# Caractérisation de l'évolution des teneurs en mycotoxines dans le blé, du champ au pain

Maria Paula Arias Benavides

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Maria Paula Arias Benavides. Caractérisation de l'évolution des teneurs en mycotoxines dans le blé, du champ au pain. Sciences du Vivant [q-bio]. 2021. hal-04804561

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Département de biotechnologies

Master 2ème année de BIOTECHNOLOGIES

Sciences pour l'ingénieur

Parcours génie biotechnologique et management des agro-industries (GBMAI)

ARIAS BENAVIDES Maria Paula

# Caractérisation de l'évolution des teneurs en mycotoxines dans le blé, du champ au pain.

L'institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement (INRAE)

Maitre de stage : Jean-Michel Savoie

Enseignant référent :

Stage du 11 janvier 2021 au 25 juin 2021

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Table des matières

<table><tr><td>1. Introduction</td><td>1</td></tr><tr><td>1.1. Organisme d'accueil</td><td>1</td></tr><tr><td>1.2. Contexte</td><td>1</td></tr><tr><td>1.2.1. Mycotoxines</td><td>2</td></tr><tr><td>1.2.2. Facteurs affectant les contaminations</td><td>4</td></tr><tr><td>1.2.3. Production en circuit court</td><td>4</td></tr><tr><td>1.3. Le projet de recherche Myco3C</td><td>5</td></tr><tr><td>1.3.1. Objectif du stage</td><td>6</td></tr><tr><td>2. Matériels et méthodes</td><td>7</td></tr><tr><td>2.1. Matériel biologique</td><td>7</td></tr><tr><td>2.1.1. Blé</td><td>7</td></tr><tr><td>2.1.2. Levains et levure</td><td>8</td></tr><tr><td>2.1.3. Huile essentielle</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2. Dispositifs expérimentaux</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2.1. Effet des processus de mouture et panification sur l'évolution des teneurs en mycotoxines</td><td>8</td></tr><tr><td>2.2.2. Effet de conditions contrôlées d'humidité et de température sur le développement des mycotoxines et des champignons dans les grains de blé pendant le stockage</td><td>10</td></tr><tr><td>2.2.3. Effets protecteurs d'une huile essentielle sur les grains de blé pendant le stockage</td><td>10</td></tr><tr><td>2.3. Analyses</td><td>11</td></tr><tr><td>2.3.1. Mesure de l'activité de l'eau (aw) et de la teneur en eau des grains</td><td>11</td></tr><tr><td>2.3.2. Extraction et amplification d'ADN</td><td>11</td></tr><tr><td>2.3.3. Extraction et dosage des mycotoxines</td><td>12</td></tr><tr><td>2.3.4. Dénombrement microbien et culture monospore</td><td>12</td></tr><tr><td>3. Résultats et discussion</td><td>13</td></tr><tr><td>3.2. Effet de différentes conditions de stockage sur le processus de panification</td><td>13</td></tr><tr><td>3.3. Effet de conditions contrôlées d'humidité et de température sur le développement des mycotoxines et des champignons dans les grains de blé</td><td>17</td></tr><tr><td>3.4. Effets protecteurs d'une huile essentielle sur les grains de blé pendant le stockage</td><td>21</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>22</td></tr><tr><td>4. Perspectives</td><td>23</td></tr></table>
# 1. Introduction

## 1.1. Organisme d'accueil

Le stage se déroule au sein de INRAE, centre de recherche public crée le 1er janvier 2020, issue de la fusion entre l'INRA (existant de 1946 à 2019) et l'IRSTEA. INRAE est le premier institut de recherche agronomique en Europe et le deuxième dans le monde. Il soutient l'innovation économique et sociale dans les domaines de l'alimentation, de l'agriculture et de l'environnement, et rassemble une communauté de 12000 personnes, avec un peu plus de 200 unités de recherche et une quarantaine d'unités expérimentales implantées dans 18 centres sur toute la France. Il est sous la supervision conjointe des ministères en charge de la Recherche, l'Enseignement supérieur, la Recherche et l'Innovation (MESRI) et celui en charge de l'Agriculture et de l'Alimentation (MAA).

Le centre Nouvelle-Aquitaine Bordeaux conduit des recherches innovantes en sciences du végétal, écologie et environnement, sciences humaines et sociales, neurosciences et nutrition, et compte avec 1100 agents titulaires et 100 doctorantes ; 21 unités de recherche, dont 9 mixtes et 6 unités expérimentales reparties sur une dizaine d'implantations géographiques.

L'UR1264 MycSA (Mycologie et Sécurité des Aliments) est l'une de ces unités de recherche, et est rattaché aux départements Santé des Plantes et Environnement (SPE) et Microbiologie de la Chaîne Alimentaire (MICA). Son objectif finalisé est de contribuer à proposer des solutions pratiques pour diminuer la contamination des céréales par les mycotoxines, ainsi que ses conséquences sur la santé animale et humaine, et sur les pertes économiques pour les producteurs.

## 1.2. Contexte

La production agricole a fortement augmentée depuis le XXème siècle pour faire face à la croissance démographique (Carvalho 2017). Au cours de la seconde moitié du siècle dernier, la population mondiale a augmenté de 90 %, alors que notre approvisionnement alimentaire a augmenté de 115 %, ce qui représente une augmentation de l'approvisionnement alimentaire de 25 % par personne (Dixon 2007). Le blé fait partie de ce dernier, puisqu'il représente actuellement plus d'un quart de l'apport calorique dans les pays en développement. Sa production est largement répartie dans le monde et sa surface de plantation est très importante.
Cette dernière année seulement, la production mondiale de blé a augmenté d'environ 7,5 millions de tonnes (FAO 2014). Le blé est non seulement une source vitale d'aliments riches en nutriments et la plus importante source de céréales alimentaires pour l'homme (FAO 2014), mais aussi une importante matière première industrielle.

Cependant, comme pour d'autres cultures, en raison de l'influence de différents facteurs environnementaux et des caractéristiques du sol, plusieurs problèmes de biosécurité peuvent affecter la production de blé. Les mycotoxines, qui sont des métabolites secondaires produits naturellement par certains champignons et qui peuvent avoir un certain nombre d'effets néfastes sur la santé, constituent l'un des principaux problèmes de qualité du blé. D'un point de vue économique, ces mycotoxines affectent gravement le rendement du blé, entraînant une réduction du revenu des agriculteurs et une perte financière importante pour la société.

Cette problématique est particulièrement présente dans la production de l'agriculture biologique et est encore plus accentuée dans la production en circuit court, car c'est la production la moins contrôlée, en raison du coût de ces contrôles, ou tout simplement du manque d'information concernant ce problème. Il est donc dans l'intérêt des agriculteurs de recueillir des informations fiables et de mettre en œuvre des pratiques qui minimisent les risques de contamination.

