# Analyse et modélisation de la résonance plasmonique de surface d'une membrane modèle formée de liposomes supportés pour l'étude de l'interaction biomoléculaire

Meryem Belkilani

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Meryem Belkilani. Analyse et modélisation de la résonance plasmonique de surface d'une membrane modèle formée de liposomes supportés pour l'étude de l'interaction biomoléculaire. Chimie. Université Claude Bernard Lyon 1; Université de Tunis (Tunisie), 2022. Français. NNT : 2022LYO1004 . tel-03888488

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Submitted on 7 Dec 2022

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THESE de DOCTORAT DE L'UNIVERSITE DE LYON

réalisée au sein de

L'UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

en co-tutelle avec

L'UNIVERSITE DE TUNIS

Ecole Nationale Supérieure d'Ingénieurs de Tunis

Ecole Doctorale : Chimie de Lyon N° 206

Ecole Doctorale : Sciences et Technologies

Spécialité de doctorat : Chimie - Sciences Physiques

Soutenue publiquement le 08/09/2022, par :

Meryem BELKILANI

Analyse et modélisation de la résonance plasmonique de surface d'une membrane modèle formée de liposomes supportés pour l'étude de l'interaction biomoléculaire

Devant le jury composé de :

<table><tr><td>DEJEU Jérôme</td><td>Maître de Conférences, Université Grenoble Alpes UMR 5250 - DCM</td><td>Rapporteur</td></tr><tr><td>VIDIC Jasmina</td><td>Ingénieure de Recherche, INRAE Jouy-en-Josas</td><td>Rapporteure</td></tr><tr><td>MIELE Adriana</td><td>Professeure des Universités, Université Lyon 1 UMR 5280 - ISA</td><td>Examinatrice</td></tr><tr><td>ALIMI Kamel</td><td>Professeur, Université de Monastir (Tunisie)</td><td>Examineur</td></tr><tr><td>CHAIX Carole</td><td>Directrice de Recherche, CNRS Lyon UMR 5280 - ISA</td><td>Directrice de thèse</td></tr><tr><td>ABDELGHANI Adnane</td><td>Professeur, Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie (Tunisie)</td><td>Directeur de thèse</td></tr></table>
Ces travaux de thèse ont été réalisés par Meryem BELKILANI sous la direction du Dr. Carole CHAIX et Pr. Adnane ABDELGHANI, au sein de l'équipe Interfaces et Biocapteurs de l'Institut des Sciences Analytiques (ISA - UMR 5280) et l'équipe de Nano-biotechnologie et valorisation des plantes médicinales (UR17ES22) de l'Institut National des Sciences Appliquées et de Technologie (INSAT-TUNISIE)

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INSTITUT DES
SCIENCES
ANALYTIQUES

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Financés par une bourse d'alternance du Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique de TUNISIE et soutenus financièrement par l'Institut de Chimie de Lyon (ICL) et l'unité de recherche de Nano-biotechnologie et valorisation des plantes médicinales (UR17ES22)

Réalisés au sein de l'Ecole Doctorale : Chimie de Lyon N° 206 et l'Ecole Doctorale : Sciences et Technologies de l'ENSIT

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RÉPUBLIQUE TUNISIENNE
MESRS

Ministère de l'Enseignement Supérieur
et de la Recherche Scientifique

<figure><img src="image_6.png" /></figure>

<figure><img src="image_7.png" /></figure>
RESUME

Ces travaux de thèse s'intéressent à l'étude des interactions membranaires avec des
biomolécules afin d'améliorer notre compréhension de leurs mécanismes d'action. L'objectif est
de développer une méthodologie innovante imitant au mieux les conditions biologiques des
cellules et permettant des études d'interaction en temps réel, sans marquage spécifique. À cette
fin, une approche de résonance plasmonique de surface multiparamétrique à double longueur
d'onde (MP-SPR) a été développée avec succès pour étudier le comportement d'une membrane
biomimétique supportée. Cette dernière est constituée de liposomes biotinylés greffés sur une
surface d'or recouverte d'une couche de streptavidine avec une grande affinité. Cette stratégie
d'ancrage s'est avérée efficace pour maintenir l'intégrité de la structure vésiculaire des
phospholipides. Cette couche a été utilisée comme une membrane biomimétique pour étudier
la liaison du mono-rhamnolipide, du peptide HA2 du virus de la grippe et du peptide
bradykinine (BK). Plusieurs séries de sensorgrammes à différentes concentrations et dans
diverses conditions expérimentales ont été générées. La modélisation théorique de la couche de
Fresnel à double longueur d'onde a été appliquée pour calculer l'épaisseur (d) et l'indice de
réfraction (n) de la couche de liposomes afin de suivre les changements de ses paramètres
optiques lors de l'interaction avec les biomolécules. Une étude cinétique des interactions a été
réalisée. Les résultats expérimentaux et les calculs théoriques ont montré différents mécanismes
d'action induits par ces biomolécules sur la couche de liposomes. Le mono-rhanomolipide a
provoqué la destruction de la couche de liposomes. Le peptide HA2 a montré une action pH-
dépendante. Il a entraîné un gonflement des liposomes à pH acide, suite à une insertion dans la
membrane, sans causer leur destruction. Le peptide BK a révélé un autre mécanisme
d'interaction, à savoir une cinétique d'interaction plus lente que celle observée pour le peptide
HA2, avec une affinité de liaison plus élevée.
ABSTRACT

The thesis focuses on the study of membrane interactions with biomolecules to improve our understanding of their mechanisms of action. The objective is to develop an innovative methodology that best mimics the biological conditions of cells and allows real-time interaction studies, without specific labeling. To this end, a dual-wavelength multiparametric surface plasmon resonance (MP-SPR) approach has been successfully developed to study the behavior of a supported biomimetic membrane. The latter consists of biotinylated liposomes grafted onto a gold surface covered with a layer of streptavidin with high affinity. This anchoring strategy has been shown to be effective in maintaining the integrity of the phospholipid vesicular structure. This layer was used as a biomimetic membrane to study the binding of mono-rhamnolipid, influenza virus HA2 peptide and bradykinin (BK) peptide. Several sets of sensorgrams at different concentrations and under various experimental conditions were generated. Theoretical modeling of the dual-wavelength Fresnel layer was applied to calculate the thickness (d) and refractive index (n) of the liposome layer in order to follow the changes of its optical parameters upon interaction with the biomolecules. A kinetic study of the interactions was performed. Experimental results and theoretical calculations showed different mechanisms of action induced by these biomolecules on the liposome layer. The mono-rhanomolipid caused the destruction of the liposome layer. The HA2 peptide showed a pH-dependent action. It induced a swelling of the liposomes at acidic pH, following insertion into the membrane, without causing their destruction. The BK peptide revealed another mechanism of interaction, namely slower interaction kinetics than that observed for the HA2 peptide, with a higher binding affinity.
Une pensée à ma famille qui a toujours été là pour moi, que ça soit dans les bons ou les mauvais moments... Sans elle, je ne serais rien.

J'offre ce travail en témoignage de l'amour, de l'amitié et de la reconnaissance que je porte à :

Mes parents : Abdessatar et Khamssa

Mes sœurs : Sarra et Siwar

et mon frère : Badr

A tous ceux qui me sont chers

Meryem,
REMERCIEMENTS

Avant de clôturer cette belle et inoubliable expérience que fut ma thèse et de partir vers de
nouveaux horizons, je tiens à remercier tous ceux qui ont de près ou de loin contribué à sa
réussite et même à ceux qui ont eu la gentillesse de faire de ces trois ans et demi un moment
très agréable et profitable.

Je remercie tout d'abord les membres du jury, Madame VIDIC Jasmina et Monsieur DEJEU
Jérôme d'avoir accepté de prendre le temps de lire et de rapporter cette thèse, ainsi que Madame
MIELE Adriana et Monsieur ALIMI Kamel de m'avoir fait l'honneur d'examiner mon
travail.

Ce travail a été réalisé à l'Institut des Sciences Analytiques (ISA - UMR 5280 - Lyon) dirigé
par Monsieur Christophe Morell. Je le remercie de m'avoir accueilli durant ces trois ans et
demi de thèse.

Je remercie tout particulièrement ma directrice de thèse, Dr. Carole CHAIX, pour m'avoir
accueilli dans son équipe Interfaces et biocapteurs à l'ISA et pour m'avoir donné l'opportunité
de réaliser cette thèse. Merci Carole, pour toute ton implication dans ma thèse, pour tes
conseils, ton soutien dans les moments les plus difficiles de la thèse, notamment la rédaction
des articles mais aussi la rédaction de la thèse dont les précieux conseils m'ont permis
d'améliorer ce manuscrit. J'ai été très heureuse de travailler à tes côtés, malgré toutes les
difficultés qu'on a rencontrées ! Tu as une manière toute particulière d'insuffler du dynamisme
et de la gaieté, tout en sérieux et en professionnalisme. Tu as été la voix du calme et de la
raison pendant ma thèse, toujours là pour me rassurer. Je ne sais pas si j'aurais pu terminer
sans, merci encore !

Je tiens également à adresser mes remerciements à mon directeur de thèse, Pr. Adnane ABDELGHANI, pour m'avoir accueilli dans son équipe Nano-biotechnologie et valorisation des plantes médicinales de l'INSAT depuis mon master. Merci Mr. Adnane pour ton aide, tes encouragements, ton investissement, et tes conseils autant sur les aspects techniques que sur l'interprétation des résultats et la rédaction. Je suis très fier de ce que l'on a pu faire ensemble !

J'exprime toute ma reconnaissance à Madame Nicole JAFFREZIC-RENAULT, Directrice
de recherche émérite au CNRS, de m'avoir proposé comme candidate pour le sujet de ma thèse.
Je tiens à la remercier très sincèrement pour son aide constante durant ces années de travail
ainsi que sa disponibilité, sa patience, sa bonne humeur et pour les nombreuses discussions
scientifiques que nous avons eues. Merci Madame Nicole !
Je tiens à exprimer ma sincère gratitude à Carole Farre, Ingénieur chimiste à l'ISA. Merci Carole pour ton accompagnement, du début du stage à la fin de la thèse. Tu as toujours été à l'écoute, au moindre problème. Merci pour toute la confiance que tu m'as accordée, au niveau des manips et de l'encadrement. J'ai pris beaucoup de plaisir pendant ces trois ans et demis avec toi !

Je voudrais, par la même occasion, exprimer mon profond respect pour Monsieur Yves CHEVALIER, Directeur de Recherches CNRS, qui m'a accueilli au sein de son laboratoire LAGEPP pour l'élaboration de liposomes. Je tiens à vous remercier également pour votre disponibilité, votre soutien et vos conseils tout au long de ce travail de thèse. Je vous remercie pour tout...

Et pour finir, je remercie toutes les personnes que j'aurais pu oublier de citer ...
« *Le rôle de l'infiniment petit est infiniment grand.* »

Louis Pasteur
TABLE DES MATIERES

<table><tr><td>RESUME</td><td>3</td></tr><tr><td>ABSTRACT</td><td>4</td></tr><tr><td>REMERCIEMENTS</td><td>6</td></tr><tr><td>INTRODUCTION GENERALE</td><td>15</td></tr><tr><td>Chapitre I : Revue bibliographique</td><td>21</td></tr><tr><td>I. Introduction</td><td>22</td></tr><tr><td>II. Des membranes biologiques aux membranes biomimétiques supportées</td><td>22</td></tr><tr><td>II.1. Les membranes biologiques</td><td>23</td></tr><tr><td>II.2. Les membranes biomimétiques modèles</td><td>27</td></tr><tr><td>II.3. Les différents modèles membranaires biomimétiques</td><td>28</td></tr><tr><td>II.4. Les membranes biomimétiques supportées</td><td>38</td></tr><tr><td>III. Applications des membranes biomimétiques supportées</td><td>47</td></tr><tr><td>III.1. Microscopie à force atomique (AFM)</td><td>48</td></tr><tr><td>III.2. Les techniques de fluorescence</td><td>51</td></tr><tr><td>III.3. Microbalance à quartz (QCM)</td><td>52</td></tr><tr><td>III.4. La Résonance Plasmonique de Surface (SPR)</td><td>54</td></tr><tr><td>IV. Conclusion</td><td>60</td></tr><tr><td>Chapitre II : La théorie de la Résonance Plasmonique de Surface (SPR)</td><td>75</td></tr><tr><td>I. Introduction</td><td>76</td></tr><tr><td>II. Résonance plasmonique de surface et approche plasmonique</td><td>76</td></tr><tr><td>II.1. Historique de la découverte du plasmon de surface</td><td>76</td></tr><tr><td>II.2. Définition du ‘plasmon de surface’</td><td>77</td></tr><tr><td>II.3. Caractéristiques du plasmon de surface</td><td>78</td></tr><tr><td>II.4. Formalisme de Fresnel pour la caractérisation des couches</td><td>88</td></tr><tr><td>II.5. Formalisme de Jung</td><td>89</td></tr><tr><td>II.6. Formule de Feijter</td><td>89</td></tr><tr><td>III. Résonance plasmonique de surface multiparamétrique (MP-SPR)</td><td>90</td></tr><tr><td>III.1. Description et intérêt de l’approche</td><td>90</td></tr><tr><td>III.2. MP-SPR à double longueur d’onde : Principe de l’approche</td><td>92</td></tr><tr><td>IV. Approches mathématiques de l’interaction moléculaire</td><td>97</td></tr></table>
<table>
  <tbody>
    <tr>
      <td>V. Conclusion</td>
      <td>99</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chapitre III : Suivi par résonance plasmonique de surface de l'interaction des mono-rhamnolipides avec une couche de liposomes supportés</td>
      <td>103</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I. Introduction</td>
      <td>104</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II. Préparation et caractérisation des liposomes biotinylés</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1. Lipides utilisés</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2. Caractérisation des liposomes</td>
      <td>107</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III. Suivi par MP-SPR de l'immobilisation des liposomes sur des surfaces modifiées</td>
      <td>109</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV. Formation et modélisation des différentes couches de la puce d'or SPR</td>
      <td>113</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V. Etude MP-SPR de l'interaction entre les mono-RLs et la couche de liposomes supportés</td>
      <td>116</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VI. Publication</td>
      <td>120</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>VII. Conclusion</td>
      <td>121</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Chapitre IV : Mécanismes d'interaction du peptide HA2 du virus de la grippe et du peptide bradykinine avec des liposomes par MP-SPR</td>
      <td>124</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>I. Introduction</td>
      <td>125</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II. Etude de l'interaction du peptide HA2 avec une membrane modèle</td>
      <td>129</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.1. Caractérisation physico-chimique des liposomes</td>
      <td>129</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.2. Formation de la couche de liposomes supportés</td>
      <td>130</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>II.3. Etude de l'interaction du peptide HA2 avec la membrane supportée</td>
      <td>135</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>III. Publication</td>
      <td>149</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV. Etude de l'interaction du peptide BK avec une membrane modèle</td>
      <td>196</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.1. Analyse de l'interaction peptide BK/liposome par MP-SPR</td>
      <td>196</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>IV.2. Protocole expérimental</td>
      <td>198</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>V. Conclusion</td>
      <td>199</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES</td>
      <td>204</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Annexe 1 : Equations de Maxwell et équation de propagation</td>
      <td>208</td>
    </tr>
    <tr>
      <td>Annexe 2 : Existence du plasmon de surface</td>
      <td>210</td>
    </tr>
  </tbody>
</table>
LISTE DES ABRÉVIATIONS ET SYMBOLES

$\theta_{SPR}$ : Angle de résonance

$n$ : Indice de réfraction

$\theta_c$: Angle d'incidence critique

$k_a$ : Constante de vitesse d'association

$k_d$ : Constante de vitesse de dissociation

$K_D$ : Constante de dissociation à l'équilibre

$T_m$ : « Melting Temperature » ou Température de transition de phase

TIR : Réflexion Interne Totale

ATR : Réflexion Totale Atténuée

SP : Plasmon de Surface

TE : Transverse Electrique

TM : Transverse Magnétique

MLV : « MultiLamellar Vesicle » ou vésicule multilamellaire

SUV : « Small Unilamellar Vesicle » ou petite vésicule unilamellaire

LUV : « Large Unilamellar Vesicle » ou grande vésicule unilamellaire

GUV : « Giant Unilamellar Vesicle » ou Vésicule unilamellaire géante

DLS : « Dynamic Light Scattering » ou Diffusion dynamique de la lumière

PDI : Indice de polydispersité

NTA : « Nanoparticle-Tracking Analysis » ou analyse du suivi individuel de particules

MEB : Microscopie Electronique à Balayage

TEM : Microscopie Electronique à Transmission

Cryo-TEM : Microscopie Electronique à Transmission cryogénique ou Cryo-Microscopie Electronique à Transmission

SERS : « Surface Enhanced Raman Spectroscopy » ou spectroscopie Raman exaltée de surface
RMN : « Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy » ou spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire

DPI : « Dual Polarization Interferometry » ou Interférométrie par Double Polarisation

SLB : « Supported Lipid Bilayer » ou bicouche lipidique supportée

SVL : « Supported Vesicle Layer » ou couche vésiculaire supportée

SAM : « Self-Assembled Monolayer » ou monocouche auto-assemblée

MUA : Acide mercaptoundécanoïque

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARN : Acide RiboNucléique

HA : Hémagglutinine

BSA : Albumine de sérum bovin

PEG : Polyéthylène glycol

PEI : Poly(Ethylène) Imine

LPS : Lipopolysaccharide

BBSA : Biotinylated BSA

CM : « Carboxymethylated dextran » ou carboxyméthyl dextrane

SM : Sphingomyéline

Chol : Cholestérol

CL : Cardiolipine

PC : phosphatidylcholine

PS : phosphatidylsérine

PI : phosphatidylinositol

PE : phosphatidyléthanolamine

DMPC : 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine

PDDA : Polychlorure de DiallylDiméthylAmmonium

DOGS-NTA : (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid)succinyl] nickel salt)
DPPC : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine

DOPC : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphatidylcholine

DOPE : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine

DSPC : 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine

DPPE : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine

DPPTE : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphothioéthanol

DSPE : 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine

POPG : 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol

POPE : 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanol-amine

DOPS : 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)

POPC : 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine

PLPC : 1-palmitoyl-2-linoléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine

HSPC : phosphatidylcholine de soja hydrogénée

SOPC : 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DSPE-PEG (2000) Biotin : 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt).

DNP-PE : N-Dinitrophényl-phosphatidyléthanolamine

DOetPC : 1,2-dioléyl-sn-glycéro-3-phosphocholine

egg-PC : egg phosphatidylcholine.

egg-PG : egg-phosphatidylglycérol

Lyso PC : 1-stéaroyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphocholine

SA : Acide Stéarique

µCP : « Microcontact printing » ou impression par microcontact

SPR : « Surface Plasmon Resonance » ou Résonance plasmonique de surface

SPRi : Imagerie par résonance plasmonique de surface

BALM : « Backside Absorbing Layer Microscopy »

AFM : Microscopie à Force Atomique
QCM : Microbalance à quartz

QCM-D : Microbalance à Quartz et à Dissipation

FRAP : « Fluorescence Recovery After Photobleaching » ou Redistribution de fluorescence
après photoblanchiment

FCS : « Fluorescence Correlation Spectroscopy » ou Spectroscopie de Corrélation de
Fluorescence

FRET : « Fluorescence Resonance Energy Transfert » ou Transfert d'énergie entre molécules
fluorescentes

FLIM : « Fluorescence-lifetime imaging microscopy »

EIS : Spectroscopie d'Impédance Electrochimique

MP-SPR : Résonance plasmonique de surface multiparamétrique

SPFS : Spectroscopie de fluorescence des plasmons de surface

IS : « Impedance Spectroscopy » ou Spectroscopie d'impédance

FTIR : « Fourier-Transformed Infrared spectroscopy » ou spectroscopie infrarouge à
transformée de Fourier

RL : rhamnolipide

mono-RL : mono-rhamnolipide

di-RL : di-rhamnolipide

CMC : Concentration Micellaire Critique

EDC : 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide

NHS : N-hydroxysuccinimide

PBS : « Phosphate Buffered Saline » ou tampon phosphate salin

BK : Bradykinine

TRIS : Tris(hydroxyméthyl)aminométhane

DMAP : 3-diméthylaminopropylamine
# INTRODUCTION GENERALE

Depuis des siècles, l'homme cherche à comprendre l'origine des maladies afin de trouver des traitements thérapeutiques. Ceci a amené la communauté scientifique à appréhender les mécanismes biologiques de l'échelle humaine à l'échelle nanométrique par de multiples recherches qui se sont succédées depuis la découverte de la cellule au cours du XVIIe siècle.

