Le premier élément soutenant l'hypothèse d'une relation entre fluidité membranaire et plasticité
cellulaire correspond à la mise en évidence d'une corrélation entre la sensibilité à la ferroptose
des lignées cancéreuses mammaires et leur fluidité membranaire. Comme nous l'avons vu, une
plus grande sensibilité à la ferroptose a fréquemment été associée aux cellules cancéreuses les
plus tumorigéniques et à l'acquisition de propriétés retrouvées dans les cellules souches. Il était
ainsi tout à fait intéressant de confirmer que les lignées Basal-like, justement plus
tumorigénique et à l'identité mammaire profondément altérée, possédaient une sensibilité
accrue à la ferroptose qui était associée à une fluidité membranaire importante. Face à cette
sensibilité, il est donc probable que ces cellules soient particulièrement dépendantes à la mise
en place de réponses antioxydantes efficaces, en particulier pour se protéger de la peroxydation
lipidique. Cette hypothèse est renforcée par l'analyse transcriptomique de la lignée métastable
qui possède le caractère bipotent des cellules souches mammaire et qui, comme les cellules
cancéreuses Basal-like, présente une fluidité membranaire plus importante que des progéniteurs
engagés dans une des branches de la hiérarchie mammaire. En effet, ces cellules expriment de
façon plus intense les gènes associés aux réponses au stress RedOx et à la ferroptose. Ces gènes
sont principalement régulés par le facteur de transcription NRF2<sup>277</sup>, impliquant que celui-ci
puisse posséder un rôle majeur dans le maintien d'un phénotype cellulaire à forte plasticité
susceptible d'être enrichie en PUFA. De plus, un métabolisme du fer soutenu nécessaire au
contrôle des mécanismes épigénétique et au maintien d'un phénotype plastique constitue sans
doute un autre élément important de sensibilité au stress oxydant et à la ferroptose chez ces
mêmes cellules<sup>217</sup>. En résumé, l'activation de NRF2 pourrait constituer un carrefour
moléculaire connectant les différentes propriétés associées aux cellules les plus plastiques,
notamment dans le contexte du développement d'une tumeur. Cette idée rejoint les observations
effectuées dans les laboratoires de Max Wicha et J.F Lo qui ont également montré dans
différents modèles de carcinome le rôle central joué par NRF2 dans l'acquisition de propriété
comme la quiescence, les fortes propriétés antioxydantes de ces cellules et surtout le maintien
dynamique de leur très grande plasticité. De façon remarquable, ces études ont même associé
les changements relatifs de niveau de stress oxydant à l'entrée des cellules cancéreuses très
indifférenciés dans des processus de réacquisition d'identité cellulaire plus proche de celle des
cellules normales<sup>152,278</sup>.

Ayant introduit l'hypothèse de NRF2 comme un lien moléculaire essentiel aux propriétés de
plasticité cellulaire exacerbées dans les cellules cancéreuses, je vais maintenant tenter d'étendre
ce concept en y intégrant les données de la littérature à mes propres résultats. Mon but ici est
notamment de démontrer la cohérence de l'hypothèse proposant que la plus grande fluidité des
membranes associée à la plasticité cellulaire puisse être une conséquence directe de ces
régulations génétiques et biochimiques. Je commencerai ici par revenir sur les états cellulaires
dits hybrides associant à la fois des caractéristiques mésenchymateuses et épithéliales. Ces états,
retrouvés dans les cellules Basal-like sont clairement la conséquence des processus de perte
d'identité cellulaire et sont aujourd'hui considérés comme à la base des processus
métastatiques, voir dans certaines conditions, à la base de l'initiation tumorale<sup>128,129,279</sup>.
L'analyse mathématique des réseaux de gènes supportant ces états hybrides a permis de mettre
en évidence la présence de NRF2 en leur cœur et sa capacité à promouvoir un état hyper
plastique en coopération avec le facteur ZEB1<sup>280</sup>. Ces analyses ont ensuite été confirmées par
des analyses *in vitro* montrant que la perte d'expression de *NFE2L2* (gène de NRF2) dans ces mêmes cellules hybrides favorisant l'acquisition d'une identité cellulaire mésenchymateuse. Des simulations informatiques par la méthode de « *Random Circuit Perturbation* » (RACIPE)²⁸¹ ont permis de mettre en évidence que l'état hybride était systématiquement associé à une expression élevée de NRF2. À l'inverse de ZEB1, SNAIL induisait quant à lui l'acquisition d'un phénotype mésenchymateux aberrant et inversement corrélé à NRF2. Ces résultats sont à rapprocher des mécanismes nous ayant permis de générer la lignée métastable justement par le contrôle de l'activité de ZEB1 où, ce n'est pas l'activation constitutive du facteur qui place la cellule dans cet état de grande plasticité, mais plutôt son activation modérée en intensité et en durée. Il est ici intéressant de rappeler qu'en cas d'activation constitutive, de ce facteur ZEB1, les cellules HMEC adoptent elles aussi un état complètement mésenchymateux. De la même façon, l'acquisition du phénotype métastable de nos cellules n'était pas accompagnée d'une augmentation d'expression de SNAI1, voir même était diminuée en comparaison des cellules HMEC d'origines. En revanche, son augmentation était observée lors de l'induction de la différenciation des cellules métastable en cellules myoépithéliales, donc lorsque les cellules acquièrent une identité plus mésenchymateuse. Ainsi, nos résultats obtenus à partir des cellules métastables étaient similaires à ceux du modèle *in silico* précédemment décrit dans lequel l'activation de NRF2 joue un rôle essentiel. Il serait donc maintenant intéressant de comprendre quels sont les mécanismes qui permettraient l'activation de NRF2 dans le cadre d'une plus grande plasticité et la façon dont ces mécanismes connecteraient les modifications épigénétiques associées à cet état à la plus grande fluidité des membranes.

