<figure><img src="image_101.png" /><figcaption>**Figure 4.** Effect of 5-25 µM E4-GGYC injection on the thickness *d* (a), refractive index *n* (b) and concentration of phospholipids *Cp* (c) of the immobilized liposome layer at pH 4.5, before and after the washing step in PBS, pH 4.5.</figcaption></figure>

Figures 4.a shows that the liposome layer thickness increases from 83.3 nm to 93.7 nm upon addition of the peptide at pH 4.5 (data reported in Table 3). This progressive increase in thickness is accompanied by a decrease in the refractive index (*n*) from 1.34997 to 1.33886 (refractive index of the layer after 25 µM peptide injection) as shown in Figure 4b.

The angular shift in SPR peak minimum of an optically homogeneous layer according to the well-established Jung model³⁵ is proportional to *d* and *n* via equation 3.

$$ \Delta\theta_{SPR} = S(n_L - n_b)[1 - e^{(-\frac{d}{\delta})}] \quad (3) $$

where *S* is the sensitivity factor per refractive index unit (deg), *n*<sub>b</sub> and *n*<sub>L</sub> are the bulk and layer refractive indices respectively, *δ* is the decay length of the intensity of the evanescent electric field and *d* is the thickness of the layer.

On the basis of this equation, it is clear from the simulated curves that the SPR response was mainly induced by the variation of the layer thickness (*d*). The multiple parameters extracted from simulated fits of the full SPR angular spectra measured in real-time during peptide-liposome interactions provide a means to explain the origin of the SPR response.
Thanks to the theoretical calculation, we were able to estimate the concentration of
phospholipids (Cp) in the initial liposome layer as well as its variation due to E4-GGYC
injection (Figure 4.c). This calculation was achieved in order to better understand the peptide
effect on the liposome layer. The concentration of phospholipids in the initial liposome layer
(before peptide injection) was calculated using equation (S5) provided by Feijter's formula. The
resulting phospholipid concentration in the liposome layer after each peptide injection was
calculated by considering that the increase in calculated thickness d was an increase in volume
of the liposome layer, and thus a change in phospholipid concentration. The Cp values
calculated after the injection of 5–25 µM peptide using equation (S6) are presented in Table 3.
Hence, Cp was estimated at 0.08925 g/cm³ for the initial liposome layer. The concentration
decreased in the presence of peptide, down to Cp ~ 0.07936 g/cm³ at 25 µM peptide injection.
Thus, we could hypothesize that during the injection of 5–25 µM peptide at pH 4.5, it penetrates
the liposome membrane, probably causing the formation of pores in the membrane as described
in the literature,⁶ followed by the swelling of the liposomes by buffer flux. This leads on the
one hand to an increase in the thickness due to the swelling and on the other hand, to a decrease
in the refractive index of the layer induced by a larger volume of buffer inside the liposomes,
which also explains the decrease in phospholipid concentration. Upon switching the medium to
buffer (washing step), the calculated values of thickness, refractive index as well as
phospholipid concentration proved that the swelling stopped and the peptide desorbed. The
calculated values suggested a partial deflation of the liposome layer without perfectly returning
to the initial values of the native layer.

In our case, we were unable to confirm the complete reversibility of the peptide insertion into
the membrane as was previously shown by Longo *et al.* ³⁶⁻³⁷ and Zhelev *et al.* ⁶ Longo *et al.*
showed that the Influenza fusion peptide (wt-20 HA2 peptide) rapidly inserts in the membrane
at low pH and that insertion was mainly reversed by rinsing the membrane with buffer. Zhelev
et al. studied the interaction of the HA2 peptide analog (AcE4K) with phosphatidylcholine liposomes and proved that the binding of the peptide increases as the pH decreases to pH 4.5, and the insertion proved to be reversible. They also observed that the peptide insertion in the lipidic membrane does not affect the membrane permeability for water, which shows that the peptide at concentrations ≤ 10 µM does not substantially perturb the packing of the hydrocarbon region. However, the ability of the membrane to retain solutes in the presence of peptide proved to be compromised, suggesting that the inserted peptide promotes the formation of short-lived pores. This point was confirmed by our theoretical calculations when the refractive index n of the liposome layer decreased following the injection of 5–25 µM peptides at pH 4.5. We suggested that nanopores created by peptides upon insertion into the lipidic membrane facilitate the flux of buffer, which decreases the calculated concentration of phospholipids.

**Kinetics of peptide interaction with liposomes at pH 4.5.** The sensorgrams resulting from the E4-GGYC/liposome interactions at pH 4.5 were analyzed through Trace Drawer™ software to perform a kinetic study of the interactions. The fitting model adopted was the simple Langmuir binding, “one-to-one” reaction model (equation S3). The sensorgrams obtained at 5–25 µM peptide concentrations were fitted simultaneously to calculate the equilibrium dissociation constant (K_D). The binding mechanism described by this model is that of the peptide (P), which represents the analyte in solution, inserted in the immobilized liposome (L) as a ligand. During the process, the association (k_a) and dissociation (k_d) rate constants control the formation of the complex (PL) at the surface, as shown in equation 4.

$$P + L \rightleftharpoons PL \qquad (4)$$

Figure S8.a represents the overlay between experimental sensorgrams and fitted curves, while in Figure S8.b, the fitting residual values after subtraction from the experimental sensorgrams are shown. Satisfactory fits were obtained using the one-to-one binding model. The kinetic parameters obtained from the fitting are reported in Table 4. The peptide was inserted in the
liposome membrane with a $K_D$ of $4.5 \times 10^{-7}$ M. This result was in good agreement with the $K_D$ calculated by Rafalski *et al.* from fluorescence measurements of HA2 peptide binding to liposome vesicles ($K_D \sim 8 \times 10^{-7}$ M).¹

<table><caption>**Table 4.** Kinetic parameters obtained from the fitting of the MP-SPR sensorgrams of E4-GGYC/liposome interaction.</caption><thead><tr><th></th><th>$k_a$ (10<sup>5</sup>)(1/M × s)</th><th>$k_d$ (10<sup>-1</sup>)(1/s)</th><th>$K_D$ (10<sup>-7</sup>)(M)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Peptide</td><td>2.820 ± 0.005</td><td>1.23000±0.00006</td><td>4.50 ± 0.03</td></tr></tbody></table>

**Effect of pH on peptide-lipid membrane interaction.** We also studied the SPR response induced by the injection of peptide solutions at basic pH. Figure 5 shows the superimposed sensorgrams for 5-25 µM E4-GGYC injections at pH 4.5 and pH 8.

<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>**Figure 5.** Superimposed sensorgrams of 5-25 µM E4-GGYC injections at pH 4.5 and pH 8 on the liposome-coated surface.</figcaption></figure>

Sensorgrams revealed two different SPR responses, probably resulting from a different mechanism of interaction at both pHs. As a control, a study carried out in PBS at pH 4.5 and
pH 8 confirmed that the SPR signal of the liposome-functionalized surface was stable upon pH variation.

Different binding kinetics in both association and dissociation rates were observed at pH 4.5 compared to pH 8. As shown, the same peptide concentrations injected at pH 8 led to a slow decrease in the signals regardless of the concentration used. The interaction kinetics were much slower than those observed at pH 4.5, and did not reach a stable signal within the injection time of 4 min. However, when the liposomes were rinsed with PBS (pH 8), the SPR angle started to increase again and about 4 min were required to reach the baseline.

Shifts in SPR signals were clearly concentration dependent for the peptide at pH 4.5, but not for pH 8, for which the variations in the SPR angles were similar for all concentrations tested.

