teur programmable, en paillettes 500 µL, sans induction de nucléation, et avec une solution cryoprotectrice à base de propane 1,2-diol et de Cryo3 (Tableau 1). Nos meilleurs rendements de récupération ont atteint 83 % des cellules fraîches, mais certaines expériences avec un matériel plus fragile, moins bien conservé lors de sa préparation, ont induit des rendements de 10 à 40 % seulement. Ces aléas de rendements seront à prendre en compte lors de la constitution de collections en cryobanque, car la qualité initiale de la préparation cellulaire vis-à-vis de son aptitude à la cryoconservation est difficile à évaluer (aucun critère fiable identifié). En revanche, la qualité des cellules décongelées est toujours proche (70 %) ou identique (100 %) au frais, et s'accompagne d'un taux très réduit de débris cellulaires. Cela signifie que, malgré des pertes d'amplitude variable, le matériel présent à la décongélation (après lavages) est de bonne qualité. Pour autant, même la meilleure méthode n'a pu empêcher une perte de 1/2 et 2/3 des cellules 24 h et 48 h post-décongélation respectivement, quels que soient nos efforts d'amélioration. Nous avons cependant observé, par la suite, que ces faibles survies ne sont pas un obstacle au succès de la greffe (voir ci-dessous).

## Stratégie de régénération de la ressource génétique

### Choix du receveur idéal

Au regard de la lourdeur technologique de la greffe (équipement de micromanipulation, formation de personnels à la microinjection, anticipation de la production des alevins receveurs et élevage jusqu'à leur maturité sexuelle), nous pensons que la restauration d'une lignée doit, autant que possible, utiliser la greffe pour assurer la production d'ovules seulement, la voie mâle étant apportée par du sperme cryoconservé de la même lignée. Ainsi, la greffe dans des alevins femelles permet de réduire de moitié le nombre d'individus greffés, et donc également la taille du cheptel à élever jusqu'à maturité. Cela permet, de plus, de réduire de moitié le matériel biologique (gonades immatures) nécessaire au moment de la congélation. Il apparaît donc judicieux d'utiliser des alevins receveurs issus de populations appelées monosexe femelle. Ces populations sont couramment produites en pisciculture, et donc aisément disponibles, grâce à une technologie d'inversion sexuelle permettant de produire des mâles XX dont la descendance sera uniquement femelle.

Un autre requis pour faciliter la restauration d'une lignée est que 100 % des ovules produits par la femelle soient issus des cellules germinales souches greffées, ce qui évite de trier les descendants après fécondation (par tests

génétiques ou phénotypiques). Il est donc nécessaire de disposer d'alevins receveurs stériles (ne produisant pas de gamètes), mais qui ont gardé la capacité à développer des ovaires fonctionnels. Ces populations stériles sont, elles aussi, disponibles en routine en pisciculture : un processus de triploïdisation des embryons juste après la fécondation est mis en œuvre par application d'un choc de pression hyperbare aux œufs fécondés (Chourrout, 1984), ce qui inhibe l'expulsion du second globule polaire de l'ovule. Les ovaires de ces femelles triploïdes se développent normalement, mais ils ont un aspect vide, car leurs ovocytes dégénèrent en début de méiose, avant l'initiation de la vitellogénèse (Lincoln et Scott, 1984). Les ovaires des animaux triploïdes gardent cependant leur capacité à produire des ovules fonctionnels après greffe de cellules germinales souches diploïdes (Okutsu et al., 2007).

### Succès reproducteur des cellules germinales souches testiculaires cryoconservées

Après décongélation, la microinjection des cellules germinales souches est délicate, car ces cellules sont souvent contaminées par un gel d'ADN libéré des cellules altérées, provoquant l'occlusion du microcapillaire. L'ajout de DNase et la réduction de la concentration des cellules injectées font partie des ajustements nécessaires. Au final, les résultats de greffe sont excellents, puisque 89 % des femelles greffées avec des cellules germinales souches purifiées, cryoconservées dans la condition retenue, présentent des ovocytes diploïdes capables d'initier leur vitellogénèse (Figure 4), contre 78 % chez les femelles greffées avec des cellules fraîches. L'importance des colonisations est variable d'une femelle à l'autre, que ce soit chez les lots cryoconservés (Figure 4) ou chez les lots frais, mais il a été montré par ailleurs, dans l'équipe, que cela avait très peu d'incidence sur la quantité et la qualité des ovules produits in fine (Lareyre et al., communication personnelle).

## Évolutions stratégiques : la cryoconservation de fragments testiculaires

Le choix de mettre au point la cryoconservation de cellules germinales souches testiculaires, que ce soit sous leur forme purifiée (enrichies par élutriation) ou sous forme d'une suspension de tous les types cellulaires testiculaires, présentait l'avantage d'une certaine sécurité. En effet, leur manipulation était maîtrisée dans l'équipe, et un savoir-faire important est disponible quant à la cryoconservation de cellules isolées (PGCs, cellules embryonnaires isolées, spermatozoïdes, cellules somatiques cultivées ...). L'intérêt réside également dans une phase de restauration
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Figure 4. Exemple d'ovaires de truites stériles de 1 an. greffées au stade alevin avec des cellules germinales souches testiculaires cryoconservées. A : l'ovaire droit (au-dessus) présente des lamelles ovigères (stries) d'aspect vide, car aucun ovocyte en vitellogénese n'est présent, tandis que l'ovaire gauche (au-dessous) est largement colonisé par des ovocytes vitellogéniques (d'aspect orangé) (accolade blanche). B : Autre exemple où les deux ovaires comportent quelques îlots d'ovocytes vitellogéniques (flèches). Barre d'échelle : 5 mm.</figcaption></figure>

relativement simplifiée avec ce matériel, puisqu'il suffit de décongeler les cellules, de les laver et de les injecter dans les alevins receveurs. A contrario, la phase de préparation du matériel avant congélation imposée par cette stratégie peut constituer un frein à l'entrée en cryobanque d'une quantité importante de matériel. Il nous a donc semblé judicieux, dans un second temps, de développer une méthode de cryoconservation de fragments testiculaires, afin que l'étape de digestion des tissus et de dissociation des cellules soit reportée au moment de la décongélation, lorsque le besoin de restauration de la lignée est avéré.

Une difficulté importante, avec les fragments testiculaires, a été d'évaluer les rendements de récupération de cellules qui permettaient de discriminer les conditions, du fait de la grande hétérogénéité des contenus cellulaires entre fragments, y compris au sein d'un même individu. Nous avons cependant pu établir une méthode répétable de cryoconservation lente de fragments testiculaires, basée sur la méthode en cellules isolées en congélateur programmable (Figure 5, Planer), avec du Cryo3, et en cryotubes. Nous avons aussi éliminé le recours à la congélation de testicules entiers ou la congélation en boite de congélation à -80 °C (Figure 5, CCBox), pour cause de rendements trop faibles ou trop aléatoires en termes de probabilité de succès. Les meilleurs rendements cellulaires obtenus sont bas, 1-4 % de cellules totales récupérées par rapport au frais. Ces taux restent cependant acceptables pour l'entrée de matériel en cryobanque. Ils impliquent de cryoconserver les testicules d'environ 90 poissons (âgés de 9 mois) pour obtenir un nombre de cellules décongelées suffisant pour greffer 200 alevins (donnant des centaines de descendants chacun).

Nous avons finalement testé une dernière stratégie de congélation, la vitrification. L'avantage de la vitrification est qu'elle suppose de plonger directement les tissus dans l'azote liquide (stérile), ce qui nous affranchit du congélateur programmable nécessaire pour la congélation lente. La congélation par vitrification consiste à limiter au maximum

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Figure 5. Performances des différentes méthodes de fragments testiculaires mises au point. Congélation lente en congélateur programmable (Planer) et en boite de congélation à -80 °C (CCbox) ; Congélation par vitrification en brochettes (Vitrif) et par vitrification en système à haut débit (Vitrif HD).</figcaption></figure>
la formation de cristaux de glace, en procédant à une des-
cente en température extrêmement rapide, et en utilisant
des cryoprotecteurs perméants à très forte concentration,
pour inhiber la croissance des cristaux. Un écueil de la vitri-
fication est que l'usage de concentrations élevées de cryo-
protecteurs peut être toxique pour les cellules, et qu'il est
très difficile d'assurer une congélation/décongélation assez
rapides pour empêcher la formation de glace. Afin d'assurer
les meilleurs échanges thermiques entre les fragments tes-
ticulaires et l'azote liquide ou le milieu de décongélation,
nous avons d'abord testé la vitrification en « brochettes »
(Wang et al., 2008 ; Liu et al., 2012 ; Marinovic et al., 2018)
où des fragments d'une vingtaine de milligramme sont en-
filés séparément sur une aiguille d'acupuncture, avant im-

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>Figure 6. Fragments testiculaires sur les aiguilles d'acupuncture dans le bain de cryoprotecteur.</figcaption></figure>

mersion dans différents bains de cryoprotecteurs puis dans
l'azote liquide (Figure 6).

Cette procédure de vitrification en brochettes nous a per-
mis, contre toute attente au vu des aléas de la vitrification,
d'augmenter jusqu'à 10 fois les taux de récupération de cel-
lules totales (Figure 5, Vitrif). Nous avons ensuite adapté ce
protocole, afin d'alléger la procédure de mise en brochettes
très longue à mettre en œuvre et source de risque de dégra-
dations et donc de variabilité (manipulation hors du milieu,
hors du froid). La procédure finale retenue, basée sur un

système de plongeoir refroidi et de manipulation de plu-
sieurs dizaines de fragments en paniers, est plus adaptée à
l'entrée en cryobanque de grande quantité de matériel, et
elle nous a donné les mêmes rendements de récupération
que la procédure en brochettes (Figure 5, Vitrif HD),

Application à la conservation en conditions
de terrain

La cryoconservation de fragments testiculaires, et la dé-
congélation et greffe des cellules ont été testées en condi-
tion de terrain, à la pisciculture expérimentale INRAE PEI-
MA. Un personnel formé et habilité pour le sacrifice et la
dissection des poissons a réalisé la collecte des testicules.
D'après les taux de récupération attendus à la décongéla-
tion, nous avons estimé à 10 le nombre de mâles de 9 mois
nécessaires pour greffer 180 alevins (obtention de 1,2 g
de testicules immatures, collecte réalisée en 30 min). La
vitrification à haut débit a été réalisée sur le site, dans un
bain d'azote liquide, suivie d'un stockage en cryotubes sous
azote liquide. Le lendemain, les fragments ont été déconge-
lés par immersion dans des bains successifs de milieu de
décongélation, et ils ont été dissociés enzymatiquement
et mécaniquement par un personnel de laboratoire, avec
un taux de récupération de 8 500 cellules/mg de testicule
(17 % du frais). La greffe dans des alevins receveurs a été
réalisée le jour même par une personne de la pisciculture
qui avait été préalablement formée à la micromanipulation
par notre équipe. Cette personne, avec l'aide d'un préposé
à la préparation des alevins et des cellules, a greffé les 180
alevins en moins de 60 min. Les survies des alevins ont été
conformes aux résultats habituels de greffe : 42 % de survi-
vants à 4 mois, puis rares mortalités jusqu'à 12 mois. Pour
cette expérience de terrain, nous avons greffé des alevins
mâles et femelles. Après 1 an, les receveurs triploïdes gref-
fés présentaient des ovocytes vitellogéniques (receveurs
femelle) ou des cellules spermatogoniales diploïdes (re-
ceveurs mâles), et la proportion de receveurs positifs a été
équivalente entre greffés avec des cellules cryoconservées
et avec des cellules fraîches (Figure 7). Cela confirme donc
les excellents résultats que nous avions déjà obtenus après
cryoconservation de suspensions de cellules testiculaires
enrichies en cellules germinales souches.

Le potentiel reproducteur des cellules cryoconservées a été
testé un an après la greffe, du fait de difficultés à mainte-
nir tous les lots expérimentaux en élevage pendant les 2
et 3 années nécessaires à l'obtention de spermatozoïdes
et ovules matures. Pour confirmation, des lots issus de
cryoconservation sont cependant toujours en élevage à
<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 7. Succès de développement de gamètes après greffe de cellules testiculaires totales issues de testicules frais (Frais) ou vitrifiés (cryo), en conditions de pisciculture (graphe de gauche).</figcaption></figure>

Les animaux âgés de 1 an ont été phénotypés comme suit : chez les femelles, le développement d'ovocytes vitellogéniques permet de discri-
miner visuellement les gonades colonisées (photos A et B) des gonades négatives (photo C) (barre d'échelle 5 mm) ; chez les mâles, la présence
de cellules spermatogoniales diploïdes doit être recherchée par cytométrie en flux (cytogrammes à droite). La nature triploïde du receveur est
attestée par le pic unique de cellules sanguines en position 3n (haut). La présence de cellules diploïdes (2n) parmi les cellules testiculaires (bas)
atteste de la colonisation des gonades et de la prolifération des cellules germinales souches greffées.

INRAE PEIMA (croissance et survies normales), et notre
expérience en frais nous laisse augurer des taux de succès
similaires entre les observations à 1 an et les observations à
maturité. De plus, malgré le succès de la vitrification à haut
débit et son applicabilité, quelques ajustements techniques
peuvent encore être apportés. Par exemple, les fragments
testiculaires vitrifiés, qui se manipulent comme des perles,
ont été regroupés dans des cryotubes. Leur incorporation
dans des paillettes 1 ml (IMV Technologies) est prévue, pour
un stockage dans les mêmes containers que les paillettes
de semence.

Conclusion

L'ensemble de ce travail a conduit à définir deux procédures
de cryoconservation de cellules germinales souches, l'une
sur cellules testiculaires isolées, l'autre sur fragments testi-
culaires ; toutes deux permettent un succès de colonisation
des gonades des receveurs équivalent aux contrôles frais
(Tableau 2). À ce stade, ces méthodes peuvent déjà être uti-
lisées pour l'entrée en cryobanque de ce matériel indispen-

sable à la conservation complète de différents génotypes
chez les poissons. Pour autant, les étapes de dissection de
gonades, de dissociation cellulaire et de greffe des alevins
restent exigeantes techniquement. Une réflexion est en
cours sur l'organisation à mettre en place pour intégrer cette
technologie à l'offre des centres de congélation aquacoles,
et pour la rendre disponible sur certains sites piscicoles.

La greffe permet la production de gamètes fonctionnels et alimente certaines questions scientifiques de l'équipe. Par exemple, la façon dont les cellules germinales souches intègrent la gonade larvaire n'est pas connue. On ignore si les cellules sont incorporées avec leur propre niche (cellules de Sertoli), si elles s'intègrent dans des régions fragilisées de la gonade receiveuse, et si elles s'intègrent en paquet dans un îlot donné ou individuellement. Ces interrogations ont pour corollaire la diversité génétique des gamètes régénérés, car on ignore encore s'ils sont issus de tous les mâles représentés dans le pool testiculaire ou de seulement quelques-uns (des travaux utilisant des mélanges de cellules germinales souches issues de donneurs de lignées isogéniques diffé-

<table><caption>Tableau 2 : Caractéristiques des méthodes de cryoconservation des cellules germinales souches testiculaires (CGS)</caption>
  <thead>
    <tr>
      <th>Animal donneur / Receveur</th>
      <th colspan="3">Mâles adultes sexuellement immatures / Alevins femelles triploïdes stériles</th>
    </tr>
    <tr>
      <th>Matériel biologique utilisé pour la cryoconservation</th>
      <th>CGSs enrichies par élutriation</th>
      <th>Fragments testiculaires</th>
      <th>Fragments testiculaires</th>
    </tr>
    <tr>
      <th>Mode de congélation</th>
      <th>Lent, en paillettes 500 µL</th>
      <th>Lent, en cryotubes</th>
      <th>Rapide, vitrification à haut débit</th>
    </tr>
  </thead>
  <tbody>
    <tr>
      <th>Rendements de récupération de cellules à la décongélation</th>
      <td>10-83 %</td>
      <td>1-4 %</td>
      <td>10-40 %</td>
    </tr>
    <tr>
      <th>Potentiel reproducteur / frais (% de gonades colonisées à 1 an)</th>
      <td>100 %</td>
      <td>Non testé</td>
      <td>100 %</td>
    </tr>
    <tr>
      <th>Nombre de donneurs de 9 mois nécessaires pour 180-200 receveurs</th>
      <td>10</td>
      <td>90</td>
      <td>10</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
rentes sont en cours). Un autre axe de recherche concerne la pérennité des collections lorsque le matériel est décongelé. Il serait particulièrement précieux de pouvoir dériver une partie des cellules décongelées pour les mettre en culture, les faire proliférer et les recongeler. Cela éviterait de devoir attendre le développement des descendants pour régénérer la collection. Des stratégies originales de culture en organoïdes sont à l'étude dans l'équipe. De même, l'intégrité épigénétique des gamètes produits par greffe est un élément de recherche en cours, notamment au niveau de la méthylation de l'ADN, du fait de l'importance de cette marque pour l'embryon (Labbé et al., 2017).

La diffusion de cette stratégie de conservation à d'autres espèces est bien sûr envisagée, d'autant plus que le nombre d'espèces aquacoles domestiquées augmente. On peut considérer que la cryoconservation des fragments testiculaires devrait être adaptable, du fait des similitudes tissulaires des testicules de différentes espèces. En revanche, nous avons déjà l'expérience d'espèces dont les alevins sont très petits, ou très fragiles vis-à-vis de l'injection, ce qui rend ces espèces difficiles à régénérer par greffe. Des études sont initiées dans l'équipe, et dans la communauté internationale (revu par Yoshizaki et Yasawa, 2019), pour développer la greffe interspecifique : les cellules germinales souches de l'espèce d'intérêt sont greffées à des alevins d'une espèce proche dont l'élevage est aisé et maîtrisé.

Les applications en aquaculture sont majeures pour la conservation, mais aussi pour raccourcir l'intervalle entre générations d'espèces à puberté tardive, ou pour produire des individus génétiquement stériles ou issus d'espèces dont la maturation sexuelle finale n'est pas maîtrisée (Yoshizaki et Yasawa, 2019).

Il convient de préciser, cependant, que le recours à la cryoconservation de cellules germinales souches adultes peut être empêché en l'absence d'animaux donneurs à des stades adaptés, ou face à des individus particuliers dont le sacrifice n'est pas envisageable. Une stratégie complémentaire à l'étude est la cryoconservation de cellules de peau (nageoires), car les fragments de nageoires sont disponibles et collectables à haut débit, sans sacrifier l'animal et quels que soient son âge et son sexe. Ces cellules somatiques impliquent, toutefois, de maîtriser la régénération par transfert nucléaire (Martinez-Paramo et al., 2017), et notamment de surmonter les difficultés liées à l'obtention de descendants intègres épigénétiquement (Depincé et al., 2021) et génétiquement (perte de l'ADN mitochondrial). L'ensemble de ces études, incluant les promesses des unes et les progrès des autres, permettent d'envisager, à terme, la mise à disposition d'un choix de technologies de la conservation adaptées aux contraintes des espèces et au contexte environnemental et sociétal dans lequel elles seront mises en œuvre. ■

## Remerciements

Ce travail a été financé par le PIA CRB Anim ANR-11-INBS-0003, par les projets européens AQUAEXCEL2020 et AQUAEXCEL3.0, et par le projet FEAMP BIOGERM mesure 47 (Innovation Aquaculture). Les auteurs remercient les personnels des installations expérimentales de INRAE LPGP et de la pisciculture INRAE PEIMA pour le soin apporté à la production des donneurs, des receveurs et à l'élevage des précieux animaux greffés.

## Références

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<figure><img src="image_47.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
FOCUS

Conserver les sols :
pourquoi et comment ?

Nicolas SOLER-DOMINGUEZ<fnref n="1" />

Céline RATIÉ<fnref n="2" />

Céline FAIVRE-PRIMOT<fnref n="3" />

Samuel MONDY<fnref n="4" />

CORRESPONDANCE

nicolas.soler-dominguez@inrae.fr

celine.ratie@inrae.fr

celine.faivre-primot@inrae.fr

samuel.mondy@inrae.fr

Pour comprendre le fonctionnement et les cycles du sol, il faut pouvoir l'étudier, donc le conserver. Plusieurs Infrastructures participent à une meilleure connaissance et gestion des sols, grâce à une approche pluridisciplinaire : les Observatoires de Recherche de l'Environnement (https://hal.archives-ouvertes.fr/hal-02330284), les zones Ateliers (https://www.za-inee.org/), les Infrastructures de Recherche comme AnaEE ou RARE, les plateformes d'expérimentation en milieu contrôlés ou In Natura, ou encore les groupements scientifiques.

En particulier à INRAE, deux structures ont été montées avec comme activité principale la conservation de sols : le Conservatoire Européen des Échantillons de Sols (https://doi.org/10.15454/VCZ6BS Orléans, Centre Val de Loire) et le Centre de Ressource Génétique de la plateforme GenoSol (https://doi.org/10.15454/L7QN45 Dijon, Centre Bourgogne - Franche-Comté). Ces deux outils sont complémentaires et permettent de répondre aux enjeux pluridisciplinaires de l'institut et à ses objectifs, en particulier sur la composante sol, que ce soit dans le cadre de l'objectif 4pour1000 (https://www.4p1000.org/fr) ou dans la réponse des sols au dérèglement climatique. Focus sur ces deux Infrastructures Scientifiques Collectives d'INRAE (labellisées ISC).

<footnote n="1">1 Unité InfoSol US 1106 - Responsable technique du Conservatoire Européen des Échantillons de Sols.</footnote>

<footnote n="2">2 Unité InfoSol US 1106 - Responsable de la plateforme CEES.</footnote>

<footnote n="3">3 UMR Agroécologie 1347 - Responsable CRG de la plateforme GenoSol.</footnote>

<footnote n="4">4 UMR Agroécologie 1347 - Responsable de la plateforme GenoSol.</footnote>
## Le sol, une interface vitale et complexe

Le sol est une couche meuble qui résulte de l'interaction entre la lithosphère (dégradation de la roche-mère), l'atmosphère, l'hydrosphère et la biosphère. Non renouvelable à l'échelle d'une génération humaine, il se définit habituellement par sa composition et ses propriétés.

C'est un véritable capital naturel, caractérisé par le stockage de matière minérale et organique, par la biodiversité qu'il héberge, mais aussi par les flux qu'il génère et qui permettent de fournir nombre de services répondant à des besoins humains. Ces services que l'on qualifie de services écosystémiques (Figure 1) sont regroupés en quatre grandes catégories i) services de support ii) services d'apprévisionnement iii) services de régulation iv) et services culturels. Ils permettent de remplir de nombreux besoins : physiologique, santé, sécurité, nourriture et habitat.

Pour comprendre le fonctionnement et les cycles du sol, il faut pouvoir l'étudier ; et ce, à de multiples échelles, tant d'un point de vue spatial, en intégrant la composante en trois dimensions du sol, que temporel, en regardant l'évolution du sol en fonction des saisons et de l'hygrométrie, en particulier dans un contexte de dérèglement climatique.

La conservation du sol provenant de dispositifs naturels ou d'expérimentation devient un challenge important pour i)

La valorisation de dispositifs expérimentaux de long terme et ii) la mise en conservation d'échantillonnage de grande ampleur, tel le Réseau de Mesures de la Qualité des Sols (RMQS). Cette conservation a pour but la mise en mémoire

des sols et contribue à une meilleure compréhension de ses mécanismes. Il est important de noter que les conditions de stockage de ces échantillons sont dépendantes des questions scientifiques : les solutions techniques et de gestion des aliquots seront différentes et adaptées en fonction des questions.

