# Ingénierie de consortia microbiens synthétiques de Bacillus subtilis à visée biotechnologique

Léa Wagner, Nathalie Laforge, Matthieu Jules, Anne-Gaëlle Planson

► To cite this version:

Léa Wagner, Nathalie Laforge, Matthieu Jules, Anne-Gaëlle Planson. Ingénierie de consortia microbiens synthétiques de Bacillus subtilis à visée biotechnologique. Congrès junior pluridisciplinaire, Jun 2022, Gif-sur Yvette, France. hal-04298531

HAL Id: hal-04298531

https://hal.inrae.fr/hal-04298531

Submitted on 21 Nov 2023

HAL is a multi-disciplinary open access
archive for the deposit and dissemination of sci-
entific research documents, whether they are pub-
lished or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est
destinée au dépôt et à la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publiés ou non,
émanant des établissements d'enseignement et de
recherche français ou étrangers, des laboratoires
publics ou privés.

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License
<figure><img src="image_2.png" /></figure>

# Ingénierie de consortia microbiens synthétiques de *Bacillus subtilis* à visée biotechnologique

Léa Wagner, Nathalie Laforge, Matthieu Jules et Anne-Gaëlle Planson – SyBER, Institut Micalis, INRAE, AgroParisTech, Université Paris-Saclay, Jouy-en-Josas, France

## INTRODUCTION

En économie comme en biologie, la division du travail est une stratégie prometteuse pour dépasser les limites d'un système et augmenter sa productivité. Dans le cas de la biologie de synthèse, qui vise à modifier génétiquement des organismes pour y implémenter des voies métaboliques d'intérêt, la cellule est limitée par le fardeau métabolique, c'est-à-dire la réduction de croissance du fait du coût additionnel engendré.

Afin d'alléger le fardeau métabolique porté par chaque souche, les gènes constituant la voie métabolique d'intérêt peuvent être répartis sur plusieurs souches mises en cocultures : on parle alors de consortium<fnref n="1" />. Cette répartition des tâches qui profite à la communauté est d'ailleurs un phénomène naturel fréquent, notamment chez la bactérie modèle des Gram+ *Bacillus subtilis*, qui peut se différencier en sous-populations synergiques<fnref n="2" />.

Ce projet a pour objectifs :

1. La construction par ingénierie génétique de consortia stables de *Bacillus subtilis* par alimentation croisée (interdépendance pour la synthèse de certains acides aminés);

2. L'optimisation du consortium par évolution dirigée;

3. L'ingénierie d'une plateforme modulaire de clonage pour insérer facilement toute voie métabolique d'intérêt (Figure 1).

> « Dans chaque art, la division du travail, aussi loin qu'elle peut y être portée, donne lieu à un accroissement proportionnel dans la puissance productive du travail. »

Adam Smith, *Recherches sur la nature et les causes de la richesse des nations*, 1776

<figure><img src="image_3.png" /><figcaption>Figure 1 – Représentation schématique d'un consortium. Les deux souches de *Bacillus subtilis* sont co-dépendantes pour la synthèse des acides aminés. Chaque souche exprime une partie de la voie métabolique d'intérêt.</figcaption></figure>

## ① Construction et stabilisation de consortia de *Bacillus subtilis* par alimentation croisée

La construction des consortia commence par la délétion d'un gène impliqué dans la production d'un acide aminé pour chaque souche. Ce gène est choisi en aval de chaque voie, afin de ne pas perturber d'autres réactions du réseau métabolique.

Une fois les souches éditées, elles peuvent être mises en cocultures pour former les consortia. Afin de permettre l'ajout d'une voie métabolique d'intérêt dans ce système, il faut que les populations se stabilisent autour d'un point d'équilibre. Cette stabilisation requiert de nombreuses optimisations, que nous opérons grâce aux méthodes décrites en Figure 2.

<figure><img src="image_4.png" /><figcaption>Figure 2 – Vue d'ensemble des principales méthodes employées pour stabiliser les *consortia*, après délétion d'un gène nécessaire pour la synthèse d'un acide aminé dans chaque souche. Les acides aminés ont été choisis à l'issue d'un crible pour identifier les complémentations assurant la meilleure croissance des souches en consortium. Le LCA (Live Cell Array)<fnref n="3" /> permet de mesurer la densité optique (représentant la biomasse) et le niveau de fluorescence, ce qui permet de déterminer les proportions des deux souches au cours du temps. Une modélisation des croissances attendues et des points d'équilibre possibles en fonction des ratios initiaux des souches, leur taux de croissance respectif μ et la capacité du milieu k, permet d'interpréter et d'analyser les résultats. PhleoR, KanR : marqueurs de résistances à la phléomycine et la kanamycine.</figcaption></figure>

## ② Optimisation des consortia par évolution dirigée

Comme pour tout organisme obtenu par ingénierie du génome, de nombreux remaniements dans le génome peuvent optimiser la fitness (capacité de survie et reproduction) des souches composant les consortia. Cette évolution se produit par diversification de la population du fait de mutations aléatoires, dont les meilleures seront sélectionnées, selon la théorie de Darwin.

L'évolution dirigée est une technique qui vise à accélérer ce processus pour identifier les mutations facilitantes (Figure 3).

Nous le ferons ici en utilisant un système hypermutateur construit par Irène Tanneur (Micalis, Jouy-en-Josas), qui augmente significativement le taux de mutation par génération en s'attaquant aux systèmes de réparation de l'ADN.

<figure><img src="image_5.png" /><figcaption>Figure 3 – Principe de l'évolution dirigée</figcaption></figure>

## ③ Implémentation d'une voie métabolique d'intérêt

Une fois stables et optimisés, les consortia sont prêts à accueillir une voie métabolique d'intérêt. Pour notre preuve de concept, nous choisirons la voie de la dégradation de la lignocellulose, ressource abondante sur Terre mais peu exploitée à ce jour. Pour faciliter la réutilisation de nos consortia quelle que soit la voie métabolique considérée, nous utilisons un système de pop-in pop-out qui permet des modifications du génome itératifs en réutilisant toujours les mêmes deux marqueurs de sélection (Figure 4)<fnref n="4" />.

<figure><img src="image_6.png" /><figcaption>Figure 4 – Principe et intérêt du pop-in pop-out applicable à la plateforme modulaire de clonage.</figcaption></figure>

## REMERCIEMENTS

Ce projet correspond à mon stage de fin d'étude en tant qu'étudiante en 3ème année à AgroParisTech, dominante BIOTECH. Je remercie chaleureusement Anne-Gaëlle Planson (CR), Nathalie Laforge (PhD) et Matthieu Jules (PR) pour leur encadrement.

<footnote n="1">1. Rafieenia R. et al. (2022). Division of labor for substrate utilization in natural and synthetic microbial communities. *Current Opinion in Biotechnology*, 75, 102706.</footnote>

<footnote n="2">2. Van Gestel, J. et al. (2015). From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. *PLoS Biol*, 13.</footnote>

<footnote n="3">3. Borkowski O. et al. (2016). Translation elicits a growth rate-dependent, genome-wide, differential protein production in Bacillus subtilis. *Molecular Systems Biology*, 14-5, 870.</footnote>

<footnote n="4">4. Dervyn E. et al. (en cours de publication).</footnote>

<footnote>École</footnote>

<footnote>normale</footnote>

<footnote>supérieure</footnote>

<footnote>paris-saclay</footnote>