# Optimisation et automatisation d'outils de bio-imagerie 3D pour caractériser la morphologie nucléaire et l'organisation de la chromatine

Tristan Dubos

► To cite this version:

Tristan Dubos. Optimisation et automatisation d'outils de bio-imagerie 3D pour caractériser la morphologie nucléaire et l'organisation de la chromatine. Bio-informatique [q-bio.QM]. Université Clermont Auvergne, 2021. Français. NNT: 2021UCFAC083. tel-03663595

HAL Id: tel-03663595

https://theses.hal.science/tel-03663595

Submitted on 10 May 2022

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
# Thèse présentée pour obtenir le grade de docteur délivré par l'Université Clermont Auvergne

École doctorale : Sciences Pour l'Ingénieur

Spécialité Bio-informatique

## Optimisation et automatisation d'outils de bio-imagerie 3D pour caractériser la morphologie nucléaire et l'organisation de la chromatine

présentée et soutenue publiquement par

Dubos Tristan

le 17 septembre 2021

Directeurs de thèse : **Sophie Desset**, **Emilie Péry**, **Frédéric Chausse**

### Jury

<table><tr><td><b>Célia Baroux,</b></td><td>Maître de Conférences, Université Zurich</td><td>Rapportrice</td></tr><tr><td><b>Nicolas Passat,</b></td><td>Professeur, Université Reims Champagne-Ardenne</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td><b>David Legland,</b></td><td>Ingénieur de recherche, INRAE Nantes</td><td>Examenateur</td></tr><tr><td><b>Sophie Desset,</b></td><td>Ingénieure de recherche, GReD</td><td>Co-directrice</td></tr><tr><td><b>Emilie Péry,</b></td><td>Maître de Conférences, Institut Pascal</td><td>Co-directrice</td></tr><tr><td><b>Frédéric Chausse,</b></td><td>Professeur, Institut Pascal</td><td>Co-directeur</td></tr></table>
<figure><img src="image_2.png" /></figure>
Remerciements

Je voudrais commencer par remercier mes co-directeurs de thèse. Un grand merci à Sophie Desset, Emilie Péry, Christophe totout et Frédéric Chausse. Sophie, tu es à l'initiative de ce projet de thèse; merci pour ton accueil, ton optimisme et pour le temps consacré à mon encadrement au cours de nos longues discussions.

Merci de m'avoir fait découvrir le monde de la microscopie et de m'avoir accordé ta confiance. Merci aussi à toi et à Stéphane d'avoir partagé vos coins à champignons. Emilie et Frédéric vous avez accepté de rejoindre mes encadrants en cours de thèse; merci pour les échanges sans limites et le partage des idées qui m'ont été très profitables lorsque je rencontrais des points de blocage. Christophe, merci pour avoir pensé à moi lors de l'initiation de ce projet de thèse. Merci pour ton dynamisme et ta passion pour la recherche.

Je voudrais aussi adresser un merci particulier à toute l'équipe pour la bonne ambiance sans laquelle je
n'aurais pas pu surmonter mes coups de mou! Merci à Aline pour ses nombreuses attentions sucrées. Merci
à Manu pour m'avoir « toléré » durant 3 ans. Merci Aurélia et Sam, merci encore de fredonner tes chansons
« phare » (Salade de fruit!!!!). Merci à Sylvie et Sylviane (les inséparables) qui m'ont permis d'accéder au
bâtiment de Math! Merci à Simon pour sa bienveillance et surtout son sérieux! Et enfin merci à mon p'tit
Corto pour ces supers moments salés dans le bureau, les lacs en été et tous les moments passés ensemble! Je
remercie toutes les personnes du laboratoire que j'ai croisées durant ces 3 ans. Merci à tous les membres des
Graduates pour les soirées thésards. Merci à Mélu pour les moments de détente en musique (ta reconversion
musicale est sur la bonne voie!!! :)). Un grand merci à Coto Margaux pour les pauses sur la terrasse et les
bières de réconfort! Merci à Marie-Jo C. Martinez pour toute son énergie et ses cours en portugais :)

Merci à toutes les personnes avec qui j'ai collaboré en particulier Cédric et Pierre pour nos passionnantes
discussions en informatique. Merci encore à Gisèle et François pour m'avoir formé et fait découvrir la bio-
informatique.

Merci à tous ceux qui m'ont permis de décompresser quand cela était nécessaire : aux acharnés de la
pétanque, Gab, JP, Tiff et Gaël! Merci à Coco pour toutes nos sorties escalades présentes passées et futures;) !

Merci à Plume et Lila, mes petites boules de poils! Merci pour tout Axel (tu n'entres dans aucune case,
je te mets avec les animaux!)

Enfin je remercie mes parents pour m'avoir soutenu tout au long de ce projet. Merci à petit nuage pour
toutes les attentions de ces derniers temps. Merci aux frangins de Jacou Dav, Cel et Bixou.
<figure><img src="image_3.png" /></figure>
Le noyau est un organite essentiel des cellules eucaryotes qui présente une morphologie dynamique et dont le contenu est organisé en domaines. Nous avons développé le plugin ImageJ appelé NucleusJ pour le calcul de paramètres caractérisant la forme et la taille des noyaux ainsi que les objets intra-nucléaires tels que les domaines de chromatine et leur position par rapport à la périphérie nucléaire [Poulet et al., 2015]. Une nouvelle version complètement automatisée appelée NucleusJ2.0 a été publiée [Dubos et al., 2020] comportant de nouvelles fonctionnalités et des alternatives aux étapes manuelles. Une étape dite d'autocrop a été implémentée pour capturer automatiquement un grand nombre de noyaux à différentes profondeurs dans une pile d'images grand champ. Nous avons complété la méthode de segmentation du noyau, un seuillage Otsu modifié, en adaptant des algorithmes de définition de l'enveloppe convexe en 3D tels que le gift wrapping (marche de Jarvis) et la méthode du parcours de Graham avant de les intégrer dans NucleusJ2.0. Afin de s'affranchir d'une étape semi-automatique inhérente à l'étape de ligne de partage des eaux utilisée pour décrire le contenu en chromatine, NODeJ a été développé pour segmenter automatiquement les domaines nucléaires de forte intensité en appliquant la méthode du gradient. De plus, pour améliorer l'efficacité de notre flux d'analyse d'images, une nouvelle bibliothèque appelée Simple OMERO Client a été conçue afin d'utiliser NucleusJ2.0 directement sur des images stockées au sein de la plateforme OMERO tout en bénéficiant de la puissance de calcul d'un serveur distant. Tous ces développements ont été utilisés collectivement dans un projet de preuve de concept où la structure tridimensionnelle du spermatozoïde est évaluée comme indicateur de sa qualité. Enfin, dans une phase plus exploratoire, un modèle U-Net a été entraîné à l'aide d'images segmentées par NucleusJ2.0 afin d'explorer les nouvelles méthodes innovantes de deep learning. Les développements présentés dans ce manuscrit ont été conçus pour optimiser le stockage et l'analyse d'images 3D de noyaux et pour évoluer vers des analyses à plus haut débit avec le souhait d'assurer un haut niveau de répétabilité, de reproductibilité et d'accessibilité. De tels développements ouvriront la voie à une meilleure description du noyau en 3D et, nous l'espérons, bénéficieront au plus grand nombre de chercheurs dans le domaine de l'imagerie 3D dédiée à la microscopie afin de faire progresser nos connaissances sur le rôle du noyau dans la régulation de l'expression des gènes.

## Abstract

The nucleus is a compartmentalized organelle of the eukaryotic cells with a dynamic morphology and containing distinct chromosomal domains and nuclear bodies. To link nuclear structure and function, we have developed a simple and user-friendly ImageJ plugin called NucleusJ to quantify in 3D the nuclear morphology as well as positioning and organization of nuclear domains. From confocal images, the workflow applies for a batch of images a modified Otsu thresholding method to segment the nuclear space and a 3D watershed algorithm to delimit chromatin domains by partitioning the nucleus. Quantitative parameters are computed including shape and size of nuclei as well as intra-nuclear objects such as chromatin domains and their position in respect to the nuclear periphery [Poulet et al., 2015]. New improvements have been added to NucleusJ and a new version has been released [Dubos et al., 2020]. First, the current version involves manual intervention to delimit a bounding volume including each considered nucleus. To overcome this limitation and automatically capture large numbers of nuclei at various depths in the original image, the so-called autocrop procedure has been implemented to automatically detect the nuclei from wide field images. Spatial positions of the cropped nuclei are then recorded in order to estimate distance maps as a new estimator of spatial distribution of the nuclei in a whole tissue context. Second, as the main step in our workflow is to delimit the nucleus or intra-nuclear objects from the background alternatives to the 3D watershed which cannot be fully automated have been explored. To this aim, we adapted convex hull algorithms in 3D such as the gift wrapping (Jarvis march) and the Graham scan methods based on discrete geometry and integrated into the NucleusJ workflow. Moreover, to get rid of the semi-automated step inherent to the 3D watershed step, NODeJ was developed to automatically segment high-intensity nuclear domains such as chromocenters by applying the gradient method on the mask of a nucleus to enhance the contrast of intra-nuclear objects and allow their segmentation. Finally, to improve the efficiency of our image analysis workflow and move to high-throughput image analysis, a new library called OMERO Service Client was designed in order to directly load NucleusJ on images stored in a well-organized manner within the OMERO platform while benefiting from the computing power of a remote server. These developments were collectively used in a proof-of-concept project to evaluate the relevance of nuclear morphology and chromatin organization traits computed by NucleusJ to predict the viability from human spermatozoa from large field images stored in OMERO. Finally, in a more exploratory phase, a U-Net model was trained using ground truth datasets gained from NucleusJ segmentation in order to explore new innovative methods to be implemented in the future. The developments presented in this manuscript have been designed to optimize the 3D image storage and analysis of nuclei and to move towards higher throughput analyses. Our workflow was designed with the aim to ensure a high standard of repeatability, reproducibility and accessibility. Such developments will open the way to a better description of the 3D nucleus that we hope will benefit the largest number of researcher in the field and advance our knowledge on the role of the nucleus in the regulation of gene expression.
<figure><img src="image_4.png" /></figure>
# Liste des abréviations

2D 2 dimensions

3D 3 dimensions

A. thaliana Arabidopsis thaliana

ADN Acide désoxyribonucléique

API Interface de Programmation d'Applications

ARN Acide ribonucléique

ARNr Acide ribonucléique ribosomique

AuBi Auvergne BioInformatique

Cc Chromocentres

CLI Command Line Interface

CNN Convolutional Neural Network

CRWN Crowded Nuclei

DAPI 4',6-diamidino-2-phénylindole

DIC Differential Interference Contrast

ER Réticulum endoplasmique

FiSH Fluorescence in Situ Hybridization

FITC Isothiocyanate de fluorescéine

GC Cellule de garde

GFP Green Fluorescent Protein

INDEPTH Impact of nuclear domains on gene expression and plant traits

INM Inner Nuclear Menbrane

KASH Klarsicht/ANC-1/Syne Homology

LAD Lamina-Associated Domains

LINC Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton

NEAP Nuclear Envelope Anchored Protein

NJ1 NucleusJ

NJ2 NucleusJ2.0

NODeJ Nuclear Object Detection
NPC Nuclear Pore Complex

ONM Outer Nuclear Membrane

PC Cellule de pavement

PI Propidium

PLAD Plant Lamina-Associated Domains

RNA-seq RNA sequencing

ROI Region Of Interest

SOC Service OMERO Client

SUN Sad1/UNc84
# Table des matières

## 1 Contexte 2

1.1 Étude de l'architecture du noyau et son contenu en ADN 3

1.1.1 Le noyau est un compartiment organisé 4

1.1.1.1 Le noyau est un organite central de la cellule eucaryote 4

1.1.1.2 L'ADN nucléaire est organisé en chromatine 8

1.1.1.3 Le noyau à l'interphase est organisé en sous domaines fonctionnels 9

1.1.2 Étude de l'organisation nucléaire chez *Arabidopsis thaliana* 10

1.2 Principe de microscopie en trois dimensions 12

1.2.1 De l'acquisition à l'image numérique 15

1.2.2 Les grandes caractéristiques descriptives d'une image 16

1.2.3 La qualité des acquisitions : un compromis 17

1.3 Méthodes de segmentation en 3 dimensions 19

1.3.1 Méthodes de segmentation 19

1.3.2 Segmentation manuelle 19

1.3.3 Approche de segmentation automatisée par méthode mathématique 20

1.3.4 Segmentation et apprentissage automatique 22

1.3.5 Réseau de neurones artificiels 24

1.4 Les solutions logicielles dédiées à la caractérisation morphologique des noyaux 27

## 2 Solutions dédiées à l'étude de la morphologie nucléaire : Nucleus2.0 33

2.1 Automatisation de la segmentation du masque du noyau 34

2.2 Automatisation de l'étape d'isolement des noyaux issus d'une image grands champs : l'autocrop 36

2.3 Validation biologique 39
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>2.4</td>
      <td>Organisation, stockage et partage de jeux de données</td>
      <td>39</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.5</td>
      <td>Développements informatiques associés à l'utilisation de NucleusJ2.0</td>
      <td>40</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.6</td>
      <td>Article: "Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0"</td>
      <td>41</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7</td>
      <td>Résultats annexes et devenir de l'outil</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.1</td>
      <td>Outil en ligne de commande et intégration continue</td>
      <td>58</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.2</td>
      <td>Connexion à la base de données OMERO</td>
      <td>59</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.7.3</td>
      <td>Optimisation des méthodes de calcul</td>
      <td>61</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>2.8</td>
      <td>Bilan</td>
      <td>64</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>3</b></td>
      <td><b>Segmentation des compartiments intra-nucléaires : NODeJ</b></td>
      <td><b>66</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.1</td>
      <td>Exploration des méthodes disponibles</td>
      <td>67</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.2</td>
      <td>Article: NODeJ : an imageJ plugin for 2D and 3D segmentation of nuclear objects</td>
      <td>68</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>3.3</td>
      <td>Bilan</td>
      <td>72</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>4</b></td>
      <td><b>Application de NucleusJ2.0 dans un environnement intégré dans OMERO sur un modèle de spermatozoïdes humains</b></td>
      <td><b>73</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.1</td>
      <td>Le modèle du spermatozoïde humain</td>
      <td>74</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.2</td>
      <td>Production des images</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.3</td>
      <td>Séquence d'analyse par NucleusJ2.0 via la bibliothèque de communication Simple Omero Client</td>
      <td>76</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.4</td>
      <td>Critères de tri des noyaux</td>
      <td>78</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.5</td>
      <td>Résultats biologiques</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.5.1</td>
      <td>Structures chromatiniennes détectées par NODeJ</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.5.2</td>
      <td>Définition des populations de spermatozoïdes morts ou vivants</td>
      <td>79</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.5.3</td>
      <td>Comparaison de la structure tridimensionnelle des noyaux de sperme frais ou congelé</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.5.4</td>
      <td>Contenu en chromatine</td>
      <td>82</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.5.5</td>
      <td>Comportement des populations de spermatozoïdes « vivants », « morts », et totaux</td>
      <td>84</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>4.6</td>
      <td>Bilan</td>
      <td>84</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>5</b></td>
      <td><b>Entraînement d'un réseau de neurones de type U-NET</b></td>
      <td><b>85</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.1</td>
      <td>Choix du réseau de neurones</td>
      <td>86</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2</td>
      <td>Choix du jeu de données</td>
      <td>87</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>5.2.1</td>
      <td>Entrainement de U-Net avec 50 images 3D</td>
      <td>89</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.2</td>
      <td>Entraînement de U-Net avec 129 images 3D</td>
      <td>90</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.2.3</td>
      <td>Utilisation d'une segmentation manuelle</td>
      <td>93</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>5.3</td>
      <td>Bilan</td>
      <td>96</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>6</b></td>
      <td><b>Discussion et perspectives</b></td>
      <td><b>97</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.1</td>
      <td>NucleusJ2.0 et NODeJ : une automatisation pour la caractérisation de la morphologie nucléaire et de la chromatine</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.1.1</td>
      <td>Validations biologiques des outils</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.1.2</td>
      <td>Perspectives d'évolution des algorithmes</td>
      <td>100</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.1.2.1</td>
      <td>Optimisation de l'étape automatisation autocrop-segmentation</td>
      <td>100</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.1.2.2</td>
      <td>Détection d'autres objets intra-nucléaires</td>
      <td>100</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.1.2.3</td>
      <td>Amélioration de la précision dans la détection du noyau</td>
      <td>101</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.2</td>
      <td>Développements informatiques dédiés à l'analyse d'images</td>
      <td>102</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.3</td>
      <td>Vers une automatisation de la segmentation par les méthodes d'apprentissage profond</td>
      <td>103</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.3.1</td>
      <td>Choix de l'utilisation du modèle U-Net</td>
      <td>103</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.3.2</td>
      <td>Les impacts du jeu de données d'entraînement</td>
      <td>103</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>6.4</td>
      <td>Conclusion</td>
      <td>104</td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>Annexe</b></td>
      <td></td>
      <td><b>105</b></td>
    </tr>
    <tr>
      <td><b>Bibliographie</b></td>
      <td></td>
      <td><b>108</b></td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
<figure><img src="image_5.png" /></figure>
# Introduction générale

La microscopie en biologie est un domaine en constant progrès générant des jeux de données d'images dont la complexité et la taille sont de plus en plus importantes. Cet afflux de données s'accompagne de grands challenges pour le traitement et le stockage des images produites. Ainsi, après l'étape d'acquisition, il est nécessaire d'appliquer divers traitements aux images afin d'en extraire les informations biologiques et de les quantifier. A ce titre, la segmentation, qui consiste à détecter la ou les régions d'intérêt, constitue l'une des étapes essentielles dans l'analyse d'images. L'imagerie au service de la biologie doit être considérée comme un processus continu. En effet, il est nécessaire de concevoir l'expérience biologique comme un tout de la préparation de l'échantillon, à l'acquisition jusqu'à la mise en place des outils permettant l'analyse des images et leur stockage de façon ordonnée et pérenne. La motivation première de ma thèse s'inscrit donc dans ce continuum et vise à automatiser l'analyse d'image de noyaux en 3 dimensions (3D) en utilisant principalement la plante *Arabidopsis thaliana* comme modèle. Cet organisme à la croissance rapide, dont le génome de petite taille est organisé en 5 chromosomes est séquencé depuis près de 20 ans, dispose de nombreuses ressources disponibles pour la communauté scientifique comme par exemple de grandes collections de mutants ce qui en fait un excellent organisme modèle en génétique. Cette plante est utilisée dans notre équipe de recherche afin de mieux comprendre la régulation de l'expression des gènes. Ainsi, les développements informatiques que j'ai réalisés durant mes années de thèse permettent de caractériser le noyau de façon quantitative afin de comprendre comment l'organisation tridimensionnelle du noyau affecte l'expression des gènes. Au départ de ce travail, malgré de multiples efforts pour standardiser la production des échantillons biologiques [Desset et al., 2018] et la mise en place de méthodes semi-automatiques d'analyse des images avec la création du logiciel NucleusJ, un plugin d'ImageJ [Poulet et al., 2015], la caractérisation des images de noyaux 3D restait encore très ma-nuelle et nécessitait des temps d'analyse importants. L'analyse d'images n'avait donc pas atteint à ce stade le haut débit et les résultats produits restaient difficiles à reproduire car dépendants de l'utilisateur.
<figure><img src="image_6.png" /></figure>
# Chapitre 1

## Contexte

Le présent manuscrit s'inscrit dans une logique de mise en place d'une analyse d'images à haut débit avec le souhait de standardiser nos méthodes d'analyse. Cet objectif, qui peut apparaître très technologique, est doublé de plusieurs enjeux scientifiques. En effet, derrière ce travail de développement dédié à l'analyse d'images, notre objectif est de pouvoir effectuer des études en architecture nucléaire de la cellule eucaryote c'est-à-dire l'étude de l'organisation spatiale d'un chromosome voire d'un gène dans le noyau. La position d'un gène dans le noyau est un élément majeur déterminant son niveau d'expression notamment en agissant sur son niveau de transcription. A titre d'exemple, l'exposition d'une plante à la lumière induit le repositionnement nucléaire d'un ensemble de gènes et active leur expression qui est essentielle à l'activité photosynthétique et la survie de la plante [Feng et al., 2014]. De plus, chez l'humain, la présence d'un chromosome 21 supplémentaire dans une maladie génétique telle que le syndrome de Down, conduit à une perturbation transcriptionnelle à l'échelle du génome [Letourneau et al., 2014].

J'ai donc articulé cette première partie de mon manuscrit de façon à décrire nos connaissances sur l'organisation 3D du noyau, son rôle dans l'organisation du génome et la régulation de la transcription. J'ai ensuite décrit les outils de microscopie et d'analyse d'images 3D les plus couramment utilisés ainsi que leur spécificité en termes de production d'images. Enfin, j'ai proposé une classification des stratégies d'analyse d'image des méthodes classiques utilisées de longue date aux méthodes plus récentes basées sur l'intelligence artificielle afin de mieux positionner mon travail.
## 1.1 Étude de l'architecture du noyau et son contenu en ADN

Le noyau est un compartiment cellulaire abritant la majeure partie de l'information génétique d'une cellule eucaryote. Il est apparu il y a environ 1,5 milliard d'années sans que son origine exacte ne soit complètement résolue [Thomas, 2010]. Les recherches sur l'origine évolutive du noyau sont basées sur la comparaison entre eucaryotes et procaryotes dont le matériel génétique est libre dans la cellule et ces études ont été relancées lors de la découverte des Archées il y a une cinquantaine d'années [Martin, 2005]. En effet, comme les eucaryotes, les Archées possèdent un noyau. Toutefois, le fait que les Archées puissent représenter un intermédiaire entre procaryotes et eucaryotes n'est pas complètement clair [Eme et al., 2017]. La présence d'un noyau chez les eucaryotes et les Archées questionne quant aux origines membranaires mobilisées lors de la mise en place de l'enveloppe nucléaire et plusieurs hypothèses non-exclusives incluant une invagination de la membrane plasmique, la fusion de vésicules ou l'implication du réticulum endoplasmique restent discutées [Martin, 2005].

Le noyau est un organite central dans la cellule eucaryote qui contient plusieurs sous-régions ou domaines regroupés sous le terme de corps nucléaires [Mao et al., 2011]. Le noyau joue un rôle essentiel dans la protection et le maintien de l'intégrité des chromosomes, participe activement au bon déroulement de la division cellulaire et donc au développement et à la reproduction des organismes eucaryotes. Il est au cœur de processus biologiques essentiels et contient toute la machinerie nécessaire à la réplication de l'ADN, la transcription des gènes et leur régulation. Depuis longtemps, les biologistes ont également noté que le noyau peut adopter une forme et un volume variables (Figure 1.1) [Skinner and Johnson, 2017]. L'existence d'une relation entre sa forme et l'organisation du contenu nucléaire au cours du développement, dans différents tissus ou encore au cours de certaines maladies humaines a permis d'utiliser sa morphologie comme biomarqueur dans certaines pathologies comme le cancer [Zink et al., 2004]. Le noyau est donc pour l'ensemble de ces raisons un objet d'étude important aussi bien en biologie fondamentale qu'en santé humaine. Après une description générale des différentes structures qui se trouvent au sein du noyau, depuis les différents constituants de la périphérie jusqu'au contenu en chromatine, je présenterai ensuite la thématique de recherche de l'équipe « Dynamique de la chromatine et du noyau 3D » (CODED) afin de mieux positionner le travail réalisé au cours de mon projet de thèse.
1.1.1 Le noyau est un compartiment organisé

1.1.1.1 Le noyau est un organite central de la cellule eucaryote

Le noyau est délimité par l'enveloppe nucléaire qui est une structure multifonctionnelle. L'enveloppe nu-
cléaire compartimente la transcription et la réplication dans le noyau et la traduction dans le cytoplasme tout
en permettant de nombreux échanges nucléo-cytoplasmiques au travers des pores nucléaires et en assurant des
interactions à la fois à l'extérieur et à l'intérieur du noyau grâce à sa double membrane lipidique (Figure 1.2).