La cellule constitue une unité fondamentale des organismes vivants. Elle est délimitée par une membrane biologique, barrière naturelle qui délimite le milieu intracellulaire du milieu extracellulaire. Les membranes remplissent de nombreux rôles, tant structurels que fonctionnels. Elles sont principalement constituées d'une bicouche lipidique qui forme leur architecture de base et dans laquelle sont intégrées des protéines fonctionnelles. Cet ensemble est impliqué dans de nombreux processus cellulaires tel que le transport moléculaire, la reconnaissance moléculaire, la fusion, l'adhésion cellulaire.... En effet, un grand nombre de pathologies peut être associé à des perturbations de la composition, de l'organisation et des propriétés de la membrane biologique. Ces altérations, qui perturbent l'homéostasie des membranes, touchent de nombreux processus cellulaires et contribuent à la progression de la pathologie.

Dans la recherche et le développement de molécules à des fins thérapeutiques ou pour comprendre l'activité biologique de certaines molécules avec les membranes, travailler directement sur des cellules vivantes peut être long et fastidieux, étant donné que les cellules sont difficiles à maintenir dans leur intégrité et que leur culture est relativement longue (au-delà d'une vingtaine de jours), coûteuse, nécessitant des précautions et un environnement contrôlé. De plus, l'étude d'une fonction distincte ou d'un composant particulier est rendue difficile en raison de la complexité des membranes naturelles. De ce fait, il est primordial de disposer des bons outils, avec des modèles membranaires fiables et représentatifs.

Des systèmes modèles de membranes biomimétiques ont été développés dans le but de réduire ce degré de complexité et de faciliter les études ciblant les mécanismes se déroulant à la surface des membranes ou en leur sein. Parmi les modèles de membrane les plus populaires figurent les membranes dites « supportées ». Les structures membranaires lipidiques supportées sont d'excellents systèmes biomimétiques en raison de leur grande ressemblance avec les membranes cellulaires et autres barrières biologiques constituées principalement de
phospholipides. Elles sont importantes pour la recherche grâce à une combinaison de facteurs tels que la facilité de leur formation, le contrôle de leur complexité, leur stabilité et leur applicabilité à une vaste gamme de techniques analytiques différentes. Les structures membranaires lipidiques supportées ont été soigneusement étudiées à l'aide de nombreuses techniques de caractérisation de surface, notamment la spectroscopie de la résonance plasmonique de surface (SPR), la microbalance à quartz (QCM), les techniques de fluorescence, la microscopie à force atomique (AFM), la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) [1] et l'interférométrie par double polarisation (DPI) [2]. Les mécanismes de formation des couches lipidiques sur un support ont été appréhendés grâce aux nombreuses études réalisées par ces techniques. Aujourd'hui, les processus d'élaboration de ces structures lipidiques, en solution ou sur un support solide, sont bien maîtrisés. Les surfaces biomimétiques permettent désormais des études pertinentes d'interaction avec les milieux liquides, notamment dans le domaine de la biologie et de la médecine.

En solution, les vésicules lipidiques sont souvent utilisées comme modèle de membrane. Les interactions biomoléculaires ont été étudiées par une grande variété de techniques biophysiques adaptées aux analyses en solution telles que la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la spectroscopie RMN et la spectroscopie de fluorescence.

Sur une surface solide, l'assemblage de membranes biomimétiques offre des possibilités attrayantes pour surveiller et caractériser les interactions avec les (bio)-molécules par diverses techniques biophysiques sensibles de détection qui sont également des techniques de caractérisation de surface. Les études exploitent principalement la résonance plasmonique de surface (SPR), la microbalance à quartz (QCM), la microscopie de fluorescence et la microscopie à force atomique (AFM). Ces dernières décennies, de nombreuses recherches ont été menées pour comprendre les mécanismes d'interaction des membranes avec les (bio)-molécules à travers des surfaces biomimétiques. Elles concernent un grand nombre d'analytes, allant de petites molécules telles que des médicaments, des toxines, des peptides, des sucres, à de plus grandes structures telles que des acides nucléiques, des protéines, des enzymes, des anticorps, voire des cellules et des microorganismes entiers tels que des pathogènes (virus, bactéries, etc.).

Les premières études ont porté sur les monocouches et les bicouches de phospholipides comme surfaces biomimétiques [3-6]. En revanche, l'étude de certains mécanismes et processus
cellulaires intéressants avec ce type de membrane demeure limitée et parfois impossible. Plus récemment, des travaux ont été réalisés sur des supports fonctionnalisés par des vésicules lipidiques intactes de type liposome [7-10]. Les liposomes se présentent comme des vésicules constituées d'une ou plusieurs bicouches lipidiques. Ils sont devenus de véritables outils de recherche dans différents domaines depuis leur découverte par Bangham et al. en 1964 [11]. Nous nous sommes intéressés aux systèmes liposomaux, répandus du fait de leur facilité de préparation, leur caractère amphiphile, leur forme vésiculaire mimant une cellule et permettant d'étudier divers processus cellulaires, ou encore leur innocuité en termes de biocompatibilité et biodégradabilité. Les liposomes utilisés dans cette thèse sont préparés à base de phosphatidylcholine (PC) afin d'imiter davantage l'environnement naturel de la membrane cellulaire.

Les travaux de cette thèse se sont intéressés aux interactions biomolécule-membrane, et plus particulièrement aux interactions entre des biomolécules d'intérêt avec des liposomes intacts supportés sur une surface. Pour ce faire, nous nous sommes investies dans deux axes de développement, à savoir :

* L'établissement d'une méthode efficace pour une immobilisation stable de liposomes intacts sur une surface d'or.

* Le développement de méthodes biophysiques et notamment la résonance plasmonique de surface multiparamétrique (MP-SPR) pour le suivi et l'étude de l'interaction biomolécule-membrane.

Dans ce cadre, nous nous sommes particulièrement intéressés aux interactions de trois types de biomolécules ayant une activité biologique différente avec les membranes. Une toxine bactérienne, le rhamnolipide, qui constitue le principal facteur de virulence de la bactérie *Pseudomonas aeruginosa* et deux peptides tels que le peptide HA2 du virus de la grippe et le peptide bradykinine (BK) ont été mis en interaction avec une membrane biomimétique supportée à base de liposomes. Malgré l'étendue des connaissances acquises et les nombreux travaux antérieurs sur les effets de ces biomolécules, leurs mécanismes d'action restent encore compliqués et nécessitent davantage de compréhension. Ainsi notre objectif a été de mieux comprendre leurs mécanismes d'interaction avec la membrane cellulaire qui contribuent notoirement à des maladies sévères chez l'homme.
Nous avons cherché à caractériser et à suivre en temps réel et sans marquage spécifique les interactions de ces biomolécules avec la membrane modèle en utilisant la résonance plasmonique de surface multiparamétrique MP-SPR à double longueur d'onde. A notre connaissance, cette technique n'a pas été utilisée jusqu'à présent pour étudier l'interaction des trois biomolécules présentées dans ce travail avec des membranes modèles. La MP-SPR, avec son mode de balayage SPR large et sa configuration optique multi-longueurs d'onde, peut fournir des informations structurelles, thermodynamiques et cinétiques très importantes sur les membranes et leurs interactions avec des (bio)-molécules. En outre, une détermination théorique unique des propriétés optiques (épaisseur et indice de réfraction) des films ultraminces à l'échelle nanométrique peut être obtenue.

Ce manuscrit s'articule en quatre chapitres :

Tout d'abord, une étude bibliographique aborde la littérature existante en mettant l'accent sur les sujets et les questions cruciales qui ont motivé les recherches présentées dans cette thèse. Ainsi, nous introduisons les différentes notions de base concernant les membranes biologiques naturelles et les membranes biomimétiques modèles, en particulier les liposomes. Ensuite, nous décrivons les principales méthodes d'élaboration des membranes biomimétiques supportées citées dans les travaux antérieurs, et notamment, la bicouche lipidique supportée (SLB) et la couche vésiculaire supportée (SVL). A la fin de ce chapitre, nous illustrons l'application de ces membranes dans l'étude des mécanismes d'interaction de diverses biomolécules et leur caractérisation par les principales techniques de caractérisation de surface.

Le second chapitre, quant à lui, est une présentation de la théorie du phénomène de résonance plasmonique de surface. Nous essayons d'expliquer, d'une manière plutôt brève, les grandes lignes du principe de résonance. Ensuite, nous présentons les avantages de l'utilisation de la technique MP-SPR par rapport à la SPR traditionnelle afin de souligner son intérêt. Nous finissons le chapitre en présentant l'approche à double longueur d'onde de la technique MP-SPR utilisée dans l'analyse optique et théorique de nos résultats.

Les deux derniers chapitres, présentent, interprètent et discutent sur la base des connaissances actuelles les résultats expérimentaux obtenus dans le cadre de cette thèse. Le troisième chapitre a fait l'objet d'une publication parue dans le journal *Langmuir* (2021, 37(26), 7975-7985) et le quatrième chapitre a fait l'objet d'une publication récemment acceptée dans le journal *ACS Applied Materials & Interfaces* et une autre en cours de rédaction.
Le troisième chapitre est consacré à l'analyse de l'interaction entre les mono-rhamnolipides et une couche de liposomes supportés en utilisant la technique MP-SPR à deux longueur d'onde. Nous présentons la caractérisation des liposomes utilisés, ainsi que la méthode efficace pour les immobiliser sur une surface solide. Ensuite, nous présentons l'approche théorique du système multicouches adaptée à l'étude de l'interaction mono-RLs/liposome. Ainsi l'étude de la spécificité et du mécanisme de cette interaction est suivie par MP-SPR et analysée théoriquement pour distinguer les différents changements morphologiques de la couche initiale de liposomes.

Le quatrième chapitre présente l'application de la MP-SPR à deux longueur d'onde pour analyser les interactions d'un analogue du peptide HA2 du virus de la grippe et du peptide bradykinine avec une couche de liposomes supportés. En premier, les liposomes sont caractérisés par DLS, dans des tampons de pH différents. Puis, nous présentons les caractérisations par AFM de la couverture de surface par les liposomes. Enfin, nous rapportons l'analyse en temps réel de l'interaction des deux peptides avec la membrane, dans des tampons de pH différents. L'étude du peptide HA2 est plus développée dans ce chapitre. Les signaux SPR résultant de l'interaction peptide HA2/liposome sont modélisés pour mieux comprendre son mécanisme d'action à différents pH et à différentes concentrations.
Références

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# Chapitre I : Revue bibliographique
# I. Introduction

La complexité des membranes naturelles rend difficile l'étude d'une fonction distincte ou d'un constituant en particulier. Leur importance croissante en biotechnologie médicale a donc conduit au développement de modèles de membranes biomimétiques pour les mimer. Différentes stratégies ont été adoptées dans la littérature pour mettre au point des membranes artificielles en vue d'obtenir un modèle simple et pertinent. Dans ce contexte, ce chapitre est une synthèse bibliographique des nombreuses informations sur les membranes biomimétiques, leurs caractérisations et leurs applications. Il a pour but de présenter le contexte et les enjeux des membranes biomimétiques supportées afin de positionner le travail qui a été réalisé au cours de cette thèse.

Ce chapitre est devisé en deux parties. Dans une première partie, nous présentons la notion générale d'une membrane biologique ainsi que ses principaux constituants. Nous décrivons également les différents modèles de membranes biomimétiques développés à ce jour et plus particulièrement les liposomes. Ainsi, nous présentons les structures, les propriétés, les méthodes d'élaboration et les outils de caractérisation des liposomes. Puis, nous documentons l'état de l'art retraçant notamment les méthodes d'élaboration des membranes biomimétiques supportées et les façons de les former sur un support solide, en particulier la bicouche lipidique supportée et la couche vésiculaire supportée, en nous focalisant notamment sur la méthode que nous avons utilisée.

Dans une seconde partie, nous évoquons l'application des membranes biomimétiques supportées dans l'étude des mécanismes d'interactions biomoléculaires notamment vis-à-vis des protéines membranaires. Nous présentons ainsi les méthodes de caractérisation les plus utilisées, en soulignant le grand intérêt de la technique de résonance plasmonique de surface (SPR) qui est la méthode utilisée dans cette thèse.

# II. Des membranes biologiques aux membranes biomimétiques supportées

Cette partie vise à définir les caractéristiques d'une membrane biologique en termes de structure, composition et propriétés en vue de proposer un modèle expérimental pertinent.
## II.1. Les membranes biologiques

La cellule est une unité structurelle et fonctionnelle de la plupart des organismes vivants, entourée d'une membrane biologique. Les membranes biologiques sont essentielles à la vie en assurant le maintien de l'intégrité cellulaire. Elles jouent un rôle indispensable de barrière imperméable et sélective entre le milieu intérieur et extérieur de la cellule. Les membranes biologiques sont très complexes, tant au niveau de leur organisation que de leur composition. Quelle que soit sa provenance, une membrane est essentiellement formée d'une bicouche lipidique dans laquelle sont insérées des protéines (Figure 1). La partie lipidique des membranes est composée principalement de phospholipides, de cholestérol et de glycolipides.

<figure><img src="image_8.png" /><figcaption>**Figure 1.** Représentation simplifiée d'une membrane biologique et de ses composants</figcaption></figure>

### II.1.1. Les phospholipides

Les phospholipides sont les lipides les plus abondants des membranes biologiques. Ce sont des molécules amphiphiles dotées d'une tête polaire hydrophile et de deux chaînes hydrocarbonées hydrophobes. La plupart des phospholipides sont des phosphoglycérides dont la structure se compose d'un squelette de glycérol auquel sont greffés deux acides gras à chaîne longue, estérifiés chacun en position sn1 et sn2. Les acides gras possèdent généralement 16 ou 18 atomes de carbone et peuvent comporter une ou plusieurs insaturations, généralement non conjuguées. Ceci forme la zone hydrophobe (apolaire) de la molécule de phospholipide. À la troisième fonction alcool du glycérol (position sn3) est liée un groupe polaire, qui constitue la tête polaire hydrophile du phospholipide. Il s'agit d'un groupement phosphate chargé négativement, lui-même estérifié par différents groupements souvent azotés tel qu'un alcool aminé (choline, éthanolamine ou sérine), ou non azotés comme un polyol (inositol). Suivant les
groupements, la tête polaire est chargée positivement, négativement ou globalement neutre (zwitterionique). La nature et la charge globale des phospholipides seront dépendantes du groupement fixé au groupement phosphate. Les plus fréquemment rencontrés sont : la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI) qui sont chargés négativement, la phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidyléthanolamine (PE) qui ont une charge globale neutre dans une solution à pH physiologique (pH 7,4) [1].

<figure><img src="image_9.png" /><figcaption>**Figure 2.** Structure chimique des phospholipides : suivant la nature du groupe R attaché au groupement phosphate, on différenciera la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI).</figcaption></figure>

Les phospholipides sont donc constitués de deux parties (polaire et apolaire) qui possèdent des affinités pour deux milieux incompatibles, d'où l'appellation des phospholipides comme molécules amphiphiles ou tensioactifs ou surfactants.

## II.1.2. Organisation des phospholipides en solution aqueuse

La présence d'eau a pour effet de conduire les phospholipides à s'auto-organiser en une forme susceptible de diminuer les interactions énergétiquement défavorables entre les groupements hydrophobes des phospholipides et le milieu aqueux. La conséquence est qu'ils présentent leur tête vers le milieu aqueux. Compte tenu de la nature moléculaire des constituants, cet auto-assemblage pourra donner lieu à des micelles (Figure 3.a) (têtes polaires hydrophiles en contact avec le milieu aqueux et queues hydrophobes à l'abri du milieu aqueux) ou bien des bicouches
lipidiques (Figure 3.b) (deux monocouches de lipides associées qui contiennent les queues hydrophobes des lipides sachant que les têtes polaires sont en contact avec la phase aqueuse). Généralement les phospholipides s'associent dans une solution aqueuse sous forme de liposomes (Figure 3.c) (connue sous l'appellation « vésicule lipidique »). En solution, les molécules de phospholipides s'organisent entre elles de sorte que les groupements polaires soient en contact et les groupements apolaires également.

<figure><img src="image_10.png" /><figcaption>**Figure 3.** Différents auto-assemblages lipidiques en solution aqueuse. a) une micelle, b) une bicouche lipidique, c) une vésicule lipidique ou liposome</figcaption></figure>

### II.1.3. Température de transition de phase d'un phospholipide

Une donnée caractéristique des phospholipides est leur température de transition de phase (T<sub>m</sub>: *melting temperature*) qui correspond au passage réversible d'un état ordonné (L<sub>β</sub> ou configuration *trans*) vers un état désordonné (L<sub>α</sub> ou configuration *gauche*) par le biais d'un état intermédiaire P<sub>β</sub> [2, 3] (Figure 4). Il faut savoir qu'à une température inférieure à T<sub>m</sub>, les chaînes hydrocarbonées sont étirées au maximum et sont parallèles les unes aux autres et peu mobiles, la bicouche est alors à l'état gel ou phase L<sub>β</sub>. Dans le cas d'une température supérieure à T<sub>m</sub>, la mobilité moléculaire augmente et les phospholipides passent à l'état fluide ou phase L<sub>α</sub>, où les chaînes hydrocarbonées ne sont plus étirées mais désordonnées.
<figure><img src="image_11.png" /><figcaption>**Figure 4.** Configuration trans et gauche des phospholipides au sein de la membrane phospholipidique [4]</figcaption></figure>

La température de transition de phase est déterminée par la longueur des chaînes lipidiques et leur degré de saturation. En effet, une chaîne hydrocarbonée longue et saturée entraîne une T<sub>m</sub> élevée. En revanche, la T<sub>m</sub> diminue quand la chaîne est plus courte et le nombre d'insaturation augmente [4]. Il est à souligner que la température de transition de phase est un facteur déterminant et doit être pris en considération lors de la préparation des liposomes. Les liposomes se forment en cas de température supérieure à la température de transition de phase du phospholipide utilisé. Si des phospholipides de différente nature sont utilisés, il est nécessaire que la température soit supérieure à la T<sub>m</sub> du phospholipide la plus élevée [4].

### II.1.4. Le cholestérol

Les stérols et plus précisément le cholestérol se définissent comme étant des lipides qui comportent un noyau stéroïde plan se composant de 4 cycles fusionnés, 3 intégrant 6 atomes de carbone et 1 constitué de 5 atomes de carbone. Dans sa partie hydrophile nous pouvons relever un groupement hydroxyle (-OH), quant à sa partie hydrophobe, elle comporte quatre cycles aromatiques ainsi qu'une chaîne hydrocarbonée (Figure 5.a). Il est à noter que dans la bicouche phospholipidique, le cholestérol est inséré parallèlement aux chaînes des acides gras des phospholipides, incluant son groupement hydroxyle polaire orienté vers les têtes polaires des phospholipides [5, 6] (Figure 5.b). Le cholestérol se distingue notamment par le rôle essentiel qu'il possède concernant la perméabilité et la fluidité des membranes. Par ailleurs, il est utilisé dans la formulation des liposomes vu sa susceptibilité de diminuer les effets de la température sur la bicouche phospholipidique. Il faut savoir que le cholestérol s'incruste dans la bicouche phospholipidique. Si la température est inférieure à la température de transition de phase, le cholestérol a pour effet de réduire la rigidité de la membrane. En revanche, si la température est
supérieure à la température de transition de phase, le cholestérol entraîne une diminution du mouvement des phospholipides dans la bicouche. L'on en déduit donc que la fonction du cholestérol est de parer aux situations extrêmes de rigidité ou de fluidité pouvant caractériser la bicouche phospholipidique.

