# Contraintes communes aux trois collections

## Température

La température est un facteur abiotique important pour la conservation de chacune des collections (Tableau 2) et doit être contrôlée en permanence. Par exemple, à l'ISA, ce contrôle se fait par des enregistreurs pilotés par un système de gestion centralisée et reliés à un logiciel de surveillance et d'alarme. Dans le cas des nématodes entomopathogènes, le renouvellement des souches (génération n+1) se fait généralement à 23 °C, mais la température d'infestation varie selon l'origine des souches entre 18 °C et 28 °C. Si la température est inadaptée, cela entraine une diminution de la production, qui peut conduire à la perte de la souche au fil des générations. En 2017, une panne d'enceintes réfrigérées a entrainé la perte de 20 % des souches de la collection.

## Caractérisation spécifique

À l'échelle des trois types d'organismes considérés ici, seules les approches de caractérisation biochimique et/ou moléculaire peuvent être mises en œuvre pour distinguer les espèces de manière fiable et s'assurer de l'absence de mélanges et/ou de contaminations, sans recourir à l'expérimentation d'un spécialiste en taxinomie.

Dans le cas des trichogrammes, c'est le séquençage d'une portion du gène codant pour la première sous-unité de la cytochrome oxydase (COI), protéine mitochondriale de la chaine respiratoire, qui est utilisé en routine pour caractériser rapidement la biodiversité des taxons (Al khatib et al., 2014 ; Correa et al., 2016). Cette méthode consiste, à partir d'individus identifiés morphologiquement et assignés à une espèce, à associer les séquences COI correspondantes. Par la suite, les séquences identiques ou proches pourront être assignées aux espèces correspondantes.
Dans le cas des nématodes phytoparasites, afin de permettre la caractérisation spécifique des souches en collection et identifier d'éventuels mélanges, différents marqueurs biochimiques (isoestérases) ou moléculaires (ADN satellite, SCAR, ADN ribosomique, ADN mitochondrial) sont utilisés en routine au laboratoire.

La caractérisation des espèces de nématodes entomopathogènes est réalisée en routine par des méthodes moléculaires basées sur le séquençage du gène codant de l'ARNr 28S ou de la région intergénique ITS. La morphométrie reste, cependant, la méthode de référence utilisée dans la littérature scientifique pour la caractérisation taxinomique de nouvelles espèces.

## Organisation du travail

La réception, le renouvellement des populations dans les meilleures conditions, c'est-à-dire sans perte de souches et sans contaminations entre souches, ainsi que la mise à disposition de matériel biologique nécessitent une organisation solide, avec des contraintes ponctuelles et récurrentes, mais aussi d'autres irrégulières, exigeant une bonne coordination des tâches. Certains CRB bénéficient de personnel dédié à 100 %, pour l'entretien, le renouvellement des élevages et l'enregistrement des données associées, c'est le cas du CRB EP-Coll, mais d'autres n'ont pas cette chance et doivent faire face à des problématiques d'organisation fortes, pour être en mesure d'assurer la grande diversité des tâches afférentes au maintien des collections vivantes. Un volant très important de l'activité concerne la gestion des données associées au matériel biologique, qui peut se faire à l'aide d'outils dédiés (SI Biolomics, Système d'Information déployé au sein de RARé dans plusieurs CRB par exemple), ou bien avec des moyens plus restreints, comme pour la collection des nématodes entomopathogènes où l'ensemble des données est actuellement stocké dans différents fichiers Excel.

De plus, depuis quelques années, la détention et l'utilisation de ressources biologiques sont soumises à des règlementations (Protocole de Nagoya, Règlementation européenne, Loi Française). D'un point de vue juridique, le gestionnaire de collections doit pouvoir renseigner les utilisateurs dans le cadre de contrats privés ou publics et transmettre, si nécessaire, les documents ad hoc selon l'origine de la ressource.

## Agréments/Confinement

Pour les trichogrammes, une distinction doit être faite selon l'origine géographique des souches. En effet, alors que la détention d'organismes issus de France Métropolitaine ne nécessite pas d'autorisation, la détention de ceux provenant d'autres aires géographiques nécessite un accord préalable, conformément à l'arrêté du 28/06/2012 portant sur les macroorganismes indigènes utilisables en lutte biologique (référence : AGRG1225395A).

Certaines des espèces de nématodes phytoparasites détenues à l'ISA sont des organismes de quarantaine (par exemple, *B. xylophilus* ou *M. chitwoodi*), qui doivent impérativement être manipulés dans des installations confinées et bénéficiant d'un agrément préfectoral au titre du règlement 2019/829/CE.
# Efforts en Recherche & Développement

## Allongement du temps intergénérationnel

L'entretien de ces collections d'organismes vivants, qui nécessitent obligatoirement au cours de leur cycle de vie un hôte vivant dont la production ou l'approvisionnement est géré par le laboratoire, est particulièrement chronophage. Du personnel dédié n'est pas toujours disponible, et des voies d'améliorations doivent être recherchées pour réduire le temps consacré au renouvellement des générations. Plussieurs pistes sont explorées, telle que la cryopréservation dans l'azote liquide pour les nématodes phytoparasites, en adaptant des protocoles déjà expérimentés sur les nématodes à galles (Carneiro et al., 2005 ; Irdani et al., 2011 ; Van der Beek et al., 1996). Les premiers résultats sont encourageants quant à la survie des individus, mais le protocole nécessite des essais complémentaires pour évaluer le pouvoir infestant des nématodes après décongélation.

Des études portant sur l'induction de périodes de quiescence ou de diapause sont également en cours sur les trichogrammes, en jouant sur des expositions à des températures et des photopériodes adaptées et appliquées à des stades précis du développement de l'embryon à l'inférieur de son hôte. Là encore, les premiers résultats sont encourageants, mais mettent en évidence des variabilités importantes entre espèces notamment, et nécessitent d'être approfondis.

La cryoconservation des NEPs a été pratiquée, mais elle n'est pas un moyen de conservation utilisé dans le laboratoire, car la méthodologie doit être adaptée à chaque espèce.

## Amélioration des outils de caractérisation moléculaire

Même si certaines méthodes d'identification moléculaire sont déjà utilisées en routine sur les trois collections, les recherches se poursuivent pour développer de nouvelles approches qui soient plus fiables et plus discriminantes. Afin de détecter plus efficacement et plus rapidement les possibles contaminations entre souches de trichogrammes, le CRB Ep-Coll, en collaboration avec des collègues du CBGP (Centre de Biologie et de Gestion des populations, Montpellier), travaille à la mise au point d'une nouvelle méthode de vérification, applicable directement sur des pools d'indi-

vidus, à l'aide des technologies NGS (séquençage nouvelle génération). En ciblant à nouveau le gène mitochondrial COI, le protocole combine deux amplifications PCR successives et un séquençage avec le système Illumina MiSeq. Pour ce qui concerne les nématodes parasites de plantes, l'objectif est d'amener le pouvoir de résolution au niveau infra spécifique, afin de différencier aisément les isolats appartenant à la même espèce. L'approche par séquençage NGS est également privilégiée.

## Amélioration du protocole d'infestation

Des pertes récurrentes de certaines espèces de nématodes entomopathogènes ont conduit à modifier des paramètres importants liés aux conditions de renouvellement des souches. En effet, des études ont montré que la durée du stockage et la température ont un effet sur le pouvoir infestant des NEPs (Molyneux, 1985 ; Stauch et al., 2000 ; Lalramliana & Yadav, 2016). Les premiers résultats d'une étude menée sur une espèce de la collection se sont avérés concluants et ont permis d'adapter la méthodologie. Dans le cadre d'une démarche d'Assurance Qualité, l'objectif est maintenant d'étendre les expérimentations à d'autres espèces, afin de déterminer les conditions optimales pour garantir une survie et une infectivité maximales de l'ensemble des souches.

## Conclusion

La gestion d'une collection n'est pas seulement et simplement limitée à l'accumulation d'échantillons inertes ou de populations d'organismes vivants, accompagnés ou non de leurs organismes hôtes associés, mais procède bien d'un processus dynamique, avec l'entrée et la sortie de souches au fil du temps. Elle s'accompagne de la manipulation d'une somme considérable de données caractérisant ces ressources. Cet ensemble représente une richesse inestimable, source de projets de recherche et réservoir de potentiel agents de lutte biologique (cas des trichogrammes et des NEPs) qui doit être pérennisée dans le temps. Pour cela, une organisation collective avec des moyens humains complémentaires, en termes de compétences scientifiques et techniques, ainsi que des moyens matériels adaptés, doit être mobilisée.
Remerciements

Ces trois collections ne pourraient pas exister sans l'investissement quotidien de nombreux collègues des unités ISA et DGIMI, que nous remercions chaleureusement. Nous adressons également nos remerciements au Département Santé des Plantes et Environnement (SPE) pour les moyens humains et matériels qui nous ont été attribués, au cours des dernières années, pour le maintien des collections. Enfin, nous remercions la CNUE, l'infrastructure RARé et le GIS IBISA pour leur soutien en moyens d'équipement et de fonctionnement.

Références

Al Khatib F., Fusu L., Cruaud A., Gibson G., Borowiec N., Rasplus J.Y., Ris N and Delvare G., 2014. An integrative approach to spe-
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from the Western Palaearctic. Systematic Entomology 39(4) : 806-862.

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Journal of Invertebrate Pathology 100(2) : 100-105.

Carneiro R.M.D.G., Martins I., Oliveira Teixera A.C. and De Castro Mota F., 2005. Freezing and storing Meloidogyne spp. in liquid nitrogen. Nematologia Brasileira 29 : 221-224.

Consoli F.L., Parra J.R.P. and R.A. Zucchi, 2010. Egg Parasitoids in Agroecosystems with Emphasis on Trichogramma Springer Netherlands.

Correa M.C.G., Palero F., Dubreuil N., Etienne L., Hulak M., Tison G., Warot S., Crochard D., Ris N. and Kreiter P., 2016. Molecu-
lar characterization of parasitoids from armored scales infesting citrus orchards in Corsica, France. BioControl, on Line first.
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Irdani T., Scotto C. and Roversi P.F., 2011. Low cryoprotectant concentrations and fast cooling for nematode cryostorage.
Cryobiology 63 : 12-16.

Lalramliana and Yadav A.K., 2016. Effects of storage temperature on survival and infectivity of three indigenous entomopa-
thogenic nematodes strains (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from Meghalaya, India. Journal of Parasitic Diseases
40 : 1150-1154.

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Molyneux A.S., 1985. Survival of infective juveniles of Heterorhabditis spp. and Steinernema spp. (Nematoda : Rhabditida) at various temperatures and their subsequent infectivity for insects. Revue de Nématologie 8 : 165-170.

Mougin C., Artige E., Marchand F., Mondy S., Ratié C., Sellier N., Castagnone-Sereno P., Coeur D'Acier A., Esmenjaud D., Faivre-Primot C., Hamelet V., Granjon L., Lange F., Pagès S., Rimet F., Ris N., and Sallé G., 2018. BRC4Env, a network of Biologi-cal Resource Centres for research in environmental and agricultural sciences. Environmental Science and Pollution Research 25 : 33849-33857.

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Van der Beek H.J.G., Veldhuis W.B.J., Zijlstra C. and Van Silfhout C.H., 1996. Preservation of Meloidogyne hapla and M. chitwoo-
di in liquid nitrogen: Differences in response between populations. Fundamental and Applied Nematology 19 : 227-234.

<figure><img src="image_82.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs,
la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Interprétation de l'âge à partir des écailles sur des espèces de salmonidés lacustres, le corégone (*Coregonus sp.*) et l'omble chevalier (*Salvelinus alpinus*)

Valérie HAMELET<fnref n="1" />
Chloé GOULON<fnref n="1" />
Frédéric MARCHAND<fnref n="2" />

## CORRESPONDANCE

valerie.hamelet@inrae.fr

## RÉSUMÉ

La connaissance de la croissance et de la structure en âge d'une population de poisson est particulièrement importante lorsque l'on s'intéresse à la dynamique des populations exploitées et à leur gestion. Le Centre de Ressources Biologiques Colisa assure cette expertise à partir de différents échantillons (écailles, otolithes, opercules ...). L'objectif de cet article est de décrire comment se fait cette interprétation de l'âge à partir des écailles sur des espèces de salmonidés lacustres, le corégone (*Coregonus sp.*) et l'omble chevalier (*Salvelinus alpinus*).

## MOTS-CLÉS

Scalimétrie, écaille, âge, croissance, omble chevalier, corégone.

<footnote n="1">1 Université Savoie Mont-Blanc, INRAE, UMR CARRTEL, 75 bis avenue de Corzent, Thonon-les-Bains Cedex, 74203, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, pôle OFB-INRAE-L'Institut Agro-UPPA pour la gestion des migrateurs amphíhalins dans leurs environnements, U3E, F-35042 Rennes, France.</footnote>
# Interpretation of age based on the scales of lacustrine Salmonidae, the common whitefish (*Coregonus sp.*) and the arctic char (*Salvelinus alpinus*)

Valérie HAMELET<fnref n="1" />
Chloé GOULON<fnref n="1" />
Frédéric MARCHAND<fnref n="2" />

## CORRESPONDENCE

valerie.hamelet@inrae.fr

## ABSTRACT

Knowledge of the growth and structure in terms of age of a fish population is very important when focusing on the dynamics of the populations exploited and their management. The Colisa Biological Resource Centre provides this expertise based on different samples (scales, otoliths, gill covers, etc.). The aim of this article is to describe this interpretation of age based on the scales of lacustrine Salmonidae species, the common whitefish (*Coregonus sp.*) and the arctic char (*Salvelinus alpinus*).

## KEYWORDS

Scale reading, scale, age, growth, arctic char, common whitefish.

<footnote n="1">1 Université Savoie Mont-Blanc, INRAE, UMR CARRTEL, 75 bis avenue de Corzent, Thonon-les-Bains Cedex, 74203, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, pôle OFB-INRAE-L'Institut Agro-UPPA pour la gestion des migrateurs amphihalins dans leurs environnements, U3E, F-35042 Rennes, France.</footnote>
## Introduction

Depuis 1985, l'INRA et aujourd'hui le CARRTEL (Centre Alpin de Recherche sur les Réseaux Trophiques et Écosystèmes Limniques, UMR INRAE/USMB) mettent en œuvre des suivis des populations de poissons dans les grands lacs périalpins (lacs de l'observatoire OLA, Rimet et al., 2020). Dans ces lacs, il existe un fort potentiel halieutique (pêche amateur et professionnelle), et où étaient présentes des populations de salmonidés : ombles chevaliers (*Salvelinus alpinus*) et corégones (*Coregonus* sp.). Dans la plupart des lacs périalpins, les populations de salmonidés ont drastiquement chuté dès les années 1980, notamment à cause de l'eutrophisation.

Le CARRTEL s'intéresse particulièrement aux salmonidés lacustres, le corégone (*Coregonus* sp.) et l'ombre chevalier, espèces emblématiques, autochtones et espèces d'intérêt pour la pêche amateur (~1 000 pêcheurs) et la pêche professionnelle (environ 150 pêcheurs). Ces espèces se situent en limite sud de leur aire naturelle de répartition et sont, en tant qu'espèce d'eau froide, vulnérables au réchauffement climatique. Pour mieux comprendre les dynamiques et gérer ces espèces durablement, la scalimétrie est un outil essentiel.

## Espèces étudiées

Le corégone est un poisson essentiellement lacustre, d'eau froide et principalement zooplanctonophage. Il peut occuper des plans d'eau variés : lacs, barrages-réservoirs, ballastières et étangs froids. En France, il est essentiellement présent dans la région Auvergne-Rhône-Alpes (dans les grands lacs subalpins: Léman, Annecy, Bourget, mais aussi dans des lacs plus petits : Aiguebelette, Nantua, Paladru, etc.) et en Franche-Comté (lacs du Jura). L'ombre chevalier est aussi un salmonidé d'eau froide. L'espèce peut se rencontrer dans des milieux très différents (lacs, rivières...) et est sédentaire dans les lacs périalpins. Son comportement alimentaire peut être très variable (planctonophage, benthophage, ichthyophage) (Keith et al., 2020).

## Principes de la Scalimétrie

La scalimétrie est une méthode permettant de déterminer l'âge et la croissance des poissons à partir de leurs écailles (Panfili et al., 2002) et plus précisément à partir des stries de croissances qu'elles affichent. Les écailles grandissent en même temps que le poisson par dépôt de couches concentriques. Cela se traduit sur la partie antérieure de

l'écaille, incluse dans le derme, par la formation de circuli. Dans les régions tempérées, les poissons présentent un rythme de croissance avec deux phases : une croissance rapide au printemps et en été, puis un ralentissement en automne, puis un arrêt en hiver. Le schéma annuel de croissance se retrouve sur l'écaille par la disposition des circuli. Une croissance rapide se traduit par une distance inter circuli espacée tandis que celle-ci se resserre lorsque la croissance des poissons se ralentit et forme un anneau plus foncé, appelé annulus. Le nombre de ces anneaux donne l'âge du poisson (Figure 1).

<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>Figure 1. Écailles de corégone et positionnement des annuli et circuli</figcaption></figure>

## Prélèvements et préparation des écailles

La lecture des écailles est la plus exploitable si le prélèvement est effectué juste avant ou pendant la phase d'arrêt de croissance. La période la plus critique est le printemps, car la date de la reprise de croissance n'est ni fixe ni simultanée pour les individus d'une même espèce.

Le choix d'une zone optimale de prélèvement est un préalable indispensable à toutes utilisations des écailles. Une zone standard de prélèvement des écailles a été définie chez le corégone et l'ombre chevalier (Gerdeaux, 1992 ; Janjua et al., 2010). Cette zone se situe au-dessus de la ligne latérale sur une droite joignant l'arrière de la nageoire dorsale et l'avant de la nageoire anal. Elle possède des écailles de forme typique, plus lisibles et faiblement régénérées (Figure 2).

Les écailles sont prélevées en nombre suffisant en raclant la peau du poisson avec un scalpel ou un couteau. Les écailles ainsi prélevées sont conservées à sec dans des sachets paiers pour une bonne conservation.

Compte tenu de la variabilité de la taille et de la morphologie des écailles au sein d'un même site de prélèvement, il est nécessaire d'observer plusieurs écailles. De même, une blessure entraînera la formation d'écailles régénérées où
les circuli se disposeront au départ en désordre avant de reprendre leur régularité concentrique. Avant toute préparation, la première étape est donc de faire une sélection des écailles sous loupe binoculaire (sélection d'écailles non générées, lisibles...).

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>Figure 2. Zone de prélèvement d'écailles chez le corégone et l'ombre chevalier</figcaption></figure>

Pour les corégones, quatre écailles (Gerdeaux, 1992) sont sélectionnées pour le nettoyage, une dizaine pour l'ombre chevalier. Parce que les écailles sont partiellement recouvertes de résidu du derme, de mucus et de pigments, il est indispensable de les nettoyer avant leur interprétation. Les écailles sont mises à tremper dans une solution de peroxyde de sodium à 5 % durant quelques minutes puis rincées dans l'eau douce. Pour les corégones, les quatre écailles sont positionnées entre deux plaques de verres pour avoir une surface de l'écaille plane et obtenir une bonne mise au point lors de la prise de photo. Les photos

des écailles sont faites à sec juste après le nettoyage. Les lectures et les mesures se font sur les écailles numérisées à l'aide du logiciel ImageJ. On réalise la même procédure pour les écailles d'ombre chevalier, la seule différence est que les écailles sont montées entre deux lames de verre.

## Sources d'erreurs

Les erreurs de détermination de l'âge proviennent d'une périodicité non annuelle de la formation des anneaux due soit à leur absence, soit à la présence de « faux anneaux ». Les marques de fraie peuvent également complètement éroder les écailles et effacer un ou plusieurs anneaux périphériques. Les erreurs ont tendance à augmenter avec l'âge du poisson. Dans les milieux où la croissance est faible, l'anneau hivernal peut ne plus se former sur les écailles des individus âgés. De même, dès l'apparition de la maturation sexuelle, la croissance se ralentit et l'écaille peut devenir difficilement interprétable. Tout choc physiologique va se marquer sur la vitesse de croissance pouvant entraîner, sur l'écaille, le resserrement de quelques circuli appelé « check » ou faux anneau. Ces chocs peuvent être dus à des stress de capture, des variations quantitatives de l'alimentation, des changements de milieux, des maladies ou des parasites. Une amélioration des déterminations d'âge est apportée par la comparaison des résultats de plusieurs lecteurs ou avec d'autres pièces osseuses, mais seule une validation directe ou indirecte (marquage, étude de la zone marginale, ...) permet d'améliorer la justesse des déterminations. Une étude détaillée et des connaissances préliminaires de la population et de son environnement permettent également une meilleure interprétation.

## Références

Gerdeaux D., 1992. Variabilité des mesures scalimétriques chez les corégones du Lac d'Annecy. In: Baglinière J.L. (ed.), Castanet J. (ed.), Conand François (ed.), Meunier F.J. (ed.) Tissus durs et âge individuel des vertébrés. Paris: ORSTOM; INRA, 211-220. (Colloques et Séminaires). Colloque National, Bondy (FRA), 1991/03/4-6. ISBN 2-7099-1071-3 (ORSTO).

Janjua M. Y., Zanella D. & Gerdeaux D., 2010. Comparative effectiveness, growth and dispersal of stocked Arctic char (Salvelinus alpinus) from different origins in Lake Annecy. Knowledge and Management of Aquatic Ecosystems, (397), 04p.

Keith P., Poulet N., Denys G., Changeux T., Feunteun É. & Persat H. (coord.), 2020. Les Poissons d'eau douce de France. Deuxième édition. Muséum national d'Histoire naturelle, Paris: Biotope, Méze, 704 p. (Inventaires & biodiversité: 18).

Panfili J., De Pontual H., Troadec H., Wright P.J., 2002. Manuel de schlérochronologie des poissons. IRD (Ed.), 467p.

Rimet F., O. Anneville D. Barbet and others., 2020. The Observatory on LAkes (OLA) database: Sixty years of environmental data accessible to the public. J Limnol. doi:10.4081/jlimnol.2020.1944.

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
David NAVARRO<fnref n="1" />,<fnref n="2" />

Victoria CHUAT<fnref n="3" />

CORRESPONDANCE

victoria.chuat@inrae.fr

Le Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM) est un Groupe-
ment d'Intérêt Scientifique (GIS), créé en 2004 par l'INRA, qui a pour vocation
la préservation, l'enrichissement et la valorisation de la diversité microbienne
présente dans ses collections. Il compte aujourd'hui plus de 22 000 souches
de champignons filamenteux, levures et bactéries.