### 1.2.1. Mycotoxines

Les champignons filamenteux présentent un potentiel remarquable de production de métabolites secondaires. Certains de ces métabolites se révèlent toxiques pour l'Homme : les mycotoxines. Ces mycotoxines sont les contaminants naturels les plus fréquemment retrouvés dans l'alimentation, et sont produites principalement par des champignons du genre *Aspergillus*, *Fusarium* et *Penicillium*. Elles ont tendance à se développer à des moments spécifiques de la production de plusieurs matières premières. Le genre *Fusarium* a tendance à se développer sur le champ, et les genres *Aspergillus* et *Penicillium* se développent généralement lors du stockage.

Ces toxines sont généralement résistantes aux différents procédés de fabrication et de transformation des aliments, y compris la cuisson. Elles ont des modes d'action différents et de nombreux effets sur la santé. Des réglementations, basées sur leur occurrence et/ou leur toxicité chez l'Homme et l'animal, ont été établies pour l'aflatoxine B1, le déoxynivalénol (DON), la fumonisine B1, l'ochratoxine, la patuline, la zéaralénone et les alcaloïdes de l'ergot (Payros et al. 2021). En plus de celles-ci, il existe des mycotoxines émergentes, qui sont régulièrement
présentes et surveillées par l'EFSA (European Food Safety Agency) pour évaluation des
risques, mais qui ne font pas encore l'objet de recommandations ou réglementations.

Outre ces toxines réglementées et surveillées, les formes modifiées ou masquées représentent
aussi un défi. Le caractère masqué de ces mycotoxines, est dû au fait que ces formes ne sont
pas facilement extraites par les méthodes classiques ou ne sont plus détectées par les analyses
pour les formes modifiées qui forment des liaisons chimiques avec d'autres composés comme
des sucres. Ceci minimise les teneurs mesurées par rapport aux teneurs réelles en mycotoxines
dans les aliments. Malgré leur plus faible toxicité par rapport aux mycotoxines "natives"
correspondantes, les formes "modifiées" restent biologiquement actives puisqu'elles peuvent
être libérées durant la digestion ou certains procédés de transformation des aliments (Atanasova-
Penichon 2017).

Dans le cas des céréales à paille (blé, orge, seigle, avoine, riz) et du maïs, on distingue les
mycotoxines du champ, produites pendant la culture par des champignons du genre *Fusarium*
et les mycotoxines de stockage produites par des espèces d'*Aspergillus* et de *Penicillium*. En
France, les trichothécènes, dont le déoxynivalénol (DON) et ses dérivés acétyldéoxynivalénols
(A-DON), le nivalénol (NIV) et les toxines T2 et HT2, sont les mycotoxines de *Fusarium* les
plus fréquentes (Bullerman 2003). La zéaralénone (ZEA), ou 6-(10-hydroxy-6-oxo-trans-1-
undécényl)-β-résorcyclique acide lactone, est également fréquente, c'est un cancérogène
potentiel. Parmi les mycotoxines émergentes, les enniatines sont retrouvées régulièrement dans
les échantillons analysés ces dernières années. Ce sont des peptides cycliques produits par
plusieurs espèces de *Fusarium* qui agissent comme des ionophores et ont des propriétés
antibactériennes. Ils perturbent également l'intégrité membranaire de nombreuses cellules.

L'ochratoxine A (OTA) est la principale mycotoxine de stockage rencontrée dans le blé. L'OTA est très stable, et n'est pas détruite par les procédures courantes de préparation des aliments. Pour réduire sa concentration, une exposition de plusieurs minutes à des températures supérieures à 250°C pendant plusieurs minutes est nécessaire. Chez les animaux, l'OTA est néphrotoxique, hépatotoxique, neurotoxique, tératogène et immunotoxique, la toxicité la plus aiguë de l'OTA se situant au niveau des reins. Chez l'homme, l'OTA a été liée à la néphropathie endémique des Balkans, à la néphropathie interstitielle chronique, aux tumeurs urothéliales, et des études épidémiologiques ont établi un lien entre l'exposition en début de vie et le cancer des testicules (Malir et al. 2016).
<table><caption>Tableau 1. Teneurs maximales en mycotoxines dans le blé tendre acceptées dans l'Union Européenne (Portail du droit de l'Union européenne 2006)</caption><thead><tr><th rowspan="2">Produit</th><th colspan="3">Concentration en mycotoxine (µg/kg)</th></tr><tr><th>DON</th><th>ZEA</th><th>OTA</th></tr></thead><tbody><tr><td>Grains non transformés</td><td>1250</td><td>100</td><td>5</td></tr><tr><td>Grains, farine son pour consommation humaine</td><td>750</td><td>75</td><td>3</td></tr><tr><td>Pain, pâtisserie, biscuits...</td><td>500</td><td>50</td><td>-</td></tr></tbody></table>

### 1.2.2. Facteurs affectant les contaminations

Le degré de contamination par les mycotoxines dépend fortement de paramètres physico-chimiques tels que la température ambiante, la teneur en humidité, l'activité de l'eau, le pH, l'humidité relative de l'air et la teneur en oxygène, mais aussi de la composition du substrat nutritif, de sa dégradation physique et de la présence de spores de moisissures. Pour la plupart des mycotoxines, la température optimale de production se situe entre 20°C et 30°C, tandis que l'activité de l'eau doit être supérieure à 0,7. La croissance des moisissures est compatible avec un large éventail de valeurs de pH, mais pas avec des surfaces nettement acides ou nettement alcalines. La production des mycotoxines dépend également de la prédisposition génétique de l'espèce de moisissure, c'est-à-dire de sa tendance à produire des métabolites secondaires lorsqu'elle habite un substrat approprié. Il faut signaler que la présence de moisissures dans une denrée alimentaire n'implique pas nécessairement la présence de mycotoxines, de même l'absence de moisissures visibles dans un aliment ne garantit pas l'absence de mycotoxines.

De plus, Également le développement et l'intensité de la production de mycotoxines sont conditionnés par des facteurs climatiques locaux qui varient dans le monde entier. Les années caractérisées par des périodes de fortes pluies, des quantités sensiblement plus élevées de mycotoxines de *Fusarium* ont été trouvées dans les céréales et, par conséquent, dans les produits à base de céréales. Les facteurs agro techniques qui englobent un traitement de base à plus petite échelle, des densités de plantation plus élevées, une plantation de type monoculture et un plus fort enherbement, favorisent la présence de mycotoxines dans le champ (Pleadin, Frece, and Markov 2019).

### 1.2.3. Production en circuit court

La notion de circuits courts est utilisée pour valoriser un mode de vente limitant le nombre d'intermédiaires mais ne prévoit pas de notion de proximité physique(DGCCRF 2020). Selon le Ministère de l'alimentation, de l'agriculture et de la pêche français, est considéré comme un circuit court « un mode de commercialisation des produits agricoles qui s'exerce soit par
la vente directe du producteur au consommateur, soit par la vente indirecte, à condition qu'il n'y ait qu'un seul intermédiaire ».