Le mécanisme classique permettant l'induction efficace de NRF2 est le déséquilibre de la balance RedOx qui, par l'augmentation des ROS et l'oxydation de cystéines, permet la libération de NRF2 d'une protéine chaperonne KEAP1. Cependant, d'autres mécanismes activant cette protéine ont été décrits. Une étude a pu mettre en évidence que lors de la mise en place d'un programme de dédifférenciation de cellules épithéliales mammaires par induction de l'expression de l'EMT-TF TWIST1, un mécanisme ROS-indépendant, mais lié au stress du réticulum endoplasmique permettait, par l'activation de PERK, d'induire une réponse de NRF2. Cette régulation homéostatique était essentielle, car son inhibition entraînait de façon spécifique à ces cellules une forte augmentation de la peroxydation lipidique. En résumé, un mécanisme moléculaire complexe semblait donc connecter une modification homéostatique du réticulum, potentiellement lipidique, à l'activation de NRF2 dans un modèle de dédifférentiation mammaire²⁸². Il est important de noter à ce niveau que même si l'induction de PERK s'effectue classiquement lors de la mise en place d'une réponse aux protéines mal repliées au sein du réticulum endoplasmique (*Unfold protein response* : UPR), l'altération des propriétés biophysiques des membranes du RE constitue sans aucun doute un autre signal activant le programme UPR, aussi bien lors d'une rigidification que d'une fluidification trop importante²⁸³,²⁸⁴,²⁸⁵. Une hypothèse probable formulée à partir des précédents résultats est donc qu'un remodelage lipidique prenne place au sein du RE lors de la mise en place d'un mécanisme de dédifférenciation, sensibilisant la cellule au stress oxydant et à la ferroptose, et nécessitant en conséquence une activation de NRF2 rendu possible par ce mécanisme connectant l'homéostasie membranaire du RE à l'activation de ce facteur de transcription. Une élévation du niveau des PUFA au niveau du RE serait notamment un élément important de cette
régulation qui mériterait d'être vérifiée par des approches lipidomiques effectuées à partir de préparation de microsomes (Figure 19).

<figure><img src="image_92.png" /><figcaption>**Figure 19 :** Activation ROS dépendant et indépendant de NRF2. Deux types d'activations de NRF2 ont été décrits dans la littérature. La première passe par l'action des ROS sur KEAP1 ce qui permet de libérer NRF2. La seconde passe quant à elle par l'activation de NRF2 par PERK permettant alors sa dissociation de KEAP1. Cette activation par PERK peut s'effectuer lorsque la protéine chaperonne GRP78 se dissocie de PERK, soit lorsqu'elle effectue son activité chaperonne (en haut à gauche), soit lorsqu'elle est transloquée vers la membrane plasmique (en haut à droite)</figcaption></figure>

Il est important de noter ensuite que ce modèle homéostatique couplant NRF2 à des perturbations homéostatiques et lipidiques du réticulum suite à l'élévation de la plasticité cellulaire a été rapporté dans d'autres études déjà mentionnées, mais est aussi validé par certaines de nos propres observations. Tout d'abord, l'activation de NRF2 par PERK a aussi été rapportée dans les cellules hybrides E/M²⁷⁸. Cette activation était connectée ici à une relocalisation des protéines chaperonnes inhibitrices de PERK à la membrane plasmique. Ces protéines, connues sous le nom de GRP78 (ou BiP) sont des régulateurs essentiels du stress du RE et il serait ainsi intéressant de vérifier si ce processus de relocalisation à la membrane plasmique est associé à des perturbations des propriétés biophysiques des membranes du RE. De façon similaire ensuite, nous avons pu observer une augmentation d'expression d'ATF4 dans notre lignée métastable en comparaison des cellules d'origines HMEC. La traduction de l'ARNm de ce facteur de transcription est elle-même augmentée par eIF2α, elle-même activée par phosphorylation par PERK. De la même manière, l'analyse par immunohistochimie de coupe de tumeur triple négative, majoritairement basal-like, montre une plus forte expression d'eIF2α et d'ATF4 en comparaison du tissu normal²⁸⁶. Ces résultats constituent d'autres
éléments indiquant que les processus de plasticité physiologiques ou pathologiques sont associés à des réponses de stress du RE. D'autre part, l'activation du facteur ATF4 pourrait être un autre événement moléculaire important permettant de connecter cette plasticité à une plus grande fluidité membranaire. L'activation de l'UPR, à travers notamment ATF4 s'accompagne de façon assez universelle d'une augmentation du volume de réticulum endoplasmique, ces résultats étant observés aussi bien chez l'homme que chez des organismes très simples comme la levure. Ce mécanisme aurait pour but de diluer les protéines intrinsèquement mal repliées et ainsi d'éviter leur agrégation, le point le plus délétère pour le contrôle de l'homéostasie du réticulum<sup>287-289</sup>. Nous avons nous-mêmes observé une tendance à un volume plus fort du RE dans notre lignée métastable et dans les lignées cancéreuses Basal-like en comparaison des autres modèles cellulaires étudiées. Ainsi, le ratio du volume du RE sur celui de la membrane plasmique serait augmenté dans les cellules possédant une plus grande plasticité phénotypique se traduisant alors par une augmentation apparente de la fluidité membranaire à l'échelle de la cellule entière puisque, comme je l'ai confirmé, la fluidité du RE est de façon générale bien supérieure à celle de la membrane plasmique. Enfin, j'aimerais souligner que l'ensemble des mécanismes que je viens de rapporter dans un contexte tumoral, ou au sein de notre modèle, semble également exister dans un modèle de plasticité extrême, les cellules iPS (Induced pluripotente stem cell)<sup>290,291</sup>. Nous venons de voir que les cellules les plus plastiques possédaient en plus d'une réponse antioxydante induite par NRF2, un métabolisme associé en soutien à cette réponse. Au vu du rôle clé de l'environnement hormono-nutritif pour l'acquisition et le maintien de nos cellules métastables. Il est justifiable de se demander, *in vivo*, dans quel microenvironnement nous retrouvons les CCDD afin de tenter de comprendre les mécanismes liés à la plasticité cellulaire et à l'acquisition d'une fluidité membranaire plus importante.

