## 4.1 Le modèle du spermatozoïde humain

En 2019, nous avons commencé une nouvelle collaboration avec une équipe du laboratoire IMOST et le service de reproduction du CHU de Clermont-Ferrand dans un projet financé par la Ligue contre le Cancer que porte le Dr Hanaë Pons. L'étude de la morphologie nucléaire est au cœur de ce projet qui vise notamment à examiner les modifications de la structure tridimensionnelle du noyau des spermatozoïdes humains dans un modèle de thérapie par irradiation (IRA-thérapie). Les éventuelles modifications de la chromatine pendant ces processus seraient alors proposées comme un indicateur de leur qualité.

L'IRA-thérapie est un traitement par iode Radioactif ($I^{131}$) pour soigner le cancer de la thyroïde, la 3e cause de cancer chez l'homme en âge de procréer. Ce traitement peut altérer la spermatogenèse avec le risque d'une stérilité. Les recommandations préconisent une cryoconservation préventive des gamètes. A ce jour, l'impact de la cryoconservation et de ce type d'irradiation sur la qualité des spermatozoïdes humains est encore mal connu. Afin de mieux quantifier l'impact de l'IRA-thérapie, l'équipe d'Hanaë Pons utilise un modèle d'exposition radioactive de spermatozoïdes humains in vitro mimant celles des gonades dans le cadre d'une irradiation par l'Iode$^{131}$. La morphologie du noyau et l'organisation de la chromatine doivent être étudiées par imagerie 3D en utilisant NucleusJ2.0 en même temps que les paramètres spermatiques standards, les altérations majeures de l'ADN et la taille des télomères par des approches moléculaires et cellulaires.

L'organisation chromatinienne du spermatozoïde fait l'objet d'études nombreuses, notamment avec des expériences de FISH qui ciblent des régions d'hétérochromatine comme les centromères ou les télomères, ou qui visent à localiser les différents territoires chromosomiques. Le modèle d'organisation initialement proposé par [Zalensky et al., 1995] est aujourd'hui contesté grâce aux progrès techniques qui permettent d'étudier la position statistique des télomères ou des centromères de plusieurs chromosomes en même temps et dans un grand nombre de cellules [Ioannou et al., 2017]. L'organisation des centromères regroupés en chromocentres et éloignés de la périphérie, reliés aux télomères se trouvant eux au plus proche de la membrane nucléaire, ne fait plus consensus avec un nouveau modèle d'une organisation davantage distribuée dans le spermatozoïde (Figure 4.1). L'organisation des télomères entre eux est également discutée, mais leur position périphérique semble acquise.
<figure><img src="image_70.png" /></figure>

FIGURE 4.1: **Le spermatozoïde et son organisation chromatinienne** : A) Schéma d'un spermatozoïde humain d'après [Manfrevola et al., 2021]. Les petits disques dans le noyau représentent les différents complexes LINC formés à partir de deux protéines KASH différentes et 4 protéines sun. B) Modèles d'organisation de la chromatine dans le spermatozoïde humain (d'après [Ioannou et al., 2017] : (a) modèle « Hairpin loop » dans lequel les centromères (rouge) sont alignés dans le spermatozoïde avec chaque bras chromosomique (bleu) qui s'allonge jusqu'au télomère (vert) en (b) nouveau modèle dit « segmenté » ou les télomères et centromères sont distribués tout le long du spermatozoïde, en périphérie nucléaire où proche de la périphérie, avec des localisations et regroupements préférentiels ou fréquents.
## 4.2 Production des images

Les échantillons de sperme ont été fixés et colorés par un intercalant avant d'être imagés par notre microscope Leica DM6000 MMAF équipé d'un Optigrid (objectif 63x N.A 1.4). Dans les expériences préliminaires menées en 2019 et 2020, le protocole de coloration (type de fixateur et des d'intercalants) et les conditions d'acquisition d'images (densité spermatique, nombre de champs) ont été définis en collaboration avec une étudiante de master 1, Maissa Andrieux (été 2020), sur la base d'analyses des images que j'ai effectuées avec NucleusJ2.0. Nous avons fait le choix de pouvoir discriminer les spermatozoïdes vivants ou morts selon un protocole établi pour le sperme de bélier [Makarevich et al., 2010]. Les conditions expérimentales retenues après mes analyses sont une coloration rapide des spermatozoïdes morts à l'iodure de propidium (PI), suivie d'une fixation et de la coloration de l'étalement total avec du DAPI. En 2021, un nouveau jeu de données a été produit par une étudiante de master 2, Marine Compagnon, avec 10 donneurs pour savoir si la description des noyaux par notre méthode pouvait discriminer une population de spermatozoïdes frais d'une population congelée. Peu de données sont disponibles dans la littérature sur la structure des noyaux après la congélation.

## 4.3 Séquence d'analyse par NucleusJ2.0 via la bibliothèque de communication Simple Omero Client

Nous avons expérimenté à cette occasion le fonctionnement de la bibliothèque de communication *Simple Omero Client* (Section 2.7.2) entre l'instance OMERO et notre serveur de calcul pour analyser directement les images sauvegardées dans OMERO. Les résultats obtenus sont directement sauvés après analyse dans la base de donnée OMERO au cours du processus, ce qui permet une traçabilité parfaite entre les jeux de données et les résultats.

L'API OMERO n'est cependant pas très souple et ne permet que deux niveaux de hiérarchie (projet/jeu de données). Ainsi, chacun des 10 donneurs représente un projet distinct et les sous-dossiers correspondent aux différents jeux de données pour ce donneur. Chaque projet contient à la fois les jeux de données d'entrée (images chargées dans OMERO) et les données de sortie (images segmentées générées par NucleusJ2.0). La séquence d'analyse par NucleusJ2.0 pour chaque donneur ainsi que l'organisation des données dans OMERO est décrite dans la Figure 4.2.
<figure><img src="image_71.png" /><figcaption>FIGURE 4.2: Workflow de l'analyse et Organisation des jeux de données dans OMERO. A) A partir de chaque donneur, une dizaine d'images grands champs sont générées. L'étape d'autocrop est réalisée et suivie par la segmentation par NucleusJ2.0 pour déterminer la morphologie nucléaire (Otsu et gift wrapping) et la viabilité des spermatozoïdes (Otsu). Enfin l'organisation de la chromatine est déterminée par NODeJ. B) Organisation des images et des fichiers de résultats dans OMERO. Un « projet » est créé pour chaque donneur, désigné par un numéro correspondant à un dossier en gris. Les sous-dossiers (« datasets » selon la nomenclature OMERO) sont en vert et contiennent les fichiers images (volet de gauche). La fenêtre centrale permet d'avoir une vision globale des images. Les fichiers .csv contenant les calculs de paramètres générés par NucleusJ2.0 ou NODeJ sont directement attachés au sous-dossier correspondant (volet de droite).</figcaption></figure>

Ce projet a permis de tester sur un grand jeu de données les performances de NucleusJ2.0 dans l'environnement OMERO grâce à la bibliothèque *Simple Omero Client*. Cette dernière facilite la gestion des fichiers et des dossiers sans risque d'erreur. La bibliothèque permet d'effectuer les calculs sans mobiliser son poste personnel et sans utiliser de disques durs externes. En revanche, le temps de calcul reste encore relativement long du fait des temps de transfert de fichiers entre serveur de calcul et le serveur d'OMERO (durant l'envoi des images brutes ou les retours de résultats), bien que ceci soit transparent pour l'utilisateur. Ceci devra être optimisé dans le futur.

Les données traitées sont résumées dans le tableau Figure 4.3. Pour chaque donneur les images sont collectées avant (Fresh) et après (Frozen) cryopréservation. NucleusJ2.0 écarte automatiquement les noyaux correctement segmentés par Otsu et pour lesquels le *gift wrapping* échoue ce sont les « Bad Crop ». Cela concerne en moyenne 10% des noyaux correctement segmentés par la méthode Otsu modifié. Il est à noter que la réalisation des expériences (mesure des paramètres biologiques et de la structure tridimensionnelle des noyaux) jusqu'à l'analyse des contenus a été menée entièrement au cours des 4 mois effectifs de stage par une
étudiante novice, tandis qu'au début de ma thèse, trois personnes expérimentées ont été nécessaires à plein temps pendant 4 semaines pour analyser la seule morphologie nucléaire du même nombre de noyaux.

