# Innovations dans le domaine des Ressources Agronomiques pour la Recherche

Philippe Mauguin, Frédéric Gaymard, Michel Verger

<figure><img src="image_1.png" /></figure>

## To cite this version:

Philippe Mauguin, Frédéric Gaymard, Michel Verger. Innovations dans le domaine des Ressources Agronomiques pour la Recherche. NOV'AE, 2022, N° Spécial: #2. hal-04795681

HAL Id: hal-04795681

https://hal.inrae.fr/hal-04795681v1

Submitted on 21 Nov 2024

HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers.

L'archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d'enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés.

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

Distributed under a Creative Commons Attribution - ShareAlike 4.0 International License
<figure><img src="image_3.png" /></figure>

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

<figure><img src="image_5.png" /></figure>

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>

NUMERO
SPECIAL
#02

NOV'AE

ingénierie & savoir-faire innovants

Innovations dans le domaine
des Ressources Agronomiques
pour la Recherche

Institut national de recherche pour l'agriculture, l'alimentation et l'environnement - 147 rue de l'Université - F - 75007 Paris
<figure><img src="image_8.png" /></figure>

Innovations dans le domaine
des Ressources Agronomiques
pour la Recherche

NUMERO
SPECIAL
#02

2022
## SOMMAIRE

# Innovations dans le domaine des Ressources Agronomiques pour la Recherche

<table><tr><td>EDITO</td><td>Michèle Tixier-Boichard</td><td>06</td></tr><tr><td>ENTRÉE EN<br>COLLECTION</td><td>Processus introduction, démarches et outils pour la gestion sanitaire des collections de fruits à noyaux du CRB Prunus-Juglans<br>Marine Delmas, Jean Leonetti, Delphine Racofier, Marie-Laure Greil, Frédéric Gauillard, Alain Blanc, Jean-Marc Audergon</td><td>10</td></tr><tr><td></td><td>Collecte d'échantillons dans le cadre du Centre de Ressources Biologiques Colisa (collection of ichyological samples)<br>Frédéric Marchand, Agnès Starck, Frédéric Lange</td><td>16</td></tr><tr><td></td><td>Projet BrasExplor : élargir les ressources génétiques du CRB BrACySol pour Brassica oleracea et Brassica rapa<br>Cyril Falentin, Vincent Richer, Pascal Glory, Gwenaëlle Deniot, Julie Ferreira De Carvalho, Claudia Bartoli-Kautsky, Anne-Yvonne Guillerm, Erckelboudt, Sylvain Théréné, Stéphane Doré, Marie Gilet, Mathieu Rousseau-Gueutin, Laurène Gay, Anne-Marie Chèvre</td><td>21</td></tr><tr><td></td><td>Enrichir les catalogues des CRB : l'exemple des collections microbiennes des Centres de Ressources Biologiques du CIRM<br>Anne Favel, Emmanuelle Helloin, Jean-Luc Legras, Perrine Portier, Florence Valence, Michel-Yves Mistou</td><td>28</td></tr><tr><td></td><td>Cani-DNA, un CRB qui a du chien !<br>Réseau de collecte de prélèvements de chiens par les vétérinaires pour la recherche biomédicale et la diversité génétique<br>Catherine André, Nadine Botherel, Edouard Cadieu, Laetitia Lagoutte, Annabelle Garet, Jérôme Abadie, Laurent Tiret, Marie Abitbol, Rachel Lavoué, Guillaume Queney, Gilles Chaudieu, Richard Guyon</td><td>34</td></tr><tr><td>CONSERVATION</td><td>Conserver les communautés microbiennes associées aux plantes viables et fonctionnelles : premiers résultats<br>Missimahou Oussou, Géraldine Taghouti, Steven Jagline, Thomas Lerenard, Audrey Lathus, Cécile Dutrieux, Perrine Portier</td><td>45</td></tr></table>
## CONSERVATION

**La cryoconservation des cellules germinales souches chez la truite arc-en-ciel : une stratégie pour restaurer l'intégralité d'un génotype d'intérêt** 54

Anne-Sophie Goupil, Stéphanie Kica, Tina Terrenne, Lionel Goardon, Alexandra Depincé, Charlène Labesse, Jean-Jacques Lareyre, Catherine Labbé

**Conserver les sols : pourquoi et comment ?** 65

Nicolas Soler-Dominguez, Céline Ratié, Céline Faivre-Primot, Samuel Mondy

**Cryoconservation d'apex de Solanum tuberosum et espèces apparentées par la technique de vitrification en gouttes** 73

Catherine Souchet, Florence Esnault, Jean-Eric Chauvin

**Développement d'une core collection pomme de terre** 84

Florence Esnault, Roland Pellé, Marie-Pierre Cann, Marie Bousseau, Marie-Ange Dantec, Catherine Souchet, Marie-Claire Kerlan, Jean-Eric Chauvin

**Culture in vitro, assainissement et indexation de la Collection Igname du Centre de Ressources Biologiques Plantes Tropicales des Antilles** 90

Yoana faure, Suzia Gelabale, Rose-Marie Gomez

**Gestion du stockage des échantillons** 99

**Évaluer l'effet du temps et de la méthode de conservation du matériel végétal sur la quantité et la qualité de l'ADN extrait**

Matthieu Lingrand, Caroline Scotti-Saintagne, Sylvie Oddou-Muratorio, Marianne Correard, Olivier Gilg, Franck Reï, Anne Roig, Patrice Brahic

**Entretenir des collections d'invertébrés d'intérêt agronomique sur hôtes vivants : un enjeu patrimonial et des contraintes spécifiques** 112

Sylvie Pagès, Nadine Sellier, Philippe Castagnone

## CARACTÉRISATION

**Interprétation de l'âge à partir des écailles sur des espèces de salmonidés lacustres, le corégone (Coregonus sp.) et l'omble chevalier (Salvelinus alpinus)** 121

Valérie Hamelet, Chloé Goulon, Frédéric Marchand

**Les automates de phénotypage à haut débit du CIRM** 125

David Navarro, Victoria Chuat,

**Le Centre ARCAD à Montpellier : conserver l'agrobiodiversité pour adapter les cultures aux changements climatiques et aux nouvelles pratiques agricoles** 130

Jean-Marie Prosperi

**La spectrométrie de masse MALDI-TOF : un outil de diagnostic pour l'identification et le typage des bactéries pathogènes des poissons** 133

Eric Duchaud

**Caractérisation de la collection caprine de la Cryobanque nationale pour une meilleure gestion des races menacées** 144

Coralie Danchin

**SAMBO : Biobanking et extraction automatisée d'ADN de microbiotes** 152

Christian Morabito
<table><tbody><tr><td rowspan="2">DISTRIBUTION</td><td><strong>Les outils de suivi de la relation client d'un Centre de Ressources Biologiques</strong><br>Victoria Chuat, Florence Valence</td><td>155</td></tr><tr><td><strong>Présentation du portail d'accès aux ressources biologiques du pilier animal de RARe</strong><br>Sylvain Marthey, Aurélie Delavaud, Nicolas Marthey, Camille Méal, Michèle Tixier-Boichard</td><td>165</td></tr><tr><td rowspan="5">SUPPORT</td><td><strong>Déploiement de Systèmes de Management de la Qualité dans les Centres de Ressources Biologiques de l'Infrastructure de Recherche RARe</strong><br>Mélanie Martignon, Valérie Bergheaud, Samuel Buff, Victoria Chuat, Roland Cottin, Juliette Goussopoulos, Déborah Jardet, Michèle Tixier-Boichard, Florence Valence</td><td>174</td></tr><tr><td><strong>Bonnes pratiques en valorisation de micro-organismes</strong><br>Angèle Charrier, Florence Valence-Bertel, Victoria Chuat, Stéphanie Mercier, Héloïse Simonson, Emmanuelle Helloin</td><td>183</td></tr><tr><td><strong>La mise en œuvre des réglementations sur l'accès aux ressources génétiques et le partage des avantages (APA) dans les Centres de Ressources Biologiques membres de RARe</strong><br>Didier Bouchel</td><td>187</td></tr><tr><td><strong>BioloMICS : Un outil pour gérer les données associées aux collections des Centres de Ressources Biologiques</strong><br>Emmanuelle Artige, Cécile Grondin, Jonathan Mineau, Michel-Yves Mistou</td><td>201</td></tr><tr><td><strong>Quelles perspectives pour RARe en Europe et dans le monde ?</strong><br>Michèle Tixier-Boichard</td><td>211</td></tr></tbody></table>
Le concept de centres de ressources biologiques (CRB) a été proposé par l'OCDE en 2001, dans le but d'organiser l'accès aux ressources biologiques pour les recherches en biotechnologies. Ce concept a été repris en France par le Bureau des Ressources Génétiques qui a lancé un appel d'offres afin de faciliter l'organisation de la conservation des ressources génétiques par la mise en place de CRB. Cet appel d'offres a permis de consolider des initiatives préexistantes ou d'en soutenir de nouvelles. Dans la foulée, le GIS (Groupement d'intérêt scientifique) IBiSA (Infrastructures en Biologie, Santé et Agronomie) a commencé à attribuer le label de CRB à des entités responsables de la gestion de ressources génétiques.

À ce stade, il est utile de préciser qu'une ressource biologique est constituée d'un matériel biologique et des données associées. Cette définition s'applique aux ressources à potentiel reproductif (banque de graines, de semence, plantules.) comme aux ressources génomiques destinées à la recherche (banques d'ADN, de tissus, de clones bactériens).

Les quatre missions canoniques d'un CRB sont la collecte, la caractérisation, la conservation et la distribution des ressources biologiques. Ces missions ne sont pas toutes effectuées avec la même intensité selon les CRB : tous conservent des ressources, ils peuvent les recevoir ou les avoir collectées, ils les caractérisent à des degrés variables, et en distribuent une proportion variable.

L'organisation des CRB pour la recherche a d'abord été organisée pour les ressources microbiennes, par la mise en place du Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM), puis pour les ressources des animaux d'élevage avec le Projet Investissements d'Avenir « CRB-Anim ». En 2015, il est devenu évident que ces démarches valaient aussi pour les ressources végétales et pour les ressources biologiques, mobilisées par les sciences de l'environnement. L'infrastructure RARe pour « Ressources Agronomiques pour la recherche » est née de cette prise de conscience, en 2015, avec le soutien des organismes de recherche INRAE, CIRAD et IRD. Outre sa contribution importante à la préservation de la biodiversité, les objectifs scientifiques de RARe sont de :

* Développer des méthodes pour préserver le potentiel reproductif des ressources (cryobiologie) et caractériser des ressources nouvelles (microbiome, organoïdes).

* Rassembler ou produire des données sur les collections et faciliter leur (ré-)utilisation.

* Tirer profit des collections historiques ou récentes pour analyser la dynamique spatio-temporelle de la biodiversité, notamment à l'échelle infra-spécifique.

* Préserver, caractériser et fournir des échantillons de référence pour identifier des gènes contrôlant des phénotypes d'intérêt.

En 2016, RARe a été inscrite sur la feuille de route nationale des infrastructures de recherche. En 2017, le calcul des coûts complets des infrastructures a placé RARe parmi les plus importantes, avec un coût total d'environ 22 M€. En 2018, ce sont les ressources forestières qui ont rejoint l'infrastructure.
Les CRB de RARe doivent afficher des règles claires pour l'accès à leurs ressources, comme demandé dans la charte d'adhésion de RARe (https://agrobrc-rare.org/Presentation/Qui-sommes-nous/Charte-d-adhesion-d-un-CRB). Au 15 avril 2022, RARe compte 26 CRB adhérents ayant signé sa charte et environ une dizaine intéressés par l'adhésion. Chaque CRB dispose, en général, d'un comité d'utilisateurs. Sur le plan administratif, les CRB sont soit intégrés dans des unités de recherche (UR ou UMR) ou expérimentales, soit constituent des unités autonomes; un seul CRB a un statut de GIS, en raison de son nombre élevé de partenaires (Cryobanque Nationale). En général, chaque CRB dispose d'un comité d'utilisateurs.

Les CRB sont regroupés en cinq piliers, définis soit par la nature biologique des ressources conservées, soit par la finalité des recherches auxquelles contribuent les ressources. Les piliers coordonnent les activités des CRB dans leur domaine. Le nombre de CRB par piliers varie de 4 à 16, à l'exception du piliers Forêt qui rassemble trois sites en un seul CRB. Les CRB qui ne seraient pas encore conformes à la charte constituent un 2e cercle et sont invités aux activités des piliers et de RARe, afin de les aider à s'organiser pour adhérer à la charte. Les piliers ont chacun une gouvernance, souvent multitutelles, pour définir et superviser les actions communes à leurs CRB et développer un point unique d'accès au catalogue de leurs collections. Le partenariat économique est généralement spécifique à chaque piliers : cultures végétales, foresterie, élevage, procédés agro-alimentaires, biocontrôle, surveillance de l'environnement.

RARe développe des activités transversales pour stimuler les synergies entre ses piliers. Outre la coordination commune, avec un comité de pilotage et les représentants des tutelles ainsi que le conseil scientifique international multi-domaines, l'infrastructure a mis place des groupes transversaux : (SI) pour l'analyse des systèmes d'information et la mise en œuvre de la politique FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) des données, APA (accès et partage des avantages) pour l'appui juridique et la mise en œuvre de la réglementation du protocole de Nagoya, ECO pour l'élaboration du modèle économique de l'infrastructure, SMQ (Système de management de la qualité) pour le management de la qualité à tous les niveaux, et COM pour proposer et mettre en œuvre le plan de communication de RARe.

RARe se définit donc par des objectifs communs et un métier commun, celui de gestionnaire de ressources biologiques, pratiqué dans des contextes très divers. Ce numéro spécial a pour but de faire connaitre les innovations et les différentes facettes de ce métier, à l'aide d'exemples choisis parmi les cinq piliers, pour illustrer les missions d'un CRB : collecte, caractérisation, conservation, distribution des ressources biologiques et leurs fonctions supports.

Michèle Tixier-Boichard

Directrice de recherche, INRAE
EDITORIAL

The concept of biological resource centres (BRC) was proposed by the OECD in 2001, in view to organising access to biological resources for research in biotechnology. This concept was taken up in France by the Bureau des Ressources Génétiques which launched a call for projects to facilitate the organisation of conserving genetic resources into BRCs. This call for projects resulted in consolidating initiatives that existed already and by supporting new ones. In parallel, the Scientific Interest Group (SIG) IBiSA (Biology, Health and Agronomy Infrastructures) started to attribute the BRC label to entities responsible for managing genetic resources.

It appears useful, here, to point out that a biological resource combines a biological material with its associated data. This definition applies to resources with reproductive potential (seed banks, seedlings) and genomic resources intended for research (DNA banks, tissue banks, bacteria clones).

The four canonical missions of a BRC are the collection, characterisation, conservation and distribution of biological resources. These missions are not all carried out with the same intensity depending on the BRC: they all conserve resources, they can receive or collect them, they characterise them to various degrees, and distribute them in varying proportions.

BRCs for research were first organised for microbial resources, with the establishment of the International Microbial Resource Centre (IMRC), then for livestock breeding resources with the Investments for the Future Project "CRB-Anim". In 2015, it became clear that these approaches were also relevant for plant and for biological resources used in the environmental sciences. The AgroBRC/RARe infrastructure for "Agronomic Research Resources" emerged from this awareness in 2015, with the support of the research institutions INRAE, CIRAD and IRD. Besides its major contribution to the preservation of biodiversity, RARe's scientific objectives are to:

* Develop methods to preserve the reproductive potential of resources (cryobiology) and characterise new resources (microbiome, organoids).

* Collect and produce data on collections and facilitate their (re-)use.

* Take advantage of historic and recent collections to analyse the spatial-temporal dynamics of biodiversity, notably at the intra-specific scale.

* Preserve, characterise and supply reference samples to identify genes controlling phenotypes of interest.

In 2016, AgroBRC was registred in the french national roadmap for research infrastructures. In 2017, the calculation of the full costs of the infrastructure positioned AgroBRC among the most important, with a total cost of around €22 M. The infrastructure integrated forestry resources in 2018.

Rules for access to the resources of RARe's BRCs must be set out clearly, as required in the RARe's charter of membership (https://agrobrc-rare.org/Presentation/Qui-sommes-nous/Charte-d-adhesion-d-un-CRB). On 15 April 2022 AgroBRC counts 26 member BRCs having signed its charter
and more than a dozen interested in doing so. In general, each BRC has a user's committee. On the administrative level, the BRCs are integrated in research units (UR or UMR), experimental units, or constitute autonomous units. Only one BRC has the status of a SIG, due to its large number of partners (National Cryobank). In general, each BRC has a user's committee.

The BCRs are grouped into five divisions, defined either by the biological nature of the resources conserved, or by the objectives of the research to which the resources contribute. The divisions coordinate the activities of the BRCs in their domain. The number of BRCs per division varies from four to 16, with the exception of the Forestry division which groups three sites and a single BRC. The BRCs that do not yet comply with the charter make up a 2nd circle and are invited to participate in the activities of the divisions and of the AgroBRC, so that they can receive help to organise themselves to comply with the charter. Each of the divisions has its own governance, often with multiple entities, which defines and supervises the joint actions of their BRCs and defines a single point of access to the catalogue of their collections. Economic partnerships are generally specific to each division: crops, forestry, livestock, agri-food processes, biocontrol, environmental monitoring.

AgroBRC develops cross-disciplinary activities to stimulate synergies between its divisions. Besides common coordination, with a steering committee and representatives of the tutelar bodies and the multi-field international scientific committee, the infrastructure has set up cross-disciplinary groups: (SI) to analyse the information systems and implement the FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) policy for data, ABS (access and benefit sharing) for legal support and the implementation of the Nagoya protocol rules, ECO for building the infrastructure's business model, QMS (Quality Management System) for managing quality at all levels, and COM to propose and implement the AgroBRC's communication plan.

The AgroBRC infrastructure is therefore defined by common objectives and skills, for managing biological resources, practiced in very different contexts. The purpose of this special edition is to make known the innovations and different facets of this occupation, using examples chosen from the five divisions to illustrate the missions of a BRC: collection, characterisation, conservation, distribution of biological resources and their support functions.

Michèle Tixier-Boichard
Director of research, INRAE
# Processus introduction, démarches et outils pour la gestion sanitaire des collections de fruits à noyaux du CRB *Prunus-Juglans*

Marine DELMAS<fnref n="1" />

Jean LEONETTI<fnref n="2" />

Delphine RACOFIER<fnref n="1" />

Marie-Laure GREIL<fnref n="1" />

Frédéric GAUILLARD<fnref n="3" />

Alain BLANC<fnref n="3" />

Jean-Marc AUDERGON<fnref n="2" />

## CORRESPONDANCE

marine.delmas@inrae.fr

jean-marc.audergon@inrae.fr

frederic.gauillard@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Les collections du CRB *Prunus-Juglans* d'INRAE conservent près de 2 800 accessions de fruitiers à noyaux (*Prunus*), en PACA et Nouvelle-Aquitaine. Ces espèces, multipliées essentiellement par voie végétative, sont particulièrement soumises aux risques sanitaires, notamment virus et bactéries. Pour protéger les collections et permettre leur valorisation, deux points de vigilance sont instruits, en relation avec les Services Régionaux pour l'ALimentation (SRAL), au plan règlementaire : l'introduction de matériel végétal sain et la surveillance des collections. Le règlement sanitaire européen, avec son passeport phytosanitaire, ainsi que le système de certification fruitière sont deux éléments clés de ces processus. Ils permettent l'introduction du matériel le plus sûr possible et la protection durable des ressources en collection. En fonction des risques, des mesures d'isolement, de contrôle et de prévention sont décidées et appliquées par les agents du CRB.

## MOTS-CLÉS

Introduction, *Prunus*, Collection, Risque Sanitaire, Quarantaine.

<footnote n="1">1 INRAE, UE 393 Unité Expérimentale Arboricole (UEA), F-47320 Bourran, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, UR 1052 Génétique et Amélioration des Fruits et Légumes (GAFL), F-84143 Montfavet, France.</footnote>

<footnote n="3">3 INRAE, UE 1495 Unité Expérimentale Avignon Horticulture Méditerranéen (AHM), F-84914 Avignon, France.</footnote>
# Introduction process, approaches and tools for managing the health of stone fruits of the BRC *Prunus-Juglans*

Marine DELMAS<fnref n="1" />

Jean LEONETTI<fnref n="2" />

Delphine RACOFIER<fnref n="1" />

Marie-Laure GREIL<fnref n="1" />

Frédéric GAUILLARD<fnref n="3" />

Alain BLANC<fnref n="3" />

Jean-Marc AUDERGON<fnref n="2" />

## CORRESPONDENCE

marine.delmas@inrae.fr

jean-marc.audergon@inrae.fr

frédéric.gauillard@inrae.fr

## ABSTRACT

The collections of the BRC *Prunus-Juglans* of INRAE conserve around 2,800 accessions of stone fruits (*Prunus*), in the PACA and Nouvelle-Aquitaine regions of France. These species, mostly obtained through vegetative propagation, are particularly vulnerable to health risks, notably viruses and bacteria. To protect the collections and permit their exploitation, two points of vigilance are ensured with the SRAL on the regulatory level: the introduction of healthy plant material, and monitoring the collections. European health regulations and phytosanitary passport, and the fruit tree certification system, are two key elements of this process. They ensure that the material introduced is as safe as possible, and the sustainable protection of the resources in the collection. Depending on the risks, isolation, control and prevention measures are decided and taken by the employees of the BRC.

## KEYWORDS

Introduction, *Prunus*, collection, health risk, quarantine.

<footnote n="1">1 INRAE, UE 393 Unité Expérimentale Arboricole (UEA), F-47320 Bourran, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, UR 1052 Génétique et Amélioration des Fruits et Légumes (GAFL), F-84143 Montfavet, France.</footnote>

<footnote n="3">3 INRAE, UE 1495 Unité Expérimentale Avignon Horticulture Méditerranéen (AHM), F-84914 Avignon, France.</footnote>
## Les collections Prunus d'INRAE en quelques mots et quelques chiffres

Le CRB *Prunus-Juglans* abrite des collections d'espèces fruitières et apparentées appartenant aux genres *Prunus* (fruitiers à noyaux) et *Juglans* (noyers), en verger ou en pot sous abris protégés des insectes. Les collections *Prunus* sont réparties sur 4 sites en Nouvelle-Aquitaine et PACA, et gérées par trois unités INRAE (UR GAFL<fnref n="4" />, UE AHM<fnref n="5" />, UEA<fnref n="6" />). Elles sont riches de 2 800 accessions appartenant à 42 espèces (Figure 1) et servent de support à plusieurs programmes de recherches et d'innovation variétale d'INRAE, notamment dans une dynamique d'adaptation aux stress biotique et abiotique auxquels la filière fruitière est confrontée. Dans ce cadre, il est primordial de garantir la qualité sanitaire des ressources diffusées. Pour exemple, en moyenne 750 échantillons par an sont diffusés depuis les collections aquitaines, essentiellement vers des équipes de recherches, mais aussi vers des professionnels et des amateurs. Et ce sont près d'une dizaine de nouvelles accessions qui entrent chaque année, de France ou de l'étranger, pour enrichir les collections, ainsi que 500 à 1 000 porte-greffes issus de la filière de certification pour le renouvellement du matériel végétal ou pour des expérimentations spécifiques.

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Figure 1. Le CRB Prunus en chiffres</figcaption></figure>

## Introduire du matériel sain : une nécessité pour les collections et les filières

Le genre *Prunus* (*Rosaceae*) comprend plus de 230 espèces, dont certaines très répandues et échangées, à travers le monde, comme cultures fruitières ou ornementales. Elles sont affectées par un très grand nombre de virus, viroïdes et bactéries (Figure 2), disséminés essentiellement lors des opérations de multiplication végétative comme le greffage (Rubio *et al.*, 2017).