## Métabolisme, UPR et modulateur de l'identité cellulaire :

Ayant vu le rôle probable de la réponse UPR et de NRF2 lors de la mise en place d'un programme de plasticité, je voudrais maintenant apporter des éléments reliant le contrôle de l'identité cellulaire au niveau épigénétique à celle de l'homéostasie du RE. Les cellules cancéreuses mammoires Basal-like expriment de façon plus importante le gène ACSL4, codant pour une enzyme essentielle à l'activation de l'acide arachidonique<sup>292</sup> et qui est couplée à une plus forte sensibilité à l'inhibition des mécanismes anti-ferroptose<sup>218</sup>. D'autre part, les facteurs de plasticité comme ZEB1 permettent d'augmenter également l'expression de l'enzyme GPX4 importante pour prévenir l'induction de la ferroptose en réponse à une augmentation du métabolisme des PUFA<sup>293</sup>. On voit ainsi que de façon très directe, les remodelages épigénétiques et les modifications d'homéostasies lipidiques peuvent être contrôlées par les mêmes facteurs inducteurs de plasticité. Pour aller plus loin, cette connexion pourrait en fait être renforcée par des mécanismes biochimiques. L'activation de la voie des hexosamines permet la production d'UDP-N-Acétylglucosamine, un substrat permettant l'ajout d'un groupement N-acetylglucosamine sur les sérines de certaines protéines. L'activité de la voie des hexosamines et cette modification post-traductionnelle (O-GlucNacylation) ont été fortement associées à de nombreux modèles de plasticité cellulaire et nous avons pu nous même
observer une élévation d'expression du gène GFPT2 dans notre lignée métastable, ce gène codant pour l'enzyme limitante de la voie des hexosamines. Des données du laboratoire montrent d'autre part que le gène GFPT2 est activé par un complexe transcriptionnel entre ZEB1 et les facteurs YAP, connectant ainsi de façon très directe l'activation de la voie des hexosamines au processus de plasticité. L'élément le plus intéressant à propos de cette régulation est la mise en évidence probable d'une boucle de régulation connectant l'activité de ces facteurs capables de perturber l'identité cellulaire, la voie des hexosamines et les enzymes de contrôle des PUFA. Au sein des tumeurs hépatiques, la O-GlucNacylation de YAP permet par exemple de le maintenir au sein du noyau, d'augmenter son activité protumorigénique et sa capacité à induire des caractères souches<sup>294</sup>. Dans ce même tissu, l'enzyme ACSL4 est elle-même modifiée post-traductionnellement par une O-GlcNAcylation augmentant son activité, ce mécanisme étant fortement sollicité dans les hépatocarcinomes agressifs<sup>295</sup>. L'activité d'ACSL4 serait elle-même capable d'intensifier celle de la voie des hexosamines. Enfin, en dehors de ces régulations par O-GlcNAcylation, des travaux par inactivation de YAP ont montré que le gène ACSL4 est lui-même régulé par YAP. On voit ainsi à travers ces résultats le très fort niveau d'intégration entre ces mécanismes génétiques et biochimiques permettant de relier probablement le contrôle de l'identité cellulaire à celui de la fluidité membranaire (Figure 20).

<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>Figure 20 : Boucle de régulation des perturbateurs de l'identité cellulaire, la voie des hexosamines et le métabolisme des PUFA.</figcaption></figure>

