# De la paire de bottes à la paire de bases : de l'intérêt d'étudier l'écologie des viromes de plantes

François Maclot, Thierry Candresse, Denis Filloux, Philippe Rott, Carolyn Malmstrom, René van Der Vlugt, Sébastien Massart, Philippe Roumagnac

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## To cite this version:

François Maclot, Thierry Candresse, Denis Filloux, Philippe Rott, Carolyn Malmstrom, et al. De la paire de bottes à la paire de bases : de l'intérêt d'étudier l'écologie des viromes de plantes. Virologie, 2021, 25 (1), pp.29-42. 10.1684/vir.2021.0879. hal-03162172

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Submitted on 26 Aug 2021

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# De la paire de bottes à la paire de bases : de l'intérêt d'étudier l'écologie des viromes de plantes

François Maclot¹, Thierry Candresse², Denis Filloux³,⁴, Philippe Rott³,⁴, Carolyn Malmstrom⁵, René van der Vlugt⁶, Sébastien Massart¹*, Philippe Roumagnac³,⁴*

* Ces deux auteurs ont contribué de manière équivalente à cette publication.

¹ Plant Pathology Laboratory, Terra-Gembloux Agro-Bio Tech, Liège University, Gembloux, Belgium

²UMR Biologie du Fruit et Pathologie, Institut National de Recherche pour l'Agriculture, l'alimentation et l'Environnement, Bordeaux University, Bordeaux, France

³ CIRAD, BGPI, Montpellier, France

⁴ BGPI, Univ Montpellier, CIRAD, INRAE, L'Institut Agro, Montpellier, France

⁵ Department of Plant Biology and Graduate Program in Ecology, Evolution, & Behavior, Michigan State University, East Lansing, MI, United States

⁶ Wageningen University and Research, Wageningen, Netherlands

Correspondances : Sébastien Massart (sebastien.massart@uliege.be), Philippe Roumagnac (philippe.roumagnac@cirad.fr)

## Résumé

L'écologie des virus végétaux a commencé à être explorée à la fin du XIXe siècle. Depuis lors, des avancées majeures ont mis en évidence de complexes interactions virus-hôte-vecteur dans des environnements variés. Ces progrès ont été accélérés par de nouvelles technologies de détection et de caractérisation des virus, dont la dernière en date est le séquençage à haut débit (HTS). Les technologies HTS permettent, pour la première fois, de caractériser sans information préalable le virome, c'est à dire l'ensemble des virus présents dans un échantillon. Ces travaux de phytoviromique basées sur les technologies HTS ont récemment produit d'importants résultats. A titre d'exemples, on peut citer la mise en évidence des influences réciproques entre la dynamique des phytovirus et la structure des communautés hôtes multi-espèces ou des effets de la simplification des écosystèmes causés par les activités humaines sur la biodiversité et l'émergence de nouveaux virus dans les cultures. Cependant, pour être efficaces les études de phytoviromique doivent surmonter des défis à chaque étape de la procédure, depuis l'échantillonnage des plantes jusqu'aux analyses bio-informatiques. Cette revue résume tout d'abord les progrès historiques majeurs de l'écologie des virus végétaux réalisés en association avec les développements technologiques, puis précise les éléments clefs à considérer pour tenter de se projeter à court terme vers des études sans a priori d'écologie des communautés virales.

**Mots-clés** : Ecologie des virus de plantes et évolution, Phytovirome, Métagénomique, Nouvelles générations de séquençage, Séquençage haut-débit (HTS), Avancées historiques, Opportunités et défis.
# From boots on the ground to nucleotides in the sequencer: a century of advances in the study of the plant virus ecology

## Abstract

Plant virus ecology began to be explored at the end of the 19th century. Since then, major advances have revealed complex virus-host-vector interactions in a variety of environments. These advances have been accelerated by development of new technologies for virus detection and characterization, the latest of which being high-throughput sequencing (HTS). HTS technologies have proved to be effective for non-targeted characterization of all or nearly all viruses present in a sample without requiring prior information about virus identity, as would be needed for virus-targeted tests. Phytoviromic studies have thus made important advances, including characterization of the complex interactions between phytovirus dynamics and the structure of multi-species host communities, and documentation of the effects of anthropogenic ecosystem simplification on plant virus emergence and diversity. However, such studies must overcome challenges at every stage, from plant sampling to bioinformatics analysis. This review summarizes major advances in plant virus ecology, in association with technological developments, and presents key considerations for use of HTS in the study of the ecology of phytovirus communities.

**Keywords:** Ecology and evolution of plant viruses, Phytovirome, Metagenomics, Next generation sequencing, High-throughput sequencing (HTS), Opportunities and challenges.
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# 1. Pourquoi étudier l'écologie des virus des plantes ?

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La pandémie mondiale liée au SARS-CoV-2 a révélé les faiblesses de nos connaissances actuelles en écologie virale [1]. On peut tout particulièrement souligner la difficulté voire l'impossibilité d'identifier clairement l'hôte primaire du SARS-CoV-2, la méconnaissance générale de la diversité des coronavirus à l'échelle des écosystèmes sauvages, et le manque d'informations précises sur les mécanismes écologiques et évolutifs à l'œuvre lors de l'émergence de virus tels que le SARS-CoV-2. Nous devons donc collectivement tirer les leçons de cette pandémie et retrouver le chemin du terrain afin de produire des connaissances en écologie virale. Ce constat en virologie humaine et animale s'applique tout autant à la virologie végétale, même si depuis quelques années s'exprime un regain d'intérêt pour l'étude de l'écologie des virus de plantes [2-4]. Bien qu'encore minoritaires, ces travaux s'appuient sur l'amélioration continue des technologies de séquençage dites à haut débit et des capacités de traitement bio-informatique des énormes jeux de données ainsi générés.