Les chaînes d'approvisionnement alimentaire courtes sont une alternative aux longues chaînes alimentaires mondialisées et jouent un rôle de plus en plus important dans les réseaux d'approvisionnement alimentaire. Cette chaîne d'approvisionnement a amélioré la soutenabilité en :

* Préservant l'environnement : de nombreuses chaînes d'approvisionnement alimentaire courtes ont minimisé l'utilisation de combustibles fossiles ou d'emballages, et/ou utilisent des méthodes de production moins polluantes.

* Augmentant les connaissances et les préoccupations des consommateurs en matière de santé et de bien-être

* Renforçant la relation directe entre le producteur et le consommateur (la traçabilité peut être plus facilement vérifiée)

* Réduisant les incertitudes économiques, puisqu'ils peuvent compléter les chaînes alimentaires plus longues et diversifier les réseaux d'approvisionnement alimentaire.

Cependant, il existe différents inconvénients pour cette production en circuit court, le plus notoire étant l'application de la réglementation, où cette production est marginalisée. Le mécanisme de marginalisation est basé sur a) des normes adaptées à la transformation à grande échelle ; b) des coûts proportionnellement plus élevés d'adaptation aux nouvelles normes ; c) une attitude discriminatoire des autorités de mise en œuvre et de contrôle ; d) un manque d'informations général ; e) un manque d'initiative des autorités nationales/régionales pour répondre aux lacunes de la réglementation européenne.

## 1.3. Le projet de recherche Myco3C

Dans le cadre de cette problématique, un projet de développement agricole rural, d'innovation et de partenariat financé par le CASDAR (compte d'affectation spécial « Développement agricole et rural ») est réalisé dans le but d'identifier et limiter les risques mycotoxiques des grains de blé et maïs produits en circuits courts, majoritairement en Agriculture Biologique (AB), en intégrant les contaminations au champ et le devenir des mycotoxines en première transformation.
Le projet Myco3C est mené par l'ITAB et INRAE et regroupe plusieurs partenaires (instituts techniques : ITAB, ACTA ; organismes de recherche public : INRAE UMR STLO et MycSA; EI Purpan ; groupements de producteurs, établissements d'enseignement agricole : ENILIA-ENSMIC). L'acquisition de données de référence permettra d'identifier les risques spécifiques et de faire ressortir les bonnes pratiques agricoles et technologiques limitant les possibilités de contamination de produits céréaliers par les champignons mycotoxinogènes et les mycotoxines tout au long de la chaîne de production, du champ au pain ou aux pâtes. Ce projet vient en appui aux filières de production en circuits courts (production, stockage et transformation par des paysans-boulangers), qui ne rentrent pas dans le circuit d'organismes stockeurs et meuneries industrielles qui pratiquent des contrôles de qualité sanitaire.

Ce travail est organisé en trois actions :

Action 1 : Basée sur des analyses de mycotoxines et de microflore toxinogène sur des échantillons de blé et de maïs provenant d'agriculteurs sélectionnés, afin de connaître le niveau de contamination associé aux conditions climatiques en situation réelle.

Action 2 : Basée sur des expériences post-récolte des échantillons sélectionnés afin d'évaluer l'évolution des agents mycotoxinogènes pendant le stockage et la transformation.

Action 3 : Cette action privilégie la sensibilisation des producteurs à la problématique et l'appropriation des solutions proposées, ce qui contribuera au développement de l'agriculture en circuit court et à la qualité sanitaire de leurs produits.

### 1.3.1. Objectif du stage

Dans le but d'améliorer les pratiques pour limiter la contamination tout au long de la chaîne de production en circuit court, l'objectif de ce stage est donc de mettre en évidence l'évolution de la teneur en mycotoxines, en fonction des pratiques de stockage et de transformation des grains du blé après récolte (action 2 de Myco3C). Et d'autre part, de démontrer l'effet d'une huile essentielle (utilisable en agriculture biologique) dans la prévention du développement des champignons et des mycotoxines.
Trois expériences différentes ont été réalisées au cours du stage pour évaluer l'effet de différentes conditions sur le développement de toxines et de champignons dans les grains de blé ou dans les produits dérivés de ces grains. Ainsi, une première expérience a été réalisée à l'échelle pilote pour définir les conséquences possibles d'un stockage dans de mauvaises conditions sur la contamination en mycotoxines et leur évolution au cours de la transformation en farine et en pain. Une deuxième expérience a été réalisée à petite échelle où les effets de différentes humidités et températures sur les grains de blé pendant le stockage ont été observés. Et enfin, une expérience a été menée pour évaluer les effets protecteurs éventuels d'une huile essentielle sur les grains de blé pendant le stockage.

<table><caption>Tableau 2. Présentation des échantillons utilisés</caption><thead><tr><th rowspan="2">Expérience</th><th rowspan="2">Nom d'échantillon</th><th rowspan="2">Type</th><th rowspan="2">Origine</th><th colspan="5">Concentration en mycotoxines (ng/g grain)</th></tr><tr><th>DON</th><th>NIV</th><th>Toxine HT-2</th><th>Zéaralé none</th><th>Aflatoxins</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">Expérience in vitro</td><td>20_044</td><td>Tendre</td><td>Pays Basque</td><td>434 (+/- 157)</td><td>140 (+/- 60)</td><td>5,1 (+/- 2,2)</td><td>23,7</td><td></td></tr><tr><td>20_045</td><td>Poulard</td><td>Pays basque</td><td>942 (+/-304)</td><td>754 (+/-252)</td><td>-</td><td>15,2 (+/- 6,7)</td><td>2,6 (+/- 1,2)</td></tr><tr><td>20_062</td><td>Tendre</td><td>Dordogne</td><td>249 (+/- 98)</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td>0,48 (+/- 21)</td></tr><tr><td rowspan="2">Panification</td><td>21_001 (20_044 après stockage)</td><td>Tendre</td><td>Pays Basque</td><td>15,18</td><td>-</td><td>0,20</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>21_002 (20_062 après stockage)</td><td>Tendre</td><td>Dordogne</td><td>507,8</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Huiles essentielles</td><td>Mélange du blé (même parcelle, après récolte (20_046) et après stockage (20_127))</td><td>Tendre</td><td>Haute Loire</td><td></td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td></td></tr></tbody></table>

### 2.1. Matériel biologique

#### 2.1.1. Blé

Trois lots de blé tendre (variétés anciennes : 20_044, 20_062 et 20_046) et un lot de blé poulard (20_045) produits en région Aquitaine ont été sélectionnés sur la base de leurs niveaux de contamination en mycotoxines révélés dans l'action 1 de Myco3C, à la sortie de la moissonneuse et après 6-7 mois de stockage chez les agriculteurs. Les grains étaient conservés au laboratoire à 4°C dans des contenants hermétiques avant utilisation
### 2.1.2. Levains et levure

Trois levains et une levure commerciale ont été utilisés pour le processus de panification. Les levains proviennent de farines biologiques de boulangers qui font du pain au levain:

- Levain provenant de Savoie (73) : levain de blé, bactérie lactique majoritaire : *Lactiplantibacillus plantarum*, levure majoritaire : *Saccharomyces cerevisiae*.