Les collections du CIRM ont la particularité d'être spécialisées, les ressources biologiques hébergées étant liées à des thématiques précises : des Levures d'intérêt biotechnologique, des Bactéries d'intérêt alimentaire, pathogènes des animaux et de l'Homme, associées aux Plantes, et des Champignons Filamenteux d'intérêt agro-industriel. Ces collections sont capables d'offrir plus d'une centaine de souches d'une seule et même espèce. Elles représentent ainsi un vivier très intéressant pour la recherche de fonctionnalités d'intérêts dans les domaines de l'agroalimentaire, de la santé et des biotechnologies.

Pour investiguer les capacités de ses ressources microbiennes, le GIS CIRM s'est doté de deux outils de criblage, l'un au CIRM dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaire (CIRM-BIA) de Rennes, et l'autre au CIRM dédié aux Champignons Filamenteux (CIRM-CF) à Marseille, chaque plateforme étant optimisée pour la manipulation des ressources biologiques lui étant propres.

<footnote n="1">1 Biodiversité et Biotechnologie Fongiques, Aix-Marseille Université, INRAE, UMR1163, 13288 Marseille, France.</footnote>

<footnote n="2">2 INRAE, Aix-Marseille Université, UMR1163, CIRM-CF, 13288 Marseille, France.</footnote>

<footnote n="3">3 STLO, INRAE, Agrocampus Ouest, 35000 Rennes, France.</footnote>
Une plateforme de criblage à haut débit pour
la caractérisation phénotypique des souches
bactériennes d'intérêt alimentaire au CIRM-
BIA de Rennes

Contexte

Le Centre International de Ressources Microbiennes dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaire (CIRM-BIA), situé à Rennes, possède une collection de plus de 4 000 souches bactériennes issues de collections rapatriées, de dépôts et de collectes ciblées. Si dans les premières années d'activité du CIRM-BIA, les souches de la collection provenaient principalement d'aliments fermentés laitiers, comme le yaourt et les fromages, la collection s'est fortement enrichie ces dernières années avec des souches provenant de matrice d'origine végétale, comme le moût de raisin, le levain de boulangerie ou encore les légumes fermentés.

Les micro-organismes jouent un rôle crucial dans la fermen-
tation des aliments. En fermentant les sucres naturellement
présents dans la matrice, différents composés aromatiques
sont produits, impactant le goût final de l'aliment. La texture
finale de l'aliment peut également être impactée par la pro-
duction d'exopolysaccharides, par exemple. Enfin, la diminu-
tion de pH ayant lieu pendant la fermentation d'une matrice
peut empêcher le développement de micro-organismes in-
désirables tout comme la production de bactériocines.

Ces fonctionnalités très recherchées sont cependant
souche-dépendantes et dépendent pour beaucoup de la
matrice à fermenter. En effet, une souche produisant des
arômes et une texture intéressante sur une matrice laitière
n'aura pas forcément les mêmes caractéristiques sur une
matrice végétale. À partir de notre expérience, nous avions
réalisé que seulement 10 % des souches criblées pouvaient
potentiellement montrer un intérêt dans la recherche d'une
fonctionnalité ciblée ; cela soulignait l'immense avantage à
mettre en place un outil permettant le criblage d'un grand
nombre de souches, pour sélectionner rapidement des
souches d'intérêt à étudier plus en détails.

Dans ce but, le CIRM-BIA s'est doté, en 2009, d'un automate
de criblage à haut débit HAMILTON. Les projets étant très
variables, nous avons souhaité une plateforme modulable
pour répondre aux questions de recherche très diverses.

Description de la plateforme

Cette plateforme est dotée de 8 canaux (1) et travaille en
plaques 96 puits. Un spectrophotomètre est relié au robot

permettant des suivis de croissance par mesure d'absor-
bance (2). La plateforme est dotée d'une pompe à vide (3)
permettant les extractions d'ADNs en haut débit. Elle pos-
sède également des blocs chauffants et agitants permettant
l'incubation de cultures bactériennes liquides en aérobiose
sur la plateforme (4, 4'). Différents supports sont présents
pour s'adapter aussi bien aux plaques (5), microplaques
PCR (6), tubes hémolyse (7), cryotubes (8), eppendorfs
(9) ou encore vials CPG (10). Tous les racks sont mobiles
et peuvent être déplacés, enlevés ou ajoutés selon le pro-
gramme. Cette plateforme ainsi équipée est située dans
une enceinte stérile.

<figure><img src="image_86.png" /><figcaption>Figure 1. Plateforme de criblage du Centre International de Res-
sources Microbiennes dédié aux Bactéries d'Intérêt Alimentaires
(CIRM-BIA).</figcaption></figure>

Méthodes développées

Si l'outil permet en routine des expérimentations classiques
de repiquages de souches, d'extractions d'ADN en plaques
96 puits ou encore de congélation de souches, il est aussi
modulable pour permettre le criblage de fonctionnalités
recherchées.

Ainsi, de nombreux suivis de croissance ont pu être réalisés, en conditions de cultures optimales ou au contraire en conditions fixées, bas pH, présence de sels, permettant ainsi de cribler les souches sur des critères bien définis.

Ces dernières années, l'outil est très utilisé pour cribler les
souches de la collection sur leur capacité à dégrader des
sucres d'intérêt dans des milieux synthétiques, des matrices
laitières ou encore des matrices végétales. Aujourd'hui ce
sont environ 1 000 souches de la collection du CIRM-BIA
qui ont déjà pu être testées.
# Une plateforme de phénotypage à haut-débit, dédiée à l'exploration fonctionnelle de la biodiversité fongique, au CIRM-CF de Marseille

## Contexte

Les champignons filamenteux, principaux micro-organismes impliqués dans la dégradation de la matière organique végétale, sont une source majeure d'enzymes et de molécules d'intérêt biologique dans les domaines de l'agro-alimentaire (arômes, antioxydants, agent de fерментation), de la santé (antiviraux, antimicrobiens, anti-inflam-matoires) ou encore des biotechnologies blanches (biore-médiation, biocarburant...). Malgré ce fort potentiel de valorisation, peu d'outils permettent d'explorer la diversité enzymatique et métabolique offerte par les champignons filamenteux, dont la biodiversité est estimée, aujourd'hui, à plus de 5 millions d'espèces. En effet, contrairement à d'autres micro-organismes (bactéries, levures), le développement de méthodes automatisées, adaptées aux champignons filamenteux, et notamment des basidiomy-cètes, est rendu difficile par des contraintes spécifiques

(cultures hétérogènes, sporulation, pigmentation et viscosité des sécrétomes). C'est dans ce contexte que le CIRM-CF et l'UMR 1163 BBF ont développé, depuis plus de 15 ans, une plateforme de phénotypage à haut-débit, dédiée à l'exploration fonctionnelle de la biodiversité fongique.

## Équipements mis en place

Pour répondre aux défis posés par la miniaturisation de culture de champignons filamenteux et par la grande diversité des différents types de champignons filamenteux, nous avons fait le choix d'une plateforme robotisée évolutive, permettant de s'adapter à chaque problématique rencontrée. Aujourd'hui, la plateforme réunit plusieurs équipes autour d'un automate de pipetage TECAN Freedom Evo 200 (Figure 2).

Selon les applications, la plateforme peut utiliser des cônes stériles ou des aiguilles téflonisées pour les pipetages (Figure 2, n°3). Deux manipulateurs de microplaques permettent de déplacer les microplaques aux emplacements requis. Enfin, un ordinateur contrôle l'ensemble de ces équipements.

<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>Figure 2. Plateforme de crïblage du Centre International de Ressources Microbiennes dédié aux Champignons Filamenteux (CIRM-CF).</figcaption></figure>

1) Automate de pipetage TECAN Freedom Evo 200 :

2) Manipulateurs de microplaques :

3) Cônes stériles ou aiguilles téflonisées pour pipetage :

4) Scelleuse de microplaque (VELOCITY11) :

5) Incubateur avec agitation pour microplaque (de 25 à 55 °C) :

6) Unité de filtration de microplaque (TECAN T-Vacs) :

7) Bloc chauffant statique pour microplaque (jusqu'à 100 °C) (EPPENDORF, Thermomixer) :

8) Spectrofluorimètre, avec agitation et incubation (TECAN Infinite 200).
Autour de la plateforme robotisée, d'autres équipements viennent compléter les possibilités :

→ Des incubateurs Minitron et Microtron (INFORS) destinés aux cultures moyen-débit (plaques 16 puits) et haut-débit (plaques 24 et 96 puits).

→ Une chaine de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) couplée à un spectromètre de masse (quadrupole simple).

<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>Figure 3. Photos des incubateurs Minitron et Microtron ainsi que de la chaine de chromatographie liquide ultra-haute performance (UHPLC) couplée à un spectromètre de masse.</figcaption></figure>

## Méthodes développées

La plateforme est ouverte à nos partenaires académiques et industriels, ainsi qu'à l'enseignement. Elle a permis le développement de méthodes variées :

→ Isolement de lignées monocaryotiques à partir de souches basidiomycètes.

→ Criblage et sélection de clones recombinants pour la production d'enzymes en système hétérologue.

→ Criblage et sélection de souches pour la production de métabolites ou d'enzymes d'intérêt.

→ Phénotypage haut-débit de sécrétomes fongiques pour la saccharification de biomasses lignocellulosiques.

→ Sélection de souches performantes pour la fermentation en milieu solide.

→ Purification haut-débit de protéines recombinantes (His-tag).

<figure><img src="image_89.png" /><figcaption>Figure 4. Chronologie des méthodes de cribages développées et des partenariats associés.</figcaption></figure>
Références

Couturier M., Navarro D., Favel A., Haon M., Lechat C., Lesage-Meessen L., Chevret D., Lombard V., Henrissat B. and Berrin JG. 2016. *Fungal secretomics of ascomycete fungi for biotechnological applications*. Mycosphere. Doi 10.5943/mycosphere/ si/3b/6.

Haon M., Grisel S., Navarro D., Gruet A., Berrin JG. and Bignon C. 2015. *Recombinant protein production facility for fungal bio- mass-degrading enzymes using the yeast Pichia pastoris*. Frontiers in Microbiology, 23: 6:1002.

Zhou S., Raouche S., Grisel S., Navarro D., Sigoillot JC. and Herpoël-Gimbert I. 2015. *Solid-state fermentation in multi-well plates to assess pretreatment efficiency of rot fungi on lignocellulose biomass*. Microbial Biotechnology, 8(6):940-9.

Liaud N., Giniés C., Navarro D., Fabre N., Crapart S., Gimbert I., Levasseur A., Raouche S. and Sigoillot JC. 2014. *Exploring fungal biodiversity: organic acid production by 66 strains of filamentous fungi*. Fungal Biology and Biotechnology, 1:1.

Liaud N., Navarro D., Vidal N., Sigoillot JC and Raouche S. 2014. *High throughput automated colorimetric method for the screening of lactic acid producing microorganisms*. MethodsX, 1:e254-e257.

Berrin JG, Navarro D., Couturier M., Olivé C., Grisel S., Haon M., Taussac S., Lechat C., Courtecuisse R., Favel A., Coutinho P-M. and Lesage-Meessen L. 2012. *Exploring the Natural Fungal Biodiversity of Tropical and Temperate Forests toward Improvement of Biomass Conversion*. Applied and Environmental Microbiology Aug 2012, 78 (18) 6483-6490; DOI: 10.1128/AEM.01651-12.

Couturier M., Navarro D., Olive C., Chevret D., Haon M., Favel A., Lesage Meessen L., Henrissat B., Coutinho P. M. and Berrin J-G. 2011. *Post-genomic analyses of fungal lignocellulosic biomass degradation reveal the unexpected potential of the plant pa- thogen Ustilago maydis*. BMC Genomics 2011, 13:57/1471-2164.

Uzarraga R., Auria R., Davidson S., Navarro D., and Combet-Blanc Y. 2010. *New Cultural Approaches for Microaerophilic Hyper- thermophiles*. Current Microbiology, Volume 62, Number 2, 346-350.

Navarro D, Couturier M, da Silva GG, Berrin JG, Rouau X, Asther M, Bignon C. 2010. *Automated assay for screening the enzymatic release of reducing sugars from micronized biomass*. Microbial Cell Factories. 2010 Jul 16:9-58.

Alberto F., Navarro D., De Vries RP., Asther M. and Record E. 2009. *Technical advance in fungal biotechnology: development of miniaturized culture method and an automated high-throughput screening*. Letters in Applied Microbiology, 49, no2, pp. 278-282.

<figure><img src="image_90.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
FOCUS

Le Centre ARCAD à Montpellier :
conserver l'agrobiodiversité pour
adapter les cultures aux changements
climatiques et aux nouvelles
pratiques agricoles

Jean-Marie PROSPERI<fnref n="1" />

CORRESPONDANCE

jean-marie.prosperi@inrae.fr

Le 6 octobre 2021, l'INRAE, le CIRAD, l'IRD et l'institut Agro ont inauguré un centre de niveau mondial dédié à la conservation et à l'étude des ressources génétiques des plantes cultivées méditerranéennes et tropicales : ARCAD (Agropolis Resource Centre for Crop Conservation, Adaptation and Diversity).

Hébergé par l'INRAE, le Centre ARCAD rassemble les principales collections de ressources génétiques végétales du Cirad, de l'IRD et d'Inrae sur Montpellier. Cinquante mille échantillons (Maïs, Medicago, Sorgho, Blé dur, Riz, Mil, Coton, Fonio, Arachide, mais aussi Vigne, Cacao, Café, Arbres forrestiers...) y sont conservés sous forme de graines, de plantes in vitro ou au sein de Centres de ressources génétiques partenaires. Focus sur la Première « banque » française de conservation de plantes cultivées.

<figure><img src="image_91.png" /></figure>

<footnote n="1">1 UMR AGAP. Équipe Ge2Pop. INRAE.</footnote>
## L'infrastructure ARCAD

Le bâtiment ARCAD est construit en forme de H avec, en son cœur, un robot transstockeur unique en Europe. Autour du plateau de conservation des graines (CRB Gamet), se déploient trois autres plateaux techniques : Génotypage et Séquençage, Phénotypage des semences et Cryoconservation.

<figure><img src="image_92.png" /><figcaption>Figure 1. Transstockeur</figcaption></figure>

* **Le Centre de Ressources biologiques (CRB) Gamet** est issu de la fusion du CRB Tropicales du Cirad et des CRB Maïs et Medicago d'Inrae. Installé au sein du bâtiment ARCAD, le CRB Gamet assure la caractérisation initiale permettant de valider l'état et le statut des accessions reçues, ainsi que leur conservation et diffusion. Les accessions sont conservées à +4 °C et 25 % d'hygrométrie dans une chambre froide robotisée de 600 m³ ; des lots de sauvegarde sont placés en congélateurs à -18 °C ou cryo-conservés. Des tests de germination sont réalisés régulièrement et les conditions de conservation sont contrôlées afin de s'assurer de leur stabilité. Pour renouveler les lots, dont la faculté de germination est basse ou dont la quantité en stock est inférieure à un seuil prédéterminé, des campagnes de multiplication sont organisées en serres ou aux champs, en Métropole ou en Guadeloupe. Labellisé IBiSA (Infrastructures en Biologie, Santé et Agronomie), en mars 2009, sous la dénomination Centre de ressources biologiques tropicales de Montpellier (CRB-T), le CRB Gamet est certifié NFS 96-900 « Qualité des centres de ressources biologiques » depuis septembre 2011.

* **Le plateau de génotypage et de séquençage** est spécialisé dans la mise en œuvre de la biologie moléculaire à haut débit au service de l'analyse génétique de la bio-

diversité végétale et en soutien à l'exploitation des ressources génétiques dans les programmes d'amélioration des plantes. Localisé sur deux sites distants de moins de 800 mètres, le plateau offre plus de 600 m² de laboratoires équipés des dernières technologies : 2 séquenceurs capillaires, 2 séquenceurs NGS de paillasse, 2 séquenceurs sur gel, 3 Machines de PCR quantitative, des thermocycleurs 96 et 384 puits, des robots variés dédiés aux extractions d'acides nucléiques, à la préparation de PCR et à la création de ressources génomiques. Inséré au sein du réseau Montpellier Génomix, le plateau a accès à de nombreux outils et équipements à très haut débit : séquençage NGS, transcriptomique, bio-informatique, bio-statistiques.

* **Le plateau de phénotypage des semences** regroupe, aux côtés d'équipements éprouvés (compteurs de grains, loupes binoculaires, balances, tamis ...), des équipements novateurs et des prototypes développés spécifiquement pour ce plateau. Ces matériels permettent de mesurer et de caractériser les graines sèches (morphométrie), leur qualité biochimique (composition chimique, structure physique) et leur faculté germinative. L'idée qui prévalait autour de la mise en place de ce plateau était d'utiliser des techniques nouvelles, comme la robotisation, l'analyse automatique d'images et la spectrométrie proche infra-rouge. Ces technologies, déjà largement éprouvées dans d'autres secteurs, permettent des gains importants de productivité, de fiabilité et de qualité des données obtenues. Sont notamment présents sur ce plateau : un banc automatique de suivi et de caractérisation de la dynamique de la germination des semences par analyse d'images ; trois appareils de mesure des semences par analyse d'images permettant d'accéder à la valeur moyenne des lots, mais aussi à leur variance ; deux trieurs expérimentaux de laboratoire, l'un sur la base de la forme et de la couleur des graines, le

<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>Figure 2. Automate de germination</figcaption></figure>
second sur leur spectre d'absorbance. Spécialement axé
sur les besoins des Centres de Ressources Biologiques, ce
plateau couvre une très large gamme d'espèces agricoles
ou apparentées ; il est aussi à la disposition des équipes
de recherche partenaires.

* La cryoconservation (conservation dans l'azote liquide à -196 °C) est la seule technique qui permet d'assurer une conservation à très long terme, sûre et pour un coût réduit de toutes les ressources biologiques. Elle permet notamment de conserver les plantes multipliées végétativement (vigne, arbres fruitiers, plantes à tubercules), les plantes qui ne produisent pas de graines (comme les bananiers ou les ananas cultivés) ou les plantes qui produisent des graines sensibles à la déshydratation, dites semences non-orthodoxes (caféiers, agrumes, palmiers, cacaoyers ou hévéa). La cryoconservation peut aussi être employée pour la conservation à long terme des graines orthodoxes conservées conventionnellement en chambre froide, notamment pour les espèces oléaginèuses dont la longévité reste faible à +4 °C. Le plateau de cryoconservation, localisé sur deux sites (IRD et Inrae), offre à la fois des équipements spécifiques (congélateurs programmables, enceintes thermostatées, cryotanks) et des moyens de culture in vitro performants. Il permet de développer et de valider des protocoles spécifiques de cryoconservation, mais assure aussi la conservation long terme des doubles de sécurité de collections importantes, comme la vigne, le café ou la banane.

Par-delà les murs du bâtiment, ARCAD est aussi **un centre de convergence et d'échanges de recherches, d'exper-tises et d'expériences** qui cherchent à comprendre com-ment les contraintes physiques, l'environnement biolo-gique et les sociétés humaines façonnent la diversité des plantes cultivées. Ces connaissances et données viennent irriguer la gestion et la mobilisation de la diversité des plantes cultivées afin de répondre aux enjeux des grandes transitions en cours et à venir : transitions agro-écologique, climatique et sociétale. Les recherches menées au sein d'AR-CAD portent notamment sur la domestication et l'histoire évolutive des plantes, l'adaptation au changement clima-tique et la gestion, par les agriculteurs, de la diversité des espèces et des variétés cultivées. Ces recherches mobilisent des disciplines variées : génomique, bio-informatique, génétique des populations, botanique, mais aussi anthro-pologie et sciences politiques. Les connaissances et les méthodologies développées sur ces thèmes sont valorisées grâce à une offre de formation déclinée sous forme d'ate-liers pédagogiques, de modules de formation et d'écoles thématiques internationales. ■

Lien : https://www.inrae.fr/actualites/conserver-lagrobiodi-versite-adapter-cultures-aux-changements-climatiques-inau-guration-deux-infrastructures-majeures-montpellier

<figure><img src="image_94.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# La spectrométrie de masse MALDI-TOF : un outil de diagnostic pour l'identification et le typage des bactéries pathogènes des poissons

Eric DUCHAUD<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

eric.duchaud@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Les méthodes d'identification des bactéries responsables d'épisodes infectieux chez les poissons reposent encore essentiellement sur des techniques traditionnelles, pas toujours discriminantes, comme l'histologie, la cytologie, la recherche de caractères phénotypiques et le sérotypage. Des méthodes moléculaires modernes (e.g., MLST, WGS) tendent à se substituer à ces approches classiques, mais restent le plus souvent, de par leur coût, leur débit et le temps requis, utilisées pour des études rétrospectives dans le cadre de travaux académiques. Pour adapter les traitements et prendre les mesures visant à contrôler un épisode infectieux, les aquaculteurs et les différentes parties prenantes (e.g., vétérinaires, Groupements de Défense Sanitaire Aquacole) ont besoin d'un diagnostic précis, rapide et, idéalement, peu onéreux de l'agent causal. La spectrométrie de masse à temps de vol par désorption laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) est une technique d'identification bactérienne largement répandue dans les laboratoires d'analyses de microbiologie médicale, qui tend à s'étendre aux laboratoires de diagnostic vétérinaire. Basée sur l'analyse directe de cultures bactériennes, la technique MALDI-TOF MS génère un spectre protéique qui est ensuite comparé à un ensemble de spectres de référence stockés dans une base de données. C'est une technique rapide, bon marché et qui se prête bien aux analyses à haut-débit. Cependant, les bases de données commerciales MALDI-TOF MS ne contiennent que peu d'espèces de bactéries pathogènes des poissons. D'autre part, l'identification est insuffisante pour répondre à des questions relevant de l'épidémiologie, dont la base est la caractérisation fine (typage) des isolats bactériens. Nous avons développé un schéma MALDI-TOF MS d'identification pour les espèces du genre *Tenacibaculum* et amélioré ses performances pour son utilisation comme outil épidémiologique de première ligne pour l'espèce *T. maritimum*, un redoutable agent pathogène des poissons marins. Cet article intègre des conseils issus de cette expérience et de recherches bibliographiques, afin de guider le lecteur pour le développement d'une telle approche.

## MOTS-CLÉS

Diagnostic, bactéries pathogènes des poissons, identification, typage, MALDI-TOF MS.

