# Etude métabolomique de la réponse au stress de lins déficients en lignanes

Kamar Hamade¹, Ophélie Fliniaux¹, Jean-Xavier Fontaine¹, Elvis Otogo Nnang¹, Roland Molinié¹, Anthony Quéro¹, Julie Pascal¹, Solène Bassard¹, Stéphanie Guénin², Laurent Gutierrez², Eric Lainé³, Christophe Hano³, Akram Hijazi⁴, Assem El Kak⁴, François Mesnard¹

1.BIOPI, EA3900, UPJV, 80000 Amiens, France; 2. CRRBM, UPJV, 80000 Amiens, France; 3. LBLGC, EA1207, 28000 Chartres, France; 4. VRNPS, Université Libanaise, Hadath, Liban

## INTRODUCTION

Les lignanes sont des composés polyphénoliques largement distribués dans le monde végétal. Le lin, cultivé pour son huile ou sa fibre, renferme de grandes quantités d'un lignane de type dibenzylbutane: le sécoisolaricirésinol, qui est stocké dans le tégument de la graine sous forme diglucosylée, dans une macromolécule contenant de nombreux composés phénoliques assemblés par des liaisons esters [1].

Le rôle de ces molécules in planta n'est pas clairement élucidé ; un rôle potentiel dans les mécanismes de réponse aux stress est toutefois proposé [3].

Une enzyme clé de la biosynthèse du sécoisolaricirésinol est la PLR (Pinorésinol Laricirésinol Réductase).

Des lins RNAi PLR ont montré l'absence d'accumulation de SDG dans les graines [4]

## OBJECTIF

Il est envisagé dans cette étude métabolomique de comparer le contenu en métabolites (semi-)polaires de lins accumulant du SDG ou non, en condition de stress osmotique ou en condition témoin.

<figure><img src="image_1.png" /><figcaption>Voie de Biosynthèse de SDG</figcaption></figure>

## MATERIELS ET METHODES

### Matériel végétal

<figure><img src="image_2.png" /></figure>

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### Extraction de métabolome des racines de Lin

<figure><img src="image_4.png" /></figure>

### Traitement de données

#### Acquisition RMN

Phasage automatique des spectres 1H
(Topspin 3.2)

Réalignment des spectres (package
"icoshift"):

- Par jour de prélèvement

- Par condition

- Par organe étudié
  (MatLab 2014b)

Découpage en bins (package "dab") et
integration.

Suppression des zones de MeOH, H2O, PEG.

Suppression de bruit (1x) (MatLab 2014b)

ACP score plot (SIMCA-P software)

#### Acquisition LC-MS

Acquisition et Processing
(Lab Solutions system software)

Conversion des données (*.lcd) en
formats CDF (*.cdf) (Lab Solutions)

Alignement et integration des pics
(XS-MS software)

OPLS-DA score plot (SIMCA-P
software)

### Acquisition par RMN et LC-MS

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<figure><img src="image_6.png" /></figure>

LC-MS-ESI simple
Quadrupole Shimadzu

#### Acquisition RMN

- RMN 600 MHz TXI-5mm
Bruker

- NOESY 1D

- TopSpin version 3.2

#### Acquisition LC-MS

- Colonne: Supelco C18
150x2 mm, 3µm

- Débit: 0.4 mL/min, T:30°C

- A: 95%-5% (H2O+0.1% HCOOH)

- B: 5%-95% (MeOH)

## RESULTATS

### RMN

<figure><img src="image_7.png" /><figcaption>ACP score plot des données RMN 1H de 32 spectres des racines de Lin en condition contrôle (Vert) ou stressé (Bleu) à jour 1. 434 bins ont été integrés et pris en compte.</figcaption></figure>

#### Effet stress

<figure><img src="image_8.png" /></figure>

#### Effet lignée

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>Ratio PEG/CT (effet stress) et AM/CT (effet lignée) en log10, des 14 métabolites influençant le plus de la séparation des variables au niveau de l'ACP (ci-dessus). \* p<0.1</figcaption></figure>

## CONCLUSION ET PERSPECTIVE

Les premières analyses réalisées en RMN et en LC-MS sur les extraits racinaires montrent une différence du profil métabolique due à la lignée de lin utilisée (avec ou sans le transgène RNAi PLR) ainsi que des variations métaboliques qui apparaît plûtot chez le WT que le AM dès le jour de l'application du stress osmotique.

Ces résultats pourront être combinés aux résultats sur l'analyse des racines ayant subi un stress plus long pour avoir la cinétique de réponse au stress. Ensuite, l'analyse des autres organes permettra d'avoir une vue plus large de la réponse globale de la plante au stress.

Le CP1 et CP2 expliquent 64.8% de la variabilité des données.

-WT semblent être fortement touchés par le stress hydrique, dès le jour 1 d'application (Séparation des racines contrôles et stressées, apparitions de 2 groupes).

-Pas d'apparition de l'effet du stress à jour 1 chez le mutant (AM), les individus AM contrôle sont proches des AM stress.

### LC-MS

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>OPLS-DA score plot des données LC-MS de 32 spectres des racines de Lin de WT (Bleu) et PiAM (Vert) en condition contrôle et stressé à jour 1. 95 pics ont été integrés et pris en compte</figcaption></figure>

### Effet lignée

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m/Z=869.4

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m/Z=523.2

<figure><img src="image_13.png" /></figure>

Concentration relative des 8 métabolites influençant le plus la séparation des variables au niveau de OPLS-DA (ci-dessus). Intégrations des métabolites à partir de spectre de masse de racine de WT et AM à jour 1 en condition control et stressé. Une moyenne de (n=8) pour chaque condition a été effectuée, l'ecart type moyen est représenté.

m/Z=257.1

<figure><img src="image_14.png" /></figure>

m/Z=588.3

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m/Z=179.0

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m/Z=537.2

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m/Z=268.0

<figure><img src="image_18.png" /></figure>

m/Z=680.9

<figure><img src="image_19.png" /></figure>

## REFERENCES

1. Ford, J. D., Huang, K. S., Wang, H. B., Davin, L. B., & Lewis, N. G. (2001). *Journal of natural products*, **64**(11), 1388-1397.

2. Gutte, K. B., Sahoo, A. K., & Ranveer, R. C. (2015). *International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research*, **31**, 42-51.

3. Davin, L. B., Jourdes, M., Patten, A. M., Kim, K. W., Vassao, D. G., & Lewis, N. G. (2008). *Natural product reports*, **25**(6), 1015-1090.

4. Renouard, S., Tribalat, M. A., Lamblin, F., Mongelard, G., Fliniaux, O., Corbin, C., ... & Hano, C. (2014). *Journal of plant physiology*, **171**(15), 1372-1377.