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>Figure 2. Quelques symptômes pathologiques sur feuilles et fruits (Rubio *et al.*, 2017)</figcaption></figure>

Ces organismes pathogènes peuvent être également disséminés par des vecteurs (insectes, acariens ou nématodes) ; c'est le cas du virus de la Sharka (Plum Pox Virus), transmis par pucerons et dont le coût mondial a été estimé à plus de 10 milliards d'euros en 30 ans (Cambra *et al.*, 2006), ou encore de la « bactérie tueuse » *Xylella fastidiosa* transmise par des cicadelles. Ces différents agents pathogènes, seuls ou en combinaison, ont des conséquences pouvant affecter la croissance, voire la survie, des arbres (PPV, X. fastidiosa, l'Enroulement Chlorotique de l'Abicotier -ECA), ou modifier certains caractères pomologiques des variétés, et donc la description de ces arbres ; par exemple, le Little Cherry Virus 2 (LChV2), entraîne, comme son nom l'indique, la formation de cerises plus petites. Il est crucial de contrôler les agents pathogènes les plus néfastes en prêtant attention aux possibilités de transmission, vecteurs, pluie, pollen, taille ou greffage, afin de se prémunir de leur diffusion au sein des vergers conservatoires. Protéger les collections

<footnote n="4">4 Unité de Recherche Génétique et Amélioration des Fruits et Légumes (Montfavet).</footnote>

<footnote n="5">5 Unité Expérimentale Avignon Horticulture Méditerranéen (Avignon).</footnote>

<footnote n="6">6 Unité Expérimentale Arboricole (Bourran).</footnote>
repose sur deux piliers indissociables : l'introduction de matériels sains et le suivi des plants en place pour s'assurer qu'ils demeurent en bon état sanitaire.

## Réglementation et certification : deux outils facilitant le contrôle des introductions

L'introduction de matériel sain et le maintien des collections sont d'une importance majeure pour les filières fruitières et ornementales. Leur gestion s'appuie sur le cadre réglementaire mis en place afin de minimiser les risques sanitaires pour les usagers : le Règlement de Santé des Végétaux (RSV) et les directives de commercialisation, notamment la démarche de certification.

## Le règlement européen sur la santé des végétaux

Avec la mondialisation des échanges et la prise de conscience de l'importance de la santé des plantes pour l'agriculture et l'économie mondiales, mais aussi pour la pré servation de l'environnement, la régulation des échanges de matériel végétal a pris de plus en plus de poids dans la politique de l'Union Européenne (UE). Des réglementa tions ont successivement été mises en place : la directive 2000/29/CE, aujourd'hui abrogée et remplacée par le rè glement 2016/2031 applicable dans tous les pays de l'UE (Montanari et Traon, 2017). Ce règlement a pour objectif de protéger le territoire européen face à l'introduction et à la dissémination d'organismes nuisibles aux végétaux. Il s'ap puie sur deux éléments essentiels : 1) la catégorisation des organismes nuisibles en fonction du risque lié à leur circu lation au sein de l'UE (Figure 3) ; 2) l'apposition d'un pas seport phytosanitaire (Figure 4) à l'ensemble des végétaux destinés à la plantation ou à la multiplication, entre opéra teurs professionnels<fnref n="7" /> au sein de l'UE, y compris au sein d'un même pays. Ainsi, tout le matériel entrant dans les col lections du CRB doit disposer d'un passeport phytosa nitaire (ou d'un certificat phytosanitaire dans le cas d'une

<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>Figure 4. Classifications des organismes nuisibles pour le genre *Prunus* réalisé d'après l'analyse du Règlement d'exécution UE 2019/2072 et du Règlement UE 2019/1702 (2021)</figcaption></figure>

provenance hors UE). Il est donc, en principe, exempt de tous les organismes réglementés pour les *Prunus*, soit plus de 80 organismes identifiés. Parmi eux, 31 virus et viroïdes ainsi que 7 bactéries pathogènes pour lesquels il n'existe pas de traitements curatifs autorisés ou efficaces. Citons à nouveau la bactérie *Xylella fastidiosa*, classée Organisme de Quarantaine Prioritaire (OQP), ou le virus de la Sharka, classé Organisme Réglementé Non de Quarantaine (ORNQ).

## La serre d'introduction *Prunus* d'INRAE

Il est parfois nécessaire d'introduire en collection du matériel sans passeport phytosanitaire, par exemple du matériel issu de prospections, ou encore pour protéger une variété implantée dans un environnement contaminé. Dans ce cas, il est obligatoire de passer par une **structure de quarantaine** agréée. Le matériel végétal y est conservé jusqu'à ce que les preuves de conformité aux exigences communautaires soient obtenues. C'est l'unité de Quarantaine de l'ANSES, située Clermont-Ferrand<fnref n="8" />, qui assure cette prestation pour les espèces fruitières en France. Au sein

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>Figure 3. Exemple de passeport phytosanitaire : expédition de greffons de pêchers depuis les collections *Prunus* de Gironde (33)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>Figure 5. La serre d'introduction *Prunus*, INRAE, UR 1052 Génétique et Amélioration des Fruits et Légumes, F-84143 Montfavet, France</figcaption></figure>

<footnote n="7">7 Notamment les obtenteurs, pépiniéristes, jardineries, mais aussi les CRB.</footnote>

<footnote n="8">8 Unité de Quarantaine, Anses (Agence nationale de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail), Laboratoire de la santé des végétaux, F-63370 Lempdes.</footnote>
d'INRAE, l'UR GAFL s'est dotée d'une serre de quarantaine agréée par le SRAL<fnref n="9" /> (Figure 5). Après introduction et gref-fage sur des porte-greffes issus de la certification, les plants introduits sont suivis pendant deux cycles de végétation complets : observations visuelles, test ELISA<fnref n="10" />, en interne et en prestation, indexage biologique<fnref n="11" />. En cas de détec-tion d'un organisme réglementé, les plants sont détruits. Dans le cas contraire, ils bénéficient d'une main levée par le SRAL et peuvent intégrer les collections, munis d'un passeport phytosanitaire.

## La certification fruitière : authenticité variétale et garanties sanitaires

Le système de certification française est un des plus an-ciens du monde. Il s'est mis en place au début des années 50 pour encourager la multiplication de certains cultivars de pêchers et pruniers, dans un souci de maîtrise d'au-thenticité variétale. Dans les années 60, au fur et à mesure des avancées en phytopathologie, les problématiques sa-

nitaires ont été intégrées (Bernhard, 1986). Le CTIFL<fnref n="12" /> est la cheville ouvrière de ce processus ; à cet effet, il conserve des plants dits initiaux, sains et authentifiés, sous in-sect proof, et en distribue des greffons aux quelques 70 pépiniéristes adhérant au dispositif (Ten Have-Lopez, 2020). Cette certification apporte une garantie sanitaire supplémentaire à celle du passeport phytosanitaire : par exemple, des tests sanitaires systématiques sont réalisés pour le suivi des organismes règlementés non de quaran-taine, comme les virus de l'ACLSV ou du PNRSV, parasites dits de qualité qui pourraient altérer le phénotype des variétés (couleur, date de maturité, productivité notam-ment). Des contrôles de filiation assurent, quant à eux, l'authenticité variétale des variétés cultivées inscrites au catalogue européen. Les 500 à 1 000 porte-greffes intro-duits chaque année, par le CRB, pour dupliquer les maté-riels d'intérêt sont issus de cette filière de production. Par contre, une grande partie de nos ressources génétiques sont par définition exclues de ce dispositif ; aussi, des points de vigilance supplémentaires sont-ils mis en place.

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>Figure 6. Gestion du risque sanitaire lors des introductions de matériel végétal dans les collections *Prunus* d'INRAE</figcaption></figure>

<footnote n="9">9 Service Régional pour l'ALimentation.</footnote>

<footnote n="10">10 ELISA : Technique d'immuno-absorption par enzyme liée.</footnote>

<footnote n="11">11 Technique permettant de détecter un pathogène par inoculation à une plante indicatrice sensible. Sur *Prunus*, elle passe en général par un greffage sur porte-greffe sensible (GF 305).</footnote>

<footnote n="12">12 Centre Technique Interprofessionnel des Fruits et Légumes.</footnote>
## Le processus global d'introduction du CRB vis-à-vis du risque sanitaire

À chaque étape du processus, une analyse de risque est conduite. Son objectif général est d'éviter toute contamination des collections pouvant entraîner leur mise en péril. Comme indiqué dans la figure 6, la première étape est de privilégier bien sûr le matériel le plus sain possible. En fonction du risque pris, des mesures d'isolement, de contrôles et de prévention plus ou moins renforcées sont prises. Les agents du CRB sont ainsi formés à contrôler le matériel entrant, et un responsable sanitaire des collections a été nommé dans chaque région.

Le risque sanitaire pesant sur les collections étant croissant, d'autres procédures sanitaires sont mises en place dans le CRB, comme les prospections et contrôles en verger et pépinières ou, *a minima*, pour les matériels les plus précieux, la mise en place de doublons de sécurité. Des recherches visant à améliorer ce processus d'introduction sont également menées : ainsi, le CTIFL et INRAE (dont le CRB *Prunus-Juglans*) travaillent actuellement à la mise au point et à l'évaluation d'une méthode d'assainissement de greffons par bain d'eau chaude, ou thermothérapie (Brans, 2019). Ceci permettrait, par exemple, de traiter préventivement des greffons introduits, mais aussi les greffons en sortie des collections, afin de protéger encore plus efficacement notre patrimoine fruitier... À suivre...

## Références

- Bernhard R., 1986. Certification des arbres fruitiers. Bulletin OEPP 16 : 245-253.

- Brans Y., 2019. Traitement à l'eau chaude pour l'assainissement du matériel fruitier - Le projet ThermoFruit évalue la faisabilité. Infos ctifl 357 : 28-33.

- Cambra M., Capote N., Myrta, A. and Llácer, G., 2006. Plum pox virus and the estimated costs associated with sharka disease. EPPO Bulletin 36 : 202-204.

- Montanari F. and Traon D., 2017. Modernising EU Policy against Phytosanitary Risks – The new EU Plant Health Law. European Food and Feed Law Review 12 : 131-141.

- Rubio M., Martinez-Gómez P., Marais A., Sánchez-Navarro J.A., Pallás V. and Candresse T., 2017. Recent advances and prospects in *Prunus* virology. Ann Appl Biol 171 : 125-138.

- Ten Have-Lopez S., 2020. Certification fruitière : accompagner les professionnels à la mise en place de la nouvelle réglementation. Infos ctifl 367 : 6-7.

<figure><img src="image_15.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Collecte d'échantillons au Centre de Ressources Biologiques Colisa
## (collection of ichtyological samples)

Frédéric MARCHAND<fnref n="1" />

Agnès STARCK<fnref n="1" />

Frédéric LANGE<fnref n="2" />

### CORRESPONDANCE

frederic.marchand@inrae.fr

### RÉSUMÉ

La gestion des populations de poissons migrateurs à des fins de restauration ou de conservation nécessite d'en connaître la dynamique spatiale et temporelle. L'âge, la croissance, l'origine géographique, par exemple, sont des éléments importants à suivre pour mieux comprendre cette dynamique. Pour cela, des prélèvements de tissus sur les poissons sont réalisés lors de leur capture, soit par les pêcheurs amateurs soit par des professionnels, sur des observatoires ou des programmes dédiés à ces populations.

L'objectif de cet article est de décrire les pratiques de l'Observatoire de Recherche en Environnement sur les poissons diadromes dans les fleuves côtiers (ORE DiaPFC) et de fournir des éléments pour réaliser la collecte d'échantillons de différents tissus de poissons.

### MOTS-CLÉS

Collection, poisson, écaille, otolithe, opercule, âge, croissance, génétique, microchimie.

<footnote n="1">1 INRAE, pôle OFB-INRAE-L'Institut Agro-UPPA pour la gestion des migrateurs amphihalins dans leurs environnements, U3E, F-35042, Rennes, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, pôle OFB-INRAE-Agrocampus Ouest-UPPA pour la gestion des migrateurs amphihalins dans leurs environnements, ECOBIOP, F-64310, Saint-Pée-Sur-Nivelle, France.</footnote>
# Sample collection at the Colisa Biological Resource Center
 collection of ichthyological samples)

Frédéric MARCHAND<fnref n="1" />

Agnès STARCK<fnref n="1" />

Frédéric LANGE<fnref n="2" />

## CORRESPONDENCE

frederic.marchand@inrae.fr

## ABSTRACT

The management of migrating fish populations for the purposes of restoration and conservation requires knowledge of spatial and temporal dynamics. Age, growth and geographical origin, for example, are important items to monitor to better understand these dynamics. To achieve this, samples of tissue are taken from fish after their capture, either by amateur anglers or by professionals, at observatories or in the framework of programs dedicated to these populations.

The objective of this article is to describe the practices of the Environmental Research Observatory regarding diadromous fish in coastal rivers (ORE Dia-PFC) and provide elements to carry out the collection of samples from different fish tissues.

## KEYWORDS

Collection, fish, scale, otolith, operculum, age, growth, genetic, microchemistry.

<footnote n="1">1 INRAE, pôle OFB-INRAE-L'Institut Agro-UPPA pour la gestion des migrateurs amphihalins dans leurs environnements, U3E, F-35042, Rennes, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, pôle OFB-INRAE-Agrocampus Ouest-UPPA pour la gestion des migrateurs amphihalins dans leurs environnements, ECOBIOP, F-64310, Saint-Pée-Sur-Nivelle, France.</footnote>
## Introduction

La collecte d'échantillons de tissus sur les poissons est depuis longtemps réalisée dans le cadre de programmes de recherches ou d'observatoires (Azam, 2020). Ces échantillons donnent accès à un grand nombre d'informations, sur le poisson ou l'environnement qu'il fréquente, grâce à diverses méthodes : étude structurale, chimique, génétique, etc. Au plan scientifique, ils contribuent à la caractérisation actuelle et rétrospective des individus ou des populations de poissons, au regard des traits d'histoire de vie, de l'évolution de la diversité génétique de ces populations et des modifications des conditions environnementales dans lesquelles elles évoluent. Au plan opérationnel, ils participent à la définition des opérations de protection, de gestion des populations exploitées : définition de quotas, périodes d'ouverture de pêche, etc.

Nos échantillons intègrent un Centre de Ressources Biologiques multisites, COLISA (https://doi.org/10.15454/D3ODJM) qui en assure la caractérisation, la conservation et la diffusion. COLISA se caractérise par son envergure historique (depuis 1958), ainsi que par la nature de ses échantillons (écailles otolithes, divers tissus ...), leur quantité (+ de 330 000 actuellement) et leur origine géographique (Métropole et Îles Kerguelen). Il résulte de la fusion d'échantillons historiques et récents collectés par l'U3E (https://doi.org/10.15454/1.5573930653786494E12) et l'UMR ESE à Rennes, l'UMR ECOBIOP à Saint-Pée-sur-Nivelle (https://doi.org/10.15454/1.5572402068944548E12), l'UMR CARRTEL à Thonon les Bains (SOERE OLA) et le Pôle OFB-INRAE-Institut Agro-UPPA pour la gestion des migrateurs amphialins dans leur environnement.

COLISA fait partie du pilier environnement, BRC4Env (https://doi.org/10.15454/TRBJTB), un des piliers constitutifs de l'Infrastructure nationale de Recherche (IR) « Ressources Agronomiques pour la Recherche » (AgroBRC-RARe). Le CRB Colisa est également inclus dans l'IR LIFE, infrastructure de recherche INRAE centrée sur « l'écologie des organismes aquatiques » dans les milieux aquatiques continentaux.

Historiquement, les échantillons étaient prélevés avec un objectif précis, et souvent unique, et le mode opératoire ne prenait pas en compte d'éventuelles autres utilisations futures. L'objectif de la collecte actuelle, présentée dans cet article, est d'offrir toutes les précautions nécessaires afin de multiplier les utilisations possibles des échantillons, en portant une attention particulière aux métadonnées associées.

## Les principaux types d'échantillons et leurs usages

En fonction des programmes de recherche, différents types d'échantillons sont prélevés sur les poissons.

## Écailles

Les écailles (Figure 1) constituent une grande partie de la collection du CRB COLISA de par la simplicité de leur conservation, de leur stockage (dans une enveloppe en milieu sec) et la facilité de leur échantillonnage. Les écailles présentent l'avantage de pouvoir être collectées sur un poisson vivant. Elles sont utilisées pour déterminer l'âge et la croissance ainsi que pour des analyses génétiques ou microchimiques (Marchand, 2006).

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>Figure 1. Écaille de saumon atlantique (Photo : F. Marchand)</figcaption></figure>

## Otolithes

Les poissons possèdent une oreille interne qui contient de petites structures calcaires appelées otolithes (Figure 2). Leur coupe

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>Figure 2. Otolithes de truite fario (Photo : J-C. Aymes)</figcaption></figure>
produit une image similaire à celle des stries de croissance d'une coupe d'arbres ou de l'écaille et permet de retracer l'histoire de vie du poisson. Avec un grossissement adapté, on peut observer les stries journalières. Elles sont obligatoirement prélevées sur poisson mort et utilisées pour déterminer l'âge, la croissance et pour des analyses microchimiques.

## Nageoires

Les nageoires sont porteuses d'ADN de meilleure qualité que celui présent sur les écailles et permettent de mieux caractériser génétiquement les individus ou les populations. Une biopsie d'une très petite partie de la nageoire (moins de 0,25 cm²) permet de relâcher ensuite le poisson.

## La collecte sur le terrain

Avant toute collecte d'échantillons, il est indispensable de vérifier les autorisations nécessaires. Ainsi, la capture du poisson dans le milieu naturel pour lui prélever des tissus est soumis à autorisation lorsque la capture n'est pas réalisée par un tiers (pêcheurs à la ligne ou professionnel). Une demande, généralement annuelle, doit être faite à la préfecture (DDTM) qui délivre alors un arrêté autorisant la capture des poissons. Un bilan de ces captures doit être envoyé, sous un à deux mois selon les préfectures, ainsi qu'un bilan annuel en fin d'année. La collecte à des fins de mise en collection n'est pas soumise à la réglementation sur l'accès aux ressources génétiques et le partage des avantages (APA), seule l'utilisation qui sera faite des échantillons l'est. Le prélèvement sur des poissons vivants destinés à retourner à l'eau nécessite de les endormir dans la plupart des cas. Le protocole doit alors être soumis à un comité d'éthique animale.

Quelle que soit la méthode de collecte et le type d'échantillon, il faut préparer en amont les conditionnements nécessaires aux prélèvements. Ces supports sont identifiés de manière unique. Le protocole définit comment, combien et quand réaliser les prélèvements. Dans le cadre de l'observatoire DiaPFC, l'échantillonnage est réalisé en fonction de l'espèce, du stade de l'individu, de son lieu de capture et de sa taille. Il est nécessaire de nettoyer les instruments de collecte entre deux poissons et, lorsque cela est possible, d'éliminer toute pollution génétique du poisson précédent en les trempant dans une solution de javel, puis d'alcool à 90 °C, puis rincés à l'eau distillée.

## Prélèvements sur poissons vivants

Pour assurer le bien-être et la sécurité du poisson vivant, il doit être endormi dans un bain contenant une solution anesthésiante (benzocaine, clou de girofle ...).

## Écailles

Les zones de prélèvement (Figure 3) sont dépendantes de l'espèce (Baglinière, 2020). Elles correspondent généralement à

l'endroit où apparaissent les premières écailles ou dans des zones où la perte d'écailles au cours de la vie du poisson est moindre. Les écailles de remplacement, appelées écailles régénérées, n'interrogent plus l'histoire de vie du poisson avant ce remplacement. Elles ne doivent pas non plus être prélevées sur la ligne latérale, car elles sont perforées par le canal sensoriel latéral (ligne latérale), ce qui réduit la lisibilité.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>Figure 3. Localisation du prélèvement sur le poisson (adapté de Ombredane et Baglinière, 1992)</figcaption></figure>

Le nombre d'écailles prélevées dépend du protocole expérimental, mais il est recommandé de prélever entre 10 à 15 écailles sur un poisson vivant (plus sur un poisson mort) pour éviter de n'avoir que des régénérées, 60 % dans le cas de la truite de mer (Baglinière et al., 1986). Elles sont prélevées soit en raclant le derme avec un scalpel (ou couteau) peu aiguisé soit à l'aide d'une pince. Cette dernière est souvent utilisée sur les gros poissons. Les écailles prélevées sont insérées dans une pochette bulle ou cristal où sont reportées les informations d'identification.

## Biopsie de nageoire

Il faut nettoyer les pinces et les ciseaux en les plongeant successivement dans l'eau de javel, l'alcool à 90 °C, puis les rincer à l'eau distillée, bien les essuyer avec le papier absorbant. Maintenir la nageoire du poisson avec la pince et en découper un petit morceau (x mm²) et déposer le morceau avec la pince dans un microtube de 1,5 ml préalablement étiqueté et rempli d'éthanol à 99,9 %.

## Prélèvements sur poissons morts

### Otolithe

Les poissons sont ramenés au laboratoire (entiers ou uniquement la tête) pour réaliser l'extraction des otolithes. Sur les gros individus, elle peut être réalisée sur le terrain. Des pinces en téflon ou plastique sont nécessaires pour ne pas polluer l'échantillon avec des minéraux.

### Sciences participatives

Dans certains cas, afin d'augmenter l'échantillonnage, il est fait
# Projet BrasExplor : élargir les ressources génétiques du CRB BrACySol pour Brassica oleracea et Brassica rapa

Cyril FALENTIN<fnref n="1" />

Sylvain THÉRÉNÉ<fnref n="2" />

Vincent RICHER<fnref n="2" />

Stéphane DORÉ<fnref n="2" />

Pascal GLORY<fnref n="1" />

Marie GILET<fnref n="1" />

Gwenaëlle DENIOT<fnref n="1" />

Mathieu ROUSSEAU-GUEUTIN<fnref n="1" />

Julie FERREIRA DE CARVALHO<fnref n="1" />

Laurène GAY<fnref n="3" />

Claudia BARTOLI-KAUTSKY<fnref n="1" />

Anne-Marie CHÈVRE<fnref n="1" />

Anne-Yvonne GUILLERM-ERCKELBOUDT<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

anne-marie.chevre@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Plusieurs espèces de Brassica sont conservées au sein du Centre de Res-
sources Biologique BrACySol à Ploudaniel (https://www6.reennes.inrae.fr/
igepp/L-IGEPP/Plateformes/BrACySol). Pour le chou (Brassica oleracea, CC,
2n=18) et le navet (Brassica rapa, AA, 2n=20), les ressources comprennent es-
sentiellement des populations fermières collectées dans les années 1980.
Ces deux espèces existent cependant sous forme de populations sauvages
ou férales sur l'ensemble du territoire français, et leurs collectes s'avèrent in-
dispensables pour élargir les ressources disponibles. Dans le cadre du projet
H2020 Prima BrasExplor comprenant 11 partenaires de six pays, nous propo-
sons de collecter environ 100 populations sauvages et fermières de chacune
de ces deux espèces, sur un gradient nord de la France jusqu'à la zone sub-
saharienne d'Afrique du Nord. Ce matériel offre une opportunité très originale
(i) d'identifier les déterminants génétiques responsables de l'adaptation aux
contraintes climatiques, et (ii) de valoriser des populations fermières. Nous
présentons ici la méthodologie suivie, les collectes en cours sur le territoire
français et les travaux qui seront engagés dans le cadre du projet BrasExplor.
Ces travaux ouvrent des perspectives d'amélioration vis-à-vis des contraintes
abiotiques et biotiques chez le chou, le navet, ou encore le colza (Brassica
napus, AACC, 2n=38) issu de l'hybridation naturelle entre ces deux espèces
diploïdes.

## MOTS-CLÉS

Choux, navets, navettes, diversité, contraintes climatiques, contrôle génétique.

