Toutefois, on utilise plus fréquemment la constante de dissociation $K_D$ afin de caractériser l'affinité. Elle est définie par la relation :

$$K_D = \frac{1}{K_A} = \frac{k_d}{k_a} \quad (\text{Equation 25.b})$$

L'affinité de liaison est habituellement mesurée et signalée par la constante de dissociation à l'équilibre ($K_D$). L'affinité désigne la force de l'interaction de liaison entre l'analyte (A) et le ligand (B). C'est donc une information très pertinente à connaître si on étudie l'interaction entre deux molécules. Plus la valeur de $K_D$ est faible, plus l'affinité de A pour B est élevée et, par conséquent, plus l'interaction est forte.

Afin de déterminer les constantes d'affinité à partir de mesures SPR, il existe des isothermes d'adsorption, qui sont des modèles mathématiques permettant de décrire des processus d'adsorption d'une molécule sur un substrat. Il existe plusieurs isothermes, dont celles de Langmuir et de Freundlich. Dans le cadre de cette thèse, nous avons utilisé le logiciel Trace Drawer™ pour SPR Navi™, afin étudier des interactions biomoléculaires. L'objectif des algorithmes d'ajustement cinétique de ce logiciel est de déterminer les constantes de vitesse d'association et de dissociation ($k_a$ et $k_d$) en ajustant le niveau de liaison de l'espèce AB en fonction du temps à une série de concentrations de l'analyte A.

## V. Conclusion

Ce second chapitre a été consacré à définir théoriquement le phénomène de la résonance du plasmon de surface. Nous avons montré que la SPR est un phénomène physique soulignant l'excitation résonante du plasmon de surface et qu'elle se manifeste par un pic au niveau de la courbe de réflectivité SPR. Nous avons ensuite évoqué le grand intérêt de l'utilisation de la MP-SPR dans la caractérisation des films minces. En effet, l'approche à double longueur d'onde avec une source lumineuse rotative associée à la configuration de Kretschmann du système offre la possibilité de réaliser des mesures SPR sur une large plage angulaire et permet de déterminer à la fois l'indice de réfraction et l'épaisseur d'une couche mince dans une seule mesure. Ces paramètres fournissent une base pour l'étude de la formation de membranes biomimétiques supportées et permettent une meilleure compréhension des mécanismes d'interaction de ces membranes avec les biomolécules.
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# Chapitre III : Suivi par résonance plasmonique de surface de l'interaction des mono-rhamnolipides avec une couche de liposomes supportés
# I. Introduction

Les rhamnolipides sont des métabolites secondaires produits naturellement par la bactérie *Pseudomonas aeruginosa*. Ils participent à diverses fonctions cellulaires essentielles. Ces composés appartiennent au groupe des glycolipides (ou lipopolysaccharides) tensioactifs et sont constitués d'une partie glycone composée d'une ou de deux fragments de rhamnose reliés par une liaison α-1,2-glycosidique et d'une partie aglycone constituée de deux chaînes alkyle, ce qui leur donne des propriétés de biosurfactant. Ils sont produits sous la forme d'un mélange composé principalement de α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate et de 2-O-α-L-rhamnopyranosyl-α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate appelés respectivement mono-rhamnolipide (mono-RL) et di-rhamnolipide (di-RL) (Figure 1). Les biosurfactants de rhamnolipides sont toujours un mélange de différents rhamnolipides.

<figure><img src="image_45.png" /><figcaption>**Figure 1.** Les structures chimiques du (a) mono-rhamnolipide et du (b) di-rhamnolipide et une illustration schématique des différentes formes proposées pour le (c) mono-rhamnolipide et le (d) di-rhamnolipide et de l'effet résultant sur la courbure de la membrane</figcaption></figure>

Ces deux composés sont les composants dominants du mélange produit naturellement. Ils constituent le principal facteur de virulence de la bactérie *Pseudomonas aeruginosa*. Les
rhamnolipides sont considérés comme le seul facteur de virulence lié à la détérioration de l'état des patients atteints de pneumonie sous ventilation assistée [1]. Ils engendrent des infections respiratoires chroniques chez les patients atteints de mucoviscidose et les personnes immunodéprimés. Il a été démontré, sur un épithélium respiratoire humain reconstitué *in vitro* que l'incorporation de rhamnolipides dans une membrane de la cellule hôte diminue la résistance transépithéliale pour des concentrations supérieures à 50 µg mL⁻¹[2]. Le rôle des rhamnolipides dans les infections pulmonaires est également confirmé par plusieurs autres rapports [3, 4]. La contribution des rhamnolipides à la virulence de *Pseudomonas aeruginosa* a aussi été relevée dans les infections de la cornée [5, 6]. En addition, les rhamnolipides peuvent tuer les leucocytes polymorphonucléaires (PMN), les macrophages et freiner la phagocytose. En somme, il est clairement démontré que les rhamnolipides constituent une source de virulence puissante chez l'homme.

Malgré les nombreuses connaissances acquises sur les effets des rhamnolipides et en raison de la complexité due à leurs nombreuses activités biologiques, une compréhension plus approfondie au niveau moléculaire de leur interaction avec les membranes cellulaires mérite encore des études détaillées. Les membranes biomimétiques modèles facilitent la compréhension des comportements biologiques complexes des membranes naturelles. Celles composées de lécithines, les principaux phospholipides de nombreuses cellules vivantes, sont structurées en bicouches qui peuvent être dispersées dans l'eau sous forme de liposomes ou vésicules. Des études calorimétriques ont montré que les di-RLs se lient aux vésicules de phospholipides mono-insaturés 1-palmitoyl-2-oléoyl-glycéro-3-phosphocholine (POPC), rompent les bicouches et provoquent une fuite du milieu aqueux interne lorsque le rapport RL/lipide est supérieur à 1. Cet effet est réduit en présence de cholestérol [7]. Une étude par FTIR a montré une interaction directe entre les groupes phosphate de la 1-palmitoyl-2-linoléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (PLPC) et les têtes polaires de rhamnolipides, ce qui a ensuite modifié l'organisation des groupes de tête polaire des phospholipides. Ces interactions ont été confirmées par des simulations de dynamique moléculaire de ces modèles de membrane en présence de rhamnolipides [8].

Il a été démontré que la structure des Rhamnolipides a une influence importante sur leur concentration micellaire critique (CMC), sur leur capacité à s'insérer dans les membranes et sur leur activité biologique [9-11]. Grâce à ses deux unités de rhamnose dans son groupe de tête polaire, le di-RL est un tensioactif plus hydrophile que le mono-RL [12]. Par ailleurs, plus le
nombre d'unités de rhamnose présentes est élevé, plus la molécule devient volumineuse, ce qui entraîne la formation de petites micelles sphériques à faible concentration et de micelles plus grandes à forte concentration. Ainsi, les di-RLs s'auto-assemblent sous forme de petites micelles, qui grandissent lorsque la concentration augmente. En revanche, les mono-RLs, qui sont moins hydrophiles, forment de grandes micelles à faible concentration [12]. Contrairement au di-RL, le mono-RL a un effet plus déstabilisant sur les membranes lipidiques en raison de sa forme conique qui permet de former des micelles inversées (voir Figure 1.c). Alors que la molécule de di-RL a une forme de cône inversé qui donne lieu à des micelles normales. (Voir Figure 1.d).

Dans le cadre de ce travail, nous avons voulu mettre en évidence l'effet déstabilisant du mono-RL vis-à-vis de vésicules lipidiques de type liposomes. En nous concentrant sur les interactions entre les mono-RLs et les membranes cellulaires modèles, nous avons recouru à la résonance plasmonique de surface MP-SPR multiparamètrique à double longueur d'onde pour suivre, détecter et analyser ces interactions en temps réel et sans marquage spécifique. A notre connaissance, la technique SPR n'a pas été utilisée jusqu'à présent pour étudier les interactions des RLs avec des couches de phospholipides ou des liposomes.

Dans ce chapitre, nous présentons les résultats expérimentaux et théoriques de l'étude de l'interaction entre le mono-RL et une couche de liposomes intacts formée sur un substrat d'or par MP-SPR. Ces travaux ont fait l'objet d'une publication parue dans le journal *Langmuir* (2021, 37(26), 7975-7985). Dans un premier temps, l'objectif de ce travail était de développer une stratégie fiable et reproductible pour immobiliser les liposomes d'une manière stable sur un substrat d'or. Ensuite, l'épaisseur et l'indice de réfraction des différentes couches formant notre système multicouche ont été déduits en modélisant les courbes SPR obtenues à deux longueurs d'onde. Dans un second lieu, des solutions de mono-RL de différentes concentrations ont été injectées sur la couche de liposomes formée et les signaux SPR (sensorgrammes) ont été enregistrés. Une solution riche en mono-RL a été préférée pour cette étude car le mono-RL est supposé se lier plus fortement aux bicouches phospholipidiques que le di-RL [12, 13]. Un mélange RL riche en mono-RL peut déstructurer les liposomes phospholipidiques avec une meilleure efficacité. Suite à cette interaction, les changements morphologiques de la couche de liposomes ainsi que la variation de la densité de masse adsorbée sur la surface d'or ont été décrits, sur la base de la variation du signal SPR et de la modélisation théorique des courbes SPR résultantes.
## II. Préparation et caractérisation des liposomes biotinylés

### II.1. Lipides utilisés

Les lipides constituent l'élément principal pour déterminer les propriétés physico-chimiques d'un liposome. Deux principaux types de lipides ont été utilisés, un lipide à base de phosphatidylcholine (PC) et un lipide biotinylé. Les lipides utilisés dans le cadre de ces travaux sont des lipides commerciaux. Ces derniers sont présentés ci-dessous.

**HSPC** : Ce phospholipide correspond à la phosphatidylcholine de soja hydrogénée (Phospholipon 90 H) qui contient 90% de PC. Les chaînes carbonées sont majoritairement constituées d'acides gras saturés, environ 85 % d'acide stéarique et 15% d'acide palmitique. l'HSPC est peu coûteux par rapport aux phospholipides synthétiques et contient en majorité de la phosphatidylcholine (PC) qui est un constituant majeur de la membrane biologique.

<figure><img src="image_46.png" /><figcaption>Figure 2. Formule du HSPC</figcaption></figure>

**DSPE-PEG (2000) Biotin** : Ce phospholipide est le 1,2-distearoyl-*sn*-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt).

<figure><img src="image_47.png" /><figcaption>Figure 3. Formule du DSPE-PEG (2000) Biotin</figcaption></figure>

### II.2. Caractérisation des liposomes

#### II.2.1. Mesure de la taille et de la charge surfacique des liposomes

Les liposomes ont été préparés selon la méthode de Bangham et ont subi une sonication avec une sonde à ultrasons. Le phospholipide biotinylé est présent dans la membrane liposomale en
très faible quantité. Le protocole expérimental est décrit dans la publication 1. Par la suite, ils ont été caractérisés en fonction de leur taille et de leur charge de surface. La caractérisation de la taille et de l'indice de polydispersité (PDI pour « PolyDispersity Index ») des liposomes préparés a été réalisée par DLS. Le diamètre hydrodynamique des liposomes a été mesuré à environ 76 nm ± 7,5, avec un indice de polydispersité (PdI) de 0,16.

La charge de surface des liposomes a été déterminée en mesurant le potentiel zêta sur la base de leur mobilité électrophorétique. Ce potentiel correspond à la charge électrique des liposomes en solution lorsqu'ils entrent en interaction avec des ions. Bien que les liposomes soient constitués de lipides zwitterioniques (charge globale neutre), une séparation des charges a lieu au sein du liposome. Il est probable que les charges négatives des groupements phosphate soient enfouies vers l'intérieur des liposomes tandis que les charges positives des ions ammonium des cholines sont plus exposées à la surface. Le potentiel zêta représente donc la charge de la couche superficielle des liposomes. Ainsi, le potentiel zêta mesuré inclut les charges des lipides à la surface du liposome, la première couche de contre-ions négatifs au contact de la tête choline et la seconde couche de contre-ions plus équilibrés en termes de charge.

<figure><img src="image_48.png" /><figcaption>**Figure 4.** Potentiel zêta à la surface d'un liposome en solution</figcaption></figure>

La surface négative des liposomes induit une répulsion électrostatique entre eux empêchant leur agrégation et leur confère une stabilité colloïdale.
## II.2.2. Etude de la morphologie des liposomes

L'observation par Cryo-TEM a confirmé la taille des liposomes synthétisés. Comme le montre la Figure 5.a, les liposomes sont apparus comme des nanovésicules parfaitement sphériques et unilamellaires. La Figure 5.b présente la distribution de taille des liposomes. Le diamètre moyen des liposomes était de 69 nm avec un écart-type de 10 nm.

Nous avons remarqué un accord satisfaisant entre les deux distributions de taille dérivées de l'analyse d'image TEM et des mesures DLS.

<figure><img src="image_49.png" /><figcaption>**Figure 5.** (a) Image TEM et (b) histogramme du diamètre d'une dispersion diluée de liposomes biotinylés</figcaption></figure>

# III. Suivi par MP-SPR de l'immobilisation des liposomes sur des surfaces modifiées

Après la préparation de liposomes biotinylés de type SUV (< 100nm), nous avons essayé d'élaborer une membrane biomimétique stable formée de liposomes intacts supportés sur la surface d'or. Pour ce faire, une étude comparative de l'interaction des liposomes biotinylés (anioniques) avec plusieurs puces SPR en or fonctionnalisées par une monocouche auto-assemblée (SAM) a été réalisée. Des SAMs d'alcanethiols à longue chaîne avec différents groupes terminaux (-COOH, -NH₂, et -CH₃) ont été formées sur les puces d'or. Une quatrième puce d'or a été fonctionnalisée par une couche de streptavidine (voir Figure 6). Avant l'injection des liposomes sur ces quatre surfaces, nous avons validé par MP-SPR chaque étape de la fonctionnalisation. Le dépôt de streptavidine sur la couche MUA (acide mercaptoundécanoïque) a entraîné une variation de +0,4° du θ<sub>SPR</sub>, alors que le dépôt des différentes SAM sur l'or a entraîné une variation du signal d'environ +0,2°.
<figure><img src="image_50.png" /><figcaption>**Figure 6.** Schéma de principe de l'étude des interactions entre des liposomes biotinylés et des puces SPR en or fonctionnalisées par différents groupements alkyles et la streptavidine</figcaption></figure>

Ensuite, nous avons injecté sur les quatre puces fonctionnalisées des dispersions de liposomes biotinylés à des concentrations comprises entre $1 \times 10^{11}$ et $5 \times 10^{12}$ lipo mL$^{-1}$ (correspondant à une teneur en phospholipides HSPC+DSPE-PEG de $1,5 \times 10^{-5}$ à $6 \times 10^{-4}$ M) et à un débit d'écoulement de 50 µL min$^{-1}$ pendant 4 minutes. Chaque injection a été suivie d'une étape de lavage de 4 minutes dans une solution de NaCl 0,15 M.

En suivant la variation de la position de l'angle $\theta_{SPR}$ (variation de l'indice de réfraction) en fonction de différentes concentrations de liposomes (C₁) pour les quatre surfaces (Figure 7), nous avons constaté que les liposomes se lient fortement à la surface fonctionnalisée par la streptavidine, ce qui a entraîné une augmentation du $\theta_{SPR}$ de +1.7° sous l'injection de $5 \times 10^{12}$ lipo mL$^{-1}$.
<figure><img src="image_51.png" /><figcaption>**Figure 7.** Déplacements angulaires du pic de résonance (Δθ<sub>SPR</sub>) (λ=670 nm) en fonction de l'injection d'une solution de liposomes à différentes concentrations (C<sub>1</sub>). Les interactions des solutions de liposomes biotinylés ont été étudiées sur des surfaces SPR en or fonctionnalisées par des groupes -COOH (acide 11-mercaptoundécanoïque), -NH<sub>2</sub> (11-amino-1-undécanethiol), -CH<sub>3</sub> (1-dodécanethiol) et modifiées par la streptavidine</figcaption></figure>

Pour la surface fonctionnalisée par une couche de thiol amine (-NH₂), le décalage angulaire était significatif (+0,86°) mais faible par rapport à celui obtenu avec la couche de streptavidine puisque l'interaction était principalement induite par une interaction électrostatique. Dans le cas de la couche MUA, un faible décalage angulaire de +0,48° a été obtenu, ce qui reflète un effet de blocage clair dû à la répulsion électrostatique. Cependant, cette liaison était encore plus forte que pour la SAM hydrophobe (1-dodécanethiol), qui a empêché les liposomes hydrophiles de se lier, ce qui a entraîné une faible variation de l'angle (+0,2°).

La surface des liposomes était faiblement anionique et comportait des fragments de PEG qui peuvent jouer un rôle dans les interactions. Nous supposons que l'interaction attractive entre les liposomes anioniques et la surface cationique (-NH₂) n'était pas suffisamment efficace pour obtenir une couche homogène de liposomes stables par rapport au substrat d'or fonctionnalisé par la streptavidine. La surface d'or SPR modifiée par la streptavidine a été choisie pour l'immobilisation des liposomes, en raison de sa forte affinité permettant un dépôt efficace et une bonne stabilité de la couche. La Figure 8 montre les étapes réactionnelles lors de cette phase de fonctionnalisation ; les carboxylates (-COOH) des MUA sont mis en réaction avec un carbodiimide tel que l'EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide), puis avec le
NHS (N-hydroxysuccinimide) pour former un ester semi-stable de NHS qui peut réagir ensuite
avec les amines primaires (-NH2) de la streptavidine.

<figure><img src="image_52.png" /><figcaption>**Figure 8.** Schéma des différentes réactions impliquant l'EDC et NHS pour l'activation de la surface SAM d'acide mercaptoundecanoïque (MUA), avant le dépôt de la streptavidine</figcaption></figure>

Comme les liposomes biotinylés interagissent avec la streptavidine par de fortes interactions, la régénération de la surface de streptavidine n'était pas possible sans enlever la couche de streptavidine. Ainsi, dans ce cas, le dispositif expérimental a consisté en des injections cumulées de liposomes sur le substrat SPR fonctionnalisé à la streptavidine, suivies de 4 minutes de lavage dans une solution de NaCl 0,15 M (Figure 9). Ainsi, la saturation du signal SPR lors de l'injection de liposomes sur la surface de streptavidine est atteinte par l'injection cumulée de concentrations de liposomes allant de 1×10<sup>11</sup> à 5×10<sup>12</sup> lipo mL<sup>-1</sup> (voir courbe rouge sur la Figure 9). Afin d'atteindre directement la saturation du signal, nous avons injecté à la surface de la streptavidine une forte concentration de liposomes de 1×10<sup>14</sup> lipo mL<sup>-1</sup> (voir courbe verte sur la Figure 9). Cette concentration entraîne un changement d'angle d'environ +1,7°, ce qui correspond au même changement d'angle global obtenu après l'injection cumulée de liposomes. Nous avons donc utilisé cette concentration élevée pour la suite de l'étude.
<figure><img src="image_53.png" /><figcaption>**Figure 9.** Sensorgrammes MP-SPR pour l'immobilisation de liposomes biotinylés et leur interaction avec la streptavidine ; mesure à la longueur d'onde de 670 nm</figcaption></figure>

## IV. Formation et modélisation des différentes couches de la puce d'or SPR

Le système multicouche considéré pour étudier l'interaction du mono-RL est présenté dans la Figure 10. Les couches 0 à 4 de la puce d'or SPR sont respectivement le substrat en verre, la couche de chrome-or, la couche MUA, la couche de streptavidine et la couche de liposomes.

<figure><img src="image_54.png" /><figcaption>**Figure 10.** Représentation schématique du système multicouche de la puce d'or SPR</figcaption></figure>
Après avoir sélectionnée la surface fonctionnalisée par la streptavidine pour déposer les liposomes, nous avons injecté une concentration de 1 × 10¹⁴ lipo mL⁻¹ pour effectuer l'ancrage (Figure 11.a).

Nous avons suivi par MP-SPR le décalage de l'angle SPR pour les deux longueurs d'onde (670 nm et 785 nm) après chaque étape de fonctionnalisation. Le décalage angulaire a confirmé le succès des fonctionnalisations successives de la surface de l'or (Figure 11.b).

<figure><img src="image_55.png" /><figcaption>**Figure 11.** (a) Sensorgramme SPR de l'immobilisation de 1 × 10¹⁴ lipo mL⁻¹ sur une puce SPR fonctionnalisée par la streptavidine, mesuré à 670 nm. (b) Spectres angulaires du signal SPR à 670 nm des différentes étapes de la fonctionnalisation : couche d'or (ligne jaune), MUA (ligne rouge),</figcaption></figure>
couche de streptavidine (ligne verte) et couche de liposomes (ligne bleue), avec les fits correspondants (lignes pointillées) provenant de la modélisation LayerSolver de chaque couche de façon individualisée. Les chiffres romains (I et II) indiquent la correspondance des événements dans (a) et (b)

Afin de mieux caractériser les couches formées et de quantifier l'adsorption, nous avons effectué une analyse à double longueur d'onde pour la détermination de l'épaisseur (d) et de l'indice de réfraction (ñ) des différentes couches de notre système avec le logiciel LayerSolver.

Les paramètres (d et n), avec (n) est la partie réelle de l'indice de réfraction complexe (ñ), provenant de la modélisation de la couche de liposomes ainsi que des autres couches sont rapportés dans le Tableau 1.

