# Dioll, a fluorescent probe for in-depth characterization of cell membrane fluidity

Sébastien Ibanez¹,²,³§, Mouhedine Cheniour¹§, David Gueyrard¹§, Milène Nitenberg¹, Larissa Socrier¹, Jihen Zouaoui¹,⁴, Layth Ben Trad¹,⁴, Julien Bompard⁵, Thomas Guillot¹, Samia Selmi-Ruby²,³, Ahmed Landoulsi⁴, Ana-Maria Trunfio-Sfarghiu⁶, Agnès Girard-Egrot⁵, Christophe Vanbelle⁷, Léa Payen-Gay⁸, Pierre Martinez²,³, Alain Puisieux²,³, Peter Goekjian¹, Ofélia Maniti⁵, Olivier Marcillat³, Arnaud M. Vigneron²,³*, Thierry Granjon¹*

§ These authors contributed equally to this work.

* To whom correspondence should be addressed: Arnaud M. Vigneron-Thierry Granjon.

arnaud.vigneron@lyon.unicancer.fr; Centre Léon Bérard, Bat Cheney D, 28 rue Laënnec, 69373 Lyon cedex 08, France. Tel: 04 69 85 60 85

thierry.granjon@univ-lyon1.fr; Université de Lyon, ICBMS UMR CNRS-UCBL 5246, Bat. Lederer, 1 rue Victor Grignard, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

**ABSTRACT:** The control of membrane fluidity constitutes an essential mechanism of cell physiology, regulating macromolecular assembly, lipid and protein trafficking, and cell signaling. The kinetic and spatial understanding of these mechanisms is underappreciated and their elucidation is highly challenging. This is partly due to the lack of tools able to quantify this property in live cells with a sufficient resolution to detect heterogeneity of inter- and intramembrane fluidity and the kinetic fluctuation of this property in response to biological stimuli. Here, we present the synthesis of a new chemical dye able to precisely and dynamically measure variations in membrane fluidity. The high affinity of the dye for all cell membranes enabled us to comprehensively visualize and quantify different membrane fluidities in live mammalian cells without interference from non-membranous lipids. Using this tool, we report for the first time the direct measurement of (1) differences in the fluidity of most membranous structures present in a cell, (2) the existence of lipid microdomains in plasma membranes, (3) the effect of cell crowding on plasma and endomembranes, and (4) the consequences of nutritive modulation on these membranous systems.

## INTRODUCTION

Biological membranes, originally regarded as inert structural constituents, are essential determinants and active regulators of biological functions. Plasma membranes control the physical separation of intracellular domains from the extracellular environment and ensure a tight control of molecular exchanges between both compartments. Similarly, endomembranes regulate molecule trafficking, isolate specific molecular functions and supply crucial platforms for the assembly of supramolecular complexes, such as the mitochondrial respiratory chain or endoplasmic reticulum (ER)-associated ribosomes. Consequently, the biophysical properties of membranes such as viscosity, bending rigidity, and fluidity are critical for many cell functions, requiring a constant biochemical control of lipid composition and partitioning between membrane leaflets.

As a consequence, dysregulations of membrane fluidity induce stress responses and pathologies, and the ability to measure fluctuations in this parameter may improve our understanding of the progression of several diseases. Metabolic syndromes induced by Western diets are for instance associated with excessive saturated fatty acid intake, disturbing the homeostasis of the ER, leading to the unfolded protein stress response and in turn to deleterious inflammation ¹. Alterations in membrane fluidity are suspected to underlie this process even though this has never been clearly demonstrated ²,³. Similarly, neurodegenerative diseases have been attributed to perturbations in the physical properties of membranes, since greater fluidity was reported to favor protein aggregates, such as those observed in Alzheimer's disease ⁴.

Owing to this key role, many efforts to measure membrane fluidity in live cells have been reported. Bulk fluidity has
been assessed via diverse spectroscopic methods, including electron paramagnetic resonance (EPR) and fluorescence spectroscopy 5-7. Solvatochromic fluorescent dyes have been developed such as Laurdan, Nile red, and Di-4-ANEPPDHQ. These dyes reflect the polarity of their environment, thus providing insight into the hydration state resulting from the packing of lipid molecules and hence the level of membrane fluidity 8. The transition from a gel phase to a crystal-liquid phase causes a clear shift in their emission spectrum towards longer wavelengths (red shift) 9-11. In the case of Di-4-ANEPPDHQ, molecular mechanisms underlying spectral changes have been shown to be dependent on the presence of cholesterol in membranes via an electrochromic effect, i.e. a change in membrane potential causing a shift in emission 12, thus casting some doubts on the relevance of this dye for measuring membrane fluidity. Nile red probes have a strong affinity for hydrophobic environments such as lipid droplets and require specific functionalization for preferential targeting to a biological membrane 13. They are therefore unable to stain the whole membranous system of a cell. Laurdan, the most commonly used probe for measuring membrane fluidity is also relatively hydrophobic and poorly soluble in biological aqueous buffers, causing its precipitation in extracellular medium and poor distribution in disordered lipid membranes 14,15. To address these constraints, several Laurdan-derived fluorophores have been reported 14-16. C-Laurdan (6-dodecanoyl-2-[N-methyl-N-(carboxymethyl)-amino] naphthalene), for instance, has a supplementary carboxyl group at the amino-naphthalene moiety, which induces favorable hydrophilic interactions with water molecules near the lipid headgroups 15; a property normally associated with a greater ability to stain membranes in an aqueous environment 9,17,18. However, due to its carboxylic group which dissociates with a pKa of 6.6, C-Laurdan fluorescence properties are affected by the presence of charged phospholipids and by pH variations in various cell compartments. Thus, while these probes perform well in model membrane systems, only few reports of successful measurements of membrane fluidity using fluorescence in live cells have been published.

In the present work, we synthesized a new chemical sensor of membrane fluidity, termed Dioll, that overcomes limitations previously associated with common solvatochromic dyes. Uptake of the dye, its brightness, and its ability to define accurately the fluidity of membrane in live cells were all enhanced through structural optimization. Cellular studies confirmed the significant advantages of Dioll for analyzing spatially and kinetically the fluidity of membranes under relevant stimuli such as mechano-transduction and nutritive modulation.

## RESULTS AND DISCUSSION

**Synthesis.** We previously proposed a versatile synthetic approach to Laurdan analogues in a two-step sequence using a Buchwald-Hartwig amination reaction 16. The new Laurdan analog, Dioll, was prepared by a similar route (Scheme 1). In the first step, 2-bromo-6-lauroylnaphtha-

lene (1) was obtained by Friedel-Crafts acylation of 6-bromomonaphthalene 19. N-methylallylamine was introduced through a palladium-catalyzed Buchwald-Hartwig reaction 20-22 (compound 2). The new Laurdan derivative 1-(6-((2,3-dihydroxypropyl)(methyl)amino)naphthalen-2-yl)dodecan-1-one) (3) was obtained through OsO4-catalyzed dihydroxylation. This probe and its precursors were well characterized by ¹H and ¹³C NMR and HRMS (Figure S1). The new molecule bears two hydroxyl groups on the polar head and was accordingly named Dioll (Scheme 1 and S1). The design rationale was to increase the polarity of the fluorescent headgroup without adding any charge, and to increase solubility of the dye at the hydrophobic/water interface. Moreover, this higher solubility was expected to prevent dye aggregation and fluorescent quenching in less hydrophobic environments.

<figure><img src="image_29.png" /><figcaption>**Scheme 1.** Synthesis of DIOLL from 2-bromomonaphthalene</figcaption></figure>

**Photophysical Properties.** The ability of Laurdan and C-Laurdan to report on the polarity of the environment is based on the shift in fluorescence emitted from lower wavelengths for non-polar solvents (423 and 416 nm for toluene, 440 and 432 nm for chloroform) to higher wavelengths for polar solvents (460 nm and 450 for DMSO, 485 nm for both in ethanol, for Laurdan and C-Laurdan, respectively) (Figures 1A and Table S1). This property, named bathochromic effect, characterizes solvatochromic dyes sensitive to the lipid-ordered state of membranes and their correlated fluidity

The spectroscopic properties of Dioll were compared to that of Laurdan and C-Laurdan in organic solutions. The bathochromic shift was confirmed with Dioll, as its maximum emission wavelength changed with increasing solvent polarity (425 nm in toluene, 441 nm in chloroform, 460 nm in DMSO and 486 nm in ethanol,) (Figures 1A and S2A). Importantly, the fluorescence intensity of Dioll was 1.5- to 2-fold greater than that of the two Laurdan analogues, irrespective of the solvent used (Figures 1A and Table S1). Unlike C-Laurdan which showed very low fluorescence intensities in polar solvents (i.e., a hypochromic effect; 3 times lower than that of Laurdan in ethanol), Dioll displayed almost no hypochromic effect and its intensity in ethanol was 2- and 5-fold greater than Laurdan and C-Laurdan, respectively. Hence, this enhanced fluorescence
makes Dioll an ideal candidate for microscopy and spectroscopic applications.

To validate this candidate, we measured the fluorescence response of Dioll in biomimetic membranes by comparing the fluorescence intensities of the new probe with those of Laurdan and C-Laurdan in liposomes constituted of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), which is one of the major phospholipid constituents of cell membranes. Interestingly, we observed an even higher response from Dioll compared to Laurdan and C-Laurdan with an increase in fluorescence intensity exceeding 7-fold (Figures 1B and Figure S2).

We then compared the ability of the new probe to report on the lipid-ordered state of a mimetic membrane with those of Laurdan and C-Laurdan by using liposomes made of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC). Its lipid-ordered transition, between a gel phase and a liquid phase occurs around 23°C, which makes it a convenient model at room temperature to evaluate the capacity of the dye to measure changes in membrane fluidity. Our results confirmed that the fluorescence spectrum of Laurdan and Dioll inserted into DMPC liposomes evolved when the temperature rose from 5°C to 65°C (Figure 1C). At temperatures below the phase transition, the fluorescence spectrum peaked at 440 nm as expected for a gel phase. Above 23°C, the fluorescence intensity at 440 nm decreased in favor of an increase in intensity around 490 nm. This shift in emission became more pronounced as the temperature rose, reflecting the number of lipid molecules in a disordered state. Emissions at 490 nm became predominant when temperatures exceeded 28°C. The fluorescence spectrum of C-Laurdan in DMPC also shifted towards higher wavelengths, but a significant decrease in fluorescence intensity was recorded as the temperature rose (Figure 1C). This reduction in fluorescence emission was also observed to a lesser extent with Laurdan, but was negligible with Dioll, with intensity ratios for gel over liquid-crystalline phase of 0.8 for Dioll vs 0.6 for Laurdan and 0.2 for C-Laurdan (Figure 1C).

The sensor response described above was then quantified by calculation of the Generalized Polarization (GP) parameter (see Methods). This parameter is commonly used to provide a quantitative index of membrane fluidity. For Dioll and Laurdan, GP values decreased with increasing temperature, with a sharp drop at 21°C, where the liquid-crystalline phase emerged (Figure 1C). Phase transition is a cooperative phenomenon and once lipid chains begin to adopt a disordered conformation, the process is amplified. The inflexion point was measured at 23°C with Laurdan and Dioll, consistent with previously reported values of DMPC melting temperature (Tm). Above the transition temperature, GP values for both dyes continued to decrease, though less sharply than around the phase transition temperature. The two fluorophores were sensitive to

the mobility of water molecules in the vicinity of the excited naphthalene moiety and, although lipids are in a liquid-crystalline phase, the solvent mobility at the polar/non-polar interface continues to increase with membrane fluidity and rising temperature. C-Laurdan also displayed a decrease in GP values with higher temperatures (Figure 1C), but the amplitude of this decrease was lower than for Laurdan and Dioll, and GP did not evolve above the phase transition temperature. Overall, Dioll and Laurdan showed large differences in GP values between the ordered/gel and disordered/liquid-crystalline states, which enabled us to detect variations in lipid bilayer fluidity in the disordered phase well beyond phase transition.

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 1.** Photophysical properties of Laurdan and its derivatives. (A) Fluorescence emission spectra of Dioll compared to Laurdan and C-Laurdan in organic solvents of increasing polarity (dash lines, Laurdan, dotted lines, C-Laurdan, full lines, Dioll). Probe concentration was 0.2 µM. (B) Fluorescent signal emitted by polarity-sensitive probes (0.2 µM) in POPC liposomes. (C) Fluorescence emission spectra (excitation wavelength 390 nm) of Laurdan (upper left), C-Laurdan (upper right) and Dioll (lower left), and Generalized Polarization (GP) calculations obtained with the polarity sensitive probes (0.2 µM) in DMPC liposomes according to temperature (lower right).</figcaption></figure>

**Enhanced properties of Dioll for spectral imaging in live-cells.** Spectral imaging of membrane fluidity in live cells requires a probe with key features in order to obtain an optimal analysis: an accurate measurement reflecting the lipid composition of membranes, the ability to efficiently enter in the cells, a high level of brightness in every type of membrane, and high sensitivity to fluidity variation over the largest dynamic range.
We thus verified each of these properties and first checked whether Dioll was also able to provide feedback on variations in the state of membranes that depend on combined lipid characteristics: acyl chain length and unsaturation. Dioll was thus inserted into preformed liposomes constituted of phosphatidylcholines with different chain lengths and unsaturation (ranging from 14 to 18 carbons for chain length and from 0 to 2 for chain unsaturation, respectively (Table S2)). Fluorescence spectra were recorded (Figure 2A) and the GP parameter was measured at 21°C (Figure 2B). GP values fluctuated according to the different Tm of the liposomes used, with the most rigid, DSPC (C18:0) resulting in a GP value of 0.58 and the most fluid DLPC (C18:2) a GP value of -0.26. Overall, we demonstrated that Dioll was able to accurately and precisely report change in membrane fluidity according to lipid composition.

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 2.** Property of Dioll to measure membrane fluidity in biomimetic and physiological vesicles. (A) Representative experiment showing the normalized spectrum of Dioll fluorescence emission wavelengths at 21°C of indicated liposomes. (B) GP values calculated from the previous spectrum.</figcaption></figure>

We then investigated whether this dye was more suitable than Laurdan derivatives at entering and staining live cells. We used adherent and non-transformed Human Mammary Epithelial Cells (HMECs), and first compared the signal intensity obtained with the different dyes at several concentrations after a 24 h incubation period. These conditions were optimized for the three dyes. As expected from its photophysical properties, the fluorescence intensity of Dioll was consistently one log higher at all concentrations tested (Figure 3A). Next, we verified whether probe entry into the cell was also enhanced. We followed and compared the kinetics of Dioll and Laurdan derivative incorporation into HMECs with different media supplemented, or not, with serum proteins (Figure 3B and Figure S3). Serum proteins were expected to increase probe solubility through their ability to create a hydrophobic water interface chemically comparable to the biological membrane²³. Moreover, Dioll containing hydroxyl groups in its structure was, comparatively with other dyes, structurally closer to endogenous lipids such as phosphorylated forms of acyl-glycerol or sphingosine base, these lipids being efficiently delivered to cells by transfer from serum proteins²⁴. For each probe tested, the medium containing either the complex palmitate/BSA or FBS led as expected to greater incorporation than serum/lipid-free media. More importantly, Dioll had a robustly shorter incorporation half-time (T₁/₂ = 21.99 min in FBS) compared to Laurdan and

C-Laurdan (T₁/₂ = 67.30 min and 157.3 min in FBS) when lipid-protein carriers were present (presence of FBS) (Figure 3C). Hence, uptake in live cells was more efficient for Dioll than for the other dyes.

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 3.** Dye uptake and staining in live cells. (A) Fluorescent intensity of HMECs incubated with different concentrations of indicated dye for 24 h. (B) Real-time measurement of Dioll fluorescence in the same cells grown in the indicated medium (no fetal bovine serum (FBS) (Empty), 10% FBS (FBS), unloaded bovine serum albumin (BSA) or BSA loaded with palmitate (4.1 ratio) (palmitate)). (C) Similar experiment in the presence of 10% FBS with the indicated dyes. Acquisition settings were adjusted to obtain a similar maximum signal between all tested dyes. The curve was fitted to a hyperbolic function and used to determine the half-maximum of dye incorporation. (D) As in C but the experiment was performed in a medium containing BSA loaded with palmitate (4.1 ratio) instead of 10% FBS.</figcaption></figure>

By establishing the stronger ability of Dioll to enter the cell (Figure 3B, 3C), its capacity to report fluidity modification resulting from alternative lipid compositions (Figure 2A, 2B) and the overall increase of signal intensity detected in live cell (Figure 3A), we obtained initial indications that it may outperform other available tools for specifically staining cell membranes *in situ* and precisely highlight their level of fluidity. In order to confirm this, HMECs were thus stained alternatively with Dioll and other Laurdan derivatives at different concentrations. The signal obtained with Dioll was, as expected, stronger than with other dyes (Figure 4A). Dioll revealed structural details such as tubules, vesicles, nuclear and endoplasmic membrane continuity, and nuclear membranes, with an unprecedented level of resolution (Figure 4B). Spectral imaging (see Methods) demonstrated an obvious difference in fluidity of membraneous systems of the stained cells. The membrane surrounding the cells displayed a reduced level of fluidity (Figure 4B), as expected from the known composition of plasma membranes enriched in sphingolipid and cholesterol. Focusing on this membrane, we observed with great
<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 4.** Enhanced detection of membranes by Dioll. (A) Confocal fluorescence images of HMECs stained with the indicated dye (4 µM) for 24 h. Laser voltage and electronic gain used for these acquisitions are specified. (B) Confocal fluorescence images of HMECs stained with Dioll (4 µM) for 24 h. Spectral encoding of images was performed and converted into a purple-green scale as indicated. Several structures are highlighted: (*) tubules, (‡) intracellular vesicles, (▲) continuity between nuclear and endoplasmic membrane, (+) nuclear membrane, (#) nuclear membrane invagination. (C) Top: Identical experiments showing structural details of plasma membranes observed through Dioll staining and gray scale encoding. Bottom: the same images were modified using spectral encoding and show the high level of rigidity of the previously highlighted structures.</figcaption></figure>

detail specific structures usually associated with plasma membranes, such as lamellipodia extensions, ruffles and blebs (Figure 4B and 4C).

Regarding improvements obtained with Dioll in comparison with other solvatochromic dyes, we performed a last series of experiments in live cells to determine if the ability to measure membrane fluidity was also improved by this dye independently of its stronger brightness and heightened capacity to stain live cells. Since Dioll conserves a

stronger fluorescence intensity after the shift in its emission wavelength, we expected to obtain a better mapping of membrane fluidity, in particular its heterogeneity within cells. Hence, we adapted acquisition settings to measure the GP parameter according to each dye. Laurdan and C-Laurdan required greater laser intensity for their proper excitation and higher electronic gain for signal detection. When we measured with spectral encoding the difference in fluidity between the well-defined plasma membrane and nuclear membrane representing two extreme cases for this parameter, we confirmed that the range of GP obtained was broader with Dioll than with Laurdan and C-Laurdan (Figure 5A).

We then demonstrated that increasing Dioll concentrations improved the number of membranes detected (Figure 5B), in stark contrast to other dyes unable to reveal the full spectrum of membranous systems. This effect was more pronounced for fluid endomembranes than plasma membranes which were efficiently stained with all the dyes, even at low doses (Figure 5B). Since endomembranes contain more disordered-lipid bilayers, this result confirmed the stronger ability of Dioll to be used in less hydrophobic environments and to measure more efficiently the fluidity of less rigid membranes.