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>FIGURE 1.1: **Variabilité de la morphologie nucléaire** : exemples de types cellulaires chez l'homme, avec le noyau représenté en bleu et le cytoplasme en rose. En **a** des formes de noyaux arrondis. En **b** les stades de la lignée des granulocytes et **c** des monocytes, décrivant des noyaux lobés. En **d** d'autres exemples de formes allongées dans les fibroblastes ou encore le noyau très condensé du spermatozoïde. Source [Skinner and Johnson, 2017].</figcaption></figure>
<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>FIGURE 1.2: **Structure schématique de la périphérie nucléaire chez Arabidopsis thaliana** : L'enveloppe nucléaire est une double membrane constituée d'une membrane externe (ONM) contenant des protéines comme WIP1 et SINE1 deux protéines à domaine KASH qui interagissent avec le cytosquelette et la membrane interne (INM) contenant la protéine SUN1 une protéine à domaine SUN ainsi que NEAP1 une protéine qui pourrait interagir avec des composants à l'intérieur du noyau. Les protéines à domaine SUN et KASH constituent le complexe LINC. La membrane nucléaire permet les échanges entre le noyau et le cytoplasme grâce aux pores nucléaires (NPC) constitués de nombreuses nucléoporines comme Nup93. Le nucléosquelette est situé immédiatement sous l'INM et est en contact avec la chromatine. Source [Graumann and Evans, 2020].</figcaption></figure>

1 - **La membrane externe** (ONM sur la Figure 1.2) est en continuité avec le réticulum endoplasmique (ER sur la Figure 1.2) et interagit avec d'autres composants de la cellule comme le cytosquelette. L'un des acteurs centraux de cette connexion est le complexe LINC (LInker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) qui, grâce aux protéines KASH (Klarsicht/ANC-1/Syne Homology), assure indirectement l'ancrage du cytosquelette à l'enveloppe nucléaire [Zhou et al., 2012]. Notre équipe a d'ailleurs permis de mieux comprendre la fonction du complexe LINC chez les plantes en caractérisant une nouvelle protéine KASH chez Arabidopsis thaliana [Graumann, 2014]. La liaison aux protéines du cytosquelette pendant la mitose est essentielle car elle permet la ségrégation correcte des chromosomes au cours des divisions cellulaires pour générer deux cellules filles viables. Chez les cellules végétales, cette connexion avec le cytosquelette contribue aux propriétés mécaniques du noyau et permet la migration nucléaire par exemple lors des alternances jour-nuit [Higa et al., 2014] ou encore lors de la polarisation du noyau dans certains types cellulaires comme lors de la différenciation des cellules de garde et de pavement de l'épiderme des feuilles [Yang et al., 2020]. L'enveloppe nucléaire est aussi un lieu d'échanges avec le cytoplasme de macromolécules comme les ARN messagers ou les protéines via les pores nucléaires (NPC sur la Figure 1.2). Les pores nucléaires sont organisés en octamère d'un complexe multiprotéique formé d'environ une trentaine de nucléoporines [Tamura et al., 2010]. Il existerait plusieurs centaines à plusieurs milliers de pores nucléaires par noyau régulant les échanges nucléocytoplasmiques [Fiserova et al., 2009].
2 - **La membrane interne** (INM sur la Figure 1.2) permet la transmission de ce lien mécanique. En effet, comme mentionné ci-dessus, si le complexe LINC interagit avec le cytosquelette côté cytoplasmique grâce aux protéines à domaine KASH, ces dernières interagissent directement avec les protéines à domaine SUN (Sad1/UNc84) qui sont, elles, ancrées dans la membrane interne et connues pour interagir avec le nucléosquelette coté intra-nucléaire [Haque et al., 2006, Graumann, 2014] (Figure 1.2). Ainsi, le complexe LINC assurerait la transmission de signaux d'origine extracellulaire vers l'intérieur du noyau grâce à un continuum entre le cytosquelette, la membrane nucléaire et le nucléosquelette [Goswami et al., 2020].

3 - **Le nucléosquelette** est une structure de type fibrillaire située immédiatement sous l'enveloppe nucléaire interne. Cette structure aussi appelée lamina interagit avec les chromosomes et contribue à leur position dans l'espace 3D du noyau avec potentiellement des conséquences sur l'expression du génome [Bickmore, 2013]. Chez les animaux, les lamines sont les constituants essentiels du nucléosquelette et des mutations dans les lamines, en particulier dans la lamine A, sont associées à un grand nombre de maladies humaines appelées laminopathies, rappelant des pathologies associées à des altérations du complexe LINC. Les orthologues les plus probables des lamines chez les plantes sont les protéines NUCLEAR MATRIX CONSTITUENT PROTEIN (NMCP) découvertes chez la carotte et ses orthologues d'A. thaliana CROWDED NUCLEI (CRWN) [Dittmer et al., 2007]. L'interaction des protéines CRWNs avec SUN1 et SUN2 a été démontrée et cette interaction pourrait participer au recrutement des protéines CRWN à la périphérie du noyau [Graumann, 2014]. Comme les mutants de la lamine animale qui présentent de petits noyaux déformés, les mutants *crwn1* et *crwn4* ont des noyaux petits, plus arrondis [Wang et al., 2013]. Un autre composant du nucléosquelette végétal est KAKU4, découvert dans un crible pour des mutants avec des noyaux plus petits et sphériques [Goto et al., 2014]. Chez A. thaliana, KAKU4 interagit avec CRWN1 et CRWN4 et sa surexpression entraîne une surcroissance de l'enveloppe nucléaire [Goto et al., 2014]. CRWN1 interagit directement avec la chromatine, comme le confirme la récente analyse d'immunoprécipitation de la chromatine effectuée à l'échelle du génome (ChIP-Seq) réalisée par [Hu et al., 2019] et qui permet d'identifier les régions de la chromatine reconnaissables par CRWN1. Ces séquences ont été appelées Plant Lamina-Associated Domains (PLAD) par analogie aux LADs bien caractérisés chez les cellules d'insectes ou les cellules animales. Les séquences PLADs sont pour la plupart des régions chromosomiques associées à une faible transcription et comprennent des éléments génétiques mobiles (les éléments transposables) qui sont proposés être des points d'ancrage plus forts pour la liaison de CRWN1 [Hu et al., 2019].
<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>FIGURE 1.3: Organisation en compartiments nucléaires dans un noyau de cellule de mammifère : Adapté de [Lanctôt et al., 2007]. L'enveloppe nucléaire délimite le contour du noyau et contient les pores nucléaires (en orange). Le réseau de lamines est représenté en gris sous l'enveloppe nucléaire et permet de structurer le noyau et d'interagir avec la chromatine. Au sein du noyau chaque chromosome occupe un territoire chromosomique (différents niveaux de gris). La transcription, est en général active aux frontières des territoires chromosomiques et forme des transcription factories. Quelques domaines nucléaires comme le nucléole, les Nuclear speckles, les PML bodies et les Cajal bodies sont représentés et localisés à l'intérieur des territoires chromosomiques.</figcaption></figure>
4 - **Le nucléoplasme**, qui correspond à l'espace intra-nucléaire, est un compartiment complexe dont l'organisation tridimensionnelle est le sujet d'un intérêt croissant ces dernières années notamment grâce à des consortium internationaux comme INC pour les cellules d'insecte, animale et humaine (International Nucleome Consortium; https://inc-cost.eu/) ou INDEPTH pour les cellules végétales (Impact of nuclear domains on gene expression and plant traits; https://www.brookes.ac.uk/indepth/). En effet, l'organisation du matériel génétique dans le noyau n'est pas aléatoire et joue un rôle important pour la régulation de la transcription, un processus essentielle dans l'établissement des caractères génétiques [Rodriguez-Granados et al., 2016].

### 1.1.1.2 L'ADN nucléaire est organisé en chromatine

Après la découverte de la double hélice d'ADN au siècle dernier, l'une des avancées les plus importantes de ces vingt dernières années en génétique est sans doute la découverte d'un ensemble de mécanismes visant notamment à emballer et compacter l'ADN en chromatine grâce aux protéines histones. Ainsi, 147 paires de bases (bp) de la double hélice d'ADN s'enroulent autour d'un octamère d'histone pour former le nucléosome, l'élément de base de la chromatine. La chromatine est souvent présentée comme un collier de perles où chaque perle représente un nucléosome et où la répartition des nucléosomes peut être plus ou moins dense. Cette organisation permet à la chromatine d'adopter différentes conformations plus ou moins compactes. Ces différents niveaux de compaction font également intervenir des modifications chimiques sur l'ADN ou sur les histones qui changent les propriétés physico-chimiques de la chromatine et modifient sa capacité d'interaction avec d'autres protéines non-histones ou des facteurs de transcription [Probst et al., 2009]. La chromatine est un point central de la régulation de l'expression des gènes permettant ou non leur expression. Schématiquement, il existe plusieurs niveaux de compaction de la chromatine initialement décrits il y a environ une centaine d'années sur la base d'observations cytologiques [Heitz, 1928] : l'hétérochromatine très compactée et défavorable à l'expression des gènes et l'euchromatine constituant un état plus relâché et favorable à l'expression des gènes. L'étude de l'ensemble de ces facteurs, qui organisent la chromatine dans l'espace nucléaire et influencent l'expression des gènes, est devenue un domaine à part entière de la génétique appelé **l'épigénétique**. L'épigénétique peut se définir comme l'ensemble des facteurs affectant l'expression d'un gène sans modifier sa séquence d'ADN, qui sont transmissibles à une cellule fille après la division cellulaire, réversibles et définissent le niveau de transcription d'un gène [Probst et al., 2009]. Ces mécanismes regroupent les modifications de l'ADN comme la méthylation, les modifications post-traductionnelles des histones et les
variants d'histones, les petits ARN non codants, le remodelage de la chromatine et l'architecture nucléaire
[Finn and Misteli, 2019].

1.1.1.3 Le noyau à l'interphase est organisé en sous domaines fonctionnels

Entre deux divisions cellulaires, le matériel génétique passe d'un statut hyper condensé (un ensemble de
chromosomes métaphasiques) à un état plus relâché (le noyau à l'interphase). A l'interphase, de nombreux
sous-compartiments se forment [Costa-Nunes et al., 2014].

Les chromosomes dans le noyau interphasique s'organisent en territoires chromosomiques comme l'avait
observé Carl Rabl en étudiant des cellules animales au microscope [Rabl, 1885]. La mise en place des terri-
toires chromosomiques pourrait dépendre de la densité en gènes (modèle radial), les régions les plus riches en
gènes étant les plus centrales et éloignées de la périphérie nucléaire et inversement pour les régions pauvres
en gènes qui seraient elles proches de la périphérie [Bickmore and Van Steensel, 2013]. L'organisation en ter-
ritoires chromosomiques pourrait également être déterminée par des interactions spécifiques entre différentes
régions chromosomiques. L'idée sous-jacente dans ces deux modèles est que l'organisation des chromosomes
à l'interphase n'est pas aléatoire. Chez Arabidopsis, l'existence de territoires chromosomiques a également
été confirmée par des expériences de FiSH (Fluorescence In Situ Hybridization) en utilisant un ensemble
de sondes spécifiques de chacun des 5 chromosomes marquées avec des fluorochromes de couleurs différentes
[Pecinka et al., 2004]. Arabidopsis est une espèce modèle diploïde (2n=10 chromosomes) avec un petit gé-
nome complètement séquencé (~150Mb soit assez proche de celui de la drosophile) et comportant peu de
séquences répétées (10% du génome). Dans une cellule somatique diploïde à l'interphase, 6 à 10 structures
appelées des chromocentres peuvent être identifiées par coloration d'un noyau avec un intercalant de l'ADN
comme le DAPI (Figure 1.4, [Fransz et al., 2002]). Ces domaines correspondent aux régions centromériques
et péricentromériques des chromosomes ainsi qu'aux régions fortement compactées comme les gènes d'ARN
ribosomiques 45S (ARNr 45S). Compte tenu de l'organisation en 5 chromosomes, ce résultat suggère que
certains chromosomes homologues sont appariés au niveau des régions centromériques et péricentromériques
et ne formeraient qu'un seul chromocentre.

Le nucléole est le siège de la transcription des ADN ribosomiques codant pour les ARNr qui s'accumulent
dans le nucléole. Cette accumulation impacte l'organisation nucléaire en excluant l'ADN génomique ce qui
se traduit lors de la coloration des noyaux au DAPI par une région dépourvue de coloration (Figure 1.4).
Territoires chromosomiques, nucléole et chromocentres ne sont que quelques exemples de domaines nucléaires
mais beaucoup d'autres ont été décrits chez différents eucaryotes [Mao et al., 2011, Costa-Nunes et al., 2014].

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>FIGURE 1.4: **Images de noyaux à l'interphase** : Noyaux d'A.thaliana colorés par un intercalant de l'ADN (DAPI). Echelle 2 µm. Les zones de forte intensité identifient les chromocentres alors que les zones dépourvues de coloration correspondent aux nucléoles (n). Extrait de [Fransz et al., 2002].</figcaption></figure>

## 1.1.2 Étude de l'organisation nucléaire chez Arabidopsis thaliana

Pour mieux comprendre comment le noyau régule l'organisation de la chromatine et donc l'expression des gènes, plusieurs stratégies et différentes approches méthodologiques peuvent être envisagées [Fraser et al., 2015]. Une première stratégie vise à caractériser les acteurs régulant l'organisation de la chromatine soit au niveau local (au niveau du nucléosome) soit à un niveau d'ordre supérieur (au niveau de l'architecture nucléaire). Une seconde stratégie est de déterminer la contribution de la périphérie du noyau dans cette organisation. En effet, la périphérie où les corps nucléaires peuvent représenter des points d'ancrage de la chromatine et structurer le reste du génome comme nous l'avons évoqué pour les LADs/PLADs. Notre équipe avait également noté la proximité des chromocentres avec la périphérie du noyau, une observation qui est à l'origine des développements en microscopie et analyse d'images réalisées par notre équipe [Poulet et al., 2015, Poulet et al., 2017]. C'est également cette seconde approche dédiée à l'imagerie 3D qui est à l'origine de mon projet de thèse. En effet, lorsqu'il s'agit de s'intéresser au noyau 3D, la microscopie à sections optiques est une approche de choix. L'observation peut se faire sur tissu vivant ou fixé, sur noyaux isolés ou dans un contexte tissulaire [Dumur et al., 2019]. L'analyse des piles d'images permet alors de définir quantitativement les variations par exemple entre un génotype sauvage et un génotype mutant et cette analyse devra être si possible automatisée afin de travailler sur un grand nombre de noyaux. C'est dans ce contexte que mon projet a démarré en 2018.
Contexte du projet de thèse

Notre constat initial est que la périphérie nucléaire contrôle l'expression des gènes en régulant leur posi-
tion dans l'espace nucléaire. Nous avons donc fait l'hypothèse que des modifications de morphologie du
noyau pourraient perturber cette organisation et affecter l'expression des gènes. C'est en suivant cette hypo-
thèse de travail que notre équipe s'intéresse depuis quelques années à la périphérie nucléaire et cherche
à identifier et caractériser certaines protéines affectant la morphologie du noyau en utilisant la plante
modèle *Arabidopsis thaliana*. Les premières études de l'équipe se sont concentrées sur les protéines SUN
[Graumann, 2014, Poulet et al., 2017], puis sur les protéines KAKU4 et CRWN (CROWDED NUCLEI) com-
posant le nucléosquelette ([Dubos et al., 2020], [Mermet et al 2021]). Pour réaliser nos études nous combinons
des approches d'imagerie 3D, de génétique, de biologie moléculaire et de bio-informatique pour mieux décrire
l'importance de la périphérie du noyau. Les approches bio-informatique et les techniques de séquençages
à haut-débit de type Hi-C [?] (une technique permettant de déterminer les interactions entre régions de
chromatine à l'échelle du génome) par exemple permettent de détecter les changements organisationnels des
séquences chromosomiques en évaluant et en quantifiant leur proximité dans la cellule. Le second exemple est
le résultat des techniques de RNA-seq qui nous permet d'évaluer le niveau de transcription des gènes dans
la plante. Ces approches donnent des résultats normalisant le contenu en ADN des cellules à l'échelle d'un
ou plusieurs organismes entiers, masquant parfois les spécificités à l'échelle d'un tissu ou d'un type cellulaire.
Enfin l'une des méthodes employées classiquement en génétique est d'étudier la fonction de gènes candidats
en caractérisant le phénotype de plantes mutées pour l'un, l'autre ou plusieurs de ces gènes. L'impact de ces
mutations sur la morphologie des noyaux et l'organisation de la chromatine, par exemple sur le nombre et la
taille des chromocentres, sont autant d'indicateurs qui nous permettront de mieux caractériser nos mutants.
Ainsi, les outils d'analyse d'images développés au cours de ma thèse permettent une analyse spatiale de la
morphologie nucléaire de façon rapide et automatisée. Cette méthodologie nous permet d'envisager d'analyser
la dynamique de l'organisation de la chromatine par exemple au cours de la germination de la graine ou au
cours du développement précoce de la plante. L'imagerie devient alors un réel outil de phénotypage au service
du généticien.
## 1.2 Principe de microscopie en trois dimensions

Inventée à la fin du XVIe siècle, la microscopie optique s'est rapidement imposée comme une technique d'observation indispensable aux études en biologie. Elle a notamment été largement appliquée à l'observation du noyau et c'est par ce biais que Boveri a découvert les chromosomes (Boveri-Sutton chromosome theory) au début du siècle dernier ou qu'Emil Heitz a suggéré l'existence de l'hétérochromatine. Un microscope optique est composé d'une source de rayonnement, d'optique pour transmettre et agrandir l'objet observé et d'un détecteur pour visualiser l'image. La fluorescence désigne l'émission de photons par une molécule, appelée fluorophore ou fluorochrome, immédiatement après une excitation lumineuse (Figure 1.5). Ce phénomène peut être observé en microscopie photonique, lorsque que la source lumineuse d'excitation est focalisée par l'objectif. La fluorescence observée est celle émise en direction de l'objectif. Nous utilisons des filtres dans le trajet lumineux qui permettent le tri des différentes longueurs d'onde. Ce type de microscopie dite à épifluorescence, présente un inconvénient majeur car elle produit du flou ; ce phénomène s'explique par le fait que la fluorescence est émise par toute l'épaisseur de l'échantillon, et pas seulement par le plan focal. Les

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>FIGURE 1.5: Spectres d'excitation et d'émission du FITC (isothiocyanate de fluorescéine) : La fluorescéine est la première molécule fluorescente qui a été très utilisée en biologie. Le pic d'excitation du FITC est de 495 nm (spectre en pointillés bleus) et son pic d'émission de 521 nm (spectre en vert). Classiquement, un laser de longueur d'onde 488nm est utilisé pour exciter le FITC (ligne verticale bleue ciel). Source : https://www.bdbiosciences.com/en-us/resources/bd-spectrum-viewer</figcaption></figure>

techniques de sectionnement optique permettent de supprimer les contributions lumineuses hors plan focal, autrement dit le flou (Figure 1.6 A). La première d'entre elles, la microscopie confocale date du milieu du XXème siècle (Marvin Minsky, brevet US3013467A 1957) et repose sur un dispositif dans le trajet lumineux, un sténopé plus communément appelé pinhole ou trou d'épingle, qui ne laisse passer que les photons venant du plan focal, d'où le nom de microscopie confocale ou monofocale (Figure 1.6 B). Une autre technique de sectionnement optique procède par prises de vues successives d'un même champ, en projetant une grille dans
le plan focal qui se déplace entre chaque image du plan. L'image est ensuite reconstituée à partir de l'ensemble des images (3 à 5 images) par soustraction des contributions hors plan focal repérées par les barreaux de la grille. Il s'agit de lumière structurée (Figure 1.7).

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>FIGURE 1.6: Principe du sectionnement optique par un sténopé. A) la fluorescence est émise par tous les plans illuminés ce qui procure l'impression de flou lors de son observation en microscopie épifluorescence. B) en intercalant un obstacle dans le trajet lumineux percé d'un sténopé ou trou d'épingle (pinhole), seule la lumière émise par le plan focal est détectée : (Sources : haut : thèse Saïma Ben Had / Bas : Damien Schapman, Université de Rouen).</figcaption></figure>

La microscopie à sectionnement optique combine plusieurs domaines technologiques : les molécules fluorescentes, l'optique, et l'informatique. Les avancées continues dans ces trois domaines sont à l'origine de sa popularité dans les laboratoires de biologie, avec des innovations qui en repoussent sans cesse les limites :

* Il existe une très grande diversité de fluorochromes, couvrant tout le spectre des rayonnements électromagnétiques de l'ultra-violet aux infra-rouges, avec des propriétés variables quant à leur stabilité,
<figure><img src="image_13.png" /></figure>

FIGURE 1.7: **Principe de la microscopie à éclairage structuré.** A Schéma du principe : Une grille (lignes de couleur) est interposée dans le trajet lumineux et son ombre projetée sur le plan focal. Trois images d'un même plan sont capturées avec un éclairage structuré, décalé en phase, par déplacement latéral de la grille. Les images sont ensuite retraitées pour éliminer les contributions lumineuses hors plan focal. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/fr_AMS/products/super-resolution-microscopes/n-sim-s/the-principle-of-structured-illumination-microscopy. B 3 images acquises avec différentes positions de la grille (à gauche) et image retraitée (à droite). (Zeiss)

brillance, rendement quantique et pouvant être couplés chimiquement pour colorer des molécules d'in-
térêt ou des compartiments cellulaires.

* Les dispositifs optiques qui s'ajoutent aux microscopes permettent des sectionnements optiques par plusieurs techniques, chacune d'elles permettant de nouvelles applications. Couplées à des dispositifs informatiques, certaines méthodes d'acquisition permettent de repousser la limite de diffraction, se sont les technologies dites de super résolution. De plus, de nouvelles générations de détecteurs, ponctuels ou vidéo, permettent de produire des images de meilleure qualité ou plus riches en informations, et des astuces de montages associées à des calculs informatiques permettent de nouvelles performances de sensibilité ou résolution (Airyscan, Zeiss), de précision pour la quantification (Hybrid, Leica), ou la rapidité de reconnaissance spectrale (module spectral, Zeiss).

* L'informatique est indispensable à l'acquisition d'images pour piloter le microscope ou reconstituer une image, qu'elle soit acquise point par point en confocal ou pour soustraire la lumière hors plan focal d'un grand champ pour la lumière structurée. L'augmentation de la puissance de calcul et des capacités de mémoire ont permis des progrès très significatifs pour les temps d'acquisition, du chargement d'images à l'écran avec une grande flexibilité pour l'affichage, du traitement d'images à la volée, et les capacités de stockage facilitent la gestion de fichiers images de plusieurs de GigaOctets (Go).
L'usage de la microscopie à sectionnement optique s'est particulièrement répandu dans les sciences biologiques. En effet, toutes les techniques d'histologie sont réalisables avec des fluorophores et peuvent donc bénéficier des apports de la microscopie confocale, en particulier de la possibilité de reconstruire les objets en 3 dimensions, l'acquisition dynamique d'échantillons vivants, la détection simultanée de plusieurs molécules grâce à la diversité des fluorophores.