La présence presque certaine des facteurs YAP au cœur de ces réseaux constitue un élément sans doute fondamental à la connexion de ces régulations épigénétiques et lipidiques. Comme
je l'ai indiqué précédemment, les programmes de plasticité sont très fortement impactés par
l'activité des facteurs ZEB1 et YAP qui sont capables de former un complexe transcriptionnel
associée à la régulation génétique et épigénétique d'un nombre de gènes très importants,
notamment dans le contexte du développement des tumeurs mammaires²⁹⁶, dont GFPT2 ferait
partie. La régulation des facteurs YAP est un processus extrêmement complexe, impliquant
des effets tissulaires par mécanotransduction et contrôle de la voie Hippo en réponse aux
jonctions cellulaires formées par les cellules épithéliales. Cependant, un contrôle biochimique
est également exercé sur YAP à travers l'activité de la voie du mévalonate et la production de
géranylgéranyl-PP associée²⁰⁴. La voie du mévalonate permet d'autre part d'assurer à la fois la
synthèse du cholestérol, et du CoQ₁₀, constituant autant de connexion entre le contrôle
transcriptomique de la plasticité et des régulations biochimiques associées à l'homéostasie
lipidique ou à la ferroptose. L'activation de la voie du mévalonate est normalement sensible au
manque de dérivés du cholestérol permettant l'activation du facteur clef SREBP2 par sa
translocation depuis le RE vers le noyau. Cependant dans un contexte de réponse UPR, SREBP2
peut être activé indépendamment de cette régulation par le cholestérol indiquant que l'induction
de cette réponse UPR par modulation du métabolisme des PUFA puisse être à l'origine d'une
intense activité de la voie des mévalonates. Que ce mécanisme puisse favoriser l'activation de
YAP et une protection contre la ferroptose par une plus grande synthèse de CoQ₁₀ est une
évidence, en revanche il est plus difficile de le relier à une plus grande fluidité des membranes,
le cholestérol favorisant au contraire des effets opposés. Nous et d'autres avons observé dans
les modèles de plasticité notamment mammaire que cette plus grande activité de la voie du
mévalonate était couplée à une plus forte expression du récepteur à efflux du cholestérol
ABCA1. Ainsi, même en cas de synthèse plus élevée du cholestérol, cela pourrait ne pas
conduire à une élévation de sa concentration au sein des membranes. Ce mécanisme permettrait
en parallèle de garantir la forte production de geranyl-geranyl-PP et de CoQ₁₀²⁹⁷. L'activation
des pompes à efflux du cholestérol est d'autre part sous le contrôle des récepteurs nucléaires
LXR²¹² et il est donc tout à fait intéressant d'observer que les protéines LXR tout comme les
transporteurs à efflux du cholestérol d'ABCA1 sont fortement exprimés au sein des tumeurs
mammaires triples négatives de sous-type Basal-like²¹³. Enfin, le traitement de tumeurs
hormono-dépendantes, dans lesquelles l'identité cellulaire est plutôt bien conservée peuvent
être rendues plus agressives, indépendantes aux œstrogènes et métastatiques suite à l'activation
de LXR par son agoniste le 27-hydroxycholesterol. Un programme de plasticité était induit suite
à ce traitement comme démontré par l'analyse de marqueurs du processus de l'EMT²¹², plaçant
ainsi potentiellement la modulation du flux du cholestérol au cœur de l'acquisition d'une plus
grande plasticité cellulaire, en soutient d'autres mécanismes vus précédents. Nous avons en ce
sens effectué des marquages à la Filipin, afin d'observer si effectivement la concentration de
cholestérol était augmentée ou pas par exemple dans notre modèle métastable. Comme attendu
par rapport à l'expression des pompes à efflux, ces marquages n'ont pas démontré une
accumulation de cholestérol. Une approche fluxomique est ainsi maintenant envisagée dans le
but de caractériser si en revanche le flux du mévalonate est quant à lui activé dans ces modèles,
complété par des approches pharmacologiques (statine), visant à vérifier si la perturbation de
ce flux conduirait à empêcher la mise en place de ces programmes de plasticité à travers
notamment l'inhibition de YAP ou un trop fort stress oxydant conduisant à la ferroptose.
Pour conclure sur cette partie, il est intéressant de se pencher d'une façon purement conceptuelle sur les raisons intrinsèques à cette connexion entre plasticité cellulaire au sens épigénétique et phénotypique, et une plus grande fluidité membranaire. La mise en place d'un tissu épithélial, tout comme les processus de régénération tissulaire associés à la cicatrisation sont sous le contrôle d'interactions morphogénétiques (voies WNT ou Notch parmi d'autres) et matricielles (contact avec les laminines des lames basales par exemple) prenant place au niveau de la membrane plasmique. La position des cellules au sein du tissu, et par extension, la position de ces contacts jouent un rôle fondamental dans ces processus de développement, en particulier dans les phénomènes de polarisation baso-apical et planaire. Ainsi on peut émettre l'hypothèse que la rigidification des membranes autour de ces contacts facilite leur stabilisation au sein des cellules ayant acquis leur identité terminale, ces deux phénomènes s'entretenant simultanément puisque les contacts notamment morphogénétiques participent de façon active au maintien de cette identité (on peut rappeler le réengagement des propriétés de bipotence dans les progéniteurs basaux mammaires suite à la perte de leurs contacts avec les cellules luminales). À l'inverse, une plus grande fluidité membranaire se mettant en place par exemple lors de la réacquisition d'une forte plasticité dans un processus de cicatrisation permettrait de dissoudre plus facilement ces points de contact tout en facilitant leur redistribution lors de la réacquisition d'une nouvelle identité. Ces mécanismes seraient bien sûr fortement perturbés dans le cadre du développement tumoral. Ces concepts, purement hypothétiques, soulèvent de nombreuses questions, comme par exemple la façon dont la fluidité des endomembranes participerait ou non à ces mécanismes. Aussi, indépendamment de tout mécanisme génétique et en lien avec ces hypothèses, il serait intéressant d'analyser si des modulations pharmacologiques de la fluidité membranaire pourraient conduire à la perturbation de ces contacts morphogénétiques et l'identité cellulaire qu'ils entretiennent. Dans ce contexte, la perturbation homéostatique pourrait alors être la cause pathologique à l'engagement des facteurs de plasticité comme ZEB1, leur activité étant elle-même sous le contrôle de ces régulations morphogénétiques et de ces contacts matriciels. Toutes ces questions pourraient faire l'objet d'un vaste programme de recherche.

