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# Caractérisation physicochimique des membranes cellulaires lors de la cancérogénèse : application à la plasticité cellulaire

Sébastien Ibanez

► To cite this version:

Sébastien Ibanez. Caractérisation physicochimique des membranes cellulaires lors de la cancérogénèse : application à la plasticité cellulaire. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Claude Bernard Lyon 1, 2021. Français. NNT: . tel-04455670

HAL Id: tel-04455670

https://hal.science/tel-04455670

Submitted on 13 Feb 2024

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Public Domain
## THESE de DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE LYON

opérée au sein de
l'Université Claude Bernard Lyon 1

### Ecole Doctorale N° 205
### Ecole doctorale interdisciplinaire sciences - santé

**Spécialité de doctorat** : Biochimie du cancer

Soutenue publiquement le 13/12/2021, par :

Sébastien IBANEZ

# Caractérisation physicochimique des membranes cellulaires lors de la cancérogénèse : application à la plasticité cellulaire

Devant le jury composé de :

<table><tr><td>GIRARD-EGROT, Agnès</td><td>Professeur - ICBMS, Lyon</td><td>Examinatrice</td></tr><tr><td>ANDRIEU-ABADIE, Nathalie</td><td>Directeur de recherche - CRCT, Toulouse</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>ROSSI, Claire</td><td>Professeur - GEC, Compiègne</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>KLYMCHENKO, Andrey</td><td>Directeur de recherche - LBP, Strasbourg</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>PICART, Catherine</td><td>Professeur - IRIG, Grenoble</td><td>Examinatrice</td></tr><tr><td>PAYEN-GAY, Léa</td><td>Professeur - CICLY, Lyon</td><td>Examinatrice</td></tr><tr><td>GRANJON, Thierry</td><td>Maître de conférence - ICBMS, Lyon</td><td>Directeur de thèse</td></tr><tr><td>VIGNERON, Arnaud</td><td>Maître de conférence - ICBMS, Lyon</td><td>Co-directeur de thèse</td></tr></table>
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Université Claude Bernard – LYON 1

<table><tr><td>Président de l'Université</td><td>M. Frédéric FLEURY</td></tr><tr><td>Président du Conseil Académique</td><td>M. Hamda BEN HADID</td></tr><tr><td>Vice-Président du Conseil d'Administration</td><td>M. Didier REVEL</td></tr><tr><td>Vice-Président du Conseil des Etudes et de la Vie Universitaire</td><td>M. Philippe CHEVALLIER</td></tr><tr><td>Vice-Président de la Commission de Recherche</td><td>M. Petru MIRONESCU</td></tr><tr><td>Directeur Général des Services</td><td>M. Pierre ROLLAND</td></tr></table>

COMPOSANTES SANTE

<table><tr><td>Département de Formation et Centre de Recherche en Biologie Humaine</td><td>Directrice : Mme Anne-Marie SCHOTT</td></tr><tr><td>Faculté d'Odontologie</td><td>Doyenne : Mme Dominique SEUX</td></tr><tr><td>Faculté de Médecine et Maïeutique Lyon Sud - Charles Mérieux</td><td>Doyenne : Mme Carole BURILLON</td></tr><tr><td>Faculté de Médecine Lyon-Est</td><td>Doyen : M. Gilles RODE</td></tr><tr><td>Institut des Sciences et Techniques de la Réadaptation (ISTR)</td><td>Directeur : M. Xavier PERROT</td></tr><tr><td>Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques (ISBP)</td><td>Directrice : Mme Christine VINCIGUERRA</td></tr></table>

COMPOSANTES & DEPARTEMENTS DE SCIENCES & TECHNOLOGIE

<table><tr><td>Département Génie Electrique et des Procédés (GEP)</td><td>Directrice : Mme Rosaria FERRIGNO</td></tr><tr><td>Département Informatique</td><td>Directeur : M. Behzad SHARIAT</td></tr><tr><td>Département Mécanique</td><td>Directeur M. Marc BUFFAT</td></tr><tr><td>Ecole Supérieure de Chimie, Physique, Electronique (CPE Lyon)</td><td>Directeur : Gérard PIGNAULT</td></tr><tr><td>Institut de Science Financière et d'Assurances (ISFA)</td><td>Directeur : M. Nicolas LEBOISNE</td></tr><tr><td>Institut National du Professorat et de l'Education</td><td>Administrateur Provisoire : M. Pierre CHAREYRON</td></tr><tr><td>Institut Universitaire de Technologie de Lyon 1</td><td>Directeur : M. Christophe VITON</td></tr><tr><td>Observatoire de Lyon</td><td>Directrice : Mme Isabelle DANIEL</td></tr><tr><td>Polytechnique Lyon</td><td>Directeur : Emmanuel PERRIN</td></tr><tr><td>UFR Biosciences</td><td>Administratrice provisoire : Mme Kathrin GIESELER</td></tr><tr><td>UFR des Sciences et Techniques des Activités Physiques et Sportives (STAPS)</td><td>Directeur : M. Yannick VANPOULLE</td></tr><tr><td>UFR Faculté des Sciences</td><td>Directeur : M. Bruno ANDRIOLETTI</td></tr></table>
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
L'ensemble des travaux constituant cette thèse ont été réalisés :

Au sein de l'équipe CO2-GLYCO de l'ICBMS à l'université Claude Bernard Lyon 1, sous la direction du Dr. Thierry GRANJON ainsi qu'au sein de l'équipe Signalisation, métabolisme et progression tumorale au Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, sous la direction du Dr. Arnaud VIGNERON

Chimie Organique 2-Glycochimie
Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires

UMR 5249 Université Lyon 1 / CNRS
Bâtiment Lederer
1 rue Victor Grignard
69100 Villeurbanne – France

INSTITUT DE CHIMIE ET BIOCHIMIE
MOLECULAIRES ET SUPRAMOLECULAIRES

icb
ims
UMR 5246

C2 Glyco

Signalisation, métabolisme et progression tumorale
Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon

UMR INSERM 1052 CNRS 5286
28 rue Laennec
69008 Lyon France

CRCL
CENTRE DE
RECHERCHE EN
CANCÉROLOGIE
DE LYON

Au sein de l'Ecole Doctorale Interdisciplinaire Science-Santé

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« Il nous faut nous rappeler que ce que nous observons, ce n’est pas la Nature en soi, mais la Nature exposée à notre méthode d’investigation. »

Werner Heisenberg
REMERCIEMENT

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

Je tiens d'abord à remercier les trois rapporteurs : la Pr Claire ROSSI, la Dr Nathalie Andrieu-Abadie et le Dr Andrey KLYMCHENKO, pour avoir accepté et pris du temps à juger mon travail de ces trois années de thèse. J'aimerais aussi remercier les autres membres du jury : la Pr Catherine PICART, la Pr Agnès GIRARD-EGROT et la Pr Léa PAYEN, pour votre présence lors de ma soutenance de thèse et votre participation à son évaluation.

Je remercie chaleureusement le Dr Thierry GRANJON et le Dr Arnaud VIGNERON pour votre
confiance et la liberté que vous m'avez laissé. Je tiens également à vous remercier sur la qualité
de ma formation et votre pédagogie durant ces trois ans. Tout particulièrement pour le temps
pris sur des notions conceptuelles en cancérologie qui ne m'était pas familier au vu de ma
formation d'origine. J'ai aimé durant ces trois ans baigner dans le milieu de la biochimie et de
la biologie, renforçant en moi l'idée que l'intégration de différents domaines scientifiques est
nécessaire pour la compréhension des mécanismes du vivant.

Je remercie également les différentes personnes des équipes avec qui j'ai pu travailler. Je
commencerai par les directeurs d'équipes, le Pr Alain PUISIEUX pour avoir accepté de me
laisser manipuler au sein de son équipe (EMT et plasticité cellulaire), mais aussi le Pr Loïc
BLUM (GEMBAS).

Je remercie l'ensemble de l'équipe GEMBAS et notamment la Pr Agnès GIRARD-EGROT et la Dr Ofélia MANITI pour leurs soutiens expérimentaux et privés ainsi que pour les échanges de réflexions scientifiques que nous avons pu avoir durant ces trois ans.

Je remercie aussi l'ensemble de l'équipe EMT et plasticité cellulaire, tout particulièrement
Freddie et Cricri qui ont été d'un soutien technique sans faille durant ces trois ans, et qui le
sont restées malgré les remaniements d'équipes. Je remercie bien évidemment la Dr Samia
RUBY, pour les échanges professionnels et son aide sur l'expérimentation in vivo, mais aussi
pour les discussions de la vie quotidienne qui m'a permis de sortir mon esprit hors de la thèse
de temps en temps.

Je remercie l'équipe LCO2-GLYCO pour leurs aides sur la compréhension des notions de chimie. Tout particulièrement le Dr David GUEYRARD et le Pr Peter GOEKJIAN qui ont toujours pris le temps de répondre à mes questions.

Je remercie également le corps d'enseignant qui m'a permis d'exercer une activité pédagogique durant ma thèse. Je pense notamment aux Drs Leyre BRIZUELA-MADRID, Dr Sébastien VIOLOT, Dr Bastien DOUMECHE et Dr Alexandre NOIRIEL.

Je remercie tous les étudiants, thésards et postdoctorants pour les moments professionnels, mais aussi ceux et celles passés dans un contexte hors professionnel. J'ai particulièrement une pensée pour Julien, Chloé, Thomas, Milène, Leith, Hadrien, Gaël, Noémie, Rhama, Maxime, Simon, Himaïji, Pauline, Lauriane, Enzo et Clara.
J'aimerais dire un énorme remerciement à ma famille, tout particulièrement mes parents et ma sœur qui ont toujours été présents pour me soutenir et qui ont toujours cru en moi. Si j'ai pu m'épanouir dans le travail et la recherche, c'est grâce à la sérénité que m'apporte ma famille.

De la même manière, j'aimerais aussi remercier mes amis qui ont eu la même importance pour mon épanouissement. Mes pensées vont à Rémi, Fleur, JF, Johann, Maximax, Julian, Thomas, Aurore, Philou, Do, Alexis et j'ai une pensée particulière pour Zach qui avait la patience de m'écouter parler de science pendant nos séances de sport.

Enfin le meilleur pour la fin. Toutes mes pensées et mon cœur vont pour Virginia qui m'a permis d'obtenir une stabilité que je n'aurais jamais eue sans elle. Tu as toujours été là et d'un soutien indéniable tout au long de cette thèse et je n'aurais jamais assez de mots pour te remercier.
# TABLE DES MATIÈRES

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

## Introduction

### A. Cancer

1. Causes et principes de l'initiation tumorale p8

2. Développement macroscopique et hétérogénéité tumorale p11

a) Hétérogénéité intertumorale p14

b) Hétérogénéité intratumorale p16

3. Perte d'identité cellulaire et plasticité, support du développement tumoral p19

4. La transition épithélio-mésenchymateuse perturbatrice majeure de l'identité épithéliale p21

5. Métabolisme associé à l'acquisition d'un phénotype au caractère souche p31

### B. Membrane cellulaire, métabolisme lipidique et plasticité cellulaire

1. Généralité p37

2. Structure des lipides et membrane p39

a) Les Acides Gras p39

b) Les Glycérides et Glycérophospholipides p40

c) Les Sphingolipides p42

d) Le Cholestérol p43

e) Les membranes p44

3. Modulation du métabolisme lipidique dans un contexte tumoral p47

a) Adaptation du métabolisme lipidique lors de la croissance tumorale p47

b) Métabolisme lipidique associé à la plasticité cellulaire p48

4. Technique de mesure des propriétés biophysiques des membranes p54

a) Résonnance paramagnétique électronique p55

b) Microscopie à force atomique p55

c) Redistribution de fluorescence après photoblanchiment p55

d) Spectroscopie par corrélation de fluorescence p56

e) Suivi de particule unique p56

5. Fluidité membranaire, Fluorescence et Solvatochromisme p56

### C. Objectif de thèse p62

## Résultats

Résultat n°1 : Caractérisation de la sonde Dioll p63

Résultat n°2 : Suivi de la plasticité cellulaire par mesure de la fluidité p97
Résultat contributeur n°1 : DiphénylPhosphate (DPP) modulateur du
métabolisme lipidique p126

Résultat contributeur n°2 : Dosage lipidique des membranes par marquage
au Dioll p149

Discussion p159

Conclusion p178

Bibliographie p179
TABLE DES ILLUSTRATIONS

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

Figure 1 : Schéma représentatif des « Cancer Hallmarks » 8

Figure 2 : Histologie du tissu mammaire 12

Figure 3 : Hiérarchie mammaire dans un tissu sain 13

Figure 4 : Probables origines des différents sous-groupes des cancers mammaires 16

Figure 5 : La dynamique phénotypique permettant l'acquisition d'un phénotype CCDD 19

Figure 6 : Le continuum de l'EMT corrélaté à la plasticité cellulaire 22

Figure 7 : Facteurs solubles et leur voie de signalisation participant à l'induction du programme de l'EMT par l'activation des gènes des EMT-TF lors du développement tumoral 23

Figure 8 : Structure des différentes classes lipidiques 39

Figure 9 : Voies de synthèse des acides gras de novo, mais aussi à partir des lipides essentiels retrouvés dans l'alimentation 40

Figure 10 : Voies de synthèses des différentes classes de phospholipides ainsi que les lipides neutres 42

Figure 11 : Voies de synthèse des sphingolipides 43

Figure 12 : Répartition asymétrique des lipides entre le feuillet interne de la membrane plasmique et le feuillet externe 44

Figure 13 : Répartition des phases lipidiques ordonnées ou désordonnées en fonction de la température 45

Figure 14 : Effet du cholestérol sur la membrane 46

Figure 15 : Effet de la tête polaire et des lysophospholipides sur la courbure membranaire 47

Figure 16 : Mécanismes anti- ou pro- ferroptoses et les molécules les inhibant 54

Figure 17 : Diagramme de Jablonski simplifié 57

Figure 18 : Mécanisme de fluorescence ratiométrique du Laurdan 58
ABRÉVIATION

AA : Acide arachidonique

ACSL4 : Acyl-CoA Synthetase Long Chain Family Member 4

ADN : Acide désoxyribonucléique

AFM : Atomic force microscopy

AG : Acide Gras

AHR : Aryl Hydrocarbon Receptor

ALDH : Aldéhyde déshydrogénase

ATP : Adénosine triphosphate

BH4 : Tétrahydrobioptérines

BRAC1 : Breast Cancer

CAF : Cancer associated fibroblast

CCDD : Cellule cancéreuse dynamiquement dédifférenciée

CoQ₁₀ : Coenzyme Q10

CTC : Cellule tumorale circulante

DAG : Diacylglycérol

DHA : Acide docosahexénoïque

DPP : Diphénylphosphate

EMT : Epithelial-mesenchymal transition

EPR : Electron paramagnetic resonance

ER : Estrogen receptor

EV : Extracellular vesicles

FADS : Fatty acids desaturases

FBP1 : Frutctose-1,6-biphosphatase

FCS : Flurorescence correlation spectroscopy

FRAP : Fluorescence recovery after photobleaching

FSP1 : Ferroptosis suppressor protein 1

FTL : Ferritin Light Chain

FTH : Ferritin Heavy Chain 1

GP : Generalized Polarisation

GPL : glycérophospholipide

GPX4 : Glutathione peroxidase 4

GUV : Giant unilamellar vesicle

H₂O₂ : Peroxyde d'hydrogène

HAT : Histones acetyltransferase

HER2 : Human epidermal growth factor receptor 2

HIF : Hypoxia Inducible Factor

HMGCR : 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Reductase

iPS : Induces pluripotent stem cell

KEAP1 : Kelch-like ECH-associated protein 1

KDM : JmJC-containing Lysine demethylases

HMOX : Heme Oxygenase

LFS : Li-Fraumeni Syndrome

LXR : Liver X receptor

MβCD : Méthyl-β-cyclodextrine

MAG : Monoacylglycérol

MUFA : monounsaturated fatty acid

NQO1 : NAD(P)H Quinone Dehydrogenase 1

NRF2 : Nuclear factor erythroid 2-related factor 2

OIS : Oncogene-induced cellular senescence

OSM : Oncostatine M

OXPHOS : Phosphorylation oxydative

PC : Phosphatidylcholine

PE : Phosphopahidyléthanolamine

PGE2 : Prostaglandine E2

PR : Progesterone receptor

PS : Phosphatidylsérine

PUFA : polyunsaturated fatty acid

PI3KC : Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate 3-Kinase Catalytic 1

PI : Phosphatidylinositol

RE : Réticulum endoplasmique

ROS : Reactive oxygen species

SCD : Stearoyl-CoA desaturases

SPT : Single-Particle Tracking

TAG : Triacylglycérol

TF : Transcription factor

TGFβ : Transforming growth factor beta

Tm : Melting temperature

TPP : Triphénylphosphate

UPR : Unfolded protein response
## A. Cancer

### 1. Causes et principes de l'initiation tumorale

Le cancer, avec environ 10 millions de morts par an, est l'une des premières causes de décès dans le monde ce qui fait de cette maladie un problème de santé publique majeur, tant dans les pays développés que ceux en voie de développement¹. La tumorigènèse peut toucher l'ensemble des cellules de l'organisme que ce soit au sein d'un tissu épithélial (carcinome), d'un tissu conjonctif (sarcome), ou encore les cellules liées au système hématopoïétique (leucémie et lymphome). La majorité des cancers chez l'adulte proviennent des tissus épithéliaux qui comme nous le reverrons ensuite présentent le plus grand risque d'altérations génétiques en raison du fort taux de division des cellules les constituants. En effet, l'une de leurs caractéristiques est notamment un renouvellement tissulaire élevé, l'épithélium intestinal se renouvelant par exemple totalement en 5 jours. De plus ces tissus sont fortement exposés aux agressions extérieures, qui peuvent avoir des effets génotoxiques et/ou épigénétiques directs sur les cellules. Les benzopyrènes par exemple, molécules retrouvées dans la fumée de cigarette ou dans notre alimentation présentent de tels effets, tandis que les réponses inflammatoires lors du processus de cicatrisation peuvent les induire de façon indirecte²,³,⁴. La première étape du processus tumorigénique se définit par la transformation néoplasique d'une cellule saine, c'est-à-dire un mécanisme permettant l'obtention d'un phénotype caractéristique d'une cellule cancéreuse. Ce phénotype se traduit notamment par l'acquisition d'une prolifération cellulaire élevée, indépendante de la présence de facteurs de croissances et associée à une morphologie et un métabolisme altérés permettant son maintien. De façon plus globale, des caractères spécifiquement liés aux cellules cancéreuses ont été définis et regroupés sous l'anglicisme « Cancer Hallmarks », caractéristiques résumées dans la Figure 1.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 1 :** Schéma représentatif des « Cancer Hallmarks ». L'ensemble des caractères associés aux cellules cancéreuses sont représentés sur ce schéma (d'après D. Hanahan et R.A. Weinberg)⁵</figcaption></figure>
En terme cinétique maintenant, la transformation néoplasique survient lorsque la cellule subit des altérations génétiques augmentant l'expression des gènes de proto-oncogènes ou l'activité des protéines qu'ils encodent, avec en parallèle une inactivation de gènes connus sous le nom de suppresseurs de tumeurs. Les oncoprotéines issues des proto-oncogènes, tel que RAS, PI3K ou MYC, peuvent activer la croissance cellulaire, la production de biomasse ou encore le cycle cellulaire de façon incontrôlée suite à des mutations leur conférant des activités constitutives⁶⁻⁹. Initialement, ces activités associées à une production de biomasse et une réplication de l'ADN excessive s'accompagnent d'un nombre important de stress homéostatiques, par exemple l'augmentation des dérivés de réactifs de l'oxygène ou un stress réplicatif au niveau de l'ADN induisant des effets similaires à des cassures du génome¹⁰. Face à ce stress, la cellule va mettre en place des réponses permettant dans un premier temps de tenter un retour à une homéostasie normale. Cependant si la réponse est inefficace des réponses plus drastiques induites par des mécanismes dits « suppresseurs de tumeurs » s'appuyant notamment sur le facteur de transcription p53, permettront alors de bloquer le potentiel prolifératif de la cellule anormale, par un mécanisme de sénescence prématurée induite par les oncogènes (Oncogene-induced cellular senescence : OIS) ou encore par une mort cellulaire programmée comme l'apoptose. Le rôle clé de p53 sur la répression des oncogènes a notamment été décrit chez l'Homme dans le syndrome de Li-Fraumeni (LFS). Cette pathologie se caractérise par l'acquisition d'un allèle P53 muté généralement par transfert héréditaire, se traduisant par un développement précoce de divers cancers pouvant toucher n'importe quels tissus de l'organisme¹¹. L'OIS se définit par la mise en place d'un arrêt définitif du cycle cellulaire, notamment par les protéines p16 et 21 produites respectivement par les gènes CDKN2A et CDKN1A ce dernier contrôlé positivement par p53. Leur activation lors du stress oncogénique induit l'inhibition des complexes kinases Cyclin/CDK, qui ne peuvent alors plus empêcher la répression des facteurs de transcription E2F1 par phosphorylation de Rb, effet se traduisant le plus souvent par un arrêt du cycle cellulaire en phase G1¹². Concernant l'apoptose, l'activation de p53 lors du stress oncogénique permet l'induction de l'expression des protéines de la famille de Bcl-2 proapoptotique (par exemple : BAX, PUMA). Ces protéines vont alors pouvoir inhiber l'activité des protéines Bcl-2 anti-apoptotique et permettre ainsi la perméabilisation de la mitochondrie, la libération du Cytochrome C dans le cytosol et ainsi l'activation des caspases entraînant la mort de la cellule¹³. De façon générale, les protéines comme p53 engagées dans ces mécanismes oncosuppresseurs ont pour origine des gènes fréquemment mutés dans les tumeurs et sont par conséquent nommées suppresseurs de tumeurs. Cette définition de gènes suppresseurs de tumeur répond d'autre part le plus souvent à une hypothèse établie pour la première fois par Alfred Knudson indiquant que les deux copies alléliques d'un gène suppresseur de tumeur doivent être altérées par des mécanismes génétiques ou épigénétiques¹⁴.

Un des concepts importants associés aux mécanismes moléculaires précédemment indiqués est la nécessité pour qu'une tumeur se développe d'un processus permettant de limiter les stress homéostatiques initiaux ou d'empêcher la conversion d'un signal issu de ces stress en une réponse suppressive de tumeur. À cette fin, deux mécanismes sont principalement à l'œuvre. Le premier est un processus génétique, de type mutationnel ou de délétion de régions génétiques dans lequel l'activation des mécanismes associés à l'élimination des cellules stressées devient impossible par inactivation des gènes suppresseurs de tumeur le plus souvent. Le second est un
processus adaptatif par une reprogrammation plutôt épigénétique ou biochimique permettant alternativement de limiter l'expression des gènes suppresseurs de tumeur ou d'adapter la cellule au stress homéostatique induit par l'oncogène afin d'en limiter leur portée. Afin d'illustrer ces concepts, je vais m'attarder dans un premier temps sur les mécanismes de régulation du facteur oncosuppresseur p53. Les altérations génétiques les plus intuitives sont les lésions génétiques touchant directement sa fonction suppresseur de tumeurs. Il a été montré qu'en fonction du type et du stade des tumeurs qu'environ 5 à 80% ont le gène TP53 altéré, avec principalement une mutation faux-sens au niveau du domaine de liaison à l'ADN de la protéine impactant ainsi son activité transcriptionnelle¹⁵. Cette perte d'activité transcriptionnelle empêche alors l'activation de gènes impliqués dans la sénescence (CDKN1A) et l'apoptose (BAX) lors d'un stress oncogénique¹⁶. D'autres altérations génétiques peuvent diminuer de façon importante l'activité de p53, notamment l'amplification du gène MDM2 qui, par l'action de type ubiquitine ligase de sa protéine, facilite la dégradation de p53¹⁷. De façon complémentaire à ces régulations génétiques, des mécanismes épigénétiques peuvent aussi intervenir dans les processus d'inactivation de la fonction de p53. Le locus INK4A codant les protéines p16INK4A et p14ARF est ainsi fréquemment inactivé de façon épigénétique dans les tumeurs. p14ARF est notamment impliquée dans la conversion des signaux de stress nucléolaires en une réponse activatrice de p53. Le stress oxydant et la forte sollicitation des processus de synthèses des ARNribosomiaux activés par les oncoprotéines favorisent l'apparition de ces stress nucléolaires en induisant des cassures de l'ADN plus spécifiquement au niveau des nucléoles. Ces cassures entraînent la formation de complexes entre les protéines p14ARF et MDM2, limitant la capacité de cette dernière à interagir avec p53 qui voit alors sa stabilité et son expression augmentées. L'inactivation épigénétique du locus INK4A permet donc de limiter l'activation de p53 en réponse au stress oncogénique¹⁸. Je tiens à souligner, que j'ai insisté ici sur l'exemple de p53, mais qu'il n'est bien sûr pas l'unique suppresseur de tumeurs et que ces processus d'inactivations de gènes ou des mécanismes suppresseurs de tumeurs se retrouvent pour d'autres protéines comme PTEN, celles appartenant à la voie Hippo, ou encore APC.