<figure><img src="image_12.png" /><figcaption>**Figure 5.** (a) Structure chimique du cholestérol et (b) son orientation dans la bicouche lipidique</figcaption></figure>

## II.2. Les membranes biomimétiques modèles

Vu la complexité des membranes biologiques qui réside notamment dans leur hétérogénéité moléculaire (variété des lipides, flexibilité organisationnelle) et leur fluidité, il n'est guère facile d'étudier leur structure et leur fonction. Par ailleurs, la dynamique cellulaire rend difficile l'évaluation de la contribution de la membrane biologique à un phénomène par rapport à la contribution du reste de la cellule [7]. Dans ce contexte, des membranes artificielles qui reproduisent les propriétés et la structure des membranes biologiques représentent des solutions de choix permettant d'atténuer ladite complexité et d'appréhender de façon plus précise des études relatives aux mécanismes ayant lieu à la surface des membranes ou au sein même de celles-ci. Ces membranes, appelées membranes biomimétiques, sont généralement constituées de lipides qui fournissent un environnement optimal aux membranes biologiques. Dans ce contexte, nous pouvons distinguer deux types de modèle, notamment les modèles de membranes libres en solution et les modèles de membranes supportées, confinées sur un support.

Pour reconstituer artificiellement les membranes biologiques et mimer ainsi leur comportement, il suffit de mettre en solution aqueuse le mélange de lipides souhaité. Les lipides s'assemblent alors naturellement pour former différentes sortes de micelles, liposomes, monocouches lipidiques ou de bicouches phospholipidiques planes. La morphologie des phases
formées dépend de plusieurs paramètres d'élaboration dont la concentration, la température, mais aussi la forme géométrique des molécules utilisées.

## II.3. Les différents modèles membranaires biomimétiques

Parmi les différentes classes de membranes biomimétiques, on retrouve les monocouches lipidiques, les vésicules lipidiques (liposomes) et les bicouches phospholipidiques planes.

### II.3.1. La monocouche de Langmuir

Les monocouches lipidiques, appelées aussi films de Langmuir sont historiquement les premiers modèles développés pour mimer les membranes [8-10]. Elles sont formées par l'étalement de lipides sur une interface air-eau. Le caractère amphiphile des lipides va conduire à l'orientation de leurs têtes polaires vers la phase aqueuse et de leurs queues hydrophobes vers la phase gazeuse [8].

<figure><img src="image_13.png" /><figcaption>**Figure 6.** Schéma représentatif d'une monocouche de Langmuir</figcaption></figure>

### II.3.2. Les vésicules lipidiques : Les liposomes

Les systèmes vésiculaires lipidiques de type liposomes, constituent un modèle simple de membrane cellulaire, en sus de leur importance dans la délivrance de médicaments. Etant constitués de lipides, leur étude permet de mieux comprendre les propriétés physico-chimiques et l'implication fonctionnelle de la fraction lipidique des membranes biologiques [11-13]. Leur utilisation permet d'étudier leur interaction avec des différentes biomolécules.

#### II.3.2.1. Structure et propriétés des liposomes

La découverte des liposomes est accordée à Alec D. Bangham suite à son étude publiée en 1964 [14] mais la dénomination "liposomes" n'est apparue que quelques années plus tard avec G. Weissman et G. Sessa [15]. Le terme « liposome » dérive de deux mots d'origine grecque, « lipos » qui signifie gras et « soma » qui signifie corps.
Les liposomes constituent le modèle le plus simple de structure biomimétique cellulaire. Ils ont la forme de vésicules lipidiques fermées, composées d'une ou plusieurs bicouches phospholipidiques qui emprisonnent une partie du solvant dans lequel elles se trouvent [16]. Etant insolubles dans l'eau, le caractère amphiphile des phospholipides détermine leur comportement en solution aqueuse. Ainsi, ces molécules tendent à s'auto-assembler afin de protéger leurs chaînes hydrophobes de l'eau. En particulier, les phospholipides possédant une forme moléculaire cylindrique, comme la phosphatidylcholine, s'auto-assemblent en bicouches lipidiques. Par conséquent, au contact d'une solution aqueuse, ces phospholipides tendent à s'aligner étroitement en bicouches afin de minimiser les interactions défavorables entre leurs chaînes hydrocarbonées et le milieu aqueux. En outre, ces bicouches se referment sur elles-mêmes pour former des vésicules closes et scellées ce qui élimine complètement les interactions défavorables avec le milieu aqueux tout en enfermant un certain volume aqueux.

Le diamètre de ces vésicules varie d'une vingtaine de nanomètres à quelques micromètres. L'épaisseur d'une bicouche phospholipidique est en moyenne de 4 à 6 nm (en fonction de la nature des phospholipides).

<figure><img src="image_14.png" /><figcaption>**Figure 7.** Structure d'un liposome : (a) un liposome fermé, (b) un demi-liposome, (c) un phospholipide</figcaption></figure>

Les liposomes peuvent être classés en fonction de leur nombre de bicouches ou de leur taille. Les liposomes multilamellaires ou MLV (MultiLamellar Vesicles) sont formées de plusieurs bicouches lipidiques, qui délimitent entre elles des compartiments aqueux. Au contraire, les liposomes unilamellaires sont uniquement constituées d'une bicouche et d'un compartiment
aqueux. Ces derniers sont répartis selon leur taille en trois grandes catégories ; les petites vésicules (Small Unilamellar Vesicles : SUV) mesurant de 20 à 100 nm, les grandes vésicules (Large Unilamellar Vesicles : LUV) mesurant de 100 nm à 1000 nm et les vésicules géantes (Giant Unilamellar Vesicles : GUV) de taille supérieure à 1000 nm [17].

<figure><img src="image_15.png" /><figcaption>**Figure 8.** Différentes structures de vésicules : SUV (petites vésicules unilamellaires), LUV (grandes vésicules unilamellaires), GUV (vésicules unilamellaires géantes) et MLV (grandes vésicules multilamellaires). Les vésicules sont présentées comme des demi vésicules pour montrer l'intérieur</figcaption></figure>

La structure des vésicules dépend du protocole de préparation de liposomes [18]. Les méthodes de préparation de base consistent généralement à sécher les lipides afin d'obtenir un film lipidique, puis à le gonfler et à le peler sous agitation énergique et/ou sonication pour former et disperser des vésicules lipidiques. La préparation des GUV nécessite des protocoles spécifiques différents de ceux de la préparation des SUV et LUV.

Une variété de phospholipides naturels et synthétiques est disponible pour la préparation de liposomes. Un équilibre précis entre les forces électrostatiques, les défauts d'empilement des lipides et la courbure est essentiel pour contrôler la taille, l'homogénéité et la stabilité des liposomes [19]. La composition lipidique modifie la charge globale des liposomes, ainsi que leur taille et leur rigidité. De ce fait, il est possible d'élaborer des liposomes anioniques, neutres ou cationiques, en utilisant des formulations lipidiques très précises. Par ailleurs, les
biomembranes classiques formées de phosphatidylcholine, un lipide zwiterrionique, sont faiblement négatives. Les propriétés électrostatiques des membranes dépendent de la fraction de lipides chargés négativement, comme la phosphatidylserine (PS) et les phosphoinositides. D'autre part, les défauts d'agencement et la courbure sont favorisés par les lipides ayant des chaînes acyles insaturées et/ou des petits groupes de tête [19]. Par conséquent, pour former un liposome, il est préférable que l'aire de la tête hydrophile des lipides soit légèrement supérieure à la section de la chaîne aliphatique. Les molécules qui remplissent ces conditions s'auto-assemblent spontanément en vésicules. Tavakoli et al. ont récemment décrit la production de différents types de liposomes pour des études d'interaction avec des protéines corona dans des milieux biologiques [20]. En ce qui concerne la formulation, les tailles peuvent aller de 30 à 300 nm et le potentiel zêta peut varier de -60 à +45mV. Un pourcentage de cholestérol peut être utilisé dans la formulation pour rigidifier la structure. La libération d'une molécule encapsulée est diminuée quand le pourcentage molaire du cholestérol augmente et avec des phospholipides de chaînes hydrocarbonées plus longues [21, 22].

Par ailleurs, les liposomes constituent de bons modèles pour étudier ce qui se déroule au niveau membranaire lors de différents processus tels que l'exocytose [23], l'endocytose [24], la fusion des membranes [25] et l'interaction des protéines avec la membrane qui est cruciale pour la régulation des fonctions biologiques [26]. Certains auteurs ont relié l'activité biologique exercée par certaines molécules à leur interaction avec la membrane biologique et ceci dans le but de fournir une base moléculaire qui peut expliquer les mécanismes d'action de ces molécules. Ainsi l'interaction de diverses molécules bioactives avec la membrane biologique a été étudiée en utilisant les liposomes comme modèles mimétiques de la membrane [27-29].

### II.3.2.2. Elaboration des liposomes

La littérature a montré qu'il existait une panoplie de méthodes de préparation des liposomes qui ont été développées et détaillées [30, 31]. Aussi, le choix de la méthode est déterminé essentiellement par la taille du liposome attendu et l'application biotechnologique à laquelle des liposomes sont nécessaires. Les GUV sont des vésicules se caractérisant par leur fragilité. Leur formation requiert des méthodes douces et lentes. Concernant la formation de MLV, elle est plutôt établie en recourant à des méthodes qui impliquent des contraintes mécaniques importantes. Il faut souligner que la méthode la plus utilisée est celle de l'hydratation d'un film lipidique sous agitation. Le résultat de cette méthode est la formation de vésicules de type MLV de taille et de lamellarité hétérogènes. La formation de LUV et de SUV est généralement
déterminée par la réduction de la taille et de la lamellarité de MLV précédemment formées sachant que des méthodes de préparation directes existent. Le passage des MLV aux LUV ou aux SUV se fait par le recours à des méthodes qui fournissent de l'énergie mécanique qui aura pour impact de casser les lamelles, parmi lesquelles on retrouve l'extrusion [32], la sonication [33] ou l'hydratation/déshydratation [34]. Autant de techniques permettent d'ouvrir les MLV, ce qui aura pour conséquence la formation des vésicules unilamellaires dont la taille sera essentiellement déterminée par la méthode utilisée et les conditions expérimentales.

Notre travail se penchera précisément sur la formation de liposomes de type SUV par la méthode d'hydratation du film lipidique décrite par Bangham en 1965 [35, 36] et suivi d'un traitement mécanique par sonication.

Force est d'admettre que la méthode d'hydratation du film lipidique est la méthode la plus utilisée en ce qui concerne la préparation des MLV. Dans ce protocole, les phospholipides sont préalablement dissous dans un solvant organique ou dans un mélange de solvants organiques. Le solvant est ensuite évaporé, ce qui entraîne la formation d'un film lipidique mince sur la paroi du ballon. Le film lipidique est hydraté en ajoutant une phase aqueuse sous agitation. L'étape d'hydratation se fait en maintenant une température supérieure à la température de transition de phase (T<sub>m</sub>) du phospholipide ou à la T<sub>m</sub> la plus élevée si un mélange de phospholipides est utilisé. La conséquence est un gonflement du film phospholipidique au contact de la solution aqueuse, pour ensuite se décoller des parois du ballon et se refermer sur lui-même en emprisonnant cette solution aqueuse. Ce procédé donne ainsi naissance à des vésicules de type MLV. La particularité de cette méthode est qu'elle génère des vésicules avec un important diamètre, de l'ordre de quelques micromètres et la distribution de la taille est très hétérogène. Les composés qui doivent être encapsulés sont ajoutés selon leur solubilité, soit dans la phase aqueuse soit dans le solvant organique contenant les lipides.

En ce qui concerne la réduction de la taille des MLV, elle se fait en les soumettant à une sonication en recourant à un bain à ultrasons ou par le biais d'une sonde à ultrasons [37, 38].

Si l'on opte pour une sonication par sonde à ultrasons, on procède en plongeant directement la sonde d'un sonicateur dans la dispersion de liposomes. En effet, dans la dispersion des liposomes, l'apport d'énergie est très élevé, ce qui entraîne un réchauffement du milieu. C'est pour cela qu'il est impératif de plonger le ballon qui contient la préparation de liposomes dans un bain de glace [39, 40].
Concernant la sonication par l'utilisation d'un bain à ultrasons : le ballon contenant la dispersion liposomale est directement plongé dans un bain à ultrasons dont la température est supérieure à la Tm du phospholipide [39, 40].

La particularité des ultrasons est qu'ils fournissent de l'énergie acoustique de sorte qu'elle exerce une pression qui fractionne les MLV en petites vésicules unilamellaires de type SUV [41]. Notons que les vésicules traitées sont influencées par la durée et la force de sonication [41]. Ceci dit, une augmentation de la durée et de la force de sonication conduit à une réduction de la taille des liposomes [42].

<figure><img src="image_16.png" /><figcaption>**Figure 9.** Préparation des liposomes par la méthode de Bangham : Hydratation d'un film lipidique</figcaption></figure>

### II.3.2.3. Caractérisation des liposomes

Les liposomes sont caractérisés par leur taille, leur charge, leur morphologie (forme, nombre de couches) et leur stabilité. Cette section est dédiée plus en détails à la méthodologie des différentes techniques de caractérisation des liposomes utilisées dans les travaux de cette thèse.

#### a. Diffusion dynamique de la lumière (DLS)

La diffusion dynamique de la lumière (DLS), connue aussi sous l'appellation "spectroscopie par corrélation de photons", est une technique mise en pratique depuis le début des années 80 pour caractériser des molécules, des particules ou des colloïdes en suspension [43]. Le principe
de fonctionnement de cette technique repose sur la mesure de la lumière diffusée par des particules de quelques nanomètres à quelques micromètres. Etant en état de suspension dans un liquide, ces particules sont animées d'un mouvement aléatoire, appelé mouvement brownien résultant du choc entre la particule et les petites molécules du solvant. Lorsque la suspension de particules est traversée par un faisceau de lumière (laser), celle-ci est alors diffusée dans toutes les directions par les particules. La lumière diffusée est enregistrée au niveau d'un détecteur placé à un angle donné vis-à-vis du faisceau incident. En mesurant la diffusion du faisceau par les particules, il sera possible de déterminer ainsi la taille des particules.

* **Diamètre hydrodynamique**

La DLS sert à déterminer le diamètre hydrodynamique de particules en suspension, pour des tailles comprises entre 1 nm à 1 µm.

L'intensité de la lumière diffusée par les particules est tributaire de leur taille. En effet, une petite taille de particule entraînera un mouvement brownien plus rapide. Le mouvement brownien donne lieu à une fluctuation de l'intensité de la lumière diffusée détectée. De ce fait, l'intensité diffusée par une petite particule varie plus rapidement que celle diffusée par une particule de plus grande taille (Figure 10).

<figure><img src="image_17.png" /><figcaption>**Figure 10.** Principe de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)</figcaption></figure>

Un corrélateur enregistre les fluctuations en calculant le temps de décalage entre la détection de chaque particule. Le mouvement brownien est influencé par la température et la viscosité du milieu de dispersion des particules. Le diamètre hydrodynamique est calculé en considérant le
coefficient de diffusion dans l'équation de Stokes-Einstein [44-46], pour des particules sphériques :

$$d = \frac{k \times T}{3 \times \pi \times \eta \times D}$$

Avec ;

d : le diamètre hydrodynamique des particules ou molécules

k : constante de Boltzmann (k = 1,3806488 × 10⁻²³ m² kg s⁻² K⁻¹)

T : la température

η : la viscosité du milieu

D : le coefficient de diffusion

Il faut savoir que le diamètre hydrodynamique est également dépendant de la force ionique du milieu de dispersion des particules. À la surface des particules, les ions créent une double couche électrique dont l'épaisseur correspond à la longueur de Debye (K⁻¹). La concentration en ions impacte nettement la vitesse de diffusion des particules puisqu'elle modifie la longueur de Debye. En effet, quand la concentration en ions est faible, la double couche s'étend autour de la particule, ce qui réduit la vitesse de diffusion et augmente le diamètre hydrodynamique apparent. Dans le cas contraire, c'est à dire lorsque la force ionique est élevée, la longueur de Debye est faible et le diamètre hydrodynamique diminue.

## • Potentiel zêta

Le potentiel zêta permet de caractériser la charge de surface d'une particule. Lorsqu'une particule chargée est mise en suspension en présence d'ions, une double couche électrique se forme entre la surface chargée et les ions du milieu. Le potentiel zêta correspond au potentiel électrocinétique d'une particule colloïdale, soit le potentiel situé au niveau du plan de cisaillement, entre la couche d'ions en forte interaction avec les colloïdes (couche de Stern) et la couche dite diffuse de la double couche électrique formée en surface du colloïde. Le potentiel zêta est déterminé par électrophorèse à laser Doppler. Une tension est appliquée entre deux électrodes, ce qui permet d'attirer les particules chargées par l'électrode de charge opposée. Une forte charge de la particule entraîne un déplacement plus rapide. Par ailleurs, la vitesse est
mesurée en fonction de la mobilité des particules. Au moyen de l'équation d'Henry, on détermine le potentiel zêta comme suit [47] :

$$Ug = \frac{2 \times \varepsilon \times \zeta \times f(ka)}{3\eta}$$

Où :

Ug = mobilité électrophorétique

$\varepsilon$ = constante diélectrique

$\zeta$ = potentiel zêta

$f(ka)$ = fonction de Henry, avec ka est une mesure du rapport entre le rayon de la particule à la longueur de Debye.

$\eta$ = viscosité du milieu

## b. Etude de la morphologie des liposomes

Les liposomes peuvent avoir une ou plusieurs bicouches lipidiques, et être sphériques ou ellipsoïdaux. Ces propriétés influencent la stabilité des liposomes, d'où la nécessité de leur caractérisation morphologique.

Les techniques microscopiques couramment utilisées pour l'imagerie des liposomes en solution sont la microscopie électronique à balayage (MEB) et la microscopie électronique à transmission (TEM). La microscopie électronique à balayage utilise les électrons rétrodiffusés et les électrons secondaires émis par l'échantillon, tandis que la microscopie électronique à transmission utilise les électrons transmis pour former une image [48].

La particularité de la microscopie électronique à balayage est qu'elle donne des informations relatives à la morphologie des liposomes et leur degré d'agrégation au sein d'un échantillon [49-51]. Néanmoins, cette technique a certaines limites en ce qui concerne la caractérisation des liposomes du fait que, par exemple, elle ne permet pas d'observer la structure interne des liposomes. Des difficultés sont également rencontrées lorsqu'il s'agit de différencier clairement les liposomes du milieu environnant. Ce problème s'accentue davantage dans le cas où les liposomes étudiés ont tendance à adhérer les uns aux autres en formant des agrégats [48].
En revanche, le recours à la microscopie électronique à transmission apporte des informations
sur la taille des particules, la forme et le nombre de lamelles qui apparaissent comme des
couches de surface [48]. Contrairement à la microscopie électronique à balayage, l'observation
de la morphologie des liposomes et l'identification de leur structure uni ou multilamellaire par
TEM est bien connue dans la littérature [52-54].

Le principe de fonctionnement de la TEM repose sur le passage d'un faisceau d'électrons à
travers un échantillon très mince. Celui-ci est ensuite guidé par un système de lentilles
magnétiques et forme au final une image. Une partie des électrons est alors absorbée par la
matière selon la densité de celle-ci. Le contact du faisceau d'électrons avec la matière engendre
l'apparition de différents types de rayonnements qui permettent de caractériser l'échantillon en
termes de forme, taille, porosité, cristallinité et composition élémentaire. Le faisceau transmis
a donc pour effet de former une image qui correspond à la projection en deux dimensions de
l'objet d'étude. Les rayons X sont exploités pour déterminer la composition chimique du
matériau. Quant au faisceau diffracté, il est analysé pour déterminer l'organisation
tridimensionnelle des atomes et caractériser la structure cristalline des matériaux.

La TEM est une technique très efficace mais elle nécessite une préparation complexe des
échantillons de suspension liposomale. Deux méthodes de préparation des échantillons sont
proposées dans la littérature : le TEM cryogénique (Cryo-TEM) [55] et la coloration négative
[56].