These results indicate that E4-GGYC has different modes of interaction with liposomes when moving from acidic to basic pH.

The negative shift in the SPR angle probably originates from morphological changes in the liposome monolayer. This suggests that injected peptide at basic pH probably induces a contraction of the liposomes accompanied by a return to their initial shape after rinsing. A similar behavior was shown by the studies of Viitala *et al.* ²⁶ Cuerrier *et al.* ³⁸ and Chabot *et al.* ³⁹ Viitala *et al.* reported from MP-SPR studies that the simulation of MDCKII cells with the D-mannitol and propranolol drugs resulted in a negative shift in the angular position of the SPR peak minimum during cell stimulation and this was induced by the contraction of the cells.

Cuerrier *et al.* and Chabot *et al.* showed that morphological changes in cells, i.e. contraction of cells, induced a negative SPR shift in the reflection intensity measured at a fixed angle. The studies carried out by MP-SPR at pH 8 do not allow us to conclude on the absence of interaction between E4-GGYC and liposome in this buffer. It will therefore be interesting to relate these studies to the results obtained by DLS and NTA to clearly conclude on the pH-dependence of the E4-GGYC/liposome interaction.
**Peptide effect on liposome size in solution.** The size and the polydispersity index (PdI) of liposomes represent pertinent parameters for their characterization.⁴⁰ These parameters can provide information on their stability and, as such, can allow a qualitative assessment of their interaction with E4-GGYC in our study. Thus, synthesized liposomes were suspended in PBS at pH 4.5 and pH 8 and hydrodynamic diameters of 98 nm and 99.6 nm were recorded by DLS, respectively. These solutions were then incubated for 30 min at room temperature with increasing concentrations of E4-GGYC (from 0.5 to 10 µM) in PBS at both pHs. The evolution of the hydrodynamic diameter and the polydispersity index (PdI) of the liposomes was then controlled by DLS and Nanosight (NTA) techniques (Figure 6). The results clearly demonstrated that increasing concentrations of E4-GGYC in PBS at pH 4.5 induced a rise in liposome size, whereas the *Pdl* remained relatively low. This strongly suggested that 0.5–10 µM peptide didn’t induce any liposome aggregation, or destruction. On the other hand, increasing concentrations of peptide from 0.5 to 10 µM in PBS at pH 8 did not promote any significant change in liposome size, as hydrodynamic diameters and *Pdl* values remained almost stable. Nanoparticle-Tracking Analysis (NTA) experiments by NanoSight revealed the same behavior. The size of the liposomes measured by NTA increased as a function of peptide concentrations, between 0.5 and 10 µM at pH 4.5, without reaching a plateau as observed by DLS. The difference in size between the two pH values was smaller by NTA measurements. It is known that the DLS measurement of the average hydrodynamic diameter is more impacted by the presence of aggregates, in a very small amount, than the NTA measurement.⁴¹ Nevertheless, both techniques confirmed the results obtained by MP-SPR and showed the different behavior of E4-GGYC towards liposomes at pH 4.5 and pH 8.
<figure><img src="image_103.png" /></figure>

<figure><img src="image_104.png" /></figure>

<figure><img src="image_105.png" /><figcaption>**Figure 6.** Effects of liposome incubation with increasing concentrations of E4-GGYC in PBS pH 4.5 and pH 8 on hydrodynamic diameter measured by DLS (a), NTA (b) and Polydispersity index (PdI) by DLS (c).</figcaption></figure>

For the study, we were not able to increase the peptide concentration beyond 10 µM. Aggregates between peptides and liposomes were observed, which prevented us from obtaining interpretable data. This observation was in agreement with results reported by Zhelev *et al.*, who also described an aggregation of a similar peptide (AcE4K) at a concentration ≥ 10 µM and under pH < 6, in the presence of liposomes in solution. Whereas the aggregation of peptide
was not observed by light scattering at 10 µM of a pure peptide solution, it precipitated from
the solution only in the presence of liposomes when the pH was below 6.⁶

By these results, we confirmed the swelling process of liposomes at pH 4.5 by DLS and NTA,
up to 10 µM of peptide in solution. For higher concentrations of peptide, peptide-liposome
conjugates started to aggregate and precipitated, disturbing the DLS and NTA measurements,
but not the MP-SPR response monitored on liposome-functionalized substrates. In the
literature, the liposome swelling in a solution of 10 µM HA2 peptide was described by Zhelev
et al. Similarly to our DLS results, they also confirmed that the peptide-liposome conjugates
deteriorated with time in peptide solutions at concentration ≥ 10 µM. The authors then
concluded that the lipid membrane was broken by a possible fusion process. Thanks to our
results obtained by MP-SPR, we were able to monitor the peptide/liposome interaction up to
25µM peptide, showing a partial reversibility of the binding without disruption of the liposome
layer.

**Disruption assays of the supported liposome layer.** In an attempt to destroy the liposome layer, we carried out the experiment with increasing peptide concentrations up to 100 µM. Figure 7.a shows the full real-time sensorgrams of the main SPR peak angular position for 50, 75 and 100 µM E4-GGYC at pH 4.5. With regard to the MP-SPR results, we were able to conclude that the interaction of E4-GGYC at pH 4.5 with the lipid layer up to 100 µM did not induce any perturbation of the membrane leading to the disruption of the liposomes. Indeed, we did not observe a drop in the SPR signal that could correspond to this degradation.

<figure><img src="image_106.png" /></figure>
<figure><img src="image_107.png" /><figcaption>**Figure 7.** The full sensorgram (a) and the superimposed sensorgrams (b) measured at a wavelength of 670 nm, during the interaction 50-100µM E4-GGYC at pH 4.5 on immobilized liposomes.</figcaption></figure>

Compared to Figure 2, the sensorgram in Figure 7.b revealed that E4-GGYC at acidic pH and at a concentration higher than 25 µM bound differently to the liposome surface. Here, the initial peptide/liposome association mechanism was also rapid. But after that, the signal slowly decreased over time until the end of the peptide injection without reaching a steady state. Upon switching to PBS pH 4.5, a rapid drop in SPR signal to the baseline was recorded. Between small and high concentrations, we noticed that there was a probable transition in the mode of action of the peptide with the layer of liposomes. This observation was consistent with the shape of the sensorgram, showing a plateau of the signal during injection of 5-25 µM peptide (Figure 2), whereas a steady state was not observed during injection of 50-100µM peptide (Figure 7.b).

This allows us to hypothesize that the peptide concentration of 25 µM was a critical concentration to saturate the membrane of the liposome layer. At 50-100 µM, the peptide first inserted into liposomes until saturation, then the excess peptide continued to adsorb onto the surface of the lipid layer, again causing an increase in the SPR signal related to peptide concentration.

Once a maximum amount of peptide was inserted and saturated the liposome membrane, the vesicular structure of the liposome was not destroyed. These results suggested that the insertion
of E4-GGYC at pH 4.5 into the lipid bilayer increased the robustness of the liposome membrane. This point was experimentally investigated in the following experiment.

The stability of the lipidic membrane and its robustness were studied after the injection of 25 µM E4-GGYC on a liposome-functionalized chip. In a previous work, the rupture of liposomes by interaction with mono-rhamnolipid (mono-RL), a biosurfactant, was proven by MP-SPR.¹⁹ Here, a solution of mono-RL was injected onto the liposome layer after the injection of peptide at pH 4.5, and in parallel onto a peptide-free liposome layer as a reference (Figure 8). The protocol was applied as described in the experimental part, i.e.: step (1) preparation of a liposome-functionalized substrate in PBS at pH 4.5, step (2) injection of 25 µM E4-GGYC in PBS at pH 4.5 (red curve), and in parallel, injection of PBS at pH 4.5 (blue curve), step (3) injection of mono-RL at a concentration of 50 µg/mL in the same phosphate buffer.