## Microenvironnement et plasticité cellulaire :

J'aimerais maintenant déplacer ce concept de plasticité cellulaire analysé pour l'instant de façon uniquement intrinsèque dans un cadre plus global de contrôle tissulaire, analysant notamment la façon dont ce cadre participe à modifier la fluidité membranaire. Au niveau d'une tumeur, l'environnement tissulaire est bien sûr perturbé, affectant notamment les gradients de concentration des composés hormonaux et nutritifs, notamment la concentration en O₂. Ainsi les processus de plasticité et la fluidité des membranes qui peuvent bien sûr être affectées par ces apports nutritifs sont vraisemblablement fortement influencés par ce contexte tissulaire. D'autre part, la communication paracrine des cellules cancéreuses avec les cellules normales de leur environnement est également susceptible de modifier leur engagement dans un processus plus ou moins exacerbé de plasticité. Je vais essayer de présenter maintenant ces deux aspects en y incorporant des éléments de mes propres travaux.
Je commencerai tout d'abord par m'intéresser aux interactions paracrines, notamment dans le contexte des niches périvasculaires. L'analyse par exemple de coupes histologiques de tumeurs de carcinomes de la tête et du cou de patient a permis de mettre en évidence une localisation des cellules les plus dédifférenciées repérées par les marqueurs de surface CD44⁺ et ALDH1A1⁺ à proximité du réseau sanguin²⁹⁸. Des apports nutritifs importants pourraient ainsi être associés à une plus grande plasticité dans ce contexte. Cependant, la formation de sphère en 3D in vitro par des lignées cellulaires maintenues dans un milieu conditionné par des cellules endothéliales était améliorée et s'accompagnait d'une augmentation du nombre de CCDD. Des effets paracrines étaient donc a priori impliqués. Ce type d'effet a également été observé avec d'autre systèmes cellulaires comme les fibroblastes associés aux cellules tumorales (*Cancer associated fibroblast*: CAF), qui jouent un rôle sur l'activation de mécanisme de plasticité, notamment par leur sécrétion de TGFβ qui est un puissant inducteur du programme de l'EMT²⁹⁹,³⁰⁰, mais aussi par la sécrétion de l'IL6¹¹⁰,³⁰¹. De façon similaire, des macrophages polarisés M2, eux aussi localisé de façon périvasculaire dans un modèle de cholangiocarcinome intrahépatique peuvent favoriser par leur sécrétion d'Interleukine 10 (IL-10) un support à la croissance et à l'invasion tumoral, notamment grâce à l'induction de l'EMT et tout particulièrement de l'EMT-TF ZEB1 par l'IL-10³⁰². Des métabolites produits par les tumeurs pourraient être impliqués de façon directe dans ces phénomènes, notamment ceux comme la kynurénine issue de la dégradation du tryptophane. La kynurénine atténue notamment les réponses immunitaires via l'activation du récepteur AHR³⁰³, en exerçant notamment un fort contrôle sur la polarisation des macrophages. D'autre part, de nombreuses études et nos propres observations ont rapporté une plus forte expression du gène *KYNU* dans les cellules possédant une plus grande plasticité indiquant l'existence possible de boucles de régulations tissulaires entretenant cette plasticité. En effet ce gène favorise la libération de composés analogue à la kynurénine conduisant donc le système immunitaire et notamment les macrophages à favoriser ce même programme de plasticité par l'IL-10 qu'ils secrètent. Il est intéressant dans ce contexte de noter que la kynurénine est plus fortement concentrée au sein des tumeurs triples négatives³⁰⁴ et serait associée à une boucle de rétrocontrôle positive avec la prostaglandine E2 (PGE₂), qui pour rappel est synthétisée à partir de l'acide arachidonique³⁰⁵. Finalement, l'activation d'AHR par la kynurénine au sein même des cellules cancéreuses pourrait participer à leur plus grande plasticité et au contrôle de la fluidité des membranes. AHR permettrait tout d'abord la modulation du métabolisme lipidique et tout particulièrement celui des PUFA, augmentant alors la synthèse de PGE₂. Cette prostaglandine peut alors à son tour moduler l'activité de l'immunité au niveau de la tumeur en faveur de la croissance tumorale et permettrait le maintien de son expression en augmentant le métabolisme de la kynurénine. AHR d'autre part, a été récemment impliqué dans le contrôle des facteurs de transcription les plus essentiels à la physiologie des cellules souches embryonnaires comme Nanog et Oct4, ces régulations s'observant dans la plasticité mammaire, notamment dans le cadre de nos études sur le DPhP. Pour finir sur cet aspect de coopération avec le système immunitaire, j'aimerais mentionner également l'interaction métabolique existant entre les macrophages et les cellules cancéreuses au niveau de l'homéostasie du fer, qui comme nous l'avons vu, joue un rôle essentiel dans les processus épigénétiques associés à la plasticité. Il a ainsi été montré qu'une l'augmentation de l'efflux du fer dans le milieu extracellulaire par les macrophages pourrait par son incorporation au sein des cellules cancéreuses influencer les mécanismes associés au
remodelage épigénétique que l'on retrouve notamment lors de l'acquisition d'un phénotype
CCDD<sup>217,306</sup>.

