# Rapport de stage: Inférence de l'histoire démographique des chèvres par deep learning

Augustine Blanck-Boekholt

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Augustine Blanck-Boekholt. Rapport de stage: Inférence de l'histoire démographique des chèvres par deep learning. ENSAT. 2024, pp.42. hal-05007978

HAL Id: hal-05007978

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Submitted on 27 Mar 2025

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ENSAT

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

INRAO
la science pour la vie, l'humain, la terre

Diplôme Ingénieur Agronome de
l'ENSAT

Réalisé à
INRAe Auzeville-Tolosane
UMR GenPhySE

# Rapport de stage

Inférence de l'histoire démographique des chèvres par deep learning

<figure><img src="image_3.png" /></figure>

Augustine
BLANC-BOEKHOLT

Professeur référent
Elie MAZA

Maîtres de stage
Pierre FAUX
Bertrand SERVIN

Année 2023-2024
Abstract

As part of my internship within the VarGoats project, I first studied the structure of the project and positioned my internship subject at the core of this complex system. I analyzed the different information and communication flows to better understand the expectations and constraints. It emerged that the main challenges were financial, and the success of the project relies on effective international collaboration among the various organizations involved. Good communication is essential to facilitate knowledge sharing on this scale.

My work focused on a preparatory step for future studies on goat population evolution, within the VarGoats project. I performed an imputation of sequencing data from 1,357 individuals, with the goal of conducting analyses such as the study of the demographic history of domestic goats. This process required data cleaning, followed by the use of Beagle 4.1 to compare different imputation methods. The testing protocol helped identify the best balance between imputation accuracy and computation time. It was determined that the GTGL imputation method, based on genotype likelihoods and haplotype comparisons, was the most optimal. Genotypes with a quality score below 30 were excluded to ensure better reliability. The results achieved with this method were very satisfactory, reaching a reliability level close to that of data generated by sequencing chips.
Remerciements

Je tiens à exprimer ma gratitude à toutes les personnes qui ont contribué à la réussite de mon stage au sein de l'INRAE et qui m'ont accueillie dans leur cercle de travail.

Tout d'abord, je remercie Pierre Faux et Bertrand Servin pour leur accompagnement, les conseils donnés ainsi que leur disponibilité tout au long de cette expérience pour répondre à mes questions et m'orienter. Ils m'ont permis de m'intégrer rapidement dans l'équipe et d'apprendre avec efficacité.

Je souhaite également remercier toutes les personnes de l'unité GenPhySE et l'équipe Chamade, qui m'ont accueillie avec bienveillance. Enfin, je remercie Myriam Blanc et Sabrina Tréhiou pour leur aide lors de la relecture et correction de ce rapport.

Ce stage a été une étape-clé dans mon parcours professionnel, et je suis reconnaissante d'avoir eu l'opportunité de travailler dans un environnement aussi stimulant.
# Table des matières

<table><tr><td>Introduction</td><td>1</td></tr><tr><td>I - Présentation de la structure d'accueil et du contexte du stage</td><td>2</td></tr><tr><td>1) Présentation de la structure d'accueil</td><td>2</td></tr><tr><td>2) Contexte de l'étude</td><td>3</td></tr><tr><td>a) Identifications du système du sujet : les enjeux et la problématique</td><td>3</td></tr><tr><td>b) Définir les composantes du système du sujet</td><td>6</td></tr><tr><td>c) Analyser la performance du système du projet</td><td>7</td></tr><tr><td>II - Étude du sujet de stage</td><td>10</td></tr><tr><td>1) Matériels et méthodes</td><td>10</td></tr><tr><td>a) Présentation des fichiers et des données</td><td>10</td></tr><tr><td>b) Traitement pré-imputation : préparation des données</td><td>11</td></tr><tr><td>c) Imputation du jeu de données</td><td>16</td></tr><tr><td>d) Traitement post-imputation</td><td>22</td></tr><tr><td>2) Résultats, interprétation et discussion</td><td>24</td></tr><tr><td>a) Résultats</td><td>24</td></tr><tr><td>b) Interprétation et discussion</td><td>26</td></tr><tr><td>Conclusion</td><td>29</td></tr><tr><td>Bibliographie</td><td>31</td></tr><tr><td>Annexes</td><td>34</td></tr></table>
## Abréviations

ACP – Analyse en Composantes Principales

CPU – Central Processing Unit

Ensat – École Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse

Inrae – Institut National de recherche pour l'agriculture, l'agroalimentaire et l'environnement

SNP – Single Nucleotide Polymorphisms

SWOT – Strengths, Weaknesses, Opportunities et Threats

VCF – Variant Call Format

## Table des figures

<table><tr><td>Figure 1 - Schéma du système complexe du sujet « Inférence de l'histoire démographique des chèvres par deep learning » détaillant les échelles géographique et temporelle.</td><td>5</td></tr><tr><td>Figure 2 - Organigramme des parties prenantes du projet VarGoats.</td><td>6</td></tr><tr><td>Figure 3 - Schéma des flux d'informations et de services ainsi que de communication au sein du système complexe.</td><td>7</td></tr><tr><td>Figure 4 - Matrice SWOT définissant les forces, les faiblesses, les menaces et les opportunités du système complexe du projet.</td><td>8</td></tr><tr><td>Figure 5 - Distribution des critères VQSLOD, FS et DP sur l'ensemble des chromosomes autosomaux. Les droites en pointillés rouges représentent les seuils choisis.</td><td>14</td></tr><tr><td>Figure 6 - Graphique de la composante principale 1 en fonction de la composante principale 2 de l'ACP provenant de PCAngsd avec les 4 groupes obtenus par kmean.</td><td>16</td></tr><tr><td>Figure 7 - Taux de discordance en pourcentage en fonction des imputations GL, GTGL sur les groupes ou ensemble des individus.</td><td>18</td></tr><tr><td>Figure 8 - Temps de l'imputation en log2 en fonction des imputations GL, GTGL sur les groupes ou ensemble des individus.</td><td>18</td></tr><tr><td>Figure 9 - Taux de discordance et temps d'imputation pour l'imputation GTGL en fonction du seuil GQ sélectionné. Source : Faux P., Inrae, 2024.</td><td>19</td></tr><tr><td>Figure 10 - Script en Bash pour l'imputation du chromosome 26.</td><td>21</td></tr><tr><td>Figure 11 - Boxplot de la discordance entre les dix tranches de 5 000 SNPs pour chaque fenêtre de 50 000 SNPs.</td><td>21</td></tr></table>
Figure 12 - Graphiques de la concordance et du R² en fonction de la fréquence allélique (par classe allélique) et du génotype avant et après imputation sur le chromosome 14. 25

Figure 13 - Graphique de la moyenne du taux de discordance pour les différentes positions exprimées en pourcentage de chromosomes. Moyenne pour les 29 chromosomes autosomaux après l'imputation. La droite rouge correspond au taux de discordance moyen des chromosomes autosomaux. 26

Figure 14 - Inertie expliquée en fonction du nombre de groupes par la méthode du kmean. 34

Figure 15 - Graphiques de la concordance et du R² en fonction de la fréquence allélique (par classe allélique) et du génotype avant et après imputation sur le chromosome 26. 34

Figure 16 - Représentation des concordances en fonction GP maximales moyens. La droite rouge est considérée comme l'idéal. La droite bleue correspond à la réalité. 36

Tableau 1 - Tableau montrant le temps et l'efficience en fonction du nombre de CPU utilisé lors de l'imputation. 20

Tableau 2 - Taux de discordance (%) avant imputation, après imputation et après nettoyage sur les probabilités de génotypes. 25

Tableau 3 - Données brutes en temps et en précision pour les différents tests. 35
## Introduction

Mon stage de deuxième année à l'ENSAT s'est déroulé au sein de l'INRAE, une institution publique de recherche dans le domaine de l'agronomie. J'ai eu l'opportunité de réaliser mon stage au sein de l'équipe Chamade, qui étudie les dynamiques et l'évolution des populations avec une spécialisation en génomique et bio-informatique. Mon projet portait sur l'inférence de l'histoire démographique des chèvres (*Capra hircus*) par *deep learning*, utilisant la base de données VarGoats, qui regroupe 1372 génomes caprins. Étant donné la vaste étendue de ce sujet, je me suis concentrée sur le traitement des données pendant mon stage, notamment l'imputation des données de séquençage, afin de les rendre plus fiables et utilisables pour l'analyse par *deep learning*. Cette étape de traitement des données précède l'analyse par *deep learning*, que je n'ai pas eu l'occasion de réaliser au cours de ces trois mois de stage. Ce rapport présente mon expérience, les connaissances acquises et les méthodes utilisées, dans le but de répondre à la problématique : comment établir la relation, chez la chèvre (*Capra hircus*), entre la structuration en races ou sous-populations et le génome, afin de conserver la diversité génétique ?