<footnote>* Premiers auteurs</footnote>

<footnote n="1">1 IGEPP, INRAE, Institut Agro, Univ Rennes, 35653, Le Rheu, France.</footnote>

<footnote n="2">2 IGEPP, INRAE, Institut Agro, Univ Rennes, 29260, Ploudaniel, France.</footnote>

<footnote n="3">3 AGAP, CIRAD, INRAE, SupAgro, Univ. Montpellier, 34060 Montpellier, France.</footnote>
# BrasExplor project: widening the Brassica oleracea and Brassica rapa genetic resources available in the Biological Resource Center BrACySol

Cyril FALENTIN*<fnref n="1" />

Sylvain THÉRÉNÉ<fnref n="2" />

Vincent RICHER*<fnref n="2" />

Stéphane DORÉ<fnref n="2" />

Pascal GLORY<fnref n="1" />

Marie GILET<fnref n="1" />

Gwenaëlle DENIOT<fnref n="1" />

Mathieu ROUSSEAU-GUEUTIN<fnref n="1" />

Julie FERREIRA DE CARVALHO<fnref n="1" />

Laurène GAY<fnref n="3" />

Claudia BARTOLI-KAUTSKY<fnref n="1" />

Anne-Marie CHÈVRE<fnref n="1" />

Anne-Yvonne GUILLERM-ERCKELBOUDT<fnref n="1" />

## CORRESPONDENCE

anne-marie.chevre@inrae.fr

## ABSTRACT

Several *Brassica* species are conserved in the Biological Resource Center BrACySol at Ploudaniel (https://www6.rennes.inrae.fr/igepp/L-IGEPP/Plate-formes/BrACySol). For *Brassica oleracea* (CC, 2n=18) with different cultigroups (cabbage, cauliflower, Brussel sprout, kale) and *Brassica rapa* (AA, 2n=20; turnip and forage), available biological resources are derived from landraces collected in small farms during the 1980s. However, both species are present in France as wild or feral populations and their conservation is essential to widen the available resources. Within the framework of the H2020 Prima BrasExplor project, which includes 11 partners from six countries, we are currently collecting 100 wild populations and landraces for each species over a large climatic gradient, ranging from the north of France to sub-Saharan regions of North Africa. This plant material offers a unique opportunity to (i) identify the genetic determinants of adaptation to climatic constraints, and (ii) promote local landraces. In this article, we present the methodology used, the sampling efforts in progress in France, and the research questions that will be investigated in the BrasExplor project. This study will open new avenues in plant breeding programs, especially for the creation of new varieties adapted to abiotic and biotic stresses in both *B. oleracea* and *B. rapa*, as well as in their derived allotetraploid species, oilseed rape (*Brassica napus*, AACC, 2n=38).

## KEYWORDS

Cabbages, cauliflower, Brussels sprouts, kales, turnip, forage, genetic determinants of climatic constraints.

<footnote>* First co-authors</footnote>

<footnote n="1">¹ IGEPP, INRAE, Institut Agro, Univ Rennes, 35653, Le Rheu, France.</footnote>

<footnote n="2">² IGEPP, INRAE, Institut Agro, Univ Rennes, 29260, Ploudaniel, France.</footnote>

<footnote n="3">³ AGAP, CIRAD, INRAE, SupAgro, Univ. Montpellier, 34060 Montpellier, France.</footnote>
## Introduction

Le genre *Brassica* présente un exemple remarquable pour illustrer la polyploïdie (génomes nucléaires dupliqués au sein de la même cellule) aussi bien dans son histoire ancienne que récente. En effet, les trois espèces diploïdes, le chou (Brassica oleracea, CC, 2n=18), la navette-le navet (Brassica rapa, 2n=20) et la moutarde noire (Brassica nigra, BB, 2n=16) sont issues d'un ancêtre commun qui a connu une triplication de son génome (~20Ma). Depuis cet évènement, les génomes de *Brassica* se sont diploïdisés et ont perdu certaines copies dupliquées par un processus dit de fractionnement. Néanmoins, il est toujours possible de retrouver au sein de chaque génome (A, B et C) des traces de ces blocs tripliqués (Murat *et al.*, 2015). Plus récemment (~7500 ans), ces espèces diploïdes se sont à leur tour hybridées pour donner naissance à trois espèces allopolyploïdes, le colza (B. napus, AACC, 2n=38) issu de l'hybridation de la navette et du chou, la moutarde brune ou condimentaire (B. juncea, AABB, 2n=36) issue de l'hybridation de la navette et de la moutarde noire, et la moutarde d'Abyssinie (B. carinata, BBCC, 2n=34) issue de l'hybridation de la moutarde noire et du chou. Les relations entre ces espèces ont été illustrées sous forme d'un triangle par Nagaharu (1935). Il est encore possible à partir des espèces diploïdes contemporaines de reproduire, par croisements, les espèces allopolyploïdes.

Ces espèces sont très consommées dans le monde entier et présentent un intérêt économique majeur comme légumes racines, feuilles ou fleurs pour les choux et les navets, comme condiment pour la moutarde brune, comme fourrages pour les choux, les navettes ou le colza, ou comme espèces oléagineuses pour la navette ou le colza. Ce dernier est la seconde espèce oléagineuse dans le monde.

Le chou et la navette ayant une origine eurasienne et étant présents actuellement dans le pourtour du Bassin Méditerranéen, il apparaît crucial de répertorier et de consover les formes sauvages et fermières dans ces régions. L'histoire de la domestication de chacune de ces espèces n'est pas complètement établie, et leur très grande diversité morphologique entraîne de très nombreux débats sur la nomenclature botanique à adopter. Le chou cultivé présente une diversité au niveau soit du bouton floral (choux-fleurs, broccolis), soit des feuilles (choux pommés, choux de Bruxelles, choux fourragers) soit du collet (choux raves). Plusieurs espèces apparentées ont été décrites (Figure 1 ; Snogerup, 1980). Il aurait pu être domestiqué il y a ~2500 av. J.-C., à partir d'une origine unique : B. cretica (Mabry et al., 2021), ou d'une espèce apparentée

différente par type morphologique : une pour les choux pommés, une autre pour les choux raves, encore une autre pour les choux-fleurs et les broccolis (Snogerup, 1980). La diversification plus récente (~400 av. J.C.) aurait conduit aux deux grands types morphologiques, les types floraux (choux-fleurs, broccolis) et les formes feuillues (choux pommés, de Bruxelles ou fourrager) (Cheng et al., 2016). Les formes sauvages présentes en Europe (Angleterre, France et Espagne) pourraient être des formes cultivées retournées à l'état sauvage ou des populations férales (Mittell et al., 2020). La navette-le navet sont cultivés soit pour leur racine (le navet), soit pour leurs feuilles principalement en Asie, soit pour leurs graines oléagineuses. La domestication du type navet ou oléagineux serait la plus ancienne (~3500 av. J.-C). B. rapa aurait été introduite vers ~2000 av. J.-C. en Asie et sélectionnée pour former un groupe à part entière, composé de certaines formes oléagineuses (yellow sarson), le Pak-Choi et le chou chinois (Qi et al., 2017 ; Cheng et al., 2016). De nombreuses formes sauvages existent du nord de l'Europe au nord de l'Afrique. En revanche, il est difficile de distinguer les formes sauvages des populations férales ou des plantes formées par flux de gènes entre les deux (McAlvay et al., 2021).

La place particulière de la France, où co-existent les formes sauvages et cultivées de *B. oleracea* et de *B. rapa*, rend particulièrement importante la préservation des ressources génétiques de ces deux espèces. Au cours des années 1980, Yves Hervé et ses collaborateurs ont collecté, auprès des agriculteurs, les variétés fermières de ces deux espèces (968 pour le chou et 36 pour le navet) sur l'ensemble du territoire français. Celles-ci sont actuellement conservées, en maintenant leur diversité, au sein du CRB BrACySol (https://www6.rennes.inrae.fr/igepp/L-IGEPP/Plateformes/BrACySol). Pour les formes sauvages, seules

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>Figure 1. Origine des formes sauvages du chou (B. oleracea) et de ses espèces apparentées (B. montana, B. insularis, B. macrocarpa, B. rupestris, B. villosa, B. incana, B. cretica et B. hilarionis) (d'après Snogerup, 1980)</figcaption></figure>
quelques populations de *B. oleracea* ont été collectées en Normandie par Grégoire Thomas et ses collaborateurs entre 1985-1986. Ce matériel a été testé vis-à-vis de la hernie des Crucifères (*Plasmodiophora brassicae*) et est conservé au CRB (liste BOS). Toutefois, ce matériel est de type biais-nuel et donc très compliqué à multiplier en accord avec les contraintes culturales du CRB. L'étalement des floraisons sur deux années ne permet pas un croisement entre chaque plant, et la longueur du cycle expose la culture à de fortes contraintes biotiques, en particulier pour la culture

sous serre. Aucune population sauvage ou férale de *B. rapa* n'est actuellement conservée au CRB.

Face aux défis actuels pour élargir la diversité génétique des variétés cultivées et pour faire face aux contraintes biotiques et abiotiques, notamment les changements climatiques, il nous a paru particulièrement important de reprendre les collectes. Ce travail a été initié dans le cadre d'un projet H2020 Prima « BrasExplor » (https://www6.inrae.fr/brasexplor), débuté en 2020, et qui réunit 11 partenaires de six pays (France, Espagne, Algérie, Tunisie, Slo-

## Tableau 1 : Fiche de description des populations sauvages

### Prospecting site sheet

<table><tr><td>Date</td><td>N° Site</td></tr><tr><td>NAME OF THE POPULATION (see nomenclature):</td><td></td></tr><tr><td>Collector's name</td><td></td></tr><tr><td>Country</td><td></td></tr><tr><td>Region</td><td></td></tr><tr><td>Province</td><td></td></tr><tr><td>Locality</td><td></td></tr><tr><td>The closest town:</td><td></td></tr><tr><td>GPS Latitude</td><td>Longitude:</td></tr><tr><td>Altitude</td><td>Road map N°</td></tr><tr><td colspan="2">1. Estimated site area: m²</td></tr><tr><td colspan="2">2. Plant density of the collected species/m²:</td></tr><tr><td colspan="2">3. Organization of the population: patches or continuous population</td></tr><tr><td colspan="2">4. Number of plants collected for seeds:</td></tr><tr><td colspan="2">(collect plant by plant with 15 mini to 30 plants max per population with 10 to 20 pods/plant)</td></tr><tr><td colspan="2">5. Number of pictures localized on the drawing map (enclosed):</td></tr><tr><td>Whole plant:</td><td></td></tr><tr><td>Population:</td><td></td></tr></table>

**6. Type of land use:**
Not determined 0
Reaping 3
Perennial crops 6
Others 9

Wasteland or fallow 1
Pasture/ reaping 4
Field border 7

Pasture 2
Annual crops 5
Undergrowth 8

**7. Land use intensity:**
Not determined 0 Not cultivated 1 Cultivated 2

**8. Animals:**
No 0 Pasture (1 low to 9 high)

**9. Soil work:**
Not determined 0 No soil work 1
Cultivated field with plowing 2

**10. Irrigation:**
No 1 Yes 2
If yes, season with irrigation:

**11. Weeding:** No 1 Chemical 2 Mechanical 3

**12. Degree of artificiality of the site:**
Natural vegetation 1 to Strong artificialisation 7
Comments:

**13. Station:**
sheltered 1
Protected 2
Open 3

**14. Exposure:**
No defined exposure 1 N 2 NE 3 E 4
SE 5 S 6 SW 7 W 8 NW 9

**15. Macro-topography:**
Closed depression 1 Open depression 2
Plateau 4 Lower slope 5
Top of slope 7 Summit / Escarpment 8

Plain 3
Mid slope 6
Dunes 9

**16. Slope:**
Zero 1 from 1 to 10% 2 from 11 to 30% 3 >31% 4

**17. Micromerief:**
Difficult to assess 1 Plan 2 Bumpy 3 Logs 4
Channel 5 Ditch 6 Bank 7

**18. Drainage:**
Zero 1 Low 2 Mid 3 Good 4

**19. Apparent site humidity:**
Not determinable 0 Very dry 1 Dry 2 Average 3
Wet 4 Very wet 5 Open water 6

**20. Type of source rock:**

**21. Soil delight:**
Skeletal 1 Normal 2 Deep 3

**22. State of the soil surface:**
Not determinable 0
With lumpy structure 2
With a smooth crust 1
With a gravelly structure 3

**23. Soil compaction:**
Loose 1 to very compact 5

**24. Surface covered by the source rock**
--- | --- | %

**25. Surface covered by pierraille**
--- | --- | %

**26. Surface covered by fine earth or sand**
--- | --- | %

**27. Surface covered by vegetation or litter**
--- | --- | %

**28. Color:**
Black 1 Red/Brown 2
Brown 3 clear 4 --- | ---

**29. Sampling of the soil:**
yes 1 --- | ---
Please find enclosed the sampling method

**30. Remarks:**

**31. Type of plant formation**
Name :

**32. Recovery rate:** --- | --- | %

**33. Major species assessed with quadra method:**

<table><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr><tr><td>Botanical name</td><td>Frequency</td><td>--- | --- | %</td></tr></table>

Remarks :

**34. General remarks :**

Draw the population on the back of the sheet
vénie, Italie). L'objectif est de tirer parti du fait que ces deux espèces, le chou et le navette-navet, existent sous formes sauvage ou fermière du nord de la France à la zone subsaharienne d'Afrique du Nord, ce qui permettrait d'identifier les déterminants génétiques de l'adaptation aux contraintes climatiques. Ce projet permettra également de valoriser les populations fermières. Dans cet article, nous décrivons le matériel en cours de récolte en France.

## Description du matériel

Afin de pouvoir comparer les données récoltées par population, nous avons établi une fiche de collecte pour chaque type de populations (Tableaux 1 et 2). L'ensemble de ces informations permettra de disposer des données passeport détaillées. Sur chaque site, dans la mesure du possible, les graines de 30 plantes bien réparties dans la population ont été collectées. De façon similaire, nous avons défini la méthode d'échantillonnage des sols afin

d'établir la structure du microbiote (bar-coding) et la nature physico-chimique du sol : 3 points de récolte de sols sur une profondeur d'environ 10 cm, bien répartis sur la surface de la population, sont mélangés pour réaliser l'ensemble des analyses. Par ailleurs, les données climatiques de chaque site sont disponibles à partir de la base de données (https://www.worldclim.org/).

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>Figure 2. Sites des collectes des populations sauvages de choux situées en région Normandie</figcaption></figure>

## Tableau 2 : Fiche de description des populations fermières

### Prospecting sheet: cultivated forms

Name of the population (Cf nomenclature)....................

<table><tr><td>Species: Brassica rapa</td><td>Brassica oleracea</td><td>Country</td><td>Region</td></tr><tr><td>Town</td><td>Place</td><td>GPS Coord. Latitude</td><td></td></tr><tr><td>Longitude</td><td>Altitude</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name of collector</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vernacular name of the cultivar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Local synonyms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meaning of name:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1. Place of seed collection: 1 Family garden; 2 market; 3 field; 4 private collection; 5 other</td></tr><tr><td colspan="4">2. Presumed origin of the cultivar: ....................................................</td></tr><tr><td colspan="4">3. Source of seeds: produced on site: 1 Friends; 2 neighbors; 3 parents; 4 exchange; 5 purchase; 6 market; 7 seed merchant; 8 other</td></tr><tr><td colspan="4">4. Are seeds purchased: 1 Never; 2 Regularly; 3 Occasionally; where? ........................</td></tr><tr><td colspan="4">5. Are seeds exchanged: 1 Never; 2 Regularly; 3 Occasionally; with whom? ........................</td></tr><tr><td colspan="4">6. If the seed is produced locally, how are individuals chosen for propagation? Is there a specific way to do this? ....................................................................................................</td></tr><tr><td colspan="4">7. Are there similar crops nearby? 1 No/ 2 Yes. Are special precautions taken to isolate the crop?....................................................................................................</td></tr><tr><td colspan="4">8. Seed conservation: duration ........................ storage conditions ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">9. Importance in the locality: 1 rare; 2 infrequent; 3 frequent; 4 abundant</td></tr><tr><td colspan="4">10. Sowing date: ....................................................................................................</td></tr><tr><td colspan="4">11. Harvest date: ....................................................................................................</td></tr><tr><td colspan="4">12. Irrigation: 1 No/ 2 Yes If yes, specify frequency ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">13. Informant: farmer: .................................... other (specify): ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">14. Use: Human food 1 No/ 2 Yes; Forage: 1 No/ 2 Yes</td></tr><tr><td colspan="4">15. Part used: 1 Root; 2 Leaves; 3 Roots + leaves; 4 other ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">16. Recorded cooking recipe: 1 No/ 2 Yes; Number of the recipe ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">17. Destination of the harvest product: 1 Consumed in the family; 2 marketed locally; 3 marketed elsewhere; If 3 where? .................................... How? ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">18. Taste qualities: (flavor, texture or any other particularity) ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">19. Why is this cultivar kept in cultivation? ....................................................</td></tr><tr><td colspan="4">20. If it has disappeared, when was its culture abandoned ................................. and why ....................................................................................................................................................................</td></tr><tr><td colspan="4">21. How long has it been grown in this place? ....................................................</td></tr><tr><td colspan="4">22. Is it very cultivated in the region? (delimit the area) ....................................</td></tr><tr><td colspan="4">Additional comments: ....................................................................................................</td></tr></table>

## Collectes de *B. oleracea*

Sur la base des références anciennes et de la publication récente de Mittell et al. (2020), nous avons collecté 11 populations de choux sauvages bien réparties le long de la côte normande (Figure 2). Ces collectes ont été complétées par une population près de St Brieuc, signalée par le conservatoire botanique de Brest (http://www.cbnbrest.fr/), et par deux populations décrites dans la littérature à Mortagne sur Gironde (33). La principale difficulté a été de localiser des plantes qui se développent à mi-falaise ainsi que de réaliser les prélèvements de sol sur les sites. Autant que possible, les graines ont été récoltées sur 30 plantes par population. Par ailleurs, Laurène Gay a pris en charge la collecte de 4 populations de *B. montana* dans le sud-est de la France, avec le soutien du conservatoire de Porquerolles (http://www.cbnméd.fr). Cette espèce très apparentée au chou (Figure 1) est la seule présente sur la côte méditerranéenne française. L'ensemble de ces populations ont été introduites dans le CRB BrACysol, dans lequel elles seront conservées et maintenues.

Pour les populations fermières françaises de choux, nous avons choisi 28 populations conservées au CRB BrACysol. Elles appartiennent aux différents culti-groupes et ont été sélectionnées dans différentes régions du territoire français, afin de disposer d'environnements climatiques très contrasteés lors de leur sélection par les agriculteurs (Figure 3).
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>Figure 3. Sites des collectes des populations fermières de choux bien réparties sur le territoire français et appartenant à différents culti-groupes.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>Figure 4. Sites des collectes des populations sauvages de *B. rapa* dans les régions entourées d'un cercle bleu et choix des populations fermières de navets (point bleu clair).</figcaption></figure>

## Collectes de *B. rapa*

Comme mentionné en introduction, il est particulièrement difficile chez cette espèce de distinguer les formes réellement sauvages des populations férales dans lesquelles le flux de gènes entre formes cultivées et sauvages a pu jouer un rôle. Elle se développe, notamment, en bordure de champ, dans les fossés, en bordure de route ou dans les vignobles du sud-ouest. Cependant, ces populations se maintiennent dans des environnements climatiques très contrastés, ce qui devrait nous permettre d'identifier les déterminants génétiques de l'adaptation aux contraintes climatiques dans le cadre du projet BrasExplor. Nous avons prospecté dans la région Bretagne-Normandie et nous avons pu identifier et collecter 7 populations ainsi que le sol associé (Figure 4). Grâce aux informations fournies par le Conservatoire Botanique National Sud-Aquitaine (http://www.cbnsa.fr), nous avons pu collecter 9 populations, principalement dans les zones végicoles, et une en moyenne montagne (Figure 4). Ces collectes restent à poursuivre, notamment dans les régions centre et méditerranéenne françaises. L'ensemble de ces populations ont été introduites dans le CRB BrACysol dans lequel elles seront conservées et maintenues.

Comme pour les choux, 29 populations fermières de navets maintenues au CRB BrACySol ont été choisies, car elles ont été sélectionnées par les agriculteurs dans des environnements climatiques très contrastés (Figure 4).

## Déroulement prévu du projet BrasExplor

Pour éviter un effet lié à la qualité de la graine, la multiplication de l'ensemble des populations de choux et de navette-navet est réalisée par l'UMR IGEPP sur le domaine de la Motte au Vicomte (Le Rheu). Il est prévu d'étudier environ 100 populations, dont celles précédemment décrites et celles fournies par les différents partenaires (Algérie, Tunisie, Slovénie, Italie, Espagne) pour chacune des deux espèces. Trente plantes par population, issues des différentes plantes mères, sont obtenues en serre. Elles sont contrôlées par cytométrie en flux, pour s'assurer du nombre de chromosomes, et à l'aide du séquençage d'une région du génome chloroplastique afin de s'assurer de l'identité de l'espèce. La même quantité de feuilles par plante est prélevée pour extraction d'ADN, et le séquençage Illumina (profondeur 50x) est réalisé en collaboration avec le Génoscope. Dix plantes retenues par population subissent des conditions de vernalisation adaptées à chaque espèce (un mois à 4 °C sans eau et sans lumière pour les choux, et 1 mois à 6 °C, 8 h jour/16 h nuit avec arrosage pour les navets-navettes), puis repiquées sous mini-cages pour la production de graines. Il a été prévu de prélever et de multiplier cent populations par espèce de 2020 à 2022 (2020-2021 : 62 populations de choux et 28 de navets-navettes / 2021-2022 : 18 populations de choux et 89 de navets-navettes).

Les lectures Illumina obtenues pour chaque population seront mappées sur les génomes de référence de chaque espèce (Belser et al., 2018) afin d'identifier l'ensemble des SNPs (UMR IGEPP). Sur cette base, la structure des populations sera précisée et une core collection par espèce
sera identifiée (UMR AGAP). Les données climatiques et celles physico-chimiques du sol seront utilisées, au regard des données de séquençage par des approches de Genomic-Environmental-Association (GEA), pour identifier les gènes ou régions génomiques candidates associées à l'adaptation des plantes à chaque environnement, ce type d'étude ayant été réalisé sur Medicago (Burgarella et al., 2016) (UMR AGAP, UMR IGEPP). Une attention particulière sera portée aux données de microbiote pour tenter d'élucider comment la diversité des plantes est corrélée à l'environnement, comme cela a été réalisé sur *Arabidopsis* (Frachon et al., 2018 ; 2019).

Sur l'ensemble des populations (~100 de choux et ~100 de navets-navettes), des analyses de vigueur germinative en conditions de stress (GEVES), de réponses au froid au cours du développement (CREA-GB, Italie) et de comportement au champ seront réalisées. Ces dernières seront effectuées sur les domaines de l'UE la Motte pour les navets-navettes et de l'UE RGCO à Ploudaniel pour les choux, avec un suivi du microbiote (UMR IGEPP). Les core collections serviront de support pour explorer les réponses aux

températures chaudes, en lien avec l'architecture racinaire et la précité de floraison (INIA, Espagne) et avec l'auto-incompatibilité pollinique (USTHB, Algérie). Les core collections de chaque espèce seront implantées chez l'ensemble des partenaires (ITCMI, INRAA Algérie, INRAT Tunisie, KIS Slovénie, UNIPA, Italie) pour appréhender, sur la base de descripteurs morphologiques communs, l'adaptation aux contraintes climatiques.

Sur la base de ces données, il est prévu de concevoir des populations de pre-breeding adaptées à chaque pays ainsi que la promotion des populations fermières dans chaque pays.

Ce matériel végétal, caractérisé de façon précise dans le cadre du projet BrasExplor, permettra d'enrichir les ressources génétiques disponibles au sein du CRB pour le chou et les navettes-navets. Ce matériel sera une nouvelle source de diversité génétique pertinente pour les programmes d'amélioration de ces deux espèces, mais pourra également être exploité pour l'amélioration du colza face aux changements climatiques et aux divers stress biotiques. ■

## Références

* Belser C., Istace B., Denis E., Dubarry M., Baurens F.C., Falentin C., Genete M., Berrabah W., Chèvre A.-M., Delourme R. et al., 2018. Chromosome-scale assemblies of plant genomes using nanopore long reads and optical maps. Nature Plants **4** (11): 879-887.

* Burgarella C., Chantret N., Gay L., Prosperi JM., Bonhomme M., Tiffin P., Young N. D. and Ronfort J., 2016. Adaptation to climate through flowering phenology: a case study in *Medicago truncatula*. Molecular Ecology **25**: 3397-3415.

* Cheng F., Sun R., Hou X., Zheng H., Zhang F., Zhang Y., Liu B., Liang J., Zhuang M., Yunxia Liu Y. et al., 2016. Subgenome parallel selection is associated with morphotype diversification and convergent crop domestication in *Brassica rapa* and *Brassica oleracea*. Nature Genetics **48**: 1218-1224.

* Frachon L., Bartoli C., Carrere S., Bouchez O., Chaubet A., Gautier M., Roby D. and Roux F., 2018. A Genomic Map of Climate Adaptation in *Arabidopsis thaliana* at a Micro-Geographic Scale. Frontiers in Plant Sciences. **9**: 967.

* Frachon L., Mayjonade B., Bartoli C., Hautkéete N.C. and Roux F., 2019. Adaptation to plant communities across the genome of *Arabidopsis thaliana*. Molecular Biology and Evolution **7**: 1442-1456.