Finalement, il est important de se pencher sur les communications paracrines mises en
place avec les adipocytes périvasculaires. Nous avons-nous même observé dans la lignée
métastable une augmentation de l'expression de FABP4 qui couplée à un milieu enrichi en
PUFA ω6 semble susceptible de favoriser l'acquisition et le maintien du phénotype métastable.
Il est intéressant de constater que ces observations peuvent être corrélées à celles retrouvées
dans des conditions *in vivo* lors d'une alimentation de type occidentale. En effet, il a pu être
décrit qu'une alimentation riche en ω6 peut influencer l'acquisition d'un phénotype CCDD.
Des travaux ont pu montrer qu'un milieu conditionné par des adipocytes primaires de souris
ayant reçu une alimentation de type occidentale riche en ω6 permettait une augmentation de la
plasticité cellulaire, notamment grâce aux facteurs protéiques sécrétés par les adipocytes tels
que IL-6 ou encore l'Oncostatine M<sup>307-309</sup>. Un rôle des PUFA non considéré dans cette étude
serait bien sûr intéressant à évaluer. De façon similaire, les processus de réoxygénation par
traitement d'un agent chimique anti-angiogénique (sunitinib) sont suivis d'une augmentation
de FABP4 lors de réémergence tumorale. La réoxygénation s'accompagnant d'un apport nutritif
global, un possible rôle des PUFA pour lequel FABP4 est plus affin semble donc aussi un
élément probant à valider dans ce contexte<sup>310</sup>. Ce rôle de FABP4 est sans doute majeur, car il a
pu être validé de façon plus directe dans d'autres études. La co-culture d'adipocyte avec des
cellules cancéreuses du colon *in vitro* et *in vivo* a pu mettre en évidence l'implication de FABP4
dans la mise en place des processus métastatiques, notamment grâce à une augmentation de
l'activation d'un programme d'EMT<sup>311</sup>. D'autre part, FABP4, connue pour son affinité pour les
PUFA ω6, a de façon plus globale, un rôle important pour l'incorporation des lipides libres
sécrétés principalement par les adipocytes<sup>312</sup>.

En conclusion, il semble donc que l'expression de FABP4 par les cellules engagées dans un
processus de plasticité intense favorise par interactions métaboliques avec les adipocytes une
plus grande incorporation de PUFA ω6 que nous avons vu être probablement intrinsèquement
liés avec les programmes de plasticité.

En bilan de cette partie, on voit donc qu'au niveau périvasculaire dans un contexte tumoral
pathologique, des mécanismes génétiques semblent se mettre en place au sein des cellules les
plus plastiques favorisant leur interaction avec les différentes composantes cellulaires présentes
dans un but d'entretenir de façon paracrine et métabolique leur grande plasticité.
<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>**Figure 21 : Interactions des cellules cancéreuses avec le stroma.** CAF (cancer associated fibroblast), NK cell (Natural killer cell), T cell (Lymphocyte T), OSM (Oncostatin M), IL6 et 10 (Interleukin 6 et 10), TGFβ (Transforming growth factor beta), PGE₂ (Prostaglandin E2), FA (Fatty acid), FFA (Free fatty acid)</figcaption></figure>

## Phénotype CCDD à la croisée d'un métabolisme et des facteurs pro-inducteurs de la plasticité :

Nous venons de voir que les cellules cancéreuses à forte plasticité n'étaient pas isolées dans le tissu, et que ses interactions avec les autres composantes cellulaires leur permettaient de soutenir l'acquisition et le maintien de leur phénotype. Au cours de la progression tumorale, l'environnement n'est pas statique, notamment dû à la croissance tumorale en elle-même, modifiant alors les interactions cellulaires, mais aussi les apports hormonaux et nutritifs. De plus lors de nos travaux nous avons pu mettre en évidence le rôle important de ces modulations pour l'acquisition d'un phénotype métastable et pour son maintien. J'aimerais donc dans cette partie décrire dans quelle région les cellules les plus plastiques pourraient se situer, mais aussi les modifications que peuvent exercer les cellules plastiques sur le tissu.