On peut ensuite s'intéresser au processus d'adaptation ou de limitation des stress homéostatiques induit par l'oncogène afin d'éviter la mise en place des mécanismes suppresseurs de tumeurs et de maintenir une homéostasie compatible avec la survie et la prolifération de la cellule. Le concept général sous-tendant ces mécanismes est de considérer que la cellule doit sortir d'un cadre métabolique rigide associé à sa fonction ou son identité, afin d'adopter de nouvelles configurations métaboliques plus propices à produire de la biomasse tout en limitant les stress connectés à cette production. Les mécanismes épigénétiques sont vraisemblablement aussi à l'œuvre dans ce contexte puisque l'identité et la fonction de nos cellules sont ancrées dans ces contrôles épigénétiques autorisant ou interdisant normalement l'expression de façon différentielle de régions spécifiques d'un génome commun à toutes nos cellules. Des remodelages épigénétiques observés à large échelle prennent ainsi place de façon précoce dans les cellules cancéreuses favorisant une plus grande souplesse phénotypique susceptible d'adapter le métabolisme des cellules aux contraintes homéostatiques imposées par l'oncogène. Ces concepts rejoignent les mécanismes connus sous le nom de plasticité cellulaire caractérisée phénotypique par une dédifférenciation cellulaire, rendant notamment plus facile la modulation métabolique par régulation de l'expression des gènes codant les enzymes ou les
transporteurs nutritifs impliqués dans les voies métaboliques. Les cellules les plus plastiques, celles aux plus grandes capacités de remodelage d'expression de leur génome, peuvent alors adopter plus facilement un métabolisme permettant de répondre au stress oncogénique. Ce stress associé à l'oncogène étant régulé, les mécanismes suppresseurs de tumeurs ne seront alors pas mis en place¹⁹. En résumé, une cellule cancéreuse est donc une cellule qui possède une suractivation anormale d'un ou plusieurs proto-oncogène(s) exacerbant alors les mécanismes de production de biomasse et de division cellulaire, et dans laquelle les stress homéostatiques ou leur conversion en des réponses suppressives de tumeurs sont atténués.

## 2. Développement macroscopique et hétérogénéité tumorale

Ayant vu les mécanismes impliqués dans l'initiation d'un processus tumoral, il est important de s'intéresser ensuite aux propriétés des tumeurs se développant à un stade macroscopique, et d'identifier dans ces propriétés quelles sont celles leur conférant une plus grande agressivité pour le patient. Les tumeurs sont notamment le plus souvent hétérogènes. Deux modèles principaux ont tenté d'expliquer l'origine et la dynamique d'acquisition de cette hétérogénéité tumorale, celui de « l'évolution clonale » et celui introduisant la notion de « cellules souches cancéreuses » que je détaillerai dans les prochaines parties. Nous verrons aussi que ces modèles ne sont pas mutuellement exclusifs et peuvent être compris dans un mécanisme plus général utilisant la notion de perte d'identité cellulaire. De façon schématique, on peut dire à ce stade que cette hétérogénéité prend sa source dans des phénomènes d'instabilités génétiques, caractéristiques des tumeurs, mais aussi dans la plus grande plasticité épigénétique et phénotypique des cellules cancéreuses qui découlent vraisemblablement très directement des processus initiaux de perte d'identité cellulaire pouvant être ensuite amplifiés lors du développement de la tumeur. Ces deux caractéristiques promeuvent l'émergence de cellules à fort potentiel adaptatif et donc résistantes aux nouvelles contraintes qu'elles peuvent rencontrer que ce soit dans le cadre du développement métastatique ou de la résistance aux traitements, les deux problèmes majeurs associés à la morbidité. L'instabilité génétique et la plasticité cellulaire ont donc des conséquences cliniques très importantes sur le développement de la maladie et comme nous le reverrons par la suite, voilà pourquoi mon projet de thèse s'est concentré sur la mise au point d'un nouvel outil pour mesurer ce paramètre de plasticité cellulaire dans l'espoir de mieux traiter les patients.

Avant de détailler ces concepts, il est important de préciser que dans le cadre de cette thèse je me suis intéressé à un cancer en particulier, celui du sein. Cette précision est importante, car les niveaux et les types d'hétérogénéités tumoraux observés dépendent très directement des cellules d'origines des tumeurs et des identités initiales des cellules qui les composent. Je commencerai donc par préciser les raisons m'ayant conduit à m'intéresser plus précisément aux cancers du sein et à rappeler quelques concepts développementaux et tissulaires importants pour comprendre l'identité de ces cellules mammaires.

Les tumeurs mammaires sont tout d'abord caractérisées par une forte hétérogénéité inter- et intrapatiente et peuvent être associées à une plasticité cellulaire élevée. Le groupement des patients par les outils de diagnostics existants permet la mise en place de traitements en lien avec l'appartenance à une classe pronostic (en fonction de critères histologiques et génétiques).
Malgré le bon pouvoir prédictif de ces outils, le manque d'information sur le niveau de plasticité cellulaire au sein des tumeurs fait que pour un même groupe, certaines patientes verront la stratégie thérapeutique insuffisante, car possédant quelques cellules très plastiques à l'origine des récidives, tandis que pour d'autres cette stratégie sera excessive avec des traitements aux effets secondaires réels afin d'éviter d'hypothétiques récidives qui ne se développeront jamais dues à l'inexistence de cellules plastiques. Le deuxième point pour lequel je me suis intéressé au cancer du sein, c'est qu'il est chez la femme celui de plus forte incidence (25% de l'ensemble des cancers) et qui se traduit, toujours chez la femme, par le taux de mortalité le plus élevé sur l'ensemble des cancers (15,5%)¹.

Concernant maintenant l'histologie et le développement du tissu mammaire, on peut tout d'abord préciser que la glande mammaire est composée de plusieurs systèmes sécréteurs tubulo-alvéolaires qui forment des lobules, eux-mêmes composant une structure plus grande, les lobes. Plusieurs lobes sont ensuite reliés au système de canaux dit galactophore permettant le drainage du lait jusqu'au mamelon. La glande mammaire est un épithélium organisé en bicouche cellulaire, les cellules myoépithéliales étant au contact d'une membrane basale et les luminales au contact de la lumière alvéolaire, l'ensemble entouré d'un stroma riche en adipocytes (Figure 2). Les cellules luminales sont impliquées dans la synthèse du colostrum et du lait lors des périodes de lactation tandis que les cellules myoépithéliales présentent des activités contractiles favorisant l'expulsion du lait dans les galactophores. Le processus de développement de ce tissu débute au cours de l'embryogenèse et se poursuit jusqu'au stade adulte, le tissu mammaire dérivant de l'ectoderme. La première étape est l'invagination de ce tissu formant alors des bourgeons. Ils se ramifient ensuite pour former des canaux primaires. Ces canaux vont croître de façon proportionnelle à l'individu, jusqu'à la puberté où l'action des œstrogènes permet une croissance rapide des glandes mammaires avec notamment l'ajout de nouvelles ramifications²⁰.

A

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

B

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

**Figure 2 : Histologie du tissu mammaire.** Le schéma représente les canaux (A) et les bourgeons terminaux (B). Les cellules myoépithéliales sont au contact de la lame basale tandis que les cellules luminales sont au contact de la lumière du tissu (d'après J.E. Visvader)²¹

Au niveau cellulaire le développement mammaire précoce est soutenu par des cellules multipotentes. Cette multipotence est à rapprocher du concept de plasticité précédemment décrit
pour les cellules cancéreuses à la différence près qu'elle constitue ici un caractère physiologique et non pathologique. Cette propriété est ensuite rapidement perdue après la naissance conduisant au maintien de progéniteurs unipotent soutenant respectivement la prolifération du lignage luminal ou basal, ce dernier étant à l'origine des cellules myoépithéliales. Ces progéniteurs unipotents vont ensuite rester fonctionnels durant la puberté et tout au long de la vie adulte²². J'aimerais souligner deux points intéressants sur la hiérarchie mammaire. Premièrement, c'est le caractère hybride de la signature génétique des cellules multipotentes. Cette signature possède la particularité de contenir simultanément des signatures luminales et basales²². Je reparlerai plus tard de cette notion d'état hybride de cellules plastiques que l'on retrouve dans un contexte tumoral et qui joue un rôle essentiel sur l'hétérogénéité tumorale. Le deuxième point que j'aimerais aborder porte sur la dynamique de la plasticité cellulaire dans un tissu sain. En effet, comme je l'ai indiqué précédemment, dans un contexte normal, l'intégrité du tissu mammaire est soutenue par des progéniteurs unipotents luminaux et basaux, engagés donc un processus différent de différenciation. Cependant, les progéniteurs basaux ont la capacité de se dédifférencier et de réacquérir un statut multipotent suite à une déplétion des cellules luminales. Ces dernières exercent donc un rétrocontrôle négatif permettant de maintenir l'engagement de ces progéniteurs basaux²³, cet engagement n'étant donc pas ancré de façon définitive dans un paysage épigénétique. D'autre part, dans ce contexte, l'acquisition du statut multipotent des progéniteurs basaux s'accompagne de la réacquisition d'une signature génomique hybride luminale et basale (Figure 3). Comme nous le verrons dans le prochain paragraphe, les cellules luminales peuvent dans un contexte tumoral acquérir de façon similaire ce statut multipotent. L'ensemble de ces observations permettent donc de mettre en lumière le lien entre plasticité cellulaire et dynamique phénotypique de la hiérarchie mammaire, ces concepts jouant un rôle important dans la compréhension des processus de transformation néoplasique prenant place au sein de ce tissu.

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

**Figure 3: Hiérarchie mammaire dans un tissu sain.** Durant l'embryogenèse et le développement juvénile, le développement de tissu mammaire est soutenu par les cellules aux caractères multipotentes. Suite à la puberté, les progéniteurs unipotents luminaux et basaux permettent de conserver l'intégrité du tissu tout au long de la vie de la femme. En absence de rétrocontrôle des cellules luminales sur les progéniteurs basaux, ces derniers peuvent réacquérir un phénotype multipotent pour redistribuer l'ensemble de la hiérarchie. (D'après Eunmi Lee *et al*.)²⁴
a) Hétérogénéité intertumorale

Les cancers mammaires possèdent une hétérogénéité intertumorale, avec des sous-
groupes cellulaires qui se caractérisent par des différences de réponses au traitement ou
d'évolution clinique. Traditionnellement, la classification s'effectue principalement par les
caractéristiques physiologiques du cancer avec notamment: la taille de la tumeur primaire,
l'envahissement des glandes lymphatiques, le grade histologique, ou encore le statut aux
récepteurs aux œstrogènes (ER pour « estrogen receptor »), aux récepteurs à la progestérone
(PR pour « progesterone receptor ») et au récepteur du facteur de croissance épidermique
humain 2 (HER2 pour « human epidermal growth factor receptor 2 »). Cependant, ces
caractéristiques sont insuffisantes pour la stratégie thérapeutique ou pour la compréhension des
mécanismes impliqués dans le développement et la progression tumorale. C'est pourquoi dans
les années 2000 avec l'avènement de la transcriptomique, des analyses d'expressions
génomiques ont permis de déterminer des signatures génétiques et de classifier les cancers du
sein en sous-groupe, tout en les associant à des paramètres cliniques tels que l'agressivité
tumorale ou encore la réponse aux traitements.

En premier lieu, il y a les tumeurs Luminal A et B, qui se définissent par une expression élevée des gènes associés aux cellules luminales de la glande mammaire. En raison de cette signature, il a été établi que ces tumeurs ont pour origine des cellules luminales différenciées. Elles sont souvent corrélées avec l'expression du récepteur aux œstrogènes et celui de la progestérone, et sont donc majoritairement (ER+, PR+). De plus sur l'ensemble des groupes, ces tumeurs sont corrélées avec le niveau d'agressivité tumorale et de métastase le plus faible, et ont une excellente réponse aux traitements hormonaux<sup>25,26</sup>.

Le second groupe représente les tumeurs qui ont un enrichissement de l'oncogène HER2, on
parle cette fois-ci de tumeur HER2+. Ces tumeurs ont une forte agressivité en lien avec une
vitesse de prolifération très importante. Cependant, grâce au développement d'anticorps
humanisés anti-HER2 bloquant le signal de ce récepteur et en raison de la dépendance de ces
cellules à l'activité de HER2, ces tumeurs ont une excellente réponse à ce type de traitement de
cytotoxicité cellulaire anticorps-dépendante<sup>25,26</sup>.

Le troisième groupe correspond aux tumeurs ayant pour signature génétique celle de la couche basale de la glande mammaire, zone où sont localisées les cellules myoépithéliales et progénitrices basales et qui peuvent sous certaines conditions réacquérir un statut plus plastique, multipotent. Ces tumeurs sont principalement des tumeurs de type triples négatives n'exprimant pas ER, PR et HER2 et sont nommées Basal-like<sup>25,26</sup>. À la différence des tumeurs Luminal, elles sont extrêmement agressives et avec un fort potentiel métastatique. De plus étant triples négatifs, leurs réponses aux traitements hormonaux ou de cytotoxicité induite par des anticorps ciblant HER2 sont très limitées. L'origine de ces tumeurs peut être diverse, elle peut provenir des cellules basales, mais aussi des cellules luminales dans lesquelles des mutations oncogéniques réactivent l'état multipotent. Pour soutenir cette hypothèse, je prendrai pour exemple les mutations sur *BRCA1* et *PI3KCA*. Les premières évidences que les cellules progénitrices luminales pouvaient être les cellules d'origines de ce type de cancer étaient démontrées dans un contexte où les cellules portaient une mutation sur le gène *BRCA1*<sup>27</sup>. En effet, cette mutation, joue un rôle très important sur l'intégrité génomique, mais aussi sur la
différenciation mammaire avec un rôle pro-différenciant²⁸. Ainsi lorsqu'une femme possède une mutation sur ce gène, les cellules mammaires sont plus prônes à perdre leur identité différenciée et de gagner des caractères plus souches, proches de ceux des progéniteurs basaux multipotents²⁹. De la même manière, une mutation sur le gène PI3KCA couplé avec la protéine P53 mutée permet l'acquisition d'un état multipotent des cellules luminales formant alors des tumeurs Basal-like hétérogène³⁰. Ainsi l'acquisition de mutations au niveau des cellules luminales permet d'outrepasser des mécanismes de différenciations et d'acquérir un phénotype plastique qui comme nous l'avons vu avait pour origine les progéniteurs unipotents basaux en temps normal²³.

Le quatrième groupe correspond au sous-groupe normal-like. Tout comme les Basal-like, ceux sont principalement des tumeurs triples négatives avec des signatures d'expression de gènes caractéristiques du tissu adipeux et d'origine non épithéliale<sup>25,26</sup>. Cependant, il est à noter que la véracité de ce sous-groupe est remise en question, car refléterait un artefact technique dû à une contamination des échantillons par le stroma<sup>31</sup>.

Enfin le dernier groupe, les tumeurs Claudin-low ont été décrites a posteriori, par l'analyse de tumeurs rares métaplasiques. La métaplasie est une réponse physiologique lors d'une agression du tissu qui peut aboutir à un changement phénotypique d'une cellule différenciée en un autre type de phénotype. Dans ce type de tumeur, on peut ainsi retrouver des cellules cancéreuses aux caractéristiques de cellules de sarcomes, ou encore ceux de cellules de types chondroïdes ou osseuses. Cette grande hétérogénéité cellulaire sous-entend la mise en place de processus de transdifférenciation par l'acquisition d'une plasticité cellulaire élevée. Ces tumeurs ont aussi pour caractéristiques d'être triples négatives et très agressives. Leurs signatures sont associées notamment à la perte de l'expression des protéines des jonctions cellulaires (les claudines), mais aussi un enrichissement des marqueurs de cellules souches et du processus épithélionésenchymateux<sup>32,33</sup>.

Il est ainsi intéressant de voir qu'à travers cette classification, l'existence d'un lien entre l'agressivité tumorale et le niveau de différenciation cellulaire (Figure 4). Pour mettre en relief ce lien, je vais maintenant décrire l'hétérogénéité cellulaire au sein même d'une tumeur afin d'introduire la notion de perte d'identité cellulaire lors du processus tumorigénique, puis dans un second temps développer les processus en lien avec ce mécanisme.
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 4 : Probables origines des différents sous-groupes des cancers mammaires.** Les sous-groupes Luminal A et B caractérisés par un niveau de différenciation importante auraient pour origines les cellules luminales différenciées. Les sous-groupes HER2 et Basal-like sont le plus souvent corrélés avec une signature moins différenciée qui pourrait traduire une origine des cellules bipotentes ou après la mise en place de mécanismes de dédifférenciation des cellules luminales. Le sous-groupe Claudin-low quant à eux par la plasticité élevée de ces cellules aurait pour origines des cellules aux caractères souches (d'après A. Prat et C.M. Perou)³⁴</figcaption></figure>

b) Hétérogénéité intratumorale

En plus de la diversité intertumorale, il existe au sein même des tumeurs une hétérogénéité phénotypique des cellules cancéreuses qui la constitue. C'est durant la seconde moitié du XXe siècle que la question de l'origine de l'hétérogénéité intratumorale a commencé à être étudiée donnant naissance à deux modèles.

Le premier correspond à l'évolution clonale, qui se base sur une vision évolutive darwinienne. Dans le cadre de ce modèle, l'initiation tumorale s'installe lorsque de multiples mutations ont eu lieu au sein d'une cellule, lui conférant un avantage prolifératif face aux cellules saines. Lors de la progression tumorale, l'instabilité génétique et la prolifération incontrôlée permettent de façon stochastique l'émergence de nouvelles mutations se traduisant par de nouveaux clones de caractéristiques phénotypiques différents. Ces clones sont exposés à différentes pressions environnementales (disponibilité en nutriment, pH de l'environnement, traitement médicamenteux, etc.) qui permettent la sélection de clones les plus aptes à survivre dans leur environnement. Ce processus dynamique est relié à la disparation et l'émergence de clones au cours du temps et est dépendant de leur localisation au sein de la tumeur, résultant à une architecture sous clonal complexe³⁵,³⁶.

Le second modèle correspond à celui des cellules souches cancéreuses. Il a notamment émergé dans les années 90 lorsque des travaux sur des cellules de leucémie myéloïde aiguë ont montré que seule une population cellulaire souche rare (CD34+/CD38-) pouvait initier dans des souris immunodéficientes une leucémie et redonner par différenciation l'ensemble des populations de
celle d'origine tout en respectant une hiérarchie phénotypique³⁷,³⁸. Ce modèle admet donc l'existence d'un sous-groupe cellulaire au sein de la tumeur qui possède des propriétés de cellules souches et qui serait à l'origine de l'initiation tumorale, la progression et la réémergence tumorale. Ces cellules souches cancéreuses primitives auraient comme propriétés d'avoir la capacité de s'autorenouveler indéfiniment ainsi que de se différencier, passant par une identité progénitrice jusqu'à une identité terminale fonctionnelle rigide, en suivant des trajectoires définies reconstituant ainsi l'ensemble des populations tumorales. À la façon du tissu sain, la cellule souche cancéreuse, indifférenciée, se situerait au sommet d'une hiérarchie cellulaire qui lors de processus de différenciation peut restituer la masse tumorale constituée alors de différents types de cellules à différents stades de différenciation. Par leur nature souche, ces cellules ont une capacité à réarranger leur phénotype, permettant ainsi leur adaptation lorsqu'une pression de sélection survient dans leur environnement. On parle alors de plasticité phénotypique cellulaire. Cette adaptation se transmet alors aux cellules filles différenciées entraînant l'émergence d'un ensemble de cellules résistantes à cette pression, qui permet alors le développement tumoral. De plus par cette adaptabilité phénotypique, les cellules souches cancéreuses seraient à l'origine de métastases, mais aussi de la réémergence tumorale due à des traitements usuels non spécifiques de ces cellules ou par la mise en place de résistances thérapeutiques³⁸.

De la même manière que le système hématopoïétique, le tissu mammaire suivrait une hiérarchie cellulaire. L'existence de cellule souche cancéreuse au sein de tumeur mammaire a été établie dans un premier temps par l'expression d'un marqueur de surface, CD44, qui est l'une des principales protéines d'adhésions de surface et très tôt reliées au processus de métastase par son rôle dans les processus d'adhésion, de migration, de signalisation et de prolifération³⁹. C'est avec les travaux d'Al-Hajj et de ses collègues qu'il a été montré que des cellules cancéreuses mammaires, qui ont pour phénotype l'expression de CD44 et l'absence du marqueur de cellule mammaire différenciée CD24, pouvaient après injection dans des souris immunodéficientes redonner des tumeurs. Tout comme les cellules souches cancéreuses des leucémies myéloïdes aiguës, ces cellules CD44⁺/CD24⁻ sont capables en plus de l'initiation tumorale de régénérer l'hétérogénéité cellulaire de la tumeur initiale, donnant pour conclusion que ces cellules ont des propriétés de cellules souches cancéreuses⁴⁰. D'autres marqueurs de cellules souches ont été décrits dans les tumeurs mammaires. Sans faire une liste exhaustive, on peut parler de l'aldéhyde déshydrogénase 1 (ALDH1) qui est le second marqueur mis en évidence. En effet sa surexpression est corrélée avec la capacité tumorigénique des cellules lorsqu'elles sont injectées dans des souris immuno-déficiente⁴¹. Enfin c'est avec les travaux de X. LI et ses collègues, mais aussi H.E Lee et ses collègues, qu'il a été montré que ces cellules CD44⁺/CD24⁻ exprimant fortement l'ALDH1 avait une capacité de résistance thérapeutique, confirmant l'une des propriétés reliées aux cellules souches cancéreuses⁴²,⁴³

Les marqueurs que nous venons de voir et qui décrivent notamment des cellules aux propriétés souches ont été utilisés pour des analyses immunohistochimiques des sous-groupes du cancer mammaire. Le premier constat, qui semble instinctif, est une corrélation entre le niveau de cellules CD44⁺/CD24⁻ et les tumeurs Basal-like, à l'inverse le niveau d'expression de CD44 est beaucoup plus faible dans les tumeurs luminales avec en parallèle une augmentation de l'expression de CD24⁴⁴. Dans une seconde étude, des travaux similaires ont été effectués avec
une combinaison de multiples marqueurs des différents sous-groupes, mais cette fois-ci en prenant en considération le grade histologique des tumeurs, carcinome ductal *in situ* (CDIS) ou carcinome ductal invasif (CDI) qui représente un grade plus avancé de la tumeur avec notamment un front de migration de cellules ayant passé la membrane basale. De la même façon que précédemment, les tumeurs Basal-like ont des populations aux caractères souches CD44⁺/CD24⁻ plus importantes que les tumeurs luminales A et B, ainsi qu'une population ALDH1⁺ plus importante. De plus au sein des tumeurs Basal-like cette population est aussi corrélée au grade de la tumeur avec une proportion plus importante dans les CDI. Enfin, point intéressant, ces populations souches sont corrélées à l'expression de la vimentine marqueur reliée à un processus jouant un rôle sur la plasticité phénotypique des cellules épithéliales en modulant leur identité cellulaire, la transition épithélio-mésenchymateuse. Je reviendrai plus en détail sur ce processus dans une prochaine partie. À l'inverse on constate que les populations CD44⁺/CD24⁺ sont quant à elles corrélées avec l'expression d'un facteur de transcription essentielle pour la mise en place de la différenciation luminale des cellules mammaires, GATA3⁴⁵. On remarque alors qu'il existe un lien entre l'hétérogénéité intertumorale et intratumorale avec un niveau de population aux caractères souches plus importante au sein des tumeurs Basal-likes que les tumeurs luminales. La mise en place de processus jouant sur l'identité cellulaire semble avoir un rôle pour la modulation du phénotype de la cellule mammaire, lui conférant alors des propriétés souches (Figure 5). Une autre observation, effectuée par la même équipe, met en lumière la modulation dynamique de l'identité cellulaire lors du processus de tumorigenèse. En effet, alors que dans des tumeurs *in situ* la composition cellulaire est majoritairement CD44⁺/CD24⁻, on retrouve au sein des métastases des mêmes patients une augmentation significative de cellules exprimant le marqueur de surface CD24. Malgré un échantillonnage assez faible de huit patients, il est intéressant d'observer que les cellules métastatiques semblent avoir un caractère plus différencié, avec une réexpression de CD24, que les cellules de la tumeur d'origine⁴⁶.