Le principe de la méthode Cryo-TEM consiste à effectuer une analyse TEM tout en maintenant
l'échantillon à des températures cryogéniques. Dans un premier temps, les échantillons de
suspension de liposomes sont soumis à une cryogénisation dans du propane liquide
(Température < 230 K). Puis l'échantillon solide est fractionné à 123 K et une reproduction de
la surface est effectuée par sublimation d'une fine couche de carbone sous vide à la surface de
l'échantillon. Une ombre de la réplique est produite à l'aide d'une vapeur de platine. On nettoie
ensuite la réplique avec de l'eau et de l'acétone, on la place sur une grille de cuivre et on l'observe
au TEM.

Dans le cas de la coloration négative, on fait absorber les échantillons de suspension liposomale
sur une grille métallique recouverte d'un mince film de carbone. On élimine l'excès d'eau à
l'aide de papier buvard. La grille est ensuite recouverte d'une solution contenant un agent de
contraste, comme le tétroxyde d'osmium ou l'acétate d'uranyle, pendant quelques secondes, puis
la solution est absorbée. L'agent de contraste se fixe de manière préférentielle sur le bord des particules absorbées. En raison de sa masse atomique élevée, l'agent de contraste dévie les électrons dans le diaphragme de l'objectif. Par conséquent, l'échantillon biologique apparaît plus clair que son environnement, d'où le nom de coloration négative. Dans les images obtenues au TEM, l'échantillon apparaît blanc sur un fond sombre.

Gao et al. [57] ont caractérisé par TEM à coloration négative des liposomes formés de phosphatidylcholine de soja, du cholestérol et PEG-ylés à la surface. Ces liposomes ont encapsulé un triterpène, l'acide oléanolique. Les images obtenues ont révélé la formation de vésicules sphériques de diamètre moyen de 100 nm (Figure 11). Autour de ces vésicules, une structure en bicouche a été clairement visualisée. Les clichés ont également permis de montrer que les liposomes contenant le tensioactif (Tween-80) présentaient moins de particules adhérées les unes aux autres en comparaison de ceux ne contenant pas le Tween-80.

<figure><img src="image_18.png" /><figcaption>**Figure 11.** Images obtenues par microscopie électronique à transmission pour des liposomes PEG-ylés encapsulant l'acide oléanolique. (A) : formulation sans le Tween-80 et (B) : formulation avec le Tween-80 [57]</figcaption></figure>

La Cryo-TEM est la méthode utilisée pour étudier la morphologie des liposomes dans cette thèse.

## II.4. Les membranes biomimétiques supportées

Dans le cadre de cette thèse, nous nous sommes intéressés plus en détail aux modèles membranaires biomimétiques supportés sur des surfaces solides, en particulier les membranes biomimétiques vésiculaires. Outre leur utilité pour la modélisation de membranes, les
liposomes présentent un grand intérêt puisqu'ils peuvent intervenir dans le processus de formation des deux principales surfaces biomimétiques membranaires, à savoir la bicouche lipidique supportée (SLB) et la couche vésiculaire supportée (SVL) [58, 59]. Ces membranes modèles formées sur une surface solide présentent le sérieux avantage de les rendre physiquement stabilisées et localisées, très pratique pour leur étude par des techniques de caractérisation de surface.

Les modèles les plus appropriés de bicouches phospholipidiques biomimétiques doivent répondre aux exigences suivantes :

- Il doit s'agir de structures fluides comportant deux couches de phospholipides authentiques.

- Les phospholipides doivent délimiter deux compartiments aqueux distincts ("cis" et "trans") des deux côtés de la bicouche.

- La bicouche doit être exempte de défauts pour éviter les canaux préférentiels pour les électrons, les ions et/ou les petites molécules.

- Leur préparation doit être facile, reproductible, robuste et stable pendant de longues périodes.

- Cette structure semblable à une membrane doit pouvoir être assemblée sur différents types de surfaces pour permettre divers types de détection ou d'analyse [60].

Les deux prochaines parties traiteront les deux principales catégories de membranes biomimétiques supportées, décrivant leurs méthodes d'élaboration et de caractérisation.

## II.4.1. La bicouche lipidique supportée (SLB)

Les bicouches lipidiques supportées (SLBs) représentent le modèle le plus simple, où une bicouche lipidique repose sur un support solide. Les SLBs ont été découvertes dans les années 80 par l'équipe Tamm et Mc Connell [61, 62] puis sont devenues très répandues en raison de leur facilité de préparation, leur robustesse et le fait qu'elles peuvent être étudiées par de nombreuses techniques de caractérisation de surface. Traditionnellement, leur formation repose sur la fusion ou l'éclatement de liposomes sur une surface hydrophile (mica, verre, oxydes métalliques...) puis du réarrangement des lipides et de leur auto-assemblage pour éviter les interactions hydrophobes-hydrophiles. [63, 64]. Dans la méthode conventionnelle de fusion de vésicules, lorsque de petites vésicules (<100 nm) sont ajoutées à une surface solide, elles s'adsorbent à la surface et, si l'énergie d'adhésion entre la membrane et le support est
suffisamment élevée, elles se rompent et fusionnent ensuite pour former une bicouche lipidique continue sur des supports hydrophiles [65]. Toutefois, si l'énergie est insuffisante, les vésicules fixées à la surface restent intactes [66]. Les propriétés chimiques de surface du substrat solide peuvent donc faciliter la formation des SLBs [67, 68], ainsi que les conditions expérimentales telles que la composition des lipides, la force ionique [69], le pH de la solution [70] et la pression osmotique [71]. Anderson et al. [72] ont étudié la formation de bicouches phospholipidiques du lipide neutre (zwitterionique) dimyristoyl-phosphatidylcholine (DMPC) sur diverses surfaces de verre à partir de vésicules dans diverses solutions aqueuses. Ils ont montré que les vésicules non chargées forment facilement des bicouches sur la silice chargée négativement dans des conditions de forte salinité mais n'adhèrent que faiblement dans des conditions de faible salinité.

Les SLBs se forment sur un support hydrophile avec une épaisseur qui varie généralement entre 4 et 7 nm suivant les lipides qui la constituent et sont séparées du support par une fine couche aqueuse d'environ 1 à 3 nm d'épaisseur (Figure 12). C'est cette fine couche qui permet à la bicouche de conserver une certaine fluidité et qui permet à la bicouche de ne pas être totalement fixée au support [73, 74].

<figure><img src="image_19.png" /><figcaption>**Figure 12.** Schéma d'une bicouche lipidique supportée sur une surface hydrophile</figcaption></figure>

Il existe une autre approche récente pour développer les SLBs : notamment la formation de bicouches attachées à un support. Le principe de cette formation est l'utilisation d'espaceurs entre le support et la membrane. L'attachement des espaceurs au support est réalisable par un traitement préalable du support par une chimie de surface qui permet ensuite la fixation de l'espaceur [75]. Pour le support solide, il s'agit généralement du verre, du mica ou encore de l'or. Ce sont en effet des matériaux pour lesquels il existe une chimie de surface développée, et pour lesquels de nombreuses techniques de caractérisation sont adaptées [75].
Sur une surface d'or, les SLBs peuvent être générées sur une monocouche auto-assemblée (SAM) d'alcanethiol. Dans la littérature, la stratégie principale pour stabiliser la bicouche membranaire déposée consiste à utiliser des thiolipides attachés à la surface d'or sous la forme d'une SAM mixte avec d'autres composés thiolés (Figure 13.a) [76-78]. Les thiolipides, en s'insérant dans la bicouche phospholipidique, permettent d'ancrer de manière stable le modèle de membrane sur la surface.

D'autres systèmes espaceurs existent, comme un système avidine-biotine utilisant la très forte affinité entre ces deux molécules en accrochant une membrane comportant des lipides biotinylés à un support greffé de streptavidine, ou encore l'ancrage par des brins d'acides nucléiques complémentaires les uns aux autres [79, 80] Dans notre groupe, nous avons observé qu'une bicouche de phospholipides pouvait être formée en ancrant un lipide biotinylé sur une couche de streptavidine déposée sur une surface d'or [81].

Une autre approche a utilisé des thiopeptides pour attacher la membrane. Ceux-ci sont construits sur la base d'un espaceur flexible comprenant un peptide court qui possède à une extrémité un groupe de thiol et à l'autre extrémité un lipide [82] (Figure 13.a). Une bicouche lipidique a également été élaborée sur des couches de polymères fonctionnalisés par des lipides, en utilisant des polymères tels que le poly(éthylène) imine (PEI) [82], le polyéthylène glycol (PEG) [83], le polychlorure de diallyldiméthylammonium (PDDA) [84], ou bien un polymère amphiphile [85]. (Figure13.b)

<figure><img src="image_20.png" /><figcaption>**Figure 13.** Schéma d'une bicouche lipidique attachée à un support solide par des espaceurs. (a) Espaceur de type lipide-alkyle ou lipide-peptide, (b) une couche d'un polymère</figcaption></figure>

Ces stratégies permettent d'obtenir une membrane modèle bien définie dans laquelle les couches lipidiques supérieure et inférieure sont fluides et avec une couche aqueuse supplémentaire entre la puce et la membrane. L'un des avantages de cette bicouche lipidique par rapport à la monocouche est qu'elle imite la membrane cellulaire. Il est possible d'inclure des protéines
transmembranaires sous une forme active dans la bicouche pour étudier leurs propriétés et leur activité de transfert.

## II.4.2. La couche vésiculaire supportée (SVL)

Ce type de membranes biomimétiques fera l'objet d'une étude privilégiée dans nos travaux. Les SVLs ont suscité une recherche intensive au cours de la dernière décennie et ont montré un grand potentiel dans les applications biologiques et biomédicales. Ces développements ont été inspirés par le fait que les liposomes ressemblent aux cellules biologiques et conservent structurellement les propriétés inhérentes aux membranes lipidiques naturelles. Les liposomes immobilisés sur une surface ont généralement été étudiés en tant que système modèle simple pour des applications biocapteur [86]. A des fins thérapeutiques, les liposomes immobilisés sur un dispositif biomédical ont été considérés comme un système potentiel de délivrance locale de médicaments qui libère immédiatement les médicaments et réduit les effets toxiques sur d'autres organismes, ce qui renforce l'effet thérapeutique du médicament [87].

Par rapport aux SLBs, les SVLs présentent plusieurs avantages en termes d'applications, parmi les plus fréquentes on peut citer :

- L'étude des interactions biomoléculaires de manière efficace grâce au rayon de courbure de la vésicule qui est un paramètre important.

- L'étude de différents mécanismes tels que l'étalement, la fusion, la rupture ou la destruction de la bicouche lipidique des vésicules.

- L'étude de la perméabilité de la bicouche lipidique, par exemple, en changeant la solution aqueuse externe, on peut mesurer la vitesse à laquelle la solution contenue dans les liposomes diffuse à travers la bicouche lipidique.

- L'étude de la fonctionnalité des protéines en insérant des protéines membranaires purifiées dans les liposomes pour former des protéoliposomes. Cela permet par exemple de mimer l'incorporation des protéines dans les membranes cellulaires.

- L'encapsulation dans leur compartiment interne des composés hydrophiles (ions, marqueurs, analytes, médicaments, gènes ...), ce qui est un plus pour des études mécanistiques par rapport aux bicouches. On peut étudier des mécanismes de fuites, de relargage, de diffusion...
De plus, les SVLs offrent une meilleure sensibilité que les SLBs et sont physiologiquement plus pertinentes. Néanmoins, l'obtention de couches stables de liposomes intacts n'est pas évidente car, en général, les liposomes se rompent au contact des surfaces solides en formant des bicouches.

Généralement, les SVLs se forment sur les supports solides soit par la formation de liaisons non covalentes, ou par la formation de liaisons covalentes en synthétisant des liposomes modifiés par des groupes d'ancrage [88].

Le comportement des liposomes sur une surface diffère considérablement selon le type de surface et les conditions expérimentales. Reimhult et al. [89-91] et Dimitrievski et Kasemo [92] ont examiné en détail les facteurs qui déterminent la stabilité des liposomes adsorbés. Ils ont abouti à la conclusion que les facteurs les plus importants qui conditionnent le destin des liposomes intacts lors de l'adsorption sont la composition lipidique et la charge de surface, bien que la taille et la concentration des liposomes, la température et la pression osmotique peuvent également jouer un rôle. Par conséquent, les vésicules neutres peuvent former des SVLs sur des surfaces de densité de charge modérée, à basse température et à faible gradient osmotique.

Les méthodes permettant d'immobiliser des liposomes en maintenant leur structure initiale sur des substrats solides ont suscité une attention considérable dans le monde de la recherche. Diverses méthodes simples et reproductibles d'immobilisation de liposomes intacts en recourant à des interactions moléculaires, telles que les interactions avidine-biotine [93], l'hybridation de l'ADN [94], ou des réactions chimiques [95] ont été rapportées.

Les premières méthodes ont exploité l'interaction avidine ou streptavidine-biotine. Des liposomes contenant une faible proportion de lipides biotinylés ont été retenus de manière stable sur une puce fonctionnalisée par une couche d'avidine greffée de manière covalente sur une matrice de carboxyméthyl dextrane [96-98] (Figure 14.a). Certains auteurs ont élaboré une monocouche plane de streptavidine directement sur une SAM mixte de poly (oxyde d'éthylène) à terminaisons biotine et hydroxyle sur une surface d'or, ce qui a permis le développement d'une couche intacte de liposomes biotinylés [99, 100]. Un film dense et homogène de liposomes biotinylés a aussi été formé sur une couche de streptavidine greffée de manière covalente sur une SAM d'acide mercaptoundécanoïque (MUA) [81] (Figure 14.b). Stamou et al. ont également réussi à adresser des liposomes biotinylés en monocouche sur un microréseau en modelant des régions de BSA biotinylées par µCP (impression par microcontact) et en formant
ensuite une couche de streptavidine pour ancrer les liposomes [101] (Figure 14.c). Biacore a commercialisé en 2000 une puce élaborée avec des groupes lipophiles fixés à la surface d'une matrice de carboxyméthyl dextrane (puce de détection L1). Des liposomes intacts ont été retenus de manière stable sur cette surface après injection [102, 103] (Figure 14.d). Stahelin et al. ont comparé la nature des couches lipidiques formées après injection de liposomes sur deux types de surface, à savoir une surface hydrophobe formée par des groupes alcanethiol et une surface recouverte par le carboxyméthyl dextrane (puce de détection Biacore Carboxymethylated dextran (CM)). Ils ont confirmé qu'une monocouche phospholipidique supportée était obtenue sur la surface d'or fonctionnalisée par des groupes alcanethiol tandis qu'une monocouche de liposomes intacts était formée sur le carboxyméthyl dextrane [59]. MacKenzie et al. ont exploité l'interaction stable entre un lipopolysaccharide (LPS) et l'anticorps spécifique du LPS pour immobiliser les liposomes sur une puce de détection CM [104, 105] (Figure 14.e). Une stratégie originale de structuration *via* la liaison d'ADN double brin a aussi été rapportée, qui pourrait être utilisée pour assembler un réseau de liposomes 3D pour les études SPR [106, 107] (Figure 14.f). Ma et al. [95] ont exploité la réaction de Staudinger afin d'immobiliser des liposomes fonctionnalisés par des groupes triphénylphosphine sur une lame de verre modifiée par des fonctions azide (Figure 14.g). Enfin récemment, Bompard et al. ont immobilisé des liposomes contenant un ratio molaire de 2 % d'un lipide chélateur appelé DOGS-NTA sur un substrat d'or SPR fonctionnalisé par des peptides *via* la formation d'un complexe histidine-NTA-nickel [108] (Figure 14.h).
<figure><img src="image_21.png" /><figcaption>a</figcaption></figure>

Carboxyméthyl dextrane + avidine

<figure><img src="image_22.png" /><figcaption>b</figcaption></figure>

SAM + streptavidine

<figure><img src="image_23.png" /><figcaption>c</figcaption></figure>

BSA + streptavidine

<figure><img src="image_24.png" /><figcaption>d</figcaption></figure>

Carboxyméthyl dextrane + lipide

<figure><img src="image_25.png" /><figcaption>e</figcaption></figure>

Carboxyméthyl dextrane + anticorps

<figure><img src="image_26.png" /><figcaption>f</figcaption></figure>

Liaison BSA + neutravidine + ADN
g

<figure><img src="image_27.png" /></figure>

h

<figure><img src="image_28.png" /><figcaption>**Figure 14.** Différentes méthodes d'immobilisation des liposomes intacts sur des substrats solides</figcaption></figure>

### II.4.3. Intercalation des protéines dans la membrane biomimétique supportée

Les protéines membranaires accomplissent un grand nombre de tâches biologiques essentielles. Cependant, elles ne peuvent pas être étudiées en dehors de leur environnement naturel, car leur structure et leur fonction naturelles sont compromises lorsque la protéine ne réside pas dans la membrane cellulaire. La recherche menée au cours des dernières décennies s'est orientée vers la mise en œuvre de fonctionnalités dans la membrane biomimétique pour fournir un environnement contrôlé, semblable à celui d'une membrane, dans lequel ces protéines peuvent être étudiées dans leur forme et leur fonction natives sans interférence avec d'autres composants membranaires.

Pour introduire des fonctions biologiques dans des systèmes de membranes lipidiques, il faut tenir compte de deux facteurs importants : a) la conformation et la fonction natives de la protéine doivent être conservées, et b) la flexibilité/fluidité du système doit être adéquate pour les changements de conformation ou les interactions physiologiques.

Il existe deux techniques principales d'intercalation des protéines dans une bicouche lipidique. La première technique consiste à reconstituer la membrane à partir de protéines pré-purifiées et mélangées à des lipides [109]. La seconde utilise des protéoliposomes qui sont isolés directement de la source cellulaire et contiennent toutes les protéines associées à la membrane
exprimées par une lignée cellulaire particulière [100]. La première approche permet d'étudier spécifiquement l'activité d'une protéine particulière tandis que la seconde minimise le risque de dénaturation des protéines membranaires qui sont généralement sensibles aux étapes de purification. Des protéines associées à des liposomes (Figure 15.a) ou à des bicouches lipidiques supportées (Figure 15.b) peuvent être élaborées à partir de liposomes natifs ou synthétiques.

a

<figure><img src="image_29.png" /></figure>

b

<figure><img src="image_30.png" /><figcaption>**Figure 15.** Approches basées sur des réseaux membranaires pour l'analyse des protéines membranaires : (a) réseau de liposomes, (b) réseau de bicouches lipidiques supportées avec des protéines membranaires incorporées</figcaption></figure>

Granéli et al. ont étudié l'insertion de deux protéines, à savoir le translocateur de proton nicotinamide nucléotide transhydrogénase (TH) de *Escherichia coli* et la gramicidine A (GrA) de *Bacillus brevis* dans des SLBs et SVLs [107, 109]. En 2005, Elie-Caille et al. [100] ont formé des membranes artificielles sur un support solide contenant des protéines transmembranaires en se servant de protéoliposomes provenant de la membrane interne de mitochondries de cellules hépatiques cancéreuses humaines. En effet, les protéoliposomes ont été attachés et fusionnés sur une surface *via* une liaison streptavidine. Chadli et al. [110] ont réussi à insérer une protéine G (CXCR4) dans une bicouche lipidique SLB greffée sur des peptides (pep-tBLM) à travers la fusion par un peptide α-hélicoïdal (AH) de protéoliposomes attachés. Ils ont montré que la bicouche lipidique insérant la protéine CXCR4 restait fluide, homogène et continue.

### III. Applications des membranes biomimétiques supportées

Le développement des modèles membranaires ouvre de nombreuses perspectives. En reproduisant les propriétés et la structure des membranes cellulaires, ils apparaissent comme des solutions privilégiées pour un grand nombre d'applications. Parmi ces applications, on peut
citer l'étude des mécanismes d'interaction des biomolécules d'intérêt avec les membranes ou
avec les protéines membranaires. D'autres applications concernent le développement de
(bio)capteurs ou bien d'approches thérapeutiques innovantes.

Nous abordons ainsi l'application des SVLs et des SLBs pour la détection de l'interaction
biomoléculaire. Les principales techniques de caractérisation les plus couramment utilisées
pour l'identification de ces interactions sont présentées ci-après.