<figure><img src="image_108.png" /></figure>
**Figure 8.** Sensorgrams measured in PBS pH 4.5 and at 670 nm wavelength during mono-RL injection at a concentration of 50 µg/mL on a pure liposome layer (CH1) and on a liposome layer saturated with 25 µM of E4-GGYC peptide at pH 4.5 (CH2).

During E4-GGYC injection (Figure 8, red curve), we observed a progressive increase in the SPR angle, followed by a stabilization of the signal to a plateau. This variation was characteristic of peptide insertion into the lipid membrane. The subsequent step was the injection of mono-RL in order to study its interaction with the lipidic membrane. The addition of mono-RL led to a further increase in the SPR angle. Thus, the positive change in SPR angle was proportional to the amount of mono-RL deposited on the surface. By contrast, injection of mono-RL onto the peptide-free liposome layer resulted in a significant drop of the SPR signal, showing that mono-RL interacted with liposomes, and started to destroy them. The disruption of tethered liposomes by mono-RL has already been described by our group.¹⁹ We reported that the liposome layer immobilized on a support could be disrupted and restructured with loss of phospholipid material by the action of mono-RL. A clear drop in the SPR signal was observed and optical parameters (d and n) calculated by MP-SPR confirmed the formation of the phospholipid bilayer after complete degradation.¹⁹ Likewise, Bombard *et al*. described the disruption of a liposome-supported surface by an amphiphilic peptide (AH peptide from the Hepatitis C virus) using Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRi) and BALM technique. They recorded an increase in SPRi signal (reflectivity) just after injection of the fusogenic peptide onto the liposome layer, indicating liposome swelling, and afterwards a remarkable signal drop, reflecting lipid material loss and liposome disruption.

Our results confirmed that the presence of E4-GGYC inserted in the double lipid layer of liposomes inhibited mono-RL-triggered disruption by enhancing membrane robustness. In the literature, a number of studies have shown that the HA2 peptide intercalates in the outer leaflet
of the lipid bilayer, increasing the ordering in the head groups of this layer, and thus increasing
its robustness. ⁴²⁻⁴⁴ Furthermore, studies revealed that the peptide does not cross the double
phospholipid layer and remains positioned in the outer part of the membrane.⁴³ It has been
described that the coupling between the hardened outer leaflet due to peptide insertion and the
softer inner leaflet generates bending stresses in the bilayer. The authors suggested that these
stresses may initiate the membrane fusion. In our case, the results obtained by SPR on a layer
of supported liposomes did not allow us to observe the fusion mechanism up to 100µM peptide
in solution.

CONCLUSION

The interaction of E4-GGYC, an analog of HA2 peptide of Influenza virus hemagglutinin, with a biomimetic surface formed with liposomes grafted on a gold substrate was studied by the MP-SPR method. A biotin/streptavidin binding strategy was developed to create a stable layer of liposomes with high coverage, as characterized by AFM. The SPR signal variation clearly illustrated the strong binding of the biotinylated liposomes to the streptavidin-functionalized surface with a calculated K_D of 9.44 10<sup>-12</sup> M. We demonstrated the capacity of the MP-SPR technique to characterize the variation of the liposome layer morphology upon injection of E4-GGYC at pH 4.5 and pH 8 and we revealed different interaction mechanisms. At pH 4.5, the peptide first inserted into the liposome membrane to saturation, and then adsorbed on the surface at high concentration, whereas the interaction mechanism did not follow the same mechanism at pH 8. The negative shift in the SPR angle observed upon peptide injection at pH 8 probably originated from morphological changes in the liposome layer. The binding sensorgrams of 5-25 µM peptide with the liposome layer at pH 4.5 were fitted to calculate an equilibrium dissociation constant K_D of 4.50 10<sup>-7</sup> M. In our study, MP-SPR studies showed that liposomes swelled in the presence of peptides in the circulating solution at pH 4.5. This
assumption was proven theoretically by calculating the thickness (d) and refractive index (n) of
the liposome layer by the SPR Navi LayerSolver™ software. This pH-dependent swelling was
confirmed in solution by Dynamic Light Scattering (DLS) and a NanoSight Nanoparticle-
Tracking Analysis (NTA). High concentrations of peptide up to 100 µM did not break down
the structure of the liposomes grafted on the surface. Our studies also revealed that peptide
insertion increased the robustness of the lipid membrane. The well-known disruption
mechanism by mono-rhamnolipids did not occur after peptide insertion into the liposome
membrane. As a further conclusion, MP-SPR analyses of E4-GGYC peptide interaction with
immobilized liposomes did not allow us to observe the fusion mechanism up to 100µM peptide
in solution. In view of the studies presented here, we believe that our MP-SPR approach on
liposomes immobilized on solid substrates can provide real-time complementary information
for a better mechanistic understanding of biomolecule/lipid membrane interaction.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors would like to thank the Tunisian government for financial support of Meryem
Belkilani's PhD thesis. The authors also acknowledge Silvia BREUSA (University of Claude
Bernard Lyon 1) for the NTA measurement.

SUPPORTING INFORMATION

Error calculation (section 1), E4-GGYC characterization by HPLC (section 2), SPR analysis of liposome immobilization on functionalized surfaces (section 3), passivation of the streptavidin-functionalized surface (section 4), SPR curve modeling before and after liposome injection (section 5), gold surface characterization by AFM (section 6), calculation of the phospholipid concentration in the liposome layer (section 7), fitting and subtraction of the fitted curves of peptide/liposome interaction (section 8)
ABBREVIATIONS

MP-SPR, Multi-parametric surface plasmon resonance; MUA, 11-mercaptoundecanoic acid;
PBS, phosphate buffered saline; DLS, Dynamic Light Scattering; PdI, polydispersity index;
SAM, self-assembled monolayers; SD, standard deviation; θSPR, SPR angular peak minimum,
Mono-RL, mono-rhamnolipid.

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# Supporting Information

## Mechanisms of influenza virus HA2 peptide interaction with liposomes studied by dual-wavelength MP-SPR

Meryem Belkilani, †‡§ Carole Farre, † Yves Chevalier, # Sylvain Minot, †

François Bessueille, † Adnane Abdelghani, § Nicole Jaffrezic-Renault, †

Carole Chaix†*

### 1. Error parameter calculation

Error values of the parameters obtained with three independent measurements were calculated as standard error of the mean (sem), defined as :

$$sem = \frac{s}{\sqrt{N}} \qquad (S1)$$

where N is the number of experiments and s is the standard deviation.

### 2. E4-GGYC peptide characterization

<figure><img src="image_109.png" /></figure>
**Figure S1** : RP HPLC analysis of E4-GGYC peptide. Gradient : from 5 to 100 % AcCN in 0.1% formic acid in 7 min and 100% AcCN in 0.1% formic acid during 1min, flow 0.3 mL/min.

