# THÈSE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

## En écologie de la santé

École doctorale GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau

Unité Mixte de recherche UMR 117 ASTRE - Animal, Santé, Territoires, Risques et Ecosystèmes

## Maladies émergentes en santé animale : diversité génétique et dispersion d'une espèce de moucheron vectrice des virus de la fièvre catarrhale ovine et de Schmallenberg en région paléarctique, *Culicoides obsoletus* (Diptera : Ceratopogonidae)

Présentée par Antoine MIGNOTTE
Le 14 décembre 2020

Sous la direction de Claire GARROS
et Karine HUBER

Devant le jury composé de

<table><tr><td>Stéphanie MANEL, DR, EPHE Paris</td><td>Membre du jury</td></tr><tr><td>Stéphanie JACQUET, Chargé de recherche, CNRS Lyon</td><td>Membre du jury</td></tr><tr><td>Patrick MARDULYN, Pr, Université Libre de Bruxelles</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Renaud VITALIS, DR, INRAE Montpellier</td><td>Président du jury</td></tr><tr><td>Jérôme DEPAQUIT, Pr, Université de Reims Champagne Ardenne</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>Claire GARROS, Chargé de recherche, CIRAD Montpellier</td><td>Directrice de Thèse</td></tr></table>
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UNIVERSITÉ DE MONTPELLIER

École doctorale : GAIA

THÈSE

Pour obtenir le grade de

Docteur de l'Université Montpellier II

Discipline : Écologie de la santé

Présentée et soutenue par

Antoine MIGNOTTE

# Maladies émergentes en santé animale : diversité génétique et dispersion d'une espèce de moucheron vectrice des virus de la fièvre catarrhale ovine et de Schmallenberg en région paléarctique, *Culicoides obsoletus* (Diptera : Ceratopogonidae)

Thèse dirigée par Claire GARROS, CIRAD et Karine HUBER, INRAE

Soutenue le 14/12/2020

Devant le jury composé de

Stéphanie MANEL, DR, EPHE Paris

Stéphanie JACQUET, Chargé de recherche, CNRS Lyon

Patrick MARDULYN, Pr, Université Libre de Bruxelles

Renaud VITALIS, DR, INRAE Montpellier

Jérôme DEPAQUIT, Pr, Université de Reims Champagne Ardenne

Claire GARROS, Chargé de recherche, CIRAD Montpellier

Membre du jury

Membre du jury

Rapporteur

Président du jury

Rapporteur

Directrice de Thèse
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# Résumé

Depuis 2006, des épizooties importantes de fièvre catarrhale ovine et de virus (FCO) de Schmallenberg (SB) sont observées dans la région ouest paléarctique, ces deux virus étant transmis par des moucherons hématophages autochtones du genre *Culicoides* (Diptera : Ceratopogonidae). Ces virus affectent les bovins, les ovins, les caprins et les ruminants sauvages. La dispersion des *Culicoides* correspond à ce que les écologues appellent dispersion stratifiée ou « stratified dispersal ». Elle résulte de la combinaison de dispersion active de proche en proche, sur de courtes distances, et de sauts sur de longues distances via le vent de manière passive ou semi-passive, permettant des sauts de dispersion de plusieurs centaines de kilomètres. *Culicoides obsoletus* est une espèce vectrice importante pour les virus de la FCO et de SB et abondante en région paléarctique. Si la dispersion des *Culicoides* par le vent au-dessus des masses d'eaux est bien établie, il est aussi important d'évaluer la dispersion au-dessus des terres et de déterminer l'influence des facteurs biotiques et abiotiques influant sur celle-ci.

L'objectif de ce travail de thèse est de déterminer, par l'observation des patrons de distribution des fréquences alléliques, comment la dispersion a pu façonner l'arrangement spatial de la diversité génétique et comment elle est influencée par les paysages et par les caractéristiques des habitats qui peuvent favoriser ou limiter les mouvements des *Culicoides*. Pour cela, deux plans d'échantillonnage ont été utilisés : un échantillonnage populationnel à l'échelle de l'Europe (de la Scandinavie aux îles Canaries, à la Turquie), et un échantillonnage individuel à l'échelle française. L'utilisation complémentaire de marqueurs mitochondriaux et nucléaires à ses différentes échelles spatiales nous ont permis (i) de clarifier la distribution et de réviser le schéma taxonomique du Complexe Obsoletus/Scoticus, (ii) de mettre en évidence des flux de gènes importants permettant d'homogénéiser la structure génétique des populations à l'échelle d'un pays et d'un continent, (iii) de quantifier l'impact d'un large éventail de facteurs environnementaux et météorologiques sur la dispersion des *Culicoides* et de mettre en évidence l'importance de la densité d'hôtes, (iv) et de proposer un scénario présentant l'histoire évolutive récente des populations européennes de *C. obsoletus*. L'hypothèse retenue est une recolonisation post-glaciaire récente depuis le refuge glaciaire des Balkans et un refuge plus au nord-est. Ces populations auraient recolonisé ensemble l'ouest de l'Europe, engendrant une admixture des populations.

Nos résultats démontrent une capacité de dispersion de *C. obsoletus* à l'intérieur des terres très importante, qui doit être prise en compte pour les travaux à venir sur la compétence des vecteurs et la modélisation épidémiologique de la transmission des virus transmis.

**Mots-clés** : *Culicoides*, dispersion, génétique des populations, microsatellites, gènes mitochondriaux.
# Summary

## Emerging diseases and animal health: genetic diversity and dispersal of a biting midge species vector of bluetongue and Schmallenberg viruses in the Palearctic region, *Culicoides obsoletus* (Diptera: Ceratopogonidae)

Since 2006, important outbreaks of bluetongue virus (BTV) and Schmallenberg virus (SBV) have been reported in the West Palearctic region. Both viruses are transmitted by hematophagous biting midges of the genus *Culicoides* (Diptera: Ceratopogonidae). These viruses affect wild cattle, sheep, goats and wild ruminants. The dispersion of *Culicoides* corresponds to what ecologists call stratified dispersal. It results from the combination of active dispersal from near to near, over short distances, and jumps over long distances via the wind in a passive or semi-passive way, allowing dispersal jumps of several hundred kilometers. *Culicoides obsoletus* is a recognized vector species for BTV and SBV, abundant in the Palearctic region. While the dispersal of *Culicoides* by wind over water bodies is well established, it is also important to assess the dispersion over land and determine the influence of biotic and abiotic factors influencing it.

The objective of this thesis is to determine by observing the pattern of distributions of allelic frequencies how dispersion may have shaped the spatial arrangement of genetic diversity and how it is influenced by landscapes and habitat characteristics that can promote or limit the movements of *Culicoides*. Two sampling strategies were used: an Europe-wide population sampling (from Scandinavia to the Canary Islands, to Turkey), and an individual sampling at the French level. The complementary use of mitochondrial and nuclear markers at these different spatial scales has allowed us (i) to clarify the distribution and revise the taxonomic scheme of the Obsoletus/Scoticus Complex, (ii) to highlight important gene flows that homogenize the genetic structure of populations at the country and continent level, (iii) to quantify the impact of a wide range of environmental and meteorological factors on *Culicoides* dispersal and highlight the importance of host density, (iv) and to propose a scenario for the recent evolutionary history of European populations of *C. obsoletus*. The hypothesis is a recent post-glacial recolonization from the Balkan ice refuge and a refuge further northeast. These populations would have recolonized together western Europe, resulting in admixture of populations. Our results demonstrate a very important inland dispersal capability of *C. obsoletus*, which must be considered for future works on vector competence and epidemiological modelling of transmitted virus transmission.

**Key-words** : *Culicoides*, dispersal, population genetics, microsatellites, mitochondrial genes.
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BD réalisée par le doctorant
# Remerciements

Merci à Patrick MARDULYN et Jérôme DEPAQUIT d'avoir accepté d'être rapporteurs de cette thèse. Merci également à Stéphanie MANEL, Stéphanie JACQUET et Renaud VITALIS d'être examinateurs de ces travaux. Pour leur soutien financier, je remercie PALE-Blu, VectorNet, et le CIRAD. Je tiens à remercier Erwan QUEMERE, Christine CHEVILLON, et Thierry BALDET d'avoir accepté de faire partie de mon comité de thèse. Vos conseils pendant ce rendez-vous annuel m'ont guidé et permis d'affiner la méthodologie à suivre pour atteindre nos objectifs.

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Je tiens à remercier chaleureusement mes encadrantes Claire GARROS et Karine HUBER. Vous avez été essentielles à l'accomplissement de cette thèse. Je mesure la chance de vous avoir eues à mes côtés pour m'épauler. Claire, comment t'exprimer ma gratitude ? Merci d'avoir été cette oreille attentive dont j'avais besoin, et d'avoir cru en moi quand bien souvent, moi-même je n'y croyais pas. Merci pour tes encouragements, ta patience lors des corrections, mais plus encore, pour ta bonne humeur et ton sourire permanent. Ta force de caractère est inspirante pour l'éternel anxieux que je suis. Merci Karine, pour ta disponibilité, ta gentillesse et tes conseils toujours pertinents qui m'ont permis de murir scientifiquement. Merci de m'avoir guidé de façon bienveillante tout au long de ces trois années et de m'avoir recentré quand il le fallait. Tes connaissances ont sans aucun doute contribué d'une manière significative à l'amélioration de ces travaux de thèse. Merci infiniment à vous deux !

Parce que la collaboration est un point clé de la recherche, je remercie tous les membres du Service d'Epidémiologie spatiale (SPELL) pour leur accueil chaleureux à Bruxelles. Une reconnaissance particulière à Simon DELLICOUR, qui m'a aiguillé dans les analyses de génétique du paysage. Tes compétences et ta pédagogie sont une réelle source d'inspiration. Merci également à l'ensemble de l'Unité Mixte de Recherche Épidémiologie des maladies animales et zoonotiques (EPIA) de l'INRA de Clermont-Ferrand pour leur accueil et particulièrement à Maude JACQUOT, pour son attention et la réceptivité portée à toutes mes interrogations. Je remercie Bruno MATHIEU, pour son accueil à Strasbourg et son aide durant cette thèse. Je tiens à remercier Marie Pierre CHAPUIS, Karine BERTHIER, et Sylvain PIRY,
d'avoir pris le temps de me recevoir, de m'écouter et de me conseiller judicieusement sur les analyses à effectuer.

Enfin, j'exprime ma gratitude à l'ensemble du Collectif Vecteur, Laetitia, Thierry, Ignace... et plus généralement, à l'ensemble des membres de l'unité ASTRE « Animal, Santé, Territoires, Risques et Ecosystèmes », notamment Nathalie VACHIERY et Thierry LEFRANÇOIS, pour m'avoir accueilli au sein de l'unité. Merci à tous les partenaires européens avec qui j'ai eu la chance de collaborer. Merci à toutes les personnes qui ont croisé mon chemin au cours de ces trois années de recherches, que ce soit autour d'un café, d'une discussion, d'un Skype, d'un mail, d'une réunion ou encore d'une bière au soleil.

La recherche ne serait rien sans congrès, et sans les rencontres que l'on fait et que l'on entretient pendant ceux-ci. Merci à Maria, Lyson, Marion et Yannick, d'avoir fait partie de mon aventure de thèse et j'espère à bientôt !

Trois ans, ça en fait des rencontres et des souvenirs. Merci à mes colloques de canap' Clélia et Janis pour avoir supporté mes rires trop forts et mes sautes d'humeurs pendant tant de temps. J'ai été chanceux d'avoir été entouré par vos ondes positives. Et quel plaisir ne pas être le seul à porter un deuxième prénom que je qualifierais d'« original ». Merci pour tout Billy et Jeanine. Merci Cécile, d'avoir ensoleillé le bureau par ta bonne humeur, ton sourire et tes cours de ukulélé. Merci à Antoni, dont le talent en photoshop n'a d'égal que celui pour la danse. Merci à Maxime, pour avoir fait tourner l'activité familiale en Bourogne en mon absence. Merci à l'éminent numérologue Roger jr ELOIFFIN, dit le bien né, pour ses prédictions avisées. Merci à Marc HOULE pour son dynamisme. Merci à micky mike pour l'ensemble de son œuvre. Merci au déménagement de nous avoir laisser l'opportunité de laisser notre trace dans l'unité. Merci au canapé du bureau de m'avoir permis d'assoir mon statut de doctorant. En clair, merci à tous les copains de thèse, Cécile, Roger, Antoni, Marine, Maxime, Etienne, Julien, Remi, Célia¹, Célia², Rémy... vous avez rendu cette expérience absolument inoubliable.

Merci également à tous les copains Bourguignons pour leur soutien : Bubu, Mout, Bibiche, JB, Marine, Eugénie, Eliott, Léa, Emilie, Coralie... et parce que le rugby c'est un ballon avec des copains autour, quand il n'y a plus de ballon, il reste le copains, merci à vous d'être toujours là après toutes ces années : Lit's, Jules, Coco...

Merci infiniment à toute ma famille d'avoir été un soutien indéfectible, toujours à mes côtés. Un merci tout particulier à mon père, ma mère, ma Juju et mes grands-parents, merci infiniment d'être là et de m'avoir soutenu jusqu'au bout !

Enfin, merci à ma petite voix, pour son soutien, pas seulement depuis le début cette thèse mais depuis ces 10 dernières années. Merci pour ta compréhension depuis tout ce temps.

J'en oublie encore certainement, ne m'en voulez pas si votre nom n'apparait pas, MERCI à tous !
## Publications de rang A

### Article 1

**Mignotte A**, Garros C, Gardès L, Balenghien T, Duhayon M, Rakotoarivony I, Tabourin L, Poujol L, Mathieu B, Ibañez-Justicia A, Deniz A, Cvetkovikj A, Purse BV, Ramilo DW, Stougiou D, Werner D, Pudar D, Petrić D, Veronesi E, Jacobs F, Kampen H, Pereira da Fonseca I, Lucientes J, Navarro J, Martinez-de la Puente J, Stefanovska J, Searle KR, Khallaayoune K, Culverwell CL, Larska M, Bourquia M, Goffredo M, Bisia M, England M, Robin M, Quaglia M, Miranda-Chueca MA, Bødker R, Estrada-Peña R, Carpenter S, Tchakarova S, Boutsini S, Sviland S, Schäfer SM, Ozoliņa Z, Segliņa Z, Vatansever Z, Huber H. (2020). **The tree that hides the forest: Cryptic diversity and phylogenetic relationships in the Palearctic species vector Complex *Culicoides obsoletus/C. scoticus* (Diptera: Ceratopogonidae) at the European level.** Parasites Vectors 13, 265, https://doi.org/10.1186/s13071-020-04114-, (impact factor 3.43).

### Article 2

**Mignotte A**, Garros C, Gardès L, Balenghien T, Duhayon M, Rakotoarivony I, Huber K. Recent phylogeographic history in western Europe of one main species vector of bluetongue and Schmallenberg viruses, *Culicoides obsoletus* (Diptera: Ceratopogonidae) demonstrates important continental connectivity. *Sera soumis dans Scientific Reports* (impact factor 5.578)

### Article 3

**Mignotte A**, Garros C, Dellicour S, Jacquot M, Gilbert M, Gardès L, Balenghien T, Duhayon M, Rakotoarivony I, de Wavrechin M, Huber K. **Important dispersal capacity of one main species vector of bluetongue and Schmallenberg viruses *Culicoides obsoletus* (Diptera: Ceratopogonidae) revealed by landscape genetic analyses** at French scale. *Soumis en septembre 2020 dans Parasites & Vectors* (impact factor 3.43), https://dx.doi.org/10.21203%2Frs.3.rs-75603%2Fv1
## Articles publiés hors du contexte de la thèse

Bourquia M, Garros C, Rakotoarivony I, Gardes L, Huber K, Boukhari I, Delécolle JC, Baldet T, **Mignotte A**, Lhor Y, Khallaayoune K, Balenghien T. 2019. **Update of the species checklist of *Culicoides* Latreille biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) of Morocco. Two new records, *C. paolae* Boorman and *C. subfagineus* Delécolle and Ortega. Parasites Vectors 12, 459, https://doi.org/10.1186/s13071-019-3720-4

## Communications orales

Mignotte A, Reveillaud J, Huber K. Population genetics and bacterial community structures of *Culicoides obsoletus*: a mirror of European geography? *Réunion annuelle de projet PALE-Blu*, Rabat, Maroc, 19 septembre 2018

Mignotte A. The tree that hides the forest: Cryptic diversity and phylogenetic relationships in the Palearctic species vector Complex *Culicoides obsoletus/C. scoticus* (Diptera: Ceratopogonidae) at the European level. *Réunion annuelle de projet PALE-Blu*, Guilianova, Italie, 25 septembre 2019

Huber K, Jacquet S, Gardès L, **Mignotte A**, Balenghien T, Bouyer J, Garros C. 2017. Where do they come from ? where do they go ? Population genetics studies on *Culicoides* biting midges. In: Sove 2017 New technology conquering old vectors ? SOVE, UIB. Palma de Mallorque : SOVE, 133. ISBN 978-84-697-6086-4 International SOVE congress: New technology conquering old vectors?. Palma de Mallorque, Espagne, 1 Octobre 2017/7 Octobre 2017.

## Poster

Mignotte A, Huber K, Gardès L, Balenghien T, Duhayon M, Rakotoarivony I, Tabourin L, Martinez de la Puente J, Lucientes J, Ibañez-Justicia A, Kampen H, Werner D, England M, Carpenter S, Garros C. 2019. **Landscape genetics of *Culicoides* vector species : evaluation of cryptic diversity and gene flow in the Palearctic region.** In : 21st E-SOVE Meeting Abstract Book. Arthropod Vector Science for the benefit of society: Educate, Empathize, Engage. ESOVE. Palermo : Italie, 22 Octobre 2018/26 Octobre 2018.
Table des matières

<table><tr><td>RESUME</td><td>5</td></tr><tr><td>SUMMARY</td><td>6</td></tr><tr><td>REMERCIEMENTS</td><td>8</td></tr><tr><td>VALORISATION SCIENTIFIQUE</td><td>I</td></tr><tr><td>TABLE DES ILLUSTRATIONS : FIGURES</td><td>V</td></tr><tr><td>TABLE DES ILLUSTRATIONS : TABLEAUX</td><td>VIII</td></tr><tr><td>INTRODUCTION GENERALE</td><td>1</td></tr><tr><td>I) L'ETUDE DE LA DISPERSION CHEZ LES ARTHROPODES VECTEURS</td><td>12</td></tr><tr><td>1.1) Des approches directes parfois inadaptées</td><td>12</td></tr><tr><td>1.2) Evaluation des flux de gènes par méthodes indirectes lors de la dispersion d'insectes vecteurs</td><td>13</td></tr><tr><td>1.3) Evaluation et quantification de l'impact des facteurs environnementaux sur les flux de gènes d'insectes vecteurs</td><td>17</td></tr><tr><td>1.4) Des flux de gènes contemporains à la création de nouvelles espèces</td><td>24</td></tr><tr><td>II) CULICOIDES OBSOLETUS, UN MODELE D'ETUDE DE LA DISPERSION D'ESPECES VECTRICES DE VIRUS D'INTERET VETERINAIRE</td><td>30</td></tr><tr><td>II.1) Généralités sur la biologie et l'écologie des Culicoides</td><td>30</td></tr><tr><td>II.2) Le rôle des Culicoides dans la transmission de pathogènes en Europe du nord</td><td>33</td></tr><tr><td>II.3) La dispersion stratifiée chez les Culicoides</td><td>37</td></tr><tr><td>II.4) Culicoides obsoletus : un besoin de clarification taxonomique</td><td>42</td></tr><tr><td>PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS DE LA THESE</td><td>46</td></tr><tr><td>CHAPITRE I : THE TREE THAT HIDES THE FOREST: CRYPTIC DIVERSITY AND PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS IN THE PALAEARCTIC VECTOR OBSOLETUS/SCOTICUS COMPLEX (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) AT THE EUROPEAN LEVEL</td><td>49</td></tr><tr><td>SUPPLEMENTARY INFORMATION</td><td>64</td></tr><tr><td>CHAPITRE II : RECENT PHYLOGEOGRAPHIC HISTORY IN WESTERN EUROPE OF ONE MAIN SPECIES VECTOR OF BLUETONGUE AND SCHMALLENBERG VIRUSES, CULICOIDES OBSOLETUS (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) DEMONSTRATES IMPORTANT CONTINENTAL CONNECTIVITY</td><td>73</td></tr><tr><td>ABSTRACT</td><td>76</td></tr><tr><td>INTRODUCTION</td><td>77</td></tr><tr><td>METHODS</td><td>80</td></tr><tr><td>RESULTS</td><td>84</td></tr><tr><td>DISCUSSION</td><td>87</td></tr></table>
<table><tr><td>CONCLUSION</td><td>91</td></tr><tr><td>FIGURES AND TABLES</td><td>93</td></tr><tr><td>SUPPLEMENTARY INFORMATION</td><td>100</td></tr><tr><td>REFERENCES</td><td>116</td></tr></table>

## CHAPITRE III : IMPORTANT DISPERSAL CAPACITY OF ONE MAIN SPECIES VECTOR OF BLUETONGUE AND SCHMALLENBERG VIRUSES *CULICOIDES OBSOLETUS* (DIPTERA: CERATOPOGONIDAE) REVEALED BY LANDSCAPE GENETIC ANALYSES AT FRENCH SCALE

<table><tr><td></td><td>126</td></tr></table>

<table><tr><td>ABSTRACT</td><td>129</td></tr><tr><td>BACKGROUND</td><td>130</td></tr><tr><td>METHODS</td><td>133</td></tr><tr><td>RESULTS</td><td>139</td></tr><tr><td>DISCUSSION</td><td>142</td></tr><tr><td>CONCLUSIONS</td><td>146</td></tr><tr><td>FIGURES AND TABLES</td><td>148</td></tr><tr><td>SUPPLEMENTARY INFORMATIONS</td><td>152</td></tr><tr><td>REFERENCES</td><td>164</td></tr></table>

## DISCUSSION GENERALE

<table><tr><td>I) LA TAXONOMIE MOLECULAIRE DE C. OBSOLETUS : L'ARBRE QUI CACHE LA FORET</td><td>173</td></tr><tr><td>II) L'HISTOIRE EVOLUTIVE DE C. OBSOLETUS EN EUROPE : UN MORCEAU DU PUZZLE</td><td>178</td></tr><tr><td>III) DE LA DIRECTION DU VENT A LA DENSITE D'HOTES : LES FACTEURS ENVIRONNEMENTAUX QUI FAVORISENT LA DISPERSION DES CULICOIDES</td><td>187</td></tr><tr><td>IV) DES SIMULATIONS DE CIRCULATION ET UNE LUTTE ANTI VECTORIELLE ADAPTEE A DE TELS FLUX DE GENES ?</td><td>191</td></tr></table>

## CONCLUSION GENERALE

## REFERENCES

## RESUME
# Table des illustrations : figures

## Introduction générale

**Figure 1.** Photos de *Culicoides*. (A et B) *Culicoides nubeculosus*, (C) Taille d'un *Culicoides* (*Culicoides impunctatus* à gauche) par rapport à un moustique (à droite) pendant le gorgement, (D) Patron alaire de *Culicoides obsoletus*, (E) Patron alaire de *Culicoides scoticus*. 30

**Figure 2.** Représentation schématique du cycle de développement et de vie des *Culicoides* (Source : Office vétérinaire fédérale 2010, Thèse Roger Venail 2014, Purse et al 2005, Purse et al 2015, Thèse Bruno Mathieu 2011, source des dessins : http://illuminationstudios.com/) 32

**Figure 3.** Distribution géographique des six principaux virus transmis par les *Culicoides* (Purse *et al*, 2015). AHSV ; virus de la peste équine ; AKAV, virus Akabane ; BTV, virus de la fièvre catarrhale ovine ; EHDV, virus de la maladie hémorragique ; OROV, virus de l'Oropouche ; SBV, virus de Schmallenberg. 34

**Figure 4.** Représentation schématique de la dispersion stratifiée des *Culicoides*. Le rouge implique une dispersion active et le bleu une dispersion passive. L'épaisseur des flèches rouges et bleues est représentative de l'intensité de la dispersion (Source Office vétérinaire fédérale 2010, Thèse Roger Venail 2014, Purse *et al* 2005, Purse *et al* 2015, Thèse Bruno Mathieu 2011). 41