- Levain provenant de (38) : levain de seigle, bactérie lactique majoritaire : *Fructilactobacillus sansfrancisensis*, levure majoritaire : *Kazachstania humilis*.

- Levain provenant de lans (38) : levain de seigle, bactérie lactique majoritaire : *Fructilactobacillus sansfrancisensis*, levure majoritaire : *Kazachstania bulderi*.

- La levure commerciale c'est une levure l'Hirondelle (Lesaffre) pressée (*Saccharomyces cerevisiae*)

Ces types de levains et levure représentent ceux qui sont le plus couramment utilisés dans les pratiques des paysans boulangers.

### 2.1.3. Huile essentielle

L'huile résultait de l'hydrodistillation de la plante médicinale *Ammoides Pusilla* collectée en Tunisie, dont le composant majoritaire c'est le thymol. Elle a été choisie pour son pouvoir antifongique (Laouer et al. 2003).

## 2.2. Dispositifs expérimentaux

### 2.2.1. Effet des processus de mouture et panification sur l'évolution des teneurs en mycotoxines.

Il s'agit d'étudier les effets de choix technologiques sur les évolutions de teneurs en mycotoxines : mouture sur meule en pierre ou cylindre, fermentation avec des levains de boulanger ou une levure commerciale. Les conséquences de la cuisson du pain ont aussi été recherchées. Cette expérience a été réalisée à partir de 4 lots de grains avec des niveaux de mycotoxines différents :

1. 50 kg de grains ont été reçus de chaque échantillon (21_001 et 21_002) et ont été séparés en deux. La première moitié a été stockée à 5°C pour sa conservation et l'autre moitié a été exposée à différentes conditions de stress (température entre 22 et 28 °C et points d'humidité) pendant environ un mois pour simuler des conditions
potentiellement réelles de mauvais stockage et ainsi favoriser le développement de champignons et la production de mycotoxines de stockage.

2. Après un mois de conditions de mauvais stockage, les quatre échantillons des grains de blé (21_001 conservé, 21_001 vieilli, 21_002 conservé et 21_002 vieilli) ont été transportés à l'école nationale supérieure de meunerie et des industries céréalières ENILIA-ENSMIC à Surgères pour être transformés en farine et puis en pain.

La moitié de la transformation de chaque échantillon en farine a été effectuée dans un moulin à cylindre et l'autre moitié dans un moulin à meule pour comparaison. Les farines obtenues étaient de type T80. Avec chacun des 8 lots de farine, trois types de levains et une levure commerciale ont été testés.

Tout au long du processus de panification, différents échantillons ont été prélevés, au niveau des sons des moutures, des farines, des levains tout point rafraîchis avec les différents levains chefs, de la pâte à la fin du pétrissage, de la pâte en fin de pousse et finalement du pain (figure 1). Ces échantillons ont été immédiatement congelée puis lyophilisées avant analyse des mycotoxines et des contaminants fongiques.

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1. Dispositif de panification à partir de 4 lots de grains (deux vieillis ; deux conservés, aussi appelés "témoins").</figcaption></figure>
2.2.2. Effet de conditions contrôlées d'humidité et de température sur le développement des mycotoxines et des champignons dans les grains de blé pendant le stockage.

Pour suivre le développement des mycotoxines sous différentes conditions de stockage, 3 échantillons de blé ont été utilisés (20_44, 20_45 et 20_62), ajustés à 3 niveaux de teneurs en eau et stockés à l'échelle du laboratoire pendant 6 semaines à 3 températures :

- Température de 25 °C et 3 humidités différentes des grains (16%, 18% et 21%).

- Humidité des grains d'environ 21% et trois températures différentes (20, 25 et 30°C).

Pour atteindre l'humidité choisie pour chaque échantillon, des feuilles de papier filtre standard (42x52 cm) pliées en deux ont été imbibées avec 40 mL d'eau chacune, puis 3 feuilles ont été mises au fond de plateaux, recouvertes d'une seule couche de grain elle-même couverte de 3 autres feuilles. Les grains ont été retirés à différents temps, lorsque l'humidité spécifique était atteinte. La teneur en eau et l'activité de l'eau (aw) des grains ont été mesurées. 60 g de grains ont chacun été placés dans des pots en plastique 40 mL avec bouchons. Trois répétitions de chaque condition ont été réalisées. Des prélèvements d'échantillons de 10 g ont été effectués après incubation pendant 2 et 4 semaines. Après 6 semaines, l'ensemble du contenu de chaque pot a été échantillonné. Les échantillons ont été pesés, congelés puis lyophilisés avant analyse du développement des champignons et mycotoxines dans les grains. Pour les échantillons finaux, une partie des grains ont été utilisés frais pour des dénombrements microbiens.

2.2.3. Effets protecteurs d'une huile essentielle sur les grains de blé pendant le stockage

Pour mesurer les éventuels effets préventifs de l'huile essentielle sur les grains, un dispositif de stockage a été mis en place comme ci-dessus dans des pots fermés contenant 50 g de grain. Pour cela, un échantillon de blé mélangé provenant de la même parcelle (échantillon après récolte (20_046) et après stockage (20_127)). Pour le dispositif, une humidité approximative de 20% était nécessaire, donc afin d'augmenter et d'homogénéiser le taux d'humidité, le dispositif de feuilles de papier présenté ci-dessus a encore été utilisé, l'aw a été mesurée (0,97) pour assurer la disponibilité d'eau nécessaire pour le développement des moisissures. Trois concentrations différentes d'huile essentielle (6.8x10⁻³ µl huile/g blé ; 13,4x10⁻³ µl huile/g blé et 0,02 µl huile/g blé) et un témoin sans huile ont été testés, et pour chaque concentration, 3 répétitions ont été effectuées. Chaque groupe de réplicat a été placé dans un bocal en verre fermé pour éviter
la "contamination" par l'huile essentielle des autres conditions avec des concentrations différentes, car elle a une volatilité très élevée.

## 2.3. Analyses

### 2.3.1. Mesure de l'activité de l'eau (aw) et de la teneur en eau des grains

L'aw des échantillons dont l'humidité relative a été montée avec le système de feuilles, est mesuré avec indicateur d'humidité Testo 650. Pour la mesure d'humidité relative (teneur en eau des grains) les échantillons sont pesés et séchés dans une étuve a 75 °C, puis pesés de nouveau après 24 heures.