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Le domaine de l'écologie des phytovirus examine les interactions complexes entre les virus associés aux plantes, leurs hôtes, leurs vecteurs, ainsi que les environnements dans lesquels ils interagissent (Figure 1), élargissant ainsi la perspective de l'épidémiologie virale [5]. Traditionnellement, celle-ci étudie les maladies et les facteurs qui influencent leur propagation ainsi que la dynamique des populations virales. De façon complémentaire, l'écologie des virus végétaux élargit le champ d'étude pour inclure la compréhension des profils de distribution et de la dynamique des phytovirus dans un environnement donné, leurs effets sur les propriétés des communautés d'hôtes végétaux et des écosystèmes, et les effets réciproques de l'environnement sur la dynamique et l'évolution des phytovirus [4,6,7].

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L'écologie des phytovirus s'appuie sur diverses disciplines, comme la virologie, l'écologie, l'épidémiologie, la biologie végétale et l'entomologie [8]. L'étude des virus nécessite des méthodes et des outils hautement spécialisés, ce qui explique pourquoi les écologues ont d'abord concentré leurs efforts sur des organismes plus facilement observables et pourquoi l'histoire de l'écologie des virus de plantes a été largement influencée par les développements technologiques. Nous présenterons dans la première partie de cette revue les avancées en écologie virale végétale réalisées durant le XXᵉ siècle puis, dans la deuxième partie, nous nous focaliserons sur les opportunités et les défis associés aux travaux prometteurs de métagénomique virale développés depuis environ deux décennies. Tout au long de cette revue, nous montrerons que la virologie végétale a toujours joué un rôle majeur pour la virologie en général, notamment au travers de découvertes marquantes : découverte du premier virus, première cristallisation de virus, première visualisation d'un virus en microscopie électronique, démonstration de l'infectivité de l'ARN viral, mécanisme du « RNA silencing », etc. [9]. Nous verrons également, qu'au travers des études menées en écologie virale, la virologie végétale continue de produire des concepts, des outils et des résultats de grand intérêt pour les modèles animaux.

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# 2. La virologie des plantes à l'avant-garde des découvertes en écologie virale au début du XXe siècle

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La première évocation écrite de symptômes viraux chez les plantes, probablement causés par un géminivirus (Eupatorium yellow-vein virus) a été rédigée au Japon, il y a plus de 1200 ans. En effet, dans le Man'yoshu, première anthologie de poésie japonaise, un poème attribué à l'impératrice Koken et rédigé au cours de l'été 752 après J.-C., décrit l'apparition automnale de jaunissement de feuilles d'une eupatoire, *Eupatorium lindleyanum* [10,11]. Environ un millénaire plus tard, Charles de L'Écluse observe des tulipes aux couleurs panachées probablement causées par un potyvirus (*tulip breaking virus*) (Figure 2), et cette observation sera à l'origine d'une commercialisation à grande échelle de ce type de tulipes au XVIIᵉ siècle. La virologie végétale, et la virologie en général, ont pris naissance à la fin du
111 XIXᵉ siècle à l'occasion de travaux décrivant pour la première fois un virus de plante, le virus de la
112 mosaïque du tabac (TMV). Cette découverte issue de l'observation de symptômes sur des plants de tabac
113 est à mettre au crédit de Mayer, Ivanowskij et Beijerinck [12–14].

114 Depuis la découverte du TMV, les scientifiques ont cherché à étudier les interactions entre les plantes
115 et les virus, mais aussi à déchiffrer la manière dont les virus sont transmis d'une plante à une autre.
116 Ainsi, la première moitié du XXᵉ siècle a vu la mise en place des bases de l'écologie des phytovirus,
117 grâce à l'utilisation de la symptomatologie de l'hôte, de la transmission mécanique expérimentale, des
118 plantes indicatrices, de la biochimie et de la microscopie. Les premières explorations des interactions
119 plantes-virus ont porté sur des plantes cultivées et ont conduit à des découvertes importantes, telles que
120 l'existence d'infections asymptomatiques [15] ou d'infections multiples [16] et également de la
121 protection croisée. Dans les années 1930, les virologues des plantes ont commencé à s'intéresser aux
122 communautés végétales sauvages. De brèves études sur des espèces non cultivées, menées en Allemagne
123 en 1932-33 et en Angleterre en 1948-49, ont permis de mettre en évidence des taux élevés d'infections
124 virales chez les mauvaises herbes des cultures (adventices). Par ailleurs, une étude à plus long terme,
125 mise en œuvre entre 1951 et 1954, a conduit à la détermination de la fréquence et de la distribution des
126 phytovirus dans leur environnement naturel [17]. Au cours de la première moitié du XXᵉ siècle, des
127 découvertes ont également été réalisées sur la circulation des virus entre les réservoirs sauvages et le
128 compartiment cultivé [18], ainsi que sur la présence d'infections virales asymptomatiques chez de
129 nombreuses plantes sauvages [19].