## Les enjeux de la conservation des sols

Les changements actuels liés au dérèglement climatique, l'anthropisation croissante des écosystèmes et la volonté d'engager la transition agroécologique nécessitent d'avoir à disposition du monde scientifique des témoins et des standards d'échantillons de sols qui pourront être comparés aux échantillons qui seront prélevés dans le futur. De plus, les importants investissements financiers et humains, dans le cas de dispositifs expérimentaux ou de suivi à long terme, exigent de pouvoir valoriser le travail accompli. Il est ainsi primordial de pouvoir conserver des quantités suffisantes d'échantillons de sols, mais aussi de garantir la stabilité de leurs caractéristiques et propriétés, sur le long terme, pour pouvoir les remobiliser ; en effet, les avancées technologiques font qu'il sera possible d'analyser ultérieurement ces échantillons avec des méthodes de rupture. Ce principe de prévoir la réalisation des analyses a posteriori avec des techniques non disponibles au moment du prélèvement est un point crucial de la conservation. En effet, il permettra, en fonction des évolutions observées d'indicateurs, de vérifier le niveau en amont et d'appréhender les dynamiques

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>Figure 1. Les services écosystémiques selon le Millenium Ecosystem Assessment (source Metro Vancouver)</figcaption></figure>
spatiales et temporelles sous-jacentes. Ces analyses a posteriori pourraient répondre à des **problématiques émergentes** ou à de nouvelles questions non présentes au moment de l'échantillonnage.

Les techniques d'analyses, les seuils de détection de différents éléments s'affinent au fur et à mesure des années, la remobilisation d'échantillons conservés permet la mise en évidence de **nouvelles informations** non accessibles avant. De plus, des conditions stables de conservation, associées à un suivi métrologique, doivent permettre de vérifier la stabilité ou non des échantillons conservés, en particulier **l'évaluation d'éventuelles dérives analytiques** dans le temps. L'utilisation d'échantillons standards doit permettre de distinguer ce qui ressort des facteurs de forçage plus que d'évolutions des caractéristiques des sols au cours du stockage. Par exemple, la quantité de Carbone organique en fonction des conditions de stockage (lyophilisation ou

non, conservation à température ambiante ou congélation) peut varier au cours du stockage. Il est impératif de pouvoir évaluer ces évolutions. Enfin, la conservation des échantillons permet de découpler prélèvement et analyses, ce qui permet de rendre possible des analyses pour lesquelles aucun budget n'était disponible au moment du prélèvement. Les mesures et analyses des caractéristiques du sol peuvent être de plusieurs natures (Figure 2). Ainsi, le CEES (Conservatoire Européen des Échantillons de Sols) et le CRB (Centre de Ressources Biologiques) de la plateforme GenoSol, bien que travaillant sur la même matrice environnementale, le sol, ne mesurent pas les mêmes choses. Le CEES vise plus à permettre la caractérisation physico-chimique et donc une conservation permettant ce type d'analyse, tandis que la plateforme GenoSol s'intéresse aux mesures de l'activité biologique, en particulier de la diversité des micro-organismes (bactéries, archées et champignons).

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>Figure 2. Diversité des paramètres mesurables pour un échantillon de sol. Les mesures peuvent être physiques, chimiques, biologiques ou biochimiques.</figcaption></figure>
Les différentes analyses nécessitent des masses différentes et des modes de préparation différents, qui ont un impact sur les processus de préparation des échantillons (Tableau 1). Le dimensionnement des structures de conservation et les flux analytiques sont donc variés, et dépendent du type d'analyses ainsi que des questionnements scientifiques ou sociétaux auxquels ces analyses doivent répondre.

<table><caption>**Tableau 1: Relation entre analyses, prise d'essai et mode de préparation, et horizons étudiés**</caption><thead><tr><td>Analyses</td><td>Prise essai</td><td>Préparation échantillon</td><td>Commentaire</td></tr></thead><tbody><tr><td>Activité enzymatiques</td><td>Quelques dizaines de grammes</td><td>Frais Tamisé 5mm</td><td>Sur horizon de surface</td></tr><tr><td>Microbiologie : approche cultivable</td><td>Quelques grammes</td><td>Sec ou frais tamisé</td><td>Sur horizon de surface</td></tr><tr><td>Microbiologie : approche moléculaire</td><td>1g</td><td>Lyophilisé et tamisé 4mm</td><td>Sur horizon de surface</td></tr><tr><td>Physico-chimie</td><td>De 1 à quelques centaines de grammes</td><td>Brut, broyé à 2mm, broyé<250µm</td><td>Sur différents horizons</td></tr><tr><td>Mésofaune</td><td>Cylindre 5cm diamètre</td><td>Sol brut</td><td>Sur horizon de surface (Profondeur 4cm)</td></tr><tr><td>Lombric</td><td>In situ sur 3*1m²</td><td>Extraction formol/ moutarde ou test bêche</td><td></td></tr><tr><td>Macrofaune totale</td><td>Bloc sol 25*25*15 cm</td><td>Sol brut</td><td>Sur différents horizons</td></tr><tr><td>Stock semencier</td><td>300g</td><td>Sol brut non remanié</td><td>Sur horizon de surface</td></tr></tbody></table>

## Le Conservatoire Européen des Échantillons de Sols (CEES) : un bâtiment en terre pour stocker des échantillons de sols...

Le Conservatoire des Sols est géré par l'unité InfoSol d'INRAE. Géographiquement implanté sur le Centre d'Orléans (https://www.gissol.fr/le-gis/conservatoire-des-sols-992), il est rattaché au Département AgroEcoSystem. L'unité InfoSol dépend directement du Groupement d'Intérêt Scientifique «Sol» Gis Sol (https://www.gissol.fr/). Ce GIS a été créé, en 2001, à l'initiative de plusieurs partenaires (le ministère de la transition écologique, le ministère de l'agriculture et de l'alimentation, l'ADEME, l'IGN, l'IRD, l'OFB, le BRGM et INRAE) ; il a pour but de constituer et de gérer le système d'information sur les sols de France, en vue de répondre aux demandes des pouvoirs publics et de la société, aux niveaux local et national.

Le Gis Sol conçoit, oriente et coordonne l'inventaire géographique des sols, le suivi de leurs propriétés et l'évolution

de leur qualité, en même temps qu'il gère le système d'information sur les sols (Donesol). Il assure également la valorisation des données sur les sols de France, en cohérence avec les programmes européens.

Le CEES constitue un outil collectif d'INRAE dont l'objectif principal est la conservation à long terme d'échantillons de sols. Il a été mis en place, en 2003, pour les échantillons de sols prélevés dans le cadre du Réseau de Mesures de la Qualité des Sols (RMQS). Ses activités se sont par la suite étendues, d'une part, aux échantillons issus des programmes nationaux d'inventaires de sols et, d'autre part, à des échantillons issus de programmes scientifiques de surveillance des sols, comme le projet européen Integrated Carbon Observation System (ICOS).

L'équipe du Conservatoire est composée de cinq personnes. Le CEES est un local de stockage d'environ 370 m² qui contient environ 70 000 échantillons, soit 98 tonnes, conservés en conditions contrôlées, adossé à un laboratoire comprenant une salle de réception/préparation des échantillons, salle de séchage, salle des étuves et une salle de lavage. Il utilise la base de données de l'Unité, Donesol, pour l'enregistrement des échantillons et toute la traçabilité de leur traitement, depuis leur arrivée au Conservatoire jusqu'à leurs divisions successives par création d'aliquotes pour envoi aux laboratoires partenaires ou pour des mises à dispositions ultérieures (Figure 3).

Donesol permet d'enregistrer la description du profil faite sur le terrain, d'où sont prélevés les échantillons. Ces derniers, après vérification de leur validité par rapport au cahier des charges, sont rattachés aux horizons décrits ; l'historique de leurs actions est enregistré jusqu'à leur stockage définitif. En fin de chaine, la BdD permet d'associer à ces données pédologiques les résultats des analyses faites dans différents laboratoires INRAE ou non-INRAE, en fonction des projets associés.

Le Conservatoire a pour vocation de garder le plus longtemps possible les échantillons à disposition pour des projets scientifiques, de nouvelles analyses ou encore des ré-analyses en fonction de problématiques. Dans ce cadre,

<figure><img src="image_50.png" /></figure>
les objectifs de la conservation sont :

* Construire la mémoire de nos sols pour pouvoir remonter le temps.

* Prévoir les évolutions en termes d'analyses : fournir un même échantillon quelques années plus tard pour faire des analyses dont le seuil de détection a été amélioré ou encore faire une analyse qui n'était pas possible ou trop coûteuse quelques années plus tôt.

* Mettre à disposition une banque d'échantillons et les méladonnées associées.

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>Figure 3. Process de mise en conservation : de la réception à la conservation des sols</figcaption></figure>

Le CEES étant une plateforme INRAE, on pourrait considérer qu'il a vocation à recevoir tous les échantillons de sols provenant de dispositifs expérimentaux ou d'observatoires environnementaux patrimoniaux. Or, de par la capacité de stockage limitée du conservatoire et la nature du process de mise en conservation, l'intégration des échantillons est soumise à conditions :

* Le lot d'échantillons doit correspondre à une étude pédo- logique déjà présente (ou saisie à l'occasion) dans la Base de Données nationale Donesol.

* Le lieu de prélèvement de l'échantillon est repéré par des coordonnées géographiques (en BdD).

* L'échantillon doit être intègre (ne pas avoir subi de modération physique, séchage à température élevée, etc.)

* L'échantillon doit être en quantité suffisante entre 500 g et 1 kg en moyenne.

Les demandes de stockage comme les demandes de mise à disposition d'échantillons sont arbitrées par le Gis Sol qui gouverne l'Unité InfoSol et le CEES.

## Le Centre de Ressources Génétiques de la plateforme GenoSol

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

La deuxième structure INRAE dont le cœur de métier est la conservation à long terme de matrices environnementales se situe dans l'UMR Agroécologie de Dijon ; elle a pour objectif le stockage et la caractérisation moléculaire d'échantillons de sols par des approches de communautés microbiennes.

La plateforme GenoSol a été créée, en 2008, au sein de l'UMR Agroécologie INRAE, centre Bourgogne-Franche-Comté de Dijon (https://www2.dijon.INRAE.fr/plateforme_genosol/). Cette plateforme offre une infrastructure unique en Europe, dont l'objectif est de fournir une structure logistique et technique assurant l'acquisition, la conservation, la caractérisation et la mise à disposition des ressources génétiques (ADN) des sols issus d'échantillonnages de grande envergure. Elle s'articule autour de trois structures principales :

* Un **Centre de Ressources Génétiques (CRG)** qui a pour but de stocker et de conserver les ressources génétiques (sols et ADN) et de les mettre à disposition de la communauté scientifique.

* Un **Laboratoire d'Analyses et de Développement Moléculaires**. Cette **plateforme technique** a pour but de développer la veille technologique sur les méthodes d'extraction des acides nucléiques des sols et les outils de caractérisation des ressources génétiques microbiennes. La plateforme a, dans un premier temps, travaillé sur des approches de type métabarcoding (amplification de gènes marqueurs). Elle évolue en ajoutant à son offre de services des extractions permettant des approches métagenomiques et métatranscriptomiques.
* **Un Système d'Information Environnementale (SIE) centré sur le développement de la base de données MicroSol-database** (http://prodinra.inra.fr/record/20022) qui permet, d'une part, de gérer le conservatoire, les métadonnées associées aux sols et la traçabilité de ses échantillons (lieu de stockage, suivi des opérations sur les sols) et, d'autre part, de stocker les données issues des analyses du LADM.

La plateforme GenoSol, pour ses activités de conservatoire et de SIE, est articulée avec le CEES d'INRAE Orléans qui, via la base de données Donesol, stocke les résultats des analyses physico-chimiques des sols (Carbone, azote, pH, polluants ...). Sur les 21 000 sols stockés au sein du CRG de la plateforme GenoSol, environ 4 000 sols sont communs avec ceux d'InfoSol. Ces deux conservatoires sont destinés à des communautés scientifiques et professionnelles différentes (science du sol, pour InfoSol, et biologie/écologie pour GenoSol). La plateforme s'est engagée dans une démarche d'amélioration continue, dès sa création, qui a été couronnée par une certification ISO9001, en 2015, pour le CRG, puis pour la totalité du périmètre de la plateforme en 2018.

proposée, lors des périodes habituelles d'échantillonnage (février à mai), et sur les dispositifs en démarrage, pour assurer la formation des personnels des sites au prélèvement et à la préparation. Les échantillons de sols conservés proviennent en majorité de réseaux de surveillance et d'observation des sols (nationaux et européens), de sites expérimentaux pérennes (INRAE, CNRS, IRD, Institut technique agricole...) et de réseaux d'exploitations agricoles. Tous ces sites sont impliqués dans des questionnements en lien avec l'évaluation environnementale des modes d'usages des sols, et trouvent dans la plateforme GenoSol une aide logistique pour renforcer les systèmes d'observation de la biodiversité tellurique. À ce jour, plus de 21 000 sols sont stockés dans le CRG, et 600 à 1 000 nouveaux sols arrivent annuellement. Les locaux de 150 m² abritent 20 congélateurs -40 °C d'une capacité de 1 440 échantillons chacun. Deux congélateurs de secours sont prévus pour permettre la mise en sécurité des échantillons en cas de pannes.

Après avoir échantillonné le dispositif, les sols sont homogénéisés puis tamisés à 4 ou 5 mm pour obtenir un échantillon de sol représentatif, dépourvu de la majorité

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>Figure 4. Process de mise en conservation des échantillons des sols au sein de la plateforme GenoSol</figcaption></figure>

Le Centre de ressources génétiques de la plateforme GenoSol a pris le parti de conserver les informations génétiques des microorganismes (ADN) dans sa matrice originelle. Ainsi, le mode de conservation est axé sur la conservation du sol. L'ADN nécessaire à l'alimentation des outils moléculaires est extrait à partir d'une fraction de ce sol conservé (1 g). La conservation mise en place vise à garantir l'absence de modification biologique à l'intérieur de l'échantillon.

Le CRG se compose actuellement d'une Technicienne de Recherche à temps plein. Son activité principale est la gestion de la collection avec la réception et le tamisage des échantillons, leur mise en conservation, le suivi des installations et la fourniture des échantillons pour le laboratoire d'analyses moléculaires. Une activité de conseil sur la stratégie d'échantillonnage et l'aide au prélèvement est aussi

des éléments non concernés par les analyses ultérieures (cailloux, débris végétaux, restes animaux...). Ils sont ensuite réceptionnés au CRG et congelés à -30 °C. Cette étape de congélation permet de stopper la vie biologique de l'échantillon et prépare le sol à la lyophilisation (Figure 4). Les acides nucléiques dans les sols sont dégradés par des enzymes nucléiques microbiennes. Le retrait de l'eau par lyophilisation empêche le fonctionnement de ces enzymes. La lyophilisation est un processus où l'eau est retirée par sublimation à partir d'un échantillon congelé sous une contrainte de vide. Pendant une cinquantaine d'heures, le sol est soumis à des températures négatives (-80 °C) et en contrainte de vide poussé (0.01 mBar). L'échantillon ainsi dépourvu de son eau acquiert une stabilité dans les conditions de stockage choisies par le CRG. En effet, même après lyophilisation, le stockage à long terme en température négative permet de conserver l'information liée à l'ADN
et à l'ARN. La lyophilisation présente un double avantage : elle permet à la fois de stabiliser l'échantillon et de pouvoir travailler sur un échantillon pour lequel la prise d'essai se fait sur la masse sèche. Cela permet de faire voyager des échantillons d'un pays à l'autre dans un délai raisonnable tout en assurant une bonne conservation de l'information génétique.

## Le CEES et GenoSol, des infrastructures en relation étroite

Le Réseau de Mesures de la Qualité des Sols (RMQS https://www.gissol.fr/le-gis/programmes/rmqs-34) est un outil de surveillance des sols à long terme. Les sols évoluent constamment sous l'effet de grands facteurs naturels et sous l'effet des activités humaines (usages, aménagements fonciers, pratiques agricoles, épandages de boues, retombées atmosphériques, pollutions accidentelles...). Ces évolutions d'origine anthropique sont, la plupart du temps, préjudiciables au maintien de la qualité des sols. Elles sont le résultat de processus longs et cumulatifs, difficilement détectables et dont certains sont parfois irréversibles à l'échelle de temps humaine. Le maintien de la qualité des sols rend indispensable de détecter, de façon précoce, l'apparition et les tendances de ces évolutions, à l'aide de programmes d'observation et de suivi de la qualité

des sols. Depuis l'an 2000, le RMQS répond à ces objectifs d'évaluation et de suivi à long terme de la qualité des sols de France (Figure 6). Le RMQS repose sur le suivi de 2 240 sites répartis uniformément sur le territoire français (métopole et outre-mer), selon une maille carrée de 16 km de côté. Des prélèvements d'échantillons de sols, des mesures et des observations sont effectués, en moyenne, tous les quinze ans au centre de chaque maille. La première campagne de prélèvement en métropole (RMQS1) s'est déroulée de 2000 à 2009 et a permis la mise en place de 2 170 sites. La deuxième campagne métropolitaine (RMQS2) a débuté en 2016 et s'étend jusqu'en 2027. Le RMQS couvre également les départements d'Outre-mer, avec 70 sites répartis aux Antilles, à la Réunion, à Mayotte et en Guyane. L'évaluation et le suivi de la qualité des sols sont fondés sur l'analyse de propriétés physiques, chimiques et biologiques des sols, associées à la recherche des sources de contamination diffuse et à la connaissance de l'historique de l'occupation et des pratiques de gestion de chaque site. De nouveaux paramètres ont été ajoutés, afin de mieux évaluer la sensibilité des sols en contexte de changement climatique (réserve utile, matières organiques particulaires, stocks de carbone profond). Des perspectives d'adosser au RMQS un programme de phytopharmacovigilance dans les sols et un réseau de surveillance de la biodiversité du sol (faune, flore, microorganismes bactériens et fongiques) sont à l'étude. Au total, ce sont 5 à 20 kg de terre par échan-

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>Figure 6. Ensemble de l'offre de service des plateformes « sol » d'INRAE</figcaption></figure>
tillon qui sont envoyés et stockés au CEES, et 500 g à Geno-Sol. Ce type de programme de grande envergure intéresse nombre de champs thématiques et voit son aire d'influence augmenter au gré des appels d'offres. Pourtant, l'équipe de base reste la même.

La banque d'échantillons ainsi constituée permet d'accéder
à un ensemble d'échantillons géoréférencés et représenta-
tifs de la variété des sols français et de leurs occupations, lui
conférant un caractère hautement patrimonial.

Perspectives des infrastructures

Au niveau du CEES, la quantité de matériel géré a mis en évidence des besoins d'évolution dans l'archivage des échantillons. Une réflexion est en cours pour essayer d'automatiser la sortie des échantillons et éviter ainsi des manipulations humaines, notamment le port de lourdes charges. Cette innovation permettrait d'optimiser la place et le contrôle des conditions de stockage. Un projet d'agrandissement avec un bâtiment enterré moins énergivore, associant stockage souterrain et bureaux à la surface, est en cours de réflexion.

Si l'ambition actuelle des deux structures CEES et CRG GenoSol est orientée vers la conservation à long terme des échantillons environnementaux, il leur tient à cœur de pouvoir mesurer l'impact de la conservation sur les informations contenues dans ces sols. Pour ce faire, chaque structure analyse un même échantillon, pour comparer ses caractéristiques et/ou sa structure, à des temps de conservation différents. Ces processus de vérification sont cependant coûteux en temps et en ressources et nécessiteraient donc d'être soutenus par les tutelles.

Le CRG GenoSol est en cours de déploiement d'une solu-
tion de traçabilité qui remplacerait le système d'informa-
tions actuel. Ce LIMS (Laboratory Information Management
System) est commun aux laboratoires avec lesquels Geno-

Sol travaille régulièrement (BioChemEnv et le LAS d'Arras) et permettrait, avec un même outil, de centraliser dans une même base de données tous les paramètres mesurés sur un même échantillon.

Quant au CEES, il étudie la faisabilité d'utiliser ce LIMS en partie à la place de la base de données actuelle ou en complément de celle-ci. L'idée étant, pour le département AgroEcoSystem, de faciliter la communication entre ses différents laboratoire et plateformes ainsi que les envois d'échantillons ou les mises en communs de résultats d'analyses. L'unité InfoSol ayant une BdD déjà bien éprouvée et qui contient toutes les données pédologiques correspondantes aux échantillons, nous devons nous assurer qu'il n'y aura pas de doublonnage.

Enfin, la plateforme GenoSol, dans le cadre du Contrat Plan État Région sur la période 2021-2027, va lancer le projet Culturomics (CPER 2021-2027). Le développement de cette activité se fera en étroite collaboration avec les équipes de l'UMR Agroécologie. Elle vise à développer une nouvelle activité, au sein de la plateforme GenoSol, qui reposera sur des approches «single cell» et de «culturomics». L'objectif est de développer un pipeline analytique à même de proposer une offre novatrice visant à : (i) isoler des consortia et isolats microbiens des sols, (ii) caractériser fonctionnellement les consortia et isolats microbiens par des approches métagénomiques (séquençage shotgun), métatranscriptomiques et métabolomiques et (iii) les stocker dans la collection de microorganismes d'intérieur agro-environnemental de l'UMR Agroécologie (Centre de Ressource Biologique). Le développement de cette activité permettra d'exploiter la diversité microbienne des sols dans des approches d'ingénierie écologique, indispensables à la transition écologique de l'agriculture, et d'alimenter le CIRM ou tout autre CRB en espèces microbiologiques candidates pour des approches de détoxification, de biocontrôle ou d'ingéniérie métabolique.

<figure><img src="image_55.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

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# Cryoconservation d'apex de *Solanum tuberosum* et espèces apparentées par la technique de vitrification en gouttes

Catherine SOUCHET<fnref n="1" />
Florence ESNAULT<fnref n="1" />
Jean-Eric CHAUVIN<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

catherine.souchet@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Le CRB BrACySol conserve 12 000 accessions de *Solanum tuberosum* et espèces apparentées. La préservation de ces clones est essentielle pour la recherche sur cette espèce. Pour sécuriser, à long terme, la conservation de certains de ces clones, nous avons opté pour la cryoconservation d'apex. Nous avons choisi la méthode de vitrification en goutte en utilisant la solution PVS2 (Plant Vitrification solution 2). Pour *Solanum tuberosum*, nous avons obtenu des résultats satisfaisants avec un taux de régénération moyen de 89 %. Ce taux nous permet d'utiliser cette méthode en routine pour cette espèce. Pour les espèces apparentées, le taux peut varier, selon les génotypes, au sein d'une même espèce. Mais cette méthode nous a permis de valider la cryoconservation de clones appartenant à 21 des 23 espèces testées.

## MOTS-CLÉS

*Solanum, tuberosum, espèces apparentées, cryoconservation, vitrification en goutte, PVS2 (Plant Vitrification solution 2).*

<footnote n="1">1 INRAE, UMR 1349 Institut de génétique environnement et protection des plantes, F-29260 Ploudaniel, France.</footnote>
# *Apex cryopreservation of Solanum tuberosum and related species using the droplet vitrification technique*

Catherine SOUCHET<fnref n="1" />

Florence ESNAULT<fnref n="1" />

Jean-Eric CHAUVIN<fnref n="1" />

## CORRESPONDENCE

catherine.souchet@inrae.fr

## ABSTRACT

BrACySol BRC conserves 12,000 accessions of *Solanum tuberosum* and related species. The preservation of these clones is essential for research on this species. To secure the long-term preservation of certain of these clones, we have opted for apex cryopreservation and the droplet vitrification method using the Plant Vitrification solution 2 (PVS2).