Sur un plan personnel, mon objectif principal était d'acquérir une première expérience professionnelle dans le domaine de la bio-informatique appliquée à la génomique. J'avais pour ambition d'apprendre à utiliser les différents outils disponibles pour l'analyse génomique, ainsi que de développer mes compétences en environnement Linux, en langages Bash, Awk et R. Mon but sous-jacent était de me préparer et de me motiver à entrer en spécialité biologie computationnelle en troisième année à l'ENSAT.

Pour accomplir les tâches qui m'ont été confiées, j'ai appris à maîtriser les différents types de fichiers utilisés en génomique, tels que les fichiers VCF, BIM et FAM, ainsi que les outils de manipulation et d'analyse de ces fichiers, comme Plink, Beagle et BCFtools. Grâce à ces compétences, j'ai pu suivre la méthodologie d'imputation des données de séquençage.

Ce rapport est structuré en deux parties principales. La première partie expose le contexte du stage, en présentant l'organisme d'accueil, le sujet du stage et son cadre général. Elle développe également l'analyse du système complexe (agrochaîne) du sujet, les acteurs impliqués, les flux d'échanges et les enjeux auxquels le projet est confronté. La deuxième partie se concentre sur la méthodologie de travail, les résultats obtenus, ainsi qu'une discussion et interprétation de ces résultats. Enfin, une critique méthodologique et les perspectives sont abordées.
# I - Présentation de la structure d'accueil et du contexte du stage

## 1) Présentation de la structure d'accueil

### L'organisme Inrae

L'Institut national de recherche pour l'agriculture, l'agroalimentaire et l'environnement, connu sous le nom d'Inrae est un organisme de recherche publique. Cet organisme est placé sous la tutelle de deux ministères, le ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche ainsi que le ministère de l'Agriculture et de la Souveraineté alimentaire. Les deux objectifs principaux sont : « Produire et diffuser des connaissances scientifiques » et « Mobiliser ces connaissances au service de l'innovation, de l'expertise et de l'appui aux politiques publiques » (Inrae, 2024). Fondé en 1946, l'Inrae avait alors comme mission principale de répondre à une demande sociale pressante d'alimenter la France. Mais aujourd'hui, cet organisme s'est diversifié et ses recherches concernent trois domaines fortement liés : l'alimentation, l'agriculture et l'environnement. Son ambition est de développer une agriculture à la fois compétitive, respectueuse de l'environnement, des territoires et des ressources naturelles, et mieux adaptée aux besoins nutritionnels de l'être humain ainsi qu'aux nouvelles utilisations des produits agricoles. Ses recherches multidisciplinaires englobent des domaines tels que la génétique, l'agronomie, l'écologie, l'économie et les sciences sociales, visant à promouvoir des pratiques agricoles respectueuses de l'environnement et à soutenir les politiques publiques en matière de développement rural et de transition écologique (Inrae, 2024).

Ce grand organisme est divisé en dix-huit centres de recherche qui se situent sur l'ensemble du territoire français, que ce soit en métropole ou dans les départements et territoires d'outre-mer. Mon stage s'est déroulé dans le centre de recherche Inrae basé sur le campus d'Auzeville-Tolosane.

### L'unité GenPhySE

L'unité GenPhySE est un laboratoire de recherche autour de la génétique, de la physiologie animale et des systèmes d'élevage. Cette unité de recherche est dédiée à l'amélioration des connaissances et des pratiques dans le domaine de l'élevage. Les recherches menées à GenPhySE visent à comprendre et optimiser les performances des animaux d'élevage tout en
optimisant leur bien-être et en minimisant l'impact environnemental de l'élevage. On y retrouve
de nombreuses et diverses disciplines telles que des études génomiques avancées, des analyses
de données phénotypiques et des modèles de gestion des systèmes d'élevage. Les travaux de
GenPhySE sont essentiels pour répondre aux enjeux actuels de durabilité et de résilience des
systèmes agricoles. Pour cela cette unité est composée de dix équipes de recherche, travaillant
sur différents sujets.

L'équipe Chamade

L'équipe Chamade est une équipe qui étudie la dynamique et l'évolution des populations. Cette
équipe est très récente, car il y a eu un remaniement des équipes de GenPhySE depuis avril
2024. Avant ce changement, l'équipe se nommait Dynagen. Cette équipe est supervisée par le
directeur d'équipe Bertrand Servin. Elle se concentre sur la recherche en génétique quantitative
et en génomique des populations animales. Elle s'intéresse plus particulièrement à la
dynamique des populations et la variabilité génétique, pour mieux comprendre les mécanismes
de sélection naturelle et artificielle. Son travail contribue non seulement à l'amélioration des
performances des espèces animales, mais aussi à la préservation de la biodiversité et à la
durabilité des systèmes d'élevage (Inrae, 2024).

2) Contexte de l'étude

a) Identifications du système du sujet : les enjeux et la
problématique

Mon sujet de stage, intitulé « Inférence de l'histoire démographique des chèvres (Capra hircus) par deep learning », repose sur la base de données de séquençage VarGoats, une base de données du projet 1 000 Génomes de chèvres initié par l'Inrae. L'étude du système (agrochaîne) du sujet se concentre sur l'analyse d'un processus complexe, analysé sous l'angle de la démarche scientifique en recherche fondamentale. Cette approche permet de comprendre les motivations, les méthodes et les bénéficiaires du projet à diverses échelles, tout en soulignant les enjeux.

Le contexte économique de la filière caprine pousse les élevages et les organismes de sélection
à maximiser l'efficience et la qualité des animaux pour obtenir une bonne production tout en
réduisant les coûts. Actuellement, en France les coûts de production ont augmenté de 4 %, soit
45 euros de plus pour 1000 litres en 2023, en raison des charges opérationnelles (Duflot B. et al, 2023). Parallèlement, les importations ont diminué, la production est restée stable et la consommation a également diminué (Duflot B. et al, 2023). Au niveau planétaire, la filière caprine est le socle de l'agriculture de subsistance, par exemple dans certains pays d'Afrique (International Goat Association, 2019). La demande est en forte hausse dans des pays de l'Amérique latine et en Asie (ILRI, 2020). Mais comme partout dans le monde cette filière doit s'adapter à des enjeux actuels tels que le changement climatique, et le bien-être animal. Le principal défi est donc de comprendre le fonctionnement génomique des races afin que les organismes puissent développer de nouvelles races et sélectionner les caractères génétiques influençant la production, tout en conservant les labels AOP directement liés aux races. Il s'agit aussi de conserver la diversité génétique des espèces caprines. Les mouvements de populations et les échanges génétiques mondiaux conduisent à des croisements, pouvant entraîner une perte de diversité génétique et l'apparition de nouvelles races. Cette question se pose aussi bien au niveau national qu'international, impliquant des acteurs de plusieurs pays. Le projet VarGoats, qui est à la base de cette étude, a abouti à la création d'une base de données regroupant 1372 génomes de diverses races et espèces de chèvres. Ce consortium scientifique rassemble sept institutions étrangères (au Royaume-Uni, aux États-Unis, un collectif de pays africain et en Italie) et françaises, dont l'Inrae et le Laboratoire d'Écologie Alpine (Goat Genome, 2024). Les génomes de chèvres séquencés proviennent de populations mondiales, avec 97 % d'individus domestiques (*Capra hircus*) et 3 % de chèvres sauvages telles que *Capra aegagrus* et *Capra ibex* (Denoyelle et al, 2021). La base de données et les publications scientifiques afférentes sont disponibles pour la communauté scientifique mondiale. Ce projet vise à comprendre la structuration des populations caprines en races et sous-races et leur relation avec le génome grâce à l'étude de la caractérisation des évènements de contraction et expansion suivant la domestication et la structuration en races (Bazin C., Maisonhaute C., Capy P., 2000). Les résultats de cette étude sont principalement destinés à la communauté scientifique, contribuant à l'avancement de la recherche et pouvant être appliqués par des organismes de sélection et de conservation des races. Pour cela, l'étude sur le sujet se base sur l'environnement Linux, le logiciel R et ainsi que les outils tels que Plink, Bcftools et Beagle pour la partie d'analyse et l'outil *dnadna* (*Deep neural Architecture for DNA* ; Sanchez et al, 2023) pour la partie analyse par *deep learning*.

Pour répondre à cette problématique, un schéma du système complexe a été développé ; se référer à la figure 1 ci-dessous.
<figure><img src="image_4.png" /></figure>

Figure 1 - Schéma du système complexe du sujet « Inférence de l'histoire démographique des chèvres par deep learning » détaillant les échelles géographique et temporelle.

Sur ce schéma, les différentes étapes en amont et en aval de l'étude sont présentées, permettant
de comprendre le contexte dans lequel l'étude évolue.

