# Expertise génétique pour l'identification taxonomique (au niveau sous espèce) de quatre cent cinquante arbres appartenant à l'espèce Pinus nigra Arnold dans la Vallée de Mialet (Gard)

Caroline Scotti, Bruno Fady, Anne Roig, Nasradin Touhami, Mehdi Pringarbe, Olivier Gilg

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Caroline Scotti, Bruno Fady, Anne Roig, Nasradin Touhami, Mehdi Pringarbe, et al. Expertise génétique pour l'identification taxonomique (au niveau sous espèce) de quatre cent cinquante arbres appartenant à l'espèce Pinus nigra Arnold dans la Vallée de Mialet (Gard). INRAE URFM; UEFM. 2022. hal-04770866

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Submitted on 7 Nov 2024

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Expertise génétique pour l'identification taxonomique (au niveau sous espèce) de quatre cent cinquante arbres appartenant à l'espèce *Pinus nigra* Arnold dans la Vallée de Mialet (Gard).

Expertise réalisée par INRAE pour la communauté de communes des Cévennes du Mont Lozère, Natura 2000 Vallée du Gardon de Mialet.

**Auteurs et affiliations :**

Caroline Scotti-Saintagne, Anne Roig, Nasradin Touhami, Bruno Fady
INRAE-URFM, Unité de recherche "Ecologie des Forêts Méditerranéennes", Avignon, France.

Cartographie sur le terrain et prélèvement des aiguilles : Mehdi Pringarbe, Olivier Gilg. INRAE.
Unité Expérimentale Entomologie et Forêt Méditerranéenne

**Résumé synthétique du rapport**

L'objectif de cette étude est de cartographier et de déterminer à quelles sous-espèces de pin noir appartiennent 450 arbres prélevés en forêt sur le territoire de la Communauté de Communes des Cévennes du Mont Lozère. La majorité des arbres expertisés sont des pins de Salzmann (404 arbres), la sous espèce de pin noir autochtone sur ce territoire. Des pins noirs exotiques sont aussi présents (16 arbres) ainsi que des hybrides (22). Huit échantillons n'ont pas pu être expertisés. Le rapport détaille la méthode employée, le génotype de chacun des arbres échantillonnés et leur identité taxonomique la plus probable.

**1. Objectif de l'étude**

Avec l'objectif de mettre en place une gestion patrimoniale et forestière du massif à pin de Salzmann, la Communauté de Communes des Cévennes du Mont Lozère a sollicité INRAE pour étendre la zone de prospection. Au total, 450 arbres (semis et adultes) ont été géoréférencés, étiquetés et des aiguilles ont été collectées pour valider leur appartenance taxonomique à la sous-espèce *Pinus nigra salzmanni* qui est autochtone. Des pins noirs exotiques sont présents dans la zone prospectée (pin laricio et pin noir) qui peuvent s'hybrider avec le pin de Salzmann mais dont les hybrides ne peuvent pas être identifiés sur la base de critères morphologiques. L'objectif de l'analyse génétique est d'utiliser des marqueurs ADN pour attribuer à chaque individu une identité taxonomique fiable : Pin de Salzmann, Pin noir exotique ou hybride.

**2. Stratégie d'échantillonnage**

L'échantillonnage des 450 arbres à expertiser a été réalisé par INRAE (UEFM, Avignon) sur la base d'un repérage préalable effectué par Natura 2000 (Luc Capon, Natura 2000 Vallée de Mialet). Chaque arbre a été géoréférencé avec un GPS Garmin et étiqueté de PNS_1445 à PNS_1894 (PNS pour pin noir Salzmann). Le statut de semis est indiqué en ajoutant la lettre 'S' au codage (PNSS). Un rameau feuillé par arbre a été prélevé et rapporté au laboratoire INRAE à Avignon. La liste des arbres échantillonnés, leurs coordonnées géographiques et leur cartographie sont données en annexe.