Regarding *Solanum tuberosum*, we have obtained satisfactory results with an average regeneration rate of 89%. This rate allows us to use this method routinely for this species. Regarding the related species, the rate can vary according to certain genotypes within the same species. Nonetheless, this method has allowed us to validate the cryopreservation of clones belonging to 21 of the 23 species tested.

## KEYWORDS

*Solanum, tuberosum*, related species, cryopreservation, droplet vitrification, PVS2 (Plant Vitrification solution 2).

<footnote n="1">1 INRAE, UMR 1349 Institut de génétique environnement et protection des plantes, F-29260 Ploudaniel, France.</footnote>
## Introduction

Un des défis actuels de la recherche et de l'agriculture est la sauvegarde de la diversité génétique pour répondre aux changements climatiques, aux besoins actuels et futurs, aux évolutions des techniques culturales et industrielles ainsi qu'aux réglementations environnementales.

Le CRB BrACySol, porté par les unités INRAE IGEPP et RGCO sur le site de Ploudaniel (Finistère), héberge des espèces à propagation végétative appartenant aux genres : *Allium*, *Cynara* et *Solanum* et des espèces à multiplication par graines du genre *Brassica*. Les ressources génétiques de *Solanum* tubéreux représentent environ 12 000 clones appartenant à 32 espèces différentes. Ces pommes de terre et espèces apparentées peuvent être conservées sous forme de tubercules, qui devront être replantés chaque année au champ ou en serre, ou sous forme de boutures *in vitro*, qui devront être repiquées tous les 15 mois.

La charge de travail que représente le maintien de cette collection, les risques de pertes dues aux bioagresseurs, les problèmes climatiques et la diminution du personnel nous ont incités à réfléchir à une méthode de conservation à long terme.

Nous avons recherché une méthode facile à mettre en place, limitant les risques liés aux manipulations, préserver les plantes des contaminations et donnant des plantes conformes à la plante mère.

Nous avons opté pour la cryoconservation d'apex. Cette méthode de conservation à -196°C dans l'azote liquide stoppe toutes les réactions biochimiques, mais doit être précédée de différentes étapes afin de préserver la viabilité des cellules. Du fait de la teneur en eau très importante des cellules, la congélation peut provoquer la mort de ces cellules, lors de leur déshydratation et de la cristallisation de l'eau. Elle peut modifier la structure des membranes. Le stress inhérent à cette technique peut perturber le métabolisme cellulaire.

Pour initier ce travail nous avons bénéficié, en 2003, du soutien financier de l'ex. Bureau des ressources génétiques (BRG) qui nous a permis d'acquérir l'équipement nécessaire.

De 2009 à 2012, nous avons participé au projet Cryoveg financé par le GIS IBiSA. Ce projet nous a permis d'échanger avec d'autres utilisateurs de techniques de cryoconservation, d'effectuer un stage à l'IRD de Montpellier pour nous familiariser avec différentes techniques de cryoconservation et nous a apporté un soutien financier pour poursuivre nos travaux.

Nos travaux ont ensuite été soutenus par l'UMT INNOPLANT, de 2012 à 2014, et par le GIS IBiSA, de 2014 à 2015, dans le cadre du projet SecureBracysol.

Nous avons expérimenté différentes méthodes :

* "Droplet Freezing" (Mix et al., 1984), méthode qui a été abandonnée car, dans nos conditions, les plantes obte-nues n'étaient pas conformes au champ.

* **Encapsulation-déshydratation** (Fabre et Dereuddre, 1990), méthode qui a aussi été abandonnée car, dans nos conditions, le taux de régénération était très lié au génotype et les résultats peu répétables.

* Finalement, nous avons opté pour la technique de « Droplet-vitrification » (Kim et al., 2006) ou vitrification en goutte que nous utilisons actuellement en routine pour cryoconserver les clones de *Solanum tuberosum*.

Afin de valider la méthode « Droplet-vitrification », la conformité des plantes cryoconservées a été vérifiée en réalisant des notations sur 12 mériclones par clone. Ces observations ont été effectuées au champ, pour les variétés issues de *S. tuberosum*, et en serre, pour les espèces apparentées. Nous avons utilisé 22 descripteurs (levée, hauteur, vigueur, niveau de ploïdie, fertilité, etc.).

Notre objectif, dans un premier temps, est de cryopréserver la collection nationale de pomme de terre, la core collection définie de façon à capturer la diversité allélique de la collection de variétés maintenue au sein du CRB BrACySol (Esnault et al., 2016) ainsi que les clones, les plus précieux et les plus difficiles à maintenir, issus des travaux de notre équipe.

## Matériels et méthode

En préambule de la cryoconservation des accessions de *Solanum*, nous avons déterminé le nombre d'apex à cryoconserver par clone (100/clone) et le taux de régénération acceptable (60 %) pour sécuriser et valider la cryoconservation d'un clone (Dussert et al, 2003).

Pour respecter les durées des différentes étapes, nous travaillons sur 2 lots de 60 apex par clone. Pour chaque lot, nous cryoconservons 10 à 12 apex témoins (1 boîte de Pertri). Ces apex témoins, décongelés au moment de la mise en place, nous permettent de contrôler le taux de survie et de régénération du clone en cours de cryoconservation.

Avant la cryoconservation de chaque clone, nous contrôlons l'état sanitaire, en effectuant des tests ELISA pour vérifier l'absence des virus PVA, PVM, PVX, PVY, PVS et PLRV.
Nous réalisons également un profil moléculaire de ce clone avec les 8 marqueurs SSR qui constituent le kit « Identification variétale » développé par la FN3PT (Marhadour et al, 2014).

## Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé est conservé au sein de CRB BrACySol. Nous avons utilisé cette méthode pour cryoconserver :

* 78 clones de *Solanum tuberosum*

* 58 clones appartenant à 23 espèces apparentées (Tableau 1).

## Préparation des milieux et réactifs

Les milieux utilisés sont les suivants :

* Milieu Tendille et Lecerf modifié

* Milieu M1 Cryo (Prétraitement) et milieu M2 Cryo (Reprise) utilisés à l'IRD pour les apex d'igname

* Milieu El Cryo

* Solution de vitrification PVS2

* Solution de charge

* Solution de rinçage

Ils sont préparés selon les fiches en annexe 1.

Les milieux gélosés sont stérilisés à l'autoclave pendant 20 min, à 1 bar. Les solutions sont stérilisées en unité de filtration avec des filtres de 0,45 µm.

## Préparation des plantes avant le prélèvement des apex

Les plantes *in vitro* sont repiquées au minimum 2 fois, à 3 semaines d'intervalle, en bocaux, sur le milieu Tendille et Lecerf modifié. Selon le génotype choisi et sa sensibilité à l'hygrométrie, on utilisera des bocaux à couvercles aérés (coton) ou non. Lors du dernier repiquage, seules des bocatures terminales sont réalisées afin d'obtenir des plantes fortes et homogènes.

Six jours avant le prélèvement des apex, la partie haute des plantules (2/3 de la hauteur) est prélevée. Les feuilles et les pétioles sont éliminés en tirant vers le bas de la bouture. Les apex terminaux sont éliminés. Quatre à cinq tronçons de 0,5 cm avec un seul œil sont coupés et repiqués dans une boîte de Petri de 90 mm de diamètre, contenant 20 ml

<table><caption>Tableau 1 : Nombre de clones cryoconservés, validés par espèce</caption><thead><tr><th>GROUPE GÉNÉTIQUE</th><th>ESPÈCE</th><th>NOMBRE DE CLONES CRYOCONSERVÉS</th><th>NOMBRE DE CLONES CRYOCONSERSÉS VALIDÉS</th><th>TAUX MOYEN DE SURVIE</th><th>TAUX MOYEN DE RÉGÉNÉRATION</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Clade 1-2</td><td><i>S. brachistotrichum</i></td><td>4</td><td>1</td><td>95</td><td>95</td></tr><tr><td><i>S. bulbocastanum</i></td><td>3</td><td>3</td><td>91</td><td>78</td></tr><tr><td><i>S. polyadenium</i></td><td>7</td><td>4</td><td>100</td><td>91</td></tr><tr><td><i>S. trifidum</i></td><td>4</td><td>4</td><td>97</td><td>84</td></tr><tr><td rowspan="5">Clade 4 Espèces Cultivées</td><td><i>S. tuberosum</i></td><td>78</td><td>72</td><td>98</td><td>90</td></tr><tr><td><i>S. andigenum</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>90</td></tr><tr><td><i>S. chaucha</i></td><td>1</td><td>1</td><td>95</td><td>95</td></tr><tr><td><i>S. phureja</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>90</td></tr><tr><td><i>S. stenotomum</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>94</td></tr><tr><td rowspan="2">Clade 4 Nord</td><td><i>S. demissum</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>78</td></tr><tr><td><i>S. alandiae</i></td><td>6</td><td>5</td><td>97</td><td>89</td></tr><tr><td rowspan="10">Clade 4 Sud</td><td><i>S. albicans</i></td><td>1</td><td>1</td><td>83</td><td>79</td></tr><tr><td><i>S. berthaultii</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>82</td></tr><tr><td><i>S. chacoense</i></td><td>2</td><td>1</td><td>100</td><td>83</td></tr><tr><td><i>S. fendleri</i></td><td>6</td><td>5</td><td>95</td><td>79</td></tr><tr><td><i>S. kurtzianum</i></td><td>1</td><td>1</td><td>95</td><td>97</td></tr><tr><td><i>S. gourlayi</i></td><td>2</td><td>0</td><td></td><td></td></tr><tr><td><i>S. oplocense</i></td><td>4</td><td>2</td><td>100</td><td>81</td></tr><tr><td><i>S. polytrichon</i></td><td>3</td><td>3</td><td>95</td><td>91</td></tr><tr><td><i>S. sparsipilum</i></td><td>1</td><td>0</td><td></td><td></td></tr><tr><td><i>S. spegazzinii</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>89</td></tr><tr><td rowspan="3">Espèce inconnue (69. 56. 52)</td><td><i>S. stoloniferum</i></td><td>4</td><td>4</td><td>98</td><td>89</td></tr><tr><td><i>S. tarijense</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>83</td></tr><tr><td><i>S. verneii</i></td><td>1</td><td>1</td><td>100</td><td>80</td></tr><tr><td></td><td></td><td>118</td><td>104</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
de milieu Tendille et Lecerf modifié, en conservant la polarité du fragment.

## Prélèvement des apex axillaires et préculture

La loupe binoculaire est placée sous la hotte, après désinfection à l'alcool. Avec une aiguille stérile, les apex composés du dôme méristématique, recouvert partiellement de 2 ébauches foliaires (0,5 à 1,5 mm), sont prélevés (Figure 1) et déposés dans une boîte de Pétri de diamètre 55 mm, contenant 10 ml de milieu de prétraitement M1 (12 apex par boite). Les boîtes de Pétri sont placées, à l'obscurité, dans un papier aluminium, pendant 1 jour, à 21 °C.

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>Figure 1. Prélèvement d'apex</figcaption></figure>

## Vitrification et congélation

Les apex sont ensuite déposés dans la solution de charge durant 20 minutes, dans un couvercle de tube Eppendorf stérile, à l'aide de la pointe d'un scalpel. Cette solution, contenant du saccharose et du glycérol, permet une déshydratation partielle des tissus.

De petits papiers aluminium, de 25 mm de long sur 8 mm de large, sont préparés. Leur bonne conductivité thermique permettra un refroidissement ou un réchauffement rapide des apex.

Chaque petit papier aluminium sera corné afin de faciliter son transport avec une pince.

Puis, sur chaque petit papier aluminium, 10 gouttes (8 µl) de solution de vitrification PVS2 (Sakai A, 1990) sont disposées (Figure 2). Cette solution, composée de 30 % (w/v) de glycérol, 15 % (w/v) d'éthylène glycol, 15 % (w/v) de DMSO (Diméthyle sulfoxyde) et 0,4 M de saccharose, a un rôle cryoprotecteur en permettant la transition vitreuse de l'eau résiduelle à -115 °C (Gallard, 2008).

Les petits papiers aluminium sont placés dans une boîte de Petri.

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>Figure 2. Gouttes de solution PVS2 sur papier aluminium</figcaption></figure>

Dans chaque gouttelette, un apex est déposé à l'aide de la pointe du scalpel ou de l'aiguille, et la boîte de Petri est placée sur de la glace durant 30 minutes. Le faible volume de PVS2 entourant l'apex favorisera aussi un refroidissement rapide.

Chaque papier aluminium est ensuite glissé, à l'aide d'une pince, dans un cryotube (Figure 3) qui sera plongé et maintenu dans l'azote liquide puis transféré dans le cryoconservateur.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure 3. Transfert des apex dans un tube de cryoconservation</figcaption></figure>

## Décongélation

Les apex sont décongelés en plongeant chaque papier aluminium dans 5 ml de solution de rinçage contenus dans une boîte de Pétri (diamètre 55 mm), placée au bain marie à 40 °C. La solution rinçage riche en saccharose (1,2 M) permet d'éliminer les cryoprotecteurs.

La décongélation rapide des apex se fait par un passage de -196 °C à 40 °C, au bain-marie, durant 30 secondes, puis à température ambiante durant 20 minutes.

## Repiquage pour régénération

Les apex sont repiqués, par 10, sans séchage, en boîtes de Pétri de diamètre 55 mm, contenant 10 ml de milieu M2 et placées une semaine à 21 °C, à l'obscurité, enveloppées dans un papier aluminium.
Ils sont ensuite repiqués, chaque semaine, sur un milieu de régénération EI (Figure 4). Les boites parafilmées sont placées, en boite cristal, à 21 °C avec 16 h d'éclairage. Après 2 semaines sur le milieu de régénération, le taux de survie est évalué. Lorsque les régénérations atteignent 1 cm, elles sont repiquées, en tube, sur le milieu Tendille et Lecerf.

<figure><img src="image_59.png" /><figcaption>Figure 4. Régénération des apex</figcaption></figure>

## Validation des lots après cryoconservation

Afin de valider la cryoconservation d'un clone, nous calculons le taux de survie et le taux de régénération des apex.

Le taux de survie, calculé 15 jours après la décongélation, correspond au nombre d'apex verts après 2 repiquages sur le milieu EI.

Le taux de régénération correspond au nombre de plantules viables, 4 à 12 semaines après la décongélation des apex, par rapport au nombre d'apex repiqués après décongélation.

La viabilité et la conformité des plantules ainsi que l'observation de leur état sanitaire, après repiquage en tube, permettent de confirmer la validation des lots placés dans le cryoconservateur.

## Résultats

L'objectif de ce travail était de mettre au point, au sein de notre laboratoire, une technique de cryoconservation et de vérifier qu'elle était applicable à différents clones de *Solanum tuberosum* et à des clones de différentes espèces apparentées de *Solanum*.

## Applicabilité de la technique utilisée

Sur les 136 clones testés, toutes espèces confondues, nous avons validé la cryoconservation de 116 clones (Tableau 1).

Sur les 24 espèces testées, seules 2 espèces appartenant au Clade 4 Sud n'ont aucun clone validé (Tableau 1) :

* *S. sparsipilum* : le clone, cryoconservé à 2 reprises, a un taux moyen de survie de 100 % et un taux moyen de régénération de 42 %. Des apex témoins, ayant subi toutes les étapes sauf le passage dans l'azote liquide, ont un taux de régénération de 60 %.

* *S. gourlayi* : le premier clone, cryoconservé 2 fois, a un taux moyen de survie de 96 % et un taux moyen de régénération de 34 % ; le second clone, cryoconservé à 6 reprises, a un taux moyen de survie de 82 % et un taux moyen de régénération de 17 %. Les témoins, sans passage dans l'azote liquide, ont un taux de régénération respectivement de 50 et 28 %.

* Au total, la cryoconservation de 20 clones, répartis dans les différents clades, n'a pas pu être validée :

* 10 clones n'ont pas atteint le taux minimum de régénération de 60 % pour sécuriser la cryoconservation.

* 7 clones avaient un taux de régénération supérieur à 60 %, mais avec une contamination bactérienne au sein des boîtes témoin.

* 3 clones n'ont pas atteint le taux minimum de régénération de 60 % et présentaient une contamination bactérienne.

## Cryoconservation de *S. tuberosum*

La diversité génétique de la collection de variétés, maintenue au sein du CRB BrACySol, est bien représentée dans le panel des variétés intégrées dans cette étude. En effet, ce panel comprend les 48 variétés de la core collection définie pour représenter la diversité allélique de cette collection (Esnault et al., 2016).

Le taux de survie moyen des 78 variétés de *Solanum tuberosum* est de 98 % et le taux de régénération est de 89 %. Un total de 72 variétés de *Solanum tuberosum* sont considérées cryoconservées.

Ainsi, 6 variétés n'ont pas été validées. Deux (Ratte et Christa) n'ont pas atteint le taux minimum de régénération de 60 % pour sécuriser la cryoconservation. Les témoins de ces variétés, sans passage dans l'azote liquide, avaient un taux de régénération de 36 %.

Quatre clones avaient un taux de régénération supérieur à 60 %, mais une contamination bactérienne au sein des boites témoins.
<figure><img src="image_60.png" /><figcaption>Figure 5. Taux de survie et de régénération des variétés de Solanum tuberosum</figcaption></figure>

## Conclusion

L'adaptation de la méthode de vitrification en goutte, au sein de notre laboratoire, la mise au point des différentes étapes préalables à la cryoconservation, telles que la préparation des plantules in vitro, la détermination de la taille optimale des apex ainsi que la mise au point d'un milieu de régénération nous ont permis d'obtenir des résultats qui nous confortent dans le choix de cette méthode.

Globalement, cette méthode permet la survie d'apex de tous les clones cryoconservés. Le plus faible taux de survie obtenu étant de 54 %.

En 2016, le CIP (Centre international de la pomme de terre) obtenait, pour des clones de *Solanum tuberosum*, avec la méthode de vitrification en goutte précédée de 2 semaines de préculture à 6 °C, un taux de survie moyen de 72 % et un taux de régénération de 59 %. Le CIP a travaillé également

sur 3 autres espèces, communes à notre liste, mais sur un nombre d'accessions beaucoup plus important que nous. Pour les espèces *Solanum chaucha*, *S. phureja* et *S. stenotomum*, ils ont obtenu des taux moyens de survie compris entre 63 et 66 % et un taux de régénération compris entre 47 et 53 % (Vollmer et al., 2016). Nous avons donc obtenu des taux de survie et de régénération supérieurs aux leurs.

Le faible nombre de clones cryoconservés, au sein de chaque espèce apparentée, ne permet pas de déterminer l'aptitude à la cryoconservation, par la méthode de vitrification en goutte, de ces espèces, ni de relier les taux de régénération des clones au groupe génétique auquel ils appartiennent.

Les témoins sans passage dans l'azote liquide, des clones testés de S. sparsipilum et de S. gourlayi ainsi que des 2 variétés récalcitrantes de S. tuberosum (Ratte et Christa), ont aussi un taux de régénération faible.
Pour ces clones, nous pourrions tester de nouveaux équilibres hormonaux dans le milieu de régénération.

Pour tous les clones récalcitrants, il faudra revoir différentes étapes de cette méthode, comme le temps d'exposition à la solution PVS2 ou la durée du bain dans la solution de rinçage. Ainsi, on pourrait augmenter la durée du bain de rinçage (passer de 20 à 40 min), afin d'être sûr d'avoir éliminé les cryoprotecteurs qui peuvent s'avérer toxiques pour les apex après la décongélation.

Si, toutefois, ces modifications ne s'avéraient pas suffisantes pour les espèces apparentées, nous pourrions, pour ces clones, accepter un taux de régénération minimum de 40 % (Reed, 2001).

Dix clones ont présenté des contaminations bactériennes. Lors de la préparation des plantules *in vitro*, les bocaux présentant des bactéries sont éliminés. Ainsi, ces bactéries, non

visibles et non pathogènes pour les clones, semblent endogènes. Lors de la cryoconservation, l'apex subit un stress qui l'affaiblit. Après décongélation, la reprise de l'activité cellulaire peut être lente ce qui semble favoriser la multiplication bactérienne. Certains méristèmes arrivent malgré tout à régénérer une plante, d'autres pas.

Il nous faudra dorénavant nous assurer de l'absence de bactéries, sinon les éliminer ou refaire une mise en culture in vitro à partir de plants sains.

La méthode de vitrification en goutte est adaptée à notre problématique de conservation à long terme des ressources génétiques *Solanum* et peut être utilisée en routine pour de nombreuses espèces dont *Solanum tuberosum*. Toutefois, elle devra faire l'objet d'amélioration pour être utilisée pour certains clones récalcitrants. ■

## Références

Dussert S., Engelmann F., Noirot M., 2003. Development of probabilistic tools to assist in the establishment and management of cryopreserved plant germplasm collections. Cryo-letters : 24, 149-160.

Esnault F., Pellé R., Dantec J.-P., Bérard A., Le Paslier M.-C., Chauvin J.-E., 2016. Development of a potato cultivar (Solanum tuberosum L.) core collection, a valuable tool to prospect genetic variation for novel traits. Potato Research. 59. 4 : 329-343.DOI 10.1007/s11540-016-9332-x.

Fabre J. and Dereuddre J., 1990. Encapsulation dehydration - A new approach to cryopreservation of Solanum shoot-tips. Cryo-Letters 11(6) : 413-426.

Gallard A., 2008. Étude de la cryoconservation d'apex en vue d'une conservation à long terme de ressources génétiques végétales : Compréhension des phénomènes mis en jeu et évaluation de la qualité du matériel régénéré sur le modèle Pélargonium. Thèse de doctorat. École doctorale d'Angers.

Huang B., Ruess H., Liang Q., Colleoni C., Spooner D., 2019. Analyses of 202 plastid genomes elucidate the phylogeny of Solanum section Petota. Scientific Reports 9 : 44-54.

Hawkes J. G., 1990. The potato: Evolution, biodiversity and genetic resources. Belhaven Press, London.

Marhadour S., Dargier C., Esnault F., Laversin N., Méar A., Perramant M. and Le Hingrat Y., 2014. Construction d'une base de données multi-utilisateurs pour améliorer la gestion des empreintes génétiques des variétés de pomme de terre produites en plants. FranceInnovations Agronomiques 35 : 161-172.

Mix-Wagner G., 1999. The conservation of potato cultivars. Potato Research 42: 427-436.

Murashige T. and Skoog F., 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Plant Physiology 15: 473-497.

Kim H. H., Yoon J. W., Park YE, Cho EG, Sohn JK, Kim TS, Engelmann F (2006). Cryopreservation of potato cultivated varieties and wild species: Critical factors in droplet vitrification. Cryo-letters 27(4) : 223-234.

Reed B (2021). Implementing cryogenic storage of clonally propagated plants. Cryo-letters 22: 97-104.

Sakai A, Kobayashi S, Oiyama L (1990). Cryopreservation of nucellar cells of navel orange by vitrification. Plant cell reports vol 9: 30-33.

Sakai A, Engelmann F (2007). Vitrification, encapsulation-Vitrification and droplet-vitification : A review. Cryo-letters 28(3): 151-172.