**Figure 5.** Aire de répartition mondiale de *C. obsoletus*. Le gris indique les pays dans lesquels l'espèce est présente, le blanc indique les pays dans lesquels n'a pas été rapportée jusqu'à présent. 45

## Chapitre I

**Figure S1.** Maximum likelihood phylogenetic tree using 16S rDNA. Values at the nodes represent bootstrap values greater than 800 for the most important nodes (1000 replicates). 70

**Figure S2.** Maximum likelihood phylogenetic tree using cox1. Values at the nodes represent bootstrap values greater than 800 for the most important nodes (1000 replicates). 71

**Figure S3 -Maximum likelihood phylogenetic tree using 28S rDNA.** Values at the nodes represent bootstrap values greater than 800 for the most important nodes (1000 replicates). 72

## Chapitre II

**Figure 1.** Graphical representation of the 4 scenarios simulated using an approximate Bayesian computation (ABC) approach on microsatellite data. Details of all scenarios and parameters are shown in Supplementary Table S2. Red circles correspond to a bottleneck event. T1, T2 and T3 correspond to successive dates of divergence times. NO: population from Norway (Narvik), SP: population from Spain (Torre del campo), FR: population from France (Les Hitres), GR: population from Greece (Vestelino). 93

**Figure 2.** Median-joining haplotype networks of cox1 mitochondrial sequences of *C. obsoletus*. The size of the circles is proportional to the number of individuals with that haplotype. Colors represent the country of sampled individuals. The length of the branches separating haplotypes is proportional to the number of mutational steps between them. 94
**Figure 3.** Mitochondrial genetic differentiation and isolation-by-distance analyses of *C. obsoletus*. Results of the smoothing of pairwise measures performed with MAPI and based on (a) $F_{ST}/(1-F_{ST})$ and (b) Isolation-by-distance analysis, Mantel test and a kernel density estimate of pairwise correlations from each sample between ($F_{ST}/(1-F_{ST})$ and geographic distance In panels (a), genetic dissimilarity is represented by a color scale ranging from brown (lower genetic dissimilarity) to blue (higher genetic dissimilarity). The Canary Islands populations are not considered in these analyses. 95

**Figure 4.** Mismatch distribution plots for 106 haplotypes of *cox1* of *C. obsoletus*. (a) The mean estimate and the 90, 95 and 99% highest posterior density (HPD) limits are indicated. 96

**Figure 5.** Microsatellite genetic clustering and genetic diversity of *C. obsoletus* sampled populations. Results of the genetic clustering analyses performed with STRUCTURE (a) and rarefied allelic richness of populations (b). Panels (1) corresponds to an enlargement of the geographical area (a) of the panel circled in red. One specific color has been assigned to each genetic cluster in panels (a) and (1). 97

**Figure 6.** Microsatellite genetic differentiation and isolation-by-distance analyses of *C. obsoletus*. Results of the smoothing of pairwise measures performed with MAPI and based on (a) $F_{ST}/(1-F_{ST})$ and (b) Isolation-by-distance analysis, Mantel test and a kernel density estimate of pairwise correlations from each sample between ($F_{ST}/(1-F_{ST})$ and geographic distance. In panels (a), genetic dissimilarity is represented by a color scale ranging from brown (lower genetic dissimilarity) to blue (higher genetic dissimilarity). The Canary Islands population is not considered in these analyses because of its insularity. 98

**Figure S1.** Identification of the optimal number of genetic clusters (K) inferred by STRUCTURE using the delta(K) and L'(K) methods. (a) and (b) panels corresponds to analyses with all 829 individuals, and (c) and (d) panels corresponds to STRUCTURE analyses on central Europe dataset. 110

**Figure S2.** Genetic clustering of *C. obsoletus*. (a) Results of the genetic clustering analyses performed with STRUCTURE on complete dataset for K=2 (second most probable K), and (b) Results of the genetic clustering analyses performed with STRUCTURE on dataset of central Europe for K=2 (most probable K). Panels (1) corresponds to an enlargement of the geographical area (a) of the panel circled in red. One specific color has been assigned to each genetic cluster in panels (a) and (b). 111

**Figure S3.** Map of genetic diversity of 2409 *cox1* sequence of *C. obsoletus*. 112

**Figure S4.** Neighbor-joining tree of *C. obsoletus* population based on the distance of Cavalli-Sforza & Edwards (1967) computed on microsatellite dataset. The belonging of populations to a genetic cluster defined by the STRUCTURE Analysis is represented by the colors, orange, green and blue for cluster 1, 2 and 3 respectively. Bootstraps values were calculated over 1000 replicates and are represented as percentage and only values superior to 60% are reported. 113

**Figure S5.** Heatmap of $F_{ST}/(1-F_{ST})$ of all population for microsatellite dataset of *C. obsoletus* in Europe. Levels of genetic distance is represented by color gradient, red mean low level of differentiation and yellow mean high levels of differentiation. The belonging of populations to a genetic cluster defined by the STRUCTURE Analysis is represented by the colors, orange, green and blue for cluster 1, 2 and 3 respectively. 114

**Figure S6.** PCA summary statistics simulated under scenario 1, the most probable scenarios. Yellow dot represents the real data set. Large dots correspond to simulated posteriors and the small circles correspond to simulated statistics from the prior statistics. 115
# Chapitre III

**Figure 1. Genetic clustering and genetic differentiation of *C. obsoletus*.** Results of the genetic clustering analyses performed with GENELAND (a) and STRUCTURE (b), as well as smoothing of pairwise measures performed with MAPI and based on (c) Rousset's ($a_R$) and (d) FCA inter-individual genetic distances (see the text for further details). One specific color has been assigned to each genetic cluster in panels (a) and (b). In panels (c) and (d), genetic dissimilarity is represented by a color scale ranging from red (lower genetic dissimilarity) to blue (higher genetic dissimilarity). 148

**Figure 2. Results of anisotropic isolation-by-distance analyses.** Polar plots show the correlation between geographical projected distances by angle and inter-individual genetic distances ($a_R$, LKC, and FCA)... 149

**Figure 3. Bearing analysis: correlation between genetic ($a_R$, LKC, and FCA) and geographical distances as a function of the angle between sampling sites.** Circles and crosses indicate significant and non-significant values, respectively. Abbreviations “E”, “W”, “S” and “N” refer to “East”, “West”, “South” and “North”, respectively. 150

**Figure S1.** Environmental variables tested as potential factors that could impact inter-individual genetic differentiation of *C. obsoletus* in France (raster cell resolution: 0.04 arcmin). 158

**Figure S2. Map of wind direction averaged from 2000 to 2010.** Sampling sites are represented by black points. The color scale represents the wind direction from 0 to 360 degrees from North The arrowheads indicate the exact wind direction of each raster pixel. 159

**Figure S3.** Analytical workflow 160

**Figure S4.** Isolation-by-distance analyses: density plots, Mantel tests and linear regressions performed with each inter-individual genetic distance considered in this study. 161

**Figure S5.** Identification of the optimal number of genetic clusters (K) inferred by STRUCTURE using the delta(K) and L'(K) methods. 162

**Figure S6.** Population genetic structure results by clustering analyses performed STRUCTURE. One specific color has been assigned to each inferred genetic cluster. 163

# Discussion générale

**Figure 1. Hypothèse de scénario d'expansion mondiale de *C. obsoletus*.** Les zones grises indiquent des pays dans lesquels *C. obsoletus* est présent. Les zones vertes représentent des zones d'admixture des populations. La zone bleue correspond à une zone en Europe qui n'a pas pu être incluse dans nos analyses mais qui devra être considérée dans le futur. Les cercles blancs indiquent l'emplacement de refuges glaciaires. Ne désigne une expansion démographique. Le beige désigne l'abaissement du niveau de la mer durant la glaciation. 186
# Table des illustrations : tableaux

## Chapitre I

**Tableau S1.** Information on adult female *Culicoides* sampling sites and results of specific assignation using cox1.

**Tableau S2.** Primers used for PCRs and sequencing in this study.

**Tableau S3.** Reference sequences used for specific assignation.

**Tableau S4.** Information on all *Culicoides* sequenced and GenBank accession numbers.

## Chapitre II

**Tableau 1. Result of confidence in scenario selection based on posterior probabilities to retrace evolutionary history of *C. obsoletus* in Europe by approximate Bayesian Computation (ABC) on microsatellite data.**

95% confidence intervals and type I and II errors were presented. Red circles correspond to a bottleneck event. T1, T2 and T3 correspond to successive dates of divergence between two taxa. NO: Norwegian population (Narvik), SP: Spanish population (Torre del campo), FR: French population (Les Hitres), GR: Greek population (Vestelino).

**Tableau S1.** Metadata of the 2409 sequences of cox1 *C. obsoletus*.

**Tableau S2. Result of most probable scenario for all ABC simulation.**

95% confidence intervals and type I and II errors were presented to. Red circles corresponds to a bottleneck event. T1, T2 and T3 correspond to successive dates of divergence between two taxa. NO: Norway population (Narvik), SP: Spain population (Torre del campo), FR: French population (Les Hitres), GR: Greece populations (Vestelino).

**Tableau S3. Demographic, historical and mutational prior parameters for ABC analyses.** Effective population sizes (N) are expressed in number of diploid individuals and times of events (t) in number of generations going back to the past.

**Tableau S4.** Population genetic diversity of 2409 cox1 sequence of *C. obsoletus* in Europe. Pi: Nucleotide diversity per site, Nh: haplotype number.

**Tableau S5.** Primers of the 11 microsatellite markers used to genotype *C. obsoletus* populations. "DYE": fluorochrome name, "Tm": half denaturation temperature in degree, "bp": base pairs.

**Tableau S6.** Microsatellite dataset of 829 *C. obsoletus* in Europe.

**Tableau S7.** Sampling sites and associated genetic diversity for microsatellite data set. N: sample size, Ho: observed heterozygosity, Hs: expected heterozygosity, FIS: Fixation index, Ar : allelic richness, Ne : sample size. P-values obtained for the Hardy-Weinberg test were adjusted for multiple comparisons at the nominal level (5%) of 0.00017.

**Tableau S8.** Genetic diversity by locus. Ho: observed heterozygosity, Hs: expected heterozygosity, FIS: Fixation index, SAD: short alleles dominance, CI: confidence index.

**Tableau S9.** Posterior checking using all the summary statistics for ABC inferences of scenario 1, the most probable scenarios.
# Chapitre III

**Tableau 1. Results of multiple regressions on distance matrices (MRDM) and additional parameters derived from commonality analysis (CA).** Pearson's correlation coefficient (*r*), significant regression coefficient (β), as well as unique (U) and common (C) contributions of environmental distances to the variance in the dependent variable. [C]/[R] indicate if the considered environmental raster was treated as a conductance or as a resistance factor, and *k* corresponds to the re-scaling parameter used to transform the initial raster file. 151

**Tableau S1. Sampling sites and associated genetic diversity.** N: sample size, Ho: observed heterozygosity, Hs: expected heterozygosity, FIS: Fixation index. 152

**Tableau S2.** Reference sequences used for specific assignation. 153

**Tableau S3.** Origin and numbers of individuals used to build up the DNA library necessary for the development of the microsatellite markers. 154

**Tableau S4.** Primers of the 13 microsatellite markers used to genotype *C. obsoletus* populations. "DYE": fluorochrome name, "TFm": half denaturation temperature in degree, "bp": base pairs. 155

**Tableau S5.** Genetic diversity by locus. Ho: observed heterozygosity, Hs: expected heterozygosity, FIS: Fixation index, SAD: short alleles dominance. 156

**Tableau S6.** Results of univariate analyses: determination coefficients R²'s estimated from univariate regressions between genetic and environmental distances. [C]/[R] indicate if the considered environmental raster was respectively treated as a conductance or resistance factor for the computation of environmental distances with circuit theory. Q: Difference between environmental MRDM R² and null raster MRDM R². The results for K=10 are not present here as they were non-significant. 157
La dispersion est un processus universel dans le monde vivant. Que ce soit au stade œuf, juvénile ou à l'âge adulte, tout être vivant possède une phase de dispersion au cours de sa vie. La dispersion désigne le mouvement ponctuel d'individus entre le lieu de naissance et de reproduction, ou entre différents lieux de reproduction (Austerlitz et al, 2007; Baguette et al, 2013; Baguette and Van Dyck, 2007; Benton and Bowler, 2012; Cayuela et al, 2018; Clobert et al, 2009; McMichael, 2013; Semenza et al, 2016). Les organismes dits fixés, comme les plantes ou les coraux, peuvent disperser de manière passive via des propagules (œufs, gamètes). Les espèces mobiles, au contraire, peuvent effectuer des déplacements durant l'intégralité de leurs cycle biologique. La dispersion permet la mise en contact avec de potentiels partenaires de reproduction. Elle peut augmenter la valeur sélective de l'individu et permettre la colonisation de nouveaux territoires. Des adaptations morphologiques et comportementales favorisant la dispersion ont été sélectionnées au cours de l'évolution afin de permettre aux propagules et aux différents stades de vie de se disperser de façon active ou passive (ailes, crochet sur les akènes, expansion ailée ou hydrophobie des graines).

## Dispersion, migration et conséquences génétiques

Les termes "dispersion" et "migration" sont souvent utilisés en synonyme (Broquet and Petit, 2009; Cayuela et al, 2018). La migration, au sens strict du terme, désigne « *le mouvement des organismes entre populations* » (Lefevre et al, 2016). Ces mouvements peuvent être récurrents, à double sens, aller et retour. Cependant, dans le lexique de la biologie évolutive, le terme « migration » est utilisé dans un sens plus précis (Lefevre et al, 2016), comme « *le mouvement d'individus entre des populations adjacentes et leur résidence pendant une durée suffisante pour contribuer au pool génétique des populations d'accueil permettant de réduire la différentiation génétique entre populations* » (Frankham, 2009). La migration (terme préféré à dispersion) est alors une force évolutive, car elle est capable de modifier les fréquences alléliques des populations. Un événement de dispersion générant une reproduction dans le nouvel environnement est dit efficace (Broquet and Petit, 2009; Cayuela et al, 2018). Les déplacements réguliers d'individus de manière quotidienne sans reproduction ne sont donc pas considérés comme de la dispersion au sens évolutif puisqu'il n'y a pas d'échange de matériel génétique (Andersson and Bodin, 2009). Lors d'un événement de dispersion active, l'échange
d'individus et de gamètes permet une contribution au pool génétique de la population
accueillant les migrants et correspond à un flux de gènes entre les deux populations, tendant à
homogénéiser les fréquences alléliques entre ces populations (Lowe and Allendorf, 2010;
Takken et al, 2008). Cependant, la façon dont les individus se déplacent dans l'espace (le
modèle de migration), influence fortement la distribution spatiale du polymorphisme, c'est-à-
dire la structure spatiale des populations. Dans l'ensemble de ce manuscrit, nous utiliserons le
mot dispersion au sens évolutif du terme, c'est-à-dire avec une contribution au pool génétique.

Le modèle le plus simple pour représenter la dispersion est conceptualisé par Wright (1931) avec le modèle en îles (Wright, 1931). Ce modèle décrit une population de taille infinie (population continent) et une infinité de sous-populations adjacentes de taille finie (population île). En raison de leur taille limitée, les sous-populations sont impactées par la dérive génétique, définie comme la modification aléatoire des fréquences des alléliques au cours des générations. Cet échantillonnage aléatoire des allèles va conduire, en l'absence de mutations, à la fixation de l'un des allèles et à une homogénéisation de la sous-population. En l'absence de migration, cela va générer de la divergence génétique entre les sous-populations. Plus la population est de petite taille, plus la dérive génétique agir rapidement. La taille d'une population détermine ainsi le rythme de la dérive génétique. Cependant, le nombre d'individus au sein de la population participant de manière active à la reproduction est rarement égal au nombre total d'individus dans la population. La taille efficace d'une population (Ne) désigne alors le nombre d'individus d'une population « idéale » de Wright-Fisher (population où la taille efficace est égale au nombre total d'individus dans la population) pour laquelle on aurait un degré de dérive génétique équivalent à celui de la population réelle (où la taille efficace est rarement égale au nombre total d'individus dans la population). Cette notion permet de quantifier le rythme auquel une population perd sa diversité génétique par dérive génétique.

En l'absence d'autres forces évolutives, la migration tend à homogénéiser les fréquences
alléliques entre populations. Plus les flux de gènes seront importants entre les populations, plus
la diversité et les fréquences des pools génétiques auront tendance à s'homogénéiser
(Saastamoinen et al, 2018). Les flux de gènes entre populations limitent l'hétérogénéité
génétique (Abbott, 2011; Bjornstad et al, 1999; Hastings et al, 1993; Ranta et al, 1997) et
l'extinction de populations locales (Gotelli, 1991; Lowe and Allendorf, 2010).Il est à noter que
le modèle en îles fait l'hypothèse, peu réaliste, d'un équilibre entre migration, mutation et dérive
(de Meeus et al, 2007). La mutation correspond aux erreurs de copie lors de la duplication de
l'ADN durant la construction des gamètes. Elle va modifier les fréquences alléliques des loci qu'elle affecte. La mutation à elle seule ne représente pas une force très puissante de l'évolution des populations, car les taux de mutation sont en général assez bas (de Meeus et al, 2007). Cependant, c'est la seule source de nouveauté héritable et associée à la dérive et à la sélection, la mutation représente une clé de l'évolution et de la structure génétique des populations.

La notion de distance entre sous-populations a été introduite par le modèle d'isolement par la distance émis par Wright (1943). Plus réaliste que le modèle en îles, ce modèle prend en compte la dispersion des individus sur de courtes distances. La distance va ainsi limiter la probabilité que les individus s'accouplent les uns avec les autres et donc la différenciation génétique va s'accumuler avec la distance (Wright, 1943). D'autres modèles théoriques font intervenir une composante géographique où l'éloignement des sous-populations va influencer les probabilités d'échanges de gènes, comme le modèle en pas japonais "stepping stone model" (Kimura 1953) (où les migrants dispersent uniquement entre populations adjacentes) ou le « neighbourhood model » (Leblois et al, 2004; Rousset, 2000) (où l'apparentement entre individus diminue avec la distance géographique qui les séparent, même sans barrière à la dispersion). Ainsi, le modèle de migration influence la distribution spatiale du polymorphisme. Tous ces modèles tentent de prédire l'agencement spatial de la diversité génétique (Gaggiotti and Smouse, 1996; Hanski, 1998; Hanski and Gaggiotti, 2004; Kimura, 1953; Levins, 1969). Cependant, ces modèles résument le paysage à la distance géographique qui sépare les différentes parcelles et négligent l'hétérogénéité du paysage.

## Dispersion et paysage

En écologie, le paysage est défini comme un ensemble d'interactions et de processus au sein d'une aire géographique spatialement hétérogène dont l'échelle et l'étendue sont pertinentes avec la résolution du phénomène (Turner, 2005). Le paysage, d'un point de vue individuel, se définit par la niche écologique propre à l'individu, c'est-à-dire un ensemble de ressources biotiques et abiotiques réparties de manière hétérogène dans l'espace. Les habitats dans lesquels les organismes vivent, influencent les processus de dynamiques démographiques, de flux génétiques et d'évolution adaptative. L'hétérogénéité du paysage est au centre de la théorie de la biogéographie insulaire de MacArthur & Wilson (1967) (MacArthur, 1967). Cette théorie formalise qu'au sein d'un paysage hétérogène, des individus vont se distribuer
spacialement en populations en fonction des parcelles d'habitats qui leurs sont favorables (les
îles). Les organismes ne sont donc pas répartis de manière homogène dans le paysage (Sork,
2016; Wiens *et al*, 1993).

La théorie de la biogéographie insulaire décrit également que le nombre d'espèces dépend de la surface d'habitat disponible et de la distance géographique qui sépare l'île du continent. Ainsi, plus une île sera éloignée du continent, plus le nombre de propagules atteignant l'île sera faible. Bien qu'initialement développée pour un système insulaire, cette théorie s'applique à tous types de populations isolées au sein de zones spatiales favorables, et sera par la suite formalisée sous l'appellation de métapopulation par Levins (1969) (Levins, 1969). En écologie, la capacité de dispersion d'un organisme va influencer sa capacité de colonisation de nouveaux patchs d'habitats. La biogéographie insulaire de MacArthur & Wilson et la théorie des métapopulations de Levins ont également donné naissance au modèle sources-puits de Pulliam (1988) (Pulliam, 1988). Ce modèle reprend l'idée principale de la biogéographie insulaire en y ajoutant la possibilité de sauvetage de petites populations par l'arrivée de nouveaux individus issus de plus grosses populations, permettant de renforcer le pool génétique local.

**Encadré 1. Représentation et quantification de la connectivité du paysage**

Les données permettant de représenter un facteur environnemental dans un paysage peuvent être de nature continue, telles que l'humidité ou la température, ou ordonnées en catégories telles que les différents types de couverture paysagère. L'utilisation de grille ou « raster » en anglais, permet de cartographier l'hétérogénéité paysagère. La grille représentant le paysage est alors découpée en pixels d'une taille prédéfinie appelé grain. Puis, une valeur représentative du facteur environnemental souhaité est attribuée à chaque pixel formant ainsi une grille environnementale. Différents modèles théoriques permettent de quantifier la connectivité paysagère entre populations. Les approches basées sur les transects, visent à créer un tracé en ligne droite entre deux sites puis de faire l'inventaire de chaque caractéristique paysagère pouvant limiter la dispersion (Angelone et al, 2011). D'autres approches utilisent des surfaces de résistances paysagères. Les surfaces de résistances sont des grilles spatiales, dans lesquelles chaque pixel ne représente pas le facteur environnemental en lui-même, mais une valeur directe du frein que représente le facteur environnemental sur le flux de gènes. Le chemin le moins coûteux calcule le chemin qui limite la résistance paysagère entre deux points (X noir) qui n'est pas toujours celui avec la distance géographique ou linéaire la plus courte.
<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Paysage hétérogène</figcaption></figure>

<figure><img src="image_16.png" /></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Caractérisation du paysage en terme
de valeur de perméabilité paysagère</figcaption></figure>

Distance
géographique
(Transect)

Distance paysagère
(Least path cost)

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Grille de résistance paysagère</figcaption></figure>

Valeur de
résistance
paysagère

Surface de résistance hypothétique qui représente le mouvement de flux de gènes à travers le paysage.

Ces méthodes permettent de générer des matrices de distances environnementales représentatives de la perméabilité paysagère entre deux sites. Ainsi le « *Least-cost path modelling* » estime le chemin optimal entre deux sites, qui minimise le coût en termes de valeurs de résistances paysagères cumulées entre les populations (Keller *et al*, 2014). Le modèle « *circuit-based* » (McRae, 2006), basé sur la théorie des circuits électriques permet quant à lui d'estimer l'ensemble des chemins possibles entre les populations à l'aide des surfaces de résistances paysagères et ainsi générer des mesures de connectivité et d'isolement mais aussi identifier les corridors et autres éléments importants du paysage reliant les parcelles d'habitat (Spear *et al*, 2015a). Les approches utilisant des surfaces de résistances permettent donc de prendre en considération la configuration du paysage contrairement aux méthodes par transect.

La structure et la composition du paysage sont les moteurs de la distribution des populations et des organismes. Par conséquent, le paysage va impacter la dispersion entre les patchs d'habitats favorables, c'est le concept de connectivité (Encadré 1). La connectivité paysagère structurelle représente l'agencement spatial et la quantité des parcelles favorables ainsi que les corridors
permettant de les relier (Lutz Tischendorf and Fahrig, 2000; Taylor et al, 1993; Uezu et al,
2005). La connectivité fonctionnelle désigne l'impact des éléments paysagers sur la dispersion.
Selon les différents traits d'histoire de vie propres à l'organisme étudié, certains facteurs
environnementaux peuvent limiter ou favoriser la dispersion (Taylor et al, 1993; Uezu et al,
2005). Lorsque le paysage facilite la dispersion d'un individu dans l'espace, on parle alors de
perméabilité paysagère. Au contraire, lorsque celui-ci est ralenti par une composante
environnementale, on parle de résistance paysagère. Toute modification de la structure, de la
composition ou de la qualité de ce paysage peut impacter la dispersion des organismes. Par
exemple, lors de la fragmentation d'un habitat, les flux de gènes sont perturbés par la scission
de l'espace favorable en plusieurs espaces favorables mais de plus faible surface, séparés par
des zones où l'aptitude phénotypique de l'individu est plus faible.