<table><caption>**Tableau 1.** Epaisseur (d) et indice de réfraction (n) des différentes couches de la puce SPR, obtenus par la simulation théorique de LayerSolver. Les valeurs calculées représentent la moyenne (± variation standard) de trois mesures répétées indépendamment.</caption><thead><tr><th>Layer</th><th>d (nm)</th><th>n<sub>670</sub></th><th>n<sub>785</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>Glass</td><td>Infinite (starting layer)</td><td>n = 1.52020</td><td>n = 1.51620</td></tr><tr><td>Chromium</td><td>1.6 ± 0.06</td><td>n = 3.51127 ± 0.02050</td><td>n = 4.04615 ± 0.17135</td></tr><tr><td>Gold</td><td>54.98 ± 0.02</td><td>n = 0.19612 ± 0.00016</td><td>n = 0.19548 ± 0.00477</td></tr><tr><td>Thiol MUA</td><td>1.50 ± 0.08</td><td>n = 1.43897 ± 0.01385</td><td>n = 1.42702 ± 0.01378</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>2.71 ± 0.31</td><td>n = 1.41646 ± 0.01102</td><td>n = 1.41416 ± 0.01102</td></tr><tr><td>Liposome</td><td>79.61 ± 6.74</td><td>n = 1.35270 ± 0.00122</td><td>n = 1.35102 ± 0.00126</td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>Infinite (ending layer)</td><td>n = 1.33216</td><td>n = 1.32966</td></tr></tbody></table>

Nous avons obtenu des résultats cohérents avec ceux rapportés dans la littérature [14-16] pour l'épaisseur et l'indice de réfraction de la couche de MUA et la couche de streptavidine (Tableau 1). La modélisation de la courbe SPR obtenue après la formation de la couche de liposomes (II, Figure 11.b) et prise après stabilisation du signal, a montré que les liposomes constituent une couche d'environ 80 nm d'épaisseur en moyenne. En regard de l'équation 19 du chapitre 2, nous
pouvons ainsi affirmer que l'onde évanescente peut pénétrer la totalité de la couche de liposomes adsorbés à la surface de la puce SPR, car l'épaisseur moyenne est inférieure à la demi-valeur de chaque longueur d'onde (670 et 785 nm) du dispositif MP-SPR. Nous avons remarqué que l'épaisseur de la couche de liposomes correspond au diamètre des liposomes mesurés par DLS et TEM. Cela suggère fortement que les liposomes s'adsorbent sous forme d'une monocouche.

# V. Etude MP-SPR de l'interaction entre les mono-RLs et la couche de liposomes supportés

Nous avons suivi en temps réel et sans marquage les interactions entre les mono-RLs et les liposomes immobilisés, par la technique MP-SPR. Le protocole expérimental est décrit dans la publication 1. Les solutions de mono-RL aux concentrations de 2 à 20 µg mL⁻¹ ont été injectées en 15 min, avec un débit de 12,5 µl min⁻¹ et les solutions de 50 à 100 µg mL⁻¹ ont été injectées à un débit de 50 µl min⁻¹. Chaque injection était alternée par une étape de lavage de 4 min dans une solution de 0,15M NaCl, à un débit de 50 µl min⁻¹. Le sensorgramme complet dans la Figure 12 montre que l'injection successive de différentes concentrations de mono-RL a provoqué des variations nettes du signal SPR et donc une déstabilisation progressive de la couche de liposomes formée à l'état III. La variation du signal a été reproductible d'une expérience à l'autre et a révélé trois domaines (état III, IV et V) pour lesquels les interactions du mono-RL avec la couche de liposome semblent suivre des mécanismes différents.
<figure><img src="image_56.png" /><figcaption>**Figure 12.** Sensorgramme de l'angle SPR en fonction du temps, mesuré à une longueur d'onde de 670 nm, pendant l'interaction des mono-RLs avec les liposomes</figcaption></figure>

Pour les faible concentrations (5 et 10 µg mL⁻¹ de mono-RL), nous pensons que le mono-RL s'intercale dans la couche phospholipidique sans déstructurer significativement la couche de liposomes. Cette interaction suit probablement un équilibre entre les mono-RLs libres en solution et les molécules intégrées dans la bicouche lipidique. Ceci conduit à une baisse réversible du signal SPR. Pour la concentration de 50 µg mL⁻¹ qui est une concentration proche de la concentration micellaire critique (CMC) du mono-RL, sachant que la valeur rapportée dans la littérature est de 56,3 µg mL⁻¹ (~110 µM) [17-19], nous avons noté un changement structurel de la couche de liposomes étant donné la chute significative du signal SPR. A cette concentration, le mono-RL s'intercale dans la double couche lipidique des liposomes en déstabilisant leur structure de bicouche fermée. Il est observé que l'ouverture des liposomes entraine une perte de masse et un changement d'état de la couche. Ce mécanisme d'interaction induit probablement une réorganisation de la couche lipidique pour former au final une bicouche adsorbée à la surface de la puce (état IV). L'excès de phospholipides est probablement éliminé par solubilisation à l'intérieur des micelles de mono-RLs. Ce phénomène est apparu irréversible.
Pour les concentrations les plus élevées (80 et 100 µg mL⁻¹), nous avons constaté un autre mécanisme d'interaction entre les RLs et la bicouche lipidique formée. Nous avons observé une baisse du signal SPR, suivie d'une ré-augmentation jusqu'à la valeur d'origine lors du passage de la solution NaCl. Une adsorption réversible de mono-RLs a eu lieu sur la bicouche phospholipidique, même après l'injection de la dernière concentration à 50 µg mL⁻¹. Ce phénomène pourrait être expliqué par la propriété des RLs d'induire une séparation de phase dans la bicouche phospholipidique comme décrit par Herzog et al. [13] Nous avons noté dans notre cas que l'organisation des phospholipides en tant qu'une bicouche semble se reformer sur la surface de la puce SPR lorsque le solvant d'élution passe de la solution de mono-RL à la solution de NaCl. Ainsi, l'étape de lavage a provoqué le relargage d'une grande quantité de mono-RL en solution ce qui a permis à la double couche de phospholipides de se reformer de façon homogène.

En regard de cette étude, nous avons conclu que les mono-RLs induisent une forte déstructuration des liposomes, qui nécessite la rupture de la membrane de la vésicule pour former une bicouche lipidique connectée latéralement à la surface de la puce d'or.

Après l'injection de Triton X-100 (1%), nous avons observé une chute remarquable du signal SPR qui a donné lieu à un autre état V.

Ces variations du signal SPR se produisent lorsque la masse et/ou l'épaisseur de la couche change. Nous avons modélisé par le logiciel LayerSolver les courbes SPR qui correspondent aux trois états (III, IV et V) et nous avons calculé les épaisseurs moyennes (d) et les indices de réfraction (n) des différentes couches pour les deux longueurs d'onde. Nous avons obtenu les résultats ci-dessous dans le Tableau 2.

<table><caption>**Tableau 2.** Epaisseur (d) et indice de réfraction (n<sub>670</sub>) obtenus à partir de l'analyse SPR dans du NaCl 0,15 M pour la couche de liposomes déposée sur la streptavidine et pour les couches lipidiques résultantes après injection de mono-RL et de Triton X-100 (1%).</caption><thead><tr><td>Couche</td><td>d (nm)</td><td>n<sub>670</sub></td></tr></thead><tbody><tr><td>Liposomes (III)</td><td>79.61 ± 6.74</td><td>1.35270 ± 0.00122</td></tr><tr><td>Bicouche lipidique (IV)</td><td>5.60 ± 0.01</td><td>1.44941 ± 0.00042</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Monocouche lipidique (V)</td><td>2.30 ± 0.43</td><td>1.41931 ± 0.00033</td></tr></table>

A partir des valeurs théoriques obtenues, nous avons confirmé que la couche obtenue à l'état IV après interaction avec le mono-RL est une bicouche lipidique contenant à la fois des lipides HSPC et DSPC-PEG biotinylés et que l'injection de Triton X-100 (1 %) sur la couche IV a laissé une monocouche lipidique sur la streptavidine qui correspond aux lipides biotinylés (DSPE-PEG) (état V). La Figure 13 illustre les différents états de la couche de phospholipides sous l'action de solutions de mono-RL à différentes concentrations et de Triton X-100 (1 %).

<figure><img src="image_57.png" /><figcaption>**Figure 13.** Schéma des changements morphologiques de la couche de liposome associés aux décalages angulaires du pic SPR après des injections de mono-RL et de Triton X-100 (1%) sur la couche de liposomes</figcaption></figure>

Par la suite, en utilisant les résultats théoriques du Tableau 2 et la formule de Feijter dans l'équation 1 (qui est l'équation 12 dans le chapitre 2), nous avons pu estimer les densités de
masse surfacique de lipides greffés sur la puce d'or après interaction des liposomes avec le mono-RL et le Triton X-100 (1%).

$$ \Gamma = \frac{d_L \times (n_L - n_b)}{dn/dc} \quad (\text{Equation 1}) $$

Dans l'équation 1, $d_L$, $n_L$ sont respectivement l'épaisseur et l'indice de réfraction de la couche correspondante L, $n_b$ est l'indice de réfraction de la solution de NaCl à chaque longueur d'onde, et $dn/dc$ est l'incrément d'indice de réfraction de la dispersion des liposomes. Une valeur de $dn/dc$ de ~0,134 cm³ g⁻¹ a été déterminée expérimentalement à partir de la pente de la variation linéaire de l'indice de réfraction en fonction de la concentration en liposomes (C₁).

Les densités de masse de lipides à la surface ont ainsi été calculées. Les valeurs obtenues ont été $\Gamma$(III) ~ 1226 ng cm⁻² pour la couche de liposomes immobilisés, puis $\Gamma$(IV) ~ 490 ng cm⁻² pour la bicouche lipidique et enfin $\Gamma$(V) ~ 150 ng cm⁻² pour la quantité de lipides restant sur la couche de streptavidine. La densité de masse surfacique des lipides calculée pour l'état III correspond à une monocouche de liposomes telle que décrite dans la littérature (densité de masse surfacique $\Gamma$ = 1557,64 ng cm⁻² pour des liposomes de 86,63 nm de diamètre) [20]. Ces résultats nous ont permis de confirmer que nous avons initialement développé une couche dense de liposomes à la surface de la streptavidine et que l'interaction avec le mono-RL entraine une perte de masse. La densité de lipides observée à l'état IV doit correspondre à une bicouche lipidique unique, car la masse calculée est comparable aux valeurs précédemment obtenues dans la littérature [21, 22].

## VI. Publication
# Surface Plasmon Resonance Monitoring of Mono-Rhamnolipid Interaction with Phospholipid-Based Liposomes

Meryem Belkilani, Maryam Shokouhi, Carole Farre, Yves Chevalier, Sylvain Minot, François Bessueille, Adnane Abdelghani, Nicole Jaffrezic-Renault, and Carole Chaix*

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Cite This: *Langmuir* 2021, 37, 7975–7985

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## ACCESS

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Metrics & More

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Supporting Information

**ABSTRACT:** The interactions of mono-rhamnolipids (mono-RLs) with model membranes were investigated through a biomimetic approach using phospholipid-based liposomes immobilized on a gold substrate and also by the multiparametric surface plasmon resonance (MP-SPR) technique. Biotinylated liposomes were bound onto an SPR gold chip surface coated with a streptavidin layer. The resulting MP-SPR signal proved the efficient binding of the liposomes. The thickness of the liposome layer calculated by modeling the MP-SPR signal was about 80 nm, which matched the average diameter of the liposomes. The mono-RL binding to the film of the phospholipid liposomes was monitored by SPR and the morphological changes of the liposome layer were assessed by modeling the SPR signal. We demonstrated the capacity of the MP-SPR technique to characterize the different steps of the liposome architecture evolution, i.e., from a monolayer of phospholipid liposomes to a single phospholipid bilayer induced by the interaction with mono-RLs. Further washing treatment with Triton X-100 detergent left a monolayer of phospholipid on the surface. As a possible practical application, our method based on a biomimetic membrane coupled to an SPR measurement proved to be a robust and sensitive analytical tool for the detection of mono-RLs with a limit of detection of 2 µg mL⁻¹.

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## INTRODUCTION

Rhamnolipids are secondary metabolites naturally produced by the bacteria *Pseudomonas aeruginosa*, with biosurfactant properties. They belong to the group of surface-active glycolipids and consist of a glycone part composed of one or two rhamnose moieties connected via an α-1,2-glycosidic linkage and a glycone part consisting of two alkyl chains. They are produced as a mixture of mainly α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate and 2-O-α-L-rhamnopyranosyl-α-L-rhamnopyranosyl-β-hydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate called mono- and di-rhamnolipid, respectively. These two compounds are the dominant components in the naturally produced mixture. They constitute the virulence factor of *P. aeruginosa* and they cause chronic respiratory infections in cystic fibrosis patients and immunocompromised individuals. It has been shown on in vitro-reconstituted human respiratory epithelium that incorporating rhamnolipids in a host cell membrane decreases transepithelial resistance for concentrations higher than 50 µg mL⁻¹. Rhamnolipids are incorporated within the apical membranes of epithelial cells and later within their basolateral membranes. The permeability of epithelia to bacteria is then increased. As biosurfactants, rhamnolipids are used in detergents, food, and cosmetic

products, as these compounds have low toxicity and a weak ecological impact.²

Because of complexity due to the numerous biological activities of rhamnolipids, interactions of rhamnolipids with cell membranes still deserve detailed investigations. Biomimetic membrane models facilitate the understanding of complex biological membrane behaviors. Those composed of lecithins, the main phospholipids of many living cells, are structured as bilayers that may be dispersed in water as liposomes or vesicles. These types of vesicles, encapsulating redox or fluorescent probes, have been used for the detection of various microorganisms through their metabolites.³,⁴ Calorimetric studies have shown that di-RLs bind to mono-unsaturated phospholipid 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) vesicles, rupture the bilayers, and cause leakage from the inner aqueous medium at RL/lipid ratios higher than one, this effect is reduced in the presence of

Received: March 26, 2021

Revised: June 16, 2021

Published: June 25, 2021

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cholesterol.⁵ An FTIR study showed a direct interaction between the phosphate groups of 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PLPC) and the polar heads of rhamnolipids, which then altered the organization of polar headgroups of the phospholipids. These interactions were confirmed by molecular dynamics simulations of these membrane models in the presence of rhamnolipids.⁶ Owing to their two rhamnose units in their polar headgroup, di-RLs are more hydrophilic surfactants than mono-RLs.⁷ Thus, di-RLs self-assemble as small micelles, which grow as the concentration increases. Conversely, the less hydrophilic mono-RLs form large micelles and vesicles in aqueous solution. On this basis, mono-RLs are more prone to mix with phospholipids and be incorporated into liposome bilayers.

Surface plasmon resonance (SPR) is a suitable label-free technique for the study of interactions between species bound to the SPR chip surface and their partners in solution. The Kretschmann configuration enables measurements avoiding interference from the surrounding liquid medium because incident light does not pass through this medium. Moreover, SPR measurements performed with two different wavelengths of incident light allow a unique pair of values of the thickness and refractive index of the films deposited on the gold surface to be determined.⁸,⁹

In the past few years, a number of studies have investigated the deposition of either planar mono- or bilipidic layers or liposomes on gold substrates by SPR.¹⁰⁻¹⁷ These membrane biomimicking systems have been applied to the study of the interactions with different molecules such as catechol,¹⁸ drugs,¹⁹ peptides,²⁰,²¹ proteins,²²⁻²⁴ or toxins.²⁵ To our knowledge, the SPR technique has not been used so far for studying the interactions of RLs with phospholipid layers or liposomes. The objective of this work was to assess the mechanism of interaction of RLs with a biomimetic membrane formed by a monolayer of liposomes. First, the immobilization of phosphatidylcholine-based liposomes on functionalized gold SPR chips was monitored. The thickness and refractive index of the different layers were deduced by modeling the SPR signals at two wavelengths. Then, RL solutions of different concentrations were flowed on the liposome layer and SPR signals (sensorgrams) were recorded. A solution rich in mono-RLs was preferred for this study because mono-RLs are presumed to bind more strongly to phospholipid bilayers than di-RLs.⁷,²⁶ A RL mixture rich in mono-RLs may destructure phospholipid liposomes with better efficacy. The change of the morphology of the liposome layer was then described, based on modeling of the SPR signal.

## MATERIALS AND METHODS

**Chemicals.** Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC) was purchased from Lipoid company, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG), cholesterol (99%), 11-mercaptoundecanoic acid (MUA), 11-amino-1-undecanethiol hydrochloride, 1-dodecanethiol, streptavidin, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), ethanolamine, mono-rhamnolipid (mono-RL) R95Md (95% pure rhamnolipids, mono-rhamnolipid dominant) produced by AGAE Technologies LLC (USA), Triton X-100, and NaCl were provided by Sigma-Aldrich. Chloroform (99.8%) was bought from Fisher Chemical. Diethyl ether was purchased from Carlo Erba. Methanol was ordered from VWR company. 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid (MES) was purchased from Dominique Dutcher company. Ultrapure water was obtained using a Milli-Q system (resistivity 18.2 MΩ cm).

**Preparation of Biotinylated Liposomes.** Biotinylated liposomes were prepared for immediate use according to the “thin layer rehydration” technique and a slightly modified protocol from that developed by Zhao et al.²⁷ HSPC, DSPE-PEG, and cholesterol (610.8, 9.8, and 200 mg, respectively) were dissolved in 75 mL of a mixed organic solvent: chloroform, diethyl ether, and methanol (5.75:5.75:1 V/V). Biotinylated phospholipids represent 1.5% (W/ W) of the total phospholipids used in this protocol. Organic solvents were then evaporated under a vacuum of -0.05 MPa in a water bath at 50 °C for 3 h using a rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-114 with Heating Waterbath B-480 and Glassware-Acomertial). The thin transparent layer in the round-bottom flask was hydrated with water at 60 °C by rotating the container for 1 h, until the thin layer was completely dispersed in water and a milky suspension solution was obtained. In order to obtain a homogeneous mixture and to reduce the average size of the liposomes, the solution was sonicated for 20 min with a UP400S - Powerful Sonication of Larger Samples (Hielscher Ultrasound Technology company) at 60 kHz in an ice bath. The liposome solution was stored at room temperature until further use.

**Physicochemical Characterization of Liposomes.** Hydrodynamic diameter measurements were performed at 25 °C by Dynamic Light Scattering (DLS) with a Zetasizer NanoZS instrument (Malvern Panalytical, Palaiseau, France) operating in a backscatter mode at an angle of 173°. A disposable polystyrene cuvette was filled with 3 mL of a diluted liposome suspension (1:10) in a 0.15 M NaCl, solution and measurements in triplicate were started after an equilibration time of 60 s. Results are based on intensity distribution calculation; they are given as an average hydrodynamic diameter ± standard deviation (SD) with a polydispersity index (PdI).

The surface charge of the liposomes was determined by ζ-potential measurements using a NanoZS Zetasizer instrument (Malvern Panalytical). The measurements were carried out in folded capillary cells DTS 1070 (Malvern Instruments), which were filled with 800 µL of a diluted liposome suspension (1:10) in 0.15 M NaCl solution and equilibrated at 25 °C for 60 s.

The refractive index of the prepared liposome suspensions was determined using an PAL-1 ATAGO refractometer.

Cryo-TEM observations were performed on diluted dispersions of purified liposomes. A drop of dispersion was cast onto a 300 mesh holey carbon film (Quantifoil R2/1) and quench-frozen in liquid ethane using a cryoplunge workstation (LPS, University of Paris-Saclay, France). The specimens were then mounted on a precooled Gatan 626 sample holder, transferred into a microscope (Phillips CM120) and observed at an accelerating voltage of 120 kV.

**Functionalization Procedure of the SPR Gold Chips.** SPR gold chips were obtained from BioNavis (BioNavis Ltd., Ylöjärvi, Finland). They were typically 20 mm long, 12 mm wide, and 0.55 mm thick, consisting of a (~50 nm) Au layer on a (~3 nm) Cr adhesive layer on a glass slide that has a refractive index of 1.52020 and 1.51620 at 670 and 785 nm, respectively. The gold surface roughness was 1.53 nm. It was measured by atomic force Microscopy (AFM) operating in a tapping mode (Agilent M5500 Picoplus, Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) and corresponds to the root mean square roughness (RMS) for an image of 2.5 × 2.5 µm in size.

The SPR gold chips were used as substrates after the following procedures:

* Any potential contaminants were removed by microwave-induced plasma generated by a microwave plasma reactor (UHP-MW-PC, Diener electronic company, Stuttgard, Germany). The operating pressure was generated by a dry-vacuum pump. We used two successive steps for plasma treatment. The first step was cleaning using dioxygen at a pressure of 0.7 mbar for 3 min with a power of 180 W dm³. To ensure the grafting of the thiols onto the metallic surface by avoiding the potential risk of oxidation, the second step was a reducing plasma treatment. We achieved this second step using dihydrogen at a pressure of 1 mbar for 5 min with a power of 126 W dm³.
Then, the slides were sonicated for 5 min in acetone and next in ultrapure water.

* To form a dense self-assembled monolayer (SAM) on the gold surface, the Au substrates were dried under a nitrogen flow and immediately immersed in a 1 mM ethanolic solution of MUA (acidic SAM) or of 11-amino-1-undecanethiol hydrochloride (amino SAM) or of 1-dodecanethiol (alkyl SAM) for a minimum duration of 20 h at 4 °C. The chips were then rinsed with ethanol and dried under a gentle nitrogen flow. SPR gold chips functionalized with different SAMs were preserved in an ultrapure water bath and used directly for liposome immobilization.