La sélection de la technique à utiliser dépend du type de membrane biomimétique utilisée et de
l'objet d'études. L'intérêt principal est généralement une bonne résolution sur l'axe z. Une
membrane biomimétique est susceptible de couvrir une large surface mais n'a que quelques
nanomètres d'épaisseur.

Parmi les techniques de caractérisation sensibles à la surface, on trouve les méthodes d'imagerie
tel que la microscopie à force atomique (AFM) et les techniques de fluorescence. Il est
également rapporté des méthodes permettant de suivre en temps réel l'adsorption de molécules
sur un support comme la microbalance à quartz (QCM) et la résonance plasmonique de surface
(SPR). Ces méthodes permettent d'imager et de caractériser de manière très sensible un
échantillon contenu dans une très fine tranche [111-113]. Dans le cas des membranes
biomimétiques planes, de nombreux travaux ont permis de mieux appréhender leur formation,
leurs propriétés et leurs mécanismes d'interaction avec diverses biomolécules d'intérêt.

### III.1. Microscopie à force atomique (AFM)

La technique de microscopie à force atomique (AFM) a été développée depuis la découverte du microscope à effet tunnel en 1981 par Gerd Binnig et Heinrich Rohrer [114]. Celle-ci était au début utilisée dans l'air et permettait essentiellement d'obtenir une résolution atomique. Par la suite, sa mise au point en milieu liquide a largement facilité l'étude structurale de membranes plasmiques ainsi que la caractérisation de molécules uniques. Elle a également la particularité de permettre l'évaluation des forces d'interaction intra ou inter moléculaire.

#### III.1.1. Principe

L'AFM est une technique où une pointe montée sur un cantilever flexible permet de balayer
ligne par ligne la surface d'un échantillon adsorbé sur un support. L'appareil enregistre alors les
forces d'interaction qui ont lieu entre ces deux derniers. Le mica (surface hydrophile) constitue
l'un des supports les plus employés grâce à ses grandes zones planes à l'échelle atomique. Le
mouvement de la pointe dans les trois dimensions (x,y,z) est réglé par un scanner
piézoélectrique.

Son fonctionnement se fait par le biais d'un faisceau laser qui se focalise sur le dessus de l'extrémité de la pointe. Grâce à sa réflexion vers un système optique de photodiode à quadrants, il est possible de détecter les mouvements de déflection de la pointe lors de sa rencontre avec un élément de topographie. Par ailleurs, ce sont les mouvements de déflection verticale (variation en z) qui feront que l'image en hauteur sera construite ligne par ligne. Cela permettra une reconstitution en trois dimensions de la surface de l'échantillon. Le petit changement qui apparaîtra dans l'angle de flexion du cantilever sera converti en une large déviation susceptible d'être mesurée.

Notons que les forces d'interaction manifestées entre la pointe et la surface dépendent de la
distance séparant la pointe de l'échantillon ainsi que de la nature physicochimique de la pointe
et de celle de la surface [115].

<figure><img src="image_31.png" /><figcaption>**Figure 16.** Schéma illustrant les composantes principales d'un microscope à force atomique (AFM)</figcaption></figure>

Deux principaux modes d'imagerie sont habituellement utilisés, qui se distinguent par la façon
dont la pointe se déplace et interagit avec l'échantillon. : le mode contact et le mode contact
intermittent (« tapping mode »).
-Le mode contact : il s'agit du mode dans lequel la pointe reste en contact avec la surface au cours du processus de balayage de l'échantillon. La force entre la pointe et l'échantillon reste constante. Il est important que ces forces soient aussi faibles que possible afin de parer aux dommages qui pourraient affecter l'échantillon.

-Le mode contact intermittent (« tapping mode ») : il s'agit d'un mode dans lequel la pointe oscille à haute fréquence, ce qui réduit le contact entre la pointe et l'échantillon. La pointe n'interagit que périodiquement avec l'échantillon, une boucle d'asservissement maintenant l'amplitude de l'oscillation constante et ajustant la hauteur lorsque la pointe touche un élément topographique. Ce mode est le plus répandu étant donné qu'il est le moins dommageable pour l'échantillon.

Par ailleurs, l'AFM permet de déterminer la taille et la hauteur des liposomes. Cependant, il est probable que le comportement élastique de l'échantillon puisse diminuer la précision des mesures. Cela peut s'expliquer par les caractéristiques de la pointe et l'aplatissement des liposomes qui ont tendance à s'élargir quand ils sont adsorbés à la surface.

Dans le cadre de cette thèse, les images d'AFM ont été principalement acquises en mode "tapping" et en milieu liquide pour les surfaces recouvertes de phospholipides.

### III.1.2. Applications

De nombreuses études ont illustré l'utilité et l'efficacité de l'AFM pour l'étude des propriétés structurales des membranes biomimétiques supportées et pour caractériser l'effet de leur interaction avec des biomolécules sur l'organisation membranaire. C'est une technique d'imagerie utilisée pour visualiser et caractériser morphologiquement des liposomes fixés sur une surface. A titre d'exemple, Takechi-Haraya et al. [116] ont caractérisé des liposomes immobilisés sur un substrat de verre recouvert de streptavidine-biotinyl-BSA (BBSA) par AFM en milieu liquide. Ils ont montré que la forme des liposomes fixés diffère selon les procédures d'immobilisation des liposomes sur un substrat solide. Ils ont constaté que l'immobilisation des liposomes sur la streptavidine augmente l'adhésion des liposomes sans modifier la forme des liposomes attachés. Bakowsky et al. [117] ont étudié par AFM la morphologie de vésicules lipidiques PEGylées qui semblent sphériques sur une surface légèrement rugueuse par rapport aux vésicules non-PEGylées. Ils ont constaté que les vésicules PEGylées conservent leur forme arrondie et qu'aucun étalement ou fusion n'est observé à la surface, alors que pour les vésicules non-PEGylées, une coalescence est observée. Anabousi et al. [118] ont étudié par AFM, l'effet
de la protéine transferrine sur la taille des liposomes. La protéine a été ajoutée par couplage covalent à la surface des liposomes. Les auteurs ont montré que la taille des liposomes augmente de 5 à 15% en présence de transferrine. Berquand et al. [119] ont étudié l'effet d'un antibiotique macrolide (l'azithromycine) sur des vésicules lipidiques de différentes compositions lipidiques (DPPC:DOPC, DPPE:DOPC, SM:DOPC et SM:Chol:DOPC). Ils ont montré que cette interaction est fortement dépendante de la nature des lipides. Les images AFM ont révélé que l'azithromycine entraîne la dégradation et la disparition des domaines de gel DPPC et DPPE, alors qu'aucun effet n'a été noté sur les domaines SM et SM:cholestérol. Domenech et al. [120] ont caractérisé les interactions de l'oritavancine, un antibiotique de type glycopeptide qui est doté d'une puissante activité antimicrobienne, avec les bicouches phospholipidiques, en utilisant des liposomes (LUV) et des bicouches supportées faites de cardiolipine (CL) ou de palmitoyleoyl phosphatidylglycérol (POPG) et de palmitoyleoyl phosphatidyléthanolamine (POPE). Ils ont montré par AFM que l'oritavancine à une concentration de 84 nM a provoqué un repositionnement des domaines lipidiques de la bicouche supportée formé par CL: POPE. Chadli et al. [110] ont étudié étape par étape l'effet de l'interaction d'un peptide α-hélicoïdal (AH) dérivé de l'extrémité N-terminale de la protéine NS5A du virus de l'hépatite C sur une couche supportée de liposomes intacts composés de DOPC/DOPS + 2% de DOGS-NTA-Ni et immobilisés sur un substrat en or fonctionnalisé par un peptide. Ils ont montré par AFM que l'addition du peptide AH à 200 µg/mL conduit à la déstabilisation de la couche de liposome et à la formation d'une bicouche lipidique attachée sur le substrat.

### III.2. Les techniques de fluorescence

#### III.2.1. Principe

La fluorescence présente une large gamme d'outils pour marquer spécifiquement un élément, un organite ou une protéine. Elle offre aussi un fort contraste du fait que l'objet est éclairé sur un fond noir, ce qui rend plus facile la détection des structures d'intérêt. Les techniques recourant à la fluorescence se sont considérablement diversifiées depuis le début du 20ème siècle. A notre connaissance, la grande majorité de ces méthodes nécessitent un marquage préalable par des molécules dites fluorochromes ou fluorophores.

Suite à une excitation lumineuse, une molécule fluorescente absorbe un photon: elle passe alors d'un état électronique fondamental à un état excité de plus haute énergie. Elle peut perdre son
excitation spontanément et revenir dans son état fondamental en réémettant de façon rapide un autre photon d'énergie plus faible.

Les techniques de fluorescence restent les plus utilisées dans les études de systèmes membranaires modèles et de membranes de cellules vivantes [121]. Elles permettent d'étudier la dynamique des molécules d'intérêt (FRAP, FCS...) ainsi que leurs interactions (FRET, FLIM...) avec des cellules ou des membranes modèles. Leurs applications sont nombreuses et ne sont que brièvement abordées ici.

### III.2.2. Applications

Christiaens et al. [122] ont étudié par la fluorescence naturelle du tryptophane, l'insertion des peptides et des protéines dans les membranes, associée à des changements de conformation. Les méthodes de spectroscopie de fluorescence ont aussi été exploitées par Matos et al. [123] pour surveiller les interactions entre peptides et membrane lipidique. Levental et al. [124] ont montré que le marquage fluorescent des protéines et des lipides dans les GUV permet de déterminer la répartition des protéines dans les Lo-domains (liquid-ordered (Lo) domains dans la bicouche). Homan et al [125] ont démontré que les stérols fluorescents peuvent permettre de suivre la cinétique d'estérification des stérols. Kiessling et al [113] ont utilisé des membranes planes supportées et la microscopie à fluorescence pour répondre à certaines des questions ouvertes concernant les mécanismes moléculaires de la fusion membranaire médiée par les protéines SNARE (sigle pour l'anglais : Soluble N-éthylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor).

## III.3. Microbalance à quartz (QCM)

### III.3.1. Principe

La microbalance à quartz (QCM) est une méthode utilisée pour mesurer la masse d'un film mince déposé sur une surface. Cette technique est essentiellement basée sur la variation de la fréquence de résonance d'une lame de quartz, celle-ci étant due à une augmentation de la masse déposée sur la surface. La QCM a été initialement développée pour des mesures dans l'air ou dans le vide. Il était ainsi possible de mesurer la masse d'un dépôt rigide comme un film métallique. Cette technique a ensuite été développée notamment dans les années 90 par Rodahl et al. [126, 127] après la mise au point de la microbalance à quartz et à dissipation (QCM-D). Ils ont ainsi été en mesure d'établir des caractérisations en milieu liquide, ce qui a ouvert un champ considérable de nouvelles applications.
Contrairement aux autres techniques, cette technique a l'avantage de ne pas nécessiter l'utilisation d'un marquage spécifique.

La QCM exploite les propriétés piézoélectriques du quartz, qui associent une déformation mécanique à une polarisation électrique. De ce fait, lorsqu'un champ électrique alternatif est appliqué à un cristal de quartz, celui-ci oscille et entre en résonance. Un apport de matière va alors provoquer une perturbation de la résonance du cristal et donc une modification de la fréquence d'oscillation : plus la masse adsorbée est importante, plus la fréquence est réduite (Figures 17.a et 17.b). La mesure du facteur de dissipation permet de quantifier l'amortissement des oscillations du cristal par le matériau adsorbé, qui dépend directement des propriétés viscoélastiques de ce dernier, les matériaux « mous » dissipant plus efficacement que les matériaux « durs » (Figures 17.c et 17.d).

<figure><img src="image_32.png" /><figcaption>**Figure 17.** Principe de la QCM. (a) Fréquence d'oscillation d'un cristal nu, (b) Fréquence d'oscillation d'un cristal après ajout de la masse, (c) Dissipation de l'oscillation d'un cristal revêtu d'un matériau dur, (d) Dissipation de l'oscillation d'un cristal revêtu d'un matériau mou</figcaption></figure>

### III.3.2. Applications

En 2010, Briand et al. [128] ont utilisé la QCM-D et la spectroscopie d'impédance électrochimique (EIS) pour étudier (i) la formation de SLBs sur un substrat SiO₂ et (ii) l'influence de l'insertion d'un peptide formant des pores (la gramicidine D) sur les propriétés mécaniques et électriques de la membrane supportée. Ils ont pu vérifier la formation d'une bicouche lipidique par l'adsorption et la rupture de vésicules de POPC sur le substrat SiO₂. Les propriétés membranaires de la SLB ont été modifiées en fonction de la concentration en peptides. De faibles concentrations de peptides n'ont pas provoqué de modifications structurelles détectables par QCM-D. En revanche, à des concentrations élevées, des changements structurels de la SLB ont été induits (également confirmés par AFM). De même,
Lu et al. [129] ont étudié le dépôt et la déformation de vésicules sur différentes surfaces, ainsi que leur interaction avec le peptide mélittine, par la technique QCM-D combinée à des simulations informatiques. Ils ont révélé la formation d'une SLB sur la surface nue de SiO₂, et la formation d'une couche de vésicules intactes sur un substrat recouvert d'or ou de polyélectrolyte. Ils ont constaté que la morphologie de la membrane influençait les interactions de celle-ci avec la mélittine, allant jusqu'à altérer l'efficacité d'insertion du peptide dans la membrane.

Zobel et al. [130] ont incorporé des protéines d'adhésion trans-synaptiques recombinantes Fc-chimera (EphrinA5 et N-Cadherinin) dans une bicouche lipidique fluide (POPC) pour constituer une plateforme biomimétique capable de favoriser l'adhésion des cellules neurales. L'intercalation efficace de ces deux protéines membranaires a été prouvée par QCM, imagerie calcique et immunofluorescence. La plateforme biomimétique résultante s'est également avérée agir pour la maturation des neurones immobilisés. Ainsi, les études ont montré que les protéines insérées dans la membrane restent actives car elles sont capables de jouer un rôle d'adhésion et de propagation de signaux dans les neurones.

### III.4. La Résonance Plasmonique de Surface (SPR)

La spectroscopie de résonance plasmonique de surface (SPR) est une technique optique, couramment utilisée pour étudier en temps réel les interactions moléculaires qui se produisent à l'interface d'un métal (l'or, l'argent ...) et d'un milieu diélectrique (eau, air, solvant). Il s'agit d'une technique sensible aux phénomènes de surface. D'une manière générale, le ligand est immobilisé sur la surface du métal, l'analyte en solution est injecté via un système microfluidique et l'interaction peut être facilement détectée et analysée. Comme pour la QCM, cette technique présente l'avantage de ne nécessiter aucun marquage spécifique de la molécule à étudier. Elle est souvent utilisée pour caractériser des couches minces, suivre des processus biologiques spécifiques (association/dissociation) et étudier des changements physico-chimiques telles que l'adsorption/désorption de molécules.

#### III.4.1. Principe

La SPR est basée sur l'utilisation d'ondes électromagnétiques évanescentes se propageant à l'interface métal/milieu diélectrique. Ces ondes évanescentes sont sensibles à tout changement de l'indice de réfraction sur une distance très courte par rapport à la surface métallique, siège des interactions moléculaires étudiées. Le principe de la SPR repose donc sur la quantification
des changements des propriétés optiques de la surface, qui sont liés à la variation de densité de masse à la surface suite à la formation et à la dissociation des complexes moléculaires.

La Figure 18 est une représentation schématique du principe de fonctionnement de la SPR. Celui-ci repose sur la mise en commun d'un prisme, d'une source de lumière monochromatique polarisée p, d'un canal d'écoulement et d'une surface formée d'une couche métallique (généralement en or) pour la génération de la résonance plasmonique de surface. Les principes physiques de la SPR seront expliqués plus en détails au niveau du second chapitre de cette thèse.

La lumière émise par la source lumineuse est réfléchie sur la surface du prisme recouvert d'or et est ensuite détectée par un photodétecteur. Ainsi, la lumière interagit avec les électrons libres du métal ce qui provoque l'excitation du plasmon de surface. Sous un angle d'incidence précis, une partie de la lumière est absorbée par le métal et entraîne une oscillation ondulatoire des électrons, connue sous le nom de résonance plasmonique de surface. Cet angle d'incidence spécifique est appelé angle de résonance et est noté θ<sub>SPR</sub> dans ce manuscrit. L'absorption de l'énergie photonique à l'angle de résonance résulte alors en une perte d'une partie de la lumière réfléchie et une forte baisse de l'intensité de la lumière réfléchie.

L'angle de résonance correspondant à l'angle d'incidence au minimum d'intensité. Il dépend d'un certain nombre de facteurs tels que l'épaisseur de la couche métallique, la longueur d'onde de la lumière excitatrice et surtout de la masse (l'indice de réfraction) adsorbée sur la surface métallique.

<figure><img src="image_33.png" /><figcaption>**Figure 18.** Représentation schématique du principe de fonctionnement de la technique SPR</figcaption></figure>
Suite à l'excitation du plasmon de surface, il apparaît un pic de résonance au niveau de la courbe SPR (également appelé courbe de plasmon ou courbe de réflectivité) (I) (Figure 19.a) qui montre la variation de l'intensité de la lumière réfléchie en fonction de l'angle de résonance θ<sub>SPR</sub>. En effet, les variations de ce pic vont permettre de quantifier les perturbations se produisant au voisinage de l'interface métal/milieu diélectrique en raison des variations de l'indice de réfraction et de l'épaisseur de la couche formée. Pour un état (I), le minimum du pic de la courbe SPR se situe à un angle de résonance (θ<sub>SPR,1</sub>). La plus faible variation à la surface entraîne un changement d'indice de réfraction du milieu. Ce changement implique la modification de l'énergie nécessaire à l'excitation du plasmon de surface et entraine donc un déplacement de l'angle de résonance θ<sub>SPR,1</sub> en θ<sub>SPR,2</sub> (état II) pour remplir les nouvelles conditions de résonance. C'est ce décalage qui est mesuré comme réponse. Le suivi de la variation de l'angle de résonance θ<sub>SPR</sub> en fonction du temps donne ce qu'on appelle le sensorgramme (Figure 19.b). Ce dernier permet de donner des informations sur la cinétique des interactions, l'épaisseur et la masse de la couche déposée sur la surface et donc sur le nombre de molécules fixées.

<figure><img src="image_34.png" /><figcaption>**Figure 19.** (a) pic de résonance avant et après formation du complexe moléculaire et (b) le sensorgramme</figcaption></figure>

La technique SPR a apporté une véritable avancée pour la détection biochimique, du fait qu'une
fine couche de biomolécules atténue fortement les conditions d'excitation du plasmon de
surface, ce qui peut être mesuré comme expliqué par le changement de l'angle de résonance
(θSPR). La méthode la plus utilisée dans les instruments SPR est la configuration de
Kretschmann où l'excitation du plasmon de surface est obtenue par réflexion interne totale (TIR), dont le principe sera défini dans le chapitre suivant.

### III.4.2. Applications

Le domaine d'applications de la SPR est large et très diversifié. Il s'étend de la détermination des propriétés optiques des couches minces (indices de réfraction, épaisseurs...) [131-133] à son utilisation comme principe de base pour des capteurs chimiques et des capteurs biologiques pouvant détecter des interactions de type antigène-anticorps, ADN-ADN, ADN-protéine, protéine-protéine et récepteur-ligand [134-136]. Récemment, la technique SPR a également été mise en œuvre pour étudier des interactions avec des membranes biomimétiques impliquant des monocouches, des bicouches ou des vésicules lipidiques supportées. Un certain nombre d'études ont porté sur le dépôt de ces membranes sur des substrats d'or par SPR [67,91,137-142] et ont ensuite été appliquées pour étudier les interactions avec différentes molécules telles que le catéchol [143], des médicaments [144], des peptides [145, 146], des protéines [58,147,148], ou des toxines [149]. Ces applications démontrent l'énorme potentiel de la SPR pour améliorer notre compréhension moléculaire des événements médiés par les membranes. La résonance plasmonique de surface permet de sonder les surfaces et les films de façon non destructive et de mesurer en temps réel les biomolécules se liant à des surfaces biomimétiques sans l'application d'un marqueur spécifique puisque la méthode SPR dépend de la variation de la masse adsorbée à la surface.