<footnote n="1">¹ Unité Virologie et Immunologie Moléculaires, INRAE, Université Paris-Saclay, 78350 Jouy-en-Josas, France.</footnote>
# MALDI-TOF mass spectrometry: a diagnostic tool for identifying and typing fish pathogenic bacteria

Eric DUCHAUD<fnref n="1" />

## CORRESPONDENCE

eric.duchaud@inrae.fr

## ABSTRACT

Methods used to identify the bacteria responsible for outbreaks of infectious diseases in fish farms still essentially rely on traditional and usually non-discriminatory techniques, such as histology, cytology, phenotypic characteristics and serotyping. Modern molecular methods (e.g., MLST, WGS) tend to replace these classical approaches but are usually employed for retrospective studies within the framework of academic research due to their cost, throughput and the time required. To adapt treatments and take control measures, fish farmers and stakeholders (e.g., aquaculture veterinarians) need an accurate, rapid and, ideally, inexpensive diagnosis of the causative agent. Matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is a bacterial identification technique widely used in medical microbiology laboratories that is progressively spreading to veterinary diagnostic laboratories. Based on the direct analysis of bacterial cultures, MALDI-TOF MS generates a protein spectrum which is then compared to a set of reference spectra stored in a database. It is a fast, inexpensive technique well-adapted to high-throughput analyses. However, commercial MALDI-TOF MS databases contain only a limited number of bacterial fish pathogens. On the other hand, identification is insufficient to answer questions related to epidemiology, the basis of which is the fine characterization (typing) of bacterial isolates. We have developed a MALDI-TOF MS identification method for species of the genus *Tenacibaculum* and improved its performance for use as a first-line epidemiological tool for the species *T. maritimum*, a devastating pathogen of marine fish. This technical notebook includes advice resulting from this experiment and bibliographic research to guide the reader in developing such an approach.

## KEYWORDS

Diagnostics, fish bacterial pathogens, identification, typing, MALDI-TOF MS.

<footnote n="1">¹ Unité Virologie et Immunologie Moléculaires, INRAE, Université Paris-Saclay, 78350 Jouy-en-Josas, France.</footnote>
## Introduction

L'aquaculture est le secteur de production alimentaire qui connaît la croissance la plus rapide (d'environ 8 % par an depuis plusieurs décennies) et joue un rôle de plus en plus critique dans la sécurité alimentaire mondiale (FAO, 2020). La consommation de poissons d'élevage dépasse désormais celle de poissons issus de capture. L'aquaculture moderne implique donc des techniques de production massive, à l'image des élevages d'animaux terrestres. Ceci n'est pas sans conséquences, notamment en termes de développement de maladies. Les niveaux actuels de survie des poissons d'élevage, de l'éclosion jusqu'à la taille commerciale, sont de seulement 20 % en moyenne, et les experts estiment que les pertes mondiales de production dues aux maladies excèdent couramment 10 % (soit 6 milliards de dollars de pertes en 2014), ce qui en fait le défi majeur au développement de l'aquaculture (World Bank, 2014).

Le genre *Tenacibaculum* (famille des *Flavobacteriae*, phylum *Bacteroidetes*) comprend 32 espèces dont les noms ont été officiellement publiés (LPSN<fnref n="2" />), et dont au moins huit (*T. maritimum*, *T. discolor*, *T. soleae*, *T. dicentrarchi*, *T. gallaicum*, *T. finnmarkense*, *T. ovolyticum* et *T. piscium*) ont été signalées comme pathogènes des poissons marins, affectant une large gamme de poissons d'élevage à grande valeur ajoutée (e.g., saumon, bar, turbot, sole) avec une très large répartition géographique. Ces espèces sont responsables d'une maladie ulcéreuse (Figure 1) dénommée ténacibaculose (également connue sous le nom de flexibactériose) et associée à de graves épisodes infectieux conduisant à des pertes économiques importantes (Nowlan JP et al., 2020). La plupart, sinon la totalité, des pays impliqués dans la production de poissons marins ont connu de graves flambées de ténacibaculose, récemment identifiée dans le projet MedAID H2020 comme la deuxième maladie la plus importante du bar dans les fermes piscicoles méditerranéennes (Muniesa et al, 2020). À ce jour il n'existe pas de vaccins commerciaux, et les traitements reposent exclusivement sur des traitements antibiotiques ou l'utilisation de désinfectants chimiques.

<figure><img src="image_95.png" /><figcaption>Figure 1. Jeune bar (*Dicentrarchus labrax*) atteint de ténacibaculose et présentant une atteinte sur le flanc.</figcaption></figure>

Dans la plupart des cas (y compris ceux de la littérature scientifique), l'isolement et l'identification bactérienne ne sont pas effectués et le diagnostic de ténacibaculose est uniquement basé sur les symptômes cliniques et des observations microscopiques des lésions. En effet, l'identification correcte des espèces impliquées dans la ténacibaculose est entraînée par une combinaison de facteurs, en particulier la découverte récente d'une diversité insoupçonnée d'espèces pathogènes du genre *Tenacibaculum* qui n'a pas été suivie du développement des outils de diagnostic correspondants (Nowlan et al, 2020).

Les méthodes modernes de typage bactérien reposent essentiellement sur des techniques moléculaires [e.g., séquençage de gènes multiples (MLST) ou du génome complet (WGS)] qui nécessitent du temps, une certaine technicité, ont un coût élevé, ne sont pas facilement automatisables et sont donc rarement applicables à du typage bactérien de routine. Le MALDI-TOF MS présentant bon nombre de ces qualités, il a donc été testé pour typer quelques bactéries, essentiellement pathogènes pour l'homme, comme *Klebsiella pneumoniae*, *Staphylococcus aureus*, *Pseudomonas aeruginosa* ou encore *Listeria monocytogenes*.

Outil innovant facile à utiliser, rapide, précis, bon marché et qui se prête bien à l'analyse à haut-débit, la spectrométrie de masse MALDI-TOF a ainsi révolutionné l'identification bactérienne dans les laboratoires de microbiologie médicale (Carbonnelle & Nassif, 2011). Permettant d'identifier les micro-organismes au niveau de l'espèce par l'analyse des protéines totales (Croxatto et al., 2012), cette technique

<footnote n="2">2 LPSN - https://lpsn.dsmz.de/search?word=tenacibaculum. consulté le 20-01-2021.</footnote>
est basée sur la génération de spectres de masse à partir de cellules entières (ou après extraction des protéines totales) et de leur comparaison à des listes de spectres de référence. Une fois les échantillons prêts, l'identification des espèces prend seulement quelques minutes. C'est ainsi que le MALDI-TOF MS a été intégré, au cours de la dernière décennie, dans les pipelines d'analyse de routine des laboratoires de microbiologie médicale pour l'identification microbienne, remplaçant les techniques biochimiques ou moléculaires traditionnelles. Cette technique trouve aussi de plus en plus sa place dans les laboratoires d'analyses vétérinaires.

Actuellement, le MALDI-TOF MS et les bases de données commerciales sont essentiellement focalisés sur l'identification taxonomique au niveau de l'espèce. Toutefois, la population d'individus constituant une espèce bactérienne est loin d'être homogène. Par conséquent, les espèces d'importance clinique sont subdivisées en groupes différant, par exemple, par leur degré de virulence, leur spectre d'hôte ou leur capacité de dissémination. Le but du typage bactérien est donc de discriminer des groupes de souches parmi d'autres et de comparer les isolats pour suivre la propagation de groupes spécifiques (e.g., clones épidémiques hautement virulents, cas sporadiques de moindre virulence) (Riley & Blanton, 2018). Le typage bactérien peut être utilisé pour réaliser des études épidémiologiques rétrospectives dans des laboratoires de recherche académique ou en routine dans des laboratoires d'analyses médicales, telle l'identification de clones épidémiques nécessitant la mise en œuvre rapide de mesures de contrôle. Par ailleurs, un des attraits du MALDI-TOF MS est que les spectres générés peuvent contenir beaucoup plus d'informations qu'il n'en faut pour l'identification des espèces bactériennes et qu'ils peuvent donc être utilisés à des fins de typage. Malheureusement, il ne semble pas possible d'établir un schéma universel de typage pour l'ensemble des espèces bactériennes, mais seulement des règles générales sur la manière d'établir et de valider un schéma (Spinali et al, 2015). Il faut également souligner que la résolution du MALDI-TOF MS a certainement des limites et qu'il n'y a aucune garantie que les objectifs soient atteints (Kang et al, 2017). Enfin, ceux qui cherchent à utiliser le MALDI-TOF MS pour effectuer du typage en routine ne peuvent probablement pas éviter d'analyser un grand

nombre de souches bien caractérisées et d'évaluer avec précision la valeur prédictive de leur schéma.

Bien que présentant de nombreux avantages, cette méthode nécessite des développements en vue d'une application en aquaculture. En effet, elle ne peut qu'identifier les espèces bactériennes pour lesquelles des spectres de référence préétablis sont présents dans les bases de données. Cette limite s'impose pour les nombreuses espèces pathogènes des poissons, pour la plupart absentes des collections de spectres fournis par les fabricants de spectromètres MALDI-TOF.

Cet article présente la stratégie mise en place pour identifier, par MALDI-TOF MS, les bactéries du genre *Tenacibaculum* et évaluer son potentiel pour le typage d'isolats appartenant à l'espèce *T. maritimum*. Ce retour d'expérience devrait permettre de guider le lecteur pour le développement d'une démarche similaire pour des espèces bactériennes intéressant son domaine de recherche.

## MALDI-TOF MS : principe de fonctionnement

Il existe une très riche bibliographie sur le principe de fonctionnement du MALDI TOF-MS et cet article n'a pas vocation à le détailler (pour des revues, voir Singhal et al., 2015 et Wieser et al., 2012). Brièvement, un spectromètre MALDI TOF est composé de trois unités : (1) une source d'ions (MALDI), (2) un dispositif permettant de séparer les ions selon leur rapport masse / charge (m/z) (TOF) et (3) un système de détection des ions. Dans le cas qui nous intéresse, l'échantillon analysé, ou analyte, se compose généralement de bactéries entières (d'extraits protéiques totaux) mélangées à une matrice favorisant l'ionisation, et les ions générés correspondent aux protéines bactériennes intactes ionisées. Les ions formés et détectés sont ceux chargés positivement (majoritairement de charge +1, c'est-à-dire ayant capté un proton). Ils sont accélérés sous l'action d'un champ électrique, puis passent dans un tube de vol. Dans ce tube, à charge égale (e.g., z = +1), ceux de petite masse sont les plus rapides, ceux de grosse masse sont les plus lents. Il existe une relation de proportionnalité entre la masse d'une protéine et son temps de vol (le TOF pour « time of flight »). C'est donc du temps de vol qu'est déduite la masse de chaque particule atteignant le détecteur. L'ensemble des ions détectés
va former un spectre caractéristique de l'échantillon
analysé. Les appareils MALDI TOF-MS commerciaux
dédiés à l'identification bactérienne sont capables
de détecter des molécules de 20 à 20 000 m/z (ou
Da pour tous ceux, majoritaires, de charge +1). Envi-
ron 50 % des protéines identifiées dans ces spectres
MALDI-TOF sont des protéines ribosomiques, car elles
sont majoritaires dans les cellules en croissance. La
plupart d'entre elles ont un faible poids moléculaire,
compatible avec la gamme de masse observable en
MALDI-TOF, et elles possèdent également un pKi
elevé, supérieur à 8, les rendant plus sensibles à
l'ionisation (Ryzhov & Fenselau, 2001). Nous revien-
drons ultérieurement sur ce point.

On représente classiquement le spectre d'un
échantillon par un graphique avec, sur l'axe des
abscisses, le rapport m/z et, sur l'axe des ordonnées,
l'intensité du signal, c'est-à-dire le nombre total de
chaque ion particulier détecté (Figure 2). Une fois
le spectre d'un échantillon acquis, des logiciels per-
mettent de comparer l'empreinte spectrale obtenue
à toutes celles contenues dans une base de données.

La fiabilité et la précision du MALDI-TOF MS ont été
vérifiées dans un certain nombre d'études ; les ré-
sultats d'identification obtenus reposent, pour une
bonne partie, sur le nombre d'entrées de la banque
de données utilisée (Singhal et al., 2015 ; Hou et al.,
2019). À ce stade, les banques de données commer-
ciales (ou bibliothèques de référence) contiennent
essentiellement des spectres issus de micro-orga-
nismes d'intérêt clinique et peu de bactéries « exo-
tiques », ce qui est le cas pour bon nombre d'espèces
pathogènes des poissons.

<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>Figure 2. Exemple de spectre MALDI-TOF MS obtenu à partir de colonies entières de *Tenacibaculum maritimum*, suivi d'une étape d'extraction protéique par éthanol/acide formique. La matrice utilisée est l'acide -cyano-4-hydroxycinnamique.</figcaption></figure>

Création d'une bibliothèque de spectres de référence à façon

Il est heureusement possible de créer sa propre librairie de spectres de référence et de l'intégrer à une base de données commerciale (e.g., Bruker's MALDI Biotyper) ou à sa propre base de données. Comme il existe nombre de logiciels libres permettant de s'affranchir des outils commerciaux, nous avons choisi d'utiliser les outils MALDIquant, MALDIquant Foreign, et MALDIrppa (Gibb & Strimmer, 2012 ; Palarea-Albaladejo et al., 2018) utilisant des scripts R. Comme évoqué précédemment, les résultats d'analyse MALDI-TOF MS d'un échantillon étant tributaires de la qualité de la banque de données (et dans une certaine mesure des logiciels d'analyse utilisés), la réalisation de cette (ou de ces) banque(s) est un prérequis nécessitant une attention particulière. Les souches types (celles à l'origine de la description de l'espèce) étant d'une importance fondamentale en systématique bactérienne, il nous est apparu indispensable d'intégrer celles de toutes les espèces du genre *Tenacibaculum* (LPSN). De plus, pour avoir une meilleure estimation de la variabilité des spectres obtenus, il nous semblait pertinent de générer plusieurs spectres de référence pour chaque espèce bactérienne particulièrement ciblée. Pour ce faire, il est nécessaire de sélectionner quelques souches représentatives de l'espèce bien caractérisées et de générer leurs spectres dans les mêmes conditions que celles utilisées pour les souches types. Pour réaliser ces spectres de référence, chaque souche type et chaque souche de référence est cultivée en triplicatas (trois réplicas biologiques). Pour chaque réplica, 12 spectres sont enregistrés (4 dépôts indépendants sur la cible MALDI (réplicas techniques) et 3 spectres acquis par dépôt). Il y a donc, en tout, 36 spectres pour chacune de ces souches. Après les contrôles qualité classiques, les spectres de bonne qualité retenus (24 spectres minimum) sont agrégés pour construire un spectre de référence moyen pour chaque souche.

De l'intérêt de la génomique

Si l'utilisation du séquençage complet du génome (WGS) est encore difficilement envisageable pour effectuer du diagnostic de routine, en particulier sur un très grand nombre d'échantillons, il trouve, en
revanche, toute sa place pour caractériser finement les souches de référence. Cette stratégie permet de confirmer l'appartenance d'une souche à une espèce bactérienne (en utilisant par exemple des métriques basées sur l'identité nucléotidique moyenne ou ANI) et de préciser les positions taxonomiques des espèces les unes par rapport aux autres (e.g., phylogénies réalisées sur l'ensemble des gènes partagés entre souches ou génome central dans le taxon considéré). Ce travail permet également d'inclure ou d'exclure des souches pour générer les spectres de référence avec objectivité.

Dans le cadre du travail que nous avons réalisé sur les bactéries du genre *Tenacibaculum*, cette stratégie nous a permis i) d'infirmer l'existence de l'espèce *T. ascidiaceicola*, dont la souche type de cette espèce partage >98 % d'identité de séquence génomique avec l'espèce *T. discolor* (il aurait donc été compliqué de discriminer par MALDI-TOF MS une espèce qui n'en est pas une !) ; ii) de décrire la nouvelle espèce *T. piscium* (Olsen et al, 2020) ; et iii) de confirmer l'identité taxonomique des souches intégrées dans notre stratégie pour réaliser la banque de spectres de référence.

L'obtention de génomes complets pour les espèces du genre *Tenacibaculum* nous a également permis de mettre en évidence l'implication de plusieurs espèces pathogènes des poissons étroitement apparentées (*T. dicentrarchi*, *T. finnmarkense* et *T. piscium*) dans des cas de tenacibaculose initialement attribués à *T. maritimum* (Bridel et al., 2018 ; Olsen et al., 2020). Ce résultat laissait, par ailleurs, entrevoir qu'il serait difficile de les discriminer par une approche classique, utilisant les spectres MALDI-TOF MS complets.

Enfin, comme évoqué précédemment, les spectres MALDI-TOF sont essentiellement constitués de protéines ribosomiques. Il est donc possible d'obtenir la séquence de ces protéines à partir des génomes afin d'y chercher des ressemblances et des différences. Cette approche visant à identifier des biomarqueurs permet de confirmer l'identification obtenue avec le spectre complet et de proposer un schéma de typage, du moins si du polymorphisme existe pour certains biomarqueurs.

## À la recherche de biomarqueurs

Si l'identification d'une espèce bactérienne par MALDI-TOF MS semble ne pas poser de grandes difficultés - sous réserve que la base de données interrogée soit complète et que les espèces considérées soient suffisamment distinctes les unes des autres -, il n'en est pas de même pour le typage bactérien. Un spectre MALDI-TOF MS contient généralement une centaine de pics, tout ou partie d'entre eux pouvant être utilisés pour du typage. Ce dernier peut donc soit exploiter le spectre entier, soit un sous-ensemble de pics ou encore un pic unique. Cependant, la capacité du MALDI-TOF MS à typer les souches dépend des caractéristiques intrinsèques de l'espèce bactérienne considérée. Il serait difficile, voire impossible, de capturer un polymorphisme suffisant pour des espèces très homogènes et présentant peu de diversité génétique, ou plus exactement protéique. Il n'est donc pas possible d'établir un schéma universel de typage, mais on peut s'appuyer sur des règles générales (Spirali et al., 2015 ; Sauget et al., 2017) de manière à développer et à valider un schéma pour les espèces que l'on souhaite étudier.

Les données MALDI-TOF MS contiennent trois types d'informations : l'intensité du signal, la perte (et le gain) de signal et le *peak shift* (décalage du signal). Une variation d'intensité du signal peut être due à une modification d'expression de la protéine correspondante, liée aux conditions de culture, à l'âge de la colonie prélevée, etc. Une perte (ou un gain) de signal peut survenir en raison de l'absence (ou de la présence) d'un gène dans une souche donnée, mais également du mode de préparation de l'échantillon ou des conditions de culture. Ainsi, la variation d'intensité et l'apparition/disparition de pics donnent une information ambiguë sur le génotype d'un isolat. En revanche, un décalage de pic est la conséquence directe d'une modification de la séquence en acides aminés (polymorphisme) de la protéine correspondante. Ces modifications de composition en acides aminés d'une protéine se matérialisent par un changement de masse entrainant un décalage, en amont ou en aval, du pic théoriquement attendu pour la protéine correspondante. Avec la sensibilité des appareils MALDI-TOF MS, le changement d'un seul acide aminé est souvent suffisant pour observer dans les spectres un *peak shift*. Ils sont donc de
très bons candidats utilisables comme biomarqueurs pour effectuer un typage bactérien.

Sachant qu'environ 50 % des pics détectés dans un spectre MALDI-TOF MS correspondent à des protéines ribosomiques, il est relativement aisé d'identifier, à partir des génomes complets, des protéines ribosomiques présentant du polymorphisme susceptible d'entrainer un *peak shift*. On peut alors déduire les masses théoriques de ces isoformes protéiques et rechercher dans les spectres MALDI-TOF MS leurs positions relatives.

Nous avons effectué ce travail pour l'espèce *Tenaci-baculum maritimum*. C'est l'espèce type du genre *Tenaci-baculum*, sans doute celle la plus répandue dans les élevages et dont le plus grand nombre d'isolats était disponible. Nous avons donc sélectionné 24 souches dans la collection du laboratoire en les choisissant les plus diverses possibles (année d'isolement, origine géographique et poisson hôte). Nous avons séquencé les génomes de ces souches et réalisé en parallèle leurs spectres MALDI-TOF MS de référence. À partir des séquences obtenues, nous avons tout d'abord réalisé les vérifications d'appartenance à l'espèce (ANI, phylogénies utilisant le génome central...) et extrait les séquences déduites des protéines ribosomiques. Il était alors possible de les comparer et d'identifier celles ne présentant pas de polymorphisme (protéines ribosomiques monomorphes) et celles présentant des variations de séquence (protéines ribosomiques polymorphes). Les premières étaient de bonnes candidates biomarqueurs pour valider l'appartenance à l'espèce *T. maritimum* lors de l'identification des souches par MALDI-TOF MS. D'autre part, elles pouvaient servir de calibration interne pour l'ensemble du spectre obtenu. Les protéines ribosomiques polymorphes, quant à elles, devaient logiquement laisser apparaître un décalage de pic dans les spectres MALDI-TOF MS, et représentaient de bonnes candidates biomarqueurs pour développer une méthode de typage.

## Utiliser une combinaison de biomarqueurs pour le typage : développement d'une stratégie Multi peak shift typing (MPST)

Pour l'ensemble des protéines ribosomiques identifiées in silico, nous avons calculé les masses prédites (en prenant soin de conserver ou d'enlever la pre-

mière méthionine selon les résultats de préiction obtenus par le logiciel « Terminator ») et recherché dans les spectres les pics correspondants. Nous avons retenu uniquement ceux présentant les critères stricts suivants : i) ils se situent dans la partie du spectre la plus discriminante (de 3 000 à 13 000 m/z) ; ii) ils correspondent aux masses des protéines ribosomiques prédites in silico avec une faible tolérance d'erreur (300 ppm) ; iii) ils sont présents dans tous les spectres MALDI-TOF des 24 isolats de référence ; iv) la plupart d'entre eux sont de haute intensité, même aux deux extrémités du spectre (bien que l'intensité soit globalement plus faible dans ces régions) ; y) ils ne sont pas perturbés par la présence d'autres pics très proches qui pourraient dégrader la fiabilité de détection des pics (en d'autres termes, les pics retenus devaient se trouver dans une fenêtre dépourvue de pics supplémentaires) ; et vi) pour les protéines polymorphes, nous avons privilégié les pics correspondant à des protéines monochargées (+1H). Ce travail nous a permis l'identifier 18 pics (soit 9 protéines différentes, certaines apparaissant en écho en fonction du nombre de charge +1H, +2H ou +3H) correspondant à des protéines ribosomiques monomorphes et 9 pics correspondant à des protéines ribosomiques polymorphes (Figure 3). Ces dernières présentaient de 2 à 5 isoformes différentes et ont servi à développer une stratégie de *Multi peak shift typing* (MPST). Nous avons, en effet, raisonné par analogie avec la stratégie de *Multi Locus Sequence Typing* (MLST) qui repose sur une combinaison de marqueurs correspondant à des séquences nucléiques, généralement des 7 gènes suffisamment conservés dans une espèce, mais présentant un certain polymorphisme permettant de discriminer les souches entre elles. Nous avons donc codé de manière arbitraire (1, 2, 3...) les différentes isoformes des protéines polymorphes retenues (à la manière des *allele type* ou AT dans l'approche MLST) et les avons agrégées : le résultat ou MALDI-type correspond à la combinaison unique d'isoformes pour chacun des 9 biomarqueurs présents dans une souche donnée (à la manière des *sequence type* ou ST correspondant à une combinaison unique d'ATs dans l'approche MLST). Cette stratégie originale permettait, par ailleurs, d'utiliser, dans le cadre des données MALDI-TOF MS, les outils informatiques (eBURST, Split tree) développés à l'origine pour re-
A)

<figure><img src="image_97.png" /></figure>

B)

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

Figure 3. Exemple de pics correspondant à des protéines ribosomiques de *Tenacibaculum maritimum* observées dans les spectres MALDI-TOF MS. A) protéine RpmB, monomorphe monochargée (masse prédite 8880 Da après retranchement de la méthionine en N-terminal). B) Alignement des trois isoformes (IF1, IF2 et IF3) de la protéine polymorphe RpmD à partir des séquences extraites de 24 génomes représentatifs de l'espèce *T. maritimum* (les masses prédites sont indiquées) et pics correspondant à ces trois isoformes, identifiés dans les spectres MALDI-TOF MS obtenus à partir des même souches.

présenter les données MLST. Ces outils ont permis de visualiser les liens, dont ceux issus de la recombinaison, entre souches et de les regrouper en complexe clonaux (CC).