Finally, since isolated membranes have a heterogeneous level of fluidity, we verified whether our dye could reflect this heterogeneity. Measuring differences of fluidity inside a same membrane required a strong sensitivity since the variation are faint, dynamic, and spatially restricted. We concentrated our analysis on plasma membranes known to contain microdomains considered to be a signaling platform for cell interactions with the microenvironment. In order to detect faint variations of fluidity, we reencoded the imaging so as to calculate the GP values for each positive pixel of the stained area and used these values to focus on these more rigid domains. The quartiles of GP values were also calculated for each dye and used to encode the obtained signal, as mean GP was more elevated for Laurdan and C-Laurdan than for Dioll when dyes were used at their optimal concentration for membrane visualization (Figure S4). As a result, clear subdomains showing an apparent non-random GP distribution could be observed on the plasma membrane after Dioll staining (Figure 5C). We used Moran's index as a spatial autocorrelation score to determine how spatial distribution of these GP deviates from a random distribution (Figure 5C and Table S3) and confirmed that Dioll can provide finer measurement of variability in membrane fluidity (MI=0.32). GP values fluctuated more randomly across the image for Laurdan and C-Laurdan (MI=0.12 and 0.09, respectively) (Figure 5C) suggesting that these dyes were less likely to quantify faint variations of fluidity in a robust manner. Overall, this result was consistent with the data showing that GP values measured with C-Laurdan beyond phase transition no longer evolved (Figure 1C), in contrast with results obtained with Dioll. In conclusion of this section, we validated Dioll superiority in comparison of other dyes for all key properties required for spectral imaging, opening the way for more detailed cellular studies.
<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 5.** Enhanced measurement of membrane fluidity by Dioll. (A) GP differences between the plasma membrane and the nuclear membrane in HMECs stained with the indicated dyes (4 µM). Data are mean of GP calculated at each pixel ± SD. Student's t-test: ns = non-significant, **=P < 0.01. (B) Positive signal area was quantified from the same images and expressed as the ratio of the whole surface measured. Measurements were made for the whole cells or their internal section (endomembranes) as indicated. Data are mean fold change ± SD between cells stained at 0.5 and 4 µM. Student's t-test: ns = non-significant, ***=P < 0.001. (C) Left: Confocal fluorescence images of HMECs stained with Dioll (top), Laurdan (Middle) or C-Laurdan (bottom) at 4 µM and focusing on the plasma membrane (1 representative picture of 5 independent experiments). A spectral encoding through GP calculation and centered on the values present in the plasma membrane was conducted. Color code used and scale bars are indicated. Right: Spatial autocorrelation score (Moran's index) calculated from left images using a direct neighbors approach. Moran's I values report the observed spatial auto-correlation, while Z-scores quantify how it compares to random expectations from the sample (see Table S3 for full description).</figcaption></figure>

Dioll can discriminate between organelles according to the fluidity of their membranes. Our findings suggested that the identity of organelles may be reflected by their different levels of membrane fluidity according to their lipid composition. Along the secretory pathway, it is well known that the liquid-ordered state of membranes decreases due to the progressive enrichment in saturated

sphingolipids and cholesterol. To identify plasma membrane and organelle membranes, co-localization experiments with specific organelle markers were performed (Figure 6A). Dioll efficiently co-localized with markers of plasma membrane (DiI), endoplasmic reticulum (ER-tracker) and mitochondria (TMRE). Moreover, Dioll clearly labeled membrane structures surrounding the nucleus stained with Hoechst. GP values could thus be estimated from the relative fluorescence intensities at 440 and 490 nm for each type of membrane identified above (Figure 6B). As expected, high GP values (around +0.12) were obtained for plasma membrane structures, whereas ER membranes were relatively more fluid with GP values around -0.2. As indicated previously, this is in line with the

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 6.** Membrane identity elucidated from the level of their fluidity. (A) Confocal fluorescence (z-section width = 85 µm) images of HMECs stained with Dioll and the indicated structural tracker (DiI for plasma membrane, ER and Mito tracker for endoplasmic reticulum and mitochondria, respectively, Hoechst for the nucleus). Merged signals for co-localization is shown. (B) Pixels corresponding to merged signals for each indicated structure were extracted and GP was calculated from their spectrum.</figcaption></figure>

membrane composition of ER tubules. ER displays extremely low concentrations of sterols and complex sphingolipids, despite being a main site of lipid and protein synthesis. Interestingly, mitochondria displayed the same
GP value as ER, which was not surprising as the amount of sterols and sphingolipids is also extremely low in this orga- nelle. Finally, nuclear membranes displayed an even lower GP value (around -0.28) than ER. This was not completely expected since the nuclear membrane is believed to be a continuous extension of the ER. However, it is well known that transmembrane proteins strongly reduce membrane fluidity<sup>27,28</sup>, with the ER concentrating this type of macro- molecules, whereas nuclear membranes are largely devoid of them.

**Dioll is a powerful sensor of pathophysiological modifications of membrane fluidity.** Having demonstrated the ability of Dioll to detect the static distribution of fluidity heterogeneity within the membranous system of a mammalian cell, we then measured the ability of this dye to expose dynamic modifications of membrane fluidity. We first verified that Dioll was not cytotoxic (Figure S5) and did not disturb membrane fluidity (Figure S6) when cells were continuously incubated with this dye over several days. Interestingly, we noted that GP could be measured without any significant variation during the experimental time-course in cells treated with 0.5-2 µM Dioll even after 4 days of continuous growth (Figure S5). Conversely, signal intensity was too low after 2 days to obtain reliable GP quantification with Laurdan and C-Laurdan at all tested concentrations (Figure S6); hence highlighting an additional advantage of using Dioll over Laurdan derivatives, especially in the context of prolonged experiments. Based on these parameters, we then evaluated the consequences of a nutritive fatty acid imbalance as a first pathophysiological insult susceptible of disturbing membrane fluidity. We treated HMECs for 24 h with excessive palmitate, a common saturated fatty acid associated with high fat diet and metabolic syndromes (Figures 7A and 7B). At the chosen dose (500 µM), an expected ER stress response and cell cycle arrest were clearly induced but no significant cell death was observed (Figures S7), highlighting the relevance of this perturbation for assessing a typical stress associated with human pathologies. Confocal microscopy and whole cell analysis demonstrated a decrease in membrane fluidity in all membranes measured (Figures 7A and 7B). Endomembranes, in particular, were affected and thin bands of highly rigid membrane could be observed crossing the cell. This effect was not an artefact due to the use of palmitate, since an equivalent result was obtained by incubating cells with arachidate (Figure 7B). We then treated the same cells with horse serum containing linoleic (C18:2 w6) and linolenic (C18:3 w9) acid in larger amounts than a medium containing control FBS<sup>29,30</sup>. We first performed cell lipid analysis and confirmed an increase in polyunsaturated fatty acids (PUFA) after cell incubation in horse serum compared to those maintained in FBS (Figure S8). Importantly, this effect was observed with the whole pool of free and hydrolyzed fatty acids, and with those more specifically attached to the two main pools of phospholipids, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine. In addition, strong responses of SREBP1 and 2 (Sterol Regulatory Element Binding Protein 1/2) were induced (Figure S7). The former response may be correlated with larger

pools of PUFA<sup>31,32</sup>, whereas SREBP2 activation is usually linked to the lack of cholesterol. Of note, polyunsaturated acids reduce lipid packing which can consequently increase membrane fluidity, an effect also enhanced by the lack of cholesterol. Accordingly, cell analysis with Dioll in this condition revealed a decrease in GP values indicative of an elevation of membrane fluidity in all tested membranes (Figures 7A and 7B). Since Dioll was always incubated

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>A</figcaption></figure>

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>B</figcaption></figure>

<figure><img src="image_38.png" /></figure>

**Figure 7.** Dioll measures dynamic changes in membrane fluidity following a metabolic insult. (A) Top and bottom left: confocal fluorescence images of HMECs stained with Dioll for 48 h. Normal medium containing FBS was exchanged during the experimental time-course after 24 h by a medium either enriched in palmitate (500 µM) or supplemented with 10% horse serum. Bottom middle and right: GPs for the indicated membranes were calculated from these images. (B) GP quantification at the whole cell level performed through a direct spectrofluorescence measurement after an overnight pre-incubation in normal medium, in a medium in which horse serum replaced FBS or conditions enriched in palmitic (500 µM) or arachidic acid (350 µM). Data are mean ± s.d.; n>3 independent experiments. Student's t-test, ns=non-significant \*=P < 0.05, \*\*=P < 0.01, \*\*\*=P < 0.001.

with cells 24 h before the onset of metabolic manipulations, these results unveiled the capacity of Dioll to detect dynamic changes in membrane fluidity in response to pathophysiological nutritive insults.

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Finally, we subjected to an additional stress known to affect membrane fluidity during epithelial cell proliferation, namely cell packing. The consequence of cell density on the fluidity of their membrane is controversial. A recent publication demonstrated an overall increase in membrane fluidity following cell crowding by using Laurdan<sup>33</sup>. However, individual membranes were not analyzed in this study and no image of cells were reported. Inversely, the analysis of giant plasma membrane vesicles (GPMV) used as a surrogate of microviscosity associated with plasma membranes revealed a specific increase in their rigidity in densely packed cells<sup>34,35</sup>. Therefore, plasma membrane and

<caption>**Figure 8.** Dioll highlights the consequences of cell crowding on membrane fluidity. (A) HMECs at the indicated density were incubated with Dioll for 24 h before being isolated and analyzed by flow cytometry. Graph shows the emission ratio fluorescence recorded with filters at 545 nm and 450 nm. (B) Fluorescence spectra obtained from an identical experiment were registered from a whole population and used to calculate the GP as a function of cell confluence (One representative of n=3 independent experiments). (C) Top: confocal fluorescence images of HMECs stained with Dioll and grown at indicated density. Bottom: GP quantification at the whole cell or the single membrane level as indicated (NM=nuclear membrane, PM=plasma membrane), performed through the analysis of previous images. Data represent mean ± s.d.; at least four experiments were conducted in (c). Student's t-test, ns=non-significant \*=P < 0.05, \*\*\*=P < 0.01, \*\*\*\*=P < 0.001.</caption>

endomembranes could react differently in the event of mechanical changes associated with cell crowding. However, using whole-cell measurements performed with Dioll, we did could confirm an overall increase in membrane fluidity when cells had more contacts and even observed the opposite effect (Figures 8A and 8B). Importantly, these data were obtained after cell dissociation and detachment, indicating that the changes in membrane fluidity were the consequence of an intrinsic biochemical parameter and not due to mechanical cues. We confirmed these first re-

sults by analyzing membrane fluidity with confocal microscopy using cells displaying a progressive increase in their contacts (Figure 8C). Interestingly, as observed with GPMV study, the fluidity of plasma membranes declined rapidly when cells were engaged in intercellular contacts (Figure 8C), yet it no longer changed when cell density increased. However, ER-related membranes were also more rigid with increasing cell-cell contacts, but this effect was apparently more sensitive to overall cell crowding than cell-cell interactions (Figure 8C). Hence, opposite measurements reported with Laurdan were likely not due to an opposite behavior of endomembranes and plasma membranes. In the study by Frechin et al, overall modifications in fluidity overlapped changes in lipid droplet quantity, their number being reduced in highly confluent cells<sup>33</sup>. We thus considered this change as the possible reason for the discrepancies between Laurdan and Dioll analyses. Due to

<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>**Figure 9.** Dioll signal is not disturbed by lipid droplets. HMECs were incubated with the indicated dyes (4µM) and placed 48 h in a medium fostering lipid droplet formation (high glucose, oleate (500 µM), palmitate (100 µM), roziglitanone (2µM). Confocal images were then taken after a 20 min incubation with Nile red to stain neutral lipids. Each signal (Dioll or Nile red) and the merged signal are shown.</figcaption></figure>

its very low polarity, Laurdan should be able to be inserted into these lipid droplets, inducing a fluorescent emission similar to a particularly rigid membrane, due to water exclusion. Hence, overall analysis of membrane fluidity using Laurdan could be disturbed by the signals emanating from these structures. Inversely, Dioll being slightly less hydrophobic may not stain these non-membranous lipid structures. We verified these hypotheses and confirmed the presence of Laurdan in lipid droplets by using Nile red (Figure 9), whereas Dioll was completely absent from these structures. Therefore, these results validate the model obtained from GPMV, demonstrating that membrane fluidity decreases when cells start to be densely packed. Moreover, we also investigated whether C-Laurdan could reach lipid droplets, as this dye is more hydrophobic than Laurdan

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due to the presence of the carboxylic acid. Surprisingly, when used at optimal concentrations for membrane visualization, C-Laurdan was similarly present in these structures, strongly decreasing the interest of this dye for quantifying membrane fluidity at the whole cell level.

## CONCLUSION

The control of fluidity has been recognized as a key feature of biological membranes providing them with a role extending far beyond that of cell/organelle compartmentalization. Typically, functions associated with the different types of membranes existing in a cell are largely influenced by differences in their fluidity. Endoplasmic membranes are for instance characterized by a higher fluidity, a condition necessary for the very high level of protein insertion and mobility required for protein synthesis in the ER lumen ³⁶. Conversely, plasma membranes are more rigid, favoring the appearance of membrane domains used as stable platforms for signal transduction, endocytosis and communication with surrounding cells ⁸.

The dye developed in the present study, Dioll, has a very intense fluorescent signal when inserted in the membranes of live-cells and is able to easily differentiate them on the basis of their fluidity. Entry of the dye was also ameliorated in comparison with other analogs and Dioll was able to reach every type of membranes. Furthermore, no interference from non-membranous lipids was observed, such as that arising with Laurdan and C-Laurdan. The affinity of Dioll for fluid domains as well as its ability to conserve a strong fluorescent signal in disordered lipids, were also enhanced compared to other Laurdan analogs, both characteristics being essential for the proper staining of endomembranes and an overall reflection of their greater fluidity. Moreover, we demonstrated the ability of Dioll to highlight local differences within an individual membrane, an ability likely due to the conservation of its brightness in a fluid membrane area and its stronger sensitivity to modifications in its environment. Importantly, we noticed the absence of cell toxicity during the incubation with Dioll and the stability of the measurement during experiments carry over several days. Therefore, this dye is highly relevant to finely measure alterations in membrane fluidity that can spatially and kinetically disrupt the normal control of membrane physiology.

Of note, we demonstrated the relevance of these improvements through detailed cellular studies after critical stimuli for the control of cell biology such as mechano-transduction or nutritive stimulation. In both case, we were able to report dynamic change in membrane fluidity and to identify the set of membranes sensitive to these modifications. The specificity of our dye for lipid bilayers helps us to observe the respective contribution of cell junction and cell crowding on the distribution of modifications in membrane fluidity. Our results nicely confirmed indirect experiments performed with GPMV suggesting that plasma membrane fluidity decreases with higher cell density, and extend these results by showing that cell junctions seem

more important for this effect than mechanical constriction. Conversely, the fluidity of endomembranes seems more sensitive to mechanical forces since it starts to decrease significantly when crowding restricts cell spreading. Mechanical transduction is known to modify the internal cytoskeleton and the positioning of several organelles, especially the nucleus ³⁷. However, it was rather unexpected that external forces could generate a biochemical signal susceptible to increase the local rigidity of membranes surrounding these organelles. The purpose of these regulations is not trivial and clearly deserves further investigation that will be possible with our tool developed in this study.

Regarding the nutritive stimulations, we were able to correlate modifications in fluidity with the membrane's lipid composition in live cells. Beyond effectively validating the link between a lipid disordered environment in a live cell and a change in emission wavelength of our inserted dye, this result demonstrated the ability of Dioll to respond dynamically to a defined biochemical signal. Indeed, Dioll was inserted in cell membranes before changing the nutritive conditions, and was still able to report a change in fluidity taking place dynamically several hours later. Therefore, this type of measurement opens the way to a comprehensive and robust analysis of pathological mechanisms connected to changes in membrane fluidity in response to abnormal regulation of nutritive environment such as diabetes or obesity ³⁸,³⁹. Dioll should constitute in these contexts a fundamental tool and assist future investigations in these directions.

## EXPERIMENTAL SECTION

**Chemicals and reagents.** Lauroylchloride and nitrobenzene were purchased from Acros. 2-bromonaphthalene, aluminium chloride, N-methylallylamine, 2-dicyclohexylphosphino2'4'6'triisopropylbiphenyl (X-Phos), palladium acetate (Pd(OAc)2), N-methylmorpholine oxide monohydrate, catalytic OsO4 2.5% solution in tert-butanol and anhydrous dioxane were purchased from Sigma-Aldrich. PBS and roziglitasone were also purchased from Sigma-Aldrich. Potassium tert-butanolate was purchased from Lancaster. Nitrobenzene and anhydrous dioxane were used without further purification. Flash chromatographies were performed on silica gels purchased from Acros Organics. Laurdan was purchased from GE healthsicences and C-Laurdan was synthesized according to the previously described procedure (Cheniour et al., 2016). Lipids were purchased from Avanti Polar Lipids (Alabaster, Al). Ultrapure water was obtained with a PureLabOpion Q7 system (Veolia Water STI, Decines, France).

**Chemical Synthesis.** Reactions were carried out in dried glassware and under argon atmosphere. All reactions were magnetically stirred and monitored by thin-layer chromatography (TLC) on silica gel 60 F254 (Merck) plates using UV light to visualize the compounds. Yields refer to chromatographically and spectroscopically pure compounds unless otherwise noted. ¹H and ¹³C NMR spectra were recorded at 23°C using Bruker Avance DRX300, DRX400 or DRX500. Chemical shifts are reported according to the residue peaks of the solvent
(CDCl3: 7.26 ppm for 1H and 77.16 ppm for 13C). The following abbreviations are used to denote the multiplicities: s = singlet, d = doublet, dd = doublet of doublets, t = triplet, m = multiplet and br s = broad singlet. NMR solvents were purchased from Euriso-Top (Saint Aubin, France). Low resolution mass spectra (ESI) and HRMS were recorded in positive ion mode using a Thermo Finnigan LCQ spectrometer.

Synthesis of 1-(6-bromonaphthalen-2-yl) dodecan-1-one (1)

2-bromonaphthalene (4 g, 19.3 mmol) was dissolved in 20 mL of nitrobenzene under an Argon atmosphere. The solution was stirred in an ice bath. Aluminium chloride (2.836 g, 21.61 mmol, 1.1 equiv.) was added by portions and lauroylchloride (5.512 mL, 23.18 mmol, 1.2 equiv.) was added dropwise. The reaction mixture was stirred at room temperature for at least 18h. The reaction mixture was quenched with distilled water at 0°C and extracted three times with ethyl acetate. The organic phases were combined, washed with brine, dried over sodium sulphate and concentrated under reduced pressure. The product was purified by crystallization from cold ethanol to obtain a yellowish powder; yield 4.215 g (56%).

1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.88 (t, 3H, J=6.6 Hz, CH3); 1.26-1.37 (m, 16H, CH2); 1.79 (m, 2H, CH2); 3.07 (t, 2H, J=7.5 Hz, CH2CO); 7.62 (d, 1H, J=8.7 Hz, H ar); 7.81 (m, 2H, H ar); 8.05 (m, 2H, H ar); 8.42 (s, 1H, H ar).

13C NMR: δ = 14.1; 22.7; 24.5; 29.4; 29.5; 29.6; 29.7; 31.9; 38.8; 122.7; 125.2; 127.5; 129.4; 129.9; 130.2; 131.0; 134.8; 136.4; 200.2.

HRMS: m/z (MH+) calculated for C₂₂H₃₀BrO: 389.1475, measured: 389.1471.

