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# Dosage de l'activité enzymatique Super Oxyde Dismutase (SOD) sur microplaque

Patrice Noury

► To cite this version:

Patrice Noury. Dosage de l'activité enzymatique Super Oxyde Dismutase (SOD) sur microplaque. 2016, pp.13. hal-02602440v2

HAL Id: hal-02602440

https://hal.inrae.fr/hal-02602440v2

Submitted on 30 Sep 2025

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## MODE OPERATOIRE/PROTOCOLE

# Dosage de l'activité enzymatique Super Oxyde Dismutase (SOD) sur microplaque

## AVERTISSEMENT ET PRECAUTIONS DE SECURITE

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Le présent mode opératoire nécessite l'utilisation toxique et volatil (mercaptoéthanol) il convient donc de respecter les règles de sécurité indispensables à l'utilisation de tels produits.

Le schéma ci-contre rappel les Equipements de Protection Individuels indispensables

Les produits et manipulations à risques ainsi que les moyens de protections spécifiques sont détaillés dans le contenu de ce document.

<table><thead><tr><td>N° de version</td><td>Rédacteur</td><td>Vérificateur</td><td>Approbateur</td></tr></thead><tbody><tr><td>1</td><td>Nom : NOURY<br/>Fonction : IE</td><td>Nom : GONZALEZ-FERNANDEZ<br/>Fonction : CR</td><td>Nom : DEGLI-ESPOSTI<br/>Fonction : Responsable du laboratoire d'Ecotoxicologie</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><td colspan="4">Mises à jour</td></tr><tr><td>N° de version</td><td>Date</td><td>Auteur</td><td>Modifications apportées par rapport à la précédente version</td></tr></thead><tbody><tr><td>1.1</td><td>30/01/2024</td><td>PN</td><td>Mise au format INRAE, corrections mineures</td></tr><tr><td>1.2</td><td>29/09/2025</td><td>PN</td><td>Nouvelle préparation de la SOD étalon et de la gamme, simplification des calculs, correction de coquilles, nouvelle référence commerciale pour la SOD</td></tr></tbody></table>
## SOMMAIRE

<table><tr><td>1</td><td>INTRODUCTION</td><td>2</td></tr><tr><td>1.1</td><td>Objet et domaine d'application</td><td>2</td></tr><tr><td>1.2</td><td>Références</td><td>2</td></tr><tr><td>1.3</td><td>Conditions d'application</td><td>2</td></tr><tr><td>1.4</td><td>Définitions et abréviations</td><td>2</td></tr><tr><td>2</td><td>VOLET SECURITE</td><td>3</td></tr><tr><td>3</td><td>PROTOCOLE</td><td>3</td></tr><tr><td>3.1</td><td>Principe</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2</td><td>Matériel et réactifs</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2.1</td><td>Matériel</td><td>3</td></tr><tr><td>3.2.2</td><td>Produits utilisés</td><td>4</td></tr><tr><td>3.2.3</td><td>Solutions préparées</td><td>4</td></tr><tr><td>3.3</td><td>Mode opératoire</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3.1</td><td>Préparation de la fraction S9 et prédilution</td><td>5</td></tr><tr><td>3.3.2</td><td>Réglage du spectrophotomètre</td><td>6</td></tr><tr><td>3.3.3</td><td>Gamme étalon et réalisation de la plaque</td><td>7</td></tr><tr><td></td><td>Préparation de la gamme étalon</td><td>7</td></tr><tr><td></td><td>Réalisation de la plaque</td><td>7</td></tr><tr><td>3.4</td><td>Expression des résultats</td><td>8</td></tr><tr><td>3.4.1</td><td>Calculs</td><td>8</td></tr><tr><td>3.4.1</td><td>Traitement statistique des résultats</td><td>8</td></tr><tr><td>4</td><td>SYNTHESE DU DOCUMENT</td><td>8</td></tr></table>
# 1 INTRODUCTION

## 1.1 Objet et domaine d'application

Mesure de l'activité enzymatique SOD (Super Oxyde Dismutase) sur fraction post
mitochondriale (S9) d'homogénat de tissus (organe ou organisme entier).

