces phénomènes et mécanismes sont, pour la plupart, identifiés depuis de nombreuses années mais ils demeurent parfaitement décrits et maitrisés. Cet exposé vise précisément à faire un point de nos connaissances actuelles sur ces lipides des bourbes : caractérisation, assimilation, conséquences sur la viabilité des levures et le déroulement des fermentations.

## Origine et caractérisation des bourbes

Les bourbes proviennent de fragments de cellules végétales déstructurées au cours des opérations d'extraction, et de l'agrégation de composés insolubles du moût. Leur nature et quantité varient de manière importante selon la matière première et le processus d'extraction. On observe en effet une différence de composition des bourbes selon l'itinéraire technologique choisi.

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 1. Bourbes obtenues par différents itinéraires technologiques.</figcaption></figure>

PP: pressoir pneumatique, DC: décanteur centrifuge, E: enzymage, F: traitement 2h au froid, D: décantation 14h au froid

<footnote n="1">¹INRA-UMR Sciences pour l'œnologie-Montpellier-France</footnote>

<footnote n="2">²INRA Unité expérimentale de Pech Rouge-Gruissan- France</footnote>
Par exemple à partir d'un cépage blanc des phénomènes d'oxydation beaucoup plus importants sont observés sur les bourbes issues de pressurage pneumatique que sur celles issues du décanteur centrifuge (Figure 1). En effet, les activités polyphénol oxydase et estérase du raisin, qui contribuent à la consommation de l'oxygène dissous, au brunissement des moûts et à la réduction des teneurs en esters, sont associées aux particules solides.

La taille des particules est généralement d'un diamètre inférieur à 2 µm comme le montrent les images ci-dessous prises au microscope électronique (Figure 2).

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Figure 2. Observation au microscope électronique de bourbes (A) et d'une fraction de bourbes enrichie en lipides (B).</figcaption></figure>

Ces particules s'agrègent dans les moûts. Des marquages spécifiques des différentes familles de lipides ont été réalisés avec des sondes fluorescentes (Figures 3 et 4). On observe au microscope à épifluorescence que les lipides (sous forme de phytostérols, phospholipides et triglycérides) sont associés aux particules solides par adsorption ou co-précipitation. Ils représentent environ 10 % de la matière sèche totale des bourbes. Si dans les baies de raisin à maturité les acides gras insaturés sont majoritaires, leur proportion varie dans les particules solides. Ainsi des moûts blancs peuvent contenir jusqu'à 53 % d'acides gras saturés et 47 % d'acides gras insaturés. La teneur en phytostérols des particules solides varie de 3 à 10 mg d'équivalents cholestérol/g de matière sèche. La composition en phytostérols est très proche de celle de la pulpe et de la pellicule de raisin. Le β-sitostérol en est le composé majoritaire.

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>Figure 3. Coloration de bourbes observées au microscope à épifluorescence. (A) stérols, (B) phospholipides, (C) triglycérides.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 4. Coloration de bourbes observées au microscope confocal. (A) phospholipides + chlorophylle, (B) phospholipides, (C) chlorophylle.</figcaption></figure>
Par exemple à partir d'un cépage blanc des phénomènes d'oxydation beaucoup plus importants sont observés sur les bourbes issues de pressurage pneumatique que sur celles issues du décanteur centrifuge (Figure 1). En effet, les activités polyphénol oxydase et estérase du raisin, qui contribuent à la consommation de l'oxygène dissous, au brunissement des moûts et à la réduction des teneurs en esters, sont associées aux particules solides.

La taille des particules est généralement d'un diamètre inférieur à 2 µm comme le montrent les images ci-dessous prises au microscope électronique (Figure 2).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 2. Observation au microscope électronique de bourbes (A) et d'une fraction de bourbes enrichie en lipides (B).</figcaption></figure>

Ces particules s'agrègent dans les moûts. Des marquages spécifiques des différentes familles de lipides ont été réalisés avec des sondes fluorescentes (Figures 3 et 4). On observe au microscope à épifluorescence que les lipides (sous forme de phytostérols, phospholipides et triglycérides) sont associés aux particules solides par adsorption ou co-précipitation. Ils représentent environ 10 % de la matière sèche totale des bourbes. Si dans les baies de raisin à maturité les acides gras insaturés sont majoritaires, leur proportion varie dans les particules solides. Ainsi des moûts blancs peuvent contenir jusqu'à 53 % d'acides gras saturés et 47 % d'acides gras insaturés. La teneur en phytostérols des particules solides varie de 3 à 10 mg d'équivalents cholestérol/g de matière sèche. La composition en phytostérols est très proche de celle de la pulpe et de la pellicule de raisin. Le β-sitostérol en est le composé majoritaire.

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 3. Coloration de bourbes observées au microscope à épifluorescence. (A) stérols, (B) phospholipides, (C) triglycérides.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>Figure 4. Coloration de bourbes observées au microscope confocal. (A) phospholipides + chlorophylle, (B) phospholipides, (C) chlorophylle.</figcaption></figure>
## Assimilation des lipides des bourbes

En absence d'oxygène, les levures puisent les phytostérols dans le milieu et les intègrent dans leurs membranes (Figure 5A, 5D). Ceci est possible grâce à deux transporteurs de stérols (AUS1 et PDR11) dont l'activité d'importation augmente au cours de la fermentation (Figure 5B). En leur absence (délétion des gènes AUS1 et PDR11, noté ΔAUS1ΔPDR11), les levures *Saccharomyces cerevisiae* ne peuvent se multiplier comme le montre le test de croissance sur milieu solide (test en goutte, Figure 5C) où l'on observe une absence de croissance de la levure sans transporteurs de stérols (ΔAUS1ΔPDR11).

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 5. Modèle d'importation des stérols (A), cinétique d'importation des stérols par les levures au cours de la fermentation (B), effet de la délétion des transporteurs de stérols sur la croissance des levures (C) et localisation des stérols dans la levure par marquage au 25-NDB cholestérol (D).</figcaption></figure>

## Impact des lipides des bourbes sur le déroulement des fermentations et la viabilité des levures

Les bourbes ont un effet important sur les cinétiques fermentaires (Figure 6). En augmentant leur teneur, on augmente les vitesses maximales de fermentations et les cinétiques sont globalement plus rapides. Ceci est lié à une meilleure assimilation de l'azote entrainant une augmentation de la population de levures et une stimulation de leur métabolisme (Casalta et al., 2013). Le facteur

nutritionnel clé des bourbes est leur contenu en phytostérols (Figure 6B) et des cinétiques de fermentations identiques sont observées avec des phystostérols d'origines différentes mais en même quantité (1 mg/L, Figure 6C). On peut considérer que 2 à 4 mg de phytostérols/L sont généralement nécessaires pour que la levure atteigne sa biomasse maximale, mais ces besoins varient selon la souche de levure utilisée (jusqu'à 8 mg/L). D'autre part, plus le moût est riche en azote, plus la levure a besoin de phytostérols pour assimiler la totalité de l'azote (Casalta et al., 2013).
## Assimilation des lipides des bourbes

En absence d'oxygène, les levures puisent les phytostérols dans le milieu et les intègrent dans leurs membranes (Figure 5A, 5D). Ceci est possible grâce à deux transporteurs de stérols (AUS1 et PDR11) dont l'activité d'importation augmente au cours de la fermentation (Figure 5B). En leur absence (délétion des gènes AUS1 et PDR11, noté ΔAUS1ΔPDR11), les levures *Saccharomyces cerevisiae* ne peuvent se multiplier comme le montre le test de croissance sur milieu solide (test en goutte, Figure 5C) où l'on observe une absence de croissance de la levure sans transporteurs de stérols (ΔAUS1ΔPDR11).

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>Figure 5. Modèle d'importation des stérols (A), cinétique d'importation des stérols par les levures au cours de la fermentation (B), effet de la délétion des transporteurs de stérols sur la croissance des levures (C) et localisation des stérols dans la levure par marquage au 25-NDB cholestérol (D).</figcaption></figure>

## Impact des lipides des bourbes sur le déroulement des fermentations et la viabilité des levures

Les bourbes ont un effet important sur les cinétiques fermentaires (Figure 6). En augmentant leur teneur, on augmente les vitesses maximales de fermentations et les cinétiques sont globalement plus rapides. Ceci est lié à une meilleure assimilation de l'azote entrainant une augmentation de la population de levures et une stimulation de leur métabolisme (Casalta et al., 2013). Le facteur

nutritionnel clé des bourbes est leur contenu en phytostérols (Figure 6B) et des cinétiques de fermentations identiques sont observées avec des phystostérols d'origines différentes mais en même quantité (1 mg/L, Figure 6C). On peut considérer que 2 à 4 mg de phytostérols/L sont généralement nécessaires pour que la levure atteigne sa biomasse maximale, mais ces besoins varient selon la souche de levure utilisée (jusqu'à 8 mg/L). D'autre part, plus le moût est riche en azote, plus la levure a besoin de phytostérols pour assimiler la totalité de l'azote (Casalta et al., 2013).
<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>**Figure 6:** Effet de l'addition de bourbes ou de phytostérol synthétique sur la cinétique de fermentation d'un moût synthétique. La vitesse de fermentation est suivie par la vitesse de dégagement de CO₂. (A) particules solides de Sauvignon, (B) addition de phytostérol synthétique, (C) particules solides de différentes variétés (quantitées ajustées pour obtenir 1 mg/L de phytostérols).</figcaption></figure>

Ces lipides permettent, par ailleurs, de conserver une bonne viabilité en fin de fermentation (Tableau 1).