Historiquement, le modèle de cellule souche cancéreuse décrivait une hiérarchie unidirectionnelle et irréversible de la cellule dite souche au sommet, aux cellules différenciées aux bases des branches de différenciation. Cependant, il est à noter que cette hiérarchie serait plutôt bidirectionnelle, avec une réversibilité du processus de différenciation. Ainsi des cellules différenciées peuvent dans certains contextes déclencher un processus de dédifférenciation et acquérir des propriétés de cellule souche cancéreuse. Ce processus dynamique est alors relié au concept de plasticité phénotypique, dans lequel des modifications génétiques et épigénétiques peuvent moduler l'identité cellulaire de la cellule lui donnant des propriétés nécessaires pour survivre à une pression de sélection. Ce qui est intéressant avec ce concept, c'est qu'il permet partiellement de relier le modèle de l'évolution clonale et celui des cellules souches cancéreuses. En effet, des mutations ponctuelles au sein de cellules différenciées peuvent induire l'acquisition de capacités souches. En revenant sur l'exemple donné de la possible origine des tumeurs Basal-like, c'est une mutation ponctuelle de *BRAC1* ou de *PI3KC* au sein des cellules mammaires qui entraîne une altération du processus de différenciation, autrement dit de l'identité cellulaire, conférant des propriétés plus souches ou du moins l'acquisition de caractères de progéniteurs multipotents²⁹,³⁰. Dans ce contexte, les cellules souches cancéreuses ne seraient alors qu'une représentation visible d'un phénomène dynamique de la modulation de
l'identité cellulaire. Or le terme cellule souche tumorale décrit un état plastique au phénotype rigide au sommet d'une hiérarchie, il semble alors cohérent d'utiliser le terme de cellules cancéreuses dynamiquement dédifférenciées (CCDD) qui serait plus en adéquation avec ces cellules à forte plasticité.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 5 :** La dynamique phénotypique permettant l'acquisition d'un phénotype CCDD. Représentation schématique de la dynamique de la plasticité cellulaire par des mécanismes de différenciation/dédifférenciation. Les marqueurs phénotypiques classiquement utilisés pour discriminer les différentes populations sont représentés CD44, CD24, ALDH (d'après A.J Cole et al.)⁴⁷</figcaption></figure>

**3. Perte d'identité cellulaire et plasticité, support du développement tumoral**

Dans cette partie, je vais contextualiser l'initiation et l'évolution tumorale en abordant l'importance de l'identité cellulaire et du processus de plasticité. Pour mettre en relief mes propos et comme ouverture, je vais tout d'abord parler des travaux de Ruba Halaoui et al.⁴⁸. En effet ils ont mis en évidence à partir de coupes histologiques de patients à différents niveaux de la tumorigènèse que la déstructuration morphologique du tissu était accompagnée d'une perte de polarité cellulaire. Cette polarité étant l'un des marqueurs d'identités cellulaires épithéliales le plus important⁴⁹. De plus ces modifications tissulaires et cellulaires étaient corrélées avec l'avancée du carcinome (Carcinome ductal in situ et Carcinome ductal invasif), et de façon plus intéressante que cette perte était aussi corrélée en amont du carcinome, dès les premières lésions prénéoplasiques (Hyperplasie ductale atypique). Autre point important, ils ont pu montrer chez la souris que l'induction de l'expression de l'oncogène PyMT entraînait le même phénotype que celui observé chez les patients avec un continuum de déstructuration de l'architecture tissulaire et de perte de polarité cellulaire jusqu'à l'obtention d'un carcinome où les pertes de structure et de polarité sont totales. C'est avec un modèle où l'expression de l'oncogène est contrôlée qu'ils ont mis en évidence, que l'arrêt de son expression entraînait une réversion phénotypique avec une reformation de structures (lumens) et une repolarisation des cellules mammaires. Cette réversion s'effectue par l'induction de l'apoptose des cellules formant la
tumeur, avec pour seules cellules résistantes celles les plus à l'extrémité, en contact avec le stroma, ce qui sous-entendant l'existence d'une régulation au niveau de la membrane basale. On peut observer avec cet exemple deux points qui permettront de postuler mon hypothèse. Le premier, mineur du point de vue de mes travaux, qui montre l'importance de contextualiser la tumorigenèse dans un cadre tissulaire et son probable rôle oncosuppresseur. Le second, plus important dans cette thèse, l'évolution tumorale allant de l'étape prénéoplasique à un carcinome invasif s'accompagne d'une perte progressive de la polarité des cellules mammaires, autrement dit le processus de tumorigenèse s'accompagne d'une perte d'identité cellulaire.

Partant de ces deux points, nous pouvons poser un cadre afin de définir la plasticité cellulaire et la perte d'identité cellulaire lors du processus de tumorigenèse. Lorsque l'individu est adulte, les cellules constituant le tissu se retrouvent dans un état différencié. Un ensemble de mécanismes, notamment au niveau du tissu, permettent le maintien de leur identité essentiel pour la physiologie de l'organe via des contraintes qui empêchent de possibles modifications profondes de l'expression du génome. À l'inverse lors de l'atteinte du tissu dû à des agressions diverses (blessures physiques ou inflammatoires), la levée de ces contraintes permet la mise en place de processus régénératifs et/ou cicatriciels par remodelage épigénétique<sup>50</sup>. La cellule acquiert alors une plasticité cellulaire qui lui permet après une phase de perte d'identité la possibilité de reconstituer le tissu. Cette contrainte tissulaire sur l'identité cellulaire est très bien caractérisée dans les travaux de Van Keymeulen et al.<sup>51</sup>. En temps normal chez une adulte lorsque le tissu est au repos, la hiérarchie structurale des populations cellulaires est linéaire et programmée pour un axe de différenciation. On retrouve alors deux types de progéniteurs unipotents permettant le développement respectif des cellules luminales et myoépithéliales. Pourtant, lorsque les progéniteurs myoépithéliaux sont transplantés seuls dans des souris syngéniques, ils acquièrent la capacité de se différencier en cellules myoépithéliales ainsi qu'en cellules luminales. Cette observation peut s'expliquer du fait que chez l'adulte, les cellules myoépithéliales gardent au niveau de leur configuration chromatinienne une accessibilité aux gènes de la lignée luminale, et que lorsque l'environnement tissulaire des cellules se retrouve modifié, ici par la manipulation en elle-même, les contraintes exercées sur l'identité de ces cellules se voient levées<sup>52</sup>.

Cependant, ce processus de plasticité phénotypique, qui est essentiel pour des organismes à durée de vie longue comme l'Homme, peut s'avérer délétère lorsqu'il est anormal. Ce remaniement épigénétique anormal joue alors un double rôle, premièrement il peut être directement associé à des mécanismes de plasticités essentiels pour l'activation et l'inactivation des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur<sup>53</sup>. Et comme second rôle, celui qui nous intéresse dans le cadre de ces travaux, le contexte épigénétique global et donc l'identité cellulaire, serait des éléments clés pour l'adaptation au processus de transformation néoplasique en augmentant la résilience de la cellule à supporter le stress oncogénique. Les remaniements épigénétiques, liés au processus de plasticité cellulaire, permettraient, dans cette hypothèse, d'augmenter le champ des possibles par un élargissement du répertoire transcriptomique afin de moduler rapidement son répertoire enzymatique et de rétablir l'homéostasie de la cellule. En effet, la nature stochastique de l'expression du génome semble aujourd'hui bien établie<sup>54</sup> et jouerait un rôle sur l'acquisition d'une identité cellulaire par la réduction déterministe de ce champ des possibles<sup>55,56</sup>. Ainsi dans un contexte de processus de transformation néoplasique,
la probabilité d'acquérir un profil transcriptomique en adéquation avec ce processus serait plus forte au sein de cellules dotées d'une plus grande plasticité. Il est intéressant de voir en lien avec ce concept que chez l'adulte les cellules de types progéniteurs luminaux ont une configuration chromatinienne la plus accessible et proche des cellules mammaires fœtales. De plus comme nous l'avons vu ultérieurement, ce type cellulaire serait à l'origine des cancers les plus précoces et les plus agressifs de type Basal-likes, ce qui est renforcé par des signatures transcriptionnelles proches<sup>55,57</sup>. Nous pouvons alors concevoir que le processus de plasticité lié à la perte d'identité cellulaire permet par l'augmentation du répertoire transcriptomique une modulation des conséquences homéostatiques de l'oncogène lors de la formation tumorale afin de supporter les stress métaboliques associés. Mais aussi dans un second temps permettre une adaptation phénotypique à des modifications environnementales (résistance thérapeutique, résistance à l'anoïkis ou encore l'adaptation à un nouvel environnement tissulaire), qui se traduit par l'observation expérimentale de cellules cancéreuses aux caractères souches<sup>19</sup>.

#### 4. La transition épithélio-mésenchymateuse perturbateur majeur de l'identité épithéliale

Le programme de plasticité cellulaire, notamment des cellules épithéliales, le mieux caractérisé permettant la modulation de l'identité cellulaire est la transition épithélio-mésenchymateuse, ou en anglais *epithelial-mesenchymal transition*. Par commodité et pour simplifier la lecture, j'utiliserai dorénavant le diminutif anglais: EMT. La fonction majeure de ce programme est d'inhiber l'expression des protéines essentielles à la formation des jonctions entre les cellules épithéliales, entraînant alors la perte de leur polarité et en gagnant en parallèle des caractéristiques mésenchymateuses. L'activation de ce processus se fait notamment par des stimuli extracellulaires, qui entraînent alors des remodelages épigénétiques réversibles<sup>58</sup>. Si l'EMT était au départ caractérisée par un changement de phénotype épithélial/mésenchymateux, il s'avère maintenant bien caractérisé comme étant un continuum de phénotypes. Ce processus permet alors à la cellule d'acquérir un ensemble d'états allant d'un état complet épithélial à celui de cellule mésenchymateuse en passant par différents états intermédiaires plus ou moins stables épigénétiques nommés métastables, ou encore hybrides<sup>59</sup>. Seulement trois familles protéiques, qui sont tous des facteurs de transcriptions (EMT-TF), sont impliquées dans l'EMT (SNAIL, ZEB et TWIST)<sup>59</sup>. Ce qui définit ces facteurs de transcriptions est leur capacité à induire directement un programme transcriptomique réprimant les gènes liés à l'identité épithéliale, notamment ceux impliqués dans la polarité, les jonctions serrées ainsi que les jonctions d'adhésion<sup>60</sup>. Ainsi, l'expression du gène CDH1 codant pour l'E-cadhérine, protéine essentielle pour la formation des jonctions cellulaires, se retrouve directement réprimée lors de la fixation des EMT-TF sur les séquences régulatrices de ces gènes contenant de multiples domaines E-boxes<sup>61,62</sup> (Figure 6).
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 6: Le continuum de l'EMT corrélé à la plasticité cellulaire.** La figure représente les états extrêmes avec une acquisition d'une identité épithéliale ou mésenchymateuse, avec entre ces deux extrêmes différents intermédiaires métastables (d'après W. Li et Y. Kang)⁶³</figcaption></figure>

En faisant le lien avec le modèle des cellules souches tumorales défini précédemment, l'équipe de R.A. Weinberg ainsi que celle d'A. Puisieux, ont pu mettre en évidence que le programme de l'EMT permet aux cellules d'acquérir un phénotype souche, avec un changement phénotypique passant de celui de cellules mammaires différenciées CD24⁺/CD44⁻ à celui de cellule souche CD24⁺/CD44⁺. De plus ce changement phénotypique s'accompagne, lorsqu'un oncogène est exprimé dans ces cellule, de l'obtention des caractéristiques associées aux cellules souches notamment un pouvoir tumorigénique plus important en comparaisons des cellules n'ayant subies aucune modification de leur identité cellulaire⁶⁴⁻⁶⁶. Dans un second temps il a été démontré que les EMT-TF pouvaient également agir comme activateur transcriptionnel en formant des complexes avec d'autres facteurs de liaison à l'ADN. Ainsi il a pu être démontré dans le modèle du cancer du sein que l'EMT-TF ZEB1 pouvait avec le facteur de transcription YAP former un complexe ZEB1/YAP, permettant ainsi la modulation d'expression d'un set de gènes augmentant les propriétés souche et de résistance aux traitements⁶⁷. Le processus d'EMT a été décrit dans un premier temps lors du développement embryonnaire, où l'importance de la plasticité et du remodelage de l'identité cellulaire est essentielle pour un développement normal⁶⁸. Tandis que, chez l'adulte sain l'EMT est activée lors du processus de cicatrisation et de régénération tissulaire, fortement liée à l'inflammation induite lors de l'atteinte de l'intégrité d'un tissu⁶⁹⁻⁷¹. Dans ce contexte, une réponse inflammatoire non résolue peut alors créer un microenvironnement propice à une fibrose tissulaire. Cette pathologie est alors supporter par l'induction de l'EMT dû à la libération de cytokines pro-inflammatoires des cellules de l'immunité innée, mais aussi l'activation des fibroblastes du stroma excréteur de facteurs de croissance, qui nous le verrons peuvent jouer un rôle lors du processus néoplasique⁷²,⁷³.

Dans le cadre du contrôle de l'identité épithéliale dans le contexte du développement tumoral, nous pouvons établir deux angles d'approches de l'EMT. Le premier, les signaux inducteurs de l'EMT et la cinétique de leur intervention lors des différentes étapes de la tumorigenèse. Le second, les conséquences de l'EMT sur ces différentes étapes. L'induction de ce processus et donc les mécanismes qui en sont à l'origine lors du développement tumoral ont pour origines
l'activation de récepteurs sensibles à des médiateurs solubles ainsi que des médiateurs membranaires, qui voient leur concentration corrélée au niveau de l'atteinte de l'organe. En lien avec le processus de cicatrisation nous retrouvons ainsi les facteurs de croissance tels que la superfamille TGFβ (*Transforming Growth Factor beta*)<sup>74</sup>. On retrouve aussi l'implication de voies de signalisations impliquées dans le processus de morphogenèse telles que NOTCH, WNT ou Hegehog, qui ont toutes été décrites pour leur rôle essentiel au développement embryonnaire<sup>75,76</sup>. Au niveau des inducteur de l'EMT nous pouvons aussi trouver celui lié au processus de l'inflammation avec notamment le recrutement des cellules immunitaires, qui jouant un rôle en deux temps, lors de l'induction du processus néoplasique et lors de la dissémination métastatique<sup>77-79</sup>. L'ensemble de ces processus sont tous des mécanismes de mise en place extrinsèque, où la communication entre les cellules tumorales et les cellules du stroma est essentielle pour la mise en place de l'EMT, son maintien et son renforcement. Tout en ayant en parallèle des mécanismes intrinsèques à la tumeur, notamment des altérations génétiques et épigénétiques jouant aussi un rôle essentiel pour la mise en place de ce programme de plasticité. Enfin, le dernier niveau d'induction que nous verrons est celui de l'impact des conditions biochimiques de l'environnement tumoral, on peut ainsi retenir l'hypoxie comme l'un des facteurs importants sur son induction (Figure 7).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 7: Facteurs solubles et leur voie de signalisation participant à l'induction du programme de l'EMT par l'activation des gènes des EMT-TF lors du développement tumoral (d'après B. Du et J.S Shim)<sup>80</sup></figcaption></figure>

Sur l'ensemble des facteurs essentiels au processus de cicatrisation, le TGFβ est probablement celui où son rôle a été le mieux caractérisé lors de l'induction de l'EMT. D'un point de vue moléculaire, la voie de signalisation de ce facteur de croissance est composée d'un récepteur qui par sa fixation avec son ligand permet la phosphorylation de SMAD2 et SMAD3. Cette phosphorylation entraîne alors la formation d'un complexe avec SMAD4. Ce complexe peut alors migrer au sein du noyau pour réaliser son rôle de facteur de transcription afin de réguler un grand panel de gènes impliqués dans l'acquisition d'un phénotype mésenchymateux. Dans ce set de gènes on retrouve ceux des EMT-TF par une régulation positive de façon directe pour Snail1 et Snail2, on parle alors de mécanisme Smad dépendant<sup>79,81</sup> et de façon indirecte pour
Zeb1 (la protéine Zeb1 ayant pour ancien nom deltaEF1)⁸²et Twist1⁸³. Il est intéressant de noter qu'après la mise en place de l'EMT par l'expression des EMT-TF qu'un mécanisme de rétrocontrôle positif se met en place, notamment par une augmentation de production de TGFβ par les cellules qui par effet autocrine permet le maintien du programme d'EMT⁸⁴. D'autres réponses, au nombre de trois, dites Smad indépendante peuvent s'effectuer lors de la fixation de TGFβ sur son récepteur, pouvant alors activer une réponse MAPK, Rho GTPases ou PI3K/AKT⁸⁵. Nous verrons par la suite que ces voies Smad-indépendantes jouent aussi un lien pour l'induction du processus EMT. Enfin dernier point sur les mécanismes moléculaires de l'induction des voies par TGFβ, qui est la régulation de l'expression de microARN et les longs ARN non codants. La famille de miR-200 est un exemple de régulateur négatif de ZEB1, qui est lui-même négativement contrôlé par ZEB1, avec une existence d'une balance miR-200/ZEB1. Comme nous l'avons vu, l'induction des EMT-TF entraîne une boucle positive autocrine de TGFβ, cette boucle joue alors un rôle sur le maintien de l'EMT. En effet, l'induction du signal de TGFβ permet la répression de miR-200, qui sur le long terme permet l'hyperméthylation réversible de loci de miR-200 et donc un maintien de sa répression, déséquilibrant la balance miR-200/ZEB1 sur le maintien du programme d'EMT⁸⁶. En se replaçant maintenant dans des conditions physiologiques, il est intéressant de souligner que des niveaux élevés de TGFβ sont associés lors de fibroses pathologiques, et sont alors un environnement propice pour le développement tumoral. Dans ces conditions pathologiques, TGFβ se retrouve libéré de façon importante par les fibroblastes du stroma, ce qui participe au maintien de la fibrose⁸⁷. Autre que son rôle possible en amont de la transformation néoplasique, la concentration de TGFβ augmente aussi lors du développement tumoral, cette augmentation de concentration étant étroitement liée par les mécanismes d'activation du stroma par le stress associé au développement de la tumeur (diminution du pH, hypoxie, stress oxydant, déplétion nutritive)⁸⁸. L'activation des fibroblastes en myofibroblastes potentialise alors le processus d'EMT, la progression tumorale ainsi que la migration métastatique, l'exemple chez la prostate montrant très bien la progression des lésions hyperplasiques de la prostate en carcinome invasif ainsi que métastatique⁸⁹. Dans ce contexte, le TGFβ a une double fonction, la première, le maintien du phénotype activé des fibroblastes et le second comme nous l'avons vu, l'activation du processus de l'EMT ou du moins pousser sur sa mise en place⁹⁰.

En lien, nous allons le voir, avec TGFβ, la voie WNT joue aussi un rôle sur la mise en place du programme de l'EMT. Cette voie moléculaire se définit par une réponse de la fixation de l'un des 19 ligands de la famille Wnt avec l'un des récepteurs membranaires de la famille de Frizzled. Cette voie comporte en réalité trois voies de signalisation, la voie canonique, celles non canoniques calcium dépendant et la dernière, la voie de polarité cellulaire planaire non canonique⁹¹. La voie canonique, la mieux étudiée, joue un rôle important sur le programme d'EMT. Cette voie est définie par l'activation de la β-caténine cytosolique par sa translocation dans le noyau. La liaison d'un ligand WNT sur un récepteur Frizzled, permet l'inhibition de GSK3β, et ainsi lever son activité kinase sur la β-caténine, n'étant plus phosphorylée, la protéine n'est alors plus ubiquitinylée et dégradée, permettant alors sa translocation dans le noyau et ainsi servir de cofacteur pour la régulation d'un ensemble de gènes impliqués dans la différenciation cellulaire, l'orientation phénotypique de différenciation, ainsi que la prolifération⁹². Au niveau de l'induction de l'EMT, des expériences *in vitro* ont montré que le
ligand WNT3A par son induction de la voir canonique, permet l'expression de TWIST, SLUG ainsi que la N-Cadhérine tout en réprimant l'E-Cadhérine dans des cellules cancéreuses mammaires HER<sup>+93</sup>. Dans une autre expérience, il a été montré que la mise en place de l'EMT par ZEB1 dans la région invasive du carcinome colorectal s'effectue préférentiellement au sein des cellules qui ont eu en amont une translocation de la β-caténine, mettant en lumière son rôle sur la mise en place du processus d'EMT<sup>94</sup>. Enfin la β-caténine en plus de son rôle régulateur de SNAIL<sup>95</sup>, il peut par son interaction avec l'EMT-TF potentialiser son activité sur les gènes régulés par la voie WNT<sup>96</sup>. De plus, il est intéressant de voir que la voie du TGFβ et celle de WNT canonique sont étroitement liées lors du processus d'EMT. Ce lien étant très bien mis en évidence sur des travaux de Kelly J. Gauger *et al.* Dans cette étude, ils mettent en évidence que la sous-expression de la protéine SFRP1, un régulateur négatif de la voie WNT par interaction avec les protéines Wnt et par formation de complexe inactif avec les récepteurs Frizzled<sup>97</sup>, permet dans des cellules mammaires tumorales *in vitro* une augmentation de la sensibilité à l'induction de l'EMT par la voie du TGFβ, mettant ainsi en lumière une coopération entre ces deux voies<sup>98</sup>. À l'inverse, la voie du TGFβ semble aussi potentialiser celle de WNT par la restructuration du cytosquelette de la cellule et de la perte de polarité induite lors de son induction. Comme nous l'avons vu lors de l'induction de la voie TGFβ, l'une des voies de signalisation possible était celle de Rho GTPases. Son activation a pour conséquence un remodelage du cytosquelette, la formation de lamellipode et de filopode, notamment par l'induction rapide de l'expression de RHOA<sup>99</sup>. Cependant, il est intéressant de voir qu'au niveau des cellules épithéliales, polarisées, le récepteur II de TGFβ a tendance à se situer au niveau apical de la cellule tout particulièrement au niveau des jonctions serrées. Il peut alors lors de sa fixation avec son ligand phosphoryler PAR6 permettre le recrutement d'une ligase d'ubiquitine E3, SMURF1, qui va lui-même et de façon locale ubiquitinyler RHOA et ainsi entraîner via la dégradation de RHOA, la déstabilisation des jonctions serrées<sup>100</sup>. Cet ensemble de remodelage de la polarité cellulaire et donc de l'identité épithéliale semble faire écho aux travaux de Ruba Halaoui *et al.* expliqués précédemment avec la mise en évidence d'une diminution de polarité lors d'une hyperplasie mammaire. De plus, cette perte de polarité s'accompagne aussi de la perte des jonctions adhérentes. Or, le complexe protéique de ces jonctions nécessite l'interaction entre l'E-Cadhérine ainsi que de la β-caténine. Il est alors assez intuitif que lors d'une induction du processus de l'EMT par TGFβ la déstructuration par la diminution de l'expression de l'E-Cadhérine permette en parallèle d'augmenter la quantité de β-catinines libre dans le cytosol, essentiel à l'induction de la voie WNT.