Cette mesure peut être réalisée avec des homogénats de foies, de branchies ou de mucus de poisson, ainsi que sur des organismes entiers de gammare, daphnie, larve de chironome, potamopyrgus, ou poisson au stade larvaire ou juvénile. Elle est un des paramètres permettant l'évaluation du stress oxydant que subit un organisme au contact de xénobiotiques de type métaux lourd, HAP, pesticide, PCB. Elle détermine spécifiquement la capacité de métabolisation de l'ion Super Oxyde (02-) qui est une espèce réactive de l'oxygène (ROS) particulièrement toxique.

## 1.2 Références

Le protocole utilisé est adapté de la méthode spectrophotométrique décrite par Paoletti *et al.*<fnref n="1" /> (1986) et adapté à la microplaque par l'Ineris (Aïssa *et al.* 2000)<fnref n="2" />

## 1.3 Conditions d'application

Le dosage de l'activité Super Oxyde Dismutase entre généralement dans l'étude d'une batterie de biomarqueurs du stress oxydant. Comme pour toute activité enzymatique il nécessite des conditions strictes de conservation de l'échantillon (-80°C) et une mesure dans la demi-journée une fois l'extrait réalisés. Cependant, la congélation des extraits (S9) pour reporter ou recommencer le dosage peut être envisagée si l'on a vérifié au préalable que la différence éventuelle d'activité par ce procédé est négligeable.

## 1.4 Définitions et abréviations

Pour les besoins du présent mode opératoire, les définitions et abréviations suivantes sont nécessaires :

* **FCR** : Force Centrifuge Relative

* **Fraction S9** : surnageant obtenu après centrifugation de 15 minutes à 9000g des homogénats de tissus

* **SOD** : Super Oxyde Dismutase

* **BSA** : Bovine Serum Albumine

* **MM** : Masse Molaire

* **SM** : solution mère

<footnote n="1">¹ Paoletti F., Aldinucci D., Mocali A., Caparrini A. (1986) A sensitive spectrophotometric method for the determination of superoxide dismutase activity in tissue extracts. Analytical Biochemistry 154:536-541.</footnote>

<footnote n="2">² Aït-Aïssa, S., O. Ausseil, O. Palluel, E. Vindimian, J. Garnier-Laplace and J. M. Porcher (2003). "Biomarker responses in juvenile rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) after single and combined exposure to low doses of cadmium, zinc, PCB77 and 17β-oestradiol." *Biomarkers* 8(6): 491-508.</footnote>
* SF: solution fille

## 2 VOLET SECURITE

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Beta Mercaptoéthanol</figcaption></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

## 3 PROTOCOLE

### 3.1 Principe

Le dosage de la SOD est basée sur l'inhibition de l'oxydation du NADH par la SOD en présence d'ion superoxyde. Cette diminution du taux d'oxydation du NADH est fonction de la concentration d'enzyme. Par définition une unité d'enzyme SOD correspond à l'activité nécessaire pour inhiber 50 % de la réaction d'oxydation. L'inhibition par la SOD de la réaction d'oxydation du beta-NADH est suivie au spectrophotomètre à 340 nm. Les inhibitions obtenues sur les échantillons sont rapportées à celle d'une gamme étalon de SOD.

L'activité enzymatique peut être rapportée à la concentration totale en protéines dans le S9. Dans notre laboratoire ce dosage protéique est réalisé selon la méthode de Bradford<fnref n="3" />. Sur organisme entier (invertébré ou larve de poisson) l'activité SOD sera de préférence rapportée à la masse de poids frais déterminée avant congélation et extraction. La concentration en protéine du S9 peut cependant être utile dans le cas de potamopyrgus dont le poids total avec coquille n'est pas très représentatif du poids frais de l'animal.

### 3.2 Matériel et réactifs

#### 3.2.1 Matériel

- Microtubes type « Eppendorf » de 0,5 mL 1,5mL et microtubes 1,5 mL à bouchon vissant

- Congélateur -80°C

- Broyeur à bille (MP biomédical) + billes de verre 2mm et acier 4mm

- Spectrophotomètre à microplaques

- Centrifugeuse réfrigérée.