L'étude dans laquelle je me situe s'articule autour de deux grandes étapes (mises en avant en
rouge sur le schéma) : le traitement des données de séquençage avant utilisation et l'analyse par
les outils de deep learning. Durant ces trois mois de stage, mes activités ont consisté à traiter
ces données, en particulier l'imputation des génotypes, le filtrage des SNPs et le filtrage des
individus. L'enjeu principal de mes missions est d'améliorer et de garantir la qualité et la fiabilité
des données, tout en optimisant le temps de calcul pour qu'elles puissent être analysées
efficacement par la suite. Lors de ces missions, il est crucial de garder à l'esprit l'objectif final
et le type d'analyse à appliquer aux données pour prendre les décisions les plus appropriées lors
du filtrage des SNPs ou des individus. De plus, la collaboration entre les unités, les équipes et
les différentes structures mène au partage des travaux sur lesquels je travaille, renforçant l'enjeu
de garantir une fiabilité et une qualité des données traitées.
L'identification de ces enjeux et du contexte socioéconomique du sujet permettent d'en déduire une problématique : comment établir la relation, chez la chèvre (*Capra hircus*), entre la structuration en races ou sous-populations et le génome, dans le but de conserver une diversité génétique ?

## b) Définir les composantes du système du sujet

Le système complexe du projet VarGoats, qui constitue le cadre de mon sujet de stage, comprend divers acteurs essentiels. L'organigramme, présenté en figure 2, illustre ces acteurs, en précisant leur position, leur rôle, ainsi que leur nature, qu'ils soient publics ou privés.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 2 - Organigramme des parties prenantes du projet VarGoats.</figcaption></figure>

Comme illustré dans la figure précédente et la figure 3, l'un des acteurs essentiels au projet est constitué par les financeurs. Seule la ressource financière garantit la continuité et la pérennité du projet. Dans notre cas, les financeurs sont publics et apportent des fonds directement à l'INRAE, qui, à son tour, finance le projet VarGoats (GoatGenome, 2023). En complément, le projet bénéficie également d'un soutien financier de l'Union européenne à travers des fonds
alloués dans le cadre de la campagne de financement Horizon 2020 (ministère de l'Économie, des Finances et de la Souveraineté industrielle et économique, 2023).

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 3 - Schéma des flux d'informations et de services ainsi que de communication au sein du système complexe.</figcaption></figure>

Les différents flux et types de communications entre les acteurs sont illustrés dans la figure 3. La majorité des flux concernent des flux d'informations, notamment à travers des publications scientifiques, rendant leur quantification et qualification complexes. Ces flux sont difficiles à différencier des communications entre organismes au sein du système. Les flux quantifiables incluent les flux financiers dirigés vers le projet VarGoats, estimés à 400 mille d'euros. Cette somme ne comprend pas le temps de travail et ni les infrastructures de calcul pour le travail bio-informatique. En termes de données, le Consortium a produit 630 giga-octets de résultats, couvrant 77 millions de SNPs recensés à partir des 1 372 génomes séquencés. Les échanges de connaissances entre organismes se font principalement par des interactions directes, comme lors de conférences, ainsi que par la diffusion d'articles scientifiques.

### c) Analyser la performance du système du projet

Afin d'analyser la performance et d'optimiser la pérennité du système en réduisant les menaces et ses faiblesses internes, une matrice SWOT (Strengths, weaknesses, opportunities and
threats), figure 4 ci-dessous, a été créée à partir d'une analyse de l'environnement du projet et des acteurs entrant en jeu.

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>Figure 4 - Matrice SWOT définissant les forces, les faiblesses, les menaces et les opportunités du système complexe du projet.</figcaption></figure>

Dans cette matrice, on retrouve les forces et les faiblesses internes au projet mais aussi les opportunités et les menaces qui sont elles externes au projet. Le projet a une force interne importante, qui est l'accès à la base de données VarGoats. Cet accès est essentiel pour le projet, mais un des points forts est l'accès total et la possibilité d'échange avec la directrice du projet, Gwenola Tosser-Klopp, et leader du consortium scientifique, travaillant dans l'unité GenPhySE. Le travail d'équipe est une des forces internes au projet. Au sein d'une même unité, les équipes échangent leurs connaissances et compétences. Cela se traduit par des réunions intra-équipe et des présentations scientifiques des différents projets dans l'unité GenPhySE. Lors de mon travail de l'imputation sur l'outil Beagle 4.1, nous sommes concertés avec une doctorante de l'équipe ainsi qu'un post-doctorant d'une équipe voisine afin de comprendre leurs travaux précédents. De plus, le projet se situant dans l'organisme, l'Inrae a l'opportunité de créer des collaborations avec d'autres organismes étrangers et locaux. Cette collaboration permet un échange de compétences mais aussi un accès à des techniques de séquençage de dernière génération. Ce séquençage est une force et une faiblesse en même temps. En effet, il permet une grande précision et une justesse maximale actuelle, mais en parallèle ces techniques ne sont pas encore fiables à 100 %, et donc l'analyse comporte une part de variabilité dû au séquençage. Le but est de le réduire au maximum. Comme évoqué, une grande force est d'avoir
accès aux différents outils précis de toutes les mises à jour comme celles de Beagle mais aussi des outils de dernière génération comme l'outil de *deep learning* Dnadna. Cette accessibilité est possible grâce à la plateforme GenoToul de bio-informatique. Cette plateforme permet une expertise poussée en bio-informatique. Une faiblesse de cette plateforme est le temps de calcul, qui reste important et limité lors de grosses analyses ou de traitements, de même vis-à-vis de la place sur le serveur, ce qui peut être un frein dans certains cas. L'utilisation des outils récents comme le *deep learning* est une grande force pour la nouveauté des analyses que cela peut apporter, mais ces outils sont complexes d'utilisation et ont peu de documentations, car ils sont récents.

L'analyse de la matrice SWOT permet de déduire les moyens stratégiques du projet VarGoats pour maintenir et renforcer sa position dans le système. Un aspect important pour assurer son maintien, et potentiellement permettre une évolution, est le financement. La recherche publique est liée ses ressources budgétaires, nécessaires pour financer les coûts matériels et les salaires. Le projet est actuellement subventionné via des financements à long terme pour l'INRAE, ainsi que des subventions à court terme, moins de dix ans, telles que celles du programme Horizon Europe, qui s'achèvent en 2027 (ministère de l'Économie, des Finances et de la Souveraineté industrielle et économique, 2023). Pour maintenir et faire progresser ce projet, il est essentiel de trouver de nouveaux financements, non seulement pour remplacer ceux qui finissent, mais aussi pour étendre les recherches. Pour cela les chercheurs doivent rester informés sur les nouveaux programmes de financement disponibles à différentes échelles, qu'elles soient locales, nationales, européennes ou internationales. La diversification des sources de financement est donc essentielle, que les subventions soient publiques ou privés.

De plus, la publication d'articles scientifiques dans des revues renommées constitue un moyen stratégique pour obtenir une reconnaissance, ce qui pourrait attirer de nouveaux financements et de nouveaux partenaires. Pour faire avancer les découvertes, les chercheurs doivent se tenir régulièrement informés des dernières technologies et techniques utilisées dans le séquençage et l'analyse génomique, en lisant les publications récentes. La collaboration avec d'autres équipes de recherche et organismes est également importante pour favoriser les échanges de connaissances, par exemple lors de congrès scientifiques. Le développement de partenariats avec des entreprises de biotechnologie, des laboratoires vétérinaires, et des organisations de
sélection et de conservation de races pourrait permettre d'appliquer concrètement ces
découvertes.

II — Étude du sujet de stage

L'étude réalisée durant ce stage porte sur la préparation de l'analyse du sujet intitulé «Inférence de l'histoire démographique des populations de chèvres par deep learning». Ce travail consiste principalement à optimiser le nettoyage et l'imputation d'un jeu de données de séquences génétiques regroupant 1 372 chèvres. Cette base de données recense l'ensemble des mutations, mais comme les échantillons proviennent de divers laboratoires, la qualité des données est très hétérogène et le jeu de données initial est peu fiable. Par exemple, certains variants peuvent être artéfactuels ou certains génotypes peuvent être très imprécis. L'objectif est donc de rendre cette base la plus cohérente et complète possible afin qu'elle puisse servir de fondement aux études à venir.