130 En parallèle, les virologues ont examiné les interactions entre les virus et leurs vecteurs. La découverte
131 du premier animal vecteur de virus de plante a été rapportée en 1901 et concerne une cicadelle vectrice
132 d'un reovirus du riz (rice dwarf virus) [20]. L'importance des insectes dans la transmission des virus a
133 conduit Carter à définir le concept de "trinité écologique" entre les virus, leurs hôtes et leurs vecteurs
134 [21]. Les relations entre les virus transmis par les insectes et leurs vecteurs ont conduit aux notions de
135 persistance ou de non-persistance décrivant la période pendant laquelle le vecteur peut transmettre le
136 virus après son acquisition [21]. D'autres vecteurs de virus ont été identifiés comme des champignons
137 (Olpidium spp. pour le lettuce big vein virus, [22]) et des nématodes (Xiphinema spp. pour le virus du
138 court noué de la vigne, [23]). L'étude des interactions entre les virus eux-mêmes ont révélé les
139 phénomènes de synergies [19,24] et d'antagonismes entre souches ou espèces virales [25,26]. Enfin, les
140 stades intimes des interactions plantes-virus-vecteurs ont été illustrés en 1951 par la démonstration qu'un
141 virus peut influencer la biologie de son vecteur, ce dernier étant préférentiellement attiré par des plantes
142 infectées plutôt que par des plantes saines [27].

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# 3. L'écologie des virus de plantes et la révolution de la biologie moléculaire

147 Dans la deuxième moitié du XXᵉ siècle, la divergence progressive de la virologie et de l'écologie,
148 causée notamment par le développement des méthodes moléculaires à partir des années 1970, a ralenti
149 l'intérêt porté aux travaux en écologie des phytovirus. En effet, l'avènement de la biologie moléculaire
150 a orienté la virologie vers la biologie moléculaire des virus et l'étude de l'infection virale dans des
151 conditions contrôlées, loin des considérations écologiques [28].

152 Toutefois, l'essor des outils de détection sérologique et moléculaire a ouvert un âge d'or pour la
153 découverte des vecteurs des phytovirus. En effet, il a été révélé que les virus végétaux étaient transmis
154 « horizontalement » par un large éventail d'agents, en particulier par les insectes piqueur-suceurs
155 (pucerons, thrips, aleurodes, cochenilles ou cicadelles), mais aussi par les coléoptères, les acariens, les
156 nématodes, les champignons et les protistes [29]. D'autres travaux ont permis de démontrer que les virus
157 de plantes peuvent être transmis « verticalement » par le pollen ou les semences [4,29]. La détection des
158 virus de plantes chez de nombreux végétaux et insectes par des méthodes basées sur des réactions
159 immuno-enzymatiques (immunodiffusion, ELISA, western blot, TBIA, etc.), l'amplification PCR et des
160 sondes moléculaires ont mis en évidence que les gammes d'hôtes et de vecteurs de certains phytovirus
peuvent être quelquefois remarquablement larges [30-32]. Toutefois, il est actuellement considéré que les phytovirus sont en grande majorité des généralistes en termes d'hôtes mais des spécialistes en termes de vecteurs, c'est-à-dire qu'ils ont une large gamme d'hôtes mais une gamme étroite de vecteurs [33]. Des progrès ont également été réalisés dans le décryptage des voies de transmission des virus, notamment pour la description des modes de transmission circulante et propagative [34,35], ainsi que les concepts de mélange phénotypique (hétéro-encapsidation) ou de trans-encapsidation [36]. Parallèlement, les interactions plantes-virus commencent à être élucidées au niveau moléculaire, avec par exemple la démonstration de l'infectivité de l'ARN viral [37], la découverte du rôle du facteur de la transmission [38], le concept du « *silencing* » de l'ARN viral comme réaction de défense de l'hôte et des suppresseurs de *RNA silencing* produits par les virus [39-41], ou le rôle de la recombinaison génétique dans l'évolution des virus [42].

D'autres avancées majeures ont été réalisés dans la compréhension de la co évolution plante-virus. La présence fréquente d'infections virales dans des plantes sauvages asymptomatiques a été confirmée [43-45]. Ce constat a été étendu avec la suggestion que certains virus pouvaient potentiellement être bénéfiques pour les plantes [46-49]. Dans l'ensemble, la gamme des interactions plantes-virus s'avère être diversifiée et couvre un continuum antagonisme-mutualisme en fonction des combinaisons de génotypes de l'hôte et du virus, ainsi que des conditions environnementales [3,46]. Par ailleurs, des co-infections de plusieurs virus ont été fréquemment observées dans les plantes cultivées ou sauvages, accroissant encore la complexité de ces interactions [50,51]. Il a également été constaté que les virus des plantes étaient capables de manipuler à la fois leurs hôtes et/ou leurs vecteurs afin de maximiser leur transmission [52-55]. Enfin, des travaux récents ont mis en évidence l'existence d'un compromis évolutif entre la virulence d'un phytovirus (*maize streak virus*, agent causal de la striure du maïs) et sa fréquence de transmission [56].

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## 4. L'avènement de l'écologie du phytovirome

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Les divergences observées pendant la deuxième moitié du XXᵉ siècle entre les domaines de l'écologie (principalement axée sur les écosystèmes naturels moins « contrôlables ») et ceux de la virologie (centrée sur des hôtes modèles ou domestiqués) ont commencé à être comblées au début du XXIᵉ siècle. Cette situation a été rendue possible grâce à l'utilisation généralisée des nouvelles techniques de séquençage à haut débit [28]. De manière globale, ces développements ont stimulé l'émergence des études du métagénome viral chez les plantes (aussi appelé "phytovirome") et qui correspond au génome collectif d'une communauté virale au sein d'un individu ou d'un environnement donné [57].