<table><caption>Tableau 1. Effet des particules solides sur la viabilité des levures</caption><thead><tr><th>% particules solides</th><th>0</th><th>0,5</th><th>1,5</th></tr></thead><tbody><tr><td>Viabilité à 40% de fermentation</td><td>69%</td><td>91%</td><td>96%</td></tr><tr><td>Viabilité à 80% de fermentation</td><td>45%</td><td>65%</td><td>85%</td></tr></tbody></table>

## Conclusion

Nous avons progressé dans nos connaissances sur le contenu en lipides des bourbes, leur impact sur la fermentation alcoolique, et les principaux mécanismes mis en jeu, en particulier le rôle clé des phytostérols. Cela permet de mieux raisonner la gestion des particules solides dans les mouts mais pas encore de parfaitement l'optimiser. En effet, il s'agit de trouver le meilleur compromis en termes de niveau de clarification des moûts pour adapter la teneur en phytostérols aux conditions de fermentation. Or, la richesse en azote des mouts, les teneurs des bourbes en phytostérols et les besoins des levures en ces nutriments sont variables, ce qui rend la construction d' « abaques » particulièrement complexe. Par ailleurs, la mesure de la turbidité des mouts ne constitue pas un indicateur précis de leur teneur en stérols et il y a un réel enjeu à rechercher un paramètre plus pertinent mais suffisamment facile à mettre en œuvre.

## Références

* Casalta E., Cervi M.-F., Salmon J.-M., Sablayrolles J.M., 2013. White wine fermentation: interaction of assimilable nitrogen and grape solids on alcoholic fermentation under oenological conditions. Australian Journal of Grape and Wine Research, 19, 47-52.

* Casalta E., Coloignier M., Salmon J.M., Sablayrolles J.M., 2017. Grape solids: composition and impact on alcoholic fermentation. *Enoforum*, May 2017, Vicence, Italy.

* Casalta E., Vernhet A., Sablayrolles J.M., Tesnière C., Salmon J.M., 2016. Review: Characterization and role of grape solids during alcoholic fermentation under enological conditions. American Journal of Enology and Viticulture, 67, 133-138.

* Luparia V., Soubeyrand V., Berges T., Julien A., Salmon J.M., 2004. Assimilation of grape phytosterols by *Saccharomyces cerevisiae* and their impact on enological fermentations. Applied Microbiology and Biotechnology, 65, 25-32.

* Salmon J.M., 2011. Particules solides : impact sur le déroulement de la fermentation. Revue Française d' Œnologie, 247,12.

* Salmon J.M., Ortiz-Julien A., 2009. Améliorer la fermentation alcoolique en conditions extrêmes. www.infowine.com, 17, p. 7.

* Vernhet A., Bes M., Bouissou D., Carrillo S., Brillouet J.M., 2016. Characterization of suspended solids in thermo-treated red musts. Journal International de la Vigne et du Vin, 50, 9.
<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>**Figure 6: Effet de l'addition de bourbes ou de phytostérol synthétique sur la cinétique de fermentation d'un moût synthétique.** La vitesse de fermentation est suivie par la vitesse de dégagement de CO₂. (A) particules solides de Sauvignon, (B) addition de phytostérol synthétique, (C) particules solides de différentes variétés (quantitées ajustées pour obtenir 1 mg/L de phytostérols).</figcaption></figure>

Ces lipides permettent, par ailleurs, de conserver une bonne viabilité en fin de fermentation (Tableau 1).

<table><caption>Tableau 1. Effet des particules solides sur la viabilité des levures</caption><tr><td>% particules solides</td><td>0</td><td>0,5</td><td>1,5</td></tr><tr><td>Viabilité à 40% de fermentation</td><td>69%</td><td>91%</td><td>96%</td></tr><tr><td>Viabilité à 80% de fermentation</td><td>45%</td><td>65%</td><td>85%</td></tr></table>

## Conclusion

Nous avons progressé dans nos connaissances sur le contenu en lipides des bourbes, leur impact sur la fermentation alcoolique, et les principaux mécanismes mis en jeu, en particulier le rôle clé des phytostérols. Cela permet de mieux raisonner la gestion des particules solides dans les mouts mais pas encore de parfaitement l'optimiser. En effet, il s'agit de trouver le meilleur compromis en termes de niveau de clarification des moûts pour adapter la teneur en phytostérols aux conditions de fermentation. Or, la richesse en azote des mouts, les teneurs des bourbes en phytostérols et les besoins des levures en ces nutriments sont variables, ce qui rend la construction d' « abaques » particulièrement complexe. Par ailleurs, la mesure de la turbidité des mouts ne constitue pas un indicateur précis de leur teneur en stérols et il y a un réel enjeu à rechercher un paramètre plus pertinent mais suffisamment facile à mettre en œuvre.

## Références

* Casalta E., Cervi M.-F., Salmon J.-M., Sablayrolles J.M., 2013. White wine fermentation: interaction of assimilable nitrogen and grape solids on alcoholic fermentation under oenological conditions. Australian Journal of Grape and Wine Research, 19, 47-52.

* Casalta E., Coloignier M., Salmon J.M., Sablayrolles J.M., 2017. Grape solids: composition and impact on alcoholic fermentation. *Enoforum*, May 2017, Vicence, Italy.

* Casalta E., Vernhet A., Sablayrolles J.M., Tesnière C., Salmon J.M., 2016. Review: Characterization and role of grape solids during alcoholic fermentation under enological conditions. American Journal of Enology and Viticulture, 67, 133-138.

* Luparia V., Soubeyrand V., Berges T., Julien A., Salmon J.M., 2004. Assimilation of grape phytosterols by *Saccharomyces cerevisiae* and their impact on enological fermentations. Applied Microbiology and Biotechnology, 65, 25-32.

* Salmon J.M., 2011. Particules solides : impact sur le déroulement de la fermentation. Revue Française d' Œnologie, 247,12.

* Salmon J.M., Ortiz-Julien A., 2009. Améliorer la fermentation alcoolique en conditions extrêmes. www.infowine.com, 17, p. 7.

* Vernhet A., Bes M., Bouissou D., Carrillo S., Brillouet J.M., 2016. Characterization of suspended solids in thermo-treated red musts. Journal International de la Vigne et du Vin, 50, 9.
# De la perception de l'amertume à l'amertume des vins

Alain Samson<fnref n="1" />, Coline Leriche<fnref n="1" />, Constant Bégué<fnref n="1" />, Charlène Fabre<fnref n="1" />, Soline Caillé<fnref n="2" />

## Introduction

Pour s'adapter à son environnement, l'homme possède 5 sens : la vue, le toucher, l'ouïe, l'odorat et le goût. Ces sens sont souvent utilisés ensemble et en interaction bien que certains prédominent tels que la vue et le toucher. Le sens du goût est quant à lui déterminant dans le choix de la nourriture (Scott, 2005). L'amertume est l'une des cinq composantes qui participe à la saveur des aliments avec l'acidité, le sucré, le salé et l'umami. Chez l'homme et plus généralement chez les mammifères, l'amertume est assimilée à des substances toxiques car effectivement un grand nombre de substances toxiques présentent un goût amer (Glendinning, 1994). C'est pourquoi, c'est une saveur peu appréciée dans l'alimentation que l'on cherche souvent à supprimer ou à atténuer. Identifier les composés qui en sont responsables et comprendre les mécanismes de sa perception sont donc des enjeux de recherche importants.

## 1. La perception de l'amertume

Aujourd'hui, il est assez réducteur de considérer que les mécanismes neurophysiologiques qui régissent la perception des saveurs par l'humain peuvent se décomposer simplement et ne faire appel qu'à l'aspect gustatif. Les sensations olfactives, et somesthésiques (tactiles, température, douleur...) y contribuent également. Les signaux envoyés par l'ensemble des récepteurs sont transmis au cortex cérébral par 4 nerfs différents : facial, glossopharyngien et vague pour les signaux issues des bourgeons du goût et trijumeau pour les signaux mécaniques, thermiques et chimiques. Les informations traitées dans différentes zones du cortex cérébral et sous-cortical associées aux messages hédoniques ou mémoriels forment une image sensorielle complexe de l'aliment ou de la boisson.