1) Matériels et méthodes

a) Présentation des fichiers et des données

Afin de comprendre le travail que j'ai effectué, il est essentiel de faire une présentation
des données que j'ai utilisées, ainsi que les types de fichiers. La base de données VarGoats
contient 30 fichiers de type VCF (Variant Call Format) où figurent les génotypes des 1 372
chèvres pour les 77 millions de Single Nucleotides Polymorphismes (SNPs) trouvés lors du
séquençage (les autres variants – insertions-deletions, etc. – ne sont pas considérés dans ce
projet). Chaque fichier recense ces mutations sur les 30 chromosomes autosomaux et sexuels.
Ce type de fichier est un format standard utilisé pour représenter des variations génétiques
trouvées dans des séquences d'ADN par rapport à une séquence de référence. La séquence de
référence de la chèvre utilisée ici est ARS1. Les informations retrouvées dans ce fichier sont :
en ligne, chaque variant ; en colonne, le numéro du chromosome sur lequel se situe le SNP,
puis la position en paire de base (pb) sur ce chromosome, l'identifiant du SNP, l'allèle de
référence et l'allèle alternatif, la qualité, le filtre, les informations sur ce SNP comme la
couverture globale de chaque allèle, le format du génotype, puis le génotype de chaque individu.
Les génotypes sont annotés comme suit : 0/0 pour homozygote de l'allèle de référence, 0/1 pour
hétérozygote et 1/1 pour homozygote alternatif. Nous avons aussi accès à des données de
génotypes pour certains variants de 478 individus en commun avec VarGoats, produits par une
Rapport de stage 2e année ENSAT – 2024
puce. Dans notre cas la plateforme employée est la puce ADAPTmap (~50,000 SNPs). Les informations de cette puce ont été transmises sous le format d'un set de trois fichiers. Ces trois fichiers sont le bed, le bim et le fam. Le fichier bed est un fichier binaire contenant les génotypes. Le bim est lui un fichier d'annotation des SNP, décrivant les SNPs présents dans le fichier bed. Pour terminer, le fichier fam contient les informations concernant les individus (identifiants, sexe, phénotype, etc.). La combinaison de ces fichiers permet de créer un fichier VCF. Afin de faire le lien entre les données du fichier VCF de VarGoats et les fichiers bim, fam, bed de la puce ADAPTmap, un fichier de type TSV (Tab-Separated Values) fait un récapitulatif des différentes données pour chaque individu. Ce document est essentiel, car les individus n'ont pas le même identifiant dans la base de données de séquençage VarGoats et dans le fichier de la puce.

Le choix a été de réaliser l'imputation seulement sur les espèces *Capra hircus* et *Capra aegagrus*. Les huit autres espèces présentes dans la base de données, tels que *Capra ibex*, *Capra caucasica*, ect. ont été exclues, car elles sont génétiquement trop éloignées de *Capra hircus* et de *Capra aegagrus*. En effet ces deux espèces sont assez proches génétiquement, on les considère parfois comme deux sous-espèces de chèvres, la première représentant les domestiques et la seconde les sauvages. Cela nous permet de faire une analyse génomique pertinente. Pour la suite du travail, seulement 1 357 individus seront traités.

## b) Traitement pré-imputation : préparation des données

### Préparation d'un pipeline de comparaison de la précision

Un pipeline de qualification de l'imputation a été développé pour obtenir des mesures objectives de la précision et de la qualité des données de séquençage. Ce pipeline, ainsi que les valeurs qu'il génère, constitue la base des étapes suivantes et sera utilisé tout au long du processus. L'évaluation de la qualité de l'imputation repose sur la comparaison des génotypes de la puce ADAPTmap avec ceux de la base de données VarGoats. Les génotypes fournis par la puce sont considérés comme plus fiables que ceux issus du séquençage. En comparant les génotypes de chaque individu entre la puce et les données de séquençage, un taux de discordance en pourcentage est calculé, la puce étant prise comme référence. Après l'imputation, les génotypes de séquençage sont modifiés, puis comparés à nouveau, ce qui permet de recalculer le taux de discordance. L'objectif est de réduire ce taux. La puce contient
44 996 SNPs en commun avec VarGoats et 478 individus partagés. Il est crucial de tester l'impact de l'imputation à chaque étape pour obtenir rapidement et efficacement les taux de discordance, de concordance, ainsi que le R² (carré de la corrélation entre deux vecteurs de génotypes, par ex. originaux et imputés), afin de quantifier les améliorations apportées par l'imputation. Ce pipeline est basé sur l'outil BcfTools, avec les options stat et plot-vcf. Le fichier de sortie utilisé contient par classe de la fréquence allélique, la concordance pour les trois génotypes ainsi que le R². Dans notre cas, le R² moyen est pondéré par les SNPs, le calcul utilisé est alors : $\overline{R^2} = \frac{\sum(n_i*R^2_i)}{\sum n_i}$, avec les $n_i$ le nombre de SNPs et $R^2_i$ les R² de chaque SNPs. Le R² est une mesure qui évalue la qualité de la correspondance entre les deux méthodes. C'est un carré de corrélation, il varie donc entre 0 et 1 : plus il est proche de 1, plus les génotypes obtenus via séquençage sont en phase avec ceux obtenus via la puce, ce qui garantit une meilleure précision des données génétiques et une plus grande fiabilité pour les analyses ultérieures.

## Vérification des données et correction

Les prochaines étapes sont plus focalisées sur le traitement des données et des fichiers dans le but de les rendre utilisables pour faire de l'imputation. Des transformations des fichiers de la puce ADAPTmap ont été réalisées afin que ces derniers puissent être analysées et utilisées avant l'imputation. Les premières modifications concernent les variants. Ces variants ont été choisi selon des filtres précis. Le premier filtre est la sélection de variants autosomaux. Il y a eu donc suppression des données pour le chromosome 0 et 30. Le chromosome noté 0 contient tous les SNPs dont la position n'a pas été localisée. Le chromosome 30 correspond aux chromosomes sexuels. Le deuxième filtre est de chercher les erreurs. Les informations des positions des mutations sont le numéro du chromosome portant la mutation puis la place sur le chromosome en paire de base (pb). Certaines positions des SNPs en pb n'étaient pas exactes ; elles correspondaient aux positions sur un ancien génome de référence. Ces positions ont été corrigées grâce à un fichier qui recense tous les SNPs et leur position sur le génome de référence actuel (ARS1). Après ce tri, un traitement d'orientation des allèles a été appliqué. En effet, pour certains variants, l'allèle était observé sur un brin différent dans le jeu de données d'ADAPTmap et dans le jeu de données VarGoats. Il a fallu donc orienter ces allèles sur le même brin. Ce travail a été réalisé au départ par Pierre Faux puis finalisé par moi-même. Après l'orientation des allèles, les variants choisis sont ceux qui ont le même polymorphisme dans la

Rapport de stage 2e année ENSAT – 2024
base de données de séquençage et celle de la puce. Ces modifications et filtres ont été opérés
grâce à des outils tels que Plink et Bcftools.

La vérification faite, il a fallu choisir les individus en commun entre le fichier de la puce
ADAPTmap et le fichier VarGoats. Initialement 475 individus étaient recensés avec leurs
identifiants puce et identifiants VarGoats dans un fichier mettant en lien la base de données
VarGoats et la puce. À noter que 25 individus de ces 475 étaient annotés comme non fiables.
Pierre Faux a fait une étude de parenté pour tous les individus grâce aux génotypes de la puce
et de séquençage. Il a alors remarqué que les 25 individus étaient bien à prendre en compte dans
notre étude car ils sont bien en commun dans les deux jeux de données. Puis quatre autres
individus ont été rajoutés, car le taux de parenté calculé est de 1 entre l'individu séquencé et
l'individu génotypé par puce, signifiant que ce sont bien le même animal, tandis qu'un individu
a été retiré car le taux de parenté lui correspondant était proche de 0. Pour finir, le même
principe a permis d'identifier que deux individus n'avaient pas l'identifiant de puce associé au
bon identifiant de VarGoats. J'ai réalisé ces changements d'identifiants dans le fichier de la
puce, puis j'ai sélectionné les 478 individus communs aux deux bases de données.

## Filtrage des SNPs

Dans le premier temps, les variants ayant une fiabilité élevée sont sélectionnés. Cette
sélection est basée sur les critères Variant Quality Score Log Odds (Vqslod), Fisher score (FS)
et Depth of Coverage (DP), qui se trouvent dans les fichiers VCF. Le Vqslod est la qualité du
score Logarithm of Odds (LOD) calculé par Genome Analysis Toolkit (GATK). Ce score a
pour but d'évaluer la probabilité qu'une variation génétique soit réelle par opposition à une
erreur de séquençage ou un artefact d'analyse (GATK, 2023). Le Fisher score est une évaluation
du biais potentiel de séquençage dans la détection des variants. Celui-ci passe par
l'identification des variations qui ont une distribution disproportionnée des allèles sur les brins
de séquençage, ce qui pourrait indiquer un biais de séquençage. Le critère de couverture (DP)
explique le nombre de fois où le variant a été lu lors du séquençage. Avec une couverture faible,
les erreurs de séquençage peuvent être confondues avec des SNP. Une couverture plus élevée
permet de vérifier les lectures à une position donnée, diminuant ainsi la probabilité de SNPs
artéfactuels. Dans notre cas, le DP est la somme de toutes les couvertures des individus pour un
SNP donné. Le critère Qual score, un score de confiance sur la présence d'un SNP n'a pas été
utilisé. Ce choix a été basé sur le fait que ce score est directement lié à la fréquence allélique.
En supprimant ces SNPs, les allèles avec une faible fréquence seraient alors eux aussi supprimés
(Etourneau A, 2024).