<table><thead><tr><td>Non du dataset</td><td>Acquisition 3D</td><td>Raw image C=1</td><td>Otsu segmentation</td><td>Gift wrapping</td><td>Chromatine</td></tr></thead><tbody><tr><td>FRESH</td><td>114</td><td>3307</td><td>2994</td><td>2492</td><td>2492</td></tr><tr><td>FROZEN</td><td>115</td><td>3212</td><td>3033</td><td>2707</td><td>2707</td></tr><tr><td>BAD</td><td></td><td>1395</td><td>669</td><td>931</td><td></td></tr></tbody></table>

FIGURE 4.3: Nombre d'images (Acquisition 3D) dans chaque dataset pour 10 donneurs dans l'étude de comparaison entre sperme frais (FRESH) et congelé (FROZEN). BAD désigne les images éliminées de noyaux isolés après autocrop (Raw image C=1) après tri visuel ou au cours du traitement par NucleusJ2.0 (Bad crop, les noyaux segmentés par Otsu modifié qui échouent).

## 4.4 Critères de tri des noyaux

Après l'étape de l'*autocrop* environ 20% des fichiers individuels de noyaux sont éliminés. Cette estimation s'avère variable d'un donneur à l'autre (de 4 à 37%) et peut refléter le taux d'agrégation des spermatozoïdes, la présence plus ou moins importante de débris cellulaires, la saturation de certaines images au moment de l'acquisition, ou des anomalies (Figure 4.4 A,B,C et D).

<figure><img src="image_72.png" /></figure>

FIGURE 4.4: Exemple de noyaux colorés au DAPI écartés de l'étude. A) Spermatozoïdes agrégés. B) Débris cellulaires. C) Images de spermatozoïdes présentant une saturation. D) Spermatozoïdes avec des formes anormales. E) Noyaux incomplets. F) Segmentations incomplètes.

Ce chiffre traduit la difficulté à détecter un noyau de spermatozoïde par la méthode Otsu lors de l'*autocrop* en raison de la très grande variation d'intensité de fluorescence au sein d'un même noyau. Nous observons sur la Figure 4.4 E que certains noyaux incomplet sont détectés au moment de l'*autocrop* et se trouvent coupés au moment du crop. Parfois, la segmentation ultérieure aboutira à un noyau incomplet, comme s'il était coupé au milieu (Figure 4.4 F). Enfin, certaines images de noyaux présentent des plans avec une invagination comme cela avait été observé pour les nucléoles dans les noyaux de plantes mais dans le cas des spermatozoïdes lié à la présence de vacuoles dans le noyau du spermatozoïde. L'existence de ces vacuoles nous a conduis à choisir
d'utiliser la méthode du *gift wrapping* pour la segmentation nucléaire. Ces noyaux (environ 20%) incomplets sont écartés de l'étude après l'étape segmentation avant de réaliser l'analyse par NODeJ.

# 4.5 Résultats biologiques

## 4.5.1 Structures chromatiniennes détectées par NODeJ

La Figure 4.5 A est une illustration d'une séquence complète d'analyse par NucleusJ2.0/NODeJ d'une image de spermatozoïde. La segmentation du contenu nculéaire par NODeJ permet de détecter les zones les plus intenses qui s'apparentent à de l'hétérochromatine. Sur l'ensemble des images, nous observons une structure typique en anneau ou en arc, située du côté de la queue du spermatozoïde. Cet anneau est positionné face à l'anneau nucléaire, une structure protéique responsable de la stabilité de l'ADN du spermatozoïde. Cet anneau est localisé à la base du noyau au niveau de la jonction entre la tête du spermatozoïde et le flagelle (Figure 4.1 A). Dans l'article de [Barone JG, De Lara J, Cummings KB, 1994], les auteurs ont démontré que lorsque le noyau spermatique humain se décondense, l'ADN reste ancré à cette structure [Ward and Coffey, 1989]. La structure détectée est parfois interrompue par des zones moins intenses, possiblement décondensées. Parfois des structures plus sphériques sont détectées à chaque extrémité de l'arc le long de la périphérie (Figure 4.5 C). Sans davantage de précision sur la nature de ces différentes régions, nous avons choisi de suivre à la fois le paramètre du volume total d'hétérochromatine détecté par NODeJ (VtCc, paramètre volume total de chromocentre) et d'extraire les paramètres de l'arc qui se trouve être le plus volumineux parmi les zones d'hétérochromatine détectées dans chaque noyau (volume et distances).

## 4.5.2 Définition des populations de spermatozoïdes morts ou vivants

Dans le cadre d'une étude de population globale par imagerie, il nous a paru important de pouvoir nous assurer de l'état de viabilité des spermatozoïdes observés. En effet, il est possible que l'irradiation n'ait pas le même impact sur la chromatine des spermatozoides vivants ou morts. Afin de distinguer, au moins a posteriori, les spermatozoïdes morts des vivants, nous avons choisi d'utiliser un double marquage DAPI (pour identifier les spermatozoïdes) et l'iodure de propidium (statut vivant/mort). Ainsi, deux populations peuvent être observées : l'une, colorée par les deux intercalants, est composée de spermatozoïdes morts (segmentation possible des images par NucleusJ2.0 et forte intensité du propidium (PI)); l'autre, colorée seulement par le DAPI, distingue les spermatozoïdes vivants (absence de résultat de segmentation obtenue sur les images du
<figure><img src="image_73.png" /><figcaption>FIGURE 4.5: Illustration de l'analyse des spermatozoïdes par NucleusJ2.0/NODeJ. A) Séquence d'analyse à partir d'un spermatozoïde coloré par deux intercalants. Images de Z projections de gauche à droite : DAPI, PI, segmentation du noyau par NucleusJ2, domaine intranucléaire segmenté par NODeJ. B) vue 3D du noyau du même spermatozoïde réalisée avec le logiciel Imaris. En segmentation du noyau (jaune) et le domaine intra-nucléaire (vert). C) Exemples de segmentations obtenues par NODeJ à partir d'un sperme frais du même donneur. Echelles : A et C, 2 µm. B, 1 µm.</figcaption></figure>

canal PI). Toutefois, l'exclusion du PI par les spermatozoïdes vivants est souvent partielle et n'est qu'un reflet de la vitalité. Cet intercalant pénètre plus ou moins dans les cellules aux membranes fragilisées. Il existe donc une population intermédiaire dont le statut n'est pas strictement définissable mais où la pénétration du PI suit un gradient d'intensité. Après la segmentation des images du canal PI par la méthode Otsu, nous avons classé les noyaux selon leur intensité moyenne après marquage au PI. Nous avons fait le choix de sélectionner parmi eux :

* Les 20% de spermatozoïdes les plus intenses pour définir la population des spermatozoïdes morts.

* Pour les vivants, nous avons conservé les images de tous les spermatozoïdes excluant le PI. Lorsque les effectifs étaient inférieurs à 10% (un seul donneur avec un sperme de faible vitalité), nous avons complété cette population avec des spermatozoïdes faiblement colorés au PI pour atteindre 10% de la population totale.
<figure><img src="image_74.png" /><figcaption>FIGURE 4.6: Impact de la congélation sur les paramètres spermatiques, morphologiques et de qualités nucléaires. Variation interindividuelle de l'impact de la congélation pour les différents paramètres de morphologie nucléaire. Les valeurs correspondent aux médianes +/- intervalle de confiance (IC) des paramètres morphologiques nucléaires. SAC : surface de l'aire corrigée ; Esr : équivalent sphérique du rayon.</figcaption></figure>
### 4.5.3 Comparaison de la structure tridimensionnelle des noyaux de sperme frais ou congelé

L'objectif de cette première étude est la validation d'un nouveau marqueur, la structure tridimensionnelle du noyau spermatique par bio-imagerie. Nous souhaitions déterminer si ce marqueur permettrait d'évaluer la qualité des spermatozoïdes humains. L'organisation 3D du noyau spermatique est donc comparée après congélation-décongélation à l'état frais. Cette analyse a été réalisée en parallèle à l'évaluation de marqueurs nucléaires usuels : fragmentation de l'ADN, décondensation de la chromatine et taille des télomères spermatiques chez 10 patients présentant diverses qualités spermatiques.

Le premier constat est que la morphologie nucléaire semble inchangée entre les conditions « frais » et « congelé ». Il existe une très grande variabilité interindividuelle pour les paramètres de morphologie (Annexe 6.3) mais globalement, en calculant la taille d'effet des populations totales, aucun des paramètres explorés n'est modifié de façon significative (Figure 4.6). Les variations entre donneurs reflètent sans doute la qualité hétérogène des 10 échantillons disponibles dans notre étude.