Synthesis of 1-(6-(allyl(methyl)amino)naphthalen-2-yl)dodecan-1-one (2) (NMAAL)

An oven-dried Schlenk flask was evacuated and backfilled with argon. The flask was charged with 1-(6-bromonaphthalen-2-yl) dodecan-1-one (200 mg, 0.514 mmol); (Pd(OAc)2) (9 mg, 41.1 µmol, 0.08 equiv.); X-Phos (39 mg, 82.2 µmol, 0.16 equiv.) and cesium carbonate (503 mg, 1.54 mmol, 3 equiv.). The Schlenk flask was capped with a rubber septum, and then evacuated and backfilled with argon three times. N-methylalylamine (128 µL, 1.34 mmol, 2.6 equiv.) and anhydrous dioxane (1.5 mL) were added through the septum. The mixture was heated to 120°C in an oil bath and stirred for 16 h. The mixture was cooled to room temperature, diluted with ethyl acetate, filtered through Celite and concentrated under reduced pressure to obtain a brown solid product. The crude product was purified by flash chromatography on silica gel eluting with ethyl acetate/petroleum ether = 3/97. A yellow powder (168 mg, yield 87%) was obtained.

1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 0.88 (t, 3H, J=5.1 Hz, CH3); 1.25-1.37 (m, 16H, CH2); 1.77 (m, 2H, CH2); 3.03 (t, 2H, J=7.7 Hz, CH2CO); 3.10 (s, 3H, NCH3); 4.07 (d, 2H, J=3.6 Hz, CH2N); 5.17-5.22 (m, 2H, CH2=CH); 5.89 (m, 1H, CH= CH2); 6.96 (br s, 1H, H ar); 7.16 (dd, 1H, J= 6.6 Hz, J=1.2 Hz, H ar); 7.64 (d, 1H, J=6.6 Hz, H ar); 7.80 (d, 1H, J=6.9 Hz, H ar); 7.93 (dd, 1H, J= 6.3 Hz, J=1.2 Hz, H ar); 8.32 (s, 1H, H ar).

13C NMR: δ = 14.1; 22.7; 24.9; 29.3; 29.5; 29.6; 29.7; 31.9; 38.3; 38.4; 55.1; 116.2; 124.7; 126.1; 129.7; 130.7; 133.0; 137.6; 200.2.

HRMS: m/z (MH+) calculated for C₂₆H₃₈NO: 380.2948, measured: 380.2938.

Synthesis of 1-(6-((2,3-dihydroxypropyl)(methyl)amino)naphthalen-2-yl)dodecan-1-one (3) (DIOLL)

The NMAAL product (164 mg, 0.43 mmol) was placed in a 25 mL flask. 5 mL of acetone, 5 mL of water, 5 mL of THF, 66 mg of N-methylmorpholine oxide monohydrate (1.3 equiv), and 1.5 mL of a 2.5% solution of OsO₄ in tert-butanol (catalytic) were added and the reaction was stirred overnight at room temperature. The mixture was then quenched with Na₂S₂O₃ solution, extracted with ethyl acetate (2x30 mL). The organic phases were combined, washed with water (30 mL) and then brine (30 mL), dried over sodium sulphate and concentrated under reduced pressure to obtain a crude product. Methanol was then added and the mixture was filtered over Celite, concentrated under reduced pressure and purified by flash chromatography on silica gel. Elution was carried out with ethyl acetate to obtain a dark green solid (65 mg, yield 36%).

1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 0.88 (t, 3H, J=7.0 Hz, CH3); 1.25-1.41 (m, 16H, CH2); 1.77 (m, 2H, CH2); 3.03 (t, 2H, J=7.5 Hz, CH2CO); 3.14 (s, 3H, CH3N); 3.51 (dd, 1H, J=15 Hz, J=5.5 Hz); 3.61 (m, 2H); 3.82 (dd, 1H, J=11.5 Hz, J=3.5 Hz); 4.11 (m, 1H, CHOH); 6.95 (br s, 1H, H ar); 7.22 (dd, 1H, J= 9.5 Hz, J=2.5 Hz, H ar); 7.63 (d, 1H, J=8.5 Hz, H ar); 7.80 (d, 1H, J=9 Hz, H ar); 7.93 (dd, 1H, J= 8.5 Hz, J=1.5 Hz, H ar); 8.32 (s, 1H, H ar).

13C NMR: δ = 14.1; 22.7; 24.8; 29.4; 29.5; 29.6; 29.7; 31.9; 38.4; 39.5; 55.3; 64.2; 69.8; 105.9; 116.5; 124.8; 125.5; 126.3; 129.7; 130.9; 131.1; 137.5; 149.5; 200.3.

HRMS: m/z (MH+) calculated for C₂₆H₄₀NO₃: 414.3003, measured: 414.2995.

**Spectroscopic measurements.** Probe fluorescence in organic solvents. Fluorescence measurements were performed with a Hitachi F4500 fluorometer. Excitation and emission slits were set at 5 nm and spectra were recorded at 25°C using a 1 cm path length thermostated quartz micro-cuvette. 0.26 mM solutions of the probes were prepared in a dichloromethane: methanol mixture (3: 1 volume ratio). Measurements were performed with 2.6 mM probes diluted in the different solvents. The initial solvent of the stock solution thus represented 1% of the final volume.

Probe fluorescence in liposomes. Liposomes were prepared in PBS buffer using a classical freeze/thawing protocol. Briefly, lipids dissolved in chloroform were dried under vacuum. The lipid film formed was rehydrated with the PBS and agitated until complete suspension of the lipid film. The vesicle solution was then submitted to 6 freeze/thawing (5 min in liquid nitrogen/ 10 min in 37°C water bath) cycles and then sequentially extruded 19 times through 400 nm and 200 nm polycarbonate membranes (Avanti Polar Lipids Liposome Extruder). The 200 nm liposome suspension was stored at 4°C.

Fluorescence data were obtained using a Hitachi F4500 fluorometer. Emission spectra were recorded between 420 and 600 nm with an excitation wavelength fixed at 385 nm and 5 nm excitation and emission slits. Ethanol solutions of fluorescent probes were prepared and added to liposomes at a 1: 400 (probe: phospholipid) molar ratio. Liposomes were used at a 40 µg mL⁻¹ final concentration. Measurements were done at 21°C for all liposome compositions indicated in Table S2, except for DMPC for which a range of temperatures from 5°C to 65°C was also applied.
**Cell culture and dye incubation.** Human mammary epithelial cells (HMECs) and HL-60 cells were provided by Lonza and the ATCC, respectively. All cells were grown at 37°C and 5% CO₂. HMECs were maintained in 1:1 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/HAMF12 medium (Gibco) complemented with 10% FBS (Gibco), 91 U.mL⁻¹ penicillin-streptomycin (P/S) (Gibco), 10 ng.mL⁻¹ human epidermal growth factor (EGF) (Promocell), 262 mU.mL⁻¹ insulin (NovoRapid) and 0.5 µg.ml⁻¹ hydrocortisone (Sigma). HL-60 were grown in RPMI1640 supplemented with 10% FBS and 91 U.mL⁻¹ penicillin-streptomycin (P/S) (Gibco).

For staining, cells were usually directly pre-incubated with dye of the Laurdan series (0.1-10µM final concentration) for 24 h. When the lipid environment was modified, extra-fatty acids (arachidate or palmitate (Merck)) or new serum (Horse serum (Gibco) instead of FBS) were added 24 h before staining, and cells were further incubated for 24 h.

For accumulation of lipid droplets, cells were incubated during 48 h in highly concentrated glucose (20mM), oleate (500 µM), palmitate (100 µM), and the PPARγ agonist rosiglitazone (2µM).

**Dye loading kinetic.** HMECs were plated in CellCarrier-96 Black plates (PerkinElmer). When cells were completely confluent, they were cleaned twice with PBS and 195 µL of experimental medium was added (DMEM containing either 2 µM of Dioll, Laurdan or C-Laurdan and no phenol red). In these experimental media, FBS was removed or replaced by 500 µM of palmitate complexed with BSA (1:4 BSA:Palmitate), or an equivalent amount of BSA. A control condition with a standard concentration of FBS was also analyzed. Fluorescence was read directly from 410 to 610 nm via the fluorescence kinetics bottom mode on the microplate reader ClarioStar® (BMGLabtech) for 12h at 37°C and 5% CO₂. Curve analysis was fitted through an exponential law (1 - e⁻λx with λ corresponding to the rate parameter of the exponential) using GraphPad Prims 8.

**Fluorescence acquisition from cells or liposomes prepared in suspension.** Cells were stained as described above. At the end of the incubation time, cells were harvested and dissociated with trypsin, and the protease was then removed. For liposome analyses, incubation was performed either temporarily after their preparation or directly during their *in vitro* synthesis. In each case, 1 nmol of dye per 50 µg of lipids was added to the vesicles. Dye was incubated overnight before acquisition when it was added on pre-formed liposomes.

**Cytometric analysis:** Cells were resuspended in PBS containing 10% FBS. Acquisition was performed with a BD LSRFortessa™ Flow Cytometer, violet laser, with 10,000 events recorded. Bandpass filter at 450 nm and 510 nm were used to quantify the fluorescence emission ratio. The final data were analyzed using the Flow Jo 7.5.5 software.

**Acquisition with a microplate reader:** After cell dissociation, cell populations were resuspended in their medium and seeded onto 96-well black plates (10,000 cells per well). Their fluorescence spectrum was immediately recorded with a microplate reader ClarioStar® (BMGLabtech) and a monochromator in spectral scan mode (ex=380-400nm/em=400-600nm).

Purified liposomes were resuspended in PBS (100µg/ml) and analyzed with a spectrofluorometer (Jasco FP-8500™, ex=390nm/em=400-600nm).

**Confocal microscopy.** Cells were grown in 8-well Lab-TEK® slides and stained with dye (0.5 or 4 µM) similarly to previous analyses. All samples were imaged using a confocal fluorescence microscope (Zeiss LSM 880 AxioObserver inverted spectral confocal microscope, environmental control: temperature, CO₂ and hygrometry) with two different objectives Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27 or 100x/1.46 Oil DIC M27. Laser power and electronic gain used for experiments are specified in the figure captions when signal intensities were compared. Laurdan and its derivates were excited with a 405 nm diode laser and, for classic acquisition, emission was recorded with a filter band 424-513 nm. For spectral mode acquisition, emission spectrum was divided into 8/9 nm bands from 424 to 513 nm and color-coded in violet-green scale.

Specific organelle markers (plasma membrane (Dil), endoplasmic reticulum (ER tracker), mitochondria (Mito tracker red), lipid droplets (Nile red) were added 20 minutes before observation. Parameters for signal acquisition followed the manufacturer's recommendations. Nuclear staining (Hoechst) was injected automatically into the chamber after Dioll fluorescence acquisition and recorded after 5 min with an excitation of 405 nm using a diode laser.

**GP parameter analysis from microscopy.** A composite image was created from the spectral slices obtained with Dioll, Laurdan or C-Laurdan. Whole cell analysis was performed automatically after background correction and selection of positive signals. Specific areas studied were either manually defined in the absence of co-marker or automatically retained through pixel selection using the specific subcellular markers (Dil, ER-tracker, Mito tracker). Background correction was also performed in these cases. Emission intensity values of each selected pixel in the 440 and 490 nm channels were recovered and used to calculate a GP of each position with the same formula as for spectroscopy experiment: $GP=(I_{440}-I_{490})/(I_{440}+I_{490})$

A median for the calculated GP values was then estimated for each field and at least 5 independent fields (each of them containing at least 10 cells) were measured for each experiment.

For subdomain analysis of the plasma membranes, positive pixels were selected and their GP calculated similarly. GP distribution was then performed to define 4 quartiles then used for image encoding (deep blue, blue, red, deep red). Subdomains were accentuated by using an "Accented Edges filter" adding white chalk dash (1 pixel width) around each homogeneous area (Adobe design Premium).

**Spatial Autocorrelation Score (Moran's index).** We used the ape R package 40 to calculate Moran's I, a spatial autocorrelation statistic. Only points with a defined value in the 2D space were included in the calculation. We used both Euclidean distances between points, and a bin-based approach to select only the direct neighbors of each point via a maximum distance cut-off of √2 to consider two points as neighbors. As all datasets demonstrated highly significant autocorrelation, a Z-score was calculated to quantify how superior the observed autocorrelation statistic was to expectations in each dataset.

**mRNA expression quantification and multivariate analysis.** 1 µg of extracted mRNA obtained from 1 million cells (Qiagen RNeasy Kits) was reverse transcribed (SuperScript™ Double-Stranded cDNA Synthesis Kit). Real-time PCR intronspanning assays were performed with the SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Biorad). Primers used are available on request. The relative quantification of gene expression

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was performed using the comparative CT method, with normalization of the target gene against the endogenous housekeeping gene 36B4 (RPLPo - ribosomal protein, large, Po). Primer sequences are available on request. For multivariate analysis of gene expression, the CT method was adapted as follows. Gene expression corresponding to 24 CT was set at 1. With this reference, the obtained fold change from the CT methods were used to scale other mRNA expressions. All values obtained for one specific gene were then divided by the mean expression of this gene in all the tested conditions. Finally, these values were log2-transformed for the principal component analysis. This strategy centers the analysis on the difference in gene expression and defines gene expression against the whole set of samples instead of arbitrarily using only one sample as a reference. PCA analysis was then performed using the R-software (v3.2.2), package ade4. Results are represented as a scatterplot (PC1 vs. PC2), and corresponding eigenvectors for each condition are drawn as arrows. Gene coordinates are also used to add their position on the plot.

**Cell death and proliferation analysis.** For cell death analysis, cells were harvested with trypsin and then incubated with 1.5µM of 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) for 20 min in their own medium. Since only dying cells incorporate the dye, cell death was counted by gating positive fluorescent cells by flow cytometry (FORTESSA, BD). The final data were analyzed using the Flow Jo 7.5.5 software.

For proliferation analysis, cells were harvested at the end of the experiment and lysed in a RIPA buffer containing 0.5% of Sodium Dodecyl Sulfate. The extract was boiled for 10 min and the amount of DNA present in the extract was quantified with the QuantiFluor® dsDNA System (Promega).

**Lipidomics analysis.** Lipids were extracted from cell pellets using the Folch method (FOLCH et al., 1951). For analysis of a particular class of lipids, lipids were separated by thin-layer chromatography on silica gel plates (Merck 5721, Germany), using petroleum ether-ethylic and ether-acetic acids as developing solvents. The plates were sprayed with bromophenol blue and individual bands of phospholipids were scraped off. The phospholipid (PL) fraction or the whole set of lipids was saponified and transmethylated with sodium methylate. The methyl esters were extracted by hexane, and analyzed by gas-liquid chromatography, using a FOCUS, Trace/ULTRA GC gas chromatograph (Thermo Separation Products) equipped with a CP-SIL fused silica capillary column (25 m x 0.25 mm internal diameter) coated with 100% cyanopropyl siloxane. Identification of individual methyl ester components was performed by comparison of the retention times with those of standard values. The results were given based on the relative abundance of individual fatty acids (in %).

**Statistical analysis and reproducibility.** Student's t-tests with two tails and Bonferroni's correction were performed for sample comparisons. Statistical significance is indicated in the caption of the figure. GraphPad Prism software was used to generate graphs and perform statistical analyses. When not indicated in the legend of the figure, experiments shown are representative of n=3 independent biological replicates.

## ASSOCIATED CONTENT

This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.

Figures of synthesis schemes, kinetic of Laurdan and C-Laurdan incorporation in cell, recorded GP from pixel corresponding to plasma membrane, cytotoxic and membrane - disturbing effect of solvatochromic dye, physiological end genetic stress. Table describing lipid used for liposome preparation (PDF)

## AUTHOR INFORMATION

### Corresponding Authors

Arnaud M. Vigneron. 2 ; "EMT and Cancer Cell Plasticity" laboratory, Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

3 ; Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Thierry Granjon. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

### Authors

Sébastien Ibanez. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

2 ; "EMT and Cancer Cell Plasticity" laboratory, Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

3 ; Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Mouhedine Cheniour. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

David Gueyrard. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

Milène Nitenberg. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

Larissa Socrier. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

Jihen Zouaoui. 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.
4 ; Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, Unité
Risques Liés au stress Environnemental, lutte et prévention
UR17ES20.Faculté des sciences de Bizerte, Tunisie. 7021 Jar-
zouna, Bizerte.

**Layth Ben Trad.** 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie
Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat.
LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-
69622 Villeurbanne cedex - France.

4 ; Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, Unité
Risques Liés au stress Environnemental, lutte et prévention
UR17ES20.Faculté des sciences de Bizerte, Tunisie. 7021 Jar-
zouna, Bizerte.

Julien Bompard. 5 ; Université de Lyon, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, équipe GEMBAS, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

**Thomas Guillot.** 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie
Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat.
LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-
69622 Villeurbanne cedex - France.

Samia Selmi-Ruby. 2 ; "EMT and Cancer Cell Plasticity" laboratory, Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

3 ; Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Ahmed Landoulsi. 4 ; Laboratoire de Biochimie et de Biologie Moléculaire, Unité Risques Liés au stress Environnemental, lutte et prévention UR17ES20.Faculté des sciences de Bizerte, Tunisie. 7021 Jarzouna, Bizerte.

Ana-Maria Trunfio-Sfarghiu. 6 ; Laboratoire de Mécanique des Contacts et Structures, LaMCoS UMR 5259, CNRS, Univ Lyon, Université Lyon 1, Lyon, France.

Agnès Girard-Egrot. 5 ; Université de Lyon, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, équipe GEMBAS, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France.

Christophe Vanbelle. 7 ; Plateforme d'Imagerie cellulaire, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL).

Léa Payen-Gay. 8 ; Biochemistry Laboratory of Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France.

Pierre Martinez. 2 ; "EMT and Cancer Cell Plasticity" laboratory, Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

3 ; Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Alain Puisieux. 2 ; "EMT and Cancer Cell Plasticity" laboratory, Equipe labellisée 'La Ligue', LabEx DEVweCAN, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

3 ; Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

**Peter Goekjian.** 1 ; Université de Lyon, Laboratoire Chimie
Organique 2, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, Bat.
LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-
69622 Villeurbanne cedex - France.

Ofélia Maniti. 5 ; Université de Lyon, ICBMS UMR 5246 CNRS-UCBL-CPE, équipe GEMBAS, Bat. LEDERER, 1 rue Victor GRIGNARD, Université Lyon 1 - F-69622 Villeurbanne cedex - France

Olivier Marcillat. 3 ; Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Present Addresses

Alain Puisieux. CNRS UMR3666, Inserm U1143, Cellular and Chemical Biology, Institut Curie, PSL Research University, 75005 Paris, France.

Arnaud M. Vigneron. "Signalling, metabolism and tumor progression" laboratory, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche
en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1,
INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Thomas Guillot. "Signalling, metabolism and tumor progression" laboratory, Institut PLAsCAN, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052-CNRS UMR5286, Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Lyon, France.

Université de Lyon, Centre Léon Bérard, Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Lyon, France.

Pierre Martinez. "Integrated analysis of the dynamics of cancer" laboratory, Université de Lyon, Claude Bernard Lyon 1 University, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Cancer Research Center of Lyon, Lyon, France.

**Complete contact information is available at:**

https://pubs.acs.org

Author Contributions

All authors have reviewed and approved the final version of
this manuscript.

§ These authors contributed equally to this work.

* To whom correspondence should be addressed: Arnaud M. Vigneron-Thierry Granjon.

**Funding Sources**

This work was supported by the Technology Transfer Accel-
erator Office Lyon-Saint-Etienne Pulsalys, a CNRS prematu-
ration program, funding from ANR, Institut de Chimie de
Lyon, French Ligue Nationale contre le Cancer, Institut
PLAsCAN (Convergence Program of ANR). MN was sup-
ported by a Pulsalys fellowship
Notes

The authors declare no competing financial interest.