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>Figure 5 - Distribution des critères VQSLOD, FS et DP sur l'ensemble des chromosomes autosomaux. Les droites en pointillés rouges représentent les seuils choisis.</figcaption></figure>
Les seuils choisis pour ces critères sont basés sur les figures réalisées ci-dessus. Les valeurs trop basses sont éliminées, car elles signifient une mauvaise qualité pouvant engendrer des erreurs. Les valeurs trop élevées sont elles aussi éliminées, étant étonnamment trop bonnes, et donc suspectes.

Les seuils sont donc entre 8 et 23 pour le Vqslod, inférieur à 15 pour le FS et compris entre 12 000 et 27 000 pour la DP, ce qui représente une couverture d'environ 8X et 20X par génotypes. Le premier pic apparaissant sur la distribution des Vqslod est dû aux fréquences alléliques inférieures à 0,02. La plupart des basses fréquences ont des Vqslod faibles. Cette observation complétée par l'article de Gundappa et al (2023) nous a amenés à compléter les filtres par le critère du Minor Allele Count (MAC) placé à trois, c'est à dire les allèles apparaissant moins de trois fois sont éliminés du jeu de données. On peut considérer cette valeur comme la limite de fréquence la plus faible : en effet, observer au moins trois fois l'allèle signifie qu'on l'a observé dans au moins deux individus différents, réduisant donc drastiquement le risque d'un SNP artéfactuel, nettement moins probable chez deux individus plutôt qu'un seul.

Pour conclure, pour la suite du travail seuls les SNPs ayant des valeurs comprises dans ces seuils seront gardés pour être imputés. Ainsi, 49,7 % des SNPs ont été gardés avec ces quatre filtres, passant de 69 millions SNPs au départ à 34 millions SNPs à l'arrivée.

## Création de groupes de population

Des groupes d'individus basés sur les ressemblances génétiques ont été réalisés. Ces groupes sont utilisés lors des différents tests qui vont suivre dans le but d'optimiser l'imputation. Pour regrouper les individus, nous nous sommes basés sur une Analyse en Composante Principale (ACP). Cette ACP va nous permettre de visualiser la structure de la population grâce au résumé des variations génétiques (Meisner, Albrechtsen, 2018). Nos données ne sont pas encore complètes, ni fiables, car cette analyse se situe en pré-imputation. Pour traiter des données de séquençage NGS de basses couvertures, l'outil PCAngsd est idéal. Cet outil base ses calculs sur l'utilisation des Genotypes Likelihood (GL), vraisemblances de génotypes, qui sont présents dans les fichiers VCF. Les vraisemblances de génotypes s'écrivent sous la forme d'un trio de chiffres qui sont les vraisemblances d'avoir un génotype hétérozygote de référence, un homozygote et un hétérozygote alternatif. Cette représentation des génotypes inclut donc une mesure de l'incertitude autour de leur détermination. Puis la méthode du kmean
est appliqué au résultat de l'ACP. La courbe d'inertie expliquée est optimale pour quatre groupes, comme le montre la figure 14 en annexe.

Grâce à la comparaison entre les groupes issus de l'ACP et les origines, nous pouvons conclure que les groupes correspondent globalement à la répartition géographique des échantillons récoltés. La figure 6 met en avant cette répartition en fonction des groupes.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 6 - Graphique de la composante principale 1 en fonction de la composante principale 2 de l'ACP provenant de PCAngsd avec les 4 groupes obtenus par kmean.</figcaption></figure>

Le groupe 1 contient 324 individus qui proviennent de pays d'Afrique du Nord. Le groupe 2 a un effectif de 153 individus provenant du reste du continent africain et du continent océanien. Le groupe 3 contient également des individus du continent océanien et asiatique, rassemblant 324 individus. Le quatrième groupe est le plus imposant, avec 556 individus, provenant tous de pays européens. La représentation de la structure de la population selon la variation génétique est directement liée à la géographie. Cette relation est totalement compréhensible par le peu d'échange génétique entre les différentes races des différents continents. En effet, chaque race a divergé de son côté, ce qui explique les différences génétiques. La proximité génétique des individus de différents pays peut être expliquée par un échange génétique. Cela peut être dû à
des croisements de races et d'individus, l'exportation de chèvres ou encore par une divergence
de population plus récente.

c) Imputation du jeu de données

Principe d'imputation de Beagle

L'imputation des génotypes avec Beagle est une technique de génétique, utilisée pour
prédire les génotypes manquants ou non observés à partir de données partielles. Ce processus
repose sur la comparaison des génotypes incomplets d'un jeu de données avec ceux des
individus de la base de données. Beagle commence par phaser les génotypes, c'est-à-dire qu'il
décompose les génotypes diploïdes en haplotypes. Ensuite, il recherche des segments
d'haplotypes similaires dans le panel de référence et, en utilisant des méthodes probabilistes,
impute les génotypes manquants en se basant sur ces correspondances. Chaque génotype imputé
est accompagné d'une probabilité, permettant d'évaluer la fiabilité de l'imputation. Ce
processus est particulièrement utile, car il permet de combler les lacunes dans les données et
d'augmenter la couverture sans nécessiter de nouveaux génotypages.

Protocole de tests pour choisir le type d'imputation

Un protocole de test a été effectué afin de trouver la meilleure combinaison des
différentes options de Beagle 4.1 entre temps de calcul et précision de l'imputation.

Nous avons cherché à comparer une imputation de type GTGL (Genotype Likelihoods in Genotype Format) et GL (Genotype Likelihoods). Le type d'imputation GTGL se base sur les génotypes existants et les vraisemblances de génotype de tous les individus. L'algorithme va seulement imputer les génotypes manquants. Contrairement au mode GL, qui se base seulement sur les GL et ne prend en compte les génotypes déjà présents. Le mode GTGL est appliqué sur les fichiers dont les génotypes sont filtrés selon leur qualité de génotype (GQ), avec un choix de seuil de 30. Ce qui veut dire que les génotypes dont le GQ est inférieur à 30 sont mis en génotypes manquants et seront imputés. La qualité de génotype est une mesure qui quantifie la fiabilité de l'appel de génotype pour un individu à une position donnée dans le génome. Elle reflète la confiance que le génotype attribué est correct. Ces choix sont menés par les résultats des différents tests qui sont illustrés par les figures ci-dessous. Pour plus de détails sur les valeurs, vous pouvez retrouver en annexe le tableau 4 avec les résultats de tous les tests. Les
tests ont été réalisé sur le chromosome 26 et une portion de 100 000 SNPs (de 20 Mb à 23 Mb),
et utilisant les groupes 1, 2 et 4 déterminés précédemment. L'imputation a été faite avec l'option
GL sur l'ensemble des individus, puis imputation seulement sur les groupes séparément. Une
imputation a été également faite en mode GTGL sur l'ensemble des individus, puis imputation
seulement sur les groupes séparément, tout en faisant varier les seuils de filtre GQ. Pour chaque
test, les valeurs de précision d'imputation sont données sous forme de R² et de taux de
discordance calculés par le pipeline (détaillé dans la sous-partie « Traitement pré-imputation »)
et le temps de calcul est relevé.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 7 - Taux de discordance en pourcentage en fonction des imputations GL, GTGL sur les groupes ou ensemble des individus.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 8 - Temps de l'imputation en log2 en fonction des imputations GL, GTGL sur les groupes ou ensemble des individus.</figcaption></figure>
Ce qui ressort des figures 7 et 8, est que le mode GTGL est meilleur que le GL selon le seuil de qualité de génotype sélectionné. Mais également que l'imputation GTGL sur l'ensemble de la population est plus juste que sur les groupes séparés étant seulement deux fois plus long.