Contrairement aux idées reçues, il n'y a pas de zone de la langue associée spécifiquement à une saveur. En effet, une même cellule gustative, quelle que soit sa localisation, est sensible à plusieurs types de stimulus sapides transmis pas une grande variété de récepteurs gustatifs peu spécifiques. Plus de 8000 bourgeons gustatifs situés essentiellement dans les papilles gustatives de la langue, mais également dans l'épiglotte, le pharynx et le palais, permettent de détecter des molécules sapides (Faurion, 2000).

Ce sont des ions H⁺ et Na⁺ qui par l'intermédiaire de canaux ioniques sont responsables respectivement des saveurs acide et salée. Pour le goût sucré et umami, un nombre assez restreint de récepteurs (T1R1, T1R2, T1R3) sont concernés. Dans le cas de la perception de l'amertume, ce sont des récepteurs de la famille des T2R (Taste 2 Receptor) ou TAS2R qui sont activés (Adler et al., 2000, Lindermann, 2001). C'est une famille d'environ 30 récepteurs TAS2R du goût amer qui a été identifiée chez les mammifères. Ils permettent de reconnaître de nombreux composés amers (Meyerhof, 2005). Cependant, pour la perception de l'amertume, en fonction des composés chimiques ce ne sont pas toujours les mêmes récepteurs qui sont activés. Ainsi, Soares et al. (2013) ont montré que pour la famille des polyphénols, un nombre variable de récepteurs TAS2R était activé. Upadhyaya et al. (2010) ont montré que c'était 25 récepteurs TAS2R qui étaient activés par des di- et tri- peptides extraits dérivées de protéines de pois et de soja. Les TAS2R sont exprimés dans un sous-ensemble de cellules du récepteur du goût, qui sont distinctes de celles qui répondent aux autres qualités gustatives. Toutefois, les cellules consacrées à la détection des stimuli sucré, umami et amer partagent des composantes de transduction de signal communes (Meyerhof 2005).

<footnote n="1">¹INRA, UE 999 Domaine de Pech Rouge, F-11430 Gruissan, France</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR1083, 2 Place Pierre Viala, F-34060 Montpellier Cedex 1, France</footnote>
# De la perception de l'amertume à l'amertume des vins

Alain Samson<fnref n="1" />, Coline Leriche<fnref n="1" />, Constant Bégué<fnref n="1" />, Charlène Fabre<fnref n="1" />, Soline Caillé<fnref n="2" />

## Introduction

Pour s'adapter à son environnement, l'homme possède 5 sens : la vue, le toucher, l'ouïe, l'odorat et le goût. Ces sens sont souvent utilisés ensemble et en interaction bien que certains prédominent tels que la vue et le toucher. Le sens du goût est quant à lui déterminant dans le choix de la nourriture (Scott, 2005). L'amertume est l'une des cinq composantes qui participe à la saveur des aliments avec l'acidité, le sucré, le salé et l'umami. Chez l'homme et plus généralement chez les mammifères, l'amertume est assimilée à des substances toxiques car effectivement un grand nombre de substances toxiques présentent un goût amer (Glendinning, 1994). C'est pourquoi, c'est une saveur peu appréciée dans l'alimentation que l'on cherche souvent à supprimer ou à atténuer. Identifier les composés qui en sont responsables et comprendre les mécanismes de sa perception sont donc des enjeux de recherche importants.

## 1. La perception de l'amertume

Aujourd'hui, il est assez réducteur de considérer que les mécanismes neurophysiologiques qui régissent la perception des saveurs par l'humain peuvent se décomposer simplement et ne faire appel qu'à l'aspect gustatif. Les sensations olfactives, et somesthésiques (tactiles, température, douleur...) y contribuent également. Les signaux envoyés par l'ensemble des récepteurs sont transmis au cortex cérébral par 4 nerfs différents : facial, glossopharyngien et vague pour les signaux issues des bourgeons du goût et trijumeau pour les signaux mécaniques, thermiques et chimiques. Les informations traitées dans différentes zones du cortex cérébral et sous-cortical associées aux messages hédoniques ou mémoriels forment une image sensorielle complexe de l'aliment ou de la boisson.

Contrairement aux idées reçues, il n'y a pas de zone de la langue associée spécifiquement à une saveur. En effet, une même cellule gustative, quelle que soit sa localisation, est sensible à plusieurs types de stimulus sapides transmis pas une grande variété de récepteurs gustatifs peu spécifiques. Plus de 8000 bourgeons gustatifs situés essentiellement dans les papilles gustatives de la langue, mais également dans l'épiglotte, le pharynx et le palais, permettent de détecter des molécules sapides (Faurion, 2000).

Ce sont des ions H⁺ et Na⁺ qui par l'intermédiaire de canaux ioniques sont responsables respectivement des saveurs acide et salée. Pour le goût sucré et umami, un nombre assez restreint de récepteurs (T1R1, T1R2, T1R3) sont concernés. Dans le cas de la perception de l'amertume, ce sont des récepteurs de la famille des T2R (Taste 2 Receptor) ou TAS2R qui sont activés (Adler et al., 2000, Lindermann, 2001). C'est une famille d'environ 30 récepteurs TAS2R du goût amer qui a été identifiée chez les mammifères. Ils permettent de reconnaître de nombreux composés amers (Meyerhof, 2005). Cependant, pour la perception de l'amertume, en fonction des composés chimiques ce ne sont pas toujours les mêmes récepteurs qui sont activés. Ainsi, Soares et al. (2013) ont montré que pour la famille des polyphénols, un nombre variable de récepteurs TAS2R était activé. Upadhyaya et al. (2010) ont montré que c'était 25 récepteurs TAS2R qui étaient activés par des di- et tri- peptides extraits dérivées de protéines de pois et de soja. Les TAS2R sont exprimés dans un sous-ensemble de cellules du récepteur du goût, qui sont distinctes de celles qui répondent aux autres qualités gustatives. Toutefois, les cellules consacrées à la détection des stimuli sucré, umami et amer partagent des composantes de transduction de signal communes (Meyerhof 2005).

<footnote n="1">¹INRA, UE 999 Domaine de Pech Rouge, F-11430 Gruissan, France</footnote>

<footnote n="2">²INRA, UMR1083, 2 Place Pierre Viala, F-34060 Montpellier Cedex 1, France</footnote>
L'activation des récepteurs va moduler une cascade de transduction qui sera responsable de la perception finale du goût par le cerveau (Zang et al., 2003 ; Ozeck et al., 2004 ; Chandrashekar et al., 2006):

* Activation d'un récepteur T2R par la liaison d'une molécule amère ;

* Dissociation de la gustducine (α, β et γ) ;

* La sous-unité α de la gustducine active la PLCβ2 qui va cliver PIP2 en DAG et IP3 ;

* IP3 entraîne une libération de Ca²⁺ dans la cellule et donc sa dépolarisation ;

* Ca²⁺ permet l'ouverture du canal TRMP5 et l'entrée de Na⁺ ;

* Libération de neurotransmetteurs et dépolarisation des cellules voisines.

Des variations inter individuelles sur la sensibilité à l'amertume sont observées, elles sont dues à des divergences dans les gènes codants pour les récepteurs du goût (Reed et al., 2006), mais d'autres facteurs tels que des facteurs environnementaux (l'âge, les pathologies, ou encore la prise de médicaments) peuvent également affecter la perception de l'amertume. Toutefois, pour des sujets sains, un facteur intéressant de variations inter individuelles pour la perception du goût amer est le volume de sécrétion de la salive et sa composition protéique (Dsamou, 2012).

## 2. Composés responsables de l'amertume dans l'alimentation

Il existe un très grand nombre de substances avec des structures chimiques différentes qui ont pu être associées à la perception de l'amertume. Une classification de 93 structures a été établie (Rodgers et al., 2005).