### 4.5.4 Contenu en chromatine

L'effet de la congélation-décongélation sur la structure de la chromatine est en revanche beaucoup plus marqué, avec un fort impact sur le volume de la structure condensée (ci-après appelée hétérochromatine-like Figure 4.7 A) observée dans les noyaux qui diminue après congélation/décongélation. De façon remarquable cet effet s'observe chez tous les donneurs (Figure 4.6).

Ces résultats sont cohérents avec la littérature qui constate une décondensation de la chromatine après la congélation [Boitrelle et al., 2012] [Hammadeh et al., 1999]. Sur les images des spermatozoïdes congelés, l'arc de chromatine condensée devient fragmenté et segmenté en plusieurs morceaux par NODeJ, ce qui se traduit par une augmentation du nombre de « chromocentres » détectés (NODeJ étant conçu à l'origine pour détecter des chromocentres).
<figure><img src="image_75.png" /></figure>

<figure><img src="image_76.png" /></figure>

FIGURE 4.7: **Impact de la congélation sur le volume de l'hétérochromatine.** A) Moyenne du volume de l'hétérochromatine-like chez chaque donneur avant et après congélation/décongélation. Les valeurs représentées par des points correspondent aux moyennes +/- SEM et chaque couleur représente un patient différent. ** indique p<0.01 . B) Violin plots comparant les volumes de l'hétérochromatine dans les spermatozoïdes frais (rouge) et congelés (vert) réalisés à partir des populations de spermatozoïdes morts (morts), de la population totale (total) ou des spermatozoïdes vivants (vivants).
4.5.5 Comportement des populations de spermatozoïdes « vivants », « morts », et totaux

Pour nous assurer que ces résultats n'étaient pas un effet de la diminution de la viabilité au cours de la congélation/décongélation, nous avons comparé les paramètres de chromatine pour les populations de spermatozoïdes vivants ou morts selon les critères de sélection du marqueur PI, à la population générale. Les paramètres mesurés dans la population générale sont représentatifs des spermatozoïdes vivants, les deux populations se comportent de façon identique

4.6 Bilan

Cette étude valide, sur un autre modèle que les noyaux de plantes les outils d'analyse d'images, que ce soit pour générer les imagettes (autocrop), la morphologie nucléaire (gift wrapping), le contenu des noyaux en chromatine (NODeJ) ou la bibliothèque de communication avec OMERO. Nous montrons ici que l'analyse de la structure tridimensionnelle peut être un indicateur pour décrire une population de spermatozoïdes frais ou congelés. Ce type d'analyse sera continué dans le reste de l'étude pour étudier la structure de la chromatine dans des spermatozoïdes irradiés. Il faudra sans doute tenter de caractériser la structure hétérochromatine-like, peut-être en effectuant des expériences de multi-FiSH, afin de déterminer si plusieurs chromosomes contribuent à cette structure ou si cette région coïncide avec un territoire chromosomique particulier. Une telle analyse avait été réalisée lors de nos travaux sur la trisomie 21 [Kemeny et al., 2018]. Enfin, la procédure actuelle pourra sans doute être simplifiée dans le futur. Nous avons vu en effet que la population totale de spermatozoïdes est un reflet de la population de cellules vivantes. Il ne sera désormais plus nécessaire de faire les colorations avec l'iodure de propidium qui augmentait le temps de manipulation des échantillons et doublait celui des acquisitions.
<figure><img src="image_77.png" /></figure>
<figure><img src="image_78.png" /></figure>
# Chapitre 5

## Entraînement d'un réseau de neurones
de type U-NET

Parallèlement à la recherche d'une solution pour segmenter le contenu des noyaux, nous avons décidé après plusieurs discussions avec des chercheurs de l'Institut Pascal de mettre en œuvre une solution de segmentation des noyaux en faisant appel aux réseaux de neurones profonds. Les méthodes d'apprentissage sont adaptées aux tâches d'automatisation de processus et spécifiquement à la segmentation d'objets qui est une étape majeure pour nos analyses. Du point de vue informatique, cette technologie est devenue accessible par la publication de nombreuses bibliothèques, avec toutefois des contraintes de matériel ou d'interopérabilité qui limitent leurs usages notamment pour les biologistes. Les réseaux de neurones sont connus pour leur capacité à résoudre des problèmes jugés faciles par un humain mais difficiles à décrire d'un point de vue informatique. Dans notre cas, la détection des zones de forte intensité dans les noyaux, décrivant les chromocentres, sont faciles à délimiter pour l'opérateur, ce qui n'est le cas pas pour la machine par une approche mathématique classique. Concernant les prérequis pour l'usage de l'apprentissage profond, nous disposions déjà d'un jeu de données de plusieurs centaines d'images 3D expertisé manuellement après traitement par NucleusJ2.0. C'est pour l'ensemble de ces raisons qu'un travail de bibliographie en vue du choix de méthodes adaptées à nos problématiques d'analyses, a été engagé courant 2019 avec un stagiaire de licence 2, Rémi Caudron (été 2019). Ce travail nous a orienté vers le réseau U-Net [Ronneberger et al., 2015] et les premiers résultats de segmentation rapidement obtenus nous ont encouragés à poursuivre dans cette voie.

Pour nous familiariser avec U-Net, les premiers essais de segmentation se sont focalisés sur la segmentation
des noyaux. Concernant le jeu d'entraînement de U-Net, nous avons choisi de recourir à nos données analysées par NucleusJ2.0 plutôt qu'à une labellisation manuelle. Ces choix ont été motivés essentiellement par les raisons suivantes :

* La segmentation d'un noyau est moins complexe que la segmentation des chromocentres dont le nombre, la position au sein du noyau ou encore l'intensité sont variables d'un noyau à l'autre.

* Dans le temps imparti nous n'avions pas la possibilité d'expertiser un jeu de données segmentées manuellement. Dans la majorité des cas, il nous est impossible de juger si la segmentation manuelle des opérateurs est de meilleure qualité que les méthodes de *gift wrapping* ou d'Otsu modifié proposées dans NucleusJ2.0.

De nombreuses questions ont émergé durant l'exploration des méthodes d'apprentissage profond. Ces questions concernent le choix des méthodes mais aussi la nature et les qualités requises pour constituer un jeu d'entraînement. Ce chapitre expose les résultats préliminaires obtenus avec U-Net qui montrent l'impact de la constitution d'un jeu de données sur le résultat de la segmentation de noyaux. Un second travail non inclus dans ce manuscrit a été d'établir une revue bibliographique des modèles disponibles en analyse du noyau 3D en collaboration avec le doctorant Guillaume Mougeot.

## 5.1 Choix du réseau de neurones

Le regain d'intérêt de la communauté scientifique pour l'apprentissage automatisé et particulièrement l'apprentissage profond a fait apparaître depuis une dizaine d'années de très nombreuses bibliothèques comme Tensorflow/Keras [Chollet et al., 2015] [Abadi et al., 2016] ou plus récemment Pytorch [Paszke et al., 2017]. De nombreux modèles ont été générés pour la segmentation, ils continuent de l'être dans de nombreux domaines d'application comme la vision par ordinateur, le diagnostic médical ou encore la robotique. Un des algorithmes majeurs appliqués aux images de biologie est apparu en 2015 et il est encore considéré comme une référence dans notre domaine, probablement pour des raisons de facilité de mise en œuvre. Il s'agit de U-Net. Ce réseau de neurones à convolution, développé spécifiquement pour l'analyse d'images, a montré durant des années son efficacité bien que ce type de réseau ne propose pas dans sa version initiale le traitement d'images en 3D. Ce modèle de référence a donc été choisi comme point de départ pour segmenter les noyaux de plantes. Notre choix pour U-Net se justifie par les points suivants :

* Le nombre important d'études portant sur l'utilisation de U-Net en fait un outil très documenté (plus de
28 000 citations). C'est un outil facile d'installation/utilisation pour un non expert. Cette référence bien connue de la communauté se présente donc comme un point d'entrée logique pour débuter l'exploration des méthodes d'apprentissage profond.

* U-Net a été développé pour la segmentation d'images de cellules en culture obtenues à partir de microscopie en contraste de phase (DIC), c'est-à-dire des images relativement similaires à nos données.

* Du point de vue technique, nous étions confrontés initialement à des contraintes en ressources informatiques avec, entre autres, l'absence de carte graphique dédiée au calcul à notre disposition. Or l'utilisation de la bibliothèque tensorflow est possible avec des ressources informatiques classiques, qui dans mon cas, correspondent à un processeur intel xeon, 32Go de RAM, AMD Radeo Pro WX4100 et ce dans des temps de calcul qui restent acceptables.