Le choix d'utiliser le seuil GQ à 30 est confirmé par la figure 9, qui souligne une baisse significative jusqu'à GQ 30, puis se stabilise alors que le temps de calcul ne fait qu'augmenter. Choisir un seuil 30 est le meilleur compromis entre la précision et le temps.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 9 - Taux de discordance et temps d'imputation pour l'imputation GTGL en fonction du seuil GQ sélectionné. Source : Faux P., Inrae, 2024</figcaption></figure>

Nous avons également fait varier l'option *modelscale*. Le paramètre *modelscale* dans Beagle est utilisé pour ajuster l'échelle du modèle statistique que Beagle utilise pour estimer les probabilités des génotypes et pour d'autres analyses, telles que l'imputation et le phasage des haplotypes (Browning, 2017). Cette valeur permet de regrouper uniquement les haplotypes très similaires, offrant ainsi un gain de temps significatif tout en maintenant une excellente précision. Le R² et le taux de discordance de l'imputation avec un *modelscale* de 0,8 sont identiques à ceux obtenus avec un *modelscale* de 1,5, mais le temps de calcul est doublé. En revanche, un *modelscale* égal à 3 réduit le temps de calcul de 1,5, mais entraîne une légère perte de qualité. Le taux d'erreur augmente de 11 %, pour un gain de temps négligeable. La valeur
1,5 est choisie pour la suite. De plus, cette valeur qui est vérifié par l'article de Pook et al (2020) qui préconise un *modelscale* de 1,5, ce qui est le plus optimal pour la version 4.1 de Beagle.

La dernière évaluation concerne le nombre de CPU à utiliser afin d'optimiser le temps de calcul.
Les résultats sont donnés dans le tableau 1.

<table><caption>Tableau 1 - Tableau montrant le temps et l'efficience en fonction du nombre de CPU utilisé lors de l'imputation.</caption><thead><tr><td></td><td>Efficience</td><td>Temps</td></tr></thead><tbody><tr><td>5 CPU</td><td>70 %</td><td>24h</td></tr><tr><td>10 CPU</td><td>53 %</td><td>18h22</td></tr><tr><td>15 CPU</td><td>40 %</td><td>18h18</td></tr><tr><td>20 CPU</td><td>35 %</td><td>14h09</td></tr></tbody></table>

Ce test démontre que l'ajout de CPU n'améliore pas substantiellement le temps de calcul, ainsi seulement 5 CPU sont utilisées pour la suite.

## Imputation

L'imputation est réalisée grâce à l'outil Beagle 4.1. L'option GTGL est utilisée comme la sous-partie précédente l'explique. Afin d'être le plus juste, une carte génétique du chromosome a été donnée, avec l'option map. Cette carte génétique contient pour chaque variant sa position physique et sa position génétique. Par défaut l'outil Beagle considère qu'un centimorgan (cM) est égal à un mégabase (Mb). Mais les recombinaisons ne sont pas linéaires sur le long du chromosome. Lors de l'imputation des génotypes manquants, une carte précise permet à Beagle de mieux estimer les génotypes probables en utilisant l'information des haplotypes de référence alignée de manière adéquate le long des chromosomiques. Les positions physiques dans le fichier de carte aident à gérer les longues distances chromosomiques, assurant que les analyses prennent en compte la structure réelle du génome. Dans le but d'optimiser le temps de calcul, 128 giga de mémoire ont été alloués. L'option gprobs est utilisée, dans le but que les probabilités de génotypes (GP) soient données dans le fichier de sortie imputé. Ces valeurs seront utilisées dans le traitement post-imputation. La figure 10 est la ligne de code appliqué à chaque chromosome pour réaliser l'imputation.
module load bioinfo/Beagle/4.1

input="/home/ablanc/work/vargoats/chr_snp selected/chr_snp selected_gq30/vargoats snps filtres_1357 chr 26 gq30.vcf.gz"
carte="/home/ablanc/work/vargoats/every_snp/Beagle_map chr26.map"

java -Xss5m -Xmx128g -jar $BEAGLE gtgl=$input out=chr26_5CPU gprobs=true chrom=26 map=$carte nthreads=5 modelscale=1.5 impute=true ne=1000
bcftools index -t chr26_5CPU.vcf.gz

<caption>Figure 10 - Script en Bash pour l'imputation du chromosome 26.</caption>

Afin de réduire le temps de traitement et optimiser la parallélisation pour des chromosomes de grandes tailles, supérieurs à 500 000 SNPs, nous avons opté pour une parallélisation manuelle en découpant les chromosomes avant l'imputation. Au préalable, nous avons montré que les extrémités des fenêtres utilisées par Beagle ne subissent pas de dégradation de qualité par rapport aux SNPs centraux. L'algorithme de Beagle fonctionne en sélectionnant des fenêtres de 50 000 SNPs, incluant un chevauchement (overlap) de 5 000 SNPs de la fenêtre précédente, ce qui pourrait potentiellement affecter la précision de l'imputation. Cependant, comme le montre la figure ci-dessous, la différence de qualité entre les extrémités et le centre est négligeable dans notre cas.

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 11 - Boxplot de la discordance entre les dix tranches de 5 000 SNPs pour chaque fenêtre de 50 000 SNPs.</figcaption></figure>

Dans un premier temps, les 29 fichiers VCF originaux sont divisés en un total de 71 fichiers à l'aide de splitvcf.jar. Un chevauchement (overlap) de 5000 SNPs est laissé entre les segments. Chaque nouveau fichier VCF est ensuite imputé séparément, avec les mêmes arguments que
sur la figure 10. Puis après imputation, les segments sont réunis à l'aide de mergevcf.jar pour
recréer un fichier entier pour chaque chromosome.

d) Traitement post-imputation

Nettoyage des données imputées

Cette étape se base sur les probabilités de génotypes (GP) calculées lors de l'imputation
et données dans le fichier VCF de sortie. La probabilité de génotypes est une probabilité
calculée par Beagle qui donne la probabilité que le génotype imputé soit vrai selon lui. Afin de
savoir comment se fier à ces probabilités, il faut les comparer aux concordances. L'objectif est
de calibrer notre confiance envers les probabilités de génotypes. Pour cela les probabilités de
génotypes sont extraites du VCF imputé. Pour chaque individu et chaque SNP, la probabilité
de génotypes maximale est récupérée, puis la moyenne de ces probabilités de génotypes
maximales est calculée pour chaque SNP, donnant ainsi la probabilité de génotypes maximale
moyenne. Les concordances sont calculées pour chaque SNP en comparant les génotypes de la
puce ADAPTmap. On réalise une régression linéaire des concordances en fonction des GP
moyens. L'optimum de fiabilité est d'obtenir une droite d'équation y = x. Les concordances
sont considérées comme la référence ultime. La droite des concordances en fonction des GP
moyens est d'équation y = 0,58x + 0,41. Ainsi les GP issus de l'imputation surestiment
légèrement leur confiance, mais restent fiables pour les valeurs proches de 1 et sont donc
exploitables pour la suite. En annexe, vous retrouverez la figure 16 avec les deux courbes
représentées. Sur l'ensemble des 1 036 970 548 probabilités de génotypes maximales, 99,79 %
sont égaux à 1. La stratégie de nettoyage choisie consiste à conserver uniquement les GP égaux
à 1 et à considérer comme manquants les génotypes dont les GP sont inférieurs à 1, considérés
comme trop peu fiables mêmes après imputation. Puis le pourcentage de génotypes manquants
est examiné pour chaque SNP et chaque individu.

Ensuite, les SNPs et individus présentant un pourcentage trop élevé de génotypes
manquants sont éliminés afin d'obtenir un jeu de données le plus complet et fiable possible.
Notre objectif est de minimiser l'élimination des individus autant que possible. Pour cela, le
seuil d'acceptabilité est placé à 5 % de génotypes manquants par individu. Avec ce seuil, six
individus ont été écartés de l'étude. Ces individus représentent seulement 0,44 % de l'ensemble
et avaient un taux de génotypes manquants compris entre 5 % et 7 %. Nous passons de 1 357
Rapport de stage 2ᵉ année ENSAT – 2024
individus initialement à 1 351. Sur ces six individus, quatre proviennent du Pakistan qui avaient déjà repérés sur une ébauche d'une ACP de dosage pour avoir taux de manquants très élevé déjà avant l'imputation.

Pour déterminer le seuil de taux de manquants par SNP à appliquer, des tests sont réalisés. Le taux de perte et la discordance sont calculés pour les seuils variant de 1 % à 6 %. Le taux de perte est calculé d'après la formule ci-dessous :

$$ \text{Taux de perte (\%)} = \frac{m_1*n+N}{m*n} * 100, $$

avec $m_1$ le nombre de SNPs éliminés, $n$ le nombre d'individus, $m$ le nombre de SNPs au départ, et $N$ le nombre de génotypes manquants dans la nouvelle matrice après élimination des SNPs.

Le Call Rate (ou taux d'appel) est mis au seuil 95 %. Ainsi tous les SNPs ayant un taux de génotypes manquants supérieur à 5 % sont éliminés. En effet pour un Call Rate de 95 %, le jeu de données a peu de perte de génotypes mais tout en diminuant le taux de discordance.