Parallèlement au développement de la microscopie confocale se multiplient les solutions d'analyse d'images. Ce terme regroupe à la fois les traitements permettant d'améliorer le rendu visuel et ceux qui extraient une information quantitative. Ce dernier domaine est particulièrement exigeant en qualité d'images et impose de connaître ses contraintes au moment de l'acquisition. C'est pourquoi nous décrirons les images numériques produites par les microscopes et les paramètres d'acquisitions essentiels pour obtenir des images de la qualité attendue avant d'aborder les grands principes de traitement d'images.

### 1.2.1 De l'acquisition à l'image numérique

L'une des étapes clefs lors de l'acquisition est la conversion de l'image en données numériques. Le terme d'image numérique désigne, dans son sens le plus général, toute image qui a été acquise, traitée et sauvegardée sous une forme codée par des valeurs numériques. La numérisation est le processus qui permet de passer de l'état d'image physique d'un objet caractérisé par l'aspect continu du signal à l'état d'image numérique caractérisé par l'aspect discret : il s'agit d'une convolution de l'objet en image au travers d'un processus de discrétisation. Du fait de la discrétisation, l'intensité lumineuse d'une image numérique ne peut prendre que des valeurs quantifiées en un nombre fini de points distincts ce qui permettra une exploitation ultérieure par des outils logiciels sur ordinateur. Une image est un ensemble de pixels (contraction du terme anglo-saxon « picture elements ») caractérisés par leur intensité lumineuse variable. Le voxel (contraction de « volumetric pixel ») est un pixel en 3D auquel est rajouté une dimension z, décrivant la distance entre 2 plans. Le voxel s'avère particulièrement adapté à la reconstitution de volumes à partir d'une série ou « pile » d'images organisées en différentes sections/coupes. Le voxel est très utilisé en Imagerie Médicale 3D (Scanner, IRM...) et en biologie (microscopie confocale, Super Resolution Microscopie...) et le plus souvent de type noir et blanc ou monochrome. L'image la plus simple a 1 bit qui pour chaque pixel ne comporte que $2^1$ possibilités : 0 pour le noir et 1 pour le blanc. Il s'agit d'une image binaire. Dans le cas d'une image en noir et blanc décrite en 8 bits, qui est un format très courant en analyse d'images, il y aura $2^8$ soit 256 possibilités de niveaux de gris : de 0 pour le noir à 255 niveaux de gris jusqu'au blanc. L'histogramme d'une image est la
représentation de la fonction discrète qui à chaque niveau de gris de l'image associe le nombre de pixels ayant
ce niveau de gris. Ainsi, l'histogramme d'une image en 256 niveaux de gris sera représenté par 256 valeurs
en abscisses, et le nombre de pixels de l'image pour chaque niveau de gris en ordonnées (Figure 1.8). En
résumé, une image numérique résulte d'une double discrétisation, un échantillonnage dans l'espace (nombre
et taille de pixels (2D) ou voxels (3D) dans l'image numérique) et d'une quantification de l'intensité (valeur
des pixels). Le processus de discrétisation permet ainsi d'extraire une description quantitative des structures
ou de processus biologiques. Il permet ainsi de décrire : le nombre d'objets, leurs formes, leurs dimensions ou
encore leurs dispositions spatiales grâce à des paramètres géométriques.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>FIGURE 1.8: **Description de l'intensité des pixels d'une image.** Représentation en histogramme des valeurs de pixels issus de imageJ provenant de l'image 2D en 8 bits de droite. Des valeurs statistiques décrivent le nombre de pixels de l'image : count = 28 840 pixels pour une image qui dans ce cas comporte au total 206 x 140 pixels. L'histogramme est également caractérisé par les valeurs d'intensités maximum (Max), minimum (Min), moyen (Mean) et un écart type (StdDev).</figcaption></figure>

1.2.2 Les grandes caractéristiques descriptives d'une image

La numérisation d'une image peut être considérée comme un tableau informatique, dans lequel chaque
case décrit une intensité au travers d'une valeur numérique. Les spécificités de chaque image peuvent être
décrites par les paramètres suivants :

* La définition de l'image : il s'agit de la taille des images exprimée en pixels.

* La taille des pixels : elle indique la distance entre deux pixels successifs dans le plan XY. Elle est parfois appelée résolution de l'image mais ce terme peut entraîner des confusions en microscopie avec la résolution optique théorique des objectifs.

* Le pas (ou résolution en z) : il indique la distance entre deux plans z successifs pour les piles d'images.
* L'histogramme : il représente la distribution des intensités des pixels/voxels dans l'image.

* La dynamique : elle rend compte de la gamme d'intensité présente dans l'image. Les valeurs d'intensité ont des correspondances en niveaux de gris dans l'image.

Un fichier image peut contenir plusieurs tableaux de voxels comme une pile de plans successifs, mais aussi d'autres dimensions :

* Le canal : plusieurs fluorochromes peuvent être détectés sur un même échantillon, donnant lieu à plusieurs piles d'images distinctes possédant les mêmes coordonnées de voxels. Un canal désigne une fenêtre de longueurs d'onde sélectionnée avant le détecteur.

* Le temps : Le même échantillon peut être imagé plusieurs fois pour suivre un phénomène dynamique. Ces paramètres sont toujours un choix de l'expérimentateur au moment de l'acquisition de l'image. Ce sont eux qui déterminent la qualité d'une image en vue de son analyse.

### 1.2.3 La qualité des acquisitions : un compromis

Il faut trouver pour chaque expérience le meilleur compromis pour ses échantillons en fonction de la question posée et de l'usage de l'image. Il existe néanmoins des règles à respecter pour produire des images pertinentes et permettre des analyses. Dans l'article [Dumur et al., 2019], les auteurs proposent d'anticiper par un plan d'expérience (experiment design) toutes les étapes pouvant impacter les images. Ces recommandations faites pour étudier le noyau chez les plantes peuvent être généralisées pour toutes les expériences de microsocopie et sont particulièrement crucial dans les techniques de super résolution. En effet, si il est possible de s'accorder facilement sur la qualité visuelle d'une image, lorsque l'objectif est d'en extraire une information quantitative, cette image doit répondre à des règles plus exigeantes. Cependant, au moment de la production d'images, l'expérimentateur rencontrera des contraintes qui le conduiront à s'écarter plus ou moins de l'image quantitative idéale :

* La définition de l'image et la taille des pixels : la durée d'acquisition sera directement impactée par le choix de l'expérimentateur. Des temps trop longs d'acquisition peuvent être incompatibles avec le temps dont dispose l'expérimentateur sur le microscope, sur la durée de vie du fluorophore ou de l'échantillon.

* La dynamique : il est recherché en général dans une image une dynamique possédant les plus faibles valeurs d'intensité et les plus grandes, sans saturation. Des signaux faibles peuvent pousser l'expérimentateur à choisir des fortes puissances de la lumière d'excitation ou des temps longs d'exposition
(lumière structurée ou spinning disc) ou des vitesses lentes du balayage par le laser. Il y aura là aussi
un impact direct sur la vitesse d'acquisition et le blanchiment possible du fluorochrome.

* Le nombre de dimensions : le nombre de canaux à imager va impacter également la vitesse d'acquisition puisqu'il est rarement possible d'imager simultanément plusieurs canaux. D'autre part, la question de superposition des spectres d'émission et d'excitation, de différence d'intensité entre eux, crée une difficulté supplémentaire dans le réglage des paramètres ou des vérifications préalables sur des échantillons témoins. Enfin, les vitesses d'acquisition doivent être cohérentes avec la dynamique du phénomène étudié.

* La nature de l'échantillon biologique étudié est aussi à prendre en compte : un échantillon vivant ne supportera pas toujours des temps longs d'acquisition par exemple.

Toutes ces règles ne sont pas toujours bien maîtrisées par les expérimentateurs mais pourtant nécessaires
pour la production d'informations quantitatives à partir d'images. C'est pour ces raisons que nous voyons
apparaître de récentes publications portant sur les bonnes pratiques en microscopie, tant pour l'acquisition
que l'analyse qui l'accompagne [Dumur et al., 2019] [Jonkman et al., 2020], [Miura and Nørrelykke, 2021]. Il
est donc important pour la reproductibilité des résultats en biologie de faire suivre avec l'image tous les
paramètres (métadonnées) qui ont permis sa production, depuis la préparation de l'échantillon jusqu'aux
paramètres d'acquisition. Du coté informatique, nous avons la plateforme OMERO (base de données destinée
au stockage et à l'annotation d'images) qui propose un service de gestion des métadonnées des images.
# 1.3 Méthodes de segmentation en 3 dimensions

## 1.3.1 Méthodes de segmentation

La segmentation est une opération de traitement de l'image visant à classifier les pixels de l'image en différents groupes. Dans le cas où nous voulons séparer deux groupes de pixels, dans notre cas différencier le noyau d'une cellule du fond de l'image, c'est une étape de binarisation. L'image après binarisation sera de même dimension que l'image de départ et les pixels composant l'objet seront représentés en blanc (valeur de pixels = 1) et les autres en noir (valeur de pixels = 0). Ce format simplifie l'image et a pour principal avantage de réduire la taille de stockage de l'image.

Afin d'isoler les régions d'intérêt ou ROI en anglais pour *Region Of Interest*, différentes méthodes peuvent être appliquées à l'image. Dans le cas du métier de bio-informaticien nous sélectionnons ces algorithmes basés sur des principes mathématiques et statistiques en fonction des objets que nous souhaitons détecter. Nous exposerons dans cette section une liste non exhaustive que nous avons utilisée dans les développements logiciels décrits dans les chapitres résultats. Nous présenterons les grandes familles d'approches et les méthodes couramment utilisées en traitement d'image pour isoler les objets d'intérêt et détaillerons les principes généraux.

## 1.3.2 Segmentation manuelle

Le cerveau humain est capable de manière instantanée de regrouper les pixels sur une image pour différencier l'ensemble des objets d'intérêt. Dans le cas d'une simple photographie, le contraste des différentes couleurs affichées permet aisément de segmenter les objets manuellement. Toutefois dans le cadre de l'analyse d'images en biologie, une expertise est nécessaire pour détecter les ROI. En effet comme les images issues de microscopie sont pour la plupart en niveaux de gris, il faut bien connaître les différentes composantes du tissu ou de l'organisme marqués afin de les distinguer correctement. Cependant les capacités visuelles de l'espèce humaine a ses limites, et la distinction du contraste entre deux niveaux de gris varie entre individus. La segmentation manuelle est par conséquent subjective et peut varier d'un opérateur à l'autre. La délimitation des objets de manière complètement manuelle engendre donc des difficultés dans la reproductibilité des résultats. Pour limiter le biais, de nombreux outils dédiés au traitement d'images comme l'adaptation de weka en plugin imageJ [Arganda-Carreras et al., 2017], ilastik [Berg et al., 2019] ou encore AnnotatorJ
[Hollandi et al., 2020], qui intègrent des méthodes statistiques ou de machine learning pour aider l’utilisateur, sont apparus ces dernières années. Dans le cadre de mon travail de thèse, le format images 3D (piles d’images) ajoute une difficulté supplémentaire dans le processus de segmentation manuelle. En effet, cette troisième dimension ne facilite pas la détermination de la limite des objets en dimension Z. La possibilité de changer de repère sur les outils de segmentation est une solution adaptée mais elle augmente considérablement le temps d’analyse par image.

### 1.3.3 Approche de segmentation automatisée par méthode mathématique

Cette famille de méthodes de segmentation se base sur la distribution des valeurs des pixels/voxels composant les images [Gonzalez, R.C., and Woods, 1992]. Les histogrammes sont très souvent utilisés pour représenter la distribution des valeurs de pixels/voxels. Ces méthodes s’appuient majoritairement sur des principes statistiques pour constituer des groupes de pixel/voxels. Voici quelques grandes familles d’algorithmes utilisés pour la segmentation notamment au cours de mon travail de thèse.

* **Segmentation basée sur les régions** : cette technique consiste dans un premier temps à choisir des pixels/voxels de manière aléatoire dans une image. Ensuite de manière itérative, les pixels/voxels voisins sont examinés et sont regroupés lorsqu’ils partagent des caractéristiques communes. Les groupements de pixels/voxels ainsi formés sont appelés des composantes connexes (connected components [Chang et al., 2004]). Lorsque les groupements de pixels ne grossissent plus, de nouveaux pixels/voxels sont tirés au sort parmi ceux qui n’ont pas été regroupés avant d’examiner leurs similarités avec leurs voisins. Ces étapes sont réitérées jusqu’à ce que l’ensemble des pixels de l’image appartiennent à une composante connexe.

* **Segmentation basée sur les gradients** [Gonzalez, R.C., and Woods, 1992] : cette approche vise à calculer la variation de chaque valeur de pixels/voxels dans une image au travers d'une fonction mathématique. Cette méthode mathématique est présente dans de nombreux algorithmes de segmentation. Par exemple si elle est couplée à une fonction seuillage elle peut permettre la segmentation des contours des objets dans l'image. La forme la plus simple de la réalisation du gradient est la soustraction des valeurs des pixels à leurs voisin. Cette opération aura alors pour conséquence de faire ressortir les chutes de valeur d'intensité des pixels.
* **Isodata algorithme** : un des premiers algorithmes de cette famille est proposé par [Ridler and Calvard, 1978].

Il consiste à choisir de manière "aléatoire" (souvent en utilisant la moyenne ou la médiane des valeurs de l'image) une première valeur de seuil afin de la faire varier de manière itérative jusqu'à minimiser la variabilité entre les différentes classes. Le seuillage de Otsu [Nobuyuki Otsu, 1979] consiste quant à lui à sélectionner le seuil pour lequel la variance des valeurs est minimale au sein de chaque classe. (Figure 1.9).

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>FIGURE 1.9: **Seuillage par la méthode d'Otsu** : Représentation d'un histogramme d'une image 8 bits (256 niveaux d'intensité en abscisse) lors d'un seuillage de Otsu. La ligne pointillée correspond au seuil (threshold) permettant de diviser les pixels/voxels en 2 classes : une contenant le fond de l'image (background) et l'autre les objets (object) d'intérêt. Cette classification en deux groupes permettra ensuite une binarisation : 0 (background) et 1 (object).</figcaption></figure>

* **Les lignes de partage des eaux** : cette famille d'algorithmes de segmentation se base sur des concepts provenant du domaine de l'étude de la topographie [Beucher and Lantuejoul, 1979]. Elle consiste à considérer les valeurs de gris d'une image comme des reliefs, où les intensités de pixels/voxels les plus faibles seront associés aux altitudes basses et les intensités fortes aux sommets. Une fois les pixels/voxels regroupés par valeurs extrêmes, une phase « d'inondation » est effectuée afin de tester les pixels/voxels de proche en proche dans l'image. Ils sont ajoutés à la composante connexe s'ils respectent une condition comme par exemple la croissance des valeurs d'intensités. Une fois les maxima atteints, la décroissance des valeurs débute (comparable à la descente d'une vallée), une nouvelle composante connexe est créée pour regrouper les pixels. Une ligne séparatrice des deux composantes connexes d'une unité de large est mémorisée. Cette dernière correspondant à la ligne de partage des eaux (Figure 1.10).
<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>FIGURE 1.10: **Segmentation par la ligne de partage des eaux** : A) A partir d'une image de noyau coloré au DAPI et présentant des régions d'intensités variables comme par exemple les régions correspondant aux chromocentres (spots blanc), B) l'algorithme va définir les valeurs d'intensité des voxels de l'image. Le schéma montre ici la définition des valeurs basses de voxels qui définissent des minima régionaux. Les minima régionaux vont servir de point d'initiation (« source ») pour la « montée des eaux » qui progresse du schéma en haut vers celui du bas. Une frontière sera créée lorsque les eaux provenant de différents minima (de différentes couleurs) sont sur le point de fusionner. Enfin, « l'inondation finale » définira ici 3 régions distinctes en fonctions des seuils d'intensités définis. C) Résultat de la segmentation par la ligne de partage des eaux de l'image en A).</figcaption></figure>

Toutes ces méthodes ont été éprouvées et largement utilisées dans le domaine de l'analyse d'image. Tou-
tefois elles présentent le désavantage d'être relativement dépendantes des images à traiter et très souvent
l'utilisateur devra tester différentes méthodes avant de retenir la plus adaptée.

1.3.4 Segmentation et apprentissage automatique

Cette famille de méthodes plus connue sous le nom de “machine learning” est en plein essor ces 10 der-
nières années, avec un effort de la recherche sur la thématique d’une sous catégorie nommée le “deep learning”
ou apprentissage profond [von Chamier et al., 2019]. Ceci s’explique majoritairement par les progrès techno-
logiques de l’informatique en termes de vitesse de calculs et notamment le développement des processeurs
graphiques. Ces évolutions nous amènent dans l’ère du « big data » où il est maintenant possible de générer
des jeux de données de grande taille. Le grand principe de ces méthodes d’apprentissage consiste à générer un
modèle. Dans le contexte de jeux de données de tailles importantes il est impossible d’expertiser entièrement
à la main, seul un sous-échantillon des données sera utilisé comme jeux de données d’entraînement. Une fois
le modèle généré il sera ensuite appliqué à l’ensemble des données.

Dans la méthodologie de l'apprentissage profond, nous pouvons subdiviser l'approche en deux catégories :
l'apprentissage supervisé et non supervisé [Huan Liu, 2004]. La différence principale réside dans l'annotation des données pour l'apprentissage. En effet dans le cas d'un apprentissage supervisé, les données sont annotées par un expert (étape de labellisation) contrairement à l'apprentissage non supervisé où seul le nombre de classe d'objet souhaité en sortie est indiqué.

Pour une donnée comme une image, il est en effet possible de répertorier des informations de manière quantitative ou qualitative comme illustré avec les deux exemples suivants :

* Un premier cas de figure est un apprentissage supervisé basé sur une approche quantitative.

Dans ce cas, considérons la segmentation des noyaux, le jeu de données d'apprentissage fourni en entrée au modèle sera constitué par des labellisations quantitatives. En termes simples, il s'agit de définir les pixels/voxels comme appartenant ou non au noyau. L'utilisateur devra donc délimiter chaque noyau manuellement afin de classer les pixels/voxels en deux catégories. Cette tâche peut s'avérer difficile notamment pour les images en niveau de gris par exemple, lorsqu'il s'agit de définir le bord d'un noyau (frontière noyau/fond de l'image) qui est parfois diffuse. La qualité des données et la précision de l'expert seront très influent sur le modèle généré et impacteront le résultat final de segmentation des noyaux. Dans le cas des données en 3D, la labellisation est d'autant plus complexe et longue ce qui constitue un problème majeur.

* Un second exemple est l'apprentissage supervisé basé sur une approche qualitative. Dans ce cas, le modèle sera entraîné à compter le nombre de noyaux au sein de notre image, mais la précision de la délimitation n'aura pas d'importance. La difficulté dans ce type de modèle vient lorsque certains des objets partagent des caractéristiques proches en termes de signaux : par exemple la cellule végétale contient d'autres organelles que le noyau, comme les chloroplastes qui sont connus pour émettre de la fluorescence qui pourra être détectée au même titre que celle du noyau introduisant la comptabilisation d'objets supplémentaires. Nous noterons enfin que dans ce cas de figure l'avantage majeur est la simplicité/rapidité de l'annotation du jeu de données d'entraînement.

Dans le cas de l'apprentissage non supervisé il n'y a pas de labellisation des données à réaliser en amont de l'entraînement du modèle. L'avantage majeur de cette approche est que le modèle est généré sans *a priori*. Il limite donc les éventuels biais introduits par les experts lors de la labellisation des données. Avec cette stratégie, il est donc possible de faire ressortir des informations jamais observées à cause du trop grand volume de données à traiter. A contrario, cette approche est assez imprévisible et peut faire ressortir des
résultats non informatifs en créant par exemple des sous-catégories inattendues [Alloghani, 2020].

Les approches supervisées et non supervisées seront donc choisies en fonction de la problématique abordée et de la complexité des données associées. De manière générale, les deux approches peuvent être utilisées pour un problème donné, et l'expérimentateur orientera le choix vers l'une ou l'autre des stratégies en fonction des avantages et inconvénients cités ci-dessus.

Enfin, il existe une alternative à ces deux premières méthodes qui est l'apprentissage semi-supervisé. C'est donc la génération d'un modèle à partir d'un mélange de données annotées et non annotées. Le modèle en cours d'entraînement demandera à l'utilisateur de labelliser certaines images afin d'orienter l'entraînement. Cette méthode est intéressante lorsque les jeux de données sont très conséquents et que le temps humain requis pour la labellisation des informations est très important.

### 1.3.5 Réseau de neurones artificiels

Dans les années 1950, deux neurologues Warren McCulloch et Walter Pitts s'inspirent des observations faites sur le fonctionnement des neurones biologiques dans l'objectif de proposer une modélisation similaire à celle de l'intelligence humaine. Leurs travaux présentent pour la première fois le neurone artificiel qui correspond à une fonction mathématique qui reçoit une ou plusieurs informations en entrée et la transforme en un résultat en sortie [W. S. McCULLOCH and PITTS, 2007]. Les opérations mathématiques du neurone peuvent être simples comme agréger les valeurs en entrée ou encore classer les données entrantes en fonction d'une valeur seuil. Le choix de la fonction est dans un premier temps manuel afin d'adapter le modèle aux données et leurs éventuelles évolutions. C'est pourquoi Franck Rosenblatt en 1957 proposera le perceptron (Figure 1.11 A)) qui est une méthode d'apprentissage supervisé qui classe de manière binaire en utilisant un système de pondération des données entrantes. Cependant, le perceptron ne peut traiter des problèmes de classification non linéaires, c'est pourquoi est apparu dans la fin des années 90 le perceptron multicouche correspondant aux premiers réseaux de neurones artificiels (Figure 1.11 B)). Le principe est de positionner les neurones sur différentes couches afin qu'ils puissent interagir avec les entrées et sorties des neurones des couches voisines, mécanismes schématisant le comportement des dendrites des neurones biologiques.
<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>FIGURE 1.11: Représentation schématique d'un neurone formel et d'un réseau de neurones (source : https://fr.wikipedia.org/wiki/). A) Neurone formel possèdant plusieurs entrées, avec $x_1$ et $x_2$ qui représentent les valeurs numériques en entrées et $w_1$ et $w_2$ leurs poids respectifs associés. L'exemple donné ici est une fonction mathématique qui permet de filtrer les valeurs avec l'utilisation d'un seuil noté T de valeur 0,5 donnant en sortie la valeur $x_1$ ou $x_2$. B) Réseau de neurones avec 3 couches : les neurones en vert représentent la couche de neurones traitant l'entrée des valeurs, la couche bleue de neurones formels dont la fonction mathématique est appliquée aux données, et enfin la couche jaune représentant la donnée en sortie.</figcaption></figure>

L'apprentissage profond ou Deep Learning, introduit par Kunihiko Fukushima [Fukushima, 1979], est la branche de l'apprentissage automatique la plus récente qui se base sur les réseaux de neurones. Les performances de ces modèles reposent totalement sur la quantité mais aussi la qualité des données annotées. Les excellentes performances particulièrement pour les applications en vision/reconnaissance d'objets des réseaux d'apprentissages profonds proviennent des progrès en informatique dans deux domaines :

* Tout d'abord dans la possibilité de stocker des bases de données annotées de grand volume comme par exemple la base de données ImageNet [Russakovsky et al., 2015] (https://image-net.org/challenges/LSVRC/2010/) qui contient désormais des millions d'images avec des objets annotés manuellement.