Spooner D., McLean K., Ramsay G., Waugh R., Bryan G. J., 2005. A single domestication for potato based on multilocus amplified fragment length polymorphism genotyping. Proceedings of the National Academy of Sciences 102: N'41.

Spooner D., 2009. DNA barcoding will frequently fail in complicated groups : An example in wild potatoes. American journal of botany 96(6) : 1177-1180.

Tendille C. and Lecerf M., 1974. La multiplication végétative de l'asperge (ASPARAGUS OFFICINALIS L). Action de divers facteurs en particulier la nutrition minérale, sur le développement des méristèmes d'asperge, sur la croissance des plantules issues de ces méristèmes et sur la production de plante adultes. Annales Amélioration des plantes 24 (3) : 269-282.

Vollmer R., Villagaray R., Egúsquiza V., Espirilla J., Garcia M., Torres A., Rojas E., Panta A., Barkley N. A., Ellis D., 2016. The potato cryobank at the International Potato Center (CIP): A model for long term conservation of clonal. CryoLetters 37(5), 318-329.
# Annexe 1. Milieux de culture

## Milieu de culture Tendille et Lecerf modifié

### Tendille et Lecerf modifié

<table><thead><tr><th></th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1 LITRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Macro-éléments KNO3</td><td>10x</td><td>100cc</td></tr><tr><td>Micro-éléments MS</td><td>1000x</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Fer EDTA</td><td>50x</td><td>20cc</td></tr><tr><td>Vitamines MS modifiées</td><td>1000x</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Myo inositol</td><td></td><td>100mg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>25g</td></tr><tr><td>Agar Agar VWR</td><td></td><td>7g</td></tr><tr><td>pH: 5.8</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

### Macro-éléments KNO3

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE (X10) 1L</th></tr></thead><tbody><tr><td>KNO3</td><td>26.90 g</td></tr><tr><td>NH4NO3</td><td>5.36 g</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2 4H2O</td><td>4.72 g</td></tr><tr><td>Mg SO4 7H2O</td><td>4.186 g</td></tr><tr><td>KH2 PO4</td><td>2.74 g</td></tr><tr><td>KCL</td><td>3.50 g</td></tr></tbody></table>

### Micro-éléments MS

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE (X1000) 1L</th></tr></thead><tbody><tr><td>H3BO3</td><td>6.2 g</td></tr><tr><td>Mn SO4 H2O</td><td>16.9 g</td></tr><tr><td>Zn SO4 7 H2O</td><td>10.6 g</td></tr><tr><td>KI</td><td>0.83 g</td></tr><tr><td>Cu SO4 5 H2O</td><td>0.025 g</td></tr><tr><td>Co Cl2 6 H2O</td><td>0.025 g</td></tr><tr><td>Na2 MoO4 2 H2O</td><td>0.25 g</td></tr></tbody></table>

### Vitamines de Murashige & Skoog modifiées

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE (X1000) 100ML</th></tr></thead><tbody><tr><td>H2 NCH2 COOH</td><td>200mg</td></tr><tr><td>Vit B1</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>Vit B6</td><td>50 mg</td></tr><tr><td>Vit B3</td><td>50 mg</td></tr></tbody></table>

### Fer EDTA

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE (X50) 1L</th></tr></thead><tbody><tr><td>SO4Fe 7H2O</td><td>1.39 g</td></tr><tr><td>NA2EDTA2H2O</td><td>2.37 g</td></tr></tbody></table>

## Milieu de régénération (EI) :
milieu Tendille et Lecerf modifié avec l'équilibre hormonal suivant :

<table><thead><tr><th>HORMONES</th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1L DE MILIEU</th></tr></thead><tbody><tr><td>AIA</td><td>1mg / ml</td><td>100µl</td></tr><tr><td>GA3</td><td>1mg / ml</td><td>200µl</td></tr><tr><td>Zéatine riboside</td><td>1mg / ml</td><td>200µl</td></tr></tbody></table>

Ce milieu est autoclavé, avec les hormones, 20 min à 1 bar.
## Milieux de culture utilisés à IRD Montpellier pour la préparation et décongélation des apex d'igname

Tous ces milieux et solutions sont préparés avec H2O ultra pure.
Les pH des milieux sont ajustés à 5,75.

M1 : Milieu de pré-traitement

M2 : Milieu de reprise des apex après congélation

### M1

<table><thead><tr><th></th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1 LITRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Macro-éléments MS IRD</td><td>20x</td><td>25cc</td></tr><tr><td>Micro-éléments MS IRD</td><td>100x</td><td>10cc</td></tr><tr><td>Fer EDTA IRD</td><td>1000x</td><td>10cc</td></tr><tr><td>Vitamines IRD</td><td>1000x</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Myo inositol</td><td></td><td>100mg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>100g</td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td></td><td>2g</td></tr><tr><td>Agar Agar VWR</td><td></td><td>7g</td></tr></tbody></table>

### M2

<table><thead><tr><th></th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1 LITRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Macro-éléments MS IRD</td><td>20x</td><td>25cc</td></tr><tr><td>Micro-éléments MS IRD</td><td>100x</td><td>10cc</td></tr><tr><td>Fer EDTA IRD</td><td>1000x</td><td>10cc</td></tr><tr><td>Vitamines IRD</td><td>1000x</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Myo inositol</td><td></td><td>100mg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>100g</td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td></td><td>2g</td></tr><tr><td>BAP</td><td>1mg/L</td><td>2cc</td></tr><tr><td>ANA</td><td>1mg/L</td><td>100µl</td></tr><tr><td>Agar Agar VWR</td><td></td><td>7g</td></tr></tbody></table>

### Macro-éléments MS

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>NH4NO3</td><td>33 g</td></tr><tr><td>KNO3</td><td>38 g</td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>8.8 g</td></tr><tr><td>Mg SO4 7H2O</td><td>7.4 g</td></tr><tr><td>KH2 PO4</td><td>3.4 g</td></tr></tbody></table>

### Oligo-éléments A

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>H3BO3</td><td>10000 mg</td></tr><tr><td>Mn SO4 H2O</td><td>2500 mg</td></tr><tr><td>Zn SO4 7 H2O</td><td>1000 mg</td></tr><tr><td>KI</td><td>83 mg</td></tr><tr><td>Cu SO4 5 H2O</td><td>2.5 mg</td></tr><tr><td>Co Cl2 6 H2O</td><td>2.5 mg</td></tr><tr><td>Na2 MoO4 2 H2O</td><td>2.5 mg</td></tr></tbody></table>

### Vitamines IRD

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE (X1000) 100ML</th></tr></thead><tbody><tr><td>Thiamine hydrochloride</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Pyridoxine hydrochloride</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Acide Nicotinique anhydre</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Pantothénate de calcium</td><td>100 mg</td></tr></tbody></table>

### Fer EDTA

<table><thead><tr><th>FORMULE CHIMIQUE</th><th>SOLUTION MÈRE (X1000) 1L</th></tr></thead><tbody><tr><td>SO4Fe 7H2O</td><td>2.49 g</td></tr><tr><td>Na2EDTA 2H2O</td><td>2.61 g</td></tr></tbody></table>
# Solutions pour la cryoconservation

Toutes ces solutions sont préparées avec H₂O ultra pure et stérilisées par filtration.

## Solution de charge

<table><thead><tr><th></th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1 LITRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Macro-éléments MS IRD</td><td>20X</td><td>100cc</td></tr><tr><td>Oligo-éléments A</td><td>100X</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Fer EDTA IRD</td><td>1000X</td><td>20cc</td></tr><tr><td>Vitamines IRD</td><td>1000X</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Myo inositol</td><td></td><td>100mg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>0.4M=136.92</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td></td><td>2M=184.18g</td></tr><tr><td>Ph : 5.8</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

## Solution de rinçage

<table><thead><tr><th></th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1 LITRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Macro-éléments MS IRD</td><td>20X</td><td>100cc</td></tr><tr><td>Oligo-éléments A</td><td>100X</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Fer EDTA IRD</td><td>1000X</td><td>20cc</td></tr><tr><td>Vitamines IRD</td><td>1000X</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Myo inositol</td><td></td><td>100mg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>1.2M=410.76</td></tr><tr><td>Ph : 5.8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ph : 5.8</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

## PVS2

<table><thead><tr><th></th><th>SOLUTION MÈRE</th><th>POUR 1 LITRE</th></tr></thead><tbody><tr><td>Macro-éléments MS IRD</td><td>20X</td><td>25cc</td></tr><tr><td>Oligo-éléments A</td><td>100X</td><td>10cc</td></tr><tr><td>Fer EDTA IRD</td><td>1000X</td><td>10cc</td></tr><tr><td>Vitamines IRD</td><td>1000X</td><td>1cc</td></tr><tr><td>Myo inositol</td><td></td><td>100mg</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td>0.4M=136.92</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td></td><td>30% (w/v)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>15% (w/v)</td></tr><tr><td>Ethylène glycol</td><td></td><td>15% (w/v)</td></tr><tr><td>Ph : 5.75</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_61.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Développement d'une core collection pomme de terre

Florence ESNAULT<fnref n="1" />

Roland PELLÉ<fnref n="1" />

Marie-Pierre CANN<fnref n="1" />

Marie BOUSSEAU<fnref n="1" />

Marie-Ange DANTEC<fnref n="1" />

Catherine SOUCHET<fnref n="1" />

Marie-Claire KERLAN<fnref n="1" />

Jean-Eric CHAUVIN<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

florence.esnault@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Le développement d'une core collection consiste à sélectionner, au sein d'une collection ayant un effectif plus ou moins important, un petit panel de génotypes qui représente la diversité génétique disponible dans la collection de départ, avec un minimum de redondance. Cette étude présente le développement d'une core collection de 48 génotypes, représentative de la diversité génétique d'un panel de 350 variétés tétraploïdes de pomme de terre (Solanum tuberosum L.). Elle a été établie en utilisant des données de génotypage par marqueurs microsatellites (SSR) et la stratégie M qui maximise la diversité allélique. Cette core collection constitue un panel d'un grand intérêt qui a été exploité jusqu'à présent dans le cadre de deux projets de recherche : d'une part, pour évaluer la possibilité d'exploiter la puce SNP SolCAP pour caractériser les ressources génétiques maintenues au sein du CRB BrACySol, et, d'autre part, pour évaluer la variabilité structurale et morphologique des grains d'amidon de pomme de terre.

## MOTS-CLÉS

Diversité génétique, *Solanum tuberosum*, marqueur microsatellite.

<footnote n="1">1 INRAE, UMR IGEPP, Domaine de Keraïber, 29260 PLOUDANIEL.</footnote>
# Development of a potato core collection

Florence ESNAULT

Roland PELLÉ

Marie-Pierre CANN

Marie BOUSSEAU

Marie-Ange DANTEC

Catherine SOUCHET

Marie-Claire KERLAN

Jean-Eric CHAUVIN

## CORRESPONDENCE

florence.esnault@inrae.fr

## ABSTRACT

Developing a core collection consists in selecting, in a more or less large collection, a small panel of genotypes representing the genetic diversity available in the initial collection, with minimum redundancy. This study presents the development of a core collection of 48 genotypes representative of the genetic diversity of a panel of 350 tetraploid varieties of potato (Solanum tuberosum L.). It was built using microsatellite marker genotyping data (SSR) and M strategy which maximizes allelic diversity. This core collection forms a panel of major interest that has been exploited up till now in the framework of two research projects: on the one hand to assess the possibility of exploiting the SNP SolCAP array to characterize the genetic resources maintained in BRC BrACySol, and on the other hand, to assess the structural and morphological variability of potato starch grains.

## KEYWORDS

Genetic diversity, *Solanum tuberosum*, microsatellite marker.

INRAE, UMR IGEPP, Domaine de Keraiber, 29260 PLOUDANIEL.
## Introduction

Les collections de ressources génétiques ont pour objectif de conserver la diversité génétique des espèces cultivées et apparentées. Elles sont constituées progressivement, au gré des programmes de recherche qui exploitent cette diversité pour des études taxonomiques ou à des fins d'amélioration génétique des plantes cultivées. Elles comprennent des échantillons provenant de missions de collecte, des génotypes créés dans les programmes de recherche, des variétés anciennes ou récentes (Van Treuren et al., 2009). La plupart de ces collections ont des effectifs importants, ce qui rend leur maintien et leur caractérisation coûteux et chronophages.

Ces difficultés peuvent être surmontées en sélectionnant un petit panel de génotypes aussi représentatifs que possible de la diversité génétique disponible avec un minimum de redondance. Ce concept a été proposé par Franco et Brown (1984) sous le terme de « core collection ». Odong et al. (2013) ont identifié trois types de core collections en fonction de leur finalité : des core collections qui représentent (1) tous les génotypes de la collection initiale, (2) les génotypes extrêmes de cette collection ou (3) la distribution des génotypes dans cette collection. Les deux premiers types ont pour objectif de représenter la diversité génétique de la collection initiale, le troisième type représente le profil de distribution de la variabilité présente dans la collection initiale.

Des core collections ont été développées pour un grand nombre d'espèces sur la base de données passeport, de données agro-morphologiques ou de données moléculaires. Dans la plupart de ces études, l'échantillonnage est réalisé en se basant sur une analyse de structuration génétique de la collection initiale et en déterminant le nombre de génotypes à retenir dans chaque groupe (Franco et al., 2006). Schoen et Brown (1993) ont décrit une autre méthode, appelée stratégie M, dans laquelle les marqueurs moléculaires sont utilisés pour sélectionner les individus à inclure dans la core collection, en maximisant la richesse allélique de chaque marqueur. Franco et al. (2006) ont montré, chez le maïs, que cette méthode permettait d'obtenir les indices de diversité les plus forts.

En ce qui concerne la pomme de terre, différentes core collections ont été définies au sein des cultivars traditionnels andins appartenant à *Solanum tuberosum* groupe *Andigenum* (Huaman et al., 2000 ; Chandra et al., 2002 ; Gopal et al., 2013) ou à *S. phureja* (Ghislain et al., 1999), au sein des espèces sauvages *S. microdontum* (Bamberg et Del Rio, 2014) ou *S. demissum* (Del Rio et Bamberg, 2020). Gopal

et al. (2013) ont montré que la stratégie M permettait d'obtenir une meilleure couverture de la diversité que les méthodes basées sur la classification hiérarchique.

Le travail présenté ici a porté sur le développement d'une core collection représentant la diversité génétique du pool des variétés « modernes » de pomme de terre, cultivées hors d'Amérique du Sud. Cette core collection a été définie en exploitant des données de génotypage obtenues à partir de marqueurs microsatellites et en utilisant la stratégie M (Esnault et al., 2016). Des exemples d'utilisation de cette core collection sont également présentés.

## Matériels et méthodes

### Matériel végétal

Le Centre de Ressources Biologiques BrACySol (INRAE, UMR IGEPP, Ploudaniel) conserve une grande collection de pommes de terre maintenues végétativement sous forme de clones. Cette collection comprend environ 1 200 variétés, anciennes ou récentes, originaires de différentes parties du monde. En utilisant les données phénotypiques disponibles dans la base de données Europotato (http://www.europotato.org), 350 variétés ont été sélectionnées de manière à représenter des phénotypes extrêmes pour 21 caractères morphologiques (descripteurs de la plante ou des tubercules), agronomiques ou technologiques. Ce panel de 350 variétés sera appelé collection initiale dans cet article.

### Génotypage

Un total de 26 marqueurs microsatellites (SSR), développés par Kawchuk et al. (1996), Milbourne et al. (1998), Ghislain et al. (2004) ou Feingold et al. (2005) ont été sélectionnés pour leur niveau de polymorphisme et leur position sur le génome (Tableau 1). La collection initiale a été génotypée avec ces 26 marqueurs SSR. Le génotypage a été réalisé sur la plateforme Gentyane (INRAE, Clermont-Ferrand). Les allèles ont été identifiés par leur taille.

### Définition de la core collection

Le logiciel MSTRAT v4.0 (Gouesnard et al., 2001), qui met en œuvre la stratégie M, a été utilisé. Les données de 15 marqueurs SSR ont été utilisées en tant que variables actives pour définir la core collection, et les données des 11 autres marqueurs SSR ont été utilisées en tant que variables cibles, pour tester l'efficacité de la méthode (Tableau 1). Les marqueurs SSR utilisés en tant que variables actives ont été choisis de manière à représenter chacun des chromosomes, et en tenant compte de leur niveau de polymorphisme et de la facilité de lecture des profils. Les génotypes porteurs
<table><caption>Tableau 1 : Liste des marqueurs SSR utilisés en variables actives ou variables cibles, nombre total d'allèles et nombre d'allèles rares révélés par chacun de ces marqueurs</caption><thead><tr><th>VARIABLE</th><th>NOM DU SSR</th><th>CHROMOSOME</th><th>NB TOTAL D'ALLÈLES</th><th>NB D'ALLÈLES RARES</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="12">ACTIVE</td><td>STi043</td><td>1</td><td>7</td><td>2</td></tr><tr><td>STi029</td><td>2</td><td>12</td><td>2</td></tr><tr><td>STM3011</td><td>2</td><td>13</td><td>1</td></tr><tr><td>STi050</td><td>3</td><td>9</td><td>1</td></tr><tr><td>STM3016</td><td>4</td><td>9</td><td>1</td></tr><tr><td>STPoAc58</td><td>5</td><td>17</td><td>0</td></tr><tr><td>STi059</td><td>6</td><td>12</td><td>1</td></tr><tr><td>STM0031</td><td>7</td><td>18</td><td>1</td></tr><tr><td>SSR1</td><td>8</td><td>13</td><td>3</td></tr><tr><td>STM1016</td><td>8</td><td>10</td><td>0</td></tr><tr><td>STi057</td><td>9</td><td>14</td><td>0</td></tr><tr><td>STi023</td><td>10</td><td>17</td><td>2</td></tr><tr><td>STM2005</td><td>11</td><td>9</td><td>4</td></tr><tr><td>STi028</td><td>11</td><td>12</td><td>2</td></tr><tr><td>STM1097</td><td>12</td><td>15</td><td>4</td></tr><tr><td rowspan="12">CIBLE</td><td>STM2030</td><td>1</td><td>3</td><td>0</td></tr><tr><td>STi024</td><td>2</td><td>11</td><td>2</td></tr><tr><td>STi060</td><td>3</td><td>4</td><td>0</td></tr><tr><td>STi012</td><td>4</td><td>9</td><td>2</td></tr><tr><td>STi006</td><td>5</td><td>16</td><td>0</td></tr><tr><td>STM0028</td><td>7</td><td>14</td><td>2</td></tr><tr><td>STi044</td><td>8</td><td>7</td><td>1</td></tr><tr><td>STM1021</td><td>9</td><td>19</td><td>0</td></tr><tr><td>STM1040</td><td>10</td><td>8</td><td>1</td></tr><tr><td>STi018</td><td>11</td><td>10</td><td>1</td></tr><tr><td>STi051</td><td>12</td><td>11</td><td>0</td></tr></tbody></table>

d'allèles rares (présents chez une seule variété) ont été inclus dans le noyau. Pour la sélection des autres variétés, 100 répétitions de 40 itérations ont été réalisées. La core collection qui présente la plus grande richesse allélique, pour les variables actives et les variables cibles, a été choisie.

## Résultats

Au sein de la collection initiale de 350 variétés, chaque marqueur SSR a révélé entre 3 et 19 allèles, avec une moyenne de 11,5 allèles par marqueur (Tableau 1). Au total, 299 allèles différents ont été identifiés, dont 33 présents chez un seul génotype. Les 28 variétés avec ces 33 allèles

rares ont été intégrées dans la core collection. La plus petite core collection, qui inclut tous les allèles des variables actives (187 allèles), comprend 53 génotypes. Cette core comprend 96,6 % des allèles des variables cibles (112 allèles). Pour des raisons pratiques, liées aux formats de génotypage, la taille retenue pour la core collection a été de 48 génotypes. Toutefois, la core de 48 génotypes qui a été définie, appelée core 48, capte la majeur partie de la richesse allélique initiale, puisqu'elle comprend 99,5 % des allèles actifs et 96,9 % des allèles cibles. Son niveau élevé de diversité est confirmé par un taux d'hétérozygotie élevé ($H_0 = 0.75$).
## Discussion

La diversité génétique présente au sein de la collection Pomme de terre du CRB BrACySol est très exploitée par la communauté scientifique et par les sélectionneurs (1 400 diffusions en moyenne par an). Cette collection a déjà été évaluée pour un certain nombre de caractères agro-morphologiques, en particulier pour la résistance à différents bioagresseurs ou pour des caractères de qualité du tubercule. Toutefois, les besoins futurs de l'agriculture demanderont d'évaluer la diversité disponible pour de nouveaux caractères, en lien par exemple avec le changement climatique ou de nouvelles utilisations. La caractérisation phénotypique et génotypique de grandes collections n'est pas toujours possible. La core 48 a été développée afin de disposer d'un panel sur lequel il peut être envisagé de faire une première analyse de diversité génotypique ou de variabilité sur des caractères agro-morphologiques nouveaux.

Ainsi cette core collection a été exploitée jusqu'à présent dans le cadre de deux projets de recherche.

Le premier projet avait pour objectif d'évaluer la possibilité d'exploiter la puce SNP SolCAP 8K pour caractériser les ressources génétiques maintenues au sein du CRB BrACySol. En effet, la puce SolCAP a été développée par une équipe américaine (Hamilton et al., 2011) à partir de données de séquençage de variétés américaines. Avant de l'utiliser sur de grands effectifs, il était important de s'assurer que les SNP positionnés sur cette puce étaient aussi

présents et polymorphes dans notre matériel végétal. Ainsi, la core 48 étant représentative de la diversité présente au sein de notre collection de variétés, elle constituait un panel de variétés intéressant pour faire cette analyse. Les résultats ont montré que la puce SolCAP était un outil pertinent pour caractériser nos collections et, depuis, elle a été utilisée sur 260 géniteurs améliorés dans le cadre du projet LDPot, financé par le métaprogramme SelGen et piloté par INRAE UMR IGEPP.

Le deuxième projet, porté par l'Institut Français des Matériaux AgroSourcés (Projet ANR PoStaTic), avait pour objectif d'étudier les caractéristiques de l'amidon de pomme de terre pour la production de bioplastiques. Une analyse de la variabilité structurale et morphologique des grains d'amidon de pomme de terre a ainsi été réalisée en évaluant les génotypes de la core 48 pour différents caractères : taille et forme des grains d'amidon, composition en amylose et amylopectine et structure de la chaine d'amidon. Les résultats ont montré qu'il existait des différences significatives pour ces caractères au sein de la core 48. La caractérisation des grains d'amidon de pomme de terre a été poursuivie dans le cadre du projet ANR TapStar, piloté par la même équipe.

La core 48 s'est donc révélée être un outil d'un grand intérêt. Afin de conserver cette collection à long terme, elle a été intégrée dans la cryobanque qui est en cours de constitution au sein du CRB BrACySol (Voir article de C. Souchet et al. dans ce numéro).
Références

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Chandra S, Huaman Z, Krishna SH, Ortiz R (2002). Optimal sampling strategy and core collection size of Andean tetraploid potato based on isozyme data - a simulation study. Theoretical and Applied Genetics 104: 1325-1334.

Del Rio A., Bamberg J. (2020). A Core Subset of the ex situ Collection of S. demissum at the US Potato Genebank. American Journal of Potato Research 97, 505-512.

Esnault F, Pellé R, Dantec JP, Bérard A, Le Paslier MC, Chauvin JE (2016). Development of a potato cultivar (*Solanum tuberosum L*) core collection, a valuable tool to prospect genetic variation for novel traits. Potato Research 59, 4, 329-343. DOI 10.1007/s11540-016-9332-x.