L'étude du phytovirome par séquençage à haut débit couplé à des approches sophistiquées de bio-informatique a initialement été réalisée pour explorer la diversité des virus végétaux. Ces travaux ont permis de mettre en évidence que la diversité des communautés virales des systèmes naturels est encore très largement sous-estimée et que la connaissance du phytovirome est biaisée en faveur des plantes cultivées [58,59]. Les études de viromique sur plantes du compartiment non cultivé, incluant les espèces sauvages et rudérales, les adventices et les repousses de cultures annuelles restent en effet à ce jour moins fréquentes que celles réalisées sur plantes cultivées [60]. Elles ont cependant permis de confirmer que l'infection des plantes par des virus est courante dans la nature [61-64] et que ces infections ne causent pas toujours des symptômes reconnaissables. De plus, l'existence d'une abondance de virus dits persistants a été mise en évidence. Ces virus ne se propagent pas entre plantes (transmission horizontale) mais sont transmis à la descendance par l'intermédiaire de gamètes ou par multiplication végétative de la plante (transmission verticale) [65]. Des virus végétaux ont aussi été détectés dans de nombreux environnements biotiques tels que les eaux continentales ou l'atmosphère [57,58,66,67], révélant ainsi une capacité intrigante de ces phytovirus à circuler entre différents environnements et à y persister avec des implications écologiques qui restent à élucider.

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Globalement, les virus détectés par les études de viromique peuvent être classés en quatre types différents : (i) les virus connus déjà décrits dans l'environnement étudié; (ii) les virus connus non décrits précédemment dans l'environnement étudié; (iii) les nouvelles espèces de virus appartenant à un genre ou une famille connue, et (iv) les virus totalement nouveaux [60]. Cette diversité de phytovirus connus/inconnus a d'abord été étudiée à partir d'échantillons groupés, puis approfondie par des analyses de plantes individuelles (études éco-génomiques [68]), et enfin considérée dans un contexte spatial explicite (études géo-métagénomiques [58,69]). Ces inventaires de virus végétaux basés sur la viromique peuvent aider à répondre à d'importantes questions en matière d'écologie virale. A titre d'exemple, on peut citer l'émergence de nouvelles maladies virales, l'impact du changement climatique ou des pressions anthropiques sur les populations virales et sur les interactions plantes-virus-vecteurs, la contribution des virus végétaux au fonctionnement des populations de plantes sauvages, les règles qui régissent l'assemblage des communautés virales, etc. Ainsi, des travaux de viromique spatiale conduits dans la région floristique du Cap en Afrique du Sud et en Camargue ont récemment révélé deux résultats fondamentaux [69] : d'une part, une fréquence des infections virales de plantes significativement plus élevée en zone cultivée qu'en zone naturelle, suggérant que le regroupement et la concentration d'organismes génétiquement proches (comme les variétés cultivées) favorisent le développement des épidémies; d'autre part, l'existence dans le compartiment naturel, encore largement inexploré en termes de biodiversité des microorganismes, d'une large diversité de phytovirus encore non connus et non caractérisés. Ces résultats suggèrent qu'une meilleure connaissance du virome des zones bordant les parcelles agricoles pourrait permettre de mieux comprendre l'émergence de nouvelles maladies et de mieux contrôler la recrudescence de certaines autres maladies virales.

D'autres travaux pionniers réalisés depuis le début du XXIème siècle ont fait progresser notre compréhension de plusieurs phénomènes évolutifs et écologiques importants (Figure 3) : (i) les influences réciproques entre la dynamique des virus et la structure des communautés hôtes multi-espèces [70], illustrées par des invasions de plantes non indigènes [71,72]; (ii) la propagation des virus végétaux entre les réservoirs et les populations hôtes (sauvages et domestiques) [73]; (iii) les événements de débordement (« spill-over ») et de retour (« spill-back ») [74,75]; (iv) les effets de la simplification des écosystèmes causée par les activités humaines (et en particulier l'agriculture) sur la biodiversité et l'émergence de nouveaux virus dans les cultures [69,75-78]; (v) les effets de la diversité des hôtes et de l'hétérogénéité génétique sur la dynamique des virus [79] et (vi) la compréhension de la diversification du phytovirome [80-82], contribuant ainsi à une meilleure conceptualisation de l'origine et de l'évolution de la virosphère [83]. Enfin, l'apport des études de viromique à notre compréhension de la diversité virale a été reconnu au niveau international, et notamment par le Comité International de Taxonomie des Virus (ICTV) qui a récemment recommandé l'incorporation de certains virus identifiés uniquement à partir de données métagénomiques dans son système de classification officiel [84].

## 5. Opportunités d'étude de l'écologie du phytovirome

Les technologies de séquençage à haut débit (HTS) permettent de détecter potentiellement, et sans a priori, l'ensemble des virus présents dans un échantillon. Elles offrent donc une opportunité majeure pour améliorer la caractérisation des viromes et pour étudier la richesse virale à de multiples échelles, de la plante individuelle aux écosystèmes entiers. En outre, ces technologies permettent de fournir de nouvelles informations sur le déchiffrage de la diversité virale intra-spécifique, facilitant la caractérisation des variants et permettant ainsi de mieux démêler la génomique des populations virales. À l'avenir, la viromique pourrait également être utilisée pour quantifier les proportions relatives des espèces et des variants de virus au sein d'un échantillon ou d'un environnement, ce qui permettrait de nouvelles analyses de la prévalence des virus et de la dynamique des co-infections.