Les différents types de dispersion

La littérature décrit le processus de dispersion en trois étapes : l'émigration, la phase mobile entre les deux matrices paysagères et l'immigration (Baguette and Van Dyck, 2007; Clobert et al, 2009). L'émigration désigne la phase de départ de l'individu de sa matrice paysagère de naissance ou de reproduction. A l'inverse, l'immigration fait référence à l'installation dans la nouvelle matrice faisant office de nouveau lieu de reproduction.

La dispersion est guidée par les caractéristiques biotiques et abiotiques paysagères (Bowler and Benton, 2005; Chaine et al, 2013; Ronce and Clobert, 2012). Durant les phases d'émigration et d'immigration, ce sont particulièrement les facteurs biotiques comme la prédation, la compétition ou la consanguinité qui peuvent influencer le processus (Bowler and Benton, 2005; Clobert et al, 2004; Clobert et al, 2009). La dispersion est dite active quand le mouvement est intentionnel, principalement guidé par la recherche de partenaires de reproduction (Cote et al, 2017; Ronce, 2007). La phase mobile individuelle de transition entre deux sites est quant à elle, plutôt impactée par les caractéristiques abiotiques du paysage (Baguette et al, 2013; Baguette and Van Dyck, 2007; Pfluger and Balkenhol, 2014). Bien que cette phase mobile puisse être active par la marche, le vol ou la nage, des facteurs extrinsèques peuvent générer des événements de dispersion passive. L'individu dispersé n'est alors pas maître de la direction ou de l'intensité de dispersion, créant une migration à direction asymétrique (Pringle et al, 2011). Ces facteurs peuvent être les courants océaniques, les vents dominants ou la dispersion d'organismes vivants utilisés comme support de dispersion, permettant souvent des dispersions
sur de très grandes distances. La dispersion passive est documentée pour les pollens (Austerlitz *et al*, 2007; Dutech *et al*, 2005; Jay *et al*, 2013), les spores fongiques (Rieux *et al*, 2014), certaines espèces aquatiques (Simpson *et al*, 2014), des insectes de petite taille (Eagles *et al*, 2012) et les stades immatures de tiques par les oiseaux (Bohonak and Jenkins, 2003; Burgess *et al*, 2015; Gillespie *et al*, 2012).

## La dispersion passive à longue distance chez les arthropodes

Les insectes sont particulièrement aptes à être dispersés sur de longues distances de manière passive, que ce soit par l'intervention d'un facteur environnemental, le vent ou par le mouvement d'autres espèces (incluant les activités des populations humaines). Cette dispersion passive contrebalance les capacités de dispersion active souvent limitées à quelques kilomètres (Reynolds *et al*, 2006).

La petite taille des insectes est un facteur facilitant la dispersion passive par le vent. Les vents de hautes altitudes permettent à certaines espèces de se disperser sur des distances pouvant aller jusqu'à plusieurs centaines de kilomètres. Phénomène considéré comme des évènements relativement rares, certains auteurs mettent en évidence l'importance des saisons dans la fréquence des épisodes de dispersion par le vent (Chapman *et al*, 2015; Johnson *et al*, 1962; Miao *et al*, 2012; Parry *et al*, 2015; Reynolds and Reynolds, 2009; Reynolds *et al*, 2006; Sanders *et al*, 2011; Wotton *et al*, 2019). Ce type de dispersion est documenté chez de nombreuses espèces de pucerons (Hemiptera : Aphididae), guêpes (Hymenoptera : Torymidae) et *Culicoides* (Diptera : Ceratogopognidae). Elle est aussi rapportée chez des espèces plus imposantes comme les mouches noires (Diptera : Simulidae), les criquets (Orthoptera : Acrididae) ou les syrphes (Diptera : Syrphidae) (Anderson and Sturtevant, 2011; Johnson *et al*, 1962; Kerdelhue *et al*, 2009; Lesieur *et al*, 2018; Miao *et al*, 2012; Rainey, 1973; Reynolds *et al*, 2006; Sanders *et al*, 2011; Sanogo *et al*, 2020; Sellers, 1980; Wotton *et al*, 2019).

Les caractéristiques abiotiques des courants d'air sont importantes, et toutes ne sont pas favorables à une dispersion passive. En effet, elles doivent permettre la survie des organismes durant l'épisode de dispersion passive (Reynolds *et al*, 2006). Les espèces de grande taille semblent pouvoir tolérer des vents violents (au-delà de 100 km/h) (Parry *et al*, 2015). Chez les moustiques, le vol se produit à une altitude inférieure à 10 m au-dessus du sol, bien que des individus aient pu être collectés à des altitudes supérieures (Huestis *et al*, 2019). L'altitude est un paramètre important à considérer, la vitesse du vent étant généralement plus élevée à haute
altitude (Westbrook and Isard, 1999). Les températures basses et le stress du transport à haute
altitude peuvent aussi impacter la survie de l'individu pendant la phase mobile et l'émigration
(Sanogo et al, 2020).

Le vent n'est pas le seul moyen de dispersion à longue distance chez les arthropodes. En effet,
la mobilité des populations humaines aujourd'hui est grande. La distance géographique n'est
plus, comme cela a pu l'être dans l'histoire évolutive, une barrière infranchissable (Gippet et
al, 2019). Les mouvements des populations humaines et animales et l'intensification des
ches commerciaux décuplent la capacité de dispersion de certaines espèces d'arthropodes.
Une des conséquences est l'introduction dans de nouveaux territoires, d'espèces exotiques
vectrices ou de ravageurs qui peuvent s'y établir et proliférer (Drake and Reynolds, 2012),
engendrant des conséquences économiques ou sanitaires importantes.

Un exemple d'intérêt agricole ayant eu des conséquences économiques importantes est celui de
l'introduction de la chrysomèle des racines du maïs (Diabrotica virgifera virgifera) en Europe
via les échanges commerciaux. La chrysomèle est probablement originaire d'Amérique centrale
(Krysan, 1986). Son aire d'extension recouvre actuellement toute l'aire de culture du maïs en
Amérique du nord où les agriculteurs américains l'ont surnommée "l'insecte à 1 milliard de
dollars" (Sappington et al, 2006). Elle est apparue en Europe en 1992 près de l'aéroport de
Belgrade (Serbie) et a été repérée en France en 2002 où elle est considérée comme une espèce
invasive. Les travaux de phylogéographie ont permis de reconstruire les routes d'invasion de la
chrysomèle des racines du maïs à l'aide de marqueurs génétiques. Cette étude a montré que la
distribution européenne de la chrysomèle des racines du maïs résultait de plusieurs
introductions à partir d'Amérique du nord vers l'Europe. Au moins trois introductions ont
successivement donné naissance aux foyers détectés en Serbie en 1992, en Italie en 2000 et en
France en 2002. Une autre étude a montré que les nouveaux foyers observés en Alsace en 2003
et en Île-de-France en 2005 étaient issus de deux nouvelles introductions en provenance
d'Amérique du nord, portant à cinq le nombre d'introductions transatlantiques de la chrysomèle
des racines du maïs. L'origine exacte des foyers européens n'a pas été identifiée, mais le nord
des États-Unis apparaît comme la région d'origine la plus probable (Ciosi et al, 2008; Miller et
al, 2005).
La dispersion passive des espèces vectrices et des pathogènes transmis

Parce que certains arthropodes sont hématophages et sont impliqués dans la transmission de pathogènes (Encadré 2), leur dispersion et la colonisation de nouveaux territoires permettent aussi l'extension de l'aire de distribution des pathogènes transmis (Gippet et al, 2019; McMichael, 2013). Les pathogènes peuvent être introduits dans les populations anciennement installées par un hôte infecté ou lors de la dispersion d'arthropodes infectés.

Le moustique-tigre (*Aedes albopictus* ou *Stegomyia albopicta* selon les auteurs), espèce de moustique de la famille des Culicidae est l'une des cent espèces les plus invasives au monde (Global Invasive Species Database), actuellement présente dans 100 pays sur les cinq continents (Lindh *et al*, 2019; Rezza *et al*, 2007; Semenza and Suk, 2018; Tatem *et al*, 2006; Venturi *et al*, 2017). Cette espèce de moustique, originaire d'Asie du sud-est, doit son expansion au flux croissant de marchandises lié au transport international. Les œufs d'Aedes peuvent survivre plusieurs mois en absence d'eau, ce qui facilite leur expansion par transport commercial international. Les adultes s'adaptent aussi très bien aux conditions environnementales des régions tempérées. Son installation est source de nuisance dans les métropoles. De par, les virus qu'elle transmet (au moins 22 espèces d'arbovirus), cette espèce est responsable de catastrophes sanitaires dans de nombreux territoires. Les mouvements des populations humaines ont permis l'introduction de pathogènes transmis par Ae. albopictus dans des zones précédemment indemnes du pathogène et du moustique. *Aedes albopictus* joue aujourd'hui un rôle majeur dans la transmission du virus de la dengue en Afrique (même si le rôle d'Ae. aegypti est central par ailleurs), du virus de Chikungunya, et de Zika (Gratz, 2004). Historiquement, le commerce triangulaire est reconnu pour être responsable de l'introduction d'Aedes aegypti, espèce de moustique afrotropicale, en Amérique du sud (Bryant *et al*, 2007), et des pathogènes transmis via les populations d'esclaves déplacées. La dispersion passive d'arthropodes infectés par les vents est documentée pour des pathogènes transmis par des moustiques ou des moucherons.

L'introduction d'animaux virémiques et la dispersion passive de moustiques infectés étaient les hypothèses classiquement avancées pour expliquer l'épidémie de fièvre de la vallée du Rift survenue en Egypte en 1977 depuis le Soudan (Sellers et al, 1982). A la lumière des connaissances actuelles sur l'importance des mouvements d'animaux entre l'Egypte et le Soudan, il semble plus probable de privilégier la piste du déplacement d'animaux. Sellers et ses collaborateurs ont étudié les trajectoires des vents dans l'ouest des Etats Unis et dans la province
de Manitoba au Canada pour expliquer les foyers d'encéphalomyélite équine occidentale observés chez les chevaux de cette région en 1987 (Sellers and Maarouf, 1993). Ils montrent que des femelles moustiques de l'espèce vectrice de ce virus, *Culex tarsalis*, auraient pu se disperser passivement grâce aux vents sud-nord, soufflant du Texas et de l'Oklahom vers le nord des Etats-Unis, puis vers la province du Manitoba. Au Japon, l'introduction d'une espèce de moustique, *Culex tritaeniorhynchus*, grâce aux vents de haute altitude permet des incursions récurrentes du virus de l'encéphalite japonaise. (Duvallet *et al*, 2017; Sellers, 1980). En Australie, la dispersion passive, grâce au vent, de cette espèce peut atteindre 648 km, à une altitude allant de 50 à 310 m, permettant ainsi l'introduction du virus de l'encéphalite japonaise dans ce territoire (Duvallet *et al*, 2017).

**Encadré 2 : Arboviroses, vecteur et cycle de transmission**

Le terme « arboviroses », de l'anglais ARthropod-BOrne VIRUSes, désigne des maladies virales infectieuses transmises par les arthropodes (Duvallet et al, 2017). Depuis toujours, l'humanité fait face à des épidémies virales transmises par des arthropodes, comme la fièvre jaune ou la dengue. C'est en 1877 que Manson démontre que le moustique est l'hôte obligatoire d'un ver, la filaire de Bancroft (*Wuchereria bancrofti*), celui-ci étant la cause de la filariose lymphatique. Cette découverte de la capacité de certains arthropodes à transmettre des pathogènes est aussi rapidement démontrée pour les agents responsables du paludisme (1898), de la fièvre jaune (1900) et la dengue (1903). On définit un vecteur comme un arthropode hématophage, qui assure la survie, la multiplication ou la transformation et la transmission active d'un agent pathogène infectieux ou parasitaire d'un vertébré à un autre vertébré (Duvallet et al, 2017). Les agents pathogènes concernés sont variés tels que les bactéries, les virus, les protozoaires, ou encore les helminthes.

La transmission biologique est qualifiée lorsque le pathogène effectue une partie ou la totalité de son cycle de réplication à l'intérieur de l'arthropode vecteur (Rodhain et al, 1985). La transmission mécanique se distingue de la transmission biologique par l'absence de phase de réplication ni d'évolution du pathogène dans le vecteur (Rodhain et al, 1985; Wagner and Fortin, 2015). Un système vectoriel comprend un agent pathogène, un ou plusieurs vecteurs, et des vertébrés faisant office d'hôtes ou de réservoirs.
C'est aussi l'hypothèse de transport passif par les vents qui est émise pour expliquer l'introduction de la fièvre catarrhale ovine dans l'ouest de la Turquie, en octobre 1977. La fièvre catarrhale ovine (FCO) est une maladie dont l'agent étiologique est transmis par des petits moucherons de la famille des Ceratopogonidae, les *Culicoides*. Bien qu'il ait été possible pour le virus d'avoir été introduit dans la région par le mouvement d'animaux infectés, des vents favorables sud-est auraient également pu transporter des moucherons infectés de Chypre, où la maladie était présente. L'étude établit précisément que dans la nuit du 14 au 15 octobre 1977, les vents sud-est auraient pu amener des moucherons infectés par le virus, après un vol de 15 h à une altitude estimée de 500 m, à une température d'environ 20 degrés. Cette hypothèse est aussi avancée pour expliquer l'introduction du virus d'Akabane, autre virus transmis par les *Culicoides*, en 1980 dans la même région (Sellers, 1980).

Les *Culicoides* sont souvent cités, à juste titre ou avec moins de prudence, comme un modèle
de vecteur très facilement dispersable par les vents, expliquant les foyers de FCO (Braverman
and Chechik, 1996) ou d'autres maladies transmises. Il est vrai que, contrairement à *Ae.
albopictus*, toutes les études ont démontré le faible nombre d'individus capables de se disperser
via les transports internationaux (Carpenter *et al*, 2013). Cependant, une étude récente de
modélisation réanalyse les articles de R. F. Sellers publiés entre 1977 et 1991 et montre que la
possibilité que les foyers de FCO soient initiés par la dispersion de *Culicoides* infectés à longue
distance par le vent est moins plausible que Sellers ne le soutient. Sellers se base en effet
uniquement sur une simple analyse de la direction du vent et ne prend pas en compte la vitesse
du vent. L'approche de modélisation confirme certains scénarios de dispersion d'individus
infectés, mais elle révèle aussi la nécessité d'intégrer les données sur la répartition des
populations d'hôtes sensibles (et d'autres covariables) dans le processus de modélisation pour
expliquer les introductions observées (Durr *et al*, 2017). Nous détaillerons dans le chapitre I et
II d'autres exemples de dispersion concernant le modèle *Culicoides*.

Cette introduction a présenté les enjeux autour de la dispersion des arthropodes vecteurs de pathogènes d'intérêts pour la santé humaine ou animale. Nous allons maintenant développer les outils permettant de décrire et de caractériser la dispersion de ces organismes.
# I) L'étude de la dispersion chez les arthropodes vecteurs

## I.1) Des approches directes parfois inadaptées

L'approche directe la plus classique pour estimer la dispersion d'organismes est la technique dite de « capture-marquage-recapture » (CMR) décrite en 1896 par Peterson (Lebreton et al, 2003; O'Brien et al, 1985). Cette technique démographique a été développée dans le but d'estimer les tailles de populations, mais elle peut être adaptée afin d'estimer la dispersion (Muir and Kay, 1998; Slade and Blair, 2000). Le principe de cette approche, est de piéger un grand nombre d'individus puis de les marquer. Ceux-ci sont ensuite libérés en un point central et des essais de recapture sont menés à des distances connues de leur site de libération. L'espace et le temps qui séparent ces deux étapes permettent d'estimer la capacité de dispersion individuelle (Lowe and Allendorf, 2010; Waples and Gaggiotti, 2006). La taille de la population, la survie ou encore la dispersion ont ainsi pu être évaluées chez des espèces vectrices de diptères comme *Aedes aegypti* (Muir and Kay, 1998; Russell et al, 2005) *Aedes notoscriptus* (Watson et al, 2000), *Glossina palpalis gambiensis* (Vreysen et al, 2013), *Anopheles gambiae* (Epopa et al, 2017) ou encore *C. obsoletus* (Kirkeby et al, 2013) grâce aux méthodes de CMR. Cependant, ces techniques sont souvent difficiles à mettre en place et ne sont pas applicables de manière systématique (Landguth et al, 2010; Manel et al, 2003; Storfer et al, 2007). Les diptères sont petits et fragiles, et le marquage, s'il est trop intrusif, peut impacter négativement la valeur sélective de l'individu, biaisant ainsi la probabilité de recapture (Hagler and Jackson, 2001). De plus, les techniques de marquage doivent être adaptées à la biologie de chaque espèce et ne sont souvent pas transposables d'une espèce à l'autre (Hagler and Jackson, 2001).

Différents types de marquage ont été utilisés sur les diptères : peinture, poudre fluorescente, marquage par des protéines (Hagler and Jackson, 2001; Hagler et al, 2014; Russell et al, 2005). Cependant, ces marquages sont généralement chronophages, coûteux et peuvent impacter la survie des individus. Une limitation de l'approche de CMR est la taille de la population et la capacité de dispersion de l'espèce. Lorsque l'espèce étudiée se disperse de manière importante, la probabilité de recapture devient extrêmement faible (Cayuela et al, 2018; Lowe and Allendorf, 2010; Waples and Gaggiotti, 2006). Ainsi, lors d'une étude récente avec une approche de CMR sur des populations de *Culicoides*, le taux de recapture était très faible (61 000 individus marqués pour 12 recapturés) (Kluiters et al, 2015a; Kluiters et al, 2015b). Un
autre exemple est l'étude d'Epopa et ses collaborateurs sur des moustiques du genre *Anopheles*.
La distance maximale à laquelle un individu a été recapturé est de seulement 549 mètres, alors
que l'on estime leur capacité de dispersion bien supérieure (Epopa *et al*, 2017).

Plus important encore, lors de la recapture d'un individu, rien n'assure qu'il ait pu s'accoupler
dans la nouvelle population. Cette recapture peut être le reflet d'un simple déplacement
physique dans l'espace (de Meeus et al, 2007). Ainsi, la dispersion efficace estimée par une
approche CMR peut être surévaluée, en intégrant des événements de dispersion ne participant
pas réellement aux flux de gènes entre populations. La reproduction réussie est un critère
particulièrement important dans le cas des insectes vecteurs, car la transmission de pathogènes
s'effectue lors du repas de sang, qui est conditionné par la reproduction.

Au vu des limites des approches directes dans l'évaluation de dispersion sur de longues
distances, une approche indirecte (Slarkin, 1985) par l'utilisation de marqueurs moléculaires
polymorphes, apparaît comme une solution plus adaptée afin d'explorer la dispersion efficace
d'insectes vecteurs (de Meeus et al, 2007; Handley et al, 2011).

## I.2) Evaluation des flux de gènes par méthodes indirectes lors de la dispersion d'insectes vecteurs

Les approches indirectes reposent sur l'utilisation de marqueurs génétiques, c'est-à-dire
une portion de l'ADN (ou un de ses produits) de l'organisme étudié. Il est important que cette
portion d'ADN (ou son produit) ait la même localisation dans le génome de chaque individu
(c'est-à-dire qu'elle se trouve au même endroit sur le même chromosome), d'où le terme de locus
(de Meeus et al, 2007). L'étude de la génétique des populations des pathogènes et de leurs
vecteurs est appelée épidémiologie moléculaire (Tibayrenc, 1998). La structure génétique des
populations et les systèmes d'accouplement des agents pathogènes sont des phénomènes
biologiques étroitement liés, qui ont des conséquences crucales sur l'épidémiologie des
maladies transmissibles (Tibayrenc and Ayala, 2002). De nombreux marqueurs moléculaires
ont été utilisés pour identifier les routes d'invasion des vecteurs, les populations sources, ou
mettre en évidence des facteurs environnementaux influençant les flux de gènes entre
populations (Estoup and Guillemaud, 2010; Kirk et al, 2013; Manel et al, 2003). Deux
catégories de marqueurs moléculaires sont couramment utilisées : les marqueurs
cytoplasmiques et les marqueurs nucléaires co-dominants.
Les marqueurs cytoplasmiques sont des loci présents dans les génomes chloroplastiques (plantes) et mitochondriaux. Largement utilisé dans les études phylogéographiques d'insectes (Allio et al, 2017; Bellis et al, 2015; Jacquet et al, 2015), l'ADN mitochondrial (ADNmt), évolue rapidement et ne recombine pas (Arbogast, 2001; Avise et al, 1987). L'ADNmt possède une héritabilité uniparentale maternelle. La taille efficace de la population de ces marqueurs est difficile à appréhender car elle dépend de la dispersion spécifique au sexe, du ratio male/femelle et de la stratégie de reproduction (de Meeus et al, 2007; Prugnolle and de Meeus, 2002). Enfin, l'ADNmt peut parfois être soumis à sélection (Gerber et al, 2001). La structure génétique identifiée à partir de l'ADNmt peut alors ne pas être uniquement le reflet de processus démographiques et géographiques. Pour ces raisons, les marqueurs mitochondriaux sont de moins en moins utilisés dans les études de génétique des populations (de Meeus et al, 2007). Cependant, l'utilisation de marqueurs mitochondriaux a par exemple permis de détecter la structure génétique et les flux de gènes entre populations d'Anopheles sinensis, vecteur d'agents du paludisme (Chang et al, 2016) à l'aide d'approche de « genetic landscape shape » (Miller, 2005). Cette méthode basée sur des matrices de distance inter-individuelle génétique et géographique permet de générer une surface tridimensionnelle où les axes X et Y correspondent aux emplacements géographiques et les hauteurs de surface (axes Z) représentent les distances génétiques.

Les marqueurs nucléaires codominants permettent de distinguer les différents génotypes homozygotes et hétérozygotes (de Meeus et al, 2007). Malgré la démocratisation des nouvelles technologies, basées sur les techniques de séquençage plus récentes (séquençage NGS), comme le ddRADseq (Andrews et al, 2016), ou le séquençage de génomes entiers (Ellegren, 2014; Fuentes-Pardo and Ruzzante, 2017) permettant l'accès à de très nombreux Single Nucleotide Polymorphism (SNP), les marqueurs microsatellites restent encore très largement utilisés du fait de leur plus faible coût et de la facilité de génotypage. De plus, les SNP possèdent des taux de mutation hétérogènes qui peuvent biaiser les conclusions (Vignal et al, 2002). Les microsatellites correspondent à des répétitions en tandem de motifs nucléotidiques de 2 à 5 nucléotides en général. Ces marqueurs sont co-dominants, abondants dans presque tous les génomes, à hérédité biparentale et généralement neutres, c'est-à-dire non soumis à sélection (de Meeus et al, 2007; Holderegger et al, 2006; Lehmann et al, 1996). Très polymorphes et possédant une fréquence de mutation rapide, les marqueurs microsatellites se révèlent très informatifs, et donc utiles en épidémiologie moléculaire (de Meeus et al, 2007). Ces marqueurs ont été très largement utilisés pour évaluer les flux de gènes de différentes espèces d'insectes
vectrices (Bouyer et al, 2007; Jacquet et al, 2015; Onyango et al, 2015a; Simo et al, 2010; Solano et al, 2010).

Les marqueurs moléculaires peuvent être utilisés individuellement ou combinés à d'autres types de marqueurs (Auger-Rozenberg and Roques, 2012; Boissin et al, 2016; Dube et al, 2017; Valade et al, 2009). Leurs utilisation lors d'approches multi-locus permet une estimation plus fine, à différents pas de temps et à plus grande échelle de la connectivité entre les populations car ils possèdent des vitesses de mutation différentes (Brito and Edwards, 2009; de Meeus et al, 2007; Prugnolle and de Meeus, 2002).

L'identification de la structure génétique des populations peut être effectuée par deux approches : des approches exploratoires sans a priori, « Exploratory data analysis » (EDA), et des approches basées sur des modèles de génétiques des populations, « Model-based clustering » (MBC) (François and Waits, 2015).