* Mabry M.E., Turner-Hissong S.D., Gallagher E.Y., McAlvay A.C., Hong An H., Edger P.P., Moore J.D., Pink D.A.C., Teakle G.R., Stevens C.J. et al., 2021. The Evolutionary History of Wild, Domesticated, and Feral *Brassica oleracea* (*Brassicaceae*). Molecular Biology and Evolution **38**(10): 4419-4434.

* McAlvay A.C., Ragsdale A.P., Mabry M.E., Qi X., Bird K.A., Velasco P., An H., Pires J.C. and Emshwiller E., 2021. *Brassica rapa* Domestication: Untangling Wild and Feral Forms and Convergence of Crop Morphotypes. Molecular Biology and Evolution **38**(8): 3358-3372.

* Mittell E.A., Cobbold C., Zeeshan Ijaz U., Kilbride A., Moore K.A. and Mable B.K., 2020. Feral populations of *Brassica oleracea* along Atlantic coasts in western Europe. Ecology and Evolution **10**: 11810-11825.

* Murat F., Louis A., Maumus F., Armero A., Cooke R., Quesneville H., Roest Crollius H. and Salse J., 2015. Understanding *Brassica caceae* evolution through ancestral genome reconstruction. Genome Biology **16**: 262.

* Qi X., An H., Ragsdale A.P., Hall T.E., Gutenkunst R.N., Pires J.C. and Barker M.S., 2017. Genomic inferences of domestication events are corroborated by written records in *Brassica rapa*. Molecular Ecology **100**: 1-16.

* Snogerup S., 1980. The wild forms of *Brassica oleracea* Group (2n=18) and their possible relations to the cultivated ones. Dans Brassica crops and wild allies. Edition Japan Scientific Societies Press, Tokyo.

* Nagaharu U., 1935. Genome analysis in Brassica with special reference to the experimental formation of *B. napus* and peculiar mode of fertilization. Japanese Journal of Botany. **7**: 389-452.

<figure><img src="image_23.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
FOCUS

Enrichir les catalogues des CRB :
l'exemple des collections
microbiennes des Centres de
ressources biologiques du CIRM

Anne FAVEL<fnref n="1" />

Emmanuelle HELLOIN<fnref n="2" />

Jean-Luc LEGRAS<fnref n="3" />

Perrine PORTIER<fnref n="4" />

Florence VALENCE<fnref n="5" />

Michel-Yves MISTOU<fnref n="6" />

CORRESPONDANCE

michel-yves.mistou@inrae.fr

Les missions des Centres de ressources biologiques (CRB), quels que soient
leurs objets d'intérêt, sont de collecter, authentifier, conserver et distribuer
des ressources biologiques. Ici nous nous intéressons à la mission de col-
lecte, à travers l'exemple du CIRM (Centre international de ressources micro-
biennes), dont les catalogues de micro-organismes rassemblent des collec-
tions spécialisées, si précieuses pour la recherche.

Mais pourquoi et comment enrichir les collections ? Nous apportons quelques
réponses à cette question, à l'appui d'exemples tirés de récentes expériences
des CRB du CIRM.

<footnote n="1">1 Unité Biologie et biodiversité fongique, CIRM Champignons filamenteux, Marseille.</footnote>

<footnote n="2">2 Infectiologie et santé publique, CIRM-BP, Nouzilly.</footnote>

<footnote n="3">3 Sciences pour l'œnologie, CIRM-levures, Montpellier.</footnote>

<footnote n="4">4 Institut de recherche en horticulture et semences, CIRM-CFBP, Angers.</footnote>

<footnote n="5">5 Sciences des technologies du lait et de l'oeuf, CIRM-BIA, Rennes.</footnote>

<footnote n="6">6 Mathématiques et Informatiques appliquées du génome à l'environnement, Coordination du CIRM, Jouy-en-Josas.</footnote>
## Intégrer de nouvelles espèces et augmenter la diversité interspécifique

L'activité des CRB s'insère dans le tissu de la recherche et doit servir et accompagner cette dernière ; or, la science évolue, et la diversité des objets biologiques, notamment dans le domaine de la microbiologie, ne se découvre que peu à peu. Les équipes de chercheurs travaillant sur différents environnements, matrices et tissus isolent régulièrement de nouveaux microorganismes ; les CRB doivent donc maintenir une veille pour identifier les échantillons qui enrichiront leurs collections. Par ailleurs, les développements dans les sciences de l'évolution conduisent à de fréquentes révisions de la classification taxonomique, susceptibles de révéler des lacunes dans les collections ; lacunes qui doivent alors être comblées pour assurer la représentativité de la diversité de ces collections. Les CRB spécialisés, comme ceux du CIRM, vont également souhaiter améliorer l'offre de diversité génétique au sein d'espèces connues, quelques variations géniques pouvant conduire à des différences importantes dans leurs propriétés biologiques ou technologiques.

## Accroître la diversité pour des espèces à fort potentiel pour supporter l'innovation

Une part importante de l'accroissement des collections vise donc à accroître l'offre de diversité des espèces qui ont un

fort potentiel dans des applications traditionnelles ou innovantes. Citons deux exemples issus du catalogue du CIRM-BIA (Figure 1).

D'abord, le cas de l'espèces bactérienne *Streptococcus thermophilus* d'intérêt pour la fabrication de laits fermenté, dont les yaourts. *S. thermophilus* a la capacité de produire des exopolysaccharides qui peuvent modifier la texture des laits fermentés. Il s'avère que cette propriété technologique importante est extrêmement souche dépendante. Dès lors, le fait de disposer d'un panel de souches varié pour cette espèce permet aux industriels de sélectionner celle qui leur permettra d'obtenir un lait fermenté avec la texture désirée. Sur le même principe, l'espèce bactérienne emblématique de l'Emmental (*Propionibactérieum freudenreichii*) a la capacité de produire des composés d'arômes variés, cette capacité étant, là encore, assujettie à la souche. Le fait de pouvoir disposer d'un grand choix de souches pour cette espèce permettrait de moduler l'arôme final des productions d'Emmental.

C'est pour répondre à ce type de besoins que le CIRM-BIA propose, aujourd'hui, à son catalogue, pour ces deux espèces, respectivement 223 et 236 souches les plus variées possibles en termes de biotope et d'origine géographique.

Figure 1. Exemple de la diversité intraspécifique au sein d'un catalogue du CIRM. Le catalogue du CIRM-BIA (bactéries d'intérêt agro-alimentaire) propose quelques 4 000 souches au sein de 160 espèces, mais une douzaine d'espèces clés rassemblent la quasi-totalité du catalogue.

<figure><img src="image_24.png" /></figure>
## Aller au-delà des souches types pour alimenter la recherche sur les espèces pathogènes

L'étude de la diversité intraspécifique est également importante dans le cas de pathologies émergentes. Il est alors nécessaire d'acquérir des connaissances sur la diversité génétique des souches, d'établir la variabilité des caractéristiques phénotypiques, afin de mieux comprendre les risques associés.

Le projet CecoType, piloté par Pascal Serror (UMR Micalis) a constitué une première étape vers l'élucidation de la pathogenèse d'Enterococcus Cecorum, un pathogène aviaire émergent et à fort impact économique, responsable de troubles squelettiques chez les poulets de chair à croissance rapide. Pour cela, une collection de 118 isolats d'E. Cecorum a été rassemblée, en collaboration avec le CIRM-BP et des partenaires privés ou académiques français et étrangers. Cette collection comporte principalement des isolats cliniques collectés au cours des dix dernières années dans une quinzaine d'élevages de poulets de chair français ainsi que des isolats commensaux aviaires et des isolats d'origine humaine. L'ensemble des isolats a été ré-identifié, validé au niveau de la pureté et caractérisé en termes de morphotype, puis conservé au CIRM-BP, associé à une collection d'ADN génomiques. Le tout a été mis à disposition de l'ensemble des partenaires du projet. Le séquençage des génomes entiers de l'ensemble des isolats et la génomique comparative ont été utilisés pour rechercher les gènes spécifiques de métabolisme et de virulence. Les capacités de formation de biofilm et d'adhésion au collagène ont été quantifiées afin d'investiguer les caractéristiques d'aptitude et de virulence. Un modèle d'œuf embryonné a également été utilisé pour caractériser la virulence d'une sélection d'isolats. Le projet CecoType fournira le premier ensemble de données sur la diversité génétique des souches d'E. Cecorum circulant entre et au sein des élevages.

## Positionner les CRB en amont dans les projets de recherche d'exploration de la diversité microbienne pour enrichir leurs catalogues

L'association d'un CRB à des projets de recherche comportant un volet d'exploration de la diversité microbienne présente dans un environnement donné permet la prise en charge de la caractérisation taxonomique des isolats et leur conservation.

Nous décrivons ci-après deux exemples récents de projets de recherche achevés ou en cours ayant conduit à l'isolement de souches qui ont rejoint les collections du CIRM.

## Projet ANR PeakYeast (Unité SPO, coord. J.-L. Legras)

Exploration du potentiel adaptatif de population de levures S. cerevisiae dans le moût de raisin en prenant compte son microbiote.

Ce projet comprenait un volet d'exploration de la diversité microbienne fongique et bactérienne de moûts de raisins. Les deux CRB impliqués dans le projet, le CIRM-Levures et le CIRM-BIA, ont pris en charge l'isolement et l'identification taxonomique des espèces présentes dans ces moûts avec le souci de maximiser la diversité collectée. Après avoir caractérisé la cohorte de souches de bactéries et levures isolées à l'aide de méthodes moléculaires, un sous ensemble des souches représentant les espèces collectées a été retenu, en limitant les risques de doublons issus d'un même échantillon. Ainsi, 52 souches de bactéries et 180 de levures ont été introduites en collection ; cela a permis d'enrichir les catalogues en souches caractéristiques du moût de raisin et, ainsi, de mieux répondre aux besoins des œnologues et de la communauté scientifique.

## Projet de recherche participative Flegme (Unité STLO, coord. Florence Valence)

Analyser la composition des consortia microbiens associés à la lactofermentation des légumes, afin de favoriser le maîtrise des processus fermentaires et encourager ainsi la production d'aliments aux qualités organoleptiques nouvelles.

Dans ce contexte il s'agissait de constituer une collection de référence représentative de la diversité bactérienne associée aux légumes lactofermentés. Pour ce faire, le CIRM-BIA a isolé et identifié 310 isolats, à partir d'échantillons fournis par des citoyens, en optimisant leur diversité, et mené en parallèle la caractérisation de l'écosystème microbien dans son intégralité par des méthodes de metabarcoding (métagénomique ciblée). Les souches isolées dans le cadre de ce projet et les métadonnées associées, dans un contexte d'open science, ont intégré la collection « ouverte » du CIRM-BIA pour être mises à disposition de l'ensemble de la communauté scientifique qui s'intéresse aux fermentations végétales.

## Découvrir de nouvelles espèces en menant des campagnes de collecte

Les CRB peuvent également être à l'origine de campagnes de collectes dans des environnements encore peu étudiés ou dans des zones géographiques où une forte biodiversi-
té est anticipée. Dans le cadre de l'ANR BioEnergie PNRB E-TriCel (Exploration de la biodiversité enzymatique pour la complémentation du sécrétome de *Trichoderma reesei* afin d'améliorer l'hydrolyse des lignocelluloses), le CIRM-CF a organisé trois campagnes de collectes (2008-2010). Ces campagnes, destinées à explorer la biodiversité fongique naturelle de Guyane, ont été initiées avec les scientifiques de l'UMR Écologie des Forêts de Guyane (EcoFoG) partenaires du projet et, pour certains lieux de collecte, elles ont fait l'objet d'autorisation de la part des autorités locales (Photo 1). Il faut noter que la mise en œuvre, aujourd'hui, du Protocole de Nagoya à travers le dispositif APA (2016) nécessite une déclaration préalable auprès du Ministère de la transition écologique et solidaire. Ces missions ont été effectuées en collaboration avec des mycologues de terrain, spécialistes de la zone Antilles-Guyane, appartenant à la Société Mycologique de France. Au final, elles ont permis une diversification de la collection du CIRM-CF, qui s'est enrichie de 146 souches authentifiées appartenant à des taxons jusque-là non représentés dans la collection, et qui ont été mises à disposition du projet. Les données associées aux souches, en particulier tout ce qui concerne leur origine géographique, sont bien sûr répertoriées dans la base de données du CIRM-CF, et accessibles via le catalogue de la collection. Le CIRM-Levures (Montpellier) a été associé à ces missions et a participé à l'isolement de souches de levures qui ont également rejoint ces collections. Sur 276 souches de levure isolées, 210 correspondaient à 82 espèces connues, tandis que 54 autres étaient réparties dans 51 nouvelles espèces potentielles, dont 8 ont été nouvellement décrites (Amoikon et al., 2018 ; Jacques et al., 2016 ; Jacques et al., 2019). Cet exemple illustre le potentiel que

recèlent les environnements naturels pour isoler de nouvelles espèces.

Ce type de missions, à caractère naturaliste, qui visent à caractériser la biodiversité microbienne dans les environnements naturels restent rares ; en effet, le financement des expéditions doit se concevoir dans la cadre de projets ayant des objectifs scientifiques précis, et nécessitent de co-construire des questions de recherche avec les équipes. Le CIRM avec son expérience et son expertise permet de construire ces volets biodiversité des projets dans leurs dimensions techniques, mais également réglementaires, devenues essentielles dans le contexte du protocole de Nagoya<fnref n="1" />.

## Sauvegarder les collections d'intérêt agronomique menacées pour préserver l'avenir

Les priorités des équipes de recherche évoluent dans le temps, et certaines collections ne peuvent plus être conservées dans de bonnes conditions lors du départ de chercheurs ou de changements dans les priorités thématiques des unités. Certaines de ces collections, qui ont parfois été constituées sur plusieurs décennies et qui sont associées à des données de collecte de qualité et caractérisées dans des publications, constituent un patrimoine scientifique de grande valeur. Leur disparition peut donc s'avérer très dommageable pour la communauté scientifique ; le rôle des CRB est alors d'évaluer, sur des critères de complétude des collections et des intérêts de la communauté dans son ensemble, si leur sauvegarde présente un intérêt et de proposer, en accord avec les départements concernés, des rapatriements pour assurer leur sauvegarde.

D'autres situations peuvent également conduire au transfert de collections dans les CRB, alors même que la thématique reste pleinement active au sein d'un collectif de recherche. Ainsi, il arrive que la maintenance de la collection excède les ressources humaines disponibles de sorte que son transfert apparaît comme la meilleure solution pour préserver et distribuer les souches. De telles opérations sont menées régulièrement au sein des CRB du CIRM, en voici, ci-après, quelques exemples récents.

## Rapatriement de la collection de souches de Fusarium de l'UR MycSA

En 2013, le CIRM-CF a été sollicité par les chercheurs de l'UR MycSA (Villenave d'Ornon) pour rapatrier une collection de plus de 400 souches de *Fusarium sp.*, réparties sur plus

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>Photo 1. Mission de terrain en Guyane (de gauche à droite: Pr. R. Courtecuisse, Faculté de Pharmacie de Lille ; Ch. Lechat, SMF ; S. Grisel, INRA, UMR 1163, Marseille ; N. Jacques, INRA/Agroparis Tech ; A. Favel, INRA, UMR 1163, Marseille, Responsable du CIRM-CF.)</figcaption></figure>

<footnote n="1">1 Le protocole de Nagoya sur l'accès aux ressources génétiques et le partage juste et équitable des avantages découlant de leur utilisation (APA) est entré en vigueur le 12 octobre 2014.</footnote>
de 25 espèces représentatives des populations françaises inféodées au blé et au maïs. La pérennisation de cette collection de souches bien identifiées et caractérisées, notamment pour leur capacité de production de mycotoxines, était vitale pour la thématique de recherche de l'unité, mais son transfert inévitable en raison des ressources humaines insuffisantes. Après accord du département MICA, à la fois concerné par la collection et par le CIRM-CF, le rapatriement a fait l'objet d'un cahier des charges établi par le CRB en concertation avec l'UR, stipulant entre autres les conditions d'accès aux souches par l'UR MycSA et par un tiers. Au final, cela a donné lieu à la signature d'une Fiche de dépôt entre unités INRAE. Dans le respect du système Qualité du CIRM-CF, certifié ISO 9001, et en accord avec les principes des Centres de Ressources Biologiques, l'intégration des souches à la collection a fait l'objet d'un travail préalable d'authentification des souches par le CRB.

## Sauver la collection de souches d'Agaric de l'UR MycSA

Dans un contexte un peu différent, à savoir un départ en retraite associé à une réorientation thématique, le CIRM-CF a procédé, en 2017, au rapatriement d'une collection de près de 800 souches de champignon de Paris (Agaricus bisporus en majorité) constituée sur plus de 20 années par l'UR MycSA (Villenave d'Ornon). L'intérêt scientifique de la pérennisation de cette collection du champignon le plus consommé au monde (40 % de la production mondiale) ayant été établi, et après accord des deux départements concernés (SPE pour la collection et MICA pour le CIRM-CF), la procédure de rapatriement s'est déroulée de la même façon que pour la collection de Fusarium. L'incontournable étape d'authentification des souches a bénéficié d'un soutien financier des deux départements concernés (CDD, consommables).

## La collection de levures de Rhum, UMR QUALITROP Antilles-Guyane

Pour la collection de l'UMR QUALITROP, la restructuration de l'unité et l'arrêt de l'activité de recherche sur les fermentations de produits tropicaux ont posé la question du devenir de cette collection de levures, construite au cours des 40 dernières années. Après prise de contact avec l'ancien responsable de la collection, les souches encore présentes et les informations associées ont été transférées auprès du CIRM-Levures. Du fait des changements importants dans la taxonomie des levures, ces souches ont été systématiquement ré-identifiées avant d'être mises en collection.

## Sécuriser la collection de bactéries pathogènes des poissons de la VIM (Jouy-en-Josas) au CIRM-BP

Dans le contexte du proche départ en retraite de Jean-François Bernardet qui avait assemblé, sur plusieurs décennies, une formidable collection de bactéries pathogènes de poissons collectées sur cinq continents, l'équipe Infec- tion et Immunité des Poissons (Éric Duchaud) a sollicité le CIRM-BP. Afin de garantir la conservation d'une sélection représentative de ces souches, des critères de choix ont été établis, comme l'usage fréquent des souches par l'équipe d'origine, la disponibilité de leurs séquences génomiques, l'implication des souches dans des publications et leur ca- ractère unique car non disponibles ailleurs. L'obtention des autorisations de la part des personnes ou instituts ayant initialement transmis les souches à l'équipe de la VIM a également été prise en compte. Après une transmission de savoir-faire de la part du futur retraité, une collection de 295 souches appartenant à 3 espèces du genre Flavobacterium et 6 espèces du genre Tenacibacillum, isolées entre 1969 et 2016 dans le monde, a ainsi été transférée au CIRM-BP en 2021. Les souches sont actuellement en cours de mise en collection après une procédure d'authentification et de mise en conformité de leur statut vis-à-vis de l'APA/Proto-cole de Nagoya.

## Préserver les intérêts des chercheurs et des unités

Dans de telles situations les CIRM privilégient les contrats de dépôt ouverts qui permettent d'exposer les souches conser- vées et de les rendre disponibles auprès de la communauté scientifique, tout en maintenant la propriété intellectuelle au déposant original en cas d'exploitation industrielle ou financière de la ressource. Cette solution permet donc, en exposant à travers le catalogue du CIRM les résultats de la recherche, d'optimiser les possibilités de valorisation et les opportunités de collaboration pour les équipes ; ces der- nières sont ainsi dispensées des tâches lourdes de conser- vation et de distribution des ressources, mais gardent le contrôle sur leur utilisation à travers les MTA.

Il est néanmoins possible, aux équipes qui le souhaitent, de déposer, moyennant des frais de garde, leurs collections sous forme de dépôts fermés qui restent confidentiels. Il existe donc de multiples modalités pour faire évoluer les catalogues des CRB microbiens, qui ont toutes leur utilité, selon les circonstances. Un message important à faire pas- ser, auprès des équipes de recherche, est qu'il est générale- ment judicieux d'associer des CRB lors de la conception de projets de recherche qui comportent un volet d'exploration de la biodiversité ; cela permet que soient pris en compte,
dès la genèse du projet, tous les aspects techniques et ré-
glementaires liés à la construction de collections originales.

Microbiotes, métagénomique et culturomique :
de nouveaux défis pour les catalogues des CRB
microbiens

Ces dernières années, les apports de la métagénomique ont permis de mesurer l'étendue des espèces microbiennes qui échappent encore à nos techniques de culture. Ainsi, sont apparus des ensembles taxonomiques de microorganismes totalement inconnus des microbiologistes, car trop difficiles à cultiver, trop rares ou présents dans des environnements peu étudiés jusqu'alors (Castelle et Banfield, 2018). À l'heure actuelle, beaucoup des taxons microbiens décrits restent inaccessibles aux approches expérimentales microbiologiques classiques. La recherche doit encore progresser pour manipuler et isoler ces microorganismes, notamment à travers des approches culturomiques.

Les CRB microbiens doivent donc rester à l'affût des déve-
lopvements sur ces fronts de la science, afin de compléter
leurs collections et de continuer à offrir à la communauté
scientifique des ressources fiables pour les activités de re-
cherche et de développement.

Plusieurs CRB du CIRM sont impliqués dans les projets d'analyse des microbiotes : Microstore (conservation des consortia associés aux plantes) pour le CIRM CFBP, Flegme (Microbiotes des légumes fermentés) pour le CIRM-BIA, Egg-to-meat (Flux bactériens chez le poulet) pour le CIRM-BP ; ils commencent donc à s'équiper dans une perspec-

tive d'analyse culturomique des microbiotes associés aux
plantes et aux aliments.

Alors que les projets d'analyse des microbiotes et holo-
biontes se développent, il nous paraît important que le
CIRM et, au-delà, le pilier microbien de RARe avec la bio-
banque SAMBO, voire l'ensemble de l'infrastructure RARe,
se saisissent des questions spécifiques posées par la mani-
pulation et la conservation des échantillons de microbiotes
et la constitution de collections issues de leur analyse cultu-
romique. Il faut noter l'initiative du CIRM qui a rassemblé 5
CRB issus de 3 piliers de RARe (Microbien, Environnement,
Animal), pour construire le projet HARMONY dédié à l'éva-
luation de protocoles d'extraction d'ADN issus de diverses
matrices (sols, fèces, fientes, aliments) et d'approches de
séquençage innovantes (shallow sequencing, SMRT) pour
caractériser les microbiotes. Ce projet s'appuie sur des ex-
pertises bio-informatiques existantes au sein des CRB et sur
la plateforme MetaQuant de MGP. Le projet, hyper-collabo-
ratif, construit sur de nombreux ateliers pour discuter les
protocoles envisagés, a deux objectifs principaux : proposer
des procédures techniques standardisées pour les analyses
microbiotes et faire monter en compétence les CRB moins
rompus à ces analyses.

La réflexion sur le rôle et l'organisation des CRB et bio-
banques INRAE dans les études de microbiotes doit se
poursuivre, car la pierre angulaire d'une science ouverte
et reproductible est de permettre l'accès des chercheurs
à du matériel intègre d'un point de vue biologique et
réglementaire.

Références

Amoikon T.L.S., Grondin C., Djéni T.N., Jacques N., Casaregola S., 2018. Starmerella reginensis f.a., sp. nov. and Starmerella kou-rouensis f.a., sp. nov., isolated from flowers in French Guiana. Int J Syst Evol Microbiol. 68: 2299-2305. DOI: 10.1099/ijsem.0.002829.

Jacques N., Sarilar V., Urien C., Lopes M.R., Morais C.G., Uetanabaro A.P.T., et al. 2016. Three novel ascomycetous yeast species of the Kazachstania clade, Kazachstania saulgeensis sp. nov., Kazachstaniaserrabonitensis sp. nov. and Kazachstania australis sp. nov. Reassignment of Candida humilis to Kazachstania humilis f.a. comb. nov. and Candida pseudohumilis to Kazachstania pseudohumilis f.a. comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 66: 5192-5200. DOI: 10.1099/ijsem.0.001495.

Jacques N., Casaregola S., 2019. Large biodiversity of yeasts in French Guiana and the description of Suhomyces coccinellae f.a. sp. nov. and Suhomyces faveliae f.a. sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol. 69: 1634-1649. DOI: 10.1099/ijsem.0.003369.