Pour certaines applications, la SPR présente quelques faiblesses, notamment dans l'incapacité à résoudre le mode et l'emplacement de la liaison d'une molécule avec la surface et l'insensibilité aux événements anisotropes tels que les changements d'orientation de l'espèce liée à la membrane [150]. Il existe d'autres techniques comme l'ellipsométrie [151] et l'interférométrie à double polarisation [152, 153] qui peuvent dévoiler ces propriétés. L'orientation des molécules dans les membranes lipidiques peut également être étudiée à l'aide de la spectroscopie infrarouge ou par le dichroïsme linéaire [154]. La QCM aussi peut fournir des informations complémentaires sur les modèles de membranes lipidiques, comme les changements de viscoélasticité et d'hydratation de la membrane [155]. Ainsi, la SPR peut être combinée à d'autres techniques simultanément dans le but d'augmenter la sensibilité de la détection et d'améliorer par conséquent ses fonctionnalités. Par exemple, la QCM-D et la SPR peuvent toutes les deux fournir des informations sur les événements de liaison avec les surfaces
et les propriétés des films lipidiques qui en résultent en temps réel en utilisant respectivement la variation de la dissipation de fréquence et le changement d'indice de réfraction.

Au cours des dernières années, de nombreux chercheurs ont exploité principalement la technique SPR, associée parfois à d'autres techniques complémentaires, pour suivre les étapes de formation des membranes biomimétiques supportées, puis étudier leur interaction avec des molécules biologiques spécifiques afin de comprendre certains mécanismes complexes. En regard des travaux rapportées dans la littérature, le Tableau 1 présente une variété des études d'interaction utilisant des systèmes membranaires modèles de type SLB ou SVL. La composition lipidique de la membrane varie entre les différentes études et parfois au sein d'une même étude afin de comprendre le rôle de différents composants membranaires dans les événements médiés par la membrane. Ces membranes ont été immobilisées sur des substrats solides *via* différentes méthodes d'élaboration pour former soit une couche de liposomes intacts ou une bicouche lipidique supportée. La formation et la stabilité des membranes biomimétiques formées ont été caractérisées par la technique SPR. Ces études prouvent qu'il est également possible d'obtenir facilement des informations sur la cinétique de liaison des biomolécules à la membrane, de fournir en temps réel les taux d'association et de dissociation, de comprendre l'effet induit par ces interactions sur la membrane grâce aux signaux SPR obtenus et à la modélisation théorique des résultats. En outre, ces chercheurs ont montré que la SPR combinée à d'autres techniques peut fournir la base d'une compréhension plus fine des mécanismes moléculaires de ces interactions membranaires. Ils ont notamment pu identifier et confirmer certains mécanismes tels que l'adsorption et/ou l'insertion, la création de pores dans les membranes, la libération de biomolécules ou d'espèces encapsulées (médicaments), ou encore la déstabilisation des membranes et la fusion membranaire, ...

<table><caption>**Tableau 1.** Différents travaux rapportés sur l'interaction de biomolécules avec des membranes biomimétiques détectée par la technique SPR en combinaison avec d'autres méthodes de mesure.</caption><thead><tr><td>Analyte cible</td><td>Modèle membranaire</td><td>Lipides</td><td>Méthode analytique</td><td>Réf</td></tr></thead><tbody><tr><td>Peptide amphiphile de la cinnamycine</td><td>Bicouche lipidique</td><td>DOPC/DOPE/DPPTE</td><td>SPR</td><td>[156]</td></tr></tbody></table>
<table><tr><td>Peptides de mélittine et de magainine</td><td>Bicouche lipidique</td><td>egg-PC/CHOL<br>PE/egg-PG</td><td>SPR</td><td>[157]</td></tr><tr><td>Protéine neurocalcine et toxine de l'adénylate cyclase</td><td>Bicouche lipidique</td><td>Egg-PC/DSPE-PEG3400-NHS</td><td>SPR</td><td>[60]</td></tr><tr><td>Médicaments</td><td>Liposome</td><td>POPC/CHOL</td><td>SPR</td><td>[144]</td></tr><tr><td>Peptides cationiques actifs sur la membrane</td><td>Liposome</td><td>POPC/MPB-PE</td><td>SPR/Fluorescence</td><td>[146]</td></tr><tr><td>Peptide HA de la protéine HCV NS5A</td><td>Liposome</td><td>POPC/DOGS-NTA(Ni)<br>POPC/SM/DOPE/CHOL/DOGS-NTA(Ni)</td><td>SPR/BALM</td><td>[108]</td></tr><tr><td>Protéine de Corona</td><td>Liposome</td><td>HSPC/cholestérol/DSPE-PEG2000 ou DSPE</td><td>MP-SPR</td><td>[131]</td></tr><tr><td>Protéine de Corona</td><td>Liposome</td><td>DPPC/DSPC/LysoPC/DSPE ou DSPE-PEG2000</td><td>MP-SPR<br>nLC-MS/MS</td><td>[147]</td></tr><tr><td>Phospholipase A2</td><td>Liposome</td><td>DOetPC/Biot-DOPC</td><td>SPR</td><td>[99]</td></tr><tr><td>Créatinine kinase mitochondriale</td><td>Liposome (LUV)</td><td>Biotin-X-DHPE/CL/PC</td><td>SPR</td><td>[98]</td></tr><tr><td>Protéotoxines</td><td>Liposome</td><td>N-Biotin PE/DNP-PE</td><td>SPR</td><td>[96]</td></tr><tr><td>Protéine G transducine</td><td>Rhodopsine insérée dans une bicouche lipidique</td><td>egg-PC</td><td>Time-resolved SPR</td><td>[158]</td></tr><tr><td>Colicine N</td><td>OmpF porine insérée dans la bicouche lipidique</td><td>dioléoyl lécithine</td><td>SPR/IS</td><td>[77]</td></tr></table>
<table><tr><td>Antagoniste α-bungarotoxine</td><td>Récepteur d'acétylcholine inséré dans la bicouche lipidique</td><td>Soybean lipids</td><td>SPRS/SPFS</td><td>[159]</td></tr><tr><td>Chemokine pour CXCR4, dérivé des cellules stromales facteur1a (SDF-1α)</td><td>GPCR inséré dans la bicouche lipidique</td><td>POPC</td><td>SPR</td><td>[160]</td></tr><tr><td>Toxine du choléra</td><td>Ganglioside GM1 inséré dans la membrane du liposome</td><td>Egg-PC</td><td>SPR</td><td>[103]</td></tr><tr><td>Antibiotiques du groupe de la vancomycine</td><td>Mucopeptide de la paroi cellulaire bactérienne, analogue inséré dans la membrane du liposome</td><td>Egg-PC</td><td>SPR</td><td>[103]</td></tr></table>

DOPC : Dioléoylphosphatidylcholine ; DOPE : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine ; DPPTE : 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphothioéthanol ; HSPC : phosphatidylcholine de soja hydrogénée ; DSPE : 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine DSPE-PEG2000 : N-(carbonyl-méthoxypolyéthylène glycol 2000)-1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine sodium salt ; DNP-PE : N-Dinitrophényl-phosphatidyléthanolamine ; N-Biotin PE : N-biotin-phosphatidyléthanolamine ; DOetPC : 1,2-dioléyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ; egg-PC, egg phosphatidylcholine. egg-phosphatidylglycérol (egg-PG) ; IS : spectroscopie d'impédance ; SPRS : spectroscopie de résonance plasmonique de surface ; SPFS : Spectroscopie de fluorescence des plasmons de surface ; DPPC : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ; DSPC : 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ; Lyso PC : 1-stéaroyl-2-hydroxy-sn-glycéro-3-phosphocholine ; POPC : 1-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine ; DOGS-NTA(Ni) : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacétic acid)succinyl] nickel salt ; SM : sphingomyéline (brain porcine) ; DSPE-PEG3400-NHS : 1,2-Distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-poly-(éthylèneglycol)-N-hydroxysuccinimide ; MPB-PE : 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(4-(p-maléimidophényl)butyramide) ; GPCR : Récepteur couplé à la protéine G ; CL : Cardiolipine ; MS-SPR : Résonance plasmonique de surface multiparamétrique ; nLC-MS/MS : nano-chromatographie liquide-spectrométrie de masse.

## IV. Conclusion

Cette étude bibliographique montre le très grand nombre de recherches menées sur le développement de membranes biomimétiques pour appréhender des phénomènes
membranaires complexes. Après avoir défini les constituants d'une membrane biologique tels que les phospholipides et le cholestérol nécessaires à la compréhension des travaux réalisés dans cette thèse, la bicouche lipidique supportée (SLB) et la couche vésiculaire supportée (SVL) ont été décrites comme des modèles membranaires pertinents du fait de leur grande similitude avec les membranes cellulaires. Nous avons abordé les nouvelles approches citées dans la littérature qui mènent à la formation de ces deux modèles, en particulier l'approche basée sur le complexe biotine/streptavidine avec laquelle nous avons choisi de travailler pour développer une couche de liposomes intacts. De nombreuses techniques de caractérisation ont été exploitées par les chercheurs afin de caractériser la formation de ces couches modèles et de détecter des phénomènes biologiques induits par leur interaction avec des biomolécules. Notamment, les techniques de microscopie à force atomique (AFM), fluorescence et microbalance à quartz (QCM) ont été privilégiées pour ces études. Des méthodes électrochimiques ont également été développées. Par ailleurs, les dernières avancées biotechnologiques montrent l'efficacité de la technique de résonance plasmonique de surface (SPR) pour suivre ces interactions membranaires en temps réel et sans marquage spécifique. Dans le chapitre suivant, nous allons présenter la théorie de la technique de résonance plasmonique de surface utilisée au long de ce travail.
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# Chapitre II : La théorie de la Résonance Plasmonique de Surface (SPR)
# I. Introduction

Ce second chapitre est dédié à la présentation de la théorie de la résonance plasmonique de surface (SPR). Nous nous intéressons, en premier lieu, à une approche théorique quant aux plasmons de surface. Leurs conditions d'existence, leurs propriétés spatiales ainsi que leurs méthodes d'excitation sont abordées. La notion de la résonance du plasmon de surface est ensuite déduite. Nous procédons ensuite à mettre en évidence l'intérêt de la résonance plasmonique de surface multiparamétrique MP-SPR par rapport à la SPR traditionnelle. Nous nous intéressons particulièrement au principe physique de la technique MP-SPR à double longueur d'onde qui est l'approche adoptée dans l'analyse optique de nos résultats.

# II. Résonance plasmonique de surface et approche plasmonique

## II.1. Historique de la découverte du plasmon de surface

L'étude du plasmon de surface n'est pas récente. Elle remonte à 1902 lorsque R.Wood, en étudiant le spectre de diffraction d'une source continue de lumière blanche à l'aide d'un réseau de diffraction recouvert de métal, avait remarqué une diffraction inhabituelle et la présence de bandes noires qu'il décrivait comme des anomalies [1]. L'interprétation théorique de ce phénomène et l'idée d'ondes de surface ont été rapportées pour la première fois en 1941 par U. Fano [2]. Cependant, la théorie n'a été pleinement développée qu'à la fin des années 50 par Ritchie [3], Stern et Ferrell [4] et Kanazawa [5] pour expliquer la perte d'énergie subie par les faisceaux d'électrons passant à travers des feuilles métalliques minces en contact avec un milieu diélectrique. Les auteurs ont constaté que les électrons à l'intérieur de la feuille pouvaient collectivement osciller à l'interface à une fréquence inférieure à la fréquence du plasma. En 1968, Otto avait montré que ces ondes de surface pouvaient être excitées en utilisant la réflexion totale atténuée (ATR) [6]. Au cours de la même année, Kretshmann et Raether [7] avaient montré la possibilité d'exciter le plasmon de surface en adoptant une autre configuration que celle d'Otto, mais toujours par ATR.

À la suite de ces travaux, l'intérêt pour la résonance du plasmon de surface a considérablement augmenté et a fait l'objet de nombreuses recherches et publications, en particulier pour caractériser les films minces et pour l'étude de processus d'interactions se déroulant sur des interfaces métalliques. Les nombreuses possibilités ouvertes dans ce domaine et le besoin de plus en plus important d'appareils robustes et fiables permettant la compréhension des
phénomènes biomoléculaires ont donné naissance à des entreprises spécialisées dans la vente d'appareils SPR. Le premier instrument commercial basé sur le principe de la SPR fut vendu par Biacore en 1990. L'émergence de cette technique a fait en sorte que le nombre de compagnies fabriquant des appareils à base de résonance du plasmon de surface a également augmenté énormément. On retrouve notamment des appareils produits par BioNavis, Horiba, Bio-Rad, BiOptix, Affinité Instruments, Texas Instruments, Biosensing Instruments et Sensia. Certains de ces appareils permettent de faire de l'imagerie, de l'électrochimie ou d'autres mesures optiques en plus des mesures SPR conventionnelles.

## II.2. Définition du ‘plasmon de surface’

Lorsque nous sommes en présence d'un métal contenant de nombreux électrons libres et pour une certaine fréquence de plasma ($w_p$), le métal est le siège d'une oscillation collective d'un gaz d'électrons libres donnant naissance à une onde longitudinale dite de plasmon. Un plasmon est une quasi-particule résultant de la quantification des oscillations du plasma, de la même manière que les photons et les phonons sont des vibrations électromagnétiques et mécaniques quantifiées.

Un plasmon de surface (SP) est une oscillation collective et cohérente d'électrons qui se propage tout au long de l'interface entre un métal et un diélectrique (comme l'air, l'eau...). Au plasmon de surface est associé un champ électrique qui décroît exponentiellement et perpendiculairement, non seulement dans le métal mais aussi dans le diélectrique comme le montre la Figure 1 [8-10]. Cette décroissance confère au plasmon de surface un caractère évanescent caractérisé par une profondeur de pénétration dans le métal et dans le diélectrique.

<figure><img src="image_35.png" /><figcaption>**Figure 1.** Représentation des ondes évanescentes du plasmon de surface à l'interface entre un métal et un diélectrique: (A) Champ électrique du plasmon de surface, (B) Amplitude du champ électrique du plasmon de surface. $\varepsilon_m$ et $\varepsilon_d$ sont respectivement les permittivités diélectriques du milieu métallique et du milieu diélectrique, E est le champ électrique, SP est le plasmon du surface, $K_{sp}$ est le vecteur</figcaption></figure>
d'onde, $\delta_{zm}$ et $\delta_{zd}$ sont respectivement les profondeurs de pénétration dans le métal et dans le diélectrique

L'excitation optique des SP par le biais d'un faisceau lumineux et sous certaines conditions est visible via un phénomène physique appelé la résonance du plasmon de surface [11]. Selon la loi de Snell [12], lorsqu'un rayon lumineux incident frappe une surface séparant deux milieux isotropes et non absorbants ayant des indices de réfraction différents, par exemple, l'air et le verre (tel que $n_{verre} > n_{air}$, où le verre est le milieu incident), avec un angle d'incidence $\theta_1$ supérieur à l'angle d'incidence critique $\theta_c$, toute la lumière sera réfléchie dans le verre ; c'est la réflexion totale interne (TIR). Pour un angle d'incidence $\theta_1$ de TIR particulier et une longueur d'onde définie $\lambda$, l'énergie apportée par le rayon incident va créer une onde évanescente capable de résonner avec l'onde électromagnétique du SP. Le terme résonance traduit ainsi le fait que les électrons libres du métal oscillent à la même fréquence que celle de l'onde excitatrice incidente. En conséquence, l'absorption de cette énergie photonique va induire une diminution de l'intensité du rayon lumineux réfléchi à un angle caractéristique ; cet angle est communément appelé l'angle de résonance plasmonique $\theta_{SPR}$. Ainsi, expérimentalement, cet effet SPR correspond à un pic d'absorption. Les conditions de résonance sont très sensibles à l'indice de réfraction du milieu diélectrique. L'onde résultante de ce phénomène est une onde évanescente, dont l'amplitude diminue exponentiellement dans la direction perpendiculaire de part et d'autre de l'interface. Lorsqu'une espèce biologique vient réagir à l'interface métal/milieu diélectrique, l'énergie nécessaire pour exciter les SP va alors changer. De plus amples détails sur la théorie associée à la résonance du plasmon de surface sont présentés au paragraphe II.3.4.

Dans cette première partie, nous avons introduit la notion générale d'un plasmon de surface, un bref historique montrant l'intérêt qu'ont toujours suscité ces derniers ainsi que le phénomène de résonance du plasmon de surface. Dans ce qui suit, nous nous penchons sur une étude « classique » du plasmon de surface à travers la théorie de Maxwell. Puis, nous déterminons quelques caractéristiques associées à cette onde. Et pour finir, nous présentons la génération des SP.

## II.3. Caractéristiques du plasmon de surface

### II.3.1. Les conditions d'existence du plasmon de surface

Les SP sont des ondes électromagnétiques de surface. Le phénomène peut être prédit par la théorie de Maxwell et conformément aux équations de Maxwell. Le champ électromagnétique associé aux SP, à l'interface entre un métal et un diélectrique, est obtenu en résolvant les
équations de Maxwell dans chaque milieu tout en utilisant les conditions de continuité à l'interface entre le milieu métallique et diélectrique. Ces dernières font intervenir les continuités des composantes tangentielles du champ électrique E et magnétique H à la traversée de l'interface [13]. La propagation d'une onde électromagnétique est décrite à travers l'équation de propagation (Equation 1), régie par les équations de Maxwell données en annexe 1.

$$ \nabla^2 E + k_0^2 \varepsilon E = 0 \quad (\text{Equation 1}) $$

où $\varepsilon$ est la permittivité diélectrique, $k_0 = \frac{w}{c}$ représente l'amplitude du vecteur d'onde de l'onde se propageant dans le vide avec $c$ la célérité de la lumière dans le vide et $w$ la fréquence angulaire de l'onde incidente.

L'équation 1, connue également sous le nom de l'équation d'Helmholtz, est aussi valable pour le champ magnétique $H$.

Passons à présent à la géométrie supportant les SP. Pour cette étude, une structure planaire est utilisée et le plan d'incidence de l'onde sera $(xOz)$. Les solutions recherchées des équations de Maxwell sont des modes guidés : évanescents selon la direction $z$, invariants selon $y$, se propageant selon la direction $x$ et de constante de propagation $k_{SP}$. L'interface considérée sépare un milieu métallique (plan $z < 0$, Figure 1) d'un milieu diélectrique (plan $z > 0$, Figure 1), tous deux considérés comme linéaires, homogènes, isotropes, non-magnétiques de perméabilité magnétique $\mu = \mu_0$ (perméabilité magnétique du vide) et de permittivité diélectrique $\varepsilon_m$ et $\varepsilon_d$ et s'écrivant sous la forme présentée par les équations 2.a et 2.b [13]:

Pour le milieu diélectrique : $\varepsilon_d = \varepsilon'_d + i \varepsilon''_d$ (Equation 2.a)

Pour le milieu métallique : $\varepsilon_m = \varepsilon'_m + i \varepsilon''_m$ (Equation 2.b)

D'autre part, d'après la Figure 2, suivant la polarisation du champ électrique vis-à-vis du plan $(xOz)$, il est possible de distinguer entre deux catégories de solutions concernant le champ électromagnétique : une catégorie faisant intervenir une polarisation transverse électrique (TE) et une seconde faisant intervenir une polarisation transverse magnétique (TM) [14].

* Si le champ électrique est perpendiculaire au plan $(xOz)$, la polarisation $s$ ou transverse électrique (TE) est mise en jeu. Dans ce cas, le champ électrique $E$ est parallèle à $y$. Le mode (TE) lie $\{E_y, H_x, H_z\}$ (voir Figure 2.a)
➤ Si le champ électrique est parallèle au plan (xOz), la polarisation p est prise en compte. Nous parlons alors de modes transverses magnétiques (TM). Dans ce cas, le champ magnétique H est orienté suivant x. Dans ce cas, le mode lie {$H_y, E_x, E_z$} (voir Figure 2.b)

<figure><img src="image_36.png" /><figcaption>**Figure 2.** Différents types de polarisation. En (a) Polarisation (TE) et en (b) Polarisation (TM)</figcaption></figure>

Dans ces conditions, il est possible de définir une composante transverse du champ, notée $\Psi_j$, qui peut-être, soit $E_{y,j}$ (polarisation TE), soit $H_{y,j}$ (polarisation TM) [15], solution de l'équation 1 qui s'écrit suivant l'équation 3 :

$$ \nabla^2 \psi_j + k_0^2 \varepsilon_j \psi_j = 0 \quad (\text{Equation 3}) $$

où $\varepsilon_j$ est définie comme étant la fonction diélectrique associée au milieu j (métal (m) ou diélectrique (d)).