Feingold S, Lloyd J, Norero N, Bonierbale M, Lorenzen J (2005). Mapping and characterization of new EST-derived microsatellites for potato (*Solanum tuberosum L*). Theoretical and Applied Genetics 111: 456-466.

Franco J, Crossa J, Warburton ML, Taba S (2006). Sampling strategies for conserving maize diversity when forming core subsets using genetic markers. Crop Science 46: 854-864.

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Gopal J, Kumar V, Kumar R, Mathur P (2013). Comparison of Different Approaches to Establish a Core Collection of Andigena (Solanum tuberosum Group Andigena) Potatoes. Potato Research 56: 85-98.

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Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Culture in vitro, assainissement et indexation de la Collection Igname du Centre de Ressources Biologiques Plantes Tropicales des Antilles

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Suzia GELABALE<fnref n="1" />
Rose-Marie GOMEZ<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

yoana.faure@inrae.fr

## RÉSUMÉ

La culture in vitro regroupe un ensemble de techniques permettant de régénérer, multiplier, conserver et assainir des plantes entières à partir de fragments de tissus végétaux, sur milieu artificiel et en conditions contrôlées pour l'éclairage et la température. Elle permet au Centre de Ressources Biologique Plantes Tropicales (CRB PT) de conserver plusieurs centaines d'accessions d'ignames, de bananiers, d'ananas et de cannes à sucre sous forme de vitroplants, dans les laboratoires de culture in vitro des Centres INRAE et CIRAD en Guadeloupe et en Martinique. La conservation in vitro des ignames s'y effectue en quatre étapes : l'introduction à partir de tiges d'ignames contenant des méristèmes, la multiplication par micro-bouturage et l'assainissement par thermothérapie et culture de méristème, suivie de l'indexation virale. Ainsi, le CRB PT a développé sur l'igname 13 tests RT-PCR permettant la détection des virus à ARN et un test IC-PCR permettant la détection d'un virus à ADN, appelé badnavirus, qui existe aussi sous forme intégrée dans le génome de l'igname. L'objectif final de ces différentes techniques est la conservation, puis la diffusion de vitroplants indemnes de virus aux agriculteurs, chercheurs et autres demandeurs à l'échelle nationale et internationale.

## MOTS-CLÉS

Culture in vitro, igname, conservation, assainissement, indexation virale, CRB Plantes Tropicales.

<footnote n="1">¹ INRAE UR1321 ASTRO, 97170 Petit-Bourg, Guadeloupe, France.</footnote>
*In vitro* culture, sanitation and indexing of the Yam Collection of the Antilles Tropical Plant Biological Resource Center

Yoana FAURE<fnref n="1" />
Suzia GELABALE<fnref n="1" />
Rose-Marie GOMEZ<fnref n="1" />

CORRESPONDENCE

yoana.faure@inrae.fr

ABSTRACT

*In vitro* culture covers a number of techniques used to regenerate, propagate, conserve and sanitize whole plants from fragments of plant tissue in artificial medium and under controlled lighting and temperature conditions. It allows the Biological Resource Center for Tropical Plant (BRC TP) to preserve several hundred accessions of yam, banana, pineapple and sugar cane, in the form of vitroplants in the *in vitro* culture laboratories of the INRAE and CIRAD centers in Guadeloupe and Martinique. The *in vitro* preservation of yams is performed in four steps: the introduction using stems of yams containing meristems, multiplication by micrografting and sanitation using thermotherapy and meristem culture, followed by viral indexing. Thus, the BRC PT has developed for yam 13 RT-PCR tests to detect RNA viruses and one IC-PCR test to detect a DNA virus called badnavirus which exists in integrated form in the yam genome. The final aim of these different techniques is the preservation and then dissemination of virus-free vitroplants to farmers, researchers, etc. at the national and international scales.

KEYWORDS

Vitroculture, yam, conservation, sanitation, viral indexing, BRC for Tropical Plants.

<footnote n="1">1 INRAE UR1321 ASTRO, 97170 Petit-Bourg, Guadeloupe, France.</footnote>
## Introduction

L'igname est une plante vivrière du genre *Dioscorea*, de la famille des *Dioscoreaceae*, qui regroupe environ 600 espèces (Degras, 1986). Elle produit des tubercules souterrains consommables pour les espèces domestiquées, des tiges volubiles et parfois des bulbes aériens qui peuvent également être consommés, mais qui sont préférentiellement utilisés comme semences. Bien que l'igname soit la troisième production en Guadeloupe, après la canne à sucre et la banane qui sont dédiées à l'exportation, sa production est en déclin. Elle est passée de 10 680 t en 2000 (FAOSTATS, 2021) à 2 157 t en 2019 (Agreste, 2020), soit une diminution de près de 80 % en presque 19 ans. Une des principales raisons est la sensibilité de cette culture aux bioagresseurs, comme le champignon responsable de l'anthracnose, les nématodes, mais également les virus (Barlagne et al., 2017). La demande des consommateurs est donc en partie satisfaite par l'importation.

L'un des premiers objectifs du Centre INRA Antilles-Guyane, à sa création en 1949, était la constitution d'un stock de ressources végétales des Caraïbes. En tant que culture vivrière majeure, une collection d'ignames anciennes et traditionnelles a vu le jour dans la station d'amélioration des plantes, puis dans les jardins créoles des ouvriers agricoles du Centre. Certaines variétés ont une très grande valeur patrimoniale, car elles ont été apportées en Guadeloupe comme « plantes de garde » sur les bateaux transportant les esclaves venant d'Afrique à partir de 1674. La collection s'est ensuite enrichie des échanges de matériel au sein des Caraïbes, de prospections plus lointaines (Nouvelle-Calédonie, Côte d'Ivoire, Nigéria, etc.) et des programmes de création variétale.

À partir des années 1980, des chercheurs à l'INRA de Guadeloupe ont commencé à mener des travaux sur la culture *in vitro* d'igname (Lacointe & Zinsou, 1987 ; Arnolin, 1988 ; Arnolin et al., 1989). L'objectif était de développer cette technique pour en faire une alternative au maintien et à la multiplication de l'igname au champ, dont le cycle de culture est de neuf mois avec une gestion de l'enherberment très chronophage. De plus, la culture *in vitro* nécessite moins d'espace et permet d'obtenir, en moins de temps, un grand nombre de plants, appelés vitroplants, d'une même accession. Pour la collection Igname, une accession est un entité immatérielle unique, identifiée par un code, un nom et des informations associées (par exemple, celles en lien avec son acquisition), et qui représente l'ensemble des échantillons obtenus par multiplication végétative d'un même génotype de départ.

Le CRB Plantes Tropicales a officiellement été créé en 2010. Il est composé de six collections dont quatre sont gérées par le CIRAD : Bananier, Canne à sucre, Manguier et Ananas, et deux sont gérées par INRAE : Igname et Herbier de Guadeloupe. Les missions de la collection Igname sont, entre autres, de conserver des variétés et de les assainir, pour pouvoir fournir aux professionnels et aux équipes de recherche du matériel végétal sain. Ces procédures s'appuient sur le laboratoire de culture *in vitro* pour la multiplication des vitroplants et l'élimination des virus, par thermothérapie et culture de méristème, et sur le laboratoire de biologie moléculaire pour l'indexation virale qui consiste à tester, par des outils de biologie moléculaire, la présence des virus infectant la plante.

## La conservation *in vitro*

Il s'agit de conserver le matériel dans des conditions de culture (milieu, température, photopériode) réduisant la vitesse de croissance des plantes, limitant ainsi le nombre de repiquages. Les repiquages permettent de ne pas perdre les accessions, en régénérant de nouveaux vitroplants à partir des nœuds et en fonction du dépérissement des vitroplants et/ou de l'épuisement du milieu de culture.

Au 31 décembre 2020, la collection Igname comportait 433 accessions dont 418 en culture *in vitro*, soit 97 % de la collection. Cinq espèces sont majoritairement représentées : *Dioscorea trifida*, *Dioscorea alata*, *Dioscorea cayenensis-rotundata*, *Dioscorea esculenta* et *Dioscorea bulbifera*. L'objectif est d'avoir la totalité de la collection en culture *in vitro*, mais des pertes d'accessions sont possibles en raison de problèmes de contamination et de dysfonctionnements des infrastructures. Elles sont alors réintroduites quand il existe un double de sécurité, par exemple, conservé au champ (conservation *in vivo*). Pour des raisons de sécurisation du matériel et en lien avec l'utilisation de ces vitroplants (assainissement, multiplication pour fournitures, sevrages, etc.), un lot d'une même accession en culture *in vitro* est composé de 12 vitroplants portant le même identifiant.

## L'introduction en culture *in vitro* à partir de tiges

L'introduction en conservation *in vitro* d'une accession se fait généralement à partir d'une tige issue d'un morceau de tubercule (semenceau) planté en chambre climatique, qui a poussé en conditions contrôlées : photopériode de 16 h et température de 25 °C. Le semenceau peut également avoir été planté en serre ou au champ, mais les chances de réussite sont plus faibles car les risques de
contamination sont plus élevés. La tige doit posséder environ 10 nœuds, pour ne pas être trop jeune ou au contraire trop développée (Figure 1).

<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>Figure 1. A) Photo d'un plant d'igname cultivé en chambre climatique en attente d'une introduction en culture *in vitro*. B) Photo de deux nœuds sur la même tige.</figcaption></figure>

La méthode utilisée (Figure 2) permet l'élimination des bactéries et des champignons que la plante peut contenir et qui empêcheraient le futur vitroplant de se développer. Dans la chambre climatique et à l'aide d'un scalpel, une dizaine de nœuds sont prélevés par accession et leurs feuilles sont retirées. Chaque morceau de tige portant au moins un nœud est une bouture. Toutes les boutures d'une même accession sont ensuite disposées dans un bocal, en veillant à reporter l'identifiant de chaque accession.

<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>Figure 2. Étapes de bouturage de tige d'igname pour une introduction en culture *in vitro*</figcaption></figure>

Le matériel est transféré dans le laboratoire de culture *in vitro* et de l'alcool à 70° est versé dans chaque bocal.

La suite de la manipulation nécessite de travailler en milieu stérile sous une hotte à flux laminaire. Après 10 minutes de trempage, l'alcool est retiré, puis de l'eau de Javel à 2,6 % de chlore actif est versée dans le bocal pour réaliser un bain de 20 minutes. Cette désinfection est suivie de trois rinçages à l'eau déminéralisée stérile. Un premier rinçage rapide permet de retirer une grande partie de l'eau de Javel. Les deux rinçages suivants se font en laissant tremper les

boutures respectivement 10 minutes, puis 20 minutes, en renouvelant à chaque fois l'eau stérile.

Les boutures sont ensuite déposées sur un papier cartonné stérile. Les extrémités de chaque bouture, endommagées par l'eau de Javel, sont découpées à l'aide d'un scalpel stérile. Entre chaque accession, les outils (scalpels et pinces) sont désinfectés à l'aide d'un stérilisateur à bille.

Les boutures sont ensuite placées dans un tube en verre contenant 10 mL de milieu de culture de croissance (Tableau 1), puis les tubes sont conservés en chambre de culture à 25 °C, avec une photopériode de 12 h, jusqu'à l'obtention de tiges.

<table><caption>Tableau 1 : Composition d'un litre de milieu de croissance pour la culture de l'igname</caption><thead><tr><td>COMPOSÉS</td><td>POUR D. ALATA ET D. CAYENENSIS-ROTUNDATA</td><td>POUR D. TRIFIDA</td></tr></thead><tbody><tr><td>Solution MacroMS 10X</td><td>100 mL</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Solution MicroMS 1000X</td><td>1 mL</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Solution FeEDTA 200X</td><td>5 mL</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Solution Vitamine de Morel 500X</td><td>2 mL</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>Solution de Cystéine 200X</td><td>5 mL</td><td>/</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>30 g</td><td>30 g</td></tr><tr><td>BAP à 1 mg/mL</td><td>1 mL</td><td>0,1 mL</td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>/</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>200 mg</td><td>200 mg</td></tr><tr><td>Agar</td><td>7 g</td><td>7 g</td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td>2 g</td><td>2 g</td></tr><tr><td>Eau filtrée</td><td>qsp 1 L</td><td>qsp 1 L</td></tr></tbody></table>

Parmi la dizaine de tubes mis en chambre de culture, des pertes par contaminations peuvent survenir. L'objectif est d'obtenir au moins une plante développée constituée de racines et de feuilles en plus de la tige, à partir de laquelle un micro-bouturage pourra être effectué pour obtenir 12 tubes. La durée de ces deux étapes de croissance, avant et après le micro-bouturage, varie en fonction de l'aptitude de chaque plante à redémarrer sa croissance malgré le stress de la mise en culture. En général, la deuxième étape dure environ deux mois. Les 12 tubes sont ensuite placés dans la chambre de culture de la collection. À partir de cette étape, l'accession est considérée comme introduite dans la collection avec succès.

## L'entretien de la collection en culture *in vitro*

L'entretien de la collection conservée en chambre de culture nécessite des repiquages réguliers (tous les 8 à 12 mois
en fonction des accessions), une surveillance de la santé des vitroplants (contaminations, épuisement du milieu de culture, plants trop développés ou au contraire ne se dévèloppant pas) et un contrôle des conditions de température, d'humidité et de luminosité.

## Préparation du milieu de culture de croissance

Le milieu synthétique sur lequel sont cultivés les vitroplants permet de répondre de façon optimale à leurs besoins nutritifs. La composition de départ a été mise au point par des chercheurs tels que Mantell & Hugo (1989), et peut être adaptée à une espèce, voire à un cultivar.

Pour être plus précis, la méthode ci-dessous présente la manipulation avec préparation des solutions-mères de macroéléments MS, de microéléments MS et de FeEDTA (Murashige & Skoog, 1962), pour la préparation de 1 L de milieu de culture (Tableau 1). Une poudre de ce milieu prêt à l'emploi, qui contient aussi les vitamines de Morel (M0222), est également disponible dans le commerce (Khalys, Montpellier, France).

Pour réaliser le milieu de culture, tous les réactifs, sauf l'agar et le charbon actif, sont mélangés dans un bécher de 1 L, sur un agitateur magnétique. Le pH de la solution est amené entre 5,6-5,7 avec quelques gouttes de NaOH 1N, et le volume de la solution est ajusté à 1 L avec l'eau filtrée.

L'agar et le charbon actif sont ajoutés dans une bouteille de laboratoire de 2 L dans laquelle la solution préparée précédemment est versée. Le tout est stérilisé par autoclavage, à 121 °C pendant 20 min, avec les tubes à essai qui recueilleront le milieu.

Une fois l'autoclavage réalisé, le milieu de culture est distribué dans les tubes à essai à l'aide d'un distributeur de milieu à raison de 10 mL par tube, sous hotte à flux laminaire.

## Micro-bouturage des plants

Le micro-bouturage consiste à découper les vitroplants en plusieurs boutures qui donneront chacune un nouveau plant génétiquement identique à la plante-mère (clone).

En général, les vitroplants à repiquer sont âgés de 8 à 12 mois, mais il peut également s'agir de plants présentant des signes de dépérissement ou d'accessions pour lesquelles moins de 6 vitroplants sont disponibles.

La vérification visuelle de l'état des vitroplants de chaque accession doit être faite régulièrement, à raison d'une fois par semaine.

## Mode opératoire (Figure 3)

Pour les accessions dont le stock de vitroplants est infé-

rieur ou égal à 6, tous les vitroplants sont utilisés pour le micro-bouturage. Dans le cas contraire, on choisit jusqu'à 4 vitroplants parmi les plus vigoureux.

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Figure 3. Conservation de vitroplants d'igname en culture in vitro : schéma représentant les étapes de la multiplication</figcaption></figure>

La manipulation se fait sous la hotte à flux laminaire en conditions stériles.

Les vitroplants sont sortis de leur tube de culture et déposés sur une feuille cartonnée, afin de prélever un maximum de micro-boutures, l'objectif étant d'en obtenir au moins 12 par accession. À l'aide d'un scalpel, les nœuds comportant chacun un méristème sont découpés et placés dans un tube contenant du milieu de croissance neuf. Le méristème est un amas de cellules totipotentes, c'est-à-dire capables d'engendrer n'importe quel tissu végétal, à partir desquels une plante entière peut-être régénérée. Si les nœuds comportent de jeunes feuilles, celles-ci sont conservées. Les feuilles âgées ou abîmées sont retirées.

Pour finir, une étiquette comportant l'identifiant de l'accession est apposée sur chaque tube. Ces derniers sont ensuite placés dans une chambre de culture à 25 °C avec une photopériode de 12 h.

Un relevé des contaminations est effectué 2 jours après le repiquage, puis 10 jours après et, enfin, 20 jours après.

Si au bout de 2 mois les microboutures présentent un développement racinaire correct, le reste du lot initial de vitroplants est éliminé. Sinon, ce dernier est utilisé pour faire un nouveau micro-bouturage.

## L'assainissement de la collection

L'indexation régulière et complète par outils moléculaires de la collection in vitro d'igname a révélé que 93 % des accessions contenaient un ou plusieurs virus. De plus, au fil des années, les outils de détection virale se sont améliorés et ont augmenté en sensibilité révélant non seulement de
nouvelles accessions infectées, mais aussi la présence de nouveaux virus encore non identifiés sur igname.

En réponse à ce constat, le CRB a mis en place des techniques d'assainissement en culture in vitro, à savoir la thermothérapie couplée à la culture de méristème (Umber et al., 2020). Elles sont complémentaires et permettent l'élimination partielle ou complète des virus infectant un vitroplant. La première consiste à faire pousser des explants d'igname dans une enceinte thermostatée à 34 °C, ce qui ralenti la réplication virale. La seconde vise à exciser les méristèmes apicaux, naturellement indemnes de nombreux virus, afin de régénérer un vitroplant sain.

Ces deux techniques doivent être effectuées successivement (Figure 4).

## Thermothérapie et culture de méristème (Figure 4)

### Thermothérapie

La première étape consiste à multiplier une série de 12 accessions issues de la collection in vitro. L'objectif est d'obtenir au moins 4 vitroplants par accessions, qui seront appelés « plantes mères ».

Après deux mois de croissance, ces vitroplants sont découpés en 20 boutures qui sont ensuite placées dans des boîtes vitrovent (Dutscher, Illkirsch, France) contenant le milieu de croissance. Chaque boîte contenant les 20 boutures d'une même accession est placée dans une enceinte thermique chauffée à 34 °C, avec une photopériode de 12h, pendant deux mois.

### Culture de méristèmes

Au bout des deux mois, les boîtes sont retirées de l'enceinte thermique et le morceau de tige portant le méristème apical de chaque plante est découpé puis déposé dans une boîte de Pétri vide.

Le méristème étant très petit (moins de 1 mm), la suite des manipulations s'effectue sous loupe binoculaire pour retirer, à l'aide d'une pointe de scalpel, les tissus de la tige et le plus d'ébauches foliaires possible. Les tissus cellulaires autres que ceux des méristèmes ont, en effet, plus de risque d'être contaminés.

Les 20 méristèmes prélevés par accession sont ensuite déposés sur un milieu de régénération (Umber et al., 2020), préparé dans des petites boîtes de Petri, pour permettre l'obtention d'une nouvelle plante. Les boîtes sont placées dans une chambre de culture à 25 °C et avec une photopériode de 16 h.

Si les boîtes ne sont pas contaminées, les 20 méristèmes prélevés permettront la régénération de 20 mériplants, c'est

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Figure 4. Étapes de l'assainissement d'une accession d'igname à partir d'un vitroplant</figcaption></figure>

à dire des vitroplants issus de méristèmes, au minimum au bout d'un mois de culture. Les mériplants sont alors repiqués dans des tubes contenant du milieu de croissance.

Une fois les mériplants suffisamment développés pour être prélevés et repiqués, ils sont indexés avec la plante-mère, à l'aide de tests de détection moléculaires, afin de vérifier l'élimination des virus.

### Indexation virale

Aujourd'hui, 13 tests permettant la détection de virus à ARN et 1 test permettant la détection de virus à ADN ont été développés par le CRB (Tableau 2).

<table><caption>Tableau 2 : Liste des 14 virus ou groupe de virus ciblés par les tests de détection développés par le CRB Plantes Tropicales sur igname</caption><thead><tr><th>GÉNOME</th><th>FAMILLE</th><th>GENRE</th><th>VIRUS CIBLÉS</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="11">Virus à ARN</td><td rowspan="3">Alphaflexiviridae</td><td rowspan="3">Potexvirus</td><td>potexvirus d'igname</td></tr><tr><td>yam virus X (YVX)</td></tr><tr><td>tout le genre</td></tr><tr><td rowspan="2">Betaflexiviridae</td><td rowspan="2">non assigné</td><td>yam virus Y (YYY)</td></tr><tr><td>cucumber mosaic virus (CMV)</td></tr><tr><td rowspan="4">Closteroviridae</td><td rowspan="2">Ampelovirus</td><td>air potato virus 1 (AiPoV1)</td></tr><tr><td>yam asymptomatic virus 1 (YaV1)</td></tr><tr><td rowspan="2">Velarivirus</td><td>Cordyline virus 1 (CoV1)</td></tr><tr><td>macluravirus d'igname</td></tr><tr><td rowspan="3">Potyviridae</td><td rowspan="3">Macluravirus</td><td>tout le genre</td></tr><tr><td>yam mosaic virus (YMV)</td></tr><tr><td>yam mild mosaic virus (YMMV)</td></tr><tr><td>Secoviridae</td><td>Sadwavirus</td><td>Dioscorea mosaic associated virus (DMaV)</td></tr><tr><td>Virus à ADN</td><td>Caulimoviridae</td><td>Badnavirus</td><td>tout le genre</td></tr></tbody></table>
## Étapes spécifiques à la détection des virus à ARN

(Umber et al., 2020; Figure 5)

Pour détecter des virus à ARN, la première étape consiste à extraire, par broyage et élimination des autres composants de la plante, la totalité du matériel génétique, aussi bien celui de la plante que celui des virus. Cette technique est appelée extraction de TNA (acides nucléiques totaux : ADN + ARN).

Les virus à ARN sont ensuite détectés par RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymérase Chain Reaction). L'ARN ne pouvant pas être amplifié directement par PCR, les génomes viraux sont d'abord transformés en ADN complémentaires (ADNc) par une enzyme rétrotranscriptase. Ensuite, l'amplification des génomes de chacun des virus est réalisée par PCR, à l'aide d'amorces génériques et/ou spécifiques, afin d'obtenir en grande quantité les séquences virales ciblées.

## Étapes spécifiques à la détection des virus à ADN

(Umber et al., 2017; Figure 6)

La particularité de la détection des virus à ADN du genre Badnavirus réside dans le fait que ces virus peuvent être présents sous deux formes chez l'igname : les particules virales libres dans les cellules de la plante et les séquences virales intégrées dans le génome de la plante. La forme que nous voulons détecter ici, car potentiellement infectieuse, est celle des particules virales. Afin de ne pas obtenir des faux positifs dus à la présence de séquences virales insérées dans le génome de la plante, les particules virales ciblées vont être piégées par des anticorps qui fixent les protéines de la capside virale. Cette étape est appelée immunocapture. Le matériel génétique de la plante est ensuite éliminé par un traitement spécifique qui ne détruit pas celui des particules virales, lequel est protégé par la capside.