Enfin, nous avons constaté que les réseaux disponibles, dont U-Net, sont majoritairement dédiés à l'analyse des images en 2D ou montrent des performances peu satisfaisantes en 3D sur nos images. Nous avons donc décidé de transformer nos images initialement de 3D en n images 2D (n correspondant au nombre de couches d'une pile d'images) afin de répondre aux contraintes du réseau.

Durant la mise en place du code j'ai utilisé la plateforme Jupyter-notebook (https://jupyterbook.org/intro.html) pour tester et mettre en place notre réseau U-Net. Une fois le code fonctionnel, plusieurs scripts python (disponibles en ligne https://gitlab.com/DesTristus/machine_leaning) ont été développés pour entraîner des modèles U-Net ou appliquer un modèle généré sur un ensemble d'images. Nous avons utilisé le coefficient de Jaccard pour l'évaluation du réseau au cours de l'entraînement, qui correspond au rapport de l'intersection entre les ensembles A et B sur les différences entre les ensembles A et B, avec A correspondant aux objets segmentés par le réseau et B aux images données pour l'apprentissage :

$$J(A, B) = \frac{|A \cap B|}{|A \cup B|}.$$

## 5.2 Choix du jeu de données

Après le choix du réseau U-Net, le second choix portait sur les données à utiliser pour l'entraînement. D'un point de vue qualitatif, il s'agira de déterminer quelles seront les images segmentées qui serviront de référence (vérité de terrain ou ground truth), et d'un point de vue quantitatif, quel devra être le nombre d'images
nécessaires pour l'entraînement du réseau. Ces deux points sont abordés de façon empirique dans la littérature, c'est pourquoi cette partie décrit la démarche utilisée pour constituer un jeu de données représentatif de nos données pour entraîner le réseau.

Concernant la vérité de terrain pour des images, les bonnes pratiques de la communauté privilégient une expertise manuelle. Dans le cas des images de nos noyaux en 3D, cette tâche peut s'avérer très chronophage suivant le volume de données nécessaires (15 minutes en moyenne par image 3D). Nous avons choisi dans cette première exploration d'utiliser la segmentation automatique issue de NucleusJ2.0 comme référence. Nous avons utilisé les 680 noyaux de l'écotype Col-0 analysés dans la publication [Dubos et al., 2020] comme jeu de données de référence. Ce jeu de données contient une grande gamme de taille de noyaux dont certains étaient difficiles à segmenter par la méthode d'Otsu modifiée, du fait de la position du nucléole proche de la périphérie nucléaire. Cette diversité nous est apparue comme adaptée pour l'apprentissage du modèle U-Net. Nous disposons également des 680 noyaux segmentés par la méthode du *gift wrapping*.

<figure><img src="image_79.png" /><figcaption>FIGURE 5.1: Comparaison des paramètres de morphologie nucléaire : résultats des segmentations par U-Net_50 et *gift wrapping* (Volume, Flatness, Elongation, Surface et MeanIntensity) pour 680 noyaux de Col-0 issus de [Dubos et al., 2020].</figcaption></figure>
### 5.2.1 Entrainement de U-Net avec 50 images 3D

Comme les méthodologies d'apprentissage profond sont très gourmandes en ressources informatiques et que nous ne disposions pas de carte graphique (GPU) dédiée durant la phase initiale d'expérimentation, il a été choisi arbitrairement de limiter à 50 images 3D soit 2644 images 2D (moyenne de 53 plans par images). Le modèle issu de cet entraînement est nommé ensuite U-Net_50.

Le premier apprentissage a été réalisé grâce à un tirage aléatoire de 50 noyaux parmi les 680 noyaux Col-0 à notre disposition. Avec ce jeu de données, la performance (accuracy) du modèle est estimée à 99,3%. Ce chiffre très élevé n'est sans doute pas représentatif de la pertinence de notre modèle car il y a de nombreuses couches de fond dans nos images de noyaux nécessaire au bon fonctionnement de la segmentation d'Otsu. Ces couches induisent une erreur dans le calcul de l'indice de Jaccard qui lisse la statistique du taux de réussite de l'apprentissage. Il conviendra de recalculer cet indice en s'affranchissant de ces plans non informatifs.

La fonctionnalité de NucleusJ2.0 qui permet de calculer les paramètres de morphologie nucléaire à partir des images segmentées a été appliquée sur les images segmentées par le modèle U-Net_50. Afin de classer puis comparer les résultats obtenus par les deux méthodes de segmentation, nous avons ensuite calculé le ratio des volumes obtenus par l'approche classique de *gift wrapping* et par la méthode U-Net :

* un ratio de volume nucléaire *gift wrapping*/U-Net_50 inférieur à 0,8 détermine une classe de noyaux qui seront appelés « DOWN »

* un ratio supérieur à 1,2, une seconde classe de noyaux qui seront « UP »

* les noyaux entre ces deux classes sont considérés comme « neutres ».

La comparaison des résultats de segmentation des 655 noyaux par le modèle U-Net_50 et ceux du *gift wrapping*, ne montre aucune différence statistique pour l'ensemble des paramètres de morphologie nucléaire Figure 5.1. Toutefois, une corrélation apparaît dans le modèle U-Net_50 entre l'intensité moyenne des noyaux et deux paramètres : la surface (cor=0,38) et le volume (cor=0,35) (Figure 5.2 (b)). De telles corrélations n'étaient pas attendues car elles suggèrent que la segmentation dépendrait de la taille du noyau et de son intensité. Nous avons examiné le détail des paramètres obtenus par chacune des deux méthodes de segmentation pour la classe DOWN et après vérification manuelle des images nous constatons que ces noyaux sont majoritairement de faible intensité. Cette classe de noyau est peu représentée dans le jeu de données d'entraînement et pourrait expliquer la difficulté du modèle U-Net_50 à segmenter les noyaux de faible intensité.
<figure><img src="image_80.png" /><figcaption>FIGURE 5.2: Matrices de corrélation des paramètres de morphologie nucléaire. (a) segmentation par la méthode de référence *gift wrapping* et en (b) segmentation à partir du modèle U-Net entraîné avec 2644 images 2D provenant de 50 images 3D. Le jeu de données correspond à 655 noyaux de Col-0 issus de [Dubos et al., 2020]</figcaption></figure>

Pour vérifier ce constat visuel nous avons réalisé des tirages aléatoires de 50 noyaux parmi les 655 noyaux pour constituer plusieurs jeux de données d'entraînement. La Figure 5.3 permet de constater la variabilité de la corrélation entre l'intensité moyenne du noyau et son volume en fonction du tirage au sort des noyaux.

A ce stade, deux questions se posent concernant le jeu de données d'apprentissage :

* Quelle est la taille minimale du jeu de données dont nous avons besoin pour entraîner un modèle U-Net ? Un effectif de 50 noyaux ne semblent pas être suffisant pour couvrir toute la gamme de diversité présente dans notre jeu de données.

* Quelles seraient les métriques ou paramètres utilisables pour estimer le nombre de classes de noyaux présents dans nos données ?

### 5.2.2 Entraînement de U-Net avec 129 images 3D

L'état de l'art et les bonnes pratiques de la communauté de recherche en apprentissage machine ne donnent pas de règles générales concernant la taille du jeu de données pour entraîner un modèle U-Net. Toutefois, au travers de la pratique des utilisateurs, plusieurs milliers d'images annotées sont souvent utilisés pour pouvoir reconnaître un objet donné. Ce nombre augmente de manière non linéaire en fonction du nombre et
<figure><img src="image_81.png" /><figcaption>FIGURE 5.3: Evaluation de la corrélation *Volume/MeanIntensity* pour 48 tirages aléatoires de 50 noyaux parmi 655 noyaux Col-0.</figcaption></figure>

de la complexité de forme des objets à détecter au sein d'une image. Le nombre de données dépend donc de la complexité du problème à résoudre mais aussi de l'architecture du réseau utilisé. Dans notre cas, avec l'utilisation de U-Net, nous montrons que le nombre de 50 images 3D sélectionnées de manière arbitraire est insuffisant, et la vérification manuelle des segmentations indique une sous-représentation des images de noyaux avec des intensités faibles. Cette classe de noyaux est encore plus problématique lorsqu'elle concerne des petits noyaux dans des contextes où le rapport signal/bruit est important. Enfin, nous ne pouvons pas certifier que l'ensemble des paramètres que nous générons nous permet de connaître et de décrire toutes les classes existantes de noyaux dans nos données.