**3. Liposome immobilization**

After a thorough cleaning and functionalization of the SPR gold chip with amino SAM, alkyl
SAM, acidic SAM and streptavidin, a continuous flow (50 µL/min) of 0.15 M NaCl solution
was first injected for approximately 20 min until the SPR sensorgram signal was stabilized in
order to accurately measure changes in the optical parameters during manipulation. Afterwards,
the freshly prepared solutions of liposomes in a concentration range from 1×10¹¹ to 5×10¹²
lipo/mL in 0.15 M NaCl solution (corresponding to 1.5×10⁻⁵ to 6×10⁻⁴ M HSPC+DSPE-PEG
phospholipid content), which cover the concentration range usually used in analytical
applications, were consecutively injected for 4 min at a flow rate of 50 µL/min to interact with
the four modified surfaces. Each injection was followed by a 4 min washing step in 0.15 M
NaCl solution to remove all loosely bound liposomes. Then, the surface was cleaned and
regenerated by a 4 min injection of Triton X-100 (1 %) in 0.15 M NaCl solution at a flow rate
of 50 µL/min. Since the biotinylated liposomes interact with the streptavidin protein through
strong interactions, regeneration of the streptavidin surface was not possible without removing
the streptavidin layer. Thus, in this case, the experimental set-up consisted in cumulative
injections of liposomes (4 min) on the streptavidin-functionalized SPR substrate, followed by
4 min washing in 0.15 M NaCl solution. The resulting sensograms were extracted with MP-
SPR Navi Data viewer and analyzed through Trace Drawer™ software.

Figures S2a-c illustrate the real-time SPR responses of the surfaces functionalized with alkyl SAM, acidic SAM and amino SAM, respectively, against different concentrations of liposomes.
<figure><img src="image_110.png" /></figure>

**Figure S2.** SPR sensorgrams (peak angular position versus time), extracted with MP-SPR Navi Data viewer, of the interaction of (a) –CH3 surface, (b) –COOH surface and (c) -NH2 surfaces with 1×10¹¹, 2×10¹¹, 1×10¹², 2×10¹² and 5×10¹² lipo/mL biotinylated liposomes. Light source at 670 nm.
The binding curves of the three surfaces were fitted to the ‘Affinity’ model following equation S2 through Trace Drawer™ software and shown in Figure S3:

$$Y = \frac{B_{max} \times C}{C + K_{D}} \qquad (S2)$$

Where Y is the recorded signal (deg), C is the concentration of the ligand (concentration of phospholipids in mol/L), K_D (M) is the equilibrium dissociation constant and B_max (deg) represents the maximum signal, dependent on the number of receptors.

<figure><img src="image_111.png" /><figcaption>**Figure S3.** Fitted curves of resonance peak angular shifts (Δθ<sub>SPR</sub>) in SPR measurement at 670nm vs phospholipid concentration (M) by the ‘Affinity’ fitting model with Trace Drawer™ software, for liposome injection on –CH3 (1-dodecanethiol), –COOH (11-mercaptoundecanoic acid) and –NH2 (11-amino-1-undecanethiol)-modified SPR gold surfaces.</figcaption></figure>

Figure S4 shows the overlay of the SPR sensorgram of biotinylated liposome interaction with streptavidin surface and the best fitted theoretical sensorgram.
<figure><img src="image_112.png" /><figcaption>**Figure S4.** Sensorgrams (solid lines) and fitted curves (dashed lines) of biotinylated liposomes interacting with streptavidin-functionalized SPR gold chip (light source at 670 nm).</figcaption></figure>

The “OneToOne” model gave the best fit to the experiments for liposome interaction study on the streptavidin surface. Equation S3 was considered to estimate the binding constants.

$$ \frac{dY(t)}{dt} = (k_a \times C - k_d) \times Y(t) \qquad (S3) $$

where $Y(t)$ is the recorded signal ($Y(0) = 0$), $C$ is the ligand (liposome) concentration in the bulk liquid, $t$ is the time in seconds, $k_a$ [1/M × s] is the association rate constant and $k_d$ [1/s] the dissociation rate constant. Calculation of the binding kinetic parameters is necessary to estimate the binding affinity constant. The equilibrium dissociation constant $K_D$ is defined as in equation S4.

$$ K_D = \frac{k_d}{k_a} \qquad (S4) $$

$K_D$ values of the interaction of liposomes with the -CH3, -COOH, -NH2 and streptavidin-functionalized surfaces were calculated and displayed in Table 2.
4. Passivation step of the streptavidin-functionalized surface

<figure><img src="image_113.png" /></figure>

**Figure S5.** Negative controls without liposomes for studying the non specific interaction of E4-GGYC peptide with the streptavidin layer after passivation with three different molecules. (1) overlaid signals after passivation with either lysine, TRIS or DMAP, (2) Injection of 10 µM of E4-GGYC in PBS pH4.5 on each surface for 4 min at a flow rate of 50 µL/min.

E4-GGYC bound significantly to the surface passivated with lysine (blue curve) and 3-dimethylaminopropylamine (green curve), but no significant interaction occurred with the surface passivated with the tris(hydroxymethyl)aminomethane (red curve). After interaction, (3) injections were followed by a washing step in PBS buffer pH4.5.
5. Full SPR angular spectra of the streptavidin-functionalized surface and the liposome-supported surface

<figure><img src="image_114.png" /><figcaption>**Figure S6.** SPR modeling of streptavidin and liposome layers using the measured full SPR angular spectra at the 670 nm wavelength. SPR peak angular position shift for measured and modeled phases, from streptavidin layer (green line) to immobilized liposome layer (blue line) in (a) PBS pH4.5 and (b) PBS pH8.</figcaption></figure>
## 6. AFM characterization of the gold surface

<figure><img src="image_115.png" /><figcaption>**Figure S7.** AFM topographic images of the gold substrate.</figcaption></figure>

## 7. Calculation of the phospholipid concentration $C_p$ in the liposome layer

Based on the De Feijter formula,¹ the refractive index ($n_L$) of the adsorbed layer is proportional to its concentration. In our case, the concentration of the initial adsorbed liposome layer is the concentration of phospholipids $C_{p1}$.

$$n_L = n_{PBS} + \frac{dn}{dc} \times C_{p1}$$

$$C_{p1} = \frac{n_L - n_{PBS}}{dn/dc} \quad (S5)$$

where $n_L$ is the refractive index of the corresponding layer L, $n_{PBS}$ is the refractive index of the PBS buffer at pH4.5, and $dn/dc$ is the refractive index increment of the dispersion of liposomes. $dn/dc$ was determined experimentally from the slope of the linear variation of the refractive index as a function of liposome concentrations. The obtained value was $dn/dc \approx 0.134 \text{ cm}^3/\text{g}$.

The concentration of phospholipids $C_{p2}$ in the liposome layer after the injection of 5–25 µM peptide was calculated as follows, considering that the increase in calculated thickness $d$ was an increase in volume of the liposome layer:
$$ \frac{d_2}{d_1} = \frac{V_2}{V_1} = \frac{C_{p1}}{C_{p2}} \Leftrightarrow C_{p2} = \frac{d_1 \times C_{p1}}{d_2} \quad (S6) $$

Where $d_1$ is the calculated thickness of the initial liposome layer, $V_1$ is the volume of the initial liposome layer, $C_{p1}$ is the concentration of phospholipids in the initial adsorbed liposomes, $d_2$ is the calculated thickness of the liposome layer after 5–25 µM peptide injection, $V_2$ is the volume of the liposome layer after 5–25 µM peptide injection and $C_{p2}$ is the concentration of phospholipids in the liposome layer after 5–25 µM peptide injection.