Comme nous l'avons vu, les interactions cellulaires permettraient d'engager les cellules dans l'acquisition d'un phénotype plastique, décrivant l'environnement périvasculaire comme une région propice à l'augmentation de la plasticité. Cette région serait alors à la croisée d'un ensemble de signaux paracrines et métaboliques et propices à l'acquisition d'un phénotype CCDD, plus plastique. En prenant en considération les effets de dilution et en se basant sur les travaux de l'équipée de Wicha, il est justifiable d'émettre l'hypothèse que le micro-environnement moins riche et plus hypoxique diminuerait la probabilité d'acquérir et de
maintenir un phénotype CCDD, notamment face à l'augmentation des ROS dus à l'hypoxie, poussant alors sur l'acquisition d'un phénotype plus différencié et prolifératif<sup>152</sup>. Cependant, comme je l'ai décrit dans l'introduction, l'hypoxie joue un rôle pro-oxydant, mais aussi pro-EMT. Cette dualité pourrait de façon stochastique induire chez les cellules l'acquisition d'un phénotype différencié ou à l'inverse pousser sur l'acquisition d'un phénotype CCDD. La population qui réacquiert une plus grande plasticité pourrait dans ces conditions d'hypoxie effectuer une transdifférenciation en cellule endothéliale afin de maintenir un pool nutritif conséquent. Pour soutenir cette hypothèse, une étude a pu décrire un mécanisme de transdifférenciation lors de l'analyse de tumeur mammaire après injection ectopique de cellules MCF7 marqué par un fluorophore (RFP)<sup>313</sup>, montrant la création de nouveaux vaisseaux par les cellules cancéreuses elles-mêmes au niveau des régions hypoxiques. En lien avec nos travaux, il serait donc intéressant d'analyser la fluidité membranaire de ces cellules grâce au Dioll, afin d'observer si celles en cours de transdifférenciation auraient une fluidité membranaire plus importante que le bulk adjacent.

Alors que dans cette hypothèse, les cellules plastiques se situeraient en périphérie de la tumeur, la néovascularisation permettrait la création de nouvelles régions propice à l'acquisition d'un phénotype plastique. Après un temps de développement tumoral plus long, le réarrangement de l'environnement tumoral lors de la tumorigenèse pourrait ainsi changer la distribution des différentes populations, notamment au niveau de la périphérie. En effet, lors de nos travaux nous avons pu observer que lors d'une exposition prolongée aux facteurs pro-EMT (TGFβ et OSM) les cellules métastables acquéraient un phénotype mésenchymateux aberrant. De la même manière, il serait possible qu'une exposition prolongée des cellules CCDD aux facteurs inducteurs du programme de l'EMT par le micro-environnement tumoral périvasculaire permettrait aux cellules d'acquérir une identité plus mésenchymateuse des CCDD. Toujours par effet de diffusion des molécules, les cellules les plus différenciées et les plus éloignées du système sanguin permettraient de maintenir une prolifération de la tumeur *in situ*. Les CCDD hybrides quant à elles seraient à l'interface de ces deux régions, qui comporterait les concentrations optimales du cocktail hormono-nutritif propice à l'acquisition d'un phénotype plastique. Cette hypothèse est fortement soutenue par les travaux de l'équipe de C. Blanpain, qui ont pu discriminer un ensemble de populations ayant différents phénotypes répartis sur le continuum du processus de l'EMT, à partir d'un modèle murin où l'expression de K-RAS<sup>G12D</sup> et la délétion de P53 au niveau des follicules pileux permettaient le développement spontané des tumeurs de la peau<sup>128</sup>. Dans ce même modèle, les auteurs indiquent que la région où se situe les cellules à la plus forte identité mésenchymateuse se situe au plus proche des cellules endothéliales avec en arrière la région comportant principalement des cellules CCDD hybrides E/M. Dans un tel contexte de répartition cellulaire, les cellules mésenchymateuses joueraient un rôle de leader pour l'invasion tumorale *in situ*, permettant alors aux cellules CCDD hybrides les plus adaptables à un nouvel environnement d'entrer dans la circulation et coloniser d'autres tissus<sup>124,127,279</sup>. En prenant en considération que nos travaux ont montré que la plasticité cellulaire était corrélée à la plasticité phénotypique, il serait intéressant d'effectuer des mesures de la fluidité membranaire sur des coupes de tumeurs, afin de discriminer différentes régions de plasticité, qui seraient corrélées à celles décrites par immunomarquages.
Création d'outils de mesures de la plasticité cellulaire par suivi de la fluidité membranaire :