Castelle C.J., Banfield J.F., 2018. Major New Microbial Groups Expand Diversity and Alter our Understanding of the Tree of Life. Cell. 172: 1181-1197. DOI: 10.1016/j.cell.2018.02.016.

<figure><img src="image_26.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Cani-DNA, un CRB qui a du chien !

## Réseau de collecte de prélèvements de chiens par les vétérinaires pour la recherche biomédicale et la diversité génétique

Catherine ANDRÉ<fnref n="1" />

Nadine BOTHEREL<fnref n="1" />

Edouard CADIEU<fnref n="1" />

Laetitia LAGOUTTE<fnref n="1" />

Benoît HEDAN<fnref n="1" />

Annabelle GARAND<fnref n="1" />

Jérôme ABADIE<fnref n="2" />

Laurent TIRET<fnref n="3" />

Marie ABITBOL<fnref n="4" />

Rachel LAVOUÉ<fnref n="5" />

Guillaume QUENEY<fnref n="6" />

Gilles CHAUDIEU<fnref n="7" />

Richard GUYON<fnref n="1" />

### CORRESPONDANCE

catherine.andre@univ-rennes1.fr

### RÉSUMÉ

Le CRB* Cani-DNA collecte des prélèvements de chiens comme modèles spontanés génétiques et précliniques de maladies génétiques humaines rares et/ou complexes. Depuis 2012, un partenariat a été établi entre le CNRS et les quatre Écoles Nationales Vétérinaires (ENV : Alfort, Nantes, Lyon, Toulouse) et la société de génétique animale Antagene (Lyon). La collecte est réalisée par Cani-DNA, ouverte vers la société, avec la participation volontaire de propriétaires, d'éleveurs de chiens ou de clubs de races, et repose sur un réseau vétérinaire national incluant des praticiens, des laboratoires d'analyses histopathologiques, des cliniques et hôpitaux spécialisés, des centres de cancérologie et d'imagerie, les CHUV* des Écoles Nationales Vétérinaires et l'association AFVAC*. Les prélèvements (sang, plasma et tissus) accompagnés de leurs données généalogiques, phénotypiques et cliniques sont réalisés par des vétérinaires diplômés (DVM), réceptionnés par le CRB qui renseigne la base de données centralisée Cani-DNA (LIMS Modul-Bio) et réalise les extractions d'ADN et d'ARN à partir de ces prélèvements ; le CRB réalise les contrôles qualité et assure le stockage des échantillons correspondants, à -20 °C. Ces échantillons d'acides nucléiques sont ensuite distribués à la communauté scientifique, locale, nationale et internationale pour des projets de recherche apportant un bénéfice mutuel en médecine vétérinaire et humaine et pour des programmes sur la diversité génétique. En 2021, Cani-DNA compte 33 000 échantillons d'ADN extraits à partir de sang, plasma et tissus dont 18 500 ADN stockés sur le site rennais, 10 000 dans les quatre ENV et 4 500 à Antagene. De plus, 6 200 échantillons de tissus sont disponibles (pour 2 000 chiens), plus spécifiquement pour des projets de cancérologie comparée. Ces ressources concernent environ 300 races de chiens et plus d'une centaine de maladies génétiques canines, homologues de maladies génétiques humaines.

### MOTS-CLÉS

Centre de Ressource biologique, chien, ADN, ARN, maladies génétiques, diversité génétique, modèle.

<footnote n="1">1 Institut de Génétique et Développement de Rennes, UMR6290 CNRS-Université de Rennes 1 (IGDR).</footnote>

<footnote n="2">2 Oniris, Site de la Chantrerie, 44307 Nantes.</footnote>

<footnote n="3">3 École Nationale Vétérinaire d'Alfort, 94700 Maisons-Alfort.</footnote>

<footnote n="4">4 VetAgro Sup, 69280 Marcy l'Étoile.</footnote>

<footnote n="5">5 École Nationale Vétérinaire de Toulouse, 31076, Toulouse.</footnote>

<footnote n="6">6 Antagène, 69890 La Tour de Salvagny.</footnote>

<footnote n="7">7 Association Française des Vétérinaires des Animaux de Compagnie (AFVAC), 75008, Paris.</footnote>

<footnote>* CRB : Centre de Ressource Biologique.</footnote>

<footnote>* CHUV : Centre Hospitalier Universitaire.</footnote>

<footnote>* AFVAC : Association Française des Vétérinaires des Animaux de Compagnie.</footnote>
# Cani-DNA, the Biological Resource Center at the head of the pack!

## Network of dog sample collection by veterinary practitioners for biomedical and genetic diversity research

Catherine ANDRÉ<fnref n="1" />

Nadine BOTHEREL<fnref n="1" />

Edouard CADIEU<fnref n="1" />

Laetitia LAGOUTTE<fnref n="1" />

Benoît HEDAN<fnref n="1" />

Annabelle GARAND<fnref n="1" />

Jérôme ABADIE<fnref n="2" />

Laurent TIRET<fnref n="3" />

Marie ABITBOL<fnref n="4" />

Rachel LAVOUÉ<fnref n="5" />

Guillaume QUENEY<fnref n="6" />

Gilles CHAUDIEU<fnref n="7" />

Richard GUYON<fnref n="1" />

### CORRESPONDENCE

catherine.andre@univ-rennes1.fr

### ABSTRACT

The Cani-DNA BRC* collects samples from dogs used as spontaneous genetic and preclinical models of rare and complex human genetic diseases. Since 2012, a partnership has been established between the CNRS and the four National Veterinary Schools (ENV: Alfort, Nantes, Lyon, Toulouse) and the biotech company Antagene (Lyon). Sample collection is open to interested parties, with the voluntary participation of dog owners, breeders and pedigree clubs, and is based on a national veterinary network including practitioners, histopathology laboratories, clinics and specialized hospitals, oncology and imaging centers, the CHUVs* of the National Veterinary Schools and the AFVAC* Association. Samples and associated genealogical, phenotypic and clinical data are collected by qualified veterinarians (DVM) to implement the centralized Cani-DNA database (LIMS Modul-Bio) and perform DNA and RNA extractions from them. The BRC performs quality controls and stores the corresponding samples at -20 °C. These nucleic acid samples are then distributed to the scientific community at local, national and international levels for mutually beneficial research projects in veterinary and human medicine and for programs on genetic diversity. In 2021, Cani-DNA contained 33,000 DNA samples extracted from blood, including 18,500 DNA samples stored at the Rennes site, 10,000 at the four ENVs and 4,500 at Antagene. In addition, 6,200 tissue samples are available (for 2,000 dogs), in particular for comparative oncology projects. These resources concern approximately 300 breeds of dogs and more than 100 canine genetic diseases homologous to human genetic diseases.

### KEYWORDS

Biological Resource Centre, dog, DNA, RNA, genetic diseases, genetic diversity, model.

<footnote n="1">¹ Institut de Génétique et Développement de Rennes, UMR6290 CNRS-Université de Rennes 1 (IGDR).</footnote>

<footnote n="2">² Oniris, Site de la Chantrerie, 44307 Nantes.</footnote>

<footnote n="3">³ École Nationale Vétérinaire d'Alfort, 94700 Maisons-Alfort.</footnote>

<footnote n="4">⁴ VetAgro Sup, 69280 Marcy l'Étoile.</footnote>

<footnote n="5">⁵ École Nationale Vétérinaire de Toulouse, 31076, Toulouse.</footnote>

<footnote n="6">⁶ Antagène, 69890 La Tour de Salvagny.</footnote>

<footnote n="7">⁷ Association Française des Vétérinaires des Animaux de Compagnie (AFVAC), 75008, Paris.</footnote>

<footnote>* BRC: Biological Resource Centre.</footnote>

<footnote>* CHUV: Veterinary University Hospital Centre.</footnote>

<footnote>* AFVAC: Companion Animal Veterinary French Association.</footnote>
## Introduction

L'espèce canine, issue de la domestication du loup par l'Homme à la période paléolithique, est la toute première espèce à avoir été domestiquée, il y a au moins 15 000 ans avant J.-C (Frantz et al., 2016), voire dès le paléolithique supérieur (-30 000 ans), selon certaines études. À ce jour, plus de 400 races sont identifiées avec des caractéristiques génétiques uniques ; elles sont souvent issues d'un petit nombre d'animaux fondateurs et constituent chacune un isolat génétique. La combinaison de toutes les races représente un large spectre d'allèles liés à des caractères spécifiques et enrichis dans chaque race par sélection artificielle (Galibert et André, 2006 ; Parker et al., 2004). Ainsi, le chien est devenu une formidable « ressource naturelle » pour l'étude des relations phénotype-génotype, qu'il s'agisse de morphologie, de comportement, de longévité ou de maladies génétiques. En effet, presque toutes les races de chiens sont affectées par une ou plusieurs maladies génétiques, représentant ainsi des alternatives uniques à l'étude de la génétique des maladies mendéliennes homologues rares ou complexes chez l'homme (André et al., 2017). Alors qu'en médecine humaine il demeure difficile de recueillir suffisamment de familles ou de cas/témoins informatifs, le modèle canin représente une excellente opportunité pour identifier des allèles rares ayant un impact majeur ou des allèles fréquents ayant un faible impact, simplement co-sélectionnés, ou même fixés dans certaines races de chiens, en réponse à la sélection faite par les éleveurs (Galibert et André, 2008 ; Ostrander et Wayne, 2005). La recherche de locus prédisposant aux maladies génétiques est donc plus facile chez les chiens. Le chien est un bon modèle car : (i) de nombreuses maladies humaines spontanées sont également diagnostiquées chez les chiens et sont homologues sur les aspects cliniques, histologiques et génétiques ; (ii) dans les races prédisposées, les maladies ségrègent avec des fréquences élevées (jusqu'à 20 %) ; (iii) la physiologie des chiens est plus proche de celle de l'homme que de celle des rongeurs ; (iv) les chiens partagent nos vies et donc notre environnement, et ce sur une période moyenne de dix ans, permettant un suivi clinique et thérapeutique ; enfin, (v) l'échantillonnage et les essais cliniques peuvent être effectués sur des chiens plus facilement que chez l'homme, en respect des règles éthiques.

Plusieurs approches génétiques peuvent être utilisées, comme les analyses d'association génétique (GWAS) ou la liaison génétique, soit au sein d'une même race, par comparaison des atteints et des indemnes (Grall et al.,

2012), soit en choisissant plusieurs races présentant une même maladie ou phénotype, par recherche d'allèles communs aux chiens atteints (Cadieu et al., 2009 ; Hédan et al., 2021 ; Karlsson et al., 2007 ; Parker et al., 2007), soit par une approche multi-races pour détecter plusieurs caractères fixés, comme démontré par le projet CanMap (Vonholdt et al., 2010).

Le chien s'avère également un modèle très pertinent pour pointer des mutations somatiques récurrentes et « drivers » en oncologie comparée (Hédan et al., 2020 ; Ulvé et al., 2017) et pour envisager aussi des essais cliniques chez le chien en amont de l'homme (LeBlanc et al., 2016 ; Paoloni et Khanna, 2007).

Le développement exponentiel des méthodologies « omic » a permis la publication de la séquence du génome d'un Boxer Tasha (Lindblad-Toh et al., 2005), puis les annotations successives de ce génome (Derrien et al., 2012 ; Hoeppner et al., 2014 ; Wucher et al., 2017) et, tout récemment, le séquençage complet de quatre chiens d'autres races, pour enrichir la connaissance du génome de l'espèce (Edwards et al., 2021 ; Field et al., 2020 ; Halo et al., 2021 ; Wang et al., 2021) et les projets de séquençage NGS de plusieurs centaines de génomes entiers (Jagannathan et al., 2019 ; Ostrander et al., 2019 ; Plassais et al., 2019). Ces données ouvrent des opportunités pour la compréhension de la dynamique et de la diversité génétique des génomes de chien ainsi que pour l'analyse des relations phénotype/génotype (Parker et al., 2017 ; Vaysse et al., 2011). La question de la conservation de la diversité génétique et du suivi des maladies génétiques, via des « observatoires » ou des « registres », est en effet devenue une préoccupation majeure des professionnels en élevage canin et de la profession vétérinaire, des sociétés savantes et d'expertise, des associations d'éleveurs et des clubs canins nationaux et internationaux. Ces programmes dépendent fortement de l'accès à des échantillons biologiques bien documentés. Ainsi, la collecte, le stockage, la caractérisation et la distribution d'échantillons biologiques de haute qualité, bien annotés, tels que l'ADN et l'ARN génomique et tissulaire, sont nécessaires pour participer à ces programmes scientifiques sur la génétique canine menés dans le monde entier.

Le CRB Cani-DNA a été créé et développé à partir de l'an 2000 au CNRS de Rennes, en collaboration avec un réseau de vétérinaires praticiens français, puis le laboratoire Antagene et les quatre écoles nationales vétérinaires. L'objectif de Cani-DNA est de collecter des prélèvements biologiques, d'en extraire des échantillons d'acides nucléiques ADN et ARN et de les distribuer après un contrôle qualité, pour des projets de recherche biomédicale, ou pour du stockage en
vue de la conservation génétique. Depuis 2012, Cani-DNA participe au Projet d'Infrastructure Nationale en Biologie et Santé (INBS) CRB-Anim, financé par le premier Programme Investissements d'Avenir (PIA1).

La spécificité de Cani-DNA est de collecter des prélèvements via un réseau de vétérinaires et d'éleveurs en lien très fort avec la société. Ce réseau de collecte volontaire fait de Cani-DNA un exemple unique, dans l'infrastructure RARe (Ressources Agronomiques pour la Recherche), de CRB à vocation biomédicale, qui a établi sa propre Charte éthique (http://igdr.univ-rennes1.fr/).

L'objectif de cet article est de décrire le chemin d'un échantillon, de sa collecte à son utilisation, en lien et grâce au projet CRB Anim (www.crb-anim.fr) et, dans la continuité, du pilier « Animal » du projet RARe (www.agrobrc-rare.org).

## Organisation de la collecte

### Réseau de collecte des prélèvements

La constitution des collections du CRB a été rendue possible grâce à un travail de communication mis en œuvre, depuis les débuts de Cani-DNA, par l'équipe de recherche « Génétique du chien », afin de faire connaître l'existence d'une telle structure de collecte de ressources biologiques canines auprès des publics concernés.

Le réseau est constitué de praticiens vétérinaires issus de cliniques privées, de centres hospitaliers, de cliniques spécialisées ou de centres de cancérologie, de laboratoires d'histopathologie vétérinaire, répartis sur l'ensemble du territoire (Figure 1). Le réseau est renforcé par plusieurs groupes vétérinaires, principalement l'Association française des Vétérinaires pour Animaux de Compagnie (AFVAC).

En outre, plusieurs clubs de race, éleveurs et propriétaires participent activement en informant leurs propres vétérinaires et en envoyant directement des échantillons à Cani-DNA. Un dépliant dédié expliquant l'objectif de Cani-DNA (http://dog-genetics.genouest.org) est distribué au réseau vétérinaire et aux clubs de race.

### Collecte des prélèvements et données associées

Les prélèvements sont réalisés exclusivement par des vétérinaires diplômés DVM (Diplomate in Veterinary Medicine), via le réseau vétérinaire externalisé décrit ci-dessus. Tous les prélèvements entrés dans Cani-DNA sont issus de

chiens appartenant à des particuliers ou des éleveurs, qui consentent au prélèvement de leurs chiens.

Le protocole de collecte est le suivant :

* Le sang (2 à 5 ml), prélevé sur EDTA K3, peut être stocké quelques jours à 4 °C avant l'expédition, par le vétérinaire préleveur.

* Les tissus (5 mm³) sont recueillis dans la solution RNAlater (Qiagen) pour préserver l'ARN et l'ADN : tissus atteints et tissus sains (le cas échéant) en tubes séparés.

Pour chaque type de tissu (atteint ou sain), les prélèvements en RNAlater sont dupliqués par un prélèvement « miroir » dans du formol afin d'assurer le diagnostic histologique et de préciser la proportion de tissu atteint dans l'échantillon de RNAlater. Dans certains cas, d'autres fluides biologiques peuvent être envoyés par des vétérinaires, des cyto-ponctions, des blocs FFPE*, des lames histologiques ou tout autre matériel biologique à partir duquel l'extraction d'acide nucléique est possible.

Les données associées comprennent :

* Le questionnaire clinique, la fiche d'identification du chien et le consentement du propriétaire signé, le pedigree du chien et toute autre information clinique pertinente, comme les analyses hématologiques et biochimiques, certificats oculaires, comptes-rendus d'histopathologie, les examens et les rapports radiographiques ou les radios numérisés...

* Le pedigree quand le chien est inscrit au LOF (Livre des Origines Françaises) : les données généalogiques servent à la construction des arbres généalogiques et

<figure><img src="image_27.png" /><figcaption>Figure 1. Le réseau vétérinaire de Cani-DNA. Partenaires : les 4 ENV, Antagene et l'AFVAC (Association Française des Vétérinaires des Animaux de Compagnie), laboratoires de biologie et d'histopathologie vétérinaires, ainsi que cliniques et hôpitaux vétérinaires spécialisés.</figcaption></figure>

<footnote>* FFPE : Formalin-Fixed Paraffin-Embedded</footnote>
à la gestion future des données génétiques. Les chiens pour lesquels l'ADN parental est disponible sont testés pour la compatibilité parentale, à l'aide d'un ensemble de marqueurs microsatellites informatifs (panel ISAG) par Antagene.

Pour réaliser cette collecte, le CRB Cani-DNA fournit des kits contenant le matériel nécessaire aux prélèvements et à leur acheminement vers le CRB. Les kits sont constitués des tubes adaptés au type de prélèvement : tubes vacutainer EDTA pour les prélèvements de sang, tubes Eppendorf avec solution de conservation RNAlater ou formol pour les prélèvements de tissus. Ces tubes sont protégés par une boîte rigide avec papier absorbant et sachet étanche, dans le respect de la règle du triple emballage pour le transport de matériel biologique (Figure 2). Une enveloppe conforme à la norme de transport UN3373 est fournie pour l'envoi des prélèvements.

Le kit est accompagné d'un protocole de prélèvement détaillé, à l'attention du vétérinaire, qui décrit les exigences du CRB pour la bonne identification et conservation des échantillons ainsi que les modalités d'envoi.

Les prélèvements (sang et tissus) collectés par le réseau de praticiens vétérinaires sont envoyés à Cani-DNA Rennes et sont traités et stockés à Cani-DNA Rennes. Les prélèvements de sang et les frottis buccaux, prélevés par Antagene et dédiés à la recherche, sont traités et stockés à Antagene, et les prélèvements de sang ou de tissus prélevés dans les écoles nationales vétérinaires (Nantes, Alfort, Toulouse, Lyon) sont traités et stockés dans chaque école vétérinaire.

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>Figure 2. Kits fournis, sur demande, aux vétérinaires praticiens pour la collecte des prélèvements.</figcaption></figure>

## Gestion des échantillons

### La base de données Cani-DNA

Le LIMS (Laboratory Information Management System)

développé par MoDul-Bio® est utilisé pour saisir et gérer les échantillons et leurs données associées. Chaque prélèvement de chien a un numéro d'identification Cani-DNA unique défini par la chronologie de l'enregistrement ; ce numéro est associé aux informations que sont : le nom du chien, de la race, le numéro de puce/tatouage, le sexe, la date de naissance, la couleur du pelage, les références du ou des vétérinaires... Une fois l'extraction d'ADN réalisée, chaque prélèvement « transformé » en ADN/ARN est alors lié à la quantité et à la concentration de l'acide nucléique, avec la date d'extraction. La présence/absence du pedigree, le consentement écrit du propriétaire et les documents cliniques qui l'accompagnent sont également renseignés. Les mesures des caractères phénotypiques (p. ex., poids corporel, taille, etc.) et toute autre information liée au chien ou à la maladie sont consignées dans la mesure du possible. La page Cani-DNA est accessible via le site Web (http://dog-genetics.genouest.org) ou via le site Web de Biosit (https://biosit.univ-rennes1.fr/centre-de-researches-biologiques-crb-cani-dna). Les collections de Cani-DNA sont exportées, au moins une fois par an, sur la base de données de CRB-Anim, afin d'être accessibles également via le portail commun au pilier animal (https://crb-anim.fr/access-to-collection/#).

### Le traitement des échantillons

À réception, les échantillons de sang sont entreposés à 4 °C. Les tissus fixés dans le formol ou les blocs FFPE (fixés en paraffine) sont stockés à température ambiante avant d'être transmis au laboratoire d'anatomopathologie pour le diagnostic des prélèvements miroirs. Les tissus en RNAlater sont congelés à -20 °C, avant l'extraction des ADN ou ARN. Les non-conformités (p. ex., tubes brisés, manque de documents, données incomplètes) sont indiquées dans la base de données Modul-Bio pour implémenter l'analyse des risques.

L'ADN génomique est extrait à partir de 2 à 5 ml de sang collecté sur EDTA avec le kit Nucleospin Blood L (Macherey Nagel) ; deux élutions (dans 200 µl d'ADN) sont effectuées. La concentration d'ADN et la pureté de l'échantillon sont mesurées (A260/A280, A260/A230) avec le spectrophotomètre NanodropTM 1000 (Thermo Scientific). Le cas échéant, l'amplification par PCR d'un fragment d'ADN de 300-400 pb est effectuée sur chaque échantillon d'ADN et vérifiée sur gel d'agarose BET à 2 %. Les extraits d'ADN sont étiquetés avec des codes barres et stockés à -20 °C.

L'ADN ou l'ARN des tissus sont extraits avec le Kit Nucleospin Tissue, (Macherey Nagel) et le Kit Nucleospin RNA II, (Macherey Nagel) respectivement. Une étape de lyse à
chaud s'est avérée nécessaire pour optimiser l'extraction. La concentration d'ADN et la pureté de l'échantillon sont mesurées (A260/A280, A260/A230) avec le spectrophotomètre NanodropTM 1000 (Thermo Scientific). Les concentrations obtenues varient de 50 à 300 ng/µl dans la première élu- tion de 200 µl, ce qui garantit une quantité minimale de 10 µg d'ADN génomique par échantillon. La qualité et l'in- tégrité de l'ARN (RIN) sont évaluées à l'aide du bioanalyseur Agilent 2100 et du nano kit RNA 6000 (Agilent), et les ex- traits sont stockés à -80 °C.

Les échantillons de sang restants, la deuxième élution d'ADN et le reste des tissus de RNA later sont conservés et stockés dans un autre congélateur à -20 °C.

Des contrôles qualité comprenant des mesures de Densité Optique (Nanodrop TM) et des réactions de PCR classiques sont systématiquement faits pour vérifier la quantité et la qualité des échantillons avant leur distribution. Les envois contiennent les échantillons biologiques emballés de façon sécurisée dans 3 contenus, un document de MAD (Mise À Disposition) des échantillons, et/ou un MTA (Material Transfer Agreement) et les documents associés (pedigree, données cliniques...) ainsi qu'une liste des échantillons avec les informations nécessaires dans un fichier excel.

## Gestion de Cani-DNA

Depuis 2012, la gestion de Cani-DNA est effectuée par le responsable scientifique et un comité de pilotage, afin de gérer collectivement les entrées et sorties d'échantillons avec les sites du réseau Cani-DNA. Le comité de pilotage est composé de 9 personnes : le responsable scientifique et le responsable qualité de Cani-DNA Rennes, un représentant d'Antagene et de chacune des quatre Écoles Nationales Vétérinaires, ainsi que de deux vétérinaires praticiens / membres de l'AFVAC. Il vise à établir des procédures qualité, à répondre aux demandes d'échantillons et à accroître les échanges de pratiques et d'échantillons au niveau national et international.