À la fin de ce filtrage, la fréquence maximale de manquants par SNPs passe de 38 % à 5 %, et la fréquence maximale de manquants par individus 7 % à 5 %. Tout cela en éliminant seulement 0,5 % des SNPs et seulement 0,44 % des individus. Le choix de filtrer sur les probabilités est mené par le fait que nous préférons obtenir un jeu de données plus réduit mais avec des génotypes le plus fiable et le plus complet possible afin que les analyses en aval (inférence démographique par *deep learning*, en particulier) soient le plus juste.

## Qualifier la qualité du nouveau jeu de données

Pour évaluer la qualité des données après imputation et traitement, plusieurs mesures et graphiques sont générés, mais uniquement pour les chromosomes 14 et 26. Ce choix se justifie par le fait que cette paire, selon nos calculs, est la plus représentative de l'ensemble des chromosomes. Pour chaque critère, les données avant imputation sont comparées à celles après imputation. La première analyse porte sur la concordance en fonction de la fréquence allélique pour les trois génotypes : homozygote de référence, hétérozygote et homozygote alternatif. Il est pertinent d'examiner la qualité des différents génotypes, car les génotypes hétérozygotes
sont souvent plus complexes à identifier. Cette difficulté provient du fait qu'il peut être difficile
de distinguer une variation réelle d'un artefact de séquençage. En outre, des erreurs peuvent
survenir lorsque l'un des allèles n'est pas correctement recopié lors du séquençage, ce qui est
fréquent dans les données à faible couverture (Meisner, Albrechtsen, 2018). Ensuite, le R² en
fonction de la fréquence allélique est évalué.

Pour mieux comprendre la qualité de l'imputation le long des chromosomes, le taux de
discordance est mesuré en fonction de la position relative des variants sur le chromosome. Cette
position relative est le ratio entre la position physique d'un variant et la longueur physique du
chromosome ; elle permet de détecter des tendances (régions bien ou mal imputées) identiques
sur des chromosomes de taille différente. En parallèle, la moyenne du taux de discordance sur
l'ensemble des chromosomes est calculée pour comparaison. Ces analyses sont réalisées à
l'aide de fenêtres glissantes de 0,2 % avec un chevauchement de 0,1 %, soit 100 fenêtres
couvrant chaque 0,01 % du chromosome. Cette approche peut être complétée par le calcul des
taux de discordance pour chaque position le long de chaque chromosome, afin d'obtenir une
vision plus précise.

## 2) Résultats, interprétation et discussion

### a) Résultats

L'imputation a été évaluée afin de suivre son évolution, vérifier sa fiabilité et observer
les améliorations. Les résultats obtenus à partir de cette imputation sont montrés dans la figure
12 et la figure 15 en annexe. La concordance des génotypes pour les chromosomes était
particulièrement élevée pour les homozygotes avant imputation, avec un taux de concordance
avoisinant les 100 %. En revanche, comme attendu, les hétérozygotes présentaient un taux de
concordance proche de 90 %. Après imputation, le taux de concordance des homozygotes reste
pratiquement inchangé, tandis que celui des hétérozygotes s'élève à près de 100 %. De même,
le R² augmente de presque 5 points après l'imputation. On observe ainsi une amélioration
générale de la qualité des données, tant en termes de R² que de taux de concordance malgré une
absence d'amélioration notable pour certaines classes alléliques situées aux extrémités.
<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 12 - Graphiques de la concordance et du R² en fonction de la fréquence allélique (par classe allélique) et du génotype avant et après imputation sur le chromosome 14.</figcaption></figure>

En effet, cette conclusion peut être renforcée par l'évolution du taux de discordance présentée dans le tableau 2, qui montre une nette diminution. Cette réduction indique une baisse des erreurs et, par conséquent, une amélioration significative de la qualité et de la fiabilité des génotypes.

<table><caption>Tableau 2 - Taux de discordance (%) avant imputation, après imputation et après nettoyage sur les probabilités de génotypes.</caption><thead><tr><th></th><th>Initialement</th><th>Post-<br>imputation</th><th>Post-<br>nettoyage</th></tr></thead><tbody><tr><td>Chromosome<br>14</td><td>2.80 %</td><td>0.32 %</td><td>0.24 %</td></tr><tr><td>Chromosome<br>26</td><td>2.76 %</td><td>0.28 %</td><td>0.19 %</td></tr></tbody></table>

Après avoir observé la nette amélioration des données, la répartition du taux de discordance a été regardée sur le long des chromosomes grâce au pourcentage de position. Cette observation est montrée dans la figure 13. Cette vérification nous permet de voir les effets de bords sur le Rapport de stage 2e année ENSAT – 2024
taux de discordance. En effet, les extrémités des chromosomes sont généralement moins bien imputées. À mesure que l'on se rapproche des bords, le nombre de SNPs flanquants diminue, ce qui complique l'identification précise des haplotypes. Ce manque de SNPs dans les régions périphériques réduit la qualité de l'imputation, car les algorithmes d'imputation s'appuient sur la densité des marqueurs génétiques pour prédire les génotypes manquants. Ainsi, plus on s'éloigne du centre du chromosome, moins l'imputation est fiable, entraînant une perte de précision, car il y a moins d'informations à utiliser pour établir des corrélations avec les haplotypes de référence. Ces effets sont visibles sur la figure 13, qui souligne bien un taux de discordance plus élevé dans les 20 premiers pourcentages de positions. Puis une diminution nette.

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>Figure 13 - Graphique de la moyenne du taux de discordance pour les différentes positions exprimées en pourcentage de chromosomes. Moyenne pour les 29 chromosomes autosomaux après l'imputation. La droite rouge correspond au taux de discordance moyen des chromosomes autosomaux.</figcaption></figure>

## b) Interprétation et discussion

Les résultats intermédiaires concernant l'optimisation de la précision avec les deux modes de Beagle ne sont pas surprenants. Nous avons conclu que l'imputation sur l'ensemble des individus offrait une meilleure précision que celle réalisée par groupe. Ce résultat était attendu et s'explique par le fait que les croisements potentiellement très anciens entre différentes
populations ont permis à certains individus de conserver des haplotypes provenant d'autres groupes. Aussi, des origines partagées entre populations, quoique très lointaines, permettent de retrouver des haplotypes identiques dans ces populations aujourd'hui divergentes. Lors de l'imputation, ces haplotypes, rares au sein d'un groupe isolé, ne trouvent pas suffisamment de correspondances pour une comparaison efficace. En revanche, sur l'ensemble de la population, tous les haplotypes sont représentés, facilitant ainsi une imputation plus précise.

Les résultats finaux de l'imputation indiquent que l'imputation a significativement amélioré la précision des données de séquençage, bien que certaines classes alléliques demeurent relativement imprécises. Ces classes contiennent peu de SNPs, rendant difficile la comparaison des haplotypes et, par conséquent, une imputation moins efficace. Ces observations soulèvent plusieurs points de discussion. Dans ces classes, on trouve autant d'homozygotes que d'hétérozygotes, ce qui pourrait suggérer que la difficulté d'imputation ne réside pas dans la complexité de différencier un artefact d'une réelle mutation, mais plutôt dans d'autres facteurs. Pour les allèles rares, leur faible fréquence complique également leur imputation précise, car les algorithmes dépendent largement des variantes disponibles dans la population. En revanche, pour les allèles fréquents, la multitude d'haplotypes similaires peut brouiller les résultats et nuire à la précision de l'imputation. Il serait également pertinent d'examiner le taux de données manquantes pour ces SNPs, ce qui pourrait expliquer une efficacité d'imputation inférieure par rapport aux autres classes alléliques. Pour vérifier cela, il serait intéressant de recréer la figure 12 après un nettoyage post-imputation, les SNPs et individus éliminés selon leur taux de données manquantes.

Concernant le taux de discordance observé à chaque étape, on note une nette diminution, indiquant une amélioration de la précision des données. À la fin du traitement, le taux de discordance atteint 0,2 %, comparable au taux de précision observé dans les analyses de génotypage par puce. Cela suggère qu'il devient difficile d'améliorer davantage la fiabilité des données de séquençage, car des erreurs peuvent provenir aussi bien du séquençage que du génotypage par puce. Cette constatation invite à réévaluer les taux de discordance, de concordance et R², qui pourraient comporter une marge d'erreur due à celle de la puce ADAPTmap. Il est essentiel de reconnaître que les valeurs de ces paramètres, utilisées pour évaluer la précision, ont une certaine marge d'erreur. Selon les SNPs et les chromosomes, des valeurs très proches de zéro ne sont pas nécessairement représentatives. Il pourrait être
intéressant de chercher à nettoyer et à affiner les données de la puce ADAPTmap pour corriger
ces erreurs.

