# Suivi de bactéries en écoulement confiné par microscopie holographique

Lucie Klopffer, Simon Becker, Laurence Mathieu, N. Louvet

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Lucie Klopffer, Simon Becker, Laurence Mathieu, N. Louvet. Suivi de bactéries en écoulement confiné par microscopie holographique. Bienvenue chez les Microbes - 19e congrès de la Société Française de Microbiologie, Oct 2024, Lille, France. hal-04767966

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# Suivi de bactéries en écoulement confiné par microscopie holographique

Lucie Klopffer<fnref n="1" />,<fnref n="2" />, Simon Becker<fnref n="2" />, Laurence Mathieu<fnref n="1" />,<fnref n="3" />, Nicolas Louvet<fnref n="2" />

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SFM

Société Française
de Microbiologie

19E CONGRÈS
NATIONAL DE LA SFM

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Lemta

Laboratoire Énergies &
Mécanique Théorique et Appliquée

LCPME

Laboratoire de Chimie Physique et Microbiologie
pour les Matériaux et l'Environnement

## 1 Contexte et objectifs

Les évènements pionniers d'adhésion des bactéries sur des surfaces jouent un rôle crucial dans la formation des biofilms. Si de nombreuses études se sont consacrées à la caractérisation de biofilms matures, peu de données expérimentales sont rapportées sur la dynamique de colonisation des bactéries pionnières [1]. Une des principales difficultés est de suivre, dans un écoulement, la trajectoire des bactéries passant du flux à la surface et inversement. Pour suivre cette dynamique ceci nécessite d'utiliser des méthodes expérimentales permettant un **suivi des bactéries en 3 dimensions, résolues spatialement** (inférieure au micromètre) et **temporellement** (environ 10 ms). Les méthodes actuelles de microscopie permettent d'obtenir des informations souvent partielles sur ces transferts et nécessite souvent une mise en place complexe et couteuse :

* Microscopie conventionnelle (fluorescence, contraste de phase) :
  Simple de mise en œuvre, limitation à un plan focal 2D.

* Microscopie confocale :
  Information 3D, pas de résolution temporelle, couteux.

* Microscopie + platine piezzo :
  Suivi temps réel, bactérie individuelle, couteux, mise en place complexe.

### Evènements pionniers

#### Transfert et adhésion

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

#### Croissance
Biofilm mature

Growth on surface
EPS matrix synthesis

min / heures

jours / mois / année

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

Nécessité de développer une méthode optique résolue spatialement et
temporellement permettant le suivi de la dynamique d'une suspension de bactéries

(Voir le poster de **Lucie Klopffer** :

Deep Learning to assess the dynamics of wall bacterial adhesion's under shear rates
in microfluidic system)

[1] S. Lecuyer, et al. 2011. Biophysical Journal, 100:341 – 350.

## 2 Holographie numérique

L'holographie numérique consiste à enregistrer sur un capteur photosensible (caméra) les interférences lumineuses résultantes de l'interaction entre une **onde de référence** $E_R$ (le laser) et les **ondes objets** $E_O$ issues de la diffraction de la lumière par les bactéries.

L'hologramme est une **image** à 2D dont l'information sur la troisième dimension (profondeur) est codée dans les figures d'interférences. La reconstruction du volume éclairé est obtenu par **retro-propagation** numérique des équations du champ diffracté.

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

## 3 Dispositif expérimental et algorithmique

### Montage holographique en ligne de type Gabor

#### Microscope inversé

- Objectif 40x, $\lambda N = 0,9$

- Laser fibré $\lambda = 660$ nm, 65mW

- Caméra 200 Hz, $px = py = 7$ µm

- Champ image $180*180$ µm<fnref n="2" />

#### Dispositif microfluidique :

- capillaire verre ($0,1 \times 1 \times 100$ mm<fnref n="3" />).

#### Bactéries : S. oneidensis MR1

- phase stationnaire ($5.10^7 \pm 3.10^6$)

### Algorithme simplifié de reconstruction d'un hologramme

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

* Algorithme à reproduire pour chaque hologramme afin d'accéder aux trajectoires

* Acquisition : 1 minutes à 100 Hz → 6 000 hologrammes à reconstruire.

* Propagation + analyses : ≈ 1,5 s par hologramme → ≈ 1h30 de traitement.

* Programmation Python + CUDA (calcul GPU).

## 4 Reconstruction des trajectoires et analyses

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

* Reconstruction de trajectoires dans un volume de 100 µm de haut (sens de propagation) par 180*180 µm<fnref n="2" />.

<figure><img src="image_9.png" /></figure>

* Exemple de reconstruction de trajectoire d'une bactérie motile.

<figure><img src="image_10.png" /></figure>

<figure><img src="image_11.png" /></figure>

$$ \bar{v}(t) = \frac{\bar{x}(t + \Delta t) - \bar{x}(t)}{\Delta t} $$

$$ \theta(t) = \cos^{-1} \frac{\bar{v}(t) \cdot \bar{v}(t + \Delta t)}{\|\bar{v}(t) \cdot \bar{v}(t + \Delta t)\|} $$

* Reconstruction de plus d'une centaine de trajectoires en une seule acquisition.

* Caractérisation de l'hétérogénéité de la motilité de la suspension bactérienne : 10 % de motile.

* Possibilité d'analyse des vitesses, des fréquences de rotation, des temps de résidence paroi.

## 5 Conclusions, perspectives

### Bilan de l'étude :

* Développement d'une méthode de microscopie holographique,

* Faisabilité du suivi spatio-temporel d'une suspension de bactérie confinée,

* Simplicité de mise œuvre expérimentale,

* Paramètres ajustables dépendant de la configuration expérimentale,

* Difficulté de reconstruction pour des bactéries en contact.

### Prochaines étapes de travail

* Améliorer l'efficacité de détection -> Approche par Deep Learning,

* Etudier l'influence du confinement et des contraintes hydrodynamiques.

<figure><img src="image_12.png" /></figure>

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

UNIVERSITÉ
DE LORRAINE

<footnote n="1">¹ Université de Lorraine, CNRS, LCPME, F-54500 Nancy, France.</footnote>

<footnote n="2">² Université de Lorraine, CNRS, LEMTA, F-54500 Nancy, France.</footnote>

<footnote n="3">³ EPHE, PSL, UMR CNRS 7564, LCPME, F-54500 Nancy, France.</footnote>