## Les collections de Cani-DNA en 2021 : exemple du site de Rennes

Depuis l'année 2000, mais surtout depuis 2005, le site de Rennes a collecté des échantillons de sang de 18 500 chiens et des échantillons de tissus de 6 200 chiens. Tous les prélèvements de sang ont été extraits en ADN génomique et les 6 200 tissus ont été stockés pour des extractions d'ADN et d'ARN selon les besoins. La collecte a progressé régulièrement (Figures 3a et 3b). Parmi ces 18 500 chiens prélevés, 6 000 ont des informations généalogiques. Concernant les tissus collectés, 1 à 6 prélève-

ments de tissus (tissus atteints et sains du même animal, le cas échéant) sont fournis, soit en moyenne 3 prélèvements de tissus par chien. Au total, nous avons collecté plus de 6 000 prélèvements provenant de 2 000 chiens pour différentes maladies, essentiellement des cancers (Figure 3b). Les chiens échantillonnés pour des projets en oncologie ont eu un diagnostic histopathologique. La plupart des chiens ont été collectés en France, mais certains ont été obtenus à partir de pays européens proches.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>Figure 3a. Nombre de chiens avec un prélèvement sanguin collectés pour le site de Rennes par le réseau vétérinaire de Cani-DNA, entre l'année 2000 et l'année 2021.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>Figure 3b. Nombre de prélèvements de tissus (en bleu), en fonction du nombre de chiens prélevés (en rouge) pour le site de Rennes, par le réseau vétérinaire de Cani-DNA, entre l'année 2000 et l'année 2021.</figcaption></figure>

La collection actuelle représente 300 races (Figure 4a, 4b), avec un effectif par race allant de 2 chiens, pour les nombreuses races régionales françaises à faible effectif, à des centaines de chiens voire quelques milliers, comme par exemple pour le Bouvier bernois (2 538 chiens prélevés). Dans plusieurs races pour lesquelles les clubs de races et/ou les éleveurs sont fortement impliqués, la plupart des
chiens, voire certaines portées entières, sont désormais
systématiquement collectés, lors des examens d'enregistre-
ment ou de confirmation. La moitié des échantillons d'ADN
canin provient d'animaux malades, et l'autre moitié, issue
de chiens indemnes, sert de témoin, en sélectionnant la
race, l'âge ou d'autres critères pertinents pour les études
génétiques. Ces échantillons d'ADN sont également utilisés
pour déterminer la fréquence des altérations génétiques
identifiées dans les races d'intérêt ainsi que dans un panel
de chiens indemnes de plusieurs races.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>Figure 4a. Proportion de races de chiens représentées au site de Rennes du CRB Cani-DNA en Octobre 2021.</figcaption></figure>

Les collections concernent 101 maladies génétiques hu-
maines homologues, principalement des cancers, des affec-
tions dermatologiques, neuro-sensorielles ou des anoma-
lies du développement (Tableau 1 et Figures 4a et 4b). Les
cancers représentés sont principalement des mélanomes,
sarcomes, ostéosarcomes, lymphomes ..., avec leurs diffé-
rents sous-types. Trois types de maladies neuro-sensorielles
sont particulièrement représentés ainsi que certaines affec-
tions dermatologiques. Les anomalies du développement
concernent le squelette (crâne, queue) et les variations de
couleur des robes (différents blancs par exemple, bringés,
spots, merle, ...).

<table><caption>Tableau 1 : Nombre de chiens atteints de cancers (en gris), géno-dermatoses (en jaune), maladies neuro-sensorielles (en mauve) (Cani-DNA site de Rennes), en Octobre 2021.</caption>
  <thead>
    <tr>
      <th>MALADIES</th>
      <th>NOMBRE DE CHIENS ATTEINTS</th>
    </tr>
  </thead>
  <tbody>
    <tr>
      <td>Mélanomes</td>
      <td>1200</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Sarcome Histiocytaire</td>
      <td>1300</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Carcinome épidermoïde</td>
      <td>50</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Mastocytomes</td>
      <td>558</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Ostéosarcomes</td>
      <td>100</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Lymphomes</td>
      <td>440</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Gliomes</td>
      <td>22</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Ichtyose</td>
      <td>33</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Hyperkeratose</td>
      <td>30</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Atrophie Progressive de la rétine</td>
      <td>160</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Auto-mutilation (neuropathie)</td>
      <td>30</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Epilepsie</td>
      <td>216</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>Figure 4b. Proportion des maladies génétiques représentées (nombre de chiens atteints issus de différentes races) dans le site de Rennes du CRB Cani-DNA en Octobre 2021.</figcaption></figure>

En complément du site de Rennes, les partenaires de Cani-DNA présentent des spécificités, associées à des services spécialisés et particulièrement motivés des ENV, ou des collaborations de longue date avec des spécialistes de pathologies humaines et/ou vétérinaires. Ainsi, les anomalies cardiaques (myocardiopathies dilatées, maladies des valves mitrales, ...) ont été principalement collectées par Antagene et l'ENV d'Alfort, l'échantillonnage pour les maladies des organes internes (hépatopathies, néphropathies, ...) a été principalement réalisé par l'ENV de Toulouse, pour les tumeurs mammaires par Oniris (ENV Nantes), et pour les lymphomes et affections neurologiques, par VetAgro Sup (ENV Lyon).

Ces échantillons d'ADN canin ou de tissus sont intéressants
pour la communauté médicale, mais aussi pour la com-
munauté de recherche sur le chien pour développer de
nouveaux outils génomiques/génétiques propres à cette
espèce. Ainsi, Cani-DNA a été sollicité par des sociétés de
biotechnologies pour valider des puces de génotypage, comme Illumina (150 ADN de différentes races de chiens fournis pour valider la puce SNP Illumina HD 170 K ; Illumina, San Diego, US) ou, plus récemment, par Affymetrix (384 ADN de différentes races de chiens fournis pour valider la puce de génotypage SNP Axiom 600K). De nombreux échantillons, ADN et ARN, ont été utilisés pour du séquençage NGS (Next Generation Sequencing) : ainsi 254 échantillons ont été utilisés pour le consortium « 10 000 génomes de chiens » (Ostrander et al., 2019) ou pour le projet DBVDC (Dog Biomedical Variant Database Consortium, Université de Berne) (Jagannathan et al., 2019). Cani-DNA est également sollicité pour développer de nouveaux tests génétiques pour le chien : 170 échantillons d'ADN de races françaises ont été fournis à la Société Mars - Petcare & Petfood, pour compléter le test d'identification génétique des races canines.

Plusieurs collaborations avec Antagene ont conduit au développement de 7 tests génétiques pour le diagnostic et le dépistage de maladies génétiques canines : ichthyose chez le Golden retrievers : Test ICHT-A, avec brevet international (Grall et al., 2012), keratodermie chez les Dogues de Bordeaux : Test HFH-B (Plassais et al., 2015) et chez les Terriers irlandais : Test HFH-A (Drögemüller et al., 2014), neuropathies chez les chiens de chasse : Test AMS (Correard et al., 2019, 2016 ; Plassais et al., 2016), et plusieurs phénotypes comme la « queue courte » (Hytönen et al., 2009) ou des couleurs de robes pour plusieurs races : Test Merle (Hédan et al., 2006) et Test INT (Hédan et al., 2019).

## Conclusion

Le CRB Cani-DNA, présenté ici, fournit une ressource unique d'ADN et d'ARN annotés de chiens, dans le respect des règles éthiques et avec une approche unique de travail-

ler avec les chiens, naturellent malades, comme modèles spontanés de pathologie pour la médecine humaine, mais aussi pour la médecine vétérinaire. Nous avons rédigé une Charte d'éthique, afin d'exposer cette démarche unique qui vise à conserver des ressources biologiques/génétiques dans un cadre non expérimental avec et pour le chien.

En Europe, d'autres CRB pour les ressources génétiques canines ont également été développés, comme la biobanque DNA-archives (Université de Liverpool), la biobanque suisse (Université de Berne) ou les biobanques nordiques de l'Université d'Helsinki et d'Uppsala. Des collaborations ont été mises en place avec le projet européen LUPA 2008-2012. Certaines de ces collaborations sont toujours actives avec la communauté de recherche canine européenne pour faciliter les échanges d'échantillons, dans le but de conserver et de proposer des échantillons annotés et de haute qualité.

En plus des projets scientifiques biomédicaux pour la santé humaine et canine, Cani-DNA offre également la possibilité de déposer / stocker les ressources génétiques de certaines races d'intérêt ou de chiens champions d'intérêt : les clubs de races de chiens à petits effectifs et spécifiques de certaines régions de France ou d'autres pays, les sociétés canines nationales et les clubs de races locales s'intéressent de plus en plus à la possibilité de conserver les ADN de leurs races.

Enfin, nous travaillons à combiner les informations du CRB « génétique/génomique » de Cani-DNA avec celles des biobanques canines « reproductives » installées dans les écoles vétérinaires nationales de Maisons-Alfort et de Lyon, afin d'enrichir mutuellement ces deux types de ressources, par des informations croisées (tests génétiques, analyses de la présence de maladies, conservation des gamètes de chiens champions, ...), qui seront utiles pour la recherche biomédicale pour le chien et pour l'homme.
Remerciements

Les auteurs remercient tout particulièrement les collègues de l'IGDR : Laetitia Herbin, Amaury Vaysse, Aline Primot, Noémie Foyart, Clotilde de Brito, Anne-Sophie Guillory, Florent Rollin, Stéphanie Robin, Fred Allais et Louis Le Nezet. Les auteurs sa-luent les contributions des collègues des ENV : Frédérique Sauvaget, Lucie Chevallier, Catia Silva-Dias, Maud Debreuque ; les collègues d'Antagene : Anne Thomas et Caroline Dufaure de Citres ; les vétérinaires praticiens de l'AFVAC : Eric Guaguere, Patrick Devauchelle, ainsi que Romain François, au CHV MicenVet, et la Société Centrale Canine Française SCC. Nous remer-cions les vétérinaires partout en France et proche Europe pour avoir collecté les prélèvements et fourni des données cliniques et généalogiques, et les nombreux propriétaires de chiens, éleveurs et clubs de race pour leur active participation. Nous re-mercions également les laboratoires d'histopathologie vétérinaire, notamment le LHA, devenu LabOniris de l'ENV à Nantes, le LAPVSO de Toulouse, le laboratoire Idexx, Alfort et le LAPV d'Amboise. Nous remercions Lionel Martignat et Sonia Becavin, à la Plateforme de Biologie Moléculaire d'ONIRIS, ENV Nantes. Nous remercions Jocelyne Le Seyec, CRITT Santé Bretagne, Univ Rennes 1, ainsi que B. Turlin du CRB Santé du CHU de Rennes et B. Clément de l'INSERM U991, Rennes, France, pour leurs conseils et leur soutien, depuis les débuts de Cani-DNA. Nous exprimons notre reconnaissance à Thierry Guillaudeux et Charles Pineau (Directeurs de l'UMS3480, Biosit) et au service des plateformes de l'UR1, pour avoir accueilli Cani-DNA au sein des locaux de Biosit (depuis 2017) ; à Alice Parnel (SATT, Rennes) pour le travail sur la tarification (2019), à Hugo Cousillas (CREEA - Comité Rennais d'Éthique en Expérimentation Animale, Rennes) et Virginie Vallet (Ministère de la recherche) pour le travail sur notre charte d'éthique. Enfin, nous remercions Michèle Tixier Boichard, en tant que coordinatrice du projet PIA1 CRB-Anim pour son suivi et ses encouragements continus, ainsi que nos tutelles (CNRS, DR17 Bretagne et Pays de Loire et Univ Rennes 1) et Reynald Gillet, notre directeur d'Unité UMR 6290, IGDR (Institut de Génétique et Développement de Rennes).

Financements

Ce CRB a été créé en 2000 et financé par le Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) France, l'Infrastructure Nationale en Biologie Santé IBiSA (Co-financement avec le CRB Santé du CHU de Rennes 2012 ; AO CRB 2015 ; AO CRB 2021) et par le projet CRB-Anim, PIA1 (2012-2022), INBS Infrastructure en Biologie Santé ANR-11-INBS-0003.

Références

André, C., Guaguere, E., Chaudieu, G., Genevois, J.-P., Devauchelle, P. (2017). Intérêt du chien dans la pathologie comparée et la génétique : exemples de ressources et de programmes partagés [The importance of dogs for comparative pathology and genetics: Examples of shared resources and programmes]. Rev. Vét. Clin. 52, 55-70.

Cadieu, E., Neff, M.W., Quignon, P., Walsh, K., Chase, K., Parker, H.G., VonHoldt, B.M., Rhue, A., Boyko, A., Byers, A. (2009). Coat variation in the domestic dog is governed by variants in three genes. Science 326, 150-153.

Correard, S., Plassais, J., Lagoutte, L., Botherel, N., Thibaud, J.-L., Hédan, B., Richard, L., Lia, A.-S., Delague, V., Mêge, C., Mathis, S., Guaguère, E., Paradis, M., Vallat, J.-M., Quignon, P., André, C. (2019). Canine neuropathies: powerful spontaneous models for human hereditary sensory neuropathies. Hum. Genet. 138, 455-466. https://doi.org/10.1007/s00439-019-02003-x.

Correard, S., Plassais, J., Lagoutte, L., Paradis, M., Guaguère, E., Quignon, P., Derrien, T., André, C. (2016). A spontaneous dog model for a human sensory neuropathy: identification of a mutation in the upstream region of a neurotrophic factor. Bull. Académie Vét. Fr. 169, 190-194. https://doi.org/10.4267/2042/61953.

Derrien, T., Vaysse, A., André, C., Hitte, C. (2012). Annotation of the domestic dog genome sequence: finding the missing genes. Mamm. Genome Off. J. Int. Mamm. Genome Soc. 23, 124-131. https://doi.org/10.1007/s00335-011-9372-0.

Drögemüller, M., Jagannathan, V., Becker, D., Drögemüller, C., Schelling, C., Plassais, J., Kaerle, C., Dufaure de Citres, C., Thomas, A., Müller, E.J., Welle, M.M., Roosje, P., Leeb, T. (2014). A mutation in the FAM83G gene in dogs with hereditary footpad hyperkeratosis (HFH). PLoS Genet. 10, e1004370. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004370.

Edwards, R.J., Field, M.A., Ferguson, J.M., Dudchenko, O., Keilwagen, J., Rosen, B.D., Johnson, G.S., Rice, E.S., Hillier, L.D., Hammond, J.M., Towarnicki, S.G., Omer, A., Khan, R., Skvortsova, K., Bogdanovic, O., Zammit, R.A., Aiden, E.L., Warren, W.C., Ballard, J.W.O. (2021). Chromosome-length genome assembly and structural variations of the primal Basenji dog (Canis lupus familiaris) genome. BMC Genomics 22, 188. https://doi.org/10.1186/s12864-021-07493-6.
Field, M.A., Rosen, B.D., Dudchenko, O., Chan, E.K.F., Minoche, A.E., Edwards, R.J., Barton, K., Lyons, R.J., Tuipulotu, D.E., Hayes, V.M., D. Omer, A., Colaric, Z., Keilwagen, J., Skvortsova, K., Bogdanovic, O., Smith, M.A., Aiden, E.L., Smith, T.P.L., Zammit, R.A., Ballard, J.W.O. (2020). Canfam_GSD: De novo chromosome-length genome assembly of the German Shepherd Dog (Canis lupus familiaris) using a combination of long reads, optical mapping, and Hi-C. *GigaScience* 9, giaa027. https://doi.org/10.1093/gigascience/giaa027.

Frantz, L.A.F., Mullin, V.E., Pionnier-Capitan, M., Lebrasseur, O., Ollivier, M., Perri, A., Linderholm, A., Mattiangeli, V., Teasdale, M.D., Dimopoulos, E.A., Tresset, A., Duffraisse, M., McCormick, F., Bartosiewicz, L., Gál, E., Nyerges, E.A., Sablin, M.V., Bréhard, S., Mashkour, M., Bălăşescu, A., Gillet, B., Hughes, S., Chassaing, O., Hitte, C., Vigne, J.-D., Dobney, K., Hänni, C., Bradley, D.G., Larson, G. (2016). Genomic and archaeological evidence suggest a dual origin of domestic dogs. *Science* 352, 1228-1231. https://doi.org/10.1126/science.aaf3161.

Galibert, F., André, C. (2008). The dog: A powerful model for studying genotype-phenotype relationships. *Comp. Biochem. Physiol. Part D Genomics Proteomics* 3, 67-77.

Galibert, F., André, C. (2006). The dog and its genome. *Med. Sci. MS* 22, 806-808. https://doi.org/10.1051/medsci/20062210806

Grall, A., Guaguère, E., Planchais, S., Grond, S., Bourrat, E., Hausser, I., Hitte, C., Le Gallo, M., Derbois, C., Kim, G.-J. (2012). PNPLA1 mutations cause autosomal recessive congenital ichthyosis in golden retriever dogs and humans. *Nat. Genet.* 44, 140-147.

Halo, J.V., Pendleton, A.L., Shen, F., Doucet, A.J., Derrien, T., Hitte, C., Kirby, L.E., Myers, B., Sliwerska, E., Emery, S., Moran, J.V., Boyko, A.R., Kidd, J.M. (2021). Long-read assembly of a Great Dane genome highlights the contribution of GC-rich sequence and mobile elements to canine genomes. *Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.* 118, e2016274118. https://doi.org/10.1073/pnas.2016274118.

Hédan, B., Cadieu, E., Botherel, N., Dufaure de Citres, C., Letko, A., Rimbault, M., Drögemüller, C., Jagannathan, V., Derrien, T., Schmutz, S., Leeb, T., André, C. (2019). Identification of a Missense Variant in MFSD12 Involved in Dilution of Phaeomelanin Leading to White or Cream Coat Color in Dogs. *Genes* 10, E386. https://doi.org/10.3390/genes10050386.

Hédan, B., Cadieu, É., Rimbault, M., Vaysse, A., Dufaure de Citres, C., Devauchelle, P., Botherel, N., Abadie, J., Quignon, P., Derrien, T. (2021). Identification of common predisposing loci to hematopoietic cancers in four dog breeds. *PLoS Genet.* 17, e1009395.

Hédan, B., Corre, S., Hitte, C., Dréano, S., Vilboux, T., Derrien, T., Denis, B., Galibert, F., Galibert, M.-D., André, C. (2006). Coat colour in dogs: identification of the merle locus in the Australian shepherd breed. *BMC Vet. Res.* 2, 9. https://doi.org/10.1186/1746-6148-2-9.

Hédan, B., Rault, M., Abadie, J., Ulvé, R., Botherel, N., Devauchelle, P., Copie-Bergman, C., Cadieu, E., Parrens, M., Alten, J., Zalcman, E.L., Cario, G., Damaj, G., Mokhtari, K., Le Loarer, F., Coulomb-Lhermine, A., Derrien, T., Hitte, C., Bachelot, L., Breen, M., Gilot, D., Blay, J.Y., Donadieu, J., André, C. (2020). PTPN11 mutations in canine and human disseminated histiocytic sarcoma. *Int. J. Cancer* 147, 1657-1665. https://doi.org/10.1002/ijc.32991.

Hoeppner, M.P., Lundquist, A., Pirun, M., Meadows, J.R.S., Zamani, N., Johnson, J., Sundström, G., Cook, A., FitzGerald, M.G., Swofford, R., Mauceli, E., Moghadam, B.T., Greka, A., Alföldi, J., Abouelleil, A., Aftuck, L., Bessette, D., Berlin, A., Brown, A., Gearin, G., Lui, A., Macdonald, J.P., Priest, M., Shea, T., Turner-Maier, J., Zimmer, A., Lander, E.S., di Palma, F., Lindblad-Toh, K., Grabherr, M.G. (2014). An improved canine genome and a comprehensive catalogue of coding genes and non-coding transcripts. *PLoS One* 9, e91172. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091172.

Hytönen, M.K., Grall, A., Hédan, B., Dréano, S., Seguin, S.J., Delattre, D., Thomas, A., Galibert, F., Paulin, L., Lohi, H., Sainio, K., André, C. (2009). Ancestral T-box mutation is present in many, but not all, short-tailed dog breeds. *J. Hered.* 100, 236-240. https://doi.org/10.1093/jhered/esn085.

Jagannathan, V., Drögemüller, C., Leeb, T., Consortium (DBVDC), D.B.V.D., Aguirre, G., André, C., Bannasch, D., Becker, D., Davis, B., Ekenstedt, K. (2019). A comprehensive biomedical variant catalogue based on whole genome sequences of 582 dogs and eight wolves. *Anim. Genet.* 50, 695-704.

Jagannathan, V., Hitte, C., Kidd, J.M., Masterson, P., Murphy, T.D., Emery, S., Davis, B., Buckley, R.M., Liu, Y.-H., Zhang, X.-Q. (2021). Dog10K_XBoxer_Tasha_1.0: A long-read assembly of the dog reference genome. *Genes* 12, 847.

Karlsson, E.K., Baranowska, I., Wade, C.M., Hillbertz, N.H.S., Zody, M.C., Eterson, N., Biagi, T.M., Patterson, N., Pielberg, G.R., Kulbokas, E.J. (2007). Efficient mapping of mendelian traits in dogs through genome-wide association. *Nat. Genet.* 39, 1321-1328.

LeBlanc, A.K., Breen, M., Choyke, P., Dewhirst, M., Fan, T.M., Gustafson, D.L., Helman, L.J., Kastan, M.B., Knapp, D.W., Levin, W.J., London, C., Mason, N., Mazcko, C., Olson, P.N., Page, R., Teicher, B.A., Thamm, D.H., Trent, J.M., Vail, D.M., Khanna, C. (2016). Perspectives from man's best friend: National Academy of Medicine's Workshop on Comparative Oncology. *Sci. Transl. Med.* 8, 324ps5. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaf0746.

Lindblad-Toh, K., Wade, C.M., Mikkelsen, T.S., Karlsson, E.K., Jaffe, D.B., Kamal, M., Clamp, M., Chang, J.L., Kulbokas, E.J., Zody, M.C., Mauceli, E., Xie, X., Breen, M., Wayne, R.K., Ostrander, E.A., Ponting, C.P., Galibert, F., Smith, D.R., deJong, P.J., Kirkness, E., Alvarez, P., Biagi, T., Brockman, W., Butler, J., Chin, C.-W., Cook, A., Cuff, J., Daly, M.J., DeCaprio, D., Gnerre, S., Grabherr, M., Kellis, M., Kleber, M., Bardeleben, C., Goodstadt, L., Heger, A., Hitte, C., Kim, L., Koepfli, K.-P., Parker, H.G., Pollinger, J.P., Searle, S.M.J., Sutter, N.B., Thomas, R., Webber, C., Lander, E.S. (2005). Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. *Nature* 438, 803-819. https://doi.org/10.1038/nature04338.
Ostrander, E.A., Wang, G.-D., Larson, G., Vonholdt, B.M., Davis, B.W., Jagannathan, V., Hitte, C., Wayne, R.K., Zhang, Y.-P. (2019). Dog10K: an international sequencing effort to advance studies of canine domestication, phenotypes and health. Natl. Sci. Rev. 6, 810-824.

Ostrander, E.A., Wayne, R.K. (2005). The canine genome. Genome Res. 15, 1706-1716.

Paoloni, M.C., Khanna, C. (2007). Comparative oncology today. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 37, 1023-1032.

Parker, H.G., Dreger, D.L., Rimbault, M., Davis, B.W., Mullen, A.B., Carpintero-Ramirez, G., Ostrander, E.A. (2017). Genomic Analyses Reveal the Influence of Geographic Origin, Migration, et Hybridization on Modern Dog Breed Development. Cell Rep. 19, 697-708. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2017.03.079

Parker, H.G., Kim, L.V., Sutter, N.B., Carlson, S., Lorentzen, T.D., Malek, T.B., Johnson, G.S., DeFrance, H.B., Ostrander, E.A., Kruglyak, L. (2004). Genetic structure of the purebred domestic dog. science 304, 1160-1164.

Parker, H.G., Kukekova, A.V., Akey, D.T., Goldstein, O., Kirkness, E.F., Baysac, K.C., Mosher, D.S., Aguirre, G.D., Aclet, G.M., Ostrander, E.A. (2007). Breed relationships facilitate fine-mapping studies: a 7.8-kb deletion cosegregates with Collie eye anomaly across multiple dog breeds. Genome Res. 17, 1562-1571.

Plassais, J., Guaguère, E., Lagoutte, L., Guillory, A.-S., de Citres, C.D., Degorce-Rubiales, F., Delverdier, M., Vaysse, A., Quignon, P., Bleuart, C., Hitte, C., Fautrel, A., Kaerle, C., Bellaud, P., Bensignor, E., Queney, G., Bourrat, E., Thomas, A., André, C. (2015). A spontaneous KRT16 mutation in a dog breed: a model for human focal non-epidermolytic palmoplantar keratoderma (FNEP-PK). J. Invest. Dermatol. 135, 1187-1190. https://doi.org/10.1038/jid.2014.526.

Plassais, J., Kim, J., Davis, B.W., Karyadi, D.M., Hogan, A.N., Harris, A.C., Decker, B., Parker, H.G., Ostrander, E.A. (2019). Whole genome sequencing of canids reveals genomic regions under selection et variants influencing morphology. Nat. Commun. 10, 1-14.