- Sorbonne

- Verrerie et pipettes automatiques

- Microplaques 96 puits sans couvercle (Greiner)

<footnote n="3">³ Bradford, M. M. (1976); A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72:248-254.</footnote>
### 3.2.2 Produits utilisés

<table><caption>**Tableau I : Produits utilisés pour le dosage de l'activité SOD**</caption><thead><tr><td>PRODUIT</td><td>N° CAS</td><td>RANGEMENT</td></tr></thead><tbody><tr><td>Potassium chlorure (KCl)</td><td>7447-40-7</td><td>Armoire 1 (E6)</td></tr><tr><td>Disodium Hydrogenophosphate (Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>, 12 H<sub>2</sub>O)</td><td>10039-32-4</td><td>Armoire 1 (E9)</td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenophosphate, (KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>)</td><td>7778-77-0</td><td>Armoire 1 (C7)</td></tr><tr><td>Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO<sub>3</sub>)</td><td>144-55-8</td><td>Armoire 1 (C02)</td></tr><tr><td>NADH (Beta-Nicotinamide adénine dinucléotide)</td><td>104809-32-7</td><td>Congélateur (Sigma N4505)</td></tr><tr><td>Manganèse (II) chlorure tétra hydrate (MnCl<sub>2</sub> 4 H<sub>2</sub>O)</td><td>13446-34-9</td><td>Armoire 1 (C40)</td></tr><tr><td>EDTA dihydrate</td><td>6381-92-6</td><td>Armoire 1 (F18)</td></tr><tr><td>Mercaptoéthanol (Beta)</td><td>60-24-2</td><td>Armoire solvant</td></tr><tr><td>Super oxyde dismutase from bovine erythrocytes (SOD)</td><td>9054-89-1</td><td>Congélateur (Sigma S7571)</td></tr></tbody></table>

### 3.2.3 Solutions préparées

#### A l'avance

* **Tampon phosphates (100 mM, pH 7,8)**

solution A : 35,8 g de Na₂HPO₄, 12H₂O (358 g.mol⁻¹) dans 1l d'eau ultra pure.

solution B : 3,4 g de KH₂PO₄ (136 g.mol⁻¹) dans 250ml d'eau ultra pure

La solution A est ajustée à pH 7,8 avec la solution B. Se conserve au frais (3-7°C) jusqu'à 6 mois. Verrerie spécifique

* **Tampon de broyage** : Le tampon de broyage est du tampon phosphate (100mM, pH7,8) additionné de 0,1 % de Triton X100 (exemple pour 50 µl + 50 ml). Bien agiter à l'aide d'un barreau aimanté.

* **EDTA dihydrate 0,2 M**

7,44g (MM : 372,24) dans 100 mL d'eau pure. (conservation 3 mois à 4°C)

* **Manganèse chlorure tétra hydrate 0,1 Molaire**

1,97g (MM : 197,91) dans 100 mL d'eau pure (conservation 3 mois à 4°C)

* **Bicarbonate de sodium (NaHCO3) 0,5%** :

500 mg (MM= 84,01) dans 100 mL d'eau pure (conservation 3 mois à 4°C)
* **Etalons de SOD:** à dissoudre dans du tampon phosphate pH 7,8 une dose commerciale de SOD (Sigma S7571). Par exemple dissoudre une dose de 15 kU dans 150 ml puis aliquoter en microtube par fraction de 1 ml la solution à 100U/ml obtenue.

## Le jour du dosage

* **Beta NADH** 7.5 mM (741,2 g.mol⁻¹) soit 5,56mg par ml de NaHCO₃. A conserver à 4°C.

* **Gamme étalon de SOD** : Décongeler un aliquote de la solution mère (SM) et le diluer en tampon phosphate additionné de BSA (1mg/ml) de façon à obtenir une solution fille (SF) à 1 U/ml. Préparer une gamme étalon (7 points + blanc) de raison 2/3 par dilution successive de la SF. A conserver à 4°C jusqu'au dosage.