Les technologies HTS ont par ailleurs permis d'accélérer considérablement la découverte de nouveaux virus et de nouveaux hôtes pour des virus déjà connus. Dans de nombreux cas, la viromique offre un avantage considérable pour la caractérisation des viromes par rapport à des protocoles de détection spécifiques faisant appel à des techniques immuno-enzymatiques ou moléculaires [85,86]. En effet,
261 l'utilisation de ces techniques plus classiques est très limitée lorsqu'il s'agit de prendre en compte de
262 nouveaux virus ou de nouveaux variants sérologiques ou moléculaires d'une espèce virale. Si l'objectif
263 est de caractériser indépendamment le virome de plusieurs espèces végétales au sein d'une communauté,
264 le nombre de virus potentiellement ciblés devient encore plus important, ce qui rend les approches de
265 détection ciblées très complexes, voire inenvisageables. Cette réalité associée au coût de ces approches
266 explique en partie pourquoi les études écologiques sur les virus ont jusqu'à présent largement été
267 focalisées sur un petit nombre d'espèces de virus. Grâce à son approche non ciblée et globale, la
268 viromique a le potentiel de générer des études plus complètes du virome végétal à l'échelle des
269 communautés et des paysages [87].

270 La troisième génération des technologies HTS, et notamment l'approche de séquençage par nanopore,
271 a laissé entrevoir récemment de nouvelles perspectives prometteuses à plusieurs niveaux [88-94]. Cette
272 approche, par sa miniaturisation et sa portabilité, permet de se rapprocher du terrain et de détecter
273 quasiment en temps réel les virus connus ou inconnus potentiellement associés aux épidémies virales.
274 Une étude pionnière a ainsi démontré la faisabilité de la détection en quelques heures et au terrain de
275 bégomovirus infectant le manioc (East African cassava mosaic virus et African cassava mosaic virus)
276 à partir d'échantillons de feuille, de tige, de tubercule et d'insectes-vecteurs [90]. Cette approche produit
277 en outre des lectures longues qui ont permis, dans la majorité des études récentes, l'obtention de
278 séquences génomiques complètes. Il semble toutefois encore préférable de compléter le séquençage par
279 nanopore, quand les budgets le permettent, par un séquençage Illumina afin de gommer les erreurs de
280 séquençage encore nombreuses de cette technique HTS de troisième génération [89].

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# 6. Les défis de l'écologie du phytovirome
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284 Les technologies HTS peuvent théoriquement fournir une analyse holistique des espèces virales
285 présentes au sein d'un échantillon : détection, séquençage du génome et identification de variants voire
286 même leur quantification relative. Néanmoins, la réalisation d'une telle analyse se heurte actuellement
287 à de nombreux verrous techniques, méthodologiques, scientifiques et budgétaires (Figure 4).

288 Jusqu'à présent, les technologies HTS ont été principalement utilisées sur des plantes individuelles,
289 généralement symptomatiques, pour identifier la ou les espèces virales présentes. Un écueil actuel est
290 d'opérer une transition depuis le séquençage de plantes individuelles vers le séquençage de populations
291 de centaines voire de milliers de plantes permettant d'analyser le virome de communautés végétales.
292 Alors que les tests classiquement utilisés comme la (RT-) PCR et l'ELISA sont bons marchés et peuvent
293 être appliqués sur un grand nombre d'échantillons, le coût plus élevé des technologies HTS limite leur
294 utilisation massive. Les chercheurs doivent actuellement trouver un équilibre entre le nombre de plantes
295 analysées, le nombre de séquences générées par échantillon et la possibilité d'analyser des échantillons
296 composites, ce qui a aussi un impact sur l'interprétation des résultats. Cette transition d'échelle nécessite
297 donc de résoudre une série de problèmes, depuis l'échantillonnage des plantes au sein de l'écosystème
298 au choix du type d'extraction nucléique virale, en passant par le séquençage en lui-même et les analyses
299 bio-informatiques qui en découlent.

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# 6.1. La définition d'un échantillonnage approprié

302 Différentes stratégies d'échantillonnage peuvent être considérées selon que l'on envisage d'étudier une
303 seule espèce virale ou, au contraire, un virome complet. L'échantillonnage peut être réalisé à une seule
304 reprise ou de manière répétée au cours de la même saison, ou au cours de saisons ou d'années différentes.
305 Le moment de prélèvement est un élément crucial à considérer, en particulier dans le cas d'un
306 échantillonnage unique.

307 Cela peut correspondre au moment où la charge virale est la plus élevée. Le taux de multiplication des
308 virus et leur accumulation au sein des plantes hôtes peuvent être influencés par divers facteurs : le temps
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post-infection; les conditions environnementales [95,96]; le stade phénologique de la plante [97]; l'organe échantillonné [98-100], ainsi que le génotype de la plante et du virus [101]. Il n'y a généralement pas de timing universellement optimal, mais les titres viraux sont généralement plus élevés dans les tissus en croissance active. Une connaissance de la biologie des virus déjà connus au sein de la communauté végétale est donc un élément important, permettant de guider le choix des périodes d'échantillonnage.

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La date de prélèvement peut aussi correspondre au moment où la diversité de virus détectables est la plus grande, ou à la fin de la saison de végétation active de manière à maximiser les possibilités de transmission horizontale. Le stade actuel des connaissances en écologie des phytovirus fait du choix raisonné d'un timing d'échantillonnage une tâche très compliquée, voire impossible pour des virus peu caractérisés voire inconnus. Dans ce cas, un échantillonnage répété peut être privilégié afin d'identifier le timing le plus approprié.