ACKNOWLEDGMENT

We thank Brigitte Manship for proofreading the manuscript and Thibault Andrieu for technical support and helpful discussions.

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## Supporting information for:

### Synthesis routes

<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>Figure S1. Structure of Dioll analogs and NMR characterization of Dioll and its precursors</figcaption></figure>
NMR spectra

<figure><img src="image_42.png" /><figcaption>Compounds 1</figcaption></figure>

Top : 1H spectrum

Bottom : 13C spectrum
<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>Compounds 2</figcaption></figure>

Top : 1H spectrum

Bottom : 13C spectrum
<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>Compounds 3 (DIOLL)</figcaption></figure>

<figure><img src="image_45.png" /></figure>

Top : 1H spectrum

Bottom : 13C spectrum
## Photophysical data

<table><caption>**Table S1.** The optical properties of Laurdan, C-Laurdan and Dioll</caption><thead><tr><th colspan="5">Polarity</th></tr><tr><th colspan="2">Solvent</th><th>Toluene</th><th>Chloroform</th><th>DMSO</th><th>Ethanol</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="3">λ emission<br>maximum (nm)</td><td>Laurdan</td><td>423</td><td>440</td><td>460</td><td>485</td></tr><tr><td>C-Laurdan</td><td>416</td><td>432</td><td>450</td><td>485</td></tr><tr><td>Dioll</td><td>425</td><td>441</td><td>460</td><td>486</td></tr><tr><td rowspan="3">Maximum<br>fluorescence<br>intensity (A. U.)</td><td>Laurdan</td><td>3814</td><td>4441</td><td>5533</td><td>4221</td></tr><tr><td>C-Laurdan</td><td>359</td><td>3115</td><td>2428</td><td>1491</td></tr><tr><td>Dioll</td><td>5041</td><td>5041</td><td>9384</td><td>7647</td></tr></tbody></table>

Table summarizing the fluorescence properties of the indicated dyes in several solvents (λ=wavelength)

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>**Figure S2.** Fluorescence intensity of Laurdan derivatives in liposomes. Fluorescence of polarity-sensitive probes (0.2 µM) in 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) liposomes (0.1 mg/mL). An additional measurement is shown for Dioll following a 7 times dilution.</figcaption></figure>
<table><caption>**Table S2.** Structural and melting temperature information of standard glycerophospholipids used to test GP analysis in various liposomes.</caption><thead><tr><th></th><th>Lipid</th><th>Acyl chain<br>composition</th><th>Schematic structure</th><th>Tm</th></tr></thead><tbody><tr><td>DLPC</td><td>1,2-dilinoleoyl-<br>sn-glycero-3-<br>phosphocholine</td><td>18:2 (Δ<sup>9,12</sup>-<br>Cis) PC</td><td></td><td>-57°C</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>1,2-dioleoyl-sn-<br>glycero-3-<br>phosphocholine</td><td>18:1 (Δ<sup>9</sup>-Cis)<br>PC</td><td></td><td>-17°C</td></tr><tr><td>POPC</td><td>1-palmitoyl-2-<br>oleoyl-glycero-3-<br>phosphocholine</td><td>16:0-18:1 PC</td><td></td><td>-4°C</td></tr><tr><td>DMPC</td><td>1,2-dimyristoyl-<br>sn-glycero-3-<br>phosphocholine</td><td>14:0 PC</td><td></td><td>24°C</td></tr><tr><td>DPPC</td><td>1,2-dipalmitoyl-<br>glycero-3-<br>phosphocholine</td><td>16:0 PC</td><td></td><td>41°C</td></tr><tr><td>DSPC</td><td>1,2-distearoyl-<br>sn-glycero-3-<br>phosphocholine</td><td>18:0 PC</td><td></td><td>55°C</td></tr></tbody></table>

Table indicates the name of phospholipids used for liposome preparation. Their acyl chain composition, structure and Tm are also specified.
Biochemical data

<figure><img src="image_47.png" /></figure>

<figure><img src="image_48.png" /></figure>

**Figure S3.** Laurdan, C-Laurdan uptake and signal in live cells. HMECs grown in medium containing no fetal bovine serum (FBS) (Empty) were incubated with Laurdan or C-Laurdan as indicated and fluorescence was recorded in real-time. Similar experiments were also performed in the presence of 10% FBS or after the addition of unloaded bovine serum albumin (BSA) or BSA loaded with palmitate (4.1 ratio). All results are expressed as a percentage of the maximal fluorescence obtained for each medium condition
Image analysis

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure S4.** GP distribution in plasma membrane according to each solvatochromic fluorescent dye. GP distribution for Dioll (up), Laurdan (Middle) and C-Laurdan (Bottom) corresponding to images presented in the Figure 5C. Min, Median and Max values are indicated for each experiment.</figcaption></figure>
<table><caption>**Table S3.** Spatial Autocorrelation Score (Moran's index) for GP values issue from images corresponding to plasma membrane sections stained with Dioll or its analogs.</caption><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="4">Euclidean Distances</th></tr><tr><th>observed</th><th>expected</th><th>sd</th><th>Z</th></tr></thead><tbody><tr><th>MatrixGP_cLaurdan</th><td>0.013091</td><td>-0.00025</td><td>0.000565</td><td>23.6168</td></tr><tr><th>MatrixGP_Dioll</th><td>0.055114</td><td>-0.00014</td><td>0.00035</td><td>158.0225</td></tr><tr><th>MatrixGP_Laurdan</th><td>0.016287</td><td>-0.00012</td><td>0.000324</td><td>50.63495</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th rowspan="2"></th><th colspan="4">Direct neighbours</th></tr><tr><th>observed</th><th>expected</th><th>sd</th><th>Z</th></tr></thead><tbody><tr><th>MatrixGP_cLaurdan</th><td>0.093922</td><td>-0.00025</td><td>0.008447</td><td>11.14817</td></tr><tr><th>MatrixGP_Dioll</th><td>0.319838</td><td>-0.00014</td><td>0.006287</td><td>50.89829</td></tr><tr><th>MatrixGP_Laurdan</th><td>0.11615</td><td>-0.00012</td><td>0.005713</td><td>20.35177</td></tr></tbody></table>

Table reports the complete statistical analysis presented in the Figure 5C. The Euclidean distances approach takes into account all pairwise point combinations, based on the correlation between the inter-point Euclidean distance and the reported GP. The direct-neighbor approach focuses on the correlation between the GP of a point and its direct neighbors (as in a square centred on a specific point) compared to all other points in the 2D space. Scores for both approaches are shown. Expected values and their standard deviation for a random distribution are indicated in each case. A Z-score was finally calculated to quantify how superior the observed autocorrelation statistic was to expectations in each dataset.
Cell analysis

<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure S5.** Effects of long-term staining on cell proliferation. HMECs were incubated with indicated dyes at specified concentrations. Cell proliferation was followed for six days by measuring oxidative activity of the whole population.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure S6.** Effects of long-term staining on apparent membrane fluidity. HMECs were incubated for 24 h with Dioll, Laurdan and C-Laurdan at the indicated concentrations. GPs associated with membranes of the whole population were calculated immediately prior to medium renewal, 2 days later or 4 days later as indicated.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_52.png" /></figure>

SREBP1 (SREBF1) target genes : FASN, SCD1

SREBP2 (SREBF2) target genes : HMGCR, LDLR

<figure><img src="image_53.png" /></figure>

<figure><img src="image_54.png" /></figure>

**Figure S7.** Stress analysis of cells treated with different lipid contents in the extracellular medium. (A) HMECs were treated with 500 µM of palmitate or 10% horse serum for 48 h. mRNA gene expression (30 genes) corresponding to stress markers (ER stress, autophagy/lysosomal stress, oxidative stress and sterol/lipid disturbance) was then analyzed through RT-qPCR. Unsupervised multivariate analysis was then performed through a principal component analysis represented by a dot/scatter plot showing the contribution of each gene to the discrimination of control, palmitate-treated and horse serum treated conditions. Kernel target genes of SREBP1 and SREBP2 is also indicated. (B) Cell proliferation was analyzed after the same treatments through the quantification of DNA in cell extracts. (C) Cell death was also analyzed in the same conditions through the spectrofluorometric quantification of DAPI incorporated exclusively in dying cells.

Data represent mean ± s.d.; three experiments were conducted for each condition in (B) and (C). Student's t-test, ns=non-significant \*=P<0.05, \*\*\*=P < 0.01, \*\*\*\*=P<0.00
<figure><img src="image_55.png" /></figure>

<figure><img src="image_56.png" /></figure>

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure S8.** Lipidomic analysis of HMECs maintained in FBS or Horse serum. Top: Whole lipid chain analysis of control cells or cells treated with 10% of horse serum. Center and Bottom: Lipid chain analysis of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in the same conditions (n=2 independent experiments). Data represent mean ± s.d.</figcaption></figure>
# Travaux supplémentaire en lien avec la publication

## Introduction :

Nous nous sommes intéressées, en plus de l'étude des cellules, aux vésicules extracellulaires (Extracellular vesicles: EV). Ces vésicules sont sécrétées par l'ensemble des cellules et son regroupés en 3 groupes : les exosomes, les microvésicules (ou ectosomes) et enfin les corps apoptotiques. La caractérisation d'origine de ces vésicules s'effectuait par des marqueurs de surface mais aussi grâce à leurs différences de tailles. Les exosomes sont caractérisées par une taille de 30 nm à 150 nm, enrichies en marqueurs de surface tels que CD63¹, CD81¹ et CD9² avec pour origine membranaire le système endosomal dans lequel la fusion du corps multivésiculaire avec la membrane plasmique permet leur libération dans la matrice extracellulaire³. Les microvésicules, aussi appelées ectosomes ou encore oncosomes, possèdent une taille entre 50 nm et 1000 nm et sont générées par bourgeonnement puis fission de la membrane plasmique permettant alors leur libération dans la matrice³. Cependant l'échelle de taille qui se chevauche, la morphologie similaire et la composition variable et croisée de leur contenu entre ces deux types de vésicules rendent difficiles les tentatives actuelles de créer une nomenclature précise de ces EV⁴. Leur nature étant membranaire et leurs biogenèses étant différentes, nous nous sommes alors demandé si la fluidité membranaire ne pourrait pas servir de paramètre permettant leur séparation.

## Résultats :

Nous avons dès lors utilisé le Dioll pour marquer les vésicules extracellulaires après purification. En effet son intensité élevée est un avantage pour la quantification de la fluidité membranaire de ces vésicules de tailles réduites. Comme preuve concept nous avons dans un premier temps montré que des liposomes pouvaient être détectés après un marquage au Dioll (Figures A-C) au microscope confocal mais aussi en cytométrie, et qu'il était possible de mesurer leur fluidité en effectuant un rapport d'émission de fluorescence (apparenté au GP mais non identique). La mesure de la fluidité membranaire peut s'effectuer par des mesures sur cytométrie classique (Figure B), mais aussi par cytométrie spectrale qui permet par déconvolution des spectres à partir de spectres de références de définir un paramètre rigide et fluide (Figure C). Dans un second temps, nous nous sommes intéressés aux vésicules extracellulaires sécrétées par des cellules. Afin d'obtenir une quantité importante de matériel biologique, nous avons utilisé une lignée cancéreuse non adhérente issue d'un syndrome myélodysplasique. Comme nous l'avons vu la nomenclature recommandé par la « International Society for Extracellular Vesicles » reflète notamment bien la difficulté de séparer clairement les exosomes et les microvésicules (ectosome)⁵. En utilisant la chromatographie d'exclusion stérique, nous avons à partir du milieu de culture cellulaire, pu obtenir deux fractions contenant chacune deux populations d'EV de taille différente, l'une légèrement inférieure à nos liposomes de 100 nm et une autre autour de 150-250 nm (Figure D). En se basant sur la taille des EV, les microvésicules sont enrichies dans la première fraction d'élution de la chromatographie, mais sont clairement toujours présentes dans la suivante. A l'inverse, les exosomes sont moins abondantes dans la première fraction avec une augmentation de leur quantité au cours de l'élution (Figure D). Comme nous l'avons vu les petites vésicules associées aux exosomes ont pour origine les corps multivésiculaires, dérivés des endosomes, tandis que les grandes
vésicules, qui elles sont associées aux microvésicules, ont pour origine le bourgeonnement de la membrane plasmique enrichie en cholestérol et sphingolipide. Sur la base de ces caractéristiques et en vue de nos mesures de GP effectuées sur cellules, nous avons émis l'hypothèse que les microvésicules seraient associées à une fluidité membranaire plus faible que celle des exosomes. Remarquablement, le Dioll peut marquer les deux types d'EV mais peut aussi les discriminer en se basant sur leur fluidité respective (Figure E). Les EV présentant une fluidité plus faible sont comme nous l'attendions enrichies dans la fraction initiale et avec une médiane de leur taille plus importante que les EV plus fluide. A l'inverse, les EV les plus enrichies dans une fraction plus tardive sont plus petites et se caractérisent par une fluidité plus élevée. Le Dioll pourrait ainsi être utilisé très efficacement en combinaison avec la cytométrie spectrale pour la discrimination des différents types d'EV à partir de leur fluidité membranaire.

<figure><img src="image_58.png" /><figcaption>Figure : Propriété du Dioll à mesurer la fluidité membranaire de vésicules biomimétiques et physiologiques.</figcaption></figure>

A) Images représentatives des liposomes indiqués adsorbés sur lame et incubé avec 0.5 µM. B) Ratio de la fluorescence des canaux 525 nm vs 450 nm du Dioll inséré dans les liposomes indiqués et mesurés par cytométrie en flux conventionnel. C) Fluorescence d'émission séparée du Dioll inséré dans les liposomes indiqués et mesurés par cytométrie en flux spectral. D) Nanoparticle Tracking Analysis de liposomes extrudés à 100 nm (graphique du haut) Nanoparticle Tracking Analysis des EV obtenues par chromatographie d'exclusion (graphique du bas). Résultats montrés sont la première et la troisième fraction. E) Fluorescence d'émission post-déconvolution du Dioll inséré dans les EV obtenues de la fraction 1 et de la fraction 3. Les graphique internes aux dot plot indiquent la médiane de la taille (paramètre Forward Side Scatter) et la déviation standard des populations rouge et bleue sélectionnées.
## Discussion :

Les premiers travaux ont permis de décrire une nouvelle sonde synthétisée au sein de notre équipe qui possède des caractéristiques plus pertinentes pour le suivie de la fluidité membranaire que les sondes préexistantes. Une meilleure résolution sur l'ensemble des membranes, notamment les régions plus fluides, qui couplé à l'absence de marquage des gouttelettes lipidiques font du Dioll un outil puissant pour suivre la fluidité membranaire des cellules. Il est cependant important de repréciser que dans ces travaux nous corrélons la fluidité membranaire par la mesure du niveau de l'hydratation des membranes. Or d'autres paramètres biophysiques permettent de décrire le niveau de la fluidité membranaire, comme par exemple la viscoélasticité. L'autre point fort du Dioll est son rapport quantique qui permet dans un premier temps de diminuer la puissance du laser et par conséquence la quantité de chaleur pouvant induire des variations de fluidité membranaire, et dans un second temps son utilisation pour le marquage des vésicules extracellulaires et leur détection au cytomètre spectral. Cependant, des expériences sont à venir sur ce dernier point pour savoir si les vésicules détectées sont des particules uniques ou des particules agrégées mais aussi si tout comme les cellules, l'analyse des vésicules extracellulaires permettraient de suivre les modifications de fluidité membranaire des cellules d'origines. En effet dans un contexte pathologique lors la tumorigenèse, les contraintes mécaniques de la matrice extracellulaire exercée sur les cellules peut être très variable. Ces effets mécaniques peuvent alors se traduire par une réponse différente des cellules. Même si des travaux ont notamment démontré que les cellules les plus agressives avaient une viscoélasticité plus importante ce qui correspondrait à une plus grande fluidité membranaire⁶⁻⁷, l'utilisation des vésicules extracellulaires pour le suivi de la plasticité cellulaire possède plusieurs avantages. Premièrement, des analyses préliminaires au sein de notre équipe semblent montrer que les vésicules extracellulaires ont une fluidité membranaire corrélée à la cellule sécrétrice. Ainsi une lignée cellulaire possédant une fluidité plus importante que celle d'une autre lignée sécrète des EV plus fluides que la seconde. Deuxièmement, les EV se retrouvent dans les biofluides tels que le sang, la salive et les urines permettant alors d'effectuer des biopsies liquides beaucoup moins invasives qu'une biopsie classique sur la tumeur *in situ*. Enfin les cellules cancéreuses sécrètent une quantité plus importante d'EV que les cellules saines. Ainsi l'analyse des EV pour la création d'un outil diagnostique basé sur des modifications de fluidité membranaire semble être une approche prometteuse.

## Matériels et Méthodes :

### Préparation des liposomes :

Les liposomes sont préparés dans un tampon PBS préfiltré à 0.22 µm par le protocole classique de congélation/décongélation. Brièvement, les lipides sont solubilisés dans du chloroforme puis séché par évaporateur rotatif. Le film lipidique formé est ensuite réhydraté avec le tampon PBS et agité jusqu'à une complète resuspension du film. La solution de vésicules est ensuite soumise à 6 cycles de congélation/décongélation (5 min dans de l'azote liquide / 10 min à 37°C dans un bain-marie) et enfin extrudée 19 fois à 400 nm suivie de nouveau 19 fois à 100 nm à travers des membranes de polycarbonates (AvantiPolar® Lipids Liposome Extruder). La solution de liposomes est ensuite conservée à 4°C.
## Préparation des vésicules extracellulaires :

4 millions de cellules en suspension d'une lignée cancéreuse myéloïde HL60 (ATCC), sont maintenues une nuit dans 20 mL de leur milieu sans sérum : milieu RPMI1640 complémenté avec 91 U.mL-1 penicillin-streptomycin (P/S) (Gibco). Le milieu est ensuite récupéré et les cellules suspendues sont éliminées par centrifugation 300g, 4min, 4°C. Deux autres centrifugations sont ensuite effectuées respectivement à 1500g et 10000g pendant 10min à 4°C afin d'éliminer les débris cellulaires et les larges particules. 10 mL de ce milieu pré-purifié sont utilisés pour la chromatographie d'exclusion (qEV10-35nm iZon™). L'ensemble des tampons sont préalablement filtrés 0.22 µm et la chromatographie est effectuée en suivant le protocole fourni par l'entreprise iZon™. Les factions obtenues de 5 mL sont ensuite analysées à l'aide du traqueur de nanoparticules Nanosight NS300 pour déterminer la distribution de taille des particules ainsi que leur quantité globale.

## Acquisition de la fluorescence des EV :

Les EV et les liposomes sont marqués extemporanément au Dioll. 1 nmol de sonde pour 50 µg de lipides est additionnée par vésicules. Le Dioll est ajouté la veille au soir avant les analyses des EV et des liposomes.

### Analyse par cytométrie
Les liposomes et les EV sont resuspendues dans un PBS. Pour la cytométrie classique, l'acquisition est effectuée par le cytomètre en flux BD LSRFortessa™, à l'aide du laser violet laser et 10 000 événements ont été enregistrés. Les filtres à 450 et 510 nm ont été utilisés pour quantifier un ratio de fluorescence d'émission. Les données sont ensuite analysées à l'aide du logiciel Flow Jo 7.5.5. Pour le cytomètre en flux de type spectral, la signature spectrale associée au Dioll au sein des liposomes DSPC et DOPC sont utilisées afin discriminer la composante rigide et fluide de l'ensemble du spectre d'émission obtenu chez d'autres liposomes et EV. Les mesures sont effectuées à partir du cytomètre spectral Aurora de chez Cyteck®.