À partir des données MALDI-TOF MS obtenues sur 131 isolats de terrain appartenant à l'espèce *T. maritimum*, notre approche MPST nous a donc permis de discriminer 2 à 5 isoformes/pic (équivalent aux ATs), 20 combinaisons différentes, ou MALDI-types (équivalent aux STs), et 4 groupes (équivalent aux CCs) ainsi qu'un singleton (Bridel *et al.*, 2020).

## De l'intérêt d'un site web intégrant une base de données et des outils d'analyse

Un des avantages majeurs de la MLST par rapport à toutes les approches traditionnelles a été le développement de bases de données regroupant pléthore d'espèces bactériennes, leurs différentes formes aléliques et des outils d'analyse. Ces bases de données, interrogeables à distance (cf. https://pubmlst.org/), permettent d'effectuer des suivis épidémiologiques en temps réel et à l'échelle mondiale ainsi que la comparaison fine de souches. Elles ont largement contribué au succès de cette approche.

Nous avons donc développé un outil en ligne, MALDIquant-TypeR, qui intègre les spectres de référence ainsi que les algorithmes élaborés durant ce projet (http://genome.jouy.inra.fr/shiny/maldiquanttyper/). Il permet de charger les spectres d'un isolat, puis de les comparer à l'intégralité de ceux des espèces du genre *Tenacibaculum* présentes dans notre base de données. Il intègre des outils d'identification basés sur la comparaison du spectre entier d'un isolat de terrain, mais également basés sur des biomarqueurs spécifiques identifiés pour différentes espèces pathogènes du genre. Si l'échantillon est identifié comme appartenant à l'espèce *T. maritimum*, l'outil applique le schéma de typage décrit dans cet article et propose une attribution pour chacun des 9 biomarqueurs retenus. Lorsqu'ils sont tous identifiés dans un échantillon, l'outil affiche le MALDI-type correspondant.

## Conclusion

Les outils de diagnostic sont essentiels pour une détection précoce des maladies, en particulier en l'absence de signes cliniques spécifiques et parce que l'agent causal pourrait être allochtone, émergent ou la maladie d'origine multifactorielle (de Lorgeril *et al.*, 2018). Ainsi, des approches non ciblées (à la différence de la plupart des techniques employant des réactions de PCR) sont à privilégier, notamment pour les pathologies en aquaculture, aussi bien des mollusques que des poissons (Moussa *et al.*, 2021). La caractérisation d'isolats par MALDI-TOF MS est une approche générique, non ciblée et très efficace lorsqu'il s'agit d'étudier un grand nombre d'échantillons. La rapidité d'acquisition des données et de leur ana-
lyse ainsi que la fiabilité des informations qu'elles contiennent sont des avantages indéniables en comparaison avec d'autres méthodes plus traditionnelles, comme les tests biochimiques ou la sérologie, ou plus modernes et ciblées comme la MLST. Comparée à cette dernière, l'approche par MALDI-TOF sacrifie un peu en précision pour gagner grandement en rapidité et en coût. C'est donc l'outil idéal pour réaliser des primo-analyses sur un grand nombre d'isolats afin de sélectionner ceux susceptibles d'être étudiés plus en détail (par exemple, par séquençage de génomes complets).

Il faut cependant garder à l'esprit que les spectres générés par MALDI-TOF MS sont des données analogiques complexes par nature (soumises au bruit de fond intrinsèque des appareils, à la méthode de culture des bactéries, à la préparation des échantillons, à la matrice d'ionisation utilisée, etc.). Elles se différencient donc des données de séquençage qui sont de nature numérique (présence de la base A, T, G ou C à la position n de la séquence) et nécessitent un traitement du signal adapté. Par ailleurs, l'emploi en routine du MALDI-TOF MS s'est, jusqu'à présent, essentiellement focalisé sur des espèces bactériennes bien caractérisées et d'importance clinique. Les banques de données commerciales ne contiennent pas ou peu d'espèces bactériennes « exotiques » ; il est donc nécessaire de construire sa propre bibliothèque de spectres de référence quand on intéresse à des taxons bactériens insolites, non encore inclus dans les banques de données existantes. Si l'identification de l'espèce ne semble pas poser de problèmes majeurs (sous réserve des éléments évoqués précédemment), l'emploi du MALDI-TOF MS pour entreprendre du typage est une entreprise plus ardue. Elle nécessite de combiner des approches de génomique analytique pour identifier des biomarqueurs susceptibles d'être observables dans les spectres. Ces étapes sont chronophages,

et l'implémentation d'algorithmes de traitements dédiés nécessite de réelles compétences en bioinformatique. Cependant, passées ces étapes de développement, la stratégie se révèle redoutablement performante. Elle permet de cribler à grande vitesse et à très faible coût des centaines ou milliers d'isolats bactériens. Un autre avantage non négligeable de la méthode est qu'elle fonctionne aussi bien sur des cultures fraîches que sur des cultures conservées sous forme inactivée jusqu'à 15 jours dans une solution d'éthanol, ce qui permet leur acheminement vers des laboratoires équipés de spectromètres de masse MALDI-TOF éloignés des sites de production. Cette facilité de transport favorise grandement les envois internationaux, les bactéries fixées en éthanol n'étant pas soumises à toutes les formalités administratives liées au transport de matériel biologique vivant, en particulier quand il s'agit d'agents pathogènes. Depuis la publication de ce travail, en 2020 (Bridel et al., 2020), nous avons pu caractériser, par cette technique, plusieurs centaines d'isolats appartenant au genre *Tenacibaculum*, en provenance de Norvège, du Chili et de Polynésie française. Enfin, le déploiement de l'outil en ligne, MALDIquant-TypeR, devrait faciliter, dans un proche avenir, des études épidémiologiques à large échelle.

On peut enfin noter que des approches purement bioinformatiques (e.g., analyses du panspectrome, clustering et recherche de co-occurrences multiples de pics intégrant des méthodes statistiques) pourraient peut-être éviter, dans le futur, de passer par la recherche systématique de biomarqueurs pour réaliser du typage, ou du moins permettre de discriminer des groupes à l'échelle infra-espèce (Giraud-Gatineau et al., 2020). Cependant, ces approches nécessitent de très grands jeux de données (au minimum 600 spectres de référence par espèce ciblée) et ne seront sans doute pas applicables à l'ensemble des espèces bactériennes. ■
Remerciements

Je tiens à remercier particulièrement Jean-François Bernardet pour avoir construit et entretenu, pendant quarante ans, la sou-
chothèque de l'équipe Infection et Immunité des poissons de l'Unité Virologie et Immunologie Moléculaires, pour ses précieux
conseils et pour sa contribution à l'amélioration de ce document ; Tatiana Rochat pour sa contribution à l'amélioration de ce do-
cument ; Frédéric Bourgeon et l'entreprise Bio Chêne Vert pour avoir réalisé l'ensemble des spectres MALDI-TOF analysés dans
le travail cité ; ce dernier a fait l'objet de la thèse CIFRE de Sébastien Bridel en partenariat avec l'entreprise Labofarm (groupe
Finalab). Ce travail a reçu le soutien financier Carnot France Futur Élevage F2E 2017, projet « FishPathoMaldi ».

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Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Caractérisation de la collection caprine de la Cryobanque nationale pour une meilleure gestion des races menacées

Coralie DANCHIN<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

coralie.danchin@idele.fr

## RÉSUMÉ

En France, la conservation des races de ferme combine gestion de terrain (ou *in situ*) et préservation à long terme de matériel reproductif dans l'azote liquide (ou conservation *ex situ*), en lien avec la Cryobanque nationale, un des CRB du pilier animal de RARe. Pour les races caprines locales, les boucs inclus en Cryobanque ont été échantillonnés à partir d'informations généalogiques, dont la connaissance était parfois très partielle. L'utilisation de ces mâles par Insémination Animale (ou IA) est donc parfois limitée faute d'informations fiables. Différents projets de recherche français ou européens ont permis le financement d'échantillonnage et de génotypage (puce caprine 50 K) d'animaux de 5 races locales de chèvres à petits effectifs (Fossés, Lorraine, Poitevine, Provençale, Pyrénées) provenant de la population active et de la collection ex situ. À partir de ces informations de génotypages, l'objectif de notre étude, financée par le projet H2020 IMAGE (https://www.imageh2020.eu), a été de mieux caractériser les collections caprines présentes en Cryobanque, en les comparant avec la population *in situ*. Le degré d'introgression génétique a également été évalué pour ces mâles afin de s'assurer qu'ils pouvaient bien être définis comme de «pure race». Différents indicateurs ont été calculés, qui ont permis de déterminer les liens de parenté réels entre les animaux, d'identifier les animaux croisés et de cibler les souches présentes dans les populations vivantes, mais absentes de la Cryobanque. Ces résultats ont permis une meilleure caractérisation de la collection caprine de la Cryobanque, facilitant ainsi des utilisations futures ; de même que la gestion de ces races à court et moyen terme a pu être affinée en lien avec les associations d'éleveurs.

## MOTS-CLÉS

Cryobanque, génotypage, races menacées, caprin.

<footnote n="1">1 Institut de l'Élevage, Paris, France.</footnote>
# Characterisation of the caprine collection of the national cryobank for better management of threatened races

Coralie DANCHIN<fnref n="1" />

## CORRESPONDENCE

coralie.danchin@idele.fr

## ABSTRACT

In France, the conservation of farm races combines field (or *in situ*) management and the long-term preservation of reproductive material in liquid nitrogen (or conservation *ex situ*), in relation with the national cryobank, one of the BRCs of the animal division of the AgroBRC/RARe. Regarding local goat races, the bucks included in the Cryobank were sampled from genealogical data, knowledge of which was sometimes very partial. The use of these males for Animal Insemination (or AI) is therefore sometimes limited for want of reliable information. Different French and European research projects have permitted financing the sampling and genotyping (50 K caprine chip) of animals from 5 local races of goats, with small numbers (Fossés, Lorraine, Poitevine, Provençale, Pyrénées) from the active population and from the collection *ex situ*. On the basis of this genotyping data, the objective of our study funded by the H2020 IMAGE project (https://www.imageh2020.eu) was to better characterise the caprine collections present in the Cryobank, by comparing them with the population *in situ*. The degree of genetic introgression has also been assessed for these males to ensure they can be defined as «pure race». Different indicators were calculated, which have permitted determining the real family relations between the animals, identifying the crossed animals, and targeting the strains present in living populations but absent from the Cryobank. These results permitted better characterisation of the caprine collection of the Cryobanque, thereby facilitating future uses. Likewise, the management of these races in the short and medium terms was refined in relation with breeding associations.

## KEYWORDS

Cryobank, genotyping, rare breeds, goat.

<footnote n="1">¹ Institut de l'Élevage, Paris, France.</footnote>
## Introduction

La conservation des races à petits effectifs s'appuie en France sur les recommandations du plan d'action de la FAO (2007), à savoir le suivi et la gestion des races en ferme (ou conservation in situ) et la conservation, puis l'utilisation de matériel reproductif conservé dans l'azote liquide (cryoconservation ou conservation ex situ). Pour cette partie, en 1999, un Groupement d'Intérêt Scientifique appelé Cryobanque nationale a été constitué par conventionnement entre douze acteurs de la sélection animale, dont le Ministère chargé de l'Agriculture, l'INRA, l'Institut de l'Élevage, Races de France et ALLICE, afin de fédérer, rationnaliser et sécuriser des collections de matériel biologique conservées dans l'azote liquide. En 2009, la Cryobanque a reçu le label Centre de Ressources Biologiques (CRB) du GIS IBiSA. Plus de 20 ans après sa création, la collection nationale avoisine les 435 000 doses provenant de 21 espèces différentes (www.cryobanque.org). L'enrichissement des collections a notamment bénéficié de l'appui financier apporté par le Projet d'infrastructure « CRB-Anim », financé par le Programme Investissements d'Avenir, alors que la gestion et la conservation des collections bénéficient d'une dotation annuelle du ministère chargé de l'agriculture.

De façon plus spécifique pour l'espèce caprine, de la semence de boucs de races locales françaises a été collectée, depuis plus de 20 ans, afin de préserver la variabilité génétique de ces races, et une partie des stocks a été mise en Cryobanque. L'échantillonnage a été réalisé afin de maximiser la variabilité génétique, sur la base des pedigrees. Cependant, dans la plupart des cas, la fiabilité et/ou la profondeur des pedigrees dans ces races sont limitées, et plusieurs mâles ont été collectés sans information sur les généalogies, à partir de dire d'éleveurs. L'utilisation de ces mâles par Insémination Animale (ou IA) est donc parfois limitée faute d'informations fiables.

Depuis une petite dizaine d'années, en caprins, une nouvelle technique dite « puce de génotypage » permet de lire les informations provenant de l'analyse de la molécule support de l'hérédité, l'ADN pour un nombre important de positions sur cette molécule (plus de 54 000 positions de Single Nucleotide Polymorphism ou SNP). L'analyse de ces données permet la création d'indicateurs qui aident à mieux estimer à la fois la variabilité génétique (analyse de la diversité à l'intérieur d'une race) et, en les comparant, l'analyse de la diversité entre les races. Il est également possible d'estimer le degré de croisement d'un animal à partir de ces données. Grâce à une série de projets, des prélèvements sanguins et des génotypages ont été réalisés

pour les races à petits effectifs suivantes : Fossés, Lorraine, Poitevine, Provençale, Pyrénées, pour des animaux actifs et des boucs conservés en Cryobanque.

À partir de ces informations de génotypages, l'objectif de notre étude, financée par le projet H2020 IMAGE (www.imageh2020.eu), a été de mieux caractériser les collections caprines présentes en Cryobanque, en les comparant avec la population in situ. Le degré d'introgression génétique a également été évalué pour ces mâles afin de s'assurer qu'ils pouvaient bien être définis comme de « pure race ».

## Matériels et méthodes

### Races étudiées et échantillonnage des boucs en cryoconservation

Le choix des races étudiées dans cet article a été restreint aux races locales caprines dont de la semence d'au moins 10 boucs a été collectée pour la cryoconservation. Le tableau 1 reprend le nombre de boucs cryoconservés en Cryobanque, ceux dont de la semence a été génotypée, les effectifs totaux estimés de la race en 2020 et le nombre totaux d'animaux génotypés. Une brève description de ces races et de leurs programmes de conservation a été réalisée par Danchin-Burge et Duclos (2008).

<table><caption>Tableau 1 : Effectifs totaux des races, nombre total d'animaux génotypés, nombre de boucs cryoconservés et génotypés</caption><thead><tr><td>RACE</td><td>EFFECTIF TOTAL (FEMELLES /2020)</td><td>NBRE TOTAL DE GÉNOTYPAGES</td><td>BOUCS CRYOCONSERVÉS</td><td>BOUCS D'IA GÉNOTYPÉS</td><td>TAUX MOYEN DE RÉGÉNÉRATION</td></tr></thead><tbody><tr><td>Fossés</td><td>1 600</td><td>43</td><td>19</td><td>12</td><td>97</td></tr><tr><td>Lorraine</td><td>1 000</td><td>3</td><td>10</td><td>8</td><td></td></tr><tr><td>Poitevine</td><td>4 400</td><td>57</td><td>32</td><td>10</td><td>81</td></tr><tr><td>Provençale</td><td>1 800</td><td>86</td><td>10</td><td>10</td><td>91</td></tr><tr><td>Pyrénées</td><td>4 000</td><td>66</td><td>13</td><td>7</td><td></td></tr></tbody></table>

Pour ces cinq races, la majorité des effectifs des élevages professionnels sont traits, mais on note également une proportion importante d'élevages allaitants en race des Pyrénées. L'éco-pâturage est une activité en croissance, particulièrement en Fossés et Lorraine. Enfin, les éleveurs amateurs représentant une part active de la conservation de ces races, en particulier en Fossés, Poitevine et Lorraine, ce sont en Provençale et en Pyrénées que la part des éleveurs professionnels est la plus importante. Le berceau des races est reflété dans leur nom, en dehors de la Fossés qui est élevée sur un territoire large de l'Ouest de la France (Bretagne, Normandie, Pays de la Loire).
À l'aube des années 1990, la menace de disparition quasi totale des ressources génétiques caprines françaises est une particularité dans le paysage de la conservation des espèces d'élevage en France. Les facteurs qui ont mené à cette situation ont été décrits par Danchin-Burge et Duclos (2008). Retenons particulièrement l'absence de la standardisation de ces races – en dehors de la Poitevine – qui a mené à les écarter des systèmes de production, cette variabilité étant suspectée comme une preuve qu'il s'agissait de populations composites, indésirables à l'époque. Les travaux menés à partir des premières campagnes d'échantillonnage et de génotypages (voir Échantillonnage et données de génotypages) ont pu montrer précisément que toutes ces races, bien que variables d'un point de vue du standard, constituaient des groupes distincts les uns des autres (Oget et al., 2019). Les programmes de conservation de ces races s'appuient sur des actions de terrain, dont l'élément fondamental est le recueil des généalogies par les associations de races (Lorraine, Poitevine, Pyrénées), accompagnées par l'Institut de l'Élevage (Fossés, Provençale). Ce recueil d'informations permet d'établir des bilans démographiques, de variabilité génétique (bilans « VARUME » de l'Institut de l'Élevage<fnref n="1" />), et de procéder au repérage de boucs d'IA.

La cryoconservation de semence en races locales caprines a pour but la conservation à très long terme de leur patrimoine génétique. Suivant les conseils de la FAO (2012), l'objectif est de conserver 25 mâles non apparentés par race, avec 200 doses par bouc, répartis sur deux sites pour des raisons de sécurité. Dans un premier temps, les boucs sont repérés en fonction de leur originalité génétique calculée à partir de leurs généalogies (degré d'apparentement avec la population, parenté entre boucs d'IA). Ce travail est réalisé par les associations de races, parfois avec l'appui de l'Institut de l'Élevage. Dans un second temps, les associations vérifient que les candidats sont représentatifs de la race au niveau de la morphologie.

## Logistique de la collecte

La collecte de semence de boucs est une opération lourde, que ce soit par son coût, qui nécessite des recherches de financement spécifiques (la collecte de deux cents doses par bouc se chiffre à environ 1 500 € HT), ou par la logistique à mettre en place. Quand les premières actions de collecte ont démarré, le centre de production, CAPGÈNES, a préconisé la recherche de boucs âgés pour s'assurer de leur bon comportement sexuel. Actuellement, on oriente l'échantillonnage vers des boucs jeunes, nés en début d'année, pour une collecte à l'automne qui est la période natu-

relle des saillies pour ces races cyclées. De plus, pour entrer en centre de collecte, les boucs doivent être non porteurs d'une série de maladies assez fréquentes en races locales, dont le CAEV, ce qui limite souvent le choix final, et parfois drastiquement. Or, les boucs âgés sont plus susceptibles d'être porteurs de maladies que des jeunes boucs qui n'ont jamais sailli, d'où le changement de paradigme.

Il faut ensuite assurer le transport des animaux (y compris son financement) jusqu'au seul centre d'IA agréé en France, CAPGÈNES, situé à Mignaloux-Beauvoir (86), sachant que, en dehors de la race Poitevine, le berceau des races locales est situé à plusieurs centaines de kilomètres (Provence et Pyrénées, en particulier). Enfin, une fois en centre, les boucs sont mis en quarantaine, et il arrive que leur sérologie change en raison du stress provoqué par le transport et le changement du lieu d'élevage, en particulier pour les maladies de type CAEV, ce qui aboutit à leur disqualification. Les boucs sont ensuite entrainés sur un mannequin de monte. Certains boucs s'avèrent inaptes à cette éducation, en particulier s'ils ont été peu familiarisés à une manipulation par l'Homme. Ensuite, même s'ils acceptent d'être prélevés, leur semence peut être insuffisamment fertile pour être congelée (33 % des boucs collectés sur 72 boucs de races locales ; chiffres CAPGÈNES/IDELE) et, enfin, que la semence ne soit pas congelable (42 % des 55 boucs de races locales ayant pu être collectés avec de la semence fertile ; chiffres CAPGÈNES/IDELE).

Le détail de la logistique de collecte permet d'expliquer l'écart entre les échantillonnages souhaités et les collections réalisées ; cela explique que des solutions pragmatiques soient parfois appliquées. Par exemple, quand un élevage est connu pour avoir un état sanitaire compatible avec la réglementation de l'IA, des demi-frères sont parfois entrés en centre, puisque en moyenne les collectes sont fructueuses pour 50 % des animaux échantillonnés.

Finalement, la variabilité du nombre de boucs cryoconservés par race provient à la fois des financements trouvés par les différentes associations d'éleveurs ces 20 dernières années, de l'ancienneté des programmes de conservation, des effectifs des races et de l'accompagnement que l'association des éleveurs a pu mettre en place pour assurer la logistique des opérations. À noter que le programme CRB-Anim a permis d'augmenter significativement les collections caprines, puisque l'intégralité des boucs de la race Lorraine ont été prélevés grâce à ces financements : 5 des boucs Fossés, 2 des Poitevins, 7 des Provençaux et 2 des Pyrénéens.