Pour illustrer cette variabilité de composés amers en alimentation, on peut faire référence à quelques aliments ou boissons courantes : l'endive ou chicorée, le pamplemousse, le cacao, la bière, le café ou certains fromages. Pour l'endive, les molécules concernées sont des sesquiterpènes lactones très représentées dans la famille botanique des Astéracées à laquelle appartient l'endive (chicorée) ou le pissenlit. Pour les pomelos ou les pamplemousses, ce sont des flavonones comme la naringine ou la neohesperidine combinées à des sucres (flavonosides). Pour le cacao, ce sont des catéchines de la famille des flavanols. Pour la bière, il s'agit principalement de l'isohumulone (acide α) qui provient du houblon. En brasserie, c'est même l'unité de poids en partie par million (ppm) de ce composé qui constitue l'International Bitterness Unit (IBU) pour quantifier l'amertume des bières. Pour le café, c'est un alcaloïde, la caféine, qui est le principal responsable de son amertume. La caféine tout comme un autre alcaloïde la quinine, extraite de l'écorce d'un arbre de la Cordillère des Andes, sont utilisées comme molécules standards en analyse sensorielle pour l'entraînement et la mesure des seuils de perception des juges. Enfin, pour terminer ce panorama, on peut déceler de l'amertume dans certains fromages, notamment à pâte molle, comme par exemple le camembert. Dans ce cas, ce sont des composés azotés qui en sont responsables. En effet, c'est la production de petits peptides par la protéolyse mal contrôlée de micro-organisme tel que Penicillium caseicolum qui en est à l'origine (Vassal et al., 1984).
L'activation des récepteurs va moduler une cascade de transduction qui sera responsable de la perception finale du goût par le cerveau (Zang et al., 2003 ; Ozeck et al., 2004 ; Chandrashekar et al., 2006):

* Activation d'un récepteur T2R par la liaison d'une molécule amère ;

* Dissociation de la gustducine (α, β et γ) ;

* La sous-unité α de la gustducine active la PLCβ2 qui va cliver PIP2 en DAG et IP3 ;

* IP3 entraîne une libération de Ca²⁺ dans la cellule et donc sa dépolarisation ;

* Ca²⁺ permet l'ouverture du canal TRMP5 et l'entrée de Na⁺ ;

* Libération de neurotransmetteurs et dépolarisation des cellules voisines.

Des variations inter individuelles sur la sensibilité à l'amertume sont observées, elles sont dues à des divergences dans les gènes codants pour les récepteurs du goût (Reed et al., 2006), mais d'autres facteurs tels que des facteurs environnementaux (l'âge, les pathologies, ou encore la prise de médicaments) peuvent également affecter la perception de l'amertume. Toutefois, pour des sujets sains, un facteur intéressant de variations inter individuelles pour la perception du goût amer est le volume de sécrétion de la salive et sa composition protéique (Dsamou, 2012).

## 2. Composés responsables de l'amertume dans l'alimentation

Il existe un très grand nombre de substances avec des structures chimiques différentes qui ont pu être associées à la perception de l'amertume. Une classification de 93 structures a été établie (Rodgers et al., 2005).

Pour illustrer cette variabilité de composés amers en alimentation, on peut faire référence à quelques aliments ou boissons courantes : l'endive ou chicorée, le pamplemousse, le cacao, la bière, le café ou certains fromages. Pour l'endive, les molécules concernées sont des sesquiterpènes lactones très représentées dans la famille botanique des Astéracées à laquelle appartient l'endive (chicorée) ou le pissenlit. Pour les pomelos ou les pamplemousses, ce sont des flavonones comme la naringine ou la neohesperidine combinées à des sucres (flavonosides). Pour le cacao, ce sont des catéchines de la famille des flavanols. Pour la bière, il s'agit principalement de l'isohumulone (acide α) qui provient du houblon. En brasserie, c'est même l'unité de poids en partie par million (ppm) de ce composé qui constitue l'International Bitterness Unit (IBU) pour quantifier l'amertume des bières. Pour le café, c'est un alcaloïde, la caféine, qui est le principal responsable de son amertume. La caféine tout comme un autre alcaloïde la quinine, extraite de l'écorce d'un arbre de la Cordillère des Andes, sont utilisées comme molécules standards en analyse sensorielle pour l'entraînement et la mesure des seuils de perception des juges. Enfin, pour terminer ce panorama, on peut déceler de l'amertume dans certains fromages, notamment à pâte molle, comme par exemple le camembert. Dans ce cas, ce sont des composés azotés qui en sont responsables. En effet, c'est la production de petits peptides par la protéolyse mal contrôlée de micro-organisme tel que Penicillium caseicolum qui en est à l'origine (Vassal et al., 1984).
<figure><img src="image_30.png" /></figure>

**Figure 1.** Molécules impliquées dans la transduction du goût sucré. Les récepteurs de deux sucres séparés sont montrés, mais il existe la possibilité qu'un récepteur active les deux (Lindermann 2001). AC, adénylate cyclase, AMPc, adénosine monophosphate cyclique, PDE, phosphodiesterase, CAM, calmoduline, PKA, protéine kinase A, inhibiteur H89, PLC, phospholipase C, DAG, diacylglycérol, IP3, inositol-1,4,5-trisphosphate, PKC, protéine kinase C, inhibiteur bim (bisindolylmaléimide), inhibiteur W7.

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

**Figure 2.** Transduction du goût amer provoquée par une variété de ligands de la famille T2R, couplés à la protéine G gustducine (Lindermann, 2001). PIP2, Phosphatidylinositol-tri-phosphate ; PLCβ2, phospholipase C β2 ; DAG, diacylglycérol ; IP3, inositol-tri-phosphate ; TRPM5, canal cationique ; αβγ, sous-unités de la gustducine.

### 3. L'amertume : défaut ou qualité ?

Si l'amertume provoque une réaction de rejet chez l'enfant (Nicklaus et al., 2005), des expériences de consommation et un apprentissage peuvent corriger cette attitude et rendre l'amertume acceptable. Chez l'adulte, l'amertume peut même aller au-delà de l'acceptable et procurer du plaisir. Ainsi, avec
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**Figure 1.** Molécules impliquées dans la transduction du goût sucré. Les récepteurs de deux sucres séparés sont montrés, mais il existe la possibilité qu'un récepteur active les deux (Lindermann 2001). AC, adénylate cyclase, AMPc, adénosine monophosphate cyclique, PDE, phosphodiesterase, CAM, calmoduline, PKA, protéine kinase A, inhibiteur H89, PLC, phospholipase C, DAG, diacylglycérol, IP3, inositol-1,4,5-trisphosphate, PKC, protéine kinase C, inhibiteur bim (bisindolylmaléimide), inhibiteur W7.

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**Figure 2.** Transduction du goût amer provoquée par une variété de ligands de la famille T2R, couplés à la protéine G gustducine (Lindermann, 2001). PIP2, Phosphatidylinositol-tri-phosphate ; PLCβ2, phospholipase C β2 ; DAG, diacylglycérol ; IP3, inositol-tri-phosphate ; TRPM5, canal cationique ; αβγ, sous-unités de la gustducine.

### 3. L'amertume : défaut ou qualité ?

Si l'amertume provoque une réaction de rejet chez l'enfant (Nicklaus et al., 2005), des expériences de consommation et un apprentissage peuvent corriger cette attitude et rendre l'amertume acceptable. Chez l'adulte, l'amertume peut même aller au-delà de l'acceptable et procurer du plaisir. Ainsi, avec
l'évolution de la consommation, l'amertume peut constituer un défaut à corriger. C'est le cas avec la sélection variétale et les techniques de pousses hors sol pour l'endive (Brand et al., 2013). C'est encore le cas avec la sélection variétale pour les pomelos. A titre d'exemple, la variété Star Ruby (rouge) réputée très aromatique mais plus riche en flavonones a une saveur plus amère que la variété Ruby Red (rose) qui est la plus cultivée au monde pour ses qualités gustatives (Mouly et al., 1995). Pour le camembert, c'est le contrôle du développement des micro-organismes dans le processus d'affinage qui va permettre de lutter contre le défaut d'amertume (Vassal et al., 1984).

Cependant, lorsque l'intensité de l'amertume est maitrisée dans l'itinéraire de production, elle peut constituer un facteur de qualité. C'est typiquement le cas des boissons comme la bière, le café ou le vin.

## 4. L'amertume dans les vins

Dans le vin, l'amertume fait partie intégrante de l'équilibre gustatif. Dans les vins rouges, avec l'astringence, elle est principalement attribuée aux flavonoïdes et elle participe à leur qualité organoleptique. Il a été montré qu'en fonction du degré de polymérisation, la perception de l'amertume variait. Ainsi, les flavanols monomères sont amers tandis que les oligomères sont essentiellement astringents (Noble, 1994). De même, la différence de chiralité entre 2 flavan-3-ols du vin entraîne une différence significative dans la perception temporelle de l'amertume: l'(-) épicatéchine provoque une amertume plus longue en bouche que la (+) catéchine (Noble, 1994). Il a été constaté que dans des vins rouges, les vins au goût amer présentaient des concentrations plus élevées de composés phénoliques (catéchine, épicatéchine, acide gallique et caféique et quercétine) que les vins non amers. Ces mesures ont été réalisées avec une langue électronique couplée à un jury expert afin de proposer une méthode rapide d'analyse de l'amertume dans les vins (Rudnitskaya et al. 2010). Il existe même une synergie entre les composés polyphénoliques et aromatiques des vins rouges dans la perception de l'amertume (Ferrer-Gallego et al., 2014). Toutefois, Hufnagel et al. (2008) suggère que les flavan-3-ols ne seraient pas les composés majeurs pour expliquer l'astringence et le goût amer. Des séries d'esters éthyliques d'acide hydroxybenzoïque et d'acide hydroxycinnamique ont été identifiés comme des composés significativement responsables de l'amertume de vins rouges. Cela pourrait constituer une piste pour expliquer l'amertume des vins blancs peu riches en flavonoïdes.