**3. Analyse génétique**

Après extraction de leur ADN, les 450 arbres échantillonnés ont été caractérisés au niveau de 72 locus bialléliques issus du projet Européen GenTree. Les génotypes obtenus ont été comparés à la base de données de référence des génotypes de pin noir de INRAE (URFM, Avignon). Un jeu de données de référence composé de 108 individus représentant un panel des sous-espèces de pins noirs a été ajouté à l'analyse statistique. Les références choisies étaient des arbres représentatifs des sous-espèces de pins noirs et des principales lignées génétiques françaises de Salzmann.
# 4. Analyses statistiques.

## - 4.1 Analyse en composantes principales

Cette analyse préliminaire et exploratoire, réalisée sous R, permet d'avoir un premier aperçu de la façon dont se structurent les arbres échantillonnés sur la base de leurs fréquences alléliques.

## - 4.2 Identification taxonomique des arbres à expertiser par la méthode de vraisemblance

Dans cette analyse nous avons utilisé le logiciel GeneClass2 (Piry et al. 2004) pour comparer les fréquences des allèles des arbres échantillonnés avec des populations de référence. Nous avons utilisé une méthode basée sur l'approche bayésienne développée par Rannala & Mountain (1997). Le résultat est une statistique d'affectation (rapport entre la vraisemblance d'appartenir à la population cible et la somme de la vraisemblance de toutes les autres populations * 100) d'un individu à une population. Des valeurs supérieures ou égale à 99 % témoigne de l'homogénéité génétique de l'individu avec une population de référence. Des valeurs entre 50 % et 98 % informent sur la présence de mélange plus ou moins important entre plusieurs populations de référence.

## - 4.3 Identification taxonomique des arbres à expertiser par recherche de populations à l'équilibre de Hardy-Weinberg

La troisième méthode utilisée est celle implémentée dans le logiciel STRUCTURE (Pritchard, et al, 2002). Elle est aussi basée sur une approche bayésienne mais, à la différence de GeneClass, l'ensemble du jeu de données (450 échantillons + 108 références) est analysé sans *a priori* sur la structuration génétique entre les individus. Plusieurs niveaux de structuration du jeu de données (de K=1 à K=10) ont été testés (pour chaque valeur de K testée : 500 000 itérations, 3 répétitions par valeur de K). L'analyse permet finalement d'associer à chaque individu sa probabilité d'appartenance à chacun des groupes génétiques identifiés (valeurs comprises entre 0 et 1). Le seuil de 0.80 a été choisi pour attribuer un individu à un groupe génétique comme suggéré par Duminil et al., 2006.

# 5. Résultats

Les données brutes du génotypage des 450 arbres sont reportés dans le tableau en annexe (feuille « génotypes »). Huit échantillons ayant plus de 70 % de données manquantes n'ont pas pu être diagnostiqués (1.8 %).

Les résultats de l'ACP et des deux analyses statistiques (GeneClass et Structure) sont aussi donnés en annexe.

## - 5.1 Résultats de l'ACP

Les deux premiers axes de l'ACP expliquent respectivement 9.2 et 5.2 % de la variance totale. L'axe 1 permet de différencier les pins de Salzmann provenance col d'Uglas utilisés comme référence (croix bleu foncé, valeurs négative de l'axe 1 et négative de l'axe 2) des autres provenances de pins de Salzmann (valeurs positive sur l'axe 1 et négative sur l'axe 2) et des pins exotiques (valeurs positive sur l'axe1 et sur l'axe2). Les arbres à expertiser (bleu ciel) sont localisés pour la grande majorité (380 arbres, voir en annexe la liste) dans l'enveloppe de distribution des pins de Salzmann appartenant à la provenance col d'Uglas. Cette analyse reste exploratoire et n'est pas utilisée pour l'attribution des arbres à un groupe génétique.
<figure><img src="image_1.png" /></figure>

## 5.2 Résultats obtenus avec GeneClass

Le tableau de résultat en annexe donne le score d'affectation de chacun des individus aux populations de référence. Le seuil de 99 a été choisi pour attribuer un arbre à une population de référence. 350 arbres sont identifiés comme étant des pins de Salzmann de provenance col d'Uglas, 62 comme des pins de Salzmann provenant d'autres provenances, 27 arbres sont classés exotiques, et 3 sont hybrides.