Nous avons alors cherché des solutions afin d'améliorer le modèle pour qu'il puisse prendre en compte la classe de noyaux de faible intensité. Pour cela, j'ai augmenté le jeu de données d'entraînement, initialement de 50 noyaux, en ajoutant 79 noyaux de faible intensité qui sont correctement segmentés avec la méthode du *gift wrapping*. L'apprentissage d'un modèle avec U-Net et ces 129 noyaux sera appelé *U-Net_129_SORT*.
Nous avons également réalisé un troisième modèle entraîné à partir de 129 noyaux tirés aléatoirement : U-Net-129_RANDOM. 129 images 3D représentent 6837 images 2D (moyenne de 53 plans par image). Nous disposons donc maintenant de 3 modèles que nous pouvons comparer pour leur efficacité à segmenter les 680 noyaux de notre jeu de données.

* Les volumes des noyaux segmentés par U-Net_129_SORT et U-Net-129_RANDOM montrent respectivement 30 et 25% de noyaux avec des ratio de volumes qui diffèrent de plus de 20% avec les résultats obtenus par la méthode du *gift wrapping* (UP + DOWN).

* U-Net_129_SORT se distingue de U-Net_129_RANDOM par une diminution de la corrélation entre intensité moyenne / volume du noyau ou surface du noyau avec respectivement r=0,18 et r=0,24 et de 0,2 et 0,27.

* Avec le modèle U-Net_129_SORT, 25 noyaux (5% de la totalité des noyaux) sont classés comme DOWN.

* Enfin, avec U-Net_129_SORT, 144 noyaux (25% du total) sont classés comme UP contre 76 noyaux (13% du total) pour le modèle U-Net_129_RANDOM. Ces 76 noyaux sont d'ailleurs inclus dans l'ensemble des 144 noyaux UP issus de U-Net_129_SORT.

Les deux modèles U-Net_129_SORT et U-Net_129_RANDOM ont des résultats de segmentation qui diffèrent du fait de la proportion variable des classes de noyaux (des noyaux de faible intensité) en données d'apprentissage. L'examen visuel des résultats de segmentation reste subjectif et pour nombre de noyaux il ne permet pas de conclure sur le résultat se trouvant le plus proche de la vérité. Toutefois, si nous regardons les segmentations sur l'ensemble de la population étudiée, il n'y a pas de décalage majeur dans le volume des objets segmentés Figure 5.4.

Malgré l'ancienneté toute relative du réseau U-Net [Ronneberger et al., 2015], ce réseau semble générer des résultats préliminaires satisfaisants sur nos données biologiques. En effet, nous sommes capables via ces modèles de discriminer les populations de noyaux appartenant aux deux populations de cellules présentes dans l'épiderme de cotylédon d'A. thaliana : les cellules de garde et de pavement (Figure 5.5). Ces premiers résultats suggèrent que 50 images 3D tirées de façon aléatoire ne seraient pas suffisantes pour couvrir la diversité des noyaux et donc pour entraîner efficacement le réseau U-Net. Les modèles U-Net_129_SORT et U-Net_129_RANDOM donnent les résultats les plus satisfaisants des 3 modèles générés et s'approchent de ceux obtenus par la méthode de segmentation de référence *gift wrapping*. Cependant, nous sommes conscients que ces segmentations peuvent être biaisées car elles ne se basent pas sur une expertise manuelle.
<figure><img src="image_82.png" /><figcaption>FIGURE 5.4: Histogramme du volume des noyaux calculé à partir de NucleusJ2.0 pour les segmentations obtenues par le *gift wrapping*, le modèle U-Net_50, U-Net_129_SORT et U-Net_129_RANDOM.</figcaption></figure>

### 5.2.3 Utilisation d'une segmentation manuelle

Avec l'aide de Guillaume Mougeot, nouveau doctorant dans l'équipe, nous avons récemment entrepris de segmenter manuellement des noyaux grâce à l'outil Ilastik [Berg et al., 2019]. Cette segmentation manuelle correspondrait mieux au standard « ground truth » décrit dans la littérature pour constituer les jeux de données d'entraînement. La comparaison de la segmentation manuelle et de celle obtenue sur les mêmes noyaux par la méthode du *gift wrapping* montre une grande disparité Figure 5.6. Ceci s'explique majoritairement par la difficulté d'expertiser visuellement la limite du masque du noyau dans les cas où le nucléole est en périphérie nucléaire. La différence est d'autant plus grande que la méthode de *gift wrapping* surestime la taille de l'objet expliquant les cas extrêmes où le ratio des volumes varie d'un facteur. Toutefois, si nous
<figure><img src="image_83.png" /></figure>

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<figure><img src="image_90.png" /></figure>

FIGURE 5.5: Analyse en composante principale de 655 noyaux de cellules de garde et de cellules de pavement obtenue A) à partir des paramètres issus de NucleusJ2.0 pour les segmentations obtenues par *gift wrapping*, B) le modèle U-Net_50, C) U-Net_129_SORT et D) U-Net_129_RANDOM.
<figure><img src="image_91.png" /><figcaption>FIGURE 5.6: Description des résultats de segmentation à partir de 318 noyaux Col-0. A) Histogramme de distribution des ratios entre les volumes des noyaux segmentés par *gift wrapping* (méthode de référence) et volumes obtenus suite à la segmentation manuelle. Analyse en composantes principales des individus générés à partir des paramètres de morphologie nucléaire B) du *gift wrapping* et C) de la segmentation manuelle. Les deux populations cellulaires sont représentées en jaune pour les cellules de pavement (PC) et en vert pour les cellules de garde (GC).</figcaption></figure>
comparons les segmentations des noyaux en globalité avec les paramètres de morphologie nucléaire générés par NucleusJ2.0, nous arrivons à discriminer nos populations cellulaires autant avec la segmentation manuelle qu'avec *gift wrapping* Figure 5.6 B et C.

## 5.3 Bilan

Cette partie constitue une étude préliminaire de l'utilisation d'un réseau de neurones de type U-Net pour segmenter des noyaux. Nos premiers essais montrent l'impact de la taille du jeu de données d'entraînement sur les modèles générés. Ainsi, un effectif de 50 images 3D ne semblent pas suffisant pour couvrir l'ensemble des classes de noyaux présentes dans nos échantillons, et l'intensité moyenne du signal des noyaux influence le modèle généré. L'enrichissement du jeu de données de 79 images supplémentaires a permis d'améliorer le modèle ou en tout cas de diminuer l'impact des noyaux faiblement colorés sur la pertinence du modèle. Il conviendrait maintenant d'estimer le coût du modèle avec l'indice de Jaccard, mais en s'affranchissant des couches non informatives de l'image. Une fois que nous disposerons de cet indicateur, nous pourrons reprendre cette analyse et faire varier le nombre de noyaux, par exemple en incrémentant de 50 le nombre de noyaux constituant le jeu d'entraînement. Nous avons maintenant créé un nouveau jeu de données expertisé manuellement pour respecter les préconisations de l'état de l'art dans le domaine. L'aspect tridimensionnel de nos données montre cependant les difficultés pour délimiter précisément la périphérie nucléaire des noyaux en présence de gros nucléoles. Cette démarche est indispensable pour vérifier l'influence de la méthode d'envveloppe convexe sur les modèles générés. L'existence de ce nouveau jeu de données permettra ainsi de tester plusieurs types de jeux de données d'entraînement segmentés manuellement par Ilastik ou automatiquement par NJ2. U-Net représente un premier modèle exploré mais d'autres modèles pourront ensuite être testés. Ce travail de « benchmarking » des modèles adaptés à la segmentation des noyaux 3D est actuellement en cours et constituera la première étape du doctorat de Guillaume Mougeot.
<figure><img src="image_92.png" /></figure>
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# Chapitre 6