* To develop the streptavidine SPR chip, the gold surface was cleaned by plasma treatment as described above and immersed in an ethanolic solution of MUA (1 mM) for 20 h at 4 °C.²⁸ Then, the chip was rinsed with ethanol and dried under a gentle flow of nitrogen. The MUA SPR gold chip was incubated in 100 µL of a mixture of 0.2 M EDC and 0.05 M NHS in MES buffer (5 mM MES, pH 5) for 2 h at room temperature. The activated surfaces were washed in 1 mL of MES buffer and then incubated in 100 µL of streptavidin solution (1 mg mL⁻¹) in PBS buffer (0.1 M NaH₂PO₄, 0.1 M Na₂HPO₄, 0.15 M NaCl, pH 7) for 12 h at room temperature. Afterward, SPR chip surfaces were rinsed with 1 mL of MES buffer, incubated in 2 mL of 10 mM ethanolamine aqueous solution for 10 min to block the residual activated acid functions and remove all the physisorbed streptavidin, and rinsed again in 1 mL of MES buffer. All functionalization steps were monitored by SPR under a 0.15 M NaCl solution flow.

### Multiparametric Surface Plasmon Resonance (MP-SPR).

Dual wavelength SPR measurements were performed with a MP-SPR Navi 200 OTSO (BioNavis Ltd., Ylöjärvi, Finland) instrument at ambient temperature. The setup was equipped with a two laser source excitation providing 670 and 785 nm incident wavelengths and two independent flow channels, inlet tubing and an outlet for waste tubing. The measurements in both flow channels were carried out in parallel with the incident lights of 670 and 785 nm. The intensity of the reflected light was measured at a resonant angle between 40 and 78°.

During the SPR measurements on the gold chips functionalized with amino SAM, alkyl SAM, acidic SAM, and streptavidin, a continuous flow (50 µL min⁻¹) of a 0.15 M NaCl solution was first injected for approximately 10 min until the SPR sensorgram signal was stabilized. After stabilization of the signal intensity, different concentrations of liposomes (1 × 10¹¹−5 × 10¹² liposomes mL⁻¹) in a 0.15 M NaCl solution were injected onto the SPR gold chips in both flow channels for 4 min at a flow rate of 50 µL min⁻¹, in order to evaluate which type of functionalization ensures a dense layer of liposomes.

### Liposome–Rhamnolipid Interaction Analysis.
An MP-SPR measuring instrument was used for monitoring interactions between mono-RLs and liposomes. The mono-RL solutions were prepared in 0.15 M NaCl, in a range of concentrations from 2 to 100 µg mL⁻¹ and then injected onto the liposome layer; 2, 5, 10, and 20 µg mL⁻¹ mono-RL solutions were injected at a flow rate of 12 µL min⁻¹ for 15 min, while the concentrations of 50, 80, and 100 µg mL⁻¹ were injected at a flow rate of 50 µL min⁻¹ for 4 min. Each injection was followed by a 4 min washing step with 0.15 M NaCl solution at 50 µL min⁻¹ until the signal was stabilized. This protocol provided an optimal variation of the SPR signal during the sensorgram. Finally, 1 mL of Triton X-100 (1%) in a 0.15 M NaCl solution was injected into both channels for 4 min. Each experimental procedure was reproduced twice.

### MP-SPR Biophysical Analysis.
The theoretical simulation of the multilayer system and the determination of the optical parameters of the different layers were performed by SPR Navi LayerSolver v. 1.2.1 (BioNavis Ltd., Ylöjärvi, Finland) software, which is supplied as associated software with the MP-SPR instrument. LayerSolver software uses the well-known Fresnel equation formalism for

calculations.²⁹,³⁰ The multilayer calculation method is based on a numerical layer-by-layer iteration and allows for multiple SPR spectra processing and a stepwise approach for calculations. A theoretical description for the resonance condition can be obtained by solving Maxwell's equations for a multilayer optical system.²⁹ Software was used to simultaneously determine the thickness and refractive index giving the best fit of the theoretical calculation to the full SPR angular spectra measured at both laser wavelengths at the same time and at the same point.⁸,²⁹ The two-wavelength method combined with angular scanning over a wide range of incidence angles has proven to be particularly efficient to retrieve the layer thickness and refractive index values of the thin biomolecular layers.⁹,³¹,³²

The schematic representation of the multilayer system is presented in Figure 1. Layers 0 to 4 of the SPR gold chip are the glass substrate,

<figure><img src="image_65.png" /><figcaption>Figure 1. Schematic representation of the multilayer system of the SPR gold chip.</figcaption></figure>

the chromium-gold layer, the SAM, the streptavidin layer, and the liposome layer, respectively. It is worth noting that the MP-SPR Fresnel's reflection coefficient is based on an independent layer model structure. Each layer is characterized by its thickness (d) and its complex refractive index (n)³³ calculated with eq 1:

$$ \tilde{n} = n + ik \quad (1) $$

where n is the real part of the complex refractive index that corresponds to the refraction of light and k is the imaginary part corresponding to the extinction or absorption of light by the material.

Since the SPR full angle spectra at both wavelengths are measured at the same location, the layer thickness should be the same for both wavelengths. The thickness values were therefore defined as global variables for both wavelengths. The complex refractive index was considered as an independent variable for the metal layer modeling (k ≠ 0) and as a linearly dependent variable between the two used wavelengths for the other organic layers that do not absorb light (k = 0). The refractive index of the layer for the second wavelength, n₂, can be calculated using eq 2.³⁰

$$ n_{\lambda 2} = n_{\lambda 1} + \frac{dn}{d\lambda} \times (\lambda 2 - \lambda 1) \quad (2) $$

where n_λ is the refractive index for wavelength 1 and dn/dλ is the linear dispersion coefficient relative to wavelength change.

The optical input parameters of chromium and gold layers are taken from the MP-SPR Navi LayerSolver User Manual as follows: for the chromium adhesion layer ñ₆₇₀ = 3.52950 + i4.26830 and ñ₇₈₅ = 3.97290 + i4.18950; for the gold layer, ñ₆₇₀ = 0.17410 + i3.61230 and ñ₇₈₅ = 0.18360 + i4.58710. The other parameters were determined by fitting to the experimental data.

The changes of the thickness and refractive index at the surface of the SPR gold chips induce a shift of the SPR angular peak minimum (θSPR). Thus, based on Feijter's formula,³⁴ the surface mass density (Γ) of an adsorbed liposome layer can be calculated using eq 3, considering the SPR measured parameters of the layer.
$$ \Gamma = \frac{d_L \times (n_L - n_b)}{dn/dc} \qquad (3) $$

where $d_L$ and $n_L$ are the thickness and refractive index, respectively, of the corresponding layer $L$, $n_b$ is the refractive index of the NaCl solution at each wavelength, and $dn/dc$ is the refractive index increment of the dispersion of liposomes. An accurate determination of $dn/dc$ is necessary to precisely quantify the surface mass densities ($\Gamma$) of liposomes. $dn/dc$ was determined experimentally from the slope of the linear variation of the refractive index as a function of liposome concentrations ($C_l$). The obtained value, $dn/dc \approx 0.134 \text{ cm}^3 \text{ g}^{-1}$, is comparable to the values reported in the literature ($dn/dc_{lipid} \approx 0.135 \text{ cm}^3 \text{ g}^{-1}$).$^{35,36}$

## RESULTS AND DISCUSSION

**Biotinylated Liposome Characterization.** The liposomes were characterized with respect to their size and surface charge. The hydrodynamic diameter of liposomes determined by DLS (Table 1) was around 76 nm, with a

<table><caption>Table 1. Properties of the Biotinylated Liposomes; the Hydrodynamic Diameter and Zeta Potential Are Given as Mean Values $\pm$ SD of Three Independent Measurements</caption><thead><tr><th>diameter (nm)</th><th>PdI<sup>a</sup></th><th>zeta potential (mV)</th><th>C<sub>p</sub><sup>b</sup> (mmol L<sup>-1</sup>)</th><th>C<sub>1</sub><sup>c</sup> (lipo mL<sup>-1</sup>)</th><th>RI<sup>d</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>76 ± 7.5</td><td>0.16</td><td>-10.8 ± 0.6</td><td>30</td><td>2.5 × 10<sup>14</sup></td><td>1.34</td></tr></tbody></table>

<sup>a</sup>Polydispersity index. <sup>b</sup>Concentration of phospholipids. <sup>c</sup>Concentration of liposomes. <sup>d</sup>Refractive index.

polydispersity index (PdI) of 0.16. It can be noted that the liposome size was less than half of both wavelengths of the MP-SPR device so that the evanescent wave could penetrate the full liposome layer. In addition, the surface potential of the liposomes was measured on the basis of their electrophoretic mobility. The zeta potential value was approximately -10.8 mV. The negative surface of the liposomes, due to the phosphate groups of the phospholipids, induces an electrostatic repulsion between them, preventing their aggregation and providing high colloidal stability. Several measurements of these parameters over time confirmed the stability of the liposome suspensions over a period of 6 months. Furthermore, the liposome suspension was carefully controlled before each SPR experiment.

The liposome concentration $C_l$ is obtained by dividing the total number of liposomes $N_{lipo}$ (calculated according to eq S1 in the Supporting Information) by the volume of the suspension ($V = 25$ mL), resulting in $2.5 \times 10^{14}$ lipo mL$^{-1}$.

Cryo-TEM observation confirmed the size of the synthesized liposomes. As shown in Figure 2a, the liposomes appeared as perfectly spherical and unilamellar nanovesicles. Figure 2b presents the size distribution of liposomes, estimated with ImageJ software. The mean diameter of the liposomes was 69 nm with a SD of 10 nm.

A satisfactory agreement is noticed between the two size distributions derived from TEM image analysis and DLS measurements. The measurement of the hydrodynamic diameter of liposomes by DLS in solution takes into account a layer of hydration around the liposomes, which leads to a difference of around 10% with the diameter measured by Cryo-TEM.

**SPR Monitoring of Liposome Immobilization on Modified Surfaces.** A comparative study of the interaction of biotinylated liposomes with several SAM-functionalized gold

SPR chips was performed so as to select a SAM binding a dense layer of immobilized liposomes. For this purpose, the gold surface underwent different functionalizations. After thorough cleaning of the gold SPR chip, SAMs of long-chain alkanethiols with varying terminal groups (–COOH, –NH₂, and –CH₃) were formed on gold chips after 20 h reaction. A fourth gold chip was functionalized by a streptavidin layer by a two-step protocol: A closely packed MUA layer was first elaborated on the gold surface. Then, the acidic function was activated using EDC/NHS chemistry in order to covalently graft the streptavidin to the SPR chip surface.

During the measurement and to ensure the accuracy of the changes in the measured optical parameters, a calibration step of the SPR device with 0.15 M NaCl solution was made. Next, biotinylated liposome dispersions at concentrations between $1 \times 10^{11}$ and $5 \times 10^{12}$ lipo mL$^{-1}$ were injected and flowed at 50 µL min$^{-1}$ for an interaction time of 4 min with the functionalized chips. This was followed by a 4 min washing step in 0.15 M NaCl to remove unbound liposomes. The variation in the $\theta_{SPR}$ position ensuing from the variation of the refractive index as a function of different liposome concentrations ($C_l$) was compared for the four different functionalized surfaces (Figure 3).

After calibration of the device, the SPR measurement of the functionalized gold surface was performed before the injection of the liposomes. Streptavidin deposition on the MUA layer resulted in a 0.4° variation of the $\theta_{SPR}$, whereas the deposition of the different SAMs on gold led to a signal variation of approximately 0.2°. As shown in Figure 3, liposomes bound strongly to the streptavidin-functionalized surface, resulting in a $\theta_{SPR}$ increase of 1.7° under injection of $5 \times 10^{12}$ lipo mL$^{-1}$. By modifying the gold surface with an amino-terminated layer,

<figure><img src="image_66.png" /><figcaption>Figure 2. (a) TEM image and (b) diameter histogram of a diluted dispersion of biotinylated liposomes.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_67.png" /><figcaption>**Figure 3.** Angular shifts of the resonance peak (Δθ<sub>SPR</sub>) in SPR measurements at 670 nm versus liposome solution injection at different concentrations (C<sub>1</sub>). The interactions of biotinylated liposome solutions were studied on –COOH (11-mercaptoundecanoic acid), –NH<sub>2</sub> (11-amino-1-undecanethiol), –CH<sub>3</sub> (1-dodecanethiol), and streptavidin-modified SPR gold surfaces.</figcaption></figure>

the angular shift was substantial (0.86°) but remained weak compared to the one obtained during the liposome binding on the streptavidin chip. The binding interaction on the amino-terminated layer was mainly driven by electrostatic interaction. In the case of the MUA layer, a low angular shift of 0.48° was obtained, which reflected a clear blocking effect due to electrostatic repulsion. However, this binding was even stronger than for the hydrophobic SAM (1-dodecanethiol), which prevented hydrophilic liposomes from binding, resulting in a small angle variation (0.2°). Thus, the order of the angle variation Δθ following the liposome immobilization on SAM surfaces was as follows: Δθ<sub>NH2 surface</sub> > Δθ<sub>COOH surface</sub> > Δθ<sub>CH3 surface</sub>. These results are in good agreement with experimental results reported by Fenzl et al.<sup>15</sup> for the interaction of negatively charged liposomes (DPPC/DPPG/cholesterol liposomes with a zeta potential of –34 mV and DPPC/DPPG/N-glutaryl DPPE/cholesterol with a zeta potential of –47 mV) with varying charge and hydrophilicity surfaces. They noted the same order of variation for refractive index values, i.e., Δn<sub>NH2 surface</sub> > Δn<sub>COOH surface</sub> > Δn<sub>CH3 surface</sub> when injecting a 453 pM (~2.5 × 10<sup>12</sup> lipo mL<sup>−1</sup>) concentration of liposomes on gold surfaces modified by 11-mercaptoundecyl amine hydrochloride, MUA, and 1-mercaptoundecane SAMs. In our case, the liposome surface was less anionic and had PEG moieties that can play a role in the interactions. We assume that the attractive interaction between the anionic liposomes and the cationic amino surface was not sufficiently effective to obtain a homogeneous layer of liposomes compared with the streptavine-functionalized gold substrate.

The efficiency of washing with Triton X-100 detergent was assessed at this stage. After immobilization of liposomes and signal stabilization in NaCl solution, Triton X-100 (1%) was injected on the surface of each SPR chip leading to phospholipid release. Thus, the success of liposome binding to the streptavidin-functionalized surface was indirectly demonstrated by the Triton treatment. As expected, a significant drop in the SPR signal down to the baseline was observed for the liposomes immobilized on SAM-function-

alized surfaces after the injection of Triton X-100, whatever the quantity of immobilized liposomes (see Figure S1 in the Supporting Information). Further details on the calculation of residual liposome masses after Triton treatment will be discussed later in the text. The streptavidin-modified SPR gold surface was preferred for liposome coating, on the basis of its strong affinity<sup>37</sup> leading to efficient loading and good layer stability.

**SPR Gold Chip Layers: Formation and Modeling.**
Figure 4a shows the time-resolved sensorgram obtained after

<figure><img src="image_68.png" /><figcaption>**Figure 4.** (a) SPR sensorgram of the immobilization of 1 × 10<sup>14</sup> lipo mL<sup>−1</sup> liposomes on a streptavidin-functionalized SPR chip, with the light source at 670 nm. (b) SPR full angle scans of the SPR gold chip at the different steps of functionalization: gold layer (yellow line), MUA layer (red line), streptavidin layer (green line), and liposome layer (blue line), with corresponding fits (dashed lines) from LayerSolver modeling of individual SPR chip layers using the full SPR angular spectra measured at a 670 nm wavelength. Roman numerals (I and II) show the correspondence of events in the sensorgram (a) and the SPR angle scans (b).</figcaption></figure>

saturation by 1 × 10<sup>14</sup> lipo mL<sup>−1</sup> of biotinylated liposomes on the streptavidin layer. The variation of θ<sub>SPR</sub> reached about 1.7° and this value remained constant during the washing step with 0.15 M NaCl solution. This value obtained in a single injection is the same as that following cumulative injections of increasing concentrations of liposomes up to 5 × 10<sup>12</sup> lipo mL<sup>−1</sup> as presented in Figure 3. Both experiments show the saturation of the SPR gold surface at this coverage.

**Figure 4b** (light source at 670 nm) and **Figure S2** (light source at 785 nm, see *Supporting Information*) present the SPR full angle scans recorded from 55 to 77° and 60 to 72°, respectively. The angular shift of the SPR confirmed the success of the successive functionalizations of the gold surface. Indeed, the θ<sub>SPR</sub> recorded for the metal (yellow trace, θ<sub>1</sub> = 68.63°) shifted to the right when the MUA layer was deposited on the surface (red trace, θ<sub>2</sub> = 68.89°), and the SPR peak subsequently moved farther to the right when streptavidin was adsorbed (green trace, θ<sub>3</sub> = 69.41°). Interestingly, the SPR peak recorded after liposome immobilization on streptavidin
was the largest of all (blue trace, $\theta_4 = 71.4^\circ$). In addition, we noted the absence of any peak in the vicinity of the total internal reflection (TIR) angle where a second peak is likely to appear when the thickness of the liposome layer exceeds the penetration depth of the evanescent SPR field. Indeed, it was reported in the literature that this exotic optical behavior of the full SPR angular spectrum was due to the formation of a waveguide on the SPR gold chip.³⁸

To confirm the formation of the layers and quantify the adsorption, a dual wavelength analysis for the determination of thicknesses (d) and refractive indexes ($\tilde{n}$) was performed with the layer resolution software LayerSolver. These parameters were independently calculated after several measurements and obtained when the upper and lower limits of the layer thicknesses and refractive indexes were fixed. The d and $\tilde{n}$ values were calculated using a consistent set of initial values throughout the modeling in order to evaluate the dynamic behavior of the modeled systems and the sensitivity of the differential equations to the initial conditions provided as inputs to LayerSolver. The parameters (d and n) coming from the liposome layer modeling as well as the other layers are reported in Table 2. The results for each individual measurement are shown in Table S1 (Supporting Information).

<table><caption>**Table 2. Thickness (d) and Refractive Index (n) of the Different Layers of the SPR Chip, Obtained by SPR LayerSolver Simulation<sup>a</sup>**</caption><thead><tr><th>layer</th><th>d (nm)</th><th>n<sub>670</sub></th><th>n<sub>785</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>glass</td><td>infinite (starting layer)</td><td>n = 1.52020</td><td>n = 1.51620</td></tr><tr><td>chromium</td><td>1.6 ± 0.06</td><td>n = 3.51127 ± 0.02050</td><td>n = 4.04615 ± 0.17135</td></tr><tr><td>gold</td><td>54.98 ± 0.02</td><td>n = 0.19612 ± 0.00016</td><td>n = 0.19548 ± 0.00477</td></tr><tr><td>thiol MUA</td><td>1.50 ± 0.08</td><td>n = 1.43897 ± 0.01385</td><td>n = 1.42702 ± 0.01378</td></tr><tr><td>streptavidin</td><td>2.71 ± 0.31</td><td>n = 1.41646 ± 0.01102</td><td>n = 1.41416 ± 0.01102</td></tr><tr><td>liposome</td><td>79.61 ± 6.74</td><td>n = 1.35270 ± 0.00122</td><td>n = 1.35102 ± 0.00126</td></tr><tr><td>NaCl solution</td><td>infinite (ending layer)</td><td>n = 1.33216</td><td>n = 1.32966</td></tr></tbody></table>

All simulations were performed with an electrolyte solution of 0.15 M NaCl and under the excitation of incident light at 670 and 785 nm. The simulation started with the determination of the optimized optical properties for the chromium adhesion layer “Cr” and the gold layer “Au” by modeling a full SPR angle spectrum of a cleaned SPR gold chip. Then, the optical properties of the SPR chip were maintained as fixed and used as the starting point to determine the optical properties of the different deposited layers.

For the determination of the MUA layer parameters, the Fresnel equations for a system of five layers (prism (glass)/Cr/Au/MUA films/NaCl) were used. MUA forms, on average, a thin layer on the surface of the SPR gold chip, with a thickness of 1.5 nm and a refractive index of 1.44 at 670 nm. These results are in good agreement with the numerical analysis results of Damos et al. who calculated a film thickness of about 1.55 nm with a dielectric constant of $\epsilon = n^2 = 2.1$ at 670 nm for the adsorption of MUA on the gold surface.³⁹ Adding the

parameters found for the MUA layer to the calculating system, a thickness of 2.7 nm was determined for the streptavidin layer (spectrum I) with a refractive index of 1.42 at 670 nm. Our theoretical simulation reproduced well the modeling results reported by Schmidt et al.⁴⁰ and Dolci et al.⁴¹ for a streptavidin layer. They measured 2.8 and 3 nm thicknesses together with 1.45 and 1.5 refractive indexes, respectively.