En plus de la voie WNT, la voie NOTCH qui a la capacité d'induire le processus d'EMT, coopère aussi avec celle du TGFβ. Cette voie est impliquée dans le contrôle de la décision de l'orientation phénotypique de différenciation des cellules, la différenciation ainsi que la prolifération. D'un point de vue moléculaire, les récepteurs membranaires NOTCH, au nombre de quatre, déclenchent lors de leur fixation avec leurs ligands (les familles Delta-like et Jagged) un mécanisme de *shedding*. Ce mécanisme protéolytique permet du cliver la partie intracellulaire de NOTCH, cette partie cytosolique libre étant actif va ensuite être transloquée dans le noyau qui par son association avec différents partenaires permettre l'expression d'un set de gènes<sup>101</sup>. Tout comme les deux autres voies, celle de NOTCH joue un rôle lors de développement embryonnaire notamment en permettant la mise en place du processus de
l'EMT¹⁰². Son implication dans un contexte tumoral a été aussi mise en évidence¹⁰³. Cette voie peut activer l'EMT par sa régulation directe d'EMT-TF, tout particulièrement SNAIL¹⁰⁴ et SLUG¹⁰⁵. Comme je l'ai dit en introduisant la voie NOTCH, cette voie a aussi une coopération avec la voie du TGFβ lors de la mise en place du programme d'EMT. Cette coopération s'effectue principalement par des associations directes entre la forme cytosolique de NOTCH avec les facteurs SMAD, permettant le contrôle de l'expression de gènes¹⁰⁶. Dans un contexte de fibrose, l'induction de la voie du TGFβ entraîne une augmentation de l'expression de Jagged1, l'un des ligands majeurs de cette voie, soutenant alors de façon autocrine l'état pathologique du tissu¹⁰⁷. Il est à noter que la collaboration entre les voies NOTCH et du TGFβ semble plus complexe qu'une co-activation similaire entre chaque isoformes du récepteur NOTCH. En effet, il a été montré que dans le tissu épithélial œsophagien que dans le tissu sain l'activation de NOTCH1, suivie de celui de NOTCH3 permet la différenciation terminale de l'épithélium stratifié. NOTCH3 à l'inverse de NOTCH1 a tendance à réprimer le processus de l'EMT, permettant ainsi d'acquérir le phénotype différencier de l'épithélium. Or, dans un contexte tumoral, notamment au niveau du front d'invasion de la tumeur où se situe la concentration élevée de TGFβ sécrété par les cellules du stroma, l'activation de la voie du TGFβ permet la mise en place du processus de l'EMT, via l'augmentation de l'expression de Zeb1 qui va lui-même réprimer l'expression de Notch3. Ces cellules ayant l'incapacité de finir leur processus de différenciation et donc d'acquérir une identité cellulaire voient leur statut indifférencié bloqué, leur conférant alors un statut de cellule cancéreuse dynamiquement dédifférenciée¹⁰³.

Enfin la dernière voie que je développerai, qui est aussi essentielle pour le développement embryonnaire et qui a aussi la capacité d'induire le processus de l'EMT, est la voie Hedgehog. Cette voie se caractérise par une famille de protéines solubles extracellulaires nommée Hedgehog. Cette famille est composée de trois protéines qui exercent des fonctions différentes, nous avons Sonic Hedgehog (SHH), Indian Hedgehog (IHH) et Desert Hedgehog (DHH). SHH est celui qui est le plus connu des trois, notamment pour son rôle dans le développement embryonnaire. Après une diffusion dans l'organisme qui peut être s'effectuer sur de longue distance, SHH peut se fixer à son récepteur membranaire PTC au niveau de la membrane plasmique de la cellule. Ce récepteur PTC a comme fonction lorsqu'il n'est pas lié à SHH, de se fixer à une autre protéine membranaire SMO inhibant ainsi son activation. Lorsque SHH se fixe à PTC, le changement structural de la protéine permet son détachement à SMO et peut exercer sa fonction induisant une voie de phosphorylation jusqu'à l'activation du facteur de transcription GLI. Ce facteur de transcription a notamment la capacité de réguler positivement l'expression de Snail1 qui permet alors la mise en place du processus de l'EMT¹⁰⁸. Enfin il est à noter qu'il existe une activation de GLI1 et 2 indépendante de la voie de Hedgehog, et qui s'effectuerait via l'activation de la voie du TGFβ dépendante aux protéines SMAD¹⁰⁹.

En plus des voies que nous venons de voir et leur rôle dans le développement embryonnaire, cicatriciel, l'état pathologique comme la fibrose, ainsi que le développement tumoral, les mécanismes de cicatrisation et de l'activation du stroma sont aussi très souvent accompagnés du processus d'inflammation constituant des signaux nécessaires au développement de l'EMT néoplasique. Un ensemble de cytokines, en plus du TGFβ, sont nécessaire pour la mise en place du processus inflammatoire, notamment l'Interleukine-6 (IL-6) ou encore l'Oncostatine M
(OSM), qui par leur fixation à leur récepteur permettent l'activation des facteurs STAT3 permettant la mise en place de l'EMT<sup>110,111</sup>. Un point intéressant est la présence d'une coopération entre l'induction de la voie par l'OSM et celle du TGFβ dépendante à Smad. Notamment par la mise en place d'une interaction physique entre les facteurs STAT3 et SMAD3, impliquée dans l'activation du gène d'un EMT-TF, Snail1. Cette coopération met en lumière d'une coordination des voies répondant aux signaux issus des altérations physiques, de l'activation des fibroblastes du stroma, ainsi que des cellules de l'immunité pour la mise en place du programme de l'EMT<sup>111</sup>. Bien qu'important l'activation de STAT3 nécessité une coopération avec d'autres médiateurs de l'inflammation comme TNFα ou encore la chimiokine CCL18<sup>112,113</sup>. L'ensemble de ces facteurs comme ceux que nous avons déjà vu précédemment peuvent accompagner le développement tumoral sur des temps précoces, tout particulièrement lorsqu'une pathologie préexiste au niveau du tissu, comme la fibrose pulmonaire ou encore la cirrhose hépatique. En dehors d'un terrain tissulaire promouvant le développement tumoral, les perturbations induites par la tumeur en elle-même peuvent être le moteur du processus d'EMT.

L'une des conséquences du développement tumoral est la mise en place d'un environnement pauvre en oxygène, l'hypoxie, ainsi qu'une augmentation du stress oxydant. Face à ces changements environnementaux, les cellules mettent en place des réponses cellulaires grâce aux facteurs de type HIF (Hypoxia Inducible Factor). L'une des conséquences de l'activité de ces facteurs est l'induction directe ou indirecte du programme de l'EMT<sup>114</sup>. La première observation démontrant l'activation directe d'un EMT-TF a été faite par MH Yang et al., montrant que HIF1-α régule l'expression du gène Twist1. Ainsi lorsque l'EMT-TF était inhibé, la présence du facteur HIF1-α constitutivement actif par une mutation sur son domaine de dégradation de l'oxygène, ne pouvait plus induire le processus de l'EMT mettant en lumière le lien entre TWIST et HIF1-α. De plus, cette inhibition de TWIST permettait aussi la perte de la mise en place du processus métastatique d'une lignée de carcinome pharyngé (FaDu), malgré l'expression de HIF1-α mutante, insensible au taux d'oxygène<sup>115</sup>. De la même manière, il a été montré dans le cancer colorectal que HIF1-α a aussi la capacité d'induire de façon directe l'expression d'un autre EMT-TF, ZEB1<sup>116</sup>. En parallèle, il a été démontré que HIF1-α avait aussi la capacité d'induire les EMT-TF par des mécanismes indirects. L'un de ces mécanismes est la modification par HIF1-α de l'expression de régulateurs épigénétiques comme l'histone déacétylase HDAC3 et la méthyltransférase WDR5. Ces facteurs n'ont pas de fonctions d'induction d'expression d'EMT-TF, mais jouent un rôle sur le contrôle de l'activité transcriptionnelle des EMT-TF. Ils permettent ainsi par leur activité de régulation des histones d'aider SNAIL1 à la répression des gènes associés au phénotype épithéliale<sup>117</sup>. De plus, la mise en place du programme de l'EMT peut aussi passer par les voies que j'ai décrites précédemment. Dans ce contexte l'hypoxie n'a pas un rôle d'inducteur des EMT-TF, mais un rôle de potentialisateur de la mise en place du programme de l'EMT. On retrouve ainsi plusieurs des voies permettant l'expression des EMT-TF, notamment la voie NOTCH<sup>118</sup>, du TGFβ<sup>119</sup>, ainsi que Hedgehog<sup>120</sup>.

Nous venons de voir que la régulation de l'identité épithéliale par le programme de l'EMT s'effectue par un ensemble de voies cellulaires décrites à l'origine pour leur rôle au développement embryonnaire. La mise en place de ces mécanismes est basée en grande partie sur des modifications homéostatiques du tissu, et leurs coordinations permettent dans un
contexte sain d'effectuer un processus régénératif, voir développer des pathologies telles que la
fibrose si le tissu ne peut rééquilibrer son homéostasie. Ainsi l'induction de ces mécanismes,
qui peut se mettre en place précocement au cours de la transformation néoplasique et dans un
second temps lors du développement de la tumeur, semble directement jouer un rôle sur
l'induction de l'EMT au cours du processus tumorigénique.

Nous pouvons maintenant nous intéresser aux effets des EMT-TF sur les différentes phases du
développement tumoral. Les premières études de l'EMT dans un contexte tumoral ont débuté
par son observation lors du développement métastatique, notamment lors des réponses des
cellules aux différents signaux évoqués précédemment. Naturellement,l'EMT a été très vite
associé à sa capacité à remodeler le phénotype de la cellule cancéreuse afin d'augmenter ses
capacités de dissémination. Son remodelage épigénétique et le gain de plasticité cellulaire
associé faisaient de ce programme l'une des hypothèses les plus robustes pour expliquer le
développement de métastase<sup>121</sup>. En modulant génétiquement l'expression d'un EMT-TF,
notamment par l'induction *in vivo* de SLUG, il a été montré que l'induction de l'EMT était
essentielle pour induire le développement de métastases à partir de cellules cancéreuses qui
étaient à l'origine non invasives<sup>122</sup>. De la même manière, il a été aussi mis en évidence le rôle
des EMT-TF dans d'autres tissus tels que le pancréas, où l'expression de ZEB1 était nécessaire
pour le développement métastatique *in vivo*. Point intéressant, c'est qu'en plus d'impacter le
processus métastatique, le développement tumoral est aussi impacté par la délétion de ZEB1
avec notamment des tumeurs contenant des populations cellulaires plus homogènes, moins
invasives et constituées de cellules à phénotype plus différencié<sup>123</sup>. Point intéressant dans le
même tissu, lors d'une lésion prénéoplasique, la détection de cellules exprimant ZEB1 devient
possible au niveau du site primaire de la lésion, mais aussi au niveau de la circulation sanguine.
Alors qu'au niveau du site primaire les cellules aux phénotypes ZEB1 positif sont minoritaires,
au niveau du système sanguin l'ensemble de la population exprime cet EMT-TF, mettant en
lumière le rôle de l'EMT dans les processus d'invasion et de dissémination tumorale. Enfin, en
écho avec les voies décrites précédemment et leurs mises en place durant le processus
inflammatoire, l'induction d'une inflammation du tissu permet une très forte augmentation de
cellules ZEB1 positives circulantes dans le système sanguin. Ceci montre bien une nouvelle
fois l'importance du microenvironnement pour la mise en place optimale du programme de
l'EMT *in vivo*<sup>124</sup>. Une autre étude, cette fois-ci sur des analyses histologiques de différentes
tumeurs, de différents organes (sein, poumon, colon et pancréas) ont mis en évidence
l'existence de bourgeons qui se définissent par un ensemble de cellules s'infiltrant dans le
stroma tout en étant connectées à la tumeur d'origine. Au sein de ces bourgeons, les cellules
semblent avoir subi un processus d'EMT dû à leur morphologie, mais aussi à une expression
de ZEB1 plus élevé tout en ayant en parallèle une diminution de l'E-Cadhérine. Une nouvelle
fois, la mise en place du programme d'EMT semble jouer un rôle essentiel dans la phase de
dissémination de la tumeur, avec une importance élevée de l'implication du stroma dans cette
activation<sup>125</sup>. Un autre point intéressant de cette étude et qui permet de nuancer sur ce processus
d'EMT, c'est la cohésion cellulaire au sein de ces bourgeons, qui pourrait s'expliquer par une
EMT partielle des cellules. Les cellules subiraient alors un remodelage épigénétique via l'EMT
sans pour autant aller jusqu'à un phénotype terminal mésenchymateux. Ces études sur la
migration des cellules tumorales dans le système sanguin font sortir aujourd'hui un consensus
notamment que la migration qui était pensée comme une migration cellulaire individuelle
semble au contraire plutôt s'effectuer de façon collective. Les cellules au sein de ces clusters
exprimant pour la plupart des signatures génétiques associées à l'EMT<sup>126</sup>. Une étude du suivi
des cellules tumorales circulantes (CTC) de patientes atteintes d'un carcinome mammaire a pu
mettre en évidence que ces cellules, présentes dans le sang et à l'origine de la formation de
métastases, étaient définies par un continuum phénotypique entre celui complètement épithélial
à celui intégralement mésenchymateux. On retrouve une nouvelle fois la notion intéressante de
l'existence d'un continuum phénotypique démontrant que le programme de l'EMT *in vivo* serait
un programme incomplet où par son induction d'un remodelage phénotypique, en soi une perte
d'identité épithéliale de la cellule, permet la dissémination plus que le caractère
mésenchymateux en lui-même. De plus, dans la même étude, le suivi des patientes suites à des
traitements a pu montrer que le phénotype des CTC était extrêmement dynamique avec une
dévolution sur ce continuum phénotypique. En gardant cependant des réserves, notamment sur
la représentativité du résultat dû à la difficulté de purifier les cellules circulantes dans le sang,
ici le niveau définit par les expérimentateurs par rapport aux témoins étant seulement de 5
cellules pour 3 mL de sang<sup>127</sup>. C'est avec des travaux plus tardifs que ce continuum
phénotypique lors du processus de l'EMT a été démontré à l'aide notamment de constructions
génétiques chez la souris<sup>128</sup> ou encore *in vitro* à partir d'une lignée mammaire transformée<sup>129</sup>).
Ces études ont montré, premièrement, qu'un ensemble de phénotypes hybrides existaient entre
une cellule complètement épithéliale et celle complètement mésenchymateuse. Deuxièmement,
les cellules phénotypiques hybrides avaient un plus grand pouvoir tumorigénique ainsi que
métastatique. Ceci est un point intéressant, car il permet de mettre en évidence qu'une cellule
ayant subi un processus de l'EMT complet perd en pouvoir tumorigénique. Par conséquent,
ceci semble confirmer que le processus de l'EMT est un puissant modulateur de l'identité
cellulaire épithéliale, qui lorsqu'il s'effectue dans son intégralité permet à la cellule d'acquérir
une nouvelle identité cette fois-ci mésenchymateuse s'accompagnant d'une diminution du
pouvoir tumorigénique et métastatique.

Un dernier aspect important de l'EMT concerne enfin la capacité de ce programme à favoriser
les processus initiaux de transformation néoplasique. Cet effet rejoint très directement les
premières notions introduites dans ce manuscrit indiquant un rôle vraisemblablement important
de la plasticité cellulaire pour l'adaptation de la cellule aux stress homéostatiques induits par
les oncogènes. Il a ainsi pu être montré que l'EMT pouvait jouer un rôle essentiel pour le
développement précoce des carcinomes. Dans ces conditions, la réacquisition de propriétés
normalement retrouvées dans les cellules les plus progénitrices a pu être observée. On trouve
notamment parmi ces propriétés la présence de nouvelles configurations épigénétiques
enrichies en domaine bivalent favorisant une grande plasticité transcriptomique des gènes
présents dans ces domaines¹³⁰. Au niveau mammaire, la première mise en évidence du lien entre
EMT, plasticité cellulaire et pouvoir tumorigénique ont été montrés par la transformation
néoplasique de cellules mammaires épithéliales immortalisées après induction de l'EMT par
traitement au TGFβ ou l'expression forcée d'EMT-TF. Ces articles obtenaient la même
conclusion, les cellules ayant subi une EMT avaient après la transformation néoplasique des
capacités d'initiation tumorale bien plus importante que les cellules épithéliales d'origines⁶⁵,⁶⁶.
Par la suite, d'autres études ont pu mettre en évidence le rôle des EMT-TF lors de l'initiation
tumorale. Notamment une basée sur un système murin où l'expression d'un oncogène *K-Ras*<sup>mutant</sup> et *Twist1* sont contrôlées au niveau du tissu mammaire. La résultante est la formation spontanée de tumeurs uniquement si l'oncogène et l'EMT-TF sont simultanément exprimés, montrant ainsi une coopération essentielle dans ce modèle entre l'oncogène et TWIST pour l'initiation tumorale<sup>131</sup>. Une autre étude a pu aussi montrer l'implication de SNAIL1 dans l'initiation tumorale. Dans un modèle murin MMTV-PyMT précédemment cité, la délétion de *Snail1* permet de diminuer drastiquement la mise en place de l'initiation tumorale. De plus, les lésions prénéoplasiques ainsi que la formation de région d'hyperplasie mammaire sont aussi diminuées fortement en l'absence de SNAIL1<sup>132</sup>. Cette étude fait écho aux travaux de Ruba Halaoui *et al*. ayant montré dans un modèle murin similaire que l'évolution tumorale s'accompagnait d'une perte de l'identité épithéliale entraînant une perte de la polarité des cellules<sup>48</sup>. Des protéines de type Rho GTPases étaient associées à cette perte d'identité, elles-mêmes étant régulées par la voie du TGFβ. On retrouve donc dans ce contexte un rôle pour la plupart des voies dont nous avons parlé (Rho GTPases et du TGFβ) dans le contexte de la progression tumorale. Enfin ZEB1 autre EMT-TF joue aussi un rôle dans les processus précoces du développement tumoral. Comme pour SNAIL1, une étude *in vivo* de souris MMTV-PyMT a permis de démontrer le rôle de ZEB1 dans l'initiation tumorale ainsi que pour l'ensemble de la tumorigenèse. Ainsi en absence d'expression de *Zeb1* l'initiation tumorale et le développement métastatique sont très fortement diminués. Et tout comme pour l'inactivation de *Snail1*, la perte de ZEB1 s'accompagne d'une diminution de l'hétérogénéité cellulaire avec des tumeurs plus différenciées<sup>133</sup>. *In vitro* il a pu être démontré que les cellules aux caractères souches exprimant de façon endogène ZEB1 avaient une résistance accrue face aux stress associés à un oncogène tel que *H-Ras*<sup>mutant</sup>. Cette résistance permettait notamment aux cellules d'avoir moins de dommage à l'ADN lors de la transformation néoplasique<sup>19</sup>.

En conclusion, les modifications de l'identité cellulaire des cellules mammaires sont associées à un remodelage épigénétique permettant l'acquisition d'une plasticité phénotypique, d'où leur comparaison à celui des cellules souches. Le programme de l'EMT est dans ce modèle l'un des mécanismes majeurs de ce remodelage épigénétique et phénotypique, les EMT-TF pouvant avoir alors un rôle essentiel tout au long de la tumorigenèse, de la lésion néoplasique à la dissémination métastatique. En effet, lors du développement tumoral, plusieurs temps forts d'adaptabilités homéostatiques sont nécessaires aux cellules cancéreuses pour résister à la mort cellulaire, notamment lors du stress métabolique associé à l'oncogène, ou encore lors des périodes d'hypoxie, d'inflammation et d'anoïkis. L'une des possibilités à la plus grande souplesse homéostatique de la cellule serait la capacité des reprogrammations génétiques et épigénétiques à permettre une sortie des cellules précédemment différenciées de sortir de leur cadre métabolique rigide afin de s'adapter aux changements intrin- et extrinsèques imposés par les processus de transformation néoplasique et de progression tumorale. Dans ce contexte, l'augmentation des possibilités transcriptomiques associée à ce remodelage génétique, grâce à une ouverture chromatinienne, permettrait alors une plus grande flexibilité métabolique. Cette flexibilité se traduirait notamment par la capacité à la cellule à modifier son pool enzymatique afin de réguler ses flux métaboliques. L'adoption d'un cadre métabolique plus permissif permettrait alors une meilleure adaptation homéostatique évitant ainsi l'induction de la mort cellulaire.
5. Métabolisme associé à l'acquisition d'un phénotype au caractère souche

Nous venons de voir que les mécanismes de plasticité cellulaire et de perte d'identité cellulaire étaient associés à un phénotype que j'ai nommé cellule cancéreuse dynamiquement dédifférenciée. Par l'acquisition de ce phénotype, les cellules auraient alors la possibilité d'effectuer une modulation métabolique leur permettant de résister aux stress cellulaires rencontrés durant le processus tumoral. Je vais donc dans un premier temps refaire un court rappel sur le métabolisme bioénergétique pour aborder la vision historique de ce métabolisme dans un contexte tumoral. Le métabolisme bioénergétique étant fortement associé à la production d'espèces réactives de l'oxygène, nous verrons ensuite que l'étude de ces deux composantes a permis de largement nuancer la vision du métabolisme dans le contexte tumoral. Enfin, je finirai par le rôle du métabolisme dans la modulation des processus épigénétique. L'ensemble de ces observations permettent de mettre en lumière la forte implication du métabolisme dans l'acquisition d'un phénotype cellulaire plastique et à l'hétérogénéité tumorale.

Pour rappel, deux types de voies métaboliques permettent la production d'énergie à partir du glucose. La première, la glycolyse, s'effectue en absence d'oxygène et permet la conversion du glucose en lactate. Elle est très peu rentable avec la formation de seulement 2 molécules d'ATP par molécule de glucose. La réduction du pyruvate en lactate servant alors pour la régénération du NAD+ en oxydant le NADH. En présence d'oxygène, les cellules peuvent effectuer une phosphorylation oxydative (OXPHOS). Cette voie s'effectue au niveau des mitochondries, qui après oxydation du NADH ou du FADH₂ provenant des voies cataboliques (glycolyse, cycle de Krebs, β-oxydation), permet par gradient électrochimique de proton de faire tourner l'enzyme ATP synthase et ainsi produite de l'ATP. L'OXPHOS est en comparaison de la glycolyse bien plus rentable avec la formation de 36 molécules d'ATP par molécule de glucose. C'est avec la découverte d'Otto Warburg, qu'il a été démontré que les cellules cancéreuses en présence de forte concentration de glucose et en présence d'oxygène généraient de l'ATP non pas par la respiration, mais par la glycolyse, c'est ce qu'on appelle l'effet Warburg¹³⁴. À l'origine expliqué par une déficience des mitochondries, il s'avère que cet effet est dû à plusieurs mécanismes. Premièrement, la vitesse de la glycolyse est nettement supérieure à celle de la respiration, ce qui dans un environnement riche en glucose peut être un avantage en étant plus compétitif face aux cellules saines¹³⁵. Deuxièmement, les cellules par cet effet ont un avantage lorsque l'environnement est pauvre en oxygène. La réponse génétique par la voie de HIF1 permet alors la mise en place d'un métabolisme glycolytique¹³⁵. Il est à noter cependant que des formes de leucémie qui ont un environnement riche en oxygène peuvent aussi avoir un métabolisme glycolytique mettant l'hypoxie dans un second plan. Troisièmement, la mise en place d'un flux élevé de la glycolyse permet d'augmenter le flux sur les voies anaboliques permettant alors la synthèse des biomolécules (acides nucléiques, lipides, protéines), mais aussi celle de la voie des pentoses phosphates pour la formation du NADPH, l'ensemble permettant de maintenir une forte prolifération et une balance redox. En contrepartie de ce métabolisme, la cellule devient
alors dépendante d'un réapprovisionnement constant du cycle de Krebs en molécules permettant son maintien. Ce réapprovisionnement s'effectue par réactions anaplérotiques comme celle du pyruvate en oxaloacétate ou encore celle en deux réactions de la glutamine en glutamate puis dans un second temps du glutamate en α-cétoglutarate¹³⁶.