En ce qui concerne la cartographie du taux de discordance le long des chromosomes, nous
observons un effet de bord dans les 20 premiers pourcents, suivi d'une diminution. Cette
tendance est attendue, car l'imputation est généralement moins précise aux extrémités des
chromosomes. Cependant, le pic observé entre 60 % et 90 %, suivi d'une diminution en dessous
du taux de discordance moyen, est inattendu. Cela soulève plusieurs questions, notamment
l'impact des fenêtres d'imputation et l'effet du taux de recombinaison. D'autres facteurs
pourraient également jouer un rôle, nécessitant une exploration plus approfondie. De plus, avant
d'approfondir ces analyses, il convient de vérifier l'orientation des chromosomes, car cet aspect
inattendu pourrait résulter de chromosomes orientés différemment. Cette caractéristique doit
être confirmée.

Le domaine de validité de cette méthode et de ces outils est relativement limité. Cette méthode
peut être appliquée de manière identique à toutes les données de séquençage ajoutées aux
données de VarGoats, car le cadre est le même. Les conclusions tirées concernant les différents
modes d'imputation ne s'appliquent qu'à l'imputation réalisée avec la version 4.1 de Beagle,
bien qu'elles puissent également être pertinentes pour d'autres travaux d'imputation. La
méthode d'imputation peut être utilisée pour d'autres bases de données de séquençage d'espèces
variées, même si les valeurs et les marges d'erreur varient selon les espèces et les types de puces
employés. Par exemple, pour une puce de séquençage humain, le taux d'erreur est d'environ
0,001 pour 100 (Jordan, B., 2012), tandis que pour les caprins, l'erreur de génotypage par puce
atteint 0,2 pour 100.

Dans cette section, il est essentiel de prendre du recul sur les méthodes utilisées pour évaluer la
qualité et la fiabilité des résultats obtenus. Les algorithmes d'imputation appliqués, bien
qu'efficaces, présentent des limites intrinsèques qui peuvent influencer la précision des données
finales. Par exemple, le choix de la version du logiciel, comme Beagle 4.1, peut avoir un impact
significatif sur les résultats, car chaque version apporte des améliorations algorithmiques et des
ajustements basés sur des données de référence. De plus, la nature des données de séquençage,
notamment la qualité et la quantité de SNPs présents dans les différentes classes alléliques, joue
un rôle crucial. Dans certaines classes, la rareté des SNPs peut entraîner des difficultés
d'imputation. Ainsi, bien que les taux de discordance observés indiquent une amélioration de
la précision, il est important de reconnaître que des erreurs peuvent persister, en partie dues à la variabilité des techniques de puçage. Par conséquent, une évaluation critique de la méthode employée et une prise en compte des marges d'erreur associées sont nécessaires pour interpréter correctement les données et s'assurer de leur fiabilité dans le contexte de l'étude.

## Conclusion

Pour conclure, l'étude préalable de la structure d'accueil ainsi que du projet VarGoats, dans lequel s'inscrit mon sujet de stage, m'a permis de prendre du recul et de mieux comprendre les attentes et ma position au sein du système. J'ai choisi d'analyser un système complexe lié au projet VarGoats. Toutefois, la réalisation concrète d'une agrochaîne n'était pas envisageable dans le contexte de recherche. Durant cette analyse, plusieurs éléments importants ont émergé, notamment la nécessité de rechercher des financements pour soutenir les diverses études et l'importance des collaborations nationales et internationales entre les différents organismes impliqués. Le partage des connaissances constitue une dimension clé de ce système.

Concernant le travail effectué, une imputation complète sur l'ensemble de la base de données VarGoats a été réalisée avec succès, conduisant à une nette amélioration de la fiabilité des données. Ainsi, à l'issue de ce stage, les données de séquençage de VarGoats sont prêtes à être diffusées au consortium scientifique et aux équipes de recherche pour des études futures. Sur le plan scientifique, mes tests ont montré que l'imputation avec le mode GTGL est plus optimale en termes de temps et de précision comparée au mode GL avec Beagle 4.1. Le résultat final offre une base de données aussi fiable qu'un génotypage par puce. Mais mon travail, bien que limité au traitement des données, a permis de mettre à disposition un jeu de données qualifié pour les recherches en aval telles que la problématique initiale : « Comment établir la relation, chez la chèvre (Capra hircus), entre la structuration en races ou sous-populations et le génome, dans le but de conserver une diversité génétique ? » et d'autres études. Un stage de M2 et un doctorat sont proposés pour tenter de répondre à cette question.

Ce stage m'a offert une première expérience concrète dans le domaine de la bio-informatique. Il a renforcé mon souhait de me spécialiser dans ce domaine, confirmant ainsi mon choix de spécialité pour ma dernière année à l'ENSAT. J'ai acquis de nombreuses compétences en génomique et en bio-informatique. Partant de zéro, je suis maintenant capable d'utiliser un Rapport de stage 2e année ENSAT – 2024
cluster de calcul et de programmer en AWK et Bash. Mes compétences en organisation, communication et collaboration ont également été sollicitées et développées. Je ressors de cette expérience avec des connaissances et des compétences professionnelles significativement enrichies, ainsi que le souvenir d'une expérience très positive dans un environnement bienveillant et propice au partage des savoirs. Je retire énormément de positif de ce stage.
Bibliographie

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## Sites

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# Annexes

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 14 - Inertie expliquée en fonction du nombre de groupes par la méthode du kmean.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 15 - Graphiques de la concordance et du R² en fonction de la fréquence allélique (par classe allélique) et du génotype avant et après imputation sur le chromosome 26.</figcaption></figure>
<table><caption>Tableau 3 – Données brutes en temps et en précision pour les différents tests.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">GTGL sur le groupe 1</th><th colspan="3">GTGL sur les 1357 (précision grp 1)</th></tr><tr><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux<br>discordance (%)</th><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux discordance<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>GQ &lt; 6</td><td>19 min</td><td>97</td><td>1,37</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GQ &lt; 18</td><td>18 min</td><td>99,38</td><td>0,29</td><td>2h23</td><td>99,46</td><td>0,25</td></tr><tr><td>GQ &lt; 30</td><td>19 min</td><td>99,49</td><td>0,25</td><td>3h12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GQ &lt; 42</td><td>22 min</td><td>99,54</td><td>0,22</td><td>4h59</td><td>99,65</td><td>0,17</td></tr><tr><td>GQ &lt; 54</td><td>24 min</td><td>99,6</td><td>0,19</td><td>6h56</td><td>99,69</td><td>0,14</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th colspan="3">GL sur groupe 1</th></tr><tr><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux<br>discordance<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>38 min</td><td>99,48</td><td>0,23</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">GTGL sur le groupe 2</th><th colspan="3">GTGL sur les 1357 (précision grp 2)</th></tr><tr><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux<br>discordance (%)</th><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux discordance<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>GQ &lt; 6</td><td>8 min</td><td>98,31</td><td>0,82</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GQ &lt; 18</td><td>8 min</td><td>99,42</td><td>0,25</td><td>2h23</td><td>99,68</td><td>0,15</td></tr><tr><td>GQ &lt; 30</td><td>7 min</td><td>99,57</td><td>0,18</td><td>3h12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GQ &lt; 42</td><td>8 min</td><td>99,64</td><td>0,16</td><td>4h59</td><td>99,77</td><td>0,1</td></tr><tr><td>GQ &lt; 54</td><td>8 min</td><td>99,7</td><td>0,13</td><td>6h56</td><td>99,76</td><td>0,1</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th colspan="3">GL sur groupe 2</th></tr><tr><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux<br>discordance (%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>16 min</td><td>99,66</td><td>0,15</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="3">GTGL sur le groupe 4</th><th colspan="3">GTGL sur les 1357 (précision grp 4)</th></tr><tr><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux<br>discordance (%)</th><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux discordance<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>GQ &lt; 6</td><td>36 min</td><td>97,8</td><td>1,1</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>GQ &lt; 18</td><td>36 min</td><td>99,26</td><td>0,35</td><td>2h23</td><td>99,38</td><td>0,3</td></tr><tr><td>GQ &lt; 30</td><td>48 min</td><td>99,63</td><td>0,19</td><td>3h12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GQ &lt; 42</td><td>1h02</td><td>99,68</td><td>0,16</td><td>4h59</td><td>99,63</td><td>0,17</td></tr><tr><td>GQ &lt; 54</td><td>1h08</td><td>99,59</td><td>0,2</td><td>6h56</td><td>99,69</td><td>0,16</td></tr></table>

<table><thead><tr><th colspan="3">GL sur groupe 4</th></tr><tr><th>Temps</th><th>R<sup>2</sup></th><th>Taux<br>discordance<br>(%)</th></tr></thead><tbody><tr><td>2h15</td><td>99,58</td><td>0,2</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 16 - Représentation des concordances en fonction GP maximales moyens. La droite rouge est considérée comme l'idéal. La droite bleue correspond à la réalité.</figcaption></figure>