The SPR spectrum (II, Figure 4b) taken after signal stabilization corresponds to the liposome layer. Liposomes immobilized on the streptavidin-functionalized chip form a layer of about 80 nm average thickness. The calculated refractive indexes at both wavelengths were $n_{670} = 1.35270$ and $n_{785} = 1.35102$. The layer thickness corresponded to the liposome diameter measured by DLS and TEM and further adsorption did not occur when the liposome concentration in the solution was increased again. This strongly suggests that liposomes adsorb as a monolayer. The difference of the theoretical thickness value compared to the hydrodynamic diameter measured in bulk can be attributed to morphological changes in the liposome shape due to the interactions with the functionalized gold chip surface and to the shear stress due to the buffer flow.

The liposome addition induced a shift of the SPR curve toward higher incidence angles which became wider due to the increased thickness of the adsorbed layer on the surface.

In most biomolecular interaction studies, layer thicknesses are lower than the penetration depth of the evanescent field. This is so in the present case; the evanescent wave of the SPR can penetrate the whole liposome layer adsorbed on the SPR chip surface because the liposome average diameter is less than half that of the wavelengths (670 and 785 nm) of the MP-SPR device.¹⁴,³³ The adsorption as a dense monolayer of liposomes is clearly demonstrated since the full angular SPR spectrum was predicted by modeling and the conditions for the validity of the optical model were satisfied.

In general, the SPR curve produced by MP-SPR provides averaged information from the entire SPR chip surface. There are factors that can influence the thicknesses and refractive indexes of the layers such as gaps in the layers, inhomogeneous coverage, or multilayer formation.⁴² In our case, the small difference of theoretical thickness and refractive index of the different layers in comparison with the calculated values can be related to the gold surface roughness or defect area of grafted biomolecules.

**Mono-Rhamnolipid Interactions with Immobilized Biotinylated Liposomes.** The MP-SPR technique allows direct measurement of interactions in real time and without labeling. Figure 5 shows the full sensorgram for successive injections of mono-RLs at different concentrations. First, the injection of $1 \times 10^{14}$ lipo mL$^{-1}$ of liposomes on the streptavidin layer yielded a +1.58° variation of the $\theta_{SPR}$. After stabilization of the signal in 0.15 M NaCl, state III of the sensorgram corresponded to the liposome-functionalized SPR chip. Then, the injection of different concentrations of mono-RLs caused definite variations of the SPR signal, showing that RLs interacted with the liposome layer, as described in the literature.²⁶,⁴³,⁴⁴ A progressive destabilization of the liposome layer was observed upon successive injections of mono-RLs. The $\theta_{SPR}$ decreased and then stabilized when the lipid layer reached a second state (state IV). At the end of the experiment, a final state of the surface was reached upon the injection of Triton X-100 (1%) followed by stabilization under the electrolyte flow (state V). The signal variation as a function

<footnote><sup>a</sup>The calculated values represent the average (± SD) of three independently repeated measurements.</footnote>
<figure><img src="image_69.png" /><figcaption>**Figure 5.** Sensorgram of the SPR angle versus time, measured at a wavelength of 670 nm, during the interaction of mono-RLs with liposomes.</figcaption></figure>

<figure><img src="image_70.png" /><figcaption>**Figure 6.** Sketches of the morphology changes of the liposome layer associated with the angular shifts of the SPR resonance peak following injections of mono-RLs and Triton X-100 (1%) onto the liposome layer.</figcaption></figure>

of the RL concentration was reproducible from one experiment to another as is shown in the two sensorgrams presented in Figure 5 and Figure S3 (see Supporting Information). Figure S4 (see Supporting Information) exhibits the corresponding full angle SPR scans and calculated fits from LayerSolver modeling associated with the III, IV, and V states, respectively.

Considering the sensorgram presented in Figure 5, it is worth noting that the mono-RLs were immediately captured by the lipid layer of the liposomes and the signal variation resulted from the change in thickness and/or refractive index of the layer after adsorption. The variations of the SPR signal revealed different phenomena on the liposome layer depending on the concentration of mono-RLs. We can differentiate three domains for which the interactions of mono-RLs with the model membrane seem to follow different mechanisms. From

2 to 20 µg mL⁻¹ mono-RLs, the sensorgram showed a progressive decrease in the SPR signal upon injection. We believe that RLs intercalate in the phospholipid layer without destructuring the liposomes. This interaction probably follows an equilibrium between free RLs in solution and molecules integrated into the lipid bilayer. This leads to a drop in the SPR signal related to the concentration of RLs. Then, the SPR signal significantly dropped upon 50 µg mL⁻¹ mono-RL injection. A structural change in the liposome layer was hypothesized at this concentration. The 50 µg mL⁻¹ concentration is close to the critical micellar concentration (CMC) for mono-RLs, as the value reported in the literature is 56.3 µg mL⁻¹ (~110 µM).⁴⁵⁻⁴⁷ At 50 µg mL⁻¹ concentration, the mono-RLs plunged into the double lipid layer of liposomes, thereby destabilizing their structure as closed
bilayers. Opening the liposomes obviously should cause the formation of an adsorbed bilayer at the surface of the chip. The excess of phospholipids was presumably washed off by the mono-RL solution by means of solubilization inside the micelles. This phenomenon was irreversible. Then, the injections of higher concentrations of mono-RLs (80 and 100 µg mL⁻¹) produced another different behavior. A drop in the angular shift of the SPR peak was observed followed by a rise of the signal back to the original value when switching to NaCl solution. A reversible adsorption of mono-RLs onto the phospholipid bilayer was taking place, even after injection of the last concentration (50 µg mL⁻¹). This phenomenon could be explained by the property of RLs to induce a phase dissociation and partitioning of the phospholipid bilayer, as described by Herzog et al.²⁶ These authors showed by AFM and confocal fluorescence microscopy that rhamnolipids were able to cause a phase separation of the phospholipid bilayer into liquid-ordered (lo) and liquid-disordered (ld) phases. The AFM measurement showed a thinner bilayer thickness of the ld phase compared to the lo phase. This mechanism was reversible, depending on the concentration of each constituent in the medium. Thus, in our case, the phospholipid organization as a bilayer seems to reform on the SPR chip surface when the eluting solvent changed from the mono-RL solution back to the NaCl solution, which caused the release of a large amount of mono-RLs in solution. This mechanism could explain the drop, and then the rise back up, of the signal observed during the study.

Figure 6 shows the SPR angular shifts (Δθ) with respect to the streptavidin layer following the successive injection of mono-RLs and then Triton X-100 (1%) on the SPR gold chip. It is interesting to note that when the mono-RLs bound to lipid vesicles, the SPR angular shifts (Δθ) decreased (red bars) and then dropped down further after the injection of Triton X-100 (1%) (green bar). This behavior is also shown in Figure S4 (Supporting Information) since the θ<sub>SPR</sub> corresponding to the liposome layer (state III) shifted to the left upon mono-RL action on the biomimetic surface. This phenomenon takes place when the mass or thickness of the layer changes. In our case, the shift toward the minimum SPR angles up to state IV and then state V is equivalent to a mass decrease of the molecules coating the SPR gold chip due to a high degree of lipid vesicle lysis.

Mono-RLs induce a strong destructuration of the liposomes, which requires the rupture of the vesicle membrane to form a lipid bilayer laterally connected to the surface of the gold chip. After each injection of RLs, a 4 min washing step of the SPR chip with 0.15 M NaCl is performed for signal stabilization. The average thicknesses (d) and refractive indexes (n) of layers at the three stages (III, IV, and V) indicated in Figure 5 are calculated after signal stabilization in 0.15 M NaCl (Table 3).

According to the results shown in Table 3, layer IV has a thickness around 5.6 nm, which is very thin compared to the initial liposome layer (III). This thickness calculated by modeling the SPR curve corresponds to the layer that remains attached to the SPR gold chip after the interaction with mono-RLs. This value is comparable to the theoretical thickness of a lipid bilayer containing both HSPC and DSPC-PEG lipids (~6 nm). Our results can also be compared to the data from the literature on the thickness and refractive index values calculated for lipid bilayers with various types of lipids; POPC (d = 4.976 nm, n = 1.4788), DOPC (d = 3.992 nm, n =

<table><caption>**Table 3. Thickness (d) and Refractive Index (n<sub>670</sub>) Obtained from the SPR Analysis in 0.15 M NaCl for the Liposome Layer Deposited on Streptavidin and for the Resulting Lipid Layers after Injection of Mono-RLs and Triton X-100 (1%)<sup>a</sup>**</caption><thead><tr><th>layer</th><th>d (nm)</th><th>n<sub>670</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td>liposomes (III)</td><td>79.61 ± 6.74</td><td>1.35270 ± 0.00122</td></tr><tr><td>lipid bilayer (IV)</td><td>5.60 ± 0.01</td><td>1.44941 ± 0.00042</td></tr><tr><td>lipid monolayer (V)</td><td>2.30 ± 0.43</td><td>1.41931 ± 0.00033</td></tr></tbody></table>

<sup>a</sup>The calculated values represent the average (± SD) of three independent measurements.

1.456) and DMPC (d = 4.980 nm, n = 1.4810),³⁵ and HSPC (d ~ 6 nm, n = 1.404).⁸

The injection of Triton X-100 (1%) on layer IV left a thin layer V on streptavidin whose calculated thickness was 2.3 nm. According to the literature studies,⁸,¹³,⁴⁰ this value is comparable to the thickness of a lipid monolayer. This layer corresponds to biotinylated lipids (DSPE-PEG) that remained attached to streptavidin due to the high strength of the biotin-streptavidin interaction.

Thanks to the theoretical modeling and calculation of the optical parameters of the layers, we were able to estimate the quantity of lipids grafted on the SPR gold chip after the interaction of the liposomes with mono-RLs and Triton X-100 (1%). This study was achieved in order to better understand the effect of the lytic mode of action of the mono-RLs against the lipids contained in the liposome layer immobilized on streptavidin. The surface mass densities of lipids bound to the surface of the SPR gold chip were calculated for the three layers (III, IV, and V) using eq 3 and the theoretical values obtained in Table 3. Hence, the surface mass densities of lipids were Γ(III) ~ 1226 ng cm⁻² for the immobilized liposome layer, then Γ(IV) ~ 490 ng cm⁻² for the lipid bilayer, and finally Γ(V) ~ 150 ng cm⁻² for the amount of lipids remaining on the streptavidin layer.

The surface mass density of lipids calculated for state III corresponds to a monolayer of liposomes as described in the literature (surface mass density Γ = 1557.64 ng cm⁻² for liposomes with a diameter of 86.63 nm).²³ In our case, this mass corresponds to 1.32 × 10¹⁰ liposomes per cm⁻². This value can be compared to the theoretical maximum number of spheres of 80 nm diameter deposited on a surface as the geometric prediction of a densely packed monolayer of spheres (1.8 × 10¹⁰ nanosphere cm⁻²) and calculated with eq S2. The lipid mass calculated in our case confirms that we have developed a dense layer of liposomes on the sensor surface. The slightly lower coverage rate compared to the theoretical value can be explained by the fact that deposition in the aqueous phase is strongly impacted by the hydrodynamic diameter and surface nature (negative charge and presence of biotin arms) of the lipidic vesicles.

The lipid mass observed after the interaction with mono-RLs (state IV) is expected to be a single lipid bilayer, as the calculated mass is comparable to values from previously published measurements.⁵⁶,⁴⁸

The present SPR device can be used as a sensitive biosensor for mono-RL detection because the interaction with a layer of immobilized liposomes was highly dependent on the concentration. Increasing the mono-RL concentration up to 50 µg mL⁻¹ led to a decrease in the θ<sub>SPR</sub>. Starting from the minimum angular value of the liposome layer, a Δθ<sub>c</sub> increase from 0.015 to 0.47° (absolute values) was observed after
injection of mono-RLs from 2 to 50 µg mL⁻¹, respectively. The Δθ_c shift indicates that the liposome-coated SPR chip detects mono-RLs even at low concentrations. Based on these results, we experimentally determined the mono-RL detection limit at 2 µg mL⁻¹ (~3 µM). The detection threshold was established as three times the SD of the SPR angle measurement recorded from three independent injections of NaCl 0.15 M solution (Δθ_c threshold: 0.005°). The sensitivity range of the method corresponds well to the concentrations of rhamnolipids that have been detected in the sputum of patients with acute P. aeruginosa infection (~1 to 10 µg mL⁻¹).⁴⁹ The sensorgram also shows that the SPR chip was able to respond immediately and continuously, indicating the ability of liposomes to monitor the presence of mono-RLs in real time (Figure 7).

<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>**Figure 7.** Cumulated Δθ_c (absolute values) versus different concentrations of mono-RLs onto the liposome-coated SPR chip (average values of two experiments).</figcaption></figure>

Our SPR chip showed good analytical performance in terms of sensitivity compared to previous studies describing other methods for RL detection. Indeed, the liposome-based fluorescence assay developed by Jenkins' group was able to detect certain toxins such as RLs with a limit of detection (LoD) of 10 µg mL⁻¹.⁴⁴ The fluorescence signal of the assay showed a nonlinear response versus RL concentration from 10 to 80 µg mL⁻¹ in solution. Jenkins' group also proved that RLs were detected in real samples of *P. aeruginosa* strains isolated from either chronic or acute infections.⁵⁰ This liposome-based fluorescence assay was recently validated for the detection of toxins associated with several bacteria including *P. aeruginosa*, *Staphylococcus aureus*, *Candida albicans*, *Candida auris*, and *Enterococcus faecalis* species in wound samples. A good correlation was demonstrated between the fluorescent sensor switch-on and early-stage wound infection.⁵¹ A high performance liquid chromatography coupled to a charged-aerosol detection (HPLC-CAD) method was also developed by Behrens et al. with a LoD for RLs of 1 µg mL⁻¹.⁵² One can note that the LoD reached by this highly sensitive technique is close to that of the proposed MP-SPR technique in this work. Thus, our strategy based on the use of a biomimetic membrane coupled to a measurement by SPR appears to be a robust and sensitive analytical approach for the easy detection of biosurfactants such as RLs.

## CONCLUSIONS

A biomimetic surface formed of liposomes grafted onto a gold substrate was developed for the study of interactions with biosurfactants by the MP-SPR method. First, we optimized the liposome anchoring on the SPR gold chip surface via a biotin/

streptavidin binding strategy in order to investigate their interactions with RLs. The SPR signal variation clearly illustrated the binding affinity and the formation of a very stable liposome layer on the streptavidin-functionalized surface, with high coverage. Monitoring the angular shifts proved to be reproducible from one experiment to another. We demonstrated the capacity of the MP-SPR technique to characterize the different states of the liposome architecture, i.e., from a monolayer of lipid vesicles to a single lipid bilayer induced by the interaction with mono-RLs and then a lipid monolayer resulting from Triton X-100 (1%) treatment. This assumption was proven theoretically by calculating the thickness (d) and refractive index (ñ) of our multilayer system via SPR Navi LayerSolver software. The modeling of the experimental data was successful and the small difference observed was mainly attributed to gold surface roughness. In addition, we were able to calculate the surface mass density (Γ) of the lipid layers on the SPR chip surface after the interaction of liposomes with mono-RLs and Triton X-100 (1%) successively. The MP-SPR characterization method is generic and can be adapted to any multilayer system undergoing morphological and quantitative transformations during the adsorption of biomolecules on their surfaces. This analytical tool proved its high sensitivity for the detection of RLs, with a detection limit of 2 µg mL⁻¹. Further studies are still needed to validate our method in real samples. On this point, it is important to note that although the test is probably not specific for the detection of rhamnolipids from *P. aeruginosa*, it may be of interest for the sensitive detection of bacterial toxins at the early stage of an infection. In summary, the use of MP-SPR and layer-by-layer modeling is a powerful combination to identify and quantify biomolecular layers deposited on a solid surface. This could open interesting perspectives to understand and study other mechanisms of interaction and transitions in membranes induced by biologically relevant processes such as membrane-interacting peptides or membrane-active drugs.

## ASSOCIATED CONTENT

### Supporting Information

The Supporting Information is available free of charge at https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.langmuir.1c00846.

Liposome concentration calculation (eq S1), theoretical maximum number of nanospheres deposited on a surface (eq S2), effect of Triton X-100 (1%) detergent on the SPR response (Figure S1), SPR full angle scans at the different steps of the SPR gold chip functionalization (Figure S2), compiled modeling results (Table S1), sensorgram of the mono-RL/liposome interaction (Figure S3), and measured and modeled SPR full angle scans of the liposome layer at 670 nm (Figure S4) (PDF)

## AUTHOR INFORMATION

### Corresponding Author

Carole Chaix - CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University,
Institute of Analytical Sciences, University of Lyon, F-69100
Villeurbanne, France; ● orcid.org/0000-0003-4882-2364;
Email: carole.chaix-bauvais@univ-lyon1.fr
## Authors

**Meryem Belkilani** — CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, Institute of Analytical Sciences, University of Lyon, F-69100 Villeurbanne, France; ENSIT, University of Tunis, 1008 Tunis, Tunisia; INSAT, Research Unit of Nanobiotechnology and Valorisation of Medicinal Plants, University of Carthage, 1080 Charguia Cedex, Tunisia

**Maryam Shokouhi** — Department of chemistry, University of Isfahan, Isfahan 81746-73441, Iran

**Carole Farre** — CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, Institute of Analytical Sciences, University of Lyon, F-69100 Villeurbanne, France

**Yves Chevalier** — CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, University of Lyon, F-69622 Villeurbanne, France; orcid.org/0000-0002-7526-5658

**Sylvain Minot** — CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, Institute of Analytical Sciences, University of Lyon, F-69100 Villeurbanne, France

**François Bessueille** — CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, Institute of Analytical Sciences, University of Lyon, F-69100 Villeurbanne, France

**Adnane Abdelghani** — INSAT, Research Unit of Nanobiotechnology and Valorisation of Medicinal Plants, University of Carthage, 1080 Charguia Cedex, Tunisia

**Nicole Jaffrezic-Renault** — CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, Institute of Analytical Sciences, University of Lyon, F-69100 Villeurbanne, France; orcid.org/0000-0003-1354-9273

Complete contact information is available at: https://pubs.acs.org/10.1021/acs.langmuir.1c00846

## Notes

The authors declare no competing financial interest.

## ACKNOWLEDGMENTS

The authors acknowledge the Tunisian government for financial support of M. B.s PhD thesis and the Institut de Chimie de Lyon (ICL) for funding support. The authors also acknowledge Pierre-Yves Dugas, C2P2 Laboratory, UMR CNRS 5128, Lyon 1 University, for the Cryo-TEM characterization of liposomes.

## ABBREVIATIONS

* Mono-RLtabmono-rhamnolipid

* MP-SPRtabmultiparametric surface plasmon resonance

* MUAtab11-mercaptoundecanoic acid

* DLStabdynamic light scattering

* PdItabpolydispersity index

* Cryo-TEMtabcryo transmission electron microscopy

* SAMtabself-assembled monolayers

* SDtabstandard deviation

* θ<sub>SPR</sub>tabSPR angular peak minimum

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# Supporting Information

## SPR monitoring of mono-Rhamnolipid interaction with phospholipid-based liposomes

Meryem Belkilani, Maryam Shokouhi, Carole Farre, Yves Chevalier, Sylvain Minot, François Bessueille, Adnane Abdelghani, Nicole Jaffrezic-Renault, Carole Chaix*

### Liposome concentration

As the hydrodynamic diameter of the vesicles was known, the total number of liposome vesicles present in the suspension was calculated using the following relationship:

$$N_{\text{lipo}} = \frac{m \times a_0 \times N}{2 \times 4\pi r^2 \times M} \quad (\text{S1})$$

where *m* is the phospholipid mass, *r* is the hydrodynamic radius (*r* = d/2 with d being the hydrodynamic diameter of the liposomes), $4\pi r^2$ represents the surface area of a liposome vesicle, $a_0$ is the surface area of a phospholipid which is equal to $5.7 \times 10^{-19} \text{ m}^2$, *M* is the molar mass of phospholipids (790.161 g·mol⁻¹) and *N* is Avogadro's number. The concentration of liposomes *C*ᵢ was then obtained by dividing the total number of liposomes (*N*<sub>lipo</sub>) by the volume of suspension *V* which has a value of 25 mL, giving $2.5 \times 10^{14} \text{ lipo mL}^{-1}$.

### Theoretical maximum number of nanospheres deposited on a surface of 1cm²

$$N_{\text{nanosphere}} = \frac{\pi}{2 \times \sqrt{3}} \frac{1}{\pi \times r^2} = \frac{1}{2 \times \sqrt{3} \times r^2} \quad (\text{S2})$$

Where *r* is the radius of a nanosphere
<figure><img src="image_72.png" /><figcaption>**Figure S1.** Grey bars: The angular shifts of the resonance in SPR measurements at 670 nm induced by the interaction of biotinylated liposome with –CH<sub>3</sub>, –COOH, –NH<sub>2</sub> SAM and with streptavidin modified gold surfaces at 5×10<sup>12</sup> lipo mL<sup>-1</sup> liposome concentration.