## 8. Fitted and residual curves of peptide/liposome interaction by Trace Drawer™ software

<figure><img src="image_116.png" /></figure>

<figure><img src="image_117.png" /></figure>
**Figure S8.** (a) MP-SPR sensorgrams (bold lines) and fitted curves (dashed lines) of 5–25 µM E4-GGYC peptide interacting with immobilized liposomes at pH 4.5. (b) Residual SPR angular response from subtraction of the fitted curves to the experimental sensorgrams.

REFERENCES

(1) Chattoraj, D. K.; Birdi, K. S. *Adsorption and the Gibbs surface excess*, 1st ed.; Springer: Boston, 1984.
## IV. Etude de l'interaction du peptide BK avec une membrane modèle

Cette partie est décrite dans ce chapitre comme une étude mécanistique complémentaire de la première étude avec le peptide HA2. Nous avons réalisé cette étude afin de mettre en évidence d'autres types d'interaction biomoléculaire avec la même membrane biomimétique déjà utilisée pour faire interagir le peptide HA2, et de prouver l'efficacité de la technique MP-SPR dans la caractérisation d'autres phénomènes d'interaction avec la membrane.

Cette étude est en cours de développement et elle fera l'objet d'une 3ème publication.

### IV.1. Analyse de l'interaction peptide BK/liposome par MP-SPR

Après avoir formé une couche de liposomes stable sur la surface de streptavidine dans les deux tampons PBS à pH 4 et à pH 7, nous avons étudié l'interaction du peptide BK en enregistrant la variation de l'angle SPR en fonction du temps. Pour cette étude, des solutions de peptide BK de concentrations croissantes dans le PBS à pH 7 ou à pH 4 ont été injectées chacune sur une couche de liposomes purs pendant 15 min, à un débit constant de 12 µL/min. Chaque injection a été suivie par une étape de lavage à un débit constant de 50 µL/min pendant une période de 30 min. L'étude à pH 4 a été réalisée avec de fortes concentrations 50-100 µM comme étude supplémentaire pour montrer le rôle du pH sur le comportement du peptide BK vis-à-vis de la membrane modèle.

Les Figures 15.a et 15.b montrent respectivement les sensorgrammes superposés obtenus suite à l'interaction du peptide BK à différentes concentrations dans le PBS à pH 7 et à pH 4 avec la couche de liposomes. Ces sensorgrammes montrent que l'interaction du peptide induit une augmentation du signal SPR dépendante de la concentration. L'inspection initiale de la forme de chaque sensorgramme révèle des cinétiques de liaison comparable, avec une similarité significative dans les taux d'association et de dissociation. En particulier, les variations des signaux SPR sont apparues clairement indépendantes du pH du milieu d'étude. Ceci nous permet de constater que le peptide BK dans les deux pHs se lie de manière semblable aux surfaces de la couche de liposomes, ce qui résulte probablement des mêmes modes d'interaction avec les liposomes lors du passage du pH physiologique au pH acide.
<figure><img src="image_118.png" /></figure>

<figure><img src="image_119.png" /><figcaption>**Figure 15.** Sensorgrammes superposés de l'injections de peptide BK à différentes concentrations sur la surface recouverte de liposomes à pH 7 (a) et pH 4 (b)</figcaption></figure>

Dans les deux tampons, nous constatons que l'adsorption du peptide BK sur la couche de liposomes commence comme un processus significativement lent qui n'atteint pas l'équilibre avant la fin de l'injection du peptide. Après l'étape de lavage avec du PBS à pH7 ou pH4, nous remarquons que le signal SPR diminue mais très lentement bien que le peptide ne soit plus présent dans la solution et que l'écoulement du tampon élimine les peptides libres ou faiblement liés. En effet, les sensorgrammes ne sont pas revenus à zéro pendant toute la durée du lavage, ce qui indique que le peptide BK est resté lié à la surface ou inséré dans la bicouche lipidique
du liposome. Une irréversibilité de l'interaction a bien été observée lorsque la solution d'injection a été remplacée par une solution PBS à pH 7 ou à pH 4.

A partir de ces résultats préliminaires, nous pouvons confirmer la forte affinité du peptide BK à la surface des liposomes à pH physiologique et aussi à pH acide. En effet, dans la littérature, il est rapporté que la BK a une forte affinité avec les surfaces membranaires, modifiant potentiellement la structure de la membrane lipidique en augmentant l'encombrement et la robustesse de la bicouche [13,17]. Par ailleurs, la BK est sensible à la courbure de la membrane lipidique, avec une affinité particulière pour les petites nanovésicules (~50-150 nm) et dans notre cas le diamètre hydrodynamique mesuré par DLS des liposomes était 87 nm et 85 nm dans le PBS à pH 7 ou à pH 4 respectivement. Saludes et al. [30] ont montré que le peptide BK interagit avec la bicouche lipidique sous une conformation active en forme de pince permettant l'orientation cruciale des résidus arginine terminaux sur la même face du peptide. Ainsi, la forte affinité du BK avec les composants hautement anioniques suggère le rôle principal des résidus arginine pour former des liaisons électrostatiques. Les acides aminés proline au sein des séquences jouent un rôle dans la structuration du peptide sous la forme d'une pince, tandis que les deux résidus phénylalanine hydrophobes jouent un rôle dans l'insertion du peptide dans la bicouche lipidique ou dans l'interaction avec son récepteur [31]. Il va être intéressant de poursuivre ce travail en calculant les épaisseurs et les indices de réfraction des différentes couches formées. Le calcul de la constante de dissociation à l'équilibre $K_D$ sera également très informative. Ce travail en cours n'a pas pu être finalisé par manque de temps dans le cadre de cette thèse.

## IV.2. Protocole expérimental

The interaction between BK peptide and the liposomes immobilized on the surface as a model cell membrane was evaluated using the MP-SPR method. After functionalization of the SPR gold chip surface with streptavidin and passivation with TRIS as described in the experimental part of publication 2, we inserted this chip into the BioNavis system. A continuous flow (50 µL/min) of PBS at pH 4 (0.1 M NaH₂PO₄, 0.05 M NaCl, pH 4) or PBS at pH 7 (0.1 M NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 0.15 M NaCl, pH 7) was first injected for approximately 20 min until a stable baseline was reached. After stabilization of the signal intensity, a liposome concentration of 1×10¹⁴ lipo mL⁻¹ in a PBS at pH 4 or pH 7 was injected on the streptavidin surface in both flow channels for 4 min at a flow rate of 50 µL/min. BK peptide solutions were prepared immediately before injection by diluting the peptide mother solution in the PBS buffers.
For the experiments in PBS pH 7, a range of peptide concentrations from 5 to 100 µM in PBS pH 7 were successively injected on the liposome-coated surface. Each concentration was injected for 15 min at a flow rate of 12 µL/min. The injections were followed by a washing step with the PBS buffer at pH 7 at a flow rate of 50 µL/min until the signal was stabilized with the objective of achieving a new baseline.

In order to study the behavior of this peptide in an acidic medium, we performed the same previous experiment with the same injection and washing cycles for higher BK peptide concentrations (50, 75 and 100 µM) in PBS pH 4.

As the liposomes were immobilized on two flow cells, one was used to inject the samples and the other was used to inject PBS buffer as control.

The MP-SPR signals vs. time at different BK peptide concentrations were recorded. Measurements were triplicated for each BK peptide concentration.