Il est cependant à noter qu'au cours du XXe siècle, notamment après la découverte de Warburg, le domaine du métabolisme a dû faire face à des problèmes conceptuels, des limitations techniques et un manque d'intérêt, ce qui engendra progressivement l'installation d'un « dogme » dans laquelle les cellules cancéreuses auraient un schéma métabolique fixe. Or aujourd'hui, plusieurs travaux tendent à monter l'hétérogénéité métabolique et la flexibilité des flux, notamment que les cellules cancéreuses peuvent avoir une respiration oxydative et/ou une glycolyse¹³⁷,¹³⁸. Cette démonstration est très bien étudiée avec les travaux d'An S. Tan et al.¹³⁸. En effet, ils ont créé à partir d'une lignée mammaire, une nouvelle lignée dans laquelle les cellules n'ont plus d'ADN mitochondrial en réponse à un traitement à faible concentration de bromure d'éthidium¹³⁹, forçant ainsi la mise en place d'un métabolisme glycolytique. Ils ont pu dans un premier temps montrer que ces cellules nommées 4T1p0 avaient lorsqu'on les injectait dans des souris une latence d'une vingtaine de jours pour une prise tumorale par rapport à la lignée de contrôle, qui avait encore un métabolisme OXPHOS viable. Dans un second temps, après l'injection des 4T1p0 et le développement de tumeurs, ils ont récupéré des cellules provenant de la tumeur primaire, celles en circulation dans le système sanguin et celles de métastases pulmonaires, donnant respectivement 4T1p0SC, 4T1p0CTC et 4T1p0SCL. Ils ont alors remarqué deux points. Premièrement, les cellules récupéraient un système respiratoire et ceci de façon croissante tout au long de la tumorigenèse. Ainsi les cellules de la tumeur primaire avaient un métabolisme OXPHOS plus important que celles d'origine 4T1p0. Les cellules circulantes avaient une respiration encore plus importante que les cellules de la tumeur primaire et de même pour les cellules métastatiques qui étaient encore plus OXPHOS que les cellules circulantes. Le point important étant que les cellules provenant des métastases avaient un métabolisme OXPHOS qui dépassait celui des cellules contrôle 4T1. Cette récupération des complexes respiratoires permettant un métabolisme OXPHOS se ferait à partir d'un regain d'ADN mitochondrial au sein des cellules, probablement dû à des mécanismes de transfert de mitochondrie avec les cellules de l'hôte¹⁴⁰. Deuxièmement, un lien direct existe entre le niveau du métabolisme OXPHOS et celui de l'initiation tumorale ainsi que la vitesse de sa progression. Plus les cellules ont un métabolisme OXPHOS, plus elles ont un pouvoir tumorigénique élevé. Il faut cependant garder quelques réserves sur leur conclusion. Il est plus probable que ce ne soit pas le métabolisme OXPHOS en tant que tel qui permet d'acquérir un pouvoir tumorigénique, mais certainement la capacité des cellules les plus plastiques à moduler leur métabolisme afin de s'adapter à son environnement. Ainsi les cellules 4T1p0, sans ADN mitochondrial, ne peuvent pas moduler leur métabolisme étant uniquement glycolytique et sont donc fermées dans une identité cellulaire. Cette identité fixée ne leur permet alors pas d'acquérir une plasticité cellulaire qui permettrait la formation de métastases. À l'inverse, lorsque les cellules peuvent réacquérir la capacité d'effectuer une phosphorylation oxydative, les cellules ne sont plus fixées dans cette identité glycolytique et peuvent donc s'adapter à différents environnements. C'est pourquoi les cellules métastatiques qui proviennent du tissu pulmonaire ont acquis un métabolisme OXPHOS en cohérence avec un environnement riche en oxygène.
Plusieurs travaux ont alors tenté de déterminer le métabolisme bioénergétique des cellules aux caractères souches, les cellules cancéreuses dynamiquement dédifférenciées (CCDD) afin de s'en servir comme cible thérapeutique. Historiquement, la détermination de la bioénérgie de ces cellules s'effectuait par analogie avec les cellules souches pluripotentes (induced pluripotent stem cell : iPS). Ce raisonnement se basait sur le fait que les iPS et les cellules souches cancéreuses avaient pour origines un remodelage épigénétique de cellules différenciées en celles aux caractères souches. La dédifférenciation des cellules somatiques en iPS s'accompagnant toujours d'une modification du métabolisme des cellules passant d'un système de phosphorylation oxydative à celui glycolytique<sup>135</sup>. En accord avec ces observations, plusieurs études sur différents tissus ont mis en évidence un métabolisme préférentiellement glycolytique chez les CCDD<sup>141-143</sup>. Cette modification métabolique se traduisant toujours par une augmentation de la consommation de glucose, l'expression des gènes associés aux enzymes glycolytiques, ainsi que la production de lactate en comparaison des cellules différenciées. Tout comme les iPS, les CCDD auraient un changement métabolique se traduisant par une perte d'activité OXPHOS pour devenir plus glycolytique en comparaison des cellules différenciées. Des travaux proches de ceux d'An S. Tan *et al*. ont permis de démontrer que des cellules mammaires normales (MCF10A) ou cancéreuses (MCF7) dans lesquelles l'ADN mitochondrial a été délété forçant un métabolisme glycolytique subissaient un processus d'EMT leur permettant d'acquérir un phénotype associé à celui des fibroblastes augmentant alors leur potentiel migratoire. Ces résultats mettent alors en lumière que le processus de l'EMT permet aux cellules luminales normales (MCF10A) et cancéreuses (MCF7) de sortir de leur cadre métabolique rigide dépendant de la phosphorylation oxydative pour l'acquisition d'un métabolisme glycolytique. Une divergence forte apparaît donc entre ces résultats obtenus *in vitro* et les données obtenues chez la souris montrant que le potentiel tumorigénique et les processus d'invasions reposent sur des propriétés oxydatives. Les conditions nutritives et les différences microenvironnementales présentes dans ces différents systèmes expérimentaux ont sans doute un rôle important dans cette divergence de résultats. D'autre part, ils suggèrent que le métabolisme des CCDD, plus que glycolytique ou oxydatif, peut se conceptualiser surtout comme un métabolisme flexible et adaptable. En effet, lorsque les cellules sont étudiées *in vitro*, les mécanismes de réacquisition d'ADN mitochondriale ne sont pas possibles et un environnement biochimique stable fortement glucidique est couramment utilisé nécessitant alors une adaptation glycolytique. In situ en revanche, dans un contexte *in vivo* cette même réacquisition d'ADN mitochondriale est possible et un mix nutritif large est le plus souvent présent dans lequel le glucose ne constitue pas forcément un apport majoritaire. Pour continuer dans ce sens, il a pu être montré que cette adaptabilité métabolique se retrouve dans d'autres situations associées à l'EMT. *In vitro* par exemple, SNAIL favorise la répression du gène codant l'enzyme Frutctose-1.6-biphosphatase (FBP1) qui est essentielle lors de la néoglucogenèse. SNAIL bloque ainsi le flux rétrograde de la glycolyse forçant alors la cellule à acquérir un métabolisme glycolytique. Alternativement, les co-activateurs de la transcription PGC1α joueraient un rôle important lors de l'invasion et la migration des cellules cancéreuses *in vivo*. En effet, ce co-activateur a pour fonction principale d'augmenter la biogenèse mitochondriale et ainsi augmenter le métabolisme respiratoire. Le rôle de PGC1α a notamment été mis en évidence chez les cellules tumorales circulantes lors du processus métastatique dans le modèle 4T1<sup>144</sup>. Ce co-activateur se retrouve aussi surexprimé au sein de lignées de mélanomes
invasives particulièrement résistantes au stress oxydant et donc adaptées au métabolisme oxydatif¹⁴⁵. Ces résultats non exhaustifs tendent donc à confirmer la capacité des processus d'EMT impliqués dans les mécanismes d'invasion et la survie des cellules cancéreuses circulantes à favoriser selon les conditions un métabolisme plus ou moins glycolytique ou oxydatif. Ce concept de flexibilité métabolique qui peut même se définir comme de la plasticité métabolique est bien sûr à raccrocher à la plasticité génétique globale associée aux CCDD et possède des conséquences fortes sur les propriétés métastatiques de ces CCDD. Le métabolisme bioénergétique au niveau des métastases est par exemple corrélat de façon différentielle à l'organe cible soutenant une nouvelle fois l'hypothèse d'une grande capacité métabolique de ces CCDD. Dans le cas de tumeurs mammaires par exemple, une métastase au niveau pulmonaire aura un métabolisme OXPHOS dû à une forte concentration d'oxygènes tandis qu'au niveau des métastases du foie les cellules auront un métabolisme plus glycolytique probablement en lien avec la fonction de l'organe notamment celle du stockage du glucose¹⁴⁶.

Dans un cadre tumoral, les cellules peuvent moduler leurs voies bioénergétiques, mais aussi augmenter leur voie de biosynthèse supportant une vitesse proliférative aberrante. Or l'une des conséquences intrinsèques au métabolisme cellulaire lié aux multiples réactions d'oxydoréductions est la formation de ROS, principalement lors de la respiration¹⁴⁷ et de la synthèse protéique au sein du réticulum endoplasmique¹⁴⁸. La famille des ROS est composée d'un ensemble de molécules radicales ou non. La molécule majeure des ROS est l'ion superoxyde ($O_2^{•-}$) qui suite à différentes étapes de détoxification va générer d'autres ROS comme le radical hydroxyle (·OH), les radicaux peroxyles (ROO·) ou encore le peroxyde d'hydrogène ($H_2O_2$). En effet, l' $H_2O_2$ produit par la dismutation de l' $O_2^{•-}$ via les enzymes superoxide dismutase (SOD), possède une durée de vie très longue en comparaison des autres ROS. En présence d'ions $Fe^{2+}$ l' $H_2O_2$ peut subir une réaction de Fenton, générant une molécule extrêmement réactive l'·OH, qui peut alors endommager les biomolécules (lipides, protéines, ADN) par oxydation et donc altérer leurs fonctions. Une trop grande production de ROS peut se finaliser par la mort cellulaire. C'est pourquoi les cellules possèdent plusieurs systèmes de détoxification. La mise en place du programme de détoxification s'effectue à partir d'une voie majeure, notamment celle du Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (NRF2)¹⁴⁹. Lorsque la balance redox est à l'équilibre, NRF2 peut interagir avec la protéine Kelch-like ECH-associated protein 1 (KEAP1), qui va l'ubiquitinyler et ainsi entraîner sa dégradation. En revanche à partir d'un certain point de concentration en ROS, KEAP1 est inactivée probablement dû à l'attaque oxydative au niveau des régions riches en cystéines, ne pouvant alors plus ubiquitinyler NRF2, celui-ci pourra alors être transloqué dans le noyau afin de réguler un set de gènes¹⁵⁰. L'ensemble des gènes associés à la réponse de détoxification se regroupe en plusieurs familles, celle liée au métabolisme du Glutathion, la molécule clé de la réduction des molécules oxydée de la cellule. En lien avec le Glutathion, les enzymes permettant sa régénération ainsi que la voie de synthèse du NADPH sont aussi régulées par NRF2. Enfin, il régule les enzymes impliquées dans le métabolisme de l'hème et du fer telles que HMOX, FTH1 et FTL1, ou encore ceux du métabolisme des quinones comme NQO1.

Le métabolisme des ROS joue un rôle important lors du processus de la tumorigenèse. En effet, l'activité des ROS tend à promouvoir le processus de tumorigenèse par déstabilisation du génome. Cependant, un excès de ROS au sein des cellules même cancéreuses peut devenir
délétère et induire la mort cellulaire. Les cellules cancéreuses ont en réponse à cette
surexposition aux ROS une augmentation de la voie NRF2. Paradoxalement, cette
augmentation d'activité de NRF2 lors de l'initiation tumorale, qui semble contrer les effets
protumorigéniques des ROS permet à l'inverse une meilleure mise en place du processus
tumorigénique¹⁴². L'équipe de M.S. Wicha a pu mettre en évidence dans leurs travaux
l'existence de deux sous-types de CCDD au sein d'une même tumeur. En lien avec ce que nous
avons vu sur le programme de l'EMT, la première définit par un marquage CD44⁺/CD24⁻,
présente des caractères mésenchymateux avec une capacité d'invasion accrue et un état
quiescent (M-CCDD). À l'inverse la seconde définie par le marquage ALDH⁺ présente des
caractères épithéliaux, à fort niveau de prolifération (E-CCDD). Même si dans leur modèle, ils
n'ont pas observé d'hybride E/M défini, ils ont tout de même observé une capacité de ces
cellules à effectuer une interconversion entre ces deux sous-types de CCDD en réponse au
changement du microenvironnement¹⁵¹. La même équipe a ensuite mis en évidence que dans
un modèle de tumeurs mammaires triples négatives que cette transition s'effectuait en réponse
à des variations du métabolisme et notamment celui des ROS¹⁵². Premièrement, ils ont
démontré que les E-CCDD avaient un métabolisme glycolytique couplé à une phosphorylation
oxydative. Ce type de métabolisme rentre en adéquation avec le caractère prolifératif de ces
cellules. En effet, la respiration permet d'avoir des avantages prolifératifs via plusieurs
conséquences lors de sa mise en place. Elle permet dans un premier temps de produire de l'ATP
essentielle à la prolifération. Deuxièmement, elle permet en conséquence de pousser les flux
sur les branches anaboliques reliées à la glycolyse qui produisent les briques pour la division
cellulaire. Enfin comme il est montré dans leurs travaux, la mise en place de la respiration
couplée à une division cellulaire soutenue permet une production de ROS qui vont stabiliser
HIF1-α permettant alors l'augmentation des enzymes impliquées dans le métabolisme du
glucose et la glycolyse. Les cellules peuvent alors acquérir un cercle vertueux d'un point de vue
prolifératif. À l'inverse, les cellules M-CCDD quiescentes sont majoritairement glycolytiques
et ont une faible production de ROS probablement dû à une prolifération moins soutenue. De
plus, le niveau d'expression de NRF2 est plus élevé chez les E-CCDD ainsi que les gènes
associés à son activité. Enfin ils mettent en évidence que le niveau du stress induit par les ROS
permet aux CCDD de passer d'un phénotype mésenchymateux à épithélial et de façon
réversible. Un traitement à l'H₂O₂ ou une hypoxie permet une transition M- en E- CCDD,
jusqu'à entraîner une différenciation des E-CCDD lorsque la réponse de détoxification devient
insuffisante face au stress oxydant. À l'inverse, un traitement par un agent réducteur comme le
N-acétyl cystéine permet d'effectuer une transition E- en M- CCDD. Ce mécanisme dynamique
passerait en autre part la stabilisation de HIF1-α notamment par une augmentation de la
concentration des ROS¹⁵³ couplé à un environnement appauvri en oxygène¹⁵⁴.

Je vais tenter maintenant de contextualiser ces observations en me replaçant dans un cadre tissulaire et en faisant des liens avec les mécanismes que j’ai détaillés plus tôt. Comme ils l’ont montré dans leurs précédents travaux¹⁵¹, les E-CCDD se situent au niveau du cœur de la tumeur tandis que les M-CCDD se retrouvent au niveau du front de la tumeur. Il est donc justifiable de poser un modèle où la raréfaction en oxygène couplé à un métabolisme prolifératif producteur de ROS pousse sur la mise en place d’une réponse de HIF1-α. Cette réponse serait alors couplée à une augmentation de NRF2, et donc à l’augmentation de l’expression de ALDH1A 1 et 3.
Ainsi de façon stochastique, des cellules où le stress n'est plus assez bien régulé rentrent dans un processus de différenciation formant en grande partie la masse tumorale. En parallèle, au niveau des cellules au front de la tumeur et donc au contact des cellules du stroma, l'activation de HIF1-α permet comme je l'avais souligné dans la partie sur l'EMT, de potentialiser l'induction de ce processus de plasticité notamment par la voie du TGFβ pour ne citer qu'elle¹¹⁹. La mise en place de l'EMT permet alors aux cellules d'acquérir un métabolisme réducteur de ROS. En effet, l'EMT-TF SNAIL par sa régulation de la phosphofrutokinase permet une augmentation du flux dans la voie des pentoses phosphates, essentiel pour la synthèse de NADPH qui a pour fonction de régénérer les molécules antioxydantes¹⁵⁵. Ces cellules au front de la tumeur acquièrent finalement un phénotype mésenchymateux, moins prolifératif et moins indépendant à l'activation de NRF2. Il est à noter cependant deux points. Premièrement, dans les travaux de l'équipe de M.S. Wicha, ils n'ont pas étudié la réponse de détoxification du fer, qui comme nous le verrons plus tard est lié au métabolisme du fer jouant lui-même un rôle sur l'acquisition de la plasticité cellulaire. Deuxièmement, l'existence d'une faible population double positive CD44⁺/CD24⁻ et ALDH⁺ ¹⁵¹ sous-entend l'existence de CCDD hydrides avec une adaptabilité métabolique plus importante, qui peuvent être les cellules à l'origine du processus métastatique¹⁴⁶.

Je finirai cette partie par le rôle direct du métabolisme sur la régulation des mécanismes épigénétiques. En effet, moduler les voies métaboliques entraîne forcément des modifications de concentrations de métabolites. Or l'ensemble des modifications épigénétiques nécessite des cofacteurs et des métabolites comme substrat. L'activité des enzymes permettant d'effectuer les réactions des modulations épigénétiques est donc directement associée à la modulation de ces métabolites. Je prendrai pour exemple la méthylation ainsi que l'acétylation des histones qui permettent respectivement la fermeture et l'ouverture de la chromatine. En lien avec le modèle que j'ai exposé sur la plasticité cellulaire qui traduit une augmentation du champ des possibles et l'adaptabilité métabolique, ces deux modulateurs ont un rôle majeur sur le statut de la chromatine. Je commencerai par les mécanismes de déméthylation des histones qui s'effectuent par l'activité de déméthylase. Les *JmJC-containing Lysine demethylases* (KDM) sont des enzymes dépendantes à l'oxygène, aux ions ferreux et qui ont pour substrat l'α-cétoglutarate¹⁵⁶. En lien avec la régulation des processus épigénétique, une étude sur les cellules souches embryonnaires permet de mettre en évidence le rôle que peut avoir le métabolisme sur les mécanismes de plasticité cellulaire. En effet, ils ont notamment démontré que le maintien d'une concentration intracellulaire élevée d'α-cétoglutarate permettait le maintien d'une chromatine ouverte grâce à l'hypométhylation des histones et donc permettaient aux cellules de garder un phénotype souche¹⁵⁷. On peut donc aisément comprendre que la disponibilité de ce métabolite en fonction du contexte environnemental peut jouer un rôle sur les processus de plasticité cellulaire. De façon similaire, le niveau d'acétylation des histones est l'un des mécanismes épigénétiques qui pour rappel permettent notamment d'ouvrir la chromatine permettant alors la transcription des gènes. Les enzymes permettant cette réaction sont des histones acetyltransferase (HAT) et ont pour substrat l'acétyl-CoA. De la même manière que pour l'α-cétoglutarate, une étude sur des cellules souches pluripotentes a mis en évidence le rôle de la concentration en acétyl-CoA de la cellule sur le maintien du phénotype pluripotent. Ils ont notamment montré que le métabolisme glycolytique que l'on retrouve chez les cellules
pluripotentes permettait le maintien d'une concentration élevée d'acétyl-CoA. En maintenant cette concentration élevée, le flux de l'acétyl-CoA va majoritairement vers le maintien de l'acétylation des histones et donc de l'ouverture chromatinienne des cellules. Ce qui est intéressant de voir c'est que le remodelage des flux de l'acétyl-CoA permet de soutenir le processus de différenciation en diminuant l'acétylation des histones. Ainsi l'engagement de l'acétyl-CoA dans le cycle de krebs lors de la phosphorylation oxydative ou la synthèse du cholestérol diminuera le pool d'acétyl-CoA nécessaire pour le maintien du phénotype pluripotent¹⁵⁸.

Nous venons de voir que l'acquisition d'un phénotype de cellule cancéreuse dynamiquement dédifférencié (CCDD) passe par des modulations génétiques et épigénétiques, ces derniers étant excessivement difficiles à mesurer. En effet, l'acquisition potentielle d'une structuration globale de la chromatine spécifique à une plus grande plasticité cellulaire au sein des cellules CCDD¹⁵⁹, pourrait permettre l'utilisation d'outils mesurant ces modifications, tels que l'ATAC-seq, l'HiC ou encore la CHIP-seq. Or ces techniques restent complexes et coûteuses pour leur utilisation dans un contexte de diagnostic médical. Cependant comme nous l'avons vu, ces modulations génétiques et épigénétiques sont associées à un remodelage métabolique. Ces observations sous-entendent notamment que l'acquisition d'un phénotype CCDD doit aussi être accompagnée par un remodelage du métabolisme lipidique. Il semble alors légitime de se poser, par rapport à ces dérégulations impliquées dans le processus de perte d'identité cellulaire, la question de l'existence de propriétés physiologiques des membranes particulières dans ce contexte.

# B. Membrane cellulaire, métabolisme lipidique et plasticité cellulaire

## 1. Généralité

Chez les eucaryotes, les membranes cellulaires permettent de compartimenter des réactions biochimiques. La membrane plasmique définit la cellule elle-même en excluant les espaces intra- et extra- cellulaires. Enfin, d'autres membranes au sein de la cellule permettent de définir d'autres espaces, nommés organites : noyau, réticulum endoplasmique (RE), mitochondrie, appareil de Golgi, peroxysome, lysosome et autres vésicules. Ces membranes sont composées de deux feuillets lipidiques avec la partie hydrophobe des lipides qui se font face et leur tête hydrophile au contact de l'eau des différents compartiments. Le maintien de son intégrité s'effectue principalement par des interactions hydrophobes et de Van der Waals. Grâce à cette structuration, les membranes permettent un contrôle de la spatialisation des molécules notamment hydrophiles, maintenant les caractéristiques biochimiques des différents espaces cellulaires. D'autres biomolécules peuvent être intégrées au sein des membranes, comme les protéines qui peuvent alors effectuer différentes fonctions. Ainsi chaque organite, membrane plasmique incluse, possède des protéines spécifiques en lien à leur fonction, je prendrai pour exemple les complexes protéiques de la chaîne respiratoire pour la mitochondrie
ou encore la translocation d'ARN par des complexes protéiques formant les pores nucléaire au niveau du noyau.

La majorité des classes lipidiques sont des molécules amphiphiles, à l'exception des triglycérides et des esters de cholestérols, c'est-à-dire composées d'une région hydrophile comportant une polarité et d'une autre région hydrophobe qui n'en comporte pas (Figure 8). Les lipides peuvent avoir différentes fonctions au sein de la cellule. Comme nous venons de le voir, ils permettent la formation des membranes cellulaires, mais elles ont aussi d'autres rôles notamment au niveau de la bioénergie de la cellule qui par la voie de la β-oxydation permet la production d'ATP, ou encore servir comme molécules de signal, et même de substrat pour des modifications post-traductionnelles. La classification des lipides s'effectue par leur structure chimique qui traduit notamment des propriétés spécifiques et permet de regrouper ces derniers en fonction de leur squelette carboné. Alors qu'il est assez facile de concevoir les diversités structurales et fonctionnelles des lipides dans un contexte d'interaction ligand-récepteur lors de la transduction d'un signal, celle dans un cadre de structuration des membranes cellulaires reste encore mâle comprise. Or nous savons aujourd'hui que cette diversité lipidique, au sein des membranes, impacte le comportement des lipides eux-mêmes via leurs interactions, mais aussi l'activité des protéines grâce aux interactions lipide-protéine. De plus, cette diversité lipidique des membranes existe à plusieurs niveaux, entre les feuillets de la bicouche des membranes, mais aussi entre les membranes constituant la cellule, on trouvera par exemple une composition différente entre le RE et la membrane plasmique. Je vais dans un premier temps faire un rappel sur les lipides et leur structure afin de comprendre leur impact sur les membranes cellulaires. Dans un second temps, je contextualiserai les variations lipidiques et leurs implications lors de la tumorigenèse en lien avec la notion de plasticité et perte d'identité cellulaire. Enfin troisièmement, je ferai un tour d'horizon sur les techniques permettant de suivre un paramètre biophysique des membranes, la fluidité membranaire, qui comme nous le verrons est fortement impactée par la composition lipidique de la membrane.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 8 :** Structure des différentes classes lipidiques (d'après A. Naudi *et al.*.)<sup>160</sup></figcaption></figure>

**2. Structure des lipides et membrane**

Les données sont en grande partie tirées de la base *Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes* (KEGG).

a) *Les Acides Gras*

Les acides gras (AG) sont composés d'une chaîne aliphatique d'une taille variable, entre 12 et 24 carbones et très majoritairement en nombre pair dû au métabolisme associé à leur synthèse chez l'Homme. À l'extrémité de cette chaîne, un groupement acide carboxylique représente la fonction chimique active de ces molécules. Ainsi comme nous le verrons une grande partie des réactions des AG se feront avec un groupement alcool d'autres molécules carbonées notamment par estérification ou avec une amine formant ainsi un amide. Des doubles liaisons carbone-carbone peuvent être aussi présentent au niveau de la chaîne aliphatique, on dit alors que l'AG est insaturé. À l'inverse, si aucune insaturation n'est présente sur l'AG, on parle alors d'AG saturé. Ces insaturations peuvent être simples ou multiples et comme nous le verrons, jouent un rôle important sur les propriétés biophysiques des membranes. En effet, les insaturations que l'on retrouve dans le métabolisme des cellules humaines sont des doubles liaisons *Cis* ce qui thermodynamiquement déstabilise les interactions hydrophobes. Les AG insaturés sont regroupés en deux groupes, les monoinsaturés (*monounsaturated fatty acids*
MUFA) avec une seule insaturation et les polyinsaturés (polyunsaturated fatty acids PUFA) ceux comportant plus d'une insaturation. Au sein des PUFA on retrouve deux autres sous-groupes les oméga 3 (ω3) et les oméga (ω6), dépendant de la position de la première insaturation à partir de l'extrémité opposée de la fonction carboxylique. Les acides gras représentant majoritairement chaque classe sont l'acide palmitique et stéarique pour les AG saturés, l'acide oléique pour les MUFA, l'acide arachidonique (AA) pour les PUFA ω6 et l'acide docosahexénoïque pour les PUFA ω3 (DHA).