* D'autre part avec l'amélioration des performances des processeurs graphiques qui permettent une acceleration du calcul.

Le challenge de reconnaissance et de labélisation d'objet par ordinateur est complexe par la diversité d'objets possibles mais aussi du fait des différentes formes et couleurs qu'un même objet peut prendre (angle de vue, distance de capture de l'objet, exposition lumineuse). Les réseaux à neurones convolutifs ou en anglais convolutional neural network (CNN) se sont imposés dans le domaine en proposant les meilleures solutions au challenge ImageNet 2012 ou encore le concours ICPR 2012 pour la détection de cellules cancéreuses. Dans ces concours, les tâches d'apprentissage et les réseaux qui en découlent consistent surtout à labelliser des objets au sein d'images en 2D plus qu'en la détection précise de ROI dans une image. C'est pourquoi en 2015 le réseau U-Net [Ronneberger et al., 2015] propose une nouvelle architecture (Figure 1.12) basée sur les CNN
pour la segmentation d'objets de nature biomédicales. Cette nouvelle méthodologie a pour avantage majeur
de proposer des résultats précis avec des jeux de données de taille réduite. Pour cela, les concepteurs ont
couplé aux étapes de pooling classique des étapes de sur-échantillonnage augmentant la résolution de l'image
en sortie.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>FIGURE 1.12: Représentation schématique de l'architecture du réseau de neurones artificiels U-Net : U-Net est composé d'une étape de convolution puis de déconvolution pour donner en résultat l'image segmentée (avec ici deux labels en sortie). Le nom de U-Net vient de la forme en U du modèle. Source [Ronneberger et al., 2015]</figcaption></figure>
## 1.4 Les solutions logicielles dédiées à la caractérisation morphologique des noyaux

Face à la génération d'images de résolution et de tailles croissantes, les solutions logicielles dédiées à l'analyse d'images se multiplient ces dernières années avec l'apparition des plus connues comme CellProfiler [Kamentsky et al., 2011], Knime4Bio [Lindenbaum et al., 2011], Icy [De Chaumont et al., 2012] ou Imaris https://imaris.oxinst.com/. Bien d'autres outils existent comme le montre la Figure 1.13 extraite du site image.sc qui est dédié aux nombreuses questions relatives à l'analyse d'images et l'utilisation des outils.

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>FIGURE 1.13: Description du forum image.sc : A) Ensemble des logiciels partenaires de la plateforme. B) Statistiques de l'activité du forum. Capture d'image extraite du site https://forum.image.sc/</figcaption></figure>

L'ensemble de ces plateformes se basent sur des langages informatiques différents mais ont une philosophie commune qui est l'interopérabilité des systèmes intégrant pour les plus récentes des méthodes d'apprentissage profond. Elles ont pour point commun la possibilité d'utiliser un logiciel pionnier en analyse d'images : ImageJ [Collins, 2007] (ou sa version plus récente intégrant des plugins majeurs : Fiji [Schindelin et al., 2009]). La plateforme ImageJ est un projet open source développé en langage Java qui a pour point fort d'être un outil facilement portable sur les différents systèmes d'exploitation. Les contributions de la communauté de
<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>FIGURE 1.14: **Exemples de segmentations de noyaux d'A. thaliana** : résultats de la segmentation d'un noyau de faible intensité par un seuillage Otsu classique et par la méthode proposée par NucleusJ : Otsu modifié qui sélectionne le seuil Otsu pour lequel la sphéricité du noyau segmenté est maximale A). Exemples de segmentation contenant des artefacts suite à l'utilisation de la méthode Otsu modifiée. Dans le cas de noyaux de faibles intensités en B) et C) de l'exclusion du nucléole dans le masque du noyau. Les flèches rouge représentent des cas de l'absence de segmentations du nucléoles.</figcaption></figure>
développeurs se font sous forme de plugins, et aujourd'hui l'ensemble des fonctions mathématiques dédiées
au traitement d'images que nous avons citées précédemment y sont disponibles. Ces deux derniers points font
d'ImageJ une des plateformes de traitement d'images en biologie la plus complète. Malgré la diversité des
possibilités des méthodes mathématiques et de plugins qu'elle propose, cette plateforme reste difficilement
accessible aux biologistes pour la mise en place de chaînes de traitements automatiques. Les principales
raisons sont les suivantes :

* La majorité des plugins proposent des méthodes mathématiques dédiées à l'analyse d'images plus que des solutions dédiées à un problème d'analyse spécifique. Il est donc souvent nécessaire de connaître et de sélectionner les méthodes puis de les chaîner afin de réaliser la bonne séquence de traitement de l'image pour en extraire l'information souhaitée.

* Bien que ImageJ embarque un langage propre de macro qui facilite la création de chaîne de traitement, beaucoup de fonctionnalités ne sont pas disponibles via le langage macro. Il est dans ce cas obligatoire d'avoir des compétences en programmation pour accéder au code source en Java (lorsqu'il est disponible).

* De nombreuses méthodes mathématiques ont été développées à une période où les microscopes produisaient majoritairement des images en 2D. Or, toutes ces méthodes n'ont pas été actualisées pour prendre en charge des images en 3D.

C'est en 2013 que l'équipe s'est intéressée à ces problématiques d'analyses d'images, suite à l'achat d'un microscope à section optique équipé d'un module OptiGrid dans le but d'étudier la morphologie nucléaire chez *A. thaliana*. Axel Poulet, doctorant en bio-informatique, a développé un plugin sur la plateforme ImageJ appelé NucleusJ [Poulet et al., 2015]. Ce plugin, initialement conçu pour des images de noyaux 3D individuels (qui étaient obtenues par microscopie confocale avant l'achat du microscope), prend en charge des piles d'images contenant un noyau par fichier et permet la segmentation du noyau et de la chromatine (Figure 1.16 D). Les paramètres en sortie d'analyse permettent de discriminer les populations cellulaires sur des aspects de morphologie nucléaire et d'organisation de la chromatine avec notamment la caractérisation des chromocentres (Figure 1.15 2).
Les raisons d'un développement d'une chaîne de traitement et non de la réutilisation de méthodes déjà existantes, s'expliquent par plusieurs spécificités liées à notre modèle biologique *A. thaliana* (illustrées Figure 1.15) :

* **Le nucléole** : c'est un domaine nucléaire représentant jusqu'à 30% du volume du noyau mais ne contenant que très peu d'ADN. Le nucléole n'est donc pas marqué par les intercalants fluorescents comme le DAPI qui cible spécifiquement la chromatine et peut donc fausser l'estimation du volume nucléaire selon la méthode utilisée.

* **Les chromocentres** qui correspondent aux regroupements des régions hétérochromatiques et qui au contraire du nucléole sont fortement marqués par le DAPI du fait de leur forte densité en ADN.

* **La grande dynamique d'intensité de marquage** : la morphologie nucléaire dans notre modèle biologique est décrite par une large gamme de forme, de taille et d'intensité de coloration des noyaux au sein d'une image grand champ (Figure 1.16 Raw images).

<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>FIGURE 1.15: **Description des composantes du noyaux d'A. thaliana** : Noyau à l'interphase d'une cellule d'A. thaliana coloré au DAPI. Nous avons considéré 4 composantes dans nos analyses d'image en fonction de la coloration au DAPI : 1) l'euchromatine, 2) l'hétérochromatine, 3) la limite de coloration et 4) le nucléole.</figcaption></figure>

Afin de répondre à ces difficultés NucleusJ propose à partir d'images contenant un seul noyau de réaliser dans un premier temps la segmentation du masque du noyau basée sur la recherche d'un seuil d'Otsu qui maximise la sphéricité de l'objet segmenté. Cette méthode permet de segmenter automatiquement des noyaux avec une plus grande diversité d'intensité et notamment les noyaux de faible intensité comme dans la Figure 1.14 A). Pour faciliter la segmentation des chromocentres, NucleusJ propose une méthode de ligne de partage des eaux en 3D (Figure 1.10), qui contient toutefois une étape de seuillage manuelle par l'utilisateur.
Les solutions proposées par le plugin NucleusJ pour accélérer les étapes manuelles sont cependant insuf-fisantes dans le cas d'analyse contenant plusieurs centaines de noyaux. Les étapes manuelles ralentissant le processus d'analyse sont les suivantes :

* Dans un premier temps, l'utilisateur devra constituer une collection d'imagettes ne contenant qu'un seul noyau à partir images grands champs, (Figure 1.16) : étape de crop.

* Deuxièmement, après l'étape de segmentation du masque du noyau, il est nécessaire de contrôler ma-nuellement le bon déroulement de la segmentation afin d'éliminer les images contenant des invaginations provenant de gros nucléoles (Figure 1.14 B) et C)). Cette sélection manuelle conduit souvent à écarter les plus gros noyaux, ce qui introduit un biais d'analyse par l'élimination des populations cellulaires avec des gros nucléoles comme c'est le cas pour les cellules de pavements de l'épiderme qui est notre tissu de prédilection lors de la collecte des images.

* Troisièmement, l'étape de segmentation des chromocentres pour décrire l'organisation de la chromatine qui fait appel à une méthode de ligne de partage des eaux est limitée en terme de débit car elle nécessite d'appliquer un seuil sélectionné par l'utilisateur. Ce seuil pourra varier d'un utilisateur à un autre et une telle méthode pose donc des problèmes de répétabilité entre opérateurs.
<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>FIGURE 1.16: Pipeline du logiciel NucleusJ permettant l'analyse 3D des noyaux d'A. thaliana.
[Poulet et al., 2015]. Chaque image complexe d'un champ de noyaux d'épiderme du cotylédon d'une plantule
A. thaliana contient de 20 à 100 noyaux. 2) Chaque noyau est individualisé (crop) manuellement par l'utili-
sateur. 3) La segmentation du noyau est basée sur la méthode d'Otsu. 4) La segmentation des chromocentres
est basée sur l'algorithme de ligne de partage des eaux, ici appliqué à des images 3D. 5) Au final, l'expé-
rimentateur détermine manuellement le seuil à appliquer afin d'obtenir une segmentation reflétant l'image
initiale : sur cette image 6 chromocentres ont été validés manuellement par le biologiste.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_23.png" /></figure>
# Chapitre 2

## Solutions dédiées à l'étude de la
morphologie nucléaire : Nucleus2.0

NucleusJ (NJ1), le premier outil créé dans l'équipe pour analyser la morphologie des noyaux et leur contenu en chromatine, a été conçu pour analyser des images acquises noyau par noyau avec un microscope confocal (CLSM-Confocal Laser Scanning Microscopy) [Poulet et al., 2015]. La qualité des images obtenues à ce moment-là nécessitait un prétraitement par une déconvolution. L'étape de déconvolution qui consiste à corriger les altérations de l'image lors de sa numérisation venait s'ajouter au temps de l'acquisition via le microscope confocal ce qui ralentissait les analyses. Un microscope à sectionnement optique par lumière structurée acquis par l'équipe (Leica DM 6000 équipé d'une optigrid) permet la capture d'images de champs larges contenant plusieurs noyaux et ne nécessitant pas de déconvolution avant leur analyse par NucleusJ. La capture des images de champs larges facilite le repérage du type cellulaire comme les cellules de garde et de pavement dans l'épiderme de feuille et permet donc de classer les noyaux en sous-populations (Figure 2.2). Les images à champ large donnent également accès à des informations sur la distribution spatiale des noyaux ou encore sur leur orientation dans le tissu. Ce paramètre spatial est particulièrement intéressant pour l'étude de notre tissu d'intérêt dans l'équipe qui est un épithélium de feuille ou cotylédon, un tissu polarisé, c'est-à-dire composé de cellules asymétriques et très organisées entre elles [Wada, 2018]. Pour finir, l'étape d'acquisition étant plus rapide, elle permet l'augmentation du volume de données et naturellement l'obtention de résultats statistiquement plus robustes. En effet, particulièrement dans le domaine de la biologie, la variabilité individuelle au sein d'une population, que ce soit à l'échelle d'un organisme, d'un organe ou encore d'une cellule,
est un souci récurrent.

La première version de NucleusJ (NJ1) permettait de calculer 15 paramètres décrivant la morphologie des noyaux, et de façon beaucoup plus originale, l'organisation de la chromatine en étudiant les chromo-centres. L'outil a été validé sur des populations de noyaux d'origines cellulaires diverses (poils racinaires et cotylédon) et il a ouvert la voie au phénotypage de mutants de différentes protéines nucléaires étudiées par l'équipe [Poulet et al., 2017, Benoit et al., 2017]. Les premiers efforts de l'équipe ont porté sur l'améliora-tion des techniques de préparation des échantillons et l'acquisition des images. A mon arrivée, la technique de production d'images était rapide et complètement standardisée [Desset et al., 2018]. Pour une condition biologique donnée, plusieurs centaines d'images de noyaux sont produites. Cependant, l'utilisation de la mi-croscopie orientée vers un plus haut débit a décalé la problématique du temps nécessaire pour générer les données au temps nécessaire pour leur analyse. C'est pourquoi le premier objectif de ma thèse a été d'auto-matiser le plugin. Cette première partie introduit donc les améliorations apportées par la seconde version du plugin NucleusJ2.0, et sera suivie des résultats obtenus présentés par l'article : Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0. Suite à l'article, je présenterai les améliorations intégrées après sa publication.

## 2.1 Automatisation de la segmentation du masque du noyau

L'algorithme de segmentation des noyaux individualisés, NJ1, propose une solution dynamique qui s'adapte bien au noyaux de petite taille et de forte intensité mais commet des erreurs pour les cas suivants :

* Les images de masques de noyaux dont l'intensité moyenne est faible (Figure 1.14 B)). Ces noyaux segmentés présentent des invaginations artificielles en bordure et dans le centre de l'image.

* Les images de masques de noyaux contenant de gros nucléoles excentrés créent des cavités qui sont des artefacts et qui ne sont pas comptabilisés dans le volume du noyau. Ce type de cas est sur-représenté dans les noyaux les plus gros comme ceux des cellules de pavement et créer des biais dans les analyses statistiques.

Ces deux types d'erreur de segmentation représentent 30% des noyaux analysés dans nos tissus de co-tylédons et nous obligent à filtrer nos données avant analyse statistique. Pour éviter cette étape de tri des images, nous avons implémenté une étape de calcul d'enveloppe convexe appelé gift wrapping à partir de la segmentation d'Otsu modifié.
Nous avons spécifiquement implémenté l'algorithmme de la marche de Jarvis [Jarvis, 1973] qui est le suivant :

**Algorithm 1:** Adaptation de l'algorithmme de la marche de Jarvis

**Data:** L : Ensemble des points bordant le masque issus de Otsu modifié

**Data:** D : 2 x (rayon du masque issu de Otsu modifié)

**Data:** L' : liste de points

repeat

**Data:** p0 : point d'abscisse minimale dans L

**Data:** p' : le point courant

for p dans L do

if angle entre p' p est le plus incliné vers la gauche ET distance euclidienne entre p et p' < D

then

**Data:** Ajouter p' dans L'

**Data:** p' = p

until p' = p0;

L'algorithmme répète cette procédure dans tous les plans de l'image en 3D du masque du noyau obtenus par la segmentation Otsu modifié, c'est-à-dire XY, XZ et YZ. Suite à cela, l'union de l'ensemble des plans segmentés est réalisée. Afin d'optimiser les temps de calcul du *gift wrapping*, nous avons limité l'exploration dans le nuage de points à une distance arbitraire. Cette dernière est calculée à partir du rayon du masque du noyau issu de la segmentation par la méthode de Otsu modifiée.

La segmentation par la méthode de gift wrapping montre des résultats satisfaisants pour les noyaux contenant de gros nucléoles comme nous pouvons le voir dans les exemples donnés en Figures 2.1 A), B) et C). Les objets segmentés présentent des volumes supérieurs car ils comblent les invaginations artéfactuelles en bordure de noyau. Ceci a d'ailleurs pu être démontré par l'utilisation de billes fluorescentes de taille standardisée utilisées au laboratoire pour calibrer les microscopes. Dans ce cas, plus la sphéricité est proche de 1 et moins cette augmentation du volume par la méthode du gift wrapping est forte (Figure 2B [Dubos et al., 2020]). Toutefois, nous observons une segmentation trop importante des noyaux ayant une forme allongée comme dans l'exemple D) de la Figure 2.1. Cependant, ces cas sont rares dans nos échantillons (moins de 0,1% sur les 680 noyaux Col-0 étudiés).
<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>FIGURE 2.1: Exemples de plan de segmentation par l'utilisation du gift wrapping : Comparaison des images brutes, des noyaux segmentés par la méthode d'Otsu modifié (NJ1) et la segmentation par la méthode du gift wrapping (NJ2). A), B) et C) sont des exemples d'anomalies de segmentation liées à la présence du nucléole et D) liées à la forme allongée du noyau.</figcaption></figure>

## 2.2 Automatisation de l'étape d'isolement des noyaux issus d'une image grands champs : l'autocrop

Le tri des noyaux ayant de gros nucléoles ou des défauts de segmentation en périphérie nucléaire n'est plus nécessaire grâce la mise en place du calcul de l'enveloppe convexe comme nous venons de le voir. Cet algorithme fonctionne avec une image en entrée contenant un noyau isolé dans un fichier. Ce format n'est plus d'actualité dans nos protocoles expérimentaux comme nous l'avons vu dans la Figure 2.2 B) notre microscope de prédilection génère des images 3D de champ large contenant plusieurs noyaux. L'évolution de la méthode d'acquisition engendre donc une étape très chronophage de sélection/découpage manuel de chaque noyau dans des fichiers séparés. Ce temps est estimé entre 1 à 2 heures par pile d'images de 10 à 60 noyaux. Nous avons donc implémenté dans NucleusJ2.0 [Dubos et al., 2020] une nouvelle méthode appelée autocrop, qui automatise cette étape, basée sur la détection de composantes connexes suite à une segmentation par la
méthode d'Otsu [Nobuyuki Otsu, 1979]. Une étape de filtre des composantes connexes est nécessaire pour
filtrer les chloroplastes qui sont aussi révélés par le marquage au DAPI.

L'algorithm de l'**autocrop** est le suivant :

**Algorithm 2:** Algorithme de l'**autocrop**

**Data:** Img : Images 3D contenant 1 ou plusieurs noyaux

Segmentation Otsu de Img

**Data:** Composante : liste des composantes connexes dans Img

for C dans Composante do

<figure><img src="image_25.png" /></figure>

if C > Volume minimum ET C < Volume maximum then

| Création d'un fichier

L'**autocrop** a été développé avec de nombreuses options modifiables (Annexe 6.2) afin de pouvoir s'adap-
ter à des images 3D d'autres modèles. L'ensemble des possibilités est fournie dans la documentation https:
//gitlab.com/DesTristus/NucleusJ2.0/-/wikis/Autocrop. Par exemple, lors de la sélection des compo-
santes connexes, il est possible de filtrer sur la taille minimale de chaque composante connexe et par défaut,
l'algorithme utilise 1 unité (1 unité = 1 100 µm³ dans nos images). Cette limite inférieure nous permet de
contre-sélectionner les chloroplastes qui sont de très petites structures par rapport au noyau et que nous
souhaitons écarter de notre analyse. Toutefois, ce seuil reste ajustable pour pouvoir analyser des cellules qui
aurait des tailles moyennes supérieures. Un second exemple de flexibilité de l'algorithme est illustré lors des
études en Fluorescence *in situ* Hybridization (FiSH) du papier NucleusJ2.0 nous pouvons choisir dans quel
canal calculer le seuil d'Otsu pour la détection des composantes connexes. Une fois les objets détectés, les
coordonnées des sous-images (ou imagettes) définies par l'**autocrop** seront appliquées à l'ensemble des canaux
de l'image. Cette méthode est particulièrement intéressante pour la co-localisation de signaux issus de plu-
sieurs canaux de fluorescence par exemple CFP et YFP. Une expérience de FiSH est décrite Figure 1-E de
l'article [Dubos et al., 2020]. L'algorithme permet ainsi de choisir dans quel canal sera calculé le seuil d'Otsu
pour la détection des composantes connexes. Une fois les objets détectés, les coordonnées des sous-images
définies lors de l'**autocrop** seront appliquées à l'ensemble des canaux de l'image.
<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>FIGURE 2.2: **Description de l'analyse de la morphologie nucléaire** : A) acquisition de portions de tissus en lumière transmise pour l'identification des types cellulaires (en bleu les cellules de pavement (PC), en vert les cellules de garde (GC)). B) Image grand champ des noyaux par fluorescence 3D suite à une coloration au DAPI. C) Annotation manuelle des types de cellules après fusion de la projection issue de l'image 3D (dont les couleurs ont été inversées pour faciliter l'annotation) depuis laquelle ont été isolés les noyaux (un par fichier, exemple noyaux 0 et 9) étape appelée crop. D) Segmentation du masque du noyau et des chromocentres, à l'issue des segmentations les paramètres géométriques permettant de discriminer les populations cellulaires sont utilisés pour représenter les résultats sous forme de graphes (boxplots, PCA...).</figcaption></figure>
## 2.3 Validation biologique

Afin de valider l'automatisation des étapes d'autocrop et de segmentation par *gift wrapping* inclues dans NJ2, nous avons réalisé une étude à grande échelle avec un jeu de données de 266 images 3D grand champ, soit plus de 3000 noyaux d'épiderme de feuille générés à partir de 8 génotypes. Cette étude s'est concentrée sur les composants du nucléosquelette et plus particulièrement sur les gènes KAKU4, CRWN1 et CRWN4. Notre équipe disposait d'une lignée sauvage (sans mutation) et de mutants correspondant à la perte de fonction de chaque gène mais également de combinaison entre ces mutants. Nous avions donc à notre disposition le génotype sauvage, les simples mutants *kaku4*, *crwn1* et *crwn4*, les doubles mutants *kaku4 crwn1*, *kaku4 crwn4* et *crwn1 crwn4* et le triple mutant *kaku4 crwn1 crwn4* [Dubos et al., 2020], les résultats du triple mutant *k4c1c4* sont présentés car ce triple mutant présente des différences significatives par rapport au génotype sauvage. J'ai également effectué l'étude de l'organisation de la chromatine, soit après une coloration au DAPI (analyse des chromocentres), soit après une analyse FISH (étude des gènes codant pour les ARN ribosomiques et du marqueur 180bp présent dans les régions centromériques de chaque chromosomes).

## 2.4 Organisation, stockage et partage de jeux de données

Le partage de données d'imagerie 3D en biologie est une étape importante encore assez peu courante. Par-
tager des jeux de données expertisés permet de comparer des résultats entre différents laboratoires et permet
de calibrer et tester les algorithmes dédiés à l'analyse d'image (benchmarking). Pour cela, il faut disposer
d'outils d'analyse communs et/ou de données communes. C'est pourquoi l'outil NucleusJ2.0 est open source
https://gitlab.com/DesTristus/NucleusJ2.0, et nous avons cherché à rendre publique nos données de
manière pérenne dans une base de données OMERO [Goldberg et al., 2005] : https://omero.bio.fsu.edu/
webclient/userdata/?experimenter=-1. Nous proposons une traçabilité des résultats en mettant à dispo-
sition 1) les images brutes, 2) les images segmentées, 3) les fichiers de résultats décrivant les paramètres,
les variables géométriques (volume ou encore la surface) mais aussi la version du logiciel utilisé ainsi que les
paramètres d'analyses. Cette contribution nous paraissait importante lors de l'initiation de mes développe-
ments. Je me suis rendu compte de la difficulté de trouver des jeux de données pour tester mes algorithmes.
Lors de mes recherches bibliographiques, il m'est apparu une nette fracture entre le monde de la biologie et
de l'informatique/calcul digital. J'ai constaté deux cas de figures :
* Dans les publications de traitement du signal, de nombreux jeux de données *in silico* dédiés à la mesure théorique de paramètres issus de méthodes mathématiques sont souvent disponibles. Cependant, ces données “parfaites” ne reflètent pas la réalité, elles n’incluent pas la convolution de l’image lors de sa numérisation, ce qui entraîne des altérations de l’image.