V. Conclusion

Dans ce travail, nous avons étudié par la méthode MP-SPR l'interaction de E4-GGYC, un analogue du peptide HA2 de l'hémagglutinine du virus de la grippe et du peptide BK, avec une surface biomimétique formée de liposomes greffés sur un substrat d'or. Une stratégie de liaison biotine/streptavidine a été développée pour créer une couche stable de liposomes avec une couverture élevée, caractérisée par AFM. La variation du signal SPR a clairement illustré la forte liaison des liposomes biotinylés à la surface fonctionnalisée par la streptavidine avec un K<sub>D</sub> calculé de 9,44 10<sup>-12</sup> M. Nous avons démontré la capacité de la technique MP-SPR à caractériser la variation de la morphologie de la couche de liposomes après injection de E4-GGYC à pH 4,5 et pH 8 et nous avons révélé différents mécanismes d'interaction. À pH 4,5, le peptide s'insère d'abord dans la membrane du liposome jusqu'à saturation, puis s'adsorbe à la surface à une concentration élevée, alors que le mécanisme d'interaction ne suit pas le même mécanisme à pH 8. Le décalage négatif de l'angle SPR observé lors de l'injection du peptide à pH 8 provient probablement de changements morphologiques de la couche de liposomes. Les sensorgrammes résultant de l'interaction de E4-GGYC aux concentrations 5-25 µM avec la couche de liposomes à pH 4,5 ont été ajustés pour calculer une constante de dissociation à l'équilibre K<sub>D</sub> de 4,50 10<sup>-7</sup> M. Les études MP-SPR ont montré que les liposomes gonflaient en présence de peptides dans la solution circulante à pH 4,5. Cette hypothèse a été prouvée théoriquement en calculant l'épaisseur (d) et l'indice de réfraction (n) ainsi que la concentration
en phospholipides (Cp) de la couche de liposomes par le logiciel LayerSolver™. Ce gonflement dépendant du pH a été confirmé en solution par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et par une analyse du suivi individuel de nanoparticules NanoSight (NTA). De fortes concentrations de peptide jusqu'à 100 µM n'ont pas dégradé la structure des liposomes greffés à la surface. Nos études ont également révélé que l'insertion du peptide augmentait la robustesse de la membrane lipidique. Le mécanisme bien connu de perturbation des double couches phospholipidiques par des mono-rhamnolipides ne se produisait pas après l'insertion du peptide dans la membrane du liposome. Comme autre conclusion, les analyses MP-SPR de l'interaction du peptide E4-GGYC avec les liposomes immobilisés ne nous ont pas permis d'observer le mécanisme de fusion jusqu'à 100µM de peptide en solution.

La seconde analyse MP-SPR de l'interaction du peptide BK avec le même modèle de membrane a été réalisée dans deux tampons PBS à pH 7 et pH 4. Les résultats ont montré la haute affinité du peptide BK pour la membrane du liposome dans les deux pHs avec une quasi irréversibilité de la liaison. La désorption complète du peptide peut être possible si un cycle de lavage plus long est effectué. Contrairement à la liaison du peptide HA2, le peptide BK interagit avec les liposomes avec une cinétique très lente qui peut être liée à un autre changement conformationnel ou à une modification de la bicouche lipidique. Cette étude nous permet de faire apparaître la capacité de la technique MP-SPR à suivre en temps réel d'autres mécanismes d'interaction avec le même modèle de membrane biomimétique montrant la spécificité de l'interaction du peptide HA2 avec les liposomes supportés par rapport au peptide BK. Au vu des études présentées ici, nous pensons que notre approche MP-SPR sur des liposomes immobilisés sur des substrats solides peut fournir des informations complémentaires en temps réel pour une meilleure compréhension mécanistique de l'interaction biomolécule/membrane lipidique.

En perspective, nous envisageons d'étudier plus en détails la cinétique et le mécanisme d'interaction du peptide BK avec les liposomes dans le but de montrer les changements morphologiques qui peuvent être dus à l'adsorption de ce peptide.
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CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Les bicouches lipidiques constituent le squelette des membranes biologiques. En raison de la complexité des membranes naturelles, de nombreux modèles biomimétiques sont développés afin d'étudier les divers processus biologiques qui se produisent au niveau cellulaire. Les efforts se concentrent sur l'amélioration de ces modèles afin de se rapprocher de l'état naturel des membranes et d'ouvrir la voie à de nouvelles techniques d'étude.

Dans une revue de la littérature présentée dans le premier chapitre de ce mémoire, nous avons mis en évidence le développement de modèles de membrane biomimétique et les techniques permettant leur caractérisation, en particulier celles adaptées aux analyses sur une surface solide. A cet égard, nous avons souligné le rôle critique des liposomes dans le processus d'élaboration des deux principaux modèles de membrane tels que la bicouche lipidique supportée (SLB) et la couche vésiculaire supportée (SVL).

L'objectif de cette thèse était de développer une couche vésiculaire supportée (SVL) formée de liposomes intacts sur un substrat d'or par une stratégie d'ancrage stable, pour mener des études d'interaction avec des biomolécules d'intérêt. Ce type de membrane a été adopté en raison de sa structure semblable à celle des membranes cellulaires et grâce au fait qu'elle peut être caractérisée à l'aide de nombreuses techniques analytiques. En tant que méthode biophysique principale de la thèse, la résonance plasmonique de surface multiparamétrique (MP-SPR) dans un format à double longueurs d'onde a été employée, permettant la caractérisation à l'échelle nanométrique de structures lipidiques et l'analyse quantitative des interactions entre les membranes et les biomolécules d'intérêt.

Nous avons consacré le deuxième chapitre de cette thèse à la compréhension du phénomène SPR et à la présentation du principe physique de l'approche MP-SPR utilisée dans cette thèse. Nous avons appris que la base de la SPR repose sur la notion du « plasmon de surface » existant à l'interface entre un métal et un diélectrique. Nous avons montré à l'aide de la théorie de Maxwell que ces ondes de surface ont une polarisation transverse magnétique notée (TM) et qu'elles ont un caractère évanescent. Nous avons également montré que le plasmon de surface ne pouvait pas être excité par une onde lumineuse incidente qui proviendrait directement du
vide. Leur excitation était possible si nous utilisions un troisième milieu. Cette idée a été
introduite par Otto puis par Krestchmann-Reather qui ont utilisé un prisme en verre et la
méthode de la réflexion totale atténuée (ATR). Cela a permis d'obtenir la résonance
plasmonique de surface. Ensuite, nous avons démontré qu'une analyse basée sur la MP-SPR,
en particulier à double longueurs d'onde, était une approche efficace pour déterminer les valeurs
uniques de l'épaisseur et de l'indice de réfraction des films ultramineses par rapport à la SPR
traditionnelle. Une évaluation minutieuse des publications présentant des résultats sur les
mesures de films ultra-minces indique que l'approche de l'analyse MP-SPR est capable de
caractériser des couches minces avec une bonne précision.

Dans cette étude et pour la première fois, la MP-SPR à double longueur d'onde a été combinée
à l'emploi d'une couche vésiculaire supportée formée de liposomes intacts pour étudier les
mécanismes d'interaction membranaire du mono-rhamnolipide produit par la bactérie
*Pseudomonas aeruginosa*, du peptide E4-GGYC, un analogue du peptide HA2 du virus de la
grippe et du peptide bradykinine (BK). Le principal défi était de suivre en temps réel, sans
aucun marquage et dans différentes conditions expérimentales, les effets de l'interaction de ces
trois biomolécules sur la structure et la morphologie des liposomes supportés afin de mieux
comprendre leurs mécanismes d'action sur les membranes. Une analyse théorique basée sur les
mesures à double longueur d'onde de la couche de Fresnell a été utilisée pour la caractérisation
des changements au niveau de la couche de liposomes.