La synthèse *de novo* des AG s'effectue au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique du côté du cytosol. La première étape de la voie de synthèse est la condensation de deux acétyl-CoA pour former un malonyl-CoA. Dans un second temps, une voie métabolique en boucle permet de construire des AG en partant d'un acétyl-CoA et en ajoutant 2C par cycle réactionnel. Concernant la formation de double liaison carbone-carbone, elle s'effectue par deux familles de désaturases, les Stearoyl-CoA desaturases (SCD) et les Fatty acids desaturases (FADS), toutes deux dépendantes de l'oxygène et du Fe²⁺. Les cellules humaines ne possédant pas les désaturases permettant la synthèse des PUFA ω6 et ω3, un import exogène est nécessaire, on parle alors de lipides essentiels, l'acide linoléique et l'acide α-linolénique. Ils permettent respectivement la synthèse de l'acide arachidonique et l'acide docosahexénoïque avec cependant un rendement faible pour le DHA¹⁶¹ (Figure 9).

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 9 :** Voies de synthèse des acides gras *de novo* mais aussi à partir des lipides essentiels retrouvés dans l'alimentation (d'après A. Naudi et al.) ¹⁶⁰</figcaption></figure>

Le catabolisme des AG peut jouer un rôle dans la bioénergie de la cellule. La voie métabolique mise en jeu est la β-oxydation. De la même manière que lors de la synthèse *de novo* cette voie métabolique se présente sous une boucle réactionnelle de 4 étapes, qui permet à chaque cycle d'extraire un acétyl-CoA de la chaîne carbonée. Dans un second temps, l'acétyl-CoA par son entrée dans le cycle de Krebs permet à la cellule d'effectuer de la phosphorylation oxydative au sein de la mitochondrie. Deux organites peuvent effectuer cette voie catabolique, la mitochondrie et le peroxysome, chacun possédant des spécificités par rapport à l'autre. La première est l'affinité des AG pour leur internalisation, la mitochondrie par le biais des
acylcarnitines permet d'importer les AG jusqu'à 20 carbones. À l'inverse, les peroxysomes par leurs transporteurs de la famille ABCG ont une meilleure affinité avec les AG de plus de 20C notamment les PUFA. Une autre différence se situe au niveau de la première réaction, qui dans la mitochondrie est grâce à une déshydrogénase ayant pour cofacteur le couple FAD/FADH₂ alors que dans le peroxysome la réaction s'effectue grâce à une oxydase et est donc couplée à l'oxygène. Ainsi au sein de la mitochondrie, le FADH₂ est réoxydé au niveau de la chaîne respiratoire tandis qu'au sein du peroxysome l'oxygène est transformé en H₂O₂ ¹⁶².

b) Les Glycérides et Glycérophospholipides

Les glycérides et les glycérophospholipides sont deux lipides qui dérivent du même squelette carboné, le glycérol. Ce dernier est composé de 3 carbones chacun portant une fonction alcool. Comme dit précédemment, c'est par estérification de ces alcools que des acides gras peuvent être rajoutés sur le glycérol. 1 à 3 ajouts d'AG sont donc possibles, on parle alors de monoacylglycérol (MAG), de diacylglycérol (DAG) ou de triacylglycérol (TAG). Au niveau du métabolisme, les TAG et les DAG ont un rôle important. Les TAG, sont essentiels pour le stockage des lipides, avec le meilleur rendement de 3 AG pour un glycérol. Cette structure a pour conséquence de n'avoir aucune région polaire et donc d'être totalement apolaire. Les TAG n'ont aucun rôle sur la structuration des membranes et forment par leur accumulation des gouttelettes lipidique servant de stockage énergétique pour la cellule. Les DAG sont des précurseurs métaboliques de la synthèse des TAG ainsi que des glycérophospholipides. Leur synthèse de novo est possible grâce à un embranchement de la glycolyse au niveau de la dihydroxyacétone phosphate (DHAP)¹⁶³. De plus, les DAG peuvent servir de messager secondaire, par exemple le cas le plus connu lors de l'activation de PKC co-stimulée avec du Ca²⁺ en réponse à des facteurs de croissances¹⁶⁴.

Les glycérophospholipides (GPL) dérivent des DAG, sur lesquels un phosphate est estérifié en *sn*-3. Différentes molécules polaires comportant une fonction alcool peuvent alors s'estérifier sur l'autre extrémité du phosphate, caractérisant la tête polaire du GPL. Les molécules majoritaires au sein des cellules humaines sont la choline, l'éthanolamine, la sérine, l'inositol, donnant respectivement la phosphatidylcholine (PC), phosphophatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et la phosphatidylinositol (PI) (Figure 10). Au sein des mitochondries, on retrouve une voie de synthèse des cardiolipines qui sont spécifiques de cet organite, et sont chimiquement constitués de deux acides phosphatidiques liés par un glycérol à l'extrémité de leurs phosphates. Ces lipides auraient notamment un rôle sur la stabilisation des complexes protéiques de la chaîne respiratoire¹⁶⁵. D'autres lipides moins communs sont proches structuralement des GPL, comme les éthers lipides, qui comportent en position *sn*-1 un AG lié par une liaison éther. Nous verrons que cette espèce lipidique peut jouer un rôle sur le métabolisme des cellules souches cancéreuses. L'ensemble de la synthèse de ces espèces lipidiques s'effectue essentiellement au niveau du réticulum endoplasmique, même si certaines voies de synthèses se retrouvent dans la mitochondrie, voir y est spécifique comme celle des cardiolipines. En lien avec le métabolisme des GPL, les lysophospholipides permettent généralement le remodelage des GPL. En effet, leur synthèse s'effectue par déacylation d'un GPL par des phospholipases A en position *sn*-1 ou *sn*-2, ce qui permet par la suite de réacyler par un autre acide gras ou effectuer une transacylation avec un second GPL. Ainsi par ce mécanisme nommé cycle de Lands la cellule peut réarranger les AG estérifiés sur ses GPL¹⁶⁶.
On peut retrouver au niveau des AG estérifiés une certaine hétérogénéité même si certains AG se retrouvent plus souvent estérifiés sur certaines positions. Ainsi au niveau du carbone *sn*-1 on retrouvera plus généralement des AG saturés ou monoinsaturés, tandis qu’en position *sn*-2 l’AG estérifié est généralement mono- ou poly- insaturés. Il est intéressant de voir qu’au niveau de certain type de GPL ou dérivés de GPL, la disparité des AG peut être plus faible, par exemple le cas des PI qui présente généralement un stéaroyl et un arachidonoyl, ou encore l’exemple des éthers lipides qui ont en grande majorité une estérification d’un PUFA en *sn*-2<sup>167</sup>.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 10 :** Voies de synthèses des différentes classes de phospholipides ainsi que les lipides neutres (d’après M. Hermansson *et al*.)<sup>168</sup></figcaption></figure>

### c) Les Sphingolipides

Le squelette carboné des sphingolipides est composé d'une chaîne de 18 carbones avec à son extrémité deux fonctions alcool ainsi qu'une fonction amine, qu'on appelle sphingosine. Un AG peut être ajouté à la sphingosine par une fonction amide, donnant ainsi un céramide. L'AG présent au niveau des céramides est le plus souvent saturé. Comme les GPL, un céramide peut estérifier une tête polaire au niveau de son premier groupement hydroxyle, notamment un groupement phosphate couplé à une choline, aussi nommé sphingomyéline, ou encore un phosphate couplé à une éthanolamine. De plus en guise de tête polaire, un ose ou plusieurs oses ou un enchaînement de dérivés osidiques peuvent être ajoutés sur cette fonction hydroxyle donnant par exemple des glucosylcéramides ou galactosylcéramides et des gangliosides. La synthèse *de novo* s'effectue au niveau du RE, la première étape limitante étant la condensation d'une L-sérine et d'un palmitoyl-CoA par le palmitoyl transferase (SPT). La réaction suivante permet la formation de la sphinganine par une reductase, suivie d'une acylation par la famille
enzymatique des ceramides synthases, et enfin la création de la double liaison de la sphingosine par une desaturase. Les changements de la chaîne acyle du céramide peut s'effectuer par un retour du squelette carboné sphingosine pour ensuite ajouter un nouvel AG¹⁶⁹ (Figure 11).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 11 ; Voies de synthèse des sphingolipides (d'après A. Naudi et al.) ¹⁶⁰</figcaption></figure>

### d) Le Cholestérol

Le cholestérol fait partie de la famille des stérols et est synthétisé de façon ubiquitaire dans les cellules humaines. Il est constitué de 4 noyaux aromatiques avec un groupement hydroxyle à une extrémité et une chaîne carbonée de 8 carbones de l'autre. Il peut être estérifié sur son groupement hydroxyle par un AG, formant alors un ester de cholestérol. Ainsi, par cette estérification, le cholestérol n'étant plus amphiphile, va de la même manière que les TAG pouvoir participer à la formation de gouttelettes lipidiques et servir de stockage lipidique. La synthèse du cholestérol s'effectue au niveau du RE pour ensuite être redistribué par le trafic vésiculaire, principalement au niveau de la membrane plasmique. Sa synthèse est composée de 5 étapes. La première est la formation de mévalonate par la voie qui porte le même nom. Deux acétyl-CoA se condensent pour former un acétoacétyl-CoA. Un troisième acétyl-CoA s'ajoute formant ainsi du HMG-CoA, qui grâce à sa réduction par l'une des enzymes limitantes de la synthèse du cholestérol l'HMG CoA reductase (HMGCR), permet de former du mévalonate. La seconde étape, composée de 3 étapes, permet la formation, d'isopentényl-PP (PP étant un diphosphate). La condensation d'un géranyl-PP et d'un isopentényl-PP permet la formation du farnésyl-PP. Cette molécule est importante, car elle se situe au carrefour entre la synthèse du cholestérol et les modifications post-traductionnelles de prénylation. La troisième étape est la formation du squalène par condensation de deux farnésyl-PP, catalysé par l'enzyme FDFT1. La réaction suivante de l'oxydation du squalène est la seconde réaction limitante de la synthèse des stéroïdes, catalysé par la squalene epoxidase (SQLE). La quatrième étape, c'est la
condensation du squalène époxyde en lanostérol. Enfin la dernière étape constituée de 7 réactions permettant la synthèse du cholestérol<sup>170</sup>.

### e) Les membranes

En 1972, Singer et Nicolson ont proposé le modèle de la mosaïque fluide pour définir la structure des membranes. Elle se définit notamment que la réduction thermodynamique du système force les lipides amphiphiles à s'autoassembler. Cet assemblage forme alors une structure en doubles feuillets lipidiques comportant un cœur hydrophobe et deux interfaces hydrophiles correspondant respectivement aux queues et aux têtes des lipides. Les membranes sont donc composées d'un ensemble de lipides divers (la « mosaïque ») avec une dynamique moléculaire possible permettant à la membrane de se déformer et aux molécules la constituant de se mouvoir en son sein (le « fluide »)<sup>171</sup>. Dans un second temps, le modèle a pu être complété sur plusieurs points notamment sur l'existence de région enrichie en certains types de lipide ou de protéine<sup>172</sup>, mais aussi d'une asymétrie des lipides entre les deux feuillets d'une membrane<sup>173</sup> (Figure 12). Pour exemple, au niveau de la membrane plasmique alors que les PC et SM ont un enrichissement au niveau du feuillet externe, les PS et PE eux sont enrichis au niveau du feuillet inter. L'une des conséquences connues de la perte de l'asymétrie d'un lipide dans une cellule saine, est celle de la translocation du PS du feuillet inter au feuillet externe jouant un rôle dans l'induction du processus d'apoptose, l'un des programmes de mort cellulaire programmé<sup>174</sup>. Du fait de l'hétérogénéité lipidique, plusieurs milliers d'espèces lipidiques répertoriées<sup>175</sup>, ainsi qu'une hétérogénéité protéique, possédant des caractéristiques physico-chimiques particulières, peuvent permettre la création de microdomaines aux caractéristiques définies. La mise en évidence de ces microdomaines a été découverte lors de la découverte de régions membranaires résistantes à l'extraction au détergeant<sup>176</sup>. L'analyse des lipides associés a permis de déterminer un enrichissement en cholestérol et en sphingolipides. Comme nous l'avions vu, les lipides composant les membranes possèdent une hétérogénéité structurale, qui lors de modifications de leur métabolisme peuvent par des variations de la composition membranaire varier les propriétés physiques des membranes, notamment la fluidité membranaire.

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 12 :** Répartition asymétrique des lipides entre le feuillet interne de la membrane plasmique et le feuillet externe (d'après M.J. Sarmento *et al*.)<sup>177</sup></figcaption></figure>

La fluidité membranaire est un paramètre dépendant des interactions lipide-lipide et lipide-protéine, qui ne sont pas caractérisées par des liaisons covalentes, mais par des interactions
dynamiques permettant un réarrangement spatial entre eux. Les membranes peuvent adopter différentes phases, qui correspondent à différents arrangements spatiaux des lipides permettant un degré de liberté de mouvement des chaînes acyles¹⁷². Ainsi à partir d'un modèle simple d'une membrane composée d'un unique lipide, on peut déterminer son comportement lors de la variation de la température. En effet, à une température donnée, la membrane possède toujours deux états physiques, la phase liquide (ou liquide désordonnée : L_d) et la phase gel (ou ordonnée : S_o). Cependant, les proportions des deux états dépendent de l'entropie des chaînes acyles, qui est proportionnelle à la température. Lorsque celle-ci augmente, la mobilité des chaînes acyles est plus grande, augmentant alors la probabilité de rotation de celles-ci. Ainsi chaque lipide est caractérisé par sa température de transition de phase (notée Tm pour melting temperature) correspondant à la température à laquelle où 50% des lipides sont en phase gel et 50% sont en phase liquide. En dessous du Tm, les lipides deviennent très vite majoritairement en phase gel, tandis qu'au-dessus les lipides deviennent vites majoritairement en phase liquide (Figure 13).

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>**Figure 13 :** Répartition des phases lipidiques ordonnées ou désordonnées en fonction de la température. Au niveau de la température de transition (Tm) la membrane arbore 50% de phase ordonnée et 50% de phase désordonnée (d'après W.D. Stein et T. Litman)¹⁷⁸</figcaption></figure>

La Tm dépend du nombre de carbones et du nombre d'insaturations des chaînes acyles du lipide. Plus le nombre de carbones est important, plus les interactions entre les chaînes sont importantes augmentant la stabilité du système. Par conséquent, il faudra un apport d'énergie plus important pour mettre en mouvement les chaînes acyles, ce qui se traduit par un Tm plus important. À l'inverse, plus le nombre d'insaturations cis est important, plus les interactions des chaînes sont faibles. Il faudra alors moins d'énergie pour mettre en mouvement les chaînes, ce qui se traduit cette fois-ci par une diminution du Tm. Le cholestérol a quant à lui un effet que ce soit sur les phases S_o ou L_d, permettant alors l'acquisition d'un autre état, la phase liquide ordonnée (L_o). Son incorporation dans une phase S_o permet de déstabiliser le réseau des chaînes
acyles réduisant ainsi l'ordre des chaînes lipidiques. À l'inverse, son incorporation dans une phase L<sub>d</sub> permet la stabilisation des chaînes acyles augmentant alors l'ordre des chaînes. La membrane en phase L<sub>o</sub> présente alors une augmentation de l'ordre des chaînes acyles, tout en augmentant la diffusion des lipides (Figure 14). Dans un contexte physiologique, les membranes cellulaires se composent uniquement des phases L<sub>o</sub> et L<sub>d</sub>. De plus, la concentration du cholestérol dans les organites est variable, pauvre au niveau du RE et riche à la membrane plasmique. On peut alors admettre qu'au niveau du RE seule la phase L<sub>d</sub> est présente tandis qu'au niveau de la membrane plasmique la membrane posséderait un mélange de phases L<sub>d</sub> et L<sub>o</sub>. La phase ordonnée correspondant à des régions enrichies en cholestérol et sphingolipides telles que les radeaux lipidiques<sup>179</sup>.

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>**Figure 14 :** Effet du cholestérol sur la membrane (d'après M. Eeman et M. Deleu)<sup>180</sup></figcaption></figure>

En plus de sa queue hydrophobe, la taille de la tête polaire du lipide influence le comportement de la membrane au niveau de la fluidité, mais aussi de la courbure. Les différentes têtes polaires des GPL entraînent toutes des contraintes physiques sur la membrane à cause de leur volume moléculaire jouant notamment un rôle sur les mécanismes qui permettent la formation de vésicules à partir d'une membrane ou encore de la fusion de deux membranes. Ainsi les PE et PA exerceront une courbure négative sur la membrane, on parle de lipide conique. À l'inverse, les PI et les lysophospholipides auront un effet de courbure positive, on parlera alors de lipide conique inverse. Enfin, les PC et PS n'ont aucun effet sur la courbure de la membrane, ce sont des lipides cylindriques (Figure 15).
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>**Figure 15 :** Effet de la tête polaire et des lysophospholipides sur la courbure membranaire (d'après T. Harayama et H. Riezman)¹⁸¹</figcaption></figure>

**3. Modulation du métabolisme lipidique dans un contexte tumoral**

a) Adaptation du métabolisme lipidique lors de la croissance
tumorale

De façon générale, l'expression des gènes associés à l'anabolisme des lipides est augmentée chez les cellules cancéreuses afin de supporter la demande en lipide pour le développement et la progression tumorale. Ainsi de façon assez ubiquitaire entre les différents cancers, les enzymes lipogéniques telles que l'acetyl-CoA carboxylase (ACAC), la fatty acid synthase (FASN), l'ATP citrate lyase (ACLY), mais aussi les enzymes de la voie de synthèse du cholestérol ont leur expression augmentée¹⁸²⁻¹⁸⁴. En plus des voies permettant la synthèse des lipides, les enzymes limitantes de la β-oxydation, tout particulièrement les carnitine palmitoyltransferase 1 A et C, sont aussi surexprimées dans de nombreuses tumeurs. Cette augmentation de l'oxydation des lipides comme source d'énergie permet le maintien de la prolifération des cellules dans des conditions pauvres en glucose¹⁸⁵,¹⁸⁶. De ce fait, plusieurs travaux ont utilisé cette enzyme comme cible thérapeutique mettant en évidence une augmentation de la sensibilité des cellules à la radiothérapie¹⁸⁷. L'une des conséquences de cette prolifération élevée poussant sur la synthèse des lipides est une induction du stress du réticulum endoplasmique¹⁸⁸ et une réponse métabolique en conséquence¹⁸⁹. En effet, l'augmentation de production des lipides entraîne notamment une accumulation des AG saturés (palmitate et stéarate) et de cholestérol, au niveau du RE. Or à trop forte concentration, ces AG deviennent cytotoxiques pour la cellule due à une mise en place d'une réponse aux protéines dénaturées (*Unfolded protein response* : UPR)¹⁹⁰. L'induction de l'UPR dans ce contexte est associée à la diminution de MUFA au sein de la membrane du RE entraînant alors l'activation IRE1α et PERK, deux protéines membranaires *biosensors* des protéines dénaturées¹⁹¹. Classiquement,
c'est la fixation de leur répresseur GRP78 (aussi appelé BiP), protéine chaperonne, aux protéines dénaturées qui permet leur dimérisation et leur activation. Ils peuvent alors activer les facteurs de transcriptions XBP1 et ATF4 qui permettront alors à leur tour la mise en place d'un programme génétique afin de rétablir une homéostasie du réticulum pouvant aller jusqu'à l'activation de l'apoptose en cas d'échec¹⁹². Or en plus de leur sensibilité à la présence de protéines dénaturées, ces deux biosensors ont aussi la capacité de sonder l'environnement lipidique de la membrane du RE. Ils peuvent ainsi activer une UPR indépendamment de la présence de protéines dénaturées lorsque la membrane se rigidifie¹⁹³. Même si la modification biophysique de la membrane suffit en elle-même pour l'induction de ces voies lors de l'UPR membranaire, l'augmentation de ROS observée semble aussi traduire une augmentation de protéines dénaturées¹⁹⁰,¹⁹⁴. D'autres travaux ont aussi vu la mise en place d'une activation du facteur de transcription LXR (Liver X receptor), augmentant l'expression des enzymes SCD (Stearoyl-CoA Desaturase) et LPCAT3 (Lysophosphatidylcholine acyltransferase 3), qui respectivement induisent la formation d'une double liaison sur le palmitate ou le stéarate et le transfert d'un PUFA en position sn2 d'un lysophospholipide. LXR augmente aussi l'expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, qui permettent l'efflux du cholestérol. De cette façon, la cellule peut augmenter la fluidité membranaire et réacquérir une homéostasie membranaire diminuant alors le stress associé. L'ensemble de ces mécanismes se retrouvant alors associés à une agressivité tumorale accrue¹⁹⁵. Il est cependant à noter que dans un contexte enzymatique où SCD est inactive, une autre voie de synthèse passant par FADS2 permet par son activité de desaturase sur le palmitate de garder un degré de désaturation lipidique au sein de la cellule¹⁹⁶. L'utilisation de FADS2 par les cellules peut s'expliquer si l'on prend en considération les flux métaboliques associés à l'absence ou l'inactivation de SCD. En effet, l'altération de l'activité de SCD a pour conséquence l'augmentation de la concentration du palmitate, qui par effet de masse sera utilisé comme substrat par FADS2 malgré son affinité faible¹⁹⁷. Ce mécanisme permet de montrer un exemple de plasticité en lien avec le remodelage des flux métaboliques des cellules cancéreuses.

Ces dérégulations métaboliques des lipides ne sont pas spécifiques à l'ensemble des cellules. Comme nous l'avons vu dans la première partie, la caractéristique majeure des tumeurs est leur hétérogénéité ainsi de la même manière, une hétérogénéité lipidique a pu être observée au sein d'une tumeur¹⁹⁸. La question qui se pose dans notre modèle est : y a-t-il un métabolisme lipidique spécifique des cellules cancéreuses dynamiquement dédifférenciées corrélé à un gain de plasticité et une perte d'identité cellulaire ? Très peu d'études se sont intéressées à cette question, même si nous allons voir que depuis quelques années des réponses peuvent être apportées.