En effet, pour les vins blancs l'identification des composés responsables de l'amertume est un sujet complexe et largement inconnu, d'autant plus qu'une amertume persistante est perçue négativement par les consommateurs (Sokolowsky et al., 2012). Ces mêmes auteurs préconisent la méthode d'analyse sensorielle du temps-intensité, en se concentrant uniquement sur le descripteur d'amertume, pour décrire les changements gustatifs temporels. D'après de récentes études de l'AWRI (Australian Wine Research Institution), il a été montré que beaucoup de consommateurs sont très sensibles à de faibles niveaux de défauts dans les vins blancs, dont l'amertume (Leigh et al., 2010). Il est bien connu que les vins de muscat sec présentent souvent une saveur amère prononcée. Leur richesse en composés terpéniques qui caractérise leur odeur pourrait en être la cause. Pourtant, Noble et al. (1988) ont montré que des glycosides terpéniques isolés à partir d'un vin amer de muscat d'Alexandrie, lorsqu'ils étaient ajoutés à un système modèle ou au vin, à raison d'une et deux fois la concentration du vin d'origine, n'induisaient aucune différence significative au niveau du goût. Par contre, dans l'eau, une différence significative a été produite. Outre la présence ou l'absence de telle ou telle molécule amère, des interactions dans le milieu sont à l'origine d'un renforcement ou d'une atténuation de la perception d'amertume. Ainsi, des teneurs élevées en éthanol renforcent la perception d'amertume (Noble, 1994, Ficher et al., 1994). Pour le glycérol l'effet serait inverse (Jones et al., 2008). Il est bien connu qu'un apport de sucre masque l'amertume du vin ce qui explique qu'à l'état de vins doux, les vins issus des cépages muscat ne présentent plus la même saveur amère qu'ils ont à l'état sec. Des interactions de l'acidité et du pH des vins sur la perception de l'amertume ne sont pas significatives (Noble 1994, Fontoin et al., 2008).
l'évolution de la consommation, l'amertume peut constituer un défaut à corriger. C'est le cas avec la sélection variétale et les techniques de pousses hors sol pour l'endive (Brand et al., 2013). C'est encore le cas avec la sélection variétale pour les pomelos. A titre d'exemple, la variété Star Ruby (rouge) réputée très aromatique mais plus riche en flavonones a une saveur plus amère que la variété Ruby Red (rose) qui est la plus cultivée au monde pour ses qualités gustatives (Mouly et al., 1995). Pour le camembert, c'est le contrôle du développement des micro-organismes dans le processus d'affinage qui va permettre de lutter contre le défaut d'amertume (Vassal et al., 1984).

Cependant, lorsque l'intensité de l'amertume est maitrisée dans l'itinéraire de production, elle peut constituer un facteur de qualité. C'est typiquement le cas des boissons comme la bière, le café ou le vin.

## 4. L'amertume dans les vins

Dans le vin, l'amertume fait partie intégrante de l'équilibre gustatif. Dans les vins rouges, avec l'astringence, elle est principalement attribuée aux flavonoïdes et elle participe à leur qualité organoleptique. Il a été montré qu'en fonction du degré de polymérisation, la perception de l'amertume variait. Ainsi, les flavanols monomères sont amers tandis que les oligomères sont essentiellement astringents (Noble, 1994). De même, la différence de chiralité entre 2 flavan-3-ols du vin entraîne une différence significative dans la perception temporelle de l'amertume: l'(-) épicatéchine provoque une amertume plus longue en bouche que la (+) catéchine (Noble, 1994). Il a été constaté que dans des vins rouges, les vins au goût amer présentaient des concentrations plus élevées de composés phénoliques (catéchine, épicatéchine, acide gallique et caféique et quercétine) que les vins non amers. Ces mesures ont été réalisées avec une langue électronique couplée à un jury expert afin de proposer une méthode rapide d'analyse de l'amertume dans les vins (Rudnitskaya et al. 2010). Il existe même une synergie entre les composés polyphénoliques et aromatiques des vins rouges dans la perception de l'amertume (Ferrer-Gallego et al., 2014). Toutefois, Hufnagel et al. (2008) suggère que les flavan-3-ols ne seraient pas les composés majeurs pour expliquer l'astringence et le goût amer. Des séries d'esters éthyliques d'acide hydroxybenzoïque et d'acide hydroxycinnamique ont été identifiés comme des composés significativement responsables de l'amertume de vins rouges. Cela pourrait constituer une piste pour expliquer l'amertume des vins blancs peu riches en flavonoïdes.

En effet, pour les vins blancs l'identification des composés responsables de l'amertume est un sujet complexe et largement inconnu, d'autant plus qu'une amertume persistante est perçue négativement par les consommateurs (Sokolowsky et al., 2012). Ces mêmes auteurs préconisent la méthode d'analyse sensorielle du temps-intensité, en se concentrant uniquement sur le descripteur d'amertume, pour décrire les changements gustatifs temporels. D'après de récentes études de l'AWRI (Australian Wine Research Institution), il a été montré que beaucoup de consommateurs sont très sensibles à de faibles niveaux de défauts dans les vins blancs, dont l'amertume (Leigh et al., 2010). Il est bien connu que les vins de muscat sec présentent souvent une saveur amère prononcée. Leur richesse en composés terpéniques qui caractérise leur odeur pourrait en être la cause. Pourtant, Noble et al. (1988) ont montré que des glycosides terpéniques isolés à partir d'un vin amer de muscat d'Alexandrie, lorsqu'ils étaient ajoutés à un système modèle ou au vin, à raison d'une et deux fois la concentration du vin d'origine, n'induisaient aucune différence significative au niveau du goût. Par contre, dans l'eau, une différence significative a été produite. Outre la présence ou l'absence de telle ou telle molécule amère, des interactions dans le milieu sont à l'origine d'un renforcement ou d'une atténuation de la perception d'amertume. Ainsi, des teneurs élevées en éthanol renforcent la perception d'amertume (Noble, 1994, Ficher et al., 1994). Pour le glycérol l'effet serait inverse (Jones et al., 2008). Il est bien connu qu'un apport de sucre masque l'amertume du vin ce qui explique qu'à l'état de vins doux, les vins issus des cépages muscat ne présentent plus la même saveur amère qu'ils ont à l'état sec. Des interactions de l'acidité et du pH des vins sur la perception de l'amertume ne sont pas significatives (Noble 1994, Fontoin et al., 2008).
Comme nous l'avons vu précédemment pour d'autres aliments, dans le vin des solutions sont aussi recherchées pour diminuer l'amertume des vins. La pratique du collage des vins qui consiste à ajouter un adjuvant pour éliminer des composés indésirables peut avoir un effet collatéral sur la diminution de l'amertume. C'est un argumentaire qui est fréquemment repris pour de nombreux produits œnologiques actuels.

## Conclusion

Par cette courte revue bibliographique nous avons vu que la perception de l'amertume était le résultat d'une chaine de réactions variées et complexes pour la transmission de l'information au cerveau et que des facteurs génétiques et environnementaux entraient en jeu pour expliquer une variabilité inter individuelle chez l'être humain. A cela, il faut ajouter la diversité importante des molécules susceptibles de déclencher un stimulus d'amertume. Si les composés responsables de l'amertume sont bien identifiés dans le cas de nombreux aliments, pour le vin le champ d'investigation reste encore très largement ouvert. En effet, pour celui-ci, son origine, la diversité des processus de vinification et sa composition chimique complexe rendent difficile la compréhension de l'amertume de cette boisson.

## Références bibliographiques

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Comme nous l'avons vu précédemment pour d'autres aliments, dans le vin des solutions sont aussi recherchées pour diminuer l'amertume des vins. La pratique du collage des vins qui consiste à ajouter un adjuvant pour éliminer des composés indésirables peut avoir un effet collatéral sur la diminution de l'amertume. C'est un argumentaire qui est fréquemment repris pour de nombreux produits œnologiques actuels.

## Conclusion

Par cette courte revue bibliographique nous avons vu que la perception de l'amertume était le résultat d'une chaine de réactions variées et complexes pour la transmission de l'information au cerveau et que des facteurs génétiques et environnementaux entraient en jeu pour expliquer une variabilité inter individuelle chez l'être humain. A cela, il faut ajouter la diversité importante des molécules susceptibles de déclencher un stimulus d'amertume. Si les composés responsables de l'amertume sont bien identifiés dans le cas de nombreux aliments, pour le vin le champ d'investigation reste encore très largement ouvert. En effet, pour celui-ci, son origine, la diversité des processus de vinification et sa composition chimique complexe rendent difficile la compréhension de l'amertume de cette boisson.