## Discussion et perspectives

Les travaux décrits dans cette thèse proposent l'automatisation du logiciel NucleusJ [Poulet et al., 2015] dédié au traitement d'images biologiques générées par microscopie 3D. Nous proposons une nouvelle version appelée NucleusJ2.0, qui s'appuie comme la version précédente sur la plateforme d'analyse d'images imageJ. Nous avons démontré ses performances dans une publication en 2020 dans la revue Nucleus [Dubos et al., 2020]. Nous avons utilisé dans cet article des images 3D de noyaux d'un mutant d'A. thaliana ayant des défauts de la morphologie nucléaire et de leur contenu en ADN pour démontrer l'efficacité de l'automatisation de la méthode. En plus de l'outil open source, nous avons mis à disposition une ressource de plusieurs milliers d'images de noyaux de tissus de plantes ainsi que leurs segmentations associées. Ces images sont adressées aux communautés scientifiques de bio-imagerie, de biologie et aux bio-analystes. Nous avons aussi associé les jeux de données d'objets de calibrations de microscope, des sphères fluorescentes, utilisées pour l'amélioration de la précision des calculs du paramètre de la surface. L'ensemble de ces images sont stockées et partagées dans une base de données communautaire OMERO, mise en place à l'initiative d'un financement européen COST-Action INDEPTH (Impact of Nuclear Domains On Gene Expression Plant Traits). L'association des outils d'analyse avec la publication d'un jeu de données expertisé est une aide à la promotion des outils. Elle permet à un utilisateur potentiel de les tester pour vérifier son bon fonctionnement et de comparer ses propres données. Elle répond également à une demande croissante de la communauté scientifique, que ce soit pour la disponibilité des données brutes en vue d'une répétabilité des analyses, ou de leur utilisation ultérieure avec d'autres techniques, comme les algorithme d'apprentissage. Cette demande s'est structurée récemment dans des démarches de science ouverte, que promeuvent les tutelles des sciences de la vie comme l'Inserm et
le CNRS, ou l'Inrae, et la gestion des données est à présent exigée par les financeurs lors des réponses aux
appels d'offre. Pour répondre à ce besoin, nous avons pu tester la pertinence de l'API OMERO également
recommandée dans la littérature de bonnes pratiques (Heddleston et al., 2021) ou au cœur du projet de
structuration d'envergure nationale MuDiS4LS porté par l'Institut Français de Bioinformatique.

Dans un second temps, nous avons proposé des solutions pour la segmentation automatique du contenu
de la chromatine des noyaux laquelle nécessitait encore une intervention manuelle de l'utilisateur pour le
choix du seuil de la méthode de ligne de partage des eaux en 3D. En collaboration avec Axel Poulet, j'ai
pu montrer comment notre nouveau plugin NODeJ, développé lui aussi sur la plateforme imageJ, pouvait
automatiser la segmentation des chromocentres au travers d'un second article soumis à Bioinformatics. Dans
cette publication nous réanalysons un ensemble de jeux de données contenant des images de mutants d'A.
thaliana connus pour contenir des modifications de la chromatine et notamment une variation du nombre de
chromocentres. Ainsi, nous montrons la rapidité et la simplicité d'utilisation de NODeJ sur le jeu de données
publié avec NucleusJ2.0 par une analyse automatique de 1400 images de noyaux en moins d'une heure.

Enfin, pour améliorer l'efficacité de notre flux d'analyse d'images, une nouvelle bibliothèque appelée Simple
OMERO Client a été conçue afin d'utiliser NucleusJ2.0 directement sur des images stockées au sein de la
plateforme OMERO, tout en bénéficiant de la puissance de calcul d'un serveur distant. L'ensemble de nos
développements ont été utilisés collectivement dans un projet de preuve de concept, où la structure tridimen-
sionnelle des spermatozoïdes est évaluée en tant que critère de leur qualité. Dans un modèle comparant les
spermatozoïdes frais et congelés, nous avons pu montrer que si leur variation de volume est différente d'un
donneur à un autre et ne représente pas un bio-marqueur de qualité, en revanche, leur contenu en régions
condensées, ressemblant à l'hétérochromatine des chromocentres, pourrait contribuer à mieux les caractériser.
Ce modèle montre que NucleusJ2.0 peut-être utile au-delà du modèle plantes notamment en santé, un point
important pour notre équipe et le maintien de sa labellisation INSERM.

Dans la dernière partie, nous avons décrit notre démarche dans l'application de méthodes d'apprentissage
profond sur nos données. Compte tenu des difficultés techniques déjà exposées, nous nous sommes donc
orientés vers l'utilisation d'un réseau de neurones à convolution appelé U-Net et nous avons constaté l'absence
d'indication de la communauté scientifique sur la quantité et la qualité de données nécessaires pour entraîner
le réseau U-Net. Ainsi, durant ces expériences préliminaires nous avons testé plusieurs volumes de données
d'apprentissage pour évaluer l'efficacité du réseau sur nos données. Les réseaux générés nous ont montré
des premier résultats encourageants, nous permettant de discriminer morphologiquement nos populations
cellulaires à partir des paramètres géométriques calculés, grâce aux images segmentées en sorties. La démarche que nous proposons est de décrire les jeux de données d'entraînement en s'assurant de la représentation de toute la diversité des objets présents dans les images. Les paramètres mesurés par NucleusJ2.0 nous ont servi de critères pour caractériser une population typique de noyaux chez *A. thaliana* et de constituer un jeu de données représentatif des classes d'objets de nos populations nucléaires. Toutefois, il est important d'identifier l'ensemble des classes et de les représenter dans de bonnes proportions pour éviter des biais d'apprentissage.

# 6.1 NucleusJ2.0 et NODeJ : une automatisation pour la caractérisation de la morphologie nucléaire et de la chromatine

## 6.1.1 Validations biologiques des outils

Les analyses de noyaux issus de mutants chez la plante modèle *A. thaliana* valident la pertinence du calcul des paramètres obtenus avec NucleusJ2.0 et NODeJ, décrivant la morphologie nucléaire et leur composition en chromatine. Nous avons montré également que ces deux outils peuvent détecter d'autres objets nucléaires comme des régions répétées rendues fluorescentes par FISH. Grâce au chaînage et à l'automatisation de ces méthodes de segmentations, nous pouvons identifier plus rapidement des phénotypes comportant des modifications du noyau ou de la chromatine, afin de mieux décrire les altérations observées chez des plantes mutantes. Ceci aura des conséquences sur les approches de génétique et participera à mieux valider la fonction de gènes notamment impliqués dans la régulation de la transcription. Nous avons appliqué notre processus d'analyse sur un modèle de spermatozoïdes chez l'homme, qui confirme l'adaptabilité de nos outils à d'autres type de données. Toutefois, dans les deux cas, les données ont été produites sur les mêmes technologies de microscopes, il serait donc intéressant de tester les limites de nos outils avec des images produites par d'autres méthodes d'acquisitions. Dans le futur, mon équipe espère explorer plusieurs autres types de microscopie comme l'imagerie sur les cellules vivantes avec le *spinning disc* afin d'étudier la dynamique de certains domaines nucléaires au cours du développement ou lors de stress biotique. La réalisation d'images en super résolution via la microscopie STED (*Stimulated-Emission-Depletion*) permettrait également d'analyser plus finement les compartiments nucléaires comme le nucléosquelette et le pore nucléaire. Enfin, il est également prévu de réaliser des images en microscopie électronique (*Serial Block Face scanning Electron Microscopy*) en collaboration avec l'équipe d'Oxford dans le cadre du doctorat de Guillaume Mougeot.
## 6.1.2 Perspectives d'évolution des algorithmes

### 6.1.2.1 Optimisation de l'étape automatisation autocrop-segmentation

Nous avons maintenant un outil qui sélectionne automatiquement les noyaux dans une image grand champ et les isole dans des imagettes. Cette étape permet de rechercher le seuil Otsu optimal de chaque noyau, nécessaire dans le cas des images grand champ, qui contiennent des noyaux de différentes intensités. Avec cette procédure, nous rencontrons des cas où deux noyaux se retrouvent dans le même fichier à cause de leur proximité. Lorsque cela se produit, seuls les paramètres du noyau le plus gros sont retenus. C'est un phénomène rare pour nos images, sans incidence sur nos analyses. Cependant, le développement d'un algorithme analysant plusieurs objets au sein d'une même image ouvrirait la possibilité d'analyser des images où les noyaux ont un plus fort taux de regroupement, ce qui est fréquent dans les modèles de culture cellulaire ou de tissus d'origine animale. De plus, ce développement permettrait à terme l'analyse en une étape des images grand champ contenant plusieurs objets que nous produisons désormais dans notre routine. Un tel développement permettrait d'ajouter des paramètres décrivant les informations spatiales des noyaux dans le tissu (profondeur, orientation du noyau, distance entre noyaux etc).