* **mélange EDTA/MnCl₂** : 1 mL EDTA + 1 mL MnCl₂. A conserver à 4°C

* Milieu réactionnel à préparer à température ambiant juste avant de remplir la plaque avec du tampon :

- 20 mL de tampon phosphate

- 1000 µL de NADH

- 625 µL d'EDTA/MnCl₂

* **Beta Mercaptoéthanol 10 mM** (78,13 g.mol⁻¹; d=1,114, pureté, 98%) soit 15,6 µL dans 20 mL d'eau pure (utiliser une pipette à déplacement positif). Peut être gardé à température ambiante. **ATTENTION** : ce produit très toxique et malodorant doit être manipulé sous Sorbonne.

* **Solution de Serum Albumine Bovine (BSA) à 1 mg/ml en tampon phosphate** : moins de 10 m sont nécessaire à la préparation de la gamme étalon de SOD

## 3.3 Mode opératoire

### 3.3.1 Préparation de la fraction S9 et prédilution

* Sortir les tubes du congélateur juste avant broyage

* Ajouter la matrice de broyage, puis le tampon d'extraction dans chacun des tubes

* Disposer les tubes bien fermés (tubes de 1,5 mL à bouchon à vis) dans le carrousel du broyeur placé préalablement dans la glace puis installer le carrousel dans le broyeur.

* Régler le broyeur à bille sur la vitesse 6 pendant 20 secondes puis lancer le broyage

* Démonter le carrousel et le placer à nouveau dans la glace puis attendre éventuellement 5 min avant un deuxième cycle (conseillé) ou bien lancer immédiatement la centrifugation (centrifugeuse réfrigérée à 4°C ; 9000g ; 15 min)

* Prélever les surnageant et aliquoter dans des tubes Eppendorf de 0,5 mL

* Un des aliquote est gardé pour la détermination le jour même de la SOD et si possible ensuite de la Catalase ; les autres sont placés à -80°C en vue d'autres dosages non enzymatique tel que le TEAC ou le dosage de protéines.
* Le S9 est ensuite prédilué en tube Eppendorf pour le dosage

**La matrice d'extraction** : les animaux entiers chitineux (gammare, chironome) ou à coquille (potamopyrgus) sont broyés avec une matrice composée d'une bille d'acier de 4 mm additionnée ou non de 3-4 billes de verre (2mm). A noter qu'avec le potamo., il est préférable de craquer (décoquiller) les animaux dans le tube avant broyage. Concernant les tissus mous comme le foie, ils peuvent être broyés avec une matrice composée d'un assortiment de billes de verre de 2 et 1 mm.

**Le tampon d'extraction** : il s'agit du tampon phosphate pH 7,8 additionné éventuellement d'un tensio-actif tel que le Triton à la concentration de 0,1 % (50 µL dans 50 mL, bien agiter). Le rapport d'extraction **masse/volume** sera de **1/10** pour le gammare ; **1/50** pour le chironome et le potamo. Pour un échantillon de foie, de branchie ou le danio juvénile le rapport peut être compris **entre 1/20 et 1/50**.

**La prédilution** : chaque S9 doit être préalablement dilué dans du tampon phosphate pour qu'avec une prise d'essai de 20 µL par puit on obtienne une inhibition de l'oxydation du NADH comprise en 10 % et 70-80% de l'inhibition totale. La prédilution conseillée est de :

* gammares extraits à 1/10 (m/V) : 1/80

* chironomes extraits au 1/50 (m/V) : 1/20

* potamos extraits au 1/50 (m/v) : 1/25

* danio juvenile extrait au 1/10 (m/v) : 1/250

* foie de truite extrait au 1/10 (m/v) : 1/350

* mucus de truite : 1/4 (directement en plaque)

### 3.3.2 Réglage du spectrophotomètre

La procédure ci-dessous se réfère au matériel Tecan Safire du laboratoire d'Ecoxicologie d'INRAE Villeurbanne :

* Allumer le spectrofluorimètre (bouton derrière en bas à gauche) et l'ordinateur.