Black bars: Effect of Triton X-100 (1%) detergent on the SPR response on the four functionalized surfaces.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>Figure S2. SPR full angle scans at the different steps of the SPR gold chip functionalization: gold layer (yellow line), 11-mercaptoundecanoic acid layer (red line), streptavidin layer (green line) and 1×10¹⁴ lipo mL⁻¹ liposome layer (blue line), with corresponding fits (dashed lines) from LayerSolver modeling of individual SPR chip layers using the full SPR angular spectra measured at 785 nm wavelength.</figcaption></figure>
<table><caption>Table S1. The compiled modeling results of separate experiments for the different layers of three similarly functionalized SPR gold chips. The calculated values are low and high limits for layer thickness (d) with the corresponding complex refractive index values (ñ) from three independent measurements and their average value (± standard deviation).</caption><thead><tr><th></th><th></th><th>d (nm)</th><th>n<sub>670</sub></th><th>k<sub>670</sub></th><th>n<sub>785</sub></th><th>k<sub>785</sub></th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">Chromium adhesion layer</td><td>1</td><td>1.64</td><td>3.48907</td><td>4.20862</td><td>4.24196</td><td>3.67297</td></tr><tr><td>2</td><td>1.52</td><td>3.52950</td><td>4.28711</td><td>3.97290</td><td>4.66136</td></tr><tr><td>3</td><td>1.62</td><td>3.51524</td><td>4.01517</td><td>3.92360</td><td>4.41747</td></tr><tr><td>Average Value ± SD</td><td>1.6 ± 0.06</td><td>3.51127 ± 0.02050</td><td>4.17030 ± 0.13996</td><td>4.04615 ± 0.17135</td><td>4.25060 ± 0.51489</td></tr><tr><td rowspan="4">Gold layer</td><td>1</td><td>55.00</td><td>0.19597</td><td>3.86388</td><td>0.20098</td><td>4.77923</td></tr><tr><td>2</td><td>54.96</td><td>0.19610</td><td>3.86296</td><td>0.19261</td><td>4.77855</td></tr><tr><td>3</td><td>54.98</td><td>0.19629</td><td>3.86374</td><td>0.19284</td><td>4.77985</td></tr><tr><td>Average Value ± SD</td><td>54.98 ± 0.02</td><td>0.19612 ± 0.00016</td><td>3.86352 ± 0.00049</td><td>0.19548 ± 0.00477</td><td>4.77921 ± 0.00065</td></tr><tr><td rowspan="4">Thiol MUA layer</td><td>1</td><td>1.40</td><td>1.44180</td><td>0.00000</td><td>1.43971</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>2</td><td>1.56</td><td>1.45120</td><td>0.00000</td><td>1.42900</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>3</td><td>1.55</td><td>1.42393</td><td>0.00000</td><td>1.41235</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>Average Value ± SD</td><td>1.50 ± 0.08</td><td>1.43897 ± 0.01385</td><td>0.00000</td><td>1.42702 ± 0.01378</td><td>0.00000</td></tr><tr><td rowspan="4">Streptavidin layer</td><td>1</td><td>2.37</td><td>1.42826</td><td>0.00000</td><td>1.42596</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>2</td><td>2.77</td><td>1.40641</td><td>0.00000</td><td>1.40411</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>3</td><td>3.00</td><td>1.41471</td><td>0.00000</td><td>1.41241</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>Average ± SD</td><td>2.71 ± 0.31</td><td>1.41646 ± 0.01102</td><td>0.00000</td><td>1.41416 ± 0.01102</td><td>0.00000</td></tr><tr><td rowspan="4">Liposome layer</td><td>1</td><td>76.49</td><td>1.35321</td><td>0.00000</td><td>1.35148</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>2</td><td>87.36</td><td>1.35131</td><td>0.00000</td><td>1.34958</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>3</td><td>75.00</td><td>1.35360</td><td>0.00000</td><td>1.35199</td><td>0.00000</td></tr><tr><td>Average ± SD</td><td>79.61 ± 6.74</td><td>1.35270 ± 0.00122</td><td>0.00000</td><td>1.35102 ± 0.00126</td><td>0.00000</td></tr></tbody></table>
<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>Figure S3. Sensorgram of the SPR angle versus time, measured at the wavelength of 670 nm, during the interaction of mono-RLs with liposomes.</figcaption></figure>
<figure><img src="image_75.png" /><figcaption>Figure S4. Measured and modeled SPR full angle scans of the liposome layer before and after interaction with mono-RLs and Triton X-100 (1 %), using the measured full SPR angular spectra at the wavelength of 670 nm. The SPR peak minimum shifts from the III state which corresponds to the liposome immobilization to the IV state (lipid bilayer) and then the V state (biotinylated lipid monolayer).</figcaption></figure>
VII. Conclusion

Dans ce travail, nous avons considéré une surface biomimétique formée de liposomes greffés
sur un substrat d'or pour l'étude des interactions avec un biosurfactant par la méthode MP-SPR.
Le mono-rhamnolipide produit par *Pseudomonas aeruginosa* a été choisi comme biosurfactant
pour cette étude. Dans un premier temps, nous avons optimisé l'ancrage des liposomes sur la
surface de la puce d'or via une stratégie de liaison biotine/streptavidine afin d'étudier les
interactions avec le mono-RL. La variation du signal SPR a clairement illustré l'affinité de
liaison et la formation d'une couche dense et très stable de liposomes sur la surface
fonctionnalisée par la streptavidine. Le suivi des décalages angulaires s'est avéré reproductible
d'une expérience à l'autre. Nous avons démontré la capacité de la technique MP-SPR à
caractériser les différents états de l'architecture des liposomes, c'est-à-dire d'une monocouche
de vésicules lipidiques à une bicouche lipidique unique, induits par l'interaction avec le mono-
RL et ensuite une monocouche lipidique résultant d'un traitement au Triton X-100 (1%). Ces
hypothèses de structure ont été validées théoriquement en calculant l'épaisseur (d) et l'indice de
réfraction (n) de notre système multicouche. La modélisation des données expérimentales a été
effectuée avec succès. En outre, nous avons été en mesure de calculer la densité de masse
surfacique (Γ) des couches lipidiques sur la surface de la puce SPR après interaction des
liposomes avec le mono-RL puis le Triton X-100 (1%). Durant cette étude, nous avons pu
mettre en évidence l'intérêt de caractériser les surfaces par la méthode MP-SPR. Cette
technique est générique et peut être adaptée à tout système multicouche subissant des
transformations morphologiques quantitatives pendant l'adsorption de biomolécules à leur
surface. Cet outil analytique a prouvé sa haute sensibilité pour la détection des mono-RLs, avec
une limite de détection de 2 µg mL⁻¹. D'autres études sont encore nécessaires pour valider notre
méthode dans des échantillons réels. Sur ce point, il est important de noter que, bien que le test
ne soit probablement pas spécifique pour la détection des rhamnolipides de *P.aeruginosa*, il
peut être intéressant pour la détection sensible de toxines bactériennes au stade précoce d'une
infection. En résumé, l'utilisation de la méthode MP-SPR et de la modélisation couche par
couche est une combinaison puissante pour identifier et quantifier les couches biomoléculaires
déposées sur une surface solide. Cela pourrait ouvrir des perspectives intéressantes pour
comprendre et étudier d'autres mécanismes d'interaction et de transition dans les membranes
induites par des processus biologiquement pertinents tels que des peptides interagissant avec
les membranes ou des médicaments actifs sur les membranes.
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# Chapitre IV : Mécanismes d'interaction du peptide HA2 du virus de la grippe et du peptide bradykinine avec des liposomes par MP-SPR
# I. Introduction

Les interactions peptide-membrane jouent un rôle critique dans de nombreux processus biologiques qui se produisent au niveau cellulaire, parmi lesquels on peut citer les mécanismes d'infections virales, l'action des toxines bactériennes de nature peptidique, des peptides antimicrobiens, cytotoxiques ou encore peptides de pénétration cellulaire, et également l'interaction des hormones peptidiques avec les récepteurs membranaires [1, 2]. La caractéristique structurelle commune des peptides est l'adoption d'une structure secondaire stable lors de la liaison à la surface de la membrane. Dans ce chapitre, nous avons choisi d'étudier l'interaction de deux peptides qui présentent une structure secondaire différente lors de leur association avec une membrane biomimétique. À cet égard, les surfaces recouvertes de liposomes sont d'excellents systèmes biomimétiques en raison de leur structure similaire à celle des membranes cellulaires et d'autres barrières biologiques constituées principalement de phospholipides. Nous avons ainsi utilisé ces surfaces pour étudier leur interaction avec le peptide HA2 issu de la protéine hémagglutinine du virus de la grippe et le peptide bradykinine (BK) qui est une hormone peptidique.

Chaque hiver, les épidémies de grippe touchent des millions de personnes. Le virus Influenza est la cause de cette infection dont les symptômes ont déjà été ressentis par la grande majorité de la population mondiale [3]. Ce virus attaque particulièrement les cellules du système respiratoire. Un taux de mortalité particulièrement élevé a été enregistré lors de certaines pandémies du siècle dernier [4]. Le génome viral est constitué de 8 segments d'ARN enfermés sous la membrane virale. Chaque segment code pour une protéine bien déterminée. Parmi celles-ci, la protéine hémagglutinine (HA) est une glycoprotéine d'enveloppe localisée à la surface du virus de la grippe. Elle joue un rôle essentiel dans le mécanisme d'entrée du virus dans la cellule hôte. Cette protéine HA est constituée de deux sous-unités, HA1 et HA2 qui sont reliées par un pont disulfure. La sous unité HA1 contient le site de liaison de HA aux récepteurs de surface des cellules hôtes. La sous unité HA2 est protégée par HA1. La sous unité HA2 est responsable de la fusion membranaire et permet l'ancrage de HA à la membrane virale. Elle comporte une courte séquence riche en résidus hydrophobes appelée peptide de fusion HA2 qui représente le peptide d'intérêt de cette étude (voir Figure 1). Ce peptide HA2 est une séquence de 20 acides aminés dérivée de l'extrémité N terminale de la sous unité HA2 [5].
<figure><img src="image_76.png" /><figcaption>**Figure 1.** Constituants de la protéine hémagglutinine (HA) du virus de la grippe</figcaption></figure>

Dans ce travail, nous avons étudié en premier lieu le peptide HA2 avec une glycine substituée par de l'acide glutamique en position 4 de la séquence de type sauvage. Une efficacité de fusion plus importante a été prouvée avec ce variant [6]. L'extrémité COOH a également été modifiée par l'ajout des acides aminés GGYC, comme décrit dans des travaux antérieurs [6]. Ce variant a été décrit par Wagner et al. comme un peptide interagissant fortement avec la membrane, à pH acide [7]. La séquence du peptide étudié est schématisée dans la Figure 2. Elle a été intitulée E4-GGYC tout au long de ce chapitre.
<figure><img src="image_77.png" /><figcaption>**Figure 2. Séquence du peptide E4-GGYC dérivée de l'extrémité N de la deuxième sous-unité de l'hémagglutinine (HA2) du virus de la grippe**</figcaption></figure>

Au cours de l'infection, l'hémagglutinine du virus Influenza opère des réarrangements structurels par acidification (pH ≤ 6), qui permettent à sa séquence fusogène N-terminale de s'insérer dans la membrane endosomale cible [8]. Les études structurales réalisées sur le peptide HA2 ont montré qu'il adopte une conformation α-hélicoïdale pour déclencher la fusion [9]. Les trois acides glutamiques et l'acide aspartique du variant E4 sont protonés à faible pH, ce qui induit un changement de conformation en une conformation en hélice α rigide [6, 10]. Luneberg et al. ont étudié le mécanisme d'interaction du peptide HA2 avec des liposomes de phosphatidylcholine comme membrane modèle [11]. Les propriétés fusogènes du peptide HA2 résultent principalement de la structure amphipathique de l'hélice α, toutes les glycines de la séquence étant situées d'un côté de l'hélice, tandis que les résidus hydrophobes volumineux se trouvent du côté opposé de l'hélice [11]. Ils ont trouvé une insertion oblique du peptide dans la bicouche lipidique avec un angle d'environ 45 ° entre l'axe de l'hélice et le plan de la membrane en utilisant la spectroscopie FTIR. Cet angle était de 30 ° d'après les calculs théoriques d'une autre référence [12]. L'interaction de l'analogue AcE4K du peptide HA2 avec les liposomes SOPC a également été étudiée par Zhelev et al. Ils ont montré la répartition dans la membrane en fonction du pH et la réversibilité de la liaison par des expériences de dichroïsme circulaire et de fluorescence. Ils ont également émis l'hypothèse de la formation de pores au sein de la membrane à faible pH (pH 4,0-4,5), ce qui pourrait provoquer la fuite des solutés internalisés [10]. Les propriétés de perturbation membranaire du peptide HA2 ont été étudiées par un test de fuite des liposomes basé sur la libération de la calcéine encapsulée dans les vésicules [6]. Le peptide a provoqué une telle fuite uniquement à un pH acide, entre 4,0 et 6,5.
Le deuxième peptide est le peptide bradykinine (BK) qui est une hormone peptidique produite par le clivage enzymatique de son précurseur protéique, le kininogène, lors d'une blessure ou d'un traumatisme tissulaire. La BK est décrite comme un puissant vasodilatateur et augmente la perméabilité vasculaire. Elle est impliquée dans de nombreux processus physiologiques tels que la contraction des muscles lisses des voies respiratoires et gastro-intestinales et de l'utérus, les stimuli de la douleur dans le système nerveux central, la réponse inflammatoire et les symptômes associés au rhume [13]. Elle est impliquée dans les complications vasculaires et respiratoires de la COVID-19 [14]. En solution aqueuse, la BK existe dans des états conformationnels de type random-coil. Le peptide subit des modifications conformationnelles lors de l'interaction avec son récepteur membranaire [15, 16]. Il est également rapporté que la BK interagit fortement avec les surfaces membranaires, modifiant potentiellement la structure de la membrane lipidique en augmentant l'emballage de la bicouche [13, 17]. Sa séquence est présentée dans la Figure 3.

<figure><img src="image_78.png" /><figcaption>**Figure 3. Séquence du peptide de bradykinine (BK)**</figcaption></figure>

Afin de comprendre en détail les interactions peptide-membrane, plusieurs recherches ont été consacrées à l'étude de ces mécanismes d'interaction soit avec des bicouches lipidiques [18-21], ou avec des couches de liposomes intacts supportés par des substrats solides [22-24]. Ces études ont été réalisées par une grande variété de techniques biophysiques comme la résonance plasmonique de surface (SPR).

Ce chapitre est divisé en deux parties. La première partie la plus développée concerne l'étude de l'interaction du peptide HA2 avec une couche de liposomes supportés. La seconde partie présente en comparaison une étude de l'interaction d'un autre peptide, la BK, avec une couche de liposomes supportés. Nous rapportons le suivi en temps réel des interactions des peptides E4-GGYC et BK avec le substrat lipidique supporté en utilisant la résonance plasmonique de surface multiparamétrique à double longueur d'onde (MP-SPR). La surface biomimétique élaborée avec des liposomes dont le diamètre moyen < 100 nm, est bien adaptée pour étudier les interactions spécifiques avec les biomolécules comme dans le cas du chapitre précédent. Au cours de cette étude, plusieurs séries de sensorgrammes SPR ont été recueillies avec différentes concentrations de peptide E4-GGYC et BK interagissant avec des surfaces recouvertes de liposomes dans des milieux de pH différentes. L'étude de peptide E4-GGYC était plus
développée dans ce travail et les sensorgrammes ont été exploités afin d'étudier les interactions dynamiques exprimées en termes de constante de vitesse d'association ($k_a$), de constante de vitesse de dissociation ($k_d$) et de constante de dissociation à l'équilibre ($K_D$). Les spectres angulaires complets SPR correspondant à la couche de liposomes avant et après son exposition au peptide E4-GGYC ont été ajustés en utilisant la modélisation de la couche de Fresnel à double longueur d'onde avec le logiciel Layer Solver™. Cette simulation théorique nous a permis d'estimer la variation de l'épaisseur moyenne (d), la variation de l'indice de réfraction (n), ainsi que la concentration de phospholipides (Cp) de la couche de liposomes.

Des informations complémentaires concernant les interactions entre les liposomes et E4-GGYC en solution ont été obtenues par diffusion dynamique de la lumière (DLS) et NanoSight (Nanoparticle-Tracking Analysis, NTA).

## II. Etude de l'interaction du peptide HA2 avec une membrane modèle

### II.1. Caractérisation physico-chimique des liposomes

Pour cette étude, nous avons préparé par la même méthode de Bangham et le même protocole expérimental, des liposomes biotinylés formés par les mêmes lipides mentionnés dans la section II.1 du chapitre 3. Nous avons utilisé la diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour mesurer leur diamètre hydrodynamique moyen et l'indice de polydispersité (PdI) dans une solution de NaCl 0,15 M et dans du PBS à pH 4,5 et pH 8. Le potentiel zêta des liposomes a été mesuré sur la base de leur mobilité électrophorétique. Le Tableau 1 présente les caractérisations physico-chimiques de l'échantillon.

<table><caption>**Tableau 1. Caractérisation des liposomes.** Les diamètres hydrodynamiques moyens et les potentiels zêta sont donnés comme des valeurs moyennes ± l'erreur standard de la moyenne de trois mesures indépendantes.</caption><thead><tr><th>Echantillon</th><th>Diamètre (nm)</th><th>PdI <sup>a</sup></th><th>Potentiel zêta (mV)</th><th>C<sub>p</sub> <sup>b</sup> (mM)</th><th>C<sub>l</sub> <sup>c</sup> (lipo/mL)</th><th>IR <sup>d</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>Liposomes/ solution de 0.15 M NaCl</td><td>94 ± 3.7</td><td>0.14</td><td>-6.6 ± 0.8</td><td>31</td><td>1.94×10<sup>14</sup></td><td>1.338</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Liposomes/<br>PBS pH 4.5<sup>e</sup></td><td>98 ± 1.1</td><td>0.15</td><td>-2.1 ± 0.5</td><td>31</td><td>1.80×10<sup>14</sup></td><td>1.334</td></tr><tr><td>Liposomes/<br>PBS pH 8<sup>f</sup></td><td>99.6 ± 1.2</td><td>0.14</td><td>-4.0 ± 0.6</td><td>31</td><td>1.73×10<sup>14</sup></td><td>1.336</td></tr></table>

Ainsi, nous avons soigneusement contrôlé la taille et le potentiel zêta de chaque suspension de liposomes avant chaque expérience MP-SPR.

## II.2. Formation de la couche de liposomes supportés

### II.2.1. Mesure de la constante de dissociation à l'équilibre $K_D$ de l'interaction des liposomes avec des surfaces fonctionnalisées

Après avoir préparé les liposomes, nous avons suivi par MP-SPR leur immobilisation sur quatre surfaces d'or différemment fonctionnalisées, selon le protocole expérimental décrit dans la publication 2 et comme mentionné dans la section III du chapitre 3. Les surfaces d'or ont été modifiées avec différentes monocouches auto-assemblées (SAMs) d'alcanethiols à longue chaîne (C11-C12) avec différents groupements terminaux (-COOH, -NH<sub>2</sub>, et -CH<sub>3</sub>) ou avec une couche de streptavidine. Dans cette section du présent chapitre, nous avons étudié l'étape de l'immobilisation des liposomes sur ces quatre surfaces d'or en calculant l'affinité de la liaison. Pour cela, les sensorgrammes résultants ont été extraits avec le visualiseur de données MP-SPR Navi et analysés par le logiciel Trace Drawer™. Ils sont présentés dans les Figures S2, S3 et S4 de la publication 2. Les constantes de dissociation à l'équilibre $K_D$ de l'interaction entre les liposomes biotinylés et les quatre surfaces d'or fonctionnalisées ont été calculées. Elles sont présentées dans le Tableau 2.

**Tableau 2. Affinité de liaison des liposomes avec différentes surfaces d'or fonctionnalisées.**
Les constantes de dissociation ($K_D$), exprimées en concentrations molaires de phospholipides, ont été obtenues à partir de l'ajustement des sensorgrammes extraits avec le visualiseur de données MP-SPR Navi. Les données ont été calculées en utilisant le modèle "Affinity" pour les surfaces (-CH<sub>3</sub>, -COOH, -NH<sub>2</sub>) et le modèle "OneToOne" pour la surface streptavidine. Ces deux modèles d'ajustement sont des modèles propriétaires du logiciel Trace Drawer™.

<footnote><sup>a</sup> Indice de polydispersité, <sup>b</sup> Concentration de phospholipides, <sup>c</sup> Concentration des liposomes, <sup>d</sup> Indice de réfraction, <sup>e</sup> PBS pH 4.5 : 0.1 M NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> + 0.05 M NaCl, <sup>f</sup> PBS pH 8 : 0.1 M Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> + 0.05 M NaCl</footnote>
<table><thead><tr><th>Surface</th><th>K<sub>D</sub> (M)</th></tr></thead><tbody><tr><td>-CH<sub>3</sub></td><td>7.20 × 10<sup>-4</sup> ± 1.01 × 10<sup>-4</sup></td></tr><tr><td>-COOH</td><td>1.09 × 10<sup>-4</sup> ± 0.74 × 10<sup>-4</sup></td></tr><tr><td>-NH<sub>2</sub></td><td>2.06 × 10<sup>-5</sup> ± 1.20 × 10<sup>-5</sup></td></tr><tr><td>Streptavidine</td><td>9.44 × 10<sup>-12</sup> ± 1.02 × 10<sup>-12</sup></td></tr></tbody></table>

Les résultats ont montré que l'affinité des liposomes pour la surface augmente en suivant l'ordre $CH_3 < COOH < NH_2 < streptavidine$. Ainsi l'ancrage des liposomes sur la couche de streptavidine a montré une très forte affinité résultant de la présence de biotine à la surface des liposomes. Par conséquent, cette surface a été choisie pour élaborer une surface fonctionnalisée par des liposomes très stable afin d'étudier l'interaction du peptide E4-GGYC par MP-SPR.