### Analyse par microscopie confocale
Les images des échantillons ont été capturées par microscopie confocale (Zeiss LSM 880 AxioObserver inversé, avec environnement contrôlé : température, CO₂ et hygrométrie) avec un objectif Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27. Le Dioll est excité avec laser diode 405 nm, d'énergie = 1.0 %max et l'acquisition s'effectue en mode spectral avec un gain = 759 A.U, le spectre d'émission est subdivisé en canaux de 8/9 nm de 424 à 513 nm avec une échelle de couleur reflétant les différentes longueurs d'onde du violet au vert.

## Bibliographie :

1. JM, E. et al. Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicular endosomes and on exosomes secreted by human B-lymphocytes. *J. Biol. Chem.* **273**, 20121–20127 (1998).

2. C, T. et al. Molecular characterization of dendritic cell-derived exosomes. Selective accumulation of the heat shock protein hsc73. *J. Cell Biol.* **147**, 599–610 (1999).

3. Colombo, M., Raposo, G. & Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. *Annu. Rev. Cell Dev. Biol.* (2014) doi:10.1146/annurev-cellbio-101512-122326.
4. J, K. et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. *Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.* **113**, E968–E977 (2016).

5. C, T. et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. *J. Extracell. vesicles* **7**, (2018).

6. J, L. et al. Cell softness regulates tumorigenicity and stemness of cancer cells. *EMBO J.* **40**, (2021).

7. J, Z. et al. Multi-scale mechanical characterization of prostate cancer cell lines: Relevant biological markers to evaluate the cell metastatic potential. *Biochim. Biophys. acta. Gen. Subj.* **1861**, 3109–3119 (2017).
# Résultat n°2

<figure><img src="image_59.png" /></figure>

## Suivi de la plasticité cellulaire par la fluidité membranaire
## Introduction :

Le tissu mammaire est intrinsèquement hétérogène en raison de la coexistence de deux lignages épithéliaux, luminaux et myoépithéliaux, supportés par une dynamique complexe de progéniteurs. D'autre part, une certaine plasticité existe au sein de ce tissu, certains de ces progéniteurs étant capables de régénérer ces différentes composantes cellulaires. Il a notamment été montré que dans un tissu sain, les progéniteurs unipotents des cellules basales normalement à l'origine des cellules myoépithéliales peuvent en absence des progéniteurs des cellules luminales acquérir un statut multipotent pour reconstituer l'ensemble de la hiérarchie mammaire¹. Cette plasticité associée à ces progéniteurs basaux constitue un mécanisme susceptible d'expliquer l'hétérogénéité des tumeurs mammaires, cette propriété étant fréquemment exacerbée lors des processus de transformation néoplasique.

De façon simplifiée, l'hétérogénéité tumorale des lésions mammaires s'est d'abord conceptualisée sous la forme de cinq grands groupes : Luminal A, Luminal B, HER2+, Basal-like et Claudin-low, caractérisé principalement par des outils génétiques et histologiques. L'un des paramètres majeurs de cette classification est l'expression des récepteurs hormonaux caractéristique des cellules les plus différenciées (récepteur à l'œstrogène, à la progestérone), ou d'un récepteur aux facteurs de croissance EGF, connu sous le nom de HER2 ou ERBB2²⁻⁴. Malgré ces premières classifications, il est vite apparu cependant que l'hétérogénéité des tumeurs mammaires reposait sur des mécanismes plus complexes, favorisant non seulement l'existence d'une hétérogénéité entre les tumeurs, mais aussi à l'intérieure d'une même tumeur. L'existence de cellules au pouvoir tumorigénique plus important présentant des caractères très indifférenciés a notamment pu être mise en évidence dans tous ces sous-groupes⁵. Ces cellules ne constituent sans doute pas une population stable au sommet d'une hiérarchie de cellules cancéreuses plus classiques, mais plutôt un pool dynamique de taille variable en fonction des tumeurs⁶. La proportion de ces cellules au sein de la tumeur dépendrait ainsi très directement de l'amplitude des altérations des mécanismes supportant normalement le contrôle de l'identité cellulaire. Ces notions ont un intérêt clinique majeur puisqu'on considère que ces cellules très indifférenciées et la dynamique associée à leur émergence à partir de cellules cancéreuses phénotypiques moins altérées favorisent et accélère le développement tumoral, la résistance thérapeutique ainsi que des métastases.

Les mécanismes à l'origine des altérations de l'identité cellulaire des cellules cancéreuses sont complexes et dépendent à la fois de leur cellule normale d'origine, des combinaisons oncogéniques ayant conduit à leur transformation néoplasique, et de programme cellulaire contrôlant normalement la plasticité des cellules épithéliales dans des contextes de réparation ou de régénération tissulaire⁷. Parmi ces programmes, on trouve notamment le processus de transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), favorisant la perte d'identité des cellules épithéliales mammaire. Ce programme induisant un fort remodelage épigénétique est fréquemment activé de manière, au moins, partielle lors de la tumorigenèse. Au sein des tumeurs, cette activité génère un continuum phénotypique entre des cellules ayant complètement conservé leurs propriétés épithéliales et d'autres très fortement engagées dans un lignage mésenchymateux. Entre les deux, des cellules de type hybrides sont fréquemment retrouvées. Cet état hybride représente une aberration phénotypique dans laquelle une
configuration épigénétique normalement transitoire est maintenue d'où le terme fréquemment utilisé de cellules métastables. D'autre part, les cellules présentant de telles caractéristiques auraient une grande capacité à osciller phénotypiquement autour de cet état hybride pouvant présenter transitoirement des caractéristiques de cellules plus différentiées avant de revenir à ce statut hybride. L'engagement des programmes EMT, par leur capacité à générer ces états métastables, jouerait ainsi un rôle très fort sur l'adaptabilité des cellules lors de changement de leur environnement (stress thérapeutique, stress oncogénique, changement tissulaire)⁸.

La plasticité cellulaire en particulier épigénétique, constituant les racines de ces états métastables, est un paramètre excessivement difficile à mesurer. Du fait d'une structuration globale de la chromatine potentiellement spécifique liée à cette plasticité⁹, des outils de mesures pourraient être utilisés comme l'ATAC-seq, l'HiC ou encore le CHIP-seq. Cependant, ces techniques restent complexes et coûteuses. Or quelques travaux ont pu mettre en évidence une modulation du métabolisme des différents composants des membranes cellulaires lors de l'acquisition d'un phénotype se rapportant à ces états métastables. Notamment une augmentation de l'incorporation des lipides polyinsaturés au sein des membranes accompagnées par une augmentation des mécanismes anti-ferroptoses¹⁰⁻¹⁴ ou encore la diminution du cholestérol libre pour la structuration des membrane notamment grâce à son efflux hors de la cellule par le transporteur ABCA1¹⁵,¹⁶. Dans ces travaux, nous avons donc utilisé la sonde fluorescente ratiométrique, le Dioll, que nous avons développé pour la mesure de la fluidité membranaire via le calcul du paramètre GP (*Generalized Polarization*) dans différents contextes de plasticité cellulaire. Nous avons pu ainsi mettre en évidence que la fluidité membranaire permettait de discriminer les différents sous-groupes tumoraux avec une fluidité membranaire la plus importante chez les cellules de types Basal-like et que ces mesures étaient reliées à leur sensibilité à l'inhibition des voies anti-ferroptoses. De plus, l'activation du programme de la transition épithélio-mésenchymateuse par activation de l'EMT-TF ZEB1 exogène est accompagnée par une diminution de la fluidité membranaire. Enfin, nous avons créé un modèle cellulaire *in vitro* 2D permettant de moduler l'identité cellulaire par la création de cellules très plastiques multipotentes avec lesquelles nous effectuons des différenciations en progéniteur myoépithélial ou luminal. La perte et l'acquisition d'une identité cellulaire sont tous deux accompagnées par une variation de la fluidité membranaire, montrant que le suivi de la fluidité membranaire permettrait la création d'outils diagnostiques du suivie de la plasticité cellulaire.
Résultats :

Mise en évidence d'un lien de corrélation entre sous-type tumoral, sensibilité à la ferroptose et fluidité membranaire :

Comme indiqué dans l'introduction de ce manuscrit, une des caractéristiques associées à la plasticité cellulaire est la présence d'une plus forte sensibilité à la ferroptose en raison d'une probable surreprésentation des acides gras polyinsaturés dans les membranes. Les lignées de type Basal-like sont considérées le plus souvent comme les plus dédifférenciées, un état associé à leur plus grand pouvoir tumorigénique et la présence de marqueurs de surface retrouvés chez les progéniteurs mammaires les plus précoces. Afin d'obtenir une première indication de particularités membranaires dans ces lignées et d'un lien corrélatif entre plasticité cellulaire et propriétés membranaires, nous avons donc tout d'abord vérifié la plus grande sensibilité des cellules cancéreuses de type basal-like à la ferroptose en utilisant un couple de trois agents pharmacologiques, RSL3, iFSP, et FIN56<sup>17,18,19</sup>. Les deux premiers inhibent respectivement GPX4 et FSP1 tandis que le troisième active notamment la Squalène synthase. Ces trois enzymes contrôlent la ferroptose à différents niveaux. GPX4 permet la réduction des lipides peroxydés, et FSP1 favorise la régénération du CoQ10, une molécule constituant un autre agent réducteur de ces mêmes lipides altérés. Enfin, l'activation de la Squalène synthase agit aussi sur le CoQ10 en favorisant sa diminution intracellulaire, sensibilisant ainsi la cellule à la ferroptose. Ces expériences ont été réalisées avec des représentants de chaque sous-groupe, à savoir les MCF7 et ZR75-1 pour les lignées Luminal, BT20 et HCC1937 pour les lignées Basal-like, MDA-MB-231 et HS578T pour les lignées Claudin-low, et HCC1954 correspondant à un sous-groupe mixte Basal-like/HER2+. Nous avons également inclus dans cette analyse des cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC), non tumorigéniques, comme contrôles. Afin d'éviter de potentiel biais nutritif, nous avons aussi adapté toutes ces lignées à un même milieu MEM (Minimum Essential Media) complémenté avec 5% de sérum de vœu fœtal (SVF).

Pris de façon isolée, les inhibiteurs RSL3 et iFSP n'induisent pas de façon évidente la mort
cellulaire après 24h de traitement (Figure 1-A), en revanche leur combinaison permet quant à
elle d'induire fortement la ferroptose chez des lignées Basal-like BT20 et HCC1937 avec
respectivement 57% et 60% de viabilité cellulaire restante (Figure 1-A). L'inhibiteur FIN56
permet d'obtenir des résultats similaires avec une nouvelle fois, un effet plus important chez
les cellules de types Basal-like, BT20 et HCC1937 (Figure 1-A). L'ajout d'iFSP ne modifie
pas ensuite la tendance observée avec l'inhibiteur FIN56 utilisé seul, augmentant simplement
légèrement la mort cellulaire dans toutes les lignées (Figure 1-A). Il est intéressant de noter
que le mécanisme toxicologique associé à FIN56 est complexe associant la déplétion du
CoQ10, mais aussi probablement l'induction de la dégradation de GPX4. Ainsi, l'obtention de
résultats similaires après un traitement avec cet inhibiteur ou après une combinaison
RSL3/iFSP suggère que la double inhibition des réactions de réduction des lipides peroxydés,
dépendant de GPX4 et du CoQ10, constitue le mécanisme permettant de déclencher le
processus de ferroptose de façon préférentielle dans les lignées Basal-like. Ces résultats
constituaient ainsi un premier indice suggérant qu'une plus grande plasticité cellulaire était bien associée à un métabolisme membranaire spécifique vraisemblablement dépendant d'une plus forte concentration de lipides polyinsaturés.

À la suite de ces observations, nous avons donc effectué la mesure des fluidités membranaires de l'ensemble des lignées. Nous avons, dans un premier temps, vérifié que le GP des cellules évoluait de façon identique en fonction de la température. Pour rappel, les valeurs de GP peuvent s'étaler entre -1 et 1, cette dernière valeur constituant un extrême de rigidité, et sont sensibles à la température qui lorsqu'elle s'élève favorise la transition des lipides membranaires d'une phase gel vers une phase liquide diminuant alors la rigidité des membranes. Nous avons effectué les mesures des GP sur l'ensemble des lignées sur une gamme de température de 21 à 41°C (Figure 1-B) et vérifié que les valeurs de GP diminuaient bien de façon linéaire avec la température pour toutes les lignées testées en suivant une pente similaire. Les comparaisons de fluidité peuvent donc se faire à différentes températures sans modifier les différences relatives potentiellement observées. Grâce à ces méthodes, nous avons pu vérifier que les lignées Basal-like (BT20, HCC1937 et HCC1954) avaient un GP plus faible que les autres lignées, donc une fluidité membranaire plus importante. À l'inverse la lignée de contrôle HMEC, non tumorigénique, est quant à elle la moins fluide avec le GP le plus élevé des différentes lignées. Ainsi une corrélation évidente semble exister entre une plus grande plasticité cellulaire, une sensibilité à la ferroptose et une plus grande fluidité membranaire, ces deux dernières caractéristiques pouvant résulter d'une plus grande concentration de lipides polyinsaturés dans les membranes des lignées Basal-like.

Pour confirmer ce résultat, nous avons répété ces mesures de la fluidité membranaire à 37 °C en utilisant ces mêmes lignées cancéreuses ainsi que de la lignée non tumorigénique HMEC. À nouveau, les cellules contrôles HMEC présentaient un GP plus élevé que l'ensemble des lignées cancéreuses, traduisant leur plus faible fluidité membranaire. Les lignées cancéreuses possédaient quant à elles aussi des différences de GP avec notamment un GP plus élevé chez les Claudin-low (MDA-MB-231 et HS578T) que chez les Luminal (MCF7 et ZR75-1), ainsi qu'un GP des cellules luminales plus levées que celui des Basal-Like (Figure 1-C). Ces résultats sont une nouvelle fois cohérents aux observations effectuées lors de l'induction de la ferroptose par inhibition des mécanismes suppresseurs de la peroxydation lipidique. D'autre part, ces résultats sont en accords aux données cliniques et moléculaires associés à ces différentes lignées puisqu'il est relativement évident que les lignées luminales dérivent de cellules largement engagées dans cette même voie de différenciation dont elles conservent la sensibilité aux hormones. À l'inverse, les lignées Basal-like sont généralement issues de cellules plus progénitrices dans lesquelles les processus de transformation néoplasique sont associés à une perte des caractères luminaux et une plus grande plasticité cellulaire. Concernant le sous-type Claudin-Low enfin, les données obtenues constituent un résultat particulièrement intéressant en raison des hypothèses effectuées sur l'origine de ces tumeurs et leur évolution. En effet, ces tumeurs de type métaplasiques peuvent provenir d'un processus de dédifférentiation extrême ou d'un progéniteur mammaire au sommet de la hiérarchie⁷. Sur ces critères, on s'attendrait donc à obtenir une très forte plasticité. Cependant,
ces tumeurs sont aussi associées à un réengagement des cellules cancéreuses dans des processus de différenciation aberrants de type mésenchymateux varié (osseuse, cartilagineuse, fibroblastique, etc.), aussi bien *in vivo* qu'*in vitro*. Ainsi, le processus de transformation néoplasique dans ce contexte n'est sans doute pas associé à l'obtention d'un état plastique métastable, mais plutôt à un état souche très transitoire suivi par une reprogrammation phénotypique forte et une perte de plasticité.

Afin de vérifier ces dernières hypothèses, nous avons voulu tester dans une des lignées Basal-like, si l'induction d'un de ces programmes de différentiation aberrante pouvait effectivement conduire à une perte de plasticité associée une rigidification des membranes cellulaires. Nous avons alors traité la lignée HCC1954 avec du TGFβ, un puissant inducteur d'EMT, et laissé se dérouler le processus de façon terminale. L'acquisition d'un phénotype mésenchymateux complet pouvait alors s'observer en suggérant que les cellules étaient sorties de leur état métastable et Basal-like (Figure 1-D). Cette lignée, nommée HCC1954mes, a été ensuite comme les autres lignées adaptées au milieu MEM complémenté avec 5% de SVF. Comme attendu, cette modification phénotypique était accompagnée d'une diminution de la fluidité membranaire en comparaison de la lignée d'origine HCC1954 (Figure 1-E). Ces résultats mettent en relief la complexité des processus d'EMT pour l'acquisition de ces états métastables de grande plasticité, en suggérant que le niveau d'engagement, partiel ou complet, module la finalité phénotypique du processus. Ce niveau d'engagement générerait ainsi alternativement des cellules hybrides présentant une grande plasticité ou au contraire des cellules ayant acquis une nouvelle identité mésenchymateuse sans conservation de cette plus grande plasticité²⁰,²¹.
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**Figure 1 :** Fluidité membranaire des lignées cancéreuses mammaires corrélée à leur sensibilité à l'inhibition des mécanismes antiferroptose. A) Intensité de fluorescence du test de viabilité cellulaire à la résazurine normalisé et représenté en pourcentage de viabilité des lignées indiquées après traitements de molécules pro-ferroptose (iFSP 5 µM, RSL3 0.5 µM et FIN56 1 µM). B) Mesure du paramètre GP représentative des lignées cellulaires indiquées après incubation avec 2 µM de Dioll pendant 24h à différentes températures (21, 27, 31, 37 et 41°C). C) Mesure du paramètre GP des sous-groupes tumoraux mammaires indiqués après incubation avec 2 µM de Dioll pendant 24h, la mesure est effectuée à 37°C. Les données sont moyenné ± s.d.; n>3 expériences indépendantes par lignées cellulaires. Student's t-test, ns=non-significative *:=P < 0.05, **=P < 0.01, ***=P < 0.001. D) Dot plot représentatif de l'expression d'ARNm des lignées HCC1954 contrôle vs HCC1954 mésenchymateuse. La ligne noire représente un niveau d'expression identique entre les deux échantillons. E) Mesure du paramètre GP des lignées HCC1954 contrôle et mésenchymateuse indiquées après incubation avec 2 µM de Dioll pendant 24h, la mesure est effectuée à 39°C. Les données sont moyennées ± s.d.; n=3 expériences indépendantes. Student's t-test, *:=P < 0.05.
Modulation de l'identité cellulaire dans un modèle isogénique par induction partielle du processus de l'EMT :

Les résultats précédents suggéraient un lien fort entre la perte d'identité cellulaire, la plus grande plasticité qui en résulte et le niveau de fluidité membranaire. Cependant, l'utilisation de lignées non isogéniques, possédant chacune un set d'altérations génétiques spécifiques et provenant de patients différents, pourrait fortement influencer les résultats que nous avons obtenus. Ainsi pour valider les corrélations mises en évidence précédemment, nous nous sommes tournés vers un nouveau modèle où seule l'identité cellulaire était perturbée de façon ectopique, dans un fond génétique dépourvu d'altérations, notamment oncogéniques. Pour cela nous avons utilisé un modèle cellulaire de type HMEC dans lequel l'expression de l'EMT-TF ZEB1 peut être augmentée par ajout de doxycycline dans le milieu de culture l'induction de cet EMT-TF active un processus d'EMT faisant alors sortir les cellules HMEC de leur identité épithéliale et permettant l'acquisition d'un phénotype plus plastique<sup>22,23</sup>. De plus, l'induction contrôlée de l'expression de ZEB1 permet à l'inverse d'une expression constitutive un contrôle cinétique du programme évitant l'acquisition définitive d'une identité mésenchymateuse. Après induction de l'EMT-TF ZEB1 pendant une période de 10 jours à la doxycycline, nous avons pu obtenir un changement phénotypique caractéristique de la mise en place du programme de l'EMT visible en microscopie optique, notamment par la perte des jonctions cellulaires. La perte au moins partielle de l'identité épithéliale pouvait également être confirmée au niveau moléculaire par la plus faible expression d'un panel de gènes associé à cette identité (EpCAM, CDH1, OVOL1, FOXA1) et une augmentation d'expression de gènes mésenchymateux (CDH2, CD44, VIM, ZEB1 humain, ZEB2) (Figure 2-A).