Ainsi, les solutions cherchées doivent présenter le caractère évanescent suivant l'axe (z) des SP. Dans l'annexe 2, nous présentons les solutions obtenues pour les deux modes (TE) et (TM) et la justification du fait qu'un SP n'intervient qu'en mode TM et non pas en mode (TE). Un SP n'existe donc qu'en polarisation (TM) où le champ électrique E se trouve dans le plan (xOz) comme le montre la Figure 1.

De plus, une autre condition révélée nécessaire à l'existence du SP est que les parties réelles de la permittivité diélectrique des deux milieux $\varepsilon_j$ doivent être de signe opposé. Cette condition plasmonique peut être remplie avec une interface métal/milieu diélectrique dont la partie réelle de la permittivité diélectrique est de signe opposé. Cependant, les applications à base de SPR utilisent généralement comme milieu diélectrique une solution aqueuse saline où se déroulent
les événements biologiques et dont la partie imaginaire de la permittivité diélectrique est nulle, soit : $n^2 = \varepsilon_d = \varepsilon'_d$ [16]. Ceci mène à choisir un métal avec $\varepsilon'_m < 0$. Plusieurs métaux satisfont à cette condition, mais en SPR, principalement quatre d'entre eux sont fréquemment utilisés : l'or (Au), l'argent (Ag), l'aluminium (Al) et le cuivre (Cu).

### II.3.2. La relation de dispersion

Le vecteur d'onde $k_{SP}$ du plasmon de surface dans la direction de propagation $x$ est donné par l'équation 4 [8]:

$$k_{SP} = k_0 \times \sqrt{\frac{\varepsilon_d \times \varepsilon_m}{\varepsilon_d + \varepsilon_m}} = k'_{SP} + ik''_{SP} \quad (\text{Equation 4})$$

où $k_0$ est le vecteur d'onde de la lumière dans l'air : $k_0 = \frac{2\pi}{\lambda} = \frac{2\pi\theta}{c} = \frac{w}{c}$, avec $\lambda$ est la longueur d'onde de la lumière, $\theta$ est la fréquence angulaire de l'onde incidente et $c$ est la célérité de la lumière. $k'_{SP}$ et $k''_{SP}$ sont respectivement la partie réelle et imaginaire du vecteur d'onde $k_{SP}$.

À partir de ce vecteur d'onde $k_{SP}$, on en déduit la relation de dispersion $w = f(k_x)$.

<figure><img src="image_37.png" /><figcaption>**Figure 3.** Relation de dispersion du plasmon de surface</figcaption></figure>

La Figure 3 montre que la courbe de dispersion des plasmons de surface (courbe (2)) se situe toujours à droite de la courbe (1) dite ligne de lumière à laquelle correspond la relation de propagation de la lumière dans le vide $k_0 = \frac{w}{c}$.
### II.3.3. Extension spatiale du plasmon de surface

Le champ électrique $E_{SP,j}$ associé à l'onde électromagnétique polarisée $p$ des SP dans chaque milieu $j$ (métal ou milieu diélectrique) s'écrit sous la forme présentée par les équations 5.a, 5.b et 5.c [9]:

$$ \vec{E}_{SP}(x, z, t) = (E_{x,j}, 0, E_{z,j})e^{-|z|k_{z,j}}e^{i(k_{SP}x - wt)} \quad (\text{Equation 5.a}) $$

$$ \vec{E}_{SP}(x, z, t) = (E_{x,j}, 0, E_{z,j})e^{-|z|k_{z,j}}e^{-k''_{SP}x}e^{i(k'_{SP}x - wt)} \quad (\text{Equation 5.b}) $$

$$ \vec{E}_{SP}(x, z, t) = (E_{x,j}, 0, E_{z,j})e^{-\frac{|z|}{2\delta_{z,j}}}e^{-\frac{x}{2L_{SP}}}e^{i(k'_{SP}x - wt)} \quad (\text{Equation 5.c}) $$

Cette même expression peut être également obtenue pour le champ magnétique $H_{SP,j}$ ($y, t$).

L'expression du champ électrique obtenue montre que l'onde associée aux SP est purement évanescente selon la direction $z$ avec une longueur caractéristique nommée profondeur de pénétration $\delta_{z,j}$. Suivant la direction $x$, l'onde se propage mais décroît exponentiellement, avec une longueur caractéristique appelée longueur de propagation et notée $L_{SP}$.

#### II.3.3.1. La profondeur de pénétration

La profondeur de pénétration appelée aussi épaisseur de peau $\delta_{z,j}$ correspond à la pénétration maximale de l'onde évanescente à l'intérieur du milieu $j$ (métal ou diélectrique) et suivant la direction $z$. Elle est donnée par l'équation suivante dans les deux milieux [8]:

$$ \delta_{z,j} = \frac{\lambda}{2\pi} \times \sqrt{\frac{\varepsilon'_{m} + \varepsilon_{d}}{\varepsilon_{j}^{2}}} \quad (\text{Equation 6}) $$

où $\varepsilon'_{m}$ est la partie réelle de la permittivité diélectrique du milieu métallique, $\varepsilon_{d}$ est la permittivité diélectrique du milieu diélectrique et $\varepsilon_{j}$ fait référence à $\varepsilon'_{m}$ ou $\varepsilon_{d}$.

Il est à noter que dans les applications capteurs, la profondeur de pénétration nous renseigne sur la distance à laquelle la molécule cible peut-être détectée.

#### II.3.3.2. La longueur de propagation

La longueur de propagation notée $L_{SP}$ du SP, suivant l'axe $x$, est donnée par l'équation 7 :

$$ L_{SP} = \frac{1}{2k''_{SP}} = \frac{\lambda (\varepsilon'_{m})^2}{2\pi \varepsilon''_{m}} \sqrt{\left(\frac{\varepsilon'_{m} + \varepsilon_{d}}{\varepsilon'_{m} \varepsilon_{d}}\right)^3} \quad (\text{Equation 7}) $$
Elle est définie comme étant la distance au bout de laquelle l'intensité du champ décroît avec une distance caractéristique de $\frac{1}{2k''_{SP}}$.

Maintenant que nous avons introduit les principales caractéristiques des SP à savoir leurs conditions d'existence ainsi que leur extension spatiale, nous procédons dans le paragraphe suivant à la détermination de la méthode de génération de la résonance du plasmon de surface qui est le phénomène physique traduisant l'excitation des SP.

### II.3.4. Excitation du plasmon de surface

Les SP peuvent être excités par une source d'énergie externe : soit par un faisceau d'électrons comme cela a été fait dans les premiers temps afin de comprendre les SP, soit par un couplage optique. Pour l'instant, nous nous concentrons uniquement sur les SP excités par la lumière. Lorsque les SP se couplent avec un photon incident, une autre quasi-particule appelée polariton est créée. D'après la Figure 3, nous remarquons que la relation de dispersion des SP ($k_{SP}$) reste toujours strictement en-dessous de la ligne de lumière $k_0$. Cette absence d'intersection entre la ligne de lumière (courbe 1, Figure 3) et la courbe de dispersion des SP (courbe 2, Figure 3) résulte du fait que l'onde du SP est une onde évanescente des deux côtés de l'interface et que la lumière incidente est progressive. Par conséquent, ceci interdit tout couplage ou résonance entre une onde électromagnétique du domaine visible en particulier, et un mode de propagation des SP. En d'autres termes, il est impossible d'exciter les SP en éclairant directement le métal avec une source de lumière, car l'accord de phase ne peut pas être réalisé sans un système particulier de couplage. C'est pour cette raison, qu'un arrangement préalable de la composante longitudinale du vecteur d'onde de la lumière incidente $k_{0x} = \frac{w}{c} \times \sin(\theta)$ (avec $\theta$ est l'angle d'incidence) est indispensable pour le couplage entre le mode photonique et plasmonique. Ce couplage est possible si on réalise l'égalité $k_{0x} = k_{SP}$ tout en augmentant la valeur de $k_{0x}$ car quel que soit l'angle d'incidence $\theta$, nous aurons toujours $k_{SP} > k_{0x}$ [17]. Ce but peut être atteint en faisant passer la lumière incidente à travers un milieu d'indice de réfraction supérieur à celui du milieu diélectrique siège des ondes du SP.

En se basant sur ce principe, des configurations optiques existent pour mettre en évidence l'excitation du plasmon. L'une des techniques les plus utilisées pour l'excitation des SP est celle se basant sur la Réflexion Totale Atténuée (ATR) à une interface. Cette technique a été employée pour la première fois par Otto (Figure 4) puis par Kretschmann-Raether (Figure 5),
qui proposent d'exciter le plasmon en éclairant l'interface métal/diélectrique à travers un
prisme. Cependant, quelques différences sont notées entre les deux configurations.

Au niveau de la configuration d'Otto [6], le prisme est disposé de façon à ce que sa base et la
surface métallique soient séparées par un milieu diélectrique (l'air par exemple) appelé « gap
». Pour assurer le couplage par effet Tunnel de l'onde incidente avec la surface métallique, il
faut s'assurer que l'épaisseur du diélectrique soit inférieure à la longueur d'onde d'excitation.
C'est pour cette raison que la distance entre le prisme et le métal (soit l'épaisseur du
diélectrique) doit être contrôlée parce qu'elle influence directement l'excitation des modes
surfaciques. Ce contrôle minutieux fait que l'utilisation de cette méthode de couplage est la
moins utilisée.

<figure><img src="image_38.png" /><figcaption>**Figure 4.** Configuration d'otto [6]</figcaption></figure>

Au niveau de la configuration de Kretschmann-Raether [7], le prisme est disposé de façon que sa base soit en contact direct avec l'une des surfaces du métal, l'autre est mise en contact avec le milieu diélectrique. Cette configuration est la plus utilisée car elle est plus facile à manier. D'autant plus, que la disposition de la surface métallique permet d'obtenir un couplage plasmonique important.
<figure><img src="image_39.png" /><figcaption>Figure 5. Configuration de Kretschmann-Raether [7]</figcaption></figure>

Nous nous intéressons à la configuration de Kretschmann dont le principe est le suivant : une
onde lumineuse excitatrice incidente, polarisée p, traverse un prisme (milieu incident)
généralement en verre d'indice de réfraction $n_p = \sqrt{\varepsilon_p}$ supérieur à celui du milieu diélectrique
$n_d$, subit une réflexion totale engendrant une onde évanescente se propageant à l'interface
métal/milieu diélectrique.

Dans ce cas, il y aura une augmentation de la projection du vecteur d'onde de la lumière
incidente sur l'axe de propagation x qui vaut $k_{0x} = \frac{w}{c}n_p \sin(\theta)$ où $n_p$ est l'indice de réfraction
du prisme et $\theta$ est l'angle d'incidence. Pour un certain angle d'incidence spécifique (angle
supérieur à l'angle d'incidence critique $\theta_c$), il y aura un couplage résonant (excitation
maximale) entre la lumière incidente $k_{0x}$, plus précisément l'onde évanescente résultante, et
l'onde du plasmon de surface $k_{SP}$. Ceci se traduit par une intersection au niveau de la courbe
de dispersion des SP et celle de la lumière incidente provenant du prisme (courbe 3, Figure 6).
Cette intersection est donnée par la relation de couplage ou de résonance traduite par l'équation
8 [8] :

$k_{0x} = k_{SP}$

$$
\frac{w}{c} n_p \sin(\theta) = \frac{w}{c} \times \sqrt{\frac{\varepsilon_d \times \varepsilon_m}{\varepsilon_d + \varepsilon_m}} \quad (\text{Equation 8})
$$
<figure><img src="image_40.png" /><figcaption>**Figure 6.** Mise en évidence de la résonance du plasmon de surface. En (a) couplage entre le mode photonique et plasmonique, en (b) le pic de résonance associé à la SPR</figcaption></figure>

La conséquence de l'excitation des SP réside dans une diminution de la réflectivité (intensité de la lumière réfléchie) observée à l'angle d'incidence correspondant à la condition de couplage des SP ($\theta_{SPR}$) puisque l'énergie lumineuse incidente est absorbée par le métal et transférée à ses électrons [7, 18]. Ce phénomène est appelé le phénomène de la résonance du plasmon de surface (SPR) qui se manifeste par l'apparition d'un pic de résonance au niveau du spectre de réflectivité visible au niveau de la Figure 6.b. L'évolution de la réflectivité en fonction de l'angle d'incidence présente un pic d'absorption à l'angle de résonnance $\theta_{SPR}$. Cet angle où l'intensité de la réflexion totale est minimale présente une caractéristique spécifique de l'état de surface et il est sensible à la variation de masse, l'épaisseur et l'indice de réfraction à l'interface. Lorsque le milieu est optiquement plus dense et que dans ce cas, le prisme ($n_p$), le film métallique ($n_m$) et la longueur d'onde de la lumière incidente ($\lambda$) sont des valeurs constantes, $\theta_{SPR}$ ne dépend que de l'indice de réfraction du milieu diélectrique ($n_d$). Ainsi, les changements de l'indice de réfraction du milieu en contact avec la couche métallique peuvent être détectés comme des variations de $\theta_{SPR}$.

La Figure 7 résume le phénomène du plasmon de surface lorsque la condition de couplage par résonance est remplie.
<figure><img src="image_41.png" /><figcaption>**Figure 7.** Illustration schématique de la SPR avec la configuration de Kretschmann lorsque la condition de couplage par résonance est remplie</figcaption></figure>

La plupart des instruments SPR commerciaux utilisent la configuration de réflexion totale atténuée (ATR) de Kretschmann pour exciter les SP [19, 20]. Ils peuvent généralement fonctionner en mode balayage angulaire, à angle fixe ou par la variation de la longueur d'onde. En mode balayage angulaire, les changements de réflectivité détectés comme intensité du signal SPR en unités arbitraires sont surveillés en fonction de l'angle d'incidence du ou des laser(s) utilisés sur une plage angulaire pour produire la courbe SPR. Tandis que, en mode angle fixe, les changements de réflectivité sont surveillés à un angle incident fixe. Ces trois modes sont illustrés dans la Figure 8.

<figure><img src="image_42.png" /></figure>
**Figure 8.** Illustration schématique de la SPR basés sur (de gauche à droite) la modulation angulaire (1), la longueur d'onde (2) et la modulation d'intensité (3)

## II.4. Formalisme de Fresnel pour la caractérisation des couches

Les courbes SPR sont utilisées pour les calculs théoriques de l'épaisseur *d* et de l'indice de réfraction *n* d'une couche moléculaire. Ainsi, le spectre SPR peut être décrit avec les équations de Fresnel comme la réflectivité d'un système multicouche pour la lumière polarisée *p* [21, 22]. Le formalisme de la matrice de couche de Fresnel est la base de la description théorique de la réflectance de la lumière provenant du système optique SPR dans une configuration de Kretschmann. Les différentes couches du système sont supposées linéaires, homogènes et isotropes. Chaque couche est caractérisée par un indice de réfraction complexe $\tilde{n} = n + ik$ où *n* est l'indice de réfraction et *k* est le coefficient d'extinction, et une épaisseur *d*. Le milieu incident 0 (le prisme) et émergeant N+1 (milieu d'analyse qui peut être gazeux ou liquide) ont une épaisseur infinie et sont non absorbants. Quant à la couche métallique, elle sera assimilée à un milieu absorbant ($k \neq 0$ et $\tilde{n} = n + ik$) et d'épaisseur finie. Les autres couches organiques intermédiaires seront assimilées à des couches non absorbantes ($k = 0$ et $\tilde{n} = n$) d'épaisseur finie.

Les perturbations de l'indice de réfraction à l'interface induisent des décalages de l'angle minimum du pic SPR en raison d'un changement de la condition de résonance. L'ajout de molécules est modélisé par une couche supplémentaire homogène entre le métal et le milieu d'analyse. Le calcul des paramètres optiques de cette couche est basé sur une matrice de diffusion $2 \times 2$. Cette matrice représente les propriétés optiques résumées du système et considère les coefficients de réflexion comme des matrices, à l'interface entre deux milieux. La propagation de la lumière dans l'un des milieux est vue comme une autre matrice. Ces matrices dépendent de l'angle d'incidence de la lumière ($\theta$), la longueur d'onde de la lumière ($\lambda$), l'épaisseur optique de la couche (*d*), les indices de réfraction de la couche (*n*) et du prisme ($n_p$)

La réflectivité d'un système multicouche est donnée par l'équation 9:

$$R = |r|^2 \quad (\text{Equation 9})$$

Le coefficient de réflexion *r* de Fresnel associé à une structure multicouche pour la lumière polarisée *p* s'écrit comme présenté dans l'équation 10 [23, 24] :
$$r_p(\theta) = \frac{(M_{(1,1)} + M_{(1,2)}Q_N)Q_1 - (M_{(2,1)} + M_{(2,2)}Q_N)}{(M_{(1,1)} + M_{(1,2)}Q_N)Q_1 + (M_{(2,1)} + M_{(2,2)}Q_N)} \quad (\text{Equation 10})$$

$$\text{Avec, } Q_k = \frac{1}{n_k^2} \times \cos\theta_k \quad \text{et} \quad M_{ij} = (\prod_{k=2}^{N-1} M_k) \text{ avec } i, j = 1, 2$$

$k$ étant le numéro de la couche, $i$ représente l'indice de la ligne et $j$ celle de la colonne.

En pratique, la modélisation et la résolution du formalisme matriciel de Fresnel sont effectuées par des outils d'ajustement mathématique ou des logiciels dédiés.

## II.5. Formalisme de Jung

Le formalisme développé par Jung et al. en 1998 [25] relie le décalage d'angles $\theta_{SPR}$ aux propriétés optiques dépendantes de la longueur d'onde $\lambda$ du film adsorbé sur une surface (épaisseur $d$, indice de réfraction $n$) et à deux paramètres liés au système SPR de mesure qui sont le coefficient de sensibilité ($S$, en deg) et la longueur de pénétration $\delta$ du champ électrique évanescent :

$$\Delta\theta_{SPR} = R = S(n - n_b) \left[1 - e^{-\left(-\frac{d}{\delta}\right)}\right] \approx S(n - n_b) \frac{d}{\delta} \quad (\text{Equation 11})$$

où $\Delta\theta_{SPR}$ (ou $R$) est la réponse SPR dans le cas où $d < \delta$, $n_b$ est l'indice de réfraction du milieu d'analyse.

## II.6. Formule de Feijter

La formule de Feijter présentée dans l'équation 12 est utilisée pour calculer la densité de masse surfacique $\Gamma$ d'une couche biomoléculaire d'épaisseur $d$ et d'indice de réfraction $n$. Cette formule a été dérivée de la dépendance de $n$ par rapport à l'incrément de concentration des molécules adsorbantes [26, 27].

$$\Gamma = c \times d = \frac{d \times (n - n_b)}{\frac{dn}{dc}} \quad (\text{Equation 12})$$

avec $c = \frac{(n-n_b)}{\frac{dn}{dc}}$, la concentration de la couche biomoléculaire, $n_b$ est l'indice de réfraction du milieu d'analyse et $\frac{dn}{dc}$ est l'incrément d'indice de réfraction.
Dans le paragraphe suivant, nous présentons la nouvelle approche multiparamétrique de la résonance plasmonique de surface et tout particulièrement le principe de la méthode à deux longueurs d'onde utilisée dans la réalisation des travaux de cette thèse.