* A l'inverse, dans les publications de logiciels ou d'algorithmes dédiés à l'analyse d'image, les résultats obtenus sont souvent spécifiques du jeu de données étudié, lequel contient très souvent un nombre faible d'images et est souvent incomplet. Appliquer de telles méthodes sur nos images se solde souvent par un échec s'expliquant par des images avec des caractéristiques différentes (en termes de dynamique des intensités et/ou de bruit de fond).

Ce constat nous a amené dans une démarche visant à associer l'ensemble des jeux de données ayant permis de valider notre outil. Une telle démarche permettra à un utilisateur de reproduire dans son environnement informatique les résultats obtenus dans notre laboratoire. Cette étape est souvent un pré-requis avant l'analyse d'un nouveau jeu de données dans un autre laboratoire. Nous avons donc rendu public à la communauté scientifique un premier jeu de données contenant des billes fluorescentes de taille théorique connue (1µm, 2.5µm et 4µm de diamètre) https://omero.bio.fsu.edu/webclient/userdata/?experimenter=902. Ces billes utilisées en métrologie lors de la calibration des microscopes nous ont permis de valider nos paramètres mathématiques (volume et surface) en situation réelle. La seconde partie du jeu de données que nous avons expertisé est composé de noyaux d'épithélium de cotylédons d'A. thaliana provenant d'un génotype sauvage et du mutant *k4c1c4*. Il nous a permis de valider notre processus d'analyse d'un point de vue algorithmique avec l'automatisation de l'analyse, mais aussi d'un point de vue biologique en montrant des différences attendues entre les populations par comparaison des paramètres morphologiques et des paramètres liés à l'organisation de la chromatine obtenus.

## 2.5 Développements informatiques associés à l'utilisation de NucleusJ2.0

Les méthodes de programmation en langage java ont évolué depuis la première version NJ1 avec notamment l'apparition de Maven https://maven.apache.org/ qui est un outil de gestion et d'automatisation de production. Cette plateforme est très utilisée par la communauté de développeurs de ImageJ et facilite
le partage et l'intégration du code. Ceci a permis d'intégrer plus facilement de nouvelles dépendances dans NucleusJ2.0, nous avons par exemple certaines fonctionnalités de morpholibJ [Legland et al., 2016] pour le calcul de paramètres morphologiques ou encore bio-format https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/ permettant de lire les images en formats propriétaires issus des microscopes. Maven permet également de produire une version logicielle complète incluant toutes les dépendances. Cette fonctionnalité représente deux avantages majeurs :

* Une facilité d'installation pour les utilisateurs biologistes qui ne nécessite uniquement un fichier au format jar à intégrer dans ImageJ.

* Une simplification de la maintenance des fonctionnalités du plugin, avec la possibilité de tester rapidement la compatibilité des dépendances en cas de changement de version.

Une grosse partie de mon travail de début de thèse à consisté à prendre en main ces outils et méthodes de développement informatique pour réorganiser le code de NucleusJ et ensuite y intégrer les nouvelles fonctionnalités et proposer NucleusJ2.0.

## 2.6 Article : "Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0"
<figure><img src="image_27.png" /></figure>

Nucleus

ISSN: (Print) (Online) Journal homepage: https://www.tandfonline.com/loi/kncl20

# Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0

Tristan Dubos, Axel Poulet, Céline Gonthier-Gueret, Guillaume Mougeot, Emmanuel Vanrobays, Yanru Li, Sylvie Tutois, Emilie Pery, Frédéric Chausse, Aline V. Probst, Christophe Tatout & Sophie Desset

**To cite this article:** Tristan Dubos, Axel Poulet, Céline Gonthier-Gueret, Guillaume Mougeot, Emmanuel Vanrobays, Yanru Li, Sylvie Tutois, Emilie Pery, Frédéric Chausse, Aline V. Probst, Christophe Tatout & Sophie Desset (2020) Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0, Nucleus, 11:1, 315-329, DOI: 10.1080/19491034.2020.1845012

**To link to this article:** https://doi.org/10.1080/19491034.2020.1845012

<figure><img src="image_28.png" /></figure>

© 2020 The Author(s). Published by Informa UK Limited, trading as Taylor & Francis Group.

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

View supplementary material 🌐

<figure><img src="image_30.png" /></figure>

Published online: 29 Nov 2020.

<figure><img src="image_31.png" /></figure>

Submit your article to this journal 🌐

<figure><img src="image_32.png" /></figure>

Article views: 523

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

View related articles 🌐

<figure><img src="image_34.png" /></figure>

CrossMark

View Crossmark data 🌐

<figure><img src="image_35.png" /></figure>

Citing articles: 1 View citing articles 🌐
<figure><img src="image_36.png" /></figure>

<figure><img src="image_37.png" /></figure>

# Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0

Tristan Dubos IDª, Axel Pouletᵇ, Céline Gonthier-Gueret IDᶜ, Guillaume Mougeot IDª,ᵈ, Emmanuel Vanrobays IDª, Yanru Liᵉ, Sylvie Tutois IDª, Emilie Pery ID>f, Frédéric Chausse ID>f, Aline V. Probst IDª, Christophe Tatout IDª, and Sophie Desset IDª

ªGReD, CNRS, INSERM, Université Clermont Auvergne, Clermont-Ferrand, France58; ᵇDepartment of Molecular, Cellular & Developmental Biology, Yale University, New Haven, CT, USA; ᶜNeurodol, INSERM, Université Clermont Auvergne, Clermont-Ferrand, France; ᵈDepartment of Biological and Medical Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, Oxford Brookes University, Oxford, UK; ᶜDepartment of Plant and Microbial Biology, Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich, Zürich, Switzerland; ᵇInstitut Pascal, Université Clermont Auvergne, Clermont-Ferrand, France

## ABSTRACT

NucleusJ 1.0, an ImageJ plugin, is a useful tool to analyze nuclear morphology and chromatin organization in plant and animal cells. NucleusJ 2.0 is a new release of NucleusJ, in which image processing is achieved more quickly using a command-lineuser interface. Starting with large collection of 3D nuclei, segmentation can be performed by the previously developed Otsu-modified method or by a new 3D gift-wrapping method, taking better account of nuclear indentations and unstained nucleoli. These two complementary methods are compared for their accuracy by using three types of datasets available to the community at https://www.brookes.ac.uk/indepth/images/. Finally, NucleusJ 2.0 was evaluated using original plant genetic material by assessing its efficiency on nuclei stained with DNA dyes or after 3D-DNA Fluorescence in situ hybridization. With these improvements, NucleusJ 2.0 permits the generation of large user-curated datasets that will be useful for software benchmarking or to train convolution neural networks.

## ARTICLE HISTORY

Received 18 August 2020
Revised 18 October 2020
Accepted 27 October 2020

## KEYWORDS

Three-dimensional
microscopy imaging; image
analysis; plant nucleus;
nuclear organization; 3D
DNA FISH

## Introduction

Investigation of nuclear morphology and its impact on chromatin organization is an active field [1]. Identification of key players that determine nuclear morphology at the nuclear periphery is a complex task, for which the model plant *Arabidopsis thaliana* offers an amenable genetic system. As in animals, the plant nucleus is delimited by a double membrane interrupted by nuclear pores, which allow exchanges with the cytoplasm. The outer nuclear membrane (ONM) is connected to the endoplasmic reticulum and the cytoskeleton, while the inner nuclear membrane (INM) is linked with a filamentous network constituting the nucleoskeleton [2]. The Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) complex provides a junction between the interior of the nucleus and the cytoplasm by means of SUN (Sad1 and Unc-84 homology) proteins anchored in the INM that interact with the nucleoskeleton [3,4] and

KASH (Klarsicht, Anc-1 and Syne homology) proteins anchored in the ONM and connected to the cytoskeleton, respectively [5,6]. In animals, the nucleoskeleton is made of lamins. Plants do not have lamin orthologs in term of sequence homology, but the CROWDED NUCLEI (CRWN) proteins, which contain long coiled-coil regions like lamins, are likely to have similar functions in nuclear morphology and chromatin organization [7,8] as well as in regulation of gene transcription [9,10]. Other proteins are thought to be involved in the constitution, or anchoring, of the nucleoskeleton at the nuclear periphery, such as KAKU4 [11] and NUCLEAR ENVELOPE ASSOCIATED PROTEINS (NEAPs) [12]. Most of these protein components have been shown to impact nuclear morphology, nuclei becoming usually smaller and more spherical in mutant backgrounds [13], allowing genetic screens for mutants with altered nuclear morphology [11]. To better understand the impact of the nuclear periphery on nuclear

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

<figure><img src="image_39.png" /></figure>

<figure><img src="image_40.png" /></figure>
organization, molecular techniques applied to the
whole genome such as chromatin conformation
capture (Hi-C) or Chromatin
Immunoprecipitation (ChIP-Seq) have been
applied in plants and brought a new vision of the
3D genome [14–16].

Bio-imaging is a complementary approach, in
particular when coupled to quantitative image
analysis [17]. However, the throughput of bio-
imaging limits its routine use in 3D image pro-
cessing [18]. To this aim, more automated meth-
ods are needed and efficient 3D segmentation is
required to delimit the boundary of objects such
as the nucleus or its chromatin organization [19].
Investigation of the cell nucleus has strongly
benefited from these applications, as the nucleus
is a spatial structure for which morphology can
be modified in diseases [20,21]. Segmentation
applied to nuclear organization is also a research
tool to investigate the genetic determinants of
nuclear size and shape and also chromatin orga-
nization [22,23]. There are various softwares
packages dedicated to nuclear segmentation
[24]. These are usually developed for the detec-
tion of nuclei in a wide-field stack and to com-
pute morphology parameters, but only a few of
these go as far as the analysis of the content and
organization of chromatin [25,26]. Moreover,
most of them are optimized for one given tissue
or cell type but they are not functional on images
containing a large diversity of nuclear size and
shape as found in plants [27]. These limitations
motivated the development of an ImageJ plugin
called NucleusJ dedicated to the analysis of
nuclear organization of 3D plant nuclei [23].
Within NucleusJ 1.0, segmentation methods to
compute nuclear morphology (a modified Otsu
threshold method) and chromatin organization (a
3D watershed method) were chosen as the most
relevant methods for nuclear segmentation for 3D
nuclei. Although initially developed for plant
nuclei stained with DNA dyes [23,28,29],
NucleusJ 1.0 can also be used for other cell
types [20] and adapted to segment Fluorescence
in situ hybridization (FISH) signals [29].
However, each NucleusJ 1.0 analysis is time-
consuming, the segmentation threshold is user-
dependent and nuclear segmentation failed for
a substantial fraction of nuclei.

Here, we introduce the optimized NucleusJ version termed NucleusJ 2.0. To increase the number of nuclei considered in a single analysis, a method was introduced to delimit an automatic bounding volume (autocrop) around each nucleus of a 3D wide-field stack containing 10 to a hundred nuclei. Each of the collected nuclei can then be segmented through two complementary methods, either based on the Otsu threshold method or on edge-detection through a 3D gift-wrapping method. From the segmented objects, NucleusJ 2.0 computes new nuclear morphology parameters using a revised and more accurate method of nuclear surface calculation. The accuracy of the measurements performed with NucleusJ 2.0 was confirmed with digitized spheres and multicolor fluorescent beads of standardized sizes. NucleusJ 2.0 was then used to characterize nuclei stained with DNA dyes or labeled with 3D-DNA FISH in whole-mount tissue of a plant mutant with strong alteration of nuclear morphology and chromatin organization. Finally, computation efficiency of NucleusJ 2.0 has been optimized to include a command line version that can be used on distant servers at computing centers.

**Material and methods**

Plant materials

All mutant and wild type (WT) *Arabidopsis thali-
ana* plants were from the Columbia-0 (Col-0) eco-
type. Mutant lines were T-DNA insertions
obtained from The Nottingham Arabidopsis
Stock Center (NASC): *kaku4-2* (SALK_076754),
*crwn1-2* (SALK_041774) and *crwn4-1*
(SALK_079296). The triple mutant *kaku4-2*
*crwn1-2 crwn4-1* (*k4c1c4*) was obtained by genetic
crosses. Cotyledons for image acquisitions were
grown from sterilized seeds sown on germination
medium containing 0.8% w/v agar, 1% w/v sucrose
and Murashige & Skoog salts (M0255; Duchefa
Biochemie, Netherlands), grown at 23°C and har-
vested 13 days after germination (dag). For phe-
notypic evaluation, seedlings were grown on soil in
an Arabilab growth chamber at 20°C. In both
cases, seeds were subjected to 2 days of stratifica-
tion at 4°C in the dark and then grown under 16 h
light/8 h dark cycles. The leaf area of the 21-day-
<figure><img src="image_41.png" /></figure>

old plants was determined with the ImageJ software using the SIOX (Simple Interaction Object eXtraction) plugin [30]. 13 dag cotyledons were used to determine the number of stomates, guard cell, and pavement cell nuclei. To this aim a maximum Z-projection of a wide-field stack stained with Hoechst 33,258 and a single plane image under transmission light using Differential Interference Contrast (DIC) were combined (overlap) as described in Figure 1.

## Digitized spheres and microspheres

Digitized spheres of various radii of 5, 10, 20, 30, 40, and 50 voxels were designed as binary objects (0 for the background, 1 for the object) using isotropic object voxels (i.e. cubes where X, Y, Z-axis values are 1, 1, 1) and background voxels

that do not belong to the object (Supplemental table 1). Fluorescent microspheres are standardized polystyrene beads commonly used for alignment and calibration of confocal microscopes. Slides containing fluorescent microspheres of 1, 2.5, and 4 µm diameter (Invitrogen) were used in this study (Supplemental table 2).

## Sample preparation, DNA staining and 3D DNA-FISH

3D images were obtained from whole mount preparations of 13 dag cotyledons as previously described [29,31]. Whole mount preparations were then used either for DNA staining using Hoechst-staining procedure (Hoechst 33 258 overnight at 1 µg/ml final) or for 3D-DNA Fluorescence *In Situ* Hybridization (3D DNA

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>**Figure 1.** Application of NucleusJ 2.0 autocrop method on a wide-field stack.</figcaption></figure>

(a) Output table from a typical experiment 'Autocrop_example' using Arabidopsis cotyledons stained with Hoechst 33,258 DNA dye. (b) Overlay of a maximum Z-projection of the Autocrop_example wide-field stack gained from a sample of cotyledon stained with Hoechst 33,258 and a single plane image under transmission light using Differential Interference Contrast (DIC). Coordinates (X, Y and Z start) of the nine nuclei are described in Figure 1a. DIC allows identifying nuclei of guard cells (autocrop boxes #0 and # 6, respectively, bordered in red and green), which are located at stomates and pavement cells outside of stomates. Autocrop automatically draws bounding boxes (from 0 to n) of the overlay and inverted Lookup Table (LUT) to easily look at the nuclei position. This example also highlights rare cases where the bounding box contains two different nuclei (autocrop box #4).(c) and (d) are close-up images of sub-regions of the Z-projection illustrating, respectively, a large pavement cell nucleus (autocrop box #0 in red) and a smaller and rounder guard cell nucleus (autocrop box #6 in green). (e) Multi-channel autocrop on 4 µm microspheres. Maximum Z-projection of a wide-field stack (left) with seven microspheres (#0 to 6). Selected Z-slice (right) of the same microsphere (autocrop box#2 in red) in two fluorescent channels; DAPI channel (top), FITC channel (bottom).(f) Multi-channel autocrop on plant nuclei. Overlay of a maximum Z-projection of the autocrop in DAPI channel wide-field stack (left) with 46 nuclei. Selected Z-slice (right) of nucleus #3 (red box) in three fluorescent channels; DAPI channel (gray level), Cy5 for 5S rDNA probe (green level) and Cy3 for 180bp probe (magenta level).
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Table 1. OMERO-FSU Datasets.</figcaption></figure>

<table><thead><tr><th>DATASET NAMES</th><th>ACQUISITION SYSTEM</th><th>DATASET NAMES</th><th>LINK</th><th>KEY FILTER</th><th>VALUE FILTER</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">#1 DIGITIZED SPHERES</td><td rowspan="2">Wide-field + OptoGrid</td><td>#1a DIGITIZED SPHERES - RAW</td><td>dataset-4902</td><td>RAW</td><td>DIGITIZED</td></tr><tr><td>#1b DIGITIZED SPHERES - SEGMENTED</td><td>dataset-4901</td><td>SEGMENTATION</td><td>OTSU</td></tr><tr><td rowspan="4">#2 FLUORESCENT MICROSPHERES</td><td rowspan="4">Wide-field + OptoGrid</td><td>#2a FLUORESCENT MICROSPHERES - ACQUISITION</td><td>dataset-4903</td><td>RAW</td><td>GIFT-WRAPPING</td></tr><tr><td>#2b FLUORESCENT MICROSPHERES - AUTOCROP</td><td>dataset-4951</td><td>PICTURE TYPE</td><td>Z MAX PROJECTION</td></tr><tr><td>#2c FLUORESCENT MICROSPHERES - RAW</td><td>dataset-4952</td><td>RAW</td><td>DAPI CROP</td></tr><tr><td>#2d FLUORESCENT MICROSPHERES - SEGMENTED</td><td>dataset-4953</td><td>SEGMENTATION</td><td>FITC CROP</td></tr><tr><td rowspan="5">#3 NUCLEAR MORPHOLOGY</td><td rowspan="5">Wide-field + OptoGrid</td><td>#3a NUCLEAR MORPHOLOGY - ACQUISITION</td><td>dataset-4954</td><td>RAW</td><td>OTSU</td></tr><tr><td>#3b NUCLEAR MORPHOLOGY - AUTOCROP</td><td>dataset-4955</td><td>PICTURE TYPE</td><td>GIFT-WRAPPING</td></tr><tr><td>#3 c NUCLEAR MORPHOLOGY - RAW</td><td>dataset-4956</td><td>RAW</td><td>WIDE FIELD STACK</td></tr><tr><td>#3d NUCLEAR MORPHOLOGY - SEGMENTED</td><td>dataset-4957</td><td>SEGMENTATION</td><td>DIC</td></tr><tr><td>#3e NUCLEAR MORPHOLOGY - RAW BAD CROPS</td><td>dataset-5009</td><td>RAW</td><td>Z MAX PROJECTION</td></tr><tr><td rowspan="4">#4 CHROMATIN ORGANIZATION</td><td rowspan="4">Wide-field + OptoGrid</td><td>#4 CHROMATIN ORGANIZATION - RAW</td><td>dataset-5018</td><td>SEGMENTATION</td><td>OVERLAY</td></tr><tr><td>#5a 180BP_5S DNA FISH - ACQUISITION</td><td>dataset-5010</td><td>RAW</td><td>DAPI CROP</td></tr><tr><td>#5b 180BP_5S DNA FISH - AUTOCROP</td><td>dataset-5011</td><td>PICTURE TYPE</td><td>OTSU</td></tr><tr><td>#5 c 180BP_5S DNA FISH - RAW</td><td>dataset-5012</td><td>SEGMENTATION</td><td>GIFT-WRAPPING</td></tr><tr><td rowspan="4">#5 180BP_5S DNA FISH</td><td rowspan="4">Wide-field + OptoGrid</td><td>#5d 180BP_5S DNA FISH - GIFT SEGMENTED</td><td>dataset-5015</td><td>SEGMENTATION</td><td>BAD CROP</td></tr><tr><td>#5e 180BP_5S DNA FISH - FISH SIGNALS</td><td>dataset-5016</td><td>SEGMENTATION</td><td>THRESHOLD WATERSHED</td></tr><tr><td>#6a SINGLE DNA FISH - RAW</td><td>dataset-5019</td><td>RAW</td><td>WIDE FIELD HYPERSTACK</td></tr><tr><td>#6b SINGLE DNA FISH - GIFT SEGMENTED</td><td>dataset-5021</td><td>SEGMENTATION</td><td>DIC</td></tr><tr><td rowspan="4">#6 5S DNA FISH</td><td rowspan="4">Confocal</td><td>#6c SINGLE DNA FISH - FISH SIGNALS</td><td>dataset-5022</td><td>SEGMENTATION</td><td>Z MAX PROJECTION</td></tr><tr><td>#6 d SINGLE DNA FISH - RAW</td><td>dataset-5023</td><td>SEGMENTATION</td><td>OVERLAY</td></tr><tr><td>#6e SINGLE DNA FISH - GIFT SEGMENTED</td><td>dataset-5024</td><td>SEGMENTATION</td><td>CY3 CROP</td></tr><tr><td>#6f SINGLE DNA FISH - FISH SIGNALS</td><td>dataset-5025</td><td>SEGMENTATION</td><td>CY3 CROP</td></tr></tbody></table>

Six types of image datasets (Dataset names) gained from wide-field or confocal microscopy (Acquisition systems) were stored as six main directories at OMERO-FSU under the name IDP3006. Dubos-Desset _2020. For each dataset, images were organized in acquisition, autocrop, raw and segmented sub-directories and can be directly accessed using the web link included into Table 1 (Link). OMERO allows to screen for key-value pairs (Key and value filters). Number of images are indicated in the last column. The six datasets and their image processing represent a total of 7,313 images.
<figure><img src="image_44.png" /></figure>

FISH). 3D DNA FISH experiments were performed as previously described [32]. 5S rDNA probe was produced from pCT4.2 vector [33] amplified with 5'CY5-dUTP and directly-labeled oligonucleotides (/CY5/CCCAAATTTTGACCTTTAAG) and (/CY5/GTCGACAAAAAGTCAATGGA) or with 5'CY3-dUTP and the same oligonucleotides without fluorescent labels. 180pb satellite repeat probe was designed as an LNA-oligonucleotide (/5TYE563/ GTATGATTGAGTATAAGAACTTAAACCG - Qiagen) [34].

## Microscope and image acquisition

Microscopic observations were performed by structured illumination microscopy to produce wide-field stacks using an Optigrid module (Leica-microsystems MAAF DM 16000B). All stacks were acquired using an X63 oil N.A. 1.4 objective and a digital CMOS Camera (ORCA-Flash4.0 V2 C11440-22 CU - Hamamatsu) at an optimal resolution such that lateral and axial resolution were respectively XY = 0.103 µm and Z = 0.2 µm. For better resolution, some confocal images were acquired with a Zeiss LSM 800 with an X63 oil N.A. 1.4 objective and a voxel size XY = 0.60 µm and Z = 0.2 µm. Final image numbers are given for each dataset in Table 1.

## Datasets storage and availability

Datasets were stored at OMERO-Florida State University (OMERO-FSU), a public repository under the accession number IDP3006 Dubos-Desset Nucleus 2020 that can be accessed through the INDEPTH COST-Action (CA16212) website at https://www.brookes.ac.uk/indepth/images/. The INDEPTH image webpage provides a guideline to access and download the datasets that are freely available for research purposes. More tutorials to use OMERO are available at the OMERO webpage at https://www.openmicroscopy.org/.