<figure><img src="image_67.png" /></figure>

<figure><img src="image_68.png" /></figure>
Une PCR classique est ensuite effectuée afin d'obtenir, en grande quantité, les séquences virales ciblées.

## Étapes communes

Pour finir, les séquences d'ADN générées par la PCR, et appelées produits PCR, sont déposées sur un gel d'agarose et révélées sur une table à UV, après application d'un courant. En effet, l'ADN est chargé négativement et migre donc vers le pôle positif à une vitesse qui dépend de la taille des produits PCR. Plus les produits PCR sont petits et plus ils migreront vite. Leur taille est estimée grâce au marqueur de taille (Figure 7), ce qui permet l'identification des virus.

La Figure 7.A montre les résultats d'une migration sur gel d'agarose après une PCR de détection de YMV sur 3 mériplants d'une même accession après assainissement. L'absence de signal pour le mériplant 1 montre qu'il est assaini pour ce virus.

De la même façon, en Figure 7.B, la révélation de la PCR de détection des badnavirus sur une autre accession montre que le mériplant 2 est assaini pour les badnavirus

<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>Figure 7. Exemples de photos de gel après migration de différents produits PCR</figcaption></figure>

## Conclusion

La conservation *in vitro* est effectivement moins contrai-gnante que la conservation au champ (espace plus réduit et entretien moins chronophage). Cependant, les moyens humains, financiers et structurels imposent des limites quant au nombre d'accessions conservées. Connaître la va-riabilité génétique au sein des différentes espèces est un de nos objectifs pour les années à venir. Ces informations nous permettraient d'orienter nos choix si nous devions réduire le nombre d'accessions conservées ou encore lors de l'in-troduction de nouvelles variétés et la fourniture de matériel aux bénéficiaires de la collection.

Aujourd'hui, le statut viral de 396 accessions en culture *in vitro* est connu pour 8 virus, et 16 accessions ont été assainies avec succès pour ces mêmes virus (CMV, DMaV, YaV1, YMV, YMMV et les genres Badnavirus, Macluravirus et Potexvirus).

La technique d'assainissement combinant la thermothé-rapie et la culture de méristème est une méthode longue et compliquée à gérer avec un taux de réussite variable. En effet, elle a une efficacité de 100 % pour l'élimination des macluravirus, retrouvés principalement sur D. alata avec 14,5 % de prévalence dans la collection (Umber et al., 2020). En revanche, le taux d'assainissement de YaV1 et de YMMV est très faible (14,5 % et 24,9 %, respectivement), alors que la prévalence de ces virus est très élevée dans la collection (par exemple 82,1 % sur D. alata pour YaV1 et 72,1 % sur D. trifida pour YMMV). Or, il est conseillé et par-fois imposé, surtout à l'international, que le matériel fourni par le CRB soit exempt de virus. Ces observations montrent le besoin de développer des techniques potentiellement plus efficaces sur igname, comme par exemple la cryothé-rapie qui utilise le traitement à l'azote liquide sur des méris-temes pour éliminer les virus.

À l'échelle du laboratoire, la découverte régulière de nou-veaux virus complique l'établissement du statut viral des accessions ainsi que leur assainissement. Mais à l'échelle internationale, ce sont les échanges de matériel biologique qui sont impactés. ■
# Remerciements

Nous tenons à remercier Marie Umber et Michel Roux-Cuvelier pour leur relecture attentive.

## Références

Agreste Guadeloupe, 2020. Mêmento de la statistique agricole. Disponible en ligne :
https://daaf.guadeloupe.agriculture.gouv.fr/IMG/pdf/memento_2020_internet_cle4814fe.pdf

Arnolin R., 1988. VII' Symposium of the International Society for Tropical Root Crops, Gosier Guadeloupe), 1-6 July 1985, Ed. INRA, Paris, 1988.

Arnolin R., Gamiette F. et Degras L., 1989. L'obtention de plantules d'igname (D. alata et D. cayenensis-rotundata) par culture d'embryons *in vitro*. Caribbean Food Crops Society > 25th Annual Meeting, July 1-6, 1989, Gosier, Guadeloupe.
https://ageconsearch.umn.edu/record/260002/

Barlagne C., Cornet D., Blazy J.M., Diman J.L. and Ozier-Lafontaine H. Consumers' preferences for fresh yam: A focus group study.
Food Sci. Nutr. 2017, 5, 54-66. https://doi.org/10.1002/fsn3.364

Degras L., 1986. L'igname. France : G.-P. MAISONNEUVE ET LAROSE A.C.C.T.

FAOSTAT. Disponible en ligne : http://www.fao.org/faostat/ (19.07.2021).

Lacointe A. et Zinsou C., 1987. Effet de la date de plantation sur la croissance et le développement de plantules d'igname (*Dioscorea alata* L.) produites par culture *in vitro*. Agronomie, EDP Sciences, 1987, 7 (7), pp.475-481. https://haLinrae.fr/hal-02722349v1.

Mantell S. H. & Hugo S. A., 1989. Effects of photoperiod, mineral medium strength, inorganic ammonium, sucrose and cytokinin on root, shoot and microtuber development in shoot cultures of *Dioscorea alata* L. and D. bulbifera L. yams. Plant cell, tissue and organ culture, 16(1):23-37.

Murashige, T. and Skoog, F., 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Plant Physiology, 15, 473-497. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x

Umber M., Gomez R.-M., Gélabale S., Bonheur L., Pavis C. and Teycheney P.-Y., 2017. The genome sequence of Dioscorea bacilliform TR virus, a member of the genus Badnavirus infecting Dioscorea spp., sheds light on the possible function of endogenous Dioscorea bacilliform viruses. Archives of Virology, 2017, 162 (2), pp.517-521. https://doi.org/10.1007/s00705-016-3113-3

Umber M., Filloux D., Gélabale S., Gomez R.-M., Marais A., Gallet S., Gamiette F., Pavis C. and Teycheney P.-Y. Molecular Viral Diagnosis and Sanitation of Yam Genetic Resources: Implications for Safe Yam Germplasm Exchange. Viruses 2020, 12, 1101.
https://doi.org/10.3390/v12101101

<figure><img src="image_70.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Évaluer l'effet du temps et de la méthode de conservation du matériel végétal sur la quantité et la qualité de l'ADN extrait

Matthieu LINGRAND<fnref n="1" />

Caroline SCOTTI-SAINTAGNE<fnref n="1" />

Sylvie ODDOU-MURATORIO<fnref n="1" />

Marianne CORREARD<fnref n="2" />

Olivier GILG<fnref n="2" />

Franck REÏ<fnref n="2" />

Anne ROIG<fnref n="1" />

Patrice BRAHIC<fnref n="3" />

CORRESPONDANCE

matthieu.lingrand@inrae.fr

RÉSUMÉ

L'URFM stocke plus de 40 000 échantillons végétaux soit à -20 °C soit à température ambiante après déshydratation. Le projet présenté dans cet article avait pour but d'évaluer la quantité et la qualité de l'ADN obtenu à partir d'échantillons de quatre espèces d'arbres méditerranéens faisant l'objet de recherches récurrentes à l'URFM : trois conifères (le pin de Salzman, le sapin pectiné et le cèdre de l'Atlas) et un feuillu (le hêtre commun). L'hypothèse retenue est que la durée de conservation a un effet sur la qualité du matériel génétique ; nous n'avions aucun a priori sur l'effet de la méthode de conservation. Pour mesurer la qualité de l'ADN, nous avons effectué des analyses de génotypage et de séquençage couramment utilisées au laboratoire. Nos résultats montrent une variation entre les quatre espèces étudiées, en fonction du mode et de la durée de conservation, sur la quantité et la qualité de l'ADN. De plus, nous avons montré que les échantillons conservés sur la plus longue période ou avec la méthode la plus basique (à sec) présentent une bonne qualité d'ADN contrairement a des échantillons plus récents.

MOTS-CLÉS

Biologie moléculaire, échantillons végétaux, qualité ADN, stockage.

<footnote n="1">1 INRAE, UR629 Écologie des Forêts Méditerranéennes (URFM), Domaine Saint Paul, Site Agroparc, FR-84914 Avignon Cedex 9, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, UE0348 Unité Expérimentale Entomologie et Forêt Méditerranéenne, INRA-UEFM Domaine Saint Paul, Site Agroparc 84914 Avignon, France.</footnote>

<footnote n="3">3 Office National des Forêts, Pôle National des Ressources Génétiques Forestières, Route du barrage 13115 Saint Paul Lez Durance, France.</footnote>
# Assessing the effect of time and conservation method of plant material on the quantity and quality of extracted DNA

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Caroline SCOTTI-SAINTAGNE<fnref n="1" />

Sylvie ODDOU-MURATORIO<fnref n="1" />

Marianne CORREARD<fnref n="2" />

Olivier GILG<fnref n="2" />

Franck REÏ<fnref n="2" />

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Patrice BRAHIC<fnref n="3" />

## CORRESPONDENCE

matthieu.lingrand@inrae.fr

## ABSTRACT

URFM stores more than 40,000 plant samples either at -20°C or at room temperature after dehydration. The aim of the project presented in this article was to assess the quantity and quality of DNA obtained from samples of four Mediterranean tree species. To evaluate DNA quality, we performed genotyping and sequencing analyses commonly used in the laboratory. Our results showed a variation among species in the quantity and the quality of DNA as a function of the method and duration of sample conservation. In addition, samples kept over the longest period or with the most basic (dry) method were not those with the poorest DNA quality

## KEYWORDS

Molecular biology, plant samples, DNA quality, storage.

<footnote n="1">1 INRAE, UR629 Écologie des Forêts Méditerranéennes (URFM), Domaine Saint Paul, Site Agroparc, FR-84914 Avignon Cedex 9, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, UE0348 Unité Expérimentale Entomologie et Forêt Méditerranéenne, INRA-UEFM Domaine Saint Paul, Site Agroparc 84914 Avignon, France.</footnote>

<footnote n="3">3 Office National des Forêts, Pôle National des Ressources Génétiques Forestières, Route du barrage 13115 Saint Paul Lez Durance, France.</footnote>
## Introduction

Les établissements de recherche se sont engagés dans une nouvelle organisation de leurs infrastructures de recherche pour en faire des lieux de production et de collecte des données mieux partagés entre les équipes d'un même organisme et avec ses partenaires (chantiers #OpenScience et #OpenData). Beaucoup d'efforts sont ainsi consacrés à INRAE et dans d'autres établissements de recherche pour archiver, traiter et partager les données expérimentales acquises au cours des programmes de recherche. En amont des données proprement dites, se pose la question de la conservation et du suivi de la qualité des échantillons de matériel végétal ou animal qui ont permis d'acquérir ces données.

Le cas de la conservation des échantillons végétaux à l'URFM (Unité de Recherche en écologie des Forêts Méditerranéennes) illustre bien cette problématique. Dans le cadre de ses recherches sur la dynamique des écosystèmes forestiers méditerranéens, l'URFM et son partenaire l'UE-FM (Unité expérimentale Entomologie et Forêt Méditerranéenne) ont mis en place un dispositif de conservation des échantillons végétaux, constitués de feuilles et de graines. Ce dispositif recouvre la gestion physique et le suivi des échantillons dans les enceintes de stockage, mais aussi leur intégration dans une base de données (BDD), créée en interne (par C. Pichot), afin de tracer l'origine du matériel récolté, le localiser dans les enceintes et gérer les quantités de matériel restantes au fil du temps. Cette BDD compte actuellement plus de 40 000 échantillons. Ces échantillons ont été collectés dans des peuplements divers, parfois éloignés du laboratoire, et sur des arbres qui ont pu mourir depuis la collecte du matériel, ce qui les rend d'autant plus précieux. Beaucoup de ces échantillons ont été utilisés pour générer des données (par génotypage et séquençage) dans le cadre de projets scientifiques de biologie et génétique des populations, mais une partie n'a encore jamais fait l'objet d'analyses. L'objectif de la conservation de ces échantillons est de disposer facilement de matériel pour de futures analyses (par exemple, avec de nouvelles techniques de biologie moléculaire), dans le cadre de projets de l'URFM ou en partenariat. Néanmoins, cela nécessite de s'assurer de la bonne qualité de la conservation du matériel. En outre, la multiplication du nombre d'échantillons stockés nous contraint à faire des choix en matière de mode de conservation.
Initialement, deux modes de conservation étaient utilisés : (1) une enceinte de stockage à -20 °C et (2) un gélateur à -80 °C. En 2012, un troisième mode de stockage a commencé à être utilisé, le stockage d'échantillons

« secs » après leur déshydratation à l'étuve.

La qualité de l'ADN nécessaire pour les analyses de biologie moléculaire reste en effet largement méconnue (méthode de dosage, présence d'inhibiteurs, taille des fragments), ainsi que l'effet du mode et de la durée de conservation de l'échantillon végétal. Il serait en particulier souhaitable de déterminer une « date de péremption » pour les échantillons que nous conservons.

De façon générale, nous avions deux hypothèses. La première considérait que la conservation du matériel à -20 °C devrait permettre d'avoir une meilleure qualité et quantité d'ADN que la conservation à sec. Toutefois, les aléas associés aux enceintes froides (problèmes de décongélation partielle des échantillons lors de pannes ou de leur manipulation) pourraient réduire cette qualité/quantité d'ADN. La deuxième hypothèse était que la qualité et quantité d'ADN diminuent avec la durée de conservation.

L'objectif du projet présenté ici, pour lequel nous avons demandé l'appui du département EFPA (Écologie des Forêts, Prairies et milieux Aquatiques), est d'étudier l'impact du mode et de la durée de conservation du matériel végétal sur la quantité et la qualité de l'ADN utilisé pour des projets scientifiques mettant en œuvre des techniques de biologie moléculaire.

Pour atteindre cet objectif, nous avons mesuré l'effet du mode et de la durée de conservation des échantillons végétaux sur la qualité et la quantité de l'ADN extrait à partir d'un lot de 48 échantillons choisis parmi les 40 000 stockés. La qualité et la quantité d'ADN ont été évaluées par différentes approches utilisées en routine au laboratoire et systématiquement comparées entre échantillons conservés et témoins « frais » récoltés sur le terrain juste avant les analyses.

## Matériels et méthodes

Afin de limiter les coûts du projet liés à la récolte des échantillons témoins, les individus sélectionnés pour les analyses ont été choisis en fonction de leur situation géographique (à proximité de l'URFM et sur des sites régulièrement visités). Les analyses en laboratoire ont été effectuées au sein du LBM (Laboratoire de Biologie Moléculaire), plateforme régionale qui accueille différentes unités du centre de recherche d'Avignon.

Par ailleurs, nous avons optimisé l'analyse en tenant compte des contraintes techniques du laboratoire. Par exemple, le séquenceur utilisé étant limité à 48 échantillons par passage, nous nous sommes basés sur ce nombre pour définir le plan d'expérience du projet (Annexe 1). Enfin,
nous avons dupliqué cette plaque pour tester la reproductibilité de nos résultats.

## Sélection des échantillons conservés et de leur témoin positif

Nous avons sélectionné les échantillons pour cette étude en interrogeant la BDD. Les critères de sélection ont été : la situation géographique des arbres d'origine des prélèvements, la durée de conservation des échantillons et la méthode de stockage des échantillons. Enfin, nous nous sommes concentrés sur quatre espèces d'arbres forestiers faisant l'objet de recherches récurrentes à l'URFM : trois conifères (le pin de Salzman, le sapin pectiné et le cèdre de l'Atlas) et un feuillu (le hêtre commun). En intégrant ces différentes contraintes, nous avons analysé un total de 23 échantillons de cèdre (correspondant à 13 individus, 3 durées de conservation et 2 méthodes de stockage), 23 échantillons de sapin (correspondant à 5 individus, 3 durées de conservation et 2 méthodes de stockage), 24 échantillons de hêtre (correspondant à 14 individus, 4 durées de conservation et 2 méthodes de stockage), 24 échantillons de pin de Salzman (correspondant à 18 individus, 5 durées de conservation et 1 méthode de stockage) et, enfin, 2 échantillons négatifs. Les échantillons négatifs correspondent à deux puits vides en pré-extraction qui vont suivre l'ensemble du processus et sont utilisés pour mettre en évidence une potentielle contamination (Annexe 1).

Pour chaque espèce, entre 5 et 8 échantillons témoins positifs ont été pré-sélectionnés au laboratoire. Pour chaque échantillon témoin, un arbre remplaçant a également été choisi pour prévenir les éventuels aléas de la récolte (arbre mort ou difficile à retrouver sur le terrain). Ces témoins positifs (« échantillons frais ») ont été prélevés sur trois sites (le Ventoux pour le sapin et le hêtre, la plantation comparative du Treps pour le cèdre et la pépinière de Cadarache pour le pin de Salzman).

## Récolte et mise en plaque

La semaine précédant la récolte des témoins positifs, les échantillons conservés et enregistrés en BDD ont été extraits des enceintes climatiques et mis en plaque. Deux plaques identiques ont été préparées et stockées à -20 °C.

La semaine de la récolte, les prélèvements de feuilles et d'aiguilles ont été réalisés en double, sur trois jours (un jour/site), les échantillons ont été transportés à -170 °C à l'aide de matériel adapté. Les témoins positifs ont été conservés ainsi jusqu'à la mise en plaque.

## Analyses au laboratoire

Notre objectif était d'évaluer la qualité des échantillons à l'aide d'analyses classiques, réalisées en routine dans le cadre des projets de biologie moléculaire, couramment mises en œuvre à l'URFM. Toutes ces analyses ont été systématiquement effectuées sur les deux plaques répliquées, sauf le séquençage qui n'a été effectué que sur l'une des deux plaques.

L'ADN des échantillons de feuilles et d'aiguilles a été extrait à l'aide du DNeasy 96 plant kit (Qiagen), puis conservé sous forme aliquotée dans plusieurs plaques.

Un dépôt sur gel d'agarose à 1 % a tout d'abord été réalisé afin d'apprécier visuellement la qualité globale de l'ADN et de mettre en évidence d'éventuelles dégradations avec la présence de « smears » (trainées). Les résultats du gel ont été notés sous forme d'une variable à trois catégories : a) présence d'une bande nette (bonne qualité d'ADN) ; b) présence d'une bande dégradée (qualité moyenne) ; c) absence de bande (absence ou faible quantité d'ADN).

La quantité d'ADN a été ensuite évaluée par un dosage au NanoDropTM (Thermo Scientific). Avec cette approche, la mesure des absorbances du spectre permet de quantifier et d'analyser la pureté des acides nucléiques. Nous avons aussi dosé l'ADN avec la méthode PicoGreenTM (Invitrogen), basée sur l'utilisation d'un colorant fluorescent spécifique de l'ADN double-brin et considérée comme plus précise que la technique au NanoDropTM.

Deux analyses classiques de biologie moléculaire ont enfin été réalisées : (a) l'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) multiplex de marqueurs microsatellites spécifiques de chacune des espèces, (b) le séquençage à partir d'amorces trnH-psbA qui ciblent l'ADN chloroplasique, utilisées couramment dans le cadre de projets de code-barres moléculaires ou Barcoding (Annexe 2).

## Analyses statistiques

Une analyse de variance de type II a été réalisée pour tester la significativité des principaux effets qui affectent la qualité et la quantité de l'ADN. La masse de matériel pesée au départ a été incluse dans le modèle en co-facteur ainsi que l'effet plaque (analyse répétée sur les deux plaques).

## Résultats

### Qualité de l'ADN visualisée sur gel d'agarose

Le dépôt sur gel d'agarose a montré une importante variabilité de la qualité de l'ADN entre espèces (Figure 1). Des bandes nettes ont été obtenues pour plus de 70 % des échantillons
de sapin et de pin et pour plus de 50 % des échantillons de cèdre (Tableau 1). En revanche, aucun des 24 échantillons de hêtre du projet ne présentait de bande nette. Des variations ont également été observées pour les témoins positifs avec 57 % de bandes nettes pour le cèdre, 80 % pour le sapin, 100 % pour le pin et aucune bande nette pour le hêtre, alors qu'on aurait pu s'attendre à 100 % de bandes nettes avec ce matériel frais. L'état du matériel récolté (phase du cycle de l'arbre en fonction de la saison) et les aléas liés au transport et au stockage de matériel frais expliquent probablement les proportions obtenues plus faibles que celles attendues.

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>Figure 1. Exemple de visualisation de la qualité de l'ADN sur gel agarose 1 % en tampon d'électrophorèse TAE 1X.</figcaption></figure>

Ce gel montre différents dépôts de 5µl ADN + 2µl tampon de charge + 5µl d'eau avec une échelle de poids moléculaire avec 2µl de 100bp DNA Ladder (PROMEGA). L'indication au-dessus des puits correspond à la position des échantillons sur la plaque.

<table><caption>**Tableau 1 : Pourcentage de bandes nettes observées pour chaque espèce selon le mode de conservation**</caption><caption>Pourcentage</caption><thead><tr><th>ESPÈCE</th><th>TOTAL (TÉMOINS POSITIFS INCLUS)</th><th>POUR LES TÉMOINS POSITIFS</th><th>POUR LES ÉCHANTILLONS STOCKÉS À -20 °C</th><th>POUR LES ÉCHANTILLONS STOCKÉS À SEC</th></tr></thead><tbody><tr><td>CÈDRE</td><td>57</td><td>57</td><td>58</td><td>50</td></tr><tr><td>HÊTRE</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td></tr><tr><td>PIN</td><td>71</td><td>100</td><td>61</td><td>NA*</td></tr><tr><td>SAPIN</td><td>74</td><td>80</td><td>80</td><td>33</td></tr></tbody></table>

L'ANOVA a permis de mesurer quantitativement l'effet de la méthode de conservation sur la qualité de l'ADN, évaluée par la présence de bandes nettes sur gel d'agarose. Pour toutes les espèces, le témoin (frais de l'année) donne toujours une proportion égale ou supérieure (Tableau 1) de bandes nettes. Pour le cèdre et le hêtre, la méthode de conservation (-20 °C ou à sec) ne joue pas sur la proportion de bandes nettes. En revanche, pour le sapin, le matériel sec est déconseillé pour avoir une bande nette sur agarose.

Concernant l'effet de la durée de conservation, nos résultats suggèrent une diminution de la qualité de l'ADN pour les échantillons conservés à -20 °C avec l'augmentation de la durée de conservation pour le pin (hors année 2011) et le sapin. Les six témoins positifs de pin testés présentent une bande nette, les échantillons de pin de 2012 et de sapin de 2011 et 2012 présentent 100 % de bandes nettes et le pourcentage descend à 33 % pour les échantillons de pin de 2008 et à 50 % pour les sapins de 2007 (Tableau 2).