Même s'il reste encore à comprendre de nombreux mécanismes permettant de lier la plasticité
cellulaire et la fluidité membranaire, il est intéressant de se projeter et d'ouvrir des perspectives
sur l'utilisation de la mesure de la fluidité membranaire par la sonde Dioll pour la création d'un
index de plasticité. La première approche qui serait possible est de déterminer un scoring au
niveau de coupes histologiques de biopsies tumorales ou par analyse FACS. L'une des variables
qui pourraient alors impacter la fluidité membranaire est les différences de pression que peut
exercer la matrice extracellulaire. Cependant, des analyses préliminaires sur des tumeurs
mammaires spontanées par induction de MYC à la doxycycline au sein de l'équipe sont
encourageantes. Nous avons pu lors de cette analyse discriminer un ensemble de populations
cellulaires, avec une fluidité membranaire la plus importante pour les cellules positives aux
marqueurs de plasticité classiques (CD29⁺, CD61⁺, CD24⁺). Néanmoins, une autre approche
semble possible par analyse des vésicules extracellulaires sécrétées par les cellules dans les
fluides biologiques. En effet par son intensité importante le Dioll à la capacité de discriminer
des EV en cytométrie. De plus, des travaux préliminaires par mesure en spectrofluorimétrie au
sein de l'équipe semblent montrer que les EV sécrétées par les cellules ont une fluidité
dépendante des cellules mères. Ces observations sous-entendent alors que la mesure de la
fluidité des EV permettrait de discriminer celles de cellules différenciées de ceux de cellules
ayant subi un processus de dédifférenciation. L'avantage de créer un outil basé sur les EV est
sa facilité et le confort du prélèvement quasi non invasif (prélèvement sanguin, collecte d'urine
ou encore de salive en fonction de l'origine de la tumeur). La limite qu'il pourrait y avoir avec
cette approche est le pouvoir discriminatoire des EV d'origines cancéreuses face à l'ensemble
des EV de l'organisme entier. Il est cependant possible d'imaginer des protocoles pour
surmonter ces limites. La première serait une prépurification des EV spécifique des cellules
cancéreuses avec un marqueur membranaire, suivie de la mesure de leur fluidité membranaire
afin de discriminer les EV les plus fluides originaires des cellules les plus plastiques. La
seconde idée, la plus difficile d'un point de vue clinique, se base sur l'absence de toxicité du
Dioll. Il serait intéressant de transporter le Dioll par un vecteur spécifique des cellules
cancéreuses. L'intégration du Dioll dans les cellules cancéreuses permettrait alors le marquage
EV lors de leur biogenèse. Il sera alors possible de directement effectuer la mesure de la fluidité
membranaire. Enfin, une autre possibilité serait à la croisée des deux autres possibilités,
vectoriser un fluorochrome spécifique à la formation des EV qui permettrait une purification
facilitée avant le marquage au Dioll et la mesure de la fluidité membranaire. Afin d'augmenter
la résolution de la mesure de la fluidité membranaire à partir de cytomètre spectral, la mise au
point d'analyse multiparamétrique de la fluidité membranaire est en cours au sein de l'équipe,
ce qui permettrait une meilleure discrimination des vésicules, mais aussi des cellules. Le
principe est d'effectué d'une analyse en composantes principales sur un ensemble de liposomes
correspondant à une gamme de fluidité membranaire. En intégrant les valeurs de la signature
spectrale de nos échantillons avec ceux des liposomes, il sera alors possible de discriminer des
variations de fluidité membranaire plus faible. Avec l'augmentation de la résolution de notre
mesure de la fluidité membranaire, l'ensemble de ces approches aurait alors pour but d'effectuer
des mesures précises afin d'aider les cliniciens sur l'orientation de la stratégie thérapeutique
notamment grâce à la création d'un scoring de plasticité. Dans un second temps, la détection de
d'EV cancéreuses permettrait d'adapter le suivie thérapeutique. Soit pour une surveillance accrue soit pour éviter un sur traitement qui à l'heure actuelle exerce des effets secondaires lourds sur des patients dont la probabilité de rechute est faible.
CONCLUSION

La création du Dioll a permis d'obtenir un outil de mesure des membranes cellulaires robuste. Par sa meilleure résolution de la discrimination des régions rigides et fluides et par son incapacité a marqué les lipides non membranaires, cette sonde semble tout à fait en adéquation pour son utilisation comme outil de diagnostic.

Lors de cette thèse, nous avons utilisé le Dioll pour déterminer le lien entre la modulation de la fluidité membranaire et celle de la plasticité cellulaire. Nous avons à partir de différentes lignées cancéreuses mammaires pu constater que la fluidité était corrélée à la classification génétique classique Luminal, Basal-like et Claudin-low. Les lignées Basal-like possédent une fluidité membranaire la plus importante probablement due à leur phénotype plus indifférencié en comparaison des lignées Luminal. Étonnamment les Claudin-low sont quant à eux les plus rigides pouvant décrire l'acquisition d'une identité mésenchymateuses aberrante dans nos conditions. Dans un second temps nous avons utilisé un modèle isogénique de la modulation de l'identité cellulaire épithéliale des cellules HMEC. L'induction de l'EMT-TF ZEB1 induit un programme de l'EMT au sein des cellules HMEC entraînant alors la perte de leur l'identité cellulaire. Nous avons alors constaté une augmentation de la fluidité membranaire lors de l'acquisition d'un phénotype plus indifférencié. Enfin sur la base de ce modèle et par modulation de l'environnement hormono-nutritif, nous avons pu développer un protocole permettant l'acquisition d'un phénotype métastable aux caractéristiques proches des cellules cancéreuses dynamiquement dédifférenciées que l'on retrouve dans un contexte tumoral. Ces cellules métastables par leur caractère multipotent permettent de les différenciées, à l'heure actuelle, en cellules progénitrices luminale ou myoépithéliale. À partir de ce modèle, l'analyse par spectrofluorimétrie des cellules montre que la fluidité membranaire est corrélée à la modulation de l'identité cellulaire. Marquant un début de réponse sur l'existence d'un lien entre plasticité et fluidité membranaire, ce dernier pouvant alors servir comme paramètre décrivant un continuum mesurable et quantifiable.

Ces observations ouvrent alors sur des approches et des perspectives mécanistiques et technologiques nouvelles ou encore peu explorées. À l'heure actuelle, une grande partie de la recherche de traitements basés sur la modulation du métabolisme lipidique des cellules CCDD se base sur l'activation de mécanisme de mort cellulaire notamment par induction de la ferroptose. Cependant, il serait intéressant de comprendre les mécanismes en amont permettant la modulation lipidique et la fluidification de la membrane. Comprendre ces modulations permettra alors le développement de molécules permettant une rigidification délétère à l'acquisition d'un phénotype plastique. Enfin, un développement de technologies serait intéressant pour la création d'outil d'aide au diagnostic et à la mise au point d'une stratégie thérapeutique. Deux approches sont alors possibles, celle des biopsies solides ou celle liquide avec l'analyse des vésicules extracellulaires.
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