# Dosage en microplaque de l'activité enzymatique
Glutathion S-Transférase (GST)

P. Noury

► To cite this version:

P. Noury. Dosage en microplaque de l'activité enzymatique Glutathion S-Transférase (GST). 2020, pp.9. hal-02602446v4

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Submitted on 30 Sep 2025

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## MODE OPERATOIRE/PROTOCOLE

# Dosage en microplaque de l'activité enzymatique Glutathion S-Transférase (GST)

## AVERTISSEMENT ET PRECAUTIONS DE SECURITE

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Le présent mode opératoire nécessite l'utilisation de **1-CHLORO-2,4-DINITROBENZENE** (CDNB) il convient donc de respecter les règles de sécurité indispensables à l'utilisation d'un tel produits.

Le schéma ci-contre rappelle les Equipements de Protection Individuels (EPI) indispensables

Les produits et manipulations à risques ainsi que les moyens de protections spécifiques sont détaillés dans le contenu de ce document.

<table><thead><tr><td>N° de version</td><td>Rédacteur</td><td>Vérificateur</td><td>Approbateur</td></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Nom : NOURY<br/>Fonction : IE</td><td>Nom : GONZALEZ-FERNANDEZ<br/>Fonction : CR</td><td>Nom : DEGLI-ESPOSTI<br/>Fonction : Responsable du laboratoire d'Ecotoxicologie</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><td colspan="4">Mises à jour</td></tr><tr><td>N° de version</td><td>Date</td><td>Auteur</td><td>Modifications apportées par rapport à la précédente version</td></tr></thead><tbody><tr><td>1.1</td><td>27/08/2021</td><td>PN</td><td>Quelques corrections et précisions</td></tr><tr><td>1.2</td><td>12/01/2024</td><td>PN</td><td>indication de mise en œuvre pour larves de poissons, correction sur la préparation du tampon</td></tr><tr><td>1.3</td><td>30/09/2025</td><td>PN</td><td>Recommandations pour échantillons de poisson (mucus, foie, etc.), correction coquilles, précisions au 3.1</td></tr></tbody></table>
# SOMMAIRE

<table><tr><td>1</td><td>INTRODUCTION</td><td>2</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Objet et domaine d'application</td><td>2</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Références</td><td>2</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Conditions d'application</td><td>2</td></tr><tr><td>1.4</td><td>Définitions et abréviations</td><td>3</td></tr><tr><td>2</td><td>VOLET SECURITE</td><td>3</td></tr><tr><td>3</td><td>PROTOCOLE</td><td>3</td></tr><tr><td>3.1</td><td>Principe</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Matériel et réactifs</td><td>4</td></tr><tr><td>3.2.1</td><td>Produits utilisés</td><td>4</td></tr><tr><td>3.2.2</td><td>Solutions préparées</td><td>4</td></tr><tr><td>3.2.3</td><td>Matériel</td><td>4</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Mode opératoire</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3.1</td><td>Préparation de la fraction S9</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3.2</td><td>Préparation du spectrophotomètre</td><td>6</td></tr><tr><td>3.3.3</td><td>Réalisation de la plaque</td><td>6</td></tr><tr><td>3.3.4</td><td>Calculs</td><td>6</td></tr><tr><td>4</td><td>SYNTHESE DU DOCUMENT</td><td>7</td></tr></table>
# 1 INTRODUCTION

## 1.1 Objet et domaine d'application

Cette procédure décrit la mesure de l'activité enzymatique Glutathion-S-Tranférase en microplaque. La mesure est réalisée sur une fraction post-mitochondriale (S9) d'homogénat de tissus (organe ou organisme entier).

Cette mesure peut être réalisée à partir d'homogénats de foies de muscle, de branchie ainsi que sur des organismes entiers de gammare, daphnie, larve de chironome, potamopyrgus, ou poisson au stade larvaire ou juvénile. D'une part, l'activité GST entre le processus de détoxification de phase II des xénobiotiques hydrophobes (HAP, pesticide, PCB), d'autre part, l'implication du glutathion relie ce marqueur aux paramètres descripteurs du stress oxydant.

## 1.2 Références

Le protocole, adapté pour la microplaque, est inspiré de la méthode Habig et al. <fnref n="1" /> (1976).

## 1.3 Conditions d'application

La GST est en général mesurée au sein d'une batterie de biomarqueurs. L'extraction commune est alors réalisée dans du tampon phosphate pH 7,8 + triton 0,1% (voir protocole AChE). Le dosage de la GST sera réalisé de préférence juste après extraction et centrifugation des échantillons mais supporte la congélation/décongélation des S9. Dans ce cas il est impératif de réaliser la mesure dans un délai optimal ne dépassant pas 1 heure après décongélation des S9. Les dilutions préalables éventuelles des cytosols ainsi que le mélange réactionnel sont effectués en tampon phosphate pH 6,5. L'extraction, la centrifugation et la conservation des surnageant jusqu'à l'analyse sont réalisés à 4°C (bain de glace). La réaction enzymatique en microplaque doit être réalisée à 19-21 °C (climatisation en été).