<footnote n="1">1 https://idele.fr/detail-dossier/bilan-de-variabilite-genetique-pour-les-filieres-caprines-ovines-et-bovines</footnote>
## Èchantillonnage et données de génotypages

Les premiers génotypages réalisés pour les races locales caprines ont été faits à partir de prélèvements réalisés pour différents projets de recherche, dans les années 2000, où les associations de races et l'Institut de l'Élevage n'avaient pas été mandatés pour procéder à l'échantillonnage. Les premières analyses réalisées (Oget et al., 2018) ont montré qu'il était probable que certaines origines génétiques importantes manquaient dans la représentation des races, en particulier pour celles avec un large berceau (Fossés, Pyrénées). Pour cette raison, le groupe pilote « ruminants » de CRB-Anim a validé le financement, par ce projet, d'une campagne spécifique de prélèvement et de génotypages des races locales s'appuyant sur l'expertise des associations d'éleveurs et de l'Institut de l'Élevage. Par ailleurs, depuis 2019, les boucs d'IA de races locales sont systématiquement génotypés par le centre de collecte CAPGÈNES. Pour les boucs d'IA plus anciens, le génotypage nécessite une logistique différente, puisque les analyses doivent être réalisées à partir des doses congelées au lieu de sang. Cette opération étant plus compliquée à réaliser, un choix a dû être réalisé parmi les animaux existants. Ont été privilégiés les boucs pour lesquels on disposait le moins d'information généalogique, ceux prélevés en début de programme de conservation et/ou dont on soupçonnait le croisement éventuel avec une autre race. Enfin, afin de repérer d'éventuelles traces de croisements, les génotypages de races disponibles librement par le consortium ADAPTPMAP (https://datadryad.org/stash/dataset/doi:10.5061/dryad.v8g21pt), ainsi que des génotypages en race Rove réalisés grâce au projet CRB-Anim ont été inclus dans les analyses.

L'ensemble des animaux ont été génotypés à l'aide de la puce GoatSNP50 BeadChip (Illumina, Inc.) développée par l'International Goat Consortium (Tosser-Klopp et al., 2014). Un contrôle qualité du jeu de données a été effectué à l'aide de PLINK v1.90 (Chang et al., 2015) en conservant les SNP dont le taux de réussite était supérieur à 0,95 et en éliminant les variants dont la fréquence était inférieure à 5 % (Minor Allele Frequency ou MAF), et ceux pour lesquels il manquait au moins 5 % de données génotypées.

## Indicateurs calculés

Les parentés génomiques ont été calculées pour tous les animaux deux à deux, c'est-à-dire en calculant la parenté de chaque animal avec successivement tous les autres animaux de la population. La matrice de parenté génomique est transformée en coordonnées d'Analyse en Composante Principale (ACP) grâce à la fonction ad hoc de PLINK ; pour

les figures, nous avons utilisé des fonctions de représentation graphique du logiciel R.

Pour l'évaluation du degré de croisement, l'approche a été réalisée en deux temps à partir de l'utilisation du logiciel ADMIXTURE (Alexander et al., 2009). Dans un premier temps, l'ensemble des animaux ont été intégrés dans l'analyse, afin de repérer les animaux avec des traces évidentes de croisement. Dans un second temps, un sous échantillon a été réalisé en conservant uniquement, par race, les animaux ayant une parenté génomique inférieure à 0,125 (fonction -rel-cutoff du logiciel PLINK) et les animaux avec une consanguinité inférieure à 12,5. La consanguinité des animaux a été estimée à partir de régions montrant très peu de variabilité du génome, appelées Run of Homozygosity (ROH), calculées en utilisant les scripts développés par Gorssen et al. (2021). Cette précaution a été prise afin d'obtenir une valeur la plus juste possible des croisements détectés, ces deux facteurs, parenté des animaux et consanguinité élevée, influençant défavorablement les estimations réalisées par le logiciel ADMIXTURE. Dans la mesure du possible, les boucs d'IA ont été choisis comme « tête de lignée » des animaux non apparentés. Le nombre optimal de clusters k a été estimé en ajoutant un indicateur de qualité (Alexander et al., 2009). Le nombre de cluster k a été varié de 8 à 12 et la valeur de k=10, soit le k avec l'indicateur de qualité avec la plus faible erreur, a été utilisée afin de choisir le nombre optimal de clusters pour l'ensemble des génotypes étudiés.

## Résultats et discussion

Au démarrage des programmes de conservation, les boucs disponibles pour être collectés étaient en général peu nombreux et les informations généalogiques limitées. Suite à l'utilisation des prélèvements par insémination, certaines associations d'éleveurs ont pu avoir des doutes sur la pureté de ces boucs ou sur les relations généalogiques affichées. L'intérêt majeur des données génomiques est qu'elles constituent une nouvelle source d'information pour estimer la parenté et les croisements. Le calcul des parentés génomiques nous a permis de positionner les boucs d'IA par rapport à des animaux actifs ; un exemple est donné dans la figure 1 pour la race Fossés. Le résultat le plus frappant est le positionnement distant des boucs Napoléon (IANAPO) et Nucléo (IANUCL), qui étaient considérés comme plein-frères puisque nés dans la même portée. La conclusion est, qu'en caprin, une gestation peut comporter des chevreaux avec des pères différents. Cela veut aussi dire que la variabilité génétique de la collection est plus large que prévue, puisque ces deux boucs étaient considérés comme
plein frères, alors qu'ils ne sont que demi-frères. Cette re-
présentation a permis aussi de positionner des boucs dont
les généalogies étaient inconnues ou très courtes, comme
Manton (IAMant), Raoul (IARaou), Onenn (IAOnen) ou en-
core Tournesol (IATour). Ce panorama montre, également,
que les grands types de souches sont présents à l'IA, en
dehors d'un groupe, qui parait également plus rare dans la
population active, représenté par les animaux Harry Potter
(HARR) et D'Artagnan (DAR).

<figure><img src="image_100.png" /><figcaption>Figure 1. ACP pour les deux premières composantes (V1, V2) à partir des données de parenté génomique en race Fossés ; les 10 boucs d'insémination sont identifiés en bleu.</figcaption></figure>

L'association d'éleveurs a pris en compte ces indicateurs
pour les prochaines campagnes de collecte de boucs d'in-
sémination en tâchant de repérer des animaux provenant
de souches non représentées. Des indicateurs équivalents
ont été calculés race par race et fournis aux associations
d'éleveurs. Ces informations ont permis d'élucider des re-
lations de parenté pour 4 boucs en race Provençale, 2 en
Poitevine, et l'intégralité de la collection génotypée en race
Pyrénées. En race Lorraine, cela a permis de confirmer que
l'échantillonnage par « famille » réalisé par l'association cor-
respondait bien à la structure génétique de la population.
Un autre attendu important des associations d'éleveurs
était l'estimation de la présence d'allèles de races exogènes
chez les animaux de la collection. L'interprétation des ré-
sultats du logiciel utilisé est néanmoins sujette à caution,
les hypothèses sous-jacentes à son fonctionnement étant
adaptées au phénomène de spéciation plus que de racia-

tion. Comme signalé dans la description des méthodes,
il est impératif d'éliminer les animaux très apparentés et
consanguins pour ne pas biaiser fortement les indicateurs
finaux. Par ailleurs, l'introduction de nouvelles races ou de
souches éloignées des échantillonnages précédents peut
faire varier les résultats d'une simulation à l'autre. Néan-
moins, les croisements avec des races peu apparentées,
comme l'Alpine ou la Saanen, peuvent être repérés avec
cette méthode. Par exemple, en chèvre des Fossés (Figure
2), le bouc d'IA Manton (IAIAMANT) est caractérisé comme
porteur de marqueurs Saanen et Alpin pour un quart de ses
gènes ; ce bouc a, depuis, été déqualifié de la race et un fils,
Jason (IAJason), a été créé par accouplement programmé
avec une souche qui avait été caractérisée comme pure lors
d'un travail précédent. Cette stratégie s'est avérée payante,
puisque Jason a effectivement à peu près la moitié des mar-
queurs génétiques de l'origine alpine de son père.

<figure><img src="image_101.png" /><figcaption>Figure 2. Détail de l'origine raciale des boucs de la race Fossés selon le résultat d'Admixture pour k=10. Légende des flux de gènes les plus importants : en vert- Fossés ; rouge- Alpine ; jaune- Pyrénées ; Bleu cyan-Saanen ; Bleu foncé-Corse</figcaption></figure>

Le même travail a été effectué en race Poitevine, et la repré-
sentation de la race après tri des animaux est décrite dans la
figure 3. La race apparait beaucoup plus homogène que la
chèvre des Fossés : sa standardisation est ancienne et date
d'au moins un siècle ; son berceau est plus restreint que ce-
lui de la chèvre des Fossés. Dans ce contexte, les traces de
croisement apparaissent plus clairement et sont moins sou-
mises aux aléas d'échantillonnage que dans une race plus
variable. L'étude ciblée plus spécifiquement pour les boucs
d'IA (non figurée ici) montre des traces faibles de croise-
ment, voire inexistantes, pour les boucs de la Cryobanque.

En Pyrénées, les origines de trois boucs collectés en début
de programme étaient sujettes à caution, et les données de
génotypage ont confirmé que ces boucs ont une constitu-
tion génétique très différente de celle des animaux actifs.
Néanmoins, il est difficile d'être plus affirmatif dans les conclusions, les pourcentages de marqueurs étrangers attribués à ces boucs par ADMIXTURE variant assez fortement en fonction des races intégrées dans l'échantillonnage. Deux hypothèses restent possibles : soit ces boucs sont porteurs de gènes d'une race étrangère non encore testée dans nos comparaisons, par exemple des races espagnoles en raison de la proximité géographique ; soit ces boucs représentent justement une souche qui n'existe plus dans la population active, et dont les allèles des gènes ont pu être sauvés grâce aux collections de la Cryobanque.

<figure><img src="image_102.png" /><figcaption>Figure 3. Détail en race Poitevine du résultat d'Admixture pour k=10. Légende des flux de gènes les plus importants : en vert- Poitevine ; rouge- Alpine ; jaune- Pyrénées ; Bleu cyan-Saanen.</figcaption></figure>

## Conclusion

L'analyse de données de génotypages de races caprines menacées provenant d'animaux actifs et de collections de la Cryobanque a permis de déterminer les liens de parenté réels entre les animaux, en particulier pour ceux dont les généalogies étaient peu connues voire inexistantes, d'identifier des animaux croisés et de cibler les origines génétiques présentes dans les populations vivantes mais non représentées en Cryobanque.

Les résultats ont été présentés aux représentants des éleveurs des races de chèvres locales françaises. Cette caractérisation des collections est à considérer comme une réussite. Les indicateurs ont été utilisés pour orienter les choix futurs des mâles à cryoconserver, mieux ajuster le choix des éleveurs pour leurs accouplementson raisonnés avec les mâles d'IA, et, dans un cas, écarter de la collection un mâle de la race Fossés qui s'est avéré croisé. Enfin, ces présentations ont permis de convaincre une association d'éleveurs, dont la race manquait à l'appel, de participer aux études suivantes sur la diversité des races et de faire collecter des mâles pour l'IA.

## Remerciements

Nous remercions ici les associations d'éleveurs, CAPGÈNES et IDELE pour la logistique associée et la consolidation des données.

## Financement

Les génotypages ont été financés par :

- les projets OPA, ADAPTMAP et VARGOATS dont le coordonnateur français est l'unité INRAE GENPHYSE (Alpine, Saanen, Fossés, Lorraine, Poitevine, Provençale, Rove) ;

- un projet de recherche mené par A. CAPITAN (ALLICE) pour des échantillons Provençale ;

- CRB ANIM, un projet du programme Investissements d'Avenir de l'ANR (Fossés, Lorraine, Poitevine, Provençale, Rove).

Pour les races locales, une partie des prélèvements qui ont permis la réalisation des génotypages ont également été financés par le projet CRB ANIM.

Les recherches qui ont conduit à ces résultats ont été menées dans le cadre du projet IMAGE qui a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne, dans le cadre de la convention n° 677353.
Références

Alexander D.H., Novembre J., Lange K., 2009. Fast model-based estimation of ancestry in unrelated individuals. Genome Research, 19:1655-1664.

Chang C.C., Chow C.C., Tellier L.C., Vattikuti S., Purcell S.M., Lee J.J., 2015. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4:7.

Danchin-Burge C., Duclos D., 2008. Situation et perspectives d'avenir des races caprines à petits effectifs. Ethnozootechnie N° 85 p 17-32.

FAO, 2007. Global plan of action for animal genetic resources. FAO, Rome, Italy.

FAO, 2012. Cryoconservation of Animal Genetic Resources; FAO Animal Production and Health Guidelines No. 12; FAO: Rome, Italy.

Gorssen W., Meyermans R., Janssens S. et al., 2021. A publicly available repository of ROH islands reveals signatures of selection in different livestock and pet species. Genet Sel Evol 53, 2.

Oget C., Servin B., Palhière I., 2019. Genetic diversity analysis of French goat populations reveals selective sweeps involved in their differentiation. Anim Genet. 50(1):54-63.

Tosser-Klopp G., Bardou P., Bouchez O. et al., 2014. Design and characterization of a 52K SNP chip for goats. PLoS ONE 9, e86227.

<figure><img src="image_103.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# SAMBO : Biobanking et extraction automatisée d'ADN de microbiotes

Christian MORABITO<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

christian.morabito@inrae.fr

Explorer les milliards de bactéries qui peuplent la flore intestinale - ou microbiote - de l'homme et de l'animal à des fins préventives, thérapeutiques et de nutrition : tel est l'enjeu du centre INRAE MetaGenoPolis (MGP), créé en 2012 et financé par le Programme des Investissements d'Avenir. L'expertise de MGP dans l'analyse du microbiome intestinal et de ses implications en matière de santé et de nutrition est largement reconnue dans la communauté scientifique internationale depuis 2010. MGP propose à ses partenaires d'étudier leurs questions par le biais de deux pipelines : la métagénomique quantitative, qui consiste à analyser et modéliser la diversité et la composition des microbiotes complexes, et la métagénomique fonctionnelle qui recherche des bactéries inconnues en vue de découvrir de nouveaux composés bioactifs. Ces activités s'articulent autour de 4 plateformes technologiques innovantes, dont Sambo.

**Le microbiote intestinal** est constitué de l'ensemble des micro-organismes vivants (archées, bactéries, eucaryotes, virus...) qui peuplent l'intestin. Il peut être considéré comme un véritable organe ayant co-évolué avec son hôte dans une relation symbiotique équilibrée, contribuant à l'homéostasie physiologique dite « eubiose ». L'avancée des recherches sur le microbiote intestinal montre à quel point cet équilibre semble être un facteur majeur pour la bonne santé d'un individu. Le déséquilibre du microbiote intestinal ou dysbiose serait au contraire associé à l'apparition de différentes pathologies chroniques.

<footnote n="1">1 Université Paris-Saclay, INRAe, MGP, 78350, Jouy-en-Josas, France.</footnote>
## Description de la plateforme SAMBO

Sambo vise à créer une biobanque nationale constituée de plus d'un million d'échantillons intestinaux humains, en mesure de répondre à la demande croissante issue d'essais cliniques et de grandes cohortes épidémiologiques et nutritionnelles.

Il est le point d'entrée du pipeline de métagénomique quantitative de l'unité MGP. Ses missions consistent à :

* Expliquer aux partenaires les bonnes pratiques de collecte des échantillons, suivant les recommandations des standards internationaux IHMS (http://www.micro-biome-standards.org/) que l'unité a contribué à élaborer.

* Réceptionner les échantillons collectés et de les conditionner de sorte à les stocker dans la biobanque de l'unité, d'une capacité de 600 000 échantillons, qui est gérée par le personnel de la plateforme.

* Réaliser une extraction d'ADN de la meilleure qualité possible pour ces échantillons, de façon à obtenir des molécules d'ADN à haut poids moléculaire, qui permettront de générer des séquences fiables (suivant les recommandations IHMS mentionnées ci-dessus).

* Développer de nouvelles applications qui permettent de diversifier le champ des possibles de l'unité et la prise en charge d'échantillons toujours plus nombreux et variés.

Pour réaliser ces missions, SAMBO s'est doté d'un laboratoire confiné de type P2 ainsi que de trois automates : une biobanque automatisée à - 80 °C, un robot de purification d'ADN et enfin, un robot de pipetage et de quantification.

## Chaîne de robots de la plateforme SAMBO

### Biobanque (Figure 1)

Après conditionnement en tubes ou boîtes compatibles, les échantillons reçus sont positionnés dans le magasin (1) de la biobanque. Une nacelle située à l'intérieur de la machine (a) vient chercher les échantillons pour les positionner dans un scanner qui identifie les codes-barres des tubes, boîtes et plaques (2), puis dans un module de picking (3 et b) où ils seront réorganisés sur de larges racks à haute densité. Ils sont ensuite déposés dans un espace de stockage à - 80 °C (c). Toute l'opération est pilotable à distance. La biobanque est sécurisée par un doublement des systèmes assurant le froid ainsi que par une cuve d'azote liquide de secours et d'onduleurs.

<figure><img src="image_104.png" /><figcaption>Figure 1. Processus de stockage des échantillons dans la biobanque.</figcaption></figure>

### Robot de purification (Figure 2)

Les échantillons à extraire subissent une lyse thermique, chimique et mécanique selon une méthode manuelle issue des standards IHMS. Les lysats générés sont pris en charge par le QIASymphony SP de la société QIAGEN, qui peut générer jusqu'à 96 purifications à la fois. Cet automate utilise la technique bien connue de purification avec des billes magnétiques ; brièvement, l'ADN contenu dans le lysat s'accroche à une suspension de billes magnétiques, qui sont ensuite retirées à l'aide d'un aimant et éluées dans un tampon. L'automate est composé d'un portoir pour les tubes de lysats (1), d'une tête de pipetage (2), de portoirs pour racks de cônes (3), d'un emplacement pour cartouches de réactifs (4), d'un plateau de travail équipé de têtes aimantées (5), d'un espace pour consommables de travail (6) et enfin, d'un portoir à plaques au format SBS (7).

<figure><img src="image_105.png" /><figcaption>Figure 2. Automate de purification QIASymphony SP.</figcaption></figure>

### Robot de pipetage et de quantification (Figure 3)

Après purification de l'ADN, les échantillons produits en rack Matrix 96 tubes peuvent être quantifiés par fluorimétrie en utilisant le robot de pipetage Biomek 4000 (Beckman Coulter), couplé à un lecteur en plaque Filtermax (Molecular De-
vices), avant mise à disposition de la plateforme MetaQuant de MGP pour séquençage. Cet automate peut également transférer les échantillons en plaques PCR pour envoi au partenaire ou à son prestataire externe de séquençage si nécessaire. Le robot est composé d'un plateau de travail (1), d'un boucheur-déboucheur de tubes (2), d'un fluorimètre en plaque (3) d'un bras de pipetage avec plusieurs têtes (4) et d'un lecteur de code-barres en plaque (5).

## Perspectives

SAMBO souhaite augmenter sa force de frappe en inau-gurant, début 2022, un nouveau pipeline totalement au-tomatisé dit « haut débit » pour l'extraction d'ADN. Ce pipe-line s'appuierait sur deux nouvelles machines de pipetage et d'extraction, soutenues par du petit équipement et par le Biomek 4000. L'objectif est de permettre de traiter des projets à grand volume d'échantillons (plusieurs milliers, voire dizaines de milliers) avec une capacité de 96 extrac-tions par jour, soit 6 fois plus que le pipeline standardisé actuel. Les 2 pipelines, le nouveau et l'ancien, cohabite-raient sur la plateforme.

<figure><img src="image_106.png" /><figcaption>Figure 3. Automate de pipetage et de quantification Biomek 4000.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_107.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Les outils de suivi de la relation client d'un Centre de Ressources Biologiques

Victoria CHUAT<fnref n="1" />
Florence VALENCE<fnref n="1" />

## CORRESPONDANCE

cirm-bia@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Au même titre que n'importe quelle organisation qui livre des biens ou des services à des clients, les Centres de Ressources Biologiques (CRB) doivent déployer des outils qui leur permettent de suivre et de gérer au mieux la relation avec leurs clients. Nous avons regroupé ces outils en quatre grandes catégories : les outils de communication pour faire la promotion des activités du CRB, les outils administratifs pour suivre la demande de ressource ou de service, les outils réglementaires qui garantissent que les produits et/ou les services délivrés répondent bien à la réglementation en vigueur et, enfin, les outils de recueil des besoins et de la satisfaction. Ces outils doivent être adaptés à chaque CRB, c'est-à-dire être en adéquation avec la taille du CRB considéré et avec sa stratégie de diffusion. Il existe peu d'outils spécifiques aux CRB, charge à ces derniers de trouver, parmi les outils existants, les plus pertinents, de les adapter ou encore d'en développer des spécifiques. Les normes ISO9001 et 20387, mais également les lignes directrices de l'OCDE relatives aux CRB sont une source d'information précieuse sur les prérequis de ces outils et sur leur finalité, et peuvent guider les CRB dans le choix et la mise en place de ces derniers.

## MOTS-CLÉS

Relation Client, outils, satisfaction, communication, réglementation, CRB.

<footnote n="1">1 CIRM-BIA, STLO, INRAE, Agrocampus Ouest, 35000 Rennes, France</footnote>
Tracking tools and
Biological Resource Center
client relations

Victoria CHUAT<fnref n="1" />
Florence VALENCE<fnref n="1" />

CORRESPONDENCE

cirm-bia@inrae.fr

ABSTRACT

As well as any organization that delivers goods or services to clients, Biologi-
cal Resource Centers (BRCs) must mobilize tools in order to monitor and ma-
nage their relationship with their clients. We have grouped these tools into
four main categories: communication tools that allow the BRC to promote
its activities, administrative tools that allow the BRC to follow up on the re-
quest for a resource and/or service, regulatory tools that guarantee that the
products and/or services delivered comply with the regulations in force and
finally the tools for collecting customer needs and satisfaction. These tools
must be adapted to each BRC, i.e. in line with the size of the BRC considered
and its dissemination strategy. There are few tools specific to BRCs; it is up
to them to find the most relevant ones among the existing tools, to adapt
them or to develop specific ones. The ISO9001 and 20387 standards, as well
as the OECD guidelines on BRCs, are a valuable source of information on the
prerequisites of these tools and their purpose and help BRCs for choice and
implementation of these tools.

KEYWORDS

Client relations, tools, satisfaction, communication, regulation, BRC.

<footnote n="1">1 CIRM-BIA, STLO, INRAE, Agrocampus Ouest, 35000 Rennes, France</footnote>
## Qu'entend-on par relation client au sein d'un CRB ?