Avant de procéder à l'immobilisation des liposomes sur la surface de streptavidine, nous avons évalué l'éventuelle adsorption non spécifique du peptide E4-GGYC sur la couche de streptavidine. Cette adsorption non spécifique engendre un signal ne pouvant être discerné du signal provenant de la liaison de l'analyte (peptide) sur le ligand (liposome). De ce fait, comme expérience préliminaire, nous avons suivi par MP-SPR l'adsorption et la désorption du peptide E4-GGYC à la concentration de 10 µM dans un tampon PBS (pH 4,5) sur une surface fonctionnalisée par la streptavidine, puis passivée soit par une solution aqueuse à 10 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (TRIS), de 3-diméthylaminopropylamine (DMAP) ou de lysine (voir Figure 4). Le protocole expérimental est décrit dans la publication 2.
<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>**Figure 4.** Contrôles négatifs sans liposome pour étudier l'interaction non spécifique du peptide E4-GGYC avec la couche de streptavidine, après passivation avec trois molécules différentes. (1) signaux superposés après passivation avec soit la lysine, le TRIS ou la DMAP, (2) Injection de 10 µM de E4-GGYC dans du PBS pH4,5 sur chaque surface pendant 4 min à un débit de 50 µL/min et (3) étape de lavage dans un tampon PBS pH4,5</figcaption></figure>

Nous avons obtenu un signal SPR négligeable suite à l'injection de 10 mM de peptide sur la surface de streptavidine passivée par le TRIS, indiquant un très faible degré de liaison non spécifique. Les deux autres méthodes de passivation par la lysine et la DMAP se sont avérées moins efficaces car montrant par SPR une adsorption significative du peptide sur la surface. Suite à cette étude, nous avons choisi le protocole de passivation par le TRIS pour passiver la surface de streptavidine avant d'immobiliser les liposomes.

Ensuite, nous avons déposé une concentration de 1×10¹⁴ lipo mL⁻¹ de liposomes biotinylés dans les deux tampons PBS à pH 4,5 et pH 8 sur la couche de streptavidine. Cette injection a généré un déplacement significatif de l'angle θSPR d'environ 1,80 ° et 1,75 ° à pH 4,5 et pH 8 respectivement, par rapport à la couche de streptavidine, indiquant ainsi le succès du dépôt. Puis nous avons calculé l'épaisseur de la couche de liposomes formée dans les deux pHs à partir de l'ajustement des courbes SPR correspondantes avec le logiciel LayerSolver™ (voir Figure S6 de la publication 2). Une épaisseur moyenne de 83 nm et 93 nm de la couche de liposomes a été obtenue à pH 4,5 et pH 8 respectivement.
II.2.2. Caractérisation morphologique par AFM

Nous nous sommes ensuite penchés sur l'utilisation de l'AFM pour imager la morphologie de
la surface de l'or et de streptavidine recouverte de liposomes afin de mettre en évidence la
qualité du dépôt des liposomes. Les liposomes sont des objets difficiles à imager par AFM en
raison de leur tendance à se déformer pendant les observations à cause des interactions avec la
pointe.

Une concentration de liposomes de 1×10¹⁴ lipo mL⁻¹ dans un tampon PBS (pH 4,5) a été directement adsorbée sur la puce d'or SPR nettoyée et sur la puce d'or SPR fonctionnalisée à la streptavidine pendant 4 min à un débit de 50 µL/min et l'excès de liposomes a ensuite été lavé. La puce a été retirée de l'instrument MP-SPR, et environ 1 mL de tampon PBS (pH 4,5) a été soigneusement déposé sur la surface pour éviter le séchage pendant l'analyse AFM.

La comparaison des images AFM de la surface de l'or avant (Figure 5.a) et après l'ajout de liposomes (Figure 5.b) a montré une topographie granulaire dans les deux cas. Cependant, la hauteur et la morphologie de la surface des éléments arrondis étaient différentes. Des objets sphériques ont été observés sur la Figure 5.b avec une hauteur moyenne approximative d'environ 30 nm. Cette valeur était bien plus petite que le diamètre hydrodynamique moyen des liposomes obtenu par DLS (voir Tableau 1). De plus, une sous-couche moléculaire de quelques nanomètres a également été observée qui pourrait correspondre à une monocouche homogène de phospholipides résultant de la destruction de liposomes en contact avec la surface d'or.

D'autre part, l'image AFM des liposomes déposés sur la surface d'or fonctionnalisée par la
streptavidine montre un fort recouvrement de la surface par des objets globulaires (Figure 5.c).
Nous avons observé une surface granulée, recouverte de liposomes intacts dont la hauteur
moyenne est supérieure à 70 nm, proche du diamètre moyen des liposomes en suspension
aqueuse. Nous avons pu montrer par ces résultats que l'interaction biotine-streptavidine favorise
l'adhésion d'une couche dense de liposomes sans modifier leur forme.
a

<figure><img src="image_80.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_81.png" /></figure>
<figure><img src="image_82.png" /></figure>

**Figure 5.** Images topographiques AFM en mode tapping de liposomes adsorbés sur un substrat d'or nu et d'or fonctionnalisé par la streptavidine. L'adsorption des liposomes sur les deux surfaces a été suivie par MP-SPR, puis par une caractérisation AFM à la fin de chaque dépôt. Images topographiques AFM du substrat d'or avant (a) et après dépôt de liposomes (b) et après dépôt de liposomes sur une surface fonctionnalisée par la streptavidine (c)

## II.3. Etude de l'interaction du peptide HA2 avec la membrane supportée

### II.3.1. Analyse MP-SPR de la liaison peptide HA2/liposome

Après avoir préparé une couche de liposomes stable sur la surface de streptavidine, nous avons étudié l'interaction de E4-GGYC en enregistrant des spectres angulaires SPR complets en fonction du temps. Pour ce faire, nous avons injecté des solutions de peptide de concentrations croissantes (5, 10 et 25 µM) dans du PBS à pH4,5 à un débit constant de 50 µL/min. D'après la Figure 6, nous avons noté que l'interaction du peptide avec la couche de liposomes induit une augmentation du signal SPR dépendante de la concentration. En particulier, les sensorgrammes ont indiqué que le processus d'association peptide/liposome était rapide et atteignait au plateau un état stable jusqu'à la fin de l'injection du peptide. Ceci nous permet de suggérer que le peptide s'est adsorbé ou inséré dans la bicouche lipidique des liposomes pendant la période d'injection. Une réversibilité relative de l'interaction a été observée lorsque la solution d'injection a été remplacée par une solution PBS à pH 4,5.
<figure><img src="image_83.png" /><figcaption>**Figure 6.** Sensorgrammes superposés (position angulaire du pic normalisé en fonction du temps) enregistrés pendant l'injection de 5-25 µM de peptide E4-GGYC à pH 4,5 sur la surface fonctionnalisée par des liposomes. Les flèches indiquent le positionnement pour les calculs d et n (Tableau 3) à 670 nm</figcaption></figure>

Afin de mieux comprendre les phénomènes qui se produisent sur la couche de liposomes suite à l'injection du peptide, nous avons modélisé les courbes SPR correspondant aux expériences en temps réel après chaque injection de peptide sur la couche de liposomes à pH 4,5 (voir Figure 7). Les courbes ont été ajustées séparément avec le logiciel Layer Solver™, en considérant chaque couche comme une seule couche optiquement homogène.

<figure><img src="image_84.png" /><figcaption>**Figure 7.** Balayages de l'angle complet aux pics SPR à 670 nm des surfaces supportées par les liposomes après injection de solutions de 5-25 µM d'E4-GGYC à pH 4,5 (courbes pleines), avec les ajustements correspondants de la modélisation LayerSolver™ (courbes en pointillés). La courbe SPR correspondant à chaque concentration a été prise à l'équilibre de l'interaction peptide/liposome pour la modélisation par le logiciel LayerSolver™</figcaption></figure>
Nous avons déterminé en premier lieu les propriétés optiques des couches constituant la puce d'or SPR fonctionnalisée telles que la couche d'adhérence de chrome 'Cr' et la couche d'or 'Au', ainsi que les deux couches organiques déposées de MUA et de streptavidine. Les paramètres obtenus ont été maintenus fixes et utilisés comme base pour calculer l'épaisseur optique (d) et l'indice de réfraction réel (n) de la couche de liposomes déposée avant et après injection des différentes concentrations de peptides. Les résultats des calculs théoriques sont présentés dans le Tableau 3.

Bien que l'épaisseur de la couche de liposomes formée sur la surface de streptavidine était inférieure à la profondeur de pénétration du champ évanescent (< 1/2 λ₁ et 1/2 λ₂), ce dernier est capable de détecter des changements optiques extrêmement faibles dans la couche de liposomes pendant l'interaction avec les peptides. Les Figures 8a-b illustrent la variation des paramètres optiques calculés (d et n) pour la couche de liposomes en fonction de la concentration de peptide injecté à pH 4,5.

<table><caption>**Tableau 3.** Epaisseur (d, nm), indice de réfraction (n, RIU) de la couche de liposomes ainsi que la concentration en phospholipides (Cp, g/cm³) après chaque injection de E4-GGYC (5-25 µM) et après chaque lavage avec du PBS à pH4.5. Les valeurs représentent la moyenne (± écart-type) de trois calculs indépendants par la simulation SPR LayerSolver™.</caption><thead><tr><th>Concentration du peptide (µM)</th><th>Pendant l'injection du peptide</th><th>Après Lavage avec PBS pH4.5</th></tr></thead><tbody><tr><td>5</td><td>d = 86.62 ± 1.00<br>n = 1.34041 ± 0.00120<br>Cp = 0.08585 ± 0.00265</td><td>d = 84.03 ± 0.98<br>n = 1.34381 ± 0.00100<br>Cp = 0.08849 ± 0.00072</td></tr><tr><td>10</td><td>d = 92.05 ± 0.70<br>n = 1.33974 ± 0.00050<br>Cp = 0.08078 ± 0.00045</td><td>D = 86.06 ± 0.80<br>n = 1.34200 ± 0.00150<br>Cp = 0.08641 ± 0.00133</td></tr><tr><td>25</td><td>d = 93.70 ± 0.90<br>n = 1.33886 ± 0.00100</td><td>d = 86.27 ± 1.10<br>n = 1.34030 ± 0.00080</td></tr></tbody></table>
$$C_p = 0.07936 \pm 0.00152 \qquad C_p = 0.08620 \pm 0.00121$$

Couche de liposomes purs ; d = 83,30 nm, n = 1,34997, Cₚ = 0,08925 g/cm³

<figure><img src="image_85.png" /></figure>

<figure><img src="image_86.png" /></figure>
<figure><img src="image_87.png" /><figcaption>**Figure 8.** Effet de l'injection de 5-25 µM d'E4-GGYC sur (a) l'épaisseur *d*, (b) l'indice de réfraction *n* et (c) la concentration de phospholipides *Cp* de la couche de liposomes immobilisés à pH 4,5, avant et après l'étape de lavage dans du PBS, pH 4,5</figcaption></figure>

D'après les Figures 8.a et 8.b, nous avons constaté que l'épaisseur de la couche de liposomes a augmenté lors de l'ajout du peptide à pH 4,5 (données reportées dans le Tableau 3). Cette augmentation progressive de l'épaisseur a été accompagnée d'une diminution de l'indice de réfraction (n) de la couche. En nous appuyant sur l'équation de Jung (équation 11 citée au chapitre 2) et sur les résultats de la modélisation, nous avons pu relever que le décalage angulaire du minimum du pic SPR vers les grandes valeurs d'angle est principalement induit par la variation de l'épaisseur de la couche (d).

Grâce au calcul théorique et aux équations appropriées cités dans la publication 2, nous avons pu estimer la concentration en phospholipides ($Cp$) dans la couche initiale de liposomes ainsi que sa variation due à l'injection de E4-GGYC (Figure 8.c). Ce calcul a été réalisé afin de mieux comprendre l'effet du peptide sur la couche de liposomes. Les valeurs de $Cp$ calculées après l'injection de 5-25 µM de peptide sont présentées dans le Tableau 3. En effet, la $Cp$ a été estimée à 0,08925 g/cm³ pour la couche initiale de liposomes. La concentration a diminué en présence du peptide, jusqu'à $Cp \sim 0,07936$ g/cm³ suite à l'injection de 25 µM de peptide. Ainsi, nous avons pu émettre l'hypothèse que lors de l'injection de 5-25 µM de peptide à pH 4,5, celui-ci s'insère dans la membrane des liposomes, provoquant probablement la formation de pores dans la membrane comme décrit dans la littérature [10] suivie du gonflement des liposomes par le tampon. Ceci conduit d'une part à une augmentation de l'épaisseur *d* due au gonflement des
liposomes et d'autre part, à une diminution de l'indice de réfraction *n* de la couche induite par l'entrée du tampon à l'intérieur des liposomes, ce qui explique également la diminution de la concentration en phospholipides *Cp*. Lors de l'étape de lavage, les valeurs calculées de l'épaisseur, de l'indice de réfraction ainsi que de la concentration en phospholipides ont prouvé que le gonflement a été stoppé et que le peptide s'est désorbé. Les valeurs calculées ont suggéré un dégonflement partiel de la couche de liposomes sans revenir parfaitement aux valeurs initiales de la couche native (voir Tableau 3).

Dans notre cas, nous n'avons pas été en mesure de confirmer la réversibilité complète de l'insertion du peptide dans la membrane comme cela a été démontré précédemment par Longo et al. [25, 26] et Zhelev et al. [10]. Longo et al. ont montré que le peptide de fusion de la grippe (peptide HA2 wt-20) s'insère rapidement dans la membrane à faible pH et que l'insertion est principalement inversée par le rinçage de la membrane avec un tampon. Zhelev et al. ont étudié l'interaction de l'analogue du peptide HA2 (AcE4K) avec des liposomes de phosphatidylcholine et ont prouvé que la liaison du peptide augmente lorsque le pH diminue jusqu'à pH 4,5, et que l'insertion s'avère réversible. Ils ont également observé que l'insertion du peptide dans la membrane lipidique n'affecte pas la perméabilité de la membrane pour l'eau, ce qui montre que le peptide à une concentration ≤ 10 µM ne perturbe pas substantiellement l'emballage de la région hydrocarbonée. Cependant, la capacité de la membrane à retenir les solutés en présence du peptide s'est révélée compromise, ce qui suggère que le peptide inséré favorise la formation de pores de courte vie. Ce point a été confirmé par nos calculs théoriques lorsque l'indice de réfraction *n* de la couche de liposomes a diminué après l'injection de 5-25 µM de peptides à pH 4,5. Nous avons suggéré que les nanopores créés par les peptides lors de leur insertion dans la membrane lipidique facilitent l'entrée du tampon, ce qui diminue en globalité la concentration calculée des phospholipides *Cp*.

### II.3.2. Cinétique de l'interaction peptides/liposomes à pH 4,5

Nous avons analysé les sensorgrammes résultant des interactions E4-GGYC/liposome à pH 4,5 par le logiciel Trace Drawer™ en utilisant le modèle d'ajustement simple de Langmuir 'one-to-one' pour réaliser une étude cinétique des interactions. La Figure 9.a représente la superposition entre les sensorgrammes expérimentaux et les courbes ajustées pour les 3 concentrations de peptide.
<figure><img src="image_88.png" /><figcaption>**Figure 9.** (a) Sensorgrammes MP-SPR (lignes en gras) et courbes ajustées (lignes en pointillés) du peptide E4-GGYC aux concentrations 5-25 µM interagissant avec des liposomes immobilisés à pH 4.5. (b) Courbes résiduelles provenant de la soustraction des courbes ajustées aux sensorgrammes expérimentaux</figcaption></figure>

Les constantes de vitesse d'association ($k_a$), de dissociation ($k_d$) ainsi que la constante de dissociation à l'équilibre ($K_D$) obtenues à partir de l'ajustement sont indiquées dans le Tableau 4.

<table><caption>**Tableau 4.** Paramètres cinétiques obtenus à partir de l'ajustement des sensorgrammes MP-SPR de l'interaction E4-GGYC/liposome.</caption><thead><tr><th></th><th>k<sub>a</sub> × 10<sup>5</sup>(1/M × s)</th><th>k<sub>d</sub> × 10<sup>-1</sup>(1/s)</th><th>K<sub>D</sub> × 10<sup>-7</sup>(M)</th></tr></thead><tbody><tr><td>Peptide</td><td>2.820 ± 0.005</td><td>1.23000±0.00006</td><td>4.50 ± 0.03</td></tr></tbody></table>
Le peptide s'est inséré dans la membrane du liposome avec une $K_D$ de $4,5 \times 10^{-7}$ M. Ce résultat est en bon accord avec la $K_D$ calculée par Rafalski et al. à partir de mesures de fluorescence de la liaison du peptide HA2 à des vésicules de liposome ($K_D \sim 8 \times 10^{-7}$ M) [5].

## II.4. Effet du pH sur l'interaction peptide-membrane lipidique

Nous avons également étudié la réponse SPR induite par l'injection de solutions de peptides à pH basique. La Figure 10 montre les sensorgrammes superposés pour des injections de 5-25 µM d'E4-GGYC à pH 4.5 et pH 8. Nous avons remarqué deux réponses SPR différentes, résultant probablement d'un mécanisme d'interaction différent aux deux pHs. Pour être sûr de l'action du peptide sur la couche de liposomes, une étude contrôle réalisée en injectant successivement du PBS à pH 4.5 et à pH 8 a confirmé que le signal SPR de la surface fonctionnalisée par les liposomes était stable lors de la variation du pH.

En superposant les sensorgrammes, nous avons observé des cinétiques de liaison différentes, tant au niveau des taux d'association que de dissociation à pH 4.5 par rapport à pH 8. Comme on le voit, les mêmes concentrations de peptides injectées à pH 8 ont conduit à une lente diminution des signaux quelle que soit la concentration utilisée. La cinétique d'interaction était beaucoup plus lente que celle observée à pH 4.5, et n'a pas atteint un signal stable pendant le temps d'injection de 4 minutes. Cependant, lorsque les liposomes ont été rincés avec du PBS à pH 8, l'angle SPR a recommencé à augmenter et il a fallu environ 4 minutes pour atteindre la ligne de base. Cela suggère que le peptide a été complètement éliminé de la bicouche lipidique ou qu'il n'a pas interagi avec le liposome. Les variations des signaux SPR étaient clairement dépendantes de la concentration pour le peptide à pH 4.5, mais pas à pH 8, pour lequel les variations des angles SPR étaient quasiment similaires pour toutes les concentrations testées.

<figure><img src="image_89.png" /></figure>
**Figure 10.** Sensorgrammes superposés d'injections de 5-25 µM d'E4-GGYC à pH 4,5 et pH 8 sur la surface recouverte de liposomes

Ces résultats indiquent que E4-GGYC a des modes d'interaction différents avec les liposomes
lors du passage d'un pH acide à un pH basique. Nous avons émis l'hypothèse que le décalage
négatif de l'angle SPR provient de changements morphologiques dans la couche de liposomes.
Le peptide injecté à pH basique induit probablement une contraction des liposomes
accompagnée d'un retour à leur forme initiale après rinçage. Cette contraction est indépendante
de la concentration en peptide. Les études réalisées par MP-SPR à pH 8 ne nous permettent pas
de conclure sur l'absence d'interaction entre E4-GGYC et le liposome dans ce tampon. Il a donc
été envisagé de mettre en relation ces études avec les résultats obtenus par DLS et NTA pour
conclure clairement sur la pH-dépendance de l'interaction E4-GGYC/liposome.

II.5. Effet du peptide sur la taille des liposomes en solution

La taille et l'indice de polydispersité (PdI) des liposomes peuvent fournir des informations sur leur stabilité et, à ce titre, peuvent permettre une évaluation qualitative de leur interaction avec E4-GGYC dans notre étude. Nous avons contrôlé ainsi ces paramètres par les techniques DLS et NanoSight-NTA (Nanoparticle-Tracking Analysis). Les résultats de ces deux techniques (voir Figure 11) ont clairement démontré que des concentrations croissantes de E4-GGYC dans du PBS à pH 4,5 induisaient une augmentation de la taille des liposomes, alors que le PdI mesuré par DLS restait relativement faible. Ceci suggère fortement que le peptide, à une concentration de 0,5 à 10 µM, n'a pas induit d'agrégation ou de destruction des liposomes. D'autre part, l'augmentation des concentrations de peptide de 0,5 à 10 µM dans du PBS à pH 8 n'a pas favorisé de changement significatif de la taille des liposomes, les diamètres hydrodynamiques et les valeurs de PdI étant restées presque stables. Par conséquence, nous avons pu confirmer les résultats obtenus par MP-SPR et avons montré le comportement différent de E4-GGYC vis-à-vis des liposomes à pH 4,5 et pH 8. Pour cette étude, nous n'avons pas été en mesure d'augmenter la concentration en peptide au-delà de 10 µM. Des agrégats entre les peptides et les liposomes ont été observés dans nos solutions, ce qui nous a empêché d'obtenir des données interprétables.
<figure><img src="image_90.png" /><figcaption>**Figure 11.** Effets de l'incubation des liposomes avec des concentrations croissantes de E4-GGYC dans du PBS à pH 4,5 et pH 8 sur le diamètre hydrodynamique mesuré par DLS (a), NTA (b) et l'indice de polydispersité (PdI) par DLS (c)</figcaption></figure>

Grâce à ces résultats, nous avons confirmé le processus de gonflement des liposomes à pH 4,5 par DLS et NTA jusqu'à 10 µM de peptide en solution. Ensuite, les conjugués peptide-liposome en solution ont commencé à s'agréger et à précipiter, perturbant les mesures DLS et NTA, mais
pas la réponse MP-SPR suivie sur des substrats fonctionnalisés par des liposomes. Dans la littérature, le gonflement des liposomes dans une solution de 10 µM de peptide HA2 a été décrit par Zhelev et al [10]. De manière similaire à nos résultats de DLS, ils ont également confirmé que les conjugués peptide-liposome se dégradaient avec le temps dans des solutions de peptide à une concentration ≥ 10 µM. Les auteurs ont alors conclu que la membrane lipidique était rompue par un éventuel processus de fusion. Grâce à nos résultats obtenus par MP-SPR, nous avons pu suivre l'interaction peptide/liposome jusqu'à 25 µM de peptide, montrant une réversibilité partielle de la liaison sans rupture de la couche de liposome.