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## 6.2. L'échantillonnage dans l'écosystème

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Le protocole utilisé pour la collecte des échantillons sur le terrain est essentiel mais souvent mal documenté dans les publications. Pour soutenir une analyse et une interprétation solides des données, il est essentiel de relier la question à étudier, la conception globale de l'étude et la stratégie d'échantillonnage, incluant notamment la méthode de conservation et de conditionnement des échantillons qui s'avère être cruciale en fonction des acides nucléiques ciblés (ARN double brin, ARN interférents, ADN – voir section 6.4). Plusieurs questions essentielles doivent ainsi être considérées : quelle configuration spatiale et quelle surface unitaire d'échantillonnage seront les plus appropriées ? Quelles espèces hôtes seront choisies ? Quand et à quelle fréquence l'échantillonnage doit-il avoir lieu ? Combien d'individus seront sélectionnés ? Quel sera le processus spécifique de sélection des plantes : le stade de développement, la taille ou l'état des symptômes doivent-ils être pris en compte ? Les réponses à ces questions influenceront la nature des analyses statistiques qui peuvent être menées et leurs conclusions.

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La stratégie d'échantillonnage doit être précisément définie avant le travail de terrain afin d'éliminer la subjectivité de l'échantillonneur et les biais associés, par exemple par une propension à prélever des plantes symptomatiques [102]. Ainsi, des points prédéterminés peuvent être présélectionnés avec un système d'information géographique (SIG), puis localisés avec un système de positionnement global (GPS) sur le terrain. Ces points peuvent être situés de manière complètement aléatoire ou être sélectionnés sur une grille pour un échantillonnage systématique [69]. Alternativement, l'échantillonnage peut être effectué à des intervalles prédéterminés le long de transects, une approche qui nécessite moins de technologie de mise en œuvre [102]. Le protocole d'échantillonnage doit également spécifier les modalités de prélèvement à chaque point de prélèvement ou unité d'échantillonnage. Cette unité d'échantillonnage peut correspondre à une ou plusieurs plantes voire à un quadrat dans lequel des plantes seront prélevées selon les modalités envisagées [103].

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La stratégie décrite ci-dessus peut ensuite être adaptée selon l'objectif de l'étude. Quand il s'agit de quantifier la prévalence de l'infection - la proportion de plantes individuelles qui ont une infection virale détectable -, les plantes seront analysées individuellement et échantillonnées en utilisant des méthodes standard d'écologie végétale ciblées, tandis que l'infection virale peut être considérée comme une caractéristique de la plante. Les plantes individuelles peuvent être codées séparément et séquencées. Il est également possible d'analyser des pools composites, puis grâce à des méthodes spécifiques (RT-) PCR ou ELISA de rechercher les virus d'intérêt dans les plantes individuées. Dans certains cas, il est essentiel de s'assurer que les individus sont échantillonnés sans tenir compte des symptômes et que toutes les classes d'âge / taille sont évaluées.

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Un objectif plus complexe est de caractériser la composition d'espèces (ou de variants) d'une communauté ou d'une population virale. En règle générale, l'objectif est alors d'identifier la totalité ou la plupart des taxons viraux au sein de l'unité d'étude et de comparer la composition de la communauté virale à travers les espèces hôtes, les localisations ou les communautés végétales. L'effort
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d'échantillonnage peut être structuré pour refléter la représentation relative des espèces composant la communauté végétale, sur la base par exemple de leur abondance, de leur couverture ou de leur biomasse relative. [57,104]. Un problème connexe est la profondeur d'échantillonnage : combien d'échantillons doivent être prélevés ? En règle générale, plus l'échantillonnage est important, plus la probabilité d'identifier des virus peu prévalents dans la communauté étudiée augmente. Les courbes d'accumulation de taxons en fonction de la profondeur d'échantillonnage illustrent l'augmentation du nombre d'espèces détectées avec un effort d'échantillonnage croissant, mais ne prédisent pas l'identité des espèces. Cependant, elles sont parfois utilisées à petite échelle lors de tests préliminaires pour évaluer l'échantillonnage à partir duquel le nombre d'espèces virales atteint un plateau [105].

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L'impartialité de l'échantillonnage est essentielle si l'objectif est d'évaluer les profils de diversité virale, y compris la richesse des taxons viraux (exprimés à différents niveaux – variants, espèces, genres ou familles). Par ailleurs, l'échantillonnage peut être basé sur « l'individu » ou sur « l'échantillon ». Les évaluations individuelles examinent des individus choisis aléatoirement sur le terrain, tandis que les évaluations basées sur un échantillon évaluent le nombre de taxons cibles dans des unités d'échantillonnage collectives telles que les quadrats [105]. Le choix entre ces modalités peut de façon évidente impacter les valeurs de richesse et de diversité virales, ou la capacité à reconstituer ou non des molécules génomiques complètes [106].

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## 6.3. Analyser des plantes individuées ou regroupées ?

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Un autre paramètre crucial est la stratégie de regroupement (ou « pooling ») des individus ou des échantillons pour le séquençage (dans la préparation de banques par exemple), ce qui peut être nécessaire pour réduire les coûts. La taille optimale du pool dépend d'un équilibre parfois difficile à atteindre entre le nombre de pools à séquencer et le nombre de plantes individuelles par pools. L'augmentation de la taille du pool est susceptible d'exacerber la concurrence entre les séquences virales ; plus le pool est grand, plus grand est le risque que certains virus à faible prévalence ou à faible concentration deviennent indétectables si d'autres virus sont présents en forte abondance/concentration (effet de dilution).