# III. Résonance plasmonique de surface multiparamétrique (MP-SPR)

## III.1. Description et intérêt de l'approche

Au cours des 20 dernières années, la SPR est apparue comme une technique optique relativement simple qui a été utilisée de manière routinière pour surveiller en situ les processus chimiques et physiques aux interfaces métalliques. Cette technique a connu un fort essor pour l'analyse des interactions biomoléculaires et pour la découverte de médicaments. Elle est extrêmement sensible aux petits changements de l'indice de réfraction à proximité d'une surface métallique et elle est utilisée pour caractériser un certain nombre de films différents, y compris les films métalliques, d'oxyde métallique et bio-organiques. Malgré son potentiel, la SPR dans sa forme traditionnelle a trouvé une utilisation limitée dans les domaines de recherche qui nécessitent d'appréhender un ensemble complet de paramètres afin de comprendre pleinement les mécanismes et le comportement des systèmes. Bien adaptée pour les études d'affinité entre molécules et surfaces, elle a rarement été utilisée sans approximation pour la caractérisation des films qui se forment sur les surfaces. Comme les mesures ellipsométriques, les mesures SPR donnent des épaisseurs et des indices de réfraction de films mais une seule mesure ne peut pas donner des valeurs uniques pour un film mince. Généralement, il n'est pas possible de déterminer *n* et *d* via une seule mesure SPR à une seule longueur d'onde [28]. De plus, lorsque l'un des paramètres doit être connu, la plupart des techniques SPR exploitent les indices de réfraction de la littérature. Ceux-ci peuvent cependant varier pour le même matériau. En conséquence, les études menées sur des nouveaux matériaux ne peuvent être qu'approximées car leur IR n'est pas encore connu. Ces hypothèses peuvent entraîner une grande incertitude dans le résultat.

Aujourd'hui, la résonance plasmonique de surface multiparamétrique (MP-SPR) redéfinit les capacités associées à la SPR traditionnelle, élargissant ainsi le champ d'application de cette technologie aux études biophysiques et aux études de biomatériaux [29]. Elle offre de nouvelles possibilités pour étudier les événements physiques impliqués à la fois dans la formation et les propriétés des couches dures et molles de matériaux et le comportement interfacial de ces couches entre elles dans des environnements solides, liquides et aussi gazeux. Cette technologie
a été spécifiquement adaptée, via son mode de balayage SPR et sa configuration optique à
plusieurs longueurs d'onde pour offrir un nouveau niveau de compréhension dans les études
biophysiques grâce à sa capacité dans l'analyse des événements de surface. En effet, elle permet
de mesurer les épaisseurs et les indices de réfraction moyens de films ultra-minces (0.5-100
nm) jusqu'à relativement épais (300 nm - microns). Les couches mesurées peuvent être
organiques, inorganiques, métalliques, et il est également possible de suivre les cinétiques
d'interaction des composants avec tous ces matériaux.

Les instruments MP-SPR fabriqués par la société BioNavis Ltd exploitent le phénomène de résonance plasmonique de surface qui est obtenu en utilisant la configuration de Kretschmann, avec une source lumineuse rotative (voir Figure 9). Une lame de verre recouverte d'or est utilisée comme puce de détection. Le côté or fait face à la cellule d'écoulement et le côté verre est couplé au prisme à l'aide d'un gel optiquement adapté pour offrir un indice de réfraction $n_p$ constant [30]. Cette configuration fournit une gamme d'indice de réfraction de 1,0 à 1,4 avec une sensibilité de 1 µRIU (unité d'indice de réfraction micrométrique). Les mesures SPR traditionnelles surveillent les angles d'incidence sur une plage angulaire étroite de ~10° autour de $\theta_{SPR}$. Cependant, la MP-SPR enregistre une courbe SPR complète en fonction du temps en balayant une plage angulaire plus large (38°-78°) avec deux lasers ou plus. Dans un mode à une seule longueur d'onde, les courbes complètes SPR résultantes peuvent être ajustées et modélisées en utilisant un indice de réfraction connu du matériau mesuré et le formalisme de Fresnel. Cependant, en mode à longueurs d'onde multiples, lorsque le matériau est balayé avec au moins deux longueurs d'onde différentes, une solution unique peut être trouvée sans indice de réfraction ou épaisseur connus [28].

<figure><img src="image_43.png" /><figcaption>**Figure 9.** Illustration schématique de la MP-SPR (BioNavis, Ltd)</figcaption></figure>
En utilisant la MP-SPR, plusieurs paramètres peuvent être acquis simultanément et suivis en temps réel tels que les positions angulaires TIR et $\theta_{SPR}$, la demi-largeur du pic ou le changement d'intensité SPR en fonction de l'angle d'incidence. En conséquence, les indices de réfraction (n), les épaisseurs (d) et les densités de masse de surface (Γ) des couches biomoléculaires peuvent être déterminées avec la MP-SPR dans un mode de balayage angulaire large. Il convient de souligner que l'approche multi-longueurs d'onde pour la caractérisation des surfaces a été mise en œuvre avec succès dans des études précédentes [21,31-34]

### III.2. MP-SPR à double longueur d'onde : Principe de l'approche

Les expériences SPR de cette thèse ont été réalisées à l'aide d'un instrument SPR multiparamétriques MP-SPR à double longueurs d'onde (670 et 785 nm) provenant de BioNavis, Tampere, Finlande (MP-SPR Navi™ 200). Cette approche à deux longueurs d'onde, combinée à un balayage angulaire sur une large gamme d'angles de lumière incidente est utilisée afin de caractériser des membranes biomimétiques supportées sur des surfaces en or. La caractérisation théorique de ces couches a été réalisée en utilisant le formalisme de Fresnel intégré dans le logiciel LayerSolver (BioNavis, Tampere, Finlande) tout en utilisant les spectres de réflectivité SPR complets en fonction de l'angle d'incidence. Le seuil de sensibilité en degré de cette technique est $10^{-3}$.

Le plasmon de surface contient des informations sur les valeurs *n* et *d* d'une couche biomoléculaire. En effet, lorsqu'une couche vient se déposer sur un substrat, le champ évanescent va pénétrer le film et sonder les variations de surface, ce qui entraîne un déplacement du vecteur d'onde résonant du plasmon de surface $k_{sp}$ d'une valeur de $\Delta k_{sp}$. La valeur de $\Delta k_{sp}$ dépend de l'épaisseur *d* et de l'indice de réfraction *n* de la couche biomoléculaire ajoutée [28]. Le nouveau vecteur d'onde $k_{sp}$ est considéré comme contenant toutes les informations et les constantes qui affectent les spectres SPR mesurés et conduisent à des différences entre les spectres SPR mesurés à plusieurs longueurs d'onde. Par conséquent, $k_{sp}$ peut-être décrit par la relation mathématique suivante :

$$k_{sp} \propto n \times d \quad (\text{Equation 13})$$

avec *d* et *n* sont l'épaisseur et l'indice de réfraction de la couche biomoléculaire.

Cependant, la résolution de l'équation 13 ne décrit qu'une seule solution de calcul pour *d* et *n* de la couche. Tandis que la solution unique pour *d* et *n* de la couche construite dans les
conditions expérimentales données ne peut être trouvée qu’à partir de l’intersection de deux solutions de calcul. Par conséquent, une mesure dans deux milieux différents ou avec plusieurs longueurs d’onde incidentes est nécessaire [21, 34].

Pour la première approche qui consiste à une mesure dans deux milieux différents (l'air et l'eau par exemple), si les propriétés optiques de la couche ne changent pas entre les différents milieux, les valeurs d'épaisseur peuvent être résolues dans deux milieux en fonction de *n*, où *n* est l'indice de réfraction de la couche. Cette approche donne lieu à deux ensembles de courbes de réflectance. Le tracé des différentes solutions pour chaque milieu est ensuite dessiné sur un graphique commun, avec l'intersection des solutions obtenues pour chaque milieu indiquant l'épaisseur et l'indice de réfraction exacts de la couche [21, 28, 34]. Liang et al. [34] ont essayé de trouver une solution unique pour *d* et *n* de monocouches de SA (Acide Stéarique) en utilisant l'approche de deux milieux différents tels que l'air et l'eau. L'intersection des deux courbes dans la Figure 10.a et 10.b donne des valeurs de *n* et *d* uniques. L'indice de réfraction et l'épaisseur pour 635 et 670 nm (intersection en (a) et (b)) sont de 1,58 - 2,66 nm et 1,4138 - 2,585 nm, respectivement.

<figure><img src="image_44.png" /><figcaption>**Figure 10.** Calculs de *d* et *n* de monocouches de SA (Acide Stéarique) déterminés par des mesures dans deux milieux (air et eau) pour des longueurs d'onde de 635 nm (a) et 670 nm (b) [34]</figcaption></figure>

La deuxième approche consiste à utiliser plusieurs longueurs d'ondes de la lumière excitatrice incidente. En effet, l'approche à double longueur d'onde est la méthode employée dans l'analyse des résultats obtenus dans cette thèse. C'est une méthode introduite depuis 1996 par Peterlinz et Georgiadis. Elle est basée sur l'hypothèse d'un coefficient de dispersion linéaire par rapport au changement de la longueur d'onde [28, 35] qui représente la dérivée de l'indice de réfraction en fonction de la longueur d'onde selon l'équation 14 :
$$ \frac{dn}{d\lambda} \approx \frac{\Delta n}{\Delta \lambda} = \frac{n_2 - n_1}{\lambda_2 - \lambda_1} \quad (\text{Equation 14}) $$

où $n_1$ et $n_2$ représente les indices de réfraction d'une couche respectivement pour les deux longueurs d'onde $\lambda_1$ et $\lambda_2$. Dans notre cas, $\lambda_1= 670$ nm et $\lambda_2 = 785$ nm.

Par conséquent, en utilisant deux longueurs d'onde laser incidentes, deux valeurs de $n$ peuvent théoriquement être obtenues pour la même couche et il est donc possible de déterminer des valeurs uniques pour $n$ et $d$ en une seule expérience [21, 22, 28, 36].

La solution unique pour l'épaisseur de couche $d$ et l'indice de réfraction $n$ peut être trouvée en résolvant les équations suivantes :

$$ k_{SP1} \propto n_{\lambda1} \times d \quad (\text{Equation 15.a}) $$

$$ k_{SP2} \propto n_{\lambda2} \times d \quad (\text{Equation 15.b}) $$

où $k_{SP1}$ et $n_{\lambda1}$ désignent respectivement le vecteur d'onde du plasmon de surface et l'indice de réfraction pour la longueur d'onde $\lambda_1$, $k_{SP2}$ et $n_{\lambda2}$ représentent respectivement le vecteur d'onde du plasmon de surface et l'indice de réfraction pour la longueur d'onde $\lambda_2$. L'indice de réfraction pour la longueur d'onde $\lambda_2$ peut s'écrire en fonction de l'indice de réfraction de $\lambda_1$ et le coefficient de dispersion $\frac{dn}{d\lambda}$ comme suit :

$$ n_{\lambda2} = n_{\lambda1} + \frac{dn}{d\lambda} \times (\lambda_2 - \lambda_1) \quad (\text{Equation 16}) $$

En remplaçant l'expression de $n_{\lambda2}$ dans l'équation 15.b, on obtient une autre expression de $k_{SP2}$ en fonction de $n_{\lambda1}$ comme suit :

$$ k_{SP2} = n_{\lambda2} \times d = \left( n_{\lambda1} + \frac{dn}{d\lambda} \times (\lambda_2 - \lambda_1) \right) \times d \quad (\text{Equation 17}) $$

Les déclarations ci-dessus sont vraies pour les couches d'échantillons qui n'absorbent pas la lumière aux longueurs d'onde utilisées dans la mesure SPR. En pratique, cela signifie que la composante imaginaire $k$ de l'indice de réfraction complexe est nulle, ce qui est le cas pour la majorité des couches d'échantillons organiques. Cependant, si la couche absorbe de la lumière, alors $k \neq 0$, et il existe une solution unique pour la couche d'échantillon :

$$ k_{SP} = (n + ik) \times d \quad (\text{Equation 18}) $$
Dans l'étape de modélisation des courbes SPR résultantes, les épaisseurs des couches modélisées peuvent être liées comme communes pour les deux longueurs d'onde, c'est-à-dire que l'épaisseur de la couche est supposée être la même pour les deux longueurs d'onde puisque les courbes SPR sont mesurées à partir du même point. Selon la nature de la couche, l'indice de réfraction complexe peut être considéré comme une variable indépendante pour la modélisation des couches métalliques (par exemple couche d'or (Au) et de chrome (Cr)), ou comme une variable dépendante linéairement des deux longueurs d'onde utilisées.

La méthode à deux longueurs d'onde s'est avérée particulièrement efficace pour la caractérisation de fines couches biomoléculaires jusqu'à quelques nanomètres [28, 35, 37, 38]. Comme mentionné ci-dessus, cette approche a été initialement utilisée par Peterlinz et Georgiadis pour déterminer une valeur moyenne de l'épaisseur d'une monocouche organique mince d'alkanethiol dans un milieu liquide [28]. Cette méthode pourrait éventuellement être appliquée à la caractérisation optique des membranes biomimétiques à base de phospholipides puisque l'indice de réfraction *n* et l'épaisseurs *d* des couches lipidiques sont considérées comme des propriétés biologiquement pertinentes pour comprendre les changements résultant de l'interaction de ces membranes avec des biomolécules.

Dans cette thèse, l'utilisation de la MP-SPR à deux longueurs d'onde pour caractériser de manière appropriée la formation d'une couche lipidique à base de liposomes sur un substrat d'or et les changements structurels qu'elle peut subir à la suite de son interaction avec des biomolécules d'intérêt nécessite que :

a) les liposomes soient immobilisés sur la surface d'or.

b) les mesures SPR des couches soient théoriquement dans la profondeur de détection du MP-SPR puisque la profondeur de pénétration est limitée par la décroissance exponentielle du champ évanescent. En effet, la profondeur de pénétration *l* déduite de l'équation 6 est donnée par l'équation 19 :

$$l = \frac{\lambda}{2\pi \times \sqrt{(n \times \sin\theta)^2 - 1}} \quad (\text{Equation 19}), \text{où } \theta > \theta_c \text{ (}\theta_c \text{ est l'angle d'incidence critique)}$$

c) la modélisation des couches donne des valeurs uniques pour l'épaisseur et l'indice de réfraction de chaque couche dans le milieu d'analyse utilisé.
Les approches multi-longueurs d'onde ont également été employées avec succès dans plusieurs études pour la caractérisation de couches minces comme les membranes biomimétiques modèles [31-34]. Des couches organiques tel que des membranes modèles à base de phospholipides ou des cellules vivantes, dont l'épaisseur peut atteindre quelques micromètres ont également été caractérisées en utilisant la MP-SPR assistée par guide d'ondes [19, 21, 32]. En théorie, résoudre à la fois *d* et *n* donnerait d'une manière pertinente des informations très utiles sur les changements structurels de la membrane biomimétique sur un substrat, c'est-à-dire les changements nets à la fois de l'épaisseur de la membrane, sa densité de masse et sa concentration. Dans le tableau 1, nous présentons plus particulièrement des études théoriques basées sur des mesures MP-SPR pour la caractérisation de l'épaisseur *d* et de l'indice de réfraction *n* des systèmes membranaires modèles de type SLB ou SVL dont la composition des phospholipides est variée.

<table><caption>**Tableau 1. Caractérisation théorique des propriétés optiques (d et n) de différents types de membranes biomimétiques supportées sur des surfaces solides par MP-SPR**</caption><thead><tr><th>Modèle<br>membran<br>aire</th><th>Lipides</th><th>Epaisseur (d)/<br>nm</th><th>Indice de<br>réfraction (n)</th><th>Réf</th></tr></thead><tbody><tr><td rowspan="4">SLB</td><td>DOPC</td><td>4.90</td><td>1.4776</td><td rowspan="4">[38]</td></tr><tr><td>DOPC-DOPS</td><td>4.89</td><td>1.4827</td></tr><tr><td>POPC</td><td>4.96</td><td>1.4776</td></tr><tr><td></td><td>6.04</td><td>1.4889</td></tr><tr><td>SVL</td><td>DOPC-Sm-<br>cholestérol<br>DPPC</td><td>76.13</td><td>1.3614</td><td></td></tr><tr><td>SVL</td><td>HSPC/ cholestérol<br>/DSPE</td><td>55.5</td><td>1.34996</td><td>[37]</td></tr><tr><td></td><td>HSPC/ cholestérol<br>/DSPE-PEG2000</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>
<table><tr><td></td><td></td><td>60.9</td><td>1.35263</td><td></td></tr><tr><td>SVL</td><td>DPPC/DSPC/LysoP<br/>C/DSPE</td><td>86.63</td><td>-</td><td>[39]</td></tr><tr><td></td><td>DPPC/DSPC/LysoP<br/>C/DSPE-PEG2000</td><td>89.13</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SLB</td><td>HSPC</td><td>8.86</td><td>1.506</td><td>[21]</td></tr><tr><td>SLB</td><td>EggPC</td><td>4.7</td><td>1.4421</td><td>[31]</td></tr><tr><td></td><td>EggPC+PS</td><td>4.63</td><td>1.4431</td><td></td></tr><tr><td></td><td>EggPC+ cholestérol</td><td>5.61</td><td>1.4236</td><td></td></tr></table>

## IV. Approches mathématiques de l'interaction moléculaire

Dans les mesures de l'interaction biomoléculaire, un ligand est immobilisé sur une surface et l'interaction d'un analyte avec le ligand est mesurée en temps réel par SPR grâce aux changements d'indice de réfraction à proximité de la surface. Cela permet d'évaluer les constantes de vitesse d'association et de dissociation et l'affinité à l'équilibre de la réaction.

Pour une réaction biomoléculaire ; A + B ⇌ AB (Equation 20), la détermination des paramètres cinétiques donne des informations sur la vitesse à laquelle les réactions se produisent. Selon la loi de l'action de masse :

* La vitesse cinétique de la réaction d'association ($v_a$) dépend de la concentration de A, de B et de la constante de vitesse d'association ($k_a$) :

$$v_a = \frac{d[AB]}{dt} = k_a [A][B] \quad (\text{Equation 21.a})$$

* La vitesse cinétique de la réaction de dissociation ($v_d$) dépend de la concentration du complexe AB et de la constante de vitesse de dissociation ($k_d$) :

$$v_d = -\frac{d[AB]}{dt} = k_d[AB] \quad (\text{Equation 21.b})$$

Avec :
[A] : concentration de l'analyte libre

[B] : concentration du ligand libre

[AB] : concentration du complexe formé

$k_a$ : constante cinétique d'association ($M^{-1}s^{-1}$)

$k_d$ : constante cinétique de dissociation ($s^{-1}$)

D'après l'équation 21.a et 21.b, il résulte la vitesse nette de l'interaction :

$$ \frac{d[AB]}{dt} = k_a[A][B] - k_d[AB] \quad (\text{Equation 22}) $$

En SPR, la réponse ΔR enregistrée est la variation de l'angle de résonance $\theta_{SPR}$. Celle-ci est proportionnelle à la quantité de complexe AB formée sur la surface d'or. On peut alors assimiler par analogie la concentration du complexe formé [AB] à la réponse ΔR (ΔR = [AB]). De ce fait la concentration du ligand libre [B] correspond à la différence entre la réponse maximale obtenue à saturation du récepteur $R_{max}$ et la réponse ΔR correspondant à la réponse du complexe formé ([B] = $R_{max}$-ΔR). Par ailleurs, la concentration de l'analyte libre [A] peut être considérée égale à la concentration de l'analyte initialement introduit dans le système noté C ([A]= C). L'équation (22) devient alors :

$$ \frac{d\Delta R}{dt} = k_a [C](R_{max} - \Delta R) - k_d \Delta R \quad (\text{Equation 23}) $$

Lorsque la réaction A + B ⇌ AB atteint un état d'équilibre, c'est-à-dire lorsque la vitesse d'association est égale à la vitesse de dissociation :

$$ v_a = v_d = > \frac{[AB]}{[A][B]} = \frac{k_a}{k_d} \quad (\text{Equation 24}) $$

On définit la constante d'équilibre liée à l'association $K_A$ exprimée en ($M^{-1}$) et la constante d'équilibre liée à la dissociation $K_D$ exprimée en ($M$).

La constante thermodynamique d'association $K_A$ qui caractérise la formation de complexe et donc l'affinité de l'analyte pour le ligand peut être calculée selon :

$$ K_A = \frac{[AB]}{[A][B]} = \frac{k_a}{k_d} \quad (\text{Equation 25.a}) $$