Nous avons alors dans un second temps mesuré par spectrofluorimétrie la fluidité membranaire de ces cellules en comparaison des cellules d'origines. Les cellules HMEC d'origines arborent un GP plus élevé que celui des cellules HMEC dans lesquelles ZEB1 a été exprimé, avec respectivement un GP de 0,195 et 0,142 (Figure 2-B). En vue de ces résultats, nous avons cherché à savoir si des modifications de compositions lipidiques, notamment au niveau des chaînes acyles, étaient associées à l'acquisition d'un phénotype plus plastique. L'analyse lipidomique des cellules a mis en lumière une diminution des sphingolipides et à l'inverse une augmentation des phosphatidyléthanolamines et des phosphatidylsérines (Figure 2-C). Les sphingolipides étant fortement associés à la rigidification de la membrane plasmique jouant notamment un rôle sur la stabilisation des radeaux lipidiques, leur diminution peut contribuer à l'augmentation de la fluidité membranaire lors du processus de dédifférenciation. Quant à l'analyse des chaînes acyles, elle a permis de mettre en lumière une augmentation des lipides mono-insaturés au sein des cellules de contrôle tandis que chez les cellules ayant subi un processus de dédifférenciation, les lipides polyinsaturés de type ω6, acide linoléique et acide arachidonique, étaient enrichis (Figure 2-D).

En lumière de ces résultats et des rôles joués par les PUFA ω6 dans les cellules les plus tumorigéniques et dédifférenciées, et présentés dans l'introduction de ce manuscrit de thèse, nous nous sommes demandé si un milieu enrichi en PUFA ω6 permettrait une meilleure mise
en place du processus de dédifférenciation associé au programme d'EMT. Pour cela, nous avons lancé une cinétique d'induction de l'expression de ZEB1 par traitement à la doxycycline sur 10jours, en comparant un milieu de culture complémenté avec du Sérum de vœux fœtal (SVF) ou avec du Serum de cheval (Horse serum : HS), ce dernier étant enrichi en PUFA ω3 et ω6²⁴. L'analyse comparative d'expression de gènes dans les deux conditions montre une différence de cinétique de l'EMT. En effet, jusqu'à 5 jours l'évolution de l'expression des gènes liés au programme de l'EMT (■) est identique entre les deux conditions. Cependant sur des temps plus longs, après 10 jours d'induction, l'expression des gènes associés au processus de l'EMT était plus importante dans la condition riche en PUFA ω6 (HS) que dans la condition normale (SVF) (Figure 2-E). Il était d'autre part intéressant de constater qu'en plus des gènes associés au programme de l'EMT (■ : ZEB1 humain, ZEB2, CD44, SNAI1), ceux induits par des mécanismes de stress associé à la physiologie du réticulum (● : ATF3, ATF4, DDIT3, TRIB3) étaient aussi surexprimés durant le processus de dédifférenciation et de façon plus importante chez les cellules maintenue dans le milieu HS. La majorité des membranes cellulaires correspondent à ce réticulum suggérant que la perte d'identité épithéliale s'inscrit dans le remodelage de ces membranes dont les réponses de stress précités seraient le témoin. Enfin, un dernier point intéressant a pu être observé au niveau du gène ACSL4. Son expression augmentait au cours du processus d'EMT et plus fortement en présence de horse sérum, indiquant que l'incorporation des PUFA dans le pool des phospholipides était vraisemblablement activée. En effet, ce gène encode une enzyme de type acyl-CoA transférase, capable d'activer spécifiquement les acides gras polyinsaturés en vue de leur incorporation dans les phospholipides membranaires.

Au cours de ces expériences, nous avons aussi pu constater que l'évolution de l'expression de ces gènes était majoritairement pulsative. Après avoir fait ce constat, nous avons alors relancé des cinétiques de l'induction de l'EMT par induction à la doxycycline dans le milieu classique contenant du SVF. Après avoir normalisé l'expression des gènes associés au caractère épithélial et ceux au caractère mésenchymateux (Tableau 1), nous avons pu vérifier que l'expression des gènes épithéliaux était bien pulsative lors de l'induction de l'EMT, tandis que ceux du caractère mésenchymateux après 3 jours de variation tendaient à se stabiliser (Figure 2-F). La mesure du GP durant la cinétique de l'induction de l'EMT permettait aussi d'observer tout comme l'évolution de l'expression des gènes, une évolution pulsatile tout en tendant vers une diminution du GP à 0,146 (Figure 2-G). L'explication sous-jacente à celle évolution pulsatile pourrait venir de l'induction de ZEB1 à la doxycycline. En effet, le changement de milieu étant fait tous les deux jours, et la doxycycline ayant un temps de demi-vie à 37°C de 24h, l'activité de ZEB1 induisant la répression des gènes liée à l'identité cellulaire n'est donc pas constante dans le temps. Cependant dans ce type d'induction de l'EMT, nous avons pu noter que les cellules tendaient vers un phénotype plus plastique atteignant beaucoup moins efficacement un phénotype complètement mésenchymateux comme observé avec une induction constitutive de l'EMT-TF. Nous nous sommes alors demandé s'il était possible de se servir de ce modèle pour générer de façon contrôlée un véritable état métastable tel qu'observé a priori dans les lignées Basal-like pouvant par la suite être utilisé pour valider la relation entre plasticités cellulaire et fluidité des membranes.
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**Figure 2 :** Suivi de la fluidité membrane lors de l'induction d'un programme de l'EMT chez les HMEC. A) Dot plot représentatif de l'expression d'ARNm des lignées HMEC contrôle vs HMEC ZEB1 induit. La ligne noire, rouge et verte correspondent respectivement, au niveau d'expression identique entre les deux échantillons, une augmentation d'expression d'un fold change de 2 pour les HMEC ZEB1 induit et une augmentation d'expression d'un fold change de 2 pour les HMEC contrôle. B) Mesure du paramètre GP par spectrofluorimétrie des cellules indiquées après incubation avec 2 µM de Dioll pendant 24h, la mesure est effectuée à 37°C. Les données sont moyennées ± s.d.; n=7 expériences indépendantes par lignées cellulaires. Student's t-test, ***=P < 0.001. C) Graphique représentatif de 3 expériences indépendantes de la quantification en % des classes lipidiques indiquées chez les cellules HMEC C et ZEB1 induit. D) Graphique représentatif de 3 expériences indépendantes de la quantification en % des chaînes acyles indiquées chez les cellules HMEC C et ZEB1 induit. E) Dot plot représentatif de l'expression d'ARNm de l'induction de ZEB1 dans un milieu complémenté en SVF ou en HS. La ligne noire correspond au niveau d'expression identique. La couleur des points représente la durée de l'induction et leur forme, la fonction cellulaire du gène. F) Variation d'expression d'ARNm de set de gènes correspondant au caractère épithélial (Bleu) ou mésenchymateux (Rouge) pendant la cinétique d'induction. G) Mesure du GP des cellules par spectrofluorimétrie tous les 24h durant l'induction de ZEB1. Les cellules sont incubées avec 2 µM de Dioll pendant 24h avant lecture.
Création d'un modèle métastable mammaire phénotypiquement très plastique permettant l'acquisition de l'ensemble de la hiérarchie mammaire

Même si l'induction de ZEB1 dans le modèle précédent permettait d'engager les cellules HMEC dans un processus d'EMT plus contrôlé, il était évident que sur le long terme, ces cellules faisaient quand même l'acquisition d'un phénotype mésenchymateux plus proche de ce qui peut s'observer par exemple dans les lignées Claudin-Low, engagées dans des processus de différenciation aberrants, que dans les lignées Basal-like qui maintiennent un statut hybride et conserve en partie leur identité épithéliale. Nous avons alors formulé une hypothèse à partir de nos précédents résultats et de la littérature que le remodelage membranaire et le maintien d'un fort taux de lipides polyinsaturés pouvaient être une des clefs permettant de maintenir les cellules dans un état métastable de grande plasticité. Sur cette base et en utilisant un milieu enrichi en horse sérum, nous avons donc effectué un criblage croisé de plusieurs paramètres hormono-nutritifs dans le but de bloquer les cellules dans un état métastable au cours de leur transition épithélio-mésenchymateuse. Nous avons aussi bien sûr tiré profit du système ZEB1-inductible comme expliqué précédemment. Ce criblage se basait enfin sur des données du laboratoire ayant montré que la réponse aux glucocorticoïdes et un profil plus oxydatif que glycolytique étaient sans doute un autre paramètre biochimique important de ce statut métastable, au moins dans les cellules mammaires. À la suite de ce criblage, nous avons donc optimisé un premier milieu dit « métastable » dans lequel les cellules HMEC pouvaient être maintenues pendant plusieurs semaines dans un état hybride suite à l'induction de ZEB1 par la doxycycline (Figure 3-A). Ce milieu contenait bien sûr du horse sérum, mais aussi des concentrations contrôlées de glucose, glutamine et pyruvate renforçant le métabolisme oxydatif des cellules et de la dexaméthasone pour maintenir une forte activité de la réponse aux glucocorticoïdes. Un aspect très important de cette méthode fut la démonstration que l'ajout de doxycycline n'était plus nécessaire après cinq semaines passées dans ce milieu pour le maintien de cet état métastable. Comme nous le verrons par la suite, une expression endogène de ZEB1 prenait notamment le relais de l'expression du transgène. Plus globalement, en termes d'expression du génome, ces cellules se caractérisaient par une expression différentielle de nombreuses familles de gènes par rapport aux cellules dont elles étaient issues (Figure 3-B) (Tableau 2). En particulier, elles exprimaient notamment de façon simultanée des facteurs de transcriptions et des marqueurs spécifiques des deux lignages luminaux (GATA3, OVOL2 ainsi que MUC1) et basaux (SNAI2 ou FOXC1). Les facteurs de transcription impliqués dans les phases précoces du programme de l'EMT étaient aussi surexprimés dans ces cellules (ZEB1, ZEB2, TWIST1) tandis que certains marqueurs épithéliaux restaient fortement exprimés (EPCAM), malgré l'engagement de la cellule dans un processus de transdifférentiation mésenchymateuse (CDH2, VIM). Finalement, élément déterminant de la nature très plastique de ces cellules, des gènes codant les facteurs normalement associés aux cellules totipotentes embryonnaires étaient fortement réactivés dans ces cellules métastables, notamment NANOG, OCT4, TCF4, et TOPO2A<sup>25-27</sup>.

En terme métabolique et biochimique ensuite, ces cellules présentaient une plus forte expression des gènes impliqués dans le contrôle de l'incorporation des lipides extracellulaire avec notamment une augmentation de l'activité des gènes PPARG, PPARA, LDLR et aussi
FABP4, ce dernier codant une protéine importante pour la protection des acides gras polyinsaturés libres contre le stress oxydant. De manière moins prononcée, ces cellules exprimaient aussi plus fortement le gène ACSL4. Ainsi, les systèmes de transport, de protection et d'incorporation des acides gras polyinsaturés semblaient tous activés dans ces cellules HMEC rendues métastables. Un autre aspect transcriptomique intéressant était lié au métabolisme du fer et aux réponses antioxydantes. La ferroptose, comme son nom l'indique, est non seulement sensible à la quantité intracellulaire de lipides polyinsaturés, mais aussi au métabolisme du fer et aux protections antioxydantes contre la réaction de Fenton. Il était alors tout à fait remarquable de noter que le programme antioxydant (NQO1, SOD1, SOD2) contrôlé par le facteur de transcription NRF2 (encodé par NFE2L2) était fortement activé dans ces cellules métastables, tout comme les gènes associés à l'homéostasie du fer et à la protection contre la ferroptose (AIFM2, GCH1, SLC2A3, FTH1 et FTL). Ces deux mécanismes, en plus de protéger la cellule contre la ferroptose lorsque celle-ci contient des niveaux importants de PUFA, ont été en parallèle associés au phénotype des progéniteurs mammaires multipotents<sup>28</sup>. Aussi les gènes de contrôle de l'homéostasie du réticulum endoplasmique (ATF4, ATF3, PDIA4, PDIA6) étaient plus fortement activés dans ces cellules en lien potentiellement avec les modifications biophysiques des membranes le constituant. Finalement, le contrôle du métabolisme du cholestérol semblait aussi modifié. L'expression du principal facteur contrôlant ce métabolisme était augmentée (SREBF2), tout comme de nombreuses enzymes clefs de sa synthèse (HMGCR, FDFT1, SQLE) ou de son export (ABCA1) ouvrant la possibilité que dans ces conditions, une activité de cette voie soit nécessaire par exemple en vue de produire suffisamment de CoQ<sup>10</sup> ou de précurseurs de prénylation, tout en limitant l'incorporation de cholestérol dans les membranes grâce à son export.

Ces données transcriptomiques pointaient clairement le positionnement de ces cellules dans un état métastable. Cependant, des confirmations fonctionnelles étaient nécessaires pour valider ce statut. En particulier, cet état métastable est par essence un équilibre précaire où la cellule peut facilement être réorientée dans une nouvelle direction phénotypique. Allant dans ce sens, nous avons pu mettre en évidence des phénomènes de reprogrammation phénotypique aléatoires quand ces cellules étaient replacées dans un milieu conventionnel. L'analyse par immunomarquage a mis en évidence l'acquisition de phénotypes aléatoirement plus luminaux (Faible et forte expression des kératines 5 et 7), ou plus basaux (Forte et faible expression des kératines 5 et 7), voire même des traits mésenchymateux accentués (kératine 5 faible, et N-cadhérine élevée (CDH2)) (Figure 3-C). Fort de ces premières observations, nous avons ensuite essayé de montrer que ces cellules répondaient mieux à l'induction des mécanismes de différenciation contrôlant normalement la hiérarchie mammaire. Pour cela, nous avons notamment mesuré l'expression de marqueur de surface spécifique des différentes populations différentiées, mais aussi des cellules mammaires plus primitives bipotentes. Tandis que les cellules HMEC initiale sont caractérisées par un profil de marqueurs de surfaces EpCAM<sup>+</sup>/CD44<sup>+</sup>/CD49f<sup>+</sup>, les cellules métastables sont EpCAM<sup>+</sup>/CD44<sup>+</sup>/CD49f<sup>+</sup> (Figure 3-D 1 et 2). La double positivité des marqueurs CD44 et CD49f est intéressante, car elle est justement associée au statut hybride des cellules métastables, telle que retrouvée *in vivo* dans les cellules mammaires bipotentes<sup>29</sup>. Lors de leur sortie du milieu métastable, ces cellules
dérivent spontanément en trois populations. L'une correspondant à cette même lignée métastable EpCAM+/CD44+/CD49f+, l'une à des HMEC contrôles au statut de progéniteurs luminaux EpCAM+/CD44+/CD49f+, et enfin une troisième population perdant le CD49f, EpCAM+/CD44+/CD49f- (Figure 3-D 3) caractéristique des cellules effectuant une EMT complète et adoptant un phénotype de fibroblaste. Grâce au suivi de ces marqueurs, nous avons pu ensuite optimiser deux protocoles de différenciation, l'un luminal, l'autre myoépithéliale pour valider la nouvelle bipotence de ces cellules rendues métastables. Concernant la différentiation luminal, nous avons tout d'abord pu montrer que la privation de réponse aux glucocorticoïdes favorisait l'émergence de ces cellules lors de leur remise en culture en milieu conventionnel (Figure 3-D 4). Le protocole pour la différenciation myoépithéliale reposait quant à lui sur une primo-induction de la composante mésenchymateuse par traitement au TGFβ (10 ng.mL-1) et à l'Oncostatin M (OSM) (50 ng.mL-1) pendant 3 jours suivi d'un traitement à l'All Trans Retinoic Acid (ATRA) (1 µM) plus du Ribitol (10 mM). Le TGFβ par son augmentation de l'expression de SNAI1 permet de conduire les cellules métastables sur la voie d'une différenciation mésenchymateuse³⁰,³¹ tandis que l'OSM permet quant à lui de diminuer la mise en place de la différenciation épithéliale³². Concernant ensuite l'ATRA et le Ribitol, ils ont pour but d'agir respectivement comme des agents pro-différentiant³³,³⁴ et d'attachement à la lame basale soutenant normalement les cellules myoépithéliales par l'augmentation d'expression des matriglycanes³⁵. Suite à cette combinaison de traitement, des cellules présentant les caractéristiques des cellules myoépithéliales sont obtenues, notamment des marqueurs de surface de type EpCAM<sub>medium</sub>/CD44<sup>+</sup>/CD49f<sup>-</sup> (Figure 3-D 5). Dernier élément concernant ces protocoles, nous avons pu vérifier que seules les cellules métastables étaient capables d'y répondre positivement, le phénotype des cellules HMEC d'origine étant complètement insensible à ces signaux de remodelage phénotypique confirmant leur absence de plasticité.

Suite à cette première validation fonctionnelle de ces modèles, nous avons réalisé de
nouvelles analyses transcriptomiques visant à vérifier l'induction des programmes génétiques
spécifiques de chaque type de différenciation, tout en analysant le maintien ou non des
réponses précédemment observé dans les cellules maintenues dans un état métastable
(Tableau 3 et 4). Nous avons tout d'abord validé l'activation du programme luminal avec le
premier protocole de différenciation en observant notamment l'activation du gène codant le
récepteur aux œstrogènes (ESR1), complètement réprimé dans les cellules métastables, mais
aussi les cellules HMEC d'origine (Figure 3-E et F). Cette identité luminale était d'autre part
clairement confirmée par l'activation des principaux régulateurs et marqueurs de ce statut
(OVOL1, FOXA1, ELF3, ERBB3, KRT19, KRT8). De la même façon, des gènes
spécifiquement associés au statut myoépithélial et moins activés lors d'un phénotype
purement mésenchymateux étaient fortement induits au cours de la différenciation
myoépithéliale (OXTR, CNN1, ACTA2, CD10, KRT17) (Figure 3-G). OXTR codant le
récepteur à l'ocytocine est notamment très spécifique des cellules myoépithéliales. À l'inverse
ensuite, les gènes caractérisant le statut métastable et sa composante mésenchymateuse étaient
tous diminués (CD44, TWIST1, ZEB1 et ZEB2) indépendamment du protocole de
différenciation utilisé, alors que des facteurs associés au statut partiellement mésenchymateux
des cellules myoépithéliales (SNAI1, SNAI2) voyaient leur expression augmenter spécifiquement avec le protocole dédié à faire émerger ces cellules.

En terme métabolique ensuite, les caractéristiques génétiques de cellules métastables observées dans les analyses précédentes étaient fortement atténuées après la mise en place de ces programmes de différenciation, en particulier pour le gène ACSL4. Les réponses de stress du réticulum endoplasmique étaient-elles aussi diminuées tout particulièrement au niveau de l'induction des gènes ATF4 et PDIA6. De façon similaire, les réponses antiferroptose et antioxydante étaient elles aussi moins activées, au moins en terme transcriptomique (AIFM2, SLC7A11, GCH1 et NFE2L2 et NQO1). Enfin l'ensemble des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol était diminué, en particulier le transporteur ABCA1. En conclusion, il était donc frappant de noter que l'ensemble des mécanismes favorisant une plus grande fluidité membranaire et une homéostasie associée à cette caractéristique semblait bien diminués lors de la mise en place d'une différenciation faisant sortir la cellule de son état métastable tout en réduisant a priori sa plasticité.