### 2.3.2. Extraction et amplification d'ADN

Deux méthodes ont été utilisées pour extraire les ADN totaux des différentes matrices obtenues :

**Extraction d'ADN fongique en plaques 96 puits avec broyeur à billes :** L'ADN total est extrait à partir du mycélium végétatif en utilisant comme détergent le N-cétyl N,N,N-triméthyl ammonium bromure (CTAB). En présence de NaCl, les acides nucléiques forment un complexe stable avec le CTAB, et sont ensuite précipités avec de l'Isopropanol. (Protocole MOP-BM-GEN-07 version 2 de l'UR1264). À partir de cette extraction, une PCR amplifiant la région ITS1-ITS4 est réalisée. Après contrôle de la qualité de l'ADN, il est envoyé pour séquençage à une entreprise prestataire de service (Genewiz). La séquence obtenue est comparée aux séquences de la base de données NCBI pour identifier le champignon.

**Extraction d'ADN à partir de grains, basée sur le kit Nucleo Mag96Plant avec le robot MagMax Express :** Il s'agit d'une extraction d'ADNg automatisée. La première étape d'extraction d'ADNg utilise un tampon de lyse MC1 contenu dans le kit. Les étapes de lavage et d'élution de l'ADNg s'effectuent dans le robot MagMax Express. Le principe du robot MagMax Express est basé sur l'utilisation de tiges magnétiques recouvertes d'éléments jetables (billes) spécialement conçues. Lors de la collecte, les tiges magnétiques protégées par un peigne montent et descendent dans les puits et ceux-ci soulèvent et transportent d'un micro-puit à un autre les billes magnétiques sur lesquelles est lié l'ADN. La séparation des tiges magnétiques des billes est rapide grâce au caractère magnétique. Ainsi l'ADNg est absorbé spécifiquement sur les billes en présence de certains sels et un pH particulier. Les contaminants sont éliminés par différentes étapes de lavage. L'ADNg est élué dans un tampon faible en sel. Des
amplifications par PCR en temps réel (qPCR) ont été réalisées sur ces extraits avec des amorces spécifiques d'espèces de Fusarium. La qPCR, est sensible pour détecter la présence des champignons ciblés et réaliser une quantification relative.

<table><caption>Tableau 3. Nom des amorces utilisées en Q-PCR. Les séquences sont disponibles sur l'intranet MycSA</caption><thead><tr><td>Espèce fusarienne ciblée</td><td>Amorce forward</td><td>Amorce reverse</td></tr></thead><tbody><tr><td>Fusarium spp.</td><td>β-tubuline F</td><td>β-tubuline R</td></tr><tr><td>Fusarium poae</td><td>Fp82F</td><td>Fp82R</td></tr><tr><td>Fusarium graminearum</td><td>Fg16NF</td><td>Fg16NR</td></tr><tr><td>Fusarium avenaceum</td><td>JIA-F</td><td>JIA-R</td></tr><tr><td>Fusarium tricinctum</td><td>EF1α-F</td><td>EF1α-R</td></tr></tbody></table>

### 2.3.3. Extraction et dosage des mycotoxines

Deux méthodes d'extraction ont été également utilisées pour l'extraction de mycotoxines :

Extraction par méthode QuEChERS et dosage par LC-MS des principales mycotoxines des céréales : Les mycotoxines sont extraites à partir des céréales par un mélange acétonitrile/eau (0,1% v/v), la séparation de phase se fait grâce à l'ajout de sels ($MgSO_4$ & NaCl). La quantification est réalisée par étalonnage externe à l'aide d'étalons de mycotoxines commerciaux par chromatographie en phase liquide haute performance (HPLC) couplée à un détecteur de spectrométrie de masse. La méthode est décrite pour permettre la détection de nombreuses toxines (enniatines, beauvericine, déoxynivalénol, dcetyldéoxynivalénol, divalénol, fusarenone-X, zéaralénone, aflatoxines). (MOP-BIO-16)

Extraction d'OTA : L'OTA est la principale mycotoxine de stockage du blé, c'est pourquoi une deuxième méthode spécifique à cette mycotoxine est utilisée (MOP-BIO-09). Cette méthode est réalisée à partir d'un échantillon de céréales séchées et broyées. L'OTA est extraite à l'aide d'acétonitrile/eau (84/16 ; v:v) puis purifiée sur colonnes MultiSep® 229 Ochia fournis par Romer Labs®. Le dosage de l'OTA est ensuite réalisé grâce à un couplage HPLC/Fluorimétrie.

### 2.3.4. Dénombrement microbien et culture monospore

Pour le dénombrement microbien, les échantillons de grain sont homogénéisés dans une solution dispersante (Bacto peptone, pyrophosphate de sodium et l'eau permutée), et mélangés dans un Waring-Blender. Puis, plusieurs dilutions 1/10 sont effectuées et étalées dans des boîtes de Pétri avec du milieu PDA (Potato dextrose agar), puis incubées à 25 °C pendant 2 à 4 jours.
Le nombre de colonies microbienne à chaque dilution est noté et converti pour évaluer la quantité d'unité formant colonies par gramme de grain.

Culture monospore : Pour isoler une spore, un fragment d'échantillon de champignon est mélangé avec un diluant (Sel de tryptone et eau milliQ), où 5 dilutions sont faites, et étalées dans des boîtes de Pétri avec du milieu PDA puis incubées pendant 24 h à 25 °C. À l'aide d'une loupe binoculaire, une seule spore est prélevée et placée dans une boîte de Pétri avec du milieu PDA (10 répétitions). Après 5 jours d'incubation, chaque boîte de Pétri contient un champignon provenant d'une seule spore, obtenant ainsi un matériel génétique pur à identifier.

# 3. Résultats et discussion

## 3.2. Effet de différentes conditions de stockage sur le processus de panification

**Teneurs en mycotoxines** : Comme indiqué précédemment (Tableau 1), les échantillons de grains choisis étaient contaminés par des fusariotoxines lorsqu'ils ont quitté le champ, et leur contamination a légèrement augmenté après 6 mois de stockage chez les agriculteurs. Ces grains ont été donc placés dans des conditions favorables à la production de mycotoxines de stockage par les champignons naturellement présents sur les grains ; après 5 semaines, les teneurs en OTA mesurées sur des grains prélevés aléatoirement étaient de 2,44 et 3,21 ng/g de blé, pour les échantillons 21_001 vieilli (1A) et 21_002 vieilli (2A), respectivement. Les témoins (1B et 2B) et les deux lots vieillis ont été transformés en farine puis en pain. Seules les données à partir de la mouture sur meules sont présentées ici, puisqu'il s'agit de la forme de transformation la plus courante chez les paysans boulangers et que les différences entre les farines sur meule et sur cylindre étaient faibles.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 2. Teneur en OTA des farines (de type 80) et des sons obtenus sur meules de pierre.
Abréviations : Mfa = farine sur meule de pierre, Mis = issues (son) sur meule de pierre</figcaption></figure>
Seuls les grains 2A présentaient de l'OTA en quantité supérieure à la limite de quantification. Les teneurs en OTA mesurées sur cet échantillon (Figure 2) obtenu après homogénéisation des lots vieillis sont inférieures à celles mesurées sur des grains prélevés ponctuellement pendant le processus de vieillissement. Ce résultat souligne l'importance de l'échantillonnage pour évaluer les contaminations en mycotoxines dans les grains. Les analyses des effets possibles des différents levains et de la levure sur les mycotoxines ont été réalisées prioritairement avec cette farine. Les valeurs du tableau 4 serviront de référence pour suivre l'augmentation ou la diminution de ces mycotoxines dans le processus de panification.