Les méthodes « Exploratory data analysis » sont sans a priori mais permettent cependant la détection de structuration génétique et de groupes d'individus génétiquement similaires (François and Waits, 2015). Parmi les méthodes EDA on peut citer les approches de type analyses en composantes principales (ACP) (Wold et al, 1987) comme l'analyse factorielle de correspondance (ACF) (qui s'applique à des tableaux de contingence c'est-à-dire des tableaux croisant deux variables qualitatives et qui est donc bien adaptée aux organismes diploïdes) (She et al, 1987) ou encore l'analyse discriminante des composantes principales (DAPC) (AFC avec une étape supplémentaire permettant d'identifier les groupes génétiques à l'aide d'analyse discriminante (AD)(Jombart et al, 2010). Ces méthodes permettent de positionner des groupes d'individus dans un espace multidimensionnel. Des approches spatialement explicites sont également disponibles parmi les méthodes EDA, comme l'ACP spatiale, dont les axes principaux maximisent l'autocorrélation spatiale au lieu de la corrélation (Jombart et al, 2008). Enfin, des approches visuelles qui permettent de cartographier la différentiation génétique, sans a priori de modèle, comme l'approche « Mapping Averaged Pairwise Information » (MAPI) (Piry et al, 2016) ou EEMS (Petkova et al, 2016). Par exemple, MAPI permet d'assigner des indices de dissimilarité moyenne sur l'ensemble des cellules de la zone d'étude et d'identifier des discontinuités significatives dans les valeurs des cellules de la grille, grâce à une procédure de randomisation non paramétrique (Piry et al, 2016).
Les méthodes MBC utilisent des modèles statistiques de génétique des populations pour créer des groupes panmictiques d'individus génétiquement similaires, délimitant les frontières entre populations (Corander et al, 2003; Manel and Holderegger, 2013; Pritchard et al, 2000; Storfer et al, 2007). Elles permettent de calculer la probabilité de chaque individu d'appartenir à une sous-population donnée (de Meeus et al, 2007) en mettant en relation les fréquences des allèles qui définissent la population et les fréquences trouvées chez les individus identifiés comme étant originaires de cette population. Un individu ayant une faible probabilité d'appartenir à la population dans laquelle il a été échantillonné est susceptible d'être un immigrant récent (Manel et al, 2005). Parmi les outils les plus utilisés, on compte les méthodes de « clustering » ou regroupement en français. Dans ces méthodes, l'individu est l'unité d'analyse. Le nombre de clusters génétiques distincts est déduit d'un ensemble de génotypes multilocus individuels, en estimant l'ascendance génétique à partir de populations sources non observées, tout en maximisant l'équilibre de Hardy-Weinberg (EHD) et en limitant le déséquilibre de liaisons entre loci (Manel et al, 2005). Les clusters déduits peuvent ensuite être utilisés pour attribuer l'appartenance, des génotypes et des individus, à un groupe. Le logiciel STRUCTURE (Falush et al, 2003; Pritchard et al, 2000), basé sur une méthode paramétrique bayésienne, est devenu l'un des plus populaires pour les études de génétique des populations et de génétique du paysage (de Meeus et al, 2007). D'autres approches possèdent l'avantage d'être spatialement explicites (Francois and Durand, 2010), comme GENELAND (Guillot et al, 2005), BAPS (Corander et al, 2007; Corander et al, 2004) ou TESS (Chen et al, 2007; Francois et al, 2006) et font l'hypothèse que les individus géographiquement proches sont plus susceptibles d'être génétiquement semblables. Les modèles intègrent alors la localisation des individus dans le modèle. La structuration spatiale de pathogènes (Carrel et al, 2012; Young et al, 2017), de parasites (Brar et al, 2015; Rieux et al, 2011) et d'hôtes (Cote et al, 2012; Cullingham et al, 2009; Frantz et al, 2009) ont été mise en évidence grâce à ces méthodes, en identifiant des barrières paysagères à leur dispersion. Cependant, lorsqu'il existe un isolement par la distance significatif, ces analyses de clustering pourraient surestimer le nombre réel de groupes génétiques (Frantz et al, 2009), car la plupart des méthodes de clustering ne prennent pas en considération l'autocorrélation spatiale (Frantz et al, 2009; Meirmans, 2015).

Cette section souligne l'intérêt des approches indirectes pour quantifier la diversité et la
différenciation génétique intra et inter-populationnelle par le calcul de distances génétiques et
l'utilisation de méthodes de regroupements d'individus ou de populations. L'identification des
facteurs environnementaux favorisant ou freinant les flux de gènes d'insectes vecteurs et donc limitant la propagation d'agents pathogènes, présente une importance capitale dans la compréhension de l'épidémiologie de maladies vectorielles (Archie *et al*, 2009; Meentemeyer *et al*, 2012).

### I.3) Evaluation et quantification de l'impact des facteurs environnementaux sur les flux de gènes d'insectes vecteurs

La génétique du paysage emprunte de nombreux concepts et méthodes à d'autres disciplines (Manel *et al*, 2003; Storfer *et al*, 2007) et peut se définir comme une discipline combinant génétique des populations, écologie du paysage et techniques d'analyses spatiales. Elle permet de quantifier explicitement les effets de la composition, de la configuration et de la qualité de la matrice du paysage sur les processus microévolutifs, tels que les flux de gènes, la dérive génétique et de la sélection, en utilisant des données génétiques neutres ou adaptatives (Balkenhol and Fortin, 2015; Holderegger and Wagner, 2008). Bien que la manière la plus directe pour identifier l'impact du paysage sur la circulation de pathogènes soit de travailler sur les agents eux même (Encadré 3), la collecte en masse d'échantillons de pathogènes peut s'avérer délicate surtout lorsque leur prévalence est faible. Celle-ci nécessite souvent un travail de laboratoire très important (conservation, diagnostic, mise en culture) et de prélèvements sur le terrain sur les animaux sauvages. De plus, l'agent pathogène peut, dans certain cas, présenter une faible variation génétique. Ainsi, l'étude de la génétique des vecteurs ou des hôtes peut être utilisée pour estimer la propagation et la dynamique d'agents infectieux et se révéler très informative (Biek and Real, 2010; Kozakiewicz *et al*, 2018). Par exemple, au Kenya, des auteurs ont constaté que la différentiation génétique mitochondriale entre populations de *Aedes mcintoshi*, vecteur du virus de la fièvre de la vallée du Rift, était corrélée avec les valeurs moyennes des précipitations (Campbell and Alexander, 2017). La génétique du paysage, appliquée aux insectes vecteurs, reste encore un champ thématique peu développé, bien que certaines études commencent à émerger depuis quelques années (Bouyer *et al*, 2015; Campbell and Alexander, 2017; Chang *et al*, 2016; Hlaing *et al*, 2010).

D'un point de vue méthodologique, on peut diviser une étude de génétique du paysage en trois étapes, les deux premières pouvant être réalisées de manière simultanée. La première étape est la quantification de l'hétérogénéité du paysage afin d'appréhender de façon numérique la configuration, la composition et la qualité de la matrice pour en déduire la connectivité paysagère (Encadré 1, Encadré 3). La seconde étape est la détection spatiale de la diversité, la
structure et la différentiation génétique entre les populations par l'utilisation de marqueurs génétiques polymorphes comme nous l'avons vu précédemment. Enfin, la dernière étape consiste à trouver des relations statistiques quantifiables entre les variations génétiques et l'hétérogénéité du paysage.

### Encadré 3 : La génétique du paysage appliquée aux pathogènes, aux hôtes et réservoirs

La manière la plus directe pour identifier l'impact du paysage sur la circulation de pathogènes est de travailler sur les agents eux-mêmes (Archie et al, 2009). L'évolution rapide des génomes viraux, combinée à la fixation rapide de ces mutations, en font de bons modèles pour étudier les processus épidémiologiques qui façonnent leur diversité. De nombreuses études se sont penchées sur l'interaction entre l'émergence de maladies infectieuses et les composantes environnementales qui peuvent y être associées (Lemey et al, 2010; Ostfeld et al, 2005). Par exemple, d'importants agents pathogènes des ongulés sauvages et domestiques ont fait l'objet d'études par l'utilisation couplée de distance phylogénétique et de résistance paysagère (Biek, 2007). Ainsi, une étude de phylogéographie du paysage par modèle linéaire généralisé a permis d'identifier les facteurs environnementaux qui ont favorisé la propagation du virus de la FCO en Europe (Jacquot et al, 2017). Cette étude était basée sur la diversité de 113 génomes du virus de la FCO, géoréférencés et horodatés, représentant différents sérotypes et souches du virus, provenant de pays touchés et identifiés comme source d'introduction en Europe. La densité d'hôtes bovins a été identifiée comme favorisant la propagation du virus de la FCO. Au contraire, les masses d'eau (mer, océan) et les hautes altitudes jouent le rôle de barrière dans la diffusion du virus.

Récemment, l'utilisation d'un workflow innovant d'analyse phylogéographique a permis de quantifier la résistance du paysage le long des voies de transmission d'un virus touchant les ratons laveurs en Amérique du nord. Cette approche nécessite de reconstituer la phylogénie des lignées du virus afin d'extraire des informations spatio-temporelles, pour estimer la dispersion et définir des statistiques épidémiologiques de propagation. La résistance paysagère est ensuite quantifiée grâce au modèle classique de mouvement spatial (least-cost transect analysis).

Enfin, des analyses de corrélation par régression multiple de matrices de distance (MRDM) permettent de tester l'impact des variables environnementales sur le mode et le rythme de dispersion des agents pathogènes lors des épidémies (Dellicour et al, 2016). Les approches MRDM permettent de tester la corrélation entre une matrice de distance basée sur des arbres
phylogénétiques de maximum de vraisemblances et une matrice de résistance ou de conductance paysagère (Carrel et al, 2012; Kozakiewicz et al, 2018; Young et al, 2017).

L'épidémiologie du paysage, en s'intéressant à l'effet de l'hétérogénéité spatiale sur la circulation des pathogènes, mais aussi de leurs vecteurs ou de leurs hôtes, permet une meilleure compréhension de la transmission des maladies infectieuses (Biek and Real, 2010; Meentemeyer et al, 2012). L'étude de DeYoung et al. (2009) a, par exemple, mis en évidence chez des populations sauvages de renards gris au Texas, des flux de gènes à longue distance permettant de mieux comprendre la circulation du virus de la rage dans cette région et ainsi proposer un plan de vaccination des renards (Deyoung et al, 2009; Hajibabaei et al, 2007). Des études de génétique du paysage ont également mis en évidence que les barrières fluviales et autoroutières pouvaient parfois limiter la dispersion des femelles mouffettes rayées, porteuses du virus de la rage (Talbot et al, 2012). Identifier les voies de propagation de vecteurs et pathogènes, permet ainsi de reconstituer l'histoire d'épidémies récentes (Corman et al, 2014; Faria et al, 2014; Fountain-Jones et al, 2017; Fountain-Jones et al, 2018; Magee et al, 2015).

Deux approches sont classiquement utilisées pour quantifier les relations statistiques entre
distance génétique et résistance paysagère. La première consiste à utiliser la configuration de
la structure génétique obtenue, que ce soit par méthodes EDA ou MBC, (Guillot et al, 2005;
Jombart et al, 2008; Pritchard et al, 2000) et de la comparer avec la configuration du facteur
environnemental étudié (Frantz et al, 2012; Prunier et al, 2013a; Prunier et al, 2013b), pour
tenter d'identifier de potentielles barrières ou corridors de dispersion. Cette approche a
l'avantage d'être relativement simple et rapide, mais ne permet pas de quantifier les relations
statistiques entre dissimilarité génétique et résistance paysagère, car elle n'utilise pas
directement de données environnementales.

La seconde approche par « *gradient direct* » (Balkenhol and Fortin, 2015; Prunier et al, 2015) quantifie la contribution relative de l'ensemble des facteurs environnementaux testés sur la variance du jeu de données génétiques (Balkenhol et al, 2009; Guillot et al, 2009). Compte tenu de l'absence de consensus actuel sur la meilleure manière d'opérer (Zeller et al, 2012), de nombreuses procédures ont été développées pour quantifier la perméabilité paysagère. L'une des plus simples et plus anciennes est le test de Mantel qui teste l'absence de relation (H0) entre deux matrices de dissimilarité (ou de distance). Le test d'isolement par la distance (IBD) utilise le test de Mantel pour étudier la corrélation entre une matrice de distance géographique et une
matrice de distance génétique (Mantel, 1967; Shirk et al, 2010). La composante paysagère est donc résumée à la distance géographique entre les populations. Le test de Mantel souffre de nombreuses critiques (Diniz-Filho et al, 2013). En effet, les deux hypothèses de base de ce test, l'homoscédasticité et la linéarité, sont rarement respectées dans les analyses spatiales. De plus, les variables utilisées dans ce test (génétiques et environnementales) ne sont pas indépendantes ce qui augmente la probabilité de rejeter l'hypothèse nulle alors que cette dernière est vraie (erreur de type I) (Balkenhol et al, 2009; Graves et al, 2013; Landguth et al, 2010). En raison de son manque de puissance statistique, ce test est aujourd'hui moins utilisé (Manel and Holderegger, 2013).

En Asie du sud-est continentale, treize marqueurs microsatellites ont été utilisés pour identifier la structure génétique de population d'Aedes aegypti et tenter de déterminer les facteurs environnementaux sous-jacents (Hlaing et al, 2010). Ainsi, les grandes voies de transport humains ont été identifiées comme facteur permettant la similarité génétique entre sites éloignés géographiquement à l'aide de la méthode bayésienne hiérarchique implémentée dans le logiciel GESTE (GEnetic STructure inference based on genetic and Environmental data) (Foll and Gaggiotti, 2006). Cette méthode, après avoir estimée les valeurs de FST populationnelle, utilise un modèle linéaire généralisé pour mettre en relation les facteurs environnementaux et la différentiation génétique (Foll and Gaggiotti, 2006). Cependant, cette approche utilise uniquement des valeurs environnementales locales et néglige la résistance paysagère qui les sépare.

## Encadré 4 : Approche populationnelle et individuelle

Le plan d'échantillonnage et le protocole d'analyse dans une étude de génétique du paysage sont guidés par la problématique à laquelle nous voulons répondre (Wagner and Fortin, 2015). L'approche classique d'échantillonnage en génétique du paysage et plus généralement en génétique des populations, est l'approche populationnelle. Roughgarden définit en 1979 une population comme « *un ensemble d'individus dont on pense qu'il fonctionne comme une unité du point de vue évolutif et écologique* ». L'approche populationnelle a donc pour objectif d'échantillonner un nombre important d'individus à un même point géographique afin d'avoir une représentation fidèle de la diversité génétique locale et donc des processus microévolutifs qui l'ont modelée. Cette approche est bien adaptée aux espèces distribuées en patch ou en métapopulations. Cependant, elle possède des limites. En effet, ce type d'approche restreint le
nombre de sites d'échantillonnage, la couverture spatiale de l'étude, et la diversité de paysage représentée, des composantes qui impactent fortement la robustesse des analyses de génétique du paysage. Le groupement d'individus au sein d'une population implique une décision a priori contestable et subjective, car il est difficile de déceler si la population étudiée peut-être ou non considérée comme une seule unité panmictique. Si cette population est subdivisée, un déficit d'hétérozygotes par rapport à la structure de Hardy-Weinberg va être observé. Cet effet est appelé effet Wahlund.

Au contraire, l'approche individuelle consiste à échantillonner un plus faible nombre d'individus dans un grand nombre de zones géographiques. Contrairement à l'approche populationnelle, la diversité génétique a plus de risques de ne pas être totalement représentative de la diversité génétique locale. En revanche, elle permet de couvrir un éventail plus grand de typologies de paysages, d'avoir une couverture spatiale plus importante, et ainsi, d'identifier de manière plus précise géographiquement, des variations de structure ou de flux génétiques (Luximon et al, 2014; Prunier et al, 2013a). Cette approche est adaptée aux organismes vivants ne possédant pas un mode de vie grégaire, mais étant plutôt répartis de manière uniforme dans le paysage (Richardson et al, 2016).

Des méthodes par gradient direct ont été développées plus récemment, comme les régressions multiples sur matrices de distances (MRDM) qui permettent de prendre en compte simultanément plusieurs vecteurs de distance explicatifs (Smouse et al, 1986) et des modèles de maximum de vraisemblance, des effets de population (MLPE) (Clarke et al, 2002; Van Strien et al, 2012) permettant de modéliser explicitement la dépendance entre des observations par paires. Dans ce type d'analyses, les variables testées sont introduites sous forme de surface de résistance paysagère ou de matrices des distances basées sur les modèles « least-cost path » (Adriaensen et al, 2003), « circuit-based » (McRae and Shah, 2008; McRae and Beier, 2007) et « transect-based approaches » (Angelone et al, 2011; Emaresi et al, 2009)(Encadré 1). Ces surfaces indiquent comment chaque cellule de la grille paysagère limite ou favorise le flux de gènes (McRae, 2006; Spear et al, 2010; Spear et al, 2015b; Storfer et al, 2010). Par exemple, Bouyer et ses collaborateurs, utilisent des cartes de friction environnementales pour étudier la dispersion de *Glossina palpalis gambiensis*, vecteur de trypanosomoses en Afrique de l'ouest. Une carte de friction est une représentation graphique qui cartographie la résistance paysagère et qui permet d'en déduire le chemin optimal minimisant la résistance paysagère entre deux zones géographiques. Cette approche a permis d'identifier les barrières environnementales à la
dispersion de ce vecteur d'intérêt (Bouyer et al, 2015). Les cartes de friction restent cependant
à ce jour peu appliquées aux espèces d'insectes (Zeller et al, 2012).

Les tests basés sur les MRDM font l'objet de critiques similaires à celles faites au test de
Mantel, notamment à cause de la multicolinéarité entre les prédicteurs (Manel and Holderegger,
2013; Prunier et al, 2015; Wagner and Fortin, 2015). Dans le cas des MRDM (Balkenhol et al,
2014; Lichstein, 2006; Wang, 2013), les différentes matrices de distances environnementales
de résistance ou perméabilité paysagère sont, en général, toutes dépendantes de la distance
géographique ; les analyses multiples deviennent ainsi redondantes et non indépendantes
(Cayuela et al, 2018). L'analyse de commonalité permet l'identification de la part commune et
unique des différents facteurs environnementaux. La part unique (U) quantifie la proportion de
la variance, expliquée de manière unique par une variable explicative. Si cette valeur est
négligeable, l'ajout du prédicteur n'améliore pas ou peu le modèle. Au contraire, la part
commune (C) représente la proportion de la variance, expliquée conjointement par plusieurs
variables explicatives. L'analyse de commonalité corrige alors la multicollinéarité inhérente
aux approches corrélatives (Prunier et al, 2017; Prunier et al, 2015). Une approche
complémentaire récente permet également, pour se défaire de l'omniprésence de la composante
liée à la distance géographique, d'utiliser d'un raster nul, qui n'est autre qu'une grille où
l'ensemble des pixels possèdent la même valeur de résistance. Seule alors compte la distance
géographique dans le calcul du chemin le plus court entre deux populations. Ainsi, il est
possible de détecter les facteurs environnementaux dont la résistance ou la perméabilité
paysagère explique mieux la dissimilarité génétique que la distance géographique seule
(Dellicour et al, 2019).

Cette section souligne l'importance d'une connaissance fine de l'influence des facteurs
paysagers sur les flux de gènes des agents pathogènes, de leurs hôtes et de leurs vecteurs. Les
outils de génétique des populations et du paysage permettent ainsi de mieux appréhender la
manière dont les maladies se transmettent et d'élaborer des stratégies de lutte ou de vaccination
plus adaptées (Biek and Real, 2010; Manel and Holderegger, 2013; Segelbacher et al, 2010).
Cependant, si la structure génétique observée résulte de processus microévolutifs récents, elle
est également le témoin de phénomènes évolutifs plus anciens.
## Encadré 5 : L'isolement par la distance anisotropique

La théorie de l'isolement par distance (IBD), introduite par Wright (1943), décrit l'accumulation de la variation génétique locale sous l'hypothèse d'une dispersion spatiale limitée (Slatkin, 1993). Selon cette théorie, les mesures de différenciation génétique par paires devraient augmenter avec la distance géographique. Cependant, l'isolement par la distance classique n'intègre pas de composante directionnelle. En effet, le modèle d'isolement par la distance suppose une homogénéité des variables paysagères ou environnementales, ce qui n'est pas le cas pour la plupart des systèmes naturels (Duvallet et al, 2017; Wagner and Fortin, 2005). Or, de nombreux phénomènes anisotropes, c'est-à-dire dont les propriétés varient selon la direction considérée, permettent la dispersion passive d'individus, comme par exemple le vent ou les courants (Bertin et al, 2015). Ainsi, en intégrant une dimension spatiale à l'analyse des distances génétiques il est possible d'identifier l'orientation la plus propice au flux de gènes, c'est-à-dire celle pour laquelle l'accumulation de la différenciation génétique est la plus importante (Rosenberg, 2010). Développées à l'origine dans le cadre d'études de génétique des populations humaines (Amit Roy, 2014; Harrup et al, 2016; Sokal et al, 1993), ces techniques ont été principalement utilisées pour d'étudier la dispersion de pollens (Dutech et al, 2005) ou de spores fongiques (Rieux et al, 2014). L'utilisation de ces approches sur des espèces d'insectes de petite taille pouvant être dispersées passivement par le vent, peuvent permettre d'identifier les grandes trajectoires de dispersion.

Ainsi, des méthodes permettant d'identifier des flux de gènes directionnels ont émergé, tels que l'isolement par la distance anisotropique (Jay et al, 2013), les « bearing correlogram » (Rosenberg, 2010), les semi-variogrammes directionnels (Wagner and Fortin, 2005) ou les « bearing analysis », disponibles dans le logiciel Pattern Analysis, Spatial Statistics and Geographic Exegesis (PASSaGE). Ces approches permettent d'identifier l'angle entre populations qui maximise et minimise la corrélation entre matrices de distances génétiques et géographiques (Jay et al, 2013). Ce type d'analyse nécessite de calculer la distance projetée entre deux sites d'échantillonnage.

Dans le calcul de la distance géographique projetée en fonction de l'angle entre les populations, d'AB correspond à la distance géographique entre les populations A et B, et αAB correspond à l'angle entre les populations A et B. La matrice de distance projetée est par la suite calculée pour chaque angle entre tous les sites d'échantillonnage, en utilisant la formule ci-dessus. Puis, une régression linéaire entre les distances génétiques et les distances géographiques projetées
obtenues pour chaque angle est effectuée. L'angle qui maximisera le R² de cette régression avec un coefficient de régression positif est considéré comme l'angle maximisant le signal d'isolement par distance.

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

$$ \log ( | d_{AB} * \cos(a_{AB}) | ) $$

Représentation schématique du calcul de la distance géographique projetée en fonction d'un angle

## I.4) Des flux de gènes contemporains à la création de nouvelles espèces

La fragmentation de populations en petits isolats entraîne une diminution de la taille de la population et à une dérive génétique plus rapide avec pour conséquence, une différenciation génétique pouvant aboutir à la création de lignées génétiques différentes. Si l'isolement géographique et l'absence de flux de gènes sont prolongés, la sélection et la dérive peuvent être à l'origine d'événements de spéciation. La sélection naturelle augmente la fréquence de variantes génétiques avantageuses dans une population, donnant naissance à des organismes avec une plus forte valeur sélective, ce qui peut conduire à de la spéciation. La spéciation résulte d'un processus évolutif aboutissant à l'accumulation de mutations dans une population sur une longue période de temps, menant possiblement à une nouvelle espèce. La création d'entités génétiques distinctes est conditionnée par l'apparition d'une incompatibilité génétique, comportementale ou écologique constituant un isolement reproducteur. Ainsi, même en cas de contact physique entre les lignées, les flux de gènes deviennent impossibles. Une espèce est un groupe d'organismes qui peuvent se reproduire les uns avec les autres pour produire une descendance fertile et qui sont isolés des autres organismes sur le plan de la reproduction. Des processus de spéciation en sympatrie, définis comme des événements de spéciation sans l'intervention de barrières aux flux de gènes, interviennent chez certaines espèces d'insectes.
Cependant, le mode de spéciation le plus répandu chez les espèces d'insectes généralistes intervient lorsque des populations biologiques de la même espèce sont isolées les unes des autres par une barrière géographique, au point que cela empêche ou interfère avec le flux de gènes (Bush and Butlin, 2004). Il s'agit là de spéciation allopatrique, dont le plus illustre exemple est la spéciation des pinsons de Darwin sur les îles des Galápagos.