<footnote n="1">¹ Habig, W. H., et al. (1976). "Glutathione S-transferase AA from rat liver." *Archives of Biochemistry and Biophysics* **175**(2): 710-716.</footnote>
## 1.4 Définitions et abréviations

Pour les besoins du présent mode opératoire, les définitions et abréviations suivantes sont nécessaires :

* **Fraction S9** : surnageant obtenu après centrifugation de 15 minutes à 9000 g des homogénats de tissus

* **GST** : Glutathion-S-Tranférase

* **GSH** : L-Glutathion réduit

* **CDNB** : 1-Chloro-2,4-Dinitrobenzène

## 2 VOLET SECURITE

CDNB

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

## 3 PROTOCOLE

### 3.1 Principe

On mesure l'activité de conjugaison du glutathion réduit (GSH) et d'un substrat, le 1 chloro 2,4 dinitrobenzène (CDNB) via l'enzyme de phase II la Glutathion-S-Transférase contenu dans un échantillon. Il en résulte un accroissement de l'absorbance du milieu réactionnel qui est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm, toutes les 30 secondes à partir du début de la réaction pendant 3 minutes.

La Glutathion-S-Tranférase étant une enzyme soluble, le dosage est réalisé sur cytosol. La fraction cytosolique est contenue dans un surnageant (S9) obtenu après homogénéisation dans un tampon phosphate et centrifugation à 9000 g. Pour une conservation des homogénats ou des cytosols à -80°C, on peut ajouter préalablement une proportion de 20 % de glycérol au tampon.
## 3.2 Matériel et réactifs

### 3.2.1 Matériel

* Microtubes Eppendorf 1,5ml

* Tubes 2 ml en polypropylène bouchon à vis

* Bille acier 4 mm + billes de verre 2 mm

* Broyeur à bille muni d'un carrousel 24 tubes 2 ml

* Azote liquide

* Congélateur -80°C

* Spectrophotomètre à microplaques

* Centrifugeuse réfrigérée.

* Machine à glace

* Verrerie courante de laboratoire

* Pipettes automatiques monocanal (10µl, 200µl 1000 µlet 5000 µl) et multicanaux (8 canaux - volumes 50-300µl)

* Embouts pour pipettes

* Pipette automatique multi coup + réservoirs 1 ml (10µl/coup)

* Microplaques 96 puits sans couvercle (Greiner)

### 3.2.2 Produits utilisés

<table><caption>**Tableau I** : produits utilisés pour le dosage de la GST</caption><thead><tr><td>PRODUIT</td><td>N° CAS</td><td>RANGEMENT</td></tr></thead><tbody><tr><td>Dipotassium Hydrogénophosphate (K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>)</td><td>7758-11-4</td><td>Armoire 1 (B 42)</td></tr><tr><td>Potassium Dihydrogénophosphate, (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)</td><td>7778-77-0</td><td>Armoire 1 (C 7)</td></tr><tr><td>CDNB (1-Chloro 2,4 Dinitrobenzene)</td><td>97-00-7</td><td>Armoire 1 (C 41)</td></tr><tr><td>L-glutathion réduit (GSH)</td><td>70-18-8</td><td>Réfrigérateur Biochimie (réactif 2)</td></tr></tbody></table>

### 3.2.3 Solutions préparées

Tampon phosphate 200 mM, pH 6,5 :

K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> (PM = 228,23) à 0,2 M soit 4,565 g dans 100 ml – soit 22,825 g / 500 ml

KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> (PM = 136,09) à 0,2 M soit 2,722 g dans 100ml – soit 27,220 g / 1000 ml

Pour un Tampon à pH 6,5 : **800 ml de KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> + environs 440 ml de K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>**
A ajuster au pH mètre
### Tampon de broyage

C'est un tampon phosphate (100mM, pH 7,8) additionné de 0,1 % de Triton X100 (exemple pour 50 µl + 50 ml). Bien agiter à l'aide d'un barreau aimanté. **A noter que c'est le tampon commun à la plupart des biomarqueurs (voir dosage de l'ACHE).**

### Solution de CDNB

Solution à 38 mM (202,56 g.mol⁻¹) dans l'éthanol :
Nécessaire pour une plaque : 15,4 mg dans 2 ml d'éthanol pur (7,7 mg.ml⁻¹).
Protéger la solution de la lumière (papier alu)

### Solution de GSH

Solution à 2,235 mM (307,33 g.mol⁻¹) dans le tampon phosphate pH 6,5
Nécessaire pour une plaque : 17,18 mg dans 25 ml de tampon

## 3.3 Mode opératoire

### 3.3.1 Préparation de la fraction S9

* Allumer et régler la centrifugeuse (4°C, FCR= 9000, 15 min)

* Exemple du gammadé錄 : sortir les échantillons du congélateur par petit nombre (4 à 6) en les maintenant en bain de glace et au fur et à mesure transférer dans chaque tube 1 bille d'acier + quelques billes de verre (1mm, 2mm) ainsi qu'un volume de tampon (0,1% triton) à la proportion de 1/10 (m/V)

* Placer ensuite les tubes dans le broyeur à bille et lancer le premier broyage (vitesse 6 – 20 secondes)

* Sortir les tubes du broyeur et les placer 5 minutes dans la glace avant de lancer le deuxième broyage (même réglage)

* Placer ensuite les tubes en centrifugeuse réfrigérée à 4°C

* Centrifuger 15 minutes à 9000 g

* Transférer environs 400 µl de surnageant (S9) en microtube et conserver en bain de glace jusqu'au dosage à effectuer dans l'heure.