De façon intuitive, nous sommes donc demandés si la fluidité des membranes de notre modèle métastable et de ses différents dérivés s'accordait bien avec leur statut tel que défini dans nos expériences précédentes. Les cellules métastables présentaient un GP très diminué en comparaison des cellules HMEC contrôles et possédaient donc une fluidité membranaire plus importante que les cellules contrôles. À l'inverse, la réacquisition d'une identité cellulaire se traduisait de façon systématique par une augmentation du GP, donc d'une diminution de la fluidité membranaire que ce soit pour les progéniteurs myoépithéliaux ou luminaux (Figure 3-H). Ces résultats confirmaient donc que la modulation de l'identité cellulaire et donc de la plasticité cellulaire s'accompagnait d'une modification de la fluidité membranaire globale des cellules. D'autre part, l'analyse par microscopie confocale des cellules HMEC contrôles et de métastables a mis en évidence une augmentation spécifique de la fluidité membranaire au niveau de la membrane plasmique (Figure 3-I) et une accumulation de membrane endoplasmique, celle-ci étant globalement plus fluides de façon générale que les membranes plasmiques. Les HMEC présentaient ainsi un GP médian au niveau de leur membrane plasmique de 0,1218 A.U, alors que les cellules métastables avaient quant à elles un GP médian de -0,1674 A.U. Ces résultats renforçaient les mesures effectuées par spectrofluorimétrie décomposant les différences observées en une plus forte fluidité intrinsèque de la membrane plasmique dans les cellules métastables, mais aussi en une augmentation du ratio endomembrane/membrane plasmique, conférant là aussi une fluidité globale plus importante à l'échelle de la cellule. Finalement, le résultat associé à la membrane plasmique pouvait être corrélé à l'expression du transporteur ABCA1 au sein des cellules métastables, son augmentation se traduisant par une augmentation de l'efflux du cholestérol l'empêchant alors d'augmenter la rigidité de la membrane.

Finalement, afin d'évaluer la pertinence de ces résultats pour la susceptibilité de ces cellules aux processus de transformation néoplasique et à l'agressivité des tumeurs qui pourraient être induites à partir de ces différents modèles, nous avons vérifié par un test fonctionnel si la perte ou l'acquisition d'une identité cellulaire modulait la résistance au stress oncogénique. Il est notamment décrit que la plasticité cellulaire favorise le processus de transformation
néoplasique en limitant les stress homéostatiques induits par l'activité de l'oncogène³⁶. Pour réaliser ces expériences, nous avons profité d'un autre transgène inductible par le 4-hydroxytamoxifène (OHT), lui aussi présent dans ces modèles et codant l'oncogène H-RAS mutée en G12V. Suite à l'induction de l'expression d'H-RAS<sup>G12V</sup>, la prolifération des cellules HMEC originelles était fortement altérée par le stress oncogénique (Figure 3-J). À l'inverse, la prolifération des cellules métastables était plus importante après expression de l'oncogène, indiquant que ces cellules s'adaptaient parfaitement à cette nouvelle condition homéostatique nécessitant normalement une plus forte activation des mécanismes biosynthétiques. Finalement, la réacquisition d'une identité cellulaire, indépendamment de la nature de cette identité, était corrélée à une diminution de la résistance au stress oncogénique, se traduisant par une prolifération diminuée, un effet particulièrement fort après une différenciation luminale. Ces résultats suggéraient donc qu'en accord avec nos hypothèses introduites au début de ce manuscrit de thèse, l'absence de cadre métabolique rigide, caractéristique des cellules les plus plastiques et associées à un état métastable, favorise les processus de transformation néoplasique et la future plus grande agressivité des tumeurs obtenues par un tel procédé.
<figure><img src="image_62.png" /></figure>

**Figure 3 :** Caractérisation de la lignée métastable et la reconstitution de la hiérarchie mammaire. A) Schéma récapitulatif de notre modèle de cellules métastables. B) Fold change d'expression d'ARNm des métastables versus les HMEC contrôle. Les groupes de gènes sont regroupés en lien avec leur fonction cellulaire. La médiane des fold change d'un groupe fonctionnel est calculée et représentée en noire. Les lignées en pointillées représente un fold change de 2¹ et de 2⁻¹. C) Immunofluorescence des marqueurs indiqués des métastables après différenciation spontanée. D) Dot plots représentatifs d'analyse en cytométrie en flux du modèle après marquage par des anticorps anti CD44, CD24 et CD49f. E) Fold change d'expression d'ARNm des Prog Lum versus Métastable. Les groupes de gènes sont regroupés en lien avec leur fonction cellulaire (1=EMT, 2=Différenciation, 3=Luminale, 4=Myoépithéliale, 5=Stem, 6=Métabo des lipides, 7=Glycolyse, 8=Stress de RE, 9=Métabo du fer, 10=Stress cellulaire et 11=Métabo du cholestérol). La médiane des fold change d'un groupe fonctionnel est calculée et représentée en noire. Les lignées en pointillées représente un fold change de 2¹ et de 2⁻¹. F) Fold change d'expression d'ARNm des gènes indiqués des Prog Lum versus HMEC C. G) Fold change d'expression d'ARNm des Prog Myoépi versus Métastable. Les groupes de gènes sont regroupés en lien avec leur fonction cellulaire. La médiane des fold change d'un groupe fonctionnelle est calculée et représentée en noire. Les lignées en pointillées représente un fold change de 21 et de 2-1. H) Mesure du paramètre GP au ClarioStar® des cellules indiquées après incubation avec 2 µM de Dioll pendant 24h, la mesure est effectuée à 37°C. Les données sont moyennées ± s.d.; n=7 expériences indépendantes par lignées cellulaires. Student's t-test, **=P < 0.001, **=P < 0.01, **=P < 0.001. I) Images représentatives des cellules indiquées après incubation avec 2 µM de Dioll pendant 24h, la mesure est effectuée à 37°C, permettant la mesure du GP de la membrane plasmique. J) Mesure de la prolifération cellulaire par un test résazurine (haut) ou par un dosage d'ADN (bas), l'intensité et la quantité mesurée sont ensuite normalisées en fonction du contrôle de chaque lignée. Les données sont moyennées ± s.d.; n>6 expériences indépendantes. Student's t-test, *=P<0.05, **=P<0.01, ***=P < 0.001.
## Discussion :

La plasticité cellulaire est un mécanisme extrêmement important pour le renouvellement et la régénération de nos tissus. Au niveau mammaire, elle permet notamment de répondre aux contraintes de l'allaitement à chaque nouvelle grossesse en engageant le tissu dans un remodelage très profond. Cette plasticité est normalement finement contrôlée et son altération constitue un moteur très puissant soutenant les processus tumorigéniques, en particulier dans les tumeurs les plus agressives. Nous avons vérifié dans cette étude que les lignées cellulaires Basal-like représentant un sous-type de cellules cancéreuses particulièrement agressives, à l'identité profondément altérée, présentaient des caractéristiques fonctionnelles souvent associées à une plus grande plasticité cellulaire comme une sensibilité au mécanisme de ferroptose. Sur cette base, et des travaux issus de la littérature ayant mis en évidence une plus grande proportion de PUFA dans les cellules les plus tumorigéniques, nous avions émis l'hypothèse que la fluidité membranaire de ces lignées soit particulièrement augmentée en comparaison de celle de lignées luminales ayant mieux conservé leur identité initiale. D'autre part, les lignées cellulaires de sous-type Claudin-low avaient elles aussi une fluidité membranaire moins importante même par rapport à des lignées luminales. En lumière des données de la littérature ayant démontré que ces tumeurs pouvaient provenir d'un progéniteur mammaire extrêmement précoce et bipotent, ces résultats pouvaient sembler être en contradiction avec un concept reliant la plasticité cellulaire à une plus grande fluidité membranaire. Cependant, il faut noter que ces tumeurs sont couramment métaplasiques et constituées d'une juxtaposition de cellules cancéreuses engagées dans des processus de différenciation aberrante (fibroblastiques, cartilagineux, osseux, etc.). Ainsi, à la différence des tumeurs Basal-like, l'état plastique de la cellule d'origine à ces tumeurs serait un phénomène très transitoire suivi d'un processus de différenciation conduisant la cellule à acquérir une nouvelle identité expliquant la rigidification de ses membranes. Ce modèle est notamment conforté par une autre étude basée sur l'analyse *in vitro* de la fluidité membranaire de la membrane plasmique, par le Laurdan en microscopie confocale, montrant notamment que les cellules MCF7 (Luminal) possèdent un GP plus faible que celui des MDA-MB-231 (Claudin-low). D'autre part, la mise en culture de ces lignées cancéreuses avec les « Cancer associated fibroblast : CAF » se traduit par une augmentation de la plasticité cellulaire à laquelle est associée une élévation de la fluidité membranaire de la membrane plasmique dans les deux types cellulaires³⁷. Ces résultats confortent ainsi nos propres observations aussi bien dans les lignées cancéreuses que dans notre modèle métastable où une augmentation de la fluidité de la membrane plasmique est observée lors du gain de plasticité de ces cellules. Un autre élément intéressant de discussion sur ces aspects concerne la méthodologie utilisée pour maintenir les cellules en culture et les comparer entre-elles. Nos lignées sont maintenues dans un milieu relativement physiologique appauvri en nutriment en comparaison des milieux extrêmement riches utilisés classiquement *in vitro*. Il est possible que ces milieux favorisent le mécanisme de différenciation des lignées Claudin-low augmentant d'autant la rigidité de leurs membranes. Ce type de mécanisme s'est déjà observé dans les lignées mammaires où des modulations nutritives influent sur l'identité cellulaire³⁸. Les mesures de résistance à la ferroptose soutiennent aussi le caractère différentié des lignées Claudin-Low en démontrant leur très forte capacité à survivre à ce processus de mort cellulaire programmée³⁹,⁴⁰. Enfin,
nous avons pu noter l'existence d'une phase d'adaptation des lignées Claudin-low aux
nouvelles conditions nutritives induisant une forme de sélection. Cette sélection pourrait
favoriser l'émergence de cellules plus différentiées, aux caractères mésenchymateux plus
affirmés en accord avec le modèle précédent. Enfin, ces premiers résultats ouvrent la porte à
une analyse plus globale visant à mieux caractériser les liens entre plasticité cellulaire,
sensibilité à la ferroptose et potentiel tumorigénique en lien avec une forte fluidité
membranaire. Parmi les pistes à suivre, il serait notamment intéressant d'analyser la
sensibilité à la ferroptose, non par des inhibiteurs des mécanismes de protection contre cette
mort cellulaire, mais par des inducteurs plus directs activant la peroxydation des lipides.
Aussi, afin de renforcer les liens précités, il serait intéressant de quantifier plus directement
les mécanismes biochimiques témoins du processus de ferroptose et de la plus grande fluidité
des membranes comme le dosage du malondialdéhyde issu de la peroxydation des lipides<sup>41</sup> ou
encore mesurer la quantité de lipides polyinsaturés par spectrométrie de masse dans ces
différents sous-types de lignées cancéreuses. Enfin, un test fonctionnel du pouvoir
tumorigénique des différentes lignées permettrait de confirmer le lien entre plasticité, fluidité
membranaire et potentiel tumorigénique. En effet, l'une des caractéristiques admises des
cellules cancéreuses les plus plastiques est leur capacité à initier une tumeur. Il serait donc
envisageable de mesurer le pouvoir tumorigénique de nos lignées par des tests *in vitro* de type
« colony forming assay » et par des tests *in vivo* via des injections de ces cellules cancéreuses
au niveau du coussinet graisseux de la glande mammaire de souris immunodéprimées de type
« nude ».

La seconde partie de nos travaux se proposaient ensuite de valider dans un modèle reconstitué
de hiérarchie mammaire le concept reliant la plasticité cellulaire à une plus grande fluidité des
membranes. Points majeurs de ce modèle, nous avons pu générer pour la première fois en 2D
par des manipulations purement effectuées *in vitro* une cellule présentant toutes les
caractéristiques d'un progéniteur bipotent maintenu pendant plusieurs mois dans un état
métastable. Nous avons pu valider une nouvelle fois dans ce modèle non oncogénique le lien
entre plasticité cellulaire et fluidité membranaire tout en montrant que les processus de
différenciation mammaire s'accompagnaient systématiquement d'une rigidification des
membranes. Concernant cette différenciation, nous avons présenté ici les résultats associés
uniquement à l'engagement des cellules métastable dans les branches luminales ou
myoépithéliales. Cependant, des stratégies de modulation du milieu hormono-nutritif sont en
cours d'analyse et d'optimisation au sein de l'équipe dans le but de pousser cette
différenciation vers des stades terminaux. La différenciation luminale ductale est notamment
basée sur l'utilisation d'un milieu enrichi en acides aminés et en FGF, couplé à un cocktail
hormonal proluminal à base d'œstradiol et d'hydrocortisone<sup>42</sup>. Concernant la différenciation,
l'allongement du temps de traitement au ribitol et à l'ATRA semble favoriser une
augmentation des caractères myoépithéliaux, mesurés notamment par la capacité de la cellule
à répondre à une stimulation à l'ocytocine, cette même hormone renforçant le caractère
myoépithélial de ces cellules<sup>43</sup>. L'intérêt de ces stratégies serait leur capacité à démontrer que
le lien entre plasticité et fluidité membranaire pourrait être conçu comme un continuum
mesurable et quantifiable. Finalement, il est important concernant ce modèle de se pencher sur
les résultats associés à la résistance au stress oncogénique. Ce test constitue un des marqueurs
de plasticité cellulaire dans un cadre oncogénique. Cependant, un test in vivo permettrait de renforcer ces résultats, en mesurant la capacité de ces cellules à induire une tumeur suite à l'apparition d'une lésion oncogénique, mais aussi en analysant les composantes phénotypiques et les sous-types moléculaires associés à ces tumeurs. Plusieurs éléments pourraient être plus particulièrement analysés. Le premier vérifierait tout d'abord qu'un seul hit oncogénique est suffisant à l'obtention d'une tumeur dans le modèle métastable alors que plusieurs seraient nécessaires dans les progéniteurs issus de ces métastables comme ce qu'il s'observe dans les cellules HMEC⁴⁴. Des analyses, du PAM50 permettant de classifier les tumeurs, pourraient être effectuées afin d'observer possiblement une plus grande variété de sous-types moléculaire dans les tumeurs formées à partir de la lignée métastable. Enfin, en lien avec leur plasticité, il serait intéressant de vérifier si ces cellules métastables auraient une capacité d'adaptation à des environnements tissulaires variés leur permettant de former des tumeurs en dehors de la glande mammaire.

Pour conclure cette discussion, il est intéressant d'analyser et de mettre en perspective les résultats obtenus en termes de profil transcriptomique, notamment ceux expliquant vraisemblablement la plus grande fluidité des membranes des cellules les plus plastiques. Le gène ACSL4 est notamment augmenté tout comme le gène SCD au sein des métastables qui sont au contraire diminués lors de la mise en place d'un programme génétique de différenciation qu'il soit luminal ou myoépithélial. En conséquence, il est vraisemblable que les niveaux d'acide gras mono- et poly- insaturés soient directement affectés par la plasticité cellulaire et la mise en place des identités cellulaires. Les gènes impliqués dans la voie de synthèse du mévalonate et la synthèse du cholestérol sont d'autre part aussi augmentés dans les cellules métastables. Ce résultat pouvait sembler surprenant puisque le cholestérol tend à rigidifier les membranes, cependant l'augmentation parallèle de l'expression du gène codant le transporteur à efflux du cholestérol ABCA1 peut permettre d'apporter un début d'explication à ce paradoxe. L'activation de la voie de synthèse du cholestérol ne serait pas associée à une plus grande incorporation de ce dernier dans les membranes, mais permettrait de maintenir des processus biochimiques déterminant pour le maintien de la plasticité cellulaire, processus prenant leur source dans cette voie métabolique de synthèse du cholestérol. Parmi les métabolites produits à partir de cette voie de synthèse du mévalonate, géranylgéranyl-PP est particulièrement intéressant puisqu'il permet de maintenir l'activité des facteurs YAP/TAZ, des régulateurs clefs de la plasticité cellulaire et des processus régénératifs associés aux épithéliums⁴⁵,⁴⁶. De façon similaire, la synthèse du CoQ10 prend sa source dans celle du mévalonate, ce coenzyme permettant secondairement de protéger la cellule contre la peroxydation des lipides grâce à la protéine FSP1 (AIFM2)⁴⁷,⁴⁸. Les hypothèses formulées ici à propos de ces régulations sont d'autre part complémentaires à des concepts émergents de la littérature récente, notamment celle associée au processus d'EMT. La répression de la voie de synthèse du cholestérol par CtBP/ZEB1 permettant le maintien de l'activité de TGFβ serait ainsi un autre exemple du lien entre diminution de l'incorporation membranaire du cholestérol et engagement d'un processus de plasticité cellulaire¹⁶. Des travaux allant dans ce sens ont aussi été rapportés à partir de modèle pancréatique où là aussi, une diminution de la synthèse du cholestérol associée à une augmentation de l'activité des facteurs SREBP1 favorise l'activation du TGFβ, une EMT partielle et l'obtention d'un
phénotype plus agressif. Point intéressant, l'analyse de coupe histologique de patients traités par des statines, des inhibiteurs de la voie du mévalonate, a mis en évidence une augmentation de cellules ayant subi un processus d'EMT partiel⁴⁹. Concernant le transporteur ABCA1 ensuite, d'autres études ont aussi rapporté sa plus grande expression dans les tumeurs du sein triples négatives, tumeurs associées au phénotype Basal-like⁵⁰. À l'inverse, l'inhibition du transporteur ABCA1 a pu être associée à une diminution de la plasticité cellulaire, une inhibition des processus d'EMT et un plus faible potentiel métastatique¹⁵. Le dernier point maintenant concernant le métabolisme lipidique concerne le manque d'information relative sur les gènes et le métabolisme associé aux sphingolipides bien que ceux-ci jouent un rôle important sur la fluidité membranaire, notamment celle de la membrane plasmique. Nous avons cependant quelques éléments de réponse comme la diminution de la quantité de sphingolipides mesurée par l'analyse de type lipidomique des cellules induite en EMT par expression ectopique de ZEB1. Des données de la littérature sont en accord avec ces résultats montrant notamment la diminution de l'expression de la ceramide synthase 6 (CERS6) lors de la mise en place de ce même programme d'EMT auquel est associée une diminution de la fluidité membranaire de la membrane plasmique⁵¹. Une analyse lipidomique complète de nos modèles, centrée uniquement sur les lipides membranaires et excluant les gouttelettes lipidiques⁵², serait ainsi tout à fait pertinente pour valider le rôle joué par les différentes espèces de lipides dans ces mécanismes de modulation de la fluidité membranaire en lien avec les niveaux de plasticité cellulaire ou le statut métastable

## Matériels et Méthodes :

### Culture cellulaire :

Les lignées cancéreuses mammaires (MCF7, ZR75-1, HCC1954, HCC1937, BT20, MDA-MB-231 et HS578T) et les cellules épithéliales mammaires humaines (HMEC) proviennent de chez ATCC et Lonza. Les cellules sont mises en culture à 37°C et 5% CO₂. Les lignées cancéreuses ont été adaptées et maintenues dans du Minimum essential medium (MEM) (Gibco) complémenté avec 5% SVF (Gibco), 91 U.mL⁻¹ pénicilline-streptomycine (P/S) (Gibco), 10 ng.mL⁻¹ human epidermal growth factor (EGF) (Promocell) et 262 mU.mL⁻¹ insuline (NovoRapid). Les HMEC sont maintenues dans du 1:1 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/HAMF12 medium (Gibco) complémenté avec 10% SVF (Gibco), 91 U.mL⁻¹ pénicilline-streptomycine (P/S) (Gibco), 10 ng.mL⁻¹ human epidermal growth factor (EGF) (Promocell), 262 mU.mL⁻¹ insuline (NovoRapid) et 0,5 µg.ml⁻¹ hydrocortisone (Sigma). Les cellules progénitrices luminales et myoépithéliales sont maintenues dans le même milieu que les cellules HMEC.