<table><caption>Tableau 4. Teneurs en mycotoxines des grains du lot 2A</caption><thead><tr><td>Mycotoxine</td><td>Quantité (ng/g blé)</td></tr></thead><tbody><tr><td>Acetyldéoxynivalénol (15 A-DON)</td><td>777,03</td></tr><tr><td>Déoxynivalénol (DON)</td><td>247,04</td></tr><tr><td>Somme Enniatins (ENN)</td><td>534,23</td></tr><tr><td>Fusarenone-X</td><td>66,25</td></tr><tr><td>Ochratoxine A (OTA)</td><td>1,98</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 3. Evolution des mycotoxines en pourcentage par rapport aux grains de blé du lot 2A (valeurs de référence dans le tableau 4) lors de la mouture sur meule de pierre et puis panification. Mfa_2A désigne la farine et Mis_2A les issues (aussi appelé son) obtenues à partir de lot de grain 2A. L1, L2, L3, LC désignent les levains et la levure commerciale utilisés pour produire le pain. PaPe est la pâte après pétrissage, Papret est la pâte avant enfournement.</figcaption></figure>

La figure 3 montre des teneurs en DON dans le son et la farine proches de 100%, ce qui signifie que ces teneurs en DON sont semblables à celles mesurées dans les grains. L'effet de dilution par fractionnement, observé sur différentes céréales par séparation des tissus du grain par
broyage à sec qui montre que le son est généralement caractérisé par des concentrations de mycotoxines plus élevées que les produits de l'endosperme (Schaarschmidt and Fauhl-Hassek 2021), n'est pas retrouvé pour le DON ici.

Le niveau d'ENN et de DON a diminué au cours de la fermentation (comparaison PaPe et Papret) pour les 3 types de levains utilisés, et a faiblement augmenté avec la levure commerciale. Cela indique un effet positif des levains de boulanger pour le contrôle des mycotoxines dans les produits provenant des céréales. Cette efficacité peut être due au fait que les levains sont un système complexe de bactéries lactiques et de levures (1/100) (Savoie and Martinez 2015), et la réduction en mycotoxines peut être associée à la fois à la biotransformation et à une liaison physique sur les parois cellulaires des levures et bactéries qui les masqueraient, les rendant plus difficile à extraire (Freire and Sant'Ana 2018). L'intérêt des levains par rapport à la levure seule est clairement visible dans la comparaison du levain 1 avec la levure commerciale, puisque le levain 1 contient la même espèce de levure que la levure commerciale (*Saccharomyces cerevisiae*), mais en plus elle contient diverses bactéries, dont la majoritaire est la bactérie lactique *Lactiplantibacillus plantarum*.

Dans le cas du DON, la transformation de sa forme modifiée 15-acétyl-DON en DON peut limiter la baisse de concentration. Wu and Wang, 2016, confirment que la désacétylation de l'ADON peut se produire non seulement pendant la fermentation mais aussi lors de la mouture, comme l'indiquent les résultats obtenus ici. En effet, la forme acétylée 15-ADON retrouvée dans les grains de blé n'est pas retrouvée dans la farine. Les concentrations en DON ne sont que faiblement diminuées pendant la cuisson.

Une autre toxine dont le niveau n'a pas diminué pendant la fermentation, ni la cuisson du pain, est l'OTA. Cela pourrait, en premier lieu, être dû à la grande stabilité de cette toxine (Vidal et al. 2014) mais également à la présence de formes modifiées de cette toxine qui sont libérées par l'action des bactéries et des levures. Ces formes modifiées peuvent aussi être clivées par le métabolisme de l'Homme et de l'animal, retournant à la toxicité d'origine en raison de la libération de la toxine libre (Freire and Sant'Ana 2018). La cuisson a eu tendance à faire augmenter la teneur en OTA dosé, confirmant sa stabilité et la possible libération de formes masquées. La forte différence entre les teneurs en OTA mesurées dans les grains et les produits de mouture n'est pas expliquée. Les grains ont subi une étape de tri pour retirer les impuretés botanique (gousses de Luzerne d'Arabie) avant mouture alors que l'analyse a été effectuée sur le grain non trié, mais cela ne peut engendrer le niveau d'augmentation observé.
**Détection d'ADN fongique** : La présence de fusariotoxines ne reflète pas forcément la présence du champignon producteur. Pour déterminer si les champignons producteurs de ces toxines sont encore présents à la sortie du champ et après le stockage et la transformation des grains, une extraction et détection d'ADN ciblant des espèces de *Fusarium* sp. a été réalisée (Figure 4).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 4. Évolution de la détection d'ADN. A. Fusarium spp B. Fusarium avenacum C. Fusarium poae D. Fusarium gramineraum au cours de la mouture</figcaption></figure>

Après une première détection du genre *Fusarium sp*, trois espèces de ce champignon ont été identifiées. F. poae, F. avenaceum et F. graminearum qui sont présents dans les trois échantillons. Ces espèces sont directement liées à la production de DON, beauvericine, ENN, NIV et ZEA (Nicholson 2004). Leur activité au cours de la panification avec la levure commerciale pourrait être en partie responsable des augmentations de concentrations en DON, 15-ADON et ENN observées plus haut. L'espèce *Fusarium tricinctum* a également été recherchée mais n'a pas été détectée.

Il a été démontré dans plusieurs études que les espèces de champignons productrices d'OTA qui se sont développées pendant le stockage en mauvaises conditions peuvent dégrader les gliadines et les gluténines du blé (gluten), plus que les espèces de *Fusarium* (Birzele and Prange 2003), (Prange et al. 2005). Les propriétés viscoélastiques des fractions protéiques de stockage (gluten) du blé sont essentielles pour son utilisation et la qualité de transformation en pain et en produits de boulangerie. Les protéines formant le gluten absorbent l'eau et forment un réseau pendant la fabrication de la pâte, qui est capable de retenir les gaz pendant le processus de
<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 5. A : Pain produit à partir du lot 2A (contaminé) avec le levain 3. B : Pain produit à partir du lot 2B avec le levain 3</figcaption></figure>

panification et donne une structure de mie élastique (Eggert, Rawel, and Pawelzik 2011). Le pain du lot 2A contaminé en OTA présentait une claire diminution du pouvoir de rétention des gaz par rapport au lot 2B (même lot mais non contaminé), ce qui peut être associé à la présence d'espèces de Penicillium et d'Aspergillus productrices d'OTA (Figure 5).