Six types of datasets were produced for this study (#1 to #6) (Table 1). Each dataset was stored at OMERO-FSU under the accession number IDP3006_Dubos-Desset_2020 where it was

organized in four folders: acquisition (wide-field stacks or confocal images), autocrop (results of autocrop processing), raw (3D images containing a single nucleus per stack) and segmented (raw image after segmentation) except for dataset#1, which was generated in *silico* and for that reason no acquisition nor autocrop was performed. OMERO allows screening for a subset of each dataset using key-pair values as described in Table 1. A training dataset is also available at OMERO-FSU under the accession number IDP2002 Dubos - Desset 2020.

## NucleusJ 2.0 algorithm development

Documentation: NucleusJ 2.0 is an ImageJ plugin in Java language released as a jar file for the ImageJ platform. Installation and usage guides are available at https://gitlab.com/DesTristus/NucleusJ2.0. The software contains a 3D autocrop module and three independent segmentation methods hereafter referred to as the modified Otsu, 3D gift-wrapping and 3D watershed methods. NucleusJ was described in a previous publication [23]. New functionalities or improvements are detailed below.

Autocrop: From any given 2D or 3D wide-field image a simple Otsu threshold [35] was applied to obtain a binary image *i.e.* transforming all the voxels of the image to a value of 0 for the background voxels and 1 for each voxel from the object (nucleus). Volume of each connected voxel (*i.e.* connected component) was computed using the MorpholibJ library [36] and connected components above 1 µm were conserved. Finally, for each connected component, a coordinate box was designed by adding as a default parameter 20 voxels at the most extreme voxels (*i.e.* boundary voxels) coordinated in each X, Y and Z dimensions. Note that the number of added voxels and hence the size of the coordinate box can be modified according to the specific application. An optional and configurable step is available when multiple coordinate boxes are produced for a single nucleus. This step groups boxes when they display a 50% shared surface. Finally, a maximum Z-projection of the initial wide-field image was automatically generated as a.tif file. In this 2D image, each nucleus was numbered and
surrounded by its coordinate box. A tabulated file containing the list of nuclei and coordinate boxes was produced as a `.txt` file. Documentation is provided as Supplemental file 1.

**Gift-wrapping:** To provide an independent and complementary method to the modified Otsu threshold method available in NucleusJ 1.0, the Jarvis march algorithm [37] was implemented into NucleusJ 2.0 (Supplemental file 2). For the sake of simplicity, the method was designed in 2D and implemented slice by slice to the whole 3D object. Hence, three axes *i.e.* XY, XZ, and YZ were used to decompose the 3D volume in 2D slices. The method then computed the union of each possible plan in XY XZ YZ. For each slice, in order to tune the 3D gift-wrapping algorithm, and to fill the shape artifacts as well as possible, a parameter of maximal threshold distance *td* was applied between two vertices defining the final boundary. The best threshold distance was determined experimentally as the half of the estimated radius of a sphere with a volume equivalent to the object one (Supplemental file 2).

**SurfaceArea calculation:** When analyzing 3D objects, the surface area plays an important role for shape description. In NucleusJ 1.0, the surface area parameter was computed for any given object as the sum of all voxel boundary exposed to the background. This was improved in NucleusJ 2.0 to better take into account the contribution of each surface element area using the discrete geometry technique [38]. The first step of the area calculation was to determine the image gradient of the raw image *f*, which was estimated from finite differences in the anisotropic image (Supplemental file 3). The algorithm then browsed each boundary voxel of the segmented object. For each boundary voxel, the contribution of each surface element area was then computed for the final area.

Nuclear morphology parameters in NucleusJ 2.0: NucleusJ 2.0 was revisited for its functionalities to segment nuclei. Description of the quantitative parameters generated by NucleusJ 1.0 can be found in supplemental materials of [23]. Parameters computed by NucleusJ 2.0 are described in Supplemental file 4.

## Statistics

Statistical analyses were performed using various R packages [39] for Principal Component Analysis (PCA) ggplot2 [40], factoextra (https://rpkgs.data

novia.com/factoextra/) and FactoMineR [41] were used. Student t-test was used to compare means between WT and mutant backgrounds.

## Results

### Automatic selection of 3D nuclei from wide-field stacks using a 3D autocrop process

Any kind of 3D bio-image analysis starts with the capture of images of best quality. During this initial step, 3D stacks containing the objects of interest, such as a cell nucleus, are collected either one by one when using a confocal microscope or by collecting multiple nuclei at a time using wide-field microscopy. In the latter, bounding boxes surrounding the 3D nuclei have to be defined to delimit and extract (crop) the appropriate volume containing each nucleus. Automatic tracking of segmented objects would strongly reduce this tedious manual step. Setting-up such middle to high-throughput 3D tracking process is a timely objective when using wide-field stacks to rapidly buildup large image datasets [42].

While ImageJ offers 3D crop and 2D autocrop plugins [42,43] automated and scalable 3D autocrop plugins to extract multiple nuclei from wide-field stacks is missing. Furthermore, detection of multiple objects should take into account variable fluorescence intensity between objects that does not allow the same segmentation threshold to be applied to the whole stack.

Our initial motivation was to implement a simple and rapid method to automatically identify and isolate large numbers of 3D nuclei from wide-field stacks, a process hereafter called autocrop. Once the objects are delimited in the wide-field stack, more sophisticated segmentation methods could be applied for each single object regardless of their fluorescence intensity. The autocrop basic principle relies on a simple Otsu threshold method [35] applied in 3D to the wide-field stack (Materials and Methods). To avoid the selection of too many objects from the background, a simple and scalable size filter was introduced. In our plant model, this has been useful to filter-out chloroplasts that as autofluorescent objects are considered as noise in our analyses. A second scalable filter allows limiting the number of multiple boxes
<figure><img src="image_45.png" /></figure>

for a given object, which was proven to be helpful especially for large nuclei. Default autocrop parameters can be modified prior to the analysis through a simple configuration file (config file). More details are available in the autocrop documentation (Supplemental file 1). The method is illustrated below for 3D stacks although it can also be used for 2D images.

The autocrop process with default settings was applied for microspheres and wide-field stacks of whole mount cotyledons of WT stained with DNA dyes (Materials and Methods; Supplemental tables 2–3). The autocrop produces i) a collection of 3D images containing a single object stored in a dedicated folder, ii) a table containing the spatial coordinates of the bounding box (X, Y and Z) to trace back their positions in the original wide-field stack, iii) the bounding box volumes (width, height, and depth) and iv) an inverted color 2D Z-projection using maximum intensity projection, in which each object is numbered (Figure 1(a-c)). The number of cropped objects obtained after the autocrop process depends on the density and size of the objects within the original wide-field stack. For instance, 91 successful crops were obtained from 3 wide-field images for 1 µm microspheres, while only 46 crops were obtained for 4 µm microspheres (Supplemental table 2). When imaging the epidermis of an Arabidopsis cotyledon, a typical experiment described in Supplemental table 3 that starts with 12 WT plants generates 35 wide-field stacks (average of 3 images per cotyledon) allows generating 786 crops using the autocrop method (average of 22 crops per wide-field stack). Once the autocrop is performed, an overlay of the Z-projection allows tracing back the nuclei in their tissue context and annotating them regarding their origin (i.e. guard cell or pavement cell nuclei) or their pertinence (some objects that are not nuclei are detected) (Figure 1(b-d)). In this experiment, the Z-projection inspection allowed discarding 92 abnormal nuclei. Finally, 694 nuclei (88% of the initial crops) were usable to further analysis of their nuclear morphology.

An interesting functionality of the autocrop is to generate multiple autocrops from a given wide-

field stack using the same coordinate table to select identical boxes in different wavelength channels. This application is illustrated with microspheres of 4 µm labeled with fluorophores emitting in the DAPI (blue) and FITC (green) channels (Figure 1 (e)) and with plant nuclei labeled with DNA dyes and two fluorescent probes emitting in two distinct channels (figure 1(f)). This functionality allows capturing DAPI and probe channels in typical Fluorescence *in situ* hybridization (FISH) experiments from the same image.

In our hands, the 3D autocrop method applied to wide-field stacks is an efficient automated process to detect position and isolate large numbers of nuclei that can then be subjected to further image analysis.

**3D gift-wrapping as a complementary method for nuclear segmentation of plant nuclei**

There is an increasing demand in biology to describe nuclear morphology (shape and size) or to evaluate the organization of chromatin domains [18,44]. A first step in such an image analysis is to delimit the nucleus from the background, a process called segmentation. We previously developed a modified Otsu threshold segmentation process delimiting the nuclear boundaries according to their range of gray scale values [23]. However, despite the improvement of the original Otsu method, 10–20% of nuclei with poor segmentation still needed to be discarded after manual curation of the images (Figure 2(a)). Standardization of sample preparation and image acquisition protocol [31] did not overcome this bias.

Careful analysis identified two main characteristics of the nuclei that were poorly segmented. First, the nucleolus that is not stained by DNA dyes such as DAPI or Hoechst is often excluded during the segmentation step. This phenomenon is common for large nuclei containing large nucleoli. A simple fill step was then introduced before segmentation. However, this did not solve the abnormal segmentation when the nucleolus is close to the nuclear periphery (Figure 2(a)). Second, very high signal intensity was observed for some chromocenters of large nuclei leading to the detection of chromocenters not as an object within a nucleus
a

<figure><img src="image_46.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

c

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

d

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 2.** Evaluation of a 3D gift-wrapping method of segmentation.</figcaption></figure>

(a) Example of a nucleus raw slice (left) after Otsu-modified segmentation (middle) and gift-wrapping segmentation (right). Artefactual indentation at the nuclear border (arrow #1); Nucleolus border (arrow #2).(b) Comparison of Otsu and gift-wrapping methods using standardized microspheres. Microsphere volume of 1, 2.5 and 4 µm diameter (n = 28, 24, and 15, respectively) were computed by the Otsu (green triangle) and gift-wrapping (gray square) methods and compared to theoretical volumes (red circle) (Supplemental table 2).(c) Comparison of nuclear volumes after segmentation of plant nuclei by the Otsu or gift-wrapping methods. Nuclei were split into two categories: guard cells (n = 375) and pavement cells (n = 127) (Supplemental table 4) were segmented by the two methods and volumes of the segmented nuclei were computed by NucleusJ 2.0. Modified Otsu method (gray); gift-wrapping (green). Student t-test P-value: *** <0.0001, * = 0.0046.(d) Principal component analysis of morphology parameters (Flatness, Elongation, New surface area and Volume) obtained after segmentation by the gift-wrapping (left) or Otsu (right) methods of the same nuclei as in Figure 2c. Guard cell nuclei (GC, black) and pavement cell nuclei (PC, orange).

but as a distinct object (i.e. a nucleus). This results in segmentation of the nucleus into several small objects. In summary, poor segmentation of plant nuclei was strongly biased toward larger nuclei with high contrast between chromocenters and nucleolus that generated concavity artifacts and holes. This also induced a bias in our analysis as a substantial fraction of the larger nuclei was discarded from the analysis.

To improve our 3D segmentation process, an alternative method, hereafter called gift-wrapping, was implemented in 3D using an edge-based segmentation [37]. The algorithm segments one 2D slice at once in all orientations of the 3D object before building the 3D segmentation (Materials and Methods).

The gift-wrapping method was implemented in NucleusJ 2.0, which now produces three folders i.e. one folder for nuclei segmented by the Otsu modified method, one segmented by the gift-wrapping method and a third one containing the nuclei that cannot be segmented. This last category is classified as ‘bad crop’ (Supplemental table 3). First, we confirmed that the method did not alter the segmentation of small convex objects with a homogeneous signal, like microspheres (Figure 2(b), Supplemental table 2). Then, a dataset of 502 nuclei from WT plants stained with Hoechst was used to evaluate the appropriateness of the method (Supplemental table 4). Shape artifacts due to the nucleolus or to low staining intensity were
<figure><img src="image_50.png" /></figure>

efficiently removed (Figure 2(a)). The limit of this method is its accuracy, as the measured nuclear volume is significantly increased especially for small objects such as guard cell nuclei (Figure 2 (c)). This over-segmentation also leads to the loss of 0.02% of the nuclei (Supplemental table 4) located at the boundaries of the 3D images that are then considered as incomplete by the software. Although the gift-wrapping method increases the size of segmented objects, PCA analysis confirmed that it does not introduce bias in the analysis and that the two nuclei populations of different cellular origin are still nicely distinguished (Figure 2(d)).

The 3D gift-wrapping segmentation process therefore resolves some drawbacks of our previous Otsu modified method by decreasing the bias previously observed for the segmentation of larger nuclei. It

provides an alternative, more efficient, segmentation method for plant nuclei.

## Computer parameter optimization

Describing nuclear morphology requires an accurate estimation of the nuclear volume and surface area. NucleusJ 1.0 takes advantage of MorphoLibJ, a library that calculates the volume as the sum of voxels included into the segmented nucleus, multiplied by the volume of an individual voxel (voxel calibration) and computes the surface area through a modified version of the Crofton formula [36].

To compute the surface area, surfaces of all voxels delimiting the boundary of the object are summed [23]. However, this calculation was the more error-prone, with the error increasing for

<figure><img src="image_51.png" /></figure>

<figure><img src="image_52.png" /></figure>

<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 3.** Evaluation of a new method of Surface Area calculation implemented into NucleusJ 2.0.</figcaption></figure>

(a) Digitized spheres of various radii of 5, 10, 20, 30, 40, and 50 voxels were generated and used to calculate the surface area (Supplemental table 1) with the initial and newly developed calculation method. Data are presented as a ratio between the observed and theoretical size of the digitized spheres. Student t-test P-value: *** <0.0001.(b) Fluorescent Microspheres of diameter of 1, 2.5, and 4 µm (n = 28, 24, and 15, respectively) were imaged using the wide-field microscope with an optigrid module, subjected to autocrop and segmented by the two NucleusJ 2.0 segmentation methods. Surface area gained from Otsu and gift-wrapping segmentation was then computed with the initial and new method of calculation (Supplemental table2). Red: theoretical surface area; gray: Otsu method; green: gift-wrapping method; triangle: new method; square: initial method. (c) Plant nuclei. Surface area of nuclei from cotyledon epidermis of WT plants were segmented by the Otsu or gift-wrapping methods. Nuclei from guard cells (GC, n = 375) and pavement cells (PC, n = 127) (Supplemental table 4). Student t-test P-value: *** <0.0001.
<figure><img src="image_54.png" /></figure>

small-segmented objects consisting of only a few voxels. This approximation led to significant over-estimation of the surface area, when artificial objects or standardized microspheres were measured with NucleusJ 1.0 (Figure 3(a)).

To correct the surface area computation, a new method (Materials and Methods) was implemented in NucleusJ 2.0 to calculate the surface element (surfel) contribution of each voxel using an iterative convolution method based on *on-surface convolution* [38]. The algorithm browses each boundary voxel delimiting the 3D object from the background of the segmented image. For each boundary voxel, the contribution of each surfel to the final area is computed. While the surface area calculation remains imperfect, it gives more meaningful results for digitized spheres of variable radius with a ratio between calculated and theoretical surface area of 1.068 and 1.084 instead of 1.608 and 1.636, respectively, for the Otsu and gift-wrapping segmentation methods (Figure 3(a)). The accuracy of our surface calculation was also assessed using standardized microspheres of three distinct diameters ranging from 1 to 4 µm. For these, the new surface area calculation was closer to the theoretical values (Figure 3(b)). Surface area was also assessed for a dataset of 502 nuclei from WT plants stained with Hoechst indicating that the surface area was over-estimated when the surface area was calculated with NucleusJ 1.0 (Figure 3(c)).

Taken together, a new surface area calculation is now introduced in NucleusJ 2.0 to obtain a more realistic value of this key parameter.

## Application of NucleusJ 2.0 to quantify alterations of nuclear morphology and nuclear organization

To better understand the contribution of nuclear morphology to chromatin organization, one possible approach is to compare WT and mutant plants. *crwn* mutants are well described and show altered nuclear morphology, chromatin organization and gene expression [7–10]. *CRWNs* are a small gene family composed of four members with CRWN1 proteins having major effects on nuclear morphology (smaller and rounder nuclei in *crwn1* mutants) and CRWN4 having major

effects on chromatin organization (dispersed chromocenters and 5S rRNA gene signals in *crwn4* mutants). Additive phenotypes are observed in the double *crwn1 crwn4* mutant [8]. Furthermore, an additional protein of the plant nuclear lamina called KAKU4 was found to co-immunoprecipitate with CRWN1 and CRWN4 [11].

We, therefore, used NucleusJ 2.0 to compare WT Col-0 seedlings (hereafter WT) and a *kaku4-2 crwn1-2 crwn4-1* mutant in the Col-0 genetic background (hereafter called *k4c1c4* mutant). The *k4c1c4* mutant was chosen for its strong impact on plant growth (Supplemental Figure 1(a)). We acquired 35 and 28 wide-field stacks, respectively, from 12 WT and 10 mutant plants stained with Hoechst. After the autocrop and segmentation process, WT (n = 502) and *k4c1c4* mutant (n = 672) nuclei were annotated manually as guard (GC) or pavement cell (PC) nuclei after examination of the Z-projection (Supplemental tables 3–4). Despite the reduced plant size of the triple mutant, we found an increased number of stomates (7.5 and 10.11, respectively, in WT and *k4c1c4* mutant; Supplemental table 5) and observed a significant increase in nuclear density both in guard and pavement cells (Supplemental Figure 1b). The dataset was then used to assess nuclear morphology and chromocenter organization. Results gained from our new gift-wrapping method are presented in Figure 4. The nuclei of the *k4c1c4* mutant are strongly affected for most of the nuclear parameters and show reduced nuclear size, reduced elongation (Figure 4(a)) and fusion of chromocenters leading to an increased chromocenter volume (Figure 4(b)). This is very similar to previous results obtained with *crwn1 crwn2* mutant [23]. NucleusJ can also be used to quantify 3D DNA FISH signals. To illustrate this application, two new datasets of 3D-DNA-FISH images were used to investigate the effect of the triple *k4c1c4* mutant. The distinct fluorescent channels were collected corresponding to signals from the DNA dye and the probes for 180bp and 5S rDNA repeats (Supplemental tables 7–8). The *k4c1c4* mutant shows a reduced number of 180bp signals, however, situated at similar positions close to the nuclear periphery as in WT nuclei (Figure 5(a) and 5(c)). In contrast, 5S rDNA loci, while their number is very similar to the WT, are
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Figure 4.** NucleusJ2.0 analysis of the *k4c1c4* mutant with 1altered nuclear morphology and chromatin organization.

Nuclear morphology parameters were computed by the gift-wrapping segmentation method using an initial dataset of WT (n = 663) and *k4c1c4* mutant (n = 881) nuclei described in Supplemental table 4.(a) Nuclear morphology parameters computed by NucleusJ 2.0 on GC and PC cells: nuclear volume (µm³), flatness, elongation and surface area (µm²). WT (n = 502) and *k4c1c4* mutant (n = 672) (Supplemental table 4). Student t-test P-value: * <0.01, ** <0.001 and *** <0.0001.(b) Chromatin organization parameters computed by NucleusJ 2.0: number of chromocentres (NbCc), Mean of chromocentre volume (VCc Mean, µm³), total volume of chromocentres (VCc Total, µm³), and distance between chromocentre barycenter and the nuclear envelope (d(CcBarycentre/NE), µm). WT (n = 186) and *k4c1c4* mutant (n = 81) (Supplemental table 6). Student t-test P-value: ns > 0.01, ** <0.001 and *** <0.0001.(c) and d) Principal component analysis using morphological parameters (n = 1544; Supplemental table 4) and chromatin organization parameters (n = 267; Supplemental table 6).(e) Typical images chosen with parameters close to the median values of morphological parameters and chromatin organization parameters. Z-projection of raw nuclei. Scale Bar 2 µm. GC: guard cell, PC: pavement cell.</figcaption></figure>

smaller in size and localize closer to the nuclear envelope (Figure 5(b) and 5(d)). Each of the NucleusJ 2.0 parameters describing the *k4c1c4* mutant is illustrated in Supplementary Figure 2 indicating a very strong effect of the mutant background on the organization of the 180bp satellite repeats.

In summary, we demonstrate that the new version of NucleusJ 2.0 can also be efficiently used to quantify alterations of nuclear domains as revealed by DNA dyes (i.e. chromocenters) or by 3D-DNA FISH (180bp satellite repeat and 5S rDNA arrays).

## Discussion

Nuclei morphology is intrinsically linked to biological processes like gene regulation or development and has been widely used as a marker for human disease [21]. Microscopy imaging provides

a classical mean to investigate nuclear morphology variations with segmentation as a critical step in the image analysis process. Although large numbers of segmentation methods are available, no universal segmentation technique will work for all images and all model systems and only few of them are suitable for big data analyses.

We provide evidence that our methods to calculate nuclear morphology parameters are accurate by using virtual objects like digitized spheres and standardized microbeads usually used to calibrate confocal microscopes and cell sorters.

The first step in NucleusJ is to describe the nuclear morphology. We have now implemented two complementary segmentation methods into NucleusJ 2.0 that give slightly different results. As a simple and fast method, the Otsu method relies on the application of a threshold to distinguish the object from the background, but
<figure><img src="image_57.png" /></figure>

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>**Figure 5.** Analysis of aspect and position of 180pb and 5S rDNA repeats revealed by 3D-DNA FISH using NucleusJ 2.0.</figcaption></figure>

NucleusJ 2.0 parameters applied to A) 180bp signals and B) 5S rDNA. Parameters: number of DNA FISH signals, mean volume of FISH signal (µm³), total volume of FISH signal (µm³), distance between FISH signal border and the nuclear envelope (d(FISH signal Border/NE), µm) and distance between FISH signal barycenter and the nuclear envelope (d(Barycenter of FISH signal/NE), µm) (Supplemental tables 7–8). Student t-test P-value: ns >0.01, * <0.01, ** <0.001 and *** <0.0001. C) Typical 3D DNA FISH Z-projection of pavement cell nuclei of WT (n = 65 for 180bp and n = 32 for 5S) and D) *k4c1c4* mutant (n = 95 for 180bp and n = 48 for 5S) (Supplemental tables 7–8). From left to right: Hoechst (DNA, blue), 5µg TYE 563 LNA probe (180bp, purple), CY5 PCR probe (5S, green) and merge. Scale Bar 2 µm.

defining the most relevant threshold for each
single nucleus of a wide-field stack is not
a simple task as local variations have to be
taken into consideration. This method is also
sensitive to nuclear indentations and low labeling
area at the position of the nucleolus often located
close to the nuclear periphery. The gift-wrapping
method was shown to be less sensitive to these
factors. It has however the drawback of slightly
increasing the object volume and it requires
more computing resources than the Otsu
method. This is one of the reasons to offer
a command line version of NucleusJ 2.0 to use
more powerful servers at computing centers.
Taken together, the two methods are considered
complementary to each other and present two
possible alternatives to generate segmented
datasets.

The autocrop process will contribute to middle
throughput 3D image analysis. It automatically
produces an average of 21 isolated 3D nuclei in
about 6 minutes reducing substantially the time-

intensive manual process. Starting from these large
populations of nuclei, NucleusJ 2.0 then describes
automatically the 3D nuclear morphology.

The second step in NucleusJ 2.0 was to describe
chromatin organization and a triple *kaku4-2 crwn
1-2 crwn 4-1* mutant was used to illustrate the
potential of our new software. In the triple mutant
some nuclear morphology parameters are altered:
guard cells show reduced nuclear volume, while
pavement cells show an increased surface area and
both types of nuclei revealed reduced flatness in
the mutant background.