Le terme relation implique qu'il y ait un lien entre les clients et le CRB, ce qui nécessite pour bien l'appréhender de définir préalablement la nature des clients. Parler de clients signifie implicitement que le CRB délivre un bien ou un service, cela nécessite donc de définir également la nature des biens ou des services qui peuvent être délivrés par ce dernier.

Si l'on se réfère aux définitions du Larousse et des normes ISO 9001 et ISO 20387, le terme client signifie « personne qui reçoit d'une entreprise, contre paiement, des fournitures commerciales ou des services » et « personne ou organisme qui est susceptible de recevoir ou qui reçoit un produit un service destiné à, ou demandé par, cette personne ou cet organisme » respectivement. Dans le cadre d'un CRB les fournitures sont représentées par des ressources biologiques d'une extrême diversité : micro-organismes, semences végétales et animales, prélèvements humains, échantillons d'ADN, arbres... En ce qui concerne les services, ils sont, eux aussi, extrêmement divers : identification et caractérisation de matériel biologique, conservation, expertise, formation... De cette diversité découle une très grande diversité de clients : chercheurs académiques et privés, scientifiques INRAE et hors INRAE, de toutes nationalités, entreprises, centres techniques et de références associés au domaine d'application des ressources considérées, enseignement, particuliers... Cela étant, les liens qui relient le client au CRB sont identiques. Le terme client induisant implicitement une notion de rétribution, ce qui n'est pas systématiquement le cas dans le cadre de l'activité de CRB, nous utilisons dans la suite de cet article le terme d'utilisateurs pour faire référence aux clients des CRB.

Dans le cas qui nous intéresse, la relation client consiste donc à mettre en œuvre des outils afin de créer et d'entretener une relation réciproquement bénéfique entre le CRB et ses utilisateurs ; l'objectif étant d'apporter de la valeur ajoutée aux utilisateurs, mais aussi de garantir le bon déroulement de la mise à disposition des ressources biologiques ou des services, dans le respect de la réglementation et de la législation.

## Quels outils ? Pour quoi faire ?

Si l'on se réfère à la définition de l'OCDE (2007), les CRB ont pour vocation de conserver la biodiversité, de sécuriser des ressources biologiques de référence, de mettre à disposition ces ressources à des fins de recherche et développement

et d'avoir une activité de recherche et développement. Si, comme évoqué précédemment, la diversité des ressources est très vaste, la mise à disposition répond aux mêmes impératifs. Il en va de même pour l'offre de services associée qui, bien qu'extrêmement diverse elle aussi, repose sur un schéma commun. De ce fait, les outils seront globalement les mêmes quel que soit le type de ressources hébergées par le CRB. Par outils, nous entendons aussi bien des trames documentaires, des logiciels, des tableurs que des procédures.

L'utilisateur doit en tout premier lieu savoir que le CRB existe ; ensuite : quelle est la nature précise des ressources biologiques distribuées et des services réalisés, quelles sont les modalités d'accès à ces derniers (conditions légales et réglementaires, tarification), comment faire part de son besoin et de sa satisfaction avant, pendant et après la distribution des ressources ou du service et, enfin, où en est sa demande. Pour répondre à ces objectifs, il est essentiel d'utiliser des outils adaptés et pertinents. Ces outils doivent permettre à l'utilisateur de communiquer avec le CRB, de la demande jusqu'à la distribution de la ressource ou la réalisation du service. Ils doivent également fournir un support documenté pour les échanges d'informations relatives à la demande de ressource ou de service. Quatre catégories d'outils peuvent ainsi être mobilisés : 1) des outils de communication, 2) des outils administratifs, 3) des outils réglementaires et, enfin, 4) des outils pour le recueil des besoins et de la satisfaction des utilisateurs.

## Les outils

### Outils de communication

Les outils de communication sont essentiels pour permettre au CRB d'être visible des utilisateurs potentiels, communiquer sur les ressources qu'il héberge et les différents services qu'il peut réaliser, les modalités d'accès à ses ressources et services, etc.

### Site Web et Catalogue en ligne

Le développement d'un site web adapté est un premier outil « d'accroche » qui permet de communiquer avec les utilisateurs potentiels. Il permet à ces derniers de trouver les informations importantes relatives aux ressources et services que le CRB délivre (modalités d'accès, réglementation en vigueur, tarification, nom des personnes contacts...). Il doit être adapté aux besoins du CRB et au profil des utilisateurs et être mis à jour régulièrement. Il existe à INRAE des outils institutionnels (sites clés en main EzPublish, EzPlateforme) qui peuvent répondre de manière tout à fait satisfaisante
à ces besoins. La structure du site WEB, sa mise en forme et son contenu peuvent être extrêmement variables, car ils relèvent d'une stratégie de communication qui est propre à chaque CRB, et qui dépend également de ses utilisateurs.

De plus, et en fonction du type de ressources hébergées, le site web peut être également un moyen pour le CRB de donner accès à ses ressources via un catalogue en ligne. Le choix des informations, relatives aux ressources, accessibles sur ce catalogue sont, là encore, très dépendantes du type de CRB concerné et de la nature de ses utilisateurs. Usuellement, les catalogues en ligne permettent d'accéder aux données dites minimales (OCDE, 2007). Le vocabulaire en lien avec ces données doit être, tant que faire se peut, normalisé pour assurer une cohérence entre les CRB au niveau de la recherche et de l'extraction des données. Les données minimales doivent permettre d'identifier de manière univoque l'échantillon biologique et permettre de savoir s'il répond aux exigences réglementaires qui lui sont associées (donnée d'identification, d'origine et date de collecte/mise en collection). Au-delà des données minimales, la décision de donner accès à des données complémentaires (données de phénotypes, caractères/particularités spécifiques) relève d'un choix stratégique de chaque CRB au regard de ses ressources et de ses utilisateurs.

Dans sa version la plus simple, le catalogue en ligne peut permettre aux utilisateurs de savoir quelles sont les ressources auxquelles il peut accéder. Mais le catalogue peut également permettre aux utilisateurs de commander les ressources en ligne. Là encore, les fonctionnalités du catalogue relèvent d'un choix stratégique de chaque CRB au regard de ses ressources et de ses utilisateurs.

Le développement d'un catalogue en ligne requiert d'avoir une base de données interrogeable et donc un format de données spécifiques. Un catalogue en ligne peut être développé à façon mais nécessite l'intervention d'un informaticien pour le développement, les évolutions et la maintenance. Il existe également des solutions généralistes open source ou commerciales (Filemaker, SQLite, MySQL,...) mais qui nécessitent d'être adaptées pour gérer des données spécifiques aux CRB. Enfin, il existe des solutions commerciales spécifiques à la gestion des ressources biologiques, la base de données BioAware (https://www.bio-aware.com/page/home) avec son catalogue en ligne Biolomics en est un exemple et équipe aujourd'hui 7 CRB de l'infrastructure RARé.

## Communications écrites, orales et affichées

La promotion des ressources et activités du CRB peut également se faire via des communications orales ou affichées

lors de séminaires ou de colloques professionnels et scientifiques, fréquentés par les utilisateurs potentiels des ressources hébergées. Les communications peuvent porter sur l'activité générique du CRB et les services qu'il offre (communications généralement effectuées par un représentant du CRB), mais également sur la mise en valeur de travaux de recherche réalisés sur les ressources du CRB (communications réalisées par le/les utilisateur(s) des ressources). De la même manière, la promotion des ressources/services du CRB peut passer par la publication d'articles dans des revues techniques ou professionnelles, mais également par des articles scientifiques qui mettent en avant les ressources/services du CRB mobilisés par les utilisateurs. Dès lors, on voit qu'il est important que les ressources biologiques/services soient clairement reliés au CRB. Il est primordial que les ressources utilisées soient citées par l'identifiant unique attribué par le CRB d'appartenance. De même, lors de la délivrance des ressources/services, le CRB peut demander expressément d'être cité, par exemple dans les remerciements ou, en fonction de la contribution aux travaux de recherche, dans les auteurs de la communication/publication. Pour améliorer la visibilité du CRB, une demande de DOI (digital object identifier) peut être faite. Le numéro DOI est un identifiant numérique qui permet au CRB d'être identifié, référencé et cité de manière unique, en l'associant à des métadonnées qui le caractérisent. La demande de DOI peut se faire auprès de la Commission Nationale des Unités expérimentales (CNUE), service dédié aux structures de recherche uniquement labellisées ISC. Cependant, face à la demande croissante, des discussions sont en cours au niveau d'INRAE pour apporter une offre adaptée à toutes les structures, hors ISC.

## Réseaux

Un autre moyen d'améliorer la visibilité du CRB consiste à intégrer des réseaux de collections nationaux et/ou internationaux. Ces réseaux offrent généralement une vitrine numérique sur les ressources/services du CRB. Ils sont en général spécifiques au type de ressources hébergées par le CRB et peuvent afficher les ressources du CRB dans un catalogue en ligne dédié. C'est le cas, par exemple, pour les ressources microbiennes de la World Federation of Culture Collection (WFCC, http://www.wfcc.info/index.php/home/). Cette organisation recense, à ce jour, 131 collections de microorganismes issues de 49 pays. Les ressources de ces collections sont accessibles et consultables sur un catalogue en ligne qui regroupe plus de 480 000 accessions. On peut également citer, pour les ressources végétales, l'European Search Catalogue for Plant Genetic Resources (EURISCO ; https://eurisco.ipk-gatersleben.de) qui recense
au niveau européen les ressources phytogénétiques destinées à la recherche, et qui fournit des informations sur plus de 2 millions d'accessions de plantes cultivées et de leurs parents sauvages, préservés ex situ par près de 400 instituts. On peut également citer, pour les ressources génétiques, le Global Genome Biodiversity Network (GGBN ; (http://www.ggbn.org), un réseau international constitué de 95 membres, qui recouvre plus de 5,7 millions d'accessions. Outre ces réseaux spécifiques à une catégorie de ressources, il existe des infrastructures telles que l'infrastructure nationale des CRB Agronomiques RARe qui rassemble cinq réseaux de CRB conservant les ressources génétiques, génomiques et biologiques issues de la recherche sur les animaux domestiques, les plantes modèles ou cultivées, les espèces sauvages apparentées aux espèces domestiques, les arbres forestiers, les micro-organismes d'intérêt agronomique ou agro-alimentaire, les micro-organismes et organismes de l'environnement. Cette infrastructure regroupe plus de 30 CRB qui relèvent de différentes tutelles (INRAE, CIRAD, IRD, CNRS) ; elle offre, par le biais de ses différentes actions, le moyen d'améliorer la visibilité française des ressources biologiques hébergées par les CRB qui la constituent et de faciliter leur utilisation par un grand nombre de chercheurs, de la communauté agronomique comme d'autres communautés, au niveau national comme européen.

## Autres supports

Enfin, tous les outils usuels de communication non numériques (dépliant, plaquette, flyer, brochure, affiches...) peuvent être utilisés. Ces médias dits « palpables » facilitent la mémorisation des informations, l'imprimé étant désormais considéré comme un complément à part entière du numérique. Il peut être utilisé comme un « média d'appel » pour attirer l'attention de l'utilisateur et l'orienter vers le site web. Le type de support, qui relève de la stratégie de communication du CRB, devra être choisi au regard du profil des utilisateurs et des moyens de diffusion.

## Outils administratifs

Ces outils doivent permettre de garantir que la distribution de la ressource ou du service satisfait aux prescriptions spécifiques requises par les réglementations nationales et internationales applicables ; ainsi, une commande ne peut être acceptée si tous les documents qui doivent l'accompagner n'ont pas été complétés, signés et renvoyés. Le principe de confidentialité doit être respecté et s'applique à toutes les demandes de distribution de ressources ou de services. Certaines données collectées auprès des utilisateurs peuvent être utilisées pour produire des statistiques sur les activités du CRB, mais sans possibilité d'identification du client, et doivent respecter la réglementation relative à la gestion des données personnelles, en accord avec la réglementation nationale et européenne en vigueur.

La mise en place d'outils administratifs permet un meilleur suivi des demandes des utilisateurs et facilite la communication avec ces derniers.

Parmi ces outils, nous pouvons distinguer : 1/ les outils qui sont diffusés auprès des l'utilisateur et qui permettent de renseigner et de valider les différentes étapes de sa demande et 2/ les outils uniquement destinés au CRB pour la bonne gestion du suivi de la demande utilisateur. Ces derniers devront être adaptés aux modalités de fonctionnement, au nombre de sollicitations et au type de ressources du CRB considéré. Les tableaux 1 et 2 détaillent les outils les plus fréquemment rencontrés. Il est possible que l'activité de certains CRB requiert des outils plus spécifiques qui seront alors à développer à façon par le CRB.

## Outils réglementaires liés à la gestion des ressources et des données

### Outils réglementaires liés à la gestion des ressources

Dans le cas de la diffusion de ressources biologiques, le CRB doit fournir à minima les informations suivantes aux utilisateurs des ressources : l'identifiant de la ressource et son numéro de lot, les instructions relatives à sa mise en œuvre, une fiche signalétique de sécurité le cas échéant, un accord de transfert de matériel et éventuellement une fiche d'accusé de réception du matériel (lignes directrices OCDE).

La distribution, l'utilisation et le dépôt des ressources biologiques sont réglementés à différents niveaux : international, européen ou encore national. Ces réglementations peuvent être d'ordre très général, comme la réglementation liée à la loi sur l'accès au partage des avantages pour les ressources biologiques (https://absch.cbd.int/), ou très spécifique selon la nature des ressources considérées comme, par exemple, les ressources relevant de la réglementation sur les organismes génétiquement modifiés, les ressources relevant du Traité International sur les Ressources Phytogénétiques pour l'Alimentation et l'Agriculture (TIRPAA) ou les organismes à double usage ou de quarantaine.

Les points de vigilance ne sont donc pas les mêmes selon les ressources et selon l'utilisation qui en sera faite par l'utilisateur (diffusion ou non, recherche académique, recherche et développement...). Les différents outils mis en œuvre doivent permettre de spécifier aux utilisateurs, de manière
## Tableau 1 : Outils administratifs à destination du client

<table><thead><tr><td>DOCUMENTS</td><td>DESCRIPTIFS</td><td>SUPPORTS</td></tr></thead><tbody><tr><td>Conditions tarifaires</td><td>Il est nécessaire d'établir un document qui affiche sans ambiguïté les conditions tarifaires pour tous les services proposés, qu'il concerne la diffusion de ressources ou la réalisation de prestations de services. Ces conditions tarifaires doivent faire l'objet d'une mise à jour régulière et respecter les règles institutionnelles dictées par la/les tutelle(s).</td><td>Établi selon la trame documentaire du CRB, dans le respect des règles établies par les tutelles.<br/>Peut être affiché sur le site WEB, catalogue en ligne ou fourni à la demande.</td></tr><tr><td>Devis</td><td>Dans le cas de demande d'accès ou de prestations spécifiques, la demande de l'utilisateur peut nécessiter d'établir un devis. Il devra détailler les services fournis à l'utilisateur et leur coût. L'établissement du devis doit respecter les règles institutionnelles dictées par la/les tutelle(s).<br/>Un accord formel sur devis est nécessaire pour pouvoir délivrer le service.</td><td>Établi selon la trame documentaire du CRB, dans le respect des règles établies par les tutelles.<br/>Confidentiel.</td></tr><tr><td>Bon de commande</td><td>Le bon de commande permet de valider officiellement la demande du client, les tarifs en vigueur, les prestations demandées.</td><td>Cela peut être la trame de bon de commande du CRB ou un bon de commande édité par le client.<br/>Dans tous les cas, le tampon de l'entreprise et une signature du client devra être présente pour faciliter la facturation, ainsi que les numéros SIRET/SIREN/ TVA au besoin.<br/>Confidentiel.</td></tr><tr><td>Bon de livraison</td><td>Dans le cas de la diffusion de ressources biologiques, un bon de livraison accompagnera ces dernières, précisant la liste détaillée des ressources délivrées, le montant global de la commande, les dates d'envoi, les adresses de facturation et de livraison ...</td><td>Établi selon la trame documentaire du CRB, dans le respect des règles établies par les tutelles.<br/>Confidentiel.</td></tr><tr><td>Rapport de prestations</td><td>Dans le cas d'une prestation de service, le rapport permettra de formaliser et de rendre compte de la prestation réalisée. Le niveau de détail du rapport de prestation relève d'un choix propre à chaque CRB en concertation avec ses utilisateurs, la finalité étant que ces derniers soient satisfaits du service rendu.</td><td>Établi selon la trame documentaire du CRB.<br/>Confidentiel.</td></tr><tr><td>Facture</td><td>La facture reprend, pour le client, la description du service réalisé (diffusion de souches, prestations de service). Elle indique le montant total ainsi que la procédure et les coordonnées bancaires pour régulariser ladite facture.</td><td>Établi par le CRB ou le gestionnaire de l'Institut dont il dépend.<br/>Confidentiel.</td></tr></tbody></table>

## Tableau 2 : Outils administratifs à destination du CRB

<table><thead><tr><td>DOCUMENTS</td><td>DESCRIPTIFS</td><td>SUPPORTS</td></tr></thead><tbody><tr><td>Fichier de suivi des demandes</td><td>Dans le cas de diffusion de souches, prestations de services, dépôts de souches, le CRB doit disposer d'un outil de suivi des diffusions et/ou des services réalisés. Ce dernier peut être au format papier ou numérique. Il reprend à minima les coordonnées du client, la nature de la demande, les dates de suivi et le montant facturé, auxquels s'ajouteront toutes informations que le CRB jugera utiles au bon suivi et à la réalisation de la demande. Une codification peut être mise en place pour un suivi rapide des services délivrés. Cette codification doit idéalement apparaître sur l'ensemble des documents diffusés auprès des utilisateurs (bon de commande, devis, bon de livraison, facture...) pour permettre un suivi efficace de toutes les étapes, de la demande jusqu'à sa facturation.<br/>Exemple :<br/>• RB-2020-19 : diffusion de Ressources Biologiques - en 2020 - N°19.<br/>• PS-2020-2 : Prestation de Service - en 2020 - N°2<br/>NB 1 : Il peut être intéressant, pour le CRB, de tracer aussi les demandes n'ayant pas abouti, ainsi que les raisons du non-aboutissement, dans un but d'amélioration des services.<br/>NB 2 : Ce suivi interne facilitera les bilans demandés dans le cadre d'une démarche qualité ou le suivi des indicateurs requis par certaines instances (CNOC, IBISA, RARe, MESRI, ...).</td><td>Établi selon la trame documentaire du CRB, dans le respect des règles établies par les tutelles.<br/>Peut être affiché sur le site WEB, catalogue en ligne ou fourni à la demande.</td></tr><tr><td>Outil de planification</td><td>La mise à disposition de la ressource ou la réalisation du service doit être planifiée en intégrant à la fois la disponibilité du personnel et celle des équipements.</td><td>Format numérique ou papier.<br/>Tableur de type Excel.<br/>Enregistrement au format papier ou informatique, logiciels spécifiques (AQ tool, GMAO, Gantt...).</td></tr><tr><td>Fichier de suivi de la satisfaction clients</td><td>Dans une démarche d'amélioration continue et plus globalement d'une démarche qualité, il est nécessaire d'évaluer la satisfaction du client. C'est une obligation pour les CRB certifiés selon les normes ISO-9001 et/ou ISO-20387.<br/>Le suivi de la satisfaction client peut s'effectuer via le fichier de suivi des demandes utilisateur mentionné ci-dessus ou bien faire l'objet d'un suivi spécifique dans un fichier dédié.<br/>Voir § Outils pour le recueil des besoins des clients et l'évaluation de leur satisfaction.</td><td>Établi selon la trame documentaire du CRB.<br/>Confidentiel.</td></tr></tbody></table>
Claire, les règles en vigueur et garantir que ces règles soient respectées. La figure 1 reprend, de manière non exhaustive, les principaux types de documents qui peuvent être mis à disposition ou échangés avec les utilisateurs pour garantir le respect de la réglementation en vigueur et la bonne gestion de la propriété intellectuelle associée aux ressources distribuées ou déposées dans le CRB. À ces documents, peuvent s'ajouter des documents spécifiques à certains types de ressources biologiques, à charge pour chaque CRB de bien connaître, via une veille réglementaire adaptée, la réglementation en vigueur concernant les ressources qu'il héberge et distribue.

## Cas particulier du Material Transfert Agreement (MTA)

selon les prescriptions OCDE relatives aux CRB, aucun échange de matériel biologique ne peut se faire sans émission d'un MTA, condition essentielle pour protéger les droits de propriété intellectuelle et obligatoire si la loi l'exige. Ces accords sont utilisés pour relayer les prescriptions du dépositaire, du propriétaire de ressources et/ou du pays d'origine concernant l'utilisation de la ressource. Le MTA spécifie, pour les ressources considérées, qui en est le propriétaire et/ou dépositaire. Il indique les coordonnées du demandeur et de la structure dont il dépend. L'utilisation devant être faite sur la/les ressource(s) doit être spécifiée clairement ainsi que les contraintes et limites d'utilisation. Pour les ressources microbiennes, un core-MTA est disponible sur le site de l'European Culture Collection Organization (https://www.eccosite.org/ecco-core-mta/). Mais il existe également des trames institutionnelles. INRAE a ainsi mis à disposition des CRB et utilisateurs des ressources biologiques deux versions modèles de MTA, une française et une anglaise à l'adresse suivante : https://sites.inrae.fr/site/maj/APA/SitePages/Documents-types.aspx.

Dans certains cas de partenariats ou de collaborations de recherche avec des partenaires académiques et/ou privés, mobilisant un nombre important de ressources ou qui requièrent des modalités de mise en œuvre particulières, la diffusion des ressources peut faire l'objet d'une contractualisation spécifique (Contrat de partenariat, contrat de criblage, accord de consortium...). À charge pour le CRB de se rapprocher des services juridiques et/ou de partenariat relatifs à sa tutelle de rattachement pour contractualiser le partenariat.

## Outils Réglementaires liés à la gestion des données

Le terme « données », dans le cadre d'une activité de CRB, recouvre : i) la documentation qualité utile au bon fonctionnement des activités du CRB et à une bonne traçabilité (Processus, Procédure, Mode-Opératoire, Enregistrement...); ii) les données décrivant les ressources biologiques hébergées et leurs origines; iii) les données personnelles concernant les utilisateurs des ressources et/ou de services et, enfin, iv) les données liées au management des ressources humaines du CRB. Dans le cadre des outils liés à la relation client, nous détaillerons uniquement les données « utilisateurs ».