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# Acquisitions récentes sur l'amertume des vins rouges : contribution des composés libérés par le bois de chêne

**Axel Marchal, Blandine Cretin, Lauriane Sindt, Marine Gammacurta, Pierre Waffo-Téguo et Denis Dubourdieu**

Univ. Bordeaux, ISVV, EA 4577, Unité de recherche OENOLOGIE, F-33882 Villenave d'Ornon, France
INRA, ISVV, USC 1366 OENOLOGIE, F-33882 Villenave d'Ornon, France

## Introduction

Le vin est une matrice complexe, constituée de plusieurs milliers de composés dont une faible part seulement est connue. Certains d'entre eux possèdent des propriétés organoleptiques et sont responsables de l'arôme et du goût du vin. De nombreuses études ont permis de caractériser les molécules volatiles à l'origine des odeurs mais la connaissance des substances sapides du vin demeure plus incomplète. Or, le goût est le facteur prédominant influençant le choix des aliments. L'Homme peut percevoir et discriminer cinq saveurs : salé, acide, amer, sucré et umami. Cette perception des goûts a été un élément clé de sa survie. En effet, si la saveur sucrée est associée à une nourriture riche en nutriments et au goût agréable, les composés fortement amers sont souvent signes de toxicité ou de poison pour l'organisme (Chandrashekar et al., 2000). La perception amère constitue donc un rempart contre l'ingestion de molécules toxiques ou dangereuses pour l'organisme (Mueller et al., 2005). Néanmoins, l'amertume est une saveur fondamentale contribuant, avec le moelleux et l'acidité, à l'équilibre gustatif des vins rouges tel que l'a défini Emile Peynaud dans Le Goût du Vin (Peynaud, 1980). Son appréciation nécessite un apprentissage, ce qui en fait certainement la plus *culturelle* des saveurs. Dans les vins rouges, les déterminants moléculaires de la saveur amère proviennent en grande partie des raisins : ce sont les polyphénols, dont les propriétés organoleptiques varient considérablement en fonction de leur nature chimique. Toutefois, on observe empiriquement une modulation significative de la saveur amère des vins et des eaux-de-vie au cours de leur élevage. Ce phénomène s'explique par une libération de composés amers par le bois de chêne. Les ellagitannins ont depuis longtemps été considérés comme les principaux responsables de cette augmentation d'amertume, en dépit de l'absence de données quantitatives établissant clairement leur contribution. Une étude récente a établi leurs seuils de perception et démontré que ces tanins du chêne influençaient davantage l'astringence des vins que leur amertume (Glabasnia and Hofmann, 2006).

Les travaux présentés lors de cette journée scientifique visent à donner un éclairage moléculaire à la modification de la perception amère observée lors de l'élevage sous bois de chêne. Deux classes chimiques ont été particulièrement étudiées : les lignanes et les triterpènes. Les principaux composés de ces deux familles ont été isolés pour les caractériser chimiquement et sensoriellement. Leur implication dans les modifications gustatives consécutives à l'élevage sous bois de chêne a pu être évaluée.

## Etude de la diversité structurale et des propriétés organoleptiques des lignanes du chêne

Afin de rechercher de nouvelles molécules sapides, une démarche de fractionnement guidée par le goût a été mise en œuvre au sein de notre laboratoire. Diverses techniques séparatives ont été utilisées pour fractionner un extrait de bois de chêne (extractions liquide-liquide, chromatographie de partage centrifuge, chromatographie liquide haute performance). A l'issue de chaque fractionnement, une analyse sensorielle a permis de préciser la fraction la plus sapide, qui était conservée pour l'étape
# Acquisitions récentes sur l'amertume des vins rouges : contribution des composés libérés par le bois de chêne

**Axel Marchal, Blandine Cretin, Lauriane Sindt, Marine Gammacurta, Pierre Waffo-Téguo et Denis Dubourdieu**

Univ. Bordeaux, ISVV, EA 4577, Unité de recherche OENOLOGIE, F-33882 Villenave d'Ornon, France
INRA, ISVV, USC 1366 OENOLOGIE, F-33882 Villenave d'Ornon, France

## Introduction

Le vin est une matrice complexe, constituée de plusieurs milliers de composés dont une faible part seulement est connue. Certains d'entre eux possèdent des propriétés organoleptiques et sont responsables de l'arôme et du goût du vin. De nombreuses études ont permis de caractériser les molécules volatiles à l'origine des odeurs mais la connaissance des substances sapides du vin demeure plus incomplète. Or, le goût est le facteur prédominant influençant le choix des aliments. L'Homme peut percevoir et discriminer cinq saveurs : salé, acide, amer, sucré et umami. Cette perception des goûts a été un élément clé de sa survie. En effet, si la saveur sucrée est associée à une nourriture riche en nutriments et au goût agréable, les composés fortement amers sont souvent signes de toxicité ou de poison pour l'organisme (Chandrashekar et al., 2000). La perception amère constitue donc un rempart contre l'ingestion de molécules toxiques ou dangereuses pour l'organisme (Mueller et al., 2005). Néanmoins, l'amertume est une saveur fondamentale contribuant, avec le moelleux et l'acidité, à l'équilibre gustatif des vins rouges tel que l'a défini Emile Peynaud dans Le Goût du Vin (Peynaud, 1980). Son appréciation nécessite un apprentissage, ce qui en fait certainement la plus *culturelle* des saveurs. Dans les vins rouges, les déterminants moléculaires de la saveur amère proviennent en grande partie des raisins : ce sont les polyphénols, dont les propriétés organoleptiques varient considérablement en fonction de leur nature chimique. Toutefois, on observe empiriquement une modulation significative de la saveur amère des vins et des eaux-de-vie au cours de leur élevage. Ce phénomène s'explique par une libération de composés amers par le bois de chêne. Les ellagitannins ont depuis longtemps été considérés comme les principaux responsables de cette augmentation d'amertume, en dépit de l'absence de données quantitatives établissant clairement leur contribution. Une étude récente a établi leurs seuils de perception et démontré que ces tanins du chêne influençaient davantage l'astringence des vins que leur amertume (Glabasnia and Hofmann, 2006).

Les travaux présentés lors de cette journée scientifique visent à donner un éclairage moléculaire à la modification de la perception amère observée lors de l'élevage sous bois de chêne. Deux classes chimiques ont été particulièrement étudiées : les lignanes et les triterpènes. Les principaux composés de ces deux familles ont été isolés pour les caractériser chimiquement et sensoriellement. Leur implication dans les modifications gustatives consécutives à l'élevage sous bois de chêne a pu être évaluée.

## Etude de la diversité structurale et des propriétés organoleptiques des lignanes du chêne

Afin de rechercher de nouvelles molécules sapides, une démarche de fractionnement guidée par le goût a été mise en œuvre au sein de notre laboratoire. Diverses techniques séparatives ont été utilisées pour fractionner un extrait de bois de chêne (extractions liquide-liquide, chromatographie de partage centrifuge, chromatographie liquide haute performance). A l'issue de chaque fractionnement, une analyse sensorielle a permis de préciser la fraction la plus sapide, qui était conservée pour l'étape
ultérieure (Marchal et al., 2011). L'application de cette méthodologie a permis d'isoler un lignane, le lyonirésinol (Figure 1).

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 1. Structure chimique du lyonirésinol</figcaption></figure>

Ce composé avait déjà été identifié dans le bois de chêne (Nabeta et al., 1987) et observé dans les vins (Moutounet et al., 1989), mais ses propriétés gustatives n'avaient jamais été décrites. Sa dégustation a révélé une saveur amère, particulièrement intense dans un vin, blanc comme rouge. Son seuil de détection dans le vin a été calculé à 1,5 mg/L. Le développement d'une méthode de quantification par LC-HRMS a permis de doser ce lignane dans des vins élevés sous bois. La figure 2 présente les teneurs en lyonirésinol mesurées dans une verticale d'un même cru du Médoc.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 2. Concentration (en mg/L) en lyonirésinol mesurées dans différents millésimes d'un cru du Médoc. La barre rouge représente le seuil de détection</figcaption></figure>

Des teneurs en lyonirésinol supérieures au seuil de détection ont été observées dans tous les vins analysés. En outre, les concentrations mesurées dans les millésimes anciens, similaires à celles des plus récents, suggèrent que ce composé est stable dans le temps. Le lyonirésinol contribue donc de façon significative et durable à l'amertume des vins rouges élevés sous bois de chêne.

Or, ce lignane est présent dans le bois de chêne sous la forme de deux énantiomères, en mélange racémique. Afin de les caractériser, des dérivés xylosylés de ces deux énantiomères ont été isolés puis
ultérieure (Marchal et al., 2011). L'application de cette méthodologie a permis d'isoler un lignane, le lyonirésinol (Figure 1).