We illustrated the use of NucleusJ 2.0 to mea-
sure FISH signals in a quantitative manner in
order to estimate the volume occupied by the
FISH signals. Then, the border or the barycenter
of the signal are used to compute the positions of
the FISH signal in respect to the nuclear periphery.
This offers an original method to quantify chro-
matin compaction while most softwares often
define FISH signals as standardized spots that
can only be used to compute distances. Using
<figure><img src="image_59.png" /></figure>

this method we observed that the 180bp signals are
more dispersed while the 5S rDNA loci seem more
condensed in the mutant background and prefer-
entially locate at the nuclear periphery. All these
parameters were detected successfully by the new
software update and are consistent with previous
observations [8].

Segmentation of nuclear domains remains chal-
lenging to characterize nuclear architecture and
NucleusJ 2.0 can provide a solution. In future,
further optimization of nuclear domain detection
and quantification are required as this still relies
on a 3D watershed process, which is time-
consuming and user-dependent. Recent progress
in Artificial Intelligence is opening up new oppor-
tunities to improve 3D bio-imaging.
Convolutional Neural Networks (CNN) such as
those developed for U-Net, Ilastik, or Star dist
[45-47] have been successfully applied for 3D bio-
imaging. For the 3D watershed process, prelimin-
ary tests using a U-Net CNN [46] currently under
development are promising. We expect that the
present study, which provides several well-
annotated training datasets, will help to pave the
way for the development of CNN methods, which
we expect will transform the way we acquire and
analyze 3D images creating an automated high-
performance tool well designed for big-data ana-
lysis. Here it is important to highlight the need for
large, high-quality datasets to train new CNNs.
When looking at image repositories, large-
annotated 3D nuclear datasets, digitized objects
or standardized microspheres are not easily acces-
sible to benchmark new software or train new
networks. This work supported by the COST-
Action CA162121 is a first attempt to provide
such datasets to the community through a fully
public repository with free access to the data.

Acknowledgments

The work of CG, TD, SD, AVP and CT was supported by
CNRS, INSERM, Université Clermont Auvergne (UCA), 16-
INDEX-0001 CAP 20-25 challenge 1, Temporary Assignment to
the CNRS (CT), Pack Ambition Recherche project Noyau-HD
from the Region Auvergne Rhone Alpes and the COST-Action
INDEPTH (CA16212). All pictures were acquired at the CLIC
microscopy facility (CLermont Imagerie Confocale). We would
like to acknowledge Eric Richards and Kentaro Tamura who
made available initial mutant seeds, Rémy Malgouyres for his

advises in discrete geometry and Pierre Pouchin for his assis-
tance for using ImageJ and OMERO. Finally, we thank David
Evans for critical reading of the manuscript.

Disclosure statement

No potential conflicts of interest were disclosed.

Funding

European Cooperation in Science and Technology
[CA16212]; Initiative Science-Innovation-Territoires
-Économie [16-INDEX-0001 CAP 20-25 challenge 1]; Région
Auvergne-Rhône-Alpes [NOYAU-HD].

ORCID

Tristan Dubos http://orcid.org/0000-0002-4265-2379

Céline Gonthier-Gueret http://orcid.org/0000-0002-4449-559X

Guillaume Mougeot http://orcid.org/0000-0003-3576-7300

Emmanuel Vanrobays http://orcid.org/0000-0002-3209-6743

Sylvie Tutois http://orcid.org/0000-0003-3429-2470

Emilie Pery http://orcid.org/0000-0001-6198-9973

Frédéric Chausse http://orcid.org/0000-0001-7794-1587

Aline V. Probst http://orcid.org/0000-0001-9534-8058

Christophe Tatout http://orcid.org/0000-0001-5215-2338

Sophie Desset http://orcid.org/0000-0002-4897-4977

References

[1] Skinner BM, Johnson EEP. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 2017;126:195-212.

[2] Meier I, Richards EJ, Evans DE. Cell biology of the plant nucleus. Annu Rev Plant Biol. 2017;68:139-172.

[3] Graumann K, Runions J, Evans DE. Characterization of SUN-domain proteins at the higher plant nuclear envelope. Plant J. 2010;61:134-144.

[4] Graumann K, Vanrobays E, Tutois S, et al. Characterization of two distinct subfamilies of SUN-domain proteins in Arabidopsis and their interactions with the novel KASH-domain protein AtTIK. J Exp Bot. 2014;65:6499-6512.

[5] Tamura K, Iwabuchi K, Fukao Y, et al. Myosin XI-i links the nuclear membrane to the cytoskeleton to control nuclear movement and shape in Arabidopsis. Curr Biol. 2013;23:1776-1781.

[6] Zhou X, Graumann K, Evans DE, et al. Novel plant SUN-KASH bridges are involved in RanGAP anchoring and nuclear shape determination. J Cell Biol. 2012;196:203-211.
<figure><img src="image_60.png" /></figure>

[7] Dittmer TA, Stacey NJ, Sugimoto-Shirasu K, et al. LITTLE NUCLEI genes affecting nuclear morphology in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 2007;19:2793-2803.

[8] Wang H, Dittmer TA, Richards EJ. Arabidopsis CROWDED NUCLEI (CRWN) proteins are required for nuclear size control and heterochromatin organization. BMC Plant Biol. 2013;13:200.

[9] Choi J, Strickler SR, Richards EJ. Loss of CRWN nuclear proteins induces cell death and salicylic acid defense signaling. Plant Physiol. 2019;179:1315-1329.

[10] Guo T, Mao X, Zhang H, et al. Lamin-like proteins negatively regulate plant immunity through NAC WITH TRANSMEMBRANE MOTIF1-LIKE9 and NONEXPRESSOR OF PR GENES1 in Arabidopsis thaliana. Mol Plant. 2017;10:1334-1348.

[11] Goto C, Tamura K, Fukao Y, et al. The novel nuclear envelope protein KAKU4 modulates nuclear morphology in Arabidopsis. Plant Cell. 2014;26:2143-2155.

[12] Pawar V, Poulet A, Détourné G, et al. A novel family of plant nuclear envelope-associated proteins. J Exp Bot. 2016;67:5699-5710.

[13] Tatout C, Evans DE, Vanrobays E, et al. The plant LINC complex at the nuclear envelope. Chromosome Res. 2014;22:241-252.

[14] Bi X, Cheng Y-J, Hu B, et al. Nonrandom domain organization of the Arabidopsis genome at the nuclear periphery. Genome Res. 2017;27:1-12.

[15] Grob S, Schmid MW, Grossniklaus U. Hi-C analysis in arabidopsis identifies the KNOT, a structure with similarities to the flamenco locus of drosophila. Mol Cell. 2014;55:678-693.

[16] Hu B, Wang N, Bi X, et al. Plant lamin-like proteins mediate chromatin tethering at the nuclear periphery. Genome Biol. 2019;20:87.

[17] Eliceiri KW, Berthold MR, Goldberg IG, et al. Biological imaging software tools. Nat Methods. 2012;9:697-710.

[18] Dumur T, Duncan S, Graumann K, et al. Probing the 3D architecture of the plant nucleus with microscopy approaches: challenges and solutions. Nucleus. 2019;10:181-212.

[19] Kaur D, Kaur Y Various image segmentation techniques: a review. 2014; 6.

[20] Kemeny S, Tatout C, Salaun G, et al. Spatial organization of chromosome territories in the interphase nucleus of trisomy 21 cells. Chromosoma. 2017;127: 247-259.

[21] Zink D, Fischer AH, Nickerson JA. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 2004;4:677-687.

[22] Andrey P, Kiieu K, Kress C, et al. Statistical analysis of 3D images detects regular spatial distributions of centromeres and chromocenters in animal and plant nuclei. PLoS Comput Biol. 2010;6:e1000853.

[23] Poulet A, Arganda-Carreras I, Legland D, et al. NucleusJ: an ImageJ plugin for quantifying 3D images

of interphase nuclei. Bioinformatics. 2015;31:1144-1146.

[24] Xing F, Yang L. Robust nucleus/cell detection and segmentation in digital pathology and microscopy images: a comprehensive review. IEEE Rev Biomed Eng. 2016;9:234-263.

[25] Iannuccelli E, Mompart F, Gellin J, et al. NEMO: a tool for analyzing gene and chromosome territory distributions from 3D-FISH experiments. Bioinformatics. 2010;26:696-697.

[26] Ollion J, Cochennec J, Loll F, et al. TANGO: a generic tool for high-throughput 3D image analysis for studying nuclear organization. Bioinformatics. 2013;29:1840-1841.

[27] Chytilova E, Macas J, Sliwinska E, et al. Nuclear dynamics in Arabidopsis thaliana. Mol Biol Cell. 2000;11:2733-2741.

[28] Benoit M, Simon L, Desset S, et al. Replication-coupled histone H3.1 deposition determines nucleosome composition and heterochromatin dynamics during Arabidopsis seedling development. New Phytol. 2019;221:385-398.

[29] Poulet A, Duc C, Voisin M, et al. The LINC complex contributes to heterochromatin organisation and transcriptional gene silencing in plants. J Cell Sci. 2017;130:590-601.

[30] Friedland G, Jantz K, Rojas R SIOX: simple interactive object extraction in still images. Seventh IEEE International Symposium on Multimedia (ISM'05), Irvine (CA). 2005. p. 253-259.

[31] Desset S, Poulet A, Tatout C. Quantitative 3D analysis of nuclear morphology and heterochromatin organization from whole-mount plant tissue using nucleus. J Methods Mol Biol. 2018;1675:615-632.

[32] Bauwens S, Katsanis K, Van Montagu M, et al. Procedure for whole mount fluorescence in situ hybridization of interphase nuclei on Arabidopsis thaliana. Plant J. 1994;6:123-131.

[33] Campell BR, Song Y, Posch TE, et al. Sequence and organization of 5S ribosomal RNA-encoding genes of Arabidopsis thaliana. Gene. 1992;112:225-228.

[34] Simon L, Probst AV. High-affinity LNA-DNA mixmer probes for detection of chromosome-specific polymorphisms of 5S rDNA repeats in arabidopsis thaliana. In: Bemer M, Baroux C, editors. Plant Chromatin Dynamics. New York: Springer New York; 2018. p. 481-491.

[35] Otsu N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 1979;9:62-66.

[36] Legland D, Arganda-Carreras I, Andrey P. MorphoLibJ: integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. Bioinformatics. 2016;32: 3532-3534. Oxford Academic.

[37] Jarvis RA. On the identification of the convex hull of a finite set of points in the plane. Inf Process Lett. 1973;2:18-21.
<figure><img src="image_61.png" /></figure>

[38] Fourey S, Magouyres R. Normals estimation for digital surfaces based on convolutions. Comput Graphics. 2009;33:2–10.

[39] The R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. r foundation for statistical computing. 2015;Version 3.2.3.

[40] Wickham H. ggplot2: elegant graphics for data analysis [internet]. New York:Springer-Verlag. 2009. cited 2020 Aug 3. Available from: https://www.springer.com/gp/book/9780387981413

[41] Lê S, Josse J, Husson F, others. FactoMineR: an R package for multivariate analysis. J Stat Softw. 2008;25:1–18.

[42] Schindelin J, Rueden CT, Hiner MC, et al. The ImageJ ecosystem: an open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 2015;82:518–529.

[43] Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH image to imageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9:671.

[44] Parry G, Aline PV, Baroux C, et al. Meeting report - INDEPTH kick-off meeting. Journal of cell science. 2018;131.

[45] Berg S, Kutra D, Kroeger T, et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 2019;16:1226–1232, Nature Publishing Group

[46] Çiçek Ö, Abdulkadir A, Lienkamp SS, et al. 3D U-Net: learning dense volumetric segmentation from sparse annotation. In: Ourselin S, Joskowicz L, Sabuncu M, et al., editors. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention – MICCAI 2016. MICCAI 2016. Lecture notes in computer science. Vol. 9901. Cham: Springer; 2016. p. 424–432.

[47] Schmidt U, Weigert M, Broaddus C, et al. Cell detection with star-convex polygons. arXiv:180603535 [cs]. 2018;11071:265–273.
## 2.7 Résultats annexes et devenir de l'outil

Cette partie décrit les développements annexes dédiés à la seule automatisation du plugin. En effet, le plugin initial a été modifié pour améliorer son fonctionnement, faciliter son utilisation et son partage, et préciser certains calculs de paramètres. Les modifications sont expliquées dans la publication mais j'ai souhaité revenir sur notre démarche et nos motivations. L'ensemble des approches informatiques mise en place dans le développement du logiciel et sa maintenance seront davantage détaillés ainsi que les diverses améliorations ajoutées depuis l'apparition de l'outil afin de maintenir son utilisation par la communauté.

### 2.7.1 Outil en ligne de commande et intégration continue

Le contexte d'analyse de volume important de données a orienté le développement de NucleusJ2.0 vers la possibilité de l'utiliser en ligne de commande (CLI). La méthode de calcul utilisée, notamment le *gift wrapping*, fait apparaître des limites dans l'utilisation du logiciel car elle nécessite des ressources informatiques importantes (plusieurs Go de mémoire vive) et de nombreux processeurs. La problématique majeure se résume donc à pouvoir analyser des quantités de données conséquentes (plus de 10 Go d'images) dans des temps acceptables (1 minute par noyau). Dans ce cadre, les serveurs représentent des solutions adaptées permettant d'analyser les données rapidement mais demandent des adaptations pour permettre l'appel du logiciel en ligne de commande. NucleusJ2.0 intègre donc cette fonctionnalité pour qu'il soit utilisable sur des structures informatiques de type serveur et adapté au calcul d'un grand volume de données. Enfin, nous proposons l'utilisation d'un fichier de configuration pour la modification des paramètres d'analyse et la traçabilité des résultats.

En parallèle, sur un autre aspect technique, il m'est apparu nécessaire de mettre en place une méthodologie informatique visant à maintenir facilement NucleusJ2.0 tout en permettant des développements ou des optimisations ultérieures. C'est pourquoi, j'ai mis en place avec l'aide de Rémi Martin (stagiaire IUT 2ème année, été 2020) l'intégration continue de l'outil via la plateforme gitlab https://docs.gitlab.com/ee/ci/ Cette méthode consiste à valider automatiquement l'ensemble des nouvelles modifications ajoutées au logiciel et donc de vérifier l'intégrité des améliorations apportées. Ce processus est d'autant plus utile que l'outil repose sur de nombreuses dépendances maintenues par des communautés extérieures (exemples : MorpholibJ [Legland et al., 2016] ou Bio-formats). Il est donc très difficile de suivre l'ensemble des nouvelles versions des dépendances et de mesurer l'impact des modifications sur l'intégrité de notre logiciel.
## 2.7.2 Connexion à la base de données OMERO

L'analyse de la morphologie nucléaire dans l'équipe est faite en routine, permettant la caractérisation rapide de génotypes mutants. La génération massive d'images 3D liée à la multiplication des expériences par l'équipe, nous a amenés avec Sophie Desset, à réfléchir à un meilleur système de gestion des données en termes d'organisation de stockage. Au début de ma thèse, nous avons donc décidé d'une nomenclature pour le nom de nos fichiers, afin de pouvoir identifier et trier nos images dans le futur. Les noms des images contiennent donc un identifiant unique, basé sur l'heure de l'acquisition du fichier (récupéré automatiquement dans les métadonnées), ainsi que les informations des marqueurs fluorescents utilisés, l'organisme, le tissu, ou encore le ou les gènes mutés. Ce travail est une plus-value pour l'intégration automatique de nos données dans un gestionnaire de base de données et un gain de temps pour les méta-analyses futures (par exemple l'analyse d'images de noyaux avec un phénotype commun ou provenant d'un même génotype mutant, d'un même tissu etc). La table présente en Figure 2.3 résume les 10 informations contenues dans le nom de nos images.

<table><caption>FIGURE 2.3: Table de la nomenclature du nom des fichiers : Dans l'exemple le nom d'image sera : 20190709_1562746680.71_Ath_Col0-HON4-wt_Cot_D13_STD_FIXE-DIC_H258_L1.</caption><thead><tr><td></td><td>FEATURE</td><td>FORMAT</td><td>CONTENT</td><td>EXAMPLE</td></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Date</td><td>YYYYMMJJ</td><td>date of the slide production</td><td>20190709</td></tr><tr><td>2</td><td>ID</td><td>10 numbers</td><td>ID produce at the time of image production, metadata of the image file (ImageJ plugin available)</td><td>1562746680.71</td></tr><tr><td>3</td><td>GENUS/species</td><td>Family (1 letter) Species (2 letters)</td><td>Genus-species</td><td>Ath</td></tr><tr><td>4</td><td>Genotype</td><td>ex: SUN1-wt, SUN1-1, genes are separated by --</td><td>Gene(s), allele(s). TAIR accession number (AT4G41310) for a gene, SALK accession number for the allele...</td><td>Col0-HON4-wt</td></tr><tr><td>5</td><td>Tissue</td><td>3 letter code</td><td>Tissue (cotyledon, leaf...), type of preparation (isolated nuclei, squash, ...) whole mount is default state</td><td>Cot</td></tr><tr><td>6</td><td>AgeStage</td><td>letter/number code</td><td>Age of the seedling (J13) or developmental stage (leaf...)</td><td>D13</td></tr><tr><td>7</td><td>GrowthCondition</td><td>Standard= STD. A code should be created for any other condition</td><td>Describe standard culture conditions: in vitro ATG medium+sucrose, 23°C 16h day 8h night ...</td><td>STD</td></tr><tr><td>8</td><td>TypeExp</td><td>LIVE, FIXE, DFISH</td><td>techniques such as FISH,immuno or DAPI/Hoechst staining, Live cell or fixed tissue</td><td>FIXE-DIC</td></tr><tr><td>9</td><td>MolSpecFluo1.2.3</td><td>Target-Technique-fluo, in the order of used channels, separeted by --</td><td>Probe (ex 180 pb), method of labelling (PCR, NT,...), fluorochrome</td><td>H258</td></tr><tr><td>10</td><td>Plant/Field</td><td>1 letter for the Plant number; 1 number for the acquisition field</td><td>Important for further analysis of the dataset</td><td>L1</td></tr></tbody></table>

Les données associées aux expériences qui ont permis de valider l'outil NucleusJ2.0 ont amené un besoin de structurer le stockage des fichiers bruts et de résultats, afin de les publier et de les rendre accessibles à la communauté scientifique. Notre choix s'est porté sur le logiciel de base de données open source OMERO
[Goldberg et al., 2005]. Notre choix pour cette plateforme s'explique par les raisons suivantes :

* Le GReD, et plus précisément notre informaticien Pierre Pouchin, a mis en place il y a 10 ans OMERO. Aujourd'hui, le GReD dispose d'environ 40 To d'images provenant d'une dizaine d'équipes. Nous avons pleinement bénéficié des compétences de Pierre pour cette partie du travail.

* La plateforme OMERO propose un système facile dans son installation et sa maintenance informatique. Une équipe de plusieurs informaticiens, basée en Ecosse, se consacre au maintien et au développement/évolution du logiciel depuis plus de 15 ans (publication initiale datant de 2005), ce qui rend l'outil pérenne. La structuration sous forme de serveur permet une maintenance facile mais aussi une accessibilité aux données à distance. Enfin, un système d'encapsulation (ou wrapper), permet l'interopérabilité d'un ensemble de langages informatiques sur la plateforme, ce qui facilite la réutilisation de fonctionnalité/pipeline développé par d'autre intervenants de la communauté.

* Les fonctionnalités basiques proposées par OMERO répondent bien au besoin de management de données à l'échelle d'une communauté scientifique. En effet, il est facile de partager, visionner ou encore annoter des images après leur intégration dans OMERO. Cette structuration favorise donc le contexte de méta-analyse en simplifiant le groupement d'images ayant une annotation commune.

Actuellement, nous disposons de 3 instances OMERO :

* un serveur local OMERO-GReD

* un serveur distant hébergé par la plateforme de Bio-Informatique du centre de calcul Clermontois (AuBi) OMERO-AuBi

* un serveur OMERO-FSU basé à Florida State University.

Les deux premières instances sont administrées par Pierre Pouchin et non ouvertes vers l'extérieur. La troisième est complètement ouverte au public et a été créée dans le cadre d'un projet Européen COST-Action coordonné par notre équipe (https://www.brookes.ac.uk/indepth/). Dans un futur proche, OMERO-GReD sera transféré vers OMERO-AuBi qui dispose de capacités de stockage et de calcul très supérieures à celles des serveurs du GReD. Notre stratégie sera donc de stocker l'ensemble de nos images au centre de calcul et de déposer les données publiées à OMERO-FSU.

Au cours de ce travail, nous avons voulu rendre possible l'analyse des images par NucleusJ2.0 directement à partir de la plateforme OMERO, sans avoir besoin de rapatrier les images à traiter sur une machine locale. Durant la mise en place de ce processus, nous avons constaté l'absence de certaines fonctionnalités permettant
la communication entre OMERO et ImageJ, nous avons décidé de développer une nouvelle bibliothèque.
Avec l'aide de Pierre Pouchin et un élève ingénieur de 2ème de année d'école informatique, Rémi Valarcher
(semestre1 2020), une liste de méthodes facilitant l'intégration des outils ImageJ en langage Java sur la
plateforme OMERO a été construite. Cette bibliothèque a été nommée Simple Omero Client (SOC) (https:
//github.com/GReD-Clermont/simple-omero-client. Les tests et la mise en pratique des fonctionnalités
de la bibliothèque ont été faites au travers de l'intégration de NucleusJ2.0 (Figure 2.4) sur une instance
OMERO. Actuellement, il est possible de lancer les analyses de NucleusJ2.0 sur le serveur OMERO-AuBi qui
récupère directement les données dans la base de données hébergée sur la plateforme AuBi. Après analyse,
les résultats générés par NucleusJ2.0 sont retournés et stockés automatiquement dans la base de données
OMERO.

<figure><img src="image_62.png" /><figcaption>FIGURE 2.4: **Intégration de SOC dans NucleusJ2.0** : capture de la boîte de dialogue de l'autocrop de NucleusJ2.0 permettant la communication avec la plateforme OMERO. La boîte de dialogue donne accès aux champs de configuration du serveur de stockage ainsi qu'aux champs déterminant les paramètres d'analyses avec en entrée l'identifiant de l'image et en sortie l'identifiant du répertoire (output project) où sont stockés les résultats dans OMERO.</figcaption></figure>

2.7.3 Optimisation des méthodes de calcul

Comme nous l'avons vu précédemment dans la section 2.1, l'implémentation d'une méthode de calcul d'en-
veloppe convexe appelée *gift wrapping* [Jarvis, 1973] répond à la problématique de segmentation du masque
du noyau. Cet algorithme initialement décrit sur des images 2D a été adapté pour traiter nos images 3D
[Dubos et al., 2020]. Les modifications pour prendre en charge l'analyse d'images 3D ont pour conséquences des temps de calcul corrélés à la taille de l'objet segmenté (Figure 2.5). Par exemple à partir d'un volume de 100 µm³, le temps passé pour segmenter le noyau est de l'ordre de 200 minutes. Ce temps de traitement n'est pas acceptable pour des utilisateurs ne disposant pas de ressources de calculs dédiées. Il faut en totalité 57 heures pour traiter les 100 noyaux sélectionnés dans les données présentées (Figure 2.5).

Une première solution pour réduire ce temps d'analyse a été de lancer NucleusJ2.0 en ligne commande (CLI). Cette fonctionnalité rend possible l'utilisation des ressources de d'OMERO-AuBi et la possibilité d'accélérer les calculs en les parallélisant grâce à la fonctionnalité parallel de bash. Cette démarche nécessite cependant des connaissances pour l'utilisateur du langage en CLI et restreint son utilisation aux environnements Unix. Toutefois, l'utilisation du CLI se démocratise de plus en plus. Il est de plus en plus facile d'installer des machines virtuelles LINUX sous l'OS windows, et l'OS Mac qui dérive d'UNIX permet facilement de passer en lignes de commandes.