Plassais, J., Lagoutte, L., Correard, S., Paradis, M., Guaguère, E., Hédan, B., Pommier, A., Botherel, N., Cadiergues, M.-C., Pilorge, P., Silversides, D., Bizot, M., Samuels, M., Arnan, C., Johnson, R., Hitte, C., Salbert, G., Méreau, A., Quignon, P., Derrien, T., André, C. (2016). A Point Mutation in a lincRNA Upstream of GDNF Is Associated to a Canine Insensitivity to Pain: A Spontaneous Model for Human Sensory Neuropathies. PLoS Genet. 12, e1006482. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1006482.

Ulvé, R., Rault, M., Bahin, M., Lagoutte, L., Abadie, J., De Brito, C., Coindre, J.-M., Botherel, N., Rousseau, A., Wucher, V., Cadieu, E., Thieblemont, C., Hitte, C., Cornevin, L., Cabillic, F., Bachelot, L., Gilot, D., Hennuy, B., Guillaudeux, T., Le Goff, A., Derrien, T., Hédan, B., André, C. (2017). Discovery of Human-Similar Gene Fusions in Canine Cancers. Cancer Res. 77, 5721-5727. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-16-2691.

Vaysse, A., Ratnakumar, A., Derrien, T., Axelsson, E., Rosengren Pielberg, G., Sigurdsson, S., Fall, T., Seppälä, E.H., Hansen, M.S.T., Lawley, C.T., Karlsson, E.K., LUPA Consortium, Bannasch, D., Vilà, C., Lohi, H., Galibert, F., Fredholm, M., Häggström, J., Hedhammar, A., André, C., Lindblad-Toh, K., Hitte, C., Webster, M.T. (2011). Identification of genomic regions associated with phenotypic variation between dog breeds using selection mapping. PLoS Genet. 7, e1002316. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002316.

Vonholdt, B.M., Pollinger, J.P., Lohmueller, K.E., Han, E., Parker, H.G., Quignon, P., Degenhardt, J.D., Boyko, A.R., Earl, D.A., Auton, A., Reynolds, A., Bryc, K., Brisbin, A., Knowles, J.C., Mosher, D.S., Spady, T.C., Elkahloun, A., Geffen, E., Pilot, M., Jedrzejewski, W., Greco, C., Reti, E., Bannasch, D., Wilton, A., Shearman, J., Musiani, M., Cargill, M., Jones, P.G., Qian, Z., Huang, W., Ding, Z.-L., Zhang, Y.-P., Bustamante, C.D., Ostrander, E.A., Novembre, J., Wayne, R.K. (2010). Genome-wide SNP and haplotype analyses reveal a rich history underlying dog domestication. Nature 464, 898-902. https://doi.org/10.1038/nature08837.

Wang, C., Wallerman, O., Arendt, M.-L., Sundström, E., Karlsson, Å., Nordin, J., Mäkeläinen, S., Pielberg, G.R., Hanson, J., Ohlsson, Å., Saelström, S., Rönnberg, H., Ljungvall, I., Häggström, J., Bergström, T.F., Hedhammar, Å., Meadows, J.R.S., Lindblad-Toh, K. (2021). A novel canine reference genome resolves genomic architecture and uncovers transcript complexity. Commun. Biol. 4, 185. https://doi.org/10.1038/s42003-021-01698-x.

Wucher, V., Legeai, F., Hédan, B., Rizk, G., Lagoutte, L., Leeb, T., Jagannathan, V., Cadieu, E., David, A., Lohi, H., Cirera, S., Fredholm, M., Botherel, N., Leegwater, P.A.J., Le Béguec, C., Fieten, H., Johnson, J., Alföldi, J., André, C., Lindblad-Toh, K., Hitte, C., Derrien, T. (2017). FEELnc: a tool for long non-coding RNA annotation et its application to the dog transcriptome. Nucleic Acids Res. 45, e57. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1306.

<figure><img src="image_33.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA) https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Conserver les communautés microbiennes associées aux plantes viables et fonctionnelles : premiers résultats

Missimahou OUSSOU<fnref n="1" />
Géraldine TAGHOUTI<fnref n="1" />
Steven JAGLINE<fnref n="1" />
Thomas LERENARD<fnref n="1" />
Audrey LATHUS<fnref n="1" />
Cécile DUTRIEUX<fnref n="1" />
Perrine PORTIER<fnref n="1" />

**CORRESPONDANCE**
perrine.portier@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Les microbiotes qui vivent en association avec l'ensemble des êtres vivants présentent un important intérêt en agriculture, notamment pour l'amélioration de la santé des plantes. Cependant, leur manipulation demande à pouvoir préserver ces communautés vivantes et fonctionnelles. Préserver ces communautés de façon efficace n'est pas simple, celles-ci étant composées d'une très grande diversité de microorganismes que, pour beaucoup, nous ne savons cultiver.

À la Collection Française des Bactéries associées aux Plantes, CIRM-CFBP, basée à INRAE Angers, nous avons mis en place le projet MICROSTORE, financé par le département Santé des Plantes et Environnement d'INRAE. L'objectif de ce projet, actuellement en cours, est de mesurer l'impact de la conservation de microbiotes associés aux feuilles et aux graines de radis ainsi que l'impact d'une étape d'amplification biologique après conservation. Nous avons, avant et après conservation pendant deux ans, mesuré la composition taxonomique (par barcoding) et la diversité fonctionnelle (par technologie Biolog) pour chaque microbiote. L'analyse des données est en cours de finalisation, cependant, les données recueillies nous livrent déjà des informations précises sur l'effet de la conservation et sur l'effet d'une étape d'amplification biologique après conservation sur les microbiotes associés aux plantes. À terme, ces travaux devraient fournir aux scientifiques des outils pour mieux préserver ce type de ressources biologiques.

## MOTS-CLÉS

Communautés microbiennes, plantes et semences, Centre de Ressources Biologiques, conservation.

<footnote n="1">¹ Université d'Angers, Institut Agro, INRAe, IRHS, SFR QUASAV, CIRM-CFBP, F-49000 Angers, France.</footnote>
# Preservation of viable and functional plant-associated microbial communities: first results

Missimahou OUSSOU<fnref n="1" />

Géraldine TAGHOUTI<fnref n="1" />

Steven JAGLINE<fnref n="1" />

Thomas LERENARD<fnref n="1" />

Audrey LATHUS<fnref n="1" />

Cécile DUTRIEUX<fnref n="1" />

Perrine PORTIER<fnref n="1" />

## CORRESPONDENCE

perrine.portier@inrae.fr

## ABSTRACT

Microbiota are communities of microorganisms living associated with all living beings. They are of a great interest in agriculture, including to enhance plant health. However, their handling requires to preserve them alive and functioning on a long-term basis.

Reliable preservation of these communities is not simple, because they are composed of a great diversity of microorganisms, some of them we do not know how to cultivate.

At the French Collection for Plant-associated Bacteria (CIRM-CFBP) located at INRAE Angers, we proposed to measure the impact of the preservation on microbiota associated with radish leaves and seeds. We measured the impact of preservation on the taxonomic diversity (by barcoding) and the functional diversity (by Biolog technology) of these microbiotas before and after preservation for two years. This work enhances knowledge of the influence of preservation and of a multiplication stage after preservation. It will permit to make tools available to scientists enhancing the preservation of these resources.

## KEYWORDS

Microbial communities, plant and seeds, Biological Resource Center, preservation.

<footnote n="1">¹ Université d'Angers, Institut Agro, INRAe, IRHS, SFR QUASAV, CIRM-CFBP, F-49000 Angers, France.</footnote>
## Introduction

Les microbiotes qui vivent en association avec l'ensemble des êtres vivants présentent un important intérêt en agriculture, notamment pour l'amélioration de la santé des plantes ; ceci sous condition de préserver ces communautés vivantes et fonctionnelles pendant leur manipulation. Or, préserver ces communautés de façon efficace n'est pas simple, car elles sont composées d'une très grande diversité de microorganismes que, pour beaucoup, nous ne sarons pas cultiver.

S'il existe des études sur la conservation, elles portent pour beaucoup sur le microbiote humain (Kerckhof et al., 2014 ; Fouhy et al., 2015 ; Gacy et al., 2017), même si on peut trouver quelques données pour des microbiotes du sol (Richaume et al., 2006) ou encore des co-cultures méthanotrophiques ou des biofilms de stations d'épuration (Kerckhof et al., 2014). En revanche, aucune publication à ce jour ne fait état de la conservation des microbiotes de plantes, ni ne permet de répondre aux questions spécifiques à cette conservation. L'utilisation, parfois, d'étapes d'amélification en fermenteur ne permet pas une comparaison stricte entre un état initial et un état d'après conservation. De plus, les données acquises concernant les capacités métaboliques sont très ciblées et ne permettent pas d'avoir une idée globale de la façon dont réagit un microbiote à la conservation.

À la Collection Française des Bactéries associées aux Plantes, CIRM-CFBP, basée à INRAE Angers, nous avons mis en place, en 2019, le projet MICROSTORE, financé par le département Santé des Plantes et Environnement d'INRAE. L'objectif de ce projet, actuellement en cours, est de mesurer l'impact de la conservation de microbiotes associés aux feuilles et aux graines de radis ainsi que celui d'une étape d'amplification biologique après conservation.

En pratique, nous avons extrait deux microbiotes de semences de radis et deux microbiotes de feuilles de radis cultivés à partir de ce même lot. Nous avons aussi construit une communauté synthétique (SynCom) à partir de 10 souches bactériennes isolées de semences de radis et de haricot afin de servir de point de référence. Les microbiotes ont ensuite été conservés pendant 2 ans selon 3 modalités : lyophilisées, cryoconservées en glycérol à -80 °C en congélateur ou à -196 °C dans l'azote liquide. Pour chaque microbiote, nous avons mesuré, avant et après conservation,

la composition taxonomique (par barcoding) et la diversité fonctionnelle (par technologie Biolog).

Nous livrons ici les premiers résultats issus de ces travaux, après une présentation des enjeux liés aux microbiotes de plantes ainsi qu'un état de l'art de la conservation du microbiote.

## Enjeux liés aux microbiotes des plantes

À l'instar des animaux, les plantes vivent en association avec des communautés microbiennes, complexes (Muller et al., 2016). Les communautés microbiennes, ou microbiotes, sont définies comme un assemblage de microorganismes appartenant à différents règnes et interagissant les uns avec les autres dans un environnement contigu (Berg et al., 2020). Ces communautés peuvent remplir plusieurs rôles pour la plante. Ainsi, la composition du microbiote, présent dans le sol ou dans les racines, a un impact sur la croissance (Sugiyama et al., 2021) et sur la date de floraison (Panke-Buisse et al., 2015) chez *Arabidopsis thaliana*. Il a aussi été démontré que le microbiote joue un rôle dans la résistance du chou champêtre (*Brassica rapa*) au stress hydrique (Lau & Lennon, 2012), ou encore que, sous l'effet d'un stress hydrique, les microbiotes associés au riz sont modifiés, permettant une meilleure survie de la plante (Santos-Medellin et al., 2017). D'une manière générale, les microbiotes végétaux sont impliqués dans la résistance à différents stress abiotiques : inondation, sècheresse, carence en azote et phosphore (Hartman & Tringe, 2019).

Les microbiotes végétaux jouent aussi un rôle dans la réponse des plantes aux pathogènes et dans la transmission de ces pathogènes par les semences. Certains pathogènes sont, en effet, transmis par les semences (qui constituent alors une source d'inoculum primaire), et sont transmis à la plantule lors de la germination. La composition du microbiote peut influer cette transmission (Barret et al., 2016). Ainsi, une forte compétition pour les ressources a été observée entre *Xanthomonas campestris*, pathogène des Brassicacées, et deux souches bactériennes appartenant à l'espèce *Stenotrophomonas rhizophila* issues du microbiote de graines de radis, suggérant que des constituants du microbiote des semences pourraient entrer en compétition avec des pathogènes et ainsi limiter leur transmission par les semences (Torres-Cortès et al., 2019). De même, l'effet suppressif de certains sols vis-à-vis de maladies microbiennes est conféré par les microorganismes du sol. Par exemple, des communautés microbiennes protègent les betteraves sucrières contre le pathogène fongique racinaire *Rhizoctonia solani* (Mendes et al., 2011), ou encore, une flavobacte-
térie a été décrite comme protégeant les tomates contre l'infection par *Ralstonia solanacearum* (Kwak et al., 2018).

Au-delà de ces effets directs de protection contre les maladies, le microbiote étendrait l'immunité des plantes via un amorçage des défenses des plantes, et agirait comme une couche supplémentaire de défense contre les organismes pathogènes (Teixera et al., 2019). Selon McLaren & Callahan (2020), la résistance aux pathogènes pourrait même être le principal avantage évolutif issu du microbiote chez les plantes.

L'utilisation de microbiotes natifs ou de communautés synthétiques (SynCom) permet ainsi d'aborder les causalités entre la composition des microbiotes et la résistance des plantes, ou de proposer des perspectives d'application.

L'utilisation de communautés synthétiques se focalise sur l'utilisation de microorganismes particuliers ou de taxons clés qui peuvent fournir des nutriments indispensables, une résistance à un pathogène ou promouvoir des fonctions microbiennes (Qiu et al., 2019). Ces SynCom peuvent également servir de modèle pour étudier les mécanismes d'assemblage du microbiote végétal (Ishizawa et al., 2020). Par exemple, une Syncom assemblée à partir de souches de la rhizosphère de canne à sucre a montré qu'elle pouvait améliorer la croissance du maïs (Armanhi et al., 2017), ou encore un assemblage de sept souches bactériennes permet de protéger le maïs contre l'infection par *Fusarium verticillioides* (Niu et al., 2017).

Cependant, même si des efforts ont été faits en ce sens (Lewis et al., 2020), il n'est pas possible d'isoler l'ensemble des membres des microbiotes, une bonne partie d'entre eux n'étant pas cultivables, et de les utiliser dans des SynCom. Celles-ci ne sont donc pas représentatives d'un microbiote natif complexe.

À l'inverse, les communautés naturelles présentent l'avantage d'être composées de la totalité du microbiote. Celles-ci sont d'ailleurs déjà utilisées en santé humaine ou vétérinaire avec succès (exemple de la transplantation fécale ; Wang et al., 2019 ; Pereira et al., 2018).

Il existe cependant une limite à l'emploi des communautés natives, c'est celle de leur conservation. En effet, leur utilisation se fait à partir soit de communautés fraîches, soit de portions de matière les contenant. Il n'existe pas de méthode établie de conservation de ces communautés en dehors de la matière dans laquelle elles se trouvent. D'autre part, chez la plante, il n'existe pas d'études sur l'utilisation de microbiotes natifs, et quasiment aucune sur leur conservation, alors que

plusieurs études tendent à les proposer comme solutions de lutte contre les pathogènes de plante. Il y a donc un enjeu important à pouvoir stocker ces microbiotes et préserver leur viabilité pour des études et utilisations ultérieures.

## La conservation des communautés microbiennes vivantes : état de l'art

Les microbiotes sont très diversifiés et sont constitués d'une part non négligeable d'organismes non cultivables en laboratoire. Ainsi, dans la phyllosphère d'Arabidopsis thaliana seulement 60 % des microorganismes sont cultivables (Bai et al., 2015).

La conservation appliquée à ces communautés, afin de les garder vivantes, aura donc un effet différentiel sur la survie des différents organismes qui les composent et, par conséquent, un impact sur la diversité taxonomique de ces communautés. En conséquence, cette modification de la composition taxonomique induite par la conservation pourra aussi avoir un impact sur la diversité fonctionnelle des communautés conservées.

À ce jour, les études sur la conservation portent pour beaucoup sur le microbiote humain (Kerckhof et al., 2014 ; Fouhy et al., 2015 ; Gacy et al., 2017) même si on peut trouver quelques données pour des microbiotes du sol (Richaume et al., 2006) ou encore des co-cultures méthanotrophiques ou des biofilms de stations d'épuration (Kerckhof et al., 2014).

Ces études sont assez diverses tant par leur mise en place que par leurs résultats.

Les modes de conservation étudiés sont la congélation à -80° C ou la lyophilisation, parfois après une étape d'amplification en fermenteur. La composition taxonomique est analysée par métabarcoding 16S, par puce à ADN spécifique des familles bactériennes du microbiote humain, ou par RISA (Ribosomal RNA intergenic spacer analysis, méthode d'analyse basée sur les régions inter-géniques de l'ARNr qui évite les biais liés aux étapes de culture). Les capacités métaboliques sont souvent non évaluées ou portent sur des activités spécifiques (production de gaz et acides gras à chaines courtes, quantification de la biomasse, des nitrites et des gaz produits, respiration sur glucose et capacité à transformer des substrats cibles).

Les résultats de ces études aussi sont divergents. Ainsi, Fouhy et al. (2014) concluent à une absence de modification de la composition taxonomique du microbiote intestinal humain après 7 jours de conservation ; mais on peut se demander si cela n'est pas biaisé par le fait que la méthode de métabarcoding analyse l'ADN
des cellules, qu'elles soient viables ou pas. Pour cette étude, seule la viabilité des microbiotes a été évaluée mais pas leurs capacités métaboliques.

Par contre, Gacy et al. (2017), toujours pour le microbiote intestinal humain, et après une étape d'amplification en fermenteur, concluent que la conservation induit des modifications de la composition taxonomique des communautés.

Kerckhof et al. (2014) ont étudié simultanément trois communautés très différentes. Ils concluent que la composition taxonomique après conservation est altérée, même si la structure générale des communautés est inchangée.

Enfin, Richaume et al. (2006) indiquent, qu'après 15 ou 30 jours de conservation, des changements dans la composition taxonomique ou les capacités métaboliques sont observables.

## Matériels et méthodes

Le CIRM-CFBP, Collection Française des Bactéries associées aux Plantes (membre du pilier microbien de RARE : https://cirm-cfbp.fr/) préserve, depuis près de 50 ans, des ressources bactériennes stratégiques pour la santé des plantes. Au CIRM-CFBP, les bactéries sont préservées sous 3 modalités : lyophilisées, cryoconservées en glycérol à -80° C en congélateur ou à -196° C dans l'azote liquide.

Nous avons proposé d'appliquer ces trois modes de préservation, que nous maitrisons, à des microbiotes issus de plantes, et d'évaluer leur composition taxonomique en bactéries et champignons et leur diversité fonctionnelle avant et après deux années de conservation.

En pratique, nous avons extrait deux microbiotes de semences de radis et deux microbiotes de feuilles de radis cultivés à partir de ce même lot. Nous avons aussi construit une communauté synthétique (SynCom) à partir de 10 souches bactériennes isolées de semences de radis et de haricot afin de servir de point de référence.

La composition taxonomique des microbiotes a été analysée par métabarcoding des marqueurs 16S, ITS1 et gyrB (Barret et al., 2015). Le marqueur 16S permet d'identifier les grandes familles bactériennes, le marqueur ITS1 est spécifique des champignons et le marqueur gyrB permet d'avoir une résolution taxonomique plus fine pour les membres des protéobactéries.

La diversité fonctionnelle a été évaluée par la technologie Biolog. Cette technologie est basée sur l'utilisation de plaques, dont chaque puits comporte un substrat unique, et la visualisation par indicateur coloré. Les plaques sont inoculées avec une souche de microorganisme ou une communauté en suspension. Si les organismes placés dans le puits sont en capacité de métaboliser le substrat, cela induit une respiration cel-lulaire et la production de NADH, ce qui se traduit par la réduction du Tetrazolium incolore en Formazan de couleur violette. Ainsi, cette méthode permet de quantifier la respiration liée à la métabolisation du substrat. Différents types de plaques sont commercialisés par

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>Figure 1. Plan expérimental du projet Microstore. La composition taxonomique et la diversité fonctionnelle de deux microbiotes de semences de radis, de deux microbiotes de feuilles de radis (cultivées à partir du même lot de semences) et d'une communauté synthétique (SynCom) sont mesurées avant et après conservation (lyophilisation, cryopréservation à -80 °C ou -196 °C), avant et après une étape d'amplification biologique sur milieu solide ou en milieu liquide.</figcaption></figure>
Biolog. Nous avons utilisé les plaques Ecoplates selon les spécifications du fournisseur. Celles-ci, spécifiquement conçues pour mesurer les empreintes métaboliques des communautés microbiennes, comportent 31 sources de carbone en triplicat (6 acides aminés, 2 amines, 10 glucides, 7 acides carboxyliques, 2 composés phénoliques et 4 polymères). L'acquisition des données s'est faite dans un appareil Omnilog permettant une acquisition à haut débit (jusque 50 plaques). La composition taxonomique et la diversité fonctionnelle ont été analysées, pour chaque microbiote, avant et après conservation, et avec ou non une étape d'amplification en milieu solide (Tryptic Soy Agar 10 %, 4 jours) ou en milieu liquide (Tryptic Soy Broth 10 %, 24h). Cette étape d'amplification par culture a été testée, car une utilisation des microbiotes dans un domaine appliqué nécessitera probablement d'amplifier le matériel biologique. Or, cette culture induit, elle aussi, des biais qui s'ajoutent à ceux induits par la seule conservation. La comparaison avant/après conservation et avec/sans culture permettra de mieux appréhender le rôle de chacune de ces étapes.

Le plan expérimental est présenté dans la figure 1.

Les expérimentations ont été menées, pour les étapes
avant conservation au printemps 2019, et pour les
étapes après conservation au printemps 2021.

Résultats préliminaires et analyse

L'analyse des données est en cours de finalisation et
donnera lieu à une publication.

Cependant, les premiers résultats nous permettent
déjà de tirer quelques conclusions.

L'analyse de la diversité taxonomique **avant conservation** indique que celle-ci est plus élevée dans les feuilles de radis que dans les semences. Ceci avait déjà été démontré pour l'épinard (Lopez-Velasco et al., 2013). De plus, après une étape de culture, la diversité diminue fortement (Figure 2).

La diversité fonctionnelle est, par contre, peu impac-
tée par les étapes de culture appliquées **avant la
conservation**. On observe plus de différences entre
les différents types de microbiotes (SynCom, graine
ou feuille) que dues aux étapes de culture (Figure 3).
Les microbiotes de feuilles se distinguent par leur ca-
pacité à métaboliser le glycogène (capacité absente
chez les autres microbiotes).

Nous avons également comparé l'empreinte méta-
bolique de la communauté synthétique à celle de
chaque souche prise individuellement (Figure 4).

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>Figure 2. Alpha-diversité (- richesse spécifique) dans les microbiotes de feuille, semences et communauté synthétique (SynCom) avant conservation, mesurée par métabarcoding avec les marqueurs 16S, gyrB et ITS1.</figcaption></figure>

a : 16S, b : gyrB. c : ITS1. En rouge : sans étape de culture. En vert : après une étape de culture en milieu liquide. En bleu : après une étape de culture en milieu solide.

NA : Non Applicable
<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>Figure 3. Intensité de métabolisation des 31 substrats présents sur les plaques Ecoplates, avant conservation. L'intensité varie du bleu (non métabolisé) au beige (métabolisation complète). Le Cluster 1 regroupe les communautés synthétiques, le cluster 2 regroupe les microbiotes de feuilles (+ un des microbiotes de semences) et le cluster 3 regroupe les microbiotes de semences. Il n'y a pas de clusterisation en fonction de l'application ou non d'une étape de culture avant conservation.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>Figure 4. Empreinte métabolique de la communauté synthétique (en dupliquat) et des souches individuelles qui la composent. Chaque case verte représente une réaction positive.</figcaption></figure>
La diversité fonctionnelle des communautés synthétiques est supérieure à celle des souches individuelles. Nous n'observons pas d'émergence de capacités, chacune est présente au moins chez une souche et, de même, nous n'observons pas de phénomène d'inhibition. Un composé (m-Erythritol) présente une réaction variable entre les deux répétitions pour la communauté synthétique.

Après conservation, on observe un effet significatif des étapes de culture sur la diversité taxonomique ; par contre, la conservation elle-même n'a pas d'effet significatif. Cela pourrait être dû à la persistance de l'ADN dans le milieu même après la perte de viabilité des organismes. Pour la diversité fonctionnelle en revanche, la conservation a un impact significatif, mais pas les étapes de cultures appliquées en sortie de conservation.