### b) Métabolisme lipidique associé à la plasticité cellulaire

Je commencerai cette partie par les travaux qui ont le mieux caractérisé le lien entre l'état phénotypique CCDD, la modulation lipidique et l'état biophysique de la membrane. En effet, R.C. Gimple *et al*. ont étudié la modulation lipidique sur les glioblastomes, qui pour rappel est le cancer le plus agressif et légal chez l'homme. Ce type de cancer est très fortement enrichi en CCDD qui contribue à de faibles pronostiques vitaux. Ils ont notamment montré que ces cellules étaient dépendantes de l'expression de l'enzyme ELOVL2, l'enzyme clé permettant la synthèse des PUFA¹⁹⁹. Comme énoncé dans la partie A de l'introduction, ces CCDD ont une
ouverture chromatinienne beaucoup plus importante que les cellules saines et que les cellules
tumorales différenciées. Ils ont notamment noté que l'une des régions les plus ouvertes au sein
des CCDD se situe au niveau du gène ELOVL2. Dans un second temps, ils ont mis en évidence
que le maintien du phénotype était dépendant de l'activité d'ELOVL2 et tout particulièrement
de l'augmentation des PUFA au sein des membranes. De plus, ils ont pu déterminer que
FADS2, l'enzyme permettant d'introduire des insaturations lors de la synthèse des PUFA, était
aussi fortement exprimée en comparaison des cellules tumorales différenciées renforçant l'idée
de la nécessité des PUFA pour les CCDD du glioblastome. L'une des conséquences de cette
augmentation de PUFA au sein des membranes est l'augmentation de la fluidité membranaire,
ici testée par la technique de Redistribution de fluorescence après photoblanchiment
(Fluorescence recovery after photobleaching : FRAP). Après analyse des voies de
signalisations impactées par cette variation de fluidité, ils ont déterminé que l'activité de
l'EGFR était fortement réduite lors de la perte d'EVOVL2. Ainsi, une fluidité membranaire
plus importante permettrait aux EGFR d'acquérir une meilleure conformation pour leur
activation<sup>200,201</sup>. Pour aller dans le sens de ces observations, des expériences au début des années
2000 ont aussi mis en évidence la modification de la fluidité membranaire de la membrane
plasmique comme modulateur de l'EGFR. En effet, la réduction du cholestérol au sein de la
cellule par traitement au méthyl-β-cyclodextrine permet une diminution des radeaux lipidiques
entraînant une autoactivation de l'EGFR ainsi qu'une élévation de sa concentration au niveau
de la membrane plasmique<sup>202</sup>. L'ensemble de ces observations semble impliquer que des
modifications de la composition lipidique puissent être associées à une augmentation de la
fluidité membranaire des cellules de glioblastome modulant les niveaux d'activité de leurs
récepteurs aux facteurs de croissance, le tout potentiellement corrélé à leur plus grande plasticité
épigénétique à travers la régulation de gènes tel que ELOVL2.

Au niveau mammaire, il a pu être montré de façon assez similaire que la voie du mévalonate
jouait un rôle sur le maintien des propriétés des CCDD. En effet, l'inhibition de cette voie au
sein de cellules Basale-like par du simvastatin a pour conséquence la diminution de la
population CCDD ALDH⁺ et donc une diminution de formation de sphère in vitro. À l'inverse,
l'ajout de mévalonate permet de réobtenir des CCDD ALDH⁺ renforçants la formation de
sphère. La voie du mévalonate est importante pour le métabolisme lipidique. Elle se subdivise
en trois voies métaboliques, permettant la production du cholestérol ainsi que de deux
molécules essentielles à la prénylation des lipides, le farnésyl-PP et le géranylgéranyl-PP. Par
la combinaison d'inhibition des différents embranchements, il a pu être montré que le maintien
de l'état CCDD était dépendant des processus de géranylgéranylation. Dans ce contexte, la
régulation d'une sous-branche du métabolisme lipidique ne modifie pas directement la structure
des membranes, mais module plutôt la capacité des protéines membranaires à s'y associer. Ce
mécanisme est très vraisemblablement important puisqu'un traitement par un inhibiteur de
prénylation permet in vivo de diminuer la croissance tumorale, ainsi que de diminuer
drastiquement le nombre de CCDD ALDH⁺ au sein de la tumeur<sup>203</sup>. Une autre étude est arrivée
à une même conclusion mettant en lumière l'importance de la voie du mévalonate pour la
synthèse du géranylgéranyl-PP qui permet alors le maintien de l'activation des facteurs
oncogéniques YAP ou TAZ<sup>204</sup>. Ces corégulateurs transcriptionnels sont sous le contrôle de la
voie Hippo, un important module de signalisation oncosuppresseur. Cette voie de signalisation
intervient dans le développement des tissus sains en contrôlant notamment la prolifération, l'apoptose ou encore l'autorenouvellement des cellules souches en fonction de la bonne mise en place des interactions physiques de la cellule avec son microenvironnement. En temps normal, les contacts de la cellule avec la matrice par exemple ou d'autres cellules permettent l'activation de cette voie Hippo conduisant à inhiber les corégulateurs transcriptionnels, YAP et TAZ, par phosphorylation puis dégradation au sein du cytosol. Lors de perte de signaux de contacts, YAP et TAZ n'étant plus phosphorylées sont alors transloquées dans le noyau augmentant alors la prolifération et inhibant l'apoptose<sup>205</sup>. Dans un contexte tumoral, la perte de l'identité épithéliale et le maintien du caractère souche sont d'autre part souvent dépendants de l'activation de YAP/TAZ<sup>206</sup>. Ainsi, la voie du mévalonate par la synthèse du géranylgéranyl-PP participe clairement au maintien du caractère souche des cellules exprimant des formes actives de YAP ou de TAZ.

Toujours en lien avec la modulation de l'identité cellulaire, comme nous l'avons vu plus tôt, l'un des processus majeurs permettant aux cellules épithéliales de perdre leur identité et d'acquérir en partie un caractère souche est le programme de l'EMT. Les travaux de Z. Zhao et al. ont permis de mettre en évidence une régulation de la voie de synthèse du cholestérol par le complexe entre le corépresseur CtBP et les EMT-TF (ZEB1 ; SNLUG ou TWIST)<sup>207</sup>. Ils ont dans un premier temps effectué une surexpression de CtBP au sein de lignées mammoires permettant d'effectuer plusieurs observations. Premièrement, l'augmentation de l'expression de ce corépresseur permet la diminution du cholestérol au sein des cellules. De plus, cette variation de cholestérol intracellulaire est accompagnée d'un changement phénotypique avec perte des marqueurs épithéliaux et gains de propriétés mésenchymateuses. Enfin, ils ont déterminé par FRAP que la membrane plasmique était plus fluide. Afin de comprendre le lien entre les effets de CtBP, l'EMT et contrôle du métabolisme du cholestérol, les auteurs se sont tout d'abord intéressés à la régulation de la voie du TGFβ du fait de sa régulation à la membrane plasmique<sup>208</sup> et de sa capacité à induire le programme de l'EMT<sup>82</sup>. L'activité du récepteur au TGFβ est notamment atténuée par sa séquestration au niveau des radeaux lipidiques riches en cholestérol, facilitant son internalisation par endocytose et sa dégradation<sup>208</sup>. En limitant la synthèse de cholestérol et la formation des radeaux lipidiques, CtBP favorise l'induction de la voie du TGFβ, observé notamment par la plus grande expression de gènes comme la SERPINE1 dont la transcription est sous le contrôle de la voie de signalisation induite par ce type de facteur de croissance. Renforçant ces conclusions, l'ajout de cholestérol s'oppose aux effets de CtBP et empêche l'induction de l'EMT par le TGFβ. Finalement, des liens moléculaires directs ont pu être établis entre l'activité de CtBP et les facteurs de transcription activateurs de l'EMT comme ZEB1. Ces deux régulateurs transcriptionnels coopèrent à un mécanisme de répression transcriptionnel du gène SREBP2. Ce gène permet l'expression d'un facteur de transcription augmentant directement l'expression des enzymes nécessaires à la synthèse du cholestérol<sup>209</sup>, son absence expliquant la diminution de synthèse de cholestérol lors de l'activation de CtBP. La participation de ZEB1 à ces régulations suggérait d'autre part l'existence d'une boucle de rétrocontrôle positive entre la diminution du taux de synthèse du cholestérol, l'activation du TGFβ et l'induction de ZEB1 lors de la mise en place de l'EMT. Enfin, pour aller plus loin, il était également frappant de noter que non seulement la synthèse du cholestérol diminuait lors de l'induction de l'EMT, mais que son efflux était également augmenté, diminuant d'autant sa
concentration intracellulaire. Un autre gène, ABCA1, était ainsi plus exprimé lors de la mise en
place de l'EMT, ce gène codant justement une pompe à efflux pour le cholestérol. Confirmant
ensuite la pertinence de ces travaux, il est tout à fait intéressant de noter que des
expérimentations in vivo ont confirmé ces résultats. Une induction ectopique de l'expression de
CtBP lors d'une injection intraveineuse d'une lignée cancéreuse mammaire chez des animaux
immunodéprimés a permis par exemple d'augmenter le nombre de prises tumorales. De façon
similaire, un traitement au méthyl-β-cyclodextrine (MβCD), un agent chimique qui permet
d'appauvrir le cholestérol membranaire²¹⁰, augmente significativement la prise tumorale, le
nombre de métastases et la grosseur des tumeurs dans ce même modèle, que CtBP soit ou non
surexprimé. À l'inverse, l'inhibition d'ABCA1 par le thioradizine permettait de diminuer
l'ensemble des paramètres que je viens de citer. En conclusion, il semble donc exister lors du
processus de l'EMT, un rétrocontrôle positif où l'expression des EMT-TF permet la diminution
du cholestérol dans la cellule, notamment au niveau de la membrane plasmique, permettant de
stabiliser le récepteur au TGFβ et donc le maintien du phénotype. En parallèle, ce phénotype
étant associé à la migration cellulaire, cette diminution du cholestérol au niveau de la membrane
aurait également l'avantage de permettre une meilleure résilience aux contraintes mécaniques
lors de la déformation de la cellule notamment durant les processus d'invasion qui constituent
l'une des caractéristiques des cellules les plus mésenchymateuses²¹¹. Le rôle complémentaire
joué par l'augmentation de l'efflux du cholestérol est sans doute aussi essentiel en favorisant
par effet de masse une activité minimale de la voie du mévalonate, voie qui comme nous l'avons
vu est importante pour la régulation des flux vers les branches biosynthétiques du
géranylgéranyl-PP et l'activation des facteurs YAP/TAZ constituant alors un autre node de
régulation accrochée à cette connexion entre voie du mévalonate et contrôle de l'identité
cellulaire.

Aussi, l'importance de ces connexions entre mécanisme d'efflux du cholestérol par ABCA1 et contrôle de l'EMT a pu être observée dans de nombreux autres modèles renforçant la pertinence de ces observations. L'une de ces études a pu montrer notamment que le 27-hydroxycholestérol et le contrôle qu'il exerce sur le récepteur nucléaire LXR favorise également l'efflux du cholestérol dans un contexte d'induction de l'EMT. Ces régulations étaient là aussi associées à une augmentation du processus métastatique et une diminution de la survie de souris traitées par un activateur de LXR²¹². LXR étant un régulateur de l'expression des pompes à efflux du cholestérol ABCA1 et ABCG1, ces résultats soulignent une nouvelle fois l'importance de ce mécanisme dans le processus d'EMT. Enfin, d'autres travaux ont permis de démontrer un lien entre l'augmentation de l'expression d'ABCA1, la fluidité membranaire de la membrane plasmique et le pouvoir d'initiation tumorale et métastatique de lignées cellulaires dans des modèles in vivo de souris²¹³. En conclusion, il est ainsi tout à fait intéressant de résumer ces travaux dans un concept où le métabolisme du cholestérol servirait de charnière à la mise en place et le maintien de processus de perte d'identité cellulaire tel que celui observé lors de l'induction de l'EMT. Il semblait donc justifiable de se demander s'il existe un métabolisme lipidique global associé à la perte d'identité cellulaire qui favoriserait ou accompagnerait l'émergence dynamique au sein des tumeurs de populations cellulaires plus plastiques que j'ai précédemment nommées cellules cancéreuses dynamiquement dédifférenciées (CCDD), et qui seraient associées à l'agressivité globale de la tumeur.
La réponse à cette question étant peu abordée dans la littérature, il existe par conséquent très peu de travaux sur ce sujet. Cependant en associant et en contextualisant différentes observations je vais formuler différentes hypothèses sur les liens entre le métabolisme lipidique et la plasticité cellulaire résumant l'état des connaissances actuelles. Pour ce faire, je vais me baser sur trois axes : la régulation du CD44, un des marqueurs majeurs des CCDD dans le tissu mammaire, le métabolisme du fer, ainsi que le métabolisme des PUFA, principalement les ω6. Alors qu'à première vue les travaux décrivant ces axes n'ont pas forcément de liens évidents, une hypothèse mécanistique semble émerger associant le métabolisme lipidique au phénotype des CCDD. Comme nous l'avions vu dans la première partie, les CCDD mammaires présentent le plus souvent une augmentation de la protéine membranaire CD44. Cette protéine est associée en autres à deux mécanismes cellulaires, la migration et l'endocytose de l'acide hyaluronique. Il a notamment été démontré que l'activité de CD44 est contrôlée par l'état d'acylation de la protéine par du palmitate. Lorsqu'elle n'est pas acylée, CD44 est positionné en dehors des radeaux lipidiques au sein des régions fluides de la membrane, ce qui permet son interaction avec une protéine de type EZRIN elle-même servant de lien entre la membrane plasmique et les filaments d'actines. Cette interaction est donc essentielle pour le remodelage du cytosquelette lors de la migration cellulaire<sup>214,215</sup>. À l'inverse lorsque CD44 est acylée, elle est séquestrée au niveau des radeaux lipidiques de la membrane plasmique permettant alors la mise en place de l'endocytose de l'acide hyaluronique<sup>216</sup>. Ce mécanisme d'endocytose du CD44 a été récemment décrit comme étant essentiel pour l'augmentation de la plasticité cellulaire jouant un rôle dans l'internalisation des ions ferreux à pH physiologique<sup>217</sup>. En effet, des mesures de RMN du proton à pH physiologique du hyaluronate ont permis de montrer qu'il était capable de fixer de façon réversible les ions ferreux. De plus, les auteurs ont pu démontrer par microscopie de fluorescence que par sa capacité à fixer le hyaluronate, CD44 jouait un rôle essentiel pour l'internalisation du fer dans les cellules. Dans un second temps, ils ont mis en évidence que l'EMT induite par l'EGF était associée à une réponse transcriptomique contrôlant le potentiel redox de la cellule et le métabolisme du fer. D'autre part, la concentration de certains métabolites était spécifiquement augmentée, particulier l'α-cétoglutarate. Point intéressant, l'induction du programme de l'EMT permettait l'augmentation de l'expression de l'enzyme histone lysine demethylase (PHF8) dont l'activité catalytique est elle-même dépendante du fer et de l'α-cétoglutarate. En effet, cette enzyme fait partie de la famille des *JmJC-containing Lysine demethylases* que j'ai déjà introduite, qui permettent l'ouverture de la chromatine par déméthylation des histones notamment au niveau des gènes du programme de l'EMT. Cet effet s'observait aussi bien *in vitro* avec les lignées mammaires qu'in vivo sur des tumeurs PDX (*Patient-derived xenograft*) soulignant l'importance de ces mécanismes pour un programme de plasticité cellulaire tel que l'EMT. En conclusion, la séquestration de CD44 au sein de radeaux lipidiques plutôt associés à des membranes rigides semble donc importante pour un contrôle spécifique du métabolisme du fer impliqué dans une plus grande plasticité cellulaire par facilitation de processus épigénétiques<sup>217</sup>.

Ce résultat semble contradictoire avec une plus grande fluidité globale des membranes dans les cellules les plus plastiques qui empêcheraient l'activation de cette boucle de régulation entre CD44 et le métabolisme du fer. Cependant, nous allons voir maintenant que ce paradoxe peut être résolu en tenant compte du rôle vraisemblablement joué par les PUFA dans ce mécanisme. Nous venons de voir que l'apport en fer au sein des cellules est nécessaire pour l'augmentation de la plasticité cellulaire et donc la mise en place du phénotype des CCDD. Cette notion est à rapprocher de résultats issus de plusieurs laboratoires ayant montré l'existence au sein des CCDD d'une réponse antioxydante spécifique au fer et aux dommages associés pouvant induire un processus de mort cellulaire non-apoptotique, la ferroptose<sup>218-222</sup>. Alors qu'on pourrait expliquer cette réponse tout simplement par une augmentation de la concentration du fer au sein
des cellules les plus plastiques, l'ensemble de ces études démontrent que les CCDD possèdent
en fait une plus grande sensibilité à la peroxydation lipidique. Cette sensibilité est notamment
soutenue par un enrichissement en enzymes liées au métabolisme des PUFA tout
particulièrement de l'acide arachidonique (AA), comme l'ACSL4 et la LPCAT3. Ces enzymes
permettant respectivement l'activation d'un AG pour son intégration dans les membranes par
ajout d'un CoA et l'acylation en sn2 des lysophospholipides. Or la ferroptose est un processus
qui se met en place lorsque les ions ferreux labiles oxydent des molécules d'oxygènes par la
réaction de Fenton produisant alors des ROS qui peuvent peroxyder les chaînes acyles
polyinsaturées²²³. Ainsi l'ensemble de ces observations semblent montrer que l'un des points
communs lors de l'acquisition d'un phénotype CCDD est l'augmentation de l'incorporation de
l'AA au sein des membranes et donc la mise en place d'une réponse au stress associé au
métabolisme du fer plus important. Deux conséquences importantes pourraient découler ensuite
directement de cette plus grande incorporation de PUFA et notamment d'AA dans ces cellules.

Premièrement, ils induiraient une augmentation globale de la fluidité membranaire permettant
ainsi une meilleure déformabilité de la membrane ce qui peut jouer un rôle important lors de la
migration dans un contexte d'invasion tissulaire²²⁴⁻²²⁶ mais aussi plus largement dans
l'établissement de nouveaux contacts avec le microenvironnement. Deuxièmement, l'insertion
de PUFA au sein des glycérophospholipides de la membrane plasmique permet par un
phénomène de séparation liquide-liquide de stabiliser les radeaux lipidiques²²⁷. En mettant en
perspective ces effets biophysiques, on peut alors émettre l'hypothèse que l'insertion des PUFA
au sein des membranes, notamment la membrane plasmique, pourrait par leurs modulations des
propriétés biophysiques de la membrane optimiser les mécanismes associés à la séquestration
du CD44 dans les radeaux lipidiques, y compris au sein d'une membrane globalement plus
fluide. En résumé, le remodelage du cytosquelette par le CD44 déacylé, situé hors des radeaux
lipidiques et permettant la motilité, se verrait facilité par l'augmentation de l'élasticité de la
membrane tandis que la stabilisation des radeaux lipidique par séparation liquide-liquide des
PUFA favoriserait le maintien d'un pool de CD44 assez stable au sein des radeaux lipidiques
dans l'optique d'internaliser du fer pour les processus épigénétiques. Un appauvrissement
global en cholestérol au sein des CCDD suivrait exactement la même logique en maintenant
des pools restreints de ces molécules, stables dans les radeaux lipidiques, et facilitant
l'endocytose du fer complexé à CD44.

Pour conclure, on voit que les rôles attribués aux PUFA dans ce contexte sont excessivement
importants et ce point peut-être magnifiquement souligné par l'analyse de cellules
intrinsèquement très plastiques comme les cellules souches embryonnaires. Des approches de
type lipidomique ont montré qu'elles contenaient une quantité de PUFA plus importante que
les cellules différenciées, comme des neurones ou encore des cardiomyocytes. De plus, leur
différenciation s'accompagne par un stress redox qui n'est pas sans rappeler les travaux de
Wicha où l'augmentation des ROS au sein des cellules cancéreuses aurait un rôle inducteur sur
la différenciation des CCDD. Les PUFA étant fortement sensibles à l'oxydation, un concept
proposant que de façon générale une augmentation des PUFA au sein des membranes puisse
servir de senseur et d'inducteur du processus de différenciation semble séduisant¹⁵²,²²⁸. La
contrepartie d'un tel mécanisme pour les cellules serait la nécessité d'une régulation élevée et
spécifique contre la peroxydation lipidique afin de limiter le processus de ferroptose. De
nombreux mécanismes redondants permettant de limiter la ferroptose par réduction des lipides
peroxydés, ont ainsi été décrits ces dernières années au sein des cellules cancéreuses les plus plastiques (Figure 16).

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

**Figure 16 : Mécanismes anti- ou pro- ferroptoses et les molécules les inhibant.** Le premier mécanisme fait appel à l'enzyme GPX4 qui permet grâce au couplage avec le glutathion de réduire les lipides peroxydés. Cette réaction de GPX4 est donc étroitement liée avec le transporteur xCT qui permet grâce à l'export d'une molécule de glutamate, l'entrée d'une molécule de cystéine et donc la formation du glutathion, mais aussi de la production cellulaire de NADPH<sup>229</sup>. Le second mécanisme est redondant avec celui de GPX4, mais fait appel à d'autres voies antioxydantes. En effet, il a pu être mis en évidence que lorsque la réduction des lipides peroxydés ne pouvait s'effectuer par GPX4, lors d'une inhibition ou de la déplétion du gène, la protéine FSP1 (Ferroptosis suppressor protein 1) pouvait grâce au CoQ<sub>10</sub>, qui est synthétisé à partir de la voie du mévalonate, inhiber la ferroptose par réduction des lipides peroxydés<sup>230,231</sup>. Ce mécanisme est aussi lié au NADPH, mais aussi à la voie métabolique des tétrahydrobioptérines (BH4) qui peut être couplée à la voie de FSP1, ou avoir une action directe sur la réduction des lipides peroxydés<sup>232</sup> (d'après J. Zheng, M. Conrad)<sup>233</sup>

L'ensemble de ces modifications du métabolisme lipidique, notamment lors de l'acquisition d'un phénotype CCDD, doivent forcément impliquer des modifications de composition lipidique des membranes. Or ces modifications notamment ceux variant le type d'acides gras acylés ou encore la quantité de cholestérols insérés dans les membranes peuvent modifier les caractéristiques biophysiques des membranes, notamment la fluidité membranaire. Je vais donc dans la prochaine partie faire le tour des techniques qui permettent de suivre ce paramètre.