<table><caption>**Tableau 2 : Pourcentage de bandes nettes observées pour chaque espèce en fonction du temps de conservation pour les échantillons stockés à -20 °C**</caption><caption>Pourcentage de bandes nettes</caption><thead><tr><th></th><th>CÈDRE</th><th>PIN</th><th>SAPIN</th><th>HÊTRE</th></tr></thead><tbody><tr><th scope="row">TÉMOINS POSITIFS</th><td>57</td><td>100</td><td>80</td><td>0</td></tr><tr><th scope="row"></th><th>Année</th><th>%</th><th>Année</th><th>%</th><th>Année</th><th>%</th><th>Année</th><th>%</th></tr><tr><th scope="row"></th><td>2001</td><td>71</td><td>2008</td><td>33</td><td>2007</td><td>50</td><td>2004</td><td>0</td></tr><tr><th scope="row">ÉCHANTILLONS STOCKÉS À -20 °C</th><td>2008</td><td>40</td><td>2009</td><td>67</td><td>2011</td><td>100</td><td>2008</td><td>0</td></tr><tr><th scope="row"></th><td></td><td></td><td>2010</td><td>67</td><td>2012</td><td>100</td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row"></th><td></td><td></td><td>2011</td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row"></th><td></td><td></td><td>2012</td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row"></th><td></td><td></td><td>58</td><td>61</td><td></td><td></td><td></td><td>0</td></tr></tbody></table>

Si la qualité de l'ADN est jugée satisfaisante dès lors qu'une bande, nette ou dégradée, est observée, la proportion d'échantillons de qualité correcte augmente (Tableau 3). Cela est particulièrement visible pour les échantillons conservés à -20 °C. Les résultats changent notablement pour le

<table><caption>**Tableau 3 : Pourcentage de bandes nettes ou dégradées observées pour chaque espèce selon le mode de conservation**</caption><caption>Pourcentage de bandes nettes ou dégradées</caption><thead><tr><th>ESPÈCE</th><th>TOTAL (TÉMOINS POSITIFS INCLUS)</th><th>POUR LES TÉMOINS POSITIFS</th><th>POUR LES ÉCHANTILLONS STOCKÉS À -20 °C</th><th>POUR LES ÉCHANTILLONS STOCKÉS À SEC</th></tr></thead><tbody><tr><td>CÈDRE</td><td>74</td><td>57</td><td>100</td><td>50</td></tr><tr><td>HÊTRE</td><td>63</td><td>87</td><td>50</td><td>50</td></tr><tr><td>PIN</td><td>92</td><td>100</td><td>89</td><td>NA*</td></tr><tr><td>SAPIN</td><td>83</td><td>80</td><td>87</td><td>33</td></tr></tbody></table>

<footnote>* NA. non analysable par absence de matériel de ce type</footnote>

<footnote>* NA : non analysable par absence de matériel de ce type</footnote>
hêtre, pour lequel plus de 60 % des échantillons présentent une bande dégradée. Deux groupes se distinguent : (1) les témoins positifs et les échantillons conservés à -20 °C qui ont une qualité satisfaisante avec un pourcentage égal ou supérieur à 50 %, (2) la condition « à sec » avec un pourcentage inférieur ou égal à 50 %. Avec ce critère de qualité, les résultats sur le hêtre rejoignent ceux obtenus sur les autres espèces. De plus, il est également observé pour le hêtre une meilleure qualité des ADN pour les échantillons récents par rapport aux échantillons plus anciens (Tableau 4). Contrairement aux attendus pour le cèdre, nous obtenons le résultat inverse, à savoir 57 % de qualité satisfaisante pour les témoins positifs, 80 % de qualité satisfaisante pour les échantillons prélevés en 2008 et, enfin, 100 % de qualité satisfaisante pour les échantillons récoltés en 2001 (Tableau 4). Les hypothèses pour expliquer les données obtenues chez le cèdre, mais que nous n'avons pas été en capacité de vérifier, peuvent être en lien avec la période de l'année à laquelle a été réalisé le prélèvement (ce qui peut affecter la qualité de l'ADN extrait) ou à une défaillance technique du congélateur contenant les échantillons.

## Quantité d'ADN évaluée par dosage

<table><caption>**Tableau 4 :** Pourcentage de bandes nettes et dégradées observées pour chaque espèce en fonction du temps de conservation pour les échantillons stockés à -20 °C</caption><caption>Pourcentage de bandes nettes</caption><thead><tr><th></th><th>CÈDRE</th><th>PIN</th><th>SAPIN</th><th>HÊTRE</th></tr></thead><tbody><tr><th scope="row">TÉMOINS POSITIFS</th><td>57</td><td>100</td><td>80</td><td>0</td></tr><tr><th scope="row" rowspan="7">ÉCHANTILLONS STOCKÉS À -20 °C</th><th scope="row">Année</th><th scope="col">%</th><th scope="col">Année</th><th scope="col">%</th><th scope="col">Année</th><th scope="col">%</th></tr><tr><td>2001</td><td>100</td><td>2008</td><td>66</td><td>2007</td><td>75</td></tr><tr><td>2008</td><td>80</td><td>2009</td><td>67</td><td>2011</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td></td><td>2010</td><td>100</td><td>2012</td><td>100</td></tr><tr><td></td><td></td><td>2011</td><td>100</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>2012</td><td>100</td><td></td><td></td></tr><tr><th scope="row">58</th><td></td><td>89</td><td>87</td><td>50</td></tr></tbody></table>

Avec la méthode NanoDropTM, les mesures montrent une grande variabilité de la concentration en ADN pour les échantillons, qui peut aller de 1 à 120 ng/µl par exemple pour le pin (Figure 2). Les concentrations moyennes d'ADN par espèces obtenues avec le dosage au PicoGreenTM et le NanoDropTM sont en général proches (Tableau 5). Le pin est l'espèce pour laquelle nous obtenons le meilleur rendement, suivi par le sapin, le hêtre et enfin le cèdre. Il est également à noter que la différence des moyennes des concentrations en ADN entre les deux plaques répétées est faible (de l'ordre de 0.5 ng/µl).

<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>Figure 2. Quantité d'ADN (mesure avec le NanoDropTM) pour l'ensemble des échantillons d'une espèce donnée.</figcaption></figure>

<table><caption>**Tableau 5 :** Comparaison de la quantité moyenne d'ADN obtenue pour les différentes espèces et avec 2 méthodes de dosage</caption><caption>Concentration moyenne d'ADN (en ng/µl)</caption><thead><tr><th>ESPÈCE</th><th>PIN</th><th>SAPIN</th><th>HÊTRE</th><th>CÈDRE</th></tr></thead><tbody><tr><th scope="row">DOSAGE NANODROPTM</th><td>57.41</td><td>21.16</td><td>12.06</td><td>3.79</td></tr><tr><th scope="row">DOSAGE PICOGREENTM</th><td>60</td><td>24.90</td><td>9.96</td><td>12.2</td></tr></tbody></table>

Les boites représentent l'intervalle interquartile (Q1 et Q3) et la ligne épaisse la médiane. Les extrémités des « moustaches » sont calculées en utilisant 1.5 x l'espace interquartile (la distance entre Q1 et Q3).

Pour les quatre espèces, l'effet de la méthode de conservation sur la concentration d'ADN mesurée avec le Nano-DropTM est significatif (Figure 3). Pour le cèdre, le matériel sec donne la meilleure concentration en ADN, alors que le meilleur mode de conservation pour le hêtre est le stockage à -20 °C, et le matériel frais pour le pin et le sapin. La concentration en ADN n'est pas significativement plus élevée pour le hêtre et le cèdre lorsque du matériel frais est utilisé, contrairement au pin et au sapin. De plus, comme les échantillons conservés à -20 °C sont situés dans

<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>Figure 3. Concentration d'ADN obtenue en fonction de la méthode de conservation et de l'espèce. Ce graphique montre les prédictions basées sur l'ANOVA.</figcaption></figure>
différentes enceintes (chambre froide ou congélateurs), nous avons pu analyser l'effet enceinte au sein de laodalité « -20 °C » (pour une année donnée et seulement chez le cèdre et le sapin). Les résultats ne montrent pas d'effet significatif de l'enceinte (données non fournies).

Pour les quatre espèces, un effet significatif de l'année de récolte est observé sur la concentration en ADN (Figure 4). On s'attendait à ce que les concentrations d'ADN les plus élevées soient mesurées pour les échantillons récoltés les plus récemment. Cette tendance semble globalement valable pour le cèdre, le pin et le sapin (avec des exceptions), mais moins pour le hêtre. Là encore, l'état du matériel au moment de la récolte (phase du cycle de l'arbre en fonction de la saison) joue probablement un rôle sur la concentration d'ADN.

<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>Figure 4. Concentration d'ADN obtenue en fonction de la durée de conservation et de l'espèce. Ce graphique montre les prédictions basées sur l'ANOVA.</figcaption></figure>

## Amplification de marqueurs microsatellites et séquençage

Nous n'avons pas détecté d'effet significatif du mode ou de la durée de conservation sur la hauteur des pics des microsatellites (Figure 5).

La qualité de la séquence d'ADN (la longueur maximale de séquence lue) est significativement moins bonne chez le cèdre lorsque le matériel de départ est sec (Figure 6). Pour les autres espèces, nous ne détectons pas d'effet significatif.

## Conclusion

Comme nous nous y attendions, cette étude montre que la qualité et la quantité d'ADN obtenue sont affectées par la durée et le mode de conservation des échantillons

<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>Figure 6. Longueur en bases de la séquence d'ADN lue en fonction de la méthode de conservation. Ce graphique montre les prédictions basées sur l'ANOVA.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>Figure 5. Comparaison de la migration sur gel d'agarose 1 % et de la hauteur des pics de microsatellites pour deux échantillons de pin.</figcaption></figure>
végétaux. Contrairement à ce que nous avions envisagé, ce ne sont pas forcément les échantillons frais qui donnent les meilleurs résultats. Il s'avère que le mode de conservation optimal dépend de l'espèce étudiée.

En ce qui concerne le mode de conservation, les plus fortes concentrations d'ADN sont obtenues avec le stockage à sec pour le cèdre, avec la conservation à -20 °C chez le hêtre et avec le matériel frais chez le sapin et le pin. Par contre, le mode de conservation maximisant la concentration d'ADN chez le cèdre est aussi associé à une moindre qualité des séquences obtenues (longueur de séquence lue diminuée). Nos résultats montrent également que, pour toutes les espèces étudiées, l'amplification des microsatellites n'est pas affectée par le mode ou la durée de conservation des échantillons.

En ce qui concerne la durée de conservation, ce ne sont pas toujours les échantillons les plus récents qui présentent la meilleure concentration ou qualité d'ADN, comme cela a été observé chez le hêtre et le cèdre. L'état du matériel au moment de la récolte doit aussi permettre avoir un effet.

Ce travail a d'ores et déjà permis de tirer un certain nombre d'enseignements pour la conservation des échantillons à l'URFM. Pour un usage courant, le mode de conservation à sec sera privilégié, car il ne donne pas de résultats significativement moins bons en termes de qualité et de quantité d'ADN, en revanche il présente l'avantage d'être moins coûteux et plus facile à mettre en œuvre.

## Perspectives

Le projet présenté ici a permis d'étudier l'effet du mode et de la durée de conservation des échantillons végétaux sur la qualité de l'ADN extrait, lors de la mise en œuvre de techniques d'analyses de biologie moléculaire utilisées en

routine (amplification de microsatellites ou séquençage avec des amorces pour le barcoding). Il serait toutefois intéressant d'évaluer la qualité de l'ADN à travers d'autres techniques (génotypage SNP, séquençage d'ADN nucléaire, par exemple). Il serait également utile de poursuivre ce projet dans la durée et d'effectuer un nouveau test qualité, dans des conditions similaires, avec une partie au moins des échantillons analysés. Cela permettrait d'affiner l'étude de l'effet de la durée de conservation et, peut-être, de fixer une durée maximale de conservation des échantillons.

Un point soulevé pendant ce projet est la possibilité de conserver les échantillons sous forme d'ADN extrait à partir de matériel frais, plutôt que sous forme d'échantillons végétaux. Dans cette optique, et dans la lignée de ce projet, nous pourrions comparer l'ADN extrait d'échantillons végétaux conservés à -20 °C avec des ADN extraits de ces mêmes échantillons dans le cadre de nos projets de ces dernières années. Un autre point à évaluer concerne la possibilité de lyophiliser les échantillons à sec, avec un lyophilisateur de qualité, plutôt que de les sécher à l'étuve. Dans cette optique, nous envisageons d'évaluer la quantité/qualité de l'ADN extrait à partir échantillons végétaux stockés à -20 °C puis lyophilisés.

De plus, dans le cadre d'un autre projet sur le sapin, où une concentration importante en ADN était demandée pour des analyses de séquençage, nous avons effectué plusieurs modifications du protocole d'extraction. Nous sommes ainsi arrivés à multiplier par quatre la quantité d'ADN extraite. Avec ce protocole modifié, et l'obtention d'une plus grande quantité d'ADN sur du matériel pauvre en ADN de bonne qualité, nous pourrions éventuellement obtenir des données de génétique sur du matériel qui jusqu'à présent ne donnait pas de résultats. Des tests complémentaires, en lien avec les essais présentés dans cet article, seraient nécessaires pour valider cette hypothèse.
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# Annexe 1 : Plan de plaque indiquant la position des échantillons

Les cellules en jaune correspondent aux échantillons de cèdre de l'Atlas, en vert de sapin pectiné, en bleu de hêtre et en rose de pin de Salzman. TP indique la position du témoin positif avec son espèce et son identifiant. Pour tous les autres échantillons, sont donnés l'identifiant, le mode de conservation et l'année de récolte.

<table><thead><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th><th>9</th><th>10</th><th>11</th><th>12</th></tr></thead><tbody><tr><td>A</td><td>TP cèdre BABO118</td><td>BABO118<br>-20°C 2001<br>VentFey_6<br>G1_652</td><td>BABO118<br>-20°C 2008<br>VentFey_6<br>G1_653</td><td>RIAL2_114<br>-20°C 2001<br>VentFey_6<br>G1_654</td><td>CHEL_122<br>-20°C 2001<br>VentFey_6<br>G1_655</td><td>TIKJ_123<br>-20°C 2001</td><td>CHEL_122<br>-20°C 2008<br>Vent_137</td><td>TIKJ_123<br>-20°C 2008</td><td>TP cèdre RIAL2_114<br>ORIJ_142</td><td>MGUI2_14 7<br>-20°C<br>2001</td><td>TP cèdre VentFey_0<br>5_26<br>VentFey_0<br>5_23</td><td>VentFey_0<br>5_26<br>-20°C<br>2008</td></tr><tr><td>B</td><td>TP cèdre VentFey_6<br>G1_653</td><td>à sec<br>2015<br>TH_60</td><td>à sec<br>2015<br>TH_60</td><td>à sec<br>2015<br>TH_60</td><td>à sec<br>2015<br>TH_60</td><td>TP cèdre Vent_137<br>TH_67</td><td>-20°C 2001<br>TH_67</td><td>TP cèdre ORIJ_142<br>TH_67</td><td>-20°C 2001<br>TH_67</td><td>TP cèdr e VentFey_0<br>5_23<br>TH_100</td><td>-20°C<br>2008<br>TH_100</td><td>Témoin négatif</td></tr><tr><td>C</td><td>TP sapin TH_60</td><td>-20°C 2007<br>TH_59</td><td>-20°C 2011<br>TH_59</td><td>-20°C 2012<br>TH_59</td><td>à sec 2012<br>TH_59</td><td>-20°C 2012<br>TH_80</td><td>-20°C 2011<br>TH_80</td><td>-20°C 2012<br>TH_80</td><td>à sec 2012<br>TH_80</td><td>-20°C 2007<br>TH_100</td><td>-20°C 2011</td><td>TP sapin TH_67</td></tr><tr><td>D</td><td>TP sapin TH_59</td><td>-20°C 2011<br>257_2_56a</td><td>TH_59<br>-20°C 2012<br>257_2_56a<br>à sec 2009</td><td>à sec 2012<br>257_2_56a<br>à sec 2009</td><td>-20°C 2007<br>257_2_58a<br>à sec 2009</td><td>-20°C 2011<br>257_2_58a<br>à sec 2009</td><td>-20°C 2012<br>257_2_64</td><td>-20°C 2007<br>257_2_64</td><td>TP sapin TH_100<br>257_2_64</td><td>-20°C 2012<br>A7</td><td>TP sapin TH_80<br>B108</td><td>Témoin négatif<br>C216</td></tr><tr><td>E</td><td>TP hêtre 257_2_56a</td><td>-20°C 2008<br>257_2_60a</td><td>257_2_60a à sec 2009</td><td>TP hêtre 257_2_58a<br>257_2_62</td><td>257_2_58a<br>-20°C 2008<br>257_2_62</td><td>TP hêtre 257_2_64<br>TP hêtre VTX_68_01</td><td>-20°C 2008<br>individu 1 à sec 2016</td><td>à sec 2009<br>TP hêtre VTX_68_02<br>individu 2 à sec 2016</td><td>numbase 6410<br>-20°C<br>individu 2 à sec 2016</td><td>numbase 6495<br>-20°C<br>TP hêtre VTX_68_03</td><td>numbase 6594<br>-20°C<br>individu 3 à sec 2016</td><td></td></tr><tr><td>F</td><td>TP hêtre 257_2_60a</td><td>-20°C 2008<br>PNS_1</td><td>PNS_2<br>-20°C 2008</td><td>TP hêtre 257_2_62<br>PNS_4</td><td>à sec 2009<br>PNS_413</td><td>ventoux sud<br>PNS_414</td><td>PNS_415<br>-20°C 2010</td><td>ventoux sud<br>TP<br>-20°C 2010</td><td>ventoux sud<br>PNS_923<br>TP<br>-20°C 2010</td><td>ventoux sud<br>PNS_923<br>PNS_924</td><td>numbase 6495<br>-20°C<br>TP hêtre VTX_68_03<br>individu 2 à sec 2016</td><td>PNS_926</td></tr><tr><td>G</td><td>TP pin PNS_1</td><td>-20°C 2008<br>PNS_31</td><td>-20°C 2008<br>PNS_33</td><td>-20°C 2008<br>PNS_34</td><td>TP pin PNS_413<br>-20°C 2010<br>PNS_390</td><td>-20°C 2010<br>PNS_391</td><td>-20°C 2010<br>PNS_393</td><td>-20°C 2010<br>pin PNS_923<br>TP<br>-20°C 2012<br>PNS_689</td><td>-20°C 2012<br>PNS_689</td><td>-20°C 2012<br>PNS_692</td><td>-20°C 2012<br>PNS_694</td><td></td></tr><tr><td>H</td><td>TP pin PNS_31</td><td>-20°C 2009</td><td>-20°C 2009</td><td>-20°C 2009<br>PNS_390</td><td>-20°C 2011<br>-20°C 2011</td><td>-20°C 2011<br>-20°C 2011</td><td>-20°C 2011<br>-20°C 2011</td><td>-20°C 2011<br>pin PNS_689<br>-20°C 2011</td><td>-20°C 2011<br>-20°C 2011</td><td>-20°C 2011<br>-20°C 2011</td><td>-20°C 2011<br>-20°C 2011</td><td></td></tr></tbody></table>
# Annexe 2 : Amorces et conditions PCR pour les marqueurs microsatellites et l'amplification du fragment de barcoding

Des sets d'amorces microsatellites spécifiques ont été utilisés pour chaque espèce.

## Hêtre

<table><thead><tr><th>NOM DE L'AMORCE</th><th>SENS DE L'AMORCE</th><th>SÉQUENCE (DE 5' -> 3')</th><th>MOTIF</th><th>BIBLIOGRAPHIE</th></tr></thead><tbody><tr><td>MFC7</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>AAAATACACTGCCCCAAAA<br>CAGGTTTTGGTTTCTTACAC</td><td>(GA)9</td><td>Vornam et al., 2004</td></tr><tr><td>Fs3_4</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>AGATGCACCACTTCAAATTC<br>TCTCCTCAGCAACATACCTC</td><td>(GCT)6</td><td>Pastoreli et al., 2003</td></tr><tr><td>Fs1_15</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>TCAAACCCAGTAAATTTCTCA<br>GCCTCAATGAACTCAAAAAAC</td><td>(GA)26</td><td>Pastoreli et al., 2003</td></tr><tr><td>Sfc1143</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>TGGCATCCTACTGTAATTTGAC<br>ATTCCACCCACCATCTGTC</td><td>(AG)21</td><td>Asuka et al., 2004</td></tr><tr><td>Sfc0007-2</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>TGTCGCAAACATTGACAAGG<br>GTGGATGTGAGGTCGTTGG</td><td>(AG)24</td><td>Asuka et al., 2004</td></tr></tbody></table>

## Cèdre de l'Atlas

<table><thead><tr><th>NOM DE L'AMORCE</th><th>SENS DE L'AMORCE</th><th>SÉQUENCE (DE 5' -> 3')</th><th>MOTIF</th><th>BIBLIOGRAPHIE</th></tr></thead><tbody><tr><td>D4</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>GCTTTACGCAATTCCCTCCTATG<br>TGAGAATTGTGAACCATTGAAAG</td><td>(TC)8(AC)6</td><td>Chaib et al., 2006</td></tr><tr><td>C6</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>GGGTTATAAGTTTTAATTATATGTGTG<br>CACCACCTTGACTTCCCTTG</td><td>(GT)27(GA)14</td><td>Chaib et al., 2006</td></tr><tr><td>D12</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>TGGTTTTCCACCTTAGTTTCC<br>GGGATGGAAGGAATAAGATAGAGG</td><td>(TC)15</td><td>Chaib et al., 2006</td></tr><tr><td>Pt15169</td><td>Forward<br>Reverse</td><td>CTTGGATGGAATAGCAGCC<br>GGAAGGGCATTAAGGTCATTA</td><td>(C)8(T)8A(T)8</td><td>Vendramin<br>et al., 1996</td></tr></tbody></table>
## Sapin pectiné

<table><thead><tr><th>NOM DE L'AMORCE</th><th>SENS DE L'AMORCE</th><th>SÉQUENCE (DE 5' -&gt; 3')</th><th>MOTIF</th><th>BIBLIOGRAPHIE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">SF333</td><td>Forward</td><td>ATTTGTTCATTTTGGTCCTG</td><td rowspan="2">(CA)12(TA)4</td><td rowspan="2">Cremer et al., 2006</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>ACACAGGAAAAAGTCGGTAA</td></tr><tr><td rowspan="2">SF1</td><td>Forward</td><td>TTGACGTGATTAACAATCCA</td><td rowspan="2">(CCG)9</td><td rowspan="2">Cremer et al., 2006</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>AAGAACGACACCATTCCTCAC</td></tr><tr><td rowspan="2">SF50</td><td>Forward</td><td>CATTTGGTGCGGTTCATTTTC</td><td rowspan="2">(GT)11(GC)10</td><td rowspan="2">Cremer et al., 2006</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>AGTGGCATTTCACTTATTGG</td></tr><tr><td rowspan="2">SF78</td><td>Forward</td><td>FAM-CATTGTTGTCTTTGTTTCACA</td><td rowspan="2">(CGCA)8(-CA)15G(CA)8</td><td rowspan="2">Cremer et al., 2006</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>TGCACCGTTTTGTTTTTCC</td></tr></tbody></table>

## Pin de Salzmann

<table><thead><tr><th>NOM DE L'AMORCE</th><th>SENS DE L'AMORCE</th><th>SÉQUENCE (DE 5' -&gt; 3')</th><th>MOTIF</th><th>BIBLIOGRAPHIE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Pt1254</td><td>Forward</td><td>CAATTGGAATGAGAACAGATAGG</td><td rowspan="2">(T)17</td><td rowspan="2">Vendramin et al., 1996</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>TGCGTTGCACTTCGTTATAG</td></tr><tr><td rowspan="2">Pt15169</td><td>Forward</td><td>CTTGGATGGAATAGCAGCC</td><td rowspan="2">(C)8(T)8A(T)8</td><td rowspan="2">Vendramin et al., 1996</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>GGAAGGGCATTAAGGTCATTA</td></tr><tr><td rowspan="2">Pt87268</td><td>Forward</td><td>GCCAGGGAAAATCGTAGG</td><td rowspan="2">(T)14</td><td rowspan="2">Vendramin et al., 1996</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>AGACGATTAGACATCCAACCC</td></tr><tr><td rowspan="2">Pt30204</td><td>Forward</td><td>TCATAGCGGAAGATCCTCTTT</td><td rowspan="2">(A)12(G)10</td><td rowspan="2">Vendramin et al., 1996</td></tr><tr><td>Reverse</td><td>CGGATTGATCCTAACCATACC</td></tr></tbody></table>