### 6.1.2.2 Détection d'autres objets intra-nucléaires

Le développement récent de NODJ permet désormais la caractérisation automatisée des domaines de chromatine comme les chromocentres à partir du masque du noyau. Les résultats que nous obtenons en sortie décrivent le nombre, la position, le volume moyen ou le volume total des chromocentres. Par soustraction de ces informations au reste du volume du masque du noyau, nous quantifions le contenu en chromatine décondensée : l'euchromatine. Actuellement, le nucléole est inclus dans le volume d'euchromatine alors qu'il ne contient pas ou très peu de chromatine. Or, l'absence de marquage du nucléole ne nous a pas permis pour l'instant de quantifier ce domaine nucléaire. L'utilisation de la méthode des gradients est une piste pour détecter ces zones de faibles intensités. Nous sommes en train de produire des images de noyaux contenant de la fibrillarine couplée à la GFP pour visualiser le nucléole au sein de noyaux colorés au DAPI qui permettraient la validation de l'algorithme. En cas de succès de ces développements, nous aurions à terme un outil décrivant les compartiments majoritaires du noyau dans nos préparations : l'hétérochromatine (les chromocentres), le nucléole et par déduction l'euchromatine.
### 6.1.2.3 Amélioration de la précision dans la détection du noyau

La détection des noyaux en microscopie se base majoritairement sur le marquage de l'ADN avec l'utilisation du DAPI. Ainsi, grâce à cette méthode, nous délimitons le volume des noyaux par segmentation de la limite de la coloration au DAPI, sans inclure la double membrane externe. Pour vérifier si cette approximation du volume nucléaire est correcte, nous pourrions essayer d'utiliser une des méthodes classiques de marquage de la périphérie nucléaire utilisée chez les autres organismes modèles qui consiste à segmenter le noyau après marquage du nucléosquelette. Cette méthodologie semble néanmoins difficile à mettre en œuvre pour plusieurs raisons :

* L'utilisation d'anticorps contre les lamines : dans les tissus de plantes, les anticorps pénètrent difficilement à cause de la paroi végétale. Ce type de marquage ne pourra être appliqué qu'aux noyaux isolés. La seconde limite provient de la difficulté de produire de bons anticorps contre des protéines végétales.

* L'utilisation d'une protéine chimère par transgenèse de la périphérie nucléaire telle que SUN, NEAP1, KAKU4 ou CRWN couplée à une molécule fluorescente de type GFP. Les essais déjà réalisés en ce sens dans l'équipe n'ont pas permis non plus de répondre à la question, à cause de difficultés techniques illustrées dans la Figure 6.1 : d'une part nous observons souvent dans ces modèles transgéniques des protubérances membranaires artéfactuelles et un signal de fluorescence discontinu, ce qui rend difficile la segmentation des images. D'autre part, les signaux sont insuffisants pour obtenir le contour complet du noyau, particulièrement dans les premiers et derniers plans (Figure 6.1).

<figure><img src="image_94.png" /><figcaption>FIGURE 6.1: Visualisation de la périphérie nucléaire. Noyau de cotylédon fixé coloré au DAPI provenant d'une plante exprimant SUN1-GFP sous contrôle du promoteur 35s [Oda et al; Plant J 2011], pile de 49 images acquises en lumière structurée objx63, NA1,4,(xyz : 0,1x0,1x0,2 µm). A gauche, 3 plans (5,22,44) du canal GFP; à droite, Z projection des deux canaux (bleu : DAPI et vert GFP).</figcaption></figure>

Enfin, l'amélioration de la segmentation du masque du noyau dans NucleusJ2.0 par l'intégration de l'al-
gorithme du *gift wrapping* en appliquant la marche de Jarvis puis, plus récemment, le parcours de Graham,
fournit des résultats pour la caractérisation de la morphologie nucléaire dans des temps d’analyse très sa-
tisfaisants, et résout les difficultés initiales observées avec la méthode d’Otsu modifiée, liées à la présence
du nucléole. Cependant, ces méthodes de calculs de l’enveloppe convexe surestiment le volume de certains
noyaux ayant des formes allongées (Figure 2.1 D)). Il semble donc nécessaire de mesurer l’impact de ce biais
par exemple sur des populations de noyaux de tissus racinaire différencié d’*A. thaliana*, dont la forme est
moins sphérique afin de déterminer les limites de l’outil. Pour réaliser cette étude, nous disposons de jeux de
données de noyaux issus de poils racinaires [Benoit et al., 2017].

6.2 Développements informatiques dédiés à l'analyse d'images

L'évolution de la microscopie à haut débit nécessite désormais des logiciels performants pour la quanti-
fication de signaux biologiques. La cadence de la production de données engendre une demande croissante
de solutions logicielles facilement accessibles, déployables et permettant la reproductibilité des résultats et la
traçabilité des données. Ce flux de données nécessite aussi des solutions de stockage adaptées et des systèmes
d'analyses optimisés en temps de calcul. Malgré la diversité des bibliothèques regroupant des fonctionnalités
mathématiques dédiées à la bio-imagerie et le nombre de plate-formes qui sont apparues ces dernières an-
nées, le domaine de la bio-analyse nécessite encore des connaissances pluridisciplinaires complexes pour leurs
mise en place et déploiement en laboratoire. Ainsi, les développements informatiques de la communauté qui se
consacre aux traitements des images est très active et tend à s'organiser par exemple autour de forum (https:
//forum.image.sc/) ou de consortium nationaux comme le GDR Imabio (http://imabio-cnrs.fr/) ou
européens comme le COST-Action NEUBIAS (http://eubias.org/NEUBIAS/). Les développements en in-
formatique se poursuivent pour adapter les algorithmes aux nouvelles technologies des microscopes, avec
notamment le passage des méthodes initialement consacrées à l'analyse d'images 2D à des images de mi-
croscopie en 3D. Ce travail se fait de manière à intégrer de nouvelles technologies informatiques telles que
l'utilisation des processeurs graphiques, ou les serveurs dédiés aux calculs pour réduire les temps d'analyse
ainsi que d'environnements assurant une meilleure reproductibilité comme docker ou conda. Pour finir ces
outils, qu'ils soient matériels ou logiciels, sont des prérequis essentiels pour mettre à disposition les nouvelles
méthodologies basées sur l'apprentissage profond, qui sont gourmandes en ressources informatiques.

Les plugins NucleusJ2.0 et NODeJ reposent sur des dépendances qui sont en constante évolution pour
intégrer les nouvelles méthodes citées ci-dessus. Nous avons constaté, il y a quelques mois, des changements
dans la méthode du filtre gaussien proposé par ImageJ suite à une mise à jour de notre code, entraînant
des difficultés de détection des noyaux par l'autocrop dans une partie de nos images. L'identification et
la correction de ce type de changement est une tâche chronophage pour le maintien des outils. Afin de
prévenir ces changements extérieurs à nos développements, il semble donc indispensable de mettre en place
des tests fonctionnels afin de s'assurer de la pérennité des plugins mais également pour suivre de façon plus
efficace les versions des dépendances. Pour cela, nous sommes en train de sélectionner des données expertisées
manuellement au travers desquelles nous pourrons vérifier automatiquement nos résultats avant de proposer
une nouvelle version aux utilisateurs.

## 6.3 Vers une automatisation de la segmentation par les méthodes d'apprentissage profond

### 6.3.1 Choix de l'utilisation du modèle U-Net

Les méthodes d'apprentissage profond sont à l'heure actuelle encore difficiles à prendre en main par un
public non initié car elles nécessitent des compétences en programmation pour les mettre en œuvre, mais
elles requièrent aussi de maîtriser l'environnement logiciel qui évolue très rapidement. Dans de nombreuses
publications seul le cœur du code est disponible, ce qui pose des difficultés de reproductibilité des résultats
car il est nécessaire de réimplémenter les algorithmes [Dacrema et al., 2019]. La simplicité de mise en place de
U-Net est donc un atout majeur de ce réseau malgré son ancienneté, et explique sans aucun doute son succès
malgré ses limites, en particulier pour la 3D. D'autres solutions existent notamment avec des modèles pré-
entrainés voire même des service web comme Imjoy (https://imjoy.io/#/) NucleAIzer (www.nucleaizer.
org), CellPose (www.cellpose.org) ou DeepCell (www.deepcell.org). Le domaine est en évolution rapide
et de nombreux nouveaux outils de type web-services se mettent en place pour partager les algorithmes et
modèles.