Nous avons également envisagé plusieurs autres solutions pour accélérer les calculs. Tout d'abord, une option a été introduite afin de modifier la distance (D) dans l'exploration des points lors de l'extension de l'enveloppe convexe (Section 2.1 algorithme 1). Initialement, ce paramètre qui avait été défini de manière arbitraire, se basait sur le diamètre de l'objet à segmenter issu du calcul de Otsu modifié (NJ1). Il existait donc une adaptation de cette constante en fonction du diamètre du noyau à segmenter, ce qui était un atout lors de la segmentation de données hétérogènes. Lors du calcul de l'enveloppe convexe, l'algorithme parcourt la totalité des points bordant l'objet obtenu après segmentation par le seuillage Otsu modifié. Afin d'optimiser le temps de calcul, le nombre de points parcourus a été réduit afin de ne conserver que les points extrêmes dans chaque plan. Cette modification a été introduite avec l'aide d'Alexandre Rongier (stagiaire IUT d'informatique, été 2021). Le *gift wrapping* est calculé à partir de la segmentation Otsu modifié, il est dépendant du nombre de points/sommets soit une complexité de $O(n^2)$ avec *n* représentant le nombre de points. Nous avons donc débuté les tests pour l'accélération du calcul en intégrant une bibliothèque de calcul de l'enveloppe convexe (QuickHull) implémenté en langage C et disponible en java à l'adresse https://www.cs.ubc.ca/~lloyd/java/quickhull3d.html. Une des méthodes présente dans cette librairie permet la simplification de l'objet segmenté en ne gardant que les sommets du polygone sur chaque plan 2D. Cette approche permet de réduire de 5 fois le temps calcul en diminuant le nombre de points explorés. Après implémentation, nous avons testé cet algorithme sur un noyau de Col-0 du jeu de données de la publication de NucleusJ2.0 pour lequel la segmentation avec le *gift wrapping* demande 15 minutes et qui passe à 3 minutes
<figure><img src="image_63.png" /><figcaption>FIGURE 2.5: Nuage de points représentant 100 noyaux segmentés issus du jeu de données Col-0 [Dubos et al., 2020]. L'axe des ordonnées représente le temps de calcul en minutes du *gift wrapping* pour un noyau donné et en abscisse son volume. Une corrélation de 0,92 entre le temps de segmentation et le volume de l'objet segmenté est observée.</figcaption></figure>

lorsque la bibliothèque QuickHull est utilisée.

En parallèle de ces expérimentations sur l'amélioration du temps de calcul de la méthode du *gift wrapping*, nous avons exploré un autre algorithme de calcul d'enveloppe convexe : le parcours de Graham [Graham, 1972]. Ce dernier, dont la complexité de calcul est de $O(n\log(n))$ où n représente le nombre de points parcourus, fait que cet algorithme est théoriquement moins gourmand en temps de calcul. Nous avons utilisé un code implémenté en java du parcours de Graham qui est disponible et rendu open source par Bart Kiers sur son répertoire github : https://github.com/bkiers/GrahamScan. Pour tester l'implémentation, nous avons donc analysé les 100 noyaux de Col-0 sélectionnés pour leur volume (Figure 2.5). La différence de temps de calcul est drastique puisque dans ce cas elle ne dure que 4 minutes contre 57 heures pour le *gift wrapping*. Afin de vérifier nos résultats, nous avons analysé 680 noyaux Col-0 de la publication de NucleusJ2.0 et comparé
les deux méthodes (*gift wrapping* / parcours de Graham) grâce aux paramètres décrivant la morphologie nucléaire en sortie de NucleusJ2.0. La méthode de Graham segmente globalement des objets plus petits et ce de manière constante comme décrit par l'allure normale de l'histogramme des ratio de volumes (Figure 2.6 A). Ainsi pour 108 noyaux (15% des 680 noyaux), l'estimation du volume diffère de plus de 5% selon la méthode utilisée. Enfin, les analyses en composante principale calculées à partir des paramètres de morphologie nucléaire ne montrent aucune différence entre les deux méthodes (Figure 2.6 B) et C)). Nous arrivons dans les deux cas à distinguer les deux types cellulaires : les cellules de garde (GC) et les cellules de pavement (PC) composant notre échantillon.

L'implémentation de la méthode de Graham répond donc bien à nos besoins d'accélération du calcul de la segmentation de nos objets avec un temps moyen de 2 secondes par noyau. Les différences avec la méthode initiale (Gift wrapping) sont mineures et uniformes au sein des images traitées. Nous pouvons grâce à cette nouvelle méthode atteindre nos objectifs clefs de biologie, visant à discriminer des populations cellulaires à partir des paramètres de morphologie nucléaire. C'est pourquoi, cette nouvelle méthode a été intégrée dans la version 2.0.0 de NucleusJ2.0 le 19/05/2021.

## 2.8 Bilan

Cette partie de mon travail de doctorat est quantitativement la plus importante. Tout d'abord, il a fallu réorganiser le code de NJ1, réaliser l'intégration des dépendances avec Maven, mettre en place l'utilisation en ligne de commande, implémenter de nouvelles méthodes comme *l'autocrop*, le *gift wrapping* et la méthode de Graham. Il a fallu ensuite organiser le stockage des données dans OMERO et relier OMERO avec ImageJ pour bénéficier de toute la puissance de calcul du serveur OMERO-AuBi. Toutefois, ce travail très technologique autorise aujourd'hui une utilisation plus sereine du plugin dans sa version NucleusJ2.0, et je l'espère, une diffusion plus large de notre outil dans la communauté scientifique dans le futur.
<figure><img src="image_64.png" /><figcaption>FIGURE 2.6: Comparaison des résultats de segmentation de la méthode de Graham à partir de 680 noyaux de Col-0 [Dubos et al., 2020]. A) histogramme de distribution des ratios entre les volumes des noyaux segmentés par *gift wrapping* (méthode initiale) et volumes obtenus suite à la segmentation de la méthode de Graham. B) analyse en composante principale des individus générés à partir des paramètres de morphologie nucléaire du *gift wrapping* et C) de la méthode de Graham. Les deux populations cellulaires sont représentées en jaune pour les cellules de pavement (PC) et en vert pour les cellules de garde (GC).</figcaption></figure>
<figure><img src="image_65.png" /></figure>
# Chapitre 3

## Segmentation des compartiments

### intra-nucléaires : NODeJ

Nous venons de voir que NucleusJ2.0 permet l'automatisation complète du processus d'analyse de la morphologie nucléaire à partir d'images grand champ, et qu'il comporte une nouvelle méthodologie de segmentation qui évite une étape fastidieuse, qui était nécessaire pour écarter les gros noyaux avec des invaginations artéfactuelles. Lors de sa publication en 2020, il restait encore une étape de l'analyse pour laquelle nous n'avions pas trouvé de solution automatisée : la segmentation des chromocentres. Cette segmentation assurée par la méthode de partage des eaux 3D (Watershed 3D) est l'une des originalités de l'outil NJ1, elle permet de décrire l'organisation de la chromatine par la détection d'objets plus intenses (chromocentres) ou d'objets révélés par FISH (Figure 2F [Dubos et al., 2020]). Cependant, la technique de partage des eaux retenue dans la version initiale NJ1, nécessite un seuillage manuel par l'utilisateur très chronophage, et entraîne une reproductibilité peu satisfaisante, puisque le seuil est défini par l'utilisateur. Cette procédure est une limite majeure pour l'analyse de composition en chromatine des noyaux à haut débit.
## 3.1 Exploration des méthodes disponibles

De nombreuses solutions logicielles sont proposées pour détecter de petites particules dans les images.
Il paraissait naturel d'explorer en priorité la solution proposée par la communauté imageJ qui est le plugin ComDet https://imagej.net/plugins/spots-colocalization-comdet. Cependant, les essais sur nos images 3D n'ont pas fonctionné pour les raisons suivantes :

* L'outil prend en charge des images 3D mais détecte les objets plan par plan en 2D.

* Il est nécessaire de fixer les paramètres connus à l'avance sur nos objets tels que l'intensité ou la taille d'objets (Figure 3.1 A).

* Les objets que détectent le plugin demanderaient des adaptations car l'algorithme détecte les objets sur l'ensemble de l'image. Dans l'exemple de résultats Figure 3.1 B on constate que l'on détecte le noyau, une composant du noyau (ne correspondant pas à un chromocentre), et des objets extra-nucléaires (correspondant certainement à du bruit de fond).

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>FIGURE 3.1: Utilisation de ComDet pour la détection des chromocentres : A la fenêtre de paramétrage du plugin ComDet dans imageJ. B Résultats de l'analyse par ComDet sur une image en 2D d'A. thaliana.</figcaption></figure>

Malgré l'existence du plugin imageJ permettant la description de certains objets intranucléaires comme les spots de FiSH ComDet, aucune méthode ni aucun outil spécifiquement dédiés aux chromocentres ne
correspondent à nos attentes. La segmentation des spots de FiSH s'inscrit le plus souvent dans une dé-
marche de dénombrement d'objets détectés (notion de spot), plutôt que dans une caractérisation morpholo-
gique/quantitative détaillée. D'autres méthodes provenant d'autres plateformes que imageJ sont disponibles
mais leurs implémentations se sont avérées peu convaincantes pour les raisons suivantes :

* La méthodologie utilisée est plus souvent adaptée aux images en 2D et se transpose très mal en 3D pour des raisons tant informatiques que mathématiques comme dans le cas de ComDet (Figure 3.1). De plus, la plupart des outils implémentés pour des images 3D ne fonctionnent pas, comme pour le cas du logiciel fish-quant https://code.google.com/archive/p/fish-quant/downloads qui est signalé comme obsolète. Nous trouvons aussi des codes qui ne sont pas à jour et demandent de nombreuses manipulations pour leur installation ou leur utilisation. Par exemple, dans le cas de FISHcount https://github.com/JIC-CSB/FISHcount nous avons générer un environnement virtuel en utilisant Docker (https://www.docker.com/) pour gérer certaines dépendances.

* Des solutions développées dans d'autres langages de programmation comme spade https://gitlab.inria.fr/ncedilni/spade en python, nécessitent des adaptations du code dans l'optique de proposer une solution informatique unique à l'utilisateur au travers de NucleusJ2.0. La multiplication des langages (Java et python) complexifie la maintenance de l'outil à long terme.

Cette exploration montre une problématique malheureusement assez classique dans le domaine de la
bioinformatique : les limites de la réutilisation des développements pré-existants. J'ai alors cherché à repartir
de différents algorithmes, comme l'utilisation de plusieurs seuils d'Otsu consécutifs (1 pour délimiter le noyau,
1 pour définir le nucléole et 1 pour définir les chromocentres) sur les voxels appartenant au masque du noyau.
Cette méthode s'est révélée efficace en 2D mais très décevante en 3D du fait de la dynamique des intensités
des voxels composant nos objets. Enfin, la solution est venue d'une collaboration avec Axel Poulet et la mise
en place d'une segmentation basée sur le calcul de gradient qui a permis le développement d'un nouveau
plugin ImageJ appelé NODeJ soumis pour publication mi-mai dans Bioinformatics.

## 3.2 Article : NODeJ : an imageJ plugin for 2D and 3D segmentation of nuclear objects
Subject Section

NODeJ: an ImageJ plugin for 2D and 3D
segmentation of nuclear objects

Tristan Dubos<sup>1,2,†</sup>, Axel Poulet<sup>3,†</sup>, Emilie Pery<sup>2</sup>, Frédéric Chausse<sup>2</sup>, Christophe Tatout<sup>1</sup>, Sophie Desset<sup>1,*</sup>, Josien C. van Wolfswinkel<sup>3,*</sup> and Yannick Jacob<sup>3,*</sup>

¹ GReD, CNRS, INSERM, Université Clermont Auvergne, Clermont-Ferrand, France. ² Institut Pascal, Université Clermont Auvergne, Clermont-Ferrand, France. ³ Yale University, Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, Faculty of Arts and Sciences, 260 Whitney Avenue, New Haven, CT 06511, USA.

† Equal contribution. * To whom correspondence should be addressed.

Associate Editor: XXXXXXX

Received on XXXXX; revised on XXXXX; accepted on XXXXX

Abstract

**Summary:** Here, we present an automated method, Nuclear Object DetectionJ (NODeJ), developed as an imageJ plugin, to segment and analyze high intensity domains in nuclei from 2D or 3D images. NODeJ applies the gradient method on the mask of a nucleus to enhance the contrast of intra-nuclear objects and allow their segmentation.

**Availability and implementation:** NODeJ is written in Java and provided as an imageJ plugin and a CLI option. Code, documentation and further information can be found at https://gitlab.com/axpoulet/image2danalysis. The images used in this application note are available here: https://www.brookes.ac.uk/indepth/images/ and https://doi.org/10.15454/1HSOIE.

Contact: sophie.desset@udamail.fr, josien.van.wolfswinkel@yale.edu and yannick.jacob@yale.edu

**Supplementary information:** Supplementary data are available at *Bioinformatics* online.

1 Introduction

The nucleus is a dynamic and complex structure that changes morphology and organization of its DNA content during development. The spatial arrangement of the chromatin and other subnuclear structures within the nucleus has fundamental consequences for the accessibility and activity of regions of the genome (Jacob et al., 2010 andBickmore and Van Steensel, 2013). Two-dimensional (2D) or three-dimensional (3D) images are widely used to investigate nucleus morphology and chromatin organization, including NucleusJ2.0 (Dubos et al., 2020) and ilastik (Berg et al., 2019). With these tools, any further segmentation of subnuclear structures relies on a semi-automated procedure that requires user input, leading to limitations in data throughput and potential user bias. In this report, we describe NODeJ as a new tool to automatically segment visible domains in the nucleus. The relevant parameters for the objects detected are then computed using the NucleusJ2.0 method implemented within NODeJ.

2 Methods

NODeJ processes images of nuclei as acquired by live imaging of strains/ecotypes expressing fluorescent reporters, or from fixed tissues or isolated nuclei stained with DNA dyes. The program can be run as an imageJ plugin or via command line. Our method is based on the gradient algorithm for object boundary detection (Gonzalez and Woods, 2008). For each image, NODeJ takes as an input the raw image of the nucleus as well as the mask of this nucleus (assuming one nucleus per image) and computes the image gradient. It then applies a threshold value computed on the image gradient to segment the final object (Fig.1). To derive the gradient (Fig.1C) from the raw image (Fig.1A), the program computes a new value $\delta v_x$ for each voxel $v_x$ inside the mask of the nucleus (Fig.1B), defined as:

$$ \delta v_x = \frac{1}{n} \sum_{neigh=x-n}^{x+n} v_x - v_{neigh} $$

The size of neighborhood *n* is automatically adjusted to the size of the nucleus (for small nuclei volume < 50µm³ *n* = 3 and for large nuclei *n* = 7). If a voxel is outside the mask, the algorithm ignores $v_{neigh}$ and goes to the n+1 $v_{neigh}$. Once the image gradient is obtained, its signal is
<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>Fig. 1: NODEJ workflow. A. Raw image of a plant nucleus (*A. thaliana*) at interphase stained with DAPI (from Arpòn et al., 2021). B. Image of the segmented nucleus. C. Image of the gradient obtain with NODEJ. High voxel values are shown in red and low values are shown in blue. D. The resulting segmented image, in which each object (connected component) can be analyzed individually.</figcaption></figure>

smoothed using a Gaussian blur filter from imageJ (Schneider et al., 2012), and the threshold value *t* is computed as $t = \bar{x} + s * f$ with *f* being a factor defined by the size of the nucleus (1.5 for small nuclei and 2.5 for large nuclei), *s* being the standard deviation and $\bar{x}$ being the average of the voxel values from the gradient image. Finally, the connected components of the binary image, obtained by applying the threshold *t*, are defined using the library morpholiBJ (Legland et al., 2016) (Fig.1D).

## 3 Results

To demonstrate the performance of NODEJ, we processed 1749 nuclei from three different *A. thaliana* data sets (Poulet et al., 2015, Dubos et al., 2020, Arpòn et al., 2021) to identify and analyze characteristic heterochromatin domains, known as chromocenters (Fransz et al., 2002). The data set from Arpòn et al., 2021 contains a heterogeneous population of nuclei from various tissues with different levels of endoreduplication (i.e. ploidy level) and therefore different numbers of chromocenters. Using NODEJ, we obtained a distribution centered between 7 and 10 chromocenters per nucleus (Fig.2A ) and most chromocenters had a volume < 1µm³ (Fig.2B ), which is in agreement with previously published results (Arpòn et al., 2021). Next, we tested whether NODEJ is able to detect known characteristics of the nuclear periphery mutants *crwn* (Wang et al., 2013) and *kaku4 crwn1 crwn4* (Dubos et al., 2020) present in the data sets of Poulet et al., 2015 and Dubos et al., 2020. NODEJ, correctly detected the previously described changes in heterochromatin organization, such as decreased number of chromocenters, increased volume, and increased distance between chromocenters and the nuclear periphery (Fig.2C and D) (Wang et al., 2013, Dubos et al., 2020).

## 4 Conclusion

NODEJ is a novel tool for automated subsegmentation of nuclear images, and is able to accurately identify heterochromatin domains from a diverse set of *A. thaliana* nuclei. NODEJ was developed as an extension of NucleusJ2.0 and allows for efficient automated analysis of subnuclear structures by eliminating the semi-automated steps inherent to the use of NucleusJ2.0, resulting in reduced processing time and bias in the analysis. This is also valuable for the preparation of training data sets for machine learning. Further, we believe that the utility of this tool can be extended to other data sets such as those obtained by nucleolar labeling or DNA fluorescent in situ hybridization (DNA-FISH).

## Funding

This project was supported by grants #R35GM128661 and #R35GM128619 from the National Institutes of Health to Y.J and J.C.vW respectively.

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>Fig. 2: Analysis of *A. thaliana* data sets with NODEJ. A. and B. Results from Arpòn et al., 2021 describing chromocenters from isolated wild type nuclei (n=212) extracted from whole plants (Supplementary data). The histograms show the repartition of the chromocenter number by nucleus (A) and their volume (B). C. and D. Results from the analysis of two data sets from mutants (*crwn* and *kaku4 crwn1 crwn4* triple mutant) known to alter chromatin organization. C. *crwn* mutants (n=39) and wild type plants (n=38) from Poulet et al., 2015 (Supplementary data). D. *kaku4 crwn1 crwn4* triple mutants (n=851) and wild type plants (n=609) from Dubos et al., 2020 (Supplementary data). Boxplots show: number of chromocenters (Nb Cc), mean chromocenter volume (Vcc Mean in µm³) and distance of chromocenter barycenter to the nuclear envelope (d(CcBarycenter/NE) in µm) (Supplementary tables 1, 2 and 3 describe the computed parameters).</figcaption></figure>

Funding support was also provided by 16-IDEX-0001 CAP 20-25 challenge 1, Pack Ambition Recherche project Noyau-HD from the Region Auvergne Rhone-Alpes and the COST-Action INDEPTH (CA16212) to C.T.

## References

Arpòn, J., K. Sakai, V. Gaudin, and P. Andrey

2021. Spatial modeling of biological patterns shows multiscale organization of Arabidopsis thaliana heterochromatin. *Scientific Reports*, 11(1):1-17.

Berg, S., D. Kutra, T. Kroeger, C. N. Straehle, B. X. Kausler, C. Haubold, M. Schiegg, J. Ales, T. Beier, M. Rudy, K. Eren, J. I. Cervantes, B. Xu, F. Beuttenmueller, A. Wolny, C. Zhang, U. Koethe, F. A. Hamprecht, and A. Kreshuk

2019. Ilastik: Interactive Machine Learning for (Bio)Image Analysis. *Nature Methods*, 16(12):1226-1232.

Bickmore, W. A. and B. Van Steensel

2013. Genome architecture: Domain organization of interphase chromosomes. *Cell*, 152(6):1270-1284.

Dubos, T., A. Poulet, C. Gonthier-Gueret, G. Mougeot, E. Vanrobays, Y. Li, S. Tutois, E. Pery, F. Chausse, A. V. Probst, C. Tatout, and S. Desset

2020. Automated 3D bio-imaging analysis of nuclear organization by NucleusJ 2.0. *Nucleus*, 11(1):315-329.

Fransz, P., J. H. De Jong, M. Lysak, M. R. Castiglione, and I. Schubert

2002. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. *Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America*, 99(22):14584-14589.
Gonzalez, R. C. and R. E. Woods
2008. CV book, volume 3rd Edition.

Jacob, Y., H. Stroud, C. Leblanc, S. Feng, L. Zhuo, E. Caro, C. Hassel, C. Gutierrez, S. D. Michaels, and S. E. Jacobsen

2010. Regulation of heterochromatic DNA replication by histone H3 lysine 27 methyltransferases. *Nature*, 466(7309):987–991.

Legland, D., I. Arganda-Carreras, and P. Andrey

2016. MorphoLibJ: Integrated library and plugins for mathematical morphology with ImageJ. *Bioinformatics*, 32(22):3532–3534.

Poulet, A., I. Arganda-Carreras, D. Legland, A. V. Probst, P. Andrey, and C. Tatout
2015. NucleusJ: An ImageJ plugin for quantifying 3D images of interphase nuclei.
*Bioinformatics*, 31(7):1144–1146.

Schneider, C. A., W. S. Rasband, and K. W. Eliceiri

2012. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. *Nature Methods*, 9(7):671–675.

Wang, H., T. A. Dittmer, and E. J. Richards

2013. Arabidopsis CROWDED NUCLEI (CRWN) proteins are required for nuclear size control and heterochromatin organization. *BMC Plant Biology*, 13(1):1–13.
## 3.3 Bilan

Avec NODeJ, nous avons maintenant la possibilité d'appliquer un *workflow* complet allant de l'*autocrop* qui génère les imaqettes individuelles, à la segmentation du noyau qui génère les paramètres de morphologie nucléaire et enfin à l'organisation de la chromatine et ce de façon beaucoup plus automatisée qu'avec NJ1.

Dans le futur, il faudra intégrer NODeJ dans NJ2 afin de permettre à l'utilisateur d'appliquer soit une segmentation en appliquant la ligne de partage des eaux (NJ1) soit le gradient descendant (NODeJ).
<figure><img src="image_69.png" /></figure>
# Chapitre 4

## Application de NucleusJ2.0 dans un environnement intégré dans OMERO sur un modèle de spermatozoïdes humains

Comme nous l'avons vu, l'étude de la morphologie des noyaux et de leur contenu est au cœur de nombreux processus biologiques. C'est pourquoi, il nous paraît important de pouvoir partager NucleusJ comme outil d'analyse dans d'autres modèles que les plantes. Mon équipe a déjà établi des collaborations en ce sens sur des modèles animaux, comme celui du développement cardiaque chez la drosophile (Guillaume Junion, GReD), ou la maturation des spermatozoïdes chez la souris (Ayhan Kocer, GReD). Un autre exemple est l'analyse nucléaire qui a permis une publication dans un modèle de trisomie humaine [Kemeny et al., 2018]. NucleusJ a été utilisé pour analyser des images de FiSH montrant que le chromosome 21 surnuméraire provoquait des modifications majeures dans le noyau des lymphocytes, avec un déplacement vers la périphérie de certains territoires chromosomiques (HSA1 et HSA17) et une augmentation de la compaction d'au moins deux chromosomes (HSA1 et HSA17).