Dans le troisième chapitre, nous avons étudié l'interaction du mono-rhamnolipide avec la
couche de liposomes intacts supportés sur l'or. Dans un premier temps, nous avons montré par
une étude comparative MP-SPR que les liposomes biotinylés interagissent de façon forte et
stable avec la surface d'or fonctionnalisée par la streptavidine. Ensuite, nous avons suivi en
temps réel les étapes de changement de la couche de liposomes suite à l'effet déstabilisant du
mono-rhamnolipide à différentes concentrations et finalement avec le Triton X-100 (1%). Nous
avons ainsi démontré l'efficacité de la méthode MP-SPR pour caractériser les différents états
de l'architecture des liposomes et distinguer une monocouche de liposomes, une bicouche
lipidique et une monocouche lipidique. Grâce à la modélisation théorique, nous avons
déterminé les valeurs uniques de l'épaisseur (d), l'indice de réfraction (n) et la densité de masse
surfacique (Γ) de ces structures lipidiques et avons pu valider nos hypothèses concernant la
rupture de la couche de liposomes. Nous avons également montré la haute sensibilité de cet
outil analytique pour la détection des mono-RLs, avec une limite de détection de 2 µg mL⁻¹.
D'autres études sont encore nécessaires pour valider notre méthode dans des échantillons réels. Sur ce point, il est important de noter que, bien que le test ne soit probablement pas spécifique pour la détection des rhamnolipides de *P.aeruginosa*, il peut être intéressant pour la détection sensible de toxines bactériennes au stade précoce d'une infection.

Dans le dernier chapitre, nous avons mis en évidence l'interaction d'autres biomolécules ayant une activité biologique différente de celle des rhamnolipides avec le même modèle de membrane. Ainsi nous avons choisi d'étudier l'interaction du peptide E4-GGYC et du peptide BK avec une couche de liposomes supportés dont la taille de liposomes est < 100 nm. Ces deux peptides ont un mécanisme d'action et une structure secondaire différents lorsqu'ils sont associés à la membrane biomimétique. Nous avons adopté la même stratégie de liaison biotine/streptavidine pour immobiliser les liposomes. Nous avons ainsi calculé l'affinité de la liaison entre les liposomes biotinylés et la surface de streptavidine ($K_D$ = 9,44 $10^{-12}$ M). Ensuite, nous avons montré par AFM la couverture élevée de la surface de streptavidine par les liposomes. Pour le peptide E4-GGYC, nous avons démontré la variation de la morphologie de la couche de liposomes après injection de E4-GGYC à pH 4,5 et pH 8 et nous avons révélé différents mécanismes d'interaction pH-dépendants. Par le calcul théorique de l'épaisseur (d), de l'indice de réfraction (n) ainsi que la concentration en phospholipides (Cp), nous avons pu identifier un mécanisme de gonflement et de dégonflement partiel de la couche de liposomes lié à l'insertion et à la désorption du peptide E4-GGYC (5-25 µM) à pH 4,5. Par une étude complémentaire, nous avons confirmé ce résultat et aussi la dépendance au pH de l'interaction peptide E4-GGYC/liposomes en solution par DLS et par NanoSight (NTA). Il est à noter que contrairement à ce qui est décrit dans la littérature, nous n'avons pas observé par MP-SPR de mécanisme de rupture, de dégradation ou de fusion des liposomes greffés en augmentant la concentration en peptide jusqu'à 100 µM. Néanmoins, nous avons montré que l'insertion du peptide E4-GGYC à pH 4,5 augmente la robustesse de la membrane. Dans le cadre de l'étude d'interaction avec la bradykinine, nous avons discerné d'autres mécanismes d'interaction dans un tampon à pH 7 et pH 4 avec le même modèle de membrane. Les résultats ont montré la haute affinité du peptide BK pour la membrane du liposome aux deux pH, avec une quasi irréversibilité de la liaison. Ces études préliminaires nous permettent de confirmer que le peptide BK interagit avec les liposomes avec une cinétique très lente et indépendante du pH du milieu d'analyse contrairement au peptide E4-GGYC.
Les travaux de cette thèse ont permis de mettre en évidence l'intérêt de la technique MP-SPR à double longueur d'onde dans la caractérisation et la compréhension des interactions biomoléculaires avec des modèles de membrane cellulaire. Cette technique est générique et peut être adaptée à tout système multicouche subissant des transformations morphologiques quantitatives pendant l'adsorption de biomolécules à leur surface. La thèse décrit également les protocoles d'analyse par modélisation pouvant aider les futurs développements de technologies analytiques sensibles à la surface utilisant des membranes lipidiques modèles.

Différentes plateformes analytiques associant membrane biomimétique et technique MP-SPR pourront probablement être construites dans les années à venir pour obtenir des informations fondamentales sur les propriétés de différents systèmes biologiques ou organiques et développer possiblement de nouveaux types de capteur.

En perspectives à ce travail, nous envisageons :

- de finaliser l'étude cinétique de la liaison du peptide BK avec les liposomes et mener une étude théorique de son mécanisme d'action sur la membrane modèle dans le but de montrer les changements morphologiques qui peuvent être dus à son adsorption.

- d'utiliser d'autres techniques de caractérisation comme l'ellipsométrie, l'interférométrie à double polarisation ou une technique basée sur la fluorescence pour identifier le mode et l'emplacement de la liaison des peptides E4-GGYC et BK avec la membrane. Cela permettrait de compenser les limites de précision de l'analyse MP-SPR.

- de varier la composition lipidique des liposomes utilisés dans cette thèse et voir l'impact de ce changement sur la membrane formée.

- d'étudier enfin par MP-SPR l'interaction d'autres types de biomolécules, ayant des activités biologiques plus complexes, avec la membrane biomimétique formée de liposomes
# Annexe 1 : Equations de Maxwell et équation de propagation

Les interactions des ondes électromagnétiques avec la matière sont décrites par les équations de Maxwell :

$$ \text{Equation de Maxwell-Gauss : } \nabla \cdot \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) = \frac{\rho(\mathbf{r}, t)}{\varepsilon_0} \quad (1.1) $$

$$ \text{Equation de Maxwell-Thomson : } \nabla \cdot \mathbf{B}(\mathbf{r}, t) = 0 \quad (1.2) $$

$$ \text{Equation de Maxwell-Faraday : } \nabla \times \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) = -\frac{\partial \mathbf{B}(\mathbf{r}, t)}{\partial t} \quad (1.3) $$

$$ \text{Equation de Maxwell-Ampère : } \nabla \times \mathbf{H}(\mathbf{r}, t) = \mathbf{J}(\mathbf{r}, t) + \frac{\partial \mathbf{D}(\mathbf{r}, t)}{\partial t} \quad (1.4) $$

Ces équations relient les variations dans l'espace et dans le temps du champ électrique $\mathbf{E}(\mathbf{r}, t)$ et le champ magnétique $\mathbf{H}(\mathbf{r}, t)$. Nous notons $\mathbf{D}(\mathbf{r}, t)$ le déplacement électrique défini par :

$$ \mathbf{D}(\mathbf{r}, t) = \varepsilon_0 \mathbf{E}(\mathbf{r}, t) + \mathbf{P}(\mathbf{r}, t) \quad (1.5) $$

$\mathbf{P}(\mathbf{r}, t)$ étant le moment dipolaire électrique par unité de volume et $\mathbf{B}(\mathbf{r}, t)$ l'induction magnétique définie par :

$$ \mathbf{H}(\mathbf{r}, t) = \frac{\mathbf{B}(\mathbf{r}, t)}{\mu_0} - \mathbf{M}(\mathbf{r}, t) \quad (1.6) $$

$\mathbf{M}(\mathbf{r}, t)$ étant le moment dipolaire magnétique par unité de volume. $\varepsilon_0$ et $\mu_0$ étant la permittivité diélectrique et la perméabilité magnétique du vide respectivement.