## II.6. Essais de destruction de la couche de liposomes supportée

Pour tenter de détruire la couche de liposomes, nous avons réalisé l'expérience avec des concentrations croissantes de peptides jusqu'à 100 µM. La Figure 12.a montre les sensorgrammes complets en temps réel pour 50, 75 et 100 µM de peptide E4-GGYC à pH 4,5. Nous avons pu conclure à partir de ces résultats que l'interaction de E4-GGYC à pH 4,5 avec la couche lipidique jusqu'à 100 µM n'a pas induit de perturbation de la membrane conduisant à la rupture des liposomes. En effet, nous n'avons pas observé une chute du signal SPR qui pourrait correspondre à une dégradation. Nous avons aussi remarqué que E4-GGYC s'est lié de manière différente à la surface des liposomes à une concentration supérieure à 25 µM (voir Figure 12.b par rapport à la Figure 6). En effet, le mécanisme initial d'association peptide/liposome était également rapide. Mais ensuite, le signal a lentement diminué dans le temps jusqu'à la fin de l'injection du peptide sans atteindre un état stable. En changeant le milieu par du PBS à pH 4.5, une chute rapide du signal SPR jusqu'à la ligne de base a été enregistrée.

<figure><img src="image_91.png" /></figure>
<figure><img src="image_92.png" /><figcaption>**Figure 12.** Le sensorgramme complet (a) et les sensorgrammes superposés (b) mesurés à une longueur d'onde de 670 nm, pendant l'interaction de E4-GGYC à une concentration de 50 à 100µM, pH 4.5 sur des liposomes immobilisés</figcaption></figure>

Entre les petites et les grandes concentrations, nous avons remarqué qu'il y avait une transition probable dans le mode d'action du peptide avec la couche de liposomes. Cette observation était cohérente avec la forme du sensorgramme, montrant un état stable au niveau du signal SPR pendant l'injection de 5-25 µM de peptide (Figure 6), alors que pendant l'injection de 50-100 µM de peptide, aucun état stable n'a été observé (Figure 12.b). Ceci nous permet d'émettre l'hypothèse que la concentration en peptide de 25 µM était une concentration critique pour saturer la membrane de la couche de liposomes. À 50-100 µM, le peptide s'est d'abord inséré dans les liposomes jusqu'à saturation, puis l'excès de peptide a continué à s'adsorber sur la surface de la couche lipidique, provoquant à nouveau une augmentation du signal SPR liée à la concentration de peptide. Cette hypothèse a été confirmée en calculant *d* et *n* de la couche de liposome après chaque injection de peptide E4-GGYC à pH 4.5 jusqu'à 100 µM comme illustré dans la Figure 13. Nous avons observé que la variation monotone de l'épaisseur (*d*) a d'abord été accompagnée d'une diminution de l'indice de réfraction (*n*) de la couche de liposomes de 1,34997 à 1.33886, suivie d'une nouvelle augmentation jusqu'à 1,34625. Il y a eu un minimum dans la courbe de l'indice de réfraction autour du point de 25 µM de peptide. Après insertion dans la membrane jusqu'à saturation, l'excès de peptide a continué à s'adsorber à la surface de la couche de liposomes, provoquant ainsi une augmentation continue de l'épaisseur avec une augmentation notable de l'indice de réfraction pour des injections de 50-100 µM. Il est à noter que l'indice de réfraction était toujours inférieur à celui de la couche de liposome pur (1,34997).
<figure><img src="image_93.png" /><figcaption>**Figure 13.** Effet de l'injection du peptide E4-GGYC à différentes concentrations à pH4,5 sur l'épaisseur (d) et l'indice de réfraction (n) de la couche de liposomes</figcaption></figure>

Une fois qu'un nombre maximal de peptide a été inséré et a saturé la membrane du liposome, la structure vésiculaire du liposome n'a pas été détruite. Ces résultats suggèrent que l'insertion de E4-GGYC à pH 4,5 dans la bicouche lipidique pourrait augmenter la robustesse de la membrane du liposome. Ce point a été étudié expérimentalement dans l'expérience ci-après.

La stabilité de la membrane lipidique et sa robustesse ont été étudiées après l'injection de 25 µM de E4-GGYC sur une couche de liposomes. Pour cela, nous avons injecté une solution de mono-rhamnolipide (mono-RL) à une concentration de 50 µg mL⁻¹ (concentration qui correspond à la concentration micellaire critique, CMC) sur une couche de liposomes saturés par 25 µM de E4-GGYC à pH 4,5, et en parallèle sur une couche de liposomes sans injection préalable de peptide, prise comme couche de référence (Figure 14).
<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>**Figure 14.** Sensorgrammes mesurés dans du PBS pH 4,5 et à la longueur d'onde de 670 nm lors d'une injection de mono-RL à une concentration de 50 µg mL⁻¹ sur une couche de liposomes purs (CH1) et sur une couche de liposomes saturés avec 25 µM de peptide E4-GGYC à pH 4,5 (CH2)</figcaption></figure>

Nous avons observé une augmentation progressive de l'angle SPR, suivie d'une stabilisation du signal jusqu'à un plateau pendant l'injection de E4-GGYC (Figure 14, courbe rouge). Cette variation était caractéristique de l'insertion du peptide dans la membrane lipidique. L'étape suivante a été l'injection de mono-RL afin d'étudier son interaction avec la membrane lipidique et de déclencher la rupture du liposome. Cependant, l'ajout de mono-RL a conduit à une nouvelle augmentation de l'angle SPR (Figure 14, courbe rouge). Ainsi, l'augmentation de l'angle SPR était proportionnelle à la quantité de mono-RL déposée sur la surface. En comparaison, l'injection de mono-RL sur la couche de liposomes sans peptide a entraîné une baisse significative du signal SPR (Figure 14, courbe bleu), ce qui montre que le mono-RL a interagi avec les liposomes et a commencé à les détruire. Cela nous rappelle l'effet perturbateur de mono-RL sur les liposomes qui a été décrit dans le chapitre 3. Nous avons rapporté que la couche de liposomes immobilisés sur un support pouvait être perturbée et restructurée avec perte de matière phospholipidique par l'action du mono-RL. Une chute nette du signal SPR a été observée et les paramètres optiques (d et n) calculés par MP-SPR ont confirmé la formation
de la bicouche phospholipidique après dégradation complète. De même, Bombard et al. [23] ont décrit la perturbation d'une couche de liposomes supportés sur une surface par un peptide amphiphile en utilisant l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi) et la technique BALM. Ils ont enregistré une augmentation du signal SPRi juste après l'injection du peptide fusogène dans la couche de liposomes, indiquant le gonflement des liposomes, et ensuite une chute remarquable du signal, reflétant la perte de matière lipidique et la rupture des liposomes. Nos résultats ont confirmé que la présence de E4-GGYC inséré dans la double couche lipidique des liposomes inhibait la perturbation déclenchée par le mono-RL en améliorant la robustesse de la membrane. Dans la littérature, un certain nombre d'études ont montré que le peptide HA2 s'intercale dans le feuillet externe de la bicouche lipidique, augmentant l'ordonnancement des groupes de tête de cette couche, augmentant de ce fait sa robustesse [27-29]. De plus, des études dans la littérature ont révélé que le peptide ne traverse pas la double couche phospholipidique et reste positionné dans la partie externe de la membrane [28]. Il a été décrit que le couplage entre le feuillet externe durci par l'insertion du peptide et le feuillet interne plus souple génère des contraintes de flexion dans la bicouche. Les auteurs ont suggéré que ces contraintes peuvent initier la fusion de la membrane. Dans notre cas, les résultats obtenus par SPR sur une couche de liposomes supportés ne nous ont pas permis d'observer le mécanisme de fusion jusqu'à 100µM de peptide en solution.

### III. Publication
# Mechanisms of Influenza virus HA2 peptide interaction with liposomes studied by dual-wavelength MP-SPR

Meryem Belkilani,†‡§ Carole Farre,† Yves Chevalier,# Sylvain Minot,† François Bessueille,†

Adnane Abdelghani,§ Nicole Jaffrezic-Renault,† Carole Chaix†*

†University of Lyon, CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, Institute of Analytical Sciences, 5 rue de la Doua, F-69100 Villeurbanne, France.

‡ University of Tunis, ENSIT, av. Taha Hussein, Montfleury, 1008 Tunis, Tunisia.

§ University of Carthage, INSAT, Research Unit of Nanobiotechnology and Valorisation of Medicinal Plants, 1080 Charguia Cedex, Tunisia.

# University of Lyon, CNRS, Claude Bernard Lyon 1 University, LAGEPP, 43 bd 11 Novembre, F-69622 Villeurbanne, France.

* Corresponding authors: carole.chaix-bauvais@univ-lyon1.fr

**KEYWORDS.** Multi-parametric surface plasmon resonance (MP-SPR), Liposome, Streptavidin, HA2 peptide, Phospholipid, Influenza virus.

## ABSTRACT

A phospholipid-based liposome layer was used as an effective biomimetic membrane model to study the binding of the pH-dependent fusogenic peptide (E4-GGYC) from the Influenza virus hemagglutinin HA2 subunit. To this end, a multi-parameter surface plasmon resonance approach (MP-SPR) was used for monitoring peptide-liposome interactions at two pH values (4.5 and 8) by means of recording sensorgrams in real-time without the need for labeling. Biotinylated liposomes were firstly immobilized as a monolayer onto the surface of a SPR gold chip coated with a streptavidin layer. Multiple sets of sensorgrams with different HA2 peptide
concentrations were generated at both pHs. Dual-wavelength Fresnel layer modeling was applied to calculate the thickness (d) and the refractive index (n) of the liposome layer in order to monitor the change in its optical parameters upon interaction with the peptide. At acidic pH, the peptide, in its alpha helix form, entered the lipid bilayer of liposomes, inducing vesicle swelling and increasing membrane robustness. Conversely, a contraction of liposomes was observed at pH 8, associated with non-insertion of the peptide in the double layer of phospholipids. The equilibrium dissociation constant K<sub>D</sub> = 4.7 × 10<sup>-7</sup> M of the peptide/liposome interaction at pH 4.5 was determined by fitting the OneToOne model to the experimental sensorgrams using Trace Drawer™ software. Our experimental approach showed that the HA2 peptide at a concentration up to 100 µM produced no disruption of liposomes at pH 4.5.

GRAPHICAL ABSTRACT

<figure><img src="image_95.png" /></figure>

INTRODUCTION

Surfaces coated with liposomes are excellent biomimetic systems as their structure is similar to cell membranes and other biological barriers mostly consisting of phospholipids. We have used
herein these functional surfaces to study their interaction with HA2 peptide. The HA2 peptide
is a 20 amino acid sequence derived from the N-extremity of the second hemagglutinin subunit
(HA2) of the Influenza virus.¹ Here, we studied the HA2 peptide with a glutamic acid-
substituted glycine at position 4 of the wild-type sequence. Higher fusion efficiency has been
proven with this variant.² The COOH end was also modified by adding GGYC amino acids as
described in a previous work.³ The HA2 peptide variant is referred to as E4-GGYC throughout
this paper. During infection, the hemagglutinin of the Influenza virus operates structural
rearrangements through acidification (pH ≤ 6), which allow its N-terminal fusogenic sequence
to enter the target endosomal membrane.⁴ Structural studies carried out on the HA2 peptide
have shown that it adopts an α-helical conformation to trigger fusion.⁵ The three glutamic acids
and one aspartic acid residues of the E4-variant are protonated at low pH, inducing a
conformation change to a rigid α-helix conformation.²,⁶ Luneberg *et al.* studied the interaction
mechanism of the HA2 peptide with phosphatidylcholine liposomes as model membrane.⁷ The
fusogenic properties of the HA2 peptide mainly results from the amphipathic structure of the
α-helix, all glycines of the sequence being located on one side of the helix, whereas the bulky
hydrophobic residues are found at the opposite side of the helix.⁷ They found an oblique
insertion of the peptide into the lipid bilayer with an angle of about 45 ° between the helix axis
and the membrane plane using FTIR spectroscopy. This angle was 30 ° from theoretical
calculations in another reference.⁸ The interaction of the AcE4K analog of HA2 peptide with 1-
stearoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine liposomes was also investigated by Zhelev *et al*. They
showed the pH-dependent partitioning in the membrane and the reversibility of the binding, by
circular dichroism and fluorescence experiments. They also hypothesized the formation of
pores within the membrane at low pH (pH 4.0–4.5), which could cause the leakage of
internalized solutes.⁶ The membrane-disrupting properties of HA2 peptide was studied by a
liposome leakage assay based on the release of calcein encapsulated inside the vesicles.² The
peptide caused such leakage only at acidic pH, between 4.0 and 6.5. This active peptide with regard to the cell membrane was used to develop new therapeutic approaches. HA2 peptide-polylysine conjugate was developed as a gene-transfer vehicle.² The conjugate was shown to package nucleic acids as a vector that can be released from the endosome under the acidification process. This peptide was also bound on the surface of an oil-in-water nanoemulsion to facilitate transfection and endosome release.³

In recent years, several research papers have been devoted to the study of the mechanisms of interaction between various types of peptides and either lipid bilayers ⁹⁻¹² or intact liposome layers ¹³⁻¹⁵ supported on solid substrates. These studies were monitored by surface plasmon resonance (SPR), an optical technique based on evanescent waves. SPR is a labeling-free technique suitable for real-time monitoring of interactions between lipid layers bound to the SPR chip surface and their partners in solution (i.e. peptides), providing an estimation of binding affinity and kinetic constants. The thickness (d) and the mean refractive index (n) of the layers deposited on the substrate can also be extracted from the MP-SPR signal through the optical modeling of the full angular spectra.¹⁶⁻¹⁸ These parameters allow a clear description of the layers before and after the interaction with peptides.

Here, we report the monitoring of E4-GGYC interactions with a liposome-supported substrate using a dual-wavelength multi-parameter surface plasmon resonance (MP-SPR) approach based on the Kretschmann configuration. This biomimetic surface elaborated with preformed liposomes (average diameter < 100 nm) is well suited to study the specific interactions with biomolecules. In a previous work, the rupture of liposomes by interaction with mono-rhamnolipid, an amphiphilic biomolecule, was characterized by MP-SPR.¹⁹

In this study, several sets of SPR sensorgrams were collected with different concentrations of E4-GGYC interacting with liposome-coated surfaces at pH 4.5 and pH 8 so as to investigate their dynamic interactions expressed in terms of the association rate constant ($k_a$), dissociation
rate constant ($k_d$) and equilibrium dissociation constant ($K_D$). The SPR angular spectra
calculated using the dual-wavelength Fresnel-layer modeling with Layer Solver™ software
were fitted to the experimental sensorgrams to estimate the kinetic variation of the thickness
(d) and in the refractive index (n) of the liposome layer.

Complementary information pertaining to interactions between liposomes and E4-GGYC in 3D
solution was obtained from Dynamic Light Scattering (DLS) and NanoSight (Nanoparticle-
Tracking Analysis, NTA).

MATERIALS AND METHODS

**Chemicals.** Hydrogenated soybean phosphatidylcholine HSPC (Phospholipon 90 H) was a generous gift of Lipoid company, 1,2-distearoyl-*sn*-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG), cholesterol (99 %), 11-mercaptoundecanoic acid (MUA), 11-amino-1-undecanethiol hydrochloride, 1-dodecanethiol, streptavidin, 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), ethanolamine, Triton X-100, NaCl, sodium dihydrogen phosphate (NaH₂PO₄), disodium hydrogen phosphate (Na₂HPO₄), tris(hydroxymethyl)aminomethane and mono-rhamnolipid (mono-RL) R95Md (95 % pure rhamnolipids, mono-rhamnolipid dominant) produced by AGAE Technologies LLC (USA) were purchased from Sigma-Aldrich. Chloroform (99.8 %) was from Fisher Chemical, diethyl ether was from Carlo Erba, methanol was from VWR company, and 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) was from Dominique Dutcher company. Ultrapure water was obtained using a Milli-Q system (resistivity = 18.2 MΩ·cm).

The peptide sequence E4-GGYC was purchased from BioMérieux company. This variant was
described by Wagner *et al.*² as a highly pH-sensitive membrane-interacting peptide. Its
sequence derived from the N-end of the second hemagglutinin subunit (HA2) of the Influenza
virus was NH₂-GLFEAIAGFIENGWEGMIDGGGYC-COOH (molar mass = 2506.8 g/mol).

The E4-GGYC purity was 75 % based on HPLC analysis (see Figure S1 in supporting information). The peptide concentration was determined using UV-Vis absorbance (Varian CARY100 Bio) at 280 nm in pH 7 PBS buffer, using the extinction coefficient ε = 6990 (1/M.cm). All experiments were carried out using freshly prepared solutions.

**Preparation of biotinylated liposomes.** Biotinylated liposomes were prepared using the Bangham's "thin layer rehydration" technique²⁰ and a slightly modified protocol from that developed by Zhao *et al.*²¹ for the preparation of small (< 100 nm) liposomes. HSPC, DSPE-PEG and cholesterol (610.8 mg, 9.8 mg and 200 mg respectively) were dissolved in 75 mL of a mixed organic solvent: chloroform, diethyl ether and methanol (5.75:5.75:1 v/v). The amount of biotinylated phospholipids was 1.5 wt % of the total phospholipids. Organic solvents were then evaporated under a reduced pressure of 0.05 MPa in a water bath at 50 °C for 3 hrs using a rotary evaporator (Buchi Rotavapor R-114 with Heating Waterbath B-480 & Glassware-Acomertial). The thin transparent layer in the round bottom flask was hydrated with 25 mL of water at 60 °C by rotating the container for 1 h until the thin layer was completely dispersed in water and a milky suspension was obtained. In order to obtain a homogeneous mixture and reduce the average size of the liposomes, the solution was sonicated for 20 min with a UP400S ultrasound device (Hielscher – Ultrasound Technology Company) at 60 kHz in an ice bath.

**Biotinylated liposome characterizations.** Hydrodynamic diameters of the liposomes before and after their interaction with E4-GGYC in solution were measured at 25 °C using two methods:

- Dynamic Light Scattering (DLS) with a Zetasizer NanoZS instrument (Malvern Panalytical, Palaiseau, France) operating in backscattering mode at an angle of 173 °. A disposable polystyrene cuvette was filled with 3 mL of a diluted liposome suspension (1:10) in a 0.15 M NaCl solution and in PBS buffers (0.1 M NaH₂PO₄, 0.05 M NaCl, pH 4.5) and (0.1 M
$Na_2HPO_4$, 0.05 M NaCl, pH 8). Diameters were calculated based on the intensity distribution of data; they were given as average hydrodynamic diameters ± standard deviation (SD) from three independent measurements with a polydispersity index (PdI).

- NanoSight NS300 (Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK), equipped with a NS300 flow-cell top plate and a laser diode operating at 405 nm. The data were analyzed using NanoSight Nanoparticle-Tracking Analysis NTA 3.4 Build 3.4.003 software. Liposomes were diluted 2.5×10⁵-fold in PBS due to the relatively low particle concentrations that are required for NTA measurements (10⁸–10⁹ liposomes/mL).²² 500 µL of the liposome solution was incubated with 500 µL of peptide at the final concentrations of 0, 0.5, 2, 5, 7, 10, 25, 50, 75 and 100 µM in PBS at pH 4.5 or pH 8, for 30 min at room temperature. Afterward, 1 mL of each sample was injected into the viewing chamber with a 1 mL syringe. The temperature was maintained at 25 °C. For each measurement, three 30 s videos were captured by a sCMOS camera level of 16 and analyzed by NanoSight NTA Software. The liposome sizes were expressed as the calculated means ± standard deviation (SD) of size distribution.

The surface potential of the liposomes was determined by ζ-potential measurements using a NanoZS Zetasizer instrument (Malvern Panalytical). The measurements were carried out in folded capillary cells DTS 1070 (Malvern Instruments) filled with 800 µL of a diluted liposome suspension (1:10) in 0.15 M NaCl solution, PBS at pH 4.5 and pH 8, and equilibrated at 25 °C for 60 s.