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 1. Structure chimique du lyonirésinol</figcaption></figure>

Ce composé avait déjà été identifié dans le bois de chêne (Nabeta et al., 1987) et observé dans les vins (Moutounet et al., 1989), mais ses propriétés gustatives n'avaient jamais été décrites. Sa dégustation a révélé une saveur amère, particulièrement intense dans un vin, blanc comme rouge. Son seuil de détection dans le vin a été calculé à 1,5 mg/L. Le développement d'une méthode de quantification par LC-HRMS a permis de doser ce lignane dans des vins élevés sous bois. La figure 2 présente les teneurs en lyonirésinol mesurées dans une verticale d'un même cru du Médoc.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 2. Concentration (en mg/L) en lyonirésinol mesurées dans différents millésimes d'un cru du Médoc. La barre rouge représente le seuil de détection</figcaption></figure>

Des teneurs en lyonirésinol supérieures au seuil de détection ont été observées dans tous les vins analysés. En outre, les concentrations mesurées dans les millésimes anciens, similaires à celles des plus récents, suggèrent que ce composé est stable dans le temps. Le lyonirésinol contribue donc de façon significative et durable à l'amertume des vins rouges élevés sous bois de chêne.

Or, ce lignane est présent dans le bois de chêne sous la forme de deux énantiomères, en mélange racémique. Afin de les caractériser, des dérivés xylosylés de ces deux énantiomères ont été isolés puis
hydrolysés. Une purification par HPLC préparative a permis d'obtenir chacun des composés énantiomériquement purs. Une collaboration avec le Dr Thierry Buffeteau, de l'Institut des Sciences Moléculaires de Bordeaux, a permis de déterminer la configuration absolue de chaque énantiomère. Les données expérimentales obtenues par dichroïsme circulaire vibrationnel ont été confrontées à des spectres théoriques résultant de calculs quantiques (Figure 3).

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 3. Structure chimique des deux énantiomères du lyonirésinol</figcaption></figure>

La caractérisation sensorielle des deux énantiomères a démontré que seul le (+)-lyonirésinol était amer (Cretin *et al.*, 2015). Son seuil de détection dans le vin est de 0,46 mg/L. Le développement d'une méthode de quantification énantiospécifique a montré que ses teneurs dans les vins élevés en barriques étaient supérieures à cette valeur. Ces résultats démontrent que le (+)-lyonirésinol concourt significativement à l'amertume des vins élevés sous bois de chêne (Cretin *et al.*, 2016).

Des molécules de structures proches peuvent présenter des propriétés gustatives similaires. Or, les lignanes constituent une famille chimique peu étudiée dans le vin. Des analogues structuraux du lyonirésinol ont été recherchés dans des extraits de bois de chêne pour tenter d'identifier de nouveaux marqueurs de l'amertume. A cette fin, un extrait de bois de chêne a été criblé par LC-HRMS pour rechercher les formules brutes associées à de potentiels dérivés du lyonirésinol. L'analyse des chromatogrammes d'ions extraits correspondant aux masses théoriques de ces dérivés a révélé la présence de 11 pics chromatographiques principaux, dont 8 correspondaient à des formules brutes différentes (3 séries de 2 isomères). Un protocole de purification guidé par LC-HRMS a été développé afin d'isoler ces composés en utilisant successivement la CPC et la HPLC préparative. Huit lignanes ont ainsi été isolés et identifiés (Figure 4). L'un d'entre eux (3) n'avait jamais été observé dans la nature jusqu'à présent tandis que quatre autres sont reportés pour la première fois dans le bois de chêne (Marchal *et al.*, 2015a).

Une analyse par LC-HRMS a confirmé la présence de ces lignanes dans des vins élevés en barriques, après plusieurs années de conservation en bouteille (Figure 5). Les propriétés sensorielles des composés purifiés ont également été établies ; quatre d'entre eux sont amers. Le lyonirésinol s'est révélé être à la fois le plus amer et le plus abondant des lignanes du bois de chêne (Figure 5).
hydrolysés. Une purification par HPLC préparative a permis d'obtenir chacun des composés énantiomériquement purs. Une collaboration avec le Dr Thierry Buffeteau, de l'Institut des Sciences Moléculaires de Bordeaux, a permis de déterminer la configuration absolue de chaque énantiomère. Les données expérimentales obtenues par dichroïsme circulaire vibrationnel ont été confrontées à des spectres théoriques résultant de calculs quantiques (Figure 3).

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 3.** Structure chimique des deux énantiomères du lyonirésinol</figcaption></figure>

La caractérisation sensorielle des deux énantiomères a démontré que seul le (+)-lyonirésinol était amer (Cretin *et al.*, 2015). Son seuil de détection dans le vin est de 0,46 mg/L. Le développement d'une méthode de quantification énantiospécifique a montré que ses teneurs dans les vins élevés en barriques étaient supérieures à cette valeur. Ces résultats démontrent que le (+)-lyonirésinol concourt significativement à l'amertume des vins élevés sous bois de chêne (Cretin *et al.*, 2016).

Des molécules de structures proches peuvent présenter des propriétés gustatives similaires. Or, les lignanes constituent une famille chimique peu étudiée dans le vin. Des analogues structuraux du lyonirésinol ont été recherchés dans des extraits de bois de chêne pour tenter d'identifier de nouveaux marqueurs de l'amertume. A cette fin, un extrait de bois de chêne a été criblé par LC-HRMS pour rechercher les formules brutes associées à de potentiels dérivés du lyonirésinol. L'analyse des chromatogrammes d'ions extraits correspondant aux masses théoriques de ces dérivés a révélé la présence de 11 pics chromatographiques principaux, dont 8 correspondaient à des formules brutes différentes (3 séries de 2 isomères). Un protocole de purification guidé par LC-HRMS a été développé afin d'isoler ces composés en utilisant successivement la CPC et la HPLC préparative. Huit lignanes ont ainsi été isolés et identifiés (Figure 4). L'un d'entre eux (3) n'avait jamais été observé dans la nature jusqu'à présent tandis que quatre autres sont reportés pour la première fois dans le bois de chêne (Marchal *et al.*, 2015a).

Une analyse par LC-HRMS a confirmé la présence de ces lignanes dans des vins élevés en barriques, après plusieurs années de conservation en bouteille (Figure 5). Les propriétés sensorielles des composés purifiés ont également été établies ; quatre d'entre eux sont amers. Le lyonirésinol s'est révélé être à la fois le plus amer et le plus abondant des lignanes du bois de chêne (Figure 5).
<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 4. Structure chimique des lignanes identifiés dans le bois de chêne</figcaption></figure>

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 5. Concentrations des différents lignanes dans le bois de chêne et dans un vin boisé (exprimées en équivalent de lyonirésinol)</figcaption></figure>

Ces travaux ont permis d'enrichir la connaissance des lignanes du chêne et d'identifier plusieurs molécules amères. Le lyonirésinol est l'un des déterminants moléculaires de l'amertume des vins élevés sous bois de chêne. L'étude de l'influence des paramètres de tonnellerie sur sa teneur est en cours et permettra de préciser les conditions de l'élevage modulant sa teneur dans les vins.
<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 4. Structure chimique des lignanes identifiés dans le bois de chêne</figcaption></figure>

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 5. Concentrations des différents lignanes dans le bois de chêne et dans un vin boisé (exprimées en équivalent de lyonirésinol)</figcaption></figure>

Ces travaux ont permis d'enrichir la connaissance des lignanes du chêne et d'identifier plusieurs molécules amères. Le lyonirésinol est l'un des déterminants moléculaires de l'amertume des vins élevés sous bois de chêne. L'étude de l'influence des paramètres de tonnellerie sur sa teneur est en cours et permettra de préciser les conditions de l'élevage modulant sa teneur dans les vins.
Les triterpènes du chêne : des composés sapides marqueurs de l'origine botanique

Les travaux entrepris sur la sucrosité des vins secs ont permis d'identifier deux triterpènes sucrés : les quercotriterpénosides I et II (Marchal et al., 2011). Des analogues structuraux ont été recherchés dans le bois de chêne par criblage en LC-HRMS. Au total, une quarantaine de molécules ont été isolées et caractérisées, dont 23 n'avaient jamais été identifiées précédemment et 12 autres jamais observées dans les vins (Marchal et al., 2015b). Les triterpènes du chêne peuvent être classés en deux catégories : certains, comme les QTT, possèdent des propriétés édulcorantes tandis que d'autres sont amers. C'est notamment le cas du dérivé glucosylé de l'acide bartogénique (Glu-AB), identifié par Arramon et al. (2002). Une méthode de dosage par LC-HRMS des composés majoritaires de chaque catégorie a été mise au point (Figure 6).