L'espèce est une unité fondamentale de la biologie, permettant d'organiser, classifier et grouper
la diversité du vivant (De Queiroz, 2007; Mayr, 1982). Cependant, le concept d'espèce ne
répond pas toujours à une définition unifiée et partagée (De Queiroz, 2007; Mayden, 1999). De
l'inflation taxonomique se produit lorsque les chercheursélèvent les sous-espèces ou les
variantes géographiques au niveau des espèces en appliquant des concepts d'espèces
alternatives. Cette subjectivité nuit à la stabilité taxonomique. De plus, les espèces ne sont pas
des entités évolutives figées et permanentes. Au contraire, ce sont des groupes de populations
en constante évolution. Pour éviter ces écueils, des méthodes de délimitation et de description
des espèces sont nécessaires. Un large éventail de nouvelles méthodes de délimitation des
espèces a été récemment développé, et ces dernières sont de plus en plus utilisées en taxonomie
(Flot, 2015). Les méthodes de délimitation d'espèces servent à identifier les entités appartenant
à la même espèce. Ces méthodes permettent d'avoir l'assurance que tous les individus utilisés
dans une étude appartiennent à la même unité taxonomique, évitant de biaiser les résultats
(Bortolus, 2008).

De nombreuses méthodes de délimitation d'espèces ont été mises au point, mais les plus
utilisées sont basées sur l'utilisation de dendrogrammes (Fontaneto et al, 2015). Les méthodes
basées sur le modèle généralisé de coalescence mixte de Yule (GMYC) (Pons et al, 2006) et
sur le « *Poisson tree processes* » (PTP) (Zhang et al, 2013) identifient les points de transition
entre diversité interspécifique et intraspécifique à l'aide d'arbres phylogénétiques (Fujisawa
and Barraclough, 2013). Les deux méthodes se distinguent par l'estimation du taux de
spéciation (Dellicour and Flot, 2018). La méthode GMYC utilise un arbre phylogénétique ultra-
métrique et considère la longueur des branches de l'arbre comme proportionnelle au temps de
divergence. Ainsi, cette approche vise à rechercher dans cet arbre ultra-métrique, le seuil auquel
les divergences entre taxons représentent des événements de spéciation ou de coalescence (Pons
et al, 2006). En revanche, la méthode PTP considère la longueur des branches proportionnelle
au nombre de substitutions (Zhang et al, 2013), sans nécessité d'arbres ultra-métriques, rendant
la méthode plus rapide et tout aussi efficace selon des études de modélisation (Dellicour and
Flot, 2018). De plus, la méthode GMYC peut parfois surestimer le nombre d'espèces suite à un
biais de certains paramètres de l'analyse, comme les différences dans la taille de la population ou les taux de spéciation (Dellicour and Flot, 2015; Esselstyn et al, 2012; Fujisawa and Barraclough, 2013; Talavera et al, 2013). Des implémentations bayésiennes de la méthode GMYC, (bGMYC) (Reid and Carstens, 2012) et de la méthode PTP (bPTP) ont également été développées.

Depuis de nombreuses années, l'ADNmt est utilisé comme marqueur moléculaire de choix pour étudier les unités évolutives correspondant à l'espèce, en particulier chez les espèces difficilement différentiables morphologiquement. L'ADNmt est un outil de taxonomie moléculaire précieux grâce à l'approche de « barcoding » moléculaire, qui permet d'identifier des unités taxonomiques opérationnelles moléculaires (MOTU). Le pourcentage de divergence nucléotidique mitochondriale permet d'identifier la frontière entre la divergence intra-spécifique et inter-spécifique. Une approche de délimitation d'espèces est basée sur ce principe de barcoding moléculaire de l'ADNmt, nommé l'ABGD (automatic barcode gap discovery) (Puillandre et al, 2012). L'approche ABGD (Puillandre et al, 2012) repose sur le « barcoding gap » c'est-à-dire l'écart qui sépare les distances génétiques inter- et intra-spécifiques déduites de l'ADNmt. Cette délimitation est particulièrement adaptée pour des jeux de données possédant une richesse spécifique importante (Puillandre et al, 2012).

La plupart de ces approches sont unilocus, principalement réalisées avec le marqueur moléculaire cox1. Cependant, nous avons vu précédemment que l'ADNmt possède une héritabilité uniparentale maternelle. La taille efficace de population des marqueurs mitochondriaux est donc inférieure à celle des loci du génome nucléaire. Par conséquent, la perte de diversité génétique, via la dérive génétique, aura tendance à être plus rapide pour les loci mitochondriaux, créant ainsi des haplotypes mitochondriaux différents (de Meeus et al, 2007; Prugnolle and de Meeus, 2002). La diversité génétique nucléaire aura normalement tendance à être mieux conservée. Ainsi, si une forte différentiation mitochondriale est détectée entre des lignées, il est important sans preuve morphologique ou écologique de différenciation ou d'isolement reproducteur, d'intégrer des marqueurs nucléaires à l'analyse. Il est donc conseillé d'utiliser pour la délimitation d'espèces, une approche multi-locus comme le Bayesian Poisson Tree Processes (bPTP), qui permet d'améliorer la résolution de l'analyse (Bakhoum et al, 2018; Fujita et al, 2012; Leache and Fujita, 2010; Pentinsaari et al, 2017). De plus, la diversité des algorithmes, des paramètres d'analyses et des implémentations disponibles pour effectuer des délimitations d'espèces, peuvent être source de résultats différents (Dellicour and Flot, 2015). Il n'existe donc pas de solution optimale, mais l'utilisation combinée de plusieurs
méthodes différentes, appliquées sur le même modèle biologique, est conseillée. Si un patron commun de délimitation émerge, l'hypothèse de délimitation devrait être correcte (Dellicour and Flot, 2018).

L'ADN mitochondrial et nucléaire peuvent également être utilisés pour détecter des expansions démographiques, des divergences entre lignées et des phénomènes d'admixture entre populations. La phylogéographie désigne justement l'étude des principes et processus qui gouvernent la distribution des lignées au sein des espèces. Elle étudie les phénomènes génétiques et démographiques, en particulier les phénomènes de spéciation, ayant conduit à la distribution et à la structuration géographique actuelle des populations (Arbogast, 2001). L'utilisation combinée de ces deux types de loci qui, de par leur héritabilité, réagissent différemment aux fluctuations démographiques, permet d'identifier des scénarii évolutifs de fragmentation des populations parfois complexes. La fragmentation du paysage, causée par les épisodes glaciaires par exemple, a été de nombreuses fois mise en évidence comme la cause, chez de nombreuses espèces européennes, de divergences entre lignées génétiques actuelles (Hewitt, 1999; Hewitt, 2004; Provan and Bennett, 2008). Durant ces épisodes glaciaires, l'ADN nucléaire aura tendance a moins diverger que l'ADNmt. L'étude d'espèces phylogénétiquement proches ayant récemment divergé peut permettre de mieux appréhender la différenciation génétique contemporaine. C'est le cas pour certaines espèces de termites dont l'étude phylogéographique révèle de multiples événements de colonisation post-glaciaires en Europe (Lefebvre et al, 2016). Lorsque des espèces ayant divergé récemment en allopatrie, présentent un isolement reproductif incomplet, l'apparition d'hybrides est encore possible lors du contact secondaire entre les deux espèces. Lors des recolonisations post-glaciaires en Europe, depuis les principaux refuges glaciaires que sont les péninsules ibérique, italienne et balkanique, des lignées divergentes sont entrées de nouveau en contact dans les Alpes et les Pyrénées, créant ainsi des zones d'hybridation (Hewitt, 2001). Lors de recolonisation spatiale, la taille de la population de front étant réduite, la diversité est sous échantillonnée par rapport à la population originale, c'est le goulot d'étranglement génétique (Nei et al, 1975). Cette perte de diversité génétique est accentuée par la dérive génétique générée par l'effet fondateur (Excoffier et al, 2009; Sexton et al, 2009). La différence de diversité génétique peut permettre ainsi d'identifier des routes d'expansion géographique en identifiant le front de propagation et la population source.

Lors de phases d'expansion géographique, comme c'est le cas lors de recolonisation post-glaciaire, la dispersion joue un rôle capital (Richardson et al, 2000). Cependant, si les individus
parviennent à franchir la barrière géographique, qui correspond à la phase de transport, il reste
toujours la barrière reproductive et de survie, correspondant à l'établissement des populations
dans le nouvel environnement (Garcia-Diaz, 2016; Richardson et al, 2000). La plasticité
phénotypique (Richards et al, 2006) et la capacité d'adaptation de l'espèce aux nouvelles
conditions biotiques et abiotiques conditionnent le succès de cette étape. Enfin, si toutes ces
barrières sont franchies avec succès et que la population nouvellement établie est en expansion,
la population peut devenir envahissante. La phylogéographie a permis d'identifier des routes
d'invasions d'insectes vecteurs responsables d'importants dommages économiques et de santé
publique (Aukema et al, 2011; Juliano and Lounibos, 2005; Kenis and Branco, 2010; Kenis et
al, 2017). Retracer les routes d'invasions et déterminer l'origine des populations est capital pour
prévenir de nouvelles introductions et établir une gestion appropriée (Estoup and Guillemaud,
2010). Par exemple, une étude de phylogéographie utilisant, entre autres, des approches
d'Approximate Bayesian computation (ABC) a permis d'invalider l'hypothèse classiquement
admise que *Culicoides imicola*, principal vecteur de la FCO en zone afrotropicale, avait étendu
récemment son aire de répartition au bassin méditerranéen, en lien avec les changements
climatiques actuels. La nouvelle hypothèse proposée soutient une présence ancienne de *C.
imicola* dans le bassin méditerranéen sur sa côte africaine et européenne. Cette extension de son
aire de répartition serait survenue suite aux changements climatiques survenus au cours du
Pléistocène et/ou de l'Holocène précoce (Jacquet et al, 2015).

L'Approximate Bayesian computation (ABC) est une approche de statistiques bayésiennes qui peut être appliquée à l'analyse de données génétiques et qui permet d'estimer la vraisemblance de modèles retraçant l'histoire évolutif et démographique de populations (Beaumont, 2010; Beaumont et al, 2002; Bertorelle et al, 2010; Csillery et al, 2010; Lopes and Beaumont, 2010). Les statistiques bayésiennes permettent, en effet, de déterminer la distribution *a posteriori* d'un modèle ou du paramètre θ en connaissant les données observées *D* en suivant l'équation suivante : P(θ|D) ∝ P(D|θ)P(θ) où P(θ) est la distribution *a priori* du modèle ou du paramètre. La probabilité P(D|θ) d'observer les données *D* étant donné le paramètre (ou le modèle) θ correspond à la vraisemblance de θ. Cette vraisemblance étant très difficile à estimer pour des modèles complexes, il est possible de calculer une distribution *a posteriori* en remplaçant la vraisemblance par une approximation en utilisant les statistiques, résumées sur des jeux de données simulés selon différents modèles.

Tout d'abord, cette approche nécessite de créer des scénarios évolutifs cohérents et d'estimer
les valeurs et les distributions *a priori* (priors) des paramètres historiques, démographiques et
génétiques du modèle biologique et des marqueurs moléculaires associés comme les taux de mutations des marqueurs, les tailles efficaces des populations et les dates de divergences. Des jeux de données génétiques, correspondant à chacun des scénarii décrits précédemment, sont alors simulés en très grands nombres à l'aide de modèles stochastiques. Les paramètres servant à alimenter ces simulations sont tirés aléatoirement dans la distribution des *priors*. Ces jeux de données sont ensuite résumés à une série de statistiques intra ou inter-populationnelles préalablement choisies, comme l'hétérozygotie observée et attendue ou les $F_{ST}$ entre populations. Ces statistiques, calculées sur les jeux de données simulés, sont ensuite comparées à celles calculées sur le jeu de données observé. Les simulations les plus éloignées des observations sont écartées (Beaumont *et al*, 2002). Une régression logistique sur les jeux de données simulés conservés, permet de calculer la probabilité, a posteriori de chaque scénario. Enfin, le calcul des erreurs de type I (faux positif) et les erreurs de type II (faux négatif) concernant le choix du scénario optimal est réalisé pour vérifier la puissance de l'analyse effectuée. Enfin, il convient de déterminer si le scénario sélectionné et les distributions a posteriori des paramètres inférés reproduisent convenablement les données observées. Ceci se fait en contrôlant la concordance entre le scénario sélectionné et les données observées, en simulant des données à partir de valeurs de paramètres tirées dans les distributions a posteriori (« model checking »). Les méthodes ABC sont donc des outils précieux en biologie évolutive qui permettent d'explorer les histoires démographiques, parfois complexes, des populations naturelles et qui permettent d'estimer des paramètres démographiques sous un modèle d'évolution donné (Alvarado-Serrano *et al*, 2015; Beaumont, 2010; Rougemont and Bernatchez, 2018).

L'utilisation couplée de méthodes de phylogénie, de délimitation d'espèces et de phylogéographie par des approches multilocus apparaissent ainsi comme des outils pertinents pour établir l'histoire évolutive des arthropodes vecteurs, parfois difficilement accessibles de par leurs capacités de dispersion passive importantes.
## II) *Culicoides obsoletus*, un modèle d'étude de la dispersion d'espèces vectrices de virus d'intérêt vétérinaire

### II.1) Généralités sur la biologie et l'écologie des *Culicoides*

Les *Culicoides* (Diptera : Ceratopogonidae) sont de petits moucherons nématocères de 1 à 3 mm de long, associés à une grande diversité d'hôtes vertébrés dont les ruminants sauvages (Lorca-Oro *et al*, 2014) et domestiques (Ayllon *et al*, 2014). Le régime alimentaire des mâles et des femelles est floricole (Goetghebuer, 1952; Zimmer *et al*, 2014a). Seules les femelles sont hématophages, les repas de sang permettant d'assurer la maturation des œufs (Barber *et al*, 2018).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 1.** Photos de *Culicoides*. (A et B) *Culicoides nubeculosus*, (C) Taille d'un *Culicoides (Culicoides impunctatus)* à gauche) par rapport à un moustique (à droite) pendant le gorgement, (D) Patron alaire de *Culicoides obsoletus*, (E) Patron alaire de *Culicoides scoticus*.</figcaption></figure>
Les *Culicoides* sont présents dans quasiment toutes les régions du monde à l'exception des régions polaires et d'îles isolées des masses continentales (Borkent, 2016). Les *Culicoides* sont présents sur un large gradient d'altitude, et certains spécimens ont été capturés jusqu'à 4 200 m au Tibet et dans les Andes (Garros and Balenghien, 2017). Cette large distribution géographique et altitudinale montre la plasticité biologique et écologique de ce genre (Werner *et al*, 2020).

Le cycle de vie comprend sept stades, les œufs, 4 stades larvaires, le stade nymphal et le stade adulte (Figure 2). La durée de chaque stade et des phases inter-stades est dépendante des conditions environnementales. Dans des conditions optimales, notamment de température, le cycle de vie entier peut être réalisé en moins d'un mois, mais il peut aussi atteindre plusieurs mois pour certaines espèces tempérées exposées à des basses températures (Purse *et al*, 2015). D'aspects fusiformes, les œufs des *Culicoides* sont pondus au sol. Les habitats larvaires sont généralement décrits comme des zones humides voire semi-aquatiques, riches en matière organique d'origine animale ou végétale : fumier, litières de forêt, fèces, boue, abords de point d'eau, mares, étangs, rivières, plages, eaux stagnantes, flaques, abords d'abreuvoirs, fruits en décomposition (Bakhoum *et al*, 2016; Carpenter *et al*, 2009; Garros and Balenghien, 2017; Gonzalez *et al*, 2013; Jenkins and Young, 2010). Les quatre stades larvaires de *Culicoides* sont vermiformes, apneustiques, mobiles (Purse *et al*, 2015) et se nourrissent de nématodes, bactéries et de matière organique (Borkent, 2014). Le stade nymphal est très peu mobile et reste à la surface de l'habitat larvaire. Les stades immatures sont très sensibles à la dessiccation et des conditions défavorables ont des conséquences fortes pour la survie des populations. Après l'émergence, pour la plupart des espèces, l'accouplement s'effectue après un vol nuptial, sur un substrat ou en essaim (Duvallet *et al*, 2017; Viennet *et al*, 2013). Les femelles stockent les spermatophores dans leurs spermathèques (nombre variant entre 1 à 3), leur permettant d'engendrer une descendance tout au long de leur vie sans avoir à effectuer de nouveau un accouplement. Après l'accouplement et avant chaque ponte, la femelle se met en quête d'un hôte vertébré pour effectuer un repas de sang. Ce repas de sang permettra d'apporter l'azote et les protéines nécessaires au développement et à la maturation des œufs (entre 10 et 100 par ponte). La durée du cycle gonotrophique, représentant l'intervalle de temps entre deux repas de sang, est dépendante des conditions environnementales. Pour la plupart des espèces, les femelles sont crépusculaires avec un pic d'activité au crépuscule ou à l'aube (Mellor *et al*, 2000; Purse *et al*, 2015). Les espèces paléarctiques utilisent principalement la végétation comme lieu de repos durant la journée (Zimmer *et al*, 2014b). Avec deux générations par an, la plupart des espèces distribuées dans l'ouest de la région paléarctique sont bivoltines (pic de population au
printemps et en été) (Blackwell et al, 1994; Garros and Balenghien, 2017; Meiswinkel et al, 2014). Lorsque les conditions environnementales ne sont pas favorables à l'émergence, certaines espèces de *Culicoides*, peuvent effectuer une diapause estivo-hivernale, permettant aux larves d'émerger à la saison suivante (Garros and Balenghien, 2017).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>**Figure 2.** Représentation schématique du cycle de développement et de vie des *Culicoides* (Source : Office vétérinaire fédérale 2010, Thèse Roger Venail 2014, Purse et al 2005, Purse et al 2015, Thèse Bruno Mathieu 2011, source des dessins : http://illuminationstudios.com/)</figcaption></figure>

Principalement mammophiles (hommes, équins, ovins, bovins, caprins, cervidés), les *Culicoides* se gorgent aussi sur d'autres types de vertébrés comme des oiseaux, des reptiles ou des amphibiens (Carpenter et al, 2008c; Gerry et al, 2009; Linden et al, 2010; Mullens et al, 2010; Viennet et al, 2013; Votypka et al, 2009). De façon plus anecdotique, des spécimens gorgés on a retrouvés sur des diptères eux-mêmes gorgés (Ma et al, 2013). La caractérisation
des préférences trophiques des espèces de *Culicoides* est compliquée par la difficulté de collecte de femelles gorgées sur les hôtes et le manque de connaissances sur les lieux de repos (Viennet *et al*, 2013). *Culicoides obsoletus*, *C. turanicus* et *C. impunctatus* effectuent des repas sur une large gamme d'hôtes, présentant un comportement opportuniste et généraliste. Au contraire, certaines espèces sont spécialistes, telles que *Culicoides maritimus*, *C. pictipennis* et *C. circumscriptus*, connues pour se gorger préférentiellement sur des oiseaux domestiques et sauvages (Blackwell *et al*, 1994). *Culicoides bolitinos*, *C. brevitarsis* et *C. chiopterus* sont décrits comme fortement inféodés aux bovins, que ce soit pour le repas de sang ou le site d'oviposition.

Cette section souligne qu'il reste encore beaucoup d'inconnues concernant la bio-écologie des *Culicoides*. Cela s'explique par la difficulté de mettre en élevage les espèces d'intérêt et de travailler *in naturae* sur les populations sauvages.

## II.2) Le rôle des *Culicoides* dans la transmission de pathogènes en Europe du nord

Le rôle nuisible des *Culicoides* est lié à l'hématophagie des femelles. La piqûre des *Culicoides* est douloureuse et la salive peut causer des prurits et des allergies, dont la dermite estivale récidivante chez les chevaux (Anderson *et al*, 1988; Kleider and Lees, 1984) ou les moutons (Yeruham *et al*, 2004). Cette nuisance affecte aussi les activités humaines (foresterie, tourisme) et peut être si intense qu'elle a conduit à nommer certaines espèces en lien avec cette nuisance, comme *C. irritans* ou *C. diabolicus* (Auriault, 1979; Garros and Balenghien, 2017; Itoua *et al*, 1987). En s'attaquant aux populations humaines, *C. furens* a longtemps nuit aux activités touristiques sur les plages des Caraïbes et de la Floride (Linley and Davies, 1971). En Ecosse, le harcèlement incessant de *C. impunctatus*, limite les activités extérieures telles que la sylviculture, l'agriculture et le tourisme durant les pics d'abondance (Blackwell, 2001; Hendry and Godwin, 1988).

Compte tenu de leur hématophagie, les femelles de *Culicoides* sont responsables de la transmission de près de 15 espèces de protozoaires et de 25 espèces de filaires et 65 espèces de virus (Carpenter *et al*, 2013; Garros and Balenghien, 2017; Mellor *et al*, 2000; Mullens *et al*, 2010). Cependant, c'est bien leur rôle dans la transmission de virus d'importance vétérinaire et
médicale qui font des *Culicoides* des vecteurs d'intérêt pour la communauté scientifique (Figure 3).

<figure><img src="image_22.png" /></figure>

**Figure 3.** Distribution géographique des six principaux virus transmis par les *Culicoides* (Purse *et al*, 2015). AHSV ; virus de la peste équine ; AKAV, virus Akabane ; BTV, virus de la fièvre catarrhale ovine ; EHDV, virus de la maladie hémorragique ; OROV, virus de l'Oropouche ; SBV, virus de Schmallenberg.

Dans la région ouest paléarctique, deux arboviroses transmises par les *Culicoides* sont d'intérêts sanitaire et économique : la fièvre catarrhale ovine (FCO) et la maladie de Schmallenberg (SBV) (Beer *et al*, 2013; Carpenter *et al*, 2013; Maclachlan, 2011; Maclachlan and Guthrie, 2010). Quelques épizooties sporadiques de peste équine (PE), impliquant une transmission par *C. imicola*, ont été observées en Espagne en 1966 et 1987, mais cette maladie reste enzootique au continent africain depuis les années 1990 (Wilson and Mellor, 2009) (au moment de la rédaction de ce manuscrit, deux émergences en Asie étaient notifiées à l'OIE).

La FCO est une arbovirose non contagieuse, transmise exclusivement par les *Culicoides* (Mellor *et al*, 2000). Largement répandue dans le monde, la FCO affecte les ruminants sauvages et domestiques (Mellor *et al*, 2000; Ruiz-Fons *et al*, 2014; Talavera *et al*, 2015). Appartenant au genre *Orbivirus* (*Reoviridae*), le virus de la FCO est un virus à ARN double brin. Actuellement, 29 sérotypes de FCO sont recensés au niveau mondial (Bumbarov *et al*, 2020), les derniers ayant été respectivement identifiés chez des chèvres en Corse en 2014 (BTV-27)
(Schulz et al, 2016; Zientara et al, 2014), isolés à partir d'un vaccin au Moyen-Orient (BTV-28) (Bumbarov et al, 2020; Sun et al, 2016), et détectés chez un alpaga en Afrique du sud (BTV-29) (Wright, 2014). La transmission s'effectue entre hôtes par piqûres de *Culicoides* cependant, une transmission verticale (Chauhan et al, 2014; Dubovi et al, 2013; Santman-Berends et al, 2010) ou horizontale par ingestion de tissus infectés est aussi rapportée (Backx et al, 2009; Darpel et al, 2009; Lopez-Olvera et al, 2010; Menzies et al, 2008)

La fièvre catarrhale ovine est aussi appelée maladie de la langue bleue en raison des hémorragies et des œdèmes faciaux qu'elle provoque. Les autres symptômes sont une forte hyperthermie, une fonte musculaire, des avortements, des écoulements nasaux et une forte salivation (Backx et al, 2007; Sperlova and Zendulkova, 2011). L'issue de la maladie est variable selon l'espèce touchée et le sérotype concerné, allant de l'absence de signes cliniques au décès. Le taux de mortalité oscille de 5 à 10%, pouvant s'élever à 40% dans de mauvaises conditions sanitaires. Après l'apparition des premiers symptômes, la mort peut survenir dans les dix jours qui suivent (Sperlova and Zendulkova, 2011). La fièvre catarrhale ovine est considérée comme enzootique dans les régions tropicales et tempérées situées entre les latitudes 40°S et 35°N (Walton, 2004). Cependant, des épizooties périodiques ont eu lieu principalement dans les régions adjacentes jusqu'à 58°N (Barcelo and Miranda, 2018; Carpenter et al, 2009; Walton, 2004; Wilson and Mellor, 2009).