$\rho(\mathbf{r}, t) = \rho_{\text{ext}}(\mathbf{r}, t) + \rho_{\text{int}}(\mathbf{r}, t)$ représente la densité de charge volumique et $\mathbf{J}(\mathbf{r}, t)$ représente la densité de courant surfacique.

Nous nous plaçons dans le cas où les deux milieux sont linéaires, homogènes et isotropes :

* La linéarité du milieu fait que $\mathbf{P}(\mathbf{r}, t) = \varepsilon_0\chi_e\mathbf{E}(\mathbf{r}, t)$. Le déplacement devient alors $\mathbf{D}(\mathbf{r}, t) = \varepsilon_0\varepsilon\mathbf{E}(\mathbf{r}, t)$ avec $\varepsilon = 1 + \chi_e$ étant la constante diélectrique du matériau ou permittivité relative.

* L'homogénéité fait que la constante diélectrique ne dépendra plus de $r$ ce qui facilitera le reste du travail, hypothèse valable également pour les couches minces.
* Nous supposons aussi, pour faciliter le travail, que les matériaux sont considérés non-magnétiques, ce qui nous permettra de mettre $M = 0$ et $\mu_r = 1$

* Pour finir, nous considérons le cas où il n'y a aucune source de courant extérieur :

$$j_{ext} = 0 \text{ et } \rho_{ext} = 0$$

Toutes ces conditions réunies nous permettent d'obtenir les équations de Maxwell :

$$\nabla \cdot D = 0, \nabla \times E = -\frac{\partial B}{\partial t} \quad (1.7)$$

$$\nabla \times H = \frac{\partial D}{\partial t}, \nabla \cdot H = 0$$

Ces équations sont utilisées pour la détermination de l'équation de propagation 1.8 :

$$\nabla^2 E - \frac{\varepsilon}{c^2} \frac{\partial^2 E}{\partial t^2} = 0 \quad (1.8)$$

Où $\varepsilon$ est la permittivité diélectrique et $c$ la célérité de la lumière dans le vide.

Si nous considérons que le champ électrique et magnétique respectivement, sont des équations harmoniques dépendantes du temps, $E$ et $H$ s'écriront d'une manière générale :

$E(r,t) = E(r)e^{-iwt}$ (1.9) et $H(r,t) = H(r)e^{-iwt}$ (1.10) [1]. Celles-ci permettent de modifier l'équation (1.8) qui devient Equation 1 (dans le chapitre 2).

Référence :

[1] Bonnand, C. (2006). Couplage fort entre plasmons de surface et excitons de semiconducteur organique (Doctoral dissertation, Université Claude Bernard-Lyon I).
Annexe 2 : Existence du plasmon de surface

Les SP étant évanescents dans la direction z, les solutions cherchées doivent contenir cette évanescence. Elles sont donc, pour les deux modes (TE) qui lie {$E_y, H_x, H_z$} et (TM) qui lie {$H_y, E_x, E_z$} écrites de la façon générale suivante :

-Pour le mode (TE) :

Pour $z > 0$

$$E_y(z) = A_d e^{ik_{SP}x} e^{-kd_z} \quad (2.1.a)$$

$$H_x(z) = -iA_d \frac{1}{\omega\mu_0} k_d e^{ik_{SP}x} e^{-kd_z} \quad (2.2.a)$$

$$H_z(z) = A_d \frac{k_{SP}}{\omega\mu_0} e^{ik_{SP}x} e^{-kd_z} \quad (2.3.a)$$

Pour $z < 0$

$$E_y(z) = A_m e^{ik_{SP}x} e^{km_z} \quad (2.1.b)$$

$$H_x(z) = iA_m \frac{1}{\omega\mu_0} k_m e^{ik_{SP}x} e^{km_z} \quad (2.2.b)$$

$$H_z(z) = A_m \frac{k_{SP}}{\omega\mu_0} e^{ik_{SP}x} e^{km_z} \quad (2.3.b)$$

-Pour le mode (TM) :

Pour $z > 0$

$$H_y(z) = A_d e^{ik_{SP}x} e^{-kd_z} \quad (2.1.c)$$

$$E_x(z) = iA_d \frac{1}{\omega\epsilon_0\epsilon_d} k_d e^{ik_{SP}x} e^{-kd_z} \quad (2.2.c)$$

$$E_z(z) = -A_d \frac{k_{SSP}}{\omega\epsilon_0\epsilon_d} e^{ik_{SP}x} e^{-kd_z} \quad (2.3.c)$$

Pour $z < 0$

$$H_y(z) = A_m e^{ik_{SP}x} e^{km_z} \quad (2.1.d)$$

$$E_x(z) = -iA_m \frac{1}{\omega\epsilon_0\epsilon_d} k_m e^{ik_{SP}x} e^{km_z} \quad (2.2.d)$$

$$E_z(z) = -A_m \frac{k_{SP}}{\omega\epsilon_0\epsilon_d} e^{ik_{SP}x} e^{km_z} \quad (2.3.d)$$

Avec $A_d$ et $A_m$ constantes associées aux milieux diélectrique et métallique respectivement, $\epsilon_0$ est la permittivité du vide et $k_{d,m} = k_{z,d/m}$ sont les composantes du vecteur d'onde, constantes positives, perpendiculaires à l'interface au niveau du métal et du diélectrique et le terme
$e^{-|z|} k_{z,d/m}$ traduit l'évanescence dans les deux milieux (métal et diélectrique) dans la direction z. On note également $k_{x,m} = k_{x,d} = k_{SP}$.

-Pour le mode (TE) :

L'application des conditions de continuité à l'interface entre le métal et le diélectrique en $z = 0$, fait que :

$$E_{y,m} = E_{y,d} \text{ et } \frac{\partial E_{y,m}}{\partial z} = \frac{\partial E_{y,d}}{\partial z} \Leftrightarrow E_{0,m} = E_{0,d} \text{ et } -k_{z,m}E_{0,m} = k_{z,d}E_{0,d}$$

$-k_{z,m} = k_{z,d}$, ce qui est impossible puisque $k_{z,m}$ et $k_{z,d}$ sont des constantes positives. Ceci implique qu'un plasmon de surface n'existe pas en polarisation transverse électrique (TE). Ce n'est pas une onde électromagnétique de polarisation transverse électrique.

-Pour le mode (TM) :

L'application des conditions de continuité à l'interface entre le métal et le diélectrique en $z = 0$ fait que :

$H_{y,m} = H_{y,d} \text{ et } \frac{1}{\varepsilon_m} \frac{\partial H_{y,m}}{\partial z} = \frac{1}{\varepsilon_d} \frac{\partial H_{y,d}}{\partial z}$, donnent, en posant $A_d = A_m$, l'équation 2.4 suivante :

$$\frac{k_d}{k_m} = -\frac{\varepsilon_d}{\varepsilon_m} \quad (2.4)$$

Cela impose que les constantes diélectriques sont de signes opposés et que $k_{z,m}$ et $k_{z,d}$ soient toujours des constantes positives. Un plasmon de surface n'existe donc qu'en polarisation (TM) et entre deux milieux de fonctions diélectriques de signes opposés.