Pour le bon suivi des diffusions de ressources biologiques et prestations de services, le CRB est amené à collecter diverses informations dites « sensibles ». Il s'agit de données relatives à l'identité de l'utilisateur (civilité, nom, prénom,

<figure><img src="image_108.png" /><figcaption>Figure 1. Exemples de documents nécessaires à la gestion des ressources biologiques, de leur acquisition à leur diffusion et valorisation.</figcaption></figure>
adresse, numéro de téléphone, adresse électronique, adresse de livraison...), mais aussi des données relatives aux paiements, comme les coordonnées bancaires ou l'adresse de facturation. À ce titre, les CRB doivent répondre aux exigences de la commission nationale de l'information et des libertés (CNIL), en respectant le règlement général sur la protection des données (RGPD) et en mettant en place un plan de gestion des données personnelles. Pour se faire, les CRB peuvent s'appuyer au niveau institutionnel sur leur référent CNIL. À INRAE, une page WEB (https://intranet.inrae.fr/donnees-personnelles/) est spécifiquement dédiée à la gestion des données personnelles et propose un certain nombre d'outils et de documents pour se mettre en conformité.

## Outils pour le recueil des besoins utilisateur et l'évaluation de sa satisfaction

Les CRB distribuant des biens et des services se doivent, dans un premier temps, de déterminer quels sont les besoins de leurs utilisateurs et, ensuite, de s'assurer de leur satisfaction, une fois les ressources délivrées ou le service réalisé.

### Recueillir les besoins

La première étape consiste à bien définir les besoins de ses utilisateurs. Nous distinguons 4 types de besoins : le besoin exprimé (explicite), le besoin légal, le besoin implicite et le besoin induit. Si les deux premiers sont assez simples à définir et à recueillir, les deux derniers sont, en revanche, plus difficiles à prendre en compte, car ils ne sont pas clairement exprimés.

* Le besoin exprimé : facile à prendre en compte, car est clairement défini par l'utilisateur. Par exemple, la commande d'une ressource appartenant à une espèce en particulier ou issue d'un biotope donné ou encore pour une demande de service : le rendu des résultats sous 2 semaines.

* Le besoin légal répond à une contrainte réglementaire en vigueur. Par exemple, la ressource a été collectée dans le respect de la réglementation internationale (Protocole de Nagoya) ou encore le CRB respecte la confidentialité des résultats ou de la ressource diffusée.

* Le besoin implicite. Il est évident pour l'utilisateur, mais n'est pas exprimé par ce dernier. Par exemple, un conditionnement adapté à la ressource biologique diffusée ou l'aide à l'interprétation des résultats dans le cadre d'une prestation de services.

* Le besoin induit est créé par le CRB et devient une attente pour l'utilisateur. Par exemple, une notice de

remise en culture ou d'utilisation fournie par le CRB et qui accompagne la ressource diffusée ou encore la conservation des échantillons après une prestation pour d'éventuelles analyses complémentaires.

Ces besoins peuvent être recueillis à différents niveaux :

* Directement lors de la prise de contact de l'utilisateur pour une demande spécifique de ressource biologique ou de service. Cela peut permettre de cerner, à ce moment-là, tous les besoins de l'utilisateur afin d'atteindre sa pleine satisfaction.

* En amont d'une demande, à tous les contacts du CRB, par le biais d'une enquête de besoins. Cela peut permettre de prendre connaissance de demandes futures et ainsi pouvoir mieux planifier les activités du CRB, ou de découvrir des besoins qui n'ont pas encore été identifiés. Par exemple, une catégorie de RB non présente dans le CRB, un type de conditionnement spécifique ou encore un besoin pour une prestation qui n'est pas encore proposée par le CRB.

Le plus difficile est sans doute de recueillir les besoins d'utilisateurs potentiels qui n'ont pas encore sollicité le CRB et pour lesquels nous n'avons pas les contacts. Le réseau professionnel prend ici toute son importance. En effet, la participation à des réseaux métiers, à des congrès et séminaires peut permettre d'identifier ces utilisateurs potentiels et éventuellement de les interroger sur leurs besoins.

Les outils pour recueillir les besoins peuvent être assez simples. Il peut s'agir d'enquêtes formelles, sous forme papier, électronique, téléphonique, ou encore informelles lors, par exemple, de réunions de travail ou de séminaires. L'enjeu réside dans la construction de ces enquêtes, quel qu'en soit le support, pour recueillir de manière exhaustive l'ensemble des besoins de l'utilisateur, y compris les besoins implicites. Le recueil de ces besoins devra être formalisé et enregistré par le CRB.

### Évaluer la satisfaction

Que l'on soit ou non certifié, suivre la satisfaction des utilisateurs permet d'être dans une démarche d'amélioration continue. Il s'agit ici d'évaluer la satisfaction de l'utilisateur après la diffusion de ressources biologiques ou la réalisation d'un service. Si l'utilisateur se dit satisfait c'est que l'ensemble de ses besoins a bien été perçu et pris en compte. L'évaluation de la satisfaction client est un impératif de la norme ISO-9001:2015. Ainsi, selon le paragraphe 9.1.2 de cette norme « L'organisme doit surveiller la perception des clients sur le niveau de satisfaction de leurs besoins et attentes. L'organisme doit déterminer les méthodes permettant d'obtenir, de surveiller et de revoir ces informations ».
Les méthodes permettant de recueillir cette satisfaction sont diverses. Le recueil peut se faire sous forme d'enquêtes (papier, e-mail, questionnaires en ligne, enquête téléphonique), mais également par le biais de rencontres avec les utilisateurs (réunions d'utilisateurs, séminaires...). Là encore, le recueil de la cette satisfaction client devra être formalisé et enregistré par le CRB.

Suite au recueil de cette satisfaction, le CRB devra trouver l'outil qui, en fonction de sa taille, son organisation, la typologie de ses utilisateurs, lui permettra un suivi efficace de la satisfaction de ses utilisateurs. Cet outil devra permettre une traçabilité de tous les échanges entre le CRB et ses utilisateurs et des décisions prises et actions mises en œuvre suite au retour de la satisfaction client. Il existe, à ce jour, plusieurs outils plus ou moins spécifiques : tableurs, logiciels commerciaux tels que MANTIS ou des outils qualité développés par des unités CIRAD ou INRAE comme AQ-Tool ou Gimaco. (http://golo.cirad.fr/FR/CRB_T_AQTools.awp ; http://cnrgv.toulouse.inra.fr/fr/Equipement/Ressources-informatiques/Au-sujet-de-GIMACO).

## Gérer les éventuelles réclamations

Malgré tout le soin pris par le CRB à satisfaire au mieux les besoins de ses utilisateurs, il peut arriver qu'il y ait des réclamations. Que ce soit la norme ISO 9001 ou les recommandations de l'OCDE, toutes exigent la prise en compte et le suivi de ces réclamations. Ainsi, selon les Lignes directrices de l'OCDE relatives aux pratiques exemplaires concernant les CRB, « le CRB doit tenir un registre de toutes les questions ou plaintes des utilisateurs et, dans toute la mesure du possible, en accuser réception par retour ou le jour même par télécopie, téléphone ou courrier électronique » (paragraphe 12.7.1) et « le CRB doit

étudier les plaintes dès réception et mettre en œuvre les actions correctives nécessaires. Toutes les plaintes doivent être prises en compte dans des analyses de tendances effectuées de façon régulière » (paragraphe 12.7.2). Tout comme pour le suivi de la satisfaction client, le CRB devra trouver l'outil adapté, les outils possibles étant globalement les mêmes que ceux cités précédemment.

## Conclusion

Les moyens de communiquer et d'échanger des informations avec les utilisateurs des ressources et/ou des services délivrés par les CRB sont nombreux. La grande majorité de ces moyens sont génériques et ne sont pas liés à la nature des ressources biologiques et/ou des services délivrés ni même au « métier » de CRB. Pour être réellement utiles et fonctionnels, ils doivent être choisis avec pertinence et éventuellement adaptés à l'activité de chaque CRB. Cela demande en prérequis que les CRB aient clairement défini leur stratégie de diffusion des ressources et/ou de services, mais également qu'ils aient bien identifié la nature de leurs utilisateurs. S'il n'y pas de règle consensuelle quant au choix de ces outils, l'application des principes relatifs à la norme ISO 9001 ou ISO 20387 ainsi que les lignes directrices de l'OCDE relatives aux pratiques exemplaires concernant les centres de ressources biologiques sont une aide précieuse pour le choix et la hiérarchisation de ces outils. Sont également disponibles, auprès des Instituts auquels sont rattachés les CRB, des outils WEB, des trames des bases documentaires qui peuvent considérablement aider les CRB dans le déploiement des outils de suivi de la relation client.

<figure><img src="image_109.png" /></figure>
## Abréviations

ABSCH : Access and Benefit-Sharing Clearing-House

CNIL : Commission nationale de l'informatique et des libertés

CNOC : Commission Nationale des Outils Collectifs

CNUE : Commission Nationale des Unités Expérimentales

CRB : Centre de Ressources Biologiques

DOI : Digital Object Identifier

GMAO : Gestion de Maintenance Assistée par Ordinateur

IBISA : Infrastructure en Biologie, Santé et Agronomie

ISC : Infrastructure Scientifique Collective

MESRI : Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation

MOT : Micro-Organismes et Toxines hautement pathogènes

MTA : Materiel Transfert Agreement

OGM : Organisme Génétiquement Modifié

TIRPAA : Traité International sur les Ressources Phytogénétiques pour l'Alimentation et l'Agriculture

RARe : Ressources Agronomiques pour la Recherche

RGPD : Règlement Général sur la Protection des Données

## Références

AqTools. http://golo.cirad.fr/FR/CRB_T_AQTools.awp

Billé J. & Soparnot R., 2006. La gestion de la relation client ou customer relationship management, une source d'innovation : Le cas de la banque Société Générale. La Revue des Sciences de Gestion, 1(1), 101-110. https://doi.org/10.3917/rsg.217.0101.

BioAware. https://www.bio-aware.com/page/Home.

European Search Catalogue for Plant Genetic Resources. EURISCO : https://eurisco.ipk-gatersleben.de.

Gimacco. http://cnrgv.toulouse.inra.fr/fr/Equipement/Ressources-informatiques/Au-sujet-de-GIMACO.

Global Genome Biodiversity Network GGBN. http://www.ggbn.org.

LabCollector. http://www.labcollector.com/.

Normes ISO 9001:2015 Systèmes de management de la qualité – Exigence. https://www.iso.org/fr/standard/62085.html)

Norme ISO 20387/2018 Biotechnologie->biobanking»- Exigences générales au « biobanking ». https://www.iso.org/fr/standard/67888.html.

OECD. Best Practice Guidelines for Biological Resource Centres (2007) (https://www.oecd.org/sti/emerging-tech/38777417.pdf).

Sites EZpublish et EZplateforme. https://www6.inrae.fr/scem-docenligne/Structurer-votre-site/Sites-cle-en-main.

World Federation of Culture Collection. WFCC http://www.wfcc.info/index.php/home/

<figure><img src="image_110.png" /></figure>

Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Présentation du portail d'accès aux ressources biologiques du pilier animal de RARé

Sylvain MARTHEY<fnref n="1" />

Aurélie DELAVAUD<fnref n="2" />

Nicolas MARTHEY<fnref n="3" />

Camille MÉAL<fnref n="4" />

Michèle Tixier-BOICHARD<fnref n="3" />

## CORRESPONDANCE

sylvain.marthey@inrae.fr

aurelie.delavaud@fondationbiodiversite.fr

## RÉSUMÉ

Le portail web https://crb-anim.fr/access-to-collection/# a été élaboré entre 2015 et 2017 grâce au soutien du projet Investissements d'Avenir CRB-Anim. Il permet de consulter le catalogue des collections de 5 CRBs concernant les espèces animales domestiques, de gérer les demandes d'entrée ou de sortie d'échantillons et d'accéder aux données associées. Cet article présente les étapes de la création du portail : définition des descripteurs standard, spécificités fonctionnelles et sélection d'un prestataire après appel d'offres, développement du portail, réalisation de connecteurs pour alimenter le portail. Depuis son ouverture en 2017, le portail est maintenu en amélioration continue.

## MOTS-CLÉS

Système d'information, mammifères, oiseaux, poissons, coquillages, accès aux ressources génétiques.

<footnote n="1">1 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, UMR GABI, Jouy-en-Josas, "affiliation actuelle UR MalAGE.</footnote>

<footnote n="2">2 Fondation pour la recherche sur la biodiversité (FRB), Paris.</footnote>

<footnote n="3">3 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, UMR GABI, Jouy-en-Josas.</footnote>

<footnote n="4">4 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, UMR GABI, Jouy-en-Josas, "affiliation actuelle US CTIG.</footnote>
# Presentation of the biological resource access portal of the RARe's animal division

Sylvain MARTHEY<fnref n="1" />

Aurélie DELAVAUD<fnref n="2" />

Nicolas MARTHEY<fnref n="3" />

Camille MÉAL<fnref n="4" />

Michèle Tixier-BOICHARD<fnref n="3" />

## CORRESPONDENCE

sylvain.marthey@inrae.fr

aurelie.delavaud@fondationbiodiversite.fr

## ABSTRACT

The web portal https://crb-anim.fr/access-to-collection/# was developed between 2015 and 2017 thanks to support from the project Investments in the Future BRC-Anim. It allows consulting the catalogue of the collections of 5 BRCs concerning domestic animal species, managing demands for introducing and withdrawing samples, and access to associated data. This article presents the steps of developing the portal: the definition of standard descriptors, functional specificities and the selection of a service provider following a call for tenders, the development of the portal, and the creation of links to fuel the portal. The portal has been continuously improved since it was opened in 2017.

## KEYWORDS

Information system, mammals, birds, fish, shellfish, access to genetic resources.

<footnote n="1">1 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, UMR GABI, Jouy-en-Josas, "affiliation actuelle UR MalAGE.</footnote>

<footnote n="2">2 Fondation pour la recherche sur la biodiversité (FRB), Paris.</footnote>

<footnote n="3">3 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, UMR GABI, Jouy-en-Josas.</footnote>

<footnote n="4">4 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, UMR GABI, Jouy-en-Josas, "affiliation actuelle US CTIG.</footnote>
## Introduction

Le pilier animal de RARe s'est développé à partir du projet d'infrastructure nationale en biologie et santé « CRB-Anim », lauréat du programme Investissements d'Avenir en 2011. L'appel d'offres de ce programme précisait qu'une infrastruc- ture nationale devait avoir un guichet unique centralisant l'accès à ses services. Le projet « CRB-Anim » déposé en 2011 proposait donc de mettre en place un portail d'accès aux ressources de tous les CRBs disposant de ressources biolo- giques pour les animaux domestiques, dans le cadre de son WP4. L'ouverture du portail constituait un des livrables du projet, dont la réalisation est suivie par l'ANR depuis 2012. L'analyse de la diversité des systèmes d'information locaux, propres à chaque CRB, a vite conduit à la conclusion qu'il n'était pas réaliste d'imposer un même système local à cha- cun, l'effort à produire paraissait trop important au regard de la solution d'un portail commun, important les données «à façon» de chaque CRB. Nous nous sommes inspirés pour cela de la solution retenue par l'infrastructure Biobanques des CRBs humains, confrontée à une diversité encore plus grande des systèmes d'information locaux.

Étant donné la diversité des espèces animales et des maté- riels biologiques concernés, la première étape a consisté à définir les descripteurs communs qui seraient accessibles sur le portail. La deuxième étape a été de préciser les spé- cificités fonctionnelles et de rédiger un cahier des charges permettant la sélection d'un prestataire informatique. La troisième étape a vu le développement du portail propre- ment dit et de la base de données associée. La quatrième étape a consisté à développer les outils d'importation des données des CRBs individuels vers la base de données commune, accessible par le portail. Les différentes étapes ont été pilotées par Aurélie Delavaud et Sylvain Marthey et ont mobilisé plusieurs instances de l'infrastructure : son conseil de gouvernance, ses groupes d'experts par espèces, son conseil scientifique et son comité consultatif interna- tional. Le portail a été créé en code ouvert, de façon à per- mettre à l'infrastructure de garder la main sur les évolutions ultérieures. Le portail a été ouvert en septembre 2017 et continue d'évoluer.

## Développement

### Minimum data set : année 2015

L'objectif est de décrire les ressources biologiques de façon assez standardisée pour faciliter leur recherche, et de façon assez complète pour répondre aux besoins d'un nombre maximal d'utilisateurs. Cela suppose que les fournisseurs

de ressources soient capables de fournir ces informations lors de l'entrée en collection. Il y a donc un compromis à trouver entre le travail de documentation demandé au déposant d'une ressource et la richesse des données per- mettant d'attirer les utilisateurs. C'est pourquoi une liste très complète de descripteurs a été élaborée, mais seul un sous-ensemble limité a été rendu obligatoire à l'entrée en collection. La définition de ce référentiel de description a été réalisée :

* **En tenant compte des besoins des utilisateurs** : un document « aide au recueil des besoins fonctionnels et non fonctionnels pour la mise en place du système d'information » a été établi et renseigné par les CRBs ou les groupes espèces ayant une expérience avec des demandes d'entrées / sorties d'échantillons (IFCE, CRB CARARE des Antilles, Cani-DNA, groupe espèce Volailles). Il a été accompagné d'entretiens téléphoniques, afin de conforter la compréhension commune du projet et de préciser les besoins sur les thèmes suivants : objectifs du portail, utilisateurs et périmètre, liens avec d'autres sys- temes d'information, fonctionnalités nécessaires et des- cription du « workflow » de gestion des requêtes d'entrée ou de sortie d'échantillons, cas et exemples d'utilisation, contraintes à prendre en compte.

* **En concertation avec les groupes espèces (GE)** : une première proposition de « minimum dataset » a été transmise aux représentants des groupes espèces, puis travaillée à distance ; celle-ci a été re-travaillée avec l'en- semble des groupes espèces (Volailles, Carnivores, Pois- sons, Équins, Porcins, Lapins) lors de deux réunions, puis, des échanges ultérieurs spécifiques ont permis d'affiner cette liste en tenant compte des spécificités des espèces (Équins, Poissons) et d'anticiper les informations collec- tées par les CRBs pour l'entrée en Cryobanque nationale.

* **En tenant compte d'un standard international afin de permettre l'interopérabilité entre les systèmes d'information et le versement des échantillons dans des bases internationales** : il s'agit en particulier des pré-requis du BioSamples Database (BioSD) de l'Euro- pean Bioinformatics Institute (EBI).

* **En tenant compte de la réglementation européenne qui s'applique aux CRB** : intégration des informations requises par le règlement européen n°511/2014 du parlement européen et du conseil relatif aux mesures concernant le respect par les utilisateurs dans l'Union du protocole de Nagoya sur l'accès aux ressources gé- nétiques et le partage juste et équitable des avantages (APA) découlant de leur utilisation.

* **En tenant compte du profil de métadonnées<fnref n="9" />**

<footnote n="9">⁹ Entendues ici comme les informations décrivant une ressource (un jeu de données, une collection...): qui, quoi, où, quand, comment, pourquoi.</footnote>
RGscope / ECOSCOPE (devenu depuis Pôle National de Données sur la Biodiversité, PNDB) afin de permettre l'interopérabilité entre les systèmes d'information : les informations du « minimum dataset » de CRB-Anim correspondant aux grandes catégories « qui, quoi, quand, où, comment, pourquoi » permettent de décrire des jeux de données, voire des collections, dans le PNDB. Ces métadonnées sont basées sur le standard international Ecological Metadata Language (EML) développé par le réseau international pour la recherche en environnement et écologie Knowledge Network for Biocomplexity (KNB).

À l'issue de ces consultations, et en conformité avec ces pré-requis, le « minimum dataset » comprend 90 champs descripteurs dont 37 obligatoires. Les champs couvrent 1/ la description de l'animal (qui peut être un embryon) et les données associées ; 2/ la description de l'échantillon et les conditions d'accès et d'utilisation ; 3/ les informations réglementaires sur le déposant ; 4/ la description du CRB et du contact.

Autre étape de l'harmonisation des informations, pour chaque champ descripteur, les valeurs possibles ont été rattachées à des référentiels et des standards nationaux ou internationaux lorsque cela était possible (identifiants na-

tionaux des animaux, taxonomie NCBI, Animal Trait Ontology (ATOL), ontologies des parties de l'organisme (UBERON, BRENDA), NCBI EFO, MIABIS, INRA...). D'autres valeurs ont fait l'objet d'un effort d'homogénéisation dans certains groupes espèces, notamment pour la description des races ou des lignées.

Le « minimum dataset » a été présenté dans sa forme préliminaire lors du séminaire scientifique international du 09/02/2015 et validé par le Conseil de Gouvernance du 14/06/2015.

## Spécificités fonctionnelles et choix du prestataire : années 2015-2016

Un livrable du projet a rassemblé la liste des fonctionnalités attendues pour le portail web qui sont résumées ci-dessous :

* Gestion centralisée des échantillons biologiques des différents CRB

* fournir l'information sur la nature et la disponibilité des collections ;

* inclure la possibilité de liens vers des publications ou d'autres bases de données ;

<table><caption>Tableau 1 : Catégories de descripteurs et nombre de descripteurs obligatoires constituant le « minimum dataset »</caption><thead><tr><th>CATÉGORIE</th><th>SOUS-CATÉGORIE</th><th>NOMBRE DE DESCRIPTEURS</th><th>NOMBRE DE DESCRIPTEURS OBLIGATOIRES</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="9">Animal</td><td>Identification et généalogie</td><td>8</td><td>5</td></tr><tr><td>Espèce, race et lignée</td><td>12</td><td>3</td></tr><tr><td>Statut sanitaire</td><td>2</td><td>1</td></tr><tr><td>Type(s) de maladie(s) connue(s)</td><td>4</td><td>0</td></tr><tr><td>Phénomène</td><td>6</td><td>0</td></tr><tr><td>Environnement</td><td>7</td><td>0</td></tr><tr><td>Pays d'origine de l'animal prélevé (APA)</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Informations complémentaires</td><td>3</td><td>0</td></tr><tr><td rowspan="7">Échantillon</td><td>Identification</td><td>3</td><td>1</td></tr><tr><td>Motif et date d'entrée en collection</td><td>2</td><td>2</td></tr><tr><td>Date de prélèvement (APA)</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Partie de l'organisme, nature (APA)</td><td>6</td><td>2</td></tr><tr><td>Préparation, Conditionnement</td><td>10</td><td>4</td></tr><tr><td>Contrôle qualité appliqué</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Protocole d'utilisation</td><td>1</td><td>0</td></tr><tr><td></td><td>Informations complémentaires, notamment sur le projet de recherche associé</td><td>5</td><td>1</td></tr><tr><td></td><td>Conditions d'accès (APA)</td><td>1</td><td>1</td></tr><tr><td>Déposant</td><td>Identification informations administratives, délégataire MTA (non publié sur le portail)</td><td>8</td><td>7</td></tr><tr><td>CRB</td><td>Identification, délégataire MTA (non publié)</td><td>8</td><td>7</td></tr></tbody></table>
* Point d'entrée unique des demandes

* permettre à un utilisateur de faire une demande d'information, une demande d'entrée ou une demande de sortie d'échantillon(s);

* permettre aux CRBs de traiter les demandes les concernant, et d'interagir directement avec le demandeur;

* lier les étapes d'entrée ou de sortie des échantillons à la signature d'un accord de transfert de matériel, (MAA pour l'entrée en collection, MTA pour la sortie de collection);

* enregistrer les étapes d'expédition et de réception;

* recueillir l'évaluation du portail par l'utilisateur après chaque transaction terminée;

* Gestion du portail

* gérer les comptes utilisateurs;

* gérer les tables de référence pour la description des collections;

* permettre l'élaboration d'indicateurs d'activité de l'infrastructure.