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 6. Structure chimique des QTT (sucrés) et du Glu-AB (amer)</figcaption></figure>

Afin d'étudier l'influence de l'espèce de chêne sur la concentration en triterpènes sapides du bois, 46 échantillons ont été prélevés dans 8 forêts françaises (Marchal et al., 2016). L'identification de l'espèce a été réalisée selon une méthode génétique développée par l'UMR BIOGECO (Guichoux et al., 2011; Guichoux et al., 2013). Pour chaque origine géographique, des échantillons ont été affectés aux deux espèces (27 de chêne sessile, 19 de chêne pédonculé). Ils ont été analysés par LC-HRMS pour quantifier les triterpènes.

Les quatre triterpènes ont été observés dans tous les échantillons, à des concentrations variant de quelques µg/g à plus d'un mg/g de bois. L'application d'un test de Kruskal-Wallis a montré des différences de concentrations significatives entre les espèces. Les teneurs moyennes en QTT étaient plus élevées dans les échantillons de chêne sessile que dans ceux de chêne pédonculé (Figure 7). A l'inverse, le chêne pédonculé contenait davantage de Glu-AB. Cette tendance était identique pour des échantillons provenant de la même forêt, suggérant que l'origine botanique du chêne influence davantage la composition triterpénique du bois que la provenance géographique. Pour chaque composé, une forte variabilité inter-individuelle a été observée au sein d'une même espèce. Une hétérogénéité similaire a été décrite pour la whisky-lactone, plus abondante dans le chêne sessile (Prida et al., 2007), ou encore les ellagitannins, plus présents dans le bois de chêne pédonculé (Masson et al., 1995; Prida et al., 2006).
Les triterpènes du chêne : des composés sapides marqueurs de l'origine botanique

Les travaux entrepris sur la sucrosité des vins secs ont permis d'identifier deux triterpènes sucrés : les quercotriterpénosides I et II (Marchal et al., 2011). Des analogues structuraux ont été recherchés dans le bois de chêne par criblage en LC-HRMS. Au total, une quarantaine de molécules ont été isolées et caractérisées, dont 23 n'avaient jamais été identifiées précédemment et 12 autres jamais observées dans les vins (Marchal et al., 2015b). Les triterpènes du chêne peuvent être classés en deux catégories : certains, comme les QTT, possèdent des propriétés édulcorantes tandis que d'autres sont amers. C'est notamment le cas du dérivé glucosylé de l'acide bartogénique (Glu-AB), identifié par Arramon et al. (2002). Une méthode de dosage par LC-HRMS des composés majoritaires de chaque catégorie a été mise au point (Figure 6).

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>Figure 6. Structure chimique des QTT (sucrés) et du Glu-AB (amer)</figcaption></figure>

Afin d'étudier l'influence de l'espèce de chêne sur la concentration en triterpènes sapides du bois, 46 échantillons ont été prélevés dans 8 forêts françaises (Marchal et al., 2016). L'identification de l'espèce a été réalisée selon une méthode génétique développée par l'UMR BIOGECO (Guichoux et al., 2011; Guichoux et al., 2013). Pour chaque origine géographique, des échantillons ont été affectés aux deux espèces (27 de chêne sessile, 19 de chêne pédonculé). Ils ont été analysés par LC-HRMS pour quantifier les triterpènes.

Les quatre triterpènes ont été observés dans tous les échantillons, à des concentrations variant de quelques µg/g à plus d'un mg/g de bois. L'application d'un test de Kruskal-Wallis a montré des différences de concentrations significatives entre les espèces. Les teneurs moyennes en QTT étaient plus élevées dans les échantillons de chêne sessile que dans ceux de chêne pédonculé (Figure 7). A l'inverse, le chêne pédonculé contenait davantage de Glu-AB. Cette tendance était identique pour des échantillons provenant de la même forêt, suggérant que l'origine botanique du chêne influence davantage la composition triterpénique du bois que la provenance géographique. Pour chaque composé, une forte variabilité inter-individuelle a été observée au sein d'une même espèce. Une hétérogénéité similaire a été décrite pour la whisky-lactone, plus abondante dans le chêne sessile (Prida et al., 2007), ou encore les ellagitannins, plus présents dans le bois de chêne pédonculé (Masson et al., 1995; Prida et al., 2006).
<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 7.** Concentrations moyennes en QTT I, II, III et en Glu-AB mesurées dans les échantillons de bois de chêne sessile et pédonculé. Les barres d'erreur indiquent les intervalles de confiance à 5 %.</figcaption></figure>

Ces résultats ont établi l'influence notable de l'espèce de chêne sur la présence en composés triterpéniques et suggéré ses conséquences sensorielles. Le chêne sessile est en effet plus riche en triterpènes sucrés (QTT) tandis que le chêne pédonculé contient davantage de triterpènes amers (Glu-AB). Un indice triterpénique, défini comme le logarithme du rapport des concentrations en QTT et en Glu-AB, a été calculé pour chaque échantillon. L'analyse des résultats a montré que cet indice permettait de discriminer l'espèce de chêne avec certitude. Il s'agit de la première méthode chimique d'identification de l'origine botanique du chêne ; elle peut être appliquée sur du bois frais, mais aussi séché et même chauffé.

Cette méthode a été utilisée pour mettre en place une expérimentation étudiant l'incidence de l'espèce de chêne utilisée pour la fabrication des barriques sur le goût du vin. Deux modalités ont été fabriquées : des barriques uniquement de chêne sessile et des barriques « mixtes », mêlant les deux espèces, comme on en rencontre dans les caves. Après mise en bouteille, une amertume significativement plus intense a été perçue dans les vins élevés en barriques « mixtes ». Ces travaux ont ainsi montré que le choix de l'espèce de chêne utilisée pour fabriquer les barriques avait une incidence sur le goût du vin, et en particulier sur son amertume.

Conclusion

La recherche des déterminants moléculaires de l'amertume conférée par l'élevage sous bois de chêne a conduit à l'identification de plusieurs lignanes et triterpènes. Certains de ces composés, libérés dans le vin à des teneurs variant en fonction des conditions de l'élevage, en modifient significativement le goût. L'amélioration de la connaissance de la composition du bois ouvre de nombreuses perspectives d'applications pratiques visant à une meilleure maîtrise de l'élevage et de ses conséquences organoleptiques.
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 7.** Concentrations moyennes en QTT I, II, III et en Glu-AB mesurées dans les échantillons de bois de chêne sessile et pédonculé. Les barres d'erreur indiquent les intervalles de confiance à 5 %.</figcaption></figure>

Ces résultats ont établi l'influence notable de l'espèce de chêne sur la présence en composés triterpéniques et suggéré ses conséquences sensorielles. Le chêne sessile est en effet plus riche en triterpènes sucrés (QTT) tandis que le chêne pédonculé contient davantage de triterpènes amers (Glu-AB). Un indice triterpénique, défini comme le logarithme du rapport des concentrations en QTT et en Glu-AB, a été calculé pour chaque échantillon. L'analyse des résultats a montré que cet indice permettait de discriminer l'espèce de chêne avec certitude. Il s'agit de la première méthode chimique d'identification de l'origine botanique du chêne ; elle peut être appliquée sur du bois frais, mais aussi séché et même chauffé.

Cette méthode a été utilisée pour mettre en place une expérimentation étudiant l'incidence de l'espèce de chêne utilisée pour la fabrication des barriques sur le goût du vin. Deux modalités ont été fabriquées : des barriques uniquement de chêne sessile et des barriques « mixtes », mêlant les deux espèces, comme on en rencontre dans les caves. Après mise en bouteille, une amertume significativement plus intense a été perçue dans les vins élevés en barriques « mixtes ». Ces travaux ont ainsi montré que le choix de l'espèce de chêne utilisée pour fabriquer les barriques avait une incidence sur le goût du vin, et en particulier sur son amertume.

Conclusion

La recherche des déterminants moléculaires de l'amertume conférée par l'élevage sous bois de chêne a conduit à l'identification de plusieurs lignanes et triterpènes. Certains de ces composés, libérés dans le vin à des teneurs variant en fonction des conditions de l'élevage, en modifient significativement le goût. L'amélioration de la connaissance de la composition du bois ouvre de nombreuses perspectives d'applications pratiques visant à une meilleure maîtrise de l'élevage et de ses conséquences organoleptiques.
Références

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Marchal A, Génin E, Waffo-Téguo P, Bibès A, Da Costa G, Mérillon J-M, Dubourdieu D (2015b) Development of an analytical methodology using Fourier transform mass spectrometry to discover new structural analogs of wine natural sweeteners. Anal Chim Acta 853:425-434. doi: 10.1016/j.aca.2014.10.039

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Marchal A, Waffo-Téguo P, Génin E, Mérillon JM, Dubourdieu D (2011) Identification of new natural sweet compounds in wine using centrifugal partition chromatography-gustatometry and Fourier transform mass spectrometry. Anal Chem 83:9629-9637

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