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Le pooling d'échantillons imbriqués est une approche intéressante pour déterminer une stratégie optimale de pooling. Dans cette approche, une série de pools avec un nombre croissant de plantes groupées provenant de la même communauté ou d'un nombre croissant de communautés est collectée et séquencée. Les résultats donneront un aperçu de l'hétérogénéité spatiale de la population échantillonnée et donc de la taille de l'échantillon nécessaire à une bonne représentation. Dans tous les cas, il est conseillé de collecter et de stocker des plantes individuelles pour la confirmation en aval des résultats HTS.

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Les stratégies de pooling doivent également tenir compte du fait que certaines espèces végétales peuvent contenir des inhibiteurs (métabolites secondaires par exemple) qui peuvent affecter négativement les étapes d'extraction, d'amplification et de séquençage dans certains protocoles. Une étude préliminaire de l'effet inhibiteur potentiel des diverses espèces échantillonnées peut être éventuellement réalisée au moyen de (RT-) PCR ciblée sur des mélanges de plantes [98].

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## 6.4. Impact du choix de l'acide nucléique viral à extraire et du séquençage

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La sélection de la population d'acides nucléiques cibles est cruciale car elle définit les types de séquences virales qui seront détectées. Il faut ainsi choisir entre le séquençage d'ARN / ADN total, des acides nucléiques associés aux virions (VANA), des ARN double brin, des ARN interférents, des ADN simple brin circulaires ou des produits d'amplification (RT-) PCR ciblés à l'aide d'amorces génériques. La fouille bioinformatique de ressources accessibles publiquement, comme les jeux de données transcriptomiques de la Sequence Reads Archive de GenBank, peut permettre de réaliser des études du virome voire des études conjointes ou corrélatives du virome et du transcriptome de l'hôte [107,108].
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Alors que les technologies HTS ont la capacité théorique de cibler n'importe quel acide nucléique viral dans n'importe quelle plante hôte ou vecteur, les protocoles d'extraction disponibles présentent chacun des avantages et des limitations spécifiques [58,106,109]. Ces limitations justifient une évaluation soigneuse *a priori* des virus et des viroïdes susceptibles d'infecter les plantes de la zone d'étude ainsi que des questions posées par l'étude envisagée. Par exemple, il n'existe actuellement aucun viroïde connu infectant les Poacées et la méthode VANA - concentrant l'ADN et l'ARN associés aux virions et excluant théoriquement les viroïdes - pourrait être un bon choix lors de l'étude d'échantillons de prairies, étant entendu que l'analyse n'identifierait probablement pas un nouveau viroïde infectant les Poacées étudiées.

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Un autre élément important à considérer à cette étape est le risque de contamination, qu'elle soit d'origine humaine - lors du prélèvement ou du traitement des échantillons ou technologique (e.g. phénomène d'index-hopping par la technique Illumina) [110] qui pourrait entrainer une identification erronée des combinaisons virus-hôte. Les mêmes précautions et normes actuellement utilisées dans les tests (RT-) PCR doivent être mises en œuvre pour les technologies HTS [86,111] avec par exemple l'utilisation d'une série de contrôles (positifs / négatifs, internes / externes, spiking) à chaque étape du protocole HTS utilisé. En outre, la confirmation par d'autres méthodes de la présence du virus identifié dans des échantillons individuels est fortement recommandée.

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Concernant le séquençage en lui-même, la longueur des reads (read length) et la profondeur de séquençage (sequencing depth) sont deux éléments clés à considérer. La longueur des reads peut affecter la précision du séquençage [89] mais aussi influencer l'assemblage des séquences et leur annotation, avec un impact sur la capacité à reconstruire des génomes viraux et à identifier des variants viraux [112,113]. Les protocoles permettant un enrichissement des séquences virales, tels que VANA ou ARN double brin ou bien ARN « ribodéplétés », peuvent améliorer significativement la sensibilité de détection des virus pour une profondeur de séquençage donnée. Ces protocoles sont donc appréciés pour les études d'écologie virale [69,73,114–117]. La profondeur de séquençage peut quant à elle agir sur la probabilité de détection de faux positifs [86]. La distinction appropriée entre la présence d'un virus en très faible proportion dans un échantillon et la contamination de cet échantillon par quelques séquences de virus d'un autre échantillon lors de l'application du HTS représente ainsi un défi important qui doit être relevé dans le futur en fixant la limite de détection. Plusieurs paramètres pourraient être utilisés tels que le nombre absolu de séquences ou la proportion relative de séquences.

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## 6.5. Analyses bio-informatiques

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Les progrès de la bio-informatique permettent d'exploiter la puissance des technologies de séquençage à haut débit aidant ainsi à mieux identifier et caractériser les génomes viraux. Si la profondeur du séquençage ou la disponibilité des cibles virales sont suffisantes, les contigs assemblés (= séquences consensus issues de l'assemblage de lectures - ou reads - de séquences chevauchantes) à partir de lectures courtes (produites par exemple par séquençage Illumina™), de lectures longues natives (issues par exemple de la technologie de séquençage par nanopore) ou de mélanges de lectures courtes et longues peuvent conduire à l'obtention de la séquence (quasi) complète de génomes viraux.