Avant 1998, seules quelques incursions épizootiques avaient été constatées dans le bassin méditerranéen (Espagne, Portugal, Grèce et Chypre) (Carpenter et al, 2013). De 1998 à 2005, six sérotypes sont entrés en Europe du sud via l'Afrique du nord à l'ouest et via la Turquie et Chypre à l'est et se sont étendus à 12 pays (Purse et al, 2005). A l'issue de cette période, la limite septentrionale de la FCO dans la région s'était déplacée de 800 km. Parallèlement, C. imicola, le principal vecteur en Afrique et dans le bassin méditerranéen, a été collecté dans des régions au-delà de sa limite nord précédemment connue atteignant à son maximum septentrional le nord de l'Espagne, le sud de la France et le nord de l'Italie (Purse et al, 2005). En 2006, le sérotype 8 est entré en Europe du nord (Belgique, Allemagne et Pays-Bas), dans une zone hors de l'aire de répartition de C. imicola. Le virus a survécu à l'hiver et s'est étendu en 2007 à 14 pays, de l'Espagne à la Norvège (Carpenter et al, 2009; Garros and Balenghien, 2017; Schwartz-Cornil et al, 2008). Parallèlement, le sérotype 1 a été introduit dans le sud de la France via la péninsule Ibérique avec une incursion en Bretagne via l'importation d'ovins infectés (Carpenter et al, 2013; Sperlova and Zendulkova, 2011). Les incursions de ces différents sérotypes de FCO en Europe ont été catastrophiques sur le plan sanitaire et
économique (Ganter, 2014; Gethmann et al, 2020; Mellor et al, 2000; Wilson and Mellor, 2009; Zientara and Sánchez-Vizcaíno, 2013).

En 2011, suit l'émergence du virus de Schmallenberg (SBV), un nouveau virus pour la science transmis par les *Culicoides* (Barber et al, 2018). La maladie de Schmallenberg affecte comme la FCO, les ruminants domestiques et sauvages et possède des symptômes, une épidémiologie et une distribution comparable à celle de la FCO (Afonso et al, 2014; Garros and Balenghien, 2017; Maclachlan et al, 2019; Sick et al, 2019; Temizel et al, 2009). Cette arbovirose a également causé d'importantes pertes économiques pour les éleveurs de ruminants domestiques notamment par les mortalités périnatales chez les bovins et les ovins (Maclachlan et al, 2019).

L'émergence et la propagation massive de ces deux maladies dans la région ouest paléarctique, hors de la distribution de *C. imicola*, ont soulevé des questions sur la compétence vectorielle des *Culicoides* autochtones de la région ouest paléarctique (Barber *et al*, 2018). Des études d'infection expérimentale ou de recherche de virus chez les espèces abondantes et distribuées sur la région paléarctique ont confirmé qu'elles étaient compétentes pour la transmission des deux virus (Barber *et al*, 2018; Sick *et al*, 2019; Veronesi *et al*, 2013). En particulier, les espèces du Groupe Obsoletus, *C. obsoletus*, *C. scoticus*, *C. dewulfi* et *C. chiopterus*, sont identifiées comme des espèces vectrices majeures pour les virus de la FCO et de Schmallenberg en région paléarctique, suite à la détection ou à l'isolement du virus dans des populations sauvages (Barber *et al*, 2018; De Regge *et al*, 2012; Sick *et al*, 2019; Veronesi *et al*, 2013). Des infections expérimentales en laboratoire ont également confirmé la compétence vectorielle de *C. obsoletus* et *C. scoticus* (Carpenter et al, 2008a).

Ces événements ont soulevé de nombreuses questions sur les facteurs ayant permis l'expansion de la FCO. Il a été constaté que la propagation du virus de la FCO est facilitée dans des conditions favorables à l'activité des *Culicoides* et à la réplication virale. Par exemple, une température ambiante élevée tend à réduire la période d'incubation du virus (Wittmann *et al*, 2002). Les arguments avancés sont fortement liés aux changements climatiques globaux (Baylis, 2017; Purse *et al*, 2005), le changement du paysage agricole (Purse *et al*, 2005), la densité des hôtes (Jacquot *et al*, 2017), et la compétence vectorielle des espèces de *Culicoides* autochtones (notamment les espèces des Groupes Obsoletus et Pulicaris) (Goffredo *et al*, 2016; Torina *et al*, 2004).
Un facteur clé de la compréhension de l'émergence et de la large circulation des deux virus est la caractérisation de la dispersion des *Culicoides* à différentes échelles spatiales et au-dessus de différents types de milieux (continents et masses d'eaux).

## II.3) La dispersion stratifiée chez les *Culicoides*

La littérature a longtemps considéré les *Culicoides* comme des diptères n'ayant pas d'importantes capacités de dispersion. Cette hypothèse se fonde sur leur petite taille ne leur permettant pas d'effectuer de vol actif de plus de quelques centaines de mètres (Murray, 1987). La dispersion active des femelles *Culicoides* est principalement motivée par la reproduction : la recherche de partenaires pour la reproduction, d'hôtes pour le repas de sang ou de sites de ponte pour l'oviposition (Kluiters *et al*, 2015b; Mellor *et al*, 2000). Compte tenu de leur taille et des limitations techniques qui en découlent, peu d'études de capture-marquage-recapture ont été menées sur les *Culicoides*.

Une première étude est réalisée en 1981 par Lillie et al. (Lillie *et al*, 1981) avec un marquage à la poudre fluorescente. Elle montre que des femelles de *C. variipennis* peuvent se disperser jusqu'à 4 kilomètres du point de lâcher d'origine, 36 heures après le lâcher. Une autre étude met en évidence une distance de recapture record chez *C. mohave*. Une femelle a été recapturée à 6 km du point de lâcher. Cependant, l'environnement désertique de la Californie du sud où est menée cette étude, les conditions environnementales et la très faible densité d'hôtes rendent peu généralisable les estimations de cette étude (Brenner *et al*, 1984). La dispersion des *Culicoides* est dépendante de facteurs environnementaux comme la vitesse et la direction du vent qui peuvent favoriser ou limiter la dispersion chez les *Culicoides* (Braverman and Chechik, 1996; Mellor *et al*, 1983). Un vent, au-delà de 3 mètres/seconde, pourrait limiter la dispersion de *C. schultzei* et de *C. imicola* (Walker, 1977). D'autres facteurs comme la température (si inférieure à 13°C, ou supérieure à 35°C), les précipitations (Braverman and Chechik, 1996) et des vitesses de vent élevées peuvent réduire l'activité de vol des *Culicoides* (Baylis *et al*, 2010; Carpenter *et al*, 2008b; Gloster *et al*, 2008).

En région paléarctique, une étude récente s'est intéressée à l'effet de certaines variables environnementales et climatiques sur l'abondance des *Culicoides* (Kirkeby *et al*, 2013), en ciblant deux groupes d'espèces (les Groupes Obsoletus et Pulicaris). Les auteurs utilisent un marquage avec un colorant d'isothiocyanate de fluorescéine. La distance de recapture maximale
observée est de 1750 m du site de lâcher. Cette étude met en évidence un effet positif et significatif de la vitesse du vent entre 1 et 5 m/s sur l'abondance des *Culicoides*. Les auteurs émettent l'hypothèse que, lors d'un vent de plus forte intensité, la dispersion active est limitée par la difficulté à localiser les hôtes par leur odeur. Les précipitations et les turbulences, estimées par les changements de direction du vent d'au moins 22,5 degrés ont, au contraire, des effets négatifs et significatifs sur l'abondances des *Culicoides* (Kirkeby *et al*, 2013). Ces conclusions sont en opposition avec celles d'une étude précédente, montrant une diminution de l'abondance de *Culicoides* lorsque la vitesse du vent est supérieure à 3 m/s (Carpenter *et al*, 2008c). Cependant, il est important de noter une différence importante entre les deux études. Le niveau d'identification taxonomique est au groupe pour l'étude de Kirkerby et al (2013), et non pas à l'espèce, ce qui limite la portée des conclusions. En effet, il est connu que la saisonnalité ou l'utilisation de l'habitat peuvent différer au niveau de l'espèce, même au sein du même groupe d'espèces (Searle *et al*, 2014). Une étude pharaonique est par la suite publiée par Kluiters et ses collaborateurs (Kluiters *et al*, 2015a; Kluiters *et al*, 2015b). Ils utilisent de la poussière fluorescente pour marquer plus de 61 000 *Culicoides* afin d'étudier la dispersion des membres du Groupe Obsoletus au Pays de Galles. Malgré le très grand nombre d'individus relâchés, le taux de recapture est de 0.02%. La distance parcourue varie entre 1 et 2, 5 km, avec une dispersion plus importante chez les femelles (2,21 km en moyenne contre seulement 1 km pour les mâles). Le point important à noter est que des captures ont été effectuées à la fois dans le sens du vent mais aussi contre la direction du vent. Cette étude conclue à une possible dispersion passive et active des *Culicoides* de proche en proche entre fermes (Kluiters *et al*, 2015a; Kluiters *et al*, 2015b). Sander et ses collaborateurs (Sanders *et al*, 2017) utilisent une autre approche de marquage pour quantifier la dispersion de *Culicoides* en Angleterre, avec une technique d'immunomarquage à l'ovalbumine. Le marquage est effectué dans cette étude directement par exposition de contact et par pulvérisation sur les sites de repos et d'oviposition supposés, ce qui peut engendrer un nombre important de contamination. Les auteurs ont une analyse plus poussée des données météorologiques leur permettant d'aller plus loin sur l'analyse du rôle du vent. Ils mettent en évidence que 84,4 % des vols de plus d'un kilomètre ont eu lieu dans le sens du vent alors que seulement 15,6 % des vols ont été effectués face au vent (Sanders and Carpenter, 2014; Sanders *et al*, 2017).

Les études sur les *Culicoides* appliquant une méthodologie de capture-marquage-recapture restent délicates compte tenu de la taille de l'insecte, du taux de mortalité des *Culicoides*
capturés et du faible taux de recapture (Kluiters et al, 2015b). Les trois exemples développés ci-dessus nous permettent de conclure que les capacités de dispersion des *Culicoides* seraient comprises entre 1 et 2,5 km (Kirkeby et al, 2013; Kluiters et al, 2015b; Sanders and Carpenter, 2014), avec une variation liée au sexe, que le vol se ferait de manière omnidirectionnelle, avec des trajectoires dans le sens du vent, mais également contre le vent (Brenner et al, 1984; Kirkeby et al, 2013). Si les capacités de dispersion horizontales actives restent faibles, des études de piégeages ont montré la présence des *Culicoides* dans des colonnes d'air à plusieurs centaines de mètres d'altitude (Bishop et al, 2000; Hardy and Cheng, 1986; Murray, 1987; Sanders et al, 2011), indiquant une potentiel dispersion verticale passive.

D'autres arguments existent qui soutiennent une importante dispersion passive sur de longues distances au-dessus des masses d'eau, grâce aux vents. Ces événements de dispersion par le vent de *Culicoides*, ont permis la colonisation et l'installation de nouvelles populations dans des zone indemnes (Johansen et al, 2003) comme en France depuis la Corse (Jacquet et al, 2016a). Le transport de *Culicoides* infectés aurait permis l'introduction de sérotypes du virus de la FCO dans des territoires insulaires ou entre régions géographiques éloignées (Aguilar-Vega et al, 2019; Alba et al, 2004; Hendrickx et al, 2008; Jacquet et al, 2016a; Sedda et al, 2015). De telles introductions ont ainsi été démontrées de la Sardaigne aux Baléares (Alba et al, 2004), mais également en Irlande (McGrath et al, 2018) et au Royaume-Uni (Burgin et al, 2017).

Ces études s'appuient sur des approches de modélisation où les trajectoires de dispersion sont estimées par des modèles de dispersion atmosphérique de particules fines comme HYSPLIT (Hybrid Single-Particle Lagrangian Integrated Trajectory) (McGrath et al, 2018), NAME (Numerical Atmospheric-dispersion Modelling Environment) (Andrew Jones, 2007; Eagles et al, 2014), ou MATCH (Multiscale Atmospheric Transport and Chemistry) (Agren et al, 2010). Initialement, ces modèles sont conçus pour simuler le transport de gaz ou des particules fines en suspension dans l'air. Jacquet et ses collaborateurs (Jacquet et al, 2016b) mettent en évidence, grâce à l'utilisation combinée de paramètres de génétique des populations classique, de méthodes bayésiennes ABC et d'un modèle de dispersion par le vent (NAME), le rôle des populations de *C. imicola* de Corse comme source d'introduction la plus probable de *Culicoides* dans les Pyrénées-Orientales via des évènements de dispersion à longue distance par le vent de plus de 500 km (Jacquet et al, 2016b).

Les études de modélisation de la dispersion appliquées à des territoires terrestres sont plus rares.
En 2015, Sedda et ses collaborateurs utilisent les données de contamination des fermes par le
virus de la FCO collectées au cours de l'épizootie de 2006 en Europe pour les comparer à des
modèles mécanistes et stochastiques de dispersion de *Culicoides* par le vent (Sedda *et al*, 2012;
Sedda *et al*, 2015). Ce modèle permet d'expliquer 94 % des données d'infections entre fermes
en incluant des vols dans le sens du vent mais également à contre-courant, le modèle prenant
en compte uniquement le vol dans le sens du vent n'étant pas assez informatif (Sedda and
Rogers, 2013). Les auteurs montrent que près de 54 % des foyers observés auraient été causés
par la dispersion du vecteur sur moins de 5 km, et 8 % des infections causées par un déplacement
du vecteur sur plus de 31 km. Ainsi, ils concluent que les infections à longue distance causées
par les *Culicoides* sont rares. De ce fait, la dynamique d'infection serait principalement
effectuée par de la dispersion de proche en proche illustrée avec et contre le vent. Enfin, une
étude de modélisation a permis de quantifier le rôle de la dispersion des vecteurs et des
déplacements d'animaux dans la transmission entre fermes du virus de Schmallenberg (SBV)
et de la FCO en Grande-Bretagne (Sumner *et al*, 2017). Les résultats de l'étude indiquent que
respectivement 90% et 98% des événements de transmission entre exploitations de FCO et de
SBV seraient dus à la dispersion des *Culicoides*. Sur la base de leurs résultats, les auteurs
concluent que l'impact des mesures de restrictions de mouvement des animaux sur la circulation
du virus dépend des hypothèses posées sur la capacité de dispersion des vecteurs. Si la
dispersion se produit principalement à l'échelle locale (99 % de la transmission dans une zone
<25 km), les restrictions de mouvement seront efficaces pour réduire la circulation du virus,
mais si la dispersion se produit fréquemment sur de plus longues distances (99 % de la
transmission dans une zone au-delà de 50 km), alors elles ne le seront pas.

Il a également été décrit que les *Culicoides* pouvaient s'élever activement dans les vents en
altitude puis être poussées par les courants de vents de manière passive (Drake and Reynolds,
2012; Huestis *et al*, 2019). La dispersion par le vent est alors qualifiée de semi-passive.
<figure><img src="image_23.png" /></figure>

**Figure 4.** Représentation schématique de la dispersion stratifiée des *Culicoides*. Le rouge implique une dispersion active et le bleu une dispersion passive. L'épaisseur des flèches rouges et bleues est représentative de l'intensité de la dispersion (Source Office vétérinaire fédérale 2010, Thèse Roger Venail 2014, Purse *et al* 2005, Purse *et al* 2015, Thèse Bruno Mathieu 2011).

En résumé, la dispersion des *Culicoides* est qualifiée de « stratifiée » (Figure 4), car elle associe
de la dispersion active à faible distance de proche en proche et de la dispersion passive par le
vent sur de longues distances, plus ou moins rare selon les masses traversées. Cette section
souligne (i) la forte divergence d'opinions sur l'importance de la dispersion par le vent (ii) le
fait que les capacités de dispersion à longue distance au-dessus des masses continentales ont
été peu évaluées que ce soit par approche directe (CMR) ou indirecte (génétique, modélisation)
(Burgin *et al*, 2013) (iii) et l'absence d'études moléculaires visant à étudier la dispersion de C.
*obsoletus* à l'aide d'outils de génétique des populations et du paysage.
## II.4) *Culicoides obsoletus* : un besoin de clarification taxonomique

L'application des méthodes de la taxonomie moléculaire au genre *Culicoides* est relativement récente, en lien avec les émergences et l'évolution des situations sanitaires dans les régions touchées par les maladies transmises. Compte tenu de cet intérêt récent en Europe, l'étude de la taxonomie et de la phylogénie des *Culicoides* paléarctique est encore naissante. Il reste donc de nombreux questionnements sur le statut spécifique de certaines entités et les relations phylogénétiques entre les différentes espèces de *Culicoides*.

Le genre *Culicoides* (Diptera: Ceratopogonidae), défini par Latreille en 1809, regroupe actuellement environ 1 400 espèces décrites, groupées en 31 sous-genres (Borkent, 2016). Plus de 10% des espèces ne sont pas affiliées à un groupe et 38 complexes d'espèces ou groupes ne sont pas affiliés à un sous-genre (Borkent, 2016). Les groupes d'espèces sont pour la plupart définis sur la base de similarités morphologiques sans réelle signification phylogénétique. La configuration des patrons alaires, des palpes maxillaires, des pièces génitales ou des antennes sont des critères diagnostiques pour l'identification à l'espèce (Augot et al, 2010; Delecolle, 1985; Hajd Henni et al, 2014; Talavera et al, 2017). La notion de groupe ou de complexe d'espèces n'a pas réellement été définie dans le genre *Culicoides* (Borkent, 2016; Harrup et al, 2015). Enfin, pour compléter l'imbroglio taxonomique, de nombreuses espèces sont dites cryptiques ou jumelles, c'est-à-dire morphologiquement identiques mais moléculairement différentes. Ainsi, la taxonomie du genre *Culicoides* est problématique, et nécessite une révision systématique (Harrup et al, 2015).

Le Groupe Obsoletus est défini dans la littérature comme un groupe d'espèces avec une morphologie marquée par des ailes tachetées mal définies et une deuxième cellule radiale avec une tâche lumineuse. Neuf espèces valides composent le Groupe Obsoletus tel que décrit par Mathieu en 2011 : *C. obsoletus* (Meigen), 1818 ; *C. sinanoensis* Tokunaga, 1937 ; *C. scoticus* Downes & Kettle, 1952 ; *C. montanus* Shakirzjanova, 1962 ; *C. gornostaevae* Mirzaeva, 1984 ; *C. abchazicus* Dzhafarov, 1964 ; *C. filicinus* Gornostaeva & Gachegova, 1972 ; *C. alachua* Jamnback & Wirth, 1963 ; et *C. sanguisuga* (Coquillet, 1901). Parmi ces espèces, *C. abchazicus*, *C. montanus*, *C. obsoletus* et *C. scoticus* sont sympatriques en région ouest paléarctique. *Culicoides obsoletus* est considéré comme une espèce holarctique car présente à la fois dans les régions néarctique et paléarctique (Mathieu, 2011). Abondantes dans les élevages de ruminants domestiques (Baldet et al, 2008; Meiswinkel et al, 2014), *C. scoticus* et *C. obsoletus* sont des espèces dites « jumelles » car les femelles sont morphologiquement très
proches avec un chevauchement de valeurs au niveau de la taille des spermathèques et des taches alaires très similaires (Figure 1). *Culicoides alachua* et *C. sanguisuga* sont exclusivement présentes dans la région néarctique (Mathieu, 2011). Les cycles de vie et les comportements trophiques de la plupart des espèces du Groupe Obsoletus ne sont pas bien décrits. Historiquement associés au Groupe Obsoletus sur la base de critères morphologiques et de leur sympatrie, *C. chiopterus* et *C. dewulfi* ont été écartées du Groupe Obsoletus récemment suite à des études moléculaires et de morphométrie géométrique des ailes (Ander *et al*, 2013; Gomulski *et al*, 2005; Hajd Henni *et al*, 2014; Kluiters *et al*, 2016; Meiswinkel *et al*, 2004). Au sein du Groupe Obsoletus, un complexe d'espèces, nommé lui aussi Obsoletus, a été défini et inclut *C. obsoletus*, *C. montanus*, *C. abchazicus* et *C. scoticus* (Mathieu, 2011). Récemment, des études moléculaires au sein du Groupe Obsoletus basées sur le polymorphisme de marqueurs mitochondriaux, ont montré l'existence d'espèces cryptiques : *C. obsoletus* clade 'O2', *C. obsoletus* clade 'O3' respectivement en Suède et en Suisse (Ander *et al*, 2013), et *C. obsoletus* clade « dark » aux Pays-Bas (Elbers and Meiswinkel, 2014; Meiswinkel *et al*, 2015).

Afin de respecter les règles posées par Harbach pour le genre *Anopheles* pour les catégories infrasubgénériques (Harbach, 1994), nous utiliserons pour ces travaux de thèse le terme "Complexe Obsoletus/Scoticus" pour désigner l'ensemble d'espèces regroupant *C. obsoletus*, *C. abchazicus*, *C. scoticus* et *C. montanus* ainsi que toutes les unités taxonomiques opérationnelles décrites récemment dans la littérature (*C. obsoletus* clade O2, *C. obsoletus* clade O3, *C. obsoletus* clade « dark »).

**Encadré 6 : Les différents marqueurs moléculaires utilisés pour estimer les relations phylogénétiques des Culicoides**

Étant donné la difficulté d'identification morphologique et l'imbroglio taxonomique actuel, des techniques d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) avec amorces spécifiques, de spectrométrie de masse (Kaufmann *et al*, 2012) de PCR en temps réel (Monaco *et al*, 2010; Talavera *et al*, 2015; Wenk *et al*, 2012), ou de puces à ADN (Deblauwe *et al*, 2012; Duvallet *et al*, 2017), ont été mises en place. Divers marqueurs moléculaires ont été utilisés pour l'identification moléculaire des *Culicoides*, notamment les gènes du cytochrome c oxydase mitochondrial sous-unité I (cox1, région du code à barres), sous-unité II (COII), l'ADN ribosomique 16S (Debeila, 2010; Emaresi *et al*, 2009; Suk and Semenza, 2011; Tabachnick, 2004), l'ADN ribosomique 28S (Bakhoum *et al*, 2018), la cytochrome oxydase B (Cytb), la
région d'espacement interne transcrite 1 (ITS1) (Cetre-Sossah et al, 2004; Duvallet et al, 2017; Jacquot et al, 2017; Mathieu, 2011; Mathieu et al, 2007) et l'ADNr ITS2 (Gomulski et al, 2005; Gomulski et al, 2006). Parmi ce panel de marqueurs moléculaires, le plus utilisé est la sous-unité 1 de la cytochrome c oxydase mitochondriale (cox1) (Nolan et al, 2007). Parmi les trois sous-unités de cytochrome oxydase dans l'ADN mitochondrial, le gène cox1 est le plus conservé (Zhang and Hewitt, 1997), et est couramment utilisé dans les études de phylogénie chez les arthropodes (Ander et al, 2013; Hebert et al, 2003). Ce fragment du gène mitochondrial cox1 a été utilisé pour développer des tests PCR avec amorces spécifiques (Cetre-Sossah et al, 2004; Garros and Balenghien, 2017; Mathieu, 2011; Nolan et al, 2007; Schwenkenbecher et al, 2009), ou pour identifier des espèces morphologiquement indifférenciables (Pages et al, 2009; Pages and Sarto, 2005; Schwenkenbecher et al, 2009). La région cox1 a été utilisée pour étudier les relations phylogénétiques des *Culicoides* afrotropicaux, comme *C. imicola* (Dallas et al, 2003; Linton et al, 2002; Suk and Semenza, 2011).

*Culicoides obsoletus* est présent sur les trois continents de l'hémisphère nord, l'Amérique, l'Europe et l'Asie (Borkent, 2016), avec un centre de distribution qui semble être en Europe. Des notifications de l'espèce existent pour une zone allant de l'ouest du continent américain, la Colombie britannique, Canada (Anderson *et al*, 1991), la Russie (Sprygin *et al*, 2014), la Chine (Gao *et al*, 2020) et la Corée du sud (Cho and Chong, 1974) à l'est, l'Afrique du nord au sud, (Maroc (Bourquia *et al*, 2019), Tunisie (Sghaier *et al*, 2017), Algérie (Hakima *et al*, 2020)), jusqu'au Portugal (Capela *et al*, 2003) et à l'Espagne (Miranda *et al*, 2003) pour l'ouest de l'Europe, et la Finlande et la Suède pour le nord de l'Europe (Mignotte *et al*, 2020). Cette espèce est également présente dans les territoires insulaires européens, comme Les Baléares (Miranda *et al*, 2003), les Canaries (Martinez-de la Puente *et al*, 2012), et la Corse (Venail *et al*, 2012). Cette espèce est considérée comme paléarctique et néarctique (Borkent, 2016; Mathieu, 2011). De nombreuses espèces synonymes ont été décrites comme *C. varius* ((Winnertz), 1852) en Allemagne, *C. yezoensis* ((Matsumura), 1911) en Russie, *C. lacteinervis* (Kieffer, 1919) en Ukraine, *C. kabyliensis* (Kieffer, 1922) en Algérie ou *C. intermedius* (Okada, 1941) au Japon.
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**Figure 5.** Aire de répartition mondiale de *C. obsoletus*. Le gris indique les pays dans lesquels l'espèce est présente, le blanc indique les pays dans lesquels n'a pas été rapportée jusqu'à présent.