**Pré-dilution** : chaque échantillon doit être préalablement prédilué dans du tampon phosphate pH 7,8 pour qu'avec une **prise d'essai de 20 µl**, l'activité soit linéaire durant 3 minutes de cinétique.

* **gammarès** extraits à 1/10 (m/V) -soit (30+210 µl) : **1/8**

* **chironomes** extraits au 1/25 (m/V) : **Pur**

* **dreissen** (glande digestive) extrait au 1/8 m/v : **1/20**

* **larve d'alose** (1larve/80µl) : **Pur**

* **Mucus truite** : **1/4** (directement dans la plaque : 5µl + 15 µl tampon)

* **Mucus de chevaine ou goujon** : pur

* **Foie de truite** : extraits au 1/10 (m/V) : **1/10**

* **Serum de truite** : **1/5**
### 3.3.2 Préparation du spectrophotomètre

* Allumer le spectrofluorimètre (bouton derrière en bas à gauche) et l'ordinateur.

* Ouvrir le programme Xfluor4 : Démarrer/Programme/Tecan/Xfluor4 (menu Windows)

* Activer la connection avec le Safire : Xfluor/Connect/Safire (menu Excel)

* Ouvrir le menu d'onglets dans Xfluor/Edit measurement (menu Excel)

* Régler les paramètres de la mesure comme dans l'exemple ci-dessous.

<table><tr><td>Measurement mode:</td><td>Absorbance</td></tr><tr><td>Measurement wavelength:</td><td>340 nm</td></tr><tr><td>Number of flashes:</td><td>1</td></tr><tr><td>Plate definition file:</td><td>GRE96ft.pdf</td></tr><tr><td>Number of kinetic cycles:</td><td>15</td></tr><tr><td>Kinetic interval (Minimal):</td><td>28 s</td></tr><tr><td>Shake duration (Orbital Normal):</td><td>4 s</td></tr></table>

### 3.3.3 Réalisation de la plaque

* Préparer extemporanément la mixture :
  17 ml GSH + 1 ml CDNB = 18 ml minimum pour une plaque
  Ou plus confortable : 21,25 ml GSH + 1,25 ml CDNB = 22.5 ml )

* Répartir dans une microplaque 96 puits les volumes suivants en triplicat :

<table><thead><tr><td></td><td>Essai</td><td>Témoin</td></tr></thead><tbody><tr><td>Tampon</td><td>150 µl</td><td>170 µl</td></tr><tr><td>Cytosol (dilué ou non)</td><td>20 µl</td><td>-</td></tr><tr><td>Mixture</td><td>180 µl</td><td>180 µl</td></tr></tbody></table>

Agiter brièvement la plaque quelques secondes puis suivre l'absorbance à 340 nm toutes les 15 s si possible sinon toutes les 30 s et pendant au moins 3 min

### 3.3.4 Calculs

#### Activité GST en nmol/min

Corriger préalablement chaque Δ DO (accroissement de DO/min):

$$ \Delta \text{DO} = \Delta \text{DO essai} - \Delta \text{DO témoin} $$

Puis d'après Ber Lambert

$$ \Delta \text{DO} = \varepsilon \times L \times \Delta c $$

$\varepsilon$ = coefficient d'absorption molaire du CDNB conjugué = 9.6 $\text{mM}^{-1}\text{cm}^{-1}$ (Habig, 74)

L = parcours optique pour 350 µl par puit = 1 cm (estimation)

$\Delta c$ = accroissement de concentration en nmol/ml/min.
**On cherche**

ΔQ = Δc x V = accroissement de quantité dans le puit par minute en nmol/min
(V = le volume réactionnel)

$$
\Delta Q = (\Delta DO * 0,35) / 0,0096
$$

Activité GST en nmol/min/mg frais

Soit Cm = concentration en équivalent matière fraiche dans le S9 brut (mg/ml)

Soit v = volume de S9 dilué dans le puit de microplaque en ml

Soit R le rapport de pré-dilution du S9

$$
Q_m = C_m * v * R = \text{quantité d'équivalent matière fraiche dans le puit en mg}
$$

$$
\text{GST} = \Delta Q / Q_m \text{ en nmol/min/mg frais}
$$

Activité GST en nmol/min/mg protéines

soit Cp = concentration en protéines du S9 brut en mg/ml

soit v = volume de S9 dans le puit de microplaque en ml

Soit R le rapport de pré-dilution du S9 (exemple : 1/8)

$$
Q_p = C_p \cdot v \cdot R = \text{quantité de protéine dans le puit en mg}
$$

$$
\text{GST} = \Delta Q / Q_p \text{ en nmol/min/mg prot}
$$

4 SYNTHESE DU DOCUMENT

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>