### 6.3.2 Les impacts du jeu de données d'entraînement

Les résultats préliminaires de la segmentation des masques de noyaux par l'utilisation d'un réseau U-Net,
montrent des résultats proches de ceux obtenus par NucleusJ2.0 pour la caractérisation de la morphologie
nucléaire. Ces résultats sont cependant à prendre avec précaution puisque pour entraîner notre modèle nous
n'avons pas utilisé comme vérité de terrain des données segmentées manuellement comme le conseillent les
bonnes pratiques de la communauté, mais les résultats de segmentation issus de NucleusJ2.0. Nous avons
donc un risque d'avoir entraîné le réseau à appliquer une méthode d'enveloppe convexe sur les images que
nous lui soumettons. Par exemple, les données en sortie risquent de contenir les biais de sur-estimation des
masques de noyaux du *gift wrapping* expliqués dans la section 2.1. Nous avons donc commencé un travail de
segmentation manuelle des noyaux qui servira de vérité de terrain au modèle U-Net et aux autres modèles
qui seront testés. Les premières segmentations de noyaux par le logiciel ilastik sont comparées aux résultats
avec les réseaux entraînés avec les données issues de NucleusJ2.0, et montrent une grande disparité d'objets
avec des ratios de volume pouvant aller jusqu'à un facteur 3. La comparaison manuelle des noyaux ayant
des résultats de segmentation les plus divergents montre qu'il est difficile de délimiter visuellement le bord
de nos objets dans le cas de gros nucléoles. Nous avons vu qu'il est important de garder une représentation
de la diversité d'un jeu de données dans le jeu d'entraînement. L'exclusion de telles images de notre jeu de
données d'entraînement nous semblerait donc risqué car cela pourrait conduire à une faiblesse du modèle et
à une mauvaise segmentation des noyaux de faible intensité comme nous l'avons vu dans la Figure 5.2. La
solution que nous envisageons est de constituer un jeu de données mixte, constitué des segmentations issues
de NucleusJ2.0 pour les noyaux avec de gros nucléoles, et des segmentations manuelles où le contour sera plus
précis. Nous ajouterons tous les autres cas où la segmentation par *gift wrapping* nous paraît satisfaisante.
Cette méthode permet ainsi de limiter les biais de la segmentation manuelle de l'opérateur et accélérerait la
constitution d'un jeu de données d'entraînement de plus grande taille.

## 6.4 Conclusion

NucleusJ2.0 et NODeJ proposent une automatisation des processus d'analyse d'images permettant un
nouveau pas dans la description de la structure tridimensionnelle des noyaux. Ces outils donnent les moyens
opérationnels d'un phénotypage haut débit, en utilisant la microscopie 3 dimensions, pour la caractérisation
de mutants de la morphologie nucléaire et de l'organisation de la chromatine. Enfin l'utilisation des résultats
de ces méthodes de segmentations conventionnelles serviront dans la mise en place de modèles d'apprentissage
profond en permettant une labellisation rapide des images.
<figure><img src="image_95.png" /></figure>
<figure><img src="image_96.png" /></figure>
# Annexes

<table><caption>FIGURE 6.2: Liste des paramètres de l'**autocrop**. Description de l'ensemble des paramètres disponibles pour l'utilisation de l'**autocrop** de NucleusJ2.0. Extrait de la documentation en ligne https://gitlab.com/DesTristus/NucleusJ2.0/-/wikis/Autocrop</caption><thead><tr><td>Parameter name</td><td>Default value</td><td>Value type</td><td>Corresponding number in user interface</td><td>Description</td></tr></thead><tbody><tr><td>xCropBoxSize</td><td>40</td><td>Int</td><td>1</td><td>Number of voxels added to xmin and xmax of the connected component defining the final box size in x</td></tr><tr><td>yCropBoxSize</td><td>40</td><td>Int</td><td>2</td><td>Number of voxels added to ymin and ymax of the connected component defining the final box size in y</td></tr><tr><td>zCropBoxSize</td><td>20</td><td>Int</td><td>3</td><td>Number of voxels added to zmin and zmax of the connected component defining the final box size in z</td></tr><tr><td>minVolumeNucleus</td><td>1</td><td>Int</td><td>4</td><td>Minimum volume of detected object</td></tr><tr><td>maxVolumeNucleus</td><td>2147483647</td><td>Int</td><td>5</td><td>Maximum volume of detected object</td></tr><tr><td>thresholdOSTUcomputing</td><td>20</td><td>Int</td><td>6</td><td>Minimal default OTSU threshold</td></tr><tr><td>channelToComputeThreshold</td><td>0</td><td>Int</td><td>7</td><td>Channel number used to compute OTSU threshold (Channel 1 is 0 etc)</td></tr><tr><td>slicesOTSUcomputing</td><td>0</td><td>Int</td><td>8</td><td>Slice start used to compute OTSU threshold</td></tr><tr><td>boxesPercentSurfaceToFilter</td><td>50</td><td>Int</td><td>9</td><td>Surface percent of boxes to groups them</td></tr><tr><td>boxesRegroupement</td><td>true</td><td>boolean</td><td>true/false</td><td>Activation of boxes regroupement</td></tr><tr><td>xcal</td><td>1</td><td>Double</td><td>11</td><td>X calibration value</td></tr><tr><td>ycal</td><td>1</td><td>Double</td><td>12</td><td>Y calibration value</td></tr><tr><td>zcal</td><td>1</td><td>Double</td><td>13</td><td>Z calibration value</td></tr></tbody></table>
<table><caption>FIGURE 6.3: Liste des paramètres décrivant la morphologie nucléaire. Description de l'ensemble des paramètres disponibles à l'issu de l'analyse de segmentation disponible dans NucleusJ2.0 (gift wrapping et Otsu modifié). Extrait de la documentation en ligne https://gitlab.com/DesTristus/NucleusJ2.0/-/wikis/Nucleus-segmentation</caption><thead><tr><td>Parameter name</td><td>Description</td></tr></thead><tbody><tr><td>NucleusFileName</td><td>Nucleus image file name</td></tr><tr><td>Volume</td><td>Volume of segmented object (sum of white voxels)</td></tr><tr><td>Flatness</td><td>Computed by ratio between major and minor axes of the segmented object</td></tr><tr><td>Elongation</td><td>Computed by ratio between major and medium axes of the object</td></tr><tr><td>Sphericity</td><td>Computed by ratio between surface area and volume</td></tr><tr><td>Esr</td><td>Equivalent spherical radius, estimated radius computed from the volume</td></tr><tr><td>SurfaceArea</td><td>Segmented object surface area</td></tr><tr><td>MeanIntensityNucleus</td><td>Mean voxels intensity of segmented image</td></tr><tr><td>MeanIntensityBackground</td><td>Mean intensity of the background</td></tr><tr><td>StandardDeviation</td><td>Standard deviation of the segmented object intensity</td></tr><tr><td>MinIntensity</td><td>Minimum voxel intensity of the segmented object</td></tr><tr><td>MaxIntensity</td><td>Maximum voxel intensity of the segmented object</td></tr><tr><td>MedianIntensityImage</td><td>Median voxel intensity of raw image</td></tr><tr><td>MedianIntensityNucleus</td><td>Median voxel intensity of segmented object</td></tr><tr><td>MedianIntensityBackground</td><td>Median voxel intensity of background</td></tr><tr><td>ImageSize</td><td>Number of voxel</td></tr><tr><td>OTSUThreshold</td><td>OTSU threshold used to segment the image</td></tr></tbody></table>
<table><thead><tr><td>Parameter name</td><td>Description</td></tr></thead><tbody><tr><td>Title</td><td>Image name</td></tr><tr><td>NbCc</td><td>mean volume of chromocenter(s) per nucleus</td></tr><tr><td>VccMean</td><td>mean volume of chromocenter(s) per nucleus</td></tr><tr><td>VccTotal</td><td>total volume of chromocenter(s) per nucleus</td></tr><tr><td>DistanceBorderToBorderMean</td><td>mean distance of chromocenter(s) border to nuclear periphery.</td></tr><tr><td>DistanceBarycenterToBorderMean</td><td>mean distance of chromocenter(s) barycenter to nuclear periphery.</td></tr><tr><td>IntensityRHF</td><td>total chromocenter intensity / nuclear intensity.</td></tr><tr><td>VolumeRHF = total chromocenter volume / nuclear volume.</td><td></td></tr></tbody></table>

FIGURE 6.4: Liste des paramètres décrivant les chromocentres. Ensemble des paramètres disponibles à l'issu de l'analyse de segmentation disponible dans NODeJ. Le fichier de résultat est au format tabulé où chaque ligne correspond aux paramètres d'un chromocentre détecté.

<table><thead><tr><td>Parameter name</td><td>Description</td></tr></thead><tbody><tr><td>Title</td><td>Image name and chromocenter number</td></tr><tr><td>Volume</td><td>volume of chromocenter</td></tr><tr><td>BorderToBorderDistance</td><td>distance between chromocenter border to nuclear periphery</td></tr><tr><td>BarycenterToBorderDistanceNucleus</td><td>distance between chromocenter barycenter to nuclear periphery.</td></tr></tbody></table>

FIGURE 6.5: Liste des paramètres décrivant les chromocentres au sein d'un noyau. Ensemble des paramètres disponibles à l'issu de l'analyse de segmentation disponible dans NODeJ. Le fichier de résultat est au format tabulé où chaque ligne correspond aux paramètres d'un noyau analysé.
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