Son comportement trophique est décrit comme généraliste et ses préférences écologiques des stades immatures sont peu exigeantes, lui permettant d'être présent dans de nombreux habitats. *Culicoides obsoletus* est abondant dans toute l'Europe centrale et septentrionale (France (Cuellar *et al*, 2018), Roumanie (Hristescu *et al*, 2020), Slovaquie (Sarvasova *et al*, 2014), et péninsule des Balkans (Goffredo *et al*, 2004; Mignotte *et al*, 2020; Pudar *et al*, 2018). Il est cependant moins abondant sur ses fronts septentrionaux et méridionaux en Europe de l'ouest, Norvège et Finlande (Mignotte *et al*, 2020) et Maroc (Bourquia *et al*, 2019), Tunisie (Sghaier *et al*, 2017), ou Algérie (Hakima *et al*, 2020).

Dans ce contexte de flou taxonomique, et sachant sa vaste répartition géographique, il apparaît primordial de clarifier la situation phylogénétique du Groupe Obsoletus.
L'Europe connaît depuis quinze ans des épizooties récurrentes de virus d'intérêt vétérinaire, le virus de Schmallenberg (SBV) et le virus de la Fièvre Catarrhale Ovine (FCO). Ces virus ont été responsables de crises sanitaires sans précédent en Europe. Des espèces de *Culicoides* paléarctiques autochtones et notamment celles appartenant au Groupe Obsoletus sont connues comme étant les vecteurs principaux de ces virus dans la région ouest paléarctique. Les analyses épidémiologiques des épizooties de FCO ou de SBV, couplées à des approches de modélisation soulignent le rôle : (i) du vent dans la dispersion à longue et à courte distance des *Culicoides* et donc des virus qu'ils transmettent (Aguilar-Vega *et al*, 2019; Burgin *et al*, 2017; Burgin *et al*, 2013; Ducheyne *et al*, 2007; Jacquet *et al*, 2016a; McGrath *et al*, 2018), (ii) que la circulation du virus de la FCO s'effectue majoritairement de proche en proche (Sedda *et al*, 2012; Sedda *et al*, 2015), (iii) et qu'un arrêt des mouvements animaux comme mesure de contrôle n'aurait pas affecté la transmission du virus de Schmallenberg (Gubbins *et al*, 2014).

L'utilisation de la méthode CMR a permis de mettre en évidence le caractère omnidirectionnel de la dispersion des *Culicoides*, à la fois dans le sens du vent mais aussi contre la direction du vent à courte distance. De plus, la dispersion des *Culicoides* sur de très longues distances (plusieurs centaines de km) au-dessus des mers en utilisant les courants d'airs chauds et de faible vitesse est bien documentée. Celle-ci est facilitée par le fait que les masses d'eau présentent peu de résistance aux flux d'air horizontaux. Au-dessus des terres, du fait des phénomènes de friction liés à la rugosité du terrain ou à la présence de barrières physiques (relief), les phénomènes de dispersion se font à de plus courtes distances (de quelques km à plusieurs dizaines de km) et sont composés à la fois de mouvements actifs et de déplacements passifs des *Culicoides*. L'ensemble de ces éléments permet de faire l'hypothèse que la dispersion des *Culicoides* correspond à ce que les écologues appellent la dispersion stratifiée.

Si le rôle des vents et des mouvements d'air locaux a un rôle indéniable dans la dispersion des *Culicoides*, à l'échelle locale, d'autres facteurs jouent également un rôle prépondérant. La distribution des hôtes dans le paysage impacte la dispersion active des *Culicoides* sur de petites distances. La présence d'hôtes conditionne l'accès au repas de sang indispensable pour le développement des œufs et constitue des milieux extrêmement favorables aux *Culicoides* en offrant des gîtes larvaires nécessaires au développement des immatures. Ainsi, la configuration et la composition du paysage (couvert végétal, densité d'hôtes) influencent la dispersion des
*Culicoides* à faible échelle. Les conditions climatiques, comme la température, la vitesse du vent, l'humidité, ou les précipitations, impactent la survie des *Culicoides* et donc par conséquent leurs capacités de dispersion.

Dans un contexte actuel et mondial favorable à la propagation de maladies vectorielles, il est important de comprendre l'impact de la dispersion stratifiée des *Culicoides* sur la structure des populations, ainsi que l'influence des facteurs biotiques et abiotiques.

L'objectif de ce travail de thèse est de déterminer par l'observation de patrons de distributions des fréquences alléliques, comment la dispersion, mais également des événements évolutifs plus anciens, ont pu façonner l'arrangement spatial de la diversité génétique et notamment comment elle est influencée par les paysages et par les caractéristiques des habitats qui peuvent selon le cas favoriser ou limiter les mouvements des *Culicoides*. Le Groupe Obsoletus est un groupe d'espèces difficilement différentiables morphologiquement, notamment pour les femelles. Au sein de ce groupe, le Complexe Obsoletus/Scoticus, tel qu'il se présente actuellement dans la littérature, est confus et nécessite une révision. De plus, les espèces cryptiques sympatriques peuvent présenter des compétences vectorielles différentes et peuvent ainsi biaiser les enquêtes épidémiologiques mais également nos conclusions sur l'étude de la dispersion des *Culicoides*. Il nous donc est apparu nécessaire d'évaluer la diversité intra- et interspécifique au sein de ce complexe.

Le **premier chapitre** de cette thèse est consacré à l'identification et à la description de la diversité cryptique du Complexe Obsoletus/Scoticus à l'échelle européenne. Des analyses de phylogénie moléculaire et de délimitation d'espèces avec une approche multi-marqueurs ont permis d'explorer la diversité génétique au sein du Complexe Obsoletus/Scoticus dans la région ouest paléarctique sur un transect allant de la Scandinavie aux Îles Canaries (du nord au sud) et des Îles Canaries à la Turquie (d'ouest en est). Cette étude a permis de cartographier la diversité d'espèces valides ou cryptiques du complexe, de clarifier les relations phylogénétiques au sein du Complexe Obsoletus/Scoticus et de remettre en question le statut taxonomique de certains clades nouvellement décrits. Nous proposons ici une redéfinition du complexe d'espèce Obsoletus/Scoticus.

La suite de ce travail s'est concentrée exclusivement sur l'espèce *C. obsoletus*.

Le **second chapitre** est dédié à l'identification de flux de gènes entre populations de l'espèce *C. obsoletus* à l'échelle continentale. Il s'intéresse à décrire l'histoire évolutives et à
émettre des hypothèses sur les événements historiques ayant façonné le schéma actuel de
structuration génétique ainsi qu’à caractériser l’influence des phénomènes de dispersion à
longue distance sur la structure génétique des populations. Pour cela, 11 marqueurs
microsatellites nouvellement développés et le gène mitochondrial cox1, ont été utilisés pour
identifier la structure génétique et phylogéographique de *C. obsoletus* à l’échelle européenne.

La dispersion des *Culicoides*, est influencée par la composition et la configuration du
paysage qui va selon ses caractéristiques, favoriser (conductance) ou freiner (résistance) la
dispersion de ces diptères. Le **troisième chapitre** vise à identifier les facteurs
environnementaux qui favorisent ou limitent les flux génétiques de *C. obsoletus* à l'échelle
française en utilisant un cadre méthodologique innovant intégrant des approches spatiales,
statistiques et de génétique des populations. Pour cela, une approche individuelle a été
développée afin de détecter des schémas spatiaux de différenciation génétique et les facteurs
environnementaux qui en sont la cause.

Enfin, l’intégralité des résultats obtenus durant ces travaux de thèse sont synthétisés puis
discutés, en relation avec des questions évolutives et écologiques. Un regard critique sera
apporté sur les résultats et des axes de développements méthodologiques seront proposés. Les
nouveaux éléments de compréhension sur la structuration et les capacités de dispersion des
*Culicoides* paléarctiques seront analysés en relation avec l'évalution du risque épidémiologique
et les stratégies de lutte. Nos résultats fournissent des clés pour le développement de modèles
prédictifs de dispersion des *Culicoides* pouvant faciliter la surveillance et les mesures de
contrôle
Chapitre I : The tree that hides the forest: cryptic diversity and phylogenetic relationships in the Palaearctic vector Obsoletus/Scoticus Complex (Diptera: Ceratopogonidae) at the European level
Une bonne connaissance de la diversité des espèces vectrices est capitale pour la mise en place de méthodes de lutte anti-vectorielle adaptées. Encore faut-il être sûr que nous avons affaire à la bonne espèce et qu'il s'agit bien d'une seule espèce. C'est dans cette optique que prend place ce premier chapitre.

A la suite des épizooties massives du virus de la FCO dans le nord de l'Europe en 2006, puis de la maladie de Schmallenberg en 2011, en l'absence de *C. imicola*, *C. obsoletus* a très rapidement été identifiée comme l'une des espèces vectrices majeures en Europe du nord en raison de son abondance et de sa compétence vectorielle confirmée.

Mais, derrière *C. obsoletus*, se cachent de nombreuses espèces, valides ou nouvellement et sommairement décrites. D'ailleurs, cette profusion décourage de nombreux auteurs comme en témoignent la plupart des études qui se limitent à l'identification des individus au niveau du Groupe Obsoletus et non à l'espèce. Neuf espèces valides composent le Groupe Obsoletus tel que décrit par Mathieu en 2011, et seulement six sont sympatriques en région ouest paléarctique : *C. obsoletus* (Meigen), 1818 ; *C. scoticus* Downes & Kettle, 1952 ; *C. montanus* Shakirzjanova, 1962 ; *C. gornostaevae* Mirzaeva, 1984 ; *C. filicinus* Gornostaeva & Gachegova, 1972 ; et *C. abchazicus* Dzhafarov, 1964. Parmi ce groupe, *C. scoticus* et *C. obsoletus* sont des espèces dites « jumelles », car les femelles sont quasi indifférentiables morphologiquement, hormis pour certains experts du genre. Un complexe d'espèces, nommé Obsoletus, a été défini et inclut *C. obsoletus*, *C. montanus*, *C. abchazicus* et *C. scoticus*. De plus, des études de taxonomie moléculaire ont montré récemment l'existence d'entités cryptiques : *C. obsoletus* clade 'O2', *C. obsoletus* clade 'O3' respectivement en Suède et en Suisse et *C. obsoletus* clade « dark » aux Pays-Bas. Il en résulte, un ensemble d'espèces cryptiques ou jumelles que nous appellerons "Complexe Obsoletus/Scoticus" pour désigner un ensemble regroupant *C. obsoletus*, *C. abchazicus*, *C. scoticus* et *C. montanus* ainsi que toutes les unités taxonomiques opérationnelles décrites récemment dans la littérature (*C. obsoletus* clade O2, *C. obsoletus* clade O3, *C. obsoletus* clade « dark »).

Ce premier chapitre présente une étude de taxonomie moléculaire multi-marqueurs du Complexe Obsoletus/Scoticus qui permet de clarifier l'imbroglio taxonomique actuel. Pour la première fois dans l'étude de ce complexe, le jeu de données inclut des individus issus de 20 pays de la région ouest paléarctique, de la Scandinavie aux îles Canaries (du nord au sud) et des îles Canaries à la Turquie (d'ouest en est). Nous avons utilisé conjointement deux marqueurs mitochondriaux (Cox1 et rDNA 16S) et un marqueur nucléaire (rDNA 28S). Cette approche multi-marqueurs a permis (i) d'identifier le statut spécifique des spécimens collectés et de
sélectionner les individus *C. obsoletus* pour la suite de nos travaux, (ii) de cartographier la diversité du Complexe Obsoletus/Scoticus à l'échelle ouest paléarctique, et (iii) de réviser le schéma taxonomique du Complexe Obsoletus/Scoticus. Nous confirmons le niveau important de diversité cryptique trouvée au sein du Complexe Obsoletus/Scoticus. Les méthodes de délimitation d'espèces nous ont permis de délimiter cinq MOTUs et (i) d'apporter la preuve de la validité taxonomique de *C. obsoletus* clade O2 et *C. obsoletus* clade dark (ii) d'identifier des individus appartenant à une espèce non encore décrite ou non présente dans les bases de données et (iii) de remettre en question le statut taxonomique de *C. montanus*.

Nos travaux apportent pour la première fois une clarification taxonomique à l'échelle
européenne permettant une redéfinition du complexe d'espèces Obsoletus/Scoticus. Cette étude
a permis également de cartographier la diversité des espèces valides ou cryptiques du complexe
et de remettre en question le statut taxonomique de certains clades nouvellement décrits.

Ce chapitre a été accepté et publié dans le journal *Parasites and Vectors* :

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-020-04114-1
RESEARCH

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# The tree that hides the forest: cryptic diversity and phylogenetic relationships in the Palaearctic vector Obsoletus/Scoticus Complex (Diptera: Ceratopogonidae) at the European level

Antoine Mignotte<fnref n="1" />,<fnref n="2" />*, Claire Garros<fnref n="1" />,<fnref n="2" />*, Laetitia Gardès<fnref n="1" />,³, Thomas Balenghien<fnref n="1" />,<fnref n="2" />,⁴, Maxime Duhayon<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Ignace Rakotoarivony<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Laura Tabourin<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Léa Poujol<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Bruno Mathieu⁵, Adolfo Ibañez-Justicia⁶†, Ahmet Deniz⁷†, Aleksandar Cvetkovikj⁸†, Bethan V. Purse⁹†, David W. Ramilo¹⁰†, Despoina Stougiou¹¹†, Doreen Werner¹²†, Dubravka Pudar¹³†, Dušan Petrić¹³†, Eva Veronesi¹⁴†, Frans Jacobs⁶†, Helge Kampen¹⁵†, Isabel Pereira da Fonseca¹⁰†, Javier Lucientes¹⁶†, Javier Navarro¹⁷†, Josue Martinez de la Puente¹⁸,¹⁹†, Jovana Stefanovska⁸†, Kate R. Searle²⁰†, Khalid Khallaayoune⁴†, C. Lorna Culverwell²¹†, Magdalena Larska²²†, Maria Bourquia<fnref n="2" />,⁴†, Maria Goffredo²³†, Marina Bisia¹¹†, Marion England²⁴†, Matthew Robin²⁵†, Michela Quaglia²³†, Miguel Ángel Miranda-Chueca²⁶†, René Bødker²⁷†, Rosa Estrada-Peña¹⁶†, Simon Carpenter²⁴†, Simona Tchakarova²⁸†, Sofia Boutsini¹¹†, Ståle Sviland²⁹†, Stefanie M. Schäfer⁹†, Zanda Ozoliņa³⁰†, Zanda Segliņa³⁰†, Zati Vatansever⁷† and Karine Huber<fnref n="1" />

**Abstract**

**Background:** *Culicoides obsoletus* is an abundant and widely distributed Holarctic biting midge species, involved in the transmission of bluetongue virus (BTV) and Schmallenberg virus (SBV) to wild and domestic ruminants. Females of this vector species are often reported jointly with two morphologically very close species, *C. scoticus* and *C. montanus*, forming the Obsoletus/Scoticus Complex. Recently, cryptic diversity within *C. obsoletus* was reported in geographically distant sites. Clear delineation of species and characterization of genetic variability is mandatory to revise their taxonomic status and assess the vector role of each taxonomic entity. Our objectives were to characterize and map the cryptic diversity within the Obsoletus/Scoticus Complex.

**Methods:** Portion of the *cox1* mitochondrial gene of 3763 individuals belonging to the Obsoletus/Scoticus Complex was sequenced. Populations from 20 countries along a Palaearctic Mediterranean transect covering Scandinavia to

<footnote>*Correspondence: antoine.mignotte@cirad.fr; claire.garros@cirad.fr</footnote>

<footnote>†All of the authors participated equally by providing samples</footnote>

<footnote n="1">¹ ASTRE, Univ Montpellier, Cirad, INRAE, Montpellier, France</footnote>

<footnote n="2">² Cirad, UMR ASTRE, 34398 Montpellier, France</footnote>

<footnote>Full list of author information is available at the end of the article</footnote>
Canary islands (North to South) and Canary islands to Turkey (West to East) were included. Genetic diversity based on *cox1* barcoding was supported by 16S rDNA mitochondrial gene sequences and a gene coding for ribosomal 28S rDNA. Species delimitation using a multi-marker methodology was used to revise the current taxonomic scheme of the Obsoletus/Scoticus Complex.

**Results:** Our analysis showed the existence of three phylogenetic clades (*C. obsoletus* clade O2, *C. obsoletus* clade dark and one not yet named and identified) within *C. obsoletus*. These analyses also revealed two intra-specific clades within *C. scoticus* and raised questions about the taxonomic status of *C. montanus*.

**Conclusions:** To our knowledge, our study provides the first genetic characterization of the Obsoletus/Scoticus Complex on a large geographical scale and allows a revision of the current taxonomic classification for an important group of vector species of livestock viruses in the Palaearctic region.

**Keywords:** *Culicoides* spp., Cryptic species, Phylogeny, Taxonomy, Species delimitation, Palaearctic Region, Biting midge

## Background

In 2006, northern Europe faced massive outbreaks of bluetongue disease (BTV), a *Culicoides*-borne viral infection which affects wild and domestic ruminants. This was followed by the emergence of Schmallenberg virus (SBV) in 2011, another *Culicoides*-borne virus, which also caused important economic losses for farmers of domestic ruminants [1]. Both, the emergence and massive spread of these diseases over the Palaearctic region raised questions about the vector competence of native Palaearctic biting midges members of the genus *Culicoides* [2, 3]. Quickly following these epizootics, studies confirmed *Culicoides* species of the subgenus *Avaritia* as the most likely vector species and particularly those of the Obsoletus group (see below) [3–5]. *Culicoides obsoletus*, *C. scoticus*, *C. dewulfi* and *C. chiopterus* are reported to be implicated in BTV and SBV transmission in Europe based on virus detection or isolation in field-collected populations [6]. Laboratory experimental infections have also confirmed the vector competence of *C. obsoletus* and *C. scoticus*, highlighting species variations in their competence level [7].

The literature defines the Obsoletus Group as a group of species with a similar morphology, especially for the characters commonly used for the identification of these insect vectors, namely wing spot pattern (poorly defined spotted wings and a second radial cell with a light spot) and distinctive male genitalia [8–10]. Adults of species in this Group are known to be abundant, widespread across central and northern Europe, and are characterized by long seasonal occurrence [11, 12]. At present, the group is an artificial taxonomic entity still poorly defined, with no real consensus on the included species, with variable internal groupings and naming. Indeed, the world catalogue of *Culicoides* does not account for levels below subgenus and does not identify species complexes as groups [13]. At present, the Obsoletus Group is composed of nine valid species: *C. obsoletus* (Meigen), 1818; *C. sinanoensis*

Tokunaga, 1937; *C. scoticus* Downes & Kettle, 1952; *C. montanus* Shakirzjanova, 1962; *C. gornostaevae* Mirzaeva, 1984; *C. abchazicus* Dzhafarov, 1964; *C. filicinus* Gornostaeva & Gachegova, 1972; *C. alachua* Jamnback & Wirth, 1963; and *C. sanguisuga* (Coquillet, 1901). The latter two are the only species belonging to this group exclusively present in the Nearctic region, while the others, are sympatric in the Palaearctic region [8]. *Culicoides obsoletus* is considered Holarctic because it is present in both Nearctic and Palaearctic regions [8]. Combined studies of the geometric morphometry of wings, coupled with molecular analysis have excluded *C. chiopterus* and *C. dewulfi* from the Obsoletus Group, despite previously being considered as part of the Group, based only on morphological features [9, 10, 14–16]. Life-cycles and trophic behaviors for most of the species in the Obsoletus Group are not well described or vary greatly. For instance, ecological niches of *C. chiopterus* and *C. obsoletus* are suspected to be different, although these two species are phylogenetically very close within the subgenus *Avaritia*. *Culicoides obsoletus* is a widespread generalist species and occupies a wide range of larval habitats such as forest litter, silage residue, tree holes or manure [17]. *Culicoides obsoletus* shows opportunistic trophic preferences and is able to take blood meals on various hosts species (man, sheep, goat, cow, horse or rodent) and, occasionally, on birds [18]. *Culicoides chiopterus* is a more specialist species, found engorged almost exclusively on cattle blood with larvae associated with cattle dung [19, 20].

In addition to the group, Meiswinkel et al. [21], defined the Obsoletus Complex to close taxa with very similar female adult morphology, including *C. obsoletus*, *C. montanus* and *C. scoticus*. Several authors have recently reported the existence of cryptic diversity within *C. obsoletus*, namely the *C. obsoletus* clade ‘O2’ and *C. obsoletus* clade ‘O3’ in Sweden and Switzerland [15], and the *C. obsoletus* clade ‘dark’ in the Netherlands [21, 22]. We will use the term “Obsoletus/Scoticus Complex” here to refer
to the cryptic species *C. obsoletus*, *C. scoticus* and *C. montanus* as well as all previously described operational taxonomic units in the literature (see above). The terminology "Obsoletus/Scoticus Complex" is written according to the rules defined by Harbach [23] for infrasubgeneric categories within the genus *Anopheles*. Considering that sympatric cryptic species may exhibit different vector competence and may confound epidemiological investigations, it is mandatory to assess the intra- and interspecific diversity within the Obsoletus/Scoticus Complex.

Given the difficulty of separating these species based on morphological identification, various molecular markers have been used to overcome specific identification problems, including 16S ribosomal DNA [24, 25], 28S ribosomal DNA [26], cytochrome oxidase *b* (*cytb*), the internal transcribed spacer region 1 (ITS1) [27] and ITS2 rDNA [28]. However, the DNA region primarily used to infer phylogenetic relationships in this complex has been the mitochondrial cytochrome *c* oxidase subunit 1 (*cox1*) [29]. Most of the diversity within the Obsoletus/Scoticus Complex has been identified using *cox1* [29–33]. Despite the diversity of markers used to characterize the phylogeny of the complex, few studies have used a multi-marker approach [34]. This study, therefore, will integrate a multi-marker approach in order to strengthen genetic reconstruction of the Obsoletus/Scoticus Complex.

The Obsoletus/Scoticus Complex, as currently presented in the literature, is confused and needs taxonomic revision. We characterized and mapped the genetic diversity of the Obsoletus/Scoticus Complex along a Palaearctic-Mediterranean transect covering Scandinavia to Canary islands (North to South) and Canary islands to Turkey (West to East). Our main objectives were to identify and describe the cryptic diversity observed within the Obsoletus/Scoticus Complex over a wide geographical area using molecular analyses and to question the taxonomic status of some newly described clades. In order to achieve these objectives, we conducted a molecular analysis which combined multi-marker sequencing, phylogenetic analyses and species delimitation to explore the genetic diversity of the Obsoletus/Scoticus Complex in the western European portion of the Palaearctic region.

## Methods

### Culicoides capture and morphological identification

Biting midges were collected at 68 sites located in 20 countries in the western European portion of the Palaearctic region, between 2009 and 2017, using national surveillance networks for *Culicoides* populations or local collections (Additional file 1: Table S1). Collections were made overnight with Onderstepoort Veterinary Institute (OVI) light traps set at farms near horses, cattle or sheep and all insects were stored in 70% ethanol. Morphological

identification to the species level of adult *Culicoides* spp. was performed under a binocular microscope using the available identification keys [35, 36].