Un point important a été de définir le niveau d'information accessible à tout public alors que l'intégralité des informations présentes n'est accessible qu'aux utilisateurs authentifiés. Cette distinction devait être bien visible sur le portail, afin d'inciter les utilisateurs à s'authentifier. L'objectif est double : permettre aux CRBs de connaitre leur public et rassurer les fournisseurs d'échantillons sur la diffusion des informations associées à leurs échantillons.

Lors des différents ateliers mis en place pour réaliser cette tâche, plusieurs difficultés ont émergé : difficulté à réunir l'ensemble des parties prenantes concernées par les ateliers ; à faire émerger une solution consensus satisfaisant tous les intervenants ; à trouver et à mobiliser certains experts ; à mobiliser les parties prenantes sur la lecture et la validation des spécifications proposées.

Malgré ces difficultés, l'implication des WP leaders et de la coordinatrice du projet dans l'animation continue de cette tâche a permis d'arriver à la définition d'un périmètre fonctionnel exhaustif et très détaillé, comprenant la modélisation des différents processus métiers. Le résultat de ce travail et ces spécifications fonctionnelles ont ensuite pu être validées par le conseil de gouvernance.

En plus des spécifications fonctionnelles, les spécifications non fonctionnelles et techniques (modèle de données, prototypes d'interfaces, etc.) ont également été effectuées par l'informaticien INRA.

L'organisation, la validation et la mise en forme de toutes ces informations au sein d'un cahier des charges ont été réalisées en collaboration avec une cheffe de projet informatique à l'IDELE. L'implication d'un consultant expert, externe au projet, a permis de vérifier la lisibilité et la cohérence du cahier des charges et, également, de s'assurer que celui-ci respectait les règles de l'art du domaine – essentiel dans le cadre d'un marché public.

Le cahier des charges produit (43 pages pour le document principal + 47 pages d'annexes) était très exhaustif et détaillé, aussi bien sur les aspects fonctionnels que techniques ; il répondait à tous les points d'interrogation qui auraient pu nécessiter une réflexion longue et concertée du WP4, et a ainsi permis aux prestataires de pouvoir soumettre des offres au plus proche de la réalité du besoin.

L'appel d'offres a été effectué dans le cadre d'un marché public à procédure adapté. Un dossier « BOAMP » a été rédigé en collaboration avec les services marchés et juridiques du centre INRA de Jouy-en-Josas. Ce dossier contenait le Cahier des Clauses Techniques Particulières (CCTP) dérivé du cahier des charges de départ, le Cahier des Clauses Administratives Particulières (CCAP), le Règlement de Consultation (RC) ainsi que l'acte d'engagement (AE). Une condition non négociable était que le code source soit ouvert et fourni à l'INRA à la fin de la prestation.

Ce dossier a été déposé sur le portail des marchés publiques le 15/01/2016, pour une durée de 6 semaines. Au final, 8 offres ont été déposées et des entretiens de négociation menés avec 4 soumissionnaires les 25 et 29 mars 2016. Le choix du prestataire a été réalisé en avril, et la prestation a débuté en mai 2016. L'offre de la société Key Consulting a été retenue. Elle incluait un module de formation de 21 jours de l'ingénieur informaticien INRA, point novateur et essentiel permettant d'évaluer la qualité du code du prestataire, de suivre au plus près l'adéquation entre besoins – cahier des charges – réalisation et de garder la main sur l'évolution ultérieure du portail.

Développement du portail : 2016-2017

Le portail CRB-Anim a été développé sur la période 2016-2017 dans le cadre d'une prestation de service couvrant deux volets : 1/ le développement technique des fonctionnalités requises inscrites dans le cahier des charges et 2/ la formation, de 21 jours, de l'ingénieur informaticien INRA (développeur, co-leader du WP4) aux principales technologies utilisées. Les principaux outils utilisés pour le développement du portail et la gestion des interactions avec les utilisateurs ont été AngularJS et Java, alors que la base de données a été développée avec MariaDB, un système de gestion de base de données en code ouvert.
Le développement a suivi un mode de programmation agile, avec des points réguliers où l'ingénieur informaticiel INRA et la coordinatrice de CRB-Anim devaient examiner et valider, ou réorienter, les développements faits par le prestataire. Chaque « sprint » durait 3 semaines (Figure 1). Ce rythme exigeait une grande vigilance de leur part, tout écart au cahier des charges initial pouvant donner lieu à une « évolution », facturée en sus par le prestataire. Cinq itérations étaient prévues pour la réalisation du volet 1, la sixième itération étant consacrée au volet 2. Toutefois, l'ingénieur informaticien INRA a commencé à être associé aux développements pendant le volet 1.

Différentes phases de test ont été menées avec les utilisateurs de l'application, tant au niveau recherche d'échantillons qu'à celui de la gestion des demandes par les CRBs et les groupes espèces lors de la « vérification d'aptitude au bon fonctionnement » (VABF), afin de s'assurer que la version livrée était conforme aux spécifications validées dans le cahier des charges.

Ces phases de test se sont avérées essentielles pour :

1/ Pointer les anomalies bloquantes, majeures et mineures.

2/ Identifier les fonctionnalités et améliorations à apporter au portail.

3/ Engager les partenaires de CRB-Anim et les parties prenantes du portail dans une démarche d'appropriation de l'application.

Les évolutions à apporter à l'application dans le cadre de la prestation ont été validées lors du Conseil de gouvernance du 29 novembre 2016. Le portail CRB-Anim a ensuite été présenté au Conseil de gouvernance de CRB-Anim le 10 février 2017 avec ses fonctionnalités :

* Fonctionnalités essentielles qui permettent, d'une part, de fournir des informations sur la nature et la disponibilité des échantillons biologiques gérés par les CRBs de CRB-Anim et, d'autre part, de fournir un point d'entrée unique - ainsi qu'un système de suivi - pour des demandes de renseignement sur des groupes ou des échantillons particuliers.

* Fonctionnalités spécifiques de gestion avancée des demandes de sortie et d'entrée des échantillons. Celles-ci sont ainsi gérées dans l'application : cela permet un suivi fin de l'utilisation des ressources de l'infrastructure.

À titre d'exemple, la figure 1 montre l'interface de recherche avancée. Dans le cas des utilisateurs non-authentifiés, cette interface ne donne accès qu'à un sous-ensemble des informations sur les échantillons, et les noms des CRB sont anonymisés.

La formation de l'ingénieur informaticien INRA sur les méthodes et technologies utilisées par le prestataire de service a permis : 1/ l'appropriation du code source ouvert de l'application développée et 2/ le développement de fonctionnalités hors du périmètre initialement prévu au cahier des charges mais ayant émergé des retours des utilisateurs lors des phases de test.

L'application a ainsi bénéficié d'améliorations majeures :

* Internationalisation des interfaces (anglais/français) accompagnée de l'internationalisation des données lorsque cela était possible (ontologies anglophones et référentiels francophones). Ces améliorations concourent à la visibilité et à la valorisation internationale des produits et services de CRB-Anim.

* Assignation d'un groupe espèce (experts) aux demandes d'entrée et implémentation de l'envoi de notifications lors d'actions réalisées dans l'application (évaluation d'un CRB ou du groupe espèce assigné, nouvelle demande de renseignement, etc.). Ces notifications sont essentielles pour tenir les utilisateurs du portail informés du suivi et du déroulé des étapes de leurs demandes.

* Ajout des aides contextuelles sur les interfaces simple et avancée de recherche (champ avec exemple, information sur l'origine des termes suggérés par l'auto-complétion, etc.). Ces informations orientent clairement le portail CRB-Anim vers les utilisateurs externes.

Le mode de développement mis en place, associant étroitement prestataire et ressources internes a rendu l'infrastructure CRB-Anim autonome pour la maintenance évolutives et corrective et a fourni une base pour la pérennité du système d'information.

L'ensemble des objectifs prévus ont été atteints dans les délais convenus. La version finale de l'application a été livrée en janvier 2017, suivie de la phase de « vérification d'aptitude au bon fonctionnement » (VABF). Cette période de 2 mois visait à vérifier que l'application livrée répondait bien aux spécifications établies. Lors de cette phase de VABF, des essais intensifs ont été réalisés pour tester de manière exhaustive l'ensemble des fonctionnalités de l'application - et ce sur chacune des 7 versions finalement livrées durant cette phase. Chacune des versions intégrait les correctifs relatifs aux anomalies constatées sur la version précédente.
<figure><img src="image_111.png" /><figcaption>Figure 1. Interface du portail pour la recherche avancée sur les collections</figcaption></figure>

## Alimentation du portail et vérification de service régulier : 2017-2018

Après la validation de la VABF, en mars 2017, la dernière phase de validation de l'application appelée « vérification de service régulier » (VSR) a débuté pour une durée de 3 mois. L'objectif de cette phase de test était de vérifier le bon fonctionnement de l'application en conditions d'utilisation réelle. Cette étape ne pouvait être pleinement réalisée qu'avec l'alimentation de la base de données du portail avec les données des CRBs, cela afin d'évaluer les performances du portail avec un volume de données significatif, proche de celui attendu in fine.

La stratégie définie pour le transfert de données depuis les systèmes d'information des CRBs vers le portail a été celle

de l'ETL (extract - transform - load) permettant d'extraire des données de ces systèmes d'information, de les re-structurer au format souhaité, puis de les charger sur le portail CRB-Anim. La définition des ETL, pivot pour l'alimentation du portail, a alors débuté sous la conduite d'un assistant ingénieur recruté spécifiquement. Sa mission principale était de concevoir et d'implémenter les composants ETL permettant de convertir les fichiers d'export issus des différents systèmes d'information des CRBs vers un format de fichier standardisé, celui du portail, afin d'alimenter la base de données du portail CRB-Anim. Cette action s'est déroulée pendant toute l'année 2017. Les informaticiens de l'infrastructure CRB-Anim (ingénieur informaticien et assistant ingénieur) se sont déplacés dans chaque CRB pour présenter les pré-requis du portail, réaliser un état des lieux
des données présentes dans les systèmes d'information locaux, développer un prototype d'import, tester l'import, analyser le taux de rejet, identifier les motifs de rejet, actua- liser les vocabulaires ou tables de références pour mettre en conformité les données du CRB avec les pré-requis de la base de données du portail, tester l'import de nouveau et recommencer l'analyse des rejets autant que nécessaire pour atteindre l'étape finale où toutes les données étaient intégrables dans le portail. Ce processus de «hackathon» a pris 2 à 3 jours par CRB pour finaliser le premier import de leurs données. Au-delà de l'import des échantillons des différents CRBs dans le portail central, ce travail d'« audit des données » a également permis d'identifier des pistes d'amélioration et d'harmonisation pour optimiser le niveau d'operérabilité des données locales.

Le portail a été officiellement lancé lors du séminaire inter- national de l'infrastructure CRB-Anim qui s'est tenu les 11 et 12 mai 2017 à Paris, en présence du comité scientifique international. Ce lancement a permis de mobiliser les CRBs et certains utilisateurs « test » pour évaluer l'application dans des conditions réelles. L'assistant ingénieur a également pris en charge l'ensemble des tests réalisés dans le cadre de la recette technique. Pour la recette fonctionnelle, il a été appuyé ponctuellement par l'ensemble des partenaires du projet, répartis en groupes d'utilisateurs ayant des rôles particuliers dans l'application, ceci afin de pouvoir simuler l'ensemble des cas d'utilisation potentiels. La réalisation des tests fonctionnels exhaustifs sur l'ensemble des fonc- tionnalités de l'application et leur qualification a demandé un effort important aux informaticiens de l'infrastructure, allant jusqu'à la négociation avec le prestataire pour la prise en charge des améliorations de l'application sans surcoût. L'harmonisation des vocabulaires de référence a aussi posé quelques difficultés pour obtenir un consensus entre plu- sieurs CRBs.

Lors de cette phase de VSR, deux nouvelles versions de l'application ont été livrées et déployées en production. À la suite de la validation de la VSR, la phase de garantie d'un an a débuté en juin 2017. Cette phase a permis la prise en charge de la correction d'anomalies majeures qui n'avaient pas été relevées lors des phases de validation précédente.

Le portail https://crb-anim.fr/access-to-collection a été ou- vert à tout utilisateur le 15 septembre 2017.

Amélioration continue du portail : 2018

L'accompagnement du déploiement du portail a suscité
plusieurs actions vers ses différents utilisateurs :

* Favoriser l'appropriation du « minimum dataset » par les déposants d'échantillons biologiques.

* Favoriser l'appropriation de l'application par les CRBs et les groupes espèces à travers une formation.

* Faire connaitre le portail lors de congrès scientifiques, avec notamment une présentation au Congrès Européen de Productions Animales en 2018.

L'administrateur du portail a mis en place une « forge de développement » pour décrire, classer et traiter toutes les remontées d'utilisateurs, en considérant leur caractère plus ou moins bloquant afin de prioriser leur traitement. Plus de 70 améliorations ont été traitées depuis l'ouverture du portail, dont 11 étaient critiques et 21 classées importantes. Il y a également eu 5 incidents de production dont la résolution était hautement prioritaire. Améliorer la documentation et l'aide en ligne est un effort continu, au fur et à mesure que de nouveaux utilisateurs signalent de nouveaux besoins.

Actuellement plus de 135 000 échantillons provenant de 14 espèces d'animaux domestiques sont accessibles via le portail pour 5 CRBs.

La règlementation sur l'accès aux données personnelles est entrée en vigueur après l'ouverture du portail. Des données à caractère personnel sont enregistrées pour la gestion des ressources, l'accès aux ressources et le suivi des utilisateurs. CRB-Anim étant une infrastructure de recherche et la recherche étant une mission d'intérêt public, la base juridique du traitement des données personnelles sur le portail est l'exécution d'une mission d'intérêt public dont est investi chaque centre de ressources biologiques, et donc l'infrastructure CRB-Anim. La politique des données de CRB-Anim est ainsi en cours de validation et sera prochainement affichée sur le portail.

Conclusion

Le développement du portail a joué un rôle fédérateur pour les CRBs de l'infrastructure CRB-Anim. L'objectif d'un guichet unique a été atteint. Sa convivialité peut encore être améliorée, de même que certains vocabulaires anglais, mais les fonctionnalités souhaitées sont opérationnelles. La phase de maintenance corrective et évolutive ne connait pas de terme annoncé. Toutefois, le maintien de la compétence au sein de l'équipe INRAE reste un enjeu, car il est nécessaire de stabiliser cette compétence au sein d'une équipe d'informaticiens.

Le portail répond aux exigences « findable» et « accessible» d'une politique FAIR de données. La principale amélioration à apporter concerne l'operérabilité avec d'autres
bases de données comportant des données phénotypiques ou moléculaires sur les collections présentes en CRB.

L'existence du portail a facilité le transfert des données des CRB animaux vers le portail web de l'infrastructure RARe, puisque les descripteurs étaient déjà standardisés et les données rassemblées. Il a aussi facilité la contribution des CRBs français au portail européen de données sur les ressources génétiques d'animaux d'élevage (https://www.image2020genebank.eu/) développé par le projet H2020 IMAGE avec l'European Bioinformatics Institute (EBI). Le modèle d'intégration des données a constitué un exemple pilote pour le développement du portail IMAGE qui a aussi

développé un outil automatique d'intégration de données externes, dénommé « inject tool» (la documentation sur les outils développés par IMAGE est accessible sur https://github.com/cnr-ibba). Verser les données de CRB-Anim sur le portail IMAGE répond à l'exigence d'interopérabilité avec les bases de données moléculaires ENA et EVA maintenues par l'EBI. En revanche, il reste à développer l'interopérabilité avec les bases de données des élevages expérimentaux d'INRAE pour ce qui concerne les données phénotypiques. Le livrable d'interopérabilité avec le portail du PNDB reste également à réaliser.

## Remerciements

Les auteurs remercient les membres du conseil de gouvernance et les membres des groupes espèces pour leur contribution. L'appui méthodologique de Béatrice Balvay (IDELE) et Cédric Chavériat (ex-FRB) a été précieux pour la préparation du cahier des charges précisant les spécifications fonctionnelles du portail.

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Cet article est publié sous la licence Creative Commons (CC BY-SA). https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/

Pour la citation et la reproduction de cet article, mentionner obligatoirement le titre de l'article, le nom de tous les auteurs, la mention de sa publication dans la revue « NOV'AE», la date de sa publication et son URL.
# Déploiement de Systèmes de Management de la Qualité dans les Centres de Ressources Biologiques de l'Infrastructure de Recherche RARe

Mélanie MARTIGNON<fnref n="1" />

Valérie BERGHEAUD<fnref n="2" />

Samuel BUFF<fnref n="3" />

Victoria CHUAT<fnref n="4" />

Roland COTTIN<fnref n="5" />

Juliette GOUSSOPOULOS<fnref n="6" />

Déborah JARDET<fnref n="7" />

Michèle TIXIER-BOICHARD<fnref n="7" />

Florence VALENCE<fnref n="4" />

## CORRESPONDANCE

melanie.martignon@inrae.fr

## RÉSUMÉ

Le système de management de la qualité d'une structure est un outil d'appui au pilotage. Cet article présente plusieurs systèmes déployés, ou en cours d'élaboration, dans les centres de ressources biologiques de l'Infrastructure de Recherche RARe. Ils constituent un panel des situations existantes dans chacun des cinq piliers (animal, environnement, forêt, microorganisme et plante), et présentent la diversité existante en termes de maturité, de normes de certification, de contextes spécifiques. Pour chacun des cas présentés, nous analysons les bénéfices perçus et les difficultés traversées.

La reconnaissance externe du niveau d'organisation qu'apporte la certification est un attendu de l'infrastructure de recherche. C'est pourquoi elle propose aux centres de ressources biologiques des animations pour favoriser le partage d'expériences et la montée en compétences des collectifs.

## MOTS-CLÉS

Système de management de la qualité, centre de ressources biologiques, RARe, diversité biologique, infrastructure de recherche, normes, ISO 9001.

<footnote n="1">1 INRAE, UE GBFOr, 45075, Orléans, France.</footnote>

<footnote n="2">2 Université Paris-Saclay, INRAE, Département de Biologie et Amélioration des Plantes, 78026, Versailles, France. Université Paris-Saclay, INRAE, Infrastructure Nationale de Ressources Agronomiques pour la Recherche (RARe), Centre de Ressources Biologiques pour les Plantes de l'Infrastructure RARe (BRC4Plants), 78026, Versailles, France.</footnote>

<footnote n="3">3 Université de Lyon, VetAgro Sup, UPSP ICE & CRB CryAnim, 69280 Marcy l'Étoile, France.</footnote>

<footnote n="4">4 UMR1253 STLO, CIRM-BIA, INRAE, Institut Agro, F35000, Rennes, France.</footnote>

<footnote n="5">5 CIRAD, UMR AGAP Institut, F-34398, Montpellier, France.
UMR AGAP Institut, Univ. Montpellier, CIRAD, INRAE, Institut Agro, Montpellier, France.</footnote>

<footnote n="6">6 UR GAFL, INRAE, 84140 Montfavet, France.</footnote>

<footnote n="7">7 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, GABI, 78350 Jouy-en-Josas, France.</footnote>
# Deployment of quality management systems in the biological resource centres of the AgroBRC infrastructure

Mélanie MARTIGNON<fnref n="1" />

Valérie BERGHEAUD<fnref n="2" />

Samuel BUFF<fnref n="3" />

Victoria CHUAT<fnref n="4" />

Roland COTTIN<fnref n="5" />

Juliette GOUSSOPOULOS<fnref n="6" />

Déborah JARDET<fnref n="7" />

Michèle TIXIER-BOICHARD<fnref n="7" />

Florence VALENCE<fnref n="4" />

## CORRESPONDENCE

melanie.martignon@inrae.fr

## ABSTRACT

The quality management system of a structure is a management support tool. This article presents several of the systems deployed or in the process of formulation in the biological resource centres of the AgroBRC/RARe research infrastructure. They form a panel of situations present in each of the five pillars (animal, environment, forest, microorganisms and plants), and represent the diversity that exists in terms of maturity, certification standards, and specific contexts. For each of the cases presented, we analyse the benefits perceived and the difficulties encountered.

The external recognition of the level of organisation provided by certification is an expected goal of the research infrastructure. That is why it organises events for the biological resource centres to foster sharing experiences and improving the skills of the teams involved.

## KEYWORDS

Quality management system, biological resource centre, AgroBRC/RARe, biological diversity, research infrastructure, standards, ISO 9001.

<footnote n="1">1 INRAE, UE GBFOr, 45075, Orléans, France.</footnote>

<footnote n="2">2 Université Paris-Saclay, INRAE, Département de Biologie et Amélioration des Plantes, 78026, Versailles, France. Université Paris-Saclay, INRAE, Infrastructure Nationale de Ressources Agronomiques pour la Recherche (RARe), Centre de Ressources Biologiques pour les Plantes de l'In-frastructure RARe (BRC4Plants), 78026, Versailles, France.</footnote>

<footnote n="3">3 Université de Lyon, VetAgro Sup, UPSP ICE & CRB CryAnim, 69280 Marcy l'Étoile, France.</footnote>

<footnote n="4">4 UMR1253 STLO, CIRM-BIA, INRAE, Institut Agro, F35000, Rennes, France.</footnote>

<footnote n="5">5 CIRAD, UMR AGAP Institut, F-34398, Montpellier, France.
UMR AGAP Institut, Univ. Montpellier, CIRAD, INRAE, Institut Agro, Montpellier, France.</footnote>

<footnote n="6">6 UR GAFL, INRAE, 84140 Montfavet, France.</footnote>

<footnote n="7">7 Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, GABI, 78350 Jouy-en-Josas, France.</footnote>