L'induction de l'EMT dans la lignée HCC1954 est effectuée par un traitement au TGFβ (10 ng.mL⁻¹) (Preprotech)

### Induction du programme de l'EMT et induction d'un phénotype métastable :

L'induction de l'expression de ZEB1 chez les HMEC est effectuée par un traitement de 10 µM de doxycycline (Sigma). Pour l'obtention d'un phénotype métastable, l'expression de
ZEB1 est induite pendant 2 semaines dans le milieu DMEM/F12 des HMEC, puis 5 semaines dans du milieu métastable : DMEM no glucose, no glutamine, no pyruvate complémenté avec 5% HS (Gibco), 6 mM de glucose (Sigma), 0.25 mM GlutaMAX™ (Gibco), 2 mM pyruvate (Gibco), 91 U.mL⁻¹ pénicilline-streptomycine (P/S) (Gibco), 10 ng.mL⁻¹ human epidermal growth factor (EGF) (Promocell), 262 mU.mL⁻¹ insuline (NovoRapid), 0,5 µg.ml⁻¹ hydrocortisone (Sigma) et 200 nM déxaméthasone (Sigma). Après ces 7 semaines d'induction, les cellules sont maintenues dans du milieu métastable.

### Analyse de la sensibilité à l'inhibition des mécanismes antiferroptose :

Les cellules sont mises en culture dans une plaque 6 puits (100 000 cellules/puits). Le lendemain les cellules sont traitées avec les différents inhibiteurs des mécanismes anti-ferroptoses ou avec le solvant des composants comme contrôle : DMSO (Sigma), 0.5 µM RSL3 (MedChemExpress), 5 µM iFSP (MedChemExpress), et 1 µM FIN56 (MedChemExpress) pendant 24h. La viabilité cellulaire est ensuite mesurée par un test à la résazurine.

### Analyse de la prolifération cellulaire :

La viabilité cellulaire est effectuée par un test à la résazurine. Le milieu des cellules est retiré, suivi d'un lavage au PBS préchauffé à 37°C des cellules. Les cellules sont ensuite incubées avec 2 mL de 120 µM de résazurine (Sigma), stérile, dilué dans du Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (Gibco) complémentée avec 6 mM de glucose et 5% de SVF et préchauffé à 37°C. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C et 5% CO₂ pendant 40min dans le noir. Trois fois 200 µL sont ensuite récupérés par conditions, déposés dans une plaque 96 puits noire, et lu par détection de la fluorescence de la résazurine par lecteur de plaque ClarioStar® (BMGlabtech) Ex = 540/20 et Em = 590/20.

La quantification cellulaire est effectuée par quantification de l'ADN. Les cellules sont lysées grâce à un tampon RIPA contenant 0.5% de dodécylsulfate de sodium. Le lysa cellulaire est ensuite chauffé à 95°C pendant 10min et la quantité d'ADN présentent est mesurée par fluorescence au lecteur de plaque ClarioStar® à l'aide du kit QuantiFluor® dsDNA System (Promega).

### Mesure de la fluidité membranaire par spectrofluorimétrie :

Les cellules sont mises en culture à la même confluence et incubées avec 2 µM de Dioll pendant 24h. A la fin du temps d'incubation, les cellules sont récupérées et dissociées par traitement à la trypsine, qui est ensuite enlevée par centrifugation (300 g, 4 min à 4°C). Les cellules ont été analysées soit par spectrofluorimétrie (Jasco FP-8500™, ex=390nm/em=400-600nm), soit les cellules sont resuspendues dans leur milieu et déposées dans une plaque noire 96 puits et analysées par le lecteur de plaque ClarioStar® (BMGlabtech) en spectral scan mode (ex=380-400nm/em=400-600nm). Le calcul du GP est effectué sous le logiciel Excel :
$$GP = \frac{I_{440} - I_{490}}{I_{440} + I_{490}}$$

Puis représenté graphiquement avec le logiciel GraphPad Prism.

## Quantification d'expression de l'ARNm :

L'ARNm est extrait à partir d'un million de cellules grâce au kit (Qiagen™ RNeasy Kits), puis 1 µg d'ARNm est utilisé pour effectuer une transcription inverse (SuperScript™ Double-Stranded cDNA Synthesis Kit). «Real-time PCR intron-spanning assays» est réalisé avec le SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Biorad). La quantification relative de l'expression des gènes est réalisée par la méthode de comparaison des Ct, grâce à une normalisation des gènes cibles avec le gène ménagé endogène 36B4 (RPLP0 – Ribosomal protein large P0). L'analyse comparative des gènes avec le contrôle s'effectue de la manière suivante : le deltaCt obtenue par normalisation du contrôle est soustrait par le deltaCt d'une des conditions permettant l'obtention d'un fold change d'expression du gène. L'ensemble des valeurs obtenues pour chaque gène sont moyennées, puis transformées en Log2. L'ensemble des calculs sont effectués sous le logiciel Excel puis les résultats sont mis en forme graphiquement avec le logiciel GraphPad Prism ou par R-software ((v3.2.2), package ggplot2, ggrepel et grid.

La variation d'ensemble de gènes au cours du temps est calculée de la manière suivante : le deltaCt de chaque gène est calculé pour chaque temps. L'expression de chaque gène est ensuite normalisée avec le minimum et le maximum d'expression sur l'ensemble de la cinétique attribuant une valeur d'expression entre -1 (expression minimum) et +1 (expression maximum). L'ensemble des variations des gènes d'un groupe sont ensuite moyennées pour chaque temps.

## Analyse lipidomique :

Les lipides sont extraits à partir de culot cellulaire grâce à la méthode de Folch (FOLCH et al., 1951). Les différentes classes lipidiques sont séparées par chromatographie sur couche mince sur plaque de silice (Merck 5721, Germany). La révélation s'est effectuée par pulvérisation de bleu de bromophénol et les bandes de chaque espèce sont grattées de la plaque. Les lipides sont ensuite saponifiés et transméthylés avec du sodium methylate. Les méthyl esters sont extraits grâce à de l'hexane et analysés par chromatographie en phase liquide et en phase gazeuse. La chromatographie en phase gazeuse Trace/ULTRA GC (Thermo Separation Products) équipé avec une colonne capillaire en silice fondue CP-SIL (25 m x 0.25 mm internal diameter) « coaté » avec 100% de cyanopropyl siloxane. L'identification individuelle des composants méthyl ester sont effectuées par comparaison avec le temps de rétention des standards. Les résultats sont donnés en abondance relative des acides gras individuels (en %).
### Immunofluorescence :

Les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldhéhyde (Sigma), puis après lavage, traitées avec du tampon PBS (Gibco), 0.3% de Triton X100 (Sigma). Suite à un second lavage, les sites non spécifiques sont saturés avec du tampon PBS, 5% de BSA (Sigma). Après lavage, le marquage par les anticorps primaires s'effectue pendant une nuit à 4°C dans le noir, l'Ac de souris anti-KRT7 et l'Ac de rat anti-KRT5 (SantaCruz) ont été dilués au 1/100 et l'Ac de souris anti-CDH2 (Abcam) a été dilué au 1/500 dans un tampon PBS, 0.5 % BSA et 0.1% Triton X100. Après lavage, le marquage par les anticorps secondaires s'effectue pendant 1h à 37°C, l'Ac de chèvre anti-rat couplé à l'AlexaFluor 488 et l'Ac de chèvre anti-souris couplée à l'AlexaFluor 555 ont été dilués au 1/1000 dans un tampon PBS, 0.5% BSA, 0.1% Triton X100 et DAPI au 1/10000. Les cellules sont ensuite lavées puis lues par microscopie à épifluorescence (Zeiss Axio Vert.A) avec un objectif Zeiss LD A-Plan 20x/0.35 Ph1. L'excitation pour l'AlexaFluor 488 et l'AlexaFluor 555 s'effectue respectivement à 475 et 555 nm par le système LED Zeiss Colibri 5. La capture d'image s'effectue à l'aide d'une caméra Zeiss Axiome color 5 et le logiciel Zen. L'analyse des images est quant à elle effectuée avec le logiciel ImageJ.

### Analyse par cytométrie en flux :

Les cellules sont détachées grâce à la trypsine, qui est ensuite neutralisée par ajout de milieu complémenté en sérum. 1 000 000 de cellules sont centrifugées à 300g pendant 4min à 4°C. Le surnageant est jeté et les cellules sont resuspendues dans 100 µL de solution de marquage : Ac anti-CD44/FITC (Biolegend) dilué au 1/400, Ac anti-EpCAM/PE (Biolegend) dilué au 1/200 et Ac anti-CD49f (Biolegend) dilué au 1/100 dans du tampon PBS, 10% de SVF, pendant 30min à 4°C dans le noir. Les cellules sont ensuite lavées 2x, puis resuspendues dans 400µL de tampon PBS, 10% PBS et mesurées au cytomètre en flux (BD LSRFortessa™). L'analyse est effectuée via le logiciel FlowJo.

### Induction de l'oncogène H-RAS<sup>G12V</sup> par traitement au 4-Hydroxytamoxifen

Les cellules sont mises en culture en plaque 6 puits la veille de l'induction de H-RAS<sup>G12V</sup> dans un milieu DMEM no glucose, no glutamine, no pyruvate complémenté avec 5% SVF (Gibco), 6 mM de glucose (Sigma), 0.25 mM GlutaMAX™ (Gibco), 0.1 mM pyruvate (Gibco), 91 U.mL<sup>-1</sup> pénicilline-streptomycine (P/S) (Gibco), 10 ng.mL<sup>-1</sup> human epidermal growth factor (EGF) (Promocell), 262 mU.mL<sup>-1</sup> insuline (NovoRapid) et 0,5 µg.ml<sup>-1</sup> hydrocortisone (Sigma). 24h après le milieu est changé contenant 500 nM de 4-Hydroxytamoxifen (OHT) (Sigma). L'induction de H-RAS<sup>G12V</sup> par l'OHT s'effectue pendant 6 jours, une trypsine est effectuée à 3 jours avec un facteur de dilution identique entre chaque condition et le milieu est changé toutes les 48h.
Microscopie confocale :

Les cellules ont été maintenues en culture dans des chambres de 8-well Lab-TEK® µslides et marquées avec 2 µM de Dioll. Les images des échantillons ont été capturées par microscopie confocale (Zeiss LSM 880 AxioObserver inversé, avec environnement contrôlé : température, CO₂ et hygrométrie) avec un objectif Plan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27. Le Dioll est excité avec laser diode 405 nm, d'énergie = 1.0 %max et l'acquisition s'effectue en mode spectral avec un gain = 759 A.U, le spectre d'émission est subdivisé en canaux de 8/9 nm de 424 à 513 nm avec une échelle de couleur reflétant les différentes longueurs d'onde du violet au vert.

Analyse du paramètre GP des images de la microscopie confocale :

Une image composite est créée à partir des tranches spectrales obtenues avec le Dioll. Après
application d'un seuil pour garder les pixels positifs, ceux correspondant à la membrane
plasmique sont sélectionnés manuellement à l'aide du logiciel ImageJ. À l'aide du logiciel R-
software ((v3.2.2), l'intensité d'émission de chaque pixel des canaux à 440 nm et 490 nm sont
utilisées pour le calcul du GP en chaque point par la formule décrite dans la section
spectrofluorimétrie. La médiane du GP de l'ensemble des pixels d'une image est calculée. Le
GP médian de 3 images est ensuite moyenné.

Analyse statistique et représentation graphique :

Un test de Student bilatéral est utilisé pour l'analyse comparative des échantillons. La significativité statistique est indiquée sur la légende des figures. Le logiciel GraphPad Prism est utilisé pour générer les graphiques et effectuer les analyses statistiques. Si l'analyse statistique n'est pas indiquée dans la légende cela signifie que la figure est représentative d'une n=3 répliqua biologique indépendant.

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<caption>Tableau 1 : Fluctuation des gènes lors de l'induction du programme de l'EMT par activation de ZEB1</caption>

<table><caption>Tableau 1 :</caption><thead><tr><th></th><th>Gene</th><th>Day 1</th><th>Day 2</th><th>Day 3</th><th>Day 5</th><th>Day 10</th><th>Signature</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="10">Test n°1</td><td>CD24</td><td>0,6859481</td><td>-0,688342</td><td>-0,862124</td><td>1</td><td>-1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CDH1</td><td>1</td><td>-0,252555</td><td>-1</td><td>0,2800606</td><td>-0,016528</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CDH3</td><td>0,3513245</td><td>-0,167427</td><td>-1</td><td>1</td><td>0,2609948</td><td>Epi</td></tr><tr><td>EPCAM</td><td>-0,410692</td><td>-1</td><td>-0,571216</td><td>1</td><td>-0,733182</td><td>Epi</td></tr><tr><td>GATA3</td><td>-0,970228</td><td>-1</td><td>-0,750147</td><td>1</td><td>0,3379556</td><td>Epi</td></tr><tr><td>KT19</td><td>-1</td><td>-0,256031</td><td>-0,758959</td><td>-0,640133</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>OVOL1</td><td>-0,993506</td><td>-1</td><td>-0,956667</td><td>1</td><td>-0,761359</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CD44</td><td>-1</td><td>-0,701106</td><td>0,5071957</td><td>0,1259576</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>CDH2</td><td>-0,167535</td><td>-1</td><td>-0,301917</td><td>-0,269751</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ITGB4</td><td>0,0746494</td><td>-0,875977</td><td>-0,998594</td><td>-1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>SNAI1</td><td>-1</td><td>-0,969851</td><td>-0,477386</td><td>1</td><td>-0,832553</td><td>Mes</td></tr><tr><td>SNAI2</td><td>1</td><td>0,2454411</td><td>-0,964506</td><td>-1</td><td>0,8399127</td><td>Mes</td></tr><tr><td>VIM</td><td>0,5315942</td><td>-0,91196</td><td>-0,083612</td><td>-1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ZEB1</td><td>-0,763096</td><td>-1</td><td>-0,473355</td><td>-0,534573</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ZEB2</td><td>-1</td><td>-0,677416</td><td>-0,755001</td><td>1</td><td>-0,366172</td><td>Mes</td></tr><tr><td rowspan="10">Test n°2</td><td>CD24</td><td>1</td><td>0,8011238</td><td>-1</td><td>0,2528229</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CDH1</td><td>0,253905</td><td>1</td><td>-1</td><td>0,1465776</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CDH3</td><td>-0,210857</td><td>0,9081061</td><td>-1</td><td>1</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>EPCAM</td><td>-0,891185</td><td>-1</td><td>-0,542599</td><td>1</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>GATA3</td><td>-1</td><td>0,2248475</td><td>-0,976352</td><td>1</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>KT19</td><td>-0,892082</td><td>1</td><td>-1</td><td>0,1482727</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>OVOL1</td><td>-1</td><td>-0,549704</td><td>0,2358814</td><td>1</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CD44</td><td>-1</td><td>-0,969511</td><td>0,7800776</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>CDH2</td><td>0,0720256</td><td>-1</td><td>-0,355858</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ITGB4</td><td>0,0027278</td><td>-1</td><td>0,6714252</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>SNAI1</td><td>-1</td><td>-0,634681</td><td>-0,255491</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>SNAI2</td><td>-0,695309</td><td>-1</td><td>0,2863115</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>VIM</td><td>1</td><td>-1</td><td>-0,536141</td><td>-0,944751</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ZEB1</td><td>-0,426735</td><td>-1</td><td>-0,403655</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ZEB2</td><td>-1</td><td>-0,299752</td><td>-0,383709</td><td>1</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td rowspan="10">Test n°3</td><td>CD24</td><td>0,8185674</td><td>1</td><td>-0,684432</td><td>0,9671128</td><td>-1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CDH1</td><td>-0,711253</td><td>0,2461964</td><td>-1</td><td>1</td><td>-0,986735</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CDH3</td><td>-0,49182</td><td>-0,556856</td><td>-1</td><td>1</td><td>-0,718915</td><td>Epi</td></tr><tr><td>GATA3</td><td>-0,906335</td><td>0,970657</td><td>-1</td><td>1</td><td>-0,987014</td><td>Epi</td></tr><tr><td>KT19</td><td>-0,418145</td><td>1</td><td>-0,258752</td><td>0,5421227</td><td>-1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>EPCAM</td><td>-0,379819</td><td>-1</td><td>-0,572511</td><td>1</td><td>0,1671832</td><td>Epi</td></tr><tr><td>OVOL1</td><td>-1</td><td>-0,710334</td><td>-0,404018</td><td>0,6748198</td><td>1</td><td>Epi</td></tr><tr><td>CD44</td><td>-1</td><td>-0,838715</td><td>0,4985483</td><td>-0,201896</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>CDH2</td><td>1</td><td>-1</td><td>-0,115198</td><td>1,1026333</td><td>0,5952718</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ITGB4</td><td>0,2944901</td><td>-1</td><td>-0,171145</td><td>-0,650852</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>SNAI1</td><td>-0,7414</td><td>-0,218049</td><td>-0,458014</td><td>1</td><td>-1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>SNAI2</td><td>-0,616165</td><td>-1</td><td>-0,231236</td><td>-0,323034</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>VIM</td><td>1</td><td>-0,890351</td><td>-0,424241</td><td>-1</td><td>0,2404753</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ZEB1</td><td>-0,649605</td><td>-1</td><td>-0,245552</td><td>-0,089024</td><td>1</td><td>Mes</td></tr><tr><td>ZEB2</td><td>-1</td><td>-0,332646</td><td>-0,557238</td><td>1</td><td>-0,569787</td><td>Mes</td></tr></tbody></table>

<table><thead><tr><th>Mean</th><th>Gene Set</th><th>Day 1</th><th>Day 2</th><th>Day 3</th><th>Day 5</th><th>Day 10</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="2">Test n°1</td><td>Epi</td><td>-0,441258</td><td>0,1356662</td><td>-0,702816</td><td>0,8834365</td><td>-0,50364</td></tr><tr><td>Mes</td><td>-0,301409</td><td>-0,776677</td><td>-0,234233</td><td>0,1680718</td><td>0,4739956</td></tr><tr><td rowspan="2">Test n°2</td><td>Epi</td><td>-0,39146</td><td>0,3406248</td><td>-0,754724</td><td>0,6496676</td><td></td></tr><tr><td>Mes</td><td>-0,380911</td><td>-0,862993</td><td>-0,02463</td><td>0,7569061</td><td></td></tr><tr><td rowspan="2">Test n°3</td><td>Epi</td><td>-0,191022</td><td>-0,623479</td><td>-0,842731</td><td>0,6628468</td><td>-0,130303</td></tr><tr><td>Mes</td><td>-0,290548</td><td>-0,736359</td><td>-0,443397</td><td>-0,209796</td><td>0,5801485</td></tr></tbody></table>