Les compositions des mélanges réactionnels de PCR sont différentes entre les espèces :

### Mélange réactionnel de PCR pour le hêtre

<table><thead><tr><th>MÉLANGE RÉACTIONNEL GLOBAL</th><th>CONCENTRATION FINALE DANS LE TUBE</th><th>VOLUME POUR 1 ÉCHANTILLON (EN µL)</th><th>VOLUMES PRÉLEVÉS POUR 100 ÉCHANTILLONS (EN µL)</th></tr></thead><tbody><tr><td>PCR MASTER MIX (QIAGENTM)</td><td>1X</td><td>5</td><td>500</td></tr><tr><td>PRIMERS À 100µM</td><td>0.2µM</td><td>0.02</td><td>2*</td></tr><tr><td>Q_SOLUTION (QIAGENTM)</td><td>0.5X</td><td>1</td><td>100</td></tr><tr><td>H2O QSP</td><td></td><td>9</td><td>900</td></tr></tbody></table>

*2µl par primer utilisé

### Mélange réactionnel pour les PCR sur conifères

<table><thead><tr><th>MÉLANGE RÉACTIONNEL GLOBAL</th><th>CONCENTRATION FINALE DANS LE TUBE</th><th>VOLUME POUR 1 ÉCHANTILLON (EN µL)</th><th>VOLUMES PRÉLEVÉS POUR 100 ÉCHANTILLONS (EN µL)</th></tr></thead><tbody><tr><td>PCR MASTER MIX (QIAGENTM)</td><td>1X</td><td>5</td><td>500</td></tr><tr><td>PRIMERS À 100µM</td><td>0.2µM</td><td>0.02</td><td>2*</td></tr><tr><td>Q_SOLUTION (QIAGENTM)</td><td>0.5X</td><td>1</td><td>100</td></tr><tr><td>H2O QSP</td><td></td><td>9</td><td>900</td></tr></tbody></table>

*2µl par primer utilisé

### Programme PCR

94 °C durant 15 min (activation de la Taq HotStart présente dans le PCR Master Mix)

94 °C durant 30 s (dénaturation de l'ADN)

57 °C durant 90 s (hybridation des amorces) } x 35 cycles

72 °C pendant 90 s (élongation des brins d'ADN)

72 °C durant 20 min pour l'élongation finale

4 °C pendant 1 min pour faire redescendre la température et stopper l'activité enzymatique de la Taq polymerase
Amorces barcoding utilisées

<table><thead><tr><th>CIBLE</th><th>NOM DE L'AMORCE</th><th>SÉQUENCE (DE 5' -> 3')</th><th>BIBLIOGRAPHIE</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">TRNH_2</td><td>trnH(GUG)f_HC</td><td>CGCGCATGGTGGATTCAACAATCC</td><td rowspan="2">Tate et Simpson, 2003</td></tr><tr><td>psbAr_HC</td><td>GTTATGCATGAACGTAATGCTC</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_77.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Entretenir des collections d'invertébrés d'intérêt agronomique sur hôtes vivants : un enjeu patrimonial et des contraintes spécifiques

Sylvie PAGÈS<fnref n="1" />
Nadine SELLIER<fnref n="2" />
Philippe CASTAGNONE<fnref n="2" />

## CORRESPONDANCE

sylvie.pages@inrae.fr
nadine.sellier@inrae.fr
philippe.castagnone@inrae.fr

## RÉSUMÉ

L'entretien de collections de ressources biologiques est une nécessité pour la recherche fondamentale et appliquée. Les moyens mis en œuvre dans ce but peuvent être plus ou moins importants en fonction de la nature de ces ressources biologiques qui sont inertes ou vivantes. Les contraintes se font encore plus lourdes si ces ressources biologiques nécessitent la mise en œuvre d'hôtes vivants. Au sein de l'infrastructure de recherche RARe, c'est le cas notamment des collections de nématodes phytoparasites, de nématodes entomopathogènes, et de parasitoïdes oophages. En effet, ces organismes sont des parasites obligatoires, c'est-à-dire qu'ils ne peuvent pas réaliser leur cycle biologique en l'absence de leur hôte vivant. Cet article décrit ces collections et présente les contraintes spécifiques liées à leur gestion.

## MOTS-CLÉS

Nématodes phytoparasites, nématodes entomopathogènes, trichogrammes, ressources biologiques.

<footnote n="1">1 Diversité, Génomes & Interactions Microorganismes-Insectes (DGIMI), UMR 1333 INRAE / Université de Montpellier, 34095 Montpellier.</footnote>

<footnote n="2">2 Institut Sophia Agrobiotech (ISA), UMR 1355 INRAE / Université Côte d'Azur / 7254 CNRS, 06903 Sophia Antipolis</footnote>
# Maintaining collections of invertebrates of agronomic interest on living hosts: a challenge of heritage and specific constraints

Sylvie PAGÈS<fnref n="1" />
Nadine SELLIER<fnref n="2" />
Philippe CASTAGNONE<fnref n="2" />

## CORRESPONDENCE

sylvie.pages@inrae.fr

nadine.sellier@inrae.fr

philippe.castagnone@inrae.fr

## ABSTRACT

It is necessary to maintain collections of biological resources for fundamental and applied research. The resources implemented to this end can vary depending on the nature of these biological resources that are inert or living. The constraints become even greater if these biological resources require the utilization of living hosts. In the AgroBRC/RARe research infrastructure, this is the case in particular of collections of plant parasitic nematodes, entomopathogenic nematodes, and oophagous parasitoids. Indeed, these organisms are obligatory parasites, meaning that they cannot fulfil their biological cycle in the absence of their living host. This article describes these collections and presents the constraints specific to their management.

## KEYWORDS

Plant parasitic nematodes, entomopathogenic nematodes, trichogramma, biological resources.

<footnote n="1">1 Diversité, Génomes & Interactions Microorganismes-Insectes (DGIMI), UMR 1333 INRAE / Université de Montpellier, 34095 Montpellier.</footnote>

<footnote n="2">2 Institut Sophia Agrobiotech (ISA), UMR 1355 INRAE / Université Côte d'Azur / 7254 CNRS, 06903 Sophia Antipolis</footnote>
## Introduction

Une collection est définie comme un « ensemble d'échantillons de ressources génétiques prélevés et les informations afférentes, rassemblés et stockés, qu'ils soient détenus par les entités publiques ou privées » (Article L412-4 8 du Code de l'Environnement).

Il existe de nombreuses collections au sein d'INRAE, dont certaines concernent des organismes maintenus vivants. Dans cet article, nous avons choisi de présenter trois collections regroupant des invertébrés d'intérêt agronomique, inscrites dans l'infrastructure de recherche RARe (Resources Agronomiques pour la Recherche), et plus précisément au sein du Pilier Environnement (www.brc4env.fr; Mougin et al., 2018). La gestion et les moyens mis en œuvre pour la conservation de ces organismes, bien qu'assez comparables à l'ensemble des collections de RARe, présentent toutefois des aspects partagés originaux, notamment une genèse commune et la nécessité de disposer d'un hôte vivant pour assurer leur maintenance.

Dans les années 1970, les travaux de recherches conduits à l'INRA d'Antibes dans le domaine de la protection des cultures se sont orientés vers l'étude de divers macro et microorganismes, qu'ils soient bio-agresseurs ou, au contraire, potentiels agents de lutte biologique, tels que les nématodes phytoparasites, les trichogrammes et les nématodes entomopathogènes. Progressivement, un ensemble de ressources biologiques y ont été rassemblées, maintenues et enrichies, aboutissant à la constitution de collections. Au fil des évolutions structurelles de l'INRA, ces collections ont été transférées en 1999 dans l'unité DGIMI (Diversité, Génomes & Interactions Microorganismes-Insectes) à Montpellier pour les nématodes parasites d'insectes, et en 2004 sur le site de l'unité ISA (Institut Sophia Agrobiotech)

à Sophia Antipolis pour les nématodes parasites de plantes et les trichogrammes.

Ces collections présentent un intérêt fort à titre patrimonial pour les recherches appliquées et/ou fondamentales qui visent à étudier la biodiversité des organismes et répondre aux enjeux majeurs du changement de paradigme de l'agriculture dans le monde. Pour entretenir ces ressources biologiques vivantes et faire vivre les collections, les besoins en installations dédiées, adaptées, ainsi qu'en moyens humains et matériels sont des contraintes majeures, renforcées ici par le besoin de production des hôtes vivants associés.

## Présentation des collections

La position systématique des invertébrés d'intérêt agronomique regroupés dans les trois collections décrites ici est présentée dans le tableau 1.

### Les nématodes parasites de plantes

Trois collections vivantes de nématodes phytoparasites sont hébergées au sein de l'ISA à Sophia Antipolis, qui concernent des groupes majeurs aux plans agronomique et/ou environnemental : les nématodes à galles (Meloidogyne spp.), les nématodes vecteurs du virus du court-noué de la vigne (Xiphinema spp.) et les nématodes du pin (Bursaphelenchus spp.).

Actuellement, 145 souches échantillonnées à l'échelle mondiale sont multipliées, ce nombre étant évolutif dans le temps :

* Bursaphelenchus spp. : 35 souches appartenant à 10 espèces ;

* Meloidogyne spp. : 80 souches appartenant à 10 espèces ;

* Xiphinema spp. : 30 souches appartenant à 10 espèces.

<table><caption>Tableau 1 : Invertébrés d'intérêt agronomique considérés dans cet article</caption><thead><tr><td>ORGANISMES</td><td>EMBRANCHEMENT</td><td>CLASSE</td><td>ORDRE</td><td>FAMILLE</td><td>GENRE</td></tr></thead><tbody><tr><td>Trichogrammes</td><td>Arthropode</td><td>Insecta</td><td>Hymenoptera</td><td>Trichogrammatidae</td><td>Trichogramma</td></tr><tr><td>Nématodes à galles</td><td>Nématode</td><td>Chromadorea</td><td>Tylenchida</td><td>Meloidogynidae</td><td>Meloidogyne</td></tr><tr><td>Nématodes du pin</td><td>Nématode</td><td>Chromadorea</td><td>Rhabditida</td><td>Parasitaphelenchidae</td><td>Bursaphelenchus</td></tr><tr><td>Nématodes entomopathogènes</td><td>Nématode</td><td>Secernentea</td><td>Rhabditida</td><td>Heterhorhabditidae</td><td>Heterhorhabditis</td></tr><tr><td>Nématodes entomopathogènes</td><td>Nématode</td><td>Secernentea</td><td>Rhabditida</td><td>Steinernematidae</td><td>Steinernema</td></tr><tr><td>Nématodes vecteurs de virus</td><td>Nématode</td><td>Enoplea</td><td>Dorylaimida</td><td>Xiphinematidae</td><td>Xiphinema</td></tr></tbody></table>
Au sein de l'ISA, les travaux de recherche sur ces ressources biologiques concernent (i) la diversité génétique et l'évolution des nématodes ; (ii) les mécanismes à l'origine du pouvoir pathogène des nématodes ; (iii) les mécanismes de la résistance des plantes aux nématodes ; (iv) les stratégies de lutte contre les nématodes.

Les installations dédiées au maintien de ces collections (serres, locaux techniques, enceintes climatiques, laboratoires ; Figure 1) bénéficient d'un agrément préfectoral pour la manipulation des espèces de quarantaine (*M. chitwoodi*, *M. fallax* et *B. xylophilus*). À ce jour, la distribution hors de l'unité de ces matériels biologiques se fait essentiellement dans le cadre de collaborations avec des partenaires académiques et/ou privés.

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>Figure 1. Les collections vivantes de nématodes phytoparasites maintenues à l'Institut Sophia Agrobiotech. (A) Nématodes à galles *Meloidogyne* spp. (B) Nématodes vecteurs de virus *Xiphinema* spp. (C). Nématodes du pin *Bursaphelenchus* spp.</figcaption></figure>

## Les parasitoïdes oophages

L'ISA héberge également une collection de parasitoïdes oophages, des insectes hyménoptères dont le développement pré-imaginal, avant le stade adulte, se fait à l'intérieur d'un

œuf hôte, finissant par le tuer. Cette collection, dénommée EP-Coll (pour Egg Parasitoids Collection), est reconnue en tant que Centre de Ressources Biologiques (CRB ; https://www6.inrae.fr/crb-eggparasitoids-coll/), labellisée par le GIS IBiSA (Infrastructures en Biologie, Santé et Agronomie) depuis 2015 et certifiée ISO 9001:2015 depuis 2018. Ces marques de reconnaissance lui permettent de s'inscrire dans le réseau RARe et de garantir la qualité de son organisation. Si, à terme, l'objectif du CRB EP-Coll est d'élargir sa collection à d'autres genres, actuellement il est centré sur le genre *Trichogramma* ; ce dernier constitue l'un des premiers marchés commerciaux dans le cadre de la lutte biologique à l'aide de macro-organismes (Smith, 1996 ; Consoli et al., 2010) et une source potentielle de nouveaux agents de lutte biologique contre les lépidoptères nuisibles (Figueiredo et al., 2015 ; Uelese et al., 2014).

Un trichogramme est un hyménoptère d'environ 1 mm, dont l'élevage se fait dans des tubes en verre bouchés avec du coton (Figure 2B), avec un apport de miel et la fourniture d'œufs vivants d'Ephestia kuehniella (la teigne de la farine). Ces tubes sont placés dans une pièce dont les conditions abiotiques sont contrôlées. Le cycle de vie est de l'ordre de 3 à 4 semaines à 18 °C. L'origine de ces souches peut être exotique, c'est pour cela que la collection est maintenue dans un bâtiment confiné, bénéficiant d'agréments pour la détention d'organismes de quarantaine.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>Figure 2 : (A) Laboratoire pour la gestion des souches de trichogrammes. (B) Tube d'élevage d'une souche de trichogrammes. (C) Femelles de trichogrammes en train de pondre dans des œufs de *Spilosoma lutea*.</figcaption></figure>

La collection du CRB représente un catalogue d'environ 130 souches vivantes caractérisées. Une souche est définie comme une combinaison d'une espèce, d'une origine géographique, d'un type de climat, d'une plante et/ou insectes hôtés, voire d'un haplotype « rare », pouvant présenter un intérêt pour la caractérisation de la biodiversité ou la lutte biologique. En parallèle, environ 200 souches en cours
de caractérisation morphologique et phénotypique sont également entretenues pour l'activité de R&D du CRB. La distribution de ces ressources biologiques se fait essentiellement dans le cadre de collaborations avec des partenaires académiques (ex : projets ANR, AAP Ecophyto Maturation, etc.) et/ou privés.

## Les nématodes parasites d'insectes

La collection de nématodes entomopathogènes (NEPs ; *Steinernematidae*, *Heterorhabditidae*) est hébergée dans l'UMR DGIMI à Montpellier. Les souches les plus anciennes sont conservées dans la collection depuis les années 1980. Cette collection est source de collaborations et d'échanges de ressources biologiques avec des laboratoires européens et aussi dans le monde entier (États-Unis, Rép. Tchèque, Liban...).

Les larves de NEPs sont des agents de biocontrôle à forte valeur ajoutée, utilisés en agriculture biologique contre les insectes ravageurs pour protéger les plantes cultivées en serre (ex : charançons du fraisier), dans les vergers (ex : carpocapse des pommiers) ou chez les particuliers. Des travaux antérieurs ont montré leur efficacité au champ, en milieu insulaire et tropical pour les cultures d'agrumes ou de canne à sucre (Mauléon et al., 1993).

Ce sont des vers ronds anguilliformes de petite taille (300 µm à 1,2 mm), ubiquistes, présents sur tous les conti- nents sauf en Antarctique et vivant libres dans les sols, préférentiellement dans les sols sableux ; ils sont retrou- vés dans les prairies, les forêts et potentiellement dans les parcelles cultivées. Ils se reproduisent dans les larves d'in- sectes, le cycle de développement parasitaire comprend 4 stades larvaires, des œufs et des adultes.

La collection des NEPs comprend 130 souches et ce nombre est évolutif dans le temps :

* *Steinernematidae* : 87 souches regroupant 15 espèces différentes ;

* *Heterorhabditidae* : 43 souches regroupant 4 espèces différentes.

Les travaux menés sur cette collection concernent (i) la taxinomie des NEPs, la taxinomie et la génomique de leurs microbiotes associés ; (ii) l'étude des mécanismes d'interactions existant entre les nématodes, les bacté- ries et les insectes hôtes ; (iii) la spécificité d'hôtes. Par exemple, dans le cadre du plan Ecophyto, l'unité DGIMI a bénéficié de financements pour travailler sur l'utilisation et l'optimisation des NEPs comme agents de biocontrôle. Ces projets portaient sur la recherche de méthodes alter- natives au traitement chimique pour lutter contre l'un des

ravageurs de culture majeur en France, le taupin (*Agriotes* spp.) (Campos-Herrera & Gutierrez, 2009).

## Production des hôtes vivants pour le maintien des collections

Les trois collections décrites dans cet article ont un point commun fort et original, à savoir qu'elles doivent être entretenues vivantes, en passant par un ou plusieurs hôtes vivants (Figure 3). Le tableau 2 résume les conditions de multiplication pratiquées dans nos laboratoires.

<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>Figure 3. Représentation schématique du processus de mise en collection d'un organisme d'intérêt (nématode, insecte) sur un hôte vivant (plante, oeuf ou larve d'insecte, champignon). Pour des informations spécifiques à chaque organisme concerné, voir le texte.</figcaption></figure>

Pour les nématodes à galles et les nématodes vecteurs de virus, le cycle biologique est simple et ne fait intervenir qu'un hôte végétal. Les nématodes du pin présentent un cycle biologique plus complexe faisant intervenir *in natura* un insecte vecteur, un hôte principal (le pin) et un hôte se- condaire (des champignons associés au pin). Cependant, en conditions contrôlées, les nématodes du pin peuvent être multipliés sur champignon sans passer par l'hôte végétal (phase fongivore). Pour maintenir la reproduction des nématodes en continu, il est nécessaire de produire très régulièrement des hôtes adaptés (tomates et figuiers en pots pour *Meloidogyne*, *Botrytis cinerea* sur milieu de culture gélosé pour *Bursaphelenchus*). À noter que pour *Xiphinema*, l'hôte est une plante pérenne (vigne), il n'est donc pas nécessaire de procéder à des repiquages aussi fréquents. Cette production des hôtes vivants, entière- ment réalisée sur site, est une étape indispensable - et chronophage - à la maintenance des collections. Ceci est particulièrement vrai pour la collection de nématodes à galles, dont le repiquage systématique est réalisé toutes les six à huit semaines. De plus, pour les deux collections maintenues en serre, l'état physiologique et sanitaire des plantes hôtes doit être contrôlé quotidiennement.
<table><caption>Tableau 2 : Les conditions de multiplication des collections</caption><thead><tr><th></th><th>HÔTE</th><th>ESPACE DÉDIÉ</th><th>NÉCESSITÉ DE CONFINEMENT</th><th>TEMPÉRATURE (°C)</th><th>DURÉE DU CYCLE DANS CES CONDITIONS</th></tr></thead><tbody><tr><td colspan="6"><strong>NÉMATODES PHYTOPATHOGÈNES</strong></td></tr><tr><td>Bursaphelenchus spp.</td><td>Botrytis cinerea</td><td>Enceinte climatique</td><td>Oui</td><td>13 - 15</td><td>Environ 2 semaines</td></tr><tr><td>Meloidogyne spp.</td><td>Tomate, figuier</td><td>Serre</td><td>Oui</td><td>Ambiante</td><td>De 6 à 8 semaines</td></tr><tr><td>Xiphinema spp.</td><td>Vigne</td><td>Serre</td><td>Non</td><td>Ambiante</td><td>De 2 à 4 mois</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>NÉMATODES ENTOMOPATHOGÈNES</strong></td></tr><tr><td>Heterorhabditis spp.</td><td>Galleria mellonella</td><td>Enceinte climatique</td><td>Non</td><td>15</td><td>De 2 à 6 mois</td></tr><tr><td>Steinernema spp.</td><td>Galleria mellonella</td><td>Enceinte climatique</td><td>Non</td><td>9</td><td>De 6 à 9 mois</td></tr><tr><td colspan="6"><strong>TRICHOGRAMMES</strong></td></tr><tr><td>Trichogramma spp.</td><td>Ephestia kuehniella</td><td>Pièces climatiques</td><td>Oui</td><td>18</td><td>Environ 3 semaines</td></tr></tbody></table>

Les trichogrammes sont reproduits sur des œufs d'E. kuehniella (Lépidoptère) livrés chaque semaine par une bio-fabrique située en France. À la réception des œufs, un contrôle qualité est réalisé afin de s'assurer que les œufs n'ont pas été « contaminés » par d'éventuels trichogrammes sauvages. Pour le renouvellement d'une population de trichogrammes, les œufs d'Ephestia, conservés à 4 °C, sont collés sur des bandelettes de papier adhésif et préalablement « stérilisés » aux rayons UV pendant 20 mn, afin de garantir qu'aucune larve de lépidoptère n'émergera risquant de dévorer les œufs parasités, entrainant ainsi la perte de la population de trichogrammes. Les souches de trichogrammes ne sont pas « synchronisées », le renouvellement est donc étalé dans le temps, et chaque jour il peut être nécessaire de mettre des œufs d'Ephestia à disposition d'un groupe de souches, d'où une contrainte forte de surveillance quotidienne.

Les populations de nématodes entomopathogènes sont produites en masse sur des larves de l'insecte Galleria mellonella (Teigne des ruches, Lépidoptère), qui est un hôte sans contrainte particulières d'élevage et très permissif aux nématodes. Au sein de l'unité DGIMI, le personnel de l'insectarium assure l'élevage et la production de Galleria en quantité suffisante pour pérenniser le renouvellement régulier des souches de la collection des nématodes. Parfois, pour répondre à certains besoins en recherche, la production des NEPs est réalisée avec des hôtes dits de « quarantaine » nécessitant une structure confinée. Après l'étape d'infestation de l'hôte, le cycle parasitaire se réalise dans le cadavre de la larve d'insecte, et la génération n+1 qui émerge du cadavre (Figure 4A) est récoltée au bout de 3 à 4 semaines pour conservation. La récolte est stockée

dans des flacons de culture de 250 mL dans une solution de Ringer dans des enceintes thermostatées réfrigérées à porte pleine, car les nématodes entomopathogènes sont sensibles aux UV qui leur font perdre leur pouvoir infestant (Figure 4B). La majorité des souches est renouvelée deux fois par an. Certaines souches plus fragiles nécessitent un renouvellement plus fréquent, par exemple tous les deux mois pour l'espèce *Heterorhabditis indica*. Pour une gestion plus sereine et pour limiter la surcharge de travail, un renouvellement de dix à quinze souches chaque mois est planifié.

<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>Figure 4. (A) Les collections de nématodes entomopathogènes maintenues vivantes dans des flacons de culture stockées en enceinte réfrigérée dans l'unité DGIMI. (B) Larves de Galleria mellonella saines utilisées comme hôte pour la reproduction des nématodes. (C) Sortie massive des larves infestantes de nématodes entomopathogènes du cadavre de la larve d'insecte.</figcaption></figure>