### DNA extraction, amplification and sequencing

DNA was extracted from a total of 3883 adult females belonging to the Obsoletus/Scoticus Complex using the NucleoSpin® DNA kit RapidLyse (Macherey-Nagel, Duren, Germany), following the manufacturer's instructions. An additional step was added, before extraction, for all individuals (specimens were ground in 50 µl of 1× PBS buffer). DNA samples are available upon request. Fragments of *cox1* were amplified for the 3883 individuals. After sequence cleaning, 3763 sequences of *cox1* were obtained [dataset *cox1* (1)]. Fragments of 16S and 28S rDNA were amplified on individuals chosen to be representative of the entire species diversity resulting from *cox1* [dataset *cox1* (2)] to reinforce mitochondrial gene sequences. All primer sequences as well as the information relating to them are present in Additional file 2: Table S2. PCR's were performed in a 25 µl reaction volume. The PCR mix contained 1× Qiagen buffer, 1 mM MgCl₂, 0.25 mM of each dNTP, 0.2 µM of each primer, 1.25 U Qiagen Taq Polymerase and 0.7 ng/µl genomic DNA for all genes. PCR programs included one-step of 5 cycles before a second step with 35 cycles for 16S rDNA and 28S rDNA. PCR amplification conditions were: an initial denaturation step at 94 °C for 5 min followed by 5 cycles of 94 °C for 30 s; 45 °C for *cox1*, 42 °C for 16S rDNA or 55 °C for 28S rDNA for 40 s; 72 °C for 1 min; 35 cycles of 94 °C for 30 s; 51 °C for *cox1*, 55 °C for 16S rDNA or 50 °C for 28S rDNA for 30 s; 72 °C for 1 min; and a final extension step at 72 °C for 10 min. For each amplification reaction, negative controls were carried out. The PCR products were visualized on 1.5% agarose gels with a GelRed® Nucleic Acid Gel Stain, staining after migration of 90 min at 130 V by electrophoresis for quality control. After purifications, carried out by the sequencing service provider, the remaining 20 µl were sequenced with the same forward primers used for PCR (https://www.genewiz.com).

### Sequence analyses

The reference sequences of *cox1* used to identify individuals to species are available in Additional file 3: Table S3. A total of 3763 *cox1* sequences (Additional file 4: Table S4) from female adults morphologically identified as belonging to the Obsoletus/Scoticus Complex were obtained after deletion of short and poor-quality sequences. The *cox1* alignment was used to identify all *Culicoides* to species- or clade-level
within the complex using the reference sequences. Among the reference sequences used to specifically assign our *Culicoides* samples, some sequences previously identified as *C. obsoletus* O1 and O3 [15] were included in our analysis in order to cover the diversity of the clades described in the literature within the Obsoletus/Scoticus Complex. After comparison with other sequences, it appears that the sequences named *C. obsoletus* O1 were actually *C. obsoletus* and that *C. obsoletus* O3 belongs to *C. obsoletus* clade dark. For this purpose, *cox1* sequences were aligned with reference sequences [dataset *cox1* (1)]. A phylogenetic tree based on maximum likelihood method allowed designation of a species name to each sequence if the latter belonged to a monophyletic clade with strong support (bootstrap < 900) that included a reference sequence. Thus, *Culicoides* were sequenced for markers 16S rDNA and 28S rDNA to support the phylogenetic reconstruction of the complex. All *cox1* [dataset *cox1* (2)], 16S rDNA and 28S rDNA sequences were independently aligned with the MUSCLE [37] algorithm available in the software GENEIOUS v.6.0.5 (Biomatters, http://www.geneious.com). Genetic diversity indices, haplotype and nucleotide diversity were evaluated using DNASP v.5.10 [38]. Alignments with gaps were cleaned using the software GBLOCKS 0.91b [39]. To assess genetic distance between clades and species within, barcoding gap bar chart using R software was performed with *ggplot2* [40] and *ggthemes* packages. Intra- and interspecific genetic differences based on the Kimura 2-Parameter (K2P) distance model [41, 42] were calculated with MEGAX [43]. In order to map the specific diversity of the Obsoletus Group, the R software version 3.6.0 was used with the *Leaflet* version 2.0.2 and *shiny* packages version 1.4.0.

## Phylogenetic inferences

Phylogenetic trees were constructed for the three markers using maximum-likelihood (ML) and Bayesian inference (BI). Bayesian inference analyses were conducted on MRBAYES version 3.2.6, with tree sampling every 1000 generations in order to calculate posterior probabilities (PP) and 10 million generations. Optimal sequence evolutionary models for each analysis were obtained with Bayesian information criterion (BIC) using JMODEL-TEST. Maximum-likelihood analyses were conducted on PHYML 3.0. The ML analyses were conducted with the best model selected using 1000 bootstrap replicates for each dataset to investigate the level of support at each node, with starting tree determined by BioNJ analysis. After independent analysis of each gene, alignment of *cox1* and 16S rDNA were concatenated, and analyzed following ML and BI methods.

## Species delimitation methods

Two species delimitation methods were applied. The first method was a Bayesian implementation of classical GMYC method, Bayesian General Mixed Yule Coalescent (bGMYC) [44]. The single-locus ultrametric gene trees used for bGMYC methods were created with BEAST 1.8.0 [45] under a strict clock model, a Yule Process Tree Model of speciation, and a random starting tree. This analysis was carried out with default prior distribution, without outgroups and with 10 million generations sampled every 1000 cycles with HKY + G substitution model for 16S rDNA, and with HKY + I for 28S rDNA [46]. The software TREEANNOTATOR v1.8.2 was used to find Ultrametric maximum clade credibility (MCC). Single-threshold GMYC analyses were conducted with *splits* package in R.

The second species delimitation method used was the Bayesian Poisson Tree Processes (bPTP) through the web server PTP (http://species.h-its.org/ptp/) [47] with 100,000 MCMC generations and a thinning parameter of 100 on a maximum likelihood phylogenetic tree constructed with *cox1* and 16S rDNA genes concatenated with *C. dewulfi* as outgroup.

## Results

### Molecular analysis

In total, 3763 sequences were obtained for *cox1*, 95 for 16S rDNA and 95 for 28S rDNA (Table 1). All sequences were deposited in GenBank (Additional file 4: Table S4). No stop codons, insertions or deletions were found in any of the *cox1* sequences, indicating functional mitochondrial products.

Within the selected samples present in our data set, the most abundant species was *C. obsoletus*, with 2416 individuals sampled, representing 68% of all *Culicoides* caught (Fig. 1). Species diversity within the complex varied according to the latitudes of the sampling sites (Fig. 1). The most sampled species in northern Europe (Norway and Finland) was the *C. obsoletus* clade O2 with 62% (162 individuals) and 58% (147 individuals) of this clade, respectively, in each country. For eastern Europe (Latvia, Poland, Serbia, Bulgaria, Macedonia, Greece and Turkey) the most sampled species was *C. obsoletus*, representing, for example, 99% (162 individuals) of all *Culicoides* sampled in Greece. However, a population in Poland (Wronka) appears to be an exception with 100% (35 individuals) of *C. obsoletus* clade O2. Three individuals, belonging to a phylogenetic clade unidentified by our reference sequences close to *C. obsoletus* dark, were reported from Latvia. The latter sequences are identical to sequences present in the BOLD database (accession numbers: GMGRC1056-13, GMGRC1000-13, GMGRD2587-13) of *Culicoides* collected in Bavaria,
<table><caption>**Table 1** Sequence statistics for four gene fragments used to reconstruct the phylogeny of the Obsoletus/Scoticus complex</caption><thead><tr><th>Dataset</th><th>n</th><th>Length (bp)</th><th>S</th><th>C+G (%)</th><th>h</th><th>Hd (SD)</th><th>π (SD)</th><th>Nucleotide model (under BIC)</th><th>Implemented model (BI)</th></tr></thead><tbody><tr><td>cox1 (1)</td><td>3763</td><td>512–627</td><td>141</td><td>34.5</td><td>228</td><td>0.890 (0.003)</td><td>0.06299 (0.00473)</td><td>TPM2uf+I+G</td><td>nst = 6; rates = invgamma</td></tr><tr><td>cox1 (2)</td><td>95</td><td>528–623</td><td>146</td><td>33.7</td><td>77</td><td>0.994 (0.003)</td><td>0.0921 (0.00489)</td><td>HKY+G</td><td>nst = 2; rates = gamma</td></tr><tr><td>16S rDNA</td><td>95</td><td>263</td><td>51</td><td>15.8</td><td>13</td><td>0.851 (0.02)</td><td>0.04791 (0.00446)</td><td>HKY+I</td><td>nst = 2; rates = propinv</td></tr><tr><td>28S rDNA</td><td>95</td><td>576</td><td>25</td><td>39.8</td><td>24</td><td>0.911 (0.015)</td><td>0.00753 (0.00099)</td><td>TPM2uf+I+G</td><td>nst = 6; rates = invgamma</td></tr><tr><td>Concatenated genes</td><td>95</td><td>731</td><td>197</td><td>32.8</td><td>90</td><td>0.998 (0.002)</td><td>0.04594 (0.00297)</td><td>TPM2uf+I+G</td><td>nst = 6; rates = invgamma</td></tr></tbody></table>

Abbreviations: n, number of individuals; h, number of haplotypes; Hd, haplotype (gene) diversity; π, nucleotide diversity; S, number of polymorphic sites; SD, standard deviation; bp, base pairs; BIC, Bayesian information criterion; BI, Bayesian inference

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>**Fig. 1** Map of biting midges sampling sites represented by the number of individuals per clade within the Obsoletus/Scoticus Complex. The different clades identified are shown in different colours. The size of circles on Europe map correspond to the number of individuals per clade within the cryptic species. The numbered maps on the right correspond to magnifications of some study areas. The sites of sampling too close and thus the pie charts this superimposed are to be taken into account in the numbered magnifications and not on the main map. Magnifications: a Scotland sample sites; b, c Denmark sample sites; d Balkans sample sites; e, f Morroco sample sites</figcaption></figure>
Germany. Finally, western and central Europe (Portugal, Spain, UK, France, Italy, Netherlands, Germany, Switzerland and Denmark) had the higher species diversity of all the species found in the Palaearctic transect. The most sampled species within this area was *C. obsoletus* with 913 individuals, representing 64% of the *Culicoides* sampled. However, unlike in eastern Europe, *C. scoticus* clade 1 was also found in significant numbers with 386 individuals, or 27% of the samples. *Culicoides obsoletus* clade dark was rarely reported in Europe with only 26 individuals found in France, Denmark, Finland, Italy, Latvia, Norway and Switzerland. *Culicoides montanus* was found in relatively high proportion in Morocco with 54% (80 individuals) of samples, whereas it was much rarer and more sporadic in European countries.

A total of 228 different *cox1* haplotypes were identified. Haplotype diversity varied from 0.829 for *C. obsoletus* clade O2 to 0.517 for *C. scoticus* clade 1 and *C. obsoletus* clade dark (Table 2). In accordance with mitochondrial genes in insects [48], the GC composition ranged from 16% for 16S rDNA alignment to 39.8% for 28S rDNA, with a strong AT bias (Table 2). *Culicoides obsoletus* showed very high intraspecific diversity with 94 different haplotypes, representing nearly 43% of the total haplotypic diversity encountered in this study. The maximum interspecific genetic distance (Fig. 2) was reached between *C. dewulfi* and other taxonomic units, with a minimum of 17% of genetic distance between this outgroup and all other members inside the complex. *Culicoides dewulfi* is used here as an outgroup. Genetic distances of the same level as the other intraspecific distances were observed between *C. scoticus* clade 1 and *C. scoticus* clade 2, and between *C. obsoletus* and *C. montanus*, with a maximum of 2% and 4%, respectively. Similar interspecific genetic distances, were observed between all the other clades within the complex, with a minimum of 8% distance. All species had mean intraspecific distances of less than 1%, other than *C. scoticus* clade 2.

Among the 228 unique *cox1* haplotypes, 95 were selected to represent the specific diversity of the complex. Using the same individuals, two alignments of 95 sequences of 16S rDNA (Additional file 5: Figure S1.) and 28S rDNA were constructed. In order to compare tree topology and to concatenate markers, a second *cox1* alignment of the 95 sequences was performed (Additional file 6: Figure S2.). The *cox1* dataset had a greater haplotype diversity than 16S rDNA and 28S rDNA datasets, with 0.994 vs 0.851 and 0.911 respectively. 28S rDNA was more monomorphic than *cox1* and 16S rDNA, with 25, 146 and 51 polymorphic sites, respectively.

## Phylogenetic analysis

Information on the alignments used for the construction of phylogenetic trees is provided in Table 1. Species with confirmed taxonomic validity (*C. montanus*, *C. obsoletus* and *C. scoticus*) and cryptic taxa (*C. obsoletus* clade O2, *C. obsoletus* clade dark) highlighted by previous studies were strongly supported (bootstrap > 90%) (Fig. 3). *Culicoides obsoletus* clade O2 constituted a monophyletic clade with strong support (bootstrap > 90%). *Culicoides obsoletus* and *C. montanus* formed a monophyletic clade. *Culicoides scoticus*, another species considered valid, showed two phylogenetic clades, i.e. *C. scoticus* clade 1 and *C. scoticus* clade 2. A monophyletic clade close to *C. obsoletus* clade dark, was strongly supported by bootstrap values. Topologies of phylogenetics trees constructed via maximum likelihood (Fig. 3a) and Bayesian inference (BI) analyses (Fig. 3b) were congruent for alignment of full haplotype diversity.

## Species delimitation

Using the *cox1* dataset and bGMYC method for species delimitation (Fig. 4), 6 molecular operational taxonomic units (MOTUs) were observed: *C. montanus*, *C. obsoletus*, *C. scoticus*, *C. obsoletus* clade O2, *C. obsoletus* clade dark and *Culicoides* sp. within the Obsoletus/Scoticus Complex. Based on the 16S rDNA

<table><caption>**Table 2** Genetic diversity indices for mitochondrial *cox1* gene segment of *Culicoides* spp. in the Obsoletus/Scoticus Complex</caption><thead><tr><th>Species</th><th>n</th><th>h</th><th>Hd (SD)</th><th>π (SD)</th><th>S</th><th>C+G (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td><i>C. montanus</i></td><td>106</td><td>13</td><td>0.642 (0.039)</td><td>0.00726 (0.00317)</td><td>66</td><td>0.334</td></tr><tr><td><i>C. obsoletus</i></td><td>2416</td><td>106</td><td>0.773 (0.005)</td><td>0.00450 (nd)</td><td>72</td><td>0.324</td></tr><tr><td><i>C. obsoletus</i> clade O2</td><td>512</td><td>38</td><td>0.829 (0.012)</td><td>0.00447 (nd)</td><td>53</td><td>0.310</td></tr><tr><td><i>C. obsoletus</i> clade dark</td><td>26</td><td>6</td><td>0.517 (0.113)</td><td>0.00191 (0.00058)</td><td>7</td><td>0.315</td></tr><tr><td><i>Culicoides</i> sp.</td><td>3</td><td>2</td><td>0.667 (0.314)</td><td>0.00749 (0.00353)</td><td>6</td><td>0.331</td></tr><tr><td><i>C. scoticus</i> clade 1</td><td>645</td><td>61</td><td>0.562 (0.023)</td><td>0.00463 (nd)</td><td>93</td><td>0.347</td></tr><tr><td><i>C. scoticus</i> clade 2</td><td>55</td><td>12</td><td>0.753 (0.046)</td><td>0.00499 (0.00093)</td><td>16</td><td>0.328</td></tr></tbody></table>

Abbreviations: n, number of individuals; h, number of haplotypes; Hd, haplotype (gene) diversity; π, nucleotide diversity; nd, not determined; S, number of polymorphic sites; SD, standard deviation
<figure><img src="image_27.png" /></figure>

dataset analysed with the same delimitation method, three MOTUs were characterised including (i) two clades within *C. scoticus*; (ii) *Culicoides* sp., *C. obsoletus* clade dark and *C. obsoletus* clade O2; and (iii) *C. obsoletus* and *C. montanus*. Species delimitation with the 28S rDNA and 16S rDNA dataset had a lower resolution compared to *cox1*. The 28S rDNA and 16S rDNA datasets were invaluable in identifying cryptic diversity within the Obsoletus/Scoticus Complex. Indeed, the tree generated with the 28S rDNA dataset showed very low polymorphisms and resolution signal (Additional

file 7: Figure S3.). The bPTP method was conducted on concatenated dataset of *cox1* and *16S* rDNA genes. The best statistical support for species delimitation was for concatenated dataset with bPTP. MOTUs found with the concatenated alignment and *cox1* were the same, except for the delimitation of *C. montanus* and *C. obsoletus*. Indeed, using molecular delineation based on bPTP analysis, MOTUs were observed for *C. scoticus*, *C. obsoletus* clade O2, *C. obsoletus* clade dark, and *Culicoides* sp. Using the bPTP method we were not able to distinguish *C. obsoletus* and *C. montanus* as well as
<figure><img src="image_28.png" /></figure>

*C. scoticus* clades 1 and 2, which were not classified as separate species by either method.

Discussion

Our study investigated the genetic diversity of the Obso-
letus/Scoticus Complex at the European level (68 sam-
pling sites across 20 Palaearctic countries with 3763 cox1
sequences). For the first time, the sample selection covers
the whole known western Palaearctic distribution area of
these species. The complementary use of the mitochon-
drial 16S rDNA and nuclear 28S rDNA genes confirms
the important level of cryptic diversity found within the
Obsoletus/Scoticus Complex. Indeed species delimita-
tion methods allowed us to delineate five MOTUs and: (i)
to provide evidence of the taxonomic validity of C. obso-
letus clade O2 and C. obsoletus clade dark (ii) to identify
individuals belonging to a species not yet described or
not present into the databases; and (iii) to question the
taxonomic status of C. montanus.

Species assignment at the European scale showed
variation in the distribution of the cryptic diversity of

Obsoletus/Scoticus Complex. This result confirmed
a previous study by Möhlmann et al. [49], who found a
strong latitudinal effect on the relative abundance of spe-
cies of the Obsoletus/Scoticus Complex. However, the
previous study was carried out with few individuals from
a relatively small number of countries and sampling sites
[49]. This contrasts with our study, the first to be con-
ducted at a European scale with a large data set sufficient
to provide a more precise idea of the cryptic diversity
within the Obsoletus/Scoticus Complex. The latitudinal
variation in the relative abundance of the different cryptic
species in the Obsoletus/Scoticus Complex, could be due
to a wide range of factors like different ecological niches,
or differences in the availability of hosts and breeding
sites [50]. For example, a study conducted in Italy showed
that *C. scoticus* collection sites were dominated by areas
of natural vegetation or forest, at medium altitudes, pref-
erably in wilder and more pristine environments [51].
However, the heterogeneity of *Culicoides* collection dates
may also explain these variations in specific diversity
within the complex. For instance, a study conducted in
<figure><img src="image_29.png" /></figure>

Sweden, found a seasonal variation in *Culicoides* community structure [52]. The omnipresence of *C. obsoletus* makes it the dominant species in Europe, confirming its status as a generalist species, which tolerates a wide range of eco-climatic conditions. The dominant species also varies according to geographical location. For example, *C. obsoletus* clade O2 is the most sampled species in Nordic countries while *C. montanus* prevails in Morocco. France, Italy and Spain appear to have the highest specific diversity of *Culicoides* belonging to the Obsoletus/Scoticus Complex. These three countries bring together all the cryptic diversity known so far, except the new, unidentified, *Culicoides* taxon that has only been found in Latvia regarding our dataset. This could be due to the significant

diversity of ecological niches as well as the high density of hosts in these countries and this species diversity variation is in line with general patterns of latitudinal increase in species richness [53].

Our phylogenetic analysis allowed us to define seven well supported phylogenetic clades. Some of them correspond to species with taxonomic validity (*C. montanus*, *C. obsoletus* and *C. scoticus*), some more recently described phylogenetic clades (*C. obsoletus* clade dark and *C. obsoletus* clade O2) [52, 54] and some clades never described before (*Culicoides* sp. and *C. scoticus* clade 2).

Without taking into account *C. scoticus*, the phylogenetic reconstruction produced herein, confirmed the presence of two divergent groups; one consisting of
C. obsoletus and C. montanus and the other of C. obso-
letus clade dark, C. obsoletus clade O2 and a clade not
yet described in the literature. We were unable to iden-
tify these sequences due to the absence of reference
sequences identified at the species level in the sequence
databases. However, three sequences, from specimens
collected in Bavaria in Germany, present in the BOLD
database are identical. Further sampling and sequencing
of Culicoides from eastern Europe are necessary in order
to associate morphological features with this new cryptic
species. The large number of Culicoides processed dur-
ing this study made it difficult to use non-destructive
DNA extraction techniques. Non-destructive techniques
would be necessary to couple morphological criteria with
genetic analysis, in order to identify this species.

We also described a second clade phylogenetically very
close to C. scoticus, C. scoticus clade 2 [55]. However,
given the small genetic distance observed between these
two clades, they can be considered as intraspecific varia-
tion within C. scoticus.

According to this study, *C. obsoletus* clade dark appears
as a true cryptic species, with high phylogenetic support.
Meiswinkel et al. [21] hypothesized that *C. obsoletus*
clade dark could be *C. gornostaevae* Mirzaeva, 1984, but
*C. gornostaevae* was significantly larger and had a distri-
bution restricted to the boreal zone of Siberia. However,
this species has been recently reported from Norway,
Poland and Sweden [56] but the lack of *C. gornostaevae*
reference sequences in publicly available databases pre-
vented comparisons with *C. obsoletus* clade dark.

*Culicoides obsoletus* clade O2 was also strongly sup-
ported by phylogenetic and species delimitation analy-
sis, and thus could be considered a cryptic species within
the Obsoletus/Scoticus Complex. However, our sample
showed a high abundance of *C. obsoletus* clade O2 mainly
at high latitudes, whereas it had initially been identified
for the first time further south in the Swiss Alps [54, 56,
57] and France.

Little is known about the ecology of *C. montanus*.
We found this species over a large geographical area,
from Morocco to a few individuals in Norway. In spite
of this, we have identified only a very small number
of *C. montanus* except in Morocco where this species
constitutes the majority. This latter result is in accord-
ance with the fact that sites in Italy, where *C. monta-
nus* is predominant are characterised by a high land
surface temperature, higher than the values registered
in the *C. obsoletus* and *C. scoticus* sites [51]. *Culicoides*
*obsoletus* and *C. scoticus* are considered to be sibling
species because of diagnostic female morphological
characters, which are difficult to observe or overlap
[16], as opposed to the morphological identification
of males which is simpler [58]. If the genetic analyses

by Pages & Sarto [58] confirm that both *C. obsoletus* and *C. scoticus* are distinct species, the question remains open for *C. montanus*. Previous phylogenetic studies based on *cox1* indeed showed limited genetic distance between *C. obsoletus* and *C. montanus* and in studies based on ITS sequences *C. montanus* always appears in one of the subclades of *C. obsoletus* [59]. In our multi-marker phylogenetic tree, *C. montanus* and *C. obsoletus* formed a monophyletic clade. In addition, the genetic distance between *C. obsoletus* and *C. montanus* was of the same order of magnitude as some intraspecific distances.

The number of putative species defined within the
Obsoletus/Scoticus Complex varied depending on the
molecular markers and species delimitation methods
used (Fig. 4), particularly pertaining to the status of
C. obsoletus and C. montanus. Unlike the other meth-
ods, the bGMYc method, based on cox1, distinguished
these two species. This can be explained by the fact that
some parameters of the analysis (i.e. priors), like differ-
ences in population size or speciation rates, can bias the
GMYC method by overestimating the number of spe-
cies [46, 60–62]. Insufficient sampling, high gene flow
or a recent speciation event are also likely explanations
for the differences in results between phylogenetic trees
and species delimitation results [63, 64]. Although sub-
ject to the same constraints, it has been shown that the
bPTP method is significantly more robust [65]. Moreo-
ver, methods based on multiple loci improve discovery,
resolution and stability of species delimitation [66, 67].
Furthermore, studies have shown that species delinea-
tion in insects is more appropriate with multilocus spe-
cies delimitation methods [68–71]. These arguments
allowed us to validate the species delimitation scheme
produced with the bPTP method. This analysis cou-
pled with the low level of genetic distances observed
between C. montanus and C. obsoletus led us to ques-
tion the taxonomic status of C. montanus. This could
be the beginning of a speciation process of C. montanus
within the clade of C. obsoletus. Hovewer, C. montanus
was originally described from Kazakhstan and present
in central Asia [57]. Therefore, examination of individu-
als sampled in this geographical area could strengthen
our conclusions.

In the light of our conclusions, in-depth morphologi-
cal analyses with the deposition of reference individuals
will have to be carried out in order to decide whether or
not to definitively rule out the taxonomic status of the
cryptic species making up this complex. Indeed, although
adult females are not morphologically distinguishable on
a routine basis, males are easier to identify using their
genitalia and pupal differences and can provide evidence
of morphological differences between the species.