## 4. Technique de mesure des propriétés biophysiques des membranes

Un ensemble de technique a été développé depuis un demi-siècle afin de mesurer les propriétés biophysiques de la membrane *in cellulo*. L'ensemble de ces techniques se sont fortement concentrées sur la discrimination des différents domaines, notamment les radeaux lipidiques au niveau de la membrane plasmique afin de décrire les mécanismes protéiques associés à ces domaines. Je commencerai par les techniques non fluorescentes.
a) Résonnance paramagnétique électronique

La Résonnance paramagnétique électronique (Electron paramagnetic resonance : EPR) est une technique proche de la RMN. Le principe de la technique est le même, cependant l'excitation s'effectue au niveau d'un électron, principalement non parié, au lieu d'un proton. Ainsi l'utilisation de cette technique nécessite l'utilisation de molécules radicalaires et qui dans notre cas est couplée à une capacité à s'insérer dans les membranes, par exemple 16-Doxyl-stearic acid methyl ester. Le signal obtenu lors d'une mesure dépend notamment de l'orientation du radical par rapport à l'axe du champ magnétique²³⁴. Ceci permet alors de sondé l'environnement, qui dans le cas de l'analyse de la membrane permet de déterminer un paramètre d'ordre S, plus il est élevé plus la membrane est rigide à l'inverse un faible niveau correspond à une plus grande fluidité membranaire²³⁵. L'inconvénient de cette technique est sa faible résolution, notamment la nécessité d'analyser un tissu et non pas une cellule unique. De plus, il est impossible de savoir la localisation de la sonde au niveau cellulaire.

b) Microscopie à force atomique

La Microscopie à force atomique (Atomic force microscopy : AFM) dans son utilisation classique est une technique permettant d'obtenir des résolutions de l'ordre du nanomètre ne nécessitant aucun ajout de sonde. Classiquement une pointe réfléchissant un laser s'approche de l'échantillon, qui est déposé sur une surface totalement plane, ce qui permet d'obtenir des informations sur les forces associées au niveau de l'interaction entre la pointe et l'échantillon. La pointe par répulsion électrique des protons permet lors d'un balayage latéral de suivre le niveau de la membrane et donc de l'épaisseur membranaire permettant ainsi de définir des microdomaines²³⁶. Cependant, l'analyse sur cellule nécessite une extraction des membranes au préalable, l'analyse ne s'effectuant jamais sur cellule entière. Une seconde utilisation peut être effectuée avec l'AFM afin d'effectuer des mesures sur la rigidité cellulaire. Cette fois-ci la pointe de l'appareil est forcée à rentrer en contact avec l'échantillon, la force est ensuite retirée pour observer la force exercée par l'échantillon lors du retour de la pointe²³⁷. L'intérêt de cette technique est de travailler sur des cellules entières et vivantes. Cependant, il est impossible de discriminer la réponse associée à l'ensemble des membranes de celle apportée par le cytosquelette.

c) Redistribution de fluorescence après photoblanchiment

Enfin, les trois autres techniques que je vais aborder sont toutes reliées à la fluorescence. Nous avons tout d'abord la Redistribution de fluorescence après photoblanchiment (Fluorescence recovery after photobleaching : FRAP). Cette technique nécessite un microscope et utilise l'une des propriétés des fluorochromes qui sont leur photoblanchiment lorsqu'ils sont soumis à de fortes intensités d'excitation. Ainsi le fluorochrome est photoblanchi dans une région de la membrane. Cette région est ensuite observée pour déterminer la vitesse à laquelle les molécules autour de la région encore fluorescentes reviennent par diffusion, donnant ainsi une courbe cinétique du retour de la fluorescence au sein de la région. Ainsi plus la membrane sera fluide, plus la diffusion des molécules sera grande et donc le temps de demi-recouvrement sera faible²³⁸. Le désavantage de cette technique est l'observation d'une seule région cellulaire ce qui ne permet pas l'analyse de l'ensemble des membranes. L'utilisation d'un laser à fort gain et l'apport élevé d'énergie peuvent physiquement modifier les propriétés de la membrane, la fluidité étant corrélée à la température
d) *Spectroscopie par corrélation de fluorescence*

La Spectroscopie par corrélation de fluorescence (*Fluorescence correlation spectroscopy* : FCS) est une technique qui permet d'observer des molécules fluorescentes à très faible concentration (nM jusqu'à pM). Cette technique est liée au mouvement Brownien des molécules et mesure les fluctuations d'intensité d'un fluorochrome dans un plan focal et au cours du temps. La FCS est généralement couplée à l'utilisation d'un microscope confocal. Elle permet notamment de mesurer un coefficient de diffusion de la molécule fluorescente²³⁹. Très utilisé pour la dynamique des protéines membranaires. La FCS a cependant des défauts, notamment la faible résolution que l'on peut obtenir, de plus il semble qu'aucune étude n'ait utilisé cette technique pour l'analyse de l'intégrité des membranes de la cellule.

e) *Suivi de particule unique*

Le Suivi de particule unique (*Single-Particle Tracking* : SPT) permet de suivre le mouvement de particules à une résolution du nanomètre. Par sa sensibilité élevée dans le temps et dans l'espace, cette technique est la plus résolutive pour étudier la dynamique des membranes, notamment la diffusion latérale. Tout comme les deux autres techniques, celle-ci nécessite aussi l'utilisation d'un microscope²⁴⁰. Cependant, la résolution élevée de cette technique a une contrepartie. En effet, il ne permet pas l'analyse des membranes dans leur intégralité et est fortement dépendant de l'affinité de la sonde fluorescente pour un environnement donné.

Des analyses utilisant certaines de ces techniques ont été utilisées au sein de l'équipe mettant en lumière que des cellules d'une lignée prostatique provenant d'une métastase osseuse (PC-3) étaient moins rigides et plus prônes à se déformer que des cellules saines de prostate (WPMY-1). Après extraction des lipides l'analyse par du FRAP sur monocouche de Langmuir appuyait ces observations avec une plus grande redistribution de la fluorescence chez les cellules PC-3 que chez les WPMY-1. Ainsi les lipides des PC-3 permettaient la constitution de membrane monocouche plus dynamique que ceux des WPMY-1²⁴¹. Ces résultats sous-entendaient avec ceux observés en EPR²³⁵ que les cellules cancéreuses possédaient des modifications de propriétés membranaires notamment par l'augmentation de leur fluidité. Cependant, l'ensemble des limites de ces techniques, l'EPR et sa résolution tissulaire, l'AFM avec la destruction du matériel d'origine et les techniques de fluorescence citée utilisable uniquement grâce à la microscopie avec une limite d'étude d'une membrane, font qu'au sein de mon projet de thèse, nous nous sommes tournés vers les sondes fluorescentes membranaires sensibles à la polarité.

5. Fluidité membranaire, Fluorescence et Solvatochromism

Le processus classique de la fluorescence se caractérise par trois étapes (Figure 17). La première étape est l'absorption d'un photon par la molécule. Seules certaines longueurs d'ondes peuvent être absorbées, celles correspondant à l'énergie entre deux niveaux orbitales. L'absorption du photon fait passer la molécule d'un état fondamental $S_0$ à un état excité $S_1$. Ce processus correspond au passage d'un l'électron à une orbitale de plus haute énergie. Ce processus d'absorption est assez rapide avec un temps de l'ordre de $10^{-15}$ s. La seconde étape
est une conversion interne d'énergie par relaxation vibrationnelle. L'électron perd un peu d'énergie jusqu'à atteindre un état excité plus stable nommé $S_1$. Ce mécanisme est aussi très rapide de l'ordre de $10^{-12}$ s. Enfin, la troisième étape correspond à l'émission d'énergie sous forme radiative, processus appelé fluorescence. Cette étape correspond à un retour de l'électron sur son orbite fondamentale $S_0$ par émission d'un photon. Ce mécanisme étant beaucoup plus lent que les deux autres étapes, de l'ordre de $10^{-9}$ s, il assez facile de comprendre que l'ensemble des électrons d'un état $S'_1$ ont eu le temps de subir une perte d'énergie pour atteindre le niveau $S_1$. Comme l'état $S_1$ a un niveau énergétique plus bas que $S'_1$, l'ensemble des molécules excitées par l'absorption d'un photon émettront des photons de plus basse énergie que celui absorbé et donc de longueur d'onde plus grande. Ceci signifie que le photon émis par la molécule fluorescente sera décalé vers le rouge, ce décalage est appelé déplacement de Stokes.

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Figure 17 :** Diagramme de Jablonski simplifié</figcaption></figure>

Certaines molécules fluorescentes conjuguées à un lipide ont été synthétisées afin de sonder l'environnement lors de leur insertion au sein de la membrane. Ces sondes sont sensibles à des paramètres de la membrane tels que la viscosité, le pH ou encore le niveau d'hydratation. Lors de ma thèse, nous nous sommes intéressés tout particulièrement aux sondes sensibles à l'hydratation de la membrane pour la mesure de la fluidité membranaire. En effet, le niveau d'hydratation d'une membrane est étroitement lié à son état physique. De plus, des changements de composition lipidique en son sein sont accompagnés d'une variation de son niveau d'hydratation<sup>242</sup>. Parmi ces sondes, le Laurdan est probablement la plus connue<sup>243</sup>. Par sa structure le Laurdan peut s'insérer au sein des membranes via sa chaîne acyle, tout en étant amphiphile grâce à sa fonction amine et fluorescent grâce à son noyau naphtalène (Figure 18 A). Ce qui est intéressant avec cette sonde est sa capacité à émettre à deux longueurs d'ondes, avec un ratio d'intensité qui évolue en fonction qu'elle soit dans un environnement pauvre ou riche en molécules d'eau. Cette fluorescence à deux longueurs d'onde est due au phénomène de solvatochromisme. Lorsque la sonde se situe au niveau de régions membranaires ordonnées, la faible hydration fait qu'il émet majoritirement à une longueur d'onde de 440 nm. À l'inverse lorsque la sonde se situe au niveau d'une région désordonnée, l'hydratation de la membrane se retrouve plus importante ce qui entraîne cette fois-ci une intensité majoritaire à 490nm<sup>244</sup> (Figure 18 B et D). Le mécanisme derrière cette sensibilité membranaire s'explique
lors de la relaxation du système. En effet, lorsque la sonde est excitée par un photon, un moment dipolaire se crée au niveau de sa région polaire (Figure 18 A). Ainsi, si des molécules polaires telles que de l'eau se situent au niveau de la région polaire de la sonde, les molécules vont alors puiser de l'énergie au système pour s'aligner avec le moment dipolaire créé. On parle alors de relaxation dipolaire. Sachant que cette perte s'effectue en amont de l'émission d'un photon par fluorescence, lorsque la sonde subit une relaxation dipolaire, le photon émis sera de plus faible énergie et donc décalé vers le rouge, à comparer du photon émis lorsque la sonde est dans un environnement apolaire (Figure 18 C). C'est en 1990 que T. Parasassi et E. Gratton ont proposé une formule mathématique permettant de représenter le niveau de fluidité membranaire, le paramètre de polarisation généralisée (Generalized Polarisation : GP) qui est la différence d'intensité entre la longueur d'onde à 440 nm et celle de 490 nm sur la somme de deux. Plus le GP est élevé plus la membrane est rigide et inversement plus il est faible plus la membrane est fluide²⁴⁵ (Figure 18 D).

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>**Figure 18 : Mécanisme de fluorescence ratiométrique du Laurdan.** A) Représentation de la création d'un moment dipolaire après excitation de la sonde. B) Schématisation de l'environnement du Laurdan en fonction de l'état physique de la membrane et du niveau d'hydratation. C) Diagramme de fluorescence du Laurdan en fonction de son environnement. D) Schématisation des spectres d'émission en fonction de l'environnement du Laurdan ainsi que la formule du paramètre de polarisation généralisé (GP) (d'après G. Gunther et al., A.G. Jay et J.A. Hamilton, et S.A. Sancher et al.)²⁴⁶⁻²⁴⁸</figcaption></figure>

L'intérêt de ce type de sonde pour mesurer la fluidité membranaire est la facilité d'utilisation tout en ayant une précision élevée grâce à la technologie basée sur la détection de la
fluorescence. De plus par rapport aux autres techniques de fluorescences citées plus tôt, la mesure du paramètre GP peut être effectuée en microscopie, mais aussi via d'autres appareils comme un spectrofluoromètre ou encore un cytomètre en flux. Chacune de ces techniques permettant d'obtenir des informations différentes avec des niveaux de complexité expérimentaux différents. Les premiers travaux effectués avec ce type de sonde se portaient quasi exclusivement sur le comportement dynamique des membranes de vésicules unilamellaires géantes et utilisaient principalement le Laurdan. Ces travaux sur les vésicules synthétiques ont permis de valider l'efficacité de la sonde pour suivre la fluidité membranaire<sup>249</sup>, mais aussi de visualiser l'effet du cholestérol, de décrire la coexistence de différentes phases au sein de la membrane lorsque plusieurs espèces lipidiques forment les vésicules<sup>250</sup>. Par la suite, lorsque la technologie des microscopes a permis une meilleure résolution, les travaux ont alors pu aborder différents aspects liés à la fluidité membranaire, comme les propriétés structurales ou encore les propriétés fonctionnelles des membranes au sein des cellules. On peut citer les travaux de K. Gaus *et al*. qui ont été les premiers à utiliser le Laurdan sur cellules vivantes<sup>251</sup>. Ils ont notamment pour la première fois pu observer le GP moyen de la membrane plasmique ainsi que des endomembranes montrant alors que leurs observations étaient bien corrélées avec la composition connue des membranes cellulaires. La membrane plasmique avait un GP plus élevé que celui des endomembranes, reflétant bien la composition riche en sphingomyélines et en cholestérol de la membrane plasmique à comparer des endomembranes. De plus, ils ont pu mettre en évidence que la déplétion du cholestérol par du MβCD sur des fibroblastes, impactait majoritairement la membrane plasmique en diminuant son GP, donc en augmentant sa fluidité membranaire. D'autres études ont permis de montrer à partir de la mesure du GP l'impact de l'apport nutritionnel sur le métabolisme des lipides modulant alors la fluidité des membranes. G. Maulucci *et al*. ont notamment étudié l'effet d'un import nutritif important sur des cellules bêta pancréatiques<sup>252</sup>. Ils ont pu ainsi observer une augmentation élevée du GP des endomembranes lors d'un ajout d'acide palmitique (500 µM durant 16 h). Ce qui est intéressant avec ce résultat, c'est de voir la modification biophysique de la membrane du réticulum endoplasmique qui renforce l'idée que la fluidité membranaire du RE serait à l'origine de la réponse UPR, que l'on retrouve dans le processus tumorale<sup>190</sup>. Enfin, leur étude de la fluidité membranaire sur des globules rouges a permis aussi d'ouvrir sur de nouvelles questions biologiques. En effet, leurs analyses de globules rouges de souris déficientes du gène *Lcat* ou *Apoa1*, qui ont tous deux un rôle sur la formation des lipoprotéines de type HDL, ont pu mettre en évidence que malgré leur rôle commun sur le métabolisme physiologique du cholestérol, les globules rouges arborent une variation du GP de leur membrane plasmique opposée. En effet, alors que les globules rouges des souris *Lcat*/- ont un GP de leur membrane plasmique qui diminue par rapport aux WT, ceux des souris *Apoa1*/- ont un GP plus élevé que ceux des WT. Par l'observation de la fluidité membranaire des globules rouges, les auteurs mettent en lumière sur un paradigme et l'influence de la régulation des lipoprotéines sur la biophysique des membranes plasmiques des globules rouges<sup>190</sup>. Il est intéressant de voir que sur l'ensemble de ces travaux le Laurdan semble marquer des compartiments très rigides au niveau du cytosol. Nous le verrons plus tard dans la partie « résultats », nous avons pu déterminer la nature de ces régions très rigides comme étant des gouttelettes lipidiques. Ce biais sur la mesure de la fluidité membranaire a pu être éliminé grâce au développement d'une nouvelle sonde analogue au Laurdan au sein de l'équipe. L'excitation
du Laurdan s'effectuant dans l'ultra-violet, pour éviter des modifications de la fluidité
membranaire durant l'exposition au laser UV lors de l'excitation, la plupart des mesures en
microscopie doivent s'effectuer en microscopie biphotonique. Ce type de microscopie se base
sur l'émission en simultané de deux photons d'énergie deux fois plus faible que la longueur
d'onde d'excitation, permettant ainsi une meilleure pénétration du rayon d'excitation ainsi que
de diminuer l'énergie du rayon permettant alors de diminuer l'impact du laser sur l'échantillon
biologique<sup>253</sup>. Or l'appareillage permettant d'effectuer ce type de microscopie étant très coûteux
et complexe, d'autres molécules dont l'excitation et l'émission ont été décalées, comme le di-
4-ANEPPDHQ, ont été développés permettant d'effectuer des mesures de GP et donc de la
fluidité membranaire avec une excitation dans le bleu (488nm)<sup>243</sup>. De même, d'autres molécules
fluorescentes plus polaires que le Laurdan comme le c-Laurdan ont été développées afin de
permettre un marquage plus efficace des membranes cellulaires<sup>254</sup>. Le c-Laurdan a notamment
été utilisé pour mesurer l'augmentation de fluidité des membranes dans un contexte de réponse
d'une alimentation riche en PUFA oméga-3<sup>255</sup>. J'aimerais une nouvelle fois souligner, que
même s'il n'est pas fait référence dans l'article, il est aussi possible tout comme pour le Laurdan
d'observer des régions rigides au sein de cytosol, qui là encore refléteraient un marquage de
gouttelettes lipidiques. Enfin, le di-4-ANEPPDHQ a quant à lui été utilisé pour observer l'effet
du maintien de la protéine Rac1 sur la fluidité membranaire de l'enveloppe nucléaire lorsqu'il
est fortement concentré au sein du noyau. Les auteurs ont pu démontrer que la translocation de
Rac1 au sein du noyau permet une augmentation de l'activité de RhoA qui contribuerait alors
à la mise en place d'un phénotype invasif. Cette modulation de l'activité de RhoA par la
séquestration de Rac1 dans le noyau s'accompagne d'une modulation de la structure
membranaire en compromettant la distribution du complexe nucléaire de Lamin/Emerin, se
traduisant par une augmentation de la fluidité membranaire<sup>256</sup>. Un point intéressant avec ces
observations est l'importance de la réduction du complexe Lamin/Ezrin pour la déformation
nucléaire qui est nécessaire lors de la migration cellulaire au sein de la matrice extracellulaire
des cellules cancéreuses<sup>257</sup>. De plus, il a pu être démontré qu'un phénotype souche, à forte
plasticité génomique, était aussi associé à une plus forte plasticité mécanique du noyau,
notamment dû à l'absence de lamine A au sein des cellules souches<sup>258</sup>. Ainsi lors de la
différenciation des cellules souches, plusieurs phénomènes biophysiques se mettent en place
grâce à l'augmentation de la LAMINE A. La première est la diminution de la dynamique du
remodelage de la chromatine, permettant alors de fixer une identité cellulaire<sup>259</sup>. Cette
diminution de la dynamique de la chromatine s'accompagne alors d'une diminution de la
plasticité mécanique du noyau<sup>258</sup>. Ainsi, il est assez tentant d'imaginer que de tels mécanismes
de remodelage chromatinien et de plasticité mécanique se mettent en place lors de l'acquisition
d'un phénotype CCDD dans un contexte tumoral, permettant alors à la cellule d'acquérir une
capacité migratoire et de perturber la fluidité membranaire.

Au sein de l'équipe, dans les années qui ont précédés mes travaux de thèse, un ensemble de
sondes ratiométriques a été développé afin d'améliorer les propriétés physicochimiques du
Laurdan et faciliter les mesures du paramètre GP in cellulo<sup>260</sup>. L'une des sondes développées,
le Dioll, a montré des résultats très prometteurs lors de sa caractérisation sur des systèmes
membranaires biomimétiques. Sa caractérisation au niveau biologique (cellulaire et vésicules
extracellulaires) sera consacrée à l'une des parties des résultats de thèse.
C. Objectif de thèse

Comme nous venons de le voir, le processus tumoral dans le tissu mammaire est fortement corrélé avec la perte de l'identité cellulaire du tissu. Cette modulation de l'identité a notamment pu être associée avec l'acquisition de caractères proches de ceux des cellules souches que l'on retrouve dans un tissu sain. La capacité de ces cellules au phénotype souche à initier la prise tumorale *in vivo* et à installer une hétérogénéité phénotypique fait que ce processus a très vite été associé au modèle des cellules souches cancéreuses, les CSC. Cependant, dans un contexte tumoral, la hiérarchie étant bidirectionnelle, avec pour origine des CSC des cellules différenciées, le nom de cellules cancéreuses dynamiquement dédifférenciées (CCDD) semble plus en adéquation avec les mécanismes de perte d'identité et d'acquisition d'une plasticité phénotypique. Ces cellules grâce à une ouverture chromatinienne plus élevée que les cellules différenciées ont la capacité d'adopter des réponses en adéquation aux différents changements qu'elles peuvent croiser. Ces réponses permettent alors de maintenir la croissance tumorale par le maintien d'un « bulk » cellulaire plus différenciée ou encore acquérir des capacités invasives et d'adaptations à un nouveau tissu. L'hétérogénéité phénotypique que l'on retrouve au sein des tumeurs se traduit aussi par une hétérogénéité métabolique, mettant en lumière certaines caractéristiques des cellules CCDD, ainsi que le rôle que peuvent avoir les variations métaboliques sur les processus de plasticité cellulaire. Ne faisant pas exception, le métabolisme lipidique est aussi impacté lors du processus tumoral, modulant alors la nature des lipides synthétisés et leur régulation. L'une des conséquences de cette variation est le changement de la composition lipidique des membranes. Or changer la nature des lipides au sein des membranes a pour répercussion une modification des propriétés biophysiques des membranes telle que la fluidité membranaire. Ce paramètre biophysique étant corrélé au niveau de l'hydratation membranaire, il est donc possible de le mesurer à l'aide d'une sonde fluorescente ratiométrique, tel que le Laurdan. Or certains défauts de l'utilisation du Laurdan sur les cellules, fait qu'au sein de l'équipe de multiples sondes analogues du Laurdan ont été synthétisées. L'une d'elles très prometteuse, le Dioll, a pu être caractérisée sur membrane biomimétique et semblait prometteuse pour son utilisation sur cellule.

Lors de ma thèse, je me suis donc intéressé à la possibilité de suivre la plasticité cellulaire par leur fluidité membranaire lors du processus tumoral. Cela permettrait alors de développer des outils de diagnostic clinique simple à partir de ce paramètre biophysique. Dans un premier temps, j'ai fini le développement d'une sonde fluorescente ratiométrique créée au sein de notre équipe se basant sur les mêmes propriétés physico-chimiques que le Laurdan, le Dioll. Cette étape a permis de montrer une meilleure résolution de la mesure de la fluidité des membranes par rapport aux sondes préexistantes. Dans un second temps, j'ai pu utiliser cette sonde en vue de suivre la fluidité membranaire lors de différents processus de plasticité. Le but étant de créer un possible index de plasticité phénotypique par la mesure de la fluidité membranaire.
# Résultat n°1

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

## Caractérisation de la sonde Dioll
Comme nous venons de le voir, les sondes fluorescentes ratiométriques préexistantes telles que le Laurdan ou encore le c-Laurdan ont un ensemble de défauts qui rend difficile leur utilisation pour le marquage de cellules. L'équipe a donc créé un ensemble de sondes analogue du Laurdan. L'une d'elles avait dans des modèles membranaires biomimétiques (les liposomes) une meilleure résolution de la mesure de la fluidité membranaire par rapport au Laurdan et au c-Laurdan. Cette sonde nommée, Dioll, par sa une tête polaire plus importante, permettrait une meilleure distribution dans un modèle cellulaire en comparaison du Laurdan et une meilleure précision que le c-Laurdan.

Ma première partie de thèse avait donc pour but de décrire et de comparer le Dioll aux deux autres sondes dans un modèle cellulaire. Ces travaux ont permis de décrire la cinétique d'incorporation de ces sondes. À l'origine pensé comme une incorporation passive suivie de sa diffusion au sein des membranes. Or nous avons pu observer que le marquage des membranes cellulaires s'effectue plus rapidement en présence de protéines « carrier » de lipides, ce qui traduirait un mécanisme de couplage entre une incorporation active au sein des endomembranes et une incorporation passive au sein de la membrane plasmique. Dans un second temps, des mesures par microscopie confocale ont permis de déterminer avec une qualité d'image encore jamais atteinte des différences de fluidité membranaire, notamment entre la membrane plasmique rigide et les endomembranes plus fluides. Ces observations étant en accord avec la description de la littérature. On remarquera cependant que le Dioll possède une meilleure distribution au sein des membranes cellulaires en comparaison des deux autres cellules, ce qui permet lors de la mesure membranaire de la cellule entière une meilleure représentation des endomembranes. De plus, sa meilleure résolution sur les variations de fluidité décrite sur les liposomes permet une meilleure discrimination entre les régions rigides et fluides. La conséquence est une amélioration des mesures entre les différents organites et la membranaire plasmique, mais aussi plus intéressant, au niveau d'une membrane donnée où l'on a mis en évidence une meilleure discrimination de microdomaines de fluidité différente au niveau de la membrane plasmique. Nous avons par la suite pu mettre en évidence l'intérêt du Dioll pour le suivi de fluctuation du métabolisme cellulaire. En effet, une complémentation du milieu avec un acide gras saturé ou insaturé s'accompagne respectivement de modifications de la fluidité membranaire, avec respectivement une rigidification et une fluidification des membranes. Montrant que le Dioll a la capacité de détecter des variations de fluidité membranaire impactées par des modifications métaboliques. Enfin, nous avons pour la première fois montrée que les sondes préexistantes à l'inverse du Dioll, marquaient les lipides non membranaires (gouttelettes lipidiques). Cette observation met ainsi en lumière les biais que peuvent entraîner les sondes préexistantes lorsque l'on veut mesurer les membranes. L'ensemble de ces résultats faisaient du Dioll un outil performant pour mesurer les variations de fluidité membranaire dans un contexte pathologique et tout particulièrement lors de remodelage du métabolisme que l'on retrouve dans la tumorigenèse.