## Conclusion

L'objectif du projet MICROSTORE est mesurer l'impact de la conservation de microbiotes associés aux feuilles et aux graines de radis. L'analyse des données est en cours de finalisation, cependant, les données recueillies nous livrent déjà des informations précises sur l'effet de la conservation et sur l'effet d'une étape d'amplification biologique après conservation sur les microbiotes associés aux plantes.

À partir de ces travaux, il reste à déterminer quelle méthode de conservation est la mieux adaptée pour optimiser la conservation de ces communautés.

Ces résultats permettront rapidement de proposer des outils, aux scientifiques du domaine, pour optimiser la préservation de leurs microbiotes d'intérêt.

## Remerciements

Un grand merci à Marie Simonin, Gilles Hunault et Matthieu Barret pour leur aide précieuse pour les analyses et leurs suggestions tout au long de ce projet.

## Financement

Projet Microstore 2019-2021, département SPE INRAE.

## Références

* Armanhi J.S.L., Souza R.S.C. de, Damasceno N. de B., Araújo L.M. de, Imperial J. and Arruda P (2017). A Community-Based Culture Collection for Targeting Novel Plant Growth-Promoting Bacteria from the Sugarcane Microbiome. Front Plant Sci. 8, 2191.

* Bai Y., Müller D. B., Srinivas G., Garrido-Oter R., Potthoff E., Rott M., Dombrowski N., Münch P.C., Spaepen S., Remus-Emsermann M., Hüttel B., McHardy A.C., Vorholt J.A. and Schulze-Lefert P. (2015). Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature 2015 Vol. 528. Pages 364.

* Barret M, Briand M, Bonneau S, Préveaux A, Valière S, Bouchez O, Hunault G, Simoneau P, Jacques MA (2015) Emergence shapes the structure of the seed-microbiota. Appl. Environ. Microbiol 81 (4) : 1257-1266

* Barret M., Guimbaud J., Darrasse A. and Jacques M. (2016). Plant microbiota affects seed transmission of phytopathogenic microorganisms. Mol Plant Pathol. 17, 791-795.

* Berg G., Rybakova D., Fischer D. et al. (2020). Microbiome definition re-visited: old concepts and new challenges. Microbiome, 8, 103.

* Fouhy F, Deane J, Rea MC, O'Sullivan Ó, Ross RP, O'Callaghan G, Plant BJ, Stanton C. (2015). The Effects of Freezing on Faecal Microbiota as Determined Using MiSeq Sequencing and Culture-Based Investigations (J Neu, Ed.). PLOS ONE 10, e0119355.
Gaci N, Chaudhary PP, Tottey W, Alric M, Brugère J-F. (2017). Functional amplification and preservation of human gut microbiota. *Microbial Ecology in Health and Disease* 28, 1308070.

Ishizawa H., Tada M., Kuroda M., Inoue D., Futamata H. and Ike M. (2020). Synthetic Bacterial Community of Duckweed: A Simple and Stable System to Study Plantmicrobe Interactions. *Microbes Environ*, 35.

Kerckhof F-M, Courtens ENP, Geirnaert A et al. (2014). Optimized Cryopreservation of Mixed Microbial Communities for Conserved Functionality and Diversity (K McCluskey, Ed.). PLoS ONE 9, e99517.

Kwak M.-J., Kong H.G., Choi K. et al. (2018). Rhizosphere microbiome structure alters to enable wilt resistance in tomato. *Nature Biotechnology*, 36, 1100-1109.

Lau J.A. and Lennon J.T. (2012). Rapid responses of soil microorganisms improve plant fitness in novel environments. *PNAS*, 109, 14058-14062.

Lewis W.H., Tahon G., Geesink P., Sousa D.Z. and Ettema T.J.G. (2020). Innovations to culturing the uncultured microbial majority. *Nat Rev Microbiol*.

Lopez-Velasco G., Carder P.A., Welbaum G.E. and Ponder M.A. (2013). Diversity of the spinach (Spinacia oleracea) spermosphere and phyllosphere bacterial communities. *FEMS Microbiol Lett*, 346, 146-154.

McLaren M.R. and Callahan B.J. (2020). Pathogen resistance may be the principal evolutionary advantage provided by the mi-crobiome. *Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences*, 375, 20190592.

Mendes R., Kruijt M., Bruijn I. de et al. (2011). Deciphering the rhizosphere microbiome for disease-suppressive bacteria. *Science*, 332, 1097-1100.

Müller D.B., Vogel C., Bai Y. and Vorholt J.A. (2016). The Plant Microbiota: Systems-Level Insights and Perspectives. *Annu Rev Genet*, 50, 211-234.

Niu B., Paulson J.N., Zheng X. and Kolter R. (2017). Simplified and representative bacterial community of maize roots. *Proc Natl Acad Sci U S A*, 114, E2450-E2459.

Pereira G.O., Gomes L.A., Santos I.S., Alfieri A.F., Weese J.S. and Costa M.C. (2018). Fecal microbiota transplantation in puppies with canine parvovirus infection. *J VetIntern Med*, 32, 707-711.

Qiu Z., Egidi E., Liu H., Kaur S. and Singh B.K. (2019). New frontiers in agriculture productivity: Optimised microbial inoculants and in situ microbiome engineering. *Biotechnology Advances*, 37, 107371.

Richaume A, Pourcelot A, Rama R, Nazaret S. (2006). Évaluation des modifications quantitatives, qualitatives et fonctionnelles induites par la conservation de consortiums bactériens extraits de sols., 19, Les Actes du BRG, 6, 371-389.

Santos-Medellin C., Edwards J., Liechty Z., Nguyen B. and Sundaresan V. (2017). Drought Stress Results in a Compartment-Specific Restructuring of the Rice Root-Associated Microbiomes. *mBio*, 8.

Sharma R., Nimonkar, Y., Sharma A., Rathore R.S. and Prakash O. (2018). Concept of Microbial Preservation: Past, Present and Future. In S. K. Sharma and A. Varma, eds. *Microbial Resource Conservation: Conventional to Modern Approaches*. Soil Biology. Cham: Springer International Publishing, pp. 35-54.

Sugiyama A, Bakker M.G., Badri D.V., Manter D.K., Vivanco J.M. (2013). Relationships between Arabidopsis genotype-specific bio-mass accumulation and associated soil microbial communities. *Botany* 91: 123-12

Teixeira P.J.P., Colaianni N.R., Fitzpatrick C.R. and Dangl J.L. (2019). Beyond pathogens: microbiota interactions with the plant immune system. *Curr Opin Microbiol*, 49, 7-17.

Torres-Cortés G., Garcia B.J., Compant S. et al. (2019). Differences in resource use lead to coexistence of seed-transmitted mi-crobial populations. *Sci Rep*, 9, 6648.

Wang J.-W., Kuo C.-H., Kuo F.-C. et al. (2019). Fecal microbiota transplantation: Review and update. *J Formos Med Assoc*, 118 Suppl 1, S23-S31.

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# La cryoconservation des cellules germinales souches chez la truite arc-en-ciel : une stratégie pour restaurer l'intégralité d'un génotype d'intérêt

Anne-Sophie GOUPIL<fnref n="1" />

Stéphanie KICA<fnref n="1" />

Tina TERRENNE<fnref n="2" />

Lionel GOARDON<fnref n="2" />

Alexandra DEPINCÉ<fnref n="1" />

Charlène LABESSE<fnref n="1" />

Jean-Jacques LAREYRE<fnref n="1" />

Catherine LABBÉ<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

catherine.labbe@inrae.fr

jean-jacques.lareyre@inrae.fr

## RÉSUMÉ

La conservation en cryobanque des ressources génétiques chez les poissons repose uniquement sur la cryoconservation du sperme, puisque la cryoconservation des ovules et des embryons chez ces espèces à œufs télolécithes est toujours impossible. Pour autant, la cryoconservation des cellules germinales souches est envisageable. On sait, par ailleurs, que des cellules germinales souches injectées dans la cavité abdominale d'alevins receveurs intégraient leurs gonades et conduisaient en fine à la production de gamètes fonctionnels. Dans le cadre de la mise en place de l'infrastructure CRB Anim, pilier animal de RARe, une méthode de cryoconservation des cellules germinales souches a été mise au point chez la truite arc-en-ciel. Nous présentons et commentons ici la méthode retenue : le recours aux protéines d'origine animale dans le dilueur a été évité, la qualité des cellules décongelées a été validée et leur capacité à coloniser les gonades d'alevins receveurs a été démontrée. La stratégie de cryoconservation décrite permet l'entrée en cryobanque d'un matériel biologique qui assure la restauration de l'intégralité d'un génotype d'intérêt après cryoconservation chez les poissons.

## MOTS-CLÉS

Cryobanque, ressources génétiques, *Oncorhynchus mykiss*, poissons.

<footnote n="1">1 INRAE, Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons LPGP, UR1037, 35 000 Rennes.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, UE PEIMA, 29450 Sizun.</footnote>

<footnote>Ce travail a été initié et encouragé par Florence Le Gac, décédée le 9 juillet 2018 alors que les premiers succès de greffe après cryoconservation étaient validés.</footnote>
# Cryopreservation of germinal stem cells in rainbow trout: a strategy to entirely restore a genotype of interest

Anne-Sophie GOUPIL<fnref n="1" />

Stéphanie KICA<fnref n="1" />

Tina TERRENNE<fnref n="2" />

Lionel GOARDON<fnref n="2" />

Alexandra DEPINCÉ<fnref n="1" />

Charlène LABESSE<fnref n="1" />

Jean-Jacques LAREYRE<fnref n="1" />

Catherine LABBÉ<fnref n="1" />

## CORRESPONDENCE

catherine.labbe@inrae.fr

jean-jacques.lareyre@inrae.fr

## ABSTRACT

Cryobanking of fish genetic resources relies exclusively on sperm cryopreservation, as the cryopreservation of oocytes and embryos is not possible in these species with telolecithal eggs. However, the cryopreservation of germinal stem cells is achievable, because they are structurally less complex than fish oocytes and embryos. In addition, it is shown that when germinal stem cells are injected into the peritoneal cavity of recipient fries, they colonize the fry gonads and undergo gametogenesis, thereby leading to the production of functional gametes. In the course of building the infrastructure of BRC Anim, the animal component of the AgroBRC/RARe infrastructure, a method for germinal stem cell cryopreservation was set up for rainbow trout. Here, we present and comment the final procedure that was adopted: the extenders were devoid of animal products, thawed cell quality was validated, and their ability to colonize recipient gonads was demonstrated. The cryopreservation strategy described enables the cryobanking of biological materials that support the regeneration of a complete genotype of interest after cryopreservation in fish.

## KEYWORDS

Cryobank, Genetic resources, *Oncorhynchus mykiss*, Fish.

<footnote n="1">1 INRAE, Laboratoire de Physiologie et Génomique des Poissons LPGP, UR1037, 35 000 Rennes.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, UE PEIMA, 29450 Sizun.</footnote>

<footnote>Ce travail a été initié et encouragé par Florence Le Gac, décédée le 9 juillet 2018 alors que les premiers succès de greffe après cryoconservation étaient validés.</footnote>
## Introduction

Chez les poissons, la cryoconservation du sperme est globalement maîtrisée chez les espèces d'intérêt aquacole et pour la recherche. Ce matériel biologique est donc désormais utilisé en routine pour conserver les ressources génétiques aquacoles, même si des améliorations sont encore recherchées ponctuellement. En France, la Cryobanque Nationale et ses partenaires aquacoles (INRAE, SYSAAF - syndicat des sélectionneurs avicoles et aquacoles français -) ont été à l'origine de la création d'une cryobanque centrisée, rassemblant la majorité des ressources génétiques aquacoles françaises sous forme de semence cryoconservée. Cependant, aucune méthode à l'heure actuelle ne permet de cryoconserver des ovules matures fonctionnels ou des embryons entiers chez les poissons, en raison de la présence d'un compartiment vitellin imperméable aux cryoprotecteurs, et dont la moindre perturbation affecte le développement embryonnaire (Martinez-Paramo et al., 2017). La régénération d'individus porteurs d'un génotype d'intérêt suppose donc de croiser le sperme cryoconservé avec des ovules frais de la même origine génétique, afin de produire les alevins attendus. Or, le maintien de la diversité génétique via les ovules frais, par conservation de cheptels femelles en pisciculture, est très lourd, couteux et peu sûr sur le long terme. En l'absence de ces géniteurs, la régénération de la ressource génétique à partir du seul sperme cryoconservé, utilisé avec des ovules d'une origine génétique différente, ne permettra de restaurer que 50 % du génotype donneur à la première génération. De plus, le génome mitochondrial d'origine sera perdu, car il est transmis uniquement par voie maternelle.

Différentes biotechnologies visant à contourner cet écueil ont été développées ces 30 dernières années (Labbé et al., 2012 ; Labbé, 2013), dont l'androgénèse (injection de 1 ou 2 spermatozoïdes dans des ovules dont l'ADN a été inactivé), la greffe de cellules germinales souches embryonnaires

et adultes, et le transfert nucléaire (injection du noyau d'une cellule somatique dans un ovule dont l'ADN a été inactivé). Pour autant, beaucoup de ces technologies sont toujours au stade de la recherche ou bien offrent des rendements de succès ou de conformité génétique encore peu compatibles avec une utilisation en routine pour la conservation des ressources génétiques. L'une de ces méthodes, la greffe de cellules germinales souches adultes, s'avérait cependant particulièrement prometteuse d'après les succès rapportés par l'équipe japonaise du Dr. Goro Yoshizaki (Okutsu et al., 2006a). Le principe de cette technologie est schématisé dans la figure 1.

L'intérêt de la régénération d'une population par greffe de cellules germinales souches est que, quel que soit le génotype des individus greffés, les gamètes produits contiennent l'intégralité du génome présent dans les cellules cryoconservées. De plus, lors de l'ovogénèse d'une femelle greffée, les ovogonies formées porteront l'ADN mitochondrial de la cellule souche dont elles sont issues, et transmettront ce patrimoine mitochondrial à la descendance. Enfin, les cellules germinales souches étant de taille et de structure proches de celles de cellules somatiques, leur cryoconservation ne soulève pas les écueils rencontrés pour les ovules ou les embryons (Okutsu et al., 2007).

Les promesses portées par les cellules germinales souches adultes vis-à-vis de la conservation des ressources génétiques chez les poissons (Yoshizaki et al., 2011 ; Lacerda et al., 2013) nous ont conduits à explorer cette voie pour la rendre opérationnelle en cryobanque. Dans le cadre du Projet Investissements d'Avenir CRB Anim, qui a soutenu le développement du pilier animal de RARe, nous avons analysé le potentiel de différentes méthodes de cryoconservation, en orientant certaines stratégies pour s'adapter aux prérequis du CRB Cryobanque Nationale et de ses sites secondaires, membres de CRB-Anim. Cela inclut i) une possibilité de collecte à grande échelle du matériel biologique, par un personnel polyvalent, ii) la biosécurité du matériel conservé (élimination des produits d'origine

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 1. Principe de la greffe de cellules germinales souches (selon Okutsu et al., 2006a)</figcaption></figure>

Les gonades de l'individu donneur adulte portant le génotype d'intérêt sont dissociées. La suspension cellulaire obtenue, contenant une petite proportion de cellules germinales souches (figurées en orange), est injectée dans la cavité abdominale (disque blanc) d'un alevin receveur. Les cellules germinales souches vont intégrer les gonades immatures du receveur (zones bleues), par un mécanisme encore mal connu, et initier la production de gamètes fonctionnels.
animale), iii) la compatibilité des contenants avec les es-
paces de stockage disponibles (paillettes notamment), et
iv) la préservation du potentiel reproducteur des cellules
germinales souches, c'est-à-dire leur capacité à coloniser
les gonades d'alevins receveurs et à se différencier en ga-
mètes fonctionnels. Ce travail a été réalisé chez la truite
arc-en-ciel (*Oncorhynchus mykiss*), une espèce à fort inté-
rêt économique en France et un modèle important pour la
recherche aquacole, induisant la création de nombreuses
lignées expérimentales.

Stratégie de cryoconservation et résultats

Choix des individus donneurs de cellules

Il a été montré que la greffe de cellules germinales souches
testiculaires de mâles adultes pouvait logiquement
conduire à la production de sperme, mais que ces cellules
étaient aussi capables de se différencier en ovules si elles
sont greffées dans un alevin femelle (Okutsu et al., 2006a).
L'inverse est vrai pour les cellules germinales souches de
l'ovaire de femelles adultes (Lee et al., 2016), ce qui prouve
la bipotence de ce matériel biologique. Cette propriété est
précieuse, car même si un seul sexe est disponible chez les
individus donneurs pour la cryoconservation, du sperme
ou des ovules pourront être obtenus dans tous les cas, en
jouant sur le sexe des receveurs. Chez les espèces à déter-
minisme sexuel XY comme la truite arc-en-ciel, les cellules
germinales souches testiculaires sont le premier matériel à
considérer, car elles contiennent l'information génétique
portée par le chromosome Y, contrairement aux ovogo-
nies. Nos récentes observations indiquent, en outre, que le
nombre de cellules germinales souches présentes dans un
testicule de mâles adultes sexuellement immatures peut
être jusqu'à 1 000 fois plus élevé, à poids de tissus équi-
valent, que dans un ovaire (Lareyre et al., communication
personnelle). Il est aussi recommandé de travailler avec
des individus adultes immatures, c'est à dire peu avancés
dans leur gamétogénèse, afin de ne pas diluer les suspen-
sions cellulaires avec d'autres cellules spermatiques ou des
ovocytes vitellogéniques. Enfin, les cellules germinales
souches adultes sont préférables aux cellules souches em-
bryonnaires (ou PGCs pour primordial germ cells), qui pos-
sèdent pourtant les mêmes capacités de greffe (Takeuchi
et al., 2004). En effet, les gonades adultes sont plus aisées
à collecter par un opérateur non expérimenté que les fils
translucides constituant les gonades embryonnaires. De

plus, les premières permettent d'obtenir plusieurs milliers
de cellules souches à partir d'un individu (dans nos condi-
tions), contre moins de 90 cellules souches par embryon et
dans une fenêtre développementale très réduite (Okutsu et
al., 2006b).

Préparation des cellules germinales souches

Notre équipe maîtrisait une méthode originale de purifica-
tion de cellules germinales souches, basée sur le principe
de l'élutriation centrifuge<fnref n="4" /> de la suspension cellulaire tes-
ticulaire totale (Rolland et al., 2009 ; Bellaiche et al., 2014)
(Figure 2). Cette maîtrise nous a permis de réaliser toutes
les mises au point de la congélation sur une population cel-
lulaire enrichie en nos cellules d'intérêt, et donc de cibler
les analyses de viabilité sur ces cellules spécifiquement.
Cela nous a affranchis du recours à l'utilisation d'animaux
transgéniques possédant des cellules germinales souches
fluorescentes, utilisés jusqu'alors pour évaluer les survies
des cellules germinales souches à la décongélation (Okut-
su et al., 2007 ; Lee et al., 2013). Cette étape d'élutriation
centrifuge nécessite un matériel peu répandu et un per-
sonnel formé, qui ne seront pas forcément disponibles lors
de congélations de routine en cryobanque. C'est pourquoi
dans un second temps, nous avons vérifié que les suspen-
sions de cellules testiculaires totales pouvaient être utili-
sées de la même façon et avec les mêmes taux de succès
reproducteur que les cellules purifiées.

Mise au point de la cryoconservation

<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>Figure 2 : Purification des cellules germinales souches</figcaption></figure>

Les testicules de plusieurs mâles sont mélangés et dilacérés, avant une dissociation enzymatique puis mécanique des cellules. Les cellules sont ensuite séparées, selon leur taille et leur densité, par une centrifugation associée à un contre-courant de milieu de culture. La fraction enrichie en cellules germinales souches est retenue pour les tests de congélation.

<footnote n="4">4 Il s'agit d'une centrifugation associée à un contre-courant de milieu. La force centrifuge qui s'exerce sur les cellules est contre-carrée par la force centripète du courant de milieu se dirigeant vers le centre du rotor. Un faible débit de contre-courant induit la sortie vers le centre des cellules les plus petites ; l'augmentation progressive du débit permet ensuite la sortie des cellules les plus grosses, telles que les cellules germinales souches.</footnote>
## Critères de qualité

Les paramètres permettant d'évaluer la qualité des cellules décongelées doivent être soigneusement choisis au regard des cellules considérées. Dans le cas des cellules germinales souches, moins abondantes que les spermatozoïdes (quelques milliers contre plusieurs milliards par individu) et dont la prolifération en culture n'est pas encore maîtrisée, un paramètre important est le taux de récupération des cellules. Il permet d'évaluer combien de cellules ont éclaté (non retrouvées à la décongélation), ces disparues étant bien sûr absentes des analyses habituelles de viabilité. Un second critère choisi a été le maintien de la taille et de la structure des cellules. Enfin, le dernier paramètre que nous avons retenu est l'intégrité de la membrane plasmique, révélée par l'imperméabilité des cellules à un fluorochrome, l'iodure de propidium. Ces trois paramètres peuvent être analysés sur une petite fraction cellulaire et en une seule fois par cytométrie en flux (Figure 3), selon des critères faciles à paramétrer. Ils peuvent également être utilisés facilement sur une fraction du matériel en sortie de cryobanque, juste avant l'utilisation des cellules. L'évaluation du potentiel reproducteur est traitée plus loin.

<figure><img src="image_41.png" /></figure>

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Figure 3 : Exemple de profil de cytométrie en flux de cellules germinales souches (CGS) fraîches (Frais, en haut) et cryoconservées (Cryo, en bas). Après congélation, la fenêtre des CGS ne contient plus que 42 % des cellules initiales (1962/4664), et la proportion de débris a augmenté. Si l'on ne regarde que la qualité des CGS obtenues (à droite), on conclura que 88 % des cellules décongelées sont viables (membranes intactes). Mais, le véritable rendement de cette congélation est de 37 % (42 % de cellules, viables à 88 %).</figcaption></figure>

## Choix des conditions de congélation

Il est souvent difficile de reproduire les résultats de congélation de travaux publiés, car les équipements de congélation peuvent différer, le matériel biologique peut être de qualité différente et la variabilité (aléas) des procédures est rarement traitée dans les publications. Nous avons choisi de tester dans nos conditions : le protocole publié par Lee et al. (2013), deux méthodes que nous maîtrisions, l'une pour la congélation de cellules embryonnaires isolées (Leveroni-Calvi et al., 1998) et l'autre pour les cellules somatiques (Mauger et al., 2006) chez la truite arc-en-ciel, et une méthode mise au point pour les PGCs (Riesco et al., 2012). À ces procédures de référence, nous avons ajouté le testage d'une congélation en paillettes 500 µL (en remplacement des cryotubes habituellement utilisés), et le remplacement des additifs d'origine animale par un milieu synthétique à base d'acide hyaluronique, le Cryo3 (Stem Alpha, France). Les différents paramètres testés sont résumés dans le tableau 1.

<table><caption>Tableau 1 : Liste des différents paramètres testés pour la cryoconservation des cellules germinales souches. La combinaison retenue est signalée par *. L'ensemble de la procédure mise au point, incluant la composition du milieu et la vitesse de congélation, est disponible auprès des auteurs (C. Labbé) ou par le portail des collections de CRB Anim https://crb-anim.fr/access-to-collection/#/.</caption><thead><tr><td>CRYOPROTECTEURS</td><td>ADDITIFS</td><td>CONTENANTS</td><td>MODES DE CONGÉLATION</td></tr></thead><tbody><tr><td>DMSO</td><td>BSA</td><td>Cryotubes</td><td>Radeau</td></tr><tr><td rowspan="3">Propane 1,2-diol*</td><td>Jaune d'œuf</td><td>Paillettes 500 µL*</td><td>Azote liquide (vitrification)</td></tr><tr><td>Cryo3* (Stem Alpha)</td><td>Paillettes 250 µL</td><td>Congélateur -80 °C (freeze box)</td></tr><tr><td>PVP 40 000*</td><td></td><td>Congélateur programmable*</td></tr><tr><td></td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

## Résultats

La méthode optimale de cryoconservation a été très complexe à définir en raison des critères de qualité que nous nous étions fixés, incluant i) un rendement élevé de récupération des cellules germinales souches, ii) une qualité maximale des cellules survivantes, iii) une quantité de débris réduite (pour limiter la compétition entre débris et cellules dans la cavité du receveur greffé), iv) une capacité des cellules à survivre pendant 1 à 2 jours post-décongélation (pour mimer un temps théorique d'incorporation tissulaire post greffe). Le meilleur compromis a été trouvé avec une procédure de congélation très lente en congéla-