### 3.3. Effet de conditions contrôlées d'humidité et de température sur le développement des mycotoxines et des champignons dans les grains de blé

Pour comparer l'impact de différents niveaux de teneur en eau et de différentes températures sur la production de mycotoxines dans le blé, les matrices ont été traitées pour l'extraction et le dosage des mycotoxines. La teneur en mycotoxines des trois échantillons prélevés aux semaines 2, 4 et 6 a été comparée (données non présentées), le niveau de production de mycotoxines le plus élevé correspondait aux prélèvements effectués à la semaine 6. Pour l'analyse, seuls les résultats obtenus à la semaine 6 seront présentés.

La dynamique de production d'OTA en fonction des conditions de température et d'humidité est semblable dans les deux lots de blé tendre (Figure 6), mais différente de celle observée pour le lot de blé poulard (20_045). Par exemple, la production d'OTA a été la plus élevée à 21% d'humidité et 25 °C pour les blés tendres, alors que pour le blé poulard la production la plus élevée a eu lieu à 21% et 20 °C. Et bien que la production maximale d'OTA soit à deux températures différentes, ces résultats confirment les études de Völkel, Schröer-Merker, and Czerny 2011, où la production d'OTA est optimale entre 20 et 25 °C. Des espèces fongiques différentes ayant des optimums de température différents pourraient être impliquées dans cette production d'OTA.
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 6. Concentration en OTA dans les grains stockés 6 semaines sous différentes conditions de température et de teneur en eau.</figcaption></figure>

A partir de maintenant, seuls les résultats du lot 20_044 à 6 semaines de stockage seront présentés car c'est l'échantillon le plus contaminé avec de l'OTA.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 7. Concentration en mycotoxines dans les grains stockés 6 semaines sous différentes conditions de température et de teneur en eau dans le lot 20_044</figcaption></figure>

La concentration d'ADON a augmenté, car au départ, la présence d'ADON n'est que faiblement détectée, mais à 6 semaines, elle est retrouvée dans une plus grande quantité les lots de grains conservés à 25°C (Figure 7).
Une synthèse de beauvericine a également eu lieu (toxine non détectée au départ), la plus élevée étant pour 30 °C à 21% d'humidité de la matrice Ce résultat confirme les études de Wang and Xu qui montrent la température optimale de production de la beauvéricine est de 27°C, cependant ils déclarent également qu'après 30°C sa production s'est arrêtée.

La plus grande concentration de DON a été observé pour 20°C à 21% d'humidité du grain (0,94 d'activité de l'eau). Dans cette expérience, la quantité de DON est restée constante puisque la même quantité de cette mycotoxine a été trouvée dans les conditions de départ. Ces résultats indiquent donc que ce sont les conditions optimales pour la conservation de DON car dans d'autres conditions, la concentration a diminué. Dans d'autres études, la plus grande production de DON, se détecte entre 20 et 25°C (Martínez et al. 2020), cependant, l'activité de l'eau est plus haute. Par conséquent, il est possible de considérer que pour sa conservation, il faut au moins ces conditions de température et d'humidité, mais pour sa production, il faut une plus grande disponibilité d'eau.

Les ENN ont un pic maximum de production à 25°C, et elles se sont dégradées à 20 °C pour 21% d'humidité (aw = 0.94). Ces résultats confirment ceux d'études sur la production d'ENN où à des températures entre 15 et 20 °C il n'y a pas de production d'ENN pour la plupart des espèces testées alors que la production la plus élevée se produit à 25°C et qu'à 30°C il y avait encore de la production. (Gautier 2020). Garcia-Cela et al. (2018) confirment également que la production optimale de ces mycotoxines à lieu pour 20-25 °C et 0,95 aw. Ils montrent par ailleurs que la production de NIV la plus élevée se produit à 25°C, ce qui est également confirmé par la production de NIV dans cette expérience à 25 °C.

Concernant la ZEA, sa production est la plus élevée pour 25°C, avec une activité de l'eau comprise entre 0,93 et 0,95 (3,9 µg/g), ce qui concorde une fois de plus avec les résultats présentés. La ZEA a fortement augmenté dans ces conditions, puisque sa concentration initiale était de 23,7 ng/g.

**Dénombrement microbien** : Pour avoir une première idée du développement des champignons dans le lot de grains étudié (20_044) en fonction des conditions de stockage, un dénombrement microbien a été effectué. Il a été constaté que la condition 25°C à 21% d'humidité a permis le développement de la plus grande quantité de champignons (Figure 8). Ceci a également été observé par plusieurs auteurs, qui attestent que le développement des
champignons dépend de nombreux facteurs, dont la température (entre 25 et 30 °C) et la disponibilité de l'eau qui en sont deux des plus importants.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 8 : Dénombrement des champignons par suspension dilution dans les grains stockés 6 semaines sous différentes conditions de température et de teneur en eau dans le lot 20_044</figcaption></figure>

À partir des boîtes utilisées pour le dénombrement microbien, 4 spores ont été isolées une à une afin de confirmer la présence d'espèces susceptibles d'avoir produit les mycotoxines détectées par les dosages précédents, et de confirmer les conditions dans lesquelles ils se développent.

Sur la base de cette culture monospore, une amplification de la région ITS1-ITS4 a été réalisée. Le résultat du séquençage de ces amplifications montre que les mycéliums isolés de nos grains appartiennent au genre *Penicillium*. Le blastn (Blast nucléotidique) des séquences dans la base de données NCBI (Genbank) révèle plusieurs espèces. Trois appartiennent à l'espèce *Penicillium aurantiogriseum* et une à l'espèce *P. polonicum* avec 100% d'identité. *Penicillium polonicum* (Figure 9) s'est développée à 20 °C et 21% d'humidité pour laquelle une de plus forte concentration d'OTA a été observée.

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 9 : Penicillium polinicum, isolé de grains contaminés en OTA.</figcaption></figure>

Cette espèce de champignon est un producteur connu d'OTA (Chen et al. 2013), ce que pourrait expliquer une
production si élevée de cette mycotoxine dans ces conditions (Figure 6).

On s'est appuyé sur l'article sur Xing et al 2018, pour une première étude phylogénétique de nos échantillons. Les quatre autres échantillons appartiennent aussi au genre Penicillium, l'identification de ces espèces fera l'objet d'une étude ultérieure en étudiant d'autre gène spécifique au genre Penicillium.

### 3.4. Effets protecteurs d'une huile essentielle sur les grains de blé pendant le stockage

Pour mesurer l'effet protecteur de cette huile, nous avons comparé dans un premier temps les résultats obtenus pour sa plus forte concentration (C3) et l'échantillon sans huile (C0). Pour cette première mesure, le niveau d'OTA de ces échantillons et d'un témoin (stocké à 4°C pour sa conservation) a été dosé.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 10 : Concentration en OTA de l'échantillon stocké à 4°C (témoin), les échantillons stockés à 25°C avec la plus forte concentration d'huile (C3), et sans huile (C0)</figcaption></figure>

On observe que l'OTA a augmenté dans les deux échantillons (Figure 10) : sans huile essentielle et avec la plus forte concentration en huile. Il n'y a pas d'étude basée sur l'inhibition de l'OTA par cette huile, cependant, il a été trouvé que pour inhiber la production d'OTA la concentration minimale inhibitrice de thymol est de 0,0313 mg/ml (Jeršek et al. 2014), qui est le composant le plus important de l'huile essentielle Ammoides Pusilla. Dans cette expérience, la plus forte concentration d'huile avait une concentration de 5,28x10⁻³ mg/ml de thymol, ce qui peut expliquer pourquoi dans cette expérience la production d'OTA n'a pas été inhibée.