## 5.2 Résultats obtenus avec Structure :

La diversité génétique des populations de référence (108 échantillons) se structure en trois groupes génétiques qui correspondent aux groupes des pins noirs exotiques (laricio et pin noir d'Autriche), des pins de Salzmann de col d'Uglas et des autres provenances de pin de Salzmann.

La probabilité d'appartenance des individus à expertiser à chacun des trois groupes génétiques est donnée en annexe.

L'analyse de Structure identifie 369 pins de Salzmann du col d'Uglas, 35 pins de Salzmann d'autres provenances, 17 pins noirs exotiques et 21 hybrides.

## 5.3 Assignation finale :

L'assignation finale est basée sur les résultats des analyses de GENECLASS et de STRUCTURE. Ces analyses étant indépendantes, nous ne pouvons privilégier une réponse plutôt qu'une autre. Par principe de précaution, nous avons considéré comme hybrides les arbres qui étaient détectés
hybrides dans au moins une des deux analyses. Au final le site prospecté est composé de 404 pins de Salzmann, 16 pins noirs exotiques, 22 hybrides (Tableau 1).

<table><caption>**Tableau 1 :** Répartition des arbres prélevés en fonction de leur groupe génétique et de leur statut (semis ou adulte)</caption><thead><tr><td>Groupe Génétique</td><td>Effectif</td></tr></thead><tbody><tr><td>EXOTIQUE</td><td>16</td></tr><tr><td>Adulte</td><td>14</td></tr><tr><td>semis</td><td>2</td></tr><tr><td>HYBRIDE</td><td>22</td></tr><tr><td>Adulte</td><td>17</td></tr><tr><td>semis</td><td>5</td></tr><tr><td>NA</td><td>8</td></tr><tr><td>Adulte</td><td>5</td></tr><tr><td>semis</td><td>3</td></tr><tr><td>SALZMANN</td><td>59</td></tr><tr><td>Adulte</td><td>45</td></tr><tr><td>semis</td><td>14</td></tr><tr><td>SALZMANN UGLAS</td><td>345</td></tr><tr><td>Adulte</td><td>276</td></tr><tr><td>semis</td><td>69</td></tr><tr><td>Total général</td><td>450</td></tr></tbody></table>
## 6. Références bibliographiques

Piry S, Alapetite A, Cornuet J-M, Paetkau D, Baudouin L., Estoup A 2004. GeneClass2: A Software for Genetic Assignment and First-Generation Migrant Detection. *Journal of Heredity* 95, 536-539.

Pritchard JK, Stephens M, Donnelly P, 2000. Inference of population structure using multilocus genotype data. *Genetics*, 155, 945-959.

Rannala B, Mountain JL, 1997. Detecting immigration by using multilocus genotypes. *Proceedings of the National Academy of Sciences USA*, 94, 9197-9201.

Duminil J, Caron H, Scotti I, Cazal S, Petit RJ, 2006. Blind population genetics survey of tropical rainforest trees. *Molecular Ecology*, 15, 3505-3513.

## 7. Annexe : résultats de génotypage et de l'expertise.

Feuille « génotypes » : résultats du génotypage de 72 SNP sur 450 individus à expertiser. Les valeurs « 0 » correspondent à des données manquantes.

Feuille « Coordonnées » : liste les 450 arbres récoltés et cartographiés

Feuille « ACP » : Coordonnées des individus sur les axes 1 et 2 de l'ACP et graphique de l'ACP

Feuille « GeneClass » : résultat de l'attribution probabiliste de chaque arbre à une population de référence avec le logiciel GeneClass

Feuille « structure » : résultat de l'attribution probabiliste de chaque arbre à un groupe génétique avec le logiciel STRUCTURE

Feuille « expertise Finale » : Tableau qui résume les résultats des analyses réalisées avec GeneClass, STRUCTURE et expertise finale

Feuille « Bilan » : comptage des effectifs par groupes génétiques et type d'échantillons (semis/adultes)

Fichier « ATLAS » : Cartographie avec le logiciel QGIS des 450 échantillons récoltés.