* Ouvrir le programme Xfluor4 : Demarrer/Programme/Tecan/Xfluor4 (menu Windows)

* Activer la connexion avec le Safire : Xfluor/Connect/Safire (menu Excel)

* Ouvrir le menu d'onglets dans Xfluor/Edit measurement (menu Excel)

* Régler les paramètres de mesure comme ci-après :

<table><tr><td>Measurement mode:</td><td>Absorbance</td></tr><tr><td>Measurement wavelength:</td><td>340 nm</td></tr><tr><td>Number of flashes:</td><td>1</td></tr><tr><td>Plate definition file:</td><td>GRE96ft.pdf</td></tr><tr><td>Number of kinetic cycles:</td><td>30</td></tr><tr><td>Kinetic interval:</td><td>60 s</td></tr></table>
### 3.3.3 Gamme étalon et réalisation de la plaque

#### Préparation de la gamme étalon

Décongeler un aliquote de solution mère (SM) de SOD étalon en bain glacé puis prédiluer au 1/20 pour obtenir une solution fille (SF) à 1 U/mL (1/100 pour une SM à 100 U/ml soit 1980 µl de tampon phosphate/BSA + 20 µl de SM de SOD

Réaliser ensuite en Eppendorf et dans du tampon phosphate la gamme étalon suivante de raison 2/3.

<table><caption>**Tableau II :** Gamme étalon de SOD</caption><thead><tr><th></th><th>1</th><th>2</th><th>3</th><th>4</th><th>5</th><th>6</th><th>7</th><th>8</th></tr></thead><tbody><tr><th>[SOD] (U/ml)</th><td>0</td><td>0,09</td><td>0,13</td><td>0,20</td><td>0,30</td><td>0,44</td><td>0,67</td><td>1,00</td></tr><tr><th>Tampon Phosphate/BSA (µl)</th><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td>400</td><td></td></tr><tr><th>SOD (µl)</th><td>0</td><td>800 de 3</td><td>800 de 4</td><td>800 de 5</td><td>800 de 6</td><td>800 de 7</td><td>800 de 8</td><td>1500 de SF</td></tr></tbody></table>

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 1 : exemple de gamme d'étalonnage de SOD</figcaption></figure>

#### Réalisation de la plaque

* Préparer le milieu réactionnel selon 3.2.3

* Sur une plaque 96 puits (Greiner) déposer 20 µL de chaque dilution de la gamme en en triplicat (8 étalons /plaque)

* Déposer ensuite 20 µL de chaque prédilution d'échantillon en triplicat (24 échantillons./plaque)

* Ajouter 175 µL de milieu réactionnel avec une pipette multicaunaux
* Ajouter 20 µL de mercaptoéthanol avec une pipette multi-coups

* Laisser incuber 15 minutes à température ambiante ou dans le spectrophotomètre (T° ambiante +4°C) puis lire l'absorbance toutes les minutes pendant 30 minutes minimum à 340 nm.

## 3.4 Expression des résultats

### 3.4.1 Calculs

* Pour chaque étalon et échantillon, calculer la pente (delta d'absorbance) sur 10 minutes minimum en zone linéaire de la cinétique *A noter que les pentes sont de valeurs négatives, celle du blanc (sans SOD) étant la plus élevée en valeur absolue.*

* Déduire la pente du blanc de chacune de ces pentes. *A noter que la soustraction entraine des delta d'absorbance positifs*

* Déterminer l'équation de la courbe d'étalonnage SOD (U/mL) = f (Abs/min)

La formule permet ensuite de calculer l'activité SOD des échantillons en Unité commerciale par mL d'échantillon.

Cette activité peut être pondérée par la teneur en protéines ou l'équivalent matière fraiche contenu dans l'échantillon.

#### 3.4.1 Traitement statistique des résultats

Les mesures de la variable SOD chez les invertébrés étant souvent effectuées sur des pools d'individus, les variations individuelles sont de ce fait pondérées. L'estimation de la moyenne arithmétique suivie de l'écart type ou d'un intervalle de confiance à 95% est donc généralement admise comme descripteur d'un groupe expérimental.

L'utilisation de pools d'individus diminuant le nombre de replicats, il peut être est conseillé d'utiliser un test non paramétrique (Test U de Mann Whitney) pour la comparaison des groupes.

# 4 SYNTHESE DU DOCUMENT
<figure><img src="image_6.png" /></figure>