Dans un second temps, les grains exposés ou non à l'huile essentielle à faible ou forte concentration ont été comparés visuellement (figure 11).
<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 11. Photographie des pots contenant les grains traités ou non à l'huile essentielle d'Ammoides Pusilla, avec un zoom montrant les effets de l'huile essentielle plus en détail. A : grains témoins, B : grains traités avec $6.8 \times 10^{-3} \mu l_{huile}/g_{blé}$ (C1), C : grains traités avec et $0,02 \mu l_{huile}/g_{blé}$ (C3).</figcaption></figure>

On constate une diminution progressive de la quantité de mycelia visibles, directement proportionnelle à l'augmentation de la concentration d'huile essentielle, jusqu'à la disparition du mycélium pour C3. Les huiles essentielles ont un grand nombre de constituants, et à cause de ceux-ci, il semble qu'il n'y ait pas de cibles cellulaires spécifiques. En tant que lipophiles typiques, elles traversent la paroi fongique et la membrane plasmique, en perturbant les couches de polysaccharides, d'acides gras et de phospholipides qui les compose et les perméabilisent. Les huiles essentielles peuvent coaguler le cytoplasme et endommager les lipides et les protéines. La perturbation de la paroi cellulaire et de la membrane plasmique peuvent entraîner la fuite de macromolécules et la lyse cellulaire (Bakkali et al. 2008). Laouer et al confirment les effets antifongiques de cette huile, en précisant que l'efficacité contre les champignons dépend de la concentration utilisée.

## 4. Conclusion

Il existe plusieurs mécanismes permettant de réduire la contamination en mycotoxines dans les grains et ses produits dérivés. Tout d'abord, juste après la récolte, les conditions de stockage
sont primordiales pour préserver les qualités du blé. Les mycotoxines ont un large rang de températures favorables à leur production (entre 15 et 30°C), notamment, la température où plus de mycotoxines sont produites est de 25° C, qui était la température idéale pour les ENN, le NIV, la ZEA et l'OTA. À 20°C le DON a eu son pic maximum et à 30°C pour la beauvericine. L'humidité et la disponibilité de l'eau sont également des facteurs clés de la production de mycotoxines, nous avons pu voir que plus l'eau est disponible, plus leur production sera élevée. Il existe également d'autres mécanismes de défense contre les champignons producteurs de mycotoxines pendant le stockage du blé, comme les huiles essentielles, qui fonctionnent comme un fongistatique pouvant empêcher le développement des champignons mycotoxinogènes, mais aussi agir sur la production de mycotoxines elle-même. Ainsi les pertes économiques des agriculteurs dues aux altérations de la qualité sanitaire et technologique causées par ces champignons sont réduites.

Concernant les processus de transformation après le stockage du blé, on peut conclure qu'il existe également différentes manières de réduire la contamination par les mycotoxines. La première étant la mouture, car le son a une concentration plus élevée de mycotoxines que les produits de l'endosperme du blé. L'utilisation de levains plutôt que de levures commerciales devrait être favorisée, grâce à leur riche microbiote qui aide à réduire la contamination par les mycotoxines dans une plus grande mesure. Cependant, il est préférable de favoriser des méthodes de prévention lors du stockage. En effet, d'une part, on peut trouver des formes modifiées ou cachées de mycotoxines, qui peuvent être libérées après divers processus (mouture, fermentation ou directement dans l'estomac) provoquant une augmentation de la quantité de mycotoxine mère, donc des risques qu'elle entraîne. D'autre part, la plupart des toxines sont thermostables et ne sont donc pas détruites lors de la cuisson, et enfin, la présence de champignons développés pendant le stockage peut gravement nuire à la qualité des produits obtenus.

## 5. Perspectives

Une partie des échantillons collectés dans ces études n'ont pas encore été analysés. Ces analyses devront être effectuées prochainement. La détection et la quantification de champignons producteurs d'OTA sera réalisée après mise au point des amorces spécifiques, ainsi que la quantification de l'ADN de blé dans chaque extrait (travaux en cours).

* Effet de différentes conditions de stockage sur le processus de panification.
Les analyses de mycotoxines et de matières fongiques doivent être effectuées avec les autres farines (sur cylindre) et leurs produits de boulangerie respectifs, pour une comparaison plus précise. L'ensemble de l'expérience sera répété pour confirmer les résultats obtenus ici. Sur des copies des échantillons traités, une analyse du microbiote par méta-barcoding sera réalisée par un autre laboratoire associé au projet. Ces données seront très utiles pour compléter l'interprétation de nos observations. Des analyses de l'effet spécifique de chaque levain, ou type de bactérie et levures isolées de ces levains, sur le développement des agents mycotoxinogènes et leur production de mycotoxines pourraient également être réalisées.

* Effet de conditions contrôlés d'humidité et de température sur le développement des mycotoxines et des champignons dans les grains de blé

Le séquençage des autres champignons de la culture monosporale doit être réalisée. Il serait également intéressant de tester d'autres lots de blé du projet de recherche provenant d'autres régions de France pour étudier leur comportement. De même, une expérience avec ces mêmes conditions peut être réalisée avec un blé fortement contaminé par les gousses de Luzerne d'Arabie (adventice du blé) ; où une partie du lot de blé peut être divisée en contaminations et blé "propre" ; et une autre partie du blé peut être stockée sans être traitée, afin d'analyser l'effet de ces contaminations sur la production des mycotoxines.

* Huiles essentielles

D'autres mycotoxines devraient être dosées pour comparer leur comportement avec l'OTA, puisque les concentrations choisies ici étaient basées sur le pouvoir inhibiteur de l'huile contre les ENN. De même, l'identification et la quantification du matériel fongique doivent être effectuées pour vérifier une inhibition proportionnelle à la concentration de l'huile utilisée.

Comme le lot de grain choisi n'a été que faiblement contaminé en OTA dans le traitement témoin, il serait intéressant de tester les lots de grains déjà utilisés dans l'expérience sur l'humidité et la température avec cette huile essentielle. Il serait également intéressant de tester les différentes conditions de température et d'humidité dans le lot de grains utilisé pour l'expérience avec les huiles essentielles. Dans ces expériences, les quantifications de champignons mycotoxinogènes par qPCR et l'analyse du microbiote seraient utiles pour l'interprétation des observations sur l'évolution des teneurs en mycotoxines,
Globalement, les connaissances acquises dans ce recherches permettront de sensibiliser les paysans-boulangers à la problématique des mycotoxines et aux moyens de limiter les contaminations