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Ces analyses bio-informatiques peuvent ensuite conduire à examiner les séquences virales assemblées et à les attribuer à des unités taxonomiques virales, afin d'estimer la structure génétique et la diversité des phytovirus (richesse et uniformité), ou même de caractériser de nouvelles espèces virales. Cependant, différents termes souvent utilisés dans ces analyses, tels que les notions d'espèces virales, isolats, souches, unité taxonomique opérationnelle (OTU) ou quasi-espèces, ont des définitions encore discutées parmi les virologues [118–120].

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Le point crucial est donc de définir clairement l'unité fondamentale utilisée pour l'estimation de la diversité virale [63], qui peut être la famille virale [69] ou les OTUs utilisés comme proxys de l'espèce virale [109,121]. D'autres problèmes peuvent rendre complexes ces analyses de diversité ou de richesse virales, comme par exemple des assemblages de génome viraux incomplets pouvant entraîner la représentation de différents virus par des régions génomiques non-chevauchantes (c'est le cas si l'espèce
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virale 1 est représentée par sa protéine de capside tandis que l'espèce virale 2 est représentée par son gène de la polymérase); ou des assemblages chimériques dus à des régions homologues entre plusieurs souches ou espèces virales. L'expertise du chercheur est donc requise pour déterminer précisément la diversité du virome au sein d'une population ou d'une communauté végétale.

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Cette expertise est tout aussi essentielle dans l'identification de nouvelles espèces virales [113] en raison des limites des approches d'annotation basées sur les homologies de séquences (BLASTn ou BLASTx). Les banques de données mal annotées ou incomplètes [121] peuvent conduire à une identification erronée des virus et *in fine* à une sous-estimation des communautés virales présentes. Néanmoins, l'attribution (assignation) des reads peut être affinée à l'aide d'un algorithme de placement phylogénétique, comme récemment illustré pour l'analyse de la phylogénie des *Mastrevirus* [64]. Un autre défi majeur est la caractérisation biologique (gamme d'hôtes, mode de transmission, symptomatologie, répartition géographique, etc.) de tout virus nouvellement identifié et, pour y répondre, une démarche logique a été récemment décrite [112].

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Enfin, les technologies HTS permettent d'analyser la diversité génétique des populations virales *via* par exemple l'examen des polymorphismes mononucléotidiques (SNPs). Cet aspect est d'un grand intérêt en écologie virale afin de mieux mesurer et cartographier les empreintes évolutives de l'émergence de virus à l'échelle de la communauté végétale. Par exemple, la caractérisation détaillée d'isolats viraux permettrait de comparer une population virale dans un hôte primaire et dans un ou plusieurs autres hôtes, validant ou invalidant ainsi le rôle de réservoirs potentiels. Cependant, le génotypage et l'haplotypage des SNPs sont déjà un défi à l'échelle d'un virus unique dans une seule plante, et ils sont encore plus complexes pour une diversité de virus et d'hôtes au sein d'une communauté végétale (mélanges d'isolats viraux différents, différenciation entre SNP et erreurs de séquençage, confirmation des SNP par PCR ciblée en temps réel, etc.). L'analyse des duplicata est une stratégie souvent utilisée lors d'analyses de diversité par métabarcoding – technique de HTS de caractérisation de la composition taxonomique d'un échantillon par l'amplification et le séquençage d'une séquence universelle [122] et pourrait permettre de distinguer les SNPs réels des erreurs de séquençage mais reste une approche coûteuse.

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## 7. Conclusion

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L'étude de l'écologie des phytovirus, depuis la fin du XIXᵉ siècle, a été accélérée par l'évolution des techniques de détection et de caractérisation des virus. La dernière révolution technique, l'utilisation des technologies HTS pour détecter les virus végétaux dans divers environnements et dans de nombreuses plantes simultanément, permet pour la première fois d'étudier en profondeur le métagénome viral ou virome. La capacité de ces technologies à détecter sans *a priori* tous ou presque tous les virus dans un échantillon ouvre d'énormes opportunités pour améliorer la caractérisation des viromes et répondre à de nouvelles questions, tant en virologie végétale qu'en virologie animale [123]. On peut ainsi s'attendre à des avancées en termes d'étiologie des maladies avec le dépassement du concept de "trinité écologique" virus-hôtes-vecteurs et la prise en compte du pathobiome [124] ou encore l'amélioration de nos connaissances sur la propagation des virus entre les réservoirs et les hôtes (sauvages, domestiques, humains) ou sur le rôle écologique joué par les vecteurs dans le choix des hôtes. Ces travaux devraient en outre se traduire par une meilleure appréciation de la contribution écologique des virus à l'échelle de l'écosystème et tendre vers une meilleure définition des facteurs impliqués dans l'émergence des nouvelles maladies virales.

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Néanmoins, l'utilisation des approches HTS dans les études écologiques est associée à une série de défis décrits en détails dans cette revue et auxquels une attention particulière doit être portée à chaque étape : sur le terrain, au laboratoire et pour les analyses bio-informatiques. Sur ce dernier point, il reste beaucoup d'efforts à faire pour optimiser le stockage, le partage et l'utilisation des données et des metadonnées issues des études de métagénomique virale, ouvrant ainsi la voie à la réutilisation de ces jeux de données par d'autres scientifiques pour des travaux de datamining, et plus largement pour la mise en place d'une veille sanitaire numérique des maladies. Les avancées récentes de l'écologie des phytovirus, qui sont
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potentiellement transférables à l'écologie des virus animaux et humains, s'inscrivent dans une histoire
riche de presque un siècle et demi d'échanges conceptuels et techniques entre la virologie végétale et la
virologie vétérinaire et humaine.

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