**SPR gold chip surface preparation.** The SPR gold chips were obtained from BioNavis (BioNavis Ltd., Ylöjärvi, Finland). They are composed of a glass plate, 240 mm² in surface area coated with a 3 nm-thick Cr adhesive layer and a 50 nm-thick gold layer. To remove surface contamination, the SPR gold chips were cleaned before use by a microwave induced plasma (UHP-MW-PC, Diener electronic company, Stuttgart, Germany). Then, the slides were sonicated for 5 min in acetone and next in ultrapure water.
In order to form a dense self-assembled monolayer (SAM) on the gold surface, the Au substrates were dried under a nitrogen flow and immediately immersed in a 1 mM ethanolic solution of 11-mercaptoundecanoic acid (MUA) (acidic SAM), 11-amino-1-undecanethiol hydrochloride (amino SAM), or 1-dodecanethiol (alkyl SAM) for 20 hrs at 4 °C. The chips were then rinsed with ethanol and dried under a gentle nitrogen flow. SPR gold chips functionalized with the different SAMs were stored in an ultrapure water bath and used directly for liposome immobilization.

The streptavidin-coated SPR chip was prepared by derivation of the MUA chip. The latter was incubated in 100 µL of a mixture of 0.2 M EDC and 0.05 M NHS in MES buffer (5 mM MES, pH 5) for 2 hrs at room temperature to activate the carboxylic groups. The activated surfaces were washed in 1 mL of MES buffer and then incubated in 100 µL of a streptavidin solution (1 mg/mL) in PBS (0.1 M NaH₂PO₄/ Na₂HPO₄, 0.15 M NaCl, pH 7) for 12 hrs at room temperature. Afterwards, the SPR chip surfaces were rinsed with 1 mL of MES buffer, incubated in 100 µL of 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane (pH = 8.1) or 10 mM 3-dimethylaminopropylamine (pH = 10.0) or 10 mM lysine (pH = 10.5) aqueous solutions for 30 min in order to deactivate all the residual active sites possibly responsible for non-specific binding, and finally rinsed again in 1 mL of ultrapure water.

**Multi-parametric-surface plasmon resonance (MP-SPR) measurements.** MP-SPR measurements were simultaneously performed at room temperature in both flow channels, at the wavelengths of 670 and 785 nm, with a MP-SPR Navi™ 200 OTSO instrument (BioNavis Ltd., Ylöjärvi, Finland). The intensity of the reflected light was measured at a resonant angle between 40 ° and 78 ° and all dual-wavelength SPR experiments were processed using the BioNavis Data viewer software.

**Atomic Force Microscopy (AFM).** AFM was used to investigate the surface morphology of the deposited liposomes on a solid surface. Measurements were carried out using Atomic Force
Microscopy (AFM) operating in tapping mode (Nano-Observer AFM Microscope – CSInstrument.eu, Les Ulis, France). A liposome concentration of 1×10¹⁴ lipo/mL in PBS buffer (pH 4.5) was directly adsorbed on the cleaned SPR gold chip and on the streptavidin-functionalized SPR gold chip for 4 min at a flow rate of 50 µL/min and the excess of liposomes was subsequently washed. The chip was removed from the MP-SPR instrument, and about 1 mL of PBS buffer (pH 4.5) was gently deposited on the surface to prevent drying during AFM analysis. Topographic images were taken using AppNano Fort A tips with a normal spring constant of 0.6 - 3.7 N/m and a frequency of 30 kHz in liquid medium. Topographic images were generated at different positions of each sample. AFM images were treated with the free software Gwyddion.

**Analysis of E4-GGYC interaction with immobilized liposomes.** The interaction between E4-GGYC and immobilized liposomes was assessed using the MP-SPR method. After inserting the SPR gold chips functionalized with streptavidin into the BioNavis system, a continuous flow (50 µL/min) of PBS at pH 4.5 or pH 8 was firstly injected for approximately 20 min until a stable baseline was reached. After stabilization of the signal intensity, a liposome concentration of 1×10¹⁴ lipo/mL in PBS at pH 4.5 or pH 8 was injected on the streptavidin surface in both flow channels for 4 min at a flow rate of 50 µL/min. The liposome layer thereby formed on the surface was then used as a model cell membrane surface to study the interaction with E4-GGYC. Peptide solutions were prepared immediately before injection by diluting the E4-GGYC mother solution in the desired volume of PBS buffer.

A peptide concentration range of 5-100 µM was injected onto the liposome layer. Initial concentrations of 5, 10, and 25 µM were injected for 4 min at a flow rate of 50 µL/min onto a newly prepared liposome-functionalized chip. High concentrations of 50, 75 and 100 µM were successively injected in a serial configuration onto the same liposome-functionalized chip for 4 min at a flow rate of 50 µL/min.
Each injection was followed by a washing step with the PBS buffer at 50 µL/min until the signal was stabilized to obtain a new baseline before another injection could be done. As the liposomes were immobilized on two flow cells, one was used for sample injection and the other was used to inject PBS buffer as reference. The MP-SPR signals vs. time at different E4-GGYC concentrations were recorded. Measurements were triplicated for each E4-GGYC concentration.

**Kinetic study of the binding.** In order to evaluate the immobilization of liposomes and the binding of E4-GGYC to liposomes, Trace Drawer™ for SPR Navi™ software was used to calculate kinetic parameters and affinity constants. For the calculations, the resulting sensorgrams were extracted via the SPR Navi™ Data viewer software and the dissociation constants ($K_D$) were calculated.

**Biophysical analysis by MP-SPR.** The SPR software Navi LayerSolver™ v. 1.2.1 (BioNavis Ltd., Ylöjärvi, Finland), provided as software associated with the MP-SPR instrument, employs the Fresnel-layer matrix formalism²³ to determine the thickness (d) and refractive index (n) of thin layers for a variety of biological applications.¹⁷⁻¹⁸, ²⁴⁻²⁵ In the LayerSolver™ analysis software, the reflection spectra calculated from the Fresnel multilayer equations for p-polarized light at both laser wavelengths (670 and 785 nm) were fitted to the experimental SPR reflection spectra to simultaneously determine d and n of the layer at the same time and at the same point.¹⁷,²³ Each layer was treated as an optically homogeneous and independent layer, and characterized by its thickness (d) and its complex refractive index ($\tilde{n}$)²⁶ defined by equation 1:

$$ \tilde{n} = n + ik \quad (1) $$

where n is the real part of the complex refractive index that corresponds to the refraction of light and k is the imaginary part corresponding to the absorption of light by the layer.

An algorithm-based dual-wavelength method was used in this work to calculate the optical parameters of the multilayer system. The thickness value (d) was defined as a global variable
for both wavelengths, whereas the complex refractive index was considered as an independent variable for the metal layer modeling ($k \neq 0$) and as a linearly dependent variable between the two wavelengths used for the other organic layers that do not absorb light ($k = 0$). The refractive index of the layer for the second wavelength, $n_{\lambda2}$, was calculated using equation 2.

$$n_{\lambda2} = n_{\lambda1} + \frac{dn}{d\lambda} \times (\lambda2 - \lambda1) \quad (2)$$

**Mono-rhamnolipid interaction with immobilized liposomes.** The same protocol as previously described was used to prepare a liposome layer immobilized on a streptavidin-functionalized gold chip passivated with TRIS. The signal was stabilized for 4 min at a flow rate of 50 µL/min in PBS (pH 4.5). Then, a solution of 25 µM E4-GGYC in PBS pH 4.5 was injected at a flow rate of 12 µL/min for 15 min in channel 1, and in parallel, PBS pH 4.5 was injected at a flow rate of 12 µL/min for 15 min in channel 2. Then, a solution of 50 µg/mL mono-RL in PBS pH 4.5 was injected at a flow rate of 50 µL/min for 4 min. The SPR signal was measured at 670 and 785 nm.

## RESULTS AND DISCUSSION

**Physicochemical characterization of liposome samples.** Biotinylated liposomes were prepared to develop the biomimetic model membrane. Dynamic light scattering (DLS) was used to measure their mean hydrodynamic diameter and the polydispersity index (PdI) in 0.15 M NaCl solution, and in PBS at pH 4.5 and pH 8. The zeta potential of the liposomes was measured on the basis of their electrophoretic mobility. The physicochemical characterizations are given in Table 1.

**Table 1.** Characterization of liposomes. The average hydrodynamic diameters and zeta potentials are given as mean values ± standard error of the mean (sem) of three independent measurements. The sem was calculated with equation (S1) (see section 1 in supporting information).
<table><thead><tr><th>Sample</th><th>Diameter (nm)</th><th>PdI <sup>a</sup></th><th>Zeta potential (mV)</th><th>C<sub>p</sub> <sup>b</sup> (mM)</th><th>C<sub>1</sub> <sup>c</sup> (lipo/mL)</th><th>RI <sup>d</sup></th></tr></thead><tbody><tr><td>Liposomes/0.15 M NaCl solution</td><td>94 ± 3.7</td><td>0.14</td><td>-6.6 ± 0.8</td><td>31</td><td>1.94×10<sup>14</sup></td><td>1.338</td></tr><tr><td>Liposomes/PBS pH 4.5</td><td>98 ± 1.1</td><td>0.15</td><td>-2.1 ± 0.5</td><td>31</td><td>1.80×10<sup>14</sup></td><td>1.334</td></tr><tr><td>Liposomes/PBS pH 8</td><td>99.6 ± 1.2</td><td>0.14</td><td>-4.0 ± 0.6</td><td>31</td><td>1.73×10<sup>14</sup></td><td>1.336</td></tr></tbody></table>

<sup>a</sup> Polydispersity index, <sup>b</sup> Concentration of phospholipids, <sup>c</sup> Concentration of liposomes, <sup>d</sup> Refractive index

In the different solutions, the liposomes presented an average size smaller than half the value of both wavelengths used in the MP-SPR device, so the SPR evanescent field could penetrate the entire liposome layer. The liposomes maintained their hydrodynamic diameters as well as their negative zeta potential in solution over a period of 6 months ensuring an efficient electrostatic repulsion between them, which prevents their aggregation. Each liposome suspension was carefully controlled for liposome size and ζ-potential before each MP-SPR experiment.

**Measurement of the equilibrium dissociation constant K<sub>D</sub> of liposome interaction with the functionalized surfaces.** The gold surfaces were modified with different self-assembled monolayers (SAMs) of functional α,ω-alkanethiols with varying terminal groups (–CH<sub>3</sub>, –COOH, and –NH<sub>2</sub>) or with a streptavidin layer, following protocols described in a previous work.<sup>19</sup> Then, liposome immobilization on these surfaces was studied by recording the SPR signal upon injection of different concentrations of the liposome suspension. The binding affinity was assessed by the shift of the SPR angle position θ<sub>SPR</sub> resulting from the change of refractive index induced by liposome binding. The equilibrium dissociation constants K<sub>D</sub> of the interaction between biotinylated liposomes and the –CH<sub>3</sub>, –COOH, –NH<sub>2</sub> (see Figure S2 and S3 in supporting information) and streptavidin (Figure S4) functionalized surfaces were
calculated from the different sensorgrams, and displayed in Table 2 (See supporting information in section 3).

**Table 2.** Binding affinity of liposomes with different functionalized gold surfaces. The dissociation constants ($K_D$), expressed as molar concentrations of phospholipids, were obtained from the fitting of the sensorgrams extracted with MP-SPR Navi Data viewer. Data were calculated using the “Affinity” model for (–CH₃, –COOH, –NH₂) surfaces and the “OneToOne” model for the streptavidin surface.

<table><thead><tr><th>Surface</th><th><i>K</i><sub>D</sub> (M)</th></tr></thead><tbody><tr><td>–CH<sub>3</sub></td><td>7.20 × 10<sup>–4</sup> ± 1.01 × 10<sup>–4</sup></td></tr><tr><td>–COOH</td><td>1.09 × 10<sup>–4</sup> ± 0.74 × 10<sup>–4</sup></td></tr><tr><td>–NH<sub>2</sub></td><td>2.06 × 10<sup>–5</sup> ± 1.20 × 10<sup>–5</sup></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>9.44 × 10<sup>–12</sup> ± 1.02 × 10<sup>–12</sup></td></tr></tbody></table>

The results show decreasing dissociation constants $K_D$ corresponding to the increasing affinity of liposomes to the functionalized surface. The affinity increases following the order CH₃ < COOH < NH₂ < streptavidin. The interaction with CH₃, COOH and NH₂ surfaces were driven by either hydrophobic or electrostatic interactions as described in the literature ¹⁹,²⁷ whereas liposome anchoring on the streptavidin layer showed a very strong affinity resulting from the presence of biotin on the liposome surface. The $K_D$ for streptavidin is of the same order of magnitude as that of biotin-streptavidin affinity constant.²⁸⁻²⁹ The latter protocol was selected to elaborate a highly stable liposome-functionalized surface to study the E4-GGYC interaction via MP-SPR.

As a preliminary experiment, the possible unspecific adsorption of the peptide on the streptavidin layer was checked by injection of a 10 µM peptide solution on the streptavidin-functionalized surface that has been passivated by either 10 mM of an aqueous solution of either
tris(hydroxymethyl)aminomethane (TRIS), 3-dimethylaminopropylamine (DMAP), or lysine
for 30 min. The peptide was injected in PBS buffer (pH 4.5) for 4 min, followed by a washing
step in PBS at pH 4.5 (see Figure S5 in the supporting information). E4-GGYC adsorption on
the streptavidin surface passivated with both DMAP and lysine generated a significant increase
of the SPR signal, with ΔθSPR of ca. 0.73 ° and 0.53 ° respectively. Conversely, a negligibly
small signal was obtained with the TRIS-passivated surface, indicating a very low degree of
unspecific binding. The TRIS protocol was selected to passivate surfaces functionalized with
liposomes.

Biotinylated liposomes were deposited on the streptavidin-covered SPR gold chip at a concentration of 1×10¹⁴ lipo/mL in PBS buffers at pH 4.5 and pH 8. Successful immobilization of the liposome was evidenced by first recording the full SPR angular spectrum. Injection of liposomes at both pHs resulted in fast deposition and generated a significant shift in the SPR angular peak minimum of ca. 1.80 ° and 1.75 ° at pH 4.5 and pH 8 respectively, compared to the streptavidin layer (see Figures 1 and S6). The thickness values of the deposited liposome layer at both pHs, before and after rinsing with PBS, and calculated from the fitting of the corresponding SPR curves with LayerSolver™ Software did not show any significant difference. An average thickness of 83 nm and 93 nm of the liposome layer was obtained at pH 4.5 and pH 8 respectively.

The morphology of the streptavidin surface coated with liposomes was characterized by AFM
in order to highlight the quality of liposome deposition. Liposomes are challenging objects to
image by AFM due to their tendency to collapse during observations because of interactions
with the tip.³⁰⁻³³ As a reference, the gold surface roughness was measured through its root mean
square roughness (RMS ≅ 1.53 nm for images of 2.5×2.5 µm² area) (see Figure S7 in the
supporting information).
<figure><img src="image_96.png" /><figcaption>**Figure 1.** MP-SPR sensorgram of the liposome adsorption on a streptavidin functionalized surface before AFM measurement (a), and AFM topographic image by tapping-mode of the liposome-functionalized surface (b).</figcaption></figure>

The AFM image of liposomes deposited on the streptavidin-functionalized gold surface shows a strong covering of the surface by globular objects (Figure 1). We observed a granulated surface, covered by intact liposomes with an average height slightly greater than 70 nm, close to the mean diameter of liposomes in aqueous suspension. The covering was formed by a monolayer of liposomes, lighter areas of the image may correspond to larger liposomes. These results showed that the biotin-streptavidin interaction promoted the adhesion of a dense layer of liposomes without changing their shape. This result is in agreement with the AFM characterization of biotinylated liposomes interacting with a streptavidin-functionalized glass surface reported by Takechi-Haraya *et al.*<sup>33</sup> showing that the shape of the liposomes was not impacted by their immobilization.

**MP-SPR analysis of peptide interaction with the model membrane.** The interaction of E4-GGYC with liposome-coated surface was investigated by recording full SPR angular spectra as a function of time. 5, 10 and 25 µM peptide solutions in PBS pH4.5 were injected at a constant flow rate of 50 µL/min.
<figure><img src="image_97.png" /></figure>

**Figure 2.** Superimposed sensorgrams (normalized peak angular position vs time) recorded during injection of 5–25 µM E4-GGYC peptide at pH 4.5 on the liposome-functionalized surface. The arrows indicate the positioning for *d* and *n* calculations (Table 3) at 670 nm.

Figure 2 shows that the interaction of the peptide with the liposome layer induced an increase in the SPR signal at pH 4.5. This increase was related to the concentration of peptide during the injection. It is worth noting that the injection of 10 µM of peptide at pH 4.5 resulted in an angle change of approximately + 0.02 °, whereas no significant change in the SPR angle was measured when the same concentration was allowed to interact with only the streptavidin layer passivated with TRIS (see Figure S5 in the supporting information). This confirmed that the signal variation measured during peptide interaction with the liposome layer reflects the actual peptide-liposome interaction and not peptide-streptavidin interaction.

Most notably, the sensorgrams indicate that the peptide/liposome association process is rapid, and reaches a stable state during the peptide injection. This suggests that the peptide is adsorbed onto or inserted into the lipid bilayer of liposomes during the injection period. Relative reversibility of the interaction was observed when the injection solution was changed to PBS solution at pH 4.5.

Figure 3 shows the measured and fitted SPR curves from real-time experiments after each injection of peptide onto the liposome layer at pH 4.5. The main SPR peak angular position shifted to higher angles with the addition of increasing concentrations of peptide at pH 4.5. The
curves were fitted separately with LayerSolver™ software, by considering each layer as a single
optically homogeneous layer. The fit of this model to the experimental data was very good.

<figure><img src="image_98.png" /></figure>

**Figure 3.** SPR peak full angle scans measured at 670 nm of the liposome-supported surfaces after injection of 5–25 µM E4-GGYC solutions at pH 4.5 (solid curves), with corresponding fits from LayerSolver™ modeling (dotted curves). The SPR curve corresponding to each concentration was taken at the equilibrium of peptide/liposome interaction for the modeling by LayerSolver™ software.

The modeling was started by determining the optical properties of the layers constituting the
functionalized SPR gold chip, such as the chromium 'Cr' adhesion layer and the gold 'Au' layer
of the cleaned SPR gold chip, as well as the two organic deposited layers of MUA and
streptavidin. These calculations were based on the stepwise numerical iteration procedure in
LayerSolver™, where the previous layer acted as a background to solve the optical parameters
of the next layer.¹⁹ The obtained parameters were maintained fixed and used as a basis for
calculating the optical thickness (d) and the real refractive index (n) of the deposited liposome
layer before and after injection of the different peptide concentrations.
The experiments were performed maintaining the same buffer for i) liposome deposition, ii) E4-GGYC binding, and iii) washing step to minimize the variation in refractive index caused by the buffer and to facilitate the interpretation of the experimental data.

According to the calculation, the addition of liposomes in PBS to the streptavidin surface generated a layer with an average thickness of *d* = 83 nm and a refractive index of *n* = 1.34997 at pH 4.5. The refractive index values of the liposome layer give an indication of the lipid/buffer ratio in the liposomes. The refractive index of the phospholipid reported in the literature was around 1.435–1.450,³⁴ while that of PBS was of 1.3352 at pH 4.5 (experimental data).

The resulting SPR curve in Figure S6.a (blue curve) showed a full SPR angular spectra without the formation of a waveguide peak in the vicinity of the total internal reflection (TIR) angle.¹⁷,²⁶ This was due to the fact that the liposome thickness formed on the surface was well below the penetration depth of the evanescent field ($< 1/2 \lambda_1 $ and $1/2 \lambda_2$). In this case, the SPR evanescent field allowed the detection of extremely small optical changes in the liposome layer during interaction with peptides. The variation of thickness (*d*) and refractive index (*n*) of the liposome layer during interaction with E4-GGYC were calculated from SPR LayerSolver™ simulations. Data are presented in Table 3. Figure 4a-b illustrate, in graph form, the variation of the calculated optical parameters (*d* and *n*) for the liposome layer as a function of injected peptide concentration at pH 4.5. The modeling was performed before and after the washing step with PBS.

**Table 3.** Thickness (*d*, *nm*), refractive index (*n*, *RIU*) of the liposome layer as well as the phospholipid concentration (*Cp*, *g/cm³*) after each E4-GGYC injection (5-25 µM) and after each washing with PBS at pH4.5. The values represent the average (± standard deviation) of three independent calculations by the SPR LayerSolver™ simulation.
<table><thead><tr><th>Peptide concentration (µM)</th><th>During peptide injection</th><th>Washing with PBS pH4.5</th></tr></thead><tbody><tr><td>5</td><td>d = 86.62 ± 1.00<br>n = 1.34041 ± 0.00120<br>Cp=0.08585 ± 0.00265</td><td>d = 84.03 ± 0.98<br>n = 1.34381 ± 0.00100<br>Cp=0.08849 ± 0.00072</td></tr><tr><td>10</td><td>d = 92.05 ± 0.70<br>n = 1.33974 ± 0.00050<br>Cp=0.08078 ± 0.00045</td><td>d= 86.06 ± 0.80<br>n = 1.34200 ± 0.00150<br>Cp=0.08641 ± 0.00133</td></tr><tr><td>25</td><td>d = 93.70 ± 0.90<br>n= 1.33886 ± 0.00100<br>Cp=0.07936 ± 0.00152</td><td>d = 86.27 ± 1.10<br>n= 1.34030 ± 0.00080<br>Cp=0.08620 ± 0.00121</td></tr></tbody></table>

Pure liposome layer; d= 83.30 nm, n=1.34997, Cp=0.08925 g/cm³

<figure><img src="image_99.png" /></figure>

<figure><img src="image_100.png" /></figure>